CN117700583A - 一种透明质酸基生物材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种透明质酸基生物材料的制备方法，属于生物材料技术领域。本发明提供的方法，通过透明质酸‑肌肽酯类化合物在无机碱的作用下，水解得到透明质酸基生物材料化合物。本发明提供的方法，减少了碱的用量比例，不会破坏酰胺键，转化率好，收率高，利于工业化实施。
Description
技术领域
本发明涉及一种透明质酸基生物材料的制备方法，属于生物材料技术领域。
背景技术
透明质酸是由葡萄糖醛酸和氨基葡萄糖为双糖单位组成的直链高分子多糖，存在于皮肤、眼玻璃体、软骨、关节滑液等许多结缔组织中，并在其中起到保湿、营养、修复和预防损伤等生理作用，透明质酸一般为其钠盐，即透明质酸钠，溶于水，但不溶于有机溶剂。
肌肽是氨基酸β-丙氨酸和组氨酸的二肽，其尤其存在于肌肉组织和脑中。肌肽具有抗氧化性质，特别是能够除去活性氧簇(“ROS”)以及在氧化应激期间由细胞膜的脂肪酸过氧化形成的α-β不饱和醛。而且，肌肽能够抑制糖化作用，可以螯合二价金属离子。由于肌肽的抗氧化性、抗糖化和金属螯合性质，其可以在抗老化治疗中用作补充剂。
透明质酸(HA)-肌肽是透明质酸的羧基与肌肽的氨基形成酰胺键后缀合形成的化合物，可以作为生物材料用于医疗等领域。专利申请WO2016016847A1公开了使用透明质酸钠(195KDa)和L-肌苷甲基酯在HOOBT、EDCI及三[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]胺的作用下缩合，最后在NaOH溶液处理下水解得到透明质酸(HA)-肌肽的方法；此方法使用了大量的氢氧化钠，且收率仅有70％，也未公开终产物的纯度等相关信息。
故一种能够使用更少的碱，高收率地得到高纯度的产物，并且适合工业化生产的方法，将更加具有市场价值和实用意义，也是行业所渴求的。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种透明质酸基生物材料的制备方法，该方法为一种全新的收率和纯度更高的适合工业化生产的方法。
本发明提供一种化合物1(即透明质酸-肌肽，也称为HA-肌肽)的制备方法，包括以下步骤(1)：化合物2(即透明质酸-肌肽酯类化合物，也称为HA-肌肽酯类化合物)在水或水与有机溶剂的混合溶剂中，在无机碱的作用下水解，制备得到化合物1；反应式如下所示：
其中，
R2为R选自甲基、乙基或苄基；
R1为钠离子、锌离子或钙离子；
R3为
n与m之和(即n+m)为20-2500的整数，n大于零，且n和m都为整数。
根据本发明的实施例，所述化合物1的制备方法，包含步骤(1)：化合物2在水或水与有机溶剂的混合溶剂中，在无机碱的作用下水解，制备得到化合物1；任选地包括，将得到的化合物1在有机膜分离机进行超滤。
在一些实施方案中，所述化合物1的制备方法，包含步骤(1)：化合物2在水中，在无机碱的作用下水解，制备得到化合物1。
在一些实施方案中，R为甲基，R1为钠离子。在一些实施方案中，R为乙基，R1为钠离子。
在一些实施方案中，n与m之和为125-1650的整数。在一些实施方案中，n与m之和为150-1500的整数。在一些实施方案中，n与m之和为250-1500的整数。在一些实施方案中，n与m之和为1500。在一些实施方案中，n与m之和为1250。
在一些实施方案中，n/(n+m)为2％-40％。在一些实施方案中，n/(n+m)为5％-35％。
在一些实施方案中，n与m之和为150-1500的整数，n/(n+m)为5％-35％。在一些实施方案中，n与m之和为150-1500的整数，n/(n+m)为10％-35％。在一些实施方案中，n与m之和为250-1500的整数，n/(n+m)为5％-35％。在一些实施方案中，n与m之和为250-1500的整数，n/(n+m)为10％-35％。
所述化合物2中，通过酰胺键与肌肽酯类缀合的透明质酸的羧基(即与R2形成酰胺键的羧基)可以占透明质酸的总羧基(即与R2形成酰胺键的羧基和剩余的羧基的总量)的2％-40％。在一些实施方案中，所述化合物2中，通过酰胺键与肌肽酯类缀合的透明质酸的羧基占透明质酸的总羧基的5％-35％，或10％-35％。在一些实施方案中，所述化合物2中，通过酰胺键与肌肽酯类缀合的透明质酸的羧基占透明质酸的总羧基的7％-25％或10％-25％。
所述化合物2的分子量可以为1万Da(道尔顿)-100万Da。在一些实施方案中，所述化合物2的分子量为5万Da至80万Da，或5万Da至70万Da，或5万Da至65万Da，或6万Da至65万Da。在一些实施方案中，所述化合物2的分子量为6万Da至60万Da。
所述步骤(1)中，所述的有机溶剂可选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、丙酮、甲苯、DMSO、DMF、THF和乙腈中的一种或多种。在一些实施方案中，步骤(1)中，所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、DMSO、DMF、THF和乙腈中的一种或多种。在一些实施方案中，步骤(1)中，所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、DMF或其组合。在一些实施方案中，步骤(1)中，所述的有机溶剂为甲醇、乙醇或其组合。
根据本发明，水与所述有机溶剂的体积比可以为10:0.1-10:2.5。在一些实施方案中，水与所述有机溶剂的体积比为10:0.5-10:1.5。在一些实施方案中，水与所述有机溶剂的体积比为10:0.5-10:1。在一些实施方案中，水与所述有机溶剂的体积比为10:1.5-10:2.5。
步骤(1)中，所述的无机碱可选自碳酸钠，碳酸钾，碳酸氢钠，碳酸氢钾，氢氧化锂，氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或多种。在一些实施方案中，所述的无机碱为碳酸钠，氢氧化锂和氢氧化钠中的一种或多种，有利于操作实施和目标产物的获得。
根据本发明，步骤(1)中，化合物2中的与R2形成的酰胺键(可根据形成酰胺键的相应的透明质酸的羧基计算)与无机碱的投料摩尔比可以为1:(8-40)。在一些实施方案中，步骤(1)中，化合物2中的与R2形成的酰胺键与无机碱的投料摩尔比为1:(8-30)，或1:(8-25)，或1:(10-25)，或1:(10-20)，有利于获得目标产物。
在一些实施方案中，步骤(1)中，所述的无机碱为碳酸钠，氢氧化锂或其组合，化合物2中的与R2形成的酰胺键与所述的无机碱的投料摩尔比可以为1:(8-40)，或1:(8-30)，或1:(8-25)，或1:(10-25)，或1:(10-20)，有利于获得目标产物。在一些实施方案中，步骤(1)中，所述的无机碱为碳酸钠，氢氧化锂或其组合，化合物2中的与R2形成的酰胺键与所述的无机碱的投料摩尔比为1:10，或1:15，或1:20，有利于实施操作和获得目标产物。
在一些实施方案中，步骤(1)中，所述的无机碱为氢氧化钠，化合物2中的与R2形成的酰胺键与氢氧化钠的投料摩尔比可以为1:(8-30)，或1:(8-25)，或1:(8-20)，或1:(10-25)，或1:(10-20)，有利于获得目标产物。在一些实施方案中，步骤(1)中，所述的无机碱为氢氧化钠，化合物2中的与R2形成的酰胺键与氢氧化钠的投料摩尔比为1:8，或1:10，或1:15，或1:20，有利于实施操作和获得目标产物。
步骤(1)中，水解的反应温度可以为-10℃-50℃。在一些实施方案中，水解的反应温度为10℃-40℃。在一些实施方案中，水解的反应温度为20℃-35℃，有利于操作实施和产物的获得。在一些实施方案中，水解的反应温度为25℃。
步骤(1)中，水解的反应时间可以为0.5小时-8小时。在一些实施方案中，步骤(1)中，水解的反应时间为1小时-5小时，有利于反应完全和产物的获得。在一些实施方案中，步骤(1)中，水解的反应时间为2小时。在一些实施方案中，步骤(1)中，水解的反应时间为3小时。
根据本发明的实施例，在一些实施方案中，所述的化合物1的制备方法包括将得到的化合物1在有机膜分离机进行超滤，可以使用1000道尔顿-5万道尔顿的滤膜进行超滤；所述超滤可以除去无机盐、小分子杂质等，有助于进一步提升产物的纯度。在一些实施方案中，使用1万道尔顿-5万道尔顿的滤膜进行超滤。
在一些实施方案中，所述化合物1的制备方法，包含步骤(1)：化合物2在水中，在无机碱的作用下，在10℃-40℃水解，制备得到化合物1；所述的无机碱为碳酸钠，氢氧化锂和氢氧化钠中的一种或多种，化合物2中的与R2形成的酰胺键与所述的无机碱的投料摩尔比为1:(8-40)，或1:(8-30)，或1:(10-25)，或1:(10-20)；任选地包括，将得到的化合物1在有机膜分离机进行超滤。
在一些实施方案中，所述化合物1的制备方法，包含步骤(1)：化合物2在水中，在无机碱的作用下，在10℃-40℃水解，制备得到化合物1；所述的无机碱为碳酸钠，氢氧化锂或其组合，化合物2中的与R2形成的酰胺键与所述的无机碱的投料摩尔比为1:(8-40)，或1:(8-30)，或1:(10-25)，或1:(10-20)；任选地包括，将得到的化合物1在有机膜分离机进行超滤。
在一些实施方案中，所述化合物1的制备方法，包含步骤(1)：化合物2在水中，在无机碱的作用下，在10℃-40℃水解，制备得到化合物1；所述的无机碱为氢氧化钠，化合物2中的与R2形成的酰胺键与氢氧化钠的投料摩尔比为1:(8-30)，或1:(8-30)，或1:(8-25)，或1:(8-20)，或1:(10-20)；任选地包括，将得到的化合物1在有机膜分离机进行超滤。
根据本发明，所述步骤(1)中，在水解反应结束后，可对反应液进行处理，包括而不限于：将反应液调节至pH为3-6，然后与乙醇混合，搅拌，过滤，干燥所得固体，得到化合物1；根据本发明，将反应液调节至酸性，相对于中性或碱性，更有利于高收率地获得高质量的目标产物；所述乙醇与反应液的体积比可以为3:1-30:1。在一些实施方案中，所述乙醇与反应液的体积比为3:1-10:1。在一些实施方案中，所述乙醇与反应液的体积比为3:1-6:1。
根据本发明，制备得到的所述化合物1，可以进行进一步提纯，以得到纯度、质量更高的化合物1产物，包括而不限于：将化合物1溶于水，再与乙醇混合，搅拌，过滤，干燥所得固体，得到化合物1；或者，将化合物1与乙醇混合打浆，或者化合物1与水和乙醇混合打浆，然后过滤，干燥所得固体，得到化合物1；其中，乙醇的体积与化合物1的质量之比可以为10mL:1g-100mL:1g；水与化合物1的质量之比可以为20:1-100:1。
所述的化合物1的制备方法，可以包括以下步骤(2)：化合物4(即透明质酸盐类化合物)和化合物3(即肌肽酯类化合物)在水、第二有机溶剂或其混合溶剂中，任选有机碱的条件下，在缩合剂的作用下，制备得到化合物2；反应式如下式所示，其中，R1，R，R2，n和m如前所述：
所述化合物4选自透明质酸钠、透明质酸锌或透明质酸钙。在一些实施方案中，所述化合物为透明质酸钠。
所述化合物4的分子量可以为1万Da(道尔顿)-100万Da。根据本发明，所述化合物4的分子量优选为5万Da至80万Da或5万Da至70万Da，或5万Da至60万Da，或6万Da至60万Da。在一些实施方案中，所述化合物4为透明质酸钠，分子量为1万Da-100万Da。在一些实施方案中，所述化合物4为透明质酸钠，分子量为5万Da至80万Da，优选为5万Da至70万Da或6万Da至60万Da。
所述化合物3可以为肌肽甲酯，肌肽乙酯或肌肽苄酯。在一些实施方案中，所述化合物3优选为肌肽甲酯。在一些实施方案中，所述化合物3优选为肌肽乙酯。
根据本发明，所述化合物4与化合物3的投料摩尔比可以为1:0.05-1:10。在一些实施方案中，所述化合物4与化合物3的投料摩尔比可以为1:0.15-1:5。在一些实施方案中，所述化合物4与化合物3的投料摩尔比可以为1:0.15-1:1.5。
步骤(2)中，所述第二有机溶剂可选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、丙酮、甲苯、DMSO、DMF、DMA、THF和乙腈中的一种或多种。在一些实施方案中，所述第二有机溶剂为甲醇、乙醇、THF、DMF、二甲基乙酰胺(DMA)和DMSO中的一种或多种。在一些实施方案中，所述第二有机溶剂为甲醇，乙醇，甲苯和DMSO的一种或多种。在一些实施方案中，所述第二有机溶剂为甲醇，乙醇或其组合。在一些实施方案中，所述第二有机溶剂为甲醇。
根据本发明的实施例，步骤(2)中，化合物4和化合物3在水和第二有机溶剂的混合溶剂中反应，更有利于目标产物的生成和获得；所述水和第二有机溶剂的体积比可以为10:0.5-10:8。在一些实施方案中，所述水和第二有机溶剂的体积比可以为10:1.5-10:8。
在一些实施方案中，步骤(2)中，化合物4和化合物3在水和甲醇的混合溶剂或在或在水和乙醇的混合溶剂中反应，更有利于目标产物的生成和获得，所述水和甲醇或乙醇的体积比为10:1.5-10:8，或者10:2-10:6。
步骤(2)中，所述的有机碱可以选自三乙胺、二乙胺、三[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]胺、N,N-二异丙基乙基胺、三乙烯二胺(DABCO)、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、1,5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、吡啶、N-甲基吗啉、四甲基乙二胺中的一种或多种。在一些实施方案中，所述有机碱为三[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]胺或N,N-二异丙基乙基胺或其组合。
所述的缩合剂可选自4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-氯化吗啉(DMTMM)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺(HONB)、氰基羟基亚氨基乙酸乙酯(oxyma)、N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(sulfo-HOSu)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、3-羟基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBt)、2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TSTU)、2-(5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸季铵盐(TNTU)中的一种或多种。
根据本发明，所述缩合剂为4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-氯化吗啉(DMTMM)，相对于其他缩合剂，更有利于反应操作、进行和高纯度的产物的获得。
根据本发明，化合物4与缩合剂的投料摩尔比可以为1:0.1-1:10。在一些实施方案中，所述化合物4与所述缩合剂的投料摩尔比为1:0.2-1:6。在一些实施方案中，所述化合物4与所述缩合剂的投料摩尔比为1:0.4-1:5。在一些实施方案中，所述化合物4与所述缩合剂的投料摩尔比为1:1-1:5。在一些实施方案中，所述化合物4与所述缩合剂的投料摩尔比为1:2-1:5。
根据本发明，所述步骤(2)中，在缩合剂的作用下，可以在0℃-40℃反应12小时-96小时，制备得到化合物2。在一些实施方案中，所述步骤(2)中，在缩合剂的作用下，可以在0℃-40℃反应24小时-72小时，制备得到化合物2。
在一些实施方案中，步骤(2)中，所述化合物2中，通过酰胺键与肌肽酯缀合的透明质酸的羧基(即与R2形成酰胺键的羧基)可以占透明质酸的总羧基(即与R2形成酰胺键的羧基和剩余的羧基的总量)的2％-40％，优选5％-35％，或10％-35％，或7％-25％，或10％-25％。
在一些实施方案中，步骤(2)中，所述化合物2为HA-肌肽甲酯，其中，通过酰胺键与肌肽甲酯缀合的透明质酸的羧基可以占透明质酸的总羧基的2％-40％，优选5％-35％或7％-25％。
在一些实施方案中，步骤(2)中，所述化合物2为HA-肌肽甲酯，其中的与R2形成的酰胺键占与R2形成的酰胺键和剩余的羧基的总量的2％-40％。在一些实施方案中，所述化合物2为HA-肌肽甲酯，其中的与R2形成的酰胺键占与R2形成的酰胺键和剩余的羧基的总量的5％-35％。
在一些实施方案中，步骤(2)中，所述化合物2为HA-肌肽乙酯，其中的与R2形成的酰胺键占与R2形成的酰胺键和剩余的羧基的总量的2％-40％。在一些实施方案中，步骤(2)中，所述化合物2为HA-肌肽甲酯，其中的与R2形成的酰胺键占与R2形成的酰胺键和剩余的羧基的总量的5％-35％。
在一些实施方案中，前述的化合物2的制备方法包括步骤(2)：化合物4和化合物3在水和甲醇的混合溶剂或在水和乙醇的混合溶剂中，在缩合剂的作用下，制备得到化合物2；其中，化合物2为HA-肌肽甲酯或化合物2为HA-肌肽乙酯，所述缩合剂为4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-氯化吗啉(DMTMM)，所述化合物4与缩合剂的投料摩尔比为1:0.1-1:10。
在一些实施方案中，前述的化合物2的制备方法包括步骤(2)：化合物4和化合物3在水和甲醇的混合溶剂或在水和乙醇的混合溶剂中，在缩合剂的作用下，在0℃-40℃反应24小时-96小时，制备得到化合物2；其中，化合物2为HA-肌肽甲酯或化合物2为HA-肌肽乙酯，所述缩合剂为4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-氯化吗啉(DMTMM)，所述化合物4与缩合剂的投料摩尔比为1:0.1-1:10；所述化合物2中，形成酰胺键的透明质酸的羧基占透明质酸的总羧基的2％-40％，或5％-35％，或7％-25％；所述水和甲醇或乙醇的体积比为10:1.5-10:8，或者10:2-10:6。
根据本发明，所述步骤(2)中，可以经过后处理以制备得到化合物2；所述后处理可以包括：化合物4和化合物3反应结束后，将反应液与乙醇混合，搅拌，过滤，干燥所得固体，得到化合物2；所述乙醇与反应液的体积比可以为3:1-30:1。在一些实施方案中，所述步骤(2)中，所述乙醇与反应液的体积比为3:1-10:1。在一些实施方案中，所述步骤(2)中，所述乙醇与反应液的体积比为3:1-6:1。在一些实施方案中，所述步骤(2)中，所述乙醇与反应液的体积比为5:1。
根据本发明，制备得到的所述化合物2，可以进行进一步提纯，以得到纯度、质量更高的化合物2产物，包括而不限于：将化合物2溶于水，再与乙醇混合，搅拌，过滤，干燥所得固体，得到化合物2；或者，将化合物2与乙醇混合打浆，或者化合物2与水和乙醇混合打浆，然后过滤，干燥所得固体，得到化合物2；其中，乙醇的体积与化合物2的质量之比可以为10mL:1g-100mL:1g，水与化合物2的质量之比可以为20:1-100:1。
所述的化合物3，可以采用肌肽在醇试剂和酰化试剂的作用下，经过酯化反应制备得到；所述醇试剂可选自甲醇、乙醇或苄醇中的一种或多种；所述酰化试剂可选自乙酰氯、乙酸酐、亚硫酰氯、草酰氯、氯甲酸甲酯、氯甲酸乙酯、氯甲酸苯酯、氯甲酸苄酯或三氯氧磷中的一种或多种。
根据本发明，在一些实施方案中，所述化合物1的制备方法，包括：
步骤(2)：化合物4(即透明质酸盐类化合物)和化合物3(即肌肽酯类化合物)在水、第二有机溶剂或其混合溶剂中，在缩合剂的作用下，制备得到化合物2；
步骤(1)：化合物2(即透明质酸-肌肽酯类化合物，也称为HA-肌肽酯类化合物)在水中，在无机碱的作用下水解，制备得到化合物1。
在一些实施方案中，所述化合物1的制备方法，包括：
步骤(2)：化合物4(即透明质酸盐类化合物)和化合物3(即肌肽酯类化合物)在水、第二有机溶剂或其混合溶剂中，在缩合剂的作用下，制备得到化合物2；
步骤(1)：化合物2(即透明质酸-肌肽酯类化合物，也称为HA-肌肽酯类化合物)在水中，在无机碱的作用下水解，制备得到化合物1；
并且，所述方法中，化合物4与缩合剂的投料摩尔比为1:0.1-1:10；化合物2中的与R2形成的酰胺键和无机碱的投料摩尔比为1:(8-40)。
根据本发明，在一些实施方案中，所述化合物1的制备方法，包括：
步骤(2)：化合物4和化合物3在水和第二有机溶剂的混合溶剂中，在缩合剂的作用下，制备得到化合物2；所述缩合剂为4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-氯化吗啉(DMTMM)；
步骤(1)：化合物2在水中，在无机碱的作用下水解，制备得到化合物1；所述无机碱为碳酸钠，氢氧化锂和氢氧化钠中的一种或多种。
根据本发明，在一些实施方案中，所述化合物1的制备方法，包括：
步骤(2)：化合物4和化合物3在水和甲醇的混合溶剂或在水和乙醇的混合溶剂中，在缩合剂的作用下，制备得到化合物2；其中，化合物2为HA-肌肽甲酯或化合物2为HA-肌肽乙酯，所述缩合剂为4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-氯化吗啉(DMTMM)，所述化合物4与缩合剂的投料摩尔比为1:0.1-1:10；
步骤(1)：化合物2在水中，在无机碱的作用下水解，制备得到化合物1；所述的无机碱选自碳酸钠，碳酸钾，氢氧化锂，氢氧化钠中的一种或多种；化合物2中的酰胺键与无机碱的投料摩尔比为1:(8-40)；
任选地包括，将制备得到的化合物1在有机膜分离机进行超滤。
在一些实施方案中，所述化合物1的制备方法，包括：
步骤(2)：化合物4和化合物3在水和甲醇的混合溶剂中，在缩合剂的作用下，制备得到化合物2；其中，化合物2为HA-肌肽甲酯，所述缩合剂为4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-氯化吗啉(DMTMM)，所述化合物4与缩合剂的投料摩尔比为1:0.1-1:10；所述水与甲醇的体积比为10:1.5-10:8；
步骤(1)：化合物2在水中，在无机碱的作用下水解，制备得到化合物1；所述的无机碱选自碳酸钠，碳酸钾，氢氧化锂，氢氧化钠中的一种或多种；化合物2中的酰胺键与无机碱的投料摩尔比为1:(8-40)；所述的化合物2中，形成酰胺键的透明质酸的羧基占透明质酸的总羧基的2％-40％，或5％-35％，或10％-35％，或7％-25％，或10％-25％；
任选地包括，将制备得到的化合物1在有机膜分离机进行超滤。
根据本发明，前述的化合物1的制备方法，可以在步骤(2)的反应结束后，直接进行步骤(1)，无需分离出化合物2。
本发明提供的方法的优点包括而不限于：所用缩合剂不需要先活化一段时间，简化了投料方式，且操作简化，更有利于工业化生产实施；减少了碱的用量，不会破坏酰胺键，转化率好，降低了成本，且收率高，所得产品纯度高，杂质低；因此，本发明提供的方法，适于工业化生产，能够高效地为行业提供高质量的产品。
附图说明
图1示预实验1所得的HA-肌肽甲酯的1HNMR谱图；
图2示预实验2中所得的酰胺键被破坏的HA-肌肽产品的1HNMR谱图；
图3示实施例1所得的HA-肌肽的1HNMR谱图；
图4示实施例1所得的HA-肌肽的GPC谱图(凝胶色谱法，分子量分布曲线图)；其中，横坐标表示重均分子量MW，纵坐标左边表示每种分子量的信号强度，右边表示累积分；
图5示实施例2所得的HA-肌肽的1HNMR谱图；
图6示实施例3所得的HA-肌肽的1HNMR谱图；
图7示实施例4所得的HA-肌肽甲酯的1HNMR谱图；
图8示实施例5所得的HA-肌肽的1HNMR谱图；
图9示实施例6所得的HA-肌肽的1HNMR谱图；
图10示实施例7所得的HA-肌肽的1HNMR谱图；
图11示实施例8所得的HA-肌肽的1HNMR谱图；
各核磁氢谱谱图中，横坐标表示化学位移(f1(ppm))，纵坐标表示峰强度(图中省略)。
具体实施方式
术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
本发明中，ppm表示百万分之一，基于质量比计。
本发明中，任选表示可以有也可以没有。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“一些实施方式”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。
以下实验、实施例中所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。除非特别指出，所述的试剂不经纯化直接使用。所有溶剂均购自商业化供应商，例如奥德里奇(Aldrich)，并且不经处理就可使用。
以下实验或实施例中，室温为20℃-30℃。
取代度：根据核磁氢谱1HNMR中在2.00ppm信号(与HA上的乙酰基相关)的积分值与在7.32ppm或8.62ppm信号(与肌肽上的咪唑环相关)的积分值的比率，经过计算得到；核磁氢谱采用氘代水，400MHz条件测得。
肌肽甲酯的制备：
将30.00g肌肽溶于1.2L甲醇中，氮气保护，冰水浴下加入12.43mL亚硫酰氯，升温至75℃反应1h；减压旋干得48.01g淡黄色粘稠液体，即得到肌肽甲酯。
预实验1
将20.00g透明质酸钠(分子量：60万Da)加入到2L水中，搅拌至完全溶解；将12.00gEDCI，13.50g HOBT和12.9gN,N-二异丙基乙胺(DIEA)加入到透明质酸钠溶液中，0℃活化30分钟；将制得的肌肽甲酯9.00g溶于400mL甲醇中，加入到反应中，反应6h；加入乙醇8L，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得18.93g白色固体，即得到HA-肌肽甲酯；根据核磁，得到取代度为20.5％，HA-肌肽甲酯的1HNMR参见附图图1。
将所得的18.93g HA-肌肽甲酯溶解于1L纯化水中，加入NaOH水溶液(30.00gNaOH溶于500mL纯化水)，室温搅拌反应2小时；使用HCl溶液调节至pH＝7后，加入乙醇7.5L，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得到16.46g白色固体，即得到HA-肌肽粗品；气相色谱检测，产品中N,N-二异丙基乙胺残留超过300ppm；经1HNMR检测，HA-肌肽的酰胺键被破坏。
预实验2
搅拌条件下，将15.00g肌肽溶于600mL乙醇中，氮气保护，冰水浴下加入6.21mL亚硫酰氯，升温至75℃反应1h；旋干得25.4g浅黄色粘稠液体，即得到肌肽乙酯。
将20.00g透明质酸钠(分子量：60万Da)加入到2L水中，搅拌至完全溶解；将4.80gEDCI，6.75g HOBT和3.87gN,N-二异丙基乙胺(DIEA)加入到透明质酸钠溶液中，0℃活化30分钟；将所得的肌肽乙酯3.85g溶于50mL甲醇中，加入到反应中，反应6h；加入乙醇7L，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得17.91g白色固体，即得到HA-肌肽乙酯；根据核磁，得到取代度为10.5％。
将所得的17.91g HA-肌肽乙酯溶解于1L纯化水中，加入NaOH水溶液(10.01gNaOH溶于400mL纯化水)，室温搅拌反应2小时；使用HCl溶液调节至pH＝7后，加入乙醇7L，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得到15.37g白色固体，即得到HA-肌肽粗品；气相色谱检测，产品中N,N-二异丙基乙胺残留超过300ppm；核磁检测，HA-肌肽的酰胺键被破坏，参见附图图2。
预实验3
将20.00g透明质酸钠(分子量：60万Da)加入到1.6L的水:DMSO＝1:1(v/v，体积比)的混合溶液中，搅拌至完全溶解；将9.60g EDCI和6.90gNHS溶于800mL水与400mL DMSO的混合溶液中，加入到反应体系中，0℃活化30分钟；将前述制得的肌肽甲酯7.2g溶于400mL的DMSO中，加入到反应中，反应48h；加入乙醇8L，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得18.46g白色固体，即得到HA-肌肽甲酯；根据核磁，得到取代度为20.5％。
将18.46g HA-肌肽甲酯溶解于1L纯化水中，加入NaOH水溶液(2.00gNaOH溶于1L纯化水)，室温搅拌反应2小时；用HCl溶液调节至pH＝7后，加入8L乙醇，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得到16.41g白色固体，即得到HA-肌肽粗品；将16.41g HA-肌肽溶于3.3L水中，使用有机膜分离机，采用1万Da滤膜进行超滤，得到的溶液浓缩冻干，得到15.68g白色固体，即得到HA-肌肽产品；经检测，HA-肌肽产品的取代度为20.5％，纯度为94.15％，其中杂质HA-肌肽甲酯高于1％；气相色谱检测产品中DMSO残留超过1000ppm。
预实验4
将20.00g透明质酸钠(分子量：60万Da)加入到2L水中，搅拌，溶解；将前述制得的肌肽甲酯7.20g溶于400mL甲醇中，加入到透明质酸钠溶液中，再加8.37gDMTMM，室温反应48h；反应结束后加入乙醇8L，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得16.67g白色固体，即得到HA-肌肽甲酯，根据核磁，得到取代度为19.8％。
将16.67g HA-肌肽甲酯溶解于1L纯化水中，加入NaOH水溶液(8.00gNaOH溶于1L纯化水)，室温搅拌反应2小时；用HCl溶液调节至pH＝7后，加入8L乙醇，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得到14.94g白色固体，即得到HA-肌肽粗品；将14.94g HA-肌肽溶于3L水中，使用有机膜分离机，采用1万Da滤膜进行超滤，得到的溶液浓缩冻干，得到14.20g白色固体，即得到HA-肌肽产品；经检测，HA-肌肽产品的取代度为19.8％，纯度为94.26％，其中杂质HA-肌肽甲酯低于0.5％，气相色谱法检测：甲醇残留低于300ppm。
预实验5
将20.00g透明质酸钠(分子量：60万Da)加入到2L水中，搅拌，溶解；将前述制得的肌肽甲酯7.20g溶于400mL甲醇中，加入到透明质酸钠溶液中，再加14.23g DMTMM，室温反应48h；反应结束后加入乙醇8L，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得17.77g白色固体，即得到HA-肌肽甲酯，根据核磁，得到取代度为20.2％。
将17.77g HA-肌肽甲酯溶解于1L纯化水中，加入碳酸钠水溶液(26.50g碳酸钠溶于1L纯化水)，室温搅拌反应2小时；用HCl溶液调节至pH＝7后，加入8L乙醇，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得到16.20g白色固体，即得到HA-肌肽粗品；将16.20g HA-肌肽溶于3.5L水中，使用有机膜分离机，采用1万Da滤膜进行超滤，得到的溶液浓缩冻干，得到15.55g白色固体，即得到HA-肌肽产品；经检测，HA-肌肽产品的取代度为20.2％，纯度为96.89％，其中杂质HA-肌肽甲酯低于0.1％。
实施例1
将20.00g透明质酸钠(分子量：60万Da)加入到2L水中，搅拌，溶解；将前述制得的肌肽甲酯3.60g溶于360mL甲醇中，加入到透明质酸钠溶液中，再加入27.91g DMTMM，室温反应48h；加入乙醇8L，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得18.75g白色固体，即得到HA-肌肽甲酯，根据核磁，得到取代度为9.6％。
将所得18.75g HA-肌肽甲酯溶解于1L纯化水中，加入NaOH水溶液(2.00gNaOH溶于400mL纯化水)，室温搅拌反应4小时；然后使用HCl溶液调节至pH＝5，加入乙醇7L，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得到18.50g白色固体，即得到HA-肌肽粗品；将所得18.50gHA-肌肽粗品溶于3.7L水中，使用有机膜分离机，采用1万Da滤膜进行超滤，得到的溶液浓缩冻干，得到17.35g白色固体，即得到HA-肌肽产品；经检测，所得HA-肌肽产品的取代度为9.6％，纯度为96.88％，其中杂质HA-肌肽甲酯低于0.1％；气相色谱法检测：甲醇残留202ppm，乙醇残留53ppm；液相-质谱联用检测：DMTMM未检出；GPC测得分子量(Mw)为65.4万Da；HA-肌肽产品的1HNMR参见附图图3，GPC谱图见附图图4。
实施例2
将20.00g透明质酸钠(分子量：60万Da)加入到1.6L水中，搅拌至完全溶解；将前述制得的肌肽甲酯3.61g溶于240mL甲醇中，加入到透明质酸钠溶液中，再加入11.20g DMTMM，室温反应48h；加入乙醇8L，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得18.60g白色固体，即得到HA-肌肽甲酯；根据核磁，得到取代度为11.8％。
将所得的18.60g HA-肌肽甲酯溶解于1L纯化水中，加入NaOH水溶液(3.00gNaOH溶于600mL纯化水)，室温搅拌反应4小时；使用HCl溶液调节至pH＝4后加入乙醇5L，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得到18.20g白色固体，即得到HA-肌肽粗品；将所得的18.20g HA-肌肽粗品溶于3.6L水中，使用有机膜分离机，采用1万Da滤膜进行超滤，得到的溶液浓缩、冻干，得到17.46g白色固体，即得HA-肌肽产品；经检测，HA-肌肽产品的取代度为11.8％，纯度为97.01％，其中杂质HA-肌肽甲酯低于0.1％；气相色谱法检测：甲醇残留低于250ppm，乙醇残留低于150ppm；液相-质谱联用检测：DMTMM未检出；HA-肌肽产品的1HNMR参见附图图5。
实施例3
将20.00g透明质酸钠(分子量：60万Da)加入到2L水中，搅拌至完全溶解；加入20.75g DMTMM；将前述制得的肌肽甲酯5.40g溶于500mL甲醇中，加入到反应中，反应48h；加入乙醇10L，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得19.31g白色固体，即得到HA-肌肽甲酯，根据核磁，得到取代度为13.6％。
将所得19.31g HA-肌肽甲酯溶解于1L纯化水中，加入碳酸钠水溶液(23.85g碳酸钠溶于1L纯化水)，室温搅拌反应2小时。使用HCl溶液调节至pH＝3，加入乙醇8L，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得到19.01g白色固体，即得到HA-肌肽粗品；将所得19.01g HA-肌肽溶于3.8L水中，使用有机膜分离机，采用1万Da滤膜进行超滤，得到的溶液浓缩、冻干，得到18.12g白色固体，即得到HA-肌肽产品；经检测，所得HA-肌肽产品的取代度为13.6％，纯度为96.78％，其中杂质HA-肌肽甲酯低于0.1％；气相色谱法检测：甲醇残留低于250ppm，乙醇残留低于150ppm；液相-质谱联用检测：DMTMM未检出；1HNMR参见附图图6。
实施例4
搅拌条件下，将15.00g肌肽溶于600mL甲醇中，氮气保护，冰水浴下加入6.21mL亚硫酰氯，升温至75℃反应1h；减压旋干得24g淡黄色粘稠液体，即得到肌肽甲酯。
将20.00g透明质酸钠(分子量：60万Da)加入到1.6L水中，搅拌至完全溶解；加入27.91g DMTMM；将所得的肌肽甲酯7.21g溶于400mL甲醇中，加入到反应中，反应60h；加入乙醇8L，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得19.55g白色固体，即得到HA-肌肽甲酯，根据核磁，得到取代度为20.4％。
将所得19.55g HA-肌肽甲酯溶解于1L纯化水中，加入NaOH水溶液(12.00gNaOH溶于1L纯化水)，室温搅拌反应1.5小时。使用HCl溶液调节至pH＝4，加入乙醇8L，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得到19.11g白色固体，即得到HA-肌肽粗品；将所得19.11g HA-肌肽溶于3.8L水中，使用有机膜分离机，采用1万Da滤膜进行超滤，得到的溶液浓缩、冻干，得到17.92g白色固体，即得到HA-肌肽产品；经检测，所得HA-肌肽产品的取代度为20.4％，纯度为96.68％，其中杂质HA-肌肽甲酯低于0.1％；气相色谱法检测：甲醇残留低于250ppm，乙醇残留低于150ppm；液相-质谱联用检测：DMTMM未检出；HA-肌肽产品1HNMR参见附图图7。
实施例5
搅拌条件下，将15.00g肌肽溶于600mL甲醇中，氮气保护，冰水浴下加入6.21mL亚硫酰氯，升温至75℃反应1h；减压旋干得24g淡黄色粘稠液体，即得到肌肽甲酯。
将20.00g透明质酸钠(分子量：60万Da)加入到2L水中，搅拌至完全溶解；将所得的肌肽甲酯13.60g溶于1.3L甲醇中，加入到透明质酸钠溶液中，再加入34.88g DMTMM，室温反应72h；然后加入乙醇12L，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得20.28g白色固体，即得到HA-肌肽甲酯；根据核磁，得到取代度为24.5％。
将所得的20.28g HA-肌肽甲酯溶解于1L纯化水中，加入LiOH水溶液(4.77gLiOH溶于700mL纯化水)，室温搅拌反应2小时；使用HCl溶液调节至pH＝3，加入乙醇7L，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得到19.68g白色固体，即得到HA-肌肽粗品；将所得的19.68g HA-肌肽溶于3.8L水中，使用有机膜分离机，采用1万Da滤膜进行超滤，得到的溶液浓缩、冻干，得到18.81g白色固体，即得到HA-肌肽产品；经检测，HA-肌肽产品的取代度为24.5％，纯度为96.90％，其中杂质HA-肌肽甲酯为52ppm，气相色谱法检测：甲醇残留低于250ppm，乙醇残留低于150ppm；液相-质谱联用检测：DMTMM未检出；HA-肌肽产品的1HNMR参见附图图8。
实施例6
搅拌条件下，将15.00g肌肽溶于600mL甲醇中，氮气保护，冰水浴下加入6.21mL亚硫酰氯，升温至75℃反应1h；减压旋干得24g淡黄色粘稠液体，即得到肌肽甲酯。
将20.00g透明质酸钠(分子量：60万Da)加入到2L水中，搅拌至完全溶解；将所得的肌肽甲酯16.30g溶于1.5L甲醇中，加入到透明质酸钠溶液中，再加入83.02g DMTMM，室温反应72h；然后加入乙醇15L，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得20.78g白色固体，即得到HA-肌肽甲酯；根据核磁，得到取代度为31.4％。
将所得的20.78g HA-肌肽甲酯溶解于1L纯化水中，加入LiOH水溶液(10.80g LiOH溶于900mL纯化水)，室温搅拌反应2小时；使用HCl溶液调节至pH＝5，加入乙醇8L，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得到20.22g白色固体，即得到HA-肌肽粗品；将所得的20.21g HA-肌肽溶于4L水中，使用有机膜分离机，采用1万Da滤膜进行超滤，得到的溶液浓缩、冻干，得到19.32g白色固体，即得到HA-肌肽产品；经检测，HA-肌肽产品的取代度为31.4％，纯度为96.89％，其中杂质HA-肌肽甲酯低于0.1％，气相色谱法检测：甲醇残留低于250ppm，乙醇残留低于150ppm；液相-质谱联用检测：DMTMM未检出；HA-肌肽产品的1HNMR参见附图图9。
实施例7
搅拌条件下，将30.00g肌肽溶于1.2L甲醇中，氮气保护，冰水浴下加入12.42mL亚硫酰氯，升温至75℃反应1h；减压旋干得45g淡黄色粘稠液体，即得到肌肽甲酯。
将20.00g透明质酸钠(分子量：6万Da)加入到2L水中，搅拌至完全溶解；将所得的肌肽甲酯30.00g溶于1.2L甲醇中，加入到透明质酸钠溶液中，再加入55.80g DMTMM，室温反应72h；加入乙醇10L沉淀，过滤，滤饼烘干得21.40g白色固体，即得到HA-肌肽甲酯；根据核磁，得到取代度为35.1％。
将所得的21.40g HA-肌肽甲酯溶解于1.5L纯化水中，加入NaOH水溶液(10.50gNaOH溶于1L纯化水)，室温搅拌反应2小时；使用HCl溶液调节至pH＝4，加入乙醇10L沉淀，过滤，滤饼烘干得到20.70g白色固体，即得到HA-肌肽粗品；将所得的20.70g HA-肌肽溶于4L水中，使用有机膜分离机，采用1万Da滤膜进行超滤，得到的溶液浓缩、冻干，得到19.69g白色固体，即得到HA-肌肽产品；经检测，HA-肌肽产品的取代度为35.1％，纯度为96.98％，其中杂质HA-肌肽甲酯低于0.1％；气相色谱法检测：甲醇残留低于250ppm，乙醇残留低于150ppm；液相-质谱联用检测：DMTMM未检出；HA-肌肽产品的1HNMR参见附图图10。
实施例8
搅拌条件下，将30.00g肌肽溶于1.2L甲醇中，氮气保护，冰水浴下加入12.42mL亚硫酰氯，升温至75℃反应1h；减压旋干得45g淡黄色粘稠液体，即得到肌肽甲酯。
将20.00g透明质酸钠(分子量：60万Da)加入到2L水中，搅拌至完全溶解；将所得的肌肽甲酯36.00g溶于1.2L甲醇中，加入到透明质酸钠溶液中，再加入55.80gDMTMM，室温反应96h；加入乙醇15L，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得20.98g白色固体，即得到HA-肌肽甲酯；根据核磁，得到取代度为33.7％。将所得的20.98g HA-肌肽甲酯溶解于1.5L纯化水中，加入碳酸钠水溶液(18.55g碳酸钠溶于1L纯化水)，室温搅拌反应3时；使用HCl溶液调节至pH＝4，加入乙醇15L，析出沉淀，过滤，滤饼烘干得到20.61g白色固体，即得到HA-肌肽粗品；将所得的20.61g HA-肌肽溶于4L水中，使用有机膜分离机，采用1万Da滤膜进行超滤，得到的溶液浓缩、冻干，得到19.38g白色固体，即得到HA-肌肽产品；经检测，HA-肌肽产品的取代度为33.7％，纯度为96.98％，其中杂质HA-肌肽甲酯低于0.1％；气相色谱法检测：甲醇残留低于250ppm，乙醇残留低于150ppm；液相-质谱联用检测：DMTMM未检出；HA-肌肽产品的1HNMR参见附图图11。
本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容和范围内对本文所述的方案或应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进条件/参数来实现和/或应用本发明技术。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。
Claims (10)
1.一种化合物1的制备方法，包括步骤(1)：化合物2在水或水与有机溶剂的混合溶剂中，在无机碱的作用下水解，制备得到化合物1；反应式如下所示：
其中，
R2为R选自甲基或乙基；
R1为钠离子、锌离子或钙离子；
R3为
n与m之和为20-2500的整数，n大于零，且n和m都为整数；
所述化合物2中，与R2形成酰胺键的羧基，占与R2形成酰胺键的羧基和剩余的羧基的总量的2％-40％；
所述的无机碱为碳酸钠，氢氧化锂和氢氧化钠中的一种或多种；
化合物2中的与R2形成的酰胺键与无机碱的投料摩尔比为1:(8-40)；
任选地包括，将制备得到的化合物1在有机膜分离机进行超滤。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括以下条件中的至少之一：
所述化合物2中，与R2形成酰胺键的羧基，占与R2形成酰胺键的羧基和剩余的羧基的总量的5％-35％；n/(n+m)为5％-35％；
所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、丙酮、DMSO、THF或乙腈中的一种或多种，水与所述有机溶剂的体积比为10:0.5-10:2.5；
水解的反应温度为-10℃-50℃；和
水解的反应时间为0.5小时-8小时。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：化合物2在水中，在无机碱的作用下，在10℃-40℃水解，水解反应结束后，将反应液调节至pH为3-6，然后与乙醇混合，搅拌，过滤，干燥所得固体，制备得到化合物1；化合物2中的与R2形成的酰胺键与所述的无机碱的投料摩尔比为1:(8-30)；所述乙醇与反应液的体积比为3:1-30:1；任选地包括，将制备得到的化合物1在有机膜分离机使用1000道尔顿-5万道尔顿的滤膜进行超滤。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于还包括：将制备得到的化合物1溶于水，再与乙醇混合，搅拌，过滤，干燥所得固体，得到化合物1；或者，将制备得到的化合物1与乙醇混合打浆或与水和乙醇混合打浆，然后过滤，干燥所得固体，得到化合物1；其中，乙醇的体积与化合物1的质量之比为10mL:1g-100mL:1g；水与化合物1的质量之比为20:1-100:1。
5.根据权利要求1-4任一所述的制备方法，还包括以下步骤(2)：化合物4和化合物3在水、第二有机溶剂或其混合溶剂中，在缩合剂的作用下，制备得到化合物2；反应式如下式所示，其中，R1，R，R2，n和m如权利要求1中所述：
其中，所述缩合剂为4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-氯化吗啉。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：化合物4与缩合剂的投料摩尔比为1:0.1-1:10。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于包括以下条件中的至少之一：
所述化合物4的分子量为1万Da-100万Da；
所述化合物4与化合物3的投料摩尔比为1:0.05-1:10；
所述化合物4与所述缩合剂的投料摩尔比为1:0.2-1:6；
所述第二有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、丙酮、DMSO、DMF、DMA、THF和乙腈中的一种或多种；
步骤(2)中，所述化合物2中，与R2形成酰胺键的羧基占与R2形成酰胺键的羧基和剩余的羧基的总量的5％-35％或10％-35％；和
在缩合剂的作用下，在0℃-40℃反应12小时-96小时，制备得到化合物2。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：化合物4和化合物3在水和第二有机溶剂的混合溶剂中反应，水和第二有机溶剂的体积比为10:0.5-10:8。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：化合物4和化合物3在水和甲醇的混合溶剂中或在水和乙醇的混合溶剂中，在缩合剂的作用下，在0℃-40℃反应12小时-96小时，制备得到化合物2；所述化合物4与化合物3的投料摩尔比为1:0.15-1:5；化合物4与缩合剂的投料摩尔比为1:0.4-1:5；所述水和甲醇或乙醇的体积比为10:1.5-10:8。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：化合物4和化合物3反应结束后，将反应液与乙醇混合，搅拌，过滤，干燥所得固体，得到化合物2；所述乙醇与反应液的体积比为3:1-30:1。
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