CN111184750B - 云南松松塔在制备治疗急性肺损伤药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了云南松松塔在制备治疗急性肺损伤药物中的用途，本发明还提供了对急性肺损伤具有保护功能的云南松松塔提取物的制备方法，经动物实验证明，本发明云南松松塔提取物具有保护急性肺损伤的功能，因而可以在作为保健食品方面得到应用。其主要的功效学作用如下：云南松松塔提取物能通过抑制TLR4/NF‑κB信号通路和ALI模型中的氧化应激，下调促炎基因TNF‑α、IL‑1β、IL‑6的相对mRNA表达，从而减少炎症因子的分泌，抑制活性氧自由基，增强抗氧化酶活性，从而对LPS诱导的大鼠ALI具有保护作用。

Description

云南松松塔在制备治疗急性肺损伤药物中的用途

技术领域

本发明公开了云南松松塔在制备治疗急性肺损伤药物中的用途，本发明还提供了对急性肺损伤具有保护功能的云南松松塔提取物的制备方法，属于医学制药技术领域。

背景技术

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是肺炎、败血症、呼吸道细菌或病毒感染等多种因素引起的危重症常见的严重肺部并发症。其特征主要是中性粒细胞内流，肺泡毛细血管屏障损伤导致间质性水肿，呼吸功能受损。虽然到目前为止，有关ALI病理生理学研究方面已经有了很大进展，但是对于ALI还没有有效的药物，它仍然是危重病人发病和死亡的主要原因。

研究表明，松科松属植物云南松(Pinus yunnanensis Franch.)的球果松塔乙醇提取物具有抗肿瘤、抗氧化等多种药理学活性，能够明显抑制肺纤维化动物模型炎症因子肿瘤坏死因子alpha(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白介素1beta(interleukin1 beta，IL-1β)、白介素6(interleukin 6，IL-6)和干扰素gamma(interferon gamma，IFN-γ)的释放，然而，未见其对急性肺损伤的深入研究。因此，本发明旨在结合前期云南松松塔对肺纤维化动物模型的作用，通过考察云南松松塔对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的ALI大鼠的影响，进一步明确云南松松塔对肺部疾病的治疗保健作用。

发明内容

本发明为了解决现有技术中存在的上述问题，提出了云南松松塔在制备治疗急性肺损伤药物中的用途，具体是通过以下技术方案来实现的：

云南松松塔在制备治疗急性肺损伤药物中的用途，对急性肺损伤具有治疗保健功能。

本发明所述的一种对急性肺损伤具有保护功能的云南松松塔提取物，具体是通过以下方法制备的：云南松松塔晾干粉碎后，消毒杀菌，提取过滤，滤液分别用1倍量、2倍量、5倍量95％乙醇沉淀后，合并沉淀物，减压干燥，得到云南松松塔提取物。

进一步的，所述消毒杀菌是通过用95％乙醇浸泡3次实现的。

进一步的，所述提取过程是用1％氢氧化钠提取。

经动物实验证明(详见实施例)，本发明云南松松塔提取物具有保护急性肺损伤的功能，因而可以在作为治疗急性肺损伤保健医药方面得到应用。其主要的功效学作用如下：经用SD大鼠为研究对象，利用脂多糖(LPS)诱导致急性肺损伤模型，服用本发明的云南松松塔提取物处理4天后，观察肺观察肺泡壁及支气管壁厚度，炎性细胞浸润情况以及充血水肿情况发生显著变化。

本发明的有益效果是：实验结果表明，云南松松塔提取物能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路和ALI模型中的氧化应激，下调促炎基因TNF-α、IL-1β、IL-6的相对mRNA表达，从而减少炎症因子的分泌，抑制活性氧自由基，增强抗氧化酶活性，从而对LPS诱导的大鼠ALI具有保护作用，本发明提供了云南松松塔新的药用用途，具备很好的药用价值，有一定的商业推广价值。

附图说明

图1为不同实验组处理对LPS诱导大鼠ALI肺组织损伤的作用的结果，其中a为正常组，b为模型组，c为阳性组，d为PE-H剂量组，e为PE-M剂量组，f为PE-L剂量组；

图2为各组大鼠肺组织中TLR4相对mRNA水平；

图3为各组大鼠肺组织中NF-κB相对mRNA水平；

图4为各组大鼠肺组织中TNF-α相对mRNA水平；

图5为各组大鼠肺组织中IL-6相对mRNA水平；

图6为各组大鼠肺组织中IL-1β相对mRNA水平。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述，但本发明不受具体实施例限制。

实施例1

1材料与方法

1.1受试样品

云南松松塔，采自云南省大理州大理市下关镇苍山东坡。松塔经自然晾干后粉碎，用95％乙醇浸泡3次，1％氢氧化钠提取，过滤；滤液分别用1倍量、2倍量、5倍量95％乙醇沉淀，合并沉淀物，减压干燥，得到云南松松塔提取物(Extracts from the pinecone ofP.yunnanensis，PE)。

1.2药品与试剂

脂多糖(LPS)(批号：042619190814/030819190428，碧云天)，醋酸地塞米松片(批号：170108，浙江仙琚制药股份有限公司)，酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)试剂盒(大鼠IL-6，批号：20190524；大鼠TNF-α，批号：20190902；大鼠TGF-β1，批号：20190902；大鼠IL-10，批号：20190902；IL-1β，批号：20190920)均购自深圳索莱宝。一氧化氮(nitric oxide，NO)测试盒(批号：20190820，南京建成)，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)测试盒(批号：20190829，20190412，20190921，南京建成)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)测试盒(批号：20190827，20190924，南京建成)，过氧化氢酶(catalase，CAT)测试盒(批号：20190829，南京建成)，Trizol^TM Regent(南京诺唯赞)，cDNA第一链合成试剂盒(南京诺唯赞)，Power Up^TM Green MasterMix(南京诺唯赞)，RT-PCR引物(上海生工)。

1.3动物

清洁级SD大鼠，雌雄各半，体重180-200g，购自湖南斯莱克景达有限公司，动物许可证号：SCXK(湘)：2016-0004。给药前，大鼠适应性喂养一周，自由饮水饮食。

1.4实验分组与给药

清洁级SD大鼠随机分为空白组、模型组、阳性组、云南松松塔提取物低(PE-L)、中(PE-M)、高(PE-H)剂量组，每组各8只。阳性组灌胃1.5mg/kg地塞米松，受试样品PE-L、PE-M、PE-H组分别灌胃50、100、200mg/kg PE，空白组和模型组灌胃等体积生理盐水。各组大鼠均连续给药4天，第4天给药后1h除空白组外，其余各组均腹腔注射LPS(10mg/kg)诱导急性肺损伤，4h后处死大鼠，收集标本。

1.5制备支气管肺泡灌洗液

实验结束后处死大鼠，打开胸腔，左肺上叶结扎，摘取支气管，通过支气管用5mL生理盐水冲洗，收集冲洗液，3000r/min离心10分钟，收集上清液-80℃保存，即为支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)。

1.6组织学评价

剪取结扎左肺固定于4％多聚甲醛溶液中，脱水后石蜡包埋，5μm切片，苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，观察肺泡壁及支气管壁厚度，炎性细胞浸润情况以及充血水肿情况。

1.6 ELISA评价BALF氧化因子水平

从-80℃取出BALF，室温溶解。按照试剂盒说明书测定BALF中SOD、MDA、NO、CAT活力。

1.7 ELISA测定BALF中炎症因子水平

支气管肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、TGF-β1的水平采用酶联免疫吸附试剂盒(ELISA试剂盒)检测。取100μL BALF上清、不同浓度标准品和标准品稀释液，加入预包被单克隆抗体的96孔板中。洗板，加入100μL生物素化抗体孵育1h。洗板，加入辣根过氧化物酶并避光孵育30min。洗板，加入100μL酶结合物抗体，孵育15min后加入终止液，用酶标仪在450nm处读数3次。根据标准曲线分别统计支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、TGF-β1的水平。

1.8 RT-PCR测定TLR4/NF-κB信号通路因子的mRNA相对表达

从-80℃取出20mg肺组织，采用Trizol试剂按照试剂盒说明书提取总RNA。利用NanoDrop One spectrophotometer和1％琼脂糖凝胶精确测定RNA浓度和确定完整性。当所测A₂₆₀/A₂₈₀的吸光度比值在1.8-2.0范围内时方可用于后续的cDNA分析。取500ng总RNA，按照试剂盒说明书合成第一链cDNA，Toll样因子4(TLR4)、核因子kappaB(nuclear factorkappaB，NF-κB)、IL-1β、IL-6和TNF-α的相对基因表达水平通过PCR进行评价。通过逆转录反应获得的cDNA稀释8倍并进行RT-PCR。RT-PCR的条件设定为：先在95℃变性30s，然后95℃变性10s，40个循环，接下来60℃变性30s，最后运行溶解曲线。GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)作为内参基因。特异性引物序列见表1，由上海生工生物工程股份有限公司合成。RT-PCR的结果采用2^-ΔΔCT法进行分析。

表1

以上序列依次记为：SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.12

1.9统计分析

统计学结果均以均数±标准差

表示，采用方差分析(One-way ANOVA)确定统计学意义，然后用Tukey多重比较检验进行多重比较检验。P<0.05认为结果有统计学差异。统计学分析采用GraphPad Prism 6进行。

2结果

2.1脏器指数变化

与正常组大鼠各脏器指数比较，模型组大鼠肺脏指数、脾脏指数、胸腺指数和肝脏指数显著增加(P<0.01)，肾脏指数和心脏指数无统计学差异。与模型组比较，阳性组和云南松松塔高剂量组肺脏指数、脾脏指数、胸腺指数和肝脏指数均明显降低(P<0.01)，肾脏指数和心脏指数无统计学差异。结果见表2。

表2 各组大鼠脏器指数(

n＝8)

注：与正常组比较，P^*<0.05，P^**<0.01；与模型组比较，P^#<0.05，P^##<0.01；ns：nosignificance

2.2组织病理学

如图1所示，与正常组大鼠肺组织相比，在模型组大鼠肺组织肺泡壁和支气管壁中有大量炎症细胞积聚，肺泡隔膜水肿变厚，导致肺泡空间急剧减少和间质充血。而松塔高剂量组明显减轻了LPS诱导的大鼠ALI反应，包括水肿、充血和炎症等。

腹腔注射LPS后，与正常组大鼠比较，模型组大鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β水平均显著提高(P<0.01)，IL-10水平显著降低(P<0.01)。与模型组比较，阳性组和云南松松塔高剂量组大鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β水平均显著降低(P<0.01)，IL-10水平显著提高(P<0.01)。结果见表3。

表3 各组大鼠BALF中细胞因子水平(

n＝8)

注：与正常组比较，P^*<0.05，P^**<0.01；与模型组比较，P^#<0.05，P^##<0.01

2.4氧化因子测定

与正常组比较，模型组大鼠BALF中SOD、CAT活力显著降低(P<0.01)，MDA、NO含量显著提高(P<0.01)。与模型组比较，阳性组和云南松松塔高剂量组大鼠BALF中SOD、CAT活力明显提高(P<0.05，P<0.01)，MDA、NO含量显著降低(P<0.01)。结果见表4。

表4 各组大鼠BALF中氧化/抗氧化因子测定(

n＝8)

注：与正常组比较，P^*<0.05，P^**<0.01；与模型组比较，P^#<0.05，P^##<0.01

2.5肺组织中mRNA的相对表达

与正常组比较，其余各组大鼠肺组织中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β相对mRNA水平显著增加(P<0.01)。与模型组比较，阳性组、云南松松塔高、中剂量组大鼠肺组织中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β相对mRNA水平显著降低(P<0.01)。结果见图2-图6。

结论

急性肺损伤(ALI)是一种严重的呼吸系统疾病，是急性和持续性肺部炎症的基础，可由败血症、肺创伤、烧伤等多种因素引起。在ALL起始和发展阶段，作为面对病原微生物感染的第一道防线，肺泡上皮细胞发挥着核心作用，然后才是大量中性粒细胞和淋巴细胞招募^[8]。在本发明中，给予SD大鼠云南松松塔提取物预处理后，ALI大鼠肺泡壁和支气管壁中的炎症细胞大量减少，肺泡隔膜水肿减轻，间质充血得到改善。

脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)，是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，在炎症中是重要的细菌诱导剂，介导ALI发生中重要的先天免疫应答。在临床病人和实验动物模型血清和肺组织中，均已观察到LPS水平的增加。在ALI实验动物模型中，来自革兰氏阴性细菌细胞外膜的脂多糖(LPS)通过产生活性氧(ROS)和炎症反应来增强氧化应激。在炎症反应中，TLR4/NF-κB信号通路具有重要作用。在此通路中，LPS能被TLR4识别，从而诱导髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MYD88)的积聚，最终导致核因子kappa B(nuclear factor kappa B，NF-κB)的激活，而NF-κB是与促炎因子产生相关非常重要的转录因子。通过NF-κB和MAPK通路激活下游信号。NF-κB和MAPK通路的激活共同诱导多种促炎因子和趋化因子的释放，包括TNF-α、IL-1β、IL-6，引发炎症反应和进一步的组织损伤。此外，TNF-α、IL-1β、IL-6的产生，会引起NF-κB的持续激活，从而诱导持续的炎症反应。因此，抑制TLR4/NF-κB信号通路的激活能够抑制炎症的发生发展。本发明中，RT-PCR结果显示云南松松塔提取物能够下调TLR4、NF-κB的相对mRNA表达，从转录水平下调TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA相对表达，减少肺泡灌洗液(BALF)中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的释放，从而减轻LPS诱导的ALI。

除了炎症反应外，宿主细胞还具有多种信号通路，其激活与细胞在各种刺激下的存活有关。其中氧化应激在LPS诱导的肺损伤病理过程中也发挥重要作用。急性肺损伤发生后，受损细胞释放大量氧自由基，而氧自由基与细胞膜中多不饱和脂肪酸质子结合会引发脂质过氧化，从而使生物膜通透性增加稳定性变差，导致体内一些细胞器和胞体溶解。此外，脂质过氧化的终产物MDA与氨基酸、蛋白质、核酸等生物分子结合会造成这些生物分子失活而产生毒性。在LPS诱导的大鼠ALI中，云南松松塔提取物显著增强了抗氧化酶SOD、CAT的活力，并明显抑制活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)包括MDA和NO介导的氧化应激。

实验结果表明，云南松松塔提取物能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路和ALI模型中的氧化应激，下调促炎基因TNF-α、IL-1β、IL-6的相对mRNA表达，从而减少炎症因子的分泌，抑制活性氧自由基，增强抗氧化酶活性，从而对LPS诱导的大鼠ALI具有保护作用。

序列表

<110> 大理大学

<120> 云南松松塔在制备治疗急性肺损伤药物中的用途

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgactgggtg agaaacgagc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttccggctc ttgtggaagc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<210> 4

<211> 22

<212> DNA

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<400> 4

gcactgtcac ctggaagcag ag 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<210> 6

<211> 22

<212> DNA

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<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acctcacaag cagagcacaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttggccgag gactaaggag 20

<210> 9

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<212> DNA

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<400> 9

gagcccacca ggaacgaaag tc 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gggaaggcag tggctgtcaa c 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggggctctct gctcctcccg g 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cggccaaatc cgttcacacc g 21

Claims (3)

1.云南松松塔在制备治疗急性肺损伤药物中的用途；所述云南松松塔经95％乙醇浸泡后，1％氢氧化钠提取，95％乙醇沉淀，合并沉淀物，减压干燥，得到。

2.一种对急性肺损伤具有保护功能的云南松松塔提取物，其特征在于，具体是通过以下方法制备的：云南松松塔晾干粉碎后，消毒杀菌，提取过滤，滤液分别用1倍量、2倍量、5倍量95％乙醇沉淀后，合并沉淀物，减压干燥，得到云南松松塔提取物；所述提取过程是用1％氢氧化钠提取。

3.根据权利要求2所述的一种对急性肺损伤具有保护功能的云南松松塔提取物，其特征在于，所述消毒杀菌是通过用95％乙醇浸泡3次实现的。

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