JP2002542304A - 酵素的に活性化された重合薬物接合体 - Google Patents

酵素的に活性化された重合薬物接合体

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、水溶性ポリマーセグメントおよび多官能化学成分を含む規則的に反復する線状ユニット、または共通多官能化学成分に各々結合した2つ以上の水溶性ポリマーセグメントを含む分枝したポリマーのいずれかに、酵素的に切断可能なリンカーを介して接合された1つ又は複数の生物学的に活性な物質をもつ、重合薬物接合体、ならびにこのような接合体の製造法に関する。本発明はさらに、このような接合体を含む薬学的組成物および、病態を治療するためのこのような接合体の使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 1.発明の分野 本発明は一般に、酵素的に切断可能なリンカーにより、規則的に反復する線状
コポリマーまたは分枝したコポリマーに結合された生物学的に活性な物質により
構成された、重合薬物接合体に関する。特に、このリンカーは、酵素により切断
され、かつ場合によってはさらに、pH、イオン強度、またはレドックス条件の変
化により切断され得るような、1つ以上の化学結合を含む。このように、本発明
の重合薬物接合体は、コポリマーの改質により最適な酵素の接近およびリンカー
の切断を提供するように具体的に設計することができる。発明された重合薬物接
合体は、薬物の溶解度、薬物の生体適合性、薬物の滞留時間、薬物の吸収特性、
および／または薬物の生体活性を変更するために使用することができる。
【０００２】 2.発明の背景及び概要 主として水への溶解度、薬物毒性、生体適合性、および患者の服薬遵守(例え
ば、薬物投与間の時間の延長)の問題点を克服するために、多くの薬学的物質の
送達を改善する新規製剤技術が開発されている。薬物送達技術は、毒性を低下す
ることにより化合物の治療範囲を増大し、これにより重要な薬物の適応および臨
床用途を広げることができる。多くの場合において、重要な薬学的物質、特に抗
癌剤の臨床適応は、全身毒性のために用量限定されることが多い。例えば可能性
のある重要な化合物の毒性は、埋植可能な生体用吸収可能なポリマーを用いて活
性物質を特定の組織に直接送達することにより、顕著に低下することができる(L
anger、1990)。しかし、薬物送達のための埋植可能なポリマー技術には固有の限
界があり、例えば、薬物放出は、会合したポリマーの加水分解的崩壊またはポリ
マーマトリックスからの薬物の単純拡散の機能であり、従ってその放出特性は、
治療される疾患の機能ではなく、該疾患に実際には無関係であるという事実が挙
げられる。
【０００３】 同様に、これまでに発表されかつ公知の製剤技術の多くは、多種の薬物または
多くの適応症によるそれらの使用を除外するような限界を有し、かつ一般には部
位特異的な送達技術ではない。例えば、徐放型送達のために広く利用された戦略
は、薬物の脂質またはポリマーへの捕獲またはカプセル封入であり、これは生体
システムに対する該物質の利用可能性を制限する(Allenら、1992；Thierryら、1
993；Tabata、1993)。この場合、薬物は、カプセルまたはポリマーマトリックス
の外側に拡散しなければならないか、もしくは、カプセル封入物質が、薬物が周
囲の組織により吸収され得る形で放出される前に、溶解、崩壊または吸収されな
ければならないかのいずれかである。これらの技術は更に、薬物放出のための加
水分解による崩壊にも頼っている。ポリマーまたは脂質のカプセル封入システム
は、カプセル封入された物質の部位特異的(標的化された)放出を提供するような
固有の特性を有さない。加えて、ポリマーカプセル封入システムは、通常水溶性
薬物にのみ適するのに対し、リポソーム製剤は、リポソーム二重層の完全性を破
壊することなくこれらの二重層に分配されるような脂溶性薬物に限定される。
【０００４】 合成ポリマー、天然ポリマー、または半合成ポリマー(化学的に修飾された天
然の巨大分子)の形の巨大分子が、様々な薬学的物質のための担体として利用さ
れている(例えば、PachenceおよびKohn、1998を参照のこと)。活性物質をポリマ
ーに共有結合し、体内での薬物の制御型または徐放型の放出が可能であるような
接合体を作成するために、様々な化学的スペーサー基が、これまで使用されてい
る。これらのスペーサー基は、制御された薬物放出をもたらすような生分解性結
合を提供している。これらのスペーサー基のサイズおよび性質、ならびに上記ポ
リマーの電荷および構造は、制御型または徐放型の放出特性を伴う薬物の設計に
おける考慮のために重要な特性である。結果的に薬物の放出は、ポリマーと活性
物質の間の結合の加水分解による切断に左右されることが多い。しかしこのよう
な方法が徐放型の放出を提供するとしても、これは活性物質を特定組織に固有に
標的化することはない。
【０００５】 重合薬物接合体は一般に、体内における制御された薬物放出または方向づけら
れた薬物分布(およびこれにより、薬物の治療指数が向上する)のための方法を提
供するが、この重合薬物送達システムの適用の成功は、下記に大きく依存する：
(1)良く定義されたポリマー／薬物接合体を再現性を持って調製する能力；(2)適
切な有効搭載量(payload)の提供(例えば、薬物の分子量(MW)とポリマーのMWの比
は最大でなければならない)；および、(3)薬物をポリマーに結合する連結基の選
択。特に天然ポリマーおよび半合成ポリマーに関して、薬物のポリマーへの共有
結合は、ポリマー主鎖に沿ったランダム分布となるであろう。従って各々の結合
した活性物質間の間隔もランダムであり、かつ一般に制御不能である。
【０００６】 様々なタンパク質分解酵素が、罹患部位の近傍もしくはその部位の細胞、また
は微生物もしくは宿主細胞による感染部位の細胞により、より多量に生成される
ことは周知である。例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)は、細胞
外マトリックス組成物を調整しかつ細胞とECMの間の相互作用を改変する酵素の
主要なファミリーである(Massovaら、1998)。MMPの治癒および代謝における正常
な役割に加えて、この酵素ファミリーはさらに、慢性炎症、関節炎および癌を含
む様々な病態の進行への関与が示されている。特にMMPは、腫瘍増殖時に活性が
あり、かつ転移に必要であることがわかっている(ChambersおよびMatrisian、19
97)。
【０００７】 さらに多くの酵素が、感染部位において病原体により、または感染症の根絶に
関与している宿主細胞(例えば白血球など)により生成される。トロンビン様アラ
ニンアミノペプチダーゼおよびエラスターゼ様酵素活性は、細菌感染症において
一般的であることは分かっており(FinlayおよびCossart、1997)、かつこのよう
な酵素のアミノ酸切断配列は詳細に文書化されている。
【０００８】 病態に起因した酵素の生成または上方制御に関する知識は、これまで薬物送達
の戦略として使用されてきた。例えば、感染部位に存在する特異的酵素により切
断されることが公知であるアミノ酸配列は、抗生物質に組合わせることができ、
これはその後ポリビニルアルコールヒドロゲル創傷用包帯に組込むことができる
ことが示されている(Suzukiら、1998)。従ってゲンタマイシンのような抗生物質
は、感染創傷の滲出液に選択的に放出することができる。同様に、癌細胞により
生成された酵素、例えばセリンプロテアーゼ前立腺特異的抗原は、プロドラッグ
の活性化に使用することができる(Denmeadeら、1998)。
【０００９】 より最近になって、文献において多くのポリマー／薬物接合体が報告されてい
る。コペセック（Kopecek）ら(米国特許第5,037,883号および第5,258,453号)は
、細胞内酵素により切断されるような連結鎖により薬物に結合された高分子担体
の使用を開示している。しかしこの方法は、酵素的切断が生じる前に細胞へ取り
込まれるべき高分子担体-連結鎖-薬物の接合体の必要要件により限定される。特
にこれらの特許は、細胞内リソソームの加水分解により薬物-担体連結の崩壊が
生じるような標的化基を伴うポリマーを開示している。コペセック（Kopecek）
の技術はさらに、予め形成されたポリマーへの薬物の化学的連結に頼っている。
この方法は、上記ポリマーに結合された薬物の量を制限し(典型的には可能性の
ある連結部位の50％未満)、かつ得られる接合体は、規則的に反復する薬物ユニ
ットを有さない。
【００１０】 同様の様式で、他の研究者らは、薬物とポリマーの間の結合の生分解に頼るよ
うなポリマーに結合した活性物質を放出する方法を確定している。例えばソープ
（Thorpe）は、加水分解性化学結合を介して連結したポリアニオン性ポリマーお
よびステロイドからなる2成分システムを開示している（米国特許第5,474,765号
)。ソープ（Thorpe）によると、硫酸化されたポリアニオン性多糖類(例えばヘパ
リン)を主要ポリマー構築物として使用し、かつポリスチレンスルホネート、硫
酸化されたポリビニルアルコール、またはポリエチレンスルホネートのような合
成の有機硫酸化されたポリマーの使用が意図されている。ソープ（Thorpe）の発
明の組織標的化成分は、ヘパリンおよび類似ポリマーの内皮細胞に結合している
結合部位である。ソープ（Thorpe）によると、この活性物質は予め形成されたポ
リマーにランダムに接合されている。さらに、これらのポリマーは、本来水溶性
ではなく、これらは薬物の滞留時間の延長を示さない。加えてソープ（Thorpe）
のポリマーへ活性物質を連結している生物学的に放出可能な結合は、一般に加水
分解可能であり、かつ疾患特異性ではない。ソープ（Thorpe）は、組織に局在化
された高濃度の活性物質につながるような薬物放出条件を開示していない。
【００１１】 他のグループは、薬物送達のための水溶性ポリマーを生じる、PEGコポリマー
を改質することを示している。例えばザリプスキー（Zalipsky）ら(米国特許第5
,219,564号および米国特許第5,455,027号)は、規則的間隔で官能性ペンダント基
を生じる、PEGおよびアミノ酸リシンの線状の予め形成されたポリマー(末端カル
ボキシル基はリシンであるような)を開示している。しかしこれらの方法は、規
則的間隔でポリマー主鎖に沿って薬物結合を提供する方法は開示していない。同
様に、部位指定した薬物送達を提供するであろう酵素により切断可能な連結基の
概念も開示されていない。
【００１２】 ザリプスキー（Zalipsky）らが開示したもののようなポリマーは、別の執筆者
達が、薬物放出法を提供するために使用している。例えばフアン（Huang）ら(Bi
oconjugate Chem.、9:612-617(1998))は、ジスルフィド連結を用いて、システイ
ン含有ペプチドをPEG-リシンコポリマー(規則的に間を空けたチオール基を提供
するように改質されている)に接合している。ポイアーニ（Poiani）ら(Bioconju
gate Chem.、5:621-630(1994)；米国特許第5,372,807号、米国特許第5,660,822
号、および米国特許第5,720,950号)は、これらの同じPEG-リシンの抗線維症化合
物cis-ヒドロキシプロリンとの併用を開示している。ザリプスキー（Zalipsky）
のように、フアン（Huang）もポイアーニ（Poiani）も、規則的間隔でポリマー
に沿って薬物結合を提供する方法も、これらの執筆者により説明された代謝によ
り切断可能な連結基の概念も開示していない。
【００１３】 別の技術は、プロドラッグ作成の手段として、ポリマーを活性物質(特にタン
パク質性（-based）薬学的化合物)に結合する方法を提供している。例えば、グ
リーンワルド（Greenwald）ら(米国特許第5,840,900号)は、プロドラッグを作成
するためのポリエチレングリコール(PEG)の活性物質への共有結合を開示してい
る。しかしグリーンワルド（Greenwald）は、活性物質を再構成するために分子
量が大きいPEG(少なくとも20,000)の加水分解による切断に頼るような化合物を
開示している。恐らく小さい有機薬物は、PEGの薬物に対する比が余りにも大き
いので適していないであろう。加えて、グリーンワルド（Greenwald）は、患部
で切断可能となるような連結基の使用を考慮しておらず、かつ得られる接合体は
、規則的なポリマー反復構造ではない。
【００１４】 多くの他の研究者(例えば、米国特許第4,753,984号、米国特許第5,474,765号
、米国特許第5,618,528号、米国特許第5,738,864号、米国特許第5,853,713号)は
、活性物質を予め形成されたポリマーに連結する技術を開示しているが、これは
単独の活性物質の種類に限定されず、かつ規則的に反復するポリマー構築物を形
成する方法を説明していない。
【００１５】 本発明は概して、規則的に反復する線状コポリマーまたは分枝したコポリマー
に、酵素的に切断可能なリンカーにより結合された生物学的に活性な物質で構成
された、重合薬物接合体に関する。より詳細には、本発明は、水溶性ポリマーセ
グメントおよび多官能化学成分を含む規則的に反復する線状ユニット、または各
々共通多官能化学成分に結合された2つ以上の水溶性ポリマーセグメントを含む
分枝したポリマーのいずれかに、酵素的に切断可能なリンカーにより接合された
1つ又は複数の生物学的に活性な物質を含む重合薬物接合体に関する。好ましい
態様において、1つ又は複数の生物学的に活性な物質が、リンカーを介して、規
則的に反復する線状ユニットの多官能化学成分に接合されている。別の好ましい
態様において、1つ又は複数の生物学的に活性な物質が、リンカーを介して、2つ
以上の水溶性ポリマーセグメントの少なくとも1つに接合されている。
【００１６】 特に、上記リンカーは、罹患した組織表面の近傍、中および／または上に高濃
度で存在するような、酵素により、かつ場合によっては追加的に、pH、イオン強
度、またはレドックス条件によっても切断され得る1つ又は複数の化学結合を含
むことができる。より詳細には、このリンカーは更に加水分解、還元反応、酸化
反応、pHシフト、光分解、またはそれらの組合せによっても切断され得る。この
リンカーはさらに、非特異的酵素反応によっても切断され得る。好ましい態様に
おいて、リンカーは、細胞内または細胞外酵素により切断され得る。更に別の好
ましい態様において、リンカーは、膜に結合した酵素により切断され得る。
【００１７】 別の好ましい態様において、上記リンカーは、標的部位において利用可能な酵
素により切断され、ここで該酵素は標的部位においてさらに上方制御されること
がある。さらにこの標的部位は、罹患した組織または生物学的液体であることが
でき、ここで罹患した組織は、皮膚、骨、軟骨、筋肉、結合組織、神経組織、生
殖器、内分泌組織、リンパ組織、脈管系、または内臓であり、かつ生物学的液体
は、血液、胸水、腹水、関節液、膵液、胆汁、または脳脊髄液であることができ
る。
【００１８】 別の好ましい態様において、リンカーは、微生物感染症から生じる酵素、皮膚
表在性酵素、または細胞により分泌された酵素、癌細胞により分泌された酵素、
癌細胞表面に局在化された酵素、慢性炎症疾患に関連した細胞により分泌された
酵素、リウマチ様関節炎に関連した細胞により分泌された酵素、骨関節症に関連
した細胞により分泌された酵素により切断され得る。
【００１９】 本発明の接合体は、線状コポリマーの水溶性ポリマーセグメントおよび／また
は分枝したコポリマーの多官能化学成分を改質することにより、リンカーに最適
な酵素の接近および切断を提供するように設計することができる。本発明の重合
薬物接合体は、薬物の溶解度、薬物の生体適合性、薬物の滞留時間、薬物の吸収
特性、および／または薬物の生体活性を変更するために使用することができる。
この重合薬物接合体の一般構造を、下記に示す。 重合薬物接合体の一般式
【化２】
【化３】
【００２０】 本発明の接合体のコポリマー主鎖は、規則的な線状に反復するかまたは分枝し
た骨格のいずれかを形成するように、多官能化学成分に結合した水溶性ポリマー
セグメントにより構成される。これらの骨格は、酵素的に切断可能な連結基を通
じて生物学的活性基の結合のために、一連の等間隔をあけた化学官能基を提供す
るように設計される。このコポリマー組成物は、個々のポリマーセグメントおよ
び／または多官能化学成分のサイズまたは化学的環境の変更により、酵素的に切
断可能なリンカーへの最適な酵素的接近が可能であるように修飾することができ
る。
【００２１】ポリ[D-L-M-P]の一般構造式 ポリマー構築物ポリ[D-L-M-P]は、規則的に反復する線状コポリマー主鎖を形
成しかつ加えて酵素的に切断可能なリンカーLを介して生物学的に活性な物質Dの
ための化学置換基を提供するように、水溶性ポリマーセグメントPを連結するた
めに使用される多官能化学成分Mからなる。規則的に反復する線状ポリマーのM-P
反復の数は、mで示され、ここでmは、好ましくは2よりも大きいかまたはこれと
等しい整数であり、より好ましくは約2〜約25の整数である。
【００２２】 上記水溶性重合薬物接合体は、Dの水への溶解度を増大するように設計するこ
とができ、かつ注射、経口的、局所的、吸入送達、皮下付着(埋植)、腹腔鏡検査
のような最小の侵襲的外科手技を用いる付着、または他の先に説明された生理的
送達法により投与されるように製剤される。
【００２３】 このコポリマー／連結している物質の接合体から酵素活性により放出される薬
学的物質は、高い局所組織濃度において再構成された薬学活性を提供する。一般
に、代謝に感受性がある連結基Lは、標的化された患部においてまたはその近傍
に高濃度(非病理部位のレベルよりも高い)で存在する酵素により切断されるよう
に設計されている。
【００２４】一般構造式Q(-P-L-D)k 式Q(-P-L-D)kの分枝した重合薬物接合体は、酵素により切断可能なリンカーL
を介して、生物学的に活性な物質Dに結合された水溶性ポリマーセグメントPをk
個結合するために使用される共通多官能化学成分Qからなる。水溶性重合薬物接
合体は、Dの水溶解度を増加するように設計することができ、かつ注射、経口的
、局所的、吸入送達、皮下付着、最小の侵襲的外科手技(例えば腹腔鏡検査)を用
いる付着、または他の先に説明された生理的送達法により投与されるように製剤
される。
【００２５】 この高分子接合体から酵素活性により放出される薬学的物質は、高い局所組織
濃度において再構成された薬学活性を提供する。一般に、代謝に感受性がある連
結基Lは、患部においてまたはその近傍に高濃度(非病理部位のレベルよりも高い
)で存在する酵素により切断されるように設計されている。
【００２６】 本発明はさらに、新規接合体および薬学的に許容される担体を含有する薬学的
組成物も含み、ここで薬学的組成物は、注射、または経口的、局所的、吸入、も
しくは埋植による投与法に適していることが好ましい。
【００２７】 本発明は、本発明の新規接合体を有効量投与することを含む病態の緩和法も含
み、ここで病態は、新生物形成疾患、慢性炎症疾患、急性炎症疾患、心疾患、腎
疾患、肝疾患、肺疾患、神経疾患、筋骨格疾患、および免疫疾患を含むことがで
きる。さらに、この方法は、心臓機能、腎機能、肝機能、肺機能、または神経機
能を調節し；免疫学的機能を改変し；ホルモン機能を改変し；微生物感染症を治
療し；もしくは、瘢痕組織を調節することを含むことができる。
【００２８】 本発明は、水溶性ポリマーに接合された薬学的物質からなる組織-標的化する
製剤を形成するための新規組成物を提供する。本発明は、罹患部位において特異
的に切断され得るポリマーと薬学的物質の間の化学連結基を用いることにより、
薬物放出を標的化する方法を提供する。加えて、本発明の薬学的物質は、水溶性
ポリマー主鎖に沿って規則的間隔で間が空けられており、ここで各活性物質間の
間隔は、合成法により制御される。
【００２９】 結果として、本発明の接合体の独特な局面は、薬物および水溶性ポリマー主鎖
上に反復するリンカーからなる構築物である。この薬物／リンカー基接合体の結
合の間の間隔は、本明細書に記された合成法により制御することができる。本発
明の接合体を形成するひとつの好ましい方法は、薬物、リンカー、およびモノマ
ーが最初に接合体化され、かつ得られた生成物が次に水溶性ポリマーに結合され
、これがその後ポリマー接合体を形成するというものである。これは、ポリマー
構築物上において高度の薬物-リンカー置換を提供し(典型的には90％より大きい
)、ポリマー主鎖に沿って薬物／リンカーの規則的に反復するユニットを提供す
る。
【００３０】 本発明はさらに、連結基が、例えば罹患組織の表面の近傍、中および／または
上に高濃度で存在する酵素によるような、酵素活性により切断可能であることを
必要とする。この独特な局面は、標的部位が指定された薬物送達を得るメカニズ
ムを提供する。
【００３１】 3.発明の詳細な説明 本発明は、酵素的に切断可能なリンカーによって共重合骨格に生物活性物質を
共有結合させることによって形成された重合薬物接合体について記述する。生物
活性物質が生理的プロセスによって重合骨格から放出され、物質の活性が再構成
される、接合体ポリ[D-L-M-P]およびQ(-P-L-D)kを患者に投与する。リンカーは
、生理的な切断、好ましくは酵素的切断を受けやすい１つまたはそれ以上の結合
を有する化学鎖からなる。本発明の構築物の構造を、全般的重合薬物接合体の式
に示す。 全般的な重合薬物接合体の式
【化４】
【化５】
【００３２】 全般的構築物の式ポリ[D-L-M-P] 本発明の式ポリ[D-L-M-P]の重合構築物は、多官能基化学部分Mからなり、これ
は有機化合物、アミノ酸、または重合セグメントと共有結合を形成するために用
いることができる化学官能基を含むその両者の組み合わせからなり、Pは、連結
基であり、Lは、独立してアミノ酸、糖、核酸、または酵素的に切断可能な１つ
またはそれ以上の化学結合を有する他の有機化合物からなりうる、またはその組
み合わせからなりうる「リンカー」である；Dは、連結基Lと共有結合を形成する
ことができる化学置換基を有する生物活性物質である；Pは、単量体M上の置換基
と共有化学結合を形成することができる少なくとも２つの官能基を含む水溶性の
重合体または共重合体である；およびmは、重合反復単位の数であり、これは典
型的に５〜12までの範囲の数であるが、２〜25までの範囲に及びうる。
【００３３】 好ましい態様において、水溶性の重合体セグメントは、分子量約2,000のポリ(
エチレングリコール)を含み、多官能基化学部分は、N-(2-ヒドロキシアセチル)
セリンを含み、リンカーは、(H-Leu-Gly-Pro-Ala-NH-CH2-CH2-NH2)を含み、生物
活性物質はドキソルビシン-14-O-ヘミグルタレートを含む。
【００３４】 もう一つの好ましい態様において、水溶性重合体セグメントは、分子量約1,00
0のポリ(エチレングリコール)を含む、多官能基化学部分は、トリス(2-アミノエ
チル)アミンを含み、リンカーは、(H-Val-Pro-Arg-OH)を含み、生物活性物質は
、N6-(アミノイミノメチル)-N2-(3-メルカプト-1-オキソプロピル-L-リジルグリ
シル-L-α-アスパルチル-L-トリプトフィル-L-プロリル-L-システインアミド、
環状（1→6）ジスルフィドを含む。
【００３５】 もう一つの好ましい態様において、水溶性重合体セグメントは、分子量約2,00
0のポリ(エチレングリコール)を含み、多官能基化学部分は、Nα-(p-アミノフェ
ニルアセチル)-p-アミノフェニルアラニルヒドラジドを含み、リンカーは、(OCH
-CO-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-OH)を含み、生物活性物質は、Leu-Gly-α-5-フルオロ
ウラシルの薬学的類似体を含む。
【００３６】 もう一つの好ましい態様において、水溶性重合体セグメントは、分子量約1,00
0のポリ(エチレングリコール)を含み、多官能基化学部分は3,5-ジヒドロキシフ
ェニル酢酸を含み、リンカー部分は、(H-Cys(S-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH2)-Gl
u-Glu-Glu-OH)を含み、および生物活性物質は、Leu-Gly-α-5-フルオロウラシル
の薬学的類似体を含む。
【００３７】 もう一つの好ましい態様において、水溶性重合体セグメントは、分子量約2,00
0のポリ(エチレングリコール)を含み、多官能基化学部分はリジンを含み、リン
カーは(H-Gly-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Trp-Lys-NH2)を含み、および生物活性物質はメ
ソトレキセートを含む。
【００３８】 もう一つの好ましい態様において、水溶性重合体セグメントは、分子量約2,00
0のポリ(エチレングリコール)を含み、多官能基化学部分はリジンを含み、リン
カーは、(H-Gly-Pro-Lys-Pro-Val-Gly-Nva-Trp-Lys-OH)を含み、および生物活性
物質はメソトレキセートを含む。
【００３９】 もう一つの好ましい態様において、水溶性重合体セグメントは、分子量約2,00
0のポリ(エチレングリコール)を含み、多官能基化学部分はリジンを含み、リン
カーは、(H-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Lys-NH2)を含み、および生物活性物質はメソ
トレキセートを含む。
【００４０】 全般的構築物の式Q(-P-L-D)k 本発明の式Q(-P-L-D)kの重合構築物は、水溶性重合体セグメントPのk個を結合
するために用いられる共通の多官能基化学部分Q、およびPを生物活性物質Dに結
合させる酵素的に切断可能なリンカーLからなり、kは好ましくは１〜約100の整
数、より好ましくは２〜約100の整数である。
【００４１】 水溶性重合接合体プロドラッグシステムは、Dの水溶性を増加させるようにデ
ザインすることができ、注射、経口、局所、吸入輸送、皮下沈着、腹腔鏡のよう
な侵襲性が最小である外科的技法を用いる沈着、またはこれまでに記述されてい
る他の物理的輸送方法によって投与するように製剤化することができる。
【００４２】 本発明のもう一つの局面は、重合構築物Q(-P-L-D)kによって、それぞれの多官
能基化学部分Q上に等しく間隔をあけた多数の薬物−リンカー置換基が可能とな
る点である。重合セグメントPの構造、化学組成、または大きさは、酵素的に切
断可能なリンカーLに対する酵素の簡便なアプローチを可能にするために、そし
て産物構築物の生物学的利用性を最適にするために容易に変更することができる
。
【００４３】 代謝活性によって重合体／連結物質接合体から放出された薬剤は、高い組織局
所濃度で再構成された薬剤活性を提供するであろう。
【００４４】 好ましい態様において、水溶性重合体セグメントは、分子量約4,000のポリ(エ
チレングリコール)を含み、共通の多官能基化学部分は、ペンタエリスリトール
またはペンタエリスリトール類似体を含み、リンカーは(H-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro
-Lys(ε-CO-CH2-CH2-OH)-NH2)を含み、生物活性物質はメソトレキセートを含み
、そして上記の整数が４である。
【００４５】 もう一つの好まし態様において、水溶性重合体セグメントは、分子量約4,000
のポリ(エチレングリコール)を含み、共通の多官能基化学部分は８アームデンド
リマーを含み、リンカーは(H-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Lys(ε-CO-CH2-CH2-OH)-NH2 )を含み、生物活性物質はメソトレキセートを含み、そして整数が８である。
【００４６】 もう一つの好ましい態様において、水溶性重合体セグメントは、分子量4,000
のポリ(エチレングリコール)を含み、共通の多官能基化学部分は、ペンタエリス
リトールまたはペンタエリスリトール類似体を含み、リンカーは(H-Glu-Glu-Glu
-Lys(ε-CO-CH2-CH2-OH)-NH2)を含み、生物活性物質はメソトレキセートを含み
、そして整数は４である。
【００４７】 もう一つの好ましい態様において、水溶性重合体セグメントは、分子量約4,
000のポリ(エチレングリコール)を含み、共通の多官能基化学部分は８アームデ
ンドリマーを含み、リンカーは(H-Glu-Glu-Glu-Lys(ε-CO-CH2-CH2-OH)-NH2)を
含み、生物活性物質はメソトレキセートを含み、そして整数が８である。
【００４８】 もう一つの好ましい態様において、水溶性重合体セグメントは、分子量約4,00
0のポリ(エチレングリコール)を含み、共通の多官能基化学部分は、ペンタエリ
スリトールまたはペンタエリスリトール類似体を含み、リンカーは(H-Gly-Pro-L
ys-Pro-Val-Gly-Nva-Trp-Lys(ε-CO-CH2-CH2-OH)-NH2)を含み、生物活性物質は
メソトレキセートを含み、そして上記の整数が４である。
【００４９】 もう一つの好ましい態様において、水溶性重合体セグメントは、分子量約4,00
0のポリ(エチレングリコール)を含み、共通の多官能基化学部分は、８アームデ
ンドリマーを含み、リンカーは(H-Gly-Pro-Lys-Pro-Val-Gly-Nva-Trp-Lys(ε-CO
-CH2-CH2-OH)-NH2)を含み、生物活性物質はメソトレキセートを含み、そして上
記の整数が８である。
【００５０】 もう一つの好ましい態様において、水溶性重合体セグメントは、分子量約4,00
0のポリ(エチレングリコール)を含み、共通の多官能基化学部分は、ペンタエリ
スリトールまたはペンタエリスリトール類似体を含み、リンカーは(H-Gly-Pro-T
yr-Ala-Tyr-Trp-Lys(ε-CO-CH2-CH2-OH)-NH2)を含み、生物活性物質はメソトレ
キセートを含み、そして上記の整数が４である。
【００５１】 もう一つの好ましい態様において、水溶性重合体セグメントは、分子量約4,00
0のポリ(エチレングリコール)を含み、共通の多官能基化学部分は、８アームデ
ンドリマーを含み、リンカーは(H-Gly-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Trp-Lys(ε-CO-CH2-CH2 -OH)-NH2)を含み、生物活性物質はメソトレキセートを含み、そして上記の整数
が８である。
【００５２】 重合薬物接合体の集合 本発明の重合薬物接合体ポリ[D-L-M-P]は、異なる４つの単位を用いて集合す
ることができる；多官能基化学部分、M；酵素的に切断可能なリンカー、L；生物
活性物質、D；および水溶性重合体セグメント、P。これらの個々の単位は当初、
構築物の他の単位との安定な化学結合を形成するために用いられる１つまたはそ
れ以上の反応性置換基によって置換される。
【００５３】 本発明に従って、共重合骨格に組み入れた多官能基化学部分Mの１〜100％を生
物活性物質リンカー接合体D-Lによって置換してもよい。さらに、水溶性重合体
セグメントPを多官能基化学部分Mに結合する化学結合は、カルバメート、チオカ
ルバメート、エーテル、ウレア、チオウレア、カーボネート、チオカーボネート
、またはエステル官能基を含んでもよい。
【００５４】 本発明の構築物Q(-P-L-D)kはまた、異なる４つの単位を用いて集合することが
できる；共通の多官能基化学部分、Q；酵素的に切断可能なリンカー、L；生物活
性物質、D；および水溶性重合体セグメント、P。これらの個々の単位は当初、構
築物の他の単位との安定な化学結合を形成するために用いられる１つまたはそれ
以上の反応性置換基によって置換される。
【００５５】 本発明に従って、共通の多官能基化学部分Qに組み入れた水溶性重合体セグメ
ントPの１〜100％を生物活性物質−リンカー接合体D-Lによって置換してもよい
。さらに、水溶性重合体セグメントPを共通の多官能基化学部分Qまたはリンカー
Lに結合させる化学結合は、カルバメート、チオカルバメート、エーテル、ウレ
ア、チオウレア、カーボネート、チオカーボネート、またはエステル官能基を含
んでもよい。
【００５６】 重合薬物接合体の単位の説明 多官能基化学部分、M 多官能基化学部分Mは、水溶性重合体セグメントPを共有結合するように、そし
てリンカーLにも結合するようにデザインされる。これは、一般式１に示す構造
および化学官能基を提供するようにデザインおよび合成される。
【化６】 式中、X1、X2、およびX3は、重合体セグメントP、または酵素的に切断可能なリ
ンカーLと共有結合を形成するために用いることができる化学置換基である。X1
、X2、およびX3は、独立して、ヒドロキシル、アミノ、チオール、アルキルもし
くはアリールジスルフィド、イソチオシアネート、チオカルボニルイミダゾール
、塩化チオカルボニル、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、カルボン酸エステル
、スルホン酸、スルホン酸エステル、塩化スルホニル、リン酸、アルキルもしく
はアリールスクシニミジルカーボネート、アルキルもしくはアリールクロロカー
ボネート、アルキルもしくはアリールスクシニミジルチオカーボネート、アルキ
ルもしくはアリールクロロチオカーボネート、ハロゲン化物またはチオエステル
官能基（おそらく、さらなる化学反応の前に除去することができる適当な保護基
によって置換される）となりうる、またはそれらに由来しうるが、これらに限定
されない。R1、R2、またはR3は、当初、反応性官能基を離れさせて、最終的な重
合薬物接合体の集合にとって最適な化学および立体環境を提供し、最終的に、本
発明の構築物の最適な生物活性を可能にするように重合体セグメントPとリンカ
ーLとを分離させるためのスペーサーとして作用する。R1、R2、またはR3は、独
立して、炭素原子20個までを含む飽和および不飽和、直鎖および分岐鎖アルキル
、アリール、アルキルアリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、またはヘテ
ロアルキルアリール鎖からなるが、これらに限定しない。a＝０〜２、b＝０〜２
、c＝０〜２；およびZ＝C、CH、N、P、PO、アリールまたはヘテロアリールであ
る。
【００５７】 好ましい態様において、多官能基化学部分は、N-(2-ヒドロキシアセチル)セリ
ン、リジン、トリス(2-アミノエチル)アミン、N-(p-ニトロフェニルアセチル)-p
-ニトロフェニルアラニン酸ヒドラジド、3,5-ジヒドロキシフェニル酢酸、3,5-
ジアミノ安息香酸、または6-アミノ-4-(2-アミノエチル)ヘキサン酸に由来する
。
【００５８】 リンカー、L 酵素的に切断可能なリンカーLを一般式２に記載し、式中、X4およびX5は、多
官能基化学部分Mおよび生物活性物質Dと共有結合を形成するために用いることが
できる化学置換基である。X4およびX5は、独立して、ヒドロキシル、アミノ、チ
オール、アルキルもしくはアリールジスルフィド、イソチオシアネート、チオカ
ルボニルイミダゾール、塩化チオカルボニル、アルデヒド、ケトン、カルボン酸
、カルボン酸エステル、スルホン酸、スルホン酸エステル、塩化スルホン酸、リ
ン酸、アルキルもしくはアリールスクシニミジルカーボネート、アルキルもしく
はアリールクロロカーボネート、アルキルもしくはアリールスクシニミジルチオ
カーボネート、アルキルもしくはアリールクロロチオカーボネート、ハロゲン化
物、またはチオエステル官能基（おそらく、さらなる化学反応の前に除去するこ
とができる適当な保護基によって置換される）となりうる、またはそれらに由来
しうるが、これらに限定されない。
【化７】 R4、またはR5は、当初、反応性官能基を離れさせて、最終的な重合薬物接合体の
集合にとって最適な化学および立体環境を提供し、本発明の構築物の最適な生物
活性を可能にするために、最終的にリンカーLを、生物活性物質Dおよび多官能基
化学部分Mから分離させるスペーサーとして作用する。R4、またはR5は、独立し
て、炭素原子20個までを含む飽和および不飽和、直鎖および分岐鎖アルキル、ア
リール、アルキルアリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、またはヘテロア
ルキルアリール鎖からなりうるが、これらに限定しない。d＝０〜２、e＝０〜２
；および（L1〜Ln）は、独立して、アミノ酸、糖、核酸、または単一もしくは多
数の酵素的に切断可能な結合を有する他の有機化合物からなる鎖、またはその組
み合わせからなる鎖である。
【００５９】 好ましい態様において、リンカーは、アミノ酸、糖、核酸、もしくは他の有機
化合物、またはその組み合わせを含んでもよい。もう一つの好ましい態様におい
て、リンカーは、ペプチド配列を含んでもよい。
【００６０】 好ましい態様において、ペプチド配列は、トロンビン、キモトリプシン、トリ
プシン、エラスターゼ、カリクレイン、またはサブスチリシンのようなセリンプ
ロテアーゼによって切断してもよい。さらに、トロンビンによって切断可能なペ
プチド配列は、-Gly-Arg-Gly-Asp-、-Gly-Gly-Arg-、-Gly-Arg-Gly-Asp-Asn-Pro
-、Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-、-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-、Gly-Pro-Arg-、-V
al-Pro-Arg-、または-Phe-Val-Arg-を含んでもよい。エラスターゼによって切断
可能なペプチド配列は、-Ala-Ala-Ala-、-Ala-Ala-Pro-Val-、-Ala-Ala-Pro-Leu
-、-Ala-Ala-Pro-Phe-、-Ala-Ala-Pro-Ala-、または-Ala-Tyr-Leu-Val-を含んで
もよい。
【００６１】 もう一つの好ましい態様において、リンカーは、パパイン、アクチニジン、ブ
ロメレイン、ライソゾームカテプシン、サイトソルカルパイン、および寄生虫プ
ロテアーゼのようなシステインプロテナーゼによって切断してもよい。さらに、
寄生虫プロテアーゼは、トリパノソーマ（Trypanosoma）または住血吸虫（Schis
tosoma）に由来してもよい。
【００６２】 もう一つの好ましい態様において、リンカーは、ペプシン、キモシン、ライソ
ゾームカテプシンD、プロセシング酵素、真菌プロテアーゼ、およびウイルスプ
ロテナーゼのような、アスパラギン酸プロテナーゼによって切断してもよいペプ
チド配列を含んでもよい。さらに、プロセシング酵素は、レニンを含んでもよく
、真菌プロテアーゼは、ペニシロペプシン、リゾパス（rhizopus）ペプシン、ま
たはエンドチアペプシンを含んでもよく、およびウイルスプロテアーゼは、AIDS
ウイルスからのプロテアーゼを含んでもよい。
【００６３】 もう一つの好ましい態様において、リンカーは、コラゲナーゼ、ストロメリシ
ン、およびゼラチナーゼのようなマトリクスメタロプロテナーゼによって切断す
ることができるペプチド配列を含んでもよい。さらに、マトリクスメタロプロテ
ナーゼは、-Gly-Pro-Y-Gly-Pro-Z-、-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Z-、-Gly-Pro-Ile-G
ly-Pro-Z-、または-Ala-Pro-Gly-Leu-Z-を含んでもよく、式中、YおよびZはアミ
ノ酸である。好ましくは、マトリクスプロテナーゼは、-Leu-Gly-または-Ile-Gl
y-を含む。さらに、コラゲナーゼ切断可能ペプチド配列は、-Pro-Leu-Gly-Pro-D
-Arg-Z-、-Pro-Leu-Gly-Leu-Leu-Gly-Z-、-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Trp-、-Pr
o-Leu-Gly-Cys(Me)-His-、-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-、-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-
Ala-Arg-、または-Pro-Leu-Ala-Tyr-Ala-Arg-を含んでもよく、式中Zはアミノ酸
である；ストロメリシン切断可能ペプチド配列は、-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Trp-Met-A
rg-を含んでもよい；およびゼラチナーゼ切断可能ペプチド配列は、-Pro-Leu-Gl
y-Met-Trp-Ser-Arg-を含んでもよい。
【００６４】 もう一つの好ましい態様において、リンカーは、アンジオテンシン転換酵素が
-Asp-Lys-Pro-、-Gly-Asp-Lys-Pro、または-Gly-Ser-Asp-Lys-Pro-を含んでもよ
い、アンジオテンシン転換酵素によって切断することができるペプチド配列を含
んでもよい。
【００６５】 もう一つの好ましい態様において、リンカーは、リンカーが-(Glu)n-を含んで
もよく、nが１〜10までの整数である、前立腺特異抗原または前立腺特異的膜抗
原によって切断することができるペプチド配列を含んでもよい。
【００６６】 生物活性物質、D 生物活性物質Dは、リンカーLと共有結合するために、少なくとも１つの化学官
能基（例えば、ヒドロキシル、アミノ、チオール、アルキルもしくはアリールジ
スルフィド、イソチオシアネート、チオカルボニルイミダゾール、塩化チオカル
ボニル、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、カルボン酸エステル、スルホン酸、
スルホン酸エステル、塩化スルホン酸、リン酸、アルキルもしくはアリールスク
シニミジルカーボネート、アルキルもしくはアリールクロロカーボネート、アル
キルもしくはアリールスクシニミジルチオカーボネート、アルキルもしくはアリ
ールクロロチオカーボネート、ハロゲン化物、またはチオエステル官能基を含む
がこれらに限定しない）を有する、生物学的に有用な物質、類似体、もしくは代
謝物、またはいくつかの系の混合物からなる。
【００６７】 本発明の系によって輸送してもよい生物活性物質には、鎮痛薬、麻酔薬、抗真
菌薬、抗生物質、抗炎症薬、駆虫薬、解毒剤、制吐剤、抗ヒスタミン剤、抗高血
圧剤、抗マラリア薬、抗微生物剤、抗精神剤、解熱剤、抗敗血症剤、抗関節炎剤
、抗結核剤、鎮咳剤、抗ウイルス剤、心作用薬、下剤、化学療法剤、コルチコイ
ド（ステロイド）、抗うつ剤、抑制剤、診断補助剤、利尿剤、酵素、去痰剤、ホ
ルモン剤、催眠剤、無機質、栄養補助剤、副交感神経模倣薬、カリウム補助剤、
放射線増感剤、鎮静剤、スルホンアミド、刺激剤、交感神経模倣薬、精神安定剤
、抗尿路感染剤、血管収縮剤、血管拡張剤、ビタミン、キサンチン誘導体等が含
まれるがこれらに限定しない。生物活性物質は、小さい有機分子、天然に単離さ
れた物質またはその類似体、またはペプチド骨格薬剤となりうる。生物活性薬は
また、DNA、RNA、DNA断片、RNA断片またはプラスミドを含んでもよい。
【００６８】 好ましい態様において、化学療法剤は、ナイトロジェンマスタード、エチレン
イミン、メチルメラミン、ニトロソウレア、アルキルスルホネート、トリアゼン
、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、ビンカアルカロイド、エピポ
ドフィロトキシン、抗生物質、酵素、生体反応修飾物質、プラチナ複合体、メチ
ルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、ソマトスタチン、ソマトスタチン類似体
、ホルモン、ホルモン拮抗剤、またはその組み合わせを含む。好ましくは、化学
療法剤はメソトレキセート、タキソール、アミノプテリン、ドキソルビシン、ブ
レオマイシン、カンプトテシン、エトポシド、エストラムスチン、プレドニムス
チン、メルファラン、ヒドロキシウレア、または5-フルオロウラシルを含む。
【００６９】 もう一つの好ましい態様において、ペプチド骨格薬剤は、サイトカイン、増殖
因子、細胞受容体アンタゴニスト、または細胞受容体アゴニストを含む。
【００７０】 もう一つの好ましい態様において、生物活性物質は、エプチフィバチドおよび
他の血小板結合蛋白質、顆粒球コロニー刺激因子、ヒト成長因子、血管内皮増殖
因子、骨形成蛋白質、インターフェロン、またはインターロイキンを含む。
【００７１】 水溶性重合体セグメント、P 水溶性重合体セグメントPは、多官能基化学部分Mに共有結合するために用いる
ことができる少なくとも２つの化学官能基（例えば、ヒドロキシル、アミノ、チ
オール、アルキルもしくはアリールジスルフィド、イソチオシアネート、チオカ
ルボニルイミダゾール、塩化チオカルボニル、アルデヒド、ケトン、カルボン酸
、カルボン酸エステル、スルホン酸、スルホン酸エステル、塩化スルホニル、リ
ン酸、アルキルもしくはアリールスクシニミジルカーボネート、アルキルもしく
はアリールクロロカーボネート、アルキルもしくはアリールスクシニミジルチオ
カーボネート、アルキルもしくはアリールクロロチオカーボネート、ハロゲン化
物またはチオエステル官能基を含むがこれらに限定しない）を含む比較的短い水
溶性重合体系（例えば、平均分子量400〜25,000）からなる。Pは、ポリ(エチレ
ングリコール)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレ
ート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸) 、ポリ(マレイン酸)、ポリ(リ
ジン)等または有機官能基におそらく置換されたこれらまたは他の重合体の混合
物からなる共重合体となりうるが、これらに限定されない。
【００７２】 共通の多官能基化学部分、Q 共通の多官能基化学部分Qは、短い水溶性重合体セグメントのk個にカップリン
グするようにデザインされている。これは、一般式３に説明する構造および化学
官能基を提供するようにデザインおよび合成される。 式中、X6は、重合体セグメントPと共有結合を形成するために用いることができ
る化学置換基である。X6は、ヒドロキシル、アミノ、チオール、アルキルもしく
はアリールジスルフィド、イソチオシアネート、チオカルボニルイミダゾール、
塩化チオカルボニル、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、カルボン酸エステル、
スルホン酸、スルホン酸エステル、塩化スルホニル、リン酸、アルキルもしくは
アリールスクシニミジルカーボネート、アルキルもしくはアリールクロロカーボ
ネート、アルキルもしくはアリールスクシニミジルチオカーボネート、アルキル
もしくはアリールクロロチオカーボネート、ハロゲン化物、またはチオエステル
官能基（おそらく、さらなる化学反応の前に除去することができる適当な保護基
によって置換される）となりうる、またはそれらに由来しうるが、これらに限定
されない。Jは、当初、反応性官能基を離れさせて最終的な重合薬物接合体の集
合にとって最適な化学および立体環境を提供し、最終的に、本発明の構築物の最
適な生物活性を可能にするために、重合体セグメントPとリンカーLとを分離させ
るスペーサーとして作用する。Jは、独立して、炭素原子100個まで、好ましくは
20個を含む飽和および不飽和、直鎖および分岐鎖アルキル、アリール、アルキル
アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、またはヘテロアルキルアリール鎖
からなりうるが、これらに限定しない。
【００７３】 好ましい態様において、共通の多官能基化学部分には、ペンタエリスリトール
、デンドリマー、または分岐リジン鎖が含まれる。
【００７４】 重合薬物接合体集合経路 本発明に記載する本発明の重合薬物接合体を集合させるために用いることがで
きるいくつかの合成経路が存在する。
【００７５】 構築物、ポリ[D-L-M-P] 集合方法I 反応スキーム１に説明する集合方法は、まず、リンカーLと生物活性薬Dとの共
有カップリングを必要とし、接合体D-Lを生成する。次に、D-L構築物を多官能基
化学部分Mに反応させて、系D-L-Mを生成する。 反応スキーム１
【００７６】 次に、D-L-Mを適当な水溶性重合体セグメントPに共有カップリングさせて、所
望の規則的な反復直鎖状重合薬物接合体であるポリ[D-L-M-P]を生じる。
【００７７】 集合方法II またはリンカーLを、まずMとカップリングさせてL-Mを生成する（反応スキー
ム２を参照のこと）。 反応スキーム２
【化８】
【００７８】 この経路の第二の反応は、L-Mの物質Dへの化学カップリングを必要とし、D-L-
Mを生成して、次に、適当な重合系Pに結合させて、本発明の構築物ポリ[D-L-M-P
]を生成する。
【００７９】 集合方法III または、Mをまず、リンカーLとカップリングさせて（反応スキーム３を参照の
こと）、接合体L-Mを調製する。次に、L-MをPと、次にDと反応させて、本発明の
構築物を調製する。 反応スキーム３
【００８０】 構造の略語の説明に関しては一般式４を参照のこと。この合成経路において用
いる反応条件に応じて、産物構築物は、生物活性物質Dによって置換した各リン
カーLを有しても有しなくてもよい。
【００８１】
【００８２】 集合方法IV または、Mを重合体Pに共有結合させて、構築物ポリ[M-P]を生成することがで
きる（反応スキーム４を参照）。次に、共重合接合体をリンカーLに反応させて
、ポリ[L-M-P]を生成し、次にこれを生物活性物質Dにカップリングさせて、産物
ポリ[D-L-M-P]を生成する。 反応スキーム４
【００８３】 この合成経路において用いられる反応条件に応じて、産物構築物は、生物活性
物質Dに置換した各リンカーLを有しても有しなくてもよい。
【００８４】 集合方法V または、MをPと反応させて、反応スキーム５に示すように、重合接合体ポリ[M
-P]を形成することができる。 反応スキーム５
【００８５】 次に、D-Lを個々に合成して、ポリ[M-P]に結合させて、本発明の構築物ポリ[D
-L-M-P]を生成することができる。この合成経路において用いられる反応条件に
応じて、産物構築物は、D-Lに置換した各多官能基部分Mを有しても有しなくても
よい。
【００８６】 構築物、Q(-P-L-D)k 集合方法VI 分岐重合薬物接合体Q(-P-L-D)kの集合を反応スキーム６に説明する。リンカー
Lを生物活性物質Dと最初に共有カップリングさせ、共通の多官能基化学部分Qを
２つまたはそれ以上の水溶性重合体セグメントPと結合させた後に、得られた双
方の接合体を結合させることによって、本発明の構築物を生成する。 反応スキーム６
【００８７】 合成経路において用いる反応条件に応じて、産物構築物は、D-Lに置換した各
重合体セグメントPを有しても有しなくともよい。
【００８８】 集合方法VII または、Qを、まず２つまたはそれ以上の重合体セグメントPとカップリングさ
せて、Q(-P)kを生成することができる（反応スキーム７を参照）。
【００８９】 反応スキーム７
【００９０】 この経路の第二の反応は、Q-(P)kとリンカーLとの化学カップリングを必要と
し、Q-(P-L)kマクロマーを生成して、これを次に適当な生物活性物質Dに結合さ
せて、本発明の構築物Q(-P-L-D)kを生成する。この合成経路において用いる反応
条件に応じて、産物構築物は、生物活性物質Dによって置換した各リンカーを有
しても有しなくともよい。
【００９１】 集合方法XIII または、生物活性物質Dを、最初にリンカーLにカップリングさせて（反応スキ
ーム８を参照）、接合体L-Dを調製する。次に、L-DをPと反応させて、マクロマ
ーP-L-Dを生成し、次にこれを共通の多官能基部分Qに結合させて、本発明の構築
物を調製する。 反応スキーム８
【００９２】 重合薬物接合体、ポリ[D-L-M-P]およびQ[-P-L-D]kの化学的集合方法 本発明の構築物は、構造部分D、L、PおよびMをD、LおよびQと共有カップリン
グさせることによって集合する。これらの単位は、重合薬物接合体の様々な単位
間の安定な共有結合の形成を可能にするように選択される置換基X1〜X6によって
結合される。
【００９３】 薬学的活性物質DのリンカーLとの結合 多くの薬剤、類似体または代謝物Dは、リンカーLとの共有結合の形成のために
反応性置換基を有する、または有するように改変することができる。または、ス
ペーサー基をDに結合させて、Lとの結合を可能にすることができる。先に述べた
ように、これらの置換基は、ヒドロキシル、アミノ、チオール、アルキルもしく
はアリールジスルフィド、イソチオシアネート、チオカルボニルイミダゾール、
塩化チオカルボニル、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、カルボン酸エステル、
スルホン酸、スルホン酸エステル、塩化スルホニル、リン酸、アルキルもしくは
アリールスクシニミジルカーボネート、アルキルもしくはアリールクロロカーボ
ネート、アルキルもしくはアリールスクシニミジルチオカーボネート、アルキル
もしくはアリールクロロチオカーボネート、ハロゲン化物、またはチオエステル
官能基（おそらく、さらなる化学反応の前に除去することができる適当な保護基
によって置換される）となりうる、またはそれらに由来しうるが、これらに限定
されない。場合によっては、共有結合を開始または増強するために、さらなる試
薬をカップリング反応の際に加える。DとLとのカップリングにとって必要な試薬
および合成技術は、有機、ペプチド、またはオリゴヌクレオチド合成の当業者に
一般的に既知である。官能基X5およびX4がいずれもカップリング反応の際にL上
に存在する場合、X4はDとの反応を防止するために化学的に保護される。
【００９４】 薬剤および類似体の調製は、特に明記していない限り、平均的な当業者に既知
の技術を用いて行われる。
【００９５】 一つの態様において、L上の官能基X5は、テトラペプチドFmoc-Cys(Dnp)-Glu-G
lu-Glu-Osu（化合物40）上のN-ヒドロキシスクシニミジルエステルであり、D上
の反応置換基は、抗癌剤類似体H-Leu-Gly(α-5-フルオロウラシル)-OH（化合物3
4）上のアミノ基である。共有カップリングしたアミド産物D-L（化合物41）を、
下記の反応スキーム９に示す。 反応スキーム９
【化９】
【００９６】 もう一つの態様において、X5は、テトラペプチドH-Leu-Gly-Pro-Ala-M-P（化
合物12）上のアミノ基であり、D上の反応官能基は、N-Fmoc-ドキソルビシン-14-
O-ヘミグルタレート（化合物13）のカルボン酸置換基である。活性化物質1,3-ジ
シクロヘキシルカルボジイミドを反応混合物に加えて、カップリング反応を起こ
させる。共有結合したアミン産物、規則的な反復直鎖状重合体ポリ[D-L-M-P]（
化合物14）を下記の反応スキーム10に示す。 反応スキーム10
【化１０】
【００９７】 もう一つの態様において、X5は、インテグリリン類似体（化合物19）のカルボ
ン酸官能基であり、D上の反応性官能基は、トリペプチドH-Val-Pro-Arg(Boc)2-O
Me（化合物20）上の末端アミノ基である。活性化物質、1,3-ジシクロヘキシルカ
ルボジイミドを反応混合物に加えて、カップリング反応を起こさせる。共有結合
したアミド産物D-L（化合物21）を、下記の反応スキーム11に示す。 反応スキーム11
【化１１】
【００９８】 もう一つの態様において、L上の官能基X5は、ペンタペプチドBoc-Gly-Pro-Leu
-Gly-Pro-Osu（化合物33）のN-ヒドロキシスクシニミジルエステルであり、D上
の反応性置換基は抗癌剤類似体H-Leu-Gly(α-5-フルオロウラシル)-OH（化合物3
4）上のアミノ基である。共有カップリングしたアミド産物D-L（化合物35）を、
下記の反応スキーム12に示す。 反応スキーム12
【化１２】
【００９９】 水溶性重合体セグメントPの多官能基化学部分Mへの結合 水溶性重合体セグメントPは、単量体Mとの共有結合のために少なくとも２つの
化学官能基を含む短い水溶性重合または共重合系からなる。PへのMのカップリン
グに必要な試薬および合成技術は、有機、ペプチド、またはオリゴヌクレオチド
合成の当業者に一般的に既知である。Pは、ポリエチレングリコール、ポリ(ビニ
ルアルコール)、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)
、ポリ(メタクリル酸) 、ポリ(マレイン酸)、またはその様々な共重合体もしく
は類似体となりうるが、これらに限定しない。様々な重合および類似体の調製は
、重合体合成の分野において平均的な知識を有する当業者に既知である標準的な
技術を用いて行われる。共通の多官能基部分Qの重合体セグメントPへの結合は、
MとPとの結合の場合と類似の合成反応によって行われる。
【０１００】 一つの態様において、M上のX1およびX2基は、いずれもアミノ官能基（化合物1
7）であり、重合体Pは、ポリエチレングリコール-1000のN-ヒドロキシスクシニ
ミジルカーボネート置換類似体（化合物16）である。得られたビスカルバメート
接合体である規則的な反復直鎖共重合P-M（化合物18）を、下記の反応スキーム1
3に示す。 反応スキーム13
【化１３】
【０１０１】 もう一つの態様において、X1およびX2はいずれもヒドロキシ基（化合物７）で
あり、P上の反応性官能基（化合物８）は、トルエンスルホネートエステルであ
る（下記の反応スキーム14を参照のこと）。塩基性の水素化ナトリウムを反応混
合物に加えて、共有カップリングを開始させ、エーテル産物である規則的な反復
直鎖状重合体ポリ[M-P]（化合物９）を生成する。 反応スキーム14
【化１４】
【０１０２】 リンカーLの多官能基化学部分Mへの結合 リンカーLの多官能基化学部分Mへのカップリングは、L上の官能基X4およびM上
のX3を用いて行う。置換基X3およびX4は、ヒドロキシル、アミノ、チオール、ア
ルキルもしくはアリールジスルフィド、イソチオシアネート、チオカルボニルイ
ミダゾール、塩化チオカルボニル、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、カルボン
酸エステル、スルホン酸、スルホン酸エステル、塩化スルホニル、リン酸、アル
キルもしくはアリールスクシニミジルカーボネート、アルキルもしくはアリール
クロロカーボネート、アルキルもしくはアリールスクシニミジルチオカーボネー
ト、アルキルもしくはアリールクロロチオカーボネート、ハロゲン化物、または
チオエステル官能基（おそらく、さらなる化学反応の前に除去することができる
適当な保護基によって置換される）となりうる、またはそれらに由来しうるが、
これらに限定されない。LとMとのカップリングにとって必要な試薬および合成技
術は、有機、ペプチド、またはオリゴヌクレオチド合成の当業者に一般的に既知
である。
【０１０３】 一つの態様において、X3基は、重合系Pに既に結合しているM上のアミン（化合
物10）であり、X4は、リンカーL上のカルボン酸（化合物11）であり、これはイ
ンサイチューで1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミドによって活性化されて、本
発明の構築物のポリ[L-M-P]部分を形成する。得られた産物（化合物12）を、反
応スキーム15に示す。 反応スキーム15
【化１５】
【０１０４】 もう一つの態様において、X3は、化合物32上の酸ヒドラジドであり、X4は、化
合物38上のアルデヒドである（反応スキーム16を参照のこと）。 反応スキーム16
【化１６】
【０１０５】 もう一つの態様において、X3は、化合物50上のピリジルジスルフィドであり、
X4は、化合物42上のチオール基である（反応スキーム17を参照のこと）。 反応スキーム17
【化１７】
【０１０６】 酵素的に切断可能なリンカーLの調製 リンカーLは、標準的な合成方法論を用いて集合し、個々の生物活性物質Dを本
発明の重合薬物接合体の重合足場構造に結合するようにデザインされる。これは
また、その切断によって、生物活性物質またはその類似体が重合構築物から放出
される、１つまたはそれ以上の酵素的に切断可能な結合を有するように操作され
る。リンカーLはまた、１つまたはそれ以上の加水分解、酸化、または光分解に
よって切断可能な化学結合を含むスペーサー基R4およびR5を含んでもよい。Lは
、２つの活性官能基R4およびR5を含むため、これらの官能基の１つまたはそれ以
上は、構築物の集合の際に化学的に保護して、必要であれば脱保護することがで
きる（化学保護基および脱保護条件の詳細なリストは、グリーン（Greene）ら、
「有機合成における保護基（Protective Groups in Organic Synthesis）」、ジ
ョン・ウィリー＆サンズ、ニューヨーク州、1981に認められる）。
【０１０７】 リンカーの酵素的に切断可能な結合は、連結基の酵素に対する暴露の増強を可
能にするために、または切断のために最適な化学環境を提供するために、スペー
サー基によって共重合骨格および生物活性物質から離れていてもよい。
【０１０８】 炭素原子20個までを含んでもよい飽和および不飽和、直鎖および分岐鎖アルキ
ル、アリール、またはアルキルアリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、ま
たはヘテロアルキルアリール基によって結合した、アミノ酸、糖、核酸、または
他の有機化合物から、独立して構成される、またはこれらの組み合わせからなる
Lの集合は、有機、ペプチド、およびオリゴヌクレオチド化学の技術分野の平均
的な当業者に既知の試薬および技術によって行うことができる。
【０１０９】 特定の態様において、酵素的に切断可能なリンカーは、標準的なアミノ酸カッ
プリング技術を用いて集合することができるトリペプチドFMOC-Cys(DNP)-Glu(Ot
Bu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OSuに由来する（ロイド・ウィリアムス（Lloyd-Willi
ams）ら、「ペプチドと蛋白質の合成に対する化学的アプローチ（Chemical Appr
oaches to the Synthesis of Peptides and Proteins）」、CRC出版、ニューヨ
ーク州、1997を参照のこと）。
【０１１０】 もう一つの態様において、切断可能なリンカーは、トリペプチドH-Val-Pro-Ar
g(Boc)2-OMeに由来する。
【０１１１】 もう一つの態様において、切断可能なリンカーは、テトラペプチドH-Leu-Gly-
-Pro-Ala-OHに由来する。
【０１１２】 もう一つの態様において、切断可能なリンカーは、ペンタペプチドH-Gly-Pro-
Leu-Gly-Pro-OSuに由来する。
【０１１３】 多官能基化学部分Mの調製 多官能基化学部分Mは、平均的な当業者に既知の試薬および技術を用いて調製
される。Mは活性官能基３個、X1、X2、およびX3を含むため、これらの官能基の
１つまたはそれ以上を、合成の際に化学的に保護して、必要であれば脱保護する
ことができる。構築物の１つの部分を別の部分に結合させるために用いることが
できる多くの反応の詳細に関しては、マーチ（March, J.）：「高等有機化学（A
dvanced Organic Chemistry）」、第４版、ジョン・ウィリー＆サンズ、ニュー
ヨーク州、1992年を参照のこと。有機、ペプチド、およびヌクレオチド部分上の
反応性官能基を調製するために用いることができる反応の説明に関しては、ラロ
ック（Larock, R.C.）の「包括的成分変換（Comprehensive Transformation）」
、VCH、ニューヨーク州、1989年；ボダンスキー（Bodansky, M.）の「ペプチド
合成の原理（Principles of Peptide Synthesis）」、スプリンガー出版、ニュ
ーヨーク、1984年、およびミズノ（Mizuno, Y.）の「核酸の有機化学（The Orga
nic Chemistry of Nucleic Acids）」、エルゼビア、ニューヨーク、1986年を参
照のこと。
【０１１４】 ４つの多官能基化学部分Mまたはその前駆体の構造を下記の図１に示す。 図１
【化１８】
【０１１５】 共通の多官能基化学部分Qの調製 本発明の分岐重合薬物接合体を調製するために用いられる多官能基化学部分Q
は、平均的な当業者に既知の試薬および技術を用いて調製される。Qは、重合体
セグメント単独と反応するようにデザインされる多数の反応性官能基X6を含むた
め、保護基は通常必要でない。しかし、場合によっては、１つ以上のタイプの生
物活性物質D、酵素的切断リンカーLまたは水溶性重合体セグメントPが、単一の
本発明の重合薬物接合体上で望ましい場合、反応性官能基のいくつかを、特定の
合成段階のあいだに保護して、必要に応じて脱保護してもよい。構築物の１つの
部分を別の部分に結合させるために用いることができる多くの反応の詳細に関し
ては、マーチ（March, J.）：「高次有機化学（Advanced Organic Chemistry）
」、第４版、ジョン・ウィリー＆サンズ、ニューヨーク州、1992年を参照のこと
。有機、ペプチド、およびヌクレオチド部分上の反応性官能基を調製するために
用いることができる反応の説明に関しては、ラロック（Larock, R.C.）の「包括
的成分変換（Comprehensive Transformation）」、VCH、ニューヨーク州、1989
年；ボダンスキー（Bodansky, M.）の「ペプチド合成の原理（Principles of Pe
ptide Synthesis）」、スプリンガー出版、ニューヨーク、1984年、およびミズ
ノ（Mizuno, Y.）の「核酸の有機化学（The Organic Chemistry of Nucleic Aci
ds）」、エルゼビア、ニューヨーク、1986年を参照のこと。
【０１１６】 ２つの多官能基モノマー態様Qの構造を下記の図２に示す。 図２
【化１９】
【０１１７】 薬物放出のメカニズム 生物活性物質Dを、リンカーLに存在する酵素的に切断可能な結合によって、重
合薬物接合体ポリ[D-L-M-P]およびQ[-P-L-D]kに共有カップリングさせる。いず
れかの接合体からのDの放出速度は、インビボでの切断メカニズムに依存するで
あろう。Dは、生物学的もしくは生理学的プロセス、または化学反応によって構
築物から切断することができる。Dは、重合薬物接合体から直接、または複合体D
-L'の形のいずれかで（Lの全てまたは一部にカップリングしたDを含む化合物が
）放出されるであろう。Dの放出は、酵素的または非酵素的プロセスの双方の組
み合わせを含んでもよい。
【０１１８】 活性物質Dの放出に至る切断（単段階または多段階）は、非酵素的プロセスに
よって行ってもよい。例えば、化学的加水分解（例えば、エステル結合で）は、
生物に輸送された際の、接合体ポリ[D-L-M-P]の単純な水和によって開始しても
よい。加水分解的切断は、複合体L-Dまたは遊離の活性化合物Dを放出する可能性
がある。切断はまた、pHの変化によって開始することができる。例えば、プロド
ラッグ接合体ポリ[D-L-M-P]を、輸送前に最小の緩衝酸または塩基pH溶液に溶解
してもよい。プロドラッグ接合体ポリ[D-L-M-P]のLとDまたはMとLの間の結合は
、生理的pH 7.4での高度の化学的不安定性を特徴とし、このように、接合体が生
物の組織または循環系に輸送された場合に切断され、活性物質Dまたは複合体L-D
を放出するであろう。必要であれば、化学的または酵素的である第二の反応によ
って、複合体L-DからのDの切断が起こるであろう。N-マンニッヒ塩基結合がこの
タイプの活性を示すことは、当技術分野で既知である。
【０１１９】 切断はまた、酸化／還元反応によって起こりうる。例えば、ジスルフィド結合
を、プロドラッグ接合体ポリ[D-L-M-P]のLとDまたはMとLのあいだに作製するこ
とができる。そのようなプロドラッグ複合体は生理的pHにおいて安定であり、プ
ロドラッグ接合体ポリ[D-L-M-P]のLとDまたはMとLのあいだの結合は、グルタチ
オンの存在下のような還元環境において高度の化学的不安定性を特徴とするであ
ろう。必要であれば、化学または酵素的のいずれかである第二の反応によって、
複合体L-DからDの切断が起こるであろう。
【０１２０】 蛋白質分解酵素は、感染物質からの生体シグナル、血液媒介サイトカイン、疾
患組織自身、または疾患組織近傍の体液の結果として疾患組織および臓器におい
て、または近傍で産生される。本発明において、連結基Lは、接合体ポリ[D-L-M-
P]のLとD、またはMとLの間で切断されるようにデザインされる。そのような蛋白
質分解酵素は、処置した生物または微生物感染症の結果として起こりうる。その
ような酵素の例には、メタロプロテナーゼおよび他の細胞外マトリクス成分プロ
テアーゼ（コラゲナーゼ、ストロメリシン、マトリリシン、ゼラチナーゼ、およ
びエラスターゼを含む）、ライソゾーム酵素（カテプシンを含む）、セリンプロ
テアーゼ、および凝固カスケードの他の酵素（トロンビンのような）、小胞体酵
素（チトクロームP450酵素、加水分解反応酵素、および結合反応酵素のような）
、非特異的アミノペプチダーゼおよびエラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、
ホスファターゼ、糖分解酵素、ならびに特定の疾患状態の際に存在する他の酵素
（アンジオテンシン転換酵素のような）が含まれるがこれらに限定しない。トロ
ンビン様のアラニンアミノペプチダーゼおよびエラスターゼ様酵素活性は、細菌
感染症において一般的であり、そのような酵素のアミノ酸切断配列は十分に報告
されている。
【０１２１】 構築物ポリ[D-L-M-P]およびQ[-G-L-D]kにおいて、疾患組織において、または
その近傍で連結基Lを切断するために用いることができる可能性があるアミノ酸
配列については多くの例が文献に報告されている。例えば、トロンビン（凝固カ
スケードの際に活性化されるセリンプロテアーゼ）は、以下の配列におけるArg-
Gly結合を切断する：
【０１２２】 マトリクスメタロプロテナーゼ（MMPs）および他のマトリクスプロテアーゼは
、治癒および代謝において多く存在する。しかし、この酵素ファミリーはまた、
慢性炎症、関節炎および癌を含む様々な病理プロセスに関係している。特に、MM
Psは腫瘍の増殖の際に活性であり、転移にとって必要である。１つの主要な細胞
外蛋白質はコラーゲンであり、これは特徴的な反復性のアミノ酸配列：-Gly-Pro
-Y-Gly-Pro-Z（式中、YおよびZは、ProおよびHyProを除くいかなるアミノ酸であ
ってもよい）を有する。マトリクスメタロプロテナーゼおよび他の細胞外マトリ
クスプロテアーゼは、Leu-GlyまたはIle-Gly結合で主に切断する。このファミリ
ーの酵素によって切断されるアミノ酸配列には、以下が含まれるがこれらに限定
しない：
【０１２３】 このファミリーの酵素によって切断される他の配列には、以下が含まれるがこ
れらに限定しない：
【０１２４】 疾患のために上方制御され、従って、本発明において用いることができる酵素
のもう一つの例は、アンジオテンシン転換酵素である。この酵素は、以下を含む
がこれらに限定しないアミノ酸配列で切断する：
【０１２５】 疾患組織の部位での細胞は、生体においてかなり低い濃度で存在する多数の酵
素、増殖因子、およびサイトカインを産生するであろう。例えば、分泌型および
細胞表面酵素を産生する炎症に関連する細胞には：顆粒球（好中球、好酸球、好
塩基球）、単球／マクロファージ、およびリンパ球が含まれる。活性化マクロフ
ァージは、エラスターゼ、コラゲナーゼ、および他のMMPs、プラスミノーゲン活
性化因子、および他の蛋白質分解酵素を分泌することが知られている。活性化腹
腔マクロファージは、過酸化水素を産生することが知られており、これは本発明
のプロドラッグ接合体からDを切断するために用いることができる。炎症部位で
活性化された好酸球は、ライソゾーム酵素、ペルオキシダーゼ、ヒスタミナーゼ
、および他の酵素を産生する。疾患特異的切断酵素のもう一つの例として、様々
な癌細胞（例えば、前立腺癌）は、特異的アミノ酸配列を切断する分泌型または
細胞表面酵素を産生する。
【０１２６】 4.実施例 4.1 本発明の薬物結合重合接合体、14の集合 この実施例（合成経路1を参照）は、生物活性物質、D、がFmoc-ドキソルビシ
ン-14-O-ヘミグルタレートから誘導され、リンカーの酵素的に切断された領域、
(L1-Ln)、がテトラペプチド、Val-Gly-Pro-Ala、であり、多官能性化学部分、M
、が化合物7であり、水溶性重合体セグメント、P、が平均分子量が約2000(PEG-2
000)のポリ（エチレングリコール）である、本発明の規則的反復鎖状重合薬物接
合体の生成法を記載している。 合成経路1
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【０１２７】 アミド、3の生成 磁気撹拌子、温度計、およびドリエライト(Drierite)充填乾燥用チューブを備
えた清潔で乾燥した500mLの丸底フラスコに、200mLのジクロロメタン、3.83g(10
mmol)のN-フルオレニルメトキシカルボニル-O-tert-ブチルセリン、1、(Bachem,
King of Prussia, PA)、1.94g(10mmol)のN-(ベンジルオキシカルボニル)-エタ
ン-1,2-ジアミン、2(Dennyら、Synthesis, 1984, 1032の方法により生成した)お
よび2.06g(10mmol)の1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド(Aldrich, Milwaukee
, WI)を添加する。得られた溶液を室温において5時間磁気的に撹拌し、次いで50
mLの水を加える。反応混合物をろ過し、水層を有機層から分離し、有機層を無水
硫酸ナトリウムで4時間乾燥する。スラリーをろ過し、溶媒を回転式エバポレー
タで留去すると粘性のオイルが残る。適当な溶媒を使用して蒸留残渣を結晶化す
ると精製生成物、アミド、3が得られる。
【０１２８】 アミン、4の生成 磁気撹拌子、温度計、およびドリエライト(Drierite)充填乾燥用チューブを備
えた清潔で乾燥した250mLの丸底フラスコに、5.59g(10mmol)の3、100mLのN,N-ジ
メチルホルムアミドおよび11mLのピペリジン(Aldrich)を添加する。反応混合物
を室温において磁力的に1.0時間撹拌し、次いで溶媒を回転式エバポレータで留
去する。蒸留残渣に250mLの適当な溶媒を加えてまぜあわせ、得られた沈殿をろ
過し、単離された固形物を減圧下で乾燥してアミン、4を得る。
【０１２９】 テトラヒドロピラニルエーテル、6の生成 温度計、磁気撹拌子、およびドリエライト(Drierite)充填乾燥用チューブを備
えた250mLの丸底フラスコに100mLのジクロロメタン、0.90gのメチルグリコレー
ト、5、(10mmol,Aldrich)0.84gの3,4-ジヒドロ-2H-ピラン(10mmol,Aldrich)およ
び0.1gのp-トルエンスルホン酸触媒を添加する。得られた溶液を室温において2
時間磁力的に撹拌し、次いで溶媒を回転式エバポレータで留去する。0.44gの水
酸化リチウム一水和物(11mmol)を含む75mLのメタノールおよび25mLの水からなる
溶液を添加し、得られたスラリーを5℃において15時間撹拌する。反応混合物が
中和されるまで、0.1Nの塩酸水溶性を徐々に添加し、かつ100mLのジクロロメタ
ンを添加する。有機層を水層から分離し、有機層を無水硫酸ナトリウムで4時間
乾燥し、ろ過し、溶媒を回転式エバポレータで留去してテトラヒドロピラニルエ
ーテル、6を得る。
【０１３０】 アミド、7の生成 温度計、ドリエライト(Drierite)充填乾燥用チューブおよび磁気撹拌子を備え
た清潔で乾燥した500mLの丸底フラスコに、200mLのジクロロメタン、1.60g(10mm
ol)のテトラヒドロピラニルエーテル、6、3.37g(10mmol)の4、および2.06g(10mm
ol)の1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド(Aldrich)を添加する。反応混合物を
室温において磁力的に6時間撹拌し、次いで50mLの水を添加する。スラリーをろ
過し、水層を有機層から分離し、有機層を無水硫酸ナトリウムで4時間乾燥する
。得られた混合物をろ過し、溶媒を回転式エバポレータで留去し、酢酸：テトラ
ヒドロ-フラン：水＝4:2:1溶液100mLを添加する。反応混合物を45℃までの温度
で3.5時間加熱し、溶媒を回転式エバポレータで留去し、適当な溶媒を使用して
蒸留残渣を結晶化し、精製生成物アミド、7を得る。
【０１３１】 ポリ(エチレングリコール)-2000ジ-4-トルエンスルホネート(DTS-PEG2000)、8の
生成 温度計、添加ロート、磁気撹拌子および乾燥N2導入-流出口を備えた清潔で乾
燥した500mLの丸底フラスコに、3.0g(1.5mmol)のポリ(エチレングリコール)平均
分子量2000(Aldrich)、75mLのピリジン、および1.14g(6.0mmol)の塩化トルエン
スルホニルを添加する。反応混合物を0℃において12時間磁力的に撹拌し、次い
で300mLの氷水に注ぐ。水溶液を100mLの塩化メチレンで3回抽出し、有機層をあ
わせて無水硫酸ナトリウムで4時間乾燥し、ろ過し、溶媒を回転式エバポレータ
で留去する。適当な溶媒を使用して蒸留残渣を結晶化し、精製重合生成物、8を
得る。
【０１３２】 重合接合体、9の生成 温度計、添加ロート、磁気撹拌子および乾燥N2導入-流出口を備えた500mLの丸
底フラスコに、60%水素化ナトリウムのミネラルオイル分散液0.86g(2.2mmol)を
添加する。分散液を乾燥窒素ブランケット下、分散液を25mLのヘキサンで3回洗
浄し、次いで250mLの乾燥テトラヒドロフラン（ナトリウムベンゾフェノンケタ
ールと共に還流することによって乾燥した）を反応フラスコに添加する。次いで
、0.34g(1 mmol)のアミド、7を50mLのテトラヒドロフランに加えた溶液を滴加し
、次に2.0g(1 mmol)のDTS-PEG2000、8、および0.5gの18-クラウン(Crown)-6（Al
drich）を添加する。反応混合物を加熱還流し、室温において8時間撹拌し、次い
で、0.1N HClを徐々に添加して反応混合物を酸性化する。溶媒を回転式エバポレ
ータで留去し、蒸留残渣を30mLの水で溶解する。水溶液を蒸留水で透析し（分子
量カットオフ値が12,000〜14,000のスペクトラポア膜）、得られた溶液を凍結乾
燥して重合接合体、9を得る。生成物の平均分子量は、PEG標準品と比較してGPC
によって求める。
【０１３３】 重合接合体、10の生成 200mLの水素化フラスコに1.0g(0.5mmol)の接合体、9、100mLの酢酸、および0.
1gの5%パラジウム炭素触媒を添加する。反応混合物を振とうし、40psiの水素で
室温において16時間水素化する。反応溶液をセライトパッドでろ過し、溶媒を回
転式エバポレータで留去して粘性のオイルを得る。蒸留残渣を30mLの水で溶解す
る。水溶液を蒸留水で透析し（分子量カットオフ値が12,000〜14,000のスペクト
ラポア膜）、得られた溶液を凍結乾燥して重合接合体、10を得る。
【０１３４】 ペプチド置換した重合接合体、12の生成 磁気撹拌子、温度計、ドリエライト(Drierite)充填乾燥用チューブ、および添
加ロートを備えた500mLの丸底フラスコに、1.0g(0.5mmol)の重合接合体、10、20
0mLのジクロロメタン、0.23g(0.5mmol)のBoc-Leu-Gly-Pro-Ala-OH、11、(Bachem
)および0.11g(5mmol)の1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド（Aldrich）を添加
する。反応混合物を室温において4時間磁力的に撹拌し、次いで50mLの水を添加
し、有機層を水層から分離し、水層を100mLのジクロロメタンで3回に分けて抽出
する。有機層を合わせて、100mLの飽和塩化ナトリウム水溶液で1回洗浄し、無水
硫酸ナトリウムで4時間乾燥し、ろ過し、溶媒を回転式エバポレータで留去する
。25mLの3N HClおよび50mLの酢酸エチルを蒸留残渣に添加し、得られるスラリー
を室温において0.5時間撹拌する。溶媒を回転式エバポレータで留去し、残渣を2
5mLの水に溶解し、水溶液を蒸留水で透析する（分子量カットオフ値が12,000〜1
4,000のスペクトラポア膜）。溶液を凍結乾燥してペプチド置換重合接合体、12
を得る。アミノ酸分析を実施して、10に結合するペプチド、11の量を求める（セ
リンに対するロイシン、グリシン、プロリンおよびアラニンの比を求めることに
よる）。
【０１３５】 本発明の薬物結合重合構築物、14の生成 磁気撹拌子、温度計、ドリエライト(Drierite)充填乾燥用チューブ、および添
加ロートを備えた500mLの丸底フラスコに0.5g(0.25mmol)の重合接合体、12、200
mLのジクロロメタン、0.40g(0.25mmol)のN-FMOC-ドキソルビシン-ヘミグルタレ
ート(Schallyら、Proc. Natl. Acad. Sci.,USA, 1996, 93, 7269の方法によって
生成した)、および0.06g(0.3mmol)の1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ald
rich）を添加する。反応混合物を室温において4時間磁力的に撹拌し、次いで50m
Lの水を添加し、有機層を水層から分離し、水層を100mlのジクロロメタンで3回
に分けて抽出する。有機層を合わせて、100mLの飽和塩化ナトリウム水溶液で1回
洗浄し、無水硫酸ナトリウムで4時間乾燥し、ろ過し、溶媒を回転式エバポレー
タで留去する。1mLのピペリジンを5mLのN,N-ジメチルホルムアミドに加えたもの
を蒸留残渣に添加し、得られるスラリーを室温において5分間撹拌する。溶媒を
回転式エバポレータで留去し、残渣を25mLの水に溶解し、水溶液を蒸留水で透析
する（分子量カットオフ値が12,000〜14,000のスペクトラポア膜）。溶液を凍結
乾燥して本発明の薬物結合重合構築物、14を得る。14の平均分子量はGPC分析に
よって求め、生成構築物13の置換の程度はUVおよびNMR分光法を使用して算出す
る。
【０１３６】 4.2 薬物結合重合接合体、22の集合 この実施例は、物質、D、がインテグリリン(N6-(アミノイミノメチル)-N2-(3-
メルカプト-1-オキソプロピル-L-リジルグリシル-L-アスパルチル-L-トリプトフ
ィル-L-プロリル-L-システインアミド、環状(1->6)-ジスルフィド)から誘導され
、リンカーの酵素的に切断された領域、(L1-Ln)、がトリペプチド、Val-Pro-Arg
、であり、多官能性化学部分、M、が化合物17であり、水溶性重合体セグメント
、P、が平均分子量が約1000(PEG1000)のポリ（エチレングリコール）である、規
則的に反復する鎖状重合薬物接合体の生成法（合成経路2を参照）を記載してい
る。 合成経路2
【化２３】
【化２４】
【化２５】
【０１３７】 N-フルオレニルメトキシカルボニル-トリス(2-アミノエチル)アミン、17の生成 磁気撹拌子、温度計、ドリエライト(Drierite)充填乾燥用チューブ、および添
加ロートを備えた500mLの丸底フラスコに、7.30g(50mmol)のトリス(2-アミノエ
チル)アミン、15(Aldrich)および200mLの1,4-ジオキサンを添加する。反応混合
物を5℃に冷却し、2.60g(10mmol)の9-フルオレニルメチルクロロカルボネート、
FMOC-Cl(Aldrich)を徐々に添加する。反応混合物を室温において12時間撹拌し、
次いで氷水に注ぐ。炭酸ナトリウム水溶液を使用して反応混合物のpHを8に調節
し、かつ水層を100mLのジクロロメタンで3回抽出する。有機層を合わせて、飽和
塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで4時間乾燥し、ろ過し、
溶媒を回転式エバポレータで留去する。適当な溶媒を使用して蒸留残渣を結晶化
して、N-フルオレニルメトキシカルボニル-トリス(2-アミノメチル)アミン、17
を得る。
【０１３８】 重合接合体、18の生成 磁気撹拌子、温度計、ドリエライト(Drierite)充填乾燥用チューブ、および添
加ロートを備えた清潔で乾燥した500mLの丸底フラスコに、0.37g(1mmol)のN-フ
ルオレニルメトキシカルボニル-トリス(2-アミノメチル)アミン、17、5.0mLの0.
1Mホウ酸緩衝液、pH9.3、およびポリ（エチレングリコール）平均分子量1000の
ビス-スクシンイミジルカルボネート、BSC-PEG-1000、16（Kohnら、Macromolecu
les, 1992, 25, 4476の手法を使用して生成した）1.14g(1mmol)を添加する。反
応混合物を15分間撹拌し、溶媒を回転式エバポレータで留去する。蒸留残渣を2m
Lのピペリジンと共に室温において15分間撹拌し、溶媒を回転式エバポレータで
留去する。蒸留に25mLの水を混合し、ろ過し、ろ液を蒸留水で透析する（分子量
カットオフ値が12,000〜14,000のスペクトラポア膜）。水溶液を凍結乾燥して重
合接合生成物、18を得る。PEG標準品に対するGPC分析を使用して、接合体の分子
量を求める。
【０１３９】 トリ-tert-ブチルオキシカルボニル保護したインテグリリン、19の生成 温度計および磁気撹拌子を備えた250mLの丸底フラスコに50mLの1,4-ジオキサ
ン、25mLの水、1mLの1N水酸化ナトリウム、および0.82g(1mmol)のインテグリリ
ン(N6-(アミノイミノメチル)-N2-(3-メルカプト-1-オキソプロピル-L-リジルグ
リシル-L-アスパルチル-L-トリプトフィル-L-プロリル-L-システインアミド、環
状(1->6)-ジスルフィド)を添加する。反応混合物を10℃に冷却し、1.44gのジ-te
rt-ブチルジカルボネート(6.6mmol,Aldrich)を添加する。得られる溶液を室温に
おいて1時間撹拌し、溶媒を回転式エバポレータで留去する。蒸留残渣を氷水浴
で冷却し、50mLの酢酸エチル中で撹拌する。pHが3になるまで、希釈したKHSO4溶
液を徐々に添加し、次いで水層を15mLの酢酸エチルで3回抽出する。有機層を合
わせて、50mLの水で2回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで4時間乾燥し、ろ過し、溶
媒を回転式エバポレータで留去する。好適な溶媒を使用して蒸留残渣を結晶化し
、保護された付加物、19を得る。
【０１４０】 ペプチド接合体、21の生成 磁気撹拌子およびドリエライト(Drierite)充填乾燥用チューブを備えた500mL
の丸底フラスコに、200mLのジクロロメタン、1.12g(1mmol)のインテグリリン類
似体、19、0.58g(1mmol, Bachem)のH-Val-Pro-Arg(Boc)2-OMe、20、および0.21g
(1mmol)の1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド（Aldrich）を添加する。得られ
る溶液を室温において5時間磁力的に撹拌し、次いで50mLの水を添加する。反応
混合物をろ過し、水層を有機層から分離し、有機層を無水硫酸ナトリウムで4時
間乾燥する。得られるスラリーをろ過し、ろ液を回転式エバポレータで留去して
シロップを得る。シロップを3mLメタノール中で1.1mLの1N水酸化リチウム溶液と
共に5℃で15時間撹拌し、次いで適当な溶媒で結晶化してペプチド接合体、21を
得る。
【０１４１】 本発明の薬物結合重合構築物、22の生成 磁気撹拌子、温度計、ドリエライト(Drierite)充填乾燥用チューブおよび添加
ロートを備えた500mLの丸底フラスコに、0.5g(0.5mmol)の重合接合体、18、200m
Lのジクロロメタン、0.84g(0.5mmol)の21および0.10g(0.3mmol)の1,3-ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（Aldrich）を添加する。反応混合物を室温において4時
間磁力的に撹拌し、50mLの水を添加し、有機層を水層から分離し、水層を100mL
のジクロロメタンで3回に分けて抽出する。有機層を合わせて、100mLの飽和塩化
ナトリウム水溶液で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで4時間乾燥し、ろ過し、溶
媒を回転式エバポレータで留去する。25mLの3N HClおよび50mLの酢酸エチルを蒸
留残渣に添加し、得られるスラリーを室温において30分間撹拌する。溶媒を回転
式エバポレータで留去し、残渣を25mLの水に溶解し、水溶液を蒸留水で透析する
（分子量カットオフ値が12,000〜14,000のスペクトラポア膜）。溶液を凍結乾燥
して本発明の薬物結合重合構築物、22を得る。22の平均分子量はGPC分析によっ
て求め、カルバメート結合の存在はIR分光法によって確認し、生成構築物の21の
置換の程度はUVおよびNMR分光法を使用して算出する。
【０１４２】 薬物結合重合接合体、39の集合 この実施例は、生物活性物質、D、がH-Leu-Gly-α(5-フルオロウラシル）-OH
から誘導され、リンカーの酵素的に切断された領域、(L1-Ln)、がヘプタペプチ
ド、Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Leu-Glyであり、多官能性化学部分、M、が化合物29で
あり、水溶性重合体セグメント、P、が平均分子量が約2000(PEG-2000)のポリ（
エチレングリコール）である、本発明の規則的反復鎖状重合薬物接合体の生成法
（合成経路3を参照）を記載している。 合成経路1
【化２６】
【化２７】
【化２８】
【化２９】
【０１４３】 p-ニトロフェニル酢酸、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、25の生成 磁気撹拌子、温度計およびドリエライト(Drierite)充填乾燥用チューブを備え
た清潔で乾燥した250mLの丸底フラスコに、1.81g(10mmol)のp-ニトロフェニル酢
酸（Aldrich）、23、200mLの1,2-ジメトキシエタン、1.15g(10mmol)のN-ヒドロ
キシスクシンイミド（Aldrich）、および2.06g(10mmol)の1,3-ジシクロヘキシル
カルボジイミド（Aldrich）を添加する。反応混合物を室温において12時間磁力
的に撹拌し、ろ過し、溶媒を回転式エバポレータで留去する。適当な溶媒を使用
して蒸留残渣を結晶化して、p-ニトロフェニル酢酸、N-ヒドロキシスクシンイミ
ジルエステル、25を得る。
【０１４４】 アミド、26の生成 磁気撹拌子、温度計およびドリエライト(Drierite)充填乾燥用チューブを備え
た清潔で乾燥した250mLの丸底フラスコに、2.78g(10mmol)のp-ニトロフェニル酢
酸、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、25、100mLの乾燥1,2-ジメトキシ
エタン、1.40mL(10mmol)のトリエチルアミン（Aldrich）、および2.10g(10mmol)
のp-ニトロフェニルアミン（Schweizerhall, South Plainfield, NJ）、24を添
加する。反応混合物を室温において14時間撹拌し、100mLの氷水を100mLのジクロ
ロメタンに加えた混合物抽出に注ぐ。反応混合物をろ過し、有機層を水層から分
離し、水層を100mLのジクロロメタンで2回転式エバポレータで留去する抽出する
。有機層を合わせて、200mLの飽和塩化ナトリウム水溶液で1回洗浄し、無水硫酸
ナトリウムで4時間乾燥し、ろ過し、溶媒を回転式エバポレータで留去する。適
当な溶媒を使用して蒸留残渣を結晶化し、アミド、26を得る。
【０１４５】 Boc保護されたヒドラジド、28の生成 磁気撹拌子およびドリエライト(Drierite)充填乾燥用チューブを備えた500mL
の丸底フラスコに、200mLのジクロロメタン、3.73g(10mmol)のアミド、26、1.60
g(10mmol、Aldrich)のN-tert-ブチルオキシカルボニル-1,2-ジアミノエタン（Al
drich）、27、および2.06g(1mmol)の1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ald
rich, Milwaukee, WI）を添加する。反応混合物を室温において5時間磁力的に撹
拌し、次いで50mLの水を添加する。反応混合物をろ過し、水層を有機層から分離
し、有機層を無水硫酸ナトリウムで4時間乾燥する。得られるスラリーをろ過し
、溶媒を回転式エバポレータで留去し、適当な溶媒を使用して蒸留残渣を結晶化
し、Boc保護されたヒドラジド、28を得る。
【０１４６】 ジアミン、29の生成 200mLの水素化フラスコに4.87g(10mmol)の、100mLのメタノールおよび0.3gの5
%Pd-C触媒（Aldrich）を添加する。得られるスラリーを40psiの水素で機械的に
振とうしながら室温において16時間水素化し、次いでセライトパッドでろ過する
。溶媒を回転式エバポレータでろ液から留去し、適当な溶媒を使用して蒸留残渣
を結晶化し、ジアミン、29を得る。
【０１４７】 5-フルオロウラシル置換したペプチド、35の生成 磁気撹拌子、温度計およびドリエライト(Drierite)充填乾燥用チューブを備え
た清潔で乾燥した250mLの丸底フラスコに、6.36g(10mmol)のBoc-Gly-Pro-Leu-Gl
y-Pro-Osu、33(Bachem)、3.16g(10mmol)のロイシル2-(5-フルオロウラシル-1-イ
ル)-L,D-グリシン、34(Putnamら、Bioconjugate Chem., 1995, 6, 483の方法に
よって生成した） 、100mLの乾燥1,2-ジメトキシエタンおよび1.40mL(10mmol)
のトリエチルアミン（Aldrich）を添加する。反応混合物を室温において5時間磁
力的に撹拌を室温において14時間撹拌し、ろ過し、溶媒を回転式エバポレータで
留去する。最小量のアセトニトリル水溶液で蒸留残渣を溶解し、次いでC-18逆相
HPLC（溶出液：アセトニトリル：水：0.1%トリフルオロ酢酸）を使用して精製す
る。回収した溶出分画を合わせて、溶媒を回転式エバポレータで留去して、オイ
ルを得、これを最小量の蒸留水に溶解する。水溶液を凍結乾燥して、アミン生成
物、35を得る。
【０１４８】 重合接合体、31の生成 磁気撹拌子、温度計、ドリエライト(Drierite)充填乾燥用チューブおよび添加
ロートを備えた清潔で乾燥した500mLの丸底フラスコに、4.27g(10mmol)のジアミ
ン、29、5mLのN,N-ジメチルホルムアミド、5.0mLの0.1Mホウ酸緩衝液、pH9.3お
よびポリ(エチレングリコール）平均分子量2000のビス-スクシンイミジルカルボ
ネート、BSC-PEG-2000、30(Kohnら、Macromolecules, 1992, 25, 4476の手法を
使用して生成した)22.80g(10mmol)を添加する。反応混合物を15分間撹拌し、溶
媒を回転式エバポレータで留去する。蒸留残渣を25mLの水と混合し、ろ過し、蒸
留水で透析する（分子量カットオフ値が12,000〜14,000のスペクトラポア膜）。
水溶液を凍結乾燥して重合接合生成物、31を得る。PEG標準品に対するGPCを使用
して接合体の分子量を求める。
【０１４９】 ペプチド付加物、37の生成 磁気撹拌子、温度計およびドリエライト(Drierite)充填乾燥用チューブを備え
た清潔で乾燥した250mLに、3.44g(10mmol)の酒石酸ジスクシンイミジル、36(Pie
rce)、100mLの乾燥1,2-ジメトキシエタン、1.40mL(10mmol)のトリエチルアミン
（Aldrich）、および7.37g(10mmol)の35を添加する。反応混合物を室温において
14時間磁力的に撹拌し、次いで氷水100mLをジクロロメタン100mLに加えたものに
注ぐ。反応混合物をろ過し、有機層を水層から分離し、水層を100mLのジクロロ
メタンで2回抽出する。有機層を合わせて、200mLの飽和塩化ナトリウム水溶液で
1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで4時間乾燥し、溶媒を回転式エバポレータで留
去する。適当な溶媒を使用して蒸留残渣を結晶化し、ペプチド付加物、37を得る
。
【０１５０】 ペプチドアルデヒド、38の生成 温度計および磁気撹拌子を備えた清潔で250mLの丸底フラスコに1.59g(2mmol)
のペプチド付加物、37および100mLの0.015Mの過ヨウ素酸ナトリウムを添加する
。リン酸ナトリウム緩衝液を使用して反応混合物のpHを7.0に調整し、反応混合
物を室温において2時間撹拌する。溶媒を回転式エバポレータで留去し、蒸留残
渣を水とアセトニトリルの1:1混合物の最小量に溶解する。得られる溶液を半精
製用の(semi-preparative)C18 HPLCカラムに注入し、水：アセトニトリル：0.1%
TFA濃度勾配を使用して生成物を溶出する。回収した分画を合わせて、凍結乾燥
し、ペプチドアルデヒド、38を得る。
【０１５１】 酸ヒドラジド置換重合接合体、32の生成 清潔で250mLの丸底フラスコに1.0gの重合接合体、31、25mLの水および5mLのト
リフルオロ酢酸を添加する。反応混合物を振とうし、溶媒を回転式エバポレータ
で留去する。蒸留残渣を最小量の水に溶解し、ろ過し、蒸留水で透析する（分子
量カットオフ値が12,000〜14,000のスペクトラポア膜）。水溶液を凍結乾燥して
酸ヒドラジド置換した重合接合生成物、32を得る。
【０１５２】 本発明の薬物結合重合接合体、39の生成 温度計および磁気撹拌子を備えた清潔で250mLの丸底フラスコに、50mLのリン
酸緩衝生理食塩液、pH5.0、1.0g(0.5mmol)の酸ヒドラジド置換した重合接合体、
32、および0.40g(0.5mmol)のペプチドアルデヒド、38を添加する。反応混合物を
室温において20時間撹拌し、次いで蒸留水で透析する。水溶液を凍結乾燥して本
発明の薬物結合重合接合生成物、39を得る。39の平均分子量はGPC分析によって
求め、カルバメート結合の存在はIR分光法によって確認し、生成構築物の38の置
換の程度はUVおよびNMR分光法を使用して算出する。
【０１５３】 4.4 薬物結合重合接合体、53の集合 この実施例は、生物活性物質、D、がH-Leu-Gly-α(5-フルオロウラシル）-OH
から誘導され、リンカーの酵素的に切断された領域、(L1-Ln)、がヘプタペプチ
ド、Cys-Glu-Glu-Glu-Leu-Glyであり、多官能性化学部分、M、が化合物51であり
、水溶性重合体セグメント、P、が平均分子量が約1000(PEG-1000)のポリ（エチ
レングリコール）である、規則的反復鎖状重合薬物接合体の生成法（合成経路3
を参照）を記載している。 合成経路1
【化３０】
【化３１】
【化３２】
【０１５４】 FMOC-L-Cys(DNP)-L-Glu(OtBu)-L-Glu(OtBu)-L-Glu(OtBu)-L-Leu-2(5-フルオロウ
ラシル-1-イル)-L,D-gly-OH、41の生成 磁気撹拌子、温度計およびドリエライト(Drierite)充填乾燥用チューブを備え
た清潔で乾燥した250mLの丸底フラスコに、11.62g(10mmol)のFmoc-Cys(2,4-ジニ
トロフェニル(DNP))-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Osu、40(Bachem)、100mL
の乾燥1,2-ジメトキシエタン、1.40mL(10mmol)のトリエチルアミン（Aldrich）
、および3.16g(10mmol)のロイシル-2-(5-フルオロウラシル-1-イル)-L,D-グリシ
ン、34(Putnamら、Bioconjugate Chem., 1995, 6, 483の方法によって生成した
）を添加する。反応混合物を室温において1時間撹拌し、次いで400mLの氷水に注
ぐ。十分量の0.1N HClを徐々に添加して溶液のpHをpH5にし、沈殿をろ過し、乾
燥して、アセトニトリルと水の混合物の最小量に溶解する。得られる溶液をC18
逆相HPLCを使用してクロマトグラフィーし（溶出液：アセトニトリル：水：0.1%
トリフルオロ酢酸）、回収した溶出液を合わせて、溶媒を回転式エバポレータで
留去してFmoc-L-Cys(DNP)-L-Glu(OtBu)-L-Glu(OtBu)-L-Glu(OtBu)-L-Leu-2-(5-
フルオロウラシル-1-イル)-L,D-Gly-OH、41を得る。
【０１５５】 Fmoc-L-Cys-L-Glu(OtBu)-L-Glu(OtBu)-L-Glu(OtBu)-L-Leu-2-(5-フルオロウラ
シル-1-イル)-L,D-Gly-OH、42の生成 磁気撹拌子および温度計を備えた清潔で250mLの丸底フラスコに6.82g(5mmol)
のFmoc-L-Cys(DNP)-L-Glu(OtBu)-L-Glu(OtBu)-L-Glu(OtBu)-L-Leu-2(5-フルオロ
ウラシル-1-イル)-L,D-Gly-OH、41および50mLの2-メルカプトエタノール（Aldri
ch）を添加する。pHが8になるまで、1N水酸化ナトリウム液を添加し、次いで反
応混合物を室温において1時間撹拌する。溶媒を回転式エバポレータで留去し、
適当な溶媒を使用して蒸留残渣を結晶化して、Fmoc-L-Cys-L-Glu(OtBu)-L-Glu(O
tBu)-L-Glu(OtBu)-L-Leu-2-(5-フルオロウラシル-1-イル)-L,D-Gly-OH、42を得
る。
【０１５６】 3,5-(2-ジテトラヒドロフラニルオキシ)-フェニル酢酸、44の生成 磁気撹拌子、乾燥N2導入-流出口および温度計を備えた清潔で250mLの丸底フラ
スコに48mLの乾燥テトラヒドロフランを添加し、次いで2.16g(16mmol)の塩化ス
ルフリル（Aldrich）を徐々に添加する。反応混合物を室温において15分間撹拌
し、同時に、0.91g(5mmol)の3,5-ジヒドロフェニル酢酸、43(Aldrich）を加えて
撹拌中の25mLのテトラヒドロフラン溶液に0.5時間かけてトリエチルアミン(3.64
g、36mmol)のテトラヒドロフラン(5mL)溶液を添加する。反応混合物を40℃にお
いてさらに1時間撹拌し、-16℃に冷却し、ろ過し、溶媒を回転式エバポレータで
ろ液から留去する。蒸留残渣に30mLのジエチルエーテルで2回混ぜ合わせ、上清
を合わせて、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、溶媒を回転式エバポレータ
で留去する。0.8Mの水酸化ナトリウムを30mLのメタノールに溶解したものからな
る5mLの溶液に蒸留残渣を溶解し、室温で15分間撹拌する。1.0N HClを添加する
ことによって反応混合物のpHを6に調整し、次いで100mLの酢酸エチルを添加する
。有機層を水層から分離し、有機層を無水硫酸ナトリウムで4時間乾燥し、ろ過
し、溶媒を回転式エバポレータで留去して、3,5-(2-ジテトラヒドロフラニルオ
キシ)-フェニル酢酸を得る。
【０１５７】 3,5-(2-ジテトラヒドロフラニルオキシ)-フェニル酢酸、N-ヒドロキシスクシン
イミジルエステル、45の生成 磁気撹拌子、温度計およびドリエライト(Drierite)充填乾燥用チューブを備え
た清潔で乾燥した250mLの丸底フラスコに、3.08g(10mmol)の3,5-(2-ジテトラヒ
ドロフラニルオキシ)-フェニル酢酸、44、200mLの1,2-ジメトキシエタン、1.15g
(10mmol)のN-ヒドロキシスクシンイミド（Aldrich）および2.06gの1,3-ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（Aldrich）を添加する。反応混合物を室温において12
時間磁力的に撹拌し、ろ過し、溶媒を回転式エバポレータで留去する。適当な溶
媒を使用して蒸留残渣を結晶化して、3,5-(2-ジテトラヒドロフラニルオキシ)-
フェニル酢酸、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、45を得る。
【０１５８】 3,5-(2-ジテトラヒドロフラニルオキシ)-フェニル酢酸、N-(N'-フルオレニルメ
トキシカルボニルエタンジアミン、47の生成 磁気撹拌子、温度計およびドリエライト(Drierite)充填乾燥用チューブを備え
た清潔で乾燥した250mLの丸底フラスコに4.05g(10mmol)の3,5-(2-ジテトラヒド
ロフラニルオキシ)-フェニル酢酸、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、45
、100mLの乾燥1,2-ジメトキシエタン、1.40mL(10mmol)のトリエチルアミン（Ald
rich）、および2.82g(10mmol)のN-フルオレニルメトキシカルボニルエタンジア
ミントリフルオロアセテート、46(Adamczykら、Organic Preparations and Proc
edures International, 1995, 27, 239の手法により生成した)を添加する。反応
混合物を室温において14時間撹拌し、次いで50mLの水および100mLのジクロロメ
タンを添加する。有機層を水層から分離し、水層を100mLのジクロロメタンで2回
洗浄する。有機層を合わせて、無水硫酸ナトリウムで4時間乾燥し、溶媒を回転
式エバポレータで留去する。適当な溶媒を使用して蒸留残渣を結晶化して、3,5-
(2-ジテトラヒドロフラニルオキシ)-フェニル酢酸、N-(N'-フルオレニルメトキ
シカルボニルエタンジアミン、47を得る。
【０１５９】 3,5-(2-ジテトラヒドロフラニルオキシ)-フェニル酢酸、N-エタンジアミンアミ
ド、48の生成 磁気撹拌子、温度計およびドリエライト(Drierite)充填乾燥用チューブを備え
た清潔で乾燥した250mLの丸底フラスコに5.72g(10mmol)の3,5-(2-ジテトラヒド
ロフラニルオキシ)-フェニル酢酸、N-(N'-フルオレニル-メトキシカルボニルエ
タンジアミン、47、および11mLのピペリジン（Aldrich）を添加する。反応混合
物を室温において1.5時間磁力的に撹拌し、溶媒を回転式エバポレータで留去す
る。蒸留残渣に250mLのジエチルエーテルを混ぜ合わせ、得られる沈殿をろ過し
、減圧下で乾燥して3,5-(2-ジテトラヒドロフラニルオキシ)-フェニル酢酸、N-
エタンジアミンアミド、48を得る。
【０１６０】 ジスルフィド付加物、50の生成 磁気撹拌子、温度計およびドリエライト(Drierite)充填乾燥用チューブを備え
た清潔で乾燥した250mLの丸底フラスコに3.50g(10mmol)の3,5-(2-ジテトラヒド
ロフラニルオキシ)-フェニル酢酸、N-エタンジアミンアミド、48、100mLの乾燥1
,2-ジメトキシエタン、1.40mL(10mmol)のトリエチルアミンおよび3.12g(10mmol)
のN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオネート、49(Pierce、Roc
kford, IL)を添加する。反応混合物を室温において14時間撹拌し、ろ過し、溶媒
を回転式エバポレータで留去する。適当な溶媒を使用して蒸留残渣を結晶化して
、ジスルフィド付加物、50を得る。
【０１６１】 ジヒドロキシフェニル-ジスルフィド付加物、51の生成 磁気撹拌子、温度計およびドリエライト(Drierite)充填乾燥用チューブを備え
た清潔で乾燥した250mLの丸底フラスコに、100mLのN,N-ジメチルホルムアミド(D
MF)、5.47g(10mmol)のジスルフィド付加物、50、および11.97gのFmoc-L-Cys-L-G
lu(OtBu)-L-Glu(OtBu)-L-Glu(OtBu)-L-Leu-2-(5-フルオロウラシル-1-イル)-L,D
-Gly-OH、42を添加する。反応混合物を室温において20時間撹拌させ、次いで溶
媒を減圧下で留去する。蒸留残渣を水：DMFの1:1混合物に溶解し、次いでトリフ
ルオロ酢酸（TFA）を添加して、pHを5にする。反応混合物を室温において2時間
撹拌し、次いで濃い炭酸ナトリウム水溶液を使用してpHをpH 7に調整する。100m
Lのジクロロメタンを添加し、有機層を水層から分離し、水層を100mLのジクロロ
メタンで2回抽出する。有機層を合わせて、無水硫酸ナトリウムで4時間乾燥し、
溶媒を回転式エバポレータで留去する。適当な溶媒を使用して蒸留残渣を結晶化
し、ジヒドロキシフェニル-ジスルフィド付加物、51を得る。
【０１６２】 本発明の薬物結合重合構築物、53の生成 温度計、添加ロート、還流器、磁気撹拌子および乾燥N2導入-流出口を備えた5
00mLの丸底フラスコに100mLのアセトニトリル、0.28g(2mmol)の炭酸カリウム細
粉、0.25gの18-クラウン(Crown)-6（Aldrich）、10mLの水、および1.49g(1mmol)
のジヒドロキシフェニル-ジスルフィド付加物、51を添加する。反応混合物を加
熱還流して、次いで、2.0gのDTS-PEG1000、52(上記ジトシレート、8の合成法参
照)を添加する。反応混合物を加熱還流して、室温において18時間撹拌し、次い
で0.1N HClを徐々に添加して反応混合物を酸性化する。溶媒を回転式エバポレー
タで留去し、5mLのピペリジンを25mLのN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解し
たものを添加する。反応混合物を室温において1時間撹拌し、溶媒を回転式エバ
ポレータで留去する。蒸留残渣を5mLのトリフルオロ酢酸（TFA）および30mLの水
に溶解し、次いで溶媒を回転式エバポレータで留去する。蒸留残渣を25mLの水に
溶解し、蒸留水で透析する（分子量カットオフ値が12,000〜14,000のスペクトラ
ポア膜）。得られた溶液を凍結乾燥して本発明の薬物重合接合生成物、53を得る
。53の平均分子量はGPC分析によって求め、生成構築物中の51の置換の程度はUV
およびNMR分光法を使用して算出する。
【０１６３】 4.5 本発明の薬物結合重合接合体、56の集合 この実施例は、物質、D、がメトトレキセートから誘導され、リンカーの酵素
的に切断可能な領域、(L1-Ln)、がヘキサペプチド、Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Lys-N
H2、であり、共通の多官能性化学部分、Q、がペンタエリスリトールであり、か
つ水溶性重合体セグメント、P、が平均分子量が約4000のポリ（エチレングリコ
ール）である、本発明の分岐重合薬物接合体の生成法（合成経路5を参照）を記
載している。 合成経路5
【化３３】
【０１６４】 発明された薬物重合構築物56の調製 磁気攪拌棒、温度計、及びドリエライト(Drierite)を充填した乾燥チューブを
装備した清浄な乾燥250mL丸底フラスコに、10mmolの4つのアームを持つ分枝PEG-
プロピオン酸システム54(Sharwater Polymers, Huntsville, AL)、100mLの乾燥N
,N-ジメチルホルムアミド、7.0mL(50mmol)のトリエチルアミン(Aldrich)、及び4
0mmolの55(Anaspec. San Jose, CA)を入れる。反応混合液を室温で10時間攪拌し
、続いて400mLの氷冷した水に注入する。pH4になるまで充分量の0.1NHClをゆっ
くりと添加し、溶媒を減圧下で除去する。得られた沈殿物を適当な溶媒から結晶
化することで、発明の薬物重合構築物56を得る。56の平均分子量をGPC分析によ
って決定し、生成構築物における55の置換の割合を、UV及びNMRスペクトル分析
を用いて算出する。
【０１６５】 4.6 薬物が結合したポリマー接合体63の集合 本実施例（下記の合成経路6参照）は規則的に反復する本発明の線状重合薬物
接合体の調製について記載しており、そこでは、生物学的活性剤Dがメトトレキ
セートであって、また酵素的に切断されたリンカー領域(L1-Ln)がヘプタペプチ
ド、Gly-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Trp-Lysであって、また多官能化学成分Mがリシンであ
って、また水溶性ポリマーセグメントPが約2000の平均分子量を持つポリ（エチ
レングリコール）(PEG-2000)である。 合成経路6
【化３４】
【化３５】
【０１６６】 ポリ（エチレングリコール）のビス（イミダゾイル）チオカルバメート58の調製 磁気攪拌棒、加熱用マントル、ジーン-スターク(Dean-Stark)水除去トラップ
、コンデンサ、及びドリエライト(Drierite)を充填した乾燥チューブを装備した
清浄な乾燥250mL丸底フラスコに、120mLのトルエンと10.0g(5mmol)のPEG-2000(A
rdrich, Milwaukee, WI)を入れる。得られた溶液を2時間還流すると、その間に
約100μLの水がジーン-スタークトラップで集められ、その後加熱用マントルが
除去される。反応混合液を周囲温度になるまで冷却し、6.0g(33.7mmol)の1,1'-
トリカルボニルジイミダゾール、テック(tech.)、90%(Aldrich)を一度に添加す
る。反応混合液を室温で70時間攪拌し、続いて回転式蒸発を行って溶媒の約3/4
を除去するとオレンジ色のオイルが得られる。オイルを、迅速に攪拌しているエ
チルエーテル300mLにゆっくりと添加することによって二相の混合液が得られる
。エーテル（上）層をデカントし、下層にある粘性オイルを300mLの新たなエチ
ルエーテルにゆっくりと添加する。エーテル層をもう一度デカントし、オイル状
の下層を70mLの酢酸エチルに溶解する。酢酸エチル溶液を300mLの迅速に攪拌し
ている冷却エチルエーテルにゆっくりと滴下することによって、灰白色の沈殿物
が得られる。沈殿した固体を濾過し、5分間空気乾燥してから4時間真空に置くこ
とによって、ポリ（エチレングリコール）のビス（イミダゾリル）トリカルバメ
ート58、6.9g(3.1mmol、62%の収率)を、灰白色の固体として得られる。1H NMRは
、脂肪族であるエチレングリコールのプロトンと、芳香族のイミダゾール置換基
が関連するプロトンの両方を示している。
【０１６７】 線状コポリマー骨格59の調製 磁気翼を装備した清浄な乾燥済みの2mLの反応容器に、0.5mLの水、0.8mLの塩
化メチレン、29mg(345μmol)の炭酸水素ナトリウム、10mg(69μmol)のリシン(Al
drich)、及び138mg(69μmol)のポリ（エチレン）グリコールのビス（イミダゾリ
ル）チオカルバメート、58を入れる。反応混合液を室温で20時間攪拌し、塩化メ
チレンを回転式蒸発によって除去し、残っている水性の残渣を3×1mLの塩化メチ
レンを用いて洗浄する。有機層を合わせて無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾
過してから溶媒を減圧下で除去する。抽出した残渣を3mLの脱イオン化水に溶解
し、蒸留水で透析する(カットオフ分子量が3,500であるスペクトラポール膜(Spe
ctrapor membram)）。透析バッグに残っている水溶液を凍結乾燥することによっ
て、64mgの線状コポリマー骨格59を白色固体として得ることができる。GPC(Poly
mer Lab PL-GEL 103及び105カラム、0.1%のLiBrを入れたDMF溶離剤）は、多分散
率が1.42で、分子量が19,022の産物コポリマーを示す。
【０１６８】 活性なコポリマー骨格61の調製 温度計、磁気攪拌棒、及びドリエライト(Drierite)を充填した乾燥チューブを
装備した50mLの丸底フラスコに、20mLのアセトニトリル、4.74g(2.0mmol）の線
状コポリマー骨格である59、1.0mLのピリシン、及び1.54g(6.0mmol）のN,N'-ジ
サクシンイミジルカーボネート、テック(tech.)(Aldrich)を入れる。得られた溶
液を室温で17時間時期的に攪拌し、続いて急速に攪拌している300mLのエチルエ
ーテルに滴下して添加する。エーテル混合液を0.5時間攪拌し、濾過してから集
めた沈殿物を2×300mLの新しいエーテルで洗浄する。単離した固体を真空下で乾
燥することによって、活性型のコポリマー骨格61が得られる。
【０１６９】 発明された薬物が結合したポリマー構築物63の調製 磁気性回転翼を装着した5mLの反応容器に、500μLのN,N-ジメチルホルムアミ
ド、117mg(50μmol)の活性型コポリマー骨格61、87μL(500μmol）のN,N-ジイソ
プロピルエチルアミン(ChemImpex, Wood Dale, IL)、及び66mg(50μmol)のペプ
チド接合体62(AnaSpec, Inc., San Jose, CA)を入れる。反応混合液を室温で24
時間攪拌し、続いて7mLのエチルエーテルを滴下して添加する。エーテルの上澄
みを黄色の沈殿物からデカントし、残っている固体を7mLの新しいエチルエーテ
ルで洗浄する。集めた固体を7.5mLの脱イオン化水に溶解し、pHを濃塩酸によっ
て2.5に調節してから得られた溶液を蒸留水で透析する（カットオフ分子量が3,5
00であるスペクトラポール膜）。水溶液を凍結乾燥することによって、薬物が結
合したポリマー構築物63が得られる。63の平均分子量をGPC分析によって測定す
るとともにチオカルバメートリンケージの存在をIRスペクトル分析によって確認
し、そして62が生成構築物に置換した割合をUV及びNMRスペクトル分析を用いて
算出する。
【０１７０】 4.7 薬物が結合したポリマー接合体67の集合 本実施例（下記の合成経路7参照）は規則的に反復する線状重合薬物接合体の
調製について記載しており、そこでは、薬学的薬剤Dがメトトレキセートであっ
て、また酵素的に切断されたリンカー領域(L1-Ln)がペプチドGly-Pro-Lys-Pro-V
al-Gly-Nva-Trp-Lysであって、また多官能化学成分Mがリシンであって、また水
溶性ポリマーセグメントPが約2000の平均分子量を持つポリ（エチレングリコー
ル）(PEG-2000)である。 合成経路7
【化３６】
【０１７１】 発明された薬物が結合したポリマー構築物66の調製 磁気性回転翼を装着した5mLの反応容器に、1mLのN,N-ジメチルホルムアミド、
74.8mg(32μmol)の活性型コポリマー骨格64（KohnらのMacromolecules, 1992, 2
5, 4476の方法によって調製した）、55μL(320μmol）のN,N-ジイソプロピルエ
チルアミン(ChemImpex, Wood Dale, IL)、及び50mg(32μmol)のペプチド接合体6
5(AnaSpec, Inc., San Jose, CA)を入れる。反応混合液を室温で60時間攪拌し、
続いて5mLの水を添加する。水溶液を室温で24時間攪拌し、200μLのヒドラジン(
Aldrich)を添加し、得られた水溶液を蒸留水で透析する（カットオフ分子量が3,
500であるスペクトラポール膜）。透析膜にある均質な溶液を凍結乾燥すること
によって、薬物が結合したポリマー構築物66が得られる。66の平均分子量をGPC
分析によって測定するとともにカルバメートリンケージの存在をIRスペクトル分
析によって確認し、そして65が産物に置換した割合をUV及びNMRスペクトル分析
を用いて算出する。
【０１７２】 4.8 薬物が結合したポリマー接合体63の別の集合 本実施例（下記の合成経路8参照）は本発明の規則的に反復する線状重合薬物
接合体の調製について記載しており、そこでは、生物学的活性剤であるDがメト
トレキセートであって、また酵素的に切断されたリンカー領域(L1-Ln)がヘプタ
ペプチドGly-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Trp-Lysであって、また多官能化学成分Mがリシン
であって、また水溶性ポリマーセグメントPが約2000の平均分子量を持つポリ（
エチレングリコール）(PEG-2000)である。 合成経路8
【化３７】
【０１７３】 ポリ（エチレングリコール）のビス-サクシンイミジルチオカルバメート67の調
製 コンデンサ、磁気攪拌棒、添加用ロート、乾燥チューブ、加熱用マントル、ジ
ーン-スターク(Dean-Stark)水除去トラップ、HClトラップを装備した清浄な乾燥
250mL丸底フラスコに、10.0g(5mmol)のPEG-2000(Ardrich)と120mLのトルエンを
入れる。ポリマー溶液を2時間還流して共沸乾燥し、室温に冷却してから2.2mL(2
9mmol)のチオホスゲン(Aldrich)を一度に添加する。反応混合液を18時間室温で
攪拌し、続いて溶媒を減圧して除去する。更に100mLのトルエンを蒸留した残渣
に添加し、溶媒を再び減圧下で蒸発させる。蒸留した残渣をトルエン：塩化メチ
レンの3：1混合液に溶解する。1.7g(14.8mmol)のN-ヒドロキシサクシンイミドを
添加して、反応混合液を室温で1時間攪拌する。反応混合液を氷浴で冷却し、1.5
g(14.9mmol)のトリエチルアミン(Aldrich)を添加する。冷却浴を取り外してから
反応混合液を室温で5時間攪拌し、続いて再び氷浴を装着し、反応混合液を濾過
する。溶媒の約半分を回転式蒸発により濾液から除去し、60mLのエチルエーテル
を激しく攪拌しながら添加する。得られた沈殿物を濾過し、適当な溶媒を用いて
結晶化することによって、ポリ（エチレングリコール）のビス-サクシンイミジ
ルチオカルボネート67が得られる。NMR及びIRスペクトル分析を用いることでチ
オカルボネートの形成の割合を同定し、定量化できる。
【０１７４】 線状反復コポリマー59の調製 オーバーヘッド攪拌器を装着した清浄な500mLの三首丸底フラスコに、1.1g(6.
8mmol)のL-リシン(Aldrich)、2.5g(31.5mmol)の炭酸水素ナトリウム及び150mLの
水を入れる。300mLの塩化メチレンに溶解した6.8mgの67からなる溶液を添加し、
反応混合液を室温で2時間、激しく攪拌する。濃塩酸を注意深く添加することでp
Hを2まで低め、有機層を水性相から分離する。有機層を2×100mLの飽和塩化ナト
リウム水溶液で洗浄し、無水マグネシウム表面上で乾燥してから濾過し、そして
溶媒を回転式エバポレータによって除去する。粗ポリマーを50mLの水に溶解して
からカットオフ分子量が12,000-14,000ダルトンのSPECTRAPOR膜を用いて蒸留水
で透析する。この透析膜に維持されている水溶液を透析乾燥することによって、
線状反復コポリマー59を白色固体として得ることができる。GPCを用いれば産物
の平均分子量を決定でき、またIRを用いればチオカルバメートリンケージの存在
を確認でき、そして1H NMRスペクトル分析を用いればリシンプロトンの存在を確
認できる。
【０１７５】 発明された薬物が結合したポリマー接合体63の調製 線状反復ポリマー59を用いて発明された構築物63を調製するために用いられる
二つの段階は、第4.6.章で記載された段階と同じである。
【０１７６】 4.9 薬物が結合したポリマー接合体71の集合 本実施例は、本発明の規則的反復線状重合薬物接合体の調製（合成経路9参照
）について記載しており、薬学的物質であるDはメトトレキセートであって、ま
た酵素的に切断されたリンカー領域(L1-Ln)がヘキサペプチドGly-Pro-Leu-Gly-P
ro-Lysであって、また多官能化学成分Mがリシンであって、また水溶性ポリマー
セグメントPが約2000の平均分子量を持つポリ（エチレングリコール）(PEG-2000
)である。 合成経路9
【化３８】
【化３９】
【０１７７】 メトトレキセート-ペプチド接合体70の調製 磁気性攪拌棒と乾燥チューブを装着した50mLの清浄な乾燥反応容器に、25mLの
N,N-ジメチルホルムアミド、1.00g(1mmol)のメトトレキセート-ペプチド接合体6
8（AnaSpec, Inc.)、1.74mL(10mmol）のN,N-ジイソプロピルエチルアミン(Aldri
ch)、及び0.44g(1mmol)のNα, Nε-ジ-t-Boc-L-リシン、N-ヒドロキシサクシン
イミドエステル(Sigma, St. Louis, MO)を入れる。反応混合液を室温で18時間攪
拌し、続いて溶媒を回転式蒸発によって除去する。蒸留した残渣を水に溶解し、
目的の産物をアセトニトリル：水(0.1%TFA）溶出溶液を用いて逆相C-18クロマト
グラフィーによって単離する。溶離物画分を含む産物を合わせて凍結乾燥するこ
とによって、メトトレキセート-ペプチド接合体である70が黄色の固体として得
られる。この産物の同定は、1H NMR及びマススペクトル分析によって決定する。
【０１７８】 発明された薬物が結合したポリマー構築物71の調製 磁気性攪拌棒と乾燥チューブを装着した50mLの清浄な乾燥反応容器に、25mLの
N,N-ジメチルホルムアミド、1.13g(1mmol)のメトトレキセート-ペプチド接合体7
0、1.74mL(10mmol）のN,N-ジイソプロピルエチルアミン(Aldrich)、及び2.22g(1
mmol)のポリ（エチレングリコール）のビス（イミダゾリル）チオカルバメート5
8を入れる。反応混合液を室温で18時間攪拌し、続いて溶媒を回転式蒸発によっ
て除去する。蒸留した残渣を水に溶解し、得られた溶液を蒸留水に対して（カッ
トオフ分子量が10,000であるスペクトラポール膜で）透析して、発明された薬物
が結合したポリマー構築物71が、黄色の固体として得られる。構築物の平均分子
量をGPCによって測定し、チオカルバメートリンケージの存在はIRスペクトル分
析によって確認し、また生成構築物への70の置換の割合はUV及びNMRスペクトル
分析を用いて算出する。
【０１７９】 4.10 薬物が結合したポリマー接合体72の集合 本実施例は、本発明の規則的反復線状重合薬物接合体の調製（合成経路10参照
）について記載しており、薬学的物質であるDはメトトレキセートであって、ま
た酵素的に切断されたリンカー領域(L1-Ln)がヘキサペプチドGly-Pro-Leu-Gly-P
ro-Lysであって、また多官能化学成分Mがリシンであって、また水溶性ポリマー
セグメントPが約2000の平均分子量を持つポリ（エチレングリコール）(PEG-2000
)である。 合成経路10
【化４０】
【０１８０】 発明された薬物が結合したポリマー構築物72の調製 磁気性攪拌棒と乾燥チューブを装着した50mLの清浄な乾燥反応容器に、25mLの
N,N-ジメチルホルムアミド、1.13g(1mmol)のメトトレキセート-ペプチド接合体7
0、1.74mL(10mmol）のN,N-ジイソプロピルエチルアミン(Aldrich)、及び平均分
子量2000のポリ（エチレングリコール）のビスサクシンイミジルカーボネート30
、2.28g(1mmol)を入れる。反応混合液を室温で18時間攪拌し、続いて溶媒を回転
式蒸発によって除去する。蒸留した残渣を水に溶解し、pHを濃HClを用いて2.5に
調節してから得られた溶液を蒸留水に対して（カットオフ分子量が10,000である
スペクトラポール膜で）透析して、発明された薬物が結合したポリマー構築物72
が、黄色の固体として得られる。この構築物の平均分子量をGPCによって測定し
、チオカルバメートリンケージの存在をIRスペクトル分析によって確認し、また
産物への70の置換の割合をUV及びNMRスペクトル分析を用いて算出する。
【０１８１】 4.11 薬物が結合したポリマー接合体66の集合 本実施例は、本発明の規則的反復線状重合薬物接合体の調製（合成経路11参照
）について記載しており、薬学的物質であるDはメトトレキセートであって、ま
た酵素的に切断されたリンカー領域(L1-Ln)がヘプタペプチドGly-Pro-Tyr-Ala-T
yr-Trp-Lysであって、また多官能化学成分Mがリシンであって、また水溶性ポリ
マーセグメントPが約2000の平均分子量を持つポリ（エチレングリコール）(PEG-
2000)である。 合成経路11
【化４１】
【０１８２】 発明された薬物が結合したポリマー構築物73の調製 磁気性回転翼を装着した5mLの反応容器に、0.5mLのN,N-ジメチルホルムアミド
、117mg(50μmol)の活性化コポリマー骨格64（KohnらのMacromolecules, 1992,
25, 4476の方法によって調製した）、87μL(10等量）のN,N-ジイソプロピルエチ
ルアミン(ChemImpex)、及び50mg(50μmol)のペプチド接合体62(AnaSpec)を入れ
る。反応混合液を室温で24時間攪拌し、続いて7mLのエチルエーテルを滴下して
添加することによって黄色の沈殿物が得られる。液体を沈殿物からデカントし、
固体を7mLの新しいエチルエーテルで洗浄する。上澄みを再びデカントしてから
固体残渣を減圧して乾燥し、7.5mLの脱イオン水を添加する。得られた水溶液を
脱イオン水で透析し（カットオフ分子量が3,500ダルトンであるスペクトラポー
ル膜）、続いて凍結乾燥することによって95mg(28.5mmol、57%の収率)の発明さ
れた薬物が結合した構築物73が黄色の固体として得られる。GPC（溶離剤として0
.1%LiBrを含むDMFを用いたPolymer Lab PL-GFL 10,000及び100,000カラム）は、
ポリマー-薬物構築物の平均分子量が73,072であって、4.17の多分散率を伴うこ
とを示す。62がPEG-リシン骨格に導入される含有量は、UVスペクトル分析によっ
て39%であると測定される。MMP3酵素（Chemicon Inteernational, Temecula, CA
）を用いて73を処理すると、結果的にメトトレキセート-ペプチド断片74が形成
される。73から74への開裂率は、RP-18 HPLCによって、37℃において2時間で33%
であると決定される。
【化４２】
【０１８３】 U973細胞を用いる細胞毒性の研究は、ポリマー構築物73が対照（100%として設
計されている）の増殖と同等に細胞増殖できることを示した。メトトレキセート
-ペプチド断片74の試料とメトトレキセート単独の試料は、それぞれ10%及び6%の
細胞増殖が可能であった。
【０１８４】 本明細書で記載された全ての刊行物、特許、及び特許文献は、その全体が参照
として本明細書内に組み入れられる。
【０１８５】 本発明は、前述した特定の、また好適な態様及び方法を参照して記載されてい
る。しかしながら本発明の精神及び意図の範囲内で、多くの改変が行われうるこ
とが理解されるべきである。したがって、前述した実施例は限定的ではなく、本
発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることが意図される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 13/12 Ａ６１Ｐ 13/12 17/02 17/02 19/00 19/00 21/00 21/00 25/00 25/00 29/00 29/00 35/00 35/00 37/00 37/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ラマニ サラシ アメリカ合衆国 ニュージャージー州 プ リンストン メイン ストリート 136 スート 101 Ｆターム(参考） 4C076 BB01 BB11 BB21 CC42 EE59

Claims (89)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 (i)水溶性ポリマーセグメントおよび多官能化学成分（multi
    functional chemical moiety）を含む、規則的に反復する線状ユニット；または
    (ii)共通多官能化学成分に各々結合した2つ以上の水溶性ポリマーセグメントを
    含む、分枝したポリマー に、酵素的に切断可能なリンカーを介して接合された1つ又は複数の生物学的に
    活性な物質を含む、重合薬物接合体（polymeric drug conjugates）。
  2. 【請求項２】 上記1つ又は複数の生物学的に活性な物質が、上記規則的に
    反復する線状ユニットの上記多官能化学成分に上記リンカーを介して接合されて
    いる、請求項１記載の接合体。
  3. 【請求項３】 上記1つ又は複数の生物学的に活性な物質が、上記リンカー
    を介して上記2つ以上の水溶性ポリマーセグメントの少なくとも1つに接合されて
    いる、請求項１記載の接合体。
  4. 【請求項４】 上記リンカーが、細胞内酵素により切断される、請求項１記
    載の接合体。
  5. 【請求項５】 上記リンカーが、細胞外酵素により切断される、請求項１記
    載の接合体。
  6. 【請求項６】 上記リンカーが、膜結合性（membrane-bound）酵素により切
    断される、請求項１記載の接合体。
  7. 【請求項７】 上記リンカーが、標的部位で利用可能である酵素により切断
    される、請求項１記載の接合体。
  8. 【請求項８】 上記酵素が、上記標的部位において上方制御される、請求項
    ７記載の接合体。
  9. 【請求項９】 上記標的部位が、罹患した組織または生物学的液体である、
    請求項７記載の接合体。
  10. 【請求項10】 上記罹患した組織が、皮膚、骨、軟骨、筋肉、結合組織、神
    経組織、生殖器、内分泌組織、リンパ組織、血管系、または内臓組織に存在する
    、請求項９記載の接合体。
  11. 【請求項11】 上記生物学的液体が、血液、胸水、腹水、関節液、膵液、胆
    汁、または脳脊髄液である、請求項９記載の接合体。
  12. 【請求項12】 リンカーが、微生物感染によりもたらされる酵素、皮膚表在
    性酵素、または細胞により分泌された酵素により切断される、請求項１記載の接
    合体。
  13. 【請求項13】 上記リンカーが、癌細胞により分泌された酵素により切断さ
    れる、請求項１記載の接合体。
  14. 【請求項14】 上記リンカーが、癌細胞表面に局在化した酵素により切断さ
    れる、請求項１記載の接合体。
  15. 【請求項15】 上記リンカーが、慢性炎症性疾患に関連した細胞により分泌
    されたものにより切断される、請求項１記載の接合体。
  16. 【請求項16】 上記リンカーが、リウマチ様関節炎に関連した細胞により分
    泌された酵素により切断される、請求項１記載の接合体。
  17. 【請求項17】 上記リンカーが、骨関節炎に関連した細胞により分泌された
    酵素により切断される、請求項１記載の接合体。
  18. 【請求項18】 上記リンカーが、加水分解、還元反応、酸化反応、pHシフト
    、光分解、またはそれらの組合せによりさらに切断される、請求項１記載の接合
    体。
  19. 【請求項19】 上記リンカーが、非特異的酵素反応によりさらに切断される
    、請求項１記載の接合体。
  20. 【請求項20】 上記多官能化学成分が、N-(2-ヒドロキシアセチル)セリン、
    リシン、トリス(2-アミノエチル)アミン、N-(p-ニトロフェニルアセチル)-p-ニ
    トロフェニルアラニン酸ヒドラジド、3,5-ジヒドロキシフェニル酢酸、3,5-ジア
    ミノ安息香酸、および6-アミノ-4-(2-アミノエチル)ヘキサノン酸から選択され
    た基に由来する、請求項２記載の接合体。
  21. 【請求項21】 上記共通多官能化学成分が、ペンタエリスリトール、デンド
    リマー、または分枝したリシン系統樹を含む、請求項３記載の接合体。
  22. 【請求項22】 上記水溶性ポリマーセグメントが、分子量約400〜約25,000
    であるポリマーを含む、請求項１記載の接合体。
  23. 【請求項23】 上記水溶性ポリマーセグメントが、ポリ(エチレングリコー
    ル)、ポリ(エチレングリコール)コポリマー、またはそれらの組合せを含む、請
    求項１記載の接合体。
  24. 【請求項24】 上記水溶性ポリマーセグメントが、ポリ(ビニルアルコール)
    、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタク
    リル酸)、ポリ(マレイン酸)、ポリ(リシン)など、またはそれらの組合せを含む
    、請求項１記載の接合体。
  25. 【請求項25】 上記リンカーが、アミノ酸、糖、核酸、もしくは他の有機化
    合物、またはそれらの組合せを含む、請求項１記載の接合体。
  26. 【請求項26】 上記リンカーがペプチド配列を含む、請求項１記載の接合体
    。
  27. 【請求項27】 上記リンカーが、セリンプロテアーゼにより切断されうるペ
    プチド配列を含む、請求項１記載の接合体。
  28. 【請求項28】 上記セリンプロテアーゼが、トロンビン、キモトリプシン、
    トリプシン、エラスターゼ、カリクレイン、およびサブチリシンからなる群より
    選択される、請求項27記載の接合体。
  29. 【請求項29】 上記トロンビン切断可能（-cleavable）ペプチド配列が、-G
    ly-Arg-Gly-Asp-、-Gly-Gly-Arg-、-Gly-Arg-Gly-Asp-Asn-Pro-、-Gly-Arg-Gly-
    Asp-Ser-、-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-、-Gly-Pro-Arg-、-Val-Pro-Arg-、
    または-Phe-Val-Argを含む、請求項28記載の接合体。
  30. 【請求項30】 上記エラスターゼ切断可能ペプチド配列が、-Ala-Ala-Ala-
    、-Ala-Ala-Pro-Val-、-Ala-Ala-Pro-Leu-、-Ala-Ala-Pro-Phe-、-Ala-Ala-Pro-
    Ala-、または-Ala-Tyr-Leu-Val-を含む、請求項28記載の接合体。
  31. 【請求項31】 上記リンカーが、システインプロテイナーゼにより切断され
    うるペプチド配列を含む、請求項１記載の接合体。
  32. 【請求項32】 上記システインプロテイナーゼが、パパイン、アクチニジン
    、ブロメライン、リソソーム性カテプシン、サイトゾル性カルパイン、および寄
    生虫プロテアーゼからなる群より選択される、請求項31記載の接合体。
  33. 【請求項33】 上記寄生虫プロテアーゼが、トリパノソーマ属（Trypanosom
    a）または住血吸虫（Schistosoma）に由来する、請求項32記載の接合体。
  34. 【請求項34】 上記リンカーが、アスパラギン酸プロテイナーゼにより切断
    されうるペプチド配列を含む、請求項１記載の接合体。
  35. 【請求項35】 上記アスパラギン酸プロテイナーゼが、ペプシン、キモシン
    、リソソーム性カテプシンD、プロセシング酵素、真菌プロテアーゼ、およびウ
    イルスプロテイナーゼからなる群より選択される、請求項34記載の接合体。
  36. 【請求項36】 上記プロセシング酵素がレニンを含む、請求項35記載の接合
    体。
  37. 【請求項37】 上記真菌プロテアーゼが、ペニシロペプシン、リゾプスペプ
    シン、またはエンドチアペプシンを含む、請求項35記載の接合体。
  38. 【請求項38】 上記ウイルス性プロテアーゼが、AIDSウイルス由来のプロテ
    アーゼを含む、請求項35記載の接合体。
  39. 【請求項39】 上記リンカーが、マトリックスメタロプロテイナーゼにより
    切断されうるペプチド配列を含む、請求項１記載の接合体。
  40. 【請求項40】 上記マトリックスメタロプロテイナーゼが、コラゲナーゼ、
    ストロメライシン、およびゼラチナーゼからなる群より選択される、請求項39記
    載の接合体。
  41. 【請求項41】 上記マトリックスメタロプロテイナーゼが、-Gly-Pro-Y-Gly
    -Pro-Z-、-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Z-、-Gly-Pro-Ile-Gly-Pro-Z-、または-Ala-Pr
    o-Gly-Leu-Z-を含み、式中、YおよびZはアミノ酸である、請求項39記載の接合体
    。
  42. 【請求項42】 上記マトリックスメタロプロテイナーゼが、-Leu-Gly-、ま
    たはIle-Glyを含む、請求項39記載の接合体。
  43. 【請求項43】 上記コラゲナーゼ切断可能ペプチド配列が、-Pro-Leu-Gly-P
    ro-D-Arg-Z-、-Pro-Leu-Gly-Leu-Leu-Gly-Z-、-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Trp-
    、-Pro-Leu-Gly-Cys(Me)-His-、-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-、-Pro-Leu-Ala-Leu
    -Trp-Ala-Arg-、または-Pro-Leu-Ala-Tyr-Trp-Ala-Arg-を含み、式中、Zはアミ
    ノ酸である、請求項40記載の接合体。
  44. 【請求項44】 上記ストロメライシン切断可能ペプチド配列が、-Pro-Tyr-A
    la-Tyr-Trp-Met-Argを含む、請求項40記載の接合体。
  45. 【請求項45】 上記ゼラチナーゼ切断可能ペプチド配列が、-Pro-Leu-Gly-M
    et-Trp-Ser-Arg-を含む、請求項40記載の接合体。
  46. 【請求項46】 上記リンカーが、アンギオテンシン変換酵素により切断され
    うるペプチド配列を含む、請求項１記載の接合体。
  47. 【請求項47】 上記アンギオテンシン変換酵素が、-Asp-Lys-Pro-、-Gly-As
    p-Lys-Pro-、または-Gly-Ser-Asp-Lys-Pro-を含む、請求項46記載の接合体。
  48. 【請求項48】 上記リンカーが、前立腺特異的抗原または前立腺特異膜抗原
    により切断されうるペプチド配列を含む、請求項１記載の接合体。
  49. 【請求項49】 上記リンカーが-(Glu)n-を含み、かつnが1〜10の整数である
    、請求項48記載の接合体。
  50. 【請求項50】 上記生物学的に活性な物質が、鎮痛薬、麻酔薬、抗真菌薬、
    抗生物質、抗炎症薬、駆虫薬、抗関節炎薬、解毒薬、制吐薬、抗ヒスタミン薬、
    抗高血圧薬、抗マラリア薬、抗菌薬、抗精神病薬、解熱薬、防腐薬、抗関節炎薬
    、抗結核薬、鎮咳薬、抗ウイルス薬、心臓作用薬、下剤、化学療法薬、コルチコ
    イド、抗鬱薬、鎮静薬、診断薬、利尿薬、酵素、去痰薬、ホルモン、催眠薬、ミ
    ネラル、栄養補助剤、副交感神経作動薬、カリウム補助剤、放射線増感剤、鎮静
    薬、スルホンアミド、刺激薬、交感神経作動薬、精神安定薬、尿路感染防止薬、
    血管収縮薬、血管拡張薬、ビタミン、キサンチン誘導体など、およびそれらの組
    合せを含む、請求項１記載の接合体。
  51. 【請求項51】 上記化学療法薬が、ナイトロジェンマスタード、エチレンイ
    ミン、メチルメラミン、ニトロソ尿素、アルキルスルホン酸、トリアジン、葉酸
    類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、ビンカアルカロイド、エピポドフィ
    ロトキシン、抗生物質、酵素、生体反応調節剤、プラチナ錯体、メチルヒドラジ
    ン誘導体、副腎皮質性抑制剤、ソマトスタチン、ソマトスタチン類似体、ホルモ
    ン、ホルモンアンタゴニスト、またはそれらの組合せを含む、請求項50記載の接
    合体。
  52. 【請求項52】 上記化学療法薬が、メトトレキセート、タキソール、アミノ
    プテリン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、カンプトセシン、エトポシド、エ
    ストラムスチン、プレドニムスチン（prednimustine）、メルファラン、ヒドロ
    キシ尿素、または5-フルオロウラシルを含む、請求項51記載の接合体。
  53. 【請求項53】 上記生物学的に活性な物質が、ペプチド性（-based）薬学的
    物質を含む、請求項１記載の接合体。
  54. 【請求項54】 上記ペプチドベースの薬学的物質が、サイトカイン、増殖因
    子、細胞受容体アンタゴニスト、または細胞受容体アゴニストを含む、請求項53
    記載の接合体。
  55. 【請求項55】 上記生物学的に活性な物質が、エプチフィバチド(eptifibat
    ide)および他の血小板結合タンパク質、顆粒球コロニー刺激因子、ヒト成長因子
    、血管内皮増殖因子、骨形成タンパク質、インターフェロン、またはインターロ
    イキンを含む、請求項１記載の接合体。
  56. 【請求項56】 上記生物学的に活性な物質が、DNA、RNA、DNA断片、RNA断片
    、またはプラスミドを含む、請求項１記載の接合体。
  57. 【請求項57】 下記の構造を含む、請求項２記載の接合体： 【化１】 式中、Pは上記水溶性ポリマーセグメントであり、Mは上記多官能化学成分であり
    、Lは上記リンカーであり、Dは上記生物学的に活性な物質であり、かつmは整数
    である。
  58. 【請求項58】 mが2と等しいか又はそれよりも大きい整数である、請求項57
    記載の接合体。
  59. 【請求項59】 mが約2から約25の整数である、請求項58記載の接合体。
  60. 【請求項60】 上記水溶性ポリマーセグメントが、分子量約2,000であるポ
    リ(エチレングリコール)を含み、上記多官能化学成分がN-(2-ヒドロアセチル)セ
    リンを含み、上記リンカーが(H-Leu-Gly-Pro-Ala-NH-CH2-CH2-NH2)を含み、かつ
    上記生物学的に活性な物質がドキソルビシン-14-0-ヘミグルタル酸を含む、請求
    項57記載の接合体。
  61. 【請求項61】 上記水溶性ポリマーセグメントが、分子量約1,000であるポ
    リ(エチレングリコール)を含み、上記多官能化学成分がトリス(2-アミノエチル)
    アミンを含み、上記リンカーが(H-Val-Pro-Arg-OH)を含み、かつ上記生物学的に
    活性な物質が、N6-(アミノイミノメチル)-N2-(3-メルカプト-1-オキソプロピル-
    L-リシルグリシル-L-α-アスパルチル-L-トリプトフィル-L-プロリル-L-システ
    イナミド、環状(1→6)-ジスルフィドである、請求項57記載の接合体。
  62. 【請求項62】 上記水溶性ポリマーセグメントが、分子量約2,000であるポ
    リ(エチレングリコール)を含み、上記多官能化学成分がNα-(-p-アミノフェニル
    アセチル)-p-アミノフェニルアラニルヒドラジドを含み、上記リンカーが(OCH-C
    O-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-OH)を含み、かつ上記生物学的に活性な物質がLeu-Gly-
    α-5-フルオロウラシルの薬学的類似体を含む、請求項57記載の接合体。
  63. 【請求項63】 上記水溶性ポリマーセグメントが、分子量約1,000であるポリ
    (エチレングリコール)を含み、上記多官能化学成分が3,5-ジヒドロキシフェニル
    酢酸を含み、上記リンカーが(H-Cys(S-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH2)-Glu-Glu-Gl
    u-OH)を含み、かつ上記生物学的に活性な物質がLeu-Gly-α-5-フルオロウラシル
    の薬学的類似体を含む、請求項57記載の接合体。
  64. 【請求項64】 上記水溶性ポリマーセグメントが、分子量約2,000であるポ
    リ(エチレングリコール)を含み、上記多官能化学成分がリシンを含み、上記リン
    カーが(H-Gly-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Trp-Lys-NH2)を含み、かつ上記生物学的に活性
    な物質がメトトレキセートを含む、請求項57記載の接合体。
  65. 【請求項65】 上記水溶性ポリマーセグメントが、分子量約2,000であるポ
    リ(エチレングリコール)を含み、上記多官能化学成分がリシンを含み、上記リン
    カーが(H-Gly-Pro-Lys-Pro-Val-Gly-Nva-Trp-Lys-OH)を含み、かつ上記生物学的
    に活性な物質がメトトレキセートを含む、請求項57記載の接合体。
  66. 【請求項66】 上記水溶性ポリマーセグメントが、分子量約2,000であるポ
    リ(エチレングリコール)を含み、上記多官能化学成分がリシンを含み、上記リン
    カーが(H-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Lys-NH2)を含み、かつ上記生物学的に活性な物
    質がメトトレキセートを含む、請求項57記載の接合体。
  67. 【請求項67】 下記構造を含む、請求項３記載の接合体： Q(-P-L-D)k 式中、Qは上記共通多官能化学成分であり、Pは上記水溶性ポリマーセグメントで
    あり、Lは上記リンカーであり、Dは上記生物学的に活性な物質であり、かつkは2
    と等しいか又はそれよりも大きい整数である。
  68. 【請求項68】 kが約2から約100の整数である、請求項67記載の接合体。
  69. 【請求項69】 上記水溶性ポリマーセグメントが、分子量約4,000であるポ
    リ(エチレングリコール)を含み、上記共通多官能化学成分がペンタエリスリトー
    ルまたはペンタエリスリトール類似体を含み、上記リンカーが(H-Gly-Pro-Leu-G
    ly-Pro-Lys(ε-CO-CH2-CH2-OH)-NH2)を含み、上記生物学的に活性な物質がメト
    トレキセートを含み、かつ上記整数が4である、請求項67記載の接合体。
  70. 【請求項70】 上記水溶性ポリマーセグメントが、分子量約4,000であるポ
    リ(エチレングリコール)を含み、上記共通多官能化学成分が8本枝（8 arm）デン
    ドリマーを含み、上記リンカーが(H-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Lys(ε-CO-CH2-CH2-O
    H)-NH2)を含み、上記生物学的に活性な物質がメトトレキセートを含み、かつ上
    記整数が8である、請求項67記載の接合体。
  71. 【請求項71】 上記水溶性ポリマーセグメントが、分子量約4,000であるポ
    リ(エチレングリコール)を含み、上記共通多官能化学成分がペンタエリスリトー
    ルまたはペンタエリスリトール類似体を含み、上記リンカーが(H-Glu-Glu-Glu-L
    ys(ε-CO-CH2-CH2-OH)-NH2)を含み、上記生物学的に活性な物質がメトトレキセ
    ートを含み、かつ上記整数が4である、請求項67記載の接合体。
  72. 【請求項72】 上記水溶性ポリマーセグメントが、分子量約4,000であるポ
    リ(エチレングリコール)を含み、上記共通多官能化学成分が8本枝デンドリマー
    を含み、上記リンカーが(H-Glu-Glu-Glu-Lys(ε-CO-CH2-CH2-OH)-NH2)を含み、
    上記生物学的に活性な物質がメトトレキセートを含み、かつ上記整数が8である
    、請求項67記載の接合体。
  73. 【請求項73】 上記水溶性ポリマーセグメントが、分子量約4,000であるポ
    リ(エチレングリコール)を含み、上記共通多官能化学成分がペンタエリスリトー
    ルまたはペンタエリスリトール類似体を含み、上記リンカーが(H-Gly-Pro-Lys-P
    ro-Val-Gly-Nva-Trp-Lys(ε-CO-CH2-CH2-OH)-NH2)を含み、上記生物学的に活性
    な物質がメトトレキセートを含み、かつ上記整数が4である、請求項67記載の接
    合体。
  74. 【請求項74】 上記水溶性ポリマーセグメントが、分子量約4,000であるポ
    リ(エチレングリコール)を含み、上記共通多官能化学成分が8本枝デンドリマー
    を含み、上記リンカーが(H-Gly-Pro-Lys-Pro-Val-Gly-Nva-Trp-Lys(ε-CO-CH2-C
    H2-OH)-NH2)を含み、上記生物学的に活性な物質がメトトレキセートを含み、か
    つ上記整数が8である、請求項67記載の接合体。
  75. 【請求項75】 上記水溶性ポリマーセグメントが、分子量約4,000であるポ
    リ(エチレングリコール)を含み、上記共通多官能化学成分がペンタエリスリトー
    ルまたはペンタエリスリトール類似体を含み、上記リンカーが(H-Gly-Pro-Tyr-A
    la-Tyr-Trp-Lys(ε-CO-CH2-CH2-OH)-NH2)を含み、上記生物学的に活性な物質が
    メトトレキセートを含み、かつ上記整数が4である、請求項67記載の接合体。
  76. 【請求項76】 上記水溶性ポリマーセグメントが、分子量約4,000であるポ
    リ(エチレングリコール)を含み、上記共通多官能化学成分が8本枝デンドリマー
    を含み、上記リンカーが(H-Gly-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Trp-Lys(ε-CO-CH2-CH2-OH)-N
    H2)を含み、上記生物学的に活性な物質がメトトレキセートを含み、かつ上記整
    数が8である、請求項67記載の構築物。
  77. 【請求項77】 請求項１記載の接合体および生理的に許容される担体を含む
    薬学的組成物。
  78. 【請求項78】 上記組成物が、注射、または、経口的、局所的、吸入的、も
    しくは移植的な投与法に適している、請求項77記載の薬学的組成物。
  79. 【請求項79】 請求項１記載の接合体を有効量投与する段階を含む、病態を
    緩和する方法。
  80. 【請求項80】 上記病態が、腫瘍性疾患、慢性炎症疾患、急性炎症疾患、心
    疾患、腎疾患、肝疾患、肺疾患、神経疾患、筋骨格疾患、および免疫障害を含む
    、請求項79記載の方法。
  81. 【請求項81】 心臓機能、腎機能、肝機能、肺機能、または神経機能を調節
    する段階を含む、請求項79記載の方法。
  82. 【請求項82】 免疫学的機能を改変する段階を含む、請求項79記載の方法。
  83. 【請求項83】 ホルモン機能を改変する段階を含む、請求項79記載の方法。
  84. 【請求項84】 微生物感染症を治療する段階を含む、請求項79記載の方法。
  85. 【請求項85】 瘢痕組織を調節する段階を含む、請求項79記載の方法。
  86. 【請求項86】 請求項57記載の接合体を製造する方法であり、以下の段階を
    含む方法： (i)上記生物学的に活性な物質を上記リンカーに結合させる段階； (ii)上記リンカーを上記多官能化学成分に結合させる段階；および (iii)上記多官能化学成分を、少なくとも2つの上記水溶性ポリマーセグメントに
    結合させる段階。
  87. 【請求項87】 請求項57記載の接合体を製造する方法であり、以下の段階を
    含む方法： (i)上記生物学的に活性な物質を上記リンカーに結合させる段階； (ii)上記多官能化学成分を少なくとも2つの上記水溶性ポリマーセグメントに結
    合させる段階；および (iii)上記多官能化学成分を上記リンカーに結合させる段階。
  88. 【請求項88】 請求項72記載の接合体を製造する方法であり、以下の段階を
    含む方法： (i)構築物を形成するために、上記生物学的に活性な物質を上記リンカーに結合
    させ、かつ上記リンカーを上記水溶性ポリマーセグメントに結合させる段階；お
    よび (ii)上記水溶性ポリマーセグメントを介して、少なくとも2つの上記構築物を上
    記共通多官能化学成分に結合させる段階。
  89. 【請求項89】 請求項72記載の接合体を製造する方法であり、以下の段階を
    含む方法： (i)上記生物学的に活性な物質を上記リンカーに結合させる段階； (ii)少なくとも2つの上記水溶性ポリマーセグメントを上記共通多官能化学成分
    に結合させる段階；および (iii)上記リンカーを上記水溶性ポリマーセグメントに結合させる段階。
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