SK16452001A3 - FAB-aktivované protinádorové zlúčeniny, ich prekurzory, spôsob ich výroby, farmaceutický prostriedok s ich obsahom, ich použitie a medziprodukty - Google Patents

Description

FAB-aktivované protinádorové zlúčeniny, ich prekurzory, spôsob ich výroby, farmaceutický prostriedok s ich obsahom, ich použitie a medziprodukty

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka oblasti liečenia nádorov podávaním prekurzora, ktorý sa konvertuje na liečivo v mieste nádoru. Konkrétne sa vynález týka prekurzorov, ktoré môžu byť konvertované na liečivo katalytickým pôsobením FAPa, spôsobu ich výroby a farmaceutického použitia.

Doterajší stav techniky

Ľudský fibroblastový aktivačný proteín (FAPa) je bunková povrchová molekula s M_r 95000, ktorá bola pôvodne identifikovaná s monoklonálnou protilátkou (mAb) F19 (Rettig a ďalší (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3110 -3114; Rettig a ďalší (1993) Cancer Res. 53, 3327 - 3335). FAPa cDNA kóduje integrálny membránový proteín typu II s veľkou extracelulámou doménou, trans-membránovým segmentom a krátkym cytoplazmatickým chvostom (Scanlan a ďalší (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5657 - 5661; WO 97/34927). FAPa vykazuje 48% aminokyselinovú sekvenčnú zhodu s T-bunkovým aktivačným antigénom CD26, ktorý je známy aj ako dipeptidyl peptidáza IV (DPPIC; EC 3.4.14.5), s na membránu naviazaným proteínom s dipeptidyl peptidázovou aktivitou (Scanlan a ďalší, citovaný vyššie). FAPa má enzymatickú aktivitu a je členom serínovej proteázovej rodiny, pričom serín 624 je kritický pre enzymatickú funkciu (WO 97/34927). Práca využívajúca membránový prekrývací test odhalila, že FAPa diméry sú schopné štiepiť Ala-Pro-7-amino-4-trifluórmetyl-kumarínový, Gly-Pro-7-4-trifluórmetyl-kumarínový a Lys-Pro-7-amino-4-trifluórmetyl-kumarínový dipeptid (WO 97/34927).

FAPa sa selektívne exprimuje v reaktívnych stromálnych fibroblastoch mnohých histologických typov ľudských epiteliálnych karcinómov, v granulačnom tkanive hojacich sa rán a v malígnych bunkách určitých kostných sarkómov a sarkómov mäkkých tkanív. V normálnych dospelých tkanivách sa vo všeobecnosti r r

-2nevyskytuje detegovateľné FAPa, ale niektoré fetálne mezenchymálne tkanivá prechodne exprimujú túto molekulu. Na rozdiel od toho, väčšina bežných typov epiteliálnych karcinómov, vrátane > 90 % karcinómov prsníka, karcinómov iných ako malých buniek pľúc a kolorektálnych karcinómov, obsahuje FAPa-reaktívne stromálne fibroblasty (Scanlan a ďalší, citovaný vyššie). Tieto FAPa⁺ fibroblasty sprevádzajú novo vytvorené krvné cievy, ktoré tvoria samostatný bunkový kompartment uložený medzi nádorovým kapilárnym endoteliom a bazálnym aspektom malígnych epiteliálnych bunkových klastrov (Welt a ďalší (1994) J. Clin. Oncol. 12(6), 1193-1203). Zatiaľ čo FAPa⁺ stromálne fibroblasty sa nachádzajú tak v primárnych, ako aj v metastatických karcinómoch, testované benígne a premalígne epiteliálne lézie (Welt a ďalší, citovaný vyššie), ako napríklad fibroadenómy prsníka a kolorektálne adenómy, len zriedka obsahujú FAPa⁺ stromálne bunky. Na základe obmedzeného distribučného vzoru FAPa v normálnych tkanivách a jeho uniformnej expresie v podpornej strome mnohých malígnych nádorov, iniciovali sa klinické pokusy s ¹³¹l-značenou mAb F19 u pacientov s metastatickým karcinómom hrubého čreva (Welt a ďalší, citovaný vyššie).

Pri nových rakovinových terapiách založených na cytotoxických alebo cytostatických liekoch sa hlavný dôraz kladie na zvýšenie terapeutického indexu zlepšením účinnosti cytotoxických alebo cytostatických činidiel pri zabíjaní nádorového tkaniva a/alebo redukciou toxicity cytotoxických alebo cytostatických činidiel pre normálne tkanivo. Na zvýšenie špecificity zabíjania nádorového tkaniva a na zníženie toxicity v normálnom tkanive môžu byť navrhnuté spúšťacie mechanizmy tak, aby sa toxické činidlá, syntetizované vo forme prekurzora alebo v neaktívnych formách, aktivizovali, keď je to potrebné a tam, kde je to potrebné, najmä v nádorových tkanivách (Panchal (1998) Biochem. Pharmacol. 55, 247-252). Spúšťacie mechanizmy môžu zahŕňať buď exogénne faktory, ako napríklad svetlo alebo chemické látky, alebo endogénne bunkové faktory, ako napríklad enzýmy s expresiou obmedzenou na nádorové tkanivá. Ďalší koncept, ktorý bol podrobnejšie rozpracovaný, sa nazýva protilátkou riadená enzýmová prekurzorová terapia (AEPT) alebo protilátkou riadená katalýza (ADC) (Huennekens (1994) Trend Biotechnol. 12, 234 - 239; Bagshawe (1994) Clin. Pharmacokinet. 27, 368 - 376;

-3Wang a ďalší (1992) Cancer Res. 52, 4484 - 4491; Sperker a ďalší (1997) Clin. Pharmacokinet. 33(1), 18-31). Pri ADEPT sa protilátka proti antigénu asociovanému s nádorom používa na nasmerovanie špecifického enzýmu na miesto nádoru. Enzým lokalizovaný v nádore konvertuje následne podaný prekurzor na aktívne cytotoxické činidlo. Konjugát protilátky a enzýmu (AEC) sa viaže na cieľový antigén na bunkových membránach alebo na voľný antigén v extracelulárnej tekutine (ECF). Časový interval medzi podaním AEC a podaním prekurzora umožňuje, aby AEC vymizol z normálnych tkanív, aby prekurzor nebol aktivovaní v normálnych tkanivách alebo v krvi. Avšak s vlastnosťami AEC sú spojené niektoré nevýhody AEPT (Bagshawe, citovaný vyššie). Napríklad u ľudí sa len malá frakcia podanej dávky cieleného AEC naviaže na nádorové tkanivo a zvyšok je distribuovaný v telesných tekutinách, z ktorých vymizne s významným časovým odstupom. Aj veľmi malé koncentrácie nenaviazaného enzýmu môžu katalyzovať dostatočné množstvo prekurzora na to, aby mal toxické účinky, pretože plazmatický objem a normálny ECF objem je oveľa väčší ako nádorový ECF objem. V mnohých prípadoch môže byť AEC aj imunogénny, čo bráni opakovanému podávaniu.

Medzinárodné prihlášky vynálezov WO 97/12624 a WO 97/14416 opisujú oligopeptidy zahŕňajúce nasledujúce penta- a hexapeptidy (sekv. č.: 151 a 177: hArg-Tyr-GIn-Ser-Ser-Pro; hArg-Tyr-GIn-Ser-Pro) obsahujúce aminokyselinové sekvencie, ktoré sú rozoznávané a proteolyticky štiepené voľným antigénom špecifickým pre prostatu (PSA), a terapeutické činidlá, ktoré obsahujú konjugáty takýchto oligopeptidov a známych terapeutických alebo cytotoxických činidiel. Tieto oligopeptidové konjugáty, ktoré obsahujú aspoň jednu glutamín-serínovú časť, sú užitočné len na liečbu rakoviny prostaty.

Predložený vynález riešil problém poskytnutia spôsobov a prostriedkov na zlepšenie tolerancie normálnych tkanív voči cytotoxickým alebo cytostatickým činidlám so známou účinnosťou voči širokému rozsahu nádorových tkanív.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu sú enzýmom aktivované protinádorové zlúčeniny.

Vynález konkrétne poskytuje prekurzory, ktoré sú schopné konvertovať sa na liečivá

-4katalytickou aktivitou endogénneho fibroblastového proteínu alfa (FAPa), o ktorom sa ukázalo, že sa nachádza v ľudských nádorových tkanivách. Výhodne má prekurzor podľa predloženého vynálezu, ktorý sa môže konvertovať na liečivo prostredníctvom katalytickej aktivity FAPa, štiepne miesto, ktoré je rozoznávané FAPa, a uvedené liečivo je cytotoxické alebo cytostatické voči nádorovým bunkám vo fyziologických podmienkach.

V kontexte tohto vynálezu znamená výraz liečivo chemickú zlúčeninu, ktorá môže byť podávaná ľuďom alebo zvieratám ako pomoc pri liečbe ochorenia. Liečivom je najmä aktívna farmakologická látka.

Výraz cytotoxická zlúčenina znamená chemickú zlúčeninu, ktorá je toxická pre živé bunky, najmä liečivo, ktoré ničí alebo zabíja bunky. Výraz cytostatická zlúčenina znamená zlúčeninu, ktorá brzdí bunkový rast a rozmnožovanie, a tým inhibuje proliferáciu buniek. Príklady cytotoxických alebo cytostatických zlúčenín vhodných pre predložený vynález zahŕňajú antracyklínové deriváty, ako napríklad doxorubicín, analógy metotrexátu, ako napríklad metotrexát, pritrexím, trimetrexát alebo DDMP, melfalán, analógy cisplatínu, ako napríklad cisplatín, JM216, JM335, bis(platinum) alebo karboplatín, analógy purínov a pyrimidínov, ako napríklad cytabrín, gemcitabín, azacitidín, 6-tioguanín, flurdarabín alebo 2-deoxykoformycín a analógy iných chemoterapeutických činidiel, ako napríklad 9-aminokaptotecín, D,Laminoglutetimid, trimetoprim, pyrimetamín, mitomycín C, mitoxantrón, cyklofosfanamid, 5-fluóruracil, extramustín, podofylotoxín, bleomycín alebo taxol.

Výraz prekurzor označuje zlúčeninu, ktorá po podaní musí podstúpiť chemickú konverziu prostredníctvom metabolických procesov pred tým, ako sa stane aktívnym farmakologickým činidlom. Prekurzor je najmä prekurzorom liečiva. V kontexte predloženého vynálezu je prekurzor významne menej cytotoxický alebo cytostatický ako liečivo, na ktoré je konvertovaný katalytickým účinkom FAPa. Priemerný odborník v oblasti pozná metódy stanovovania cytotoxicity, pozri napr. príklad 6, alebo Mosmann ((1983) J. Immun. Meth. 65, 55-63). Výhodne je prekurzor aspoň trikrát menej cytotoxický ako liečivo pri in vitro teste.

Liečivo cytostatické alebo cytotoxické vo fyziologických podmienkach znamená chemickú zlúčeninu, ktorá je cytostatická alebo cytotoxická v živom

-5ľudskom alebo zvieracom tele, najmä zlúčeninu, ktorá zabíja bunky alebo inhibuje proliferáciu buniek v živom ľudskom alebo zvieracom tele.

Prekurzor majúci štiepne miesto, ktoré je rozoznávané FAPa znamená prekurzor, ktorý slúži ako substrát pre enzymatickú aktivitu FAPa. Enzymatická aktivita FAPa môže katalyzovať najmä štiepenie kovalentnej väzby prekurzora vo fyziologických podmienkach. Rozštiepením tejto kovalentnej väzby sa prekurzor konvertuje na liečivo, buď priamo, alebo nepriamo. Nepriama aktivácia by nastala, ak by štiepny produkt FAPa katalytického kroku nebol farmakologicky aktívnym činidlom, ale musel by sa podrobiť ďalšiemu reakčnému kroku, napr. hydrolýze, aby sa aktivizoval. Výhodnejšie je štiepne miesto prekurzora špecificky rozoznávané FAPa, ale nie inými proteolytickými enzýmami nachádzajúcimi sa v ľudskom alebo živočíšnom tele. Štiepne miesto je tiež výhodne rozoznávané FAPa, ale nie proteolytickými enzýmami nachádzajúcimi sa v ľudských alebo živočíšnych telesných tekutinách, najmä v plazme. V najvýhodnejšom uskutočnení je prekurzor stabilný v plazme, iných telesných tekutinách alebo tkanivách, v ktorých sa nenachádza biologicky aktívny FAPa, alebo v ktorých nie je detegovateľný. Výhodne sa pri in vitro teste uskutočňovanom podľa tu uvedeného príkladu 7 v roztoku obsahujúcom 10 % objemových ľudskej plazmy po 8 hodinách pri 37 °C ešte nachádza viac ako 50 %, výhodnejšie viac ako 80 %, výhodnejšie viac ako 90 % prekurzora. Najvýhodnejšie by malo byť štiepne miesto špecifické pre FAPa. Vo výhodnom uskutočnení obsahuje štiepne miesto L-prolínový zvyšok, ktorý je spojený s cytotoxickým alebo cytostatickým liečivom prostredníctvom amidovej väzby. Príkladom tejto triedy je doxorubícín-peptidový konjugát. FAPa môže katalyzovať štiepenie peptidovej väzby medzi C-koncovým aminokyselinovým zvyškom, ktorým je výhodne L-prolín, a cytotoxickou alebo cytostatickou zlúčeninou.

Výhodné zlúčeniny vykazujú najmenej 10% konverziu na voľné liečivo v štandardných podmienkach, ktoré sú uvedené nižšie. Výhodnejšie sú zlúčeniny, ktoré vykazujú najmenej 20% konverziu na voľné liečivo v štandardných podmienkach. Ešte výhodnejšie sú zlúčeniny, ktoré vykazujú najmenej 50% konverziu na voľné liečivo v štandardných podmienkach. V tomto kontexte sú štandardné podmienky definované nasledovne: Každá zlúčenina sa rozpustí v 50 * P

-6mM Hepes tlmivého roztoku, 150 mM NaCI, pH 7,2 do konečnej koncentrácie 5 μΜ a inkubuje sa so 100 ng CD8FAPa (pozri príklad 4) 24 hodín pri 37 °C. Uvoľňovanie voľného liečiva prostredníctvom CD8FAPa sa stanovuje podľa príkladu 5.

Výhodne sa predložený vynález týka zlúčeniny všeobecného vzorca I

alebo jej farmaceutický prijateľnej soli, kde

R¹ znamená aminoalkanoyl, oligopeptidoyl, najmä di- alebo tripeptidoylovú skupinu, ktorej N-koncová aminoskupina môže byť pripojená na ukončovaciu skupinu;

R^a a R^b spolu so spojovacou N-C skupinou tvoria voliteľne substituovaný, voliteľne benzo- alebo cyklohexano-kondenzovaný 3- až 7-členný nasýtený alebo nenasýtený heterocyklický kruh, v ktorom môže byť jedna z dvoch CH₂ skupín nahradená NH, O alebo S;

R⁴ znamená H, CrC6-alkyl, Cs-Ce-cykloalkyl, aryl alebo heteroaryl; a

Cyť znamená zvyšok cytotoxickej alebo cytostatickej zlúčeniny, s podmienkou, že /V2-acetyl-L-homoarginyl-L-tyrozyl-L-glutaminyl-L-seryl-/V-[2,3,6-trideoxy-1-0[(1 S,3S)-1,2,3,4,6,11-hexahydro-3,5,12-trihydroxy-3-(hydroxyacetyl)-10-metoxy6.11- dioxo-1-naftacenyl]-alfa-L-lyxo-hexopyranoz-3-yl]-L-prolínamid; a /V2-acetyl-L-homoarginyl-L-tyrozyl-L-glutaminyl-L-seryl-L-seryl-/V-[2,3,6-trideoxy-1O-[(1 S,3S)-1,2,3,4,6,11 -hexahydro-3,5,12-trihydroxy-3-(hydroxyacetyl)-10-metoxy6.11- dioxo-1-naftacenyl]-alfa-L-lyxo-hexopyranoz-3-yl]-L-prolínamid sú vylúčené.

Výnimočne výhodné sú tie zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorých R¹ znamená zvyšok vzorca Cg-A, Cg-B-A alebo Cg-(D)m-B-A, v ktorom Cg znamená atóm vodíka alebo ukončovaciu skupinu vybranú zo skupiny, ktorá obsahuje R⁵-CO, R^S-O-CO-, R⁵-NH-CO-, R⁵-SO2- alebo R⁵, kde R⁵ znamená

-7voliteľne substituovanú Ci-C6-alkylovú, Cs-Ce-cykloalkylovú, arylovú, aralkylovú alebo heteroarylovú skupinu;

výhodne Cg znamená acetyl, benzoyl, D-alanyl, (R)-H2NCH(CH3)- alebo

H2NCOCH2CH2- substituent alebo inú ukončovaciu skupinu na ochranu N-koncovej amino funkčnej skupiny;

A, B a D, každý nezávisle, znamenajú substituenty odvodené od aminokarboxylových kyselín vzorca -[NR⁶-(X)_P-CO]-, kde X znamená CR⁷R⁸, a kde R⁶, R⁷ a R⁸, každý nezávisle, znamenajú atóm vodíka, voliteľne substituovanú Ci-Ce-alkylovú, C3-Ce-cykloalkylovú, arylovú alebo heteroarylovú skupinu, a kde p je 1, 2, 3, 4, 5; alebo A, B a D, každý nezávisle, znamenajú substituenty odvodené od cyklických aminokarboxylových kyselín vzorca:

kde

R⁹ znamená Ci-C6-alkyl, OH alebo NH2, m je prirodzené číslo od 1 do 10, q je 0,1 alebo 2; a r je 0,1 alebo 2.

Výhodnejšie sú tie zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorých R⁶, R⁷ a R⁸, každý nezávisle, znamenajú atóm vodíka alebo CH3-, CH3CH2-, CH3CH2CH2-, (CH₃)₂CH-, CH3CH2CH2CH2-, (CH₃)₂CHCH2-, CH₃CH₂CH(CH₃)-, (CH₃)₃C-, HOCH2-, CH₃CH(OH)-, CH₃CH(OH)CH₂CH₂-, HOCH2CH2CH2CH2-, H2NCH2CH2CH2-, H2NCH2CH2CH2CH2-, H₂NCH2CH(OH)CH2CH₂-, H₂NC(=NH)NHCH2CH2CH₂-, HSCH2-, CH3SCH2CH2-, HOOCCH2-, HOOCCCH2CH2-, H₂NC(=O)CH₂-, H₂NC(=O)CH₂CH2-, benzyl, para-hydroxy-benzyl,

alebo

NH

CH,

-8cyklohexyl, fenyl, p je 1, a kde konfigurácia v CR⁷R⁸ môže byť R alebo S; ak R⁷ neznamená H, potom R⁸ výhodne znamená H; R⁶ výhodne znamená H; ak p je väčšie ako jedna, R⁷ a R⁸ výhodne znamenajú H.

Ďalším výhodným uskutočnením predloženého vynálezu sú tie zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorých je heterocyklický kruh, ktorý je tvorený R^a, R^b a spojovníkom N-C, substituovaný R² a R³, kde R² a R³, každý nezávisle, znamenajú atóm vodíka alebo halogénu alebo Ci-C₆-alkylovú, Ci-C₆-alkylamino, di-Ci-C₆alkylamino, C_rC6-alkoxy, tiol, Ci-Ce-alkyltio, oxo, imino, formylovú, Ci-C₆-alkoxykarbonylovú, aminokarbonylovú, C3-Ce-cykloalkylovú, arylovú alebo heteroarylovú skupinu.

Ak nie je uvedené inak, vynález zahrnuje jednoduché stereoizoméry, ako aj zmesi alebo racemáty stereoizomérov.

CrC6-alkyľ vo všeobecnosti znamená nerozvetvený alebo rozvetvený uhľovodíkový radikál s 1 až 6 atómami uhlíka.

Výraz voliteľne substituovaný tak ako je tu používaný s ohľadom na skupinu alebo časť, znamená skupinu alebo časť, ktoré môžu byť voliteľne substituované jedným alebo niekoľkými atómami halogénu, hydroxylovými, amino, CrCe-alkylamino, di-CrC6-alkyl-amino, Ci-Cú-alkyloxy, tiolovými, Ci-C₆-alkyl-tio, =0, =NH, -CHO, -COOH, -CONH₂, -NHC(=NH)NH_2i C₃-C₈-cykloalkylovými, arylovými alebo heteroarylovými substituentami, ktoré môžu byť navzájom identické alebo rôzne.

Ako príklad môžu byť uvedené nasledujúce radikály:

Metyl, etyl, propyl, 1-metyletyl (izopropyl), butyl, 1-metylpropyl, 2-metylpropyl,

1.1- dimetyletyl, n-pentyl, 1-metylbutyl, 2-metylbutyl, 3-metylbutyl, 1,1-dimetylpropyl,

1.2- dimetylpropyl, 2,2-dimetylpropyl, 1-etylpropyl, hexyl, 1-metylpentyl, 2-metylpentyl, 3-metylpentyl, 4-metylpentyl, 1,1-dimetylbutyl, 1,2-dimetylbutyl,

1.3- dimetylbutyl, 2,2-dimetylbutyl, 2,3-dimetylbutyl, 3,3-dimetylbutyl, 1-etylbutyl, 2-etylbutyl, 1,1,2-trimetylpropyl, 1,2,2-trimetylpropyl, 1-etyl-1-metylpropyl a 1-etyl-2metylpropyl, HOCH₂-, CH₃CH(OH)-, CH₃CH(OH)CH₂CH₂-, HOCH₂CH₂CH₂CH₂-, H₂NCH₂CH₂CH₂-, H₂NCH₂CH₂CH₂CH₂-, H₂NCH₂CH(OH)CH₂CH₂-, H₂NC(=NH)nhch₂ch₂ch₂-, hsch₂-, ch₃sch₂ch₂-, hoocch₂-, hoocch₂ch₂-, H₂NC(=O)CH₂-, H₂NC(=O)CH₂CH₂-, benzyl, para-hydroxy-benzyl,

Ak je Ci-C6-alkylová skupina substituovaná, substituentami sú výhodne hydroxyl, amino, dimetylamino, dietylamino, tiol, metyl-tiol, metoxy, etoxy, =0, =NH, -CHO, -COOH, -COOCH3, -COOCH2CH3, -CONH2, -NHC(=NH)NH₂, cyklohexyl, fenyl, benzyl, para-hydroxy-benzyl,

Ak je CrC6-alkyl substituovaný arylom alebo heteroarylom, výhodne Ci-Cealkyl znamená C1, výhodnejšie metylénovú skupinu.

Výrazy aminoalkanoyľ a oligopeptidoyľ vrátane di- alebo tripeptidoylu, ako sú tu používané vo vzťahu k radikálu R1, opisujú radikál, v ktorom aminokyselina alebo oligomér obsahujú najviac 12, výhodne 2 alebo 3 aminokyselinové substituenty pripojené C-koncom na atóm dusíka v heterocyklickom kruhu prostredníctvom amidovej väzby.

Pre priemerného odborníka v oblasti chémie aminokyselín a oligopeptidov bude zrejmé, že určité aminokyseliny sa môžu nahradiť inými homologickými, izosterickými a/alebo izoelektrickými aminokyselinami, pričom pri modifikácii ostáva zachovaná biologická aktivita pôvodnej aminokyseliny alebo oligopeptidu. Ako náhrada zodpovedajúcej prirodzenej aminokyseliny môžu byť využité aj určité neprirodzené a modifikované prirodzené aminokyseliny. Tak môže byť napríklad tyrozín nahradený 3-jódtyrozínom, 2- alebo 3-metyltyrozínom, 3-fluórtyrozínom.

Výraz ukončovacia skupina tak ako je používaný tu v súvislosti so skupinou, ktorá je pripojená na N-koncový atóm dusíka aminoalkanoylovej alebo

-10oligopeptidoylovej skupiny radikálu R¹, definuje skupinu alebo časť, ktorá redukuje alebo eliminuje enzymatickú degradáciu zlúčenín podľa predloženého vynálezu účinkom aminopeptidáz, ktoré sa nachádzajú v krvnej plazme teplokrvných živočíchov. Vhodné ukončovacie skupiny zahŕňajú Ci-Ci₀-alkanoyl, C6-Cie-aryl-Cr Cio-alkanoyl, C6-Cie-aryl-Ci-Cio-alkylsulfonyl. Takéto ukončovacie skupiny zahŕňajú aj hydrofilné blokovacie skupiny, ktoré sa vyberajú v prípade prítomnosti hydrofilnej funkcionality. Takéto ukončovacie skupiny zvyšujú hydrofilnosť zlúčenín podľa predloženého vynálezu, a tým zosilňujú ich rozpustnosť vo vodných médiách. Tieto hydrofilicitu zosilňujúce ukončovacie skupiny sú výhodne vybrané zo skupiny, ktorá obsahuje hydroxylovaný alkanol, polyhydroxylovaný alkanoyl, hydroxylovaný aroyl, hydroxylovaný arylalkanoyl, polyhydroxylovaný aroyl, polyhydroxylovaný arylalkanoyl, polyetylénglykol, glykozyláty, sacharidy a crown-étery.

C3-Ca-cykloalkyľ vo všeobecnosti predstavuje cyklický uhľovodíkový radikál majúci 3 až 8 atómov uhlíka, ktoré môžu byť voliteľne substituované jedným alebo viacerými hydroxylovými, amino, Ci-C6-alkyl-amino, di-Ci-C6-alkyl-amino, C1-C6alkyl, Ci-Ce-alkyloxy, tiolovými, Ci-C6-alkyl-tio, =0, =NH, -CHO, -COOH, -COOCH3, -COOCH2CH3, -CONH2, -NHC(=NH)NH2 alebo halogénovými substituentami, ktoré môžu byť navzájom identické alebo rozdielne.

Heterocyklický kruh tak ako je používaný tu v súvislosti so skupinou tvorenou R^a a R^b spolu so spojovacou N-C skupinou, vo všeobecnosti predstavuje 3- až 7-členný, výhodne 4-, 5- alebo 6-členný nearomatický heterocyklický kruhový systém obsahujúci jeden atóm dusíka a voliteľne 1 alebo 2 ďalšie heteroatómy vybrané zo skupiny, ktorá obsahuje dusík, kyslík a síru, ktoré môžu byť substituované jedným alebo niekoľkými atómami halogénu alebo Ci-C₆-alkylovou, CrC₆-alkylamino, di-CrC6-alkylamino, CrC₆-alkoxy, tiolovou, Ci-C₆-alkyltio, oxo, imino, formylovou, CrC6-alkoxykarbonylovou, aminokarbonylovou, C3-Ce-cykloalkýlovou, arylovou alebo heteroarylovou skupinou, ktoré môžu byť navzájom identické alebo rozdielne, a ktoré môžu byť voliteľne benzo- alebo cyklohexanokondenzované. Takéto heterocyklické kruhy sú výhodne azetidínové alebo sú odvodené od úplne alebo čiastočne hydrogenovanej pyrolovej, pyridínovej, tiazolovej, izoxazolovej, pyrazolovej, imidazolovej, indolovej, benzimidazolovej, indazolovej, pyridazínovej, pyrimidínovej, pyrazínovej skupiny. Najvýhodnejší je

-11 azetidín, pyrolidín, 3,4-dehydropyrolidín, piperidín, hexahydro-1H-azepín, oktahydroindol, imidazolidín, tiazolidín.

Ak je takýto heterocyklický kruh substituovaný, substituentami sú výhodne metyl, etyl, propyl, 1-metyletyl (izopropyl), butyl, 1-metylpropyl, 2-metylpropyl, 1,1dimetyletyl, hydroxyl, amino, dimetyl-amino, dietyl-amino, tiol, metyl-tiol, metoxy, etoxy, -CHO, -COOH, -COOCH₃, -COOCH2CH3 alebo -CONH₂.

Aryl vo všeobecnosti predstavuje aromatický kruhový systém so 6 až 10, výhodne 6, atómami uhlíka, ktoré môžu byť voliteľne substituované jedným alebo niekoľkými hydroxylovými, amino, Ci-C6-alkyl-amino, di-Ci-C₆-alkyl-amino, Οι-Οβalkyl, Ci-C6-alkyloxy, tiolovými, Ci-C6-alkyl-tio, -CHO, -COOH, -COOCH3, -COOCH2CH3, -CONH2 alebo halogénovými substituentami, ktoré môžu byť navzájom identické alebo rozdielne, a ktoré môžu byť voliteľne benzokondenzované. Arylové substituenty môžu byť výhodne odvodené od benzénu, pričom výhodnými príkladmi sú fenyl, 2-hydroxy-fenyl, 3-hydroxy-fenyl, 4-hydroxyfenyl, 4-amino-fenyl, 2-amino-fenyl, 3-amino-fenyl.

Ak je aryl substituovaný, výhodnými substituentami sú metyl, etyl, propyl, 1-metyletyl (izopropyl), butyl, 1-metylpropyl, 2-metylpropyl, 1,1-dimetyletyl, hydroxyl, amino, dimetyl-amino, dietyl-amino, tiol, metyl-tiol, metoxy, etoxy, -CHO, -COOH, -COOCH3, -COOCH2CH3 alebo -CONH₂.

Heteroaryl vo všeobecnosti predstavuje 5 až 10-členný aromatický kruhový systém obsahujúci 1 až 5 heteroatómov vybraných zo skupiny, ktorá zahŕňa dusík, kyslík alebo síru, ktorý môže byť voliteľne substitovaný jedným alebo niekoľkými hydroxylovými, amino, CrCe-alkyl-amino, di-Ci-Ce-alkyl-amino, Ci-C6-alkyl, C1-C6alkyloxy, tiolovými, C-i-Ce-alkyl-tio, -CHO, -COOH, -COOCH3, -COOCH2CH3, -CONH2 alebo halogénovými substituentami, ktoré môžu byť navzájom identické alebo rozdielne, a ktoré môžu byť voliteľne benzokondenzované. Heteroarylové substituenty sú výhodne odvodené od furánu, pyrolu, tiofénu, pyridínu, tiazolu, izoxazolu, pyrazolu, imidazolu, benzofuránu, tianafténu, indolu, benzimidazolu, indazolu, chinolínu, pyridazínu, pyrimidínu, pyrazínu, chinazolínu, pyránu, purínu, adenínu, guanínu, tymínu, cytozínu, uracilu.

Ak je heteroaryl substituovaný, substituentami sú výhodne metyl, etyl, propyl,

1-metyletyl (izopropyl), butyl, 1-metylpropyl, 2-metylpropyl, 1,1-dimetyletyl, hydroxyl,

-12amino, dimetyl-amino, dietyl-amino, tiol, metyl-tiol, metoxy, etoxy, -CHO, -COOH,

-COOCH3, -COOCH₂CH₃ alebo -CONH₂.

Zvyšok cytotoxickej alebo cytostatickej zlúčeniny znamená zlúčeninu H₂N-Cyť, ktorá sa uvoľňuje po rozštiepení amidovej väzby znázornenej vo všeobecnom vzorci I, a ktorá je buď ako taká cytotoxická alebo cytostatická, alebo ktorá môže byť konvertovaná na cytotoxickú alebo cytostatickú zlúčeninu v následnom kroku.

V druhom prípade môže byť -Cyť zvyšok vzorca -L-Cyt, kde L znamená spojovníkový zvyšok odvodený od bifunkčnej molekuly, napríklad diamin H₂N-UNH₂, aminoalkohol H₂N-Ľ-OH, napríklad p-aminobenzylalkohol (PABOH), aminokarbonát, napríklad

OH alebo neprirodzenú aminokarboxykyselinu. Ak má -Cyť vzorec -L-Cyt, enzymatickým štiepením amidovej väzby znázornenej vo vzorci I sa generuje H₂N-Ľ-Cyt. Zlúčenina H₂N-L’-Cyt” môže byť cytotoxická alebo cytostatická ako taká, alebo sa v následnom kroku môže odštiepiť spojovníkový zvyšok od Cyt”, a tým sa uvoľní cytotoxická alebo cytostatická činidlo. Zlúčenina H₂N-Ľ-Cyť’ môže byť napríklad vo fyziologických podmienkach hydrolyzovaná na zlúčeninu H₂N-Ľ-OH a cytotoxickú alebo cytostatickú zlúčeninu H-Cyt”, ktorá je aktívnou terapeutickou látkou (v nasledujúcom texte sa používa len výraz Cyť, tak pre Cyť, ako aj pre Cyt, a len výraz L, tak pre L, ako aj pre Ľ, v záujme zjednodušenia).

Farmaceutický prijateľné soli zlúčenín podľa predloženého vynálezu zahŕňajú bežné netoxické soli vytvorené z netoxických anorganických alebo organických kyselín. Takéto bežné netoxické soli zahŕňajú napríklad soli anorganických kyselín, ako kyseliny chlorovodíkovej, bromovodíkovej, sírovej, sulfámovej, fosforečnej, dusičnej a podobne; a soli pripravené z organických kyselín, ako napríklad kyseliny octovej, propiónovej, jantárovej, glykolovej, steárovej, mliečnej, jablčnej, vínnej,

-13citrónovej, askorbovej, maleínovej, fenyloctovej, glutámovej, benzoovej, salicylovej, sulfanilovej, oxalotrifluóroctovej a podobne.

Výhodnými zlúčeninami všeobecného vzorca I sú zlúčeniny vzorca IA

kde R², R³, R⁴, Cyť sú definované vyššie,

R¹ znamená aminoalkanoylovú alebo oligopeptidoylovú skupinu, a

X-Y znamená CHR²-CH2, CR²=CH, NH-CH2, CH₂-NH, -CR², CH2-CHR²-CH2; s podmienkou, že R¹ znamená aminoalkanoylovú, di- alebo tripeptidoylovú skupinu, alebo R¹ znamená oligopeptidoyl s viac ako troma aminokyselinovými časťami, ktoré neobsahujú Gln-Ser aminokyselinovú sekvenciu v prípade, že X-Y znamená CH₂-CH₂ skupinu.

Výhodne je a uhlíkový atóm cyklického aminokyselinového zvyšku racemický, tzn. má (R/S) konfiguráciu, najvýhodnejšie (S) konfiguráciu. Vo výnimočne výhodnom uskutočnení má a uhlíkový atóm (S) konfiguráciu a R² znamená H. V prípade, že R² znamená OH, je výhodne v trans polohe.

R², R³ výhodne znamenajú atóm vodíka, metylovú, etylovú, propylovú, izopropylovú, fenylovú, metoxy, etoxy alebo hydroxylovú skupinu, najvýhodnejšie atóm vodíka. R⁴ výhodne znamená atóm vodíka alebo metylovú, etylovú, propylovú, izopropylovú alebo fenylovú skupinu, najvýhodnejšie atóm vodíka.

Výnimočne výhodné zlúčeniny vzorca IA sú vybrané zo zlúčenín vzorca IA1, IA2, IA3, IA4 a IA5

(IA1)

(ΙΑ2) (ΙΑ3) (ΙΑ4) (ΙΑ5) hfrN-Cyť znamená výhodne antracyklínový derivát všeobecného vzorca II

(H) kde

R^c znamená Ci-C₆-alkyl, CrC₆-hydroxyalkyl alebo CrCe-alkanoyloxy-CrCe-alkyl, najmä metyl, hydroxymetyl, dietoxyacetoxymetyl alebo butyryloxymetyl;

R^d znamená vodík, hydroxy alebo CrC₆-alkoxy, najmä metoxy;

-15jeden z R^e a R^f znamená atóm vodíka; a druhý znamená atóm vodíka alebo hydroxy alebo tetrahydropyrán-2-yloxy (OTHP) skupinu.

Výnimočne výhodné sú nasledujúce zlúčeniny všeobecného vzorca II

Rc	Rd	Re	Rf	Cyt
CH2OH	och3	H	OH	doxorubicín
ch3	och3	H	OH	daunorubicín
ch2oh	och3	OH	H	epirubicín
ch3	H	H	OH	idarubicín
ch2oh	och3	H	OTHP	THP
ch2oh	och3	H	H	ezorubicín
CH2OCOCH(OC2H5)2	och3	H	OH	detorubicín
ch2oh	H	H	OH	karminorubicín
ch2ococ4h9	och3	H	OH

Najvýhodnejší je doxorubicín (Dox). Iné cytotoxické alebo cytostatické zvyšky Cyť môžu byť odvodené napríklad od metotrexátu, trimetrexátu, pyritrexímu, 5,10dideazatetrahydrofolátpyrimetamínu, trimetoprimu, 10-propargyl-5,8-dideazafolát2,4-diamino-5(3^,,4’-dichlórfenyl)-6-metylpyrimidínu, aminoglutetimidu, goreserelínu, melfalánu, chlorambucilu, analógov iných chemoterapeutických látok, ako napríklad 9-aminokamtotecínu (príklady sú uvedené napr. v Burris HA, r. d. a S. M. Fields (1994). Topoisomerase I inhibitors. An overview of the camptothecin analogs. [Review]. Hematol. Oncol. Clin. North Am. 8(2): 333 - 355; lyer, L. a M. J. Ratain (1998). Clinical pharmacology of camptothecins. [Review] [137 refs]. Cancer Chemother. Pharmacol. 42 Dodat.; S31 - S43).

Vo vzorci I môže byť Cyť aj biologická efektorová molekula, ktorá buď priamo, alebo nepriamo, ovplyvňuje deštrukciu nádorových buniek, ako napríklad TNFa.

Výhodnými príkladmi aminokarboxylových kyselín, od ktorých môžu byť odvodené jednotky A, B a D, sú glycín (Gly) alebo D- alebo výhodnejšie L-formy alanínu (Ala), valínu (Val), leucínu (Leu), izoleucínu (lle), fenylalanínu (Phe), tyrozínu (Tyr), tryptofánu (Trp), cysteínu (Cys), metionínu (Met), serínu (Ser),

-16treonínu (Thr), lyzínu (Lys), arginínu (Arg), histidínu (His), kyseliny asparágovej (Asp), kyseliny glutámovej (Glu), asparagínu (Asn), glutamínu (Gin), prolínu (Pro), ŕrans-4-hydroxyprolínu (Hyp), 5-hydroxylyzinu (Hyl), norleucínu (Nie), 5-hydroxynorleucínu, 6-hydroxynorleucínu (Hyn), ornitínu (Orn), cyklohexylglycínu (Chg), fenylglycínu (Phg), glutamínu (Gin), cyklohexylalanínu (Cha), metionín-S-oxidu (Met(O)), β-cyklopropylalanínu (β-Cpa), ferc-leucínu (Tie) alebo homoserínu (Hse).

Výhodné zlúčeniny majú všeobecný vzorec I, v ktorom je A jednotka odvodená od alanínu, valínu (Val), leucínu (Leu), izoleucínu (lle), fenylalanínu (Phe), tyrozínu (Tyr), tryptofánu (Trp), cysteínu (Cys), metionínu (Met), serínu (Ser), treonínu (Thr), lyzínu (Lys), arginínu (Arg), histidínu (His), kyseliny asparágovej (Asp), kyseliny glutámovej (Glu), asparagínu (Asn), glutamínu (Gin), prolínu (Pro), ŕrans-4-hydroxyprolínu (Hyp), 5-hydroxylyzínu (Hyl), norleucínu (Nie), 5-hydroxynorleucínu, 6-hydroxynorleucínu (Hyn), ornitínu (Orn) alebo cyklohexylglycínu (Chg), fenylglycínu (Phg), glutamínu (Gin), cyklohexylalanínu (Cha), metionín-Soxidu (Met(O)), β-cyklopropylalanínu (β-Cpa), ŕerc-leucínu (Tie) alebo homoserínu (Hse).

Výnimočne výhodné sú zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorých R¹ znamená skupinu vybranú zo vzorcov 1 až 34.

H-Chg	(1)	H-Tle	(18)
H-Lys	(2)	H-Hyl	(19)
H-NIe	(3)	H-Hse	(20)
H-Ala	(4)	Cg-Gly	(21)
H-Hyn	(5)	Cg-NIe	(22)
H-Pro	(6)	Cg-Val	(23)
H-Phg	(7)	Cg-Met	(24)
H-GIn	(8)	H-Xaa-Lys	(25)
H-ŕrans-Hyp	(9)	H-Xaa-Hyn	(26)
H-Val	(10)	H-Xaa-Pro	(27)
H-Cha	(11)	H-Xaa-His	(28)
H-Met	(12)	H-Xaa-Met	(29)

r r

C r

H-Nva	(13)	H-Xaa-Ala	(30)
H-Met(O)	(14)	Cg-Xaa-Hyn	(31)
Η-β-Cpa	(15)	Cg-Xaa-Ala-Gly	(32)
H-lle	(16)	Cg(Xaa)m-Xaa-Ala-Gly	(33)
H-Ser	(17)	Cg-(Xaa)m-Xaa-Gly	(34)

kde

Cg znamená atóm vodíka alebo ukončovaciu skupinu vybranú zbenzoyloxykarbonylu, fenylacetylu, fenylmetylsulfonylu a benzylaminokarbonylu; Xaa znamená časť odvodenú od aminokarboxylovej kyseliny, výhodne vybranú z prirodzených aminokyselín, najmä zo skupiny obsahujúcej Ala, Pro, Tyr, Phe, His, Ser, Thr, Hyp a Lys; a m je prirodzené číslo od 1 do 6.

Výhodnými ukončovacími skupinami Cg sú acetyl (Ac), sukcínimidyl (Suc), Dalanyl, benzyloxykarbonyl (Cbz alebo Z) alebo makromolekuly, ako napríklad polyetylénglykol.

Výhodnými antracyklínovými prekurzormi sú zlúčeniny všeobecného vzorca III

kde R^a, R^b, R^c, R^d, R^e, R^f a R¹ sú definované vyššie.

Najvýhodnejšími zlúčeninami podľa vynálezu sú doxorubicínové deriváty všeobecných vzorcov IHA až IIIF

ο '•n θ' r Γ

-19(IIID)

-20Ak obsahuje časť Cg-B-A alebo Cg-(D)_m-B-A vzorca I dva alebo viac atómov síry, môže zlúčenina podľa vynálezu obsahovať jednu alebo viac disulfidových väzieb.

Jedna trieda cytotoxíckých alebo cytostatických zlúčenín, ktoré môžu byť použité podľa predloženého vynálezu, má primárnu aminoskupinu, ktorá je prístupná na vytvorenie amidovej väzby, ako je znázornená vo všeobecnom vzorci I, príkladom je doxorubicín. V tomto prípade nie je nevyhnutná spojovníková molekula

L. Ak cytostatičká alebo cytotoxická zlúčenina nemá takúto aminoskupinu, musí byť takáto funčná skupina vytvorená v takejto zlúčenine prostredníctvom chemickej modifikácie, napr. zavedením alebo konvertovaním funkčnej skupiny alebo pripojením spojovníkovej molekuly ku zlúčenine. Spojovníková molekula môže byť začlenená aj medzi oligomérnu časť (tzn. časť obsahujúcu aminokarboxylové zvyšky) a cytostatickú alebo cytotoxickú časť zlúčeniny podľa vynálezu, aby sa zaistilo alebo optimalizovalo štiepenie amidovej väzby medzi oligomérnou časťou a cytotoxickóu alebo cytostatickou časťou. Ak je prítomná spojovníková molekula, tzn. v zlúčeninách obsahujúcich štruktúru L-Cyť, väzba medzi L a Cyť je výhodne amidová alebo esterová väzba. Vo výhodnom uskutočnení sa takáto spojovníková molekula hydrolyzuje, a tým sa odštiepi cytostatická alebo cytotoxická zlúčenina, vo fyziologických podmienkach po enzymatickom štiepení, a tým sa generuje voľná cytostatická alebo cytotoxická zlúčenina. V každom prípade musí byť zlúčenina podľa vynálezu štiepiteľná katalytickým účinkom FAPa a priamym alebo nepriamym následkom tohto štiepenia musí byť uvoľňovanie cytostatickej alebo cytotoxickej zlúčeniny vo fyziologických podmienkach.

V ďalšom uskutočnení sa vynález týka prekurzora, ktorý je schopný byť konvertovaný na liečivo katalytickým účinkom FAPa, pričom uvedený prekurzor má štiepne miesto rozoznávané FAPa a liečivo je cytotoxické alebo cytostatické vo fyziologických podmienkach. Takýto prekurzor výhodne zahŕňa oligomérnu časť obsahujúcu dve alebo viac aminokarboxylových zvyškov a cytotoxickú alebo cytostatickú časť, pričom C-koncový aminokarboxylový zvyšok oligomérnej časti je 3- až 7-členná prirodzená alebo neprirodzená cyklická aminokyselina, výhodne Dalebo L-prolín alebo D- alebo L-hydroxyprolín a C-koncová karboxylová funkčná skupina je spojená s cytotoxickou alebo cytostatickou časťou amidovou väzbou, *· e r r • r e r r > r r f r ť r f r · »

-21 ktorá môže byť rozštiepená katalytickým účinkom FAPa. Oligomérnou časťou je výhodne peptid. Výhodne oligomérna časť obsahuje dva, tri, štyri, päť, šesť, sedem, osem, deväť, desať, jedenásť alebo dvanásť aminokarboxykyselinových zvyškov, výhodne dva, tri alebo štyri aminokarboxylové zvyšky. N-koncová aminoskupina je výhodne chránená ukončovacou skupinou.

Zlúčeniny podľa vynálezu môžu byť syntetizované spôsobmi známymi v oblasti (E. Wúnsch, Synthese von Peptiden, v Methoden der organischen Chemie, Houben-Weyl (vy. E. Muller, O. Bayer), zv. XV, časť 1 a 2, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974). Zlúčeniny by mohli byť napríklad syntetizované spôsobom blokovej syntézy, kondenzáciou koncovej karboxylovej funkčnej skupiny oligomérnej časti, kde X môže byť OH alebo aktivovaná odštepujúca sa skupina, s aminoskupinou cytotoxickej alebo cytostatickej molekuly H₂N-Cyť, čoho výsledkom by bolo vytvorenie amidovej väzby.

Ak je medzi oligomérnou časťou a cytotoxickým alebo cytostatickým činidlom potrebný spojovníkový zvyšok (L), bloková syntéza sa môže uskutočniť rovnakým spôsobom.

+ H₂N—Cyť + x¹oc-Cyť + X¹OC—Cyť

- HX¹

- HX¹

-HX¹

-22Ak je nositeľom cytotoxicity alebo cytostatickosti karboxylová funkčná skupina, spojovníkovou molekulou na pripojenie oligomérnej časti môže byť imino alebo aminoalkohol a bloková syntéza takýchto zlúčenín sa môže uskutočňovať podobným spôsobom, reakciou aktivovanej XOC-Cyť, buď s hydroxy, alebo amino zložkou.

My.

HO-Cyľ

HX¹

Ak má cytotoxické alebo cytostatické reakčné činidlo hydroxy funkčnú skupinu, ktorá je vhodná na spájanie s oligomérnou časťou, spojovníkovým zvyškom môže byť aminokarboxylová kyselina a bloková syntéza sa môže uskutočňovať podobne.

Ak je to nevyhnutné, môžu byť iné funkčné skupiny v jednotkách Cyť, L, hydroxyprolínu, A, B a D, ktoré nesmú reagovať počas zostavovania cieľových molekúl, chránené vhodnými ochrannými skupinami. Vhodné ochranné skupiny sú v oblasti dobre známe (P. G. M. Wuts, Protective groups in organic synthesis, John Wiley and Sons Inc., New York 1991). Tieto ochranné skupiny sa odstraňujú na konci syntézy.

Len ako príklad môžu užitočné amino-ochranné skupiny zahŕňať C1-C10alkanoylové skupiny, ako formyl, acetyl, dichlóracetyl, propionyl, 3,3-dietylhexanoyl a podobne, C_rCio-alkoxykarbonylové skupiny a C6-Ci7-aralkyloxykarbonylové skupiny, ako ŕerc-butoxykarbonyl, benzyloxykarbonyl (BOC), fluorenylmetoxykarbonyl a podobne. Najvýhodnejší je fluorenylmetoxykarbonyl (FMOC).

Vhodné karboxy-ochranné skupiny môžu zahŕňať napríklad CrCio-alkylové skupiny, ako metyl, ŕerc-butyl, decyl; C6-Ci7-aralkylové skupiny, ako benzyl, 4metoxybenzyl, difenylmetyl, trifenylmetyl, fluórenyl; tri-(Ci-Cio-alkyl)silylové alebo (Ci-Cw-alkylj-diarylsilylové skupiny, ako trimetylsilyl, dimetyl-ŕerc-butylsilyl, difenylŕerc-butylsilyl a príbuzné skupiny.

Aby sa dosiahlo vytvorenie takéhoto esteru alebo amidu, môže byť nevyhnutné aktivovať karbonylovú skupinu karboxylovej kyseliny na nukleofilný atak

I» ŕ

-23amínu alebo alkoholu, tzn. X musí byť aktivačná skupina alebo odštiepiteľná skupina, ktorá je vhodná na to, aby bola substituovaná aminoskupinou. Táto aktivácia sa môže uskutočňovať konverziou karboxylovej kyseliny na chlorid kyseliny alebo fluorid alebo konverziou karboxylovej kyseliny na aktivovaný ester, napríklad /V-hydroxysukcínimidylester alebo pentafluórfenylester. Iným spôsobom aktivacie je transformácia na symetrický alebo asymetrický anhydrid. Alternatívne je možné dosiahnuť vytvorenie amidovej alebo esterovej väzby použitím in situ spájacích reakčných činidiel, ako napríklad benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrolidinofosfóniumhexafluórfosfátu (PyBOP) (E. Frerot a ďalší, Tetrahedron, 1991, 47, 25970), 1,ľ-karbonyldimidazolu (CDI) (K. Akaji a ďalší, THL, 35,1994, 3315-18), 2-(1Hbenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametyluróniumtetrafluórborátu (TBTU) (R. Knorr a ďalší, THL, 30, 1989, 1927-30), 1-(mesitylén-2-sulfonyl)-3-nitro-1H-1,2,4-triazolu (MSNT) (B. Blankenmeyer-Menge a ďalší, THL, 31,1990,1701-04).

Ako alternatíva blokovej syntézy, môžu byť molekuly všeobecného vzorca I zostavované postupným krokovým spôsobom zo začiatkom na pravej strane prostredníctvom postupných kondenzačných reakcií príslušných monomérov Cyť, L, cyklickej aminokyselinovej skupiny tvorenej R^a, R^b a spojovacou N-C skupinou, najmä prolínu alebo hydroxyprolínu, A, B a D. Na kondenzačnú reakciu môžu byť aplikované rovnaké kopulačné metódy, ako boli uvedené vyššie. Keďže jednotky L, prolín/hydroxyprolín, A, B a D sú aspoň bifunkčné molekuly obsahujúce aminoskupinu (aspoň jednotky A, B, a cyklická aminokyselinová skupina vytvorená R^a, R^b a spojovacou N-C skupinou, najmä prolín/hydroxyprolín) a karboxyskupinu, aminoskupina musí byť blokovaná ochrannou skupinou (PG) pred aktiváciou karboxylovej funkčnej skupiny. Na ochranu aminoskupín sa môže aplikovať skupina BOC alebo výhodne skupina FMOC. Po kopulačnej reakcii sa musí amino ochranná skupina odstrániť a môže sa uskutočniť kuplovanie s nasledujúcou Fmoc- alebo Boc-chránenou jednotkou. Ak je to nevyhnutné, môžu byť iné funkčné skupiny v jednotkách Cyť, L, cyklickej aminokyselinovej skupiny tvorenej R^a, R^b a spojovacou N-C skupinou, najmä hydroxyprolínu, A, B a D, ktoré nesmú reagovať počas zostavovania cieľových molekúl, chránené vhodnými ochrannými skupinami. Tieto ochranné skupiny sa odstraňujú na konci syntézy.

ŕ r r f

-24Ukončovacie skupiny, ako sú definované v kontexte všeobecného vzorca I, môžu slúžiť aj ako ochranné skupiny, najmä keď sa pridáva posledná (N-koncová) aminokarboxykyselinová jednotka. V tomto poslednom prípade sa ochranná skupina neodstraňuje, keďže je časťou cieľovej molekuly. Alternatívne sa ukončovacia skupina môže pridať potom ako sa pripojila posledná aminokarboxykyselinová jednotka a odstránila ochranná skupina.

Syntéza krok za krokom je znázornená na nasledujúcich schémach. Druhá schéma je príkladom toho, že spojovníkový zvyšok, ako aj Cyť zvyšok môžu obsahovať iné funkčné skupiny, ako je znázornené v tejto schéme (pozri vyššie):

t Γ

-25r r r »· • - ŕ» p Z toho vyplýva, že vynález ďalej poskytuje spôsob výroby zlúčeniny všeobecného vzorca I, ktorý spočíva v tom, že zlúčenina všeobecného vzorca V

kde R¹, R^a a R^b sú definované vyššie, X¹ znamená OH alebo odštiepiteľnú skupinu, ktorá je vhodná na to, aby bola substituovaná aminoskupinou, reaguje so zlúčeninou HN(R⁴)-Cyť, kde Cyť je zvyšok cytotoxickej alebo cytostatickej zlúčeniny a R⁴ je definované vyššie.

Výhodne znamená X¹ vo všeobecnom vzorci V odštiepiteľnú skupinu, napríklad -Cl, -F, /V-hydroxysukcínimidyl, pentafluórfenyl alebo karboxylát. Alternatívne môže X¹ znamenať OH a kondenzácia sa dosiahne použitím in situ spájacieho činidla, napríklad benzotriazol-1 -yl-oxy-tris-pyrolidino-fosfóniumhexafluórfosfátu (PyBOP), 1,ľ-karbonyldimidazolu (CDI), 2-(1/-/-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametyluróniumtetrafluórborátu (TBTU) alebo 1-(mesitylén-2-sulfonyl)-3-nitro-1 /-/-1,2,4triazolu (MSNT).

Ďalej vynález poskytuje spôsob výroby zlúčeniny všeobecného vzorca I, spočívajúci v tom, že zlúčenina všeobecného vzorca VI

kde R¹, R^a a R^b sú definované vyššie, Y¹ znamená L-COX², kde L znamená spojovníkový zvyšok a X² znamená OH alebo odštiepiteľnú skupinu, ktorá je vhodná na to, aby bola substituovaná aminoskupinou alebo hydroxyskupinou, reaguje so zlúčeninou H2N-Cyť alebo so zlúčeninou HO-Cyť, kde Cyť je zvyšok cytotoxickej alebo cytostatickej zlúčeniny.

t r

-26Výhodne znamená X² vo vzorci VI odštiepiteľnú skupinu, napríklad -Cl, -F, Nhydroxysukcínimidyl, pentafluórfenyl alebo karboxylát. Alternatívne môže X² znamenať OH a kondenzácia sa dosiahne použitím in situ spájacieho činidla, napríklad benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrolidino-fosfóniumhexafluórfosfátu (PyBOP), 1 ,ľ-karbonyldimidazolu (CDI), 2-(1 F/-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametyluróniumtetrafluórborátu (TBTU) alebo 1-(mesitylén-2-sulfonyl)-3-nitro-1H-1,2,4-triazolu (MSNT).

Ďalej vynález poskytuje spôsob výroby zlúčeniny všeobecného vzorca I, spočívajúci v tóm, že zlúčenina všeobecného vzorca VII

R'

R' (VII) kde R¹, R^a a R^b sú definované vyššie, Y² znamená L-OH alebo L-NH₂, kde L znamená spojovníkový zvyšok, reaguje so zlúčeninou X³OC-Cyť, kde X³ znamená OH alebo odštiepiteľnú skupinu, ktorá je vhodná na to, aby bola substituovaná aminoskupinou alebo hydroxyskupinou, a kde Cyť je zvyšok cytotoxickej alebo cytostatickej zlúčeniny.

Výhodne znamená X³ v zlúčenine X³OC-Cyť odštiepiteľnú skupinu, napríklad -Cl, -F, N-hydroxysukcínimidyl, pentafluórfenyl alebo karboxylát. Alternatívne môže X³ znamenať OH a kondenzácia sa dosiahne použitím in situ spájacieho činidla, napríklad benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrolidino-fosfóniumhexafluórfosfátu (PyBOP), 1,ľ-karbonyldimidazolu (CDI), 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametyluróniumtetrafluórborátu (TBTU) alebo 1-(mesitylén-2-sulfonyl)-3-nitro-1H-1,2,4-triazolu (MSNT).

Ďalej vynález poskytuje spôsob výroby zlúčeniny všeobecného vzorca I, spočívajúci v tom, že zlúčenina H2N-Cyť sa postupne kondenzuje s jednotkami tvoriacimi zlúčeninu všeobecného vzorca I. Pred každým kopulačným krokom môže byť nevyhnutné odstrániť ochrannú skupinu PG, ak je prítomná.

Z toho vyplýva, že ďalej vynález poskytuje spôsob výroby zlúčeniny všeobecného vzorca I, spočívajúci v tom, že zlúčenina všeobecného vzorca VIII f '

kde PG¹ znamená ochrannú skupinu a významy ostatných substituentov sú vysvetlené vyššie, reaguje so zlúčeninou vzorca HN(R⁴)-Cyť, kde Cyť znamená zvyšok cytotoxickej alebo cytostatickej zlúčeniny;

ochranná skupina PG¹ sa potom odstráni a výsledná zlúčenina vzorca VIIIA

O

(VIIIA) následne reaguje so zlúčeninou PG²-A-X⁴, kde

PG² znamená ochrannú skupinu a X⁴ znamená OH alebo odštiepiteľnú skupinu, ktorá je vhodná na to, aby bola nahradená aminoskupinou; a ak je to nevyhnutné uskutočňujú sa ďalšie kopulačné kroky, pokiaľ sa nezíska kompletná zlúčenina.

PG¹ a PG² môžu byť napríklad BOC, alebo výhodne FMOC.

Z toho vyplýva, že ďalej vynález poskytuje spôsob výroby zlúčeniny všeobecného vzorca I, spočívajúci v tom, že zlúčenina vzorca PG³-N(R⁴)-L-COX³, kde PG³ znamená ochrannú skupinu a významy ostatných substituentov sú vysvetlené vyššie, reaguje so zlúčeninou vzorca Y⁴-Cyť, kde

Cyť znamená zvyšok cytotoxickej alebo cytostatickej zlúčeniny; a Y⁴ znamená H2N alebo OH;

ochranná skupina PG³ sa potom odstráni a výsledná zlúčenina HN(R⁴)-L-Y⁴-Cyť reaguje so zlúčeninou vzorca VIII r r

(Vili) ochranná skupina PG¹ sa potom odstráni a výsledná zlúčenina vzorca _R.Z^'Y^'|j|-L-YÍ-Cyf R^b R⁴ reaguje potom so zlúčeninou PG⁴-A-X⁴, kde

PG⁴ znamená ochrannú skupinu a X⁴ môže znamenať OH alebo odštiepiteľnú skupinu, ktorá je vhodná na to, aby bola substituovaná aminoskupinou; a ak je to nevyhnutné uskutočňujú sa ďalšie kopulačné kroky, pokiaľ sa nezíska kompletná zlúčenina.

Ďalej vynález poskytuje spôsob výroby zlúčeniny všeobecného vzorca I, spočívajúci v tom, že zlúčenina vzorca PG⁵-N(R⁴)-L-Y⁵, kde PG⁵ znamená ochrannú skupinu, Y⁵ znamená OH alebo NH2 a významy ostatných substituentov sú vysvetlené vyššie, reaguje so zlúčeninou vzorca X⁵OC-Cyť, kde

Cyť znamená zvyšok cytotoxickej alebo cytostatickej zlúčeniny; a X⁵ znamená OH alebo vhodnú odštiepiteľnú skupinu;

ochranná skupina PG⁵ sa potom odstráni a výsledná zlúčenina HN(R⁴)-L-Y⁵-COCyť reaguje so zlúčeninou vzorca VIII

< r

-29ochranná skupina sa potom odstráni a výsledná zlúčenina vzorca

O

U

N-L—Y⁵ Cyť reaguje potom so zlúčeninou PG²-A-X⁴, kde PG² znamená ochrannú skupinu a X⁴ znamená OH' alebo odštiepiteľnú skupinu, ktorá je vhodná na to, aby bola substituovaná aminoskupinou;

a ak je to nevyhnutné uskutočňujú sa ďalšie kopulačné kroky, pokiaľ sa nezíska kompletná zlúčenina.

Ďalej vynález poskytuje nové medziprodukty vzorca VI HA

R'

Cyť (VIIIA) kde R^a, R^b, R⁴ a Cyť sú definované vyššie.

Zlúčeniny podľa vynálezu sú určené na medicínske použitie. Tieto zlúčeniny sú užitočné najmä na liečbu nádorov, ktoré sú spojené so stromálnymi fibroblastami, ktoré exprimujú FAPa, a ktoré vo všeobecnosti nie sú optimálne liečené dostupnými cytotoxickými a/alebo cytostatickými činidlami. Nádormi s touto vlastnosťou sú napríklad epiteliálne karcinómy, ako napríklad karcinóm pľúc, prsníka a hrubého čreva. Týmito zlúčeninami môžu byť liečené aj nádory, ako napríklad kostné sarkómy a sarkómy mäkkých tkanív, ktoré exprimujú FAPa.

Z toho vyplýva, že ďalším predmetom predloženého vynálezu sú farmaceutické prostriedky obsahujúce zlúčeninu podľa predloženého vynálezu a voliteľne jeden alebo viac vhodných a farmaceutický prijateľných excipientov, ktorých príklady sú uvedené v: Remington: The Science and practice of pharmacy. 19. vyd. Easton: Mack Publ., 1995. Farmaceutické prostriedky môžu byť vo forme tuhých látok alebo roztokov. Tuhé formulácie môžu byť určené na prípravu roztokov t r

-30pred injekciou. Výhodnými farmaceutickými prostriedkami podľa vynálezu sú roztoky pre injekciu. Môžu byť podávané systémovo, napr. intravenóznou injekciou, alebo topicky, napr. priamou injekciou do miesta nádoru. Dávka bude nastavená v súlade s faktormi akými sú telesná hmotnosť a zdravotný stav pacienta, povaha liečenej choroby, terapeutické vlastnosti zlúčeniny, ktorá sa má aplikovať, rozpustnosť a podobne. Pre priemerného odborníka v oblasti je zrejmé príslušné nastavenie dávky. Napríklad pre doxorubicínové konjugáty bude dávka výhodne v rozsahu od 10 mg/m² do 1350 mg/m², ale vhodné môžu byť aj vyššie alebo nižšie dávky.

Z toho vyplýva, že ďalej sa predložený vynález týka použitia zlúčeniny podľa vynálezu na prípravu farmaceutického prostriedku na liečbu rakoviny. Okrem toho predmetom vynálezu je liečba rakoviny, ktorá zahŕňa podávanie účinného množstva farmaceutického prostriedku podľa vynálezu pacientovi. Indikácie špecificky zahŕňajú liečbu nižšie uvedených stavov:

1) Liečbu epiteliálnych karcinómov vrátane karcinómu prsníka, pľúc, kolorektálneho karcinómu, karcinómu hlavy a krku, pankreasu, vaječníkov, močového mechúra, tráviacej sústavy, kože, endometria, semenníkov, ezofágu, prostaty a obličiek;

2) Sarkómov kostí a mäkkých tkanív: osteosarkómov, chondrosarkómov, fibrosarkómov, malígnej fibróznej histiocytómie (MFH), leiomyosarkómov;

3) Hematopoietických malignít: Hodgkinových lymfómov a iných ako Hodgkinových lymfómov;

4) Neuroektodermálnych nádorov: periférnych nervových nádorov, astrocytómií, melanómov;

5) Mesoteliómov.

Zahrnutá je aj liečba chronických zápalových stavov, ako napríklad reumatoidnej artritídy, osteoartritídy, cirhózy pečene, pľúcnej fibrózy, artériosklerózy a abnormálneho hojenia rán.

Ďalším predmetom vynálezu je spôsob liečby rakoviny, pri ktorom sa pacientovi podáva prekurzor, ktorý je schopný byť konvertovaný na cytotoxické alebo cytostatické liečivo enzymatickou aktivitou, pričom túto enzymatíckú aktivitu má produkt exprimovaný bunkami asociovanými s nádorovým tkanivom. Výhodne je enzymatickou aktivitou proteolytická aktivita FAPa.

r

-31 Jedným spôsobom podávania zlúčenín je intravenózna infúzia. Iné možné spôsoby podávania zahŕňajú intraperitoneálnu (buď ako bolus, alebo ako infúziu), intramuskulárnu alebo intratumorálnu injekciu. Ak je to vhodné, možná je aj priama aplikácia (napríklad pľúcna fibróza).

Pre priemerného odborníka v oblasti techniky bude zrejmé, že hoci sú v nasledujúcich príkladoch uvedené špecifické reakčné činidlá a reakčné podmienky, je možné uskutočňovať modifikácie, ktoré spadajú do rozsahu vynálezu. Nasledujúce príklady sú teda určené na podrobnejšie ilustrovanie vynálezu a nie na jeho obmedzenie.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1: Štiepenie doxorubicín-peptidových konjugátov s FAPa. Chromatogramy pre ZGP-Dox(Z-Gly(L)-Pro-doxorubicín) po inkubovaní s purifikovaným FAPmCD8 fúznym proteínom (A) alebo s tlmivým roztokom (B). Pozri príklad 5.

Obrázok 2: Redukcia doxorubicínovej cytotoxicity prostredníctvom konjugácie doxorubicínu s FAPa-štiepiteľnými peptidmi. Pozri príklad 6.

Obrázok 3: Demonštrácia cytotoxicity doxorubicínu uvoľňovaného z FAPaštiepiteľných doxorubicínových peptidových konjugátov klonom buniek HT1080 33, ktoré exprimujú FAPa, v porovnaní s rodičovskými HT1080 bunkami. Pozri príklad 8.

Obrázok 4: Stabilita /V-Cbz-Gly-(L)-Pro-doxorubicínu a /V-Cbz-(L)-Pro-(L)-AlaGly-(L)-Pro-doxorubicínu v myšacej a ľudskej plazme. Pozri príklad 9.

Obrázok 5: Demonštrácia FAPa enzymatickej aktivity a potvrdenie jeho zdanlivej molekulovej hmotnosti vo vzorkách ľudského nádorového tkaniva. Pozri príklad 12.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Syntetické postupy pre doxorubicínové konjugáty

-32A/-Cbz-Gly-Pro-doxorubicín /V-Cbz-Gly-Pro (116,1 mg, 0,37 mmol) a /V-hydroxysukcínimid (44 mg, 0,37 mmol) sa rozvážili a umiestnili do banky s guľatým dnom a dvoma hrdlami v dusíku. Pridal sa bezvodný /V./V-dimetylformaid (20 ml) a banka sa ochladila na 0 °C v ľadovom kúpeli. Pridal sa dicyklohexylkarbodiimid (78 mg, 0,37 mmol) ako 1 ml roztoku v /V,/V-dimetylformamide. Roztok sa miešal pri 0 °C 40 minút.

Doxorubicín*HCI (100 mg, mmol) sa odvážil do nádobky s malou miešacou tyčinkou a umiestnil sa pod dusík. Do nádobky sa za stáleho miešania pridal Ν,Νdimetylformamid (3 ml) a /V./V-izopropyletylamín (33,1 μΙ, 0,19 mmol). Striekačkou sa doxorubicínový roztok prilial k peptidovému roztoku a nádobka sa premyla ďalšími 2 ml /V./V-dimetylformamidu. Odstránil sa ľadový kúpeľ a reakčná zmes sa miešala približne 48 hodín pri laboratórnej teplote.

Reakčná zmes sa extrahovala etylacetátom (500 ml). Etylacetát sa postupne premyl s 10% roztokom vodnej kyseliny citrónovej (250 ml), nasýteným vodným uhličitanom sodným (250 ml) a soľným roztokom (250 ml). Organický extrakt sa vysušil bezvodným MgSO₄ a rozpúšťadlo sa odstránilo pomocou rotačnej odparky. Produkt, ktorý bol bohatý na DMF kontaminant, sa podrobil chromatografii na C-18 reverznej fázovej bleskovej kolóne so zmesou metanoľvoda v pomere 8:2, ako eluentom. Izolovali sa oranžové škvrny, rf« 0,3, ktoré fluoreskovali pod dlhovlnným UV svetlom. Metanol sa odstránil v rotačnej odparke a posledné stopy rozpúšťala sa odstránili cez noc s vysoko vákuovou pumpou.

A/-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro /V-Cbz-Pro-Ala (5 g, 15 mmol) a karbonyldiimidazol (2,43 g, 15 mmol) sa umiestnili do 250ml banky s guľatým dnom a 3 hrdlami do argónovej atmosféry. Pridal sa bezvodný tetrahydrofurán (50 ml) a roztok sa miešal pri laboratórnej teplote približne 45 minút. Pozorovalo sa prudké uvoľňovanie plynu (CO₂). Do druhej banky sa odvážil Gly-Pro-OCH3«HCI (2,9 g, 15 mmol). Pridal sa tetrahydrofurán (5 ml) a /V,/V-iizopropyletylamín (5,23 ml, 30 mmol) a roztok sa miešal niekoľko minút. Materiál, ktorý sa rozpustil, sa striekačkou pridal k aktivovanému

-33peptidu a zvyšný materiál sa rozpustil v minimálnom množstve CH2CI2 a tiež sa pridal striekačkou k aktivovanému peptidu.

Reakčná zmes sa miešala cez noc pri laboratórnej teplote (15 hodín) a ráno vzniklo hojné množstvo bieleho precipitátu. Reakčná zmes sa premyla 10% roztokom vodnej kyseliny citrónovej (300 ml) a extrahovala sa s etylacetátom (500 ml). Etylacetátový extrakt sa premyl s nasýteným vodným roztokom hydrogenuhličitanu (300 ml) a vysušil sa soľným roztokom (300 ml) a bezvodným MgSO4. Etylacetát sa odstránil v rotačnej odparke, čím vzniklo 5 g bezfarebného oleja, ktorá poskytol uspokojujúce charakterizačné údaje.

Surový olej /V-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro-OCH3 (5 g, 12 mmol) sa rozpustil v metanole (20 ml) v banke s guľatým dnom. Banka sa umiestnila do vodného kúpeľa s teplotou okolitého prostredia. Opatrne sa pridal 1N roztok hydroxidu sodného (12 ml). Roztok sa miešal 3,5 hodiny a potom sa pridal 1N roztok HCI (12 ml). Roztok sa zakoncentroval v rotačnej odparke a pridalo sa ešte niekoľko kvapiek 1N HCI, kým pH nebolo približne 1,5, čo sa meralo pH papierikom. Vákuovou pumpou sa odstránila voda, čím vznikol olej, ktorý pomaly rekryštalizoval z etanolu.

/V-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro-doxorubicín /V-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro (180 mg, 0,38 mmol) sa rozpustil v bezvodnom N,Ndimetylformamide (15 ml). 1-Hydroxybenzotriazol (51,3 mg, 38 mmol) a dicyklohexylkarbodiimid (78 mg, 28 mmol) sa každý rozpustil v 1 ml N,Ndimetylformamiu a pridali sa ku peptidu ako roztoky. Reakčná zmes sa miešala pri laboratórnej teplote 45 minút.

Doxorubicín«HCI (116 mg, 20 mmol) sa odvážil do inej nádobky a rozpustil sa v Λ/,/V-dimetylformamide (3 ml). Do nádobky obsahujúcej doxorubicín sa striekačkou pridal /V,/V-izopropyletylamín (34,8 μΐ, 20 mmol) a obsahy sa miešali niekoľko minút, aby sa zaistilo úplné rozpustenie. K aktivovanému peptidu sa striekačkou pridal doxorubicínový roztok. Roztok sa miešal 48 hodín pri laboratórnej teplote.

Produkt sa extrahoval etylacetátom (2 I) a premyl sa 10% roztokom vodnej kyseliny citrónovej (500 ml). Oddelila sa etylacetátová vrstva, vysušila sa s MgSO4 a zakoncentrovala sa na olejovej rotačnej odparke. Olej sa podrobil chromatografii na C-18 reverznom fázovom silikagéli, ktorej výsledkom boli oranžové škvrny

-34fluoreskujúce pod dlhovlnným UV. Konečný produkt poskytoval uspokojujúce charakterizačné údaje.

Príklad 2

Príprava FAPa-exprimujúcich bunkových línií

Pripravili sa cicavčie bunkové línie exprimujúce rekombinantný FAPa. HT1080 fibrosarkómové bunky, všeobecne známe a dostupné z DSMZ (Nemecká zbierka mikroorganizmov a bunkových kultúr, Braunschweig, Nemecko) pod prístupovým číslom DSMZ ACC 315, sa udržiavali v MEM/F12 zmesi s pomerom 50:50 obsahujúcej 10% fetálne bovinné sérum v atmosfére 95 % vzduchu a 5 % CO₂. HT1080 bunky sa transfekovali FAP.38 vektorom (WO 97/34927, Scanlan a ďalší, citovaný vyššie) použitím Lipofektínovej metódy podľa inštrukcií výrobcu (Gibco/BRL). Transfektanty sa selektovali na rezistenciu voči antibiotikám (200 pg/ml geneticínu) a potom sa udržiavali v médiu obsahujúcom geneticín. Jednotlivé kolónie rezistentných buniek sa odpichli, nechali sa narásť do súvislej vrstvy na 10cm tkanivových Petriho miskách a testovali sa na FAPa expresiu vimunofluorescenčnom teste použitím FAPa-špecifickej monoklonálnej protilátky F19, ako je opísané v Garin-Chesa a ďalší (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(18), 72357239. Rodičovská HT1080 bunková línia nevykazovala žiadnu detegovateľnú FAPa expresiu v tomto imunofluorescenčnom teste, zatiaľ čo jeden kloň, tu označovaný ako HT1080 kloň 33, bol pozitívny na FAPa.

Podobne, ľudské embryotické obličkové 293 bunky, všeobecne známe a dostupné z Americkej zbierky typov tkanív (Rockville, MD), sa udržiavali v DMEM obsahujúcom 10% fetálne bovinné sérum v atmosfére 95 % vzduchu a 5 % CO₂. Bunky sa transfekovali FAPa expresným vektorom pFAP.38 použitím transfekcie prostredníctvom fosforečnanu vápenatého, ako je opísané v (Park, J.E., Chen, H.H., Winer, J., Houck, K.A. & Ferrara, N. (1994). Placenta growth factor. Potentiation of vascular endothelial growth factor bioactivity, in vitro and in vivo, and high affinity binding to Flt-1 but not to Flk-1/KDR. J. Biol. Chem. 269(41), 25646-25654). Transfektanty sa selektovali a analyzovali z hľadiska FAPa expresie, ako bolo

-35opísané vyššie. Rodičovská 293 bunková línia nevykazovala žiadnu detegovateľnú

FAPa expresiu. Jeden kloň, tu označovaný ako 293-1/2, bol FAPa pozitívny.

Príklad 3

Skúmanie FAPa expresie v transfekovaných bunkových líniách

FAPa expresia sa skúmala v HT1080 bunkách a v bunkách HT1080 klonu 33. Metabolické značenie, imunoprecipitácie a fluorografia sa uskutočňovali v podstate ako je opísané v Park a ďalší (1991) Somatic Celí Mol. Genet. 17(2), 137150. HT1080 bunky a bunky HT1080 klonu 33 sa metabolický označili s ³⁵Smetionínom. Detergentné extrakty týchto buniek sa imunoprecipitovali s monoklonálnou protilátkou F19 alebo s myšacou lgG1 protilátkou ako negatívnou kontrolou. Precipitáty sa povarili vo vzorkovom tlmivom roztoku a separovali sa SDS (nátriumdodecylsulfát) gélovými elektroforózami, ako je opísané v Laemmli (1970) Náture 227(259), 680-685. Fluorografická analýza výsledného gélu potvrdila, že bunky HT1080 klonu 33 produkujú FAPa proteín. Žiadny FAPa proteín nebol detegovateľný ani v extraktoch rodičovských HT1080 buniek, ani vimunoprecipitátoch s myšacou lgG1.

Príklad 4

Rozpustný rekombinantný FAPa

Rozpustná rekombinantná forma FAPa proteínu sa pripravila nasledovne. cDNA, kódujúca extracelulárnu doménu (ECD) hlodavčieho CD8a (Genbank M12825) pozostávajúcu zo 189 N-koncových aminokyselín CD8a, sa ligovala s cDNA kódujúcou extracelulárnu doménu FAPa (aminokyseliny 27 až 760), čím vznikol fúzovaný proteínový konštrukt, FAPmCD8, s podobnou štruktúrou ako CD8a-CD40 ligandový fúzovaný proteín, ktorý bol už opísaný v Lane a ďalší (1993) J. Exp. Med. 177(4), 1209-1213. cDNAs sa overili sekvenovaním a začlenili sa do pVL1393 vektora. Transfekcia Sf9 buniek a amplifikácia výsledných rekombinantných bakulovírusov sa uskutočňovala ako je opísané v O’Reilly (1994)

-36Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press, New York. Supernatant kultúry High Five buniek infikovaných rekombinantným FAPmCD8 bakulovírusom počas štyroch dní sa odobral a vyčistil ultracentrifugáciou. Z takýchto supernatantov sa purifikoval FAPmCD8 fúzovaný proteín použitím anti-FAPa monoklonálnej protilátky ímobilizovanej na aktivovaných agarózových guľôčkach (Pierce Chemical, Indianopolis, IN, USA). Kultivačné supernatanty sa prepasážovali cez protilátkovú afinitnú kolónu a eluovali sa prostredníctvom posunu pH použitím 0,1 M citrátového tlmivého roztoku, pH 3. Vzorky sa okamžite neutralizovali nasýteným Tris roztokom (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) a spojili sa frakcie obsahujúce proteín.

Príklad 5

Meranie štiepenia doxorubicín-peptidových konjugátov

Vzorky sa separovali reverznou fázovou kvapalnou chromatografiou s vysokou rozlišovacou schopnosťou (HPLC), ktorá bola určená na meranie štiepenia doxorubicín-peptidových konjugátov. HPLC systém pozostával z Waters 717 autosamplera vybaveného 100 μΙ nádobkami a dvoma pumpami Waters model 510 na dodávanie rozpúšťadiel. Separácie sa uskutočňovali v izokratických podmienkach s rýchlosťou prietoku 0,7 ml/min na Nucleosil C-18 kolóne, 100 mm dlhej x 4 mm I.D., s veľkosťou častíc 5 pm (Dr. Ing. H. Knauer GmbH, Berlín). Mobilná fáza pozostávala zo zmesi metanokvoda (70:30, v/v) obsahujúcej 0,2 M octanu amónneho, s pH nastaveným na 3,2. Voľný doxorubicín a doxorubicín-peptidové konjugáty sa detegovali prostredníctvom fluorescencie (excitácia 475 nm; emisia 585 nm) použitím Waters 474 fluorescenčného detektora. Injektovanie, dodávanie rozpúšťadiel, získavanie údajov a analýza údajov sa všetky uskutočňovali použitím Millennium 2010 chromatografického softwarového balíka (Waters Corp., Milford, MA, USA). Látky, ktorá sa mali testovať, sa pred nanesením na HPLC kolónu najprv rozpustili v dimetylsulfoxide v koncentrácii 5 mM a potom sa nariedili vo vodnom roztoku.

Skúmala sa schopnosť rozpustného rekombinantného FAPa enzýmu uvoľňovať doxorubicín z doxorubicín-peptidových konjugátov. Zásobné roztoky

-37doxorubicín-peptidových konjugátov (5 mM) sa nariedili s Hepes-tlmeným fyziologickým roztokom pH 7,4 do konečnej koncentrácie 50 až 100 μΜ. Dvadsať μΙ výsledného roztoku sa zmiešalo s 50 μΙ purifikovaného FAPmCD8 fúzovaného proteínu (približne 20 ng) opísaného vyššie a s 30 μΙ Hepes-tlmeného fyziologického roztoku, pH 7,4. Zmes sa nechala inkubovať pri 37 °C jeden deň a uvoľňovanie voľného doxorubicínu sa meralo opísaným HPLC testom. Použitím vyššie opísaného softwarového balíka sa kvantifikovala oblasť pod každým vrcholom a počiatočná hodnota bola určená ako 100 %. Rýchlosť uvoľňovania voľného doxorubicínu sa merala prostredníctvom tvaru vrcholu s rovnakým retenčným časom ako mal voľný doxorubicín v týchto HPLC podmienkach. Oblasti pod každým vrcholom sa použili na vypočítanie relatívnych množstiev voľného doxorubicínu vo vzťahu k doxorubicín-peptidovému konjugátu. Integrácia vrcholových oblastí na stanovenie percenta štiepenia sa uskutočňovala použitím vyššie uvedeného Millennium 2010 chromatografického softwarového balíka. Ako je možné vidieť z chromatogramov pre ZGP-Dox (/V-Cbz-Gly-Pro-Doxorubicín) znázornených na obrázku 1, doxorubicín-peptidové konjugáty sa mohli konvertovať na voľný doxorobicín po inkubovaní s purifikovaným FAPmCD8 fúzovaným proteínom, ale retenčný čas konjugátu sa nemenil inkubovaním s tlmivým roztokom.

Príklad 6

Redukcia cytotoxicity doxorubicínu konjugáciou s FAPa-štiepiteľnými peptidmi

Stanovovala sa schopnosť FAPa-štiepiteľných peptidov blokovať cytotoxický účinok doxorubicínu na FAPa-negatívne, doxorubicín-senzitívne bunky. K562 bunky, dostupné z American Type Tissue Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC číslo: CCL-243) sa vysiali na 96-jamkové platne (Greiner Scientific) v hustote 1000 buniek na jamku. K bunkám sa pridalo kultivačné médium bez séra obsahujúce rôzne koncentrácie voľného doxorubicínu alebo ekvivalentné molárne koncentrácie doxorubicín-peptidových konjugátov. O štyri dni sa stanovoval počet buniek použitím automatického ČASY® bunkového počítadla (Schärfe System GmbH, Reutlingen, Nemecko). Výsledky sú znázornené na obrázku 2.

-38Príklad 7

Uvoľňovanie voľného doxorubicínu bunkovo viazaným FAPa

Skúmala sa schopnosť bunkovo viazaného FAPa enzýmu uvoľňovať voľný doxorubicín z doxorubicín-peptidových konjugátov. Každý konjugát sa rozpustil v bunkovom médiu bez séra do konečnej koncentrácie 1 μΜ. Desať mililitrov tohto roztoku sa pridalo k súvislej momovrstve HT1080 buniek alebo buniek HT1080 klonu 33 na 10cm tkanivových kultivačných platniach na 19 hodín pri 37 °C. Médium sa odstránilo a meralo sa uvoľňovanie doxorubicínu, ako je opísané v príklade 5. FAP-exprimujúca bunková línia, HT1080 kloň 33 konvertovala 81 % ZGP-Dox (/V-Cbz-Gly-Pro-Doxorubicín) konjugátu na voľný doxorubicín a 43 % ZPAGP-Dox (W-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro-Doxorubicín) konjugátu na voľný doxorubicín. V rovnakých podmienkach konvertovala rodičovská HT1080 bunková línia len 9 % ZGP-Dox na voľný doxorubicín. V týchto podmienkach sa pozorovala malá alebo žiadna detegovateľná konverzia ZPAFP-Dox na voľný doxorubicín rodičovskou HT1080 bunkovou líniou.

Príklad 8

Usmrcovanie senzitívnych buniek FAPa-uvoľňovaným doxorubicínom

Stanovovala sa schopnosť FAPa generovať voľný doxorubicín schopný usmrcovať doxorubicín-senzitívne bunky. K562 bunky, dostupné z American Type Tissue Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC číslo: CCL-243) sa vysiali na 96-jamkové platne (Greiner Scientific) v hustote 1000 buniek na jamku. Na misky s HT1080 bunkami alebo bunkami HT1080 klonu 33 sa pridalo kultivačné médium bez séra obsahujúce 1 μΜ doxorubicín-peptidového konjugátu na 19 hodín pri 37 °C. Odstránilo sa médium a uvoľňovanie doxorubicínu sa potvrdilo ako je opísané v príklade 5. 66 μΙ tohto média sa potom pridalo do každej jamky ku K562 bunkám. O štyri dni sa stanovil počet buniek použitím automatického ČASY® bunkového počítadla. Výsledky sú znázornené na obrázku 3.

-39Príklad 9

Plazmatická stabilita doxorubicín-peptidových konjugátov

Plazmatická stabilita doxorubicín-peptidových konjugátov sa merala použitím metód opísaných v príklade 5. Vzorky obsahujúce doxorubicín-peptidové konjugáty (s koncentráciou 1 μΜ) sa inkubovali v prítomnosti 10% (v/v) myšacej alebo ľudskej plazmy v priebehu uvedeného času pri 37 °C. Výsledky pre ZGP-Dox a ZPSGP-Dox v myšacej a ľudskej plazme sú znázornené na obrázku 4.

Príklad 10

FAPa-katalyzované štiepenie vybraných 4-metoxy-p-naftylamid-peptidových konjugátov

Aby sa identifikovali výhodné FAPa peptidové substráty, syntetizovali sa oligoméry zložené z prirodzených a/alebo neprirodzených aminokarboxylových kyselín a spájali sa s prolín-4-metoxy-p-naftylamínom (Pro-MNA) použitím spôsobov známych v oblasti (E. Wíinsch, Synthese von Peptiden, v Methoden der organischen Chemie, Houben-Weyl (vyd. E. Míiller, O. Bayer), zv. XV, časť 1 a 2, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974).

Syntéza Pro-Pro-4-metoxy-p-naftylamidu

Boc-Pro (32 mg, 0,15 mmol), 2-(1H-benzotriazol-1,1,3,3-tetrametylurónium tetrafluórboorát (53 mg, 0,15 mmol) a Pro-4-metoxy-p-naftylamid hydrochlorid (46 mg, 0,15 mmol) sa rozpustili v zmesi bezvodného /V,/V-dimetylformamidu a tetrahydrofuránu s pomerom 1:1 (4 ml). Pridal sa /V-etyldiizopropylamín (0,26 ml, 0,44 mmol) rozpustený v /V-metylpyrolidóne (1,7 molárny) a zmes sa miešala pri laboratórnej teplote cez noc.

Rozpúšťadlo sa odstránilo na rotačnej odparke a zvyšok sa rozpustil v etylacetáte (10 ml) a extrahoval sa trikrát vodou. Organická vrstva sa vysušila s bezvodným Na2SO4 a rozpúšťadlo sa odstránilo na rotačnej odparke. Zvyšok sa rozpustil v zmesi kyseliny trifluóroctovej a dichlórmetánu (1:4, 25 ml) a nechal sa

-40reagovať 1 hodinu. Rozpúšťalo sa odstránilo na rotačnej odparke a výsledný olej sa vysušil prúdom dusíka. Surový produkt sa purifikoval preparatívnou reverznou fázovou HPLC pričom sa aplikoval gradient zmesi acetonitrilu a vody. Produkt poskytoval uspokojivé analytické údaje (NMR a hmotnostné spektrá).

Potom sa meralo uvoľňovanie MNA z peptidov v Cytofluor fluorimetri (PerSeptive Biosystems, Inc.) použitím 355 nm excitačnej/405 nm emisnej sady filtrov. Enzýmové kinetické parametre (Michaelis-Menten Km a k_cat hodnoty) sa vypočítali použitím metód známych v oblasti (pozri napríklad Yun, S. L. & Suelter, C. H. (1977); A simple method for calculating Km and V from a single enzýme reaction process curve. Biochim. Biophys. Acta 480(1), 1-13) s FAPa enzýmom odvodeným od membránových extraktov 293-I/2 transfekovaných buniek z príkladu 2.

Tabuľka 1

K_m a kcat hodnoty FAPa-katalyzovaného štiepenia vybraných 4-metoxy-p-naftylamid (MNA)-peptidových konjugátov

Substráty	KM [μΜ]	Kcat [S	Kcat/KM x 104 [M’1 .s’1]
Chg-Pro-MNA	75	53,7	71,6
Hyn-Pro-MNA	69	27,4	39,7
Pro-Pro-MNA	154	49,5	32,1
Val-Pro-MNA	95	27,7	29,2
Met-Pro-MNA	127	27,9	22,0
Arg-Pro-MNA	278	50,6	18,2
frans-Hyp-Pro-M NA	254	37,9	14,9
Gln-Pro-MNA	273	40,5	14,8
Ala-Pro-MNA	267	35,7	13,4
Lys-Pro-MNA	530	57,1	10,8
Ile-Pro-MNA	43	12,6	8,8
Met(O)-Pro-MNA	378	26,9	7,1
Ser-Pro-MNA	872	28,3	3,3

*· r

-41 Chg = cyklohexylglycín, Hyn = 6-hydroxynorleucín, ŕrans-Hyp = ŕrans-4-hydroxyprolín, Met(O) = metionín-S-oxid

Príklad 11

Špecificita peptidov s pripojeným MNA voči FAPa versus DPP-IV

Spomedzi členov známej prolyl-špecifickej serínovej oligopeptidázovej rodiny je najbližším príbuzným enzýmom FAPa DPP-IV. Keďže v plazme a v mnohých rozličných typoch buniek sa nachádza aktívny DPP-IV, je nevyhnutná optimalizácia relatívnej (voliteľnej) selektivity prekurzorových peptidových látok voči FAPa v porovnaní so selektivitou voči DPP-IV, aby sa redukovala nežiaduca konverzia prekurzorov v miestach mimo nádoru (napr. v plazme). Aby sa identifikovali peptidy špecifické pre FAPa, porovnávalo sa štiepenie peptidov s pripojeným MNA prostredníctvom FAPa so schopnosťou DPP-IV štiepiť rovnaké peptidové konjugáty. Vylučovanie MNA sa meralo ako je opísané v príklade 9. Výsledky sú uvedené v tabuľke 2.

Tabuľka 2

Porovnanie selektivity štiepenia MNA-peptidových konjugátov s FAPa a DPP-IV

	Selektivita štiepenia
	FAP	DPP IV
Ala-Pro-MNA	+	+
Z-Gly-Pro-MNA	+	-
Z-Pro-Ala-Gly-Pro-MNA	+	-
+ znamená, že enzým bo	schopný štiepiť substrát

- označuje neobjavenie sa štiepenia

Príklad 12

FAPa aktivity vo vzorkách nádorov

-42Enzymatická aktivita FAPa sa merala v ľudských nádorových vzorkách. 96jamkové ELISA (s enzýmom spojený imunoadsorbčný test) platne (Costar, Corning, NY) sa cez noc pokrývali pri 4 °C 1 pg/ml F19 protilátkou alebo kontrolnou protilátkou vo fosfátom tlmenom fyziologickom roztoku (PBS), pH 7,4. Jamky sa potom premyli premývacím tlmivým roztokom (PBS, 0,1 % Tween 20, pH 7,4) a nadbytočné väzobné miesta sa blokovali blokovacím tlmivým roztokom (5% bovinný sérový albumín v PBS, pH 7,4) 1 hodinu pri laboratórnej teplote. FAPa aktivita sa merala v nádorovom tkanive (plné symboly) alebo sa porovnávala s normálnym kontrolným tkanivom (zodpovedajúce prázdne symboly) z membránových extraktoch obohatených konkanavalínom A (obrázok 5a). Nádorové vzorky zahŕňali rakovinu prsníka (+, Ψ), hrubého čreva (·, O), rakovinu hrubého čreva s metastázami do pečene (♦, □) a rakovinu pľúc (▲, Δ). Extrakty sa pridali na platne pokryté s F19 a inkubovali sa 1 hodinu pri laboratórnej teplote. Nenaviazaný materiál sa odstránil, jamky sa trikrát premyli premývacím tlmivým roztokom a testovala sa FAPa enzymatická aktivita použitím 100 μΙ Ala-Pro-AFC, ako je opísané vo WO 97/34972, 1 hodinu pri 37 °C. Merali sa prvé dva Konkanavalín A frakcie každého extraktu a každá hodnota sa zanášala do grafu jednotlivo. Od každej hodnoty sa odčítala fluorescencia pozadia (bola meraná použitím platní pokrytých kontrolnou protilátkou).

Nezávislé biochemické potvrdenie FAPa enzymatickej aktivity a jeho zdanlivej molekulovej hmotnosti v nádorových extraktoch sa získalo prostredníctvom značenia vyššie uvedených tkanivových extraktov s ¹⁴C-značeným diizopropylfluórfosfátom (DFP; NEN-DuPont, Cologne, Nemecko). O DFP je známe, že sa kovalentne a ireverzibilné viaže na a aktivuje serínové miesta mnohých serínových proteáz, čím zabraňuje ďalšej katalýze (Hayashi, R., Bai, Y. & Hata, T. (1975); Further confirmation of carboxypeptidase Y as a metal-free enzýme having a reactive serine residue. J. Biochem. 77(6), 1313-1318; Wahlby, S. & Engstrom, L. (1968); Studies on Streptomyces griseus protease II. The amino acid sequence around the reactive serine residue of DFP-sensitive components with esterase activity. Biochim. Biophys. Acta 151(2), 402-408). ¹⁴C-DFP značenie FAPa imunopurifikovaného nádoru (T) zodpovedajúcemu vzorke z hrubého čreva (·) z obrázka

-435Α, je znázornené na obrázku 5B. Nátriumdodecylsulfátové polyakrylamidové gélové elektroforézy (Laemmli, U.K. (1970); Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Náture 227(259), 680-685) a následná autorádiografia (Park, J. E., Draper, R. K. & Brown, W. J. (1991); Biosynthesis of lysosomal enzymes in celíš of the End3 complementation group conditionally defective in endosomal acidification. Somatic Celí Mol. Genet. 17(2), 137-150) týchto vzoriek odhalili prítomnosť značeného 95kD proteínu nachádzajúceho sa vo vzorke rakoviny hrubého čreva. Žiadne rádioaktívne značené pásy sa nepozorovali v normálnom kontrolnom imunoprecipitáte (N), ani s kontrolnou protilátkou. Zdanlivá molekulová hmotnosť imunopurifikovaného, ¹⁴C-značeného proteínu znázorneného na obrázku 5B súhlasí s predtým publikovanými údajmi pre FAPa (Rettig, W. J., Su, S. L., Fortunato, S. R., Scanlan, M. J., Mohan Raj, B. K., Garin-Chesa, P., Healey, J. H. & Old, L. J. (1994); Fibroblast activation protein: Purification, epitope mapping and induction by growth factors. Int. J. Cancer 58(3), 385-392; WO 97/34927).

Príklad 13

Príprava chránených oligopeptidov

Chránené oligopeptidy sa buď pripravovali v roztoku podľa protokolov známych z doterajšieho stavu techniky (napr. M. Bodanszky a A. Bodanszky, The practice of Peptide Synthesis, 2. vydanie, Springer, New York, 1994), alebo syntézou na tuhej fáze na automatickom peptidovom syntetizéry Applied Biosystems model 430A. Odstránenie ochranných skupín a oddelenie oligopeptidu od živicového podkladu sa dosiahlo pôsobením zmesí kyseliny trifluóroctovej a bežne používaných aditív. Purifikácia sa uskutočňovala preparatívnou vysokotlakovou kvapalnou chromatografiou na reverzných fázových C18 kremičitých kolónach použitím gradientu zmesi vodnej 0,1% kyseliny trifluóroctovej a acetonitrilu. Identita a homogenita peptidov sa potvrdzovala vysokotlakovou kvapalnou chromatografiou a hmotnostnou spektrálnou analýzou. Oligopeptidy, ktoré sa pripravili týmto spôsobom, sú uvedené v tabuľke 3.

-44Tabuľka 3 Oligopeptidy

Z-Gly-Pro-OH

Z-Pro-Ala-Gly-Pro-OH

Fmoc-Pro-Ala-Gly-Pro-OH

Fmoc-Chg-Pro-OH

Fmoc-NIe-Pro-OH

Fmoc-Hyn-Pro-OH

Fmoc-Pro-Pro-OH

Fmoc-Ser-Ala-Hyn-Pro-OH

Fmoc-Ser-Ala-NIe-Pro-OH

Fmoc-Ser-Ala-Chg-Pro-OH

Gly-Ser-Ala-Glu-Pro-OH

Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Pro-OH

Ser-Glu-Asn-Arg-Lys-Val-Pro-OH

Gly-T yr-Ser-Arg-Met-Pro-OH

Gln-Gly-Tyr-Ser-Arg-Met-Pro-OH

Gly-Gly-Gly-T rp-Pro-OH

Asn-Arg-Lys-Val-Pro-OH

Glu-Asn-Arg-Lys-Val-Pro-OH

Ser-Glu-Asn-Arg-Lys-Val-Pro-OH

Ala-His-Met-His-Pro-OH

Tyr-Ala-Phe-His-Pro-OH

Ser-Tyr-Ala-Phe-His-Pro-OH

Leu-Asn-Leu-Tyr-Met-Pro-OH

Gly-Ser-Ala-Glu-Pro-OH

Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Pro-OH

Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Pro-OH

Z znamená benzyloxykarbonyl

Fmoc znamená 9-fluórfenylmetoxykarbonyl

-45Chg znamená L-cyklohexylglycyl

Nie znamená L-norleucinyl

Hyn znamená L-6-hydroxynorleucinyl

Príklad 14

Príprava Fmoc-Pro-Ala-Gly-Pro-Dox

Fmoc-Pro-Ala-Gly-Pro-OH (44 mg, 0,078 mmol) sa rozpustil v bezvodnom /V,/\/-dimetylformamide (10 ml) a pH sa nastavilo na 7,5 A/./V-diizopropyletylamínom. Pridal sa /V-hydroxysukcínimid (1 M v DMF, 78 μΙ, 0,078 mmol) a zmes sa ochladila v ľadovom kúpeli. Za stáleho miešania sa pridal dicyklohexylkarbodiimid (1 M v DMF, 87 μΙ, 0,087 mmol) a roztok sa miešal pri 0 °C 1 hodinu.

Doxorubicín*HCI (25 mg, 0,043 mmol) sa rozpustil v 20 ml bezvodného DMF a pridal sa A/.N-diizopropyletylamín (8,2 μΙ, 0,048 mmol). Táto zmes sa striekačkou pridala k aktivovanému peptidu. Reakčná zmes sa nechala zahriať na laboratórnu teplotu a miešala sa 48 hodín.

Potom sa odstránilo rozpúšťadlo a produkt sa purifikoval preparatívnou RPHPLC na C18 použitím gradientu zmesi vody a acetonitrilu s 0,1% kyselinou trifluóroctovou.

Analytická HPLC >90 %; ES-MS 1110,5 ([M+Na]*); 674,4

Príklad 15

Príprava H-Pro-Ala-Gly-Pro-Dox

Fmoc-PAGP-Dox (pripravený v príklade 14, 44 mg, 0,040 mmol) sa rozpustil v zmesi THF a dietylamínu (2:1, 20 ml) pri 0 °C a miešal sa 2 hodiny. Odstránilo sa rozpúšťadlo a produkt sa purifikoval preparatívnou RP-HPLC na C18 použitím gradientu zmesi vody a acetonitrilu s 0,1% kyselinou trifluóroctovou.

Analytická HPLC >90 %; ES-MS 866,6 ([M+Na]⁺); 452,4

-46Príklad 16

Príprava H-Chg-Pro-Dox

Fmoc-Chg-Pro-OH (46 mg, 0,096 mmol) sa rozpustil v bezvodnom N,Ndimetylformamide (10 ml) a pH sa nastavilo na 7,5 Λ/,/V-diizopropyletylamínom. Pridal sa /V-hydroxysukcínimid (1 M v DMF, 96 μΙ, 0,096 mmol) a zmes sa ochladila v ľadovom kúpeli. Za stáleho miešania sa pridal dicyklohexylkarbodiimid (1 M v DMF, 107 μΙ, 0,107 mmol) a roztok sa miešal pri 0 °C 1 hodinu.

Doxorubicín»HCI (31 mg, 0,053 mmol) sa rozpustil v 20 ml bezvodného DMF a pridal sa Λ/,/V-diizopropyletylamín (10 μΙ, 0,059 mmol). Táto zmes sa striekačkou pridala k aktivovanému peptidu. Reakčná zmes sa nechala zahriať na laboratórnu teplotu a miešala sa 48 hodín.

Potom sa odstránilo rozpúšťadlo a produkt sa purifikoval preparatívnou RPHPLC na C18 použitím gradientu zmesi vody a acetonitrilu s 0,1% kyselinou trifluóroctovou.

Lyofilizovaný produkt sa rozpustil v zmesi THF a dietylamínu (2:1, 20 ml) pri 0 °C a miešal sa 2 hodiny. Odstránilo sa rozpúšťadlo a produkt sa purifikoval preparatívnou RP-HPLC na C18 použitím gradientu zmesi vody a acetonitrilu s 0,1% kyselinou trifluóroctovou.

Analytická HPLC >90 %; ES-MS 780,2 ([M+Na]⁺); 366,4

Nasledujúca tabuľka uvádza peptid-doxorubicínové konjugáty, ktoré boli pripravené analogicky a zahŕňa údaje o štiepení s FAP (po 20 hodinách).

Tabuľka 4 \

O HO

OH

R1	Štiepenie s FAP
Z-Gly-	>95 %
Z-Pro-Ala-Gly-	>95 %
Fmoc-Pro-Ala-Gly-	>95 %
H-Pro-Ala-Gly-	približne 11 %
H-Chg-	>95 %
H-NIe-	>95 %
H-Hyn	>95 %

Z znamená benzyloxykarbonyl, Fmoc znamená 9-fluórfenylmetoxykarbonyl, Chg znamená L-cyklohexylglycyl, Nie znamená L-norleucinyl, Hyn znamená L-6-hydroxynorleucinyl

Príklad 17

Príprava /V-Cbz-Gly-Pro-melfalánu

dimetylformamide (8 ml) a pH sa nastavilo na 7,5 /V,A/-diizopropyletylamínom. Pridal sa A/-hydroxysukcínimid (1 M v DMF, 72 μΙ, 0,072 mmol) a zmes sa ochladila v ľadovom kúpeli. Za stáleho miešania sa pridal dicyklohexylkarbodiimid (1 M v DMF, 67 μΙ, 0,67 mmol) a roztok sa miešal pri 0 °C 2 hodiny.

Melfalán (14,7 mg, 0,048 mmol) sa rozpustil v 30 ml bezvodného DMF a pridal sa Λ/,ΛΖ-diizopropyletylamín (12,3 μΙ, 0,072 mmol). Táto zmes sa striekačkou pridala k aktivovanému peptidu. Reakčná zmes sa nechala zahriať na laboratórnu teplotu a miešala sa 24 hodín.

-48Potom sa odstránilo rozpúšťadlo a produkt sa purifikoval preparatívnou RP HPLC na C18 použitím gradientu zmesi vody a acetonitrilu s 0,1% kyselinou trifluór octovou.

Analytická HPLC >90 %; ES-MS 593,0 ([M+Naf).

Claims (20)

1. PATENTOVÉ NÁROKY r· r r - · r r

   F F · f >· f *- · r r

   1. FAB-aktivované protinádorové zlúčeniny všeobecného vzorca I (I) alebo ich farmáceuticky prijateľné soli, kde

   R¹ znamená zvyšok vzorca Cg-A, Cg-B-A alebo Cg-(D)m-B-A, v ktorom Cg znamená ukončovaciu skupinu vybranú zo skupiny, ktorá obsahuje R⁵-CO, R⁵-O-CO-, R⁵-NH-CO-, R⁵-SO2- alebo R⁵, kde R⁵ znamená voliteľne substituovanú Ci-C6-alkylovú, C3-Ce-cykloalkylovú, arylovú, aralkyiovú alebo heteroarylovú skupinu;

   A je odvodené od L-prolínu, glycínu, L-norleucínu, L-cyklohexylglycínu, L-5-hydroxynorleucínu, L-6-hydroxynorleucínu, L-5-hydroxylyzínu, L-arginínu alebo L-lyzínu; a B a D, každý nezávisle, znamenajú skupiny odvodené od aminokarboxylových kyselín vzorca -[NR⁶-(X)p-CO]-, kde X znamená CR⁷R⁸, a kde R⁶, R⁷ a R⁸, každý nezávisle, znamenajú atóm vodíka, voliteľne substituovanú Ci-C6-alkylovú, C₃-Cecykloalkylovú, arylovú alebo heteroarylovú skupinu, a kde p je 1, 2, 3, 4, 5; alebo B a D, každý nezávisle, znamenajú skupiny odvodené od cyklických aminokarboxylových kyselín vzorca

   R⁹ znamená Ci-Ce-alkyl, OH alebo NH₂, m je prirodzené číslo od 1 do 10, q je 0,1 alebo 2; a r je 0, 1 alebo 2;

   -50R^a a R^b spolu so spojovacou N-C skupinou tvoria voliteľne substituovaný, voliteľne benzo- alebo cyklohexano-kondenzovaný 3- až 7-členný nasýtený alebo nenasýtený heterocyklický kruh, v ktorom môže byť jedna z dvoch CH2 skupín nahradená

   NH, O alebo S;

   R⁴ znamená H, Ci-C6-alkyl, C3-Ce-cykloalkyl, aryl alebo heteroaryl; a

   Cyť znamená zvyšok cytotoxickej alebo cytostatickej zlúčeniny.
2. 2. Zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa nároku 1, kde je heterocyklický kruh, ktorý je tvorený R^a, R^b a spojovníkom N-C, substituovaný R² a R³, kde R² a R³, každý nezávisle, znamenajú atóm vodíka alebo halogénu alebo Ci-C₆-alkylovú, Ci-C₆-alkylamino, di-Ci-C6-alkylamino, CrC6-alkoxy, tiol, Ci-C₆-alkyltio, oxo, imino, formylovú, CrC6-alkoxykarbonylovú, aminokarbonylovú, C3-Ce-cykloalkylovú, arylovú alebo heteroarylovú skupinu.
3. 3. Zlúčeniny všeobecného vzorca IA kde R¹, R², R³, R⁴, Cyť sú určené v nároku 1 alebo 2, a X-Y znamená CHR²-CH2, CR²=CH, NH-CH2, CH2-NH, -CR², CH2-CHR²-CH₂.
4. 4. Zlúčeniny všeobecného vzorca IA1

   Cyť (IA1) kde R¹ a Cyť sú určené v ktoromkoľvek z nárokov 1 až 3.

   f -51
5. 5. Zlúčeniny vybrané zo skupiny zlúčenín všeobecných vzorcov IA2, IA3, IA4 a IA5 kde R¹ a Cyť sú určené v ktoromkoľvek z nárokov 1 až 4.
6. 6. Zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, kde R¹ znamená skupinu vybranú zo vzorcov 21,22 a 34

   Cg-Gly (21) Cg-NIe (22) Cg-(Xaa)_m-Xaa-Gly (34)

   kde

   Cg znamená atóm vodíka alebo ukončovaciu skupinu vybranú z benzoyloxykarbonylu, fenylacetylu, fenylmetylsulfonylu a benzylaminokarbonylu;

   Xaa znamená skupinu odvodenú od aminokarboxylovej kyseliny; a m je prirodzené číslo od 1 do 6.

   -527. Zlúčeniny podľa nároku 6, kde skupiny aminoalkánových kyselín existujú v (L)-konfigurácii.
7. 8. Zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, kde H₂N-Cyť znamená antracyklínový derivát.
8. 9. Zlúčeniny podlá nároku 8, ktoré sú vybrané zo skupiny zlúčenín všeobecných vzorcov IIIA, IIIB, IIIE a IIIF f t r
9. 10. Prekurzor, ktorý je možné konvertovať na liečivo prostredníctvom katalytického účinku FAPa, majúci štiepne miesto, ktoré je rozoznávané FAPa, ale nie je rozoznávané proteolytickými enzýmami prítomnými v ľudských alebo živočíšnych telesných tekutinách, obsahujúce oligomérnu časť zahŕňajúcu dve, tri alebo štyri aminokarboxylové zvyšky, a cytotoxickú alebo cytostatickú časť, pričom N-koncová aminoskupina je chránená ukončovacou skupinou a C-koncový aminokarboxylový zvyšok oligomérnej časti je vybraný z D-prolínu, L-prolínu, D-hydroxyprolínu a Lhydroxyprolínu a C-koncová karboxylová skupina je spojená s cytotoxickou alebo cytostatickou časťou amidovou väzbou;

   a uvedené liečivo je cytotoxické alebo cytostatické vo fyziologických podmienkach.

   -5411. Spôsob výroby zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že zlúčenina všeobecného vzorca V kde R¹, R^a a R^b sú určené v nároku 1, X¹ znamená OH alebo odštiepiteľnú skupinu, ktorá je vhodná na to, aby bola substituovaná aminoskupinou, reaguje so zlúčeninou HN(R⁴)-Cyť, kde Cyť je zvyšok cytotoxickej alebo cytostatickej zlúčeniny a R⁴ je určené v nároku 1.
10. 12. Spôsob výroby zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že zlúčenina všeobecného vzorca VI kde R¹, R^a a R^b sú určené v nároku 1, Y¹ znamená L-COX², kde L znamená spojovníkový zvyšok a X² znamená OH alebo odštiepiteľnú skupinu, ktorá je vhodná na to, aby bola substituovaná aminoskupinou alebo hydroxyskupinou, reaguje so zlúčeninou HaN-Cyť alebo so zlúčeninou HO-Cyť, kde Cyť je zvyšok cytotoxickej alebo cytostatickej zlúčeniny.
11. 13. Spôsob výroby zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že zlúčenina všeobecného vzorca VII (VII)

    -55kde R¹, R^a a R^b sú určené v nároku 1, Y² znamená L-OH alebo L-NH_2l kde L znamená spojovníkový zvyšok, reaguje so zlúčeninou X³OC-Cyť, kde X³ znamená OH alebo odštiepiteľnú skupinu, ktorá je vhodná na to, aby bola substituovaná aminoskupinou alebo hydroxyskupinou, a kde Cyť znamená zvyšok cytotoxickej alebo cytostatickej zlúčeniny.
12. 14. Spôsob výroby zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, vyznačujúcisa tým, že zlúčenina všeobecného vzorca VIII kde PG¹ znamená ochrannú skupinu a významy ostatných substituentov sú vysvetlené vyššie, reaguje so zlúčeninou vzorca HN(R⁴)-Cyť, kde Cyť znamená zvyšok cytotoxickej alebo cytostatickej zlúčeniny;

    ochranná skupina PG¹ sa potom odstráni a výsledná zlúčenina všeobecného vzorca VIIIA

    O (VIIIA) následne reaguje so zlúčeninou PG²-A-X⁴, kde

    PG² znamená ochrannú skupinu a X⁴ znamená OH alebo odštiepiteľnú skupinu, ktorá je vhodná na to, aby bola nahradená aminoskupinou; a ak je to nevyhnutné uskutočňujú sa ďalšie kopulačné kroky, pokiaľ sa nezíska kompletná zlúčenina.
13. 15. Spôsob výroby zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že zlúčenina všeobecného vzorca PG³-N(R⁴)-L-COX³,

    -56kde PG³ znamená ochrannú skupinu a významy ostatných substituentov sú vysvetlené vyššie, reaguje so zlúčeninou vzorca Y⁴-Cyť, kde

    Cyť znamená zvyšok cytotoxickej alebo cytostatickej zlúčeniny; a Y⁴ znamená H₂N alebo OH;

    ochranná skupina PG³ sa potom odstráni a výsledná zlúčenina HN(R⁴)-L-Y⁴-Cyť reaguje so zlúčeninou všeobecného vzorca VIII ochranná skupina PG¹ sa potom odstráni a výsledná zlúčenina všeobecného vzorca

    O a/ N “L—Y*-Cyť reaguje potom so zlúčeninou PG⁴-A-X⁴, kde

    PG⁴ znamená ochrannú skupinu a X⁴ môže znamenať OH alebo odštiepiteľnú skupinu, ktorá je vhodná na to, aby bola substituovaná aminoskupinou; a ak je to nevyhnutné uskutočňujú sa ďalšie kopulačné kroky, pokiaľ sa nezíska kompletná zlúčenina.
14. 16. Spôsob výroby zlúčeniny všeobecného vzorca I, vyznačujúci sa t ý m , že zlúčenina všeobecného vzorca PG⁵-N(R⁴)-L-Y⁵, kde PG⁵ znamená ochrannú skupinu, Y⁵ znamená OH alebo NH₂ a významy ostatných substituentov sú vysvetlené vyššie, reaguje so zlúčeninou všeobecného vzorca X⁵OC-Cyť, kde

    Cyť znamená zvyšok cytotoxickej alebo cytostatickej zlúčeniny; a X⁵ znamená OH alebo vhodnú odštiepiteľnú skupinu;

    f ·

    -57ochranná skupina PG⁵ sa potom odstráni a výsledná zlúčenina HN(R⁴)-L-Y⁵-CO Cyť reaguje so zlúčeninou všeobecného vzorca Vili ochranná skupina sa potom odstráni a výsledná zlúčenina vzorca

    Cyť reaguje potom so zlúčeninou PG²-A-X⁴, kde

    PG² znamená ochrannú skupinu a X⁴ znamená OH alebo odštiepiteľnú skupinu, ktorá je vhodná na to, aby bola substituovaná aminoskupinou; a ak je to nevyhnutné uskutočňujú sa ďalšie kopulačné kroky, pokiaľ sa nezíska kompletná zlúčenina.
15. 17. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje zlúčeninu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10 a voliteľne jeden alebo viac farmaceutický prijateľných excipientov.
16. 18. Zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10 na použitie na medicínske účely.
17. 19. Prekurzor podľa nároku 10 na použitie na liečenie rakoviny.
18. 20. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 17 na použitie na liečenie rakoviny.

    -5821. Použitie zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10 na výrobu farmaceutického prostriedku na liečenie rakoviny.
19. 22. Použitie prekurzora podľa nároku 10 na výrobu farmaceutického prostriedku na liečenie rakoviny.
20. 23. Zlúčenina všeobecného vzorca VIIIA

    HN

    R* (VIIIA) kde R^a, R^b, R⁴ a Cyť sú určené v nároku 1, ako medziprodukt na výrobu zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa nároku 1.