CN110128506B - 一种寡肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一个系列寡肽及其应用，属于生物医药技术领域。本发明系列寡肽序列为Xm‑Leu‑Asn‑Leu‑Tyr‑Yn(m、n大于等于零,X、Y为任何氨基酸，如Pro、Tyr等，或者为任何氨基酸组合如Leu‑Asn‑Leu‑Tyr(LNLY，LP‑4)、Leu‑Asn‑Leu‑Tyr‑Pro(LNLYP，LP‑5)、Leu‑Asn‑Leu‑Tyr‑Pro‑Tyr(LNLYPY，LP‑6)。该系列寡肽既能增加上皮细胞电阻，促进细胞连接蛋白的表达，抑制旁细胞渗漏，同时还能抑制炎症因子的产生，显示其在改善上皮细胞屏障完整性方面具有重要的开发和应用价值。

Description

一种寡肽及其应用
技术领域
本发明涉及多肽领域，具体涉及寡肽在治疗或改善上皮细胞屏障完整性损伤的药物中的应用。
背景技术
上皮细胞及内皮细胞形成了机体的功能性屏障，将机体器官组织与外界隔开。这一功能依赖于细胞间连接，紧密连接是位于相邻上皮细胞连接顶侧面的蛋白复合体，由Occludin、Claudin家族等跨膜蛋白、ZO-家族为主要成员的胞浆蛋白以及肌动蛋白、肌球蛋白等细胞骨架和信号蛋白构成[1]。紧密连接具有栅栏和屏障的功能，是物质通过旁细胞通路转运的基础。栅栏功能把上皮细胞分为顶侧膜和基底膜部分，限制两个不同功能区之间的脂质和蛋白等物质自由弥散；屏障功能则通过对分子大小和所带电荷的选择性，调节旁细胞通路途径可以调节水、离子、不同大小的分子通过细胞间的间隙的转运，维持组织的内环境稳态[2]。
在多种疾病中均可观察到细胞屏障功能受损、通透性增加以及紧密连接蛋白表达和分布异常。例如有研究发现[3]，克罗恩病的肠上皮对旁细胞路的示踪物质乳果糖的通透性要显著高于正常人群，这提示在炎症性肠病中，以紧密连结蛋白为物质基础的屏障功能异常可能是引起腹泻等临床表现的重要机制之一。旁细胞通透性反映了紧密连接的功能，除了用示踪物质来显示外，还可以通过检测上皮细胞电阻(transepithelial electricalresistance,TEER)来评价，TEER降低反应旁细胞途径通透性升高。在小鼠炎症性肠病模型中，TEER显著降低。说明紧密连接屏障功能障碍是肠炎潜在的致病因素，也是一个显著的病变特点。
肾病综合征(nephrotic syndrome,NS)是临床上常见的肾小球疾病之一，其典型表现为大量蛋白尿(≥3.5g/d)、低蛋白血症(血浆蛋白<30g/L)、水肿、高脂血症[4]。持续性的蛋白尿会造成肾小球高滤过状态，甚至导致肾脏的不可逆损伤，从而严重影响人们的生活质量，给人们带来严重的经济负担和心理负担。产生蛋白尿的主要原因之一是肾小球滤过屏障的变化，特别是足细胞的结构及相关分子的改变，其中足细胞相关分子包括nephrin、ZO-1、podocin等。在糖尿病肾病(DN)、膜性肾病(MN)、HIV相关性肾病(HIVAN)、肥胖相关肾病等一些疾病中都伴有足细胞形态和功能的异常。近年来已研究证实分布于足细胞上或裂孔隔膜的蛋白分子如nephrin、podocin、ZO-1等对维系足细胞的正常结构及滤过屏障起关键作用，在肾小球滤过屏障通透性改变/蛋白尿的发生中发挥了重要作用。因此上调足细胞间的细胞连接相关蛋白水平可减轻足细胞损伤，起到肾保护作用[5]。
上呼吸道是机体直接与外界相通的门户，而鼻黏膜是机体与吸入抗原、异物、微生物等接触的第一个部位。鼻黏膜屏障主要由物理屏障和免疫屏障构成。有研究表明鼻黏膜物理屏障被破坏是上呼吸道感染发生的重要原因。而细胞间紧密连接作为鼻黏膜物理屏障的组成部分，在维持上呼吸道黏膜屏障的完整性中发挥了极为重要的作用[6]。研究表明细菌、病毒等可通过破坏上呼吸道黏膜紧密连接蛋白的结构来改变细胞间的通透性，损伤上呼吸道屏障功能，引发上呼吸道感染。因此维持上呼吸道紧密连接的完整性，对于防治上呼吸道感染具有重要意义。肺泡上皮细胞之间的连接包括紧密连接和缝隙连接。肺水肿与肺泡上皮细胞通透性增加密切相关，已有研究证实肺水肿动物的肺泡上皮细胞紧密连接蛋白表达降低及屏障功能下降；肺泡上皮细胞中紧密连接蛋白的改变也会影响细胞旁路运输，导致肺水肿。因此调节紧密连接蛋白的表达水平可能是治疗急性肺损伤和肺水肿的有效方法[7]。
发明内容
本发明目的在于提供能够改善上皮细胞屏障功能的系列寡肽。
技术方案
一种寡肽，其特征在于：所述的寡肽的氨基酸序列为Xm-Leu-Asn-Leu-Tyr-Yn，X或Y为任何氨基酸且m、n大于等于零。
所述的一种寡肽，其特征在于：所述的X或Y为Pro、Tyr。
所述的一种寡肽，其特征在于：所述的寡肽为氨基酸组合为Leu-Asn-Leu-Tyr(LP-4)、Leu-Asn-Leu-Tyr-Pro(LP-5)或Leu-Asn-Leu-Tyr-Pro-Tyr(LP-6)。
所述的寡肽在制备预防或治疗上皮细胞屏障完整性损伤的药物中的应用。
所述的应用为抑制炎症因子产生、治疗溃疡性结肠炎、肾脏疾病或肺损伤。
有益效果
本发明所述的系列寡肽有效降低了上皮细胞的细胞旁渗透性，通过促进细胞连接蛋白ZO-1、Occludin、Nephrine、Claudin等的表达及重构，进而改善上皮细胞的屏障功能，同时本发明所述的系列寡肽也具有抗炎作用。
附图说明
图1为LP-4/5/6对TNF-α诱导的IEC-6细胞电阻及渗漏的影响，其中
A.LP-4(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的IEC-6细胞电阻(TEER)的影响
B.LP-4(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的IEC-6细胞渗漏的影响
C.LP-5(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的IEC-6细胞电阻(TEER)的影响
D.LP-5(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的IEC-6细胞渗漏的影响
E.LP-6(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的IEC-6细胞电阻(TEER)的影响
F.LP-6(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的IEC-6细胞渗漏的影响
(n＝3，*P＜0.05,**P＜0.01,compared with Control group；#P＜0.05,##P＜0.01,compared with Model group；)
图2为LP-4/5/6对TNF-α诱导的Caco-2细胞电阻及渗漏的影响，其中
A.LP-4(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的Caco-2细胞电阻(TEER)的影响
B.LP-4(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的Caco-2细胞渗漏的影响
C.LP-5(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的Caco-2细胞电阻(TEER)的影响
D.LP-5(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的Caco-2细胞渗漏的影响
E.LP-6(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的Caco-2细胞电阻(TEER)的影响
F.LP-6(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的Caco-2细胞渗漏的影响
(n＝3，*P＜0.05,**P＜0.01,compared with Control group；#P＜0.05,##P＜0.01,compared with Model group；)
图3为LP-4/5/6对TNF-α诱导的IEC-6细胞连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-2表达的影响，其中
A.LP-4(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的IEC-6细胞连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-2表达的影响
B.LP-5(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的IEC-6细胞连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-2表达的影响
C.LP-6(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的IEC-6细胞连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-2表达的影响
(n＝3，*P＜0.05,**P＜0.01,compared with Control group；#P＜0.05,##P＜0.01,compared with Model group；)
图4为LP-4/5/6对TNF-α诱导的IEC-6细胞连接蛋白ZO-1、Occludin表达的影响的免疫荧光检测图
图5为LP-4/5/6对TNF-α诱导的IEC-6细胞炎症因子IL-6、IL-1βmRNA水平的影响，其中
A.LP-4(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的IEC-6细胞IL-6mRNA水平的影响
B.LP-4(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的IEC-6细胞IL-1βmRNA水平的影响
C.LP-5(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的IEC-6细胞IL-6mRNA水平的影响
D.LP-5(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的IEC-6细胞IL-1βmRNA水平的影响
E.LP-6(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的IEC-6细胞IL-6mRNA的影响
F.LP-6(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的IEC-6细胞IL-1βmRNA水平的影响
(n＝3，*P＜0.05,**P＜0.01,compared with Control group；#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001,compared with Model group；)
图6为LP-4/5/6对DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎中小鼠活动指数及结肠长度的影响，其中
A.各组小鼠活动指数DAI评分；B.各组小鼠结肠长度；
(n＝10，*P＜0.05,**P＜0.01,compared with Control group；#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001,compared with Model group；)
图7为LP-4/5/6对DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎中小鼠结肠组织病理切片(HE染色，比例尺＝100μm)，其中A：空白组；B：模型组C：LP-6组(100mg/kg)；D：LP-5组(100mg/kg)；E：LP-4组(100mg/kg)；F：美沙拉嗪组(10mg/kg)
图8为LP-4/5/6对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎中小鼠结肠组织炎症因子IL-6、IL-1βmRNA水平的影响，其中
A.各组小鼠结肠组织中IL-6mRNA表达水平；B.各组小鼠结肠组织中IL-1βmRNA水平变化
(n＝10，*P＜0.05,**P＜0.01,compared with Control group；#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001,compared with Model group；)
图9为LP-4/5/6对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎中小鼠结肠组织连结蛋白ZO-1、Occludin表达水平的影响
(n＝10，*P＜0.05,**P＜0.01,compared with Control group；#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001,compared with Model group；)
图10为LP-4/5/6对阿霉素诱导的大鼠肾脏组织结蛋白ZO-1、Nephrine mRNA表达水平的影响
(n＝10，*P＜0.05,**P＜0.01,compared with Control group；#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001,compared with Model group；)
图11为LP-4/5/6对阿霉素诱导的大鼠肾脏组织连接蛋白ZO-1、Nephrine表达水平的影响
(n＝10，*P＜0.05,**P＜0.01,compared with Control group；#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001,compared with Model group；)
图12为LP-4/5/6对TNF-α诱导的16HBE细胞电阻及渗漏的影响，其中
A.LP-4(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的16HBE细胞电阻(TEER)的影响
B.LP-4(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的16HBE细胞渗漏的影响
C.LP-5(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的16HBE细胞电阻(TEER)的影响
D.LP-5(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的16HBE细胞渗漏的影响
E.LP-6(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的16HBE细胞电阻(TEER)的影响
F.LP-6(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的16HBE细胞渗漏的影响
(n＝3，*P＜0.05,**P＜0.01,compared with Control group；#P＜0.05,##P＜0.01,compared with Model group；)
图13为LP-4/5/6对TNF-α诱导的16HBE细胞连接蛋白ZO-1、Occludin表达的影响，其中
A.LP-4(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的16HBE细胞连接蛋白ZO-1、Occludin表达的影响
B.LP-5(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的16HBE细胞连接蛋白ZO-1、Occludin表达的影响
C.LP-6(10、1、0.1μM)对TNF-α诱导的16HBE细胞连接蛋白ZO-1、Occludin表达的影响
(n＝3，*P＜0.05,**P＜0.01,compared with Control group；#P＜0.05,##P＜0.01,compared with Model group；)
图14为LP-4/5/6对LPS诱导的小鼠肺组织连接蛋白ZO-1、Occludin表达水平的影响
(n＝10，*P＜0.05,**P＜0.01,compared with Control group；#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001,compared with Model group；)
具体实施方式
以下实施例中涉及的材料：
1、细胞
IEC-6大鼠小肠隐窝上皮细胞株；Caco-2人结肠癌上皮细胞株；16HBE人气道上皮细胞株，均来源于中国科学院上海细胞库。
2、试剂
Leu-Asn-Leu-Tyr(LP-4)、Leu-Asn-Leu-Tyr-Pro(LP-5)或Leu-Asn-Leu-Tyr-Pro-Tyr(LP-6)由南京金斯瑞公司合成；注射用盐酸多柔比星(阿霉素，浙江海正药业股份有限公司)；醋酸泼尼松片剂(天津天药药业)；脂多糖(LPS，sigma)；DSS(MP Biomedicals)；美沙拉嗪片剂(黑龙江天宏药业)；Fluorescein isothiocyanate-dextran(FD-4，Sigma)；DMEM,Bovine Serμm Albμmin(Sigma)；TNF-α(novoprotein,开盖前离心，加PBS溶解至100μg/mL，分装后于-20℃冻存，实验前用DMEM培养液稀释至100ng/mL)；ZO-1(proteintech)；Occludin(proteintech)；Claudin-2(Biotech Lab)；DEPC(南京碧云天科技有限公司)；
3、试剂盒
TransZol Up核酸纯化试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)；TransStart TopGreen qPCR荧光定量试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)；反转录试剂盒(南京诺唯赞生物技术有限公司)；引物(南京金斯瑞生物科技公司)；粪便隐血试剂盒(南京建成生物有限公司)；马斯亮蓝尿蛋白测定试剂盒(南京建成生物有限公司)；
4、实验动物
清洁级健康雄性C57BL/6小鼠，体重18-22g；雄性SD大鼠，体重180-220g，由扬州大学动物实验中心提供(许可证号：SYXK(苏)2018-0019)。实验动物进行分笼饲养，环境温度24±2℃、相对湿度60％，每天12h光照和12h黑夜循环。
实施例1、LP-4/5/6对肠上皮细胞屏障完整性的影响
1.1 LP-4/5/6对TNF-α诱导的IEC-6细胞通透性损伤的影响
1.1.1实验方法
将对数生长期的IEC-6细胞以5×104个/孔接种于孔径0.4μM的CorningTranswell 24孔板上室。设置正常对照组、模型组、给药组，将细胞培养10d后，细胞电阻值(TEER)上升到平台期后，正常组给予DMEM培养基，模型组用50ng/mL的TNF-α刺激24h，给药组预先用寡肽不同浓度(10、1、0.1μM)预先处理1h，再加入终浓度为50ng/mL TNF-α刺激24h。将Transwell板置于室温下平衡30min，使用细胞电阻仪测定电阻值，以空白组为对照计算电阻变化百分比。将上下室培养基弃去，上室加入含有1mg/mL的FD-4葡聚糖Krebs液200μL，下室加入600mL krebs液，培养1h后从下室收集100μL样品置于96孔板中，以空白组为对照计算FD-4渗漏百分比。
1.1.2实验结果
如图1所示，TNF-α可显著降低IEC-6细胞电阻，增加FD-4的渗漏；LP-4在10、1、0.1μM均可显著增加IEC-6细胞电阻，在10、1μM时可显著降低FD-4的渗漏；LP-5在10、1、0.1μM均可显著增加IEC-6细胞电阻，显著降低FD-4的渗漏；LP-6在10、1μM均可显著增加IEC-6细胞电阻，在10μM时可显著降低FD-4的渗漏。表明LP-4/5/6均能改善细胞通透性，发挥保护作用。
1.2 LP-4/5/6对TNF-α诱导的Caco-2细胞通透性损伤的影响
1.2.1实验方法
将对数生长期的Caco-2细胞以5×104个/孔接种于孔径0.4μM的CorningTranswell 24孔板上室。设置正常对照组、模型组、给药组，将细胞培养21d后，细胞电阻值(TEER)上升到平台期后，正常组给予DMEM培养基，模型组用50ng/mL的TNF-α刺激24h，给药组预先用寡肽不同浓度(10、1、0.1μM)预先处理1h，再加入终浓度为50ng/mL TNF-α刺激24h。将Transwell板置于室温下平衡30min，使用细胞电阻仪测定电阻值，以空白组为对照计算电阻变化百分比。将上下室培养基弃去，上室加入含有1mg/mL的FD-4葡聚糖Krebs液200μL，下室加入600mL krebs液，培养1h后从下室收集100μL样品置于96孔板中，以空白组为对照计算FD-4渗漏百分比。
1.2.2实验结果
如图2所示，TNF-α可明显降低Caco-2细胞电阻，增加FD-4细胞渗漏；LP-4、LP-5、LP-6均可显著增加Caco-2细胞电阻，降低FD-4渗漏，且呈剂量依赖性。表明LP-4/5/6均可降低细胞通透性，改善肠道Caco-2细胞的屏障功能。
1.3 LP-4/5/6对TNF-α诱导的IEC-6细胞连结蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-2表达的影响
1.3.1实验方法
免疫印迹(Western blot)：IEC-6细胞给予LP-6(10、1、0.1μM)、LP-5(10、1、0.1μM)、LP-4(10、1、0.1μM)孵育24h后，取出置于冰上以冷PBS轻轻荡洗2次，按一定比例加入中等强度RIPA裂解液，按照说明提取细胞蛋白，加入5×loading buffer，100℃金属浴10min，取20μg蛋白样品上样于10％SDS-PAGE进行凝胶电泳，转膜，分别加入一抗室温孵育3h，4℃过夜，TBST洗10min×3，加入二抗，室温下孵育2h，TBST洗10min×3，加入ECL发光底物显色。用分子显影仪(Gel DocTM XR，170-8170)联合QuantityOne-4.6.5(Bio-RadLaboratories)软件分析数据。用目的蛋白灰度值与胞浆蛋白内参GAPDH灰度值之比进行半定量分析。
1.3.2实验结果
如图3所示，TNF-α可显著降低IEC-6细胞ZO-1、Occludin蛋白表达水平，促进Claudin-2的表达；LP-4、LP-5、LP-6均可显著促进ZO-1、Occludin蛋白表达，降低Claudin-2蛋白表达量，且呈剂量依赖性。表明LP-4/5/6可通过促进细胞连接蛋白表达发挥肠屏障保护作用。
1.4免疫荧光检测LP-4/5/6对TNF-α诱导的IEC-6细胞连结蛋白ZO-1、Occludin表达的影响
1.4.1实验方法
将对数期的IEC-6细胞以1×105个/mL接入共聚焦小皿培养24h。实验设置空白组、模型组和给药组，空白组给予DMEM培养基，给药组预先用寡肽不同浓度(10、1、0.1μM)预先处理1h，再加入终浓度为50ng/mL TNF-α刺激24h。结束后进行免疫荧光处理，显微镜下观察，拍照。
1.4.2实验结果
免疫荧光结果显示，ZO-1(绿色)与Occludin(红色)主要表达在细胞膜上，而Occludin在胞浆中也有表达。给予TNF-α后ZO-1、Occludin表达较正常组减弱，形态不够光滑，部分连续性中断，破坏明显；给予寡肽后，可见ZO-1、Occludin表达明显增强，连续性增加，尤其给予LP-5后，在10μM时，ZO-1、Occludin表达趋于正常水平。(图4)
实施例2、LP-4/5/6对TNF-α诱导的IEC-6细胞炎症因子表达的影响
2.1实验方法
IEC-6细胞给予LP-6(10、1、0.1μM)、LP-5(10、1、0.1μM)、LP-4(10、1、0.1μM)与TNF-α共同孵育24h后，预冷的PBS漂洗三次，按照TransZol Up试剂盒提取RNA。根据反转录试剂盒将细胞RNA逆转录为cDNA，采用标准商品化的TransStart Top Green Qpcr SuperMix进行QPCR，于QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪中进行Q-PCR。分析各样本熔解曲线、Ct值、扩增曲线，根据公式2-ΔΔCt进行相对定量分析。各目的基因引物序列见表1。
表1引物序列
Figure BDA0002068182270000081
2.2实验结果
如图5所示，TNF-α可显著增加IEC-6细胞IL-6、IL-1βmRNA水平，；LP-4、LP-5、LP-6均可显著抑制这两个炎症因子的表达，且呈剂量依赖性。表明这3个寡肽可发挥抗炎作用。
实施例3、LP-4/5/6对DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用
3.1实验方法
小鼠随机分为6组，分别为空白组、模型组、LP-6组(100mg/kg)、LP-5组(100mg/kg)、LP-4组(100mg/kg)、美沙拉嗪组(10mg/kg)。通。小鼠饮用3％DSS水同时每日给予寡肽溶液或美沙拉嗪。每日记录小鼠体重、大便性状及便血情况，计算各组小鼠疾病活动指数(disease activity index，DAI)评分，6日后小鼠脱颈处死，迅速解剖，取小鼠全部结直肠及回盲部，测量结肠长度；取病变明显处结肠组织标本(约5mm×10mm)，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片后进行HE染色。
结肠组织蛋白提取：取小鼠结肠标本约5mm肠段，置于1.5mL离心管中，冰上剪碎，按一定比例加入中等强度RIPA裂解液，按照说明提取组织蛋白，加入5×loading buffer，100℃金属浴10min，取50μg蛋白样品上样于10％SDS-PAGE进行凝胶电泳，转膜，分别加入一抗室温孵育3h，4℃过夜，TBST洗10min×3，加入二抗，室温下孵育2h，TBST洗10min×3，加入ECL发光底物显色。用分子显影仪(Gel DocTM XR，170-8170)联合QuantityOne-4.6.5(Bio-Rad Laboratories)软件分析数据。用目的蛋白灰度值与胞浆蛋白内参GAPDH灰度值之比进行半定量分析。
组织RNA提取：取结肠组织约0.5cm，冰上剪碎，按照TransZol Up试剂盒提取RNA。根据反转录试剂盒将细胞RNA逆转录为cDNA，采用标准商品化的TransStart Top GreenQpcr SuperMix进行QPCR，于Quant Studio 3实时荧光定量PCR仪中进行Q-PCR。分析各样本熔解曲线、Ct值、扩增曲线，根据公式2-ΔΔCt进行相对定量分析。各目的基因引物序列见表2。
表2引物序列
Figure BDA0002068182270000091
3.2实验结果
造模过程中空白组小鼠体重均无明显降低，无隐血现象；模型组小鼠体重下降明显，在3d开始出现隐血试验阳性，4d开始出现便血，并逐渐加重，结肠长度明显缩短(P<0.01)；给予寡肽及美沙拉嗪后，给药组体重、便血情况均较造模组程度较轻，结肠长度均显著变长(P<0.01)(图6)。
结肠组织HE染色结果(图7)表明，模型组小鼠结肠可见较大面积溃疡，肠上皮脱落(实心箭头)，固有层腺消失，被增生的结缔组织取代，伴有较多炎性细胞浸润(虚线箭头)，并有炎性细胞浸润至粘膜下层与肌层(单箭头)；寡肽组及阳性药物组小鼠粘膜层肠上皮结构较完整，上皮细胞排列紧密，粘膜下层轻度水肿(双箭头)，固有层局部可见少量结缔组织增生，并伴有少量炎性细胞浸润(实心箭头)；局部黏膜下层结缔组织可见少量炎性细胞浸润(虚线箭头)。
QPCR结果显示(图8)，与空白组比较，模型组结肠组织中IL-6、IL-1βmRNA表达水平显著升高(P<0.001)；与模型组比较，给药组小鼠结肠组织中IL-6、IL-1βmRNA水平显著下降，差异均有统计学意义(P<0.01)。
图9结果表明DSS可显著降低小鼠结肠组织中连结蛋白ZO-1、Occludin的蛋白表达水平(P<0.01)；寡肽组均能上调ZO-1、Occludin的蛋白表达水平，差异具有统计学意义，但阳性药物美沙拉嗪对其上调作用不明显(P>0.05)。
在溃疡性结肠炎模型中可观察到结肠缩短、便血、炎症因子表达增加、结肠组织损伤等，给予LP-4/5/6可通过促进细胞间连接蛋白的表达及抑制炎症因子的产生来发挥治疗溃疡性结肠炎的作用。
实施例4、LP-4/5/6对阿霉素诱导的大鼠肾病足细胞损伤的影响
4.1实验方法
大鼠适应性饲养一周后，单次尾静脉注射阿霉素(6.5mg/mL)建立阿霉素肾病大鼠模型，1周后将大鼠笼放入代谢笼收集24h尿液标本，测定大鼠尿蛋白量，定量超过100mg/d视为模型成功。随机分为空白组、模型组、LP-6组(100mg/kg)、LP-5组(100mg/kg)、LP-4组(100mg/kg)、泼尼松组(7.5mg/kg)。给药4周后，处死前一天将各组大鼠放入代谢笼以收集尿液记录总量，按照尿蛋白定量试剂盒说明书上的进行操作并计算24h尿蛋白总量。处死大鼠后立即摘取肾脏，称重、记录，将其迅速冻存于液氮中，-80℃低温保存，用于连接蛋白表达测定。
肾脏组织RNA提取：将存放于-80℃的肾组织取出，称取约100g肾组织，用干净的剪刀剪碎，其余方法同实施例3中结肠组织RNA提取，引物序列见表3。
表3引物序列
Figure BDA0002068182270000101
Figure BDA0002068182270000111
肾脏组织蛋白提取：将存放于-80℃的肾组织取出，称取约100g肾组织，用干净的剪刀剪碎，其余操作同实施例3中结肠组织蛋白提取。
4.2实验结果
4.2.1尾静脉注射阿霉素一周后，24h尿蛋白总量显著增加，造模成功。给药4周后，与正常组比较，模型组尿蛋白总量仍明显升高，差异具有统计学意义；给予寡肽后显著降低肾病大鼠24h尿蛋白总量，其中LP-5组接近正常水平，结果见表4。
表4各组大鼠24h尿蛋白总量
Figure BDA0002068182270000112
Figure BDA0002068182270000113
4.2.2给药4周后，模型组大鼠肾脏组织nephrin、ZO-1的mRNA水平较正常组明显下降(**，P<0.01)，给予寡肽后均可不同程度的恢复这2个蛋白的转录表达水平(#，P<0.05；##，P<0.01)，其中LP-5作用最明显(图10)。
4.2.3给药4周后，模型组大鼠肾脏组织中nephrin、ZO-1表达下调。与模型组比较，寡肽给药组nephrin、ZO-1表达均上调，其中LP-5上调作用最明显(图11)。
以上结果表明阿霉素可诱导大鼠尿蛋白含量增加，肾脏足细胞屏障损伤；给予LP-4/5/6可通过促进细胞连接蛋白表达减轻阿霉素诱导的大鼠肾损伤，降低尿蛋白含量。
实施例5、LP-4/5/6对气道上皮细胞屏障完整性的影响
5.1寡肽对TNF-α诱导的16HBE细胞通透性损伤的影响
5.1.1实验方法
将对数生长期的16HBE细胞以5×104个/孔接种于孔径0.4μM的CorningTranswell 24孔板上室。其余方法同实施例1中1.1项下方法。
5.1.2实验结果
如图12所示，TNF-α可明显降低16HBE细胞电阻，增加FD-4细胞渗漏；LP-4在10、1、0.1μM均可显著增加IEC-6细胞电阻，在10、1μM时可显著降低FD-4渗漏；LP-5在10、1、0.1μM均可显著增加IEC-6细胞电阻，显著降低FD-4渗漏；LP-6在10、1μM均可显著增加IEC-6细胞电阻，在10μM时可显著降低FD-4渗漏。表明LP-4/5/6可显著降低气道上皮细胞通透性，改善细胞屏障完整性。
5.2寡肽对TNF-α诱导的16HBE细胞连结蛋白ZO-1、Occludin表达的影响
5.2.1实验方法
同实施例1中1.1.1项下方法。
5.2.2实验结果
如图13所示，TNF-α可显著降低16HBE细胞ZO-1、Occludin蛋白表达水平，；LP-4、LP-5、LP-6均可显著促进ZO-1、Occludin蛋白表达，且呈剂量依赖性。表明LP-4/5/6可通过促进细胞连结蛋白表达发挥屏障保护作用。
实施例6、LP-4/5/6对LPS诱导小鼠急性肺损伤的影响
6.1实验方法
小鼠随机分为6组，分别为空白组、模型组、LP-6组(100mg/kg)、LP-5组(100mg/kg)、LP-4组(100mg/kg)。通。小鼠每日给予寡肽溶液，6日后用10％水合氯醛(3.5mg/kg)腹腔麻醉。将小鼠仰卧位固定在手术板上，纵向切开颈部皮肤，钝性分离皮下组织，暴露气管，用注射器滴入LPS溶液(5mg/kg)，空白组滴入生理盐水，滴入后立即直立小鼠，上下晃动数次，缝合伤口。24h后处死小鼠，取肺组织，测定含水量，提取组织蛋白，检测连接蛋白ZO-1、Occludin的变化。
6.2实验结果
表5各组小鼠肺组织含水量
Figure BDA0002068182270000121
Figure BDA0002068182270000122
表5说明LPS可诱导小鼠肺含水量增加，造成肺水肿(**，P<0.01)；给予LP-4/5/6均可显著降低肺含水量，表明这3个寡肽能够减轻LPS引起的肺水肿(#，P<0.05；##，P<0.01)。图14表明LPS可显著降低肺组织的ZO-1及Occludin蛋白表达；给予LP-4、LP-5或LP-6后均能显著增加二者的表达，表明LP-4、LP-5或LP-6可通过增加连接蛋白的表达改善肺组织屏障及通透性，发挥保护作用。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 一种寡肽及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Leu Asn Leu Tyr
1
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
Leu Asn Leu Tyr Pro
1 5
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
Leu Asn Leu Tyr Pro Tyr
1 5

Claims (2)

1.一种寡肽，其特征在于：所述的寡肽为Leu-Asn-Leu-Tyr、Leu-Asn-Leu-Tyr-Pro或Leu-Asn-Leu-Tyr-Pro-Tyr。
2.根据权利要求1所述的寡肽在制备治疗溃疡性结肠炎、肾病综合征及急性肺损伤药物中的应用。
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