DE4316293C2 - Verwendung einer Kombination von Anserin/Carnosin und Hypotaurin/Taurin zur Bekämpfung entzündlicher Erkrankungen - Google Patents

Verwendung einer Kombination von Anserin/Carnosin und Hypotaurin/Taurin zur Bekämpfung entzündlicher Erkrankungen

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DE4316293C2 DE19934316293 DE4316293A DE4316293C2 DE 4316293 C2 DE4316293 C2 DE 4316293C2 DE 19934316293 DE19934316293 DE 19934316293 DE 4316293 A DE4316293 A DE 4316293A DE 4316293 C2 DE4316293 C2 DE 4316293C2
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Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Kombination von Anserin/Carnosin zusammen mit Hypotaurin/Taurin zur Bekämpfung entzündlicher Erkrankungen der Atemwege, des Auges, der Ohren und der Haut.
Es ist heute bekannt, daß aktivierte Sauerstoffspezies, die sich aufgrund oxidativer Vorgänge in den Zellen bilden, einen schädigenden Effekt auf verschiedene Körpergewebe haben können. Die Sauerstoffaktivierung kann prinzipiell in allen lebenden Zellen stattfinden, jedoch existieren besonders gefährdete Systeme, in denen entweder die Sauerstoffkonzentration besonders hoch ist (Lungengewebe) oder die Sauerstoffaktivierung durch Ein-Elektronen-Reduktionen (Erythrozyten) oder physikalische Aktivierung (Retina) besonders ausgeprägt ist. Auf diese Weise kommt es zu Entzündungsreaktionen. Entzündungen des Lungengewebes können z. B. zu Asthma führen.
An der Schädigung von Zellkomponenten können alle Formen des aktivierten Sauerstoffs beteiligt sein. Sie leiten sich von molekularem Sauerstoff durch schrittweise Ein-Elektronen-Übergänge ab:
Die Notwendigkeit von Schutzmechanismen gegen aktivierte Sauerstoffspezies bei bestimmten pathologischen Situationen ist umfassend dokumentiert. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sollen insbesondere in ihrer Kombination einen optimalen Schutzmechanismus gegen aktivierte Sauerstoffspezies bilden.
Das angegriffene Gewebe besitzt einen gewissen Schutz gegenüber diesen aktivierten Sauerstoffspezies, der sich entweder in einer enzymatischen Umwandlung oder in einer nicht-enzymatischen Umsetzung zu weniger schädlichen Metaboliten zeigt. Die nicht-enzymatische Umsetzung wird durch eine Reihe kleinerer Moleküle bewirkt, die entweder als Scavenger chemisch mit den aktivierten Sauerstoffspezies reagieren, oder als Quencher die Anregungsenergie des Singulett-Sauerstoffes übernehmen. In diesem Zusammenhang sind alpha-Tocopherol, β-Carotin, Glutathion und Ascorbat zu nennen, die zum Teil kooperativ wirken (Asc-alpha-Tocopherol). Neben den primären antioxidativen Schutzmechanismen lassen sich als sekundäre Schutzmechanismen solche verstehen, die bereits gesetzte Schädigungen wieder beseitigen können. Gemäß der Erfindung soll eine Kombination von Scavengern bzw. Quenchern zur Verfügung gestellt werden, die wie die obengenannten Vitamine kooperativ wirken und als körpereigene Substanzen besonders verträglich sind, und über die Eliminierung aktivierter Sauerstoffspezies die dadurch erfolgende Schädigung der Gewebe in optimaler Weise verhindern. Auf diese Weise können manche Probleme vermieden werden, die bei der Applikation chemisch wirksamer, aber nicht-biologischer Substanzen auftreten können.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Zurverfügungstellung eines Arzneimittels körpereigener Substanzen zur Bekämpfung entzündlicher Erkrankungen, insbesondere zur topischen Anwendung von Entzündungserkrankungen der Atemwege, des Auges, der Ohren, der Nase und der Haut.
Die vorstehende Aufgabe wird gelöst durch eine Kombination von Anserin und/oder Carnosin zusammen mit Hypotaurin und/oder Taurin.
Mit Hilfe einer Kombination von Anserin und/oder Carnosin zusammen mit Hypotaurin und/oder Taurin können entzündliche Erkrankungen der Atemwege, des Auges, der Ohren, der Nase und der Haut prophylaktisch verhindert bzw. kuriert werden. Die erfindungsgemäße Kombination eignet sich darüber hinaus auch zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen im Genitalbereich, insbesondere in der Frauenheilkunde.
Allgemein ist die erfindungsgemäße Kombination geeignet, um entzündliche Erkrankungen der Schleimhäute zu behandeln. Dabei erfolgt die Behandlung vorwiegend topisch. Darüber hinaus ist es auch möglich, die erfindungsgemäße Kombination durch Inhalation anzuwenden.
Im weiteren ist es bevorzugt, der erfindungsgemäßen Kombination eine weitere, reduzierend wirkende Substanz zuzugeben, wie z. B. Ascorbinsäure.
Die Erfindung sieht eine Kombination der folgenden Substanzen vor, welche die nachfolgend angegebenen Strukturformeln aufweisen:
Erfindungsgemäß werden die vorstehend genannten Substanzen in folgenden Konzentrationsbereichen in wäßrigen bzw. wäßrig-alkoholischen Lösungen eingesetzt:
L-Anserin
0,1 bis 10 Gew.-%
L-Carnosin 0,1 bis 10 Gew.-%
Hypotaurin 0,01 bis 5 Gew.-%
Taurin 0,01 bis 5 Gew.-%
Als Verabreichungsformen eignen sich gemäß der Erfindung insbesondere: Spray, Aerosole, Lösungen, Tinkturen, Salben.
Den erfindungsgemäßen Arzneimitteln können folgende Hilfsstoffe zugesetzt werden:
Ascorbinsäure (bis zu 5 Gew.-%), Phosphat- oder Boratpuffer, Glycerin, usw.
Im folgenden werden einige Rezepturen der erfindungsgemäßen Arzneimittel aufgeführt:
Rezeptur A:
0,4 Gew.-% L-Anserin;
0,1 Gew.-% Hypotaurin.
Wäßrige Lösung zur topischen Applikation bei entzündlichen Augenerkrankungen.
Rezeptur B:
1 Gew. -% Carnosin;
0,2 Gew.-% Taurin.
Wäßrig-alkoholische Lösung zur Applikation bei Mittelohrentzündung u. a.
Rezeptur C:
0,2 Gew.-% Anserin
0,05 Gew.-% Taurin
0,01 Gew.-% Hypotaurin
Spray zur Applikation bei chronisch obstruktiver Bronchitis u.ä., besonders bei beginnendem Emphysem.
Die nachfolgenden Versuche zeigen, daß mit Hilfe der körpereigenen Substanzen Anserin/Carnosin einerseits sowie Hypotaurin/Taurin andererseits toxische Produkte der frühen und späten Phase von Entzündungsprozessen eliminiert bzw. in ihrer negativen Funktion auf die Atemwege, das Auge und die Haut so beeinflußt werden, daß Enzündungsprozesse vermieden oder, sofern sie sich bereits manifestiert haben, inhibiert werden. Insbesondere wird auch gezeigt, daß durch eine Kombination Anserin/Carnosin und Hypotaurin/Taurin ein optimaler Effekt der Wirkung gegenüber verschiedenen Sauerstoffspezies erzielt wird.
1. Schutzwirkung von Anserin, Carnosin, Hypotaurin und Taurin gegenüber dem Hydroxylradikal 1.1 Oxidierende Systeme
Um die antioxidative Wirkung der Testsubstanzen zu untersuchen wurden nachfolgend als oxidierende Systeme Fenton-Systeme eingesetzt. Das Radikal der Fenton-Systeme ist das Hydroxylradikal. Es wird dann geprüft, in welchem Masse die Fenton-Nachweissysteme in Anwesenheit von Testsubstanzen in ihrer oxidativen Wirkung beeinträchtigt werden.
Das Hydroxylradikal, welches u. a. bei Entzündungsprozessen gebildet wird, bewirkt eine starke Schädigung der Zielmoleküle, da es mit nahezu allen organischen Molekülen rasch reagieren kann.
In den nachfolgenden Versuchen werden die erfindungsgemäß verwendeten Substanzen sowie einige weitere Vergleichssubstanzen auf ihre Fähigkeit untersucht als Scavenger oder als Quencher zu wirken. Allen erfindungsgemäß eingesetzten Substanzen gemeinsam ist, daß sie im menschlichen Körper natürlich vorkommen. Durch Verwendung dieser Substanzen können Probleme vermieden werden, die sich sonst bei der Applikation nicht-biologischer Substanzen ergeben können. Die folgenden Versuche bestimmen die Aktivität der genannten Substanzen in vitro im Hinblick auf eine Anwendung als Medikament.
Unter "Scavenger" werden hier nicht nur Testsubstanzen verstanden, die aktivierte Sauerstoffspezies abfangen und zu weniger schädlichen Produkten umwandeln, sondern auch Substanzen, die mit reaktiven Oxidationsprodukten aus der Lipidperoxidation reagieren. Es handelte sich hierbei um antioxidative Wirkungen auf zwei verschiedenen Ebenen: Reagieren die Substanzen mit aktivierten Sauerstoffspezies, so verhindern sie eine Schädigung von Zellkomponenten und zählen daher zum Verteidigungsstoffwechsel. Reagieren sie jedoch mit reaktiven Carbonylverbindungen aus der Lipidperoxidation, so verhindern sie, daß eine bereits gesetzte Schädigung noch schlimmere Konsequenzen nach sich zieht; diese Substanzen zählen daher zum Entgiftungsstoffwechsel.
Experimentell wird das Hydroxylradikal in einer Fenton-Reaktion mittels Fe2+-Katalyse erzeugt (Fenton(II)-System):
Fe2+ · EDTA + H₂O₂ → Fe3+ · EDTA + OH˙ + OH⁻
H₂O₂ wird in zehnfacher Konzentration in bezug auf die Eisenionen eingesetzt. Bei der Bewertung der Ergebnisse ist zu beachten, das neben dem Hydroxylradikal auch andere aktivierte Sauerstoffspezies -entstehen können, wie z. B. das Superoxidanionradikal O₂˙ -.
Alternativ hierzu wird Fe3+ mit Ascorbat als Reduktionsmittel verwendet (Fenton(III)-System):
Fe3+ · EDTA + Ascorbat → Fe2+ · EDTA + Ascorbyl˙ + H⁺
Fe² · EDTA + H₂O₂ → Fe3+ · EDTA + OH˙ + OH⁻
Diese Variante hat den Vorteil, daß sie den physiologischen Gegebenheiten im Organismus entspricht, da das aufgenommene Fe2+ schnell zum Fe3+ oxidiert.
FeCl₃ und Ascorbat werden im Ansatz äquimolar verwendet. EDTA wird leicht im Überschuß (104 : 100) zugegeben. Hierdurch wird trotz der in Spuren in allen Reagenzien vorhandenen Eisenionen ein 1 : 1-Verhältnis zwischen Eisen und EDTA erreicht.
1.2 Nachweissysteme 1.2. 1 Desoxyribose-Test
Dieses Testsystem dient speziell zum Nachweis der antioxidativen Wirkung einer Substanz gegenüber dem Hydroxylradikal, welches mittels eines Fenton-Systems erzeugt wird. OH˙ setzt aus Desoxyribose Derivate frei, die unter dem Einfluß von Hitze, Säure und Thiobarbitursäure zu Malondialdehyd fragmentieren. Dieses kann durch die Farbreaktion mit Thiobarbitursäure bei lamda = 532 nm fotometrisch erfaßt werden (DBA-Test). Die untersuchten Testsubstanzen treten in diesem Testsystem in Konkurrenz zur Desoxyribose. Sind sie reaktiver als Desoxyribose, so zeigt sich dies in einer geringeren Extinktion in der Farbreaktion. Der Test wird in zwei Schritten nach folgendem Schema in verschließbaren Pyrex-Gläsern durchgeführt (Konzentrationsangaben beziehen sich auf die Stammlösungen):
Durch Bestimmung von Konzentrationsreihen der Testsubstanzen ist es möglich, die Geschwindigkeitskonstanten der Reaktion der Testsubstanz mit dem OH˙-Radikal zu bestimmen.
Für die einzelnen Testverbindungen wurden folgende Konzentrationen im Ansatz verwendet:
Anserin
0,625 mM bis 2,5 mM
Carnosin 1,25 mM bis 5,0 mM
Hypotraurin 1,25 mM bis 5,0 mM
Taurin 1,25 mM bis 5,0 mM
Als weitere Testsubstanzen wurden zum Vergleich die Aminosäuren bzw. Aminosäure-Derivate Histidin, Histamin, Carnitin, und Homocarnosin unter äquivalenten Bedingungen untersucht.
Aus den erhaltenen Kurven wurden die jeweiligen Reaktionskonstanten ermittelt. Die folgende Tabelle 1 gibt einen Vergleich der Reaktionskonstanten der Testsubstanzen wieder:
Tabelle 1
Die in Tabelle 1 aufgeführten Werte zeigen, daß insbesondere für Anserin, Carnosin und Hypotaurin hohe Reaktionskonstanten im Fenton(II)- und Fenton(III)-System erhalten werden.
Es ist bekannt, daß die besten aus der Literatur bekannten OH˙-Scavenger die folgenden Verbindungen darstellen:
Tabelle 2
Wie die vorstehende Tabelle 2 zeigt, besitzen Anserin, Carnosin und Hypotaurin vergleichbare Reaktionskonstanten. Die Reaktivität von Anserin wird lediglich durch die von Imidazol übertroffen.
1.2.2 Linolensäure-Test
Mit diesem Test kann die Reaktivität der Testsubstanzen mit Alkyl-, Alkoxyl- oder Peroxylradikalen, die aus der Lipidperoxidation stammen, ermittelt werden. Als Modellsubstanz wird alpha-Linolensäure verwendet, da diese bei der Peroxidation die größte Menge an Lipidradikalen und auch Carbonylverbindungen im Vergleich zu den anderen C-18-Fettsäuren, i.e. Ölsäure und Linolsäure, freisetzt. Die Lipidperoxidation wird durch ein Fenton(II)-System ausgelöst, wobei Eisen(II)-Sulfat und H₂O₂ ohne EDTA eingesetzt werden. Die durch die Oxidation des Fe2+-Ions entstehenden Hydroxylradikale sind in der Lage, die radikalische Kettenreaktion zu starten, währen überschüssige Fe2+-Ionen die Fragmentierung der entstehenden Hydroperoxide auslösen. Als Endprodukte treten reaktive Aldehyde, u. a. auch Malondialdehyd auf, die mit Thiobarbitursäure in dem vorstehend beschriebenen Farbtest quantifiziert werden können. In diesem Farbtest werden nur die bereits vorhandenen Aldehyde erfaßt, da die möglicherweise ebenfalls vorliegenden Hydroperoxide unter den Bedingungen des Verfahrens nicht fragmentieren. Die Testsubstanzen werden jeweils nach der Lipidperoxidations-Reaktion zugesetzt. Der Test wird in drei Schritten nach dem folgenden Schema in verschließbaren Pyrex-Gläsern durchgeführt (Konzentrationsangaben beziehen sich auf die Stammlösungen):
1.2.2.1 Reaktion zwischen den Testsubstanzen und reaktiven Aldehyden aus Linolensäure
Mittels eines Fenton-Systems aus Fe2+ (1 mM) und H₂O₂ (5 mM) wurden aus Linolensäure reaktive Aldehyde erzeugt. Zu diesen wurden die Testsubstanzen in jeweils 3,33 mM Konzentration im Ansatz gegeben. In der nachfolgenden Tabelle 3 wird das Ausmaß der Reaktion der Testsubstanzen mit reaktiven Aldehyden als Extinktionswert wiedergegeben.
Tabelle 3
Reaktion der Testsubstanzen mit reaktiven Aldehyden (n=8)
Wie sich aus der vorstehenden Tabelle 3 ergibt, zeigen Anserin, Carnosin und Hypotaurin statistisch signifikante Abweichungen von der Nullprobe. Diese Substanzen sind in der Lage, die Menge der freien Aldehyde zu verringern.
2. KMB-Spaltung
Das aktive Zentrum der Cu-Zn-Superoxiddismutase besteht aus einem Histidin-Rest, der ein Cu-Ion an einem Ringstickstoff trägt. Dieses Cu-Ion zeigt einen Redoxwechsel bei der Reaktion mit Superoxid:
Es wurde untersucht, inwieweit Übergangsmetallkomplexe der Testsubstanzen mit Superoxid reagieren können.
Superoxidanionradikale wurden durch das Riboflavin/Licht-System erzeugt. Als Superoxidnachweis dient die Spaltung von KMB (Keto-S-methylbuttersäure), deren Produkt Ethen gaschromatographisch quantifiziert wurde.
Im folgenden wurde die Reaktion von Carnosin-Kupfer(II)-Komplexen mit Superoxid bestimmt. Hierzu wurden Kupfer(II)-Sulfat und Carnosin in 1 mM und 0,1 mM Konzentration eingesetzt. Zur Kontrolle wurde Superoxiddismutase in einer Aktivität von 500 E/ml zu einem Ansatz mit Kupfer-Carnosin 1 mM zugegeben. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.
Tabelle 4
Während Carnosin oder Kupfer(II) in den verwendeten Konzentrationen nur einen geringen Einfluß auf die Ethenfreisetzung zeigen, kann die Kombination in der Konzentration von 1 mM die Ethenfreisetzung auf etwa 40% senken. Superoxiddismutase zeigt keinen zusätzlichen Effekt.
3. t-BuOOH/KMB-Spaltung
KMB (Keto-S-methylbuttersäure) zerfällt bei Reaktion mit ¹O₂, O₂˙- oder OH˙. Es entsteht dabei Ethen, das sich gaschromatographisch nachweisen läßt. Inkubiert man tertiäres Butylhydroperoxid (t-BuOOH) bei 37°C, so bildet sich in geringen Mengen OH˙, welches zu einer KMB-Spaltung führt. Somit ist dieses Nachweissystem geeignet, das Ausmaß der antioxidativen Wirkung der Testsubstanzenbestimmen.
Für den jeweiligen Testansatz wurden zusammengestellt:
Phosphatpuffer, pH 7,4 : 100 mM
H₂O₂ dest.: ad 1 ml
Testsubstanz: Konzentrationsreihe
KMB: 3 mM
BuOOH: 3 mM (Start)
Testbedingungen: 30 Minuten, dunkel, 37°C, gasdicht verschlossene, volumengeeichte (ca. 6 ml) Reagenzgläser.
Grundrate: 800 ± 55 pmol Ethen.
Die Ergebnisse der Reaktionsrate in % in Abhängigkeit von der Konzentration an L-Anserin und L-Carnosin sowie von L-Homocarnosin sind in Fig. 1 schematisch dargestellt.
Wie sich aus Fig. 1 ergibt, stellen die Histidin-Derivate Carnosin, Anserin und Homocarnosin gute Radikalfänger dar. Die KMB-Spaltung durch t-BuOOH wird ab einer Konzentration von 10-5 M des Antioxidans jeweils gehemmt.
4. Rose Bengal/Licht/KMB-Spaltung
Rose Bengal reagiert im Licht unter Bildung von Singulett-Sauerstoff (¹O₂), der über die KMB-Spaltung gemessen werden kann.
Für den Testansatz wurden jeweils zusammengestellt:
Phosphatpuffer, pH 7,4 : 100 mM
H₂O dest: ad. 1 ml
Testsubstanz: Konzentrationsreihe
KMB: 3 mM
Rose Bengal: 1 µM (Start)
Testbedingungen: 10 Minuten, 37°C, Licht (30 klux), gasdicht verschlossene, volumengeeichte Reagenzgläser (ca. 12 ml).
Grundrate: 1672 ± 56 pmol Ethen.
In Fig. 2 sind die ermittelten Werte für Hypotaurin und Taurin, in Fig. 3 die Werte für L-Carnosin, L-Homocarnosin, sowie in Fig. 4 für L-Anserin schematisch wiedergegeben.
Wie sich aus den Fig. 2 bis 4 ergibt, werden für sämtliche Testsubstanzen, mit Ausnahme von Taurin, ab einer Konzentration von 10-4 M stark ansteigende Reaktionsraten erhalten. Dies ist ein Beweis dafür, daß über das lichtaktivierte Rose Bengal aktivierte Spezies aus Anserin usw. entstehen.
5. Hypochlorit/Luminol
Auch Hypochlorit (OCl⁻) ist eine reaktiv Spezies. OCl⁻ kann über die Chemilumineszenz bei der Reaktion mit Luminol nachgewiesen werden.
Der jeweilige Testansatz setzt sich wie folgt zusammen:
Phosphatpuffer, pH 7,4 : 100 mM
H₂O dest: ad 1 ml
Testsubstanz: Konzentrationsreihe
(H₂O₂: 0, 1 µM)
Luminol: 0,1 µM (kurz vor Start)
OCl⁻: 0,15 mM (Start)
Die Chemilumineszenz wurde integrierend über 10 Sek. bestimmt.
Grundrate mit H₂O₂: 21956 ± 1298 counts/10 Sek.
ohne H₂O₂: 2950 ± 186 counts/10 Sek.
In Fig. 5 bis 7 sind die Reaktionsraten für Hypotaurin, Taurin, Carnosin, Anserin sowie weiterer Testsubstanzen schematisch wiedergegeben.
Fig. 5 zeigt, daß Taurin und Hypotaurin ab einer Konzentration von 10-5M OCl bedingte Lichtemission hemmt. Ab 10-4 M tritt für Hypotaurin eine vollständige Hemmung auf. Das gleiche gilt für Taurin ab einer Konzentration von 10-3.
Fig. 6 ist zu entnehmen, daß Carnosin, Homocarnosin in 1 mM Konzentrationen nahezu vollständig die Chemilumineszenz des OCl⁻/Luminol-Systems hemmen.
Fig. 7 bis 9 zeigen den Kurvenverlauf in Gegenwart von 0.1 µM H₂O₂.
Die Reaktionen 5 bis 9 zeigen klar, daß die vergeschlagenen Substanzen sowohl mit freien Radikalen (L˙, LO˙, LOO˙, OH˙) als auch mit lichtaktivierten Pigmenten (RB*) oder mit dem reaktivierten Hypochlorit (OCl⁻) als Hauptprodukt aktivierter Leukozyten (wirkt stark proteinschädigend!, z. B. zerstört es alpha-l-Antitrypsin) reagieren und auf entsprechende Indikatorreaktionen ansprechen.
6. Hämin/Chemilumineszenz-Messung
Alle Sauerstoffradikale erzeugen eine gewisse Chemilumineszenz, die allerdings oft sehr schwach ist. Um diese Chemilumineszenz besser nachweisen zu können, wird oft ein Sensitizer zur Erhöhung der Lichtquanten-Ausbeute zugesetzt. Als ein solcher Sensitizer eignet sich Luminol. Luminol ist ein zyklisches Hydrazid, welches durch H₂O₂ zum Diazochinon oxidiert werden kann. Dieses Diazochinon wird durch den nukleophilen Angriff eines Wasserstoffoxidanions weiter umgewandelt zum alpha-Hydroxy-hydroperoxid (LHOOH), welches unter Emission von Licht schnell zum Aminophthalat zerfällt.
Die Chemilumineszenz-Reaktion wurde in Gegenwart von Hämin durchgeführt. Ein Reaktionsansatz umfaßte folgende Komponenten:
0,5 ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 7,4
1,0 ml H₂O dest.
0,1 ml 5 µM Hämin (10 mM an NaOH)
0,1 ml 0,1 µM Luminol
0,1 ml Testsubstanz verschiedener Konzentration
0,1 ml 0,1 mM H₂O₂ (via Dispenser)
Meßzeit 60 Sekunden; Spektralbereich 375 bis 620 nm.
Fig. 10 gibt die Chemilumineszenz-Messung für Taurin und Hypotaurin in Abhängigkeit von der Konzentration wieder, wobei sich für Hypotaurin eine deutliche, konzentrationsabhängige Hemmung des Chemilumineszenz-Signals zeigt. Dieses Ergebnis bedeutet, daß Hypotaurin in der Lage ist, aktiviertes Hämin ("Compound I"-Typ Oxidans) abzufangen bzw. ihre Bildung zu verhindern. Taurin zeigt dagegen nur keinen Einfluß auf die Luminol-Reaktion mit Hämin und H₂O₂.
7. Hyaluronsäure-Abbau an der FPLC
Hyaluronsäure, ein unverzweigtes Polysaccharid aus N-Acetylglucosamin und Glucuronsäure, ist ein wichtiger Bestandteil der Grundsubstanz des Bindegewebes. Hyaluronsäure kommt u. a. in der Synovialflüssigkeit, im Glaskörper des Auges und in der Haut vor. Ebenso wie andere Polysaccharide wird auch Hyaluronsäure durch oxidativen Angriff geschädigt (Arthritis, Arthrosen).
In dem folgenden Testsystem wird untersucht, ob die Depolymerisation der Hyaluronsäure durch NaOCl mit Hilfe der hier in Frage kommenden Testsubstanzen vermindert bzw. sogar ganz verhindert werden kann.
Die Messung wurde mit Hilfe der FPLC-Technik (= fast protein liquid chromatography) durchgeführt. Die PFLC ist eine der HPLC verwandten Technik zur schnellen Reinigung von Proteinen. Moleküle, die von der Säule eluiert werden, werden bei einer bestimmten Wellenlänge, die an die jeweiligen Versuchsbedingungen angepaßt werden kann, nachgewiesen; das Signal wird in elektrische Spannung umgesetzt und vom Schreiber aufgezeichnet.
Der Reaktionsansatz umfaßte folgende Komponenten:
0,2 ml 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,4
0,1 ml H₂O dest.
0,5 ml 1,0 mM Hyaluronsäure
0,1 ml ± 1,0 mM ±NaOCl
0,1 ml 0,1 mM bzw. 1,0 mM Testsubstanz
Inkubation: 15 Min. bei 37°C im Dunkeln
Auftragsvolumen auf die Säule: 0,5 ml (d. h. 0,5 mg Hyaluronsäure)
Säulenlaufmittel: Phosphat-Puffer (entgast), pH 6,85; 50 mM
Flußrate: 0,8 ml/min
Detektion bei 230 nm
Laufzeit 25 Min.
In Fig. 11 ist die Schutzwirkung einer Reihe von Testsubstanzen in bezug auf den oxidativen Abbau der Hyaluronsäure durch NaOCl dargestellt. Aus Fig. 11 ist zu ersehen, daß sämtliche der erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen, nämlich Hypotaurin, Carnosin, Anserin, aber auch Taurin in einer Konzentration von 1 mM in der Lage sind, Hyaluronsäure sehr wirkungsvoll vor dem Abbau durch NaOCl zu schützen. Auch bei Konzentrationen von 0,1 mM im Ansatz ist noch eine Schutzwirkung zu erkennen.
Außerdem wurde geprüft, ob die Substanzen Anserin und Hypotaurin bei gleichzeitiger Anwesenheit im Schädigungsansatz eventuell eine synergistische Schutzwirkung zeigen. Anserin (0,1 mM i.A.) schützt Hyaluronsäure zu 31,3% (± 1,7%), Hypotaurin (0,1 mM i.A.) zu 37,0% (± 1,8%). Dagegen wurde durch die Kombination Anserin + Hypotaurin (je 0,05 mM i.A., d. h. die Gesamtkonzentration an Testsubstanz war 0,1 mM i.A.) eine erhöhte Schutzwirkung der Hyaluronsäure von 46,1% (-2,4%) erzielt. Dies bedeutet, daß die Kombination von Anserin und Hypotaurin eine erhöhte Schutzwirkung im Vergleich zu den Einzelsubstanzen bewirkt.
8. Oxidative Schädigung von Liposomen
Veränderungen im Membranaufbau von Zellen sowie Zellorganellen können zu starken Störungen von Membranprozessen bis hin zum Zelltod führen. Als vereinfachtes Modell für Zellmembranen werden häufig Liposomen verwendet. Dabei handelt es sich um Phospholipid-Vesikeln mit einer Phospholipid-Doppelschicht, welche ein wäßriges Kompartiment einschließen. Es wird angenommen, daß mit diesem System bestimmte Situationen, die an der Zelloberfläche auftreten, nachgeahmt werden können.
Erfindungsgemäß wurde für die Liposomenherstellung Phosphatidylcholin (= Lecithin) aus Soja verwendet. Die Herstellung erfolgte nach einer von R. Volpert entwickelten Methode, welche nach J. Merlin (Eur. J. Cancer, 27 (8), 1026-1030 (1991)) abgewandelt wurde.
Ziel der nachfolgend beschriebenen Versuche war es, die so hergestellten Liposomen oxidativ zu schädigen und den schützenden Einfluß der Testsubstanzen auf das Ausmaß der oxidativen Schädigung festzustellen. Es ist bekannt, daß Liposomen relativ unempfindlich gegenüber oxidativen Angriffen sind und nur in dem System Fe2+ (1 mM)/EDTA (1 mM)/Ascorbat (2 mM)/H₂O₂ (10 mM) nach 60 Minuten eine deutliche Schädigung erkennbar ist.
Für die Versuchsdurchführung umfaßt ein Reaktionsansatz folgende Komponenten:
0,3 ml 45,0 mM Phosphat-Puffer (0,15 m), pH 7,4 (0,15 M an NaCl)
0,1 ml H₂O dest.
0,2 ml gelfiltrierte Liposomensuspension
0,1 ml 1,0 mM EDTA
0,1 ml 1,0 mM Fe2+
0,1 ml 2,0 mM Ascorbat
0,1 ml 10,0 mM H₂O₂
0,1 ml 1,0 mM Testsubstanz
Inkubation: 60 Minuten bei 37°C im Dunkeln in volumengeeichten, gasdicht verschlossenen Gläsern.
Die Proben wurden dann mittels dreier Meßverfahren auf das Ausmaß der oxidativen Schädigung untersucht:
  • a) Messung der Ethanfreisetzung mit Hilfe des Gaschromatographen
  • b) photometrische Messung der Extinktionsänderung bei 585 nm
  • c) Messung der Fettsäurezusammensetzung mit Hilfe des Fettsäuregaschromatographen
Zu a): Das Ausmaß der oxidativen Schädigung von Liposomen wurde zunächst mittels einer Messung der Gaszusammensetzung im Reaktionsgefäß (nach 60 Minuten Inkubation) mit Hilfe des Gaschromatographen bestimmt. Bei dieser Messung geht man davon aus, daß infolge von oxidativen Angriffen auf die in der Liposomenmembran in großen Mengen vorhandenen Fettsäuren Linol- und Linolensäure aus diesen vor allem Ethan und in geringen Mengen auch Ethen freigesetzt wird.
Es wurden folgende area-Werte gemessen (Mittelwerte aus je vier Versuchsansätzen für Ethan; die Ethenwerte waren bei allen Proben nahezu unverändert):
(Konzentration der Testsubstanzen i.A. je 1,0 mM)
Tabelle 5
Wie die vorstehenden Werte zeigen, zeichnet sich insbesondere Hypotaurin durch eine Schutzwirkung aus. Eine solche kann auch für Carnosin angenommen werden.
Zu b): Für diese Bestimmung wurden die Proben auf mit Puffer equilibrierte NAP-10-Säulen aufgetragen und diese mit 1,5 ml Puffer eluiert und die Eluate anschließend im Photometer bei 585 vermessen. Außerdem wurde der Liposomenpräparation noch Trypanblau zugegeben.
Die Differenz der Extinktion von ungeschädigten und durch Fe2+ (1 mM)/EDTA (1 mM)/Ascorbat (2 mM)/H₂O₂ (10 mM) oxidativ geschädigten Liposomen wurde als 100% Schädigung definiert. In Gegenwart der Testsubstanzen ergaben sich für das Ausmaß der Verhinderung dieser Schädigung folgende Werte:
Tabelle 6
Wie die vorstehenden Werte zeigen, ist insbesondere mit Hilfe von Anserin und Carnosin eine Verhinderung des Ausmaßes der oxidatdiven Schädigung festzustellen.
Zu c): Für diese Messungen wurden 0,5 ml Proben in flüssigem Stickstoff eingefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Am nächsten Tag erfolgte die Methylierung der Fettsäuren durch Zugabe von 0,3 ml Bortrifluorid-Methanol und anschließende Inkubation von 30 Minuten bei 80°C. Nach dem Abkühlen der Proben wurden die 1 ml dest. H₂O zugegeben und dreimal mit je 1 ml Ether ausgeschüttelt. Die Etherfraktionen wurden gesammelt und zweimal mit je 1 ml dest. H₂O gewaschen. Der Ether wurde dann mit N₂ ausgetrieben und die Proben über Nacht eingefroren. Am folgenden Tag erfolgte die Messung am Fettsäuregaschromatographen, wobei jede Probe in 50 µl Chloroform aufgenommen und von dieser Lösung 1 µl in den Chromatographen eingespritzt wurde.
Im folgenden sind die Mittelwerte der verschiedenen Reaktionsansätze aufgeführt:
(Konzentration der Testsubstanzen jeweils 1,0 ml i.A.)
Tabelle 7
Die vorstehenden Werte zeigen, daß insbesondere bei Anserin eine Schutzwirkung auf das oxidativ geschädigte System festzustellen ist. Dabei muß berücksichtigt werden, daß die oxidative Schädigung der Liposomen in zwei Schritten verläuft, nämlich
  • 1. die Bildung von Fettsäureperoxiden, z. B. durch Einwirkung von H₂O₂, und
  • 2. die Freisetzung von z. B. Ethan aus den Fettsäureperoxiden durch Metallkatalyse.
Mit Hilfe des Fettsäuregaschromatographen werden jedoch nur ungeschädigte Fettsäuren erfaßt. Somit ist es möglich, daß mit Hilfe der vorstehenden Meßmethode eine antioxidative Wirkung einer Substanz nicht erkannt wird, sofern diese Substanz die Peroxidbildung nicht verhindert, den Zerfall der Peroxide aber hemmen kann. Aus diesem Grunde ist die alleinige Analyse hinsichtlich des Ausmaßes der oxidativen Schädigung von Liposomen mit Hilfe des Fettsäuregaschromatographen nicht ausreichend.
9. Hämolyse-Test
Die Hämolyse kann als Störung oder Zerstörung der Erythrozyten-Membran bezeichnet werden, wobei es zur Freisetzung von Hämoglobin kommt. Das Ausmaß dieser Hämolyse kann durch Messung der Extinktion bei 540 nm (alpha-Bande von Hb) bestimmt werden. Je höher der gemessene Extinktionswert, desto mehr Hämoglobin wurde infolge von Hämolyse freigesetzt. Der Hämolyse-Test stellt somit ein gutes System dar, um die oxidative Zerstörung bzw. das Ausmaß von Testsubstanzen zur Verhinderung derselben zu bestimmen.
Für die Bestimmung des Einflusses von Hypotaurin, Taurin, Anserin und Carnosin auf die Hämolyse wurden jeweils die folgenden Versuchsansätze zusammengestellt:
Ansatz A
Ansatz B
Für die Hämolyse in Gegenwart von Fe2+ (nach Ansatz A) sind für die Verbindungen Hypotaurin, Taurin, Anserin und Carnosin die in Abhängigkeit von der Konzentration erhaltenen Werte in Fig. 12 wiedergegeben. Wie aus Fig. 12 hervorgeht, weisen die genannten Testsubstanzen eine antioxidative Wirkung auf, die mit steigender Konzentration zunimmt.
Bei Durchführung der Versuche in Gegenwart von Kupfer-Ionen gemäß Ansatz B wurden die in Fig. 13 wiedergegebenen Werte erhalten. Auch Fig. 13 ergibt für sämtliche Testsubstanzen in Abhängigkeit von der Konzentration steigende Werte, was auf einen antioxidativen Schutz dieser Substanzen beim Hämolysetest schließen läßt.
Wie die vorstehenden in vitro Untersuchungen zeigen, können bei den verschiedenen Nachweissystemen, denen jeweils unterschiedliche aktivierte Sauerstoffspezies etc. zugrundeliegen, mit Hilfe der körpereigenen Substanzen Anserin, Carnosin, Hypotaurin und Taurin ausgezeichnete Ergebnisse im Hinblick auf eine Eliminierung dieser Sauerstoffspezies in vitro erzielt werden. Da davon auszugehen ist, daß den Verbindungsgruppen Anserin/Carnosin und Hypotaurin/Taurin möglicherweise ein unterschiedlicher Wirkmechanismus zugrundezulegen ist, ist davon auszugehen, daß mit einer Kombination von jeweils mindestens einer dieser Verbindungen ein optimaler Effekt erzielt wird.
Die Erfindung soll daher die Verbindungen Anserin, Carnosin, Hypotaurin und Taurin zur Applikation bei der Bekämpfung entzündlicher Erkrankungen der genannten Art in bestimmten Kombinationen dieser Verbindungen umfassen.

Claims (3)

1. Verwendung einer Kombination von Anserin und/oder Carnosin, zusammen mit Hypotaurin und/oder Taurin zur Bekämpfung entzündlicher Erkrankungen.
2. Verwendung der Kombination nach Anspruch 1 in einer topischen oder inkulativen Verabreichungsform.
3. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Kombination als weitere Substanz Ascorbinsäure zugegeben wird.
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