WO2005095464A1 - ヒアルロン酸－メトトレキサート結合体 - Google Patents

ヒアルロン酸－メトトレキサート結合体 Download PDF

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WO2005095464A1
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hyaluronic acid
mtx
substituted
formula
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PCT/JP2005/006472
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French (fr)
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Hitoshi Ikeya
Tadashi Morikawa
Koichi Takahashi
Noriyuki Izutani
Tatsuya Tamura
Akira Okamachi
Takenori Ishizawa
Haruhiko Sato
Yoshinobu Higuchi
Tatsuya Kato
Akie Honma
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Denki Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates

Definitions

  • the present invention relates to a hyaluronic acid-methotrexate conjugate and a pharmaceutical use thereof.
  • OA Osteoarthritis
  • OA is a type of degenerative disease that develops based on aging.
  • the number of patients is steadily increasing. Still, sufficient diagnostic and therapeutic methods have not been established.
  • the first pathological change that occurs in OA is the degeneration and wear of articular cartilage, which is the mechanical stress caused by aging, which has become the bow I metal. This change progresses at a very slow rate and gradually evolves into pain.
  • HA is an in vivo polysaccharide composed of repeating units of N-acetyldarcosamine and glucuronic acid. As a main component of synovial fluid, it works to maintain the viscoelasticity, load absorption and lubrication of synovial fluid. In the cartilage matrix, it binds to cartilage proteodalican to form a polymer called aggrecan, and plays a central role in maintaining water retention and viscoelasticity.
  • HA having a molecular weight of about 600,000 daltons or more and a crosslinked product thereof into a knee joint removes OA pain, and thus HA preparations are widely used as one of the treatments for OA.
  • a high-molecular-weight HA preparation (trade name: Svenyl (registered trademark), manufactured and sold by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) that is close to the molecular weight of HA in normal synovial fluid is available in Japan.
  • ⁇ Application is also approved for pain relief in knees associated with gussets (hereinafter also referred to as RA).
  • the molecular weight of HA is correlated with the potency of the drug, and it is said that the high molecular weight type HA has a longer lasting, stronger, and more medicinal effect than the low molecular weight type HA! .
  • HA preparations relieve pain by returning the viscosity and elasticity of joint fluid impaired in the pathology of OA (or rheumatoid arthritis (RA)) to normal.
  • RA rheumatoid arthritis
  • the HA formulation added from the outside disappears within a few days from the synovial fluid, the effect lasts for a long period of time. It has also been suggested that it may be working in pain relief.
  • One of such mechanisms is an inhibitory effect on OA synovitis described below.
  • OA synovitis is not only a major cause of pain and inflammatory symptoms such as joint swelling and hot sensation, but also promotes joint destruction through the production of proteolytic enzymes, cytokins and radicals. It is considered a major exacerbating factor in the development of the disease.
  • OA synovitis has no significant proliferative changes as seen in RA, but is common to RA synovitis, such as synovial cell proliferation, angiogenesis and hyperemia, subsynovial edema and fibrosis. Many aspects have been observed. Thus, control of OA synovitis is important from the standpoint of more efficiently removing the pain and inflammation of OA and preventing the development of pathological conditions.
  • drugs that control synovitis include modified antirheumatic drugs used in the treatment of RA.
  • a group of drugs called drugs (hereinafter also referred to as DMARDs) is well known.
  • drugs hereinafter also referred to as MTX
  • MTX methotrexate
  • MTX is a drug that has advantages such as excellent efficacy and a relatively short time to onset of action.
  • MTX is only approved for systemic administration. (At present, only capsules are approved as a therapeutic agent for RA in Japan. Overseas, tablets and injections are approved.
  • the synovium is a tissue in which HA easily accumulates.
  • Synovial cells also have a mechanism to incorporate HA into cells via HA receptors such as CD44. Therefore, it is thought that HA may be a carrier for accumulating drugs in the synovium. So far, several technologies using HA as a drug carrier in vivo have been reported. However, there are almost no examples of application to technology related to the creation of a drug delivery system (hereinafter, also referred to as DDS) for the treatment of joint diseases, typically MTX, especially for the control of synovitis. Not known.
  • DDS drug delivery system
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-39306
  • Patent Document 2 International Publication W094Z19376). These are all related to the DDS technology of an anticancer drug that has been shown to migrate to cancer tissues.
  • MTX is used for the purpose of an anticancer agent.
  • the binding rate of MTX is high (6.4-19% in the examples) to enhance its anticancer effect, and HA has a low molecular weight (100,000 daltons in the example).
  • HA has a low molecular weight (100,000 daltons in the example).
  • the peptide chain is bonded to the hydroxyl group of HA by an isourea bond, the stability in an aqueous solution is low.
  • Patent Document 2 discloses a sputter such as a butyleneamine group (-CHNH-) and an otathyleneamine group (-CHNH-).
  • conjugate of HA and a drug bound via 488 816 ser there is disclosed a conjugate of HA and a drug bound via 488 816 ser.
  • the conjugate is described as exhibiting a drug effect in a state in which the drug remains bound, assuming an extracellular drug effect.
  • the binding between the drug and HA via the spacer is relatively strong, so that the conjugate cannot exert its efficacy unless the conjugate power is released like MTX! is there.
  • the patent document is directed to a conjugate using a matrix meta-oral proteinase inhibitor (hereinafter, also referred to as MMP I) as a drug, and the disclosed examples also relate to a conjugate of MMPI. Only things.
  • MMP I matrix meta-oral proteinase inhibitor
  • the conjugate using MTX as a drug is not specifically disclosed at all, and its usefulness as a medicament is not included in any description.
  • Patent Document 3 In International Publication WO02Z44218 (Patent Document 3), norbornene is used by using a spacer in which a more specific group (norbornene) is bonded to a 13-amino-4,7,10-trioxatelide group.
  • HA-drug conjugates formed by the formation of a rubamate bond between OH and the hydroxyl group of HA.
  • the conjugate also assumes an extracellular drug effect as in Patent Document 2, and the drug effect is exhibited in a state where the drug remains bound. Therefore, if the binding strength is not released, it cannot exert its medicinal effect, and it is difficult to adapt to drugs such as MTX. is there.
  • Patent Document 3 is directed to a conjugate using MMPI as a drug, and there is no suggestion about a conjugate using MTX as a drug!
  • the present inventors have found that in the method of synthesizing an HA-drug conjugate, which is known as prior art, the molecular weight of HA is greatly reduced during the synthesis process, and the medicinal properties of HA are impaired. Check them out! Conventional methods for the synthesis of HA-drug conjugates use general organic synthesis reaction conditions and post-treatment conditions, but further improvements are needed to prepare high-molecular-weight HA-drug conjugates It is.
  • HA-drug conjugates used as pharmaceuticals particularly high-molecular-weight HA-drug conjugates suitable for the treatment of joint diseases, formulations using the same, and methods for synthesizing the conjugates have been known. There was no.
  • Patent Document 1 JP-5 - No. 39306
  • Patent document 2 International publication WO99Z59603 pamphlet
  • Patent document 3 International publication WO02Z44218 pamphlet
  • the problem to be solved by the invention is to provide a hyaluronic acid-methotrexate conjugate useful as a therapeutic drug for joint diseases.
  • methotrexate is bound to a hydroxyl group of hyaluronic acid via a linker containing a peptide chain, and the linker is linked to the hyaluronic acid, hyaluronic acid derivative or a salt thereof.
  • linker is linked to the hyaluronic acid, hyaluronic acid derivative or a salt thereof.
  • methotrexate is bound to a hydroxyl group of hyaluronic acid via a linker containing a peptide chain having 1 to 8 amino acids.
  • a hyaluronic acid-methotrexate conjugate wherein the linker and the hyaluronic acid, the hyaluronic acid derivative or a salt thereof form a sorbate group and are bound to each other.
  • the linker is a peptide chain with 1-8 amino acid strengths, and may have 1-5 oxygen atoms inserted and Z or carboxyl group or C alkoxycarbo- C alkylenediamine optionally substituted with
  • the methotrexate bound to the linker has the formula (I), (II), (III) or (IV):
  • R and R each independently represent a hydroxyl group, an amino group, a C alkoxy group, a C
  • L is the linker binding position
  • hyaluronic acid-methotrexate conjugate as described above, represented by:
  • a linker containing a peptide chain and methotrexate bound to the linker are represented by the formula ( ⁇ ) or ( ⁇ ′):
  • R and R are each independently a hydroxyl group, an amino group, a C alkoxy group, a C
  • Q is a peptide chain consisting of 1 to 8 amino acids together with the NH to be bound
  • each residue of the amino acid contained in the peptide chain is independently a C alkyl group
  • 1-6 1-6 1-6 A group consisting of a sulfonyl group and a substituted! /, May! /, C arylsulfonyl group
  • Each amide bond in the peptide chain which may be substituted or protected by one or more groups selected from the group consisting of one or more c alkyl groups and Z or c
  • a carbonyl group may be substituted on the nitrogen atom by a carbonyl group, and each carboxy group contained in the residue may be independently an amide group optionally substituted by 1 or 2 C alkyl groups.
  • R and R are each independently a hydrogen atom or a C alkyl group
  • Q may have 1-5 oxygen atoms inserted and
  • [HA] indicates the position of a hydroxyl group in hyaluronic acid, a hyaluronic acid derivative, or a salt thereof, and a linker is bonded to the hyaluronic acid, a hyaluronic acid derivative, or a salt thereof at this position by a hydroxyl group.
  • the oxygen atom “-0-0” in “-0-0 [118]” represents an oxygen atom derived from a hydroxyl group at any position in hyaluronic acid, a hyaluronic acid derivative, or a salt thereof. This is the linker to be used. ]
  • a pharmaceutical composition containing the above-mentioned hyaluronic acid-methotrexate conjugate as an active ingredient, and a therapeutic agent for joint disease.
  • R and R each independently represent a hydroxyl group, an amino group, a C alkoxy group, a C
  • L is the formula ( ⁇ ')
  • each residue of the amino acid contained in the peptide chain is independently a C alkyl group
  • 1-6 1-6 1-6 A group consisting of a sulfonyl group and a substituted! /, May! /, C arylsulfonyl group
  • the peptide chain which may be substituted or protected by one or more groups selected from Each included amide bond is independently one or more c alkyl groups and
  • the carbonyl group may be substituted on the nitrogen atom by a carbonyl group, and each carboxy group contained in the residue may be independently an amide group optionally substituted by 1 or 2 C alkyl groups.
  • R and R are each independently a hydrogen atom or C alkyl
  • R represents a C alkyl group, a carboximide group, an optionally substituted heteroaryl group
  • Q may have 1-5 oxygen atoms inserted and Z or carboxyl group
  • the compound of formula (Va) or (Vb) or a salt thereof is reacted with hyaluronic acid, a hyaluronic acid derivative, or a salt thereof, and the hyaluronic acid is reacted.
  • Producing the above-mentioned hyaluronic acid-methotrexate conjugate, comprising the step of bonding the compound of formula (Va) or (Vb) or a salt thereof with a hydroxyl group at the position of the hydroxyl group of the acid, hyaluronic acid derivative or salt thereof A method is also provided.
  • the hyaluronic acid-methotrexate conjugate (HA-MTX conjugate) of the present invention is a novel compound (hereinafter, in the HA-MTX conjugate, HA is a hyaluronic acid derivative, a salt thereof, or a salt of hyaluronic acid) May be present).
  • HA hyaluronic acid
  • methotrexer HMTX MTX is bound to the hydroxyl group of HA via a linker containing a peptide chain, and the linker and the HA are linked to each other.
  • an HA-MTX conjugate that retains the pain-reducing action of HA and also has the synovitis-reducing action of MTX. That is, it is considered that the HA-MTX conjugate of the present invention accumulates in the synovium, is taken into synovial cells, and expresses the medicinal effect of MTX in the cells.
  • the HA-MTX conjugate of the present invention when administered into a joint of an OA or RA patient, for example, into a joint of a knee, a shoulder, or an elbow, like a conventional HA preparation, a pain relieving action based on the properties of HA is achieved.
  • a pain relieving action based on the properties of HA is achieved.
  • synovial tissue while accumulating in synovial tissue, it is gradually taken into synovial cells, By dissociating MTX, the synovitis inhibitory action is continuously exhibited.
  • the dose of MTX can be significantly reduced as compared with oral administration, and systemic side effects that are a problem with oral administration can be reduced.
  • both the HA preparation and the MTX can exhibit pharmacological effects with different mechanisms of action, and thus synergistic drug effects can be expected.
  • HA-MTX conjugate of the present invention HA itself exhibits a medicinal effect and also acts as a carrier for localizing MTX.
  • the HA-MTX conjugate of the present invention can safely exhibit the synovitis-inhibiting effect of MTX only in the administered joint, while having the aspect of HA as a joint injection. Nina !, an excellent remedy for joint diseases is provided.
  • the hyaluronic acid-methotrexate conjugate (HA-MTX conjugate) of the present invention has methotrexate bound to the hydroxyl group of hyaluronic acid via a linker containing a peptide chain. It is linked with hyaluronic acid to form a hydroxyl group.
  • the hydroxyl group is one NRCOO—group (R is, for example, represented as R in the formula (X).
  • the bond by a forcebamate bond or a forcebamate group means a bond through a forcebamate group.
  • a state in which an arbitrary hydroxyl group in hyaluronic acid, a hyaluronic acid derivative, or a salt thereof is bonded to the linker via a power rubamate group is referred to as “1-NRCO—O— [HA] ”,“ One NHCO—0— [HA] ”or“ MTX— (linker containing peptide chain) —O— [HA] ”, where“ —O— [HA] ”
  • the oxygen atom “-0-” represented therein is an oxygen atom derived from a hydroxyl group at any position in hyaluronic acid, a hyaluronic acid derivative, or a salt thereof.
  • hyaluronic acid is generally referred to as hyaluronic acid, and is a polymer containing, as a repeating unit, a substance such as glucuronic acid and N-acetyldarcosamine.
  • a substance such as glucuronic acid and N-acetyldarcosamine.
  • a polysaccharide There is no particular limitation as long as it is a polysaccharide.
  • it is a polymer of glucuronic acid, N-acetyldarcosamine and a disaccharide having an average molecular weight of 50,000 to 10,000,000 daltons.
  • the salt of hyaluronic acid is not particularly limited, and includes, for example, sodium salt, potassium salt, calcium salt, aluminum salt, zinc salt, iron salt, ammonium salt, tetrabutylammonium salt and the like. .
  • Specific examples of hyaluronic acid and its salts, and mixtures thereof For example, trade name Smony (registered trademark: manufacture and sale Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.); trade name Altz (registered trademark: manufacture Seikagaku Corporation, sales Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.); trade name Opegan (registered trademark: manufacture biochemistry) Industrial Co., Ltd., and sales Santen Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • the “hyaluronic acid derivative” means a substance having an HA skeleton derived from HA.
  • the hyaluronic acid derivative include, but are not limited to, a substance in which one or more carboxyl groups in HA are esterified! (For example, benzyl esterified HA (trade name: Hyaff (registered trademark), Fidia Advanced Biopolymers)), a substance obtained by crosslinking HA with formaldehyde and further polymerizing (for example, Synvisc (registered trademark), Biomatrix)), acetylation in which one or more hydroxyl groups in HA are acetylated HA, and the like.
  • the HA-MTX conjugate of the present invention expresses the pain relieving action of HA, and therefore has the same molecular weight size and viscoelasticity as HA as a HA-MTX conjugate, which has been confirmed to have a clinical pain relieving action. Is preferable. Considering that the molecular weight increases, the viscoelasticity increases and handling becomes difficult, and considering the effect of HA as a carrier in vivo, the molecular weight of the HA-MTX conjugate is specifically 600,000-600. The molecular weight of the HA-MTX conjugate is more preferably 800,000-6,000,000 daltons The molecular weight of the HA-MTX conjugate is more preferably 1,000,000-5,000,000 daltons Especially preferred,.
  • the molecular weight of the raw material HA and the molecular weight of the HA-MTX conjugate are measured by a method of calculating a viscosity average molecular weight from an intrinsic viscosity.
  • the conversion from the intrinsic viscosity ([7?]) To the viscosity average molecular weight (Mw) can be calculated using the following equation.
  • the peptide chain in the linker containing the peptide chain of the present invention is composed of amino acids.
  • the amino acids include glycine, alanine, serine, proline, quinoline, phosphorus, threonine, cysteine, leucine, isoleucine, asparagine, aspartic acid, lysine, glutamine, glutamic acid, methionine, histidine, hueralanine, arginine, tyrosine, tripline.
  • ⁇ -amino acids such as tofuan, ⁇ -amino acids with alkyl side chains (eg, norparin, norleucine, t-leucine, etc.), and alanine substituted with a cycloalkyl group Or glycine (eg, cyclopentylalanine, cyclohexylalanine, cyclohexylglycine, etc.), or alanine or glycine substituted with an aryl group (eg, pyridylalanine, chelylalanine, naphthylalanine, substituted phenolylalanine, phenolic)
  • ⁇ -amino acids such as ⁇ -alanine
  • ⁇ -amino acids such as ⁇ -aminobutyric acid
  • aminosulfonic acids such as taurine.
  • amino acids in the linker peptide of the present invention include those in which the residues are appropriately substituted or protected.
  • a functional group on the residue can be protected using a protecting group.
  • Protecting groups used for this purpose are well known in the art, some examples of which are described in other paragraphs herein.
  • the method for introducing each substituent and protecting group, particularly the protecting group may be any of those well known in the art!
  • the linker may be composed of only amino acids, or may contain a portion derived from a compound other than amino acids in or at the peptide chain.
  • a linker in which a diamino compound such as alkylenediamine or oxaalkylenediamine or a dicarboxylic acid conjugate such as succinic acid is bonded to the inside or terminal of a peptide chain is also included in the linker.
  • a compound other than an amino acid is contained in or at the terminal of the peptide chain, and the linker binds to the carboxyl group of ⁇ and the hydroxyl group of hyaluronic acid, a compound such as alkylene diamine or oxaalkylene diamine is used.
  • a novel diamino compound be present at the end of the peptide chain. It is particularly preferred that 4,7,10 trioxa-1,13 tridecanediamine be present at the end of the peptide chain.
  • the amino acid constituting the peptide chain is not particularly limited. However, from the viewpoint of affinity for protease, a terminal which binds to MTX of a linker containing a peptide chain having a preferred amino acid must be a single amino acid. Is preferred.
  • the number of amino acids constituting the peptide chain is not particularly limited, but is typically 1 to 8, preferably 1 to 6, and particularly preferably 1 to 4.
  • Each residue of amino acids constituting the peptide chain can be appropriately substituted or protected independently by one or more groups.
  • groups include C alkyl groups, C alkylcarbo-
  • C alkoxycarbonyl group for example, methoxycarbonyl group, ethoxycarbonyl
  • a hole group an ethanesulfol group, and (n- or i-) propanesulfol group
  • a substituted or unsubstituted Carylsulfol group for example, a benzenesulfol group, (o- ,
  • the residue may be converted to an amide group.
  • the residue contains a nitrogen-containing heterocyclic ring such as an indole ring or an imidazole ring
  • the nitrogen atoms on the ring are each independently a carbon atom.
  • the nitrogen atom contained therein is also a C alkyl group.
  • the one used can also be selected.
  • a thiol group is included in the residue, it may be protected with a C alkyl or C alkylcarbonyl group.
  • the amide bond or peptide bond contained in the nitrogen chain also has a C alkyl group on its nitrogen atom.
  • the amino acid sequence constituting the peptide chain is not particularly limited !, but examples include the following.
  • an amino acid sequence containing the recognition site and Z or a cleavage site may be used.
  • Peptide chain with one amino acid Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His ⁇ lie ⁇ Leu ⁇ Lys ⁇ Met ⁇ Phe ⁇ Pro, Ser ⁇ Thr ⁇ Trp ⁇ Tyr ⁇ Val ,Such.
  • P he ⁇ Tyr, Ile, Glu Preferably, P he ⁇ Tyr, Ile, Glu.
  • Peptide chain consisting of two amino acids: PhePhe, PheGly, PheLeu, TyrPhe, TrpPhe, PheTrp, PheTyr, GlyPhe, GlyGly, and the like.
  • PhePhe, PheGly G PhePhe, PheGly G
  • Peptide chain consisting of three amino acids: PheGlyGly, PheLeuGly, PhePheGly, AsnPhePhe, GlyPhePhe, LeuPhePhe, LeuAlaLeu, AlaValAla, GlyAlaPhe, GlyPheAla, GlylleAla, GlyllePal, GlyllePal, GlylleAhe, Ly Preferably, AsnPhePhe.
  • Peptide chain consisting of 4 amino acids: GlyPheLeuGly, GlyPhePheLeu, GlyPhePhe Ala, GlyPheTyrAla, GlyPheGlyPhe ⁇ GlyPheGlyGly, GlyGlyPheGly, GlyGlyPheTyr, GlyGlyGuA, GlyGly, Aly Preferably, GlyPheLeuGly 0
  • the linker in the present invention may have, for example, the structure represented by the above formula (X), in which case Q is bonded to -NH together with 1 to 8 From amino acids
  • Q is the force to insert 1 to 5 oxygen atoms or
  • Q include a 1,2-diyl group and a 1,3-diphenyl propane
  • the HA-MTX conjugate of the present invention is a compound in which MTX is bound to a hydroxyl group of HA via a linker containing a peptide chain, and the linker and the hyaluronic acid are bound by a forcebamate bond.
  • Any connection mode may be used. That is, a linker containing a peptide chain is
  • the linker containing a peptide chain is preferably bonded to the carboxyl group at the ⁇ -position of ⁇ and the carboxyl group at the ⁇ or ⁇ to form the linker. Is more preferably combined with the carboxyl group at the a position of ⁇ . /.
  • a linker containing a peptide chain and a particularly preferable binding mode thereof include a diamino compound at the end of the peptide chain in which the linker containing the peptide chain is a amino acid.
  • the N-terminus of the peptide chain is bonded to the ⁇ -position carboxyl group of MTX by an acid amide bond, and the C-terminus of the peptide chain is linked via a diamino compound to the hydroxyl group and the olebamate group.
  • methotrexate ( ⁇ ) portion in the hyaluronic acid-methotrexate conjugate of the present invention may be prodruged by a known method in addition to modification with a linker.
  • a C alkyl group has 1 carbon atom.
  • C alkylcarbonyl is a straight or branched chain having 1 to 6 carbon atoms.
  • alkyl carboxy group for example, an acetyl group, a propioyl group, a 2-methylpropioyl group, a 2,2-dimethylpropioyl group, etc. Includes what you have.
  • C alkoxy is a straight-chain or branched alcohol having 1 to 6 carbon atoms.
  • xy group includes those having an alkyl group as defined above, such as a methoxy group, an ethoxy group and an n-propoxy group, as an alkyl moiety.
  • C alkylamino is a straight-chain or branched chain having 1 to 6 carbon atoms.
  • alkylamino group includes those having an alkyl group as defined above, such as a methylamino group, an ethylamino group, an n-propylamino group, as an alkyl moiety.
  • di C alkylamino is a straight-chain or branched-chain having 1 to 6 carbon atoms.
  • Dialkylamino group including those having an alkyl moiety which has the same or different alkyl group as defined above, such as a dimethylamino group, an ethylmethylamino group, a methylamino group, and an ethyl n-propylamino group. It is.
  • C alkylene is a straight-chain or branched alkyl having 2 to 20 carbon atoms.
  • kylene group includes, for example, an ethylene group, a propylene group, a butylene group, an otaylene group, a decalene group and the like.
  • a C alkoxycarboyl group is a straight or branched chain having 1 to 6 carbon atoms.
  • chain alkoxycarbyl group includes, for example, those having an alkyl group as defined above, such as a methoxycarbyl group, an ethoxycarbonyl group, an n -propoxycarbyl group, as an alkyl moiety.
  • a C alkylsulfonyl group is a straight or branched chain having 1 to 6 carbon atoms.
  • alkyl moiety has an alkyl group as defined above, such as a methanesulfol group, an ethanesulfol group or an n-propanesulfol group.
  • the carboximide group may be cyclic or linear. May be substituted with a plurality of substituents.
  • the carboximide group is bonded to the ⁇ atom at the ⁇ atom.
  • Specific examples of the carboximide group include, for example, a succinimide group, a phthalimide group, a 5-norbornene 2,3 carboximide group, a maleimide group, and a daltarimide group.
  • the aryl group means an aryl group having 6 to 18 carbon atoms which may be substituted with one or more substituents, and may be monocyclic or polycyclic.
  • the substituent includes a C alkyl group as defined above; a C alkoxy group as defined above;
  • Halogens such as nitrogen, chlorine, bromine and iodine; nitro groups; c alkoxycarbo as defined above
  • Specific examples of the aryl group include a phenyl group, a nitrophenyl group, a fluorophenyl group, a chlorophenyl group, a naphthyl group, and an anthral group.
  • a Caryl sulfol group is substituted with one or more substituents.
  • the substituent includes a C alkyl group as defined above; a C alkoxy group as defined above; fluorine, chlorine, and odor.
  • Halogen such as iodine and iodine; nitro group; C alkoxycarbonyl group as defined above; acyl
  • Caryl sulfol groups include benzenesulfo-
  • heteroaryl group means a group containing a 5- or 6-membered aromatic ring having one or more heteroatoms in the ring, and may be 1 or It may be substituted with a plurality of substituents. Heteroatoms include nitrogen, oxygen, and sulfur. The substituents include the substituents and oxo groups described above for the aryl group.
  • Heteroaryl groups include pyridyl, pyrazil, pyrimidinyl, pyridazyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, triazolyl, triazinyl, tetrazolyl, oxazolyl, indolizinyl, indolyl, isoindolyl, indazolyl, purinyl, quinolizyl, isoquinolyl, quinolyl, Includes tarazinyl, naphthyridinyl, quinoxalinyl, oxaziazolyl, thiazolyl, thiadiazolyl, benzimidazolyl.
  • the triazolyl group may be any isomer and may be substituted with one or more substituents.
  • the triazolyl group is preferably bonded to a ⁇ atom by a ⁇ atom.
  • Specific examples of the triazolyl group include, for example, a benzotriazolyl group, a 7-azabenzotriazolyl group, and the like.
  • the triazyl group may be any isomer and may be substituted with one or more substituents.
  • the triazyl group is preferably bonded to a ⁇ atom by a ⁇ atom.
  • Specific examples of the triazinyl group include, for example, a 3,4 dihydro-14-oxo 1,2,3 benzotriazyl group.
  • acylation in the present specification includes C alkylcarbonylation
  • benzoyl group is C alkyl, halogen atom, C alkoxy, etc.
  • the binding ratio of ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ in the ⁇ - ⁇ conjugate of the present invention is preferably within a range in which a medicinal effect is exhibited and side effects are reduced.
  • the bond ratio of ⁇ in the present specification is represented by the following formula:
  • [0082] is calculated.
  • a value calculated based on an ultraviolet absorption spectrum is used as the bond ratio of ⁇ .
  • the binding ratio of ⁇ is not particularly limited, but is preferably 0.5% or more, and more preferably 1.0% or more, from the viewpoint of exhibiting a drug effect.
  • the binding rate is preferably less than 10% in order to localize the action of ⁇ to the administration site and reduce the systemic side effects of ⁇ .
  • the binding rate of ⁇ is 0.5%. More preferably, it is more preferably less than 4.5%, more preferably more than 1.0% and less than 4.5%.
  • the present ⁇ - ⁇ conjugate is preferably a pharmaceutically acceptable salt in consideration of its use, which can also exist as a salt, and its use.
  • Pharmaceutically acceptable salts of the HA-MTX conjugate include non-toxic base addition salts commonly used in the art, for example, alkali metal salts, alkaline earth metal salts, or ammonium salts. Contains salt. Such base addition salts include sodium, potassium, calcium, aluminum, zinc, iron, magnesium, ammonium, trimethylammonium, triethylammonium, piberidium. Powers including, but not limited to, gum salt, morpholium salt, pyrrolidium salt, benzylammonium salt, diethanolammonium salt, triethanolammonium salt, tetrabutylammonium salt, etc.
  • the pharmaceutically acceptable salts of the HA-MTX conjugate also include non-toxic inorganic or organic acid addition salts commonly used in the art.
  • acid addition salts include hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, hydrofluoride, sulphate, sulphate, phosphate, hydrogen phosphate, phosphorus Dihydrogen acid, nitrate, phosphite, formate, acetate, trifluoroacetate, benzoate, succinate, saccharate, fumarate, maleate, lactate, citrate, tartaric acid Salts, dalconate, methanesulfonate, ethanesulfonate, benzenesulfonate, p-toluenesulfonate, and pamoate, but are not limited thereto.
  • the HA-MTX conjugate of the present invention can be obtained by binding HA, a linker containing a peptide chain, and MTX in an appropriate order.
  • a route for introducing MTX after constructing a linker containing an HA-peptide chain there are a route for introducing MTX after constructing a linker containing an HA-peptide chain, and a route for constructing a linker containing an MTX-peptide chain and then introducing the linker into HA.
  • R and R each independently represent a hydroxyl group, an amino group, a C alkoxy group, a C
  • L is the formula ( ⁇ ')
  • each residue of the amino acid contained in the peptide chain is independently a C alkyl group
  • 1-6 1-6 1-6 A group consisting of a sulfonyl group and a substituted! /, May! /, C arylsulfonyl group
  • Each amide bond in the peptide chain which may be substituted or protected by one or more groups selected from one or more, is independently one or more c alkyl groups and
  • the carbonyl group may be substituted on the nitrogen atom by a carbonyl group, and each carboxy group contained in the residue may be independently an amide group optionally substituted by 1 or 2 C alkyl groups.
  • R and R are each independently a hydrogen atom or C alkyl
  • R is a hydrogen atom, a C alkyl group, a carboximide group, an optionally substituted
  • Q is an alkylene, wherein the alkylene has 1 to 5 oxygen atoms inserted.
  • heteroaryl group and aryl group used in R may be substituted with one or more substituents.
  • substituents include, but are not limited to, any of those already exemplified in relation to the aryl group, for example, a C alkyl group as previously defined;
  • Halogen such as nitrogen, chlorine, bromine and iodine; and -toro.
  • R is preferably a C alkyl group or an optionally substituted aryl group.
  • the active substance may be isolated and used, or may be generated in-situ and reacted with force. Further, the isolated active form can be provided in the form of a salt acceptable for organic synthesis. Such salts may be any of the acid or base addition salts already exemplified in connection with the HA-MTX conjugate.
  • active form salts include hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, hydrofluoride, sulfate, hydrogen sulfate, phosphate, hydrogen phosphate, dihydrogen phosphate Salt, nitrate, phosphite, formate, acetate, trifluoroacetate, benzoate, succinate, saccharate, fumarate, maleate, lactate, citrate, tartrate, dalcone Acid, methanesulphonate, ethanesulphonate, benzenesulphonate, p-toluenesulphonate and pamoate; sodium, potassium, calcium, aluminum, zinc, iron, magnesium, ammonium Salt, trimethylammonium salt, triethylammonium salt, piberidinium salt, morpholium salt, pyrrolidi-pam salt, benzylammonium salt, diethanolammonium salt, triethanolamine Mode - ⁇ unsalted, Tetorabu Chi
  • the reaction can be carried out at a temperature of 20 ° C. to 50 ° C. for several minutes to several days using a generally used solvent and, if necessary, a reaction promoting additive.
  • Examples of the solvent include water, N, N dimethylformamide, N, N dimethylacetamide, dimethyl sulfoxide, tetrahydrofuran, dioxane, methanol, ethanol, dichloromethane, and chloroform. These solvents may be used alone or in combination.
  • Examples of the reaction promoting additive include a phase transfer catalyst and a base.
  • Examples of the phase transfer catalyst include various halogenated quaternary ammonium salts such as cetylpyridyl-dimethyl chloride, tetrabutylammonium-dimethylbromide, cetyltrimethylammonium-dimethylbromide, and benzylcetyldimethylammonium-dimethyl chloride. ⁇ Muchloride is preferred.
  • Examples of the base include triethylamine, tributylamine, N-methylmorpholine, N, N-diisopropylethylamine, tris [2- (2-methoxyethoxy) ethyl] amine, and the like, with triptylamine being preferred. These additives may be used alone or in combination.
  • a functional group such as an amino acid side chain, for example, a hydroxyl group, a carboxyl group, or an amino group, a protecting group widely used in ordinary organic synthesis can be used, if necessary.
  • the reaction temperature is not particularly limited as long as a medicinal HA-MTX conjugate is obtained, but is typically -10 ° C or higher, preferably 0 ° C or higher, and 40 ° C or lower. Preferably it is 30 ° C or lower.
  • the reaction time is not particularly limited, but is 1 hour or more from the viewpoint of performing a uniform reaction, and is economically 24 hours or less, preferably 12 hours or less.
  • joint disease specifically refers to articular cartilage defect, osteoarthritis (including primary having no apparent cause and secondary having a causal disease), shoulder Refers to diseases such as periarthritis, rheumatoid arthritis, reactive arthritis, viral arthritis, pyogenic arthritis, tuberculous arthritis, and neuroarthritis. Knee joint pain).
  • agent for treating joint disease includes a drug used for the prevention of the disease used alone for the treatment of the joint disease, and a drug used for suppressing the progression of the disease state (preventing deterioration and maintaining the status quo). Include.
  • the HA-MTX conjugate of the present invention is obtained by adding an effective amount of a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, disintegrant, lubricant, binder, flavor, coloring agent and the like to an effective amount thereof. It can be used as a product.
  • the pharmaceutical composition containing the HA-MTX conjugate of the present invention as an active ingredient is preferably used as a therapeutic drug for joint diseases, and among them, it is particularly preferable to be used as a preparation for local administration to joints.
  • the HA-MTX conjugate of the present invention is formulated as a therapeutic agent for joint disease, it is not particularly limited.
  • the HA-MTX conjugate is dissolved in physiological saline or phosphate physiological saline or the like to a desired concentration, and the mixture is injected. It can be formulated as a formulation.
  • the solution may be adjusted to a desired pH by adding an acid or a base.
  • the solution is adjusted to a desired salt concentration by adding a monovalent metal salt such as a sodium salt and a potassium salt, and an inorganic salt such as a divalent metal salt such as a magnesium salt, a calcium salt, and a manganese salt. Is also good.
  • the HA-MTX conjugate of the present invention may be distributed in a form in which it is pre-filled in a syringe such as a disposable syringe.
  • a syringe such as a disposable syringe.
  • the HA-MTX conjugate of the present invention is 0.01% to 10%.
  • a solution having a solution concentration of 0.1% to 2.0% w / v, preferably 0.5% to 1.5% w / v, 1 to 3 mL per patient may be administered.
  • the dose may be appropriately increased or decreased depending on the instructions of a doctor, the target patient, the type and severity of the disease, the molecular weight of the HA-MTX conjugate, and the like, as appropriate.
  • the HA-MTX conjugate of the present invention reduces synovitis not seen in HA when administered intraarticularly to an arthritis model in which a pathological condition develops in the knee joint. Is expressed.
  • FIG. 1 shows the time course of knee joint swelling measured in each test substance-administered group and control group (HA and vehicle) when an mBS A solution was administered into the knee joint. Is shown.
  • FIG. 2 shows the AUC for the graph of each test substance administration group and control group in FIG.
  • Fig. 3 shows the time course of the knee joint width in a collagen arthritis model.
  • the left figure shows the right knee joint (administration site) measured immediately after the induction of collagen arthritis in the group to which the compound of Example 3-7 or the control drug (HA or Vehicle) was administered only into the right knee joint.
  • the time course of the width is shown.
  • the right figure shows the time course of the left knee joint width, which is the non-administration site.
  • the graph shows the standard error of the mean.
  • FIG. 4 shows the results of measuring knee swelling in a collagenase-induced arthritis (OA) model.
  • the left figure shows the time course of knee swelling measured from immediately after the induction of arthritis to 27 days after the administration of the compound of Example 3-7 or the control drug (HA or vehicle), and the right figure shows the time course. Indicates AUC.
  • N-carbobenzoxy-L-phen-l-alanine (Cbz Phe: 7.16 g, 25.4 mmol)
  • Nt-butoxycarbo-lu-ethylenediamine hydrochloride (5.00 g, 25.4 mmol)
  • 1-hydroxybenzo Triazole hydrate (HOBT: 4.28 g, 28. Ommol)
  • N-methylmorpholine NMM: 3.07 mL, 28. Ommol
  • NMM 3.07 mL, 28. Ommol
  • DMF dimethylformamide
  • EDC 1-ethyl 3 — (3 Dimethylaminopropyl) carposimid hydrochloride
  • the compound lb (11.lg, 18.9 mg) was dissolved in 800 mL of methanol, 50 mL of DMF and 500 mL of THF, 1.00 g of 10% palladium on carbon was added, and the mixture was stirred at room temperature under a hydrogen atmosphere for 1 day. After filtering off the catalyst from the reaction mixture, the reaction mixture was concentrated under reduced pressure.
  • N-Carbobenzoxy-L-phen-alanine (Cbz Phe: 852 mg, 2.85 mmol) and N-t-butoxycarbonyl-4,7,10 trioxa-1,13 tridecanediamine (76 Omg, 2.37 mmol) and 1-hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT: 363 mg, 2.37 mmol) were dissolved in 6 mL of dimethylformamide (DMF), and the mixture was stirred under ice-cooling and stirred with 1-ethyl-3- (3-dimethylamino).
  • DMF dimethylformamide
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylamino
  • the compound 2c (514 mg, 0.576 mmol) was suspended in 30 mL of methanol, 100 mg of 10% palladium on carbon was added, and the mixture was stirred at room temperature under a hydrogen atmosphere for 1.5 hours. After filtering off the catalyst from the reaction mixture, the reaction mixture was concentrated under reduced pressure. This residue, 4- [N- (2,4-diamino-6-pteridyl-methyl) -N-methylamino] benzoic acid: 281 mg, 0.864 mmol) and HOBT (132 mg, 0.864 mmol) were dissolved in 5 mL of DMF.
  • Trioxa 13— [N— [N— [N— [4 — [[(2,4 diamino-16 pteridyl) methyl] methylamino] benzoyl] —a— (O 5-ethyl Glutamyl)] Fer-Fara-L] Fuer-Fala-Lamino] Tride-Lamine: MTX (Et) -a-PhePhe-N HC HO NH (Compound 2,)
  • a yellow powder was prepared in the same manner as in Example 1-1, except that Nt-butoxycarbol-l, 5-pentadiamine was used instead of Nt-butoxycarbol-l, 2-ethylenediamine. 148 mg of the title compound was obtained.
  • Example 12 Title of yellow powder was prepared in the same manner as in Example 1-2 except that N-carbobenzoxyglycine was used in place of N-carbobenzoxy L-phenylalanine in the step of (a). 528 mg of the compound were obtained.
  • N-t-butoxycarbol-4,7,10-trioxa--1,13 instead of tridecanediamine, N-t-butoxycarbonyl-4,9-dioxa-1 Using 12 dodecanediamine, 300 mg of the title compound was obtained as a yellow powder.
  • N-t-butoxycarbol-4,7,10-trioxa--1,13 instead of tridecandamine, N-t-butoxycarbonyl-4,7-dioxa-1 Using 10 decanedamine, 300 mg of the title compound was obtained as a yellow powder.
  • Example 1-2 The title of a yellow powder was obtained in the same manner as in Example 12 except that N-carbobenzoxy L-proline was used in place of N-carbobenzoxy L-phenalanine in the step (a). 382 mg of the compound were obtained.
  • Example 1-2 A yellow powder was prepared in the same manner as in Example 1-2, except that N-carbobenzoxy ⁇ -alanine was used in place of N-carbobenzoxy L-phenalanine in the step (a). 180 mg of the title compound were obtained.
  • Example 11 A yellow powder of the title compound was obtained in the same manner as in Example 1-1, except that N-carbobenzoxy- ⁇ -alanine was used in place of N-carbobenzoxy L-phenalanine in the step of (a). 194 mg were obtained.
  • Example 1-2 Except that the step of (b) was omitted, 496 mg of the title compound as yellow powder was obtained in the same manner as in Example 1-2.
  • N-t-butoxycarbonyl-4,7,10-trioxa-1,13-substituted N-t-butoxycarbonyl-1,2-ethylenediamine was used in place of tridecandamine. This gave 320 mg of the title compound as a yellow powder.
  • Example 117 By a method similar to that in Example 117, 133 mg of the title compound was obtained as a yellow powder using N-carbobenzoxy L-tyrosine in place of N-carbobenzoxy L-phenylalanine.
  • Example 117 In the same manner as in Example 117, 416 mg of the title compound was obtained as a yellow powder by using N-carbobenzoxy L-serine instead of N-carbobenzoxy L-phenalanine.
  • Example 117 By a method similar to that in Example 117, 590 mg of the title compound was obtained as a yellow powder by using N-carbobenzoxy L-valine instead of N-carbobenzoxy L-phenalanine.
  • N-carbobenzoxy L-histamine was used in place of N-carbobenzoxy L-phenalanine V, to give the title compound as a yellow powder, 81 mg.
  • Example 1-5 the title of a yellow powder was obtained using ⁇ -carbobenzoxy-L-glutamic acid- ⁇ -methylester instead of N-carbobenzoxy-L-glutamic acid- ⁇ -methyl ester. 80 mg of the compound were obtained.
  • Example 1-17 In the same manner as in Example 1-17, 480 mg of the title compound was obtained as a yellow powder by using ⁇ -carbobenzoxy-L-glutamic acid- ⁇ -methyl ester instead of N-carbobenzoxy-L-glutamic acid- ⁇ -methyl ester. Obtained.
  • Example 1-20 the title compound was obtained as a yellow powder by using ⁇ -carbobenzoxy-L-glutamic acid- ⁇ methyl ester instead of N-carbobenzoxy-L-glutamic acid- ⁇ -methyl ester. 438 mg were obtained.
  • Example 1 In the same manner as in Example 30, N-carbobenzoxy L-phenylalanine Using N-carbobenzoxy D-phenylalanine instead, 85 mg of the title compound was obtained as a yellow powder.
  • Example 1-2 In the same manner as in Example 1-2, the peptide chain was extended according to a usual peptide synthesis method to obtain 145 mg of the title compound as a yellow powder.
  • Example 2-1 the compounds of Examples 1-1 to 1-8, 1-10 to 1-17, and 1-19 to 1-38 can be respectively converted to phenyl carbamates. It was possible.
  • Example 2-6 In the same manner as in Example 2-2 above, it was possible to convert the compounds of Examples 1-1 to 1-38 to p-to-mouth phenol carbamates, respectively.
  • the precipitate was dissolved in ultrapure water (60 mL), 1N aqueous sodium hydroxide solution (7.5 mL) was added, and the mixture was stirred at 5 ° C for 2 hours. The solution was neutralized by adding 1N hydrochloric acid (7.5 mL), and sodium chloride (2.25 g) was added. Then, ethanol (150 mL) was added dropwise to perform ethanol precipitation. Was separated by centrifugation.
  • the precipitate was dissolved in ultrapure water (lOOmL), and a solution prepared by dissolving sodium salt (6g) in ultrapure water (lOOmL) was added thereto. Then, ethanol (400 mL) was added dropwise to the filtrate aseptically to precipitate ethanol, and the precipitate was collected by filtration and dried in vacuo.
  • the molecular weight determined by gel filtration using hyaluronic acid as a standard substance was about 2.44 million. . Further, the binding ratio of MTX in the obtained conjugate was 1.0% as calculated by measuring ultraviolet absorption (259 nm).
  • Example 3-1 In the same manner as in Example 3-1, hyaluronic acid sodium salt (200 mg, molecular weight: about 2.5 million) and MTX- ⁇ -PhePhe-NHCHONHCO-O-C obtained in Example 2-1
  • the molecular weight determined by the same method as in 3-1 is about 2.48 million, and the binding rate of MTX is 1.8%.
  • Example 3-1 hyaluronic acid sodium salt (200 mg, molecular weight: about 2.2 million) and MTX- ⁇ -PhePhe—NHC H O NHCO—O—C obtained in Example 2-2
  • Example 3-1 hyaluronic acid sodium salt (200 mg, molecular weight: about 2.2 million) and MTX- ⁇ -PhePhe—NHC H O NHCO—O—C obtained in Example 2-2
  • the molecular weight determined by the same method as in Example 3-1 was about 2.16 million, and the binding ratio of MTX was 2.0%.
  • Example 3-1 hyaluronic acid sodium salt (200 mg, molecular weight: about 2.2 million) and MTX- ⁇ -PhePhe—NHC H O NHCO—O—C obtained in Example 2-2
  • the molecular weight determined by the same method as in Example 3-1 was about 2.11 million, and the binding ratio of MTX was 1.6%.
  • the precipitate was dissolved in ultrapure water (35 mL), and 1N aqueous sodium hydroxide solution (5 mL) was added thereto, followed by stirring at 5 ° C for 1 hour.
  • the solution was neutralized by adding 1N hydrochloric acid (5 mL), and a solution of sodium chloride (1.17 g) dissolved in ultrapure water (5 mL) was added. Then, ethanol (100 mL) was added. Ethanol was precipitated by dropping, and the precipitate was separated by centrifugation.
  • the precipitate was dissolved in ultrapure water (50 mL), a solution of sodium chloride (3 g) dissolved in ultrapure water (50 mL) was added, and then a 0.45 m filter (Sterivex HV) was added. : Millipore), ethanol (200 mL) was added dropwise to the filtrate aseptically to precipitate ethanol, and the precipitate was collected by filtration and dried in vacuo.
  • Example 2-1 sodium hyaluronate (500 mg, molecular weight: about 2.3 million) and MTX- ⁇ -PhePhe-NHCHONHCO-O-C obtained in Example 2-1 were used.
  • the molecular weight determined by the same method as in 3-6 was about 2.1 million, and the binding ratio of MTX was 2.0%.
  • Example 2-1 sodium hyaluronate (500 mg, molecular weight: about 2.3 million) and MTX- ⁇ -PhePhe-NHCHONHCO-O-C obtained in Example 2-1 were used.
  • the molecular weight determined by the same method as in 3-6 was about 2.13 million, and the binding ratio of MTX was 2.5%.
  • Example 2-1 sodium hyaluronate (500 mg, molecular weight: about 2.3 million) and MTX- ⁇ -PhePhe-NHCHONHCO-O-C obtained in Example 2-1 were used.
  • the molecular weight determined by the same method as in 3-6 was about 2.32 million, and the binding ratio of MTX was 2.6%.
  • Example 2-1 sodium hyaluronate (500 mg, molecular weight: about 2.3 million) and MTX- ⁇ -PhePhe-NHCHONHCO-O-C obtained in Example 2-1 were used.
  • the molecular weight determined by the same method as in 3-6 was about 2.05 million, and the binding ratio of MTX was 3.8%.
  • Example 2-1 sodium hyaluronate (100 mg, molecular weight: about 860,000) and MTX— ⁇ —PhePhe—NHC H O NHCO—O—CH obtained in Example 2-1 were used.
  • Example 2-1 sodium hyaluronate (100 mg, molecular weight: about 860,000) and MTX— ⁇ —PhePhe—NHC H O NHCO—O—CH obtained in Example 2-1 were used.
  • Example 2-1 sodium hyaluronate (100 mg, molecular weight: about 350,000) and MTX— ⁇ —PhePhe—NHC H O NHCO—O—C H obtained in Example 2-1
  • HA-MTX conjugate (0.004 mmol) to give an aqueous solution of the title HA-MTX conjugate.
  • the molecular weight determined by the same method as in Example 36 was about 350,000, and the binding ratio of MTX was 1.1%.
  • Example 2-3 sodium hyaluronate (100 mg, molecular weight: about 2.3 million) and MTX- ⁇ -PheGly-NHC H O NHCO—O—C obtained in Example 2-3
  • the viscoelasticity of the conjugate of Example 3 and the viscoelasticity of hyaluronic acid as a control were It was measured at 37 ° C with a mold stress-controlled rheometer (Carri-Med) using a cone having a diameter of 4 cm.
  • HA- ⁇ conjugate of the present invention Using human synovial cells (HFLS), the effect of the HA- ⁇ conjugate of the present invention on the enhancement of cell proliferation induced by TNF- ⁇ was examined.
  • the main focus of rheumatoid arthritis (RA) is the synovial tissue.
  • RA rheumatoid arthritis
  • One of its features is that synovial cells abnormally proliferate to form granulation tissue (pannus) and destroy cartilage and bone of joints. It is known. Secondary synovitis is also seen in osteoarthritis (OA).
  • synovitis causes inflammatory symptoms such as joint swelling, pain and warmth that are characteristic of knee OA ( Edited by Nobuyuki Takasaka et al., "Bone and Joint Diseases" 2003, Asakura Shoten). Therefore, a compound that inhibits the proliferation of synovial cells enhanced by TNF- ⁇ , which is an inflammatory site power-in, can be used as a drug for suppressing or treating the progression of RA and OA.
  • HFLS is composed of human synovial cells from RA patients (HFLS-RA, CA404-05, Lot No .: 1493) and human synovial cells from OA patients 03 ⁇ 41 ⁇ -08, Ji400-05, 1 ⁇ No .: 1442) was purchased from CELL APPLICATIONS INS.
  • HFLS was seeded on a 96-well plate (Falcon) at 5000 cells Zwell, and cultured in an Iscove's modified Dulbecco s medium (IMDM) medium containing 5% FBS and lx Antibiotic-antimycotic (uIB and O) for 3 hours. After cell attachment, TNF-a (final concentration lOngZ mL) and HA-MTX conjugate at each concentration were added and cultured for 5 days.
  • IMDM Iscove's modified Dulbecco s medium
  • uIB and O Antibiotic-antimycotic
  • the radioactivity of each test substance measured in each experiment was calculated as a relative value (% of control) using the radioactivity of the group cultured without adding the test substance as a control.
  • the MTX concentration of the HA-MTX conjugate is 2.49x10 " 3 mol / L (lg / 401 / L: 401 is the molecular weight of N-acetyldarcosamine + glucuronic acid) per 1 mgZmL of hyaluronic acid Therefore, the value was calculated by multiplying this value by the binding ratio of MTX. (MTX coupling ratio of 1% HA -.
  • MTX conjugate Img / mL MTX concentration 2.49x10- 5 molZL and the) obtained using the value 4 parameter logistic method (analysis software GraphPad Prism 3.02 Contact and 4.02), the cell growth inhibitory activity (IC value) was calculated.
  • Table 2 shows the IC values of the HA-MTX conjugate in HFLS-RA and those in HFLS-OA.
  • Table 3 shows the IC values of the HA-MTX conjugate.
  • S-RA has an effect of suppressing the increase in cell proliferation.
  • the in vivo synovitis inhibitory effect of the HA-MTX conjugate of the present invention was evaluated by the knee methyl swelling inhibitory effect of a rat methylated bovine serum albumin (mBSA) -induced monoarthritis model.
  • mBSA rat methylated bovine serum albumin
  • the mBSA-induced monoarthritis model used in this experiment is widely used as an antigen-induced arthritis model and is known to induce synovitis (Sven E. Andersson, et al. The Journal of From Rheumatology (1998) 25: 9, 1772-7), the inhibitory effect on joint swelling in vivo observed in this model can be considered to be a synovitis inhibitory effect.
  • Compounds that suppress synovitis in vivo are useful as therapeutics for joint diseases associated with synovitis (such as RA and OA).
  • the animals used were LEWZCrj rats (Charles Japan's Riva-1, 6 weeks old, male). Twenty-one and fourteen days before the induction of arthritis, 0.5 mL of an emulsion prepared with 2 mgZmL of mBSA (Calbiochem) aqueous solution and an equal amount of Freund's complete adjuvant (Difco) was subcutaneously administered to the flank of rats. Arthritis was induced by injecting 50 L of a 2 mg ZmL aqueous solution of mBSA into the right knee joint. The left knee joint was untreated and served as a control for each individual. The test substance (sterile water solution) and the control drug, hyaluronic acid, were administered 50 L intra-articularly to the right knee joint 7 days and 1 day before and 7 days after induction of arthritis.
  • mBSA Calbiochem
  • Freund's complete adjuvant Freund's complete adjuvant
  • the knee joint swelling was measured by measuring the width of both knee joints with a vernier caliper, and the difference between the left and right sides (right knee diameter, left knee diameter) was defined as knee joint swelling.
  • the width of the knee joint is measured twice a week from immediately before the induction of arthritis to two weeks later, and the change over time is used to determine the AUC (Area Under the Curve; also referred to as the area under the curve. The area under the objective curve is shown.)
  • the average value and standard deviation of AUC were calculated for each measurement, and a t-test was performed between the test substance-administered group and the HA-administered group, and a significant difference was judged to be significant when the risk factor was less than 5%. .
  • Statistical analysis used SAS version 6.12 or 8.02 (SAS Institute Japan). For the AUC of each test substance, the relative value (% of control) of each test substance was calculated using the HA administration group as a control.
  • Table 4 shows the results of examining the effect of each HA-MTX conjugate of the present invention by the above method. [0230] [Table 4]
  • HA-MTX conjugate of the present invention In order to verify the usefulness of the HA-MTX conjugate of the present invention according to the method of Experimental Example 3, 1) the administration group of the HA-MTX conjugate (sterile aqueous solution) prepared in Example 3-10, 2) HA—Group administered with a solution containing the same amount of MTX as the MTX contained in the MTX conjugate, and 3) a mixture of the same amount of MTX and hyaluronic acid (HA) (HA + MTX) contained in the conjugate ) Were compared for their joint swelling inhibitory effects. HA and Veicle (2 mM phosphate buffer, 0.9% NaCl) were used as controls.
  • the HA-MTX conjugate of the present invention was obtained in vitro, which is not observed in HA.
  • TNF- ⁇ stimulation has been shown to have an inhibitory effect on human synovial cell proliferation and an effect of reducing synovitis in vivo (in a model of developing arthritis).
  • MTX alone or a mixture of HA and MTX did not show a sufficient synovitis-mitigating effect, whereas the HA-MTX conjugate had a strong synovitis-mitigating effect. It became clear that it exerted.
  • the in vivo synovitis inhibitory effect of the HA-MTX conjugate was evaluated using a rat collagen arthritis model (Kane et al., “Joint Surgery” (1998), Vol. 17, No. 2), which is widely used as a model for rheumatoid arthritis (RA). , 111-21).
  • the compound of the present invention that suppresses inflammation in this model is useful for treating autoantigen-induced immune diseases represented by RA.
  • DAZSlc rats Japan SLC, Inc., 11 weeks old, female were used as animals.
  • Dissolve E-type collagen (collagen technology workshop) in a 0.1 mol / mL aqueous solution of OlmolZL acetic acid and add an equal amount of Freund's incomplete adjuvant (Difco) to the emulsion.
  • Difco Freund's incomplete adjuvant
  • a total of 0.4 mL of this emulsion was applied to the skin at the back of the rat at a total of 0.4 mL / force to induce arthritis.
  • test substance sterile aqueous solution
  • control agents hyaluronic acid (HA) and Vehicle (2 mM phosphate buffer, 0.9% NaCl)
  • HA hyaluronic acid
  • Vehicle 2 mM phosphate buffer, 0.9% NaCl
  • FIG. 3 shows the results of examining the effect of the HA-MTX conjugate of the present invention by the above method.
  • the HA-MTX conjugate of the present invention was found to be more active than the HA-administered group.
  • the width of swollen joints was significantly suppressed by the induction of monogen arthritis, and the change over time in the joint widths was almost at the same level as in the normal group. This effect was observed only at the site where the HA-MTX conjugate was administered (right knee), and was not observed at the site where no HA-MTX conjugate was administered (left knee).
  • the present compound can exert an action limited to the administration site.
  • Collagenase-induced OA model is a model in which collagen in cartilage tissue is directly digested by injecting aqueous collagenase solution into the joint to induce inflammation in the joint.
  • This model shows histopathological changes similar to human OA pathology, such as articular cartilage degeneration and synovitis, and is useful for evaluating therapeutic agents for OA (Takanori K. et al., Osteoarthritis and Cartilage (1998) 6, 177-86). Therefore, the compound that suppresses the inflammation of the present model is useful as a therapeutic agent for OA.
  • the animals used were SDZCrj rats (Charles' Riva Japan, 6 weeks old, male). 1.5 ⁇ L Collagenase (SIGMA) solution (50 ⁇ L) was administered into the right knee joint cavity to induce arthritis. The left knee joint was left untreated to serve as a control for each individual.
  • the test substance of Example 3-7 sterile aqueous solution
  • the control drugs hyaluronic acid (HA) and Vehicle (2 mM phosphate buffer, 0.9% NaCl) were administered weekly from 7 and 1 days before the induction of arthritis. In each case, 50 L was administered into the right knee joint.
  • the knee joint swelling was measured by measuring the width of both knee joints with a vernier caliper, and calculating the difference between the left and right sides (right knee diameter, left knee diameter) as knee joint swelling. From just before the induction of arthritis to 20 days after the induction of arthritis, the width of the knee joint was measured approximately twice a week, and the AUC of the graph showing the time course was calculated. The average value and standard error of AUC were calculated for each measurement, and an unpaired t-test was performed between the test substance-administered group and the HA-administered group. When the risk factor was less than 5%, it was determined that there was a significant difference.
  • FIG. 4 shows the results of examining the effect of the HA-MTX conjugate of the present invention by the above method.
  • the left figure in FIG. 4 shows the time-dependent changes in typical joint swelling of the HA-MTX conjugate, and the AUC obtained therefrom is shown in the right figure in FIG. [0243]
  • the HA-MTX conjugate of the present invention can safely exhibit the synovitis-inhibiting effect of MTX only in the administered joint, while having the aspect of HA as a joint injection. (4) An excellent therapeutic agent for joint disease having an effect is provided.

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Abstract

　本発明の課題は、関節疾患治療薬として有用な、ヒアルロン酸－メトトレキサート結合体を提供することである。 　この課題を解決する手段として、ヒアルロン酸の水酸基に、１～８個のアミノ酸からなるペプチド鎖を含有するリンカーを介してメトトレキサートが結合しており、該リンカーと該ヒアルロン酸とがカルバメート基により結合している、関節疾患治療に有用なヒアルロン酸－メトトレキサート結合体を見出した。                                                                                   

Description

明 細 書
ヒアルロン酸—メトトレキサート結合体
技術分野
[0001] 本発明はヒアルロン酸—メトトレキサート結合体、及びその医薬用途に関する。
背景技術
[0002] 変形性関節症（以下、 OAとも称す）は加齢を基盤として発症する、 Vヽゎゆる退行性 疾患の一種である。高齢化社会の現在、患者数は増加の一途を迪つている力 未だ 十分な診断法、治療法は確立されていない。 OAで最初に起こる病態変化は、加齢 によるメカ-カルストレスが弓 Iき金となった関節軟骨の変性と磨耗であると考えられて いる。この変化は極めてゆるやかな速度で進行し徐々に痛みへと進展する。
[0003] 現在の OA薬物治療では、全身療法として、 1)解熱鎮痛薬 (ァセトァミノフェン）、及 び 2)非ステロイド性抗炎症薬 (以下、 NSAIDsとも称す)、局所療法 (関節内注入)とし て、 3)ヒアルロン酸 (以下、 HAとも称す)製剤及び 4)ステロイド製剤が使われている。 従来、 NSAIDsをはじめとする全身療法を行っても関節局所の疼痛や腫脹が軽快し ない場合、抗炎症作用が最も優れているステロイド製剤の関節内注入が行われてき た。しかし、ステロイド製剤は、関節注入症候群 (ステロイド関節症)や全身性の副作 用など安全性の面で問題がある。そのため、ステロイド製剤に代わる安全な関節内注 入剤として、 HA製剤の有用性が高まりつつある。
[0004] HAは、 N—ァセチルダルコサミンとグルクロン酸との繰り返し単位より構成される生 体内多糖である。関節液を構成する主成分として関節液の粘弾性、荷重吸収作用お よび潤滑作用の保持に働いている。また、軟骨マトリックスにおいては、軟骨プロテオ ダリカンと結合してァグリカンと呼ばれる重合体を形成し、水分保持能と粘弾性の維 持に中心的な役割を担っている。
[0005] 分子量約 60万ダルトン以上の HAおよびその架橋物を膝関節内に注入すると OA の疼痛が除去されることから、 HA製剤は OAの治療法の一つとして広く用いられて いる。また、正常関節液中の HAの分子量に近い高分子量タイプの HA製剤（商品名 スべニール (登録商標）、製造販売 中外製薬株式会社)は、日本にお 、て関節リ ゥマチ（以下、 RAとも称す）に伴う膝の疼痛除去にも適用が認められている。なお、 H Aの分子量は薬効の強さと相関があり、高分子量タイプの HAの方が、低分子量タイ プの HAよりも持続性に優れ、より強 、薬効を示すと言われて!/、る。
[0006] 一般に、 HA製剤は、 OA (または関節リウマチ (RA) )の病態で損なわれた関節液 の粘性と弾性を正常に戻すことにより疼痛除去していると考えられている。しかし、外 部から加えた HA製剤は関節液中から数日以内には消失してしまうにもかかわらず、 効果は長期間持続するため、上記の関節液の粘弾性改善とは異なる機序で疼痛除 去に働いている可能性も示唆されている。そのような機序の一つとして、後述の OA 滑膜炎に対する抑制作用が挙げられる。
[0007] さて、 OAの痛みや炎症の発症メカニズムについては、未だ不明な点が多いが、最 近では軟骨の変性によって二次的に引き起こされる滑膜炎との関連性が注目されて いる。 OA滑膜炎は関節水症や熱感など疼痛、炎症症状の主たる原因となるのみな らず、タンパク分解酵素、サイト力インやラジカルの産生を介して関節破壊をも促進す るため、 OAの病態を進展させる主要な増悪因子と考えられている。また、 OA滑膜炎 は、 RAで見られるような著しい増殖性変化はないものの、滑膜細胞の増殖、血管新 生と充血、滑膜下の浮腫および繊維化など、 RA滑膜炎に共通した面も多く認められ ている。このように、 OAの疼痛や炎症をより効率よく除去し、病態の進展を防ぐという 見地から、 OA滑膜炎の制御は重要である。
[0008] 滑膜に対する HAの作用は未だ十分には解明されていないが、アイソトープを使つ た実験から、 HAは関節腔よりも滑膜に集積しより長期に存在することが知られている 。また、滑膜組織を構成する滑膜細胞の表層には、 HAを認識するレセプター〔CD4 4や RHAMM (receptor for HA -mediated motility)〕が存在し、滑膜細胞 は表層の CD44を介して、分子量 200万以上の HAをも細胞内に取り込む機構を備 えていることも報告されている。これらの知見から、 HAの疼痛除去作用の少なくとも 一部は、滑膜への作用を介して発現している可能性が示唆されている。しかしながら HA製剤は、 OA滑膜炎で引き起こされる炎症症状そのものを抑制するまでの作用は なぐ炎症症状の強 、OAや RAに対する効果は決して十分ではな 、。
[0009] 一方、滑膜炎を制御する薬物としては、 RAの治療で用いられる修飾性抗リウマチ 薬 (以下、 DMARDとも称す）と呼ばれる薬物群が良く知られている。その中でも特に メトトレキサート（以下、 MTXとも称す）は、効力が優れていること、作用発現までの時 間が比較的短いこと、などの長所を有する薬剤である。しかし、 MTXは全身投与で のみ使用を認められている（現在、日本において、 RA治療薬として医薬品の承認を 受けているものはカプセル剤のみである。海外では、錠剤と注射剤が承認を受けて いる。）ため、治療目的部位である関節以外の部位で、その作用メカニズムに起因す る重篤な副作用 (肝障害、造血障害、肺障害、消化管障害など)を起こすことが知ら れている。その結果、使用に当たっては十分な副作用のモニタリングと副作用発症時 の対策が不可欠である。こうした副作用の懸念の大きさから、 MTXをはじめとする滑 膜炎抑制薬は、 RAに比べ症状の軽い OAなどの他の関節疾患への適応は認められ ていない。言い換えれば、 MTXの全身性の副作用を軽減する手段、もしくは薬効発 現に必要な部位でのみ MTXの作用を発現できる手段を見出せれば、より安全な RA 治療法を提供するのみならず、 OAを含む広範囲の関節疾患に MTXを用いることが 可能となる。
[0010] MTXの副作用を軽減し、望ましい薬効のみを引き出す手段として、これまでにも M TXの作用を関節内や滑膜にのみ限局させるための方法力 ^、くつ力試みられている 。例えば、 MTXを単独で局所投与（関節内投与)する方法が報告されているが、関 節内から MTXが速やかに消失してしまうため十分な薬効を発揮できない。また、リポ ゾーム化した MTXを用いることによって、マクロファージによる貪食能を利用して関 節内貯留性を向上させる方法も報告されているが、未だに臨床での有用性は確かめ られていない。このように、関節疾患治療薬としての MTXの副作用を軽減し、期待さ れる薬効のみを引き出すためには、なお技術的な改良が必要である。
[0011] 上述のように、滑膜は HAが集積しやす 、組織である。また、滑膜細胞は CD44な どの HAレセプターを介して HAを細胞内に取り込む機構を備えている。そのため、 H Aは薬物を滑膜に集積させるためのキャリアになりうる可能性が考えられる。これまで に、薬物の生体内キャリアとして、 HAを利用する技術はいくつか報告されている。し かし、 MTXを代表例とする関節疾患治療薬、特に滑膜炎制御に適した薬物のドラッ グデリバリーシステム（以下、 DDSとも称す)創出に関する技術への応用例はほとん ど知られていない。
[0012] これまでの報告例としては、例えば、 HAを含む多糖体にペプチド鎖を介して薬物 を結合した多糖体-薬物結合体が知られている（特許文献 1：特開平 5— 39306号、 特許文献 2 :国際公開 W094Z19376号など)。これらはいずれも癌組織移行性をう たった抗癌剤の DDS技術に関するものである。
[0013] 特開平 5— 39306号では、抗癌剤としての目的で MTXが用いられている。しかし、 癌組織への移行性と長期体内残留性の無さとを特徴としていることから、抗癌作用を 高めるために MTXの結合率は高く（実施例では 6. 4〜19%)、かつ、 HAの分子量 は低い（実施例では 10万ダルトン)。また、 HAの水酸基にイソウレァ結合によりぺプ チド鎖が結合して 、るので、水溶液中での安定性は低 、。
[0014] 一方、 HAと薬物とを結合させた結合体 (コンジュゲート)を関節疾患治療薬に利用 した報告例もある。例えば、国際公開 WO99Z59603号 (特許文献 2)では、ブチレ ンァミン基 (-C H NH-)およびオタチレンアミン基 (-C H NH-)などのスぺー
4 8 8 16 サーを介して結合した HAと薬物の結合体が開示されて 、る。当該特許文献にお!ヽ て、当該結合体は、細胞外での薬効を想定して、薬物が結合したままの状態で薬効 を発現するものとして記載されている。実際、当該結合体ではスぺーサーを介しての 薬物と HAとの結合が比較的強固なため、 MTXのように結合体力 遊離しなければ 薬効を発揮できな!、薬物への適応は困難である。
[0015] それにカ卩え、当該特許文献はマトリックスメタ口プロティナーゼ阻害剤（以下、 MMP Iとも称す)を薬物として用いた結合体に向けられており、開示された実施例も MMPI の結合体に関するもののみである。薬物として MTXを用いた結合体は何ら具体的に 開示されておらず、その医薬としての有用性にっ 、て何らの記載も含まれて 、な 、。
[0016] 国際公開 WO02Z44218号 (特許文献 3)では、 13—ァミノ— 4, 7, 10—トリオキ サトリデ力-ル基に更に特殊な基 (ノルボルネン)を結合させたスぺーサーを用い、ノ ルボルネンと HAの水酸基との力ルバメート結合の形成により生成した HA—薬物結 合体が開示されている。しかし、当該結合体も特許文献 2と同様に細胞外での薬効を 想定したものと考えられ、薬物が結合したままの状態で薬効を発現する。従って、結 合体力 遊離しなければ薬効を発揮できな 、薬物、例えば MTXへの適応は困難で ある。さらに、特許文献 3は、 MMPIを薬物として用いた結合体に向けられており、薬 物として MTXを用いた結合体につ!ヽては何ら示唆されて!ヽな!、。
[0017] 以上、述べた通り、上記の文献には MTXを用いた HA— MTX結合体について何 ら記載されておらず、 HA— MTX結合体を関節疾患治療薬として使用することに関 し何ら記載も示唆もされて!/、な 、。
[0018] また、先行技術として知られて 、る HA—薬物結合体の合成方法では、合成過程 で HAの分子量が大きく低下してしま 、、 HAの薬効が損なわれてしまうことを本発明 者らは確認して!/ヽる。従来の HA—薬物結合体の合成方法では一般的な有機合成 反応条件や後処理条件が用いられているが、高分子量の HAと薬物との結合体を調 製するには、さらなる改良が必要である。
[0019] このように、医薬品として用いる HA—薬物結合体、特に関節疾患治療に適した高 分子量の HA—薬物結合体、それを用いた製剤、および当該結合体の合成方法は これまで知られて 、なかった。
特許文献 1：特開平5— 39306号
特許文献 2：国際公開 WO99Z59603号パンフレット
特許文献 3：国際公開 WO02Z44218号パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0020] 発明が解決しょうとする課題は、関節疾患治療薬として有用な、ヒアルロン酸—メトト レキサート結合体を提供することである。
課題を解決するための手段
[0021] 本発明者らは、ヒアルロン酸の水酸基に、ペプチド鎖を含有するリンカ一を介してメ トトレキサートが結合しており、該リンカ一と該ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体また はそれらの塩とがカルノメート結合により共有結合して 、る、ヒアルロン酸一メトトレキ サート結合体が、関節疾患治療薬として卓効を有することを見出し、本発明を完成し た。
[0022] すなわち本発明の一つの側面により、ヒアルロン酸の水酸基に、 1〜8個のアミノ酸 力もなるペプチド鎖を含有するリンカ一を介してメトトレキサートが結合しており、該リ ンカーと該ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体またはそれらの塩とが力ルバメート基を 形成して結合している、ヒアルロン酸一メトトレキサート結合体が提供される。本発明 の 1つの実施態様において、当該リンカ一は、 1〜8個のアミノ酸力もなるペプチド鎖 、および 1〜5個の酸素原子が挿入されていてもよくおよび Zまたはカルボキシル基 または C アルコキシカルボ-ル基で置換されていてもよい C アルキレンジァミン
1-6 2-20
鎖を含むものである。
[0023] 本発明の別の側面により、リンカ一に結合したメトトレキサートが、式 (I)、 (II)、 (III) または (IV) :
[0024] [化 1]
Figure imgf000008_0001
[0025] [化 2]
H
Figure imgf000008_0002
[0026] [化 3]
Figure imgf000009_0001
[0027] [化 4]
Figure imgf000009_0002
[0028] [式中、 Rおよび Rはそれぞれ独立に、水酸基、アミノ基、 C アルコキシ基、 C ァ
1 2 1-6 1-6 ルキ /レアミノ基、またはジ C アルキルアミノ基であり；
1-6
Lは、リンカ一の結合位置である。 ]
0
で表される、上記のヒアルロン酸—メトトレキサート結合体もまた提供される。
[0029] また、本発明の別の側面により、ペプチド鎖を含有するリンカ一および当該リンカ一 に結合したメトトレキサートが、式 (Γ )または (Π' )：
[0030] [化 5]
Figure imgf000010_0001
[0031] [ィ匕 6]
Figure imgf000010_0002
[0032] [式中、 Rおよび Rはそれぞれ独立に、水酸基、アミノ基、 C アルコキシ基、 C ァ
1 2 1-6 1-6 ルキルアミノ基、またはジ—C アルキルアミノ基であり；
1-6
Lは、式 (X)
[0033] [化 7]
Figure imgf000010_0003
(X)
[0034] (式中、 Qは結合する NH と一緒になつて 1〜8個のアミノ酸力 なるペプチド鎖
1
を形成し、当該ペプチド鎖に含まれるアミノ酸の各残基は、独立に、 C アルキル基、
1-6
C アルキルカルボニル基、 C アルコキシカルボニル基、ホルミル基、 C アルキル
1-6 1-6 1-6 スルホニル基、および置換されて!/、てもよ!/、C ァリールスルホニル基からなる群か
6-10
ら選択される 1個以上の基により置換または保護されていてもよぐ当該ペプチド鎖に 含まれる各アミド結合は、独立に 1個以上の c アルキル基および Zまたは c アル キルカルボニル基で窒素原子上を置換されて 、てもよく、当該残基に含まれる各力 ルボキシル基は、独立に 1または 2個の C アルキルで置換されていてもよいアミド基
1-6
に変換されていてもよく；
R および R はそれぞれ独立に水素原子または C アルキル基であり；
11 12 1-6
Qは 1〜5個の酸素原子が挿入されていてもよくおよび
2 Zまたはカルボキシル基も しくは C アルコキシカルボ-ル基で置換されていてもよい C アルキレンであり；
1-6 2-20
[HA]はヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはそれらの塩中の水酸基の位置 を表し、リンカ一と該ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはそれらの塩とが該位 置で力ルバメート基により結合し;および
「ー0—[11八]」中の酸素原子「ー0—」は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、ま たはそれらの塩中の任意の位置における水酸基に由来する酸素原子を表す)で表さ れるリンカ一である。 ]
で表される、上記のヒアルロン酸—メトトレキサート結合体が提供される。
[0035] さらに本発明のその他の側面によれば、上記ヒアルロン酸ーメトトレキサート結合体 を有効成分として含有する医薬組成物、および関節疾患治療薬もまた提供される。
[0036] さらに本発明の別の側面によれば、上記のヒアルロン酸ーメトトレキサート結合体の 製造に利用することができる、式 (Va)または (Vb)：
[0037] [化 8]
Figure imgf000011_0001
[0038] [化 9]
,
)
Figure imgf000012_0001
[0039] [式中、 Rおよび Rはそれぞれ独立に、水酸基、アミノ基、 C アルコキシ基、 C ァ
1 2 1-6 1-6 ルキルアミノ基、またはジ—C アルキルアミノ基であり；
1-6
Lは、式 (Χ' )
1
[0040] [化 10]
Figure imgf000012_0002
[0041] または式 (X" )
[0042] [化 11]
^i^†!— Q2-N=C =0
R11
(X ")
(式中、 Qは結合する一 NH—と一緒になつて 1〜8個のアミノ酸力 なるペプチド鎖
1
を形成し、当該ペプチド鎖に含まれるアミノ酸の各残基は、独立に、 C アルキル基、
1-6
C アルキルカルボニル基、 C アルコキシカルボニル基、ホルミル基、 C アルキル
1-6 1-6 1-6 スルホニル基、および置換されて!/、てもよ!/、C ァリールスルホニル基からなる群か
6-10
ら選択される 1個以上の基により置換または保護されていてもよぐ当該ペプチド鎖に 含まれる各アミド結合は、独立に 1個以上の c アルキル基および
1-6 Zまたは c アル
1-6 キルカルボニル基で窒素原子上を置換されて 、てもよく、当該残基に含まれる各力 ルボキシル基は、独立に 1または 2個の C アルキルで置換されていてもよいアミド基
1-6
に変換されていてもよく；
R および R はそれぞれ独立に水素原子または C アルキルであり；
11 12 1-6
R は、 C アルキル基、カルボキシミド基、置換されていてもよいへテロアリール基
13 1-6
、または置換されていてもよい C ァリール基であり；
6-18
Qは 1〜5個の酸素原子が挿入されていてもよくおよび Zまたはカルボキシル基も
2
しくは C アルコキシカルボニル基で置換されていてもよい C アルキレンである。 )
1-6 2-20
である。 ]の化合物またはその塩が提供される。
[0044] さらに本発明の別の側面によれば、上記の式 (Va)または (Vb)の化合物またはそ の塩を、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはそれらの塩と反応させ、当該ヒア ルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはそれらの塩の水酸基の位置で力ルバメート基 により式 (Va)または (Vb)の化合物またはその塩を結合させる工程を含む、上記のヒ アルロン酸—メトトレキサート結合体の製造方法もまた提供される。
[0045] 以下本発明の詳細について説明する。
[0046] 本発明のヒアルロン酸ーメトトレキサート結合体 (HA—MTX結合体）は新規化合 物である（以下、 HA— MTX結合体において、 HAはヒアルロン酸誘導体、その塩、 またはヒアルロン酸の塩であってもよい）。本発明では、ヒアルロン酸 (HA)とメトトレキ サー HMTX)とを結合させる手段として、 HAの水酸基に、ペプチド鎖を含有するリ ンカーを介して MTXが結合しており、該リンカ一と該 HAとが力ルバメート基を形成し て結合している構造を採用したことにより、 HAの疼痛除去作用を保持し、かつ、 MT Xの滑膜炎軽減作用を併せ持つ HA—MTX結合体が得られる。即ち、本発明の H A— MTX結合体は、滑膜に集積した後、滑膜細胞内に取り込まれ、細胞内で MTX の薬効を発現すると考えられる。
[0047] 従って、本発明 HA— MTX結合体を OAまたは RA患者の関節内、例えば膝、肩、 肘の関節内に投与した場合、従来の HA製剤同様、 HAの特性に基づく疼痛除去作 用を発現する一方で、滑膜組織に蓄積しながら、徐々に滑膜細胞内に取り込まれ、 MTXを解離することにより、滑膜炎抑制作用を持続的に発現する。これにより、経口 投与に比べ MTXの投与量を大幅に低減することが可能であり、経口投与で問題と なる全身性の副作用を軽減できる。また、投与部位において、 HA製剤と MTXの両 者は、作用機序の異なる薬理効果を発現し得るので、両者相俟つた相乗的な薬効が 期待できる。本発明の HA— MTX結合体では、 HA自身が薬効を示すだけでなぐ MTXを限局させるキャリアとしても作用する。
[0048] 即ち、本発明の HA—MTX結合体により、関節注入剤としての HAの側面を持ちな がら、 MTXの滑膜炎抑制作用を投与関節内でのみ安全に発現させることができる、 従来にな!、優れた関節疾患治療薬が提供される。
[0049] 本発明のヒアルロン酸ーメトトレキサート結合体（HA—MTX結合体）は、ヒアルロン 酸の水酸基に、ペプチド鎖を含有するリンカ一を介してメトトレキサートが結合してお り、該リンカ一と該ヒアルロン酸とが力ルバメート基を形成して結合しているものである 。ここで力ルバメート基とは一 NRCOO—基 (Rとしては、例えば式 (X)の R として記
12 載した基が挙げられる）を指す。力ルバメート結合または力ルバメート基による結合と は力ルバメート基を介した結合をいう。本発明のヒアルロン酸—メトトレキサート結合体 において、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはそれらの塩中の任意の水酸基 とリンカ一と力 力ルバメート基を介して結合している状態を「一 NRCO— O— [HA]」 、 「一 NHCO— 0—[HA]」または「MTX—（ペプチド鎖を含有するリンカ一）—O— [HA]」などと示し、ここで、 「― O— [HA]」中に表される酸素原子「-0-」は、ヒア ルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはそれらの塩中の任意の位置における水酸基に 由来する酸素原子である。
[0050] 本発明にお!/、て「ヒアルロン酸 (HA)」とは、一般にヒアルロン酸と称されて 、る物質 、例えばグルクロン酸と N—ァセチルダルコサミンとを繰り返し単位として含む高分子 多糖であればよぐ特に限定はされない。例えば平均分子量 5万〜 1000万ダルトン を有する、グルクロン酸と N—ァセチルダルコサミンと力 成る二糖の重合体である。 ヒアルロン酸の塩には、特に限定はされないが、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カル シゥム塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、鉄塩、アンモ-ゥム塩、テトラプチルアンモ -ゥム 塩などが含まれる。ヒアルロン酸及びその塩、並びにそれらの混合物の具体例には、 例えば、商品名 スべニール (登録商標:製造販売 中外製薬株式会社）；商品名 ァルツ (登録商標:製造 生化学工業株式会社、販売 科研製薬株式会社）；商品名 オペガン (登録商標:製造 生化学工業株式会社、販売 参天製薬株式会社)など が含まれる。本発明において「ヒアルロン酸誘導体」とは、 HAから誘導される HA骨 格を有する物質を意味する。ヒアルロン酸誘導体としては、特に限定はされないが、 例えば、 HA中の一つ以上のカルボキシル基がエステル化されて!/、る物質（例えば、 ベンジルエステル化 HA (商品名 Hyaff (登録商標）、 Fidia Advanced Biopoly mers) )、 HAをホルムアルデヒドで架橋しさらに高分子化した物質 (例えば、商品名 Synvisc (登録商標）、 Biomatrix) )、 HA中の一つ以上の水酸基がァセチル化さ れているァセチル化 HA、などを包含する。
[0051] 本発明 HA— MTX結合体は、 HAの疼痛除去作用を発現させるため、 HA— MT X結合体として、臨床での疼痛除去作用が確認されている HAと同等の分子量サイズ と粘弾性を保持したものであることが好ましい。また、分子量が大きくなると粘弾性が 上がりハンドリングが困難になること、および生体内におけるキャリアとしての HAの効 果を考慮すると、具体的には、 HA— MTX結合体としての分子量が 60万〜 600万 ダルトンであることが好ましぐ HA— MTX結合体としての分子量が 80万〜 600万ダ ルトンであることがより好ましぐ HA— MTX結合体としての分子量が 100万〜 500万 ダルトンであることが特に好まし 、。
[0052] ここで、上記した原料 HAの分子量、 HA— MTX結合体の分子量は、極限粘度か ら粘度平均分子量を算出する方法で測定したものである。極限粘度（[ 7? ])から粘度 平均分子量 (Mw)への換算は、以下の式を用いて算出することができる。
Mw= ( [ r? ]/0. 00036) 1 282
本発明のペプチド鎖を含有するリンカ一におけるペプチド鎖は、アミノ酸により構成 される。当該アミノ酸には、グリシン、ァラニン、セリン、プロリン、ノ《リン、トレオニン、シ スティン、ロイシン、イソロイシン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、リジン、グルタミン、 グルタミン酸、メチォニン、ヒスチジン、フエ-ルァラニン、アルギニン、チロシン、トリプ トフアンなどの天然 α—アミノ酸の他に、アルキル側鎖を持つ α—アミノ酸 (例えば、 ノルパリン、ノルロイシン、 t—ロイシンなど）、シクロアルキル基で置換されたァラニン やグリシン（例えば、シクロペンチルァラニン、シクロへキシルァラニン、シクロへキシ ルグリシンなど）、またはァリール基で置換されたァラニンやグリシン (例えば、ピリジ ルァラニン、チェ-ルァラニン、ナフチルァラニン、置換フエ-ルァラニン、フエ-ルグ リシンなど）などの非天然 α—アミノ酸、 β—ァラニンなどの β—アミノ酸、 γ—ァミノ 酪酸などの γ—アミノ酸、およびタウリンなどのアミノスルホン酸などが含まれる。本発 明のリンカ一ペプチドにおけるアミノ酸には、その残基が適切に置換または保護され たものも含まれる。例えば、当該残基上の官能基は、保護基を用いて保護され得る。 この目的のために使用する保護基は当該技術分野で周知であり、その一部の例は、 本明細書の他の段落に記載される。各置換基および保護基、特に保護基の導入方 法は、当該技術分野にお!、て周知のものを用いればよ!、。
[0053] 当該リンカ一はアミノ酸のみにより構成されていてもよぐまたはペプチド鎖の中また は末端にアミノ酸以外の化合物に由来する部分を含んでいてもよい。例えば、アルキ レンジァミン、ォキサアルキレンジァミンのようなジァミノ化合物ゃコハク酸のようなジ カルボン酸ィ匕合物がペプチド鎖の中または末端に結合したものなども当該リンカ一 に含まれる。ペプチド鎖の中または末端にアミノ酸以外の化合物を含む場合で、当 該リンカ一が ΜΤΧのカルボキシル基とヒアルロン酸の水酸基に結合する場合には、 アルキレンジァミン、ォキサアルキレンジァミンのようなジァミノ化合物がペプチド鎖の 末端に存在することが好ましぐ 4, 7, 10 トリオキサ一 1, 13 トリデカンジァミンが ペプチド鎖の末端に存在することが特に好ましい。また、ペプチド鎖を構成するァミノ 酸は特に限定されないが、プロテアーゼに対する親和性の観点から、 a アミノ酸が 好ましぐペプチド鎖を含有するリンカ一の MTXに結合する末端はひ—アミノ酸であ ることが好ましい。
[0054] 当該ペプチド鎖を構成するアミノ酸の数は、特に限定はされないが、典型的には 1 〜8であり、好ましくは 1〜6であり、特に好ましくは 1〜4である。
[0055] 当該ペプチド鎖を構成するアミノ酸の各残基は、独立に 1個以上の基により適切に 置換または保護され得る。そのような基には、 C アルキル基、 C アルキルカルボ-
1-6 1-6
ル基、 C アルコキシカルボニル基（例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボ二
1-6
ル基、（n または i一）プロピルォキシカルボニル基、および（n—、 s—、または t一） ブトキシカルボ-ル基）、ホルミル基、 C アルキルスルホ -ル基（例えば、メタンスル
1-6
ホ-ル基、エタンスルホ-ル基、および（n—または i—)プロパンスルホ-ル基）、置換 されて 、てもよ 、C ァリールスルホ -ル基（例えば、ベンゼンスルホ-ル基、（o—、
6-10
m—または p—)トルエンスルホ-ル基、および（1 または 2—）ナフタレンスルホ-ル 基)が含まれるが、これらに限定されない。例えば、置換または保護により、当該残基 に含まれるカルボキシル基は C アルコキシカルボ-ル基に、ヒドロキシ基は C アル
1-6 1-6 コキシ基または C アルキルカルボ-ルォキシ基に、アミノ基は C アルキルアミノ基
1-6 1-6
、ジ C アルキルアミノ基、 C アルキルカルボ-ルァミノ基または N— C アルキル
1-6 1-6 1-6
C アルキルカルボ-ルァミノ基にそれぞれ変換されていてもよい。また、当該残基
1-6
に含まれるカルボキシル基は、 1または 2個の C アルキル基で置換されていてもよい
1-6
アミド基に変換されて 、てもよ 、。当該残基中にインドール環やイミダゾール環のよう な含窒素複素環が含まれる場合は、その環上の窒素原子は、各々独立して、 C ァ
1-6 ルキル基または c アルキルカルボニル基で保護されていてもよい。当該残基中に
1-6
グァ -ジノ基が存在する場合には、そこに含まれている窒素原子も、 C アルキル基
1-6
または C アルキルカルボニル基で保護され得る。窒素原子に対する他の保護基と
1-6
しては、限定されないが、上記した C アルコキシカルボニル基、ホルミル基、 C ァ
1-6 1-6 ルキルスルホニル基、置換されて!/、てもよ!/、C ァリールスルホニル基のような通常
6-10
用いられるものを選択することもできる。チオール基が当該残基に含まれる場合は、 C アルキル基または C アルキルカルボニル基で保護され得る。また、当該べプチ
1-6 1-6
ド鎖に含まれるアミド結合またはペプチド結合も、その窒素原子上を C アルキル基
1-6
および Zまたは C アルキルカルボニル基で置換されていてもよぐ例えば CON (
1-6
C アルキル） に変換されて!/、てもよ！/、。
1-6
[0056] ペプチド鎖を構成するアミノ酸配列は特に限定されな!、が、例えば、以下のようなも のが挙げられる。尚、ターゲットとなる生体内プロテアーゼが存在し、その基質認識ァ ミノ酸配列が既知の場合、その認識部位および Zまたは切断部位を含むアミノ酸配 列を用いてもよい。
[0057] アミノ酸 1個力もなるペプチド鎖： Ala、 Arg、 Asn、 Asp、 Cys、 Gln、 Glu、 Gly、 His ゝ lieゝ Leuゝ Lysゝ Metゝ Pheゝ Pro、 Serゝ Thrゝ Trpゝ Tyrゝ Val、など。好ましくは、 P heゝ Tyr、 Ile、 Glu。
[0058] アミノ酸 2個からなるペプチド鎖： PhePhe、 PheGly、 PheLeu、 TyrPhe、 TrpPhe 、 PheTrp、 PheTyr、 GlyPhe、 GlyGly,など。好ましくは、 PhePhe、 PheGlyG
[0059] アミノ酸 3個力らなるペプチド鎖： PheGlyGly、 PheLeuGly, PhePheGly, AsnPh ePhe、 GlyPhePhe, LeuPhePhe, LeuAlaLeu、 AlaValAla, GlyAlaPhe, GlyP heAla, GlylleAla, GlyllePhe, GlyLeuAla, GlyValAla, GlyValPhe, GlyGly Gly、など。好ましくは、 AsnPhePhe。
[0060] アミノ酸 4個力らなるペプチド鎖： GlyPheLeuGly、 GlyPhePheLeu, GlyPhePhe Ala、 GlyPheTyrAla, GlyPheGlyPheゝ GlyPheGlyGly, GlyGlyPheGly, GlyG lyPheTyr, GlyGlyGlyGly, LeuAlaLeuAla, AlaLeuAlaLeu, AlaGlyValPheゝ GluAsnPhePhe,など。好ましくは、 GlyPheLeuGly0
[0061] 本発明におけるリンカ一は、例えば上記式 (X)で示される構造を有していてもよぐ その場合 Qは結合する—NH と一緒になつて上述したような 1〜8個のアミノ酸から
1
なるペプチド鎖を形成する。また、 Qは 1〜5個の酸素原子が挿入される力 または
2
カルボキシル基または C アルコキシカルボ-ル基で置換されていてもよい C アル
1-6 2-20 キレンである。 Qの具体例としては、ェタン一 1, 2 ジィル基、プロパン一 1, 3 ジィ
2
ル基、ブタン—1, 4 ジィル基、ペンタン 1, 5 ジィル基、へキサン 1, 6 ジィ ル基、ヘプタン 1, 7 ジィル基、オクタン 1, 8 ジィル基、ノナン一 1, 9ージィ ル基、デカン—1, 10 ジィル基、 2 メチルプロパン 1, 3 ジィル基、 2 メチル ブタン 1, 4 ジィル基、 3 メチルブタン 1, 4 ジィル基、 3—メチルペンタン 1, 5 ジィル基、 3 ェチルペンタン 1, 5 ジィル基、 2—メチルへキサン 1, 6 ジィル基、 3—メチルへキサン—1, 6 ジィル基、 4 メチルヘプタン 1, 7 ジィ ル基、 3 ォキサペンタン 1, 5 ジィル基、 3—ォキサへキサン 1, 6 ジィル基 、 4ーォキサへキサン 1, 6 ジィノレ基、 3 ォキサヘプタン 1, 7 ジィノレ基、 4 ォキサヘプタン 1, 7 ジィル基、 4 ォキサオクタン 1, 8 ジィル基、 3, 6 ジ ォキサオクタン 1, 8 ジィノレ基、 3, 6 ジォキサノナン 1, 9ージィノレ基、 3, 6— ジォキサ一 4—メチルノナン一 1, 9 ジィル基、 4, 7 ジォキサデカン一 1, 10 ジ ィル基、 4, 9 ジォキサドデカン一 1, 12 ジィル基、 4, 7, 10 トリオキサトリデカ ン一 1, 13 ジィル基などが挙げられ、好ましくは、ェタン一 1, 2 ジィル基、ペンタ ン 1, 5 ジィノレ基、 3 ォキサペンタン 1, 5 ジィノレ基、 3, 6 ジォキサォクタ ン一 1, 8 ジィノレ基、 4, 7 ジォキサデカン一 1, 10 ジィノレ基、 4, 9 ジォキサド デカン— 1, 12 ジィル基、 4, 7, 10 トリオキサトリデカン— 1, 13 ジィル基など が挙げられる。
[0062] 本発明 HA—MTX結合体は、 HAの水酸基に、ペプチド鎖を含有するリンカ一を 介して MTXが結合し、該リンカ一と該ヒアルロン酸とが力ルバメート結合により結合す るものであればどのような結合様式をとつていてもよい。即ち、ペプチド鎖を含有する リンカ一は、
1) MTXの α位のカルボキシル基；
2) ΜΤΧの γ位のカルボキシル基；および
3) ΜΤΧのァミノ基と結合しうるものであり、さらにこれらの結合様式が複数混在 (例え ば、 ΜΤΧの α位のカルボキシル基で結合した結合体と、 ΜΤΧの γ位のカルボキシ ル基で結合した結合体が混在）して 、てもよ、。プロテアーゼに対する親和性と合成 上の観点からは、ペプチド鎖を含有するリンカ一は ΜΤΧの α位のカルボキシル基及 び Ζまたは Ί位のカルボキシル基と結合して 、ることが好ましぐ当該リンカ一は ΜΤ の a位のカルボキシル基と結合して 、ることがより好まし！/、。
[0063] 本発明の HA— MTX結合体において、ペプチド鎖を含有するリンカ一およびその 結合様式のうち特に好ましいものは、ペプチド鎖を含有するリンカ一が a アミノ酸 力 なるペプチド鎖の末端にジァミノ化合物が存在するものであり、そのペプチド鎖 の N末端が MTXの α位のカルボキシル基に酸アミド結合によって結合し、そのぺプ チド鎖の C末端がジァミノ化合物を介して ΗΑの水酸基と力ルバメート基により結合し ているものである。
[0064] 本発明のヒアルロン酸一メトトレキサート結合体におけるメトトレキサート（ΜΤΧ)部 分は、リンカ一による修飾以外に、公知の方法によりプロドラッグィ匕されていてもよい。
[0065] 本明細書において C アルキル基は、炭素数 1
1-6 〜6の直鎖または分枝鎖状のアル キル基を意味し、例えば、メチル基、ェチル基、 η—プロピル基、 i—プロピル基、 n— ブチル基、 s ブチル基、 i ブチル基、 t ブチル基、 n ペンチル基、 3—メチルブ チル基、 2—メチルブチル基、 1 メチルブチル基、 1 ェチルプロピル基、及び n— へキシル基等を含む。
[0066] 本明細書において C アルキルカルボニルは、炭素数 1〜6の直鎖または分枝鎖
1-6
状のアルキルカルボ二ル基を意味し、例えば、ァセチル基、プロピオ-ル基、 2—メ チルプロピオ-ル基、 2, 2—ジメチルプロピオ-ル基などの既に定義したアルキル基 をアルキル部分として有するものが含まれる。
[0067] 本明細書において C アルコキシは、炭素数 1〜6の直鎖または分枝鎖状のアルコ
1-6
キシ基を意味し、例えばメトキシ基、エトキシ基、 n プロポキシ基などの既に定義し たアルキル基をアルキル部分として有するものが含まれる。
[0068] 本明細書において C アルキルアミノは、炭素数 1〜6の直鎖または分枝鎖状のァ
1- 6
ルキルアミノ基を意味し、例えばメチルァミノ基、ェチルァミノ基、 n—プロピルアミノ基 などの既に定義したアルキル基をアルキル部分として有するものが含まれる。
[0069] 本明細書においてジ C アルキルアミノは、炭素数 1〜6の直鎖または分枝鎖状の
1-6
ジアルキルアミノ基を意味し、例えばジメチルァミノ基、ェチルメチルァミノ基、ジェチ ルァミノ基、ェチル n—プロピルアミノ基などの、同一または異なってもよい既に定義 したアルキル基をアルキル部分として有するものが含まれる。
[0070] 本明細書において C アルキレンは、炭素数 2〜20の直鎖または分枝鎖状のアル
2- 20
キレン基を意味し、例えばエチレン基、プロピレン基、ブチレン基、オタチレン基、デ カレン基などが含まれる。
[0071] 本明細書において C アルコキシカルボ-ル基は、炭素数 1〜6の直鎖または分枝
1-6
鎖状のアルコキシカルボ-ル基を意味し、例えばメトキシカルボ-ル基、エトキシカル ボニル基、 n—プロポキシカルボ-ル基などの既に定義したアルキル基をアルキル部 分として有するものが含まれる。
[0072] 本明細書において C アルキルスルホニル基は、炭素数 1〜6の直鎖または分枝鎖
1-6
状のアルキルスルホ -ル基を意味し、例えばメタンスルホ-ル基、エタンスルホ-ル 基、 n プロパンスルホ-ル基などの既に定義したアルキル基をアルキル部分として 有するものが含まれる。
[0073] 本明細書においてカルボキシミド基は、環状であっても鎖状であってもよぐ 1また は複数の置換基で置換されていてもよい。式 (Χ' )及び (X' ' )において、カルボキシ ミド基は Ν原子で Ο原子と結合する。当該カルボキシミド基の具体例としては、例えば スクシンイミド基、フタルイミド基、 5 ノルボルネン 2, 3 カルボキシミド基、マレイ ミド基、ダルタルイミド基などが挙げられる。
[0074] 本明細書においてァリール基は、 1または複数の置換基で置換されていてもよい炭 素数 6〜 18のァリール基を意味し、単環式であっても多環式であってもよい。ここで 置換基としては、既に定義した C アルキル基;既に定義した C アルコキシ基;フッ
1-6 1-6
素、塩素、臭素、ヨウ素などのハロゲン;ニトロ基;既に定義した c アルコキカルボ-
1-6
ル基；ァシル基；水酸基；シァノ基；置換または無置換のアミノ基等が挙げられる。当 該ァリール基の具体例としては、例えばフヱ-ル基、ニトロフヱ-ル基、フルオロフェ -ル基、クロロフヱ-ル基、ナフチル基、アントラ-ル基、などが挙げられる。
[0075] 本明細書において C ァリールスルホ -ル基は、 1または複数の置換基で置換さ
6-10
れていてもよい炭素数 6〜 10のァリール部分を有するァリールスルホ-ル基を意味し 、当該ァリール部分は単環式であっても多環式であってもよい。ここで置換基として は、既に定義した C アルキル基;既に定義した C アルコキシ基;フッ素、塩素、臭
1-6 1-6
素、ヨウ素などのハロゲン；ニトロ基;既に定義した C アルコキカルボニル基；ァシル
1-6
基;シァノ基等が挙げられる。 C ァリールスルホ-ル基の例には、ベンゼンスルホ-
6-10
ル基、（o—、 m—または ρ—)トルエンスルホ-ル基、および（1—または 2—)ナフタレ ンスルホニル基等が含まれる。
[0076] 本明細書においてへテロアリール基は、 1つ以上のへテロ原子を環中に有する 5若 しくは 6員の芳香環を含有する基を意味し、縮合していてもよぐ 1または複数の置換 基で置換されていてもよい。ヘテロ原子には、窒素、酸素、硫黄が含まれる。置換基 には前述のァリール基にっ 、て記載した置換基やォキソ基が含まれる。ヘテロァリー ル基には、ピリジル、ピラジュル、ピリミジニル、ピリダジ -ル、ピロリル、イミダゾリル、 ピラゾリル、トリァゾリル、トリアジニル、テトラゾリル、ォキサゾリル、インドリジニル、イン ドリル、イソインドリル、インダゾリル、プリニル、キノリジ -ル、イソキノリル、キノリル、フ タラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、ォキサジァゾリル、チアゾリル、チアジア ゾリル、ベンズイミダゾリルが含まれる。中でも、トリァゾリル、トリアジニルが好ましい。 [0077] 本明細書においてトリァゾリル基は、何れの異性体であってもよぐ 1または複数の 置換基で置換されていてもよい。式 (Χ' )及び (X' ' )において、トリァゾリル基は Ν原 子で Ο原子と結合することが好ましい。当該トリァゾリル基の具体例としては、例えば ベンゾトリアゾリル基、 7—ァザべンゾトリァゾリル基、などが挙げられる。
[0078] 本明細書においてトリアジ-ル基は、何れの異性体であってもよぐ 1または複数の 置換基で置換されていてもよい。式 (Χ' )及び (X' ' )において、トリアジ-ル基は Ν原 子で Ο原子と結合することが好ましい。当該トリアジニル基の具体例としては、例えば 3, 4 ジヒドロ一 4—ォキソ 1, 2, 3 ベンゾトリアジ-ル基などが挙げられる。
[0079] 本明細書におけるァシル化には、 C アルキルカルボニル化；およびべンゾィルイ匕
1-6
などが含まれ、当該ベンゾィル基は C アルキル、ハロゲン原子、 C アルコキシなど
1-6 1-6
で置換されていてもよい。
[0080] 本発明 ΗΑ— ΜΤΧ結合体における ΜΤΧの結合率は、薬効を発揮し副作用が軽 減される範囲であることが好ましい。本明細書における ΜΤΧの結合率は、以下の式:
[0081] [化 12]
, 、、 （分子中に結合する ΜΤΧ部分の数）
(ΜΤΧの結合率 ( ¾) )= (分子中の Ν -ァセチルグルコサミン部分の数） Χ 1 0°
[0082] により算出される。本明細書において、 ΜΤΧの結合率は紫外線吸収スペクトルに基 づいて算出した値を用いる。 ΜΤΧの結合率は、特に限定はされないが、薬効発現の 観点から 0. 5%以上が好ましぐ 1. 0%以上がより好ましい。一方で、 ΜΤΧの作用を 投与部分に限局させ、 ΜΤΧの有する全身性の副作用を低減するためには、結合率 は 10%より小さいことが好ましい。また、本発明 HA— ΜΤΧ結合体は、分子量が大き ぐかつ、 ΜΤΧの結合率が高いと不溶ィ匕を起こし合成上の不都合が生じることを考 慮すると、 ΜΤΧの結合率は 0. 5%以上かつ 4. 5%より小さいことが好ましぐ 1. 0% 以上かつ 4. 5%より小さ 、ことが特に好まし 、。
[0083] 本発明 ΗΑ— ΜΤΧ結合体は、塩として存在することもできる力 その用途を考慮す れば薬学上許容可能な塩であることが好ま 、。 [0084] HA— MTX結合体の薬学的に許容可能な塩には、当該技術分野で通常用いられ る非毒性の塩基付加塩、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、またはアン モ -ゥム塩が含まれる。そのような塩基付加塩には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシ ゥム塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、鉄塩、マグネシウム塩、アンモニゥム塩、トリメチル アンモ-ゥム塩、トリェチルアンモ -ゥム塩、ピベリジ-ゥム塩、モルホリュウム塩、ピロ リジ -ゥム塩、ベンジルアンモ -ゥム塩、ジエタノールアンモ-ゥム塩、トリエタノール アンモニゥム塩、テトラプチルアンモ-ゥム塩等が含まれる力 これらに限定されない
[0085] また、 HA— MTX結合体の薬学的に許容可能な塩には、当該技術分野で通常用 V、られる非毒性の無機または有機酸の付加塩も含まれる。そのような酸付加塩の例 には、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、フッ化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水 素塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、硝酸塩、亜リン酸塩、蟻酸塩、酢酸 塩、トリフルォロ酢酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、糖酸塩、フマル酸塩、マレイン酸 塩、乳酸塩、クェン酸塩、酒石酸塩、ダルコン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスル ホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、 p—トルエンスルホン酸塩及びパモ酸塩などが含 まれるが、これらに限定されない。
[0086] 本発明 HA— MTX結合体の合成にあたっては、 HA、ペプチド鎖を含有するリンカ 一、 MTXを適当な順番で結合させることによって得ることができる。例えば、 HA—ぺ プチド鎖を含有するリンカ一を構築した後に MTXを導入するルートや、 MTX—ぺプ チド鎖を含有するリンカ一を構築した後に HAに導入するルートが挙げられる。そして 、 MTX—ペプチド鎖を含有するリンカ一と HAの水酸基との間に力ルバメート結合を 形成するには、 MTX—ペプチド鎖を含有するリンカ一のアミノ基側を活性ィ匕する方 法と HAの水酸基側を活性化する方法が挙げられる。結合率と HA分子量の制御の し易さを考慮すると、 MTX—ペプチド鎖を含有するリンカ一を構築し活性体とした後 に HAに導入するルートが好ましい。ここで、活性体としては、式 (Va)及び式 (Vb)： [0087] [化 13]
Figure imgf000024_0001
[0088] [化 14]
Figure imgf000024_0002
[0089] [式中、 Rおよび Rはそれぞれ独立に、水酸基、アミノ基、 C アルコキシ基、 C 了
1 2 1-6 1-6 ルキルアミノ基、またはジ C アルキルアミノ基であり；
1-6
Lは、式 (Χ')
1
[0090] [化 15]
Figure imgf000024_0003
[0091] または式 (Χ'') [0092] [化 16]
Figure imgf000025_0001
(X ")
[0093] (式中、 Qは結合する一 NH—と一緒になつて 1〜8個のアミノ酸力 なるペプチド鎖
1
を形成し、当該ペプチド鎖に含まれるアミノ酸の各残基は、独立に、 C アルキル基、
1-6
C アルキルカルボニル基、 C アルコキシカルボニル基、ホルミル基、 C アルキル
1-6 1-6 1-6 スルホニル基、および置換されて!/、てもよ!/、C ァリールスルホニル基からなる群か
6-10
ら選択される 1個以上の基により置換または保護されていてもよぐ当該ペプチド鎖に 含まれる各アミド結合は、独立に 1個以上の c アルキル基および
1-6 Zまたは c アル
1-6 キルカルボニル基で窒素原子上を置換されて 、てもよく、当該残基に含まれる各力 ルボキシル基は、独立に 1または 2個の C アルキルで置換されていてもよいアミド基
1-6
に変換されていてもよく；
R および R はそれぞれ独立に水素原子または C アルキルであり；
11 12 1-6
R は水素原子、 C アルキル基、カルボキシミド基、置換されていてもよいへテロア
13 1-6
リール基、または置換されていてもよい C ァリール基であり；
6-18
Qはじ アルキレンであり、当該アルキレンは 1〜5個の酸素原子が挿入されてい
2 2-20
てもよくおよび Zまたはカルボキシル基若しくはじ アルコキシカルボ-ル基で
1-6 置換さ れていてもよい。）である。 ]
が挙げられる。
[0094] R において用いられるヘテロァリール基およびァリール基は、 1個以上の置換基に
13
より置換されていてもよい。そのような置換基は、限定されないが、ァリール基との関 係で既に例示されたいずれのものでもよぐ例えば、既に定義した C アルキル基;フ
1-6
ッ素、塩素、臭素、ヨウ素などのハロゲン；および-トロ基等である。
[0095] R は、 C アルキル基および置換されていてもよいァリール基が好ましぐフエ-ル
13 1-6
基および-トロフエ-ル基 (好ましくは o—または p— )が特に好まし 、。 [0096] 活性体は単離して用いてもよぐ in— situで生成させて力も反応させてもよい。また 、単離した活性体は、有機合成上許容される塩の形態で提供することもできる。その ような塩は、 HA— MTX結合体に関連して既に例示された ヽずれの酸付加塩または 塩基付加塩でもよい。活性体の塩の例には、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸 塩、フッ化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素 塩、硝酸塩、亜リン酸塩、蟻酸塩、酢酸塩、トリフルォロ酢酸塩、安息香酸塩、コハク 酸塩、糖酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、クェン酸塩、酒石酸塩、ダルコン 酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、 p トルエン スルホン酸塩及びパモ酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩 、亜鉛塩、鉄塩、マグネシウム塩、アンモニゥム塩、トリメチルアンモ -ゥム塩、トリェチ ルアンモ -ゥム塩、ピベリジ-ゥム塩、モルホリュウム塩、ピロリジ -ゥム塩、ベンジル アンモ-ゥム塩、ジエタノールアンモ-ゥム塩、トリエタノールアンモ-ゥム塩、テトラブ チルアンモ-ゥム塩等が含まれる力 これらに限定されない。
[0097] 力ルバメート結合形成反応の条件は、 MTX リンカ一に応じて適宜選択される。
例えば、一般に用いられる溶媒と必要に応じて反応促進性の添加剤とを用いて、 20°C〜50°Cの温度で、数分〜数日間反応させることで行うことができる。
[0098] 溶媒としては、例えば、水、 N, N ジメチルホルムアミド、 N, N ジメチルァセタミ ド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジォキサン、メタノール、エタノール、ジ クロロメタン、クロ口ホルムなどが挙げられる。これらの溶媒は単独で用いてもよぐ組 み合わせて用いてもよい。
[0099] 反応促進性の添加剤としては、例えば、相間移動触媒や塩基が挙げられる。相間 移動触媒としては、各種のハロゲン化 4級アンモ-ゥム、例えばセチルピリジ-ゥムク 口ライド、テトラプチルアンモ -ゥムブロマイド、セチルトリメチルアンモ-ゥムブロマイ ド、ベンジルセチルジメチルアンモ -ゥムクロライドなどが挙げられ、セチルピリジ-ゥ ムクロライドが好ましい。塩基としては、トリェチルァミン、トリブチルァミン、 N—メチル モルホリン、 N, N ジイソプロピルェチルァミン、トリス [2— (2—メトキシェトキシ）ェ チル]ァミンなどが挙げられ、トリプチルァミンが好ましい。これらの添加剤は単独で用 いてもよぐ組み合わせて用いてもよい。 [0100] 反応の際、アミノ酸側鎖等の官能基、例えば水酸基、カルボキシル基、アミノ基等 は、必要に応じて通常の有機合成において汎用される保護基を用いることができる。
[0101] 反応温度は、薬効のある HA— MTX結合体が得られる限り特に制限はないが、典 型的には— 10°C以上、好ましくは 0°C以上であり、 40°C以下、好ましく 30°C以下で ある。反応時間に特に制限はないが、均一な反応を行うという点からは 1時間以上で あり、経済的には 24時間以下、好ましくは 12時間以下である。
[0102] 本発明において「関節疾患」とは、具体的には、関節軟骨欠損、変形性関節症 (明 らかな原因のない 1次性と原因疾患が認められる 2次性を含む)、肩関節周囲炎、関 節リウマチ、反応性関節炎、ウィルス性関節炎、ィヒ膿性関節炎、結核性関節炎、神 経性関節症などの疾患を指し、さらに、これら疾患における関節痛 (例えば、関節リウ マチにおける膝関節痛など)をも包含する。また、「関節疾患治療薬」とは、前記関節 疾患の治療に用いられる薬剤だけでなぐ予防に用いられる薬剤、病態の進展抑制 (悪化の防止や現状維持)等のために用いられる薬剤をも包含する。
[0103] 本発明 HA— MTX結合体は、その有効量に、適宜、製薬上許容しうる担体、賦型 剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、香料、着色剤等を加えて医薬組成物として用いること ができる。本発明 HA— MTX結合体を有効成分とする医薬組成物は、関節疾患治 療薬として用いられることが好ましぐその中でも関節局所投与製剤として用いられる ことが特に好ましい。
[0104] 本発明 HA— MTX結合体を関節疾患治療薬として製剤化するに際しては、特に 限定されないが、例えば、生理食塩水やリン酸生理食塩水等に所望の濃度に溶解さ せ、注射用製剤として製剤化することができる。この際、必要に応じて、酸又は塩基を カロえることにより、溶液を所望の pHに調整してもよい。また、ナトリウム塩、カリウム塩 等の 1価の金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩等の 2価の金属塩等 の無機塩等を加えることにより、溶液を所望の塩濃度に調整してもよい。更に、所望 に応じて、安定化剤等が加えられていてもよい。このようにして調製された、本発明 H A—MTX結合体を溶解させた溶液を、デイスポーザブル注射筒等の注射器に予め 充填させた形で流通させてもよい。本発明 HA— MTX結合体を有効成分とする関節 疾患治療薬として投与するに際しては、本発明 HA— MTX結合体が 0. 01%〜10 %w/vの溶液濃度、好ましくは 0. 1 %〜2. 0%w/vの溶液濃度、特に好ましくは 0. 5%〜1 . 5%w/vの溶液濃度のものを、 1回あたり l〜3mLを患者に投与すればよい 。但し、この投与量は、医師の指示、対象となる患者、又は疾患の種類やその重篤度 、或いは HA— MTX結合体の分子量等により、それぞれ最適な投与量に適宜増減 してちよい。
[0105] 本発明の HA— MTX結合体は、以下の実施例において説明するとおり、膝関節に 病態が発症する関節炎モデルに関節内投与すると、 HAには見られない滑膜炎の軽 減作用を発現する。
図面の簡単な説明
[0106] [図 1]図 1は、各被験物質投与群および対照群 (HAおよび vehicle)において、 mBS A溶液を膝関節内に投与した時カゝら測定された膝関節腫脹の経時的推移を示す。
[図 2]図 2は、図 1の各被験物質投与群および対照群のグラフについての AUCを示 す。
[図 3]図 3は、コラーゲン関節炎モデルにおける膝関節幅の経時的推移を示す。左図 は、実施例 3— 7の化合物または対照薬 (HAまたは Vehicle)を右膝関節内のみに 投与された群における、コラーゲン関節炎の誘導直後力 測定された右膝関節 (投 与部位)の幅についての経時的推移を示す。右図は非投与部位である左膝関節幅 の経時的推移を示す。グラフは平均士標準誤差で示す。
[図 4]図 4は、コラゲナーゼ誘導関節炎 (OA)モデルにおける膝関節腫脹の測定結 果を示す。左図は、実施例 3— 7の化合物または対照薬 (HAまたは vehicle)を投与 した群における、関節炎誘導直後から 27日後まで測定された膝関節腫脹の経時的 推移を示し、右図は、その AUCを示す。
実施例
[0107] 本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施 例に限定されるものではない。
[実施例 1 1 ]
2 - [N - [N - [N - [4 - [ [ (2, 4 ジァミノ一 6 プテリジ -ル)メチル]メチルアミ ノ]ベンゾィル]— a— (O 5—メチルグルタミル）]フエ-ルァラ -ル]フエ-ルァラ-ル ァミノ]ェチルァミン： MTX— a -PhePhe-NH-C H— NH (化合物 1)の製造
2 4 2
(a) Cbz-Phe-NH-C H—NH— Boc (化合物 la)の製造
2 4
N—カルボベンゾキシ - L-フエ-ルァラニン（Cbz Phe:7. 16g、 25. 4mmol)と N—t—ブトキシカルボ-ルーエチレンジァミン塩酸塩（5. 00g、 25.4mmol)と 1 ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（HOBT: 4. 28g、 28. Ommol)と N—メチルモ ルホリン（NMM:3. 07mL、 28. Ommol)をジメチルホルムアミド（DMF) lOOmLに 溶解し、氷冷撹拌下 1―ェチル 3— (3 ジメチルァミノプロピル)カルポジイミド塩酸 塩 (EDC:5. 36g、 28. Ommol)をカ卩え、室温で 1日間撹拌した。反応液に 10%タエ ン酸水溶液を加え、析出した固体をクロ口ホルムと少量のメタノールに溶かし、飽和 重曹水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧濃縮して得られた残 渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶出溶媒 クロ口ホルム：メタノール = 95： 5)で 精製し、白色固体の標題ィ匕合物 9. 69gを得た。
[0108] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 37(9H、 s)、 2. 69— 3. 19(6H、m)
6
、4. 12-4. 22(lH、m)、4. 93(2H、 dd、 J=12. 9Hz、J=15. lHz)、 6. 75(1 H、 br. t)、 7. 22-7. 33(10H、 m)、 7.48(1H、 d、J = 8. 6Hz)、 8. 05(1H、 br . t)。
[0109] LC/MS:441. 9(M+H+)464. l(M+Na+)。
(b) Cbz - PhePhe - NH - C H—NH— Boc (化合物 lb)の製造
2 4
化合物 la(9. 69g、 21. 9mmol)をメタノール 200mLに溶解し、 10%パラジウム 炭素 500mgを加え、水素雰囲気下室温で 1日撹拌した。反応混合物より触媒をろ別 後、減圧濃縮した。この残 と Cbz Phe(6. 92g、 23. lmmol)と HOBT(3. 71g 、 24. 2mmol)と NMM(2. 66mL、 24. 2mmol)をジメチルホルムアミド（DMF) 50 mLに溶解し、氷冷撹拌下 EDC(4. 64g、 24. 2mmol)をカ卩え、室温で 1日間撹拌し た。反応液に水を加え、 10%クェン酸水溶液、飽和重曹水、水で洗浄し乾燥した。 得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ (溶出溶媒 クロ口ホルム:メタノール = 90: 10)で精製し、白色固体の標題ィ匕合物 12. 8gを得た。
[0110] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d)： δ 1. 37(9H、 s)、 2. 62— 3. 18(8H、 m)
6
、 4. 18-4. 29(1H、 m)、 4.40—4. 51(1H、 m)、 4. 93(2H、 s)、 6. 72(1H、 b r. t)、 7. 10-7. 32(15H、 m)、 7.46(1H、 d、J = 8.6Hz), 7. 97(1H、 br. t)、 8. 11(1H、 d、J = 7. 9Hz)。
[0111] LC/MS:588.8(M+H+)611. l(M+Na+)。
(c) Cbz-Glu (OMe) PhePhe— NH— C H— NH— Boc (化合物 1 c)の製造
2 4
ィ匕合物 lb (11. lg、 18. 9mg)をメタノール 800mLと DMF50mLと THF500mL に溶解し、 10%パラジウム炭素 1.00gを加え、水素雰囲気下室温で 1日撹拌した。 反応混合物より触媒をろ別後、減圧濃縮した。この残渣と N カルボベンゾキシ L —グルタミン酸一 —メチルエステル（Cbz— Glu(OMe) :5. 58g、 18. 9mmol)と HOBT(3. 18g、 20. 8mmol)と NMM(2. 29mL、 20.8mmol)を DMFlOOmL に溶解し、氷冷撹拌下 EDC(3. 99g、 20.8mmol)を加え、室温で 2日間撹拌した。 氷冷撹拌下反応液に 10%クェン酸を加え生じた沈殿を、 5%重曹水、水で洗浄後、 シリカゲルカラムクロマトグラフィ (溶出溶媒 ジクロロメタン:メタノール =10: 1)で精 製し、メタノールを加え沈殿を生じさせ白色粉末の標題ィ匕合物 11. lgを得た。
[0112] 1H-NMR(270MHz, DMSO d )： δ 1. 36(9H、 s)、 1.64—1.80(2H、 m)
6
、 2. 17-2. 23(2H、 m)、 2. 76— 3. 12(8H、 m)、 3. 56(3H、 s)、 3. 93—4.0 3(1H、 m)、 4.40-4. 58(2H、 m)、 5.00(2H、 s)、 6.68(1H、 br. t)、 7. 18— 7.44(16H、 m)、 7.84— 7. 90(2H、 m)、 8. 19(1H、 d、J = 7. 7Hz)。
[0113] LC/MS:732.4(M+H+)、 754.4(M+Na+)。
(d) MTX -a- PhePhe— NH— C H— NH— Boc (化合物 1 d)の製造
2 4
化合物 lc(348mg、 0.476mmol)をメタノール lOmLとテトラヒドロフラン lOmLに 懸濁し、 10%パラジウム炭素 33mgをカ卩え、水素雰囲気下室温で 1. 5時間撹拌した 。反応混合物より触媒をろ別後、減圧濃縮した。この残渣と 4 [N— (2, 4ージァミノ —6 プテリジ -ルメチル） N—メチルァミノ]安息香酸： 197mg、 0. 547mmol)と HOBT(76mg、 0.499mmol)を N—メチルピロリドン（NMP)4mLに溶解し、氷冷 撹拌下 N—メチルモルホリン（NMM、 55;zL、 0.499mmol)と EDC (105mg、 0. 5 47mmol)をカ卩え、室温で 4日間撹拌した。反応液に 5%重曹水をカ卩ぇ生じた沈殿を シリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶出溶媒 ジクロロメタン:メタノール =10:1)、続い て、ァミンシリカゲル（NH— DM1020、 100— 200mesh、富士シリシァ化学株式会 社製)カラムクロマトグラフィ (溶出溶媒 ジクロロメタン:メタノール = 10： 1)で精製し、 黄色粉末の標題化合物 362mgを得た。
[0114] 1H-NMR(270MHz, DMSO— d )： δ 1. 35(9H、 s)、 1. 78— 1. 94(2H、 m)
6
、 2. 23(2H、 m)、 2.69— 3. 10(8H、 m)、 3. 22(3H、 s)、 3. 55(3H、 s)、 4. 27 —4. 52 (3H、 m)、 4. 79 (2H、 s)、 6.63 (2H、 br. s)、 6. 70 (1H、 br. t)、 6.82 ( 2H、 d、J = 8. 9Hz)、 7.06— 7. 25(10H、 m)、 7.46(1H、 br. s)、 7.66— 7.8 8(5H、 m)、 8.06-8. 17(2H、 m)、 8. 56(1H、 s)。
[0115] LC/MS:905. 5(M+H+)。
(e)MTX— a—PhePhe NH— C H—NH (化合物 1)の製造
2 4 2
ィ匕合物 ld(360mg、 0. 398mmol)に、氷冷下、トリフルォロ酢酸 5mLを加え 1時 間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、残渣をァミンシリカゲルカラムクロマトグラフィ (溶 出溶媒 ジクロロメタン:メタノール =100: 10、 2回）で精製し、黄色粉末の標題化合 物 275mgを得た。
[0116] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 80—1. 96(2H、m)、2. 20— 2. 28
6
(2H、 m)、 2.45(2H、 t、J=6.6Hz)、 2. 70— 3. 10(6H、 m)、 3. 22(3H、 s)、 3 . 55(3H、 s)、 4. 26-4. 52(3H、 m)、 4. 79(2H、 s)、 6.61(2H、 br. s)、 6.82 (2H、 d、J = 8. 7Hz)、 7.06— 7. 21(10H、 m)、 7.46(1H、 br. s)、 7.65— 7. 7 3(3H、 m)、 7.85(1H、 d、J = 8. lHz)、 8.08— 8. 16(2H、 m)、 8. 56(1H、 s)
[0117] LC/MS:805. 3(M+H+)。
[実施例 1 2]
4, 7, 10 トリオキサ一 13— [N— [N— [N— [4— [[(2, 4 ジァミノ一 6 プテリ ジ -ル）メチル]メチルァミノ]ベンゾィル]—a— (O 5—メチルグルタミル）]フ -ルァ ラ -ル]フエ-ルァラ -ルァミノ]トリデ力-ルァミン： MTX— a— PhePhe NH— C
10
H O NH (化合物 2)の製造
20 3 2
(a) Cbz-Phe-NH-C H O—NH— Boc (化合物 2a)の製造
10 20 3
N—カルボベンゾキシ - L-フエ-ルァラニン（Cbz Phe:852mg、 2.85mmol)と N—t—ブトキシカルボニル— 4, 7, 10 トリオキサ— 1, 13 トリデカンジァミン（76 Omg、 2.37mmol)と 1—ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（HOBT:363mg、 2. 37mmol)をジメチルホルムアミド（DMF) 6mLに溶解し、氷冷撹拌下 1—ェチル— 3 — (3—ジメチルァミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDC:546mg、 2.85mmol) を加え、室温で 2日間撹拌した。反応液に酢酸ェチルを加え、 10%クェン酸水溶液 、 5%重曹水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧濃縮して得ら れた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ (溶出溶媒 ジクロロメタン:メタノール = 1 00:3)で精製し、油状の標題化合物 1.35gを得た。
[0118] 1H-NMR(270MHz, CDC1 )： δ 1.43(9H、 s)、 1.56— 1.74(4H、 m)、 3.
3
06(2H、 d、J = 6.8Hz)、 3.17— 3.58(16H、 m)、 4.30—4.39(1H、 m)、 4.9 8(1H、 br)、 5.08(2H、 s)、 5.50(1H、 br)、 6.40(1H、 br)、 7.16— 7.32(10 Hゝ m)。
[0119] LC/MS:624.3(M+Na+)。
(b) Cbz - PhePhe - NH - C H O—NH— Boc (化合物 2b)の製造
10 20 3
化合物 2a (1.35g、 2.24mmol)をメタノール 12mLに溶解し、 10%パラジウム炭 素 200mgを加え、水素雰囲気下室温で 4時間撹拌した。反応混合物より触媒をろ別 後、減圧濃縮した。この残渣と Cbz— Phe(l.07g、 3.57mmol)と HOBT(514mg 、 3.36mmol)を DMFlOmLに溶解し、氷冷撹拌下 EDC(688mg、 3.59mmol) を加え、室温で 2日間撹拌した。反応液に酢酸ェチルを加え、 10%クェン酸水溶液 、 5%重曹水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧濃縮して得ら れた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ (溶出溶媒 ジクロロメタン:メタノール = 1 00 :3)で精製した。 n—へキサンを加えると白色沈殿物を生じ、ろ取して標題ィ匕合物 1.56gを得た。
[0120] 1H-NMR(270MHz, CDC1 )： δ 1.43(9H、 s)、 1.60—1.78(4H、 m)、 2.
3
96-3.60(20H、 m)、 4.42—4.59(2H、 m)、 4.96— 5.07(3H、 m)、 5.41( 1H、 br. d)、 6.39(1H、 br)、 6.73(1H、 br. d)、 7.08— 7.31(15H、 m)。
[0121] LC/MS:771.3(M+Na+)。
(c) Cbz - Glu (OMe) PhePhe - NH - C H O—NH— Boc (化合物 2c)の製造
10 20 3
ィ匕合物 2b(500mg、 0.668mmol)をメタノール 10mLに溶解し、 10%パラジウム 炭素 150mgを加え、水素雰囲気下室温で 1日撹拌した。反応混合物より触媒をろ別 後、減圧濃縮した。この残渣と N—カルボベンゾキシ—L—グルタミン酸— γ—メチル エステル（Cbz— Glu(OMe) :217mg、 0. 734mmol)と HOBT(102mg、 0. 668 mmol)を DMF5mLに溶解し、氷冷撹拌下 EDC(141mg、 0. 734mmol)を加え、 室温で 16時間撹拌した。反応液に酢酸ェチルを加え、 10%クェン酸水溶液、 5%重 曹水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧濃縮して得られた残渣 をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶出溶媒 ジクロロメタン:メタノール = 100： 5)で 精製した。 n—へキサンを加えると白色沈殿物を生じ、ろ取して標題ィ匕合物 529mgを 得た。
[0122] 1H-NMR(270MHz, DMSO— d )： δ 1. 36(9H、 s)、 1. 50—1. 85(6H、 m)
6
、 2. 20(2H、 t、J = 7. 9Hz)、 2. 70— 3. 10(8H、 m)、 3. 25— 3. 48(12H、 m)、 3. 56(3H、 s)、 3. 93-4. 02(1H、 m)、 4. 20—4. 60(2H、 m)、 5. 00(2H、 s) 、 6. 77(1H、 br. t)、 7. 10— 7.45(16H、 m)、 7. 82(1H、 br. t、J = 6. lHz)、 7 . 91(1H、 d、J = 7. 9Hz)、 8. 22(1H、 d、J = 7. 9Hz)。
[0123] LC/MS:914. 3(M+Na+)。
(d)MTX- a -PhePhe-NH-C H O —NH— Boc (化合物 2d)の製造
10 20 3
ィ匕合物 2c(514mg、 0. 576mmol)をメタノール 30mLに懸濁し、 10%パラジウム 炭素 lOOmgを加え、水素雰囲気下室温で 1. 5時間撹拌した。反応混合物より触媒 をろ別後、減圧濃縮した。この残渣と 4— [N— (2, 4—ジァミノ— 6—プテリジ -ルメ チル）— N—メチルァミノ]安息香酸： 281mg、 0. 864mmol)と HOBT(132mg、 0. 864mmol)を DMF5mLに溶解し、氷冷撹拌下 EDC(166mg、 0. 864mmol)をカロ え、室温で 2日間撹拌した。反応液に 5%重曹水を加え生じた沈殿をァミンシリカゲ ル（NH— DM1020、 100— 200mesh、富士シリシァ化学株式会社製）カラムクロマ トグラフィ（溶出溶媒 1回目、ジクロロメタン:メタノール =100: 7、 2回目、クロ口ホル ム：メタノール =100:4)で精製し、黄色粉末の標題化合物 415mgを得た。
[0124] 1H-NMR(270MHz, DMSO— d )： δ 1. 36(9H、 s)、 1.48— 1. 61(4Η、 m)
6
、 1. 81-1. 92(2Η、 m)、 2. 24(2Η、 t、J = 7. 9Ηζ)、 2. 70— 3. 10(8Η、 m)、 3 . 22(3Η、 s)、 3. 25-3.47(12Η、 m)、 3. 54(3Η、 s)、 4. 25—4. 50(3Η、 m) 、 4. 79(2H、 s)、 6.61(2H、 br. s)、 6. 76— 6.83(3H、 m)、 7.06— 7. 24(10 H、 m)、 7.45(1H、 br. s)、 7. 67— 7.80(4H、 m)、 7. 86(1H、 d、J = 8. 1Hz), 8.09(1H、 d、J = 7.4Hz)、 8. 15(1H、 d、J = 8. lHz)、 8. 56(1H、 s)。
[0125] LC/MS:1087. 5(M + Na+)。
(e)MTX— a— PhePhe— NH— C H O— NH (化合物 2)の製造
10 20 3 2
ィ匕合物 2d(413mg、 0. 388mmol)に、水冷下、トリフノレ才ロ醉酸 3mLをカロえ 40分 間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、残渣をァミンシリカゲルカラムクロマトグラフィ (溶 出溶媒 ジクロロメタン:メタノール =100: 7、 2回）で精製し、黄色粉末の標題化合物 344mgを得た。
[0126] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1.49— 1. 95(4H、m)、 1. 81— 1. 92
6
(2H、 m)、 2. 24(2H、 t、J=7. 9Hz)、 2. 70— 3. 10(8H、 m)、 3. 22(3H、 s)、 3 . 25-3.47(12H、 m)、 3. 54(3H、 s)、 4. 25—4. 50(3H、 m)、 4. 79(2H、 s) 、 6.61(2H、 br. s)、 6. 76— 6.83(3H、 m)、 7.06— 7. 24(10H、 m)、 7.45(1 H、 br. s)、 7.83(1H、 br. t、J = 5. 8Hz)、 8.01(1H、 d、J = 7. 9Hz)、 8.09(1 H、 d、J=7. lHz)、 8. 15(1H、 d、J = 7.8Hz)、 8. 56(1H、 s)。
[0127] LC/MS:965. 5(M+H+)。
[実施例 1 2，]
4, 7, 10 トリオキサ一 13— [N— [N— [N— [4— [[(2, 4 ジァミノ一 6 プテリ ジ -ル）メチル]メチルァミノ]ベンゾィル]—a— (O 5—ェチルグルタミル）]フエ-ル ァラ -ル]フエ-ルァラ -ルァミノ]トリデ力-ルァミン： MTX(Et) - a -PhePhe-N H-C H O NH (化合物 2，）の製造
10 20 3 2
実施例 1—2と同様の方法で、 N—カルボベンゾキシ—L—グルタミン酸— γ—メチ ルエステル（Cbz - Glu (OMe) )の代わりに N カルボベンゾキシ L グルタミン酸 - y—ェチルエステル (Cbz— Glu (OEt))を用いて、黄色粉末の標題化合物 1.02 gを得た。
[0128] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 13(3H、 t、 J = 7.0Ηζ)、 1.49— 1.
6
61(4H、 m)、 1.80-1. 96(2H、 m)、 2. 19— 2. 28(2H、 m)、 2. 53— 2. 58(2 H、 m)、 2. 72-3. 12(6H、 m)、 3. 22(3H、 s)、 3. 27— 3.47(12H、 m)、 4.0 0(2H、 q、J = 7. lHz)、 4. 28—4. 50(3H、 m)、 4. 79(2H、 s)、 6.62(2H、 br. s)、 6.81(2H、 d、J = 8.6Hz)、 7.08— 7. 21(10H、 m)、 7.46(1H、 br. s)、 7. 65-7.88(5H、 m)、 8.08— 8. 18(2H、 m)、 8. 55(1H、 s)。
[0129] LC/MS:979. 5(M+H+)。
[実施例 1 3]
MTX- a -PhePhe-NH-C H O NH (化合物 3)の製造
10 20 2 2
実施例 1—2と同様の方法で、 N—t ブトキシカルボ-ル— 4, 7, 10 トリオキサ —1, 13 トリデカンジァミンの代わりに N—t—ブトキシカルボニル— 4, 9 ジォキ サ— 1, 12—ドデカンジァミンを用いて、黄色粉末の標題化合物 22 lmgを得た。
[0130] NMR(400MHz、 DMSO d)： δ 1.47—1.60(8H、m)、 1. 80—1. 95
6
(2H、 m)、 2. 20-2. 29(2H、 m)、 2.60(2H、 t)、 2. 70— 3. 10(6H、 m)、 3. 2 2(3H、 s)、 3. 25-3. 50(8H、 m)、 3. 54(3H、 s)、 4. 25—4.49(3H、 m)、 4. 79(2H、 s)、 6. 60(2H、 br. s)、 6. 81(2H、 d、J = 8.4Hz)、 7.06— 7. 20(10H 、 m)、 7.45 (1H、 br. s)、 7.65 (1H、 br. s)、 7. 70 (2H、 d)、 7. 73 (1H、 br. t)、 7. 83(1H、 d)、 8. 10(1H、 d)、 8. 11(1H、 d)、 8. 55(1H、 s)。
[0131] LC/MS:949. 5(M+H+)。
[実施例 1 4]
MTX— a - PhePhe-NH-C H O NH (化合物 4)の製造
8 16 2 2
実施例 1—2と同様の方法で、 N—t ブトキシカルボ-ル— 4, 7, 10 トリオキサ —1, 13 トリデカンジァミンの代わりに N—t—ブトキシカルボニル— 4, 7 ジォキ サ— 1, 10 デカンジァミンを用いて、黄色粉末の標題化合物 407mgを得た。
[0132] 'H-NMR (400MHz, DMSO-d )： δ 1. 50—1. 57(4H、m)、 1. 85— 1. 91
6
(2H、 m)、 2. 21-2. 28(2H、 m)、 2.60(2H、 t)、 2. 70— 3. 13(6H、 m)、 3. 2 2(3H、 s)、 3. 25-3.45(8H、 m)、 3. 55(3H、 s)、 4. 27—4.49(3H、 m)、 4. 79(2H、 s)、 6. 60(2H、 br. s)、 6. 82(2H、 d、J = 8.8Hz)、 7.07— 7. 21(10H 、 m)、 7.43(1H、 br. s)、 7.69(1H、 br. s)、 7. 71(2H、 d、J = 8.8Hz)、 7. 75 ( 1H、 br. t)、 7.85(1H、 d)、 8.08(1H、 d)、 8. 13(1H、 d)、 8. 56(1H、 s)。
[0133] LC/MS:921.4(M+H+)。 [実施例 1 5]
MTX— a -PhePhe-NH-C H O NH (化合物 5)の製造
6 12 2 2
実施例 1—2と同様の方法で、 N—t ブトキシカルボ-ル— 4, 7, 10 トリオキサ —1, 13 トリデカンジァミンの代わりに N—t—ブトキシカルボニル— 3, 6 ジォキ サ— 1, 8—オクタンジァミンを用いて、黄色粉末の標題化合物 148mgを得た。
[0134] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 81— 1. 91(2H、m)、 2. 20— 2. 25
6
(2H、 m)、 2.61-2.64(2H、 t)、 2. 70— 2. 97(6H、 m)、 3. 22(3H、 s)、 3. 2 7-3.47(8H、 m)、 3. 55(3H、 s)、 4. 27—4.47(3H、 m)、 4. 79(2H、 s)、 6. 62(2H、 br. s)、 6.82(2H、 d、J = 8. 7Hz)、 7.06— 7. 25(10H、 m)、 7.46(1 H、 br. s)、 7.67(1H、 br. s)、 7. 71(2H、 d、J = 8.6Hz), 7.85(1H、 d)、 7. 92 (1H、 br. t)、 8.07(1H、 d)、 8. 15(1H、 d)、 8. 56(1H、 s)。
[0135] LC/MS:893.6(M+H+)。
[実施例 1 6]
MTX— a - PhePhe-NH-C H O— NH (化合物 6)の製造
4 8 2
実施例 1—2と同様の方法で、 N—t ブトキシカルボ-ル— 4, 7, 10 トリオキサ — 1 , 13-トリデカンジァミンの代わりに N t ブトキシカルボニル 3 ォキサ 1 , 5 ペンタンジァミンを用いて、黄色粉末の標題化合物 52mgを得た。
[0136] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 84—1. 92(2H、m)、 2. 20— 2. 27
6
(2H、 m)、 2.60-2.64(2H、 t)、 2. 71— 2. 99(6H、 m)、 3. 22(3H、 s)、 3. 2 5-3.45(4H、 m)、 3. 54(3H、 s)、 4. 27—4. 50(3H、 m)、 4. 79(2H、 s)、 6. 61(2H、 br. s)、 6.81(2H、 d、J = 8.4Hz)、 7.05— 7. 21(10H、 m)、 7.45(1 H、 br. s)、 7.65(1H、 br. s)、 7. 70(2H、 d、J = 8.6Hz), 7.84(1H、 d)、 7. 91 (1H、 br. t)、 8.07(1H、 d)、 8. 15(1H、 d)、 8. 55(1H、 s)。
[0137] LC/MS:849.4(M+H+)。
[実施例 1 7]
MTX- a - PhePhe-NH-C H NH (化合物 7)の製造
5 10 2
実施例 1—1と同様の方法で、 N—t—ブトキシカルボ-ルー 1, 2—エチレンジアミ ンの代わりに N—t—ブトキシカルボ-ルー 1, 5 ペンタンジァミンを用いて、黄色粉 末の標題ィ匕合物 148mgを得た。
[0138] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 16— 1. 56(6H、m)、 1. 81— 1. 97
6
(2H、 m)、 2. 21-2. 29(2H、 m)、 2.69— 3.06(6H、 m)、 3. 23(3H、 s)、 3. 5 5(3H、 s)、 4. 25-4. 50(3H、 m)、 4. 80(2H、 s)、 6.65(2H、 br. s)、 6. 82(2 H、 d、J=8.6Hz)、 7.08-7. 24(10H、 m)、 7. 50(1H、 br. s)、 7.60— 7.89 ( 5H、 m)、 8. 10-8. 16(2H、 m)、 8. 55(1H、 s)。
[0139] LC/MS:847.4(M+H+)。
[実施例 1 8]
MTX— a PhePhe— Lys— OMe (化合物 8)の製造
実施例 1—2と同様の方法で、 N— t ブトキシカルボ-ル— 4, 7, 10 トリオキサ —1, 13 トリデカンジァミンの代わりに N— ε —t ブトキシカルボニル— L リジン メチルエステルを用いて、黄色粉末の標題化合物 178mgを得た。
[0140] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 25— 1. 34(4H、m)、 1. 56— 1.69
6
(2H、 m)、 1.75-1. 90(2H、 m)、 2. 18— 2. 25(2H、 br. t)、 2. 50— 2.60(2 H、 m)、 2.65-3.07(4H、 m)、 3. 22(3H、 s)、 3. 54(3H、 s)、 3.60(3H、 s)、 4. 15-4.60(4H、 m)、 4. 79(2H、 s)、 6.63(2H、 br. s)、 6. 81(2H、 d、J = 8 . 7Hz)、 7.00-7. 25(10H、 m)、 7.45(1H、 br. s)、 7.62(1H、 br. s)、 7.69 (2H、 d、 J = 8.6Hz)、 7.80(1H、 d)、 8.05(1H、 d)、 8. 16(1H、 d)、 8. 30(1H 、 d)、 8. 56(1H、 s)。
[0141] LC/MS:905.4(M+H+)。
[実施例 1 9]
MTX- a -PheGly-NH-C H O—NH (化合物 9)の製造
10 20 3 2
実施例 1 2 (a)の工程の N カルボベンゾキシ L フエ-ルァラニンの代わりに N—カルボベンゾキシグリシンを用いた以外は、実施例 1—2と同様の方法で、黄色 粉末の標題ィ匕合物 528mgを得た。
[0142] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 51— 1.64(4H、m)、 1. 84—1. 94
6
(2H、 m)、 2. 21-2. 30(2H、 m)、 2. 55(2H、 t、J = 6. 3Hz)、 2. 78— 2. 92(1 H、 m)、 3.03-3. 76(17H、 m)、 3. 22(3H、 s)、 3. 55(3H、 s)、 4. 26—4. 52 (2H、 m)、 4. 79(2H、 s)、 6.63(2H、 br. s)、 6.82(2H、 d、J = 8. 7Hz), 7. 11 -7. 24(5H、 m)、 7.47(1H、 br. s)、 7.62— 7. 72(4H、 m)、 8.04— 8. 16(2 H、 m)、 8. 28(1H、 br. t)、 8. 56(1H、 s)。
[0143] LC/MS:875. 5(M+H+)。
[実施例 1 10]
MTX- a -PheGly-NH-C H O—NH (化合物 10)の製造
10 20 2 2
実施例 1—9と同様の方法で、 N—t ブトキシカルボ-ル— 4, 7, 10 トリオキサ —1, 13 トリデカンジァミンの代わりに N—t—ブトキシカルボニル— 4, 9 ジォキ サ— 1, 12 ドデカンジァミンを用いて、黄色粉末の標題化合物 300mgを得た。
[0144] 'H-NMR (400MHz, DMSO-d )： δ 1.47—1. 50(4H、m)、 1. 54—1.60
6
(4H、 m)、 1.82-1. 95(2H、 m)、 2. 25— 2. 28(2H、 m)、 2. 58(2H、 t、J = 6 . 6Hz)、 2.82-2.87(1H、 m)、 3.02— 3.07(3H、 m)、 3. 22(3H、 s)、 3. 25 -3.41(8H、 m)、 3. 55(3H、 s)、 3. 55— 3.63(2H、 m)、 4. 28—4.47(2H、 m)、 4. 79(2H、 s)、 6.60(2H、 br. s)、 6.81(2H、 d、J = 8.8Hz)、 7.09— 7. 1 8 (5H、 m)、 7.45 (1H、 br. s)、 7. 59 (1H、 br. t)、 7.66 (1H、 br. s)、 7. 70 (2 H、 d、 J=8.8Hz)、 8.02(1H、 d)、 8.08(1H、 d)、 8. 26(1H、 br. t)、 8. 56(1 H、 s)。
[0145] LC/MS:859. 3(M+H+)。
[実施例 1 11]
MTX— a - PheGly-NH-C H O— NH (化合物 11)の製造
8 16 2 2
実施例 1—9と同様の方法で、 N—t ブトキシカルボ-ル— 4, 7, 10 トリオキサ —1, 13 トリデカンジァミンの代わりに N—t—ブトキシカルボニル— 4, 7 ジォキ サ— 1, 10 デカンジァミンを用いて、黄色粉末の標題化合物 300mgを得た。
[0146] 'H-NMR (400MHz, DMSO-d )： δ 1. 53— 1.62(4H、m)、 1. 82—1. 92
6
(2H、 m)、 2. 20-2. 27(2H、 m)、 2. 50— 2.60(2H、 t)、 2.81— 2.86(1H、 m)、 2. 97-3.08(3H、 m)、 3. 22(3H、 s)、 3. 25— 3.47(8H、 m)、 3. 55 (3H 、 s)、 3. 55-3. 73(2H、 m)、 4. 24—4.47(2H、 m)、 4. 79(2H、 s)、 6. 60(2 H、 br. s)、 6.81(2H、 d)、 7. 12— 7. 21(5H、 m)、 7.45(1H、 br. s)、 7.60(1 H、 br. t)、 7.63 (1H、 br. s)、 7. 69 (2H、 d)、 8.03 (1H、 d)、 8. 10 (1H、 d)、 8 . 28(1H、 br. t)、 8. 56(1H、 s)。
[0147] LC/MS:831. 3(M+H+)。
[実施例 1 12]
MTX— a -PheGly-NH-C H O— NH (化合物 12)の製造
6 12 2 2
実施例 1—9と同様の方法で、 N—t ブトキシカルボ-ル— 4, 7, 10 トリオキサ —1, 13 トリデカンジァミンの代わりに N—t—ブトキシカルボニル— 3, 6 ジォキ サ— 1, 8—オクタンジァミンを用いて、黄色粉末の標題化合物 18 lmgを得た。
[0148] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 83— 1. 92(2H、m)、2. 21— 2. 27
6
(2H、 m)、 2.60-2.65(2H、 t)、 2. 75— 3. 10(2H、 m)、 3. 22(3H、 s)、 3. 2 3-3.46(10H、 m)、 3. 55(3H、 s)、 3. 55— 3. 75(2H、 m)、 4. 25—4. 52(2 H、 m)、 4. 79(2H、 s)、 6.61(2H、 br. s)、 6.82(2H、 d、J = 8.6Hz), 7. 10— 7. 20(5H、 m)、 7.45(1H、 br. s)、 7.63— 7. 72(4H、 m)、 8.00(1H、 d)、 8. 10(1H、 d)、 8. 27(1H、 br. t)、 8. 56(1H、 s)。
[0149] LC/MS:803.4(M+H+)。
[実施例 1 13]
MTX— a - PheGly-NH-C H O— NH (化合物 13)。
4 8 2
[0150] 実施例 1—9と同様の方法で、 N—t ブトキシカルボ-ル— 4, 7, 10 トリオキサ — 1 , 13-トリデカンジァミンの代わりに N t ブトキシカルボニル 3 ォキサ 1 , 5 ペンタンジァミンを用いて、黄色粉末の標題化合物 318mgを得た。
[0151] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 82—1. 95(2H、m)、2. 22— 2. 27
6
(2H、 m)、 2. 59-2.64(2H、 t)、 2. 73— 3. 15(2H、 m)、 3. 23(3H、 s)、 3. 2 5-3. 38(6H、 m)、 3. 55(3H、 s)、 3.46— 3. 77(2H、 m)、 4. 23—4. 51 (2H 、 m)、 4. 79(2H、 s)、 6.62(2H、 br. s)、 6.82(2H、 d、J = 8.6Hz), 7. 10— 7 . 17(5H、 m)、 7.47(1H、 br. s)、 7.63— 7. 75(4H、 m)、 8.02(1H、 d)、 8. 1 1(1H、 d)、 8. 27(1H、 br. t)、 8. 56(1H、 s)。
[0152] LC/MS:759. 3(M+H+)。
[実施例 1 14] MTX- a -PhePro-NH-C H O NH (化合物 14)の製造
10 20 3 2
実施例 1— 2 (a)の工程で N -カルボベンゾキシ L フエ-ルァラニンの代わりに N カルボベンゾキシ L—プロリンを用いた以外は、実施例 1 2と同様の方法で、 黄色粉末の標題化合物 382mgを得た。
[0153] NMR(270MHz、DMSO d) : δ ΐ, 49— 2. 03(10H、m)、2. 19— 2. 3
6
0(2H、 m)、 2. 55(2H、 t、J = 6. 6Hz), 2. 62— 3. 69(21H、 m)、 3. 55(3H、 s) 、 4. 28—4. 38(1H、 m)、 4. 63—4. 75(1H、 m)、 4. 79(2H、 s)、 6. 60(2H、 b r. s)、 6. 82(2H、 d、J = 8. 6Hz)、 7. 14— 7. 29(5H、 m)、 7.47(1H、 br. s)、 7 . 66— 7. 72(4H、 m)、 7. 94— 8. 10(2H、 m)、 8. 56(1H、 s)。
[0154] LC/MS:915. 3(M+H+)。
[実施例 1 15]
MTX- a -Phej8Ala-NH-C H O —NH (化合物 15)の製造
10 20 3 2
実施例 1— 2 (a)の工程で N -カルボベンゾキシ L フエ-ルァラニンの代わりに N—カルボベンゾキシ βーァラニンを用いた以外は、実施例 1—2と同様の方法で 、黄色粉末の標題化合物 180mgを得た。
[0155] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 52—1. 62(4H、m)、 1. 78— 1. 95
6
(2H、 m)、 2. 16-2. 22(4H、 m)、 2. 56(2H、 t、J = 7. 3Hz)、 2. 71— 3. 48(2 1H、 m)、 3. 55(3H、 s)、 4. 10(2H、 br. s)、 4. 21—4. 30(1H、 m)、 4. 38—4 . 49(1H、 m)、 4. 80(2H、 s)、 6. 59(2H、 br. s)、 6. 83(2H、 d、J=8. 6Hz)、 7 . 10-7. 21(5H、 m)、 7. 43(1H、 br. s)、 7. 65— 7. 74(3H、 m)、 7. 83— 7. 8 9(2H、 m)、 7. 96(1H、 br. t)、 8. 08(1H、 d、J = 6. 8Hz)、 8. 56(1H、 s)。
[0156] LC/MS:889. 5(M+H+)。
[実施例 1 16]
MTX - a - Phe j8 Ala - NH - C H —NH (化合物 16)の製造
2 4 2
実施例 1 1 (a)の工程で N カルボベンゾキシ L フエ-ルァラニンの代わりに N—カルボベンゾキシ βーァラニンを用いた以外は、実施例 1—1と同様の方法で 、黄色粉末の標題化合物 194mgを得た。
[0157] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 80—1. 94(2H、m)、2. 18— 2. 26 (4H、 m)、 2. 54(2H、 t、J=6. lHz)、 2. 74— 3.08(6H、 m)、 3. 23(3H、 s)、 3 . 55 (3H、 s)、 4. 24-4.48 (2H、 m)、 4.80 (2H、 s)、 6. 59 (2H、 br. s)、 6.83 (2H、 d、J = 8.4Hz)、 7. 13(5H、 s)、 7.45(1H、 br. s)、 7.65— 7.86(5H、 m )、 7. 96(1H、 br. t)、 8.09(1H、 d、J = 6.8Hz)、 8. 56(1H、 s)。
[0158] LC/MS:729. 3(M+H+)。
[実施例 1 17]
MTX- a -Phe-NH-C H O NH (化合物 17)の製造
10 20 3 2
実施例 1— 2 (b)の工程を省略した以外は実施例 1— 2と同様の方法で、黄色粉末 の標題ィ匕合物 496mgを得た。
[0159] NMR(300MHz、 DMSO d)： δ 1.49— 1. 59(4H、m)、 1. 82—1.89
6
(2H、 m)、 2. 19-2. 27(2H、 m)、 2. 55(2H、 t、J = 7. 2Hz)、 2. 73— 3. 10(4 H、 m)、 3. 23(3H、 s)、 3. 17— 3.48(12H、 m)、 3. 55(3H、 s)、 4. 21—4. 28 (1H、 m)、 4. 38-4.45(1H、 m)、 4.80(2H、 s)、 6.61(2H、 br. s), 6.83(2 H、 d、J=9. 3Hz)、 7. 11-7. 20(5H、 m)、 7.46(1H、 br. s)、 7.66(1H、 br. s)、 7. 73(2H、 d、 J = 9.0Hz)、 7.83(1H、 t)、 7. 92(1H、 d、J = 8.4Hz)、 8. 1 2(1H、 d、 J = 7. 5Hz)、 8. 56(1H、 s)。
[0160] LC/MS:818.4(M+H+)。
[実施例 1 18]
MTX- a -Ile-NH-C H O NH (化合物 18)の製造
10 20 3 2
実施例 1 17と同様の方法で、 N -カルボベンゾキシ L フエ-ルァラニンの代 わりに N カルボベンゾキシ L イソロイシンを用いて、黄色粉末の標題化合物 56 2mgを得た。
[0161] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 0. 76— 0.80(6H、 m)、 0. 99— 1. 10
6
(1H、 m)、 1. 36-1.45(1H、 m)、 1.49— 1. 73(5H、 m)、 1.88— 2.07(2H、 m)、 2. 33-2. 38(2H、 m)、 2. 55(2H、 t、J = 6.6Hz), 2. 98— 3.48(14H、 m)、 3. 21(3H、 s)、 3. 56(3H、 s)、 4.05—4. 13(1H、 m)、 4.40—4.48 (1H 、 m)、 4. 78(2H、 s)、 6.60(2H、 br. s)、 6.82(2H、 d、J = 8.4Hz), 7.46 (1H 、 br. s)、 7.66-7. 72(3H、 m)、 7. 98(1H、 br. t)、 8. 12(1H、 d、J = 7.6Hz) 、 8. 56(1H、 s)
LC/MS:784.4(M+H+)。
[実施例 1 19]
MTX— a lie— NH— C H NH (化合物 19)
2 4 2
実施例 1— 18と同様の方法で、 N—t ブトキシカルボ-ル— 4, 7, 10 トリオキサ —1, 13 トリデカンジァミンの代わりに N—t—ブトキシカルボニル— 1, 2 ェチレ ンジァミンを用いて、黄色粉末の標題化合物 320mgを得た。
[0162] NMR(300MHz、 DMSO d)： δ 0. 76— 0.80(6H、m)、0. 96— 1.08
6
(1H、 m)、 1. 34—1.48(1H、 m)、 1.62—1. 70(1H、 m)、 1.85— 2.03(2H、 m)、 2. 36(2H、 t、J = 7. 8Hz)、 2. 95— 3.08(2H、 m)、 3. 21(3H、 s)、 3. 56 ( 3H、 s)、 4.06—4. 12(1H、 m)、 4. 38—4.45(1H、 m)、 4. 78(2H、 s)、 6. 61 (2H、 br. s)、 6.83(2H、 d、J = 9. OHz)、 7.43(1H、 br. s)、 7.64— 7. 72 (4H 、 m)、 7. 92(1H、 t、J = 5. 7Hz)、 8. 12(1H、 d、J = 7. 5Hz)、 8. 57(1H、 s)。
[0163] LC/MS:624. 2(M+H+)。
[実施例 1— 20]
MTX— α— Glu(OMe)— NH— C H O NH (化合物 20)の製造
10 20 3 2
実施例 1 17と同様の方法で、 N -カルボベンゾキシ L フエ-ルァラニンの代 わりに N カルボベンゾキシ L グルタミン酸一 y—メチルエステルを用いて、黄 色粉末の標題ィ匕合物 600mgを得た。
[0164] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 50— 2.03(8H、m)、2. 24— 2. 31
6
(2H、 t)、 2. 34-2.40(2H、 t)、 2.49— 2. 57(2H、 t)、 2. 97— 3. 52(14H、 m)、 3. 21 (3H、 s)、 3. 53 (3H、 s)、 3. 55 (3H、 s)、 4. 15—4. 36 (2H、 m)、 4. 78(2H、 s)、 6. 61(2H、 br. s)、 6. 81(2H、 d、J = 8. 7Hz)、 7.46(1H、 br. s)、 7. 67(1H、 br. s)、 7. 72(2H、 d、J = 8.6Hz)、 7. 84(1H、 br. t)、 7. 95(1H、 d )、8. 14(1H、 d)、 8. 55(1H、 s)。
[0165] LC/MS:814.4(M+H+)。
[実施例 1 21]
MTX— a -Glu(OMe)— NH— C H— NH (化合物 21)の製造 実施例 1— 20と同様の方法で、 N—t—ブトキシカルボ-ルー 4, 7, 10 トリオキサ —1, 13 トリデカンジァミンの代わりに N—t—ブトキシカルボニル— 1, 2 ェチレ ンジァミンを用いて、黄色粉末の標題化合物 283mgを得た。
[0166] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 71— 2.09(4H、 m)、 2. 28(2H、t、
6
J = 7. 6Hz), 2. 39(2H、 t、J = 7.6Hz), 2. 53(2H、 t、J = 6. 1Hz), 2. 99— 3. 05 (2H、 m)、 3. 21 (3H、 s)、 3. 54 (3H、 s)、 3. 56 (3H、 s)、 4. 14—4. 36 (2H 、 m)、 4. 79(2H、 s)、 6.61(2H、 br. s)、 6.82(2H、 d、J = 8.6Hz), 7.43 (1H 、 br. s)、 7.65-7. 79(4H、 m)、 7. 95(1H、 d、J = 7. 8Hz)、 8. 14(1H、 d、J = 6. 9Hz)、 8. 56(1Hゝ s)。
[0167] LC/MS:654. l(M+H+)。
[実施例 1— 22]
MTX- a -Tyr-NH-C H O NH (化合物 22)の製造
10 20 3 2
実施例 1 17と同様の方法で、 N -カルボベンゾキシ L フエ-ルァラニンの代 わりに N カルボベンゾキシ L チロシンを用いて、黄色粉末の標題化合物 133m gを得た。
[0168] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 51— 1.62(4H、m)、 1. 85— 1. 95
6
(2H、 m)、 2. 23-2. 31(2H、 m)、 2. 51— 2. 58(2H、 t)、 2.63— 2. 91(2H、 m)、 2. 95-3. 16(2H、 m)、 3. 22(3H、 s)、 3. 27— 3. 54(12H、 m)、 3. 56(3 H、 s)、 4. 22-4. 35(2H、 m)、 4. 79(2H、 s)、 6. 57(2H、 d、J = 8. lHz)、 6. 6 1(2H、 br. s)、 6.82(2H、 d、J = 8. 7Hz)、 6. 92(2H、 d、J = 8. lHz)、 7.47(1 H、 br. s)、 7.67-7.88(5H、 m)、 8. 13(1H、 d)、 8. 55(1H、 s)。
[0169] LC/MS:834.4(M+H+)。
[実施例 1— 23]
MTX- a -Trp-NH-C H O NH (化合物 23)の製造
10 20 3 2
実施例 1 17と同様の方法で、 N -カルボベンゾキシ L フエ-ルァラニンの代 わりに N カルボベンゾキシ L トリブトファンを用いて、黄色粉末の標題化合物 1 71mgを得た。
[0170] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 50—1.61(4H、m)、 1. 84—1. 97 (2H、 m)、 2. 23-2. 32(2H、 m)、 2. 50— 2. 56(2H、 t)、 2. 92— 3. 15(4H、 m)、 3. 22(3H、 s)、 3. 29— 3.45(12H、 m)、 3. 55(3H、 s)、 4. 29—4.49(2 H、 m)、 4. 78 (2H、 s)、 6.64 (2H、 br. s)、 6.80 (2H、 d)、 6. 92 (1H、 t)、 7.0 4(1H、 t)、 7. 10(1H、 s)、 7. 26(1H、 d)、 7.44(1H、 br. s)、 7. 51(1H、 d)、 7 . 65(1H、 br. s)、 7.69(2H、 d)、 7.82(1H、 br. t)、 7. 93(1H、 d)、 8. 10(1H 、 d)、 8. 55(1H、 s)、 10.80(1H、 s)。
[0171] LC/MS:857. 5(M+H+)。
[実施例 1— 24]
MTX- a -Ser-NH-C H O NH (化合物 24)の製造
10 20 3 2
実施例 1 17と同様の方法で、 N -カルボベンゾキシ L フエ-ルァラニンの代 わりに N カルボベンゾキシ Lーセリンを用 、て、黄色粉末の標題化合物 416mg を得た。
[0172] NMR(300MHz、 DMSO d)： δ 1. 50—1.63(4H、m)、 1. 90— 2.08
6
(4H、 m)、 2. 39(2H、 t、J=7.8Hz)、 2. 55(2H、 t、J = 6.6Hz)、 3.05— 3.48 (16H、 m)3. 21(3H、 s)、 3. 56(3H、 s)、 4. 13—4. 20(1H、 m)、 4. 33—4.4 1(1H、 m)、 4. 78(2H、 s)、 6.61(2H、 br. s)、 6.82(2H、 d、J = 9.0Hz)、 7.4 4(1H、 br. s)、 7.66— 7. 80(5H、 m)、 8. 19(1H、 d、J = 6. 9Hz)、 8. 56(1H、 s)0
[0173] LC/MS:758.4(M+H+)。
[実施例 1— 25]
MTX- a -Leu-NH-C H O— NH (化合物 25)の製造
10 20 3 2
実施例 1 17と同様の方法で、 N -カルボベンゾキシ L フエ-ルァラニンの代 わりに N カルボベンゾキシ L ロイシンを用 、て、黄色粉末の標題化合物 283m gを得た。
[0174] 1H-NMR(270MHz, DMSO d )： δ 0. 80— 0.87(6H、 d)、 1.43— 1.64 (
6
7H、 m)、 1. 90-2.06(2H、 m)、 2. 34— 2. 30(2H、 t)、 2. 53— 2. 58(2H、 t) 、 3.04-3.08(2H、 m)、 3. 21(3H、 s)、 3. 33— 3.47(12H、 m)、 3. 56(3H、 s)、 4. 19-4. 37(2H、 m)、 4. 78(2H、 s)、 6.62(2H、 br. s)、 6.82(2H、 d、J =8. 7Hz)、 7.45(1H、 br. s)、 7.64— 7.85(5H、 m)、 8. 10(1H、 d)、 8. 55( 1H、 s)
LC/MS:784.4(M+H+)。
[実施例 1 26]
MTX- a -Val-NH-C H O NH (化合物 26)の製造
10 20 3 2
実施例 1 17と同様の方法で、 N -カルボベンゾキシ L フエ-ルァラニンの代 わりに N カルボベンゾキシ L—バリンを用いて、黄色粉末の標題化合物 590mg を得た。
[0175] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 0. 79 (6H、 d、 J = 6.8Hz)、 1. 52—1
6
. 59(4H、 m)、 1.85— 2.04(3H、 m)、 2. 33— 2. 35(2H、 t)、 2. 56— 2. 58(2 H、 t)、 2. 93-3. 55(14H、 m)、 3. 21(3H、 s)、 3. 56(3H、 s)、 4.03—4.08 ( 1H、 m)、 4.42-4.47 (1H、 m)、 4. 78 (2H、 s)、 6.62 (2H、 br. s)、 6.82 (2H 、 d、J = 8. 7Hz)、 7.45(1H、 br. s)、 7.61— 7. 72(4H、 m)、 7. 98(1H、 br. t) 、 8. 13(1H、 d)、 8. 56(1H、 s)
LC/MS:770.4(M+H+)。
[実施例 1— 27]
MTX— α— His— NH— C H O NH (化合物 27)の製造
10 20 3 2
実施例 1 17と同様の方法で、 N -カルボベンゾキシ L フエ-ルァラニンの代 わりに N カルボベンゾキシ L ヒスチジンを用 V、て、黄色粉末の標題化合物 81 mg¾ ^守に。
[0176] NMR(300MHz、 DMSO d)： δ 1.49— 1. 58(4H、m)、 1. 90— 2.04
6
(2H、 m)、 2. 39(2H、 t、J=6.6Hz), 2. 55(2H、 t、J = 6. 9Hz), 2. 83(2H、 m )、 3.02(2H、 m)、 3. 16— 3.47(12H、 m)、 3. 23(3H、 s)、 3. 57(3H、 s)、 4. 22 (1H、 m)、 4. 32 (1H、 m)、 4. 80 (2H、 s)、 6.61 (2H、 br. s)、 6. 72 (1H、 s) 、 6.84(2H、 d、J = 8.4Hz), 7. 10— 7. 70(5H、 m)、 7. 77(2H、 d、J = 8. 7Hz )、 8. 36(1H、 br), 8. 57(1H、 s)。
[0177] LC/MS:808. 3(M + H+)。
[実施例 1 28] MTX- a -Pro-NH-C H O NH (化合物 28)の製造
10 20 3 2
実施例 1 17と同様の方法で、 N -カルボベンゾキシ L フエ-ルァラニンの代 わりに N カルボベンゾキシ L プロリンを用 、て、黄色粉末の標題化合物 683m gを得た。
[0178] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 58 (4H、 dd、 J = 6. 5Hz、J=12.8
6
Hz), 1.69-2. 10(6H、 m)、 2.44(2H、 t、J = 7. 7Hz), 2.60(2H、 t、J = 6.8 Hz), 2. 91-3. 75(19H、 m)、 3. 57(3H、 s)、 4. 18—4. 25(1H、 m)、 4.61— 4. 72(1H、 m)、 4. 77(2H、 s)、 6.61(2H、 br. s)、 6.80(2H、 d、J = 8. 7Hz), 7.44(1H、 br. s)、 7. 69— 7.80(4H、 m)、 8. 15(1H、 d、J = 7. lHz)、 8. 55 ( 1H、 s)。
[0179] LC/MS:768. 3(M+H+)。
[実施例 1— 29]
MTX- a - j8 Ala-NH-C H O—NH (化合物 29)の製造
10 20 3 2
実施例 1 17と同様の方法で、 N -カルボベンゾキシ L フエ-ルァラニンの代 わりに N—カルボベンゾキシ βーァラニンを用いて、黄色粉末の標題化合物 230 mg¾ ^守に。
[0180] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1.49— 1.62(4H、m)、 1. 79— 2.02
6
(2H、 m)、 2. 21(2H、 t、J=6. 9Hz), 2. 32(2H、 t、J = 7. 3Hz), 2. 56(2H、 t 、J = 6.6Hz)、 3.00-3.61(19H、 m)、 3. 55(3H、 s)、 4. 29—4. 38(1H、 m) 、 4. 78(2H、 s)、 6.61(2H、 br. s)、 6.81(2H、 d、J = 8.6Hz), 7.43(1H、 br. s)、 7.61-7. 91(3H、 m)、 7. 72(2H、 d、J=8.6Hz)、 8.02(1H、 d、J = 7. 8 Hz)ゝ 8. 55(1H、 s)。
[0181] LC/MS:742.4(M+H+)。
[実施例 1— 30]
MTX- y -PhePhe-NH-C H O NH (化合物 30)の製造
10 20 3 2
実施例 1—2と同様の方法で、 N—カルボベンゾキシ—L—グルタミン酸— γ—メチ ルエステルの代わりに Ν—カルボベンゾキシ—L—グルタミン酸— α メチルエステ ルを用いて、黄色粉末の標題化合物 312mgを得た。 [0182] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1.49— 1.60(4H、m)、 1. 76— 1. 98
6
(2H、 m)、 2.09-2. 20(2H、 m)、 2. 56(2H、 t、J = 6. 6Hz)、 2.62— 3. 16(6 H、 m)、 3. 21(3H、 s)、 3. 27— 3.48(12H、 m)、 3. 59(3H、 s)、 4. 27—4. 53 (3H、 m)、 4. 78(2H、 s)、 6.61(2H、 br. s)、 6.81(2H、 d、J = 8.6Hz), 7. 16 -7. 23(10H、 m)、 7.48(1H、 br. s)、 7.68— 7. 74(3H、 m)、 7.83(1H、 br. t)、 8.01(1H、 d、J = 7. 9Hz)、 8. 10(1H、 d、J = 7.8Hz)、 8. 36(1H、 d、J = 6 . 8Hz)、 8. 55(1H、 s)。
[0183] LC/MS:965. 5(M+H+)。
[実施例 1 31]
MTX— γ -PhePhe-NH-C H O NH (化合物 31)の製造
6 12 2 2
実施例 1—5と同様の方法で、 N—カルボベンゾキシ—L—グルタミン酸— γ—メチ ルエステルの代わりに Ν—カルボベンゾキシ—L—グルタミン酸— α メチルエステ ルを用いて、黄色粉末の標題化合物 80mgを得た。
[0184] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 75— 1. 97(2H、m)、2.08— 2. 17
6
(2H、 m)、 2. 59-2.62(2H、 t)、 2. 58— 3.05(6H、 m)、 3. 22(3H、 s)、 3. 1 5-3. 52(8H、 m)、 3. 59(3H、 s)、 4. 23—4. 52(3H、 m)、 4. 78(2H、 s)、 6. 63(2H、 br. s)、 6.81(2H、 d、J = 8. 7Hz)、 7. 11— 7. 21(10H、 m)、 7.44(1 H、 br. s)、 7.65(1H、 br. s)、 7. 70(2H、 d)、 7. 94— 8. 12(3H、 m)、 8. 35(1 H、 d)、 8. 55(1H、 s)
LC/MS:893. 5(M+H+)。
[実施例 1— 32]
MTX— y -PhePhe-NH-C H O— NH (化合物 32)の製造
4 8 2
実施例 1—6と同様の方法で、 N—カルボベンゾキシ—L—グルタミン酸— γ—メチ ルエステルの代わりに Ν—カルボベンゾキシ—L—グルタミン酸— α メチルエステ ルを用いて、黄色粉末の標題化合物 49mgを得た。
[0185] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 73— 1. 97(2H、m)、2.08— 2. 18
6
(2H、 m)、 2.60-2.65(2H、 t)、 2. 59— 3.02(6H、 m)、 3. 21(3H、 s)、 3. 1 3-3.44(4H、 m)、 3. 59(3H、 s)、 4. 25—4. 53(3H、 m)、 4. 78(2H、 s)、 6. 63(2H、 br. s)、 6.81(2H、 d、J = 8.7Hz)、 7.09— 7.25(10H、 m)、 7.43(1 H、 br. s)、 7.66(1H、 br. s)、 7.72(2H、 d、J = 8.4Hz), 7.95— 8.10(3H、 m)、 8.36(1H、 d)、 8.55(1H、 s)。
[0186] LC/MS:849.5(M+H+)。
[実施例 1— 33]
MTX- y -PheGly-NH-C H O—NH (化合物 33)の製造
10 20 3 2
実施例 1—9と同様の方法で、 N—カルボベンゾキシ—L—グルタミン酸— γ—メチ ルエステルの代わりに Ν—カルボベンゾキシ—L—グルタミン酸— α メチルエステ ルを用いて、黄色粉末の標題化合物 693mgを得た。
[0187] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1.50—1.68(4H、m)、 1.80— 2.02
6
(2H、 m)、 2.12-2.27(2H、 m)、 2.55(2H、 t、J = 6.4Hz)、 2.71— 2.79(1 H、 m)、 2.96-3.14(3H、 m)、 3.22(3H、 s)、 3.38— 3.74(12H、 m)、 3.5 9(3H、 s)、 4.28-4.48(2H、 m)、 4.79(2H、 s)、 6.62(2H、 br. s)、 6.81(2 H、 d、J=8.4Hz)、 7.14-7.28(5H、 m)、 7.47(1H、 br. s)、 7.63— 7.73(4 H、 m)、 8.19(1H、 d、J = 7.6Hz)、 8.29— 8.36(2H、 m)、 8.56(1H、 s)。
[0188] LC/MS:875.4(M+H+)。
[実施例 1— 34]
MTX- y -Phe-NH-C H O NH (化合物 34)の製造
10 20 3 2
実施例 1— 17と同様の方法で、 N カルボベンゾキシ—L グルタミン酸— γ—メ チルエステルの代わりに Ν—カルボベンゾキシ—L—グルタミン酸— α メチルエス テルを用いて、黄色粉末の標題化合物 480mgを得た。
[0189] NMR(300MHz、 DMSO d)： δ 1.49— 1.58(4H、m)、 1.79— 2.00
6
(2H、 m)、 2.10-2.27(2H、 m)、 2.55(2H、 t、J = 6.9Hz)、 2.69— 2.93(2 H、 m)、 2.96-3.12(2H、 m)、 3.22(3H、 s)、 3.26— 3.48(12H、 m)、 3.5 9 (3H、 s)、 4.25-4.33 (1H、 m)、 4.38—4.46 (1H、 m)、 4.79 (2H、 s)、 6. 62(2H、 br. s)、 6.81(2H、 d、J = 8.7Hz)、 7.10— 7.24(5H、 m)、 7.44 (1H 、 br)、 7.70(1H、 br), 7.72(2H、 d、J = 8.7Hz)、 7.95(1H、 t)、 8. 10(1H、 d 、J = 8. lHz)、 8.35(1H、 d、J = 6.9Hz)、 8.56(1H、 s)。 [0190] LC/MS:818.4(M+H+)。
[実施例 1— 35]
MTX— γ Glu(OMe)— NH— C H O— NH (化合物 35)の製造
10 20 3 2
実施例 1— 20と同様の方法で、 N—カルボベンゾキシ—L—グルタミン酸— γ—メ チルエステルの代わりに Ν—カルボベンゾキシ—L—グルタミン酸— α メチルエス テルを用いて、黄色粉末の標題化合物 438mgを得た。
[0191] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 52— 2.06(8H、m)、2. 22— 2. 30
6
(4H、 m)、 2. 53-2. 58(2H、 t)、 3.03— 3. 15(2H、 m)、 3. 22(3H、 s)、 3. 2 5-3. 54(12H、 m)、 3. 56(3H、 s)、 3. 61(3H、 s)、 4. 13—4.40(2H、 m)、 4 . 79(2H、 s)、 6.63(2H、 br. s)、 6.81(2H、 d、J = 8.6Hz)、 7.44(1H、 br. s) 、 7.67(1H、 br. s)、 7. 72(2H、 d、J = 8.4Hz)、 7. 90(1H、 br. t)、 7. 99(1H、 d)、 8. 37(1H、 d)、 8. 56(1H、 s)。
[0192] LC/MS:814. 5(M+H+)。
[実施例 1 36]
MTX- a -D-Phe-D-Phe-NH-C H O NH (化合物 36)の製造
10 20 3 2
実施例 1 2と同様の方法で、 N カルボベンゾキシ L フエ-ルァラニンの代わ りに N カルボベンゾキシ D フエ-ルァラニンを用いて、黄色粉末の標題化合物 313mgを得た。
[0193] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1.40—1. 59(4H、m)、 1. 74—1.83
6
(2H、 m)、 2.04-2. 11(2H、 m)、 2. 56— 2. 58(2H、 t)、 2. 59— 3. 12(6H、 m)、 3. 21(3H、 s)、 3. 17— 3. 51(12H、 m)、 3. 55(3H、 s)、 4. 24—4.44(3 H、 m)、 4. 78(2H、 s)、 6.62(2H、 br. s)、 6.81(2H、 d、J = 8.6Hz), 7. 10— 7. 26(10H、 m)、 7.45(2H、 m)、 7.64(1H、 br. s)、 7. 72(2H、 d、J = 8.4Hz )、8. 18(2H、 m)、 8.43(1H、 d)、 8. 55(1H、 s)。
[0194] LC/MS:965.6(M+H+)。
[実施例 1— 37]
MTX- y -D-Phe-D-Phe-NH-C H O NH (化合物 37)の製造
10 20 3 2
実施例 1 30と同様の方法で、 N -カルボベンゾキシ L フエ-ルァラニンの代 わりに N カルボベンゾキシ D—フエ二ルァラニンを用 、て、黄色粉末の標題化合 物 85mgを得た。
[0195] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 51— 1.61(4H、m)、 1. 74— 2.02
6
(2H、 m)、 2. 11-2. 16(2H、 m)、 2. 54-2. 59(2H、 t)、 2.62— 3. 12(6H、 m)、 3. 22(3H、 s)、 3. 25— 3. 53(12H、 m)、 3.60(3H、 s)、 4. 31—4.46(3 H、 m)、 4. 79(2H、 s)、 6.61(2H、 br. s)、 6.81(2H、 d、J = 8.6Hz), 7.08— 7. 26(10H、 m)、 7.44(1H、 br. s)、 7.66— 7. 77(4H、 m)、 8.06(2H、 m)、 8 . 36(1H、 d)、 8. 56(1H、 s)。
[0196] LC/MS:965.6(M+H+)。
[実施例 1 38]
MTX- a -AsnPhePhe-NH-C H O—NH (化合物 38)の製造
10 20 3 2
実施例 1—2と同様に、通常のペプチド合成法に従ってペプチド鎖を伸張し、黄色 粉末の標題ィ匕合物 145mgを得た。
[0197] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 52—1. 59(4H、m)、 1. 87— 2.02
6
(2H、 m)、 2. 32-3.48(24H、 m)、 3. 22(3H、 s)、 3. 55(3H、 s)、 4. 24—4. 56(4H、 m)、 4. 79(2H、 s)、 6.60(2H、 br. s)、 6.81(2H、 d、J = 8. 6Hz)、 7. 04-7. 75(17H、 m)、 8.07— 8. 26(4H、 m)、 8. 56(1H、 s)。
[0198] LCZMS:1079. 5(M+H+)。
[実施例 1— 39]
MTX— α/γ— GlyPheLeuGly— NH— C H O— NH (化合物 39)の製造
10 20 3 2
実施例 1—2と同様に、通常のペプチド合成法に従ってペプチド鎖を伸張し、黄色 粉末の化合物 723mgを得た。 LCZMS解析により、精製過程で異性化を生じ α Z Ύの混合物（ α： γ = 3： 1)となって 、ること (化合物 39)を確認した。
[0199] LCZMS:1045. 7(Μ+Η+)。
[実施例 2 - 1]
MTX- a -PhePhe-NHC H O NHCO— O— C Hの製造
10 20 3 6 5
MTX(Et) - a -PhePhe-NH-C H O— NH (ィ匕合物 2' : 500mg、 0. 51
10 20 3 2
mmol)をジメチルァセタミド 5. lmLに溶解し、 10°Cで、フエ-ルクロロフオルメート (70. 9/zL、 0. 56mmol)を加え 80分撹拌した。反応液に、酢酸ェチル 20mL、 n— へキサン 10mL、水 20mLをカ卩え、析出した沈殿をろ取し、黄色粉末の標題化合物 4 92mgを得た。
[0200] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 13(3H、t、J = 7. 1Ηζ)、 1.49— 1.
6
95(6H、 m)、 2. 19— 2. 28(2H、 m)、 2. 74— 3. 16(8H、 m)、 3. 24(3H、 s)、 3 . 27-3.49(12H、 m)、 4.00(2H、 q、J = 7. lHz)、 4. 28—4. 52(3H、 m)、 4. 85(2H、 s)、 6. 82(2H、 d、J = 8. 7Hz)、 7.07— 7. 38(15H、 m)、 7. 71— 7.8 9(6H、 m)、 8.09-8. 18(2H、 m)、 8.47(1H、 br. s)、 8. 65(1H、 s)、 8.65(1 H、 br. s)。
[0201] LC/MS:1099.4(M+H+)、 1121. 5(M+Na+)。
[実施例 2— 2]
MTX— a -PhePhe-NHC H O NHCO— O— C H -NOの製造
10 20 3 6 4 2
MTX(Et) - a -PhePhe-NH-C H O— NH (ィ匕合物 2' : 509mg、 0. 52
10 20 3 2
mmol)をジメチルァセタミド 5. 2mLに溶解し、氷冷下、 p—二トロフエ-ルクロロフォ ルメート（115mg、 0. 57mmol)をカ卩ぇ 90分撹拌した。反応液に、酢酸ェチル 20m L、 n—へキサン 10mL、水 20mLをカ卩え、析出した沈殿をろ取し、黄色粉末の標題 化合物 489mgを得た。
[0202] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 13(3H、t、J = 6. 9Hz)、 1. 50—1.
6
95(6H、 m)、 2. 19— 2. 28(2H、 m)、 2. 71— 3. 20(8H、 m)、 3. 24(3H、 s)、 3 . 27-3.49(12H、 m)、 4.00(2H、 q、J = 6. 9Hz)、 4. 30—4. 52(3H、 m)、 4. 85(2H、 s)、 6. 82(2H、 d、J = 8.4Hz)、 7.09— 7. 21(10H、 m)、 7. 39(2H、 d 、J = 8. 9Hz)、 7. 71-7. 90(5H、 m)、 8.02— 8. 18(3H、 m)、 8. 24(2H、 d、J =8. 9Hz)、 8. 55(1H、 br. s)、 8.65(1H、 s)、 8. 76(1H、 br. s)。
[0203] LC/MS:1144.4(M+H+)、 1166.4(M+Na+)。
[実施例 2 - 3]
MTX- a -PheGly-NHC H ONHCO— O— CH (2TFA塩）の製造
10 20 3 6 5
実施例 2—1と同様の方法で、 MTX(Et)— a—PhePhe— NH— C H O—NH
10 20 3 の代わりに MTX— a—PheGly—NH— C H O—NH (化合物 9)を用いて反応 を行なった後に、溶媒として 0. l%TFA-MeCN/H Oを用いた HPLC分取を行
2
い、黄色粉末の標題ィ匕合物 57.6mgを得た。
[0204] 1H-NMR(270MHz, DMSO-d )： δ 1. 58 (2Η, m)、 1.68 (2H, m)、 1. 90
6
(2H, m)、 2. 24 (2H, m)、 2.83 (2H, m)、 3.03— 3.67(16H, m)、 3. 25(3 H, s)、 3. 55 (3H, s)、 4. 30 (IH, m)、 4.44 (IH, m)、 4.88 (2H、 s)、 6.82 (2 H, d, J=7. 7Hz)、 7.07-7. 17(5H, m)、 7. 36 (2H, m)、 7. 50(1H, br)、 7 . 61 (IH, m)、 7. 72 (2H, d, J = 7. 3Hz)、 8.04 (IH, d, J = 7. 3Hz)、 8. 10(1 H, d, J=6. 9Hz)、 8. 27(1H, m)、 8.62(1H, br)、 8. 71 (IH, s)、 9.09(1H , s)、 9. 29(1H, s)。
LC/MS:995. 3(M+H+)。
[実施例 2 - 4]
MTX- a -Ile-NHC H O NHCO— O— C H (2TFA塩)の製造
10 20 3 6 5
実施例 2—1と同様の方法で、 MTX(Et)— a—PhePhe— NH— C H O—NH
10 20 3 の代わりに MTX— a—Ile— NH— C H O—NH (化合物 18)を用いて反応を行
2 10 20 3 2
なった後に、溶媒として 0. l%TFA-MeCN/H Oを用いた HPLC分取を行い、
2
黄色粉末の標題化合物 127. 9mgを得た。
1H-NMR(270MHz, DMSO-d)： δ 0. 77 (3Η, m)、 1.02 (IH, m)、 1. 38 (
6
IH, m), 1. 57-1. 70 (4H, m)、 1. 90— 2.07 (2H, m)、 2.07 (3H, d, J = 2. 2Hz), 2. 34 (2H, m)、 3.00— 3. 55(18H, m)、 3. 25 (3H, s)、 4.06 (IH, t, J = 7. 3Hz)、4.42(1H, m)、4. 87 (2H, s)、 6.82 (2H, d, J = 8.0Hz), 7.08 (2H, d, J = 7. 7Hz)、 7. 19(1H, m)、 7. 35 (2H, m)、 7. 50(1H, br)、 7. 71( 4H, m)、 7. 97(1H, m)、 8. 14(1H, d, J = 7. 3Hz)、 8.62(1H, br)、 8. 71(1 H, s)、 9. 10(1H, s)、 9. 29(1H, s)。
[0205] LC/MS:904. 2(M+H+)。
[実施例 2— 5]
上記実施例 2—1と同様にして、実施例 1— 1〜1— 8、 1— 10〜1— 17、 1— 19〜1 —38の化合物をそれぞれフエ二ルカルバメート体に変換することが可能であった。
[実施例 2— 6] 上記実施例 2— 2と同様にして、実施例 1— 1〜1— 38の化合物をそれぞれ p— -ト 口フエ-ルカルバメート体に変換することが可能であった。
[実施例 3 - 1 ]
MTX- a - PhePhe -NHC H O NHCO— O— [HA]の製造
10 20 3
ヒアルロン酸ナトリウム塩（200mg、分子量：約 250万）に、セチルピリジ-ゥムクロラ イド (0. 5mmol)をジクロロメタン（lOmL)に溶解した液を添加した後、減圧濃縮した 。この残渣に、実施例 2—1で得られた MTX— a—PhePhe— NHC H O NHCO
10 20 3
- O - C H (0. O lOmmol)をジクロロメタン：メタノール =9 : l ( 10mL)に溶解した液を
6 5
添加した後、減圧濃縮し、さらに真空乾燥した。この残渣に、トリプチルァミン (0. 5m mol)をジクロロメタン（lOmL)に溶解した液を添加した後、減圧濃縮した。この残渣 に超純水（75mL)を添加し、室温で 1時間撹拌した。この反応液に塩化ナトリウム（2 . 25g)を添カ卩し、室温で 1. 5時間撹拌した後、エタノール（75mL)をゆっくり添カロし、 室温で 1時間撹拌した。この溶液にエタノール（75mL)を滴下してエタノール析出を 行い、析出物を遠心分離により分離した。
[0206] 析出物を超純水（60mL)に溶解し、 1Nの水酸ィ匕ナトリウム水溶液 (7. 5mL)を添 加し、 5°Cにて 2時間撹拌した。この溶液に 1Nの塩酸（7. 5mL)を添加することにより 中和し、さらに塩ィ匕ナトリウム（2. 25g)を添加した後、エタノール（150mL)を滴下し てエタノール析出を行い、析出物を遠心分離により分離した。
[0207] 析出物を超純水（75mL)に溶解し、塩化ナトリウム（2. 25g)を添加した後、ェタノ ール（150mL)を滴下してエタノール析出を行い、析出物を遠心分離により分離した
[0208] さらに析出物を超純水（lOOmL)に溶解し、塩ィ匕ナトリウム（6g)を超純水（lOOmL )に溶解した液を添カ卩した後、 0. 45 μ mのフィルター（ステリベックス HV :ミリポア）で ろ過し、以後無菌的に濾液にエタノール (400mL)を滴下してエタノール析出を行い 、析出物を濾取し、真空乾燥した。
[0209] この析出物をリン酸緩衝液（2mMリン酸ナトリウム、 154mM塩化ナトリウム · ρΗ7.
2) ( 15mL)に溶解し、標題の HA—MTX結合体の水溶液を得た。
[0210] ヒアルロン酸を標準物質とするゲルろ過法により求めた分子量は約 244万であった 。また、得られた結合体の MTXの結合率は、紫外吸収（259nm)を測定することによ り算出したところ、 1.0%であった。
NMR(500MHz、 D O)： δ 1.63— 1. 70(m)、 1. 70—1.81(m)、 1.84—
2
1. 93(m)、 2.02 (br. s)、 2. 10— 2. 20(m)、 2.60(m)、 2. 78(m)、 2. 90 (m) 、 3.00(m)、 3. 13-3. 25(m)、 3. 33(s)、 3. 34 (br. s)、 3. 51 (br. s)、 3. 58 ( br. s)、 3.64 (br. s)、 3. 71 (br. s)、 3.83 (br. s)、 4. 18 (t)、 4.45 (br. s)、 4. 56 (br. s)、 4.88(d), 4. 95(d), 6. 77(d), 6. 96— 7. 10(m)、 7. 72(d), 8.6 7(s)
[実施例 3— 2]
MTX- a -PhePhe-NHC H O NHCO— O— [HA]の製造
10 20 3
実施例 3—1と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（200mg、分子量:約 250 万）と実施例 2— 1で得られた MTX— α— PhePhe— NHC H O NHCO— O— C
10 20 3 6
H (0.023mmol)を反応させ、標題の HA— MTX結合体の水溶液を得た。実施例
5
3— 1と同様の方法で求めた分子量は約 248万であり、 MTXの結合率は 1.8%であ つ 7こ。
— NMR(500MHz、 D O)： δ 1.63— 1. 70(m)、 1. 70—1. 79(m)、 1.83—
2
1. 90(m)、 1. 92-1. 95(m)、 2.02 (br. s)、 2. 12— 2. 19(m)、 2. 59(m)、 2. 78(m)、 2. 91(m)、 3.00(m)、 3. 12— 3. 18(m)、 3. 18— 3. 25(m)、 3. 33 (s )、 3. 34 (br. s)、 3. 51 (br. s)、 3. 57 (br. s)、 3.64 (br. s)、 3. 71 (br. s)、 3.8 3 (br. s)、 4. 18 (t)、 4.46 (br. s)、 4. 55 (br. s)、 4.88 (d)、 4. 94 (d)、 6. 77 (d )、 6. 95-7.09(m)、 7. 72(d), 8.67 (s)
[実施例 3— 3]
MTX- a - PhePhe-NHC H O NHCO— O— [HA]の製造
10 20 3
実施例 3—1と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（200mg、分子量:約 220 万）と実施例 2— 2で得られた MTX— α— PhePhe— NHC H O NHCO— O— C
10 20 3 6
H -NO (0.050mmol)を反応させ、標題の HA— MTX結合体の水溶液を得た。
4 2
実施例 3— 1と同様の方法で求めた分子量は約 210万であり、 MTXの結合率は 2. 9 %であった。 Ή—NMR (500MHz, D O) : δ 1. 59— 1.69(m)、 1.69— 1.81(m)、 1.82—
2
1. 90(m)、 2.02 (br. s)、 2. 12— 2. 20(m)、 2.60(m)、 2. 78(m)、 2. 90 (m) 、 3.00(m)、 3. 13-3. 26(m)、 3. 33(s)、 3. 35 (br. s)、 3. 52 (br. s)、 3. 58 ( br. s)、 3. 71 (br. s)、 3. 84 (br. s)4. 19(t)、 4.46 (br. s)、 4. 56 (br. s)、 4.8 7(d), 4. 95(d), 6. 78(d), 6. 93— 7. 10(m)、 7. 72(d), 8.67 (s)
[実施例 3— 4]
MTX- a -PhePhe-NHC H O NHCO— O— [HA]の製造
10 20 3
実施例 3—1と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（200mg、分子量:約 220 万）と実施例 2— 2で得られた MTX— α— PhePhe— NHC H O NHCO— O— C
10 20 3 6
H -NO (0.025mmol)を反応させ、標題の HA— MTX結合体の水溶液を得た。
4 2
実施例 3— 1と同様の方法で求めた分子量は約 216万であり、 MTXの結合率は 2.0 %であった。
— NMR(500MHz、 D O)： δ 1.61— 1. 70(m)、 1. 70—1.80(m)、 1.82—
2
1. 92(m)、 2.02 (br. s)、 2. 12— 2. 20(m)、 2.60(m)、 2. 78(m)、 2. 90 (m) 、 3.01(m)、 3. 12-3. 25(m)、 3. 33(s)、 3. 34 (br. s)、 3. 52 (br. s)、 3. 58 ( br. s)、 3. 72 (br. s)、 3. 83 (br. s)4. 18 (t)、 4.46 (br. s)、 4. 56 (br. s)、 4.8 7(d), 4. 95(d), 6. 77(d), 6. 95— 7. 10(m)、 7. 72(d), 8.67 (s)
[実施例 3— 5]
MTX- a - PhePhe-NHC H O NHCO— O— [HA]の製造
10 20 3
実施例 3—1と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（200mg、分子量:約 220 万）と実施例 2— 2で得られた MTX— α— PhePhe— NHC H O NHCO— O— C
10 20 3 6
H -NO (0.015mmol)を反応させ、標題の HA— MTX結合体の水溶液を得た。
4 2
実施例 3— 1と同様の方法で求めた分子量は約 211万であり、 MTXの結合率は 1.6 %であった。
'H—NMR (500MHz, D O)： δ 1.63— 1. 71(m)、 1. 71— 1. 79(m)、 1.83—
2
1. 90(m)、 2.02 (br. s)、 2. 12— 2. 20(m)、 2.60(m)、 2. 78(m)、 2. 90 (m) 、 3.01(m)、 3. 12-3. 25(m)、 3. 33(s)、 3. 34 (br. s)、 3. 52 (br. s)、 3. 58 ( br. s)、 3. 72 (br. s)、 3. 83 (br. s)4. 18 (t)、 4.46 (br. s)、 4. 56 (br. s)、 4.8 8 (d) , 4. 95 (d) , 6. 77 (d) , 6. 95— 7. 10 (m)、 7. 73 (d) , 8. 67 (s)
[実施例 3 - 6]
MTX- a -PhePhe-NHC H O NHCO— O— [HA]の製造
10 20 3
ヒアルロン酸ナトリウム塩（lOOmg,分子量:約 230万）にセチルピリジ-ゥムクロライ ド（0. 25mmol)をジクロロメタン（10mL)に溶解した液と、実施例 2— 1で得られた M TX- a - PhePhe-NHC H O NHCO— O— C H (0. 004mmol)をジクロロメ
10 20 3 6 5
タン:メタノール = 8 : 2 (5mL)に溶解した液を添加した後、減圧濃縮し、さらに真空乾 燥した。この残渣に、トリブチルァミン（0. 25mmol)をジクロロメタン（5mL)に溶解し た液を添カ卩した後、減圧濃縮した。この残渣に超純水（40mL)を添カ卩し、 5°Cで 1. 5 時間撹拌した。この反応液に塩化ナトリウム（1. 17g)を超純水（5mL)に溶解した液 を添カ卩し、室温で 1時間撹拌した。この溶液にエタノール（90mL)をゆっくり滴下して エタノール析出を行い、室温で 1時間撹拌した後、析出物を遠心分離により分離した
[0211] 析出物を超純水（35mL)に溶解し、 1Nの水酸ィ匕ナトリウム水溶液（5mL)を添カロし 、 5°Cにて 1時間攪拌した。この溶液に 1Nの塩酸（5mL)を添加することにより中和し 、さらに塩ィ匕ナトリウム（1. 17g)を超純水（5mL)に溶解した液を添加したのち、エタ ノール（lOOmL)を滴下してエタノール析出を行い、析出物を遠心分離により分離し た。
[0212] 析出物を超純水 (40mL)に溶解し、塩化ナトリウム（1. 17g)を超純水（5mL)に溶 解した液を添カ卩した後、エタノール（lOOmL)を滴下してエタノール析出を行い、析 出物を遠心分離により分離した。
[0213] さらに析出物を超純水（50mL)に溶解し、塩化ナトリウム（3g)を超純水（50mL)に 溶解した液を添カ卩したのち、 0. 45 mのフィルター（ステリベックス HV :ミリポア）でろ 過し、以後無菌的にろ液にエタノール（200mL)を滴下してエタノール析出を行い、 析出物をろ取し、真空乾燥した。
[0214] この析出物をリン酸緩衝液（2mMリン酸ナトリウム、 154mM塩化ナトリウム、 pH7.
2) (8. 6mL)に溶解し、標題の HA— MTX結合体の水溶液を得た。ヒアルロン酸を 標準物質とするゲルろ過法により求めた分子量は約 216万であった。また、得られた 結合体の MTXの結合率は、紫外吸収（304nm)を測定することにより算出したところ 、 1. 1%であった。
[実施例 3— 7]
MTX- a -PhePhe-NHC H O NHCO— O— [HA]の製造
10 20 3
実施例 3— 6と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（500mg,分子量:約 230 万）と実施例 2— 1で得られた MTX— α— PhePhe— NHC H O NHCO— O— C
10 20 3 6
H (0. 040mmol)を反応させ、標題の HA— MTX結合体の水溶液を得た。実施例
5
3— 6と同様の方法で求めた分子量は約 210万、 MTXの結合率は 2. 0%であった。
[実施例 3— 8]
MTX- a - PhePhe-NHC H O NHCO— O— [HA]の製造
10 20 3
実施例 3— 6と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（500mg,分子量:約 230 万）と実施例 2— 1で得られた MTX— α— PhePhe— NHC H O NHCO— O— C
10 20 3 6
H (0. 063mmol)を反応させ、標題の HA— MTX結合体の水溶液を得た。実施例
5
3— 6と同様の方法で求めた分子量は約 213万、 MTXの結合率は 2. 5%であった。
[実施例 3— 9]
MTX- a - PhePhe-NHC H O NHCO— O— [HA]の製造
10 20 3
実施例 3— 6と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（500mg,分子量:約 230 万）と実施例 2— 1で得られた MTX— α— PhePhe— NHC H O NHCO— O— C
10 20 3 6
H (0. 044mmol)を反応させ、標題の HA— MTX結合体の水溶液を得た。実施例
5
3— 6と同様の方法で求めた分子量は約 232万、 MTXの結合率は 2. 6%であった。
[実施例 3 - 10]
MTX- a - PhePhe-NHC H O NHCO— O— [HA]の製造
10 20 3
実施例 3— 6と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（500mg,分子量:約 230 万）と実施例 2— 1で得られた MTX— α— PhePhe— NHC H O NHCO— O— C
10 20 3 6
H (0. 094mmol)を反応させ、標題の HA— MTX結合体の水溶液を得た。実施例
5
3— 6と同様の方法で求めた分子量は約 205万、 MTXの結合率は 3. 8%であった。
[実施例 3 - 11]
MTX- a - PhePhe-NHC H O NHCO— O— [HA]の製造 実施例 3— 6と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（lOOmg,分子量:約 86万) と実施例 2— 1で得られた MTX— α— PhePhe— NHC H O NHCO— O— C H
10 20 3 6 5
(0. 004mmol)を反応させ、標題の HA— MTX結合体の水溶液を得た。実施例 3 6と同様の方法で求めた分子量は約 86万、 MTXの結合率は 1. 2%であった。
[実施例 3— 12]
MTX- a -PhePhe-NHC H O NHCO— O— [HA]の製造
10 20 3
実施例 3— 6と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（lOOmg,分子量:約 86万) と実施例 2— 1で得られた MTX— α— PhePhe— NHC H O NHCO— O— C H
10 20 3 6 5
(0. 008mmol)を反応させ、標題の HA— MTX結合体の水溶液を得た。実施例 3 6と同様の方法で求めた分子量は約 83万、 MTXの結合率は 2. 0%であった。
[実施例 3 - 13]
MTX- a - PhePhe-NHC H O NHCO— O— [HA]の製造
10 20 3
実施例 3— 6と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（lOOmg,分子量:約 86万) と実施例 2— 1で得られた MTX— α— PhePhe— NHC H O NHCO— O— C H
10 20 3 6 5
(0. 019mmol)を反応させ、標題の HA— MTX結合体の水溶液を得た。実施例 3 6と同様の方法で求めた分子量は約 85万、 MTXの結合率は 3. 3%であった。
[実施例 3 - 14]
MTX- a - PhePhe-NHC H O NHCO— O— [HA]の製造
10 20 3
実施例 3— 6と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（lOOmg,分子量:約 35万) と実施例 2— 1で得られた MTX— α— PhePhe— NHC H O NHCO— O— C H
10 20 3 6 5
(0. 004mmol)を反応させ、標題の HA— MTX結合体の水溶液を得た。実施例 3 6と同様の方法で求めた分子量は約 35万、 MTXの結合率は 1. 1%であった。
[実施例 3— 15]
MTX- a -PheGly-NHC H O NHCO— O— [HA]の製造
10 20 3
実施例 3— 6と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（lOOmg,分子量:約 230 万）と実施例2— 3で得られたMTX—α—PheGly—NHC H O NHCO— O— C
10 20 3 6
H (0. 008mmol)を反応させ、標題の HA— MTX結合体の水溶液を得た。実施例
5
3— 6と同様の方法で求めた分子量は約 232万、 MTXの結合率は 2. 4%であった。 [実施例 3 - 16]
MTX- a -Ile-NHC H O NHCO— O— [HA]の製造
10 20 3
実施例 3— 6と同様の方法で、ヒアルロン酸ナトリウム塩（lOOmg,分子量:約 230 万）と実施例 2— 4で得られた MTX— a—lie— NHC H O NHCO— O— C H (0
10 20 3 6 5
. 008mmol)を反応させ、標題の HA—MTX結合体の水溶液を得た。実施例 3— 6 と同様の方法で求めた分子量は約 226万、 MTXの結合率は 2. 2%であった。
[0215] 上記実施例 3—1と同様にして、以下の HA—MTX結合体も合成することが可能で ある。
[0216] [表 1]
MTX- (ペプチド鎖を含有するリンカ一） 一 0_ [HA]
Figure imgf000060_0001
[実験例 1]
分子量 Z粘弾性の測定
実施例 3の結合体の粘弾性及び対照としてのヒアルロン酸の粘弾性を、 CSL500 型ストレス制御式レオメーター（Carri— Med社製）で、直径 4cmのコーンを用い、 37 °Cで測定した。
[実験例 2]
滑膜細胞増殖抑制作用
ヒト滑膜細胞 (HFLS)を用いて、 TNF- α刺激による細胞増殖亢進に対する本発 明の HA— ΜΤΧ結合体の影響を検討した。関節リウマチ (RA)の主病巣は、滑膜組 織であり、その特徴の一つとして、滑膜細胞が異常増殖して肉芽組織 (パンヌス)を形 成し、関節の軟骨 ·骨を破壊することが知られている。また、変形性関節症 (OA)でも 二次性の滑膜炎が見られる。 OAにおいては、 RAで見られるような滑膜細胞の著し い増殖変化はないものの、滑膜炎は膝 OAの特徴である関節水症や疼痛、熱感とい つた炎症症状の原因となる (宫坂信之ら編集、「骨 ·関節疾患」 2003年、朝倉書店)。 従って、炎症性サイト力インである TNF— αで亢進した滑膜細胞の増殖を阻害する 化合物は、 RAおよび OAの病態進行抑制や治療のために薬剤となる。
[0218] 被験物質として実施例 3の HA—MTX結合体の無菌水溶液を使用した。 HFLSは RA患者由来のヒト滑膜細胞（HFLS—RA、 CA404— 05、 Lot No. : 1493)と OA 患者由来のヒト滑膜細胞0¾ 1^ー0八、じ八400— 05、1^^ No. : 1442)を CELL APPLICATIONS INS.より購入して使用した。
[0219] HFLSは 96穴プレート（Falcon)に 5000cellsZwellで播種して 5%FBS、 lx A ntibiotic— antimycotic (uIBし O)含 Iscove s modified Dulbecco s medi um (IMDM)培地にて 3時間培養した。細胞付着後、 TNF— a (最終濃度 lOngZ mL)、各濃度の HA—MTX結合体を添加して 5日間培養した。培養終了 2日前に、 37kBqZwellの [¾]—デォキシゥリジン（MORAVEK)を加え、細胞内への [ ] ーデォキシゥリジン取り込み量 (放射活性)をシンチレーシヨンカウンターで測定した。 細胞の回収は 0. 05%トリプシン— 0. 2%EDTAで細胞を剥がして行った。
[0220] 各実験で測定した各被験物質の放射活性は、被験物質を添加せず培養した群の 放射活性を controlとして、相対値 (％ of control)を算出した。 HA—MTX結合体 の MTX濃度は、ヒアルロン酸 lmgZmLあたりフリーのカルボキシル基が 2. 49x10 "3mol/L (lg/401/L： 401は N—ァセチルダルコサミン +グルクロン酸の分子量） であることから、この値に MTXの結合率を乗じて算出した。（MTX結合率 1%の HA — MTX結合体 Img/mLの場合、 MTX濃度は 2.49x10— 5molZLとした。）得られ た値を使用して 4 parameter logistic法（解析ソフト GraphPad Prism 3.02お よび 4.02)により細胞増殖阻害活性 (IC 値)を算出した。
50
[0221] HFLS— RAにおける HA— MTX結合体の IC 値を表 2に、 HFLS— OAにおける
50
HA— MTX結合体の IC 値を表 3に示す。
50
[0222] [表 2]
¾ 2 T N F 刺激したヒト滑膜細胞 （H F L S R A) の増殖抑制作用
Figure imgf000062_0001
[0223] 表 2の結果より、検討した HA— MTX結合体はいずれも TNF— α刺激による HFL
S— RAの細胞増殖亢進を抑制する作用を有することが確認された。
[0224] [表 3]
表 3 T N F a刺激したヒト滑糗細胞 （H F L S— OA) の增殖抑制作用
Figure imgf000062_0002
表 3の結果より、検討した HA— MTX結合体はいずれも TNF ひ刺激による HFL S OAの細胞増殖亢進を抑制する作用を有することが確認された。 [0226] [実験例 3]
mBSA誘導単関節炎モデルに対する膝関節腫脹抑制効果
本発明の H A— MTX結合体の in vivoでの滑膜炎抑制作用を、ラット methylated bovine serum albumin (mBSA)誘導単関節炎モデルの膝関節腫脹の抑制効果にて 評価した。本実験で用いられた mBSA誘導単関節炎モデルは、抗原誘発関節炎モ デルとして汎用されるものであり、滑膜炎を誘発することが知られている (Sven E. Andersson, et al. The Journal of Rheumatology (1998) 25:9, 1772- 7)ことから、本モ デルで認められる in vivoにおける関節腫脹の抑制効果は、滑膜炎抑制作用である と考えることができる。滑膜炎を in vivoで抑制する化合物は、滑膜炎を伴う関節疾 患 (RAや OAなど）の治療薬として有用である。
[0227] 動物は LEWZCrj系ラット（日本チャールズ 'リバ一、 6週齢、雄)を使用した。関節 炎を誘導する 21日および 14日前に、 2mgZmLの mBSA(Calbiochem)水溶液と 等量の Freund' s complete adjuvant (Difco)で作製した乳濁液 0. 5mLをラットのわき 腹に皮下投与した。関節炎は 2mgZmLの mBSA水溶液 50 Lを右膝関節内投与 して誘導した。左膝関節は無処置で各個体のコントロールとした。被験物質 (無菌水 溶液)および対照薬であるヒアルロン酸は関節炎誘導 7日および 1日前と 7日後に、 5 0 Lを右膝関節内投与した。
[0228] 膝関節腫脹の測定は両膝関節の幅をノギスで測定して、左右差 (右膝直径 左膝 直径)を膝関節腫脹とした。関節炎誘導直前より 2週間後まで週 2回の頻度で膝関節 幅を測定して、その経時的推移から AUC (Area Under the Curveの略。曲線下面積 ともいう。ここでは、関節腫張の経時的曲線下の面積を示す。）を算出した。測定時ご とに AUCの平均値および標準偏差を算出し、被検物質投与群と HA投与群間で対 応のない t検定を行い、危険率 5%未満の場合に有意差ありと判断した。統計解析は SAS version 6.12または 8.02 (SASインスティチュートジャパン）を使用した。また、各 被験物質の AUCは HA投与群を controlとして、各被験物質の相対値 (％ of control) を算出した。
[0229] 本発明の各 HA— MTX結合体の効果を上記の方法で検討した結果を表 4に示す [0230] [表 4]
表 tnBSA誘導単関節炎モデルの関節腫脹に対する HA-MTX結合体の抑制作用
Figure imgf000064_0001
[0231] 表 4に示される結果より、今回検討した HA— MTX結合体はいずれも、 HA投与群 に比べ、関節炎モデルの膝関節腫脹を有意に抑制することが明らかとなった。また、 HAに結合する MTXの結合率の影響に注目すると、特に、 MTXの結合率が 1. 1か ら 3. 8% (実施例 3)の場合に、関節炎モデルの膝関節腫脹を HA投与群に比べて 有意に抑制することが示唆された。
[0232] [実験例 4]
実験例 3の方法に従い、本発明の HA— MTX結合体の有用性を検証する目的で 、 1)実施例 3— 10で調製した HA— MTX結合体 (無菌水溶液)の投与群、 2)その H A— MTX結合体が含有する MTXと同量の MTXを含む溶液の投与群、および 3)そ の結合体が含有するのと同量の MTXおよびヒアルロン酸（HA)の混合物（HA+M TX)の投与群の間で関節腫脹抑制作用を比較した。対照薬として、 HAおよび Vehi cle (2mMリン酸緩衝液、 0. 9%NaCl)を用いた。本実験例においては、 HAとして スべニール (SVE、中外製薬株式会社)を用いた。本試験の膝関節腫脹の経時的推 移を図 1に、及びその AUCを図 2に示す。図 1および図 2に示される結果より、 MTX 単体および MTXと HAの混合物に比べ、 HA— MTX結合体は、関節炎モデルの関 節腫脹に対する著しく強い抑制作用を有することが確認された。従って、 MTXと HA との結合は、 MTXの関節腫脹抑制作用を著しく向上させることが明らかとなった。
[0233] 以上のことより、本発明の HA— MTX結合体は、 HAには認められない in vitroで の TNF— α刺激によるヒト滑膜細胞の増殖抑制作用、及び、 in vivoでの滑膜炎を 軽減する作用（関節炎を発症するモデルにおいて)を有することが明らかとなった。ま た、関節炎モデルにおいては、 MTX単独および HAと MTXの混合物では十分な滑 膜炎の軽減作用が認められな ヽのに対し、 HA— MTX結合体は強力な滑膜炎の軽 減作用を発揮することが明らかとなった。
[0234] [実験例 5]
コラーゲン関節炎モデルに対する影響
HA—MTX結合体の in vivoにおける滑膜炎抑制作用を、関節リウマチ (RA)の モデルとして汎用されるラットコラーゲン関節炎モデル (金ら、「関節外科」（1998)、 Vol. 17、 No. 2、 111— 21)にて評価した。本モデルで炎症を抑制する本発明化合 物は、 RAに代表される自己抗原誘発の免疫疾患治療に有用である。
[0235] 動物は DAZSlcラット（日本エスエルシー (株）、 11週齢、メス）を使用した。ゥシ Π 型コラーゲン (コラーゲン技術研修会）を 0. OlmolZL酢酸水溶液に 1. 5mg/mL となるように溶解して、これに等量の Freund's incomplete adjuvant (Difco)をカ卩えて 乳濁液を作製した。この乳濁液をラットの背部皮内 4力所に 1力所当たり約 0. lml^C 合計 0. 4mL投与し、関節炎を誘発した。実施例 3— 7の被験物質 (無菌水溶液)およ び対照薬であるヒアルロン酸（HA)と Vehicle (2mMリン酸緩衝液、 0. 9%NaCl)は 、感作当日より、 5日に 1回の割合で、 50 Lを右膝関節内にのみ投与を行った。左 膝関節は無処置とした。また、病態モデルの対照として、関節炎を誘導しない動物（ Normal)の右膝関節内に Vehicleを投与した。
[0236] 膝関節腫脹の変化は両膝の関節幅をノギスで測定して正常群の関節幅と比較する ことで観察した。関節炎誘導直前より 30日後まで、週 2回程度の割合で観察した。膝 関節幅の測定値については、測定時ごとに平均値および標準誤差を算出し、被験 物質群と HA投与群間で対応のな ヽ t検定を行 ヽ、危険率 5%未満の場合に有意差 ありと判断した。統計解析は SAS version 8.02 (SASインスティチュートジャパン）を使 用した。
[0237] 本発明の HA— MTX結合体の効果を上記の方法で検討した結果を図 3に示す。
[0238] 図 3に示される結果より、本発明の HA— MTX結合体は、 HA投与群に比べてコラ 一ゲン関節炎の誘導により腫脹した関節幅を有意に抑制し、その関節幅の経時的推 移は、正常群とほぼ同等レベルであった。また、この効果は、 HA— MTX結合体を 投与した部位 (右膝）においてのみ観察され、非投与部位 (左膝）においては認めら れな力つた。このように、本化合物が、投与部位に限局して、作用を発現できることが 明らかとなった。
[0239] [実験例 6]
コラゲナーゼ誘導関節炎 (OA)モデルに対する関節腫脹抑制効果
HA—MTX結合体の in vivoにおける滑膜炎抑制作用を、コラゲナーゼ誘導 OA モデルラットにて評価した。コラゲナーゼ誘導 OAモデルは関節内にコラゲナーゼ水 溶液を注入することにより、軟骨組織のコラーゲンを直接消化して、関節内で炎症を 誘発するモデルである。このモデルは関節軟骨変性や滑膜炎などのヒト OA病態と類 似した病理組織学的変化を示し、 OA治療薬の評価に有用である (Takanori K. et al., Osteoarthritis and Cartilage (1998) 6, 177-86)。従って、本モデノレの炎症を抑制 する化合物は OA治療薬として有用である。
[0240] 動物は SDZCrj系ラット（日本チャールズ 'リバ一、 6週齢、雄）を使用した。 1. 5% Collagenase (SIGMA)溶液 50 μ Lを右膝関節腔内に投与して関節炎を誘導した。 左膝関節は、各個体のコントロールとするために無処置にした。実施例 3— 7の被験 物質 (無菌水溶液)および対照薬であるヒアルロン酸 (HA)と Vehicle (2mMリン酸緩 衝液、 0. 9%NaCl)は、関節炎誘導の 7および 1日前より、週 1回の割合で 50 Lを 右膝関節内に投与した。
[0241] 膝関節腫脹の測定は、両膝関節の幅をノギスで測定して、その左右差 (右膝直径 左膝直径)を求めて膝関節腫脹とした。関節炎誘導直前より 20日後まで、週 2回 程度の頻度で膝関節幅を測定して、その経時的推移を示すグラフの AUCを算出し た。測定時ごとに AUCの平均値および標準誤差を算出し、被検物質投与群と HA投 与群間で対応のない t検定を行い、危険率 5%未満の場合に有意差ありと判断した。
[0242] 本発明の HA— MTX結合体の効果を上記の方法で検討した結果を図 4に示す。
図 4中の左図に HA—MTX結合体の典型的な関節腫脹の経時変化を示し、そこか ら求めた AUCを図 4中の右図に示した。 [0243] これらの結果より、 HA— MTX結合体は、コラゲナーゼ誘導関節炎モデルにおい て、 HA投与群が示す関節腫脹と比べて有意に関節腫脹を抑制することが明らかと なった。
産業上の利用可能性
[0244] 本発明の HA— MTX結合体により、関節注入剤としての HAの側面を持ちながら、 MTXの滑膜炎抑制作用を投与関節内でのみ安全に発現させることができる、従来 にな!ヽ効果を有する、優れた関節疾患治療薬が提供される。

Claims

請求の範囲
[1] ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体またはそれらの塩の水酸基に、 1〜8個のアミノ酸 力もなるペプチド鎖を含有するリンカ一を介してメトトレキサートが結合しており、該リ ンカーと該ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体またはそれらの塩とが力ルバメート基を 形成して結合している、ヒアルロン酸—メトトレキサート結合体。
[2] リンカ一が、 1〜8個のアミノ酸からなるペプチド鎖、および C アルキレンジァミン
2-20
鎖を含み、当該アルキレンジァミン鎖は、 1〜5個の酸素原子が挿入されていてもよく および Zまたはカルボキシル基若しくはじ アルコキシカルボ-ル基で置換されて!ヽ
1-6
てもよ 、、請求項 1に記載のヒアルロン酸ーメトトレキサート結合体。
[3] ヒアルロン酸の N—ァセチルダルコサミン数に対するメトトレキサートの結合率が 0.
5%〜4. 5%である、請求項 1または 2に記載のヒアルロン酸ーメトトレキサート結合体
[4] ヒアルロン酸の分子量力 ½0万ダルトン以上である請求項 1〜3のいずれ力 1項に記 載のヒアルロン酸—メトトレキサート結合体。
[5] リンカ一に結合したメトトレキサートが、式 (1)、（Π)、（III)または (IV)：
[化 1]
Figure imgf000068_0001
Figure imgf000069_0001
Figure imgf000069_0002
[化 4]
Figure imgf000069_0003
[式中、 Rおよび Rはそれぞれ独立に、水酸基、アミノ基、 C アルコキシ基、 C ァ
1 2 1-6 1-6 ルキルアミノ基、またはジ—C アルキルアミノ基であり；
1-6
Lは、リンカ一の結合位置である。 ]
0
で表される、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のヒアルロン酸ーメトトレキサート結 合体。
[6] ペプチド鎖を含有するリンカ一および当該リンカ一に結合したメトトレキサートが、式
(1' )または(11' )： [化 5]
Figure imgf000070_0001
[式中、 Rおよび Rはそれぞれ独立に、水酸基、アミノ基、 C アルコキシ基、 C ァ
1 2 1-6 1-6 ルキルアミノ基、またはジ—C アルキルアミノ基であり；
1-6
Lは、式 (X)
[化 7]
Figure imgf000070_0002
(X)
(式中、 Qは結合する一 NH—と一緒になつて 1〜8個のアミノ酸力 なるペプチド鎖
1
を形成し、当該ペプチド鎖に含まれるアミノ酸の各残基は、独立に、 C アルキル基、
1-6
C アルキルカルボニル基、 C アルコキシカルボニル基、ホルミル基、 C アルキル
1-6 1-6 1-6 スルホニル基、および置換されて!/、てもよ!/、C ァリールスルホニル基からなる群か ら選択される 1個以上の基により置換または保護されていてもよぐ当該ペプチド鎖に 含まれる各アミド結合は、独立に 1個以上の c アルキル基および
1-6 Zまたは c アル
1-6 キルカルボニル基で窒素原子上を置換されて 、てもよく、当該残基に含まれる各力 ルボキシル基は、独立に 1または 2個の C アルキル基で置換されていてもよいアミド
1-6
基に変換されていてもよく；
R および R はそれぞれ独立に水素原子または C アルキル基であり；
11 12 1-6
Qは C アルキレンであり、当該アルキレンは 1〜5個の酸素原子が挿入されてい
2 2-20
てもよくおよび Zまたはカルボキシル基若しくは c アルコキシカルボニル基で置換さ
1-6
れていてもよく；
[HA]はヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはそれらの塩中の水酸基の位置 を表し、リンカ一と該ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはそれらの塩とが該位 置で力ルバメート基により結合し;および
「ー0—[11八]」中の酸素原子「ー0—」は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、ま たはそれらの塩中の任意の位置における水酸基に由来する酸素原子を示す)で表さ れるリンカ一である。 ]
で表される、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のヒアルロン酸ーメトトレキサート結 合体。
[7] 請求項 1〜6のいずれか 1項に記載のヒアルロン酸ーメトトレキサート結合体を有効 成分として含有する医薬組成物。
[8] 請求項 1〜6のいずれか 1項に記載のヒアルロン酸ーメトトレキサート結合体を有効 成分として含有する関節疾患治療薬。
[9] 関節局所投与製剤である請求項 8に記載の関節疾患治療薬。
[10] 式 (Va)または (Vb) :
[化 8]
Figure imgf000072_0001
Figure imgf000072_0002
[式中、 Rおよび Rはそれぞれ独立に、水酸基、アミノ基、 C アルコキシ基、 C ァ
1 2 1-6 1-6 ルキルアミノ基、またはジ—C アルキルアミノ基であり；
1-6
Lは、式 (Χ')
1
[化 10]
Figure imgf000072_0003
(Χ') または式 (χ'')
[化 11]
Figure imgf000072_0004
(X") (式中、 Qは結合する一 NH—と一緒になつて 1〜8個のアミノ酸力 なるペプチド鎖
1
を形成し、当該ペプチド鎖に含まれるアミノ酸の各残基は、独立に、 C アルキル基、
1-6
C アルキルカルボニル基、 C アルコキシカルボニル基、ホルミル基、 C アルキル
1-6 1-6 1-6 スルホニル基、および置換されて!/、てもよ!/、C ァリールスルホニル基からなる群か
6-10
ら選択される 1個以上の基により置換または保護されていてもよぐ当該ペプチド鎖に 含まれる各アミド結合は、独立に 1個以上の c アルキル基および Zまたは c アル
1-6 1-6 キルカルボニル基で窒素原子上を置換されて 、てもよく、当該残基に含まれる各力 ルボキシル基は、独立に 1または 2個の C アルキルで置換されていてもよいアミド基
1-6
に変換されていてもよく；
R および R はそれぞれ独立に水素原子または C アルキルであり；
11 12 1-6
R は水素原子、 C アルキル基、カルボキシミド基、置換されていてもよいへテロア
13 1-6
リール基または置換されていてもよい c ァリール基であり；
6-18
Qはじ アルキレンであり、当該アルキレンは 1〜5個の酸素原子が挿入されてい
2 2-20
てもよくおよび Zまたはカルボキシル基若しくはじ アルコキシカルボ-ル基で
1-6 置換さ れていてもよい。）である。 ]
の化合物またはその塩。
式 (Va)または (Vb)
[化 12]
Figure imgf000073_0001
[化 13]
Figure imgf000074_0001
[式中、 Rおよび Rはそれぞれ独立に、水酸基、アミノ基、 C アルコキシ基、 C
1 2 1-6
ルキルアミノ基、またはジ—C アルキルアミノ基であり；
1-6
Lは、式 (Χ' )
1
[化 14]
Figure imgf000074_0002
(Χ ') または式 (χ' ')
[化 15]
Figure imgf000074_0003
(X ")
(式中、 Qは結合する一 NH—と一緒になつて 1〜8個のアミノ酸力 なるペプチド鎖
1
を形成し、当該ペプチド鎖に含まれるアミノ酸の各残基は、独立に、 C アルキル基、
1-6
C アルキルカルボニル基、 C アルコキシカルボニル基、ホルミル基、 C アルキル
1-6 1-6 1-6 スルホニル基、および置換されて!/、てもよ!/、C ァリールスルホニル基からなる群か
6-10
ら選択される 1個以上の基により置換または保護されていてもよぐ当該ペプチド鎖に 含まれる各アミド結合は、独立に 1個以上の c アルキル基および Zまたは c アル
1-6 1-6 キルカルボニル基で窒素原子上を置換されて 、てもよく、当該残基に含まれる各力 ルボキシル基は、独立に 1または 2個の C アルキルで置換されていてもよいアミド基
1-6
に変換されていてもよく；
R および R はそれぞれ独立に水素原子または C アルキルであり；
11 12 1-6
R は水素原子、 C アルキル基、カルボキシミド基、置換されていてもよいへテロア
13 1-6
リール基、または置換されていてもよい C ァリール基であり；
6-18
Qはじ アルキレンであり、当該アルキレンは 1〜5個の酸素原子が挿入されてい
2 2-20
てもよくおよび Zまたはカルボキシル基若しくはじ アルコキシカルボ-ル基で
1-6 置換さ れていてもよい。）である。 ]
の化合物またはその塩を、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはそれらの塩と反 応させ、当該ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、またはそれらの塩の水酸基の位置 で力ルバメート基により式 (Va)または (Vb)の化合物またはその塩を結合させる工程 を含む、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体またはそれらの塩の水酸基に、 1〜8個の アミノ酸力もなるペプチド鎖を含有するリンカ一を介してメトトレキサートが結合してお り、該リンカ一と該ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体またはそれらの塩とがカルバメー ト基を形成して結合して 、る、ヒアルロン酸ーメトトレキサート結合体の製造方法。
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