NO333042B1

NO333042B1 - Taksan, fremstilling og anvendelse, samt preparat omfattende taksan.

Info

Publication number: NO333042B1
Application number: NO20052399A
Authority: NO
Inventors: Gilda De Luca; Rinaldi Marini Bettolo; Maria Luisa Migneco
Original assignee: Fidia Farmaceutici
Priority date: 2002-10-18
Filing date: 2005-05-18
Publication date: 2013-02-18
Also published as: PT1560854E; EP2045270A3; NZ540034A; JP4704753B2; CA2783175C; AU2003267441A1; US7897584B2; WO2004035629A8; EP1560854B1; ES2320439T3; SI1560854T1; DK1560854T3; NO20052399L; CA2783175A1; US20110159052A1; KR101076414B1; ATE420117T1; WO2004035629A3; NO20052399D0; NZ547668A

Abstract

Den foreliggende oppfinnelse angår vannløselige taksaner som er kovalent bundet til hyaluronsyre eller hyaluronsyrederivater, og spesielt til paclitaksel og docetaksel som er anvendelige for fremstillingen av farmasøytiske preparater som skal anvendes innenfor onkologiområdet, i behandlingen av autoimmune sykdommer og restenose. Oppfinnelsen angår også fremgangsmåten for fremstillingen av taksaner som er kovalent bundet til hyaluronsyre eller hyaluronsyrederivater gjennom direkte syntese mellom hyaluronsyremolekyler og taksaner eller gjennom indirekte syntese ved å introdusere et avstandsstykke (spacer) mellom hyaluronsyren og hyaluronsyrederivatet og taksanet.

Description

Oppfinnelsens område

Den foreliggende oppfinnelse angår taksaner, spesielt paclitaksel og docetaksel, som er kovalent bundet til hyaluronsyre eller hyaluronsyrederivater, fremgangsmåten for fremstillingen derav og anvendelsen av disse innenfor onkologiområdet, i behandlingen av autoimmune sykdommer og restenose.

Kjent teknikk

Taksaner, og spesielt paclitaksel og docetaksel som for tiden markedsføres under varemerkene Taxol<®>og Taxotere<®>er antikreftmidler (Huizing M.T. et al., Cancer Inv., 1995, 13: 381-404) som utøver sin antiproliferative virkning ved å virke på organiseringen av mikrotubuler i det cellulære cytoskjelettsystemet. Ved å hemme depolariseringen av nevnte mikrotubuler forhindrer de faktisk den normale dynamiske reorganiseringen som skjer ved mitotisk celledeling (Manfredi J.J. et al., J CellBiol, 1982, 94: 688-696).

De viktigste terapeutiske indikasjonene for paclitaksel er:

- terapi for fremskreden brystkreft; - terapi for Kaposis sarkom; - terapi for karsinom i lungen (ikke mikrocyton); - eggstokkarsinom som er motstandsdyktig mot standard kjemo terapibehandling.

Videre anvendes også nevnte kjemoterapi for behandling av karsinom i blæren, prostata og endometrium.

Gitt at paclitaksel er uløselig i vann blandes den med Cremophor<®>EL (lakserolje)-etylalkohol i et l:l-forhold i de farmasøytiske preparatene som for tiden anvendes i kreftkjemoterapi (Pfeifer R.W. et al., Am. J. Hosp. Pharm. 1993, 50: 2520-2521). Denne formuleringen anvendes vanligvis for kontinuerlig intravenøs infusjon (mellom 3 og 24 timer) ved en dosering på 135-175mg/m<2>.

Nærværet av Cremophor<®>EL i den ovenfor nevnte formuleringen er hovedårsaken til bivirkningsreaksjonene som normalt opptrer ved administreringen av paclitaksel og som strekker seg fra enkle urtikariaanfall til dyspnea og bronkospasme og til og med anafylaktiske sjokk (Weiss, R.B., et al., J. Clin. Oncol, 1990, 8: 1263-1268).

Enhver pasient som skal motta behandling med et farmasøytisk preparat med paclitaksel-Cremophor<®>EL må derfor først gjennomgå en premedikasjonsprotokoll med deksametasonadministrering, muligens assosiert med et antihistamin.

Til tross for disse forholdsreglene opplever opptil 40 % av pasientene som mottar intravenøse infusjoner av paclitaksel fortsatt mer eller mindre alvorlige bivirkningsreaksj oner.

Det kan derfor sies at den formuleringen av Taxol® som for tiden anvendes klinisk og fremgangsmåtene som anvendes for administreringen av dette er en begrensning for dets effektivitet. Dette er grunnen til at det nå forskes direkte mot syntesen av nye farmasøytiske formuleringer og/eller mot nye kjemiske formuleringer av ovenfor nevnte antikreftmedikament som er vannløselige.

Derfor har forskere forsøkt å innkapsle paclitaksel i liposomer, nanokapsler og mikrosfærer som består av en polymervegg dannet av biodegraderbare kopolymerer, slik som polymelkesyre, og ikke-biodegraderbare kopolymerer slik som etylenvinylacetat.

Videre har det blitt fremstilt mikrosfærer som er fylt med paclitaksel dannet av en biodegraderbar polymer slik som polyfosfoester for å danne et system med forlenget medikamentfri gjøring ved behandlingsstedet i lungekarsinomterapien (Nuijen, B. et al., Investigational New Drugs, 2001, 19: 143-153). Det har også vært forsøk på å fremstille miceller av nevnte antikreftmedikament gjennom presipitering av paclitaksel i et organisk løsningsmiddel med fosfatidylcholin/gallesalter (Nuijen, B. et al, Investigational New Drugs, 2001, 19: 143-153).

Imidlertid kan disse nye systemene for innkapsling av paclitaksel vise seg problematiske med hensyn til stabilitet, fremstilling og reproduserbarhet.

Ulike forsøk har videre blitt utført for å løse medikamentet med syklodekstrin, men de nye formuleringene ga ikke de ønskede resultatene (Nuijen, B. et al., Investigational New Drugs, 2001, 19: 143-153).

Kjemisk forskning etter nye formuleringer av paclitaksel som gjør medikamentet mer vannløselig mens det samtidig opprettholder effektiviteten som et antikreftmiddel har medført syntesen av nye analoger modifisert ved C2- og C7-posisjonen (US patentsøknad nr. 2001/0018531), så vel som fremstillingen av nye forløpermedikamenter.

Forløpermedikamenter er terapeutisk inerte medikamentderivater som aktiveres ved introduksjon i et legeme. Etter spontan hydrolyse og/eller enzymatiske degraderingsprosesser frigjøres således det aktive prinsippet.

I lys av dette og av de ovenfor nevnte grunner har det vært mange forsøk på å syntetisere nye forløpermedikamenter som har medført f.eks. fremstillingen av medikamenter så som acetylpaclitaksel (Mellado, W. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1984, 124(2): 329-336), eller til syntesen av nye estere av nevnte medikament med ravsyre-, glutar- og sulfonsyre på karbonet i posisjon C2<1>. Disse esterne viste seg imidlertid å være ustabile i vandige miljøer.

Videre har enkelte derivater med en fosfonoksyfenylpropionatestergruppe ved C2<1->eller C7-posisjonen blitt syntetisert, slik som paclitaksel-2<1->karbonat, og en serie nye aminosyreestere av paclitaksel og derivater derav med en glutarylgruppe ved posisjon C2<1>.

Glutaryl-paclitaksel-asparagin og glutaryl-paclitaksel-glutamin har vist seg å være de to mest vannløselige produktene som er oppnådd ved syntesetypen beskrevet ovenfor, men de er mindre effektive enn paclitaksel per se (Nuijen, B. et al., Investigational New Drugs, 2001, 19: 143-153).

Det er også kjent at paclitaksel er blitt esterifisert med poly-L-glutaminsyre for å danne et nytt vannløselig derivat av nevnte kjemoterapimedikament med en signifikant høyere plasmahalveringstid enn ikke-konjugert paclitaksel (Li C. et al., Cancer Research, 1998, 58(11): 2404-2409).

Paclitaksel har også blitt derivatisert med PEG (polyetylenglykol) gjennom esterifisering til kjemoterapimedikamentet ved posisjon C2<1>; det nye molekylet har imidlertid vist seg å være svært vannløselig, men ikke svært stabilt.

Til sist har et nytt leveringssystem for medikamentet nylig blitt utviklet gjennom konjugeringen av paclitaksel med humant serumalbumin (HSA). Paclitaksel-HSA-konjugatet har vist seg å være svært vannløselig og i stand til å bære opptil 30 kjemoterapimedikamentmolekyler. Imidlertid har eksperimenter utført in vitro vist at det er mindre effektivt mot kreft enn paclitaksel per se (Nuijen, B. et al., Investigational New Drugs, 2001, 19: 143-153).

Nylig har forskere syntetisert et nytt leveringssystem for paclitaksel esterifisert med på forhånd modifisert hyaluronsyre (heretter kalt "HA"), dvs. HA omsatt med molekyler av hydrazid bundet til karoksylgruppen av HA gjennom en amidbinding (Luo Y., et al., Biomacromolecules 2000, 1 (2): 208-218; US patent nr. 5 874 417). Dette nye leveringssystemet for paclitaksel gjør det mulig for medikamentet å gå direkte til membranoverflaten til målkreftcellen som er kjennetegnet ved overekspresjon av HA-reseptoren CD44. Følgelig er paclitaksel bundet til HA funksjonalisert med et hydrazid i stand til å binde spesifikt til CD44 på kreftcellen og det gjør det følgelig mulig (takket være endocytoseprosessen) at det går inn i cellecytoplasma hvor det kan enzymatisk frigjøres og aktiveres og utløse dets inhibering av depolariseringen av tubulin og derfor celledeling. Denne mekanismen for selektiv transport av medikamentet kalles "cellemålretting"(cell targeting).

Videre er det kjent at HA kan anvendes som en bærer for antikreftmedikamenter i farmasøytiske preparater hvori HA er forbundet med (og ikke kovalent bundet til) kjemoterapimedikamenter slik som paclitaksel for å øke deres terapeutiske effektivitet takket være målrettingsfenomenet beskrevet ovenfor (internasjonal patentsøknad WO 00/41730) og som muliggjør at dosene som vanligvis spesifiseres i normale kjemoterapiprotokoller senkes (internasjonal patentsøknad nr. WO 99/02151).

Til slutt er lavmolekylvekts HA og/eller lipidderivater derav kjent anvendt for fremstilling av liposomer anvendt for levering av medikamenter, inkludert antikreftmedikamenter slik som paclitaksel (internasjonal patentsøknad nr. WO 01/39815). 1 lys av diskusjonen ovenfor er det fortsatt et behov for nye taksanderivater som er stabile og løselige i vann og terapeutisk effektive, i det minste like terapeutisk aktive som ikke-modifiserte taksaner.

Sammendrag av oppfinnelsen

Søkeren har nå funnet at kovalent binding av taksaner til HA eller HA-derivater, eventuelt ved hjelp av et avstandsstykke ("spacer") gir stabile og vannløselige produkter anvendelig for fremstillingen av farmasøytiske preparater for behandlingen av tumorer, autoimmune sykdommer og restenose.

Et taksan kovalent bundet til HA eller til et HA-derivat, hvori den kovalente bindingen dannes mellom hydroksylgruppene til taksanet og karboksyl gruppene eller hydroksylgruppene til HA eller HA-derivatene, eller aminogruppene til deacetylert HA, eventuelt ved hjelp av et avstandsstykke som binder taksanene til HA eller HA-derivatet, og hvor avstandsstykket er en esterbinding, er derfor et formål ved oppfinnelsen.

I følge en aspekt ved den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et taksan ifølge oppfinnelsen hvori taksanet er valgt mellom paclitaksel og docetaksel, fortrinnsvis paclitaksel.

I følge et annet apsekt tilveiebringes et taksan der hyaluronsyren har en molekylvekt på mellom 400 og 3xl0<6>Dalton, så som på mellom 400 og lxl 06 Dalton eller på mellom 400 og 230000 Dalton.

I følge enda et aspekt tilveiebringes et taksan der hyaluronsyren er mettet med organiske og/eller uorganiske baser.

I følge ytterligere et aspekt tilveiebringes et taksan der hyaluronsyrederivatet er valgt fra gruppen bestående av estere av hyaluronsyre med alkoholer av den alifatiske, aralifatiske, sykloalifatiske, aromatiske, sykliske og heterosykliske serier, hvor nevnte estere har en esterifiseringsgrad tilsvarende til eller lavere enn 50 %.

I følge ytterligere et aspekt tilveiebringes et taksan der hyaluronsyrederivatet er valgt fra gruppen bestående av amider av hyaluronsyre med aminer av de alifatiske, aralifatiske, sykloalifatiske, aromatiske, sykliske og heterosykliske seriene, hvor nevnte amider har en amideringsgrad på mellom 0,1 % og 10 %.

I følge ytterligere et aspekt tilveiebringes et taksan der hyaluronsyrederivatet er valgt fra gruppen bestående av O-sulfaterte derivater av hyaluronsyre opp til den fjerde sulfateringsgraden.

I følge ytterligere et aspekt tilveiebringes et taksan der hyaluronsyrederivatet er valgt fra gruppen bestående av indre estere av hyaluronsyre med en esterifiseringsgrad tilsvarende til eller lavere enn 15 %.

I følge ytterligere et aspekt tilveiebringes et taksan der hyaluronsyrederivatet er valgt fra gruppen bestående av deacetylert hyaluronsyre fra deacetyleringen av N-acetylglukosamin-enheten og med en deacetyleringsgrad på mellom 0,1 % og 30 %.

I følge ytterligere et aspekt tilveiebringes et taksan der hyaluronsyrederivatet er valgt fra gruppen bestående av perkarboksylerte derivater av hyaluronsyre oppnådd fra oksideringen av den primære hydroksyl i N-acetylglukosaminenheten med en perkarboksyleringsgrad på mellom 1 og 100 %.

I følge ytterligere et aspekt tilveiebringes et taksan der avstandsstykket som binder taksanet til hyaluronsyre eller hyaluronsyrederivat er valgt fra gruppen bestående av alifatiske eller aralifatiske kjeder, lineære eller forgrenede, substituert med én eller flere grupper valgt fra hydroksyl, karboksyl, karbonyl, epoksid, acylklorid, tiol, nitryl, halogen, anhydrid, isocyanat, isotiocyanat og aminogrupper.

I følge ytterligere et aspekt tilveiebringes et taksan der avstandsstykket er valgt fra gruppen bestående av karboksylsyrer med fra 2-18 karbonatomer i den alifatiske eller aralifatiske kjeden, substituert med brom.

I følge enda et ytterligere aspekt tilveiebringes et taksan ifølge oppfinnelsen der avstandsstykket er valgt fra gruppen bestående av karboksylsyrer med fra 3-10 karbonatomer i den alifatiske eller aralifatiske kjeden, substituert med brom, så som der avstandsstykket er valgt fra 3-brompropionsyre og 4-brombutyrsyre.

I følge ytterligere et aspekt tilveiebringes et taksan der hyaluronsyren er esterifisert etter dannelsen av den kovalente bindingen med taksanet.

I følge ytterligere et aspekt tilveiebringes et taksan der den kovalente bindingen mellom taksanet og avstandsstykket er en esterbinding.

I følge ytterligere et aspekt tilveiebringes et taksan der den kovalente bindingen mellom taksanet og avstandsstykket er en uretan- eller tiouretanbinding.

I følge ytterligere et aspekt tilveiebringes et taksan der den kovalente bindingen mellom taksanet og avstandsstykket er en acetal- eller ketalbinding.

I følge ytterligere et aspekt tilveiebringes et taksan der bindingsprosenten mellom hyaluronsyre og taksan er mellom 0,1 % og 100 %, så som mellom 0,1 % og 35 %.

Den foreliggende oppfinnelse angår videre fremgangsmåten for fremstillingen av taksaner kovalent bundet til HA eller HA-derivater. I følge oppfinnelsen kan et taksan kovalent bundet til hyaluronsyre eller til et hyaluronsyrederivat i form av et avstandsstykke i følge oppfinnelsen fremstilles ved en fremgangsmåte omfattende følgende trinn: a) tilsette et aktiveringsmiddel til en løsning inneholdende hyaluronsyre eller hyaluronsyrederivat; b) tilsette avstandsstykket, eventuelt tidligere bundet til taksanet, til løsningen fremkommet i trinn a); c) eventuelt rense det derved oppnådde produktet, og omsette dette med taksanet dersom taksanet ikke tidligere er blitt bundet til avstandsstykket.

I følge et annet aspekt ved oppfinnelsen kan et taksan som er kovalent bundet til hyaluronsyre eller til et hyaluronsyrederivat i form av et avstandsstykke i følge oppfinnelsen der nevnte avstandsstykke har i det minste et halogen, og som binder karboksylgruppen til hyaluronsyren eller hyaluronsyrederivatet gjennom en esterbinding, fremstilles ved en fremgangsmåte omfattende følgende trinn: a') tilsette avstandsstykket, eventuelt tidligere bundet til taksanet, til en løsning av hyaluronsyre eller hyaluronsyrederivat;

b') eventuelt rense det derved oppnådde produktet og omsette det med taksanet dersom det ikke tidligere er blitt bundet til avstandsstykket.

I følge et aspekt av denne fremgangsmåten er nevnte halogenatom er i avstandsstykket brom.

Ytterligere formål ved oppfinnelsen er farmasøytiske preparater omfattende som det aktive middel i det minste et taksan kovalent bundet til HA eller HA-derivater og anvendelse derav i behandlingen av tumorer, autoimmune sykdommer og restenose.

I følge et aspekt tilveiebringes et farmasøytisk preparat omfattende som den aktive forbindelse i det minste et taksan kovalent bundet til hyaluronsyre eller til et hyaluronsyrederivat i følge oppfinnelsen i kombinasjon med farmasøytisk akseptable eksipienter og fortynningsmidler. Det farmasøytiske prapratet i følge oppfinnelsen er i følge et aspekt ved oppfinnelsen egnet for administrering gjennom oral, intravenøs, arteriell, intramuskulær, subkutan, intraperitoneal eller transdermal rute, eller ved direkte injeksjon i et tumorsete, fortrinnsvis gjennom den orale rute.

I følge et annet aspekt tilveiebringes et farmasøytisk preparat der hyaluronsyren eller hyaluronsyrederivatet er i stand til å frigjøre taksanet inn i administreringssetet.

I følge enda et aspekt omfatter det farmasøytisk preparat ifølge oppfinnelsen ytterligere én eller flere biologiske eller farmakologiske aktive forbindelser, f eks valgt fra gruppen bestående av steroider, hormoner, trofiske faktorer, proteiner, vitaminer, ikke-steroide antiinflammatoriske medikamenter, kjemoterapimedikamenter, kalsiumblokkere, antibiotika, antivirale midler, interleukiner og cytokiner, fortrinnsvis interferon.

De foreliggende taksaner som er kovalent bundet til HA eller HA-derivater har mange fordeler som kan sammenfattes som følger: 1) de er umiddelbart løselige i blodstrømmen; 2) de behøver ikke å blandes med Cremophor<®>EL for fremstillingen av formuleringer og overvinner derfor de foran nevnte problemene angående hypersensitivitet og anafylakse; 3) takket være den enzymatiske virkningen til enzymet slik som esteraser som vanligvis er tilstede i plasma frigjøres taksanene umiddelbart fra deres vesikkel HA eller HA-derivat fra det foreliggende preparat i blodet hvor de fritt kan utøve sin antikreftaktivitet; 4) de muliggjør oppnåelsen av et nytt medikament som i tilfelle av visse krefttyper kan utøve overraskende kjemoterapiaktivitet som er signifikant større enn den oppnådd når et ikke-konjugert taksan administreres ved å betrakte samme medikamentdose.

I følge et annet aspekt tilveiebringes anvendelse av taksanet i følge oppfinnelsen for fremstillingen av farmasøytiske preparater anvendelige for behandlingen av tumorer, inkludert behandling av tumorer omfattende kjemoterapi for brystkreft, kreft i eggstokken og/eller endometriet, melanom, lungekreft, leverkreft, prostatakreft og/eller blærekreft, mage- og/eller tarmkreft, leukemi og kaposis sarkom.

I følge et annet aspekt tilveiebringes anvendelse av taksanet i følge oppfinnelsen for fremstillingen av farmasøytiske preparater anvendelige for behandlingen av autoimmune patologier, inkludert behandling av autoimmune patologier valgt fra gruppen bestående av reumatoid artritt, Hashimotos tyroiditt, systemisk lupus erytematosus og autoimmun glomerulonefritt.

I følge et annet aspekt tilveiebringes anvendelse av taksanet i følge oppfinnelsen for fremstillingen av farmasøytiske preparater anvendelige for behandlingen av restenose.

I følge et annet aspekt tilveiebringes anvendelse av taksanet i følge oppfinnelsen for fremstillingen av farmasøytiske preparater for beleggingen av stent og medisinske anordninger.

Endelig tilveiebringes et stent og medisinske anordninger belagt med et taksan kovalent bundet til hyaluronsyre eller til et hyaluronsyrederivat som definert i kravene 1-24.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 viser prosent overlevelse etter implantering av neoplastiske celler som beskrevet i eksempel 1 for kontroller (svart histogram) og for mus som mottok paclitaksel (grått histogram) og paclitaksel kovalent bundet til HA-ester med 16 % esterifisering (hvitt histogram) fremstilt i eksempel 7. Fig. 2 viser den farmakologiske styrken uttrykt som IC50 og som er et resultat av eksperimenter i eksempel 2 av paclitaksel kovalent bundet til esterderivater av HA med 16 % esterifisering (grått histogram), 22 % esterifisering (svart histogram) og 6,8 % esterifisering (hvitt histogram) for fire brystkreftcellelinjer mot referanseproduktet paclitaksel. Fig. 3 viser prosent overlevelse etter implantering av neoplastiske celler som beskrevet i eksempel 3 i kontrollmus (stiplet linje) og i mus som mottok ACP<®->gel (kontinuerlig linje). Fig. 4 viser prosent paclitaksel kovalent bundet til HA-ester fremstilt som beskrevet i eksempel 7, frigjort i human plasma som beskrevet i testen i eksempel 13 mot tid.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse beskriver forbindelser som tilhører taksanfamilien, fortrinnsvis paclitaksel og docetaksel heretter representert ved henholdsvis formelen (I) og (II), kovalent bundet til HA eller HA-derivater, fortrinnsvis gjennom et avstandsstykke som et mellomrom mellom taksankomponenten og HA eller HA-derivatet som er kovalent bundet til begge molekyler.

HA er et heteropolysakkarid sammensatt av alternerende rester av D-glukuronsyre og N-acetyl-D-glukosamin med den følgende repeterende enhet:

HA er en lineær kjedepolymer med en molekylvekt som kan variere mellom 50000 og 13 x IO<6>Da i forhold til dets kilde og fremgangsmåten som anvendes for å oppnå det. Det finnes naturlig i de pericellulære geler i den fundamentale substansen til bindevev i vertebratorganismer (hvor det er én av hovedkomponentene), i synovialvæsken i ledd, i vitreous humor og i navlestrengen. HA spiller en viktig rolle i den biologiske organisme som en mekanisk støtte for cellene i mange vev slik som huden, senene og musklene og brusken. Det er hovedkomponenten i den ekstracellulære matriks men har også andre funksjoner slik som hydratiseringen av vev, smøring og cellemigrering og -differensiering.

HA som anvendes i den foreliggende oppfinnelse kan ekstraheres fra enhver kilde, f.eks. fra hanekammer eller det kan oppnås gjennom fermenteringsruten eller ved hjelp av tekniske midler og det kan ha en molekylvekt på mellom 400 og 3 x IO<6>Da, spesielt mellom 400 og 1 x 10<6>Da, og fortrinnsvis mellom 400 og 230000 Da.

HA-derivatene ifølge den foreliggende oppfinnelse velges fortrinnsvis fra gruppen bestående av de følgende HA-derivater: - HA mettet med organiske og/eller uorganiske baser; - Hyaff<®>: HA-estere med alkoholer av de alifatiske, aralifatiske, sykloalifatiske, aromatiske, sykliske og heterosykliske seriene, med en esterifiseringsgrad som kan variere i henhold til typen og lengden alkohol som anvendes, og som i ethvert tilfelle aldri er over 50 % esterifisering, og fortrinnsvis mellom 0,1 og 20 % siden den endelige polymeren som oppnås alltid må være vannløselig mens den gjenværende prosenten ikke-esterifisert HA kan være mettet med organiske og/eller uorganiske baser beskrevet i US patent nr. 4 851 521 inkorporert ved referanse heri; - Hyadd™: amider av HA med aminer av de alifatiske, aralifatiske, sykloalifatiske, aromatiske, sykliske og heterosykliske seriene med en prosent amidering på mellom 0,1 og 10 % siden den endelige polymeren alltid må være vannløselig mens den gjenværende prosenten HA som ikke er amidert kan være mettet med organiske og/eller uorganiske baser beskrevet i europeisk patentsøknad nr. 1095064 som herved er inkorporert ved referanse; - O-sulfaterte HA-derivater til den 4. grad sulfatering beskrevet i US patent nr. 6 027 741 som herved er inkorporert ved referanse; - ACP<®>: indre estere av HA med en esterifiseringsprosent som ikke er mer enn 15 % ettersom polymeren alltid må være vannløselig, fortrinnsvis mellom 0,05 og 10 % esterifisering mens den gjenværende prosenten ikke-esterifisert HA kan være mettet med organiske og/eller uorganiske baser beskrevet i europeisk patent nr. 0341745 Bl som herved er inkorporert ved referanse; - deacetylater av HA: disse er utledet fra deacetyleringen av N-acetylglukosaminenheten med en prosent deacetylering på fortrinnsvis mellom 0,1 og 30 % mens alle karboksylgruppene i HA kan være mettet med organiske og/eller uorganiske baser som illustrert i den følgende struktur (A): Deacetylater av HA er beskrevet i internasjonal patentsøknad nr. WO 02/18450 som herved er inkorporert ved referanse; - Hyoxx : percarboksylerte HA-derivater oppnådd gjennom oksidering av den primære hydroksylen til N-acetylglukosaminenheten med en perkarboksyleringsgrad på mellom 1 og 100 %, fortrinnsvis, fortrinnsvis mellom 25 og 75 %. Alle karboksylgruppene i HA kan være mettet med organiske og/eller uorganiske baser som illustrert i den følgende strukturen (B):

Perkarboksylerte HA-derivater er beskrevet i US patentsøknad nr. US 2003181689.

De foreliggende forbindelser hvor et taksen, og spesielt paclitaksel er kovalent bundet til en HA-ester kan videre oppnås ved å starte fra det kjemisk umodifiserte HA-molekylet og, kun etter syntese med det kjemoterapeutiske medikamentet, modifisere HA ved esterifisering av dette med alle alkoholene angitt ovenfor for Hyaff<®->produktene eller ved å danne indre estere som i tilfelle av ACP<®>(se eksempel 8). De tidligere angitte HA-derivatene som er spesielt viktige i synteseprosessen av forløpermedikament-HA taksan, og spesielt forløpermedikament-HA-paclitaksel, er deacetylerte og sulfaterte derivater fordi de gjør det endelige produktet mer løselig i blodstrømmen ved den samme prosent paclitaksel bundet til tidligere ikke-modifisert hyaluronsyre.

Det er kjent at HA påvirker mange ulike prosesser i forhold til cellefysiologi og -biologi slik som prolifereringen, differensieringen og bevegelsen av kreftceller og andre celler ved hjelp av CD44-membranreseptoren.

Vitenskapelig litteratur har nylig vist virkningen av HA mot kreft når HA injiseres som sådan direkte inn i kreftveksten. Det har vist seg mulig å bestemme den fullstendige regresjonen til 30 % av tumorene (Herrera-Gayol, A. et al., Experimental and Molecular Pathology, 2002, 72: 179-185).

Det er også kjent at HA kan være forbundet med ethvert kjemoterapeutisk medikament for å fremstille mange forskjellige farmasøytiske preparater siden det er mulig å virke som et andre antineoplastisk middel som synergistisk forsterker antikreftvirkningen til medikamentet assosiert med HA (internasjonal patentsøknad nr. WO 01/47561); alternativt kreves HA som et antikreftmedikament som skal administreres på egenhånd i ulike kliniske protokoller for reduksjonen/regresjonen av kreftvekst (internasjonal patentsøknad nr. WO 97/40841).

Det foreliggende taksan kovalent bundet til HA eller HA-derivater som nevnt ovenfor er forskjellig fra alle taksanformuleringene, spesielt den kovalente bindingen av paclitaksel med HA eller HA-derivater, eventuelt ved hjelp av et avstandsstykke som gjør paclitaksel løselig i vann uten å skade dets farmakologiske virkning. In vivo-eksperimentene beskrevet i eksempel 1 viser faktisk klart den samme antikreftvirkningen til det foreliggende konjugerte paclitaksel og ikke-konjugert paclitaksel når samme doser administreres.

HA-paclitaksel kan videre vise overraskende farmakologiske egenskaper som er forskjellige fra de til det ikke-konjugerte paclitaksel, spesielt tilfelle av disse tumortyper.

Eksempel 2 viser vitterlig klart at det foreliggende esterderivat av HA bundet til paclitaksel har en ny antineoplastisk farmakologisk aktivitet: i in vitro-cytotoksisitetsmodellen beskrevet i det følgende viser det foreliggende HA-paclitaksel overraskende antikreftaktivitet som er i stor grad overlegen i forhold til den utøvet av ikke-konjugert paclitaksel alene.

Denne nye antineoplastiske egenskapen betyr at de foreliggende taksaner, spesielt paclitaksel konjugert til HA eller HA-derivater, kan anvendes for fremstillingen av farmasøytiske preparater anvendelige som et kjemoterapeutisk medikament, ikke bare for behandling av alle tumorformene som Taxol<®>administreres for, men også for andre tumorformer som ikke normalt behandles med Taxol<®>, slik som kreft i magen og leveren, tarmkreft, melanom og leukemi. Videre kan det anvendes i systemiske autoimmune sykdommer slik som reumatoid artritt, systemisk lupuserytematosus, autoimmun glomerulonefritt og ikke minst Hashimotos thyroiditis.

Anvendelsen av de foreliggende produkter i en ny farmakologisk terapi for de ovenfor nevnte patologier er mulig fordi den nye HA-paclitakselforbindelsen reduserer den systemiske toksisiteten til Taxol<®>og derved øker den terapeutiske virkningen av medikamentet i seg selv siden det er: - vannløselig; - ikke assosiert med Cremophor<®>EL og derfor er fri for de toksiske virkningene som dette gir; - like effektiv ved doser bestemt lavere enn (eller tilsvarende til) de som normalt anvendes i kliniske protokoller.

Anvendelsen av paclitaksel som et medikament som kan anvendes for å hemme restenoseprosessen som vanligvis følger angioplastier (vanligvis arteriell), koronar bypass og organtransplantasjoner er kjent.

De foreliggende taksanene og spesielt paclitaksel, kovalent bundet til HA eller HA-derivater, kan også anvendes for å forebygge restenose eller de kan anvendes for å danne et indre belegg for stenter og anordninger implantert etter de ovenfor angitte vaskulære operasjoner, ettersom det har vist seg mulig å binde det kjemisk til

overflaten til nevnte stenter eller lett å adsorbere dem dertil.

Uansett er oppholdstiden for de foreliggende produkter på overflaten til stenten og følgelig dets gradvise frigjøring ut i blodstrømmen større enn den til ikke-konjugert paclitaksel fordi de kjemiske-fysiske egenskapene til HA favoriserer en progressiv, sakte men kontinuerlig frigjøring av Taxol<®>fra overflaten til anordningen.

De farmasøytiske preparatene som omfatter de foreliggende taksaner kovalent bundet til HA eller HA-derivater, kan administreres systemisk (ved hjelp av intravenøse eller arterielle, intramuskulære, intraperetonale, subkutane eller orale ruter), det kan anvendes for topisk påføring (ved hjelp av transdermal absorpsjon), eller det kan administreres direkte til kreftsetet ved hjelp av injeksjon.

HA eller et derivat derav kovalent bundet til paclitaksel kan også virke som et antikreftmedikament per se.

I det følgende eksempel 3 demonstrerer søkeren hvordan behandling av eksperimentelt induserte tumorer vokser i nakne mus med det kryssbundede derivatet HA, ACP<®>avslører en signifikant regresjon av tumoren sammenlignet med ikke-behandlede kontroller.

Søkeren beskriver derfor for første gang en ny funksjon for HA og derivatene derav som utgjør de foreliggende produktene taksan-HA eller taksan-HA-derivat, som antineoplastiske midler og deres relative anvendelser i onkologifeltet. De foreliggende taksanene kovalent bundet til HA eller HA-derivater kan videre være assosiert med ulike biologiske og farmakologiske aktive molekyler slik som f.eks. teroider, hormoner, proteiner, trofiske faktorer, vitaminer, ikke-steroide antiinflammatoriske medikamenter, kjemoterapimedikamenter, kalsiumantagonister, antibiotika, antivirale midler, interleukiner og cytokiner slik som interferon.

På denne måten er det mulig å oppnå mange ulike assosiasjoner av ovenfor nevnte medikamenter og relativt forskjellige farmasøytiske preparater omfattende toksanene ifølge oppfinnelsen.

Den foreliggende oppfinnelse angår også fremgangsmåten for å fremstille de foreliggende taksaner, spesielt paclitaksel, kovalent bundet til HA eller HA-derivater; de foreliggende produkter kan være oppnådd gjennom de følgende prosesser: 1) gjennom en indirekte syntese som involverer introduksjonen av et avstandsstykke mellom taksanet og HA eller HA-derivatet, eller 2) gjennom den direkte syntesen mellom taksanet og HA eller HA-derivatet.

De funksjonelle gruppene til HA eller HA-derivatene som kan reagere med taksanet direkte eller indirekte ved hjelp av et avstandsstykke er følgende: 1) hydroksyl grupper; 2) karboksylgrupper;

3) aminogrupper på deacetylert HA.

Avstandsstykket kan f.eks. velges fra gruppen bestående av en alifatisk eller en aralifatisk kjede, lineær eller forgrenet, substituert med én eller flere grupper valgt fra hydroksyl-, karboksyl- eller karbonylgrupper, epoksider, acylklorider, merkaptaner, nitriler, halogener, anhydrider, isocyanater og isotiocyanater og aminogrupper.

Blant de mulige avstandsstykkene er bromidene av karboksylsyrer med fra 2-18 karbonatomer foretrukket, og spesielt de med fra 3-10 karbonatomer; mer foretrukket er 3-brompropionsyre og 4-brombutyrsyre.

Syntesereaksjonen mellom de funksjonelle hydroksylgruppene på HA (eller derivatene derav) og en taksankomponent slik som paclitaksel kan oppnås gjennom en indirekte eller direkte synteseprosess.

Indirekte syntese kan medføre dannelsen av de følgende typene kovalent binding mellom avstandsstykket og HA eller HA-derivater:

esterbinding:

- som involverer karboksylfunksjonen til et egnet valgt avstandsstykke som aktiveres med et aktiveringsmiddel slik som f.eks. et karbodiimid (skjema 1 nedenfor); - som involverer hydroksylgruppene på HA eller HA-derivatet som er brominert eller substituert med en tosylgruppe med påfølgende nukleofil substitusjon av karboksylen til det egnede valgte avstandsstykket (skjema 2 nedenfor); eller - som involverer anhydridfunksjonen til et egnet valgt avstandsstykke (skjema 2 nedenfor);

- uretan- eller tiouretanbinding:

- som involverer aminogruppen til et egnet valgt avstandsstykke (skjema 4 nedenfor); eller - som involverer isocyanat- eller isotiocyanatfunksjonen til et egnet valgt avstandsstykke (skjema 5 nedenfor).

eterbinding:

- som involverer epoksy funksjonen til avstandsstykket (funnet egnet) (skjema 6 nedenfor); - som involverer hydroksylgruppene til HA eller HA-derivatet som er brominert eller substituert med en tosylgruppe med påfølgende nukleofil substitusjon av hydroksylgruppen til et egnet valgt avstandsstykke (skjema 7 nedenfor).

acetal- eller ketalbinding:

- som involverer aldehyd- og/eller ketongruppen til det egnede valgte avstandsstykket (skjema 8 nedenfor); - som involverer hydroksylgruppen til det egnede valgte avstandsstykket og som krever nærvær av en enkel karbonylforbindelse slik som formaldehyd (skjema 9 nedenfor).

De ovenfor beskrevne prosessene kan utføres ved anvendelse av midler som aktiverer hydroksylgruppen til HA eller HA-derivatene, f.eks. valgt fra gruppen bestående av karbonyldiimidazol og di-(N-suksimidyl)karbonat.

Den direkte syntesereaksjonen mellom hydroksylgruppene på HA eller HA-derivatene og et taksan slik som paclitaksel kan medføre dannelsen av den følgende typen kovalent binding:

acetalbinding:

- som involverer hydroksylgruppen på taksanet og hydroksylgruppen på HA eller HA-derivatene som er kovalent bundet ved tilsetting av en enkelt karbonylforbindelse slik som formaldehyd (skjema 10).

Reaksjonen mellom karboksylgruppene på HA eller HA-derivatene og et taksan slik som paclitaksel kan oppnås gjennom en direkte eller indirekte synteseprosess. Indirekte syntese kan medføre dannelsen av de følgende typer kovalent binding mellom avstandsstykket og HA eller HA-derivatene:

esterbinding:

- karboksylgruppen til det egnede valgte avstandsstykket, slik som 4-brombutyrsyre, aktiveres ved hjelp av et aktiveringsmiddel slik som et karbodiimid og gjøres følgelig egnet for syntese med hydroksylgruppen fra taksanet, fortrinnsvis den på karbonet ved C2<1>), slik som paclitaksel. Gjennom direkte kontakt i et vannfritt løsningsmiddel med et kvarternært ammoniumsalt, spesielt tetrabutylammoniumsaltet (TBA) av HA eller HA-derivatet oppnås deretter en nukleofil substitusjon av karboksylen på HA eller HA-derivatet med brom på avstandsstykket. På denne måten dannes en esterbinding mellom HA eller HA-derivatet og avstandsstykket, som igjen er bundet til paclitaksel. Alternativt kan den nukleofile substitusjonen av karboksylgruppen på HA eller HA-derivatet til brominet på avstandsstykket skje før bindingen mellom avstandsstykket selv og taksanet (skjema 11 nedenfor); - ved å anvende aktiveringsmidlene til karboksylgruppen på HA eller HA-derivatet slik som et karbodiimid er det mulig å oppnå en esterbinding mellom nevnte gruppe og hydroksylfunksjonen til (egnet valgt) avstandsstykke, fortrinnsvis eller deretter bundet til paclitaksel (skjema 12 nedenfor).

amidbinding:

- aktivering av karboksylgruppene på HA eller HA-derivatene gjennom et aktiveringsmiddel muliggjør en binding med aminogruppen på det egnede valgte avstandsstykket med unntak av alle hydrazidene, på forhånd eller påfølgende bundet til et taksan slik som paclitaksel (skjema 13 nedenfor).

Direktesyntese kan medføre dannelsen av de følgende typer kovalent binding: esterbinding: - aktiveringen av karboksylgruppen på HA eller HA-derivatet ved hjelp av et aktiveringsmiddel muliggjør dets binding med hydroksylgruppen på taksanet (skjema 14 nedenfor); - aktivering av hydroksylgruppen på taksankomponenten gjennom aktiveringsmidlet muliggjør dets binding med karboksylfunksjonen på HA eller et derivat derav (skjema 14); - den følgende bindingstypen krever bromidet eller tosylatet av taksanet.

Nevnte binding fremstilles gjennom nukleofil substitusjon av bromidet eller tosylgruppen med karboksylgruppen på HA eller HA-derivatet (skjema 15). Syntesereaksjonen mellom aminogruppene på deacetylert HA og en taksankomponent slik som paclitaksel kan skje gjennom en fremgangsmåte for indirekte eller direkte syntese.

Indirekte syntese kan medføre dannelsen av de følgende kovalente bindingstypene mellom avstandsstykket og HA:

amidbinding:

- som involverer karboksylgruppen på et egnet valgt avstandsstykke (skjema 16).

Direktesyntese kan medføre dannelsen av de følgende kovalente bindingstypene: uretanbinding:

- som involverer hydroksylgruppen til taksan og aminofunksjonen til deacetylert HA (skjema 18).

På samme måte kan bindingen som involverer avstandsstykket og et taksan slik som paclitaksel være en ester (skjema 19), uretan eller tiouretan (skjema 20), acetal-eller ketaltype (skjema 21) og kan kreve nærværet av et aktiveringsmiddel spesielt for ester- og uretanbindingene.

Avstandsstykket kan være bundet til taksaner slik som paclitaksel før eller etter dets binding med de funksjonelle gruppene på HA eller HA-derivatene avhengig av typen funksjonelle grupper på det egnede valgte avstandsstykket.

Prosent direkte eller indirekte binding av taksan, slik som paclitaksel, til HA eller HA-derivat kan variere mellom 0,1 % og 100 % og fortrinnsvis mellom 0,1 % og 35 %.

De følgende eksemplene er gitt for å tilveiebringe ikke-begrensende illustrasjoner av den foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

Virkningen av det nye ester derivat et av HA med paclitaksel i nakne mus etter implantering av neoplastiske celler

For delte eksperimentet anvendte vi humane eggstokkadenokarsinomceller, OVCAR-3-celler, i immunundertrykte nakne mus tilhørende Athymic CD-1-arten. Hver mus ble inokulert gjennom den intraperitoneale rute med 5xl0<6>kreftceller.

Eksperimentell design

Testmedikament:

- Taxol<®>, 5 dyr behandlet

- HYTADlp20: esterderivat av HA kovalent bundet til paclitaksel med 16 % esterifisering av karboksyl (vekt/vekt). Molekylvekten til HA anvendt for syntese av dette nye medikamentet var 200000 Da (se eksempel 7 for detaljer om dets fremstilling). Fem dyr ble anvendt for dette medikamentet også.

Behandlede dyr: 10 dyr ble først inokulert med OVCAR-3-celler. Fem ble anvendt i dette eksperimentet med Taxol<®>og ytterligere fem for eksperimentet med HYTADlp20: - alle ti dyrene fikk etter hverandre, ved hjelp av intraperitoneal injeksjon, 3 doser farmakologisk behandling (på 6., 13. og 20. dagen etter inokulering av kreftcellene), tilsvarende 20 mg/kg kroppsvekt Taxol<®>eller 125 mg/kg kroppsvekt HYTAD (svarende til 20 mg/mus på paclitaksel).

Kontrolldvr: 5 dyr ble først inokulert med den kreftinduserende suspensjonen av OVCAR-3-celler, hvoretter de ikke mottok noen form for behandling.

Bestemmelse av overlevelseskurve

Overlevelseskurven ble beregnet fra dataene ifølge oppfinnelsen til 92. dag etter inokulering av kreftcellene i peritoneum.

Resultater: De oppnådde resultatene er illustrert i fig. 1.

Tre kontrolldyr utviklet adenokarsinom i eggstokken og døde mellom 70. og 75. dag etter inokulering av kreftcellene.

På den 92. dagen etter intervensjon, den siste dagen for eksperimentet, var ingen av dyrene som hadde mottatt farmakologisk behandling med paclitaksel eller HYTAD, døde.

Eksempel 2

In vitro eksperiment

Formålet med in vitro-eksperimentet var hovedsakelig å definere aktivitetsprofilen til de nye esterderivatene av HA bundet til paclitaksel og til å vurdere/sammenligne den antineoplastiske aktiviteten til HYTAD-derivatene vs paclitaksel, for dermed å bestemme deres farmakologiske potensiale sammenlignet med det antineoplastiske medikament.

Eksperimentell design:

Testprodukter:

- Taxol<®>: referanseprodukt

- HYTADlp20 - HYTAD2p20 - HYTAD2plO: esterderivater av HA kovalent bundet til paclitaksel med 16 % esterifisering av karboksyl (vekt/vekt) (i tilfelle av HYTADlp20, var den molekylære vekten til HA anvendt i syntesen av dette nye medikamentet 200000 Da) (se eksempel 7 for detaljer ved dets fremstilling) eller 22 % (i tilfelle av HYTAD2p20, var molekylvekten til det anvendte HA 39000 Da), eller 6,8 % (i tilfelle av HYTAD2plO, var molekylvekten til anvendt HA 39000 Da).

Cellelinjer

Cellelinjer av human opprinnelse

Fire cellelinjer av human brystkreft ble anvendt. Alle fire testcellestammer svarer normalt på paclitaksel og uttrykker reseptoren CD44 tilsynelatende med samme amplifikasjon.

- MCF- 7

- MDA- MB- 231

- MDA- MB- 468

- SKBR- 3

Eksperimentell protokoll:

1) testcellelinjen ble sådd ut ved en konsentrasjon på 3000 celler pr. brønn, på en flatbundet 96-brønners plate; 2) 24 timer senere ble cellene tilført testløsningene passende fortynnet i kulturmedium; 3) etter ytterligere 72 timer ble cellene testet ved hjelp av kolorimetri med 3-(4,5-dimetyl-2-tiazolyl)-2,5-difenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT); ved å vurdere cellelevedyktighet avslørte denne testen også cellenes ulike sensitivitet for testmedikamentet. Dette er mulig fordi mitokondriell dehydrogenase er i stand til å redusere tetrazoliumsaltene (gul) til blå formazankrystaller. Større eller mindre fargeintensitet bestemmes ved spektrofotometri (Dezinot, F. et al., J. Immunol. Methods, 1986, 22 (89): 271-277).

Resultater

Heretter rapporteres, i tabell- og grafisk form i fig. 2, oppnådde resultatene i form av ICso(den konsentrasjon av medikamentet som er nødvendig for å hemme cellevekst med 50 % med hensyn til testproduktet og de ulike anvendte celletypene).

I fig. 2 representerer x-aksen den farmakologiske styrken uttrykt som IC50og beregnet som forholdet mellom de molare konsentrasjonene vs. referanseproduktet (paclitaksel) som vanligvis sies å ha en verdi på null. Følgelig indikerer den stiplede linjen en farmakologisk styrke som er større enn den til referanseproduktet.

IC50(uttrykt som nM eller uM paclitaksel eller dets HYTAD-derivater i kulturmedium)

Konklusjoner

Som rapportert om i litteraturen er alle de anvendte cellelinjene sensitive for taksol, et medikament som hovedsakelig anvendes for å behandle metastatisk karsinom i brystet eller i eggstokkene. I forhold til brystkreftcellelinjene viste de ulike HYTAD seg å være betraktelig sterkere enn paclitaksel, med en faktor på +150 med hensyn til HYTADlp20 på kreftcellelinjen MCF-7.

Eksempel 3

Virkning av ACP®- gel i nakne mus etter implantering av neoplastiske celler

For dette eksperimentet anvendte vi humane magekarsinom-HT29-celler i immunundertrykte nakne mus tilhørende den atymiske nakne (nu/nu)-arten. Hvert dyr ble bedøvet og 0,3 ml av en HT29-cellesuspensjon ble injisert inn i dets peretonealhulrom ved en konsentrasjon på 166000 celler/ml. Hver mus mottok følgelig 50000 kreftceller.

Eksperimentell design:

Behandlede dyr: 113 dyr ble først inokulert med HT29 og de mottok umiddelbart etterpå en enkelt behandlingsdose tilsvarende 0,2 ml ACP-gel 40 mg/ml;

Kontrolldvr: 117 dyr ble inokulert med HT29-kreftcellesuspensjon men mottok ingen behandling.

Overlevelseskurve: overlevelseskurven ble beregnet fra inokuleringsdagen opp til dagen de døde. Død ble enten fastslått eller forårsaket ved avlivning av dyrene ved det tidspunktet hvor dyrenes vekt hadde falt med mer enn 20 % i forhold til utgangsvekten, og i tilfelle hemoperitoneum indikerte diffuse metastaser. Prosenten overlevelse i de to gruppene ble bestemt daglig og uttrykt som en graf for å oppnå kurven som er rapportert i fig. 3.

Eksperimentet varte i 120 dager hvoretter alle de overlevende dyrene ble avlivet og undersøkt nekroskopisk for å sjekke nærværet av abdominale tumorer.

Resultater: 32 dyr ut av 230 hadde ikke utviklet noen merkbar neoplasi. 22 av disse dyrene tilhørte gruppen mus behandlet med ACP<®->gel, 10 til kontrollgruppen.

ACP^-gel: 19,5 % av de behandlede dyrene utviklet ikke neoplasi;

Kontroll: 8,5 % av kontrolldyrene utviklet ikke neoplasi.

Eksempel 4

Fremstilling av HA med en molekylvekt på mellom 5000 og 10000 Daltons ( for mulig syntese av HA- paclitaksel med lave molekylvekts HA)

2,40 g natrium-HA med en molekylvekt på 990000 Da ble løst i 240 ml av en løsning 0,15M NaCl. Dette ble deretter tilført 7,9 ml av en 14 % NaOCl-løsning. Ved en konstant temperatur på +4°C ble løsningen sonikert i 120 min. ved en frekvens på 20 Hz og ved 150 W. Med én gang reaksjonen var fullstendig ble pH justert til 6,5 med 0,1N HC1 og løsningen ble deretter presipitert i 1000 ml av en 2:1-blanding metanol-aceton. Produktet ble samlet ved hjelp av filtrering og vakuumtørking i 48 timer ved 45°C. 1,65 g natriumsalt oppnås dermed. Høytrykks væskekromatografi (HPLC)-GPC-analyse avslørte at den oppnådde HA-fraksjonen hadde en gjennomsnittelig molekylvekt (MW) på 5850 og et gjennomsnitt nummerisk molekylvekt (MN) på 3640 og en polydispersitetsindeks på 1,61.

Eksempel 5

Fremstilling av et esterderivat av HA bundet til paclitaksel med esterifisering av karboksylen på omtrent 4 % vekt/ vekt

51 mg paclitaksel ble løst i CH2CI2og løsningen ble tilført 104 mg l-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid (EDC) og 20 mg 4-brombutyrsyre. Deretter ble løsningen fordelt i vann. Etter eliminering av karbodiimid- og bromidrester ble reaksjonsløsningsmiddelet tørket med vannfri natriumsulfat og eliminert med en rotasjonsfordamper. 21 mg produkt oppnådd på denne måten ble løst i n-metyl-pyrrolidon (NMP) og tilsatt til en 20 mg/ml HA-løsning mettet med tetrabutylammonium (TBA) i NMP (200 mg i 10 ml NMP). Etter syv dagers reaksjon ved omgivelsestemperatur ble løsningen fortynnet med 5 ml vann og 1 ml mettet NaCl-løsning. Den derved oppnådde løsningen ble rørt i 1 time for å muliggjøre utbytting av natrium med TBA-ionet. Deretter ble etanol sakte tilsatt en dråpe om gangen og det filamentøse produktet som dermed var oppnådd ble løst i vann, dialysert og til sist frysetørket.

Eksempel 6

Fremstilling av et esterderivat av HA med paclitaksel med esterifisering ved karboksylen på omtrent 10% vekt/ vekt

Som i eksempel 5 ble 308,7 mg paclitaksel løst i 15 ml diklormetan tilsatt 117,2 mg 4-brombutyrsyre og 614,1 mg EDC. Deretter ble vann tilsatt til løsningen for å eliminere alt bromidet og karbodiimidet. Den organiske løsningen som derved var oppnådd ble tilsatt natriumsulfat for å dehydrere løsningen mens løsningsmidlet ble fjernet med en rotasjonsfordamper. Endelig ble 363 mg mellomprodukt oppnådd.

175 mg mellomprodukt oppnådd på denne måten ble tilsatt til 1 g HA-TBA løst i vannfri NMP. Løsningen ble rørt ved omgivelsestemperatur i 7 dager hvoretter 20 ml vann og 4 ml av en mettet NaCl-løsning ble tilsatt. Det ble rørt i 1 time for å muliggjøre utbytting av natrium med THA-ionet. Deretter ble etanol sakte tilsatt 1 dråpe om gangen og det filamentøse oppnådde produktet ble løst i vann, dialysert og til slutt frysetørket.

Eksempel 7

Fremstilling av et esterderivat av HA med paclitaksel med esterifisering ved karboksylen på omtrent 16% vekt/ vekt

164 mg av mellomproduktet oppnådd ifølge prosedyren beskrevet i det tidligere eksempel 5 og 6 ble tilsatt til en løsning 680 mg HA-TBA løst i 25 ml vannfri NMP. Etter 7 dagers reaksjon ved omgivelsestemperatur ble løsningen tilsatt 20 ml vann og 4 ml mettet NaCl-løsning. Etter 1 time ble etanol sakte tilsatt 1 dråpe om gangen. Det oppnådde produktet ble samlet ved hjelp av filtrering og løst i vann, dialysert og når ledeevnen til dialyseløsningen var falt under 10 u.S ble det fyst. Den frosne løsningen ble deretter frysetørket.

Eksempel 8

Fremstilling av et HA- esterderivat med paclitaksel med esterifisering ved hydroksylen på omtrent 10 % vekt/ vekt

102,6 mg paclitaksel ble løst i 5 ml diklormetan og løsningen ble suplementert med 20,4 mg ravsyreanhydrid. Tre timer senere ble løsningsmidlet eliminert ved hjelp av fordampning ved anvendelse av en rotasjonsfordamper. Produktet oppnådd på denne måten ble løst i 5 ml dimetylsulfoksid (DMSO) med lavt vanninnhold og 27,3 mg

disykloheksylkarbodiimid ble tilsatt. Omtrent 5 min. senere ble løsningen tilsatt en løsning HA-TBA, oppnådd ved å løse 327 mg polymer i 15 ml DMSO med lavt vanninnhold. Løsningen ble rørt ved omgivelsestemperatur i omtrent 24 timer. Deretter ble noen få ml vann og 3 ml mettet NaCl-løsning tilsatt til løsningen. Etter 1 time ble det presipitert ved tilsetting av etanol. Det filamentøse produktet ble samlet ved hjelp av filtrering, løst i vann, dialysert og til sist frysetørket.

Eksempel 9

Fremstilling av et HA- ester derivat med paclitaksel med esterifisering ved karboksyl på omtrent 4 % vekt/ vekt

510,1 mg paclitaksel løst i 6 ml diklormetan ble tilsatt 95,4 mg 3-3-brompropionsyre og 525,0 mg EDC. Deretter ble vann tilsatt til løsningen for å eliminere bromidet og karbodiimidet ved fordeling mens 10 volum vann ble anvendt for å eliminere reagensene. Den organiske løsningen ble tilsatt natriumsulfat for dehydrering og løsningsmidlet ble fjernet med en rotasjonsfordamper.

155,5 mg mellomprodukt oppnådd på denne måten ble tilsatt til 1,46 g HA-TBA løst i vannfri NMP og løsningen oppnådd på denne måten ble rørt ved omgivelsestemperatur i 7 dager. Deretter ble 20 ml vann og 4 ml mettet NaCl-løsning tilsatt. Løsningen ble rørt i 1 time for å muliggjøre utbytting av natrium med TBA-ionet. Deretter ble etanol sakte tilsatt 1 dråpe om gangen og det filamentøse produktet oppnådd på denne måten ble løst i vann, dialysert og til sist frysetørket.

Eksempel 10

Fremstilling av et hyaluronsyreesterderivat med esterifisering ved karboksyl på omtrent 30% vekt/ vekt

500 mg paclitaksel ble løst i CH2CI2og løsningen ble suplementert med 397,6 mg 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid (EDC) og 300,9 mg 4-brombutyrsyre. Deretter ble løsningen fordelt i vann. Med én gang karbodiimidet og bromidresten var eliminert ble reaksjonsløsningsmidlet tørket med vannfritt natriumsulfat og eliminert med en rotasjonsfordamper. Produktet oppnådd på denne måten ble løst i NMP og tilsatt til en løsning som inneholder tilnærmet 20 mg/ml hyaluronsyre mettet med TBA i NMP (1,95 g i 100 ml NMP). Etter 7 dagers reaksjon ved omgivelsestemperatur ble løsningen fortynnet med 20 ml vann og 4,5 ml mettet NaCl-løsning. Løsningen ble rørt i 1 time for å muliggjøre utbyttingen av natrium med TBA-ionet. Deretter ble etanol sakte tilsatt 1 dråpe om gangen og det filamentøse produktet oppnådd på denne måten ble løst i vann og dialysert og til slutt frysetørket.

Eksempel 11

Fremstilling av den delvise autokryssbundede HA- esteren ( omtrent 10 % substitusjon) med 8 % paclitaksel vekt/ vekt

3,10 g HA mettet med TBA ble løst i 150 ml DMSO med et lavt vanninnhold ved

omgivelsestemperatur. Løsningen ble deretter tilsatt 541,0 mg mellomprodukt paclitaksel oppnådd ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 5, 6 og 7. Med én gang det hadde fått reagere i 7 dager ved omgivelsestemperatur ble reaksjonsløsningen tilsatt 126,5 g trietylamin og det hele ble rørt i 30 min.

En løsning 319,5 g 2-klor-l-metylpyridiniodid i 30 ml DMSO ble sakte tilsatt 1 dråpe om gangen i løpet av et 45-min. intervall og blandingen ble etterlatt ved 30°C i 15 timer.

En løsning dannet av 50 ml vann og 1,7 g natriumklorid ble tilsatt og den resulterende blandingen ble helt sakte over i 400 ml aceton under kontinuerlig røring. Et presipitat ble dannet som ble filtrert og vasket tre ganger med 50 ml acetomvann, 5:1 og tre ganger med aceton (50 ml). Det endelige oppnådde produktet ble vakuumtørket ved 38°C.

Eksempel 12

Tester av løseligheten til HA- paclitakselestere oppnådd ifølge eksempel 5 i en 5 % glukoseløsning

14,6 mg av et HA-paclitakselprodukt oppnådd ved esterifisering ifølge eksempel 7 (ved å starte fra HA med en molekylvekt på 200 kDa) med en substitusjonsgrad ved karboksyl på 16,3 % vekt/vekt, ble løst i 1 ml vandig 5 % glukoseløsning. Løsningen, rørt med en magnet, kan filtreres gjennom et 0,20 u.m sterilfilter tilpasset en sprøyte. Konsentrasjonen av paclitaksel i løsningen var 2,38 mg/ml.

Vi forsøkte også å finne den maksimale konsentrasjonen av produktet pr. ml 5 % vandig glukoseløsning. Ved en konsentrasjon på 32,8 mg HA-paclitakselprodukt pr. ml glukoseløsning ble en viskøs løsning oppnådd med en paclitaksel-konsentrasjon på 5,35 mg/ml.

Eksempel 13

Tester for å gjenvinne paclitaksel fra human plasma

En løsning ble fremstilt som består av 101,3 mg HA-paclitaksel i 10 ml vann. HA-paclitaksel ble fremstilt som beskrevet i eksempel 7.

Gjenvinningstesten ble utført ved å plassere 40 mg av den ovenfor beskrevne løsningen i kontakt med 2 ml human plasma ved 37°C.

For å bestemme paclitaksel frigjort i plasma ved å avkoble seg selv fra HA ble tre kontakttider satt: 6, 30 og 60 min. Ved slutten av hvert kontaktintervall ble paclitaksel ekstrahert fra plasma-HA-paclitaksel-løsningen med tre rensinger, hver med 1,5 ml tetrabutylmetyleter (TBME), som ble samlet sammen, fordampet til tørrhet ved naturlig fordampning ved 65°C og resuspendert i 400 u.1 absolutt etanol for å bestemme innholdet av det aktuelle medikamentet ved hjelp av HPLC (høytrykks væskekromatografi). De oppnådde resultatene er vist i fig. 4: etter 6 min. var mer enn 80 % av paclitaksel avkoblet fra HA og prosenten hadde ikke økt ved de senere observasjonstidspunkter.

Det er klart at oppfinnelsen som herved er beskrevet kan modifiseres på ulike måter. Slike modifikasjoner skal ikke ansees å avvike fra ånden og formålet ved oppfinnelsen og at det er åpenbart for fagmannen på området at slike modifikasjoner kommer innenfor rammen av de følgende krav.

Claims

1. Taksan kovalent bundet til hyaluronsyre eller til et hyaluronsyrederivat, hvori den kovalente bindingen i form av et avstandsstykke er dannet mellom hydroksylgrupper på taksanet og karboksylgrupper på hyaluronsyren eller på et hyaluronsyrederivat og bindingen mellom karboksylgrupper på hyaluronsyren eller derivatet derav og avstandsstykket er en esterbinding.

2. Taksan ifølge krav 1, hvori taksanet er valgt mellom paclitaksel og docetaksel.

3. Taksan ifølge krav 1, hvori nevnte taksan er paclitaksel.

4. Taksan ifølge krav 1, hvori hyaluronsyren har en molekylvekt på mellom 400 og 3x106 Dalton.

5. Taksan ifølge krav 4, hvori hyaluronsyren har en molekylvekt på mellom 400 og lxl 06 Dalton.

6. Taksan ifølge krav 4, hvori hyaluronsyren har en molekylvekt på mellom 400 og 230000 Dalton.

7. Taksan ifølge krav 1, hvori hyaluronsyren er mettet med organiske og/eller uorganiske baser.

8. Taksan ifølge krav 1, hvori hyaluronsyrederivatet er valgt fra gruppen bestående av estere av hyaluronsyre med alkoholer av den alifatiske, aralifatiske, sykloalifatiske, aromatiske, sykliske og heterosykliske serier, hvor nevnte estere har en esterifiseringsgrad tilsvarende til eller lavere enn 50 %.

9. Taksan ifølge krav 1, hvori hyaluronsyrederivatet er valgt fra gruppen bestående av amider av hyaluronsyre med aminer av de alifatiske, aralifatiske, sykloalifatiske, aromatiske, sykliske og heterosykliske seriene, hvor nevnte amider har en amideringsgrad på mellom 0,1 % og 10 %.

10. Taksan ifølge krav 1, hvori hyaluronsyrederivatet er valgt fra gruppen bestående av O-sulfaterte derivater av hyaluronsyre opp til den fjerde sulfateringsgraden.

11. Taksan ifølge krav 1, hvori hyaluronsyrederivatet er valgt fra gruppen bestående av indre estere av hyaluronsyre med en esterifiseringsgrad tilsvarende til eller lavere enn 15 %.

12. Taksan ifølge krav 1, hvori hyaluronsyrederivatet er valgt fra gruppen bestående av deacetylert hyaluronsyre fra deacetyleringen av N-acetylglukosaminenheten og med en deacetyleringsgrad på mellom 0,1 % og 30 %.

13. Taksan ifølge krav 1, hvori hyaluronsyrederivatet er valgt fra gruppen bestående av perkarboksylerte derivater av hyaluronsyre oppnådd fra oksideringen av den primære hydroksyl i N-acetylglukosaminenheten med en perkarboksyleringsgrad på mellom 1 og 100 %.

14. Taksan ifølge krav 1, hvori avstandsstykket som binder taksanet til hyaluronsyre eller hyaluronsyrederivat er valgt fra gruppen bestående av alifatiske eller aralifatiske kjeder, lineære eller forgrenede, substituert med én eller flere grupper valgt fra hydroksyl, karboksyl, karbonyl, epoksid, acylklorid, tiol, nitryl, halogen, anhydrid, isocyanat, isotiocyanat og aminogrupper.

15. Taksan ifølge krav 14, hvori avstandsstykket er valgt fra gruppen bestående av karboksylsyrer med fra 2-18 karbonatomer i den alifatiske eller aralifatiske kjeden, substituert med brom.

16. Taksan ifølge krav 14, hvori avstandsstykket er valgt fra gruppen bestående av karboksylsyrer med fra 3-10 karbonatomer i den alifatiske eller aralifatiske kjeden, substituert med brom.

17. Taksan ifølge krav 14, hvori avstandsstykket er valgt fra 3-brompropionsyre og 4-brombutyrsyre.

18. Taksan ifølge krav 8, hvori hyaluronsyren er esterifisert etter dannelsen av den kovalente bindingen med taksanet.

19. Taksan ifølge krav 11, hvori hyaluronsyren er esterifisert etter dannelsen av den kovalente bindingen med taksanet.

20. Taksan ifølge krav 1, hvori den kovalente bindingen mellom taksanet og avstandsstykket er en esterbinding.

21. Taksan ifølge krav 1, hvori hyaluronsyren er esterifisert etter dannelsen av den kovalente bindingen med taksanet.

22. Taksan ifølge krav 1, hvori den kovalente bindingen mellom taksanet og avstandsstykket er en uretan- eller tiouretanbinding.

23. Taksan ifølge krav 1, hvori bindingsprosenten mellom hyaluronsyre og taksan er mellom 0,1 % og 100 %.

24. Taksan ifølge krav 23, hvori bindingsprosenten mellom hyaluronsyre og taksan er mellom 0,1 % og 35 %.

25. Farmasøytisk preparat omfattende som den aktive forbindelse i det minste et taksan kovalent bundet til hyaluronsyre eller til et hyaluronsyrederivat som definert i kravene 1- 24 i kombinasjon med farmasøytisk akseptable eksipienter og fortynningsmidler.

26. Farmasøytisk preparat ifølge krav 25, for administrering gjennom oral, intravenøs, arteriell, intramuskulær, subkutan, intraperitoneal eller transdermal rute, eller ved direkte injeksjon i et tumorsete.

27. Farmasøytisk preparat ifølge krav 25, for administrering gjennom den orale rute.

28. Farmasøytisk preparat ifølge krav 25, hvori hyaluronsyren eller hyaluronsyrederivatet er i stand til å frigjøre taksanet inn i administreringssetet.

29. Farmasøytisk preparat ifølge hvilket som helst av kravene 25-28, hvori preparatet ytterligere omfatter én eller flere biologiske eller farmakologiske aktive forbindelser.

30. Farmasøytisk preparat ifølge krav 29, hvori nevnte biologiske eller farmakologiske aktive forbindelser er valgt fra gruppen bestående av steroider, hormoner, trofiske faktorer, proteiner, vitaminer, ikke-steroide antiinflammatoriske medikamenter, kjemoterapimedikamenter, kalsiumblokkere, antibiotika, antivirale midler, interleukiner og cytokiner.

31. Farmasøytisk preparat ifølge krav 29, hvori nevnte biologiske eller farmakologiske aktive forbindelse er interferon.

32. Anvendelse av taksan kovalent bundet til hyaluronsyre eller til et hyaluronsyrederivat som definert i kravene 1-24, for fremstillingen av farmasøytiske preparater anvendelige for behandlingen av tumorer.

33. Anvendelse ifølge krav 32, hvori behandlingen av tumorene omfatter kjemoterapi for brystkreft, kreft i eggstokken og/eller endometriet, melanom, lungekreft, leverkreft, prostatakreft og/eller blærekreft, mage- og/eller tarmkreft, leukemi og kaposis sarkom.

34. Anvendelse av taksan kovalent bundet til hyaluronsyre eller til et hyaluronsyrederivat som definert i kravene 1-24, for fremstillingen av farmasøytiske preparater anvendelige for behandlingen av autoimmune patologier.

35. Anvendelse ifølge krav 34, hvor nevnte autoimmune patologier er valgt fra gruppen bestående av reumatoid artritt, Hashimotos tyroiditt, systemisk lupus erytematosus og autoimmun glomerulonefritt.

26. Anvendelse av taksan kovalent bundet til hyaluronsyre eller til et hyaluronsyrederivat som definert i kravene 1-24, for fremstillingen av farmasøytiske preparater anvendelige for behandlingen av restenose.

37. Anvendelse av taksan kovalent bundet til hyaluronsyre eller til et hyaluronsyrederivat som definert i kravene 1 -24, for beleggingen av stent og medisinske anordninger.

38. Stent og medisinske anordninger belagt med et taksan kovalent bundet til hyaluronsyre eller til et hyaluronsyrederivat som definert i kravene 1-24.

39. Fremgangsmåte for fremstillingen av et taksan kovalent bundet til hyaluronsyre eller til et hyaluronsyrederivat i form av et avstandsstykke i følge krav 1-24, karakterisert vedat nevnte fremgangsmåte omfatter følgende trinn: a) tilsette et aktiveringsmiddel til en løsning inneholdende hyaluronsyre eller hyaluronsyrederivat; b) tilsette avstandsstykket, eventuelt tidligere bundet til taksanet, til løsningen fremkommet i trinn a); c) eventuelt rense det derved oppnådde produktet, og omsette dette med taksanet dersom taksanet ikke tidligere er blitt bundet til avstandsstykket.

40. Fremgangsmåte for fremstilling av et taksan kovalent bundet til hyaluronsyre eller til et hyaluronsyrederivat i form av et avstandsstykke i følge krav 1-24, whori nevnte avstandsstykke har i det minste et halogen, og binde karboksylgruppen til hyaluronsyren eller hyaluronsyrederivatet gjennom en esterbinding,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter følgende trinn: a') tilsette avstandsstykket, eventuelt tidligere bundet til taksanet, til en løsning av hyaluronsyre eller hyaluronsyrederivat; b') eventuelt rense det derved oppnådde produktet og omsette det med taksanet dersom det ikke tidligere er blitt bundet til avstandsstykket.

41. Fremgangsmåte i følge krav 40, karakterisert vedat nevnte halogenatom er i avstandsstykket er brom.

42. Taksan i følge krav 1, hvori hyaluronsyren eller derivatet derav øker antikreftvirkningen til taksanet.

43. Taksan i følge krav 11, hvori den indre esteren til hyaluronsyren øker antikreftvirkningen til taksanet.