PL216861B1

PL216861B1 - Taksany kowalencyjnie związane z kwasem hialuronowym lub pochodnymi kwasu hialuronowego, sposób ich otrzymywania, kompozycja je zawierająca oraz zastosowanie

Info

Publication number: PL216861B1
Application number: PL392566A
Authority: PL
Inventors: Luca Gilda De; Bettolo Rinaldo Marini; Luisa Maria Migneco
Original assignee: Fidia Farmaceutici
Priority date: 2002-10-18
Filing date: 2003-10-10
Publication date: 2014-05-30
Also published as: PT1560854E; EP1560854A2; NO20052399L; HRP20050416A2; EP1560854B1; IL168086A; WO2004035629A8; AU2003267441A1; US7897584B2; NO333042B1; ITPD20020271A1; US8034795B2; BR0315431A; HK1082753A1; KR20050065595A; AU2003267441B2; US20110159052A1; CA2783175A1; KR101076414B1; CN1705683B

Description

Opis wynalazku

Zakres wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku są taksany, w szczególności paklitaksel i docetaksel, kowalencyjnie związane z kwasem hialuronowym lub pochodnymi kwasu hialuronowego, sposób ich wytwarzania i ich zastosowanie w dziedzinie onkologii.

Stan techniki

Taksany, a w szczególności paklitaksel i docetaksel, obecnie sprzedawane pod nazwami handlowymi Taxol® i Taxotere®, są środkami przeciwrakowymi (Huizing M.T. i in., Cancer Inv., 1995, 13: 381-404), które wywierają działanie przeciwrozrostowe działając na organizację mikrotubul w układzie cytoszkieletowym komórki. Istotnie, przez hamowanie depolaryzacji mikrotubul, zapobiegają ich normalnej dynamicznej reorganizacji zachodzącej podczas mitotycznego podziału komórki (Manfredi J.J. i in., J. Cell Biol., 1982, 94: 688-696).

Głównymi leczniczymi wskazaniami dla paklitakselu są:

- leczenie zaawansowanego raka sutka;

- leczenie mięsaka Kaposiego;

- leczenie raka płuc (nie mikrocytomy);

- rak jajnika, oporny na standardową chemioterapię.

Ponadto, chemioterapia jest również stosowana do leczenia raka pęcherza, stercza i szyjki macicy.

Zważywszy, że paklitaksel jest nierozpuszczalny w wodzie, miesza się go z Cremophor® EL (olej rycynowy) - alkoholem etylowym w stosunku 1:1, w kompozycje farmaceutyczne obecnie stosowane w chemioterapii raka (Pfeifer R. W. i in., Am. J. Hosp. Pharm., 1993, 50:2520-2521). Taki prepa₂ rat jest zwykle stosowany do ciągłej dożylnej infuzji (od 3 do 24 godzin) w dawce 135-175 mg/m².

Obecność Cremophor® EL w powyższym preparacie jest główną przyczyną szkodliwych reakcji zwykle zachodzących podczas podawania paklitakselu, w zakresie od prostych ataków pokrzywki do duszności i skurczu oskrzeli, i nawet szoku anafilaktycznego (Weiss, R. B. i in., J. Clin. Oncol., 1990, 8: 1263-1268).

Z tego powodu, każdy pacjent, który ma otrzymywać terapię kompozycją farmaceutyczną kompozycją paklitaksel-Cremophor® EL, musi najpierw poddać się protokołowi wstępnej terapii, z podawaniem deksametazonu, ewentualnie w powiązaniu z antyhistaminą.

Pomimo tych środków zapobiegawczych, do 40% pacjentów, którzy otrzymują dożylną infuzję paklitakselu, wciąż doznają większych lub mniejszych szkodliwych reakcji.

Można więc powiedzieć, że preparat Taxol® obecnie w klinicznym stosowaniu, i sposoby stosowane do jego podawania, stanowią ograniczenie jego skuteczności. To jest powód, dla którego badania obecnie kierują się na syntezę nowych farmaceutycznych preparatów i/lub na nowe chemiczne preparaty powyższego leku przeciwrakowego, które są rozpuszczalne w wodzie.

Na przykład, badacze próbowali kapsułkować paklitaksel w liposomach, nanokapsułkach i mikrokulkach złożonych ze ścianki polimeru tworzonej przez biodegradujące kopolimery, takie jak poli(kwas mlekowy), i niebiodegradujące kopolimery, takie jak etylen-octan winylu.

Ponadto, wytworzono mikrokulki, napełnione paklitakselem, tworzone przez biodegradujący polimer, taki jak polifosfoester, dla wytworzenia układu przedłużonego uwalniania leku w miejscu traktowanym przy leczeniu raka płuc (Nuijen, B. i in., Investigational New Drugs, 2001, 19: 143-153).

Próbowano również wytwarzać micele leku przeciwrakowego przez strącanie paklitakselu w organicznym rozpuszczalniku z fosfatydylocholiną/solami kwasów żółciowych (Nuijen, B. i in., Investigational New Drugs, 2001, 19: 143-153).

Jednakże, te nowe systemy kapsułkowania paklitakselu mogą być powodować problemy z trwałością, wytwarzaniem i powtarzalnością.

Ponadto, próbowano rozpuszczać lek w cyklodekstrynie, lecz nowe preparaty nie dają poszukiwanych wyników (Nuijen, B. i in., Investigational New Drugs, 2001, 19: 143-153).

Poszukiwania z dziedzinie chemii nowych preparatów paklitakselu, które nadają lekowi lepszą rozpuszczalność w wodzie, zachowując jego skuteczność jako środek przeciwrakowy, doprowadziły do syntezy nowych analogów zmodyfikowanych w pozycjach C2^I i C7 (zgłoszenie patentowe US nr 2001/0018531), jak też do wytworzenia nowych proleków.

PL 216 861 B1

Proleki są leczniczo obojętnymi pochodnymi leków, które są aktywowane po wprowadzeniu do ciała. Tam, po spontanicznych procesach hydrolizy i/lub enzymatycznej degradacji, uwalnia się składnik czynny.

W świetle tego, i z powyżej podanych przyczyn, dokonano wielu wysiłków syntezy nowych proleków, które doprowadziły, na przykład, do wytworzenia leków takich jak acetylopaklitaksel (Mellado, W. i in., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1984, 124(2): 329-336), lub do syntezy nowych estrów tego leku z kwasem bursztynowym, glutarowym i sulfonowym na węglu w pozycji C2^I. Jednakże te estry okazały się nietrwałe w wodnym środowisku.

Ponadto zostały zsyntetyzowane pewne pochodne z fosfonoksyfenylopropionianową grupą estrową w pozycji C2^I lub C7, takie jak 2^I-węglan paklitakselu, i serię nowych estrów aminokwasów paklitakselu i ich pochodnych, z grupą glutarylową w pozycji C2^I.

Glutarylo-paklitakselo-asparagina i glutarylo-paklitakselo-glutamina okazały się dwoma najlepiej rozpuszczalnymi w wodzie produktami otrzymanymi metodą syntezy opisanej powyżej, lecz są one mniej skuteczne niż sam paklitaksel (Nuijen, B. i in., Investigational New Drugs, 2001, 19: 143-153).

Wiadomo również, że paklitaksel estryfikowano kwasem poli-L-glutaminowym z wytworzeniem nowej rozpuszczalnej w wodzie pochodnej chemioterapeutyku, ze znacząco wyższym czasem półtrwania w osoczu niż niesprzęgany paklitaksel (Li C. i in., Cancer Research, 1998, 58(11): 2404-2409).

Paklitaksel również derywatyzowano PEG (poli(glikol etylenowy)) przez estryfikację chemioterapeutyku w pozycji C2^I; jednakże, nowa cząsteczka okazała się wysoce rozpuszczalna w wodzie, lecz niezbyt trwała.

Na koniec, ostatnio opracowano nowy system dostarczania dla leku, przez sprzęganie paklitakselu z albuminą ludzkiej surowicy (HSA). Koniugat paklitaksel-HSA okazał się dobrze rozpuszczalny w wodzie i zdolny do przeniesienia 30 cząsteczek chemioterapeutyku. Jednakże doświadczenia przeprowadzone in vitro wykazały, że jest mniej skuteczny przeciwko rakowi niż sam paklitaksel (Nuijen, B. i in., Investigational New Drugs, 2001, 19:143-153).

Ostatnio, badacze zsyntetyzowali nowy system dostarczania dla paklitakselu estryfikowanego poprzednio zmodyfikowanym kwasem hialuronowym (dalej określanym jako ''HA), który jest HA poddanym reakcji z cząsteczkami hydrazydu związanymi z grupę karboksylową HA wiązaniem amidowym (Luo Y. i in., Biomacromolecules 2000, 1 (2): 208-218; opis patentowy US nr 5874417). Ten nowy system dostarczania dla paklitakselu pozwala na dostarczanie leku bezpośrednio do powierzchni błony docelowej komórki rakowej, charakteryzującej się nadekspresją receptora HA, CD44. Wskutek tego, paklitaksel związany z HA funkcjonalizowanym hydrazydem może się wiązać specyficznie z CD44 komórki rakowej, i może więc (dzięki procesowi endocytozy) wchodzić do cytoplazmy komórki, gdzie może być enzymatycznie uwalniany i aktywowany, wyzwalając inhibicję depolaryzacji tubuliny, a więc podziału komórkowego. Taki mechanizm selektywnego transportu leku jest nazywany dostarczaniem komórkowym.

Ponadto wiadomo, że HA można stosować jako nośnik dla leków przeciwrakowych w kompozycjach farmaceutycznych, w których HA jest połączony (i nie związany kowalencyjnie) z chemioterapeutykami, takimi jak paklitaksel, dla zwiększenia ich leczniczej skuteczności dzięki zjawisku dostarczania opisanemu powyżej (międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 00/41730) i obniżenia dawek zwykle wykazywanych w normalnych protokołach chemioterapii (międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 99/02151).

Na koniec, HA o niskiej masie cząsteczkowej i/lub jego lipidowe pochodne są znane z zastosowania do wytwarzania liposomów stosowanych do dostarczania leków, w tym leków przeciwrakowych, takich jak paklitaksel (międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 01/39815).

W świetle powiedzianego powyżej, odczuwa się wciąż zapotrzebowanie na nowe pochodne taksanów, które są trwałe i rozpuszczalne w wodzie, i leczniczo skuteczne co najmniej tak, jak niezmodyfikowane taksany.

Streszczenie wynalazku

Zgłaszający odkrył obecnie, że wiążąc kowalencyjnie taksany z HA lub pochodnymi HA, za pomocą przerywnika, otrzyma się trwałe i rozpuszczalne w wodzie produkty, przydatne do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do leczenia nowotworów.

Tak więc wynalazek dotyczy taksanu kowalencyjnie związanego z kwasem hialuronowym lub z pochodną kwasu hialuronowego, w którym kowalencyjne wiązanie za pośrednictwem przerywnika jest tworzone pomiędzy grupami hydroksylowymi taksanu i grupami karboksylowymi kwasu hialuronowego lub pochodnych kwasu hialuronowego i wiązanie pomiędzy grupami karboksylowymi kwasu hialuronowego lub jego pochodnych i przerywnikiem jest wiązaniem estrowym. Przerywnik łączący

PL 216 861 B1 taksan z kwasem hialuronowym lub pochodną kwasu hialuronowego, wybiera się z grupy obejmującej alifatyczne lub aralifatyczne łańcuchy, liniowe lub rozgałęzione, podstawione jedną lub większą liczbą grup wybranych spośród hydroksylu, karboksylu, karbonylu, epoksydu, chlorku acylu, tiolu, nitrylu, halogenu, bezwodnika, izocyjanianu, izotiocyjanianu i grup aminowych.

Pośród możliwych przerywników, kwasy karboksylowe mające od 2 do 18 atomów węgla w alifatycznym lub aralifatycznym łańcuchu, podstawione atomami bromu są korzystne, a w szczególności te mające od 3 do 10 atomów węgla; korzystniejsze są kwas 3-bromopropionowy i kwas 4-bromomasłowy.

Wynalazek dotyczy ponadto kompozycji farmaceutycznych zawierających jako czynną substancję co najmniej taksan kowalencyjnie związany z HA lub pochodnymi HA, i ich zastosowania w leczeniu nowotworów, takich jak rak sutka, rak jajnika i/lub szyjki macicy, czerniak, rak płuca, rak wątroby, stercza i/lub pęcherza, rak żołądka i/lub jelit, białaczka i mięsak Kaposiego, jak również do powlekania stentów.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania taksanów kowalencyjnie związanych z HA lub pochodnymi HA, za pośrednictwem przerywnika zdefiniowanego wyżej, obejmującego następujące etapy:

a) dodania karbodiimidu jako środka aktywującego do roztworu zawierającego kwas hialuronowy lub pochodną kwasu hialuronowego;

b) dodania przerywnika ewentualnie wcześniej związanego z taksanem do roztworu przychodzącego z etapu a);

c) ewentualnie oczyszczania tak otrzymanego produktu, i poddania reakcji z taksanem, jeśli nie był wcześniej związany z przerywnikiem.

W przypadku, gdy przerywnik ma co najmniej atom halogenu, i wiąże grupę karboksylową kwasu hialuronowego lub pochodnej kwasu hialuronowego wiązaniem estrowym, sposób obejmuje następujące etapy:

a') dodania przerywnika ewentualnie wcześniej związanego z taksanem, do roztworu kwasu hialuronowego lub pochodnej kwasu hialuronowego;

b') ewentualnie oczyszczania tak otrzymanego produktu, i poddanie reakcji z taksanem, jeśli nie był wcześniej związany z przerywnikiem.

Zgodnie z wynalazkiem kwas hialuronowy lub pochodna kwasu hialuronowego oraz wewnętrzny ester kwasu hialuronowego wzmacniają działanie przeciwrakowe taksanu.

Taksany kowalencyjnie związane z HA lub pochodnymi HA mają wiele zalet, które można podsumować jak następuje:

1) są one natychmiast rozpuszczalne w krwiobiegu;

2) nie wymagają mieszania z Cremophor® El dla wytworzenia preparatów, tak więc rozwiązują wspomniane wyżej problemy związane z nadwrażliwością i anafilaksją;

3) dzięki enzymatycznemu działaniu enzymów, takich jak esterazy zwykle obecne w osoczu, taksany są natychmiast uwalniane z nośnika HA lub pochodnej HA z kompozycji do krwi, gdzie mogą swobodnie wykazywać przeciwrakową aktywność;

4) pozwalają na otrzymanie nowego leku, który w przypadku pewnych typów raka mogą wywierać zaskakującą aktywność chemioterapeutyczną, która jest znacznie większa od uzyskiwanej przy podawaniu niesprzężonego taksanu, gdy bierze się pod uwagę takie same dawki leku.

Krótki opis rysunków

Fig. 1 pokazuje procentową wartość przeżywalności po implantacji komórek nowotworowych, jak opisano w przykładzie 1 dla prób kontrolnych (czarny histogram), i dla myszy, które otrzymały paklitaksel (szary histogram), i paklitaksel kowalencyjnie związany z estrem HA z 16% estryfikacji (biały histogram) wytworzony jak w przykładzie 7.

Fig. 2 pokazuje siłę farmakologiczną wyrażoną jako IC50 i wynikającą z eksperymentów w przykładzie 2, paklitakselu kowalencyjnie związanego z estrową pochodną HA mającą 16% estryfikacji (szary histogram), 22% estryfikacji (czarny histogram) i 6,8% estryfikacji (biały histogram) dla czterech linii komórkowych raka sutka, względem produktu odniesienia paklitakselu.

Fig. 3 pokazuje procent przeżywalności po implantacji komórek nowotworowych, jak opisano w przykładzie 3, u myszy kontrolnych (linia przerywana) i u myszy, które otrzymywały żel ACP® (linia ciągła).

Fig. 4 pokazuje procentową ilość paklitakselu kowalencyjnie związanego z estrem RA wytworzonym jak opisano w przykładzie 7, uwalnianym w ludzkim osoczu, jak opisano w teście w przykładzie 13, w funkcji czasu.

PL 216 861 B1

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek opisuje związki należące do rodziny taksanów, korzystnie paklitaksel i docetaksel dalej reprezentowane odpowiednio wzorami (I) i (II), kowalencyjnie związane z HA lub pochodnymi HA, za pomocą przerywnika jako połączenia pomiędzy składnikiem taksanowym i HA lub pochodną HA, kowalencyjnie związanego z obu cząsteczkami.

PL 216 861 B1

HA oznacza hetero-polisacharyd złożony z naprzemiennych reszt kwasu D-glukuronowego i N-acetylo-D-glukozaminy, mający następującą jednostkę powtarzalną:

HA jest liniowym polimerem z masą cząsteczkową, która może wahać się od 50000 do 13 x 10⁶ Da, zależnie od źródła i sposobu użytego do wytwarzania. Występuje w naturze w okołokomórkowych żelach, w podstawowej substancji tkanki łącznej w organizmach kręgowców (w której jest jednym z głównych składników), w płynie maziówkowym stawów, w cieczy szklistej i w pępowinie. HA gra ważną rolę w biologicznym organizmie, jako mechaniczne oparcie dla komórek wielu tkanek, takich jak skóra, ścięgna, mięśnie i chrząstki. Jest głównym składnikiem matrycy pozakomórkowej, lecz ma inne funkcje, takie jak uwodnienie tkanek, smarowanie oraz migracja i różnicowanie komórek.

HA użyty w niniejszym wynalazku można ekstrahować z dowolnego źródła, np. z grzebieni kogutów, lub można otrzymać przez fermentację, lub metodą technologiczną, i może mieć masę cząsteczkową pomiędzy 400 i 3 x 10⁶ Da, w szczególności pomiędzy 400 i 1 x 10⁶ Da, i korzystnie, pomiędzy 400 i 230000 Da.

Pochodne HA według niniejszego wynalazku są wybrane z grupy obejmującej następujące pochodne HA:

- HA wysolone organicznymi i/lub nieorganicznymi zasadami;

- Hyaff®: estry HA z alkoholami serii alifatycznej, aralifatycznej, cykloalifatycznej, aromatycznej, cyklicznej i heterocyklicznej, ze zmiennym stopniem estryfikacji w zależności od typu i długości użytego alkoholu, i nigdy nie przekraczającym 50% estryfikacji, i korzystnie pomiędzy 0,1 i 20%, ponieważ końcowy polimer, który otrzymuje się, musi zawsze być rozpuszczalny w wodzie, podczas gdy reszta nieestryfikowanego HA może być wysolona organicznymi i/lub nieorganicznymi zasadami, ujawnionymi w opisie patentowym US nr 4851521 dołączanym jako odnośnik;

- Hyadd™: amidy HA z aminami z serii alifatycznej, aralifatycznej, cykloalifatycznej, aromatycznej, cyklicznej i heterocyklicznej, z procentem amidowania pomiędzy 0,1 i 10%, ponieważ końcowy polimer musi zawsze być rozpuszczalny w wodzie, podczas gdy pozostały procent HA nie amidowanego może być wysolony organicznymi i/lub nieorganicznymi zasadami, ujawnionymi w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 1095064 dołączanym jako odnośnik;

- O-siarczanowane pochodne HA do czwartego stopnia siarczanowania, ujawnione w opisie patentowym US nr 6027741 dołączanym jako odnośnik;

- ACP®: wewnętrzne estry HA z procentem estryfikacji nie większym niż 15%, ponieważ polimer musi zawsze być rozpuszczalny w wodzie, korzystnie pomiędzy 0,05 i 10% estryfikacji, podczas gdy pozostały procent HA nie estryfikowanego może być wysolony organicznymi i/lub nieorganicznymi zasadami, ujawnionymi w europejskim opisie patentowym nr 0341745 B1 dołączanym jako odnośnik;

- deacetylaty HA: pochodzą z deacetylowania jednostki N-acetylo-glukozaminy z procentowym deacetylowaniem korzystnie pomiędzy 0,1 i 30%, podczas gdy wszystkie grupy karboksylowe HA mogą być wysolone organicznymi i/lub nieorganicznymi zasadami, jak wskazuje następująca struktura (A):

PL 216 861 B1

Deacetylaty HA ujawnia międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 02/18450 dołączane jako odnośnik;

- Hyoxx™: perkarboksylowane pochodne HA otrzymane przez utlenianie pierwszorzędowego hydroksylu jednostki N-acetyloglukozaminy ze stopniem perkarboksylowania pomiędzy 1 i 100%, korzystnie pomiędzy 25 i 75%. Wszystkie grupy karboksylowe HA mogą być wysolone organicznymi i/lub nieorganicznymi zasadami jak ilustruje następująca struktura (B):

Perkarboksylowane pochodne HA ujawniono w zgłoszeniu patentowym US nr US 2003181689.

Ponadto, niniejsze związki, w których taksan, a w szczególności paklitaksel, jest kowalencyjnie związany z estrem HA, można otrzymać rozpoczynając od cząsteczek chemicznie niemodyfikowanego HA i, po syntezie z chemioterapeutykiem, modyfikując HA przez estryfikowanie go wszystkimi alkoholami wymienionymi powyżej dla produktów Hyaff®, lub tworząc wewnętrzne estry, jak w przypadku ACP® (patrz przykład 8).

Poprzednio wymienione pochodne HA, które są szczególnie ważne w sposobie syntezy proleku HA-taksan, i w szczególności proleku HA-paklitaksel, są deacetylowanymi i siarczanowanymi pochodnymi, ponieważ przy tej samej ilości procentowej paklitakselu związanego z poprzednio niezmodyfikowanym kwasem hialuronowym, powodują, że końcowy produkt jest bardziej rozpuszczalny w krwiobiegu.

Wiadomo, że za pośrednictwem receptora błony CD44, HA moduluje wiele różnych procesów w odniesieniu do fizjologii i biologii komórki, takich jak rozrost, różnicowanie i poruszanie komórek rakowych i innych.

Naukowa literatura wykazała ostatnio skuteczność HA przeciwko rakowi, gdy HA jest wstrzykiwany jako taki bezpośrednio do miejsca wzrostu raka. Można było stwierdzić pełną regresję 30% nowotworów (Herrera-Gayol, A. i in., Experimental and Molecular Pathology, 2002, 72: 179-185).

Wiadomo również, że HA można powiązać z dowolnym chemioterapeutykiem dla wytworzenia wielu różnych kompozycji farmaceutycznych, ponieważ może działać jako drugi środek przeciwnowotworowy, który synergicznie polepsza działanie przeciwrakowe leku powiązanego z nim (międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 01/47561); alternatywnie, HA zastrzega się jako lek przeciwrakowy podawany sam w różnych klinicznych protokołach redukcji/regresji wzrostu raka (międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 97/40841).

PL 216 861 B1

Niniejszy taksan kowalencyjnie związany z HA lub pochodnymi HA, jak wspomniano powyżej, różni się od wszystkich preparatów taksanów. W szczególności kowalencyjne związanie paklitakselu z HA lub pochodnymi HA, ewentualnie za pośrednictwem przerywnika, powoduje, że paklitaksel jest rozpuszczalny w wodzie, bez zmniejszania jego farmakologicznej skuteczności.

Istotnie, eksperyment in vivo opisany w przykładzie 1 wyraźnie pokazuje taką samą przeciwrakową skuteczność niniejszego sprzęganego paklitakselu i niesprzęganego paklitakselu, gdy podaje się te same dawki.

Ponadto, HA-paklitaksel może wykazać niespodziewane farmakologiczne właściwości, które są różne od właściwości niesprzężonego paklitakselu, zwłaszcza w przypadku pewnych typów nowotworu.

Istotnie, przykład 2 wyraźnie wykazuje, że niniejsza pochodna estrowa HA związana z paklitakselem ma nową przeciwnowotworową farmakologiczną aktywność: w modelu cytotoksyczności in vitro opisanym dalej, niniejszy HA-paklitaksel pokazuje zaskakującą przeciwrakową aktywność znacznie lepszą do wywieranej przez sam niesprzężony paklitaksel.

Ta nowa przeciwnowotworowa właściwość oznacza, że niniejsze taksany, w szczególności paklitaksel, sprzężone z HA lub pochodnymi HA, można stosować dla wytwarzania kompozycji farmaceutycznych przydatnych jako chemioterapeutyki, nie tylko do leczenia wszystkich form nowotworu, dla których podaje się Taxol®, lecz również dla innych form nowotworu nie leczonych zwykle TaxoIem®, takich jak rak żołądka i wątroby, rak okrężnicy, czerniak i białaczka. Ponadto, można go stosować do leczenia restenozy i w układowej autoalergii, takiej jak reumatoidalne zapalenie stawów, układowy toczeń rumieniowaty, autoalergiczne zapalenie kłębuszków nerkowych i, na koniec, zapalenie tarczycy Hashimoto.

Zastosowanie niniejszych produktów w nowej farmakologicznej terapii powyższych patologii jest możliwe, ponieważ nowy związek HA-paklitaksel zmniejsza układową toksyczność Taxol®, a więc zwiększa leczniczą skuteczność samego leku, ponieważ jest on:

- rozpuszczalny w wodzie;

- nie związany z Cremophor® EL, a więc wolny od toksycznych efektów powodowanych przez niego;

- równie skuteczny przy dawkach zdecydowanie niższych (lub równych) niż normalnie stosowane w klinicznych protokołach.

Również znane jest zastosowanie paklitakselu jako leku do stosowania do hamowania procesu restenozy ogólnie następującego po angioplastyce (głównie tętniczej), przepływach omijających wieńcowych i przeszczepach narządów.

Niniejsze taksany, i w szczególności paklitaksel, kowalencyjnie związane z HA lub pochodnymi HA można również stosować do tworzenia wewnętrznej powłoki dla stentów po powyżej wymienionych operacjach na naczyniach, ponieważ okazało się możliwe związanie go chemicznie z powierzchnią stentów lub łatwej adsorpcji na nich. Niniejsze takasany można stosować także do zapobiegania restenozie lub do tworzenia powłoki na innych, niż stenty, urządzeniach implantowanych.

Estrowe pochodne HA z paklitakselem wytworzone zgodnie z przykładami zastosowano do wytworzenia wewnętrznej powłoki na stentach. W każdym przypadku, czas przebywania niniejszych produktów na powierzchni stentu, i wskutek tego jego stopniowego uwalniania do krwiobiegu, jest dłuższy niż dla niesprzężonego paklitakselu, ponieważ chemiczno-fizyczna charakterystyka HA sprzyja postępującemu, powolnemu lecz ciągłemu uwalnianiu Taxol® z powierzchni urządzenia.

Kompozycje farmaceutyczne zawierające niniejsze taksany kowalencyjnie związane z HA lub pochodnymi HA można podawać układowo (drogą dożylną lub tętniczą, domięśniową, dootrzewnową, podskórną lub doustną), można je stosować do miejscowego stosowania (przez absorpcję przezskórną), lub można ją podawać bezpośrednio w miejsce raka przez iniekcję.

HA lub jego pochodna kowalencyjnie związana z paklitakselem, może również działać sam jako lek przeciwrakowy.

W następującym przykładzie 3, zgłaszający wykazuje, jak traktowanie wzrostu eksperymentalnie indukowanego nowotworu u nagich myszy sieciowaną pochodną HA, ACP®, powoduje znaczącą regresję nowotworu w porównaniu z niepotraktowanymi zwierzętami kontrolnymi.

Zgłaszający opisuje więc po raz pierwszy nową rolę HA i jego pochodnych stanowiących niniejsze produkty taksan-HA lub taksan-pochodna HA, jako środków przeciwnowotworowych i ich odpowiednie zastosowanie w dziedzinie onkologii.

PL 216 861 B1

Niniejsze taksany kowalencyjnie związane z HA lub pochodnymi HA mogą, ponadto, być związane z różnymi biologicznie i farmakologicznie czynnymi cząsteczkami, takimi jak, np. steroidy, hormony, białka, czynniki troficzne, witaminy, niesterydowe leki przeciwzapalne, chemioterapeutyki, związki antagonistyczne wapnia, antybiotyki, środki przeciwwirusowe, interleukiny i cytokiny, takie jak interferon.

W ten sposób jest możliwe wytworzenie wielu różnych połączeń powyższych leków i odpowiednich różnych kompozycji farmaceutycznych zawierających taksany według wynalazku.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także sposób wytwarzania niniejszych taksanów, w szczególności paklitakselu, kowalencyjnie związanych z HA lub pochodnymi HA; niniejsze produkty mogą być uzyskiwane przez bezpośrednią lub pośrednią syntezę obejmującą wprowadzanie przerywnika pomiędzy taksan i HA lub pochodną HA.

Grupy funkcyjne HA lub pochodnych HA, które mogą reagować z taksanem pośrednio za pośrednictwem przerywnika, są grupami karboksylowymi.

Reakcję pomiędzy grupami karboksylowymi HA lub pochodnych HA i taksanem takim jak paklitaksel, można uzyskać w procesie bezpośredniej lub pośredniej syntezy.

Pośrednia synteza może prowadzić do tworzenia następujących typów kowalencyjnego wiązania pomiędzy przerywnikiem i HA lub pochodnymi HA:

wiązanie estrowe:

- grupę karboksylową dogodnie wybranego przerywnika, takiego jak kwas 4-bromomasłowy, aktywuje się środkiem aktywującym, takim jak karbodiimid, a więc przygotowuje do syntezy z hydroksylową grupą taksanu (korzystnie na atomie węgla przy C2^I), takiego jak paklitaksel. Z kolei, przez bezpośredni kontakt w bezwodnym rozpuszczalniku z czwartorzędową solą amoniową, w szczególności solą tetrabutyloamoniową (TBA) HA lub pochodnej HA, otrzyma się nukleofilowe podstawienie karboksylu HA lub pochodnej HA atomu bromu przerywnika. W ten sposób powstaje wiązanie estrowe pomiędzy HA lub pochodną HA i przerywnikiem, z kolei związanym z paklitakselem. Alternatywnie, nukleofilowe podstawienie grupy karboksylowej HA lub pochodnej HA atomu bromu przerywnika może zajść przed wiązaniem pomiędzy samym przerywnikiem i taksanem (schemat 1 poniżej).

- stosując środki aktywujące grupę karboksylową HA lub pochodnej HA takie jak karbodiimid, możliwe jest wytworzenie wiązania estrowego pomiędzy grupą i hydroksylową grupą funkcyjną (dogodnie wybranego) przerywnika, wcześniej lub następnie związanego z paklitakselem (schemat 2 poniżej).

wiązanie amidowe:

- aktywacja grupami karboksylowymi HA lub pochodnych HA środkiem aktywującym, pozwala na związanie z grupą aminową dogodnie wybranego przerywnika, poza wszystkimi hydrazydami, wcześniej lub następnie wiązanej z taksanem, takim jak paklitaksel (schemat 3 poniżej).

PL 216 861 B1

Bezpośrednia synteza może prowadzić do tworzenia następujących typów kowalencyjnego wiązania:

wiązanie estrowe:

- aktywacja grup karboksylowych HA lub pochodnej HA środkiem aktywującym, pozwala na wiązanie z grupą hydroksylową taksanu (schemat 14 poniżej);

- aktywacja hydroksylu składnika taksanowego środkiem aktywującym pozwala na wiązanie z karboksylową grupą funkcyjną HA lub jego pochodnej (schemat 4);

- następujący typ wiązanie wymaga bromku lub tosylanu taksanu. Wiązanie wytwarza się metodą nukleofilowego podstawienia bromkowej lub tosylowej grupy przez grupę karboksylową HA lub pochodnej HA (schemat 5).

PL 216 861 B1

Schemat 5

W taki sam sposób, wiązanie wykorzystujące przerywnik i taksan, taki jak paklitaksel, może być typu estru (schemat 6), uretanu lub tiouretanu (schemat 7), acetalu lub ketalu (schemat 8) i może wymagać obecności środka aktywującego, zwłaszcza dla wiązań estrowych i uretanowych.

PL 216 861 B1

Schemat 6

Przerywnik może być wiązany z taksanem, takim jak paklitaksel, przed lub po jego związaniu z grupą funkcyjną HA lub pochodnych HA, zależnie od typu grup funkcyjnych dogodnie wybranego przerywnika.

Procent bezpośredniego lub pośredniego wiązania taksanu, takiego jak paklitaksel, z HA lub pochodną HA może się wahać pomiędzy 0,1% i 100% i korzystnie pomiędzy 0,1% i 35%.

Poniższe przykłady podano dla uzyskania nie ograniczających przykładów niniejszego wynalazku.

P r z y k ł a d 1

Wpływ nowej pochodnej estrowej HA z paklitakselem u nagich myszy po implantacji komórek nowotworowych

W tym eksperymencie, użyto ludzkich komórek gruczolakoraka jajnika, komórek OVCAR-3, w immunosupresyjnych nagich myszy należących do odmiany Athymic CD-1.

Każdej myszy wszczepiono dootrzewnowe 5x10⁶ komórek rakowych.

Projekt eksperymentu

Testowane leki:

Taxol®, potraktowano 5 zwierząt

PL 216 861 B1

HYTAD1p20: estrowa pochodna HA kowalencyjnie związana z paklitakselem z 16% estryfikacji karboksylu (wagowo). Masa cząsteczkowa HA użytego do syntezy tego nowego leku wynosiła 200000 Da (szczegóły wytwarzania patrz przykład 7). Przy tym leku użyto pięć zwierząt.

Potraktowane zwierzęta: 10 zwierząt najpierw zaszczepiono komórkami OVCAR-3. Pięć użyto do eksperymentu z Taxol® i inne pięć do eksperymentu z HYTAD1p20:

wszystkie 10 zwierząt z kolei otrzymało, przez dootrzewnową iniekcję, 3 dawki farmakologicznej terapii (w dniu 6, 13 i 20 po wszczepieniu komórek rakowych), równe 20 mg/kg masy ciała Taxol® lub 125 mg/kg masy ciała HYTAD (odpowiada 20 mg/mysz paklitakselu).

Zwierzęta kontrolne: 5 zwierząt najpierw zaszczepiono indukującą raka zawiesiną komórek OVCAR-3, po czym nie otrzymywały żadnej terapii.

Określanie krzywej przeżywalności

Krzywą przeżywalności obliczono od daty interwencji do 92 dnia po wszczepieniu komórek rakowych do otrzewnej.

Wyniki: otrzymane wyniki zilustrowano na fig. 1.

Trzy zwierzęta kontrolne rozwinęły gruczolakoraka jajnika i zdechły pomiędzy 70 i 75 dniem po wszczepieniu komórek rakowych.

dnia po interwencji, ostatniego dnia eksperymentu, żadne ze zwierząt, które otrzymało farmakologiczną terapię paklitakselem lub HYTAD, nie zdechło.

P r z y k ł a d 2

Eksperyment in vitro

Celem eksperymentu in vitro było głównie zdefiniowanie profilu aktywności nowej estrowej pochodnej HA związanej z paklitakselem i ocena/porównanie przeciwnowotworowej aktywności pochodnych HYTAD względem paklitakselu, a więc określenie ich farmakologicznego potencjału w porównaniu z lekiem przeciwnowotworowym.

Projekt eksperymentu:

Produkty testowane:

Taxol®: produkt odniesienia

HYTAD1p20 - HYTAD2p20 - HYTAD2p10: estrowe pochodne HA kowalencyjnie związane z paklitakselem z 16% estryfikacji karboksylu (wagowo) (w przypadku HYTAD1p20, masa cząsteczkowa HA użytego w syntezie tego nowego leku wynosi 200000 Da) (szczegóły jego wytwarzania, patrz przykład 7) lub 22% (w przypadku HYTAD2p20, masa cząsteczkowa użytego HA wynosi 39000 Da), lub 6,8% (w przypadku HYTAD2p10, masa cząsteczkowa użytego HA wynosi 39000 Da).

Linie komórek

Linie komórek pochodzenia ludzkiego

Użyto czterech linii komórek ludzkiego raka sutka. Wszystkie cztery testowe szczepy komórek normalnie reagują na paklitaksel i eksprymują receptor CD44 widocznie z tym samym wzmocnieniem.

- MCF-7

- MDA-MB-231

- MDA-MB-468

- SKBR-3

Protokół doświadczenia:

1) testowaną linię komórkową rozmieszczono w stężeniu 3000 komórek na dołek, w płaskodennej 96-dołkowej płytce;

2) 24 godziny później, komórki uzupełniono testowymi roztworami dogodnie rozcieńczonymi w pożywce kultury;

3) po kolejnych 72 godzinach, komórki testowano kolorymetrycznie bromkiem 3-(4,5-dimetylo-2-tiazolilo)-2,5-difenylo-2H-tetrazoilowym (MTT); oceniając żywotność komórek, ten test ujawnia również różną wrażliwość komórek na testowany lek. Jest to możliwe, ponieważ mitochondrialna dehydrogenaza może redukować sole tetrazoliowe (żółte) do niebieskich kryształów formazanu. Większa lub mniejsza intensywność zabarwienia jest oceniana spektrofotometrycznie (Dezinot, F. i in., J. Immunol. Methods, 1986, 22 (89): 271-277).

Wyniki

Poniżej podajemy, w postaci tabeli i wykresu na fig. 2, wyniki otrzymane w kategoriach IC50 (stężenia leku koniecznego do hamowania wzrostu komórki o 50% względem testowanego produktu i różnych użytych linii komórek).

PL 216 861 B1

Na fig. 2, oś odciętych oznacza siłę farmakologiczną, wyrażoną jako IC50 i obliczoną jako stosunek pomiędzy molowymi stężeniami, względem produktu odniesienia (paklitaksel) który jest zwyczajowo przyjęty jako mający wartość zero. Stąd kreski wskazują siłę farmakologiczną większą niż u produktu odniesienia.

IC50 (wyrażone jako nM lub μΜ paklitakselu lub jego pochodnej HYTAD w pożywce kultury)

Linie komórek	Taxol©	HYTAD2p20	HYTAD1p20	HYTAD2p10
Linie komórek raka sutka
MCF/7	3,5 nM	0,86 nM	0,024 nM	0,68 nM
MDA/MB/231	0,35 nM	2,58 nM	-	0,24 μΜ
MDA/MB/468	9,4 nM	-	0,18 nM	-
SKBR/3	0,23 nM	-	-	0,14 nM

Wnioski

Jak podano w literaturze, wszystkie użyte linie komórek są wrażliwe na taksol, lek głównie stosowany do leczenia przerzutów raka piersi i jajnika. Co się tyczy linii komórek raka sutka, różne HYTAD okazały się znacznie silniejsze niż paklitaksel, z czynnikiem +150 względem HYTAD1p20 wobec linii komórkowej raka MCF-7.

P r z y k ł a d 3

Wpływ żelu ACP® u nagich myszy po implantacji komórek nowotworowych.

W tym eksperymencie użyto komórek ludzkiego raka okrężnicy HT29 w immunosupresyjnych nagich myszach należących do odmiany Athymic Nude-nu (nu/nu).

Każde zwierzę znieczulono i 0,3 ml zawiesiny komórek HT29 wstrzyknięto do jamy otrzewnej w stężeniu 166000 komórek/ml. Tak więc, każda mysz otrzymała 50000 komórek rakowych.

Projekt eksperymentu:

Potraktowane zwierzęta: 113 zwierząt najpierw zaszczepiono HT29 i natychmiast po tym otrzymały pojedynczą dawkę terapii równą 0,2 ml żelu ACP 40 mg/ml;

Zwierzęta kontrolne: 117 zwierząt zaszczepiono zawiesiną komórek raka HT29, lecz bez terapii.

Krzywa przeżywalności: krzywą przeżywalności obliczono od dnia wszczepienia do dnia śmierci. Śmierci stwierdzano lub powodowano uśmiercając zwierzęta, których masa spadła o więcej niż 20% masy początkowej, i w przypadku krwiaka otrzewnej wskazującego rozproszone przerzuty. Procent przeżywalności w dwu grupach określano codziennie i wyrażono jako wykres otrzymując krzywą z fig. 3.

Eksperyment trwał 120 dni, po czym wszystkie przeżywające zwierząt uśmiercono i zbadano nekropsyjnie dla sprawdzenia obecności nowotworów żołądka.

Wyniki: 32 zwierzęta z 230 nie rozwinęło żadnego wyraźnego nowotworu. 22 z tych zwierząt należało do grupy myszy potraktowanych żelem ACP®, 10 do grupy kontrolnej.

Żel ACP®: u 19,5% potraktowanych zwierząt nie rozwinął się nowotwór.

Kontrola: u 8,5% zwierząt kontrolnych nie rozwinął się nowotwór.

P r z y k ł a d 4

Wytwarzanie HA z masą cząsteczkową pomiędzy 5000 i 10000 Da (do możliwych syntez HApaklitakselu z HA o niskiej masie cząsteczkowej).

2,40 g HA sodu z masą cząsteczkową 990000 Da rozpuszcza się w 240 ml roztworu 0,15 M NaCl. Następnie uzupełnia się 7,9 ml 14% roztworu NaOCl. W stałej temperaturze +4°C, roztwór sonifikuje się przez 120 minut przy częstości 20 Hz i przy 150 W. Po zakończeniu reakcji, pH ustawia się na 6,5 0,1 N HCl i z roztwór następnie wytrąca się osad w 1000 ml mieszaniny 2:1 metanol-aceton. Produkt zbiera się przez odsączenie i osusza pod próżnią przez 48 godzin w temperaturze 45°C. Otrzymuje się 1,65 g soli sodowej. Wysokociśnieniowa cieczowa chromatografia (HPLC)-analiza GPC ujawnia, że otrzymana frakcja HA ma średnią masę cząsteczkową (MW) 5850, średnią liczbowo masę cząsteczkową (MN) 3640 i wskaźnik polidyspersyjności 1,61.

PL 216 861 B1

P r z y k ł a d 5

Wytwarzanie estrowej pochodnej HA związanej z paklitakselem przy estryfikacji karboksylu około 4% wagowych.

mg paklitakselu rozpuszcza się w CH2CI2 i roztwór uzupełnia 104 mg 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidem (EDC) i 20 mg kwasu 4-bromomasłowego. Z kolei, roztwór dzieli się w wodzie. Po usunięciu karbodiimidu i reszty bromków, rozpuszczalnik reakcji osusza się bezwodnym siarczanem sodu i odparowuje na wyparce obrotowej. 21 mg otrzymanego produktu rozpuszcza się w n-metylo-pirolidonie (NMP) i dodano do roztworu 20 mg/ml HA wysolonego jonem tetrabutyloamoniowym. (TBA) w NMP (200 mg w 10 ml NMP). Po 7 dniach reakcji w temperaturze otoczenia, roztwór rozcieńcza się 5 ml wody i 1 ml nasyconego roztworu NaCl. Otrzymany roztwór miesza się przez 1 godzinę dla umożliwienia wymiany sodu na jon TBA. Z kolei, etanol powoli dodaje się kroplami i otrzymany nitkowaty produkt rozpuszcza się w wodzie, dializuje i na koniec liofilizuje.

P r z y k ł a d 6

Wytwarzanie estrowej pochodnej HA z paklitakselem przy estryfikacji karboksylu około 10% wagowych

Jak w przykładzie 5, 308,7 mg paklitakselu rozpuszczonego w 15 ml dichlorometanu uzupełnia się 117,2 mg kwasu 4-bromomasłowego i 614,1 mg EDC. Z kolei, wodę dodaje się do roztworu dla eliminacji całego bromku i karbodiimidu. Otrzymany organiczny roztwór uzupełnia się siarczanem sodu dla odwodnienia, podczas gdy rozpuszczalnik odparowuje się na wyparce obrotowej. Na koniec otrzymuje się 363 mg związku pośredniego.

175 mg otrzymanego związku pośredniego dodaje się do 1 g HA-TBA rozpuszczonego w bezwodnym NMP. Roztwór miesza się w temperaturze otoczenia przez 7 dni, po czym dodaje się 20 ml wody i 4 ml nasyconego roztworu NaCl. Miesza się przez 1 godzinę dla umożliwienia wymiany sodu na jon TBA. Z kolei etanol powoli dodaje się kroplami i otrzymany nitkowaty produkt rozpuszcza się w wodzie, dializuje i na koniec liofilizuje.

P r z y k ł a d 7

Wytwarzanie estrowej pochodnej HA z paklitakselem przy estryfikacji karboksylu około 16% wagowych

164 mg związku pośredniego, otrzymano według procedury opisanej w poprzednich przykładach 5 i 6, dodaje się do roztworu 680 mg HA-TBA rozpuszczonego w 25 ml bezwodnego NMP. Po 7 dniach reakcji w temperaturze otoczenia, roztwór uzupełnia 20 ml wody i 4 ml nasyconego roztworu NaCl. Po 1 godzinie powoli dodaje się kroplami etanol. Otrzymany produkt odsącza się i rozpuszcza w wodzie, dializuje i, gdy przewodnictwo roztworu dializowanego spada poniżej 10 μδ, zamraża się. Zamrożony roztwór następnie liofilizuje się.

P r z y k ł a d 8

Wytwarzanie estrowej pochodnej HA z paklitakselem z estryfikacji hydroksylu około 10% wagowych

102,6 mg paklitakselu rozpuszcza się w 5 ml dichlorometanu i roztwór uzupełnia 20,4 mg bezwodnika bursztynowego. Trzy godziny później, rozpuszczalnik eliminuje się przez odparowanie stosując wyparkę obrotową. Otrzymany produkt rozpuszcza się w 5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) z małą zawartością wody i dodaje się 27,3 mg dicyklo-heksylo-karbodiimidu. Około 5 minut później, roztwór uzupełnia roztworem HA-TBA, otrzymanym przez rozpuszczenie 327 mg polimeru w 15 ml DMSO z niską zawartością wody. Roztwór miesza się w temperaturze otoczenia przez około 24 godziny. Z kolei dodaje się do roztworu kilka ml wody i 3 ml nasyconego roztworu NaCl. Po godzinie strąca się dodając etanol. Nitkowaty odsączony produkt rozpuszcza się w wodzie, dializuje i na koniec liofilizuje.

P r z y k ł a d 9

Wytwarzanie estrowej pochodnej HA z paklitakselem przy estryfikacji karboksylu około 4% wagowych

510,1 mg paklitakselu rozpuszczonego w 6 ml dichlorometanu uzupełnia się 95,4 mg kwasu 3-bromopropionowego i 525,0 mg EDC. Z kolei, wodę dodaje się do roztworu dla eliminacji bromku i karbodiimidu przez rozdzielanie, podczas gdy 10 objętości wody stosuje się dla eliminacji reagentów. Organiczny roztwór uzupełnia się siarczanem sodu dla odwodnienia i rozpuszczalnik odparowuje się na wyparce obrotowej.

155,5 mg otrzymanego związku pośredniego dodaje się do 1,46 g HA-TBA rozpuszczonego w bezwodnym NMP i otrzymany roztwór miesza się w temperaturze otoczenia przez 7 dni. Z kolei dodaje się 20 ml wody i 4 ml nasyconego roztworu NaCl. Roztwór miesza się przez 1 godzinę dla

PL 216 861 B1 umożliwienia wymiany sodu na jon TBA. Następnie etanol powoli dodaje się kroplami i otrzymany nitkowaty produkt rozpuszcza się w wodzie, dializuje i na koniec liofilizuje.

P r z y k ł a d 10

Wytwarzanie estrowej pochodnej kwasu hialuronowego przy estryfikacji karboksylu około 30% wagowych

500 mg paklitakselu rozpuszcza się w CH2CI2 i roztwór uzupełnia 397,6 mg 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (EDC) i 300,9 mg kwasu 4-bromomasłowego. Z kolei, roztwór dzieli się w wodzie. Po usunięciu reszty karbodiimidu i bromku rozpuszczalnik reakcji osusza się bezwodnym siarczanem sodu i odparowuje na wyparce obrotowej. Otrzymany produkt rozpuszcza się w NMP i dodaje do roztworu zawierającego ~20 mg/ml kwasu hialuronowego wysolonego TBA w NMP (1,95 g w 100 ml NMP). Po 7 dniach reakcji w temperaturze otoczenia, roztwór rozcieńcza się 20 ml wody i 4,5 ml nasyconego roztworu NaCl. Roztwór miesza się przez godzinę dla umożliwienia wymiany sodu na jon TBA. Z kolei, etanol powoli dodaje się kroplami i otrzymany nitkowaty produkt rozpuszcza się w wodzie i dializuje i na koniec liofilizuje.

P r z y k ł a d 11

Wytwarzanie częściowo samosieciowanego estru (około 10% podstawienia) HA z 8% wagowych paklitakselu

3,10 g HA wysolonego TBA solubilizuje się w 150 ml DMSO z małą zawartością wody w temperaturze otoczenia. Roztwór uzupełnia się następnie 541,0 mg pośredniego paklitakselu otrzymanego zgodnie ze sposobem opisanym w przykładach 5, 6 i 7. Po pozostawieniu do reakcji przez 7 dni w temperaturze otoczenia, roztwór reakcyjny uzupełnia się 126,5 g trietyloaminy i całość miesza się przez 30 minut.

Roztwór 319,5 g jodku 2-chloro-1-metylo-pirydyny w 30 ml DMSO powoli dodaje się kroplami w czasie 45 minut i mieszaninę pozostawia się w temperaturze 30°C przez 15 godzin.

Dodaje się roztwór utworzony przez 50 ml wody i 1,7 g chlorku sodu i powstałą mieszaninę wylewa się powoli do 400 ml acetonu z ciągłym mieszaniem. Powstaje osad, który przesącza się i przemywa trzy razy 50 ml acetonu z wodą 5:1 i trzy razy acetonem (50 ml). Otrzymany końcowy produkt osusza się próżniowo w temperaturze 38°C.

P r z y k ł a d 12

Testy rozpuszczalności estru HA-paklitaksel otrzymanego zgodnie z przykładem 5 w 5% roztworze glukozy.

14,6 mg produktu HA-paklitaksel otrzymanego przez estryfikację zgodnie z przykładem 7 (rozpoczynając od HA z masą cząsteczkową 200 kDa) ze stopniem podstawienia karboksylu 16,3% wagowych, rozpuszczonego w 1 ml 5% roztworu wodnego glukozy. Roztwór, mieszany mieszadłem magnetycznym, można odsączyć przez 0,20 μm sterylny filtr na strzykawce. Stężenie paklitakselu w roztworze wynosi 2,38 mg/ml.

Próbowaliśmy również znaleźć maksymalne stężenie produktu na ml 5% roztworu wodnego glukozy. Przy stężeniu 32,8 mg produktu HA-paklitaksel na ml roztworu glukozy, otrzymuje się roztwór o dużej lepkości ze stężeniem paklitakselu 5,35 mg/ml.

P r z y k ł a d 13

Testy odzyskiwania paklitakselu z ludzkiego osocza

Wytwarza się roztwór, który stanowi 101,3 mg HA-paklitakselu w 10 ml wody. HA-paklitaksel wytwarza się jak opisano w przykładzie 7.

Test odzyskiwania przeprowadza się umieszczając 40 mg powyżej opisanego roztworu w kontakcie z 2 ml ludzkiego osocza w temperaturze 37°C.

Dla określenia paklitakselu uwalnianego do osocza przez odłączanie od HA, ustalono trzy czasy kontaktu: 6, 30 i 60 minut. Na koniec każdego okresu kontaktu, paklitaksel ekstrahowano z roztworu osocze-HA-paklitaksel przy 3 przemywaniach, każde 1,5 ml eteru tert-butylowo-metylowego (TBME), które zebrano razem, odparowano do suchej masy przez naturalne odparowanie w temperaturze 65°C, i umieszczono w zawiesinie w 400 μl absolutnego etanolu dla określenia zawartości danego leku metodą HPLC (wysokociśnieniowa cieczowa chromatografia). Otrzymane wyniki pokazano na fig. 4: po 6 minutach ponad 80% paklitakselu odłączało się od HA i procent ten nie wzrastał przy dalszej obserwacji.

Po opisaniu wynalazku, jest jasne, że te sposoby można modyfikować na różne sposoby. Takie modyfikacje nie są uważane za odchylenia od istoty i celu wynalazku, i dowolne takie modyfikacje, które mogą być oczywiste dla eksperta w dziedzinie, wchodzą w zakres poniższych zastrzeżeń.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Taksan kowalencyjnie związany z kwasem hialuronowym lub z pochodną kwasu hialuronowego, w którym kowalencyjne wiązanie za pośrednictwem przerywnika jest tworzone pomiędzy grupami hydroksylowymi taksanu i grupami karboksylowymi kwasu hialuronowego lub pochodnych kwasu hialuronowego i wiązanie pomiędzy grupami karboksylowymi kwasu hialuronowego lub jego pochodnych i przerywnikiem jest wiązaniem estrowym, zaś przerywnik wybiera się z grupy obejmującej alifatyczne lub aralifatyczne łańcuchy, liniowe lub rozgałęzione, podstawione jedną lub większą liczbą grup wybranych spośród hydroksylu, karboksylu, karbonylu, epoksydu, chlorku acylu, tiolu, nitrylu, halogenu, bezwodnika, izocyjanianu, izotiocyjanianu i grup aminowych.
2. Taksan według zastrz. 1, znamienny tym, że taksan wybiera się spośród paklitakselu i docetakselu.
3. Taksan według zastrz. 2, znamienny tym, że taksanem jest paklitaksel.
4. Taksan według któregokolwiek z zastrz. 1-3, znamienny tym, że kwas hialuronowy ma masę cząsteczkową pomiędzy 400 i 3 x10⁶ Da.
5. Taksan według zastrz. 4, znamienny tym, że kwas hialuronowy ma masę cząsteczkową pomiędzy 400 i 1x10⁶ Da.
6. Taksan według zastrz. 5, znamienny tym, że kwas hialuronowy ma masę cząsteczkową pomiędzy 400 i 230000 Da.
7. Taksan według któregokolwiek z zastrz. 1-6, znamienny tym, że kwas hialuronowy jest wysolony organicznymi i/lub nieorganicznymi zasadami.
8. Taksan według któregokolwiek z zastrz. 1-7, znamienny tym, że pochodną kwasu hialuronowego wybiera się z grupy obejmującej estry kwasu hialuronowego z alkoholami z serii alifatycznych, aralifatycznych, cykloalifatycznych, aromatycznych, cyklicznych i heterocyklicznych, przy czym estry mają stopień estryfikacji równy lub niższy niż 50%.
9. Taksan według któregokolwiek z zastrz. 1-7, znamienny tym, że pochodną kwasu hialuronowego wybiera się z grupy obejmującej amidy kwasu hialuronowego z aminami z serii alifatycznych, aralifatycznych, cykloalifatycznych, aromatycznych, cyklicznych i heterocyklicznych, przy czym amidy mają stopień amidowania pomiędzy 0,1% i 10%.
10. Taksan według któregokolwiek z zastrz. 1-7, znamienny tym, że pochodną kwasu hialuronowego wybiera się z grupy obejmującej O-siarczanowane pochodne kwasu hialuronowego do czwartego stopnia siarczanowania.
11. Taksan według któregokolwiek z zastrz. 1-7, znamienny tym, że pochodną kwasu hialuronowego wybiera się z grupy obejmującej wewnętrzne estry kwasu hialuronowego mające stopień estryfikacji równy lub niższy niż 15%.
12. Taksan według któregokolwiek z zastrz. 1-7, znamienny tym, że pochodną kwasu hialuronowego wybiera się z grupy obejmującej deacetylaty kwasu hialuronowego, pochodzące z deacetylowania jednostki N-acetylo-glukozaminy i mające stopień deacetylowania pomiędzy 0,1% i 30%.
13. Taksan według któregokolwiek z zastrz. 1-7, znamienny tym, że pochodna kwasu hialuronowego wybiera się z grupy obejmującej perkarboksylowane pochodne kwasu hialuronowego otrzymane z utleniania pierwszorzędowego hydroksylu jednostki N-acetylo-glukozaminy, mającej stopień perkarboksylowania pomiędzy 1 i 100%.
14. Taksan według któregokolwiek z zastrz. 1-13, znamienny tym, że przerywnik wybiera się z grupy obejmującej kwasy karboksylowe mające od 2 do 18 atomów węgla w alifatycznym lub aralifatycznym łańcuchu, podstawione atomami bromu.
15. Taksan według zastrz. 14, znamienny tym, że przerywnik wybiera się z grupy obejmującej kwasy karboksylowe mające od 3 do 10 atomów węgla w alifatycznym lub aralifatycznym łańcuchu, podstawione atomami bromu.
16. Taksan według zastrz. 15, znamienny tym, że przerywnik wybiera się spośród kwasu 3-bromopropionowego i kwasu 4-bromomasłowego.
17. Taksan według zastrz. 8, znamienny tym, że kwas hialuronowy jest estryfikowany po utworzeniu kowalencyjnego wiązania z taksanem.
18. Taksan według zastrz. 11, znamienny tym, że kwas hialuronowy jest estryfikowany po utworzeniu kowalencyjnego wiązania z taksanem.
19. Taksan według któregokolwiek z zastrz. 1-18, znamienny tym, że kowalencyjne wiązanie pomiędzy taksanem i przerywnikiem jest wiązaniem estrowym.

PL 216 861 B1
20. Taksan według któregokolwiek z zastrz. 1-18, znamienny tym, że kowalencyjne wiązanie pomiędzy taksanem i przerywnikiem jest wiązaniem acetalowym lub ketalowym.
21. Taksan według któregokolwiek z zastrz. 1-18, znamienny tym, że kowalencyjne wiązanie pomiędzy taksanem i przerywnikiem jest wiązaniem uretanowym lub tiouretanowym.
22. Taksan według któregokolwiek z zastrz. 1-21, znamienny tym, że procent wiązania pomiędzy kwasem hialuronowym i taksanem wynosi pomiędzy 0,1% i 100%.
23. Taksan według zastrz. 22, znamienny tym, że procent wiązania pomiędzy kwasem hialuronowym i taksanem wynosi pomiędzy 0,1% i 35%.
24. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera jako substancję czynną co najmniej taksan kowalencyjnie związany z kwasem hialuronowym lub pochodną kwasu hialuronowego jak zdefiniowano w zastrz. 1-23, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnymi zaróbkami i rozcieńczalnikami.
25. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 24, do podawania drogą doustną, dożylną, tętniczą, domięśniową, podskórną, dootrzewnową lub przezskórną, lub przez bezpośrednie wstrzykiwanie w miejsce nowotworu.
26. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 25, do podawania drogą doustną.
27. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrz. 24-26, znamienna tym, że kwas hialuronowy lub pochodna kwasu hialuronowego może uwalniać taksan w miejsce podawania.
28. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrz. 24-27, znamienna tym, że ponadto zawiera jedną lub więcej biologicznie lub farmakologicznie czynnych substancji.
29. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 28, znamienna tym, że biologicznie lub farmakologicznie czynne substancje wybiera się z grupy obejmującej steroidy, hormony, czynniki troficzne, białka, witaminy, niesteroidowe leki przeciwzapalne, chemioterapeutyki, inhibitory wapnia, antybiotyki, środki przeciwwirusowe, interleukiny i cytokiny.
30. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 28, znamienna tym, że biologicznie lub farmakologicznie czynną substancją jest interferon.
31. Zastosowanie taksanu kowalencyjnie związanego z kwasem hialuronowym lub pochodną kwasu hialuronowego jak zdefiniowano w zastrz. 1-23, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych przydatnych do leczenia nowotworów wybranych z: raka sutka, raka jajnika i/lub szyjki macicy, czerniaka, raka płuca, raka wątroby, stercza i/lub pęcherza, raka żołądka i/lub jelit, białaczki i mięsaka Kaposiego.
32. Zastosowanie według zastrz. 31, znamienne tym, że leczenie nowotworów obejmuje chemioterapię.
33. Zastosowanie taksanu kowalencyjnie związanego z kwasem hialuronowym lub pochodną kwasu hialuronowego jak zdefiniowano w zastrz. 1-23, do powlekania stentów.
34. Stenty powlekane taksanem kowalencyjnie związanym z kwasem hialuronowym lub pochodną kwasu hialuronowego jak zdefiniowano w zastrz. 1-23.
35. Sposób wytwarzania taksanu kowalencyjnie związanego z kwasem hialuronowym lub pochodną kwasu hialuronowego za pośrednictwem przerywnika, jak zdefiniowano w zastrz. 1-23, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a) dodania karbodiimidu jako środka aktywującego do roztworu zawierającego kwas hialuronowy lub pochodną kwasu hialuronowego;

b) dodania przerywnika ewentualnie wcześniej związanego z taksanem do roztworu przychodzącego z etapu a);

c) ewentualnie oczyszczania tak otrzymanego produktu, i poddania reakcji z taksanem, jeśli nie był wcześniej związany z przerywnikiem.
36. Sposób wytwarzania taksanu kowalencyjnie związanego z kwasem hialuronowym lub pochodną kwasu hialuronowego za pośrednictwem przerywnika, jak zdefiniowano w zastrz. 1-23, w którym ten przerywnik ma co najmniej atom halogenu, i wiążącego grupę karboksylową kwasu hialuronowego lub pochodnej kwasu hialuronowego wiązaniem estrowym, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a') dodania przerywnika ewentualnie wcześniej związanego z taksanem, do roztworu kwasu hialuronowego lub pochodnej kwasu hialuronowego;

b') ewentualnie oczyszczania tak otrzymanego produktu, i poddanie reakcji z taksanem, jeśli nie był wcześniej związany z przerywnikiem.

PL 216 861 B1
37. Sposób według zastrz. 36, znamienny tym, że atom halogenu przerywnika jest bromem.
38. Taksan według zastrz. 1, znamienny tym, że kwas hialuronowy lub pochodna kwasu hialuronowego wzmacnia działanie przeciwrakowe taksanu.
39. Taksan według zastrz. 11, znamienny tym, że wewnętrzny ester kwasu hialuronowego wzmacnia działanie przeciwrakowe taksanu.