JPWO2006095775A1 - 水溶性ヒアルロン酸修飾物とｇｌｐ−１アナログの結合体 - Google Patents

Abstract

本発明は、水溶性のヒアルロン酸修飾物に１以上のグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）アナログが結合したヒアルロン酸−ペプチド結合体またはその塩、特に、水溶性のヒアルロン酸修飾物において、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分に含まれるカルボキシ基の７０％以上がＮ−置換アミド基に変換されており、ここで当該ヒアルロン酸修飾物中の各Ｎ−置換アミド基の置換基は同一であっても異なってもよく、当該置換基の少なくとも１つが前記ＧＬＰ−１アナログと連結する２価の連結基である、前記ヒアルロン酸−ペプチド結合体またはその塩に関する。

Description

本発明は、糖尿病および高血糖症に起因する糖尿病性合併症、肥満症の予防または治療薬として有用な、水溶性ヒアルロン酸修飾物とＧＬＰ−１アナログの結合体（コンジュゲート）、並びにその結合体を含む持続性糖尿病および高血糖症に起因する糖尿病性合併症、肥満症の予防または治療薬に関する。

グルカゴン様ペプチド−1（ＧＬＰ−１）は、食物摂取に応答して小腸Ｌ−細胞から分泌される３１アミノ酸からなるペプチドである。膵臓ベータ細胞に作用し、インスリン分泌を促進し、血清中グルコース量を減少させることが知られている（非特許文献１を参照）。この作用は血糖値が低い時には見られないことから低血糖のリスクが低いこと、さらに、ＧＬＰ−１にはインスリンを産生するベータ細胞の増殖、前駆細胞からの分化誘導作用、グルカゴン分泌抑制作用、胃排出遅延作用あるいは摂食抑制作用などがあることが知られており（非特許文献１を参照）、糖尿病および高血糖症に起因する糖尿病性合併症、肥満症の予防または治療薬としての利用への期待が高い。しかし、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰIV）による分解と腎からの排泄により、ＧＬＰ−１の血中半減期は数分間と短く、糖尿病および高血糖症に起因する糖尿病性合併症、肥満症の予防または治療薬として使用するためには頻回投与が必要になる。生物活性を維持し、ＤＰＰIV耐性を付与した様々なＧＬＰ−１類縁体、誘導体(アナログ)が報告されている（特許文献１〜８を参照）が、腎排泄は回避できないため血中滞留時間の延長は十分ではない。

また、一般に、低分子薬物、ペプチド薬物、タンパク質薬物等の血中滞留性の向上、安定性の向上、溶解性の向上、抗原性の低減等を目的として、薬物と水溶性ポリマーとの結合体の形成（コンジュゲーション）が試みられている。特に、ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」とも称す）は、その不活性な性質と生体内でのタンパク質による薬物の吸着を防ぐ効果を有することから広く用いられており、ＰＥＧ結合体化タンパク質は医薬品として既に実用化されている。しかし、ＰＥＧは生分解性ポリマーではない為、長期投与により体内に蓄積した場合の安全性等の問題は明らかでない。更には、最近、ＰＥＧ結合体化リポソームにおいて投与２回目のクリアランスが異常に早い現象（Ａｃｃｅｒｅｌａｔｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ現象）が報告されており（非特許文献２および３を参照）、ＰＥＧ結合体化医薬品の安全性、有効性は充分に確立されたとは言い難い。

ヒアルロン酸（以下、「ＨＡ」とも称す）は、１９３４年、Ｋ．Ｍｅｙｅｒによって牛の眼の硝子体から単離された多糖であり、細胞外マトリックスの主成分として古くから知られている。ＨＡは、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとがβ（１→３）グリコシド結合により連結された二糖単位から成るグルコサミドグリカンの一種である。ヒアルロン酸は、その化学的および物理的構造に種差が無く、ヒトにおいてもヒアルロン酸の代謝系が存在する。さらに免疫性または毒性の点に関しても非常に安全な生体材料（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ）ということができる。近年、細胞の接着、増殖、移動の誘導に関するヒアルロン酸の生理活性物質としての側面が注目されている。また、微生物による高分子量のヒアルロン酸の大量生産が可能となり、関節疾患治療薬などの医薬として実用化されており、化粧品等の分野においても実用化が進んでいる。さらに、薬物をヒアルロン酸と結合体化することで、薬物の癌組織へのターゲティング（特許文献９を参照）、肝臓へのターゲティング（特許文献１０を参照）、抗原性の低減（特許文献１１を参照）、血中滞留時間の延長（特許文献１２、１３および１４を参照）等が達成できるという報告がなされている。

汎用されているＰＥＧと比べて、薬物の結合体担体としてヒアルロン酸を用いる際の利点は、生分解性を有する点、巨大サイズ化が可能な点、さらに、１分子中に多くの反応点を持つため、複数の薬物（同一薬物を複数、或いは２種類以上の薬物）を１分子中に担持できるということである。このような利点を有するヒアルロン酸を薬物結合体担体として用いることは、ターゲティング、徐放等、より高度な薬物動態制御機能を持つ結合体を設計開発する手段となる。また、ヒアルロン酸は生分解性である上に、その化学的構造に種差が無いことから、安全性という点においてもＰＥＧよりも優れた担体であるといえる。

しかし、ヒアルロン酸自体の血中滞留時間は短く、静脈内投与（以下、「ｉｖ」とも称す）で半減期が２分であると報告されている（非特許文献４を参照）。本発明者の検討においても、ただ単にヒアルロン酸を薬物に結合体化しただけでは、薬物の血中滞留時間の大きな延長や、薬効の持続性の向上は確認されなかった。ヒアルロン酸の主代謝部位は肝臓およびリンパ腺であり、その代謝は、主にＣＤ４４、ＲＨＡＭＭ、ＨＡＲＥ等のヒアルロン酸に特異的に結合する細胞膜局在レセプターを介した細胞内への取り込みとそれに引き続くヒアルロニダーゼによる分解によるものである。これらのレセプター分子は共に、ヒアルロン酸の連続した遊離のカルボキシ基（６糖）を主な認識部位にしていることが報告されている（非特許文献５を参照）。

従って、血中滞留時間が短いというヒアルロン酸の問題を克服すべく、ヒアルロン酸に置換基を導入したヒアルロン酸修飾物を薬物担体として利用する試みもある（特許文献４、５および６を参照）。一般に、ヒアルロン酸に置換基を導入すればその血中滞留時間は延長され、その程度は置換基の導入率と相関すると考えられる。ヒアルロン酸の様々な位置に置換基が導入されたヒアルロン酸修飾物が報告されている。その中でも、ヒアルロン酸におけるグルクロン酸部分のカルボキシ基に加水分解されにくいアミド結合を介して置換基を導入することが、得られるヒアルロン酸修飾物とヒアルロン酸レセプターとの結合阻害において効果的であり、当該ヒアルロン酸修飾物は血中滞留時間の面において優れていると考えられる。

一方、ヒアルロン酸をテトラブチルアンモニウム塩にし、ジメチルスルホキシド中で置換基と反応させることによって、ヒアルロン酸のカルボキシ基をアミド化したヒアルロン酸修飾物（特許文献７を参照）も報告されているが、この発明は架橋体調製を目的としたもので、血中滞留性向上を目指したものではない。さらに言えば、この発明においては縮合剤として１，１−カルボニルジイミダゾール（以下、「ＣＤＩ」とも称す）を用いている。我々の検討では、縮合剤としてＣＤＩを用いても血中滞留性が充分に向上された（ヒアルロニダーゼによる分解に対して充分な耐性を持つような）ヒアルロン酸誘導体を得ることはできず、さらに、反応中にヒアルロン酸分子量が大きく低下することが確認されている。

これら以外にも、水と極性有機溶媒の混合溶媒中で、ヒアルロン酸のカルボキシ基に置換基を導入した例も報告されている（特許文献８を参照）。しかしながら、得られたヒアルロン酸修飾物について、血中滞留時間の延長が見られるかどうかについては一切触れられていない。

このように、薬物担体として実用的な水溶性ヒアルロン酸修飾物、特に血中滞留時間を実用的なレベルまで延長した水溶性ヒアルロン酸修飾物は知られていない。

ＧＬＰ−１アナログのポリマー結合体としては、Ｃ末端でＰＥＧと結合体化したものが報告されているが（国際公開ＷＯ０４／０２２００４号パンフレット、国際公開ＷＯ０３／０４０３０９号パンフレット）、血中滞留性を改善した水溶性ヒアルロン酸修飾物とＧＬＰ−１アナログとの結合体の報告は無い。
国際公開ＷＯ９１／１１４５７号パンフレット、 特開平１１／３１０５９７号公報、 国際公開ＷＯ９９／４３７０５号パンフレット、 国際公開ＷＯ００／０６９９１１号パンフレット、 国際公開ＷＯ９５／３１２１４号パンフレット、 国際公開ＷＯ００／０７６１７号パンフレット、 国際公開ＷＯ０３／１０３５７２号パンフレット、 国際公開ＷＯ９７／２９１８０号パンフレット 国際公開ＷＯ９２／０６７１４号パンフレット 特開２００１−８１１０３号公報 特開平２−２７３１７６号公報 特開平５−８５９４２号公報 国際公開ＷＯ０１／０５４３４号パンフレット 国際公開ＷＯ０１／６０４１２号パンフレット 特表２００２−５１９４８１号公報 国際公開ＷＯ９４／１９３７６号パンフレット 国際公開ＷＯ０４／０２２００４号パンフレット、 国際公開ＷＯ０３／０４０３０９号パンフレット Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒａｃｏｌ．Ｓｃｉ．第２４巻、第３７７−３８３頁、２００３年 Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．第２５５巻、第１６７−１７４頁、２００３年 Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．第８８巻、第３５−４２頁、２００３年 Ｊ．Ｉｎｔｅｒ．Ｍｅｄ．第２４２巻、第２７−３３頁、１９９７年 Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．第２２８巻、第２１６−２２８頁、１９９６年

発明が解決しようとする課題は、糖尿病、高血糖症、糖尿病性合併症、または肥満症などの慢性疾患の予防または治療に有用なＧＬＰ−１アナログ結合体であって、実用的な血中滞留時間を有し、かつ生分解性で安全なＧＬＰ−１アナログ結合体を提供することにある。さらに、前記ＧＬＰ−１アナログ結合体の製造方法、当該結合体の製造に使用することができるＧＬＰ−１アナログ、および当該結合体を含む医薬組成物および治療方法を提供することにある。

本発明者は、かかる課題を解決する為に鋭意研究を進めたところ、非プロトン性極性溶媒中で、特定の縮合剤を用い、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸のカルボキシ基に置換基をアミド結合で導入することにより得られた水溶性ヒアルロン酸修飾物とＧＬＰ−１アナログの結合体が、実用的なレベルの血中滞留時間を有することを見出し、また、当該結合体が持続的な血糖降下作用を有することを見出し、本発明を完成させた。

本発明の１つの側面によれば、水溶性のヒアルロン酸修飾物に１以上のグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）アナログが結合した、ヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩が提供される。当該ＧＬＰ−１アナログは、多価、好ましくは２価の連結基を介して前記ヒアルロン酸修飾物に結合する。上記ヒアルロン酸−ペプチド結合体の塩は、特に限定されないが、例えば医薬として許容な塩（例えば、酸付加塩（例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、リン酸塩など）、および塩基付加塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩など））が含まれる。

水溶性のヒアルロン酸修飾物は、特に限定はされないが、例えば、ヒアルロン酸の分子中に含まれるカルボキシル基が置換アミド基に変換された化合物が用いられる。本発明に使用される水溶性のヒアルロン酸修飾物は、好ましくは、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分に含まれるカルボキシ基の７０％以上がＮ−置換アミド基に変換されており、ここで当該ヒアルロン酸修飾物中の各Ｎ−置換アミド基の置換基は同一であっても異なってもよく、当該置換基の少なくとも１つが前記ＧＬＰ−１アナログと連結する２価の連結基でありうる。

本発明の別の側面によれば、ＧＬＰ−１アナログが、ＧＬＰ−１（１−３６）またはＧＬＰ−１（７−３６）のＣ末端側に−Ｘａ−Ｃｙｓで表されるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであり（前記アミノ酸配列の置換は、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸により置換されてもよい）、ここでＸａは直接結合またはプロリン、グリシン、セリンおよびグルタミン酸から独立に選択される１〜９のアミノ酸からなる配列であり、当該ペプチドのＣ末端のシステインのカルボキシ基はアミド基に変換されていてもよい、既に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩が提供される。

本発明の当該側面における１つの態様によれば、ＧＬＰ−１アナログは、例えば、ＧＬＰ−１（１−３６）またはＧＬＰ−１（７−３６）のＣ末端に−Ｘａ−Ｃｙｓで表されるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列の８位のアラニン（Ａｌａ⁸）が天然または非天然アミノ酸に置換されている配列からなるペプチドであり、当該ペプチドのＣ末端のシステインのカルボキシ基はアミド基に変換されていてもよい。ここで、前記アラニンと置換する天然または非天然アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン、アルギニンおよびアミノ酪酸などが挙げられる。好ましくは、前記アラニンは、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびスレオニンから選択されるアミノ酸、さらに好ましくはグリシンおよびセリンから選択されるアミノ酸と置換される。

本発明の当該側面における別の態様によれば、本発明に使用されるＧＬＰ−１アナログは、
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｘａ−Ｃｙｓ（配列番号１）
で表されるペプチド、または当該ペプチドのＣ末端のシステインのカルボキシ基がアミド基に変換されたペプチドあってもよい。ここで、Ｘａは既に定義した通りであり、例えば直接結合または−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−が含まれる。

本発明の別の側面において、ＧＬＰ−１アナログが、ＧＬＰ−１（１−３６）、ＧＬＰ−１（１−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１（７−３７）に、−Ｑａ−ＳＨで表されるメルカプト化合物を付加したアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであり（前記アミノ酸配列は、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸により置換されてもよい）、
ここでＱａは−ＮＨ−Ｘ⁵−、−ＣＯ−Ｘ⁵−または−ＣＯＮＨ−Ｘ⁵−から選択され、ペプチドのＣ末端アミノ酸残基に含まれるカルボキシ基、アミノ基または水酸基と連結してアミド結合、ウレア結合またはエステル結合を形成し、
Ｘ⁵はＣ_1-50アルキレン基であり、ここで当該アルキレン基の１以上の個所において当該アルキレン基に含まれる２つの炭素原子の間に酸素原子が挿入されていてもよく、当該アルキレン基の炭素原子は、水酸基およびＣ_1-6アルキル基から選択される１以上の置換基により独立に置換されていてもよい、既に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩が提供される。

本発明のさらなる側面において、２価の連結基の一端がＧＬＰ−１アナログに導入されたメルカプト基において結合する、既に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩が提供される。

本発明のこの側面の１つの態様において、２価の連結基は、式（Ｉ）：

［式中、ＱはＣ_1-400アルキレン基（例えば、Ｃ_1-10アルキレン基を含む）であり、ここで当該アルキレン基の１以上の個所において当該アルキレン基に含まれる２つの炭素原子の間に酸素原子が挿入されていてもよく、さらに当該アルキレン基の１以上の個所において当該アルキレン基に含まれる炭素原子の間あるいは末端に−ＣＯ−、−ＮＨＣＯ−または−ＣＯＮＨ−が挿入されていてもよく、当該アルキレン基の炭素原子は、水酸基およびＣ_1-6アルキル基から選択される１以上の置換基により独立に置換されていてもよく；
Ｘは、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−^**、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−^**、もしくは−ＣＨ（−ＣＨ₃）−ＣＨ₂−^**であり、Ｒは水素原子またはＣ_1-6アルキル基であり；または
ＸおよびＲは結合する炭素原子および窒素原子と一緒になって、式（ＩＩ）：

で表される基を形成し；
^*はヒアルロン酸修飾物中のアミド基の窒素原子への結合位置を表し、^**はＧＬＰ−１アナログのメルカプト基の硫黄原子への結合位置を表す］
で表されうる。

上述の２価の連結基には、例えば、式（Ｉａ）：

［式中、Ｑ¹はＣ_1-10アルキレン基であり、ここで当該アルキレン基の１以上の個所において当該アルキレン基に含まれる２つの炭素原子の間に酸素原子が挿入されていてもよく、当該アルキレン基の炭素原子は、水酸基およびＣ_1-6アルキル基から選択される１以上の置換基により独立に置換されていてもよく；
Ｘ¹は、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−^**、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−^**、もしくは−ＣＨ（−ＣＨ₃）−ＣＨ₂−^**であり、Ｒ¹は水素原子またはＣ_1-6アルキル基であり；または
Ｘ¹およびＲ¹は結合する炭素原子および窒素原子と一緒になって、式（ＩＩａ）：

で示される基を形成し；または
Ｘ¹は、式（Ｉｂ）：

（式中、Ｑ²はＣ_1-10アルキレン基であり、ここで当該アルキレン基の１以上の個所において当該アルキレン基に含まれる２つの炭素原子の間には酸素原子が挿入されていてもよく、当該アルキレン基の炭素原子は、水酸基およびＣ_1-6アルキル基から選択される１以上の置換基により独立に置換されていてもよく；
Ｘ²は、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−^**、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−^**、もしくは−ＣＨ（−ＣＨ₃）−ＣＨ₂−^**であり、Ｒ²は水素原子またはＣ_1-6アルキル基であり；または
Ｘ²およびＲ²は結合する炭素原子および窒素原子と一緒になって、式（ＩＩｂ）：

で示される基を形成し；または
Ｘ²は、式（Ｉｃ）：

（式中、Ｑ³はＣ_1-10アルキレン基であり、ここで当該アルキレン基の１以上の個所において当該アルキレン基に含まれる２つの炭素原子の間には酸素原子が挿入されていてもよく、当該アルキレン基の炭素原子は、水酸基およびＣ_1-6アルキル基から選択される１以上の置換基により独立に置換されていてもよく；
Ｘ³は、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−^**、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−^**、−ＣＨ（−ＣＨ₃）−ＣＨ₂−^**であり、Ｒ³は水素原子またはＣ_1-6アルキル基であり；または
Ｘ³およびＲ³は結合する炭素原子および窒素原子と一緒になって、式（ＩＩｃ）：

で表される基を形成する）
で表される基であり）
で表される基であり；
^*はヒアルロン酸修飾物中のアミド基の窒素原子への結合位置を表し、^**はＧＬＰ−１アナログのメルカプト基の硫黄原子への結合位置を表す］
で表される２価の連結基も含まれる。

上記式（Ｉａ）において、Ｑ¹は、例えば、式：−（ＣＨ₂）_m−、または−（ＣＨ₂）_m−（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂）_n−
［式中、ｍは、例えば１〜２０、好ましくは１〜１５、より好ましくは２〜１０からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｎは、例えば１〜２００、好ましくは１〜２５、より好ましくは１〜４から選択される整数である］
で表される基であってもよい。

上記式（Ｉａ）において、Ｘ¹は、例えば、式：−（ＣＨ₂）_m−ＣＨ₂−（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂）_p−ＮＨＣＯ−（ＣＨ₂）_q−Ｙ¹−^**、または−（ＣＨ₂）_r−Ｙ¹−^**
［式中、ｍは、例えば１〜２０、好ましくは１〜１５、より好ましくは２〜１０から選択される整数であり、ｐは、例えば１〜２００、好ましくは１〜２５、より好ましくは１〜４から選択される整数であり、ｑおよびｒは、例えば１〜２０、好ましくは１〜１５、より好ましくは１〜１０から選択される整数であり、Ｙ¹は式（ＩＩｃ）：

で表される基であり、
^**はＧＬＰ−１アナログのメルカプト基の硫黄原子への結合位置を表す］
で表される基であってもよい。

本発明のさらに別の側面によれば、式（ＶＩａ）：

［式中、Ｒａ¹、Ｒａ²、Ｒａ³およびＲａ⁴は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ_1-6アルキル基またはＣ_1-6アルキルカルボニル基から選択され、
Ｘ⁰は、既に定義したＸまたはＸ¹を表し、
Ｑ⁰は、既に定義したＱまたはＱ¹を表し、
Ｒおよび^**は、既に定義されたとおりである］
で表される繰り返し単位、および式（ＶＩｂ）：

［式中、Ｒａ¹、Ｒａ²、Ｒａ³、Ｒａ⁴、Ｘ⁰、Ｑ⁰、Ｒおよび^**は、既に定義されたとおりであり、Ｘ⁶は−ＣＨ＝ＣＨ₂、−ＣＨ₂−ＣＨ＝ＣＨ₂、−Ｃ（ＣＨ₃）＝ＣＨ₂、−（ＣＨ₂）_m−Ｙ²または−（ＣＨ₂）_m−（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂）_n−Ｙ²であり、Ｙ²は式（ＶＩＩ）：

で表される基であり、
ｍは、例えば１〜２０、好ましくは１〜１０から選択される整数であり、
ｎは、例えば１〜２００、好ましくは１〜２５から選択される整数である］
で表される繰り返し単位、および式（ＶＩｃ）：

［式中、Ｒａ¹、Ｒａ²、Ｒａ³、Ｒａ⁴、Ｑ⁰およびＲは、既に定義されたとおりである］
で表される繰り返し単位を含む、既に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、前記アミド基の窒素原子上に導入された置換基の１以上が、式（ＩＶ）：

［ＱおよびＲは既に定義したとおりであり、Ｑ⁴はＣ_1-6アルキレン基である］
で表される基である、既に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、ヒアルロン酸に含まれるカルボキシ基のＮ−置換アミド基への修飾率が７０モル％以上である、既に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩もまた提供される。

本発明の１つの態様において、ＧＬＰ−１アナログに結合した連結基により置換されたアミド基のヒアルロン酸１分子に含まれるカルボキシ基に対する導入率は、例えば、平均０．１モル％以上であり１５モル％以下であり、好ましくは０．１モル％〜１０モル％であり、さらに好ましくは０．１モル％〜５モル％である。また、本発明に係るヒアルロン酸−ＧＬＰ−１アナログ結合体の平均分子量は、粘度平均分子量として測定した場合、例えば、５０００ダルトン〜１００万ダルトン、好ましくは１万ダルトン〜３０万ダルトン、さらに好ましくは８万ダルトン〜３０万ダルトンである。

本発明のさらに別の側面によれば、既に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩を含む医薬組成物もまた提供される。当該医薬組成物の投与方法は、特に限定されず、当該技術分野において当業者に周知の方法により投与されうるが、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与および経肺投与から選択される手段によっても投与されうる。

本発明のさらに別の側面によれば、既に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩を含む、糖尿病、高血糖症、糖尿病性合併症、および肥満症から選択される疾患の予防または治療に使用される医薬が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、既に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩の治療有効量を投与することを含む、糖尿病、高血糖症、糖尿病性合併症、および肥満症から選択される疾患の予防または治療方法もまた提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、非プロトン性極性溶媒中で、式（Ｖ）：

［式中、Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ¹²、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴およびＲ¹⁵は、それぞれ独立にＣ_1-6アルキル基から選択され、またはＲ¹⁰およびＲ¹¹、Ｒ¹²およびＲ¹³、ならびにＲ¹⁴およびＲ¹⁵は、それぞれ独立にそれらが結合する窒素原子と一緒になって含窒素ヘテロ環を形成してもよく、環Ｂは置換されていてもよい単環式または縮環式の含窒素ヘテロ環基であり、Ｘ^-はアニオンを表す］
で表される縮合剤を使用して、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分に含まれるカルボキシ基を、Ｎ−置換アミド基に変換して水溶性ヒアルロン酸修飾物を得る工程を含む、既に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩の製造方法が提供される。ここで、前記非プロトン性極性溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、スルホラン、Ｎ−メチルピロリドンまたはこれらの２種以上の混合溶媒が使用されうる。好ましくは、前記非プロトン性極性溶媒として、ジメチルスルホキシドが使用されうる。

上記式（Ｖ）において、環Ｂは、好ましくはベンゾトリアゾール−１−イルであり、上記式（Ｖ）で表される縮合剤の例には、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート、およびこれらの混合物から選択されるＢＯＰ系縮合剤が含まれる。

本発明のさらに別の側面によれば、上記の製造方法により製造することができる、既に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、ＧＬＰ−１（１−３６）またはＧＬＰ−１（７−３６）のＣ末端側に−Ｘａ−Ｃｙｓで表されるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであり（前記アミノ酸配列の置換は、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸により置換および／または付加されてもよい）、ここでＸａは直接結合またはプロリン、グリシン、セリンおよびグルタミン酸から独立に選択される１〜９のアミノ酸からなる配列であり、当該ペプチドのＣ末端のシステインのカルボキシ基はアミド基に変換されていてもよいペプチドであるＧＬＰ−１アナログが提供される。

本発明の当該側面の１つの態様によれば、ＧＬＰ−１アナログは、ＧＬＰ−１（１−３６）またはＧＬＰ−１（７−３６）のＣ末端に−Ｘａ−Ｃｙｓで表されるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列の８位のアラニン（Ａｌａ⁸）が天然または非天然アミノ酸に置換されている配列からなるペプチドであり、当該ペプチドのＣ末端のシステインのカルボキシ基がアミド基に変換されていてもよく、Ｘａは既に定義されたとおりである。ここで、前記アラニンと置換する天然または非天然アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン、アルギニンおよびアミノ酪酸などが挙げられる。好ましくは、前記アラニンは、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびスレオニンから選択されるアミノ酸、さらに好ましくはグリシンおよびセリンから選択されるアミノ酸と置換される。

前記ＧＬＰ−１アナログには、例えば、配列番号１で表されるペプチド、または当該ペプチドのＣ末端のシステインのカルボキシ基がアミド基に変換されたペプチドが含まれる。好ましくは、Ｘａは、直接結合または−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−である。

本発明の別の側面によれば、当該水溶性ヒアルロン酸修飾物は特に限定されないが、ヒアルロン酸をその構成ユニットの２糖にまで分解することができ且つ分解産物の非還元末端にΔ−４，５−グルクロン酸残基をもつ不飽和２糖分解物を生成させるヒアルロニダーゼで該水溶性ヒアルロン酸修飾物を分解し、得られる分解産物の２３２ｎｍにおける吸収を測定した場合に、分解産物に由来する全吸収に対する２糖に由来する吸収の分率が３０％以下となるものが好ましい。

本発明のヒアルロン酸修飾物−ＧＬＰ−１アナログ結合体を用いることで、その血中滞留時間も延長が実現され、従来の技術では達成できなかった実用的でかつ安全なＧＬＰ−１アナログの持続性製剤、および当該アナログを含む糖尿病、高血糖症、糖尿病性合併症、または肥満症の予防または治療薬を提供することが可能である。

本発明に使用することができる水溶性ヒアルロン酸修飾物のヒアルロニダーゼ処理後のＧＰＣデータの一例である。 本発明に使用することができる水溶性ヒアルロン酸修飾物ＮＭＲデータの一例である。 本発明に使用することができる水溶性ヒアルロン酸修飾物のアミノ基をカルボン酸へ変換した水溶性ヒアルロン酸修飾物ＮＭＲデータの一例である（実施例２−２）。 本発明に使用することができる水溶性ヒアルロン酸修飾物のアミノ基をカルボン酸へ変換した水溶性ヒアルロン酸修飾物のヒアルロニダーゼ処理後のＧＰＣデータの一例である。 本発明に使用することができる水溶性ヒアルロン酸修飾物ＮＭＲデータの一例である（実施例３−１）。 分子量の異なる蛍光標識ＨＡ修飾物の血中濃度推移を示した図である。 本発明に使用することができる水溶性ヒアルロン酸修飾物ＮＭＲデータの一例である（実施例４−１）。 分子量２００ｋＤａ ＨＡから合成したアミノ基修飾率の違う蛍光標識ＨＡ修飾物の血中濃度推移を示した図である。 ＨＡ修飾物のアミノ基修飾率と平均血中滞留時間（ＭＲＴ）との相関およびアミノ基修飾率とヒアルロニダーゼにより分解される２糖の分率との相関を示した図である。 ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ１結合体をラットに静脈内投与したときの血漿中濃度推移を示した図である。 ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体および対照化合物のＧＰＣデータの一例である。 ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体をラットに静脈内投与したときの血漿中濃度推移を示した図である。 ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ１結合体をラットに静脈内投与したときの血漿中濃度推移を示した図である。

発明の実施の形態

以下、本発明を更に具体的に説明する。

本発明において使用されるヒアルロン酸修飾物の水溶性は、得られるヒアルロン酸−ペプチド結合体が所望の効果をそうする限りにおいて特に限定されないが、水に対して、例えば０．１〜１０００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１〜１００ｍｇ／ｍＬの溶解度を有するヒアルロン酸修飾物を本発明に用いることができる。

本発明において使用される水溶性ヒアルロン酸修飾物は、非プロトン性極性溶媒などの溶媒中で、縮合剤を用い、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸のカルボキシ基をＮ−置換アミド基に変換することにより得ることができる。当該水溶性ＨＡ修飾物における修飾率は、修飾されたカルボキシ基の割合、すなわちＮ−置換アミド基に変換されているカルボキシ基の割合である、アミド基導入率として以下の式：

により算出される。本発明に使用される水溶性ＨＡ修飾物のＮ−置換アミド基導入率の下限は７０％以上であることが好ましく、８５モル％以上であることがさらに好ましい。また、導入率の上限は１００モル％以下であればよい。

上記のＮ−置換アミド基への変換反応は、ヒアルロン酸またはその誘導体と種々のアミン類を適当な縮合剤を用いることにより行うことができる。ここで使用されるアミン類は、特に限定されないが、例えば、以下の式：
Ｈ₂Ｎ−（ＣＨＲ⁵）_m−ＮＨ₂；
Ｈ₂Ｎ−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＮＨ₂；
Ｈ₂Ｎ−（ＣＨＲ⁵）_m−ＯＨ；
Ｈ₂Ｎ−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＯＨ；
Ｈ₂Ｎ−（ＣＨＲ⁵）_m−ＳＲ⁶；
Ｈ₂Ｎ−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＳＲ⁶；
Ｈ₂Ｎ−（ＣＨＲ⁵）_m−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ⁷）＝ＣＨ₂；
Ｈ₂Ｎ−（ＣＨＲ⁵）_m−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨＲ⁵）_p−Ｃ（Ｒ⁷）＝ＣＨ₂；
Ｈ₂Ｎ−（ＣＨＲ⁵）_m−ＮＨＣＯ−Ｃ（Ｒ⁷）＝ＣＨ₂；
Ｈ₂Ｎ−（ＣＨＲ⁵）_m−ＮＨＣＯ−ＣＨ₂Ｃ（Ｒ⁷）＝ＣＨ₂；
Ｈ₂Ｎ−（ＣＨＲ⁵）_m−ＣＯＮＨ−（ＣＨＲ⁵）_p−Ｃ（Ｒ⁷）＝ＣＨ₂；
Ｈ₂Ｎ−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＮＨＣＯ−Ｃ（Ｒ⁷）＝ＣＨ₂；
Ｈ₂Ｎ−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＮＨＣＯ−ＣＨ₂Ｃ（Ｒ⁷）＝ＣＨ₂；
Ｈ₂Ｎ−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＣＯＮＨ−（ＣＨＲ⁵）_p−Ｃ（Ｒ⁷）＝ＣＨ₂；
Ｈ₂Ｎ−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ⁷）＝ＣＨ₂；
Ｈ₂Ｎ−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨＲ⁵）_p−Ｃ（Ｒ⁷）＝ＣＨ₂；
Ｈ₂Ｎ−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＮＨＣＯ−（ＣＨ₂）_m−Ｙ²；
Ｈ₂Ｎ−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＣＯＮＨ−（ＣＨ₂）_m−Ｙ²；
Ｈ₂Ｎ−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＮＨＣＯ−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−Ｙ²；
Ｈ₂Ｎ−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＣＯＮＨ−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−Ｙ²；
Ｈ₂Ｎ−（ＣＨＲ⁵）_m−ＮＨＣＯ−（ＣＨ₂）_m−Ｙ²；
Ｈ₂Ｎ−（ＣＨＲ⁵）_m−ＣＯＮＨ−（ＣＨ₂）_m−Ｙ²；
Ｈ₂Ｎ−（ＣＨＲ⁵）_m−ＮＨＣＯ−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−Ｙ²；
Ｈ₂Ｎ−（ＣＨＲ⁵）_m−ＣＯＮＨ−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−Ｙ²；
Ｈ₂Ｎ−（ＣＨＲ⁵）_m−Ｙ²；または
Ｈ₂Ｎ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂）_n−Ｙ²
［式中、存在するｍは、各々独立に、例えば１〜２０、好ましくは１〜１０から選択される整数であり、
存在するｎは、各々独立に、例えば１〜２００、好ましくは１〜２５から選択される整数であり、
存在するｐは、各々独立に、例えば０〜２０、好ましくは０〜１０から選択される整数であり、
存在するＲ⁵は、各々独立に、水素原子、Ｃ_1-6アルキル基および水酸基から選択され、
Ｒ⁶は、各々独立に、水素原子、Ｃ_1-6アルキル基およびメルカプト基の保護基（例えば、ピリジルスルフィド基、アセチル基、トリチル基およびエトキシカルボニルエチル基など）から選択され、
Ｒ⁷は、各々独立に、水素原子およびＣ_1-6アルキル基から選択され、
Ｙ²は、式（ＶＩＩ）：

で表される基である］
で表されるアミン類が挙げられる。したがって、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分に含まれるカルボキシ基がＮ−置換アミド基に変換されているヒアルロン酸修飾物のうち、置換基が以下の基：
−（ＣＨＲ⁵）_m−ＮＨ₂；
−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＮＨ₂；
−（ＣＨＲ⁵）_m−ＯＨ；
−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＯＨ；
−（ＣＨＲ⁵）_m−ＳＲ⁶；
−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＳＲ⁶；
−（ＣＨＲ⁵）_m−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ⁷）＝ＣＨ₂；
−（ＣＨＲ⁵）_m−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨＲ⁵）_p−Ｃ（Ｒ⁷）＝ＣＨ₂；
−（ＣＨＲ⁵）_m−ＮＨＣＯ−Ｃ（Ｒ⁷）＝ＣＨ₂；
−（ＣＨＲ⁵）_m−ＮＨＣＯ−ＣＨ₂Ｃ（Ｒ⁷）＝ＣＨ₂；
−（ＣＨＲ⁵）_m−ＣＯＮＨ−（ＣＨＲ⁵）_p−Ｃ（Ｒ⁷）＝ＣＨ₂；
−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＮＨＣＯ−Ｃ（Ｒ⁷）＝ＣＨ₂；
−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＮＨＣＯ−ＣＨ₂Ｃ（Ｒ⁷）＝ＣＨ₂；
−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＣＯＮＨ−（ＣＨＲ⁵）_p−Ｃ（Ｒ⁷）＝ＣＨ₂；
−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ⁷）＝ＣＨ₂；
−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＣＯ−Ｏ−Ｃ（Ｒ⁷）＝ＣＨ₂；
−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＮＨＣＯ−（ＣＨ₂）_m−Ｙ²；
−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＣＯＮＨ−（ＣＨ₂）_m−Ｙ²；
−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＮＨＣＯ−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−Ｙ²；
−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＣＯＮＨ−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−Ｙ²；
−（ＣＨＲ⁵）_m−ＮＨＣＯ−（ＣＨ₂）_m−Ｙ²；
−（ＣＨＲ⁵）_m−ＣＯＮＨ−（ＣＨ₂）_m−Ｙ²；
−（ＣＨＲ⁵）_m−ＮＨＣＯ−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−Ｙ²；
−（ＣＨＲ⁵）_m−ＣＯＮＨ−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−Ｙ²；
−（ＣＨＲ⁵）_m−Ｙ²；または
−ＣＨ₂−ＣＨ₂−（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂）_n−Ｙ²
であるヒアルロン酸修飾物は、それぞれ対応するアミン類から製造することができる。

本発明のヒアルロン酸−ペプチド結合体の合成のために好ましいアミン類は、ジアミン類（Ｈ₂Ｎ−（ＣＨＲ⁵）_m−ＮＨ₂、およびＨ₂Ｎ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂）_n−ＮＨ₂）である。上記のジアミン類は例えばシグマ−アルドリッチ社などから市販されており、適宜購入して利用することができる。また、文献記載の方法に従い、もしくは文献記載の方法を参考にして合成してもよい。

上記の溶媒としては極性有機溶媒が好ましく、特に非プロトン性極性溶媒が好ましい。非プロトン性極性溶媒と水との混合溶媒、あるいは、水を溶媒に使用した場合には、何れの縮合剤を用いても実用上十分な血中滞留性を付与するために必要な導入率を得ることが難しい。使用可能な非プロトン性極性溶媒は、ジメチルホルムアミド（以下、「ＤＭＦ」とも称す）、ジメチルアセトアミド（以下、「ＤＭＡｃ」とも称す）、ジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」とも称す）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（以下、「ＤＭＩ」とも称す）、スルホラン（以下、「ＳＦ」とも称す）、Ｎ−メチルピロリドン（以下、「ＮＭＰ」とも称す）またはそれらの２種以上の混合溶媒等が挙げられる。好ましくは、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドンまたはそれらの２種以上の混合溶媒であり、特に好ましくは、ジメチルスルホキシドである。

上記反応溶媒中の反応基質の濃度は、特には限定されないが、反応基質となるヒアルロン酸中のＮ−アセチルグルコサミン−グルクロン酸の繰り返し単位（ユニット）のモル濃度として、例えば、０．０２５〜２５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは、０．２５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲から選択されうる。

反応温度は特に限定されないが、例えば、４〜８０℃、好ましくは４〜４０℃、より好ましくは２０〜４０℃の範囲から選択されうる。

上記の縮合剤としては、式（Ｖ）：

［式中、Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ¹²、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、環ＢおよびＸ^-は、既に定義したとおりである］
で示される縮合剤を用いることができる。ここで、環Ｂは、酸性プロトンを有さない含窒素へテロ環基であれば特に限定されず、Ｃ_1-6アルキル基またはハロゲン原子などの置換基により置換されていてもよい。環Ｂには、例えばピロリジン−２，５−ジオン−１−イル、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン、ベンゾトリアゾール−１−イルなどが含まれる。Ｘ^-には、例えばフッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオンなどのハロゲン化物イオン、ＣＦ₃ＳＯ₃ ^-、ＢＦ₄ ^-、ＰＦ₆ ^-などが含まれる。

Ｒ¹⁰およびＲ¹¹、Ｒ¹²およびＲ¹³、ならびにＲ¹⁴およびＲ¹⁵が、それらが結合する窒素原子と一緒になって形成する含窒素ヘテロ環としては、５〜７員飽和含窒素ヘテロ環などが好ましく、具体的にはピロリジン、ピペリジン、ホモピペリジンなどが含まれる。

好ましくは、当該縮合剤は環Ｂがベンゾトリアゾール−１−イルであるＢＯＰ系縮合剤である。好ましいＢＯＰ系縮合剤としては、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（以下、「ＢＯＰ」とも称す）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（以下、「ＰｙＢＯＰ」とも称す）、およびこれらの混合物が挙げられる。ＢＯＰ系縮合剤は単独でまたは適宜組み合わせて利用することができる。

ヒアルロン酸とジアミン類を反応させる場合、ヒアルロン酸中に含まれるカルボキシル基、すなわちヒアルロン酸中のＮ−アセチルグルコサミン−グルクロン酸の繰り返し単位（１ユニット）に対して等量以上のジアミン類を用いて反応させることが好ましく、（ジアミン類）／（ＨＡユニット）のモル比は、例えば、1〜１０００、好ましくは２０〜７５０、より好ましくは５０〜５００の範囲から選択されうる。さらに、ジアミン類を導入する場合に使用する縮合剤のモル比（縮合剤／ＨＡユニット）は、ジアミン類のアミノ基の反応性により適宜調整されるが、例えば、１〜１０、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３の範囲から選択されうる。

上記の製造工程において使用されうるヒアルロン酸（ＨＡ）はＨＡ骨格を有していれば特に限定されず、ＨＡの一部を誘導体化したＨＡ誘導体や、酵素、熱分解等で低分子化したＨＡ、ＨＡ及びＨＡ誘導体の塩（ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩、等）なども含まれる。本発明に用いられるＨＡは、どのようにして得られたＨＡでもよく、動物組織から抽出されたＨＡ、発酵法で得られたＨＡ、化学合成で得られたＨＡなど、その由来は限定されない。また、ＨＡを有機溶媒に可溶化する為に、テトラブチルアンモニウム塩等の疎水性の高い対イオンにイオン交換したものを用いてもよい。上記の製造工程において使用されうるヒアルロン酸誘導体としては、例えば、一部をアルキル化、アルキルエステル化あるいは脱アセチル化したものなどが挙げられる。

ここで、Ｎ−置換アミド基の導入率は、プロトンＮＭＲで定量することができる。具体的には、プロトンＮＭＲで得られるアミノ化されたＨＡ修飾物中のアミノ化合物の量と、ＨＡ由来のピークとの比較から求めることができる。例えば、エチレンジアミン（以下、「ＥＤＡ」とも称す）でアミノ基を導入したヒアルロン酸修飾物（以下、「ＨＡ−ＡＭ」とも称す）のプロトンＮＭＲから得られるアミン化合物由来のピーク（２．９〜３．１ｐｐｍ：測定溶媒Ｄ₂Ｏ）と、ＨＡ由来のピーク（１．８〜１．９ｐｐｍ：測定溶媒Ｄ₂Ｏ）の比を実測する。

アミノ基を導入したヒアルロン酸修飾物（以下、「ＨＡ−ＡＭ」とも称する）は、アミノ基に適当な置換基を導入することにより、本発明のヒアルロン酸−ペプチド結合体の前駆体として使用することができる。上記方法によりヒアルロン酸またはヒアルロン酸誘導体とジアミン類とを反応させて得られるヒアルロン酸修飾物は、例えば以下の式（ＶＩｄ）

［式中、Ｒａ¹、Ｒａ²、Ｒａ³、Ｒａ⁴、Ｑ⁰およびＲは、既に定義されたとおりである］
で表される繰り返し単位を分子内に含む、アミノ基が導入されたヒアルロン酸修飾物であり、本発明のヒアルロン酸−ペプチド結合体の前駆体として使用することができる。

本発明に係るヒアルロン酸−ペプチド結合体の調製方法は、既知のポリマーの薬物との結合体化で使用されている方法を用いることができる。例えば、水溶性ＨＡ修飾物のアミノ基と、ＧＬＰ−１アナログのカルボキシ基との脱水縮合反応；ＧＬＰ−１アナログのアミノ基と、水溶性ＨＡ修飾物のカルボキシ基との脱水縮合反応；水溶性ＨＡ修飾物のアミノ基と、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（以下、「ＮＨＳ」とも称す）エステルおよびエポキシドなどとして修飾基が導入されたＧＬＰ−１アナログとの反応；ＧＬＰ−１アナログのアミノ基と、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステルおよびエポキシドなどとして修飾基が導入された水溶性ＨＡ修飾物との反応；水溶性ＨＡ修飾物のアミノ基と、アルデヒドおよびケトンなどのカルボニル化物として修飾基が導入されたＧＬＰ−１アナログとのシッフ塩基形成ならびに還元アミノ化反応；ＧＬＰ−１アナログのアミノ基と、アルデヒドおよびケトンなどのカルボニル化物として修飾基が導入された水溶性ＨＡ修飾物とのシッフ塩基形成ならびに還元アミノ化反応；水溶性ＨＡ修飾物に導入したメルカプト基と、マレイミド、アクリルエステル、アクリルアミド、メタクリルエステル、メタクリルアミド、アリル化物、ビニルスルホンおよびメルカプト化物などとして修飾基が導入されたＧＬＰ−１アナログとの反応；ＧＬＰ−１アナログに導入したメルカプト基と、マレイミド、アクリルエステル、アクリルアミド、メタクリルエステル、メタクリルアミド、アリル化物、ビニルスルホンおよびメルカプト化物などとして修飾基が導入された水溶性ＨＡ修飾物との反応；水溶性ＨＡ修飾物に導入したアビジンと、ＧＬＰ−１アナログに導入したビオチンとの結合；ＧＬＰ−１アナログに導入したアビジンと、水溶性ＨＡ修飾物に導入したビオチンとの結合；などを利用することができる。水溶性ＨＡ修飾物あるいはＧＬＰ−１アナログへこれらの修飾基（アビジンおよびビオチン由来の基を含む）を導入するには、これらの修飾基およびカルボキシ基（このカルボキシ基はＮＨＳエステルなどの活性エステルとなっていてもよい）から任意に選ばれる２つ以上、好ましくは２つの基を分子内に有する化合物が用いられ、この化合物においては、これらの基以外の分子内の構造は、結合体を調製するまでの間に不都合な反応が進行しないものであれば、特に限定されない。該化合物は試薬として入手可能であるか、または文献公知の方法を参考にして合成してもよい。

具体的には、Ｎ−置換アミド基の置換基が、アミノ基を含む水溶性ＨＡ修飾物（ＨＡ−ＡＭ）を合成し、ここで、アミノ基の一部をＮ−スクシンイミジル ３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３−［２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ］ｐｒｏｐｉｎａｔｅ；ＳＰＤＰ）と反応させ、メルカプト基を導入したＨＡ（以下、「ＨＡ−ＳＨ」とも称す）を調製する。この際、余剰のアミノ基は、例えば無水コハク酸等で処理、カルボキシ基に戻してトータル電荷をアニオン性にした方が好ましい。一方で、ＧＬＰ−１アナログにメルカプト基と特異的に反応する修飾基として、マレイミド、ビニルスルホン、アクリロイル、メタクリロイル、アリルなどを導入する。これをＨＡ−ＳＨと反応させ結合体を調製してもよい。

また逆に、Ｎ−置換アミド基の置換基がアミノ基を含む水溶性ＨＡ修飾物の当該アミノ基を修飾することにより二重結合を含有する基を導入し、さらに、メルカプト基含有ＧＬＰ−１アナログと反応させることにより、本発明の結合体を調製してもよい。二重結合を含有する基を導入した水溶性ＨＡ修飾物は、例えば、式（ＶＩｄ）：

［式中、Ｒａ¹、Ｒａ²、Ｒａ³、Ｒａ⁴、Ｑ⁰およびＲは、既に定義されたとおりである］
で表される繰り返し単位を分子内に含むヒアルロン酸修飾物を、適切な試薬と反応させることにより、式（ＶＩｂ）：

［式中、Ｒａ¹、Ｒａ²、Ｒａ³、Ｒａ⁴、Ｑ⁰、ＲおよびＸ⁶は、既に定義されたとおりである］
へ変換することにより調製することができる。上記反応において使用されうる試薬としては、例えば、アクリル酸クロリド（Ｘ⁶が−ＣＨ＝ＣＨ₂の場合）、メタクリル酸クロリド（−Ｃ（ＣＨ₃）＝ＣＨ₂の場合）、Ｎ−(γ−マレイミドブチリルオキシ)スルホサクシンイミドエステル、Ｎ−（κ−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホサクシンイミドエステル（以上、Ｘ⁶が−（ＣＨ₂）_m−Ｙ²の場合）、およびＮ−ヒドロキシサクシンイミジル−１５−(３−マレイミドプロピオニル)−アミド−４，７，１０，１３−テトラオキサペンタデカノエート（以下、「ＮＨＳ−（ＥＯ）₄−ＭＩ」とも称する）、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジル−７５−(３−マレイミドプロピオニル)−アミド−４，７，１０，１３，１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３−テトラコサオキサペンタヘプタコンタノエート（以上、Ｘ⁶が−ＣＨ₂−ＣＨ₂−（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂）_n−Ｙ²の場合）が挙げられる。余剰のアミノ基は、例えば無水コハク酸等で処理してもよい。

一方でＧＬＰ−１アナログにはシステインを導入するか、またはメルカプト基を有するリンカーを反応させておき、これをＨＡ−マレイミドと反応させ結合体を調製してもよい。これらの中で、特に好ましいのは、マレイミド基とメルカプト基の反応であり、例えば、ＧＬＰ−１アナログに導入されたシステインのメルカプト基とＨＡ−ＡＭの一部にＮＨＳ−（ＥＯ）₄−ＭＩで導入したマレイミド基との反応で結合体化したものが好ましい。ＧＬＰ−１アナログの導入率は、ＨＡ１分子当たり平均０．１モル％以上であり１５モル％以下が好ましい。導入率が少ないと相対的に投与量に占めるＨＡ量が増大し、高用量のＧＬＰ−１アナログを投与しようとしたときに現実的な投与用量ではＨＡの濃度が上がってしまい、高い粘度となり投与が困難になる。一方、導入率が高すぎると結合体の不溶化が起こり易くなる。

また、本発明に用いられるマレイミド基等の結合体用官能基を導入した後のＨＡ−ＡＭ残存したアミノ基は、ＧＬＰ−１アナログの結合前に、例えば無水コハク酸、無水マレイン酸、無水グルタル酸および無水アジピン酸などのジカルボン酸無水物などで処理するか、マレイン酸、グルタル酸およびアジピン酸などのジカルボン酸を縮合剤共存下で反応させることで、末端の官能基をカルボキシ基に戻してトータル電荷をアニオン性にした方が血中滞留時間の延長には好ましい。特に無水コハク酸が好ましい。ここで用いられる縮合剤は、特に限定されず、例えば、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート、Ｎ，Ｎ'−カルボニルジイミダゾール、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、ＥＤＣ／３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン、４−（４，６−ジメトキシＤｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリウムクロリド ｎ−水和物、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレートならびにこれらの混合物などを使用することができる。

また、ＧＬＰ−１アナログとの結合体とした時に実用的な血中滞留時間を得るためのヒアルロン酸修飾物としての観点では、本発明に用いられる水溶性ＨＡ修飾物の分子量も、その体内動態を左右する。本発明に用いられる原料ＨＡの分子量は特に制限されないが、余りに低分子量では得られた水溶性ＨＡ修飾物の血中滞留時間が短くなる。逆に、余りに高分子量になると得られた水溶性ＨＡ修飾物の粘度が非常に高くなり、高濃度での投与が難しくなる。また、本発明に用いられる水溶性ＨＡ修飾物の血中滞留時間は分子量が一定以上大きくなるとほとんど変化しなくなるので、通常、原料ＨＡの分子量は粘度平均分子量で５０００ダルトン〜１００万ダルトンであることが好ましく、１万ダルトン〜３０万ダルトンであることがより好ましく、８万ダルトン〜３０万ダルトンであることがさらに好ましい。

なお、ＨＡ重量平均分子量の測定方法については、例えば、中浜精一他著「エッセンシャル高分子科学」（講談社発行、ＩＳＢＮ４−０６−１５３３１０−Ｘ）に記載された、光散乱法、浸透圧法、粘度法等、各種の公知の方法を利用することができ、本明細書において示される粘度平均分子量もウベローデ粘度計を使用するなど、本発明が属する技術分野において通常用いられる方法により測定することができる。

本発明に用いられる水溶性ＨＡ修飾物の血中滞留時間は、ラットで平均血中滞留時間が１８時間以上のものであることが好ましく、２５時間以上のものがより好ましい。

また、本発明の別の側面によれば、本発明に使用される水溶性ＨＡ修飾物は、原料ＨＡに比べてヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有するものである。ここで、「ヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有する」とは、原料ＨＡと本発明の水溶性ＨＡ修飾物をそれぞれヒアルロニダーゼにより酵素分解させた際に、原料ＨＡよりも分解速度が遅いかまたは分解が進まない性質を有することを指す。例えば、ＨＡ修飾物１ｍｇに対してヒアルロニダーゼを０．４ユニット添加して３７℃で２４時間ヒアルロニダーゼ処理した際に、原料ＨＡで観察される２糖分解物より少ないか２糖分解物が観察されなければ「分解が進まない」性質を有する（即ち、ヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有する）と判定することができる。具体的には、例えば、ヒアルロン酸をその構成ユニットの２糖にまで分解することができ且つ分解産物の非還元末端にΔ−４，５−グルクロン酸残基をもつ不飽和２糖分解物（例えば、式ＩＶの化合物を含む）：

を生成させるヒアルロニダーゼで該水溶性ヒアルロン酸修飾物を分解し、得られる分解産物の２３２ｎｍにおける吸収ピークを測定して判定することができる。当該測定は、通常の高速液体クロマトグラフィーを用いて当該技術分野において通常用いられる方法により行うことができ、例えばゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）カラム（例えばＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨＲ １０／３０およびＳｕｐｅｒｄｅｘ ＰｅｐｔｉｄｅＨＲ １０／３０（いずれもアマシャムバイオサイエンス株式会社製）を連結したものなど）を使用することができる。また使用する溶離液は特には限定されないが、例えばＰＢＳ(例えば、ＳＩＧＭＡ製Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｔａｂｌｅｔｓ ２錠をとり、精製水４００ｍＬに溶解させて得たもの)を使用することができる。

本発明で用いる水溶性ヒアルロン酸修飾物としては、上記方法で測定した場合、分解産物に由来する全ピークエリアに対する２糖に由来するピークエリアの分率の上限が３０％以下であることが好ましい。さらに好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１３％以下である。また、下限は０％以上であればよい。

ここで、分解産物に由来する全ピークエリアに対する２糖に由来するピークエリアの分率は、以下の式：

で求めることができる。また、ヒアルロニダーゼとしては、例えばヒアルロニダーゼＳＤ（生化学工業株式会社製）等を使用することができる。

ＧＬＰ−１アナログと結合体とした時に実用的な血中滞留時間を得るためのヒアルロン酸修飾物としての観点では、本発明に用いられる水溶性ＨＡ修飾物は、特に限定はされないが、例えば室温において生理食塩水に対して１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの溶解度を有する。実際に治療を目的として投与される時のＨＡ修飾物の濃度は５０ｍｇ/ｍＬ以下が好ましい。

本明細書において「Ｃ_1-6アルキル基」とは、炭素数１〜６の直鎖状、分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチルなどの「Ｃ₁−Ｃ₄アルキル基」が含まれ、さらに、ｎ−ペンチル、３−メチルブチル、２−メチルブチル、１−メチルブチル、１−エチルプロピル、ｎ−ヘキシル、４−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−メチルペンチル、１−メチルペンチル、３−エチルブチル、および２−エチルブチルなどが含まれる。

本明細書において「Ｃ₁−Ｃ₆アルキルカルボニル基」とは、炭素数１〜６の直鎖状、分岐鎖状のアルキル基を有するアルキルカルボニル基を意味し、例えば、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ピバロイル、バレリル、イソバレリル、ヘキサノイルなどが含まれる。

本明細書において「Ｃ_1-400アルキレン基」とは、炭素数１〜４００の直鎖状アルキレン基を意味し、例えば、Ｃ_1-200アルキレン基、Ｃ_1-100アルキレン基、Ｃ_1-50アルキレン基、Ｃ_1-20アルキレン基、Ｃ_1-10アルキレン基などが含まれる。ここで、当該アルキレン基が１以上の個所において当該アルキレン基に含まれる２つの炭素原子の間に酸素原子が挿入されていてもよい場合、当該定義には、例えば、−ＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−（ここでｎは０〜１９９から選択される整数）で表されるエチレンオキシド基などが含まれる。

本明細書において天然アミノ酸とは、グリシン、アラニン、セリン、プロリン、バリン、トレオニン、システイン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸、リジン、グルタミン、グルタミン酸、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アルギニン、チロシン、トリプトファンなどから選択されるα−アミノ酸の他に、β−アラニンなどのβ−アミノ酸、γ−アミノ酪酸などのγ−アミノ酸、およびタウリンなどのアミノスルホン酸などが含まれる。また、非天然α−アミノ酸には、アルキル側鎖を持つα−アミノ酸（例えば、ノルバリン、ノルロイシン、ｔ−ロイシンなど）、シクロアルキル基で置換されたアラニンやグリシン（例えば、シクロペンチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシンなど）、またはアリール基で置換されたアラニンやグリシン（例えば、ピリジルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、置換フェニルアラニン、フェニルグリシンなど）などが含まれる。

本発明において導入される置換基の導入量は、縮合剤のＨＡに対する添加量などで調節することができる。

また、本発明に使用される水溶性ＨＡ修飾物の電荷が、ＧＬＰ−１アナログとの結合体後にカチオン性であった場合、生体膜などとの非特異的相互作用により血中滞留時間の短縮に繋がるため、酸無水物、ラクトン、ラクチドあるいは活性エステルを含む化合物などと反応させることによりノニオン性か、アニオン性に変換することが好ましい。

本発明に使用される水溶性ＨＡ修飾物の調製方法では、例えば、テトラブチルアンモニウム(ＴＢＡ)塩化したＨＡをＤＭＳＯに溶解し、分子の両末端にアミノ基を１つずつ有するジアミノ系化合物を添加、ＨＡのカルボキシ基にＢＯＰ系縮合剤で縮合させ、アミノ基を導入したＨＡ（以下、「ＨＡ−ＡＭ」とも称す）を合成できる。

ＧＬＰ−１アナログとの結合体合成は、活性低下を抑える上から部位特異的な結合体化が好ましい。

本発明のＧＬＰ−１アナログには、例えば、ＧＬＰ−１（１−３６）またはＧＬＰ−１（７−３６）などの天然型ＧＬＰ−１フラグメントのＣ末端側に−Ｘａ−Ｃｙｓで表されるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１以上（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドが含まれる。ここで、前記アミノ酸配列は、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸により置換および／または付加されてもよく、Ｘａは直接結合または独立に選択される１以上（例えば１〜９個、好ましくは１〜４個）のアミノ酸（天然アミノ酸および非天然アミノ酸から選択される）からなる配列であり、当該ペプチドのＣ末端のシステインのカルボキシ基はアミド基に変換されていてもよい。

さらにＧＬＰ−１アナログには、ＧＬＰ−１（１−３６）、ＧＬＰ−１（１−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１（７−３７）に、−Ｑａ−ＳＨで表されるメルカプト化合物を付加したアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１以上（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドも含まれる。前記アミノ酸配列の置換は、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸により置換されてもよい。

ここでＱａは−ＮＨ−Ｘ⁵−、−ＣＯ−Ｘ⁵−または−ＣＯＮＨ−Ｘ⁵−から選択され、ペプチドのＣ末端アミノ酸残基に含まれるカルボキシ基、アミノ基または水酸基と連結してアミド結合、ウレア結合またはエステル結合を形成する。

Ｘ⁵はＣ_1-50アルキレン基であり、ここで当該アルキレン基の１以上の個所において当該アルキレン基に含まれる２つの炭素原子の間に酸素原子が挿入されていてもよく、当該アルキレン基の炭素原子は、水酸基およびＣ_1-6アルキル基から選択される１以上の置換基により独立に置換されていてもよい。

本発明の１つの態様において、ＧＬＰ−１アナログは、ＧＬＰ−１（１−３７）、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）等の天然型ＧＬＰ−１構成アミノ酸の１〜５残基を置換、欠失、付加したアナログ、及び当該アナログのＣ末端のアミノ酸残基を１〜１０残基のアミノ酸配列で置換したアナログまたはＣ末端側にα−アミノ基を除くアミノ基、カルボキシ基あるいは水酸基にアミド結合、ウレア結合あるいはエステル結合を介して−Ｘ⁵−ＳＨで表されるメルカプト化合物が付加したＧＬＰ−１アナログを示す。ここで置換、付加されるアミノ酸残基は天然型でも非天然型であってもよい。

ＧＬＰ−１アナログとしては、ＤＰＰIV耐性を示すことが期待される置換と部位特異的な結合体化部位としてメルカプト基を与えるアナログが好ましい。具体的には、少なくとも天然型のＧＬＰ−１の２番目（８位）のアラニンを他の天然型或いは非天然型のアミノ酸残基に置換したアナログにおいて、さらに当該アナログのＣ末端のアミノ酸残基を−Ｘａ−Ｃｙｓで表されるアミノ酸配列（Ｘａは直接結合またはプロリン、グリシン、セリンおよびグルタミン酸から独立に選択される１〜９のアミノ酸からなる配列を示す）で置換したＧＬＰ-1アナログ（ここでＣ末端のシステインはアミド化されていてもよい）、あるいはＣ末端側アミノ酸のα−アミノ基を除くアミノ基、カルボキシ基あるいは水酸基にアミド結合、ウレア結合あるいはエステル結合を介して−Ｘ⁵−ＳＨで表されるチオール化合物が付加したＧＬＰ−１アナログが好ましい。

好ましいＧＬＰ−１アナログとしては、天然型のＧＬＰ−１（Ｈｕｍａｎ、７−３７；特表平７−５０４６７９号公報記載）のアナログであり、例えば、ＧＬＰ−１（７−３６）−Ｘｂ−Ｃｙｓ、ＧＬＰ−１（７−３６）−Ｘｂ−ＣｙｓＮＨ₂、［Ｇｌｙ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）−Ｘｂ−Ｃｙｓ、［Ｇｌｙ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）−Ｘｂ−ＣｙｓＮＨ₂、［Ｓｅｒ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）−Ｘｂ−Ｃｙｓ、［Ｓｅｒ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）−Ｘｂ−ＣｙｓＮＨ₂、［Ｖａｌ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）−Ｘｂ−Ｃｙｓ、［Ｖａｌ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）−Ｘｂ−ＣｙｓＮＨ₂、［Ｌｅｕ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）−Ｘｂ−Ｃｙｓ、［Ｌｅｕ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）−Ｘｂ−ＣｙｓＮＨ₂、［Ｉｌｅ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）−Ｘｂ−Ｃｙｓ、［Ｉｌｅ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）−Ｘｂ−ＣｙｓＮＨ₂、［Ｔｈｒ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）−Ｘｂ−Ｃｙｓ、［Ｔｈｒ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）−Ｘｂ−ＣｙｓＮＨ₂（式中、Ｘｂは、直接結合またはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−を表す）、ＧＬＰ−１（７−３７）ＮＨ−Ｘ⁵−ＳＨ、ＧＬＰ−１（７−３６）−Ｌｙｓ−ε−ＮＨＣＯ−Ｘ⁵−ＳＨ、ＧＬＰ−１（７−３６）−ＬｙｓＮＨ₂−ε−ＮＨＣＯ−Ｘ⁵−ＳＨ、［Ｇｌｙ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３７）ＮＨ−Ｘ⁵−ＳＨ、［Ｇｌｙ⁸］−ＧＬＰ−１（７−３６）−ＬｙｓＮＨ₂−ε−ＮＨＣＯ−Ｘ⁵−ＳＨ（式中、Ｘ⁵は、−(ＣＨ₂)_n−、直接結合または−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_m−であり、ｎおよびｍは１〜２０から選択される整数である）
などが含まれる。なお、上記のＣｙｓＮＨ₂はカルボキシ基がアミド化されたシステインを、ＬｙｓＮＨ₂はカルボキシ基がアミド化されたリシンを表す。

特に、天然型のＧＬＰ−１の２番目（８位）のアラニンをグリシンに、３１番目（３７位）のグリシンをシステインに変更したアナログ、天然型ＧＬＰ−１の２番目をグリシンに、３１番目（３７位）のグリシンをグリシン‐プロリン−プロリン−プロリン−システインに変更したアナログが好ましい。また、ＧＬＰ−１アナログのＣ末端は周知の方法でアミド化されていてもよい。

本発明のＧＬＰ−１アナログの合成は、通常用いられる、固相法、液相法による化学合成法でも、大腸菌や動物細胞を宿主として製造される組み換え培養法でも、無細胞タンパク質合成法でも良い。

本発明の結合体は、１種もしくはそれ以上の薬学的に許容し得る希釈剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤等を含む医薬組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。

本発明の結合体を含む医薬組成物は、非経口的に全身又は局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、鼻腔内投与、経肺投与などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、投与経路、投与頻度によって異なる。副作用（悪心、嘔吐等）の発生を抑制しつつ薬効を得るための血中濃度として、２ｐＭから２００００ｐＭが想定されるので、当該血中濃度となるように投与量を調整することが好ましい。

本発明を適用することができる糖尿病性合併症は特に限定されず、例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性動脈硬化症、糖尿病性心筋梗塞、脳梗塞、糖尿病性足病変などが挙げられる。

本発明により、従来の方法では得られない、長期間の持続性糖尿病医薬を提供することが可能である。

本発明により、血中滞留時間が延長された実用的でかつ安全なＧＬＰ−１アナログ結合体を製造することが可能となる。

以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

ＮＭＲ測定は、核磁気共鳴装置 ＪＮＭ−ＥＣＡ５００（日本電子株式会社製）を用いて測定した。ＮＭＲの測定条件を以下に示す：
Ｄａｔａ ｐｏｉｎｔ：１６３８４
Ｓｐｅｃｔｒａｌ ｗｉｄｔｈ（Ｘ ｓｗｅｅｐ）：１５ｐｐｍ
Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｔｉｍｅ（Ｘ ａｃｑ ｔｉｍｅ）：１．７４９ｓ
Ｐｕｌｓｅ ｄｅｌａｙ（Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｄｅｌａｙ）：３０ｓ
Ｔｒａｎｓｉｅｎｔｓ（Ｓｃａｎｓ）：６４
温度：室温
測定溶媒：Ｄ₂Ｏ
また、以下の記載中のＨＡユニットとは、ヒアルロン酸中のＮ−アセチルグルコサミン−グルクロン酸の繰り返し単位（１ユニット）を意味する。
〔実施例１〕非プロトン性極性溶媒中でのヒアルロン酸修飾物の合成（縮合剤、溶媒混合比率、酵素分解性）
非極性溶媒中における様々な合成条件を検討し、各条件で得られたヒアルロン酸修飾物の酵素耐性の評価を行った。
（実施例１−１）
テトラブチルアンモニウムヒドロキシド（シグマ−アルドリッチ社製）でテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩化したＤＯＷＥＸ ５０ＷＸ８−４００（シグマ−アルドリッチ社製）を用いて、分子量２００ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ；電気化学工業株式会社製）をＴＢＡ塩化した。得られたテトラブチルアンモニウム塩化ヒアルロン酸（以下、「ＨＡ−ＴＢＡ」とも称す）２９．１ｍｇを２．０ｍｇ／ｍＬ濃度となるようＤＭＳＯ（和光純薬株式会社製）に溶解した。ＨＡユニット／ＢＯＰ（和光純薬株式会社製）／エチレンジアミン（以下、「ＥＤＡ」とも称す；シグマ−アルドリッチ社製）＝１／２．５／１００（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比でＥＤＡ、ＢＯＰの順で添加し、室温下で一晩反応させた。その後、１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を１０ｍＬ加えた後、５Ｎ ＨＣｌを加えてｐＨを３まで低下させ、さらに２Ｎ ＮａＯＨにて中和を行った。大過剰量の蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、分画分子量（以下、「ＭＷＣＯ」とも称す）：１２ｋ−１４ｋＤａ）、限外ろ過後（ＹＭ−１０、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、凍結乾燥して標題のアミノ基が導入されたヒアルロン酸（以下、「ＨＡ−ＡＭ」とも称す）２５．８ｍｇを得た。
（実施例１−２）
エチレンジアミンの代わりに２，２'−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（以下、「ＥＤＯＢＥＡ」とも称す；シグマ−アルドリッチ社製）を用い、ＨＡ−ＴＢＡ ３５．１ｍｇを用い、ＨＡユニット／ＢＯＰ／ＥＤＯＢＥＡ＝１／２．５／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比で反応させたこと以外は実施例１−１と同様の方法で行い、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）２７．２ｍｇを得た。
（実施例１−３）
ＥＤＯＢＥＡの代わりにヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ；シグマ−アルドリッチ社製）を用い、ＨＡ−ＴＢＡ ６２．０ｍｇを用いたこと以外は実施例１−２と同様の方法で行い、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）４１．１ｍｇを得た。
（実施例１−４）
ＢＯＰの代わりにＰｙＢＯＰ（国産化学株式会社製）を用い、ＨＡ−ＴＢＡ ５１．８ｍｇを用いたこと以外は実施例１−２と同様の方法で、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）３９．０ｍｇを得た。
（試験例１）酵素分解性評価
実施例１−１〜１−４で得られたＨＡ−ＡＭを２ｍｇ/ｍＬ濃度に蒸留水（ミリＱ水）に溶解した。この溶液５５μＬに０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）１３２μＬおよび水７７μＬを加え、ヒアルロニダーゼＳＤ（生化学工業株式会社製）１Ｕ/ｍＬ溶液(０．０１％ＢＳＡを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）)４４μＬを加えて３７℃で２４時間インキュベートした。各サンプル１００μＬを分取し、５０ｍＭ酢酸溶液を７２０μＬ加え反応を停止させた。対照として酵素非添加群も同様に行った（データ省略）。それぞれゲル浸透クロマトグラフィー（以下、「ＧＰＣ」とも称す）に供してＨＡ−ＡＭの分子量の変化、分解産物の生成パターンを観察した（２３２ｎｍの吸収）。ＧＰＣの条件を以下に示す。

ＧＰＣ Ｃｏｌｕｍｎ：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨＲ １０／３０、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ＰｅｐｔｉｄｅＨＲ １０／３０（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）（３本連結）
Ｅｌｕｅｎｔ：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
Ｆｌｏｗ Ｒａｔｅ：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ：５０μＬ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ（２３２ｎｍ）
２糖分解ピーク（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ：１３０分）は観察されなかった。また、ＧＰＣデータを図１に示す（実施例１−１〜１−４）。

また、実施例１−１〜１−４のアミノ基導入率をプロトンＮＭＲ法で定量した（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８〜１．９ｐｐｍ、ＡＭ：遊離のアミノ基に隣接するメチレンプロトン、２．９〜３．１ｐｐｍ）。プロトンＮＭＲデータを図２に示す。アミノ基導入率はそれぞれ９７．５、７５．５、８８．３、８４．５％だった。
〔実施例２〕カルボン酸変換したＨＡ修飾物のヒアルロニダーゼ耐性評価
より詳細に酵素耐性を評価するために、導入した一級アミンをコハク酸アミドに変換したＨＡ修飾物（ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣ）の合成を行い、得られたＨＡ修飾物の酵素耐性の評価を行った。
（実施例２−１）ＥＤＯＢＥＡ導入ＨＡ修飾物の合成
ＨＡ（２００ｋＤａ）−ＴＢＡのＤＭＳＯ溶液（４．０ｍｇ／ｍＬ）を６つ用意し、各溶液に２，２'−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（ＥＤＯＢＥＡ）をＨＡユニット／ＥＤＯＢＥＡ＝１／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比で加え、ＢＯＰをＨＡユニットに対し、０．４、０．６、０．８、１．０、１．５、１．８５または２．５の当量比で加え、一晩反応させた。その後反応混合物の容量の半分量の１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を加え、５Ｎ ＨＣｌにてｐＨを３まで低下させた後、２Ｎ ＮａＯＨにて中和を行った。その後０．３Ｍ ＮａＣｌ水溶液に対して透析を行い、次に大過剰量の蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）、凍結乾燥を行い、ＥＤＯＢＥＡ導入ＨＡ修飾物を得た。
（実施例２−２）一級アミンのコハク酸アミドへの変換
上記（実施例２−１）で得られたサンプルを蒸留水（ミリＱ水）で２０．０ｍｇ／ｍＬの溶液とし、これに０．２Ｍ炭酸緩衝液(ｐＨ９．０)を加え、１０．０ｍｇ／ｍＬとした。この溶液にＨＡのユニットに対して２０モル倍の無水コハク酸（和光純薬株式会社製）をＨＡ−ＡＭ溶液の１／１０容量のＤＭＳＯ溶液として加えて室温で３０分間撹拌した。その後０．３Ｍ ＮａＣｌ水溶液に対して透析を行い、次に大過剰量の蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）、凍結乾燥を行ない、ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣを得た。ＮＭＲスペクトルを図３に示す。アミノ基の隣のメチレンのピーク（２．９〜３．１）が完全に消失し、新たにコハク酸由来のピーク（２．４〜２．６ｐｐｍ）が観察され、アミノ基がコハク酸アミドに変換され新たにカルボキシ基が導入されていることが明らかとなった。
（実施例２−３）酵素分解性評価
実施例２−２で得られたＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣを４ｍｇ/ｍＬ濃度で蒸留水（ミリＱ水）に溶解した。この溶液２５μＬに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）２００μＬおよび水２５μＬを加え、ヒアルロニダーゼＳＤ（生化学工業株式会社製）１Ｕ/ｍＬ溶液(０．２Ｍリン酸緩衝液；ｐＨ６．２)５０μＬを加えて３７℃で２４時間インキュベートした。各サンプル１００μＬを分取し、５０ｍＭ酢酸溶液を７００μＬ加え反応を停止させた。対照として酵素非添加群も同様に行った（データ省略）。それぞれゲル浸透クロマトグラフィー（以下、「ＧＰＣ」とも称す）に供してＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣの分子量の変化、分解産物の生成パターンを観察した（２３２ｎｍの吸収）。結果を図４および表１に示す。
また、ＧＰＣの条件を以下に示す。

ＧＰＣ Ｃｏｌｕｍｎ：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ＰｅｐｔｉｄｅＨＲ １０／３０（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）（２本連結）
Ｅｌｕｅｎｔ：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
Ｆｌｏｗ Ｒａｔｅ：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ：５０μＬ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ（２３２ｎｍ）

ここで分解産物のうちの２糖分率は溶媒由来のピーク（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ：９０分）を除いた範囲で１００×（２糖のピークエリア）／(全ピークエリア−酵素非添加時全ピークエリア)(％)として算出した。酵素耐性はアミド基の導入率、すなわちＨＡのカルボン酸の修飾率に対応して酵素耐性が上がることが明らかとなった。
〔実施例３〕ヒアルロン酸修飾物（ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣ）の分子量と血中滞留時間との相関（分子量依存性）
ヒアルロン酸修飾物（ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣ）の血中滞留性を分子量の観点から解析するために、２３ｋ、１００ｋおよび２００ｋＤａのＨＡからＨＡ修飾物を合成し、蛍光色素であるＦＩＴＣを導入したサンプルを調製し、それぞれの血中滞留性を観察した。
（実施例３−１）ＨＡ−ＡＭの合成
ＨＡ（２３ｋＤａ）−ＴＢＡのＤＭＳＯ溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、ＨＡ（１００ｋＤａ）−ＴＢＡおよびＨＡ（２００ｋＤａ）−ＴＢＡのそれぞれのＤＭＳＯ溶液（４ｍｇ／ｍＬ）を調製した。ＨＡユニット／ＢＯＰ／２，２'−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（ＥＤＯＢＥＡ）＝１／２．５／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比でＥＤＯＢＥＡ、ＢＯＰの順で各溶液に添加し、室温下で一晩反応させた。その後、反応混合物の容量の半分量の１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を加えた後、５Ｎ ＨＣｌを加えてｐＨを３まで低下させ、さらに２Ｎ ＮａＯＨにて中和を行った。大過剰量の蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）、限外ろ過後（ＹＭ−１０、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、凍結乾燥して標題のアミノ基が導入されたＮ−置換アミド化ヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）を得た。アミド基導入率はプロトンＮＭＲ法で定量した。ＮＭＲチャートを図５に示す（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８〜１．９ｐｐｍ、ＡＭ：ＥＤＯＢＥＡ部分のメチレンプロトン、２．９〜３．１ｐｐｍ）。それぞれ導入率は２３ｋＤａ：８７モル％、１００ｋＤａ：９２．５モル％、２００ｋＤａ：９３．５モル％であった。
（実施例３−２）蛍光標識ＨＡ修飾物の合成
上記（実施例３−１）で得られたＨＡ−ＡＭを蒸留水（ミリＱ水）で溶解し２０．０ｍｇ／ｍＬの溶液とし、これに０．２Ｍ炭酸緩衝液(ｐＨ９．０)を加え、濃度を１０．０ｍｇ／ｍＬとした。この溶液にＨＡのユニットに対して０．０７モル倍のフルオレセインイソチオシアネート（以下、「ＦＩＴＣ」とも称す；ピアス社製）をＨＡ−ＡＭ溶液の１／１０容量のＤＭＳＯ溶液として加えて室温で１時間撹拌した。その後、ＨＡのユニットに対して４０モル倍の無水コハク酸（和光純薬株式会社製）をＨＡ−ＡＭ溶液の１／１０容量のＤＭＳＯ溶液として加えて室温で３０分間撹拌した。ＰＤ−１０カラム（アムシャムバイオサイエンス株式会社製）によるゲル濾過で粗精製した後、大過剰量の０．５Ｍ ＮａＣｌ水溶液に対して透析精製した（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）。透析外液を蒸留水（ミリＱ水）に置換してさらに透析精製し、得られた水溶液を凍結乾燥して蛍光標識化ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣを得た。

ここで得られた各蛍光標識ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣを０．２５ｍｇ／ｍＬ濃度で５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解し、その溶液の４９４ｎｍにおける吸光度からＦＩＴＣ由来のＮ−フルオロセイニルチオカルバモイル基のモル濃度を定量し、以下の式に従って各ユニットの濃度を算出した。さらに、モル分率への変換、ＨＡ修飾物中のＨＡ由来の重量分率算出を行った。
未修飾 ＨＡユニット： ｘ ｎｍｏｌ／ｍＬ
ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣユニット： ｙ ｎｍｏｌ／ｍＬ (ＡＭが無水コハク酸処理されたユニット)

なお、式中の残存ＡＭ ｃｏｎｃ．とは未反応のアミノ基を有するユニットのモル濃度を意味し、ＦＴＣ ｃｏｎｃ．とはＦＴＣ基を有するユニットのモル濃度を意味する。

得られた結果を表２にまとめた。

（比較例３−１）蛍光標識ＨＡ−ＨＺ−ＳＵＣの合成
５８０ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム（電気化学工業株式会社製）を０．２５％濃度（ｗ／ｖ）で蒸留水に溶解し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に調整した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とアジピン酸ジヒドラジド（以下、「ＡＤＨ」とも称す）を、ＨＡのユニット：ＥＤＣ：ＡＤＨ＝１：５：４０のモル比になるよう添加し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に保ちながら室温で２時間反応させた。大過剰量の１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液、２５％エタノール水溶液、蒸留水（ミリＱ水）に対して順に透析（スペクトラポア７、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）し、凍結乾燥してヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）を得た。ＨＡ−ＨＺ中のＨＺ導入率をＡＤＨ導入率としてプロトンＮＭＲ法で定量したところ、ＨＡのカルボキシ基の７３％であった。

このＨＡ−ＨＺを蒸留水（ミリＱ水）に溶解させた後、等量の１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて終濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整した。これにＦＩＴＣ／ＨＡのユニット＝３．０ｍｏｌ／ｍｏｌの仕込比で、ＨＡ−ＨＺ溶液の１／１０容量のＤＭＳＯに溶解させたＦＩＴＣを添加し、室温、遮光下に１時間反応させた。反応溶液２５ｍＬを予め５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化したＰＤ−１０カラム（１０本）に投入し、未反応のＦＩＴＣを除去した。この粗精製した溶液に無水コハク酸／ＨＺ＝２５０ｍｏｌ／ｍｏｌの仕込比で、ＤＭＳＯに溶解させた無水コハク酸を添加し（３．５ｍＬ）、同様に反応させた。反応混合物を大過剰量の蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し、凍結乾燥してＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺ−ＳＵＣを得た。

得られた各蛍光標識ＨＡ−ＨＺを０．２５ｍｇ／ｍＬ濃度で５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解し、その溶液の４９４ｎｍにおける吸光度からＦＩＴＣ濃度を定量し、以下の式に従って各ユニットの濃度を算出した。さらに、モル分率への変換、ＨＡ修飾物中のＨＡ由来の重量分率算出を行った。

未修飾 ＨＡユニット： ｘ μｍｏｌ／ｍＬ
ＨＡ−ＨＺ−ＳＵＣユニット： ｙ μｍｏｌ／ｍＬ (ＨＺが無水コハク酸処理されたユニット) と定義し、以下の式より算出した。

なお、式中ＦＩＴＣ ｃｏｎｃ．とはＦＩＴＣ基を有するユニットのモル濃度を意味する。得られた結果を表３にまとめた。

（実施例３−３）血中滞留時間評価
ＨＡ投与ラット血漿サンプル
実施例３−２および比較例３−１の蛍光標識ＨＡ修飾物を１０ｍｇ／ｋｇの用量でラット静脈内（ｉｖ）および皮下（ｓｃ）に単回投与し、投与前および投与後０．０８３３、０．５、２、４、８、２４、４８、７２、９６、１６８時間に採血（ヘパリン処理）し、遠心分離により血漿を得た。この血漿サンプルは測定まで−２０℃以下で凍結保存した。

測定方法
ＧＰＣにより検量線用標準試料および測定用試料の分析を行った。以下に条件を示す。

ＧＰＣ Ｃｏｌｕｍｎ：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ６０００ＰＷ_XL（ＴＯＳＯＨ社製）
Ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
Ｅｌｕｔｉｏｎ ｍｏｄｅ：Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ：４０μＬ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＸ：４９４ｎｍ，ＥＭ：５１８ｎｍ）
測定試料の調製
・検量線用試料；
各蛍光標識ＨＡ修飾物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて希釈し、１、５、１０、５０、１００、５００μｇ／ｍＬおよび０μｇ／ｍＬ（対照、ＰＢＳ（ｐＨ７．４））の標準液を調製した。この標準液に等容量の正常ラット血漿を添加し検量線用試料を調製した。
・測定用試料の調製；
ＨＡ修飾物投与ラット血漿サンプルに等容量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加して測定用試料を調製した。
・血漿中のＨＡ修飾物濃度の算出；
解析ソフトＭｉｌｌｅｎｉｕｍ Ｖｅｒ ３．２１（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いてピーク面積を算出した。各標準試料のピーク面積から得られた検量線より血漿中のＨＡ修飾物濃度を算出した。

薬物動態データ
実施例３−２および比較例３−１の蛍光標識ＨＡ修飾物の蛍光標識ＨＡ修飾物の血中濃度推移のデータについて、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｖｅｒ ４．０．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）で薬物動態学的パラメーターを算出した。各個体の最終測定点３点のデータを用いてモデル非依存的解析を行い、半減期（ｔ１／２）、平均血中滞留時間（ＭＲＴ）を算出した。蛍光標識ＨＡ修飾物の血中濃度推移を図６に示し、算出した薬物動態学的パラメーターを表４に示す。

蛍光標識化ＨＡ修飾物を用いた薬物動態試験により、非プロトン極性有機溶媒中で合成した本発明ＨＡ修飾物（実施例３−２）はＨＡおよびこれまで報告されたＨＡ誘導体（ＨＡ−ＨＺ−ＳＵＣ；特許文献１２、１３および１４を参照）と比較して、ラット単回静脈内投与後の血中滞留時間が大幅に改善されることが確認された。これまでに報告された分子量６００ｋＤａのＨＡ修飾物（７０モル％修飾）においてもラット単回静脈内投与後の平均血中滞留時間（ＭＲＴ）は１６時間程度であり、血中滞留性が５．５倍程度延長されていることが明らかとなった。２３ｋＤａ ＨＡ修飾物に関しては、初期段階で血中濃度が減少する傾向が観察され、一部低分子ＨＡ修飾物が腎排泄されている可能性が示唆された。１００ｋＤａおよび２００ｋＤａのＨＡ修飾物に関しては、血中滞留性に関する特性（ＣＬ、ＭＲＴ，ｔ１／２）はほぼ同様の値となった。
〔実施例４〕ヒアルロン酸修飾物（ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣ）のアミド基導入率と血中滞留時間との相関
ヒアルロン酸修飾物（ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣ）の血中滞留性を修飾率の観点から解析するために、２００ｋＤａのＨＡから様々な修飾率のＨＡ修飾物を合成し、蛍光色素であるＦＩＴＣを導入したサンプルを調製し、それぞれの血中滞留性を観察した。
（実施例４−１）ＨＡ−ＡＭの調製
ＨＡ（２００ｋＤａ）−ＴＢＡのＤＭＳＯ溶液（４．０ｍｇ／ｍＬ）を５つ調製し、各溶液にＨＡユニット／ＥＤＯＢＥＡ＝１／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比でＥＤＯＢＥＡを添加し、ＢＯＰ試薬をＨＡユニットに対し、０．２５、０．５、０．７５、１．０、または１．５の当量比でそれぞれの溶液に加え、一晩反応させた。その後反応混合物の容量の半分量の１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を加え、５Ｎ ＨＣｌにてｐＨを３まで低下させた後、２Ｎ ＮａＯＨにて中和を行った。その後大過剰量の蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）、限外ろ過後（ＹＭ−１０、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、凍結乾燥を行った。置換基の末端にアミノ基を有するＮ−置換アミド基導入率はプロトンＮＭＲ法で定量した。ＮＭＲチャートを図７に示す。（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８〜１．９ｐｐｍ、ＡＭ：ＥＤＯＢＥＡ部分のメチレンプロトン、２．９〜３．１ｐｐｍ）それぞれ導入率はＢＯＰ試薬比率０．２５：２０．０モル％、０．５：３６．５モル％、０．７５：５４．５モル％、１．０：６９．０モル％、１．５：９０．５モル％であった。
（実施例４−２）蛍光標識化ＨＡ修飾物の合成
実施例４−１で得られたＨＡ−ＡＭのそれぞれを、蒸留水（ミリＱ水）で２０．０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解し、これに０．２Ｍ炭酸緩衝液(ｐＨ９．０)を加え濃度を１０．０ｍｇ／ｍＬとした。これらの溶液にＨＡのユニットに対して０．０７モル倍（６９％および９０．５％アミド導入率のＨＡの溶液）、０．１７５モル倍（５４．５％アミド導入率のＨＡの溶液）、０．２８モル倍（３６．５％アミド導入率のＨＡの溶液）および０．６３モル倍（２０．０％アミド導入率のＨＡの溶液）のフルオレセインイソチオシアネートをＨＡ−ＡＭ溶液の１／１０容量のＤＭＳＯ溶液として加え、室温で１時間撹拌した。その後、ＨＡのユニットに対して４０モル倍の無水コハク酸をＨＡ−ＡＭ溶液の１／１０容量のＤＭＳＯ溶液として加え、室温でさらに３０分間撹拌した。２０％アミン修飾物は大過剰量ＤＭＳＯへ透析を行った後、またその他のサンプルは直接、大過剰量の２５％ＥｔＯＨ水溶液に対して透析し（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）、その後、０．５Ｍ ＮａＣｌ水溶液に対して透析精製した。透析外液を蒸留水（ミリＱ水）に置換してさらに透析精製し、得られた水溶液を凍結乾燥して蛍光標識化ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣを得た。

ここで得られた各蛍光標識化ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣを０．２５ｍｇ／ｍＬ濃度で５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解し、その溶液の４９４ｎｍにおける吸光度からＦＩＴＣ濃度を定量し、以下の式に従って各ユニットの濃度を算出した。さらに、モル分率への変換、ＨＡ修飾物中のＨＡ由来の重量分率算出を行った。
未修飾 ＨＡユニット： ｘ ｎｍｏｌ／ｍＬ
ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣユニット： ｙ ｎｍｏｌ／ｍＬ (ＡＭが無水コハク酸処理されたユニット)

得られた結果を表５にまとめた。

（実施例４−３）血中滞留時間評価
ＨＡ投与ラット血漿サンプル
実施例４−２の蛍光標識ＨＡ修飾物を１０ｍｇ／ｋｇの用量でラット静脈内に単回投与し、投与前および投与後０．５、２、４、８、２４、４８、７２、９６、１６８時間に採血（ヘパリン処理）し、遠心分離により血漿を得た。この血漿サンプルは測定まで−２０℃以下で凍結保存した。

測定方法
９６穴プレートに検量線用標準試料および測定用試料を分注しマイクロプレートリーダーを用いて分析を行った。以下に条件を示す。

マイクロプレートリーダー：ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ ＧＥＭＩＮＩ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）
Ｓａｍｐｌｅ ｖｏｌｕｍｅ：１００μＬ／ｗｅｌｌ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＸ：４８５ｎｍ，ＥＭ：５３８ｎｍ）
測定試料の調製
・検量線用試料；
各蛍光標識ＨＡ修飾物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて希釈し、１、５、１０、５０、１００、５００μｇ／ｍＬおよび０μｇ／ｍＬ（対照、ＰＢＳ（ｐＨ７．４））の標準液を調製した。この標準液に等容量の正常ラット血漿を添加し検量線用試料を調製した。
・測定用試料の調製；
ＨＡ修飾物投与ラット血漿サンプルに等容量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加して測定用試料を調製した。
・血漿中のＨＡ修飾物濃度の算出；
解析ソフトＳＯＦＴｍａｘ ＰＲＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて各標準試料の蛍光強度から得られた検量線より血漿中のＨＡ修飾物濃度を算出した。

薬物動態データ
実施例４−２の蛍光標識ＨＡ修飾物の血中濃度推移のデータについて、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｖｅｒ ４．０．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）で薬物動態学的パラメーターを算出した。各個体の血漿中濃度推移についてモデル非依存的解析を行い、平均血中滞留時間（ＭＲＴ）を算出した。半減期（ｔ１／２）は各個体の測定可能な最終３点のデータを用いて算出した。蛍光標識ＨＡ修飾物の血中濃度推移を図８に示し、ＡＭ導入率とＭＲＴの関係を図９に示す。また、算出した薬物動態学的パラメーターを表６に示す。

図９に示されるアミド基導入率とＭＲＴとの関係から、修飾率が５０％の後半から急激にＭＲＴの増加すなわち血中滞留性の向上が起こることが示唆された。すなわち導入率が５５モル％以上、好ましくは６５モル％以上、さらに好ましくは６９モル％以上の場合、１８時間以上のＭＲＴを有する血中滞留時間の面において好ましいＨＡ修飾物が得られる可能性が高い結果となった。

酵素耐性を獲得したＨＡ誘導体は、ＣＤ４４などＨＡレセプターへの結合能も大きく低下しているため長期間の血中滞留性が得られるものと考えられる。
〔実施例５〕水溶性ＨＡ修飾物−ＧＬＰ−１アナログ１結合体の調製と評価
（実施例５−１）ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＣＨ₂）₁₀−ＭＩ／ＳＵＣの調製
ＢＯＰ試薬をＨＡユニットに対し２．５の当量比とした以外は実施例３−１と同様にして得たＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ（２００ｋＤａ ＨＡ−ＴＢＡ、ＥＤＯＢＥＡ導入率：９５．５％）水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、１７．６６ｍＬ）に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、２２．０７５ｍＬ）を加えた。Ｎ−［κ−マレイミドウンデカノイルオキシ］スルホスクシンイミド エステル（以下、「Ｓｕｌｆｏ−ＫＭＵＳ」とも称す）（ピアス社製）のＤＭＳＯ溶液（０．５７３ｍｇ／ｍＬ、４．４１５ｍＬ）を加え、室温で３０分間振とうした。無水コハク酸ＤＭＳＯ溶液（２８３．９５ｍｇ／ｍＬ、４．４１５ｍＬ）を加えて、更に室温で１．５時間振とうした。４℃で大過剰量の蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、ＭＷＣＯ：１２ｋ−１４ｋＤａ）、得られた溶液を凍結乾燥して、マレイミド基およびコハク酸が導入されたヒアルロン酸修飾物（以下、「ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−ＭＩ／ＳＵＣ」とも称す、１７７．８０ｍｇ）を得た。
（実施例５−２）ヒアルロン酸−ＧＬＰ−１アナログ１結合体溶液の調製
天然型のＧＬＰ−１（Ｈｕｍａｎ、７−３７；特表平７−５０４６７９号公報記載）の２番目（８位）のアラニンをグリシンに、３１番目（３７位）のグリシンをシステインに変更したアナログ（以下、「ＧＬＰ−１アナログ１」とも称す）を固相法ペプチド合成法で得た（(株)ペプチド研究所製）。ＧＬＰ−１アナログ１の０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ）にトリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン塩酸塩（以下、「ＴＣＥＰ」とも称す）（ピアス社製）水溶液（２０ｍＭ）を１／２０容量加えた。このＴＣＥＰを含むＧＬＰ−１アナログ１溶液（１．３２６３ｍＬ）を実施例５−１で得たＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−ＭＩ／ＳＵＣ水溶液（２０ｍｇ／ｍＬ、１．２ｍＬ）に加え、３７℃で２時間静置した。同じＴＣＥＰを含むＧＬＰ−１アナログ１溶液（１．３２６３ｍＬ）を再度添加し、同様に静置した。システイン塩酸塩一水和物の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液（３．６ｍｇ／ｍＬ、０．３８５３ｍＬ）を加え、更に３７℃で１時間静置した。反応混合液を３回に分けて下記の条件でＧＰＣに供して結合体画分を分取した。分取した画分を遠心式限外濾過（Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０、ＭＷＣＯ：５００００、フナコシ株式会社製）で約４．８５ｍＬまで濃縮して、標題のＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ１結合体溶液を得た。ＧＬＰ−１アナログ１を使用せずに本実施例と同様の操作を行なって得られた試料を対照として補正に用い、得られたＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ１溶液の２８０ｎｍにおける吸光度とカルバゾール−硫酸法で、ＧＬＰ−１アナログ１濃度、ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−ＭＩ／ＳＵ濃度およびＧＬＰ−１アナログ１導入率を算出した。ＧＬＰ−１アナログ１が４２．６ｎｍｏｌ／ｍＬ、ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−ＭＩ／ＳＵが３．５４ｍｇ／ｍＬ、ＧＬＰ−１アナログ１が３．７／ＨＡ（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。

ＧＰＣ条件
Ｓｙｓｔｅｍ：ＦＰＬＣ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）
ＧＰＣ Ｃｏｌｕｍｎ：ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｒｅｐ ｇｒｅｄｅ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）
Ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ（２８０ｎｍ）
カルバゾール−硫酸法によるＨＡ修飾物定量方法
［試薬］
硫酸溶液：Ｎａ₂Ｂ₄Ｏ₇・１０Ｈ₂Ｏの硫酸溶液（２５ｍＭ）
カルバゾール溶液：カルバゾールのエタノール溶液（１．２５ｍｇ／ｍＬ：０．１２ ５％）
［標準物質］
Ｎ−［κ−マレイミドウンデカノイルオキシ］スルホスクシンイミド エステルのＤＭＳＯ溶液を加えないこと以外は実施例５−１と同様にして、ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡに無水コハク酸のみが導入されたヒアルロン酸修飾物（ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−ＳＵＣ）を調製し、ＰＢＳに溶解して０．５ｍｇ／ｍＬとした。この０．５ｍｇ／ｍＬのＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−ＳＵＣ溶液から２倍希釈列を調製した（濃度５点：０．０３１２５〜０．５ｍｇ／ｍＬ）。
［定量］
氷冷した硫酸溶液（１ｍＬ）に、ＰＢＳ（対照）および標準物質（各０．２ｍＬ）、ならびに実施例５−２で得られたＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ１結合体溶液をＰＢＳで１９．８倍希釈して得た溶液（０．２ｍＬ）を加え、混合した。熱水浴中で約２５分間加熱した後、流水で室温まで冷却した。それぞれにカルバゾール溶液（４０μＬ）を加えて混合した。再度熱水浴中で約３０分間加熱した後、流水で室温まで冷却した。５３０ｎｍにおける吸光度を測定し、対照および標準物質の吸光度から検量線を作成し，試料溶液に含まれるＨＡ修飾物の濃度を定量した。
（実施例５−３）ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ１結合体の血中滞留時間評価
ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ１結合体投与ラット血漿サンプル
実施例５−２で得られたＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ１結合体溶液をＴｗｅｅｎ ８０を０．０５％含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４；以下、「溶媒Ｚ」とも称す）で希釈し、５０μｇ／ｋｇの用量でラット静脈内に単回投与し、投与後１、４、８、２４、４８、７２、９６、および１６８時間で採血（ヘパリン処理）し、遠心分離により血漿を得た。この血漿サンプルは測定まで−２０℃以下で凍結保存した。

測定方法
ＧＬＰ−１（Ａｃｔｉｖｅ）ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．製；以下、「キットＷ」とも称す）の９６穴プレートに検量線用標準試料および測定用試料を分注し、マイクロプレートリーダーを用いて分析を行った。以下に条件を示す。

マイクロプレートリーダー：ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ ＧＥＭＩＮＩ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＸ：３５５ｎｍ，ＥＭ：４６０ｎｍ）
測定試料の調製
・検量線用試料；
実施例５−２で得られたＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ１結合体溶液を溶媒ＺおよびキットＷに同封されたＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを用いて希釈し、１２．８、６．４、３．２、１．６、０．８、０．４、０．２、０．１μｇ／ｍＬおよび０μｇ／ｍＬの標準液を調製した。この標準液に５μＬの正常ラット血漿を添加し、検量線用試料を調製した。
・測定用試料の調製；
ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ１結合体投与ラット血漿サンプルに、キットＷに同封されたＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを添加して測定用試料を調製した。
・血漿中のＨＡ修飾物濃度の算出；
解析ソフトＳＯＦＴｍａｘ ＰＲＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて各標準試料の蛍光強度から得られた検量線より血漿中のＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ１結合体濃度を算出した。

薬物動態データ
投与したＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ１結合体の血中濃度推移のデータについて、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｖｅｒ ４．０．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）で薬物動態学的パラメーターを算出した。各個体の血漿中濃度推移についてモデル非依存的解析を行い、平均血中滞留時間（ＭＲＴ）を算出した。半減期（ｔ１／２）は各個体の測定可能な最終３点のデータを用いて算出した。ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ１結合体の血中濃度推移を図１０に示す。また、算出した薬物動態学的パラメーターを表７に示す。

天然型のＧＬＰ−１および天然型のＧＬＰ−１の２番目のアラニンをグリシンに変更した変異体を、ヒトおよびブタに静脈内投与したときの半減期が１〜５分間であることが報告されている（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１０巻、第２４７１−２４８３頁、２００３年およびＤｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、第４１巻、第２７１−２７８頁、１９９８年）。図１０および表7から、ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ１結合体をラットに静脈内投与したときの半減期は、２３．６時間、ＭＲＴは３０．２時間となり、天然型のＧＬＰ−１などと比較して大幅に血中滞留性が向上したことが示唆された。
（実施例５−４）経口糖負荷試験
８週齢の雄性ＢＫＳ．Ｃｇ−＋ Ｌｅｐｒ^db／＋ Ｌｅｐｒ^db／Ｊｃｌマウス（日本クレア株式会社）を一晩絶食した後、実施例５−２で得られたＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ１結合体溶液を溶媒Ｚで希釈したもの（ペプチド量として、１．５μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇまたは１５０μｇ／ｋｇ）または溶媒Ｚを静脈内投与し、静脈内投与１分後に５０％グルコース溶液（（株）大塚製薬工場製）を３ｇ／ｋｇになるように経口投与した。同様にＧＬＰ−１（Ｈｕｍａｎ、７−３７；（株）ペプチド研究所製）を溶媒Ｚで希釈したもの（１５０μｇ／ｋｇまたは１５００μｇ／ｋｇ）または溶媒Ｚを静脈内投与し、静脈内投与１分後に５０％グルコース溶液を３ｇ／ｋｇになるように経口投与した。６匹を１群として試験に用いた。

グルコース投与前（０時間の値とする）、グルコース投与０．５、１、２、および４時間後に尾部より血液を採取し、血糖値を酵素法（ヘキソキナーゼ法、試薬名：オートセラＳ ＧＬＵ（第一化学薬品（株）製）；機器名：ＢｉｏＭａｊｅｓｔｙ ＪＣＡ−ＢＭ１２５０（日本電子（株）製））にて測定した。
以下の式より血糖降下率を算出した。

ここで、血糖上昇値のＡＵＣとは、横軸にグルコース投与後の時間、縦軸に各個体の血糖値をプロットし、各点を直線で結んで得られるグラフの曲線下面積から、各個体のグルコース投与前の血糖値がグルコース投与４時間後まで変化無く一定であったとした場合のグラフの曲線下面積を減算したものである。具体的には、Ａ¹＝グルコース投与前の血糖値、Ｂ¹＝グルコース投与３０分後の血糖値、Ｃ¹＝グルコース投与１時間後の血糖値、Ｄ¹＝グルコース投与２時間後の血糖値、Ｅ¹＝グルコース投与４時間後の血糖値としたとき、血糖上昇値のＡＵＣは、以下の式：

から求めることができる。

算出された血糖降下率から、各群ごとに平均値及び標準誤差を算出し、表８および表９に示した。ＨＡ-ＧＬＰ−１アナログ１結合体では、ＧＬＰ−１（Ｈｕｍａｎ、７−３７）と比較して、血糖降下作用が大幅に増大し、糖尿病治療剤としての有用性が示唆された。

〔実施例６〕水溶性ＨＡ修飾物−ＧＬＰ−１アナログ２結合体の調製と評価
（実施例６−１）ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＥＯ）₄−ＭＩ／ＳＵＣの調製
ＢＯＰ試薬をＨＡユニットに対し２．５の当量比とした以外は実施例３−１と同様にして得たＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ（１００ｋＤａ ＨＡ−ＴＢＡ、ＥＤＯＢＥＡ導入率：９７．０％）水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍＬ）３本に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、５．０ｍＬ）および０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、３０ｍＬ）をそれぞれ加えた。Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジル １５−(３−マレイミドプロピオニル)−アミド−４，７，１０，１３−テトラオキサペンタデカノエート（以下、「ＮＨＳ−（ＥＯ）₄−ＭＩ」とも称す）（Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ．製）のＤＭＳＯ溶液（２．２８３ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍＬ）をそれぞれ加え、室温で３０分間振とうした。無水コハク酸ＤＭＳＯ溶液（２８７ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍＬ）をそれぞれ加えて、更に室温で１．５時間振とうした。４℃で大過剰量の蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、ＭＷＣＯ：１２ｋ−１４ｋＤａ）、得られた溶液を凍結乾燥して、マレイミド基およびコハク酸が導入されたヒアルロン酸修飾物（以下、「ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＥＯ）₄−ＭＩ／ＳＵＣ」とも称す、４６．９３，４８．０１，２２．５７ｍｇ）を得た。

それぞれのＨＡ１分子あたりのマレイミド（ＭＩ）導入量（以下、「ＭＩ／ＨＡ」とも称す）を評価したところ７．０、７．８、７．４（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。

ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＥＯ） ₄ −ＭＩ／ＳＵＣにおけるＭＩ／ＨＡ定量法
［分子量の算出］
ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＥＯ）₄−ＭＩ／ＳＵＣのコハク酸導入率をプロトンＮＭＲ法で定量した（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８〜１．９ｐｐｍ、コハク酸：エチレンプロトン、２．４〜２．５５ｐｐｍ）。（ＥＯ）₄−ＭＩ導入率は低率であるため考慮せずＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＥＯ）₄−ＭＩ／ＳＵＣの平均分子量およびユニット当たりの平均分子量を算出した。
[ＭＩの定量]
ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＥＯ）₄−ＭＩ／ＳＵＣ水溶液（２０．０ｍｇ／ｍＬ、５５μＬ）に２Ｍシステインを含む０．２Ｍリン酸、２０ｍＭエチレンジアミン四酢酸緩衝液（ｐＨ７．０、５５μＬ）あるいはシステインを含まない同じ緩衝液を加えた。３７℃で３０分間静置した後、残存するシステインをエルマン試薬で定量した。対照として蒸留水（５５μＬ）に２Ｍシステインを含む０．２Ｍリン酸、２０ｍＭエチレンジアミン四酢酸緩衝液（ｐＨ７．０、５５μＬ）を加えたもの、ＮＨＳ−（ＥＯ）₄−ＭＩのＤＭＳＯ溶液に替えてＤＭＳＯを加えたこと以外は実施例６−１と同様にして得たＨＡ−ＥＤＯＢＥＡにコハク酸のみが導入されたヒアルロン酸修飾物（ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−ＳＵＣ）についても同様に行った。対照で非特異的消費を補正してシステインの消費量をマレイミド量として、ＨＡ濃度との比からＭＩ／ＨＡ（ｍｏｌ／ｍｏｌ）を算出した。
［エルマン試薬を用いたシステイン定量法］
反応溶媒として１ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製した。標準試料溶液としてシステインを反応溶媒に溶解させ、１．２、０．６、０．３、０．１５、０．０７５ｍＭに調整した。エルマン試薬をＤＭＳＯに溶解し（４０ｍｇ／ｍＬ）、これを反応溶媒で１０倍稀釈してエルマン試薬溶液を調製した。反応溶媒（１．０ｍＬ）にエルマン試薬溶液（２０μＬ）を加え、これにブランクとして反応溶媒、標準試料溶液および試料溶液をそれぞれ加え（１００μＬ）加えて混合した後、室温、遮光下に１５分間静置した。４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ブランクおよび標準試料の吸光度から検量線を作成し，試料溶液に含まれるシステイン残存量を定量した。ヒアルロン酸誘導体の４１２ｎｍにおける吸光度はシステインを加えなかった試料溶液の測定値で補正した。
（実施例６−２）ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体溶液の調製
天然型のＧＬＰ−１（Ｈｕｍａｎ、７−３７；特表平７−５０４６７９号公報記載）の２番目（８位）のアラニンをグリシンに、３１番目（３７位）のグリシンＣ末端側にプロリン−プロリン−プロリン−システインを付加し、Ｃ末端をアミド化した変異体（以下、「ＧＬＰ−１アナログ２」とも称す）を固相法ペプチド合成法で得た（（株）ペプチド研究所製）。実施例６−１で得たＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＥＯ）₄−ＭＩ／ＳＵＣ（ＭＩ／ＨＡ＝７．０、７．８、７．４（ｍｏｌ／ｍｏｌ）水溶液（２０ｍｇ／ｍＬ、２．０、２，０、０．８３ｍＬ）をそれぞれ混合し、ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＥＯ）₄−ＭＩ／ＳＵＣ（平均ＭＩ／ＨＡ＝７．４（ｍｏｌ／ｍｏｌ）水溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）とした。このＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＥＯ）₄−ＭＩ／ＳＵＣ水溶液（２０ｍｇ／ｍＬ、４．０２ｍＬ）にＧＬＰ−１アナログ２の０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ、７．０５２ｍＬ）に加え、３７℃で１時間静置した。システイン塩酸塩一水和物の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液（１１．９８ｍｇ／ｍＬ、１．１０７ｍＬ）を加え、更に３７℃で３０分間静置した。反応混合液を３回に分けて下記の条件でＧＰＣに供して結合体画分を分取した。分取した結合体画分を濾過（ＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ、φ＝０．２２μｍ、ミリポア社製）した後、遠心式限外濾過（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−２０、分画分子量：３００００、ミリポア社製）で容量が約１／２０程度になるまで濃縮した。濃縮液をＰＢＳで約２０倍程度に稀釈、再度同様に濃縮、稀釈した。再び濃縮して得られた濃縮液をＰＢＳで約１６ｍＬに調整し、これを濾過（ＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ、φ＝０．２２μｍ、ミリポア社製）して標題のＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体溶液を得た。図１１にＧＰＣのクロマトグラムを示す。ＧＬＰ−１アナログ２を添加した試料について高分子量画分でペプチドに由来すると考えられる２８０ｎｍにおける吸収が強く観察され、ＧＬＰ−１アナログ２がヒアルロン酸修飾物に結合したことが支持された。ＧＬＰ−１アナログを使用せずに本実施例と同様の操作を行なって得られた試料を対照として補正に用い、得られたＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２溶液の２８０ｎｍにおける吸光度とカルバゾール−硫酸法で、ＧＬＰ−１アナログ２濃度、ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＥＯ）₄−ＭＩ／ＳＵＣ濃度およびＧＬＰ−１アナログ２導入率を算出した。ＧＬＰ−１アナログ２が１６１．８ｎｍｏｌ／ｍＬ、ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＥＯ）₄−ＭＩ／ＳＵＣが３．２２ｍｇ／ｍＬ、ＧＬＰ−１アナログ２が７．９／ＨＡ（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。

ＧＰＣ条件
Ｓｙｓｔｅｍ：ＦＰＬＣまたはＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）
ＧＰＣ Ｃｏｌｕｍｎ：ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｒｅｐ ｇｒｅｄｅ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）
Ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ：３０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：２．５ｍＬ／ｍｉｎ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ（２８０ｎｍ）
カルバゾール−硫酸法によるＨＡ修飾物定量方法
［試薬］
硫酸溶液：Ｎａ₂Ｂ₄Ｏ₇・１０Ｈ₂Ｏの硫酸溶液（２５ｍＭ）
カルバゾール溶液：カルバゾールのエタノール溶液（１．２５ｍｇ／ｍＬ）
［標準物質］
ＮＨＳ−（ＥＯ）₄−ＭＩのＤＭＳＯ溶液に替えてＤＭＳＯを加えたこと以外は実施例６−１と同様にして得たＨＡ−ＥＤＯＢＥＡにコハク酸のみが導入されたヒアルロン酸修飾物（ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−ＳＵＣ）をＰＢＳに溶解して０．５ｍｇ／ｍＬとした。この０．５ｍｇ／ｍＬのＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−ＳＵＣ溶液から２倍稀釈列を調製した（濃度５点：０．０３１２５〜０．５ｍｇ／ｍＬ）。
［定量］
氷冷した硫酸溶液（１ｍＬ）に、ＰＢＳ（対照）および標準物質（各０．２ｍＬ）、ならびに実施例６−２で得られたＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体溶液（１５μＬ）をＰＢＳで２０倍希釈して得た溶液（０．２ｍＬ）を加え、混合した。熱水浴中で約２５分間加熱した後、流水で室温まで冷却した。それぞれにカルバゾール溶液（４０μＬ）を加えて混合した。再度熱水浴中で約３０分間加熱した後、流水で室温まで冷却した。５３０ｎｍにおける吸光度を測定し、対照および標準物質の吸光度から検量線を作成し，試料溶液に含まれるＨＡ修飾物の濃度を定量した。

ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体におけるＧＬＰ−１アナログ２濃度およびＧＬＰ−１アナログ２導入率決定方法
ＧＬＰ−１アナログを使用せずに本実施例と同様の操作を行なって得られた試料および得られたＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２溶液（５０μＬ）をＰＢＳで２倍稀釈した溶液の２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。カルバゾール−硫酸法で定量したＧＬＰ−１アナログを使用せずに本実施例と同様の操作を行なって得られた試料のＨＡ修飾物濃度と２８０ｎｍにおける吸光度から比例定数を算出し、ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体溶液のＨＡ修飾物濃度から結合体溶液の２８０ｎｍにおける吸収のＨＡ寄与分を算出した。差分をＧＬＰ−１アナログ２の吸収としてモル吸光係数からＧＬＰ−１アナログ２濃度を算出した。ＧＬＰ−１アナログ２濃度とＨＡ修飾物濃度の比からＧＬＰ−１アナログ２導入率（ｍｏｌ／ｍｏｌ）を算出した。
（実施例６−３）ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体のｃＡＭＰ産生能評価
ヒトＧＬＰ−１受容体の公開されているＤＮＡ配列情報［Ｇｒａｚｉａｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９３．１９６：１４１−１４６（１９９３）］に基づき、発現ベクターを構築した。ヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３細胞を該ベクターで形質転換し、ヒトＧＬＰ−１受容体を発現する組換えＨＥＫ２９３細胞を得た。

ヒトＧＬＰ−１受容体発現細胞は、９６ｗｅｌｌプレートで３日間培養し、アッセイに供した。培養液を反応液（０．５ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン、３．７ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ₃を含むＤＭＥＭ）に置換し、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ８０を含むＤＭＥＭで希釈したＧＬＰ−１または実施例６−２で得られたＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体を添加して、３７℃、ＣＯ₂インキュベータ中で３０分間インキュベーションした後、細胞溶解用緩衝液を添加して反応を停止した。

ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体とＧＬＰ−１受容体との反応により細胞内に生成されるサイクリックＡＭＰは、ｃＡＭＰ−Ｓｃｒｅｅｎ^TM（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）による化学発光ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）法により、ＡＲＶＯ ＨＴＳ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｗａｌｌａｃ）社製）を用いて測定した。標準サイクリックＡＭＰ試料の発光強度から得られた検量線より、解析ソフトＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０２（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．製）を用いて細胞溶解液中のサイクリックＡＭＰを算出し、細胞ｗｅｌｌあたりのサイクリックＡＭＰ量に換算した。ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体と細胞ｗｅｌｌあたりのサイクリックＡＭＰ量の濃度−反応曲線から、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０２を用いて結合体のＥＣ５０値を算出した。なお、結合体のＥＣ５０値はＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体におけるＧＬＰ−１アナログ２濃度に基づいて算出した。表１０に、ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体のサイクリックＡＭＰ産生能を、天然型ＧＬＰ−１（Ｈｕｍａｎ、７−３７）のＥＣ５０値を１とした時の相対値で示した。

ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体のＥＣ５０値は、巨大分子であるＨＡによる立体障害などのために天然型ＧＬＰ−１に比して高い値であったが、ＧＬＰ−１のもつｃＡＭＰ産生能を保持していることが確認された。
（実施例６−４）ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体の血中滞留時間評価
ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体投与ラット血漿サンプル
実施例６−２で得られたＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体溶液をＴｗｅｅｎ ８０ ０．０５％含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（以下、「溶媒Ｚ」とも称す）で希釈し、５０μｇ／ｋｇの用量でラット静脈内に単回投与し、投与後１、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８時間に採血（ヘパリン処理）し、遠心分離により血漿を得た。この血漿サンプルは測定まで−２０℃以下で凍結保存した。

測定方法
ＧＬＰ−１（Ａｃｔｉｖｅ）ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．製）（以下、「キットＷ」とも称す）の９６穴プレートに検量線用標準試料および測定用試料を分注しマイクロプレートリーダーを用いて分析を行った。以下に条件を示す。

マイクロプレートリーダー：ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ ＧＥＭＩＮＩ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＸ：３５５ｎｍ，ＥＭ：４６０ｎｍ）
測定試料の調製
・検量線用試料；
実施例６−２で得られたＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体溶液を溶媒ＺおよびキットＷに同封されたＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを用いて希釈し、３．２、１．６、０．８、０．４、０．２、０．１、０．０５μｇ／ｍＬおよび０μｇ／ｍＬの標準液を調製した。この標準液に５μＬの正常ラット血漿を添加し、検量線用試料を調製した。
・測定用試料の調製；
ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体投与ラット血漿サンプルに、キットＷに同封されたＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを添加して測定用試料を調製した。
・血漿中のＨＡ修飾物濃度の算出；
解析ソフトＳＯＦＴｍａｘ ＰＲＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて各標準試料の蛍光強度から得られた検量線より血漿中のＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体濃度を算出した。

薬物動態データ
投与したＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体の血中濃度推移のデータについて、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｖｅｒ ４．０．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）で薬物動態学的パラメーターを算出した。各個体の血漿中濃度推移についてモデル非依存的解析を行い、平均血中滞留時間（ＭＲＴ）を算出した。半減期（ｔ１／２）は各個体の測定可能な最終３点のデータを用いて算出した。ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体の血中濃度推移を図１２に示す。また、算出した薬物動態学的パラメーターを表１１に示す。

天然型のＧＬＰ−１および天然型のＧＬＰ−１の２番目のアラニンをグリシンに変更した変異体を、ヒトおよびブタに静脈内投与したときの半減期が１〜５分間であることが報告されている（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１０巻、第２４７１−２４８３頁、２００３年およびＤｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、第４１巻、第２７１−２７８頁、１９９８年）。図１２および表１１から、ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体をラットに静脈内投与したときの半減期は、２１．３時間、ＭＲＴは３２．６時間となり、天然型のＧＬＰ−１などと比較して大幅に血中滞留性が向上したことが示唆された。
（実施例６−５）経口糖負荷試験
８週齢の雄性ＢＫＳ．Ｃｇ−＋ Ｌｅｐｒ^db／＋ Ｌｅｐｒ^db／Ｊｃｌマウス（日本クレア株式会社）を一晩から２４時間絶食した後、実施例６−２で得られたＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体溶液を溶媒Ｚで希釈したもの（ペプチド量として、３００μｇ／ｋｇ）または溶媒Ｚを皮下投与し、皮下投与６、２４または４８時間後に５０％グルコース溶液（（株）大塚製薬工場製）を３ｇ／ｋｇになるように経口投与した。同様に天然型のＧＬＰ−１（Ｈｕｍａｎ、７−３７；特表平７−５０４６７９号公報記載）の２番目（８位）のアラニンをグリシンにした変異体（以下、「ＧＬＰ−１アナログ０」とも称す）（（株）ペプチド研究所製）を溶媒Ｚで希釈したもの（３０００μｇ／ｋｇ）または溶媒Ｚを皮下投与し、皮下投与２分後または４時間２分後（溶媒Ｚは皮下投与１または５時間後）に５０％グルコース溶液を３ｇ／ｋｇになるように経口投与した。６匹を１群として試験に用いた。

グルコース投与前（０時間の値とする）、グルコース投与０．５、１、および２時間後に尾部より血液を採取し、血糖値を酵素法（ヘキソキナーゼ法、試薬名：オートセラＳ ＧＬＵ（第一化学薬品（株）製）；機器名：ＢｉｏＭａｊｅｓｔｙ ＪＣＡ−ＢＭ１２５０（日本電子（株）製））にて測定した。

実施例５−４に記載の式より血糖降下率を算出した。

ここで、血糖上昇値のＡＵＣとは、横軸にグルコース投与後の時間、縦軸に各個体の血糖値をプロットし、各点を直線で結んで得られるグラフの曲線下面積から、各個体のグルコース投与前の血糖値がグルコース投与２時間後まで変化無く一定であったとした場合のグラフの曲線下面積を減算したものである。具体的には、Ａ¹＝グルコース投与前の血糖値、Ｂ¹＝グルコース投与３０分後の血糖値、Ｃ¹＝グルコース投与１時間後の血糖値、Ｄ¹＝グルコース投与２時間後の血糖値としたとき、血糖上昇値のＡＵＣは、以下の式：

から求めることができる。

算出された血糖降下率から、各群ごとに平均値及び標準誤差を算出し、表１２および表１３に示した。ＨＡ-ＧＬＰ−１アナログ２結合体では、ＧＬＰ−１アナログ０と比較して、血糖降下作用が大幅に持続し、糖尿病治療剤としての有用性が示唆された。

〔実施例７〕水溶性ＨＡ修飾物−ＧＬＰ−１アナログ１およびＧＬＰ−１アナログ２結合体の調製と評価
異なるＨＡ分子量、異なる水溶性ＨＡ修飾物とマレイミド間のリンカーおよび異なるＧＬＰ−１アナログからなる水溶性ＨＡ修飾物−ＧＬＰ−１アナログ結合体を調製した。
（実施例７−１） ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＣＨ₂）₁₀−ＭＩ／ＳＵＣの調製
ＢＯＰ試薬をＨＡユニットに対し２．５の当量比とした以外は実施例３−１と同様にして得たＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ（２００ｋＤａ ＨＡ−ＴＢＡ、ＥＤＯＢＥＡ導入率：９８．５％）水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、９．０ｍＬ）に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、１１．２５ｍＬ）を加えた。Ｎ−［κ−マレイミドウンデカノイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル（以下、「Ｓｕｌｆｏ−ＫＭＵＳ」とも称す）（ピアス社製）のＤＭＳＯ溶液（０．５６７ｍｇ／ｍＬ、２．２５ｍＬ）を加え、室温で３０分間振とうした。無水コハク酸ＤＭＳＯ溶液（２９０ｍｇ／ｍＬ、２．２５ｍＬ）をそれぞれ加えて、更に室温で１．５時間振とうした。４℃で大過剰量の蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、ＭＷＣＯ：１２ｋ−１４ｋＤａ）、得られた溶液を凍結乾燥して、ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＣＨ₂）₁₀−ＭＩ／ＳＵＣ（９４．８１ｍｇ）を得た。

ＭＩ／ＨＡを実施例６−１記載の方法で評価したところ５．０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。
（実施例７−２） ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＣＨ₂）₁₀−ＭＩ／ＳＵＣおよびＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＥＯ）₄−ＭＩ／ＳＵＣの調製
ＢＯＰ試薬をＨＡユニットに対し２．５の当量比とした以外は実施例３−１と同様にして得たＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ（１００ｋＤａ ＨＡ−ＴＢＡ、ＥＤＯＢＥＡ導入率：９５．５％）水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、３．５、４．０ｍＬ）に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、４．３７５、５．０ｍＬ）および０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、８．７５、１０．０ｍＬ）をそれぞれ加えた。Ｓｕｌｆｏ−ＫＭＵＳ（ピアス社製）のＤＭＳＯ溶液（０．８５８ｍｇ／ｍＬ、０．８７５ｍＬ）あるいはＮＨＳ−（ＥＯ）₄−ＭＩ（Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ．製）のＤＭＳＯ溶液（１．５２８ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍＬ）をそれぞれ加え、室温で３０分間振とうした。無水コハク酸ＤＭＳＯ溶液（２８３ｍｇ／ｍＬ、０．８７５，１．０ｍＬ）をそれぞれ加えて、更に室温で１．５時間振とうした。４℃で大過剰量の蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、ＭＷＣＯ：１２ｋ−１４ｋＤａ）、得られた溶液を凍結乾燥して、ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＣＨ₂）₁₀−ＭＩ／ＳＵＣ、ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＥＯ）₄−ＭＩ／ＳＵＣ（３７．８７、４２．４２ｍｇ）を得た。

それぞれのＭＩ／ＨＡを実施例６−１記載の方法で評価したところ４．７、４．７（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。
（実施例７−３） ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２およびＧＬＰ−１アナログ１結合体溶液の調製
実施例７−１で得たＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＣＨ₂）₁₀−ＭＩ／ＳＵＣ（ＭＩ／ＨＡ＝５．０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））水溶液（２０ｍｇ／ｍＬ、０．１５ｍＬ）にＧＬＰ−１アナログ２の０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ、０．８９５ｍＬ）を加えた。実施例７−２で得たＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＣＨ₂）₁₀−ＭＩ／ＳＵＣ（ＭＩ／ＨＡ＝４．７（ｍｏｌ／ｍｏｌ））水溶液（２０ｍｇ／ｍＬ、０．１５、０．１５ｍＬ）にＧＬＰ−１アナログ２あるいはＧＬＰ−１アナログ１の０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ、０．１５２７、０．１６８４ｍＬ）をそれぞれ加えた。また、実施例７−２で得たＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＥＯ）₄−ＭＩ／ＳＵＣ（ＭＩ／ＨＡ＝４．７（ｍｏｌ／ｍｏｌ））水溶液（２０ｍｇ／ｍＬ、０．１５ｍＬ）にＧＬＰ−１アナログ１の０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ、０．１５３９ｍＬ）を加えた。それぞれ３７℃で１時間静置した。システイン塩酸塩一水和物の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液（１１．２２（実施例７−１記載ＨＡ修飾物使用例）、２１．２８（実施例７−２記載ＨＡ修飾物使用例）ｍｇ／ｍＬ、それぞれ０．０１５ｍＬ）を加え、更に３７℃で３０分間静置した。反応混合液を下記の条件でＧＰＣに供して結合体画分を分取した。分取した画分を遠心式限外濾過（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−２０、分画分子量：３００００、ミリポア社製）で容量が約１／２０程度になるまで濃縮した。濃縮液をＰＢＳで約２０倍程度に稀釈、再度同様に濃縮、稀釈した。再び濃縮して得られた濃縮液をＰＢＳで約１．２（実施例７−１記載ＨＡ修飾物使用例）、０．６（実施例７−１記載ＨＡ修飾物使用例）ｍＬに調整し、標題のＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体およびＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ１結合体の溶液を得た（試料番号７−３−１〜７−３−４）。試料溶液の稀釈率を適宜変更した以外は実施例６−２記載の方法と同様に定量した結果を表１４にまとめた。

ＧＰＣ条件
Ｓｙｓｔｅｍ：ＦＰＬＣまたはＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）
ＧＰＣ Ｃｏｌｕｍｎ：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）
Ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ：３０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ（２８０ｎｍ）

（実施例７−４）ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体のｃＡＭＰ産生能評価
実施例７−３で得られた各種ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体のｃＡＭＰ産生能は、実施例６−３と同様に測定した。

表１５に、各種ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体のサイクリックＡＭＰ産生能を、天然型ＧＬＰ−１のＥＣ５０値を１とした時の相対値で示した。

ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体は、分子量２００ｋＤａのＨＡを用いた場合、および水溶性ＨＡ修飾物とマレイミド基の間の連結基に疎水性の（ＣＨ₂）₁₀を用いた場合にも、ＧＬＰ−１のもつｃＡＭＰ産生能は維持されることが確認された。
（実施例７−５）ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体の血中滞留時間評価
実施例７−３で得られたＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体溶液を溶媒Ｚで希釈し、５０μｇ／ｋｇの用量でラット静脈内に単回投与し、投与後１、４、８、２４、４８、７２、１２０、１６８時間に採血（ヘパリン処理）し、遠心分離により血漿を得た。この血漿サンプルは測定まで−２０℃以下で凍結保存した。

測定方法
ＧＬＰ−１（Ａｃｔｉｖｅ）ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．製）（以下、「キットＷ」とも称す）の９６穴プレートに検量線用標準試料および測定用試料を分注しマイクロプレートリーダーを用いて分析を行った。以下に条件を示す。

マイクロプレートリーダー：ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ ＧＥＭＩＮＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＸ：３５５ｎｍ，ＥＭ：４６０ｎｍ）
測定試料の調製
・検量線用試料；
実施例７−３で得られたＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体溶液を溶媒ＺおよびキットＷに同封されたＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを用いて希釈し、３．２、１．６、０．８、０．４、０．２、０．１、０．０５μｇ／ｍＬおよび０μｇ／ｍＬの標準液を調製した。この標準液に５μＬの正常ラット血漿を添加し、検量線用試料を調製した。
・測定用試料の調製；
ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体投与ラット血漿サンプルに、キットＷに同封されたＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを添加して測定用試料を調製した。
・血漿中のＨＡ修飾物濃度の算出；
解析ソフトＳＯＦＴｍａｘ ＰＲＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて各標準試料の蛍光強度から得られた検量線より血漿中のＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体濃度を算出した。

薬物動態データ
投与したＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体の血中濃度推移のデータについて、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｖｅｒ ４．０．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）で薬物動態学的パラメーターを算出した。各個体の血漿中濃度推移についてモデル非依存的解析を行い、平均血中滞留時間（ＭＲＴ）を算出した。半減期（ｔ１／２）は各個体の測定可能な最終３点のデータを用いて算出した。ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体の血中濃度推移を図１３に示す。また、算出した薬物動態学的パラメーターを表１６に示す。

いずれのペプチドおよびリンカーを用いてもＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体とすることによって、半減期が１８〜２６時間、平均血中滞留時間が２５．３〜４１．２時間と滞留性が非常に向上することが明らかとなった。

ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体は合目的的にＨＡの分子量や連結基構造を選択すること可能であることが示された。
〔実施例８〕水溶性ＨＡ修飾物−ＧＬＰ−１アナログ結合体の調製と評価
ＧＬＰ−１アナログ導入率の異なる水溶性ＨＡ修飾物−ＧＬＰ−１アナログ結合体を調製した。
（実施例８−１） ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＥＯ）₄−ＭＩ／ＳＵＣの調製
ＢＯＰ試薬をＨＡユニットに対し２．５の当量比とした以外は実施例３−１と同様にして得たＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ（１００ｋＤａ ＨＡ−ＴＢＡ、ＥＤＯＢＥＡ導入率：１００％）水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、５．０、９．０ｍＬ）に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、６．２５、１１．２５ｍＬ）をそれぞれ加えた。ＮＨＳ−（ＥＯ）₄−ＭＩ（Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ．製）のＤＭＳＯ溶液（０．３７７、１．５１０ｍｇ／ｍＬ、１．２５、２．２５ｍＬ）をそれぞれ加えた。また、同じＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ（１００ｋＤａ ＨＡ−ＴＢＡ、ＥＤＯＢＥＡ導入率：１００％）水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、５．０ｍＬ）３本に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、６．２５ｍＬ）および０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、３７．５ｍＬ）をそれぞれ加えた。ＮＨＳ−（ＥＯ）₄−ＭＩ（Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ．製）のＤＭＳＯ溶液（２．１１４、２．７１７、３．３２１ｍｇ／ｍＬ、１．２５ｍＬ）をそれぞれ加えた。室温で３０分間振とうした。無水コハク酸ＤＭＳＯ溶液（２９３ｍｇ／ｍＬ、ＮＨＳ−（ＥＯ）₄−ＭＩのＤＭＳＯ溶液と等量）をそれぞれ加えて、更に室温で１．５時間振とうした。４℃で大過剰量の蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、ＭＷＣＯ：１２ｋ−１４ｋＤａ）、得られた溶液を凍結乾燥して、マレイミド基およびコハク酸が導入されたＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＥＯ）₄−ＭＩ／ＳＵＣ（５７．７８、９９．２４、６１．３３、６０．９２、５９．０２ｍｇ）を得た。

それぞれのＭＩ／ＨＡを実施例６−１に記載の方法で評価したところ１．２、４．７、６．０、７．３、９．３（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。

マレイミド導入量（マレイミド／ＨＡ（ｍｏｌ／ｍｏｌ））は添加するＮＨＳ−（ＥＯ）₄−ＭＩ添加量で制御することが可能であった。
（実施例８−２）ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体溶液の調製
実施例８−１で得たそれぞれのＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＥＯ）₄−ＭＩ／ＳＵＣ水溶液（２０ｍｇ／ｍＬ、０．１５ｍＬ）にＧＬＰ−１アナログ２の０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液をＭＩとＧＬＰ−１アナログ２が等モルとなるように（２．０ｍｇ／ｍＬ、０．０４３２、０．１６７７、０．２１２８、０．２５８８、０．３３１９ｍＬ）それぞれ加え、３７℃で１時間静置した。システイン塩酸塩一水和物の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液（４．２１、９．９３、１１．０３、１１．９０、１２．９５ｍｇ／ｍＬ、０．０１９３、０．０３１８、０．０３６３、０．０４０９、０．０４８２ｍＬ）をそれぞれ加え、更に３７℃で３０分間静置した。反応混合液を実施例７−３記載の条件でＧＰＣに供して結合体画分を分取した。分取した画分を濾過（ＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ、φ＝０．２２μｍ、ミリポア社製）した後、遠心式限外濾過（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−２０、分画分子量：３００００、ミリポア社製）で容量が約１／２０程度になるまで濃縮した。濃縮液をＰＢＳで約２０倍程度に稀釈、再度同様に濃縮、稀釈した。再び濃縮して得られた濃縮液をＰＢＳで約０．４８，０．４５、０．４８、０．６０、０．６０ｍＬに調整し、これを濾過（ＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ、φ＝０．２２μｍ、ミリポア社製）して標題のＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体溶液を得た（試料番号８−２−１〜８−２−５）。試料溶液の稀釈率を適宜変更した以外は実施例６−２記載の方法と同様に定量した。結果を表１７にまとめた。

ＧＬＰ−１アナログはマレイミドと等量添加することで、その導入量はマレイミド量に近い値として定量され、ほぼ定量的に結合体化されるものと考えられた。

マレイミド導入量、ＧＬＰ−１アナログ導入量が制御可能であることは、再現性高く結合体を調製し得ることを示すものである。
（実施例８−３）ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体のｃＡＭＰ産生能評価
実施例８−２で得られた各種ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体のｃＡＭＰ産生能は、実施例６−３と同様に測定した。

表１８に、各種ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体のサイクリックＡＭＰ産生能を、天然型ＧＬＰ−１のＥＣ５０値を１とした時の相対値で示した。なお、結合体のＥＣ５０値はＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体におけるＧＬＰ−１アナログ２濃度に基づいて算出した。

ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体は、ＧＬＰ−１アナログ導入率を変化させてもＧＬＰ−１のもつｃＡＭＰ産生能を保持することが確認された。

ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体をＧＬＰ−１アナログ持続性糖尿病および高血糖症に起因する糖尿病性合併症、肥満症の予防または治療薬として使用する上では、投与するＧＬＰ−１量と投与方法から規定される投与容量において、ＨＡに起因する粘度の上昇が許容される範囲でＧＬＰ−１アナログ導入率を選択することができる。
〔実施例９〕水溶性ＨＡ修飾物−ＧＬＰ−１アナログ結合体の調製と評価
異なるＧＬＰ−１アナログでＧＬＰ−１アナログ導入率の異なる水溶性ＨＡ修飾物−ＧＬＰ−１アナログ結合体を調製した。
（実施例９−１）ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体溶液の調製
実施例７−１で得たＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＣＨ₂）₁₀−ＭＩ／ＳＵＣ（ＭＩ／ＨＡ＝５．０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））水溶液（２０ｍｇ／ｍＬ、０．１５ｍＬ）にＧＬＰ−１アナログ１あるいは２の０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液をＧＬＰ−１アナログ／ＨＡが１．０、２．０、４．０、５．０、６．０、７．５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）となるように（ＧＬＰ−１アナログ１：２．０ｍｇ／ｍＬ、０．０１６２、０．０３２５、０．０６４９、０．０８１２、０．０９７４、０．１２１７ｍＬ、ＧＬＰ−１アナログ２： ２．０ｍｇ／ｍＬ、０．０１７９、０．０３５８、０．０７１６、０．０８９５、０．１０７４、０．１３４３ｍＬ、）それぞれ加え、３７℃で１時間静置した。システイン塩酸塩一水和物の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液（１１．２２ｍｇ／ｍＬ、０．０１５０ｍＬ）をそれぞれ加え、更に３７℃で３０分間静置した。反応混合液を実施例７−３記載の条件でＧＰＣに供して結合体画分を分取した。分取した画分を濾過（ＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ、φ＝０．２２μｍ、ミリポア社製）した後、遠心式限外濾過（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−２０、分画分子量：３００００、ミリポア社製）で容量が約１／２０程度になるまで濃縮した。濃縮液をＰＢＳで約２０倍程度に稀釈、再度同様に濃縮、稀釈した。再び濃縮して得られた濃縮液をＰＢＳで約０．４８，０．４５、０．４８、０．６０、０．６０ｍＬに調整し、これを濾過（ＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ、φ＝０．２２μｍ、ミリポア社製）して標題のＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ１およびＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ２結合体溶液を得た。試料溶液の稀釈率を適宜変更した以外は実施例６−２記載の方法と同様に定量した。

結果を表１９にまとめた。

マレイミド導入量（ＭＩ／ＨＡ（ｍｏｌ／ｍｏｌ））を一定とした時、ＧＬＰ−１アナログ導入率はＧＬＰ−１アナログ添加量で制御できることが示された。一方、ＧＬＰ−１アナログ添加量をマレイミドの1から１．５等量に増大してもＧＬＰ−１導入率はほぼ不変であったことから、結合体化はマレイミドとＧＬＰ−１アナログのチオールとの特異的な反応で形成されていることが支持された。
（実施例９−２） ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体のｃＡＭＰ産生能評価
実施例９−１で得られた各種ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体のｃＡＭＰ産生能は、実施例６−３と同様に測定した。

表２０に、各種ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体のサイクリックＡＭＰ産生能を、天然型ＧＬＰ−１のＥＣ５０値を１とした時の相対値で示した。

ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体は、マレイミドに対するＧＬＰ−１アナログ導入率を変化させてもＧＬＰ−１のもつｃＡＭＰ産生能を保持することが確認された。
〔実施例１０〕水溶性ＨＡ修飾物−ＧＬＰ−１アナログ１およびＧＬＰ−１アナログ３結合体の調製と評価
ＧＬＰ−１アナログのＣ末端が異なる水溶性ＨＡ修飾物−ＧＬＰ−１アナログ結合体を調製した。
（実施例１０−１） ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＥＯ）₄−ＭＩ／ＳＵＣの調製
ＢＯＰ試薬をＨＡユニットに対し２．５の当量比とした以外は実施例３−１と同様にして得たＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ（１００ｋＤａ ＨＡ−ＴＢＡ、ＥＤＯＢＥＡ導入率：９７．０％）水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、５．０ｍＬ）に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、６．２５ｍＬ）および０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、３７．５ｍＬ）をそれぞれ加えた。ＮＨＳ−（ＥＯ）₄−ＭＩ（Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ．製）のＤＭＳＯ溶液（１．８２６ｍｇ／ｍＬ、１．２５ｍＬ）を加え、室温で３０分間振とうした。無水コハク酸ＤＭＳＯ溶液（２８７ｍｇ／ｍＬ、１．２５ｍＬ）を加えて、更に室温で１．５時間振とうした。４℃で大過剰量の蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、ＭＷＣＯ：１２ｋ−１４ｋＤａ）、得られた溶液を凍結乾燥して、ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＥＯ）₄−ＭＩ／ＳＵＣ（５４．０ｍｇ）を得た。

ＭＩ／ＨＡを実施例６−１記載の方法で評価したところ７．７（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。
（実施例１０−２） ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ３およびＧＬＰ−１アナログ１結合体溶液の調製
天然型のＧＬＰ−１（Ｈｕｍａｎ、７−３７；特表平７−５０４６７９号公報記載）の２番目（８位）のアラニンをグリシンに、３１番目（３７位）のグリシンをシステインに変更し、Ｃ末端をアミド化した変異体（以下、「ＧＬＰ−１アナログ３」とも称す）を固相法ペプチド合成法で得た（（株）ペプチド研究所製）。実施例１０−１で得たＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−（ＥＯ）₄−ＭＩ／ＳＵＣ（ＭＩ／ＨＡ＝７．７（ｍｏｌ／ｍｏｌ））水溶液（２０ｍｇ／ｍＬ、０．１５ｍＬ）にＧＬＰ−１アナログ３あるいはＧＬＰ−１アナログ３の０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ、０．２５０ｍＬ）を加えた。それぞれ３７℃で１時間静置した。システイン塩酸塩一水和物の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液（１２．９６ｍｇ／ｍＬ、それぞれ０．０４０ｍＬ）を加え、更に３７℃で３０分間静置した。反応混合液を下記の条件でＧＰＣに供して結合体画分を分取した。分取した結合体画分を濾過（ＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ、φ＝０．２２μｍ、ミリポア社製）した後、遠心式限外濾過（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−２０、分画分子量：３００００、ミリポア社製）で容量が約１／２０程度になるまで濃縮した。濃縮液をＰＢＳで約２０倍程度に稀釈、再度同様に濃縮、稀釈した。再び濃縮して得られた濃縮液をＰＢＳで約０．６ｍＬに調整し、これを濾過（ＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ、φ＝０．２２μｍ、ミリポア社製）して標題のＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ１およびアナログ３結合体溶液を得た（試料番号１０−２−１〜１０−２−２）。試料溶液の稀釈率を適宜変更した以外は実施例６−２記載の方法と同様に定量した結果を表２１にまとめた。

ＧＰＣ条件
Ｓｙｓｔｅｍ：ＦＰＬＣ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）
ＧＰＣ Ｃｏｌｕｍｎ：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）
Ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ：３０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ（２８０ｎｍ）

（実施例１０−３）ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体のｃＡＭＰ産生能
実施例１０−２で得られたＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ３およびＧＬＰ−１アナログ１結合体のｃＡＭＰ産生能は、実施例６−３と同様に測定した。

表２２に、ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ３およびＧＬＰ−１アナログ１結合体のｃＡＭＰ産生能を、天然型ＧＬＰ−１のＥＣ５０値を１とした時の相対値で示した。

ＨＡ−ＧＬＰ−１アナログ結合体は、ＧＬＰ−１アナログのＣ末端カルボキシ基がアミド化されていてもＧＬＰ−１のもつｃＡＭＰ産生能を保持することが確認された。

Claims (34)

1. 水溶性のヒアルロン酸修飾物に１以上のグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）アナログが結合した、ヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩。
2. 前記ＧＬＰ−１アナログが２価の連結基を介して前記ヒアルロン酸修飾物に結合する、請求項１に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩。
3. 水溶性のヒアルロン酸修飾物において、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分に含まれるカルボキシ基の７０％以上がＮ−置換アミド基に変換されており、ここで当該ヒアルロン酸修飾物中の各Ｎ−置換アミド基の置換基は同一であっても異なってもよく、当該置換基の少なくとも１つが前記ＧＬＰ−１アナログと連結する２価の連結基である、請求項１または２に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩。
4. 糖尿病、高血糖症、糖尿病性合併症、および肥満症から選択される疾患の予防または治療に使用される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩。
5. ＧＬＰ−１アナログが、ＧＬＰ−１（１−３６）またはＧＬＰ−１（７−３６）のＣ末端側に−Ｘａ−Ｃｙｓで表されるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであり（前記アミノ酸配列は、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸により置換および／または付加されてもよい）、ここでＸａは直接結合またはプロリン、グリシン、セリンおよびグルタミン酸から独立に選択される１〜９のアミノ酸からなる配列であり、当該ペプチドのＣ末端のシステインのカルボキシ基はアミド基に変換されていてもよい、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩。
6. ＧＬＰ−１アナログが、ＧＬＰ−１（１−３６）またはＧＬＰ−１（７−３６）のＣ末端に−Ｘａ−Ｃｙｓで表されるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列の８位のアラニン（Ａｌａ⁸）が天然または非天然アミノ酸に置換されている配列からなるペプチドであり、当該ペプチドのＣ末端のシステインのカルボキシ基がアミド基に変換されていてもよい、請求項５に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩。
7. ＧＬＰ−１アナログが、ＧＬＰ−１（１−３６）またはＧＬＰ−１（７−３６）のＣ末端に−Ｘａ−Ｃｙｓで表されるアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列の８位のアラニン（Ａｌａ⁸）が、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびスレオニンから選択されるアミノ酸に置換されている配列からなるペプチドであり、当該ペプチドのＣ末端のシステインのカルボキシ基がアミド基に変換されていてもよい、請求項５に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩。
8. ＧＬＰ−１アナログが、
   Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｘａ−Ｃｙｓ（配列番号１）
   で表されるペプチド、または当該ペプチドのＣ末端のシステインのカルボキシ基がアミド基に変換されたペプチドである、請求項５に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩
9. Ｘａが、直接結合または−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−である請求項５〜８のいずれか１項に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩。
10. ＧＬＰ−１アナログが、ＧＬＰ−１（１−３６）、ＧＬＰ−１（１−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１（７−３７)に、−Ｑａ−ＳＨで表されるチオール化合物を付加したアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであり（前記アミノ酸配列は、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸により置換および／または付加されてもよい）、
    ここでＱａは−ＮＨ−Ｘ⁵−、−ＣＯ−Ｘ⁵−または−ＣＯＮＨ−Ｘ⁵−から選択され、ペプチドのＣ末端アミノ酸に含まれるカルボキシ基、アミノ基または水酸基と連結してアミド結合、ウレア結合またはエステル結合を形成し、
    Ｘ⁵はＣ_1-50アルキレン基であり、ここで当該アルキレン基の１以上の個所において当該アルキレン基に含まれる２つの炭素原子の間に酸素原子が挿入されていてもよく、当該アルキレン基の炭素原子は、水酸基およびＣ_1-6アルキル基から選択される１以上の置換基により独立に置換されていてもよい、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩。
11. ２価の連結基の一端がＧＬＰ−１アナログに導入されたメルカプト基において結合する請求項５〜１０のいずれか１項に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩。
12. ２価の連結基が式（Ｉ）：
    

    

    ［式中、ＱはＣ_1-400アルキレン基であり、ここで当該アルキレン基の１以上の個所において当該アルキレン基に含まれる２つの炭素原子の間に酸素原子が挿入されていてもよく、さらに当該アルキレン基の１以上の個所において当該アルキレン基に含まれる炭素原子の間あるいは末端に−ＣＯ−、−ＮＨＣＯ−または−ＣＯＮＨ−が挿入されていてもよく、当該アルキレン基の炭素原子は、水酸基およびＣ_1-6アルキル基から選択される１以上の置換基により独立に置換されていてもよく；
    Ｘは、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−^**、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−^**、もしくは−ＣＨ（−ＣＨ₃）−ＣＨ₂−^**であり、Ｒは水素原子またはＣ_1-6アルキル基であり；または
    ＸおよびＲは結合する炭素原子および窒素原子と一緒になって、式（ＩＩ）：
    

    

    で表される基を形成し；
    ^*はヒアルロン酸修飾物中のアミド基の窒素原子への結合位置を表し、^**はＧＬＰ−１アナログのメルカプト基の硫黄原子への結合位置を表す］
    で表される、請求項１１に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩。
13. ２価の連結基が式（Ｉａ）：
    

    

    ［式中、Ｑ¹はＣ_1-10アルキレン基であり、ここで当該アルキレン基の１以上の個所において当該アルキレン基に含まれる２つの炭素原子の間に酸素原子が挿入されていてもよく、当該アルキレン基の炭素原子は、水酸基およびＣ_1-6アルキル基から選択される１以上の置換基により独立に置換されていてもよく；
    Ｘ¹は、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−^**、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−^**、もしくは−ＣＨ（−ＣＨ₃）−ＣＨ₂−^**であり、Ｒ¹は水素原子またはＣ_1-6アルキル基であり；または
    Ｘ¹およびＲ¹は結合する炭素原子および窒素原子と一緒になって、式（ＩＩａ）：
    

    

    で示される基を形成し；または
    Ｘ¹は、式（Ｉｂ）：
    

    

    （式中、Ｑ²はＣ_1-10アルキレン基であり、ここで当該アルキレン基の１以上の個所において当該アルキレン基に含まれる２つの炭素原子の間には酸素原子が挿入されていてもよく、当該アルキレン基の炭素原子は、水酸基およびＣ_1-6アルキル基から選択される１以上の置換基により独立に置換されていてもよく；
    Ｘ²は、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−^**、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−^**、もしくは−ＣＨ（−ＣＨ₃）−ＣＨ₂−^**であり、Ｒ²は水素原子またはＣ_1-6アルキル基であり；または
    Ｘ²およびＲ²は結合する炭素原子および窒素原子と一緒になって、式（ＩＩｂ）：
    

    

    で示される基を形成し；または
    Ｘ²は、式（Ｉｃ）：
    

    

    （式中、Ｑ³はＣ_1-10アルキレン基であり、ここで当該アルキレン基の１以上の個所において当該アルキレン基に含まれる２つの炭素原子の間には酸素原子が挿入されていてもよく、当該アルキレン基の炭素原子は、水酸基およびＣ_1-6アルキル基から選択される１以上の置換基により独立に置換されていてもよく；
    Ｘ³は、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−^**、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−^**、−ＣＨ（−ＣＨ₃）−ＣＨ₂−^**であり、Ｒ³は水素原子またはＣ_1-6アルキル基であり；または
    Ｘ³およびＲ³は結合する炭素原子および窒素原子と一緒になって、式（ＩＩｃ）：
    

    

    で表される基を形成する）
    で表される基であり）
    で表される基であり；
    ^*はヒアルロン酸修飾物中のアミド基の窒素原子への結合位置を表し、^**はＧＬＰ−１アナログのメルカプト基の硫黄原子への結合位置を表す］
    で表される、請求項９または１０に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩。
14. 前記アミド基の窒素原子上に導入された置換基の１つが、式（ＩＶ）：
    

    

    ［ＱおよびＲは請求項１２で定義したとおりであり、Ｑ⁴はＣ_1-6アルキレン基である］
    で表される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩。
15. Ｑ¹が、式：−（ＣＨ₂）_m−、または−（ＣＨ₂）_m−（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂）_n―
    ［式中、ｍは１〜１０からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｎは１〜２００から選択される整数である］
    で表される、請求項１３または１４に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩。
16. Ｘ¹が、式：−（ＣＨ₂）_m−（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂）_p−ＮＨＣＯ−（ＣＨ₂）_q−Ｙ¹−^**、または−（ＣＨ₂）_r−Ｙ¹−^**
    ［式中、ｍは１〜１０から選択される整数であり、ｐは１〜２００から選択される整数であり、ｑおよびｒは１〜１０から独立に選択される整数であり、Ｙ¹は式（ＩＩｃ）：
    

    

    で表される基であり、
    ^**はＧＬＰ−１アナログのメルカプト基の硫黄原子への結合位置を表す］
    で表される、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩。
17. ヒアルロン酸に含まれるカルボキシ基のＮ−置換アミド基への修飾率が８５モル％以上である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩。
18. ＧＬＰ−１アナログに結合した連結基により置換されたアミド基のヒアルロン酸に含まれるカルボキシ基に対する導入率が、平均０．１モル％以上であり１５モル％以下である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩。
19. 粘度平均分子量が５０００ダルトン〜１００万ダルトンである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩。
20. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩を含む医薬組成物。
21. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩を含む、糖尿病、高血糖症、糖尿病性合併症、および肥満症から選択される疾患の予防または治療に使用される医薬。
22. 静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与および経肺投与から選択される手段により投与される、請求項２０に記載の医薬組成物。
23. 請求項１〜１９いずれか１項に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩の治療有効量を投与することを含む、糖尿病、高血糖症、糖尿病性合併症、および肥満症から選択される疾患の予防または治療方法。
24. 非プロトン性極性溶媒中で、式（Ｖ）：
    

    

    ［式中、Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ¹²、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴およびＲ¹⁵は、それぞれ独立にＣ_1-6アルキル基から選択され、またはＲ¹⁰およびＲ¹¹、Ｒ¹²およびＲ¹³、ならびにＲ¹⁴およびＲ¹⁵は、それぞれ独立にそれらが結合する窒素原子と一緒になって含窒素ヘテロ環を形成してもよく、環Ｂは置換されていてもよい単環式または縮環式の含窒素ヘテロ環基であり、Ｘ^-はアニオンを表す］
    で表される縮合剤を使用して、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分に含まれるカルボキシ基を、Ｎ−置換アミド基に変換して水溶性ヒアルロン酸修飾物を得る工程を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩の製造方法。
25. 上記非プロトン性極性溶媒が、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、スルホラン、Ｎ−メチルピロリドンまたはこれらの２種以上の混合溶媒から選択される請求項２４に記載の製造方法。
26. 上記非プロトン性極性溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項２５に記載の製造方法。
27. 式（Ｖ）において、環Ｂがベンゾトリアゾール−１−イルである、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の製造方法。
28. 上記縮合剤が、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート、およびこれらの混合物から選択されるＢＯＰ系縮合剤である、請求項２７に記載の製造方法。
29. 請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の製造方法により製造することができる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のヒアルロン酸−ペプチド結合体、またはその塩。
30. ＧＬＰ−１（１−３６）またはＧＬＰ−１（７−３６）のＣ末端側に−Ｘａ−Ｃｙｓで表されるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであり（前記アミノ酸配列は、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸により置換および／または付加されてもよい）、ここでＸａは直接結合またはプロリン、グリシン、セリンおよびグルタミン酸から独立に選択される１〜９のアミノ酸からなる配列であり、当該ペプチドのＣ末端のシステインのカルボキシ基はアミド基に変換されていてもよいペプチドである、ＧＬＰ−１アナログ。
31. ＧＬＰ−１アナログが、ＧＬＰ−１（１−３６）またはＧＬＰ−１（７−３６）のＣ末端に−Ｘａ−Ｃｙｓで表されるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列の８位のアラニン（Ａｌａ⁸）が天然または非天然アミノ酸に置換されている配列からなるペプチドであり、当該ペプチドのＣ末端のシステインのカルボキシ基がアミド基に変換されていてもよく、Ｘａは請求項３０に定義されたとおりである、ＧＬＰ−１アナログ。
32. ＧＬＰ−１アナログが、ＧＬＰ−１（１−３６）またはＧＬＰ−１（７−３６）のＣ末端に−Ｘａ−Ｃｙｓで表されるアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列の８位のアラニン（Ａｌａ⁸）が、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびスレオニンから選択されるアミノ酸に置換されている配列からなるペプチドであり、当該ペプチドのＣ末端のシステインのカルボキシ基がアミド基に変換されていてもよい、請求項３１に記載のＧＬＰ−１アナログ。
33. 配列番号１で表されるペプチド、または当該ペプチドのＣ末端のシステインのカルボキシ基がアミド基に変換されたペプチドである、請求項３０に記載のＧＬＰ−１アナログ。
34. Ｘａが、直接結合または−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−である請求項３３に記載のＧＬＰ−１アナログ。
    
    
    
    

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