JP2006504747A

JP2006504747A - ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサン類

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Publication number: JP2006504747A
Application number: JP2004544138A
Authority: JP
Inventors: デ・ルカ・ジルダ; マリニ・ベットロ・リナルド; ミグネコ・ルイサ・マリア
Original assignee: フィディアファルマチェウティチソシエタペルアチオニ
Priority date: 2002-10-18
Filing date: 2003-10-10
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2023-10-10
Also published as: WO2004035629A2; CA2783175C; DE60325760D1; AU2003267441B2; US20060116346A1; RU2005115116A; CN1705683A; RU2384593C2; CN1705683B; US7897584B2; NZ547668A; SI1560854T1; PL392566A1; KR20050065595A; EP2045270A2; PL376349A1; CA2783175A1; IL168086A; EP2045270A3; KR101076414B1

Abstract

本発明は、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合した水溶性タキサン類に係り、特に、腫瘍学の領域において、自己免疫疾患や再狭窄の処置に使用される医薬品組成物の調製に有用な、パクリタキセル及びドセタキセルに関する。また、本発明は、ヒアルロン酸及びタキサンを直接合成することにより、或いはヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体とタキサンとの間にスペーサーを導入する間接的な合成により行う、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンの調製方法にも関する。

Description

本発明は、タキサン類に係り、特に、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したパクリタキセル又はドセタキセルに関する。また、本発明は、これら物質の製造方法並びに自己免疫疾患及び再狭窄の処置における腫瘍学での使用に関する。

現在タキソール（登録商標、以下同様）及びＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標、以下同様）として市販されているタキサン類並びに特にパクリタキセル及びドセタキセルは、細胞骨格におけるマイクロチューブルの組織化に作用することにより抗増殖効果に影響を与える抗ガン剤である（非特許文献１参照）。実際、これら化合物は、上記のマイクロチューブルの脱分極を阻害することにより、細胞分裂中に起こる動的組織化を阻止する（非特許文献２参照）。

パクリタキセルに関する腫瘍な治療適用は：
進行性乳癌に対する治療；
カポジ肉腫に対する治療；
肺癌腫（マイクロサイトーマ（ｍｉｃｒｏｃｙｔｏｍａ）ではない）に対する治療；
標準的な化学療法に耐性を示す卵巣癌腫；
がある。

さらに、上記の化学療法は、膀胱癌、前立腺癌及び子宮内膜癌の治療にも使用される。

パクリタキセルは水に不溶性を示すので、現在使用される癌に対する化学療法における薬学的組成物には、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標、以下同様）ＥＬとエチルアルコールとの１：１混合物を有する（非特許文献３参照）。この処方は、通常、１３５〜１７５ｍｇ／ｍ^２の処方量で、連続静脈注射に使用される。

上述の組成においてＣｒｅｍｏｐｈｏｒが存在することにより、パクリタキセルの投与中、湿疹や呼吸困難や、気管支痙攣や、アナフィラキシーショックといった副作用が起こる（非特許文献４参照）。

これにより、パクリタキセル−Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒからなる薬学組成物で処置を受け続ける患者は、抗ヒスタミン作用に関連したデキサメタゾンの投与という前薬物処置を受ける必要が生じる。

これらの予防策にもかかわらず、パクリタキセルの静脈投与を受ける患者の４０％未満は、重篤な副作用を経験している。

従って、現在使用されているタキソールの処方及びその投与方法は、その有効性に制約があるといえる。このことが、水溶性を示す上記の抗ガン剤に係る新規の薬学的処方の合成及び／又は新規の化学処方が研究されている理由である。

例えば、ポリ乳酸などの生分解性共重合体やエチレンビニルアセテートなどの非生分解性ポリマーにより形成されたポリマー壁により構成されるリポソーム、ナノカプセル及びマイクロスフェアにパクリタキセルをカプセル化する試みがなされている。

さらに、マイクロスフェアは、肺癌腫の治療における処置部位において持続的に薬剤を放出するシステムを形成するように、ポリホスホエステルなどの生分解性ポリマーにより形成されてパクリタキセルを充填した形で調製されている（非特許文献５参照）。

また、有機溶媒中で、ホスファチジルコリン／胆汁酸を用いてパクリタキセルを沈殿させることにより、上記の抗ガン剤のミセルを調製する試みもなされている（非特許文献５参照）。

しかしながら、パクリタキセルのカプセル化に関するこれらの新規のシステムは、溶解性、製造性及び再現性の点で問題を生じる可能性がある。

さらに、シクロデキストリンを用いてこれらの薬物を溶解させる試みがなされているが、これら新規の処方では、所望する結果を与えていないのが現状である（非特許文献５参照）。

これら薬物により高い水溶性を与えつつ抗ガン剤として有効性を保持させるパクリタキセルの新規の処方に関する化学的研究は、パクリタキセルのＣ２’及びＣ７位を改変した新規のアナログの合成（特許文献１参照）や、新規のプロドラッグの調製へと向かっている。

プロドラッグは、体内に導入されることにより活性化する、治療学的に不活性な薬物誘導体である。加水分解及び／又は酵素分解の後に、活性物が放出される。

この観点において且つ上述の理由に関して、新規のプロドラッグを合成する種々の試みがなされており、例えば、アセチル−パクリタキセルなどのプロドラッグの調製（非特許文献６参照）や、パクリタキセルのＣ２’位の炭素にコハク酸、グルタミン酸及びスルホン酸を用いて上記の薬物の新規のエステルを合成する試みなどがある。しかしながら、これらのエステル類は、水系環境において不安定となることが証明されている。

さらに、パクリタキセル−２’−カーボネートや、Ｃ２’位のグルタリル基で、パクリタキセル及びこれらの誘導体の新規のアミノ酸エステル類などの、パクリタキセルのＣ２’又はＣ７位にホスホンオキシフェニルプロピオネートエステル基を有する種々の誘導体が合成されている。

上述の合成法により得られる最も水溶性の高い製品は、グルタリル−パクリタキセルアスパラギン及びグルタリル−パクリタキセルグルタミンであるが、パクリタキセルに対して若干有効性が低い（非特許文献５参照）。

また、パクリタキセルは、ポリ−Ｌ−グルタミン酸でエステル化して、非コンジュゲート型のパクリタキセルよりも長い血漿半減期を有する新規の水溶性誘導体を形成することが知られている（非特許文献７参照）。

また、パクリタキセルは、Ｃ２’位をエステル化してＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を有する誘導体に合成されるが；この新規の分子は、高い水溶性を有するものの安定ではない。

最後に、パクリタキセルをヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）を用いてコンジュゲート化することによる新規の薬物送達システムが開発されている。このパクリタキセル−ＨＡＳコンジュゲートは、非常に水溶性が高く、３０分子以上を運搬し得る。しかしながら、ｉｎｖｉｔｒｏでの実験において、癌に対してパクリタキセルよりも効果が少ないことが示されている（非特許文献５参照）。

近年、改変ヒアルロン酸（以下、ＨＡと称する）を用いてエステル化されたパクリタキセルの新規の送達システムが合成され、ＨＡは、アミド結合によりＨＡのカルボキシ基に結合したヒドラジド分子と反応する（非特許文献８及び特許文献２参照）。パクリタキセルに関するこの新規の送達システムは、ＨＡの受容体であるＣＤ４４が過剰発現した標的となるガン細胞の細胞膜表面に直接この薬物を指向させる。次に、ヒドラジドで機能化されたＨＡに結合したパクリタキセルは、ガン細胞のＣＤ４４に特異的に結合し得るようになり、よって、（エンドサイトーシスにより）細胞質に進入することが可能となり、そこで酵素的に放出され且つ活性化され、チューブリンの脱分極を阻止し、従って、細胞分裂を阻害する。この薬物の選択的な輸送機構を、「セルターゲッティング」と称する。

さらに、ＨＡは、上述の標的部位における現象に由来してその治療的有効性を増加させるように（特許文献３参照）、且つ通常の化学療法プロトコールにおいて特定される通常の投与量を減量させるように（特許文献４参照）、ＨＡがパクリタキセルなどの化学療法剤に関連づけられ（且つ共有結合されていない）、薬学的組成物における抗ガン剤用のビヒクルとして使用され得ることが知られている。

最後に、パクリタキセルなどの抗ガン剤を含む薬物の送達に使用されるリポソームを調製するのに、低分子量のＨＡ及び／又はその脂質誘導体を使用することが知られている（特許文献５参照）。
米国特許出願第２００１／００１８５３１号明細書米国特許第５，８７４，４１７号明細書国際公開第００／４１７３０号パンフレット国際公開第９９／０２１５１号パンフレット国際公開第０１／３９８１５号パンフレット米国特許第６，０２７，７４１号明細書国際公開第０２／１８４５０号パンフレット米国特許第４，８５１，５２１号明細書欧州特許出願第１０９５０６４号明細書欧州特許第０３４１７４５号明細書国際公開第０１／４７５６１号パンフレット国際公開第９７／４０８４１号パンフレットＨｕｉｚｉｎｇＭ．Ｔら著、ＣａｎｃｅｒＩｎｖ．，１９９５，１３巻：３８１〜４０４頁ＭａｎｆｒｅｄｉＪ．Ｊ．ら著、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、１９９２、９４巻：６８６〜６９６頁ＰｒｅｉｆｅｒＲ．Ｗら著、Ａｍ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．，１９９３，５０巻：２５２０〜２５２１頁Ｗｅｉｓｓ、Ｒ．Ｂ．ら著、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１９９０，８巻：１２６３〜１２６８頁Ｎｕｉｊｅｎ、Ｂら著、ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌＮｅｗＤｒｕｇｓ、２００１、１９巻：１４３〜１５３頁Ｍｅｌｌａｄｏ，Ｗ．ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８４，１２４（２）：３２９−３３６ＬｉＣ．ら著、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９８、５８（１１）：２４０４〜２４０９頁ＬｕｏＹ．ら著、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０００、１（２）：２０８〜２１８Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｇａｙｏｌ、Ａ．ら著、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰａｔｈｏｌｏｇｙ，２００２，７２巻：１７８〜１８５頁Ｄｅｚｉｎｏｔ、Ｆら著、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８６，２２（８９）：２７１−２７７頁

上述の事項の観点において、水に対して安定で溶解性を示す新規のタキサン誘導体及び治療的な有効性が改変されないタキサン類が未だ必要とされている。

本願出願人は、任意でスペーサーを有し、安定で水溶性を示す、ＨＡ又はＨＡ誘導体に共有結合し、腫瘍、自己免疫疾患及び再狭窄の処置用の薬学的組成物の調製に有用な、タキサン類が得られることを見出した。

従って、本発明の目的は、ＨＡ又はＨＡ誘導体に共有結合したタキサンであって、この共有結合は、タキサンの水酸基と、ＨＡ又はＨＡ誘導体のカルボキシル基若しくは水酸基又は脱アセチル化されたＨＡのアミノ基との間に形成され、任意で、タキサンをＨＡ又はＨＡ誘導体に結合させるスペーサーにより形成される。なお、上記のスペーサーは、ヒドラジドではないことを条件とする。

さらに、本発明は、ＨＡ又はＨＡ誘導体に共有結合したタキサン類の調製方法にも関する。

本発明のさらなる目的は、活性物質として少なくともＨＡ又はＨＡ誘導体に共有結合したタキサンを有する薬学組成物並びに腫瘍、自己免疫疾患及び再狭窄の処置へのこれらの組成物の使用にも関する。

本発明に係るＨＡ又はＨＡ誘導体に共有結合したタキサン類は、以下に示す通りの種々の利点を有する：
１）血流に急速な溶解性を示す；
２）処方の調製にＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬと混合する必要がなく、過敏症やアナフィラキシーといった上述の問題を克服する；
３）血漿中に通常見出されるエステラーゼなどの酵素による酵素作用に起因して、これらタキサン類は、本発明に係る組成物からビヒクルであるＨＡ又はＨＡ誘導体により、血流中へと放出され、抗ガン作用を自由に発揮し得る；
４）特定の癌の場合に同様の投与量と考えられる非コンジュゲートタキサンを投与した際に得られる効果よりも有意に高い化学療法的活性を惹起し得る新規の薬物を得ることができる。

本発明は、下記の式（Ｉ）及び（ＩＩ）でそれぞれ示す、タキサンファミリー並びに好ましくはパクリタキセル及びドセタキセルに属する化合物について開示し、これらは、ＨＡ又はＨＡ誘導体に共有結合しており、好ましくは、タキサン成分とＨＡ又はＨＡ誘導体との間のインターフェースとしてスペーサーにより結合されており、これらの分子を共有結合させている。

ＨＡは、以下の繰り返し単位を有するＤ−グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの繰り返し残基からなるヘテロ多糖類である：

ＨＡは、起源及び使用する取得方法に依存して５０，０００から１３×１０^６Ｄａの間の分子量を有する直鎖のポリマーである。ＨＡは、天然には、ペリセルラー（ｐｅｒｉｃｅｌｌｕｌａｒ）のゲル、脊椎動物における主要な成分の一つである結合組織の基礎物質、接合部の滑液、硝子体液及び臍帯中に存在する。ＨＡは、生命体において、皮膚、腱、筋肉及び軟骨などの多くの組織に係る細胞の機械的な支持体として重要な役割を演じる。ＨＡは、細胞外マトリックスの主成分であるが、細胞の水分補給、潤滑並びに細胞の移行及び分化などのその他の機能も有する。

本発明に使用するＨＡは、ニワトリの鶏冠などのいかなる起源から抽出されてもよく、或いは、発酵又は技術手段により得てもよく、且つ、４００〜３×１０^６Ｄａ、特に４００〜１×１０^６Ｄａ、好ましくは４００〜２３０，０００Ｄａの分子量を有してもよい。

本発明によるＨＡ誘導体は、以下のＨＡ誘導体からなる群から好ましく選択される：
有機及び／又は無機塩基を有するＨＡ；
Ｈｙａｆｆ（登録商標、以下同様）：脂肪族、脂環族（ａｒａｌｉｐｈａｔｉｃ）、環状脂肪族、芳香族、環状化合物、ヘテロ環状化合物のアルコール類を有するＨＡエステルであって、使用するアルコール類の種類及び長さに応じて変化し得るエステル化度合を有するもの。得られる最終のポリマーが常に水溶性である必要あるため、５０％のエステル化度を越えず、好ましくは、０．１〜２０％であるものであって、一方で、エステル化されていないＨＡの残りは、有機及び／又は無機塩基で加塩されていてもよい。なお、このことは、特許文献８に開示されており、参照して本願に取り込む；
Ｈｙａｄｄ（登録商標、以下同様）：脂肪族化合物、脂環族化合物、環状脂肪族化合物、芳香族化合物、環状化合物、ヘテロ環状化合物のアミン類を有するＨＡのアミド。最終的なポリマーが水溶性である必要あるので、アミド化率は、０．１〜１０％である一方、アミド化されていないＨＡの残りのアミドは、有機及び／又は無機塩基で加塩されていてもよい。なお、このことは、特許文献９に開示されており、参照して本願に取り込む；
特許文献６に開示の４級以下の硫酸塩であって、硫酸化（ｓｕｌｐｈａｔｉｏｎ）されたＯ−硫酸化ＨＡ誘導体（なお、特許文献６を参照して本願に取り込む）；
ＡＣＰ（登録商標、以下同様）：水溶性の必要があるため、１５％未満のエステル化率のＨＡの内部エステル体で、好ましくは、０．０５〜１０％のエステル化率を有する一方、残りのエステル化されていないＨＡは、有機及び／又は無機塩基で加塩されていてもよい。なお、このことは、特許文献１０に開示されており、参照して本願に取り込む；
ＨＡの脱アセチル化体：Ｎ−アセチルグルコサミン単位の脱アセチルに由来し、脱アセチル化率は、好ましくは０．１〜３０％であって、残りのＨＡに係るカルボキシル基は、下記の構造（Ａ）のように、有機及び／又は無機塩基で加塩されていてもよい：

このＨＡ脱アセチル化体は、特許文献７に開示されており、参照して本願に取り込む；
Ｈｙｏｘｘ（登録商標、以下同様）：Ｎ−アセチルグルコサミン単位の一級水酸基の酸化により得られる過カルボキシル化ＨＡ誘導体（ｐｅｒｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄＨＡｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）であって、１〜１００％、好ましくは２５〜７５％の過カルボキシル化率を有する。ＨＡに係るすべてのカルボキシル基は、下記構造（Ｂ）に示すように有機及び／又は無機塩基で加塩されていてもよい：

過カルボン酸化ＨＡ誘導体は、特許文献８に開示されている。

さらに、タキサン及び特にパクリタキセルがＨＡエステルに共有結合している本発明に係る化合物は、化学的に修飾されていないＨＡ分子から出発して得てもよく、且つ、上述のＨｙａｆｆ製品にて記載したすべてのアルコール類でエステル化することにより或いはＡＣＰの場合のように内部にてエステル体を形成することにより上述の化学療法剤で合成した後に得てもよい（例８参照）。

プロドラッグであるＨＡ−タキサンの合成方法に特に重要である上述に一覧を記したＨＡ誘導体及び特にプロドラッグであるＨＡ−パクリタキセルは、脱カルボキシル化され且つスルホン化された誘導体であり、非改変方のヒアルロン酸に結合したの割合が同程度であるので、これらは血流中でより高い溶解性を示す最終産物を与える。

ＨＡは、ＣＤ４４膜受容体により、癌細胞及びその他の細胞の増殖、分化及び異同などの細胞生理学的且つ生物学的に相対したその他の異なる多くのプロセスを調節する。

ＨＡを直接癌細胞へと注入するなどした際、癌に対するＨＡの効果を示す化学文献が示されている。３０％の腫瘍が完全に消失したことを同定し得ることが証明されている（非特許文献９参照）。

また、ＨＡは、関連づけられる薬物の抗ガン作用を相乗的に促進する第２の抗新生物剤として機能し得るので、多くの異なる薬学的組成物を調製するため、ＨＡは、種々の化学療法剤と関連づけされ得ることも知られている（特許文献１１参照）；代替的に、ＨＡは、癌増殖の減少／退化用に、種々の医療プロトコールにおいて投与されるべき抗ガン剤としてクレームされている（特許文献１２参照）。

上述のように本発明に係るＨＡ又はＨＡ誘導体に共有結合したタキサン類は、タキサン類の処方のすべてから異なり、特に、任意でスペーサーによりＨＡ又はＨＡ誘導体とパクリタキセルとでなる共有結合は、薬学的有効性を減弱させることなく、パクリタキセルを水溶性とする。

事実、例１に述べたｉｎｖｉｖｏでの実験で示すように、本発明によるコンジュゲートされたパクリタキセルとコンジュゲートされていないパクリタキセルを同じ投与量で使用した際、同様の抗ガン作用を明確に示している。

さらに、ＨＡ−パクリタキセルは、特に、特定の腫瘍の場合、コンジュゲートされていないパクリタキセルとは異なった予期せぬ薬学的特性を示し得る。

事実、例２が明確に示すように、本発明によるパクリタキセルに結合したＨＡのエステル誘導体は、新規の抗新生物活性を有し：下述するｉｎｖｉｔｒｏでの細胞毒性においては、本発明によるＨＡ−パクリタキセルは、コンジュゲートされていないパクリタキセルを単独で用いた際に惹起されるよりも非常に優れた、驚くべき抗ガン作用を示す。

この新規の抗新生物特性は、ＨＡ又はＨＡ誘導体にコンジュゲートされた本発明によるタキサン類、特にパクリタキセルは、タキソールが投与される腫瘍のすべての処置だけでなく胃癌、肝臓癌、結腸癌、メラノーマ及び白血病などの通常タキソールで処理されないその他の腫瘍に対しても、化学療法剤として有用な薬学的組成物の調製に使用され得る。さらに、リューマチ、全身性エリテマトーデス、自己免疫疾患性糸球体腎炎及び橋本病などの全身性自己免疫疾患にも使用され得る。

上述の病態用に、新規の薬学的治療への本発明による産物の使用は、この新規のＨＡ−パクリタキセル化合物がタキソールの全身的な毒性を減弱させるため、可能であって、それ自体の治療効果を増加させる。その理由は：
水溶性である；
ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬに関連づけられず、従って、この物質が生じさせる毒性が生じない；
治療プロトコールに通常使用されるよりも低い（または同様の）投与量で同様の効力を発揮する；
などがある。

また、一般的に血管形成（動脈）、冠状動脈のバイパス、組織移植に続く再狭窄工程を阻止するのに使用されるべき薬物としてパクリタキセルを使用することが知られている。

本発明によるＨＡ又はＨＡ誘導体に共有結合したタキサン類、特にパクリタキセルは、ステントの表面に化学的に結合され或いはこれらに容易に吸着され得ることが証明されているので、再狭窄の阻止に使用されてもよく、或いは、上述の血管手術の後に埋め込まれるステント及びこれに類する器具用の内部コーティングを形成させるのに使用されてもよい。

いずれかの場合において、本発明による製品のステント表面に対する滞留時間及びこれに続く血流への緩徐な放出は、ＨＡの物理化学的特性により上述の装置の表面からのタキソールの進行的で遅いが連続的な放出を促進するので、コンジュゲートされていないパクリタキセルよりも大きい。

ＨＡ又はＨＡ誘導体に共有結合した本発明によるタキサン類を有する薬学的組成物は、（静脈、動脈、筋中、腹腔、皮下又は経口により）全身的に投与されてもよく、（経皮吸収により）局所的に投与されてもよく、或いは、注射により癌部位に直接投与されてもよい。

パクリタキセルに共有結合されたＨＡ又はＨＡ誘導体は、それ自体、抗ガン剤として作用し得る。

以下の例３において、本願出願人は、ヌードマウスに対してＨＡの架橋誘導体であるＡＣＰを用いて実験的に誘導した腫瘍増殖の処置により非処理のコントロールに比べて所望の有意な退化を同定する方法を示している。

従って、本願出願人は、腫瘍学の分野において抗新生物剤及び相対的な使用として、本発明によるタキサン−ＨＡ又はタキサン−ＨＡ誘導体を構成するＨＡ及びＨＡ誘導体に関する最初で、新規な役割を示す。

ＨＡ又はＨＡ誘導体に共有結合した本発明によるタキサン類は、さらに、例えば、ステロイド、ホルモン、タンパク質、局所因子、ビタミン、非ステロイド性抗炎症剤、化学療法剤、カルシウムアンタゴニスト、抗菌剤、抗ウィルス剤、インターフェロンなどのインターロイキンやサイトカインなどの種々の生物学的及び薬理学的活性分子に関連づけされ得る。

この方式において、上述の薬剤及び本発明によるタキサン類を有する相対的に異なる薬学的組成物に係る多くの異なる関連物を得ることが可能である。

また、本発明は、ＨＡ又はＨＡ誘導体に共有結合したタキサン類特にパクリタキセルの調製方法にも関する；本発明の産物は、以下の工程により達成されてもよい。つまり：
１）タキサンとＨＡ又はＨＡ誘導体との間にスペーサーを導入することを含む間接合成により；或いは
２）タキサンとＨＡ又はＨＡ誘導体とを直接合成することにより；
達成されてもよい。

スペーサーにより直接又は間接的にタキサンと反応し得るＨＡ又はＨＡ誘導体の機能性基は：
１）水酸基；
２）カルボキシル基；
３）脱カルボキシル化されたＨＡのアミノ基；
である。

上述のスペーサーは、直鎖若しくは分岐の、脂肪族又は脂環族鎖で、水酸基、カルボキシル基、カルボニル基、エポキシド、アシルクロライド、メルカプタン、ニトリル、ハロゲン、無水物、イソシアネート、イソチオシアネート及びアミノ基からなる群かから選択された１つ以上の置換基により置換されたものからなる群から、例えば選択される。

可能性のあるスペーサーの中で、２乃至１８の炭素原子を有するカルボン酸の臭化物が好ましく、特に、３乃至１０の炭素原子を有するものが特に好ましく、さらに好ましくは、３−ブロモプロピオン酸及び４−ブロモブチル酸である。

ＨＡ（又はＨＡ誘導体）の機能性水酸基とパクリタキセルなどのタキサン成分との間の合成反応は、間接又は直接合成方法により行われてもよい。

間接合成は、スペーサーとＨＡ又はＨＡ誘導体との間の共有結合に関し、以下のタイプのものを形成させ得る。つまり、

エステル結合：
カルボジイミドなどの活性剤により活性化される適切に選択されたスペーサーのカルボキシル基の機能を有し（下述のスキーム１）；
臭素化された、或いは、トシル基で置換され適切に選択されたスペーサーのカルボキシル基による求核置換されたＨＡ又はＨＡ誘導体の水酸基を含み（下述のスキーム２）；或いは
適切に選択されたスペーサーの無水物の機能を有する（下述のスキーム３）；
スキーム１、２、３

ウレタン又はチオウレタン結合：
適切に選択されたスペーサーのアミノ基を含み（下述のスキーム４）；或いは
適切に選択されたスキームのイソシアネート又はイソチオシアネート機能を有する（下述のスキーム５）；
スキーム４、５

エーテル結合：
（適切に選択された）スペーサーのエポキシ機能を含み（下述のスキーム６）；或いは
臭素化された、或いは、トシル基で置換され適切に選択されたスペーサーのカルボキシル基による求核置換されたＨＡ又はＨＡ誘導体の水酸基を含む（下述のスキーム７）；
スキーム６、７

アセタール又はケタール結合：
適切に選択されたスペーサーのアルデヒド基及び／又はケトン基を含み（下述のスキーム８）；或いは
適切に選択されたスペーサーの水酸基を含みホルムアルデヒドなどの簡単なカルボニル化合物の存在を必要とするもの（下述のスキーム９）；

上述の工程は、ＨＡ又はＨＡ誘導体の水酸基を活性化する薬剤を用いて行われてもよく、例えば、カルボニルジイミダゾール及びジ−（Ｎ−サクシミジル）カーボネートからなる群から選択されたものなどがある。

ＨＡ又はＨＡ誘導体の水酸基と、パクリタキセルなどのタキサンとの直接合成反応により、以下の種類の共有結合が形成されてもよい。つまり、
アセタール結合：
ホルムアルデヒドなどの簡単なカルボニル化合物を添加することにより共有結合を形成される、タキサンの水酸基及びＨＡ又はＨＡ誘導体の水酸基を含むもの。
スキーム１０

ＨＡ又はＨＡ誘導体のカルボキシル基とパクリタキセルなどのタキサンとの反応は、直接又は間接合成方法により行われてもよい。
直接合成により、スペーサーとＨＡ又はＨＡ誘導体との間に以下の種類の共有結合が形成されてもよい。つまり、
エステル結合：
４−ブロモブチル酸などの適切に選択されたスペーサーのカルボキシル基は、カルボジイミドなどの活性剤により活性化され、パクリタキセルなどのタキサンの水酸基（好ましくは、Ｃ２’位）との合成用に適切に産生される。次に、無水溶媒中で四級アンモニウム塩、特にＨＡ又はＨＡ誘導体のテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩などと直接接触させることにより、スペーサーの臭素に対してＨＡ又はＨＡ誘導体のカルボキシル基への求核置換が起こる。この方法において、ＨＡ又はＨＡ誘導体とスペーサーとの間にエステル結合が形成され、パクリタキセルに結合される。代替的に、ＨＡ又はＨＡ誘導体のカルボキシル基のスペーサーの臭素への求核置換は、スペーサー自体とタキサンとの間の結合に先立って起こってもよい（下述のスキーム１１）；或いは
カルボジイミドなどのＨＡ又はＨＡ誘導体のカルボキシル基の活性剤を用いることにより、パクリタキセルへの結合に先立って或いはそれに続いて、上述の置換基と（適切に選択された）スペーサーの水酸基との間にエステル結合を導入し得る（下述のスキーム１２）；
スキーム１１、１２

アミド結合：
活性剤によるＨＡ又はＨＡ誘導体のカルボキシル基の活性化により、パクリタキセルへの結合に先立って或いはそれに続いて、適切に選択されたスペーサーのアミノ基を有し、ヒドラジドのすべてを除く部位への結合が可能となる。
スキーム１３

直接合成により、以下の種類の共有結合の形成が可能となる。つまり、
エステル結合：
活性剤によるＨＡ又はＨＡ誘導体のカルボキシル基の活性化により、タキサンの水酸基への結合が可能となる（下述のスキーム１４）；
活性剤によるタキサン成分の水酸基の活性化により、ＨＡ又はＨＡ誘導体のカルボキシル機能を有する結合が可能となる（スキーム１４）；或いは
スキーム１４

以下のタイプの結合は、タキサンの臭素又はトシレートを必要とする。この結合は、ＨＡ又はＨＡ誘導体のカルボキシル基による上述の臭素又はトシル基の求核置換により調製される（スキーム１５）。
スキーム１５

脱アセチル化ＨＡのアミノ基とパクリタキセルなどのタキサン成分との合成反応は、間接又は直接合成により行われてもよい。

間接反応により、スペーサーとＨＡとの間に以下の種類の共有結合が形成される。つまり、
アミド結合：
適切に選択されたスペーサーのカルボキシル基を含むもの（スキーム１６）；
スキーム１６

ウレタン又はチオウレタン結合：
適切に選択されたスペーサーの水酸基又はチオリック（ｔｈｉｏｌｉｃ）結合を含むもの（スキーム１７）。
スキーム１７

直接合成により、以下の種類の共有結合が形成される。つまり、
ウレタン結合：
タキサンの水酸基と、脱アセチル化ＨＡのアミノ機能とを含むもの（スキーム１８）。
スキーム１８

同様の方法において、スペーサーとパクリタキセルなどのタキサンを含む結合は、エステル（スキーム１９）、ウレタン若しくはチオウレタン（スキーム２０）又はアセタール若しくはケタール（スキーム２１）であってもよく、且つ、活性剤、特にエステル及びウレタン結合に対する活性剤の存在を必要としてもよい。
スキーム１９

スキーム２０

スキーム２１

上述のスペーサーは、上述の適切に選択されたスペーサーの機能性置換基の種類に応じて、ＨＡ又はＨＡ誘導体の機能性置換基との結合の前又は後に、パクリタキセルなどのタキサンに結合されてもよい。

ＨＡ又はＨＡ誘導体へのパクリタキセルなどのタキサンの直接又は間接結合率は、０．１〜１００％であってもよく、好ましくは０．１〜３５％であってもよい。

本発明に係る非限定的な図示を提供するため、以下の例を示す。

（例１）
新生物細胞を移植した後のヌードマウスにおけるパクリタキセルを有するＨＡの新規のエステル誘導体の効果
この実験に関し、胸腺が欠損したＣＤ−１種に属する免疫抑制ヌードマウスにおいて、ヒト卵巣アデノカルシノーマ細胞であるＯＶＣＡＲ−３細胞を用いた。

５×１０^６個の癌細胞を腹腔経由で各マウスに接種した。

（実験設計）
試験薬剤：
タキソール、５の動物を処理
ＨＹＴＡＤ１ｐ２０：カルボキシル基（ｗ／ｗ）基準で１６％のエステル化率を有するパクリタキセルに共有結合されたＨＡのエステル誘導体。この新規の薬剤の合成に使用したＨＡの分子量は、２００，０００Ｄａである（詳細な調製方法は例７参照のこと）。この薬剤に関し、５の動物を用いた。

処理動物：
ＯＶＣＡＲ−３細胞を用い、最初に１０の動物に接種した。そのうち、５の動物は、タキソールの実験に用い、その他の５の動物は、ＨＹＴＡＤ１ｐ２０の実験に用いた：

１０の動物すべてに、腹腔注射により、（癌細胞の接種の後、６日目、１３日目及び２０日目に）薬物処理を３回、２０ｍｇ／ｋｇ体重のタキソール又は１２５ｍｇ／ｋｇ体重のＨＹＴＡＤ（２０ｍｇ／マウスのパクリタキセルに相当）を投与した。

コントロール動物：
最初に癌を誘導するＯＶＣＡＲ−３細胞の懸濁液を５の動物に接種し、その後、処理を行わなかった。

生存曲線の同定
生存曲線は、上述の癌細胞を腹膜に接種させた後９２日目の診断データから算出した。

結果：
得た結果を図１に示す。

３つのコントロール動物では、卵巣のアデノカルシノーマが進行し、癌細胞接種後７０〜７５日目に死亡した。

実験の最終日である診断後９２日目には、パクリタキセル又はＨＹＴＡＤで薬物処理した動物は、いずれも死亡しなかった。

例２
ｉｎｖｉｔｒｏ処理
ｉｎｖｉｔｒｏでの実験の目的は、主として、パクリタキセルに結合したＨＡの新規のエステル誘導体の活性特性を同定し且つパクリタキセルに対するＨＹＴＡＤ誘導体の抗新生物活性の調査／比較するためである。これにより、抗新生物剤に比較したこれらの薬理的潜在性を同定する。

（実験設計）
試験産物：
タキソール：参照産物
ＨＹＴＡＤ１ｐ２０−ＨＹＴＡＤ２ｐ２０−ＨＹＴＡＤ１ｐ２０：カルボキシル基のエステル化率が１６％（ｗ／ｗ）であるパクリタキセルに共有結合したＨＡのエステル誘導体（ＨＹＴＡＤ１ｐ２０の場合、この新規の薬剤の合成に使用したＨＡの分子量は２００，０００Ｄａである）（詳細な調製方法は例７参照）、上述のエステル化率が２０％であるもの（ＨＹＴＡＤ２ｐ２０の場合、使用したＨＡの分子量は３９，０００Ｄａである）、或いは、上述のエステル化率が６．８％であるもの（ＨＹＴＡＤ１ｐ２０の場合、使用したＨＡの分子量は、３９，０００Ｄａである）。

細胞株
ヒト由来の細胞株
ヒト乳癌由来の４つの細胞株を使用した。これら４つの試験細胞種は、通常パクリタキセルに反応し、みかけ上同様の程度でＣＤ４４受容体を発現する。

ＭＣＦ−７
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８
ＳＫＢＲ−３

実験プロトコール：

１）試験細胞株を、９６穴の平底プレート上にウェル当たり３，０００細胞の濃度で載置する；

２）２４時間後、これら細胞に培地で適切に希釈した試験溶液を添加する；

３）さらに７２時間後、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）を用いた比色法により、これら細胞を試験した；細胞のバイアビリティーを測定することにより、これら細胞の試験薬剤に対する異なる感受性も明らかとなる。このことが可能となるのは、ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼは、上述のテトラゾリウム塩（黄色）を青色のホルマザン結晶へと還元し得るためである。色の強弱は、分光光度計により検査される（非特許文献１０参照）。

結果
以下の表及び図２のグラフに示したように、これら結果では、ＩＣ_５０が得られた（試験物質及び使用した細胞株に対して細胞増殖を５０％阻止するのに必要な薬物濃度である）。

図２において、横軸は、ＩＣ_５０で示した薬理的作用を示し、ゼロ値を取る参照産物（パクリタキセル）に対する上述の分子の濃度の比率として算出したものである。また、破線は、参照産物よりも大きな薬理的作用を示す。

表１
ＩＣ_５０（培地中のパクリタキセル又はＨＹＴＡＤ誘導体のｎＭ又はμＭで示す）

結論
文献に報告されているように、使用したすべての細胞株は、胸及び卵巣の転移性カルシノーマを処置するのに主として使用される薬剤であるタキソールに対して感受性を示す。乳癌細胞株に関しては、種々のＨＹＴＡＤは、パクリタキセルに対してかなり強力であることが証明され、その程度は、乳酸細胞株ＭＣＦ−７に対するＨＹＴＡＤ１ｐ２０に関して１５０倍であった。

例３
新生物細胞の移植後、ヌードマウスにおけるＡＣＰゲルの効果
本実験に関し、胸腺を除去したヌード−Ｎｕ（ｎｕ／ｎｕ）種に属する免疫抑制性ヌードマウスにおいて、ヒト結腸カルシノーマＨＴ２９細胞を使用した。

各細胞を麻酔し、０．３ｍＬのＨＴ２９細胞懸濁液を１６６，０００細胞／ｍＬの濃度で腹腔内に注入した。従って、５０，０００個の癌細胞を各細胞に注入した。

（実験設計）
試験動物：
最初にＨＴ２９細胞で１１３の動物を接種し、０．２ｍＬのＡＣＰゲル４０ｍｇ／ｍＬを単回投与した。

コントロール動物：
ＨＴ２９癌細胞懸濁液で１１７の動物を接種し、その後、処置を行わなかった。

生存曲線：
接種後死亡日までの生存曲線を算出した。実験開始時の体重の２０％未満となった動物及び拡散転移を示す腹腔内出血の場合に死亡であると判定した。上述の２つの群における生存率は、日毎に同定し、グラフにして、図３に示す曲線を得た。

実験は１２０日間継続し、その後、生存しているすべての動物を屠殺し、腹部に腫瘍が存在することを検視により検討した。

結果：
２３０中３２の動物では、顕著な新生物は見出されなかった。これらの動物のうち２２の動物は、ＡＣＰゲルで処理したマウス群に属し、その他の１０の動物はコントロール群に属していた。

ＡＣＰゲル：処置した動物の１９．５％は、新生物が発達しなかった；
コントロール動物の８．５％は、新生物が発達しなかった。

例４
５，０００〜１０，０００ダルトンの分子量を有するＨＡの調製（低分子量のＨＡを有するＨＡ−パクリタキセルの合成用）
５，０００〜１０，０００ダルトンの分子量を有する２．４０ｇのＨＡナトリウムを、２４０ｍＬの０．１５ＭＮａＣｌ溶液に溶解する。その後、これに、７．９ｍＬの１４％ＮａＯＣｌ溶液を添加する。＋４℃において、この溶液を、２０Ｈｚ、１５０Ｗで１２０分間超音波処理する。この反応が完了した後、０．１ＮＨＣｌでｐＨを６．５に調製し、その後、この溶液を、２：１のメタノール−アセトンの１０００ｍＬ溶液で沈殿させる。この産物を、濾過により収集し、４５℃で４８時間真空乾燥させる。その結果、１．６５ｇのナトリウム塩化合物を得る。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）−ＧＰＣ分析により、得たＨＡの画分は、５，８５０の分子量、３，６４０の平均数分子量、１．６１の多分散性インデックス（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙｉｎｄｅｘ）を有する。

例５
カルボキシル基に対して約４ｗ／ｗ％のエステル化率を有するパクリタキセルに対して結合したＨＡのエステル誘導体の調製
５１ｍｇのパクリタキセルを、ＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解し、この溶液に、１０４ｍｇの１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）と２０ｍｇの４−ブロモブチル酸とを添加する。次に、この溶液を水で分画する。カルボジイミド及び臭素の残渣が消失した後、上述の反応溶媒を無水硫酸ナトリウムで乾固し、ロータリーエバポレーターで除去する。このようにして得た２１ｍｇの産物を、ｎ−メチル−ピロリドン（ＮＭＰ）に溶解し、ＮＭＰのテトラブチルアンモニウム（１０ｍＬのＮＭＰ中に２００ｍｇを含有するもの）で加塩したＨＡの２０ｍｇ／ｍＬ溶液に添加する。周囲温度において７日間反応させた後、この溶液を、５ｍＬの水と１ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液とで希釈する。このようにして得た溶液を、１時間攪拌し、ナトリウム塩をＴＢＡイオンで置き換える。その後、これにエタノールをゆっくり滴下し、このようにして得たフィラメント状の産物を水に溶解し、透析し、最終的に凍結乾燥する。

例６
カルボキシル基に対して約１０ｗ／ｗ％のエステル化率を有するパクリタキセルを有するＨＡのエステル誘導体の調製
例５のように、１０ｍＬのジクロロメタンに溶解した３０８．７ｍｇのパクリタキセルに、１１７．２ｍｇの４−ブロモブチル酸と６１４．４ｍｇのＥＤＣとを添加する。次に、この溶液に水を添加して、すべての臭素及びカルボジイミドを除去する。このようにして得た有機溶液に、硫酸ナトリウムを添加し、脱水する一方、上述の溶媒を、ロータリーエバポレーターを用いて除去する。その結果、最終的に３６３ｍｇの中間産物を得る。

このようにして得た１７５ｍｇの中間産物を、無水ＮＭＰに溶解した１ｇのＨＡ−ＴＢＡに添加する。この溶液を、周囲温度にて、７日間攪拌し、その後、２０ｍＬの水と４ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液とを添加する。さらに１時間攪拌し、ナトリウム塩をＴＢＡイオンで交換する。次に、エタノールをゆっくり滴下し、このようにして得たフィラメント状の産物を水に溶解し、透析し、最終的に凍結乾燥する。

例７
カルボキシル基に対して約１６ｗ／ｗ％のエステル化率を有するパクリタキセルを有するＨＡのエステル誘導体の調製
上述の例５及び６に従って得た１６４ｍｇの中間産物を、２５ｍＬの無水ＮＭＰに溶解した６８０ｍｇのＨＡ−ＴＢＡ溶液に添加する。周囲温度で７日間反応させた後、この溶液に、２０ｍＬの水と４ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液とを添加する。１時間後、エタノールをゆっくり滴下する。得た産物を、濾過により収集し、水に溶解させ、透析し、この透析溶液の導電率が１０Ｓに低下してから凍結する。その後、この凍結溶液を凍結乾燥する。

例８
水酸基に対して約１０ｗ／ｗ％のエステル化率を有するパクリタキセルを有するＨＡのエステル誘導体の調製
１０２ｍｇのパクリタキセルを５ｍＬのジクロロメタンに溶解し、この溶液に２０．４ｍｇの無水コハク酸を添加する。３時間後、上記の溶媒を、ロータリーエバポレーターを用いて蒸発させて除く。このようにして得た産物を、低い水分含量の５ｍＬのジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、２７．３ｍｇのジシクロ−ヘキシル−カルボジイミドを添加する。５分後、この溶液に、低い水分含量の１５ｍＬのＤＭＳＯ中に３２７ｍＬのポリマーを溶解させて得たＨＡ−ＴＢＡ溶液を添加する。この溶液を、周囲温度で約２４時間攪拌する。その後、この溶液に、数ｍＬの水と３ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液とを添加する。１時間後、エタノールを添加して沈殿させる。濾過により収集したフィラメント状産物を、水に溶解し、透析し、最終的に凍結乾燥する。

例９
カルボキシル基に対して約４ｗ／ｗ％のエステル化率を有するパクリタキセルを有するＨＡのエステル誘導体の調製
６ｍＬのジクロロメタンに溶解した５１０．１ｍｇのパクリタキセルに、９５．４ｍｇの３−３−ブロモブチル酸と５２５．０ｍｇのＥＤＣとを添加する。次に、この溶液に水を加え、１０部の水を使用して上記の試薬を消失させるとともに、分画にて臭素とカルボジイミドとを消失させる。この有機溶液に、硫酸ナトリウムを添加して、水和し、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去する。

このようにして得た１５５．５ｍｇの中間産物を無水ＮＭＰに溶解した１．４６ｇのＨＡ−ＴＢＡに添加し、得た溶液を、周囲温度で７日間攪拌する。その後、２０ｍＬの水と４ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液とを加える。この溶液を１時間攪拌し、ナトリウム塩をＴＢＡイオンで交換する。その後、エタノールをゆっくり滴下し、このようにして得たフィラメント状の産物を水に溶解し、透析し、最終的に凍結乾燥する。

例１０
カルボキシル基に対して約３０ｗ／ｗ％のエステル化率を有するパクリタキセルを有するヒアルロン酸のエステル誘導体の調製
５００ｍｇのパクリタキセルをＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解し、この溶液に３９７．６ｍｇの１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）と３００．９ｍｇの４−ブロモブチル酸とを添加する。次に、この溶液を水で分画する。カルボジイミドと臭素残渣とを消失させた後、その反応溶媒を、無水硫酸ナトリウムで乾固し、ロータリーエバポレーターで除去する。このようにして得た産物を、ＮＭＰに溶解し、ＮＭＰ中にＴＢＡを有するもの（１００ｍＬＮＭＰ中に１．９５ｇのＴＢＡを有するもの）で加塩した２０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸を含有する溶液に添加する。周囲温度で７日間反応させた後、この溶液を、２０ｍＬの水と４．５ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液とで希釈する。この溶液を１時間攪拌して、ナトリウム塩をＴＢＡイオンで交換する。その後、エタノールをゆっくり滴下し、得たフィラメント状の産物を、水に溶解し、透析し、最終的に凍結乾燥する。

例１１
８％ｗ／ｗのパクリタキセルを有するＨＡの部分的自己架橋エステル（約１０％置換率）の調製
ＴＢＡで加塩した３．１０ｇのＨＡを、低い水分含量の１５０ｍＬのＤＭＳＯに周囲温度にて溶解させる。その後、この溶液に、上述の例５乃至７で得た５４１．０ｍｇの中間パクリタキセルを添加する。周囲温度で７日間反応させた後、この反応溶液に、１２６．５ｇのトリエチルアミンを添加し、３０分間攪拌する。

３０ｍＬＤＭＳＯ中に３１９．５ｇの２−クロロ−１−メチルピリジンヨウ化物の溶液を、４５分の間隔でゆっくり滴下し、この混合物を、３０℃で１５時間保持する。

５０ｍＬの水と１．７ｇの塩化ナトリウムとでなる溶液を添加し、得た混合物を、連続的に攪拌しつつ、４００ｍＬのアセトンにゆっくり添加する。生成する沈殿物を濾過し、５０ｍＬのアセトン水５：１液で３回洗浄し、アセトン（５０ｍＬ）で３回洗浄する。このようにして得た最終産物を、４８℃で吸引乾固する。

例１２
例５に従って得たＨＡ−パクリタキセルの５％グルコース溶液に対する溶解度試験
（２００ｋＤａの分子量を有するＨＡから開始して）例７に従ってエステル化して得た、カルボキシル基において１６．３ｗ／ｗ％の置換率を有する１４．６ｍｇのＨＡ−パクリタキセル産物を、１ｍＬの５％グルコース水溶液に溶解した。マグネティックスターラーバーで攪拌した溶液を、シリンジに装着した０．２０μｍの滅菌フィルターで濾過する。この溶液中のパクリタキセルの濃度は、２．３８ｍｇ／ｍＬである。

また、５％グルコース水溶液中のこの産物の最大濃度を見出すことも試みた。濃度が単位グルコースｍＬ当たり３２．８ｍｇのＨＡ−パクリタキセル産物において、粘調な溶液が得られ、その濃度は、５．３５ｍｇ／ｍＬである。

例１３
ヒト血漿からのパクリタキセルの回収試験
１０ｍＬの水に１０１．３ｍｇのＨＡ−パクリタキセルで構成される溶液を調製する。このＨＡ−パクリタキセルを、例７に従って調製する。

上述の４０ｍｇの溶液を３７℃において、２ｍＬのヒト血漿に接触させて回収試験を行う。

ＨＡからパクリタキセルが解離することにより上記の血漿へと放出されるパクリタキセルを同定するため、６、３０及び６０分という３回の接触時間を設定した。画接触時間の終期において、パクリタキセルを、１．５ｍＬのターブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）で３回リンスすることにより上述の血漿−ＨＡ−パクリタキセル溶液から回収し、６５℃で自然に蒸発させることによりエバポレートし、４００μＬのエタノールで再懸濁して、薬物の含量をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で同定する。得た結果を図４に示す：６分後、８０％以上のパクリタキセルが、ＨＡから解離し、その後の観察時間においては、この比率は増加しなかった。

上述の通り述べた本発明において、種々の様式で、上述の方法を改変してもよい。かかる改変は、本発明の精神及び目的から逸脱してものとして考慮されるべきではなく、且つ、当業者に明らかであろうかかる種々の改変は、添付した特許請求の範囲内に包含されるものである。

例１に述べる腫瘍細胞をマウスに移植した後のコントロール（黒）に対する、パクリタキセル（灰色）及び例７に従って調製した１６％がエステル化されたＨＡエステルに共有結合したパクリタキセル（白）の百分率を示す。パクリタキセルに共有結合したエステル誘導体のエステル化度が１６％（灰色）、２２％（黒）及び６．８％（白）を乳癌細胞に用いた際、例２の実験から得られた、参照化合物であるパクリタキセルに対して、ＩＣ５０として示した薬学的効力を示す。コントロールのマウス（破線）及びＡＣＰ（登録商標）ゲル（実線）における、例３に述べた腫瘍細胞移植後の生存率を示す。例１３の試験に述べたヒト血漿への、例７に従って調製したＨＡエステルに共有結合したパクリタキセルの放出百分率の経時変化を示す。

Claims

ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンであって、
前記共有結合は、当該タキサンの水酸基と前記ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体のカルボキシル基若しくは水酸基、又は脱アセチル化された前記ヒアルロン酸のアミノ基との間で、選択的に当該タキサンを前記ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に結合させるスペーサーを用いて、形成され、且つ、
該スペーサーは、ヒドラジドとは異なる、ことを特徴とするタキサン。
当該タキサンは、パクリタキセル及びドセタキセルからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
当該タキサンは、パクリタキセルであることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記ヒアルロン酸は、４００乃至４×１０^６ダルトンの分子量を有することを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記ヒアルロン酸は、４００乃至１×１０^６ダルトンの分子量を有することを特徴とする請求項４に記載のタキサン。
前記ヒアルロン酸は、４００乃至２３０，０００ダルトンの分子量を有することを特徴とする請求項４に記載のタキサン。
前記ヒアルロン酸は、有機及び／又は無機塩基で加塩されていることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記ヒアルロン酸誘導体は、脂肪族化合物、脂環族化合物、環状脂肪族化合物、芳香族化合物、環状化合物及びヘテロ環状化合物のアルコールとヒアルロン酸とのエステル体からなる群から選択され、
該エステル体は、５０％以下のエステル化率を有することを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記ヒアルロン酸誘導体は、脂肪族化合物、脂環族化合物、環状脂肪族化合物、芳香族化合物、環状化合物及びヘテロ環状化合物のアルコールとヒアルロン酸とのアミド体からなる群から選択され、
該アミド体は、０．１乃至１０％のアミド化率を有することを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記ヒアルロン酸誘導体は、４級以下の硫黄塩であって、ヒアルロン酸−Ｏ−硫酸化誘導体からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記ヒアルロン酸誘導体は、１５％以下のエステル化率を有するヒアルロン酸の内部エステルからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記ヒアルロン酸誘導体は、Ｎ−アセチル−グルコサミン単位の脱アセチル化に由来し０．１乃至３０％の脱アセチル化度を有する、ヒアルロン酸の脱アセチル体からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記ヒアルロン酸誘導体は、Ｎ−アセチル−グルコサミン単位の１級水酸基を酸化して得られ、１乃至１００％の過カルボキシル化度を有する、ヒアルロン酸の過カルボキシル化誘導体からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記共有結合は、当該タキサンの水酸基と、前記ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の水酸基との間に形成されることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記共有結合は、当該タキサンの水酸基と、前記ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体のカルボキシル基との間に形成されることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記共有結合は、当該タキサンの水酸基と、脱アセチル化されたヒアルロン酸のアミノ基との間に形成されることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
当該タキサンを前記ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に結合する前記スペーサーは、水酸基、カルボキシル基、カルボニル基、エポキシド、アシルクロライド、チオール、ニトリル、ハロゲン、無水物、イソシアネート、イソチオシアネート及びアミノ基からなる群から選択された１つ以上の基で置換された、直鎖又は分岐の、脂肪族又は脂環族鎖からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記スペーサーは、臭素で置換された、脂肪族又は脂環族鎖において２乃至１８の炭素原子を有するカルボン酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項１７に記載のタキサン。
前記スペーサーは、臭素で置換された、脂肪族又は脂環族鎖において３乃至１０の炭素原子を有するカルボン酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項１７に記載のタキサン。
前記スペーサーは、３−ブロモプロピル酸及び４−ブロモブチル酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項１７に記載のタキサン。
前記共有結合は、前記スペーサーと、前記ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の水酸基との間のエステル結合であることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記共有結合は、前記スペーサーと、前記ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の水酸基との間のウレタン又はチオウレタン結合であることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記共有結合は、前記スペーサーと、前記ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の水酸基との間のエーテル結合であることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記共有結合は、前記スペーサーと、前記ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の水酸基との間のアセタール又はケタール結合であることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記共有結合は、前記ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の水酸基と、当該タキサンとの間のアセタール結合であることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記共有結合は、前記スペーサーと、前記ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体のカルボキシル基との間のエステル結合であることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記共有結合は、前記スペーサーと、前記ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体のカルボキシル基との間のアミド結合であることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記共有結合は、前記ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体のカルボキシル基と、当該タキサンの水酸基との間のエステル結合であることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記共有結合は、前記スペーサーと、脱アセチル化されたヒアルロン酸のアミノ基との間のアミド結合であることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記共有結合は、前記スペーサーと、脱アセチル化されたヒアルロン酸のアミノ基との間のウレタン又はチオウレタン結合であることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記共有結合は、脱アセチル化されたヒアルロン酸のアミノ基と、当該タキサンの水酸基との間のウレタン結合であることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記ヒアルロン酸は、当該タキサンと共有結合を形成した後、エステル化されることを特徴とする請求項８に記載のタキサン。
前記ヒアルロン酸は、当該タキサンと共有結合を形成した後、エステル化されることを特徴とする請求項１１に記載のタキサン。
前記共有結合は、当該タキサンと、前記スペーサーとの間のエステル結合であることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記共有結合は、当該タキサンと、前記スペーサーとの間のウレタン又はチオウレタン結合であることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記共有結合は、当該タキサンと、前記スペーサーとの間のアセタール又はケタール結合であることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記ヒアルロン酸と、当該タキサンとの間の結合率は、０．１乃至１００％であることを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
前記ヒアルロン酸と、当該タキサンとの間の結合率は、０．１乃至３５％であることを特徴とする請求項３８に記載のタキサン。
前記ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体は、当該タキサンの抗ガン作用を促進することを特徴とする請求項１に記載のタキサン。
ヒアルロン酸の内部エステルは、当該タキサンの抗ガン作用を促進することを特徴とする請求項１１に記載のタキサン。
前記ヒアルロン酸は、当該タキサンの抗ガン作用を促進することを特徴とする請求項２６に記載のタキサン。
活性物質として、請求項１乃至４１のいずれか一項に記載のヒアルロン酸又はヒアルロン酸に共有結合したタキサンを少なくとも有し、薬学的に許容な賦形剤及び希釈剤と組み合わせたことを特徴とする薬学的組成物。
経口、静脈、動脈、筋中、皮下、腹腔若しくは軽皮により投与され、或いは、腫瘍部位に直接注入されることを特徴とする請求項４２に記載の薬学的組成物。
経口により投与されることを特徴とする請求項４２に記載の薬学的組成物。
前記ヒアルロン酸又は前記ヒアルロン酸誘導体は、前記タキサンから投与部位に放出され得ることを特徴とする請求項４２に記載の薬学的組成物。
１つ以上の生物学的又は薬理学的活性物質をさらに有することを特徴とする請求項４２乃至４５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
前記生物学的又は薬理学的活性物質は、ステロイド、ホルモン、局所因子、タンパク質、ビタミン、非ステロイド性抗炎症剤、化学療法剤、カルシウムブロッカー、抗菌剤、抗ウィルス剤、インターロイキン及びサイトカインからなる群から選択されることを特徴とする請求項４６に記載の薬学的組成物。
前記生物学的又は薬理学的活性物質は、インターフェロンであることを特徴とする請求項４６に記載の薬学的組成物。
腫瘍の処置に有用な薬学的組成物の調製への、請求項１乃至４１のいずれか一項に記載のヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンの使用。
前記の腫瘍の処置は、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、メラノーマ、肺癌、肝臓癌、前立腺癌、膀胱癌、胃癌、腸癌、白血病及び／又はカポジ肉腫に対する化学療法であることを特徴とする請求項４９の使用。
自己免疫疾患の処置に有用な薬学的組成物の調製への、請求項１乃至４１のいずれか一項に記載のヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンの使用。
前記自己免疫疾患は、リューマチ、橋本病、全身性エリテマトーデス及び自己免疫性糸球体腎炎からなる群から選択されることを特徴とする請求項５１の使用。
再狭窄の処置に有用な薬学的組成物の調製への、請求項１乃至４１のいずれか一項に記載のヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンの使用。
ステント及び医療用器具のコーティングへの、請求項１乃至４１のいずれか一項に記載のヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンの使用。
請求項１乃至４１のいずれか一項に記載のヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンによりコートされたステント及び医療用器具。
ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンの調製方法であって、前記共有結合は、エステル結合であり、当該方法は：
Ａ）前記タキサンの水酸基又は前記ヒアルロン酸若しくはヒアルロン酸誘導体のカルボキシル基を活性剤で活性化するステップ；
Ｂ）前記ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体を、適切な溶媒に溶解した前記タキサンに添加するステップ；及び
Ｃ）上述の通りに得た産物を任意で精製するステップ；
を有することを特徴とする方法。
ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンの調製方法であって、前記共有結合は、エステル結合であり、当該方法は：
Ａ’）前記タキサンの臭化物又はトシル化物を調製するステップ；
Ｂ）ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体のカルボキシル基により、前記ステップＡ’）のタキサンの臭化物又はトシル化物の求核置換を実行するステップ；及び
Ｃ）上述の通りに得た産物を任意で精製するステップ；
を有することを特徴とする方法。
ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンの調製方法であって、前記共有結合は、ウレタン又はチオウレタン結合であり、当該方法は：
Ｄ）タキサンの水酸基を活性剤で活性化するステップ；
Ｅ）適切な溶媒に溶解した脱アセチル化されたヒアルロン酸を添加するステップ；及び
Ｆ）上述の通りに得た産物を任意で精製するステップ；
を有することを特徴とする方法。
ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンの調製方法であって、前記共有結合は、アセチル結合であり、当該方法は：
Ｇ）適切な溶媒にヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体及び前記タキサンを含有する溶液を調製するステップ；
Ｈ）ホルムアルデヒド等の簡単なカルボニル化合物を添加するステップ；並びに
Ｉ）上述の通りに得た産物を任意で精製するステップ；
を有することを特徴とする方法。
少なくともカルボキシル基を有しエステル結合によりヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の水酸基を結合するスペーサーにより、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンの調製方法であって：
Ｌ）前記タキサンに前もって結合される可能性のある、前記スペーサーのカルボキシル基を活性化するステップ；
Ｍ）ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体を添加するステップ；及び
Ｎ）上述の通りに得た産物を任意で精製し、前記スペーサーが結合されていない場合、前記タキサンと反応させるステップ；
を有することを特徴とする方法。
少なくともカルボキシル基を有しエステル結合によりヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の水酸基を結合するスペーサーにより、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンの調製方法であって：
Ｌ’）ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の水酸基をトシル基又はブロモ基で置換するステップ；
Ｍ’）前記タキサンに前もって結合される可能性のある、前記スペーサーを添加するステップ；及び
Ｎ’）上述の通りに得た産物を任意で精製し、前記スペーサーが結合されていない場合、前記タキサンと反応させるステップ；
を有することを特徴とする方法。
少なくとも無水物基を有しエステル結合によりヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の水酸基を結合するスペーサーにより、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンの調製方法であって：
Ｌ’’）前記スペーサーを、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体を含有する溶液に添加するステップ；
Ｍ’’）上述の通りに得た産物を任意で精製するステップ；及び
Ｎ’’）前記ステップＬ’’）及びＭ’’）に由来する産物を、前記タキサンと反応させるステップ；
を有することを特徴とする方法。
少なくともアミノ基を有しウレタン又はチオウレタン結合によりヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の水酸基を結合するスペーサーにより、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンの調製方法であって：
Ｏ）ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の水酸基を、活性剤で活性化するステップ；
Ｐ）前記タキサンに前もって結合される可能性のある、前記スペーサーを添加するステップ；及び
Ｑ）上述の通りに得た産物を任意で精製し、前記スペーサーが結合されていない場合、前記タキサンと反応させるステップ；
を有することを特徴とする方法。
少なくともイソシアネート又はイソチオシアネート基を有しウレタン又はチオウレタン結合によりヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の水酸基を結合するスペーサーにより、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンの調製方法であって：
Ｏ’）前記タキサンに前もって結合される可能性のある、前記スペーサーを有する溶液に、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体を添加するステップ；及び
Ｎ’）上述の通りに得た産物を任意で精製し、前記スペーサーが結合されていない場合、前記タキサンと反応させるステップ；
を有することを特徴とする方法。
少なくともエポキシ基を有しエーテル結合によりヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の水酸基を結合するスペーサーにより、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンの調製方法であって：
Ｒ）酸又は塩基の存在下で、前記タキサンに前もって結合される可能性のある、前記スペーサーを有する溶液に、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体を添加するステップ；及び
Ｓ）上述の通りに得た産物を任意で精製し、前記スペーサーが結合されていない場合、前記タキサンと反応させるステップ；
を有することを特徴とする方法。
少なくとも水酸基を有しエーテル結合によりヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の水酸基を結合するスペーサーにより、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンの調製方法であって：
Ｒ’）ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の水酸基をトシル基又はブロモ基で置換するステップ；
Ｓ’）塩基環境下で、該ステップＲ’）に由来する産物に、前記スペーサーを添加するステップ；
Ｔ’）上述の通りに得た産物を任意で精製するステップ；
Ｕ’）前記ステップＳ’）及びＴ’）に由来する産物を、前記タキサンと反応させるステップ；
を有することを特徴とする方法。
少なくともカルボニル基を有しアセタール又はケタール結合によりヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の水酸基を結合するスペーサーにより、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンの調製方法であって：
Ｖ）塩基環境下で、前記スペーサーを、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体を含有する溶液に添加するステップ；
Ｗ）上述の通りに得た産物を任意で精製するステップ；及び
Ｚ）前記ステップＶ）及びＷ）に由来する産物を、前記タキサンと反応させるステップ；
を有することを特徴とする方法。
少なくとも水酸基を有しアセタール又はケタール結合によりヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の水酸基を結合するスペーサーにより、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンの調製方法であって：
Ｖ’）ホルムアルデヒド等の簡単なカルボニル化合物を、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体及び前記タキサンに前もって結合される可能性のある、前記スペーサーを有する溶液に添加するステップ；及び
Ｗ’）上述の通りに得た産物を任意で精製し、前記スペーサーが結合されていない場合、前記タキサンと反応させるステップ；
を有することを特徴とする方法。
少なくとも水酸基を有しエステル結合によりヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体のカルボキシル基を結合するスペーサーにより、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンの調製方法であって：
ａ）活性剤を、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体を有する溶液に添加するステップ；
ｂ）該ステップａ）に由来する溶液に、前記タキサンに前もって結合される可能性のある、前記スペーサーを添加するステップ；及び
ｃ）上述の通りに得た産物を任意で精製し、前記スペーサーが結合されていない場合、前記タキサンと反応させるステップ；
を有することを特徴とする方法。
少なくとも臭素等のハロゲン基を有しエステル結合によりヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体のカルボキシル基を結合するスペーサーにより、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンの調製方法であって：
ａ’）前記タキサンに前もって結合される可能性のある、前記スペーサーを、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体を有する溶液に添加するステップ；及び
ｂ’）上述の通りに得た産物を任意で精製し、前記スペーサーが結合されていない場合、前記タキサンと反応させるステップ；
を有することを特徴とする方法。
少なくともアミノ基を有しアミド結合によりヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体のカルボキシル基を結合するスペーサーにより、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に共有結合したタキサンの調製方法であって：
ｄ）活性剤を、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体を有する溶液に添加するステップ；
ｅ）該ステップｄ）に由来する溶液に、前記タキサンに前もって結合される可能性のある、前記スペーサーを添加するステップ；及び
ｆ）上述の通りに得た産物を任意で精製し、前記スペーサーが結合されていない場合、前記タキサンと反応させるステップ；
を有することを特徴とする方法。
少なくともカルボキシル基を有しアミド結合により脱アセチル化したヒアルロン酸のアミノ基を結合するスペーサーにより、脱アセチル化したヒアルロン酸に共有結合したタキサンの調製方法であって：
ｇ）前記タキサンに前もって結合される可能性のある、前記スペーサーのカルボキシル基を、活性剤で活性化するステップ；
ｈ）脱アセチル化したヒアルロン酸を有する溶液を添加するステップ；
ｉ）上述の通りに得た産物を任意で精製し、前記スペーサーが結合されていない場合、前記タキサンと反応させるステップ；
を有することを特徴とする方法。
少なくとも水酸基を有しウレタン又はチオウレタン結合により脱アセチル化したヒアルロン酸のアミノ基を結合するスペーサーにより、脱アセチル化したヒアルロン酸に共有結合したタキサンの調製方法であって：
ｌ）前記タキサンに前もって結合される可能性のある、前記スペーサーの水酸基を、活性剤で活性化するステップ；
ｍ）脱アセチル化したヒアルロン酸を有する溶液を添加するステップ；
ｉ）上述の通りに得た産物を任意で精製し、前記スペーサーが結合されていない場合、前記タキサンと反応させるステップ；
を有することを特徴とする方法。