KR101234476B1 - 히알루론산/메토트렉세이트 화합물 - Google Patents
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Abstract
관절 질환용 치료제로서 유용한 히알루론산/메토트렉세이트 화합물. 관절 질환용 치료제로서 유용한 히알루론산/메토트렉세이트 화합물은 1 내지 8 개의 아미노산을 포함하는 펩티드 사슬을 갖는 연결기를 통해 히알루론산의 카르복실기에 결합된 메토트렉세이트 및 히알루론산을 포함한다.
Description
본 발명은 히알루론산-메토트렉세이트 결합체 및 그것의 약학적 용도에 관한 것이다.
골관절염 (이후 "OA" 라고도 칭함) 은 노화에 근거하여 발생하는 소위 퇴행성 질환의 하나이다. OA 환자의 수는 현재의 고령화 사회에서 꾸준히 증가해 왔지만, 그에 대한 어떠한 적절한 진단 또는 치료법도 아직 확립되지 않았다. OA 에서의 초기의 병리학적 변화는 노화에 기인하여 물리적 압력에 의해 야기되는 관절 연골의 퇴행 및 마모라고 여겨진다. 이러한 변화는 매우 느린 속도로 진행되고 통증의 점진적인 진행에 이른다.
OA 의 현행 약물 치유법은, 전신 치유법으로, 1) 해열 진통제 (아세트아미노펜) 또는 2) 비스테로이드성 항염증성 약물 (이후 NSAID 라고도 칭함), 또는 국소 치유법 (관절-속 주사) 으로, 3) 히알루론산 (이후 HA 라고도 칭함) 제제, 및 4) 스테로이드 제제를 사용한다. NSAID 를 포함하는 전신 약물 치유법이 관절의 국부의 팽창 또는 통증을 완화시키지 못하는 경우, 가장 우수한 항염증성 작용을 갖는 스테로이드 제제의 관절-속 주사를 지금까지 수행해왔다. 그러나, 스테로이드 제제는 예를 들어 그들은 관절-속 주사 증후군 (스테로이드 관절증) 을 야기 할 수 있고 전신 부작용을 가질 수 있기 때문에, 안전성의 관점에서 문제가 있다. 따라서, HA 제제는 스테로이드 제제에 대해서 대안적인 더욱 안전한 관절-속 주사로서 더욱 유용해지고 있다.
HA 는 N-아세틸글루코사민 및 글루쿠론산의 반복 단위로 구성된 내생성 다당류이다. HA 는 활액 유체를 구성하는 주성분으로서 활액 유체의 점탄성 및 부하-흡수 및 윤활 효과를 유지하고, 연골 매트릭스에서는, 연골 프로테오글리칸에 결합하여 애그리칸 (aggrecan) 이라 부르는 중합체를 형성하여, 그의 수분-보유능 및 점탄성을 유지하는데 중심적인 역할을 한다.
분자량이 약 600,000 돌턴인 HA 또는 그의 가교결합 생성물을 무릎 관절 속에 주사하면 OA 로부터 유도된 통증이 제거되기 때문에, HA 제제는 OA 치유법 중 하나로서 널리 사용된다. 게다가, 정상 활액 유체에 존재하는 HA 와 분자량이 유사한 고분자량 유형의 HA 제제 (제품명: SuvenylTM, 제조 및 유통: Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) 는 일본에서 류마티스성 관절염 (이후 RA 라고도 칭함) 과 연관된 무릎 통증의 제거에 대한 표시와 관련하여 승인되어 있다. 이와 관련하여, HA 의 분자량은 그의 효능과 서로 관련되며, 고분자량 유형의 HA 의 효과가 저분자량 유형의 HA 보다 더 오래 지속되고 더 효능이 있다.
일반적으로 HA 제제는 OA (또는 RA) 의 병리학적 상태로부터 생긴 활액 유체의 손상된 점성 및 탄성을 역전시켜 통증을 제거한다고 여겨진다. 그러나, 외용 HA 제제의 효과는 장기간에 걸쳐 지속되는 반면, 활액 유체에서는 HA 가 수 일 내에 소실된다. 따라서, 앞서-설명한 활액 유체의 점탄성 향상에서와는 다른 기작에 의해 외용 HA 제제가 통증 제거 작용을 할 수 있다는 가능성도 제안되었다. 그 기작의 예에는 이후 설명할 OA 활액막염에 대한 저해 효과가 포함된다.
OA 에서의 통증 및 염증에 대한 발병 기작은 아직도 불명료한 점이 많지만, 최근 연골 퇴행에 의해 2차로 촉발되는 활액막염과 상기 기작의 있음직한 관련성이 주목받고 있다. OA 활액막염은, 그것이 관절수종 또는 열과 같은 통증 및 염증 증상의 주요 원인이 될 뿐만 아니라, 프로테아제, 사이토킨, 및 라디칼의 생성을 통해 관절 파괴를 가속화시키기 때문에, OA 의 병리학적 상태를 조장하는 주요 악화 인자라고 여겨진다. 또한, OA 활액막염은 RA 에서 보이는 바와 같은 상당한 증식성 변화를 나타내지는 않지만, RA 활액막염에 공통되는 많은 면모, 예컨대 활액 세포 증식, 혈관신생, 충혈, 및 활막하 부종 및 섬유증을 갖는다. 따라서, OA 활액막염의 제어는 OA 에서 통증 및 염증을 효과적으로 제거하여 그의 병리학적 상태의 진행을 막는다는 점에서 중요하다.
활액막에서의 HA 의 효과는 아직 완전히 밝혀지지는 않았지만, 동위원소를 사용한 실험으로부터, HA 가 관절강에서보다는 활액막에서 더욱 장기간에 걸쳐 축적되고 존재한다는 것이 알려져 있다. 수용체 인식 HA (CD44 및 RHAMM (HA-매개 운동성에 대한 수용체)) 가 활액 조직을 구성하는 활액 세포의 표면층에 존재하고 활액 세포는 분자량이 심지어 2,000,000 이상인 HA 를 세포의 표면층에서 CD44 를통해 세포 속으로 포함시키는 기작으로 제공된다는 것도 보고되어 있다. 이러한 사실들은, 활액막에서의 효과를 통해 HA 의 통증-제거 효과의 적어도 일부가 발휘됨을 시사한다; 그러나, HA 제제는 OA 활액막염에서 유발되는 염증성 증상 자체를 저해하기에 충분한 효과를 가지지는 않으며, 따라서, 강력한 염증성 증상을 나타내는 OA 및 RA 에 대한 그들의 효과는 조금도 적절하지 않다.
활액막염 제어 약물로서 RA 치료에 사용되는 질환 조절 항류마티스 약물 (이후 DMARD 라고도 칭함) 이라 불리는 약물류가 주지되어 있다. 그 중, 메토트렉세이트 (이후 MTX 라고도 칭함) 는, 예를 들어, 효능이 우수하고 그의 효과 발휘 전 시간이 비교적 짧다는 장점을 갖는 약물이다. 그러나, MTX 는, 치료할 관절 이외의 부위에서는, MTX 의 작용 기작에 기인한 심각한 부작용 (간병증, 조혈 장애, 폐 장애, 위장관 장애 등) 을 야기한다고 알려져 있으며, 이는 MTX 의 사용은 전신 투여에만 승인되었기 때문이다 (일본에서 RA 를 치료하기 위한 약제로서 현재 MTX 캡슐만이 승인되어 있고; 외국에서는 그의 정제 및 주사가 승인되어 있음). 그 결과, MTX 의 사용시 부작용을 충분히 모니터링하고 부작용 발생에 대한 조치를 취하는 것은 필수이다. 그와 같은 부작용이 매우 우려되어, MTX 를 포함하는 활액막염-억제 약물은 RA 보다는 증상이 더 나은 OA 와 같은 기타 관절 질환에 대해서는 승인 표시가 없다. 따라서, MTX 의 전신 부작용 경감 방법 또는 MTX 의 이로운 효과의 발현이 요구되는 부위에서만 MTX 가 그의 작용을 발휘할 수 있도록 하는 방법을 발견한다면, 더욱 안전한 RA 치유법을 제공하는 것뿐만 아니라, MTX 를 광범위한 관절 질환에 사용하는 것이 가능해질 것이다.
MTX 의 부작용을 경감시키고 그의 원하는 효과만 끌어내기 위한 방법으로서, MTX 의 효과를 관절 내부 및 활액막에만 국소화시키려는 여러 방법이 시도되어 왔 다. 예를 들어, MTX 만을 국소적으로 (관절-속으로) 투여하는 방법이 보고되어 있다; 그러나, 그것은 그의 충분한 이로운 효과가 발휘되도록 할 수 없으며, 이는 MTX 가 관절강에서 급속하게 소실되기 때문이다. 리포솜으로 형성한 MTX 를 사용하여 대식세포의 식세포능을 이용하여 그의 관절-속 체류를 개선시키는 방법도 보고되어 있다; 그러나, 그의 임상적 유용성은 아직 확인되지 않았다. 따라서, 관절 질환용 치료 약물로서 MTX 의 부작용을 경감시키고 기대 효과만을 끌어내기 위해서는 기술적 진보가 여전히 필요하다.
앞서 설명한 바와 같이, 활액막은 HA 가 축적되기 쉬운 조직이다. 또한, 활액 세포에는 CD44 와 같은 HA 수용체를 통해 HA 를 세포 속에 포함시키는 기작이 제공된다. 따라서, HA 는 활액막 내에 약물을 축적시키기 위한 담체 제공 가능성을 갖는 것으로 보인다. HA 를 약물용 내부 담체로서 사용하는 몇몇 기술은 이미 보고되었다. 그러나, MTX 로 나타내는, 관절 질환에 적합한 치료 약물, 특히 활액막염 제어에 적합한 약물용 약물 전달 시스템 (이후 DDS 라고도 칭함) 의 창안과 관련된 기술에 HA 를 적용하는 예는 거의 알려져 있지 않다.
이미 알려진 보고서 예들은 다당류-약물 결합체를 포함하며, 여기서는 펩티드 사슬을 통해서 HA 를 포함하는 다당류와 약물이 결합된다 (특허 문헌 1: 일본 공개 특허 No. 05-39306, 특허 문헌 2: 국제 공개 WO94/19376 등). 각각의 문헌은 항암 약물용 DDS 기술에 관한 것이고, DDS 기술이 약물의 암 조직으로의 이동을 개선시킨다고 말한다.
일본 공개 특허 No. 05-39306 에는, 항암 약물로서의 MTX 가 사용된다. 그러나, 그 기술은 MTX 의 암 조직으로의 이동이 개선된 것 및 체내에서의 장기간 존속성이 없는 것을 특징으로 하기 때문에, MTX 의 결합률을 높게 만들고 (상기 특허 문헌의 실시예에서 6.4 내지 19 %), HA 의 분자량을 낮게 만들어서 (상기 특허 문헌의 실시예에서 100,000 돌턴), 항암 효과를 강화시킨다. 또한, 이소우레아 결합을 통한 HA 의 히드록시기와 펩티드 사슬의 결합은 결합체를 수용액 중 덜 안정하게 만든다.
각각 HA 가 약물과 결합되어 있는 결합체를 관절 질환용 치료 약물로서 사용하는 보고서의 실례도 있다. 예를 들어, 국제 공개 WO99/59603 (특허 문헌 3) 에는 부틸렌아민기 (-C4H8NH-) 또는 옥틸렌아민기 (-C8H16NH-) 와 같은 스페이서를 통해 HA 가 약물과 결합된 결합체가 나와 있다. 이 특허 문헌에는 약물이 결합 상태를 유지하는 상태에서 이로운 효과 (세포외의 이로운 효과라고 가정) 를 발휘할 수 있다고 그 결합체를 설명한다. 사실, 이 결합체에서, 스페이서를 통한 약물과 HA 사이의 결합은 비교적 강하며, 따라서 MTX 와 같이 결합체로부터 분리되지 않는 한 이로운 효과를 발휘할 수 없는 약물에 이 기술을 적용하기는 어렵다.
또한, 이 특허 문헌은 매트릭스 메탈로프로테이나아제 저해제 (이후 MMPI 라고도 칭함) 를 약물로서 사용하는 결합체에 관한 것이고, 기재된 실시예도 MMPI 결합체에만 관련되어 있다. MTX 를 약물로서 사용하는 결합체는 특별히 나와 있지 않고, 그 결합체의 약제로서의 유용성에 대한 설명도 없다.
국제 공개 WO02/44218 (특허 문헌 4) 에는 13-아미노-4,7,10-트리옥사트리데 카닐기에 특정기 (노르보넨) 가 추가로 결합되어 있는 스페이서를 사용하고, 노르보넨과 HA 의 히드록시기 사이에 카르바메이트 결합을 형성하여 제조한 HA-약물 결합체가 나와 있다. 그러나, 이 결합체도 특허 문헌 2 에서와 같이 세포외의 이로운 효과를 나타내고자 하는 것으로 보인다; 그 효과는 약물이 결합 상태를 유지하는 상태에서 발휘된다. 따라서, 결합체로부터 분리되지 않는 한 이로운 효과를 발휘할 수 없는 MTX 와 같은 약물에 이 기술을 적용하기는 어렵다. 또한, 특허 문헌 3 은 MMPI 를 약물로서 사용하는 결합체에 관한 것이고, MTX 를 약물로서 사용하는 결합체에 대한 표시는 없다.
이미 검토한 바와 같이, 앞서-언급한 문헌 중 어느 것도 MTX 를 사용하는 HA-MTX 결합체를 기재하지 않을뿐더러, 관절 질환용 치료 약물로서 HA-MTX 결합체를 사용한다는 설명이나 표시가 없다.
또한, 본 발명자들은, 종래 기술로서 공지된 HA-약물 결합체의 합성 방법에서, HA 의 분자량은 합성 공정 도중에 현저하게 감소하여, HA 의 이로운 효과의 손실을 야기함을 입증하였다. HA-약물 결합체를 합성하는 종래의 방법은 일반 조건의 유기 합성 반응 및 후처리를 사용하지만, 고분자량 HA 및 약물의 결합체를 제조하기 위해서는 상기 방법을 추가로 개선할 필요가 있다.
앞서 기재한 바와 같이, 약제로서 사용되는 HA-약물 결합체, 특히 관절 질환 치료에 적합한 고분자량 HA-약물 결합체, 그것을 사용하는 제제, 및 그 결합체의 합성 방법은 이전에는 알려지지 않았다.
특허 문헌 1: 일본 공개 특허 No. 5-39306
특허 문헌 2: 국제 공개 팜플렛 WO94/19376
특허 문헌 3: 국제 공개 팜플렛 WO99/59603
특허 문헌 4: 국제 공개 팜플렛 WO02/44218
본 발명이 해결해야할 과제
본 발명의 목적은 관절 질환용 치료 약물로서 유용한 히알루론산-메토트렉세이트 결합체를 제공하는 것이다.
과제를 해결하는 수단
본 발명자들은, 펩티드 사슬을 포함하는 연결기를 통해 메토트렉세이트가 히알루론산의 카르복실기와 결합된 히알루론산-메토트렉세이트 결합체가 관절 질환용 치료 약물로서 탁월한 효과를 가짐을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 한 가지 요지는 1 내지 8 개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 사슬을 포함하는 연결기를 통해 히알루론산의 카르복실기와 메토트렉세이트가 결합된 히알루론산-메토트렉세이트 결합체를 제공한다. 본 발명의 한 구현예에서, 연결기는 1 내지 8 개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 사슬 및 그 안에 1 내지 5 개의 산소 원자가 임의로 삽입되어 있고/있거나 카르복실기 또는 C1 -6 알콕시카르보닐기로 임의치환되는 C2 -20 알킬렌디아민 사슬을 포함한다.
본 발명의 또다른 요지는 또한 연결기와 결합된 메토트렉세이트가 화학식 (I), (Ⅱ), (Ⅲ), 또는 (Ⅳ) 로 표시되는, 앞서-기재한 히알루론산-메토트렉세이트 결합체를 제공한다:
(식 중, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 히드록시기, 아미노기, C1 -6 알콕시기, C1-6 알킬아미노기, 또는 디-C1 -6 알킬아미노기이고;
L0 는 연결기의 결합 위치임).
본 발명의 추가의 요지는 펩티드 사슬을 포함하는 연결기 및 연결기와 결합된 메토트렉세이트가 화학식 (I') 또는 (Ⅱ') 로 표시되는, 앞서-기재한 히알루론산-메토트렉세이트 결합체를 제공한다:
{식 중, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 히드록시기, 아미노기, C1 -6 알콕시기, C1-6 알킬아미노기, 또는 디-C1 -6 알킬아미노기이고;
L 은 화학식 (X) 으로 나타내는 연결기임:
[식 중, Q1 은, 거기에 결합하는 -NH- 와 함께, 1 내지 8 개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 사슬을 형성하고; 펩티드 사슬에 포함되어 있는 아미노산 잔기는 각각 독립적으로 C1 -6 알킬기, C1 -6 알킬카르보닐기, C1 -6 알콕시카르보닐기, 포르밀기, C1 -6 알킬술포닐기, 및 C6 -10 아릴술포닐기로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의치환되거나 보호되며; 펩티드 사슬에 포함되어 있는 아미드 결합은 각각 독립적으로 질소 원자에 하나 이상의 C1 -6 알킬기 및/또는 C1 -6 알킬카르보 닐기가 임의치환되며; 잔기에 포함되어 있는 카르복실기는 각각 독립적으로 1 또는 2 개의 C1 -6 알킬기로 임의치환된 아미드기로 임의로 전환되고;
R11 및 R12 는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1 -6 알킬기이고;
Q2 는 C2 -20 알킬렌 (여기서 알킬렌은 그 안에 1 내지 5 개의 산소 원자가 임의로 삽입되어 있고/있거나 카르복실기 또는 C1 -6 알콕시카르보닐기로 임의치환됨) 이고;
[HA] 는 히알루론산과의 결합 위치를 나타내고, 연결기는 히알루론산에 포함된 카르복실기와 아미드 결합을 형성함]}.
본 발명의 다른 요지는 또한 각각이 활성 성분으로서 앞서-기재한 히알루론산-메토트렉세이트 결합체를 포함하는, 관절 질환용 약학적 조성물 및 치료 약물을 제공한다.
본 발명의 추가의 요지는 앞서-기재한 히알루론산-메토트렉세이트 결합체를 제조하는데 사용할 수 있는, 하기 화학식 (Va) 또는 (Vb) 의 화합물을 제공한다:
{식 중, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 히드록시기, 아미노기, C1 -6 알콕시기, C1-6 알킬아미노기, 또는 디-C1 -6 알킬아미노기이고;
L1 은 화학식 (X') 으로 나타내는 연결기임:
[식 중, Q1 은, 거기에 결합하는 -NH- 와 함께, 1 내지 8 개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 사슬을 형성하고; 펩티드 사슬에 포함되어 있는 아미노산 잔기는 각각 독립적으로 C1 -6 알킬기, C1 -6 알킬카르보닐기, C1 -6 알콕시카르보닐기, 포르밀기, C1 -6 알킬술포닐기, 및 C6 -10 아릴술포닐기로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의치환되거나 보호되며; 펩티드 사슬에 포함되어 있는 아미드 결합은 각각 독립적으로 질소 원자에 하나 이상의 C1 -6 알킬기 및/또는 C1 -6 알킬카르보 닐기가 임의치환되며; 잔기에 포함되어 있는 카르복실기는 각각 독립적으로 1 또는 2 개의 C1 -6 알킬기로 임의치환된 아미드기로 임의로 전환되고;
R11 및 R12 는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1 -6 알킬기이고;
Q2 는 C2 -20 알킬렌 (여기서 알킬렌은 그 안에 1 내지 5 개의 산소 원자가 임의로 삽입되어 있고/있거나 카르복실기 또는 C1 -6 알콕시카르보닐기로 임의치환됨) 임]}.
본 발명의 추가의 요지는 또한 앞서-기재한 화학식 (Va) 또는 (Vb) 의 화합물을 히알루론산과 반응시키고, 히알루론산의 카르복실기를 N-치환 아미드기로 전환시키는 단계를 포함하는, 앞서-기재한 히알루론산-메토트렉세이트 결합체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명을 아래에 상세하게 설명한다.
본 발명의 히알루론산-메토트렉세이트 결합체 (HA-MTX 결합체) 는 신규의 화합물이다. 본 발명에 따르면, 펩티드 사슬을 포함하는 연결기를 통해 히알루론산 (HA) 의 카르복실기와 메토트렉세이트 (MTX) 가 결합되는 구조를 히알루론산 HA 와 MTX 의 결합 수단으로 사용하여 그 결합체가 HA 의 통증-제거 효과를 보유하고, 또한 MTX 의 활액막염-완화 효과를 갖도록 한다. 따라서, 본 발명의 HA-MTX 결합체는 활액막에 축적된 후, 활액 세포 속으로 들어가서 세포 내에서 MTX 의 이로운 효과를 발휘할 것이다.
그리하여, OA 또는 RA 환자의 무릎 관절 속으로 투여한 경우, 본 발명의 HA- MTX 결합체는 종래의 HA 제제에서와 같이 HA 의 특성을 기반으로 하여 통증-제거 효과를 발휘하면서, 활액 조직 내에 축적되고, 동시에 활액 세포 속으로 서서히 들어가고 MTX 를 방출하여 활액막염-억제 효과를 지속적으로 발휘한다. 이는 MTX 투약량을 경구 투여에서와 비교하여 현저히 감소시켜 (경구 투여에서는 문제가 될) 전신 부작용의 우려를 소멸시키는 것을 가능하게 한다. 또한, 투여 부위에서, HA 제제 및 MTX 는 서로의 작용 기작과는 작용 기작이 다른 약리학적 효과를 발휘할 수 있고, 따라서 그들 사이에서는 상승적인 이로운 효과를 기대할 수 있다.
따라서, 본 발명의 HA-MTX 결합체에 따르면, 관절내 치유법으로서의 HA 의 측면을 가지며, 그로 인해 MTX 의 활액막염-억제 효과가 처리하는 관절에서만 안전하게 발휘될 수 있는, 관절 질환에 있어서 통상적이지 않은 우수한 치료 약물이 제공된다.
본 발명의 히알루론산-메토트렉세이트 결합체 (HA-MTX 결합체) 는 펩티드 사슬을 포함하는 연결기를 통해 히알루론산의 카르복실기와 결합한 메토트렉세이트이다.
본 발명의 목적상, "히알루론산 (HA)" 은 특별히 제한되지는 않지만, 예를 들어, 평균 분자량 50,000 내지 10,000,000 돌턴의 중합체인, 글루쿠론산 및 N-아세틸글루코사민으로 이루어지는 이당류의 중합체이다. 히알루론산의 염은 특별히 제한되지는 않지만, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 알루미늄, 아연, 철, 암모늄, 및 테트라부틸암모늄의 염이 포함된다. 히알루론산 또는 그의 염 및 그들 의 혼합물의 구체적인 예로는 SuvenylTM (제조 및 유통: Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.); ArtzTM (제조: Seikagaku Corporation, 유통: Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.); 및 OpeganTM (제조: Seikagaku Corporation, 유통: Santen Pharmaceutical Co., Ltd.) 이 포함된다. 본 발명의 목적상, "히알루론산 유도체" 는 HA 로부터 유도된, HA 골격을 갖는 물질을 가리킨다. 히알루론산 유도체는 특별히 제한되지는 않지만, 예를 들어, 하나 이상의 카르복실기가 에스테르화된 HA (예를 들어, 벤질 에스테르화 HA (상표명: HyaffTM, Fidia Advanced Biopolymers), 포름알데히드를 사용하여 가교결합시켜 추가로 중합시킨 HA (예를 들어, 상표명: SynviscTM, Biomatrix), 및 HA 내의 하나 이상의 히드록시기를 아세틸화시켜 수득한 아세틸화 HA 가 포함된다.
본 발명의 HA-MTX 결합체는 바람직하게는, 거기에서 HA 의 통증-제거 효과를 감소시키지 않기 위해서, 통증-제거 효과가 임상적으로 확인된 HA 에 견줄만한 상당한 정도의 분자량 및 점탄성을 보유한다. 구체적으로는, 상기 HA-MTX 결합체는, 분자량 증가는 점탄성의 증가를 야기하고 이는 취급을 어렵게 만든다는 점, 및 내부 담체로서의 HA 의 효과를 고려하여, 바람직하게는 600,000 내지 6,000,000 돌턴, 더욱 바람직하게는 800,000 내지 6,000,000 돌턴, 특히 바람직하게는 1,000,000 내지 5,000,000 돌턴의 분자량을 갖는다.
본원에서, 원료 HA 및 HA-MTX 결합체의 분자량은 극한 점도로부터 점도-평균 분자량을 계산하는 방법으로 측정한다. 극한 점도 ([η]) 의 점도-평균 분자량 (Mw) 으로의 전환은 하기식을 사용하여 계산할 수 있다.
Mw = ([η]/0.00036)1.282
본 발명의 펩티드 사슬을 포함하는 연결기에서, 펩티드 사슬은 아미노산으로 구성된다. 아미노산의 예로는 천연 α-아미노산 예컨대 글리신, 알라닌, 세린, 프롤린, 발린, 트레오닌, 시스테인, 류신, 이소류신, 아스파라긴, 아스파르트산, 리신, 글루타민, 글루탐산, 메티오닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 아르기닌, 타이로신, 및 트립토판; 및 비-천연 α-아미노산 예컨대 알킬 측쇄를 갖는 α-아미노산 (예를 들어, 노르발린, 노르류신, 또는 t-류신), 시클로알킬기로 치환된 알라닌 또는 글리신 (예를 들어, 시클로펜틸알라닌, 시클로헥실알라닌, 또는 시클로헥실글리신), 및 아릴기로 치환된 알라닌 또는 글리신 (예를 들어, 피리딜알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌, 치환 페닐알라닌, 또는 페닐글리신), β-아미노산 예컨대 β-알라닌, γ-아미노산 예컨대 γ-아미노부티르산, 및 아미노술폰산 예컨대 타우린이 포함된다. 본 발명의 연결기 펩티드 내의 아미노산은 또한 잔기가 적당히 치환 또는 보호된 것들을 포함한다. 예를 들어, 보호기를 사용하여 잔기의 작용기를 보호할 수 있다. 이를 위해 사용되는 보호기는 업계에 주지되어 있고, 그들의 일부 예를 본 명세서의 다른 단락에서 설명한다. 각각의 치환기 및 보호기, 특히 보호기를 도입하는 방법은 업계에 주지된 것일 수 있다.
연결기는 아미노산으로만 구성될 수 있거나, 펩티드 사슬 내부 또는 말단에, 아미노산 이외의 화합물로부터 유도된 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 연결기로는 디아미노 화합물 예컨대 알킬렌디아민 또는 옥사알킬렌디아민 또는 디카르복실산 화합물 예컨대 숙신산이 펩티드 사슬 내부 또는 말단에 연결된 펩티드 사슬을 갖는 연결기가 포함된다. 연결기가 펩티드 사슬 내부 또는 말단에 아미노산 이외의 화합물을 포함하고 MTX 및 히알루론산의 카르복실기에 연결되어 있는 경우, 디아미노 화합물 예컨대 알킬렌디아민 또는 옥사알킬렌디아민은 바람직하게는 펩티드 사슬의 말단에 존재하고; 특히 바람직하게는, 에틸렌디아민 또는 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민은 펩티드 사슬의 말단에 존재한다. 펩티드 사슬을 구성하는 아미노산은 특별히 제한되지는 않지만, 프로테아제에 대한 친화력의 관점에서, 바람직하게는 α-아미노산이고; MTX 에 결합하는, 펩티드 사슬을 포함하는 연결기의 말단은 바람직하게는 α-아미노산이다.
펩티드 사슬을 구성하는 아미노산의 수는 특별히 제한되지는 않지만, 전형적으로는 1 내지 8, 바람직하게는 1 내지 6, 특히 바람직하게는 1 내지 4 이다. 펩티드 사슬을 구성하는 아미노산 잔기는 각각 독립적으로 하나 이상의 기로 적당히 치환 또는 보호될 수 있다. 그러한 기의 비제한적 예로는 C1 -6 알킬기, C1 -6 알킬카르보닐기, C1 -6 알콕시카르보닐기 (예를 들어, 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기, (n- 또는 i-)프로필옥시카르보닐기, 및 (n-, s-, 또는 t-)부톡시카르보닐기), 포르밀기, C1 -6 알킬술포닐기 (예를 들어, 메탄술포닐기, 에탄술포닐기, 및 (n- 또는 i-)프로판술포닐기), 및 C6 -10 아릴술포닐기 (예를 들어, 벤젠술포닐기, (o-, m-, 또는 p-)톨루엔술포닐기, 및 (1- 또는 2-)나프탈렌술포닐기) 가 포함된다. 치환 또는 보호의 결과로, 예를 들어, 잔기 내에 포함되어 있는 카르복실기는 C1-6 알콕시카르보닐기로; 그 안에 있는 히드록시기는 C1 -6 알콕시기 또는 C1 -6 알킬카르보닐옥시기로; 그리고 그 안에 있는 아미노기는 C1 -6 알킬아미노기, 디-C1 -6 알킬아미노기, C1 -6 알킬카르보닐아미노기, 또는 N-C1 -6 알킬-C1 -6 알킬카르보닐아미노기로 전환될 수 있다. 또한, 잔기 내에 포함되어 있는 카르복실기는 하나 또는 두 개의 C1 -6 알킬기로 임의치환되는 아미드기로 임의로 전환된다. 질소-함유 헤테로사이클 예컨대 인돌 고리 및 이미다졸 고리가 잔기 내에 포함되어 있는 경우, 그 고리에서의 질소 원자는 각각 독립적으로 C1 -6 알킬기 또는 C1 -6 알킬카르보닐기로 보호될 수 있다. 구아니딘기가 잔기 내에 포함되어 있는 경우, 그 안에 포함되어 있는 질소 원자는 또한 C1 -6 알킬기 또는 C1 -6 알킬카르보닐기로 보호될 수 있다. 질소 원자를 위한 기타 보호기는 특별히 제한되지는 않지만, 흔히 사용되는 기 예컨대 앞서-기재한 알콕시카르보닐, 포르밀, C1 -6 알킬술포닐, 및 C1 -6 아릴술포닐기로부터 선택될 수도 있다. 티올기가 잔기 내에 포함되어 있는 경우, C1-6 알킬기 또는 C1 -6 알킬카르보닐기로 보호될 수 있다. 또한, 펩티드 내에 포함되어 있는 아미드 결합은 C1 -6 알킬기 및/또는 C1 -6 알킬카르보닐기로 치환될 수도 있고, 예를 들어, -CON(C1 -6 알킬)- 로 전환될 수 있다.
펩티드 사슬을 구성하는 아미노산 서열은 특별히 제한되지는 않지만, 그들의 예로는 하기가 포함된다. 이와 관련하여, 표적 프로테아제가 생체 내에 존재하고, 거기에 대한 기질 인식 아미노산 서열을 알고 있는 경우, 인식 부위 및/또는 절단 부위를 포함하는 아미노산 서열을 사용할 수도 있다.
1 개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 사슬:
Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val 등. Phe, Tyr, Ile, 및 Glu 가 바람직하다.
2 개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 사슬:
PhePhe, PheGly, PheLeu, TyrPhe, TrpPhe, PheTrp, PheTyr, GlyPhe, GlyGly 등. PhePhe 및 PheGly 가 바람직하다.
3 개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 사슬:
PheGlyGly, PheLeuGly, PhePheGly, AsnPhePhe, GlyPhePhe, LeuPhePhe, LeuAlaLeu, AlaValAla, GlyAlaPhe, GlyPheAla, GlyIleAla, GlyIlePhe, GlyLeuAla, GlyValAla, GlyValPhe, GlyGlyGly 등. AsnPhePhe 가 바람직하다.
4 개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 사슬:
GlyPheLeuGly, GlyPhePheLeu, GlyPhePheAla, GlyPheTyrAla, GlyPheGlyPhe, GlyPheGlyGly, GlyGlyPheGly, GlyGlyPheTyr, GlyGlyGlyGly, LeuAlaLeuAla, AlaLeuAlaLeu, AlaGlyValPhe, GlyAsnPhePhe 등. GlyPheLeuGly 가 바람직하다.
본 발명에 따른 연결기는, 예를 들어, 상기 화학식 (X) 으로 나타내는 구조 를 가질 수 있고, 여기서 Q1 은, 거기에 결합하는 -NH- 와 함께, 상기 기재한 바와 같이 1 내지 8 개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 사슬을 형성한다. 또한, Q2 는 그 안에 1 내지 5 개의 산소 원자가 임의로 삽입되거나 카르복실기 또는 C1 -6 알콕시카르보닐기로 임의치환된 C2 -20 알킬렌이다. Q2 의 구체적인 예로는 에탄-1,2-디일기, 프로판-1,3-디일기, 부탄-1,4-디일기, 펜탄-1,5-디일기, 헥산-1,6-디일기, 헵탄-1,7-디일기, 옥탄-1,8-디일기, 노난-1,9-디일기, 데칸-1,10-디일기, 2-메틸프로판-1,3-디일기, 2-메틸부탄-1,4-디일기, 3-메틸부탄-1,4-디일기, 3-메틸펜탄-1,5-디일기, 3-에틸펜탄-1,5-디일기, 2-메틸헥산-1,6-디일기, 3-메틸헥산-1,6-디일기, 4-메틸헵탄-1,7-디일기, 3-옥사펜탄-1,5-디일기, 3-옥사헥산-1,6-디일기, 4-옥사헥산-1,6-디일기, 3-옥사헵탄-1,7-디일기, 4-옥사헵탄-1,7-디일기, 4-옥사옥탄-1,8-디일기, 3,6-디옥사옥탄-1,8-디일기, 3,6-디옥사노난-1,9-디일기, 3,6-디옥사-4-메틸노난-1,9-디일기, 4,7-디옥사데칸-1,10-디일기, 4,9-디옥사도데칸-1,12-디일기, 및 4,7,10-트리옥사트리데칸-1,13-디일기가 포함된다. 바람직한 예로는 에탄-1,2-디일기, 펜탄-1,5-디일기, 3-옥사펜탄-1,5-디일기, 3,6-디옥사옥탄-1,8-디일기, 4,7-디옥사데칸-1,10-디일기, 4,9-디옥사도데칸-1,12-디일기, 및 4,7,10-트리옥사트리데칸-1,13-디일기가 포함된다.
본 발명의 HA-MTX 결합체는, MTX 가 펩티드 사슬을 포함하는 연결기를 통해 HA 의 카르복실기에 결합되는 한, 어떠한 결합 방식도 취할 수 있다. 따라서, 펩티드 사슬을 포함하는 연결기는 하기와 결합될 수 있고:
1) MTX 의 α-위치에서의 카르복실기;
2) MTX 의 γ-위치에서의 카르복실기; 또는
3) MTX 의 아미노기,
그러한 복수의 결합 방식이 공존할 수 있다 (예를 들어, MTX 의 α-위치에서의 카르복실기와 결합된 결합체 및 MTX 의 γ-위치에서의 카르복실기와 결합된 결합체가 공존할 수 있음). 그러나, 펩티드 사슬을 포함하는 연결기는, 프로테아제에 대한 친화력 및 합성의 관점에서, 바람직하게는 MTX 의 α-위치에서의 카르복실기 및/또는 MTX 의 γ-위치에서의 카르복실기와, 더욱 바람직하게는 MTX 의 α-위치에서의 카르복실기와 결합된다.
본 발명의 HA-MTX 결합체에 따르면, 펩티드 사슬을 포함하는 연결기는 특히 바람직하게는 펩티드 사슬의 말단에 디아미노 화합물을 가지고, α-아미노산으로 이루어지는 펩티드 사슬을 포함하는 연결기이고; 그 연결기의 결합 방식은 특히 바람직하게는 산 아미드 결합을 통한 펩티드 사슬의 N-말단과 MTX 의 α-위치에서의 카르복실기의 결합 및 디아미노 화합물에 의한 산 아미드 결합을 통한 펩티드 사슬의 C-말단과 HA 의 카르복실기의 결합으로 이루어지는 결합 방식이다.
본 발명의 히알루론산-메토트렉세이트 결합체에서, 메토트렉세이트 (MTX) 부분은 연결기에 의한 개질에 더하여, 공지의 방법으로 전구약물의 형태로 만들 수 있다.
본원에서 사용될 때, "C1 -6 알킬기" 는 탄소 원자가 1-6 개인 직쇄 또는 분지 형 알킬기를 가리키며, 그 기의 예로는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, i-프로필기, n-부틸기, s-부틸기, i-부틸기, t-부틸기, n-펜틸기, 3-메틸부틸기, 2-메틸부틸기, 1-메틸부틸기, 1-에틸프로필기, 및 n-헥실기가 포함된다.
본원에서 사용될 때, "C1 -6 알킬카르보닐" 은 탄소 원자가 1-6 개인 직쇄 또는 분지형 알킬카르보닐기를 가리키며, 그 기의 예로는 알킬 부분으로 앞서 정의한 알킬기를 갖는 것들, 예컨대 아세틸기, 프로피오닐기, 2-메틸프로피오닐기, 또는 2,2-디메틸프로피오닐기가 포함된다.
본원에서 사용될 때, "C1 -6 알콕시" 는 탄소 원자가 1-6 개인 직쇄 또는 분지형 알콕시기를 가리키며, 그 기의 예로는 알킬 부분으로 앞서 정의한 알킬기를 갖는 것들, 예컨대 메톡시기, 에톡시기, 또는 n-프로폭시기가 포함된다.
본원에서 사용될 때, "C1 -6 알킬아미노" 는 탄소 원자가 1-6 개인 직쇄 또는 분지형 알킬아미노기를 가리키며, 그 기의 예로는 알킬 부분으로 앞서 정의한 알킬기를 갖는 것들, 예컨대 메틸아미노기, 에틸아미노기, 또는 n-프로필아미노기가 포함된다.
본원에서 사용될 때, "디-C1 -6 알킬아미노" 는 탄소 원자가 1-6 개인 직쇄 또는 분지형 디알킬아미노기를 가리키며, 그 기의 예로는 알킬 부분으로 앞서 정의한 알킬기 (동일 또는 상이할 수 있음) 를 갖는 것들, 예컨대 디메틸아미노기, 에틸메틸아미노기, 디에틸아미노기, 또는 에틸-n-프로필아미노기가 포함된다.
본원에서 사용될 때, "디-C2 -20 알킬렌" 은 탄소 원자가 2-20 개인 직쇄 또는 분지형 알킬렌기를 가리키며, 그 기의 예로는 에틸렌기, 프로필렌기, 부틸렌기, 옥틸렌기, 및 데칼렌기가 포함된다.
본원에서 사용될 때, "C1 -6 알콕시카르보닐기" 는 탄소 원자가 1-6 개인 직쇄 또는 분지형 알콕시카르보닐기를 가리키며, 그 기의 예로는 알킬 부분으로 앞서 정의한 알킬기를 갖는 것들, 예컨대 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기, 또는 n-프로폭시카르보닐기가 포함된다.
본원에서 사용될 때, "C1 -6 알킬술포닐기" 는 탄소 원자가 1-6 개인 직쇄 또는 분지형 알킬술포닐기를 가리키며, 그 기의 예로는 알킬 부분으로 앞서 정의한 알킬기를 갖는 것들, 예컨대 메탄술포닐기, 에탄술포닐기, 또는 n-프로판술포닐기가 포함된다.
본원에서 사용될 때, "아실화" 는 C1 -6 알킬카르보닐화 및 벤조일화를 포함하며; 벤조일기는 C1 -6 알킬, 할로겐 원자, C1 -6 알콕시 등으로 임의치환된다.
본 발명의 HA-MTX 결합체 중 MTX 의 결합율은 바람직하게는 이로운 효과가 발휘되고 부작용의 우려가 없는 범위 내이다. 본원에서 사용될 때, "MTX 의 결합율" 은 하기식으로 계산한다:
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MTX 의 결합율은 특별히 제한되지는 않지만, 이로운 효과를 발휘한다는 관점에서, 바람직하게는 0.5 % 이상, 더욱 바람직하게는 1.0 % 이상이다. 한편, MTX 의 효과를 투여 부위로 한정하고, MTX 의 전신 부작용을 감소시키기 위해서, 결합율은 바람직하게는 10 % 미만이다. 또한, 본 발명의 HA-MTX 결합체는 그의 불용화를 야기하여, 그 결합체의 분자량이 크고 MTX 의 결합율이 큰 경우의 합성시 문제가 생김을 고려하면, MTX 의 결합율은 바람직하게는 0.5 % 이상 내지 4.5 % 미만, 특히 바람직하게는 1.0 % 이상 내지 4.5 % 미만이다.
본 발명의 HA-MTX 결합체는 또한 염의 형태로 존재할 수 있지만, 그 염은 그것을 적용한다는 관점에서 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 염이다. 그 염의 예로는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 알루미늄, 아연, 철, 암모늄, 및 테트라부틸암모늄의 염이 포함된다.
본 발명의 HA-MTX 결합체의 합성시, HA, 펩티드 사슬을 포함하는 연결기, 및 MTX 를 적당한 순서로 결합시킬 수 있다. 예를 들어, MTX 를 도입하기 전에 HA-펩티드 사슬을 포함하는 연결기를 구축하는 방법, 및 HA 를 도입하기 전에 MTX-펩티드 사슬을 포함하는 연결기를 구축하는 방법을 예로 든다. 각각의 결합 반응은 -20 ℃ 내지 40 ℃ 의 온도에서 수 분 내지 수 일 동안 통상의 산 아미드 결합 반응에 이용되는 용매 및 축합제 및, 필요하다면, 반응-촉진 첨가제를 사용하는 반응에 의해 수행될 수 있다. 용매의 예로는 물, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, 디메틸술폭시드, 테트라히드로푸란, 디옥산, 메탄올, 에탄올, 디클로로메탄, 클로로포름 등, 또는 그들의 혼합물이 포함된다. 축합제의 예로 는 카르보디이미드 화합물 예컨대 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드; 디시클로헥실카르보디이미드, 또는 디이소프로필카르보디이미드, 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트, O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트, 및 1-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디히드로퀴놀린이 포함된다. 반응-촉진 첨가제의 예로는 활성 에스테르제 예컨대 N-히드록시숙신이미드, N-히드록시-5-노르보넨-2,3-카르복스이미드, 1-히드록시벤조트리아졸, 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸, 또는 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아졸; 및 pH 조절제 예컨대 트리에틸아민, N-메틸모르폴린, N,N-디이소프로필에틸아민, 또는 트리스[2-(2-메톡시에톡시)에틸]아민이 포함된다. 반응에서, 아미노산 측쇄와 같은 작용기 (예를 들어, 히드록시기, 카르복실기, 또는 아미노기) 에 대해서는, 통상의 유기 합성에 널리 이용되는 보호기를 사용하는 것이 가능하다.
본원에서는, HA 의 분자량 감소를 방지하기 위해서, 결합 반응의 제어 용이성의 관점에서, HA 를 도입하기 전에 MTX-펩티드 사슬을 포함하는 연결기를 구축하는 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 용매는 바람직하게는 물, N,N-디메틸포름아미드, 테트라히드로푸란, 에탄올, 또는 그들의 혼합물이고, 가장 바람직하게는 물 및 테트라히드로푸란의 혼합물 (그들의 혼합비는 가장 바람직하게는 1:1 임) 이다. 축합제는 바람직하게는 수용성인 것이고, 가장 바람직하게는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드이며, 이것은 가장 바람직하게는 HA 중 카르복실기를 기준으로 0.1 당량의 양으로 첨가된다. 반응-촉진 첨가제는 활성 에스 테르제에 있어서 가장 바람직하게는 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아졸이고, 이것은 가장 바람직하게는 HA 중 카르복실기를 기준으로 0.1 당량의 양으로 첨가된다. pH 조절제는 가장 바람직하게는 트리스[2-(2-메톡시에톡시)에틸]아민이고; 반응 도중의 pH 는 가장 바람직하게는 6 내지 7 이다. 반응 온도는 바람직하게는 -10 ℃ 내지 30 ℃, 가장 바람직하게는 0 ℃ 내지 15 ℃ 이다. 반응 시간은 바람직하게는 1 시간 내지 48 시간, 가장 바람직하게는 12 시간 내지 24 시간이다.
본원에서 사용될 때, "관절 질환" 은 구체적으로는 관절 연골 결손, 골관절염 (명백한 원인이 없는 일차 질환, 및 원인이 되는 질환이 존재하는 이차 질환 포함), 어깨 주위관절염, 류마티스성 관절염, 반응성 관절염, 바이러스성 관절염, 화농성 관절염, 결핵성 관절염, 또는 신경성관절병증과 같은 질환을 가리키며, 추가로 이러한 질환에서의 관절 통증 (예를 들어, 류마티스성 관절염에서의 무릎 관절 통증) 을 포함한다. 본원에서 사용될 때, "관절 질환용 치료 약물" 에는 앞서-기재한 관절 질환을 치료하는데 사용되는 약물뿐만 아니라, 그의 예방, 그 병리학적 상태의 진행의 억제 (현재 상태의 악화의 방지 또는 현재 상태의 유지) 등에 사용되는 약물이 포함된다.
본 발명의 HA-MTX 결합체는 그의 유효량을 약학적에 허용가능한 담체, 부형제, 붕해제, 윤활제, 결합제, 착향제 또는 착색제 등을 적당히 첨가하여 약학적 조성물의 형태로 사용할 수 있다. 본 발명의 HA-MTX 결합체를 활성 성분으로서 함유하는 약학적 조성물은 바람직하게는 관절 질환용 치료 약물로서 사용되며, 특 히 바람직하게는 관절 속에 투여하기 위한 국소 제제의 형태로 이용된다.
비-제한적 예로서, 본 발명의 HA-MTX 결합체를 관절 질환용 치료 약물로서 제형화하는 경우, 주사 제제 형태로 제형화하기 위해서 예를 들어 생리식염수 또는 인산염 생리식염수에 원하는 농도로 용해시킬 수 있다. 이 경우, 산 또는 염기를 첨가하여 상기 용액을 원하는 pH 로 임의로 조절할 수 있다. 상기 용액은 또한 나트륨 또는 칼륨과 같은 1가 금속 염 또는 마그네슘, 칼슘, 또는 망간과 같은 2가 금속 염을 포함하는 무기 염을 첨가하여 원하는 염 농도로 조절할 수 있다. 또한, 안정화제 등을 임의로 첨가할 수 있다. 그와 같이 제조된 본 발명의 HA-MTX 결합체의 용액은 미리 일회용 주사 시린지 등에 채워 살포할 수 있다. 본 발명의 HA-MTX 결합체를 활성 성분으로서 함유하는 관절 질환용 치료 약물을 투여하는 경우, 그 용액 1 내지 3 ㎖ 를 환자에게 각각 투여할 때 0.01 % w/v 내지 10 % w/v, 바람직하게는 0.1 % w/v 내지 2.0 % w/v, 특히 바람직하게는 0.5 % w/v 내지 1.5 % w/v 의 HA-MTX 결합체 농도로 사용할 수 있다. 그러나, 투약량은 의사의 지시, 대상 환자, 질환의 유형 및 심각도, HA-MTX 결합체의 분자량 등에 따라 최적으로 바뀔 수 있다.
아래 실시예에서 설명하듯이, 본 발명의 HA-MTX 결합체는, 무릎 관절에 병변이 생긴 관절염 모델에 관절-속으로 투여할 때, HA 로는 볼 수 없는, 활액막염에 대한 완화 효과를 발휘한다. 또한, 본 발명자들은 분자량이 600,000 돌턴 이상, 특히 800,000 돌턴 이상인 HA-MTX 결합체의 활액막염에 대한 완화 효과가 저분자량 (300,000 돌턴) HA-MTX 결합체에 비하여 매우 높음을 발견하였다.
도 1 은 시험 물질 및 대조 물질 (분자량이 1900,000 인 히알루론산 및 분자량이 800,000 인 히알루론산) 의 점탄성 측정 결과를 보여주는 그래프 세트이고;
도 2 는 시험 물질-처리군 및 대조 (HA 및 운반체) 군에서, 무릎 관절 속에 mBSA 를 주사한 직후 무릎 관절 팽창의 시간 경과를 보여주는 그래프이고;
도 3 은 도 2 에서 시험 물질-처리 및 대조군에 대한 그래프의 AUC 를 보여주는 그래프이고;
도 4 는 실시예 1 의 물질로 처리한 군 및 대조 (HA 및 식염수) 군에서 콜라겐 관절염 유도 직후 무릎 관절 폭의 시간 경과를 보여주는 그래프 세트이다. 좌측 도면은 처리한 우측 무릎 관절의 시간 경과를 보여주고, 우측 도면은 비처리한 좌측 무릎 관절의 시간 경과를 보여준다. 이들 그래프에서는, 평균 ± 평균의 표준 오차를 나타내고;
도 5 는 실시예 1 의 물질로 처리한 군 및 대조 (HA 및 식염수) 군에서, 콜라게나아제 OA 모델의 관절염 유발 직후부터 그 후 20 일까지, 무릎 관절 팽창의 시간 경과를 보여주는 그래프이다. 이 그래프에서는, 평균 ± 평균의 표준 오차를 나타내고;
도 6 은 실시예 2-2 의 물질로 처리한 군 및 식염수-처리군에서, 콜라게나아제 OA 모델의 내측 경골 고원 (medial tibial plateau) 에서 연골 퇴행의 정도를 보여주는 그래프이다. 이 그래프에서는, 평균 ± 평균의 표준 오차를 나타낸다.
본 발명을 수행하는
최량의
형태
아래의 실시예를 근거로 하여, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명을 이러한 실시예로 한정시키고자 함은 아니다.
실시예
실시예
1-1
2-[N-[N-[N-[4-[[(2,4-디아미노-6-프테리디닐)메틸]메틸아미노]벤조일]-α-(O5-메틸글루타밀)]페닐알라닐]페닐알라닐아미노]에틸아민: MTX-α-PhePhe-NH-C2H4-NH2 (화합물 1) 의 제조
(a) Cbz-Phe-NH-C2H4-NH-Boc (화합물 1a) 의 제조
N-카르보벤족시-L-페닐알라닌 (Cbz-Phe: 7.16 g, 25.4 m㏖), N-t-부톡시카르보닐-에틸렌디아민 염산염 (5.00 g, 25.4 m㏖), 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (HOBT: 4.28 g, 28.0 m㏖), 및 N-메틸모르폴린 (NMM: 3.07 ㎖, 28.0 m㏖) 을 100 ㎖ 의 디메틸포름아미드 (DMF) 에 용해시킨 후, 거기에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염 (EDC: 5.36 g, 28.0 m㏖) 을 교반 하에 빙냉시키면서 첨가한 다음, 실온에서 1 일 동안 교반하였다. 10 % 시트르산 수용액을 반응 용액에 첨가하고, 침전된 고체를 클로로포름 및 소량의 메탄올에 용해시킨 다음, 중탄산나트륨 포화 용액 및 포화 식염수로 상기 용액을 세척한 후, 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 하에 농축시킨 후, 생성된 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크 로마토그래피 (용출 용매: 클로로포름:메탄올 = 95:5) 를 사용하여 정제시켜 9.69 g 의 표제 화합물을 백색 고체로 얻었다.
(b) Cbz-PhePhe-NH-C2H4-NH-Boc (화합물 1b) 의 제조
화합물 1a (9.69 g, 21.9 m㏖) 를 200 ㎖ 의 메탄올에 용해시킨 후, 거기에 500 ㎎ 의 10 % 팔라듐 탄소를 첨가한 다음, 수소 대기 하에 1 일 동안 실온에서 교반하였다. 촉매를 반응 혼합물로부터 여과해낸 후, 감압 하에 농축시켰다. 이 잔류물, Cbz-Phe (6.92 g, 23.1 m㏖), HOBT (3.71 g, 24.2 m㏖), 및 NMM (2.66 ㎖, 24.2 m㏖) 을 50 ㎖ 의 디메틸포름아미드 (DMF) 에 용해시킨 후, EDC (4.64 g, 24.2 m㏖) 를 교반 하에 빙냉시키면서 첨가한 다음, 1 일 동안 실온에서 교반하였다. 물을 반응 용액에 첨가한 후, 10 % 시트르산 수용액, 중탄산나트륨 포화 용액, 및 물로 세척한 다음 건조시켰다. 생성된 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (용출 용매: 클로로포름:메탄올 = 90:10) 를 사용하여 정제시켜 12.8 g
의 표제 화합물을 백색 고체로 얻었다.
(c) Cbz-Glu(OMe)PhePhe-NH-C2H4-NH-Boc (화합물 1c) 의 제조
화합물 1b (11.1 g, 18.9 ㎎) 를 800 ㎖ 의 메탄올, 50 ㎖ 의 DMF, 및 500 ㎖ 의 THF 에 용해시킨 후, 거기에 1.00 g 의 10 % 팔라듐 탄소를 첨가한 다음, 수소 대기 하에 1 일 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물로부터 촉매를 여과해낸 후, 감압 하에 농축시켰다. 이 잔류물, N-카르보벤족시-L-글루탐산-γ-메틸 에스테르 (Cbz-Glu(OMe): 5.58 g, 18.9 m㏖), HOBT (3.18 g, 20.8 m㏖), 및 NMM (2.29 ㎖, 20.8 m㏖) 을 100 ㎖ 의 DMF 에 용해시킨 후, 거기에 EDC (3.99 g, 20.8 m㏖) 을 교반 하에 빙냉시키면서 첨가한 다음, 2 일 동안 실온에서 교반하였다. 상기 반응 용액에 10 % 시트르산을 교반 하에 빙냉시키면서 첨가하고, 생성된 침전물을 5 % 중탄산나트륨 용액 및 물로 세척한 후, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (용출 용매: 디클로로메탄:메탄올 = 10:1) 를 사용하여 정제한 다음, 메탄올을 첨가하여 침전물을 생성시켜 11.1 g 의 표제 화합물을 백색 분말로 얻었다.
(d) MTX-α-PhePhe-NH-C2H4-NH-Boc (화합물 1d) 의 제조
화합물 1c (348 ㎎, 0.476 m㏖) 를 10 ㎖ 의 메탄올 및 10 ㎖ 의 테트라히드로푸란에 용해시킨 후, 33 ㎎ 의 10 % 팔라듐 탄소를 거기에 첨가한 다음, 수소 대 기 하에 1.5 시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물로부터 촉매를 여과해낸 후, 감압 하에 농축시켰다. 이 잔류물, 4-[N-(2,4-디아미노-6-프테리디닐메틸)-N-메틸아미노]벤조산 (197 ㎎, 0.547 m㏖), 및 HOBT (76 ㎎, 0.499 m㏖) 를 4 ㎖ 의 N-메틸피롤리돈 (NMP) 에 용해시킨 후, 거기에 N-메틸모르폴린 (NMM, 55 ㎕, 0.499 m㏖) 및 EDC (105 ㎎, 0.547 m㏖) 를 교반 하에 빙냉시키면서 첨가한 다음, 4 일 동안 실온에서 교반하였다. 반응 용액에 5 % 중탄산나트륨 용액을 첨가하고, 생성된 침전물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (용출 용매: 디클로로메탄:메탄올 = 10:1) 및 이어서 아민 실리카 겔 (NH-DM1020, 100-200 메쉬, Fuji Silysia Chemical Ltd.) 칼럼 크로마토그래피 (용출 용매: 디클로로메탄:메탄올 = 10:1) 를 사용하여 정제시켜 362 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 얻었다.
(e) MTX-α-PhePhe-NH-C2H4-NH2 (화합물 1) 의 제조
화합물 1d (360 ㎎, 0.398 m㏖) 에 5 ㎖ 의 트리플루오로아세트산을 빙냉 하에 첨가한 후, 1 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 감압 하에 농축시킨 후, 아민 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (용출 용매: 디클로로메탄:메탄올 = 100:10, 2 회) 를 사용하여 잔류물을 정제하여 275 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 얻었 다.
실시예
1-2
4,7,10-트리옥사-13-[N-[N-[N-[4-[[(2,4-디아미노-6-프테리디닐)메틸]메틸아미노]벤조일]-α-(O5-메틸글루타밀)]페닐알라닐]페닐알라닐아미노]트리데카닐아민: MTX-α-PhePhe-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 2) 의 제조
(a) Cbz-Phe-NH-C10H20O3-NH-Boc (화합물 2a) 의 제조
N-카르보벤족시-L-페닐알라닌 (Cbz-Phe: 852 ㎎, 2.85 m㏖), N-t-부톡시카르보닐-4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민 (760 ㎎, 2.37 m㏖), 및 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (HOBT: 363 ㎎, 2.37 m㏖) 을 6 ㎖ 의 디메틸포름아미드 (DMF) 에 용해시킨 후, 거기에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염 (EDC: 546 ㎎, 2.85 m㏖) 을 교반 하에 빙냉시키면서 첨가한 다음, 2 일 동안 실온에서 교반하였다. 에틸 아세테이트를 반응 용액에 첨가한 후, 10 % 시트르산 수용액, 5 % 중탄산나트륨 용액, 및 포화 식염수로 세척한 후, 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 하에 농축시킨 후, 생성된 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토 그래피 (용출 용매: 디클로로메탄:메탄올 = 100:3) 를 사용하여 정제시켜 1.35 g 의 표제 화합물을 유성 물질로 얻었다.
(b) Cbz-PhePhe-NH-C10H20O3-NH-Boc (화합물 2b) 의 제조
화합물 2a (1.35 g, 2.24 m㏖) 를 12 ㎖ 의 메탄올에 용해시킨 후, 거기에 200 ㎎ 의 10 % 팔라듐 탄소를 첨가한 다음, 수소 대기 하에 4 시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물로부터 촉매를 여과해낸 후, 감압 하에 농축시켰다. 이 잔류물, Cbz-Phe (1.07 g, 3.57 m㏖) 및 HOBT (514 ㎎, 3.36 m㏖) 를 10 ㎖ 의 DMF 에 용해시킨 후, EDC (688 ㎎, 3.59 m㏖) 를 교반 하에 빙냉시키면서 첨가한 다음, 2 일 동안 실온에서 교반하였다. 에틸 아세테이트를 반응 용액에 첨가한 후, 10 % 시트르산 수용액, 5 % 중탄산나트륨 용액, 및 포화 식염수로 세척한 다음, 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 하에 농축시킨 후, 생성된 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (용출 용매: 디클로로메탄:메탄올 = 100:3) 를 사용하여 정제하였다. n-헥산을 거기에 첨가하여 백색 침전물을 생성한 후, 여과에 의해 수집하여 1.56 g 의 표제 화합물을 얻었다.
(c) Cbz-Glu(OMe)PhePhe-NH-C10H20O3-NH-Boc (화합물 2c) 의 제조
화합물 2b (500 ㎎, 0.668 m㏖) 를 10 ㎖ 의 메탄올에 용해시킨 후, 거기에 150 ㎎ 의 10 % 팔라듐 탄소를 첨가한 다음, 수소 대기 하에 1 일 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물로부터 촉매를 여과해낸 후, 감압 하에 농축시켰다. 이 잔류물, N-카르보벤족시-L-글루탐산-γ-메틸 에스테르 (Cbz-Glu(OMe): 217 ㎎, 0.734 m㏖) 및 HOBT (102 ㎎, 0.668 m㏖) 를 5 ㎖ 의 DMF 에 용해시킨 후, 거기에 EDC (141 ㎎, 0.734 m㏖) 를 교반 하에 빙냉시키면서 첨가한 다음, 16 시간 동안 실온에서 교반하였다. 에틸 아세테이트를 반응 용액에 첨가한 후, 10 % 시트르산 수용액, 5 % 중탄산나트륨 용액, 및 포화 식염수로 세척한 다음, 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 하에 농축시킨 후, 생성된 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (용출 용매: 디클로로메탄:메탄올 = 100:5) 를 사용하여 정제하였다. n-헥산을 거기에 첨가하여 백색 침전물을 생성한 후, 여과에 의해 수집하여 529 ㎎ 의 표제 화합물을 얻었다.
(d) MTX-α-PhePhe-NH-C10H20O3-NH-Boc (화합물 2d) 의 제조
화합물 2c (514 ㎎, 0.576 m㏖) 를 30 ㎖ 의 메탄올에 현탁시킨 후, 거기에 100 ㎎ 의 10 % 팔라듐 탄소를 첨가한 다음, 수소 대기 하에 1.5 시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물로부터 촉매를 여과해낸 후, 감압 하에 농축시켰다. 이 잔류물, 4-[N-(2,4-디아미노-6-프테리디닐메틸)-N-메틸아미노]벤조산 (281 ㎎, 0.864 m㏖), 및 HOBT (132 ㎎, 0.864 m㏖) 를 5 ㎖ 의 DMF 에 용해시킨 후, 거기에 EDC (166 ㎎, 0.864 m㏖) 를 교반 하에 빙냉시키면서 첨가한 다음, 2 일 동안 실온에서 교반하였다. 5 % 중탄산나트륨 용액을 반응 용액에 첨가하고, 생성된 침전물을 아민 실리카 겔 (NH-DM1020, 100-200 메쉬, Fuji Silysia Chemical Ltd.) 칼럼 크로마토그래피 (용출 용매: 1차 용출; 디클로로메탄:메탄올 = 100:7, 2차 용출; 클로로포름:메탄올 = 100:4) 로 정제하여 415 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 얻었다.
(e) MTX-α-PhePhe-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 2) 의 제조
화합물 2d (413 ㎎, 0.388 m㏖) 에 3 ㎖ 의 트리플루오로아세트산을 빙냉 하에 첨가한 후, 40 분 동안 교반하였다. 반응 용액을 감압 하에 농축시킨 후, 아민 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (용출 용매: 디클로로메탄:메탄올 = 100:7, 2 회) 를 사용하여 잔류물을 정제하여 344 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 얻었다.
실시예
1-3
MTX-α-PhePhe-NH-C10H20O2-NH2 (화합물 3) 의 제조
실시예 1-2 에서와 유사한 방법에 의해, N-t-부톡시카르보닐-4,7,10-트리옥 사-1,13-트리데칸디아민 대신 N-t-부톡시카르보닐-4,9-디옥사-1,12-도데칸디아민을 사용하여 221 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-4
MTX-α-PhePhe-NH-C8H16O2-NH2 (화합물 4) 의 제조
실시예 1-2 에서와 유사한 방법에 의해, N-t-부톡시카르보닐-4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민 대신 N-t-부톡시카르보닐-4,7-디옥사-1,10-데칸디아민을 사용하여 407 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-5
MTX-α-PhePhe-NH-C6H12O2-NH2 (화합물 5) 의 제조
실시예 1-2 에서와 유사한 방법에 의해, N-t-부톡시카르보닐-4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민 대신 N-t-부톡시카르보닐-3,6-디옥사-1,8-옥탄디아민을 사용하여 148 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-6
MTX-α-PhePhe-NH-C4H8O-NH2 (화합물 6) 의 제조
실시예 1-2 에서와 유사한 방법에 의해, N-t-부톡시카르보닐-4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민 대신 N-t-부톡시카르보닐-3-옥사-1,5-펜탄디아민을 사용하여 52 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-7
MTX-α-PhePhe-NH-C5H10-NH2 (화합물 7) 의 제조
실시예 1-1 에서와 유사한 방법에 의해, N-t-부톡시카르보닐-1,2-에틸렌디아민 대신 N-t-부톡시카르보닐-1,5-펜탄디아민을 사용하여 148 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-8
MTX-α-PhePhe-Lys-OMe (화합물 8) 의 제조
실시예 1-2 에서와 유사한 방법에 의해, N-t-부톡시카르보닐-4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민 대신 N-ε-t-부톡시카르보닐-L-리신 메틸 에스테르를 사용하여 178 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-9
MTX-α-PheGly-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 9) 의 제조
실시예 1-2(a) 의 단계에서 N-카르보벤족시-L-페닐알라닌 대신 N-카르보벤족시글리신을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1-2 에서와 동일한 방식으로, 528 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-10
MTX-α-PheGly-NH-C10H20O2-NH2 (화합물 10) 의 제조
실시예 1-9 에서와 유사한 방법에 의해, N-t-부톡시카르보닐-4,7,10-트리옥 사-1,13-트리데칸디아민 대신 N-t-부톡시카르보닐-4,9-디옥사-1,12-도데칸디아민을 사용하여 300 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-11
MTX-α-PheGly-NH-C8H16O2-NH2 (화합물 11) 의 제조
실시예 1-9 에서와 유사한 방법에 의해, N-t-부톡시카르보닐-4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민 대신 N-t-부톡시카르보닐-4,7-디옥사-1,10-데칸디아민을 사용하여 300 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-12
MTX-α-PheGly-NH-C6H12O2-NH2 (화합물 12) 의 제조
실시예 1-9 에서와 유사한 방법에 의해, N-t-부톡시카르보닐-4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민 대신 N-t-부톡시카르보닐-3,6-디옥사-1,8-옥탄디아민을 사용하여 181 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-13
MTX-α-PheGly-NH-C4H8O-NH2 (화합물 13) 의 제조
실시예 1-9 에서와 유사한 방법에 의해, N-t-부톡시카르보닐-4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민 대신 N-t-부톡시카르보닐-3-옥사-1,5-펜탄디아민을 사용하여 318 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-14
MTX-α-PhePro-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 14) 의 제조
실시예 1-2(a) 의 단계에서 N-카르보벤족시-L-페닐알라닌 대신 N-카르보벤족시-L-프롤린을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1-2 에서와 동일한 방식으로, 382 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-15
MTX-α-PheβAla-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 15) 의 제조
실시예 1-2(a) 의 단계에서 N-카르보벤족시-L-페닐알라닌 대신 N-카르보벤족시-β-알라닌을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1-2 에서와 동일한 방식으로, 180 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-16
MTX-α-PheβAla-NH-C2H4-NH2 (화합물 16) 의 제조
실시예 1-1(a) 의 단계에서 N-카르보벤족시-L-페닐알라닌 대신 N-카르보벤족시-β-알라닌을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1-1 에서와 동일한 방식으로, 194 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-17
MTX-α-Phe-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 17) 의 제조
실시예 1-2(b) 의 단계를 생략하는 것을 제외하고는 실시예 1-2 에서와 동일 한 방식으로, 496 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-18
MTX-α-Ile-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 18) 의 제조
N-카르보벤족시-L-페닐알라닌 대신 N-카르보벤족시-L-이소류신을 사용하여, 실시예 1-17 에서와 유사한 방법에 의해, 562 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-19
MTX-α-Ile-NH-C2H4-NH2 (화합물 19) 의 제조
N-t-부톡시카르보닐-4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민 대신 N-t-부톡시카르보닐-1,2-에틸렌디아민을 사용하여, 실시예 1-18 에서와 유사한 방법에 의해, 320 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-20
MTX-α-Glu(OMe)-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 20) 의 제조
N-카르보벤족시-L-페닐알라닌 대신 N-카르보벤족시-L-글루탐산-γ-메틸 에스테르를 사용하여, 실시예 1-17 에서와 유사한 방법에 의해, 600 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-21
MTX-α-Glu(OMe)-NH-C2H4-NH2 (화합물 21) 의 제조
N-t-부톡시카르보닐-4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민 대신 N-t부톡시카르보닐-1,2-에틸렌디아민을 사용하여, 실시예 1-20 에서와 유사한 방법에 의해, 283 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-22
MTX-α-Tyr-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 22) 의 제조
N-카르보벤족시-L-페닐알라닌 대신 N-카르보벤족시-L-타이로신을 사용하여, 실시예 1-17 에서와 유사한 방법에 의해, 133 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-23
MTX-α-Trp-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 23) 의 제조
N-카르보벤족시-L-페닐알라닌 대신 N-카르보벤족시-L-트립토판을 사용하여, 실시예 1-17 에서와 유사한 방법에 의해, 171 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-24
MTX-α-Ser-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 24) 의 제조
N-카르보벤족시-L-페닐알라닌 대신 N-카르보벤족시-L-세린을 사용하여, 실시예 1-17 에서와 유사한 방법에 의해, 416 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-25
MTX-α-Leu-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 25) 의 제조
N-카르보벤족시-L-페닐알라닌 대신 N-카르보벤족시-L-류신을 사용하여, 실시예 1-17 에서와 유사한 방법에 의해, 283 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-26
MTX-α-Val-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 26) 의 제조
N-카르보벤족시-L-페닐알라닌 대신 N-카르보벤족시-L-발린을 사용하여, 실시예 1-17 에서와 유사한 방법에 의해, 590 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-27
MTX-α-His-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 27) 의 제조
N-카르보벤족시-L-페닐알라닌 대신 N-카르보벤족시-L-히스티딘을 사용하여, 실시예 1-17 에서와 유사한 방법에 의해, 81 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-28
MTX-α-Pro-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 28) 의 제조
N-카르보벤족시-L-페닐알라닌 대신 N-카르보벤족시-L-프롤린을 사용하여, 실시예 1-17 에서와 유사한 방법에 의해, 683 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-29
MTX-α-βAla-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 29) 의 제조
N-카르보벤족시-L-페닐알라닌 대신 N-카르보벤족시-β-알라닌을 사용하여, 실시예 1-17 에서와 유사한 방법에 의해, 230 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-30
MTX-γ-PhePhe-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 30) 의 제조
N-카르보벤족시-L-글루탐산-γ-메틸 에스테르 대신 N-카르보벤족시-L-글루탐산-α-메틸 에스테르를 사용하여, 실시예 1-2 에서와 유사한 방법에 의해, 312 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-31
MTX-γ-PhePhe-NH-C6H12O2-NH2 (화합물 31) 의 제조
N-카르보벤족시-L-글루탐산-γ-메틸 에스테르 대신 N-카르보벤족시-L-글루탐산-α-메틸 에스테르를 사용하여, 실시예 1-5 에서와 유사한 방법에 의해, 80 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-32
MTX-γ-PhePhe-NH-C4H8O-NH2 (화합물 32) 의 제조
N-카르보벤족시-L-글루탐산-γ-메틸 에스테르 대신 N-카르보벤족시-L-글루탐산-α-메틸 에스테르를 사용하여, 실시예 1-6 에서와 유사한 방법에 의해, 49 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-33
MTX-γ-PheGly-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 33) 의 제조
N-카르보벤족시-L-글루탐산-γ-메틸 에스테르 대신 N-카르보벤족시-L-글루탐산-α-메틸 에스테르를 사용하여, 실시예 1-9 에서와 유사한 방법에 의해, 693 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-34
MTX-γ-Phe-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 34) 의 제조
N-카르보벤족시-L-글루탐산-γ-메틸 에스테르 대신 N-카르보벤족시-L-글루탐 산-α-메틸 에스테르를 사용하여, 실시예 1-17 에서와 유사한 방법에 의해, 480 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-35
MTX-γ-Glu(OMe)-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 35) 의 제조
N-카르보벤족시-L-글루탐산-γ-메틸 에스테르 대신 N-카르보벤족시-L-글루탐산-α-메틸 에스테르를 사용하여, 실시예 1-20 에서와 유사한 방법에 의해, 438 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-36
MTX-α-D-Phe-D-Phe-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 36) 의 제조
N-카르보벤족시-L-페닐알라닌 대신 N-카르보벤족시-D-페닐알라닌을 사용하여, 실시예 1-2 에서와 유사한 방법에 의해, 313 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-37
MTX-γ-D-Phe-D-Phe-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 37) 의 제조
N-카르보벤족시-L-페닐알라닌 대신 N-카르보벤족시-D-페닐알라닌을 사용하여, 실시예 1-30 에서와 유사한 방법에 의해, 85 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-38
MTX-α-AsnPhePhe-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 38) 의 제조
통상의 펩티드 합성법에 따라 펩티드 사슬을 연장시켜, 실시예 1-2 에서와 유사한 방법에 의해, 145 ㎎ 의 표제 화합물을 황색 분말로 수득하였다.
실시예
1-39
MTX-α/γ-GlyPheLeuGly-NH-C10H20O3-NH2 (화합물 39) 의 제조
통상의 펩티드 합성법에 따라 펩티드 사슬을 연장시켜, 실시예 1-2 에서와 유사한 방법에 의해, 723 ㎎ 의 상기 화합물을 황색 분말로 수득하였다. LC/MS 분석을 사용하여, 정제 도중 이성질체화가 일어나서 α 및 γ 의 혼합물 (α:γ = 3:1) (화합물 39) 이 생겼음을 확인하였다.
LC/MS: 1045.7 (M + H+)
실시예
2-1
MTX-α-PhePhe-NHC2H4NH-HA 의 제조
1급수 및 테트라히드로푸란 (THF) 의 동량 혼합물 (20 ㎖) 에 용해시킨 3-히드록시-3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (HOOBt) (0.125 m㏖) 및 실시예 1-1 에서 수득한 화합물 1 (0.031 m㏖) 로 이루어지는 용액을 THF (10 ㎖) 를 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 에 첨가한 현탁액에 첨가한 후, 1급수 및 THF 의 동량 혼합물 (10 ㎖) 에 용해시킨 트리스[2-(2-메톡시에톡시)에틸]아민 (0.094 m㏖) 으로 이루어지는 용액을 거기에 첨가한 다음, 5 ℃ 에서 교반하였다. 교반을 시작한 지 30 분 후에, 1급수 (10 ㎖) 에 용해시킨 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염 (EDC) (0.125 m㏖) 으로 이루어지는 용액을 첨가한 후, 5 ℃ 에서 20 시간 동안 교반하였다. 반응 용액에 0.09N 수산화나트륨 수용액 (220 ㎖) 을 첨가한 후, 5 ℃ 에서 3.5 시간 동안 교반하였다. 이 용액에 1N 염산 (20 ㎖) 을 중화를 위하여 첨가하고, 1급수 (45 ㎖) 에 용해시킨 염화나트륨 (9 g) 으로 이루어지는 용액을 거기에 추가로 첨가한 후, 에탄올 침전을 위하여 에탄올 (600 ㎖) 을 적가한 다음 원심분리로 침전물을 분리하였다. 침전물을 1급수 (40 ㎖) 에 용해시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 표준 물질로서 히알루론산을 사용하여 겔 여과 기술에 의해 측정한 상기의 분자량은 약 1,950,000 이었다. 생성된 결합체 중 MTX 의 결합율은 자외선 흡수 (259 ㎚) 를 측정하여 계산하였을 때 2.1 % 였다.
1급수 (160 ㎖) 에 용해시킨 염화나트륨 (6 g) 을 상기 수용액에 첨가한 후, 에탄올 침전을 위하여 에탄올 (400 ㎖) 을 거기에 적가한 다음, 원심분리를 통하여 침전물을 분리하였다. 1급수 (500 ㎖) 에 침전물을 용해시킨 후, 거기에 염화나트륨 (15 g) 을 첨가한 다음, 0.45 ㎛ 필터 (Stervex HV: Millipore) 를 사용하여 여과하고, 이어서 에탄올 침전을 위하여 여과액에 에탄올 (1000 ㎖) 을 무균적 가한 후, 여과하여 침전물을 수집한 다음 진공 건조시켰다. 이 침전물을 인산염 완충액 (2 mM 인산나트륨, 154 mM 염화나트륨, pH 7.2) (40 ㎖) 에 용해시켜 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 표준 물질로서 히알루론산을 사용하여 겔 여과 기술에 의해 측정한 상기의 분지량은 약 1,860,000 이었다. 생성된 결합체 중 MTX 의 결합율은 자외선 흡수 (259 ㎚) 를 측정하여 계산하였을 때 2.1 % 였다.
실시예
2-2
MTX-α-PhePhe-NHC2H4NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해, 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-1 에서 수득한 화합물 1 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 2,280,000 및 1.9 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 2,180,000 및 1.9 % 였다.
실시예
2-2'
MTX-α-PhePhe-NHC2H4NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해, 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-1 에서 수득한 화합물 1 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 2,190,000 및 2.2 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 2,060,000 및 2.3 % 였다.
실시예
2-3
MTX-α-PhePhe-NHC2H4NH-HA 의 제조
1급수 및 테트라히드로푸란 (THF) 의 동량 혼합물 (20 ㎖) 에 용해시킨 3-히드록시-3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (HOOBt) (0.125 m㏖) 및 실시예 1-1 에서 수득한 화합물 1 (0.008 m㏖) 로 이루어지는 용액을 THF (10 ㎖) 를 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 에 첨가한 현탁액에 첨가한 후, 1급수 및 THF 의 동량 혼합물 (10 ㎖) 에 용해시킨 트리스[2-(2-메톡시에톡시)에틸]아민 (0.118 m㏖) 으로 이루어지는 용액을 거기에 첨가한 다음, 5 ℃ 에서 교반하였다. 교반을 시작한 지 30 분 후에, 1급수 (10 ㎖) 에 용해시킨 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염 (EDC) (0.125 m㏖) 으로 이루어지는 용액을 첨가한 후, 5 ℃ 에서 20 시간 동안 교반하였다. 반응 용액에 0.09N 수산화나트륨 수용액 (220 ㎖) 을 첨가한 후, 5 ℃ 에서 3.5 시간 동안 교반하였다. 이 용액에 1N 염산 (20 ㎖) 을 중화를 위하여 첨가하고, 1급수 (45 ㎖) 에 용해시킨 염화나트륨 (9 g) 으로 이루어지는 용액을 거기에 추가로 첨가한 후, 에탄올 침전을 위하여 에탄올 (600 ㎖) 을 적가한 다음 원심분리로 침전물을 분리하였다. 침전물을 1급수 (40 ㎖) 에 용해시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 표준 물질로서 히알루론산을 사용하여 겔 여과 기술에 의해 측정한 상기의 분자량은 약 2,320,000 이었다. 생성된 결합체 중 MTX 의 결합율은 자외선 흡수 (259 ㎚) 를 측정하여 계산하였을 때 0.6 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 2,170,000 및 0.5 % 였다.
실시예
2-4
MTX-α-PhePhe-NHC2H4NH-HA 의 제조
1급수 및 테트라히드로푸란 (THF) 의 동량 혼합물 (20 ㎖) 에 용해시킨 3-히드록시-3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (HOOBt) (0.125 m㏖) 및 실시예 1-1 에서 수득한 화합물 1 (0.015 m㏖) 로 이루어지는 용액을 THF (10 ㎖) 를 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 에 첨가한 현탁액에 첨가한 후, 1급수 및 THF 의 동량 혼합물 (10 ㎖) 에 용해시킨 트리스[2-(2-메톡시에톡시)에틸]아민 (0.110 m㏖) 으로 이루어지는 용액을 거기에 첨가한 다음, 5 ℃ 에서 교반하였다. 교반을 시작한 지 30 분 후에, 1급수 (10 ㎖) 에 용해시킨 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염 (EDC) (0.125 m㏖) 으로 이루어지는 용액을 첨가한 후, 5 ℃ 에서 20 시간 동안 교반하였다. 반응 용액에 0.09N 수산화나트륨 수용액 (220 ㎖) 을 첨가한 후, 5 ℃ 에서 3.5 시간 동안 교반하였다. 이 용액에 1N 염산 (20 ㎖) 을 중화를 위하여 첨가하고, 1급수 (45 ㎖) 에 용해시킨 염화나트륨 (9 g) 으로 이루어지는 용액을 거기에 추가로 첨가한 후, 에탄올 침전을 위하여 에탄올 (600 ㎖) 을 적가한 다음 원심분리로 침전물을 분리하였다. 침전물을 1급수 (40 ㎖) 에 용해시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 표준 물질로서 히알루론산을 사용하여 겔 여과 기술에 의해 측정한 상기의 분자량은 약 2,320,000 이었다. 생성된 결합체 중 MTX 의 결합율은 자외선 흡수 (259 ㎚) 를 측정하여 계산하였을 때 1.1 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 2,230,000 및 1.1 % 였다.
실시예
2-5
MTX-α-PhePhe-NHC2H4NH-HA 의 제조
1급수 및 테트라히드로푸란 (THF) 의 동량 혼합물 (20 ㎖) 에 용해시킨 3-히드록시-3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (HOOBt) (0.125 m㏖) 및 실시예 1-1 에서 수득한 화합물 1 (0.020 m㏖) 로 이루어지는 용액을 THF (10 ㎖) 를 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 에 첨가한 현탁액에 첨가한 후, 1급수 및 THF 의 동량 혼합물 (10 ㎖) 에 용해시킨 트리스[2-(2-메톡시에톡시)에틸]아민 (0.105 m㏖) 으로 이루어지는 용액을 거기에 첨가한 다음, 5 ℃ 에서 교반하였다. 교반을 시작한 지 30 분 후에, 1급수 (10 ㎖) 에 용해시킨 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염 (EDC) (0.125 m㏖) 으로 이루어지는 용액을 첨가한 후, 5 ℃ 에서 20 시간 동안 교반하였다. 반응 용액에 0.09N 수산화나트륨 수용액 (220 ㎖) 을 첨가한 후, 5 ℃ 에서 3.5 시간 동안 교반하였다. 이 용액에 1N 염산 (20 ㎖) 을 중화를 위하여 첨가하고, 1급수 (45 ㎖) 에 용해시킨 염화나트륨 (9 g) 으로 이루어지는 용액을 거기에 추가로 첨가한 후, 에탄올 침전을 위하여 에탄올 (600 ㎖) 을 적가한 다음 원심분리로 침전물을 분리하였다. 침전물을 1급수 (40 ㎖) 에 용해시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 표준 물질로서 히알루론산을 사용하여 겔 여과 기술에 의해 측정한 상기의 분자량은 약 2,270,000 이었다. 생성된 결합체 중 MTX 의 결합율은 자외선 흡수 (259 ㎚) 를 측정하여 계산하였을 때 1.4 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 2,090,000 및 1.3 % 였다.
실시예
2-6
MTX-α-PhePhe-NHC2H4NH-HA 의 제조
1급수 및 테트라히드로푸란 (THF) 의 동량 혼합물 (20 ㎖) 에 용해시킨 3-히드록시-3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (HOOBt) (0.125 m㏖) 및 실시예 1-1 에서 수득한 화합물 1 (0.063 m㏖) 로 이루어지는 용액을 THF (10 ㎖) 를 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 에 첨가한 현탁액에 첨가한 후, 1급수 및 THF 의 동량 혼합물 (10 ㎖) 에 용해시킨 트리스[2-(2-메톡시에톡시)에틸]아민 (0.063 m㏖) 으로 이루어지는 용액을 거기에 첨가한 다음, 5 ℃ 에서 교반하였다. 교반을 시작한 지 30 분 후에, 1급수 (10 ㎖) 에 용해시킨 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염 (EDC) (0.125 m㏖) 으로 이루어지는 용액을 첨가한 후, 5 ℃ 에서 20 시간 동안 교반하였다. 반응 용액에 0.09N 수산화나트륨 수용액 (220 ㎖) 을 첨가한 후, 5 ℃ 에서 3.5 시간 동안 교반하였다. 이 용액에 1N 염산 (20 ㎖) 을 중화를 위하여 첨가하고, 1급수 (45 ㎖) 에 용해시킨 염화나트륨 (9 g) 으로 이루어지는 용액을 거기에 추가로 첨가한 후, 에탄올 침전을 위하여 에탄올 (600 ㎖) 을 적가한 다음 원심분리로 침전물을 분리하였다. 침전물을 1급수 (40 ㎖) 에 용해시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었 다. 표준 물질로서 히알루론산을 사용하여 겔 여과 기술에 의해 측정한 상기의 분자량은 약 2,050,000 이었다. 생성된 결합체 중 MTX 의 결합율은 자외선 흡수 (259 ㎚) 를 측정하여 계산하였을 때 3.9 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,910,000 및 3.8 % 였다.
실시예
2-7
MTX-α-PhePhe-NHC2H4NH-HA 의 제조
1급수 및 테트라히드로푸란 (THF) 의 동량 혼합물 (20 ㎖) 에 용해시킨 3-히드록시-3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (HOOBt) (0.125 m㏖) 및 실시예 1-1 에서 수득한 화합물 1 (0.125 m㏖) 로 이루어지는 용액을 THF (10 ㎖) 를 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 에 첨가한 현탁액에 첨가한 후, 1급수 및 THF 의 동량 혼합물 (10 ㎖) 을 거기에 첨가한 다음, 5 ℃ 에서 교반하였다. 교반을 시작한 지 30 분 후에, 1급수 (10 ㎖) 에 용해시킨 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염 (EDC) (0.125 m㏖) 으로 이루어지는 용액을 첨가한 후, 5 ℃ 에서 20 시간 동안 교반하였다. 반응 용액에 0.09N 수산화나트륨 수용액 (220 ㎖) 을 첨가한 후, 5 ℃ 에서 3.5 시간 동안 교반하였다. 이 용액에 1N 염산 (20 ㎖) 을 중화를 위하여 첨가하고, 1급수 (45 ㎖) 에 용해시킨 염화나트륨 (9 g) 으로 이루어지는 용액을 거기에 추가로 첨가한 후, 에탄올 침전을 위하여 에탄올 (600 ㎖) 을 적가한 다음 원심분리로 침전물을 분리하였다. 침전물을 1급수 (40 ㎖) 에 용해시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 표준 물질로서 히알루론산을 사용하여 겔 여과 기술에 의해 측정한 상기의 분자량은 약 1,970,000 이었다. 생성된 결합체 중 MTX 의 결합율은 자외선 흡수 (259 ㎚) 를 측정하여 계산하였을 때 4.5 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,740,000 및 4.4 % 였다.
실시예
2-8
MTX-α-PhePhe-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-2 에서 수득한 화합물 2 (0.031 m㏖) 와 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 2,110,000 및 1.6 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,980,000 및 1.4 % 였다.
실시예
2-9
MTX-α-PhePhe-NHC10H20O2NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-3 에서 수득한 화합물 3 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,830,000 및 1.8 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,550,000 및 1.7 % 였다.
실시예
2-10
MTX-α-PhePhe-NHC8H16O2NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-4 에서 수득한 화합물 4 (0.031 m㏖) 와 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,890,000 및 1.6 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,620,000 및 1.6 % 였다.
실시예
2-11
MTX-α-PhePhe-NHC6H12O2NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-5 에서 수득한 화합물 5 (0.031 m㏖) 와 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,920,000 및 1.9 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,620,000 및 2.0 % 였다.
실시예
2-12
MTX-α-PhePhe-NHC4H8ONH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-6 에서 수득한 화합물 6 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,720,000 및 2.0 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,490,000 및 1.9 % 였다.
실시예
2-13
MTX-α-PhePhe-NHC5H10NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-7 에서 수득한 화합물 7 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 2,140,000 및 1.4 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,960,000 및 1.2 % 였다.
실시예
2-14
MTX-α-PhePhe-Lys-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-8 에서 수득한 화합물 8 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정 하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,890,000 및 1.4 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,720,000 및 1.4 % 였다.
실시예
2-15
MTX-α-PheGly-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-2 에서 수득한 화합물 2 (0.031 m㏖) 와 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 830,000 및 1.4 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 800,000 및 1.4 % 였다.
실시예
2-16
MTX-α-PheGly-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
1급수 및 테트라히드로푸란 (THF) 의 동량 혼합물 (20 ㎖) 에 용해시킨 3-히드록시-3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (HOOBt) (0.125 m㏖) 및 실시예 1-2 에서 수득한 화합물 2 (0.009 m㏖) 로 이루어지는 용액을 THF (10 ㎖) 를 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 800,000) 에 첨가한 현탁액에 첨가한 후, 1급수 및 THF 의 동량 혼합물 (10 ㎖) 에 용해시킨 트리스[2-(2-메톡시에톡시)에틸]아민 (0.116 m㏖) 으로 이루어지는 용액을 거기에 첨가한 다음, 5 ℃ 에서 교반하였다. 교반을 시작한 지 30 분 후에, 1급수 (10 ㎖) 에 용해시킨 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염 (EDC) (0.125 m㏖) 으로 이루어지는 용액을 첨가한 후, 5 ℃ 에서 20 시간 동안 교반하였다. 반응 용액에 0.09N 수산화나트륨 수용액 (220 ㎖) 을 첨가한 후, 5 ℃ 에서 3.5 시간 동안 교반하였다. 이 용액에 1N 염산 (20 ㎖) 을 중화를 위하여 첨가하고, 1급수 (45 ㎖) 에 용해시킨 염화나트륨 (9 g) 으로 이루어지는 용액을 거기에 추가로 첨가한 후, 에탄올 침전을 위하여 에탄올 (600 ㎖) 을 적가한 다음 원심분리로 침전물을 분리하였다. 침전물을 1급수 (40 ㎖) 에 용해시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 표준 물질로서 히알루론산을 사용하여 겔 여과 기술에 의해 측정한 상기의 분자량은 약 830,000 이었다. 생성된 결합체 중 MTX 의 결합율은 자외선 흡수 (259 ㎚) 를 측정하여 계산하였을 때 0.5 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 810,000 및 0.5 % 였다.
실시예
2-17
MTX-α-PheGly-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
1급수 및 테트라히드로푸란 (THF) 의 동량 혼합물 (20 ㎖) 에 용해시킨 3-히드록시-3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (HOOBt) (0.125 m㏖) 및 실시예 1-2 에서 수득한 화합물 2 (0.125 m㏖) 로 이루어지는 용액을 THF (10 ㎖) 를 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 800,000) 에 첨가한 현탁액에 첨가한 후, 1급수 및 THF 의 동량 혼합물 (10 ㎖) 을 거기에 첨가한 다음, 5 ℃ 에서 교반하였다. 교반을 시작한 지 30 분 후에, 1급수 (10 ㎖) 에 용해시킨 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염 (EDC) (0.125 m㏖) 으로 이루어지는 용액을 첨가한 후, 5 ℃ 에서 20 시간 동안 교반하였다. 반응 용액에 0.09N 수산화나트륨 수용액 (220 ㎖) 을 첨가한 후, 5 ℃ 에서 3.5 시간 동안 교반하였다. 이 용액에 1N 염산 (20 ㎖) 을 중화를 위하여 첨가하고, 1급수 (45 ㎖) 에 용해시킨 염화나트륨 (9 g) 으로 이루어지는 용액을 거기에 추가로 첨가한 후, 에탄올 침전을 위하여 에탄올 (600 ㎖) 을 적가한 다음 원심분리로 침전물을 분리하였다. 침전물을 1급수 (40 ㎖) 에 용해시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 표준 물질로서 히알루론산을 사용하여 겔 여과 기술에 의해 측정한 상기의 분자량은 약 770,000 이었다. 생성된 결합체 중 MTX 의 결합율은 자외선 흡수 (259 ㎚) 를 측정하여 계산하였을 때 3.4 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 760,000 및 3.4 % 였다.
실시예
2-18
MTX-α-PheGly-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-9 에서 수득한 화합물 9 (0.031 m㏖) 와 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,990,000 및 1.5 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,860,000 및 1.4 % 였다.
실시예
2-19
MTX-α-PheGly-NHC10H20O2NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-10 에서 수득한 화합물 10 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,440,000 및 1.8 % 였다.
실시예
2-20
MTX-α-PheGly-NHC8H16O2NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-11 에서 수득한 화합물 11 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,730,000 및 1.6 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,500,000 및 1.6 % 였다.
실시예
2-21
MTX-α-PheGly-NHC6H12O2NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-12 에서 수득한 화합물 12 (0.031 m㏖) 와 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,500,000 및 2.3 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,390,000 및 2.3 % 였다.
실시예
2-22
MTX-α-PheGly-NHC4H8ONH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-13 에서 수득한 화합물 13 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,560,000 및 2.0 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,400,000 및 2.2 % 였다.
실시예
2-23
MTX-α-PhePro-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-14 에서 수득한 화합물 14 (0.031 m㏖) 와 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,660,000 및 1.6 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,520,000 및 1.6 % 였다.
실시예
2-24
MTX-α-PheβAla-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-15 에서 수득한 화합물 15 (0.031 m㏖) 와 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,520,000 및 1.5 % 였다.
실시예
2-25
MTX-α-PheβAla-NHC2H4NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-16 에서 수득한 화합물 16 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 2,090,000 및 2.3 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,980,000 및 2.3 % 였다.
실시예
2-26
MTX-α-Phe-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-17 에서 수득한 화합물 17 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 2,130,000 및 1.7 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,790,000 및 1.7 % 였다.
실시예
2-27
MTX-α-Ile-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-18 에서 수득한 화합물 18 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,920,000 및 1.7 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,620,000 및 1.7 % 였다.
실시예
2-28
MTX-α-Ile-NHC2H4NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-19 에서 수득한 화합물 19 (0.031 m㏖) 와 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 2,310,000 및 2.1 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 2,020,000 및 2.1 % 였다.
실시예
2-29
MTX-α-Glu-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-20 에서 수득한 화합물 20 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 2,010,000 및 1.5 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,830,000 및 1.5 % 였다.
주의: 밑줄친 부분은 작은 신호임. 상기 신호들로부터, α- 및 γ- 이성질체의 혼합물임을 추론하였음.
실시예
2-30
MTX-α-Glu-NHC2H4NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-21 에서 수득한 화합물 21 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 2,260,000 및 2.1 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 2,060,000 및 2.1 % 였다.
실시예
2-31
MTX-α-Tyr-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-22 에서 수득한 화합물 22 (0.031 m㏖) 와 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,900,000 및 1.6 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,760,000 및 1.7 % 였다.
실시예
2-32
MTX-α-Trp-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-23 에서 수득한 화합물 23 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,870,000 및 1.9 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,390,000 및 1.9 % 였다.
실시예
2-33
MTX-α-Ser-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-24 에서 수득한 화합물 24 (0.031 m㏖) 와 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,860,000 및 1.7 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,650,000 및 1.7 % 였다.
주의: 밑줄친 부분은 작은 신호임. 상기 신호들로부터, α- 및 γ- 이성질체의 혼합물임을 추론하였음.
실시예
2-34
MTX-α-Leu-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-25 에서 수득한 화합물 25 (0.031 m㏖) 와 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,890,000 및 1.7 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,470,000 및 1.6 % 였다.
실시예
2-35
MTX-α-Val-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-26 에서 수득한 화합물 26 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측 정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,870,000 및 1.7 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,560,000 및 1.7 % 였다.
실시예
2-36
MTX-α-His-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-27 에서 수득한 화합물 27 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,910,000 및 1.2 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,620,000 및 1.2 % 였다.
실시예
2-37
MTX-α-Pro-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-28 에서 수득한 화합물 28 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,670,000 및 1.5 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,520,000 및 1.6 % 였다.
실시예
2-38
MTX-α-βAla-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-29 에서 수득한 화합물 29 (0.031 m㏖) 와 반응시켜 표 제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,910,000 및 1.7 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,430,000 및 1.7 % 였다.
실시예
2-39
MTX-γ-PhePhe-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-30 에서 수득한 화합물 30 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 2,090,000 및 1.5 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였 을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,880,000 및 1.5 % 였다.
실시예
2-40
MTX-γ-PhePhe-NHC6H12O2NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-31 에서 수득한 화합물 31 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,890,000 및 2.0 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,760,000 및 2.0 % 였다.
실시예
2-41
MTX-γ-PhePhe-NHC4H8ONH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-32 에서 수득한 화합물 32 (0.031 m㏖) 와 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,960,000 및 2.1 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,800,000 및 2.1 % 였다.
실시예
2-42
MTX-γ-PheGly-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-33 에서 수득한 화합물 33 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표 제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,900,000 및 1.4 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,720,000 및 1.5 % 였다.
실시예
2-43
MTX-γ-Phe-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-34 에서 수득한 화합물 34 (0.031 m㏖) 와 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,870,000 및 1.7 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,650,000 및 1.7 % 였다.
실시예
2-44
MTX-γ-Glu-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-35 에서 수득한 화합물 35 (0.031 m㏖) 와 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,790,000 및 1.6 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,490,000 및 1.7 % 였다.
실시예
2-45
MTX-α-D-Phe-D-Phe-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-36 에서 수득한 화합물 36 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,480,000 및 1.4 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,350,000 및 1.4 % 였다.
실시예
2-46
MTX-γ-D-Phe-D-Phe-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-37 에서 수득한 화합물 37 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측 정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,600,000 및 1.4 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,410,000 및 1.3 % 였다.
실시예
2-47
MTX-α-AsnPhePhe-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-38 에서 수득한 화합물 38 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 2,100,000 및 1.3 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,780,000 및 1.2 % 였다.
주의: 밑줄친 부분은 작은 신호임. 상기 신호들로부터, α- 및 γ- 이성질체의 혼합물임을 추론하였음.
실시예
2-48
MTX-α/γ-GlyPheLeuGly-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 2,300,000) 를 실시예 1-39 에서 수득한 화합물 39 (0.031 m㏖) 와 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 2,060,000 및 1.4 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 1,850,000 및 1.3 % 였다.
주의: 밑줄친 부분은 작은 신호임. 상기 신호들로부터, α- 및 γ- 이성질체의 혼합물임을 추론하였음.
실시예
2-49
MTX-α-PhePhe-NHC10H20O3NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 320,000) 를 실시예 1-2 에서 수득한 화합물 2 (0.031 m㏖) 와 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 330,000 및 1.1 % 였다.
실시예
2-50
MTX-α-PhePhe-NHC2H4NH-HA 의 제조
실시예 2-1 과 유사한 방법에 의해 나트륨 히알루로네이트 (500 ㎎, 분자량: 약 340,000) 를 실시예 1-1 에서 수득한 화합물 1 (0.031 m㏖) 과 반응시켜 표제 HA-MTX 결합체 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 340,000 및 2.0 % 였다.
이 수용액을 실시예 2-1 에서와 동일한 방법에 의해 정제하여 표제 HA-MTX 결합체의 무균 수용액을 얻었다. 실시예 2-1 에서와 동일한 방법으로 측정하였을 때, 상기의 분자량 및 그 안에 있는 MTX 의 결합율은 각각 약 340,000 및 1.9 % 였다.
실시예 2-1 내지 2-50 에서 수득한 본 발명의 HA-MTX 결합체를 하기 표에 요약한다.
실험예
1
점탄성의
측정
히알루론산 (분자량: 1,900,000 및 800,000) 및 실시예 2-1, 2-8, 2-18, 2-27, 및 2-29 의 결합체의 무균 용액의 점탄성을 CSL500 응력-조절 유량계 (Carri-Med Ltd.) 로 직경이 4 ㎝ 인 콘을 사용하여 37 ℃ 에서 측정하였다. 도 1 은 결합체의 점탄성이 분자량이 800,000 및 1,900,000 인 히알루론산의 점탄성의 중간임을 보여준다.
실험예
2
활액
세포에 대한
항증식
효과
TNF-α자극에 의해 유도된 세포 증식에 대한 본 발명의 HA-MTX 결합체의 효과를 인간 활액 세포 (HFLS) 를 사용하여 조사하였다. 류마티스성 관절염 (RA) 에서의 주요 병소는 활액 조직에 생기고, 그 특징 중 하나로서, 활액 세포는 비정상적으로 증식하여 육아 조직 (판누스 (pannus)) 을 형성하여 관절의 연골 및 뼈를 파괴한다고 알려져 있다. 2차 활액막염은 또한 골관절염 (OA) 에서 관찰된다. OA 는 RA 에서처럼 활액 세포의 증식에 있어서 그와 같은 뚜렷한 변화를 보여주지는 않지만, 활액막염은 무릎 OA 의 특징인 관절 수종, 통증 및 열과 같은 염증성 증상의 원인이 된다 ("Hone, kansetsu Shikkan (골 및 관절 질환)" ed. Nobuyuki Miyasaka, 2003, Asakura Publishing Co., Ltd.). 따라서, 염증성 사이토킨 TNF-α로 자극한 활액 세포의 증식을 저해하는 화합물은 RA 및 OA 의 병리학적 상태의 진행을 억제하고, 그에 대한 치료 약물이 된다.
실시예 2 에서의 HA-MTX 결합체의 무균 수용액 (표 2) 을 시험 물질로서 사용하였다. HFLS (CA40405, 로트 번호 1413 및 1493) 를 Cell Applications Ins. 에서 구입하여 사용하였다.
HFLS 를 96-웰 플레이트 (Falcon) 에 5,000 세포/웰로 뿌리고 5% FBS 및 1X 항생-항진균제 (Antibiotic-Antimycotic) (GIBOC) 을 함유하는 Iscove's 개질 Dulbecco's 배지 (IMDM) 에서 3 시간 동안 배양하였다. 세포 부착 후, TNF-α(최종 농도: 10 ng/㎖) 및 농도가 각각인 HA-MTX 결합체 각각을 첨가한 다음, 5 일 동안 배양하였다. 배양 종결 2 일 전, 세포에 37 kBq/웰의 [3H]-데옥시우리딘 (MORAVEK) 을 첨가한 후, 신틸레이션 (scintillation) 계수기를 사용하여 [3H]-데옥시우리딘의 흡수량 (방사능) 을 측정하였다. 0.05% 트립신-0.2% EDTA 로 세포를 잡아떼어 세포를 회수하였다.
각각의 시험 물질을 사용한 각각의 실험에서 측정한 방사능을, 대조군으로서, 어떠한 시험 물질도 첨가하지 않고 배양한 세포군에서의 방사능을 사용하여 상대치 (대조군의 %) 로서 계산하였다. 각각의 1 ㎎/㎖ 의 히알루론산에 대하여 자유 카르복실기의 농도는 2.49 × 10-3 ㏖/ℓ(1 g/401/ℓ; 401 은 N-아세틸글루코사민+글루쿠론산의 분자량임) 이기 때문에, 그 값을 MTX 의 결합률로 곱하여 각각의 HA-MTX 중 MTX 의 농도를 계산하였다. (MTX 의 결합률 1% 인 HA-MTX 결합체 1 ㎎/㎖ 에 대하여, MTX 의 농도는 2.49 × 10-5 ㏖/ℓ임). 수득한 값을 사용하여 4-변수 논리법 (분석 소프트웨어: GraphPad Prism 3.02) 으로 세포 증식 저해 활성 (IC50 값) 을 계산하였다.
HFLS 중 HA-MTX 결합체의 IC50 값을 표 2 에 나타낸다.
표 2 는 조사한 HA-MTX 결합체 각각이 TNF-α자극에 의해 증강된 HFLS 세포의 증식에 대해 억제 효과를 가짐을 입증한다.
실험예
3
mBSA
-유도 단발성 관절염 모델에서 무릎 관절 팽창에 대한 억제 효과
본 발명의 각각의 HA-MTX 결합체의 생체내 활액막염-억제 효과를 메틸화 소 혈청 알부민 (mBSA)-유도 단발성 관절염 래트 모델에서 무릎 관절 팽창에 대한 억제 효과를 기초로 평가하였다. 이 실험예에서 이용하는 mBSA-유도 관절염 모델은 항원-유도 관절염 모델로서 널리 사용되고, 활액막염을 발병시킨다고 알려져 있기 때문에 (Sven E. Andersson 등, The Journal of Rheumatology (1998) 25: 9, 1772-7), 이 모델에서 관찰되는 생체내 무릎 관절 팽창-억제 효과는 예측컨대 활액막염-억제 효과를 나타낸다. 생체내에서 활액막염을 억제하는 본 발명의 화합물은 활액막염을 수반하는 관절 질환 (RA, OA 등) 용 치료 약물로서 유용하다.
사용하는 동물은 LEW/Crj 래트 (6-주령 수컷, Charles River Laboratories Japan, Inc.) 였다. 관절염 유발 21 및 14 일 전에, 2 ㎎/㎖ mBSA (Calbiochem) 수용액 및 동량의 Freund's 완전 보조약 (Difco) 으로부터 제조한 에멀션 0.5 ㎖ 를 래트의 옆구리 속으로 피하 주사하였다. 우측 무릎 관절 속으로 2 ㎎/㎖ mBSA 수용액 50 ㎕ 를 투여하여 관절염을 유도하였다. 좌측 무릎 관절은 비처리하였고, 각각의 개체에 있어서 대조군으로 두었다. 각각의 시험 물질 (무균 수용액) 및 대조 약물 히알루론산을 관절염 유도 7 일 및 1 일 전 및 7 일 후에 50 ㎕ 의 양으로 우측 무릎 관절 속으로 각각 투여하였다.
무릎 관절 팽창의 측정은 캘리퍼스로 두 무릎 관절의 폭을 측정하여 무릎 관절 팽창으로서 좌측/우측 차 (우측 무릎 직경 - 좌측 무릎 직경) 를 확정하는 것을 포함하였다. 각각의 무릎 관절의 폭은 관절염 유도 직전부터 그 후 2 주까지 매주 2 회의 빈도로 측정하여 시간에 따른 그들의 변화로부터 AUC (곡선 아래 면적에 대한 약어; 본원에서는, 관절 팽창에 있어서 시간에 따른 곡선 아래 면적을 의미함) 를 계산하였다. 각각의 측정에서, AUC 의 평균 및 표준 편차를 계산하여 각각의 시험 물질-처리군 및 HA-처리군 사이에 독립된 (unpaired) t-시험을 수행하였고, 확률 수준이 5% 미만이면 유의차가 있는 것으로 판단하였다. 통계적 분석은 SAS 버젼 6.12 (SAS Institute Japan) 를 사용하였다. 또한, 각각의 시험 물질의 AUC 를, 대조군으로서 HA-처리군에서의 것을 그에 대한 상대치 (대조군의 %) 로 사용하여 계산하였다.
앞서-설명한 방법을 사용하여 본 발명의 HA-MTX 결합체의 효능을 조사하여 수득한 결과를 표 3 에 나타낸다.
표 3 에 나타낸 결과는, 지금 조사한 HA-MTX 결합체 각각이 HA-처리군에 비하여 관절염 모델에서의 무릎 관절 팽창을 상당히 억제함을 보여준다. HA 와 결합한 MTX 의 결합률의 효과를 보면, 0.5 내지 4.4% 의 MTX 결합률 (실시예 1 내지 7) 이 HA-처리군에 비하여 관절염 모델에서의 무릎 관절 팽창을 상당히 억제함을 시사한다.
실험예
4
본 발명의 HA-MTX 결합체의 유용성을 확인하기 위하여, 실시예 3 의 방법에 따라, 1) 실시예 2-2 에서 제조한 HA-MTX 결합체 (무균 수용액) 로 처리한 군; 2) HA-MTX 결합체에 포함된 MTX 와 동량의 MTX 를 함유하는 용액으로 처리한 군; 및 3) 결합체에 포함된 것들과 동량의 MTX 및 히알루론산 (HA) 의 혼합물 (HA + MTX) 로 처리한 군 사이에서 관절 팽창에 대한 억제 효과를 비교하였다. 이 시험에서의 시간에 따른 무릎 관절 팽창의 변화를 도 2 에, 그리고 그의 AUC 를 도 3 에 나타낸다. 도 2 및 도 3 에서의 결과로, HA-MTX 결합체가 MTX 단독 또는 MTX 및 HA 의 혼합물에 비하여 관절염 모델에서의 관절 팽창에 대하여 현저히 강한 억제 효과를 가짐을 확인하였다. 따라서, MTX 및 HA 의 결합체는 MTX 의 관절 팽창-억제 효과를 상당히 향상시킴을 입증하였다.
앞서-기재한 결과로부터, 본 발명의 HA-MTX 결합체는 TNF-α에 의해 자극된 인간 활액 세포의 생체외 증식에 대한 억제 효과, 및 생체내 관절염 발병 모델에서의 활액막염에 대한 완화 효과를 가짐을 알게 되었다. 나아가, 관절염 모델에서, MTX 단독 또는 HA 와 MTX 의 혼합물 중 어느 것도 활액막염에 대하여 충분한 완화 효과를 가지지 않는 반면, HA-MTX 결합체는 활액막염에 대하여 강한 억제 효과를 발휘하였다.
실험예
5
콜라겐-유도 관절염 모델에 대한 효과
HA-MTX 결합체의 생체내 활액막염-억제 효과를 류마티스성 관절염 (RA) 모델로서 널리 사용되는 래트 콜라겐-유도 관절염 모델 (Kim 등, "Kansetsu geka (관절 수술)" (1998) 17(2): 111-21) 에서 평가하였다. 이 모델에서 염증을 억제하는 본 발명의 화합물은 RA 로 나타내는 자가항원-유도 면역 질환을 치료하는데 유용할 것이다.
사용하는 동물은 DA/Slc 래트 (Japan SLC Inc., 11-주령 암컷) 였다. 소 Ⅱ 형 콜라겐 (Collagen Gijutsu Kenshukai) 을 0.01 ㏖/ℓ아세트산 수용액에 용해시켜 1.5 ㎎/㎖ 농도를 얻은 후, 여기에 동량의 Freund's 불완전 보조약 (Difco) 을 첨가하여 에멀션을 만들었다. 이 에멀션을 각각의 래트의 등에 4 지점에 지점 당 약 0.1 ㎖ 로, 또는 총량 0.4 ㎖ 로 피내 투여하여 관절염을 유도하였다. 우측 무릎 관절 속에만 각각의 시험 물질 (무균 수용액) 50 ㎕ 및 대조 약물 히알루론산 (HA) 및 식염수를 감작일로부터 5일 마다 1 회 투여하였다. 좌측 무릎 관절은 비처리하였다. 또한, 병리학적 모델에 대한 대조군으로는, 식염수를 (정상) 동물의 우측 무릎 관절 속으로 투여하였고, 여기서 관절염은 유도되지 않았다.
캘리퍼스로 두 무릎의 폭을 측정하여 그들을 정상군의 폭과 비교함으로써 무릎 관절 팽창의 변화를 관찰하였다. 관찰은 관절염 유도 직전부터 그 후 23 일까지 매주 2 회 정도로 수행하였다. 각각의 측정에서, 무릎 관절 폭의 평균 및 평균의 표준 오차를 계산하여, 시험 물질-처리군 및 HA-처리군 사이에 독립된 t-시험을 수행하였고, 확률 수준이 5% 미만이면 유의차가 있는 것으로 판단하였다. 통계적 분석은 SAS 버젼 8.02 (SAS Institute Japan) 를 사용하였다.
앞서-설명한 방법을 사용하여 본 발명의 HA-MTX 결합체의 효능을 조사하여 수득한 결과를 표 4 에 나타낸다.
도 4 에서의 결과는 본 발명의 HA-MTX 결합체가 HA-처리군에 비하여 콜라겐-유도 관절염의 유도에 의해 팽창된 관절의 폭을 상당히 억제시키며, 시간에 따른 상기 폭의 변화는 정상군에서와 거의 동일하였음을 보여준다. 또한, 이 효과는 HA-MTX 결합체를 투여한 부위 (우측 무릎) 에서만 관찰되었고, 비처리 부위 (좌측 무릎) 에서는 보이지 않았다. 그와 같이, 본 화합물은 그것으로 처리한 부위에서만 효과를 발휘할 수 있음이 입증되었다.
실험예
6
콜라게나아제
-유도 관절염 (
OA
) 모델에서 무릎 관절 팽창에 대한 억제 효과
콜라게나아제-유도 OA 모델 래트에서 HA-MTX 결합체의 생체내 활액막염-억제 효과를 평가하였다. 콜라게나아제-유도 OA 모델은 콜라게나아제를 무릎 관절 속에 주사하여 연골 조직 내 콜라겐을 직접 증해시켜 무릎 관절 내에 염증을 유발한 모델이다. 이 모델은 관절 연골 퇴행 및 활액막염과 같은 인간 OA 의 병리생리학에 유사한 조직병리학적 변화를 나타내며, OA 용 치료 약물을 평가하는데 유용하다 (Takanori K 등, Osteoarthritis and Cartilage (1998) 6: 177-86). 따라서, 상기 모델에서 염증을 저해하고 거기서 연골 퇴행을 억제하는 본 발명의 화합물은 OA 용 치료 약물로서 유용할 것이다.
사용하는 동물은 SD/Crj 래트 (6-주령 수컷, Charles River Laboratories Japan, Inc.) 였다. 우측 무릎의 관절강 속에 1.5% 콜라게나아제 (Sigma) 용액 50 ㎕ 를 투여하여 관절염을 유도하였다. 좌측 무릎 관절은 비처리하여 각각의 개체에 있어서 대조군으로 사용하였다. 관절염 유도 7 일 및 1 일 전, 각각의 시험 물질을 우측 무릎 관절 속에 매주 50 ㎕ 의 양으로 투여하였다.
무릎 관절 팽창의 측정은 캘리퍼스로 두 무릎 관절의 폭을 측정하여 무릎 관절 팽창으로서 정의하는 좌측/우측 차 (우측 무릎 직경 - 좌측 무릎 직경) 를 측정하는 것을 포함하였다. 각각의 무릎 관절의 폭은 관절염 유도 직전부터 그 후 20 일까지 매주 2 회 정도로 측정하여 시간에 따른 그들의 변화를 나타내는 그래프로부터 AUC 를 계산하였다. 각각의 측정에서, AUC 의 평균 및 평균의 표준 오차를 계산하여 각각의 시험 물질-처리군 및 HA-처리군 사이에 독립된 t-시험을 수행하였고, 확률 수준이 5% 미만이면 유의차가 있는 것으로 판단하였다.
앞서-설명한 방법을 사용하여 본 발명의 HA-MTX 결합체의 효능을 조사하여 수득한 결과를 도 5 및 표 4 에 나타낸다. HA-MTX 결합체에 있어서 시간에 따른 전형적인 관절 팽창의 변화는 도 5 에 나타내고, 조사한 시험 물질에 관한 결과는 표 4 에 나타낸다.
이들 결과는 지금 조사한 HA-MTX 결합체 각각이 HA-처리군에 비하여 콜라게나아제-유도 관절염 모델에서 관절 팽창을 상당히 억제함을 보여준다.
실험예
7
콜라게나아제
-유도 관절염 (
OA
) 모델에서 관절 연골 파괴에 대한 저해 효과
실시예 6 의 서두에 기재한 바와 같이, 콜라게나아제-유도 OA 모델은 OA 용 치료 약물을 평가하는데 유용한 것으로 알려져 있다. 따라서, 이 모델에서 염증을 억제하고 거기서 연골 퇴행을 저해하는 화합물은 OA 용 치료 약물로서 유용할 것이다.
사용하는 동물은 SD/Crj 래트 (6-주령 수컷, Charles River Laboratories Japan, Inc.) 였다. 우측 무릎의 관절강 속에 1.5% 콜라게나아제 (Sigma) 용액 50 ㎕ 를 투여하여 관절염을 유도하였다. 좌측 무릎 관절은 비처리하여 각각의 개체에 있어서 대조군으로 사용하였다. 관절염 유도 7 일 및 1 일 전, 시험 물질, 또는 대조군으로서 식염수를 우측 무릎 관절 속에 매주 1 회 50 ㎕ 의 양으로 투여하였다.
무릎 관절 연골의 파괴 정도를 평가하기 위해서, 관절염 유도 28 일 후에 우측 무릎 관절을 떼어 주사 전자 현미경 (SEM) 을 사용하여 대퇴골의 내측 복사뼈에서 퇴행 관절 연골의 영상을 촬영하였다. 영상 촬영 후, 맹검을 수행한 다음, 각각의 개체의 SEM 영상으로부터 관절 연골 퇴행 정도의 등급을 매겼다. 데이타 조정 후, 맹검을 제거하여 각각의 군의 등급 평균을 계산하였다. 식염수-처리군 및 시험 물질-처리군 사이에 윌콕슨 등급 합 시험 (Wilcoxon rank sum test) 을 수행하였고, 확률 수준이 5% 미만이면 유의차가 있는 것으로 판단하였다. 통계적 분석은 SAS 버젼 8.02 (SAS Institute Japan) 를 사용하였다.
앞서-설명한 방법을 사용하여 본 발명의 HA-MTX 결합체의 효능을 조사하여 수득한 결과를 도 6 에 나타낸다.
도 6 에서의 결과는 본 발명의 HA-MTX 결합체가 식염수-처리군에 비하여 콜라게나아제-유도 OA 모델에서 연골 퇴행을 상당히 저해함을 보여준다. 이러한 결과는 HA-MTX 결합체가 관절염 모델에서 관절 팽창뿐만 아니라 관절 연골의 파괴도 억제할 수 있음을 입증하였다. 따라서, 본 발명의 HA-MTX 결합체는 관절 연골 퇴행 또는 결손을 수반하는 관절 질환을 치료하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 HA-MTX 결합체에 따르면, 관절 질환용의 우수한 치료 약물이 제공되며, 이것은 통상적이지 않은 효과를 갖고, HA 의 관절-속 치유법으로서의 면모를 가지며, 처리한 관절에서만 MTX 의 활액막염-억제 효과를 안전하게 발휘할 수 있다.
Claims (11)
1 내지 8 개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 사슬을 포함하는 연결기를 통해 메토트렉세이트가 히알루론산, 히알루론산 유도체, 또는 그 염의 카르복실기와 결합하는 히알루론산-메토트렉세이트 결합체로서, 연결기가 1 내지 8 개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 사슬 및 C2-20 알킬렌디아민 사슬을 포함하고, 여기서 알킬렌디아민 사슬은 그 안에 1 내지 5 개의 산소 원자가 삽입되어 있어도 되며, 연결기와 결합된 메토트렉세이트가 화학식 (I), (Ⅱ), (Ⅲ), 또는 (Ⅳ) 로 표시되는 히알루론산-메토트렉세이트 결합체:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
(식 중, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 히드록시기, 아미노기, C1-6 알콕시기, C1-6 알킬아미노기, 또는 디-C1-6 알킬아미노기이고;
L0 는 연결기의 결합 위치임).
삭제
제 1 항에 있어서, 메토트렉세이트의 결합율이 히알루론산의 총 카르복실기를 기준으로 0.5 % 내지 4.5 % 인 히알루론산-메토트렉세이트 결합체.
제 1 항에 있어서, 히알루론산-메토트렉세이트 결합체로서의 분자량이 600,000 내지 6,000,000 돌턴인 히알루론산-메토트렉세이트 결합체.
삭제
제 1 항에 있어서, 펩티드 사슬을 포함하는 연결기 및 연결기와 결합된 메토트렉세이트가 화학식 (I') 또는 (Ⅱ') 로 표시되는 히알루론산-메토트렉세이트 결합체:
[화학식 5]
[화학식 6]
{식 중, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 히드록시기, 아미노기, C1-6 알콕시기, C1-6 알킬아미노기, 또는 디-C1-6 알킬아미노기이고;
L 은 화학식 (X) 으로 나타내는 연결기임:
[화학식 7]
[식 중, Q1 은, 거기에 결합하는 -NH- 와 함께, 1 내지 8 개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 사슬을 형성하고; 펩티드 사슬에 포함되어 있는 아미노산 잔기는 각각 독립적으로 C1-6 알킬기, C1-6 알킬카르보닐기, C1-6 알콕시카르보닐기, 포르밀기, C1-6 알킬술포닐기, 및 C6-10 아릴술포닐기로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 기로 치환되거나 보호될 수 있으며; 펩티드 사슬에 포함되어 있는 아미드 결합은 각각 독립적으로 질소 원자에 하나 이상의 C1-6 알킬기, C1-6 알킬카르보닐기 또는 이들 모두가 치환될 수 있으며; 잔기에 포함되어 있는 카르복실기는 각각 독립적으로 1 또는 2 개의 C1-6 알킬기로 치환될 수 있는 아미드기로 전환될 수 있고;
R11 및 R12 는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-6 알킬기이고;
Q2 는 C2-20 알킬렌 (여기서 알킬렌은 그 안에 1 내지 5 개의 산소 원자가 삽입되어 있을 수 있음) 이고;
[HA] 는 히알루론산과의 결합 위치를 나타내고, 연결기는 히알루론산에 포함된 카르복실기와 아미드 결합을 형성함]}.
삭제
활성 성분으로서 제 1 항에 따른 히알루론산-메토트렉세이트 결합체를 포함하는, 관절 질환용 치료 약물.
제 8 항에 있어서, 관절 속으로 투여하기 위한 국소 제제인, 관절 질환용 치료 약물.
화학식 (Va) 또는 (Vb) 의 화합물:
[화학식 8]
[화학식 9]
{식 중, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 히드록시기, 아미노기, C1-6 알콕시기, C1-6 알킬아미노기, 또는 디-C1-6 알킬아미노기이고;
L1 은 화학식 (X') 으로 나타내는 연결기임:
[화학식 10]
[식 중, Q1 은, 거기에 결합하는 -NH- 와 함께, 1 내지 8 개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 사슬을 형성하고; 펩티드 사슬에 포함되어 있는 아미노산 잔기는 각각 독립적으로 C1-6 알킬기, C1-6 알킬카르보닐기, C1-6 알콕시카르보닐기, 포르밀기, C1-6 알킬술포닐기, 및 C6-10 아릴술포닐기로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 기로 치환되거나 보호될 수 있으며; 펩티드 사슬에 포함되어 있는 아미드 결합은 각각 독립적으로 질소 원자에 하나 이상의 C1-6 알킬기, C1-6 알킬카르보닐기 또는 이들 모두가 치환될 수 있으며; 잔기에 포함되어 있는 카르복실기는 각각 독립적으로 1 또는 2 개의 C1-6 알킬기로 치환될 수 있는 아미드기로 전환될 수 있고;
R11 및 R12 는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-6 알킬기이고;
Q2 는 치환되지 않은 C2-20 알킬렌 (여기서 알킬렌은 그 안에 1 내지 5 개의 산소 원자가 삽입되어 있어도 됨) 임]}.
제 1 항에 따른 히알루론산-메토트렉세이트 결합체의 제조 방법에 있어서, 제 10 항에 따른 화학식 (Va) 또는 (Vb) 의 화합물을 히알루론산과 반응시키고, 히알루론산의 카르복실기를 N-치환 아미드기로 전환시키는 단계를 포함하는 방법.
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