KR970009887B1 - 심방의 나트륨이뇨성 펩티드의 선형유사체 - Google Patents

Abstract

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Description

심방의 나트륨이뇨성 펩티드의 선형유사체

1987년 5월 7일에 공개되고 본원에 참고로 삽입된 본 출원인의 공개된 PCT 출원인 WO 87/02674는 심방조직에서 발견되는 것과 유사하고 심장 혈관 시스템의 긴장조절에 기여하는 혈관활성 펩티드의 한 종류를 기재하고 있다. 이들 화합물은 환식(cyclic) 천연의 심방 나트륨이뇨성 펩티드(ANP)의 합성 선형 유사체이다.

그것들의 나트륨이뇨성, 이뇨성, 및/또는 혈관이완 활성에 유용한 선형 펩티드의 특이적 종의 개시이외에도, 공개된 그 출원은 이들 펩티드의 합성방법 뿐만 아니라 체내에서 염과 물평형 및 심장혈관 긴장을 조절하는 그것들의 능력을 평가하는 방법을 기재하고 있다.

공개된 그 출원에 개시된 바와 같이, 심방의 펩티드의 선형합성형태가 합성될 수 있고 그때에 N-말단은 일반적으로 자연상태에서 소수성인 비-펩티트기로 보충된다. 그 출원의 실시예 306과 307은 그러한 유사체를 합성하기 위한 수단을 설명한다.

나아가, 공개된 그 출원은 간단한 시험관내 시험에서, 체내에서의 심장 혈관 조절제와 같이 행동하는 시험된 화합물의 능력을 예측할 수 있는 생물학적 측정법을 기재하고 있다. 배양된 BASM 또는 BAE 세포에 결합하는 천연 ANP와의 결합을 이용하는 수용체-결합 측정은 마취된 쥐와 개의 전체 포유류 측정의 결과와 상관관계가 있는 것으로 입증되었다. 단리된 조질 측정에서 화합물은, 비록 체내에서는 활성이었어도 일반적으로 비활성적이었다(예를들어 단리되 관류된 쥐 신장에서). 그럼에도 불구하고, 그것들은 이들 단리된 조직에서 천연 ANP의 효과를 강화시킬 수 있었다. 체내 및 시험관애 측정 2가지에서 그 결과는 비록 출원인과 부합하는 특별한 이론은 없지만, 발명의 합성 유사체가 적어도 부분적으로는 천연 ANP의 제거 수용체의 결합에 기입하여 효과적일 수 있음을 나타냈다.

공개된 출원의 실험결과를 본원에서 참고로 인용 및 삽입한다.

발명의 개시

본 발명의 합성 유사체 화합물의 대부분은 아틀라스, 에스, 등의 Nature (1987) 309 : 717-719로부터의 확인시스템을 사용하여 아미노-말단 아르기닌 잔기가 위치 1에 있는 천연 ANP의 서열 AA₈-AA₁₂에 대해 규정된 방식으로 해당하는 아미노산 잔기의 코아 펜타펩티드 서열을 보유한다. 공지의 천연 ANP에서 이 코아 서열은 쥐에서는 RIDRI이고 사람에서는 RMDMI이다. AA₁₂가 존재하지 않는 일부를 포함하여, 이 서열의 일정한 변환은 체내에서 활성을 보유하고, 코아 펩티드 구조는 펩티드의 생물학적 합성에 중요한 인자인 것으로 입증한다. 그러나, 본원에서 설명되는 바와 같이 많은 이들 화합물은 이뇨성 또는 나트륨이뇨성 활성의 측정을 위한 시험관내 모델 시스템에서는 비활성적이다. 이들 유사체는 이들 펩티드에 대한 제거 수용체(들)을 차단함으로써 내인성 ANP의 기능혁을 부여하는 것같다.

따라서 본 발명은 한 측면에서 다름 식을 가지며, 포유류에서 나트륨이뇨성, 이뇨성, 및/또는 혈관이완 활성을 가지고 있는 선형유사 펩티드 화합물에 관한 것이다.

Z₁Z₂-AA₈-AA₉-AA₁₀-AA₁₁-AA₁₂-Z₃...(1)

상기식에서, AA₈과 AA₁₁의 각각은 독립적으로 바람직하게는 염기성/비환식이지만, 또한 중성/비극성/작은 또는 중성/극성/큰/비방향족 아미노산 잔기일 수 있고, 더불어 AA₈은 중성/비극성/큰/비방향족 아미노산일 수 있고, AA₉는 D 또는 L 구조의 중성/비극성/큰/비방향족 아미노산 잔기이며, AA₁₀은 산성 아미노산 잔기이고, 그리고, AA₁₂는 D 또는 L 구조의 중성/비극성/큰/비방향족 아미노산 잔기이거나 또는 공유결합이며, 상기식에서 Z₁은 그것의 카르복시-말단 잔기로서 소수성 아미노산 잔기, 또는 그것의 des NH₂형태를 가지고 있는 1 내지 125 아미노산의 펩티드이거나 또는 6 내지 20 탄소원자의 소수성 지방족, 방향족 또는 혼합 지방족/방향족 유기 기이고, Z₂는 약 4.5~15 옹스트롬의 공간지수를 제공하는 스페이서 기, 즉 연결된 기에 3-9의 원자를 함유하거나 또는 폴딩에 의해 적절한 공간구조로 적합하게 될 수 있으며, 그리고 Z₃는 (OH), NH₂, NHR' 또는 NR'R이고 상기에서 R' 또는 R는 각각 독립적으로 1 내지 10 탄소원자의 직쇄 또는 분기쇄 알킬이며 그중 1 또는 2 탄소는 O,N, 또는 S로 대치될 수 있으며, 또는 AA₁₂가 공유 결합인 경우 Z₃은 OH,NH₂또는 펩티드일 수 없다면, Z₃은 1-20 아미노산 잔기의 펩티드 잔기이거나, 또는 그것의 아미드 또는 알킬 아미드이며, 상기식에서,어떠한 인접한 아미노산 잔기 사이의 하나 이상의 마이드 골격 결합이 -CH₂NH-, CH₂S-, -CH₂, CH₂-, -CH=CH-(시스 및 트란스), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂및 -CH₂SO-로 이루어지는 군으로 부터 선택된 결합에 의해 대치된다.

다른 측면으로, 발명은 다음 식을 가지며, 포유류에서 나트륨이뇨성, 이뇨성, 및/또는 혈관이완활성을 가지는 선형 유사 펩티드 화합물에 관한 것이다.

Z₁Z₂-AA₈-AA₉-AA₁₀-AA₁₁-AA₁₂-Z₃...(1)

상기식에서, AA₈과 AA₁₁의 각각은 독립적으로 바람직하게는 염기성/비환식이지만, 또한 중성/비극성/작은 또는 중성/극성/큰/비방향족 아미노산 잔기일 수 있고, 더불어 AA₈은 중성/비극성/큰/비방향족 아미노산일 수 있고, AA₉는 D 또는 L 구조의 중성/비극성/큰/비방향족 아미노산 잔기이며, AA₁₀은 산성 아미노산 잔기이고, 그리고, AA₁₂는 공유결합이며, 상기식에서 Z₁은 그것의 카르복시-말단 잔기로서 소수성 아미노산 잔기, 또는 그것의 des NH₂형태를 가지고 있는 1 내지 125 아미노산의 펩티드이거나, 또는 6 내지 20 탄소원자의 소수성 지방족, 방향족 또는 혼합 지방족/방향족 유기 기이고, Z₂는 약 4.5-15 옹스트롬의 공간 치수를 제공하는 스페이서기, 즉 연결된 기에 3-9의 원자를 함유하거나 또는 폴딩에 의해 적절한 공간구조로 적합하게 될 수 있으며, 그리고 Z₃는 NHR' 또는 NR'R이며 이때에 R' 또는 R는 각각 독립적으로 1-10 탄소원자의 직쇄 또는 분기쇄 알킬이며 그중 1 또는 2 탄소는 O,N, 또는 S로 대치될 수 있다.

발명의 전술한 화합물에서 어떠한 인접한 아미노산 잔기 사이의 하나 이상의 아미드 공격 결합이 -CH₂NH-, CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH-(시스 및 트란스), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂및 -CH₂SO-로 이루어지는 군으로부터 선택된 연쇄에 의해 선택적으로 대치될 수 있다.

여전히 또 다른 측면으로, 발명은 포유류에서 나트륨이뇨성, 이뇨성, 및/또는 혈관이완활성을 가지고 있는 다음 식을 가지는 선형 유사 펩티드 화합물에 관한 것이다.

Z₁Z₂-AA₈-AA₉-AA₁₀-AA₁₁-AA₁₂-Z₃...(1)

상기식에서, AA₈과 AA₁₁의 각각은 독립적으로 바람직하게는 염기성/비환식이지만, 또한 중성/비극성/작은 또는 중성/극성/큰/비방향족 아미노산 잔기일 수 있고, 더불어 AA₈은 중성/비극성/큰/비방향족 아미노산일 수 있고, AA₉는 D 또는 L 구조의 중성/비극성/큰/비방향족 아미노산 잔기이며, AA₁₀은 산성 아미노산 잔기이고, 그리고, AA₁₂는 (D 또는 L 구조의 중성/비극성/큰/비방향족 아미노산 잔기이거나 또는) 공유결합이며, 상기식에서 Z₁은 그것의 카르복시-말단 잔기로서 소수성 아미노산 잔기, 또는 그것의 des NH₂형태를 가지고 있는 1 내지 125 아미노산의 펩티드이거나, 또는 6 내지 20 탄소원자의 소수성 지방족, 방향족 또는 혼합 지방족/방향족 유기 기이고, Z₂는 약 4.5-15 옹스트롬의 공간 치수를 제공하는 스페이서기, 즉 연결된 기에 3-9의 원자를 함유하며 또는 폴딩에 의해 적절한 공간구조로 적합하게 될 수 있고 -(P)_n-(CO)_x-(식중_x는 0 또는 1이고,_n은 1-6이며, P는 CH₂이고, N-N이 일어나지 않고, Z₂가 -NH(CH₂)₃-6CO-일 수 없으면 상기 -CH₂- 기중 1 또는 2개는 NH로 대치될 수 있다).

-(Q)_m-B-(Q)_m-(CO)_x-(식중_x는 0 또는 1이고, 각_m은 독립적으로 0-3이지만 2개의 합이 5 이하이며, -N-N-이 일어나지 않으면 Q는 CH₂또는 NH이고, 그리고 B는 임의로 N헤테로원자를 함유하고 있는 포화 또는 불포화 5- 또는 6-원고리이며, B는 1,4 또는 1,3으로 Q와 결합될 수 있다)로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

Z₃는 (OH), NH₂, NHR' 또는 NR'R이며 상기식에서 R' 또는 R는 각각 독립적으로 1-10 탄소원자의 직쇄 또는 분기쇄 알킬이며 그중 1 또는 2 탄소는 O,N, 또는 S로 대치될 수 있으며, 또는 만약 AA₁₂가 공유 결합인 경우 Z₃은 OH,NH₂또는 펩티드일 수 없다면, Z₃은 1-20 아미노산 잔기의 펩티드 잔기이거나, 또는 그것의 아미드 또는 알킬 아미드이다.

발명의 전술한 화합물에서, 어떠한 인접한 아미노산 잔기 사이의 하나 이상의 아미드 골격 결합이 선택적으로 -CH₂NH-, CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH-(시스 및 트란스), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂및 -CH₂SO-로 이루어지는 군으로부터 선택된 결합에 의해 선택적으로 대치될 수 있다.

또 다른 측면으로, 발명은 다음 구조식을 가지며, 포유류에서 나트륨이뇨성, 이뇨성, 및/또는 혈관이완활성을 가지고 있는 선형 유사 펩티드 화합물에 관한 것이다.

Z₁Z₂-AA₈-AA₉-AA₁₀-AA₁₁-AA₁₂-Z₃...(1)

상기식에서, AA₈과 AA₁₁의 각각은 독립적으로 바람직하게는 염기성/비환식이지만, 또한 중성/비극성/작은 또는 중성/극성/큰/비방향족 아미노산 잔기일 수 있고, 더불어 AA₈은 중성/비극성/큰/비방향족 아미노산일 수 있고, AA₉는 D 또는 L 구조의 중성/비극성/큰/비방향족 아미노산 잔기이며, AA₁₁은 산성 아미노산 잔기이고, 그리고, AA₁₂는 D 또는 L 구조의 중성/비극성/큰/비방향족 아미노산 잔기이거나 또는 공유결합이고, 상기식에서 Z₁은 R'₁CO,R'₁COCH₂,R'₁O- 또는 R₁의 것이고, 식중 R₁은 카르보닐 부분에 대하여 적어도 하나의 할로기 알파를 함유하고, Z₂는 약 4.5-15 옹스트롬의 공간 치수를 제공하는 스페이서기이고, 즉 연결된 기에 3-9의 원자를 함유하며 또는 폴딩에 의해 적절한 공간구조로 적합하게 될 수 있고 Z₃는 (OH),NH₂,NHR' 또는 NR'R이고 상기에서 R' 또는 R는 각각 독립적으로 1-10 탄소원자의 직쇄 또는 분기쇄 알킬이며 그중 1 또는 2 탄소는 O,N, 또는 S로 대치될 수 있으며, 또는 만약 AA₁₂가 공유결합인 경우 Z₃은 OH,NH₂또는 펩티드일 수 없다면, Z₃은 1-20 아미노산 잔기의 펩티드 잔기이거나, 또는 그것의 아미드 또는 알킬 아미드이다.

발명의 전술한 화합물에서, 어떠한 인접 아미노산 잔기 사이의 아미드 골격 결합은-CH₂NH-, CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH-(시스 및 트란스), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂및 -CH₂SO-로 이루어지는 군으로부터 선택된 결합에 의해 임의로 대치될 수 있다.

발명의 다양한 측면의 모든 펩티드에서, 하나 또는 2개의 아미노산 잔기는 해당하는 D 이성체, 더불어, 또는 그 대신에 AA₉와 적용가능하다면, AA₁₂로 대치될 수 있다.

발명은 또한 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템의 나트륨이뇨제, 이뇨제, 혈관 확장제 및/또는 조정제로서 유용한 약학적 조성물에 관한 것이며, 그 조성물은 그것들의 아미드 및 에스테르를 포함하여 상기 설명한 유사 펩티드 화합물, 및 그의 비독성 부가염과, 약학적으로 허용가능한 액체, 겔 또는 고형담체를 함유하고 있다. 치료적으로 유효한 양의 이들 조성물의 투여는 상기 설명된 생물학적 활성을 포유류 숙주에게 효과적으로 전달할 수 있다.

본 발명의 추가의 관점은 이러한 화합물 및 조성물의 제조방법, 그리고 화합물 및 조성물을 치료제로 사용하는 방법을 제공한다.

발명을 수행하기 위한 형태

본 발명에 따르면, 천연 심방나트륨이뇨성 펩티드(AMP) 화합물의 몇가지 부류의 신규한 유사체를 제공하는데 이들 유사체는 포유동물의 체내에 천연 펩티드의 나트륨이뇨성, 이뇨성, 및/또는 혈관이완활성을 나타낼 수 있거나 또는 조정할 수 있다.

코아 펜타펩티드를 포함하는 본 발명의 함성유사체 화합물의 아미노산 잔기의 서열, 및 그의 바람직한 구체예들은 특정 하위부류의 일정한 특징의 아미노산에 의해 정의된다.

아미노산 잔기는 인반적으로 다음과 같이 그리고 제1도에 나타낸 것과 같이 4가지 주 하위부류로 하위분류될 수 있다.

산성 : 잔기는 생리적 pH에서 H이온의 손실로 인해 음의 전하를 가지며 잔기는 펩티드가 생리적 pH에서 수성 매체에 있을때의 펩티드의 형태(conformation)에 함유되는 표면 위치를 추구하도록 수용액에 의해 이끌린다.

염기성 : 잔기는 생리적 pH에서 H이온과의 결합으로 인해 양의 전하를 가지며 잔기는 펩티드가 생기적 pH에서 수성 매체에 있을때의 펩티드의 형태에 함유되는 표면위치를 추구하도록 수용액에 의해 이끌린다.

중성/비극성 : 잔기는 생리적 pH에서 하전되지 않으며 잔기는 펩티드가 수성매체이 있을 때의 펩티드의 형태에 함유되는 내부위치를 추구하도록 수용액에 의해 반발된다.

이들 잔기는 또한 여기서 소수성이라 칭한다.

중성/극성 : 잔기는 생리적 pH에서 하전되지 않으나 잔기는 펩티드가 수성매체이 있을 때의 펩티드의 형태에 함유되는 외부 위치를 추구하도록 수용액에 의해 이끌린다.

물론, 개개의 잔기 분자들의 통계학적 수집에 있어서, 어떤 분자들은 하전될 것이고 어떤 분자들은 하전되지 않을 것이며 더크거나 더적은 정도로 수성매체에 이끌림 또는 그로부터 반발이 있을 것이다. 하전되의 정의를 만들기 위해, 상당한 백분율(적어도 대략 25%)의 개개 분자들을 생리적 pH에서 하전시킨다.

극성 또는 비극성으로서 분류하기 위해 요구되는 이끌림 또는 반발의 정도는 임의적이며 따라서, 본 발명에 의해 특정적으로 숙고된 아미노산들은 이리저리 특정적으로 분류되었다.

특정적으로 명칭되지 않은 대부분의 아미노산들은 공지의 작용을 기포고 분류될 수 있다.

아미노산 잔기는 환식 또는 비환식 및 방향족 또는 비방향족, 잔기의 측쇄치환기에 관하여 자명한 분류, 그리고 작은 것 또는 큰 것으로 더 하위분류될 수 있다.

잔기가 카르복실 탄소를 포함하여 총 4개의 탄소원자 또는 그 이하를 함유한다면 작은 것으로 생각된다.

작은 잔기는 물론 항상 비방향족이다.

천연발생단백질 아미노산에 대하여, 전술한 개요에 따르는 하위분류는 다음과 같다(또한 제1도 참조).

산성 : 아스파르트산 및 글루탐산

염기성/비환식 : 알기닌, 라이신

염기성/환식 : 히스티딘

중성/극성/작은 것 : 글리신, 세린 및 시스테인

중성/극성/큰 것/비방향족 : 트레오닌, 아스파라긴. 글루타민

중성/극성/큰 것/방향족 : 티로신

중성/비극성/작은 것 : 알라닌

중성/비극성/큰 것/비방향족 : 발린, 이소로이신, 로이신, 메티오닌

중성/비극성/큰 것/방향족 : 페닐알라닌, 및 트립토판

유전자 코드화된 아미노산 프롤린은 기술적으로는 중성/비극성/큰 것/환식 및 비방향족군에 들어가나 펩티드 사슬의 2차 형태에 대한 공지의 효과로 인해 특별한 경우이며 이 정의된 군에 포함되지 않는다.

소정의 통상적으로 직면하는 아미노산들은 유전자코드에 의해 코드화되지 않는데, 예를들면 베타-알라닌(베타-ala), 또는 3-아미노프로피온산, 4-아미노부티르산 등과 같은 다른 오메가-아미노산, 알파-아미노이소부티르산(Aib), 사르코신(Sar), 오르니틴(Orn), 시트룰린(Cit), t-부틸알라닌(t-BuA), t-부틸글리신(t-BuG), N-메틸이소로이신(N-Melle), 페닐글리신(Phg), 및 시클로헥실알라닌(Cha), 노르로이신(Nle), 시스테인산(Cya) 및 메티오닐술폭시드(MSO)를 포함한다. 이것들은 또한 편리하게 특정 카테고리들에 속한다.

상기 정의를 기초로 하여, Sar 및 베타-ala는 중성/비극성/작은 것이며, t-BuA,t-BuG,N-Melle,NLe 및 Cha는 중성/비극성/큰 것/비방향족이고, Orn은 염기성/비환식이며, Cya는 산성이고, Cit, 아세틸 Lys 및 MSO는 중성/극성/큰 것/비방향족이며, Phg는 중성/비극성/큰 것/방향족이다.

또한 제1도 참조.

여러가지 오메가-아미노산은 크기에 따라 중성/비극성/작은 것(베타-ala, 즉 3-아미노프로피온산, 4-아미노부티르산) 또는 큰 것(기타 모두)으로 분류된다.

유전자에서 코드화된 것들에 대한 다른 아미노산 치환도 또한 본 발명 범위내의 펩티드 화합물에 포함될 수 있고 이 일반적 개요내에서 분류될 수 있다.

본 발명의 ANP 유사체 화합물을 기술하기 위해 사용된 명명법은 관행을 따르며 아미노기는 펩티드의 각 아미노산의 왼쪽으로 하고 카르복시기는 오른쪽으로 한다.

본 발명의 선정된 특정구체예를 나타내는 식에서 아미노- 및 카르복시-말단기들은 종종 비특정적으로 나타나나, 달리 명시되지 않으면 생리적 pH 값에서 추정되는 형태인 것으로 이해될 것이다.

그러므로 생리학적 pH에서 N-말단 H⁺ ₂및 C-말단 -O^-는 모두 특정한 예에서 일반식으로 특정되고 표시될 필요는 없지만 존재하는 것으로 이해된다.

도시된 펩티드에 있어서, 특정하게 코드화된 각각의 잔기는 하기의 통상적인 목록에 따라서 아미노산의 통상적인 명칭에 대응하여 단일 문자로 표기함으로써 표시된다.

유전학적으로 코드화되지 않은 아미노산은 상기 표시한 것처럼 단축되어 표시된다.

본원에서 표시된 특정 팹티드에 있어서, 칼표(

)에 의해 표시되지 않는다면 광학적 이성체를 갖고 있는 어떠한 아미노산이라도 L-형태가 의도된다. 본 발명의 펩티드의 잔기는 천연 L 광학적 이성체 형태인 것이 정상적이지만, 하나 또는 둘, 바람직하게는 하나의 AA₉및 AA₁₂를 대신할 뿐만아니라 이것에 부가되는 아미노산은 광학적 이성체 D형으로 대체할 수 있다(AA₉와 AA₁₂가 모두 L인 구체예를 포함함).

카르복시- 또는 아미노-말단에 있는 것들을 포함하여 유리기능기도 아미드화, 아실화 또는 기타 다른 치환에 의해 변형될 수 있는데, 이것은 예컨대 그것들의 활성에 영향을 주지 않으면서 화합물의 용해도를 변화시킬 수 있다.

특히 심방의 나트륨이뇨성 펩티드의 카르복실 말단 아미드-변형 유사체는 특히 강련한 효과가 있으므로 이것은 본 발명의 바람직한 구체예라는 것이 발견되었다.

일반적으로 카르보닐 탄소에 공유결합된 아미도기의 질소원자는 NH₂, -NHR' 또는 NR'R일 것이고, 여기에서 R'와 R는 1-2 탄소가 질소, 산소 또는 황원자로 대치되는 기를 포함하여 1-10탄소의 바람직하게는 1-6탄소의 직쇄 또는 분기쇄 알킬 또는 알킬아실이다.

이와 같은 아미노기의 대표적인 것은 많은 것 중에서 특히 -NH₂, -NHCH₃, -N(CH₃)₂, -NHCH₂CH₃, -NHC₆H₅, -NHCH₂CH(CH₃)₂, -NHCH₂(CH)₃CH₂CH₃, -NHCH₂CH₂OH, -NHCH₂OCH₂CH₃및 -N(CH₃)CH₂CH₂SCH₂CH₃등이 있다.

본 발명의 아미드화 유사체를 형성함에 있어서, 유사체화합물은 예컨대 Boc-AAx-pMBHA-수지 또는 Boc-AAx-BHA-수지를 사용하여 직접 합성될 수 있는데, 여기서에서 AAx는 다음에 더욱 상세히 설명되는 것처럼 소정의 유사체 화학물은 해당기술분야에 널리 공지된 수단을 사용하여 펩티드 합성에 후속하여 화학적으로 또는 효소적으로 아미드화될 수 있거나 또는 표준 용액-상 펩티드 합성 프로토콜에 의해 제조될 수 있다.

바람직한 구체예

A. 코아 펜타펩티드

본 발명의 화합물 모두는 펜타펩티드 코아서열을 포함한다.

AA₈-AA₉-AA₁₀-AA₁₁-AA₁₂

여기에서 AA₈과 AA₁₁각각은 독립적으로, 염기성/비환식이거나, 또는 중성/비극성/작은 것이거나, 또는 중성/극성/큰/비방향족 아미노산잔기이고, 또한, AA₈은 중성/비극성/큰/비방향족 아미노산이며, AA₉은 D 또는 L 구조의 중성/비극성/비방향족 아미노산 잔기이고, AA₁₀은 산성 아미노산잔기이며, 및 AA₁₂는 D 또는 L 구조의 중성/비극성/큰/비방향족 아미노산 잔기 또는 공유결합이다.

이 코아의 가장 바람직한 직열은 R(I/M)DRI인데, 여기에서 모든 잔기는 L구조이고 괄호내에 포함된 아미노산 잔기는 선택적이다. 다음으로 R(I/M)DRI잔기중 하나만이 상기 정의내에서 선택적인 잔기로 치환되어진 이들 서열이 우선적이다.

바람직한 치환기는 다음과 같다.

AA₈에 대하여 R 대신에 : K, 아세틸 Lys,A,Q,N,L 또는 Nle; AA₉에 대하여 I/M 대신에 : V,V⁺,L,L⁺,I⁺M+,t-BuA,t-BuG 또는 Cha; AA₁₀에 대하여 D 대신에 : E 또는 Cya; AA₁₁에 대하여 R 대신에 : K,아세틸 Lys,A,Q,N,Orn 또는 Cit; AA₁₂에 대하여 I 대신에 : M,M+,V,V⁺,L,L⁺,I⁺,N-Melle,t-BuA 또는 공유결합이다.

특히 바람직한 구체예에는 이와 같은 서열이 다음과 같이 구성되는 군으로부터 선택된 것이다.

A(I/M)DRI RM⁺DRI R(I/M)DRL

K(I/M)DRI RLDRI R(I/M)DRM

아세틸 Lys (I/M)DRI

Q(I/M)DRI R(I/M)ERI R(I/M)DRM⁺

RVDRI R(I/M)DKI R(I/M)DRI⁺

RI⁺DRI R(I/M)DQI R(I/M)DRV

천연발생의 RIDRI 또는 RMDRI 서열로부터 하나 이상 변경된 것도 본 발명의 범위에 속하나 덜 바람직하다.

상기 군의 특히 바람직한 하위 세트에는 또다른 치환에 부가하여 AA₁₀으로서 클루탐산이 아스파르트산을 대시한 것이 포함된다.

B. Z₁의 구체예

Z₁의 바람직한 형에는 후술하는 비-아미노산 소수성(疏水性) 잔기에 부가하여 1~5의 펩티드, 더욱 통상적으로는 1~3의 펩티드와, 아미노산 또는 그의 desNH₂형이 포함되며, 이때 C-말단 아미노산은 소수성, 즉 중성 및 비극성이며, 특히 Phe 또는 desNH_2-Phe이다.

Z₁의 바람직한 구체예에는 R-S-S-C-F,R-S-S-A-F,Y-A-F,R-C-F,S-C-F,A-F,C-F 및 F 또는 desNH₂-F 즉, C-말단끝의 아미노산 잔기가 F이며, 상류 잔기는 Y,A,C,S 및 R로부터 선택되는 것들이 있다.

Z₁의 바람직한 비-펩티드-유도형에는 일반적으로 비독성이고 소수성이며, 통장적으로 아미노산 잔기에서 발견되는 치환기에 비교할 때 비교적 거대한 유기 치환기가 포함된다.

현재 바람직한 유기 치원기의 한 부류는 다음과 같은 일반식으로 표시될 수 있다.

R₁-CO-

상기 R₁은 유기 소수성 기이다.

이 일반식에는 2-치환 아세틸, 3-치환 프로피오닐 및 4-치환 부타릴기가 포함되며, 이때 이들 기의 치환분에는 중성, 소수성 모노- 및 폴리환산방향족 또는 포화 환상 시스템이 포함된다.

CO에 대한 할로겐 알파가 포함되는 구체예에 있어서, 치환분은 지정된 R'₁CO이다.

기타 부류는 R₁-COCH₂-, R₁-O-, R'₁-COCH₂, R'₁-O- 또는 단순히 R₁- 또는 R'₁의 일반식을 갖는다.

바람직한 치환기의 대표적인 실례에는 다음의 것이 포함된다.

플루오레닐메틸옥시카르보닐(FMOC)

특히 바람직한 것은 NA,NOA 및 NYL이다.

2-할로 형은 슈이사이드(suicide) 결합제로서 제거수용체에 공유결합할 가능성이 있는 것으로 생각된다.

C. Z₂의 구체예

본 발명화합물에 있어서 Z₂는 Z₁의 소수성 부분으로부터 AA₈을 분리하는 스페이서 요소를 제공한다. 링커 Z₂는 AA₈과 소수인자 사이에, 일반적인 연장쇄내의 3-9개 원자에 대응하는, 약 4.5 내지 15Å의 거리를 이룰 수 있어야 한다. 물론 보다 킨 링커가 그의 3차원 형태가 상기 공간거리를 수반하기만 한다면, 이용될 수 있다.

Z₂의 바람직한 구체예는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

(a) (AA)a

이때 AA는 아미노산이며 a는 1 또는 2이고, 특히 각각의 AA는 G,S,A,Sar 및 Aib로부터 선택된다.

(b) -(P)_n-(CO)_x-

이때 x는 0 또는 1이고, n은 1~6이며, P는 CH₂이고, 또한 여기에서 상기 -CH₂- 기의 1-2개는 N-N가 있지 않는 조건하에서 NH로 대치될 수 있다.

(c) -(Q)_m-B-(Q)_m-(CO)_x-

이때 x는 0 또는 1이고 각개 m은 독립적으로 0-3이나, 두께 m의 합은 5 또는 그 이하이고, Q는 -N-N-이 있지 않는 조건하에서 CH₂또는 NH이고, 그리고 B는 선택적으로 N 헤테로원자를 포함하는 포화 또는 불포화 5원환 또는 6원환이다.

B는 1,4 또는 1,3으로 Q와 결합될 수 있다. 특히 p-아미노페닐 아세틸(4-APA)이 바람직하다.

D. Z₃의 구체예

Z₃에 대하여 바람직한 것은 NH₂,NHR' 그리고 AA₁₂가 결합인 화합물을 제외한, 1-3 아미노산의 펩티드 잔기의 아미드 또는 알킬아미드이다.

AA₁₂가 공유결합인 경우 Z₃은 알킬 아미드화 형, 예를들면 -NHR'인 것이 바람직하며, 이때 R'는 2~10C이다.

펩티드 잔기인 여러 구체예중 특히 바람직한 것은 아미노산이 G,A 및 S로부터 선택되는 것들이다.

E. 비-펩티드 연쇄

본 발명의 한 구체예에 있어서, 코아 펜타 펩티드 또는 상기 Z₁및/또는 Z2 및/또는 Z₃에서 기술한 펩티드내의 아미드 결합(-CH-NH-)은 본 분야에 공지된 방법에 의하여, -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH=CH-(시스 및 트란스), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- 및 -CH₂SO-와 같은 기타 형의 결합으로 대치될 수 있다. 다음에 기술하는 문헌에는 이들 선택적-연결부분을 포함하는 펩티드 유사체의 제조법이 기술되어 있다. 스파톨라, 에이. 에프.(Spatola, A. F., Vega Data Mar. 1983, 1 : 3 Peptide Backbone Modifications general review) : 스파톨라, 에이. 에프.(Chemistry and Biochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins, 1983, (B. Weinstein et al., eds.) Marcel Dekker, New York, p267 general review) : 모올리, 제이. 에스.(Morley, J.S., Trends Pharm Sci, 1980, pp.463-468 general review) : 허드슨, 디. 등(Hudson, D. et al., Int J Pept Prot Res, 1979, 14 : 177-185 (-CH₂NH-,-CH₂CH₂-)) : 스파톨라, 에이. 에프. 등(Life Sci, 1986, 38 : 1243-1249 (-CH₂S-)) : 한, 엠. 엠.(Hann. M. M. J Chem Soc Perkin Trans I 1982, 307-314(-CH-CH-, Cis and Trans)) : 알름귀스트, 알. 지. 등(Almquist, R.G. et al., J Med Chem, 1980, 23 : 1392-1398(-COCH₂-)) : 제닝스화이트, 씨. 등(Jenninge White, C. et al., Tetrahedron Lett, 1982, 23 : 2533 (-COCH₂-)) : 스젤케, 엠. 등(Szelke, M., et al., European Application No, EP 45665, 1982, CA : 97 : 39405 (-CH(OH)CH₂-)) : 훌라데이, 엠. 더블유 등(Hollasay, M.W. et al., Tetrahedron Lett, 1983, 24 : 4401-4401 (-CH(OH)CH₂-)) : 흐러비, 브이. 제이.,(Hruby, V.J., Life Sci, 1982, 31 : 189-199(-CH₂S-)).

특히 바람직한 것은 -CH₂NH-이다.

합성

본 발명 범위내의 화합물은 예를들면 고상 펩티드 합성과 같은 본 분야에 잘 공지된 수단에 의하여 화학합성될 수 있다.

합성은 알파-아미노 보호된 아미노산을 사용하여 펩티드의 카르복시-말단으로부터 시작된다. 기타보호기도 적당하지만 t-부틸옥시카르보닐(Boc) 보호기가 모든 아미노기에 대하여 사용될 수 있다.

예컨대, Boc-Asn-OH, Boc-Ser-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Arg-OH 또는 Boc-Tyr-OH(즉 선택된 ANP 유사 카르복시-말단 아미노산)는 틀로로메틸화 폴리스티렌 수지 지지체로 에스테르화될 수 있다.

바람직하게는 폴리스티렌 수지 지지체는 스티렌과 가교결합제로서의 약 0.5 내지 2%의 디비닐 벤젠과의 공중합체이며, 이 가교제는 폴리스티렌 중합체가 어떤 유기용매에 전혀 불용성이 되게 한다.

스티와아트등의 고체상 펩티드 합성 및 메리필드의 미 화학회지를 참조하라(Stewart et al., Soiid-Phase Peptide Synthesis (1969) W.H. Freeman Co., San Francisco and Merrifield, J Am Chem Soc (1963) 85 : 2149-2154). 이들 및 기타 펩티드 합성법이 미국특허 제3,862,925호, 제3,842,067호, 제2,972,852호 및 제4,105,602호에도 예시되어 있다.

이 합성은 인위적 방법을 쓸 수도 있고, 또는 제작자가 제공하는 사용설명서에 기재된 지시에 따라, 예컨대 어플라이드 바이오시스템 430A 펩티드 합성기(Foster City, California) 또는 바이오서어취 SAM II 자동 펩티드 합성기(Biosearch, Inc. San Rafael, California)를 자동적으로 사용하여서도 가능하다.

펩티드 합성방법에 대해 통상의 지식을 가진자는 본 유사 화합물의 합성 과정중에 본 발명에 따라 만들어지는 중간체들은 그자체 신규하고도 유용한 화합물이고 따라서 본 발명의 범위에 포함된다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

다른 방법으로는, 본 발명의 선택된 화합물들은 주지의 방법으로 제조된 재조합 DNA 구조물을 발현함에 의해서도 생성될 수 있다. 이러한 제조방법은 그런 화합물의 대량 또는 다른 구체예를 제공하기 위해 바람직하다.

펩티드 서열은 비교적 짧기 때문에 재조합 생산을 용이해진다.

투여 및 사용

본 발명의 화합물들은 무상(infact)포유동물에 있어 나트륨이뇨, 이뇨 및 혈압저하 활성을 갖는 것으로 나타났고 혈관 이완 능력을 갖거나 알도스테론 및 레닌의 방출을 억제할 수도 있다.

그리하여 이들 화합물 및 이들을 함유한 조성물은 비효율적 신장관류 또는 감소된 사구체 여과율로 인한 고혈압 및 신장부전에 추가하여 예컨대 울혈성 심부전, 신장증후군 및 간경변, 폐 질병과 같은 각종 부종상태의 치료에 있어서의 치료제로 사용될 수 있다.

그리하여 본 발명은, 단독으로 상술한 치료적 이점을 제공하도록 작용할, 본 발명의 화합물 또는 그의 비독성 부가염, 아미드, 에스테르의 유효량을 함유하는 조성물도 제공한다.

그런 조성물은 생리적으로 허용되는 액산, 겔상 또는 고상의 희석제, 보조제 및 부형제와 함께도 사용될 수 있다.

이들 화합물 및 조성물은 가축과 같이 수의용으로서 포유동물에 투여될 수 있고 또한 다른 치료제와 유사한 방식으로 인간에게 임상적으로 사용될 수 있다.

일반적으로 치료 효과를 위해 요구되는 양은 숙주체중 kg당 약 0.01 내지 1000mcg, 보다 통상적으로는 0.1 내지 1000mcg이다. 또는, 이 범위내의 양이 원하는 치료적 이점이 얻어질때까지 장기간에 걸쳐 일정 주입에 의해 계속 투여될 수 있다.

대표적으로는, 그런 조성물은 용액이나 현탁액형의 주사제로 만들어진다. 주사전에 액체에 녹이거나 현탁시킬 수 있는 고체형으로 제조될 수도 있다. 제제는 유화될 수도 있다.

활성성분은 생리적으로 허용되고 활성성분과 조화될 수 있는 희석제 또는 부혈제와 흔히 혼합된다.

적당한 희석제 및 부형제는 예컨대 물, 식염수, 텍스트로스, 글리세롤 등 및 그들의 조합물이다.

그 위에 소망에 따라 조성물에는 습윤 또는 유화제, 안정화 또는 pH-완충제 등과 같은 보조물질 소량을 함유하게 할 수 있다.

조성물은 통상적으로 예컨대 피하적 또는 정맥내로 주사에 의해 비경구 투여될 수 있다. 다른 형식의 투여에 적합한 추가 제형에는 좌약, 비내 에어로졸 및 어떤 경우에는 구강 제형이 있다. 좌약에 있어서는, 관용적 결합제 및 부형제에는 예컨대 폴리알킬렌글리콜 또는 트리글리세리드가 있으며, 그런 좌약은 0.5% 내지 10%, 바람직하게는 1%-2% 범위로 활성성분을 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다.

경구 제형에는 예컨대 약제급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로오스, 탄산마그네슘 등과 같은 통상적으로 사용되는 부형제가 있다.

이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐, 서방제형 또는 분말의 형을 취하며 10%-95%, 바람직하게는 25%-70%의 활성성분을 함유한다.

펩티드 화합물은 중성형 또는 염형으로서 조성물로 만들어질 수 있다. 제약상 허용되는 비독성염에는(유리 아미노기와 함께 형성되는) 산부가염이 있고 이 산부가염은 예컨대 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 더불어 형성된다.

유리 카르복실기와 함께 형성되는 염은 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화 제2철과 같은 무기 염기 및 이소프로필 아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로 부터 유도될 수 있다.

나트륨이뇨성, 이뇨성 및 혈관 이완 활성을 나타내는 본 발명의 화합물에 추가하여, 본 발명의 화합물은 그런 유용한 화합물의 합성에 있거 중간체로서 사용될 수도 있다.

또는, 적당히 선택함으로써 그 활성수준이 감소되거나 완전히 없어진 본 발명의 화합물은 예컨대 대체 수용체에 결합하고 그 수용체 전환을 자극하고 또는 분해 효소 또는 수용체활성을 위한 대체 기질을 제공하고 그렇게 함으로써 이들 효소 또는 수용체를 억제함으로써, 본 발명의 범위밖의 화합물을 포함하여, 다른 이뇨성, 나트륨이뇨성 또 혈관이완성 화합물의 활성을 조정하는 역할을 할 수 있다.

이런 식으로 사용될 때는, 그런 화합물은 다른 활성화합물과의 혼합물로서 전달될 수 있거나, 또는 별도로, 예컨대 자체의 담체내에 수용되어 전달될 수도 있다.

본 발명의 화합물은 표지 시약, 통상 항체를 사용하는 면역측정에 사용될 항 혈청제조에 사용될 수도 있다.

편리하게, 폴리펩티드는 필요에 따라 디알데히드, 카르보디이미드에 의해, 또는 시판 링커를 사용하여 항원성-부여담체에 포함될 수 있다. 이들 화합물 및 면역학적 시약은 크로모포아, 예컨대 플루오레신 또는 로다민 같은 플루오로포아, 예컨대,¹²⁵I,³⁵S,¹⁴C 또는³H 같은 방사성동위원소, 또는 자력에 띄게된 입자와 같은 각종 표지로, 기술분야에 잘 알려진 수단에 의하여 표지될 수 있다.

이들 표지된 화합물 및 시약 또는 그것들을 인지하고 특이적으로 결합할 수 있는 표지된 시약은 예컨대 진단시약으로서 사용될 수 있다. 생물학적 시료로부터 유도된 샘플은 본 발명의 화합물로 공통 항원 결정기를 가지는 물질의 존재 또는 양에 대하여 측정될 수 있다. 더불어, 단일클론성 항체는 기술분야에 공지된 방법에 의하여 제조될 수 있고, 그 항체는 예컨대 체내에서 면역학적 관련 화합물의 과잉 생산을 중화시키는 치료적 용도에 사용될 수 있다. 다음의 실시예를 예시에 의해 제공하면, 그것이 본 발명의 어떠한 제한을 나타내지는 않는다.

본 발명은 심장혈관 시스템의 대사조절 분야에 관한 것이다. 특히 본 발명은 나트륨이뇨성, 이뇨성, 및/또는 혈관이완 활성을 가지는 화합물 종류에 관한 것이다.

제1도는 여기서 사용된 것과 같은 아미노산의 분류에 대한 개략도.

제2도는 본 발명의 여러가지 화합물을 열거하는 도면.

제3도는 본 발명과 유사하나 본 발명의 범위밖인 여러가지 화합물을 열거하는 도면이다.

다음과 같은 실험명세서에 있어서, 화학적으로 합성된 ANP 유사체 화합물의 아미노산 서열을 아트라스, 에스., 등의 Nature (1984) 309 : 717-719에 설명된 자연상태의 유래된 심방나트륨이뇨성 펩티드 서열내의 1위치에서 발견되는 아르기닐 잔기에 대응하는 아미노-말단의 아르기닌 잔기로부터 번호를 정한다.

I. 심방나트륨이뇨성펩티드 유사체화합물의 화학적 합성

수공으로 수행되는 고체-상 기술에 의해 또는, 다르게는 제조자의 지시에 따라 t-Boc 아미노산을 사용하고 Applied Biosystems 430A 펩티드합성기(Foster시, 캘리포니아)나 Biosearch Sam II 자동화펩티드합성기(Biosearch, 산 라파엘, 캘리포니아) 상에서 본 발명의 화합물을 합성하였다.

과정 A

Boc-AA_1……AA_n-1-AA_n-수지 히드록시메틸 폴리스티렌에스테르의 제조

선택된 Boc-AA_n-O-폴리스티렌-수지(0.2~0.6mmole/g 수지)(예컨대 Peninsula Labs, Inc.로부터 구입가능)1g을, Boc-AA_n-1-OH의 혼합을 위한 일정 A에 따라 처리한다.

일정 A

1) 디클로로메탄(CH₂Cl₂)로 3회 세척한다.

2) TFA : CH₂Cl₂: 에탄디티올(EDT)(45:50:5 부피)로 1분간 처리한다.

3) TFA : CH₂Cl₂: 에탄디티올(EDT)(45:50:5 부피)로 20분간 처리한다.

4) CH₂Cl₂로 3회 세척한다.

5) CH₂Cl₂내의 10%(v/v) 디이소프로필에틸아민(DIPEA)으로 1분간씩 2회 처리한다.

6) CH₂Cl₂로 2회 세척한다.

7) 메탄올(MeOH)로 2회 세척한다.

8) (5-7)과정을 한번도 반복한다.

9) CH₂Cl₂로 3회 세척한다.

10) CH₂Cl₂또는 디메틸포름아미드(DMF)/CH₂Cl₂(50:50)에 용해되어 있고 적당히 보호된 Boc-아미노산의 사전 형성된 대칭형 무수물을 1내지 6당량 가한다.

(N-히도록시벤조트리아졸을 사용하여 활성 에스테르로서 Boc-Asn-OH, Boc-Cln-OH 및 Boc-Arg(TOS)-OH를 커플시켰다)

11) CH₂Cl₂로 2회 세척한다.

12) 10% DIPEA로 2회 세척한다.

13) CH₂Cl₂로 2회 세척한다.

14) MeOH로 2회 세척한다.

15) CH₂Cl₂로 2회 세척한다.

16) (11-15)단계를 한번 더 반복한다.

17) 카이저(Kaiser)외, Anal. Biochem. 34 : 595(1970)에 따라 닌히드린 반응으로 시험한다.

만일 커플링반응이 불완전했다면(10-16) 단계를 반복하거나 또는, 달리 N-아세틸이미다졸(DMF내에 0.30M)이나 CH₂Cl₂중의 과잉의 아세트산 무수물을 사용하여 합성을 완성한다.

과정 B

Boc-AA_n-p-메틸벤즈히드릴아민수지의 제조

선택된 Boc-AA_n-OH를 하기와 같이, N,N'-디시클로헥실카아보디이미드를 거쳐서 p-메틸벤즈히드릴아민(pMBHA) 수지에 부착한다.

일정 B

1) pMBHA HCl 수지를 세척한다.

2) CH₂Cl₂내의 10%(v/v)DIPEA로 수지를 2회 세척한다.

3) CH₂Cl₂로 2회 세척한다.

4) MeOH로 2회 세척한다.

5) CH₂Cl₂로 2회 세척한다.

6) CH₂Cl₂내에 용해되어 있고 적당히 보호된 Boc-아미노산의 사전형성된 대칭형 무수물 1-6당량을 가하고 0.5-24시간 반응시킨다.

미반응 아미노기는 0.30M N-아세틸이미다졸 : DMF 또는 아세트산무수물 : CH₂Cl₂로 아세틸화한다.

다음 실시예들은 본 발명의 어떤 면을 설명해주는 대표적 유사체 ANP 화합물(AP#로 확인됨)의 화학적 합성을 증명한다.

본 발명 화합물은 하기와 같이 제조되며 여기세어는 편의상 WO 87/02674로부터 참조하였다.

실시예 306

* AP306 (2-나프틸아세틸)-G-G-R-I-D-R-A-G-A-NH₂

일정 B를 이용하여 얻은 Boc-Ala-pMBHA수지(0.4meq/gm) 1g을 아미노산의 요구되는 서열 및 아미노-말단 치환기(Boc-Gly-OH, Boc-Ile-OH 1/2H₂O, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Asp(OBzl)-OH, Boc-Ile-OH 1/2H₂O, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Gly-OH, Boc-Gly-OH, 2-나프틸아세트산 순서대로 도입한다.)와 함께 과정 A로 처리한다.

보호된 펩티딜 수지를 CH₂Cl₂로 3회, MeOH로 3회 세척하고 진공하에서 건조시켰다.

그리고나서 펩티딜 수지를 10% 아니솔, 2%에틸메틸술피드를 함유하는 무수 HF에 -10^oC에서 30분, 0^oC에서 30분간 현탁시켰다.

진공하에서 HF를 증발시켜 제거하고 펩티드/수지 혼합물을 에틸에테르내에 현탁시켰다.

펩티드/수지혼합물을 유리 깔때기에 옮긴후에 에틸에테르로 2회, 클로로포름으로 1회, 에틸에테르로 1회, 클로로포름으로 1회, 그리고나서 다시 에틸에테르로 1회 세척하였다.

그 다음에는 혼합물로부터 펩티드를 2.0M 아세트산으로 추출해내고 H₂O로 희석한 후 동결 건조하였다.

pH 6.5인 100mM NH₄OAc를 pH 4.5인 10mM NH₄OAc 용액에 가하여 산출되는 용출구배를 이용하여 CM-세파로스

(Pharmacia) 상에서 이온교환크로마토그래피에 의해 펩티드의 정제를 수행하였다.

254nm에서 분획들을 모니터하고 역-상 HPLC에 의해 분석하였다.

최저 순도가 97%인 분획들을 한곳에 모아 수회 H₂O로부터 동결 건조하여 정제된 AP306아세테이트염을 수득하였다.

실시예 307

* AP307 (2-나프톡시아세틸)-NH(CH₂)₄CO-R-I-D-R-I-NH₂

일정 B를 이용하여 얻은 Boc-Ile-pMBHA수지(0.4meq/gm) 1g을 아미노산의 요구되는 서열 및 아미노-말단 치환기(Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Asp(OBzl)-OH, Boc-Ile-OH 1/2H₂O, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-NH(CH₂)₄COOH, 2-나프톡시아세트 산의 순서로 도입한다.)와 함께 과정 A로 처리한다. 보호된 펩티딜 수지를 CH₂Cl₂로 3회 세척하고 MeOH로 3회 세척한 후 진공 건조하였다.

그런 다음 펩티딜 수지를 10% 아니솔, 2% 에틸 메틸 술피드 함유 무수 HF에 30분동안 -10^oC에서, 그리고 30분동안 0^oC에서 현탁시켰다. HF응 진공하에 증발로써 제거하고 펩티드/수지 혼합물을 에틸에테르에 현탁시켰다.

유리 깔때기에 옮긴후 펩티드/수지 혼합물을 에틸에테르로 2회, 클로로포름으로 1회, 에틸에테르로 1회, 클로로포름으로 1회, 그리고 다시 에틸 에테르로 1회 세척하였다.

그런 다음 펩티드를 혼합물로부터, 2.0M 아세트산을 사용하여 추출하고, H₂O로 희석하여 동결건조하였다.

100mM NH₄OAc, pH 6.5를 10mM NH₄OAc, pH 4.5 용액에 첨가함으로써 생성된 용출 구배를 이용하여 CM-세파로스

(Pharmacia) 상에서 이온교환 크로마토그래피에 의하여 펩티드 정제를 수행하였다.

분획물 254nm에서 모니터하고 역상 HPLC에 의해 분석하였다.

최저 순도가 97%인 분획들을 모아서 H₂O로부터 수회를 걸쳐 동결건조시켜 정제된 AP307아세테이트 염을 수득하였다.

실시예 306 및 307에 설명된 방법(AP306 및 AP307 유사체 펩티드를 생성하기 위함)을 적절히 변형하여 제2도 및 3도에 설명된 ANP 유사체를 합성하였다. 도면에 있어서, 상기 설명된 다음과 같은 약어가 사용되었다.

AA=아다만틸아세틸, BPA=비페닐아세틸, CHA=시클로헥실아세틸, DBA=디벤질아세틸, DPP=디페닐프로피오닐, IB=인돌부티릴, IP=인돌프로피오닐, NA=나프틸아세틸, NL=나프틸, NM=나프틸메틸, NO=나프톡시, NOA=나프톡시아세틸, NTA=나프틸 티오아세틸, NYC=나프토일, POP=테녹시 프로피오닐, TPP=트리페닐프로피오닐, MeONAP=메톡시나프틸프로피오닐.

각각의 별표를 한 실시예에서 펩티드의 적정한 아미노산 서열이 얻어졌음을 아미노산 분석은 실증하였다.

II. 생물학적 실험 : 수용체 결합측정

상술한 바와 같이 합성한 본 발명의 선정된 유사 심방 나트륨이뇨성 펩티드(ANP)에 대한 생물학적 활성 데이타를 수용체 결합측정의 결과로서 다음에 나타낸다. 단리된 조직과 전 포유동물의 생물학적 측정과의 상호관계는 WO 87/02674에 기재되어 있다.

어떤 이론에 의해 제한할 의도는 없으나, 본 발명의 ANP 유사체 화합물의 활성은 내인성 ANP들의 제거에 영향을 미치는데 확실한 신장 및 기타 부위에서 수용체에 대한 그들의 친화도에 기인한다고 본다.

다음 시험관내 생물학적 데이타는 본 발명의 유사체 화합물이 배양된 소의 대동맥 평활근(BASM)세포와 소의 내피(BAE) 세포로부터 수용체로의 결합을 위해 요오드화 천연 ANP 분자와 경합한다는 것을 나타낸다. 이 경합은 관련 제거 수용체로의 결합에 대한 척도인 것이 분명하다.

이 상호관계는 상술한 WO 87/02674의 데이타에 의해 확증된다. 또한, 본 발명의 유사체는 ANP의 직접적인 생물학적 기능의 특징인 감소된 환상 GMP 활성도를 나타낸다.

또 여기에 기재된 몇몇의 펩티드 및 펩티드 유사체도 또한 경구활성을 가질 것이라는 것을 본 발명자들은 가정하였다.

특정 ANP수용체 부위는 신장, 부신, 혈액관 및 배양된 세포와 같은 표적 조직상에서 확인된 바 있다.

Napier, M. A., et al., Proc Nat Acad Sci USA (1984) 81 : 5946-5940; DeLean, A., et al., Endocrinology (1984) 115 : 1636-1638; Schenk, D.B., et al., Biochem Ciphys Res Comm (1985) 127 : 433-442.

이들 특정 수용체 부위로의 ANP 또는 ANP 유사체의 결합이 생물학적 활성의 전제 조건이라는 가정하에 볼 때, 이들 수용체로의 ANP 유사체의 결합은 생물학적 활성에 입각한 것으로 고려된다.

측정법이 Schenk (상기동일)와 Scarborough, R.M., et al., J Biol Chem (1986) 261 : 12960-12964의 기재에 따라 통상 개발되어 왔으며, 이것은 배양된 BASM과 BAE 세포로의 결합을 위한 표지된 천연 ANP와 경합하기 위한 ANP 유사체의 능력을 평가한다.

의 아미노산 서열을 가지는 이 천연 ANP는 카르복시-말단 Y잔기상에서 요오드화되며 (¹²⁵I)-rANP(126-150)으로서 확인된다.

유사한 경합대치 수용체 결합측정은 특정 리간드-수용체 상호작용을 시험하기 위한 기술분야에서는 평범한 것으로 간주된다.

이 측정에서 0.5nM(¹²⁵I)-rANP(126-150)은 표지안된 rANP(126-150) 또는 시험화합물의 변화량의 존재하에서 BASM세포의 각 개별 샘플에서 배양된다.

최대(¹²⁵I)-rANP(126-150)결합의 50%가 대치되는 미표지된 펩티드의 농도는 Ki(app)리 불리며 수용체-결합친화도를 나타낸다. 그러므로 Ki(app)=100nM인 가정의 펩티드 A는 Ki(app)=100nM의 가정의 펩티드 B보다 실질적으로 수용체와의 약한 상호작용을 나타낸다. 이들 ANP 유사체가 하나 또는 그이상의 ANP수용체 부위에서 작용한다고 가정하면 증가된 수용체 친화도는 증가된 생물학적 효능을 나타낸다.

표 1-5는, 본 발명의 유사체화합물이 BASM 또는 BAE 세포상의 특정 수용체 부위로부터 (¹²⁵I)-rANP(126-150)결합을 대치하는 농도를 비교하는 데이타를 나타낸다.

상술한 모든 화합물은 그 자체 바람직한 R(I/M)DRI 코아를 함유한다.

상기 화합물에서 Z₂스페이서는 (AA)a 또는 HN(CH₂)_mCO-이다. 이 경우에 Z₃은 NH₂, NHR', 또는 1-3아미노산 잔기 또는 그의 아미드 또는 알킬아미드인 매우 짧은 펩티드이다.

Ki에 의해 판정된 바 비교적 낮은 활성도를 갖는 화합물을 표의 마지막에 위치시켰다. AP512, AP514, AP515, AP516, AP519, AP521 및 AP575는 있다하더라도 매우 낮은 활성도를 지닌다.

AP519를 제외한 모두는 소정의 펜타펩티드코아가 부족하므로 본 발명 화합물 범위를 벗어나며; AP519는 바람직한 구체예가 못된다.

표 2는 식 -(Q)_m-B-(Q)_m-(CO)_x-의 스페이서가 있는 것을 제외하고 표 1의 것에 유사한 화합물의 활성도를 나타낸다.

표 3은 코아 R(I/M)DRI서열이 적어도 하나의 치환, 바람직하게는 R 보다는 K 또는(아세틸) Lys, 또는(I/M) 보다는 L을 포함하는 것을 제외하고는 표 2의 것과 유사한 화합물을 나타낸다.

표 4는 코아서열에서 비-펩티드 결함연쇄를 지나나, 그렇지 않으면 미변형된 R(I/M)DRI를 함유하는 화합물; 또는 그내에 단지 또 하나의 변형기를 지니는 화합물에 대한 결과를 나타낸다.

표 5는 AA가 공유결합이고; 다른 변형도 가해질 수 있는 구체예의 활성도를 나타낸다.

이들 데이타는 AA에서 Ile는, Z가 NHR'(여기서 R'은 상기 실시예에서 4-5C의 알킬이다)이면 활성도에 대해 중요치 않다는 것을 나타낸다.

수용체 결합 측정이 ANP에 특정적이다라는 것을 나타내기 위해서 rANP(126-150)의 ANP-수용체 상호작용을 미관련된 펩티드 호르몬 엔지오텐신 II, 클루카곤, 부갑상선호르몬 및 감마-MSH와 결합하는 데이타를 다음에 도시한다.

상술한 바와 같이 rANP(126-150)만이 탐지가능한 ANP-수용체 친화도를 나타내며, 이것은 이 수용체의 관련 ANP-특성을 입증한다.

상술한 표의 데이타는 본 발명의 화합물의 큰 대표적 샘플이 기술된 특정 수용체-결합 측정에서 친화도를 표시한다는 것을 보여준다.

상기 본 발명은 이해르 돕기 위하여 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명의 변형은 수반된 특허청구범위의 범주 및 정신을 벗어남이 없이 실행될 수 있다.

Claims (8)

1. 다음식을 가지며, 포유류에서 나트륨이뇨성, 이뇨성, 또는 혈관이완 활성을 가지고 있는 선형 펩티드 화합물 :

   Z₁Z₂-AA₈-AA₉-AA₁₀-AA₁₁-AA₁₂-Z₃...(1)

   상기식에서, AA₈과 AA₁₁의 각각은 독립적으로 염기성/비환식; 중성/비극성/작은 또는 중성/극성/큰/비방향족 아미노산 잔기이고; AA₈은 또한 중성/비극성/큰/비방향족 아미노산 잔기이고; AA₉는 D 또는 L 구조의 중성/비극성/큰/비방향족 아미노산 잔기이고; AA₁₀은 산성 아미노산 잔기이고; 그리고 AA₁₂는 D 또는 L 구조의 중성/비극성/큰/비방향족 아미노산 잔기이거나 또는 공유결합이며; 상기식에서 Z₁은 그것의 카르복시-말단 잔기로서 소수성 아미노산 잔기, 또는 그것의 des NH₂형태를 가지고 있는 1 내지 125 아미노산의 펩티드이거나, 또는 6 내지 20 탄소원자의 소수성 지방족, 방향족 또는 혼합 지방족/방향족 유기 기이고; Z₂는 AA₈과 Z₁의 소수성 부분사이에 4.5-15 옹스트롬의 공간 치수를 제공할 수 있는 스페이서기이며; Z₃는 (OH), NH₂, NHR' 또는 NR'R이고 상기식에서 R' 또는 R는 각각 독립적으로 1 내지 10 탄소원자의 직쇄 또는 분기쇄 알킬이며, 그중 1 또는 2 탄소는 O, N, 또는 S로 대치될 수 있으며, 또는 만약 AA₁₂가 공유결합인 경우 Z₃은 OH, NH₂또는 펩티드일 수 없다면, Z₃은 1-20 아미노산 잔기의 펩티드이거나, 또는 그의 아미드 또는 알킬 아미드이며, 그리고 상기식(I)의 화합물이 하나 이상의 하기 특성을 갖는다 : a) 인접한 아미노산 잔기 사이의 하나 이상의 아미드 결합이 -CH₂NH-, CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH-, -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- 및 -CH₂SO-로 이루어지는 군으로부터 선택되는 결합에 의해 대치되고; b) AA₁₂는 공유결합에 의해 대치되고, Z₃는 NHR' 또는 NR'R이며, 상기식에서 R' 또는 R는 각각 독립적으로 1 내지 10 탄소원자의 직쇄 또는 분기쇄 알킬이고, 상기에서 1 또는 2 탄소는 O, N, 또는 S로 대치될 수 있고; c) Z₂는 -(P)_n-(CO)_x-(식중에서 x는 0 또는 1이고, n은 1 내지 6이고 P는 CH₂이고, N-N이 발생되지 않는다면 상기 -CH₂-기의 1 또는 2개가 NH로 대치될 수 있다), 및 -(Q)_m-B-(Q)_m-(CO)_x-(식중에서 x는 0 또는 1이고, 각각의 m은 독립적으로 0 내지 3이나, 이 두 개의 m의 합은 5이하이며, N-N이 발생되지 않는다면 Q가 CH₂또는 NH이고, 그리고 B는 선택적으로 N헤테로원자를 함유하는 포화 또는 불포화 5- 또는 6-원 고리이며 Z₂가 -NH(CH₂)₃-6CO-일 수 없는 것을 조건으로 1,4 또는 1,3으로 Q와 결합될 수 있다)로 구성되는 군으로부터 선택되며; 그리고 d) Z₁은 R'₁CO, R'₁COCH₂, R'₁O- 또는 R'₁-을 갖으며, 식에서 R₁은 카르보닐 부분에 대하여 하나 이상의 할로가 알파를 갖는다.
2. 제1항에 있어서, Z₁이 플루오레닐메틸옥시카르보닐, 벤질옥시카르보닐, 2-[2'-(6'-메톡시나프틸)]프로피오닐, 디페닐프로피오닐, 비페닐아세틸, 트리페닐프로피오닐, 시클로헥실아세틸, 3-인돌프로피오닐, 4-인돌부티릴, 1-아다만틸아세틸, 1-나프틸아세틸, 2-나프틸아세틸, 1-나프톡시아세틸, 2-나프톡시아세틸, 디벤질아세틸, 비스(1'-나프틸메틸)아세틸, 2-나프틸티오아세틸, 3-페녹시프로피오닐, 2-나프토일, 2-나프톡시, 2-나프틸, 페닐알라닐 및 des-NH₂페닐알라닐로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
3. 제2항에 있어서, Z₁이 2-할로페닐아세틸과 2-할로아세틸페닐알라닐로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
4. 제1항에 있어서, Z₂가 4APA인 것을 특징으로 하는 화합물.
5. 제1항에 있어서, AA₈-AA₉-AA₁₀-AA₁₁-AA₁₂가 R(I/M)DRI이고 상기 식에서 하나의 잔기가 AA₈로서 R 대신에 K, (아세틸) Lys, A, Q, N, L 또는 NMelle; AA₉로서 I 또는 M 대신에 V, V⁺, L, L⁺, I⁺, M⁺, t-BuA, t-BuA, 또는 Cha; AA₁₀으로서 D 대신에 E; AA₁₁로서 R 대신에 K, (아세틸) Lys, A, Q, N, Orn 또는 Cit; AA₁₂로서 I 대신에 M, M⁺, V, V⁺, L, L⁺, I, N-Melle, t-BuA 또는 공유결합으로 치환하여 대치되는 것을 특징으로 하는 화합물.
6. 제5항에 있어서 AA₈-AA₉-AA₁₀-AA₁₁-AA₁₂가

   A(I/M)DRI RM⁺DRI R(I/M)DRL

   K(I/M)DRI RLDRI R(I/M)DRM

   (Acetly) Lys (I/M)DRI

   Q(I/M)DRI R(I/M)ERI R(I/M)DRM⁺

   RVDRI R(I/M)DKI R(I/M)DRI⁺

   RI⁺DRI R(I/M)DQI R(I/M)DRV

   로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
7. 약제학적으로 허용되는 담채와 함께 치료에 효과적인 양의 제1항의 화합물로 이루어지는 나트륨이뇨제, 이뇨제, 혈관이완제로 유용한 조성물.
8. 포유동물에서 나트륨이뇨제, 이뇨제, 혈관 이완활성이 있고, 제1항의 화합물의 식을 가지는 펩티드 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 그의 염을 제조하는 방법에 있어서, 그 방법이 하기의 단계들로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법 : a. 반응 혼합물중에서 상기한 것과 같은 아미노산 서열을 갖는, 고형 수지 담채에 결합된 보호 펩티드를 만드는 단계; b. 펩티드로부터 고형수지담체를 제거하고 펩티드를탈보호하는 단계; c. 상기한 것과 같은 소정의 유기 치환기를 가하여 펩티드를 선택적으로 변형하는 단계; d. 펩티드를 반응 혼합물로부터 분리해내고, 선택적으로 폴리펩티드를 그것의 산 부가염으로 전환하는 단계.

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