JP2019059951A - グリコサミノグリカン誘導体及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
薬物をGAGに導入する目的は、(1)GAGをキャリアーとして目的部位にデリバーさせる、(2)高分子のGAGを用いることで患部に滞留させ薬物を放出させる、(3)GAG自体の機能、薬理作用を利用するなどが考えられる。
適用する疾患は種々あるが、疾患によっては早期に薬物を放出させることが必要な疾患、あるいは長期間の放出が必要な疾患、あるいはその中間に位置する微妙な放出速度が必要な疾患などがある。
しかしながら、これまで開発された薬物導入GAG誘導体は、適用領域で求められる放出の速度とその化合物の適性がたまたま合致したときに効果を発揮し、積極的に放出速度を制御する試みはなされてこなかった。
<2> グリコサミノグリカンに由来する基と、カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する生理活性物質に由来する基とがスペーサーを介する共有結合で連結され、スペーサーが生理活性物質に由来する基との共有結合の分解速度に応じて選択される、グリコサミノグリカン誘導体である。
<3> グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、へパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも1種である、前記<2>に記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
<4> 生理活性物質が、非ステロイド性抗炎症薬、ステロイド、抗リウマチ薬、抗アレルギー薬、高脂血症治療薬及びβ刺激薬からなる群より選択される少なくとも1種である、前記<2>又は<3>に記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
<5> 生理活性物質に由来する基とスペーサーとが、エステル結合で共有結合している前記<2>〜<4>のいずれか1つに記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
<6> グリコサミノグリカンに由来する基とスペーサーとが、アミド結合で共有結合している前記<2>〜<5>のいずれか1つに記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
<7> スペーサーがアミノアルコール、アミノ酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも1種の化合物に由来する2価以上の基である、前記<2>〜<6>のいずれか1つに記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
<8> スペーサーが下記一般式(I)で表されるアミノ酸に由来する2価の基である、前記<2>〜<7>のいずれか1つに記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
−HN−(CH2)m−CR11R12−CR13R14−CO− (I)
(式中、mは0〜12の整数を示す。R11〜R14はそれぞれ独立に、水素原子、電子吸引基、電子供与基又は立体障害性基を示す)
<9> スペーサーが下記一般式(II)で表されるアミノアルコールに由来する2価の基である、前記<2>〜<7>のいずれか1つに記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
−HN−(CH2)n−CR21R22−CR23R24−O− (II)
(式中、nは0〜12の整数を示す。R21〜R24はそれぞれ独立に、水素原子、電子吸引基、電子供与基又は立体障害性基を示す)
<10> スペーサーが、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、システイン、プロリン、β−アラニン及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも1種のアミノ酸に由来する2価以上の基、又はアミノプロパノール、アミノエタノール及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも1種のアミノアルコールに由来する2価以上の基である、前記<2>〜<7>のいずれか1つに記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
<11> 前記<2>〜<10>のいずれか1つに記載のグリコサミノグリカン誘導体を含む医薬組成物である。
<12> 前記<2>〜<10>のいずれか1つに記載のグリコサミノグリカン誘導体を含む放出制御製剤である。
<13> 前記<2>〜<10>のいずれか1つに記載のグリコサミノグリカン誘導体を含む持続型疼痛抑制剤である。
<14> カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する生理活性物質を準備することと、生理活性物質に由来する基と共有結合を形成するスペーサーを該共有結合の分解速度に応じて選択することと、生理活性物質に由来する基とグリコサミノグリカンに由来する基とをスペーサーを介して共有結合することと、を含むグリコサミノグリカン誘導体の製造方法である。
<15> グリコサミノグリカンに由来する基と、カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する生理活性物質に由来する基とがスペーサーを介する共有結合で連結されたグリコサミノグリカン誘導体であって、
グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸であり、
生理活性物質が、非ステロイド性抗炎症薬であり、
生理活性物質に由来する基とスペーサーとが、エステル結合で共有結合しており、
グリコサミノグリカンに由来する基とスペーサーとが、アミド結合で共有結合しており、
スペーサーが下記一般式(II)で表されるアミノアルコールに由来する2価の基である、グリコサミノグリカン誘導体である。
−HN−(CH2)n−CR21R22−CR23R24−O− (II)
(式中、nは0〜12の整数を示す。R21〜R24はそれぞれ独立に、水素原子又は立体障害性基を示す)
<16> 生理活性物質が、ジクロフェナクである、前記<15>に記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
<17> 前記R21〜R24の1又は2以上が立体障害性基である、前記<15>又は<16>に記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
<18> 前記R21〜R24の1又は2以上がメチル基である、前記<15>又は<16>に記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
<19>グリコサミノグリカンに由来する基と、カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する生理活性物質に由来する基とがスペーサーを介する共有結合で連結されたグリコサミノグリカン誘導体であって、
グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸であり、
生理活性物質が非ステロイド性抗炎症薬、であり、
生理活性物質に由来する基とスペーサーとが、エステル結合で共有結合しており、
グリコサミノグリカンに由来する基とスペーサーとが、アミド結合で共有結合しており、
スペーサーが下記一般式(II)で表されるアミノアルコールに由来する2価の基である、グリコサミノグリカン誘導体である。
−HN−(CH2)n−CR21R22−CR23R24−O− (II)
(式中、nは0〜12の整数を示す。R21〜R24はそれぞれ独立に、水素原子又は電子吸引基を示す)
<20> 生理活性物質が、ケトプロフェンである、前記<19>に記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
<21> 前記R21〜R24の1又は2以上が電子吸引基である、前記<19>又は<20>に記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
<22> 前記R21〜R24の1又は2以上がフッ素である、前記<19>又は<20>に記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
<23> 前記<15>〜<22>のいずれか1つに記載のグリコサミノグリカン誘導体を含む医薬組成物である。
<24> 前記<15>〜<22>のいずれか1つに記載のグリコサミノグリカン誘導体を含む疼痛抑制剤である。
<25> グリコサミノグリカン誘導体における生理活性物質の導入率が、3%〜50%である前記<24>に記載の疼痛抑制剤である。
<26> グリコサミノグリカン誘導体における生理活性物質の導入率が、5%〜35%である前記<24>に記載の疼痛抑制剤である。
<27> グリコサミノグリカン誘導体における生理活性物質の導入率が、10%〜30%である前記<24>に記載の疼痛抑制剤である。
<28> <13>及び<24>〜<27>が溶液である疼痛抑制剤。この場合において、グリコサミノグリカン誘導体の含有量が、溶液全体の0.5%(w/v%)〜10%(w/v%)である前記<13>及び<24>〜<27>のいずれか1つに記載の疼痛抑制剤である。
<29> グリコサミノグリカン誘導体の含有量が、溶液全体の0.7%(w/v%)〜1.8%(w/v%)である前記<13>及び<24>〜<27>のいずれか1つに記載の疼痛抑制剤である。
<30> グリコサミノグリカン誘導体の含有量が、溶液全体の1%(w/v%)〜7%(w/v%)である前記<13>及び<24>〜<27>のいずれか1つに記載の疼痛抑制剤である。
<31> 3日以上の投与間隔で投与される、前記<13>及び<24>〜<30>のいずれか1つに記載の疼痛抑制剤である。
<32> 7日以上の投与間隔で投与される、前記<13>及び<24>〜<30>のいずれか1つに記載の疼痛抑制剤である。
<33> 10日以上の投与間隔で投与される、前記<13>及び<24>〜<30>のいずれか1つに記載の疼痛抑制剤である。
<34> 14日以上の投与間隔で投与される、前記<13>及び<24>〜<30>のいずれか1つに記載の疼痛抑制剤である。
<35> 疼痛抑制効果が、投与後3日間またはそれ以上持続するものである前記<13>及び<24>〜<34>のいずれか1つに記載の疼痛抑制剤である。
<36> 疼痛抑制効果が、投与後7日間またはそれ以上持続するものである前記<13>及び<24>〜<34>のいずれか1つに記載の疼痛抑制剤である。
<37> 疼痛抑制効果が、投与後10日間またはそれ以上持続するものである前記<13>及び<24>〜<34>のいずれか1つに記載の疼痛抑制剤である。
<38> 疼痛抑制効果が、投与後14日間またはそれ以上持続するものである前記<13>及び<24>〜<34>のいずれか1つに記載の疼痛抑制剤である。
<39> 前記<13>及び<24>〜<38>のいずれか1つに記載の疼痛抑制剤であって、筋肉内注射用の疼痛抑制剤である。
<40> 筋肉痛の治療用である前記<13>及び<24>〜<39>のいずれか1つに記載の疼痛抑制剤である。
<41> グリコサミノグリカン誘導体からの生理活性物質の遊離速度が、pH7.5、36℃のリン酸緩衝生理食塩液中において、0.1〜30%/日である、<2>〜<10>及び<15>〜<22>のいずれか1つに記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
<42> グリコサミノグリカン誘導体からの生理活性物質の遊離速度が、pH7.5、36℃のリン酸緩衝生理食塩液中において、0.1〜30%/日である、<11>又は<23>に記載の医薬組成物である。
<43> グリコサミノグリカン誘導体からの生理活性物質の遊離速度が、pH7.5、36℃のリン酸緩衝生理食塩液中において、0.1〜30%/日である、<13>及び<24>〜<40>のいずれか1つに記載の疼痛抑制剤である。
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
本実施形態のグリコサミノグリカン誘導体は、グリコサミノグリカンに由来する基と、カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する生理活性物質(以下、薬物ともいう)に由来する基とがスペーサーを介する共有結合で連結され、該スペーサーが生理活性物質に由来する基とスペーサーとの共有結合の分解速度に応じて選択されることを特徴とする、薬物導入されたグリコサミノグリカン誘導体である。
本実施形態のグリコサミノグリカン誘導体は、薬物の構造に大きく依存せずに薬物放出速度を制御することが可能で、適用される疾患に応じて適切な速度で薬物を放出することができる。これにより、早期の薬物放出が必要な疾患、あるいは長期間の薬物徐放の必要な疾患等のいずれにも応用が可能である。又、グリコサミノグリカン誘導体を含む医薬組成物の形態も注射薬、粉末製剤等に応用可能であり、高脂血症等の様々な疾患、関節炎、喘息、腰痛、疼痛制御などに利用可能である。
更に本実施形態によれば、あらゆる温度条件でも薬物遊離速度を制御することが可能であり、また薬物放出される期間についても、秒、分、時間、日、月、年単位に関わらず薬物遊離速度を制御することが可能である。
GAG誘導体においては、GAGに由来する基に、1つのスペーサーを介して2以上の生理活性物質に由来する基が共有結合していてもよい。1つのスペーサーに共有結合する生理活性物質に由来する基の数は少なくとも1であれば、特に制限されない。スペーサーは2価以上の基であれば、特に制限されないが、2価の基であることが好ましい。
GAG分子を構成するアミノ糖としては、D−グルコサミン、α−D−ガラクトサミン等を挙げることができる。またウロン酸としては、β−D−グルクロン酸、α−L−イズロン酸等を挙げることができる。
GAG分子は硫酸基が付加した構造であってもよい。硫酸基は、ヒドロキシ基に付加していてもアミノ基に付加していてもよい。
GAG分子は1種単独でも2種以上を組み合わせて用いてもよい。
これらの中でも、GAG分子は、GAG誘導体からの生理活性物質の遊離速度制御の観点から、構成単位中にカルボキシ基及び硫酸基からなる群より選択される少なくとも一方の反応性官能基を有するGAG分子であることが好ましく、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、へパリン、へパラン硫酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも1種であることが更に好ましい。
β刺激薬として具体的には、ツロブテロールが挙げられる。また、キサンチン誘導体として具体的には、プロキシフィリンが例示される。副交感神経遮断薬としては、後述する抗コリン薬が例示される。
トロンボキサン拮抗薬として具体的には、セラトロダストが例示される。ロイコトリエン拮抗薬として具体的には、モンテルカストが例示される。
ここでカルボキシ基、ヒドロキシ基及びアミノ基からなる群より選択される2以上の反応性官能基は、GAG分子及び生理活性物質の構造に応じて適宜選択される。例えば、GAG分子が反応性官能基としてカルボキシ基を有する場合、スペーサー形成分子はこれに対応してヒドロキシ基又はアミノ基を有することが好ましく、アミノ基を有することがより好ましい。GAG分子が反応性官能基としてヒドロキシ基を有する場合、スペーサー形成分子はこれに対応してカルボキシ基を有することが好ましい。
一方、生理活性物質がカルボキシ基を有する場合、スペーサー形成分子はこれに対応してアミノ基又はヒドロキシ基を有することが好ましく、ヒドロキシ基を有することがより好ましい。また生理活性物質がヒドロキシ基を有する場合、スペーサー形成分子はこれに対応してカルボキシ基を有することが好ましい。
連結基は、抗原性抑制の観点から、反応性官能基間の長さが原子数12以下であることが好ましく、原子数2〜6であることがより好ましい。
連結基が有する置換基の位置は、例えば、生理活性物質に由来する基とスペーサーとの共有結合(好ましくは、エステル結合)の安定性が影響をうける位置であればよく、具体的には、生理活性物質に由来する基に結合する反応性官能基のα位及びβ位からなる群より選ばれる少なくとも1ヵ所であることが好ましい。置換基の数は目的に応じて選択可能であり、例えば1〜4であることが好ましく、1〜2であることがより好ましい。例えば置換基が2つの場合、置換位置はα位とβ位とであっても、α位のみ又はβ位のみであってもよい。
更に、電子吸引基及び電子供与基の両方を導入して遊離速度を微調整することも可能であるし、電子吸引性又は電子供与性と立体障害性とを併せ持つ置換基を導入して遊離速度を微調整することも可能である。
すなわちスペーサーの構造を選択することで、GAG誘導体に適用可能な生理活性物質の範囲を拡張することができる。
生理活性物質がカルボキシ基を有する場合、スペーサー形成分子は、アミノアルコール、ヒドロキシ酸、ジオール化合物及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも1種であることが好ましく、アミノアルコール及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも1種であることがより好ましい。
アミノ酸として具体的には、グリシン、アラニン、β−アラニン、アルギニン、アスパラギン、セリン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、プロリン、チロシン、トリプトファン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、ヒスチジン、ノルバリン、ノルロイシン、イソセリン、オルニチン、アミノ酪酸、アミノ吉草酸、アミノヘプタン酸、アミノオクタン酸、アミノデカン酸、アミノウンデカン酸、アミノドデカン酸、及びこれらの構造異性体を挙げることができる。
これらの中でも、グリシン、β−アラニン、アミノ酪酸、アミノ吉草酸、アミノヘプタン酸、アミノオクタン酸、アミノデカン酸、アミノウンデカン酸、アミノドデカン酸等のω−アミノ脂肪酸を好ましく用いることができる。なお、これらのω−アミノ脂肪酸は置換基を有していてもよく、カルボキシ基のα位又はβ位に置換基を有していることが好ましい。ω−アミノ脂肪酸の炭素数は特に制限されないが、遊離速度制御の観点から、3以上であることが好ましく、3〜12であることがより好ましく、3〜6であることが更に好ましい。なお、ω−アミノ脂肪酸の炭素数はカルボキシ基のカルボニル炭素を含む総炭素数を意味する。
アミノ酸誘導体として、前述のアミノ酸から選択されて、組み合わされたジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドを用いてもよい。
式中、mは0〜12の整数を示す。R11、R12、R13及びR14はそれぞれ独立に、水素原子、電子吸引基、電子供与基又は立体障害性基を示す。mは、0〜8であることが好ましく、0〜4であることがより好ましい。また、R11、R12、R13及びR14の基はその全部又は一部において、同一であっても異なっていてもよい。
例えば、R11〜R14の少なくとも1つをハロゲン原子等の電子吸引基とすれば、結合強度が弱まるため生理活性物質が遊離され易くなり、遊離速度は速くなる。
例えばR13又はR14としてフッ素、塩素、臭素のようなハロゲン原子を導入すると上述の理由により電気陰性度の高い順(F>Cl>Br)に生理活性物質の遊離速度は大きくなる。
R11(又はR12)及びR13(又はR14)を、各々電子吸引基及び電子供与基とすることで遊離速度を微調整することも可能である。更に電子吸引性又は電子供与性と立体障害性とを併せ持つ置換基をR11〜R14とすることで、遊離速度を微調整することも可能である。
式中、nは0〜12の整数を示す。R21、R22、R23及びR24はそれぞれ独立に、水素原子、電子吸引基、電子供与基又は立体障害性基を示す。nは、0〜8であることが好ましく、0〜4であることがより好ましい。また、R21、R22、R23及びR24の基はその全部又は一部において、同一であっても異なっていてもよい。
なお、生理活性物質の含有比率は、生理活性物質の用途、種類、効果の強さ及び水に対する溶解性等の生理活性物質の性質並びにスペーサーの種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、生理活性物質の含有量が1回の投与あたり1μg〜100mgとなるように調製されることが好ましい。
なお、生理活性物質の遊離量は生理活性物質の種類に応じて適宜選択される方法によって測定される。
本実施形態のグリコサミノグリカン誘導体の製造方法は、
(1)カルボキシ基又はヒドロキシ基を有する生理活性物質を準備することと、
(2)生理活性物質に由来する基と共有結合を形成するスペーサーを該共有結合の分解速度に応じて選択することと、
(3)生理活性物質に由来する基とグリコサミノグリカンに由来する基とをスペーサーを介して共有結合することと、を含む製造方法である
GAG誘導体を構成するスペーサーが、生理活性物質に由来する基との共有結合の分解速度に応じて選択されることで、生理活性物質の構造に大きく依存せずに、その遊離速度を制御することが可能となる。
工程(2)では、生理活性物質の遊離速度が所望の範囲となるようにスペーサーを形成するスペーサー形成分子を選択することが好ましい。スペーサー形成分子は生理活性物質とエステル結合を形成する反応性官能基であるヒドロキシ基又カルボキシ基と、GAGと共有結合(好ましくは、アミド結合)を形成する反応性官能基(好ましくは、アミノ基)と、2つの反応性官能基を連結し、生理活性物質とのエステル結合の分解速度を制御するように選択される連結基とを有する。例えば、スペーサー形成分子が有する置換基を適宜選択することにより、所望の分解速度を達成することができる。スペーサー形成分子の選択方法の詳細は既述の通りである。
(3a)生理活性物質が有するカルボキシ基又はヒドロキシ基と、スペーサー形成分子の反応性官能基とをエステル結合させることと、
(3b)GAG分子が有するカルボキシ基をスペーサー形成分子の反応性官能基と縮合して共有結合させることと、を含む製造方法。
エステル化方法としては例えば、水溶性カルボジイミド(例えば、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)、ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤を用いる方法、対称酸無水物法、混合酸無水物法、活性エステル法などの方法を挙げることができる。エステル化方法の反応条件は適用するエステル化方法に応じて適宜選択される。
工程(3a)と工程(3b)の順番は特に制限されない。製造効率の観点から、工程(3a)の後に工程(3b)を行うことが好ましい。
本実施形態のグリコサミノグリカン誘導体からの生理活性物質の遊離速度の制御方法は、グリコサミノグリカンに由来する基と、カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する生理活性物質に由来する基とが、スペーサーを介する共有結合で連結されたグリコサミノグリカン誘導体に含まれるスペーサーを、生理活性物質に由来する基とスペーサーとの共有結合の分解速度に応じて選択することを含むことを特徴とする。
GAG誘導体を構成するスペーサーが、生理活性物質に由来する基との共有結合の分解速度に応じて選択されることで、生理活性物質の構造に大きく依存せずに、その遊離速度を制御することが可能となる。
本実施形態の医薬組成物は、上記グリコサミノグリカン誘導体の少なくとも1種を含む。医薬組成物は、GAG誘導体を1種単独で含んでいても2種以上を組み合わせて含んでいてもよい。2種以上のGAG誘導体を含む場合、同一の生理活性物質と2種以上の異なるGAGとをそれぞれ組み合わせた2種以上のGAG誘導体の組み合わせであっても、同一のGAGと2種以上の異なる生理活性物質とをそれぞれ組み合わせた2種以上のGAG誘導体の組み合わせであってもよい。
医薬組成物におけるGAG誘導体の含有量は特に制限されず、目的等に応じて適宜選択することができる。
本実施形態の医薬組成物は、所望の生理活性を有する薬物を用いて、所望の遊離速度が達成されるように制御されたGAG誘導体を含むことから、種々の慢性疾患に適用可能で、アドヒアランスの向上に資するものである。
例えば、標的組織が肺である場合、一般に肺胞被覆層のpHは弱アルカリ性(pH7.5前後)であることが知られているため、評価対象の医薬組成物をpH約7.5に調製した10mMリン酸緩衝液中に溶解し、36℃で1週間保管した際の生理活性物質の遊離率により、効果の持続性を評価することができる。
また、標的組織が鼻腔である場合、一般にアレルギー性鼻炎に罹患している患者の鼻腔粘液pHは弱アルカリ性(pH8.0前後)であることが知られているため、評価対象の医薬組成物をpH約8.0に調製した10mMリン酸緩衝液に溶解し、36℃で1週間保管した際の生理活性物質の遊離率により、効果の持続性を評価することができる。
この場合、医薬組成物の形態は、呼吸器への投与が可能な形態であればよく、粉体、液体、懸濁液等のいずれの形態であってもよい。
投与方法については、使用者自らの吸気により、若しくは外部装置が発生する気流を用いて、又はその両方を用いて投与する方法、ネブライザーを用いて投与する方法等を挙げることができる。
医薬組成物を呼吸器疾患の治療又は予防に用いる場合、呼吸器疾患としては、気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、ウィルス感染症、急性アレルギー疾患、慢性アレルギー疾患等が例示される。
気管支喘息(喘息)は、アレルギー反応などで気道過敏性が亢進し、気道の閉塞が起こり、呼吸が苦しくなる病気である。現在、喘息治療の中心になるのは、吸入ステロイドを用いた長期管理薬と発作時に処方される気管支拡張薬を用いた治療を組み合わせることが主になっている。喘息は、前述のように気道の慢性炎症と定義されるため、発作発現前にも喘息患者には気道炎症が見られる。このため強い抗炎症作用を作用機序とするステロイドを発作前から長期管理薬として継続的に吸入することにより慢性的な気道の炎症を抑え、喘息症状を大きく改善することが可能になった。
そこでGAGにステロイドを化学的に導入したステロイド導入GAG誘導体を長期管理薬として用いることにより、1回の吸入だけ数日間の長期の抗炎症効果の持続が可能になり、毎日数回の吸入の必要がなくなり、その煩雑さも解消され、患者のアドヒアランス向上も期待できる。
この場合、GAG誘導体が有するスペーサーの構造を変えることにより投与間隔、つまり抗炎症作用の持続時間を延ばすことも短くすることも可能であり、更に選択するステロイドにより抗炎症作用の強弱をコントロールすることも可能である。
投与方法としては、例えば、関節内投与、筋肉内投与等が挙げられる。
例えば非ステロイド性抗炎薬(NSAIDs)を生理活性物質としてGAGに導入した生理活性物質の遊離速度が制御可能なNSAIDs導入GAG誘導体には、関節炎や腰痛等への長期持続的な疼痛抑制及び抗炎症作用を期待できる。
すなわち、上記グリコサミノグリカン誘導体は、生理活性物質として例えばNSAIDsが導入されることで、これを含む疼痛抑制剤や持続型の疼痛抑制剤を構成することができる。
慢性腰痛は慢性疼痛の中で最も頻繁に観察され、炎症性疼痛と神経障害性疼痛が混合した原因部位の特定可能な特異的腰痛と、痛みの原因部位の特定が困難な、時に社会心理的要因と強く関連した非特異的腰痛に分類でき、その症状、原因に応じ特異的腰痛、非特異的腰痛のどちらに対しても生理活性物質の遊離速度調整が可能なNSAIDs導入GAG誘導体を用いることが可能である。
特にMPS治療に汎用される局所麻酔薬のトリガーポイント注射は一定の鎮痛効果は得られるものの、有効期間は長くて1〜2日程度であり、治療頻度が高い。そのため、通院回数の減らせる持続性鎮痛剤のニーズは高い。また、薬物療法として、非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)、筋弛緩薬、抗うつ薬などが投薬されているが、効果は低いのが現状である。また、治療対象患者には高齢者が多く、局所麻酔薬は、徐脈、不整脈等の心血管系及び呼吸抑制など中枢神経系の副作用もあり、持続性と安全性を併せ持った局所疼痛治療剤が求められており、リリースコントロール可能なNSAIDs導入GAG誘導体は、当該用途に適している。
又、上記腰痛症、筋・筋膜性疼痛症候群等の筋肉痛に対する筋注用局所徐放性鎮痛剤は、薬物としてNSAIDsでなくステロイドを用いたステロイド導入GAG誘導体を用いることも可能である。
<1a> グリコサミノグリカンに由来する基と、
グリコサミノグリカンに由来する基と共有結合し、電子吸引基、電子供与基及び立体障害性基からなる群より選択される少なくとも1種の置換基並びに生理活性物質と共有結合可能な反応性官能基を有するスペーサー形成基と、を有する第二のグリコサミノグリカン誘導体である。
<2a> 反応性官能基が、ヒドロキシ基、カルボキシ基及びこれらの誘導体から選択される少なくとも1種の基であり、生理活性物質との共有結合がエステル結合である前記<1a>に記載の第二のグリコサミノグリカン誘導体
<3a> グリコサミノグリカンに由来する基と、スペーサー形成基とは、アミド結合で共有結合している前記<1a>又は<2a>に記載の第二のグリコサミノグリカン誘導体である。
<4a> スペーサー形成基が、アミノアルコール、アミノ酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも1種に由来する基である、前記<1a>〜<3a>のいずれか1つに記載の第二のグリコサミノグリカン誘導体である。
<5a> スペーサー形成基が、下記一般式(Ia)で表されるアミノ酸に由来する基である、前記<1a>〜<4a>のいずれか1つに記載の第二のグリコサミノグリカン誘導体である。
−HN−(CH2)m−CR11R12−CR13R14−COOH (Ia)
(式中、mは0〜12の整数を示す。R11〜R14はそれぞれ独立して、水素原子、電子吸引基、電子供与基又は立体障害性基を示す)
<6a> スペーサー形成基が、下記一般式(IIa)で表されるアミノアルコールに由来する基である、前記<1a>〜<4a>のいずれか1つに記載の第二のグリコサミノグリカン誘導体。
−HN−(CH2)n−CR21R22−CR23R24−OH (IIa)
(式中、nは0〜12の整数を示す。R21〜R24はそれぞれ独立して、水素原子、電子吸引基、電子供与基又は立体障害性基を示す)
<7a> グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、へパラン硫酸及びケラタン硫酸からなる群より選択される少なくとも1種である、前記<1a>〜<6a>のいずれか1つに記載の第二のグリコサミノグリカン誘導体である。
<8a> 前記<1a>〜<7a>のいずれか1つに記載の第二のグリコサミノグリカン誘導体と、生理活性物質とが共有結合してなる第一のグリコサミノグリカン誘導体。
<9a> 前記<8a>に記載の第二のグリコサミノグリカン誘導体を含む放出制御製剤。
前記第二のグリコサミノグリカン誘導体を用いることで、生理活性物質の遊離速度を制御可能にすることができる。
1−1. Boc−β−アラニンとベタメタゾンの縮合反応
Boc−β−アラニン 1g(1.0eq,5.29mmol)をジクロロメタン(DCM)18mL及びジメチルホルムアミド(DMF)12mLに溶解し、ベタメタゾン 2.07g(1.0eq,5.29mmol)及びN,N−ジメチルアミノピリジン(DMAP) 194mg(0.3eq,1.59mmol)を加えた。その後、氷冷下、水溶性カルボジイミド(WSC、東京化成工業社製) 1.11g(1.1eq,5.81mmol)を加えて室温にて終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、トルエン及び水を用いて分液抽出を3回行い、集めた有機層を飽和NH4Cl水溶液、飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで60℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とするBoc−β−アラニン−ベタメタゾンを3.18g得た。なお、Bocはtert−ブチルオキシカルボニル基を意味する。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.05(3H, s), 1.13(3H, m), 1.20(1H, m),1.46(9H, s), 1.58-1.61(4H, m), 1.99(1H, m), 2.05(1H, m), 2.15(2H, m), 2.38(1H, dd), 2.42(1H, dd), 2.52(1H, m), 2.62(2H, t), 2.75(1H, m), 3.38(2H, t), 4.25(1H, m), 4.95(2H, s), 6.09(1H, s), 6.29(1H, d), 7.50(1H, d).
Boc−β−アラニン−ベタメタゾン2gをテトラヒドロフラン(THF) 20mLに溶解し、氷冷下、4M 塩酸/酢酸エチル(HCl/AcOEt) 15mLを加えて7時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とするβ−アラニン−ベタメタゾン塩酸塩を1.2g得た。(2工程収率73%)
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ1.08(3H, s), 1.12(3H, m), 1.20(1H, m),1.54-1.62(4H, m), 1.98-2.18(4H, m), 2.38(1H, dd), 2.42(1H, dd), 2.52(1H, m), 2.75(1H, m), 2.91(2H, t), 3.30(2H, t), 4.27(1H, m), 5.10(2H, dd), 6.11(1H, s), 6.30(1H, d), 7.42(1H, d).
コンドロイチン硫酸(重量平均分子量約40kDa) 1gを注射用水(WFI) 100mL及びエタノール(EtOH) 100mLに溶解し、β−アラニン−ベタメタゾン塩酸塩を199mg(0.2eq, 0.40mmol)加えた。その後、4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロリドn水和物(DMT−MM)を187mg(0.2eq, 0.40mmol)加えて終夜攪拌した。その後、炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)750mgを加えて3時間攪拌し、酢酸400μL、塩化ナトリウム(NaCl) 3gを順次加えた。30分攪拌後、90%EtOH/WFIを200mL加えて沈殿形成し、上清を捨てて90%EtOH/WFI洗浄を2回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的とするGAG誘導体(以下、コンジュゲートともいう)として、CS−ベタメタゾンが760mg得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、17%であった。
ベタメタゾン(F)−コンドロイチン硫酸(スペーサー形成分子にα−フルオロ−β−アラニンを用いたベタメタゾン−コンドロイチン硫酸 コンジュゲート)の調製をスキーム2に示す。
α−フルオロ−β−アラニン塩酸塩1を原料とし、1のアミノ基をtert−ブトキシカルボニル(Boc)基で保護することで化合物2とした後にベタメタゾンとの縮合反応に付して化合物3を得た。続いて化合物3のBoc基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体4へと変換し、コンドロイチン硫酸への導入を行ってコンジュゲート5を合成した。
α−フルオロ−β−アラニン塩酸塩1 600mg(1.0eq,4.18mmol)をtert−ブタノール 24mL及び1M水酸化ナトリウム(NaOH) 12mLに溶解し、氷冷下、二炭酸ジ−tert−ブチル(Boc2O) 1.19g(1.3eq,5.43mmol)を加えた。その後、室温にて終夜攪拌した。薄層クロマトグラフィー(TLC)にて原料の消失を確認後、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮し、酢酸エチル及び1M塩酸(HCl)を用いて分液抽出を3回行い、集めた有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物2を865mg得た(収率99%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45(9H, s), 3.64-3.79(2H, br), 4.98(1H, br), 5.05(1H, br).
化合物2 500mg(1.0eq,2.41mmol)をDMF 30mLに溶解し、ベタメタゾン 947mg(1.0eq,2.41mmol)及びDMAP 89mg(0.3eq,0.72mmol)を加えた。その後、氷冷下、WSC 694mg(1.5eq,3.62mmol)を加えて室温にて終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、トルエン及び水を用いて分液抽出を3回行い、集めた有機層を飽和塩化アンモニウム(NH4Cl)水溶液、飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで60℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物3を1.4g得た(収率99%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.04(3H, d), 1.16(4H, m), 1.46(9H, s), 1.84-2.01(6H, m), 2.31-2.65(7H, m), 3.60-3.72(2H, m), 4.41(1H, d), 4.95-5.20(3H, m), 6.12(1H, s), 6.35(1H,d), 7.21(1H, d).
化合物3 250mgをジクロロメタン(DCM) 20mLに溶解し、氷冷下、4M塩酸/酢酸エチル(HCl/AcOEt) 16mLを加えて3時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする導入前駆体4を188mg得た(収率82%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ1.04-1.80(13H, m)1.95-2.20(4H, m), 2.31-2.80(4H, m), 3.60-3.72(2H, m), 4.20(1H, m), 5.01(1H, m), 5.35(1H, m), 6.02(1H, s), 6.28(1H,d), 7.33(1H, d).
コンドロイチン硫酸(重量平均分子量約40kDa) 1gを注射用水(WFI) 80mL及びEtOH 80mLに溶解し、導入前駆体4を349mg(0.34eq,0.68mmol)加えた。その後、DMT−MMを317mg(0.34eq,0.68mmol)加えて終夜攪拌した。その後、NaCl 3gを加えて30分攪拌し、90%エタノール(EtOH)/WFI 160mLを加えて沈殿形成し、上清を捨てて90%EtOH/WFI洗浄を2回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物5が1.08g得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、16%であった。
ベタメタゾン(Cl)−コンドロイチン硫酸(スペーサー形成分子にα−クロロ−β−アラニンを用いたベタメタゾン−コンドロイチン硫酸 コンジュゲート)の調製をスキーム3に示す。
フタルイミド6及び2−クロロアクリロニトリル7を反応させて化合物8とした後にこれを加水分解条件に付し、α−クロロ−β−アラニン塩酸塩9を得た。続いてα−クロロ−β−アラニン塩酸塩9のアミノ基をBocで保護して化合物10へと変換し、ベタメタゾンとの縮合反応を行って化合物11を得た。さらに化合物11のBoc基を酸性条件下除去してアミン塩酸塩である導入前駆体12へ導き、コンドロイチン硫酸への導入を行い、コンジュゲート13を合成した。
フタルイミド6 5g(1.0eq,33.4mmol)にメタノール40mL、トリエチルアミン 2.4mL(0.5eq,16.7mmol)及び2−クロロアクリロニトリル7 5.4mL(2.0eq,66.8mmol)を加えて還流下、15時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、溶液を室温まで冷却し、沈殿物をメタノールで洗浄し、吸引ろ過した。この沈殿物を減圧乾燥した結果、目的とする化合物8を5.9g得た(収率75%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ4.26(2H, dd), 4.95(1H, t), 7.80(2H, dd), 7.92(2H, dd).
化合物8 300mgに濃塩酸10mLを加えて還流下、15時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、溶液を室温まで冷却し、沈殿物を吸引ろ過した。得られた溶液を減圧乾燥して析出した固体をアセトンで洗浄し、再度吸引ろ過した。この固体を減圧乾燥した結果、目的とするα−クロロ−β−アラニン塩酸塩9を192mg得た(収率97%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ3.49(1H, dd), 3.60(1H, dd), 4.68(1H, t).
α−クロロ−β−アラニン塩酸塩9 168mg(1.0eq,1.05mmol)をtert−ブタノール 6mL及び1M NaOH 3mLに溶解し、氷冷下Boc2O 300mg(1.3eq,1.37mmol)を加えた。その後、室温にて終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮し、酢酸エチル及び1M HClを用いて分液抽出を3回行い、集めた有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物10を235mg得た(収率quant.)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.49(9H, s), 3.64(1H, br), 4.41-5.10(2H, br).
化合物10 230mg(1.0eq,1.03mmol)をDMF 10mL、DCM10mLに溶解し、ベタメタゾン 404mg(1.0eq,1.03mmol)及びDMAP 63mg(0.5eq,0.51mmol)を加えた。その後、氷冷下、WSC 297mg(1.5eq,1.55mmol)を加えて室温にて終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、トルエン及び水を用いて分液抽出を3回行い、集めた有機層を飽和NH4Cl水溶液、飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで60℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物11を625mg得た(収率quant.)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.04-1.15(7H, m), 1.46(9H, s), 1.65(4H, m), 1.95-2.23(6H, m), 2.36-2.65(5H, m) 3.78(1H, m), 4.30-4.49(3H, m), 4.95(1H, m), 6.11(1H, s), 6.35(1H,d), 7.17(1H, d).
化合物11 200mgをDCM 9mLに溶解し、氷冷下、4M HCl/AcOEt 6mLを加えて2時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮し、ジエチルエーテルを用いて濃縮物を洗浄した結果、目的とする導入前駆体12を146mg得た(収率81%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ1.04-1.70(13H, m), 2.01-2.17(5H, m), 2.36(1H, m), 2.45(2H, m), 2.89(1H, m),4.28(1H, m), 5.15(2H, m), 6.11(1H, s), 6.30(1H,d), 7.41(1H, d).
コンドロイチン硫酸(重量平均分子量約40kDa) 200mgをWFI 20mL及びEtOH 20mLに溶解し、導入前駆体12を120mg(0.56eq,0.22mmol)加えた。その後、DMT−MMを75mg(0.56eq,0.22mmol)加えて終夜攪拌した。その後、反応溶液を2等分し、以下(1)、(2)の操作を実施した。
(1) 可溶化処理あり3時間:NaHCO3 75mgを加えて3時間攪拌し、酢酸40μL、NaCl 300mgを順次加えた。30分攪拌後、90%EtOH/WFIを40mL加えて沈殿形成し、上清を捨てて90%EtOH/WFI洗浄を2回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物13が90mg得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、14%であった。
(2) 可溶化処理なし: NaCl 300mgを加えて30分攪拌し、90%EtOH/WFIを40mL加えて沈殿形成し、上清を捨てて90%EtOH/WFI洗浄を2回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物13が97mg得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、32%であった。
ベタメタゾン(Br)−コンドロイチン硫酸(スペーサー形成分子にα−ブロモ−β−アラニンを用いたベタメタゾン−コンドロイチン硫酸 コンジュゲート)の調製をスキーム4に示す。
DL−イソセリン14のアミノ基をBocで保護、化合物15とした後にカルボキシル基をメチルエステル化して化合物16に変換した。これに対し二級水酸基をトシル化(化合物17)し、続いてリチウムブロミドと反応させてα位にブロモ基を導入した化合物18へと導いた。さらにメチルエステルの加水分解を行なって化合物19を合成し、ベタメタゾンとの縮合(化合物20)、Boc基の脱保護(導入前駆体21)、コンドロイチン硫酸への導入を行い、コンジュゲート22を合成した。
DL−イソセリン14 1g(1.0eq,9.52mmol)をtert−ブタノール 40mL及び1M NaOH 20mLに溶解し、氷冷下Boc2O 2.7g(1.3eq,12.37mmol)を加えた。その後、室温にて終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮し、酢酸エチル及び1MHClを用いて分液抽出を3回行い、集めた有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物15を1.95g得た(収率100%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45(9H, s), 3.51-3.65(2H, m), 4.32(1H, m), 5.10(1H, br).
化合物15 800mg(1.0eq,3.90mmol)をDMF 5mLに溶解し、氷冷下、炭酸カリウム 593mg(1.1eq,4.29mmol)及びヨウ化メチル(1.1eq,4.29mmol)を加えた。その後、遮光下室温にて終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、トルエン及び水を用いて分液抽出を3回行い、集めた有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物16を724mg得た(収率82%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.48(9H, s), 3.26(1H, br), 3.50(2H, d), 3.80(3H, s), 4.28(1H, dd), 4.88(1H, br).
化合物16 660mg(1.0eq,3.01mmol)をDCM23mLに溶解し、トリエチルアミン 1.47mL(3.5eq,10.54mmol)及びDMAP 184mg(0.5eq,1.51mmol)を加えた。その後、氷冷下、トシルクロライド 1.72g(3.0eq,9.03mmol)を加えて室温にて終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、DCM及び水を用いて分液抽出を3回行い、集めた有機層を飽和NH4Cl水溶液、飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した。この反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、(ヘキサン:酢酸エチル=5:1)化合物17を1.08g得た(収率96%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45(9H, s), 2.45(3H, s), 3.52-3.66(2H, m), 3.77(3H, s), 4.80(1H, dd), 4.98(1H, br), 7.35(2H, d), 7.82(2H, d).
化合物17 690mg(1.0eq,1.84mmol)をTHF 7mLに溶解し、リチウムブロマイド(5.0eq,9.22mmol)を加えて50℃にて終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、酢酸エチル及び水を用いて分液抽出を3回行い、集めた有機層を飽和NH4Cl水溶液、飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した。この反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、(ヘキサン:酢酸エチル=7:1)化合物18を300mg得た(収率58%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.48(9H, s), 3.65(2H, dd), 3.80(3H, s), 4.38(1H, dd), 5.01(1H, br).
化合物18 400mg(1.0eq,1.42mmol)をTHF 14mL、水 7mLに溶解し、氷冷下、水酸化リチウム一水和物(1.3eq,1.85mmol)を加えて室温にて2時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、1M HCl、ジエチルエーテル、水を用いて分液抽出を3回行い、集めた有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、化合物19を380mg得た(収率99%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.48(9H, s), 3.67(2H, m), 4.18(1H, br), 4.42(1H, dd), 5.09(1H, br).
化合物19 422mg(1.0eq,1.58mmol)をDMF 18mL、DCM18mLに溶解し、ベタメタゾン 589mg(0.95eq,1.50mmol)及びDMAP 96mg(0.5eq,0.79mmol)を加えた。その後、氷冷下、WSC 606mg(2.0eq,3.16mmol)を加えて室温にて終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、トルエン及び水を用いて分液抽出を3回行い、集めた有機層を飽和NH4Cl水溶液、飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで60℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物20を961mg得た(収率95%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ1.11-1.84(22H, m), 2.04-2.10(5H, m), 2.30-2.50(3H, m), 2.60(1H,m), 3.53(1H, m), 4.39(2H, m), 4.50(1H, m), 5.01(1H, m), 6.11(1H, s), 6.33(1H,d), 7.18(1H, d).
化合物20 819mgをDCM 20mL、AcOEt 52mLに溶解し、氷冷下、4M HCl/AcOEt 48mLを加えて2時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮し、ジエチルエーテルを用いて濃縮物を洗浄した結果、目的とする導入前駆体21を589mg得た(収率80%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ1.11-1.48(11H, m), 1.67(2H, m), 2.04-2.17(5H, m)2.20-2.61(3H, m), 2.89(1H, m)3.55(2H, m), 4.25(1H, m), 4.45(1H, d), 6.10(1H, s), 6.30(1H,d), 7.43(1H, d).
コンドロイチン硫酸(重量平均分子量約40kDa) 100mgをWFI 8mL及びEtOH 8mLに溶解し、導入前駆体21を24mg(0.21eq,0.04mmol)加えた。その後、DMT−MMを20mg(0.21eq,0.04mmol)加えて終夜攪拌した。その後、NaCl 300mgを加えて30分攪拌し、90%EtOH/WFIを20mL加えて沈殿形成し、上清を捨てて90%EtOH/WFI洗浄を2回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物22が105mg得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、15%であった。
CS(Cl)−フェンブフェンの合成をスキーム5に示す。
3−アミノ−1,2−プロパンジオール(23)を原料とし、23のアミノ基をBocで保護することで化合物24とした後に1級水酸基をベンジル化し、化合物25を得た。続いて化合物25の2級水酸基に対しトシル化を施し化合物26へと導いて、さらにトシル基をクロロ基に変換した。このクロロ体である化合物27に水酸化パラジウムを用いた水素添加を行なうことで脱ベンジル体である化合物28とし、これとフェンブフェンを縮合した。フェンブフェン縮合体である化合物29はBoc基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体30へと変換し、CSへの導入を行ってコンジュゲート31とした。
3−アミノ−1,2−プロパンジオール23 3g(1.0eq,32.93mmol)をtert−BuOH 20mL及び1M NaOH 20mLに溶解し、氷冷下Boc2O 7.19g(1.0eq,32.93mmol)のtert−BuOH溶液 20mLを加えた。その後、室温にて5時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、エバポレーターで50℃水浴中、減圧濃縮し、1M HClを用いて反応溶液を中和した。その中和液に酢酸エチル及び水を加えて分液抽出を3回行い、集めた有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物2を6.3g得た(収率quant.)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45(9H, s), 2.68-2.71(1H, br), 2.75-2.81(1H, br), 3.20(2H, dd), 3.63(2H, dd), 3.71(1H, m)4.91(1H, br).
化合物24 1.91g(1.0eq, 9.96mmol)をTHF 20mLに溶解し、水素化ナトリウム 251mg(1.05eq,10.46mmol)を加えて室温で15分撹拌した。その後、氷冷下ベンジルブロミド1.24mL(1.05eq,10.46mmol)を加え、室温にて終夜撹拌した。TLCにて原料の消失を確認後、氷冷下飽和NH4Cl水溶液で反応溶液をクエンチし、酢酸エチル及び水を用いて分液抽出を3回行った。集めた有機層は飽和NH4Cl水溶液、飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、エバポレーターで40℃水浴中減圧濃縮した。この反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、(ヘキサン:酢酸エチル=5:1)目的とする化合物25を2.3g得た(収率81%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.44(9H, s), 3.18(1H, m), 3.29(1H, m), 3.32(1H, br), 3.45(1H, dd), 3.54(1H, dd), 3.63(1H, m), 4.57(2H, s, ), 4.91(1H, br), 7.26-7.31(5H, m).
化合物25 1.14g(1.0eq,4.06mmol)をDCM 40mLに溶解した後にトリエチルアミン1.4mL(2.5eq,10.14mmol)、DMAP 248mg(0.5eq,2.03mmol)、トシルクロリド1.55g(2.0eq,8.11mmol)を氷冷下加え、室温にて終夜撹拌した。TLCにて原料の消失を確認後、氷冷下飽和NH4Cl水溶液で反応溶液をクエンチし、DCM及び水を用いて分液抽出を3回行った。集めた有機層は飽和NH4Cl水溶液、飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、エバポレーターで40℃水浴中減圧濃縮した。この反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、(ヘキサン:酢酸エチル=5:1)目的とする化合物26を1.4g得た(収率80%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.55(9H, s), 2.44(3H, s), 3.35(1H, m), 3.51(1H, m), 3.53(2H, d), 4.10(1H, m), 4.39(2H, dd), 7.20-7.79(9H, m).
化合物26 425mg(1.0eq, 0.98mmol)をDMF 4mLに溶解し、リチウムクロリド207mg(5.0eq,4.89mmol)を加え、室温にて終夜撹拌した。TLCにて原料の消失を確認後、氷冷下飽和NH4Cl水溶液で反応溶液をクエンチし、トルエン及び水を用いて分液抽出を3回行った。集めた有機層は飽和NaCl水溶液で洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、エバポレーターで60℃水浴中減圧濃縮した。この反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、(ヘキサン:酢酸エチル=9:1)目的とする化合物27を158mg得た(収率54%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.44(9H, s), 3.37-3.64(4H, m), 4.14(1H, m), 4.59(2H, dd), 7.29-7.38(5H, m).
化合物27 100mg(1.0eq,0.33mmol)をAcOEt 2mL及びEtOH1mLに溶解して20%水酸化パラジウム70mg(0.3eq,0.10mmol)を加え、水素を3回添加した後、室温にて終夜撹拌した。TLCにて原料の消失を確認後、反応溶液をセライトろ過し、エバポレーターで50℃水浴中減圧濃縮した結果、目的とする化合物28を69mg得た(収率98%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45(9H, s), 3.34(1H, m), 3.58(1H, m), 3.74(1H, m), 3.87(1H, m), 4.01(1H, m), 5.01(1H, br).
化合物28 65mg(1.0eq,0.31mmol)をDCM 4mL及びDMF 1mLに溶解し、フェンブフェン 83mg(1.05eq,0.33mmol)及びDMAP 19mg(0.5eq,0.16mmol)を加えた。その後、氷冷下、WSC 119mg(2.0eq,0.62mmol)を加えて室温にて終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、氷冷下飽和NH4Cl水溶液で反応溶液をクエンチし、トルエン及び水を用いて分液抽出を3回行った。集めた有機層は飽和NH4Cl水溶液、飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで60℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物29を139mg得た(収率100%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45(9H, s), 2.84(2H, m), 3.40-3.42(3H, m), 3.53(1H, m), 4.20(1H, m), 4.35(2H, m), 5.01(1H, br), 7.16-8.07(9H,m).
化合物29 138mgをDCM 5mLに溶解し、氷冷下、4MHCl/AcOEt 2mLを加えて2.5時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、エバポレーターで40℃水浴中減圧濃縮し、残留物をジエチルエーテルで洗浄した結果、目的とする導入前駆体30を115mg得た。(収率97%)
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ2.82(2H, dt), 3.52(2H, m), 3.68(2H, m), 3.82(1H, m), 4.40(2H, m), 7.43-8.13(9H, m).
CS(重量平均分子量約40kDa) 200mgをWFI 16mL及びEtOH 16mLに溶解し、導入前駆体30を33mg(0.22eq,0.087mmol)及びDMT−MMを41mg(0.22eq,0.087mmol)加えて終夜攪拌した。その後NaClを600mg、90%EtOH/WFIを80mL加えて沈殿形成し、上清を捨てて90%EtOH/WFI洗浄を2回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物31が198mg得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、15%であった。
CS(重量平均分子量約40kDa) 200mgをWFI 16mL及びEtOH 16mLに溶解し、導入前駆体8を43mg(0.28eq,0.11mmol)及びDMT−MMを52mg(0.28eq,0.11mmol)加えて終夜攪拌した。その後NaClを600mg、90%EtOH/WFIを80mL加えて沈殿形成し、上清を捨てて90%EtOH/WFI洗浄を2回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物31が198mg得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、19%であった。
CS(F)−フェンブフェンの合成をスキーム6に示す。
化合物25の水酸基をフッ素へ変換し化合物32とした後にベンジル基の脱保護を実施して化合物33を得た。これにフェンブフェンを縮合させて化合物34へと変換し、続いて脱Boc化を施して導入前駆体35とした。最後に導入前駆体35をCSへ導入し、コンジュゲート36を得た。
化合物25 1.5g(1.0eq,5.34mmol)をDCM 18mLに溶解した後にトリエチルアミン7.3mL(10.0eq,53.4mmol)、Deoxo−Fluoro 2.95mL(3.0eq,16.01mmol)を氷冷下加え、室温にて終夜撹拌した。TLCにて新たなスポットを確認後、氷冷下飽和NaHCO3水溶液で反応溶液をクエンチし、DCM及び水を用いて分液抽出を3回行った。集めた有機層は飽和NaCl水溶液で洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、エバポレーターで40℃水浴中減圧濃縮した。この反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、(ヘキサン:酢酸エチル=10:1)目的とする化合物32を408mg得た。(収率27%)
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.44(9H, s), 3.42(2H, m), 3.65(2H, m), 4.56(2H, dd), 4.70(1H, m), 4.83(1H, br), 7.20-7.36(5H, m).
化合物32 25mg(1.0eq,0.09mmol)をAcOEt 2mL及びEtOH 1mLに溶解して20%水酸化パラジウム19mg(0.3eq,0.03mmol)を加え、水素を3回添加した後、室温にて終夜撹拌した。TLCにて原料の消失を確認後、反応溶液をセライトろ過し、エバポレーターで50℃水浴中減圧濃縮した結果、目的とする化合物33を17mg得た(収率97%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45(9H, s), 3.39-3.55(4H, m), 3.73(1H, m).
化合物33 15mg(1.0eq,0.08mmol)をDCM 3mL及びDMF 1mLに溶解し、フェンブフェン 21mg(1.05eq,0.08mmol)及びDMAP 4.7mg(0.5eq,0.04mmol)を加えた。その後、氷冷下、WSC 30mg(2.0eq,0.16mmol)を加えて室温にて終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、氷冷下飽和NH4Cl水溶液で反応溶液をクエンチし、トルエン及び水を用いて分液抽出を3回行った。集めた有機層は飽和NH4Cl水溶液、飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで60℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物34を32mg得た(収率95%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45(9H, s), 2.80(2H, dt), 3.37-3.53(6H, m), 4.33(1H, m), 7.41-8.07(9H,m).
化合物34 142mgをDCM 5mLに溶解し、氷冷下、4M HCl/AcOEt 2mLを加えて2時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、エバポレーターで40℃水浴中減圧濃縮し、残留物をジエチルエーテルで洗浄した結果、目的とする導入前駆体35を115mg得た(収率95%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ2.82(2H, m), 3.26(2H, t), 3.45(2H, m), 3.67(2H, m), 4.40(1H, m), 7.43-8.13(9H,m).
CS(重量平均分子量約40kDa) 200mgをWFI 16mL及びEtOH 16mLに溶解し、導入前駆体35を35mg(0.24eq,0.095mmol)及びDMT−MMを45mg(0.24eq,0.095mmol)加えて終夜攪拌した。その後NaClを600mg、90%EtOH/WFIを90mL加えて沈殿形成し、上清を捨てて90%EtOH/WFI洗浄を2回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物36が195mg得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、9%であった。
CS(重量平均分子量約40kDa) 200mgをWFI 16mL及びEtOH 16mLに溶解し、導入前駆体8を43mg(0.26eq,0.103mmol)及びDMT−MMを49mg(0.26eq,0.103mmol)加えて終夜攪拌した。その後NaClを600mg、90%EtOH/WFIを90mL加えて沈殿形成し、上清を捨てて90%EtOH/WFI洗浄を2回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物36が196mg得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、12%であった。
CS(F,F)−フェルビナクの合成をスキーム7に示す。
化合物37を出発原料とし、一方のエチルエステルを加水分解して化合物38を得た。化合物38のエチルエステルにベンジルアミンを反応させてアミド体である化合物39とし、続いてアミド、カルボン酸を同時に還元して化合物40を合成した。さらに化合物40のベンジル基を脱保護後、Boc基へのアミノ保護基変換を実施し、化合物42とフェルビナクとの縮合反応に付した。さらに、フェルビナク縮合体である化合物43のBoc基を脱保護し導入前駆体44へと導き、最後にCSへ導入して、コンジュゲート45を得た。
化合物37 5g(1.0eq,25.49mmol)をメタノール 40mLに溶解し、そこに水酸化カリウム1.43g(1.0eq,25.49mmol)のメタノール溶液 30mLを滴下した。室温下3時間半撹拌し、TLCにて原料の消失を確認後、ベンジルアミン8.4mL(3.0eq,76.47mmol)を加えて55℃で終夜撹拌した。その後、反応溶液をエバポレーターで減圧濃縮し、析出した固体にジエチルエーテルを加えて洗浄ろ過した。洗浄した固体は1M HClに溶解させ、酢酸エチルを用いて分液抽出を3回実施した。集めた有機層は飽和NaCl水溶液で洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮し、残渣物(化合物39)を得た。これはこのまま次の還元反応に付した。
化合物39 4.9g(1.0eq,21.35mmol)をTHF 35mLに溶解し、ジメチルスルフィドボラン 8.2mL(4.0eq,85.41mmol)にTHF15mLを加えた溶液を0℃で滴下した。0℃下、1時間攪拌した後に室温にて3時間半攪拌し、さらにその後55℃にて終夜攪拌した。TLCにて新たなスポットを確認後、1M HClを用いてクエンチし、酢酸エチル及び水を用いて分液抽出を3回行った。集めた有機層は1M NaOH水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した。この反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、(ヘキサン:酢酸エチル=2:1)目的とする化合物40を2.5g得た(化合物37から3工程収率48%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ3.12(2H, dd), 3.87-3.93(4H, m), 7.26-7.37(5H,m).
化合物40 1.04g(1.0eq,5.17mmol)をメタノール 9mLに溶解し、10%パラジウム炭素550mg及びギ酸アンモニウム1.63g(5.0eq,25.86mmol)を加えて65℃で5時間撹拌した。TLCにて原料の消失を確認後、セライトろ過し、1M HClをろ液に滴下してpH約3に調整した。その後、エバポレーターでメタノールを除去し、酢酸エチルを用いて2回洗浄した。得られた水層に1M NaOHを加えてpH約10に調整し、化合物41の水溶液を得た。これはこのまま次のBoc化反応に付した。
化合物41の水溶液50mLにTHF50mLを加え、0℃下、Boc2Oを1.13g(1.0eq,5.17mmol)反応させた。終夜攪拌後、TLCで原料の消失を確認し、エバポレーターを用いてTHFを除去した。残渣液に酢酸エチルを加えて分液抽出を3回行い、集めた有機層は飽和NaCl水溶液で洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮したところ固体が得られ、これをヘキサンで洗浄した結果、目的とする化合物42を1.08g得た(化合物18から2工程収率99%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.46(9H, s), 3.54(2H, ddd), 3.67(2H, ddd), 3.95(1H, m), 4.98(1H, br).
化合物42 300mg(1.0eq,1.42mmol)をDCM 10mL及びDMF 1mLに溶解し、フェルビナク 317mg(1.05eq,1.49mmol)及びDMAP 52mg(0.3eq,0.426mmol)を加えた。その後、氷冷下、WSC 545mg(2.0eq,2.84mmol)を加えて室温にて終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、氷冷下飽和NH4Cl水溶液で反応溶液をクエンチし、トルエン及び水を用いて分液抽出を3回行った。集めた有機層は飽和NH4Cl水溶液、飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで60℃水浴中、減圧濃縮した結果、残渣物(化合物43)を570mg得た(収率99%)。これはこのまま次の脱Boc化に用いた。
化合物43 570mgをDCM 15mLに溶解し、氷冷下、4M HCl/AcOEt 6mLを加えて3時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、エバポレーターで40℃水浴中減圧濃縮し、残留物をジエチルエーテルで洗浄した結果、目的とする導入前駆体44を471mg得た(収率98%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ3.45(2H, m), 3.83(2H, s), 4.52(2H, dd), 4.62(2H, br), 7.36-7.64(9H,m).
CS(重量平均分子量約40kDa) 200mgをWFI 16mL及びEtOH 16mLに溶解し、導入前駆体44を34mg(0.28eq,0.111mmol)及びDMT−MMを52mg(0.28eq,0.111mmol)加えて終夜攪拌した。その後NaClを600mg、90%EtOH/WFIを90mL加えて沈殿形成し、上清を捨てて90%EtOH/WFI洗浄を2回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物45が202mg得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、13%であった。
CS(重量平均分子量約40kDa) 200mgをWFI 16mL及びEtOH 16mLに溶解し、導入前駆体44を29mg(0.24eq,0.095mmol)及びDMT−MMを45mg(0.24eq,0.095mmol)加えて終夜攪拌した。その後NaClを600mg、90%EtOH/WFIを90mL加えて沈殿形成し、上清を捨てて90%EtOH/WFI洗浄を2回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物45が200mg得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、12%であった。
CS(F,F)−インドメタシンの合成をスキーム8に示す。
化合物1とインドメタシンを縮合し、化合物2とした後にBoc基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体3へと変換し、CSへの導入を行ってコンジュゲート4とした。
化合物1 100mg(1.0eq,0.47mmol)をDCM 10mLに溶解し、インドメタシン178mg(1.05eq,0.50mmol)及びDMAP 17mg(0.3eq,0.14mmol)を加えた。その後、氷冷下、WSC 182mg(2.0eq,0.95mmol)を加えて室温にて終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、氷冷下飽和NH4Cl水溶液で反応溶液をクエンチし、DCM及び水を用いて分液抽出を3回行った。集めた有機層は飽和NH4Cl水溶液、飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物2を260mg得た(収率quant.)。
化合物2 260mgをDCM 7mLに溶解し、氷冷下、4M HCl/AcOEt 3mLを加えて2.5時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、エバポレーターで40℃水浴中減圧濃縮し、残留物をジエチルエーテルで洗浄した結果、目的とする導入前駆体3を223mg得た(収率97%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ2.36(3H, s), 3.51(2H, m), 3.84(3H, s), 3.90(2H, s), 4.55(2H, m), 6.72-7.71(7H, m).
CS(重量平均分子量約20kDa) 639mgをWFI 13mL及びEtOH 13mLに溶解し、導入前駆体3を186mg(0.3eq,0.41mmol)及びDMT−MMを179mg(0.3eq,0.41mmol)加えて終夜攪拌した。続いてNaCl 620mgを加え、この溶液を95%EtOH/WFI 60mLに滴下することで沈殿形成し、上清を捨てて90%EtOH/WFI洗浄及び95%EtOH/WFI洗浄を2回ずつ実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物4が736mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、28%であった。
CS(F,F)−ケトプロフェンの合成をスキーム9に示す。
化合物1とケトプロフェンを縮合し、化合物5とした後にBoc基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体6へと変換し、CSへの導入を行ってコンジュゲート7とした。
化合物1 100mg(1.0eq,0.47mmol)をDCM 3mLに溶解し、ケトプロフェン127mg(1.05eq,0.50mmol)及びDMAP 17mg(0.3eq,0.14mmol)を加えた。その後、氷冷下、WSC 182mg(2.0eq,0.95mmol)を加えて室温にて終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、氷冷下飽和NH4Cl水溶液で反応溶液をクエンチし、DCM及び水を用いて分液抽出を3回行った。集めた有機層は飽和NH4Cl水溶液、飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物5を210mg得た(収率99%)。
化合物5 210mgをDCM 7mLに溶解し、氷冷下、4M HCl/AcOEt 3mLを加えて3.5時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、エバポレーターで40℃水浴中減圧濃縮し、残留物をジエチルエーテルで洗浄した結果、目的とする導入前駆体6を177mg得た(収率98%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ1.58(3H, d), 3.51(2H, m), 4.03(1H, q), 4.53(2H, m), 7.53-7.87(9H, m).
CS(重量平均分子量約20kDa) 716mgをWFI 14mL及びEtOH 14mLに溶解し、導入前駆体6を164mg(0.3eq,0.47mmol)及びDMT−MMを200mg(0.3eq,0.47mmol)加えて終夜攪拌した。続いてNaCl 870mgを加え、この溶液を95%EtOH/WFI 55mLに滴下することで沈殿形成し、上清を捨てて90%EtOH/WFI洗浄及び95%EtOH/WFI洗浄を2回ずつ実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物7が784mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、32%であった。
CS(F,F)−フルルビプロフェンの合成をスキーム10に示す。
化合物1とフルルビプロフェンを縮合し、化合物8とした後にBoc基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体9へと変換し、CSへの導入を行ってコンジジュゲート10とした。
化合物1 100mg(1.0eq,0.47mmol)をDCM 10mLに溶解し、フルルビプロフェン122mg(1.05eq,0.50mmol)及びDMAP 17mg(0.3eq,0.14mmol)を加えた。その後、氷冷下、WSC 182mg(2.0eq,0.95mmol)を加えて室温にて終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、氷冷下飽和NH4Cl水溶液で反応溶液をクエンチし、DCM及び水を用いて分液抽出を3回行った。集めた有機層は飽和NH4Cl水溶液、飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物8を211mg得た(収率quant.)。
化合物8 210mgをDCM 7mLに溶解し、氷冷下、4M HCl/AcOEt 3mLを加えて2.5時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、エバポレーターで40℃水浴中減圧濃縮し、残留物をジエチルエーテルで洗浄した結果、目的とする導入前駆体9を167mg得た(収率93%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ1.20(3H, d), 3.51(2H, m), 3.99(1H, q), 4.53(1H, dt), 7.19-7.56(8H, m).
CS(重量平均分子量約20kDa) 596mgをWFI 12mL及びEtOH 12mLに溶解し、導入前駆体9を133mg(0.3eq,0.39mmol)及びDMT−MMを167mg(0.3eq,0.39mmol)加えて終夜攪拌した。続いてNaCl 750mgを加え、この溶液を95%EtOH/WFI 50mLに滴下することで沈殿形成し、上清を捨てて90%EtOH/WFI洗浄及び95%EtOH/WFI洗浄を2回ずつ実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物10が649mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、33%であった。
CS(H)−ケトプロフェンの合成をスキーム11に示す。
アミノプロパノール11をスペーサーとし、アミノ基をBoc保護した後、ケトプロフェンとの縮合反応に付して化合物13とした。続いてBoc基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体14へと変換し、CSへの導入を行ってコンジュゲート15とした。
化合物11 5g(1.0eq, 66.6mmol)をDCM 120mLに溶解し、氷冷下、Boc2O 14.5g(1.0eq,66.6mmol)を加えて室温にて終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、反応溶液をエバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物12を11.7g得た(収率quant.)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45(9H, s), 1.65(2H, m), 2.94(1H, br), 3.30(2H, m), 3.66(2H, m), 4.76(1H, br).
化合物12 1.07g(1.0eq, 6.09mmol)をDCM 12mLに溶解し、ケトプロフェン1.55g(1.0eq, 6.09mmol)及びDMAP 74mg(0.1eq, 0.61mmol)を加えた。その後、氷冷下、WSC 2.34g(2.0eq, 12.2mmol)を加えて室温にて終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、酢酸エチル及び水を用いて分液抽出を3回行った。集めた有機層は5%クエン酸水溶液、5%NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物13を2.18g得た(収率87%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45(9H, s), 1.54(3H, d), 1.77(2H, m), 3.11(2H, m), 3.80(1H, q), 4.14(2H, m), 4.69(1H, br), 7.42-7.83(9H, m).
化合物13 2.18gをDCM 70mLに溶解し、氷冷下、4M HCl/AcOEt 30mLを加えて2時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、エバポレーターで40℃水浴中減圧濃縮し、残留物をジエチルエーテルで洗浄した結果、目的とする導入前駆体14を1.81g得た(収率98%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ1.53(3H, d), 1.95(2H, m), 2.91(2H, t), 3.91(1H, q), 4.19(2H, t), 7.51-7.78(9H, m).
CS(重量平均分子量約20kDa) 2.5gをWFI 50mL及びEtOH 50mLに溶解し、導入前駆体14を518mg(0.3eq,1.66mmol)及びDMT−MMを699mg(0.3eq,1.66mmol)加えて終夜攪拌した。続いてNaCl 2.5gを加え、白濁する直前まで95%EtOHを加えた。この溶液を95%EtOH/WFI 150mLに滴下することで沈殿形成し、上清を捨てて90%EtOH/WFI洗浄及び95%EtOH/WFI洗浄を2回ずつ実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物7が2.6g得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、26%であった。
CS(F)−ケトプロフェンの合成をスキーム12に示す。
化合物16とケトプロフェンを縮合し、化合物17とした後にBoc基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体18へと変換し、CSへの導入を行ってコンジュゲート19とした。
化合物16 100mg(1.0eq,0.52mmol)をDCM 5mLに溶解し、ケトプロフェン138mg(1.05eq,0.54mmol)及びDMAP 31mg(0.5eq,0.26mmol)を加えた。その後、氷冷下、WSC 199mg(2.0eq,1.04mmol)を加えて室温にて終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、氷冷下飽和NH4Cl水溶液で反応溶液をクエンチし、DCM及び水を用いて分液抽出を3回行った。集めた有機層は飽和NH4Cl水溶液、飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物17を218mg得た(収率98%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.43(9H, s), 1.54(3H, d), 3.25-3.41(2H, m), 3.85(1H, q), 4.18-4.33(2H, m), 4.78(1H, br), 7.42-7.81(9H, m).
化合物17 237mgをDCM 7mLに溶解し、氷冷下、4M HCl/AcOEt 3mLを加えて2時間攪拌したその後室温にてさらに1時間攪拌し、TLCにて原料の消失を確認後、エバポレーターで40℃水浴中減圧濃縮した。残留物をジエチルエーテルで洗浄した結果、目的とする導入前駆体18を169mg得た(収率91%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ1.50(3H, d), 3.10-3.28(2H, m), 3.96(1H, q), 4.26-4.47(2H, m), 4.92(1H, m), 7.40-7.80(9H, m).
CS(重量平均分子量約20kDa) 760mgをWFI 15mL及びEtOH 15mLに溶解し、導入前駆体18を166mg(0.3eq, 0.45mmol)及びDMT−MMを213mg(0.3eq, 0.45mmol)加えて終夜攪拌した。続いてNaCl 760mgを加え、この溶液を90%EtOH/WFI 90mLに滴下することで沈殿形成し、上清を捨てて90%EtOH/WFI洗浄及びEtOH洗浄を2回ずつ実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物19が750mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、30%であった。
CS(F,F)−メフェナム酸の合成をスキーム13に示す。
化合物1とメフェナム酸を縮合し、化合物20とした後にBoc基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体21へと変換し、CSへの導入を行ってコンジュゲート22とした。
化合物1 302mg(1.0eq,1.43mmol)をDCM 15mLに溶解し、メフェナム酸346mg(1.0eq,1.43mmol)及びDMAP 17mg(0.1eq,0.14mmol)を加えた。その後、氷冷下、WSC 550mg(2.0eq,2.87mmol)を加えて室温にて終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、酢酸エチル及び水を用いて分液抽出を3回行った。集めた有機層は5%クエン酸水溶液、5%NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した(トルエン:酢酸エチル=15:1)結果、目的とする化合物20を252mg得た(収率41%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45(9H, s), 2.16(3H, s), 2.33(3H, s), 3.70(2H, m), 4.55(2H, t), 4.91(1H, br), 6.66(2H,m), 7.03-7.28(3H,m), 7.97(1H,d), 9.02(1H,s).
化合物20 235mgをDCM 1mLに溶解し、氷冷下、4M HCl/AcOEt 3mLを加えて2.5時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、エバポレーターで40℃水浴中減圧濃縮し、残留物をジエチルエーテルで洗浄した結果、目的とする導入前駆体21を192mg得た(収率96%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ2.14(3H, s), 2.31(3H, s), 3.57(2H, t), 4.63(2H, t), 6.66(2H,m), 7.08(3H,m), 7.91(1H,d), 8.99(1H,s).
CS(重量平均分子量約20kDa) 863mgをWFI 17mL及びEtOH 17mLに溶解し、導入前駆体21を191mg(0.3eq,0.52mmol)及びDMT−MMを244mg(0.3eq,0.52mmol)加えて終夜攪拌した。続いてNaCl 2.6gを加えたところ、ゴム状沈殿が形成されたので、これにEtOH 70mLを加えて沈殿を出し切り、得られた沈殿にWFI 50mL、EtOH 10mLを加えて再溶解した。その後、EtOH 40mL、NaCl 100mg、EtOH 130mLを順次加えた。この溶液を90%EtOH/WFI 85mLに半量滴下し、その後EtOH 100mL、残り半量の反応液を滴下して沈殿形成し、上清を捨てて90%EtOH/WFI洗浄及びEtOH/WFI洗浄を2回ずつ実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物7が825mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、30%であった。
CS(F,F)−ロキソプロフェンの合成をスキーム14に示す。
ロキソプロフェン23を以下の手順で活性体であるtrans−OH型化合物26に変換し、CS(F,F)−フルルビプロフェン等と同様の手順でCSコンジュゲート32を合成した。
化合物23 5g(1.0eq, 16.4mmol)にトルエン及び1M HClを加えて分液抽出を3回行った。集めた有機層は飽和NaCl水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後にエバポレーターで60℃水浴中、減圧濃縮した。得られた化合物24はそのままメチルエステル化反応に付した。化合物24含有の濃縮液をMeOH 100mLに溶解し、DMAP 402mg(0.2eq,3.29mmol)を加え、その後、氷冷下WSC 6.29g(2.0eq,32.9mmol)を加えて室温にて終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、酢酸エチル及び水を用いて分液抽出を3回行った。集めた有機層は5%クエン酸水溶液、5%NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物25を4.27g得た(収率quant.)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.48(3H, d), 1.50-1.98(4H, m), 2.07-2.37(4H, m), 2.53(1H, m), 3.66(3H, s), 3.69(1H, q), 7.11-7.26(4H,m).
化合物25 2g(1.0eq,7.71mmol)をEtOH 60mLに溶解し、氷冷下、水素化ホウ素ナトリウム 417mg(3.4eq,26.5mmol)を加え、2時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、酢酸エチル及び水を用いて分液抽出を3回行った。集めた有機層は5%クエン酸水溶液、5%NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物26を1.09g得た(収率54%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δ1.14(1H, m), 1.43(3H, d), 1.45-1.90(6H, m), 2.28(1H, dd), 2.76(1H, dd), 3.58(3H, s), 3.65(1H, m), 3.74(1H, q), 7.11-7.20(4H, m).
化合物26 1.09g(1.0eq,4.17mmol)をDCM 10mL、DMF 3mLに溶解し、氷冷下、トリイソプロピルシリルクロリド 1.78g(2.2eq,12.8mmol)及びイミダゾール 1.09g(3.8eq,16.0mmol)を加え、終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、氷冷下水でクエンチし、酢酸エチル及び水を用いて分液抽出を3回行った。集めた有機層は5%クエン酸水溶液、5%NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した(ヘキサン:酢酸エチル=20:1)結果、目的とする化合物28を1.65g得た(収率95%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.00(21H, m)1.20(1H, m), 1.47(3H, d), 1.51-2.10(6H, m), 2.29(1H, dd), 2.78(1H, dd), 3.65(3H, s), 3.68(1H, m), 3.95(1H, q), 7.11-7.20(4H, m).
化合物27 1.65g(1.0eq,3.94mmol)をTHF 45mL、H2O 15mL、EtOH 50mLに溶解し、氷冷下、水酸化リチウム一水和物 442mg(2.6eq,10.5mmol)を加え、終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、氷冷下水でクエンチし、ジエチルエーテル及び1M HClを用いて分液抽出を3回行った。集めた有機層は飽和NaCl水溶液で洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した(クロロホルム:アセトン=3:1)結果、目的とする化合物29を1.47g得た(収率92%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.00(21H, m), 1.21(1H, m), 1.49(3H, d), 1.51-2.10(6H, m), 2.29(1H, dd), 2.78(1H, dd), 3.70(1H, m), 3.95(1H, q), 7.11-7.20(4H, m).
化合物1 306mg(1.0eq,1.45mmol)をDCM 6mLに溶解し、化合物28 587mg(1.0eq,1.45mmol)及びDMAP 20mg(0.1eq,0.16mmol)を加えた。その後、氷冷下、WSC 576mg(2.0eq,2.90mmol)を加えて室温にて終夜攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、酢酸エチル及び水を用いて分液抽出を3回行った。集めた有機層は5%クエン酸水溶液、5%NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した(ヘキサン:酢酸エチル=10:1)結果、目的とする化合物30を781mg得た(収率90%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.00(21H, m), 1.21(1H, m), 1.45(9H, s), 1.51(3H, d), 1.51-2.10(6H, m), 2.29(1H, dd), 2.82(1H, dd), 3.49(2H, m), 3.72(1H, m), 3.95(1H, q), 4.28(2H, m), 4.70(1H, br), 7.11-7.23(4H, m).
化合物30 781mg(1.0eq,1.31mmol)をDCM 2mLに溶解し、氷冷下、4M HCl/AcOEt 10mLを加えて5時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、エバポレーターで40℃水浴中減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した(クロロホルム:メタノール=1:1)結果、目的とする導入前駆体31を157mg得た(収率32%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.21(1H, m), 1.51(3H, d), 1.51-2.12(6H, m), 2.51(1H, m), 2.65(1H, m), 3.07(2H, m), 3.75(1H, m), 3.86(1H, m), 4.20-4.57(2H, m), 7.11-7.23(4H, m).
CS(重量平均分子量約20kDa) 750mgをWFI 14mL及びEtOH 14mLに溶解し、導入前駆体31を156mg(0.3eq,0.41mmol)及びDMT−MMを194mg(0.3eq,0.41mmol)加えて終夜攪拌した。続いてNaCl 70mg、EtOH 13mLを加え、この溶液の半量を24mLの90%EtOHに滴下した。続いてEtOH 30mLと反応液残り半量を加えて沈殿形成し、上清を捨てて90%EtOH/WFI洗浄及びEtOH洗浄を2回ずつ実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物32が609mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、約31%であった。
ジクロフェナク−(1−アミノ−2−プロパノール)−コンドロイチン硫酸(スペーサーに1−アミノ−2−プロパノールを用いたジクロフェナク−コンドロイチン硫酸コンジュゲート)の調製をスキーム15に示す。1−(tert−ブトキシカルボニル)アミノ−2−プロパノール(1)を原料とし、水酸基をBr化して化合物2とした後にジクロフェナクナトリウムと縮合して化合物3を得た。続いてBoc基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体4へと変換し、コンドロイチン硫酸への導入を行ってコンジュゲート5を合成した。
1−(tert−ブトキシカルボニル)アミノ−2−プロパノール(1) 1000mg(1.0eq, 5.71mmol)をDCM 10mLに溶解し、氷冷下、四臭化炭素(CBr4) 2852mg(1.5eq,8.60mmol)とトリフェニルホスフィン(PPh3) 2256mg(1.5eq,8.60mmol)を加えて30分攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、氷水を加えて20分攪拌し、酢酸エチルで分液抽出した。有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後にエバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し(ヘキサン:酢酸エチル=10:1)、化合物2を876mg得た(収率64%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) 1.45(9H, s), 1.68(3H, d), 3.27-3.33(1H, m), 3.56(1H, br), 4.21(1H, br), 4.96(1H, br).
化合物2 876mg(1.0eq,3.68mmol)とジクロフェナクナトリウム1170mg(1.0eq,3.68mmol)をDMF 10mLに溶解し、60℃下、3昼夜攪拌した。酢酸エチル及び5%重曹水を用いて分液抽出し、有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し(ヘキサン:酢酸エチル=6:1)、化合物3を889mg得た(収率53%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) 1.25(3H, d), 1.40(9H, s), 3.18-3.23(1H, m), 3.35(1H, br), 3.79(1H, d), 3.83(1H, d), 4.62(1H, br), 5.02(1H, br), 6.56(1H, d), 6.82(1H, s), 6.94-7.00(2H, m), 7.12(1H, t), 7.22(1H, d), 7.34(2H, d).
化合物3 636mgをDCM 1.5mLに溶解し、氷冷下、4M HCl/AcOEt 3mLを加えて3時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、ジエチルエーテルとヘキサンを加えて沈殿とし、減圧下溶媒留去した結果、目的とする導入前駆体4を539mg得た(収率99%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) 1.22(3H, d), 2.90(1H, dd), 3.29(1H, dd), 3.88(1H, d), 4.01(1H, d), 5.22(1H, m), 6.50(1H, d), 6.71(1H, s), 6.89-6.97(2H, m), 7.08(1H, t), 7.33(2H, d).
コンドロイチン硫酸(重量平均分子量約20kDa) 1500mgをWFI 24mL及びEtOH 24mLに溶解し、導入前駆体 4 279mg(0.24eq,0.72mmol)の50% EtOH/WFI溶液 6mL、DMT−MM 338mg(0.24eq,0.72mmol) の50% EtOH/WFI溶液 6mLを加えて終夜攪拌した。その後、NaCl 150mgのWFI溶液 0.6mLを加え、90% EtOH/WFI 90mL及びEtOH 110mLを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を90% EtOH/WFI、EtOHにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物5が1460mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、22%であった。
ジクロフェナク(セリンエチルエステル)−コンドロイチン硫酸(スペーサーにセリンエチルエステルを用いたジクロフェナク−コンドロイチン硫酸コンジュゲート)の調製をスキーム16に示す。Boc−L−セリン(1)を原料とし、カルボキシル基をエチルエステルとして化合物2とした後にジクロフェナクナトリウムと縮合して化合物3を得た。続いてBoc基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体4へと変換し、コンドロイチン硫酸への導入を行ってコンジュゲート5を合成した。
Boc−L−セリン 501mg(1.0eq,2.44mmol)をEtOH 25mLに溶解し、WSC 941mg(2.0eq,4.91mmol)とDMAP 34mg(0.1eq,0.28mmol)を加えて室温下3昼夜攪拌した。反応液を濃縮し、酢酸エチルに溶解後に5%クエン酸水溶液、5%重曹水で分液抽出した。有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後にエバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物2を394mg得た(収率69%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.31(3H, t), 1.46(9H, s), 3.92-3.97(2H, m), 4.12(2H, q), 4.37(1H, br), 5.42(1H, br).
化合物2 130mg(1.0eq,0.56mmol)とジクロフェナク 332mg(2.0eq,1.12mmol)をDCM 5mLとDMF 0.5mLに溶解し、DMAP 15mg(0.2eq,0.12mmol)とWSC 326mg(3.0eq,1.70mmol)を加えて室温下終夜攪拌した。さらにジクロフェナク 165mg(1.0eq,0.56mmol)とWSC 163mg(1.5eq,0.85mmol)を加えて室温下終夜攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、5%クエン酸水溶液、5%重曹水を用いて分液抽出し、有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し(ヘキサン:酢酸エチル=4:1)、化合物3を含む画分341mgを得た。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.21(3H, t), 1.46(9H, s), 3.81(1H, d), 3.83(1H, d), 4.11-4.18(2H, m), 4.40(1H, dd), 4.52(1H, dd), 4.58(1H, bt), 5.29(1H, br), 6.55(1H, d), 6.78(1H, s), 6.94-7.00(2H, m), 7.12(1H, t), 7.20(1H, d), 7.35(2H, d).
化合物3を含む画分341mgをDCM 1mLに溶解し、氷冷下、4M HCl/AcOEt 3mLを加えて2時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、ジエチルエーテルとヘキサンを加えて沈殿とし、減圧下溶媒留去した結果、目的とする導入前駆体4を158mg得た(化合物2から導入前駆体4の2工程、収率60%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.25(3H, t), 3.86(1H, d), 3.92(1H, d), 4.17-4.29(3H, m), 4.60-4.68(2H, m), 6.53(1H, d), 6.96(1H, t), 7.01(1H, t), 7.23(1H, d), 7.36(2H, d).
コンドロイチン硫酸(重量平均分子量約20kDa) 446mgをWFI 8mL及びEtOH 8mLに溶解し、導入前駆体4 95mg(0.24eq,0.21mmol)の50% EtOH/WFI溶液 2mL、DMT−MM 101mg(0.24eq,0.21mmol) の50% EtOH/WFI溶液 2mLを加えて終夜攪拌した。その後、NaCl 50mgのWFI溶液 0.2mLを加え、90% EtOH/WFI 30mL及びEtOH 37mLを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を90% EtOH/WFI、EtOHにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物5が358mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、24%であった。
ジクロフェナク(トレオニンエチルエステル)−コンドロイチン硫酸(スペーサーにトレオニンエチルエステルを用いたジクロフェナク−コンドロイチン硫酸コンジュゲート)の調製をスキーム17に示す。Boc−L−トレオニン(1)を原料とし、カルボキシル基をエチルエステルとして化合物2とした後にジクロフェナクナトリウムと縮合して化合物3を得た。続いてBoc基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体4へと変換し、コンドロイチン硫酸への導入を行ってコンジュゲート5を合成した。
Boc−L−トレオニン 3000mg(1.0eq,13.7mmol)をEtOH 150mLに溶解し、WSC 5274mg(2.0eq,27.5mmol)とDMAP 166mg(0.1eq,1.36mmol)を加えて室温下終夜攪拌した。反応液を濃縮し、酢酸エチルに溶解後に5%クエン酸水溶液、5%重曹水で分液抽出した。有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後にエバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物2を2149mg得た(収率64%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.26(3H, d), 1.30(3H, t), 1.46(9H, s), 1.93(1H, d), 4.22-4.26(3H, m), 4.37(1H, br)5.28(1H, br).
化合物2 233mg(1.0eq,0.94mmol)とジクロフェナク 839mg(3.0eq,2.83mmol)をDCM 9mLとDMF 1.5mLに溶解し、DMAP 36mg(0.3eq,0.29mmol)とWSC 820mg(4.5eq,4.28mmol)を加えて室温下終夜攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、5%クエン酸水溶液、5%重曹水を用いて分液抽出し、有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し(ヘキサン:酢酸エチル=4:1)、化合物3 242mgを得た(収率49%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.12(3H, t), 1.34(3H, d), 1.49(9H, s), 3.73(1H, d), 3.79(1H, d), 3.97-4.04(2H, m), 4.43(1H, dd), 5.22(1H, br), 6.55(1H, d), 6.80(1H, s), 6.94-6.98(2H, m), 7.11(1H, t), 7.18(1H, d), 7.34(2H, d).
化合物3 242mgをDCM 0.5mLに溶解し、氷冷下、4M HCl/AcOEt 2mLを加えて徐々に室温としながら1.5時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、ジエチルエーテルとヘキサンを加えて沈殿とし、減圧下溶媒留去した結果、目的とする導入前駆体4を206mg得た(収率97%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.11(3H, t), 1.65(3H, d), 3.92(1H, d), 3.96(1H, d), 3.98-4.16(2H, m), 4.17(1H, s), 5.55-5.60(1H, m), 6.48(1H, d), 6.85-6.88(2H, m), 6.96(1H, t), 7.06(1H, d), 7.31-7.32(3H, m).
コンドロイチン硫酸(重量平均分子量約20kDa) 500mgをWFI 8mL及びEtOH 8mLに溶解し、導入前駆体 4 111mg(0.24eq,0.24mmol)の50% EtOH/WFI溶液 2mL、DMT−MM 113mg(0.24eq,0.24mmol) の50% EtOH/WFI溶液 2mLを加えて終夜攪拌した。その後、NaCl 50mgのWFI溶液 0.2mLを加え、90% EtOH/WFI 30mL及びEtOH 37mLを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を90% EtOH/WFI、EtOHにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物5が368mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、24%であった。
ジクロフェナク(1−アミノ−3,3−ジメチルブタン−2−オール)−コンドロイチン硫酸(スペーサーに1−アミノ−3,3−ジメチルブタン−2−オールを用いたジクロフェナク−コンドロイチン硫酸コンジュゲート)の調製をスキーム18に示す。1−アミノ−3,3−ジメチルブタン−2−オールをBoc化して化合物2とした後にジクロフェナクと縮合して化合物3を得た。続いてBoc基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体4へと変換し、コンドロイチン硫酸への導入を行ってコンジュゲート5を合成した。
1−アミノ−3,3−ジメチルブタン−2−オール 1 2002mg(1.0eq,17.1mmol)をWFI 15mL及び1,4−ジオキサン 10mLに溶解し、Boc2O 3771mg(1.0eq,17.1mmol)の1,4−ジオキサン溶液 30mLを加えて室温下23時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物2を3663mg得た(収率99%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ0.93(9H, s), 1.45(9H, s), 2.98(1H, br), 3.31-3.34(1H, m), 3.38-3.42(1H, m), 4.88(1H, br).
化合物2 210mg(1.0eq,0.97mmol)とジクロフェナク 863mg(3.0eq,2.91mmol)をDCM 9mLとDMF 1.5mLに溶解し、DMAP 39mg(0.3eq,0.32mmol)とWSC 747mg(4.0eq,3.90mmol)を加えて室温下終夜攪拌した。さらにジクロフェナク 864mg(3.0eq,2.92mmol)とWSC 761mg(4.0eq,3.97mmol)を加えて室温下終夜攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、5%クエン酸水溶液、5%重曹水を用いて分液抽出し、有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し(ヘキサン:酢酸エチル=4:1)、化合物3 208mgを得た(収率43%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ0.91(9H, s), 1.35(9H, s), 3.15-3.21(1H, m), 3.46-3.50(1H, m), 3.85(2H, s), 4.54(1H, br), 3.81(1H, d ), 6.55(1H, d), 6.81(1H, s), 6.94-6.99(2H, m), 7.11(1H, t), 7.23(1H, d), 7.34(2H, d).
化合物3 208mgをDCM 0.5mLに溶解し、氷冷下、4M HCl/AcOEt 3mLを加えて徐々に室温としながら1時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、ジエチルエーテルとヘキサンを加えて沈殿とし、減圧下溶媒留去した結果、目的とする導入前駆体4を125mg得た(収率69%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ0.74(9H, s), 2.82(1H, t), 3.05(1H, d), 3.96(1H, d), 4.10(1H, d), 5.07(1H, d), 6.48-6.52(2H, m), 6.91-6.96(2H, m), 7.06-7.09(1H, m), 7.31(2H, d), 7.39(1H, d).
コンドロイチン硫酸(重量平均分子量約20kDa) 200mgをWFI 3.2mL及びEtOH 3.2mLに溶解し、導入前駆体4 41mg(0.24eq,95.7μmol)の50%EtOH/WFI溶液 0.8mL、DMT−MM 45mg(0.24eq,95.7μmol)の50%EtOH/WFI溶液 0.8mLを加えて終夜攪拌した。その後、NaCl 20mgのWFI溶液 80μLを加え、90%EtOH/WFI 12mL及びEtOH 15mLを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を90%EtOH/WFI、EtOHにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物5が228mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、24%であった。
ジクロフェナク(1−アミノ−2−ブタノール)−コンドロイチン硫酸(スペーサーに1−アミノ−2−ブタノールを用いたジクロフェナク−コンドロイチン硫酸 コンジュゲート)の調製をスキーム19に示す。1−アミノ−2−ブタノール(1)をBoc化して化合物2とした後にジクロフェナクと縮合して化合物3を得た。続いてBoc基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体4へと変換し、コンドロイチン硫酸への導入を行ってコンジュゲート5を合成した。
1−アミノ−2−ブタノール(1) 2142mg(1.0eq,24.0mmol)をWFI 30mL及び1,4−ジオキサン 20mLに溶解し、Boc2O 5244mg(1.0eq,24.0mmol)の1,4−ジオキサン溶液 30mLを加えて室温下20時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物2を4606mg得た(収率quant.)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ0.96(3H, t), 1.42-1.59(11H, m), 2.99-3.04(1H, m), 3.30-3.33(1H, m), 3.70(1H, br), 4.90(H, br).
化合物2 330mg(1.0eq,1.74mmol)とジクロフェナク1554mg(3.0eq,5.25mmol)をDCM 5mLとDMF 1.5mLに溶解し、DMAP 64mg(0.3eq,0.524mmol)とWSC 1346mg(4.0eq,7.02mmol)を加えて室温下終夜攪拌した。さらにジクロフェナク 1552mg(3.0eq,5.24mmol)とWSC 1327mg(4.0eq,6.92mmol)を加えて室温下終夜攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、5%クエン酸水溶液、5%重曹水を用いて分液抽出し、有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し(ヘキサン:酢酸エチル=4:1)、化合物3 633mgを得た(収率78%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ0.88(3H, t), 1.39(9H, s), 1.60-1.63(2H, m), 3.19-3.24(1H, m), 3.38-3.40(1H, m), 3.81(1H, d), 3.85(1H, d), 4.57(H, br), 4.88-4.92(1H, m), 6.56(1H, d), 6.81(1H, s), 6.94-7.00(2H, m), 7.12(1H, t), 7.24(1H, d), 7.35(2H, d).
化合物3 633mgをDCM 1mLに溶解し、氷冷下、4M HCl/AcOEt 5mLを加えて140分攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、ジエチルエーテルとヘキサンを加えて沈殿とし、減圧下溶媒留去した結果、目的とする導入前駆体4を469mg得た(収率86%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ0.77(3H, t), 1.39(9H, s), 2.91(1H, dd), 3.01(1H, d), 3.92(1H, d), 4.02(1H, d), 5.12(1H, br), 6.50(1H, d), 6.67(1H, s), 6.89-6.97(2H, m), 7.05-7.09(1H, m), 7.30-7.33(3H, m).
コンドロイチン硫酸(重量平均分子量約20kDa) 200mgをWFI 3.2mL及びEtOH 3.2mLに溶解し、導入前駆体 4 39mg(0.24eq,95.6μmol)の50% EtOH/WFI溶液 0.8mL、DMT−MM 45mg(0.24eq,95.5μmol) の50% EtOH/WFI溶液 0.8mLを加えて終夜攪拌した。その後、NaCl 20mgのWFI溶液 80μLを加え、90%EtOH/WFI 12mL及びEtOH 15mLを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を90% EtOH/WFI、EtOHにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物5が230mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、24%であった。
ジクロフェナク(2−アミノ−1−シクロヘキシルエタン−1−オール)−コンドロイチン硫酸(スペーサーに2−アミノ−1−シクロヘキシルエタン−1−オールを用いたジクロフェナク−コンドロイチン硫酸コンジュゲート)の調製をスキーム20に示す。2−アミノ−1−シクロヘキシルエタン−1−オール(1)をBoc化して化合物2とした後にジクロフェナクと縮合して化合物3を得た。続いてBoc基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体4へと変換し、コンドロイチン硫酸への導入を行ってコンジュゲート5を合成した。
2−アミノ−1−シクロヘキシルエタン−1−オール(1) 705mg(1.0eq,4.92mmol)をWFI 10mL及び1,4−ジオキサン 15mLに溶解し、Boc2O 1074mg(1.0eq,4.92mmol)の1,4−ジオキサン溶液 15mLを加えて室温下18時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物2を1189mg得た(収率99%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.19-1.25(5H, m), 1.36-1.37(1H, m), 1.45(9H, s), 1.66-1.68(2H, m), 1.73-1.78(2H, m), 1.85(1H, d), 3.02-3.08(1H, m), 3.34-3.38(1H, m), 3.41-3.42(1H, m), 4.88(1H, br).
化合物2 291mg(1.0eq,1.20mmol)とジクロフェナク 1063mg(3.0eq,3.59mmol)をDCM 9mLとDMF 1.5mLに溶解し、DMAP 43mg(0.3eq,0.36mmol)とWSC 921mg(4.0eq,4.81mmol)を加えて室温下終夜攪拌した。さらにジクロフェナク 1065mg(3.0eq,3.59mmol)とWSC 924mg(4.0eq,4.82mmol)を加えて室温下終夜攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、5%クエン酸水溶液、5%重曹水を用いて分液抽出し、有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し(ヘキサン:酢酸エチル=4:1)、化合物3 407mgを得た(収率65%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ0.96-1.17(5H, m), 1.38(9H, s), 1.54-1.69(6H, m), 3.22-3.27(1H, m), 3.40-3.43(1H, m), 3.83(2H, d), 4.52(1H, br), 4.80(1H, t), 6.56(1H, d), 6.78(1H, s), 6.94-7.00(2H, m), 7.12(1H, t), 7.23(1H, d), 7.34(2H, d).
化合物3 407mgをDCM 1mLに溶解し、氷冷下、4M HCl/AcOEt 4mLを加えて徐々に室温としながら1時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、ジエチルエーテルとヘキサンを加えて沈殿とし、減圧下溶媒留去した結果、目的とする導入前駆体4を125mg得た(収率93%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ2.93(1H, t), 3.01(1H, d), 3.93(1H, d), 4.03(1H, d), 5.04(1H, Br), 6.49(1H, d), 6.61(1H, s), 6.90-6.97(2H, m), 7.06-7.09(1H, m), 7.31-7.35(3H, m).
コンドロイチン硫酸(重量平均分子量約20kDa) 200mgをWFI 3.2mL及びEtOH 3.2mLに溶解し、導入前駆体4 44mg(0.24eq,96.1μmol)の50%EtOH/WFI溶液 0.8mL、DMT−MM 45mg(0.24eq,95.9μmol) の50% EtOH/WFI溶液 0.8mLを加えて終夜攪拌した。その後、NaCl 20mgのWFI溶液 80μLを加え、90%EtOH/WFI 12mL及びEtOH 15mLを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を90%EtOH/WFI、EtOHにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物5が234mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、24%であった。
ジクロフェナク(4−アミノ−3−ヒドロキシ酪酸エチルエステル)−コンドロイチン硫酸(スペーサーに4−アミノ−3−ヒドロキシ酪酸エチルエステルを用いたジクロフェナク−コンドロイチン硫酸コンジュゲート)の調製をスキーム21に示す。Boc−4−アミノ−3−ヒドロキシ酪酸(1)をエチルエステル化して化合物2とした後にジクロフェナクと縮合して化合物3を得た。続いてBoc基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体4へと変換し、コンドロイチン硫酸への導入を行ってコンジュゲート5を合成した。
Boc−4−アミノ−3−ヒドロキシ酪酸(1) 503mg(1.0eq,2.29mmol)をEtOH 100mLに溶解し、WSC 880mg(2.0eq,4.59mmol)とDMAP 28mg(0.1eq,0.23mmol)を加えて室温下17時間攪拌した。反応液を濃縮し、酢酸エチルに溶解後に5%クエン酸水溶液、5%重曹水で分液抽出した。有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後にエバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し(ヘキサン:酢酸エチル=1:1)、目的とする化合物2を397mg得た(収率70%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.28(3H, t), 1.45(9H, s), 2.44-2.53(2H, m), 3.09-3.15(1H, m), 3.34(1H, br), 4.10(1H, br), 4.18(2H, dd), 4.95(1H, br).
化合物2 397mg(1.0eq,1.60mmol)とジクロフェナク 1425mg(3.0eq,4.81mmol)をDCM 6mLとDMF 2.5mLに溶解し、DMAP 60mg(0.3eq,0.49mmol)とWSC 1227mg(4.0eq,6.40mmol)を加えて室温下終夜攪拌した。さらにジクロフェナク 1425mg(3.0eq,4.81mmol)とWSC 1227mg(4.0eq,6.40mmol)を加えて3昼夜攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、5%クエン酸水溶液、5%重曹水を用いて分液抽出し、有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し(トルエン:アセトン=15:1)、化合物3 503mgを得た(収率60%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.17(3H, t), 1.40(9H, s), 2.62-2.65(2H, m), 3.35-3.41(2H, m), 3.79(1H, d), 3.83(1H, d), 4.02-4.07(2H, m), 4.64(1H, br), 5.31-5.34(1H, m), 6.54(1H, d), 6.75(1H, s), 6.93-7.00(2H, m), 7.12(1H, t), 7.21(1H, dd), 7.34(2H, d).
化合物3 491mgをDCM 3mLに溶解し、氷冷下、4M HCl/AcOEt 5mLを加えて徐々に室温としながら140分攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、ジエチルエーテルとヘキサンを加えて沈殿とし、減圧下溶媒留去した結果、目的とする導入前駆体4を393mg得た(収率91%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.11(3H, t), 2.57(2H, dt), 3.06(1H, dd), 3.14(1H, d), 3.88(1H, d), 3.93-4.00(2H, m), 4.02(1H, d), 4.51(1H, br), 6.47(1H, d), 6.58(1H, s), 6.90(1H, t), 6.96(1H, t), 7.06(1H, t), 7.30-7.32(3H, m).
コンドロイチン硫酸(重量平均分子量約20kDa) 200mgをWFI 3.2mL及びEtOH 3.2mLに溶解し、導入前駆体 4 38mg(0.20eq,81.2μmol)の50% EtOH/WFI溶液 0.8mL、DMT−MM 45mg(0.20eq, 79.7μmol) の50% EtOH/WFI溶液 0.8mLを加えて終夜攪拌した。その後、NaCl 20mgのWFI溶液 100μLを加え、90% EtOH/WFI 12mL及びEtOH 15mLを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を90% EtOH/WFI、EtOHにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物5が209mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、20%であった。
上記18−3.記載の導入前駆体をヒアルロン酸に導入した。
ヒアルロン酸 66mgをWFI 6.55mL及びEtOH 6.55mLに溶解し、導入前駆体 7.1mg(0.10eq,16.3μmol)の50%EtOH/WFI溶液 0.3mL、DMT−MM 7.7mg(0.10eq,16.4μmol)の50% EtOH/WFI溶液 0.33mLを加えて終夜攪拌した。その後5%重曹水 0.98mLを加え、4時間後に酢酸にて中和し、NaCl 0.33gを溶解させ、EtOHを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を90%EtOH/WFI、EtOHにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物5が63mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、11%であった。
上記19−3.記載の導入前駆体をヒアルロン酸に導入した。
ヒアルロン酸(重量平均分子量約900kDa) 100mgをWFI 10mL及びEtOH 10mLに溶解し、導入前駆体 10.1mg(0.10eq,25.0μmol)の50% EtOH/WFI溶液 0.5mL、DMT−MM 11.7mg(0.10eq,25.0μmol) の50% EtOH/WFI溶液 0.5mLを加えて終夜攪拌した。その後5%重曹水 1.5mLを加え、4時間後に酢酸にて中和し、NaCl 0.5gを溶解させ、EtOHを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を90% EtOH/WFI、EtOHにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物5が97mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、12%であった。
上記20−3.記載の導入前駆体をヒアルロン酸に導入した。
ヒアルロン酸(重量平均分子量約900kDa) 100mgをWFI 10mL及びEtOH 10mLに溶解し、導入前駆体 11.4mg(0.10eq,24.9μmol)の50% EtOH/WFI溶液 0.5mL、DMT−MM 11.7mg(0.10eq,25.0μmol) の50% EtOH/WFI溶液 0.5mLを加えて終夜攪拌した。その後5%重曹水 1.5mLを加え、4時間後に酢酸にて中和し、NaCl 0.5gを溶解させ、EtOHを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を90% EtOH/WFI、EtOHにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物5が98mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、11%であった。
上記21−3.記載の導入前駆体をヒアルロン酸に導入した。
ヒアルロン酸(重量平均分子量約900kDa) 200mgをWFI 20mL及びEtOH 20mLに溶解し、導入前駆体 23.3mg(0.10eq,50.5μmol)の50% EtOH/WFI溶液 1mL、DMT−MM 24.9mg(0.11eq,53.1μmol) の50% EtOH/WFI溶液 1mLを加えて終夜攪拌した。その後5%重曹水 3mLを加え、4時間後に酢酸にて中和し、NaCl 1gを溶解させ、EtOHを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を90% EtOH/WFI、EtOHにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物5が187mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、11%であった。
上記15−3.記載の導入前駆体をヒアルロン酸に導入した。
ヒアルロン酸(重量平均分子量約900kDa) 200mgをWFI 20mL及びEtOH 20mLに溶解し、導入前駆体 38.0mg(0.20eq,97.5μmol)の50% EtOH/WFI溶液 1.5mL、DMT−MM 45.4mg(0.19eq,96.7μmol)の50% EtOH/WFI溶液 1.5mLを加えて終夜攪拌した。その後5%重曹水 3mLを加え、4時間後に酢酸にて中和し、NaCl 1gを溶解させ、EtOHを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を90% EtOH/WFI、EtOHにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物5が200mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、19%であった。
上記16−3.記載の導入前駆体をヒアルロン酸に導入した。
ヒアルロン酸(重量平均分子量約900kDa) 200mgをWFI 20mL及びEtOH 20mLに溶解し、導入前駆体 43.4mg(0.19eq,96.9μmol)の50% EtOH/WFI溶液 1.5mL、DMT−MM 45.9mg(0.20eq,97.8μmol) の50% EtOH/WFI溶液 1.5mLを加えて終夜攪拌した。その後5%重曹水 3mLを加え、4時間後に酢酸にて中和し、NaCl 1gを溶解させ、EtOHを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を90% EtOH/WFI、EtOHにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物5が215mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、20%であった。
上記17−3.記載の導入前駆体をヒアルロン酸に導入した。
ヒアルロン酸(重量平均分子量約900kDa) 200mgをWFI 20mL及びEtOH 20mLに溶解し、導入前駆体 44.7mg(0.19eq,96.8μmol)の50% EtOH/WFI溶液 1.5mL、DMT−MM 45.9mg(0.20eq,97.8μmol) の50% EtOH/WFI溶液 1.5mLを加えて終夜攪拌した。その後5%重曹水 3mLを加え、4時間後に酢酸にて中和し、NaCl 1gを溶解させ、EtOHを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を90% EtOH/WFI、EtOHにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物5が227mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、21%であった。
29−1. 21−Boc−アラニル−ベタメタゾンの調製
Boc−アラニン 0.964gを、ジクロロメタン 10mL及びジメチルホルムアミド15mLに溶解し、ベタメタゾン 2gを加えた。0℃に冷却した後、N,N−ジメチルアミノピリジン 186.8mg及び水溶性カルボジイミド(WSC) 1.27gを加え、室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止した。トルエン及び水を用いて分液抽出し、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧下留去し、目的とする化合物29−1を得た(2.72g,98%)
化合物29−1 2.72gを、テトラフドロフラン15mLに溶解し、0℃に冷却した後、4M塩酸/酢酸エチル 100mLを加えて、室温で3時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、溶媒を減圧下留去し、目的とする導入前駆体である化合物29−2を得た(1.98g,86%)。
コンドロイチン硫酸ナトリウム(重量平均分子量約20kDa) 1gに、蒸留水 15mLを加え30分撹拌し溶解した。エタノール15mLを徐々に加え、溶液を均一に撹拌した後に、化合物29−2 185.0mgをエタノール/蒸留水=1/1溶液 5mLに溶解し加えた。ついで、4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロリドn水和物(DMT−MM) 110.7mgをエタノール/蒸留水=1/1溶液 5mLに溶解し加え、終夜撹拌した。塩化ナトリウム 1gを加えた後、反応溶液を、90%エタノール/蒸留水 200mL中に加えて、沈殿を形成し静置した。上清を除いた後に、90%エタノール/蒸留水 150mLを加え5分間撹拌洗浄し、再度静置した。同様の洗浄をさらに2回実施した後、ガラスフィルターでろ過し、得られた沈殿を加温減圧下(40℃,75mmHg)終夜乾燥することでGAG誘導体として、目的とするコンジュゲートである化合物29−3(0.90g)を得た。1H−NMRを測定したところ、導入率は18%であった。
30−1. 21−Boc−グリシル−ベタメタゾンの調製
Boc−グリシン 1.34gを、ジクロロメタン 20mL及びジメチルホルムアミド 20mLに溶解し、ベタメタゾン 3gを加えた。0℃に冷却した後、N,N−ジメチルアミノピリジン 280.2mg及び水溶性カルボジイミド 1.91gを加え、室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止した。トルエン及び水を用いて分液抽出し、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧下留去し、目的とする化合物30−1を得た(3.35g,82%)。
化合物30−1 3.35gを、テトラフドロフラン 20mLに溶解し、0℃に冷却した後、4M 塩酸/酢酸エチル 100mLを加えて、室温で1時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、溶媒を減圧下留去し、目的とする導入前駆体である化合物30−2を得た(2.69g,95%)。
コンドロイチン硫酸ナトリウム(重量平均分子量約20kDa) 1gに、蒸留水 15mLを加え30分撹拌し溶解した。エタノール 15mLを徐々に加え、溶液を均一に撹拌した後に、化合物30−2 224.3mgをエタノール/蒸留水=1/1溶液 5mLに溶解し加えた。ついで、4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロリドn水和物 110.7mgをエタノール/蒸留水=1/1溶液 5mLに溶解し加え、終夜撹拌した。塩化ナトリウム 1gを加えた後、反応溶液を、90%エタノール/蒸留水 200mL中に加えて、沈殿を形成し静置した。上清を除いた後に、90%エタノール/蒸留水 150mLを加え5分間撹拌洗浄し、再度静置した。同様の洗浄をさらに2回実施した後、ガラスフィルターでろ過し、得られた沈殿を加温減圧下(40℃,75mmHg)終夜乾燥することでGAG誘導体として、目的とするコンジュゲートである化合物30−3(0.61g)を得た。1H−NMRを測定したところ、導入率は20%であった。
31−1. 21−(Boc−イソロイシル)−ベタメタゾンの調製
Boc−イソロイシン 1.77gを、ジクロロメタン 20mL及びジメチルホルムアミド 20mL に溶解し、ベタメタゾン 3gを加えた。0℃に冷却した後、N,N−ジメチルアミノピリジン 280.2mg及び水溶性カルボジイミド 1.91gを加え、室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止した。トルエン及び水を用いて分液抽出し、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧下留去し、目的とする化合物31−1を得た(3.96g,87%)。
化合物17 3.96gを、テトラフドロフラン 20mLに溶解し、0℃に冷却した後、4M 塩酸/酢酸エチル 100mLを加えて、室温で1時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、溶媒を減圧下留去し、目的とする導入前駆体である化合物31−2を得た(3.36g,99%)。
コンドロイチン硫酸ナトリウム(重量平均分子量約20kDa) 1gに、蒸留水 15mLを加え30分撹拌し溶解した。エタノール 15mLを徐々に加え、溶液を均一に撹拌した後に、化合物31−2 201.9mgをエタノール/蒸留水=1/1溶液 5mLに溶解し加えた。ついで、4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロリドn水和物 110.7mgをエタノール/蒸留水=1/1溶液 5mLに溶解し加え、終夜撹拌した。塩化ナトリウム 1gを加えた後、反応溶液を、90%エタノール/蒸留水 200mL中に加えて、沈殿を形成し静置した。上清を除いた後に、90%エタノール/蒸留水 150mLを加え5分間撹拌洗浄し、再度静置した。同様の洗浄をさらに2回実施した後、ガラスフィルターでろ過し、得られた沈殿を加温減圧下(40℃,75mmHg)終夜乾燥することで多糖誘導体として、目的とするコンジュゲートである化合物31−3(0.76g)を得た。この1H−NMRを測定したところ、導入率は15%であった。
32―1. Boc-アミノエチルブロマイドの調製
3−ブロモエチルアミン臭化水素酸塩 2.155g(10.5mmol)をジクロロメタン 20mlに溶解し、氷冷下でトリエチルアミン 1.463ml(10.5mmol)を加え、さらにBoc2O 2.299g(10.5mmol)のジクロロメタン溶液5mlを加え撹拌した。室温で90分間撹拌した後、酢酸エチルを加え、5%クエン酸水溶液、水、飽和食塩水で順次分液洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒を減圧留去した。標記化合物 2.287g(97%)を得た。
(1)Boc−アミノエタノール-ジクロフェナク
32―1.で得られたBoc−アミノエチルブロマイド 2.287g(10.2mmol)のDMF溶液5mlを氷冷し、ジクロフェナクナトリウム 3.255g(10.2mmol)のDMF溶液6mlを加え、室温で一晩撹拌した。60℃で11時間撹拌し、室温で一晩撹拌した。酢酸エチルを加え、5%炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で順次分液洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水後、酢酸エチルを減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン:酢酸エチル=20:1、0.5%トリエチルアミン)で精製し、標記化合物を2.675g(60%)得た。
(1)で得られたBoc−アミノエタノール−ジクロフェナク2.108g(4.80mmol)をジクロロメタン5mlに溶解し、氷冷下で4M塩酸/酢酸エチル20mlを加えて2.5時間撹拌した。ジエチルエーテル、ヘキサンを加えて沈殿させ、沈殿を減圧乾燥した。標記化合物を1.775g(98%)得た。
コンドロイチン硫酸(重量平均分子量約20kDa) 1000mgをWFI 100ml及びEtOH 100mlに溶解し、ジクロフェナク−2−アミノエタノール塩酸塩を186mg(0.25eq,0.50mmol)、及びDMT−MMを232mg(0.25eq,0.50mmol)加えて終夜攪拌した。その後、NaHCO3 750mgを加えて攪拌しpH9になったことを確認後、攪拌を停止して3時間静置した。次いで酢酸400μl、NaCl 3gを順次加えて30分攪拌し、90%EtOH/WFIを200ml加えて沈殿形成した。最後に懸濁液の上清を捨てて90%EtOH/WFI洗浄を2回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、ジクロフェナク−(2−アミノエタノール)−コンドロイチン硫酸(DF−CS)が1.08g得られた。NMRで導入率を求めた結果、25%であった。
ヒアルロン酸(重量平均分子量約900kDa) 1000mgにWFI 100mlを加え、3時間攪拌して溶解した。その後EtOH 100mlを追加し、さらに30分攪拌した。続いてジクロフェナク−(2−アミノエタノール塩酸塩 178mg(0.19eq,0.47mmol)の50%EtOH溶液5ml及びDMT−MM 222mg(0.19eq,0.47mmol)の50%EtOH溶液5ml加えて終夜攪拌した。その後、NaHCO3 750mg水溶液15mlを加えて攪拌しpH9になったことを確認後、攪拌を停止して3時間静置した。次いで次いで酢酸400μl、NaCl 3gを順次加えて30分攪拌し、90%EtOH/WFIを465ml加えて沈殿形成した。最後に懸濁液の上清を捨てて90%EtOH/WFI洗浄を2回、95%EtOH/WFI洗浄及びEtOH洗浄を各1回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、ジクロフェナク−(2−アミノエタノール)−ヒアルロン酸(DF−HA)が1.04g得られた。カルバゾール硫酸法で導入率を求めた結果、17%であった。
CS−フェンブフェンの合成を下記スキームに示す。化合物32とフェンブフェンとを縮合し、化合物33とした後に保護基を除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体34へと変換し、CSへの導入を行ってコンジュゲート35とした。
化合物32 653mg(1.0eq,4.01mmol)をDCM 8mLに溶解し、フェンブフェン 1.02g(1.0eq,4.01mmol)及びDMAP 98mg(0.2eq,0.80mmol)を加えた。その後、氷冷下、WSC 846mg(1.1eq,4.41mmol)を加えて室温にて終夜攪拌した。TLCにて新たなスポットを確認後、氷冷下飽和NH4Cl水溶液で反応溶液をクエンチし、DCM及び水を用いて分液抽出を3回行った。集めた有機層は5%クエン酸水溶液、飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物33を得た。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45(9H, s), 2.80(2H, t), 3.37(2H, t), 3.41(2H, m), 4.19(2H, m), 4.99(1H, br), 7.38-8.09(9H, m).
化合物33 1.5gをDCM 10mLに溶解し、氷冷下、4M HCl/AcOEt 40mLを加えて2.5時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、エバポレーターで40℃水浴中減圧濃縮し、残留物をヘキサンで洗浄した結果、目的とする導入前駆体34を1.27g得た(2工程収率95%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ2.84(2H, t), 3.28(2H, t), 3.47(2H, m), 4.37(2H, m), 7.38-8.09(9H, m).
CS(重量平均分子量約40kDa) 1gをWFI 100mL及びEtOH 100mLに溶解し、導入前駆体34を200mg(0.3eq,0.596mmol)及びDMT−MMを280mg(0.3eq,0.596mmol)加えて終夜攪拌した。その後NaHCO3溶液(750mg/15mL)を加えて1時間攪拌し、酢酸 400μL、NaCl 3g、90%EtOH/WFI 200mLを順次加えて沈殿形成した。続いて懸濁液の上清を捨てて90%EtOH/WFI洗浄及びEtOH洗浄を2回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物としてコンジュゲート35が1.07g得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、17%であった。
CS−フェルビナクの合成を下記スキームに示す。化合物32とフェルビナクとを縮合し、化合物36とした後に保護基を除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体37へと変換し、CSへの導入を行ってコンジュゲート38とした。
化合物32 1g(1.0eq,6.13mmol)をDCM 15mL及びDMF 10mLに溶解し、フェルビナク 1.3g(1.0eq,6.13mmol)及びDMAP 225mg(0.3eq,1.84mmol)を加えた。その後、氷冷下、WSC 1.29g(1.1eq,6.75mmol)を加えて室温にて終夜攪拌した。TLCにて新たなスポットを確認後、氷冷下飽和NH4Cl水溶液で反応溶液をクエンチし、DCM及び水を用いて分液抽出を3回行った。集めた有機層は1M塩酸、飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物36を2.2g得た(収率98%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45(9H, s), 3.39(2H, t), 3.69(2H, s), 4.18(2H, t), 4.70(1H, br), 7.33-7.59(9H, m).
化合物36 2gをDCM 7mLに溶解し、氷冷下、4M HCl/AcOEt 17mLを加えて3時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、エバポレーターで40℃水浴中減圧濃縮し、残留物をヘキサンで洗浄した結果、目的とする導入前駆体37を1.45g得た(収率88%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ3.28(2H, t), 3.81(2H, s), 4.38(2H, t), 7.33-7.64(9H, m)
CS(重量平均分子量約40kDa) 1gをWFI 100mL及びEtOH 100mLに溶解し、導入前駆体37を174mg(0.3eq,0.596mmol)及びDMT−MMを280mg(0.3eq,0.596mmol)加えて終夜攪拌した。その後NaHCO3溶液(750mg/15mL)を加えて1時間攪拌し、酢酸 400μL、NaCl 3g、90%EtOH/WFI 200mLを順次加えて沈殿形成した。続いて懸濁液の上清を捨てて90%EtOH/WFI洗浄及びEtOH洗浄を2回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物としてコンジュゲート38が1.08g得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、15%であった。
ベザフィブラート(アミノエタノール)−コンドロイチン硫酸(スペーサーにアミノエタノールを用いたベザフィブラート−コンドロイチン硫酸コンジュゲート)の調製を下記スキームに示す。Bocアミノエタノールとベザフィブラートを縮合し、続いてBoc基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体4へと変換し、コンドロイチン硫酸への導入を行ってコンジュゲート5を合成した。
化合物2 174mg(1.0eq,0.93mmol)とベザフィブラート 336mg(1.0eq,0.93mmol)をDCM 1.5mLとDMF 1.5mLに溶解し、DMAP 11mg(0.1eq,0.09mmol)とWSC 275mg(1.5eq,1.43mmol)をDCM 1.5mLに溶解した液を加えて室温下終夜攪拌した。さらにベザフィブラート 335mg(1.0eq,0.93mmol)とWSC 285mg(1.5eq,1.49mmol)をDCM 1.0mLに溶解した液を加えて室温下終夜攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、5%クエン酸水溶液、5%重曹水を用いて分液抽出し、有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し(ヘキサン:酢酸エチル=1:1)、化合物3 477mgを得た(収率88%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.40(9H, s), 1.62(6H,s), 2.87(2H,t), 3.27(2H,br), 3.66(2H,br), 4.20(2H,br), 4.41(1H,br), 6.13(1H,br), 6.80(2H,br), 7.09(2H,br), 7.37(2H,br), 7.62(2H,br),
35−2. 化合物3の脱Boc化反応
化合物3 477mgをDCM 1mLに溶解し、氷冷下、4M HCl/AcOEt 4mLを加えて80分間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、ジエチルエーテルを加えて沈殿とし、ジエチルエーテルで洗浄した結果、目的とする導入前駆体4を401mg得た(収率96%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ1.58(6H,s), 2.85(2H,t), 3.20(2H,t), 3.55(2H,t), 4.34(2H,t), 6.82(2H,dd), 7.17(2H,dd), 7.46(2H,dd), 7.74(2H,dd),
35−3. 導入前駆体4のコンドロイチン硫酸への導入
コンドロイチン硫酸(重量平均分子量約20kDa) 200mgをWFI 3.2mLに溶解し、導入前駆体4 35mg(0.20eq,79.8μmol)とDMT−MM 39mg(0.20eq,82.1μmol) をEtOH 4.0mLとWFI 0.8mLに溶解した液を加えて18時間撹拌した。その後、20% NaCl溶液 100μLを加え、90%EtOH/WFI 12mL及びEtOH 15mLを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を90%EtOH/WFI、EtOHにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物5(化合物35−1)が208mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、22%であった。
35−4. ベザフィブラート(アミノエタノール)−ヒアルロン酸の調製
実施例35に記載の導入前駆体4をヒアルロン酸に導入した。
ヒアルロン酸(重量平均分子量約900kDa) 200mgをWFI 20mL及びEtOH 20mLに溶解し、導入前駆体 22.1mg(0.10eq,50.1μmol)の50%EtOH/WFI溶液 1mL、DMT−MM 24.8mg(0.10eq,52.9μmol)の50% EtOH/WFI溶液 1mLを加えて終夜攪拌した。その後5%重曹水 3mLを加え、4時間後に酢酸にて中和し、NaCl 1gを溶解させ、EtOHを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を90%EtOH/WFI、EtOHにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物5(化合物35−2)が190mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、13%であった。
ベザフィブラート(2−アミノ−1−シクロヘキシルエタン−1−オール)−コンドロイチン硫酸(スペーサーに2−アミノ−1−シクロヘキシルエタン−1−オールを用いたベザフィブラート−コンドロイチン硫酸コンジュゲート)の調製を下記スキームに示す。2−アミノ−1−シクロヘキシルエタン−1−オールのBoc化体とベザフィブラートを縮合し、続いてBoc基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体4へと変換し、コンドロイチン硫酸への導入を行ってコンジュゲート5を合成した。
化合物2 201mg(1.0eq,0.83mmol)とベザフィブラート 300mg(1.0eq,0.83mmol)をDCM 1.5mLとDMF 1.5mLに溶解し、DMAP 10mg(0.1eq,0.08mmol)とWSC 244mg(1.5eq,1.27mmol)をDCM 1.5mLに溶解した液を加えて室温下終夜攪拌した。さらにベザフィブラート 301mg(1.0eq,0.83mmol)とWSC 245mg(1.5eq,1.28mmol)をDCM 1.0mLに溶解した液を加えて室温下終夜攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、5%クエン酸水溶液、5%重曹水を用いて分液抽出し、有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで40℃水浴中、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し(トルエン:酢酸エチル=3:1)、化合物3 375mgを得た(収率77%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ0.94-1.17(5H, m), 1.41(9H, br), 2.86(2H,br), 3.13-3.19(3H,m), 3.63-3.68(2H,m), 4.32(1H,s), 4.79(1H,m), 6.15(1H,s), 6.78-6.83(2H,m), 7.09(2H,d), 7.37(2H,d), 7.62-7.77(2H,m)
36−2. 化合物3の脱Boc化反応
化合物3 375mgをDCM 1mLに溶解し、氷冷下、4M HCl/AcOEt 4mLを加えて80分間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認後、ジエチルエーテルを加えて沈殿とし、ジエチルエーテルで洗浄した結果、目的とする導入前駆体4を309mg得た(収率92%)。
1H−NMRの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ0.97-1.03(6H,m), 1.61-1.71(6H,m), 2.85(2H,t), 3.10(2H,m), 3.48-3.58(3H,m), 4.83-4.91(1H,m), 6.84(2H,d), 7.17(2H,d), 7.46(2H,dd), 7.75(2H,dd)
36−3. 導入前駆体4のコンドロイチン硫酸への導入
コンドロイチン硫酸(重量平均分子量約20kDa) 200mgをWFI 3.2mLに溶解し、導入前駆体4 42mg(0.20eq,79.7μmol)とDMT−MM 38mg(0.20eq,81.0μmol) をEtOH 4.0mLとWFI 0.8mLに溶解した液を加えて18時間撹拌した。その後、20% NaCl溶液 100μLを加え、90%EtOH/WFI 12mL及びEtOH 15mLを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を90%EtOH/WFI、EtOHにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物5(化合物36−1)が215mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、20%であった。
実施例36に記載の導入前駆体4をヒアルロン酸に導入した。
ヒアルロン酸(重量平均分子量約900kDa) 200mgをWFI 20mL及びEtOH 20mLに溶解し、導入前駆体 26.3mg(0.10eq,50.2μmol)の50%EtOH/WFI溶液 1mL、DMT−MM 23.7mg(0.10eq,50.5μmol)の50% EtOH/WFI溶液 1mLを加えて終夜攪拌した。その後5%重曹水 3mLを加え、4時間後に酢酸にて中和し、NaCl 1gを溶解させ、EtOHを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を90%EtOH/WFI、EtOHにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物5(化合物36−2)が192mg得られた。1H−NMRにて導入率を求めた結果、13%であった。
実施例1〜実施例4にて合成したベタメタゾン−コンドロイチン硫酸(コンジュゲート)について、以下の条件でin vitroリリース試験(薬物遊離試験)を行った。
(1) リン酸2水素ナトリウム2水和物(NaH2PO4・2H2O)及びリン酸水素2ナトリウム12水和物(Na2HPO4・12H2O)を用いてpH5.3、6.3、7.0、7.5、8.1、9.2の溶液を調製した。
(2) (1)で調製した各溶液に0.05%になるようにコンジュゲートを溶解した。
(3) 36℃にて保存、1日毎にサンプリングを行い、HPLC(SEC:サイズ排除クロマトグラフィー)にてコンジュゲートとベタメタゾン単体のピーク面積比率を確認した。
リン酸2水素ナトリウム2水和物(NaH2PO4・2H2O) 780mg(5.0mmol)及びリン酸水素2ナトリウム12水和物(Na2HPO4・12H2O) 1.79g(5.0mmol)をそれぞれWFI 500mLに溶解し、NaH2PO4溶液、Na2HPO4溶液とした。この2つの溶液を以下の比率で混合し、リリース試験溶液A〜Fとした。
ベタメタゾン−コンドロイチン硫酸 5mgをリリース試験溶液A〜F10mLそれぞれに溶解し、36℃のHPLCオートサンプラー内で保存し、一日ごとにサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)測定を実施した。溶解後、0日目(初期値)から6日目まで測定した。
HPLC条件は以下の通り。
分析時間:40分
流速:0.5mL/min
グラジエント:isoclatic
溶媒:アセトニトリル(HPLC用):生理食塩液=1:2
検出:フォトダイオードアレイ(PDA)を用い、ベタメタゾンの極大吸収波長(240nm)におけるベタメタゾン−コンドロイチン硫酸及び遊離ベタメタゾンの比率を面積%で測定した。
温度:36℃
ベタメタゾン(F)−コンドロイチン硫酸 5mgをリリース試験溶液A〜F10mLそれぞれに溶解し、36℃のHPLCオートサンプラー内で保存し、一日ごとにSEC測定を実施した。溶解後、0日目(初期値)から6日目まで測定した。HPLC条件はA1−2と同じである。
ベタメタゾン(Cl)−コンドロイチン硫酸 5mgをリリース試験溶液A〜F10mLそれぞれに溶解し、36℃のHPLCオートサンプラー内で保存し、一日ごとにSEC測定を実施した。溶解後、0日目(初期値)から6日目まで測定した。HPLC条件はA1−2と同じである。
ベタメタゾン(Br)−コンドロイチン硫酸 2mgをリリース試験溶液A〜F4mLそれぞれに溶解し、36℃のHPLCオートサンプラー内で保存し、一日ごとにSEC測定を実施した。溶解後、0日目(初期値)から6日目まで測定した。HPLC条件はA1−2と同じである。
C液(pH7.0)、D液(pH7.5)における各コンジュゲートのリリース速度の比較を以下に示す。
実施例5〜7で合成した各コンジュゲート31、36、45並びに実施例33で合成したCS−フェンブフェン(CSとフェンブフェンを無置換のアミノエタノールで連結したコンジュゲート)及び実施例34で合成したCS−フェルビナク(CSとフェルビナクを無置換のアミノエタノールで連結したコンジュゲート)について、以下の条件でin vitroリリース試験を行った。
(1) NaH2PO4・2H2O及びNa2HPO4・12H2Oを用いてpH5.3、6.3、7.0、7.5、8.1、9.2の溶液をそれぞれ調製した。
(2) (1)で調製した各溶液に0.05%になるようにコンジュゲートを溶解した。
(3) 36℃にて保存、1日毎にサンプリングを行い、HPLC(SEC:サイズ排除クロマトグラフィー)にてコンジュゲートとフェンブフェン及びフェルビナク単体のピーク面積比率を確認した。
NaH2PO4・2H2O 780mg(5.0mmol)及びNa2HPO4・12H2O 1.79g(5.0mmol)をそれぞれWFI 500mLに溶解し、NaH2PO4溶液、Na2HPO4溶液とした。この2つの溶液を以下の比率で混合し、リリース試験溶液A〜Fとした。
CS−フェンブフェン、CS−フェルビナク 各5mg程度をリリース試験溶液A〜Fそれぞれに濃度が0.05%になるように溶解し、36℃ HPLCオートサンプラー内で保存して一日ごとにSEC測定を実施した。溶解後、0日目(初期値)から6日目又は7日目までについて、フェンブフェン及びフェルビナクの遊離率(%)をそれぞれ測定した。フェンブフェンの遊離率を表11に、フェルビナクの遊離率を表12にそれぞれ示した。
HPLC条件は以下の通り。
分析時間:40分
流速:0.5mL/min
グラジェント:isoclatic
溶媒:アセトニトリル(HPLC用):生理食塩液=1:2
検出:PDAを用い、各極大吸収波長(フェンブフェン:285nm、フェルビナク:253nm)におけるCS−コンジュゲート及び遊離薬物の比率を面積%で測定した。
温度:36℃
CS(Cl)−フェンブフェン 3mg程度をリリース試験溶液A〜Fそれぞれに濃度が0.05%になるように溶解し、36℃のHPLCオートサンプラー内で保存して一日ごとにSEC測定を実施した。溶解後、0日目(初期値)から6日目までフェンブフェンの遊離率(%)を測定した。HPLC条件はA2−2と同じである。結果を下表に示した。
CS(F)−フェンブフェン 10mg程度をリリース試験溶液A〜Fそれぞれに濃度が0.05%になるように溶解し、36℃のHPLCオートサンプラー内で保存して一日ごとにSEC測定を実施した。溶解後、0日目(初期値)から6日目までフェンブフェンの遊離率(%)を測定した。HPLC条件はA2−2と同じである。結果を下表に示した。
CS(F,F)−フェルビナク 10mg程度をリリース試験溶液A〜Fそれぞれに濃度が0.05%になるように溶解し、36℃のHPLCオートサンプラー内で保存して一日ごとにSEC測定を実施した。溶解後、0日目(初期値)から7日目までフェルビナクの遊離率(%)を測定した。HPLC条件はA2−2と同じである。結果を下表に示した。
上記で得られた結果について、CS−フェンブフェン、CS(Cl)−フェンブフェン及びCS(F)−フェンブフェンのpH6.9及びpH7.5におけるフェンブフェンの遊離率の比較を下表に示した。
上記で得られた結果について、CS−フェルビナク及びCS(F,F)−フェルビナクのpH6.9及びpH7.5におけるフェルビナクの遊離率の比較を下表に示した。
A3−1.リリース試験溶液の調製
NaH2PO4・2H2O 780mg(5.0mmol)及びNa2HPO4・12H2O 1.79g(5.0mmol)をそれぞれWFI 500mLに溶解し、NaH2PO4溶液、Na2HPO4溶液とした。この2つの溶液を以下の比率で混合し、リリース試験溶液A〜Fとした。
各コンジュゲートそれぞれ5mg程度をリリース試験溶液A〜Fそれぞれに濃度が0.05%になるように溶解し、36℃のHPLCオートサンプラー内で保存して一日ごとにSEC測定を実施した。溶解後、0日目(初期値)から7日目まで測定した。結果を下表に示した。表中の「−」は未測定であることを示す
なお、HPLC条件は以下の通りであった。
分析時間:40分
流速:0.5mL/min
グラジェント:isoclatic
溶媒:アセトニトリル(HPLC用):生理食塩液=1:2
検出:PDAを用い、各極大吸収波長におけるCS−コンジュゲートに含まれる薬物及び遊離薬物の比率を面積%で測定した。
温度:36℃
上記で得られた結果について、CS(H)−ケトプロフェン、CS(F)−ケトプロフェン及びCS(F,F)−ケトプロフェンのpH6.9及びpH7.5におけるフェルビナクの遊離率の比較を下表に示した。
上記で合成したジクロフェナク(1−アミノ−2−プロパノール)−コンドロイチン硫酸(A4−1)、ジクロフェナク(セリンエチルエステル)−コンドロイチン硫酸(A4−2)、ジクロフェナク(トレオニンエチルエステル)−コンドロイチン硫酸(A4−3)の各コンジュゲートについて、以下の条件でリリース試験を行った。
HPLC条件は以下のとおり。
カラム:TSGgel ODS−100Z(4.6×150),
流速:1mL/min
温度:35℃
グラジエント:アセトニトリル/20mMリン酸ナトリウム=0.40(0min)―0.68(21min)
上記で合成したジクロフェナク(1-アミノ-3,3-ジメチルブタン-2-オール)-コンドロイチン硫酸(A5−1)、ジクロフェナク(1-アミノ-2-ブタノール)-コンドロイチン硫酸(A5−2)、ジクロフェナク(2-アミノ-1-シクロヘキシルエタン-1-オール)-コンドロイチン硫酸(A5−3)、ジクロフェナク(4-アミノ-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステル)-コンドロイチン硫酸(A5−4)について、上記試験例A4と同様の条件でリリース試験を行った。結果を下表に示した。
上記で合成したジクロフェナク(1−アミノ−3,3−ジメチルブタン−2−オール)−ヒアルロン酸(A6−1)、ジクロフェナク(1−アミノ−2−ブタノール)−ヒアルロン酸(A6−2)、ジクロフェナク(2−アミノ−1−シクロヘキシルエタン−1−オール)−ヒアルロン酸(A6−3)、ジクロフェナク(4−アミノ−3−ヒドロキシ酪酸エチルエステル)−ヒアルロン酸(A6−4)について、上記試験例A4と同様の条件でリリース試験を行った。結果を下表に示した。
上記で合成したジクロフェナク(1−アミノ−2−プロパノール)−ヒアルロン酸、ジクロフェナク(セリンエチルエステル)−ヒアルロン酸、ジクロフェナク(トレオニンエチルエステル)−ヒアルロン酸について、以下の条件でリリース試験を行った。
HPLC条件は以下のとおり。
カラム:TSGgel ODS−100Z(4.6mm×150mm)
流速:1mL/min
温度:35℃
グラジエント:アセトニトリル/20mMリン酸ナトリウム=0.40(0min)〜0.68(21min)
(スペーサーの違いによる遊離特性の変化)
化合物29−3、30−3及び31−3を5mg/10mL(0.05w/w%)となるよう各pHの緩衝液に溶解したのち、36℃恒温槽中で1週間加温し、その間の薬物遊離率(%)を試験例A1と同様に評価した。評価結果を以下に示す。
上記で合成したジクロフェナク(1−アミノ−2−プロパノール)−ヒアルロン酸、ジクロフェナク−(2−アミノエタノール)−ヒアルロン酸について、以下の条件でリリース試験を行った。
クエン酸ナトリウム緩衝液pH5.1に各コンジュゲートを1%濃度で溶解し分注した。溶解直後に、初期状態(保存0日)として溶液に存在した遊離ジクロフェナク成分量をODS−HPLCにて定量分析した。他の分注液を溶解直後から60℃、40℃及び25℃の保存条件に付し、各時間経過後にジクロフェナクエステルの分解量を同様に定量分析した。こうして得られた各時点での遊離ジクロフェナク成分量と、上記の強制分解による遊離ジクロフェナク成分量の比から、遊離率(%)を算出した。なお、HPLC試料の前処理にはOASIS HLBを用い、アセトニトリル溶出画分を分析した。
HPLC条件は以下のとおり。
カラム:TSGgel ODS−100Z(4.6mm×150mm)
流速:1mL/min
温度:35℃
グラジエント:アセトニトリル/20mMリン酸ナトリウム=0.40(0min)〜0.68(21min)
実施例35及び36で合成したベザフィブラート(2−アミノエタノール)−コンドロイチン硫酸及びベザフィブラート(2−アミノ−1−シクロヘキシルエタン−1−オール)−コンドロイチン硫酸について、以下の条件でリリース試験を行った。
20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0に各コンジュゲートを0.1%濃度で溶解し分注した。溶解直後に初期状態(保存0日)として溶液に存在した遊離ベザフィブラート成分量、及び塩基性にて強制分解したベザフィブラートエステル量についてODS−HPLCにて定量分析した。ほかの分注液を溶解直後から36℃の保存条件に付し、1、4、8、16及び24日後にベザフィブラートエステルの分解量を同様に定量分析した。こうして得られた各時点での遊離ベザフィブラート成分量と、上記の強制分解による遊離ベザフィブラート成分量の比の値から、遊離率(%)を算出した。なお、HPLC試料の前処理にはOASIS HLBを用い、アセトニトリル溶出画分を分析した。
HPLC条件は以下のとおり。
カラム:TSGgel ODS−100Z(4.6mm×150mm)
流速:1mL/min
温度:35℃
グラジエント:アセトニトリル/20mMリン酸ナトリウム=0.46
1)試験系
試験系には、BN/CrlCrljラット (日本チャールス・リバー株式会社、5週齢)を用いた。
2)試験物質
試験物質には、各種ハロゲン導入ベタメタゾン結合コンドロイチン硫酸(F導入:ベタメタゾン(F)−CS、Beta−F−CS;Cl導入:ベタメタゾン(Cl)−CS、Beta−Cl−CS)及びハロゲン非導入ベタメタゾン結合コンドロイチン硫酸(ベタメタゾン(H)−CS、Beta−H−CS)を用い、ベタメタゾン濃度が3mg/mLとなるよう、りん酸緩衝生理食塩液(PBS)にて調製したものを用いた。また、りん酸ベタメタゾンをPBSで3mg/mLとなるよう懸濁した比較用の試験物質を調製した。
3)試験物質の投与
各試験物質の投与は、試験系を全身麻酔下で背位固定し、気管内投与用ゾンデ(MicroSprayer(R)Aerosolizer Model IA−1B、Penn−Century製)を用いて100μLの用量で気管内投与した。全身麻酔は、小動物用麻酔器(TK−4、バイオマシナリー製)に充填したイソフルラン(フォーレン(登録商標)、大日本製薬株式会社製)の吸入麻酔(濃度3.0%、流量2.0L/min)を用いた。
4)肺組織中ベタメタゾン含量測定
試験物質投与後、4、24、48、72及び168時間にペントバルビタール麻酔下でハサミとピンセットを用いて肺組織を採取した。なお、評価時点毎3例にて実施した。得られた肺組織は、ポリプロピレン製チューブへ採取したのち、その重量を測定した。ギ酸アンモニウム水溶液(pH6.0):メタノール(3:2,v/v)を40倍量の割合(1g:40mL)で加え、ヒスコトロンホモジナイザーを用いて、氷冷下で約1分間ホモジネートした。得られた肺組織ホモジネートを測定試料とした。得られた測定試料は、測定するまで冷凍保存(−20℃設定)した。肺組織中ベタメタゾン含量は、測定試料をクロロホルム・メタノール抽出し、Liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC−MS/MS)にて測定した。
5)薬物動態パラメータ
得られた肺組織中ベタメタゾン含量より、薬物動態パラメータを算出した。各薬物動態パラメータは平均肺組織中含量推移より算出した。平均肺組織中含量は、測定値が定量下限値未満(<10ng/g)の個体があった場合、0を代入して算出した。AUC0−t算出における時間t(hr)は、定量可能な最終時点とした。なお、薬物動態パラメータの算出にはWinNonlin Professional Ver 5.2.1のNon−compartmental analysis model解析を用いた。
6)結果
結果を図1及び下表に示した。正常ラットにベタメタゾン結合コンドロイチン硫酸を気管内投与した際、最終評価時点である投与後168時間まで、投与局所において、ベタメタゾンの曝露が認められた。投与後168時間までの曝露量は、Beta−F−CSが最も高値を示した。一方、ベタメタゾン単剤は、投与後48時間までしか曝露は認められなかった(定量下限値:10ng/g)。正常ラットにベタメタゾン結合コンドロイチン硫酸気管内投与後のベタメタゾンの消失半減期は、29.5〜128.0時間であった。一方、ベタメタゾン単剤を気管内投与した際の肺組織中ベタメタゾン含量の消失半減期は、8.7時間であった。
各種ベタメタゾン結合コンドロイチン硫酸気管内投与後の全身曝露は、試験例B1における各試験物質投与ラットにおける血漿中濃度より評価した。
1)血漿中ベタメタゾン濃度測定
試験物質投与後0.5、1、2、4、8、24、48、72及び168時間に、ヘパリン処理した27Gの注射針付きのテルモシリンジを用いて頸静脈より300μL採血し、血液をPP製容器(1.5mL、アシスト製)へ採取した。その後、血液を速やかに遠心分離(1800×g、4℃、15min)した。得られた血漿100μLをPP製容器(1.5mL、アシスト製)に移し、900μLのギ酸アンモニウム水溶液(pH6.0):メタノール(1:2,v/v)を添加し、攪拌した。これを測定試料とし、測定をするまで、冷凍保存(−20℃設定)した。血漿中ベタメタゾン濃度は、測定試料をクロロホルム・メタノール抽出し、LC−MS/MSにて測定した。
2)薬物動態パラメータ
得られた血漿中ベタメタゾン濃度より、薬物動態パラメータを算出した。各薬物動態パラメータは平均血漿中含量推移より算出した。平均血漿中濃度は、測定値が定量下限値未満(<5ng/mL)の個体があった場合、0を代入して算出した。なお、薬物動態パラメータの算出にはWinNonlin Professional Ver 5.2.1のNon−compartmental analysis model解析を用いた。
3)結果
結果を図2及び下表に示した。正常ラットにベタメタゾン結合コンドロイチン硫酸を気管内投与した際の最高血漿中ベタメタゾン濃度は、ベタメタゾン単剤投与時と比較し、低値(約1/3〜1/100)を示した。
B3−1.目的
非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)を導入したコンドロイチン硫酸誘導体を評価することを目的に、当該モデルにおけるケトプロフェン結合コンドロイチン硫酸(KP−(F,F)−CS)、インドメタシン結合コンドロイチン硫酸(IM−(F,F)−CS)、フェルビナク結合コンドロイチン硫酸(FB−(F,F)−CS)及びジクロフェナク結合コンドロイチン硫酸(DF−CS)の鎮痛作用を評価した。
起炎剤には0.1mol/L硝酸銀溶液を0.22μmフィルターでろ過したものを用いた。全身麻酔には小動物用麻酔器(TK−4、株式会社バイオマシナリー)に充填したイソフルランの吸入麻酔(濃度3.0%、流量2.0 L/min)を用いた。
ラット(Crj:SD系(SPF)、雄性、5週齢)を全身麻酔下で背位固定し、左腓腹筋周辺を広くバリカンで剃毛した。注射部位周辺を70%アルコールで噴霧消毒し、インスリン皮下投与用針付注射筒(マイジェクター(登録商標)、テルモ株式会社)を用いて0.1 mol/L硝酸銀溶液を100 μL/siteの容量でラットの左腓腹筋内側に筋肉内投与し、硝酸銀誘発ラット筋肉障害疼痛モデルを作製した。
試験物質:
(1)PBS(Control)
(2)1%(w/v%)ジクロフェナク結合コンドロイチン硫酸(DF−CS)
(3)5%(w/v%)フッ素導入インドメタシン結合コンドロイチン硫酸(IM−(F,F)−CS)
(4)5%(w/v%)フッ素導入ケトプロフェン結合コンドロイチン硫酸(KP−(F,F)−CS)
(5)5%(w/v%)フッ素導入フェルビナク結合コンドロイチン硫酸(FB−(F,F)−CS)
試験物質投与後24、48及び72時間に、各個体の歩行状態をブラインド下で肉眼観察し、以下の基準に従って4段階にスコア化した。結果は図3に示す。
図3において、結果は、平均疼痛スコア±標準誤差(各群例数=8)によって示した。また、***及び*は、パラメトリックTukey検定において、それぞれ***p<0.001、*p<0.05(vs Control)を示す。
スコア0:正常
スコア1:軽度の跛行
スコア2:重度の跛行
スコア3:三足歩行
図4において、結果は、平均刺激圧スコア±標準誤差(各群例数=8)によって示した。また、***及び*は、パラメトリックTukey検定において、それぞれ***p<0.001、*p<0.05(vs Control)を示す。
図3より、1%DF−CS、5%IM−(F,F)−CS 、5%KP−(F,F)−CS はControl群と比較して有意に疼痛スコアを改善した。一方、5%FB−(F,F)−CSは、Control群と比較し有意な差は認められなかったもののControl群と比較していずれの評価時点においても低値であった。
また、図4より、1%DF−CS、5%IM−(F,F)−CS 、5%KP−(F,F)−CS 及び5%FB−(F,F)−CSは、いずれもControl群と比較して有意に筋圧痛閾値を上昇させた。それらの化合物間に明確な違いは認められなかった。
B4−1.目的
スペーサーの結合様式の異なるケトプロフェン結合コンドロイチン硫酸(KP−CS、KP−(F)−CS及びKP−(F,F)−CS)の鎮痛作用を比較し、リリース速度の差異が薬効に与える影響を検証することを目的とした。
上記試験例B3の実験手順に準じ実験を行い、下記試験物質に関する評価を行った。
試験物質:
(1)PBS(Control)
(2)5%(w/v%)ケトプロフェン結合コンドロイチン硫酸溶液(KP−CS)
(3)5%(w/v%)フッ素導入ケトプロフェン結合コンドロイチン硫酸溶液(KP−(F)−CS)
(4)5%(w/v%)フッ素導入ケトプロフェン結合コンドロイチン硫酸溶液(KP−(F,F)−CS)
図5において、結果は、平均疼痛スコア±標準誤差(各群例数=10)によって示した。また、***及び**は、パラメトリックDunnett検定において、それぞれ***p<0.001、**p<0.01(vs Control)を示す。
スコア0:正常
スコア1:軽度の跛行
スコア2:重度の跛行
スコア3:三足歩行
図6において、結果は、平均刺激圧スコア±標準誤差(各群例数=10)によって示した。また、***は、パラメトリックDunnett検定において、***p<0.001(vs Control)を示す。
図5より、KP−(F)−CS及びKP−(F,F)−CS群はControl群と比較して有意な疼痛スコアの改善作用を示した。一方、KP−CS群は、投与後1日に僅かにスコアが低値であったもののその作用は弱く、Control群との間に有意な差は見られなかった。
図6より、KP−(F)−CS及びKP−(F,F)−CS群は、いずれもControl群と比較して有意に筋圧痛閾値を上昇させた。その2群間に差は見られなかった。一方、KP−CS群とControl群との間に有意な差は見られず、それらは投与後3日間ほぼ同様に推移した。
5%KP−(F)−CS及び5%KP−(F,F)−CSはいずれも3日間の鎮痛作用を示した。一方、5%KP−CSは、疼痛スコアの改善作用及び圧疼痛閾値の上昇作用を示さなかった。別途、in vitroリリース試験において、KP−(F,F)−CS > KP−(F)−CS > KP−CSの順でKPのリリースが早くなることが確認されており、結合体からリリースされたKPが鎮痛作用を発揮していると推察された。
B5−1.目的
非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)を導入したヒアルロン酸誘導体の結合様式の違いによる薬効への影響を検証することを目的に、当該モデルにおけるジクロフェナク結合ヒアルロン酸(ジクロフェナク−アミノエタノール−ヒアルロン酸:DF−HA) 、立体障害基導入ジクロフェナク結合ヒアルロン酸(ジクロフェナク−(1−アミノ−2−プロパノール)−ヒアルロン酸:DF−(Me)−HA)の鎮痛作用を評価した。
起炎剤には0.1mol/L硝酸銀溶液を0.22μmフィルターでろ過したものを用いた。全身麻酔には小動物用麻酔器(TK−4、株式会社バイオマシナリー)に充填したイソフルランの吸入麻酔(濃度3.0%、流量2.0L/min)を用いた。
ラット(Crj:SD系(SPF)、雄性、5週齢)を全身麻酔下で背位固定し、左腓腹筋周辺を広くバリカンで剃毛した。注射部位周辺を70%アルコールで噴霧消毒し、インスリン皮下投与用針付注射筒(マイジェクター(登録商標)、テルモ株式会社)を用いて0.1mol/L硝酸銀溶液を100μL/siteの容量でラットの左腓腹筋内側に筋肉内投与し、硝酸銀誘発ラット筋肉障害疼痛モデルを作製した。
試験物質:
(1)クエン酸緩衝液(Control)
(2)1%(w/v%)ジクロフェナク結合ヒアルロン酸(DF−HA)
(3)1%(w/v%)立体障害基導入ジクロフェナク結合ヒアルロン酸(DF−(Me)−HA)
試験物質投与後24、48及び72時間に、各個体の歩行状態をブラインド下で肉眼観察し、以下の基準に従って4段階にスコア化した。結果は図7に示す。
図7において、結果は、平均疼痛スコア±標準誤差(各群例数=8)によって示した。また、**及び*は、パラメトリックTukey検定において、それぞれ**p<0.01、*p<0.05(vs Control)を示す。
スコア0:正常
スコア1:軽度の跛行
スコア2:重度の跛行
スコア3:三足歩行
図8において、結果は、平均刺激圧スコア±標準誤差(各群例数=8)によって示した。また、***は、パラメトリックTukey検定において、***p<0.001(vs Control)を示す。
図7より、1%DF−HA及び1%DF−(Me)−HAはControl群と比較して有意に疼痛スコアを改善した。化合物間に明確な違いは認められなかった。
また、図8より、1%DF−HA及び1%DF−(Me)−HAは、いずれもControl群と比較して有意に筋圧痛閾値を上昇させた。それらの化合物間の作用に明確な違いは認められず、投与後3日間ほぼ同様に推移した。
1%DF−HA及び1%DF−(Me)−HAはいずれも3日間の鎮痛作用を示した。それらの化合物間の作用に有意な差は認められず、それらの投与後3日間の鎮痛作用は同様と考えられた。
B6−1.目的
ジクロフェナク結合ヒアルロン酸ナトリウム(DF−HA)の筋肉内投与における鎮痛作用についてその持続性を検証することを目的に、当該モデルにおけるDF−HAの投与10日後の鎮痛作用を評価した。
クエン酸緩衝液を溶媒とする下記を被験物質として調製した。
試験物質:
(1)クエン酸緩衝液(Control)
(2)1%(w/v%)ジクロフェナク結合ヒアルロン酸(DF−HA)
ラット(Crj:SD系(SPF)、雄性、8週齢)を全身麻酔下で背位固定し、左腓腹筋周辺を広くバリカンで剃毛した。注射部位周辺を70%アルコールで噴霧消毒し、インスリン皮下投与用針付注射筒(マイジェクター(登録商標)、テルモ株式会社)を用いて各試験物質を100μL/siteの容量でラットの左腓腹筋内側に筋肉内投与した。
試験物質投与後10日に、各群に10 mg/mLカラゲニン溶液を投与した。投与方法は、試験物質と同様、イソフルランによる吸入麻酔下、腓腹筋周囲を70%アルコールで噴霧消毒し、29Gインスリン皮下投与用針付注射筒を用いて100μL/siteの容量で左腓腹筋内側に筋肉内投与した。
カラゲニン溶液投与後3時間に、各個体におけるPAM鎮痛効果測定装置(バイオリサーチセンター株式会社)による投与部位の刺激圧評価を行った。具体的には、投与部位(腓腹筋内側頭)への圧刺激によって、ラットが逃避反応(足の引っ込み行動、鳴き声、身震いなど)を示した際の刺激圧(N(ニュートン))を測定した。結果は図9に示す。
図9において、結果は、平均刺激圧±標準誤差(各群例数=7)によって示した。また、*は、t検定において、*p<0.05(vs Control)を示す。
図9より、10日前に筋肉内投与された1%DF−HAはControl群と比較して有意に筋圧痛閾値を上昇させた。
筋肉内投与された1%DF−HAは投与後10日間の鎮痛作用を示すことが明らかとなった。
B7−1.目的
非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)を導入したヒアルロン酸誘導体の結合様式の違いによる薬効持続性への影響を検証することを目的に、当該モデルにおけるジクロフェナク結合ヒアルロン酸(ジクロフェナク−アミノエタノール−ヒアルロン酸:DF−HA)、立体障害基導入ジクロフェナク結合ヒアルロン酸(ジクロフェナク−(1−アミノ−2−プロパノール)−ヒアルロン酸:DF−(Me)−HA)の投与後14日の鎮痛作用を評価した。
各々、クエン酸緩衝液を溶媒とする下記を被験物質として調製した。
試験物質:
(1)クエン酸緩衝液(Control)
(2)1%(w/v%)ジクロフェナク結合ヒアルロン酸(DF−HA)
(3)1%(w/v%)立体障害基導入ジクロフェナク結合ヒアルロン酸(DF−(Me)−HA)
ラット(Crj:SD系(SPF)、雄性、7週齢)を全身麻酔下で背位固定し、左腓腹筋周辺を広くバリカンで剃毛した。注射部位周辺を70%アルコールで噴霧消毒し、インスリン皮下投与用針付注射筒(マイジェクター(登録商標)、テルモ株式会社)を用いて各試験物質を100μL/siteの容量でラットの左腓腹筋内側に筋肉内投与した。
試験物質投与後14日に、各群に10mg/mLカラゲニン溶液を投与した。投与方法は、試験物質と同様、イソフルランによる吸入麻酔下、腓腹筋周囲を70%アルコールで噴霧消毒し、29Gインスリン皮下投与用針付注射筒を用いて100μL/siteの容量で左腓腹筋内側に筋肉内投与した。
カラゲニン溶液投与後3時間に、各個体におけるPAM鎮痛効果測定装置(バイオリサーチセンター株式会社)による投与部位の刺激圧評価を行った。具体的には、投与部位(腓腹筋内側頭)への圧刺激によって、ラットが逃避反応(足の引っ込み行動、鳴き声、身震いなど)を示した際の刺激圧(N(ニュートン))を測定した。結果は図10に示す。
図10において、結果は、平均刺激圧±標準誤差(各群例数=10)によって示した。
図10より、14日前に筋肉内投与された1%DF−HAは筋圧痛閾値の上昇作用を示さず、Control群との間に有意な差は認められなかった。一方、1%DF−(Me)−HAはControl群と比較して有意に(t検定においてp<0.05(vs Control))筋圧痛閾値を上昇させた。
筋肉内投与された1%DF−HAの鎮痛作用は14日未満であるのに対し、1%DF−(Me)−HAは14日間の鎮痛作用を示すことが明らかとなった。DF−(Me)−HAのDF−HAと比較した薬効の持続性が明確となった。
B8−1.目的
ジクロフェナク結合コンドロイチン硫酸(ジクロフェナク−(2−アミノエタノール)−コンドロイチン硫酸: DF−CS)の筋肉内投与における鎮痛作用についてその持続性を検証することを目的に、当該モデルにおけるDF−CSの投与7日後の鎮痛作用を評価した。
PBSを溶媒とする下記を試験物質として調製した。
試験物質:
(1)PBS(Control)
(2)1%(w/v%)ジクロフェナク結合コンドロイチン硫酸(DF−CS)
ラット(Crj:SD系(SPF)、雄性、9週齢)を全身麻酔下で背位固定し、左腓腹筋周辺を広くバリカンで剃毛した。注射部位周辺を70%アルコールで噴霧消毒し、インスリン皮下投与用針付注射筒(マイジェクター(登録商標)、テルモ株式会社)を用いて試験物質を100μL/siteの容量でラットの左腓腹筋内側に筋肉内投与した。
試験物質投与後7日に、各群に10 mg/mLカラゲニン溶液を投与した。投与方法は、試験物質と同様、イソフルランによる吸入麻酔下、腓腹筋周囲を70%アルコールで噴霧消毒し、29Gインスリン皮下投与用針付注射筒を用いて100μL/siteの容量で左腓腹筋内側に筋肉内投与した。
カラゲニン溶液投与後3時間に、各個体におけるPAM鎮痛効果測定装置(バイオリサーチセンター株式会社)による投与部位の刺激圧評価を行った。具体的には、投与部位(腓腹筋内側頭)への圧刺激によって、ラットが逃避反応(足の引っ込み行動、鳴き声、身震いなど)を示した際の刺激圧(N(ニュートン))を測定した。結果は図11に示す。
図11において、結果は、平均刺激圧±標準誤差(各群例数=6又は7)によって示した。また、*は、t検定において、*p<0.05(vs Control)を示す。
図11より、7日前に筋肉内投与された1%DF−CSはControl群と比較して有意に筋圧痛閾値を上昇させた。
筋肉内投与された1%DF−CSは投与後7日間の鎮痛作用を示すことが明らかとなった。
B9−1.目的
非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)を導入したコンドロイチン硫酸誘導体の結合様式の違いによる薬効持続性への影響を検証することを目的に、当該モデルにおける、スペーサーの結合様式の異なるジクロフェナク結合コンドロイチン硫酸(DF−(Me)−CS、DF−(Thr)−CS及びDF−(Ser)−CS)の投与後10日の鎮痛作用を評価した。
PBSを溶媒とする下記を試験物質として調製した。
試験物質:
(1)PBS(Control)
(2)1%(w/v%)ジクロフェナク−(1−アミノ−2−プロパノール)−コンドロイチン硫酸(DF−(Me)−CS)
(3)1%(w/v%)ジクロフェナク(トレオニンエチルエステル)−コンドロイチン硫酸(DF−(Thr)−CS)
(4)1%(w/v%)ジクロフェナク(セリンエチルエステル)−コンドロイチン硫酸(DF−(Ser)−CS)
図12において、結果は、平均刺激圧±標準誤差(各群例数=8)によって示した。また、*は、t検定において、*p<0.05(vs Control)を示す。
図12より、10日前に筋肉内投与された1%DF−(Me)−CSはControl群と比較して有意に筋圧痛閾値を上昇させた。
筋肉内投与された1%DF−(Me)−CSは投与後10日間の鎮痛作用を示すことが明らかとなった。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。
Claims (14)
- グリコサミノグリカンに由来する基と、カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する生理活性物質に由来する基とが、スペーサーを介する共有結合で連結されたグリコサミノグリカン誘導体に含まれるスペーサーを、生理活性物質に由来する基とスペーサーとの共有結合の分解速度に応じて選択することを含む、グリコサミノグリカン誘導体からの生理活性物質の遊離速度の制御方法。
- グリコサミノグリカンに由来する基と、カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する生理活性物質に由来する基とがスペーサーを介する共有結合で連結され、スペーサーが生理活性物質に由来する基との共有結合の分解速度に応じて選択される、グリコサミノグリカン誘導体 。
- グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、へパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項2に記載のグリコサミノグリカン誘導体。
- 生理活性物質が、非ステロイド性抗炎症薬、ステロイド、抗リウマチ薬、抗アレルギー薬、高脂血症治療薬及びβ刺激薬からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項2又は請求項3に記載のグリコサミノグリカン誘導体。
- 生理活性物質に由来する基とスペーサーとが、エステル結合で共有結合している請求項2〜請求項4のいずれか1項に記載のグリコサミノグリカン誘導体。
- グリコサミノグリカンに由来する基とスペーサーとが、アミド結合で共有結合している請求項2〜請求項5のいずれか1項に記載のグリコサミノグリカン誘導体。
- スペーサーがアミノアルコール、アミノ酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも1種の化合物に由来する2価以上の基である、請求項2〜請求項6のいずれか1項に記載のグリコサミノグリカン誘導体。
- スペーサーが下記一般式(I)で表されるアミノ酸に由来する2価の基である、請求項2〜請求項7のいずれか1項に記載のグリコサミノグリカン誘導体。
−HN−(CH2)m−CR11R12−CR13R14−CO− (I)
(式中、mは0〜12の整数を示す。R11〜R14はそれぞれ独立に、水素原子、電子吸引基、電子供与基又は立体障害性基を示す) - スペーサーが下記一般式(II)で表されるアミノアルコールに由来する2価の基である、請求項2〜請求項7のいずれか1項に記載のグリコサミノグリカン誘導体。
−HN−(CH2)n−CR21R22−CR23R24−O− (II)
(式中、nは0〜12の整数を示す。R21〜R24はそれぞれ独立に、水素原子、電子吸引基、電子供与基又は立体障害性基を示す) - スペーサーが、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、システイン、プロリン、β−アラニン及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも1種のアミノ酸に由来する2価以上の基、又はアミノプロパノール、アミノエタノール及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも1種のアミノアルコールに由来する2価以上の基である、請求項2〜請求項7のいずれか1項に記載のグリコサミノグリカン誘導体。
- 請求項2〜請求項10のいずれか1項に記載のグリコサミノグリカン誘導体を含む医薬組成物。
- 請求項2〜請求項10のいずれか1項に記載のグリコサミノグリカン誘導体を含む放出制御製剤。
- 請求項2〜請求項10のいずれか1項に記載のグリコサミノグリカン誘導体を含む持続型疼痛抑制剤。
- カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する生理活性物質を準備することと、
生理活性物質に由来する基と共有結合を形成するスペーサーを該共有結合の分解速度に応じて選択することと、
生理活性物質に由来する基とグリコサミノグリカンに由来する基とをスペーサーを介して共有結合することと、
を含むグリコサミノグリカン誘導体の製造方法。
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