KR101393715B1 - 펩타이드 구조물용 아미노산 대체물 - Google Patents

펩타이드 구조물용 아미노산 대체물 Download PDF

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Abstract

하기 화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물 (식 중, R1, R2, R3, R4, R5, R6a, R6b, R7 및 y는 명세서 중에서 정의된 바와 같다), 화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물의 합성 방법, 및, 화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물 하나 이상과 복수개의 아미노산 잔기를 포함하는 선형 또는 사이클릭 화합물 및 화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물 하나 이상과 복수개의 아미노산 잔기를 포함하는 선형 또는 사이클릭 화합물에서 사용하는 것을 포함하는 화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물의 사용 방법.
Figure 112009032700195-pct00173
고리-구속형 아미노산 대체물, 아미노산 잔기

Description

펩타이드 구조물용 아미노산 대체물{AMINO ACID SURROGATES FOR PEPTIDIC CONSTRUCTS}
관련출원에 대한 상호참조 사항
본 출원은 2006년 3월 30일 출원된 "선형 나트륨 이뇨 펩타이드 구조물"이라는 명칭의 미국 가특허출원 60/743,963호 및 2006년 3월 30일 출원된 "보결분자단을 갖는 선형 나트륨 이뇨 펩타이드 구조물"이라는 명칭의 미국 가특허출원 60/743,964호, 2006년 3월 30일 출원된 "사이클릭 나트륨 이뇨 펩타이드 구조물"이라는 명칭의 미국 가특허출원 60/743,960호 및 2006년 3월 30일 출원된 "보결분자단을 갖는 고리형 나트륨 이뇨 펩타이드 구조물"이라는 명칭의 미국 가특허출원 60/743,961호의 우선권 주장 출원으로서 상기 기초 출원의 명세서와 특허청구범위는 본 발명에 참조 통합되어 있다.
2개의 관련출원으로서, 국제특허출원 PCT/US07/65656 (대리인 참조번호: 0307-042-PCT) "선형 나트륨 이뇨 펩타이드 구조물"과 국제특허출원 PCT/US07/65645 (대리인 참조번호: 0307-041-PCT) "사이클릭 나트륨이뇨 펩타이드 구조물"이 계류 중이며 이들 출원의 명세서와 특허청구범위 역시 본 발명에 참조 통합되어 있다.
발명의 분야 (기술분야):
본 발명은 고리-구속형 아미노산 대체물, 고리-구속형 아미노산 대체물의 합성 방법, 및 복수개의 아미노산 잔기와 하나 이상의 고리-구속형 아미노산 대체물을 포함하는 선형 또는 사이클릭 구조물 또는 화합물에 있어서의 사용 방법을 포함하는, 고리-구속형 아미노산 대체물의 사용 방법에 관한 것이다.
배경 기술:
아미노산 대체물: 몇가지 상이한 펩타이드 모방체들이 알려져 있으며 펩타이드의 중요한 기능 도메인의 모방물질을 만드는데 사용되고 있다. 일반적으로, Bioorganic Chemistry: Peptides and Proteins 참조, S. M. Hecht, ed., Oxford University Press, 1998, 특히 Chapter 12, pages 395-419, 및 인용된 참조 문헌을 살펴볼 것. 펩타이드 및 단백질은 매우 유연한데, 이는 주로 개개의 아미노산 잔기들의 자유회전도가 높기 때문이다. 또한, 개별적인 아미노산 잔기들의 측쇄 중의 몇몇 결합들 역시 자유회전도를 갖는다. 아미노산 잔기들 간의 결합되지 않은 입체 상호작용은 그의 자유도와 함께 펩타이드나 단백질을 상당히 안정환 최소 자유에너지 배열로 만든다. "2차 구조(secondary structure)"라고도 알려진 국소 구조들이 펩타이드와 단백질에 공통적이다. 이러한 구조들로는 α-헬릭스, β-벤드, 시트, 연장된 사슬, 루프 등을 들 수 있으며, 이들 대부분은 펩타이드와 단백질의 결합특이성 또는 수용체 특이성에 기여한다. α-헬릭스는 몇가지 유형이 알려져 있는데, 이들은 실제 회전하는 아미노산 잔기의 비틀림각과, 분자내 및 분자간 수소 결합의 패턴이 서로 상이하다. 다이헤드랄(dihedral) 비틀림각 ψ (C a -C 결합의 경우) 또는 φ (C a -N 결합의 경우), 또는 두가지가 모두 다른 공지의 상이한 β-벤드들도 몇가지 알려져 있다. 펩타이드 모방체는 분자내에서 입체배열적으로 제한된 성분을 제공하는데 사용되며, 부분적으로는 소망되는 생물학적 반응에 가장 적합한 제한적인 배입체배열로 중요한 기능적 도메인을 고정시키려는 목적으로 사용된다.
일반적으로 펩타이드 모방체는 디펩타이드나 트리펩타이드의 기능을 고정 및 모방시키기 위해 고안되거나 의도된다. 예컨대, 역회전(reverse-turn) 모방체들이미국특허 7,008,941, 6,943,157, 6,413,963, 6,184,223, 6,013,458 및 5,929,237, 및 공개된 미국특허출원 2006/0084655에 설명되어 있고, 이들 모두는 디펩타이드나 트리펩타이드 서열을 모방하는 것으로 주장된 다양한 바이시클릭 고리 구조를 설명하고 있다. 다른 출원들도 여러가지 상이한 소분자 화합물을 개시하고 있는데, 이들 문헌 역시 디펩타이드나 트리펩타이드 서열을 모방하는 것으로 주장되고 있다. 예컨대, 공개된 미국특허출원 2006/0234923 및 2003/0191049 참조.
나트륨 이뇨 펩타이드 시스템. 아미노산 대체물로서 잠재적으로 이용가능한 한가지는 나트륨 이뇨 펩타이드 시스템을 이용하는데, 이것은 1984년 인간의 심방 나트륨 이뇨 펩타이드 (ANP: atrial natriuretic peptide) 서열과 유전자 구조가 동정된 이래로 나트륨 이뇨 펩타이드 시스템은 집중적으로 탐구되어왔다. ANP는 나트륨 이뇨 펩타이드 시스템의 일부로서, 이것은 사람에 있어서 ANP 유전자와 관련되는데, 이 유전자는 후번역 프로세싱에서 분화를 통해 ANP와 유로딜라틴을 모두 결과시키며 이 유로딜라틴은 BNP 또는 뇌 나트륨 이뇨 펩타이드를 생산하고 이 유전자는 다시 CNP 또는 c형 나트륨 이뇨 펩타이드를 생산한다. ANP, 유로딜라틴, BNP 및 CNP는 각각 시스테인-시스테인 디설파이드 결합에 의해 형성된 17 아미노산 루프를 갖는 고리 구조로 되어 있다. ANP, 유로딜라틴, BNP 및 CNP는 밀접하게 연관되어 있고, 고리 구조 내의 5 또는 6개 아미노산이 다르며, N- 및 C-말단 꼬리는 실질적으로 다르다.
ANP, BNP 및 CNP는 각각 서로 다른 수용체인 나트륨 이뇨 펩타이드 수용체 A, B 및 C (NPRA, NPRB 및 NPRC)에 대해 특이적이다. NPRA 및 NPRB는 구아니닐 사이클라제에 결합되는 반면, NPRC는 G-단백질 연결된 소거 수용체이다. ANP, BNP 및 CNP는 이제까지 동정된 일차적인 내인성 포유류 나트륨 이뇨 펩타이드들이다. 그러나, 동정된 것들 중에는 비포유류성 나트륨 이뇨 펩타이드들이 몇가지 있으며 이들은 포유류에서도 치료 효과를 갖는 것일 수 있다. 여기에는 연어의 나트륨 이뇨 또는 심장 펩타이드(sCP), 심실 나트륨 이뇨 펩타이드 (VNP), 도마뱀과 여러가지 물고기에서 동정된 심장 나트륨 이뇨 펩타이드 및 맘바뱀의 뱀독에서 동정된 나트륨이뇨 펩타이드, 덴드로아스피스의 나트륨이뇨 펩타이드 (DNP), 대만 뱀독에서 분리된 3가지 나트륨 이뇨-유사 펩타이드(TNP-a, TNP-b, 및 TNP-c)가 포함된다. 일반적으로 Tervonen V, Ruskoaho H, Lecklin T, Ilves M, Vuolteenaho O 참조. 연어의 심장 나트륨 이뇨 펩타이드는 부피를 조절하는 호르몬이다. 　Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 283:E353-61 (2002); Takei Y, Fukuzawa A, Itahara Y, Watanabe TX, Yoshizawa Kumagaye K, Nakajima K, Yasuda A, Smith MP, Duff DW, Olson KR. 새로운 나트륨 이뇨 펩타이드가 송어의 심방으로부터 분리된 바 있다. Oncorhynchus mykiss. FEBS Lett. 414:377-80 (1997); 　Schweitz H, Vigne P, Moinier D, Frelin C, Lazdunski M. 또한 녹색 바 (Dendroaspis angusticeps)의 독에도 나트륨 이뇨 펩타이드 패밀리의 새로운 멤버가 존재한다. J. Biol. Chem. 267:13928-32 (1992); Lisy O, Jougasaki M, Heublein DM, Schirger JA, Chen HH, Wennberg PW, Burnett JC. Renal actions of synthetic dendroaspis natriuretic peptide.　 Kidney Int. 56:502-8 (1999); 및 Fry BG, Wickramaratana JC, Lemme S, Beuve A, Garbers D, Hodgson WC, Alewood P. 인랜드(Oxyuranus microlepidotus)의 뱀독으로부터 새로운 나트륨 이뇨 펩타이드가 분리되었다: 분리, 화학적 및 생물학적 특징화. Biochem. Biophys. Res. Comm. 327:1011-1015 (2005).
ANP는 주로 심방 압력의 증가에 반응하여 내인적으로 분비되지만, 다른 원인, 예컨대 시토카인 수용체의 자극도 이러한 내인성 분비의 원인이 될 수 있다. 일단 분비되면, ANP는 혈압, 나트륨 및 플루이드 항상성의 호르몬 조절자로서, 혈관확장 효과를 부여하며, 심장혈관 리모델링 등에 영향을 미친다. 따라서, 내인성 ANP를 비롯하여 ANP는 만성적으로 활성화된 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템에 대한 방어능을 부분적으로 제공함으로써 울혈성 심부전증 및 기타 심장혈관 질환에 대해 효과적이다. 순환 ANP는 두가지 메카니즘, 즉 나트륨 이뇨 펩타이드 수용체에 대한 결합과 효소적 분해에 의해 순환계로부터 신속히 제거된다.
인간의 ANP는 또한 야생형 인간 ANP, hANP, ANP(1-28) 및 ANP(99-126) (후자 는 분비 중 C-말단 대역의 Arg98 - Ser99에서 일반적으로 절단되는, proANP(1-126) 내의 해당 서열을 칭한다)으로도 칭해진다. 이하에서 인간의 ANP는 때로 "hANP"로 칭하기로 한다.
일반적으로, 나트륨 이뇨 펩타이드 및 이의 변형체는 울혈성 심부전증, 신장 고혈압, 급성 신부전 및 관련 질환 뿐만 아니라, 이뇨, 나트륨 이뇨 및/또는 혈관확장 반응이 치료 또는 예방 효과를 갖는 여하한 질병이나 증상을 치료하는데 유용한 것으로 믿어지고 있다. ANP를 비롯한 나트륨 이뇨 펩타이드, 및 심부전증에 있어서 나트륨 이뇨 펩타이드 시스템의 용도를 설명한 논문 중 하나는 Schmitt M., Cockcroft J.R., 및 Frenneaux M.P. Modulation of the 나트륨 이뇨 펩타이드 system in heart failure: from bench to bedside? Clinical Science 105:141-160 (2003)이다.
대단히 많은 수의 ANP 모방물질(mimetics)과 변형체가 만들어져 왔고, 이들 중 몇몇은 실제로 ANP로부터 크기가 감소된 것이다. ANP 버젼에서 크기는 감소되었으나 생물학적으로 활성적인 것으로 H-Met-cyclo(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2 (SEQ ID NO:1)를 들 수 있는데 이것은 Li B, Tom JY, Oare D, Yen R, Fairbrother WJ, Wells JA, Cunningham BC. Minimization of a polypeptide hormone. Science 270:1657-60 (1995)에 기재되어 있다. 이 15-mer 펩타이드는 흔히 "mini-ANP"로 칭해진다.
발명의 개요
한가지 측면에서, 본 발명은 다음 일반식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물, 또는 그의 거울상 이성질체, 입체이성질체 또는 부분입체이성질체, 또는 합성적으로 허용가능한 그의 염을 제공한다:
Figure 112008075651893-pct00001
식 중, R1은 H, 알킬, 아릴, 알킬아릴, 알킬-N(R8)2, 알킬-OR8, 알킬-C(=O)OR8, C(=O)OR8, 알킬-NH2, 알킬-S-R8, 알킬-C(=O)N(R8)2, 또는 다음 화학식을 갖는 기:
Figure 112008075651893-pct00002
R2는 H 또는 알킬, 단, R1 및 R2 두가지 모두가 H인 것은 아님;
R3는 H 또는 제1 질소 보호기;
R4는 H, 알킬, (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qO알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R5는 H 또는 알킬;
R6a는 H, 알킬, (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qO알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R6b는 H 또는 알킬;
단, R4 및 R6a 두가지 모두가 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qO알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2인 것은 아님;
R7은 H, C(=O)알킬, C(=O)(CH2)m(NR8)2, 알킬, 아르알킬, 또는 아릴;
R8 은 각각의 출현시 독립적으로 H, 아릴, 또는 알킬;
R11은 펩타이드 고상 지지체;
R12 는 H 또는 제2 질소 보호기;
m은 각각의 출현시 독립적으로 0 내지 6의 정수;
q는 각각의 출현시 독립적으로 1 내지 6의 정수;
p는 1 내지 10의 정수; 및
y는 0 또는 1이다.
일반식 I의 대체물의 한가지 측면에서, y는 1이다. 또 다른 측면에서, y는 0이다.
일반식 I의 대체물의 한가지 측면에서, R4는 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)NR11, (CH2)mC(=O)OR11이고 R6a는 H 또는 알킬이다.
일반식 I의 대체물의 한가지 측면에서, R6a는 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)NR11, (CH2)mC(=O)OR11이고 R4는 H 또는 알킬이다.
일반식 I의 대체물의 한가지 측면에서, R3는 다음 화학식을 갖고:
Figure 112008075651893-pct00003
R9는 3차-부틸, 알릴 또는 다음 화학식을 갖는 기이다:
Figure 112008075651893-pct00004
일반식 I의 대체물의 한가지 측면에서, R1은 알킬-N(R8)2, 알킬-OR8, (CH2)n-C(=O)OR8, C(=O)OR8, 알킬-NH2, 알킬-S-R8, 알킬-C(=O)N(R8)2, 또는 다음 화학식을 갖는 기이고:
Figure 112008075651893-pct00005
R12는 H 또는 트리페닐메틸렌, 3차-부틸옥시카르보닐, 톨루엔설포닐, 포르밀, 니트로 또는 벤질옥시카르보닐이며, n은 2 내지 6의 정수이다.
일반식 I의 대체물의 한가지 측면에서, 다음 화학식을 갖는 화합물, 그의 거울상 이성질체, 입체이성질체또는 부분입체이성질체, 또는 그의 합성적으로 허용가 능한 염이 제공된다:
Figure 112008075651893-pct00006
식 중:
R6a는 H 또는 알킬; 및
R9은 3차-부틸, 알릴, 또는 다음 화학식을 갖는 기이다:
Figure 112008075651893-pct00007
상기 중, R1은 알킬-N(R8)2, 알킬-OR8, (CH2)n-C(=O)OR8, C(=O)OR8, 알킬-NH2, 알킬-S-R8, 알킬-C(=O)N(R8)2, 또는 다음 화학식을 갖는 기이다:
Figure 112008075651893-pct00008
식 중, R12는 H 또는 트리페닐메틸렌, 3차-부틸옥시카르보닐, 톨루엔설포닐, 포르밀, 니트로 또는 벤질옥시카르보닐이고 n은 2 내지 6의 정수이다. R7은 H일 수 있다. R4는 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)N(R8)2, (CH2)mC(=O)NR11, 또는 (CH2)mC(=O)OR11일 수 있다.
일반식 I의 대체물의 한가지 측면에서, 다음 화학식을 갖는 화합물, 그의 이성질체, 입체이성질체또는 부분입체이성질체, 또는 합성적으로 허용가능한 염이 제공된다:
Figure 112008075651893-pct00009
식 중,
R1은 알킬-N(R8)2, (CH2)nOR8, (CH2)nC(=O)OR8, C(=O)OR8, 알킬-NH2, 알킬-S-R8, 알킬-C(=O)N(R8)2, 또는 다음 화학식을 갖는 기이다:
Figure 112008075651893-pct00010
식 중, R4는 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qO알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2; R6a는 H 또는 알킬; 및 n 은 2 내지 6의 정수이다.
상기 중, R1은 알킬-N(R8)2, 알킬-OR8, (CH2)n-C(=O)OR8, C(=O)OR8, 알킬-NH2, 알킬-S-R8, 알킬-C(=O)N(R8)2, 또는 다음 화학식을 갖는 기이고:
Figure 112008075651893-pct00011
식 중, R12는 H 또는 트리페닐메틸렌, 3차-부틸옥시카르보닐, 톨루엔설포닐, 포르밀, 니트로 또는 벤질옥시카르보닐이고 n은 2 내지 6의 정수이다. R7은 H일 수 있다. R4는 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)N(R8)2, (CH2)mC(=O)NR11, 또는 (CH2)mC(=O)OR11일 수 있다.
일반식 I의 대체물의 한가지 측면에서, 다음 화학식을 갖는 화합물 또는 그의 거울상 이성질체, 입체이성질체또는 부분입체이성질체 또는 합성적으로 허용가능한 염이 제공된다:
Figure 112008075651893-pct00012
식 중, R1은 알킬-N(R8)2, (CH2)nOR8, (CH2)nC(=O)OR8, C(=O)OR8, 알킬-NH2, 알킬-S-R8, 알킬-C(=O)N(R8)2, 또는 다음 화학식을 갖는 기이다:
Figure 112008075651893-pct00013
R4는 H 또는 알킬;
R6a는 H 또는 알킬; 및
n은 2 내지 6의 정수이다.
상기 중, R3은 다음 화학식을 갖는 기일 수 있고:
Figure 112008075651893-pct00014
R9은 3차-부틸, 알릴 또는 다음 화학식을 갖는 기일 수 있다:
Figure 112008075651893-pct00015
R1은 알킬-N(R8)2, 알킬-OR8, (CH2)n-C(=O)OR8, C(=O)OR8, 알킬-NH2, 알킬-S-R8, 알킬-C(=O)N(R8)2, 또는 다음 화학식을 갖는 기일 수 있다:
Figure 112008075651893-pct00016
식 중, R12는 H 또는 , 톨루엔설포닐, 포르밀, 니트로 또는 벤질옥시카르보닐이고 n은 2 내지 6의 정수이다. R7은 H일 수 있다.
일반식 I의 대체물의 한가지 측면에서, 다음 화학식을 갖는 화합물, 그의 거울상 이성질체, 입체이성질체, 또는 부분이성질체, 또는 그의 합성적으로 허용가능한 염이 제공된다:
Figure 112008075651893-pct00017
식 중,
R1은 알킬-N(R8)2, 알킬-OR8, (CH2)n-C(=O)OR8, C(=O)OR8, 알킬-NH2, 알킬-S-R8, 알킬-C(=O)N(R8)2, 또는 다음 화학식을 갖는 기이고:
Figure 112008075651893-pct00018
R4는 H 또는 알킬; 및
R6a는 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qO알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2이다
상기 중, R3는 다음 화학식을 갖는 기일 수 있고:
Figure 112008075651893-pct00019
R9은 3차-부틸, 알릴, 또는 다음 화학식을 갖는 기일 수 있다:
Figure 112008075651893-pct00020
상기 중, , R1은 알킬-N(R8)2, 알킬-OR8, (CH2)n-C(=O)OR8, C(=O)OR8, 알킬-NH2, 알킬-S-R8, 알킬-C(=O)N(R8)2, 또는 다음 화학식을 갖는 기일 수 있다:
Figure 112008075651893-pct00021
식 중, R12는 H 또는 트리페닐메틸렌, 3차-부틸옥시카르보닐, 톨루엔설포닐, 포르밀, 니트로 또는 벤질옥시카르보닐이다. R6a는 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)N(R8)2, (CH2)mC(=O)NR11, 또는 (CH2)mC(=O)OR11일 수 있다 R7은 H일 수 있다.
일반식 I의 대체물의 한가지 측면에서, 다음 화학식을 갖는 화합물 또는 그의 거울상 이성질체, 입체이성질체, 부분입체이성질체, 또는 그의 합성적으로 허용가능한 염이 제공된다:
Figure 112008075651893-pct00022
R4는 H 또는 알킬이고;
R9은 3차-부틸, 알릴, 또는 다음 화학시을 갖는 기이다:
Figure 112008075651893-pct00023
상기 중, R1은 알킬-N(R8)2, 알킬-OR8, (CH2)n-C(=O)OR8, C(=O)OR8, 알킬-NH2, 알킬-S-R8, 알킬-C(=O)N(R8)2, 또는 다음 화학식을 갖는 기일 수 있다:
Figure 112008075651893-pct00024
식 중, R12는 H 또는 트리페닐메틸렌, 3차-부틸옥시카르보닐, 톨루엔설포닐, 포르밀, 니트로 또는 벤질옥시카르보닐이고 n은 2 내지 6의 정수이다. R7은 H일 수 있다.
R4는 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)N(R8)2, (CH2)mC(=O)NR11, 또는 (CH2)mC(=O)OR11일 수 있다.
일반식 I의 대체물의 한가지 측면에서, 다음 화학식을 갖는 화합물, 그의 거 울상 이성질체, 입체이성질체, 부분입체이성질체 또는 그의 합성적으로 서용가능한 염이 제공된다:
Figure 112008075651893-pct00025
식 중, R1 및 R2는 독립적인 알킬기이다.
상기 중, R3는 다음 화학식을 갖는 기일 수 있다:
Figure 112008075651893-pct00026
식 중, R9은 3차-부틸, 알릴 또는 다음 화학식을 갖는 기이다:
Figure 112008075651893-pct00027
R4는 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NR11, 또는 (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qO알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2일 수 있고 R6a는 H 또는 알킬이다. R6a는 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qO알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2 일 수 있고, R4는 H 또는 알킬이다. R7은 H일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 다음 화학식을 갖는 펩타이드의 합성 방법이 제공되며:
Figure 112008075651893-pct00028
상기 방법은 다음 구조의 화학식 I을 갖는 화합물, 또는 그의 거울상 이성질체, 입체이성질체 또는 부분입체이성질체, 또는 합성적으로 허용가능한 그의 염을 N-보호 아미노산과 반응시키는 단계를 포함하여 이루어진다:
식 중:
R1은 H, 알킬, 아릴, 알킬아릴, 알킬-N(R8)2, 알킬-OR8, 알킬-C(=O)OR8, C(=O)OR8, 알킬-NH2, 알킬-S-R8, 알킬-C(=O)N(R8)2, 또는 다음 화학식을 갖는 기:
Figure 112008075651893-pct00029
R2는 H 또는 알킬, 단, R1 및 R2가 모두 H인 것은 아님;
R3는 H 또는 제1 질소 보호기;
R4는 H, 알킬, (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qO알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R5는 H 또는 알킬;
R6a는 H, 알킬, (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qO알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R6b는 H 또는 알킬;
단, R4 및 R6a 두가지 모두가 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qO알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2인 것은 아님:
R7은 H, C(=O)알킬, C(=O)(CH2)m(NR8)2, 알킬, 아르알킬, 또는 아릴;
R8은 각각 출현시마다 독립적으로 H, 아릴, 또는 알킬;
R11은 펩타이드 고상 지지체;
R12는 H 또는 제2 질소 보호기;
m은 각각 출현시마다 0 내지 6의 정수;
q는 각각 출현시마다 1 내지 6의 정수:;
p는 1 내지 10의 정수이고;
y는 0 또는 1이다.
또 다른 구체에에서, 복수개의 아미노산 잔기 및 다음 화학식을 갖는 적어도 하나의 기를 포함하여 이루어지는 화합물 또는 그의 거울상 이성질체, 입체이성질체 또는 부분입체이성질체가 제공된다:
Figure 112008075651893-pct00030
식 중,
R1은 H, 알킬, 아릴, 알킬아릴, 알킬-N(R8)2, 알킬-OR8, 알킬-C(=O)OR8, C(=O)OR8, 알킬-NH2, 알킬-S-R8, 알킬-C(=O)N(R8)2, 또는 다음 화학식을 갖는 기:
Figure 112008075651893-pct00031
R2는 H 또는 알킬, 단, R1 및 R2 두가지 모두가 H인 것은 아니다;
R3는 H 또는 제1 질소 보호기;
R4는 H, 알킬, (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qO알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R5는 H 또는 알킬;
R6a는 H, 알킬, (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qO알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R6b는 H 또는 알킬;
단, R4 및 R6a 두가지 모두가 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qO알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2인 것은 아니다;
R7은 H, C(=O)알킬, C(=O)(CH2)m(NR8)2, 알킬, 아르알킬, 또는 아릴;
R8는 각각 출현시마다 H, 아릴, 또는 알킬;
R11은 펩타이드 고상 지지체;
R12는 H 또는 제2 질소 보호기;
m은 각각 출현시마다 0 내지 6의 정수;
q는 각각 출현시마다 1 내지 6의 정수;
p는 1 내지 10의 정수이고;
y는 0 또는 1이다.
또 다른 구체예에서, 복수개의 아미노산 잔기와 다음 화학식을 갖는 적어도 하나의 기, 또는 그의 거울상 이성질체, 입체이성질체, 또는 부분입체이성질체를 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure 112008075651893-pct00032
R1은 H, 알킬, 아릴, 알킬아릴, 알킬-N(R8)2, 알킬-OR8, 알킬-C(=O)OR8, C(=O)OR8, 알킬-NH2, 알킬-S-R8, 알킬-C(=O)N(R8)2, 또는 다음 화학식을 갖는 기:
Figure 112008075651893-pct00033
R2는 H 또는 알킬, 단, R1 및 R2 는 두가지 모두가 H인 것은 아님;
R3은 H 또는 제1 질소 보호기;
R4는 H, 알킬, (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qO알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R5는 H 또는 알킬;
R6a는 H, 알킬, (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qO알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R6b는 H 또는 알킬;
단, R4 및 R6a 두가지 모두가 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qO알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2인 것은 아님;
R7은 H, C(=O)알킬, C(=O)(CH2)m(NR8)2, 알킬, 아르알킬, 또는 아릴;
R8는 각각 출현시마다 독립적으로 H, 아릴, 또는 알킬;
R11은 펩타이드 고상 지지체;
R12는 H 또는 제2 질소 보호기;
m은 각각 출현시마다 0 내지 6의 정수;
q는 각각 출현시마다 1 내지 6의 정수;
p는 1 내지 10의 정수이고;
y는 0 또는 1이다.
본 발명의 한가지 측면에서, 본 발명의 화합물에 하나의 아미노산 대체물이 사용될 수 있고, 본 발명의 화합물에 두개의 아미노산 대체물이 사용될 수 있으며, 또는 본 발명의 화합물에 두개를 초과하는 아미노산 대체물이 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 아미노산 잔기들 간의 하나 이상의 펩타이드 결합이 비펩타이드 결합에 의해 치환된 아미노산 대체물을 포함하는 화합물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 적어도 하나의 아미노산 대체물과 복수개의 아미노산 잔기를 포함하는 화합물이 제공되며, 여기서, 상기 화합물은, 두개의 아미노산 잔기의 측쇄들 사이, 아미노산 잔기 측쇄와 아미노산 대체물기 사이, 두개의 아미노산 대체물 기들 사이, 상기 화합물의 말단기와 아미노산 잔기 측쇄 사이 또는 화합물의 말단기와 아미노산 대체물의 기 사이의 결합에 의해 사이클화된 사이클릭 화합물이다.
화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물은 포유류에게 투여될 경우, 본 발명의 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열에 비해 한가지 이상의 장점을 나타내는 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 구조물을 제공하는 것으로, 상기 장점이란 효소 분해에 대한 증가된 내성, 증가된 순환 반감기, 증가된 생체이용성, 증가된 효능, 연장된 효능 기간 및 이들의 조합 중에서 선택된다.
본 발명의 한가지 목적은 모(parent) 폴리펩타이드의 아미노산 잔기를 대체하기 위해 사용될 수 있는 화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물을 제공하는 것 이다.
본 발명의 또 다른 목적은 평형 수용체 결합 친화도가, Ki(nM)값으로 측정시 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열의 Ki(nM) 값 미만인 화합물을 합성하는데 유용한 화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 나트륨 이뇨 펩타이드 수용체에 대한 수용체 결합 친화도가 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열의 수용체 결합 친화도보다 더 큰 화합물을 합성하는데 유용한 화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 생물학적 효능이, 동일 투여량에서 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열의 생물학적 효능과 같은 정도이거나 더 효과적인 화합물을 합성하는데 유용한 화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 생물학적 효능이, 동일 투여량에서 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열의 생물학적 효능보다 더 효과적인 화합물을 합성하는데 유용한 화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열이 모 폴리펩타이드의 서열에 대해 적어도 약 60%의 상동성을 갖는 것인 화합물을 합성하는데 유용한 화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열이 모 폴리펩타이드의 서열에 대해 적어도 약 80%의 상동성을 갖는 것인 화합물을 합성하는데 유용한 화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열이 ANP, BNP, CNP, sCP, DNP, TNP-a, TNP-b 또는 TNP-c에 대한 수용체와 결합하는 펩타이드 서열에 대해 적어도 약 60%의 상동성을 갖는 것인 화합물을 합성하는데 유용한 화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열이 NP, BNP, CNP, sCP, DNP, TNP-a, TNP-b 또는 TNP-c에 대한 수용체와 결합하는 펩타이드 서열에 대해 적어도 약 80%의 상동성을 갖는 것인 나트륨 이뇨 수용체-특이적인 화합물을 합성하는데 유용한 화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 아미노산 대체물을 포함하지 않는 상응하는 아미노산 서열이 공지의 수용체에 결합하는 모 폴리펩타이드인 것인 화합물을 합성하는데 유용한 화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 모 폴리펩타이드의 천연 또는 재조합 형태보다 생체이용성과 반감기가 더 큰 화합물을 합성하는데 유용한 화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 분해 내성은 증가된 반면 그의 수용체에 대한 결합 친화도가 유의적으로 높은 화합물을 합성하는데 유용한 화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 서방형 포뮬레이션으로 화합물을 합성하는데 유용한 화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 기타의 목적, 장점 및 신규한 특징과 추가적인 응용 범위의 일부는 명세서 설명 중에 제시될 것이며, 일부분은 다음 명세서를 시험할 경우 당업자에게 자명하거나, 또는 본 발명의 실시예 의해 명백히 드러날 것이다. 본 발명의 목적과 장점들은 특히 특허청구범위에 구체적으로 지적된 수단과 조합에 의해 실현 및 달성될 수 있다.
1. 정의
"알킬기"
본 명세서에서, "알킬기"라는 용어는 포화된, 일가의, 비분지상 또는 분지상 탄화수소쇄를 의미한다. 알킬기의 예로는 (C1-C6) 알킬기, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 2-메틸-1-프로필, 2-메틸-2-프로필, 2-메틸-1-부틸, 3-메틸-1-부틸, 2-메틸-3-부틸, 2,2-디메틸-1-프로필, 2-메틸-1-펜틸, 3-메틸-1-펜틸, 4-메틸-1-펜틸, 2-메틸-2-펜틸, 3-메틸-2-펜틸, 4-메틸-2-펜틸, 2,2-디메틸-1-부틸, 3,3-디메틸-1-부틸, 2-에틸-1-부틸, 부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 및 헥실, 및 장쇄 알킬기, 예컨대, 헵틸, 및 옥틸을 들 수 있다. 알킬기는 치환되지 않거나 또는 임의로 하나 이상의 적절한 치환기에 의해 치환될 수 있다.
"지방족"
본 명세서에서, "지방족"이라는 용어는 예컨대 알켄, 알킨 및 이들의 유도체와 같은 탄화수소쇄를 갖는 화합물을 포함한다.
"오메가 아미노 지방족"은 말단 아미노기를 갖는 지방족 모이어티를 포함한다. 오메가 아미노 지방족의 예로는 오르니틴과 라이신의 아미노산 측쇄 모이어티 및 7'-아미노-헵타노일을 들 수 있다.
"알케닐기"
본 명세서에서, "알케닐기"라는 용어는 하나 이상의 이중결합을 갖는, 일가의 비분지상 또는 분지상 탄화수소쇄를 의미한다. 알케닐기의 이중결합은 다른 불포화기에 컨쥬게이션되거나 되지 않을 수 있다. 적절한 알케닐기의 비제한적인 예로는 (C2-C6) 알케닐기, 예컨대, 비닐, 알릴, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐, 부타디에닐, 펜타디에닐, 헥사디에닐, 2-에틸헥세닐, 2-프로필-2-부테닐, 4-(2-메틸-3-부텐)-펜테닐을 들 수 있다. 알케닐기는 치환되지 않거나 또는 필요에 따라 하나 또는 두개의 적절한 치환기에 의해 치환될 수 있다.
"알키닐기"
본 명세서에서, "알키닐기"라는 용어는 하나 이상의 삼중결합을 갖는, 일가의 비분지상 또는 분지상 탄화수소쇄를 의미한다. 알키닐기의 합중결합은 다른 불포화기에 컨쥬게이션되거나 되지 않을 수 있다. 적절한 알키닐기의 비제한적인 예로는, (C2-C6) 알키닐기, 예컨대, 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐, 헥시닐, 메틸프로피닐, 4-메틸-1-부티닐, 4-프로필-2-펜티닐, 및 4-부틸-2-헥시닐을 들 수 있다. 알키닐기는 치환되지 않거나 또는 필요에 따라 하나 또는 두개의 적절한 치환기에 의해 치환될 수 있다.
"아르알킬"
"아르알킬"이라는 용어는 래디칼 -RaRb를 포함하며, Ra는 알킬렌 (2가 알킬)기이고 Rb는 상기 정의한 바와 같은 아릴기이다. 아르알킬기의 예로는 벤질, 페닐에틸, 3-(3-클로로페닐)-2-메틸펜틸, 등을 들 수 있다.
"아릴기"
본 명세서에서, "아릴기"라는 용어는 탄소 원자와 수소 원자를 포함하는 모노시클릭 또는 폴리시클릭-방향족 래디칼을 의미한다. 적절한 아릴기의 비제한적인 예로는 페닐, 톨릴, 안트라세닐, 플루오레닐, 인데닐, 아줄레닐, 나프틸, 1-나프틸, 2-나프틸 및 비페닐과 벤조-융합 카르복실 모이어티, 예컨대, 5,6,7,8-테트라히드로나프틸을 들 수 있다. 아릴기는 치환되지 않거나 필요에 따라 하기 정의된 바와 같은 하나 또는 두개의 적절한 치환기에 의해 치환될 수 있다. 아릴기는 필요에 따라 시클로알킬기, 또 다른 아릴기, 헤테로아릴기 또는 헤테로시클로알킬기에 융합될 수 있다. 바람직한 아릴기의 비제한적인 예로는 6 내지 12개의 고리 원자를 갖는 모노시클릭 또는 바이시클릭 방향족 탄화수소 래디칼을 포함하며, 이 래디칼은 필요에 따라 알킬, 할로알킬, 시클로알킬, 알콕시, 알킬티오, 할로, 니트로, 아실, 시아노, 아미노, 일치환 아미노, 이치환 아미노, 히드록시, 카르복시, 또는 알콕시-카르보닐 중에서 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 독립적으로 치환될 수 있다.
일 구체예에서, 페닐은 바람직한 아릴기이며, 이것은 "치환"될 경우 에테르 결합을 통해 또는 직접 부착된 히드록실, 할로겐, 알킬 또는 아릴기를 독립적으로 포함한다. 페닐 고리가 이런 식으로 치환될 경우, 아미노산 잔기는 치환 Phe, 치환 HPhe 또는 치환 Pgl에서처럼 치환되었다고 칭한다.
"헤테로아릴기"
본 명세서에서, "헤테로아릴기"라 함은 질소, 산소 및 황 중에서 독립적으로 선택된 헤테로원자 1 내지 4개와 탄소 원자, 및 수소원자를 함유하는 모노시클릭- 또는 폴리시클릭 방향족 고리를 의미한다. 헤테로아릴기의 비제한적인 예로는 피리딜, 피리다지닐, 피라질, 인돌릴, 트리아지닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, (1,2,3,)-트리아졸릴, (1,2,4)-트리아졸릴, 피라지닐, 피리미디닐, 테트라졸릴, 퓨릴, 티에닐, 이속사졸릴, 티아졸릴, 티아디아졸릴, 퓨릴, 피에닐, 이속사졸릴, 옥사졸릴, 피라졸릴, 테트라졸릴, 트리아졸릴, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 이속사졸릴, 트리아지닐 및 피라지닐을 들 수 있다. 바이시클릭 헤테로방향조고 고리의 비제한적인 예로는 벤조티아디아졸릴, 인돌릴, 벤조티오페닐, 벤조퓨릴, 벤즈이미다졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤조티아졸릴, 퀴놀리닐, 벤조트리아졸릴, 벤족사졸릴, 이소퀴놀리닐, 퓨리닐, 퓨로피리디닐 및 티에노피리디닐을 들 수 있다. 헤테로아릴은 치환되지 않거나 또는 필요에 따라 하기에 정의된 바와 같은 하나 또는 두개의 적절한 치환기에 의해 치환될 수 있다. 헤테로아릴기는 필요에 따라 또 다른 헤테로아릴기, 아릴기, 시클로알킬기 또는 헤테로시클로알킬기에 융합될 수 있다.
"시클로알킬기"
본 명세서에서, "시클로알킬기"라는 용어는 탄소 원자와 수소 원자를 포함하나 탄소-탄소 다중 결합은 포함하지 않는 모노시클릭 또는 폴리시클릭 포화 고리를 의미한다. 시클로알킬기의 비제한적인 예로는 (C3-C7) 시클로알킬기, 예컨대, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 및 시클로헵틸, 및 포화 시클릭 및 비시클릭 테르펜을 들 수 있다. 시클로알킬기는 치환되지 않거나 또는 필요에 따라 하기 정의되는 하나 또는 두개의 적절한 치환기에 의해 치환되리 수 있다. 시클로알킬기는 필요에 따라, 다른 시클로알킬기, 아릴기, 헤테로아릴기, 또는 헤테로시클로알킬기에 융합될 수 있다.
"헤테로시클로알킬기"
본 명세서에서, "헤테로시클로알킬기"라는 용어는 적어도 하나의 헤테로원자, 바람직하게는 질소, 산소 및 황 중에서 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자와, 탄소 원자 및 수소 원자를 함유하는 모노시클릭 또는 폴리시클릭 고리를 의미한다. 헤테로시클로알킬기는 아릴 또는 헤테로아릴기에 융합될 수 있다. 헤테로시클로알킬기의 비제한적인 예로는 피롤리디닐, 피롤리디노, 피페리디닐, 피페리디노, 피페라지닐, 피페라지노, 모르폴리닐, 모르폴리노, 티오모르폴리닐, 티오모르폴리노, 및 피라닐을 들 수 있다. 헤테로시클로알킬기는 치환되지 않거나 또는 필요에 따라 하기 정의된 바와 같은 하나 또는 두개의 적절한 치환기에 의해 치환될 수 있다. 헤테로시클로알킬기는 필요에 따라 시클로알킬기, 아릴기, 헤테로아릴기 또는 다른 헤테로시클로알킬기에 융합될 수 있다.
예컨대, 헤테로시클로알킬기는 아릴기나 헤테로아릴기, 비제한적인 예로서 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀리닐 및 1,2,3,4-테트라히드로퀴놀리닐, 테트라히드로나프티리디닐, 페닐피페리디닐 및 피페리디닐피리디닐에 융합되거나 이들로 치환될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 헤테로시클로알킬기는 모노시클릭 또는 바이시클릭 고리이며, 더욱 바람직하게는 모노시클릭 고리인 것이 좋으며, 여기서, 상기 고리는 이하에서 (C3-C6) 헤테롯클로알킬로 칭해지는, 1 내지 3개의 헤테로원자와 3 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 고리이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 헤테로시클로알킬기는 아릴기 또는 헤테로아릴기에 융합되거나 이들에 의해 치환된다.
"헤테로시클릭 래디칼" 또는 "헤테로시클릭 고리"
본 명세서에서, "헤테로시클릭 래디칼" 또는 "헤테로시클릭 고리"란 헤테로시클로알킬기 또는 헤테로아릴기를 의미한다.
"시클릭 래디칼"
본 명세서에서, "시클릭 래디칼"이라는 용어는 아릴기, 시클로알킬기, 헤테로시클로알킬기 또는 헤테로아릴기를 의미한다.
"알콕시기"
본 명세서에서, "알콕시기"라는 용어는 -O-알킬기를 의미하는 것으로, 여기서 알킬기는 상기 정의된 바와 같다. 알콕시기는 치환되지 않거나 또는 필요에 따라 하기 정의된 바와 같은 하나 또는 두개의 적절한 치환기에 의해 치환될 수 있다. 바람직하게는, 알킬옥시기의 알킬쇄는 길이가 1 내지 6개 탄소 원자인, 본 명세서에서 "(C1-C6)알콕시"라 칭해지는 것이 좋다.
"아릴옥시기"
본 명세서에서, "아릴옥시기"는 -O-아릴기를 의미하는 것으로, 여기서 아릴기는 상기 정의된 바와 같다. 아릴옥시기는 치환되지 않거나 또는 필요에 따라 하기 정의된 바와 같은 하나 또는 두개의 적절한 치환기에 의해 치환될 수 있다. 바람직하게는, 아릴옥시기의 아릴은 모노시클릭 고리인 것이 좋고, 여기서 상기 고리는 본 명세서에서 "(C6)아릴옥시"라 칭해지는 탄소 원자 6개를 함유하는 고리인 것이 좋다.
"알콕시카르보닐"
본 명세서에서, "알콕시카르보닐"기라는 용어는 화학식 -C(=O)-알콕시인 일가의 기를 의미한다. 바람직하게는, 알콕시카르보닐기의 탄화수소쇄는 길이가 1 내지 8개 탄소원자이며, 본 명세서에서, "저급 알콕시카르보닐"기라고 칭해지는 것이 좋다.
"카르바모일"
본 명세서에서, "카르바모일"기라는 용어는 래디칼 -(=O)N(R')2를 의미하며, 여기서 R'은 수소, 알킬 및 아릴 중에서 선택되는 기이다.
"카르보닐"
본 명세서에서, "카르보닐"기는 화학식 C(=O)인 이가의 기이다.
"옥소"
본 명세서에서, "옥소"기는 화학식 (=O)인 기이다.
"아실"
"아실"이라는 용어는 R-C(=O)-기를 포함하는 것으로, 여기서 R은 유기기이다. 일례로 본 명세서에서 "Ac"라 칭해지는 아세틸기 CH3-C(=O)-를 들 수 있다.
펩타이드 또는 지방족 모이어티는 상기 정의한 바와 같은 아릴, 알킬 또는 치환 알킬기가 하나 이상의 카르보닐 {-(C=O)-}기를 통해 결합되는 경우, "아실화"된 것이다. 펩타이드는 가장 흔하게는 N-말단에서 아실화된다.
"아미드"
"아미드"는 예컨대 메틸아미드, 에틸아미드, 프로필아미드 등과 같이, 카르보닐기 (-C(=O)-NH2)에 부착된 3가 질소를 갖는 화합물을 포함한다.
"이미드"
"이미드"에는 이미도기 (-C(=O)-NH-C(=O)-)를 함유하는 화합물이 포함된다.
"아민"
"아민"에는 아미노기(-NH2)를 함유하는 화합물이 포함된다.
"니트릴"
"니트릴"에는 카르복실산 유도체이면서 유기기에 결합된 (-CN)기를함유하는 화합물이 포함된다.
"할로겐"
본 명세서에서 "할로겐"이라는 용어는 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드를 의미한다. 이에 대응하여, "할로" 및 "Hal"이라는 용어는 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 포괄한다.
"고상 지지체"
본 명세서에서, "펩타이드 고상 지지체"라는 용어는, 일반적으로는 링커를 통해, 화학식 I의 대체물이나 N-보호 아미노산 관능기의 카르복실기와 반응할 수 있음으로 해서, 화학식 I의 대체물 또는 상기 아미노산을 폴리머에 공유적으로 결합시키는, 반응성기(유리 히드록실 또는 아미노기)를 산생하는, 펩타이드 합성에서 사용되는 합성 폴리머를 의미한다. 펩타이드 합성 말기에, C-말단 아미노산이나 대체물과 폴리머 지지체 사이의 결합은 화학적으로 절단될 수 있다. 이러한 방식으로, 화학식 I의 대체물을 포함하는 화합물이나 펩타이드는 용액으로 되어 용액으로부터 분리될 수 있다. 펩타이드 고상 지지체의 비제한적인 예로는 고상 합성을 위한 적절한 링커를 갖는 폴리스티렌 수지와 폴리아미드 수지를 들 수 있다. 수지의 예로는 Merrifield 수지, BHA 수지, MBHA 수지, Wang 수지, 옥심 수지 등을 들 수 있다. 사용가능한 링커로는 Fmoc-Rink, Sieber 링커, Weinreb 링커 등을 들 수 있다.
"질소 보호기"
본 명세서에서, "질소 보호기"라는 용어는 반응, 예컨대 펩타이드 합성이 진행되는 동안, 부반응과 분해에 대한 보호 목적으로, 아미노 수소를 대체하는 기를 의미한다. 고상 펩타이드 합성은 N-보호 아미노산이나 대체물의 카르복시기를 펩타이드 기질의 아미노기와 커플링시킨 다음, 다음의 아미-보호 신톤이 커플링될 수 있도록 질소 보호기를 화학적으로 절단시키는 것을 포함하는 연속적인 반응 사이클이 포함된다. 본 발명에서 유용한 질소 보호기의 비제한적인 예로는 t-Boc (3차-부틸옥시카르보닐), Fmoc (9-플루오레닐메틸옥시카르보닐), 2-클로로벤질옥시카르보닐, 알릴옥시카르보닐 (alloc), 벤질옥시카르보닐, 2-(4-비페닐프로필-2-옥시카르보닐 (Bpoc), 1-아다만틸옥시카르보닐, 트리틸 (트리페닐메틸), 및 톨루엔 설포닐을 비롯하여 고상 펩타이드 합성 분야에서 잘 알려진 질소 보호기를 들 수 있다.
"적절한 치환기"
본 명세서에서, "적절한 치환기"라는 용어는 본 발명의 화합물 또는 이의 제조에 유용한 중간체의 합성, 치료 또는 약학적 용도를 무효화하지 않는 기를 의미한다. 적절한 치환기의 비제한적인 예로는: 알킬; 알케닐; 알키닐; 아릴; 헤테로아릴; 헤테로시클로알킬; 시클로알킬; O-알킬; O-알케닐; O-알키닐; O-아릴; CN; OH; 옥소; 할로; C(=O)OH; C(=O)할로; OC(=O)할로; CF3; N3; NO2; NH2; NH(알킬); N(알킬)2; NH(아릴); N(아릴)2; C(=O)NH2; C(=O)NH(알킬); C(=O)N(알킬)2; C(=O)NH(아릴); C(=O)N(아릴)2; OC(=O)NH2; C(=O)NH(헤테로아릴); C(=O)N(헤테로아릴)2; NHOH; NOH(알킬); NOH(아릴); OC(=O)NH(알킬); OC(=O)N(알킬)2; OC(=O)NH(아릴); OC(=O)N(아릴)2; CHO; C(=O)(알킬); C(=O)(아릴); C(=O) O(알킬); C(=O)O(아릴); OC(=O)(알킬); OC(=O)(아릴); OC(=O)O(알킬); OC(=O)O(아릴); S-알킬; S-알케닐; S-알키닐; SC(=O)2-아릴, SC(=O)2-알킬; SC(=O)2-알케닐; SC(=O)2-알키닐; 및 SC(=O)2-아릴을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 당업자라면 본 발명의 화합물의 합성, 안정성 및 약학적 활성에 기초해서 적절한 치환기를 용이하게 선택할 수 있다.
Figure 112008075651893-pct00034
본 명세서의 화학 구조식에서, 상기 "파선"은 어떤 화학기가 다른 화학기에 부착되어 있는 위치에서의 결합을 가리킨다. 따라서, 이 정의에 따르면, R'이 다음 화학식 "B"
Figure 112008075651893-pct00035
를 나타내는 것인 다음 화학식 "A"
Figure 112008075651893-pct00036
는 결과적으로 다음 화합물을 나타내는 것이다.
Figure 112008075651893-pct00037
"조성물"
약학적 조성물에서와 같은 "조성물"이라는 용어는 활성 성분(들), 및 담체르르 포함하는 불활성 성분(들)을 포함하는 생성물, 뿐 아니라 상기 성분들의 두가지 이상의 조합, 착화 또는 집괴에 의해 직간접적으로 결과되는 여하한 생성물, 또는 하나 이상의 성분들의 기타 유형의 반응 또는 상호작용으로부터 결과되는 여하한 생성물을 포괄하는 것이다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 화합물을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 혼합함으로써 만들어지는 모든 조성물을 포괄한다.
"EC 50 "
"EC50"이라는 용어는 어떤 아고니스트에 대해 가능한 최대 반응의 50%를 생산하는 그 아고니스트의 몰 농도를 나타낸다. 예컨대, 어떤 화합물이 72 nM의 농도에서, cGMP 분석법으로 측정시 그 화합물에 대해 가능한 최대 반응의 50%를 나타내었다면, 그 화합물의 EC50은 72 nM이다. 달리 명시하지 않는 한, EC50 측정과 관련된 몰 농도는 나노몰(nM)이다.
"Ki(nM)"
"Ki(nM)"이라는 용어는 경쟁인자가 부재시 평형상태에서 수용체 결합부위의 절반에 결합하는 경쟁 화합물의 몰 농도를 나타내는 평형 수용체 결합 친화도를 나타낸다. 일반적으로, Ki는 그 수용체에 대한 화합물의 친화도와 역비례 관계에 있으며, 예를들어 Ki가 낮으면, 친화도는 높은 것이다. Ki는 Cheng 및 Prusoff의 방정식에 따라 측정할 수 있다 (Cheng Y., Prusoff W. H., Biochem. Pharmacol. 22: 3099-3108, 1973):
Figure 112008075651893-pct00038
식 중, "ligand"는 리간드의 농도이며, 방사능리간드일 수 있고, Kd는 50% 수용체 점유율을 생산하는 수용체 친화도의 역척도(inverse measure)이다. 달리 명시하지 않는 한, Ki 측정과 관련된 몰 농도는 nM이다.
"펩타이드"
"펩타이드"라는 용어는 본 명세서와 특허청구범위를 통해 두개 이상의 아미노산으로 된 여하한 구조를 모두 포함하는 것으로 의도되며, 아미노산의 화학적 변형과 유도체도 포함된다. 펩타이드 전체 또는 일부를 형성하는 아미노산들은 자연 발생적인 아미노산, 이러한 아미노산의 입체이성질체 및 변형물, 후번역적으로 변형된 아미노산, 효소적으로 변형된 아미노산 등일 수 있다. "펩타이드"라는 용어에는 또한 펩타이드의 이량체와 다량체도 포함된다. "제조된(manufactured)" 펩타이드에는 화학 합성, 재조합 DNA 기술, 보다 큰 분자의 생화학적 또는 효소적 단편화, 이들의 조합, 또는 일반적으로 여타 방법에 의해 제조된 펩타이드가 포함된다.
"아미노산 측쇄 모이어티"
"아미노산 측쇄 모이어티"라는 용어에는 본 명세서에서 정의된 대로의 여하한 "아미노산"의 측쇄가 모두 포함된다. 따라서, 이 용어에는 자연발생적인 아미노산에 존재하는 측쇄 모이어티도 포함된다. 이 용어는 또한 글리코실화된 아미노산과 같이 변형된 자연발생적 아미노산 중의 측쇄 모이어티도 포함한다. 이 용어는 또한 자연 발생적인 단백질 아미노산, 비단백질 아미노산, 후번역적으로 변형된 아미노산, 효소적으로 합성된 아미노산, 유도된 아미노산, 아미노산을 모방하기 위해 고안된 구조물이나 구조체 등의 입체이성질체 및 변형물 중의 측쇄 모이어티를 포함한다. 예컨대, 본 발명에 개시된 여하한 아미노산의 측쇄 모이어티가 모두 이 정의에 포괄된다. 이하에서 정의되는 "아미노산 측쇄 모이어티의 유도체"는 아미노산 측쇄 모이어티의 정의 중에 포함된다.
"아미노산 측쇄 모이어티의 유도체"
"아미노산 측쇄 모이어티의 유도체"는 자연발생적이거나 자연발생적이지 않은 아미노산 측쇄 모이어티 중의 변형 또는 변이를 비롯하여, 여하한 아미노산 측쇄 부분에서의 변형 또는 변이를 가리키는 것으로, 이러한 변형이나 변이에는 다음이 포함된다: (a) 하나 이상의 포화 또는 불포화 탄소 원자를 기존의 알킬, 아릴 또느 ㄴ아르알킬쇄에 부가하는 것; (b) 측쇄 중의 탄소를 다른 원자, 바람직하게는 산소나 질소로 치환하는 것; (c) 메틸 (-CH3), 메톡시 (-OCH3), 니트로 (-NO2), 히드록실 (-OH), 또는 시아노 (-C≡N)를 비롯하여, 측쇄의 탄소 원자에 말단기를 부가하는 것; (d) 히드록시, 티올 또는 아미노기를 포함하는 측쇄 모이어티에 대해, 적절한 히드록시, 티올 또는 아미노 보호기를 부가하는 것; 또는 (e) 고리 구조를 포함하는 측쇄 모이어티에 대해, 직접 또는 에테르 결합을 통해 부착된 아릴기, 히드록실, 할로겐, 또는 알킬을 비롯하여 하나 또는 고리 치환기를 부가하는 것. 아미노기의 경우, 적절한 보호기로는 Z, Fmoc, Boc, Pbf, Pmc 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
"아미노산"
명세서와 특허청구범위에서 사용되는 것을 비롯, 본 발명의 구체예에서 사용되는 "아미노산"에는 자연 발생적인 단백질 아미노산이 포함되며, 이들은 흔히 사용되는 3문자 약어와 1문자 약어 모두에 의해 칭해진다. Synthetic Peptides: A User's Guide, G. A. Grant, editor, W.H. Freeman & Co., New York (1992)를 참조할 수 있으며, 이 문헌의 개시 내용은 11 내지 24쪽의 텍스트와 표의 내용을 포함하여 모두 본 명세서에 참조로 통합되어 있다. "아미노산"은 통상적인 α-아미노산을 포함하며 추가로 β-아미노산, α,α-이치환 아미노산 및 N-치환 아미노산을 포함하는데, 여기서 적어도 하나의 측쇄는 본 명세서에 정의된 바와 같은 아미노산 측쇄 모이어티이다. 아미노산"은 또한 N-알킬 α-아미노산을 포함하여, 여기서 N-말단 아미노기는 C1 내지 C6 직쇄 또는 분지상 알킬 치환기를 갖는다. 따라서 "아미노산"이라는 용어는 자연발생적인 단백질 아미노산, 비단백질 아미노산, 후번역적으로 변형된 아미노산, 효소적으로 합성된 아미노산, 유도된 아미노산, 아미노산을 모방하도록 고안된 구조물 또는 구조체 등의 입체이성질체 및 변형체를 모두 포함하는 것이다. 변형된 특이한 아미노산을 대체로 상기 언급한 바 있는 Synthetic Peptides: A User's Guide; Hruby V. J., Al-obeidi　F., Kazmierski W., Biochem. J. 268:249-262 (1990); 및 Toniolo C., Int. J. Peptide Protein Res. 35:287-300 (1990)에 설명되어 있으며; 이 문헌들의 개시 내용은 본 명세서에 참고로 통합되어 있다. 이에 더해, 아미노산과 그의 보호기 및 변형기를 포함하여, 다음의 약어들은 아래에 주어진 의미를 갖는다.:
Abu - 감마-아미노 부티르산
12-Ado - 12-아미노 도데칸산
Aib - alpha-아미노이소부티르산
6-Ahx - 6-아미노 헥산산
Amc - 4-(아미노메틸)-사이클헥산 카르복실산
8-Aoc - 8-아미노 옥탄산
Bip - 바이페닐알라닌
Boc - t-부톡시카르보닐
Bzl - 벤질
Bz - 벤조일
Cit - 시트룰린
Dab - 디아미노부티르산
Dap - 디아미노프로피온산
Dip - 3,3-디페닐알라닌
Disc - 1,3-디히드로-2H-이소인돌카르복실산
Et - 에틸
Fmoc - 플루오레닐메톡시카르보닐
Hept - 헵타노일 (CH3-(CH2)5-C(=O)-)
Hex - 헥사노일 (CH3-(CH2)4-C(=O)-)
HArg - 호모아르기닌
HCys - 호모시스테인
HLys - 호모라이신
HPhe - 호모페닐알라닌
HSer - 호모세린
Me - 메틸
Met(O) - 메티오닌 설폭사이드
Met(O2) - 메티오닐 설폰
Nva - 노르발린
Pgl - 페닐글리신
Pr - 프로필
Pr-i - 이소프로필
Sar - 사르코신
Tle - 3차-부틸알라닌
Z - 벤질옥시카르보닐
본 발명에 따른 화합물의 목록에서, 통상적인 아미노산 잔기들은 Manual of Patent Examining Procedure, 8th　Ed의 챕터 2400에 주어진 통상적인 의미를 갖는다. 따라서, "Nle"는 노르류신; "Asp"는 아스파르트산; "His"는 히스티딘; "Arg"는 아르기닌: "Trp"는 트립토판; "Lys"는 라이신; "Gly"는 글라이신; "Pro"는 프롤린; "Tyr"는 티로신, "Ser"는 세린과 나머지 아미노산도 통상적인 의미를 갖는다. 모든 잔기들은 D-알라닌의 경우 "D-Ala"로 표시되는 것처럼, D-이성질체임을 명기하지 않는 한, L-이성질체 입체배열로 있는 것이다.
자연발생적인 단백질 아미노산, 비단백질 아미노산, 후번역적으로 변형된 아미노산, 효소적으로 합성된 아미노산, 유도된 아미노산, 전술한 것 중 여하한 것으로부터 유도된 α,α-이치환 아미노산 (즉, 적어도 하나의 측쇄는 그것이 유래된 잔기의 그것과 동일한 것인 α,α-이치환 아미노산), 전술한 것 중 여하한 것으로부터 유도된 β-아미노산 (즉, β-탄소의 존재를 제외하고는 그것이 유래된 잔기와 동일한 β-아미노산)등 전술한 것 모두의 입체이성질체와 변형체를 비롯한 단일 아미노산은 본 명세서에서 때로 "잔기"로 칭한다.
"α,α-이치환 아미노산"
"α,α-이치환 아미노산"은 α-위치에 추가의 치환기를 갖는 여하한 α-아미노산을 모두 포함하며, 이러한 치환기는 α-아미노산의 측쇄 모이어티와는 같거나 다를 수 있다. 적절한 치환기는 α-아미노산의 측쇄 모이어티에 더해, C1 내지 C6 직쇄 또는 분지상 알킬을 포함한다. α,α- 이치환 아미노산은 통상적인 L- 및 D-이성질체 레퍼런스를 이용하여 호칭할 수 있는 한편, 이러한 레퍼런스는 편의를 위한 것이고, α-위치의 치환기들이 서로 다를 경우, 이러한 아미노산은 적절하다면, 지정된 아미노산 측쇄 모이어티를 갖는 잔기의 L- 또는 D-이성질체로부터 유도된 α,α-이치환 아미노산으로 호환적으로 호칭될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, (S)-2-아미노-2-메틸-헥산산은 L-Nle로부터 유도된 α,α-이치환 아미노산 또는 D-Ala로부터 유도된 α,α-이치환 아미노산으로 칭해질 수 있다. α,α-이치환 아미노산이 제공되는 경우에는 항상 그의 모든 (R) 및 (S) 입체배열이 모두 포함되는 것으로 이해하여야 한다.
"N-치환 아미노산"
"N-치환 아미노산"은 아미노산 측쇄 모이어티가 백본 아미노기에 공유결합된 여하한 아미노산을 모두 포함하며, 필요에 따라 α-탄소 위치에는 H 이외에 다른 치환기는 없다. 사르코신은 N-치환 아미노산의 일례이다. 예시를 위해, 사르코신은 사르코신과 Ala의 아미노산 측쇄 모이어티가 메틸로서 동일한 점에서, Ala의 N-치환 아미노산 유도체로도 칭해질 수 있다.
"C-말단 캡핑기"
"C-말단 캡핑기"라는 용어는 말단 고리 탄소 원자, 또는 제공될 경우 화합물의 C-말단의 말단 카르복실기를 통해 부착된 여하한 말단기를 포함하는 것이다. 말단 고리 탄소 원자, 또는 제공될 경우 말단 카르복실기는 잔기의 일부를 형성하거나, 또는 아미노산 대체물의 일부를 형성할 수 있다. 바람직한 측면에서, C-말단 캡핑기는 화합물의 C-말단 위치에 있는 아미노산 대체물의 일부를 형성한다. C-말단 캡핑기의 비제한적인 예로는, -(CH2)n-OH, -(CH2)n-C(=O)-OH, -(CH2)m-OH, -(CH2)n-C(=O)-N(v1)(v2), -(CH2)n-C(=O)-(CH2)m-N(v1)(v2), -(CH2)n-O-(CH2)m-CH3, -(CH2)n-C(=O)-NH-(CH2)m-CH3, -(CH2)n-C(=O)-NH-(CH2)m-N(v1)(v2), -(CH2)n-C(=O)-N-((CH2)m-N(v1)(v2))2, -(CH2)n-C(=O)-NH-CH(-C(=O)-OH)-(CH2)m-N(v1)(v2), -C(=O)-NH-(CH2)m-NH-C(=O)-CH(N(v1)(v2))((CH2)m-N(v1)(v2)), 또는 -(CH2)n-C(=O)-NH-CH(-C(=O)-NH2)-(CH2)m-N(v1)(v2), 이들의 모든 (R) 또는 (S) 입체배열 형태를 포함하고, 상기 중, v1 및 v2는 각각 독립적으로 H, C1 내지 C17 직쇄 또는 분지상 알킬쇄, m은 0 내지 17이고, n은 0 내지 2이다; 또는 여하한 오메가 아미노 지방족, 말단 아릴 또는 아르알킬, 예컨대, 메틸, 디메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸, 헥실, 알릴, 시클로프로판 메틸, 헥사노일, 헵타노일, 아세틸, 프로피오닐, 부타노일, 페닐아세틸, 시클로헥실아세틸, 나프틸아세틸, 신나모일, 페닐, 벤질, 벤조일, 12-Ado, 7'-아미노 헵타노일, 6-Ahx, Amc 또는 8-Aoc, 또는 여하한 단일의 천연 또는 비천연 α-아미노산, β-아미노산 또는 α,α-이치환 아미노산, 이들의 모든 (R) 또는 (S) 입체배열 형태를 포함하며, 필요에 따라 전술한 여하한 비아미노산 캡핑기들과의 조합을 포함할 수도 있다. 상기 내용에서, 예컨대, -C(=O)-NH-(CH2)m-NH-C(=O)-CH(N(v1)(v2))((CH2)m-N(v1)(v2))은:
Figure 112008075651893-pct00039
인 것으로 이해되어야 한다.
"N-말단 캡핑기"
"N-말단 캡핑기"라는 용어는 화합물의 N-말단의 말단 아민을 통해 부착된 여하한 말단기를 모두 포함한다. 말단 아민은 잔기의 일부를 형성하거나, 또는 아미노산 대체물의 일부를 형성할 수 있다. 바람직한 측면에서, N-말단 캡핑기는 화합물의 N-말단 위치에 존재하는 아미노산 대체물의 일부를 형성한다. N-말단 캡핑기는 비제한적인 예로서, 오메가 아미노 지방족, 아실기 또는 말단 아릴 또는 아르알킬, 예컨대, 메틸, 디메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸, 헥실, 알릴, 시클로프로판 메틸, 헥사노일, 헵타노일, 아세틸, 프로피오닐, 부타노일, 페닐아세틸, 시클로헥실아세틸, 나프틸아세틸, 신나모일, 페닐, 벤조일, 12-Ado, 7'-아미노 헵타노일, 6-Ahx, Amc 또는 8-Aoc를 포함하거나, 또는 N-말단 캡핑기는 -(CH2)m-NH(v3), -(CH2)m-CH3, -C(=O)-(CH2)m-CH3, -C(=O)-(CH2)m-NH(v3), -C(=O)-(CH2)m-C(=O)-OH, -C(=O)-(CH2)m-C(=O)-(v4), -(CH2)m-C(=O)-OH, -(CH2)m-C(=O)-(v4), C(=O)-(CH2)m-O(v3), -(CH2)m-O(v3), C(=O)-(CH2)m-S(v3), 또는 -(CH2)m-S(v3)을 들 수 있으며, 여기서 v3는 H 또는 C1 내지 C17 직쇄 또는 분지상 알킬쇄이고 v4는 C1 내지 C17 직쇄 또는 분지상 알킬쇄이며 m은 0 내지 17이다.
본 명세서에서 사용된 화학적 명명 프로법과 구조 다이아그램은 ChemDraw 프로그램 (Cambridgesoft Corp., Cambridge, Mass.에서 구입가능)에서 사용되는 화학적 명명법 특성에 따라 사용한 것이다. 특히, 특정 화합물의 명칭은 Chemdraw Ultra 또는 ISIS base (MDL Corp.)에 의해 사용되는 것과 같은 Autonom 프로그램을 이용한 구조로부터 유래된 것이다. 일반적으로, 구조 다이아그램에서 수소 원자는 말단기에 있는 경우와 기타 특수 환경을 제외하고, 탄소 원자와 결합된 경우 도시하지 않았다.
본 명세서의 어떤 화합물에서 대체물은 구조 다이아그램으로 표시하고, 아미노산 잔기는 3문자 약어로 표시하였다. 달리 명시하지 않는 한, N-말단과 C-말단 양쪽 모두에서, 대체물과 잔기 사이의 결합, 또는 잔기와 대체물 사이의 결합, 또는 대체물과 잔기 사이의 결합은 통상적인 펩타이드 결합 -C(=O)-NH- 이거나, 펩타이드 결합이 대체물의 N-말단 상의 고리 질소에 대한 것일 경우, -C(=O)-N-이다. 일반적으로, 이러한 결합을 설명함에 있어서, 아미노산 대체물의 원자들은 표시되지만 (예컨대, -C(=O)- 또는 -N), 아미노산 잔기의 원자들은 표시되지 않는다.
2. 이성질체의 순도 및 분리
본 발명의 대체물은 하나 이상의 키랄 중심 및/또는 이중 결합을 함유할 수 있으므로, 이중 결합 이성질체 (즉, 기하학적 이성질체), 거울상 이성질체, 또는 부분입체이성질체와 같은 입체이성질체로서 존재할 수 있다. 본 발명에 있어서, 본 명세서에 도시된 화학 구조, 및 본 발명의 화합물들은 따라서 모든 거울상 이성질체와 입체이성질체 뿐 아니라 본 발명 화합물의 라세미 형태를 포괄하며, 즉, 입체화학적으로 순수한 형태 (예컨대, 기하학적으로 순수한, 거울상 이성질체적으로 순수한, 또는 부분입체이성질체적으로 순수한)와 거울상 이성질체의 혼합물 및 입체이성질체의 혼합물들을 모두 포괄하는 것이다.
본 발명의 대체물은 화합물이 약 90% ee (enantiomeric excess) 이상, 바람직하게는 특정 키랄 중심에 대해 95% ee 이상인 경우 키랄 중심에 대해 광학 활성적이거나 순수한 거울상 이성질체인 것으로 생각된다 (즉, 실제로 R-형이거나 실제로 S-형임). 본 발명의 화합물은 화합물의 ee가 약 80%를 초과하거나, 바람직하게는 약 85% ee를 초과하는 경우 강화 거울상 이성질체인 것으로 여겨진다. 본 명세서에서, 라세미 혼합물이라 함은 분자 내에 약 50%의 한가지 거울상 이성질체와 모든 키랄 중심에 대한 그의 대응하는 거울상 이성질체가 약 50% 존재하는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 화합물의 순 거울상 이성질체, 강화 거울상 이성질체, 및 라세미 혼합물을 모두 포괄한다.
따라서, 한가지 측면에서, 본 발명의 대체물은 다음 일반 구조를 갖는다:
Figure 112008075651893-pct00040
식 중, 별표는 여하한 입체화학적 입체배열도 모두 가능함을 가리킨다. 이는 따라서 다음의 거울상 이성질체 형태를 포함한다.
Figure 112008075651893-pct00041
거울상 이성질체 및 입체이성질체의 혼합물을 공지 방법, 예컨대 키랄상 가스 크로마토그래피, 키랄상 고성능 액체 크로마토그래피, 화합물을 키랄염 복합체로서 결정화시키거나, 키랄 용매 중 화합물을 결정화시키는 등의 공지 방법에 의해 분할할 수 있다. 거울상 이성질체들과 입체이성질체들은 또한 공지의 비대칭 합성법에 의해 입체이성질체적 또는 거울상 이성질체적으로 순수한 중간체, 시약, 및 촉매로부터 얻을 수 있다.
3. 본 발명의 화합물
본 발명은 다음 화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물 및 화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물을 포함하는 선형 또는 사이클릭 화합물:
Figure 112008075651893-pct00042
또는 이의 거울상 이성질체, 입체이성질체 또는 부분입체이성질체 또는 합성적으로 허용되는 이의 염을 제공한다:
식 중, R1은 H, 알킬, 아릴, 알킬아릴, 알킬-N(R8)2, 알킬-OR8, 알킬-C(=O)OR8, C(=O)OR8, 알킬-NH2, 알킬-S-R8, 알킬-C(=O)N(R8)2, 또는 다음 화학식을 갖는 기이고:
Figure 112008075651893-pct00043
R2는 H 또는 알킬, 단, R1 및 R2가 모두 H인 것은 아님;
R3는 H 또는 제1 질소 보호기;
R4는 H, 알킬, (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qO알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R5는 H 또는 알킬;
R6a는 H, 알킬, (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qO알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R6b는 H 또는 알킬;
단, R4 및 R6a 두가지 모두가 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qO알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2인 것은 아님:
R7은 H, C(=O)알킬, C(=O)(CH2)m(NR8)2, 알킬, 아르알킬, 또는 아릴;
R8은 각각 출현시마다 독립적으로 H, 아릴, 또는 알킬;
R11은 펩타이드 고상 지지체;
R12는 H 또는 제2 질소 보호기;
m은 각각 출현시마다 0 내지 6의 정수;
q는 각각 출현시마다 1 내지 6의 정수:;
p는 1 내지 10의 정수이고;
y는 0 또는 1이다.
화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물은 복수개의 아미노산 잔기로 만들어진 폴리펩타이드 화합물의 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환하는데 이용될 수 있다.
화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물은 Fmoc과 같은 보호기와 반응성 카르복실 C-말단을 이용하여 통상적인 아미노 보호 N-말단을 이용하여 만들어질 수 있는 것이 바람직하고, 따라서, 통상적인 펩타이드 합성방법론에 이용될 수 있다. 화학식 I의 아미노산 대체물이 화합물의 C-말단 위치에 커플링될 경우, 그러한 대체물 상의 카르복실 말단 이외의 부위가 이용될 수 있을 것으로 이해된다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에 따라 적절히 변형되어, 펩타이드 합성 방법론에 의해, 복수개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩타이드 화합물 내로 통합되기 위한 고리-구속형 아미노산 대체물이 제공된다.
R1 및 R2 두가지 모두가 H인 경우를 제외하고, 본 발명의 각각의 대체물은 4가지 서로 다른 거울상 이성질체 형태 중 어느 하나일 수 있다. 따라서, 예시 목적에서, R1 또는 R2기가 Arg의 아미노산 측쇄 모이어티인 경우, 본 발명의 화합물은 일반적으로 다음과 같이 표시될 수 있다.:
Figure 112008075651893-pct00044
식 중, 각각의 별표 표시는 어떠한 입체배영 형태로도 있을 수 있는 키랄 중심을 나타낸다. 따라서, 다음의 형태들이 가능하며, 고려될 수 있고, 또한 의도되는 것으로 이해되어야 한다.
Figure 112008075651893-pct00045
마찬가지로, 각각의 대체물과 관련하여, 통상적인 펩타이드 합성 방법론을 이용하는 화합물 합성에 사용하기 위해, 만일 대체물이 N-말단 이외의 위치에 있는 경우 R3 위치는 H가 아니라 질소 보호기를 포함함으로 해서 다음의 일반 구조를 가질 것이다.
Figure 112008075651893-pct00046
식 중, PRG는 예컨대 비제한적인 예로서 다음 화학식을 갖는 질소 보호기이다:
Figure 112008075651893-pct00047
식 중, R9는 3차-부틸, 알릴 또는 다음 화학식을 갖는 기이다:
Figure 112008075651893-pct00048
따라서, R1 또는 R2기가 Arg의 아미노산 측쇄 부분이고 R3이 질소 보호기 Fmoc인 예에서는, 다음의 각각의 형태가 가능하며, 고려되고, 의도됨을 이해할 수 있을 것이다:
Figure 112008075651893-pct00049
전술한 특정예에서, 예컨대 Pbf와 같은 질소 보호기를 구아니디노기에 사용하는 것이 가능하고 또 고려할 수 있다. 또한 질소 보호기로서 다른 기를 사용하거나 R1 또는 R2기로서 다른 아미노산 측쇄 모이어티 또는 아미노산 측쇄 모이어티의 유도체를 사용하거나, 또는 그 중 하나가 알킬, 아릴, 알킬아릴, 알킬-N(R8)2, 알킬-OR8, 알킬-C(=O)OR8, C(=O)OR8, 알킬-NH2, 알킬-S-R8, 알킬-C(=O)N(R8)2, 또는 다음 화학식을 갖는 기인 것을 사용하는 것도 가능하다:
Figure 112008075651893-pct00050
식 중, R8은 H, 아릴, 또는 알킬이고 R12는 H 또는 제2 질소 보호기이다.
만일 대체물이 통상적인 펩타이드 합성 방법론을 이용하는 화합물 합성에 사용되고 C-말단 위치에 있는 경우라면, 그 대체물은 수지와 같은 펩타이드 고상 지지체에 결합된 화합물일 수 있다. 이 경우 대체물은 다음 일반 구조를 갖는 것일 수 있다:
Figure 112008075651893-pct00051
상기 식 중, 타원형 부분은 수지 및 링커나 또는 기타 펩타이드 고상 지지체를 나타낸다. 여기서도 역시 R1 또는 R2기는 어떠한 아미노산 측쇄 모이어티나 또는 아미노산 측쇄 모이어티의 유도체여도 무방하며, 또는 다른 한편, 이들 중 적어도 하나는 알킬, 아릴, 알킬아릴, 알킬-N(R8)2, 알킬-OR8, 알킬-C(=O)OR8, C(=O)OR8, 알킬-NH2, 알킬-S-R8, 알킬-C(=O)N(R8)2, 또는 다음 화학식을 갖는 기일 수 있다:
Figure 112008075651893-pct00052
식 중, R8는 H, 아릴, 또는 알킬이고 R12는 H 또는 제2 질소 보호기이다.
한가지 측면에서, 본 발명은 따라서 다음 일반 구조를 갖는 대체물을 제공한다:
Figure 112008075651893-pct00053
식 중, R1은 다음 중 어느 하나이다:
Figure 112008075651893-pct00054
Figure 112008075651893-pct00055
식 중, R3는 H 또는 제1 질소 보호기; R4는 H, 알킬, (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qO알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2; R5는 H 또는 알킬; R8는 H, 아릴, 또는 알킬; R11은 펩타이드 고상 지지체이고; m은 각각 출현시마다 독립적으로 0 내지 6의 정수이고; q는 각각 출현시마다 독립적으로 1 내지 6의 정수이며; p는 1 내지 10의 정수이고; 아릴기는 어느 것이든 알킬, 할로알킬, 시클로알킬, 알콕시, 알킬티오, 할로, 니트로, 아실, 시아노, 아미노, 일치환 아미노, 이치환 아미노, 히드록시, 카르복시, 또는 알콕시-카르보닐 중에서 선택된 한가지 이상의 치환기에 의해 독립적으로 치환될 수 있다. 따라서, 한가지 측면에서 R1기가 다음의 19가지 자연적으로 코딩된 아미노산 잔기 (Pro 생략) 중 어느 하나의 아미노산 측쇄 모이어티인 대체물이 제공된다:
Figure 112008075651893-pct00056
Figure 112008075651893-pct00057
Figure 112008075651893-pct00058
Figure 112008075651893-pct00059
상기한 각각의 경우에서, R3 위치는 H가 아니라 다른 여하한 질소 보호기일 수 있고; R4의 경우 -C(=O)OH 대신 알킬, (CH2)qC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qOBn, (CH2)qO알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2일 수 있으며 (여기서 R8는 H, 아릴, 또는 알킬, R11은 펩타이드 고상 지지체임, m은 독립적으로 0 내지 6의 정수, q는 독립적으로 1 내지 6의 정수이며 p는 1 내지 10의 정수임); R5 위치는 H 대신 알킬일 수 있고; R7 위치는 H가 아니라 C(=O)알킬 또는 C(=O)(CH2)m(NR8)2일 수 있다. 마찬가지로, R1은 전술한 아미노산 측쇄 모이어티 중 어느 하나가 아니라 알킬, 아릴, 알킬아릴, 알킬-N(R8)2, 알킬-OR8, 알킬-C(=O)OR8, C(=O)OR8, 알킬-NH2, 알킬-S-R8, 알킬-C(=O)N(R8)2, 또는 다음 화학식을 갖는 기일 수 있다:
Figure 112008075651893-pct00060
식 중, R8은 H, 아릴, 또는 알킬이고 R12은 H 또는 제2 질소 보호기이다.
4. 본 발명의 화합물의 용도
본 발명의 한가지 측면에 따라, 어떤 대체물을 포함하는 화합물의 제조 방법이 제공되며, 여기서 상기 화합물은 목적하는 표적에 결합하는 공지의 모 폴리펩타이드에 기초하는 것이다. 모 폴리펩타이드는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 모 폴리펩타이드의 이차 구조를 동정하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 이차 구조는 목적하는 표적에 결합하는데 관련이 있거나 또는 그러한 결합에 책임이 있는 것이다. 이러한 방법은 (a) n개의 아미노산 잔기로 이루어진 공지의 일차 구조를 가지며 목적하는 표적에 결합하는 공지의 모 폴리펩타이드를 제공하는 단계; (b) 모 폴리펩타이드 중의 아미노산 잔기가 대체물에 의해 치환되어 있는 화합물을 복수개 구축하는 단계, 여기서 치환된 대체물은 바람직하게는 치환된 아미노산 잔기의 아미노산 측쇄 모이어티의 것 또는 치환된 아미노산 잔기의 아미노산 측쇄 모이어티의 유도체의 것과 동일한 R1 또는 R2기를 갖는 것이 바람직하다; (c) 대체물을 포함하는 복수개의 화합물을 스크리닝하는 단계; 및 (d) 목적하는 표적에 결합하는 것으로 나타난 화합물, 즉 그에 따라 목적하는 표적에 결합하는 이차 구조를 포함하는 화합물을 선별하는 단계를 포함하여 이루어진다.
본 발명의 관련 측면에서, 모 폴리펩타이드의 이차 구조를 동정하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 이차 구조는 목적하는 표적에 결합하는데 관련이 있거나 또는 그러한 결합에 책임이 있는 것으로서, 이 방법은 모 폴리펩타이드 중의 아미노산 잔기가 대체물에 의해 치환되어 있는 화합물을 복수개 구축하는 단계를 포함하며, 여기서 치환되는 대체물은 바람직하게는 R1과 R2기가 양쪽 위치 모두 H로 국한되거나 또는 한쪽은 메틸이고 다른 한쪽은 H인 것이 좋다. 이러한 방식으로, 효능이나 또는 기타 확인가능한 다른 변수들에 미치는 아미노산 측쇄 모이어티의 효과를 쉽게 결정할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법은 모 폴리펩타이드와 표적 물질과의 상호반응, 예컨대 결합에 연관된, 모 폴리펩타이드 중의 하나 이상의 활성 서열 또는 도메인을 결정하기 위한, 모 폴리펩타이드의 시스템 분석방법을 제공한다. 본 명세서에서, "모 포리펩타이드(parent polypeptide)"라 함은 표적 물질과 예컨대 결합과 같은 상호작용을 나타내는 아미노산 잔기들의 여하한 서열로서, 이들은 따라서, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질로 구성될 수 있다. 모 폴리펩타이드는 일반적으로 본 명세서에 일반적으로 정의된 와 같이, 약 3 내지 약 100개의 아미노산 잔기를 갖지만, 모 폴리펩타이드는 당해 기술분야에서 일반적으로 더 큰 폴리펩타이드나 단백질로서 간주되는 보다 큰 구조물도 포함할 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하기 위해서는 모 폴리펩타이드의 적어도 일부, 바람직하게는 전체의 일차 구조, 즉 서열이 입수되어야 한다. 그러나, 본 발명의 방법을 실시하는데 있어서는 모 폴리펩타이드의 이차 또는 삼차 구조와 관련한 어떠한 정보가 필요한 것은 아니다.
모 폴리펩타이드는 예컨대 세포, 조직, 기관 또는 기타 생물학적 물질 상에서 발견되는 수용체에 결합하는 것으로 나타나는 여하한 서열일 수 있다. 모 폴리펩타이드의 예로는 생물학적으로 활성적인 펩타이드, 호르몬, 신경전달물질, 효소, 항체 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 이러한 모 폴리펩타이드는 수용체에 대한 결합의 결과로서, 직접 또는 간접적으로 신호를 전달할 수 있으며 따라서 모 폴리펩타이드는 아고니스트, 안타고니스트 또는 혼합형 아고니스트-안타고니스트일 수 있다. 적절한 모 폴리펩타이드의 예로는 멜라노코르틴-수용체 특이적인 펩타이드, 우로키나제형 조직 플라스미노겐 활성화제 단백질, 아밀로이드 베타-단백질 관련 펩타이드, 프라이온 질환 관련 펩타이드, 바소프레신 펩타이드, 옥시토신 펩타이드, 나트륨 이뇨 펩타이드, 안지오텐신 펩타이드, 칼시토닌, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드, 아편유사 펩타이드, 인간 성장 호르몬, 인간 프로락틴 수용체 리간드, 알파-인터페론과 같은 다양한 인터페론, 상피 성장 인자, 종양 괴사 인자, 및 다양한 저혈압 펩타이드, 섬유소 용햄 펩타이드, 케모스타틱 펩타이드, 성장프로모터 펩타이드, 세포 부착 펩타이드 및 폴리펩타이드, 미토겐, 면역조절자 등을 들 수 있다.
일반적으로, 본 발명을 사용하기 위해서는, 목적하는 수용체와 관련하여 본 발명의 구조물의 변수를 측정하기 위한 적어도 하나의 분석 또는 테스트를 수행한다. 한가지 측면에서, 본 발명의 구조물의 목적 수용체에 대한 결합을 이용하며, 바람직하게는 목적 수용체에 대한 모 폴리펩타이드의 결합을 병행 측정하는 것이 좋다. 그러나, 결합 특성 이외의 변수들, 예컨대 여러가지 기능 분석 시스템, 효능 분석 시스템 등을 이용할 수도 있다. 이러한 변수들은 기능 분석 시스템의 경우 Ki값, EC50 값 등과 같이 하나 이상의 화합물의 적절한 측정 단위로 표현할 수 있다. 따라서 본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 경쟁적 분석 또는 유사한 분석이 이용되며, 이에 따라 본 발명의 구조물의 결합 또는 기능적 활성 모 폴리펩타이드와 직접 비교할 수 있으며, 상대적인 결합 또는 기능 활성도 직접 측정할 수 있다. 또 다른 구체예에서는 다른 분석법이나 테스트가 이용될 수 있다. 이러한 분석법은 기능 분석일 수 있으나 반드시 그러한 것은 아니다. 분석예로는 다양한 경쟁적 저해 분석, 직접 결합 분석, 기능 분석 등을 들 수 있다. 예컨대 본 발명의 구조물이 아고니스트인지, 안타고니스트인지 또는 혼합형 아고니스트-안타고니스트인지 결정하는 분석법 역시 가능하며 따라서 이러한 분석법의 사용을 고려할 수 있다. 나아가 결합과 기능을 별도로 측정하여 기능 활성 뿐만 아니라 수용체 친화도와 특성 모두를 독립적으로 측정할 수도 있다. 이러한 분석법 및 테스트의 예는 기술 분야에 잘 알려져 있고 잘 문헌화되어 있으며, 어떤 모 폴리펩타이드에 대해서든, 일반적으로 한가지 이상의 이러한 분석법이나 테스트가 알려져 있다.
본 발명의 한가지 방법에서, 모 폴리펩타이드의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 치환하는 대체몰을 각각 적어도 하나 포함하는, 하나 이상의, 바람직하게는 일련의 화합물들을 제조하기 위한 템플레이트로서 모 폴리펩타이드를 사용할 수 있다. 한가지 측면에서, 적어도 하나의 대체물을 갖는 이러한 화합물은 모 폴리펩타이드에서 발견되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 생략될 수 있다. 또 다른 측면에서, 적어도 하나의 대체물을 갖는 이러한 화합물은 모 폴리펩타이드에서 발견되는 것과 같은 같거나 다른 아미노산 잔기 또는 그의 상동체를 갖는 한편, 하나 이상의 아미노산 잔기가 대체물에 치환되어 있는 것이다. 한가지 측면에서 치환된 대체물은 바람직하게는 치환되는 아미노산 잔기의 아미노산 측쇄 모이어티의 것과 동일하거나, 또는 치환되는 아미노산 잔기의 아미노산 측쇄 모이어티의 유도체의 것과 동일한 R1 또는 R2기를 갖는 것이 좋다. 또 다른 측면에서, 치환되는 대체물은 양쪽 모두 H이거나 한쪽은 메틸이고 다른 한쪽은 H인 R1 및 R2기를 갖는 것이 좋다.
특정한 공지의 수용체에 결합하는 6개의 아미노산 잔기로 된 모 폴리펩타이드를 예로 들면, 이러한 모 폴리펩타이드는 다음과 같이 설명될 수 있다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6
"S"로 표시되는 본 발명의 대체물을 이용하여 다음과 같은 화합물을 합성할 수 있다:
X1-X2-X3-S-X5-X6
아미노산 잔기 X4가 S에 의해 치환되어 있는 화합물 X1-X2-X3-S-X5-X6의 한가지 측면에서, S는 X4의 아미노산 측쇄 모이어티 또는 X4의 아미노산 측쇄 모이어티의 유도체와 동일한 R1 또는 R2를 갖는다. X4가 Gly 또는 Ala가 아닌 또 다른 경우, S는 양쪽 모두 H이거나 한쪽은 메틸이고 다른 한쪽은 H인 R1 및 R를 갖는다. 화합물 X1-X2-X3-S-X5-X6의 결합, 또는 그 밖의 효능 척도를 측정하여 모 폴리펩타이드인 X1-X2-X3-X4-X5-X6와 비교한다.
시스템 평가를 수행하는 것이 가능하며 따라서 고려대상이 된다. 15개의 아미노산 잔기로 된 펩타이드가 공지의 특이적인 수용체에 결합한다고 가정해 보면, 이 펩타이드는 다음과 같이 설명될 수 있다:
NH2-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-COOH
상기 모 폴리펩타이드에서, X는 여하한 잔기일 수 있으며, 이 잔기는 어떠한 순서나 서열로든 여러번 반복될 수 있다. 따라서 X1 위치의 잔기는 X2 위치의 잔기와 같거나 다를 수 있으며, X2는 다시 X1이나 X3의 잔기와 같거나 다를 수 있는 등의 상황이 계속된다. 어떤 아미노산 잔기가 대체물 "S"로 대체된 일련의 화합물들을 연속적 또는 단계적 방식으로 제작한다. 따라서, 예컨대 다음의 것이 얻어질 수 있다:
Figure 112008075651893-pct00061
상기 중, 대체물 S는 각각의 화합물에 있어서, 치환된 아미노산 잔기의 아미노산 측쇄 모이어티 또는 치환된 아미노산 잔기의 아미노산 측쇄 모이어티의 유도체와 동일한 R1 또는 R2기를 갖는다. 마찬가지로, 각각의 위치에서 모든 거울성 이성질체 형태를 사용하여 평가할 수 있다. 이에 더하여, X는 Gly 또는 Ala 이외의 것이고, S는 양쪽 모두 H이거나 한쪽은 메틸이고 나머지 한쪽은 H인 R1과 R2인 각각의 위치에서 "녹-아웃" 접근법을 평가할 수 있다.
모 폴리펩타이드 중의 하나 이상의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하는 한편 모 포리펩타이드 중의 하나 이상의 아미노산 잔기를 본 발명의 대체물로 치환시키는 것도 가능하며 고려될 수 있다. 일례에서 천연 발생적인 모 폴리펩타이드의 L-이성질체를 D-이성질체로 치환한다. 화학식 I의 대체물을 적어도 하나 포함하는 대응하는 아미노산 서열은 공지의 모 폴리펩타이드와 동일하거나, 또는 그에 상동적일 수 있다. 즉, 예컨대 적어도 60% 상동적이거나, 더욱 바람직하게는 적어도 약 80% 상동성인 대응하는 아미노산 서열일 수 있다. 이러한 목적을 위해, 하나 이상의 화학식 I의 대체물에 의해 치환 또는 부가된 호합물에 대한 공지 아미노산 서열의 동일성을 참고로 측정함으로써 상동성을 평가한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 나트륨 이뇨 펩타이드에 대한 수용체에 결합하지만, 공지 펩타이드에 함유된 하나 이상의 아미노산 잔기가 대체물에 의해 치환되거나, 공지 펩타이드를 포함하는 서열에 상기 대체물이 부가되어 있는 것과 같은 형식으로, 하나 이상의 아미노산 대체물을 포함하는, 공지의 펩타이드를 모델로 하는 화합물을 합성하는데 유용한 화학식 II의 고리-구속형 아미노산 대체물을 제공한다. 상기한 공지 펩타이드는 기술 분야에 알려져 있는 여하한 나트륨 이뇨 펩타이드일 수 있으며, 예컨대 다음의 공개문헌, 특허, 특허출원 또는 본 명세서에 참고 인용된 문헌에 기재된 것일 수 있으나 하기 문헌들로 한정되지 않는다: 미국특허 4,496,544; 4,609,725; 4,656,158; 4,673,732; 4,716,147; 4,757,048; 4,764,504; 4,804,650; 4,816,443; 4,824,937; 4,861,755; 4,904,763; 4,935,492; 4,952,561; 5,047,397; 5,057,495; 5,057,603; 5,091,366; 5,095,004; 5,106,834; 5,114,923; 5,159,061; 5,204,328; 5,212,286; 5,352,587; 5,376,635; 5,418,219; 5,665,704; 5,846,932; 5,583,108; 5,965,533; 6,028,055; 6,083,982; 6,124,430; 6,150,402; 6,407,211; 6,525,022; 6,586,396 또는 6,818,619; 미국특허출원 공개 2004/0002458; 2004/0063630; 2004/0077537; 2005/0113286; 2005/0176641; 또는 2006/0030004; 또는 다양한 미국 이외 국가의 특허 및 특허출원, 예컨대 WO 85/04870; WO 85/04872; WO 88/03537; WO 88/06596; WO 89/10935; WO 89/05654; WO 90/01940; WO 90/14362; WO 92/06998; WO 95/13296; WO 99/08510; WO 99/12576; WO 01/016295; WO 2004/047871; WO 2005/072055; EPO 0 291 999; EPO 0 323 740; EPO 0 341 603; EPO 0 350 318; EPO 0 356 124; EPO 0 385 476; EPO 0 497 368; 또는 EPO 0 542 863. 한가지 측면에서, 공지의 펩타이드는 미국특허4,656,158, 4,824,937, 4,935,492, 5,159,061, 5,204,328, 5,376,635, 5,665,704, 5,846,932, 6,028,055, 6,407,211, 6,525,022, 6,586,396, 또는 6,818,619, 미국특허출원 공개 2004/0002458, 2004/0063630, 또는 2005/0176641, 또는 국제 특허출원 공개 WO 2004/047871 또는 WO 2005/072055에 개시된 펩타이드나 그의 상동체일 수 있다. 전술한 특허 및 특허출원 각각의 개시 내용은 그 내용 전체가 본 발명에 참고로 통합된다. 한가지 측면에서, 나트륨 이뇨 펩타이드 수용체에 결합하는 아미노산 서열은 치환 전, H-Met-시클로(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2 (SEQ ID NO:1)이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 ANP 또는 BNP에 대한 수용체를 비롯, 나트륨 이뇨 펩타이드에 대한 수용체에 결합하는 화합물을 합성하는데 유용한 화학식 I의 고리-구속형 아미노산 대체물를 제공한다.
화학식 I의 대체물을 한가지 이상 이용하여 만들어진 화합물들은 의약 용도와 축산 또는 수의용 분야 모두에서 사용가능하다. 일반적으로, 이 화합물, 이 화합물물을 포함하는 약학적 조성물은 사람에 대해 사용되지만, 다른 포유류에 대해서도 사용가능하다. "환자"라는 용어는 포유류 개체를 가리키는 것으로서, 본 명세서와 청구범위에서도 이러한 의미로 사용된다. 본 발명의 주분야는 사람 환자를 대상으로 한 것이지만, 본 발명은 실험실, 농장, 동물원, 야생, 애완동물, 돌연변종 또는 기타 동물에 대해서도 사용가능하다.
본 명세서에 개시된 화합물, 또는 본 명세서에 개시된 방법에 의해 만들어지는 화합물은 여하한 증상, 증후군 또는 질환, 특히, 모 폴리펩타이드가 일저어 효능을 갖는 여하한 증상, 증후군 또는 질환을 치료하는데 사용되리 수 있다. 본 명세서에 개시된 화합물, 또는 본 명세서에 개시된 방법에 의해 만들어지는 화합물은 모 폴리펩타이드에 비해 한가지 이상의 장점을 가질 수 있으며, 상기 장점이란 효소 분해에 대한 증가된 내성, 증가된 순환 반감기, 증가된 생체이용성, 증가된 효능, 연장된 효능 기간 및 이들의 조합 중에서 선택된다.
한가지 측면에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 조기 단계, 예컨대 클래스 1의 울혈성 심부전증을 치료하는데 이용가능하다. 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 만성 또는 대상부전형 울혈성 심부전증을 치료하는데 이용된다. 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 휴식 중 또는 최소한의 활동 중에도 호흡곤란을 일으키는 환자의 급성 대상부전형 울혈성 심부전증을 비롯한 급성 울혈성 심부전증을 치료하는데 이용된다.
화합물의 염 형태. 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태일 수 있다. "약학적으로 허용가능한 염"이라는 용어는 무기 또는 유기 염기 및 무기 또는 유기산을 비롯하여 약학적으로 허용가능한 비독성 염기 또는 산으로부터 제조된 염을 가리킨다. 무기 염기로부터 유래한 염에는 알루미늄, 암모늄, 칼슘, 구리, 제1철, 제2철, 리튬, 마그네슘, 망간, 제2망간, 칼륨, 나트륨, 아연 등의 염이 포함된다. 특히 바람직한 것은 암모늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 칼륨 및 나트륨염이다. 약학적으로 허용가능한 유기 비독성 염기로부터 유래된 염에는 일차, 이차 또는 삼차 아민, 자연 발생적인 치환 아민을 비롯한 치환 아민, 사이클릭 아민, 및 염기성 이온 교환 수지, 예컨대, 아르기닌, 베타인, 카페인, 콜린, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 디에틸아민, 2-디에틸아미노에탄올, 2-디메틸아미노에탄올, 에탄올아민, 에틸렌di아민, N-에틸-모르폴린, N-에틸피페리딘, 글루카민, 글루코사민, 히스티딘, 하이드라바민, 이소프로필아민, 라이신, 메틸글루카민, 모르폴린, 피페라진, 피페리딘, 폴리아민 수지, 프로카인, 퓨린, 테오브로민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 트로메타민 등이 포함된다.
본 발명의 화합물이 염기성인 경우, 무기산 및 유기산을 비롯한 약학적으로 허용가능한 비독성 산으로부터 산부가염이 제조될 수 있다. 이러한 산에는 아세트산, 벤젠설폰산, 벤조산, 캠포설폰산, 카르복실산, 시트르산, 에탄설폰산, 포름산, 푸마르산, 글루콘산, 글루탐산, 브롬화수소산, 염산, 이세티온산, 락트산, 말레산, 말산, 만델산, 메탄설폰산, 말론산, 뮤신산, 질산, 팜산, 판토텐산, 인산, 프로피온산, 숙신산, 황산, 타르타르산, p-톨루엔설폰산, 트리플루오로아세트산 등이 포함된다. 본 발명의 화합물의 산부가염은 적절한 용매 중에서 화합물과 과량의 산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 아세트산, 트리플로오로아세트산, 시트르산, 타르타르산, 말레산, 숙신산 또는 메탄설폰산으로부터 만들어진다. 아세테이트 염 형태가 특히 유용하다. 본 발명의 구체예의 화합물이 산성 모이어티를 포함할 경우, 적절한 약학적으로 허용가능한 염은 나트륨염 또는 칼륨염과 같은 알칼리 금속염, 칼슘염이나 마그네슘염과 같은 알칼리토 금속염을 포함할 수 있다.
약학적 조성물. 본 발명의 또 다른 구체예에 따라 본 발명의 화합물과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 담체는 액상 포뮬레이션일 수 있으며, 바람직하게는, 완충, 등장된 수용액인 것이 좋다. 약학적으로 허용가능한 담체는 또한 부형제, 예컨대, 희석제, 담체 등, 및 첨가제, 예컨대, 안정화제, 방부제, 가용화제, 완충제 등도 포함하며, 이에 대해서는 후술한다.
본 발명의 몇몇 구체예의 화합물은 본 발명의 화합물 적어도 한가지와 예컨대 희석제, 담체 등과 같은 부형제 및 안정화제, 방부제, 가용화제, 완충제 등과 같은 첨가제를 비롯한 약학적으로 허용가능한 담체 한가지 이상을 필요에 따라 포함하는 약학적 조성물이 되도록 조성되거나 혼합될 수 있다. 포뮬레이션 부형제에는 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 히드록시 셀룰로스, 아카시아, 폴리에틸렌 글리콜, 만니톨, 소듐 클로라이드 및 소듐 시트레이트가 포함될 수 있다. 주사 또는 기타 액상 투여용 포뮬레이션의 경우, 적어도 한가지 이상의 완충 성분을 함유하는 물이 바람직하며, 안정화제, 방부제 및 가용화제도 사용할 수 있다. 고상 투여용 포뮬레이션의 경우, 여러가지 농후제, 충전제, 벌크화제 및 담체 첨가물, 예컨대 전분, 슈가, 지방산 등을 사용할 수 있다. 국소 투여용 포뮬레이션의 경우, 여러가지 크림제, 연고제, 겔제, 로션제 등을 사용할 수 있다. 대부분의 약학적 포뮬레이션에 있어서, 비활성 성분은 제제 부피나 중량에 대해 더 큰 부분을 차지할 것이다. 약학적 포뮬레이션에 있어서, 다양한 측정 방출, 서방형 또는 타임 방출형 포뮬레이션 및 첨가제를 사용하여, 본 발명의 화합물의 전달이 일정 시간 동안 지속적으로 효과를 나타낼 수 있도록 조성할 수 있다.
일반적으로, 환자에게 투여되는 화합물의 실제량은 투여 방식, 사용되는 포뮬레이션, 및 소망되는 반응 정도에 따라 큰폭으로 달라질 수 있다.
실제 사용시, 본 발명의 화합물은 통상적인 약학적인 제약 기술에 따라 혼합물 중에 활성 성분으로서, 약학적 담체와 결합될 수 있다. 담체는 예컨대, 경구, 비경구(정맥 경로 포함), 요도내, 질내, 콧속, 경피, 폐내, 폐심부내, 흡입, 입안, 설파 등을 비롯한 소망되는 투여경로에 의한 제제 형태에 따라 광범위한 형태를 취할 수 있다. 경구 투여용 조성물을 제조하는 경우, 예컨대 현탁제, 엘릭시르제 및 용액제와 같은 경구용 액상 제제의 경우에는 예컨대, 물, 글라이콜, 오일, 알코올, 풍미제, 방부제, 색소 등과 같은 통상적인 약학적 매질을 사용할 수 있고; 예컨대, 분말제, 경질 및 연질 캡슐 및 정제와 같은 경구용 고상 제제의 경우에는, 전분, 슈가, 미세결정성 셀룰로스, 희석제, 과립화제, 윤활제, 바인더, 붕괴제 등을 사용할 수 있다.
정제와 캡슐제는 투여하기가 쉽기 때문에, 이로운 경구 투여 단위 형태를 대표한다. 소망되는 경우, 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물을 표준 수성 또는 비수성 기술에 의해 피복시킬 수 있다. 이러한 치료적으로 유용한 조성물 중 활성 화합물의 양은 효과적인 투여량이 얻어지도록 하는 양이다. 또 다른 바람직한 투여 단위 형태에서, 시트, 웨이퍼, 정제 등과 같이, 설하용 약학적 조성물을 사용할 수 있다. 활성 화합물은 또한 예컨대 액상 점적제 또는 스프레이제와 같이 콧속으로도 투여될 수 있다.
정제, 알약, 캡슐제 등 역시도 트라가칸트검, 아카시아, 옥수수 또는 젤라틴과 같은 바인더; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분 또는 알킬산과 같은 붕괴제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 및 수크로스, 락토스 또는 사카린과 같은 감미료를 포함할 수 있다. 투여 단위 형태가 캡슐일 경우, 이것은 전술한 종류에 더해서, 지방 오일과 같은 액상 담체를 함유할 수도 있다.
여러가지 다른 물질들이 코팅제로서 사용가능하거나 투여 단위의 물리적 형태를 변형시키는데 사용될 수 있다. 예컨대, 정제는 쉘락, 슈가 또는 두가지 모두에 의해 피복될 수 있다. 시럽이나 엘릭시르제는 활성 성분에 더해서, 감미료로서 수크로스, 방부제로서 메틸 및 프로필파라벤, 체리향 또는 오렌지향과 같은 염료 및 향료를 함유할 수 있다.
화합물은 또한 비경구적으로 투여될 수 있다. 이러한 활성 펩타이드의 용액 또는 현탁액은 히드록시-프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 함께 물 속에서 적절히 혼합될 수 있다. 분산제 역시 글리세롤, 오일 중 액상 프로필렌 글리콜 및 이들의 혼합물 중에서 제조가능하다. 이러한 제제들은 미생물의 성장을 방지하기 위해 필요에 따라 방부제를 함유할 수 있다. 동결건조된 단일위 단위 포뮬레이션 역시 사용가능하며, 이것은 투여 직전에 식염수 등으로 재조성되므로 방부제를 필요로 하지 않는다.
주사용 용도로 적합한 약학적 형태는 예컨대, 멸균 주사용액 또는 분산액의 임시처방을 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말, 예컨대 동결건조된 포뮬레이션을 포함한다. 모든 경우에 있어서, 투여 형태는 멸균 상태여야 하고, 주사에 의해 투여될 수 있는 정도로 유동가능하여야 한다. 투여 형태는 제조 및 유통 과정에서 안정하여야 하며 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 활동에 대해 안전하게 유지되어야 한다. 담체는 예컨대 물, 에탄올, 폴리올, 예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜 또는 액상 폴리에틸렌 글리콜, 이들의 적절한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.
본 명세서에 개시된 화합물은 비내 투여 수단에 의해 치료적으로 적용가능하다. "비내 투여(nasal administration)"이라 함은 본 발명의 여하한 화합물을 콧속으로 투여하는 모든 투여 형태를 가리킨다. 본 발명의 화합물은 수용액, 예컨대 식염수, 시트레이트 또는 기타 보통의 부형제 또는 방부제를 포함하는 용액과 같은 수용액 중에 조성될 수 있다. 이 화합물은 또한 건조 또는 분말 포뮬레이션일 수도 있다.
또 다른 구체예에서, 화합물은 폐 속으로 직접 투여될 수 있다. 계량된 투여량 흡입 수단, 즉, 숨을 들이쉬는 동안 환자에 의해 작동될 경우, 본 발명의 화합물의 계량된 볼러스를 자가 투여가능하게 해주는 장치에 의해 폐속으로 투여가능하다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따라, 본 발명의 화합물은 펩타이드 약물을 비롯하여, 약물의 효과적인 비내 흡수를 증가시켜주는 여하한 제제와 함께 조성될 수 있다. 이러한 제제는 점막에 허용불가능한 손상을 입히는 일 없이 비내 흡수를 증가시켜준다. 미국특허 5,693,608, 5,977,070 및 5,908,825는 그 중에서도 흡수 촉진제를 포함하여, 사용가능한 여러가지 약학적 조성물을 개시하고 있으며, 이들 문헌의 개시 내용은 본 발명에 참고 통합되어 있다.
본 발명의 수용액, 특정 화합물은 식염수, 아세테이트, 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트 또는 기타 완충제 수단에 의해 적절히 완충될 수 있고 적절한 생리적으로 허용가능한 pH, 일반적으로 약 pH 4 내지 약 pH 7로 완충가능하다. 예컨대 포스페이트 완충 식염수, 식염수와 아세테이트 완충액, 등과 같이 완충제의 조합도 이용가능하다. 식염수의 경우, 0.9% 식염수 용액을 사용할 수 있다. 아세테이트, 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트 등의 경우, 50 mM 용액을 사용할 수 있다. 완충제에 더해서, 세균 및 기타 미생물의 성장을 예방하거나 제한하기 위해, 적절한 방부제를 사용할 수 있다. 사용가능한 이러한 방부제의 일례로 0.05% 벤잘코늄 클로라이드를 들 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 건조한 미립자 형태로 사용가능하다. 바람직한 구체예에서, 이러한 입자들은 크기가 약 0.5 내지 6.0㎛인 것이 좋고, 이에 따라 입자들은 흡입됨이 없이 폐 표면에 머물기에 충분한 질량을 가질 수가 있으면서도, 폐에 도달하기 전에 기도 표면에 흡착되지 않을 정도로 충분히 작다. 비제한적인 에로서 마이크로 밀링, 분무 건조 및 동결건조를 수반하는 급속 동결 에어로졸법 등 여러가지 다양한 기술들을 이용하여 건조 분말 미립자를 만들 수 이다. 미립자 형태로 화합물은 폐심부에 흡착될 수 있기 때문에, 혈류 내로 신속하고 효율적으로 흡수될 수 있다. 또한, 이러한 접근법에서는 경피, 비내 또는 구강 점막 전달 경로에서 때로 그러하듯이 침투 촉진제가 필요하지 않다. 추진식 에어로졸, 분무기, 단일 투여 건조 분말 흡입기 및 멀티투여 건조 분말 흡입기를 비롯한 여러가지 다양한 흡입기를 사용할 수 있다. 현재 흔히 이용되는 기기에는 계량식 투여 흡입기가 있는데, 이것은 천식, 만성 폐쇄폐병 등의 치료약을 전달하는데 이용된다. 바람직한 기기로는 입도가 언제나 약 6.0㎛ 미만인 미세분말의 분진 또는 에어로졸을 형성하도록 고안된 건조 분말 흡입기를 들 수 있다.
평균 크기 분포를 비롯한 미립자 크기는 제조방법 수단에 의해 제어할 수 있다. 마이크로 밀링의 경우, 밀링 헤드의 크기, 로터의 속도, 가공 시간 등에 의해 미립자의 크기가 조절된다. 분무 건조의 경우, 노즐 크기, 유속, 드라이어의 온도 등에 의해 미립자 크기가 결정된다. 동결건조를 수반하는 신속 동결 에어로졸 수단에 의해 제조할 경우, 노즐 크기, 유속, 에어로졸 용액의 농도 등에 의해 미립자 크기가 조절된다. 이러한 변수 및 기타의 변수는 미립자 크기를 조절하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 시간 방출형 주사용 포뮬레이션 형태로 볼기 근육이나 삼각근에 주사, 전형적으로는 심부 근육 주사함으로써, 치료적으로 투여될 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 화합물은 pH 등의 조절을 위해 폴리(에틸렌 글리콜)3350과 같은 PEG 및 임의로 한가지 이상의 부가적인 부형제 및 방부제, 예컨대 비제한적인 예로서 염, 폴리소르베이트 80, 소듐 히드록사이드 또는 염산과 같은 부형제와 함께 조성될 수 있다. 또 다른 구체에에서, 본 발명의 화합물은 폴리(오르토 에스테르)와 함께 조성될 수 있는데, 이것은 폴리머 백본 중 다양한 백분율의 락트산에 의해 자가-촉매된 폴리(오르토 에스테르)일 수 있으며, 필요에 따라 한가지 이상의 부가적인 부형제와 함께 조성될 수 있다. 일 구체예에서, 폴리 (D,L-락타이드-코-글리콜라이드) 폴리머 (PLGA 폴리머)가 사용되며, 바람직하게는 Boehringer Ingelheim, Inc. (독일, 잉겔하임)사가 판매하는 PLGA RG502H와 같은 친수성 말단기를 갖는 PLGA 폴리머를 사용하는 것이 좋다. 이러한 포뮬레이션은 예컨대, 반응기 중에서 본 발명의 화합물을 적절한 용매, 예컨대 메탄올 중에서 메틸렌 클로라이드 중 PLGA 용액과 함께 결합시키고, 여기에 적절한 혼합 조건 하에 폴립닐 알코올의 연속상 용액을 첨가함으로써 만들 수 있다. 일반적으로, 바람직하게는 부착성 폴리머이기도 한 여하한 몇가지 주사가능하며 생분해성인 폴리머들을 시간 방출형 주사용 포뮬레이션에 사용할 수 있다. 미국특허 4,938,763, 6,432,438, 및 6,673,767의 개시내용과, 본 명세서에 개시된 포뮬레이션 방법 및 생분해성 폴리머는 본 발명 명세서에 참고로 통합된다. 화합물의 농도 및 양, 폴리머의 생분해율, 및 기타 당업자에게 알려진 인자들에 따라, 주일별, 월별 또는 기타 주기적 기준으로 포뮬레이션을 주사할 수 있다.
투여 경로. 만일 주사 투여될 경우, 정맥, 피하, 근육내, 복강내 또는 기타 기술 분야에 알려진 다른 수단으로 주사될 수 있다. 본 발명의 화합물은 비제한적인 예로서 정제, 캡슐제, 캐플렛제, 현탁제, 분말제, 동결건조 제제, 좌약제, 점안제, 피부 팻치제, 경구 가용성 포뮬레이션, 스프레이제, 에어로졸제 등과 같은 포뮬레이션을 비롯한 여하한 수단에 의해 조성될 수 있으며, 완충제, 바인더, 부형제, 안정화제, 항산화제 및 기술분야에 알려진 기타 제제와 함께 혼합 및 조성될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물은 세포의 표피층을 통하여 도입되는 여하한 투여경로에 의해 투여될 수 있다. 따라서 투여 수단에는 점막을 통한 투여, 구강내 투여, 경구 투여, 경피 투여, 흡입 투여, 폐내 투여, 비내 투여, 요도내 투여, 질내 투여 등이 포함된다.
한가지 측면에서, 본 발명의 화합물은 본 발명의 화합물을 PEG, 폴리(오르토 에스테르) 또는 PLGA 폴리머와 함께 조성시키는 것처럼, 시간-방출 주입형 포뮬레이션 수단에 의해 투여될 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 화합물은 자동화 전달 장치 수단에 의해 연속 또는 간헐적으로 경피 전달하는 방식으로 투여된다. 전술한 여하한 방법과 포뮬레이션은 만성 울혈성 심부전증 및 특히 만성 대상부전 울혈성 심부전증과 같은 만성 질환이나 증후군을 치료하는데 특히 적용가능하다.
한가지 측면에서, 본 발명의 여하한 화합물은 미국특허 6,586,396에 개시된 모든 방법을 비롯한 경피 투여에 의해 투여될 수 있다. 또 다른 측면에서, 환자들, 특히 외래 환자 세팅에서 비교적 대상부전형이거나 울혈성 심부전증을 앓는 환자들에게 미국특허출원 공개 2004/0077537 및 국제특허출원 공개 WO 2003/079979에 개시된 방법과 투여량으로 본 발명의 화합물을 투여할 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 구조물을 미국특허출원 공개 2005/0113286에 기재된 방법에 의해 환자에게 투여할 수 있다. 또 다른 측면에서, 심장근육이 손상된 환자들은 미국특허출원 공개 2006/0019890에 개시된 바와 같은 방법에 의해 심장 리모델링을 위해 치료될 수 있다.
본 발명의 구조물은 또한 미국특허출원 공개 2006/0034903에 개시된 방법 및 장치를 비롯한 전달 시스템 수단에 의해, 경피적으로 투여될 수 있다. 마찬가지로, 이 문헌에 개시된 하이드로젤 포뮬레이션 및 고체상태 포뮬레이션들을 본 발명의 구조물에 대한 사용을 위해 채택할 수 있다.
치료학적 유효량. 일반적으로, 환자에 대한 본 발명의 구조물의 실제 투여량은 투여 방식, 사용되는 포뮬레이션 및 소망되는 반응에 따라 매우 광범위하게 변할 수 있다. 치료를 위한 투여량은 전술한 여하한 수단이나 방법에 의해, 소망되는 치료학적 효과를 가져오는데 충분한 투여량이다. 따라서, 치료학적 유효량은 특히 항고혈압, 심장혈관, 신장 및/또는 내분비 효과를 유도하는데 충분한 본 발명의 구조물 또는 약학적 조성물의 양을 포함한다. 한가지 측면에서 치료학적 유효량은 소망되는 나트륨 이뇨, 이뇨, 및/또는 혈관확장을 초래하는 양이다.
일반적으로, 본 발명의 구조물은 매우 활성적이다. 예컨대, 이러한 조성물은 선택된 특정 구조물, 소망되는 치료적 반응, 투여 경로, 포뮬레이션 및 당업자에게 알려진 기타의 인자에 따라, 약 0.001, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 또는 100 μg/kg 체중의 양으로 투여될 수 있다.
5. 화학식 I의 대체물의 합성 방법
본 발명의 화학식 I의 대체물은 표준적인 합성 방법론에 의해 얻을 수 있다. 이하의 반응식에서는 몇가지 간편한 방법들이 예시된다. 본 발명의 화합물과 그의 중간체를 제조하는데 유용한 출발 물질들은 시판되는 것들이거나 또는, 공지의 합성 방법과 시약을 이용함으로써 시판 물질로부터 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 보호기는 일반적으로 최종 치료 화합물에서는 발견되지 않으나, 보호되지 않을 경우 화학적 조작 중에 변경될 우려가 있는 기들을 보호하기 위해 합성의 어떤 단계에서 의도적으로 도입되는 것들이다. 이러한 보호기들은 합성 말기 단계에서 제거되거나 다른 소망되는 기로 전환되며 이러한 보호기를 산생하는 화합물들은 따라서 주로 화학적 중간체로서 중요하다 (비록 몇몇 유도체들 역시 생물학적 활성을 나타내지만). 따라서, 보호기의 정확한 구조가 중요한 것은 아니다.
이러한 보호기의 형성 및 제거를 위한 많은 반응들이 몇가지 스탠다드한 연구 논문에 설명되어 있으며, 그 예로 Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, London 및 New York, 1973; Greene, Th. W. Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, New York, 1981; The Peptides, Vol. I, Schroder 및 Lubke, Academic Press, London 및 New York, 1965; 및 Methoden der organischen Chemie, Houben-Weyl, 4th Edition, Vol.15/I, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974를 들 수 있고, 이들 문헌의 개시 내용은 본 발명 내용에 참고로 통합되어 있다.
다음에 예시된 본 발명의 화학식 I의 아미노산 대체물의 합성방법들은 어디까지나 예시를 위한 것으로, 당업자는 이를 필요에 따라 변형시킬 수 있으며, 이러한 변형 역시 본 발명 범위에 포괄되는 것으로 이해되어야 한다.
다음에 예시된 본 발명의 아미노산 대체물의 합성방법들은 어디까지나 예시를 위한 것으로, 당업자는 이를 필요에 따라 변형시킬 수 있으며, 이러한 변형 역시 본 발명 범위에 포괄되는 것으로 이해되어야 한다.
관능화된 R 측쇄가 없는 아미노산을 모방하는 케토피페라진 스캐폴드의 합성 (방법 A 및 B)
다음 방법 A 및 B에 설명된 바와 같이 여러가지 방법으로 구조물을 제조하였다.
방법 A: 혼합 무수법에 의해 Boc-세린 (OBn)-OH (1), 및 α-아미노 에스테르 (2)를 사용하여 디펩타이드(3)을 형성하였다. 디펩타이드는 고수율로 얻어졌으며, 대개 정제를 요하지 않는다. 2차 아민을 보호시킨 채로 디보란-테트라히드로퓨란을 이용하여 메틸 에스테르와 아미드기를 두가지 모두 환원시켜 di-Boc 보호된 아미노 알코올 중간체(4)를 얻었다. 알코올을 피리디늄 디크로메이트(PDC)로 산화시키는 동시에 고리화시킴으로써 한 단계로 피페라진-2-온(5)을 얻어다. 수소첨가에 의해 벤질 에테르를 제거한 다음, 보호기 교환시켜 Fmoc 보호된 피페라진-2-온 (6)을 얻엇다. 마지막으로, 몇가지 상이한 방법 (PDC, Jones 산화, 루테늄 클로라이드-소듐 퍼요오데이트, 2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥시, 유리 래디칼(TEMPO) 산화)에 의해 일차 알코올을 산이 되도록 산화시켜 최종 생성물(7)을 얻었다.
Figure 112008075651893-pct00062
2-(3-벤질옥시-2-3차-부톡시카르보닐아미노-프로피오닐아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (3)의 합성: 질소 하, -20℃에서 유지된 30mL의 건조 테트라히드로퓨란 중 10mmol의 Boc 세린 벤질 에테르 (1) 용액에, 22mmol의 트리에틸아민을 첨가한 다음 11.4mmol의 이소부틸클로로포르메이트를 서서히 첨가하였다. 백색의 고체가 석출되었다. 슬러리를 15분간 교반한 다음, 11.1 mmol의 α-아미노 에스테르(2)를 한번에 첨가하였다. 이 슬러리를 -20℃에서 30분간 교반한 다음, 실온으로 승온시킨 다음, 2시간 교반한 후 농축 건조시켰다. 이어서 혼합물을 50 mL의 에틸 아세테이트/30ml의 1N 염산 용액에서 분별시켰다. 층들을 분리하고, 유기층을 1x 20ml의 1N 염산, 및 1 x 20 mL의 중탄산나트륨 포화용액으로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 화합물 (3)은 일반적으로 90% 이상의 수율로 얻어지며, 정제를 필요하지 않았다.
Figure 112008075651893-pct00063
Di-Boc-2-치환-(2-아미노-3-벤질옥시-프로필-아미노)-에탄올(4)의 합성: 질소 하 실온에서 유지된 건조 테트라히드로퓨란 50mL 중 35 mmol의 (3)의 용액에 테트라히드로퓨란 중 1N 디보란 용액 200 mL를 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 밤새 교반한 다음, 1N 염산 용액 200 mL의 빙냉 용액에 천천히 부었다. 이중상(biphasic) 용액을 고상 수산화나트륨으로 중화시켰다. 중탄산나트륨 포화용액 140mL를 첨가한 다음, 디-3차-부틸-디카보네이트 70mmol을 첨가한 후 혼합물을 실온에서 2일간 교반한 다음, 200mL의 에틸 아세테이트로 희석하고 층을 분리하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 생성물(4)를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.
Figure 112008075651893-pct00064
1,4-디-Boc-6-벤질옥시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (5)의 합성: 300 mL의 건조 디메틸포름아미드 중 400mmol의 피리디늄 디크로메이트와 70 mmol의 (4)의 용액을 질소 하 48℃에서 6시간 교반하고, 실온으로 냉각한 다음 1500mL의 물에 부은 다음4 x 500 mL 에틸 에테르로 추출하였다. 에테르층을 결합시키고 황산마그네슘으 로 건조 및 농축시켰다. 생성물(5)를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
Figure 112008075651893-pct00065
4-Fmoc-6-히드록시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (6)의 합성: 200mL 에탄올 중 탄소상 2g의 10% 팔라듐과 19mmol의 (5)의 현탁액을 실온 및 대기압 하에서 밤새 수소첨가시켰다. 이 현탁액을 셀라이트를 통해 여과 및 농축시켰다. 잔사를 디클로로메탄 중 50% 트리프루오로아세트산 40 mL에 용해시켰다. 용액을 실온에서 2시간 교반한 다음 농축시켰다. 잔사를 60 mL 테트라히드로퓨란/40 mL 물에 재용해시키고, 고상 중탄산나트륨으로 중화시킨 다음, 고상 중탄산나트륨 40mmol 및 Fmoc 클로라이드 20 mmol을 첨가하였다. 이어서 이 혼합물을 실온에서 2시간 교반하고, 에틸 아세테이트 300 mL로 희석한 다음, 층을 분리하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 농축시킨 다음 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.
Figure 112008075651893-pct00066
4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-카르복실산 (7)의 합성: 화합물 (7)을 여러가지 방법으로 제조하였다.
(a) 180 mL 아세토니트릴, 180 mL 사염화탄소, 및 240 mL 물 중 10 mmol (6)의 이중상(biphasice) 용액을 0℃로 냉각한 다음 112 mmol의 고상 소듐 퍼요오데이트를 첨가하고 이어서 340mg의 염화루테늄을 첨가하였다. 반응물을 실온으로 승온시키고 2시간 교반한 다음, 셀라이트를 통해 여과하였다. 층들을 분리하고, 수층을 2 ㅌ 75 mL 에틸 아세테이트로 재추출하였다. 유기층을 결합하고 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다.
(b) 60 mL 건조 디메틸포름아미드 중 12 mmol의 (6), 및 59 mmol의 PDC 용액을 질소 분위기 하 48℃에서 ~ 5시간 교반한 다음, 실온으로 냉각하고 600 mL의 물을 붓고, 3 x 200 mL의 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 결합시키고 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다.
(c) 실온으로 유지된 350mL의 아세톤 중 17 mmol의 (6)의 용액에 25mL의Jones 시약 (8.0 g의 크롬산, 17.4 mL의 물, 및 6.9 mL의 진한 황산으로부터 제조됨)을 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반하고, 이소프로판올 150 mL를 첨가한 다음 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하였다. 셀라이트를 에틸 아세테이트로 세척하였다. 유기층을 결합 및 농축시켰다. 잔사를 250 mL의 에틸 아세테이트에 용해시키고 2 x 50 mL의 물로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다.
(d) 실온에서 유지된 810mL의 아세토니트릴 중 81mmol 알코올(6)의 용액에, 포스페이트 완충용액 (물 295mL 중 7.2 g의 소듐 포스페이트 모노베이직, 및 14.3 g의 소듐 포스페이트 디베이직으로부터 제조됨)을 첨가한 다음, 3.3 g (20.7 mmol)의 TEMPO, 및 18.6 g (164.4 mmol)의 소듐 클로라이트를 첨가하고, 이중상 용액을 43℃로 유지된 유조에 넣은 다음, 43.3 mL (25.9 mmol)의 소듐 하이포클로라이트 용액 (19.3 mL의 10-13% 소듐 하이포클로라이트 용액, 및 24 mL의 물을 혼합하여 제조함)을 서서히 첨가하였다. 반응물을 43℃에서 4시간 교반하였다. 용액을 실온으로 냉각하고, 200 mL의 10% 소듐 히드로겐 설파이트 용액 을 첨가한 다음 10분간 교반한 후, 500 mL의 에틸 아세테이트로 희석한 다음 층들을 분리하였다. 유기층을 1 x 100 mL의 식염수, 1 x 160mL의 1N 염산 용액으로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다.
생성물(7)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
Figure 112008075651893-pct00067
Figure 112008075651893-pct00068
방법 B: 상기 방법 A에 설명한 바와 같이 제조된 중간체 디-Boc-2-치환-(2-아미노-3-벤질옥시-프로필-아미노)-에탄올 (4)를 TEMPO이소시아누르산 시약을 이용하여 산이 되도록 산성화시킨 다음, 요오도메탄으로 에스테르화시켜 완전히 보호된 환원 디펩타이드 유사체(8)을 얻었다. Boc기, 및 벤질 에테르의 탈보호에 의해, 3치환 5-히드록시메틸-피페라진-2-온s이 수득되었으며, 이를 Fmoc 유도체로 보호시켜 (6)을 얻고, 방법 A에 설명된 바와 같이 산화시켜 최종 생성물을 얻었다.
Figure 112008075651893-pct00069
디-Boc-(2-아미노-3-벤질옥시-프로필아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (8)의 합성: 0℃에서 유지된 210mL의 중탄산나트륨 포화용액 및 680 mL의 아세톤 중 76 mmol의 (4)의 현탁액에, 21 mmol의 고상 브롬화나트륨, 2.9mmol의 TEMPO를 첨가한 다음 156mmol의 트리클로로이소시아누르산을 서서히 첨가하였다. 0℃에서 반응물을 30분간 교반한 다음, 실온에서 밤새 교반하고, 1N 염산 용액으로 산성화시킨 다음 2 x 300 mL 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 3 x 50 mL의 1N 염산으로 세척하고, 황산 마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 잔사를 건조 디메틸포름아미드 40 mL 및 95 mmol의 고상 중탄산나트륨에 재용해시키고 112 mmol의 요오도 메탄을 첨가한 다음, HPLC가 반응이 종결되었음을 알릴 때까지 실온에서 혼합물을 교반하였다.; 이어서 용액을 200mL의 에틸 아세테이트로 희석하고, 2 x 100mL의 물로 세척한 다음, 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 생성물(8)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
Figure 112008075651893-pct00070
4-Fmoc-6-히드록시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (6)의 합성: 디클로로메탄 중 50% 트리플루오로아세트산 40 mL 중 36 mmol의 (8)의 용액을 실온에서 2시간 교반한 다음, 중탄산나트륨 포화용액 200 mL에 부었다. 층들을 분리하고, 유기층을 농축시켰다. 잔사를 100 mL 에틸 아세테이트에 재용해시킨 다음 2 x 50 mL의 물로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 잔사를 100 mL의 에탄올에 용해시키고, 탄소상 10% 팔라듐 5g과 35mL의 1N 염산 용액을 첨가한 다음 혼합물을 실온에서 수소첨가하고 HPLC가 반응 종결을 알릴 때가지 실온 및 대기압 하에서 혼합물을 수소첨가하였다; 이어서 용액을 셀라이트를 통해 여과 및 농축시켰다. 잔사를 80mL의 에틸 아세텡트에 재용해시키고, 30mL 물 중 중탄산나트륨 70mmol을 첨가한 다음, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 에틸 아세테이트를 제거하고 100 mL 테트라히드로퓨란을 첨가한 다음, 178 mmol의 고상 중탄산나트륨 및 43 mmol의 Fmoc 클로라이드를 첨가하고, HPLC가 반응 종결을 나타낼 때가지 혼합물을 교반한다음, 에틸 아세테이트 300 mL로 희석한 다음 층들을 분리하였다. 유기층을 2 x 50 mL의 물로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 생성물(6)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-카르복실산 (7)의 합성: 화합물 (7)을 방법 A에 설명된 바와 같이 제조하였다.
관능화된 R 측쇄를 갖거나 갖지 않는 화합물에 적용가능한 케토피페라진 스캐폴드의 제조를 위한 일반적인 공통 합성 방법 (방법 C, E, F)
방법 C: 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 이용하여 Fmoc O-보호 세린알을 α-아미노 에스테르 (2)로 환원적 아민화시킴으로써 (2-Fmoc-아미노-3- R'-O-프로필아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (10)를 제조하였다. 에스테르(12)를 디-이소부틸알루미늄 하이드라이드에 의해 환원, Dess-Martin 퍼요오디난 (Des-Martin periodinane)에 의한 Fmoc O-보호 세린알(13)의 산화나, 또는 수소화리튬 알루미늄에 의한 Fmoc O-보호 세린 Weinreb 아미드(14)의 환원에 의해 환원성 아민화에 필요한 Fmoc O-보호 세린알 (9)는 방법 D에 의해 제조하였다. Fmoc O-보호 세린알(9)의 바람직한 제조 방법은 Weinreb 아미드 유사체를 환원시키는 것이었다. (2-Fmoc-아미노-3-R'-O-프로필아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (10)를 이어서 N 및 O 탈보호, 고리화시키고 Fmoc 보호시켜 3치환 6-히드록시메틸--피페라진-2-온 (6)을 얻고, 이어서 이를 방법 A에 설명된 바와 같이 산성화시켜 최종 생성물을 얻었다.
합성에 사용되는 Fmoc-O-보호 세린알 (9)의 히드록실기 상의 보호기 (R')는 아미노 에스테르의 측쇄 R의 특성에 좌우된다. R이 관능기를 함유하지 않으면, Fmoc 세린의 측쇄를 Bu 에테르로서 보호하였다. R이 관능기를 함유하면, Fmoc 세린의 측쇄를 트리틸 에테르로서 보호하였다.
Figure 112008075651893-pct00071
Figure 112008075651893-pct00072
방법 D: 여러가지 Fmoc-O-보호 세린알 (9)의 합성. Fmoc-O-R' 세린 메틸 에스테르 (12)의 합성: 질소 하에 유지된 80 mL의 건조 디메틸포름아미드 중 80 mmol의 Fmoc O-R' 세린 (11), 10.0 g (120 mmol)의 고상 중탄산나트륨 및 10.0 mL (160 mmol)의 요오도메탄의 약한 현탁액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 500 mL의 물에 붓고, 고체를 여과하였다. 고체를 800 mL의 에틸 아세테이트에 재용해하고 1 x 200 mL의 물로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 정제는 필요하지 않았다.
Figure 112008075651893-pct00073
Fmoc-O-R' 세린올 (13)의 합성: 질소 하, -20℃에서 유지된 50 mL의 건조 테트라히드로퓨란 중 10.0 mmol의 Fmoc O-R' 세린 (11)의 용액에 1.77 mL (12.7 mmol)의 트리에틸 아민을 첨가한 다음 1.57 mL (12.0 mmol)의 이소부틸클로로포르메이트를 서서히 첨가하였다. 이 혼합물을 30분간 교반한 다음, 10 mL의 물 중 소듐 보로하이드라이드 3.77g(99.6 mmol)의 빙냉 용액에 서서히 붓고, 온도를 5℃ 미만으로 유지하였다. 반응물을 0℃에서 15분간 교반한 다음 1N 염산 용액으로 중단(quenching)시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 100 mL로 희석시키고 층을 분리하였다. 유기층을 1N 염산 용액 2 x 25 m, 물 2 x 25 mL로 세척하고 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 화합물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
Figure 112008075651893-pct00074
Fmoc-O-R' 세린 Weinreb 아미드(14)의 합성: 80 mL의 건조 디클로로메탄 중 20.2 mmol의 Fmoc O-R' 세린 (11), 6.98 g (21.6 mmol)의 2-(1H-벤조벤조트링졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU), 및 2.5 mL (22.7 mmol)의 N-메틸-모르폴린의 현탁액을 실온에서 질소 분위기 하에 20분간 교반한 다음, 3.02 g (31 mmol)의 N,O-디-메틸-히드록실아민 히드로클로라이드 및 3.3 mL (30 mmol)의 N-메틸-모르폴린을 첨가하고, 이 현탁액을 실온에서 밤새 교반하였다. 형성된 용액을 농축 건조시키고, 200 mL의 에틸 아세테이트와 100 mL의 물 사이에서 재분배한 다음, 2 x 40 mL의 1N 염산 용액으로 세척한 다음 2 x 40 mL의 중탄산나트륨 포화용액으로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 정제는 필요하지 않았다.
Figure 112008075651893-pct00075
에스테르 (12)로부터 Fmoc-O-R' 세린알 (9)의 합성: 질소 하 -78℃에서 유지된 5 mL의 테트라히드로퓨란 중 3.5 mmol의 (12) 용액에, 10 mL의 1N 디이소부틸 알루미늄 하이드라이드 (DIBAL) 용액을 서서히 첨가하고, 15분간 교반한 다음 주석산 나트륨 및 주석산칼륨의 포화용액을 서서히 첨가하여 중단시켰다. 반응물을 실온으로 승온시키고, 에틸 아세테이트 50 mL로 희석한 다음, 50 mL의 주석산나트륨 및 주석산 칼륨 포화용액을 첨가하였다. 층을 분리하고 수층을 1 x 50 mL의 에틸 아세테이트로 재추출하였다. 유기층을 결합시키고 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 화합물(9)를 다음 단계에서 추가 정제하지 않고 사용하였다.
Figure 112008075651893-pct00076
알코올 (13)으로부터 Fmoc-O-R' 세린알 (9)의 합성: 질소 하, 실온에서 유지된 건조 디클로로메탄 200 mL 중 80 mmol의 Fmoc-O-R' 세린올 (13) 용액에, 88 mmol의 Dess-Martin 퍼요오디난을 첨가하고, 반응물을 2.5시간 교반한 다음 400 mL의 10% 소듐 트리설페이트 수용액을 첨가하여 중단시켰다. 층을 분리하고, 유기층을 농축한 다음 300 mL의 에틸 에테르로 희석하고, 10% 소듐 티오설페이트를 함유하는 바이카보네이트 포화수용액으로 3회 세정한 후 황산 마그네슘으로 건조 및 농축시켰다.
Weinreb 아미드 (14)로부터의 Fmoc-O-R' 세린알(9)의 합성: 질소 하, -78℃로 냉각시킨 60 mL의 건조 테트라히드로퓨란 중 8.8 g (20.2 mmol)의 조질의 Fmoc-O-R' 세린 Weinreb 아미드 중간체 (14) 용액에, 테트라히드로퓨란 중 1N 수소화리튬 알루미늄 용액 30 mL를 첨가하였다. 이 용액을 15분간 교반한 다음 30 mL의 1.4N 황산수소칼륨 용액을 서서히 첨가함으로써 중단시켰다. 실온으로 승온시킨 후, 고체를 여과하고 여액을 농축 건조시켰다. 잔사를 에틸 아세테이트 50 mL와 25 mL의 1N 염산 용액 사이에서 재분배하였다. 층을 분리하고, 유기층을 황산마그네슘으로 건조, 여과 및 농축시켰다.
(2-Fmoc-아미노-3-R'-O-프로필아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (10)의 합성: 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 이용하여 환원적 아민화에 의해 화합물(10)을 제조하였다.
소듐 시아노보로하이드라이드 방법: 질소 하, 실온에서 유지된 20 mL의 메탄올 중 8.5 mmol의 (2) 하이드로클로라이드 염의 용액에 2.3 mmol의 고상 수산화칼륨을 첨가하고 혼합물을 25분간 교반하였다. 10 mL 메탄올 중 Fmoc-O-R' 세린알 (9)의 용액을 전술한 현탁액에 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 테트라히드로퓨란 중 1N 소듐 시아노보로하이드라이드 8.5 mL 용액을 서서히 첨가하고, 반응물을 1시간 교반한 다음 여과 및 농축시켰다. 잔사를 에틸 아세테이트와 물 사이에서 분배하고 유기층을 1 x 20 mL의 포화 중탄산나트륨으로 세척한 다음, 황산나트륨으로 건조 및 농축하였다.
소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 방법: 50 mL의 건조 테트라히드로퓨란 중 21 mmol의 (2) 하이드로클로라이드 염, 및 2.9 mL (21 mmol)의 트리에틸 아민의 용액을 실온에서 45분간 교반한 다음, 30 mL 테트라히드로퓨란 중 ~20 mmol의 조질의 Fmoc-(O-R')-세린알 (9) 용액을 첨가하고, 이어서 1.7 g의 4A 분말상 분자체를 첨가한 다음 이 현탁액을 다시 2시간 동안 교반하였다. 6.4 g (30 mmol)의 고상 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 첨가하고, 실온에서 현탁액을 밤새 교반하였 다. 현탁액을 메탄올로 희석하고, 분자체를 여과하고 여액을 농축시켰다. 잔사를 100 mL의 에틸 아세테이트와 50 mL의 물 사이에ㅓ 분배하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조, 여과 및 농축시켰다.
Figure 112008075651893-pct00077
Figure 112008075651893-pct00078
Figure 112008075651893-pct00079
4-Fmoc-6-히드록시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (6)의 합성: 하합물 (6)을 생산하기 위해서는 3 단계가 필요하다: (a) 부수적인 사이클화를 수반하는 Fmoc 탈보 호, (b) Fmoc 보호, 및 (c) 히드록실기 탈보호.
Fmoc기의 제거 및 사이클화: 에틸 아세테이트 용액 중 30 mL의 30% 디에틸 아민 중 10 mmol의 사이클릭 화합물 용액을 실온에서 밤새 교반한 다음, 농축 건조시켰다.
(a) Fmoc 보호: 20 mL의 테트라히드로퓨란 및 10 mL의 물 중 10 mmol의 화합물의 이중상 용액에, 2.52 g (30 mmol)의 고상 중탄산나트륨, 이어서, 3.36 g (13 mmol)의 Fmoc-Cl을 첨가하였다. 이 혼합물을 3시간 동안 교반하고, 에틸 아세테이트로 희석한 다음, 층을 분리하고, 유기층을 물로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다.
(b) 히드록시실기 탈보호: Bu 에테르 보호기를 함유하는 화합물의 경우: 디클로로메탄 중 90% 트리플루오로아세트산 용액으로 화합물들을 1-2시간 동안 탈보호시킨 다음 농축 건조시켰다. 잔사를 에틸 아세테이트에 용해시키고 중탄산나트륨 포화용액으로 세척한 다음 황산 마그네슘으로 건조 및 농축하였다. Trt 에테르 보호기를 함유하는 화합물의 경우: 2-10% 트리-이소프로필 실란을 함유하는 디클로로메탄 중에서 1-10% 트리플루오로아세트산의 용액을 첨가함으로써 화합물을들 탈보호시켰다. 반응은 즉각적이었다. 이어서 용액을 중탄산나트륨 포화용액에 부어 중화시켰다. 층을 분리하고, 황산나트륨으로 건조 및 농축시켰다.
화합물 (6)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
Figure 112008075651893-pct00080
Figure 112008075651893-pct00081
4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-카르복실산 (7)의 합성: 방법 A에 설명된 바와 같이 화합물 (7)을 제조하였다. 화합물 (7)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
Figure 112008075651893-pct00082
Figure 112008075651893-pct00083
방법 E: 환원제로서 소듐 ㅋ시아노보로하이드라이드나 소듐 트리아세톡시보로하아ㅣ드라이드를 이용하여, Fmoc 세린알(OR')(9)를 α 아미노 에스테르(2)의 환원적 아민화에 의해 (2-Fmoc-아미노-3-히드록시-프로필-Cbz-아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (15)를 제조하였다. 2차 아민을 벤질클로로포르메이트로 보호시킨 다음, 트리플루오로아세트산 용액으로 히드록실기를 탈보호하였다. 이어서 화합물 (15)를 Fmoc 탈보호시켰다. 아미노 에스테르 중간체를 즉시 사이클화시켜 4-Cbz-3치환 6-히드록시메틸-피페라진-2-온 (16)을 형성하였다. Fmoc 3치환 6-히드록시메틸-피페라진-2-온 (6)을 보호기 교환에 의해 제조한 다음 방법 A에 설명된 바와 같이 산화시켜 소망 생성물 (7)을 얻었다.
Figure 112008075651893-pct00084
(2-Fmoc-아미노-3-히드록시-프로필-Cbz-아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (15)의 합성: 80 mL 메탄올 중 67 mmol의 아미노 에스테르 하이드로클로라이드 (2), 및 20.9 mmol의 고상 수산화칼륨의 현탁액을 실온에서 25분간 교반한 다음, 250 mL의 메탄올 중의 현탁액(9)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 1.5시간 교반하고, 테트라히드로퓨란 중 70 mL의 1N 소듐 시아노보로하이드라이드 용액을 서서히 첨가 하였다. 반응물을 밤새 교반한 다음 농축하였다. 잔사를 300 mL의 테트라히드로퓨란과 50 mL의 1N 염산 용액 사이에서 분배하였다. 층을 분리하고, 유기층을 50 mL의 물 중 239 mmol의 주탄산나트륨 용액으로 중화시킨 다음 66 mmol의 벤질 클로로포르메이트르르 서서히 첨가하고, 반응물을 3시간 교반한 다음 200 mL의 에틸 아세테이트로 희석하고 층을 분리하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조, 및 농축하였다. 잔사를 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산 용액에 용해시키고 실온에서 2시간 교반하였다. 용액을 중탄산나트륨 포화 용액 200 mL에 부었다. 층을 분리하고, 유기층을 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 화합물(15)를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
Figure 112008075651893-pct00085
4-Cbz-6-히드록시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (16)의 합성: 에틸 아세테이트 중 100 mL의 30% 디에틸 아민 중 24 mmol의 (15)의 용액을 실온에서 밤새 교반한 다음 농축 건조시켰다. 이 화합물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
Figure 112008075651893-pct00086
4-Fmoc-6- 히드록시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (6)의 합성: 50 mL의 에탄올 중 15 mmol의 (16), 및 1.8 g의 탄소상 10% 팔라듐의 현탁액을 실온 및 대기압 하에서 HPLC가 반응 종류를 나타낼 때까지 수소첨가하였다. 이어서 혼합물을 셀라이트를 통해 여과, 농축시키고 잔사를 35 mL의 테트라히드로퓨란 및 10 mL의 물에 용해시킨 다음 62 mmol의 고상 중탄산나트륨을 첨가한 후, 16 mmol의 Fmoc-Cl을 첨가하고, 이 혼합물을 3시간 교반한 다음, 100 mL의 에틸 아세테이트 및 10 mL의 물로 희석하였다. 층을 분리하고, 유기층을 황산마그네슘으로 건조 및 농축하였다. 화합물 (6)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
Figure 112008075651893-pct00087
4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-카르복실산 (7)의 합성: 화합물 (7)을 방법 A에 설명된 바와 같이 제조하고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.
Figure 112008075651893-pct00088
방법 F: 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드랑드를 이용하고, Cbz 세린알 (OBn) (19)를 α-아미노 에스테르(2)에 의해 환원적으로 아민화시킴으로써 (2-Cbz-아미노-3-벤질옥시-프로필아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (20)를 제조하였다. 환원적 아민화에 필요한 Cbz O-벤질 세린알 (19)는 Cbz 세린올 (OBn) (18)을 with Dess-Martin 퍼요오디난으로 산화시킴으로써 수득하였다. (20)을 수소첨가한 다음 사이클화시켜 3-치환 6-히드록시메틸-피페라진-2-온을 얻고 이를 Fmoc 보호시켜 4-Fmoc-3-치환 6-히드록시메틸-피페라진-2-온 (6)을 얻었다. 최종 생성물 (7)은 방법 A에서와 같이 제조하였다.
Figure 112008075651893-pct00089
Cbz-세린올 (OBn) (18)의 합성: 화합물 (13)에 대해 설명된 바와 같이 화합물 (18)을 제조하였다. 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 정제 후 화합물 (18)을 79% 수율로 얻었다. 1H NMR δ (CDCl3) 3.57 -3.74 (two m, 3H, CHN, 및 CH2O), 3.76-3.96 (two m, 2H, CH2O), 4.50 (s, 2H, CH2O), 5.10 (s, 2H, CH2O), 5.40-5.50 (br. d, 1H, NH), 7.22-7.38 (m, 10H, Ph); HPLC tR = 5.33 분, (M+ + Na+) = 337.64.
Cbz 세린알 (OBn) (19)의 합성: 화합물 (9)에 대해 설명한 바와 같이 화합물 (19)를 제조하였다. 질소 하 실온에서 유지된 200 mL의 건조 디클로로메탄 중 80 mmol의 Cbz-O-Bn 세린올 (18)의 용액에 88 mmol의 Dess-Martin 퍼요오디난을 첨가하고, 반응물을 2.5시간 교반한 다음 400 mL의 10% 소듐 티오설페이트 수용액을 첨가함으로써 중단시켰다. 층을 분리하고 유기층을 농축시킨 다음 300 mL의 에틸 에테르로 희석하고, 10% 티오황산나트륨을 함유하는 바이카보네이트 포화수용액으로 3회 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 화합물 (19)는 99% 조질 수율로서 수득되었고, 추가 정제 없이 사용하였다. 1H NMR δ (CDCl3) 3.69-3.78 (dd, 1H, CH2O), 3.99-4.06 (dd, 1H, CH2O), 4.37-4.46 (m, 1H, CHN), 4.47-4.52 (d, 2H, CH2O), 5.14 (s, 2H, CH2O), 5.65-5.75 (br. d, 1H, NH), 7.14-7.48 (연속적인 m, 9H, Ph), 7.98-8.08 (dd, 1H, Ph), 9.63 (s, 1H, CHO).
(2-Cbz-아미노-3-벤질옥시-프로필아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (20)의 합성: 알데하이드로서 Cbz 세린알 (19)을 사용한 것을 제외하고, 화합물 (10)에 대해 설명한 바와 같이 화합물 (20)을 제조하였다. 화합물 (20)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
Figure 112008075651893-pct00090
4-Fmoc-6- 히드록시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (6)의 합성: 160 mL의 에탄올, 38 mL의 1N 염산 및 20 g의 탄소상 10% 팔라듐 중 38 mmol의 (20)의 현탁액을 실온 및 대기압 하에서 HPLC가 반응 종료를 나타낼 때가지 수소첨가하였다. 이어서 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고 농축 건조시켰다. 잔사를 75 mL의 테트라히드로퓨란으로 희석한 다음 중탄산나트륨 포화용액으로 중화시켰다. 106 mmol의 고상 중탄산나트륨 및 53 mmol의 Fmoc 클로라이드를 첨가하고, HPLC가 반응 종료를 나타낼 때까지 반응물을 실온에서 교반한 다음, 300 mL의 에틸 아세테이트 및 300 mL의 식염수로 희석하였다. 층을 분리하고, 유기층을 식염수로 2회 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 생성물(6)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-카르복실산 (7)의 합성: 화합물 (7)을 방법 A에서와 설명되니 바와 같이 제조하였다.
관능화 측쇄가 없는 아미노산을 모방하는 2,2-이치환 케토피페라진 스캐폴드의 합성(방법 G)
관능화된 측쇄가 없는 아미노산을 모방하는 4-Fmoc-5-치환- 6-옥소-피페라진-2-메틸-2-카르복실산 스캐폴드의 합성은 방법 G를 이용하여 수행하였다. 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드나 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 이용하여, 2-Boc-아미노-2-메틸-3-옥소-프로피온산 메틸 에스테르 (22)를 α-아미노 에스테르(2)로 환원적 아미노화시킴으로써 2-Boc-아미노-3-메톡시카르보닐-1-치환-메틸아미노-2-메틸-프로피온산 3차-부틸 에스테르 (23)를 제조하였다. 환원적 아민화에 필요한 화합물 (22)는 α-메틸-Boc 세린 3차-부틸 에스테르 (21)를 Dess-Martin 퍼요오디난으로 산화시킴으로써 수득하였다. (23)의 Boc기를 디옥산 중 2N 염화수소, 및 아미노 에스테르에 의해 제거하고 사이클화시켜 보호되지 않은 5-치환-6-옥소-피페라진-2-메틸-2-카르복실산 3차-부틸 에스테르 (24)를 얻고, 이를 Fmoc 클로라이드로 보호시켜 4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-메틸-2-카르복실산 3차-부틸 에스테르를 얻은 다음, 이를 트리플루오로아세트산으로 탈보호시켜 최종 생성물 (25)를 얻었다.
Figure 112008075651893-pct00091
2-Boc-아미노-2-메틸-3-옥소-프로피온산 3차-부틸 에스테르 (22)의 합성: 전술한 바와 같이 Dess-Martin 퍼요오디난을 이용하여Boc α-메틸 세린 3차-부틸 에스테르 (21)를 산화시켜 소망 생성물 (22)를 96%의 조질 수율로서 얻었다. 이 화하물을 추가정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다. 1H NMR δ (CDCl3): 1.44 (s, 18H, t Bu), 1.46 (s, 3H, CH3), 5.63-5.70 (br. s, 1H, NH), 9.5 (s, 1H, CHO)
2-Boc-아미노-3-메톡시카르보닐-1-치환-메틸아미노-2-메틸-프로피온산 3차-부틸 에스테르 (23)의 합성: 알데하이드로서 화합물 (22)를 사용한 것을 제외하고 화합물 (10)에 대해 설명한 것과 유사한 방법을 이용하여 화합물 (23)을 제조하였다. 화합물 (23)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
Figure 112008075651893-pct00092
2-메틸-6-옥소-5-치환-피페라진-2-카르복실산 (25)의 합성: 디옥산 중 8 mL의 2N 염화수소 중 4 mmol의 (23)의 용액을 실온에서 5시간 교반한 다음, 농축 건조시켰다. 잔사를 20 mL의 테트라히드로퓨란에 현탁시키고, 10 mmol의 트리에틸아민으로 중화시킨 다음 60℃에서 2일간 교반하였다. 이어서, 이를 농축 건조시키고, 20 mL의 테트라히드로퓨란과 10 mL의 물에 재현탁시킨 다음 고상 중탄산나트륨을 첨가하여 pH를 염기성으로 조절한 다음, 5.6 mmol의 고체 Fmoc 클로라이드를 촘가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음 1N 염산 용액으로 pH를 1로 조정한 후, 100 mL의 에틸 아세테이트로 희석한 다음 층을 분리하였다. 유기층을 2 x 100 mL의 식염수로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 잔사를 디클 로로메탄 중 10 mL의 50% 트리플루오로아세트산에 용해시키고 용액을 실온에서 3시간 교반하였다. 용매를 농축하고 생성물(25)를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
Figure 112008075651893-pct00093
관능화 측쇄를 갖는 아미노산을 모방하는 2,2-이치환 케토피페라진 스캐폴드의 합성 (방법 H)
관능화 측쇄를 갖는 아미노산을 모방하는 4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-메틸-2-카르복실산 스캐폴드의 합성을 방법 H를 이용하여 수행하였다. 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드나 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 이용하여, 2-Alloc-아미노-2-메틸-3-옥소-프로피온산 메틸 에스테르 (28)를 α-아미노 아릴 에스테르 (29)로 환원적 아민화시킨 다음, 2차 아민을 벤질클로로포르메이트로 보호시켜 2-Alloc-아미노-3-메톡시카르보닐-1-치환-메틸아미노-2-메틸-프로피온산 메틸 에스테르 (30)를 제조하였다. 환원적 아민화에 필요한 화합물 (28)은 화합물 (27)을 Dess-Martin 퍼요오디난으로 산화시켜 수득하였다. 유사체(30)의 alloc기와 알릴 에스테르를 테트라키스트리페닐 포스핀 팔라듐(0) 및 펩타이드 커플링제와의 반응에 의해 사이클화된 아미노산을 이용하여 제거하여 5-치환-6-옥소-피페라진-2-메틸-2-카르복실산 메틸 에스테르 (31)를 얻었다. 메틸 에스테르의 비누화 및 이어 서 보호기 교환에 의해 4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-메틸-2-카르복실산 (25)을 얻었다.
Figure 112008075651893-pct00094
Alloc α-메틸 세린 메틸 에스테르 (27)의 합성: 질소하에 유지된 8 mL의 건조 디메틸포름아미드 중 8 mmol의 Boc α-메틸 세린 (26), 1.0 g (12 mmol)의 고상 중탄산나트륨, 및 1.0 mL (16 mmol)의 요오도메탄의 용액을 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 50 mL의 물에 붓고, 50 mL의 디에틸 에테르로 추출한 다음, 1 x 20 mL의 물로 세척하고 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 잔사를 디클로로메탄 중 20 mL의 90% 트리플루오로아세트산에 용해시키고, 용액을 실온에서 3시간 교반한 다음 농축 건조시켰다. 잔사를 35 mL의 테트라히드로퓨란, 및 10 mL의 물에 용해시킨 다 음, 30 mmol의 고상 중탄산나트륨을 첨가하고, 12 mmol의 알릴 클로로포르메이트르르 서서히 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 2시간 교반하고, 50 mL의 에틸 아세테이트로 희석한 다음, 층을 분리하였다. 유기층을 1 x 10 mL의 중탄산나트륨 포화용액 및, 1 x 10 mL의 1N 염산 및 1 x 10 mL의 물로 세척하고 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 화합물 (27)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
2-Alloc-아미노-2-메틸-3-옥소-프로피온산 메틸 에스테르 (28)의 합성: 전술한 바와 같이 Dess-Martin 퍼요오디난을 이용하여 Alloc α-메틸 세린 메틸 에스테르 (27)을 산화시킴으로써 소망 생성물 (28)을 얻었다.
2-Alloc-아미노-3-메톡시카르보닐-1-치환-메틸-Cbz-아미노-2-메틸-프로피온산 알릴 에스테르 (30)의 합성: 알데하이드로서 화합물 (28)을 사용한 것을 제외하고 화합물(15)에 대해 설명된 것과 유사한 공정을 이용하여 화합물 (30)을 제조하였다.
4-Cbz-2-메틸-6-옥소-5-치환-피페라진-2-카르복실산 메틸 에스테르 (31)의 합성: 질소 하 실온에서 유지된 30 mL의 디클로로메탄 중 10 mmol의 화합물 (30) 용액에, 2 당량의 페닐실란과 0.3 당량의 테트라키스트리페닐포스핀 팔라듐(0)을 첨가하고, 용액을 2시간 교반한 다음, 11 mmol의 TBTU, 및 14 mmol의 N-메틸-모르폴린을 첨가하고, 이 용액을 실온에서 2시간 교반한 다음 농축 건조시켰다.
4-Fmoc-2-메틸-6-옥소-5-치환-피페라진-2-카르복실산 (25)의 합성: 질소 하 실온에서 유지된 25mL 메탄올 중 10 mmol의 화합물 (31)의 용액에, 11 mmol의 1N 수산화나트륨 용액을 서서히 첨가하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 21 mL의 1N 염산 용액으로 중화시키고, 탄소상 10% 팔라듐 1g을 첨가한 다음 현탁액을 실온 및 대기압 하에서 3시간 동안 수소첨가시켰다. 이 현탁액을 셀라이트를 통해 여과 및 농축시켰다. 잔사를 25 mL의 테트라히드로퓨란, 및 10 mL의 물에 재용해시킨 다음, 30 mmol의 고상 중탄산나트륨과 10 mmol의 Fmoc 클로라이드를 첨가하고, 반응물을 질소 하, 실온에서 2시간 교반하였다. 이어서 반응물을 50 mL의 에틸 아세테이트로 희석하고, 1N 염산 용액으로 산성화시켰다. 이어서 층을 분리하고, 유기층을 1 x 20 mL의 물로 세척한다음 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 화합물 (25)를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
(5-치환-6-옥소-피페라진-2-일)-아세트산 스캐폴드의 합성 (방법 I, J, K)
(5-치환-6-옥소-피페라진-2-일)-아세트산 스캐폴드의 합성을 몇가지 방법에 의해 수행하였다.
방법 I: 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 이용하여, 3차-부틸 3-보호-아미노-4-옥소-부티레이트 (34)를 α-아미노 에스테르 (2)로 환원적 아민화시킴으로써 (3차-부틸 3-보호-아미노-4-(메톡시카르보닐-치환-메틸아미노)-부티레이트 (35)를 제조하였다. 환원적 아민화에 필요한 3차-부틸 3-보호-아미노-4-옥소-부티레이트 (34)는 Weinreb 아미드 유도체 (33)의 수소화리튬 알루미늄 (LAH) 환원에 의해 제조하였다. 이어서 3차-부틸 (5-치환-6-옥소-피페라진-2-일)-아세테이트 (36)를 탈보호, 사이클화 및 Fmoc 보호시켜 3차-부틸(5-치환-6-옥소-피페라진-2-일)-아세테이트 (36)을 얻고, 이를 탈보호 시켜 최종 생성물 (37)을 수득하였다.
Figure 112008075651893-pct00095
아미노 보호된 Asp-(O t Bu) Weinreb 아미드 (33)의 합성: 화합물(14)에 대해 설명된 것과 유사한 공정을 이용하여 화합물 (33)를 제조하였다.
Figure 112008075651893-pct00096
Figure 112008075651893-pct00097
3차-부틸 3-아미노 보호된-아미노-4-옥소-부티레이트 (34)의 합성: 화합물(9)에 대해 설명된 것과 유사한 공정을 이용하여 화합물 (34)를 제조하였다.
Figure 112008075651893-pct00098
3차-부틸 3-보호-아미노-4-(메톡시카르보닐-치환-메틸아미노)-부티레이트 (35)의 합성: 알데하이드로서 화합물(34)를 사용한 것을 제외하고 화합물(10)에 대해 설명된 것과 유사한 방법으로 화합물 (35)를 제조하였다.
Figure 112008075651893-pct00099
Figure 112008075651893-pct00100
3차-부틸 (4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-일)-아세테이트 (36)의 합성: Fmoc 아미노 보호기를 함유하는 화합물의 경우, 에틸 아세테이트 용액 중 30 mL의 30% 디에틸 아민 중 10 mmol의 화합물 (35)의 용액을 실온에서 밤새 교반한 다음, 농축건조시켰다. Cbz 아미노 보호기를 함유하는 화합물의 경우, 30mL 에탄올 중 10 mmol의 화합물 (35)의 용액을 실온 및 대기압 하에서 2시간 동안 수소첨가시키고, 셀라이트를 통해 여과 및 농축 건조시켰다. Fmoc 보호의 경우, 잔사를 20 mL의 테트라히드로퓨란 및 10 mL의 물에 용해시키고, 2.52 g (30 mmol)의 고상 중탄산나트륨을 첨가한 다음 3.3 g (13 mmol)의 Fmoc-Cl을 첨가하였다. 혼합물을 3시간 교반한 다음 에틸 아세테이트로 희석하였다. 층을 분리하고, 유기층을 물로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 화합물(36)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
Figure 112008075651893-pct00101
Figure 112008075651893-pct00102
(4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-일)-아세테이트 (37)의 합성: 디클로로메탄 중 90% 트리플루오로아세트산 용액으로 화합물(36)을 3시간 동안 탈보호시키니 다음, 농축 건조시켰다. 최종 생성물 (37)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
Figure 112008075651893-pct00103
Figure 112008075651893-pct00104
방법 J: 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드나 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 이용하여, 디페닐메틸 3-Fmoc-아미노-4-옥소-부티레이트 (40)를 α-아미노 에스테르 (2)에 의해 환원적 아민화시켜 디페닐메틸 3-Fmoc-아미노-4-(메톡시카르보닐-치환-메틸아미노)-부티레이트 (41)를 제조하였다. 환원적 아민화에 필요한 디페닐메틸 3-Fmoc-아미노-4-옥소-부티레이트 (40)는 Weinreb 아미드 유도체 (39)를 수소화리튬 알루미늄 환원시켜 얻었으며, 상기 아미드 유도체는, 미츠노부 조건 하에서 β-에스테르를 보호함으로써 시판하는 Fmoc-아스파르트산 α-알릴 에스테르 유도체 (38)로부터 형성되었다. 알릴 에스테르를 팔라듐(0) 촉매를 이용한 다음, 커플링제로소 TBTU를 이용하여 Weinreb 아미드 형성시킴으로써 제거하였다. 이어서, 디페닐메틸 3-Fmoc-아미노-4-(메톡시카르보닐-치환-메틸아미노)-부티레이트 (41)를 Fmoc 탈보호시키고, 사이클화시켜 디페닐메틸 에스테르를 수소첨가에 의해 제거한 다음, Fmoc 보호시켜 최종생성물 (4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-일)-아세트산 (37)을 얻었다.
Figure 112008075651893-pct00105
Figure 112008075651893-pct00106
Fmoc-Asp-(OCHPh2) Weinreb 아미드 (39)의 합성: 0℃ 질소하에서 유지된, 3.4 g (13 mmol)의 트리페닐포스핀, 및 2.41 g (13.1 mmol)의 디페틸메탄올을 함유하는 30 mL의 건조 테트라히드로퓨란 중 5.1 g (13.0 mmol)의 Fmoc-아스파르트산 α-알릴 에스테르 (38)의 용액에, 2.6 mL (13.4 mmol)의 디이소프로필 아조디카르복실레이트를 서서히 첨가하였다. 아이스배쓰를 제거하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반한 다음 농축 건조시킨 후 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 1H NMR δ (CDCl3) 2.96-3.06 (dd, 1H, CH2CO), 3.15-3.26 (dd, 1H, CH2CO), 4.18-4.76 (연속적인 m, 3H, CH, CH2), 5.14-5.32 (m, 1H, CHN), 5.76-5.86 (m, 1H, CHO), 7.20-7.80 (연속적인 m, 18H, 풀벤, 및 Ph); HPLC tR = 7.68 분, (M+ + Na+) = 583.90.
이어서 생성물 (9.8 mmol)을 1.5 g (1.3 mmol)의 테트라키스 트리페닐포스핀 팔라듐 (0)을 함유하는 40 mL의 디클로로메탄:아세트산:N-메틸 모르폴린 용액 (37:2:1)에 용해시키고 이 용액을 실온에서 밤새 교반한 다음 농축 건조시키고 100 mL의 에틸 아세테이트와 30 mL의 물 사이에서 분배하였다. 층들을 분리하고, 유기 층을 1 x 50 mL의 물로 세척한 다음, 황산나트륨으로 건조 및 농축시켰다. 잔사를 20 mL의 건조 디클로로메탄에 현탁시키고, 1.65 mL (15 mmol)의 N-메틸 모르폴린, 및 4.07 g (12.7 mmol)의 TBTU를 첨가한 다음 현탁액을 실온에서 20분간 교반한 후, 1.65 mL (15 mmol)의 N-메틸 모르폴린, 및 1.52 g (15.6 mmol)의 N,O-디메틸 히드록실아민 하이드로클로라이드 염을 첨가하였다. 이 현탁액을 실온에서 2시간 교반한 다음, 농축하고 100 mL의 에틸 아세테이트와 50 mL의 물 사이에서 분배하였다. 유기층을 1 x 30 mL의 물, 1 x 30 mL의 중탄산나트륨 포화용액 및 1 x 30 mL의 1N 염산 용액으로 세척한 다음, 황산나트륨으로 건조 및 농축시켰다. 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 1H NMR δ (CDCl3) 2.76-2.88 (dd, 1H, CH2CO), 2.89-3.00 (dd, 1H, CH2CO), 3.16 (s, 3H, CH3N), 3.70 (s, 3H, CH3O), 4.14-4.22 (dd, 1H, CH), 4.28-4.40 (t, 2H, CH2), 5.07-5.16 (dd, 1H, CHN), 5.69-5.76 (d, 1H, CHO), 7.24-7.8 (연속적인 m, 18H, 풀벤, 및 Ph); HPLC tR = 7.08, (M+ + Na+) = 587.03.
디페닐메틸 3-Fmoc-아미노-4-옥소-부티레이트 (40)의 합성: 화합물(9)에 대해 설명된 것과 유사한 공정을 이용하여 화합물 (40)을 제조하였다.
디페닐메틸 3-Fmoc-아미노-4-(메톡시카르보닐-치환-메틸아미노)-부티레이트 (41)의 합성: 알데하이드로서 화합물(40)을 사용한 것을 제외하고, 화합물(10)에 대해 설명된 것과 유사한 공정을 이용하여 화합물 (41)을 제조하였다.
Figure 112008075651893-pct00107
(4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-일)-아세트산 (37)의 합성: 에틸 아세테이트 중 30 mL의 30% 디에틸아민 중 10 mmol의 화합물 (41)의 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 용액을 건조 농축하고, 2 x 30 mL의 에틸 아세테이트에 재용해시킨 다음 재농축시켰다. 잔사를 50 mL의 에탄올 및 20 mL의 1N 염산용액에 용해시키고, 대기압 하 실온에서, 밤새 수소첨가시키고, 셀라이트를 통해 여과 및 농축건조시켰다. 잔사를 20 mL의 테트라히드로퓨란 및 10 mL의 물에 용해시키고, 2.52 g (30 mmol)의 고상 중탄산나트륨을 첨가한 다음, 3.3 g (13 mmol)의 Fmoc-Cl을 첨가하였다. 혼합물을 3시간 교반하고, 100 mL의 에틸 아세테이트로 희석한 다음 층을 분리하고 유기층을 2 x 50 mL의 물로 세척한 다음, 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
Figure 112008075651893-pct00108
방법 K: 시판하는 Fmoc-아스파르트산 α3차-부틸 에스테르 (42)로부터 출발하여 (5-치환-6-옥소-피페라진-2-일)-아세트산 스캐폴드를 합성한다. 혼합 무수물을 통해 소듐 보로하이드라이드를 이용하여 Fmoc-아스파르트산 α 3차-부틸 에스테르를 Fmoc-호모세린으로 환원시킨 다음, 알코올을 벤질 브로마이드로 보호하여Fmoc-호모세린 벤질 에테르 α 3차-부틸 에스테르 (43)을 얻었다. 이 3차-부틸 에스테르를 트리플루오로아세트산을 이용하여 제거하고, 혼합 무수물을 통해 소듐 보로하이드라이드를 이용하여 산을 알코올로 환원시켜 2-Fmoc-아미노-4-벤질옥시-1-부탄올 (44)를 얻었다. 이어서 전술한 바와 같이 Dess-Martin 퍼요오디난을 이용하여 알코올 (44)을 2-Fmoc-아미노-4-벤질옥시부탄알 (45)로 전환시켰다. 2-Fmoc-아미노-4-벤질옥시부탄알 (45) 및 α-아미노 에스테르 (2)의 환원적 아민화에 의해 (2-Fmoc-아미노-4-벤질옥시-부틸아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (46)을 얻는다. 디에틸 아민에 의한 Fmoc 탈보호에 의해 유리 일차 아민을 얻고 이를 사이클화하여 6-벤질옥시에틸-3-치환-피페라진-2-온을 자연적으로 얻는다. 이 벤질 에테르를 수소첨가에 의해 제거하고, 2차 아민을 그의 Fmoc 유도체로서 보호시켜 4-Fmoc-6-히드록시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (47)을 얻었다. 마지막으로, 일차 알코 올을 산이 되도록 산화시켜 최종 생성물(48)을 방법 A에 설명된 바와 같이 얻었다.
Figure 112008075651893-pct00109
Fmoc-Homo세린 (OBn) α 3차-부틸 에스테르 (43)의 합성: 질소 하, -20℃에서 유지된 50 mL의 건조 테트라하ㅣ드로퓨란 중 10.0 mmol의 Fmoc Asp-O t Bu (42) 용액에, 1.77 mL (12.7 mmol)의 트리에틸 아민을 첨가한 다음, 1.57 mL (12.0 mmol)의 이소부틸클로로포르메이트를 서서히 첨가하였다. 이 혼합물을 30분간 교반한 다음, 10 mL 물 중 소듐 보로하이드라이드 3.77g (99.6 m mol)의 빙냉 용액에 서서히 붓고, 온도를 5℃ 미만으로 유지하였다. 반응물을 0℃에서 15분간 교반한 다음, 1N 염산 용액으로 중단시켰다. 반응 혼합물을 100 mL의 에틸 아세테이트로 희석하고, 2 x 25 mL의 물로 세척한 다음, 황산마그네슘으로 건조 및 농축시키고 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이어서 정제된 화합물을 30 mL의 테트라히드로퓨란에 용해시키고, 미네랄 오일 중 12 mmol의 60% 소듐 하이드라이드 분산액을 첨가한 다음, 0.2 mmol의 테트라부틸암모늄 요오다이드 및 12 mmol의 벤질 브로마이드를 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반한 다음 50 mL의 중탄산나트륨 포화수용액으로 중단시킨 후 100 mL의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 이어서 이 화합물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.
2-Fmoc-아미노-4-벤질옥시-1-부탄올 (44)의 합성: 방법 I에서 화합물(37)에 대해 설명된 바와 같이, 90% 트리플루오로아세트산을 이용하여 3차-부틸 에스테르를 탈보호시킨 다음, 화합물 (13)에 대해 설명된 바와 같이 혼합 무수물 중간체를 경유하여 소듐 보로하이드라이드로 산을 알코올로 환원시켰다.
2-Fmoc-아미노-4-벤질옥시-부탄알 (45)의 합성: 화합물(9)의 합성에 대해 설명된 바와 같이 Dess-Martin 퍼요오디난을 이용하여 2-Fmoc-아미노-4-벤질옥시-1-부탄올 (44)을 알데하이드로 산화시켰다.
(2-Fmoc-아미노-4-벤질옥시-부틸아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (46)의 합성: 화합물 (10)의 합성에 대해 설명한 바와 같이, 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 이용하여 2-Fmoc-아미노-4-벤질옥시-부탄알 (45)을 α-아미노 에스테르 (2)로 환원적 아민화시켰다.
4-Fmoc-6-히드록시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (47)의 합성: 방법 J에서 화합물(37)에 대해 설명된 바와 같이, 부수적인 사이클화를 수반하는 (2-Fmoc-아미노-4-벤질옥시-부틸아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (46)의 Fmoc 탈보호에 이어 탈벤질화 및 Fmoc 재보호를 수행한다.
4-Fmoc-5-치환-6-옥소-피페라진-2-일-아세트산 (37)의 합성: 방법 A에 설명된 바와 같이 4-Fmoc-6-히드록시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (47)을 산이 되도록 산화시킨다. 사용된 산화제의 선택은 5-위치에 있는 기의 특성에 의해 좌우된다.
2치환 3-옥소-[1,4]-디아제판-5-카르복실산 스캐폴드의 합성 (방법 L, M, N)
여러가지 방법에 의해 2치환 3-옥소-[1,4]-디아제판-5-카르복실산 스캐폴드를 제조한다.
방법 L: 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드를 이용하여, 아미노 에스테르(51)로 3차-부틸 Cbz-2-아미노-4-옥소-부티레이트 (50)를 환원적 아민화시킨 다음, 2차 아민을 Boc보호시킴으로써 3차-부틸 2-Cbz-아미노-4-(벤질옥시카르보닐-치환-메틸-Boc 아미노)-부티레이트 (52)를 제조한다. 환원적 아민화에 필요한 아미노 에스테르 (51) 3차-부틸 Cbz-2-아미노-4-옥소-부티레이트 (50)은 Weinreb 아미드 유도체 (49)의 리튬 알루미늄 하이드라이드 환원에 의해제조한다. 보호기 제거에 의해 디아제판 고리를 형성시킨 다음, 펩타이드 형성 시약으로 사이클화시킴으로써 화합물(53)을 얻는다. 마지막으로, 보호기 교환에 의해, 4-Fmoc-2치환 3-옥소-[1,4]-디아제판-5-카르복실산 (54)을 형성한다.
Figure 112008075651893-pct00110
Cbz-Asp-(Weinreb 아미드)-O t Bu (49)의 합성: 화합물 (14)에 대해 설명한 것과 유사한 공정을 이용하여 화합물 (49)를 제조한다..
3차-부틸 3-Cbz-아미노-4-옥소-부티레이트 (50)의 합성: 화합물 (9)에 대해 설명한 것과 유사한 공정을 이용하여 화합물 (50)을 제조한다.
3차-부틸 2-Cbz-아미노-4-(벤질옥시카르보닐-치환-메틸아미노)-부티레이트 (52)의 합성: 화합물(10)에 대해 설명한 것과 유사한 공정을 이용하여 환원적 아민화를 수행한다.조질의 혼합물을 테트라히드로퓨란 중 2 당량의 Boc 디카보네이트와 반응시킴으로써 2차 아민을 보호시킨다.
3차-부틸 1-Boc 2-치환-3-옥소-[1,4]-디아제판-5-카르복실레이트 (53)의 합성: 30 mL 에탄올 중 10 mmol의 화합물 (52) 용액을 대기압 하 실온에서 2시간 동안 수소첨가하고, 셀라이트를 통해 여과한 다음 농축 건조시켰다. 잔사를 100 mL 디클로로메탄에 용해시키고, 1.2 당량의 TBTU와, 2.6 당량의 N-메틸-모르폴린을 첨가한다. 이 용액을 실온에서 밤새 교반한 다음 농축시켰다. 잔사를 50 mL의 에틸 아세테이트와 25 mL의 1N 염산 용액 사이에서 분배하고, 1 x 20 mL의 중탄산나트륨 포화용액으로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다.
1-Fmoc 2-치환-3-옥소-[1,4]-디아제판-5-카르복실산 (54)의 합성: 디클로로메탄 중 10 mL의 90% 트리플루오로아세트산 중 10 mmol의 화합물 (53)의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 이 용액을 농축 건조시켰다. 잔사를 20 mL의 테트라히드로퓨란과 10 mL의 물에 용해시키고, 2.52 g (30 mmol)의 고상 중탄산나트륨을 첨가한 다음, 3.36 g (13 mmol)의 Fmoc-Cl을 첨가하였다. 이 혼합물을 3시간 교반한 다음, 에틸 아세테이트로 희석하였다. 층을 분리하고, 유기층을 2 x 50 mL의 물로 세척한 다음, 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다.
방법 M: 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 이용하여 디페닐메틸 Alloc-2-아미노-4-옥소-부티레이트 (59)를 아미노 에스테르 (29)로 환원적 아민화시킨 다음, 2차 아민을 Cbz 보호시킴으로써 환원된 디펩타이드 유사체(60)을 제조하였다. 환원적 아민화에 필요한 디페닐메틸 Alloc-2-아미노-4-옥소-부티레이트 (59)는 Weinreb 아미드 유도체(57)의 보호기 교환에 의해 제조된 Winreb 아미드 유도체(58)의 수소화리튬 알루미늄 환원에 의해 제조한 다. 이어서 알릴 및 alloc기 제거, 및 이어서 펩타이드 형성제 존재 하에 폐환시킴으로써 디아제판 고리를 형성한다. 2-치환 3-옥소[1,4]-디아제판-5-카르복실산 스캐폴드(54)를 보호기 교환에 의해 형성한다.
Figure 112008075651893-pct00111
Figure 112008075651893-pct00112
Fmoc-Asp-(Weinreb 아미드)-OCHPh2 (57)의 합성: 화합물(39)에 설명된 것과 유사한 공정에 의해 화합물 (57)을 제조한다.
Alloc-Asp-(Weinreb 아미드)-OCHPh2 (58)의 합성: 에틸 아세테이트 중 20 mL의 30% 디에틸아민 중 10 mmol의 화합물 (56)의 용액을 2시간 동안 교반한 다음 농축 건조시켰다. 잔사를 20 mL의 테트라히드로퓨란 및 10 mL의 물에 용해시키고, 2.52 g (30 mmol)의 고상 중탄산나트륨을 첨가한 다음 13 mmol의 Alloc-Cl을 첨가하였다. 혼합물을 3시간 교반한 다음 에틸 아세테이트로 희석한다. 층을 분리하고, 유기층을 물로 세척한 다음 황산마그네슘으로 건조 및 농축시켰다. 화합물(58)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.
디페닐메틸 3-Alloc-아미노-4-옥소-부티레이트 (59)의 합성: 화합물 (9)에 대해 설명된 것과 유사한 공정을 이용하여 화합물 (59)를 제조한다.
디페닐메틸 2-Alloc-아미노-4-(알릴옥시카르보닐-치환-메티아미노)-부티레이트 (60)의 합성: 알데하이드로서 화합물(59)를 사용한 것을 제외하고, 화합물(15)에 대해 설명된 것과 유사한 공정을 이용하여 환원적 아민화에 의해 화합물 60을 제조한다. 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.
디페닐메틸 1-Cbz 2-치환-3-옥소-[1,4]-디아제판-5-카르복실레이트 (61)의 합성: 질소 하 실온에서 유지된 30 mL의 디클로로메탄 중 10 mmol의 화합물 (60)의 용액에, 2 당량의 페닐실란과 0.3 당량의 테트라키스트리페닐포스핀 팔라듐(0)을 첨가하고 이 용액을 2시간 교반한 다음, 1.2 당량의 TBTU 및 1.3 당량의 N-메틸-모르폴린을 첨가한다. 용액을 실온에서 밤새 교반한 다음 농축한다. 잔사를 50 mL의 에틸 아세테이트 및 25 mL의 1N 염산 용액 사이에서 분배하고, 1 x 20 mL의 중탄산나트륨 포화용액으로 세척한 다음, 황산마그네슘으로 건조 및 농축하였다.
1-Fmoc 2-치환-3-옥소-[1,4]-디아제판-5-카르복실산 (54)의 합성: 30 mL 에탄올 중 10 mmol의 화합물 (61) 용액을 실온에서 2시가나 동안 수소첨가하고, 셀라이트를 통해 여과한 다음 용액을 농축 건조시킨다. 잔사를 20 mL의 테트라히드로퓨란 및 10 mL의 물에 용해시키고, 2.52 g (30 mmol)의 고상 중탄산나트륨을 첨가한 다음, 3.36 g (13 mmol)의 Fmoc-Cl을 첨가한다. 혼합물을 3시간 동안 교반한 다음, 에틸 아세테이트로 희석한다. 층을 분리하고, 유기층을 물로 세척한 다음, 황산마그네슘으로 건조 및 농축시킨다.
방법 N: 혼합 무수물을 경유하여, Fmoc-아스파르트산 β 3차-부틸 에스테르 를 소듐 보로하이드라이드에 의해 Fmoc-아스파르탄올 β 3차-부틸 에스테르 (63)으로 환원시켜 Fmoc-아스파르탄올 알릴 에테르 β 3차-부틸 에스테르 (64)를 제조한다. 이어서 3차-부틸 에스테르를 트리플루오로아세트산으로 제거하고, 혼합 무수물을 경유하여 소듐 보로하이드라이드에 의해 산을 알코올이 되도록 환원시켜 3-Fmoc-아미노-4-알릴옥시-1-부탄올 (65)을 얻는다. 이어서 전술한 바와 같이 Dess-Martin 퍼요오디난을 이용하여 알코올 (65)을 3-Fmoc-아미노-4-알릴옥시부탄올 (66)로 전환시킨다. 3-Fmoc-아미노-4-알릴옥시부탄알 (66) 및 α 아미노 에스테르(51)의 환원적 아민화와 후속적인 2차 아민 상의 alloc 보호에 의해, (3-Fmoc-아미노-4-알릴옥시-부틸-alloc-아미노)-2치환 아세트산 벤질 에스테르 (67)를 얻는다. 벤질 에스테르의 비누화 및 그에 이은 디에틸 아민에 의한 Fmoc 탈보호에 의해 유리 일차 아민을 얻고, 이를 TBTU와 같은 펩타이드 형성 시약을 이용하여 사이클화함으로써 Alloc 7-알릴옥시메틸-3-치환-[1,4]-디아제판-2-온 (68)을 형성시킨다. 최종 생성물 (54)는 보호기 교환에 의해 형성된다; 알리리 에테르와 alloc을 팔라듐(0)에 의해 제거하고, 2차 아민을 그의 Fmoc 유도체로서 보호하여 4-Fmoc-7-벤질옥시메틸-3-치환-[1,4]-디아제판-2-온을 얻은 다음, 산이 되도록 일차 알코올 산화시켜, 최종 생성물 (54)를 얻는다. 사용되는 산화제의 선택은 2-위치에 있는 기의 특성에 좌우된다.
Figure 112008075651893-pct00113
Fmoc-아스파르탄올 β 3차-부틸 에스테르 (63)의 합성: 출발물질로서 Fmoc-Aspartic acid β 3차-부틸 에스테르 (62)를 이용하여 화합물(13)의 합성에 설명된 것과 같이 화합물 (63)을 제조한다.
3-Fmoc-아미노-4-알릴옥시-부티르산 3차-부틸 에스테르 (64)의 합성: 질소 하, 실온에서 유지된 30 mL의 테트라히드로퓨란 중 10 mmol의 (63)의 용액에, 미네랄 오일 중 12 mmol의 60% 소듐 하이드라이드 분산액, 2 mmol의 테트라부틸암모늄 요오다이드, 및 13 mmol 알릴 브로마이드를 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반한 다음, 10 mL의 중탄산나트륨 포화수용액으로 중단시키고, 50 mL의 에틸 아세테이트로 추출하였다.
3-Fmoc-아미노-4-알릴옥시-1-부탄올 (65)의 합성: 화합물(44)의 합성에 대해 설명된 바와 같이 화합물 (65)를 제조한다.
3-Fmoc-아미노-4-알릴알릴옥시-부탄알 (66)의 합성: 화합물 (9)의 합성에 대해 설명된 바와 같이 Dess-Martin 퍼요오디난을 이용하여 3-Fmoc-아미노-4-알릴옥시-1-부탄올 (65)을 알데하이드가 되도록 산화시킨다.
(3-Fmoc-아미노-4-알릴옥시-부틸-alloc-아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (67)의 합성: 화합물(10)에 대해 설명된 바와 같이 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 이용하여 α-아미노 에스테르(51)에 의해 3-Fmoc-아미노-4-벤질옥시-부탄알 (66)을 환원적으로 아민화시킨 다음, 벤질 클로로포르메이트 대신 알릴 클로로포르메이트를 사용한 것을 제외하고 화합물(15)에 대해 설명된 것과 같이, 2차 아민을 alloc 유도체로서 보호 한다.
4-Alloc-7-알릴옥시메틸-3-치환-[1,4]-디아제판-2-온 (68)의 합성: 20 mL의 메탄올, 및 10 mL의 물 중 10 mmol의 (3-Fmoc-아미노-4-알릴옥시-부틸-alloc-아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (67), 20 mmol의 탄산칼륨의 용액을 실온에서 3시간 교반하고, 21 mL의 1N 염산 용액으로 중화한 다음 농축 건조시켰다. 잔사를 에틸 아세테이트 중 20 mL의 30% 디에틸 아민에 용해시키고 3시간 교반한 다음, 농축 건조시켰다. 잔사를 100 mL의 디클로로메탄에 용해시키고, 12 mmol의 TBTU 및 24 mmol의 N-메틸모르폴린을 첨가한 다음, 이 용액을 실온에서 밤새 교반한 다음 농축 건조시켰다. 잔사를 30 mL의 에틸 아세테이트 및 30 mL의 1N 염산 용액 사이에서 분배한 다음, 층을 분리하였다. 유기층을 30 mL의 중탄산나트륨 포화용액으로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조한 다음 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.
4-Fmoc-2-치환-3-옥소-[1,4]-디아제판-5-카르복실산 (54)의 합성: 질소 하 실온에서 유지된 30mL의 디클로로메탄 중 10 mmol의 화합물 (68)의 용액에, 2 당량의 페닐실란과 0.3 당량의 테트라키스페닐포스핀 팔라듐(0)을 첨가하고, 이 용액을 2시간 교반한 다음 농축 건조시켰다. 2차 아민을 20 mL의 테트라히드로퓨란, 및 10 mL의 물에 용해시킨 다음, 2.52 g (30 mmol)의 고상 중탄산나트륨과 1.2 당량의Fmoc-Cl을 첨가하고 이 이중상 용액을 실온에서 2시간 교반한 다음, 30 mL의 에틸 아세테이트로 희석한 후 층을 분리하였다. 방법 A에 설명된 바와 같이 4-Fmoc-7-히드록시메틸-3-치환-[1,4]-디아제판-2-온을 산화시켜 최종 생성물(54)을 얻는다. 사용되는 산화제의 선택은 화합물 (6)을 (7)로 전환시키는데 사용된 방법 A에서와 같이, 2-위치에 있는 기의 특성에 좌우된다.
6-치환-5-옥소-피페라진-2-카르복실산 스캐폴드의 합성 (방법 O)
6-위치에 비관능화 측쇄를 함유하는 6-치환-5-옥소-피페라진-2-카르복실산 스캐폴드의 합성은 방법 O에 개략된 바와 같이 수행하며, 시판하는 3-Fmoc-아미노-1,2-프로판-디올 1-클로로-트리틸 수지(69)로부터 출발하여 이를 Dess-Martin 퍼요오디난을 이용하여 케톤(70)으로 산화시킨다. 케톤(70)을 α 아미노 에스테르(2)로 환원 적 아민화시켜 수지 결합된 (1-아미노메틸-2-클로로-트리틸옥시-에틸아미노)-2치환 아세트산 메틸 에스테르 (71)를 얻고, 아민을 탈보호한 뒤 이를 사이클화시켜, 5-클로로트리틸옥시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (72)을 얻는다. 2차 아민을 재보호한 다음, 수지로부터 절단하여 Fmoc-5-히드록시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (73)을 얻고, 방법 A에 설명된 것 중 어느 하나의 공정을 이용하여 이를 산화시켜 6-치환-5-옥소-피페라진-2-카르복실산 (74)를 얻는다.
Figure 112008075651893-pct00114
1-아미노-3-클로로트리틸옥시-프로판-2-온(70)의 합성: 삼산화황 산화, NMO/TPAP(N-메틸모르폴린-N-옥사이드/테트라프로필 암모늄 퍼루테네이트)산화 또는 PDC 산화를 이용하여 수지 결합 알코올(69)을 산화시킨다. 삼산화황 산화의 경우, Parikh, J.R. 및 Doering, W.V., J. Am. Chem. Soc. 89:5505-5507 (1967)에 설명된 것과 유사한 공정을 이용한다. NMO/TPAP 산화의 경우, 0.3 mmol의 수지-결합 알코 올 용액에 10 mL의 건조 디메틸포름아미드 중 3 mmol의 N-메틸모르폴린 N-옥사이드용액을 첨가한 다음, 이 수지 현탁액에 0.06 mmol의 테트라프로필암모늄 퍼루테네이트(TPAP)를 첨가한다. 반응물을 80분간 진탕시킨다. 용매를 배수하고, 수지를 테트라히드로퓨란 및 디클로로메탄으로 세척한 다음, 진공 건조시킨다. PDC 산화의 경우, 디메틸포름아미드 중 0.2M 피리디늄 디크로메이트 중의 수지 결합 알코올의 현탁액을 37℃에서 4시간 진탕시키고, 용매를 배수한 다음 수지를 디메틸포름아미드, 테트라히드로퓨란 및 디클로로메탄으로 세척하였다.
(1-아미노메틸-2-클로로-트리틸옥시-에틸아미노)-2-치환 아세트산 메틸 에스테르(71)의 합성: 2가지 방법 중 한 방법에 의해 아미노산으로 수지 결합 케톤(70)을 환원적 아민화시킨다. 한가지 방법에서, 디메틸포름아미드 중 20 mL의 1% 아세트산 중 α 아미노 에스테르92) 2.6 mmol의 용액을 2.6 mmol의 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드에 첨가한 다음, 케톤-유도화된 수지(70) 0.5mmol을 즉시 첨가하고, 이 혼합물을 60분간 진탕시킨 다음 메탄올, 10% 디-이소프로필 에틸 아민, 디메틸포름아미드, 및 메탄올로 헹군다. 두번째 방법에서는, 0.05M 소듐 시아노보로하이드라이드를 함유하는, 메탄올 중 0.05 mmol의 케톤-유도화된 수지 (70) 및 2.0 M α 아미노 에스테르 하이드로클로라이드(2)의 현탁액을 실온에서 5시간 동안 진탕하고, 배수 및 세척한다.
5-클로로트리틸옥시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (72)의 합성: 디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘 10 mL 중 0.05 mmol의 현탁액을 실온에서 2시간 진탕한다.
Fmoc-5-히드록시메틸-3-치환-피페라진-2-온 (73)의 합성: 0.25 mmol의 Fmoc- Cl 및 0.25 mmol의 트리에틸 아민을 함유하는 10 mL의 디클로로메탄 중, 0.05mmol의 화합물(72)의 현탁액을 실온에서 6시간 교반하고, 배수 및 디클로로메탄으로 세척한다. 수지를 디클로로메탄 중 95% 트리플루오로아세트산 10 mL에 재현탁하고, 현탁액을 2시간 진탕 및 여과하고 여액을 농축시킨다.
Fmoc-6-치환-5-옥소-피페라진-2-카르복실산 (74)의 합성: 방법 A에 설명된 여하한 공정에 의해 화합물 (73)을 소망하는 생성물이 되도록 산화시킨다.
α,α-이치환 아미노산의 합성 (방법 P 및 Q)
본 발명의 특정 구조물에서, 치환기가 서로 같거나 다른 α,α-이치환 아미노산과 같은 이치환 아미노산 잔기를 사용하는 것이 가능하며 또한 이를 고려할 수 있다. 한가지 측면에서, α,α-이치환 아미노산을 Aaa1 또는 Aaa8 위치에 사용하고, 여기서, α,α-이치환 아미노산의 측쇄 중 적어도 하나는 Nle, Ala, Leu, Ile, Val, Nva, Met(O) 또는 Met(O2)의 측쇄이다. 다음의 합성방법 P 및 Q는 α,α-디-n-부틸글라이신 (2-아미노-2-부틸-헥산산)의 제조 방법을 설명하는 것인데, 각각의 측쇄는 -(CH2)3-CH3이므로 이들 각각은 Nle의 측쇄와 동일하다. 그러나, 치환기가 서로 같거나 다른 여타의 α,α-이치환 아미노산을 제조하는데도 유사한 방법과 반응을 사용할 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, α,α-이치환 아미노산의 어떠한 제조방법이든 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있으며, 본 발명의 실시는 다음의 합성 반응 방법에 국한되는 것은 아니다. 다라서, α,α-이치환 아미노산의 공지 합성 방법은 모두 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있다. 다음의 문헌들은 α,α- 이치환 아미노산을 제조하는 대안적인 방법을 개시하고 있다. Clark J.S. 및 Middleton M.D.: Synthesis of novel alpha치-substituted and alpha,alpha-disubstitued amino acid by rearrangement of ammonium ylides generated from metal carbenoids. Org. Lett. 4(5):765-8 (2002); Guino M., Hii K.K.: Wang-aldehyde resin as a recyclable support for the synthesis of alpha,alpha-disubstitued amino acid derivatives. Org Biomol. Chem. 3(17):3188-93 (2005); 및 Kotha S., Behera M.: Synthesis and modification of dibenzylglycine derivatives via the Suzuki-Miyaura cross-coupling reaction. J. Pept. Res. 64(2):72-85 (2004).
Figure 112008075651893-pct00115
벤조일 디-n-부틸글라이신 (80)의 합성: 질소 하, 0℃에서 유지된 20 mL 디클로로메탄 중 10 mmol 벤조일 글라이신 (75) 용액에, 12 mmol의 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC)를 서서히 첨가하고, 반웅물을 2시간 교반하여 화합물 (76)을 생산한다. 고체를 여과하고, 여액을 농축하였다. 잔사를 15 mL 테트라히드로퓨란 중에 용해하고, 0℃로 냉각한 다음 24 mmol의 소듐 하이드라이드를 첨가한 후 30 mmol의 n-부틸 브로마이드를 첨가한다. 이 현탁액을 0℃에서 2시간 교반한 다음 실온으로 승온시키고, 용액을 농축 건조시켜 화합물 (77)을 생산한다. 또 다른 방 법으로, 화합물 (77)은 또한 12 mmol의 소듐 하이드라이드 및 15 mmol의 n-부틸 브로마이드가 사용되는 것을 제외하고, 유사한 방법으로 벤조일 노르류신(78)로부터 제조될 수 있다. 화합물 (77)을 메탄올에 용해시키고, 50 mL의 1N 염산을 첨가한 다음, 용액을 2시간 교반 및 농축하였다. 화합물(80)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.
Fmoc 디-n-부틸글라이신 (81)의 합성: 10 mmol의 화합물 (80)을 30 mL의 디옥산에 첨가하고, 용액을 밤새 환류시킨다. 반응물을 실온으로 냉각하고, 농축 건조시킨 다음 30 mL의 테트라하이드로퓨란에 재용해시킨 다음, 10 mL의 물 및 30 mmol의 중탄산나트륨을 첨가한 후, 15 mmol의 Fmoc-Cl을 첨가한다. 이 이중상 용액을 1시간 교반하고, 테트라히드로퓨란을 진공 하에 제거한다. 수용액을 1 x 50 mL의 디에틸 에테르로 추출하고, 1N 염산 용액으로 산성화시킨 다음, 2 x 50 mL의 에틸 아세테이트로 추출한다. 에틸 아세테이트 층을 결합시키고 황산나트륨으로 건조 및 농축시킨다. 화합물(81)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.
적절한 아미노산 유도체 (화합물 78과 유사한 것)로부터 출발하여, 유사한 방법을 사용할 수 있으며, 적절한 알킬 부틸, 아릴 부틸 또는 아르알킬 부틸 시약을 사용함으로써, 이 반응에 의해 R과 R'이 서로 다른 여러가지 다양한 이치환 (R,R') 아미노산 대체물을 얻는다.
Figure 112008075651893-pct00116
Fmoc - α,α 디-n-부틸 글라이신 (87)의 합성: 실온에서 유지된 40 mL의 건조 테트라히드로퓨란 중 20 mmol의 글라이신 메틸 에스테르 하이드로클로라이드 (82), 및 2 g의 분말화된 분자체의 현탁액에, 24 mmol의 수산화칼륨을 첨가한 다음 22 mmol의 벤즈알데하이드를 첨가한다. 현탁액을 2시간 교반하고, 여과한 다음 여액을 농축한다. 잔사를 40 mL의 건조 톨루엔에 재용해시킨 다음, 톨루엔 중 60 mmol의 소듐 하이드라이드 현탁액에 첨가한 다음, 60 mmol의 n-부틸 브로마이드를 첨가한다. 이 현탁액을 12시간 교반한 다음, 30 mL의 6N 염산 용액을 첨가하고 실온에서 2시간 교반한 다음 층을 분리한다. 이렇게 얻어진 하이드로클로라이드 염 (84)를 화합물 (87)의 제조를 위해 in situ 사용한다. (84)를 하이드로클로라이드 염으로서 분리하기 위해 수층을 농축 건조시키고 생성물을 건조 메탄올-에테르로부터 결정화시킨다.
또한, (86)을 (84)로 전환시키는데 30 mmol의 n-부틸 브로마이드와 30mmol의 소듐 하이드라이드를 사용한 것을 제외하고, 유사한 합성 공정을 이용하여 노르류신 메틸 에스테르 하이드로클로라이드로부터 화합물 (84)를 제조할 수 있다.
전술한 바와 같이 수득된 화합물(84)의 하이드로클로라이드 형태의 수성 혼합물을 1시간 동안 가열 환류시킨 다음 실온으로 냉각한다. 이를 고상 수산화나트륨으로 중화시킨 다음 30 mL의 테트라하이드로퓨란으로 희석한다. 중탄산나트륨 (30 mmol)을 첨가한 다음 15 mmol의 Fmoc-Cl을 첨가한다. 이중상 용액을 1시간 교반하고, 진공 하에서 테트라히드로퓨란을 젝한다. 수용액을 1x50 mL의 디에틸 에테르로 추출하고, 1N 염산 용액으로 산성화한 다음, 2 x 50 mL의 에틸 아세테이트로 추출한다. 에틸 아세테이트 층을 결합시키고 황산나트륨으로 건조 및 농축시킨다. 화합물(87)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.
적절한 아미노산 유도체 (화합물 85와 유사한 것)로부터 출발함으로써 유사한 방법을 사용하고, 적절한 알킬 부틸, 아릴 부틸, 또는 아르알킬 부틸 시약을 사용함으로서 R'과 R'이 서로 다른 다양한 이치환 (R, R') 아미노산 대체물들을 생산할 수 있다.
이치환 (R, R') 스캐폴드의 합성 (방법 R)
본 발명은 두개의 R기, R 및 R'를 갖는 아미노산 대체물이 사용되는 구조물을 제공한다. 다음의 방법은 Fmoc 보호된 (R)-5,5-di부틸-6-옥소-피페라진-2-카르 복실산의 합성 방법을 설명한 것으로, 여기서 R 및 R'은 각각 노르류신 측쇄 모이어티에 대응하는 기이다. 하기의 방법을 부분적으로 전술한 방법에 기초하여 변형시킴으로서 유사하게 이치환된(R, R') 아미노산 대체물들을 얻을 수 있음을 이해할 것이다. 유사한 방법들은 적절한 아미노산 유도체 (화합물(84)에 유사한 화합물)을 출발물질로 할 수 있으며, 이러한 반응에 의해 R과 R'이 상이한 여러가지 이치환 (R,R') 아미노산 대체물을 생산할 수 있다.
Figure 112008075651893-pct00117
(2-Fmoc-아미노-3-3차-부톡시-프로필아미노)-2,2,디-n-부틸 아세트산 메틸 에스테르 (88)의 합성: 50 mL 건조 테트라히드로퓨란 중 21 mmol의 (84, 반응도 Q), 및 2.9 mL (21 mmol)의 트리에틸 아민의 현탁액을 실온에서 45분간 교반한 다음 30 mL 중 ~ 20 mmol 조질의 Fmoc-(O-t-부틸)-세린알 (9, 반응도 D) 용액을 첨가한 다음, 1.7 g의 4Å 분말상 분자체를 첨가한 후 현탁액을 다시 2시간 교반한다. 6.4 g (30 mmol)의 고상 소듐 트리아세톡시모로하이드라이드를 첨가하고, 현탁액을 실온에서 밤새 교반한다. 현탁액을 메탄올로 희석하고, 분자체를 여과한 다음 여액을 통축한다. 잔사를 100 mL의 에틸 아세테이트 및 50 mL의 물 사이에서 분배한다. 유기층을 황산나트륨으로 건조하고 농축한다. 화합물(88)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.
4-Fmoc-6-히드록시메틸-3,3-di-n-부틸-피페라진-2-온 (89)의 합성: 에틸 아세테이트 중 30% 디에틸 아민 30 mL 중 10 mmol의 화합물 (88)의 용액을 실온에서 밤새 교반한 다음 농축 건조시킨다. 잔사를 20 mL 테트라히드로퓨란과 10 mL의 물에 용해시키고, 2.52 g (30 mmol)의 고상 중탄산나트륨을 첨가한 후, 3.36 g (13 mmol)의 Fmoc-Cl을 첨가한다. 이 혼합물을 3시간 교반하고, 에틸아세테이트 50 mL로 희석한 다음, 층을 분리하고 유기층을 30 mL 물로 세척한 다음, 황산마그네슘으로 건조 및 농축시킨다. 조질의 혼합물을 디클로로메탄 중 90% 트리플루오로아세트산 10 mL의 용액에 용해시키고, 2시간 교반한 다음 농축 건조시킨다. 잔사를 에틸 아세테이트에 용해시키고 50 mL의 중탄산나트륨 포화 용액으로 세척한 다음 황산 마그네슘으로 건조 및 농축시킨다. 화합물(89)를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.
4-Fmoc-5,5-디-n-부틸-6-옥소-피페라진-2-카르복실산 (90)의 합성: 실온에서 유지된 81 mL의 아세토니트릴 중 8 mmol 알코올 (89) 용액에, 포스페이트 완충 용액 (29.5 mL 물 중 0.72 g의 소듐 포스페이트 모노베이직 및 1.43 g의 소듐 포스페이트 디베이직으로 제조됨)을 첨가하고, 0.33g (2.1 mmol)의 TEMPO, 및 1.86 g (16.5 mmol)의 소듐 클로라이트를 첨가한 후, 이 이중상 용액을 43℃로 유지된 유조에 넣는다. 4.3 mL(2.6 mmol)의 소듐 하이포클로라이트 용액 (1.9 mL의 10-13% 소듐 하이포클로라이트 용액 및 2.4 mL의 물을 혼합하여 제조함)을 서서히 첨가한다. 반응물을 43℃에서 4시간 교반하고 50 mL의 에틸 아세테이트로 희석한 다음 층을 분리한다. 유기층을 1 x 10 mL 식염수, 1 x 10 mL의 1N 염산 용액으로 세척하고 황산나트륨으로 건조 및 농축시킨다. 화합물 (90)을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.
6. 화학식 I의 대체물을 포함하는 화합물의 합성 방법
본 발명의 몇가지 구체예에 개시된 바와 같은 화학식 I의 하나 이상의 대체물을 포함하는 화합물들은 아미노산들 사이의 펩타이드 결합을 형성하기 위한 공지의 통상적인 방법에 의해 쉽게 합성될 수 있다. 이러한 통상적인 방법으로는, 예컨대, 카르복실기나 기타 보호된 반응성기를 갖는 아미노산 잔기의 유리 알파 아미노기와 아미노기 또는 기타 보호된 반응성기를 갖는 또 다른 아미노산 잔기의 유리 일차 카르복실기 사이의 축합을 가능케하는 고상 공정을 들 수 있다. 바람직한 통상적인 공정에서, 본 발명의 구조물은 기술 분야에 알려진 고상 합성 및 정제 공정에 의해 합성될 수 있다. 본 발명의 아미노산 대체물은 잔기에 대해 사용된 것과 실제로 유사하거나 동일한 방법을 이용함으로써 본 발명의 화합물 내로 통합될 수 있다. 여러가지 수지와 시약을 사용하는 많은 공지의 공정들을 이용하여 본 발명의 화합물을 제조할 수 있다.
화합물의 합성 방법은 소망되는 서열의 아미노산 또는 아미노산 대체물 각각을 다른 아미노산 잔기 또는 아미노산 대체물에 연속적으로 한번에 하나씩 부가하는 방법에 의해, 또는 하나 이상의 아미노산 대체물을 포함할 수 있는 소망되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 단편을 먼저 통상적으로 합성한 다음 축합시켜 소망 화합물을 얻는 방법에 의해 수행가능하다. 얻어진 화합물을 사이클화시켜 본 발명의 사이클 구조물을 생산한다.
고상 펩타이드 합성법은 기술 분야에 잘 알려져 있으며 실제로 실시되고 있다. 이러한 방법에서 본 발명의 화합물의 합성은 소망되는 아미노산 잔기 또는 아미노산 대체물을 고상 방법의 일반적인 이론에 따라 성장중의 펩타이드쇄에 한번에 하나씩 연속적으로 부가하는 방식으로 수행할 수 있다. 이러한 방법은 Merrifield R.B., Solid phase synthesis (Nobel lecture). Angew. Chem. 24:799-810 (1985) 및 Barany et al., The Peptides, Analysis, Synthesis 및 Biology, Vol. 2, Gross E. 및 Meienhofer J., Eds. Academic Press, 1-284 (1980)을 비롯한 여러 문헌에 개시되어 있다..
화합물을 화학적으로 합성하는데 있어서, 여러가지 아미노산 잔기 또는 아미노산 대체물의 반응성 측쇄기를 적절한 보호기로 보호시켜 보호기가 제거될 때까지 그 부위에서 화학 반응이 일어나는 것을 방지한다. 또한 아미노산 잔기나 아미노산 대체물의 알파 아미노기를 보호하는 한편, 그것이 카르복실기에서 반응한 다음, 알 파 아미노 보호기를 선택적 제거하여 후속반응이 그 부위에서 일어나도록 하는 방식도 흔한 방법이다. 특이적인 보호기가 개시되어 있으며 고상 합성법과 용액상 합성법이 알려져 있다.
알파 아미노기는 예컨대 우레탄형 보호기, 예컨대 벤질옥시카르보닐(Z) 및 치환 벤질옥시카르보닐, 예컨대, p-클로로벤질옥시카르보닐, p-니트로벤질옥시카르보닐, p-브로모벤질옥시카르보닐, p-비페닐-이소프로폭시카르보닐, 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc) 및 p-메톡시벤질옥시카르보닐(Moz); t-부틸옥시카르보닐(Boc), 디이소프로필메톡시카르보닐, 이소프로폭시카르보닐 및 알릴옥시카르보닐과 같은 지방족 우레탄형 보호기를 비롯한 적절한 보호기에 의해 보호될 수 있다. Fmoc은 알파 아미노 보호에 바람직하다.
구아니디노기는 니트로, p-톨루엔설포닐(Tos), Z, 펜타메틸크로만설포닐(Pmc), 아다만틸옥시카르보닐, 펜타메틸디하이드로벤조퓨란-5-설포닐(Pbf), Fmoc 및 Boc와 같은 적절한 보호기에 의해 보호될 수 있다. Pbf는 Arg에 대한 바람직한 보호기의 하나이다. 기타 바람직한 보호기로는 Z, Fmoc, 및 Boc을 들 수 있다. 특히 구아니디노 보호기는 합성 중에 절단되어 제거되거나, 다른 과정 중에 절단 또는 제거될 수 있음을 이해하여야 하는데, 이 경우 보호기가 달린 측쇄는 본 명세서에 정의된 바와 같은 아미노산 측쇄 모이어티의 유도체를 형성한다. 특히 보호기가 불안정한 경우, 환자에게 투여시 생체내의 어떤 메카니즘에 의해 제거될 수 있는데, 이 경우 화합물은 "전구약물(prodrug)", 즉, 환자에게 투여시, 어떠한 화학적 또는 생리학적 과정을 거쳐 소망되는 약물 형태로 전환되는 약물 전구체가 된다 (예컨대, 생리학적 pH에서 또는 효소 작용을 통해 소망되는 약물 형태로 전환된다).
본 발명 명세서에 설명된 화합물은 수동으로 또는 제조업자가 제시한 프로토콜에 따라 제조업자가 제공한 프로그래밍 모듈을 이용함으로써 자동화 펩타이드 합성기에 의해 고상 합성법을 이용하여 제조될 수 있으며, 또는, 어려운 커플링 작업의 수율을 향상시키기 위해 제조업자의 프로토콜을 변형시켜 제조할 수도 있다.
고상 합성법은 보호된 α 아미노산, α-아미노산 대체물 또는 α-아미노 알코올 모방체를 적절한 수지에 커플링시킴으로서 화합물의 C-말단으로부터 개시된다. 이러한 출발 물질은 α-아미노-보호된 아미노산 또는 α-아미노-보호된 아미노산 대체물을 에스테르 결합에 의해 p-벤질옥시벤질 알코올 (Wang) 수지 또는 2-클로로트리틸 클로라이드 수지에 부착하거나, 예컨대 p-[(R, S)-α-[1-(9H-플루오-렌-9-일)-메톡시포름아미도]-2,4-디메틸옥시벤질]-페녹시아세트산 (Rink 링커)와 같은 Fmoc-링커 사이의 아미드 결합을 통해 벤즈하이드릴아민(BHA) 수지에 부착하거나, 또는 기술분야의 공지수단에 의해, 예컨대 α-아미노-보호된 알코올 모방체를 클로로메틸 폴리스티렌 수지에 부착된 3,4-디히드로-2H-피란-2일-메탄올 링커에 부착함으로써 제조된다. 수지들은 필요한 만큼의 반복 사이클을 통해 아미노산에 연속적으로 부가된다. 알파 아미노 Fmoc 보호기는 염기성 조건 하에서 제거된다. N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 중 피페리딘, 피페라진, 디에틸아민 또는 모르폴린 (20-40% v/v)를 이러한 목적에 사용할 수 있다.
알파 아미노 보호기를 제거한 다음, 후속적으로 보호된 아미노산 또는 아미 노산 대체물을 단계적으로 소망되는 순서로 커플링시켜 중간체 펩타이드-수지를 얻는다. 펩타이드의 고상 합성시 아미노산을 커플링시키는데 사용되는 활성 시약은 기술 분야에 잘 알려져 있다. 화합물 합성 후, 필요하다면 직각으로 보호된 측쇄 보호기를 공지기술로 제거하여 화합물을 추가로 유도화시킬 수 있다.
화합물 중의 반응성기들은 고상 합성시 또는 수지를 제거한 후에 선택적으로 변형시킬 수 있다. 예컨대, 화합물들을 변형시켜 수지 상에서 아세틸화와 같은 N-말단 변형물을 얻거나, 또는 절단 시약을 이용함으로서 수지로부터 제거한 다음 변형시킬 수도 있다. 아세틸화와 같은 N-말단 변형법, 또는 아미드화 또는 N-아세틸기의 도입과 같은 C-말단 변형법이 기술 분야에 알려져 있다. 마찬가지로, 아미노산의 측쇄 변형방법은 펩타이드 합성기술 분야에 잘 알려져 있다. 화합물 상에 존재하는 반응성기에 대해 이루어지는 변형의 선택은, 부분적으로는 화합물에서 요망되는 특성에 의해 결정될 것이다.
일 구체예에서, 본 발명의 화합물은 수지로부터 분리되기 전에 사이클화된다. 반응성 측쇄 모이어티를 통항 사이클화를 위해서, 소망되는 측쇄를 보호시키고, 적절한 용매 중에 현탁된 화합물과 사이클릭 커플링제를 첨가한다. 적절한 용매로는, 예컨대 DMF, 디클로로메탄 (DCM) 또는 1-메틸-2피롤리돈 (NMP)을 들 수 있다. 적절한 사이클릭 커플링 시약에는 예컨대, 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU), 벤조트리아졸-1-일-트리스(디메틸아미노)포스포늄헥사플루오로포스페이트 (BOP), 벤조트리아졸-1-일-옥 시-트리스(피롤리디노)포스포늄헥사플루오로포스페이트(PyBOP), 2-(7-아자-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TATU), 2-(2-옥소-1(2H)-피리딜)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TPTU) 또는 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드/1-히드록시벤조트리아졸 (DCCI/HOBt)을 들 수 있다. 커플링은 통상적으로 예컨대, N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA), sym-콜라이딘 또는 N-메틸모르폴린 (NMM)과 같은 적절한 염기를 사용함으로써 개시된다.
고상 합성 후 화합물을 분리한 다음, 이 화합물을 C18 컬럼과 같은 적절한 컬럼을 이용하는, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)와 같은 몇몇 방법에 의해 정제할 수 있다. 화합물의 크기나 전하에 기초한 방법과 같은 분리 또는 정제를 위한 기타 방법들 역시 이용가능하다. 일단 정제되면, 화합물을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 아미노산 분석, 질량 분광계 등과 같은 몇가지 방법에 의해 특징화시킨다.
치환된 아미드 유도체 C-말단, 일반적으로 N-알킬기를 갖는 본 발명의 화합물은 화합물의 C-말단으로부터 개시되는 고상 합성에 의해, 보호된 알파 아미노산 또는 아미노산 대체물을 적절한 수지에 커플링시킴으로써 제조한다. 고상으로 치환 아미드 유도체를 제조하는 이러한 방법은 기술 분야에 이미 설명되어 있다. 예컨대, Barn D.R., Morphy J.R., Rees D.C. Synthesis of an array of amids by aluminum chloride assisted cleavage of resin-bound esters. Tetrahedron Lett. 37, 3213-3216 (1996); DeGrado W. F. Kaiser E. T. Solid-phase synthesis of protected peptides on a polymer bound oxime: Preparation of segments comprising the sequences of a cytotoxic 26-peptide analogue. J. Org. Chem. 47:3258-3261 (1982) 참조. 이러한 출발물질은 알파 아미노-보호된 아미노산 또는 아미노산 대체물을 에스테르 결합에 의해 p-벤질옥시벤질 알코올(Wang) 수지에 공지 수단에 의해 부착시킴으로써 제조할 수 있다. 펩타이드쇄는 아미노산 또는 아미노산 대체물의 소망되는 서열로 성장하며, 생성물을 사이클화시키고, 디클로로메탄 중 적절한 아민 및 알루미늄 클로라이드 (예컨대, 아민, 디메틸 아민, 에틸아민 등)의 용액으로 수지를 처리한다. 얻어진 아미드 유도체 화합물을 수지로부터 용액 중에 방출시킨다. 수지를 여과하고 아미드 유도체 화합물을 용매 농축 및 에테르를 이용한 침전에 의해 회수한다. 조질의 화합물을 건조시키고 남은 아미노산 측쇄 보호기를 물과 트리이소프로필실란(TIS)의 존재 하에 트리플루오로아세트산(TFA)를 이용하여 절단한다. 차가운 에테르를 첨가하여 최종 생성물을 침전시킨 다음 여과 수집한다. 최종 정제는 C18 컬럼을 이용하여 RP-HPLC에 의한다.
바람직한 한가지 방법에서, 실시예 1의 화합물을 다음 방법에 의해 합성하였다. 각각의 화합물들은 케토-피페라진 구조에 기초하여 1 또는 2개의 아미노산 대체물을 가졌다. 아미노산대체물을 상기와 같이 합성하였다. 화합물들은 Fmoc 화학을 이용하여 합성하였다. 케토-피페라진 아미노산 대체물의 통합 직전 및 직후에 커플링을 위해 수동 합성 접근법을 이용하였다.
다음의 프로토콜을 이용하여 예컨대 아미노산 대체물이 말단 위치에 있는 경 우, 아미노산 대체물을 수지에 부착시켰다. Rink 아미드 수지(부하량 0.3 mmol/g, Advanced ChemTech)을 DMF에서 30분간 팽창시켰다. 수지의 Fmoc 탈보호를 20% 피페리딘/DMF를 이용하여 20분간 수행하였다. 선택된 케토-피페라진 아미노산 대체물(2eq)와 수지와의 커플링은 DMF 중에서 PyBop (2 eq) 및 DIEA (4 eq)와 함께 밤새 인큐베이션시킴으로써 달성하였다. 다음의 Kaiser 테스트가 양성적인 결과를 나타내면, 커플링 반응을 2회 수행하였다. DMF 중에서 Ac2O (10 eq) 및 피리딘 (20 eq)을 이용하여 아세틸화를 수행하였다.
다음의 케토-피페라진 아미노산 대체물을 펩타이드 수지에 부착하기 위해 다음 프로토콜을 사용하였다. Fmoc-보호된 케토 피페라진 아미노산 대체물(2 eq), TBTU (2 eq) 및 DIEA (4 eq)를 DMF 중에서 혼합한 다음 밤새 인큐베이션시켜 커플링을 수행하였으며, 양성적인 Kaiser 테스트 결과가 얻어질 경우에는 커플링 반응을 반복하였다. DMF 중에서 Ac2O (10 eq) 및 피리딘 (20 eq)을 이용하여 아세틸화를 수행하였다.
다음의 프로토콜을 이용하여 Fmoc-보호된 아미노산을 고상의 케토-피페라진 아미노산 대체물에 커플링시켰다. 대부분의 경우 적어도 2회의 커플링 사이클이 필요하였으며 종종 3회의 사이클이 요구되었다. 전형적인 사이클에서 Fmoc-보호된 아미노산(4 eq)를 DMF 중 HOAt (4 eq) 및 DIC (4 eq)과 혼합하였다. 이어서, 얻어진 혼합물을 SPE 튜브에서, 수지에 직접 부착되거나 중간체를 통해 부착된 케토-피페라진 아미노산 대체물과 함께 밤새 혼합하였다.
서열 중 케토-피페라진 아미노산 대체물에 직접 인접하지 않은 아미노산들 사이의 커플링은 고상 펩타이드 합성을 위한 표준 프로토콜을 이용하여 수행하였다. 다음의 보호기를 이용하였다: Lys 및 Orn에는 Boc, Tyr과 Ser에는 t-부틸, Cys와 His에는 Trityl, Asp에는 O-t-부틸 및 Arg에는 Pbf.
TFA/티오아니솔/페놀/H2O/DTT/TIS (87.5/2.5/2.5/5/2.5/11) (5 mL) 혼합물을 이용하여 3시간 동안 화합물을 수지로부터 떼어내었다. 결과적인 물질을 여과하고 동결조건하 1시간 동안 차가운 에테르로부터 침전시켰다. 침전된 시스테이닐 펩타이드를 산화 단계에 사용하기에 앞서 3회 이상 차가운 에테르로 세척하였다.
공기 산화를 통한 디설파이드 결합을 형성하기 위한 사이클화에 있어서, 조질의 시스테이닐 화합물을 아세토니트릴과 물의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물의 pH를 5% NH4OH를 이용하여 7-8로 조정하였다. 얻어진 용액을 2일간 150 mg 과립 활성탄소와 함께 서서히 교반하였다. 다음 공정 단계로 진행하기에 앞서 LC-MS 분석을 통해 사이클화가 완결되었는지 확인하였다. 여과액을 급속 진공 하에 동결건조 건조시킴으로써 조질의 사이클릭 화합물을 얻었다.
본 발명의 특정 화합물들은, 그 화학식 I의 대체물이 수지 또는 기타 펩타이드 고상 지지체에 결합되고 C-말단 위치에 있을 경우, 다음 반응에 의해 합성될 수 있다.
Figure 112008075651893-pct00118
전술한 방법 A나 또는 기타 여하한 대안법에 따라 대체물 (7)을 제조한다. 디메틸포름아미드와 디클로로메탄의 1:1 혼합물 중 Fmoc 보호된 Sieber 아미드 수지를 팽윤시킴으로써 상기 수지를 처리한 다음, 이를 여과하고 디메틸포름아미드로 세척하였다. 세척된 수지를 디메틸포름아미드 중 15분간 20% 피페리딘으로 탈보호시키고, 여과한 다음 디메틸포름아미드로 세척하였다.
디메틸포름아미드 중 Fmoc-보호 대체물 (7)의 용액을 전술한 바와 같이 제조된 탈보호된 Sieber 아미드 수지에 부가한 다음, 고상 PyBop, 및 디이소프로필에틸아민을 첨가하고, 이어서 또 다시 디메틸포름아미드를 첨가하였다. 혼합물을 질소 기포 발생시키면서 밤새 교반하였다. 수지를 여과하고, 디메틸포름아미드로 세척한 다음, 디메틸포름아미드:무수아세트산:피리딘의 3:2:1의 용액으로 된 150 mL의 캡핑 용액으로 30분간 캡핑시킨 다음, 여과하고, 디메틸포름아미드로 세척하여 수지에 착화(complexed)된 대체물(7)을 얻었다.
수지에 착화된 결과적인 Fmoc-보호 대체물 (7)을 디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 탈보호시키고, 여과한 다음 디메틸포름아미드로 세척하여 수지에 착화된 대체물 (7)을 얻었다. 디메틸포름아미드 중 Fmoc-AA-OH (4 eq., 여기서 AA는 소망되는 여하한 아미노산이다) 용액을 수지에 착화된 대체물 (7)에 첨가한 다음, DMF 중 HCTU (60 mmol, 4 eq.), 및 (120 mmol, 8 eq.)의 디이소프로필에틸아민의 용액을 첨가하고 질소 기포발생 하에 밤새 커플링시켰다. 얻어진 Fmoc-Tyr-(tBu)-대체물 (7)-수지를 여과에 의해 분리하고 디메틸포름아미드로 세척하였다. 커플링의 완결을 확인하기 위해, 생성물을 디메틸포름아미드 중 상기한 바와 같은 Fmoc-AA-OH 용액으로 재차 처리하는 한편 밤새 질소 발포시켰다.
결과적인 Fmoc-AA-대체물 (7)-수지를 전술한 바와 같이 캡핑 용액으로 30분간 캡핑시켰다. 수지를 여과하고 디메틸포름아미드, 디클로로메탄, MeOH의 디에틸 에테르로 세정한 다음, 진공 하에 건조시켰다.
그 후 통상적인 펩타이드 커플링 방법을 이용하여 각각의 연속적인 아미노산을 커플링시켰다.
후술하는 방법을 포함하여, 본 발명의 화학식 I의 대체물을 사용하여 화합물을 임의로 PEG시켰다.
라이신 또는 오르니틴 측쇄, N-말단 위치의 오메가 아미노 지방족, 또는 C-말단 위치의 화학식 I의 대체물의 아민기와 같은 반응성 아민기의 PEG화는, 0.005 mmol의 정제된 화합물을 2mL의 디메틸설폭사이드에 용해시킨 다음, 55.5 mg (0.011mmol, 2eq)의 PEG-5K-OSu (5,000 Da MW 숙신이미딜 프로피오네이트 반응기가 부착된 메톡시-PEG), 및 17.7μL (0.13 mmol, 20 eq)의 트리에틸아민을 첨가한 다음, 약간 탁한 용액을 실온에서 3시간 교반함으로써 달성하여다. 과량의 PEG-5K-OSu를 7 μL (0.111 mmol, 10eq.)의 에탄올 아민을 첨가함으로써 중단시킨 다음 반응물을 밤새 교반하였다.
화학식 I의 말단 대체물 또는 말단 아미노산 잔기 상의 화합물 상의 말단 카르복실 또는 Asp나 또는 Glu 측쇄의 PEG화는 Asp 또는 Glu의 측쇄 또는 C-말단에 카르복실기를 함유하는 구조물에 PEG-NH2(PEG-아민)을 커플링시킴으로써 수행한다. 펩타이드 구조물 (0.005 mmol)을 DMSO (2 mL)에 용해시킨 다음, 55.5 mg (0.011 mmol, 2 eq)의 PEG-NH2 및 HOBt(0.01 mmol)를 첨가한다. 0.0055 mmole의 커플링 시약 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDAC)를 첨가함으로써 커플링을 개시한다. 약간 탁한 용액을 실온에서 밤새 교반한다. 이어서 PEG화된 펩타이드 구조물을 HPLC에 의해 정제한다.
화학식 I의 대체물의 R1 중의 티올기 또는 Cys 또는 Hcys 측쇄와 같은 반응성 티올기의 PEG화는, 화합물을 DMSO 중에서 PEG-메틸-말레이미드 시약 (Sunbio, Orinda, California)으로 밤새 처리함으로서 수행한다. 이렇게 PEG화된 화합물을 HPLC로 정제한다.
PEG화에 이어서, 결과적인 조질의 화합물을 HPLC에 의해 정제한 다음, 하나 이상의 아미노산 대체물을 포함하는 PEG 유도화 화합물을 생산한다.
7. 화학식 I의 대체물을 포함하는 화합물의 효능 측정을 위한 분석.
일반적으로, 모 폴리펩타이드에 적절한 여하한 분석 시스템을 사용할 수 있다. 다음의 예시적인 분석 시스템들은 모 폴리펩타이드가 mini-ANP와 같이 ANP 펩타이드인 분석 시스템이었다. 화학식 I의 적어도 하나의 대체물을 포함하는 선별된 화합물들을 결합상태와 기능 상태를 측정하기 위해 시험하였다. 다음의 분석법이 사용되었다.
세포 배양 인간의 나트륨 이뇨 펩타이드 수용체 A (NPRA)를 코딩하는 cDNA 클론을 Bio S&T Inc. (Montreal, Quebec)로부터 구입하였다. cDNA 클론을 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen)에 삽입하고 HEK-293 세포 내로 트랜스펙션시켰다. G418 설페이트의 존재 하에 새포를 배양함으로써 안정한 클론들을 선별하였다. 클론 세포주로부터 제조된 막 균질물에 대한 [125I]-심방 나트륨 이뇨 펩타이드 ([125I]-ANP)의 결합에 의해 NPRA의 발현을 시험하였다. HEK-hNPRA 세포들을 10% FBS, G418 설페이트 (300 μg/mL) 소듐 글루타메이트 (0.29 mg/mL), 페니실린 (100 유닛/mL) 및 스트렙트로마이신 (100 ug/mL)이 보강된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 중 37℃에서 5% CO2 중 배양물에서 HEK-hNPRA 세포를 유지시켰다.
경쟁적 결합 분석. HEK-hNPRA 세포로부터 제조된 조질의 막 균질물을 이용하여 경쟁적 저해 결합 분석법을 수행하였다. 막 균질물을 제조하기 위해, 세포들을 인산염 완충염수로 세정한 다음, 저장성 용해 완충액 (hypotonic lysis buffer) (10 mM Tris, pH 7.4 + 5 mM EDTA) 중, 4℃에서 15분간 인큐베이션시켰다. 세포들을 플레이트로부터 폴리프로필렌 튜브로 이동시키고 균질화시켰다. 균질물을 25,000 x g에서 20분간 원심분리시켰다. 50 mM Tris (pH 7.4) 및 1 mM EDTA을 함유하는 완충액에 펠릿을 재현탁시키고, 균질화시킨 다음 25,000 x g에서 20분간 원심분리시켰다. 100 mM Tris (pH 7.4) 및 10 mM MgCl2로 구성된 완충액에 펠렛을 재현탁시킨 다음 필요할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 분석 당일에, 균질물을 해동 및 균질화시켰다. 25 mM Hepes (pH 7.4), 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 0.1% BSA 및 1 mM 1,10-페난트롤린을 함유하는 완충액 중에서 [125I]-ANP의 결합을 수행하였다. 균질물 (1-10 μg 단백질/웰)을 [125I]-ANP (25-30 pM)와 함께 인큐베이션시킨 다음 Millipore 필터 플레이트 중의 경쟁 리간드의 농도를 4℃에서 120분간 증가시켰다. 차가운 세척 완충액 (포스페이트 완충염수)를 첨가한 다음 배큠 매니폴드를 이용하여 여과함으로써 분석을 종료시켰다. 감마 계수기를 이용하여 결합 방사능활성을 측정하였다. [I125]-hANP의 비트랜스펙션 HEK293 막에 대한 결합에 의해 비특이적인 결합을 정의하였다. GraphPad Prism
Figure 112008075651893-pct00119
곡선-피팅 소프트웨어를 이용하여 데이타를 분석하였다.
EC 50 측정을 위한 일반적인 방법. 재조합 hNPR-A를 발현하는 HEK-293 세포 중 세포내 cGMP의 축적량을 측정함으로써 구조물의 기능 평가를 수행하였다. HE-NPRA 세포들을 Cell Dissociation Buffer (Gibco, Life Technologies) 중에서 세척 및 원심분리시킴으로서 수확하였다. 펠릿화된 세포들을, 10 mM Hepes (pH 7.4), 5 mM MgCl2, 200 mM L-글루타민, 1 mM 1,10-페난트롤린 및 BSA (0.5 mg/mL)를 함유하는 Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)에 재현탁시켰다. 원심분리에 이어, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴(IBMX)이 보강된 전술한 완충액에 세포들을 재현탁시켰다. 세포들 (~2 x 105/웰)을 96-웰 플레이트의 각각의웰에 첨가하고 37℃에서 15분간 인큐베이션시켰다. 예비-인큐베이션 기간 경과 후, 구조물의 농도를 증가시키면서 세포들을 15분간 더 인큐베이션시켰다. 온도 쇼크에 의해 세포를 용해시킴으로써 반응을 종결시켰다. 반응 플레이트를 건조한 얼음/에탄올 배쓰 중에서 15분간 인큐베이션한 다음 90℃에서 10분간 인큐베이션시켰다. cGMP Flashplate RIA (Perkin-Elmer)를 이용하여 cGMP의 축적량을 측정하였다. 데이타 분석 및 EC50 값을 GraphPad Prism
Figure 112008075651893-pct00120
소프트웨어에 의해 비선형 회귀 분석을 이용함으로써 측정하였다.
질량 측정 및 핵자기공명 분석. 포지티브 모드를 이용하는 Waters MicroMass ZQ 장치를 사용하여 질량값을 측정하였다. 질량 측정값을 계산값과 비교하고, 달리 언급하지 않는 한 질량 중량 플러스 2를 2로 나눈 형태 (((M+2)/2)로 표현하였다.
Bruker 300 MHz 분광계를 이용하여 양성자 NMR 데이타를 얻었다. 스펙트럼을 클로로포름, DMSO, 또는 메탄올과 같은 중수소화된 적절한 용매에 구조물을 용해시킨 후에 스펙트럼을 얻었다.
1mL/분으로 용출되는 YMC Pack Pro C18 컬럼 (4.6 x 50 mm, 3μ)이 구비된 Waters Alliance HT를 이용하여 HPLC 측정을 단계별 공정으로 수행하였다. 용매 A (0.1% 트리플루오로아세트산 v/v를 함유하는 물) 및 용매 B (0.1% 트리플루오로아세트산 v/v을 함유하는 아세토니트릴)를 이동상으로서 이용하였다. 케토 피페라진 중간체의 분석을 우해, 컬럼을 10% B로 평형시킨 다음 B를 8분에 걸쳐 90%까지 증가시켰다. 펩타이드 분석을 위해, 컬럼을 2% B로 평형시킨 다음 8분에 걸쳐 B를 90%까지 증가시켰다.
8. 화학식 I의 대체물을 포함하는 화합물
본 발명을 다음의 비제한적인 실시예를 들어 더욱 구체적으로 설명한다.
실시예 1
전술한 방법들 중 하나 이상의 방법에 의해 화학식 I의 단일 아미노산 대체물을 각각 사용하여, 모 폴리펩타이드 H-Met-시클로(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2 (SEQ ID NO:1)에 기초한 다음 화합물들을 합성하였다. 합성상의 이유에서, 위치 1의 Met는 Nle로 치환하였다. 결과적인 화합물들을 정제하고 질량 중량을 측정하여 다음 표에 나타내었다.
Figure 112008075651893-pct00121
Figure 112008075651893-pct00122
Figure 112008075651893-pct00123
Figure 112008075651893-pct00124
표 1의 화합물 중, 화합물 1-1, 1-5, 1-7, 1-8, 1-12, 1-15, 1-18, 1-20 및 1-22는 관련 분석 시스템에서 불활성적이었다. 나머지 화합물들은 활성적이었다.
다음의 구조를 갖는 화합물 1-2를 전술한 바와 같이 시험하였다.
Figure 112008075651893-pct00125
수용체 결합 연구에서, hANP의 Ki는 0.05 nM이고 mini-ANP의 Ki는 0.6 nM인 분석 시스템에서 이 화합물의 평균 Ki값은 0.3nM이었다. hANP의 EC50이 0.6 nM이고 mini-ANP의 EC50이 3.3 nM인 분석 시스템에서 화합물 1-2의 EC50은 2 nM이었다.
다음 구조를 갖는 화합물 1-14를 전술한 바와 같이 시험하였다.
Figure 112008075651893-pct00126
수용체 결합 연구에서, hANP의 Ki는 0.05 nM이고 mini-ANP의 Ki는 0.6 nM인 분석 시스템에서 이 화합물의 평균 Ki값은 0.9nM이었다. hANP의 EC50이 0.6 nM이고 mini-ANP의 EC50이 3.3 nM인 분석 시스템에서 화합물 1-14의 EC50은 3.5 nM이었다.
다음 구조를 갖는 화합물 1-13을 전술한 바와 같이 시험하였다.
Figure 112008075651893-pct00127
수용체 결합 연구에서, hANP의 Ki는 0.05 nM이고 mini-ANP의 Ki는 0.6 nM인 분석 시스템에서 이 화합물의 평균 Ki값은 0.2nM이었다. hANP의 EC50이 0.6 nM이고 mini-ANP의 EC50이 3.3 nM인 분석 시스템에서 화합물 1-13의 EC50은 2 nM이었다.
실시예 2
전술한 방법들 중 하나 이상의 방법에 의해 화학식 I의 아미노산 대체물을 두개 사용하여, 모 폴리펩타이드 H-Met-시클로(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2 (SEQ ID NO:1)에 기초한 다음 화합물들을 합성하였다. 합성상의 이유에서, 위치 1의 Met는 Nle로 치환하였다. 결과적인 화합물들을 정제하고 질량 중량을 측정하여 다음 표에 나타내었다.
Figure 112008075651893-pct00128
Figure 112008075651893-pct00129
표 2의 화합물들 중, 화합물 2-2와 2-4는 관련 분석 시스템에서 불활성적이었다. 나머지 화합물들은 활성적이었다. 다음 구조를 갖는 화합물 2-6를 전술한 바와 같이 시험하였다.
Figure 112008075651893-pct00130
수용체 결합 연구에서, hANP의 Ki는 0.05 nM이고 mini-ANP의 Ki는 0.6 nM인 분석 시스템에서 이 화합물의 평균 Ki값은 0.027nM이었다. hANP의 구조물의 EC50이 0.6 nM이고 mini-ANP의 EC50이 3.3 nM인 분석 시스템에서 화합물 2-6의 EC50은 2 nM이었다.
실시예 3
전술한 방법들 중 하나 이상의 방법에 의해 화학식 I의 아미노산 대체물 세개를 사용하여, 모 폴리펩타이드 H-Met-시클로(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2 (SEQ ID NO:1)에 기초한 다음 화합물들을 합성하였다. 합성상의 이유에서, 위치 1의 Met는 Nle로 치환하였다. 결과적인 화합물들을 정제하고 질량 중량을 측정하였다.
Figure 112008075651893-pct00131
실시예 4
전술한 방법들 중 하나 이상의 방법과 PEG 보결분자단에 의해 화학식 I의 아미노산 대체물 세개를 사용하여, 모 폴리펩타이드 H-Met-시클로(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2 (SEQ ID NO:1)에 기초한 다음 화합물들을 합성하였다. 합성상의 이유에서, 위치 1의 Met는 Nle로 치환하였다. 결과적인 화합물들을 정제하고 질량 중량을 측정하였다.
Figure 112008075651893-pct00132
Figure 112008075651893-pct00133
상기 표 4의 화합물에서, 화합물 4-6은 관련 분석 시스템에서 불활성적이었다. 나머지 화합물들은 활성적이었다.
실시예 5
전술한 하나 이상의 방법 중 화학식 I의 아미노산 대체물 1개 또는 2개를 사용하여, 모 폴리펩타이드 H-Met-시클로(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2 (SEQ ID NO:1)에 기초한 다음 화합물들을 합성하였다. 모 폴리펩타이드는 사이클릭인 반면, 이들 화합물들은 선형이었으며, 각각의 Cys 잔기들은 Ala 잔기로 대체되었다. 합성상의 이유에서, 위치 1의 Met는 Nle로 치환하였다.
다음 구조를 갖는 화합물 5-1를 전술한 바와 같이 시험하였다.
Figure 112008075651893-pct00134
수용체 결합 연구에서, hANP의 Ki는 0.05 nM이고 mini-ANP의 Ki는 0.6 nM인 분석 시스템에서 이 화합물의 평균 Ki값은 88.5nM이었다. hANP의 EC50이 0.6 nM이고 mini-ANP의 EC50이 3.3 nM인 분석 시스템에서 화합물 5-1의 EC50은 340 nM이었다.
다음 구조를 갖는 화합물 5-2를 전술한 바와 같이 시험하였다.
Figure 112008075651893-pct00135
수용체 결합 연구에서, hANP의 Ki는 0.05 nM이고 mini-ANP의 Ki는 0.6 nM인 분석 시스템에서 이 화합물의 평균 Ki값은 14.5nM이었다. hANP의 EC50이 0.6 nM이고 mini-ANP의 EC50이 3.3 nM인 분석 시스템에서 화합물 5-2의 EC50은 550 nM이었다.
다음 구조를 갖는 화합물 5-3을 전술한 바와 같이 시험하였다.
Figure 112008075651893-pct00136
수용체 결합 연구에서, hANP의 Ki는 0.05 nM이고 mini-ANP의 Ki는 0.6 nM인 분석 시스템에서 이 화합물의 평균 Ki값은 8.7nM이었다. hANP의 EC50이 0.6 nM이고 mini-ANP의 EC50이 3.3 nM인 분석 시스템에서 화합물 5-3의 EC50은 80.5 nM이었다.
실시예 6
전술한 하나 이상의 방법 중 화학식 I의 단일의 아미노산 대체물을 사용하여, 옥시토신 모 폴리펩타이드 H-시클로(Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys)-Pro-Leu Gly-NH2 (SEQ ID NO:3)에 기초한 다음 화합물들을 합성하였다.
Figure 112008075651893-pct00137
Figure 112008075651893-pct00138
실시예 7
전술한 하나 이상의 방법 중 화학식 I의 단일의 아미노산 대체물을 사용하여, 옥시토신 모 폴리펩타이드 H-시클로(Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys)-Pro-Leu Gly-NH2 (SEQ ID NO:3)에 기초한 다음 화합물들을 합성하였다. 모 폴리펩타이드는 사이클릭인 반면, 이들 화합물들은 선형이었으며, 각각의 Cys 잔기는 Ala 잔기로 대체되었다.
Figure 112008075651893-pct00139
Figure 112008075651893-pct00140
전술한 실시예들은 전술한 실시예에서 사용된 일반적으로 또는 특정하게 설명된 본 발명의 반응물 및/또는 작동 조건을 치환시킴으로써 유사한 성공율로 반복가능하다.
비록 바람직한 구체예를 들어 본 발명을 상세히 설명하였으나, 다른 구체예에 의해서도 동일한 결과를 얻을 수 있다. 본 발명의 변형 및 변경은 당업자에게 자명하며 이러한 모든 변경 및 동등한 등가물 역시 본 발명에 의해 포괄되는 것으로 이해되어야 한다. 상기한 상세한 설명 및/또는 첨부물, 및 대응 출원(들)에서 인용되었거나 첨부된 모든 참고자료, 출원,특허 및 공개문헌등의 개시내용 전체가 본 발명에 참고로 통합된다.

Claims (36)

  1. 다음 구조의 화학식 I을 갖는 화합물 또는 그의 거울상 이성질체, 입체이성질체, 부분입체이성질체, 또는 그의 염:
    Figure 112013117946916-pct00141
    식 중, R1은 다음 화학식을 갖는 기:
    Figure 112013117946916-pct00174
    R2는 H 또는 (C1-C6)알킬;
    R3는 H 또는 제1 질소 보호기;
    R4는 H, (C1-C6)알킬, (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NHR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qO-벤질, (CH2)qO-(C2-C6)알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
    R5는 H 또는 (C1-C6)알킬;
    R6a는 H, (C1-C6)알킬, (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NHR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qO-벤질, (CH2)qO-(C2-C6)알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
    R6b는 H 또는 (C1-C6)알킬;
    단, R4 및 R6a 중 하나는 H 또는 (C1-C6)알킬이고 R4 및 R6a 중 다른 하나는 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NHR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qO-벤질, (CH2)qO-(C2-C6)알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2임;
    R7은 H;
    R8 은 각각의 출현시 독립적으로 H;
    R11은 펩타이드 고상 지지체;
    R12 는 H 또는 제2 질소 보호기;
    m은 각각의 출현시 독립적으로 0 내지 6의 정수;
    q는 각각의 출현시 독립적으로 1 내지 6의 정수;
    p는 1 내지 10의 정수; 및
    y는 0 또는 1이고;
    여기서 상기 펩타이드 고상 지지체는 고상 합성을 위한 반응성 링커 그룹을 갖는 것으로서, 폴리아미드, 폴리스티렌, p-벤질옥시벤질 알코올, 2-클로로트리틸 클로라이드 또는 벤즈하이드릴아민(benzhydrylamine) 수지로부터 선택되는 것이고;
    여기서 상기 제1 질소 보호기 및 제2 질소 보호기 각각은 독립적으로 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임:
    t-Boc(3차-부틸옥시카르보닐), Fmoc(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐), 2-클로로벤질옥시카르보닐, 알릴옥시카르보닐(alloc), 벤질옥시카르보닐, 2-(4-비페닐프로필-2-옥시카르보닐(Bpoc), 1-아다만틸옥시카르보닐, 트리틸(트리페닐메틸), 톨루엔 설포닐, 포르밀, 니트로 및
    Figure 112013117946916-pct00193
    여기서 R9는 다음 화학식을 갖는 것임:
    Figure 112013117946916-pct00194
  2. 제1항에 있어서, R3는 다음 화학식을 갖는 기이고:
    Figure 112013117946916-pct00175
    R9는 3차-부틸, (C2-C6)알릴 또는 다음 화학식을 갖는 기인 것인 화합물:
    Figure 112013117946916-pct00176
  3. 제1항에 있어서, R1은 다음 화학식을 갖는 기인 것인 화합물:
    Figure 112013117946916-pct00177
    식 중, R12는 H 또는 트리페닐메틸렌, 3차-부틸옥시카르보닐, 톨루엔설포닐, 포르밀, 니트로 또는 벤질옥시카르보닐이고
    m은 2 내지 6의 정수이다.
  4. 제1항에 있어서, 다음 화학식을 갖는 화합물, 또는 그의 거울상 이성질체, 입체이성질체 또는 부분입체이성질체, 또는 그의 염:
    Figure 112013117946916-pct00178
    식 중, R6a는 H 또는 (C1-C6)알킬이고;
    R9은 3차-부틸, (C2-C6)알릴 또는 다음 화학식을 갖는 기이다:
    Figure 112013117946916-pct00179
  5. 제4항에 있어서, R1은 다음 화학식을 갖는 기이고
    Figure 112013117946916-pct00180
    R4는 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)NHR11이며;
    R12는 H 또는 트리페닐메틸렌, 3차-부틸옥시카르보닐, 톨루엔설포닐, 포르밀, 니트로 또는 벤질옥시카르보닐이고,
    m은 2 내지 6의 정수인 것인 화합물.
  6. 제1항에 있어서, 다음 화학식을 갖는 화합물, 또는 그의 거울상 이성질체, 입체이성질체, 부분입체이성질체, 또는 그의 염:
    Figure 112013117946916-pct00181
    식 중, R1은 다음 화학식을 갖는 기이고:
    Figure 112013117946916-pct00182
    R4는 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NHR11, (CH2)qOH, (CH2)qO-벤질, (CH2)qO-(C2-C6)알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
    R6은 H 또는 (C1-C6)알킬이고;
    m은 2 내지 6의 정수이다.
  7. 제1항에 있어서, R1은 다음 화학식을 갖는 기이고,
    Figure 112013117946916-pct00183
    R7은 H이며;
    R4는 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)N(R8)2, (CH2)mC(=O)NHR11 또는 (CH2)mC(=O)OR11이고;
    R12는 H 또는 트리페닐메틸렌, 3차-부틸옥시카르보닐, 톨루엔설포닐, 포르밀, 니트로 또는 벤질옥시카르보닐이며,
    m은 2 내지 6의 정수인 것인 화합물.
  8. 제1항에 있어서, 다음 식을 갖는 화합물 또는 그의 거울상 이성질체, 입체이성질체, 부분입체이성질체, 또는 그의 염:
    Figure 112013117946916-pct00184
    식 중, R1은 다음 화학식을 갖는 기:
    Figure 112013117946916-pct00185
    R4는 H 또는 (C1-C6)알킬;
    R6a는 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NHR11, (CH2)qOH, (CH2)qO-벤질, (CH2)qO-(C2-C6)알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2이고;
    m은 2 내지 6의 정수이다.
  9. 제8항에 있어서, R3는 다음 화학식을 갖는 기이고:
    Figure 112013117946916-pct00186
    R9는 3차-부틸, (C2-C6)알릴 또는 다음 화학식을 갖는 기인 것인 화합물:
    Figure 112013117946916-pct00187
  10. 제1항에 있어서, 다음 식을 갖는 화합물 또는 그의 거울상 이성질체, 입체이성질체, 부분입체이성질체, 또는 그의 염:
    Figure 112013117946916-pct00188
    식 중, R4는 H 또는 (C1-C6)알킬이고;
    R9는 3차-부틸, (C2-C6)알릴 또는 다음 화학식을 갖는 기인 것인 화합물:
    Figure 112013117946916-pct00189
  11. 제1항에 있어서, R1은 다음 화학식을 갖는 기이고:
    Figure 112013117946916-pct00190
    R4는 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)N(R8)2, (CH2)mC(=O)NHR11, 또는 (CH2)mC(=O)OR11;
    R12는 H 또는 트리페닐메틸렌, 3차-부틸옥시카르보닐, 톨루엔설포닐, 포르밀, 니트로 또는 벤질옥시카르보닐이고;
    m은 2 내지 6의 정수인 것인 화합물.
  12. 제1항에 있어서, R3는 다음 화학식을 갖는 기이고:
    Figure 112013117946916-pct00191
    R4는 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NHR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qO-벤질, (CH2)qO-(C2-C6)알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2; R6a는 H, 또는 (C1-C6)알킬이거나 또는 R6a는 (CH2)mC(=O)OH, (CH2)mC(=O)NHR11, (CH2)mC(=O)OR11, (CH2)qOH, (CH2)qO-벤질, (CH2)qO-(C2-C6)알릴, (CH2)mC(=O)N(R8)2, 또는 (CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2; R4는 H 또는 (C1-C6)알킬이고;
    R9는 3차-부틸, (C2-C6)알릴 또는 다음 화학식을 갖는 기인 것인 화합물:
    Figure 112013117946916-pct00192
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