CZ20014097A3 - Protinádorové sloučeniny aktivované FAP - Google Patents

Protinádorové sloučeniny aktivované FAP Download PDF

Info

Publication number
CZ20014097A3
CZ20014097A3 CZ20014097A CZ20014097A CZ20014097A3 CZ 20014097 A3 CZ20014097 A3 CZ 20014097A3 CZ 20014097 A CZ20014097 A CZ 20014097A CZ 20014097 A CZ20014097 A CZ 20014097A CZ 20014097 A3 CZ20014097 A3 CZ 20014097A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
compound
group
formula
cytotoxic
cytostatic
Prior art date
Application number
CZ20014097A
Other languages
English (en)
Inventor
Pilar Garin-Chesa
Martin Lenter
John Edward Park
Stefan Peters
Wolfgang Rettig
Raymond Armand Firestone
Dietmar Leipert
Jürgen Mack
Leila A. Telan
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Pharma Kg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Pharma Kg filed Critical Boehringer Ingelheim Pharma Kg
Publication of CZ20014097A3 publication Critical patent/CZ20014097A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A61K47/67—Enzyme prodrug therapy, e.g. gene directed enzyme drug therapy [GDEPT] or VDEPT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/252—Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1019—Tetrapeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1024—Tetrapeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká oblasti léčby nádorů podáváním prekurzoru léčiva, který se převede na léčivo v místě nádoru. Konkrétně se vynález týká prekurzorů léčiv, které lze převést na léčivo katalytickým účinkem FAPa, jejich výroby a farmaceutického použití.
Dosavadní stav techniky
Lidský aktivační protein fibroblastů (FAPa) je molekula buněčného povrchu (Mr 95,000) původně identifikovaná monoklonální protilátkou (mAb) F19 (Rettig et al. (1988) Proč.Nati.Acad.Sci.USA 85, 3110-3114; Rettig et al. (1993) Cancer Res. 53, 3327-3335). FAPa cDNA kóduje integrální membránový protein typu II s velkou extracelurální doménou, transmembránový segment a krátký cytoplasmatický zbytek (Scanlan et al. (1994) Proč.Nati.Acad.Sci.USA 91, 5657-5661; WO 97/34927). FAPa má 48% identitu sekvence aminokyselin s aktivačním antigenem CD26 buněk T, známým také jako dipeptidyl peptidáza IV (DPPIV; EC 3.4.14.5), membránově vázaným proteinem s aktivitou dipeptidyl peptidázy (Scanlan et al., loc.cit.). FAPa má enzymatickou aktivitu a je součástí skupiny serinových proteáz, kde serin v poloze 624 je kritický pro enzymatickou funkci (WO 97/34927). Práce používající test s potažením membránou ukazuje, že dimery FAPa jsou schopné štěpit dipeptidy Ala-Pro-7-amíno-4-trifluoromethylkumarin, Gly-Pro-7amino-4-trifluoromethylkumarin a Lys-Pro~7-amino-4-trifluoromethylkumarin (WO 97/34927).
• · «·««
- 2• · · ···
FAPa jee selektivně exprimován reaktivními stromálními fibroblasty mnoha histologických typůů lidských epiteliálních rakovin, granulační tkáně hojících se ran a maligních buněk některých sarkomů kostí a měkkých tkání. Normální tkáně dospělých jsou obecně prosté detekovatelného FAPcc, ale některé plodové mezenchymální tkáně přechodně tvoří tuto molekulu. Naproti tomu většina běžných druhů epiteliálních rakovin včetně více než 90% rakovin prsu, jiných než malých plicních buněk a kolorektálních karcinomů, obsahuje reaktivní stromální fibroblasty FAPa (Scanlan et al., loc.cit/). Tyto fibroblasty FAPa+ doprovázejí nově vytvořené krevní cévy tumoru, za vytvoření odlišné celulární části vložené mezi endotel tumorových kapilár a bazální aspekt shluků maligních epiteliálních buněk (Welt et al. (1994) J.CIin.OncolA2(Q), 1193-1203). Zatímco se stromální fibroplasty FAP+ nacházejí jak v primárních, tak i metastatických rakovinách, testovaná benigní a premaligní epitelová poškození (Welt eř al., loc.ciť), jako fibroadenomy prsu a kolorektální adenomy, obsahují jen zřídka stromální buňky FAPa+. Na základě modelu omezeného rozšíření FAPa v normální tkáni a jeho ronoměrné exprese v podpůrném stroma mnoha maligních tumorů se zahájily klinické zkoušky s monoklonální protilátkou mAb F19 značenou 131J u pacientů s metastatickými nádory tlustého střeva (Welt eř al., loc.cit.).
Pro nové způsoby léčby rakoviny založené na cytotoxických nebo cytostatických léčivech je nejdůležitější zvýšit léčebný index zlepšením účinnosti usmrcování rakovinové tkáně a/nebo snížením toxicity cytotoxických nebo cytostatických prostředků pro normální tkáně. Pro zvýšení specifity usmrcování tumorové tkáně a redukci toxicity v normálních tkáních se spouštěcí mechanizmus může upravit tak, že se toxické látky syntetizované ve formě svých prkurzorů nebo inaktivních forem aktivují tehdy a tam, kde je to žádoucí, zvláště v nádorových tkáních (Panchal (1998) Biochem. Pharmacol.55, 247-252). Spouštěcí mechanizmus může obsahovat buď exogenní faktory, jako je světlo nebo chemikálie nebo endogenní celulární faktory, jako jsou enzymy s omezenou expresí v rakovinové tkáni. Dalším konceptem, který byl podrobně zpracován, se nazývá „léčba prekurzorem enzymu řízeného protilátkou“ (ADEPT) nebo „katalýza řízená protilátkou“ (ADC) (Huennekns (1994) Trends Biotechnol. 12, 234-239; Bagshawe (1994) Clin.Pharmacokinet. 27, 376; Wang et al. (1992) Cancer Res. 52, 4484-4491; Sperker eř.a/.(1997) Clin.Pharmacokinet. 33(1), 18-31). U ADEPT se protilátka zaměřená na antigen spojený s tumorem používá pro zaměření specifického enzymu na místo tumoru. Enzym umístěný na tumoru převede následně podaný prekurzor léčiva na účinný cytoxický prostředek. Konjugát protilátka-enzym (AEC) se váže na cílový antigen na buněčných membránách nebo na volný antigen v mimobuněčné tekutině (ECF). Časový interval mezi vytvořením AEC a prekurzorem umožňuje AEC, aby se oprostil od normálních tkání tak, že se prekurzor neaktivuje v normálních tkáních nebo krvi. Avšak některé nevýhody ADEPT se týkají vlastností AEC (Bagshawe, loc.cit.). Například se u lidí pouze malá část podávané dávky cíleného AEC váže na tumorovou tkáň a zbytek se rozptýlí tělesnými tekutinami, ze kterých se odstraní se značýn časovým zpožděním. Dokonce velmi nízké koncentrace nevázaného enzymu mohou katalyzovat dostatek prekurzoru, aby měl toxický účinek, protože objem plazmy a normální ECF jsou mnohem větší než objem tumorové ECF. AEC může mít také imunogenní účinek, a tím v mnoho případech zabránit opakovanému podávání.
Mezinárodní přihlášky WO 97/12624 a WO 97/14416 popisujíjí oligopeptidy včetně následujícího penta a hexapeptidu (SEQ.ID.NOs,: 151 a 177:hArg-TyrGln-Ser-Ser-Pro; hArg-Tyr-GIn-Ser-Pro;), obsahující sekvence aminokyselin, které jsou rozpoznány a proteolyticky štěpeny volným specifickým antigenem prostaty (PSA), a terapeutickými prostředky, které obsahují konjugáty těchto oligopeptidů, a známé terapeutické nebo cytotoxické prostředky. Tyto konjugáty oligopeptidů, které obsahují alespoň jednu skupinu glutamin-serin, jsou výhodné pouze pro léčbu rakoviny prostaty.
Zásadním problémem předkládaného vynálezu bylo poskytnout způsoby a prostředky zlepšení schopnosti normální tkáně tolerovat cytotoxické nebo *
• to
- 4cytostatické prostředky se známou účinností proti široké řadě tumorových tkání.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se týká protinádorových sloučenin aktivovaných enzymy. Konkrétně vynález poskytuje prekurzory, které je mohou být převedeny na léčiva katalytickým účinkem endogenního fibroblastu protein alfa aktivujícího fibroblasty (FAPa), který se objevuje v rakovinových tkáních člověka. Výhodně může být prekurzor léčiva předkládaného vynálezu převeden na léčivo katalytickým účinkem FAPa, uvedený prekurzor léčiva má místo štěpení, které je rozpoznáváno FAPa, a uvedené léčivo se za fyziologických podmínek chová cytotoxicky nebo cytostaticky proti rakovinovým buňkám.
V kontextu předkládaného vynálezu bude „léčivo“ znamenat chemickou sloučeninu, kterou lze podávat lidem nebo zvířatům jako pomoc při léčbě onemocnění. Konkrétně je léčivo aktivním farmakologickým činitelem.
Termín „cytotoxické sloučenina“ znamená chemickou sloučeninu, která je toxická pro živé buňky, konkrétně léčivo, které ničí nebo zabíjí buňky.
Termín „cytostatické sloučenina“ bude znamenat sloučeninu, která potlačuje růst a dělení buněk a tedy inhibuje proliferací buněk. Příklady pro cytotoxické a cytostatické sloučeniny vhodné pro předkládaný vynález jsou antracyklinové deriváty jako je doxorubicin, analogy methotrexátu jako je methotrexát, pritrexim, trimetrexát nebo DDMP, melfalan, analogy cisplatiny jako je cisplatina, JM216, JM335, bis(platina) nebo karboplatina, analogy purinů a pyrimidinů jako je cytarbin, gemcitabin, azacitidin, 6-thioguanin, flurdarabin nebo 2-deoxykoformycin, a analogy jiných chemoterapeutických prostředků jako je 9-aminokamptothecin, D,L-aminogiutethimid, trimethoprim, pyrimethamin, mitomycin C, mitoxantron, cyklofosfanamid, 5-fluorouracil, extramustin, podofyllotoxin, bleomycin nebo taxol.
4
9494
4 ·· · «49
9 9 4 4
4 4 9 9 4
4 4 4 9
444 49· 44 449 „Prekurzor“ bude znamenat sloučeninu, u které musí při podání dojít metabolickými procesy k chemické konverzí, než se získal aktivní farmakologický prostředek. Konkrétně je prekurzor prekurzorem léčiva. V kontextu předkládaného vynálezu je prekurzor výrazně méně cytotoxický nebo cytostatický než léčivo, na které se prekurzor převede katalytickým účinkem FAPa. Odborník zná způsoby určení cytotoxicity sloučeniny, viz například příklad 6, nebo Mosmann ((1983) J.lmmun.Meth.65, 55-63). Výhodně je prekurzor alespoň třikrát méně cytotoxický ve srovnání s léčivem v testu in vitro.
„Léčivo, které je za fyziologických podmínek cytostatické nebo cytotoxické“ bude znamenat chemickou sloučeninu, která je cytostatické nebo cytotoxické v živém lidském nebo zvířecím těle, konkrétně sloučenina, která zabíjí buňky nebo inhibuje proliferaci buněk v živém lidském nebo zvířecím těla.
„Prekurzor s místem štěpení, které je rozpoznáváno FAPa“ bude znamenat prekurzor, který může působit jako substrát enzymatické aktivity FAPa. Konkrétně může enzymatická aktivita FAPa katalyzovat štěpení kovalentní vazby prekurzoru za fyziologických podmínek. Rozštěpením této kovalentní vazby se prekurzor převede na léčivo buď přímo nebo nepřímo. Nepřímá aktivace by nastala, pokud by produkt štěpení katalyzovaného FAPa nebyl sám o sobě farmakologicky účinným prostředkem, ale podléhal by dalšímu reakčnímu kroku, např. hydrolýze pro vznik účinného prostředku. Výhodnější je, když je místo štěpení prekurzoru specificky rozpoznáno FAPa, ale nikoliv jinými enzymy, které jsou přítomné v lidském nebo zvířecím těle. Je také výhodné, když je místo štěpení specificky rozpoznáno FAPa, ale nikoliv proteolytickými enzymy, které jsou přítomné v lidských nebo zvířecích tělesných tekutinách, zvláště v plasmě. Ve zvláště výhodném provedení je prekurzor stabilní v plazmě, v jiných tělesných tekutinách nebo tkáních, kde není biologicky aktivní FAPa přítomen nebo není detekovatelný. Výhodně je ve vzorku in vitro uvedeném v příkladu 7 po 8 h při 37°C stále přítomno více než 50%, výhodněji více než 80%, ještě výhodněji více než 90% prekurzorů v roztoku, který obsahuje 10% obj.(v/v) lidské plasmy. Bylo by nejvýhodnější, aby místo štěpení bylo specifické pro FAPa. Ve výhodném provedení obsahuje místo štěpení zbytek L-prolinu, který je vázán na cytotoxické nebo cytostatické léčivo amidovou vazbou. Příkladem tohoto druhu je konjugát doxorubicin-peptid. FAPa může kataiyzovat štěpení peptidické vazby mezi zbytkem C-koncové aminokyseliny peptidu, který je výhodně L-prolin, a cytotoxickou nebo cytostatickou sloučeninou.
Výhodné sloučeniny dosahují alespoň 10% konverze na volné léčivo za standardních podmínek uvedených níže. Výhodnější jsou sloučeniny, které dosahují alespoň 20% konverze na volné léčivo za standardních podmínek. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, které dosahují alespoň 50% konverze na volné léčivo za standardních podmínek. V tomto kontextu jsou standardní podmínky definované následovně:
Každá sloučenina se rozpustí v 50 mM pufru Hepes, 150 mM NaCl, pH 7,2 na finální koncentraci 5 μΜ a inkubuje se 100 ng CD8FAPa (viz příklad 4) po dobu 24 hodin při teplotě 37°C. Uvolnění volného léčiva pomocí CD8FAPa se stanoví způsobem popsaným v příkladu 5.
Výhodně se předkládaný vynález týká sloučeniny vzorce (I)
nebo její farmaceuticky přijatelné soli, kde • ft ft
- 7ft * · ftft · ft ftft ftft · » ftft • ft ft ft ftft· ftft·· ftft ft · · · · ft ftftftft· • ftftft ftftft ftft ftftft
R1 znamená skupinu amino alkanoyl, oligopeptidoyl, zvláště di nebo tripeptidoyl, jejíž N-koncová funkční skupina amino, kterou může být navázána na zakončovací skupinu;
Ra a Rb společně s vloženou skupinou N-C tvoří případně substituovaný, případně benzo nebo cyklohexano-kondenzovaný 3 až 7- členný nasycený nebo nenasycený heterocyklický kruh, ve kterém lze jednu nebo dvě skupiny CH2 také nahradit skupinou NH, atomem O nebo S;
R4 znamená atom H, skupinu Ci-C6 -alkyl, C3-C8 -cykloalkyl, aryl nebo heteroaryl; a
Cyť znamená zbytek cytotoxické nebo cytostatické sloučeniny s podmínkou, že jsou vyloučeny sloučeniny:
N2-acetyl-L-homoarginyl-L-tyrosyl-L-glutaminyl-L-seryl-N-[2,3,6-trideoxy-1-O· [(1S,3S)-1,2,3,4,6,11-hexadihydro-3,5,12-trihydroxy-3-(hydroxyacetyl)-10methoxy-6,11 -dioxo-1 -naftacenyl]-.alfa.-L-lyxo-hexopyranos-3-yl]-L-prolinamid; a
N2-acetyl-L-homoarginyl-L-tyrosyl-L-glutaminyl-L-seryl-L-seryl-N-[2,3,6-trideoxy-1-O-[(1S,3S)-1,2,3,4,6,11-hexahydro-3,5,12-trihydroxy-3-(hydroxyacetyl) 10-methoxy-6,11-dioxo-1-naftacenyl]-. alfa.-L-lyxo-hexopyranos-3-yl]-L-prolin amid.
Zvláště výhodné jsou sloučeniny vzorce I, kde
R1 je zbytek vzorce Cg-A, Cg-B-A nebo Cg-(D)m-B-A,
• ·· • e • 9 • «6 • · 99
• • 9 • • • ·
• ···· · • • 9 ·
• • • • • •
··« • ·*· ·· 99
kde
Cg znamená atom vodíku nebo zakončovací skupinu zvolenou ze skupin R5-CO, R5-O-CO-, R5-NH-CO-, R5-SO2- nebo R5-, kde. skupina R5 je případně substituovaná skupinou Ci-C6 -alkyl, C3-C8 -cykloalkyl, aryl, aralkyl nebo heteroaryl;
výhodně je Cg substituent acetyl, benzoyl, D-alanyl, (R)-H2NCH(CH3)- nebo H2NCOCH2CH2- nebo jiná zakončovací skupina pro ochranu N-koncové funkční skupiny amino;
každá skupina A, B a D nezávisle znamená zbytek odvozený z amino karboxylových kyselin vzorce -[NR6-(X)P-CO]-, kde X znamená skupinu CR7R8, a kde každá skupina R6, R7 a R8 nezávisle znamená atom vodíku, případně substituovanou skupinu Ci-C6 alkyl, C3-C8 -cykloalkyl, aryl nebo heteroaryl, a p je 1, 2, 3, 4, 5; nebo každá skupina A, B a D nezávisle znamená zbytek odvozený z cyklických aminokarboxylových kyselin vzorce,
kde
R9 znamená skupinu Ci-C6 -alkyl, OH nebo NH2, m je celé číslo od 1 do 10, q je 0, 1 nebo 2; a r je 0, 1 nebo 2.
• ·
9· · · · · ·
- ······· · · · • · · · · • ·· · ··· · · · ·«
7 8
Dále jsou výhodné sloučeniny vzorce I, kde každá skupina R , R a R nezávisle znamená atom vodíku nebo
CH3-, CH3CH2-, CH3CH2CH2-, (CH3)2CH-, CH3CH2CH2CH2-, (CH3)2CHCH2-, CH3CH2CH(CH3)-, (CH3)3C-, HOCH2-, CH3CH(OH)-, CH3CH(OH)CH2CH2-, hoch2ch2ch2ch2-, h2nch2ch2ch2-, h2nch2ch2.ch2ch2-,
H2NCH2CH(OH)CH2CH2-, H2NC(=NH)NHCH2CH2CH2-, hsch2-, ch3sch2ch2, HOOCCH2-, HOOCCH2CH2-, H2NC(=O)CH2-, H2NC(=O)CH2CH2-, benzyl, para-hydroxybenzyl,
cyklohexyl, fenyl p je 1, a kde konfigurace CR7R8 může být R nebo S;
pokud skupina R7 je jiná než atom H, potom R8 je výhodně atom H; R6 je výhodně atom vodíku;
pokud p je větší než jedna, jsou skupiny R7 a R8 výhodně atom vodíku;
Dalším výhodným provedením předkládaného vynálezu jsou sloučeniny vzorce I, kde je heterocyklický kruh tvořen skupinami Ra, Rb a vložený N-C je substituován skupinou R2 a R3, kde každá skupina R2 a R3 nezávisle znamená atom vodíku nebo atom halogenu nebo skupinu C1-C6 -alkyl, C-i-Cg -alkylamino, di-Ci-C6 -alkylamino, Ci-C6 -alkoxy, thiol, Ci-C6 -alkylthio, oxo, imino, fomyl, C1-C6 -alkoxykarbonyl, aminokarbonyl, C3-C8 -cykloalkyl, aryl nebo heteroaryl.
Pokud není uvedeno jinak, jsou jednoduché stereoizomery, stejně tak směsi nebo racemáty stereoizomerů zahrnuty do vynálezu.
- 10„Ci-C6 -alkyl obecně znamená uhlovodíkový radikál s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující 1 až 6 atomů uhlíku.
Termín „případně substituovaný“ uvedený výše nebo níže s ohledem na skupinu nebo zbytek znamená skupinu nebo zbytek, který může být případně substituován jedním nebo několika atomy halogenu, substituenty hydroxyl, amino, C1-C6 -alkyl-amino, di-Ci-C6 -alkyl-amino, C1-C6 -alkyl-oxy, thiol, C^Ce-alkyl-thio, =0, = NH, -CHO, -COOH, -CONH2, -NHC(=NH)NH2, C3-C8 cykloalkyl, aryl nebo heteroaryl, které mohou být identické nebo rozdílné.
Následující radikály lze uvést jako příklady:
Methyl, ethyl, propyl, 1-methylethy! (isopropyl), butyl, 1-methylpropyl,
2- methylpropyl, 1,1-dimethylethyl, n-fenyl, 1-methylbutyl, 2-methylbutyl,
3- methylbutyl, 1,1-dimethylpropyl, 1,2-dimethylpropyi, 2,2-dimethylpropyl, 1 -ethylpropyl, hexyl, 1-methylpentyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl,
4- methylpentyl, 1,1-dimethylbutyl, 1,2-dimethylbutyl, 1,3-dimethylbutyl,
2,2-dimethylbutyl, 2,3-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl, 1-ethylbutyl, 2-ethylbutyl, 1,1,2-trimethylpropyl, 1,2,2-tromethylpropyl, 1-ethyl-1 -methylpropyl a 1ethyl-2-methylpropyl, HOCH2-, CH3CH(OH)-, CH3CH(OH)CH2CH2-, HOCH2CH2.CH2CH2-, H2NCH2CH2CH2-, H2NCH2CH2CH2CH2-,
H2NCH2CH(OHCH2CH2-, H2NC(=NH)NHCH2CH2CH2-, hsch2-, ch3sch2ch2-, HOOCCHz-, HOOC-CH2CH2-, H2NC(=O)CH2-, H2NC(=O)CH2CH2-, benzyl, para-hydroxy-benzyl,
Pokud je skupina Ci-Ce -alkyl substituovaná, výhodnými substituenty jsou hydroxyl, amino, dimethylamino, diethylamino, thiol, methyl-thiol, methoxy,
- 11ethoxy, =0, =NH, -CHO, -COOH, -COOCH3, -COOCH2CH3, -CONH2, -NHC(=NH)NH2, cyklohexyl, fenyl, benzyl, para-hydroxybenzyl.
Pokud je skupina Ci-C6 -alkyl substituovaná skupinou aryl nebo heteroaryl, Ci-Οδ -alkyl je výhodně Ci, výhodněji methylenová skupina.
Termíny „amino alkanoyl“ a „oligopeptidoyl“ včetně „di nebo tripeptidoyl“ uvedené výše nebo níže s ohledem na radikál R1 znamenají radikál, kde aminokyselina nebo oligomer s obsahem až 12, výhodně 2 nebo 3 aminokyselinových zbytků, je vázán C-koncově na atom N heterocyklického kruhu amidovou vazbou.
Odborník v oboru chemie aminokyselin a oligopeptidů si je vědom, že určité aminokyseliny lze nahradit jinými homoiogy, isosterickými a/nebo isolektronickýmí aminokyselinami, kde byla biologická aktivita původní aminokyseliny nebo oligopeptidů konzervována modifikací. Určité nepřírodní a modifikované přírodní aminokyseliny lze také použít pro náhrádu odpovídající přírodní aminokyseliny. Tedy například tyrosin lze nahradit 3-jodotyrosinem, 2 nebo 3-methyltyrosinem, 3-fluorotyrosinem.
Termín „zakončovací skupina“ uvedená výše nebo níže s ohledem na skupinu, která se váže na N-koncový atom dusíku skupiny amino alkanoyl nebo na skupinu oligopeptidoyl radikálu R1, definuje skupinu nebo zbytek, který omezuje nebo eliminuje enzymatické odbourávání sloučenin podle předkládaného vynálezu působením aminopeptidáz, které jsou přítomné v krevní plazmě teplokrevných zvířat. Vhodné zakončovací skupiny zahrnují skupiny C1-C10 -alkanoyl, C6-Ci8 -aryl-Ci-C10-alkanoyl, C6-C18 -aryl-Ci-C10 - 12alkylsulfonyl. Zakončovací skupiny také zahrnují hydrofilní blokové skupiny, které se volí přítomnosti hydrofilní funkční skupiny. Zakončovací skupiny zvyšují hydrofilitu sloučenin předkládaného vynálezu a tedy zvyšují jejich rozpustnost ve vodném prostředí. Tyto zakončovací skupiny zvyšující hydrofilitu se výhodně se volí ze skupin hydroxylovaný alkanol, polyhydroxylovaný alkanoyl, hydroxylovaný aroyl, hydroxylovaný arylalkanoyl, polyhydroxylovaný aroyl, polyhydroxylovaný arylalkanoyl, polyethylen glykol, z glykosylátů, cukrů a kruhových etherů.
Skupina „C3-C8 -Cykloalkyl“ obecně znamená cyklický uhlovodíkový radikál, který má 3 až 8 atomů uhlíku, a který lze případně substituovat jednou nebo několika substituenty hydroxyl, amino, Ci-C6 -alkylamino, di-Ci-Cs -alkylamino, Ci-C6 -alkyloxy, thiol, Ci-C6 -alkyl-thio, =0, =NH, -CHO, -COOH, COOCH3, COOHCH2CH3, -CONH2, -NHC(=NH)NH2, nebo halogen, které mohou být identické nebo rozdílné.
„Heterocyklický kruh“ uvedený výše nebo níže s ohledem na skupinu tvořenou skupinou Ra a Rb společně s vloženou skupinou N-C obecně znamená 3- až
7-členný, výhodně 4-, 5- nebo 6-členný nearomatický heterocyklický systém, který obsahuje jeden atom dusíku a případně 1 nebo 2 další heteroatomy zvolené z atomů dusíku, kyslíku a síry, které mohou být substituované jedním nebo několika atomy halogenu nebo skupinami Ci-C6 -alkyl, Ci-C6 alkylamino, di-Ci-C6 -alkylamino, Ci-C6 -alkoxy, thiol, Cí-Cg -alkylthio, oxo, imino, fomyl, C-i-Cg -alkoxykarbonyl, aminokarbonyl, C3-C8 -cykloalkyl, aryl nebo heteroaryl, které mohou být identické nebo vzájemně odlišné, a které mohou být případně benzo nebo cyklohexano-kondenzované. Takovým heterocyklickým kruhem je s výhodou azetidin nebo jsou odvozené od zcela nebo částečně hydrogenovaných skupin pyrol, pyridin, thiazol, isoxazol, pyrazol, imidazol, indol, benzimidazol, indazol, pyridazin, pyrimidin, pyrazin. Nejvýhodnější jsou azetidin, pyrrolidin, 3,4-dihydropyrrolidin, piperidin, hexahydro-1H-azepin, oktahydroindol, imidazolidin, thiazolidin.
- 13• ·
Pokud je takový heterocyklický kruh substituovaný, jsou sunstituenty výhodně skupiny methyl, ethyl, propyl, 1-methylethyl (isopropyl), butyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, 1,1-dimethylethyl, hydroxyl, amino, dimethylamino, diethylamino, thiol, methylthiol, methoxy, ethoxy, -CHO, -COOH, -COOCH3, -COOCH2CH3 nebo -CONH2.
Výraz „aryl“ obecně znamená aromatický kruhový systém se 6 až 10, výhodně 6 atomy uhlíku, které lze případně substituovat jedním nebo několika substituenty hydroxyl, amino, Ci-C6 -alkylamino, di-Ci-Ce -alkylamino, CrC6 alkyl, C-|-C6 -alkyloxy, thiol, Ci-C6 -alkylthio, -CHO, -COOH, -COOCH3, -COOCH2CH3, -CONH2 nebo halogen, které mohou být identické nebo odlišné, a které mohou být případně benzo-kondenzované. Substituenty aryl mohou být výhodně odvozeny od benzenu, výhodnými příklady jsou skupiny fenyl, 2-hydroxyfenyl, 3-hydroxyfenyl, 4hydroxyfenyl, 4-aminofenyl, 2-aminofenyl, 3-aminofenyl.
Pokud je skupina aryl substituovaná, jsou substituenty výhodně skupiny methyl, ethyl, propyl, 1-methylethyl (isopropyl), butyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, 1,1-dimethylethyl, hydroxyl, amino, dimethylamino, diethylamino, thiol, methoxy, ethoxy, -CHO, -COOH, -COOCH3, -COOCH2CH3 nebo -CONH2.
„Heteroaryl“ obecně znamená 5 až 10-členný aromatický heterocyklický kruhový systém, který obsahuje 1 až 5 heteroatomů zvolených z atomů dusíku, kyslíku nebo síry, které mohou být případně substituované jedním nebo několika substituenty hydroxyl, amino, C-i-Ce -alkylamino, di-Ci-C6 -alkylamino, Ci-C6 -alkyl, Ci-C6 -alkyloxy, thiol, Ci-C6 -alkylthio, -CHO, -COOH, -COOCH3, -COOCH2CH3, -CONH2 nebo halogen, které mohou být identické nebo odlišné, a které mohou být případně benzo-kondenzované. Substituenty heteroaryl mohou být případně odvozené od sloučenin furan, pyrrol, thiofen, pyridin, thiazol, isoxazol, pyrazol, imidazol, benzofuran, thianaften, indol, • ·
- 14• · · · · benzimidazol, indazol, chinolin, pyridazin, pyrimidin, pyrazin, chinazolin, pyran, purin, adenin, guanin, thymin, cytosin, uráčil.
Pokud je skupina heteroaryl substituovaná, jsou výhodnými substituenty skupiny methyl, ethyl, propyl, 1-methyl-ethyl (isopropyl), butyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, 1,1-dimethylethyl, hydroxyl, amino, dimethylamino, diethyiamino, thiol, methylthiol, methoxy, ethoxy, -CHO, -COOH, -COOCH3, -COOCH2CH3 nebo -CONH2.
„Zbytek cytotoxická nebo cytostatické sloučeniny“ znamená, že sloučenina H2N-Cyť, která se uvolňuje při štěpení amidové vazby uvedené ve vzorci (I), je sama o sobě buď cytotoxická nebo cytostatická nebo se může v následném kroku převést na cytotoxickou nebo cytostatickou sloučeninu.
V tomto naposledy uvedem případě může být -Cyť zbytkem vzorce -L-Cyt, kde L je vazebný zbytek odvozený od bifunkční molekuly, například diaminu H2N-L'-NH2, aminoalkoholu H2N-L'-OH, například p-aminobenzylalkoholu (PABOH), aminokarbonátu, například
OH nebo nepřírodní aminokarboxylové kyseliny. Pokud má -Cyť vzorec -L-Cyt, sloučenina H2N-L'-Cyt vzniká při enzymatickém štěpení amidové vazby uvedené ve vzorci (I). Sloučenina H2N-L'-Cyť'múže být sama o sobě cytotoxická nebo cytostatická nebo v následném kroku vzniká odštěpením vazebného zbytku od Cyť' cytotoxický nebo cytostatický prostředek. Například se sloučenina H2N-L'-Cyt může za fyziologických podmínek hydrolyzovat na sloučeninu H2N-L'-OH a cytotoxickou nebo cytostatickou sloučeninu H-Cyt, která je účinným terapeutickým prostředkem (dále se pro • ·
- 15jednoduchost používá pro oba výrazy Cyťa Cyt pouze výraz Cyť a pro oba výrazy L a L'pouze výraz L).
Farmaceuticky přijatelné soli sloučenin podle předkládaného vynálezu zahrnují obvyklé netoxické soli vytvořené z netoxických anorganických nebo organických kyselin. Například obvyklé netoxické soli z anorganických kyselin jako je kyselina chlorovodíková, bromovodíková, sírová, sulfamová, fosforečná, dusičná a podobně; a soli vyrobené z organických kyselin jako je kyselina octová, propionová, jantarová, glykolová, stearová, mléčná, jablečná, vinná, citrónová, askorbová, maleinová, fenyloctová, glutamová, benzoová, salicylová, sulfanilová, oxalová (šťavelová), trifluoroctová a podobně.
Výhodné sloučeniny vzorce I jsou sloučeniny vzorce IA,
R'
kde
R2, R3, R4, Cyť jsou definované výše,
R1 znamená skupinu amino alkanoyl nebo oligopeptidoyl a
X-Y znamená CHR2-CH2, CR2=CH, NH-CH2, CH2-NH, -CR2-, CH2-CHR2CH2;
s podmínkou, že
R1 znamená skupinu amino alkanoyl, di nebo tri-peptidoyl nebo
R1 znamená oligopeptidoyl s více než třemi aminokyselinovými zbytky, které neobsahují sekvenci aminokyselin Gln-Ser v případě, že
X-Y znamená skupinu CH2-CH2.
- 16• 9
9 9 • 9 • · • 9
9 9
Výhodně je atom uhlíku a zbytku cyklické aminokyseliny racemický, t.zn. v konfiguraci (R/S), nejvýhodněji v konfiguraci (S); ve zvláště výhodném provedení je atom uhlíku a v konfiguraci (S) a R2 je atom vodíku. V případě, že je R2 skupina OH, je s výhodou v poloze trans.
R2, R3 výhodně znamenají atom vodíku nebo skupinu methyl, ethyl, propyl, isopropyl, fenyl, methoxy, ethoxy nebo hydroxy, nejvýhodněji atom vodíku.
R4 je výhodně atom vodíku nebo skupina methyl, ethyl, propyl, isopropyl nebo fenyl, nejvýhodněji atom vodíku.
Zvláště výhodné sloučeniny vzorce IA se volí ze vzorců IA1, IA2, IA3, ÍA4 a IA5:
(IA1) (IA2) (IA3) (IA4) (IA5)
Cyť
- 17H2N-Cyť je výhodně antracyklinový derivát vzorce II,
Rc znamená skupinu Ci-C6 -alkyl, C^Ce -hydroxyalkyl nebo Ο·,-Ο6 alkanoyloxy-Ci-C6 -alkyl, zvláště methyl, hydroxymethyl, diethoxyacetoxymethyl nebo butyryloxymethyl;
Rd znamená atom vodíku, skupinu hydroxy nebo Ο-ι-Οβ -alkoxy, zvláště skupinu methoxy;
jedna ze skupin Re a Rf znamená atom vodíku; a druhá znamená atom vodíku nebo skupinu hydroxy nebo tetrahydropyran-2-yloxy (OTHP).
Zvláště výhodné jsou následující sloučeniny vzorce II:
Rc Rd Re Rf Cyt
CH2OH och3 H OH doxorubicin
ch3 och3 H OH daunorubicin
CH2OH och3 OH H epirubicin
ch3 H H OH idarubicin
ch2oh och3 H OTHP THP
CH2OH och3 H H esorubicin
CH2OCOCH(OC2H5)2 och3 H OH detorubicin
ch2oh H H OH karminorubicin
- 18CH2OCOC4H9
OCH3 Η
OH
Nejvýhodnější je doxorubicin (Dox). Další cytotoxické nebo cytostatické zbytky Cyťlze odvodit například od sloučenin methotrexat, trimetrexat, pyritrexim, 5,10-dideazatetrahydrofoláttepyrimetamin, trimethoprim, 10-propargyl-5,8-dideazafolat-2,4-diamino-5(3',4'-dichiofenyl)-6-methylpyrimidin, aminoglutethimid, goreserelin, melpalan, chlorambucil, analogy dalších chemoterapeutických prostředků jako je 9-aminokamtothecin (například viz Burris HA, r.d. a S.M.Fields (1994). „Topoisomerase I inhibitors. An overview of the camptothecin analogs. [Review].“ Hematol. Oncol. din. North- Am. 8(2): 333-355; lyer, L. a M.J.Ratain (1998). „Clinical pharmacology of camptothecins. [Review] [237 refs].“ Cancer Chemother. Pharmacol. 42 Suppl; S31-S43).
Ve vzorci (I) může být Cyť také biologická efektorová molekula, která buď přímo nebo nepřímo způsobuje destrukci tumorových buněk jako například TNFa.
Výhodnými příklady aminokarboxylových kyselin, ze kterých lze jednotky A, B a D odvodit, jsou glycin (Gly) nebo alanin (Ala) nebo formy D nebo výhodněji formy L, valin (Val), leucin (Leu), isoleucin (Ile), fenylalanin (Phe), tyrosin (Tyr), tryptofan (Trp), cystein (Cys), methionin (Met), serin (Ser), threonin (Thr), lysin (Lys), arginin (Arg), histidin (His), kyselina asparagová (Asp), kyselina glutamové (Glu), asparagin (Asn), glutamin (Gin), prolin (Pro), trans4-hydroxy-prolin (Hyp), 5-hydroxy-lysin (Hyl), norleucin (Nle), 5-hydroxynorleucin, 6-hydroxyleucin (Hyn), ornithin (Orn), cyklohexylglycin (Chg), fenylglycin (Phg), glutamin (Gin), cyklohexylalanin (Cha), methionin-S-oxid (Met), β-cyklopropylalanin (Cpa), terc-leucin (Tle) nebo homo-serin (Hse).
Výhodné sloučeniny mají obecný vzorec (I), kde jednotka A je odvozená od sloučenin alanin, valin (Val), leucin (Leu), isoleucin (Ile), fenylalanin (Phe), tyrosin (Tyr), tryptofan (Trp), cystein (Cys), methionin (Met), serin (Ser), threonin (Thr), lysin (Lys), arginin (Arg), histidin (His), kyselina asparagová (Asp), kyselina glutamová (Glu), asparagin (Asn), glutamin (Gin), prolin (Pro), trans-4-hydroxy-prolin (Hyp), 5-hydroxy-lysin (Hyl), norleucin (Nle), 5hydroxynorleucin, 6-hydroxynorleucin (Hyn), ornithin (Orn) nebo cyklohexylglycin (Chg), fenylglycin (Phg), glutamin (Gin), cyklohexylalanin (Cha), methionin-S-oxid (Met(O)), β-cyklopropylalanin (β-Cpa), terc-leucin (Tle) nebo homo-serin (Hse).
Zvláště výhodné jsou sloučeniny vzorce (1), kde R1 je skupina zvolená vzorců (1) až (34):
H-Chg (D H-Tle (18)
H-Lys (2) H-Hyl (19)
H-NIe (3) H-Hse (20)
H-Ala (4) Cg-Gly (21)
H-Hyn (5) Cg-NIe (22)
H-Pro (6) Cg-Val (23)
H-Phg (7) Cg-Met (24)
H-GIn (8) H-Xxx-Lys (25)
H-trans-Hyp (9) H-Xxx-Hyn (26)
H-Val (10) H-Xxx-Pro (27)
H-Cha (11) H-Xxx-His (28)
H-Met (12) H-Xxx-Met (29)
H-Nva (13) H-Xxx-Ala (30)
H-Met(O) (14) Cg-Xxx-Hyn (31)
Η-β-Cpa (15) Cg-Xxx-Ala-Gly (32)
H-lle (16) Cg-(Xxx)m-Xxx-Ala-Gly (33)
- 204
4 • 4 • 4 4 4 • 4
Η-Ser (17)
Cg-(Xaa)m-Xaa-Gly (34) kde
Cg znamená atom vodíku nebo zakončovací skupinu zvolenou ze skupin benzoyloxykarbonyl, fenylacetyl, fenylmethylsulfonyl a benzylaminokarbonyl;
Xaa znamená zbytek odvozený od aminokarboxylových kyselin, výhodně zvolených ze skupiny přírodních aminokyselin, zvláště ze skupiny zahrnující Ala, Pro, Tyr, Phe, His, Ser, Thr, Hyp a Lys; a m je celé číslo od 1 do 6.
Výhodné krycí skupiny Cg jsou acetyl (Ac), sukcinimidyl (Suc), D-alanyl, benzylkarbonyl (Cbz nebo Z) nebo makromolekuly jako je polyethylenglykol.
Výhodná antracyklinové prekurzory jsou sloučeniny vzorce lil,
(ΠΙ) ' kde Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf a R1 jsou definované výše.
- 21• • A • A A A A
A : < · • · A • A • AA A
Nejvýhodnější sloučeniny podle vynálezu jsou deriváty doxorubicinu podle vzorců (IIIA) až (INF):
O OH
OMe O OH O
HO
H
NH
N (IIIA).
O OH
N
W
- H
OMe O OH O
NH (IIIB)
O OH
OMe O OH O Me-
i I .
O (HIC)
- 23Jedna třída cytotoxických nebo cytostatických sloučenin, které lze použít pro předkládaný vynález, má primární aminovou funkční skupinu, která je k dispozici pro tvorbu amidové vazby uvedené ve vzorci (I), jako doxorubicin. V tomto případě není vazebná molekula L nezbytná. Pokud cytostatická nebo cytotoxická sloučenina nemá takovou funkční skupinu amino, tak lze funkční skupinu amino v takové sloučenině vytvořit cestou chemické modifikace, např. zavedením nebo převedením funkční skupiny nebo napojením spojovací molekuly na sloučeninu. Spojovací molekula se může také vložit mezi oligomerní část (t.zn. část obsahující aminokarboxylové zbytky) a cytostatickou nebo cytotoxickou část sloučeniny podle vynálezu, aby se zajistilo nebo optimalizovalo štěpení amidové vazby mezi oligomerní částí a cytotoxickou nebo cytostatickou částí. Pokud je přítomna spojovací molekula, t.zn. ve sloučeninách, které obsahují strukturu L-Cyť, je vazba mezi L a Cyťvýhodně amidová nebo esterová. Ve výhodném provedení se spojovací molekula za fyziologických podmínek po enzymatickém štěpení hydrolyzuje z cytostatické nebo cytotoxické sloučeniny a vytvoří se tedy volná cytostatická nebo cytotoxická sloučenina. V každém případě musí mít sloučenina podle vynálezu vlastnost, která umožňuje ze fyziologických podmínek štěpení katalytickým působením FAPa a následkem přímého nebo nepřímého štěpení uvolnění cytostatické nebo cytotoxické sloučeniny.
V dalším aspektu se předkládaný vynález týká prekurzoru léčiva, který je možné katalytickým působením FAPa přeměnit na léčivo; uvedený prekrzor léčiva má místo štěpení, které je rozpoznáno FAPa, a uvedená léčivo je za fyziologických podmínek cytostatické nebo cytotoxické. Takový prekurzor léčiva výhodně obsahuje oligomerní část obsahující dva nebo více aminokarboxylových zbytků a cytotoxickou nebo cytostatickou část, kde Ckoncový aminokarboxylový zbytek oligomerní části je 3 až 7 členná přírodní nebo nepřírodní cyklická aminokyselina, výhodně D- nebo L-prolin, nebo D nebo L-hydroxyprolin, a C-koncová funkční skupina karboxy je vázáná na cytotoxickou nebo cytostatickou část amidovou vazbou, která může být • · • « ···· ·
- 24katalytickým působením FAPa. štěpena. Oligomerní částí je výhodně peptid. Výhodně obsahuje oligomerní část dva, tři, čtyři, pět, šest, sedm, osm, devět, desek, jedenáct nebo dvanáct aminokarboxylových zbytků, výhodněji dva, tři nebo čtyři aminokarboxylové zbytky. N-koncová funkční skupina amino je výhodně chráněná zakončovací skupinou.
Sloučeniny podle vynálezu lze syntetizovat způsoby, které jsou známé v oboru (E. Wunsch, Synthese von Peptiden, v „Methoden der organischen Chemie“, Houben-Weyl (Eds. E. Můller, O.Bayer), Vol. XV, část 1 a 2, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974). Například, sloučeniny by se mohly syntetizovat v blokovém uspořádání syntézy kondenzací koncové funkční skupiny karboxy oligomerní části, kde X může být skupina OH nebo aktivační odštěpitelná skupina, s aminoskupinou cytotoxické nebo cytostatické molekuly H2N-Cyť za vzniku amidové formy.
Pokud se mezi oligomerní částí a cytotoxickým nebo cytostatickým prostředkem požaduje vazebný zbytek (L), lze blokovou syntézu provést stejným způsobem.
Pokud cytotoxický nebo cytostatický prostředek nese funkční skupinu karboxy pro vazbu na oligomerní část, může být spojovací molekula imin nebo
- 254 · • 44 4
4 4
4444 4
4 • » 9 4 4 aminoalkohol a bloková syntéza takové sloučeniny může probíhat podobnou způsobem reakcí aktivované sloučeniny XOC-Cyť buď s částí hydroxy nebo amino.
N a/
HO-Cyť
- HX1
Pokud má cytotoxické nebo cytostatické činidlo funkční skupinu hydroxy, která je vhodná pro vazbu s oligomerní částí, může být vazebným zbytkem aminokarboxylová skupina a blokovou syntézu lze provést podobně.
Pokud je to nutné, mohou být další funkční skupiny v jednotkách Cyť, L, hydroxyprolin, A, B a D, které nebudou reagovat během uspořádání cílových molekul, chráněny vhodnými ochrannými skupinami. Vhodné ochranné skupiny jsou všeobecně známé ze stavu techniky (P.G.M.Wuts, „Protective groups in organic synthesis“, John Wiley and Sons Inc., New York 1991). Tyto ochranné skupiny se odstraní na konci syntézy.
Výhodné skupiny chránící skupinu amino mohou například zahrnovat skupiny Cú-Cio -alkanoyl jako je formyl, acetyl dichloroacetyl, propionyl, 3,3-diethylhexanoyl a podobně, C1-C10-alkoxykarbonyl a C6-C17 -aralkyloxykarbonyl jako je terc-butoxykarbonyl, benzyloxykarbonyl (BOC), fluorenylmethoxykarbonyl a podobně. Nejvýhodnější je skupina fluorenyl-methoxykarbonyl (FMOC).
Vhodné skupiny chránící skupinu karboxy mohou být například skupiny C-i-Cw -alkyl jako je methyl, terc-butyl, decyl; C6-C17 -aralkyl jako je benzyl, 4-methoxybenzyl, difenylmethyl, trifenyimethyl, fluorenyl; tri-(Ci-Cio -alkyl)silyl nebo (C1-C10 -alkyl)-diarylsilyl jako je trimethylsilyl, dimethyl-íercbutylsilyl, difenyl-terc-butylsilyl a příbuzné skupiny.
- 269 9 · 9 ·» «9 9 99 9· #99
4 4 9 9 9 9
9999 4 9 9999
4 9 9 9 9
999 9 999 499 99 4
Pro vytvoření takových esterů nebo amidů může být nezbytné aktivovat karbonylovou skupinu karboxylové skupiny pro nukleofilní atak aminu nebo alkoholu, např. X je aktivační skupina nebo odštěpitelná skupina, která je vhodná pro substituci skupinou amino. Tato aktivace může být provedena konverzí karboxylové kyseliny na chlorid kyseliny nebo fluorid kyseliny nebo konverzí karboxylové kyseliny na aktivovaný ester, například Nhydroxysuccinimidylester nebo pentafluorofenylester. Další způsob aktivace je transformace na symetrický nebo nesymetrický anhydrid. Alternativně lze vytvoření amidových nebo esterových vazeb dosáhnout použitím vazebných činidel in sítu jako je benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-fosfonium hexafluorofosfát (PyBOP) (E.Frerot et al., Tetrahedron, 1991, 47, 259-70), 1,1'-karbonyldimidazol (CDI) (K.Akaji et al., THL, 35, 1994, 3315-18), 2-(1Hbenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyiuroniumtetrafluoroborát (TBTU) (R.Knorr etal., THL, 30, 1989, 1927-30), 1-(mesitylen-2-sulfonyl)-3-nitro-1H-1,2,4triazol (MSNT) (B.BIanke-mayer-Menge et al., THL, 31, 1990, 1701-04).
Alternativně k blokové syntéze se molekuly v obecném vzorci (I) mohou uspořádat způsobem krok za korkem počínaje na pravé straně postupnými kondenzačními reakcemi příslušných monomerů Cyť, L, skupiny cyklické aminokyseliny tvořené skupinami Ra, Rb a vložené skupiny N-C, zvláště prolin nebo hydroxyprolin, A, B a D. Pro kondenzační reakci se mohou aplikovat stejné výše uvedené způsoby vazeb. Protože jednotky L, prolin/hydroxyprolin, A, B a D jsou alespoň bifunkční molekuly obsahující skupinu amino (alespoň jednotky A, B, D a skupina cyklické amonokyseliny tvořená skupinami Ra, Rb a vložená skupina N-C, zvláště prolin/hydroxyprolin) skupinu karboxy, musí být skupina amino blokovaná ochrannou skupinou (PG) před aktivací karboxylové funkční skupiny. Pro ochranu skupin amino lze aplikovat skupinu BOC nebo výhodně skupinu FMOC. Po vazebné reakci se odstraní ochranná skupina skupiny amino a může probíhat vazba s další skupinou chráněnou Fmoc nebo Boc. Pokud je to nutné, mohou být další skupiny v jednotkách Cyť, L, skupiny cyklické aminokyseliny tvořené skupinami Ra, Rb a vložené skupiny N-C, zvláště hydroxyprolinu, A, B a D, které nemají reagovat v průběhu sestavování cílových molekul, chráněny vhodnými ochrannými skupinami.
< to • • • to
• « ·· to· • • ··
• · • • to • ·
to ·· ·· · • • • · •
• • • • •
• to >·· ··· toto • to
Tyto ochranné skupiny se odstraní na konci syntézy.
Zakončovací skupiny definované v kontextu se vzorcem (I) mohou také působit jako ochranné skupiny, zvláště když se přidá poslední (N-koncová) jadnotka aminokarboxylové skupiny. V tomto případě se ochranná skupina neodstraní, protože je částí cílové molekuly. Alternativně se může zakončovací skupina přidat tehdy, když se poslední jednotka aminokarboxylové kyseliny navázala a odstranila ochranná skupina.
Syntéza krok za krokem je patrná z následujících schémat. Druhé schéma slouží jako příklad, protože vazebný zbytek jako je zbytek Cyť může obsahovat jiné funkční skupiny, něž které se nacházejí v tomto schématu (viz výše):
PG
N
Ra/
PG O X -HX ” R r> H
- PG .kbp* k H
PG-A-X
PG-A
Ra/
,Cyť
-HX
-PG
N
Ra/
-Cyť
RÍ O R ř H pg-nh^X*
HjN—Cyť •HX
PG-NH. X .Cyť
L N Η
-PG
Η,Ν«. X ..Cyť Η pc o
PY 'x
PG O k
R
Η .L. .Ν.
ϊ c»'
ΗΧ
Rb Η Ο - pg
Υγ-ο,
R
R1 Ο
I ίί , Η
Rb Ο
Dalším aspektem vynálezu je tedy způsob výroby sloučeniny vzorce (I), vyznačující se tím, že se provede reakce sloučeniny obecného vzorce (V),
- 284 ·
kde
R1, Ra a Rb jsou definované výše,
X1 znamená skupinu OH nebo odštěpitelnou skupinu, která je vhodná pro substituci skupinou amino, se sloučeninou HN(R4)-Cyť, kde
Cyť je zbytek cytotoxické nebo cytostatické sloučeniny a
R4 je definovaná výše.
Výhodně je X1 ve vzorci (V) odštěpitelná skupina, například -Cl, -F, Nhydroxysuccinimidyl, pentafluorofenyl nebo karboxylát. Alternativně může být X1 skupina OH, a kondenzace se dosáhne použitím vazebného činidla in sítu, například sloučeniny benztriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-fosfonium hexafluoro-fosfát (PyBOP), 1 ,Γ-karbonyldimidazol (CDI), 2-(1 H-benztriazol-1-yi)1,1,3,3-tetra-methyluronium tetrafluoroborát (TBTU) nebo 1-(mesitylen-2sulfonyl)-3-nitro-1 H-1,2,4-triazol (MSNT).
Dalším aspektem vynálezu je způsob výroby sloučeniny vzorce (I), vyznačující se tím, že se provede reakce sloučeniny obecného vzorce (VI),
(Ví)
- 2999 ·· 9 9 · · t • · · · • · 9 · · •9 » · • ······ « · e kde
R1, Ra a Rb jsou definované v nároku 1,
Y1 znamená L-COX2, kde
L je zbytek propojovací skupiny a
X2 znamená skupinu OH nebo odštěpitelnou skupinu, která je vhodná pro substituci skupinou amino nebo hydroxy, se sloučeninou H2N-Cyť- nebo se sloučeninou HO-Cyť, kde
Cyť je zbytek cytotoxické nebo cytostatické sloučeniny.
Výhodně je X2 ve vzorci (VI) odštěpitelná skupina, například -Cl, -F, Nhydroxysuccinimidyl, pentafluorofenyl nebo karboxylát. Alternativně může být X2 skupina OH a kondenzace se dosáhne použitím vazebného činidla in šitu, například sloučeniny benzotriazol-1-yl-oxo-tris-pyrrolidino-fosfonium hexafluorofosfát (PyBOP), 1,1'-karbonyldimidazol (CDI), 2-(1 H-benztriazol-1-yl)1,1,3,3-tetra-methyluronium tetrafluoroborát (TBTU) nebo 1-(mesitylen-2sulfonyl)-3-nitro-1 H-1,2,4-triazol (MSNT).
Dalším aspektem vynálezu je způsob výroby sloučeniny vzorce (l), vyznačující se tím, že se provede reakce sloučeniny obecného vzorce (VII),
R1 λ
(Vil) ,2
- 30kde
R1, Ra a Rb jsou definované výše,
Y2 znamená vzorec L-OH nebo L-NH2, kde
L je zbytek propojovací skupiny, se sloučeninou X3OC-Cyť, kde
X3 může být skupina OH nebo odštěpitelná skupina, která je vhodná pro substituci skupinou amino nebo hydroxy, kde
Cyť je zbytek cytotoxické nebo cytostatické sloučeniny.
Výhodně je X3 sloučeniny X3OC-Cyťodštěpitelná skupina, například -Cl, -F, N-hydroxysuccinimidyl, pentaflourofenyl nebo karboxylát. Alternativně může být X skupina OH a kondenzace se dosáhne použitím vazebného činidla in šitu, například sloučeniny benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-fosfonium hexafluorofosfát (PyBOP), 1,1 '-karbonyldimidazol (CDI), 2.(1H-benztriazol-1yl)-1,1,3,3-teramethyluronium tetrafluorobirát (TBTU) nebo 1-(mesitylen-2sulfonyl)-3-nitro-1H-1,2,4-triazol (MSNT).
Dalším aspektem vynálezu je způsob výroby sloučeniny vzorce (I), vyznačující se tím, že se sloučenina H2N-Cyt'postupně kondenzuje s jednotkami složenými ze sloučeniny vzorce (I). Před každým vazebným krokem je nezbytné odstranit ochranou skupinu PG, pokud je přítomná.
Podle toho je dalším aspektem vynálezu způsob výroby sloučeniny vzorce (I) vyznačující se tím, že se provede reakce sloučeniny obecného vzorce (Vlil),
kde
PG1 je ochranná skupina a ostatní substituenty mají výše uvedený význam, se sloučeninou HN(R4)-Cyť-, kde
Cyť je zbytek cytotoxické nebo cytostatické sloučeniny;
ochranná skupina PG1 se potom odstraní a výsledná sloučenina vzorce (VI IIA)
O
následně reaguje se sloučeninou PG2-A-X4, kde
PG2 je ochranná skupina a
X4 znemaná skupinu OH nebo odštěpitelnou skupinu vhodnou pro substituci skupinou amino;
a pokud je to nutné, probíhají další vazebné kroky, dokud se nezíská kompletní sloučenina.
PG1 a PG2 mohou být například BOC nebo výhodně FMOC.
Podle toho je dalším aspektem vynálezu způsob výroby sloučeniny vzorce (I), vyznačující se tím, že se provede reakce sloučeniny vzorce
- 32PG3-N(R4)-L-COX3, kde
PG3 je ochrannou skupinou a ostatní substituenty mají výše uvedený význam, se sloučeninou vzorce Y4-Cyť, kde
Cyť je zbytek cytotoxické nebo cytostatické sloučeniny; a
Y4 znamená skupinu H2N nebo HO;
ochanná skupina PG3 se potom odstraní; a provede se reakce výsledné sloučeniny HN(R4)-L-Y4-Cyť se sloučeninou vzorce (Vlil),
ochranná skupina PG1 se potom odstraní a provede se potom reakce výsledné sloučeniny vzorce
R‘
Ru
N-L—Y*-Cyť R4 se sloučeninou pg4-a-x4, kde
PG4 je ochranná skupina a
X4 může být skupina OH nebo odštěpitelná skupina vhodná pro substituci skupinou amino;
• · a pokud je to nutné, probíhají další vazebné kroky, dokud se nazíská kompletní molekula.
Dalším aspektem vynálezu je způsob výroby sloučeniny vzorce (I), vyznačující se tím, že se provede reakce sloučeniny vzorce
PG5-N(R4)-L-Y5, kde
PG5 znamená ochrannou skupinu,
Y5 znamená skupinu OH nebo NH2 a substituenty mají výše uvedený význam, se sloučeninou vzorce
X5OC-Cyť, kde
Cyť je zbytek cytotoxické nebo cytostatické sloučeniny a
X5 je skupina OH nebo vhodná odštěpitelná skupina;
ochranná skupina PG5 se potom odstraní; a provede se reakce výsledné sloučeniny
HN(R4)-L-Y5-CO-Cyť se sloučeninou vzorce (Vlil),
ochranná skupina se potom odstraní sloučeniny
O
(Vlíi) a potom se provede reakce výsledné
O
A —Y5 Cyť se sloučeninou PG2-A-X, kde PG2 je ochranná skupina a
- 34X4 znamená skupinu OH nebo odštěpitelnou skupinu vhodnou pro substituci skupinou amino;
a pokud je to nutné, probíhají dalši vazebné kroky, dokud se nezíská kompletní molekula.
Dalším aspektem předkládaného vynálezu jsou nové meziprodukty vzorce VIIIA,
R’
O
HN
1/
Ν'
R R ,Cyť (VIIIA) kde Ra, Rb, R4 a Cyťjsou definované výše.
Sloučeniny podle vynálezu jsou určené pro lékařskéské použití. Tyto sloučeniny jsou zvláště výhodné pro léčbu tumorů, které jsou spojené se stromálními fibroblasty s expresí FAPa, a které nejsou obecně optimálně léčené obvyklými cytotoxickými a/nebo cytostatickými prostředky. Tumory s touto vlastností jsou například epiteliální rakoviny jako nádory plic, prsu a tlustého střeva. Tumory jako zhoubné nádory kosti a měkké tkáně s expresí FAPa, se mohou také léčit těmito sloučeninami.
Následně dalším aspektem předkládaného vynálezu jsou tedy farmaceutické sloučeniny obsahující sloučeninu podie předkládaného vynálezu a případně jeden nebo více vhodných a farmaceuticky přijatelných pomocných látek jak je doloženo na příkladech ukázáno v: Remington: the science and practice of pharmacy, 19th ed. Eston: mack Publ., 1995. Farmaceutické prostředky se mohou formulovcat jako pevné látky nebo roztoky. Pevné formulace mohou sloužit pro přípravu roztoků před injekcí. Výhodně jsou farmaceutické prostředky podle vynálezu ve formě injekčních roztoků. Mohou se podávat systémově, např. intravenózni injekcí, nebo lokálně, například přímou injekcí
- 35♦ ♦ · · · · · ··· • * · © © · © ······ · · · · · • © · · · © ·©· · ·©· ··· ·© · do místa tumoru. Dávky se upravují podle faktorů jako je tělesná hmotnost a zdravotní stav pacienta, povaha vlastního onemocnění, terapeutické rozmezí sloučeniny, která se aplikuje, rozpustnost a podobně. Závisí to na znalosti odborníka, který vhodně upraví dávkování. Pro konjugáty doxorubicinu například bude výhodná dávka v rozmezí od 10 mg/m2 do 1350 mg/m2, ale také mohou být vhodné vyšší nebo nižší dávky.
Podle toho je dalším aspektem předkládaného vynálezu použití sloučeniny podle vynálezu pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu rakoviny. Dalším aspektem vynálezu je způsob léčení rakoviny, zahrnující podávání účinného množství farmaceutického prostředku podle vynálezu pacientovi. Indikace zahrnují léčbu rakoviny, specificky;
1. Léčbu epiteliálních zhoubných nádorů včetně nádorů pocházejícíh z prsu, plic, konečníku, hlavy a hrdla, pankreatu, vaječníků, měchýře, žaludku, kůže, děložní sliznice, varlat, jícnu, prostaty a ledvin;
2. Zhoubné nádory kosti a měkké káně: osteosarkom, chondrosarkom, fibrosarkom, maligní vazivový histiocytom (MFH), leiomyosarkom;
3. Hematopoietic maligní stavy: Hodgkinovy a ne-Hodgkinovy lymfomy;
4. Neuroektodermáiní tumory: tumory periferních nerů, astrocytom, melanomy;
5. Mesoteliomy
Součástí vynálezuje také léčba chronických zánětlivých stavů jako je reumatoidní artritida, osteoatritida, jaterní cirhóza, plicní fibróza, arterioskleróza a abnormální hojení ran.
Dalším aspektem vynálezu je způsob léčby rakoviny, kde se prekurzor léčiva podává pacientovi, a kde je možné uvedený prekurzor enzymatickou aktivitou převést na cytotoxické nebo cytostatické léčivo; uvedená enzymatická aktivita
je produktem exprese buněk spojených s tumorovou tkání. Výhodně je uvedené enzymatická aktivita proteolytickou aktivitou FAPa.
Jedním způsobem podávání sloučenin je intravenózní infúze. Jiná možná cesta podávání zahrnuje intraperitoneální (buď jako jednorázová dávka nebo infúze), intramuskulární nebo intratumorální injekcí. Kde je to vhodné, je také možná přímá aplikace (například plicní fibróza).
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1:
Štepení konjugátů doxorubucin-peptid pomocí FAPa. Chromatogramy ZGPDox (Z-Gly-(L)-Pro-Doxorubicin) po inkubaci s vyčištěným fuzním proteinem FAPmCD8 (A) nebo pufrem (B). Viz příklad 5.
Obrázek 2\
Snížení cytotoxicity doxorubicinu konjugací doxorubicinu na peptidy štepitelné FAPa. Viz příklad 6.
Obrázek 3:
Zobrazení cytotoxicity doxorubicinu uvolňovaného z konjugátů doxorubicinpeptid štěpitelných FAPa pomocí buněk HT1080 klon 33 exprimujících FAPa ve srovnání s parentálními buňkámi HT1080. Viz příklad 8.
Obrázek 4:
Plazmatická stabilita N-Cbz-Gly-(L)-Pro-Doxorubicinu a N-Cbz-(L)-Pro-(L)-AlaGly-(L)-Pro-Doxorubicinu v plazmě myši a člověka. Viz příklad 9.
- 37Obrázek 5'.
Zobrazení aktivity enzymu FAPa a potvrzení jeho zdánlivé molekulární hmotnosti ve vzorcích lidské tumorové tkáně. Viz příklad 12.
Odborník v oboru si je vědom, že ačkoliv v následujících příkladech se uvádějí specifické reagencie a reakční podmínky, mohou být provedeny modifikace, které spadají do rámce vynálezu. Proto mají následující příklady za úkol vynález dále objasnit, ale neomezovat.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Způsoby syntézy kojugátů doxorubicinu
W-Cbz-Gly-Pro-Doxorubicin:
N-Cbz-Gly-Pro (116,1 mg, 0,37 mmol) a N-hydroxy sukcinimid (44 mg. 0,37 mmol) se navážily a umístily do 2 hrdlé baňky s kulatým dnem pod dusíkem. Přidal se bezvodý A/,A/-dimethylformamid (20 ml) a baňka se ochladila na 0°C v ledové lázni. Přidal se roztok 1 ml dicykiohexylkarbodiimidu (78 mg, 0,37 mmol) v Ν,Ν-dimethylforrnamidu. Roztok se míchal při teplotě 0°C po dobu 40 minut.
Doxorubicin.HCI (100 mg, mmol) se navážil do zkumavky s malou míchací tyčinkou a umístil pod dusík. N,N-domethylformamid (3 ml) a N,Ndiisopropylethylamin (33,1 μΙ, 0,19 mmol) se přidal do zkumavky s mícháním. Roztok doxorubicinu se přidal injekční stříkačkou do roztoku peptidu a zkumavka se vypláchla dalšími 2 ml Ν,Ν-dimethylformamidu. Odstranila se ledová lázeň a reakční směs se míchala přibližně 48 hodin při pokojové teplotě.
- 38• 4 4 9 9 9 9
9949 9 4 4994
4 9 9 9 9
494 4 444 944 44 4
Reakční roztok se extrahoval ethylacetátem (500 ml). Ethylacetát se postupně promyl 10% vodným roztokem kyseliny citrónové (250 ml), nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (250 ml) a solným roztokem (250 ml). Organický extrakt se sušil bezvodým MgSO4 a rozpouštědlo se odstranilo rotačním odpařovákem. Produkt bohatý kontaminující DMF se chromatografoval na rychlé koloně C-18 s reverzní fází s eluentem matanol:voda 8:2. Izolovala se oranžová skvrna, rf«0,3, která fluoreskovala v dlouhovlném UV světle. Rotačním odpařovákem se odstranil methanol a poslední stopy rozpouštědla se odstranily přes noc vývěvou s vysokým vakuem.
/V-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro.
N-Cbz-Pro-Ala (5g, 15 mmol) a karbonyldiimidazol (2,43 g, 15 mmol) se vložil do 250 ml, 3-hrdlé baňky s kulatým dnem pod atmosféru argonu. Přidal se bezvodý tetrahydrofuran (50 nl) a roztok se míchal při pokojové teplotě přibližně 45 minut. Bylo pozorovábo silné uvolňování plynu (CO2).
Do oddělené baňky se navážil Gly-Pro-OCH3.HCI (2,9 g, 15 mmol). Přidal se tetrahydrofuran (5 ml) a Ν,Ν-diisopropylethylamin (5,23 ml, 30 mmol) a roztok se míchal několik minut. Materiál, který se rozpustil, se přidal injekční stříkačkou do aktivovaného peptidu, zbývající materiál se rozpustil v minimálním množství CH2CI2 a také se přidal do aktivovaného peptidu injekční stříkačkou.
Reakční roztok se míchal přes noc při pokojové teplotě (15 hodin) a ráno zde bylo hojné množství bílé sraženiny. Reakční směs se promyla 10% vodným roztokem kyseliny citrónové (300 ml) a extrahovala ethylacetátem (500 ml). Extrakt ethylacetátu se promyl nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (300 ml) a sušil solankou a bezvodým MgSO4- Ethylacetát se odstranil rotačním odpařovákem za vzniku 5 g bezbarvého oleje, který poskytl uspokojivá charakteristická data.
- 39Surový olej /V-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro-OCH3 (5g, 12 mmol) se rozpustil v methanolu (20 ml) v baňce s kulatým dnem. Baňka se umístila do vodní lázně o teplotě okolí. Opatrně se přidal 1 N roztok hydroxidu sodného (12 ml). Roztok se míchal po dobu 3,5 hodin a potom se přidal 1 N roztok HCl (12 ml). Roztok se zkoncentroval na rotačním odpařováku a přidalo se několik dalších kapek 1 N HCl dokud hodnota pH nedosáhla přibližně 1,5 (pH-parírek). Voda se odstranila vakuovou vývěvou za vzniku oleje, který pomalu rekrystalizoval z ethanolu.
/V-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro-Doxorubicin:
/V-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro (180 mg, 0,38 mmol) se rozpustil v bezvodém N,Ndimethylformamidu (15 ml). 1-Hydroxybenztriazol (51,3 mg, 38 mmol) a dicyklohexylkarbodiimid (78 mg, 38 mmol) se každý rozpustil v 1 ml N,Ndimethylformamidu a přidal se do peptidu jako roztok. Reakční směs se míchala při pokojové teplotě po dobu 45 minut.
Doxorubicin.HCI (116 mg, 20 mmol) se navážil do zvláštní zkumavky a rozpustil v A/,/\/-dimethylformamidu (3 ml). N,N-Diisopropylethylamin (34,8 μΙ, 20 mmol) se injektoval do zkumavky obsahující doxorubicin a obsahy se míchaly několik minut k dosažení úplného rozpuštění. Roztok doxorubicinu se přidal injekční stříkačkou k aktivovanému peptidu. Roztok se míchal 48 hodin při pokojové teplotě.
Produkt se extrahoval ethylacetátem (2 I) a promyt 10% vodným roztokem kyseliny citrónové (500 ml). Oddělila se vrstva ethylacetátu, sušila MgSO4 a rotačním odpařovákem zkoncentrovala na olej. Olej se chromatografoval na C-18 silikagelu s reverzní fází, který poskytl oranžovou, v dlouhovlném UV světle fluoreskující skvrnu vlnové délky UV při rf = 0,25. Konečný produkt poskytl uspokojivá charakterisktická data.
- 40• · · · » · ····· * · · φ 9
4 4 4 9 • ······ 94 4
Příklad 2: Příprava buněčných linií s expresí FAPa
Byly připraveny linie savčích buněk s expresí rekombinantního FAPa. Buňky fibrosarkomu HT1080 široce známé a běžné z DSMZ (Německá sbírka mokroorganismů a buněčných kultur, Braunschweig, Německo) pod přístupovým číslem DSMZ ACC 315, se udržovaly ve směsi DMEM/F12 v poměru 50:50 s obsahem 10% fetálního bovinního sera v atmosféře 95% vzduchu a 5% CO2. Buňky HT1080 se transfekovaly vektorem FAP.38 (WO 97/34927, Scanlan et al., loc.cit.) za použití lipofektinové metody podle instrukcí výrobce (Gibco/BRL). Transfektanty byly selektovány podle rezistence na antibiotika (200 pg/ml Genaticin) a potom se udržovaly v prostředí obsahující genaticin. Jednotlivé kolonie rezistentních buněk byly odpíchnuty, pěstovány do konfluence v 10 cm Petriho miskách pro tkáňové kultury a testovaly se na expresi FAPa v imunofluorescenčním testu za použití monoklonální protilátky F19 specifické pro FAPa tak, jak je popsáno (Garin-Chesa et al., (1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(18), 7235-7239). Parentální linie buněk HT1080 neprojevila žádnou detekovanou expresi FAPa v tomto imunoflouroscenčním testu, zatímco jeden klon uvedený dále jako HT1080 klon 33 byl pozitivní na FAPa
Podobně 293 lidských embryonálních ledvinových buněk široce známých a běžných z americké sbírky American Tissue Type Collection (Rockville, MD), se udržovalo v DMEM s obsahem 10% fetálního bovinního séra v atmosféře 95% vzduchu a 5% CO2. Buňky se transfekovaly vektorem exprese FAPa, pFAP.38 za použití uvedené trasfekce uhličitanem vápenatým popsané v (Park, J.E., Chen, H.H., Winer, J., Houck, K.A.& Farrara, N. (1994). Placenta growth factor. Potentiation of vaskular endothelial growth fakctor bioactivity, in vitro and in vivo, and high affinity binding to Flt-1 but not to Flk-1/KDR. J.Biol.Chem. 269(41), 25646-25654). Transfektanty se selektovaly a analyzovaly výše uvedeným způsobem pro expresi FAPa. Parentální buněčná linie 293 neprojevila žádnou detekovatelnou expresi FAPa. Jeden klon uvedený dále jako 293-I/2 byl FAPa pozitivní.
- 41• · · · 9 · · ··*··· · A · · · • · · · · · ··· · ··· »·· ··
Příklad 3: Stanovení exprese FAPa ve tranfekovaných liniích buněk
Exprese FAPa se zkoumala v buňkách HT1080 a HT1080 kolon 33. Byla provedená provedena metabolícká značení imunoprecipitace a fluorografie v podstatě tek, jak bylo popsáno v (Park et al. (1991) Somatic Cell Mol.Genet. 17(2), 137-150). Buňky HT 1080 a HT 1080 klon 33 byly metabolicky označeny S35-methioninem. Detergentové extrakty těchto buněk se imunoprecipitovaly monoklonální protilátkou F19 nebo myší protilátkou lgG1 jako negativní kontrolou. Sraženiny se vařily ve vzorkovém pufru a oddělily elektroforézou na gelu s dodecylsulfátem sodným (jak je popsáno Laemmli (1970) Nátuře 227(259), 680-685). Fluorografická analýza výsledného gelu potvrdila, že buňky HT 1080 klon 33 produkují protein FAPa. Žádný protein FAPa nebyl detekovatelný v extraktech parentálních buněk HT 1080, ale ani v imunoprecipitátech myším lgG1.
Příklad 4: Rozpustný rekombinantní FAPa
Rozpustná rekombinantní forma proteinu FAPa se připravila následovně. cDNA kódující extracelulární doménu (EDC) myší CD8a (Genbank M12825), sestávající z 189 N-koncových aminokyselin CD8a, se vázala na cDNA kódující extracelulární oblast FAPa (aminokyseliny 27 až 760), vytvářející konstrukt fuzního proteinu FAPmCD8 strukturně podobný fuznímu proteinu CD8a-ligand CD40, jak bylo již dříve popsáno (Lané et al., (1993) J.Exp.Med. 177(4), 1209-1213). cDNA byly ověřeny sekvencováním a vloženy do vektoru pVL1393. Byla provedena transfekce buněk Sf9 a amplifikace výsledného rekombinantního bakuloviru způsobem uvedeným v (O'Reily (1994): Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory manual, Oxford University press, New York). Supernatant kultury buněk High Five infikovaných rekombinantním bakulovirem FAPmCD8 se oddělil a čistil ultracentrifugací. Fuzní protein FAPmCD8 se vyčistil z těchto supernatantů použitím monoklonální protilátky imobilizoné na aktivovaných agarozových kuličkách (Pierce Chemical, Indianapolis, IN, USA). Supernatant z kultury byl převeden • · · » ·· © • · © ·© ·© © © · © . 42- · ·*·♦ · · · ♦ · · © · · · · · · © «·· « ··· β·· ·© ··· afinřtní kolonou s protilátkami a eluoval se změnou hodnoty pH za použití pufru 0,1 M citrátu, pH3. Vzorky se okamžitě neutralizovaly nasyceným roztokem Tris (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) a frakce s obsahem proteinu byl spojeny.
Příklad 5: Měření štěpení konjugátů doxorubicin-peptid
Vzorky se oddělily testem s použitím kapalinové chromatografie (HPLC) s reverzní fází, který byl vytvořen pro měření štěpení konjugátů doxorubicinpeptid. Systém HPLC se skládal z autodávkovače Waters 717 vybaveného smyčkou 100 μΙ a dvěma čerpadly Watres model 510 pro dodávání rozpouštědel. Separace byla provedena za izokratických podmínek při průtoku 0,7 ml/min kolonou Nucleosil C-18, délky 100 mm x 4 mm průměr (I.D.) o velikosti částic 5 μίτι (Dr.Ing.H-Knauer GmbH, Berlin). Mobilní fáze se skládala z metanolu:vody (70:30, % obj.) s obsahem 0,2 M octanů amonného, upraveného na hodnotu pH 3,2. Volný doxorubicin a konjugáty doxorubicinpeptid se detekovaly fluorescencí ( exitace 475 nm; emise 585 nm) za použití fluorescenčního detektoru Watres 474. Nástřik, dodávka rozpouštědla, sběr dat a analýza dat se prováděly za použití chromatografického softwaru Millennium 2010 (Waters Corp., Milford, MA, USA). Testované látky se nejprve rozpustily v dimethylsulfoxidu o koncentraci 5 mM a následně se před aplikací ne kolonu HPLC zředily ve vodném roztoku.
Zjišťovala se schopnost rozpustného rekombinantního enzymu FAPa uvolňovat volný doxorubicin z konjugátů doxorubicin-peptid. Zásobní roztoky konjugátu doxorubicin-peptid (5 mM) byly zžeděny v solném roztoku pufrovaném Hepes o hodnotě pH 7,4 na finální koncentrací 50 až 100 μΜ. Dvacet μΙ výsledného roztoku se smíchalo s 50 μΙ vyčištěného fuzního proteinu FAPmCD8 (přibližně 20 ng) uvedeného výše a 30 μΙ solného roztoku pufrovaného Hepes o hodnotě pH 7,4. Směs se inkubovala při 37°C 1 den a uvedeným testem HPLC se měřilo uvolňování volného doxorubicinu. Oblasti pod každým pikem se kvantifikovaly za použití výše uvedeného softwaru a počáteční honoty byly vztaženy na 100%. Rychlost uvolňování volného
- 43• · • · * · • · « · · ·· • · · ♦ · • ···· · · · • · · » · « · • » · » )14 ··· *« Ht doxorubicinu se měřila vystoupením píku se stejným retenčním časem jako volný doxorubicin za těchto podmínek HPLC. Oblasti pod každým pikem se použily pro výpočet relativních množství volného doxorubicinu ke konjugátu doxorubicin-peptid. Integrace ploch píků pro stanovení procentuálního štěpení byla provedena použitím balíku chromatografického softwaru Millennium 2010. Jak je vidět v chromatogramech pro ZGP-Dox (/V-Cbz-Gly-ProDoxorubicin) uvedených na obrázku 1, konjugát doxorubicin-peptid mohl převeden na volný doxorubicin po inkubaci s vyčištěným fuzním proteinem FAPmCD8, ale retenční čas konjugátu se nezměnil inkubací s pufrem.
Příklad 6: Snížení cytotoxicity doxorubicinu konjugací na peptidy štěpitelné FAPa
Byla stanovena schopnost peptidů štěpitelných FAPa blokovat cytotoxický účinek doxorubicinu na buňky FAPa -negativní, doxorubicin-senzitivní. Buňky K562 dostupné z americké sbírky typů tkáňových kultur (American Type Tissue Culture Collection, Rockville, MD, USA, ATCC Number: CCL-243), se vložily do destiček o 96 jamkách (Greiner Scientific) o hustotě 1000 buněk/ jamku. K buňkám se přidala živná půda bez séra obsahující různé koncentrace volného doxorubicinu nebo ekvivalentní molární koncentrace konjugátů doxorubicin-peptid. Po čtyřech dnech se zjistil počet buněk za použití atutomatického čítače buněk ČASY™ (Schárfe System GMbH, Reutlingen, Germany). Výsledky jsou zobrazené na obrázku 2.
Příklad 7; Uvolnění volného doxorubicinu buněčně vázaným FAPa
Zjišťovala se schopnost buněčně vázaného enzymu FAPa uvolňovat volný doxorubicin z konjugátů doxorubicin-peptid. Každý konjugát se rozpustil v živné půdě bez séra na finální koncentraci 1 μΜ. Deset mililitrů tohoto roztoku se přidalo do souvislých monovrstev buněk HT1080 nebo HT1080 klon 33 v 10 cm miskách tkáňových kultur na 19 hodin při teplotě 37°C. Odstranily se živné půdy a měřilo se uvolňování doxorubicinu způsobem uvedeným v příkladu 5. Buněčná linie s expresí FAP, HT 1080 klon 33 převedla 81% a
• « • · ·· ·
• · ·· »· • • ··
• * · • • 9 •
• «··» · • • 9 9 •
• · • 9 9 4
·· · • 99 99
43% konjugátů ZGP-DOx (N-Cbz-Gly-Pro-Doxorubicin), popřípadě ZPAGPDox (N-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro-Doxorubicin) na volný doxorubicin v tomto pořadí. Parenterální buněčná linie HT1080 převedla pouze 9% ZGP-Dox na volný doxorubicin za stejných podmínek. Za těchto podmínek byla zjištěna malá nebo nedekovatelná přeměna ZPAGP-Dox na volný doxorubicin buněčnou linií HT1080.
Příklad 8: Usmrcení senzitivních buněk doxorubicinem uvolněným FAPa
Byla stanovena schopnost FAPa generovat volný doxorubicin schopný usmrcovat buňky senzitivní na doxorubicin. Buňky K562 dostupné z americké sbírky typů tkáňových kultur (Amarican Type Tissue Culture Collection, Rockville, MD, USA, ATCC Number: CCL-243) se vložily do destiček o 96 jamkách (Greiner Scientific) s hustotou 1000 buněk/jamku. Živná půda bez séra s obsahem 1 μΜ konjugátu doxorubicin-peptid se přidala do misek s buňkami HT1080 nebo HT1080 klon 33 na 19 hodin při teplotě 37°C. Odstranily se živné půdy a uvolňování doxorubicinu se potvrdilo stejným způsobem jako v příkladu 5. Šedesát šest μΙ této živné půdy se potom přidalo na jamku k buňkám K562. Po čtyřech dnech se stanovil počet buněk za použití automatického čítače buněk ČASY™. Výsledky jsou zobrazené na obrázku 3.
Příklad 9: Stabilita konjugátů doxorubicin-peptid v plazmě
Stabilita konjugátů doxorubicin-peptid v plazmě se měřila za použití metod uvedených v příkladu 5. Vzorky s obsahem konjugátů doxorubicin-peptid (o koncentraci 1μΜ) se inkubovaly za přítomnosti 10% (obj.) myší nebo lidské plazmy po vyznačenou dobu při teplotě 37°C. Výsledky pro ZGP-Dox a ZPAGP-Dox v myší a lidské plazmě jsou zobrazené na obrázku 4.
Příklad 10: Štěpení zvolených konjugátů 4-methoxy-fi-naftylamid-peptid katalyzované FAPa
Pro identifikaci výhodných peptidových substrátů FAPa byly syntetizovány oligomery složené z přírodních a/nebo nepřírodních aminokarboxylových kyselin, které byly navázány na proline-4-methoxy-p-naftylamin (Pro-MNA) při použití způsobů známých v oboru (E.Wunsch, Synthese von Peptiden, in Metoden der organischen Chemie, Houben-Weyl (Eds.E.Můller, O.Bayer), Vol.XV, Part 1 and 2, Georg Thieme Veriag, Stuttgart, 1974).
Syntéza Pro-Pro-4-methoxy-p-naftylamidu:
Boc-Pro (32 mg, 0,15 mmol), 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborát (53 mg, 0,15 mmol) a Pro-4-methoxy-p-naftylamid hydrochlorid (46 mg, 0,15 mmol) se rozpustily v bezvodém N,N-dimethylformamidu/tetrahydrofuranu 1:1 (4 ml). Přidal se N-ethyldiisopropylamin (0,26 ml, 0,44 mmol) rozpuštěný v N-methylpyrrolidonu (1,7 molární) a směs se míchala při pokojové teplotě přes noc.
Rozpouštědlo se odstranilo rotačním odpařovákem a zbytek se rozpustil v ethylacetátu (10 ml) a extrahoval 3 krát vodou. Organická fáze se sušila bezvodým Na2SO4 a rozpouštědlo se odstranilo rotačním odpařovákem. Zbytek se rozpustil v kyselině trifluoroctové/dichlormethanu (1:4, 25 ml) a nechal reagovat 1 hodinu. Rozpouštědlo se odstranilo rotačním odpařovákem a výsledný olej se sušil proudem dusíku. Surový produkt se čistil preparativní HPLC s reverzní fází za použití gradientu acetonitril/voda. Produkt poskytl uspokojivá analytická data (NMR a hmotové spektrum).
Uvolnění volného MNA z peptidů se potom měřilo fluorimetrem Cytofluor (PerSeptive Biosystems, lne.) za použití exitačního 355 nm / emisního 405 nm filtračního setu. Kinetické parametry enzymu (hodnoty rovnice MichaelisMentena Km a kcyt se vypočítaly za použití způsobů známých v oboru (viz například Yun, S.L. & Suelter, C.H. (1977). A simple method for calculating Km and V from single enzym reaction progress curve. Biochem. Biophys. Acta
- 46480 (1), 1-13.) enzymem FAPa odvozeným z membránových extraktů transfektovaných buněk 293-I/2 v příkladu 2.
Tabulka T. Hodnoty Km a kcat pro štěpení zvolených konjugátů 4-methoxy-Pnaftylamid (MNA)-peptid katalyzované FAPa
Subtráty Km [μΜ] kcat [S ] kcat/Km X104 [M'1S'1]
Chg-Pro-MNA 75 53,7 71,6
Hyn-Pro-MNA 69 27,4 39,7
Pro-Pro-MNA 154 49,5 32,1
Val-Pro-MNA 95 27,7 29,2
Met-Pro-MNA 127 27,9 22,0
Arg-Pro-MNA 278 50,6 18,2
trans-Hyp-Pro-MNA 254 37,9 14,9
Gln-Pro-MNA 273 40,5 14,8
Ala-Pro-MNA 267 35,7 13,4
Lys-Pro-MNA 530 57,1 10,8
Ile-Pro-MNA 43 12,6 8,8
Met(O)-Pro-MNA 378 26,9 7,1
Ser-Pro-MNA 872 28,3 3,3
Chg = cyklohexylglycin Hyn = 6-hydroxynorleucin trans-Hyp = trans-4-hydroxypyrolin Met(O) = methionin-S-oxid
Příklad 11: Specifičnost peptidů vázaných MNA pro FAPa versus DPP-IV
Mezi známými členy skupiny prolyl-specifických serinových oligopetidáz je
DPP-IV nejvíce příbuzným enzymen k FAPa. Pokud se aktivní DPP-IV
- 47nachází v plazmě a v mnoha různých typech buněk, je co nejlepší využití relativní (případné) selektivity peptidických prekurzorů pro FAPa ve srovnání k DPP-IV nezbytné pro snížení nežádoucí konverze prekurzoru v místech jiných něž je místo tumoru (např. v plazmě). Pro identifikaci peptidů specifických pro FAPa se štěpení peptidů vázaných MNA pomocí FAPa srovnávalo se schopností DPP-IV štěpit stejné konjugáty peptidu. Uvolnění volného MNA se měřilo způsobem uvedeným v příkladu 9. Výsledky jsou zobrazené v tabulce 2.
Tabulka 2: Srovnání selektivity štěpení konjugátů MNA-peptid pomocí FAPa a DPP-IV.
Specifita štěpení
FAPa DPP-IV
Ala-Pro-MNA + +
Z-Gly-Pro-MNA + -
Z-Pro-Ala-Gly-Pro-MNA + -
+ znamená, že enzym byl schopný štěpit substrát znamená nepřítomnost štěpení
Příklad 12: Aktivita FAPa ve vzorcích tumoru
Enzymatická aktivita FAPa meřená ve vzorcích lidského tumoru. Destičky (Costar, Corning, NY) ELISA s 96 jamkami (test imunosorbentu vázaného enzymem) se přes noc při teplotě 4°C potahovali 1 pg/ml protilátky F19 nebo kontrolní protilátkou ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS), pH 7,4. Jamky se potom vypláchly promývacím pufrem (PBS, 0,1% Tween 20, pH 7,4) a nadbytečná vazebná místa se blokovala blokovacím pufrem (5% bovinní sérový albumin v PBS, pH 7,4) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Aktivita FAPa se měřila v tumorové tkáni (uzavřené symboly) nebo srovnávala
-48s normální kontrolní tkání (odpovídající otevřené symboly) z membránových extraktů obohacených konkanavalinem A (obrázek 5a). Vzorky tumoru včetně rakoviny prsu (*, χ), tlustého střeva (·), rakoviny tlustého střeva metastázované do játer (0), rakoviny plic (a<). Extrakty se přidaly do destiček potažených F19 a inkubovaly 1 hodinu při pokojové teplotě. Nevázaný materiál se odstranil, jamky se promyly třikrát promývacím pufrem a enzymatická aktivita FAPa se testovala při použití 100 μΙ Ala-Pro-AFC způsobem uvedeným ve(WO 97/34927) po dobu jedné hodiny při teplotě 37°C. Měřily se první dvě frakce konkanavalinu A každého extraktu a každá hodnota se individuálně vynesla. Fluorescenční pozadí (měřeno za použití kontrolních destiček potažených protilátkou) se odečetlo z každé hodnoty.
Nezávislé biochemické potvrzení enzymatické aktivity FAPa a jeho zdánlivé molekulární hmotnost se získaly značením výše uvedených tkáňových extraktů diisopropylfluorofosfátem značeným 14C (DFP; NEN-DuPont, Cologne, Germany). Je známo, že DFP je schopný se kovalentně a ireverzibilně vázat na šeřiny aktvních míst mnoha serinových proteáz a tím zabraňuje další katalýze (Hayashi, R., Baí, Y.& Hata, T.(1975). Futher confirmation of carboxypeptidase Y as a metal-free enzyme having a reactive serine residue. J.Biochem. 77 (6), 1313-1318; Wahlby, S. & Engstrom, L. (1968). Studies on Streptomyces griseus protease. II. The amino acid sequence around the reactive serine residue of DFP-sensitive components with esterase activity. Biochim. Biophys.Acta 151(2), 402-408). Značení 14CDFP imunopurifikovaného FAPa z tumoru (T) odpovídající vzorku tlustého střeva · z obrázku 5a je zobrazeno na obrázku 5b. Elektroforéza polyakrylamidového gelu s dodecylsulfátem sodným (Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of struktural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nátuře 227(259), 680-685) a následná autoradiografie (Park, J.E., Draper, R.K.&Brown, W.J.(1991). Biosynthesis of lysosomal enzymes in cells of the End3 complementation group conditionally defective in endosomal acidification. Somatic Cell Mol.Genet. 17(2), 137-150) těchto vzorků odhaluje přítomnost značeného proteinu 95 kD, přítomného ve vzorku
- 49rakoviny tlustého střeva. Nebyly pozorovány žádné radioaktivně značené pásy v normálním odpovídajícím kontrolním iminoprecipitátu (N), ani s kontrolní protilátkou. Zdánlivá molekulární hmotnost imunopurifikovaného proteinu značeného 14C zobrazená na obrázku 5b souhlasí s předchozími zprávami o FAPa (Rettig, W.J., Su, S.L., Fortunato, S.R., Scanlan, M.J., Mohan Raj, B.K, Garin-Chesa, P., Healey, J.H. & Old, L.J. (1994). Fibroblast activation protein: Purification, epitope mapping and induction by growth factors. Int.J.Cancer 58(3), 385-392; WO 97/34927).
Příklad 13: Příprava chráněných oligopeptidů
Chráněné oligopeptidy se připravily buď v roztoku podle protokolů ze stavu techniky v oboru (např. M.Bodanszky a A.Bodanszky, „The practice of Peptide Synthesis“, druhé vydání Springer, New York, 1994) nebo syntézou pevné fáze na peptidovém syntetizátoru Applied Biosystems, model 430A. Odstranění ochranných skupin a oddělení oligopeptidů z pryskyřičného nosiče se dosáhlo směsí kyseliny trifluoroctové a hojně používaných čistících přísad. Čištění probíhalo preparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií na silkagelových kolonách C18 s reverzními fázemi při použití vodného gradientu 0,1% kyseliny trifluoroctové/acetonitrilu. Identita a homogenita peptidů byla potvrzena vysokotlakou kapalinovou chromatografií a hmotnostní spektrální analýzou.
Oligopeptidy, které se připravily tímto způsobem zobrazuje tabulka 3.
Tabulka 3: Oligopeptidy
- 50• · · · · · • · · · · ·· ··· • · · · · · · ······ · · · · · • · · · · · • · · · · · · · · · ·· ·
Fmoc-NIe-Pro-OH
Fmoc-Hyn-Pro-OH
Fmoc-Pro-Pro-OH
Fmoc-Ser-Ala-Hyn-Pro-OH
Fmoc-Ser-Ala-NIe-pro-OH
Fmoc-Ser-Ala-Chg-Pro-OH
Gly-Ser-Ala-Glu-pro-OH
Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Pro-OH
Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Pro-OH
Ser-Glu-Asn-Arg-Lys-Val-Pro-OH
Gly-T yr-Ser-Arg-Met-Pro-OH
Gln-Gly-Tyr-Ser-Arg-Met-Pro-OH
Gly-Gly-Gly-Trp-Pro-OH
Asn-Arg-Lys-Val-Pro-OH
Glu-Asn-Arg-Lys-Val-Pro-OH
Ser-Glu-Asn-Arg-Lys-Val-Pro-OH
Ala-His-Met-His-Pro-OH
Tyr-Ala-Phe-His-Pro-OH
Ser-Tyr-Ala-Phe-His-Pro-OH
Leu-Asn-Leu-Tyr-Met-Pro-OH
Gly-Ser-Ala-Glu-Pro-OH
Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Pro-OH
Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Pro-OH
Z = benzyloxykarbonyl Fmoc = 9-fluorenylmethoxykarbonyl Chg = L-cyklohexylglycyl • · ·· · • »*·· ·
- 51Nle = L-norleucinyl
Hyn = L-6-hydroxynorleucinyl
Příklad 14: Příprava Fmoc-Pro-Ala-Gly-Pro-Dox
Fmoc-pro-Ala-Gly-Pro-OH (44 mg, 0,078 mmol) se rozpustil v bezvodém N,Ndimethylformamidu (10 ml) a hodnota pH se upravila N,N-diisopropylethylaminem na 7,5. Přidal se N-hydroxysuccinimid (1M v DMF, 78 μΙ, 0,078 mmol) a směs se ochladila v ledové lázni. Za míchání se přidal dicyklohexylkarbodiimid (1M v DMF, 87 μΙ, 87 μΙ, 0,087 mmol) a roztok se míchal při teplotě 0°C po dobu 1 hodiny.
Doxorubicin*HCI (25 mg, 0,043 mmol) se rozpustil ve 20 ml bezvodého DMF a přidal se N,N-diisopropylethylamin (8,2 μΙ, 0,048 mmol). Směs se vstříkla injekční stříkačkou do aktivovaného peptidu. Reakční směs se nachala ohřát na pokojovou teplotu míchala po dobu 48 hodin.
Rozpouštědlo se potom odstranilo a produkt se čistil preparativní RP-HPLC na C18 za použití gradientu vody/acetonitrilu s 0,1% kyselinou trifluoroctovou.
Analytická data: HPLC >90%; ES-MS 1110,5 ([M+Na]+ ; 674,4
Příklad 15: Příprava H-Pro-Ala-Gly-Pro-Dox
Fmoc-PAGP-Dox (připraven v příkladu 14, 44 mg, 0,040 mmol) se rozpustil v THF/diethylaminu (2:1, 20 ml) při teplotě 0°C a míchal 2 hodiny. Rozpouštědlo se odstranilo a produkt se čistil preparativní RP-HPLC na C18 za použití gradientu vody/acetonitrilu se 0,1% kyselinou trifluoroctovou.
Analytická data: HPLC >90%; ES-MS 866,6 [M+H]+; 452,4
Příklad 16: Příprava H-Chg-Pro-Dox
Fmoc-Chg-Pro-OH (46 mg, 0,096 mmol) se rozpustil v bezvodém N,N-dimethylformamidu (10 ml) a Ν,Ν-diisopropylethylaminem se upravila hodnota pH na 7,5. Přidal se N-hydroxysuccinimid (1M v DMF, 96 μΙ, 0,096 mmol) a
- 52směs se ochladila v ledové lázni. Za míchání se přidal dicyklohexylkarbodiimid (1M v DMF, 107 μΙ, 0,107 mmol) a roztok se míchal při teplote 0°C po dobu 1 hodiny.
Doxorubicin*HCI (31 mg, 0,053 mmol) se rozpustil ve 20ml bezvodého DMF a přidal se Ν,Ν-diisopropylethylamin (10 μΙ, 0,059 mmol). Tato směs se vstříkla injekční stříkačkou do aktivovaného peptidu. Reakční směs se ohřála na pokojovou teplotu a míchala 48 hodin.
Rozpouštědlo se potom odstranilo a produkt se čistil preparativní RP-HPLC na C18 za použití gradientu voda/acetonitril s 0,1% kyselinou trifluoroctovou.
Lyofilizovaný produkt se rozpustil v THF/diethylaminu (2:1, 20 ml) při teplotě 0°C a míchal 2 hodiny. Rozpouštědlo se odstranilo a produkt se čistil preparativní RP-HPLC na C18 za použití gradientu vody/acetonitril s 0,1% kyselinou trifluoroctovou.
Analytická data: HPLC >90%; ES-MS 780,2 ([M+H]+); 366,4
Následující tabulka zobrazuje konjugáty peptid-doxorubicin, které se připravily analogicky a zahrnuje data štěpení FAPa (po 20 h).
Tabulka 4
OH
R1 Štěpení FAP
Z-Gly- > 95%
Z-Pro-Ala-Gly- > 95%
Fmoc-Pro-Ala-Gly- > 95%
H-Pro-Ala-Gly- ca. 11%
H-Chg- > 95%
H-NIe- > 95%
H-Hyn- > 95%
Z = benzyloxykarbonyl Fmoc = 9-fluorenylmethoxykarbonyl Chg = L-cyklohexylglycyl Nle = L-norleucinyl
Hyn = L-6-hydroxynorleucinyl
Příklad 17: Příprava N-Cbz-Gly-Pro-Melfalanu
N-Cbz-Gly-Pro-OH (22 mg, 0,072 mmol) se rozpustil v bezvodém N,N-dimethylformamidu (8 ml) Ν,Ν-diisopropylethylaminem se upravil hodnota pH na
7,5. Přidal se N-hydroxysuccinimid (1M v DMF, 72 μΙ, 0,072 mmol) a směs se ochladila v ledové lázni. Za míchání se přidal dicyklohexylkarbodiimid (1Mv DMF, 67 μΙ, 0,67 mmol) a roztok se míchal při teplotě 0°C po dobu 2 hodin.
Melfalan (14,7 mg, 0,048 mmol) se rozpustil ve 30 ml bezvodého DMF a přidal se Ν,Ν-diisopropylethylamin (12,3 μΙ, 0,072 mmol). Směs se vstříkla
- 54• · · · · · « ····· · · ·· · · • · · · · · • ··· ··· ·· ··· injekční stříkačkou do aktivovaného peptidu. Reakční směs se ohřála na pokojovou teplotu a míchala 24 hodin.
Rozpouštědlo se potom odstranilo a produkt se čistil preparativní RP-HPLC na C18 za použití gradientu vody/acetonitril s 0,1% kyselinou trifluoroctovou. Ananalytická data: HPLC >90%; ES-MS 593,0 ([M+H]+).
Zastupuje:
- 55ftft ftft ftft · • ftft ftft ·· ftftftft • ftft · ft ft·· •••ftftft · ft ftft ft ft • · ft · ft · ft ··· * ··· ftftft ftft ftftft
TV ώθΟΛ — koq).

Claims (21)

  1. Patentové nároky
    1. Sloučenina vzorce (I) (l) nebo její farmaceuticky přiateiná sůl, kde
    R1 znamená zbytek vzorce Cg-A, Cg-B-A nebo Cg-(D)m-B-A, kde
    Cg znamená zakončující skupinu zvolenou ze skupin R5-CO, R5-O-CO-, R5-NH-CO-, R5-SO2- nebo R5-, kde
    R5 je případně substituovaná skupina Ci-Cg -alkyl, C3-C8 -cykloalkyl, aryl, aralkyl nebo heteroaryl;
    A je odvozená z L-prolinu, glycinu, L-norleucinu, L-cyk!ohexylglycinu, L-5-hydroxynorleucinu, L-6-hydroxynorleucinu, L-5-hydroxylysinu, L-argininu nebo L-lysinu; a každá skupina
    B a D nezávisle znamená zbytky odvozené z aminokarboxylových kyselin vzorce -[NR6-(X)P-CO]-, kde X znamená skupinu CR7R8 ,a kde každá skupina R6, R7 a R8 nezávisle znamená atom vodíku, případně substituovanou skupinu Ci-C6 -alkyl, C3-C8 -cyklo-alkyl, aryl nebo heteroaryl, a p je
    1,2,3, 4, 5; nebo každá skupina
    B a D nezávisle znamená zbytky odvozené z cyklických aminokarboxylových kyselin vzorce
    - 56• * « 1 94 t
    49 4 44 99 9 · 49
    9 9 4 9 9 9 4 4
    4 9444 4 9 4 4 4 9 4
    9 4 4 9 9 4 4
    444 4 94 4 449 49 449 kde
    R9 znamená skupinu C1-C6 -alkyl, OH nebo NH2; m je celé číslo od 1 do 10; q je 0, 1 nebo 2; a r je 0, 1 nebo 2;
    Ra a Rb společně s vloženou skupinou N-0 tvoří případně substituovaný, případně benzo- nebo cyklohexanokondenzovaný 3 až 7-členný nasycený nebo nenasycený heterocyklický kruh, ve kterém může být jedna až dvě skupiny CH2 také nahrazeny skupinou NH, atomem O nebo síry;
    R4 znamená atom H, skupinu Ci-C6 -alkyl, C3-C8 -cykloalkyl, aryl nebo hetroaryl; a
    Cyť znamená zbytek cytotoxické nebo cytostatické sloučeniny.
  2. 2. Sloučenina vzorce 1 podle nároku 1, kde je heterocyklický kruh tvořený skupinami Ra, Rb a vloženou skupinou N-C substituován skupinou R2 a R3, kde každá skupina R2 a R3 nezávisle znamená atom vodíku nebo halogenu nebo skupinu C1-C6 -alkyl, C1-C6 alkylamino, di-Ci-C6 -alkylamino, Ci-C6 -alkoxy, thiol, Ci-C6 alkylthio, oxo, imino, formyl, CrC6 - alkoxykarbonyl, aminokarbonyl, C3-C8 -cykloalkyl, aryl nebo heteroaryl.
    ft
    V · ftft • ftft ftftft · ftftft • ftft ftftft
    - 57• ft • ftftft
  3. 3. Sloučenina vzorce IA kde skupiny R1, R2, R3, R4, Cyť jsou definované stejným způsobem jako v některém z předcházejících nároků, a X-Y znamená CHR -CH2,
    CR2=CH, nh-ch2, ch2-nh,-cr2-, ch2-chr2-ch2.
  4. 4. Sloučenina vzorce IA1,
    O
    -Cyť (ÍA1) kde skupiny R1 a Cyťjsou definované stejným způsobem jako v některém z předcházejících nároků.
  5. 5. Sloučenina zvolená ze vzorců IA2, IA3, IA4 a IA5, (IA2) (IA3) (IA4)
    - 58(IA5) kde skupiny R1 a Cyť jsou definované stejným způsobem jako v některém z předcházejících nároků.
    R1
    O
  6. 6. Sloučenina podle některého z předcházejících nároků, kde je skupina
    R1 zvolená ze vzorců (21), (22) a (34),
    Cg-Gly (21)
    Cg-NIe (22)
    Cg-(Xaa)m-Xaa-Gly (34) kde
    Cg znamená atom vodíku nebo zakončovací skupinu zvolenou ze skupin benzoyloxykarbonyl, fenylacetyl, fenylmethylsulfonyl a benzyiaminokarbonyl;
    Xaa znamená zbytek odvozený z aminokarboxylové kyseliny; a m je celé číslo 1 až 6.
  7. 7 Sloučenina podle nároku 6, kde jsou zbytky kyseliny aminoalkanové v konfiguraci (L).
  8. 8. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 7, kde je skupina H2-N-Cyť antracyklinový derivát.
  9. 9. Sloučenina podle nároku 8 zvolená ze vzorců (ÍIIA), (lIIB), (IIIE) a (IIIF):
    -590 OH O
    O
  10. 10. Prekurzor, který může být katalytickým působením FAPa převeden na léčivo; uvedený prekurzor má místo štěpení, které je rozpoznáno FAPa, ale není rozpoznáno proteolytickými enzymy přítomnými v lidských nebo zvířecích tělesných tekutinách, a obsahuje oligomerní část s obsahem dvou, tří nebo čtyř aminokarboxylových zbytků, a cytotoxickou nebo cytostatickou část, kde N-koncová funkční skupina amino je chráněná zakončovací skupinou a C-koncový aminokarboxylový zbytek oligomerní části je zvolen z D-prolinu, L-prolinu, D-hydroxyprolinu a L-hydroxyprolinu a C-koncová funkční skupina karboxy je vázaná na cytotoxickou nebo cytostatickou část amidovou vazbou;
    a uvedené léčivo je za fyziologických podmínek cytotoxické nebo cytostatické.
  11. 11. Sloučenina podle některého z předcházejících nároků pro lékařské použití.
  12. 12. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle některého z nároků 1 až 10 a případně jeden nebo více farmaceuticky přijatelných pomocných látek.
    - 6113. Použití sloučeniny podle některého z nároků 1 až 10 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu rakoviny.
  13. 14. Způsob výroby sloučeniny podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující se t í m, že se provede reakce sloučeniny podle vzorce (V), kde
    R1, Ra a Rb jsou skupiny definované stejným způsobem jako v nároku 1,
    X1 znamená skupinu OH nebo odštěpitelnou skupinu, která je vhodná pro substituci skupinou amino, se sloučeninou
    HN(R4)-Cyť, kde
    Cyť je zbytek cytotoxické nebo cytostatické sloučeniny a skupina R4 je definovaná stejným způsobem jako v nároku 1.
    Způsob výroby sloučeniny podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující se t í m, že se provede reakce sloučeniny vzorce (VI),
    R1 \
    (VI)
    - 62kde
    R1, Ra a Rb jsou skupiny definované stejným způsobem jeko v nároku 1, Y1 znamená skupinu L-COX2, kde
    L je zbytek propojovací skupiny a
    X2 znamená skupinu OH nebo odštěpitelnou skupinu, která je vhodná pro substituci skupinou amino nebo hydroxy, se sloučeninou
    H2N-Cyť nebo se sloučeninou
    HO-Cyť, kde
    Cyť je zbytek cytotoxické nebo cytostatické sloučeniny.
  14. 16. Způsob výroby sloučeniny podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že se provede reakce sloučeniny vzorce (VII), kde
    R1, Ra a Rb jsou skupiny definované stejným způsobem jako v nároku 1, Y2 je skupina vzorce L-OH nebo L-NH2, kde Lje zbytek propojovací skupiny, se sloučeninou X3OC-Cyť,
    - 63kde
    X3 může být skupina OH nebo odštěpitelná skupina, která je vhodná pro substituci skupinou amino nebo hydroxy a kde
    Cyť je zbytek cytotoxické nebo cytostatické sloučeniny.
  15. 17. Způsob výroby sloučeniny podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že se provede reakce sloučeniny vzorce (Vlil), kde
    PG1 je ochranná skupina a ostatní substituenty mají výše uvedený význam, se sloučeninou
    HN(R4)-Cyť, kde
    Cyť je zbytek cytotoxické nebo cytostatické sloučeniny;
    ochranná skupina PG1 se potom odstraní a následně se provede reakce výsledné sloučeniny vzorce (VIIIA)
    R a/
    Cyť (Vlil A) se sloučeninou
    PG2-A-X4
    - 64• · · · ·· • · · · · · · ··· • · · · · · · ···*·* · · · · · • · · · · · • · · * · · · · · · tt · kde
    PG2 je ochranná skupina a
    X4 znamená skupinu OH nebo odštepitelnou skupinu vhodnou pro substituci skupinou amino;
    a pokud je to nezbytné, probíhají další vazebné kroky, dokud se nezíská kompletní sloučenina.
  16. 18. Způsob výroby sloučeniny podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že se provede reakce sloučeniny vzorce
    PG3-N(R4)-L-COX3, kde
    PG3 je ochranná skupina a ostatní substituenty mají výše uvedený význam, se sloučeninou vzorce
    Y4-Cyť, kde
    Cyť je zbytek cytotoxické nebo cytostatické sloučeniny a Y4 znamená skupinu H2N nebo HO;
    ochranná skupina PG3 se potom odstraní a provede se reakce výsledné sloučeniny
    HN(R4)-L-Y4-Cyť se sloučeninou vzorce (Vlil);
    (Vlil) c ··· ···
    - DO- · 999· ♦ * · · ·
    9 9 9 · · • · · · 9 9 9 ··· 9« ochranná skupina PG1 se potom odstraní a potom provede se reakce výsledné sloučeniny vzorce
    R' a/
    N-l—yi-cyť
    I 4
    R se sloučeninou
    PG4-A-X4, kde
    PG4 je ochranná skupina a
    X4 může být skupina OH nebo odštěpitelné skupina vhodná pro substituci skupinou amino;
    a pokud je to nutné, probíhají další vazebné kroky, dokud se nezíská kompletní sloučenina.
  17. 19. Způsob výroby sloučeniny vzorce (I), vyznačující se tím, že se provede reakce sloučeniny vzorce
    PG5-N(R4)-L-Y5, kde
    PG5 znamená ochrannou skupinu,
    Y5 znamená skupinu OH nebo NH2 a substituenty mají výše uvedený význam se sloučeninou vzorce
    X5OC-Cyť, kde
    Cyť zbytek cytotoxické nebo cytostatické sloučeniny a X5 je skupina OH nebo vhodná odštěpitelná skupina;
    - 66·· ·· • · ochranná skupina PG5 se potom odstraní a provede se reakce výsledné sloučeniny
    HN(R4)-L-Y5-CO-Cyť se sloučeninou vzorce (Vlil);
    PG
    O ;b
    X
    R (Vili) ochranná skupina se potom odstraní a provede se reakce výsledné sloučeniny vzorce se sloučeninou
    PG2-A-X4, kde
    PG2 je ochranná skupina a
    X4 znamená skupinu OH nebo odštěpitelnou skupinou vhodnou pro substituci skupinou amino;
    a pokud je to nutné, probíhají další vazebné kroky, dokud se nezíská kompletní molekula.
  18. 20. Sloučenina vzorce VIIIA,
    HN
    O (VIIIA)
    I kde
    Ra, Rb, R4 a Cyťjsou definované stejným způsobem jako v nároku 1.
  19. 21. Způsob léčby rakoviny zahrnující podávání farmaceutického prostředku podle nároku 12 pacientovi.
  20. 22. Způsob léčby rakoviny, kde je prekurzor podle nároku 10 podáván pacientovi.
  21. 23. Použití prekurzorů podle nároku 10 pro výrobu léčiva pro léčbu rakoviny.
CZ20014097A 1999-05-14 2000-05-11 Protinádorové sloučeniny aktivované FAP CZ20014097A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13413699P 1999-05-14 1999-05-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20014097A3 true CZ20014097A3 (cs) 2002-02-13

Family

ID=22461925

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20014097A CZ20014097A3 (cs) 1999-05-14 2000-05-11 Protinádorové sloučeniny aktivované FAP

Country Status (28)

Country Link
US (1) US6613879B1 (cs)
EP (1) EP1180116A2 (cs)
JP (1) JP3607201B2 (cs)
KR (1) KR20020030270A (cs)
CN (1) CN1213058C (cs)
AR (1) AR033792A1 (cs)
AU (1) AU777521B2 (cs)
BG (1) BG106096A (cs)
BR (1) BR0010564A (cs)
CA (1) CA2369933A1 (cs)
CO (1) CO5170516A1 (cs)
CZ (1) CZ20014097A3 (cs)
EA (1) EA005204B1 (cs)
EE (1) EE200100600A (cs)
HK (1) HK1048642B (cs)
HU (1) HUP0202367A3 (cs)
IL (1) IL145798A0 (cs)
MX (1) MXPA01011401A (cs)
MY (1) MY125939A (cs)
NO (1) NO20015536L (cs)
NZ (1) NZ516075A (cs)
PL (1) PL351680A1 (cs)
SK (1) SK16452001A3 (cs)
TW (1) TWI248444B (cs)
UA (1) UA73506C2 (cs)
WO (1) WO2000071571A2 (cs)
YU (1) YU80901A (cs)
ZA (1) ZA200109151B (cs)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR0109266A (pt) 2000-03-15 2003-04-29 Bristol Myers Squibb Pharma Co Composto, composição farmacêutica, método de tratamento de um mamìfero afetado com um câncer, método de liberação de um composto nas células de um mamìfero afetado com um câncer e uso do composto
GB0027551D0 (en) * 2000-11-10 2000-12-27 Boehringer Ingelheim Pharma Anti-tumor compounds
GB0027552D0 (en) * 2000-11-10 2000-12-27 Boehringer Ingelheim Pharma Anti-tumor compounds
WO2002089739A2 (en) * 2001-05-09 2002-11-14 Newbiotics, Inc. Peptide deformylase activated prodrugs
US7091186B2 (en) * 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
EP1333033A1 (en) * 2002-01-30 2003-08-06 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG FAP-activated anti-tumor compounds
US20030211979A1 (en) * 2002-01-30 2003-11-13 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg FAP-activated anti-tumor compounds
AU2003225047A1 (en) * 2002-04-18 2003-11-03 Celmed Oncology (Usa), Inc. Peptide deformylase activated prodrugs
US20040033957A1 (en) * 2002-05-10 2004-02-19 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg FAP-activated anti-tumor prodrugs
EP1506221A2 (en) * 2002-05-10 2005-02-16 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG Fap-activated anti-tumor prodrugs
US20040001801A1 (en) * 2002-05-23 2004-01-01 Corvas International, Inc. Conjugates activated by cell surface proteases and therapeutic uses thereof
JP2006514009A (ja) 2002-11-14 2006-04-27 セルメド オンコロジー （ユーエスエイ）， インコーポレイテッド ペプチドデホルミラーゼ活性化プロドラッグ
GB0310593D0 (en) 2003-05-08 2003-06-11 Leuven K U Res & Dev Peptidic prodrugs
JP2007511467A (ja) 2003-05-14 2007-05-10 タケダ サン ディエゴ インコーポレイテッド ジペプチジルペプチダーゼインヒビター
US7169926B1 (en) 2003-08-13 2007-01-30 Takeda Pharmaceutical Company Limited Dipeptidyl peptidase inhibitors
US7678909B1 (en) 2003-08-13 2010-03-16 Takeda Pharmaceutical Company Limited Dipeptidyl peptidase inhibitors
US7732446B1 (en) 2004-03-11 2010-06-08 Takeda Pharmaceutical Company Limited Dipeptidyl peptidase inhibitors
JP2008501714A (ja) 2004-06-04 2008-01-24 武田薬品工業株式会社 ジペプチジルペプチダーゼインヒビター
WO2006019965A2 (en) 2004-07-16 2006-02-23 Takeda San Diego, Inc. Dipeptidyl peptidase inhibitors
WO2006073167A1 (ja) * 2005-01-07 2006-07-13 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. ピロリジン誘導体
JP2008545661A (ja) * 2005-05-19 2008-12-18 ジェネンテック・インコーポレーテッド 線維芽細胞活性化タンパク質阻害剤化合物および
EP1963537A4 (en) * 2005-12-14 2009-11-11 Ludwig Inst For Cancer Res Ltd METHOD FOR DIAGNOSING RHEUMATOID ARTHRITIS BY DETERMINING FIBROBLASTIC SYNOVIOCYTES FOR FIBROBLAST ACTIVATION PROTEIN
WO2007087131A2 (en) * 2006-01-05 2007-08-02 The Johns Hopkins University Peptide prodrugs
WO2007112347A1 (en) 2006-03-28 2007-10-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Dipeptidyl peptidase inhibitors
WO2008005479A2 (en) * 2006-07-06 2008-01-10 University Of Wyoming Charge reversible polymers
WO2008116053A2 (en) * 2007-03-20 2008-09-25 Trustees Of Tufts College Fap-activated chemotherapeutic compounds, and methods of use thereof
US8563517B2 (en) * 2008-09-12 2013-10-22 Cadila Pharmaceuticals Limited Dipeptidyl peptidase IV (DP-IV) compounds
US20130030359A1 (en) 2010-01-22 2013-01-31 Ascendis Pharma A/S Dipeptide-based prodrug linkers for aromatic amine-containing drugs
DK2525830T3 (en) 2010-01-22 2016-08-15 Ascendis Pharma As DIPEPTID-BASED PRODRUG LINKERS TO ALIFATIC AMINE-CONTAINING MEDICINES
US20150335761A1 (en) * 2012-02-16 2015-11-26 Raymond Firestone Compositions and methods for contraception
AU2013369261B2 (en) * 2012-12-28 2018-08-09 Cobiores Nv Minimally toxic prodrugs
CN105121447B (zh) * 2013-04-19 2018-02-02 暨南大学 长春碱类衍生物及其制备方法和应用
WO2015067923A1 (en) * 2013-11-05 2015-05-14 Astrazeneca Ab Nmda antagonist prodrugs
US10245248B2 (en) 2014-06-13 2019-04-02 Bach Biosciences, Llc FAP-activated therapeutic agents, and uses related thereto
US9737556B2 (en) 2014-06-13 2017-08-22 Trustees Of Tufts College FAP-activated therapeutic agents, and uses related thereto
CN105524141B (zh) * 2015-11-12 2019-11-26 中山大学 一种FAPa激活式肿瘤诊断多肽磁珠复合物的制备与应用
EP3222292A1 (en) 2016-03-03 2017-09-27 Heidelberg Pharma GmbH Amanitin conjugates
CN107043456B (zh) * 2017-04-19 2019-05-17 川北医学院 对氧环己酮与l-苯丙氨酸氮芥共聚物及其应用
CN110128501A (zh) * 2019-05-21 2019-08-16 北京海美源医药科技有限公司 一种靶向fap酶的喜树碱类化合物及其制备方法和应用
CN110128506B (zh) * 2019-05-22 2021-03-30 中国药科大学 一种寡肽及其应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3915800A (en) * 1972-03-30 1975-10-28 Kelco Co Polysaccharide and bacterial fermentation process for its preparation
FR2546163B1 (fr) 1983-05-16 1987-10-09 Centre Nat Rech Scient Nouveaux derives acyles hydrosolubles de peptides ou d'amino-acides, leur preparation et leur application
US5047401A (en) * 1985-09-09 1991-09-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Use of dipeptide alkyl esters to treat GVHD
DE3783966T2 (de) 1986-07-29 1993-05-27 Sunstar Inc Reagens zur pruefung von periodentalen erkrankungen.
US5776892A (en) * 1990-12-21 1998-07-07 Curative Health Services, Inc. Anti-inflammatory peptides
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5866679A (en) 1994-06-28 1999-02-02 Merck & Co., Inc. Peptides
DE19512484A1 (de) * 1995-04-04 1996-10-17 Bayer Ag Kohlenhydratmodifizierte Cytostatika
JP2000506494A (ja) 1995-10-18 2000-05-30 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド 良性前立腺過形成の治療に有用な複合体
EP0914123A4 (en) 1996-05-29 2000-10-11 Prototek Inc THALIDOMIDE PRODUCTS AND METHODS OF USING SAID PRODUCTS AS T CELL MODIFIERS
US5952294A (en) 1996-07-31 1999-09-14 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Peptidyl prodrugs and methods of making and using the same
CA2264227A1 (en) 1996-09-27 1998-04-02 Raymond A. Firestone Hydrolyzable prodrugs for delivery of anticancer drugs to metastatic cells
DE19640970A1 (de) * 1996-10-04 1998-04-16 Bayer Ag Modifizierte Cytostatika
AU773420B2 (en) 1998-12-11 2004-05-27 Medarex, Inc. Prodrug compounds and process for preparation thereof
AU772074B2 (en) 1999-04-28 2004-04-08 Vectramed, Inc. Enzymatically activated polymeric drug conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
EA200101155A1 (ru) 2002-10-31
TWI248444B (en) 2006-02-01
CA2369933A1 (en) 2000-11-30
KR20020030270A (ko) 2002-04-24
YU80901A (sh) 2005-07-19
UA73506C2 (en) 2005-08-15
CO5170516A1 (es) 2002-06-27
WO2000071571A3 (en) 2001-09-07
CN1374969A (zh) 2002-10-16
US6613879B1 (en) 2003-09-02
MXPA01011401A (es) 2002-06-04
JP3607201B2 (ja) 2005-01-05
HK1048642B (zh) 2005-10-28
EE200100600A (et) 2003-02-17
EA005204B1 (ru) 2004-12-30
JP2003500417A (ja) 2003-01-07
IL145798A0 (en) 2002-07-25
SK16452001A3 (sk) 2002-03-05
MY125939A (en) 2006-09-29
EP1180116A2 (en) 2002-02-20
HUP0202367A2 (hu) 2002-11-28
WO2000071571A2 (en) 2000-11-30
BR0010564A (pt) 2002-02-19
AR033792A1 (es) 2004-01-07
NO20015536L (no) 2002-01-10
BG106096A (bg) 2002-05-31
PL351680A1 (en) 2003-06-02
NO20015536D0 (no) 2001-11-13
HUP0202367A3 (en) 2003-10-28
HK1048642A1 (en) 2003-04-11
ZA200109151B (en) 2002-12-17
NZ516075A (en) 2004-03-26
AU6559100A (en) 2000-12-12
WO2000071571A8 (en) 2002-03-07
CN1213058C (zh) 2005-08-03
AU777521B2 (en) 2004-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6613879B1 (en) FAP-activated anti-tumour compounds
US20030055052A1 (en) FAP-activated anti-tumor compounds
JP7417432B2 (ja) 新規リンカー、その製造方法およびその応用
US20020155565A1 (en) FAP-activated anti-tumor compounds
EP1472277A1 (en) Fap-activated anti-tumor compounds
US6844318B2 (en) Peptidase-cleavable, targeted antineoplastic drugs and their therapeutic use
KR20200105840A (ko) EphA2에 특이적인 바이사이클릭 펩티드 리간드
JP2004501875A (ja) トリペプチドプロドラッグ化合物
CN113474045A (zh) Pd-l1特异性的双环肽配体
SK286581B6 (sk) Deriváty dolastatinu 15, farmaceutický prípravok s ich obsahom a ich použitie
WO2002038590A1 (en) Fap-alpha-activated anti-tumor compounds
US20030232742A1 (en) FAP-activated anti-tumor compounds
CN113507961A (zh) FAPα特异性的双环肽配体
Su et al. Development of novel bone targeting peptide–drug conjugate of 13-aminomethyl-15-thiomatrine for osteoporosis therapy
US20030211979A1 (en) FAP-activated anti-tumor compounds
US20040033957A1 (en) FAP-activated anti-tumor prodrugs
WO2003094972A2 (en) Fap-activated anti-tumor prodrugs
JP3939354B2 (ja) 抗腫瘍性ペプチド
WO2002038187A1 (en) Fap-activated anti-tumour prodrug
WO2002038591A1 (en) Fap-activated anti-tumor compounds
WO2019181901A1 (ja) 細胞移植を効率化する化合物
JP2022182687A (ja) ペプチド化合物
CN113439088A (zh) 整联蛋白αvβ3特异性的双环肽配体