CN101484171A - 用于肽构建体的氨基酸替代物 - Google Patents
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Abstract
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6a、R6b、R7和y如本说明书中所定义的式I的环约束性氨基酸替代物,用于合成式I的环约束性氨基酸替代物的方法,使用式I环的约束性氨基酸替代物的方法,包括用于包含多个氨基酸残基和一个或多个式I的环约束性氨基酸替代物的线形或环状化合物以及包括多个氨基酸残基和一个或多个式I的环约束性氨基酸替代物的线形或环状化合物中。
Description
发明背景
相关申请的交叉引用
本申请对如下临时专利申请的提交内容要求优先权和权益:2006年3月30日提交的名为“线形利尿钠肽构建体”的美国临时专利申请系列号60/743,963、2006年3月30日提交的名为“具有辅基的线形利尿钠肽构建体”的美国临时专利申请系列号60/743,964、2006年3月30日提交的名为“环状利尿钠肽构建体”的美国临时专利申请系列号60/743,960以及2006年3月30日提交的名为“具有辅基的环状利尿钠肽构建体”的美国临时专利申请系列号60/743,961,并且所述各篇专利文献的说明书及权利要求书通过引用的方式并入本文。
在此与本申请共同提交两件相关的申请,即名为“线形利尿钠肽构建体”的代理人案号0307-042-PCT的专利合作条约国际申请PCT/US07/65656和名为“环状利尿钠肽构建体”的代理人案号0307-041-PCT的专利合作条约国际申请PCT/US07/65645,并且其说明书和权利要求书通过引用的方式并入本文。
发明领域(技术领域)
本发明涉及环约束性氨基酸替代物,用于合成环约束性氨基酸替代物的方法和使用环约束性氨基酸替代物的方法,包括在包含多个氨基酸残基和一个或多个环约束性氨基酸替代物的线形或环状构建体或化合物中的用途。
背景技术
氨基酸替代物。众多不同的肽模拟物是已知的,并且用来产生肽的关键功能结构域的模拟物。通常见于Bioorqanic Chemistry:Peptides and Proteins.S.M.Hecht编辑,Oxford University Press,1998和尤其第12章相关内容,第395-419页,以及其中援引的参考文献。肽和蛋白质是高度柔性的,这主要因为单个氨基酸残基的高度旋转自由度。此外,单个氨基酸残基侧链中的某些键也具有旋转自由度。氨基酸残基之间的非键合性立体相互作用迫使肽或蛋白质按照其自由度形成某种自由能最小的稳定构型。局部结构(又称作“二级结构”)在肽和蛋白质中常见。这些结构包括α-螺旋、β-弯曲、片、伸展链、环等,并且往往对肽及蛋白质的结合和受体特异性有影响。存在几种类型的已知α-螺旋,区别在于实际转角的氨基酸残基内部的扭角和分子内及分子间氢键作用方式。还存在众多已知的不同β-弯曲,区别在于二面扭角Ψ(对于Ca-C键而言)或Φ(对于Ca-N键)或在这两者。使用肽模拟物来提供分子中限制构象的组件,其部分目的是固定对于所需生物学反应为最适的限制性构型中的关键功能结构域。
一般,设计肽模拟物并意图使其固定及模拟二肽或三肽的功能。例如、见美国专利7,008,941、6,943,157、6,413,963、6,184,223、6,013,458和5,929,237和美国公开专利申请2006/0084655中公开的逆转角模拟物,其中全部所述文献描述声称模拟了二肽或三肽序列的多样双环状环结构。其它申请公开了众多不同的小分子化合物,这些申请也声称模拟了二肽或三肽序列。见例如美国公开专利申请2006/0234923和2003/0191049。
利尿钠肽系统。氨基酸替代物的一项潜在应用是使用从1984年鉴定人心房钠尿肽(ANP)序列和基因结构以来已经深入探究的利尿钠肽系统。ANP是利尿钠肽系统的部分,其中所述的利尿钠肽系统在人类中包括因翻译后加工差异而产生ANP和尿舒张肽的ANP基因、产生BNP或脑钠肽的基因以及产生CNP或c-型利尿钠肽的基因。ANP、尿舒张肽、BNP和CNP分别是环结构,具有由半胱氨酸-半胱氨酸二硫键形成的一个17氨基酸环。人ANP(hANP)的氨基酸序列及结构示于图1中。ANP、尿舒张肽、BNP和CNP是密切相关的,区别在于环内某5个或6个氨基酸,尽管氨基端尾和羧基端尾基本上是不同的。
ANP、BNP和CNP分别针对不同的受体利尿钠肽受体A、B和C(NPRA、NPRB和NPRC)具有特异性。NPRA和NPRB与鸟苷酸环化酶连接,而NPRC是连接G蛋白的清除受体。ANP、BNP和CNP是迄今已鉴定的主要内源性哺乳动物利尿钠肽。然而,存在已经鉴定并可以在哺乳动物中具有治疗性用途的众多非哺乳动物利尿钠肽。这些非哺乳动物利尿钠肽包括鲑利尿钠肽或心脏肽(sCP)、心室利尿钠肽(VNP)(在鳗鱼和多种鱼中鉴定到的一种心利尿钠肽)、树眼镜蛇利尿钠肽(DNP)(在树眼镜蛇蛇毒中鉴定到的一种利尿钠肽)和三种从太攀蛇蛇毒中分离的利尿钠样肽(TNP-a、TNP-b和TNP-c)。通常参见Tervonen V,Ruskoaho H,Lecklin T,Ilves M,VuolteenahoO.Salmon cardiac natriuretic peptide is a volume-regulating hormone.Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.283:E353-61(2002);Takei Y,Fukuzawa A,ltaharaY,Watanabe TX,Yoshizawa Kumagaye K,Nakajima K,Yasuda A,Smith MP,Duff DW,Olson KR.A new natriuretic peptide isolated from cardiac atria oftrout,Oncorhynchus mykiss.FEBS Lett.414:377-80(1997);Schweitz H,VigneP,Moinier D,Frelin C,Lazdunski M.A new member of the natriuretic peptidefamily is present in the venom of the green mamba(Dendroaspis angusticeps).J.Biol.Chem.267:13928-32(1992);Lisy O,Jougasaki M,Heublein DM,SchirgerJA,Chen HH,Wennberg PW,Burnett JC.Renal actions of syntheticdendroaspis natriuretic peptide.Kidney Int.56:502-8(1999)和Fry BG,Wickramaratana JC,Lemme S,Beuve A,Garbers D,Hodgson WC,Alewood P.Novel natriuretic peptides from the venom of the inland(Oxyuranusmicrolepidotus):isolation,Chemical and biological characterization.Biochem.Biophys.Res.Comm.327:101 1-1015(2005)。
ANP主要在应答增加的心房压时内源性地分泌,但是其它因素(包括细胞因子受体刺激)可以促进内源性分泌。一旦释放,则ANP是血压、钠和流体稳态的激素性调节物,提供血管舒张效应、影响心血管重塑等。因此,ANP(包括内源性ANP)有效用于充血性心力衰竭和其它心血管病中,其部分原因在于提供针对慢性活化的肾素-血管紧张素-醛固酮系统的防御。循环性ANP通过两种机制即与利尿钠肽受体结合和酶降解而从循环中迅速除去。
人ANP也称作野生型人ANP、hANP、ANP(1-28)和ANP(99-126)(后者指前ANP(1-126)中的相关序列,其中所述的前ANP通常在分泌期间在羧基端区域内在Arg98-Ser99处被切割)。下文中,人ANP有时候称作“hANP”。
通常,认为利尿钠肽及其变体用于治疗充血性心力衰竭、肾性高血压、急性肾衰竭及相关病症以及利尿反应、促钠尿排泄反应和/或血管扩张反应将对其有治疗或预防效果的任何病症、疾病或综合征中。一篇描述利尿钠肽(包括ANP)及利尿钠肽系统在心力衰竭中用途的综述是Schmitt M.,Cockcroft J.R.和Frenneaux M.P.Modulation of the natriuretic peptide systemin heart failure:from bench to bedside?Clinical Science 105:141-160(2003)。
已经产生为数众多的ANP模拟物和变体,其中一些模拟物和变体在尺寸上比ANP大幅度缩小。一种尺寸上缩小但仍有生物学活性的ANP形式是如Li B,Tom JY,Oare D,Yen R,Fairbrother WJ,Wells JA,Cunningham BC.Minimization of a polypeptide hormone.Science 270:1657-60(1995)中所述的15聚二硫化环状肽H-Met-环(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(SEQ ID NO:1)。这种15聚肽常称作“mini-ANP”。
发明简述
在一个方面,本发明提供通式I的环约束性氨基酸替代物:
或其对映异构体、立体异构体或非对映异构体或其合成上可接受的盐,其中:
R1是H、烷基、芳基、烷基芳基、烷基-N(R8)2、烷基-OR8、烷基-C(=O)OR8、C(=O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(=O)N(R8)2或下式的基团:
R2是H或烷基,前提是R1和R2不都是H;
R3是H或第一氮保护基团;
R4是H、烷基、(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R5是H或烷基;
R6a是H、烷基、(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R6b是H或烷基;
前提是R4和R6a不均是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R7是H、C(=O)烷基、C(=O)(CH2)m(NR8)2、烷基、芳烷基或芳基;
R8的每个存在独立地是H、芳基或烷基;
R11是肽固体支持物;
R12是H或第二氮保护基团;
m的每个具体值是具有0与6之间的值的独立整数;
q的每个具体值是具有1与6之间的值的独立整数;
p是具有1与10之间的值的整数;并且
y是0或1。
在通式I的替代物的一个方面,y是1。在另一方面,y是0。
在通式I的替代物的一个方面,R4是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11,并且R6a是H或烷基。
在通式I的替代物的一个方面,R6a是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11,并且R4是H或烷基。
在通式I的替代物的一个方面,R3是下式的基团:
并且R9是叔丁基、烯丙基或下式的基团:
在通式I的替代物的一个方面,R1是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(=O)OR8、C(=O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(=O)N(R8)2或下式的基团:
并且R12是H或三苯亚甲基、叔丁氧羰基、甲苯磺酰基、甲酰基、硝基或苄氧羰基,并且n是具有2与6之间的值的整数。
在通式I的替代物的一个方面,提供具有下式的化合物:
或其对映异构体、立体异构体或非对映异构体或其合成上可接受的盐,其中:
R6a是H或烷基;并且
R9是叔丁基、烯丙基或下式的基团:
在前式中,R1可以是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(=O)OR8、C(=O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8烷基-C(=O)N(R8)2或下式的基团:
其中R12是H或三苯亚甲基、叔丁氧羰基、甲苯磺酰基、甲酰基、硝基或苄氧羰基,并且n是具有2与6之间的值的整数。R7可以是H。R4可以是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)N(R8)2、(CH2)mC(=O)NR11或(CH2)mC(=O)OR11。
在通式I的替代物的一个方面,提供具有下式的化合物:
或其对映异构体、立体异构体或非对映异构体或其合成上可接受的盐,其中:
R1是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(=O)OR8、C(=O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(=O)N(R8)2或下式的基团:
其中R4是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;R6a是H或烷基;并且n是具有2与6之间的值的整数。
在前式中,R1可以是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(=O)OR8、C(=O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(=O)N(R8)2或下式的基团:
其中R12是H或三苯亚甲基、叔丁氧羰基、甲苯磺酰基、甲酰基、硝基或苄氧羰基,并且n是具有2与6之间的值的整数。R7可以是H。R4可以是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)N(R8)2、(CH2)mC(=O)NR11或(CH2)mC(=O)OR11。
在通式I的替代物的一个方面,提供具有下式的化合物:
或其对映异构体、立体异构体或非对映异构体或其合成上可接受的盐,其中:
R1是烷基-N(R8)2、(CH2)nOR8、(CH2)nC(=O)OR8、C(=O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(=O)N(R8)2或下式的基团:
R4是H或烷基;
R6a是H或烷基;并且
n是具有2与6之间的值的整数。
在前式中,R3可以是下式的基团:
并且R9可以是叔丁基、烯丙基或下式的基团:
R1可以是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(=O)OR8、C(=O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(=O)N(R8)2或下式的基团:
其中R12是H或甲苯磺酰基、甲酰基、硝基或苄氧羰基,并且n是具有2与6之间的值的整数。R7可以是H。
在通式I的替代物的一个方面,提供具有下式的化合物:
或其对映异构体、立体异构体或非对映异构体或其合成上可接受的盐,其中:
R1是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(=O)OR8、C(=O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(=O)N(R8)2或下式的基团:
R4是H或烷基;并且
R6a是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2。
在前式中,R3可以是下式的基团:
并且R9可以是叔丁基、烯丙基或下式的基团:
在前式中,R1可以是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(=O)OR8、C(=O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8烷基-C(=O)N(R8)2或下式的基团:
其中R12是H或三苯亚甲基、叔丁氧羰基、甲苯磺酰基、甲酰基、硝基或苄氧羰基。R6a可以是(CCH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)N(R8)2、(CH2)mC(=O)NR11或(CH2)mC(=O)OR11。R7可以是H。
在通式I的替代物的一个方面,提供具有下式的化合物:
或其对映异构体、立体异构体或非对映异构体或其合成上可接受的盐,其中:
R4是H或烷基;并且
R9是叔丁基、烯丙基或下式的基团:
在前式中,R1可以是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(=O)OR8、C(=O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(=O)N(R8)2或下式的基团:
其中R12是H或三苯亚甲基、叔丁氧羰基、甲苯磺酰基、甲酰基、硝基或苄氧羰基,并且n是具有2与6之间的值的整数。R7可以是H。
R4可以是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)N(R8)2、(CH2)mC(=O)NR11或(CH2)mC(=O)OR11。
在通式I的替代物的一个方面,提供具有下式的化合物:
或其对映异构体、立体异构体或非对映异构体或其合成上可接受的盐,其中:
R1和R2是独立烷基。
在前式中,R3可以是下式的基团:
其中R9是叔丁基、烯丙基或下式的基团:
R4可以是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11或(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2,并且R6a是H或烷基。R6a可以是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2,并且R4是H或烷基。R7可以是H。
在另一个实施方案中,提供合成包含下式基团的肽的方法:
所述方法包括使具有结构式I的化合物:
或其对映异构体、立体异构体或非对映异构体或其可用盐与N-保护的氨基酸反应的步骤,
其中:
R1是H、烷基、芳基、烷基芳基、烷基-N(R8)2、烷基-OR8、烷基-C(=O)OR8、C(=O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(=O)N(R8)2或下式的基团:
R2是H或烷基,前提是R1和R2不都是H;
R3是H或第一氮保护基团;
R4是H、烷基、(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R5是H或烷基;
R6a是H、烷基、(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R6b是H或烷基;
前提是R4和R6a不均是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R7是H、C(=O)烷基、C(=O)(CH2)m(NR8)2、烷基、芳烷基或芳基;
R8的每次出现独立地是H、芳基或烷基;
R11是肽固体支持物;
R12是H或第二氮保护基团;
m的每个具体值是具有0与6之间的值的独立整数;
q的每个具体值是具有1与6之间的值的独立整数;
p是具有1与10之间的值的整数;并且
y是0或1。
在另一个实施方案中,提供包含多个氨基酸残基和至少一个下式的基团的化合物:
或其对映异构体、立体异构体或非对映异构体,其中:
R1是H、烷基、芳基、烷基芳基、烷基-N(R8)2、烷基-OR8、烷基-C(=O)OR8、C(=O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(=O)N(R8)2或下式的基团:
R2是H或烷基,前提是R1和R2不都是H;
R3是H或第一氮保护基团;
R4是H、烷基、(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R5是H或烷基;
R6a是H、烷基、(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R6b是H或烷基;
前提是R4和R6a不均是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R7是H、C(=O)烷基、C(=O)(CH2)m(NR8)2、烷基、芳烷基或芳基;
R8的每次出现独立地是H、芳基或烷基;
R11是肽固体支持物;
R12是H或第二氮保护基团;
m的每个具体值是具有0与6之间的值的独立整数;
q的每个具体值是具有1与6之间的值的独立整数;
p是具有1与10之间的值的整数;并且
y是0或1。
在本发明的一个方面,可以在本发明的化合物中使用一个氨基酸替代物,可以在本发明的化合物中使用二个氨基酸替代物,或可以在本发明的化合物中使用多于两个氨基酸替代物。
在本发明的另一方面,提供包括其中氨基酸残基之间一个或多个肽键由非肽键取代的氨基酸替代物的化合物。
在本发明的另一方面,提供包含至少一个氨基酸替代物和多个氨基酸残基的化合物,其中所述化合物是这样的环状化合物,其通过两个氨基酸残基的侧链之间、氨基酸残基侧链与氨基酸替代物的基团之间、两个氨基酸替代物的基团之间、该化合物的端基与氨基酸残基侧链之间、或该化合物的端基与氨基酸替代物的基团之间的键环化。
式I的环约束性氨基酸替代物可以用来合成这样的化合物,其中相对于不包含本发明氨基酸替代物的对应氨基酸序列,该化合物在施用至哺乳动物时显示一个或多个优势,所述的优势选自增加的抗酶降解性、增加的循环半寿期、增加的生物利用度、增加的效力、延长的作用持续时间及其前述组合。
本发明的一个目的是提供可以通过置换原始多肽(parent peptide)的氨基酸残基方式使用的式I的环约束性氨基酸替代物。
本发明的另一个目的是提供用来合成化合物的式I的环约束性氨基酸替代物,其中所述的化合物具有由Ki(nM)值确定的平衡受体结合亲和力,其小于不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列的Ki(nM)值。
本发明的另一个目的是提供用来合成化合物的式I环约束性氨基酸替代物,其中所述的化合物具有针对利尿钠肽受体的受体结合亲和力,其大于不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列的受体结合亲和力。
本发明的另一个目的是提供用来合成化合物的式I环约束性氨基酸替代物,其中所述的化合物具有与至少相同剂量的不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列同样有效或较之更有效的生物学效力。
本发明的另一个目的是提供用来合成化合物的式I环约束性氨基酸替代物,其中所述的化合物具有比相同剂量的不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列更有效的生物学效力。
本发明的另一个目的是提供用来合成化合物的式I环约束性氨基酸替代物,其中不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列具有与原始多肽序列的至少约60%的同源性。
本发明的另一个目的是提供用来合成化合物的式I环约束性氨基酸替代物,其中不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列具有与原始多肽序列的至少约80%的同源性。
本发明的另一个目的是提供用来合成化合物的式I环约束性氨基酸替代物,其中不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列具有与肽序列的至少约60%的同源性,其中所述的肽与ANP、BNP、CNP、sCP、DNP、TNP-a、TNP-b或TNP-c的受体结合。
本发明的另一个目的是提供用来合成利尿钠肽受体特异性化合物的式I环约束性氨基酸替代物,其中不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列具有与肽序列的至少约80%的同源性,其中所述的肽与ANP、BNP、CNP、sCP、DNP、TNP-a、TNP-b或TNP-c的受体结合。
本发明的另一个目的是提供用来合成包括如本文中所定义替代物的化合物的式I环约束性氨基酸替代物,其中不包含氨基酸替代物的相应氨基酸序列是与已知受体结合的原始多肽。
本发明的另一个目的是提供用来合成化合物的式I环约束性氨基酸替代物,其中所述的化合物比原始多肽的天然形式或重组形式具有更大的生物利用度和半寿期。
本发明的另一个目的是提供用来合成化合物的式I环约束性氨基酸替代物,其中所述的化合物具有增加的抗降解性,但具有对其受体显著高的结合亲和力。
本发明的另一个目的是提供用来合成在持续释放制剂中的化合物的式I环约束性氨基酸替代物。
本发明的其它目的、优势和新特性和可用性的其它范围将部分地在以下详细叙述中描述并且部分地在检验下文时对于本领域的技术人员而言变得显而易见,或可以通过实施本发明而习得。本发明的目的和优势可以通过所附权利要求书中具体指出的手段和组合而实现和达到。
发明详述
1.定义
“烷基”
如本文中所用,术语“烷基”意指饱和、单价、非分支或分支的烃链。烷基的实例包括,但不限于(C1-C6)烷基,如甲基、乙基、丙基、异丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2,2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2,2-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基和己基,以及更长的烷基,如庚基和辛基。烷基可以是非取代的或任选地由一种或两种合适的取代基取代。
“脂族”
如本文中所用,术语“脂族”包括带烃链的化合物,例如烷、烯、炔及其衍生物。
“Ω氨基脂族基团”包括带末端氨基的脂族部分。Ω氨基脂族基团的实例包括7′-氨基-庚酰基以及鸟氨酸和赖氨酸的氨基酸侧链部分。
“链烯基”
如本文中所用,术语“链烯基”意指其中具有一个或多个双键的单价、非分支或分支的烃链。链烯基的双键可以不缀合或缀合至另一种不饱和基团。合适的链烯基包括,但不限于(C2-C6)链烯基,如乙烯基、烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基、2-乙基己烯基、2-丙基-2-丁烯基、4-(2-甲基-3-丁烯)-戊烯基。链烯基可以是非取代的或任选地由一种或两种合适的取代基取代。
“炔基”
如本文中所用,术语“炔基”意指其中具有一个或多个叄键的单价、非分支或分支的烃链。炔基的叄键可以不缀合或缀合至另一种不饱和基团。合适的炔基包括,但不限于(C2-C6)炔基,如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、甲基丙炔基、4-甲基-1-丁炔基、4-丙基-2-戊炔基和4-丁基-2-己炔基。炔基可以是非取代的或任选地由一种或两种合适的取代基取代。
“芳烷基”
术语“芳烷基”包括基团-RaRb,其中Ra是链烯基(二价烃基),并且Rb是如上所定义的芳基。芳烷基的实例包括苄基、苯乙基、3-(3-氯苯基)-2-甲基戊基等。
“芳基”
如本文中所用,术语“芳基”意指包含碳原子和氢原子的单环或多环状芳基。合适芳基的实例包括,但不限于苯基、甲苯基、蒽基(anthacenyl)、芴基、茚基、薁基(azulenyl)、萘基、1-萘基、2-萘基和联苯基以及苯并稠合碳环部分如5,6,7,8-四氢萘基。芳基可以是非取代的或任选地由一种或两种如下文所定义的合适取代基取代。芳基任选地可以与环烷基稠合、与另一种芳基稠合、与杂芳基稠合或与杂环烷基稠合。优选的芳基包括但不限于6-12环原子的单环或双环状芳烃基,并且任选地用选自烷基、卤烷基、环烷基、烷氧基、烷基硫代、卤代、硝基、酰基、氰基、氨基、单取代氨基、双取代氨基、羟基、羧基或烷氧羰基的一个或多个取代基独立地取代。
在一个实施方案中,苯基是优选的芳基,其在独立地被“取代”时,包含直接连接或通过醚键连接的羟基、卤素、烷基或芳基。在苯基环被如此取代的情况下,该氨基酸残基可以称作取代的,如在取代的Phe、取代的HPhe或取代的Pgl中那样。
“杂芳基”
如本文中所用,术语“杂芳基”意指单环或多环状芳环,其包含碳原子、氢原子和一个或多个杂原子,优选1-4个杂原子,所述杂原子独立地选自氮、氧和硫。杂芳基的说明性实例包括,但不限于吡啶基、吡嗪基、吡唑基、吲哚基、三嗪基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、(1,2,3)-三唑基、(1,2,4)-三唑基、吡嗪基、嘧啶基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噻二唑基、呋喃基、苯基、异噁唑基、噁唑基、吡唑基、四唑基、三唑基、噁二唑基、噻二唑基、异噁唑基、三嗪基和吡嗪基。双环状杂芳环包括,但不限于苯并噻二唑基、吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并异噁唑基、苯并噻唑基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噁唑基、异喹啉基、嘌呤基(purinyl)、呋喃并吡啶基(furopyridinyl)和噻吩并吡啶基。杂芳基可以是非取代的或任选地由一种或两种如下文所定义的合适取代基取代。杂芳基任选地可以与另一种杂芳基稠合、与芳基稠合、与环烷基稠合或与杂环烷基稠合。
“环烷基”
如本文中所用,术语“环烷基”意指包含碳原子和氢原子并且没有碳-碳多键的单环或多环状饱和环。环烷基的实例包括,但不限于(C3-C7)环烷基,如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基,以及饱和环状和双环状萜。环烷基可以是非取代的或任选地由一种或两种如下文所定义的合适取代基取代。环烷基任选地可以与另一种环烷基稠合、与芳基稠合、与杂芳基稠合或与杂环烷基稠合,
“杂环烷基”
如本文中所用,术语“杂环烷基”意指单环或多环状环,其包含碳原子和氢原子以及至少一个杂原子,优选1—3个选自氮、氧和硫的杂原子。杂环烷基可以与芳基或杂芳基稠合。杂环烷基的实例包括,但不限于吡咯烷基、吡咯烷代(pyrrolidino)、哌啶基、哌啶子基(piperidino)、哌嗪基、哌嗪代(piperazino)、吗啉基、吗啉代、硫吗啉基(thiomorpholinyl)、硫吗啉代(thiomorpholino)和吡喃基。杂环芳基可以是非取代的或任选地由一种或两种如下文所定义的合适取代基取代。杂环芳基任选地可以与环烷基稠合、与芳基稠合、与杂芳基稠合或与另一杂环烷基稠合。
例如,杂环芳基可以与芳基或杂芳基稠合或以之取代,所述的芳基或杂芳基例如是,但不限于1,2,3,4四氢异喹啉基和1,2,3,4-四氢喹啉基、四氢萘啶基(naphthyridinyl)、苯基哌啶基(phenylpiperidinyl)和哌啶基吡啶基(piperidinyl pyridinyl)。
在优选的实施方案中,杂环烷基是单环或双环状环,更优选单环状环,其中所述的环包含3-6个碳原子和1-3个杂原子,在本文中称作(C3-C6)杂环烷基。在另一个优选实施方案中,杂环芳基与芳基或杂芳基稠合或以之取代。
“杂环基”或“杂环状环”
如本文中所用,术语“杂环基”或“杂环状环”意指杂环烷基或杂芳基。
“环状基”
如本文中所用,术语“环状基”意指芳基、环烷基、杂环烷基或杂芳基。
“烷氧基”
如本文中所用,术语“烷氧基”意指-O-烷基,其中烷基是如上所定义的。烷氧基可以是非取代的或任选地由一种或两种合适的取代基取代。优选地,烷氧基中烷基链的长度是1-6个碳原子,在本文中称作“(C1-C6)烷氧基”。
“芳氧基”
如本文中所用,术语“芳氧基”意指-O-芳基,其中芳基是如上所定义的。芳氧基可以是非取代的或任选地由一种或两种合适的取代基取代。优选地,芳氧基的芳基环是单环状环,其该环包含6个碳原子,在本文中称作“(C6)芳氧基。
“烷氧羰基”
如本文中所用,术语“烷氧羰基”意指式-C(=O)-烷氧基的单价基团。优选地,烷氧羰基中烃链的长度是1-8个碳原子,在本文中称作“低级烷氧羰基”。
“氨基甲酰基”
如本文中所用,术语“氨基甲酰基”意指原子团-C(=O)N(R′)2,其中R′选自氢、烷基和芳基。
“羰基”
如本文中所用,“羰基”是式C(=O)的二价基团。
“氧代”
如本文中所用,“氧代”基团是式(=O)的基团。
“酰基”
术语“酰基”包括基团R-C(=O)-,其中R是有机基团。实例是乙酰基CH3-C(=O)-,在本文中称作“Ac”。
当如上所定义的芳基、烷基或取代烷基经一个或多个羰基{-(C=O)-}连接时,肽或脂族部分是“酰化”的。肽最常见在氨基端处酰化。
“酰胺”
“酰胺”包括连接至羰基的三价氮的化合物(-C(=O)-NH2),例如甲酰胺、乙酰胺、丙酰胺等。
“酰亚胺”
“酰亚胺”包括含有亚胺基(-C(=O)-NH-C(=O)-)的化合物。
“胺”
“胺”包括含有氨基(-NH2)的化合物。
“腈”
“腈”包括作为羧酸衍生物并含有与有机基团结合的(-CN)基的化合物。
“卤素”
如本文中所用,术语“卤素”意指氟、氯、溴或碘。因此,术语“卤代”和“Hal”的意思包括氟代、氯代、溴代和碘代。
“肽固体支持物”
如本文中所用,术语“肽固体支持物”意指(一般通过接头)携带反应基(游离羟基或氨基)的用于肽合成中的合成聚合物,其中所述的反应基可以与N-保护的氨基酸官能团或式I替代物的羧基反应,因而将该氨基酸或式I替代物共价地结合至该聚合物上。在肽合成结束时,可以化学地切开羧基端氨基酸或替代物与该聚合物支持物之间的键。包含一个或多个式I替代物的肽或化合物随后进入溶液并可以从溶液中分离。肽固体支持物的实例包括,但不限于具有用于固相合成的合适接头的聚酰胺树脂和聚苯乙烯树脂。树脂的实例包括Merrifield树脂、BHA树脂、MBHA树脂、Wang树脂、肟树脂等。可以使用的接头包括Fmoc-Rink、Sieber接头、Weinreb接头等。
“氮保护基团”
如本文中所用,术语“氮保护基团”意指替换氨基氢、旨在防止反应工序期间(例如,在肽合成期间)副反应及降解的替换基团。固相肽合成包括一系列反应循环,包括偶联N-保护的氨基酸或替代物的羧基与肽底物的氨基,随后化学切除氮保护基团以至可以偶联下一个氨基受保护的合成元。用于本发明中的氮保护基团包括在固相肽合成中众所周知的氮保护基团,包括但不限于t-Boc(叔丁氧羰基)、Fmoc(9-芴甲氧羰基)、2-氯苄氧羰基、烯丙氧羰基(alloc)、苄氧羰基、2-(4-联苯基)丙基-2-氧羰基(Bpoc)、1-金刚烷氧羰基、三苯甲基(三苯甲基)和甲苯磺酰基。
“合适的取代基”
如本文中所用,术语“合适的取代基”意指不致使本发明化合物或用于制备本发明化合物的中间体的合成用途、治疗用途或药学用途失效的基团。合适的取代基的实例包括,但不限于烷基;链烯基;炔基;芳基;杂芳基;杂环烷基;环烷基;O-烷基;O-链烯基;O-炔基;O-芳基;CN;OH;氧代;卤代;C(=O)OH;C(=O)卤代;OC(=O)卤代;CF3;N3;NO2;NH2;NH(烷基);N(烷基)2;NH(芳基);N(芳基)2;C(=O)NH2;C(=O)NH(烷基);C(=O)N(烷基)2;C(=O)NH(芳基);C(=O)N(芳基)2;OC(=O)NH2;C(=O)NH(杂芳基);C(=O)N(杂芳基)2;NHOH;NOH(烷基);NOH(芳基);OC(=O)NH(烷基);OC(=O)N(烷基)2;OC(=O)NH(芳基);OC(=O)N(芳基)2;CHO;C(=O)(烷基);C(=O)(芳基);C(=O)O(烷基);C(=O)O(芳基);OC(=O)(烷基);OC(=O)(芳基);OC(=O)O(烷基);OC(=O)O(芳基);S-烷基;S-链烯基;S-炔基;SC(=O)2-芳基;SC(=O)2-烷基;SC(=O)2-链烯基;SC(=O)2-炔基和SC(=O)2-芳基。本领域技术人员可以基于本发明化合物的合成法、稳定性和药理学活性而容易地选择合适的取代基。
如本文中所用,在化学结构图中,以上的“波浪线”标示在该点上一个化学基团与另一个化学基团连接的键。因此,根据该定义,以下化学式“A”:
其中R′是式“B”的基团
代表以下化合物
“组合物”
术语“组合物”,如在药物组合物中,意图包括包含活性成分和充当载体的惰性成分的产物,以及直接或间接地因任意两种或多种成分的组合、复合或聚集、因一种或多种成分的解离或因一种或多种成分的其它类型反应或相互作用而产生的任何产物。因此,本发明的药物组合物包括通过将本发明化合物与可药用载体混合而产生的任何组合物。
“EC
50
”
术语“EC50”意图包括激动剂的如此摩尔浓度,其产生针对该激动剂的50%最大可能反应。例如,构建体在浓度72nM上产生如cGMP测定法中所测定的针对该构建体的50%最大可能反应,则该构建体具有72nM的EC50。除非另外说明,与EC50测定有关的摩尔浓度以纳摩尔(nM)为单位。
“Ki(nM)”
术语“Ki(nM)”意图包括受体平衡结合亲和力,其代表平衡时在竞争剂不存在下与半数的受体结合部位相结合的竞争性化合物的摩尔浓度。通常,Ki与化合物对受体的亲和力成反比,以至于当Ki低时,则亲和力高。Ki可以使用Cheng和Prusoff等式(Cheng Y.,Prusoff W.H.,Biochem.Pharmacol.22:3099-3108,1973)测定:
其中“配体”是配体的浓度,其中配体可以是放射性配体,并且Kd是引起50%受体占据的受体亲和力的倒数量值。除非另外说明,与Ki测定有关的摩尔浓度是nM。
“肽”
术语“肽”如本说明书及权利要求书通篇范围中所用,意图包括由两个或多个氨基酸(包括氨基酸的化学变型和衍生物)构成的任何结构。形成肽的全部或部分氨基酸可以是天然存在的氨基酸、此类氨基酸的立体异构体和变型、非蛋白质氨基酸、翻译后修饰的氨基酸、酶修饰的氨基酸等。术语“肽”也包括肽的二聚体或多聚体。“制造的”肽包括通过化学合成法、重组DNA技术、较大分子的生物化学片段化法或酶的片段化法、前述方法组合所产生的肽,或通常由任何其它方法制造的肽。
“氨基酸侧链部分”
用于本发明中(包括如用于说明书和权利要求书中)的术语“氨基酸侧链部分”包括如本文中术语“氨基酸”所定义的任何氨基酸的任何侧链。该术语因此包括在天然存在氨基酸中出现的侧链部分。它还包括在修饰的天然存在氨基酸(如糖基化氨基酸)中的侧链部分。它还包括在天然存在的蛋白质氨基酸的立体异构体和变型、非蛋白质氨基酸、翻译后修饰的氨基酸、酶合成的氨基酸、衍生化氨基酸、设计来模拟氨基酸的构建体或结构等中的侧链部分。例如,在该定义的范围内包括本文中公开的任何氨基酸的侧链部分。在氨基酸侧链部分的定义范围内包括如本文以下所定义的“氨基酸侧链部分的衍生物”。
“氨基酸侧链部分的衍生物”
“氨基酸侧链部分的衍生物”是针对任何氨基酸侧链部分的修饰或在其中的变异,包括针对天然存在的或非天然的氨基酸侧链部分的修饰或在其中的变异,其中所述的修饰或变异包括:(a)向现有的烷基、芳基或芳烷基链添加一个或多个饱和或不饱和碳原子;(b)用另一种原子,优选用氧或氮取代侧链中的碳;(c)向侧链的碳原子添加端基,所述的端基包括甲基(-CH3)、甲氧基(-OCH3)、硝基(-NO2)、羟基(-OH)或氰基(-C≡N);(d)对于包括羟基、硫氢基或氨基的侧链部分,添加合适的羟基、硫氢基或氨基保护基团;或(e)对于包括环结构的侧链部分,添加一个取代基或环状取代基,包括直接连接或通过醚键连接的羟基、卤素、烷基或芳基。对于氨基,合适的氨基保护基团包括但不限于Z、Fmoc、Boc、Pbf、Pmc等。
“氨基酸”
在本发明实施方案中所用的“氨基酸”和如用于说明书和权利要求书中的此术语包括已知的天然存在的蛋白质氨基酸,所述氨基酸由其常用的三字母缩写和单字母缩写提及。通常参见Synthetic Peptides:A User’s Guide,编者G.A.Grant,W.H.Freeman & Co.,New York(1992),其教导通过引用的方式并入本文中,包括在第11至24页中所述的文本内容及表格。“氨基酸”包括常规的α-氨基酸,并且还包括其中至少一个侧链是如本文中所定义的氨基酸侧链部分的β-氨基酸、α,α-双取代氨基酸和N-取代氨基酸。“氨基酸”还包括N-烷基α-氨基酸,其中氨基端氨基具有C1-C6直链或支链的烷基取代基。因此可以看出术语“氨基酸”包括天然存在的蛋白质氨基酸的立体异构体和变型、非蛋白质氨基酸、翻译后修饰的氨基酸、酶合成的氨基酸、衍生化氨基酸、为模拟氨基酸所设计的构建体或结构等。修饰及非天然氨基酸通常在上文援引的Synthetic Peptides:A User’s Guide;Hruby V.J.,Al-obeidi F.,Kazmierski W.,Biochem.J.268:249-262(1990);和Toniolo C,Int.J.Peptide Protein Res.35:287-300(1990)中描述;全部文献的教导通过引用的方式并入本文中。此外,下列缩写(包括氨基酸及其保护基团和修饰基团)具有给出的意思:
Abu — γ-氨基丁酸
12-Ado — 12-氨基十二烷酸
Aib — α-氨基异丁酸
6-Ahx — 6-氨基己酸
Amc — 4-(氨甲基)-环己烷羧酸
8-Aoc — 8-氨基辛酸
Bip — 联苯胺
Boc — 叔丁氧羰基
Bzl — 苄基
Bz — 苯甲酰
Dab — 二氨基丁酸
Dap — 二氨基丙酸
Dip — 3,3-二苯基丙氨酸
Disc — 1,3-二氢-2H-异吲哚羧酸
Et — 乙基
Fmoc — 芴甲氧羰基
Hept — 庚酰基(CH3-(CH2)5-C(=O)-)
Hex — 己酰基(CH3-(CH2)4-C(=O)-)
HArg — 高精氨酸
HCys — 高半胱氨酸
HLys — 高赖氨酸
HPhe — 高苯丙氨酸
HSer — 高丝氨酸
Me — 甲基
Met(O) — 甲硫氨酸亚砜
Met(O2) — 甲硫氨酸砜
Nva — 正缬氨酸
Pgl — 苯基甘氨酸
Pr — 丙基
Pr-i — 异丙基
Sar — 肌氨酸
Tle — 叔丁基丙氨酸
Z — 苄氧羰基
在本发明化合物的列表中,常规氨基酸残基具有如《专利审查程序手册》第8版第2400章中给出的常规含义。因此,“Nle”是正亮氨酸;“Asp”是天冬氨酸;“His”是组氨酸;“Arg”是精氨酸;“Trp”是色氨酸;“Lys”是赖氨酸;“Gly”是甘氨酸;“Pro”是脯氨酸;“Tyr”是酪氨酸;“Ser”是丝氨酸等。全部残基处于L-异构体构型,除非指明D-异构体,如“D-Ala”表示D-丙氨酸。
单个氨基酸,包括天然存在的蛋白质氨基酸的立体异构体和变型、非蛋白质氨基酸、翻译后修饰的氨基酸、酶合成的氨基酸、衍生化氨基酸、从任何前述项衍生的α,α-双取代氨基酸(即这样的α,α-双取代氨基酸,其中至少一个侧链与从中衍生该α,α-双取代氨基酸的残基的侧链相同)、从任何前述项衍生的β-氨基酸(即这样的β-氨基酸,其除存在β-碳之外与从中衍生所述β-氨基酸的残基相同)和包括前述各项的其它情况,有时在本文中称作“残基”
“α,α-双取代氨基酸”
“α,α-双取代氨基酸”包括在α-位置中具有其它取代基的任何α-氨基酸,其中所述的取代基可以与α-氨基酸的侧链部分相同或相异。除了α-氨基酸的侧链部分之外,合适的取代基还包括C1-C6直链或支链的烷基。Aib是α,α-双取代氨基酸的实例。在可以使用常规的L-和D-异构体称谓提及α,α-双取代氨基酸时,将理解的是这些称谓出于便利目的,并且其中取代基在α-位置上相异的情况下,此类氨基酸根据需要可以互换地称作从具有所指明氨基酸侧链部分的残基的L-或D-异构体衍生的α,α-双取代氨基酸。因此(S)-2-氨基-2-甲基-己酸可以称作从L-Nle衍生或称作从D-Ala衍生的α,α-双取代氨基酸。类似地,Aib可以称作从Ala衍生的α,α-双取代氨基酸。无论何时提供α,α-双取代氨基酸,将理解为包括其全部(R)和(S)构型。
“N-取代氨基酸”
“N-取代氨基酸”包括其中氨基酸侧链部分共价连接至主链氨基的任何氨基酸,任选其中在α-碳位置中除H之外没有取代基。肌氨酸是N-取代氨基酸的实例。例如,肌氨酸可以称作Ala的N-取代氨基酸衍生物,因为肌氨酸与Ala的氨基酸侧链部分是相同的,即均为甲基。
“羧基端封端基团”
术语“羧基端封端基团”包括经化合物的羧基端的末端环碳原子或(若提供)末端羧基连接的任何端基。末端环碳原子或(若提供)末端羧基可以形成残基的一部分或可以形成氨基酸替代物的一部分。在优选的方面,羧基端封端基团形成在化合物的羧基端位置处的氨基酸替代物的一部分。羧基端封端基团包括,但不限于-(CH2)n-OH、-(CH2)n-C(=O)-OH、-(CH2)m-OH、-(CH2)n-C(=O)-N(v1)(v2)、-(CH2)n-C(=O)-(CH2)m-N(v1)(v2)、-(CH2)n-O-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-C(=O)-NH-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-C(=O)-NH-(CH2)m-N(v1)(v2)、-(CH2)n-C(=O)-NH-((CH2)m-N(v1)(v2))2、-(CH2)n-C(=O)-NH-CH(-C(=O)-OH)-(CH2)m-N(v1)(v2)、-C(=O)-NH-(CH2)m-NH-C(=O)-CH(N(v1)(v2))((CH2)m-N(v1)(v2))或-(CH2)n-C(=O)-NH-CH(-C(=O)-NH2)-(CH2)m-N(v1)(v2),包括前述基团的全部(R)或(S)构型,其中v1和v2各自独立地是H、C1-C17直链或支链的烷基链,m是0-17并且n是0-2;或任何Ω氨基脂族基团、末端芳基或芳烷基,包括以下基团,如甲基、二甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、己基、烯丙基、环丙烷甲基、己酰基、庚酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、苯乙酰基、环己基乙酰基、萘乙酰基、肉桂酰基、苯基、苄基、苯甲酰、12-Ado、7′-氨基庚酰基、6-Ahx、Amc或8-Aoc或任意的单个天然或非天然α-氨基酸、β-氨基酸或α,α-双取代氨基酸,包括前述基团的全部(R)或(S)构型,任选地与任意的前述非氨基酸封端基团的组合。在前述基团中,例如将理解-C(=O)-NH-(CH2)m-NH-C(=O)-CH(N(v1)(v2))((CH2)m-N(v1)(v2))是:
“氨基端封端基团”
术语“氨基端封端基团”包括经化合物末端的末端胺所连接的任何端基。该末端胺可以形成残基的一部分或可以形成氨基酸替代物的一部分。在优选的方面,氨基端封端基团形成在化合物的氨基端位置处的氨基酸替代物的一部分。氨基端封端基团包括,但不限于任何Ω氨基脂族基团、酰基团或末端芳基或芳烷基,包括下列基团,如甲基、二甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、己基、烯丙基、环丙烷甲基、己酰基、庚酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、苯乙酰基、环己基乙酰基、萘乙酰基、肉桂酰基、苯基、苄基、苯甲酰、12-Ado、7′-氨基庚酰基、6-Ahx、Amc或8-Aoc,或备选地,氨基端封端基团是-(CH2)m-NH(v3)、-(CH2)m-CH3、-C(=O)-(CH2)m-CH3、-C(=O)-(CH2)m-NH(v3)、-C(=O)-(CH2)m-C(=O)-OH、-C(=O)-(CH2)m-C(=O)-(v4)、-(CH2)m-C(=O)-OH、-(CH2)m-C(=O)-(v4)、C(=O)-(CH2)m-O(v3)、-(CH2)m-O(v3)、C(=O)-(CH2)m-S(v3)或-(CH2)m-S(v3),其中v3是H或C1-C17直链或支链的烷基链,并且v4是C1-C17直链或支链的烷基链并且m是0-17。
本文中所用的化学命名方案和结构简图采用并依赖如(可从Cambridgesoft Corp.,Cambridge,Mass.获得的)ChemDraw程序所用的化学命名特征。尤其,使用Autonom程序从如Chemdraw Ultra或ISIS base(MDLCorp.)所用的结构中衍生某些化合物名称。通常,结构简图不描绘与碳原子连接的氢原子,除非在端基内和在其它特定环境下。
描述了具有由结构简图确定的替代物和由三字母缩写确定的氨基酸残基的某些化合物。除非另外说明,可理解的是在在所述替代物和残基之间、或者所述残基和替代物之间、或者一个替代物和其氨基端和羧基端侧上的残基之间的键是常规肽键-C(=O)-NH-,或在其中肽键与替代物的氨基端上的环氮连接时,是-C(=O)-N-。通常,在此类键的描绘中,绘出氨基酸替代物的原子(例如-C(=O)-或-N),但是不绘出氨基酸残基的原子。
2.异构体的纯度和分离
本发明的替代物可以含有一个或多个手性中心和/或双键,并且因而作为立体异构体如双键异构体(即几何异构体)、对映异构体或非对映体存在。根据本发明,本文中所述的化学结构并且因而本发明的化合物,包括本发明化合物的消旋形式以及全部的对映异构体和立体异构体,即立体纯形式(例如几何纯、对映异构体纯或非对映体纯)和对映异构体混合物与立体异构体混合物。
当化合物相对于特定手性中心是约90%ee(对映体过量)或更大,优选地等于或大于95%ee时,认为本发明的替代物相对于该手性中心是光学活性的或对映异构体纯的(即基本上是R-形式或基本上是S-形式)。当本发明的化合物具有大于约80%ee、优选大于约85%ee的对映体过量时,认为该化合物处于对映异构体富集形式中。如本文中所用,消旋混合物意指相对于分子中全部手性中心的约50%一种对映异构体和约50%其相应的对映异构体。因此,本发明包括本发明化合物的全部对映异构体纯的混合物、对映异构体富集的混合物和消旋混合物。
因此,在一个方面,替代物具有以下的一般结构:
其中星号表示任何可能的立体化学构象。该结构因此包括以下对映异构体形式:
对映异构体和立体异构体混合物可以通过众所周知的方法拆解成其组成性对映异构体或立体异构体,所述的方法例如是手性相气相色谱法、手性相高效液相色谱法、使化合物结晶成手性盐复合体或使化合物在手性溶剂中结晶。对映异构体和立体异构体也可以通过众所周知的非对称合成方法从立体纯的或对映异构体纯的中间体、试剂和催化剂中获得。
3.本发明的化合物
本发明提供式I环约束性氨基酸替代物和包含式I环约束性氨基酸替代物的线形或环状化合物:
或其对映异构体、立体异构体或非对映异构体或其合成上可接受的盐,其中:
R1是H、烷基、芳基、烷基芳基、烷基-N(R8)2、烷基-OR8、烷基-C(=O)OR8、C(=O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(=O)N(R8)2或下式的基团:
R2是H或烷基,前提是R1和R2不都是H;
R3是H或第一氮保护基团;
R4是H、烷基、(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R5是H或烷基;
R6a是H、烷基、(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R6b是H或烷基;
前提是R4和R6a不均是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R7是H、C(=O)烷基、C(=O)(CH2)m(NR8)2、烷基、芳烷基或芳基;
R8的每次出现独立地是H、芳基或烷基;
R11是肽固体支持物;
R12是H或第二氮保护基团;
m的每个具体值是具有0与6之间的值的独立整数;
q的每个具体值是具有1与6之间的值的独立整数;
p是具有1与10之间的值的整数;并且
y是0或1。
式I环约束性氨基酸替代物可以用于置换由多个氨基酸残基组成的多肽化合物的一个或多个氨基酸残。
式I环约束性氨基酸替代物优选地是这样的,以至于它可以用常规的氨基受保护氨基端(使用保护基团(如Fmoc))和羧基端活性羧基产生,并且可以因此用于常规的肽合成方法学中。可理解的是若式I氨基酸替代物偶联在化合物的羧基端位置处,则可以使用在此种替代物上除羧基端之外的位置。
因此,在优选的实施方案中,本发明提供用于通过肽合成方法学(其根据需要进行调整)掺入多肽化合物的环约束性氨基酸替代物,其中所述的多肽化合物包含多个氨基酸残基。
除了R1和R2均是H之外,将理解的是本发明的每种替代物可以具有四种不同对映异构体形式之一。因此,例如,当R1或R2基团是Arg的氨基酸侧链部分,该化合物可以类属地显示为:
其中每个星号代表可以处于任何立体化学构型的手性中心。因此,将理解以下每种构型是可能的、构思的及想要的:
类似地,就每种替代物而言,对于在使用常规肽合成方法学的化合物合成中的用途,可理解如果替代物处于除N末端位置之外的位置,则R3位置将包括氮保护基团而非H,并且因此该替代物将具有以下的一般结构:
其中PRG是氮保护基团,例如并且是不限于下式的基团:
其中R9是叔丁基、烯丙基或下式的基团:
因此,在R1或R2基团是Arg的氨基酸侧链部分、并且R3是氮保护基团Fmoc的实例中,可以明白以下每种结构是可能的、构思的及想要的:
在上文的具体实施例中,也有可能和构思的是将在胍基内使用氮保护基团,例如Pbf。也可以明白有可能并构思类似的替代物,此时使用另一种基团作为氮保护基团或使用另一种氨基酸侧链部分或氨基酸侧链部分的衍生物作为R1或R2基团,或者备选地,其中它们中至少一个是烷基、芳基、烷基芳基、烷基-N(R8)2、烷基-OR8、烷基-C(=O)OR8、C(=O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(=O)N(R8)2或下式的基团:
其中R8是H、芳基或烷基,并且R12是H或第二氮保护基团。
若替代物用于使用常规肽合成方法学合成化合物中并且位于羧基端位置,则该替代物可以是与肽固体支持物(如树脂)结合的化合物。在这种情况下,该替代物可以具有以下的一般结构:
其中椭园形表示树脂和接头或另一种肽固体支持物。这里,R1或R2基团也可以是任何氨基酸侧链部分或氨基酸侧链部分的衍生物,或者它们中至少一个可以是烷基、芳基、烷基芳基、烷基-N(R8)2、烷基-OR8、烷基-C(=O)OR8、C(=O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(=O)N(R8)2或下式的基团:
其中R8是H、芳基或烷基,并且R12是H或第二氮保护基团。在一个方面,本发明因此提供具有以下一般结构的替代物:
其中R1是以下基团之一:
或
其中R3是H或第一氮保护基团;R4是H、烷基、(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;R5是H或烷基;R8是H、芳基或烷基;R11是肽固体支持物;m的每个具体值是具有0与6之间的值的独立整数;q的每个具体值是具有1与6之间的值的独立整数;p是具有1与10之间的值的整数;并且任何芳基可以独立地由选自烷基、卤烷基、环烷基、烷氧基、烷基硫代、卤代、硝基、酰基、氰基、氨基、单取代氨基、双取代氨基、羟基、羧基或烷氧羰基的一个或多个取代基取代。因此,在一个方面,提供带R1基团的替代物,其中所述R1基团是以下19种天然编码的氨基酸残基(省去Pro)之一的氨基酸侧链部分,包括下列:
5-异丁基-6-氧代-哌嗪-2-羧酸
5-(4-氨基-丁基)-6-氧代-哌嗪-2-羧酸
5-(3-胍基-丙基)-6-氧代-哌嗪-2-羧酸
在前述每种结构中,除不是H之外,R3位置中可以存在任意的氮保护基团;除不是-C(=O)OH之外,R4位置可以是烷基、(CH2)qC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2,其中R8是H、芳基或烷基,R11是肽固体支持物,m是具有0与6之间的值的独立整数,q是具有1与6之间的值的独立整数并且p是具有1与10之间的值的整数;除不是H之外,R5位置可以是烷基;并且除不是H之外,R7位置可以是C(=O)烷基或C(=O)(CH2)m(NR8)2。类似的,除不是前述氨基酸侧链部分之一外,R1可以是烷基、芳基、烷基芳基、烷基-N(R8)2、烷基-OR8、烷基-C(=O)OR8、C(=O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(=O)N(R8)2或下式的基团:
其中R8是H、芳基或烷基,并且R12是H或第二氮保护基团。
4.本发明化合物的用途
根据本发明的一个方面,提供了产生包含替代物的化合物的方法,其中所述的化合物基于与目的靶结合的已知原始多肽。所述原始多肽可以是肽、多肽或蛋白质。
在本发明的另一方面,提供用于鉴定原始多肽二级结构的方法,其中所述的二级结构参与或负责对目的靶的结合。该方法包括(a)提供与具有已知一级结构的目的靶结合的已知原始多肽,这种一级结构由n个氨基酸残基组成;(b)构建其中替代物取代原始多肽中氨基酸残基的多种化合物,取代的替代物优选地具有这样的R1或R2基团,其与该替代物所取代氨基酸残基的氨基酸侧链部分相同或是该替代物所取代氨基酸残基的氨基酸侧链部分的衍生物;(c)筛选包括替代物的多种化合物;和(d)选择显示与目的靶结合的化合物,因而这种化合物包含与目的靶结合的二级结构。
在本发明的相关方面,提供用于鉴定原始多肽中参与或负责对目的靶结合的二级结构的方法,所述方法包括构建其中替代物取代原始多肽中氨基酸残基的多种化合物的步骤,取代的替代物优选地具有在两个位置中均限定是H或在一个位置中限定是甲基而在剩余位置中限定是H的R1和R2基团。按照这种方式,可以容易地确定氨基酸侧链部分对效力或任何其它可确定参数的影响。
在一个实施方案中,本发明的方法提供对原始多肽的系统分析以确定原始多肽中参与原始多肽与靶物质相互作用(如结合)的至少一个活性序列或结构域。如本文中所用,“原始多肽”指显示与靶物质相互作用(如结合)并且可以因此构成肽、多肽或蛋白质的任何氨基酸残基序列。原始多肽一般是如本文中所定义的多肽,具有约3-约100个氨基酸残基,不过术语“原始多肽”也可以包括更大的构建体,其通常在本领域中被视为大的多肽或蛋白质。为使用本发明的方法,必须可获得至少部分并且优选全部的原始多肽一级结构(也即序列)。然而,不需要具有关于原始多肽二级结构或三级结构的任何信息以实施本发明的方法。
原始多肽可以是显示与例如细胞、组织、器官或其它生物材料上存在的受体相结合的任何序列。原始多肽的实例包括而不限于生物学活性肽、激素、神经递质、酶、抗体等。此类原始多肽可以通过与受体结合而直接或间接地传递信号,并且因此原始多肽可以是激动剂、拮抗剂或混合的激动剂-拮抗剂。合适的本发明原始多肽的实例包括黑皮质素-受体特异性肽、尿激酶型组织纤溶酶原激活蛋白、淀粉样β-蛋白相关肽、朊蛋白病相关肽、血管升压素肽、催产素肽、利尿钠肽、血管紧张素肽、降钙素、降钙素基因相关肽、阿片样肽、人生长激素、人促乳素受体配体、多种干扰素如α-干扰素、表皮生长因子、肿瘤坏死因子和多种致低血压肽、纤维蛋白溶解肽、趋化肽、生长促进肽、细胞粘附肽和多肽、促分裂原、免疫调节剂等。
通常,为了使用本发明,利用至少一种测定法或试验以确定本发明构建体针对目的受体的参数。在一个方面,利用了本发明构建体与目的受体的结合,并且优选地平行测定原始多肽与目的受体的结合。然而,可以利用除结合之外的其它参数,包括多种功能性测定系统、效力测定系统等。此类参数可以相对于任何相关的测量单位(包括在功能性测定系统中表达一种或多种化合物、Ki值、EC50值等)进行确定。因此,在本发明的一个优选实施方案中,使用竞争性抑制测定法或相似的测定法,因而本发明构建体的结合活性或功能活性可以直接与原始多肽比较,并且因而直接测定相对结合活性或功能活性。在其它实施方案中,可以使用其它测定法或试验。这些测定法可以,但不需要是功能性测定法。测定法的实例包括多种竞争性抑制测定法、直接结合测定法、功能测定法等中的任一种。也有可能和构思的是使用这样的测定法,其中所述的测定法确定例如本发明的构建体是否是激动剂、拮抗剂或混合激动剂-拮抗剂,并且进一步确定是否可以分别测定结合和功能,以独立地测定受体亲和力和特异性以及功能活性。测定法和试验的实例是本领域众所周知并有许多资料证明的,并且通常对于任何原始多肽已知有一种或多种测定法或试验。
在本发明的一项方法中,使用原始多肽作为模板以产生一种或多种化合物,和更优选一系列化合物,其中每种所述的化合物包括取代原始多肽中至少一个氨基酸残基的至少一个替代物。在一个方面,具有至少一种替代物的化合物可以省去原始多肽中存在的一个或多个氨基酸残基。在另一方面,具有至少一个替代物的化合物含有如原始多肽中存在的相同氨基酸残基或其同系物,同时用替代物取代一个或多个氨基酸残基。在一个方面,取代的替代物优选地具有这样的R1或R2基团,其与该替代物所取代氨基酸残基的氨基酸侧链部分相同或是该替代物所取代氨基酸残基的氨基酸侧链部分的衍生物。在另一方面,取代的替代物优选地具有在两个位置中均限定是H、或在一个位置中限定是甲基而在剩余位置中限定是H的R1和R2基团。
例如,假定存在与一种指定及已知受体结合的具有6个氨基酸残基的原始多肽。该原始多肽可以描述为:X1-X2-X3-X4-X5-X6。
本发明的替代物(称作“S”)用来合成如下所述的化合物:
X1-X2-X3-S-X5-X6
在化合物X1-X2-X3-S-X5-X6的一个方面,其中氨基酸残基X4由S替换,S具有与X4的氨基酸侧链部分相同或作为X4的氨基酸侧链部分的衍生物的R1或R2基团。在另一方面,在X4不是Gly或Ala的情况下,S具有在两个位置中均是H、或在一个位置中是甲基而在剩余位置中是H的R1和R2基团。对化合物X1-X2-X3-S-X5-X6的结合或对效力的某些其它度量进行测定,并与原始多肽X1-X2-X3-X4-X5-X6比较。
有可能并构思的是可以进行系统性评估。假定存在与指定已知受体结合的具有15个氨基酸残基的原始多肽。该原始多肽可以描述为:
NH2-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-COOH
在这种原始多肽中,X可以是任意残基,其中残基可以按照任意顺序或次序重复多次。因此,在位置X1中的残基可以与位置X2中的残基相异或相同,其中位置X2中的残基可以与X1或X3等中的残基相异或相同。产生了其中替代物“S”以依次方式或逐步方式取代氨基酸残基的一系列化合物,因此,例如可以产生以下化合物:
S-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-COOH
NH2-X1-S-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-COOH
NH2-X1-X2-S-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-COOH
NH2-X1-X2-X3-S-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-COOH
NH2-X1-X2-X3-X4-S-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-COOH
NH2-X1-X2-X3-X4-X5-S-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-COOH
NH2-X1-X2-X3-X4-X5-X6-S-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-COOH
NH2-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-S-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-COOH
NH2-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-S-X10-X11-X12-X13-X14-X15-COOH
NH2-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-S-X11-X12-X13-X14-X15-COOH
NH2-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-S-X12-X13-X14-X15-COOH
NH2-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-S-X13-X14-X15-COOH
NH2-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-S-X14-X15-COOH
NH2-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-S-X15-COOH
NH2-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-S
在前述化合物中,对于每种化合物,替代物S具有这样的R1或R2基团,其与该替代物所取代氨基酸残基的氨基酸侧链部分相同或是该替代物所取代氨基酸残基的氨基酸侧链部分的衍生物。对于每个位置,可以采用并评估全部对映体形式。此外,对于每个位置,可以评估“敲除”方法,其中在X不是Gly或Ala的情况下,S具有在两个位置中均是H或在一个位置中是甲基而在剩余位置中是H的R1和R2基团。
也有可能和构思的是用另一种氨基酸残基取代原始多肽中的一个或多个氨基酸残基,同时还用本发明的替代物取代原始多肽中的一个或多个氨基酸残基。在一个方面,D-异构体取代在天然存在的原始多肽中的L-异构体。包含至少一个式I替代物的对应氨基酸序列可以与已知原始多肽相同或可以与其同源,如至少60%同源或更优选至少约80%同源的对应氨基酸序列。出于这些目的,通过参照已知氨基酸序列的同源性而确定不包括一个或多个式I替代物置换或添加的化合物的同源性。
在另一方面,本发明提供这样的式II环约束性氨基酸替代物,其用来合成在与利尿钠肽受体结合的已知肽上建模而包括一个或多个氨基酸替代物的化合物,此类替代物取代了在已知肽中含有的一个或多个氨基酸残基,或对于包含已知肽的序列是额外的。已知肽可以是本领域已知的任意利尿钠肽,包括但不限在本文援引的任何出版物、专利、申请或参考文献中公开的那些利尿钠肽,包括但不限于在美国专利4,496,544;4,609,725;4,656,158;4,673,732;4,716,147;4,757,048;4,764,504;4,804,650;4,816,443;4,824,937;4,861、755;4,904,763;4,935,492;4,952,561;5,047,397;5,057,495;5,057,603;5,091,366;5,095,004;5,106,834;5,114,923;5,159,061;5,204,328;5,212,286;5,352,587;5,376,635;5,418,219;5,665,704;5,846,932;5,583,108;5,965,533;6,028,055;6,083,982;6,124,430;6,150,402;6,407,211;6,525,022;6,586,396或6,818,619中;在美国专利申请公开2004/0002458;2004/0063630;2004/0077537;2005/0113286;2005/0176641或2006/0030004中;或在多种非美国专利和专利申请,包括WO 85/04870;WO 85/04872;WO 88/03537;WO 88/06596;WO 89/10935;WO 89/05654;WO 90/01940;WO 90/14362;WO 92/06998;WO 95/13296;WO 99/08510;WO 99/12576;WO 01/016295;WO 2004/047871;WO 2005/072055;EPO 0 291 999;EPO0 323 740;EPO 0 341 603;EPO 0 350 318;EPO 0 356 124;EPO 0 385 476;EPO 0 497 368;或EPO 0 542 863中公开的利尿钠肽。在一个方面,已知肽是在美国专利4,656,158、4,824,937、4,935,492、5,159,061、5,204,328、5,376,635、5,665,704、5,846,932、6,028,055、6,407,211、6,525,022、6,586,396或6,818,619,美国专利申请公开2004/0002458、2004/0063630或2005/0176641或国际专利申请公开WO 2004/047871或WO 2005/072055中公开的肽或其同系物。前述每篇专利和专利申请的教导通过引用的方式如完整所述那样并入。在一个方面,与利尿钠肽受体结合的氨基酸序列在置换之前是H-Met-环(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(SEQ ID NO:1)。在另一方面,本发明提供这样的式I环约束性氨基酸替代物,其用于合成与利尿钠肽受体(包括ANP或BNP的受体)结合的化合物。
使用一种或多种式I替代物所产生的化合物既可以用于医学应用,也可以用于畜牧业或兽医应用。通常,该化合物或包含该化合物的药物组合物用在人体中,不过也可以用在其它哺乳动物中使用。术语“患者”意图指哺乳动物个体,并且在本说明书通篇范围内和在权利要求书中如此使用。本发明的主要应用涉及人类患者,不过本发明可以应用至实验动物、农场动物、动物园动物、野生动物、宠物、体育动物或其它动物。
在本文中公开或通过本文中公开的方法所产生的化合物可以用于治疗任何病症、综合征或疾病,并且尤其用于治疗原始多肽对其具有某些效力的任何病症、综合征或疾病。在本文中公开或通过本文中公开的方法所产生的化合物可以具有相对于原始多肽的一个或多个优势,包括但不限于以下优势,如增加的抗酶降解性、增加的循环半寿期、增加的生物利用度、增加的效力、延长的作用持续时间及其前述组合。此类优势从整体上或部分地归因于使用本发明的式I替代物。
在一个方面,本文中公开的化合物用于早期(如1类)充血性心力衰竭的治疗中。在另一方面,本文中公开的化合物用于慢性或代偿失调性充血性心力衰竭的治疗中。在另一方面,本文中公开的化合物用于急性充血性心力衰竭(包括在休息及最小活动情况下呼吸困难的患者的急性代偿失调性充血性心力衰竭)的治疗中。
化合物的盐形式。本发明的化合物可以处于任何可药用盐形式。术语“可药用盐”指从可药用的无毒碱或无毒酸(包括无机碱或有机碱和无机酸或有机酸)制备的盐。从无机碱衍生的盐包括铝、铵、钙、铜、高铁、亚铁、锂、镁、锰、亚锰、钾、钠、锌等的盐。特别优选铵、钙、锂、镁、钾和钠盐。从可药用的有机无毒碱中衍生的盐包括伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、环状胺和碱性离子交换树脂如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N,N′-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基-吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、氨基葡糖、组氨酸、哈胺、异丙基胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙基胺、氨丁三醇等的盐。
当本发明的化合物呈碱性时,酸加成盐可以从可药用的无毒酸(包括无机酸和有机酸)制备。此类酸包括乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、羧酸、柠檬酸、乙磺酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖酸、谷氨酸、氢溴酸、氢氯酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、丙二酸、粘酸、硝酸、双羟萘酸、泛酸、磷酸、丙酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸等。本发明的化合物的酸加成盐从该化合物和过量的酸如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、柠檬酸、酒石酸、马来酸、琥珀酸的或甲基磺酸在合适的溶剂中制备。乙酸盐形式尤其是有用的。在本发明实施方案的化合物包括酸性部分的情况下,合适的可药用盐可以包括碱金属盐(如钠或钾盐)或碱土金属盐(如钙或镁盐)。
药物组合物。本发明的另一实施方案提供包括本发明化合物和可药用载体的药物组合物。载体可以是液体制剂,并且优选地是缓冲、等张的水溶液剂。可药用载体也包括赋形剂如稀释剂、载体等,以及添加剂,如稳定剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂等,如下文所述。
本发明的数个实施方案的化合物可以配制成或复合成包括至少一种本发明化合物连同一种或多种可药用载体的药物组合物,其中所述的可药用载体可以根据需要包括赋形剂如稀释剂、载体等和添加剂如稳定剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂等。制剂用赋形剂可以包括聚乙烯吡咯烷酮、明胶、羟基纤维素、阿拉伯胶、聚乙二醇、甘露醇、氯化钠和柠檬酸钠。对于注射剂或其它液态施用制剂,优选含有至少一种或多种缓冲组分的水,并且也可以使用稳定剂、防腐剂和增溶剂。对于固态施用制剂,可以使用任意的多种增稠剂、填料、填充剂和载体添加剂,如淀粉、糖、脂肪酸等。对于局部施用制剂,可以使用任意的多种乳膏剂、软膏剂、凝胶剂、洗剂等。对于绝大多数药物制剂,按照重量或体积,非活性成分将构成制剂的主要部分。对于药物制剂,还构思的是可以施用任意的多种定量释放性、缓释性或定时释放性制剂和添加剂,以至可以配制出这样的剂量来实现经一段时间送递本发明的化合物。
通常,施用至患者的化合物的实际量将在相当宽泛的范围内变化,这取决于施用模式、使用的制剂和想要的反应。
在实际使用中,化合物可以根据常规药学复合技术作为掺合剂中的活性成分与药用载体组合。载体可以采取种类繁多的形式,这取决于施用(例如口服、胃肠道外(包括静脉内)、尿道、阴道、鼻、皮肤、经皮、肺、肺深部、吸入、口颊、舌下等)所需要的制剂形式。在制备用于口服剂量形式的组合物中,可以使用任何常见的药用介质,例如在口服液体制剂例如混悬剂、酏剂和溶液剂的情况下,使用水、二醇、油、醇、增香剂、防腐剂、着色剂等;或如在口服固体制剂例如粉剂、硬胶囊剂和软胶囊剂和片剂的情况下,使用载体,如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。
因为其易于施用,片剂和胶囊剂代表有利的口服剂量单位形式。若需要,包括本发明化合物的组合物可以通过标准的含水或不含水技术加以包衣。活性化合物在此类治疗用组合物中的量是这样的,以至于将获得有效剂量。在另一种有利的剂量单位形式中,可以使用舌下药物组合物,如薄片(sheet)、糯米纸囊剂、片剂等。活性化合物也可以作为例如液态滴剂或喷雾剂进行鼻内施用。
片剂、丸剂、胶囊剂等也可以含有粘合剂如黄芪树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶;赋形剂如磷酸氢二钙;崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉或藻酸;润滑剂如硬脂酸镁和甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精。当剂量单位形式是胶囊剂时,除以上类型的材料之外,它还可以含有液态载体如动物油。
多种其它材料可以用作包衣层或用来对剂量单位的物理形式修饰。例如,片剂可以用紫胶、糖或这两者加以包衣。除活性成分外,糖浆剂或酏剂还可以含有蔗糖作为甜味剂、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯作为防腐剂、染料和香料如樱桃香料或橙香料。
化合物也可以作胃肠道外施用。这些活性肽的溶液剂或混悬剂可以在适度与表面活性剂(如羟丙基纤维素)混合的水中制备。也可以在甘油、液态聚乙二醇及其在油中的混合物内制备分散体。这些制剂可以任选地含有防止微生物生长的防腐剂。也可以使用冻干的单个单位剂量,如其在紧邻施用前用盐水重构,并且因此不需要防腐剂
适于可注射用途的药物形式,包括,例如用于临时制备无菌可注射溶液剂或分散体的无菌水溶液或分散体和无菌粉末,如冻干制剂。在所有情况下,该形式必须是无菌的并且必须具有如此程度的流动性,以至于它可以通过注射器施用。该形式必须在制造和储存条件下是稳定的并且必须保存避免微生物(如细菌和真菌)污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇)或液态聚乙二醇、其合适混合物及植物油的溶剂或分散体介质。
如本文中公开的化合物可以通过鼻施用方式治疗性地应用。“鼻施用”意指鼻内施用本发明的任意化合物的任何形式。化合物可以存在于水溶液剂如包含盐、柠檬酸盐或其它常见赋形剂或防腐剂的溶液剂中。化合物也可以存在于干燥制剂或粉剂制剂中。
在备选实施方案中,化合物可以直接施用至肺内。肺内施用可以通过定量投药吸入器(当由患者在呼吸期间开动时允许自行施用本发明化合物的定量大丸剂的一种装置)而进行。可以使用干粉吸入气雾剂和喷洒气雾剂。
根据本发明的另一种实施方案,本发明的化合物可以与增加药物(包括肽药物)的有效鼻吸收效果的多种药剂中的任一种一起配制。这些药剂应当增加鼻吸收效果,而不对粘膜造成不可接受的损伤。美国专利5,693,608、5,977,070和5,908,825及其它美国专利教授了可以使用的包括吸收增强剂的众多药物组合物,并且前述每篇专利的教导及其中援引的全部参考文献和专利通过引用的方式并入。
若在水溶液中,本发明的某些化合物可以通过可以处于任何生理可接受性pH(一般约pH4-约pH7)上的盐水、乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐或其它缓冲剂而适度受到缓冲。也可以使用缓冲剂的组合,如磷酸盐缓冲盐水、盐水和乙酸盐缓冲剂等。在盐水的情况下,可以使用0.9%盐水溶液。在乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等的情况下,可以使用50mM溶液。除了缓冲剂之外,还可以使用防止或限制细菌生长和其它微生物生长的合适防腐剂。一种可以使用的此种防腐剂是0.05%苯扎氯铵。
还有可能并构思的是化合物可以是干燥颗粒形式。在优选的实施方案中,颗粒大小为约0.5μm至6.0μm,从而所述颗粒具有足够质量以停留在肺表面上并且不被呼出,然而是足够小的以至于它们在抵达肺之前不沉积在气道表面上。多种不同技术均可以用来产生干粉微粒,包括但不限于微碾磨法、喷雾干燥法和气雾剂快速冷冻随后冻干法。利用微粒子,构建体可以沉积至肺深部,因而提供迅速及高效的进入血流的吸收。此外,采用这种方法,则不需要渗透增强剂,正如有时在经皮、鼻或口粘膜送递途径的情况。多种吸入器均可以使用,包括基于推进剂的气雾剂、雾化吸入器、单次剂量干粉吸入器和多剂量干粉吸入器。当前使用的常见装置包括定量剂量吸入器,其用来送递用于治疗哮喘、慢性闭塞性肺病等的药物。优选的装置包括干粉吸入器,其设计旨在形成具有总是小于约6.0μm粒度的细微粉末的云雾或气雾剂
可以通过制造方法控制微粒大小,包括平均大小分布。对于微碾磨法,碾磨头的尺寸、转子速度、加工时间等控制微粒大小。对于喷雾干燥法,喷嘴尺寸、流速、干燥器热度等控制微粒大小。对于通过气雾剂快速冷冻随后冻干法的产生而言,喷嘴尺寸、流速、气雾化溶液的浓度等控制微粒大小。这些参数和其它参数可以用来控制微粒大小。
本发明的化合物可以通过注射定时释放的可注射制剂而治疗性地施用,其中所述的注射一般是深部肌内注射,如在臀肌或三角肌中。在一个实施方案中,本发明的化合物与PEG如聚乙二醇3350和任选一种或多种其它赋形剂和防腐剂(包括但不限于赋形剂如盐、聚山梨醇酯80、调节pH的氢氧化钠或氢氯酸等)一起配制。在另一个实施方案中,本发明的化合物与聚(原酸酯)和任选地一种或多种其它赋形剂一起配制,其中所述的聚(原酸酯)可以是在聚合物主链中具有任何可变百分含量乳酸的自催化性聚(原酸酯)。在一个实施方案中,使用聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)聚合物(PLGA聚合物),优选地使用具有亲水端基的PLGA聚合物,如来自BoehringerIngelheim,Inc.(Ingelheim,Germany)的PLGA RG502H。此类制剂可以例如通过将合适溶剂(如甲醇)中的本发明化合物与PLGA的二氯甲烷溶液合并,并在反应器中于适宜混合条件下向其添加聚乙烯醇的连续相溶液而产生。通常,众多可注射及生物可降解的聚合物均可以在定时释放的可注射制剂中使用,所述的聚合物优选地也是粘性聚合物。美国专利4,938,763、6,432,438和6,673,767的教导及其中公开的生物可降解聚合物及配制方法通过引用的方式并入本文。制剂可以是这样的,以至需要基于周、月或其它周期基础提供注射,这取决于化合物的浓度和量、聚合物的生物降解速率和本领域技术人员已知的其它因素。
施用途径。若通过注射法施用本发明的化合物,则注射可以是静脉内、皮下、肌内、腹膜内或本领域已知的其它方式。本发明的化合物可以通过本领域已知的任何方法配制成(包括但不限于以下的)制剂,如片剂、胶囊剂、小胶囊、混悬剂、粉剂、冻干制剂、栓剂、滴眼剂、皮肤贴剂、口服可溶性制剂、喷雾剂、气雾剂等,并可以与缓冲剂、粘合剂、赋形剂、稳定剂、抗氧化剂和本领域已知的其它添加剂混合及配制。通常,可以使用经表皮细胞层导入本发明化合物的任何施用途径。施用方法可以因此包括经粘膜施用、口颊施用、口服施用、皮肤施用、吸入施用、肺施用、鼻施用、尿道施用、阴道施用等。
在一个方面,本发明的化合物通过定时释放的可注射制剂(如在具有PEG、聚(原酸酯)或PLGA聚合物的制剂中的本发明化合物)施用。在另一方面,本发明的化合物通过提供连续或间歇式皮下送递的自动送递装置施用。任意的前述方法和制剂特别适用于治疗慢性病症或综合征,包括慢性充血性心力衰竭并且特别是慢性代偿失调性充血性心力衰竭。
在一个方面,本发明的任意化合物可以通过皮下施用法(包括在美国专利6,586,396中公开的全部方法)施用。在另一方面,患者,尤其相对受到补偿的或作为门诊患者环境下充血性心力衰竭患者的患者可以通过如美国专利申请公开2004/0077537和国际专利申请公开WO 2003/079979中公开的方法并以其中公开的剂量而施用本发明的化合物。在另一方面,患者可以通过如美国专利申请公开2005/0113286中公开的方法施用本发明的化合物。在又一方面,可以通过如美国专利申请公开2006/0019890中公开的方法为心脏重塑而治疗已经遭受心肌损伤的患者。
本发明的化合物也可以通过经皮施用法施用,包括通过如美国专利申请公开2006/0034903中公开的装置和方法的送递系统。类似地,在其中公开的水凝胶制剂和固态制剂可以改进以与本发明的化合物一起使用。
治疗有效量。通常,施用至患者的本发明化合物的实际量将在相当宽泛的范围内变化,这取决于施用模式、使用的制剂和想要的反应。用于治疗的剂量,即足以产生想要的治疗效果的量,通过前述任意方法或本领域已知的任何其它方法施用。因此,治疗有效量包括足以诱导预期效果的本发明化合物或药物组合物的量。在其中利尿钠肽在产生包括式I替代物之一的化合物中用作原始多肽的一个方面,治疗有效量是产生想要的钠尿排泄、利尿和/或血管舒张的量。
通常,本发明的化合物具有高度活性。例如,化合物可以按照约0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50或100μg/kg体重施用,这取决于所选的具体化合物、想要的治疗应答、施用途径、制剂和本领域技术人员已知的其它因素。
5.用于式I替代物的合成方法
本发明的式I替代物可以通过标准的合成方法学获得。在下文方案中显示一些常规方法。用于制备本发明化合物和所述化合物的中间体的起始材料是市售的或可以使用已知合成方法和试剂从市售材料制备。
本文中使用的保护基团指这样的基团,其一般不存于最终治疗化合物中,但在某些合成阶段有意地导入以便保护可能在化学操作期间受到改变的基团。此类保护基团在合成的较晚阶段被除去或转化成想要的基团,并且携带此类保护基团的化合物因此主要作为化学中间体是重要的(虽然一些衍生物也表现生物学活性)。因此,保护基团的精确结构不是关键性的。
用于形成和除去此类保护基团的众多反应在众多标准著作中描述,所述的著作例如包括Protective Groups in Organic Chemistry,Plenum Press,London和New York,1973;Greene,Th.W.Protective Groups in Organic Synthesis,Wiley,NewYork,1981;The Peptides,第I卷,Schroder和Lubke,Academic Press,London和New York,1965;以及Methoden der organischen Chemie,Houben-Weyl,第四版,第15/1卷,Georg Thieme Verlag,Stuttgart1974,所述文献通过引用的方式并入本文。
以下合成本发明式I氨基酸替代物的方法的实例将是说明性的,并且将理解对所述方法实例的变型可以由本领域技术人员实施,并且将在本文中包括这类变型。
合成模拟无官能化R侧链的氨基酸的哌嗪酮支架(方法A和B)
该构建体通过如方法A和B中描述的多种方法制备。
方法A:二肽(3)通过混合酐法,使用Boc-丝氨酸(OBn)-OH(1)和α-氨基酯(2)形成。该二肽以高产率获得并且通常无需纯化。使用乙硼烷-四氢呋喃还原甲基酯和酰胺基团,其中保护仲胺以产生二-Boc保护的氨基醇中间体(4)。用重铬酸吡啶鎓(PDC)氧化该醇并伴随环化而在一个步骤中产生哌嗪-2-酮(5)。通过氢化除去二苄醚,随后交换保护基团,产生Fmoc保护的哌嗪-2-酮(6)。最后,将伯醇通过众多不同方法(PDC、Jones氧化法、氯化钌-高碘酸钠法、2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧自由基(TEMPO)氧化法)中的任一种氧化成酸以产生终产物(7)。
方法A
2-(3-苄氧基-2-叔丁氧羰基氨基-丙酰氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(3)的合成:向保持在-20℃于氮气下的在30mL无水四氢呋喃中的10mmol Boc丝氨酸二苄醚(1)的溶液添加22mmol三乙胺,随后缓慢添加11.4mmol氯甲酸异丁酯。白色固体析出。浆液搅拌15分钟,并且随后以一个份额添加11.1mmolα-氨基酯(2)。浆液在-20℃搅拌30分钟并随后升温至室温,搅拌2小时,并随后浓缩至干燥。混合物随后在50mL乙酸乙酯/30mL1N氢氯酸溶液之间分配。使各层分开,并且有机层用1×20mL1N氢氯酸和1×20mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。化合物(3)通常以高于90%的产率获得,并且无需纯化。
双-Boc-2-取代-(2-氨基-3-苄氧基-丙基-氨基)-乙醇(4)的合成:向保持在室温于氮气下的在50mL无水四氢呋喃中的35mmol(3)溶液添加在四氢呋喃中的200mL 1N乙硼烷溶液。溶液在室温搅拌过夜,并且随后缓慢倾倒在200mL 1N氢氯酸的冰冷溶液上。双相溶液随后用固体氢氧化钠中和。添加140mL饱和碳酸氢钠溶液,随后添加70mmol二-叔丁基-二碳酸酯,并且将混合物在室温搅拌2日,用200mL乙酸乙酯稀释并使各层分开。有机层经硫酸镁干燥,并浓缩。产物(4)通过硅胶柱层析法纯化。
1,4-二-Boc-6-苄氧基甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(5)的合成:70mmol(4)和在300mL无水二甲基甲酰胺中的400mmol重铬酸吡啶鎓的溶液在48℃于氮气下搅拌6小时,冷却至室温,倾倒至1500mL水中,并用4×500mL乙醚萃取。将醚层合并、经硫酸镁干燥,并浓缩。产物(5)通过硅胶柱层析法纯化。
4-Fmoc-6-羟甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(6)的合成:在200mL乙醇中的19mmol(5)和2g10%钯碳的混悬液在室温及常压下氢化过夜。混悬液经硅藻土过滤并浓缩。残余物重溶解在二氯甲烷中的40mL50%三氟乙酸中。溶液在室温搅拌2小时,并且随后浓缩。残余物重溶解在60mL四氢呋喃/40mL水中,并用固体碳酸氢钠中和,随后添加40mmol固体碳酸氢钠以及20mmol芴甲氧羰酰氯。混合物随后在室温搅拌2小时,用300mL乙酸乙酯稀释,并使各层分离。有机层经硫酸镁干燥、浓缩并通过硅胶柱层析法纯化。
4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-羧酸(7)的合成:通过几种方法制备化合物(7)。
(a)向冷却至0℃的在180mL乙腈中的10mmol(6)、180mL四氯化碳和240mL水的双相溶液添加112mmol固体高碘酸钠,随后添加340mg氯化钌。使反应升温至室温,搅拌2小时并且随后经硅藻土过滤。使各层分开,并且水层用2×75mL乙酸乙酯再萃取。将有机层合并,经硫酸镁干燥,并浓缩。
(b)在48℃于氮气下搅拌在60mL无水二甲基甲酰胺中的12mmol(6)和59mmol PDC的溶液约5小时,将溶液冷却至室温并且倾倒在600mL水上,并用3×200mL二氯甲烷提取。将有机层合并,经硫酸镁干燥,并浓缩。
(c)向在室温保持的在350mL丙酮中的17mmol(6)的溶液添加(从8.0g铬酸、17.4mL水和6.9mL浓硫酸中制备的)25mL Jones试剂。混合物搅拌1小时,添加150mL异丙醇并将混合物经硅藻土过滤。硅藻土用乙酸乙酯洗涤。将有机层合并及浓缩。残余物溶解在250mL乙酸乙酯中并用2×50mL水洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。
(d)向在室温保持的在810mL乙腈中的81mmol醇(6)的溶液添加磷酸盐缓冲液(用7.2g磷酸二氢钠和14.3g磷酸氢二钠在295mL水中制备),随后添加3.3g(20.7mmol)TEMPO和18.6g(164.4mmol)亚氯酸钠,并将双相溶液置于维持在43℃的油浴中,并且随后缓慢添加(通过混合19.3mL10-13%次氯酸钠溶液与24mL水而制备的)43.3mL(25.9mmol)次氯酸钠溶液。反应在43℃搅拌4小时。溶液冷却至室温,并添加200mL10%亚硫酸氢钠溶液,搅拌10分钟,用500mL乙酸乙酯稀释,并使各层分开。有机层用1×100mL盐水、1×160mL 1N氢氯酸溶液洗涤,经硫酸钠干燥,并浓缩。
产物(7)通过硅胶柱层析法纯化。
方法B:使用TEMPO/异氰尿酸试剂,如方法A中所述那样制备的中间体双-Boc-2-取代-(2-氨基-3-苄氧基-丙基-氨基)-乙醇(4)氧化成酸,并且随后用碘甲烷酯化以产生完全受保护的还原二肽类似物(8)。Boc基团和二苄醚的脱保护产生了3-取代的5-羟甲基-哌嗪-2-酮,其作为Fmoc衍生物受到保护以产生(6),后者被氧化成如方法A中所述的终产物。
方法B
二-Boc-(2-氨基-3-苄氧基-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(8)的合成:向保持在0℃的在680mL丙酮中的76mmol(4)和210mL饱和碳酸氢钠溶液的混悬液添加21mmol固体溴化钠和2.9mmol TEMPO,随后缓慢添加156mmol三氯异氰尿酸。反应在0℃搅拌30分钟,并且随后在室温过夜,用1N氢氯酸溶液酸化,并用2×300mL乙酸乙酯萃取。有机层用3×50mL的1N氢氯酸洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。残余物重溶解在40mL无水二甲基甲酰胺和95mmol固体碳酸氢钠中,并添加112mmol碘甲烷,并将混合物在室温于氮气下搅拌直至HPLC显示反应结束;溶液随后用200mL乙醚稀释,并用2×100mL水洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。产物(8)通过硅胶柱层析法纯化。
4-Fmoc-6-羟甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(6)的合成:将二氯甲烷中的40mL50%三氟乙酸中36mmol(8)的溶液在室温搅拌2小时,并且随后倾倒在200mL饱和碳酸氢钠溶液内。使各层分开,并且将有机层浓缩。残余物重溶解在100mL乙酸乙酯中,并用2×50mL水洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。残余物溶解在100mL乙醇中,并且添加5g的10%钯碳和35mL的1N氢氯酸溶液,并将混合物在室温及常压下氢化直至HPLC显示反应结束;溶液随后经硅藻土过滤并浓缩。残余物重溶解在80mL乙酸乙酯中,添加在30mL水中的70mmol碳酸氢钠,并且混合物在室温搅拌过夜。除去乙酸乙酯并添加100mL四氢呋喃,随后添加178mmol固体碳酸氢钠和43mmol芴甲氧羰酰氯,并且将混合物搅拌直至HPLC显示反应结束,用300mL乙酸乙酯稀释,并使各层分开。有机层用2×50mL水洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。产物(6)通过硅胶柱层析法纯化。
4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-羧酸(7)的合成:化合物(7)如方法A中所述那样制备。
用于制备适用于具有或没有官能化R侧链的化合物的哌嗪酮支架的一般常见合成方法(方法C、E、F)
方法C:(2-Fmoc-氨基-3-R′-O-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(10)通过使用氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂,以α-氨基酯(2)使Fmoc O-保护的丝氨醛(9)还原氨化而制备。还原氨化所需要的Fmoc O-保护的丝氨醛(9)根据方法D通过用二-异丁基氢化铝还原酯(12),通过用Dess-Martin高价碘化合物氧化Fmoc O-保护的丝氨醇(13)或通过用氢化锂铝还原Fmoc O-保护的丝氨酸Weinreb酰胺(14)而制备。用于制备Fmoc O-保护的丝氨醛(9)的优选方法是Weinreb酰胺类似物还原法。(2-Fmoc-氨基-3-R′-O-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(10)随后进行N和O脱保护、环化和Fmoc保护以产生3-取代的6-羟甲基-哌嗪-2-酮(6),后者随后氧化成如方法A中所述的终产物。
合成中所用在Fmoc-O-保护的丝氨醛(9)的羟基上的保护基团(R′)取决于氨基酯的侧链R的性质。当R不含官能团时,将Fmoc丝氨酸的侧链保护为tBu醚。当R含有官能团时,将Fmoc丝氨酸的侧链保护为三苯甲基醚。
方法C
方法D
方法D:多种Fmoc-O-保护的丝氨醛(9)的合成。Fmoc-O-R’丝氨酸甲基酯(12)的合成:将保持在氮气下的在80mL无水二甲基甲酰胺中的80mmolFmoc O-R’丝氨酸(11)、10.0g(120mmol)固体碳酸氢钠和10.0mL(160mmol)碘甲烷的轻度混悬液在室温搅拌过夜。反应混合物随后倾倒在500mL水上,并滤出固体。将该固体重溶解在800mL乙酸乙酯中,并用1×200mL水洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。无需纯化。
R′ | 化合物(12)的分析数据 |
tBu | 1H NMR δ(CDCl3):1.14(s,9H,tBu),3.57-3.70(m,1H,CH2-O),3.75(s,3H,O-CH3),3.79-3.83(m,1H,CH2-O),4.01-4.50(一系列多重峰,4H),5.64-5.68(d,1H,NH),7.28-7.78(8H,富烯),产率=93% tR=7.8min. |
Trt | 1H NMR δ(CDCl3):3.42-3.48(m,1H,CH2-O),3.59-3.66(m,1H,CH2-O),3.81(s,3H,CH3-O),4.10-4.18(m,1H,CH),4.36-4.42(m,2H,CH2-O),4.50-4.57(m,1H,CH-N),5.73-5.78(d,1H,NH),7.22-7.82(8H,富烯),产率=定量,tR=9.04min. |
Fmoc-O-R′丝氨醇(13)的合成:向保持在-20℃于氮气下的在50mL无水四氢呋喃中的10.0mmol Fmoc O-R′丝氨酸(11)的溶液添加1.77mL(12.7mmol)三乙胺,随后缓慢添加1.57mL(12.0mmol)氯甲酸异丁酯。混合物搅拌30分钟,并且随后缓慢地倾倒在10mL水中的3.77g(99.6mmol)硼氢化钠的冰冷溶液上,维持温度低于5℃。反应在0℃搅拌15分钟,并且随后用1N氢氯酸溶液猝灭。反应混合物用100mL乙酸乙酯稀释,并使各层分开。有机层用2×25mL 1N氢氯酸溶液、2×25mL水洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。化合物通过硅胶柱层析法纯化。
R′ | 化合物(13)的分析数据 |
tBu | 1H NMR δ(CDCl3):1.14(s,9H,tBu),2.90-2.95(d,1/2H,CH2-O),3.63(d,2H,CH2-O),3.65-3.93(m,3H,CH2-O),4.20-4.35(t,1H,CH),4.35-4.45(d,2H,CH2),5.50-5.57(d,1H,NH),7.26-7.8(8H,富烯),产率=85%,tR=6.42min. |
Trt | 1H NMR δ(CDCl3):3.24-3.32(br.d,1H,CH2-O),3.30-3.45(br.m,1H,CH2-O),3.60-3.987(br.m,3H,CH2-O,和CH-N),4.13-4.22(br.m,1H,CH),4.32-4.40(br.d,2H,CH2),5.24-5.32(br.d,1H,NH),7.16-7.76(23H,富烯,和Trt),产率=92%,tR=8.39min. |
Fmoc-O-R′丝氨酸Weinreb酰胺(14)的合成:在80mL无水二氯甲烷中的20.2mmol Fmoc O-R′丝氨酸(11)、6.98g(21.6mmol)2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和2.5mL(22.7mmol)N-甲基-吗啉的混悬液在室温于氮气下搅拌20分钟,并且随后添加3.02g(31mmol)N,O-二-甲基-羟胺盐酸盐和3.3mL(30mmol)N-甲基-吗啉,并且该混悬液在室温搅拌过夜。将形成的溶液随后浓缩至干燥,在200mL乙酸乙酯与100mL水之间再分配,用2×40mL 1N氢氯酸溶液并且随后用2×40mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。无需纯化。
R′ | 化合物(14)的分析数据 |
tBu | 1H NMR δ(CDCl3):1.45(s,9H,tBu),3.30(s,3H,CH3-N),3.55-37(m,2H,CH2-O),3.76(s,3H,CH3-O),4.19-4.26(m,1H,CH),4.30-4.38(m,2H,CH2-O),4.82-4.91(宽m,1H,CHN),5.68-5.75(d,1H,NH),7.2-7.8(8H,富烯),产率=定量,tR=6.59min. |
Trt | 1H NMR δ(CDCl3):3.24(s,3H,CH3N),3.34-3.46(m2H,CH2O),3.62(s,3H,CH3O),4.15-4.37(两个m,CH2,CH),4.86-4.98(m1H,CHN),5.80-5.86(d,1H,NH),7.18-7.8(一系列m,23H,Trt和富烯),产率=定量,tR=8.0min. |
从酯(12)合成Fmoc-O-R′丝氨醛(9):向保持在-78℃于氮气下的在5mL四氢呋喃中的3.5mmol(12)的溶液缓慢添加10mL 1N二异丁基氢化铝(DIBAL)溶液,搅拌15分钟并通过缓慢添加酒石酸钾钠饱和溶液被猝灭。将反应升温至室温,用50mL乙酸乙酯稀释,并且添加50mL酒石酸钾钠饱和溶液。使各层分开,并且水层用1×50mL乙酸乙酯再萃取。将有机层合并,经硫酸镁干燥,并浓缩。化合物(9)用于以下步骤中,无需进一步纯化。
R′ | 化合物(9)的分析数据 |
tBu | 1H NMR δ(CDCl3):1.16(s,9H,tBu),3.59-3.66(dd,1H,CH2O),3.90-3.98(dd,1H,CH2O),4.20-4.27(t,1H,CH),4.32-4.45(两个m,3H,CHN,和CH2O),5.64-5.74(br.d,1H,NH),7.28-7.35(m,2H,富烯),7.36-7.44(m,2H,富烯),7.58-7.65(d,2H,富烯),7.73-7.78(d,2H,富烯),9.62(s,1H,CHO). |
Trt | 1H NMR δ(CDCl3):3.53-3.61(dd,1H,CH2O),3.66-3.75(dd,1H,CH2O),4.33-4.47(两个m,4H,CHN,CH,和CH2),5.66-5.75(d,1H,NH),7.20-7.81(一系列m,23H,Trt,和富烯),9.6(s,1H,CHO). |
从醇(13)合成Fmoc-O-R′丝氨醛(9):向保持在室温于氮气下的在200mL无水二氯甲烷中的80mmol Fmoc-O-R’丝氨醇(13)的溶液添加88mmolDess-Martin高价碘化合物,并且反应搅拌2.5小时并通过添加400mL10%硫代硫酸钠水溶液被猝灭。使各层分开,并且将有机层浓缩,用300mL乙醚稀释并用含有10%硫代硫酸钠的饱和碳酸氢盐水溶液洗涤三次,经硫酸镁干燥,并浓缩。
从Weinreb酰胺(14)合成Fmoc-O-R′丝氨醛(9):向冷却至-78℃于氮气下的在60mL无水四氢呋喃中的8.8g(20.2mmol)粗制Fmoc-O-R′丝氨酸Weinreb酰胺中间体(14)的溶液添加四氢呋喃中的30mL 1N氢化锂铝溶液。将溶液搅拌15分钟并且随后通过缓慢添加30mL 1.4N硫酸氢钾溶液被猝灭。升温至室温后,滤除固体并浓缩滤液至干燥。残余物在50mL乙酸乙酯与25mL1N氢氯酸溶液之间再分配。使各层分开,并且有机层经硫酸镁干燥,过滤,并浓缩。
(2-Fmoc-氨基-3-R′-O-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(10)的合成:化合物(10)使用氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂,通过还原氨化法制备。
氰基硼氢化钠法:向保持在室温于氮气下的在20mL甲醇中的8.5mmol(2)氢氯酸盐的溶液添加2.3mmol固体氢氧化钾,并将混合物搅拌25分钟。添加在10mL甲醇中的Fmoc-O-R′丝氨醛(9)溶液至上述混悬液中,并且将反应混合物搅拌1小时。缓慢添加在四氢呋喃中的8.5mL 1N氰基硼氢化钠溶液,并将反应搅拌另外1小时,过滤并浓缩。残余物在水与乙酸乙酯之间分配,并且有机层用1×20mL饱和碳酸氢钠洗涤,经硫酸钠干燥,并浓缩。
三乙酰氧基硼氢化钠法:在50mL无水四氢呋喃中的21mmol(2)氢氯酸盐与2.9mL(21mmol)三乙胺的混悬液在室温搅拌45分钟,并且随后添加在30mL四氢呋喃中的约20mmol粗制Fmoc-(O-R′)-丝氨醛(9)的溶液,随后添加1.7g的4A粉末状分子筛,并将此混悬液搅拌另外2小时。添加6.4g(30mmol)固体三乙酰氧基硼氢化钠并将此混悬液在室温搅拌过夜。混悬液用甲醇稀释,用分子筛过滤,并浓缩滤液。残余物在100mL乙酸乙酯与50mL水之间分配。有机层经硫酸钠干燥,过滤,并浓缩。
化合物(10)通过硅胶柱层析法纯化。
4-Fmoc-6-羟甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(6)的合成:为制备化合物(6),需要三个步骤:(a)Fmoc脱保护,同时伴随环化、(b)Fmoc保护和(c)羟基脱保护。
除去Fmoc基团及环化:将30mL乙酸乙酯溶液中30%二乙胺中的10mmol环状化合物的溶液在室温搅拌过夜并随后浓缩至干燥。
(a)Fmoc保护:向在20mL四氢呋喃和10mL水中的10mmol化合物的双相溶液添加2.52g(30mmol)固体碳酸氢钠,随后添加3.36g(13mmol)Fmoc-Cl。混合物搅拌3小时,用乙酸乙酯稀释,使各层分开,并且有机层用水洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。
(b)羟基脱保护:对于含有tBu醚保护基团的化合物:化合物用在二氯甲烷中的90%三氟乙酸的溶液脱保护1-2小时,并随后浓缩至干燥。残余物溶解在乙酸乙酯中并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤,经硫酸镁干燥并随后浓缩。对于含有Trt醚保护基团的化合物:化合物通过添加在含有2-10%三异丙基硅烷的二氯甲烷中的1-10%三氟乙酸的溶液加以脱保护。反应是瞬时作用的。溶液随后通过倾入饱和碳酸氢钠溶液进行中和。使各层分开,经硫酸钠干燥,并浓缩。
化合物(6)通过硅胶柱层析法纯化。
4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-羧酸(7)的合成:化合物(7)如方法A中所述那样制备。化合物(7)通过硅胶柱层析法纯化。
方法E:2-Fmoc-氨基-3-羟丙基-Cbz-氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(15)通过使用氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂,以α氨基酯(2)使Fmoc丝氨醛(OR′)(9)还原氨化而制备。仲胺用氯甲酸苄酯保护,并且随后羟基用三氟乙酸溶液脱保护。化合物(15)随后进行Fmoc脱保护。氨基酯中间体立即环化以形成4-Cbz-3-取代的6-羟甲基-哌嗪-2-酮(16)。Fmoc3-取代的6-羟甲基-哌嗪-2-酮(6)通过保护基团交换而制备,并且随后被氧化成如方法A中所述的预期产物(7)。
方法E
(2-Fmoc-氨基-3-羟丙基-Cbz-氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(15)的合成:67mmol氢氯酸氨基酯(2)和在80mL甲醇中的20.9mmol固体氢氧化钾的混悬液在室温搅拌25分钟,并且随后添加至在250mL甲醇中的(9)的混悬液内。反应混合物搅拌1.5小时,随后缓慢添加在四氢呋喃中的70mL1N氰基硼氢化钠的溶液。反应搅拌过夜并且随后浓缩。残余物在300mL四氢呋喃与50mL1N氢氯酸溶液之间分配。使各层分开,并且有机层用在50mL水中的239mmol碳酸氢钠的溶液中和,并且随后缓慢添加66mmol氯甲酸苄酯,并且将反应搅拌3小时,用200mL乙酸乙酯稀释并使各层分开。有机层经硫酸镁干燥,并浓缩。残余物溶解在二氯甲烷内的三氟乙酸的溶液中并在室温搅拌2小时。将溶液倾倒在200mL饱和碳酸氢钠溶液上。使各层分开,并且有机层经硫酸镁干燥,并浓缩。化合物(15)通过硅胶柱层析法纯化。
4-Cbz-6-羟甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(16)的合成:在乙酸乙酯中的100mL30%二乙胺中的24mmol(15)的溶液在室温搅拌过夜,并随后浓缩至干燥。化合物通过硅胶柱层析法纯化
4-Fmoc-6-羟甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(6)的合成:在50mL乙醇中的15mmol(16)和1.8g 10%钯碳的混悬液在室温及常压下氢化直至HPLC显示反应结束。混合物随后经硅藻土过滤,浓缩,并且残余物溶解在35mL四氢呋喃和10mL水中,并且随后添加62mmol固体碳酸氢钠,随后添加16mmol Fmoc-Cl,并且将混合物搅拌3小时,用100mL乙酸乙酯和10mL水稀释。使各层分开,并且有机层经硫酸镁干燥,并浓缩。化合物(6)通过硅胶柱层析法纯化。
4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-羧酸(7)的合成:化合物(7)如方法A中所述那样制备并通过硅胶柱层析法纯化。
方法F:(2-Cbz-氨基-3-苄氧基-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(20)通过使用氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂,以α-氨基酯(2)使Cbz丝氨醛(OBn)(19)还原氨化而制备。对于还原氨化所需要的Cbz O-苄基丝氨醛(19)通过用Dess-Martin高价碘化合物氧化Cbz丝氨醇(OBn)(18)而制备。(20)的氢化及随后环化产生了3-取代的6-羟甲基-哌嗪-2-酮,后者随后经Fmoc保护成为4-Fmoc-3-取代的6-羟甲基-哌嗪-2-酮(6)。终产物(7)如方法A中所述而获得。
方法F
Cbz-丝氨醇(OBn)(18)的合成:化合物(18)如对化合物(13)所述那样制备。化合物(18)在硅胶柱层析纯化后以79%产率获得。1HNMR δ(CDCl3):3.57-3.74(两个m,3H,CHN,和CH2O),3.76-3.96(两个m,2H,CH2O),4.50(s,2H,CH2O),5.10(s,2H,CH2O),5.40-5.50(br.d,1H,NH),7.22-7.38(m,10H,Ph);HPLC tR=5.33min,(M++Na+)=337.64。
Cbz丝氨醛(OBn)(19)的合成:化合物(19)如对化合物(9)所述那样制备。向保持在室温于氮气下的在200mL无水二氯甲烷中的80mmol Cbz-O-Bn丝氨醇(18)的溶液添加88mmol Dess-Martin高价碘化合物,并且反应搅拌2.5小时,并随后通过添加400mL 10%硫代硫酸钠水溶液被猝灭。使各层分开,并且将有机层浓缩,用300mL乙醚稀释并用含有10%硫代硫酸钠的饱和碳酸氢盐水溶液洗涤三次,经硫酸镁干燥,并浓缩。化合物(19)以99%粗产率获得并且无需进一步纯化即可使用。1H NMR δ(CDCl3):3.69-3.78(dd,1H,CH2O),3.99-4.06(dd,1H,CH2O),4.37-4.46(m,1H,CHN),4.47-4.52(d,2H,CH2O),5.14(s,2H,CH2O),5.65-5.75(br.d,1H,NH),7.14-7.48(一系列m,9H,Ph),7.98-8.08(dd,1H,Ph),9.63(s,1H,CHO)。
(2-Cbz-氨基-3-苄氧基-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(20)的合成:化合物(20)如对化合物(10)所述那样制备,不过使用Cbz丝氨醛(19)作为醛。化合物(20)通过硅胶柱层析法纯化。
4-Fmoc-6-羟甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(6)的合成:将160mL乙醇中的38mmol(20)、38mL1N氢氯酸和20g10%钯碳的混悬液在室温及常压下氢化直至HPLC显示反应结束。混合物随后经硅藻土过滤并浓缩至干燥。残余物用75mL四氢呋喃稀释并用饱和碳酸氢钠溶液中和。添加106mmol固体碳酸氢钠和53mmol芴甲氧羰酰氯,并且反应在室温搅拌直至HPLC显示反应结束,用300mL乙酸乙酯和300mL盐水稀释。使各层分开,并且有机层用盐水洗涤两次,经硫酸镁干燥,并浓缩。产物(6)通过硅胶柱层析法纯化。
4-Fmoc-5-取代-δ-氧代-哌嗪-2-羧酸(7)的合成:化合物(7)如方法A中所述那样制备。
模拟无官能化侧链的氨基酸的2,2-双取代哌嗪酮支架的合成(方法G)
使用方法G实施模拟无官能化侧链的氨基酸的4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸支架的合成。2-Boc-氨基-3-甲氧羰基-1-取代-甲基氨基-2-甲基-丙酸叔丁基酯(23)通过使用氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂,以α-氨基酯(2)使2-Boc-氨基-2-甲基-3-氧代-丙酸甲基酯(22)还原氨化而制备。对于还原氨化所需要的化合物(22)通过用Dess-Martin高价碘化合物氧化α-甲基-Boc丝氨酸叔丁基酯(21)而获得。用二噁烷中的2N氯化氢除去(23)的Boc基团,并且将氨基酯环化成非保护的5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸叔丁基酯(24),后者用芴甲氧羰酰氯保护以产生4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸叔丁基酯,其用三氟乙酸脱保护以产生终产物(25)。
方法G
2-Boc-氨基-2-甲基-3-氧代-丙酸叔丁基酯(22)的合成:Boc α-甲基丝氨酸叔丁基酯(21)的氧化使用如前所述的Dess-Martin高价碘化合物进行,以96%粗产率产生目的产物(22)。该化合物用于下一步骤中,无需进一步纯化。1H NMR δ(CDCl3):1.44(s,18H,tBu),1.46(s,3H,CH3),5.63-5.70(br.s,1H,NH),9.5(s,1H,CHO)。
2-Boc-氨基-3-甲氧羰基-1-取代-甲基氨基-2-甲基-丙酸叔丁基酯(23)的合成:使用与对化合物(10)所述方法相似的方法制备化合物(23),不过使用化合物(22)作为醛。化合物(23)通过硅胶柱层析法纯化。
2-甲基-6-氧代-5-取代-哌嗪-2-羧酸(25)的合成:二噁烷中的8mL 2N氯化氢的4mmol(23)的溶液在室温搅拌5小时,并随后浓缩至干燥。残余物在20mL四氢呋喃中悬浮,用10mmol三乙胺中和,并在60℃搅拌2日。随后将残余物浓缩至干燥,在20mL四氢呋喃和10mL水中重悬,添加固体碳酸氢钠以调节pH至碱性,随后添加5.6mmol固体芴甲氧羰酰氯,并将反应混合物在室温搅拌过夜,用1N氢氯酸溶液调节pH,用100mL乙酸乙酯稀释,并使各层分开。有机层用2×100mL盐水洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。残余物溶解在二氯甲烷内的10mL 50%三氟乙酸中,并且将溶液在室温搅拌3小时。浓缩溶剂,并且产物(25)通过硅胶柱层析法纯化。
模拟具有官能化侧链的氨基酸的2,2-双取代哌嗪酮支架的合成(方法H)
使用方法H实施模拟具有官能化侧链的氨基酸的4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸支架的合成。2-烯丙氧羰基-氨基-3-(甲氧羰基-1-取代-甲基氨基-2-甲基-丙酸甲基酯(30)通过使用氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂,以α-氨基烯丙基酯(29)使2-烯丙氧羰基-氨基-2-甲基-3-氧代-丙酸甲基酯(28)还原氨化,随后用氯甲酸苄酯保护仲胺而制备。对于还原氨化所需要的化合物(28)通过用Dess-Martin高价碘化合物氧化(27)而获得。类似物(30)的烯丙基酯和烯丙氧羰基使用四(三苯膦)钯(O)予以除去,并且氨基酸通过与肽偶联试剂反应被环化以产生5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸甲基酯(31)。4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸(25)通过使甲基酯皂化,随后交换保护基团而获得。
方法H
烯丙氧羰基α-甲基丝氨酸甲基酯(27)的合成:将保持于氮气下的在8mL无水二甲基甲酰胺中的8mmol Boc α-甲基丝氨酸(26)、1.0g(12mmol)固体碳酸氢钠和1.0mL(16mmol)碘甲烷的溶液搅拌过夜。反应混合物随后倾倒在50mL水上并用50mL二乙醚萃取,并用1×20mL水洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。残余物溶解在二氯甲烷中的20mL 90%三氟乙酸中,并且溶液在室温搅拌3小时,并随后浓缩至干燥。残余物溶解在35mL四氢呋喃和10mL水中,随后添加30mmol固体碳酸氢钠,并且缓慢添加12mmol氯甲酸烯丙酯。混合物在室温搅拌2小时,用50mL乙酸乙酯稀释,并使各层分开。有机层随后用1×10mL饱和碳酸氢钠和1×10ml的1N氢氯酸和1×10mL水洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。化合物(27)通过硅胶柱层析法纯化。
2-烯丙氧羰基-氨基-2-甲基-3-氧代-丙酸甲基酯(28)的合成:使用如上所述的Dess-Martin高价碘化合物进行烯丙氧羰基α-甲基丝氨酸甲基酯(27)的氧化以产生目的产物(28)。
2-烯丙氧羰基-氨基-3-甲氧羰基-1-取代-甲基-Cbz-氨基-2-甲基-丙酸烯丙基酯(30)的合成:化合物(30)使用与对化合物(15)所述方法相似的方法而制备,不过使用化合物(28)作为醛。
4-Cbz-2-甲基-6-氧代-5-取代-哌嗪-2-羧酸甲基酯(31)的合成:向保持在室温于氮气下的在30mL二氯甲烷中的10mmol化合物(30)的溶液添加2当量苯基硅烷和0.3当量四(三苯基膦)钯(O),并且溶液搅拌2小时,并随后添加11mmol TBTU和14mmol N-甲基-吗啉,并且溶液在室温搅拌2小时,并随后浓缩至干燥。
4-Fmoc-2-甲基-6-氧代-5-取代-哌嗪-2-羧酸(25)的合成:向保持在室温于氮气下的在25mL甲醇中的10mmol化合物(31)的溶液缓慢添加11mmol1N氢氧化钠溶液,并且反应在室温搅拌过夜,用21mL 1N氢氯酸溶液中和,添加1g 10%钯碳,并且混悬液在室温及常压下氢化3小时。混悬液经硅藻土过滤并浓缩。残余物重溶解在25mL四氢呋喃和10mL水中,随后添加30mmol固体碳酸氢钠和10mmol芴甲氧羰酰氯,并且反应在室温于氮气下搅拌2小时。随后将反应用50mL乙酸乙酯稀释并用1N氢氯酸溶液酸化。随后使各层分开并且有机层用1×20mL水洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。化合物(25)通过硅胶柱层析法纯化。
(5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸支架的合成(方法I、J、K)
通过几种方法实施(5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸支架的合成
方法I:(叔丁基3-保护-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(35)通过使用氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂,以α-氨基酯(2)使叔丁基3-保护-氨基-4-氧代-丁酸酯(34)还原氨化而制备。对于还原氨化所需要的叔丁基3-保护-氨基-4-氧代-丁酸酯(34)通过氢化锂铝(LAH)使Weinreb酰胺衍生物(33)还原而制备。叔丁基(3-保护-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯类似物(35)随后进行脱保护、环化和Fmoc保护以产生叔丁基(5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸酯(36),后者随后脱保护以产生终产物(37)。
方法I
氨基保护的Asp-(OtBu)Weinreb酰胺(33)的合成:化合物(33)使用与对化合物(14)所述方法相似的方法而制备。
R2 | 化合物(33)的分析数据 |
Cbz | 1H NMR δ(CDCl3):1.40(s,9H,tBu),2.47-2.59(dd,1H,CH2CO),3.20(s,3H,CH2N),3.77(s,3H,CH3O),4.96-5.05(br.m,1H,CHN),5.05-5.12(br.d,2H,CH2O),5.58-5.66(br.d,1H,NH),7.30-7.36(br.m,5H,Ph),产率=90% |
Fmoc | 1H NMR δ(CDCl3):1.45(s,9H,tBu),2.55-2.64(dd,1H,CH2CO),2.69-2.80(dd,1H,CH2O),3.60(s,3H,CH3N),3.79(s,3H,CH3O),4.18-4.26(t,1H,CH),4.32-4.40(d,2H,CH2O),4.98-5.19(m,1H,CHN),5.70-5.76(br.d,1H,NH),7.35-7.80(一系列m,8H,富烯),产率=定量 |
叔丁基3-氨基保护的-氨基-4-氧代-丁酸酯(34)的合成:化合物(34)使用与对化合物(9)所述方法相似的方法而制备
R2 | 化合物(34)的分析数据 |
Cbz | 1H NMR δ(CDCl3):1.40(s,9H,tBu),2.69-2.81(dd,1H,CH2CO),2.89-3.01(dd,1H,CH2CO),4.33-4.42(m 1H,CHN),5.12(s,2H,CH2O),5.83-5.88(br.d,1H,NH),7.31-7.39(br.m,5H,Ph),9.64(s,1H,CHO) |
Fmoc | 1H NMR δ(CDCl3):1.45(s,9H,tBu),2.58-3.02(一系列m,2H,CH2CO),4.20-4.28(t,1H,CH),4.35-4.49(m,3H,CH2O,和CHN),5.85-5.92(br.d,1H,NH),7.27-7.80(一系列m,8H,富烯),9.65(s,1H,CHO) |
叔丁基3-保护-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(35)的合成:化合物(35)使用与对化合物(10)所述方法相似的方法而制备,不过使用化合物(34)作为醛。
叔丁基(4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸酯(36)的合成:对于含有Fmoc氨基保护基团的化合物,将在30mL乙酸乙酯溶液中的30%二乙胺中的10mmol化合物(35)的溶液在室温搅拌过夜,并随后浓缩至干燥。对于含有Cbz氨基保护基团的化合物,将30mL乙醇中的10mmol化合物(35)的溶液在室温及常压下氢化2小时,经硅藻土过滤并浓缩至干燥。为进行Fmoc保护,残余物溶解在20mL四氢呋喃中和10mL水中并添加2.52g(30mmol)固体碳酸氢钠,随后添加3.3g(13mmol)Fmoc-Cl。将混合物搅拌3小时并用乙酸乙酯稀释。使各层分开并且有机层用水洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。化合物(36)通过硅胶柱层析法纯化。
(4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸酯(37)的合成:对化合物(36)用二氯甲烷中的90%三氟乙酸溶液脱保护持续3小时,并随后浓缩至干燥。终产物(37)通过硅胶柱层析法纯化。
方法J:二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(41)通过使用氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂,以α-氨基酯(2)使二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-氧代-丁酸酯(40)还原氨化而制备。对于还原氨化所需要的二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-氧代-丁酸酯(40)通过氢化锂铝还原Weinreb酰胺衍生物(39)而制备,其中Weinreb酰胺衍生物(39)通过在Mitsunobu条件下保护β-酯而从市售的Fmoc-天冬氨酸α-烯丙基酯衍生物(38)中形成。使用钯(O)催化剂除去烯丙基酯,随后使用TBTU作为偶联剂形成Weinreb酰胺。随后二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(41)经Fmoc脱保护、环化、通过氢化除去二苯基甲基酯,随后进行Fmoc保护以产生终产物(4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸(37)。
方法J
Fmoc-Asp-(OCHPh2)Weinreb酰胺(39)的合成:向保持在0℃于氮气下的在30mL无水四氢呋喃中的5.1g(13.0mmol)Fmoc-天冬氨酸α-烯丙基酯(38)的溶液缓慢添加2.6mL(13.4mmol)偶氮二甲酸二异丙酯,其中所述的溶液含有3.4g(13mmol)三苯基膦和2.41g(13.1mmol)二苯基甲醇。撤去冰浴,并且反应在室温搅拌过夜,浓缩至干燥并且随后通过硅胶柱层析法纯化。1H NMR δ(CDCl3):2.96-3.06(dd,1H,CH2CO),3.15-3.26(dd,1H,CH2CO),4.18-4.76(一系列m,3H,CH,CH2),5.14-5.32(m,1H,CHN),5.76-5.86(m,1H,CHO),7.20-7.80(一系列m,18H,富烯,和Ph);HPLCtR=7.68分钟,(M++Na+)=583.90。
该产物(9.8mmol)随后溶解在含有1.5g(1.3mmol)四(三苯基膦)钯(O)的40mL二氯甲烷:乙酸:N-甲基吗啉37:2:1的溶液中,并且溶液在室温搅拌过夜,浓缩至干燥并在100mL乙酸乙酯和30mL水之间分配。使各层分开,并且有机层用1×50mL水洗涤,经硫酸钠干燥,并浓缩。残余物悬浮在20mL无水二氯甲烷中,并添加1.65mL(15mmol)N-甲基吗啉和4.07g(12.7mmol)TBTU,并且混悬液在室温搅拌20分钟,随后添加1.65mL(15mmol)N-甲基吗啉和1.52g(15.6mmol)N,O-二甲基羟胺氢氯酸盐。混悬液在室温搅拌2小时,浓缩,在100mL乙酸乙酯与50mL水之间分配。有机层用1×30mL水、1×30mL饱和碳酸氢钠溶液和1×30mL 1N氢氯酸溶液洗涤,经硫酸钠干燥,并浓缩。产物通过硅胶柱层析法纯化。1H NMR δ(CDCl3):2.76-2.88(dd,1H,CH2CO),2.89-3.00(dd,1H,CH2CO),3.16(s,3H,CH3N),3.70(s,3H,CH3O),4.14-4.22(dd,1H,CH),4.28-4.40(t,2H,CH2),5.07-5.16(dd,1H,CHN),5.69-5.76(d,1H,CHO),7.24-7.8(一系列m,18H,富烯,和Ph);HPLC tR=7.08,(M++Na+)=587.03.
二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-氧代-丁酸酯(40)的合成:化合物(40)使用与对化合物(9)所述方法相似的方法而制备。
二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(41)的合成:化合物(41)使用与对化合物(10)所述方法相似的方法而制备,不过使用化合物(40)作为醛。
(4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸(37)的合成:将在30mL乙酸乙酯中的30%二乙胺中的10mmol化合物(41)的溶液在室温搅拌3小时。该溶液随后浓缩至干燥,重溶解在2×30mL乙酸乙酯中并再浓缩。残余物溶解在50mL乙醇和20mL1N氢氯酸溶液中,并且在室温及常压下氢化过夜,经硅藻土过滤并浓缩至干燥。残余物溶解在20mL四氢呋喃和10mL水中,并添加2.52g(30mmol)固体碳酸氢钠,随后添加3.3g(13mmol)Fmoc-Cl。混合物搅拌3小时,用100mL乙酸乙酯稀释,使层分离并且有机层用2×50mL水洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。产物通过硅胶柱层析法纯化。
方法K:从市售Fmoc-天冬氨酸α叔丁基酯(42)开始进行(5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸支架的合成。Fmoc-天冬氨酸α叔丁基酯通过混合酐用硼氢化钠还原成Fmoc-高丝氨酸α叔丁基酯,随后用溴化苄保护醇,以产生Fmoc-高丝氨酸二苄醚α叔丁基酯(43)。随后用三氟乙酸除去叔丁基酯,并且将酸用硼氢化钠通过混合酐法还原成醇,以产生2-Fmoc-氨基-4-苄氧基-1-丁醇(44)。醇(44)随后使用如前所述的Dess-Martin高价碘化合物转化成2-Fmoc-氨基-4-苄氧基丁醛(45)。2-Fmoc-氨基-4-苄氧基丁醛(45)和α-氨基酯(2)的还原氨化产生了(2-Fmoc-氨基-4-苄氧基-丁基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(46)。用二乙胺的Fmoc脱保护产生了自发环化成6-苄氧乙基-3-取代-哌嗪-2-酮的游离伯胺。通过氢化作用除去二苄醚,并且将仲胺作为其Fmoc衍生物加以保护,以产生4-Fmoc-6-羟甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(47)。最后,将伯醇氧化成酸,以如方法A中所述产生终产物(48)。
方法K
Fmoc-高丝氨酸(OBn)α叔丁基酯(43)的合成:向保持在-20℃于氮气下的在50mL无水四氢呋喃中的10.0mmol Fmoc Asp-OtBu(42)的溶液添加1.77mL(12.7mmol)三乙胺,随后缓慢添加1.57mL(12.0mmol)氯甲酸异丁酯。将混合物搅拌30分钟并且随后缓慢倾倒在10mL水中的3.77g(99.6mmol)硼氢化钠的冰冷溶液上,维持温度低于5℃。反应在0℃搅拌15分钟,并且随后用1N氢氯酸溶液猝灭。反应混合物用100mL乙酸乙酯稀释并使各层分开。有机层用2×25mL 1N氢氯酸溶液,2×25mL水洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩,并且通过硅胶柱层析法纯化。纯化的化合物随后溶解在30mL四氢呋喃中,并添加矿物油中的12mmol 60%氢化钠分散体,随后添加0.2mmol四丁基碘化铵和12mmol溴化苄,并且混合物搅拌过夜,用50mL饱和碳酸氢钠水溶液猝灭,并用100mL乙酸乙酯萃取。化合物随后通过硅胶柱层析法纯化。
2-Fmoc-氨基-4-苄氧基-1-丁醇(44)的合成:如对方法I中化合物(37)所述,使用90%三氟乙酸对叔丁基酯脱保护,随后将酸如对化合物(13)所述通过混合酐中间体用硼氢化钠还原成所述醇。
2-Fmoc-氨基-4-苄氧基-丁醛(45)的合成:如对(9)合成所述,使用Dess-Martin高价碘化合物将2-Fmoc-氨基-4-苄氧基-1-丁醇(44)氧化成所述醛。
(2-Fmoc-氨基-4-苄氧基-丁基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(46)的合成:如对(10)合成所述,使用氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂,以α-氨基酯(2)使2-Fmoc-氨基-4-苄氧基-丁醛(45)还原氨化。
4-Fmoc-6-羟甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(47)的合成:以伴随环化对(2-Fmoc-氨基-4-苄氧基-丁基氨基)-2-取代乙酸甲基酯(46)进行Fmoc脱保护,随后如对方法中化合物(37)所述进行去苄化作用和Fmoc再保护。
4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基-乙酸(37)的合成:如方法A中所述将4-Fmoc-6-羟甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(47)氧化成所述的酸。所用酸的选择基于5-位的基团的性质。
2-取代的3-氧代-[1,4]-二氮杂卓-5-羧酸支架的合成(方法L、M、N)
使用几种方法进行2-取代的3-氧代-[1,4]-二氮杂卓-5-羧酸支架的合成。
方法L:叔丁基2-Cbz-氨基-4-(苄氧羰基-取代-甲基-Boc氨基)-丁酸酯(52)通过使用氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂,以氨基酯(51)使叔丁基Cbz-2-氨基-4-氧代-丁酸酯(50)还原氨化,随后进行仲胺的Boc保护而制备。对于还原氨化所需要的叔丁基Cbz-2-氨基-4-氧代-丁酸酯(50)通过氢化锂铝还原Weinreb酰胺衍生物(49)而制备。二氮杂卓环通过除去保护基团形成,随后与肽形成试剂环化以产生(53)。最后,4-Fmoc-2-取代的3-氧代-[1,4]-二氮杂卓-5-羧酸(54)通过保护基团交换而形成。
方法L
Cbz-Asp-(Weinreb酰胺)-OtBu(49)的合成:化合物(49)使用与对化合物(14)所述方法相似的方法而制备。
叔丁基3-Cbz-氨基-4-氧代-丁酸酯(50)的合成:化合物(50)使用与对化合物(9)所述方法相似的方法而制备。
叔丁基2-Cbz-氨基-4-(苄氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(52)的合成:还原氨化用与对化合物(10)所述方法相似的方法进行。仲胺通过粗制混合物与在四氢呋喃中的2当量Boc二碳酸酯反应而得以保护。
叔丁基1-Boc2-取代-3-氧代-[1,4]-二氮杂卓-5-羧酸酯(53)的合成:在30mL乙醇中的10mmol化合物(52)的溶液在室温及常压下氢化2小时,经硅藻土过滤并浓缩至干燥。残余物溶解在100mL二氯甲烷和1.2当量TBTU中并且添加2.6当量N-甲基-吗啉。溶液在室温搅拌过夜,并且随后浓缩。残余物在50mL乙酸乙酯与25mL 1N氢氯酸溶液之间分配,用1×20mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。
1-Fmoc 2-取代-3-氧代-[1,4]-二氮杂卓-5-羧酸(54)的合成:在10mL二氯甲烷中的90%三氟乙酸中的10mmol化合物(53)的溶液在室温搅拌2小时,并且随后将溶液浓缩至干燥。残余物溶解在20mL四氢呋喃和10mL水中,并且添加2.52g(30mmol)固体碳酸氢钠,随后添加3.36g(13mmol)Fmoc-Cl。将混合物搅拌3小时并且随后用乙酸乙酯稀释。使各层分开并且有机层用2×50mL水洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。
方法M:还原的二肽类似物(60)通过使用氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂,以氨基酯(29)使二苯基甲基烯丙氧羰基-2-氨基-4-氧代-丁酸酯(59)还原氨化,随后进行仲胺的Cbz保护而制备。对于还原氨化所需要的二苯基甲基烯丙氧羰基-2-氨基-4-氧代-丁酸酯(59)通过氢化锂铝还原Weinreb酰胺衍生物(58)而制备,其中Weinreb酰胺衍生物(58)通过Weinreb酰胺衍生物(57)的保护基团交换而制备。二氮杂卓环随后通过除去烯丙基和烯丙氧羰基,随后在肽形成试剂存在下的环闭合而形成。2-取代的3-氧代-[1,4]-二氮杂卓-5-羧酸支架(54)通过保护基团交换而形成。
方法M
Fmoc-Asp-(Weinreb酰胺)-CHPh2(57)的合成:化合物(57)使用与对化合物(39)所述方法相似的方法而制备。
烯丙氧羰基-Asp-(Weinreb酰胺)-OCHPh2(58)的合成:将20mL乙酸乙酯中的30%二乙胺中的10mmol化合物(56)的溶液搅拌2小时并浓缩至干燥。残余物溶解在20mL四氢呋喃和10mL水中,并添加2.52g(30mmol)固体碳酸氢钠,随后添加13mmol烯丙氧羰基-Cl。混合物搅拌3小时,并且随后用乙酸乙酯稀释。使各层分开,并且有机层用水洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。化合物(58)通过硅胶柱层析法纯化。
二苯基甲基3-烯丙氧羰基-氨基-4-氧代-丁酸酯(59)的合成:化合物(59)使用与对化合物(9)所述方法相似的方法而制备。
二苯基甲基2-烯丙氧羰基-氨基-4-(烯丙氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(60)的合成:化合物(60)通过还原氨化,使用与对化合物(15)所述方法相似的方法而制备,不过使用化合物(59)作为醛。产物通过硅胶柱层析法纯化。
二苯基甲基1-Cbz 2-取代-3-氧代-[1,4]-二氮杂卓-5-羧酸酯(61)的合成:向保持在室温于氮气下的在30mL二氯甲烷中的10mmol化合物(60)的溶液添加2当量苯基硅烷和0.3当量四(三苯基膦)钯(O),并且溶液搅拌2小时,并且随后添加1.2当量TBTU和1.3当量N-甲基-吗啉。溶液在室温搅拌过夜并浓缩。残余物在50mL乙酸乙酯与25mL 1N氢氯酸溶液之间分配,用1×20mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。
1-Fmoc 2-取代-3-氧代-[1,4]-二氮杂卓-5-羧酸(54)的合成:将30mL乙醇中的10mmol化合物(61)的溶液在室温氢化2小时,经硅藻土过滤,并随后将溶液浓缩至干燥。残余物溶解在20mL四氢呋喃和10mL水中,并添加2.52g(30mmol)固体碳酸氢钠,随后添加3.36g(13mmol)Fmoc-Cl。混合物搅拌3小时并随后用乙酸乙酯稀释。使各层分开并且有机层用水洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。
方法N:Fmoc-天冬氨酸β叔丁基酯通过混合酐用硼氢化钠还原成Fmoc-天冬氨醇(Aspartanol)β叔丁基酯(63),随后用烯丙基溴保护该醇以产生Fmoc-天冬氨醇烯丙基醚β叔丁基酯(64)。随后用三氟乙酸除去叔丁基酯,并将酸用硼氢化钠通过混合酐法还原成醇以产生3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-1-丁醇(65)。醇(65)随后使用如前所述的Dess-Martin高价碘化合物转化成3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基丁醛(66)。将3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基丁醛(66)和α氨基酯(51)还原氨化,随后在仲胺上进行烯丙氧羰基保护,产生(3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-丁基-烯丙氧羰基-氨基)-2-取代的乙酸苄基酯(67)。烯丙氧羰基7-烯丙氧基甲基-3-取代-[1,4]-二氮杂卓-2-酮(68)通过苄基酯的皂化,随后用二乙胺进行Fmoc脱保护以产生游离伯胺而形成,其中所述的游离伯胺使用肽形成试剂如TBTU而环化。终产物(54)通过保护基团交换而形成:通过钯(O)除去烯丙基醚和烯丙氧羰基并且将仲胺作为其Fmoc衍生物加以保护,以产生4-Fmoc-7-苄氧基甲基-3-取代-[1,4]-二氮杂卓-2-酮,随后使伯醇氧化成酸以产生终产物(54)。所用氧化剂的选择基于2-位的基团的性质。
方法N
Fmoc-天冬氨醇β叔丁基酯(63)的合成:使用Fmoc-天冬氨酸β叔丁基酯(62)作为起始材料,如对化合物(13)的合成所述而制备化合物(63)。
3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-丁酸叔丁基酯(64)的合成:向保持在室温于氮气下的在30mL四氢呋喃中的10mmol(63)的溶液添加矿物油中的12mmol60%氢化钠分散体、2mmol四丁基碘化铵和13mmol烯丙基溴,并且混合物搅拌过夜,用10mL饱和碳酸氢钠水溶液猝灭并用50m L乙酸乙酯萃取。3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-1-丁醇(65)的合成:化合物(65)如对化合物(44)的合成所述而制备。
3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-丁醛(66)的合成:如对(9)的合成所述,使用Dess-Martin高价碘化合物将3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-1-丁醇(65)氧化成醛。
(3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-丁基-烯丙氧羰基-氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(67)的合成:如对化合物(15)所述,使用如对化合物(10)所述的氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂,以α-氨基酯(51)使3-Fmoc-氨基-4-苄氧基-丁醛(66)还原氨化,随后将仲胺保护为烯丙氧羰基衍生物,不过使用氯甲酸烯丙酯代替氯甲酸苄酯。
4-烯丙氧羰基-7-烯丙氧基甲基-3-取代-[1,4]-二氮杂卓-2-酮(68)的合成:将20mL甲醇中10mmol(3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-丁基-烯丙氧羰基-氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(67)、20mmol碳酸钾和10mL水的溶液在室温搅拌3小时,用21mL 1N氢氯酸溶液中和,并随后浓缩至干燥。残余物溶解在乙酸乙酯中的20mL 30%二乙胺中并搅拌3小时,并且随后浓缩至干燥。残余物溶解在100mL二氯甲烷中,并且添加12mmol TBTU和24mmolN-甲基吗啉,并且溶液在室温搅拌过夜,并随后浓缩至干燥。残余物在30mL乙酸乙酯与30mL 1N氢氯酸溶液之间分配,并且随后使层分离。有机层用30mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤,经硫酸镁干燥并通过硅胶柱层析法纯化。
4-Fmoc-2-取代-3-氧代-[1,4]-二氮杂卓-5-羧酸(54)的合成:向保持在室温于氮气下的在30mL二氯甲烷中的10mmol化合物(68)的溶液添加2当量苯基硅烷和0.3当量四(三苯基膦)钯(O),并且溶液随后搅拌2小时,并浓缩至干燥。仲胺溶解在20mL四氢呋喃和10mL水中,随后添加2.52g(30mmol)固体碳酸氢钠和1.2当量Fmoc-Cl,并且双相溶液在室温搅拌2小时,用30mL乙酸乙酯稀释,并使各层分开。将4-Fmoc-7-羟甲基-3-取代-[1,4]-二氮杂卓-2-酮如方法A中所述氧化成终产物(54)。所用氧化剂的选择基于2-位的基团的性质,如方法A中对(6)转化成(7)那样。
6-取代-5-氧代-哌嗪-2-羧酸支架的合成(方法O)
如方法O中概述,合成6-位含有非官能化侧链的6-取代-5-氧代-哌嗪-2-羧酸支架从使用Dess-Martin高价碘化合物氧化成酮(70)的市售3-Fmoc-氨基-1,2-丙二醇1-氯-三苯甲基树脂(69)开始而进行。以α氨基酯(2)对酮(70)的还原氨化产生了结合树脂的(1-氨基甲基-2-氯-三苯甲基氧-乙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(71),后者在胺的脱保护后环化成5-氯三苯甲基氧甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(72)。仲胺受到再保护,随后从树脂上切下,产生Fmoc-5-羟甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(73),后者使用方法A中所述的两种方法之一而氧化成6-取代-5-氧代-哌嗪-2-羧酸(74)。
方法O
1-氨基-3-氯三苯甲基氧-2-丙酮(70)的合成:结合树脂的醇(69)的氧化通过三氧化硫氧化、NMO/TPAP(N-甲基吗啉-N-氧化物/高铼酸四丙胺)氧化或PDC氧化而进行。对于三氧化硫氧化,使用与Parikh,J.R.和Doering,W.V.,J.Am.Chem.Soc.89:5505-5507(1967)中所述方法相似的方法。对于NMO/TPAP氧化,向0.3mmol结合树脂的醇添加在10mL无水二甲基甲酰胺中的3mmol N-甲基吗啉N-氧化物的溶液,并且随后将0.06mmol高铼酸四丙胺(TPAP)添加至树脂混悬液中。反应振摇80分钟。排干溶剂,将树脂用四氢呋喃和二氯甲烷洗涤并且随后在真空下干燥。对于PDC氧化,将二甲基甲酰胺中0.2M重铬酸吡啶鎓中的结合树脂的醇的混悬液在37℃振摇4小时,排干溶剂并且将树脂用二甲基甲酰胺、四氢呋喃和二氯甲烷洗涤。
(1-氨基甲基-2-氯-三苯甲基氧-乙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(71)的合成:用氨基酯对树脂结合酮(70)的还原氨化通过两种不同方法之一进行。在一种方法中,向二甲基甲酰胺中的20mL 1%乙酸中的2.6mmol α氨基酯(2)的溶液添加2.6mmol三乙酰氧基硼氢化钠,随后立即添加0.5mmol酮衍生化树脂(70),并且混合物振摇60分钟,用甲醇、10%二异丙基乙胺、二甲基甲酰胺和甲醇漂洗。在第二种方法中,将含有0.05M氰基硼氢化钠的甲醇中的0.05mmol酮衍生化树脂(70)和2.0M氢氯酸α氨基酯(2)的混悬液在室温振摇5小时,排干并洗涤。
5-氯三苯甲基氧甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(72)的合成:将10mL二甲基甲酰胺中的20%哌啶中的0.05mmol树脂的混悬液在室温振摇2小时
Fmoc-5-羟甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(73)的合成:将含有0.25mmolFmoc-Cl和0.25mmol三乙胺的10mL二氯甲烷中的0.05mmol(72)的混悬液在室温搅拌6小时,排干并用氯甲烷洗涤。树脂重悬在二氯甲烷内的10mL 95%三氟乙酸中,并将混悬液振摇2小时,过滤,并浓缩滤液。
Fmoc-6-取代-5-氧代-哌嗪-2-羧酸(74)的合成:将(73)氧化成目的产物通过对方法A所述的任意方法进行。
α,α-双取代氨基酸的合成(方法P和Q)
在本发明的某些构建体中,有可能并构思的是利用双取代氨基酸残基,如其中取代基相同或不同的α,α-双取代氨基酸。在一个方面,在Aaa1或Aaa8位置中利用α,α-双取代氨基酸,其中α,α-双取代氨基酸的至少一个侧链是Nle、Ala、Leu、Ile、Val、Nva、Met(O)或Met(O2)的侧链。以下合成方法P和Q描述α,α-二-正丁基甘氨酸(2-氨基-2-丁基-己酸)的产生,其中每个侧链是-(CH2)3-CH3,并且因此每个侧链与Nle的侧链相同。然而,将理解的是相似方法和方案可以用于其中取代基相同或不同的其它α,α-双取代氨基酸的产生中。此外,产生α,α-双取代氨基酸的任何方法可以用于本发明的实施中,并且本发明的实施不限于以下合成方案的方法。因此,用于合成α,α-双取代氨基酸的本领域已知任何方法可以用于本发明的实施中。下文教授用于产生α,α-双取代氨基酸的替代方法:Clark J.S.和Middleton M.D.:Synthesis of novel alpha-substituted and alpha,alpha-disubstituted amino acidsby rearrangement of ammonium ylides generated from metal carbenoids.Org.Lett.4(5):765-8(2002);Guino M.,Hii K.K.:Wang-aldehyde resin as arecyclable support for the synthesis of alpha,alpha-disubstituted amino acidderivatives.Org Biomol.Chem.3(17):3188-93(2005);和Kotha S.,Behera M.:Synthesis andmodification of dibenzylglycine derivatives via theSuzuki-Miyaura cross-coupling reaction.J.Pept.Res.64(2)72-85(2004)。
方法P
苯甲酰二-正丁基甘氨酸(80)的合成:向保持在0℃于氮气下的在20mL二氯甲烷中的10mmol苯甲酰甘氨酸(75)的溶液缓慢添加12mmol N,N′-二环已基碳二亚胺(DCC),并且反应搅拌2小时以产生化合物(76)。滤除固体并浓缩滤液。残余物溶解在15mL四氢呋喃中,冷却至0℃,并且随后添加24mmol氢化钠,随后添加30mmol正丁基溴。混悬液在0℃搅拌2小时,并且随后升温至室温,并将溶液浓缩至干燥以产生化合物(77)。或者,化合物(77)也可以按照相似方式从苯甲酰正亮氨酸(78)中制备,除使用12mmol氢化钠和15mmol正丁基溴之外。化合物(77)溶解在甲醇中,添加50mL1N氢氯酸溶液,并且将此溶液搅拌2小时并浓缩。化合物(80)通过硅胶柱层析法纯化。
Fmoc二-正丁基甘氨酸(81)的合成:10mmol化合物(80)溶解在30mL二噁烷中,并添加10mL6N氢氯酸溶液,并使溶液回流过夜。将反应冷却至室温、浓缩至干燥,重溶解在30mL四氢呋喃中,并添加10mL水和30mmol碳酸氢钠,随后添加15mmol Fmoc-Cl。搅拌双相溶液1小时并且在真空下除去四氢呋喃。水溶液用1×50mL二乙醚提取,用1N氢氯酸溶液酸化,并用2×50mL乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯层合并,经硫酸钠干燥,并浓缩。化合物(81)通过硅胶柱层析法纯化。
相似的方法可以通过始自(与化合物78相似的)任何适宜的氨基酸衍生物而使用,并且通过使用适宜的烷基丁基、芳基丁基或芳烷基丁基试剂,该方案将产生其中R和R′不同的多种双取代(R,R′)氨基酸替代物。
方法Q
Fmoc-α,α二-正丁基甘氨酸(87)的合成:向室温下保持的在40mL无水四氢呋喃中的20mmol甘氨酸甲基酯氢氯化物(82)和2g粉末状分子筛的混悬液添加24mmol氢氧化钾,随后添加22mmol苯甲醛。混悬液搅拌2小时,过滤,并浓缩滤液。残余物重溶解在40mL无水甲苯中,并且随后添加至在甲苯中的60mmol氢化钠的混悬液内,随后添加60mmol正丁基溴。混悬液搅拌12小时,随后添加30mL 6N氢氯酸溶液,在室温搅拌2小时,并且随后使层分离。因此获得的(84)的氢氯酸盐原位地用于制备(87)。为分离作为氢氯酸盐的(84),将水层浓缩至干燥并使产物从无水甲醇-醚中结晶。
或者,化合物(84)可以使用相似的合成方法自正亮氨酸甲基酯氢氯化物制备,除了30mmol氢化钠和30mmol正丁基溴用于转化(86)成(84)之外。
将如上文所获得氢氯酸化物形式的化合物(84)的水性混合物加热至回流1小时并且随后冷却至室温。该混合物用固体氢氧化钠中和并且随后用30mL四氢呋喃稀释。添加碳酸氢钠(30mmol),随后添加15mmol Fmoc-Cl。将双相溶液搅拌1小时,并将四氢呋喃在真空下除去。水溶液用1×50mL二乙醚萃取,用1N氢氯酸溶液酸化,并用2×50mL乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯层合并,经硫酸钠干燥,并浓缩。化合物(87)通过硅胶柱层析法纯化。
相似的方法可以通过始自(与化合物85相似的)任何适宜的氨基酸衍生物而使用,并且通过使用适宜的烷基丁基、芳基丁基或芳烷基丁基试剂,该方案将产生其中R和R′不同的多种双取代(R,R′)氨基酸替代物。
双取代(R,R′)支架的合成(方法R)
本发明还提供其中使用具有两种R基团即R和R′的氨基酸替代物的构建体。以下方法描述Fmoc保护的(R)-5,5-二丁基-6-氧代-哌嗪-2-羧酸的合成,其中R和R′分别是对应于正亮氨酸侧链部分的基团。可以明白以下的方法可以基于前述方法部分地加以调整以产生相似的双取代(R,R′)氨基酸替代物。相似的方法可以通过始自(与化合物84相似的)任何适宜的氨基酸衍生物而使用,该方案将产生其中R和R′不同的多种双取代(R,R′)氨基酸替代物。
方法R
(2-Fmoc-氨基-3-叔丁氧基-丙基氨基)-2,2,二-正丁基乙酸甲基酯(88)的合成:50mL无水四氢呋喃中的21mmol(84,方案Q)和2.9mL(21mmol)三乙胺的混悬液在室温搅拌45分钟,并且随后添加在30mL四氢呋喃中的约20mmol粗制Fmoc-(O-叔丁基)-丝氨醛(9,方案D)的溶液,随后添加1.7g的4粉末状分子筛,并且混悬液搅拌额外2小时,添加6.4g(30mmol)固态三乙酰氧基硼氢化钠,并且混悬液在室温搅拌过夜。混悬液用甲醇稀释,滤除分子筛并浓缩滤液。残余物在100mL乙酸乙酯与50mL水之间分配。有机层经硫酸钠干燥,过滤,并浓缩。化合物(88)通过硅胶柱层析法纯化。
4-Fmoc-6-羟甲基-3,3-二-正丁基-哌嗪-2-酮(89)的合成:在30mL乙酸乙酯中的30%二乙胺中的10mmol化合物(88)的溶液在室温搅拌过夜,并随后浓缩至干燥。残余物溶解在20mL四氢呋喃和10mL水中,添加2.52g(30mmol)固体碳酸氢钠,随后添加3.36g(13mmol)Fmoc-Cl。将混合物搅拌3小时,用50mL乙酸乙酯稀释,使各层分开,并且有机层用30mL水洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。粗制混合物溶解在二氯甲烷中的10mL 90%三氟乙酸溶液中,搅拌2小时,并随后浓缩至干燥。残余物溶解在乙酸乙酯中并用50mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤,经硫酸镁干燥,并浓缩。化合物(89)通过硅胶柱层析法纯化。
4-Fmoc-5,5-二-正丁基-6-氧代-哌嗪-2-羧酸(90)的合成:向在室温保持的在81mL乙腈中的8mmol醇(89)的溶液添加磷酸盐缓冲液(用0.72g磷酸二氢钠和1.43g磷酸氢二钠在29.5mL水中制备),随后添加0.33g(2.1mmol)TEMPO及1.86g(16.5mmol)亚氯酸钠,并将双相溶液置于维持在43℃的油浴中。缓慢添加(通过混合1.9mL 10-13%次氯酸钠溶液与2.4mL水而制备的)4.3mL(2.6mmol)次氯酸钠溶液。反应在43℃搅拌4小时,冷却至室温,添加20mL 10%亚硫酸氢钠,搅拌10分钟,用50mL乙酸乙酯稀释,并使各层分开。有机层用1×10mL盐水、1×10mL 1N氢氯酸溶液洗涤,经硫酸钠干燥,并浓缩。化合物(90)通过硅胶柱层析法纯化。
6.用于包括式I替代物的化合物的合成方法
如本发明几个实施方案中公开的包括一种或多种式I替代物的化合物可以通过在氨基酸之间形成肽键的任何已知常规方法容易地合成。此类常规方法包括例如任何液相方法,其中所述的液相方法允许使其羧基或其它反应基受保护的氨基酸残基的游离α氨基与其氨基或其它反应基受保护的另一种氨基酸残基的游离伯羧基之间缩合。在优选的常规方法中,本发明的化合物可以通过固相合成法合成并根据本领域的已知方法纯化。本发明的氨基酸替代物可以通过与对于残基所用的方法基本上相似或相同的方法掺入本发明化合物中。利用多种树脂和试剂的众多熟知方法均可以用来制备本发明的化合物。
用于合成化合物的过程可以通过每个氨基酸或氨基酸替代物以所需的序列一次一个连续添加至另一个氨基酸残基或氨基酸替代物的方法,或通过首先常规合成具有所需氨基酸序列的肽片段(其可以包括一个或多个氨基酸替代物)并随后缩合以提供所需化合物的方法而实施。使产生的化合物环化以产生本发明的环状化合物。
固相肽合成方法是众所周知的并在本领域中实施。在此类方法中,本发明化合物的合成可以根据固相方法的一般原理,通过将想要的氨基酸残基或氨基酸替代物一次一个依次掺入增长的肽链而实施。这些方法在众多参考文献中公开,所述文献包括Merrifield R.B.,Solid phase synthesis(Nobellecture).Angew.Chem.24:799-810(1985)和Barany等,The Peptides,Analysis, Synthesis和Biology,第2卷,Gross E.和Meienhofer J.编辑.Academic Press,1-284(1980)。
在化合物的化学合成中,用合适的保护基团保护多种氨基酸残基或氨基酸替代物的活性侧链基团,其中所述的保护基团防止化学反应在该部位上发生直至除去该保护基团为止。还常见是保护氨基酸残基或氨基酸替代物的α氨基而该实体在羧基处发生反应,随后选择性地除去α氨基保护基团以允许后续反应在该位点上发生。具体的保护基团已经公开并且在固相合成法和液相合成法中是已知的。
α氨基可以由合适的保护基团保护,包括氨基甲酸乙酯型保护基团(如苄氧羰基(Z))和取代的苄氧羰基,如对氯苄氧羰基、对硝基苄氧羰基、对溴苄氧羰基、对联苯基-异丙氧羰基、9-芴甲氧羰基(Fmoc)和对甲氧基苄氧羰基(Moz);脂族氨基甲酸乙酯型保护基团,如叔丁氧羰基(Boc)、二异丙基甲氧羰基、异丙氧羰基和烯丙氧羰基。Fmoc优选用于α氨基保护。
胍基可以由合适的保护基团保护,如硝基、对甲苯磺酰基(Tos)、Z、五甲基色烷磺酰基(Pmc)、金刚烷氧羰基、五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、Fmoc和Boc。Pbf是用于Arg的一种优选保护基团。其它优选的保护基团包括Z、Fmoc和Boc。尤其将理解的是胍基保护基团可以在合成过程期间被切除或除去,或可以备选地不被切除或除去,此时带保护基团的侧链形成如本文中所定义的氨基酸侧链部分的衍生物。特别在保护基团不稳定以及可能在施用至患者时因某种机制而被除去的情况下,化合物变成“前药”,也就是说作为药物前体的化合物,其中所述的药物前体在施用至患者后通过某些化学或生理过程在体内转化成所需药物形式(例如前药在接触于生理pH时或因酶作用转化成想要的药物形式)。
本文中所述的本发明化合物可以使用固相合成法,手工地或借助自动肽合成仪,使用如由制造商提供的编程模块并遵循由制造商描述的方案或通过改良制造商的方案以改善苛刻偶联的产率而制备。
固相合成通过使保护的α-氨基酸、α-氨基酸替代物或α-氨基醇模拟物偶联至合适树脂而始于化合物的羧基端。通过如下方式制备这种起始材料,即α-氨基-受保护氨基酸或α-氨基-受保护氨基酸替代物通过酯键连接至对苄氧基苄醇(Wang)树脂或2-氯三苯甲基氯树脂,通过Fmoc-接头如对-[(R,S)-α-[1-(9H-芴-9-基)-甲氧基甲酰胺基]-2,4-二甲氧基苄基]-苯氧乙酸(Rink接头)之间的酰胺键连接至二苯甲基胺(BHA)树脂,或通过本领域众所周知的其它方法,如通过α-氨基-保护的醇模拟物连接至与氯甲基聚苯乙烯树脂连接的3,4-二氢-2H-吡喃-2基-甲醇接头。Fmoc-接头-BHA树脂支持物是市售的并且通常在可行时使用。在重复循环期间根据需要携带这些树脂以依次添加氨基酸。在碱性条件下除去α氨基Fmoc保护基团。为此目的可以使用在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的哌啶、哌嗪、二乙胺或吗啉(20-40%v/v)。
在除去α氨基保护基团后,以想要的次序逐步偶联后继受保护的氨基酸或氨基酸替代物以获得中间态的保护的肽-树脂。用于肽固相合成中偶联氨基酸的活化试剂是本领域众所周知的。在合成化合物后,根据需要,可以使用本领域众所周知的方法除去正交保护的侧链保护基团以便使化合物进一步衍生化。
化合物中的活性基团可以在固相合成期间或从树脂上切下后选择性地加以修饰。例如,化合物可以在树脂上时被修饰以获得氨基端修饰,如乙酰化,或可以通过使用切除试剂从树脂上切下并且随后加以修饰。用于氨基端修饰(如乙酰化)或羧基端修饰(如酰胺化)或导入N-乙酰基的方法是本领域已知的。类似地,用于修饰氨基酸侧链的方法是肽合成领域技术人员众所周知的。对化合物上存在的反应基修饰的选择部分地由化合物中想要的特征决定。
在一个实施方案中,化合物在从树脂上切下之前被环化。对于通过活性侧链部分的环化,使想要的侧链脱保护,并将化合物悬浮在合适的溶剂中并添加环状偶联剂。合适的溶剂包括例如DMF、二氯甲烷(DCM)或1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。合适的环化偶联剂包括例如2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、苯并三唑-1-基-氧代-三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)、苯并三唑-1-基-氧基-三(吡咯烷基)磷鎓六氟磷酸盐(PyBOP)、2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TATU)、2-(2-氧代-1(2H)-吡啶基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TPTU)或N,N′-二环已基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑(DCCI/HOBt)。通过使用合适的碱如N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、均三甲基吡啶(sym-collidine)或N-甲基吗啉(NMM)而常规地启动偶联。
合成后从固相上切下化合物之后,该化合物可以通过任何数目的方法如反相高效液相色谱(RP-HPLC)法,使用合适的柱(如C18柱)加以纯化。也可以使用其它分离方法或纯化方法,如基于化合物大小或电荷的方法。一旦纯化,则化合物可以通过任何数目的方法如高效液相色谱(HPLC)、氨基酸分析法、质谱法等表征。
通过固相合成法制备具有取代的酰胺衍生的羧基端(一般是N-烷基)的本发明化合物,其中所述的固相合成法通过将保护的α氨基酸或氨基酸替代物偶联至合适树脂而始于化合物的羧基端。此类用于固相上制备取代的酰胺衍生物的方法已经在本领域中描述。见,例如Barn D.R.,Morphy J.R.,Rees D.C.Synthesis of an array of amides by aluminum chloride assistedcleavage of resin-bound esters.Tetrahedron Lett.37,3213-3216(1996);DeGrado W.F.Kaiser E.T.Solid-phase synthesis of protected peptides on apolymer bound oxime:Preparation of segments comprising the sequences of acytotoxic 26-peptide analogue.J.Org.Chem.47:3258-3261(1982)。此类起始材料可以通过熟知的方法将α氨基受保护的氨基酸或氨基酸替代物经酯键连接至对苄氧基苄醇(Wang)树脂而制备。肽链按照想要的氨基酸或氨基酸替代物序列增长,使产物环化并用二氯甲烷中的适宜胺和氯化铝(如甲胺、二甲胺、乙胺等)的溶液处理树脂。产生的酰胺衍生的化合物从树脂释放在溶液内。滤除树脂并将酰胺衍生的化合物通过浓缩溶剂随后用醚沉淀加以回收。干燥粗制化合物并使用三氟乙酸(TFA)在水和三异丙基硅烷(TIS)存在下切除仍存在的氨基酸侧链保护基团。终产物通过添加冷醚沉淀并通过过滤收集。通过RP-HPLC,使用C18柱开展最终纯化。
在一个优选的方法中,化合物通过以下方法合成。每种化合物具有一个或两个基于酮-哌嗪结构的氨基酸替代物。该氨基酸替代物如上文所述合成。化合物使用Fmoc化学合成。使用手工合成方法以便在掺入酮-哌嗪氨基酸替代物之前和之后立即偶联。
以下方案用来连接氨基酸替代物至树脂,例如,其中氨基酸替代物位于末端位置。Rink酰胺树脂(以0.3mmol/g载量,Advanced ChemTech)在DMF中溶胀30分钟。使用20%哌啶/DMF持续20分钟,实现树脂的Fmoc脱保护。通过在DMF中与PyBop(2当量)和DIEA(4当量)过夜温育而实现该树脂与所选择的Fmoc-保护的酮-哌嗪氨基酸替代物(2当量)的偶联。若Kaiser检验后,获得阳性结果,则进行第二次偶联反应。使用DMF中的Ac2O(10当量)和吡啶(20当量)实施乙酰化。
以下方案用来连接酮-哌嗪氨基酸替代物至肽-树脂。通过混合在DMF中的Fmoc-保护的酮哌嗪氨基酸替代物(2当量)、TBTU(2当量)和DIEA(4当量)并允许温育过夜而实施偶联,若获得阳性Kaiser检验,则重复偶联反应。使用在DMF中的Ac2O(10当量)和吡啶(20当量)实施乙酰化。
以下方案用来将Fmoc-保护的氨基酸偶联至固相上的酮-哌嗪氨基酸替代物。在大多数情况下,需要至少两个偶联循环,并且往往使用三个循环。在常见循环中,Fmoc-保护的氨基酸(4当量)与HOAt(4当量)和DIC(4当量)在DMF中混合30分钟。产生的混合物随后在SPE管中与直接地或经中间体连接至树脂的酮-哌嗪氨基酸替代物混合过夜。
使用固相肽合成的标准方案实施序列中不与酮-哌嗪氨基酸替代物直接相邻的氨基酸之间的偶联。使用以下保护基团:Boc用于Lys和Orn,叔丁基用于Tyr和Ser,三苯甲基用于Cys和His,O-叔丁基用于Asp和Pbf用于Arg。
使用TFA/苯甲硫醚/苯酚/H2O/DTT/TIS(87.5/2.5/2.5/5/2.5)的混合物(5mL)3小时而从树脂切下化合物。产生的材料经过滤并在冷冻条件下持续1小时而从冷醚中析出。析出的半胱氨酰肽在用于氧化步骤中之前用冷醚洗涤至少三次。
为通过空气氧化而环化以形成二硫键,将粗制半胱氨酰化合物溶解在乙腈与水的混合物中。使用5% NH4OH调节反应混合物的pH至7-8。将得到的溶液与150mg粒状活性碳一起缓慢搅拌2日。环化的完成在进入下个加工步骤之前通过LC-MS分析证实。在环化后,从溶液中滤除固体碳。将滤液冻干或在speed-vac中干燥以获得粗制环状化合物。
可以通过以下方案合成其中替代物与树脂或其它肽固体支持物结合并且位于羧基端位置的本发明某些化合物。
通过上文的方法A的方案或任何替代方法制备替代物(7)。Fmoc保护的Sieber酰胺树脂通过将该树脂在二甲基甲酰胺和二氯甲烷1:1的200mL混合物中溶胀45分钟,随后过滤并用二甲基甲酰胺洗涤而处理。洗涤的树脂随后用在二甲基甲酰胺中的20%哌啶脱保护,过滤并用二甲基甲酰胺洗涤。
在二甲基甲酰胺中的Fmoc-保护的替代物(7)的溶液添加至如上文所制备的脱保护的Sieber酰胺树脂,随后添加固体PyBop和二异丙基乙胺,随后又添加额外的二甲基甲酰胺。混合物搅动过夜并吹氮。将树脂滤出并用二甲基甲酰胺洗涤,用由二甲基甲酰胺:乙酸酐:吡啶的3:2:1溶液构成的封端溶液封端30分钟,过滤并用二甲基甲酰胺洗涤,以提供与树脂复合的替代物(7)。
与树脂复合的所得Fmoc-保护的替代物(7)用在二甲基甲酰胺中的20%哌啶脱保护15分钟,过滤并用二甲基甲酰胺洗涤,以产生与树脂复合的替代物(7)。在二甲基甲酰胺中的想要的Fmoc-AA-OH(4当量,其中AA是任何想要的氨基酸)的溶液添加至与树脂复合的替代物(7)中,随后添加在DMF中的HCTU(60mmol,4当量)和二异丙基乙胺(120mmol,8当量)的溶液并偶联过夜,同时吹氮。产生的Fmoc-AA-替代物(7)-树脂经过滤分离并用二甲基甲酰胺洗涤。为确保完全偶联,产物再次用如上Fmoc-AA-OH的溶液过夜处理,并吹氮。将树脂滤出并用二甲基甲酰胺洗涤。
产生的Fmoc-AA-替代物(7)-树脂随后用如上文的封端溶液封端30分钟。随后将树脂滤出,用二甲基甲酰胺、二氯甲烷、MeOH和二乙醚洗涤,并随后在真空下干燥。
此后可以使用常规的肽偶联方法偶联每个后继的氨基酸。
可以实行使用本发明式I替代物产生的化合物的任选PEG化,包括通过下文所述的那些方法。
活性胺基(如赖氨酸或鸟氨酸侧链)、氨基端位置内的Ω氨基脂族基团或在羧基端位置内的式I替代物的胺基的PEG化通过在2mL二甲基亚砜中溶解0.005mmol纯化的化合物,随后添加55.5mg(0.011mmol,2当量)PEG-5K-OSu(带琥珀酰亚胺丙酸酯反应基的分子量5,000Da的甲氧基-PEG),随后添加17.7μL(0.13mmol,20当量)三乙胺。并将略微浑浊的溶液在室温搅拌3小时而实现。过量的PEG-5K-OSu通过添加7μL(0.111mmol,10当量)乙醇胺而猝灭,并将反应搅拌过夜。
活性羧基(如Asp或Glu侧链或残基)或在末端氨基酸残基或末端式I替代物上的化合物上的末端羧基的PEG化通过偶联PEG-NH2(PEG-胺)至在Asp或Glu的侧链中或在羧基端处含有羧基的化合物上而实现。肽构建体(0.005mmol)溶解在DMSO(2mL)中,随后添加55.5mg(0.011mmol,2当量)PEG-NH2和HOBt(0.01mmol)。通过添加0.0055mmol偶联试剂N-乙基-N’-(3-二甲胺基丙基)-碳二亚胺(EDAC)启动偶联。将略微浑浊的溶液在室温搅拌过夜。PEG化的肽构建体随后通过HPLC纯化。
活性硫氢基如Cys或Hcys侧链或在式I替代物的R1中的硫氢基的PEG化在DMSO中用PEG-甲基-马来酰亚胺试剂(SunBio,Orinda,California)处理肽化合物过夜而实现。PEG化的化合物随后通过HPLC纯化。
PEG化后,产生的粗制化合物混合物随后通过HPLC纯化,产生PEG衍生化的包括一个或多个氨基酸替代物的化合物。
7.测定包括式I替代物的化合物的效力的测定法
通常,可以使用适于原始多肽的任何测定系统。下文例举了使用的测定系统,其中原始多肽是ANP肽,如mini-ANP。在测定法中检验所选择的包括至少一种式I替代物的化合物,以确定结合状态和功能状态。使用以下的测定法。
细胞培养。从Bio S&T Inc.(Montreal,Quebec)购买编码人利尿钠肽受体A(NPRA)的cDNA克隆。将该cDNA克隆插入哺乳动物表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)并转染至HEK-293细胞。通过在硫酸G418存在下培养细胞而选择到稳定的克隆。通过[125I]-心房钠尿肽([125I]-ANP)与从克隆细胞系制备的膜匀浆物结合而检验NPRA的表达。HEK-hNPRA细胞在37℃于5%CO2下维持培养在补充有10% FBS、硫酸G418(300μg/mL)、谷氨酸钠(0.29mg/mL)、青霉素(100单位s/mL)和链霉素(100ug/mL)的Dulbecco改良Eagle氏培养基(DMEM)中。
竞争性结合测定法。使用从HEK-hNPRA细胞制备的粗制膜匀浆实施竞争性抑制结合测定法。为制备膜匀浆物,细胞用磷酸盐缓冲盐水漂洗并在4℃在低渗裂解缓冲液(10mM Tris,pH7.4+5mM EDTA)中温育15分钟。将细胞从平板中转移至聚丙烯管内并均化。匀浆物在25,000×g离心20分钟。沉淀重悬在由50mM Tris(pH7.4)和1mM EDTA组成的缓冲液中,均化,并在25,000×g离心20分钟。沉淀重悬在由100mM Tris(pH7.4)和10mM MgCl2组成的缓冲液中并在-80℃贮存直至需要。在分析当日,融化匀浆并均化。对[125I]-ANP的结合在含有25mM Hepes(pH7.4)、100mMNaCl、2mM CaCl2、5mM MgCl2、0.1% BSA和1mM 1,10-菲咯啉的缓冲液中实施。匀浆物(1-10μg蛋白质/孔)在4℃与[125I]-ANP(25-30pM)和递增浓度的竞争性配体在Millipore滤盘中温育120分钟。通过添加冷的洗涤缓冲液(磷酸盐缓冲盐水)而终止测定,随后使用真空多歧管过滤。使用γ计数器测定结合放射活性。非特异性结合由[I125]-hANP与非转染HEK293膜的结合而定义。使用GraphPad 曲线拟合软件分析数据。
用于测定EC50的通用方法。通过测量胞内cGMP在表达重组hNPR-A的HEK-293细胞中的聚积而开展化合物的功能性评价。HEK-NPRA细胞通过在细胞解离缓冲液(Gibco,Life Technologies)中洗涤并离心而收获。沉淀的细胞重悬在含有10mM Hepes(pH7.4)、5mM MgCl2、200mM L-谷氨酰胺、1mM1,10-菲咯啉和BSA(0.5mg/mL)的Hank氏平衡盐溶液(HBSS)中。离心后,细胞重悬在补充有0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)的以上缓冲液中。细胞(约2×105/孔)添加至96孔平板的各孔中并在37℃温育15分钟。在预温育时间后,将细胞在递增浓度的化合物存在下温育额外15分钟。反应通过用温度休克(temperature shock)法裂解细胞而终止。反应平板在干冰/乙醇浴中孵育15分钟,随后在90℃温育10分钟。使用cGMPFlashplate RIA(Perkin-Elmer)测量cGMP的聚积。通过使用非线性回归分析用GraphPad 软件测定数据分析和EC50值。
质量测定和核磁共振分析。使用Waters MicroMass ZQ装置,利用阳性模式测定质量值。质量测定值与计算值进行比较并以质量(mass weight)加二除以二((M+2)/2)的形式表述,除非另外说明。
使用Bruker 300MHz分光计获得质子NMR数据。光谱在化合物溶解在氘化溶剂如氯仿、DMSO或(如适合)甲醇中后获得。
使用带YMC Pack Pro C18柱(4.6 x 50mm,3μ)的Waters Alliance HT进行HPLC测量,其中所述的柱通过逐步方法以1mL/分钟洗脱。使用溶剂A(含有0.1%三氟乙酸v/v的水)和溶剂B(含有0.1%三氟乙酸v/v的乙腈)作为流动相。对于酮哌嗪中间体的分析,柱用10% B平衡并且随后经8分钟时间段增加B至90%。对于肽的分析,柱用2% B平衡并且随后经8分钟时间段增加B至90%。
8.包含式I替代物的化合物
进一步由以下非限制性实施例说明本发明。
实施例1
合成以下基于原始多肽H-Met-环(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(SEQ IDNO:1)的化合物,每种化合物的合成使用前述一种或多种方法的单种式I氨基酸替代物。出于合成原因,1位的Met以Nle取代。纯化得到的化合物并测定其质量,结果显示如下:
表1
在表1的化合物中,化合物1-1、1-5、1-7、1-8、1-12、1-15、1-18、1-20和1-22在相关的测定系统中无活性。其余化合物有活性。如上所述测试具有以下结构的化合物1-2。
在受体结合研究中,该化合物在测定系统中的平均Ki为0.3nM,其中hANP的Ki为0.05nM并且mini-ANP的Ki为0.6nM。化合物1-2在测定系统中的EC50为2nM,其中hANP的EC50为0.6nM并且mini-ANP的EC50为3.3nM。
如上所述测试具有以下结构的化合物1-14。
在受体结合研究中,该化合物在测定系统中的平均Ki为0.9nM,其中hANP的Ki为0.05nM并且mini-ANP的Ki为0.6nM。化合物1-14在测定系统中的EC50为3.5nM,其中hANP的EC50为0.6nM并且mini-ANP的EC50为3.3nM。
如上所述测试具有以下结构的化合物1-13。
在受体结合研究中,该化合物在测定系统中的平均Ki为0.2nM,其中hANP的Ki为0.05nM并且mini-ANP的Ki为0.6nM。化合物1-13在测定系统中的EC50为2nM,其中图1的化合物的EC50为0.6nM和mini-ANP的EC50为3.3nM。
实施例2
合成以下基于原始多肽H-Met-环(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(SEQ ID NO:1)的化合物,每种化合物的合成使用前述一种或多种方法的两种式I氨基酸替代物。出于合成原因,1位的Met以Nle取代。纯化得到的化合物,并测定质量,结果显示如下:
表2
在表2的化合物中,化合物2-2和2-4在相关的测定系统中无活性。其余化合物有活性。如上所述测试具有以下结构的化合物2-6。
在受体结合研究中,该化合物在测定系统中的平均Ki为0.027nM,其中hANP的Ki为0.05nM并且mini-ANP的Ki为0.6nM。化合物2-6在测定系统中的EC50为0.2nM,其中hANP的EC50为0.6nM并且mini-ANP的EC50为3.3nM。
实施例3
使用前述一种或多种方法的三种式I氨基酸替代物,合成以下基于原始多肽H-Met-环(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(SEQ ID NO:1)的化合物。出于合成原因,1位的Met以Nle取代。纯化得到的化合物并测定其质量,结果显示如下:
表3
实施例4
使用前述一种或多种方法的两种式I氨基酸替代物和PEG辅基,合成以下基于原始多肽H-Met-环(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(SEQ ID NO:1)的化合物。出于合成原因,1位的Met以Nle取代。纯化得到的化合物并测定其质量,结果显示如下:
表4
在表4的化合物中,化合物4-6在相关的测定系统中无活性。其余化合物有活性。
实施例5
使用前述一种或多种方法的一种或两种式I氨基酸替代物,合成以下基于原始多肽H-Met-环(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(SEQ ID NO:1)的化合物。尽管原始多肽是环状的,然而这些化合物是线形的,每个Cys残基以Ala残基取代。出于合成原因,1位的Met以Nle取代。
如上所述测试具有以下结构的化合物5-1
在受体结合研究中,该化合物在测定系统内中的平均Ki为88.5nM的,其中hANP的Ki为0.05nM并且mini-ANP的Ki为0.6nM。化合物5-1在测定系统中的EC50为340nM,其中hANP的EC50为0.6nM并且mini-ANP的EC50为3.3nM。
如上所述测试具有以下结构的化合物5-2。
在受体结合研究中,该化合物在测定系统中的平均Ki为14.5nM,其中hANP的Ki为0.05nM并且mini-ANP的Ki为0.6nM。化合物5-2在测定系统中的EC50为550nM,其中hANP的EC50为0.6nM并且mini-ANP的EC50为3.3nM。
如上所述测试具有以下结构的化合物5-3。
在受体结合研究中,该化合物在测定系统中的平均Ki为8.7nM,其中hANP的Ki为0.05nM并且mini-ANP的Ki为0.6nM。化合物5-3在测定系统中的EC50为80.5nM,其中hANP的EC50为0.6nM并且mini-ANP的EC50为3.3nM。
实施例6
使用前述一种或多种方法的单种式I氨基酸替代物,合成以下基于催产素原始多肽H-环(Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys)-Pro-Leu Gly-NH2(SEQ IDNO:3)的化合物。
表6
实施例7
使用前述一种或多种方法的单种式I氨基酸替代物,合成以下基于催产素原始多肽H-环(Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys)-Pro-Leu Gly-NH2(SEQ IDNO:3)的化合物。尽管原始多肽是环状的,然而这些化合物是线形的,每个Cys残基以Ala残基取代。
表7
前述实施例可以通过用本发明一般描述或具体描述的反应物和/或操作条件替代于先前实施例中使用的那些反应物和/或操作条件而重复,获得相似的成功。
尽管已经参考那些优选的实施方案详细地说明了本发明,然而其它实施方案可以显示相同的结果。本发明的变体和变型对本领域技术人员而言是显而易见的,并且本发明意图覆盖全部此类变型和等效物。上文援引和/或附件中的所有参考文献、申请、专利和出版物的全部公开内容和相应申请的全部公开内容因而通过引用的方式并入。
Claims (36)
1.一种具有结构I式的化合物:
或其对映异构体、立体异构体或非对映异构体或其合成上可接受的盐,其中:
R1是H、烷基、芳基、烷基芳基、烷基-N(R8)2、烷基-OR8、烷基-C(=O)OR8、C(=O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(=O)N(R8)2或下式的基团:
R2是H或烷基,前提是R1和R2不都是H;
R3是H或第一氮保护基团;
R4是H、烷基、(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R5是H或烷基;
R6a是H、烷基、(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R6b是H或烷基;
前提是R4和R6a不均是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R7是H、C(=O)烷基、C(=O)(CH2)m(NR8)2、烷基、芳烷基或芳基;
R8的每次出现独立地是H、芳基或烷基;
R11是肽固体支持物;
R12是H或第二氮保护基团;
m的每个具体值是具有0与6之间的值的独立整数;
q的每个具体值是具有1与6之间的值的独立整数;
p是具有1与10之间的值的整数;并且
y是0或1。
2.权利要求1所述的化合物,其中y是1。
3.权利要求1所述的化合物,其中y是0。
4.权利要求1所述的化合物,其中R4是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11,并且R6a是H或烷基。
5.权利要求1所述的化合物,其中R6a是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11,并且R4是H或烷基。
8.权利要求1所述的化合物,其中R7是H。
11.权利要求9所述的化合物,其中R7是H。
12.权利要求9所述的化合物,其中R4是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)NR11。
15.权利要求13所述的化合物,其中R7是H。
16.权利要求13所述的化合物,其中R4是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11。
20.权利要求17所述的化合物,其中R7是H。
24.权利要求21所述的化合物,其中R6a是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11。
25.权利要求21所述的化合物,其中R7是H。
28.权利要求26所述的化合物,其中R7是H。
29.权利要求26所述的化合物,其中R4是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11。
32.权利要求26所述的化合物,其中R4是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2,并且R6a是H或烷基。
33.权利要求26所述的化合物,其中R6a是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2,并且R4是H或烷基。
34.权利要求26所述的化合物,其中R7是H。
35.合成包含下式基团的肽的方法:
或
所述的方法包括使具有以下结构式I的化合物
或其对映异构体、立体异构体或非对映异构体或其合成上可接受的盐与N-保护的氨基酸反应的步骤,
其中:
R1是H、烷基、芳基、烷基芳基、烷基-N(R8)2、烷基-OR8、烷基-C(=O)OR8、C(=O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(=O)N(R8)2或下式的基团:
R2是H或烷基,前提是R1和R2不都是H;
R3是H或第一氮保护基团;
R4是H、烷基、(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R5是H或烷基;
R6a是H、烷基、(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R6b是H或烷基;
前提是R4和R6a不均是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R7是H、C(=O)烷基或C(=O)(CH2)m(NR8)2;
R8的每次出现独立地是H、芳基或烷基;
R11是肽固体支持物;
R12是H或第二氮保护基团;
m的每个具体值是具有0与6之间的值的独立整数;
q的每个具体值是具有1与6之间的值的独立整数;
p是具有1与10之间的值的整数;并且
y是0或1。
36.一种化合物,其包含多个氨基酸残基和至少一个具有下式的基团:
或其对映异构体、立体异构体或非对映异构体,其中:
R1是H、烷基、芳基、烷基芳基、烷基-N(R8)2、烷基-OR8、烷基-C(=O)OR8、C(=O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(=O)N(R8)2或下式的基团:
R2是H或烷基,前提是R1和R2不都是H;
R3是H或第一氮保护基团;
R4是H、烷基、(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R5是H或烷基;
R6a是H、烷基、(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R6b是H或烷基;
前提是R4和R6a不均是(CH2)mC(=O)OH、(CH2)mC(=O)NR11、(CH2)mC(=O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(=O)N(R8)2或(CH2)mC(=O)N(R8)(CH2)pN(R8)2;
R7是H、C(=O)烷基或C(=O)(CH2)m(NR8)2;
R8的每次出现独立地是H、芳基或烷基;
R11是肽固体支持物;
R12是H或第二氮保护基团;
m的每个具体值是具有0与6之间的值的独立整数;
q的每个具体值是具有1与6之间的值的独立整数;
p是具有1与10之间的值的整数;并且
y是0或1。
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