CN104628868A - 重组二聚化抗凝血酶III-Fc融合蛋白及其哺乳动物细胞高效表达系统 - Google Patents
重组二聚化抗凝血酶III-Fc融合蛋白及其哺乳动物细胞高效表达系统 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种重组二聚化抗凝血酶III-Fc融合蛋白，具有与血浆来源的抗凝血酶III类似或更高的体外生物学活性，以及延长的体内半衰期。本发明提供的这种融合蛋白含有人抗凝血酶III（hAT）、约20个或更少氨基酸的柔性肽接头(L)、和人IgG Fc变体(vFc) (表示为hAT-L-vFc)（Fc）。这种Fc变体无裂解性，且显示极小的不良Fc-介导的负作用。这类hAT-L-vFc融合蛋白表现出血清半衰期延长，且生物活性增加，从而改善药物动力学和药效。本发明还公开了一种采用哺乳动物细胞高效表达或生产这类重组融合蛋白的方法。
Description
本发明为分案申请，其原申请的申请号为2012101468630，申请日为2012年5月14日，发明名称为“重组二聚化抗凝血酶 III-Fc 融合蛋白及其哺乳动物细胞高效表达系统”。
技术领域
本发明涉及一种重组二聚化抗凝血酶III的Fc融合蛋白及其制备方法和它在医疗上的应用，特别是在治疗多种凝血相关的疾病, 抗血管新生，抗炎症和抗病毒方面的用途。
背景技术
人体内与凝血系统功能相拮抗的是抗凝血系统，在正常情况下，两者保持动态平衡。抗凝血酶III（AT）是人体血浆中的一种重要的抗凝血因子，它在血浆中承担着70%的生理性抗凝血酶活性（Johnson DJ等, EMBO J, 2006, 25:
2029-37），在维持血液生理性凝血与抗凝血平衡中起非常重要的作用。AT是肝细胞和血管内皮细胞分泌的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族(Serine Protease
Inhibitor, SEPIN) 的重要成员之一。AT通过与凝血酶FIIa结合成凝血酶-抗凝血酶(TAT)复合物，从而灭活凝血酶。此外，它还可以较强地抑制凝血因子Xa、IXa的活性，对凝血因子XIa、XIIa、纤溶酶、激肽释放酶的活性也有一定的抑制作用。
体内AT升高一般不会引起病理性后果，但是AT量减少常见于以下病例：a）遗传性AT缺乏：遗传性抗凝血酶缺陷症是一种较常见的人类遗传性疾病，它与家族性静脉血栓形成倾向有关（Abildgaard U等, Thromb Haemost,
2007, 98: 97-104）；b）获得性AT缺乏：见于各种肝病，如肝硬化、重症呷、肝癌晚期等；c）AT丢失增多：如肾脏疾病；d）AT消耗增多：如各种原因所造成的血液凝固性增高，AT中和活化的凝血因子，以致消耗增加；e）最重要的是：AT的先天性或后天获得性缺乏症可导致血栓的形成，而引起脑血栓或心肌梗塞等非常严重的疾病。因此，AT在临床上有预防和治疗慢性血栓或血塞形成的作用，对治疗抗凝血酶缺失症也有显著效果。
除了抗凝作用，AT还具有抗炎作用。其抗炎作用首先由 Taylor在猴子模型上研究弥散性血管内凝血（DIC）时提出，他发现输注AT能大大降低接受致死量大肠杆菌猴子的死亡率（Taylor FB Jr等, Crit Care Med,
2000, 28: S12-9）。越来越多的证据表明体内凝血与炎症反应之间存在网络效应关系(Esmon CT, Blood, 2000, 95:
1113-16; Cirino G等, Thrends Pharmacol Sci, 2000, 21: 170-2)。Johnson等(Johnson K等, J Immunol, 1998,
160: 5130-35)进一步研究发现，身体内局部血栓的形成可刺激单核细胞及血管内皮细胞合成大量的促炎因子，包括IL-8、IL-6。凝血酶在其中也起重要作用。凝血酶能裂解白细胞、内皮细胞源性的IL-8(含77个氨基酸，第77位残基为丙氨酸残基)生成含72个氨基酸的IL-8(第72位的残基为丝氨酸)，增强了其中性粒细胞激活活性，故当凝血酶及IL-8在血管炎症反应部位共存时可放大IL-8的效应。相应的，严重炎症反应还可通过白细胞-内皮细胞的相互作用损伤微血管细胞、微血管组织，进而刺激凝血酶的大量生成。迄今AT抗炎作用机制尚未完全阐明， 可能存在多种作用机制。Okajima等(Okajima K等, Semin Thromb Hemost,
1998, 24: 27-32)认为AT可促使内皮细胞释放PGI2，PGI2能抑制白细胞-内皮细胞相互反应；同时，AT还通过与内皮细胞表面的葡胺聚糖相互作用，干扰了细菌毒素与葡胺聚糖的结合，减轻了细菌毒素的细胞反应，所以AT的抗炎作用与其与内皮细胞上的葡萄糖胺聚糖结合能力紧密相关（Johnson DJ等, EMBO J, 2006, 25:
2029-37）。Minnema等(Minnema MC等, Blood, 2000, 95:
1117-23)认为AT通过抑制凝血酶/FXa介导的促炎因子如IL-6、IL-8、IL-10等的释放来削弱炎症反应。另外AT灭活了丝氨酸蛋白酶活性中心，从而抑制丝氨酸蛋白酶本身引起的细胞炎症反应。大量的研究表明AT在多种组织中发挥其抗炎功能。在肺组织中，AT可抑制嗜中性粒细胞的渗透作用，且减少微血管渗漏（Duru S 等, Acta Anaesthesiol
Scand, 2005, 49: 1142-8）。在肝组织中，AT通过调节局部前列环素水平来抑制肝损伤（Aytekin FO等, Am J Surg, 2005, 189: 161-6；Tsuboi H等, Am J Physiol
Gastrointest Liver Physiol, 2007, 292: G678-83）。在胃肠道，AT可减少白细胞在血管内的粘附和集聚（Ostrovsky L等, Circulation,
1997, 96: 2302-10）。在皮肤组织中，AT可降低脂多糖（LPS）诱导的白细胞-内皮细胞间相互作用（Hoffmann JN等，Am J Physiol Cell Physiol, 2000, 279: C98-107）。此外，AT还被发现对非典型性分枝杆菌感染（Chan ED等, Scand J Infect Dis,
2007, 39: 690-6）、糖尿病（Hashemi M等，Diabetes Res Clin Pract, 2007, 75: 246-8）和脂膜炎的病理过程有影响作用（O’Riordan K等，Transplantation, 1997, 63: 480-2）。进一步的实验发现AT的抗炎特性与其使用剂量有关。小剂量的AT(50U/kg及100U/kg)虽能明显抑制内毒素诱导的大鼠发生凝血障碍，但不能阻止白细胞在肺内的聚集及对肺血管造成的损伤。而大剂量的AT(250U/kg)能显著改善由内毒素诱导的肺内皮细胞的损伤(Uchiba M等, Thromb Res, 1998,
89: 233-41)。这一研究结果也已在AT对重症感染疾病治疗作用研究的多中心KyberSept III期临床试验中得到证实。
近年研究发现，通过有限的水解或热变性后，AT具有抗血管新生的作用（Richard B等, J Biol Chem,
2008, 283: 14417-29），能阻止细胞从G1向S期转变，抑制细胞增殖；同时还能抑制内皮细胞表面促血管新生硫酸乙酰肝素蛋白多糖（proangiogenic heparan
sulfate proteoglycan，HSPG）和基底膜蛋白多糖(perlecan)的表达。通过抑制HSPG介导的FGF家族信号通路以及VEGF家族信号通路（Zhang W等, Blood, 2004, 103:
1185-91）、阻断HSPG介导的血管生长因子与血管内皮细胞的黏附（Zhang W等, J Biol Chem,
2006, 281: 37302-10）从而抑制血管新生。Zhang等（Zhang W等, Cancer Res, 2006, 66: 5047-55）通过研究表明AT可以改变人脐静脉内皮细胞基因表达，有35种基因表达水平显著增高，其中大多数基因具有抗血管生成作用，例如半胱天冬酶-3(caspase-3)、p21、基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)-1、2、3等；而有93种基因表达水平明显下降，其中超过50%的基因具有血管形成作用，例如基底膜蛋白多糖(perlecan)、丝裂原蛋白活化激酶-3(MAPK3)、早期生长反应因子-1(EGR1)等。但目前尚缺乏动物或临床前试验证明AT在体内有抗血管新生作用，如果该作用得到证实，那么联合应用标准化疗及这种抗凝药应能更好地抑制肿瘤的生长和转移，并能减少肿瘤患者的血栓并发症。
丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)，包括AT对慢性病毒性疾病的进程具有双向调节作用。HIV-1型及HCV感染者，其α-1抗胰蛋白酶（AAT）水平异常偏低(Potthoff AV等, AIDS, 2007, 21:
2115-6；Shapiro L等, FASEB J, 2001,
15: 115-22)，且被证实它与进行性疾病和进行性肝纤维化有关(Cheung KJ等,J Viral Hepat,
2009, 16: 418-29)。相反，大量的临床数据揭示serpin表达水平升高与HIV感染的发生率的下降，或延缓疾病进程相关(McNeely TB等,Blood, 1997, 90: 1141-9；Burgener A等, J Proteome Res,
2008, 7: 4446-54；Geiben-Lynn R等, J Biol Chem, 2002, 277: 42352-7)。肝素活化的AT显示出极强的抗病毒作用，它不仅对HIV-1(Elmaleh DR等,Int J Mol Med,
2005, 16: 191-200)具有抑制作用，且同样可抑制HCV、HSV-1和HSV-2(Whitney JB等, PLoS One, 2011,
6: e18589)。
AT在抗凝血、抗炎症、抗血管新生和抗病毒方面显现的生物学特性，使其在临床上具有重大应用价值。AT在国外临床上已经广泛使用，用于多种疾病的治疗，包括：弥散性血管内凝血（DIC）、先天及后天获得性AT缺乏症、多器官功能障碍综合征（MODS）、败血症、重症感染介导的全身炎症反应和感染中毒性休克等（Puskás A等, Int Angiol, 2007,
26: 53-63; Topaloglu S等, Angiology, 2007, 58: 85-91）。尤其是针对DIC的治疗，效果极为显著。DIC在欧美每年的发病率约为50万例，死亡率超过50%，仅美国即有20-30亿美元市场。美国GTC公司用转基因山羊生产的人抗凝血酶“ATryn”分别于2006年8月和2008年10月获得了欧洲药监局和美国FDA的批准。另外，最新研究结果表明，AT可以缓解抗凝血常用药肝素形成的耐药性（Spiess BD,Ann Thorac
Surg, 2008, 85: 2153-60），这也预示着其更加广阔的市场前景。随着对AT作用机理的进一步深入研究、适应症的进一步拓宽，有望被开发成为抗炎症、抗病毒、抗肿瘤等的药物，运用到各类严重危害人类健康的炎症疾病、病毒性疾病、肿瘤疾病、心脑血管疾病的预防和治疗。
AT是一种单链糖蛋白，分子量大约为59,000至65,000，AT基因位于第1号染色体长臂（1q23-25），长约16kb，包括7个外显子和6个内含子，其mRNA长为1.5kb，编码432个氨基酸的成熟蛋白，分子中有3对二硫键，Cys8-Cys128、Cys21-Cys95和Cys247-Cys430（Chandra T等, Proc Natl Acad Sci
USA, 1983, 80: 1845-8）。AT有两个重要的功能区(Patnaik MM等, Haemophilia, 2008, 14: 1229-39)，一个是位于N端的肝素结合区，一个是位于C端的凝血酶反应位点。AT反应位点在P1(Arg393)和P1’(Ser394)位，P1通过与凝血酶活性中心的Ser结合，形成稳定的AT凝血酶复合物，而灭活凝血酶。AT与Serpin家族的其他成员的一个很重要的区别是它可以通过结合肝素类分子来提高其抑制活性。肝素是一种高度硫酸化的粘多糖，被广泛用作抗凝剂。这类分子有一个特殊的戊糖序列，可以被AT识别，使AT分子构象发生变化暴露出反应中心环，从而大大提高其结合凝血酶的能力(Johnson DJ等, EMBO J, 2006, 25:
2029-37)。在肝素存在下，AT的抗凝作用可以增加数千倍（Izaguirre G等, J Biol Chem,
2007, 282: 33609-22）。AT在人血浆中以两种异构形式存在，α型具有4个N糖苷连接的糖链，β型仅有3个N糖苷连接的糖链，缺少Asn135上的糖链，人血浆中的AT中，90%~95%是α型，其余5%~10%是β型。在体内存在的α型和β型AT都能有效结合肝素，但β型AT只需要较低浓度的肝素就能达到最高活性。
目前，AT蛋白的主要来源包括天然提纯和基因工程两种途径。从人血浆中提取的AT蛋白已广泛应用于临床，但使用血液制品的缺点在于有病毒感染的危险，且这种危险性采用现有技术不能完全排除，尽管AT蛋白在血液制品的生产过程中进行了病毒灭活处理，仍然有许多问题还不能完全解决，如AT蛋白的变性以及潜存的AIDS病毒、人细小病毒和可引起突变型克雅氏的朊病毒（prion）。所以，利用基因工程的方法表达人重组AT（rhAT）蛋白已成为一种必然趋势。
采用基因工程途径获得rhAT蛋白，主要包括乳腺生物反应器（美国专利US2003096974；中国专利CN1840187A）、原核表达体系及真核表达体系三种方法。目前，由转基因山羊乳腺生产的抗凝血药Atryn（α-antithrombin）由美国FDA批准上市，但是转基因动物表达体系的构建耗时长、费用高，不适于大规模生产，且留有潜在的使用安全性问题，动物体内虽然可以对外源蛋白进行翻译后修饰，但由于牛、羊等家畜存在自身机体保护系统可对所有外源性物质产生排斥反应，如出现蛋白质水解等问题。此外乳汁中可能含有的微生物及不完全修饰的多肽都对产品的安全性构成了极大的威胁，如出现引起人类过敏反应的蛋白质。迄今，已在多种原核和真核体系中表达rhAT，先后在E .coli (Bock SC等, Nucleic Acid Res,
1982, 10: 8113-25)、COS细胞(Stephens AW等, Proc Natl Acad Sci
USA, 1987, 84: 3886-90)、BHK细胞(Fan B等, J Biol Chem, 1993,
268: 17588-96；Garone L等, Biochemistry,
1996, 35: 8881-9)以及酵母(中国专利CN101402968A; Mochzuki S等, Protein Expression Purif,
2001, 23: 55-65)等系统对AT进行了表达。但是，采用基因重组技术制备的rhAT在活性上次于血浆源性的AT（pAT），并且存在表达量不高的问题。Bock等1982年最早报道AT在大肠杆菌中表达，所产生的蛋白没有糖基化修饰，也未能检测到功能活性。
中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary Cell，CHO）是用于真核生物外源基因表达最为成功的宿主细胞，已有越来越多的药用蛋白在其中获得了高效表达，很多药物已投放市场，如EPO、G-CSF，多种抗体药物等。与其它表达系统相比，该系统具有许多优点，如拥有完备的翻译后加工过程，包括糖基化、羟基化，使表达的外源真核基因产物能够保持其天然结构及活性，且使表达产物分泌到胞外，有利于外源蛋白的分离纯化。有大量文献报道了利用CHO细胞表达rhAT的先例 (Wasley LC等, J Biol Chem,
1987, 262: 14766-72；Zettlmeissl G等, J Biol Chem, 1989, 264: 21153-9; PCT专利WO02/02793)。据文献可知利用CHO细胞表达AT存在以下几个问题，首先是表达量低(<120mg/L)（Rössler B等, Enzyme Microb Technol,
1996, 18: 423-7），无法满足工业化大规模生产的需求；其二，采用基因重组技术制备的rhAT在活性上次于从天然原料如血浆中获得的pAT，如Wasley等于1987年将AT基因在CHO细胞系中表达，但仅检测到5%~10%活性。近年来，研究者对CHO表达体系及细胞大规模培养条件不断进行优化和改进，获得了较高的表达量。2005年，Kuwae利用CHO细胞成功表达了AT，其表达量可高达1 g/L (Kuwae S等, J Biosci Bioeng,
2005, 100: 502-10)。其三，表达产物rhAT的糖基化形式与pAT不同(Zettlmeissl G等, J Biol Chem, 1989, 264:
21153-9；Franze´n LE等, J Biol Chem,
1980, 255: 5090-3)，这可能导致rhAT在生物活性上次于pAT，且会改变其在体内的半衰期。根据pAT的结构, 可推测由CHO细胞表达的具有生物活性的rhAT包含四个潜在的糖基化位点，每个位点含1个复合体型N-糖苷连接的糖链，由N-乙酰氨基葡萄糖、唾液酸、半乳糖和甘露糖构成，且它的糖链结构未经岩藻糖修饰，而采用重组技术生产的rhAT，在其复合体型N-糖苷连接的糖链还原末端N-乙酰氨基葡萄糖上均结合了岩藻糖，这可能导致它与肝素的结合亲和力变低，因此便不能获得足够的抗凝血活性(Fan B等, J Biol Chem,
1993, 268: 17588-96; Garone L等, Biochemistry, 1996, 35: 8881-9)。另一方面，pAT或rhAT如缺失糖链还原末端唾液酸，则其血浆清除率都将大大加快，即体内半衰期缩短(Zettlmeissl G等, J Biol Chem,
1989, 264: 21153-59)，而在高密度细胞培养生产rhAT时，由死细胞裂解所释放的唾液酸苷酶对糖链的去唾液酸化作用是不可避免的。由此，可知rhAT的体内半衰期及生物活性都不及pAT。
据已报道的有关AT的药代动力学数据显示，对正常受试者或遗传性AT缺乏症病人，AT在体内半衰期变化范围为22小时至4.8天（Bucur SZ等, Transfusion,
1998, 38: 481-98；Schwartz RS等, Am J Med, 1989, 87: 53S–60S），但对于急性DIC患者，因AT在短时间内被大量消耗，致使AT的体内半衰期降至几小时。据两项AT临床研究数据显示（Blauhut B等, Thromb Res, 1982,
27: 271-278；Vinazzer H, Ann Univ
Sarav Med, 1983, Suppl 3:185-7）在给予AT治疗后，急性DIC患者体内AT平均活性仅恢复了38%和47%，而正常组AT平均活性已恢复了78%和83%；正常组AT的血浆清除相对半衰期分别为20和25小时，而急性DIC患者仅为4.25和4.4小时。抗凝血药物的抗凝、抗栓效力，主要取决于其对适当血液水平(blood level)的控制和维持。而根据AT的抗凝机制可知，AT是凝血酶的一种自杀型抑制剂，以底物的形式与凝血酶1:1结合，形成一个紧密的不可逆的复合物，在抑制凝血酶等目标酶的过程中，自身亦被裂解灭活，而形成的抗凝血复合物（TAT）亦迅速于网状内皮系统清除。由此可知，半衰期适当延长更有利于AT在一定时间内建立并维持体内凝血和抗凝血系统的平衡，血药浓度更趋于平稳，减小血药浓度波动并减少给药次数，且在体内不会造成累积，不增加出血风险，安全性高，尤其对于急性DIC患者及类似因AT消耗大量增加，致其体内半衰期大幅缩短的病症，或对重症感染者抗炎治疗以及DIC患者单用AT治疗都必须给予大剂量AT，长效AT制剂的开发及应用显得更加必要和迫切。
IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质。它们的半衰期可高达21天，而Fc片段是IgG保持体内较长半衰期的主要原因, 同时具有稳定蛋白的作用。
针对以上现有技术中所述有关AT的制备及其在临床应用过程中存在的缺点及局限，如表达量不高、半衰期短以及稳定性差等，本领域迫切需要开发长效、稳定性好且降低生产成本的AT衍生物。迄今为止尚没有具有半衰期显著延长且可以高效稳定表达的AT衍生物AT产生。
发明内容
本发明目的就是克服现有AT制备及其在临床应用过程中存在的缺点及局限，提供具有半衰期显著延长且可以高效稳定表达的AT衍生物。
本发明一个目的是提供一种重组二聚化hAT-L-vFc融合蛋白，具有与血浆来源的抗凝血酶III类似或更高的体外生物学活性，以及延长的体内半衰期。
本发明另一个目的是提供一种采用哺乳动物细胞表达系统高效表达或生产这类重组二聚化hAT-L-vFc融合蛋白的方法。
本发明另一目的提供了一种编码上述重组二聚化hAT-L-vFc融合蛋白的DNA序列，进一步地，该DNA序列具有SEQ ID NO：1、3或5所示的DNA序列。
根据本发明的另一目的，提供一种载体，该载体包含上述DNA序列。
根据本发明的另一目的，提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含上述载体。
进一步。本发明另一个目的涉及高效表达或生产这类重组二聚化hAT-L-vFc融合蛋白所采用的CHO衍生细胞株。
本发明另一个目的涉及含有重组二聚化hAT-L-vFc融合蛋白的药物组合物。
以下具体介绍本发明内容：
融合蛋白及其制备方法
本发明提供了一种重组二聚化hAT-L-vFc融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白从N端到C端依次含有人AT、肽接头和人IgG Fc变体，并且所述的人IgG Fc变体选自下组：
(i)含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域；
(ii)含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域；
(iii)含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1绞链区、CH2和CH3区域。
其中，IgG Fc变体是无裂解性的，且与天然IgG Fc相比含有氨基酸突变，较佳地，使用约2-20个氨基酸长度的、含有以下2种或多种氨基酸构成的柔性肽接头：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸，如本发明实施例中所公开的优选序列为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。
本发明所述的重组二聚化hAT-L-vFc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、4或6所示，其成熟蛋白为去除了hAT前导肽之后SEQ ID NO：2、4或6所示的氨基酸序列，其特征在于，人IgG Fc 变体含有绞链区、CH2和CH3区域。其CH2区域在228、234、235和331位(由EU编号体系确定的位置)含有氨基酸突变，从而降低Fc的效应子功能。
元件
Fc元件来自免疫球蛋白的Fc区域，Fc在消灭病原体的免疫防御中具重要作用。IgG的效应子功能由Fc介导通过两种主要机制：（1）与细胞表面Fc受体（FcγRs）的结合，由吞噬作用或裂解作用或杀伤细胞通过抗体-依赖性细胞毒性（ADCC）途径消化病原体，或（2）与第一补体成分C1的C1q部分的结合，引发依赖于补体的细胞毒性(CDC)途径，从而裂解病原体。在四种人IgG同种型中，IgG1和IgG3能有效的结合FcγRs。IgG4与FcγRs的结合亲和力比IgG1和IgG3的低一个数量级，而IgG2与FcγRs的结合低得难以测定。人IgG1和IgG3还能有效地结合C1q，并激活补体级联反应。人IgG2对补体的固定很弱，而IgG4表现极端缺乏激活补体级联的能力（Jefferis R等, Immunol Rev,
1998, 163: 59-76）。对应用于人的治疗而言，融合蛋白的Fc区域必须不会介导不良效应子功能而裂解或除去这些细胞。因此，hAT-L-Fc的Fc区域必须是非裂解性的，即在结合FcγRs和C1q而触发效应子功能方面，Fc必须是无活性的。显然，没有一种天然的IgG同种型适合产生hAT-L-Fc融合蛋白。为了得到非裂解性的Fc，必须使天然Fc区域中的一些氨基酸突变，以减少其效应子功能。
通过比较人和鼠的IgG同种型的氨基酸序列，CH2区域氨基末端附近的Fc部分显示在IgG Fc与FcγRs的结合中起作用。已用基因工程抗体证明在234位至237位基序的重要性Duncan AR等, Nature, 1988,
332:563-564）。按Kabat等人（Sequences of Proteins of
Immunological Interest，1991, 第5版，United States Department
of Health and Human Services）所述的EU编号体系将氨基酸残基编号。在四种人IgG同种型中，IgG1和IgG3与FcγRs的结合最好，且具有相同的序列Leu234-Leu-Gly-Gly237（图 1仅显示了IgG1）。在以低亲和力与FcγRs结合的IgG4中，其序列含有单个氨基酸取代，Phe取代234位的Leu。在不结合FcγRs的IgG2中，两个取代和一个缺失形成Val234-Ala-Gly237（图 1）。为了减少Fc与FcγRs的结合和ADCC活性，用Ala替代IgG4中的Leu235（Hutchins JT等, Proc Natl Acad Sci
USA, 1995, 92: 11980-4）。IgG1抗体内的Glu233-Leu-Leu235序列曾被用IgG2中的Pro233-Val-Ala235相关序列来替换。这种改变使IgG1变体在小鼠中失去了透过FcγR-介导除去靶点细胞的能力（Isaacs JD等, J Immunol,
1998, 161: 3862-9）。
对于FcγR与C1q结合非常重要的第二部分位于人IgG的CH2区域羧基端附近（Duncan AR等, Nature, 1988,
332: 738-40）。在四种人IgG同种型中，这部分中仅有一个位点显示取代: 用IgG1、IgG2和IgG3中的Ala330和Pro331替代IgG4中的Ser330和Ser331（图 1）。Ser330的存在不影响FcγR与C1q的结合。用Ser替代Pro331使IgG1失去了与C1q的结合亲和力，而用Pro替代Ser331部分保留了IgG4补体固定活性（Tao MH等, J Exp Med, 1993,
178: 661-7；Xu Y等, J Biol Chem,
1994, 269: 3469-74）。
肽接头
连接肽的长度对融合蛋白的活性非常重要。已有人报道了促红细胞生成素(EPO) 衍生物（如二聚物），与EPO单体相比，含有2个完整的EPO区域（相隔3到7个氨基酸肽接头）的融合蛋白表现出减弱的活性（Qiu H等, J Biol Chem,
1998, 273: 11173-6）。然而，当这两个EPO区域间的肽接头的长度为17个氨基酸时，二聚体EPO分子的体外和体内生物活性明显提高（Sytkowski AJ等, J Biol Chem, 1999, 274:
24773-8；美国专利No. 6,187,564）。这可能解释为融合蛋白两部分间增加的连接肽，使该分子的两部分能分别行使其功能（Ashkenazi A等, Curr Opin in Immunol,
1997, 9: 195-200）。
本发明人经过长期而深入的研究，首次设计了一种独到的绞链区肽接头来降低空间位阻效应，可以制得hAT的C端与Fc连接的融合蛋白，中间有柔软的肽接头, 如本发明实施例中所公开的优选序列为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。令人意外的是，此融合蛋白不仅不会导致hAT的功能丧失，反而能够维持、甚至提高AT-Fc融合蛋白的生物活性。
此外，本发明人还发现，在hAT和人IgG Fc变体间添加的肽接头以两种方式提高hAT-L-Fc的体外生物活性：(1)使Fc区域远离hAT上的结构域，和(2)使一个hAT远离另一个hAT的结构域，从而降低空间位阻效应。且人的IgG Fc变体在CH2区域在228、234、235、331位点含有氨基酸突变，从而降低Fc的效应子功能。
本发明融合蛋白通常由生物合成的方法制备。根据本发明所述的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J. 萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。
本发明还提供了一种表达载体，包含编码本发明的融合蛋白的序列以及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
表达载体可采用市售的例如但不限于：pcDNA3、pIRES、pDR、pBK、pSPORT 等可用于真核细胞系统表达的载体。本领域技术人员可以根据宿主细胞来选择合适的表达载体。
根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将本发明的融合蛋白的编码序列插入合适的限制性位点，制得本发明的重组表达载体。
本发明还提供了表达本发明融合蛋白的宿主细胞，其中含有本发明的融合蛋白的编码序列。所述的宿主细胞优选的是真核细胞，例如但不限于CHO，COS细胞，293细胞，RSF细胞等。作为本发明的优选方式，所述的细胞是CHO细胞，其可较佳地表达本发明的融合蛋白，可获得结合活性良好，稳定性良好的融合蛋白。
用重组DNA制备本发明融合蛋白的方法，通常的步骤包括：
1) 提供编码融合蛋白的核酸序列；
2) 将1)的核酸序列插入到合适的表达载体，获得重组表达载体；
3) 将2)的重组表达载体导入合适的宿主细胞；
4) 在适合表达的条件下培养转化宿主细胞；
5) 收集上清液，并纯化融合蛋白产物。
将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于：磷酸钙沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法，噬菌体转导法，碱金属离子法。
有关宿主细胞的培养和表达可参见Olander RM Dev Biol Stand 1996; 86：338。可通过离心去除悬浮液中的细胞和残渣，收集清液。可通过琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定。
可将上述制备获得的融合蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。例如，当重组蛋白为分泌表达时，可以采用商品化的超滤膜来分离所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司产品，首先将表达上清浓缩。浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析(DEAE等)或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的基质。Q-或SP-基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析，疏水相互作用层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。
可利用含有所述融合蛋白的特异性抗体、受体或配体的亲和层析柱对表达的融合蛋白进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。可选择地，所述的融合蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA, c-Myc，6-His或8-His等。这些标签可用于对融合蛋白进行纯化。
在本发明的另一方面提供了一种从哺乳动物细胞系如CHO-衍生的细胞系制备或生产这种重组融合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将编码重组二聚化hAT-L-vFc融合蛋白的DNA引入CHO细胞，生成CHO衍生的细胞系；
(b)培养这种CHO衍生的细胞系，从而表达重组hAT-L-vFc融合蛋白；和
(c)纯化步骤(b)表达的重组hAT-L-vFc融合蛋白。
所述的编码重组hAT-L-vFc融合蛋白的DNA具有SEQ ID NO：1、3或5所示的核苷酸序列。
所述重组二聚化融合蛋白从N端到C端依次含有hAT、肽接头和人IgG Fc变体（表示为hAT-L-vFc），其特征为表现出很好的体外生物活性，即在摩尔基础上，具有与hAT类似或更高的体外生物活性，以及更长的体内半衰期；其中在hAT和IgG Fc变体间存在含有约2-20个氨基酸的柔性肽接头；和柔性肽接头含有2个或多个氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸；和其中人IgG Fc变体含有选自以下的人IgG的绞链区、CH2和CH3区域：Pro331Ser突变的人IgG2；Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4；和Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1。
所述的 hAT-L-vFc融合蛋白在其生长培养基中每24小时内，在表达超过30（较佳地为50）μg /106(百万)个细胞的条件下，培养转染的CHO-衍生的细胞系；其中重组融合蛋白在摩尔基础上，具有与hAT类似的或更高的体外生物活性，更长的体内半衰期。
这些hAT-L-vFc融合蛋白具有延长的血清半衰期而无不良副作用，改善了药物动力学和药效，从而降低了实现类似药效所需的剂量和注射次数。
此外，本发明表达产量高且IgG的融合蛋白可以通过Protein A 亲和层析得到高效便捷的纯化。
本发明一优选实施例中，高产量CHO-衍生的细胞株在100 mL摇瓶中培养16天，其表达的重组融合蛋白累积产量为2 g/L（图3）。在细胞培养的第6天至第12天间，活细胞数目最多约为7×106个/mL，在此条件下，分泌率测定为50 μg/106个细胞/24小时。
因此，本发明还提供了高效表达或生产这类重组二聚化hAT-L-vFc融合蛋白的CHO细胞系，其含有编码所述融合蛋白的核酸序列。
综上，本发明所述的融合蛋白及其制备方法的优点概括如下：
1．Fc与hAT偶联形成的二聚体hAT-L-vFc融合蛋白，在CHO细胞中具有较高的表达量，比重组hAT 在CHO细胞中表达量高 2倍以上。
2．二聚体hAT-L-vFc融合蛋白纯化步骤简单、高效便捷、可降低生产成本。
3．二聚体hAT-L-vFc融合蛋白和具有和与血浆来源的hAT类似的体外生物学活性。（摩尔比活性）。
4．二聚体hAT-L-vFc融合蛋白的循环半衰期延长，血清中药物浓度波动的减少，安全性提高，耐受性的改善，降低注射频率而提高患者的生活质量。
药物组合物
本发明提供了一种药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的本发明所述的hAT-L-vFc融合蛋白。
本发明所述的hAT-L-vFc融合蛋白一般地应用于AT先天性或获得性缺乏症患者的出血性疾病的预防和治疗以及血友病A或B患者的自发或手术性出血的预防和治疗或其他相关的出血性疾病。
进一步讲，本发明提供了一种药物组合物，它含有有效量 (如0.000001-90wt%；较佳的0.1-50wt%；更佳的，5-40wt%)的本发明的融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将有效量的本发明融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应 (如毒性、刺激和变态反应) 的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
药学上可接受的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
本发明所述的融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图 1显示了人IgG1、IgG2、IgG4和它们变体的绞链区和CH2区域的氨基酸序列的比对。比较这三部分氨基酸序列：氨基酸区域228、234-237和330-331。这些变体的氨基酸突变以粗斜体显示。氨基酸残基编号是根据EU编号体系标定。
图 2显示了所构建hAT-L-vFc融合蛋白基因的真核表达质粒的基因图谱。该表达质粒全长9740 bp，含有10个主要基因片断，包括1. hCMV启动子; 2. 目标基因hAT-L-vFc; 3. EMCV IRES;
4. mDHFR筛选基因; 5. bGH 中止序列; 6. SV40启动子; 7. 卡拉霉素抗性基因; 8. SV40中止序列; 9. ColE1 复制子; 10. 氨苄青霉素抗性基因。
图 3显示了在300 ml摇瓶内细胞株的生长及其分泌hAT-L-vFc融合蛋白的浓度趋势曲线图。
图 4显示了hAT-L-vFc纯化蛋白的体外活性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1. 构建编码hAT-L-vFcγ融合蛋白的基因
人AT基因购自Thermo-Fisher公司。通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因，为了便于克隆，将引入限制性酶内切位点NheI的寡核苷酸序列TCAGATCCGCTAGCCGCCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGCTC用作5’引物；将引入BamHI限制性酶内切位点的寡核苷酸序列GTCGAGGATCCGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGGAC用作3’引物。由DNA测序验证人AT基因序列。
柔性肽Linker与人IgG Fc区域Fcγ 2变体vFcγ 2（Pro331Ser突变）、Fcγ 4变体vFcγ 4（Ser228Pro和Leu235Ala突变）、Fcγ 1变体vFcγ 1（Leu234Val、Leu235Ala和Pro331SSer突变）的融合基因由人工合成的方法获得，所合成的片段5’和3’端各有一个限制性酶内切位点，分别为BamHI 和 EcoRI。由DNA测序验证L-vFcγ基因序列。将获得的DNA片段经插入到哺乳动物细胞表达载体PCDNA3(Invitrogen)的BamHI 和EcoRI位点，得到PCDNA3-L-vFCγ质粒。将获得的AT片段经NheI/BamHI双酶切后，插入到质粒PCDNA3-L-vFcγ的相应酶切位点间，得到了融合基因表达质粒pCDNA3-hAT-L-vFcγ，该质粒含巨细胞病毒早期启动子，它是哺乳动物细胞高水平表达外源基因所需的增强子。该质粒还含有选择性标记物，从而在细菌中可以具有氨苄青霉素抗性，而在哺乳动物细胞中可以具有G418抗性。另外，当宿主细胞是DHFR基因表达缺陷型时，PCDNA3表达载体含有小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）基因，从而存在氨甲蝶呤（MTX）时能共扩增hAT-L-vFcγ融合基因和DHFR基因（美国专利4,399,216），图 2为所构建的融合蛋白基因的真核表达质粒的基因图谱。
在人AT和Fc部分间存在的（且彼此化学结合）的肽接头（较佳地为柔性接头）增加了AT区域的柔性且提高了它的生物活性。对本发明而言，优选的是长度为约20个或更少（但不能少于2个）氨基酸的肽接头。宜使用含有或由2个或更多选自以下氨基酸构成的肽接头：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。一种肽接头的例子含有Gly-Ser肽构件，如GlyGlyGlyGlySer。
实施例2. 融合蛋白在转染细胞系中的表达
将重组的表达载体质粒转染入哺乳动物宿主细胞系，以表达hAT-L-vFcγ融合蛋白。为了稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是DHFR酶缺陷型CHO-细胞（美国专利No. 4,818,679）。一种优选的转染方法是电穿孔，也可以使用其它方法，包括磷酸钙共沉降、脂转染和原生质融合。在电穿孔中，用设置为250V电场和960μFd电容的Gene Pulser
Electroporator （Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA），在比色杯内的2~5×107个细胞中加入10μg用PvuI线性化的质粒DNA。在转染两天后，将培养基改成含0.4 mg/mL G418的生长培养基。用抗人IgG Fc 的ELISA分析方法，筛选对选择用药具有抗性的转染子。也可用抗AT分析的ELISA进行融合蛋白表达量的定量。通过极限稀释96孔组织培养板，亚克隆产生高水平Fc融合蛋白的孔。
为了实现融合蛋白较高水平的表达，宜用受MTX药物抑制的DHFR基因进行共扩增。在含有递增浓度MTX的生长培养基中，用DHFR基因共扩增转染的融合蛋白基因。用极限稀释的亚克隆能在高达1 μg/mL MTX培养基中生长的转染子。测定分泌率对亚克隆的细胞系进行进一步的分析。分泌率水平超过约30（较佳地约50）μg/106（即百万）个细胞/24小时的细胞系适应使用无血清生长培养基的悬浮培养。然后用条件培养基纯化融合蛋白。
实施例3. 融合蛋白的生产
实施例2优选得到的高产量细胞株首先在培养皿中进行无血清驯化培养，然后转移到摇瓶中进行悬浮驯化培养。待细胞适应这些培养条件后，然后在300 ml摇瓶中进行补料添加培养。上述CHO衍生的细胞株在100 ml体积的摇瓶中培养16天，其表达的重组融合蛋白累积产量为2 g/L（图 3）。在细胞培养的第6天至第12天间，活细胞数目最多约为7×106个/mL。为了得到更多的hAT-L-vFc重组蛋白，也可以选用2000 ml摇瓶培养。
实施例4. 融合蛋白的纯化与定性
用1N NaOH将含有实施例3的融合蛋白的条件培养基滴定到pH 7~8，然后用0.45微米的硝酸纤维素过滤器过滤。将滤液加样到磷酸盐缓冲液盐水（PBS）平衡的ProsepA柱上。待融合蛋白结合于Prosep A后，弃去流出的组分。用PBS洗涤该柱，直到280 nm处的OD值低于0.01。然后用0.1M pH为3.75的柠檬酸缓冲液洗脱结合的融合蛋白。用0.4体积的1M K2HPO4中和，合并含有纯化蛋白的组分，并用PBS透析。然后用0.22微米的硝酸纤维素过滤器过滤，并存储在-70°C。在还原条件下，由SDS-PAGE测得纯化的血浆来源hAT蛋白分子量在60 kDa。纯化的hAT-L-vFcγ蛋白迁移至约 85 kDa。用BSA作为标准，通过BCA蛋白质分析定量该融合蛋白。
实施例5. 体外活性检测
本发明采用HYPHEN BioMed公司生产的BIOPHEN Antithrombin 5试剂盒（Ref: A221105）定量测定所制备的hAT-L-vFc融合蛋白在肝素协同作用下的体外生物学活性。该试剂盒采用自动或手动操作来检测其抗Xa因子活性。
AT是人体血浆中的一种重要的生理性抗凝血酶，它通过抑制丝氨酸蛋白酶类凝血因子的活性，尤其是凝血酶、凝血因子Xa和因子IXa，以调节血液凝血过程和阻止血栓的形成。当与肝素形成复合物后，使AT更快、更强的抑制凝血酶的活性。该试剂盒是基于在肝素协同作用下AT对一定量的（过量）凝血因子Xa的抑制作用来动态检测AT的活性大小。反应体系中凝血因子Xa对其特异性显色底物的酰胺分解作用（amydolitic activity）使底物裂解并产生pNA，而所产生pNA的量与体系中AT的量成反比，通过测定所释放pNA的量可计算出体系中因子Xa的残留量。测量波长为405nm，反应体系温度须维持在37°C。图 4显示了与血浆来源的hAT或纯化的实施例4的重组hAT-L-vFc蛋白的摩尔浓度（nM）与其参比活性的对应关系。在上述条件下，hAT的IC50值约为29.2 ± 2.2 nM，而经纯化的实施例4的hAT-L-vFc蛋白约为7.24 ± 0.39 nM。
实施例6. 融合蛋白的药代动力学测定
SD大鼠单剂量（10 mg/Kg）尾静脉注射hAT-L-vFc样品，选取不同时间点抽取SD大鼠的血液样品，肝素抗凝，离心后的上清液用 ELISA方法测定血浆中的融合蛋白含量。用ELISA测定时，用羊抗人的Fc的多抗进行包埋、辣根过氧化物酶标记的鼠抗人hAT的单抗来检测。实施例4中纯化hAT-L-vFc样品的血浆半衰期约为180 分钟，而美国GTC公司用转基因山羊生产的重组hAT药品ATryn同剂量血浆半衰期约为40分钟， 所以本发明中重组hAT-L-vFc 体内半衰期大幅度延长。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以诶对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种重组二聚化hAT-L-vFc融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白从N端到C端依次含有人AT、肽接头和人IgG Fc变体，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示或是去除了hAT前导肽之后SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
2.一种重组二聚化hAT-L-vFc融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白从N端到C端依次含有人AT、肽接头和人IgG Fc变体，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示或是去除了hAT前导肽之后SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
3.一种重组二聚化hAT-L-vFc融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白从N端到C端依次含有人AT、肽接头和人IgG Fc变体，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示或是去除了hAT前导肽之后SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
4.一种编码根据权利要求1-3任意一项权利要求所述的重组二聚化hAT-L-vFc融合蛋白的DNA序列，优选该DNA序列具有SEQ ID NO：1、3或5所示的DNA序列。
5.一种载体，该载体包含如权利要求4所述的重组二聚化hAT-L-vFc融合蛋白的DNA序列。
6.一种CHO衍生细胞株，其特征在于，其含有编码hAT-L-vFc融合蛋白的DNA序列，并且所述的DNA序列具有如权利要求4所述的重组二聚化hAT-L-vFc融合蛋白的DNA序列，所述细胞株在其生长培养基中在每24小时内，产生超过50 mg/百万个细胞的如权利要求1-3任一项所述的重组二聚化hAT-L-vFc融合蛋白。
7.一种制备如权利要求1-3任一所述的重组二聚化hAT-L-vFc融合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将编码根据权利要求1-3任意一项权利要求所述的重组二聚化hAT-L-vFc融合蛋白的DNA引入CHO细胞，生成CHO衍生的细胞系；
(b)培养这种CHO衍生的细胞系，从而表达重组hAT-L-vFc融合蛋白；和
(c)纯化步骤(b)表达的重组hAT-L-vFc融合蛋白。
8.一种药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的权利要求1-3任意一项权利要求所述的hAT-L-vFc融合蛋白。
9.如权利要求8所述的药物组合物在制备预防和治疗AT先天性或获得性缺乏症患者的出血性疾病以及血友病A或B患者的自发或手术性出血疾病药物中的应用。
10.如权利要求1-3任一所述的重组二聚化hAT-L-vFc融合蛋白在制备在摩尔基础上具有较rhAT更高的体外生物活性和更长的半衰期的药物中的应用。
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