JP2012515189A - 変異アンチトロンビン、その製造方法及び薬剤としての使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
血液凝固系の全身性活性化は、重症敗血症及び/又は敗血症性ショックの患者で頻繁に観察される。感染合併症としての重症敗血症は、全身性炎症、タンパク質分解カスケードの活性化、血液凝固異常(DIC)及び種々の臓器の機能不全により特徴付けられる。そのより重症の形態である敗血症性ショックは、加えて、血行動態の変化及び臓器灌流の欠陥と関連し、臓器不全を更に悪化させ、しばしば多臓器不全での死亡に至る。敗血症性ショックでの死亡率は高く(40%〜50%)、不全となった臓器数とともに甚だしく上昇する。すなわち、急性腎不全についての腎置換療法を必要とする患者は、80%を超える死亡率である。重症敗血症の発症の開始事象は、Toll様受容体表面への結合を介する微生物抗原(すなわち、グラム陰性細菌から遊離されるリポ多糖(LPS)、グラム陽性細菌からのリポテイコイン酸、真菌抗原)による単球/マクロファージの活性化である(Cohen J., The immunopathogenesis of sepsis., Nature, 2002; 420: 885-91)。
単球/マクロファージの活性化(続いておそらく内皮細胞が活性化される)は、サイトカインメディエータの分泌をもたらす(例えばインターロイキン6(IL-6)、腫瘍壊死因子(TNFα)及びケモカイン、脂質メディエータ、細胞膜での接着分子及び組織因子の発現、一酸化窒素及び活性酸素種の形成)。このステップの後、血液凝固及び補体を含む、炎症反応及び血液凝固活性化の維持に貢献する生物学的カスケードが活性化される。これら事象は、感染部位で微生物病原体を根絶するために十分に適合しているのではあるが、それが広がり、調節されず維持されるようになると、有害な結果、すなわち種々の臓器不全をもたらす(Aird W., The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome., Blood, 2003; 101: 3765-77)。
アンチトロンビンは、血液の流動性の維持で必須の役割を果たす。血液凝固は、一連のセリンプロテアーゼにより媒介される。アンチトロンビンは、血液凝固セリンプロテアーゼ、特に第IIa因子(トロンビン)、第Xa因子、第IXa因子及び第XIa因子の強力なインヒビターである。ATと内皮細胞上のヘパリン様グリコサミノグリカン(HGAG)との相互作用は、ATによるトロンビン阻害の加速に重要である(Rosenberg RD., Biochemistry of heparin antithrombin interactions, and the physiologic role of this natural anticoagulant mechanism., Am J Med, 1989; 87: 2S-9S)。実際、血栓エピソードが、先天性AT欠損症患者及びヘパリンへの親和性を欠く変異型ATを有する患者で観察された。このことは、内皮細胞表面のヘパリン様GAGとのATの相互作用が、ATによる血液凝固カスケードの調節に重要であることを示唆している(Kuhle S, Lane DA, Jochmanns K, Male C, Quehenberger P, Lechner K, Pabinger I, Homozygous antithrombin deficiency type II (99 Leu to Phe mutation) and childhood thromboembolism., Thromb Haemost., 2001; 86: 1007-11)。過剰な血液凝固の予防におけるアンチトロンビンの生理学的重要性は、アンチトロンビンレベルが遺伝的又は後天的な欠損に起因して減少している個体の研究により明らかにされている。このような人々は、血栓症を自然発症しやすく、関連して播種性血管内凝固症候群、心筋梗塞、脳血管発作及び肺塞栓症の危険にある。
ATは、ヒヒ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ラット及びニワトリの胚で示されたように調べた種にかかわらず、敗血症及び敗血症性ショックの幾つかの実験モデルで有効であることが示されている。これらモデルにおいて、ATは、生細菌(大腸菌(Escherichia coli)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae))及び細菌性リポ多糖(LPS)を含む異なる病原体を用いた敗血症又は敗血症性ショックの誘導後に効果的であることが証明された。
モルモットモデルにおいて、ATがDIC及び臓器出血を予防し得、グラム陽性細菌である黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)での感染後の死亡率を改善し得ることが証明されている。
治療用量のヘパリン(Corrigan JJ., Heparin therapy in bacterial septicemia., J Pediatr., 1977; 91: 695-700)又はアンチトロンビン(Schipper HG, Jenkins CSP, Kahl LH, ten Cate JW, Antithrombin III transfusion in disseminated intravascular coagulation., Lancet, 1978; 1: 854-856)は、効力の明確な証拠がないまま、播種性血管内凝固症候群及び敗血症の予防及び治療のために20年以上臨床で用いられている。
重症敗血症の間の血液凝固系の活性化及び抗凝固因子の消耗に対処するために、高用量のアンチトロンビンを用いる幾つかの研究が患者で行われている。
重症敗血症に関連するDICに焦点を当てたこの研究の事後分析は、この投薬量(4日間で30,000IU)のATが、プラシーボで処置された対照と比較して、ヘパリン処置をしていない患者で出血リスクを増加させることを報告した(Treatment effects of high-dose antithrombin without concomitant heparin in patients with severe sepsis with or without disseminated intravascular coagulation, 2006, J. of Thrombosis and Haemostasis, 4: 90-97)。
活性化プロテインC(ドロトレコギンα)は、最高の重症度スコアの患者で重症敗血症の死亡率を低減することが示されている[Bernard GR, Vincent JL, Laterre PF, LaRosa SP, Dhainaut JF, Lopez-Rodriguez A, Steingrub JS, Garber GE, Helterbrand JD, Ely EW, Fisher CJ Jr; Recombinant human protein C Worldwide Evaluation in severe sepsis (PROWESS) study group, Efficacy and safety of recombinant human activated protein C for severe sepsis., N Engl J Med, 2001; 344: 699-709]。この研究の結果にもかかわらず、活性化プロテインCの使用は、とりわけ出血に関するこの薬剤の効力/安全性プロファイルに関してのもののような、議論の余地を残している。WO2005/007820は、抗凝固活性が低下している変異した活性化プロテインC変異型の、細胞性の細胞保護を必要とする病状の治療のための使用を開示するが、これら変異型は、臨床の場で試験されていない[Kerschen EJ, Fernandez JA, Cooley BC, Yang XV, Sood R, Mosnier LO, Castellino FJ, Mackman N, Griffin JH, Weiler H., Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant antivated protein C., J Exp Med., 2007年10月1日; 204(10): 2439-48]。
また、本発明の別の目的は、活性物質として改変アンチトロンビンを含んでなる新たな医薬組成物を提供することである。
− 非変異アンチトロンビンの抗凝固活性と比べて実質的に低下した抗凝固活性を有するか、又は
− 抗凝固活性を実質的に有さない
変異アンチトロンビンを少なくとも含んでなる組成物の、感染、炎症又は低酸素傷害のような細胞傷害と関係する病状の予防又は治療を意図する薬剤の製造のための使用に関する。
上記変異アンチトロンビンは、実験の部Iに記載される方法に従って製造できる。
ヒトアンチトロンビン配列は、Olds R.J., Lane D.A., Chowdhury V., De Stefano V., Leone G.及びThein S.L., "Complete nucleotide sequence of the antithrombin gene: evidence for homologous recombination causing thrombophilia", Biochemistry, 32 (16), 4216-4224 (1993)に記載されている。
本発明のヒトアンチトロンビン配列は、ホモ・サピエンス(Homo sapiens)セルピンペプチダーゼインヒビター、クレードC(アンチトロンビン)、メンバー1(SERPINC1)、mRNAである。アクセッションNM 000488、バージョンNM 000488.2、GI:50541941。
アンチトロンビンのヒトアミノ配列は2つの形態を示す:シグナルペプチドを含まない「短形態」(配列番号2)及びシグナルペプチドを含んでなる「長形態」(配列番号26)である。
シグナルペプチドは32アミノ酸を含んでなり、アンチトロンビン分泌に必要である。これは、アンチトロンビンのプロセシングの間に除去され、血漿アンチトロンビンは「短形態」として循環する。
本発明による変異アンチトロンビンは、アンチトロンビンの抗凝固活性の副作用に起因する抗凝固の望まない合併症、特に出血を予防できることが、予想外にも見出された。
表現「非変異アンチトロンビンの抗凝固活性と比べて実質的に低下した抗凝固活性を有する変異アンチトロンビン」は、野生型アンチトロンビンと比較して、凝固を阻害する能力が低下した(2〜20分の1に低下した(2 to 20 fold reduced))変異アンチトロンビンをいう。
変異アンチトロンビンの抗凝固活性は精製した系で評価される。変異アンチトロンビンの抗Xa及び抗IIa阻害活性は、「材料及び方法」の章に記載されるように測定する。
変異アンチトロンビンの細胞保護活性は、「材料及び方法」の章に記載されるように評価する。簡潔には、変異アンチトロンビンの存在下又は非存在下でLPSに曝露した全血中の炎症促進性サイトカインのレベル(IL6及びTNFα)を比較する。
細胞傷害は、限定されないが、炎症、感染、低酸素症及び虚血/再灌流により引き起こされ得る。
虚血は、動脈硬化又は血栓により動脈流が妨害されると生じ、低酸素症の最も一般的な原因であり、心肺不全に起因する血液の不適切な酸素付加の間又は貧血若しくは一酸化炭素中毒のような血液の酸素運搬能力の喪失の間に生じる。
細胞傷害は可逆的又は不可逆的であり得る。不可逆的傷害の場合、多くの細胞がアポトーシス又は壊死を受ける。壊死は、細胞死の最も一般的なタイプであるが、極度の細胞膨張又は細胞破裂、細胞質タンパク質の凝固、リソソームのような細胞小器官の破壊などにより顕現する。
より好ましくは、本発明は、非変異アンチトロンビンの抗凝固活性と比べて実質的に低下した抗凝固活性を有するか又は抗凝固活性を実質的に有さない変異アンチトロンビンの、感染、炎症又は低酸素傷害のような細胞傷害と関係する病状の予防又は治療を意図する薬剤の製造のための使用であって、該変異アンチトロンビンが、必要とする患者に、血漿中約100%〜750%のATに達するように約0.5〜約15UI/ml、特に約1〜約7.5UI/mlの濃度で投与される使用に関する(細胞保護効果は、血漿ATに関して250%を超えるAT濃度について観察された)。1IUのアンチトロンビンは、1mLの血漿中に含まれるアンチトロンビンの量と規定され、約0.15g/L〜約0.3g/L血漿の範囲に相当する。
− 非変異アンチトロンビンの抗凝固活性と比べて実質的に低下した抗凝固活性を有するか、又は
− 抗凝固活性を実質的に有さない
変異アンチトロンビンを少なくとも含んでなる組成物を投与する工程を含んでなり、該組成物が、約20UI/kg/日〜約600UI/kg/日、好ましくは約40UI/kg/日〜約300UI/kg/日の投薬量で投与する方法に関する。
本発明によれば、「低酸素傷害」は、低酸素症又は虚血/再灌流を意味する。
重症敗血症の定義及び分類は、当該分野において公知であり、例えば、Levy, M.M.らに開示される(Levy, M.M.ら、Intensive Care Med, 2003, 29(4): 530-8)。
脳卒中(急性脳血管発作)は、脳への血流が減少するか又は停止すると生じる。
− 実質的に低下したトロンビン阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性を実質的に失っている、又は
− 低下した第Xa因子阻害活性を有するか若しくは第Xa因子阻害活性を実質的に失っている、又は
− 実質的に低下したトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を実質的に失っている、
上記使用に関する。
アンチトロンビンの完全な抗凝固活性は、トロンビンと第Xa因子の凝固促進活性の阻害により達成される。したがって、アンチトロンビンの抗凝固活性を低下させるために、変異によってトロンビン及び/又は第Xa因子を阻害する能力を低下させることができる。好ましくは、アンチトロンビンの抗凝固活性を完全に低下させるために、アンチトロンビンのトロンビン及び第X因子阻害活性の両方を不活化する。
抗Xa及び抗IIa阻害活性は、「材料及び方法」の章に記載されるような精製された系で測定する。
抗Xa及び抗IIa阻害活性は、「材料及び方法」の章に記載されるような精製された系で測定する。
本発明の変異アンチトロンビンは、変異アンチトロンビンの上記特性に変化がないことを条件に、380位のアミノ酸から400位のアミノ酸までの領域外に、その他の変異を含んでなることができる。
グリコシル化部位は、アンチトロンビンが真核生物で発現するとき、アンチトロンビンの分泌に必要である。しかし、1つの部位の除去は、アンチトロンビン分泌を損なわず、ヘパリン様グリコサミノグリカン結合を増加させる。実際、グリコシル化鎖は、アンチトロンビン-細胞性ヘパリン様グリコサミノグリカン結合に関与する。
該変異アンチトロンビンが更に、
− 実質的に低下したトロンビン阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性を実質的に失っている、又は
− 低下した第Xa因子阻害活性を有するか若しくは第Xa因子阻害活性を実質的に失っている、又は
− 実質的に低下したトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を実質的に失っており、
該変異アンチトロンビンが、少なくとも1つの変異を
− 380位のアミノ酸から400位のアミノ酸までの領域内、特に393位若しくは394位(アミノ酸番号付けは、配列番号2で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する)、又は
− 412位のアミノ酸から432位のアミノ酸までの領域内、特に425位若しくは426位(アミノ酸の番号付けは、シグナルペプチドを含む配列番号26で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する)
に含んでなり、
該変異が置換、挿入又は欠失である
組成物の、感染、炎症又は低酸素傷害と関係する病状、特に敗血症及び脳卒中に関連した虚血/再灌流、手術に関連した虚血/再灌流、並びに臓器移植に関連した虚血/再灌流の予防又は治療を意図する薬剤の製造のための使用に関する。
− 配列番号4(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換を含んでなる)、
− 配列番号6(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸と394位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入を含んでなる)、
− 配列番号8(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、
− 配列番号10(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、
− 配列番号62(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、及び
− 配列番号64(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)による置換を含んでなる)
からなる群より選択されるアミノ酸配列である、上記使用に関する。
− 配列番号14(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号16(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸と394位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号18(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位及び394位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、
− 配列番号20(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸の欠失及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号22(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸の欠失及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号24(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位及び394位のアミノ酸の欠失と、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含んでなる)、
− 配列番号66(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、及び
− 配列番号68(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)による置換及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)
からなる群より選択されるアミノ酸配列である、上記の使用に関する。
本発明の変異アンチトロンビンは、変異アンチトロンビンの上記特性に変化がないことを条件に、412位のアミノ酸から432位のアミノ酸までの領域外に、その他の変異を含んでなることができる。
− 配列番号28(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換を含んでなる)、
− 配列番号30(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸と426位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入を含んでなる)、
− 配列番号32(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、又は
− 配列番号34(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、
− 配列番号70(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、及び
− 配列番号72(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)による置換を含んでなる)、
からなる群より選択されるアミノ酸配列である、上記使用に関する。
− 配列番号38(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号40(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸と426位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号42(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸及びと426位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、
− 配列番号44(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸の欠失及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号46(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸の欠失及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号48(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸と426位のアミノ酸の欠失及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号74(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、及び
− 配列番号76(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)による置換及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)
からなる群より選択されるアミノ酸配列である、上記使用に関する。
− 本明細書に記載される、実質的に低下した抗凝固活性を有するか又は抗凝固活性を実質的に有さない少なくとも1つの変異アンチトロンビンからなる第1のアンチトロンビンと、
− 野生型アンチトロンビンのものと類似の抗凝固活性を有する少なくとも1つのアンチトロンビンからなる第2のアンチトロンビンと
を含んでなる組合せの、感染、炎症又は低酸素傷害のような細胞傷害と関係する病状の予防又は治療を意図する薬剤の製造のための組合せ製品としての使用に関し、ここで、
該組合せ製品は同時、逐次的又は別々の投与に用いることができ、
前記第1及び第2のアンチトロンビンは、所定の重量比、好ましくは約9:1〜約1:4、好ましくは約4:1〜約1:2、より好ましくは約2:1〜約1:2のそれぞれの重量比である。
本発明によれば、用語「野生型アンチトロンビンのものと類似の抗凝固活性を有する少なくとも1つのアンチトロンビンからなる第2のアンチトロンビン」は、変異を有さず野生型アンチトロンビンに相当する任意のアンチトロンビン又は該第2のアンチトロンビンの抗凝固活性に影響しない少なくとも1つの変異を有するアンチトロンビンをいう。
ヘパリンは、変異アンチトロンビンと細胞性ヘパリン様グリコサミノグリカンとの間の相互作用と競合し得るので、本発明による変異アンチトロンビンは、ヘパリン治療を受けている患者には投与しないのが好ましい。その他の抗凝固因子は、その組合せが変異アンチトロンビンの細胞保護活性を損なわないことを条件に、本発明の変異アンチトロンビンと共に使用することができる。
− 本明細書に記載される、実質的に低下した抗凝固活性を有するか又は抗凝固活性を実質的に有さない少なくとも1つの変異アンチトロンビンからなる第1のアンチトロンビンと、
− 野生型アンチトロンビンのものと類似の抗凝固活性を有する少なくとも1つのアンチトロンビンからなる第2のアンチトロンビンと
を含んでなる組合せを投与する工程を含んでなる方法にも関し、ここで、前記組合せは、約20UI/kg/日〜約600UI/kg/日、好ましくは約40UI/kg/日〜約300UI/kg/日の投薬量で投与される。
− 実質的に低下したトロンビン阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性を実質的に失っている、又は
− 低下した第Xa因子阻害活性を有するか若しくは第Xa因子阻害活性を実質的に失っている、又は
− 実質的に低下したトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を実質的に失っている、
上記の組合せの使用に関する。
第1のアンチトロンビンが、
− 配列番号4(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換を含んでなる)、
− 配列番号6(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸と394位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入を含んでなる)、
− 配列番号8(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、
− 配列番号10(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、
− 配列番号18(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位及び394位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、
− 配列番号62(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、及び
− 配列番号64(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)による置換を含んでなる)
からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
第2のアンチトロンビンが配列番号2からなる、
上記の使用に関する。
第1のアンチトロンビンが、
− 配列番号14(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号16(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸と394位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号20(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸の欠失及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号22(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸の欠失及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号24(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位及び394位のアミノ酸の欠失と、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含んでなる)、
− 配列番号66(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、及び
− 配列番号68(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)による置換及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)
からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
第2のアンチトロンビンが配列番号2からなる、
上記の使用に関する。
第1のアンチトロンビンが、
− 配列番号14(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号16(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸と394位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号20(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸の欠失及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号22(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸の欠失及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号24(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位及び394位のアミノ酸の欠失と、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含んでなる)、
− 配列番号66(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、及び
− 配列番号68(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)による置換及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)
からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
第2のアンチトロンビンが配列番号78のアミノ酸配列(このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)からなる、
上記の使用に関する。
− 配列番号28(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換を含んでなる)、又は
− 配列番号30(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸と426位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入を含んでなる)、又は
− 配列番号32(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、又は
− 配列番号34(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、
− 配列番号42(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位及び426位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、
− 配列番号70(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、及び
− 配列番号72(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)による置換を含んでなる)、
からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
第2のアンチトロンビンが配列番号26からなる、上記の使用に関する。
第1のアンチトロンビンが、
− 配列番号38(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号40(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸と426位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号44(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸の欠失及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号46(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸の欠失及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号48(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位及び426位のアミノ酸の欠失と、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含んでなる)、
− 配列番号74(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、及び
− 配列番号76(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)による置換及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)
からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
第2のアンチトロンビンが配列番号26からなる、上記の使用に関する。
第1のアンチトロンビンが:
− 配列番号38(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号40(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸と426位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号44(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸の欠失及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号46(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸の欠失及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
− 配列番号48(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位及び426位のアミノ酸の欠失と、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含んでなる)、
− 配列番号74(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、及び
− 配列番号76(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)による置換及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)
からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
第2のアンチトロンビンが配列番号80のアミノ酸配列(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、上記の使用に関する。
− 請求項1〜5又は9のいずれかに記載の、実質的に低下した抗凝固活性を有するか又は抗凝固活性を実質的に有さない少なくとも1つの変異アンチトロンビンからなる第1トロンビンと、
− 野生型アンチトロンビンのものと類似の抗凝固活性を有する少なくとも1つのアンチトロンビンからなる第2のアンチトロンビンと
を少なくとも含んでなる、感染、炎症又は低酸素傷害のような細胞傷害と関係する病状の予防又は治療を意図する薬剤の製造のための組合せ製品としての組成物に関し、ここで、
該組合せ製品は同時、逐次的又は別々の投与に用いることができ、
前記第1及び第2のアンチトロンビンは、所定の重量比、好ましくは約10:1〜約1:5、好ましくは約5:1〜約1:2、より好ましくは約2:1〜約1:2のそれぞれの重量比である。
− 実質的に低下したトロンビン阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性を実質的に失っている、又は
− 低下した第Xa因子阻害活性を有するか若しくは第Xa因子阻害活性を実質的に失っている、又は
− 実質的に低下したトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を実質的に失っている、
上記の組合せに関する。
表現「医薬的に許容され得るビヒクル」とは、医薬組成物を製造するために製薬産業において通常用いられる医薬的に許容され得る固体又は液体の、希釈剤又はカプセル化剤、充填剤又は運搬剤を意味する。
好ましくは、本発明による医薬組成物は、静脈内、腹腔内、皮下又は経口で送達できる。
1つの他の好ましい実施形態において、本発明は、好ましくは約80IU/kg/日〜約300IU/kg/日、好ましくは約100IU/kg/日〜約200IU/kg/日の投薬量で投与される上記の医薬組成物に関する。
活性成分として、
− 上記の、抗凝固活性が実質的に低下しているか若しくは抗凝固活性を実質的に有さない少なくとも1つの変異アンチトロンビンからなる第1のアンチトロンビンと、
− 野生型アンチトロンビンのものと類似の抗凝固活性を有する少なくとも1つのアンチトロンビンからなる第2のアンチトロンビンと
を含んでなる組合せであって、
− 配列番号4;配列番号6、配列番号8若しくは配列番号10、配列番号18、配列番号62若しくは配列番号64と配列番号2、
− 配列番号14、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号66若しくは配列番号68と配列番号2、
− 配列番号14、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号66若しくは配列番号68と配列番号78、
− 配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号42、配列番号70若しくは配列番号72と配列番号26、
− 配列番号38、配列番号40、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号74若しくは配列番号76と配列番号26、及び
− 配列番号38、配列番号40、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号74若しくは配列番号76と配列番号80
からなる群の組合せ
を医薬的に許容されるビヒクルと共に含む医薬組成物に関する。
1つの他の好ましい実施形態において、本発明は、好ましくは約20UI/kg/日〜約600UI/kg/日、好ましくは約40UI/kg/日〜約300UI/kg/日の投薬量で投与される上記の医薬組成物に関する。
− 配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中の、394位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)又はグルタミン(Gln)による置換である第1の変異、及び
− 135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換である第2の変異
を含有する変異アンチトロンビン、特に配列番号66又は68で表される変異アンチトロンビンに関する。
− 配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中の、426位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)又はグルタミン(Gln)による置換である第1の変異、及び
− 167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による変異である第2変異
を含有する変異アンチトロンビン、特に配列番号74又は76で表される変異アンチトロンビンに関する。
抗凝固活性、特に第Xa因子及び第IIa因子阻害活性を喪失しているか又は低下しており、ヘパリン及びペンタサッカライドに結合することができる変異アンチトロンビンを製造するため、種々のタイプの変異、特に反応中心ループ(アミノ酸380〜アミノ酸400の領域)内の変異、ループから遠隔でありプロテイナーゼ相互作用のために接近しやすいエキソサイト領域(Chuang YJ, Swanson R, Raja SM, Olson ST, Heparin enhances the specificity of antithrombin for thrombin and factor Xa independent of the reactive center loop sequence. Evidence for an exosite determinant of factor Xa specificity in heparin-activated antithrombin, J Biol Chem., 2001; 276: 14961-71)内の変異及びグリコシル化のコンセンサス配列(アミノ酸135〜137及び155〜157) (Fan B, Crews BC, Turko IV, Choay J, Zettlmeissl G, Gettins P., Heterogeneity of recombinant human antithrombin III expressed in baby hamster kidney cells., J Biol Chem., 1993; 268: 17588-96)内の変異が企図された。
− FXa及びFIIaのような任意の凝固プロテアーゼに対するアンチトロンビンの阻害活性を除去するための、アンチトロンビンの反応性ループ内の領域P4-P4' (Ala 391〜Asn 396)における欠失、
− 反応性ループの領域P4-P4' (Ala 391〜Asn 396)内のアミノ酸の置換、特に393位のアミノ酸(Arg)のヒスチジンによる置換又は394位のアミノ酸(Ser)のグルタミン酸若しくはグルタミンによる置換、
− 393位のアミノ酸と394位のアミノ酸との間のプロリンの挿入、及び
− ヘパリン及びペンタサッカライドとの親和性を増大させるための、アンチトロンビンのグリコシル化領域内のアミノ酸の置換、特に135位のアミノ酸(Asp)のグルタミンによる置換
を行った。
I 変異アンチトロンビンの製造
全長アンチトロンビンcDNAを有するシャトルベクターpENTR (pENTR-AT)の製造
pENTRベクター(Invitrogen, HORFクローンリファレンスIOH14497)中に最初にクローニングされたアンチトロンビンcDNA配列は、短縮型であることが判明し、pCMV6 (Origene, リファレンスTC110831)にクローニングされた全長アンチトロンビン配列で置き換えなければならない。全長アンチトロンビンcDNAを含有するプラスミドpCMV6を、SacII及びStuIの両エンドヌクレアーゼで消化する。1182塩基対のフラグメントを1%アガロースゲル上で単離し、QIAquickゲル抽出キットを用いて精製する。この1182塩基対のフラグメントは、アンチトロンビンcDNAのSacII-StuIフラグメントに相当するが、それを、SacII及びStuIにより線状化したpENTRベクター(2760bp)にライゲーションし、上記のように回収する。このカセット交換の結果は、1%アガロースゲル上での電気泳動(図1)及び配列決定により検証する。
野生型アンチトロンビンをコードするcDNAを有する得られたプラスミドpENTR (pENTR-ATwt)を、製造業者(Stratagene)の推奨に従ってQuickChange II部位特異的変異誘発キットを用いるPCRによる更なる変異誘発用の鋳型として用いる。野生型アンチトロンビンは、血漿アンチトロンビンと同じアミノ酸配列を有するが、組換え形態で生成する。変異誘発プライマー(表1)を用いて、アルギニン135のコドンの代わりにグルタミンのコドンを導入し(N135Q)、プラスミドpENTR-AT-N135Qを作製する。QuickChange II部位特異的変異誘発キットを鋳型としてのpENTR-ATwt及び表1に記載される変異誘発プライマーと共に用いるPCRにより、アルギニン393のヒスチジンによる単一アミノ酸置換(R393H)、セリン394のグルタミン酸若しくはグルタミンによる単一アミノ酸置換(それぞれS394Q、S394E)、アルギニン393とセリン394の間のプロリンの挿入(Pro394)又はアルギニン393、セリン394若しくはアルギニン393及びセリン394の両方の欠失(それぞれΔR393、ΔS394、ΔR393S394)を導入する。pENTR-AT-N135Qを鋳型として用いるPCR反応で同じ組の変異誘発プライマーを使用して、二重変異体及び三重変異体アンチトロンビンN135Q-R393H、N135Q-S394Q、N135Q-S394E、N135Q-Pro394、N135Q-ΔR393、N135Q-ΔS394及びN135Q-ΔR393S394をそれぞれコードするcDNAを有するプラスミドを製造する。次いで、各変異体カセット、すなわち上記の二重変異体又は三重変異体アンチトロンビンをコードするcDNAの完全性を、DNA配列決定により確立する。
アンチトロンビン、単一変異アンチトロンビン又は二重変異アンチトロンビンをコードする上記cDNAの全てを、シャトルベクターpENTRから真核発現ベクターpCDNA 3.2中に、Gateway LR Clonase II酵素ミックス(Invitrogenにより開発された「Gatewayテクノロジー」)を用いる組換えによって移す。最終発現構築物は、1%アガロースゲル上での電気泳動及びトランスフェクション前の再度の配列決定により検証する(図2)。
事前の組換えにより得られたpCDNA-ATwt、pCDNA-AT-N135Q、pCDNA-AT-R393H、pCDNA-AT-S394Q、pCDNA-AT-S394E、pCDNA-AT-Pro394、pCDNA-AT-ΔR393、pCDNA-AT-ΔS394、pCDNA-AT-ΔR393S394、pCDNA-AT-N135Q-R393H、pCDNA-AT-N135Q-S394Q、pCDNA-AT-N135Q-S394E、pCDNA-AT-N135Q-Pro394、pCDNA-AT-N135Q-ΔR393、pCDNA-AT-N135Q-ΔS394及びpCDNA-AT-N135Q-ΔR393S394と名付けたプラスミド構築物をそれぞれ、改変ヒト胚性腎臓細胞(HEK-293)又はベビーハムスター腎臓細胞(BHK-21)のトランスフェクションに用いる。細胞を、2mM L-グルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン及び5%胎仔ウシ血清を含有する「ダルベッコ改変イーグル培地/F-12」(Invitrogen)中で成長させ、リン酸カルシウム共沈によりおよそ106細胞に20μgのDNAをトランスフェクトする(Sambrookら、Molecular cloning: A laboratory manual, 第2版、16.33頁)。安定発現細胞株を、G418により選択し(クローン選択の間、G418濃度は細胞培養培地中0.8mg/mlであり、次いで0.4mg/mlに減少させて、クローン増殖の間、選択圧を維持する)、マウスモノクローナル抗体 抗アンチトロンビンを捕捉抗体として、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ヒツジポリクローナル抗体 抗アンチトロンビンを検出抗体として用いるELISA (Antithrombine BioAssay (商標) ELISAキット(EUROMEDEX))により、アンチトロンビン分泌についてスクリーニングする。分泌されたアンチトロンビンの完全性は、ヒツジモノクローナル抗体 抗アンチトロンビン及びセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ロバポリクローナル抗体 抗ヒツジ(The Binding Site、UK)を用いるウェスタンブロッティングにより確立する(図3)。各変異アンチトロンビンについて、単一安定発現クローンを「セルファクトリーヌンクロン(cell factories nunclon)」(Nunc)中で拡大培養し、2mM L-グルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン及び5μg/mlインスリン/トランスフェリン/セレンを含有する「ダルベッコ改変イーグル培地/F-12」(Invitrogen)を300μl/cm2 (製造業者により推奨されるように、6320cm2培養面積のセルファクトリーに適する最小容量は2リットルである)で用いて、大規模タンパク質生産を行う。毎日採集する馴化培地を3000gで4℃にて15分間遠心分離し、5mMベンズアミジン、5mM EDTAで処理し、-20℃にて保存する。
馴化培地を融解し、プールして、塩濃度を0.4M NaClに調整し、次いで10mM Tris又は20mMリン酸緩衝液、0.4M NaCl及び0.1mM EDTA、pH7.4を用いて平衡化したヘパリン固定化カラム(Hitrap Heparin 5ml又はHeparin-sepharose CL6B 50ml、GE Biological)に適用する。結合したタンパク質を、0.4M〜2MのNaCl勾配の同じ緩衝液で溶出させる。0.8M NaCl以上で溶出した画分は、野生型アンチトロンビン又は高いヘパリン親和性を有する変異アンチトロンビンのみを含有していた。アスパラギン135のグルタミンによる置換を有する変異アンチトロンビン(AT-N135、ATN135Q-R393H、AT-N135Q-S394Q、AT-N135Q-S394E、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393、AT-N135Q-ΔS394、AT-N135Q-ΔR393S394)は、野生型アンチトロンビンより高いイオン強度にてアフィニティーカラムから溶出した。このことにより、135位のグリコシル化部位の破壊はヘパリンに対するアンチトロンビンの親和性を増大させることが確証された(90%が0.8M〜1.2M NaClに溶出する野生型アンチトロンビンと比較して、置換N135Qを有する変異アンチトロンビンの約90%は、1M〜1.4M NaClに溶出する)。採集した画分をプールし、10mM Tris又は20mMリン酸塩及び0.1M NaCl、pH7.4に対して4℃にて一晩透析するか、又は10mM Tris若しくは20mMリン酸塩及び0.1M NaCl、pH7.4で平衡化したHiPrep 26/10脱塩カラムに適用するかのいずれかにより、塩濃度を減少させる。次いで、アンチトロンビンを、10mM Tris又は20mMリン酸塩及び0.1M NaCl、pH7.4を用いて平衡化した「Resource Q」1mlカラム(GE, Biological)を用いるイオン交換クロマトグラフィーにより濃縮し、0.1mM〜0.5M又は20mM〜0.5MのNaCl勾配の同じ緩衝液中に溶出させる。
変異アンチトロンビンの特徴決定は、以下のことを目的とする:
− a)精製された系において、以下の変異アンチトロンビン:AT-R393H、S394Q、AT-S394E、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-S394Q、AT-N135Q-S394E、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393及びAT-N135Q-ΔS394が、野生型アンチトロンビン(AT-wt)のもとのと比較して、低下した抗FXa活性及び抗FIIa活性をヘパリン誘導体の存在又は非存在下で示すことを証明すること、
− b)以下の変異アンチトロンビンAT-R393H、AT-S394Q、AT-S394E、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-S394Q、AT-N135Q-S394E、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393、AT-N135Q-ΔS394又はこれら変異アンチトロンビンの少なくとも1つと野生型アンチトロンビンのものに類似する抗凝固活性を有するアンチトロンビンとを含んでなる組成物が、野生型アンチトロンビンと比較した場合、少なくとも同等の細胞保護特性を有することを証明すること。
第Xa因子(FXa, Kordia)のアンチトロンビン阻害についての動力学的アッセイを、「動力学的」緩衝液(Hepes、20mMリン酸塩、pH7.4、0.15M NaCl、0.1% PEG 8000及び1mg/mlウシ血清アルブミン)中で擬似一次反応条件で行う。簡潔には、第Xa因子を、過剰の試験アンチトロンビン(血漿アンチトロンビン又は野生型アンチトロンビン又は変異アンチトロンビンに相当し、行う各アッセイで変わる)とペンタサッカライド(フォンダパリヌクスナトリウム、Arixtra (登録商標)、GlaxoSmithKline)の存在下又は非存在下でインキュベートし、残存する第Xa因子活性を時間の関数として測定する。全ての試験アンチトロンビンがペンタサッカライドと結合するように、ペンタサッカライドを反応媒体中に過剰に加える。ペンタサッカライド非存在下では、反応媒体中に存在する可能性がある硫酸化グリコサミノグリカンを中和するために、ポリブレン(最終100μg/ml)を加える。残存第Xa因子活性を、色素産生性基質(S2765又はS2222、Chromogenix)の開裂に起因する405nmでの吸光度の増大として、マイクロプレートリーダー(Dynatech MR 5000)を用いて測定する。データの分析は、GraphPad Prismバージョン3ソフトウェアを用いて行う。吸光度の記録は、予測される阻害速度定数(kon)に応じて連続又は不連続である。
予測されるkonが104 M-1.s-1より低いとき、不連続法を用いる。第Xa因子(2〜200nM)を、試験アンチトロンビン(20nM〜20μM)とペンタサッカライド又はポリブレンの存在下で、10μlの最終容量で10秒間〜5時間又は10秒間〜24時間インキュベートする。このインキュベーション期間の終時に、200μMの基質を含有する190μlの動力学的緩衝液を加え、405nmでの吸光度を記録する。
vt = (v0 + v∞). exp (-k.t) (1)
k = AT. kon (2)
A405 = A0 + vi.(1 - exp (-k.t)) / k (3)
等式(3')も、特に血漿の存在下で用いられる。
A405 = A0 + vs * t + (vi - vs) * (1 - exp (-kt)) / k
k = (kon / (1 + S / Km)). [AT] (4)
変異アンチトロンビン及び野生型ATの阻害活性は、同じ条件下で測定し、血漿ATの阻害活性と比較する。
− 野生型アンチトロンビン及びAT-N135Qの第Xa因子阻害活性は、血漿アンチトロンビンの第Xa因子阻害活性と同様である。
− 以下の変異アンチトロンビン:AT-R393H、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393、AT-N135Q-ΔS394の第Xa因子阻害活性は、野生型アンチトロンビンの第Xa因子阻害活性と比較して無視できる。
− 以下の変異アンチトロンビン:AT-S394Q、AT-S394E、AT-N135Q-S394Q及びAT-N135Q-S394Eの第Xa因子阻害活性は、野生型アンチトロンビンの第Xa因子阻害活性と比較して2〜20分の1に減少する。
− 野生型アンチトロンビンと比較して2〜20分の1への第Xa因子阻害活性の減少は、以下の変異アンチトロンビン:AT-R393H、AT-S394Q、AT-S394E、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-S394Q、AT-N135Q-S394E、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393又はAT-N135Q-ΔS394の1つとAT-wt又はAT-N135Qとを種々の比率で含有する組成物を用いて達成される。
第IIa因子(FIIa、Kordia)のアンチトロンビン阻害についての動力学的アッセイを、「動力学的」緩衝液(Hepes、20mMリン酸塩、pH7.4、0.15M NaCl、0.1% PEG 8000及び1mg/mlウシ血清アルブミン)中で擬似一次反応条件で行う。簡潔には、第IIa因子を、過剰の試験アンチトロンビン(血漿アンチトロンビン又は野生型アンチトロンビン又は変異アンチトロンビンに相当し、行う各アッセイで変わる)とヘパリン(ヘパリンナトリウム、Choay(登録商標))の存在下又は非存在下でインキュベートし、残存する第IIa因子活性を時間の関数として測定する。全ての試験アンチトロンビンがヘパリンと結合するように、ヘパリンを反応媒体中に過剰に加える。ヘパリン非存在下では、反応媒体中に存在する可能性がある硫酸化グリコサミノグリカンを中和するために、ポリブレン(最終100μg/ml)を加える。残存第IIa因子活性を、色素産生性基質(S2238、Chromogenix)の開裂に起因する405nmでの吸光度の増大として、マイクロプレートリーダー(Dynatech MR 5000)を用いて測定する。データの分析は、GraphPad Prismバージョン3ソフトウェアを用いて行う。吸光度の記録は、予測される阻害速度定数(kon)に応じて連続又は不連続である。
予測されるkonが104 M-1.s-1より低いとき、不連続法を用いる。第IIa因子(2〜200nM)を、試験アンチトロンビン(20nM〜20μM)とヘパリン又はポリブレンの存在下で、10μlの最終容量で10秒間〜5時間又は10秒間〜24時間インキュベートする。このインキュベーション期間の終時に、200μMの基質を含有する190μlの動力学的緩衝液を加え、405nmでの吸光度を記録する。
vt = (v0 + v∞). exp (-k.t) (1)
k = AT. kon (2)
A405 = A0 + vi.(1 − exp (-k.t)) / k (3)
A405 = A0 + vs * t + (vi - vs) * (1 - exp (-kt)) / k (3')
k = (kon / (1 + S / Km)). [AT] (4)
変異アンチトロンビン及び野生型ATの阻害活性は、同じ条件下で測定し、血漿ATの阻害活性と比較する。
− 野生型アンチトロンビン及びAT-N135Q第IIa因子阻害活性は、血漿アンチトロンビン第IIa因子阻害活性と同様である。
− 以下の変異アンチトロンビン: AT-R393H、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393、AT-N135Q-ΔS394の第IIa因子阻害活性は、野生型アンチトロンビンの第IIa因子阻害活性と比較して無視できる。
− 以下の変異アンチトロンビン:AT-S394Q、AT-S394E、AT-N135Q-S394Q及びAT-N135Q-S394Eの第IIa因子阻害活性は、野生型アンチトロンビンの第IIa因子阻害活性と比較して2〜20分の1に減少する。
− 野生型アンチトロンビンと比較して2〜20分の1への第IIa因子阻害活性の減少は、以下の変異アンチトロンビン:AT-R393H、AT-S394Q、AT-S394E、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-S394Q、AT-N135Q-S394E、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393又はAT-N135Q-ΔS394の1つとAT-wt又はAT-N135Qとを種々の比率で含有する組成物を用いて達成される。
c-1)ヒト全血での評価
変異アンチトロンビン(AT-R393H、AT-S394Q、AT-S394E、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-S394Q、AT-N135Q-S394E、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393及びAT-N135Q-ΔS394)の細胞保護特性を、インビトロで、細菌性リポ多糖(LPS)に曝露したヒト全血で評価する。
初代細胞の培養を、性交の16日後にマウスから単離した胚からの脳組織を用いることにより、記載されたように行う(Lubetzki, C., Demerens, C., Anglade, P., Villarroya, H., Frankfurter, A., Lee, V.M.Y., Zalc, B., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90, 6820-6824. Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons)。胚の脳から大脳半球を切り出し、トリプシン消化により分離させて、単細胞懸濁物を、BioCoat (登録商標)ポリ-L-リジン被覆96ウェルプレート(Becton Dickinson、Bedford、MA 01730、USA)に、ウェルあたり200μlの培地中105細胞で播種する。1% FCS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(Seromed)及び10ng/mLの組換え血小板由来成長因子AA (PDGF-AA、R&D Systems)を補充したBottenstein-Sato培地(GIBCO Invitrogen)中で細胞を培養する。培養物を37℃及び10% CO2にて数週間成長させる。
細胞を、処理しないか又は1〜10IU/mlの範囲の種々の濃度の野生型若しくは変異ATと3時間前処理し、10ng/mlのLPSと37℃及び10% CO2にて48時間インキュベートする。次いで、細胞上清を2300gにて10分間12℃にて遠心分離し、用時まで-80℃にて保存する。細胞上清からのIL6及びTNFαタンパク質レベルを、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)(IL-6 duoset及びTNFαduoset、R&D System、Minneapolis、MI、USA)を用いて定量的に測定する。
低酸素/再酸素負荷傷害を誘導するため、酸素-グルコース剥奪(OGD)実験を、グルコースを含まない無血清DMEM中95% N2/5% CO2で1〜12時間処理し、続いて5mMol/Lのグルコースを有する酸素正常条件に12〜24時間曝露することにより行った。野生型又は変異AT (1〜10IU/mLの範囲の濃度)は全研究期間を通じて加えた(13〜36時間)。
細胞損傷は、OGDへの曝露後24時間に細胞外流体中に傷害細胞から放出される乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の量を測定することにより評価した。バックグラウンドのLDH放出は、OGDに曝露していない対照培養で決定し、全実験値から減じた。
変異アンチトロンビンAT-R393H、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-S394Q、AT-N135Q-S394E、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393、AT-N135Q-ΔS394の解毒剤(antidote)としての有効性を、マウスモデルで評価する。
少なくとも12週齢の野生型C57BL/6雄性マウス(JANVIER)を、血液凝固パラメータを改変しない、動物実験に関する欧州ガイドラインに従うプロトコルを用いて麻酔する。
全ての実験で、アンチトロンビン変異型又はプラシーボは、尾静脈に静脈内注射により投与する。
血液を、大静脈(cave vein)への穿刺により、0.105mol/Lクエン酸三ナトリウムを含有する試験管に採集する(1:10)。低血小板血漿を、2300gにて10分間12℃での遠心分離により取得し、用時まで-80℃にて保存する。
マウス実験は、2つの敗血症モデル:1)盲腸結紮及び穿刺(CLP)、2)リポ多糖(LPS)注射で行い、各アンチトロンビン変異型をプラシーボに対して評価する。各アンチトロンビン変異型について、第1セットの実験では、両敗血症モデルで敗血症に対する炎症及び血液凝固応答をプラシーボと比較する。第2セットの実験では、CLP及びLPS注射後の生存をアンチトロンビン注射マウスとプラシーボ注射マウスとの間で比較する。飼育及び実験は、フランスの規則及び欧州共同体実験ガイドラインに従う。
CLP手順を、他に記載されるように行う(Wichterman KA, Baue AE, Chaudry IH., Sepsis and septic shock- a review of laboratory models and a proposal., J Surg Res, 1980; 29: 189-201)。簡潔には、イソフルラン麻酔下に、1cmの正中切開により腹壁を開く。盲腸を露出させ、盲腸端(cecal pole)から15mm付近を5/0 Prolene糸(Ethicon、Somerville、NJ、USA)で回盲弁を狭窄させずに結紮する。次いで、結紮した盲腸を21ゲージ針で1回穿刺する。少量の便が現れるまで盲腸を穏やかに圧迫する。偽操作動物及びCLP動物で、閉腹直前に1mlの0.9%正常食塩水を腹腔内に注入する。更なる蘇生法は実施せず、抗生物質は投与しない。次いで腹壁を閉じる(2層、筋肉及び皮膚; 5/0 Ethilon糸)。対照として、盲腸を結紮も穿刺もしない以外はCLP手順に従って偽手術を行う。
両モデルで、ATを、約40〜約300IU/kg/日の用量で、尾静脈に静脈内注射により投与する。
各試験アンチトロンビン変異型について、各15匹のマウスからなる2群をCLP敗血症モデルに用いる。
− 第1の群では、マウスにアンチトロンビン変異型を与え、マウスをCLPに供する。
− 第2の群では、マウスにプラシーボを与え、マウスをCLPに供する。
− 第1の群では、マウスにアンチトロンビン変異型を与え、LPSを注射する。
− 第2の群では、マウスにプラシーボを与え、溶媒を注射する。
これらの実験条件下、プラシーボ注射マウスと比較して、アンチトロンビン変異型注射マウスで、より長い生存が観察される。
各試験アンチトロンビン変異型について、各5匹のマウスからなる4群を各敗血症モデルに用いる。
CLPモデル:
− 第1の群では、マウスにアンチトロンビン変異型を与え、マウスをCLPに供する。
− 第2の群では、マウスにプラシーボを与え、マウスをCLPに供する。
− 第3の群では、マウスにアンチトロンビン変異型を与え、マウスを偽手術する。
− 最後の群では、マウスにプラシーボを与え、マウスを偽手術する。
− 第1の群では、マウスにアンチトロンビン変異型を与え、LPSを注射する。
− 第2の群では、マウスにプラシーボを与え、LPSを注射する。
− 第3の群では、マウスにアンチトロンビン変異型を与え、溶媒を注射する。
− 最後の群では、マウスにプラシーボを与え、溶媒を注射する。
出血性の傾向に対する変異AT投与の影響を、偽手術及びCLP手術を行ったマウスで、術後採血に続いて犠牲にした後、腹腔検査により評価する。
アンチトロンビン抗原レベルを、ELISA試験(Antithrombin BioAssay(商標) ELISAキット(EUROMEDEX))を用いて測定し、マウス血漿におけるアンチトロンビンの第Xa因子阻害活性を、Biophen(登録商標) ATキット(Hyphen BiMed, France)を用いて決定する。アンチトロンビン変異型を注射したマウスでの敗血症に対する炎症応答及び凝血促進応答を、幾つかのパラメータの測定により評価する。白血球数及び血小板数並びにヘモグロビンレベルの決定は自動で行う(Sci Vet ABC Animal Blood Counter, ABX Diagnostics, Montpellier, France)。血漿インターロイキン-6(IL-6)及びTNFα濃度は、マウスIL-6及びTNFα Quantikineキット(R&D Systems, Minneapolis, MI, USA)を用いて評価する。血液凝固活性化はF1+2測定により評価する。
Claims (13)
- 非変異アンチトロンビンの抗凝固活性と比べて実質的に低下した抗凝固活性を有するか又は抗凝固活性を実質的に有さない変異アンチトロンビンを少なくとも含んでなる組成物であって、前記変異アンチトロンビンが更に、
− 実質的に低下したトロンビン阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性を実質的に失っている、又は
− 低下した第Xa因子阻害活性を有するか若しくは第Xa因子阻害活性を実質的に失っている、又は
− 実質的に低下したトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を実質的に失っており、
前記変異アンチトロンビンが、少なくとも1つの変異を
− アミノ酸380位から400位までの領域内、特に393位若しくは394位(アミノ酸番号付けは配列番号2で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する)、又は
− アミノ酸412位から432位までの領域内、特に425位若しくは426位(アミノ酸の番号付けはシグナルペプチドを含んでなる配列番号26で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する)
に含んでなり、
前記変異が置換、挿入又は欠失である
組成物の、感染、炎症又は低酸素傷害と関係する病状、特に敗血症及び脳卒中に関連した虚血/再灌流、手術に関連した虚血/再灌流、並びに臓器移植に関連した虚血/再灌流の予防又は治療を意図する薬剤の製造のための使用。 - 前記変異アンチトロンビンが、
− 配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号62及び配列番号64からなる群、又は
− 配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号66及び配列番号68からなる群
より選択されるアミノ酸配列である請求項1に記載の使用。 - 前記変異アンチトロンビンが、
− アミノ酸96位、135位、155位又は192位、特に135位のグリコシル化部位に少なくとも1つの変異(アミノ酸の番号付けは配列番号2で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する)を更に含んでなり、好ましくは、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号70及び配列番号72からなる群より選択されるアミノ酸配列であるか、又は
− アミノ酸128位、167位、187位又は224位、特に167位のグリコシル化部位に少なくとも1つの変異(アミノ酸の番号付けはシグナルペプチドを含んでなる配列番号26で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する)を更に含んでなり、好ましくは、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号74及び配列番号76からなる群より選択されるアミノ酸配列である
請求項2に記載の使用。 - − 請求項1〜3のいずれか1項に記載される、実質的に低下した抗凝固活性を有するか又は抗凝固活性を実質的に有さない少なくとも1つの変異アンチトロンビンからなる第1のアンチトロンビンと、
− 野生型アンチトロンビンのものと類似の抗凝固活性を有する少なくとも1つのアンチトロンビンからなる第2のアンチトロンビンと
を含んでなり、前記第1及び第2のアンチトロンビンが、所定の重量比、好ましくは約9:1〜約1:4のそれぞれの重量比である組合せの、同時、逐次的又は別々の投与のために用いることができる、感染、炎症又は低酸素傷害のような細胞傷害と関係する病状の予防又は治療を意図する薬剤の製造のための組合せ製品としての使用。 - 前記第1のアンチトロンビンが、
− アミノ酸380位からアミノ酸400位までの領域内、特に393位若しくは394位(アミノ酸番号付けは配列番号2で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する)に1つの変異、又は
− アミノ酸412位からアミノ酸432位までの領域内、特に425位若しくは426位(アミノ酸の番号付けはシグナルペプチドを含んでなる配列番号26で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する)に少なくとも1つの変異
を少なくとも含んでなり、前記変異は置換、挿入又は欠失であり、
前記第2のアンチトロンビンが、野生型アンチトロンビンであり、
好ましくは、
− 前記第1のアンチトロンビンが、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号18、配列番号62、配列番号64からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、前記第2のアンチトロンビンが配列番号2からなるか、又は
− 前記第1のアンチトロンビンが、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号42、配列番号70及び配列番号72からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、前記第2のアンチトロンビンが配列番号26からなる
請求項4に記載の組合せの使用。 - 前記第1のアンチトロンビンが、
− アミノ酸96位、135位、155位又は192位、特に135位のグリコシル化部位(アミノ酸の番号付けは配列番号2で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する)、又は
− 少なくとも1つの変異を、アミノ酸128位、167位、187位又は224位、特に167位のグリコシル化部位(アミノ酸の番号付けはシグナルペプチドを含んでなる配列番号26で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する)
に少なくとも1つの変異を含んでなり、好ましくは、
− 配列番号14、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号66及び配列番号68からなる群より選択されるアミノ酸配列であるか、又は
− 配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号74及び配列番号76からなる群より選択されるアミノ酸配列である
請求項5に記載の組合せの使用。 - 前記第2のアンチトロンビンが、
− アミノ酸96位、135位、155位又は192位、特に135位のグリコシル化部位に1つの変異(アミノ酸の番号付けは配列番号2のアンチトロンビンアミノ酸配列に関する)を含んでなり、好ましくは配列番号78のアミノ酸配列からなるか、又は
− アミノ酸128位、167位、187位又は224位、特に167位のグリコシル化部位に1つの変異(アミノ酸の番号付けは、シグナルペプチドを含んでなる配列番号26で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する)を含んでなり、好ましくは配列番号80のアミノ酸配列からなる
請求項5又は6に記載の組合せの使用。 - 同時、逐次的又は別々の投与のために用いることができる、感染、炎症又は低酸素傷害のような細胞傷害と関係する病状の予防又は治療を意図する薬剤の製造のための組合せ製品としての、
− 請求項1〜3のいずれか1項に記載される、実質的に低下した抗凝固活性を有するか又は抗凝固活性を実質的に有さない少なくとも1つの変異アンチトロンビンからなる第1のアンチトロンビンと、
− 野生型アンチトロンビンのものと類似の抗凝固活性を有するアンチトロンビンから少なくともなる第2のアンチトロンビンと
を含んでなり、前記第1及び第2のアンチトロンビンが、所定の重量比、好ましくは約9:1〜約1:4のそれぞれの重量比である組合せであって、
前記組成物が、好ましくは、
− 配列番号4;配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号18、配列番号62若しくは配列番号64と配列番号2、
− 配列番号14、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号66若しくは配列番号68と配列番号2、
− 配列番号14、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号66若しくは配列番号68と配列番号78、
− 配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号42;配列番号70若しくは配列番号72と配列番号26、
− 配列番号38、配列番号40、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号74若しくは配列番号76と配列番号26、及び
− 配列番号38、配列番号40、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号74若しくは配列番号76と配列番号80
からなる群の1つの組合せを含んでなる組合せ。 - 活性成分として、少なくとも請求項1〜3のいずれか1項に記載の変異アンチトロンビン、特に、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74及び配列番号76の変異アンチトロンビンを、医薬的に許容され得るビヒクルと共に含んでなる医薬組成物。
- 活性成分として、
− 請求項1〜3のいずれか1項に記載の、抗凝固活性が実質的に低下しているか若しくは抗凝固活性を実質的に有さない少なくとも1つの変異アンチトロンビンからなる第1のアンチトロンビンと
− 野生型アンチトロンビンのものと類似の抗凝固活性を有する少なくとも1つのアンチトロンビンからなる第2のアンチトロンビンと
を含んでなる組合せであって、
− 配列番号4;配列番号6、配列番号8若しくは配列番号10、配列番号18、配列番号62若しくは配列番号64と配列番号2、
− 配列番号14、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号66若しくは配列番号68と配列番号2、
− 配列番号14、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号66若しくは配列番号68と配列番号78、
− 配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号42、配列番号70若しくは配列番号72と配列番号26、
− 配列番号38、配列番号40、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号74若しくは配列番号76と配列番号26、及び
− 配列番号38、配列番号40、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号74若しくは配列番号76と配列番号80
からなる群の組合せ
を医薬的に許容されるビヒクルと共に含む医薬組成物。 - 配列番号2の394位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)又はグルタミン(Gln)によるアミノ酸置換を少なくとも含んでなり、特に配列番号62又は配列番号64で表され、好ましくは、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換である第2の置換を更に含んでなり、特に配列番号66又は68で表される変異アンチトロンビン。
- 配列番号26の426位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)又はグルタミン(Gln)によるアミノ酸置換を少なくとも含んでなり、特に配列番号70又は配列番号72で表され、好ましくは、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換である第2変異を更に含んでなり、特に配列番号74又は76で表される変異アンチトロンビン。
- 請求項11又は12で規定される変異アンチトロンビンをコードし、DNA又はRNAであり、特に配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73及び配列番号75又は前記核酸配列の相補配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列。
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