CN111163808A - 含有透明质酸和肌肽的药物组合物及其相关用途 - Google Patents

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Abstract

描述了含有透明质酸和肌肽的药物组合物，其用于治疗和预防骨关节炎(OA)和用于治疗类风湿性关节炎(RA)。

Description

含有透明质酸和肌肽的药物组合物及其相关用途
本发明涉及含有透明质酸和肌肽的药物组合物及其相关用途。
发明领域
骨关节炎(OA)是一种严重致残的病理学，其特征是由于基质的降解和主要的软骨细胞成分(软骨细胞)的丧失而引起的关节软骨的逐渐侵蚀。
病因仍是部分未知的，但是最近的实验结果表明，在其复杂性当中可能牵涉关节的机械不平衡也可能是上述病理发作的最初原因。
实际上，关节的过度和/或不正确负载会导致软骨细胞反应，这种反应在负责软骨本身降解的那些酶的合成中表现。这些蛋白酶称为金属蛋白酶(MMP)，当受到促炎细胞因子(如IL-1、IL-6和TNF-α)刺激时，由软骨细胞合成。这些细胞因子尤其是炎症病理的发作时产生并释放到关节腔中。这些细胞因子还刺激了高水平的一氧化氮的合成(由软骨细胞的凋亡导致死亡)，此外，还抑制了蛋白聚糖(基质的结构成分)的合成(Dozin B.等人，MatrixBiology，2002，21：449-459)。
在患有类风湿性关节炎(RA)和牛皮癣性关节炎的患者的滑液中也发现了高水平的促炎分子(Arend W.P.等人，Arthritis Rheum，1995，38：151-160)。
类风湿关节炎(RA)是一种慢性、强直性和进行性炎性多关节炎，具有自身免疫性发病机制和病因不明，主要是由于滑膜关节会引起变形和疼痛，直至关节功能丧失。
实际上，RA的进展决定了滑膜强烈的炎症反应，随之而来的是细胞肿胀，滑液过多和纤维组织的发育。更具体地说，滑膜是由滑膜细胞(巨噬细胞和纤维蛋白样类型)形成的间质起源的膜，滑膜细胞在疾病中经历增生和肥大，然后变厚(非病理状态的两/三层变为7层或更多)，形成滑膜血管翳(synovial pannus)，开始逐渐侵蚀未被软骨覆盖的骨骼。
同时，具有T、B淋巴细胞和浆细胞的多形核细胞移动到滑液中，增加了受累关节的炎症，受RA(具有相对下面的骨骼)影响的关节软骨在逐渐受到破坏的情况下变薄。
这种病理通常在全身水平上也表现出来，也涉及其他器官和装置。类风湿结节是典型的，可在肺水平形成，继而发生肺纤维化、胸膜炎和胸膜腔炎，在心脏水平可加速冠状动脉粥样硬化，而在眼水平可出现干眼症、葡萄膜炎和巩膜炎。淀粉样变性和骨质疏松也是RA的并发症(Cecil，TEXTBOOK of MEDICINE，1988)。
类风湿关节炎影响全世界0.5％至1％的成年人，并且通常在40至50岁之间开始。
RA的治疗很困难，取决于它的严重程度和所涉及器官的类型，并且包括使用适合控制炎症的药物来预防和/或治疗关节损伤(除其他器官外)，目的是减缓降低导致的残疾。包括类固醇和非甾体抗炎药在内的止痛和抗炎药可抑制症状，但不能阻止病情发展，但是，改变风湿病的抗风湿药(DMARD)可以减缓病情。
以更进取的形式，通常使用甲氨蝶呤，其是一种叶酸合成的抗代谢抑制剂，在低剂量时可作为免疫抑制剂，但最近已引入生物药，其作用更具选择性和特异性(Canete JD等，Expert Opinion Biol Ther，2017，17：1-15)，例如Etanercept，一种融合蛋白，可拮抗促炎性TNF细胞因子。
TNF是负责全身性炎症急性期的那类细胞因子的一部分。它涉及许多过程，例如细胞增殖、分化和凋亡、致癌作用和病毒复制。它主要是由巨噬细胞产生的。其合成可以被细菌内毒素刺激并被类固醇抑制。
它与许多其他细胞因子一起作用于众多器官和系统，促进炎症反应，进而引发多种病理(包括自身免疫性疾病)，如RA和OA、克罗恩病、牛皮癣和哮喘；这种细胞因子还能够激活破骨细胞，从而诱导骨吸收，它能够刺激巨噬细胞产生具有氧化作用的分子，它牵涉心血管系统参与静脉血栓形成的特殊病理过程(Alam J.，Biomed Pharmacother，2017，92：615-633)，并最终能够增加组织对胰岛素的抗性，从而有利于II型糖尿病的发作(NicolauJ等，Joint Bone Spine，2017，84(4)：411-416)。
对于OA和RA，有多种类型的药物可有效减缓上述病理过程或治疗相关症状，但是对于必须长期维持的药物治疗方案，以及还有给药方法，通常是胃肠外，但首先是口服，因此涉及整个有机体，即使在许多情况下，仅仅是发炎的关节要治疗，作为合成分子(因此非天然)，它们可能具有严重的副作用，通常是有毒的。
因此，本发明的目的是确定包含透明质酸(HA)/肌肽缀合物的药物组合物，其特别有效地用于治疗和预防OA和治疗RA(所有由RA直接引起或与RA间接相关/取决于RA的随后疾病)，优选通过口服(首先在疾病已获得明确的全身表现时)和/或在疾病早期或该相同关节的关节局部强化阶段通过在关节中关节内给药。
肌肽是从体内β-丙氨酸和L-组氨酸之间的缩合反应获得的二肽。在肌肉和大脑中大量发现，科学文献一致地赋予其抗氧化剂、抗自由基和抗炎活性(Budzen S.等，Adv ClinExp Med，2013，22(5)：739-44)。
临床前研究已证明其在预防和治疗白内障方面具有抗自由基能力(BabizhayevM.等，Biochim，Biophys，Acta，1989，1004(3)：363-371)，而其抗炎活性已经在消化系统的一些组织、眼睛和皮肤中得到证实(US4508728，WO01/52808)；还证明了其作为针对自由基羟基的清除剂的特定活性(La Mendola D.等人，Helv.Chim.Acta，2002，85(6)：1633-1643)。
然而，肌肽的肽性质对其使用施加了一些限制，与其热不稳定性相关的限制以及由于特定的肽酶引起的其高体内降解性。为了克服该限制，已经提出了使用N-乙酰基肌肽(WO95/10294)，其降解速度要比游离形式的慢得多(Babizhayev MA等人，Clin.Chim.Acta，1996，254(1)：1-21)，同时还与环糊精(EP1176154)合成了肌肽的化学衍生物。环糊精是医学上用作药物载体的天然环状低聚糖。在这种情况下，环糊精稳定二肽，保护其免受肌肽酶的水解活性(Schaschke N.等人，JACS，1998，120(28)：7030-7038)，从而使上述分子发挥其生物活性。基于相同的原理，肌肽与海藻糖的缀合物随后被授予专利权，作为具有抗氧化、抗糖化和抗聚集活性的体系(EP1860116)。
HA的衍生物也是已知的，其通过使肌肽与所述多糖通过涉及HA的羧基和二肽的氨基的酰胺键缀合而获得(WO2016016847)。
但是，该衍生物并未考虑用于治疗RA和OA。此外，根据上述参考文献，该衍生物最多只能被衍生化至25％(HA与肌肽之间的摩尔/摩尔比)。
本发明描述了一种组合物，其包含HA和肌肽的酰胺衍生物，其衍生化度高于25％，其因此是基于现有技术本领域技术人员认为其合成不可能的缀合物。
HA是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺的交替残基构成的杂多糖。它是一种线性链状聚合物，分子量范围为50,000至13x 106Da，取决于获得其的来源和所用的制备方法。它天然存在于细胞周凝胶中，脊椎动物生物体结缔组织的基质中，关节的滑液中，玻璃体液中和脐带中。因此，HA在生物体中起着重要作用，不仅作为皮肤、肌腱、肌肉和软骨等许多组织的细胞的机械支撑，而且还作为能够调节(通过CD44受体)许多与细胞生理和生物有关过程的活性剂，例如增殖、迁移、细胞分化和血管生成；其在维持组织的水合和关节润滑中的作用也是已知的。HA实际上是一种具有特殊粘弹性的多糖，主要通过滑膜细胞在关节腔中合成和分泌(Asari A.等，Arch.Histol.Cytol.，1995，58(1)：65-76)，并且其是滑液的主要成分之一。在关节缓慢运动期间，HA充当粘性润滑剂，而在快速运动过程中，它具有弹性，吸收可能冲击关节的任何可能的创伤或微创伤。
非病理性滑膜液中HA的交换通常非常快，而OA中的浓度却随着平均分子量(MW)的降低而降低，但最重要的是其交换流量急剧降低(Balazs EA等，J Rheumatol，Suppl.，1993，12：75-82)。
由于这些原因，Balazs首先提出了可能通过直接在关节腔中贡献外源HA(特别是具有高MW)来改变骨关节炎过程的发展的可能性，并且由于这种治疗方法，有可能证明HA针对牵涉由炎症性疾病或外伤所致的关节软骨损伤所引起的退化。
详细说明
本发明的目的涉及一种药物组合物，其包含透明质酸(HA)/肌肽缀合物，其在HA的羧基和肌肽的氨基之间具有直接酰胺键，用于预防和治疗OA，治疗RA和直接由RA引起或与RA间接相关/取决于RA的病理，特别是用于治疗由RA直接引起的疾病，选自包括以下的组：肺纤维化、胸膜炎和胸膜心包炎(pleuropycarditis)、干眼症、葡萄膜炎和巩膜炎的疾病，或者与RA间接相关/取决于RA的病理，选自包括以下的组：病理性早衰、心脏病、中风、动脉硬化和冠状动脉粥样硬化、动脉高血压、痴呆、糖尿病、骨质疏松和淀粉样变、癌症、蛋白尿和肾炎、胃部病变、白内障、银屑病关节炎、胃炎、脉管炎、I型糖尿病和自身免疫性甲状腺炎。这种用途会产生真正的治疗上的益处，因为这是这些疾病所源自的RA治疗的直接结果。
根据本发明用途的药物组合物优选包含HA/肌肽缀合物，其HA(DS)的羧基的衍生化(酰胺化)程度高于25％(从25％至100％)，优选为30％至100％，更优选30％至60％，甚至更优选在35±3％(即32％至38％)至45±5％(即40％至50％)的范围内变化。
所述HA与肌肽的酰胺衍生物(即HA/肌肽缀合物)是通过在HA的羧基和肌肽的胺基之间形成直接酰胺键(无需借助于永久性间隔基)将二肽(即，肌肽)与透明质酸(HA)共价结合而获得的。
如下所述，申请人实际上已经惊讶地发现了本发明的缀合物在肌肽和HA之间在RA和OA的治疗中具有意想不到的协同作用，从而实现了上述病理的显著临床/组织学改善，炎症和脂质氧化的血浆指标显著降低。
本发明的目标缀合物的衍生化程度通过以下实施例4中所述的方法测量。
用于合成本发明的HA/肌肽缀合物的HA可以来自任何来源，例如，通过从公鸡鸡冠中提取(EP138572)，通过发酵(从马链球菌(Streptocuccus Equi)或兽疫链球菌(Zooepidemicus)，EP716688)或通过生物合成(从杆菌(Bacillus,EP2614087)，并且平均分子量(MW)可以为400至3x106 Da，特别是1x 105Da至1x106 Da，甚至更特别是在130-220kDa的范围内和/或在500-750kDa的范围内。
优选药物组合物，其中HA的衍生化程度在30％至60％的范围内变化，并且HA的平均分子量范围为1×105Da至1×106Da；更优选其中HA的DS在30％至60％范围内变化并且HA的平均分子量在130-220kDa或500-750kDa和相关组合的范围内的药物组合物。
甚至更优选的是其中HA的DS在31至34％(35±3％)范围内或在40至50％(45±5％)的范围内和在相关组合的范围内变化的药物组合物，以及HA的平均分子量在130-220kDa或500-750kDa及相关组合的范围内；特别地，优选这些组合物，其中，当HA的DS在35±3％的范围内变化时，HA的平均分子量在500-750kDa的范围内，以及当HA的DS在45±5％的范围内变化时，HA的平均分子量在130-220kDa的范围内。
应该指出的是，平均分子量是指用“固有粘度”法(Terbojevich等，CarbohydrRes，1986，363-377)计算的重均分子量。
用于合成所述缀合物的透明质酸选自HA的钠盐(EP138572)，优选用于合成高达约40％(因此从25％至40％)的DS的HA/肌肽缀合物，和HA的四丁铵(TBA)盐(EP216453)，优选用于合成DS高于40％(因此为40％至100％)的HA/肌肽缀合物，最终产物(描述于下文提供的制备实施例中)(优选)制备为HA/肌肽缀合物的钠盐，不管用作试剂的HA盐。
本发明的另一个目的涉及生物材料，该生物材料由与肌肽以HA所述的方式和程度缀合的HA衍生物(再次地通过所述的酰胺键)组成，在本文中定义为“HA/肌肽生物材料”。
下面列出了可用于上述生物材料形成的HA衍生物：
Figure BDA0002436208650000072
HA与脂族、芳脂族、脂环族、芳族、环状和杂环系列醇的酯，其酯化百分比可根据所用醇的类型和长度而变化，优选为1％至70％，而剩余百分比的未酯化的HA可以用有机和/或无机碱成盐(EP216453)；
Figure BDA0002436208650000073
HA与脂肪族、芳脂族、脂环族、芳族、环状和杂环系列的胺类的酰胺，酰胺化百分比范围为0.1％至50％，而剩余百分比的未酰胺化的HA可用有机和/或无机碱成盐(EP1095064)；
Figure BDA0002436208650000074
酯化百分比不高于20％，优选酯化比例为0.05％至10％的HA的内酯，而剩余百分比的未酯化的HA可用有机和/或无机碱成盐(EP341745)；
Figure BDA0002436208650000071
HA的过羧酸酯衍生物，其通过氧化N-乙酰基-葡萄糖胺级分的伯羟基而得到，其过羧化度为0.1至100％，优选为25至75％。HA的羧基可以用有机和/或无机碱成盐(EP1339753)。
HA的O-硫酸化衍生物，至多第4级的硫酸化度(EP702699)。
还可以从HA/肌肽缀合物开始合成(根据本领域技术人员已知的技术)上述HA/肌肽生物材料，进一步使HA衍生化：因此可以使用所述的缀合物作为起始原料(代替HA钠盐或TBA盐)以按照本领域技术人员已知的方式进行HYAFF、ACP、HYADD、HYOXX或硫酸化衍生物的合成，以获得先前定义为HA/肌肽生物材料的产物。
在HA的衍生物中，酯和酰胺是在本发明目标生物材料目的的形成过程中特别重要的那些。在这种情况下，特别令人感兴趣的是酯化百分比范围优选为5％至50％的苄基酯(HYAFF)和衍生化度至多为5％(在HPLC中测定)的HA的十六烷基酰胺(HYADD4)，这种酰胺与它作为粘弹性凝胶所起的作用特别相关，可以在关节损伤的情况下在临床上用作滑膜替代物(EP1853279)。
许多科学实验充分证明了HYAFF如何是一种完全生物相容的可生物降解的聚合物(Campoccia D.等人，Biomaterials，1998，19：2101-2127)以及如何使用HA的酯衍生物形成纤维(EP618817)，以非织造形式或作为海绵加工，可以构成可用于皮肤病学和整形外科领域的三维基质。
ACP衍生物已成功用作皮肤填充剂和抗粘连凝胶(EP0850074)，而对于HA的硫酸化衍生物，其抗炎作用已被研究用作皮肤病学组合物(EP2429515)的局部成分，或其在口服或关节内组合物的情况下软骨基质的保护/再生作用(EP2021078，EP2786782)。
因此，根据本发明的由上述HA衍生物的羧基与肌肽的酰胺键形成的新的生物材料，可以有效地用于治疗RA(此外，由RA直接引起或与RA间接相关/取决于RA的所有疾病)和OA(以及预防OA)，作为以纤维、凝胶、水凝胶、微球、海绵、织物或非织造织物(non-wovenfabrics)、薄膜形式加工的生物材料。
由RA直接引起的疾病是涉及除关节以外的器官和装置的相同病理的系统临床表现。
具体而言，存在RA，其中在肺水平上形成了类风湿结节，其结果是肺纤维化、胸膜炎和胸膜心包炎，而在眼睛水平上存在干眼症、葡萄膜炎和巩膜炎。
与RA间接相关/依赖于RA的病理在本文中定义为由RA间接引起的病理，因为它们与免疫谱改变的严重情况和/或高氧化应激的状况相关。自由基产生的改变实际上会严重损害结缔组织的结构、蛋白质的结构、细胞膜和DNA基因。因此，氧化应激可被认为是由自由基产生与清除之间的微妙平衡破坏引起的病理状况。
氧化应激目前被认为是导致RA发作的积极因素，因此，其他一些重要的疾病往往会因此而发生和/或依赖于RA，例如病理性早衰、心脏病、中风、动脉硬化和冠状动脉粥样硬化、动脉高血压、痴呆、糖尿病、骨质疏松和淀粉样变、多种形式的癌症、某些肝或肾疾病，例如蛋白尿和肾炎、胃部病变、白内障。
另一方面，与免疫特性改变有关的疾病包括牛银屑病关节炎、胃炎、脉管炎、I型糖尿病和自身免疫性疾病，包括例如自身免疫性甲状腺炎。
在涉及预防或治疗上述病理和相关/依赖性疾病的所有需要所述给药的领域中，描述了包含HA/肌肽缀合物和HA/肌肽生物材料的药物组合物用于局部、口服、关节内、胃肠外或外科给药，并且可以与药理和/或生物学活性物质相结合，例如类固醇、抗炎细胞因子、干扰素、生长因子(例如BMP2和BMP7)、NSAID，和/或与受控的药物递送系统，例如环糊精和/或天然聚合物，例如HA及其衍生物，优选与HA与十六烷基胺的酰胺衍生物，称为HYADD4(EP1095064)，或合成性质的聚合物结合。
下面描述本发明的HA/肌肽缀合物的合成，其肌肽甲酯与透明质酸钠盐或四丁基铵盐之间的缀合过程在包含DMSO或DMSO/H2O作为主要溶剂的介质中进行。
在以上讨论的专利申请WO2016016847中，仅描述了HA的钠盐和肌肽甲酯在THF中的缀合过程。
因此，在根据本发明的方法中，合成在室温下在非质子且强吸湿的偶极溶剂中进行。根据现有技术的在THF中的合成在具有较低极性的非质子挥发性溶剂中进行，因此在4℃下进行。
与不同的反应温度相关的不同溶剂的化学特性，也允许使用不同于钠盐的HA盐，从而使得可以获得在下文所述和权利要求书书中所要求的HA与肌肽的衍生化度。
本发明的HA/肌肽缀合物的制备方法
实施例1
肌肽甲基酯(盐酸盐)的合成
该反应在无水环境中进行。在250ml烧瓶中搅拌下，将1.5g肌肽用50ml乙酰氯在无水甲醇中的溶液(预混合)以1:20的比例(v/v)处理12小时，此后通过真空蒸发除去约90％的溶剂。将20ml无水甲醇加入到反应残余物中，并再次通过蒸发除去约90％的溶剂。重复该操作，直到除去所有的HCl(其在反应过程中形成)；然后将产物在真空下蒸干。
通过纸上电泳对产物进行控制，并使用茚三酮检测样品的各种成分。
实施例2
HA/肌肽缀合物的合成，DS的范围为35±3％mol/mol)
将1.1g MW为700kDa的透明质酸钠盐(HANa)引入反应器中，随后在恒定搅拌下(在室温下)将80ml H2O：DMSO混合物(1：1v/v的比例)加入其中至少4个小时。然后依次添加含有480μl三[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]胺(TMEA)的40ml的H2O：DMSO(1：1v/v)溶液、400mg粉末形式的3-羟基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBt)和含有240mg N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC HCl)的20ml H2O。
30分钟后，加入含有365mg肌肽甲酯的20ml DMSO溶液。然后将该混合物在25℃下剧烈搅拌4天。
然后通过加入乙醇(1L)使上述反应的产物沉淀，然后在恒定的搅拌下于25℃用0.1N NaOH对肌肽的甲酯进行脱保护(碱性水解)，进行2小时。
然后通过加入1N HCl中和pH，产物用800ml乙醇沉淀。然后将该沉淀物溶于水中，在水中透析2天，然后冻干。
实施例3
HA/肌肽共轭物的合成，DS范围为50±5％mol/mol)
将1.5g的MW为200kDa的透明质酸四丁基铵盐(HATBA)引入到反应器中，随后在恒定搅拌下(在室温下)向反应器中添加50ml DMSO至少4小时。然后依次加入2.4毫升三[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]胺(TMEA)、400毫克粉末形式的3-羟基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBt)和20毫升含有240mg N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC HCl)的DMSO。
30分钟后，添加含有365毫克肌苷甲酯的10毫升DMSO溶液。然后将该混合物在25℃下剧烈搅拌1天。
最后再加入10毫升含有240毫克N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，HCl)的DMSO，和10毫升含有365毫克肌苷甲基酯的DMSO溶液。
将该混合物在25℃下剧烈搅拌3天。
然后加入5ml NaBr饱和溶液和800ml乙醇使上述反应产物沉淀，然后在恒定搅拌下于25℃下用0.1N NaOH进行肌肽的脱保护(碱性水解)，进行2小时。
然后通过加入1N HCl中和pH，并用800ml乙醇沉淀产物。然后将该沉淀物溶解在水中，在水中再次透析2天，然后冻干。
实施例4
根据实施例2和3制备的样品的HPLC分析
(与HA的羧基结合的肌肽中所存在的β-丙氨酸的定量分析)
样品制备：
-将HA/肌肽缀合物在70℃下以25mg/ml的浓度溶于6M HCl中5分钟，然后在6M HCl中稀释1/10；
-然后将0.1ml的样品溶液转移到试管中，向其中加入1.9ml的HCl 6M。
-将样品在165℃下水解2小时，使其冷却，然后加入8ml H2O MilliQ，将整个样品混合直至完全重悬浮并过滤；
-然后将8ml过滤后的样品转移至20ml烧瓶中，向其中加入10ml NaOH 1M；
-将0.2毫升如此制备的样品转移到一个小瓶中，然后加入0.2毫升0.2M pH 9.3的硼酸盐缓冲液和0.2毫升FMOC-Cl(在ACN(乙腈)中以1毫克/毫升的浓度制备)；反应时间：至少30分钟；
-最终使用以下带有UV检测器的HPLC方法将样品注入HPLC：
-Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱(15cm，5μ，
Figure BDA0002436208650000111
)
-流量：1毫升/分钟
-进样量：50μl
-波长：262nm
-流动相A：Na2HPO4 40mM pH 7.8
-流动相B：ACN/MeOH/H2O 45/45/10
-A相/B相比率＝60/40(梯度)。
结果：实施例2的样品显示出对HA的羧基的衍生化度为35％mol/mol，而实施例3的样品显示出的衍生化度等于50％mol/mol。
HA/肌肽结合物的动物实验
实施例5
RA的实验模型：小鼠胶原诱发的关节炎(CIA)
HA/肌肽结合物的口服治疗
多年来，CIA被公认为是小鼠或大鼠RA的有效实验模型，因为它确定了动物RA的体液、细胞、组织学和病理学特征(Holmdahl等人，Immunological Reviews，1990，118：193-232)。实际上，在小鼠中诱导CIA之后，其关节中存在大量活化的嗜中性粒细胞/巨噬细胞/淋巴细胞，从而产生了RA的滑膜血管翳。
CIA诱导：将II型鸡胶原蛋白(CII)以2mg/ml的浓度溶于0.01M乙酸中，然后通过向不完全佐剂(由水/矿物油乳液组成)中添加结核分枝杆菌H37Ra(2mg/ml)(Mycobacteriumtuberculosis H37Ra)制备完全的弗氏佐剂(CFA)，然后将两种组分(CII和CFA)混合并以相同的v/v比例乳化。
通过皮内注射(第1天)在小鼠的尾巴根部注射由此获得的100μl乳液(包含100μg的CII)。21天后进行第二次相同的注射。
实验组：
使用9周大的DBA/IJ雄性小鼠，每只约30g，每组20只小鼠。
第1组：CIA对照：通过CIA诱导并随后从所述CIA后第25天直至实验结束第35天，每24小时口服蒸馏水治疗动物。
第2组：CIA+HA/肌肽结合物：通过CIA诱导并随后从所述CIA后第25天直至第35天，每24小时用上述缀合物治疗动物。用于测试的缀合物是根据实施例3制备的，因此以50％ mol/mol衍生化，口服施用的剂量是81mg/kg缀合物(20mg肌肽和61mg HA)。
第3组：CIA+HA/肌肽混合物：通过CIA诱导并随后从所述CIA后第25天直至第35天，每24小时用HA/肌肽治疗动物。该制剂由HA钠盐和肌肽在水中的混合物组成，口服剂量为20mg/kg肌肽和61mg/kg HA。
临床评估
首次注射后20天，每天按照以下评估方案对每只爪子评估疾病的发展：
0＝无关节炎发展迹象
1＝爪子肿胀和/或发红
2＝至少2个关节的爪子肿胀和/或发红
3＝至少3个关节的爪子肿胀和/或发红
4＝牵涉所有脚趾的整个爪子发展成严重的关节炎
对于每只动物，总的CIA发展指数(定义为关节炎爪评分(Arthritic Paw Score))是通过将每只爪子所获得的值相加(并按上述方法进行评估)来计算的。
临床严重性指数由爪的体积(每两天由肢体肿大容积测量仪(plethysmometer)测量)给出，其根据疾病的严重性在整个分析期间逐渐增加：脚增大(foot increase)。
组织学评估
在评估期结束时，即在实验开始后的第35天，处死动物，移除处理过的爪子(包括膝关节)并固定在10％福尔马林中；随后脱钙并浸入石蜡中以制备5μm切片机切片，然后用苏木精/曙红染色。光学显微镜分析是按照以下组织学评分进行的：
0＝无损伤
1＝水肿
2＝存在炎性细胞浸润
3＝骨吸收的证据
血浆分析：
血浆TNF-α定量
在实验结束时，使用Calbiochem-Novabiochem Corporation，IT的ELISA试剂盒测量动物血浆中TNF-α水平，以确定TNF-α水平(读数极限10pg/ml)。
血浆脂质过氧化指数的量化
存在于生物膜中的脂质受到自由基的攻击决定了氧依赖衰退过程(脂质过氧化)的开始，这导致生物膜完整性受损，并形成氧化的脂质蛋白和脂质过氧化物，以及副产物，例如醛，包括丙二醛(MDA)。所有这些过程都导致氧化应激。为了测量由CIA引起的对小鼠的自由基损伤，将在实验结束时采集的处理组的血浆样品(因此含有上述醛)与巴比妥酸(TBARs)反应，与用MDA给出的标准(即99％四甲氧基丙烷溶液，Sigma，米兰)比较。结果是用分光光度计OD650nm容易检测到的加合物(Ohkawa H等人，Anal.Biochem.，1979，95：351-358)。
结果：
临床评估
如图1所示(关节炎爪评分)，最大的病理表现指标显示了CIA处理后30至35天的明显的关节周围红斑和爪水肿的迹象(对照组)。与CIA组+HA/肌肽混合物相比，口服HA/肌肽缀合物的口服给药可显著减少关节炎症，尤其是在30天时。当共价结合至所述实验的DS时，这种功效上的显著差异，HA和肌肽之间协同作用的指标保持甚至更长的时间，直到实验结束。
图2示出了脚增大(foot increase)的趋势：同样在这种情况下，用本发明的目标缀合物进行的治疗证实了图1的令人惊讶的效果，其中，在实验结束时，用所述缀合物处理的爪的肿胀与未治疗的对照组以及用HA/肌肽混合物治疗的组相比，其明显降低。
组织学评估
图3：在实验的第35天(结束)，对CIA-对照动物的组织学评估显示出清晰且重要的组织学迹象，表明发展成了一种严重的RA，伴有骨侵蚀和关节组织的中度/重度坏死。另一方面，与对照和与用HA/肌肽混合物治疗的组相比，用HA/肌肽缀合物的治疗显著降低了这种侵蚀。
血浆分析：血浆TNF-α的定量
在实验结束时，对所有接受过CIA和未接受的动物的促炎性细胞因子TNF-α的血浆水平进行了分析(Sham样品，即未诱导CIA的非操作的健康动物的血浆TNF值—作为比较)。
如图4所示，在CIA-对照组中，上述炎症细胞因子的值非常高，几乎比Sham对照组高5倍，而用本发明的目标缀合物治疗可使TNF-α值减少一半以上，与施用HA/肌肽混合物的组相比，也显著降低。
实施例6
OA实验模型：诱导大鼠碘乙酸单钠(MIA)骨关节炎。
通过关节内注射MIA，在受试大鼠的后膝关节中诱发OA：将25μl含1mg/kg MIA的盐水通过下韧带注入每只动物(在治疗中)右爪的关节(膝)，而左关节接受等体积的生理盐水0.9％(Sagar DR等人，Ann.Rheum.Dis.，2013，73：1558-1565)。
HA/肌肽缀合物的关节内治疗
实验组：
使用雄性Sprague-Dawley大鼠，每只约230g，每组20只大鼠。
第1组：MIA对照：通过MIA诱导并随后在MIA后第7、10、13、16和19天，在右膝关节内给予25μl蒸馏水治疗动物。第21天，实验以动物的安乐死结束。
第2组：MIA+HA/肌肽缀合物：通过MIA诱导并随后在MIA后第7、10、13、16和19天，在右膝关节内给予25μl根据实施例2制备的缀合物(然后以35％mol/mol衍生化)治疗动物，直到第21天。25μl HA/肌肽缀合物包含250μg缀合物，即45.75μg肌肽和204.25μg HA。
第3组：MIA+HA/肌肽混合物：通过MIA诱导并随后在MIA后第7、10、13、16和19天，在右膝关节内给予25μl HA和肌肽治疗动物，直到第21天。该制剂由HA钠盐与肌肽在水中的混合物组成，因此25μl的该制剂含有45.75μg肌肽和204.25μg HA。
血浆TNF-α定量
在实验结束时，使用Calbiochem-Novabiochem Corporation，IT的ELISA试剂盒测量动物血浆TNF-α水平，以确定TNF-α水平(读数极限10pg/ml)。
结果
图6显示了在治疗组和Sham组中获得的结果，Sham组定义为未对动物进行MIA治疗的组：在这种情况下，同样是MIA-对照的TNF细胞因子的血浆水平组被证明是非常高的，而用HA/肌肽缀合物治疗不仅与该对照组相比，而且与已施用HA/肌肽混合物但未显示任何功效的组相比，均显著降低了TNF-α值。再次证明了本发明的目标缀合物的惊人效果，因此证明了其衍生化水平相对于现有技术而言特别高。
HA/肌肽缀合的口服治疗
实验组：
使用雄性Sprague-Dawley大鼠，每只约230g，每组20只大鼠。
组1：MIA对照：通过MIA诱导并随后从MIA后第3天直至实验结束第20天每24小时口服蒸馏水治疗动物。
组2：MIA+HA/肌肽缀合物：通过MIA诱导并随后从MIA后第3天直至第20天每24小时给予上述缀合物治疗动物。根据实施例2制备用于实验的缀合物，然后将其以35％mol/mol衍生化，口服施用的剂量等于88.5mg/kg缀合物(16.2mg肌肽和72.3mg HA)。
第3组：MIA+HA/肌肽混合物：通过MIA诱导处理动物，随后从MIA后的第3天开始直至第20天，每24小时给予HA/肌肽治疗。该制剂由HA钠盐和肌肽在水中的混合物组成，口服剂量为16.2mg/kg肌肽和72.3mg/kg HA。
第4组：MIA+萘普生：通过MIA诱导处理动物，随后从MIA后的第3天开始直至第20天，每24小时以10mg/kg的剂量口服给予萘普生治疗。
组织学评估
在实验期结束时，即从MIA诱导开始的第21天，处死动物，移除经治疗的腿(包括膝关节)并固定在10％福尔马林中。随后将它们脱钙并浸入石蜡中以制备5μm切片机切片，然后用苏木精/曙红染色。光学显微镜分析是按照Mankin的修改的组织学评分进行的，评分范围为0-12，即从正常的细胞组织到完全的组织破坏和低细胞性(hypocellularity)；(Mankin HJ等人，J Bone Joint Surg Am.，1971，53(3)：523-537)。
结果：
第1组样品的组织学检查显示组织结构不规则，表层有纤维性颤动、细胞减少和软骨层变性。用HA/肌肽缀合物进行口服治疗可显著降低组织学损伤和软骨变性，完全可与萘普生(已证明有效的已知非甾体抗炎药)所产生的效果相媲美，而相对于第1组未经处理的样品(MIA对照)，使用HA/肌肽混合物进行的治疗并未导致任何组织学方面的改善(图7)。

Claims (11)

1.药物组合物，其包含透明质酸(HA)/肌肽缀合物，在透明质酸的羧基和肌肽的胺基团之间具有直接酰胺键，用于骨关节炎的预防和治疗和类风湿性关节炎(RA)的治疗。
2.根据权利要求1的药物组合物，用于治疗由RA直接引起的病理，选自包括以下的组：肺纤维化、胸膜炎和胸膜心包炎、干眼症、葡萄膜炎和巩膜炎，或者与RA间接相关/取决于RA的病理，选自包括以下的组：病理性早衰、心脏病发作、中风、动脉硬化和冠状动脉粥样硬化、动脉高血压、痴呆、糖尿病、骨质疏松和淀粉样变、癌症、蛋白尿和肾炎、胃部病变、白内障、银屑病关节炎、胃炎、脉管炎、I型糖尿病和自身免疫性甲状腺炎。
3.根据前述权利要求一项或多项的药物组合物，其中所述透明质酸(HA)/肌肽缀合物通过在HA的羧基和肌肽的胺基之间形成直接的酰胺键，将肌肽的二肽与透明质酸共价结合而获得，其HA的羧基的衍生化度，即酰胺化度高于25％，优选为30至100％，更优选为30至60％，甚至更优选在35±3％或45±5％及其组合的范围内变化。
4.根据前述权利要求一项或多项的药物组合物，其中所述HA的平均分子量为400至3x106Da，优选为1x105Da至1x106Da，甚至更优选为130-220k Da或500-750k Da及其组合。
5.根据前述权利要求一项或多项的药物组合物，其中HA的衍生化度为30至60％，并且HA的平均分子量为1x 105Da至1x106，并且优选为130-220k Da或500-750k Da及其组合。
6.根据前述权利要求一项或多项的药物组合物，其中用于HA与肌肽的酰胺衍生物的透明质酸是HA的钠盐或HA的四丁基铵盐。
7.根据前述权利要求一项或多项的药物组合物，用于局部、口服、关节内、肠胃外或外科施用。
8.由HA与肌肽缀合的衍生物组成的生物材料，其中所述衍生物选自HA的酯、HA的酰胺、HA的内酯、HA的过羧酸酯和HA的硫酸酯。
9.根据权利要求8的由HA与肌肽缀合的衍生物组成的生物材料，其用于预防和治疗骨关节炎、用于治疗类风湿性关节炎(RA)、以及用于治疗由RA直接引起的病理，选自包括以下的组：肺纤维化、胸膜炎和胸膜心包炎、干眼症、葡萄膜炎和巩膜炎，或者与RA间接相关/取决于RA的病理，选自包括以下的组：病理性早衰、心脏病发作、中风、动脉硬化和冠状动脉粥样硬化、动脉高血压、痴呆、糖尿病、骨质疏松和淀粉样变、癌症、蛋白尿和肾炎、胃部病变、白内障、银屑病关节炎、胃炎、脉管炎、I型糖尿病和自身免疫性甲状腺炎。
10.根据权利要求9的由HA与肌肽缀合的衍生物组成的生物材料，其形式为纤维、凝胶、水凝胶、微球、海绵、织物或非织造织物、薄膜，用于局部、口服、关节内、肠胃外或外科施用。
11.根据前述权利要求的药物组合物或生物材料，其与药理和/或生物活性物质和/或药物和/或天然聚合物或合成性质的聚合物的控释系统结合。
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