CN106573957B - 由透明质酸和肌肽得到的衍生物 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及具有式(1)的肌肽(β‑丙氨酰‑L‑组氨酸)的衍生物，通过透明质酸与肌肽的官能作用获得。

Description

由透明质酸和肌肽得到的衍生物
本发明涉及具有式(1)的肌肽(β-丙氨酰-L-组氨酸)的衍生物，通过透明质酸与肌肽的官能作用得到。
更具体地，本发明涉及具有式(1)的化合物
Figure BDA0001218003060000011
即，3-N-透明质酸基(hyaluronyl)缀合的2-(3-氨基丙酰胺)-3-(1H-咪唑-4-基)丙酸,或透明质酸基-肌肽(hyaluronyl-carnosine)或3-(1H-咪唑-4-基)-2-(3-透明质酰胺丙酰胺(hyaluronamidopropanamide))丙酸。
以上所示具有(1)的化合物是具有式(2)的肌肽二肽
Figure BDA0001218003060000012
与透明质酸之间的缀合物，其中所述缀合物由肌肽的NH2基团、优选在羧基上受保护的，与透明质酸、优选透明质酸的活性衍生物、甚至更优选具有式(3)的COX酯的一个或多个羧基之间形成酰胺键而得到。
Figure BDA0001218003060000021
本发明还涉及用于制备3-N-透明质酸基(hyaluronyl)缀合的2-(3-氨基丙酰胺)-3-(1H-咪唑-4-基)丙酸(HyCar)的方法以及含有其的制剂在药物，化妆品和营养食品中的用途，具有抗氧化、愈合(cicatrizing)、螯合、胃保护(gastroprotective(作为与Zn2+的复合物))、葡萄糖调节(glucomodulatory)、免疫调节(immunomodulatory)、抗肿瘤、抗遗传毒性(antigenotoxic)、神经保护(neuroprotective)、抗糖化(anti-glycation)、抗纤维原形成活性(antifibrillogenic activity)、中枢神经系统的抗衰老活性、由于缺血/再灌注损伤的保护活性、肾保护(nephroprotective)、肝保护活性(hepato-protective activity)。
细胞呼吸方法产生了重要和有潜在危险的副产物：超氧自由基O2 ·-,其会与生物大分子比如蛋白质、DNA和脂质反应，损伤它们，并会产生其它高反应性物质(ROS)比如·OH,RO2 ·,ROOH,RO·,H2O2和ONOO·，其对于细胞系统具有潜在攻击性。所有需氧生物体都具有抗O2 ·-自由基的防御机制，其中主要的是超氧化物歧化酶(SOD)酶系，其催化由O2 ·-到O2和H2O2的歧化作用。由此产生的过氧化氢转而通过过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化酶转化为H2O，从而防止形成将会通过芬顿(Fenton)反应(Fe(II)+)+H2O2→Fe(III)+·OH+-OH)产生的·OH自由基。在一些病理条件下(炎症性过程、再灌注损伤、心脏病发作、阿尔茨海默病、ALS等)，所述SOD酶系可能不足以消除产生的过量O2 ·-，在这些情况下，生物组织会遭受进一步损伤。在以更高水平的氧化代谢为特征的一些脊椎动物组织，比如肌肉或脑中，已经发现具有抗氧化活性的高水平的小分子比如谷胱甘肽和其它肽类(肌肽、高肌肽、鹅肌肽等)，其具有对抗氧化性应激过程的强化保护功能。已经广泛讨论并在文献中证明这些肽类对于ROS的保护活性((Biochim.Biophys.Acta1570,89,2002；Mol.Cells 13,498,2002；Biochem.J.967,241,1988)。
对于肌肽，特别地，关于其抗自由基和抗过氧化性质，临床前研究已经证明了其预防和在某些情况下治愈白内障的能力(Biochem.Int.15,1105,1987；Biochim.Biophys.Acta 1004,363,1989)。已经在消化系统的组织、眼睛和皮肤中证明了抗炎活性(US4508728 A,DE4316293,WO 01/52808 A)。另外，肌肽已经显示出关于由Cu(II)诱导的人LDL氧化的抑制作用(Eur.J.Med.Chem.43,373,2008)，并且已经特别证明了它对羟基自由基的清除剂活性(Helv.Chim.Acta85,1633,2002)。关于允许肌肽抵消亚硝化应激的病理作用的机制，已经证明与一氧化氮直接的相互作用是可能的路径之一(J.Neurosci.Res.85,2239,2007)，然而，只有天然二肽大大降低由No供体释放的一氧化氮的量。最近，已经证明在氧化性应激诱导之后，肌肽在降低PARP-1和PARP-2活化中的有效性(Neurochem.Res.35,2144,2010；Mol.Aspects Med.32,258,2011)。另一方面，L-肌肽与N-一甲基-精氨酸(iNOS已知的抑制剂)类似，下调PRAP-1表达(Neurochem.Res.38,50,2013)。
还令人感兴趣的是观察到肌肽与Cu(II)的复合物显示出抗两种有毒的自由基，O2 -·和HO·的协同活性(DaltonTrans.4406,2003)。类似地，还观察到肌肽,鹅肌肽,高肌肽和其它类似肽类的存在改善了锌的肠内吸收，实际上，改善了生物利用度。该事实在锌缺乏综合征和炎性肠疾病中是特别感兴趣的(Biomed.Res.Trace Elem.12,159,2001)。
肌肽的肽性质对其使用中施加了各种限制，与关于特定肽酶的其降解度有关。已经建议使用N-乙酰基-肌肽(WO 95/10294 A)来克服该限制，其降解比游离肌肽慢得多(Clin.Chim.Acta 254,1-21,1996)。出于相同的目的，已经使用肌肽与环糊精，即与广泛用作药物载体的化合物，通过形成仲胺的衍生化(EP 1176154 A)。在这种情况下，所述环糊精稳定了二肽，保护其免受肌肽的水解活性，如对类似系统所证明的(J.Am.Chem.Soc.120,7030,1998)，由此允许肌肽发挥其生物活性，得益于消除·OH自由基的寡糖的存在(Helv.Chim.Acta 85,1633,2002)。基于相同的理论，肌肽与海藻糖的缀合化合物(EP1860116 A1)随后被授予专利，作为具有抗氧化、抗糖化和抗血小板活性的系统。在这种情况下，肌肽也通过键与海藻糖的-OH官能团形成仲胺而缀合。由此形成的键肯定比通过离子键获得的更稳定，不仅保护肌肽至少部分免受酶的降解，而且还利用已知的海藻糖的能力保护蛋白质免受由于变性剂的构象变化。
本发明的目的的具有式(1)的化合物，相反是通过肌肽与透明质酸共价缀合，通过在HA的羧基和肌肽的氨基之间形成酰胺键得到。
透明质酸是由重复的二糖单元组成的聚合物，所述二糖单元由葡萄醛糖(β-D-吡喃葡糖醛酸)和乙酰胺基葡糖(2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡萄吡喃糖(lucopyranosium))构成，通过乙酰氨基葡糖的第一个异头碳原子和C-3之间的糖苷键彼此结合。二糖单元又通过二糖单元的乙酰基葡糖胺的异头碳与属于以下二糖单元的葡糖醛酸残基的C-3之间的糖苷键彼此结合，形成长度可变的直链。HA的平均分子量(MW)取决于该长度，所述MW极端可变，还取决于获得HA的来源。特别地，本发明中使用的HA可以通过提取(例如来自公鸡冠)，通过发酵或通过生物合成获得，具有平均MW在90至230kDa之间,优选180至210kDa之间。进一步用于本发明目的的平均MW范围包含在500至730kDa之间。在本说明书中平均MW指“重量平均MW”,根据“特性粘度”的方法(Terbojevich等人,Carbohydr Res,1986,363-377)计算。透明质酸(HA)是天然生物可降解聚合物，在医学中有各种应用，包括用于组织工程学的分子支架以及用于治疗骨关节病的粘度补充剂。因为透明质酸的保护和补水性质，其目前用于化妆品领域。它代表脊椎动物组织的细胞外基质(ECM)的主要成分之一，并且可以在身体的几乎所有体液和组织比如滑液，玻璃体液和透明软骨中发现它(Biomedical applicationsof hyaluronic acid.ACS Publications,p.155–74,2006；Biomaterials 25,1339,2004；Calcified Tissue Int.7,175,1971；Dumitriu S.,Polymeric biomaterials.New York:Marcel Dekker,2002.ISBN:0-8247-8969-5)。该生物聚合物充当分子支架并与其他基质分子连接，其中有软骨聚集蛋白聚糖。(Garg H.G.,Hales C.A.,Chemistry and biology ofhyaluronan.Oxford:Elsevier Science,2004.ISBN:978-0-08-044382-9)。
HA还在各种生物学功能中起作用，比如调节细胞粘附和运动性，操纵细胞分化和增殖并给组织提供机械性质(Biomaterials 25,1339,2004)。已经证明一些细胞表面受体(比如CD44,RHAMM和ICAM-1)与HA相互作用，影响一些细胞过程，其中有形态发生、瘢痕形成、炎症和转移(Biomaterials 26,359–71,2005；Nat.Rev.Cancer 4,528,2004；J.Surg.Res.147,247,2008；J.Cell.Sci.103,293,1992)。HA还负责一些生物体液(滑液，眼睛的玻璃体液)的粘弹性，并且其控制组织水合以及水运输(Vet.Med.53,397,2008)。另外，已经在胚胎发育期间在脐带中发现HA，表明HA复合材料可以诱导对于组织再生和生长的有利条件(Acta Biomater.6,2407,2010；Biomaterials 28,1830,2007；J.Control.Release69,1 69,2000；Chem.Rev.101,1869,2001；Biomaterials 24,4337,2003)。
HA的特性包括其一致性、生物相容性和亲水性，使其成为用于化妆品皮肤病学和皮肤护理产品中优异的保湿剂(Vet.Med.53,397,2008)。
在专利申请WO 2012/076961 A2中，要求保护包含成盐的或至少部分成盐的透明质酸与肌肽的化合物；该专利申请发明人的目的是获得提供两种化合物的生物药理学性质的制剂。然而，在这种情况下，由于将两种有效成分保持在一起的键的离子性质，当所要求的化合物到达生物体液时，它将立即释放出游离的肌肽，其将被血清肌肽酶迅速破坏。本发明的目的的具有式(1)的缀合物，相反并如前所认为的，其特征在于在肌肽和透明质酸之间存在不能立即水解的酰胺型共价键；肌肽以其缀合形式因此对血清肌肽酶的作用更具抗性，并且具有式(1)的化合物保持肌肽被连接和完整一段时间，其足以使该相同肌肽到达将发挥其作用的位点，得到缓慢释放的技术效果。
以非常令人惊讶的方式，申请人已经发现并证明了这种键不仅如所预期的那样减慢了肌肽的释放，比前述键的可水解性(hydrolyzable)更低，而且主要赋予式(1)的化合物极高的抗氧化活性。如本文所要求保护的HA和肌肽通过酰胺键的缀合增加了肌肽的生物效应，其程度明显高于由于来自酶水解的简单保护的效果，并且这是完全出乎意料的，因为HA本身不具有抗氧化活性。
鉴于上述，本发明的目的缀合物中透明质酸的存在协同地增强了对抗已经存在于肌肽中的氧化过程的作用，保证了后者对血清肌肽酶相当的稳定性，并因此给予关于肌肽本身或作为乙酰基衍生物更高的活性。
通过酰胺键与肌肽缀合的透明质酸的羧基百分比占HA总羧基的2至25％的范围,优选5至20％的范围，并甚至更优选等于7％。
本申请的目的还涉及具有式(1)缀合物的Cu(II)复合物。
事实上评价了具有式(1)缀合物的Cu(II)复合物的SOD-样抗氧化活性，通过将游离肌肽的Cu(II)复合物与非缀合透明质酸的Cu(II)复合物相比进行体外验证。结果显示具有式(1)的Cu(II)复合物的活性明显高于相对于相应的肌肽或透明质酸的复合物的活性。
本发明的目的还涉及用于制备具有式(1)的化合物的方法，其中透明质酸的衍生物与在羟基上受保护的肌肽共价缀合。根据本发明的具有式(1)的化合物事实上是从适当活化的透明质酸以及在羧基上受保护的肌肽出发合成的。透明质酸的活性衍生物优选酯并甚至更优选3-羟基-1,2,3,-苯并三嗪-4(H)-酮(HOOBT)的酯,而肌肽二肽优选使用甲基酯形式。
肌肽的其他酯或与HOOBT的酯等价的透明质酸的其他活性衍生物，可以用于该目的。
具有式(1)的化合物显示出相对于非缀合的肌肽对于人血清肌肽酶作用更强的抗性。
本发明的目的还涉及药物、化妆品或营养食品组合物，包含作为有效成分的具有式(1)的化合物。考虑到关于过渡金属的抗氧化、抗糖化、抗血小板和螯合性质，含有具有式(1)的化合物的组合物可用于治疗或预防病症，其中由于糖基化和其他原因自由基或受损的蛋白质构象的形成具有致病作用。这些病症的实例包含：白内障，干眼，皮肤老化，创伤，胃损害，糖尿病，受损的免疫调节应答，肾脏疾病，肝脏疾病，肿瘤和神经病理学(中枢神经系统老化，阿尔茨海默病)，由缺血/再灌注引起的损伤。
因此本发明的目的涉及药物、化妆品或营养食品组合物，包含作为有效成分的具有式(1)的化合物,用于治疗和/或预防蛋白质构象(protein conformational)障碍和病症比如白内障，干眼，皮肤老化，创伤，胃损害，糖尿病，受损的免疫调节应答，肾脏疾病，肝脏疾病，肿瘤和神经疾病，由局部缺血/再灌注引起的损伤。事实上，这些组合物具有愈合、胃保护、优选作为与Zn2+的复合物、葡萄糖调节(glucomodulatory)、免疫调节、抗肿瘤、抗遗传毒性(antigenotoxic)、神经保护活性、中枢神经系统的抗衰老、由局部缺血/再灌注引起的损伤的保护活性、肾保护和肝保护活性。
剂量和给药途径取决于一般由临床专家确定的病症，但是，通常在100至5000mg/每日口服(die per os)的范围,和从0.1至10％重量的范围，对于制剂用于局部或全身用途(即，注射)。
制剂可能的实例包括：胶囊，片剂，颗粒，粉末，溶液，软膏，凝胶，滴眼剂和制剂专家已知的任何其它制剂。
可能的给药途径显然相关于要治疗的疾病，并且用于说明性目的，可以包括口腔，局部(topical)，局部(local)-区域，肌内，皮内，眼内，关节内或关节周围，注入(infusive)等。
以下提供解释本发明的实例。
除非另有指明，当需要时，如下使用、处理市售可得的试剂：用于合成肌肽甲基酯的无水甲醇(SIGMA,MeOH)，使用前在
Figure BDA0001218003060000081
分子筛上保持24小时。
合成肌肽甲基酯(Car-OMe)，在0℃，在甲醇中用盐酸处理肌肽(Sigma)。使用乙酰氯作为HCl源。
在Varian仪器上以500MHz(Inova 500)记录1H-NMR谱，使用HOD频率作为参照。
在配备有Malvern三重检测器(ViscoteckTDmax)的CPG/SEC色谱系统上进行旨在确定缀合的HyCar的分子量分布(MWD)和特性粘度的实验。
在SHIMADZU RF-5301 PC分光荧光光度计上进行荧光测量，而在SHIMADZU UV-1800或Beckman DU 650分光光度计上进行UV-vis吸收测量。
通过Fridovich试验(Anal.Biochem.44,276,1971)确定缀合的HyCar的Cu(II)复合物和肌肽或HA的Cu(II)复合物的SOD-样活性。
为了制备所述Cu(II)复合物，在以下浓度的水溶液中使用硝酸铜:[L]＝[Cu(II)]＝10-6-10-7；事实上，本领域技术人员已知肌肽容易与过渡金属形成螯合物(Free RedRes.Commun.；1991,12-13pt.1,179-185)。使用的全部化学产品购自Sigma。
在具有UV检测器的Agilent 1200色谱系统上，使用Supelcosil LC-SAX1柱(25×4.6cm；Supelco)进行具有牛睾丸透明质酸酶的HyCar或游离透明质酸的酶消化之后产生的寡糖的HPLC分析，并在214nm的波长下读取色谱图。洗脱：流速1.2ml/min；等梯度NaCl 50mM(pH 4)5分钟，然后在60分钟内程序化为NaCl 1.2M(pH 4)。
实施例:
3-N-透明质酸基(hyaluronyl)缀合的2-(3-氨基丙酰胺)-3-(1H-咪唑-4-基)丙酸 (HyCar)的合成
在通常的合成过程中，在5℃搅拌下，向20ml冷四氢呋喃(THF)中加入1克透明质酸钠(195KDa)。将以下产物依次加入到所得悬浮液中:含有0.5mmol HOOBT的20ml H2O/THF(1:1v/v)溶液,含有0.2mmol三[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]胺的10ml H2O/THF(1:1v/v)溶液,和含有0.125mmol L-肌苷甲基酯的5ml甲醇溶液。在5℃30分钟之后,向混合物中加入10ml N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基-碳二亚胺盐酸溶液(EDC·HCl；0.25mmol)，并在5℃持续搅拌全部反应物料20小时。此期间,用100ml NaOH 0.1N溶液处理反应混合物，并在5℃放置另外3.5小时。此时，用2N HCl将混合物的pH调至7.0，通过加入800ml丙酮使缀合物沉淀。然后通过离心从上清液中除去感兴趣的产物，随后对水透析60小时。然后回收缀合物并冻干(产率70％)。
1H NMR(D20,500MHz)(ppm):8.66(单峰；咪唑环的H-2),7.34(单峰；咪唑环的H-5),4.61-4.52(宽多重峰；葡糖醛酸残基的H-6，N-乙酰氨基葡糖残基的H-1和丙酸链的H-2),3.90-3.23(宽多重峰；葡糖醛酸残基的H-2,H-3,H-4和H-5,N-乙酰氨基葡糖残基的H-2,H-3,H-4,H-5,2H-6和丙酰氨基基团的C-3亚甲基),3.17(多重峰；丙酸链的2H-3,2.44(多重峰；丙酰氨基基团的亚甲基C-2),2.06(N-乙酰氨基葡糖残基的宽单峰CH3)。具有主要谱线归属(assignment)的缀合的HyCar的1H NMR光谱表示于图1中，其显示出共振，用于计算与酰胺桥连接到肌肽单元(负载％)的羧基百分比的。
存在于缀合物中肌肽的数量由在2.06ppm(与HA的乙酰基相关)信号的积分值与在2.44ppm(与丙酰氨基的C-3相关)信号或咪唑环的H-2或H-5信号之一(分别在8.66和7.34ppm)的积分值之间的比率确定。
按照上述合成过程，证明存在于与肌肽形成的酰胺键的缀合物的多糖单元中的羧基百分比等于7％。通过适当改变HA与另一种试剂之间的化学计量比，得到高达25％的缀合值。
缀合的HyCar的特性粘度和分子量分布
通过在配备有串联安装的两个TSK-GEL GMPWXL柱(7.8mm ID×30cm；Viscotek-TOSOH BIOSCIENCE)的色谱系统GPCmax VE 2001(Malvern)上进行的尺寸排阻色谱法确定上述参数。该系统与串联安置的三个检测器的系统耦合，包括：折射率检测器，光散射检测器和四毛细管微分粘度计(a four-capillary differential viscometer)。在40℃，使用含有0.5g/L叠氮化钠的0.1M硝酸钠水溶液将样本洗脱，流速为0.6ml/min。使用Omnisec4.1软件进行采集和数据分析。
图2显示出对于HyCar(负载7％)获得的典型色谱图，其指示在TSK-GEL GMPWXL柱上HyCar样品(7％负载)的色谱行为。在Viscotek TDA 302(Malvern)上进行三重检测器检测。
关于透明质酸-肌肽缀合物在不同浓度下确定的关于特性粘度和分子量(MW)的物理参数，与通过耦合三重检测器的尺寸排阻色谱法确定的相应透明质酸的关于特性粘度和分子量(MW)的物理参数相比较，如下表1所示。
表1
Figure BDA0001218003060000101
图3显示出作为实例的透明质酸-肌肽(负载7％)的缀合物与非缀合的透明质酸相比的Mark-Howink图(粘度对数对分子量对数，MW)：更具体地，获得HyCar(7％负载)溶液(0.5mg/ml)与相同浓度的相应非缀合透明质酸溶液相比的图。
结果显示出HyCar缀合物的特性粘度仅仅是略低于具有相同MW的非缀合透明质酸的特性粘度，而缀合物的重均分子量一致地大于母体多糖的重均分子量。这意味着缀合作用不改变HA的流变学行为所依赖的它的物理化学性质。当需要建立推理的终产物的流变参数(粘度、平滑度等)时，这尤其在制备产物的阶段中是非常重要的。
SOD-样抗氧化活性
使用Fridovich的间接方法(Anal.Biochem.44,276,1971)确定HyCar缀合物的Cu(II)复合物的SOD-样活性。通过黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统酶促产生超氧化物阴离子，随后分光光度法监测在560nm处硝基蓝四唑(NBT)的还原。反应混合物含有:在pH 7.4的磷酸缓冲液(10mM)中的细胞色素c(30μM)或NBT(250μM)、黄嘌呤(50μM)。向2ml该混合物中加入适当量的黄嘌呤氧化酶，以便产生0.024△A min-1。这相应于等于1.1μMmin-1的O2 ·-的产率。在存在和不存在检查的复合物的情况下测量显色分子的还原速率600秒。使用具有1cm的光路、恒温调节并装备有磁力搅拌的比色皿在25±0.2℃下进行所有测量。为了排除对黄嘌呤氧化酶活性的可能抑制，在独立的实验中，在295nm下用分光光度计随后测量就黄嘌呤氧化酶而言产生的尿酸。
在pH 7.4确定检测的金属复合物的I50值(即产生NBT还原抑制50％的浓度)如下图4和表2所示。
表2
复合物 I<sub>50</sub>μM
SOD 0.014(±0.003)
Cu/HyCar(7％) 0.21(±0.04)
Cu/Car 0.8(±0.16)
Cu/HA 1.0(±0.2)
表2因此表示HyCar、Car和
Figure BDA0001218003060000121
的Cu(II)复合物的SOD-样活性，表达为能够抑制50％NBT还原(I50)的浓度。
更具体地,图4表示(Cu-HyCar)和非缀合HA(Cu-HA)的Cu(II)复合物的SOD-样活性，通过由Fridovich提出的间接方法根据上述操作规范来确定。显然，用于获得I50值的产物的量越小，其抗氧化活性越大。从数据分析，显然缀合物Cu/Hycar具有比Cu/Car高约4倍的抗氧化活性。考虑到如预期的那样，复合物Cu/HA具有非常低的抗氧化活性，用Cu/Hycar获得的结果是令人惊讶和意想不到的，并且其证明了由于通过酰胺键的特定类型的缀合HA/肌肽的协同作用，如本文所述。
就人血清肌肽酶而言的酶法水解
与肌肽+HA的混合物或单独的肌肽的稳定性相比，通过用上述酶(CN1)在37℃于50mM Tris/HCl(pH 8.0)中温育这些物质(900μM)中的每一种来确定HyCar相对人血清肌肽酶的时间依赖的稳定性，通过如前表示的稳定转染的Hela细胞的培养基进行纯化(Antioxid.Redox Signal.,11,2759,2009)。进行平行实验作为阴性对照，其中使单独的透明质酸进行酶促作用。在反应过程之后，以不同时间间隔收集50μl等分混合物总共5小时，并在用三氯乙酸(TCA)去蛋白之后，根据已经描述的过程(Clin.Chim.Acta,1982,123,221)，在与邻苯二甲醛(OPA；Fluka)反应之后，通过荧光分光光度法确定最终溶液中组氨酸的数量。结果示于图5中。
更具体地,图5表示与肌肽(■)、肌肽+HA(▲)和单独的HA(◆)(后者用作实验的阴性对照)的稳定性相比，经历人血清肌肽酶作用的HyCar(·)随时间的稳定性。通过分光光度计测定作为OPA衍生物释放的组氨酸。
就牛睾丸透明质酸酶而言的酶法水解
通过用1,500单位酶在37℃于缓冲液(乙酸钠100mM,NaCl 150mM,pH 5.2)中温育HyCar缀合物(250μL,20mg/mL)2h来评价相对透明质酸酶(牛睾丸透明质酸酶，Sigma)的HyCar缀合物的稳定性。在该时间段之后，在说明书第9页第2段和之前文献(Anal.Chem.,2007,6390-6397)中引用的所述实验条件下用HPLC在阴离子交换柱上分析水解产物。在平行实验中，使用游离透明质酸作为相同实验条件下相同酶的底物。在这两种情况下，获得相似的色谱图，其特征在于存在的降解产物基本上由四聚体和六聚体缩水甘油单元组成。
本说明书中引用的文献题录
以下列表表明申请人提到的文献题录仅为了方便读者而制作。这不应被认为是专利文件的一部分。即使非常小心准备，也不能排除可能的错误或遗漏。因此，在这方面不承担责任。
本说明书中引用的专利:
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·DE 4316293；
·WO 0152808 A；
·WO 9510294 A；
·EP 1176154 A；
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Claims (15)

1.式(1)的化合物
Figure FDA0003237979920000011
其是具有式(2)的肌肽二肽与透明质酸的缀合物，
Figure FDA0003237979920000012
其中缀合作用通过肌肽的NH2基团与透明质酸的一个或多个羧酸基团之间或通过肌肽的NH2基团与具有式(3)的酯之间形成酰胺键进行
Figure FDA0003237979920000021
2.根据权利要求1的化合物，其中通过与肌肽形成酰胺键而缀合的透明质酸的羧基的百分比在2至25％的范围。
3.根据权利要求的1或2的化合物，其中所述透明质酸具有重均分子量在90至230kDa之间的范围。
4.根据权利要求1或2的化合物，其中所述透明质酸具有重均分子量在500至730kDa的范围。
5.根据权利要求1或2的化合物，其中具有式(1)的化合物是以Cu(II)的复合物形式。
6.根据权利要求1或2的化合物，其中肌肽在羧基基团上受保护。
7.根据权利要求1或2的化合物，其中通过与肌肽形成酰胺键而缀合的透明质酸的羧基的百分比在5至20％的范围。
8.根据权利要求1或2的化合物，其中通过与肌肽形成酰胺键而缀合的透明质酸的羧基的百分比等于7％。
9.根据权利要求3的化合物，其中所述透明质酸具有重均分子量在180至210kDa之间的范围。
10.根据权利要求1-9中任一项的化合物的制备方法，其特征在于透明质酸或式(3)的酯与肌肽共价缀合。
11.根据权利要求10的制备方法，其中肌肽在羧基上受保护。
12.根据权利要求10的方法，其中所述具有式(3)的酯是3-羟基-1,2,3,-苯并三嗪-4(H)-酮的酯。
13.根据权利要求10-12中任一项的方法，其中所述肌肽通过形成甲基酯在羧基上受到保护。
14.药物组合物或营养食品组合物，其包含根据权利要求1-9中任一项的具有式(1)的化合物作为有效成分。
15.药物组合物在制备药物中的用途,所述药物组合物包含根据权利要求1-9中任一项的具有式(1)的化合物作为有效成分，所述药物用于治疗和/或预防蛋白质构象障碍和病症，其选自白内障，干眼，皮肤老化，创伤，胃损害，糖尿病，受损的免疫调节应答，肾脏疾病，肝脏疾病，肿瘤和神经疾病，由局部缺血/再灌注引起的损伤。
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