CN101773527A - 云南松属植物的松塔提取物及其制备方法和药物用途 - Google Patents

Abstract

本发明“云南松属植物的松塔提取物及其制备方法和药物用途”涉及云南产松属植物华山松、云南松、乔松和/或思茅松的松塔提取物的制备方法及其医药用途。本发明的云南松属植物的松塔提取物由经粉碎的松塔以乙醇溶液浸泡、热水提取、碱水室温提取后的滤液再醇沉提取而得，本发明得到的云南松属植物松塔提取物能有效抑制艾滋病毒(HIV)，可以预期发展成为防治艾滋病的药物。药效学试验结果显示：云南松属植物的松塔提取物具有体外抗HIV-1活性，其治疗指数大于50(59.99-515.48)。

Description

云南松属植物的松塔提取物及其制备方法和药物用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域。具体而言，本发明涉及云南松属植物的松塔提取物及其医药用途。该提取物表现出有效的体外抑制艾滋病病毒复制作用，治疗指数较高，可以预期发展成为防治艾滋病的药物。

背景技术

艾滋病的医学全名为“获得性免疫缺陷综合征”(AcquiredImmune Deficiency Syndrome，即AIDS)，由人类免疫缺陷病毒(HIV，又称艾滋病病毒)引起。HIV病毒是一种能攻击人体免疫系统的病毒，它把人体免疫系统中最重要的T4淋巴细胞作为攻击目标，大量吞噬、破坏T4淋巴细胞，从而破坏人的免疫系统，最终使免疫系统崩溃，使人体因丧失对各种疾病的抵抗能力而发病，从而发生多种感染或肿瘤，最后导致死亡。当HIV感染者的免疫功能受到病毒的严重破坏、以至不能维持最低的抗病能力时，感染者便发展为艾滋病病人。

HIV在病毒分类学上属逆转录病毒科(Retroviridae)慢病毒属(lentivirus)，目前已发现两种HIV病毒株系，分别为HIV-1和HIV-2。两者具有相似的病毒结构和传播途径。HIV-2主要分布于非洲西部，在欧洲和美洲的一些感染者中也被检测到。其毒力和传播力都低于HIV-1，引起的艾滋病病程较慢且较缓和。HIV-1广泛分布于世界各地，是引起全世界AIDS流行的病原，目前HIV的研究也是以HIV-1为主进行的。

艾滋病的危害席卷全球，蔓延之势十分迅猛。1984年，全世界报告的艾滋病患者不足3000人。联合国艾滋病规划署发布的《2008艾滋病流行状况报告》指出：截至2007年底，艾滋病已经导致2500万人死亡，另有3300万人受感染，其中我国有70万人。我国自1985年首次发现HIV病毒感染者，至今已有60～80万人发生了感染，专家估计，如果不迅速采取有效的预防措施，按目前的年平均30％的增长速度，到2010年，我国的HIV感染者将超过1000万。在非洲的有些国家，HIV的感染率达总人口30％以上。因此，预防和治疗艾滋病，已不仅仅是挽救个人生命的问题，而是关系到民族存亡的大事。

艾滋病目前仍是不治之症。历史上许多曾严重威胁人类健康的疾病，都因开发出有效的疫苗而被控制甚至消灭，例如天花、小儿麻痹、麻疹等。但目前人类还没有研制成功艾滋病疫苗，科学家们仍在努力。因此，研制抗HIV药物迫在眉睫。目前，艾滋病的治疗一方面是抑制病毒，增强免疫功能，另一方面是防治机会性感染，缓解症状、延长生命。经过几年的实践证明，最行之有效的治疗措施是增加使用有效的抗HIV药物，通常使用联合疗法，包括核苷类(如美国FDA推荐应用的AZT(重氮脱氧胸苷))、非核苷类及蛋白酶抑制剂在内的两种或多种药物。这样的联合疗法被认为是高效的抗逆转录病毒治疗(HAART，或称“鸡尾酒疗法”)。但HAART并不能根除体内的病毒，而长期的药物治疗也会带来一些副作用，且价格较高。

中国经济发展的现状决定，在艾滋病的治疗上无法承担美国FDA推荐应用的AZT的费用(每人每年8000-10000美金)，更无法承受“鸡尾酒疗法”需要的每人每年高达15000美金的治疗费用。我们只能结合中国的现状，充分利用本国资源，发掘中国医药学宝库，研发高效、低毒、廉价的抗HIV药物，而我们的前期研究已经看到了希望。

松属植物全世界约有100种，分布于北半球直达极圈，在热带和亚热带地区只生于山地。我国有50余种松属植物，分布极广。云南产松树主要有六种，包括：①华山松(Pinus armandii Franch)，山西、陕西、贵州、四川、甘肃等省亦有分布；②乔松(P.griffithiiM′delland)；③毛枝五叶松(P.wangii Hu)；④马尾松(P.massoniaLamb.)，四川也产；⑤云南松(P.yunnanensis Fr.)，四川、广西有产；⑥思茅松(P.szemaoensis Cheng et Lau)，特产于云南思茅。松树松塔、松子壳与松子仁中的成分包括萜类、木质素、黄酮、芪类、挥发油、维生素类、棕榈碱、矿物质、多糖、蛋白质与脂肪等。长期以来，松子仁作为营养食品，或称长寿食品、仙人食品，而松塔、松子壳则仅作农家燃料。日本南部九州地区民间长期用日本白松(Pinuspariflora Sieb.et Zucc)松塔煎水喝治疗胃癌；在我国，仅白皮松(Pinusbungeana)松塔为药典用药。白皮松松塔性温味苦，祛痰、止咳、平喘，主治慢性气管炎、哮喘、咳嗽痰多。

日本学者Sakagami H.等对日本白松松塔的抗肿瘤活性研究中发现，其热水提取物可以对移植到小鼠体内的各种固体和腹水肿瘤细胞产生抑制作用；同时发现日本白松松塔热水提取物能够激活小鼠巨嗜细胞；Sakagami等学者还发现日本白松松塔的提取物有抗HIV的功效(发明专利申请号：EP88110142A)。我国吕永俊教授、李好枝教授在对国内的油松、东北红松等松树的活性成分研究中发现，松塔和松子壳均有抗肿瘤活性，但其活性强度具有种的差异。根据中外文献检索查询，除日本学者提出日本白松松塔具有抗HIV作用外，未见来源于其它树种的松塔具有抗HIV活性的相关报导。此外，日本学者认为日本白松松塔的抗HIV活性部位是大分子的酸性多糖，其提取方式为反复使用碱水提取，工艺复杂。

云南有云南松、华山松等六种松树，资源丰富。云南农民在采收松子后一般将松塔废弃或当做燃料烧掉，若能从中提取抗HIV活性成分，变废为宝，不仅能为山区农民致富提供良机，更能为艾滋病的防治提供新的选择。因此，将云南松属植物的松塔按现代工艺进行提取分离并寻找其有效抑制艾滋病毒的有效部位既有巨大的社会效益又有显著的经济效益。在进行了一系列相关研究后，我们发现了一种十分经济有效的具有抗HIV活性的云南松属植物的松塔提取物的制备方法，并据此完成了本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适于工业化生产的抗HIV的云南松属植物的松塔提取物，并公开了该提取物用于制备防治艾滋病的药物的用途。

本发明的另一目的在于提供一种具有抑制艾滋病病毒复制功能的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的云南松属植物的松塔提取物和可药用载体。其制剂形式包括片剂、胶囊剂、控释剂或缓释剂。

具体而言，本发明中云南松属植物的松塔抗艾滋病毒的活性部位提取物的制备方法如下：

a)松塔经粉碎浸泡于乙醇溶液12-30小时，重复1-3次，残渣用80-100℃热水提取1-3小时，重复1-3次，再用碱水室温提取，过滤，得滤液A；

b)滤液A用酸性溶液调pH值至5，过滤，得滤液B；

c)滤液B依次用1-5倍量乙醇溶液沉淀、过滤1-3次；

d)步骤c)中得到的沉淀物用无水乙醇和/或乙醚依次洗涤，在25-55℃减压干燥，即得。

其中，步骤a)与步骤c)中的乙醇溶液浓度为80％-95％；步骤a)中的碱水选自氨水、氢氧化钠或氢氧化钾溶液，碱水的浓度为0.5％-2％，优选1％氢氧化钠溶液；步骤b)中的酸性溶液选自盐酸、硫酸、硝酸、亚硫酸、磷酸、醋酸、碳酸或硫氢酸溶液，浓度为0.5％-2％，优选1％醋酸溶液；步骤a)中的松塔是指剥离了松子的新鲜或干燥球果。根据初步的化学分析得知，本发明的云南松属植物的松塔提取物为弱碱性物质，其与Sakagami等提出的日本白松松塔提取物(发明专利申请号：EP88110142A)为酸性大分子多糖物质不同。

本发明中的云南松属植物的松塔提取物来源于云南省内分布的6种松树，优选华山松、云南松、乔松和/或思茅松。

本发明所述的具有抑制艾滋病病毒复制功能的药物组合物是由云南松属植物的松塔提取物和药学上应用的各种制剂辅料，通过合理组合制成的用于医疗目的口服制剂。

所述的药物组合物制剂包括片剂、胶囊剂等剂型药物，还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。所述的药学上可接受的载体，包括制剂中常规的稀释剂、填充剂(如乳糖、聚乙二醇)，粘合剂(如淀粉、微晶纤维素)，崩解剂(如羧甲基纤维素、低取代的羟丙基纤维素)，润滑剂(如滑石粉、硬脂酸镁)，湿润剂(如丙二醇、乙醇)，稳定剂(如EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、乙醇胺、碳酸氢钠、烟酰胺)等等。上述辅料采用常用剂量，以常用的配比与云南松属植物的松塔提取物混合，当云南松属植物的松塔提取物用量确定后，各药用辅料之间的配比根据需要适当调节。

本发明的具有抗HIV病毒功能的云南松属植物的松塔提取物可以与现已上市的抗艾滋病药物如重氮脱氧胸苷(AZT)、齐多夫定(zidovudine)、拉米夫定(lamivudine)、地拉韦定(delavirdine)、沙喹那韦、奈韦拉平(nevirapine)、利托那韦(ritonavir)和吲哚那韦等联合使用，制备得到具有艾滋病毒抑制活性的组合物，可用于治疗艾滋病。该类药物组合物可以采用片剂、胶囊剂等剂型药物，还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。这些药物组合物可以用于治疗艾滋病、延长艾滋病人生存时间和/或质量等用途。

本发明的有益之处是：云南松属植物自然资源丰富，本发明提取物原料云南松属植物的松塔资源丰富易得，提取工艺简单、成分及药效稳定，容易实现产业化。此外，该项研究完全有希望研发出一种对边疆经济发展有重大推动作用并对艾滋病防治提供有效策略的抗艾滋新药。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的实质，下面通过实施例进一步说明本发明。实施例给出了代表性的部分云南松属植物的松塔提取物的制备方法和抗HIV病毒活性数据的药理实验结果，说明其在抗艾滋病药物研究领域中的用途。必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数。

实施例1：云南松属植物的松塔提取物H-D的制备

华山松干燥松塔10公斤，粉碎，加20升的95％的乙醇溶液浸泡24小时×3次，过滤。残渣用沸水提取2小时×3次，再用1％氢氧化钠溶液室温提取，过滤。滤液用醋酸溶液调pH值至5，过滤。滤液用倍量乙醇溶液沉淀，过滤。沉淀物用无水乙醇洗涤，在40℃减压干燥，得云南华山松的松塔提取物7.52克(样品编号：H-D)。

实施例2：云南松属植物的松塔提取物H-F的制备

华山松干燥松塔10公斤，粉碎，加20升的95％的乙醇溶液浸泡小时×3次，过滤。残渣用沸水提取2小时×3次，再用1％氢氧化钠溶液室温提取，过滤。滤液用醋酸溶液调pH值至5，过滤。滤液用倍量乙醇溶液沉淀，过滤。滤液再用2倍量乙醇溶液沉淀，过滤。滤液再用5倍量乙醇溶液沉淀，过滤。沉淀物用无水乙醇、乙醚依次洗涤，在40℃减压干燥，得云南华山松的松塔提取物3.83克(样品编号：H-F)。

实施例3：云南松属植物的松塔提取物Y-E的制备

云南松干燥松塔10公斤，粉碎，加20升的95％的乙醇溶液浸泡24小时×3次，过滤。残渣用沸水提取2小时×3次，再用1％氢氧化钠溶液室温提取，过滤。滤液用醋酸溶液调pH值至5，过滤。滤液用倍量乙醇溶液沉淀，过滤。滤液再用2倍量乙醇溶液沉淀，过滤。沉淀物用无水乙醇洗涤，在50℃减压干燥，得云南松的松塔提取物3.96克(样品编号：Y-E)。

实施例4：云南松属植物的松塔提取物Y-F的制备

云南松干燥松塔10公斤，粉碎，加20升的95％的乙醇溶液浸泡24小时×3次，过滤。残渣用沸水提取2小时×3次，再用1％氢氧化钠溶液室温提取，过滤。滤液用醋酸溶液调pH值至5，过滤。滤液用倍量乙醇溶液沉淀，过滤。滤液再用2倍量乙醇溶液沉淀，过滤。滤液再用5倍量乙醇溶液沉淀，过滤。沉淀物用无水乙醇、乙醚依次洗涤，在40℃减压干燥，得云南松的松塔提取物3.65克(样品编号：Y-E)。

实施例5：云南松属植物的松塔提取物抑制HIV病毒的活件试验

5.1实验原理与依据：根据国家食品药品监督管理局(SFDA)发布的“抗HIV药物非临床药效学研究技术指导原则(2006)”，采用国际通用实验方法对药物的抗HIV-1活性进行检测。

5.2材料与方法

5.2.1测定药物和化合物：待测样品为根据实施例1-2制备得到的云南华山松的松塔提取物H-D(以下简称“样品1”)、H-F(以下简称“样品2”)。待测样品溶解于PRMI-1640中，4℃保存，贮存浓度为10.0毫克/毫升。重氮脱氧胸苷(AZT)为阳性对照药品。5.2.2试剂和溶液：生物缓冲剂HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸)、噻唑蓝MTT(3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazoliumbromide)、DMF(N，N-二甲基甲酰胺)、青霉素(Penicillin)、硫酸链霉素(Streptomycin sulfate)、谷氨酰胺(Glutamine)均购自Sigma公司；2-巯基乙醇(2-ME，2-Mercaptoethanol)为Bio-Rad公司产品。RPMI-1640和新生小牛血清为Gibco公司产品。

5.2.3细胞和病毒：人T淋巴细胞系C8166细胞、MT-4细胞以及HIV-1实验株HIV-1_IIIB均由英国Medical Research Council，AIDS ReagentProject惠赠。所有细胞和病毒均以含10％小牛血清的RPMI-1640完全培养基进行培养。按常规方法制备HIV-1_IIIB，滴定并计算出病毒的TCID₅₀。病毒贮存液分装后，置-70℃保存。细胞和病毒按常规方法冻存和复苏。

5.2.4HIV-1感染性滴定：HIV-1_IIIB按Johnson & Byington(1990)所述方法改良进行滴定，简述如下：将HIV-1_IIIB贮存液在96孔板上作4倍稀释，10个梯度，每梯度6个重复孔，同时设置对照孔6孔。每孔加入C8166细胞50微升，每孔终体积为200微升。37℃，5％CO₂培养。第3天补加新鲜RPMI-1640完全培养基100微升，第7天在倒置显微镜下观察每孔中HIV-1诱导的细胞病变效应(CytopathicEffect，CPE)，以每孔是否有合胞体(Syncytium)的形成确定；按Reed & Muench方法计算病毒的TCID₅₀(50％组织培养染毒浓度)。

5.2.5对C8166细胞的毒性实验：4×10⁵/毫升C8166细胞悬液100微升与不同的待测药物溶液混合，设3个重复孔。同时设置不含药物的对照孔，37℃，5％CO₂培养3天，采用MTT比色法检测细胞毒性。ELx800酶标仪测定OD值，测定波长为595nm，参考波长为630nm。计算得到CC₅₀值(50％抑制细胞生长浓度)，即对50％的正常T淋巴细胞系C8166细胞产生毒性时的药物浓度。

5.2.6对HIV-1_IIIB致细胞病变(CPE)的抑制实验：将8×10⁵个/毫升C8166细胞50微升/孔接种到含有100微升/孔梯度倍比稀释药物的96孔细胞培养板上，然后加入50微升的HIV-1_IIIB稀释上清，1300TCID₅₀/孔。设3个重复孔。同时设置不含药物的正常细胞对照孔。AZT为阳性药物对照。37℃，5％CO₂培养3天，倒置显微镜下(100×)计数合胞体的形成。EC₅₀(50％有效浓度)为抑制合胞体形成50％时的药物浓度。

5.2.7计算公式：根据实验结果绘制剂量反应曲线，按Reed & Muench法计算出化合物抑制病毒的50％有效浓度(EC₅₀)，50％抑制细胞生长浓度(CC₅₀)及抗HIV-1活性的治疗指数TI值(Therapeuticindex)。

(1)细胞生长存活率(％)＝实验孔OD值/对照孔OD值×100

(2)HIV-1致细胞病变的抑制率(％)＝(1-实验孔合胞体数/对照孔合胞体数)×100

(3)TI＝CC₅₀/EC₅₀

5.3结果

测试样品的细胞毒性作用、对HIV-1_IIIB诱导C8166细胞病变的抑制作用、抗HIV-1病毒的治疗指数如表1至表3所示。

表1测试样品对人T淋巴细胞系C8166细胞的毒性作用的实验数据

表2.测试样品对HIV-1_IIIB诱导C8166细胞病变的抑制作用实验数据

表3.测试样品的治疗指数

5.4结论

样品1、2对人T淋巴细胞系C8166细胞毒性小，重复试验显示其CC₅₀均大于2000微克/毫升；对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体抑制活性较好，EC₅₀为47.44～56.46微克/毫升，治疗指数(TI值)为59.99-85.88。实验结果显示：云南松属植物的松塔提取物(样品1-2)具有一定的体外抗HIV-1活性，其治疗指数均大于50，可以预期发展成为用于治疗HIV病毒感染引起的艾滋病的药物。

实施例6：云南松的松塔提取物抑制HIV病毒的活性试验

6.1实验原理与依据：同实施例5。

6.2材料与方法

6.2.1测定药物和化合物：待测样品为根据实施例31-4制备得到的云南松的松塔提取物Y-E(以下简称“样品A”)和Y-F(以下简称“样品B”)。待测样品溶解于PRMI-1640中，4℃保存，贮存浓度为10.0毫克/毫升。重氮脱氧胸苷(AZT)为阳性对照药品。

6.2.2试剂和溶液：同实施例5。

6.2.3细胞和病毒：同实施例5。

6.2.4HIV-1感染性滴定：同实施例5。

6.2.5对C8166细胞的毒性实验：同实施例5。

6.2.6对HIV-1_IIIB致细胞病变(CPE)的抑制实验：同实施例5。

6.2.7计算公式：同实施例5。

6.3结果

测试样品的细胞毒性作用、对HIV-1_IIIB诱导C8166细胞病变的抑制作用、抗HIV-1病毒的治疗指数如表4所示。

表4测试样品体外细胞毒性和抗HIV-1活性结果汇总表

6.4结论

从实验结果来看，样品A和B对C8166细胞毒性不大，其CC₅₀均在685.59～902.22微克/毫升之间；样品A和B对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体抑制有较强的活性：EC₅₀分别为1.33微克/毫升和4.39微克/毫升，治疗指数分别为515.48和205.52。实验结果显示：云南松的松塔提取物样品A和B体外抗HIV-1的活性较强，可以预期发展成为用于治疗HIV病毒感染引起的艾滋病的药物。

Claims (8)

1.一种云南松属植物的松塔提取物，其由包含下列步骤的方法制备得到：

a)松塔经粉碎浸泡于乙醇溶液12-30小时，重复1-3次，残渣用80-100℃热水提取1-3小时，重复1-3次，再用碱水室温提取，过滤，得滤液A；

b)滤液A用酸性溶液调pH值至5，过滤，得滤液B；

c)滤液B依次用1-5倍量乙醇溶液沉淀、过滤1-3次；

d)步骤c)中得到的沉淀物用无水乙醇和/或乙醚依次洗涤，在25-55℃减压干燥，即得。

2.根据权利要求1的云南松属植物的松塔提取物，其制备方法的步骤a)与步骤c)中的乙醇溶液浓度为80％-95％。

3.根据权利要求1的云南松属植物的松塔提取物，其制备方法的步骤a)中的碱水选自氨水、氢氧化钠或氢氧化钾溶液，碱水的浓度为0.5％-5％；步骤b)中的酸性溶液选自盐酸、硫酸、硝酸、亚硫酸、磷酸、醋酸、碳酸或硫氢酸溶液，浓度为0.5％-10％。

4.根据权利要求1的云南松属植物的松塔提取物，其制备方法的步骤a)中的碱水是指1％氢氧化钠溶液，步骤b)中的酸性溶液是指1％醋酸溶液。

5.根据权利要求1的云南松属植物的松塔提取物，其制备方法的步骤a)中的松塔是指剥离了松子的新鲜或干燥球果，球果选自华山松、云南松、乔松和/或思茅松。

6.权利要求1-5之一的云南松属植物的松塔提取物用于制备防治艾滋病的药物的用途。

7.一种具有抑制艾滋病病毒复制功能的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的权利要求1-5之一的云南松属植物的松塔提取物和可药用载体。

8.根据权利要求7的药物组合物，其是片剂、胶囊剂、控释剂或缓释剂。