UA73506C2 - Antitumour compounds activated by fibroplasts activation proteins (fap) - Google Patents

Antitumour compounds activated by fibroplasts activation proteins (fap) Download PDF

Info

Publication number
UA73506C2
UA73506C2 UA2001128659A UA2001128659A UA73506C2 UA 73506 C2 UA73506 C2 UA 73506C2 UA 2001128659 A UA2001128659 A UA 2001128659A UA 2001128659 A UA2001128659 A UA 2001128659A UA 73506 C2 UA73506 C2 UA 73506C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
compound according
compound
group
formula
formulas
Prior art date
Application number
UA2001128659A
Other languages
English (en)
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Pharma filed Critical Boehringer Ingelheim Pharma
Publication of UA73506C2 publication Critical patent/UA73506C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A61K47/67—Enzyme prodrug therapy, e.g. gene directed enzyme drug therapy [GDEPT] or VDEPT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/252—Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1019—Tetrapeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1024—Tetrapeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Description

Опис винаходу
Даний винахід стосується лікування пухлин шляхом уведення проліків, які перетворюються на ліки при 2 потраплянні в пухлину. Зокрема, винахід стосується проліків, що можуть бути перетворені на ліки в результаті каталітичної дії РАРу, їх одержання і застосування у фармацевтиці.
Протеїн активації фібробластів людини (ЕАРо) являє собою молекулу, розташовану на поверхні клітини, з молекулярною масою М, 95000, яку спочатку було ідентифіковано за допомогою моноклонального антитіла (МАТ) 19 |Кейід та ін. Ргос. Май. Асад, сі. ОБА 85, 3110-3114 (1988); Кейід та ін. Сапсег Кев. 53, то 3327-3335 (1993))Ї. КДНК РАР»о, кодує інтегральний мембранний протеїн типу ІІ, який має великий позаклітинний домен, трансмембранний сегмент і короткий цитоплазматичний кінцевий сегмент |Зсапіап та ін. Ргос. Маїй|. Асад.
Зсі. ОБА 91, 5657-5661 (1994); МО 97/34927). Амінокислотна послідовність ЕБАРо на 4895 ідентична амінокислотній послідовності антигену СЮО26 Т-клітинної активації, також відомого як дипептидилпептидаза ІМ (ОРРІМ; КФ 3.4.14.53, який являє собою зв'язаний із мембраною протеїн, що має дипептидилпептидазну активність |(Зсапіап та ін., у зазначеному місці). РАРо, має ферментативну активність і є представником сімейства серинпротеаз, для ферментативної активності яких вирішальне значення має наявність серину в положенні 624 (МО 97/34927). Дослідження, що включає аналіз зовнішньої поверхні мембрани, дозволило встановити, що димери БАРо мають здатність розщеплювати дипептиди АПІа-Рго-7-аміно-4--рифторметилкумарин |і
Гуз-Ріо-7-аміно-4-трифторметилкумарин (МУО 97/34927).
ЕАРо вибірково експресується в реактивних стромальних фібробластах багатьох гістологічних типів епітеліального раку людини, грануляційної тканини ран, які загоюються, і злоякісних клітинах певних типів сарком кісткової тканини та м'яких тканин. У нормальних тканинах дорослої людини зазвичай відсутні виявлювані кількості ЕАРо, однак у деяких ембріональних мезенхімних тканинах відбувається короткочасна експресія цієї Га молекули. На противагу цьому більшість розповсюджених типів епітеліального раку, у тому числі 29095 типів о раку молочної залози, недрібноклітинного раку легені та колоректальних карцином містять ЕАР о-реактивні стромальні фібробласти |Зсапіап та ін., у зазначеному місці). Ці ЕАРУ" - фібробласти виникають при формуванні нових кровоносних судин пухлини, утворюючи окремий клітинний компартмент, розташований між ендотелієм капілярів пухлини і базальною частиною кластерів злоякісних епітеліальних клітин (МуеїК та ін. У. Сійп. Опсої! іс), 12(6), 1193-1203 (1994)). Тоді як ЕАР у"-стромальні фібробласти присутні як у первинних, так і в метастатичних о карциномах, дослідження дозволили встановити, що в доброякісних і передракових ушкодженнях епітелію (ММеїї та ін., у зазначеному місції, таких як фіброаденоми молочної залози і колоректальні аденоми, ЕАРо; -стромальні юю клітини присутні дуже рідко. На основі даних, що свідчать про обмежений характер розподілу БАРа У «о нормальних тканинах і його постійну експресію в підтримувальній стромі багатьох злоякісних пухлин, було розпочато клінічні випробування на пацієнтах, що страждають на метастатичні карциноми ободової кишки, з - використанням МАТ Е19, міченого за допомогою "| МУуеї: та ін., у зазначеному місції.
Для нових протиракових терапій, заснованих на застосуванні цитотоксичних або цитостатичних ліків, основною метою є збільшення терапевтичного індексу за рахунок підвищення ефективності знищення « 20 канцерогенної тканини і/або зменшення токсичності цитотоксичних або цитостатичних агентів щодо нормальної -о тканини. Для того, щоб підвищити специфічність дії щодо знищення пухлинної тканини і зменшити токсичність с щодо нормальних тканин, можуть бути створені пускові механізми, суть яких полягає в тім, що токсичні агенти, :з» синтезовані у вигляді їхніх проліків або в неактивних формах, стають активними тільки тоді й у тому місці, де це потрібно, насамперед у канцерогенних тканинах |Рапсна!, Віоспет. РНаптасої. 55, 247-252 (1998)). Пускові 415 механізми можуть включати як екзогенні фактори, такі як світло або хімічні речовини, так і ендогенні клітинні -1 фактори, такі як ферменти, експресія яких відбувається тільки в ракових тканинах. Інша розроблена концепція називається "терапія, заснована на застосуванні проліків, з використанням ферменту, що направляється і95) антитілом" (АОЕРТ) або "каталіз, що направляється антитілом' (АОС) |Ниеппекепз, Тгепаз Віоїесппої. 12, сл 234-239 (1994); Вадзпамже, Сііп. РпагтасокКіпеї. 27, 368-376 (1994); МУапд та ін., Сапсег Кев. 52, 4484-4491 (1992); ЗрегкКег та ін., Сіпй. РІаптасоКіпеї. 33(1), 18-31 (1997)). Згідно з АОЕРТ, для спрямованого («в перенесення визначеного ферменту в ділянку пухлини використовують антитіло до зв'язаного з пухлиною
Ф антигену. Присутній у пухлині фермент перетворює введені після цього проліки на активний цитотоксичний агент. Кон'югат антитіло-фермент (АЕС) зв'язується з антигеном-мішенню на клітинних мембранах або з вільним антигеном у позаклітинній рідині (ЕСЕ). Проміжок часу між введенням АЕС і проліків є достатнім для виведення
АЕС з нормальних тканин, так що проліки не активуються в нормальних тканинах або крові. Однак у АСЕРТ є деякі недоліки, пов'язані з властивостями АЕС |Вадзпауге, у зазначеному місці). Наприклад, в організмі людей (Ф) лише невелика частина введеної дози направлюваного АЕС зв'язується з пухлинною тканиною, тоді як інша г частина розподіляється в загальній воді організму, з якої вона виводиться з великою затримкою у часі. Навіть у невеликих концентраціях незв'язаний фермент може каталізувати досить велику для прояву токсичних дій во кількість проліків, оскільки об'єми плазми і нормальної ЕСЕ є набагато більшими, ніж об'єми ЕСЕ пухлини. АЕС може також виявитися імуногенним, що у багатьох випадках перешкоджає його повторному введенню.
У Міжнародних заявках на патент УУО 97/12624 і МО 97/14416 описано олігопептиди, включаючи такі пента- і гексапептиди (ЗЕО.ЛО.МО: 151 і ЗЕОЛО.МО: 177: пАго-Туг-СІп-Зег-Зег-Рго;. пПАга-Туг-СіІп-Зег-Рго), які мають амінокислотні послідовності, що розпізнаються і протеолітично розщеплюються вільним простатичним антигеном ве (РЗА), і терапевтичні агенти, які містять кон'югати таких олігопептидів і відомих терапевтичних або цитотоксичних агентів. Такі олігопептидні кон'югати, що містять принаймні один глутамін-сериновий фрагмент,
можна застосовувати тільки для лікування раку передміхурової залози.
Задачею даного винаходу є розроблення методів і засобів поліпшення переносимості нормальними тканинами цитотоксичних або цитостатичних агентів, які мають відому ефективність щодо широкого спектра пухлинних тканин.
Даний винахід стосується протипухлинних сполук, активованих ферментами. У винаході запропоновано проліки, які мають здатність перетворюватися на ліки в результаті каталітичної дії ендогенного протеїну альфа активації фібробласта (ГАРо), який, як було встановлено, присутній у ракових тканинах людини. У бажаному варіанті проліки за даним винаходом мають здатність перетворюватися на ліки в результаті каталітичної дії 70 ЕАРо, при цьому проліки мають сайт розщеплення, який розпізнається ГАР о, і ліки мають цитотоксичну або цитостатичну дію щодо ракових клітин у фізіологічних умовах.
У контексті даного винаходу поняття "ліки" означає хімічну сполуку, яка може вводитися людям або тваринам з метою лікування хвороби. Зокрема, ліки являє собою агент, що має фармакологічну активність.
Поняття "цитотоксична сполука" означає хімічну сполуку, яка є токсичною щодо живих клітин, зокрема, ліки, 75 що руйнують або вбивають клітини. Поняття "цитостатична сполука" означає сполуку, яка придушує ріст клітин і розмноження, і у такий спосіб інгібує проліферацію клітин. Прикладами цитотоксичних або цитостатичних сполук, які можна застосовувати за даним винаходом, є антрациклінові похідні, такі як доксорубіцин, аналоги метотрексату, такі як метотрексат, притрексим, триметрексат або ОЮОМР, мелфалан, аналоги цисплатину, такі як цисплатин, УМ216, УМ335, біс(платина) або карбоплатин, аналоги пуринів і пиримідинів, такі як цитарбін, гемцитабін, азацитидин, б-тіогуанін, флурдарабін або 2-дезоксикоформіцин, і аналоги інших хіміотерапевтичних агентів, такі як 9-амінокамптотецин, 0, -аміноглутетимід, триметоприм, піриметамін, мітоміцин с, мітоксантрон, циклофосфанамід, 5-фторурацил, екстрамустин, подофілотоксин, блеоміцин або таксол.
Поняття "проліки" означає сполуку, яка після введення має зазнати хімічного перетворення в результаті процесів метаболізму перш ніж вона стане фармакологічно активною. Зокрема, проліки є попередником ліків. У СМ контексті даного винаходу проліки мають істотно меншу цитотоксичну або цитостатичну активність, ніж ліки, на о які вони перетворюються в результаті каталітичної дії РЕАР у. Фахівцю відомі методи визначення цитотоксичності сполуки, див., наприклад, приклад б даного опису або в |Мозтапп, У. Іттип. Мей. 65, 55-63 (19833). У бажаному варіанті проліки при аналізі іп міго повинні мати принаймні в три рази меншу цитотоксичну дію в порівнянні з ліками. (Се) "Ліки, які мають цитостатичну або цитотоксичну дію у фізіологічних умовах" означає хімічну сполуку, яка о має цитостатичну або цитотоксичну дію в організмі живої людини або тварини, зокрема, сполуку, яка вбиває клітини або інгібує проліферацію клітин в організмі живої людини або тварини. ІФ) "Проліки, які мають сайт розщеплення, що розпізнається ГАР у" означає проліки, що можуть виступати як с субстрат для ферментативної активності ЕАР у. Зокрема, ферментативна активність ЕАРо, може каталізувати у
Зо фізіологічних умовах розщеплення ковалентного зв'язку, присутнього у проліках. У результаті розщеплення в. цього ковалентного зв'язку проліки безпосередньо або непрямим чином перетворюються на ліки. Непряма активація може мати місце в тому випадку, коли продукт розщеплення, який утворюється на стадії, каталізованій
ЕАРо, сам по собі не має фармакологічної активності, але здобуває активність після проходження наступної « стадії реакції, наприклад, гідролізу. У бажанішому варіанті сайт розщеплення проліків специфічно розпізнається ЕАРо, але не іншими протеолітичноми ферментами, присутніми в організмі людини або тварини. З с Також бажано, щоб сайт розщеплення специфічно розпізнавався ЕАР у, але не протеолітичноми ферментами, "з присутніми у загальній воді організму людини або тварини, насамперед, у плазмі. В оптимальному варіанті здійснення проліки є стабільними у плазмі, інших складових загальної води організму або тканинах, у яких відсутній або не може бути виявлений РАР у, що має біологічну активність. За даними аналізу іп міго, який - 75 здійснюють методом, викладеним у прикладі 7 даного опису, після витримування протягом 8год. при 37 оС в розчині, що містить 1006.96 людської плазми, у бажаному варіанті ще присутні більш ніж 5095, бажаніше більш (95) ніж 8095, ще бажаніше більш ніж 9095 проліків. А в оптимальному варіанті сайт розщеплення повинен мати сл специфічність щодо ГАРоу. В оптимальному варіанті здійснення сайт розщеплення містить залишок І -проліну, зв'язаний із цитотоксичними або цитостатичними ліками за допомогою амідного зв'язку. Прикладом сполуки, що о належить до цього класу, є кон'югат доксорубіцин-пептид. ЕАРо, може каталізувати розщеплення пептидного
Ф зв'язку між залишком С-кінцевої амінокислоти пептиду, яка у бажаному варіанті являє собою І -пролін, і цитотоксичною або цитостатичною сполукою.
Для бажаних сполук ступінь перетворення на вільні ліки становить принаймні 1095 у зазначених нижче стандартних умовах. Для більш бажаних сполук ступінь перетворення на вільні ліки в стандартних умовах становить принаймні 2095. Для ще бажаніших сполук ступінь перетворення на вільні ліки в стандартних умовах (Ф) становить принаймні 5095. У контексті даного опису стандартні умови визначаються в такий спосіб: кожну ка сполуку розчиняють у 50ММ Нерез-буфера, 150мМ масі, рН 7,2, у кінцевій концентрації 5мкМ та інкубують з 100нг СО8ЕАРО, (див. приклад 4) протягом 24год. при 37 2С. Вивільнення вільних ліків під дією СО8ЕАРа бо визначають за методом, описаним у прикладі 5.
Переважно даний винахід стосується сполуки формули (І) т у , ик ши (в 65 те або її фармацевтично прийнятної солі, де
В! означає аміноалканоїл, олігопептидоїл, насамперед ди- або трипептидоїльну групу, М-кінцева амінофункція якої може бути приєднана до блокувальної групи;
Ве ї 2? разом із проміжною М-С-групою утворюють необов'язково заміщене, необов'язково сконденсоване з бензо- або циклогексаногрупою 3-7--ленне насичене або ненасичене гетероциклічне кільце, у якому одна або дві СНо-групи також можуть бути заміщені МН, О або 5,
В означає Н, С.-Свалкіл, Сз-Свциклоалкіл, арил або гетероарил; і
Сує означає фрагмент цитотоксичної або цитостатичної сполуки, за умови, що виключаються
М2-ацетил-ї -гомоаргініл-! -тирозил-і -глутамініл-Ї -серил-М-(2,3,6-тридезокси-1-0-(15,35)-1,2,3,4,6,11-гекса 70. гідро-3,5,12-тригідрокси-3-(гідроксіацетил)-10-метокси-6,11-діоксо-1-нафтаценілі- о, -ІЇ -ліксогексопіраноз-3-ил|-І -пролінамід; і
М2-ацетил-ї -гомоаргініл-! -тирозил-їі -глутамініл-Ї -серил-і -серил-М-(2,3,6-тридезокси-1-0-(15,35)-1,2,3,4,6, 11-гексагідро-3,5,12-тригідрокси-3-(гідроксіацетил)-10-метокси-6,11-діоксо-1-нафтаценіл|- с, -ІЇ -ліксогексопіраноз-3-ил|-І -пролінамід.
Особливо бажаними є сполуки формули !І, у яких К " означає фрагмент формули Са9-А, Со-В-А або
Са). В-а, де
С означає атом водню або блокувальну групу, вибрану з ряду, який містить В. 2-СО, В2-0О-СО-, БЗ-МН-СО-, вВ-805- або КУ-, де КЕ? означає необов'язково заміщену С.-Свалкільну, Са-Свциклоалкільну, арильну, аралкільну або гетероарильну групу; у бажаному варіанті Суд означає ацетил, бензоїл, ЮО-аланіл, (К)-НОМСН(СН»З)- або НЕМСОСН.ОСН»-заміснитк, або іншу блокувальну групу для захисту М-кінцевої амінофункції; А, В і ЮО кожен незалежно один від одного означає фрагменти, що є похідними амінокарбонових кислот формули Ім 9-(х)р-СО., де Х означає СВ'ВЗ і де 29 вк і 28 кожен незалежно один від одного означає атом водню, необов'язково заміщений С.-Свалкільною, см
Сз-Свциклоалкільною, арильною або гетероарильною групою, і р означає 1, 2, 3, 4, 55 або А, В і О кожен (5) незалежно один від одного означає фрагменти, що є похідними циклічних амінокарбонових кислот формули 8. (Се) де о 7 со- ю де со
В? означає С.-Свалкіл, ОН або МН», 3о т означає ціле число від 1 до 10; в д означає 0, 1 або 2; і г означає 0, 1 або 2;
Крім того, бажаними є сполуки формули І, у яких вові З кожен незалежно один від одного означає атом « дю водню або СНа-, СНазСНо-, СНазСНосСнН»-, (СНаз)»СснН-, СНзСнН.сСнНосСнН»о-, (СНаз)»СснНеНно-, СНУСнН.сСн(СН»)-, з (СНез)»с-, ноОсн»-, СснНЗсн(ОН)-, снУнОнесНносн»-, нОосн.сносСНносн»-, н.Мснь.сСНноснН»-, с начсн.сНньСнНоСНно-, НеМсСньЬСнН(онсСНносН»ю-, НаоМме(-МнІМноеносНносн»о-, НЗОН»о-, СНзЗСнНьСНо-, НООССН»-, :з» ноОоссносн»о-, НаМОС(О)СН»-, НЄМО(О)СНоСН»-, бензил, пара-гідроксибензил, не сн, -1 й: або їх
МН Го (95) н «сл циклогексил, феніл, р означає 1, і де конфігурація СЕ ВЗ може являти собою Б- або З-конфігурацію; причому, якщо Б 7 не о означає Н, то ЕЗ бажано означає Н; 2? бажано означає Н; якщо р більше 1, В її 28 бажано означають Н; 4) Іншим бажаним варіантом здійснення даного винаходу є сполуки формули !, де гетероциклічне кільце, утворене КЗ, ее проміжною М-С-групою, заміщене 2 ї 23, де В2 | ЕЗ кожен незалежно один від одного означає атом водню або атом галогену або С.-Свалкіл, Сі-Свалкіламіно, диС.і-Свалкіламіно, С--Свалкокси, тіол, С.і-Свалкілтіо, оксо, іміно, форміл, Сі-Свалкоксикарбоніл, амінокарбоніл, Сз-Свциклоалкіл, арил або гетероарил. о Якщо не зазначено іншого, окремі стереоізомери, а також суміші або рацемати стереоізомерів підпадають під обсяг винаходу. ю "С.-Свалкіл" зазвичай являє собою углеводневий радикал з прямим або розгалуженим ланцюгом, який містить 1-6 атомів вуглецю. 60 Поняття "необов'язково заміщений", уживане вище і нижче в даному описові стосовно групи або фрагменту, означає групу або фрагмент, що можуть бути необов'язково заміщені одним або декількома атомами галогену, гідроксилом, аміно-, С.--Свалкіламіно-, диС--Свалкіламіно-, С--Свалкілоксигрупою, тіолом, С.і-Свалкілтіогрупою, -0, МН, -СНО, -СООН, -СОМН», -МНО(-МН)МН», Сз-Свциклоалкілом, арилом або гетероарилом, при цьому зазначені замісники можуть бути однаковими або різними. б5 Прикладами можуть служити такі радикали: метил, етил, пропіл, 1-метилетил (ізопропіл), бутил, 1-метилпропіл, 2-метилпропіл, 1,1-диметилетил, н-пентил, 1-метилбутил, 2-метилбутил, З-метилбутил,
1,1-диметилпропіл, 1,2-диметилпропіл, 2,2-диметилпропіл, 1-етилпропіл, гексил, 1-метилпентил, 2-метилпентил,
З-метилпентил, 4-метилпентил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 2,3-диметилбутил, З,З-диметилбутил, 1-етилбутил, 2-етилбутил, 1,1,2-триметипропіл, 1,2,2-триметилпропіл, 1-етил-1-метилпропіл і 1-етил-2-метилпропіл, нОсн».-, снЗен(ОН)-, снсн(ІОнеНносн»-, нОосно.сСносСНносн»-, н.Мснь.сСНноснН»-, ноМснНьсСНноСНоснН»-, носно нсНносн»-,
НнгМе(-МНМнНеносСНоснН»-, нзен»о-, снУЗоеносн»-, ноОсенН».-, ноОосСесНносн»-, Наче: ОСН»-,
НоМС(-О)СНоСН»-,бензил, пара-гідроксибензил, со сни - ГЧ або їх
Мн М
Нн к
Якщо С--Свалкільна група є заміщеною, бажаними замісниками є гідроксил, аміно, диметиламіно, діетиламіно, тіол, метилтіол, метокси, етокси, ОО, МН, -СНО, -СООН, -СООСНУ, -СООСНоСН», -СОМН», -МНСс-Мн)МН », циклогексил, феніл, бензил, пара-гідроксибензил, й сн, хо М ст -е 13
МН М
Н .
Якщо С.і-Свалкіл заміщений арилом або гетероарилом, то Сі-Свалкіл у бажаному варіанті являє собою С, бажаніше метиленову групу.
Поняття "аміноалканоїл" або "олігопептидоїл", включаючи "ди- або трипептидоїл", використовуване вище і Ге! нижче в даному описові стосовно радикала ЕК", означають радикал, у якому амінокислота або олігомер, що о містить до 12, бажано 2 або З амінокислотних фрагменти, приєднаний за допомогою амідного зв'язку С-кінцем до атома азоту гетероциклічного кільця.
Фахівцю в галузі хімії амінокислот і олігопептидів має бути очевидним, що певні амінокислоти можуть бути замінені іншими гомологічними, ізостеричними і/або ізоелектронними амінокислотами, при цьому біологічна «О активність вихідної амінокислоти або олігопептиду зберігається після такої модифікації. Для заміни о відповідних амінокислот, що зустрічаються в природних умовах, можна застосовувати певні, такі, що не зустрічаються в природних умовах, і модифіковані, які зустрічаються в природних умовах, амінокислоти. Так, Іс) наприклад, тирозин може бути замінений З-йодтирозином, 2- або З-метилтирозином, З-фтортирозином. со
Поняття "блокувальна група", використовуване вище або нижче в даному описові стосовно групи, приєднаної до М-кінцевого атома азоту аміноалканоїльної або олігопептидоїльної групи радикала ВК", означає групу або ї- фрагмент, що зменшує або усуває ферментативне розщеплення сполук за даним винаходом під дією амінопептидаз, присутніх у плазмі крові теплокровних тварин. Придатні блокувальні групи включають
С.-Сіралканоїл, Се-Сіварил-С.--Соралканоїл, Св-Сіварил-С.4-Сіралкілсульфоніл. Такі блокувальні групи також « включають гідрофільні блокувальні групи, які вибирають за умови наявності гідрофільних функціональних груп.
Такі блокувальні групи збільшують гідрофільність сполук за даним винаходом і у такий спосіб підвищують їхню З с розчинність у водних середовищах. Такі блокувальні групи, що підвищують гідрофільність, у бажаному варіанті » вибирають з ряду, який містить гідроксилований алканол, полігідроксилований алканоїл, гідроксилований ароїл, гідроксилований арилалканоїл, полігідроксилований ароїл, полігідроксилований арилалканоїл, поліетиленгліколь, глікозилати, цукри і прості краунефіри. "С3-Свциклоалкіл" зазвичай являє собою циклічний вуглеводневий радикал, що містить 3-8 атомів вуглецю, ш- який необов'язково може бути заміщений одним або декількома замісниками, вибраними з ряду, що містить 2) гідроксил, аміно, С--Свалкіламіно, диС.--Свалкіламіно, Сі-Свалкіл, С--Свалкокси, тіол, С--Свалкілтіо, 50, МН, -бнНо, -СООН, -СоОСсН», -СООСНоСН», -СОМН», -МНО(-МН)МН»о або галоген, при цьому зазначені замісники о можуть бути однаковими або різними. о 20 Поняття "тетероциклічне кільце", використовуване вище і нижче в даному описові стосовно групи, утвореної К а і В? у комбінації з проміжною М-С-групою, зазвичай означає 3-7-ч-ленну, бажано 4-, 5- або б-членну с неароматичну гетероциклічну кільцеву систему, що містить один атом азоту і, необов'язково, 1 або 2 додаткових гетероатома із групи, що містить азот, кисень і сірку, яка може бути заміщена одним або декількома атомами галогену або С.і-Свалкілом, С.і-Свалкіламіно-, диС--Свалкіламіно-, Сі-Свалкоксигрупою, тіолом, С.4-Свалкілтіо-, оксо-, іміногрупою, формілом, С.і-Свалкоксикарбонілом, амінокарбонілом, Сз-Свциклоалкілом, арилом або
ГФ) гетероарилом, при цьому зазначені замісники можуть бути однаковими або різними, і яка необов'язково може бути сконденсована з бензо- або циклогексаногрупою. Такі гетероциклічні кільця у бажаному варіанті являють о собою азетидин або похідні повністю або частково гідрогенізованого піролу, піридину, тіазолу, ізоксазолу, піразолу, імідазолу, індолу, бензімідазолу, індазолу, піридазину, піримідину, піразину. Найбажанішими є бо азетидин, піролідин, З,4-дегідропіролідин, піперидин, гексагідро-1Н-азепін, октагідроіндол, імідазолідин, тіазолідин.
Якщо таке гетероциклічне кільце є заміщеним, то замісники бажано являють собою метил, етил, пропіл, 1-метилетил (ізопропіл), о бутил, 1-метилпропіл, 2-метилпропіл, 1,1-диметилетил, гідроксил, аміно, диметиламіно, діетиламіно, тіол, метилтіол, метокси, етокси, -СНО, -СООН, -СООСН»З, -СООСНЬОСНУ або бо -СОМН».
"Арил" зазвичай являє собою ароматичну кільцеву систему, що містить 6-10, бажано 6 атомів вуглецю, яка необов'язково може бути заміщена одним або декількома замісниками, вибраними з ряду, що містить гідроксил, аміно, С.--Свалкіламіно, диС.--Свалкіламіно, С.--Свалкіл, С.-Свалкокси, тіол, С.--Свалкілтію0, -СНО, -СООН, -Цбоосн», -ЖЯООсСНнНосСН», -«СОМН»о або галоген, при цьому зазначені замісники можуть бути однаковими або різними, і яка необов'язково може бути сконденсована з бензогрупою. Замісники для арилу переважно можуть бути вибрані з похідних бензолу, бажаними прикладами є феніл, 2-гідроксифеніл, З-гідроксифеніл, 4-гідроксифеніл, 4-амінофеніл, 2-амінофеніл, З-амінофеніл.
Якщо арил є заміщеним, то замісниками у бажаному варіанті є метил, етил, пропіл, 1-метилетил (ізопропіл), 70 бутил, 1-метилпропіл, 2-метилпропіл, 1,1-диметилетил, гідроксил, аміно, диметиламіно, діетиламіно, тіол, метилтіол, метокси, етокси, -СНО, -СООН, -СООСН», -СООСНОСН» або -СОМН». "Гетероарил" зазвичай являє собою 5-10-ч-ленну ароматичну гетероциклічну кільцеву систему, що містить 1-5 гетероатомів, вибраних із азоту, кисню або сірки, яка необов'язково може бути заміщена одним або декількома замісниками, вибраними з групи, яка містить гідроксил, аміно, С .-Свалкіламіно, диС--Свалкіламіно, С.і-Свалкіл,
С.-Свалкілокси, тіол, Сі-Свалкілтіо, -СНО, -СООН, -СООСН», -СООСНОСН», -СОМН»о або галоген, при цьому зазначені замісники можуть бути однаковими або різними, і яка необов'язково може бути сконденсована з бензогрупою. Замісники для гетероарила у бажаному варіанті можуть бути похідними фурану, піролу, тіофену, піридину, тіазолу, ізоксазолу, піразолу, імідазолу, бензофурану, тіанафтену, індолу, бензімідазолу, індазолу, хіноліну, піридазину, піримідину, піразину, хіназоліну, пірану, пурину, аденіну, гуаніну, тиміну, цитозину, урацилу.
Якщо гетероарил є заміщеним, то замісники бажано являють собою метил, етил, пропіл, 1-метилетил (ізопропіл), бутил, 1-метилпропіл, 2-метилпропіл, 1,1-диметилетил, гідроксил, аміно, диметиламіно, діетиламіно, тіол, метилтіол, метокси, етокси, -СНО, -СООН, -СООСН», -СООСНОСН» або -СОМН». "Фрагмент цитотоксичної або цитостатичної сполуки" означає, що сполука НоМ-Суг, яка вивільняється після розщеплення амідного зв'язку, присутнього у формулі (І), або сама є цитотоксичною або цитостатичною, або сч г Може бути перетворена на цитотоксичну або цитостатичну сполуку на наступній стадії.
В останньому випадку -Суг може являти собою фрагмент формули -І-Суг, де | означає сполучний і) фрагмент, отриманий із біфункціональної молекули, наприклад, діаміну Н2М--МН», аміноспирту НаМ-Г-ОН, наприклад, пара-амінобензилового спирту (РАВОН), амінокарбонату, наприклад, (Се) 5-4 он, юю або такої, що не зустрічається в природних умовах, амінокарбонової кислоти. Якщо -Суї є фрагментом со формули -І-Сує, то сполуку НаМ-Г-Суг одержують шляхом ферментативного розщеплення амідного зв'язку, присутнього у формулі (І). Сполука НьМ-І-Суг" може бути цитотоксичною або цитостатичною сама по собі, або - сполучний фрагмент відщеплюють від Су!" на наступній стадії, вивільняючи цитотоксичний або цитостатичний агент. Наприклад, сполука НоїМ-І-Суї" може бути гідролізована у фізіологічних умовах з одержанням сполуки
На.Мм-С-ОН ії цитотоксичної або цитостатичної сполуки Н-Суї", що являє собою агент, який має терапевтичну « дю активність (надалі для простоти як для Суї, так і для Су!" використовується тільки одне позначення СуЇї, і з тільки одне позначення І використовується як для Ї, такі для / . с Фармацевтично прийнятні солі сполук за даним винаходом включають звичайні нетоксичні солі, утворені з :з» нетоксичними неорганічними або органічними кислотами. Наприклад, такі звичайні нетоксичні солі включають солі неорганічних кислот, таких як соляна, бромистоводнева, сірчана, сульфамінова, фосфорна, азотна кислота і т.п.; Її солі, отримані з органічних кислот, таких як оцтова, пропіонова, бурштинова, гліколева, стеаринова, - 75 молочна, яблучна, винна, лимонна, аскорбінова, малеїнова, фенілоцтова, глутамінова, бензойна, саліцилова, сульфанілова, щавлева, трифтороцтова кислота і т.п. (95) Бажаними сполуками формули І є сполуки формули ІА т, ї о 9 ву тов.
Ф х-х Гм де К2, ВЗ, 27, Суг мають зазначені вище значення,
В" означає аміноалканоїльну або олігопептидоїльну групу, і
Х-ї означає СНЕ?-СНо, СЕ?-СН, МН-СНо, СНо-МН, -СВ?-, СНо-СНВ?-СНо; за умови, що коли Х-ХУ означає
Ф) групу СНо-СН», то В! означає аміноалканоїльну, ди- або трипептидоїльну групу або В! означає олігопептидоїл, ка який має більше ніж три амінокислотних фрагменти, що не містять амінокислотної послідовності СіІп-Зег.
Бажано, щоб атом вуглецю в о-положенні циклічного фрагмента амінокислоти був рацемічним, тобто бо знаходився в (К,5)-конфігурації, в бажанішому варіанті в (5)-конфігурації; в оптимальному варіанті здійснення атом вуглецю в о-положенні знаходиться в (5)-конфігурації і К? означає Н. У тому випадку, коли К2 означає ОН, він бажано знаходиться в трансоріентації. 2, ВЗ у бажаному варіанті означають атом водню або метил, етил, пропіл, ізопропіл, феніл, метокси-, етокси- або гідроксигрупу, а в оптимальному варіанті атом водню. К7 бажано означає атом водню або метил, бо етил, пропіл, ізопропіл або феніл, а в оптимальному варіанті атом водню.
Найбажанішими є сполуки формули ІА, вибрані зі сполук формул ІА1, ІА2, ІАЗ, ІА4 іїА5 т ки риси (дл) м и 5 . т вору (Аг)
Кі б 9 1 вро пути (З)
Мк
В 6)
Мити (Аа) в "ДА
С ми (АБ)
Н н с
НьМ-Сує бажано означає антрациклінове похідне формули Ії, о о он о зо (Се)
ІСТН
. о оно (0 о дет їй в Мн, о і - де
Ко означає С.-Свалкіл, С.-Сегідроксиалкіл або С.-Свалканоїлокси- С.--Свалкіл, зокрема, метил, гідроксиметил, діетоксіацетоксиметил або бутирилоксиметил;
ВЗ означає водень, гідрокси або С.-Свалкокси, зокрема метокси; « один із радикалів К: і В! означає атом водню, а інший означає атом водню або гідрокси- або ЩЗ с тетрагідропіран-2-ілокси-"ОТНР)-групу. ц Найбажанішими є такі сполуки формули ІІ: т п во ві ве в сує сноон ОСНУ НО ОН о фдоксорубіцин -І сНЗ ОСНУ НО ОН о даунорубіцин со сноон оснзоОон нн епірубіцин сНЗ н нон ідарубіцин о сноон ОсСНУ НО ОТНР ТНР («в | 20 сНнгОоНн осн нн езорубіцин
Ф СнОоСОосн(ОСоНь)» Осн Но он деторубіцин сноон н Н Он кармінорубіцин сСн»оСОСаНо Осн Но ОН
Найбажанішим є доксорубіцин (Обох). Інші цитотоксичні або цитостатичні фрагменти Суї можна отримати, (Ф, наприклад, на основі метотрексату, триметрексату, піритрексима, 5,10-дидеазатетрагідрофолатпіриметаміну, ка триметоприма, 10-пропаргіл-5,8-дидеазафолат-2,4-діаміно-5-(34-дихлорофеніл)-б6-метилпіримідину, аміноглутетиміду, горесереліну, мелфалану, хлорамбуцилу, аналогів інших хіміотерапевтичних агентів, таких як 60 9-амінокамтотецин |див., наприклад, Витів Н. А, г. а. і 5. М. Ріеїдв, "Тороівотегазе Іпрпірйогв. Ап омегміем/у ої (Ше сатріоїйпесіп апаіодз |огляд|", НетаїйоіІ. ОпсоїЇ. Сіп. Мой Ат. 8(2): 333-355 (1994); Іуег, Її. і М. у. Каїавіп, "Сіїіпіса! рпагппасоїоду ої сатріоїпесіпв (огляд) (137 посилань)", Сапсег Спетоїпег. РНагтасо). 42 додаток: 531-543 (1998)|.
У формулі (І), Суб може також позначати біологічну ефекторну молекулу, яка прямо або побічно чинить 65 Буйнівну дію на пухлинні клітини типу, наприклад, ТМЕо;.
Бажаними прикладами амінокарбонових кислот, на основі яких можна отримати фрагменти А, В і 0, є гліцин
(Су), або О- або бажаніше І-форми / аланіну (Ата), валін (Маї), лейцин (І ец), ізолейцин (Пе), фенілаланін (Рпе), тирозин (Туг), триптофан (Тгр), цистеїн (Сув), метіонін (Ме), серин (Зег), треонін (Тпг), лізин (Гуз), аргінін (Аго), гістидин (Нів), аспарагінова кислота (Авр), глутамінова кислота (Си), аспарагін (Авп), глутамін (Сіп), опролін (Рго), транс-4-гідроксипролін (Нур), 5-гідроксилізин (Ну), норлейцин (Міє), 5-гідроксинорлейцин, б-гідроксинорлейцин (Нуп), орнітин (Огп), циклогексилгліцин (Спа), фенілгліцин (Ро), глутамін (Сіп), циклогексилаланін (Спа), метіонін-З-оксид (Ме), р-циклопропілаланін (Сра), трет.-лейцин (Тіє) або гомосерин (Нзе).
Бажаними сполуками є сполуки загальної формули (І), де фрагмент А отримано на основі аланіну, валіну 7/0 Маї), лейцину (Ге), ізолейцину (Пе), фенілаланіну (Ре), тирозину (Туг), триптофану (Тгр), цистеїну (Сув), метіоніну (Ме), серину (Зег), треоніну (Тйг), лізину (Гуз), аргініну (Аго), гістидину (Нів), аспарагінової кислоти (Авр), глутамінової кислоти (СіІш), аспарагіну (Авп), глутаміну (СіІп), проліну (Рго), транс-4-гідроксипроліну (Нур), 5-гідроксилізину (НУ), норлейцину (Мі), 5-гідроксинорлейцину, б-гідроксинорлейцину (Нуп), орнітину (Огп) або циклогексилгліцину (Спо), фенілгліцину (Рпд), глутаміну (Сіп), 7/5 циклогексилаланіну (Сна), метіоніну-5-оксиду (МекО)), р-циклопропілаланіну (рД-Сра), трет.-лейцину (Те) або гомосерину (Нзве).
Найбажанішими є сполуки формули (І), де КЕ! являє собою групу, вибрану з формул (1)-(34): сч о
Ф зо о ю ще » й де
Суд означає атом водню або блокувальну групу, вибрану з бензоїлоксикарбонілу, фенілацетилу, « фенілметилсульфонілу і бензиламінокарбонілу; Хаа означає фрагмент, отриманий із амінокарбонової кислоти, 70 бажано вибраної з групи амінокислот, які зустрічаються в природних умовах, насамперед із групи, що включає 8 с Аа, Ро, Туг, Ре, Нів, 5ег, ТНг, Нур і Гуз; і т означає ціле число від 1 до 6. з» Бажаними блокувальними групами Са є ацетил (Ас), сукцинімідил (5ис), О-аланіл, бензилоксикарбоніл (Сб2 або 7) або макромолекули, такі як поліетиленгліколь.
Бажаними антрацикліновими проліками є сполуки формули ЇЇ, о он (8) -І с нео ос; 1 Н т о оно" (1 («в) е
Ф нику в в 1
Ф) шо в іме) в де Б2, 2, 2, ВЗ, ве, В В! мають зазначені вище значення. 60 Найбажанішими сполуками за даним винаходом є похідні доксорубіцину формул (ША)-(ПР): б5 в) ОН о он ї
Омео бно" шия
М
7 С. Й бро 5 0.
І ик о о
Ї он
ОС омео он вч
М
"77 сл «апв) ешой
М ці с о
Су й (о) о Он о он (Се) оМмебО он в" І в)
Ме Го) со анс)
НО вн ча
АХ
І І нм ге! 2 ці Нн « о он о - с | он «» «о. омебо он 6
Ме о - і щі (Ко) о ко о сл нд но о 50 о 4) (Ф. ко 60 65 ик о о
А он ; СО ен
Омеб оно ну суди
М ці й о Он о он
С ен
І"н омео оно
Мет то ансу сан сч м що мо Ге) (о) з Н о оон о он ї-о " 3999; ;
Омеб он 5 о «ре со шко) но цн у че
Х о нм Мо ї « - с з -І (95) 1 о 4) (Ф) ко 6о 65 ик о о
А он ; СО ен
Омеб оно ну суди
М ці й о Он о он
С ен
І"н омео оно
Мет то ансу сан сч м що мо Ге) (о) з Н о оон о он ї-о " 3999; ;
Омеб он 5 о «ре со шко) но цн у че
Х о нм Мо ї « - с з -І (95) 1 о 4) (Ф) ко 6о 65 о віз! а он с г
СОмеб оно
Ме о м пе н; но (НЕ) о м Мн
Нн
М й А
Мн іо)
Си о он в) он омео оно"
Ме о но ТЕ (в) во, Що с но, Кк й
Су А 9 о
М о
Су» (Се) о віз! а (ав) ! он ю со т)
Омебо он че
Ме о м пе н; но ій (НЕ) о М «
М.Х, о о - с рани ч о - ;» ФА о о он (в) -І он (95)
Ін с Омеб он мето о 50 но ТЕ в о во, "ою
НО,
СК АА, 3 ре о о С (в) іме)
Якщо фрагмент С9-В-А або Са-(0)21-8-А формули (І) включає два або більше атомів сірки, то сполука за бо даним винаходом може містити один або більше дисульфідних зв'язків.
Один із класів цитотоксичних або цитостатичних сполук, які можна застосовувати за даним винаходом, містить первинну амінофункцію, яка може утворювати амідний зв'язок, показаний на структурній формулі (І), наприклад, доксорубіцин. У цьому випадку наявність сполучної молекули | не є обов'язковою. Якщо цитостатична або цитотоксична сполука не містить такої амінофункції, то така функція може бути введена в цю 65 сполуку за допомогою хімічної модифікації, наприклад, шляхом введення або перетворення функціональної групи, або приєднання до сполуки сполучної молекули. Сполучна молекула може бути також убудована між олігомерним фрагментом (тобто фрагментом, який містить залишки амінокарбонових кислот) і цитостатичним або цитотоксичним фрагментом сполуки за даним винаходом для того, щоб або забезпечити, або оптимізувати розщеплення амідного зв'язку між олігомерним фрагментом і цитотоксичним або цитостатичним фрагментом.
Якщо присутня сполучна молекула, наприклад, у сполуках, які містять структуру Г-СуЄ, то зв'язок між І і Сує у бажаному варіанті являє собою амідний або складноефірний зв'язок. У бажаному варіанті здійснення у фізіологічних умовах після ферментативного розщеплення така сполучна молекула піддається гідролізу з відщепленням цитостатичної або цитотоксичної сполуки, в результаті чого утворюється цитостатична або цитотоксична сполука. У будь-якому випадку сполука за даним винаходом повинна мати здатність 7/0 розщеплюватися в умовах каталітичної дії РАРо,, і в результаті безпосереднього або непрямого впливу такого розщеплення вивільняти у фізіологічних умовах цитостатичну або цитотоксичну сполуку.
Ще одним об'єктом даного винаходу є проліки, які можуть перетворюватися на ліки в результаті каталітичної дії РАРо, при цьому проліки мають сайт розщеплення, що розпізнається ЕАР «с, і проліки є цитотоксичними або цитостатичними у фізіологічних умовах. Такі проліки у бажаному варіанті містять олігомерний фрагмент, що 75 включає два або більше амінокарбонових залишки, і цитотоксичний або цитостатичний фрагмент, де С-кінцевий амінокарбоновий залишок олігомерного фрагмента являє собою таку, що зустрічається в природних умовах або синтетичну 3-7--ленну циклічну амінокислоту, бажано 0О- або І -пролін, або О- чи І -гідроксипролін, а С-кінцева карбоксифункція зв'язана з цитотоксичним або цитостатичним фрагментом за допомогою амідного зв'язку, який може бути розщеплений в результаті каталітичної дії РЕАРо. Олігомерний фрагмент у бажаному варіанті являє собою пептид. Бажано, щоб олігомерний фрагмент містив два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять або дванадцять залишків амінокарбонової кислоти, бажаніше два, три або чотири залишки амінокарбонової кислоти. У бажаному варіанті М-кінцеву амінофункцію захищають за допомогою блокувальної групи.
Сполуки за даним винаходом можуть бути синтезовані методами, відомими в даній галузі (див. у Е. МУипвсй, Ге
Зупіпезе моп Реріїдеп, у "Меїййодеп дег огдапізспеп Спетієе", Ноиреп-УУеу! (за редакцією Е. МійШег, О. Вауег), о том ХУ, частини 1 і 2, видавництво Сеогуд Тпіете, Штутгарт, 1974). Наприклад, сполуки можуть бути синтезовані методом блокового синтезу шляхом конденсації кінцевої карбоксифункції олігомерного фрагмента, де Х може означати ОН або активувальну відхідну групу, з аміногрупою цитотоксичної або цитостатичної молекули
НьаМм-Сує, що приводить до утворення аміду. (Се) зо о то І о вих 1 . поря ви хо ж нас -ек я Н юю ве -нх Шк:
Якщо між олігомерним фрагментом і цитотоксичним або цитостатичним агентом має бути сполучний о фрагмент (І), то блоковий синтез може бути здійснений у такий самий спосіб. ч-
ШИ меш
І КМ
«руту фонду --к. Моя реж «
Кк о -Нх Кк о то ві Її т
І
- вл трон зхос-сує 2 у зо сує а к -нх в т о В о о
А щ 45 а вхос-су --- кю сує
Кк -НЕ Кк мні Якщо цитотоксичний або цитостатичний фрагмент містить карбоксифункдію, необхідну для приєднання до , (9) олігомерного фрагмента, то сполучна молекула може являти собою імін або аміноспирт, і блоковий синтез таких о 50 сполук може бути здійснений аналогічним чином шляхом взаємодії активованого фрагмента ХОС-Суг або з гідрокси-, або з аміногрупою. 4) т ! т Ге) «Ар ж о но-буг -яюя кр юрох ьЕ 6) -НЕ Кк о
Якщо цитотоксичний або цитостатичний реагент містить гідроксильну функцію, яку можна застосовувати для
ГФ) сполучення з олігомерним фрагментом, то сполучний залишок може являти собою амінокарбонову кислоту і т блоковий синтез може бути проведений аналогічним чином.
У разі потреби за допомогою відповідних захисних груп у радикалах Суї, І, гідроксипролін, А, В ії 0 можуть бути захищені інші функціональні групи, які не повинні вступати в реакцію в процесі утворення бо молекул-мішеней. Придатні захисні групи широко відомі в даній галузі (Р.С.М. УУців, "Ргоїесіїме дгоцйрз іп огдапіс зупіпевів", дойп УМйеу апа Бопв Іпс., Мем Могк, 1991). Ці захисні групи видаляють після завершення синтезу.
З метою ілюстрації можна відзначити, що придатні амінозахисні групи можуть включати, наприклад,
С.і-Сіроалканоїльні групи, такі як форміл, ацетилдихлорацетил, пропіоніл, З,З-діетилгексаноїл і ят.п., бо С.-Сіралкоксикарбоніл і Се-С.-7аралкілоксикарбоніл, наприклад, трет.-бутоксикарбоніл, бензилоксикарбоніл
(ВОС), флуоренілметоксикарбоніл і т.п. Найбажанішим є флуоренілметоксикарбоніл (ЕМОС).
Придатні карбоксизахисні групи можуть включати, наприклад, С.і-Сіралкільні групи, такі як метил, трет.-бутил, децил; С.-С.і7аралкіл, такий як бензил, 4-метоксибензил, дифенілметил, трифенілметил, флуореніл; три(С.4-Сіралкіл)усиліл або (С.-Сіралкіл)удіарилсиліл, такий як триметилсиліл, диметил-трет.-бутилсиліл, цдфеніл-трет.-бутилсиліл, і споріднені групи.
Для утворення такого складного ефіру або аміду може виявитися необхідним активувати карбонільну групу карбонової кислоти для нуклеофільної взаємодії з аміном або спиртом, тобто Х має являти собою активувальну групу або відхідну групу, яка може бути заміщена аміногрупою. Така активація може бути здійснена шляхом /о перетворення карбонової кислоти на хлорангідрид або фторангідрид, або шляхом перетворення карбонової кислоти на активований ефір, наприклад, М-гідроксисукцинімідиловий ефір або пентафторфеніловий ефір. Інший метод активації являє собою трансформацію в симетричний або несиметричний ангідрид. В альтернативному варіанті утворення амідних або ефірних зв'язків можна досягти шляхом використання іп зіш реагентів для реакції сполучення, таких як гексафторфосфат бензотриазол-1-ілокситриспіролідинфосфонію (РУВОР) (Е. Егегої ув та ін., Тейгапедгоп, 47, 259-270, 19911, 1,1"-карбонілдімідазол (ЗО) ІК. АКаїї та ін., ТНІ, З5, 3315-3318, 1994), тетрафторборат 2-(1Н-бензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуронію (ТВТО) |К. Кпоїт та ін., ТНІ, З0, 1927-1930, 19891, 1-(мезитилен-2-сульфоніл)-З-нітро-ТН-1,2,4-триазол (М5МТ) ІВ. ВіапКкептеуег-Мепде та ін.,
ТНУ, 31, 1701-1704, 1990).
Як альтернатива методу блокового синтезу створення молекул загальної формули (І) може бути здійснене постадійно в напрямку справа наліво методом послідовних реакцій конденсації відповідних мономерів СУ, Ї, циклічної аміногрупи, утвореної КУ, В? і проміжною М-С-групою, насамперед проліну або гідроксипроліну, А, В і
О. Для здійснення реакції конденсації можна використовувати ті ж методи сполучення, які зазначено вище.
Оскільки елементи І, пролін/гідроксипролін, А, В ії ЮО являють собою принаймні біфункціональні молекули, що містять аміно-і (принаймні фрагменти А, В, О і циклічна аміногрупа, утворена Ка, КБ проміжною М-С-групою, Га насамперед пролін/гідроксипролін) карбоксигрупу, то аміногрупа має бути блокована захисною групою (РО) о перед активацією карбоксильної функції. Для захисту аміногруп можна використовувати групу ВОС або, бажано, групу ЕМОС. Після здійснення реакції сполучення амінозахисна група має бути вилучена, і може бути здійснене сполучення з наступним фрагментом, захищеним групою Етос- або Вос. У разі потреби за допомогою придатних захисних груп можуть бути захищені інші функціональні групи, присутні у фрагментах Суїг, ЇЇ, циклічній «о амінокислотній групі, утвореній Ка, КЬ і проміжною М-С-групою, насамперед у гідроксипроліні, А, В і 0, які не повинні вступати в реакцію в процесі синтезу молекул-мішеней. Ці захисні групи мають бути вилучені після о закінчення синтезу. ю
Блокувальні групи, як їх визначено для формули (І), можуть також служити у функції захисних груп, насамперед при додаванні останнього (М-кінцевого) залишку амінокарбонової кислоти. У цьому останньому о випадку захисну групу не видаляють, оскільки вона є частиною молекули-мішені. В альтернативному варіанті ча блокувальна група може бути приєднана після проведення сполучення з останнім залишком амінокарбонової кислоти і потім вилучена.
Постадійний синтез описано на наведених нижче схемах. На другій схемі показано приклад того, що « сполучний фрагмент, а також фрагмент Суї можуть містити інші функціональні групи, показані на цій схемі (див. вище): - с . и? -І (95) 1 о 50 42)
Ф) іме) 60 б5
Р . ге Н і, на-су м исує І Су ви х ви Н С Й
І - НХ ее - РО Г- вом на
РО-А-Х М сує н «Сук пами лю і МИ в (З -НХ -Рб Кк 1
Ло Ж ок шостою в й р н-су
РО-МН Ї ---- РОН бу -- Я их «Ннх т М сРО сля тин т, -Х ! "? 7 у: т В а і у . С. щі Й - и ри се кур си -нх о "Ро є 0 с ч т Ге)
М А. за -оно- Сус г
Таким чином, наступним об'єктом даного винаходу є спосіб одержання сполуки формули (І), який ісе) відрізняється тим, що сполуку загальної формули о її ю лих (М со »
Кк ї- де В", ВК і ЕР мають зазначені вище значення, Х" означає ОН або відхідну групу, яка може бути заміщена аміногрупою, вводять у взаємодію зі сполукою НМ(В 7)-Суї, де Суї означає фрагмент цитотоксичної або цитостатичної сполуки і В" має зазначені вище значення. « дю У бажаному варіанті Х' у формулі (М) означає відхідну групу, наприклад, -СІ, -Е, М-гідроксисукцинімідил, з с пентафторфеніл або карбоксилат. В альтернативному варіанті Х' може означати ОН і конденсація може бути здійснена з використанням іп зіш реагенту для реакції сполучення, наприклад, гексафторфосфату :з» бензотриазол-1-ілокситриспіролідинфосфонію (РУВОР), 1,1-карбонілдімідазол (СОЇ), тетрафторборату 2-(1Н-бензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуронію (твти) або 1-(мезитилен-2-сульфоніл)-3-нітро-1Н-1,2,4-триазолу (МБМТ). - Наступним об'єктом даного винаходу є спосіб одержання сполуки формули (І), який відрізняється тим, що сполуку загальної формули (МІ) (95) пн 20 х
М т «7 чия (м) го Кк ь («в) Кк
Ф де К!, Ва і ЕР мають значення, зазначені в п.1 формули винаходу,
У" означає І-СОХ? , де | означає сполучний фрагмент і Х? означає ОН або відхідну групу, яка може бути заміщена аміногрупою або гідроксигрупою, вводять у взаємодію зі сполукою Н.оМ-Суг або зі сполукою НО-СУЇ, де Суї означає фрагмент цитотоксичної або цитостатичної сполуки. о У бажаному варіанті Х? у формулі (МІ) означає відхідну групу, наприклад, -СІ, -Е, М-гідроксисукцинімідил, пентафторфеніл або карбоксилат. В альтернативному варіанті Х' може означати ОН і конденсація може бути де здійснена з використанням іп зіш реагенту для реакції сполучення, наприклад, гексафторфосфату бензотриазол-1-ілокситриспіролідинфосфонію (РУВОР), 1,1-карбонілдімідазол (СОЇ), тетрафторборату 60 0 2-(1н-бензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуронію (твти) або 1-(мезитилен-2-сульфоніл)-3-нітро-1Н-1,2,4-триазолу (МБМТ).
Ще одним об'єктом даного винаходу є спосіб одержання сполуки формули (І), який відрізняється тим, що сполуку загальної формули (МІЇ) б5 т 069 «ря мо де В", Ва ії 2? мають зазначені вище значення, У 2 означає І-ОН або ІЇ-МН»о, де І означає сполучний фрагмент, вводять у взаємодію зі сполукою ХЗОС-Суї, де ХЗ може означати ОН або відхідну групу, яка може бути заміщена аміногрупою або гідроксигрупою, і де Суї означає фрагмент цитотоксичної або цитостатичної сполуки. 70 У бажаному варіанті ХЗ у сполуці ХЗОС-Сук означає відхідну групу, наприклад, -СІ, -Е,
М-гідроксисукцинімідил, пентафторфеніл або карбоксилат. В альтернативному варіанті Х може означати ОН, а конденсацію здійснюють із використанням іп 5зйи реагенту для реакції сполучення, наприклад, гексафторфосфату бензотриазол-1-ілокситриспіролідинфосфонію (РУВОР), тетрафторборату 1,1-карбонілдіїмідазолу (СО), тетрафторборату 2-(1Н-бензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуронію (ТВТ) або 75. 1-(мезитилен-2-сульфоніл)-З-нітро-1Н-1,2,4-триазолу (М5МТ).
Наступним об'єктом даного винаходу є спосіб одержання сполуки формули (І), який відрізняється тим, що сполуку формули НоМ-Суї піддають постадійній конденсації з фрагментами, які утворюють сполуку формули (1).
Перед кожною стадією сполучення може виявитися необхідним видалити захисну групу РО, якщо вона присутня.
Таким чином, ще одним об'єктом даного винаходу є спосіб одержання сполуки формули (І), який 2о Відрізняється тим, що сполуку загальної формули (МІП)
Ро" о арх (МІ) в с
Й о де РО" означає захисну групу, а інші замісники мають зазначені вище значення, вводять у взаємодію зі сполукою НМ(БК7)-Суї, де Сук означає фрагмент цитотоксичної або цитостатичної сполуки; потім видаляють захисну групу РО", після чого утворену сполуку (МІПА) с о ' о
Щі нн ие (МА)
Кк в в ІС по зі 2 4 2 с х4 глухі о вводять у взаємодію зі сполукою Ро --А-Х", де РОО- означає захисну групу і Х" означає ОН або відхідну групу, яка може бути заміщена аміногрупою; і потім у разі потреби здійснюють додаткові стадії сполучення до і - одержання кінцевої сполуки.
Групи РО і РО? можуть являти собою, наприклад, ВОС або, бажано, ЕМОС.
Таким чином, ще одним об'єктом даного винаходу є спосіб одержання сполуки формули (І), який « відрізняється тим, що сполуку формули РО З-МЖ(273-І-СОХЗ, де РОЗ означає захисну групу, а інші замісники - то мають зазначені вище значення, вводять у взаємодію зі сполукою формули У 7-Суї, де Суг означає фрагмент с цитотоксичної або цитостатичної сполуки; і М? означає НМ або НО; потім видаляють захисну групу РО З і ;» сполуку, що утворилася, НМ(К7)-І-М7-Сук вводять у взаємодію зі сполукою формули (МІ), 1 - 7 х (Мі) о т с після чого видаляють захисну групу РО", і утворену сполуку формули о н о
Ф ж р трн-жой й
Кк Кк. вводять у взаємодію зі сполукою РО7-А-Х7, де РО" означає захисну групу і Х" може означати ОН або відхідну групу, яка може бути заміщена аміногрупою; і потім у разі потреби здійснюють додаткові стадії сполучення до
ГФ) одержання кінцевої сполуки. 7 Наступним об'єктом даного винаходу є спосіб одержання сполуки формули (І), який відрізняється тим, що сполуку формули РОЗ-М(В7)3-І-Ж?, де РОЗ означає захисну групу, У? означає ОН або МН», і замісники мають во зазначені вище значення,
Вводять у взаємодію зі сполукою формули Х "ОС-Суї, де Су означає фрагмент цитотоксичної або цитостатичної сполуки і Х? означає ОН або прийнятну відхідну групу; потім видаляють захисну групу РО ?; і сполуку, що утворилася, НМЖ(В-І -У2-СО-Суї вводять у взаємодію зі сполукою формули (МІ), б5 ро 0 вибух (МІВ ' після чого видаляють захисну групу і сполуку, яка утворилася, 8) о я Д в "М--у сує
Ь ЩО
Кк Кк вводять у взаємодію зі сполукою РО 2-А-Х", де РО? означає захисну групу і Х? означає ОН або відхідну групу, яка може бути заміщена аміногрупою; і потім у разі потреби здійснюють додаткові стадії сполучення до одержання кінцевої сполуки.
Ще одним об'єктом даного винаходу є нові проміжні сполуки формули МІША
Ге)
М нео о (МА) п води
Кк в де Ва, ВР, Ві Су мають зазначені вище значення.
Сполуки за даним винаходом призначені для застосування в медицині. Зокрема, ці сполуки можна застосовувати для лікування пухлин, пов'язаних зі стромальними фібробластами, що експресують БАР м, лікування яких за допомогою існуючих цитотоксичних і/або цитостатичних агентів не є оптимальним. Пухлинами такого типу є, наприклад, різноманітні види епітеліальних карцином, такі як карциноми легені, молочної залози с й ободової кишки. За допомогою цих сполук можна лікувати також такі пухлини, як саркоми кісткової тканиниї (3 м'яких тканин, які експресують ЕАРо.
Таким чином, ще одним об'єктом даного винаходу є фармацевтичні композиції, що містять сполуку за даним винаходом і, необов'язково, один або декілька придатних і фармацевтично прийнятних ексципієнтів, приклади яких наведено в |Кептіпдіоп: (Ше зсіепсе апа ргасіїсе ої рпаптасу, 19-е вид. Еавіоп: Маск Рибі, 1995). іш
Фармацевтичні композиції можуть бути виготовлені у формі твердих продуктів або розчинів. Тверді композиції «з можна використовувати з метою одержання розчинів для ін'єкцій. У бажаному варіанті фармацевтичні композиції являють собою розчини для ін'єкцій. Їх можна вводити системно, наприклад, шляхом внутрішньовенної ін'єкції, о або місцево, наприклад, шляхом ін'єкції безпосередньо в ділянку пухлини. Доза має бути вибрана з урахуванням со таких факторів, як вага тіла і стан здоров'я пацієнта, природа хвороби, що піддається лікуванню, спектр терапевтичної активності застосовуваної сполуки, розчинність і т.п. Відповідне регулювання дози знаходиться в - компетенції фахівця в даній галузі. Наприклад, для кон'югатів доксорубіцину доза у бажаному варіанті має становити від 10мг/м? до 1350 мг/м", однак можна застосовувати також більш високі і більш низькі дози. « дю Таким чином, ще одним об'єктом даного винаходу є застосування сполуки за даним винаходом для з виготовлення фармацевтичної композиції, призначеної для лікування раку. Крім того, об'єктом даного винаходу є с спосіб лікування раку, який передбачає введення пацієнтові ефективної кількості фармацевтичної композиції за :з» даним винаходом. Композиції можна застосовувати для лікування різних типів раку, а саме: 1) епітеліальних карцином, включаючи карциноми молочної залози, легені, колоректальну карциному, карциному голови і шиї, підшлункової залози, яєчника, сечового міхура, шлунка, шкіри, ендометрія, яєчок, - 15 стравоходу, передміхурової залози і нирок; 2) карцином кісткової тканини і м'яких тканин: остеосаркоми, хондросаркоми, фібросаркоми, злоякісної (95) фіброзної гістіоцитоми (МЕН), лейоміосаркоми; сл З) гематопоетичних злоякісних пухлин: лімфоми Ходжкіна і не-ходжкінської лімфоми; 4) нейроектодермальних пухлин: пухлин периферичної нервової системи, астроцитом, меланом; (ав) 5) мезотеліом.
Ф Композиції можна також застосовувати для лікування хронічних запальних станів, таких як ревматоїдний артрит, остеоартрит, цироз печінки, фіброз легені, артеріосклероз і аномальне загоєння рани.
Ще одним об'єктом даного винаходу є спосіб лікування раку, який передбачає введення пацієнтові проліків, де проліки можуть бути перетворені на цитотоксичні або цитостатичні ліки в результаті ферментативної активності, при цьому ферментативна активність обумовлюється продуктом, який експресується клітинами,
ГФ) зв'язаними з пухлинною тканиною. У бажаному варіанті ферментативна активність являє собою протеолітичну
ГФ активність ЕАРо.
Одним із методів введення сполук є внутрішньовенна інфузія. Інші можливі шляхи введення включають во внутрішньочеревну (за допомогою болюсу або інфузії), внутрішньом'язову або внутрішньопухлинну ін'єкцію. У разі потреби також можна використовувати безпосереднє введення (наприклад, у випадку фіброзу легені).
Опис креслень
Фіг.1: Розщеплення кон'югатів доксорубіцин-пептид за допомогою ЕАР у. Наведено хроматограми 2ОР-Бох (2-с1у-(ЦД)-Рго- доксорубіцин) по завершенні інкубації з очищеним злитим протеїном ЕАРтСОЗв8 (А) або з буфером в5 (Б) (див. приклад 5).
Фіг2: Зменшення цитотоксичності доксорубіцину в результаті кон'югації доксорубіцину з пептидами, які можуть бути розщеплені за допомогою ЕАРо, (див. приклад 6).
Фіг.3: Демонстрація цитотоксичної дії доксорубіцину, вивільненого з кон'югатів доксорубіцин-пептид, які можуть розщеплюватися за допомогою ЕАР о, у результаті експресії РАРо клітинами клону НТ1080 33 у порівнянні з батьківськими клітинами лінії НТ1080 (див. приклад 8).
Фіг.4: Стабільність М-Ср2-С1у-(І|3)-Рго-доксорубіцину і /М-Св2-(Ц)-Рго-(І)-АІа-СІу-(І3-Рго-доксорубіцину в плазмі миші та людини (див. приклад 9).
Фіг.5: Демонстрація ферментативної активності ЕАР у і визначення його середньої молекулярної маси в зразках пухлинних тканин людини (див. приклад 12). 70 Фахівцю в даній галузі має бути очевидним, що незважаючи на те, що в наведених нижче прикладах описано конкретні реагенти й умови реакцій, можуть використовуватися також їх модифікації, які варто розглядати як такі, що підпадають під обсяг даного винаходу. Таким чином, нижченаведені приклади призначені для більш докладного пояснення винаходу, але не спрямовані на обмеження його обсягу.
Приклади
Приклад 1: Процеси синтезу кон'югатів доксорубіцину
М-Ср2-С1у-Рго-доксорубіцин: Зважували М-Ср2-с1у-Рго (116,1мг, О,37ммоля) і М-гідроксисукцинімід (44мг, 0,37ммоля) і вносили в 2-горлу круглодонну колбу в атмосфері М». Додавали безводний М,М-диметилформамід (20мл) і колбу охолоджували до 02С в крижаній бані. Додавали дициклогексилкарбодіїмід (78мг, 0,37ммоля) у вигляді розчину в М,М-диметилформаміді об'ємом 1мл. Розчин перемішували протягом 4Охв. при 020.
Зважували доксорубіцин-НСІ (100мг, ммоля), вносили в посудину, забезпечену невеликою мішалкою і поміщали в атмосферу Мо. У посудину додавали при перемішуванні М,М-диметилформамід (Змл) і
М,М-діїзопропілетиламін (33,1мкл, 0,19ммоля). Розчин доксорубіцину за допомогою шприца додавали до розчину пептиду і посудину додатково промивали 2мл М,М-диметилформаміду. Крижану баню видаляли і реакційну суміш перемішували протягом приблизно 48год. при кімнатній температурі. с
Реакційний розчин екстрагували етилацетатом (500мл). Етилацетатний шар промивали послідовно 1095-вим ге) розчином лимонної кислоти (250мл), насиченим водним розчином бікарбонату натрію (250мл) і соляним розчином (250мл). Органічний екстракт сушили над безводним Мо95О, і розчинник видаляли за допомогою роторного випарника. Продукт, який містить велику кількість домішки у вигляді ДМФ, піддавали експрес-хроматографії зі зверненою фазою на колонці типу С-18, використовуючи у функції елюенту суміш ре) метанол:вода (8:22). Виділяли одну пляму оранжевого кольору, час утримання (п) якої становив «0,3, яка о флуоресціювала при освітленні довгохвильовим УФ-світлом. Метанол видаляли за допомогою роторного випарника, а останні слідові кількості розчинника видаляли протягом ночі за допомогою високовакуумного о насоса. с
М-Ср2-Рго-АІа-СІу-Рго: М-Ср2-Рго-АІїа (5г, 1Т5ммолей) і карбонілдімідазол (2,43г, 15ммолей) вносили в
Зо атмосфері аргону в З-горлу круглодонну колбу об'ємом 250мл. Додавали безводний тетрагідрофуран (5Омл) і - розчин перемішували при кімнатній температурі протягом приблизно 45хв. При цьому відбувалося інтенсивне виділення газу (СО5).
Зважували Сіу-Рго-ОСНУ.-НСЇІ (2,9г, 15ммолей) і вносили в окрему колбу. Додавали тетрагідрофуран (5мл) і «
М,М-дизопропілетиламін (5,23мл, ЗОммолей), і розчин перемішували протягом декількох хвилин. Розчинений З 70 продукт додавали за допомогою шприца до активованого пептиду, продукт, який залишився, розчиняли в с мінімальній кількості СНоСі» і також додавали за допомогою шприца до активованого пептиду.
Із» Реакційний розчин перемішували протягом ночі при кімнатній температурі (15год.), і до ранку утворювалася значна кількість осаду білого кольору. Реакційну суміш промивали 1095-вим водним розчином лимонної кислоти (З00мл) і екстрагували етилацетатом (500мл). Етилацетатний екстракт промивали насиченим водним розчином бікарбонату натрію (ЗО0Омл) і сушили в присутності соляного розчину (З0Омл) і безводного Мо5О ). Етилацетат і видаляли за допомогою роторного випарника, одержуючи 5бг безбарвної олії, що мала задовільні со характеристики.
Неочищену олію, що являє собою М-Ср2-Рго-АІа-СІу-Рго-ОСН з (5г, 12ммолей), розчиняли в метанолі (20мл) і-й у круглодонній колбі. Колбу поміщали у водну баню при температурі навколишнього середовища. Обережно ав! 20 додавали 1н. розчин гідроксиду натрію (12мл). Розчин перемішували протягом 3З,5год., після чого додавали 1н. розчин НОСІ (12мл). Розчин концентрували на роторному випарнику і додавали ще декілька крапель ін. розчину ши НОЇ до досягнення значення рН приблизно 1,5, яке визначали за допомогою лакмусового паперу. Воду видаляли за допомогою вакуумного насоса, одержуючи продукт у вигляді олії, який повільно перекристалізовували з етанолу. 29 М-Ср2-Рго-АІа-СІіу-Рго-доксорубіцин: М-СЬ2-Рго-АІа-сСІу-Рго (180мг, О,Звммоля) розчиняли в безводному
ГФ) М,М-диметилформаміді (15мл). 1-Гідроксибензотриазол (51,3мг, Звммолей) і дициклогексилкарбодіїмід (78мг,
Звммолей) кожен розчиняли в їмл М,М-диметилформаміду і додавали у вигляді розчинів до пептиду. Реакційну о суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 45хв.
Зважували доксорубіцин-НСІ (11бмг, 20Оммолей), вносили в окрему посудину і розчиняли в 60 М,М-диметилформаміді (Змл). У посудину, що містить доксорубіцин, вносили за допомогою шприца
М,М-діїзопропілетиламін (34, ,8мкл, 2о0ммолей) і вміст перемішували протягом декількох хвилин для забезпечення повного розчинення. Розчин доксорубіцину додавали за допомогою шприца до активованого пептиду. Розчин перемішували протягом 48год. при кімнатній температурі.
Продукт екстрагували етилацетатом (2л) і промивали 1095-вим водним розчином лимонної кислоти (500мл). бо Етилацетатний шар відокремлювали, сушили над Мо5зО, і концентрували на роторному випарнику, одержуючи продукт у вигляді олії. Олію піддавали хроматографії зі зверненою фазою на колонці типу С-18 на силікагелі, одержуючи пляму оранжевого кольору 1-0,25, що флуоресціювала при освітленні довгохвильовим УФ-світлом.
Кінцевий продукт мав задовільні характеристики.
Приклад 2: Одержання ліній клітин, що експресують ЕАРо,
Одержували лінії клітин ссавців, які експресують рекомбінантний ЕАР у. Добре відомі клітини фібросаркоми
НТ1080, які можуть бути отримані від ОМА (Німецька колекція мікроорганізмів і клітинних культур, Брауншвейг,
Німеччина) за реєстраційним номером ОЗМ2 АСС 315, підтримували в суміші ОМЕМ/Е12 (50:50), яка включає 10956 фетальної бичачої сироватки, в атмосфері з умістом 9595 повітря і 595 СО 5. Клітини лінії НтТ1080 70 трансфектували вектором РАР.38 МО 97/34927, Зсапіап та ін., у зазначеному місці| методом із використанням ліпофектину згідно з інструкціями виробника (фірма сірсо/ВКІ). Піддані трансфекції клітини відбирали за ознакою стійкості до антибіотиків (200мкг/мл генетрицину) і потім підтримували в середовищі, яке містить генетрицин. Відбирали окремі колонії стійких клітин, вирощували до конфлуенції на чашках Петрі для культур тканин діаметром 1Осм і аналізували щодо експресії РЕАРо за допомогою імунофлуоресцентного аналізу з 75 використанням ЕАР оу-специфічного моноклонального антитіла Е19 згідно з описаним в літературі методом
ІСагіп-Спеза та ін. Ргос. Май). Асад. сі. ОБА 87(18), 7235-7239 (1990)). За допомогою імунофлуоресцентного аналізу для батьківської лінії клітин НТ1080 не було виявлено помітної експресії РАРа, тоді як один клон, позначений далі як клон НТ1080 33, виявився позитивним щодо експресії ЕАРо.
Аналогічно до цього клітини нирки ембріона людини лінії 293, які є добре відомими і які можна отримати від Американської колекції тканинних культур (Роквілл, штат Меріленд), вирощували в середовищі ОМЕМ, доповненому 1095 фетальної бичачої сироватки, в атмосфері, що містить 9595 повітря і 595 СО ». Клітини трансфектували вектором, який експресує РГАРо, тобто рЕАР.38, шляхом трансфекції з використанням фосфату кальцію згідно з описаним в літературі методом |Рагк 9У.Е., Спеп Н.Н., МУіпег 9., Ноиск К.А. і Реїтага М.,
Ріасепіа дгом/й Тасіог. Роїепійайоп ої мазсцаг епдоїпеїйа дгомій Тасіог бБіоасіїмійу, іп мйко апа іп мімо, ЄМ апа Нідн айіпйу Біпаіпд йо ЕйЙ-1 риб пої йо РІК-Л/КОМК. 9. Віої. Спет. 269(41), 25646-25654 (1994)). Добір і о аналіз трансфектантів здійснювали згідно з методом, описаним вище стосовно експресії БАРо. Для батьківської лінії клітин 293 не було виявлено помітної експресії ЕАР у. Один клон, що позначається далі як 293-1/2, виявився позитивним щодо ЕАРо.
Приклад 3: Дослідження експресії ЕАР у у трансфектованих лініях клітин ї-оі
Експресію РАРо досліджували в клітинах лінії НТ1080 і клону НТ1080 33. Метаболічне мічення, (ав) імунопреципітацію і флуорографію здійснювали в основному за описаним у літературі методом (РагК та ін., ою
Зотаїййс СеїЇ Мої. Сепеї. 17(2), 137-150 (1991)). Клітини лінії НТТО80 і клону 33 лінії НТ1080 метаболічно мітили за допомогою З5-метіоніну. Екстракти, отримані за допомогою детергентів, піддавали імунопреципітації і) зв за допомогою моноклонального антитіла Е19 або мишачого антитіла досі у функції негативного контролю. Осади їм- кип'ятили в буфері для зразків і розділяли за допомогою гель-електрофорезу з використанням додецилсульфату натрію Іза методом, описаним у І аеттії, Майте 227(259), 680-685 (1970)). Флуорографічний аналіз отриманого гелю показав, що клітини клону 33 лінії НТ1080 продукують протеїн ЕАРао. Ні в екстрактах батьківських клітин лінії НТ1080, ні в зразках, підданих імунопреципітації, отриманих за допомогою мишачого досі, протеїн РГАРо, не « був виявлений. - с Приклад 4: Розчинний рекомбінантний ЕАРо, ц Розчинну рекомбінантну форму протеїну ГАРа одержували таким чином. кДНК, що кодує позаклітинний "» домен (ЕСЮ) мишачого СОво (Сепрапк М12825), який містить 189 М-кінцевих амінокислот СЮОв8 о, лігували з
КДНК, що кодує позаклітинний домен ЕРАРо, (амінокислоти 27-760), одержуючи конструкцію злитого протеїну, а саме, ЕАРтСОЮв8, аналогічну за структурою лігандові злитого протеїну СЮОво, -СО40, згідно з описаним раніше - методом (апе та ін. 9. Ехр. Мей. 177(4), 1209-1213 (1993)). кКДНК перевіряли шляхом секвенування і с вбудовували у вектор рМм!/ 1393. Трансфекцію клітин лінії 519 і ампліфікацію отриманого рекомбінантного бакуловіруса здійснювали згідно з описаним в літературі методом (О'КейУу, Васціомігиз Ехргезвіоп Месіоге: А о І арогаюгу Мапиаі, Ожхтога Опімегейу Ргез5, Мем МЖогк (19943). Супернатант культури Нідп Ріме-клітин, о 20 заражених рекомбінантним бакуловірусом ЕАРтСОв8 і вирощених протягом 4 днів, збирали й очищували шляхом ультрацентрифугування. Злитий протеїн РАРтСО8 очищували з цих супернатантів з використанням 4» моноклонального антитіла до РЕАРоу, іммобілізованого на активованих агарозних кульках (фірма Ріегсе
Спетісаї, Індіанополіс, штат Індіана, США). Супернатант культури пропускали через колонку з високою афінністю до антитіла й елюювали за допомогою зсуву значення рН з використанням 0,1М цитратного буфера, 25 рН 3. Зразки відразу ж нейтралізували за допомогою насиченого розчину Трис (фірма Зідта Спетісаї!в,
Ф! Сент-Луїс, штат Міссурі) і поєднували фракції, що містять протеїн.
Приклад 5: Оцінка розщеплення кон'югатів доксорубіцин-пептид о Зразки розділяли методом рідинної хроматографії високого дозволу (РХВД) зі зверненою фазою, адаптованим для вимірювання розщеплення кон'югатів доксорубіцин-пептид. РХВД-система включала 60 автоматичний аплікатор зразків типу Умаїегз 717, забезпечений 100-мікролітровою (мкл) петлею, і два насоси типу У/а(егз модель 510 для введення розчинників. Розділення здійснювали в ізократичних умовах при швидкості потоку 0,7мл/хв. на колонці типу Мисіеовії С-18, завдовжки 100мм, внутрішнім діаметром 4мм, з розміром часток носія 5мкм (фірма Ог. Іпд. Н. Кпацег стр, Берлін). Рухлива фаза являла собою суміш метанол:вода (70:30, об./об.), яка містить О0,2М ацетат амонію, значення рН якої доводили до 3,2. Вільний доксорубіцин і кон'югати бо доксорубіцин-пептид виявляли за допомогою флуоресценції (довжина хвилі збудження 475нм; довжина хвилі випущення 585нм) з використанням флуоресцентного детектора типу УМаїегз 474. Ін'єкцію, введення розчинника,
збір даних і аналіз даних здійснювали з використанням програмного забезпечення для хроматографії типу
МіПеппішт 2010 (фірма М/аїеге Согр., Мілфорд, штат Мінесота, США). Речовини, що підлягають тестуванню, спочатку розчиняли в диметилсульфоксиді до одержання концентрації 5ММ, а потім розводили у водному розчині перед внесенням у колонку для РХВД.
Досліджували здатність розчинного рекомбінантного ферменту РАРо, вивільняти вільний доксорубіцин з кон'югатів доксорубіцин-пептид. Маткові розчини кон'югатів доксорубіцин-пептид (5мММ) розбавляли забуференим Нерез фізіологічним розчином, рН 7,4, до одержання кінцевої концентрації 50-100мкМ. 20мкл утвореного розчину змішували з 5О0мкл описаного вище очищеного злитого протеїну ЕАРтСОв8 (приблизно 2Онг) і 7/0 ЗОмкл забуференого Нерев фізіологічного розчину, рН 7,4. Суміш інкубували при 372С протягом 1 дня і вивільнення вільного доксорубіцину оцінювали шляхом наведеного вище аналізу за допомогою РХВД. Площі під кожним піком оцінювали кількісно за допомогою вищезазначеного програмного забезпечення, при цьому вихідне значення приймали за 10095. Швидкість вивільнення вільного доксорубіцину оцінювали за появою піка з таким самим часом утримування, як і у вільного доксорубіцину в розглянутих умовах для РХВД. Величини площ під 75 Кожним піком використовували для обчислювання відношення кількості вільного доксорубіцину до кількості кон'югата доксорубіцин-пептид. Інтегрування площ піків для визначення відсотка розщеплення здійснювали за допомогою зазначеного вище програмного забезпечення для хроматографії типу МіПеппішт 2010. Як видно на хроматограмах для 2ОР-Бох (М-Ср2-О1Іу-Рго-доксорубіцин), наведених на Фіг.1, кон'югат доксорубіцин-пептид може бути перетворений на вільний доксорубіцин по завершенні інкубації з очищеним злитим протеїном
ЕАРТСОЗ5, але час утримування кон'югата не змінювався в результаті інкубації з буфером.
Приклад 6: Зменшення цитотоксичності доксорубіцину шляхом кон'югації з пептидами, які можуть розщеплюватися за допомогою БАР.
Визначали здатність пептидів, що можуть розщеплюватися за допомогою РАРо, блокувати цитотоксичну дію доксорубіцину щодо ЕАРо-негативних чутливих до доксорубіцину клітин. Клітини лінії К5б2, які можна Ге отримати від Американської колекції типових культур, Роквілл, штат Меріленд, США (АТСС-номер: ССІ -243), о висівали в 9б-лункові планшети (фірма Огеїпег Зсіепійіс) із щільністю 100Оклітин/лунку. До клітин додавали безсироваткове середовище для культури клітин, яке містить різні концентрації вільного доксорубіцину або еквівалентні молярні концентрації кон'югатів доксорубіцин-пептид.
Через 4 дні визначали кількість клітин з використанням автоматичного лічильника клітин типу САЗУтм (фірма 0
Зспапе Зувіет СтрьнН, Реутлінген, Німеччина). Результати наведено на Фіг.2. о
Приклад 7: Вивільнення вільного доксорубіцину за допомогою зв'язаного з клітинами ЕАРо.
Досліджували здатність зв'язаного з клітинами ферменту БАР у вивільняти вільний доксорубіцин з юю кон'югатів доксорубіцин-пептид. Кожен кон'югат розчиняли в безсироватковому середовищі для культури клітин со до кінцевої концентрації їмкМ. їОмл цього розчину додавали до конфлуентних моношарів клітин лінії НТ1080 39 або клону ЗЗ лінії НТ1080, які знаходяться в планшетах для культури тканини діаметром 1Осм, і витримували в протягом 19год. при 372. Середовище видаляли і вивільнення доксорубіцину оцінювали згідно з методом, описаним у прикладі 5. Лінія клітин, що експресують БАР, тобто клон НТ1080 33, перетворювала на вільний доксорубіцин 8190 і 4390 кон'югатів 2ОР-БбОХ (М-СЬ2-Огу-Рго-доксорубіцин) і 2РАСР-ВБох « (М-СЬ2-Рго-АІа-Сту-Рго-доксорубіцин) відповідно. Батьківська лінія клітин НТ1О080 у таких самих умовах 70 перетворювала на вільний доксорубіцин тільки 995 20Р-ЮБох. У цих же умовах батьківська лінія. НТ1080 н- с перетворювала на вільний доксорубіцин лише незначну кількість 2-РАСР-Бох, або цю кількість не можна було :з» виявити.
Приклад 8: Знищення чутливих клітин доксорубіцином, який вивільняється за допомогою ЕАР о,
Оцінювали здатність ЕАРо утворювати вільний доксорубіцин, що має здатність знищувати чутливі до -1 що доксорубіцину клітини. Клітини лінії К562, які можна отримати від Американської колекції типових культур,
Роквілл, штат Меріленд, США (АТСС-номер: ССІ-243), висівали на 9б-лункові планшети (фирма Огеїіпег (95) Зсіепіййс) із густиною 100Оклітин/лунку. Безсироваткове середовище, що містить мкМ кон'югата сл доксорубіцин-пептид, додавали до клітин лінії НТ1080 або клону 33 лінії НТ1080, які знаходяться в планшетах для культури тканини діаметром 1Осм, і витримували протягом 19год. при 37 «С. Середовище видаляли і о вивільнення доксорубіцину оцінювали згідно з методом, описаним у прикладі 5. Потім ббмкл цього середовища
Ф додавали в кожну лунку до клітин лінії К5б2. Через 4 дні визначали кількість клітин з використанням автоматичного лічильника клітин типу САБУ тм, Результати наведено на Фіг.3.
Приклад 9: Стабільність кон'югатів доксорубіцин-пептиду плазмі 5Б Стабільність кон'югатів доксорубіцин-пептид у плазмі оцінювали за допомогою методів, описаних у прикладі 5. Зразки, що містять кон'югати доксорубіцин-пептид (у концентрації їмкМ) інкубували в присутності 10о6.95 (Ф) мишачої або людської плазми при 372С протягом зазначених періодів часу. Результати для 7ОР-бох і ка 7РАСР-Бох по завершенні інкубації в мишачій або людській плазмі наведено на Фіг.4.
Приклад 10: Каталізоване РГАРо, розщеплення певних кон'югатів 4-метокси-р-нафтиламід-пептид во Для виявлення бажаних для ЕАР у пептидних субстратів синтезували олігомери, які складаються з таких, що зустрічаються в природних умовах і/або не зустрічаються в природних умовах амінокарбонових кислот, і піддавали їх сполученню з пролін-4-метокси-д-нафталінаміном (Рго-ММА) з використанням методів, відомих у даній галузі (Е. М/йпзсй, Зупіпйезе моп Реріїдеп, у Меїйодеп дег огдапізснеп Спетіє, Ноиреп-УУеу! (ред-ри Е.
МиПег, 0. Вауег), том ХУ, частини 1 і 2, вид-во бСеогуд Тпіете, Штутгарт, 1974). бБ Синтез Рго-Рго-4-метокси-р-нафтиламіду:
Вос-Рго (32мг, 0,15ммоля), тетрафторборат 2-(1Н-бензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуронію (5Змг,
О,15ммоля) і гідрохлорид Рго-4-метокси- Д-нафтиламіду (4бмг, 0,15ммоля) розчиняли в суміші безводний
М,М-диметилформамід/тетрагідрофуран 1:1 (4мл). Додавали М-етилдізопропіламин (0,2бмл, 0,44ммоля), розчинений у М-метилпіролідоні (1,7мол.) і суміш перемішували протягом ночі при кімнатній температурі.
Розчинник видаляли за допомогою роторного випарника і залишок розчиняли в етилацетаті (1Омл) і тричі екстрагували водою. Органічний шар сушили над безводним Ма»ЗО, і розчинник видаляли за допомогою роторного випарника. Залишок розчиняли в суміші трифтороцтова кислота/дихлорметан (1:4, 25мл) і давали прореагувати протягом год. Розчинник видаляли за допомогою роторного випарника й отриману олію сушили в потоці азоту. Неочищений продукт очищували за допомогою препаративної РХВД зі зверненою фазою з 7/0 використанням градієнта ацетонітрилу/води. Продукт мав задовільні аналітичні характеристики (ЯМР і -мас-спектри).
Потім за допомогою флуориметра типу Суоїйсног (фірма Регзеріїме Віозувіетв, Іпс.) оцінювали вивільнення вільного ММА з пептидів, використовуючи набір фільтрів для довжини хвилі збудження З55нм/довжини хвилі випущення 405нм. Кінетичні параметри ферменту (значення константи Міхаеліса-Ментен К т і Коса) 75 розраховували за допомогою методів, відомих у даній галузі |див., наприклад, Мип, 5.Ї. і ЗцеМег, С.Н.. А вітріе теїйподй їог саісціацйпуд Кт апа М їот а віпдіе еплуте геасіоп ргодгезв сигме. Віоспіт. Віорпувз. Асіа 480(1), 1-13 (1977)), для ферменту ЕАР о, виділеного з екстрактів мембран трансфектованих 293-1/2-клітин, описаних у прикладі 2. мів 1хмюім'єт сч убюМмА 69001024 о
Ф зо о в не зв т «
Приклад 11: Специфічність ММА-зв'язаних пептидів щодо ГАРу, у порівнянні з ОРР-ЇМ - с Серед відомих представників сімейства серинолігопептидаз, які мають специфічність щодо пролілу, "» найближчим до ЕАРо ферментом є ОРР-ІМ. Оскільки активний ОРР-ІМ виявлено у плазмі та у багатьох різних " типах клітин, то потрібна оптимізація відносної (необов'язково) вибірковості пептидних проліків для БАР с У порівнянні з ОРР-ІМ для того, щоб зменшити небажане перетворення проліків в ділянках, відмінних від пухлини (наприклад, у плазмі). Для виявлення пептидів, що мають специфічність щодо БАР о, здатність ЕАРо, і розщеплювати ММА-зв'язані пептиди порівнювали зі здатністю ЮОРР-ЇМ розщеплювати ті ж самі пептидні оз кон'югати. Вивільнення вільного ММА оцінювали згідно з методом, описаним у прикладі 9. Результати наведено в таблиці 2. 1 о» є ин нн 11111 оРРМ теурюмя 111 о ттедасутюм 00101031 ю 60
Приклад 12: Активність ЕАРо, у зразках пухлини
Ферментативну активність ГЕАРа вимірювали в зразках пухлини людини. 9б-лункові планшети для ЕГІЗА (твердофазний імуноферментний аналіз) (фірма Созіаг, Корнінг, штат Нью-Джерсі) сенсибілізували протягом ночі при 49С з використанням мкг/мл антитіла Е19 або контрольного антитіла в забуференому фосфатом бо фізіологічному розчині (ЗФР), рН 7,4. Потім лунки промивали буфером для відмивання (ЗФР, 0,195 Тм"єеп 20, рн
7,4) і надлишок сайтів зв'язування блокували протягом год. при кімнатній температурі блокувальним буфером (596 бичачий сироватковий альбумін у ЗФР, рН 7,4). Вимірювали активність РГАРу у пухлинній тканині (зафарбовані символи) або у відповідній нормальній контрольній тканині (відповідні незафарбовані символи) з екстрактів мембран, збагачених конкаваліном А (Фіг.5а). Зразки пухлин включали рак молочної залози (Н,9), ободової кишки (г), метастази пухлини ободової кишки в печінку (є) і рак легені (си). Екстракти вносили на сенсибілізовані за допомогою Е19 планшети та інкубували протягом год. при кімнатній температурі. Незв'язаний продукт видаляли, лунки тричі промивали буфером для відмивання і ферментативну активність БАР «с аналізували протягом год. при 372 з використанням 10Омкл АїІа-Рго-АЕС згідно з методом, описаним у УУО 70 97/34927. Для кожного екстракту оцінювали перші дві конкавалін А-фракції і результати кожного вимірювання окремо наносили на графік. Від кожного значення віднімали фонову флуоресценцію (вимірену для планшетів, сенсибілізованих за допомогою контрольного антитіла).
Незалежні біохімічні дані про ферментативну активність ГАРо, і його середню молекулярну масу в екстрактах пухлинних тканин одержували шляхом мічення вищевказаних екстрактів тканини з 75 використанням ""С-діїізопропілфторфосфату (ОРР; фірма МЕМ-ОиРопі, Соіодпе, Німеччина). Відомо, що ОРР ковалентно і необоротно зв'язується з активними сайтами серину багатьох серинпротеаз, перешкоджаючи тим самим подальшому каталізу (Науавзні
К., Ваї У. і Найа Т., Ригйег сопіїгтаййоп ої сагрохурерідазе М аз а теїй(аІ-їгтее епгуте Ппаміпд а геасіїме зегіпе гевідце. 9). Віоспет. 77(6), 1313-1318 (1975); МУапібу 5. і Еподвігот |., 5ійаіїевз оп Зігеріотусев агізеив ргоїєаве. І. Те атіпо асій взедцепсе агоцпа (Ше геасіїме вегіпе гезвідце ої ОБР -вепейіме сотропепів мій евіегазе асіїмну. Віоспіт. Віорпуз. Асіа 151(2), 402-408 (1968)). Результати мічення з використанням ""С-ОЕР
ЕАРо, виділеного за допомогою імунопреципітації з пухлини (Т), яка відповідає зразку пухлини ободової кишки, позначеному символом є на Фіг.5. Аналіз за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію (І аеттії ОО. К., Сівгамаде ої вігисішга! ргоїеіпз ацгіпуд (бе аззетбіу ої те с йеай ої расіепіорпаде Т4. Мате 227(259), 680-685 (1970))| і наступної авторадіографії (Рак 9.Е., Огарег о
К.К. Її Вгом/п МУ.)., Віозупіпевзів ої Іузозота! еплутевз іп сеїЇїв ої Ше Епаз сотріетепіайоп дгоцр сопайіопаїу дегесіме іп епдозотаї! асідійсаєноп. Зотайййс Се Мої. Сепеї. 17(2), 137-150 (1991)|) цих зразків дозволив виявити присутність міченого протеїну з молекулярною масою 95КДА в зразку ракової тканини ободової кишки. Ні «со зр для відповідного контрольного зразка, отриманого імунопреципітацією (М), ні для контрольного антитіла не було виявлено смуг, що несуть радіоактивну мітку. Величина середньої молекулярної маси міченого за о допомогою С протеїну, отриманого шляхом імунопреципітації, яку наведено на Фіг.5, погоджується з ю опублікованими раніше даними для ЕБАР у |Кейід МУУ.9., Зи 5.Ї., Бопйцпайо 5.К., Зсапіап М.)., Мойпап Каї
В.К.,, Сагіп-Снпеза Р., Неаву -.Н. ії сСіа ї1330., Ріргоріазі асіїмайоп ргоївіп: Ригіїісайоп, ерйоре тарріпд і. зв апа іпдисбоп Бу дгоулй Тасіогв. Іпі. У. Сапсег 58(3), 385-392 (1994); МО 97/34927). ї-
Приклад 13: Одержання захищених олігопептидів
Захищені олігопептиди одержували або в розчині згідно з протоколами, відомими з існуючого рівня техніки
Їдив., наприклад, у М. Водапз2Ку і А. Водапза2аКу, "Те ргасіїсе ої Реріїде Зупіпевзів", 2-е вид., вид-во
Зргіпдег, Нью-Йорк, 1994)Ї), або за допомогою твердофазного синтезу з використанням автоматичного « синтезатора пептидів типу Арріїгеа Віозувіетв модель 430А. Видалення захисних груп і відділення оліопептиду й) с від смоляної підкладки здійснювали шляхом оброблення сумішами трифтороцтової кислоти і широко й використовуваних акцепторних домішок. Очищування здійснювали за допомогою рідинної хроматографії «» високого тиску зі зверненою фазою на колонках типу С18 на силікагелі з використанням градієнта 0,195-вого водного розчину трифтороцтової кислоти/ацетонітрилу. Ідентичність і гомогенність пептидів підтверджували за допомогою рідинної хроматографії високого тиску і мас-спектрометричного аналізу. Олігопептиди, отримані -І таким методом, наведено в таблиці 3.
Таблиця З о Олігопептиди с 2-ОСіІу-Рго-ОН 2-Рго-АІа-СІу-Рго-ОН о Етос-Рго-АІа-СІу-Рго-ОН
Ф Етос-Спд-Рго-ОН
Етос-Міе-Рго-ОН
Етос-Нуп-Рго-ОН
Етос-Рго-Рго-ОН
Етос-5ег-АІа-Нуп-Рго-ОН іФ) Етос-5ег-АІа-Міе-Рго-ОН ко Етос-Зег-АІа-Спд-Рго-ОН
Сіу-Зег-АІа-С|ІШ-Рго-ОН во сіу-сіу-Зег-АІа-СіШ-Рго-ОН
СІу-Сіу-СІу-Зег-АІа-СІШ-Рго-ОН
Зег-СІц-Авп-Аго-І уз-МаІ-Рго-ОН сІу-Туг-Зег-Ага-МесРго-ОН
СіІп-СІу-Туг-Зег-Ага-МесРго-ОН 65 Сіу-Сіу-С1у-Ттр-Рго-ОН
Азп-Ага-І уз-МаІ-Рго-ОН
СіІц-Авп-Аго-Ї уз-МаІ-Рго-ОН
Зег-СІц-Авп-Аго-І уз-МаІ-Рго-ОН
АІа-Ніз-Ме-Нів-Рго-ОН
Туг-АІа-Рпе-Ніз-Рго-ОН
Зег-Туг-АІа-Рпе-Ніз-Рго-ОН
Ї ен-Авп-І еи-Туг-МесРго-ОН
Сіу-Зег-АІа-С|ІШ-Рго-ОН
Сіу-Сіу-Зег-АІа-СІШ-Рго-ОН 70 СІу-Сіу-СІу-Зег-АІа-СІШ-Рго-ОН 7 означає бензилоксикарбоніл
Етос означає 9-флуоренілметоксикарбоніл
Спа означає І -циклогексилгліцил
Міе означає І -норлейциніл
Нуп означає І -6-гідроксинорлейциніл
Приклад 14: Одержання Етос-Рго-АІа-СІу-Рго-бох
Етос-Рго-АІа-СІу-Рго-ОН (44мг, 0,078ммоля) розчиняли в безводному М,М-диметилформаміді (1Омл) і значення рН доводили до 7,5 за допомогою М,М-діззопропілетиламіна. Додавали М-гідроксисукцинімід (ІМ в ТГФ, 7вмкл, 0,078ммоля) і суміш охолоджували в крижаній бані. Додавали при перемішуванні дициклогексилкарбодіїмід (ІМ в ДМФ, 87мкл, 0,087ммоля) і розчин перемішували протягом год. при 02С.
Доксорубіцин. НСІ (25мг, 0,04Зммоля) розчиняли в 20мл безводного ДМФ і додавали М,М-діїізопропілетиламін (8,2мкл, 0,04вммоля). Цю суміш за допомогою шприца додавали до активованого пептиду. Реакційній суміші давали нагрітися до кімнатної температури і перемішували її протягом 48год.
Потім розчинник видаляли і продукт очищували за допомогою препаративної ОФ-РХВД на колонках типу СІВ, су використовуючи градієнт води/ацетонітрилу з додаванням 0,195-вої трифтороцтової кислоти. о
Вихід за даними аналітичної РХВД 29095; Е5-МС 1110,5 ((М--Ма|"); 6744.
Приклад 15: Одержання Н-Рго-АІа-СІу-Рго-Юбох
Етос-РАСР-бох (отриманий у прикладі 14, 44мг, 0,040ммоля) розчиняли в суміші ТГФ/діетиламін (2:11, 20мл) при 02С і перемішували протягом 2год. Розчинник видаляли і продукт очищували за допомогою препаративної (Се)
ОФ-РХВД на колонках типу С18, використовуючи градієнт води/ацетонітрилу з додаванням 0,1905-вої о трифтороцтової кислоти.
Вихід за даними аналітичної РХВД 29095; Е5-МС 866,6 МАНІ", 452,4. Щео,
Приклад 16 Одержання Н-Спо-Рго-Юох со
Етос-Спд-Рго-ОН (4бмг, 0,09бммоля) розчиняли в безводному М,М-диметилформаміді (1Омл) і значення рн
Зо доводили до 7,5 за допомогою М,М-діізопропілетиламіну. Додавали М-гідроксисукцинімід (ЛІМ в ДМФ, 9бмкл, в. 0,09бммоля) і суміш охолоджували в крижаній бані. Додавали при перемішуванні дициклогексилкарбодіїмід (1М в ДМФ, 107мкл, 0,107ммоля) і розчин перемішували протягом год. при 026.
Доксорубіцин.НС1 (З1мг, О0,05Зммоля) розчиняли в 20мл безводного ДМФ і додавали М,М-діїзопропілетиламін « (1Омкл, О,059ммоля). Цю суміш за допомогою шприца додавали до активованого пептиду. Реакційній суміші - 70 давали нагрітися до кімнатної температури і перемішували її протягом 48год. с Потім розчинник видаляли і продукт очищували за допомогою препаративної ОФ-РХВД на колонках типу С18, "з використовуючи градієнт води/ацетонітрилу з додаванням 0,195-вої трифтороцтової кислоти.
Ліофілізований продукт розчиняли в суміші ТГФ/діетиламін (2:11, 20мл) при 02С і перемішували протягом 2год.
Розчинник видаляли і продукт очищували за допомогою препаративної ОФ-РХВД на колонках типу С18, -1 395 використовуючи градієнт води/ацетонітрилу з додаванням 0,195-вої трифтороцтової кислоти.
Вихід за даними аналітичної РХВД 29095; Е5-МС 780,2 (МАНІ); 366,4. (95) У наведеній нижче таблиці зазначено кон'югати пептид-доксорубіцин, які одержували аналогічним методом, а сл також дані про розщеплення за допомогою ЕАР (через 20год.). о ії у 5-5 ря ї оно у 9 Ф, о о То но у, он о мо о том 60 он б5
Н-Рго-АїІа-СІу- прибл. 1195
! ! ! ! в 7 означає бензилоксикарбоніл, ЕРтос означає 9-флуоренілметоксикарбоніл, Спд означає І-циклогексилгліцил, Міе означає І-норлейциніл, Нуп
Приклад 17 Одержання М-СЬ2-С1у-Рго-мелфалану 8) 70 ХЛ 18) 6)
СУА вав й о он жене),
М-Ср2-С1у-Рго-ОН (22мг, 0,072ммоля) розчиняли в безводному М,М-диметилформаміді (8мл) і значення рн доводили до 7,5 за допомогою М,М-дізопропілетиламіну. Додавали М-гідроксисукцинімід (М в ДМФ, 72мкл, 0,072ммоля) і суміш охолоджували в крижаній бані. Додавали при перемішуванні дициклогексилкарбодіїмід (1М в ДМФ, б7мкл, 0,67ммоля) і розчин перемішували при 02С протягом 2год.
Мелфалан (14,7мг, 0,04вммоля) розчиняли в ЗОмл безводного ДМФ і додавали М,М-дізопропілетиламін (12,Змкл, 0,072ммоля). Цю суміш за допомогою шприца додавали до активованого пептиду. Реакційної суміші давали нагрітися до кімнатної температури і перемішували її протягом 24год.
Розчинник видаляли і продукт очищували за допомогою препаративної ОФ-РХВД на колонках типу С18, використовуючи градієнт води/ацетонітрилу з додаванням 0,195-вої трифтороцтової кислоти. сч
Вихід за даними аналітичної РХВД 29095; Е5-МС 593,0 ((М'-НІ. (8) (Се) «в)
Іо) со і - - с . и? -І (95) 1 о 50 42)
Ф) іме) 60 б5 ох
ФІГ 1 а т; 2 Оіу-Рго-Пох «СОЗБАР з шк ї тк, -
Ек я їх (Є пл - Жили сч о як
Ге) ки: 2-Фіу-Рго-бох | о 7 буфер Ї во ж я. ' с
І їч- й. їй « е Кхй на 7 - с
І» !
Кон'югат -І с с о 50
Ф
Ф) т бо 65
ФІГ.2 ш ррох 70 ба з 70Р-0ХХх 5 а ТБ ЮХ р
ШРАСР-Вох г чі т» ХОСР-Вох
З 304 5 20
Б я за
В сч ха о Доксорубшин о 0 ва 1
Еквивалентні мкм як о
ФІГ. 3 ю со їч-
ФРАСР « 40 ' | - с х ;» е -І щі Е щи! СЕ і я с 5 РАС о в
В 16
Ф
З ОР о ( ке Ї пови паяння Ї, ння пан пін зни няння батьківський клон 33 бо
НТІОВО ЕАР? 65
ФІГ. 4
Й Плазма людини и, во -ж ТОРрох
Е о - гРАСВРАВЬХ »ь во во во
Н аг о б 30 - 29 70 , ле. з пі ИЙ и | 2
Дні сч о
Плазма людини з 106 щі ри о : в ще че е- Бо ша
В дв а « ь с 40 ще й - з» "ї " 1 18 0 1 2 - Дн (95) 1 о 50 4)
Ф) ко бо 65
ФІГ. 5
А со тобою о в во «г, : БООЮ й 70 - я зобою . «ЗЕ 20000 ч? «Ж
Е ат, в опой т в в те шЖоо сто е
Зразки Нормальні сч пухлини тканини

Claims (1)

  1. Формула винаходу о о
    1. Сполука формули (1) ю по М сує 7 ве М (о ї- вв або її фармацевтично прийнятна сіль, де « В" означає фрагмент формули С9-А, Со-В-А або Са-(0)т-В-А, де - т0 Сд означає атом водню або блокувальну групу, вибрану з ряду, що включає БК 2-СО, К5-0-СО-, Кр-МН-СО-, с 25-805- або КУ, де :з» В? означає необов'язково заміщену С 4-Свалкільну, Сз-Свциклоалкільну, арильну, аралкільну або гетероарильну групу; А є похідним І-проліну, гліцину, І-норлейцину, І-циклогексилгліцину, І1-5-гідроксинорлейцину, -І ІЇ-6-гідроксинорлейцину, І -5-гідроксилізину, І -аргініну або І -лізину; і В ї О кожен незалежно один від одного означає фрагменти, які є похідними амінокарбонових кислот формули о -Іме9-(Х)р-СОЇ., де Х означає СЕР, ії де Я, Кк" ї КУ кожен незалежно один від одного означає атом водню, «сл необов'язково заміщений С -Свалкільною, Сз-Свациклоалкільною, арильною або гетероарильною групою, і р 5ор означає 1, 2, З, 4, 5; або о В їі О кожен незалежно один від одного означає фрагменти, які є похідними циклічних амінокарбонових кислот Ф формули
    9. вх нн що хо) М--С / со- 60 де 2? означає С.-Свалкіл, ОН або МН», т означає ціле число від 1 до 10; д означає 0, 1 або 2; і 65 гозначає 0, 1 або 2; Ве і 2? разом із проміжною М-С-групою утворюють необов'язково заміщене, необов'язково сконденсоване з бензо- або циклогексаногрупою 3-7--ленне насичене або ненасичене гетероциклічне кільце, у якому одна або дві СНо-групи також можуть бути заміщені МН, О або 5, В" означає Н, С.-Свалкіл, Сз-Свциклоалкіл, арил або гетероарил; і Суєг означає фрагмент цитотоксичної або цитостатичної сполуки.
    2. Сполука формули (І) за п. 1, де гетероциклічне кільце, утворене БУ, Б? і проміжною М-С-групою, є заміщеним вів, при цьому 22 і З кожен незалежно один від одного означає атом водню або атом галогену, або С.-Свалкіл, С--Свалкіламіно, ді-С--Свалкіламіно, Сі-Свалкокси, тіол, С.і-Свалкілтіо, оксо, іміно, форміл,
    С.-Свалкоксикарбоніл, амінокарбоніл, Сз-Свациклоалкіл, арил або гетероарил.
    3. Сполука за п. 1 або 2, де В! означає групу, вибрану з формул (21), (22) і (34): Са-сіу (21) Са-Ме ,(22) Са-(Хаа)т-Хаа-СІу о, (34) де СЯ означає атом водню або блокувальну групу, вибрану з ряду, який містить бензоїлоксикарбоніл, 72 фенілацетил, фенілметилсульфоніл і бензиламінокарбоніл; Хаа означає фрагмент, одержаний із амінокарбонової кислоти; і т означає ціле число від 1 до 6.
    4. Сполука за п. З, де фрагменти аміноалканової кислоти знаходяться в (І )-конфігурації.
    5. Сполука за будь-яким із пп. 1-4, де НоМ-Сує означає антрациклінове похідне.
    6. Сполука за п. 5, вибрана зі сполук формул (ША), (ПІВ), (ПЕ) ії (ПР): о он о , он От с ІТН » омео оно (о) недте ША си Щі Ф М щоб «в) 8) М що б. о ів) о он о , со до ї- "он сн СИМ С он а « Ме її ю ле з н с о МН СщЕЯ п » Ків) Н ІК п М Си «о о й) - око (95) о оо он о ! о 50 ОН с Се ІН Ома о он о не?
    Н.М ШЕ (Ф, ? но (те) чн іме) Н М М бо Н МН ай ут б5
    С Он г ОН чес ОМе й Он о й Ме Га но ШЕ)
    НО... СИ, Ск М о Су
    7. Сполука за будь-яким із попередніх пунктів, призначена для застосування в медицині.
    8. Сполука формули (ІА) 1 о р ІА) м-сує ( тс ій іа й см т. Кк (8) де В", В, 23, В", Сук мають значення, зазначені вп. 1, і Х-Ж означає СНЕ?-СНо, СВЕ?-СН, МН-СН»о, СНо-МН, -СВ2-, СНо-АСНВ2-СН». 9, Сполука за п. 8, де В! означає групу, вибрану з формул (21), (22) і (34): «со Са-сіу (21) Са-Ме ,(22) | «в) Са-(Хаа)т-Хаа-СІу о, (34) ю де СЯ означає атом водню або блокувальну групу, вибрану з ряду, який містить бензоїлоксикарбоніл, фенілацетил, фенілметилсульфоніл і бензиламінокарбоніл; (зе) Хаа означає фрагмент, одержаний із амінокарбонової кислоти; і їч- т означає ціле число від 1 до 6.
    10. Сполука за п. 9, де фрагменти аміноалканової кислоти знаходяться в (І )-конфігурації.
    11. Сполука за будь-яким із пп. 8-10, де НоМ-Суї означає антрациклінове похідне.
    12. Сполука за п. 11, вибрана зі сполук формул (ША), (ПІВ), (ШЕ) ї (ШЕ): « 20 о он 6) ; -о с он и? ІСТН ОоМе о он о - не дте ША о ся (ША) М ій 50 С М. А о те Ф о Ф) іме) 60 б5 а он о , он чес з 7 Ома 0 оно но (А чи о й й 07-Х КА, ке А й а о
    . а сн а ; ОН » Се Омео он а" Ме га нм но (НЕ) с 7 й о Н М -е «ло о МН а (Се) ва ща о ІС) І со ій) Он че м ОН чес ген « ОМе й он о ші с Ме Га ч но а Н М
    НО... СИ, о й ре од 1 ав | 20 13. Сполука за будь-яким із пп. 8-12, призначена для застосування в медицині. Ф 14. Сполука формули (ІА1) в г) '
    1
    М.Х (9) ' ГФ) 7 ко дев'ї Суг мають значення, зазначені в п. 1.
    15. Сполука за п. 14, де В! означає групу, вибрану з формул (21), (22) і (34): 60 Са-сіу (21) Са-Ме ,(22) Са-(Хаа)т-Хаа-СІу , (34) де СЯ означає атом водню або блокувальну групу, вибрану з ряду, який містить бензоїлоксикарбоніл, фенілацетил, фенілметилсульфоніл і бензиламінокарбоніл; 65 Хаа означає фрагмент, одержаний із амінокарбонової кислоти; і т означає ціле число від 1 до 6.
    16. Сполука за п. 15, де фрагменти аміноалканової кислоти знаходяться в (І )-конфігурації.
    17. Сполука за будь-яким із пп. 14-16, де НаМ-Сує означає антрациклінове похідне.
    18. Сполука за п. 17, вибрана зі сполук формул (ША), (ПІВ), (ШЕ) ї (ШЕ): о он 9) , Он С ен СН оМе о он о ето, ША, си ще М й С М. шанси о а он о , он чес сн СИМ С он а с ший (о) н о чн (БУ Кк цН м М (Се) Й Си о р еш їй С ї со
    35 . о ОН а , ч- ОН ово; Я « Ома о он о й ші с Ме га нм іп) "з но п чн ї у «А, о н їв. МН а (95) оо 1 о 50 42) Ф) іме) 60 б5
    С Он г ОН чес ОМе й Он о й но й се ме)
    НО... Н СИ, Ї М Н о Су
    19. Сполука за будь-яким із пп. 14-18, призначена для застосування в медицині.
    20. Сполука, вибрана зі сполук формул (ІА2), (ІАЗ), (ІА4) та (ІАБ): "т Маси (Аг) ч- й с о о А ху буся (дз) Н Ка | Ф 7 о о вв ни (ла) їй ї н ї со в о і - во | - с | щу : з» ЧЕ мя (А) в Го; -і | и В бр (дз) Н
    М . 1 ' (в) о К Ж си Ф та бай пла) Я н ій іо)
    Кк. г 60 б5 в о , і Я МИХ риси (А) -н д-у- вн 0 і о ну буси (дз) . Н 170 М ї нн 29 м. риси (да) С і 1 о мо Ж оси иОтниси (АБ) А Н п 0 ' і :
    М. ися (Аг) я сі о о А ху буся (Аз) хі й . і-й в" о | «в) і ОЇ м. риси (Аа) ю г; Н Гео) і - 7 о мо осу иОтМии (АБ) г Н « що | ші с де Кі Сує мають значення, зазначені в п. 1. . 21. Сполука за п. 20, де В! означає групу, вибрану з формул (21), (22) і (34): "» Саву (21) Са-Ме ,(22) Са-(Хаа)т-Хаа-СІу о, (34) -І де СЯ означає атом водню або блокувальну групу, вибрану з ряду, який містить бензоїлоксикарбоніл, фенілацетил, фенілметилсульфоніл і бензиламінокарбоніл; о Хаа означає фрагмент, одержаний із амінокарбонової кислоти; і с т означає ціле число від 1 до 6.
    22. Сполука за п. 21, де фрагменти аміноалканової кислоти знаходяться в (І )-конфігурації. о 23. Сполука за будь-яким із пп. 20-22, де НоМ-Суї означає антрациклінове похідне. Ф 24. Сполука за п. 23, вибрана зі сполук формул (ША), (ПІВ), (ШЕ) ї (ПР): о он о) , он Ф) чн ОоМе 0 он о іме) нте 60 НО нн (ПА)
    С. я Ї о М й «Уло (8) о б5 а он о , он че; з 7 Ома 0 оно но (А чи т Н й 07-Х КА, ке А Й а о Гі, сн а ; ОН » Се Омео он а" Ме га нм не (НЕ) с 7 й 6) Н М -е «го о МН а (Се) ут о ІС) І со ій) Он че м ОН чес ген « ОМе й он о то Ме Га - с ч но а Н М
    НО... 15 ан що В рем од 1 ав | 20 25. Сполука за будь-яким із пп. 20-24, призначена для застосування в медицині.
    26. Фармацевтична композиція, яка містить сполуку за будь-яким із пп. 1-6, 8-12, 14-18 та 20-24 і, с необов'язково, один або декілька фармацевтично прийнятних ексципієнтів.
    27. Спосіб лікування раку, який передбачає введення пацієнту фармацевтичної композиції за п. 26. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних ГФ) мікросхем", 2005, М 8, 15.08.2005. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і кю науки України. 60 б5
UA2001128659A 1999-05-14 2000-11-05 Antitumour compounds activated by fibroplasts activation proteins (fap) UA73506C2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13413699P 1999-05-14 1999-05-14
PCT/EP2000/004261 WO2000071571A2 (en) 1999-05-14 2000-05-11 Fap-activated anti-tumor compounds

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA73506C2 true UA73506C2 (en) 2005-08-15

Family

ID=22461925

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA2001128659A UA73506C2 (en) 1999-05-14 2000-11-05 Antitumour compounds activated by fibroplasts activation proteins (fap)

Country Status (28)

Country Link
US (1) US6613879B1 (uk)
EP (1) EP1180116A2 (uk)
JP (1) JP3607201B2 (uk)
KR (1) KR20020030270A (uk)
CN (1) CN1213058C (uk)
AR (1) AR033792A1 (uk)
AU (1) AU777521B2 (uk)
BG (1) BG106096A (uk)
BR (1) BR0010564A (uk)
CA (1) CA2369933A1 (uk)
CO (1) CO5170516A1 (uk)
CZ (1) CZ20014097A3 (uk)
EA (1) EA005204B1 (uk)
EE (1) EE200100600A (uk)
HK (1) HK1048642B (uk)
HU (1) HUP0202367A3 (uk)
IL (1) IL145798A0 (uk)
MX (1) MXPA01011401A (uk)
MY (1) MY125939A (uk)
NO (1) NO20015536L (uk)
NZ (1) NZ516075A (uk)
PL (1) PL351680A1 (uk)
SK (1) SK16452001A3 (uk)
TW (1) TWI248444B (uk)
UA (1) UA73506C2 (uk)
WO (1) WO2000071571A2 (uk)
YU (1) YU80901A (uk)
ZA (1) ZA200109151B (uk)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUP0300590A2 (hu) 2000-03-15 2003-07-28 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Peptidázzal hasítható, célzott antineoplasztikus szerek és terápiás alkalmazásuk
GB0027552D0 (en) * 2000-11-10 2000-12-27 Boehringer Ingelheim Pharma Anti-tumor compounds
GB0027551D0 (en) * 2000-11-10 2000-12-27 Boehringer Ingelheim Pharma Anti-tumor compounds
EP1399467A4 (en) * 2001-05-09 2004-09-15 Newbiotics Inc PRODRUGS ACTIVATED BY PEPTIDDEFORMYLASE
US7091186B2 (en) * 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
US20030211979A1 (en) * 2002-01-30 2003-11-13 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg FAP-activated anti-tumor compounds
EP1333033A1 (en) * 2002-01-30 2003-08-06 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG FAP-activated anti-tumor compounds
AU2003225047A1 (en) * 2002-04-18 2003-11-03 Celmed Oncology (Usa), Inc. Peptide deformylase activated prodrugs
WO2003094972A2 (en) * 2002-05-10 2003-11-20 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co Kg Fap-activated anti-tumor prodrugs
US20040033957A1 (en) * 2002-05-10 2004-02-19 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg FAP-activated anti-tumor prodrugs
US20040001801A1 (en) * 2002-05-23 2004-01-01 Corvas International, Inc. Conjugates activated by cell surface proteases and therapeutic uses thereof
JP2006514009A (ja) * 2002-11-14 2006-04-27 セルメド オンコロジー （ユーエスエイ）， インコーポレイテッド ペプチドデホルミラーゼ活性化プロドラッグ
GB0310593D0 (en) * 2003-05-08 2003-06-11 Leuven K U Res & Dev Peptidic prodrugs
EP1625122A1 (en) 2003-05-14 2006-02-15 Takeda San Diego, Inc. Dipeptidyl peptidase inhibitors
US7169926B1 (en) 2003-08-13 2007-01-30 Takeda Pharmaceutical Company Limited Dipeptidyl peptidase inhibitors
US7678909B1 (en) 2003-08-13 2010-03-16 Takeda Pharmaceutical Company Limited Dipeptidyl peptidase inhibitors
US7732446B1 (en) 2004-03-11 2010-06-08 Takeda Pharmaceutical Company Limited Dipeptidyl peptidase inhibitors
WO2005118555A1 (en) 2004-06-04 2005-12-15 Takeda Pharmaceutical Company Limited Dipeptidyl peptidase inhibitors
WO2006019965A2 (en) 2004-07-16 2006-02-23 Takeda San Diego, Inc. Dipeptidyl peptidase inhibitors
WO2006073167A1 (ja) * 2005-01-07 2006-07-13 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. ピロリジン誘導体
EP1943257A2 (en) 2005-05-19 2008-07-16 Genentech, Inc. Fibroblast activation protein inhibitor compounds and methods
US8067248B2 (en) * 2005-12-14 2011-11-29 Luwig Institute for Cancer Research Method for diagnosing rheumatoid arthritis via assaying myofibroblast-like synoviocytes for fibroblast activation protein
WO2007087131A2 (en) * 2006-01-05 2007-08-02 The Johns Hopkins University Peptide prodrugs
WO2007112347A1 (en) 2006-03-28 2007-10-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Dipeptidyl peptidase inhibitors
WO2008005479A2 (en) * 2006-07-06 2008-01-10 University Of Wyoming Charge reversible polymers
WO2008116053A2 (en) * 2007-03-20 2008-09-25 Trustees Of Tufts College Fap-activated chemotherapeutic compounds, and methods of use thereof
AU2009290531B2 (en) * 2008-09-12 2014-08-21 Cadila Pharmaceuticals Ltd. Novel dipeptidyl peptidase (DP-IV) compounds
WO2011089215A1 (en) 2010-01-22 2011-07-28 Ascendis Pharma As Dipeptide-based prodrug linkers for aromatic amine-containing drugs
WO2011089216A1 (en) 2010-01-22 2011-07-28 Ascendis Pharma As Dipeptide-based prodrug linkers for aliphatic amine-containing drugs
US20150335761A1 (en) * 2012-02-16 2015-11-26 Raymond Firestone Compositions and methods for contraception
AU2013369261B2 (en) 2012-12-28 2018-08-09 Cobiores Nv Minimally toxic prodrugs
EP2987794B1 (en) * 2013-04-19 2018-05-30 Jinan University Vinblastine derivatives, preparation method therefor and application thereof
HUE045001T2 (hu) 2013-11-05 2019-12-30 Astrazeneca Ab NMDA antagonista prodrugok
CN106573073B (zh) 2014-06-13 2021-09-28 塔夫茨大学信托人 Fap激活的治疗剂以及其相关用途
US9737556B2 (en) 2014-06-13 2017-08-22 Trustees Of Tufts College FAP-activated therapeutic agents, and uses related thereto
CN105524141B (zh) * 2015-11-12 2019-11-26 中山大学 一种FAPa激活式肿瘤诊断多肽磁珠复合物的制备与应用
EP3222292A1 (en) 2016-03-03 2017-09-27 Heidelberg Pharma GmbH Amanitin conjugates
CN107043456B (zh) * 2017-04-19 2019-05-17 川北医学院 对氧环己酮与l-苯丙氨酸氮芥共聚物及其应用
CN110128501A (zh) * 2019-05-21 2019-08-16 北京海美源医药科技有限公司 一种靶向fap酶的喜树碱类化合物及其制备方法和应用
CN110128506B (zh) * 2019-05-22 2021-03-30 中国药科大学 一种寡肽及其应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3915800A (en) * 1972-03-30 1975-10-28 Kelco Co Polysaccharide and bacterial fermentation process for its preparation
FR2546163B1 (fr) 1983-05-16 1987-10-09 Centre Nat Rech Scient Nouveaux derives acyles hydrosolubles de peptides ou d'amino-acides, leur preparation et leur application
US5047401A (en) * 1985-09-09 1991-09-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Use of dipeptide alkyl esters to treat GVHD
DE3783966T2 (de) 1986-07-29 1993-05-27 Sunstar Inc Reagens zur pruefung von periodentalen erkrankungen.
US5776892A (en) * 1990-12-21 1998-07-07 Curative Health Services, Inc. Anti-inflammatory peptides
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5866679A (en) 1994-06-28 1999-02-02 Merck & Co., Inc. Peptides
DE19512484A1 (de) * 1995-04-04 1996-10-17 Bayer Ag Kohlenhydratmodifizierte Cytostatika
EP0855910A4 (en) 1995-10-18 2000-07-05 Merck & Co Inc CONJUGATES USEFUL FOR TREATING BENIN PROSTATIC ADENOMA
EP0914123A4 (en) 1996-05-29 2000-10-11 Prototek Inc THALIDOMIDE PRODUCTS AND METHODS OF USING SAID PRODUCTS AS T CELL MODIFIERS
US5952294A (en) 1996-07-31 1999-09-14 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Peptidyl prodrugs and methods of making and using the same
CA2264227A1 (en) 1996-09-27 1998-04-02 Raymond A. Firestone Hydrolyzable prodrugs for delivery of anticancer drugs to metastatic cells
DE19640970A1 (de) * 1996-10-04 1998-04-16 Bayer Ag Modifizierte Cytostatika
IL143666A0 (en) 1998-12-11 2002-04-21 Coulter Pharm Inc Prodrug compounds and process for preparation thereof
JP2002542304A (ja) 1999-04-28 2002-12-10 ベクトレイムド インコーポレイテッド 酵素的に活性化された重合薬物接合体

Also Published As

Publication number Publication date
CN1374969A (zh) 2002-10-16
US6613879B1 (en) 2003-09-02
EP1180116A2 (en) 2002-02-20
IL145798A0 (en) 2002-07-25
EA005204B1 (ru) 2004-12-30
HK1048642B (zh) 2005-10-28
CN1213058C (zh) 2005-08-03
MY125939A (en) 2006-09-29
AR033792A1 (es) 2004-01-07
BG106096A (bg) 2002-05-31
ZA200109151B (en) 2002-12-17
WO2000071571A8 (en) 2002-03-07
CO5170516A1 (es) 2002-06-27
MXPA01011401A (es) 2002-06-04
JP3607201B2 (ja) 2005-01-05
HUP0202367A3 (en) 2003-10-28
WO2000071571A3 (en) 2001-09-07
JP2003500417A (ja) 2003-01-07
AU6559100A (en) 2000-12-12
NZ516075A (en) 2004-03-26
EA200101155A1 (ru) 2002-10-31
KR20020030270A (ko) 2002-04-24
SK16452001A3 (sk) 2002-03-05
AU777521B2 (en) 2004-10-21
HK1048642A1 (en) 2003-04-11
EE200100600A (et) 2003-02-17
BR0010564A (pt) 2002-02-19
CZ20014097A3 (cs) 2002-02-13
CA2369933A1 (en) 2000-11-30
NO20015536L (no) 2002-01-10
TWI248444B (en) 2006-02-01
YU80901A (sh) 2005-07-19
HUP0202367A2 (hu) 2002-11-28
NO20015536D0 (no) 2001-11-13
WO2000071571A2 (en) 2000-11-30
PL351680A1 (en) 2003-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA73506C2 (en) Antitumour compounds activated by fibroplasts activation proteins (fap)
JP6290166B2 (ja) 注射可能な医薬調製剤の製法
AU2001266853B2 (en) Prodrug compounds with an oligopeptide having an isoleucine residue
US20030055052A1 (en) FAP-activated anti-tumor compounds
AU2001275525B2 (en) Tripeptide prodrug compounds
US20020155565A1 (en) FAP-activated anti-tumor compounds
AU2001266853A1 (en) Prodrug compounds with an oligopeptide having an isoleucine residue
JP2003526683A (ja) ペプチダーゼ切断可能な標的抗新生物薬およびそれらの治療への使用
EP1333033A1 (en) FAP-activated anti-tumor compounds
WO2002038590A1 (en) Fap-alpha-activated anti-tumor compounds
US20030232742A1 (en) FAP-activated anti-tumor compounds
US20040033957A1 (en) FAP-activated anti-tumor prodrugs
WO2003094972A2 (en) Fap-activated anti-tumor prodrugs
US20030211979A1 (en) FAP-activated anti-tumor compounds
Kratzel et al. Valaminols, probably the most simplified peptide-analogs acting as pepsin inhibitors
WO2002038591A1 (en) Fap-activated anti-tumor compounds
WO2002038187A1 (en) Fap-activated anti-tumour prodrug