KR20010025040A - 관절질환 치료제 및 히알루론산의 결합체 - Google Patents

관절질환 치료제 및 히알루론산의 결합체 Download PDF

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나가야마 오사무
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Abstract

히알루론산, 히알루론산 유도체 또는 이들 염의 결합된 관절질환 치료제이고, 치료제는 관절강내에 보유시킬 수 있다. 즉, 히알루론산, 히알루론산 유도체 또는 이들 염에 결합된 하나 이상의 관절질환 치료제; 관절질환 치료제 (예컨대, 매트릭스프로테아제 억제제) 중의 약효에 영향을 주지 않는 부위와, 히알루론산, 히알루론산 유도체 또는 이들 염의 카르복실기, 히드록실기 또는 환원말단의 관능기를, 직접 화학반응에 의해 또는 스페이서를 통하여 결합시키는 것을 포함하는, 상기 결합체의 제조방법; 및 상기 결합체를 포함하는 약물이 제공된다.

Description

관절질환 치료제 및 히알루론산의 결합체{REMEDIES FOR JOINT DISEASES BOUND TO HYALURONIC ACID}
관절연골은 약 70% 의 수분과, 연골세포 및 연골 매트릭스로 구성되어 있다. 연골 매트릭스를 구성하는 주성분은 콜라겐과 프로테오글리칸으로, 양호한 수분보유능을 갖는 프로테오글리칸은 그물망구조를 갖는 콜라겐의 네트워크에 함유되어 있다. 연골매트릭스는 점탄성이 풍부하고, 연골에 관련되는 자극이나 부하를 경감시켜, 관절연골이 정상인 형태와 기능을 유지하는데 중요한 역할을 하고 있다.
변형성관절증 (이하, OA 라고도 함) 과 만성관절류머티즘 (이하, RA 라고도 함) 은, 모두 연골 매트릭스의 파괴를 수반하는 대표적인 질환이다. 이러한 질환에 있어서의 매트릭스의 파괴는, OA 에서는 년령증가에 따른 기계적인 스트레스, RA 에서는 활막표층세포의 과잉증식, 판누스 형성, 염증성세포의 침윤 등이 원인이 되며, 이러한 현상은 프로테아제의 유도를 통하여 야기되는 것으로 생각되고 있다. 관절연골의 분해는 중성의 pH 를 갖는 세포외 영역에서 진행되기 때문에, 최적의 pH가 중성의 범위에 있는 매트릭스 메탈로프로테아제 (이하, 일반명으로 사용되는 경우, "MMP" 또는 "MMPs"로 언급) 가 분해의 중심적인 역할을 하는 것으로 말해지고 있다.
현재까지, 인체에 대해, MMP 패밀리에 속하는 16 종류의 프로테아제가 보고되어 있고, 상기 프로테아제에 결합하여 그들의 활성을 억제하는 4종류의 생체내 단백질이 발견되었고, 조직 메타로프로테아제 억제제 (이하, TIMP 라고도 함. 총칭으로 사용할 때에는, TIMPs 라고도 함) 라고 명명되었다. MMPs 는 생리적 조건에서 발생, 혈관신생, 성주기, 뼈 리모델링 및 조직수복 등 여러가지의 기능을 맡고 있다. 이들의 기능이 적절하게 발현되도록, MMPs 의 생산, 활성화 및 기질과의 상호작용의 각 단계는 TIMPs 및 기타 생체내 프로테아제 억제제에 의해 엄격하게 조절되고 있다. 다시 말하면, 질환이 있는 조건에서 매트릭스의 파괴는, MMPs 의 조절 메카니즘에 어떠한 오류가 발생하여, MMPs 의 과도한 생산 및 활성화를 초래하는 것으로 생각되고 있다.
따라서, MMPs 를 억제하는 약물은, OA 나 RA 등의 관절 질환에 있어서의 연골 매트릭스의 파괴를 억제하는 약물로서 매우 유망하다. MMPs 를 억제하는 약물이 지금까지도 많이 보고되어 있으나, 그 중, 히드록삼산이 MMPs에 대한 강한 억제 활성 및 높은 특이성으로인해 가장 주목되고 있다. 이미 경구투여에서도 MMP 억제작용을 발휘하는 히드록삼산이 발견되었고, 그들중 일부는 이미 암환자 및 관절염 환자를 대상으로 임상실험이 개시되고 있다.
그러나, 이러하 종류의 MMP 억제제는 다소 모든 MMPs 에 대한 억제작용을 나타내고, 심지어 생리적인 작용의 역할을 하는 MMPs 도 억제한다는 중대한 결점이 있다. 사실, 암환자를 대해 진행중인 히드록삼산의 임상시험에서는, 일시적 골근육통 및 건염 등의 부작용이 보고되어 있다. 최근에는, 특정의 MMPs 에 대해 특이성을 높인 개선된 제품의 개발도 진행되고 있지만, 아직 질환 상태만 관여하는 MMPs 는 발견되고 있지 않다. 또한, 계속해서 신규인 MMPs 가 발견되고 있지만, MMPs 의 전신 투여시 MMPs 의 생리작용 중 일부를 억제해 버릴 가능성이 여전히 남는다.
상기 문제점을 해소하는 효과적인 방법으로서, 첫번째로, 히드록삼산의 관절강내로의 국소투여를 생각할 수 있다. 그러나, 히드록삼산의 국소농도를 유지하기 위해서는, 빈번한 회수의 투여가 필요하게 되며, 장기 투여를 요하는 OA 나 RA 의 환자에게는 상기 빈번한 투여가 매우 곤란하다. 이와는 다른 방법으로서, 히드록삼산을 표적부위에만 한정적으로 국재시키는, 소위 약물 전달 시스템의 사용을 생각할 수 있다. 그러나, 종래기술에서는 투여된 히드록삼산을 나환관절내에 한정적으로 국재 또는 유지시키는 방법은 확립되어 있지 않다.
이와 같이, 히드록삼산은 우수한 약리작용을 갖지만, OA 나 RA 와 같은 만성질환의 치료약으로서 임상응용하기 위해서는, 여전히 해결해야하는 문제점이 존재한다.
또한, 현재, 관절질환, 특히 OA 나 어깨 관절주위염에 있어서는, 히알루론산 (이하, "HA" 라고도 함) 및 그 가교물 (이하, 히알루론산과 그 가교물을 총칭하여 "HA 제제" 라고도 함) 의 관절내 주입요법이 임상적으로 널리 적용되고 있다.
히알루론산 (HA) 은, N-아세틸글리코사민 및 글루코론산과의 반복단위로 구성되는 생체내 다당류로, 관절액을 구성하는 주성분으로서 관절액의 점탄성, 하중흡수작용 및 윤활작용의 유지에 중요한 역할을 하고 있다. 또한, HA 는, 연골매트릭스에서 연골프로테오글리칸과 결합하여, 아글리칸이라 불리는 중합체를 형성하고, 연골기질의 수분보유능과 점탄성을 유지하는 중심적인 역할을 맡고 있다.
일반적으로, HA 제제는, MMPs 를 억제하는 작용은 없지만, 윤활제로서, 또한 관절에서의 HA 생산을 촉진하는 것 등에 의해, 관절기능의 장해를 완화하는 작용을 갖는 것으로 말해지고 있다. HA 는 원래, 세포외 매트릭스의 구성성분이므로, 세포외 매트릭스에 높은 친화성을 갖고, 또 그 자체로 높은 점탄성을 가지며, 따라서 관절강 내에 주입된 후, 관절강 내에 장시간 국재하는 특징을 갖는다. 실제,14C 표식 HA 를 사용한 실험에서, 토끼 무릎 관절강 내에 투여된14C 표식 HA 는, 관절액, 활막조직, 관절연골의 표층 등에 분포되고, 이들의 조직으로부터 소실되는데에 3 일간 이상 필요하다는 것이 보고되어 있다. 또한, HA 는 관절액중에서는 분해되지 않고, 활막조직이나 관절연골에서는 일부가 분해되며, 대부분은 서서히 활막을 통하여 혈중으로 이행하여, 간에서 저급 분자 기질로 분해되는 것으로 말해진다.
따라서, HA 에 결합된 약물을 생체내에 투여하면, 그 약물은 HA 와 함께 특정 부위에 장시간 보유되고, 약물을 단독으로 투여한 경우에 비하여, 특정부위에서의 약물의 작용시간은 눈에띠게 연장되는 것이 기대된다. 또한, 이러한 효과에 의해, 약물의 투여량 및 투여회수는 종래의 투여방법에 비하여 현저하게 감소될 수 있어, 결과적으로 부작용을 상당히 경감시킬 수 있게 되는 것이 기대된다.
HA-약물 결합체로서, 지금까지, 일본공개특허공보 평 5-85942 호에 기재된 인터페론/히알루론산 결합체, WO92/06714 호 기재의 히알루론산/항암제 결합체, 일본공개특허공보 소 62-64802 호(1987) 기재의 히알루론산/코르티코스테로이드 결합체, 및 특허 제 2701865 호 기재의 히알루론산/항생물질 결합체 등이 알려져 있다.
그러나, 이들의 경우의 대부분에서, HA 가 저급 분자 기질로 분해되거나, HA 와 약물의 결합이 가수분해를 받는 것 등에 의해 약물이 유리되고, 그 약물이 표적세포 또는 조직에 삽입된 후 비로소 약효가 발현된다.
본 발명은 히알루론산, 그의 유도체 또는 그의 염 및 관절질환 치료제의 결합체에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은, 변형성관절증, 만성관절류머티즘 등의 치료에 유효한, 관절질환 치료제에, 히알루론산 또는 그의 유도체 또는 염을 화학적으로 결합시킴으로써 수득되는 결합체, 상기 결합체의 제조방법 및 상기 결합체를 함유하는 약제 조성물에 관한 것이다.
도 1 은 각종 MMPs 에 대한 본 발명의 결합체의 억제활성 (상부 도면은 콜라게나아제 1 에 대한 억제활성, 하부 도면은 스트로멜리신-1 에 대한 억제활성) 을 나타내는 그래프이다.
도 2 는 각종 MMPs 에 대한 본 발명의 결합체의 억제활성 (상부 도면은 젤라티나아제 A 에 대한 억제활성, 하부 도면은 젤라티나아제 B 에 대한 억제활성) 을 나타내는 그래프이다.
도 3 은 콜라겐 필름 파괴에 대한 본 발명의 결합체의 억제활성을 나타내는 그래프이다.
도 4 는 본 발명의 결합체의 결합-안정성 (37 ℃의 생리식염수중의 결합체 5 의 안정성) 을 나타내는 그래프이다.
도 5 는 본 발명의 결합체의 결합-안정성 (결합체 4 의 반투과막에 대한 투과성) 을 나타내는 그래프이다.
도 6 은 본 발명의 결합체의 래트 관절강에서의 보유성을 나타내는 그래프이다.
도 7 은 본 발명의 결합체의 래트 관절강에서의 보유성을 나타내는 그래프이다.
도 8 은 각종 MMPs 에 대한 본 발명의 결합체의 억제활성 (상부 도면은 콜라게나아제-1 에 대한 억제활성, 하부 도면은 스트로멜리신-1 에 대한 억제활성) 을 나타내는 그래프이다.
도 9 는 각종 MMPs 에 대한 본 발명의 결합체의 억제활성 (상부 도면은 젤라티나아제 A 에 대한 억제활성, 하부 도면은 젤라티나아제 B 에 대한 억제활성) 을 나타내는 그래프이다.
도 10 은 관절연골 콜라겐 파괴에 대한 본 발명의 결합체의 억제활성을 나타내는 그래프이다. 도 10 에 있어서, *는 인터루킨-1 및 플라스미노겐 첨가군과 유의차가 있는 것을 나타낸다[ p〈0.05, Dunnett 의 다중비교검정, 평균치 ±표준오차 (n=4)].
본 발명을 수행하는 바람직한 양태
본 발명에 있어서, 관절질환 치료제는, 예를 들면, 하기를 포함한다:
(1) 살리실산계 비스테로이드 항염증제 (사사피린, 아스피린, 디플루니살, 살리실아미드 등); 페남산계 비스테로이드 항염증제 (풀페남산, 풀페남산알루미늄, 메페남산, 프록타페닌 및 톨루페남산 등); 아릴아세트산계 비스테로이드 항염증제 (디클로로페낙나트륨염, 톨루메틴나트륨염, 술린닥, 펜부펜, 인도메타신, 인도메타신파루네실, 아세메타신, 말레인산프로글루메타신, 안페낙나트륨염, 나부메톤, 모페졸락, 에트돌락 및 알클로페낙 등); 프로피온산계 비스테로이드 항염증제 (이부프로펜, 플루르비프로펜, 케토프로펜, 나프록센, 프라노프로펜, 페노프로펜칼슘염, 티아프로펜산, 옥사프로진, 록소프로펜나트륨염, 알루미노프로펜, 잘토프로펜 및 티아프로펜산 등), 피라졸론계 비스테로이드 항염증제 (케토페닐부타존 등), 옥시캄계 비스테로이드 항염증제 (피록시캄, 테녹시캄 및 안피록시캄 등), 염기성 비스테로이드 항염증제 (염산티알라미드, 염산티노리딘, 염산벤지드아민, 에피리졸 및 에모르파존 등) 등의 비스테로이드 항염증제;
(2) 시클로옥시게나아제-2 억제제 (셀레콕시브 (celecoxib), Searle 제품, MK-966 : Merck 제품, 및 JTE522 니혼타바코 제품 등);
(3) 페니실아민, 로벤자리트이나트륨, 오라노핀, 부실아민, 아크타리트, 살라조술파피리딘, 금티오말산나트륨, 클로로퀸, TNF α수용체 [예컨대, Enbrel (등록상표, 아메리칸·홈·프로덕트 제품), 미조리빈, 시클로스포린, 메토트렉세이트, 레플루노미드(훽스트 마리온 루셀 제품), 아자티오프린, FK-506(후지사와 제약회사 제품), VX-497(Vertex 제품), TAK-603(다께다 케미칼사 제품), 항-TNF α항체[예컨대, infliximab(Centocor 제품) 및 D2E7(Knoll 제품)], 항-인터루킨-6 수용체 항체[예컨대, MRA(추가이 제약회사 제품), T-614(도야마 케미칼 사 제품), KE-298(다이쇼세이야쿠 제품), 미노페놀레이트 메페틸(Roche 제품), 탈리도미드(Celgen 제품), 항-CD4 항체, 인터루킨-1 수용체 길항제, 항-CD52 항체, p38MAP 키나제 억제제, ICE 억제제, TACE 억제제를 포함하는 항류머티즘제;
(4) 스테로이드 (아세트산코르티존, 히드로코르티존, 프레드니졸론, 메틸프레드니졸론, 트리암시놀론, 트리암시노론아세토니드, 덱사메타존, 팔미틴산덱사메타존, 베타메타존, 아세트산파라메타존, 아세트산할로프레돈, 파르네실산프레드니졸론, 아세트산테트라코삭티드 등);
(5) 예를 들면 염산프로카인, 염산테트라카인 및 염산리도카인을 포함하는 국소 마취제; 및
(6) 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제 등의 연골보호제.
그 중, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제가 바람직하다.
본 발명에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP) 억제제는, 임의의 생체 (바람직하게는 포유류, 특히 바람직하게는 인간) 유래의 임의의 매트릭스 메탈로프로테아제의 활성을, 예컨대 그에 결합하는 것 등에 의해, 억제할 수 있는 모든 물질을 의미한다.
보다 구체적으로는, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제는, 카르복실산, 인산, 티올 및 히드록삼산 등의 관능기를 통하여 MMP 의 활성중심인 아연에 결합함으로써 효소활성을 억제하는 화합물 또는 단백질 (폴리펩티드를 포함); 및 MMPs 또는 분자중에 디스인테그린과 MMP와 같은 도메인을 함께 갖는 단백질분해효소 (예컨대, TNFα변환효소, 또는 디스인테그린/메탈로프로테아제 패밀리 (ADAM) 에 속하는 프로테아제의 군) 의 효소활성의 발현을 억제하는 것들을 의미한다. 이들의 MMP 억제제의 활성은, 표식 기질(Cawston, T.E.＆ Barrett, A.J, Anal Biochem.,99,340-345(1979) 및 Baici,A 등 Anal Biochem.,108,230-232(1980)) 및 합성 기질(Masui, Y 등 Biochem.Med., 17,215-221(1977))의 MMPs 에 의한 분해에 대한 억제활성으로서 측정할 수 있고; 더욱 간편하게는, 이들의 방법에 근거하여 개발된 시판의 MMP 활성측정키트를 사용하여 동일하게 측정할 수도 있다. 또한, 콜라겐 등의 기질의 필름상에서 배양한 세포를 사이토카인으로 자극했을 때에 생산·활성화되는 MMPs 의 활성을, 배양액 중으로의 기질분해물의 유리를 지표에 측정하는 실험 시스템(Gavrilovic,J 등 : Cell.Biol.Int.Reports, 9, 1097-1107(1985): Br.J. Pharmacol.,100, 631-635(1990) 중에서 인용되어 있다), 또는 말초백혈구를 리포폴리삭카리드 등으로 자극하여 야기되는 세포막표층으로부터의 TNFα의 유리를 TNFα변환효소의 활성으로서 평가하는 실험 시스템(DiMartino 등 : Inflam.Res.,46, 211-215(1997)) 등에 있어서, MMPs 나 TNFα변환효소의 생산이나 활성화에 대한 억제활성으로서 측정할 수도 있다. 상기의 MMP 억제제는, 이들 측정계의 적어도 하나로 10 ㎎/㎖ 이하의 어느 하나의 농도에서 50% 이상의 억제를 나타내는 것을 특징으로 한다. 또한, MMP 억제제는 억제활성이 10 ㎎/㎖ 이하의 어느 하나의 농도에서 45% 이상의 억제 활성을 나타내는 한, 화학적으로 개질된 억제제를 포함된다.
MMP 억제제의 비제한적 구체예로서는, 테트라사이클린계 화합물 (테트라사이크린, 독시사이클린, 미노사이클린 및 테트라사이클린의 화학개질체 (예컨대 CMT 1 내지 4 ; 콜라게넥스 제품) 등), TIMPs 및 히드록삼산 등을 들 수 있고, MMP 억제활성의 강도와 MMPs 로의 높은 특이성의 점으로부터, 바람직하게는 히드록삼산을 들 수 있다.
이와 같은 MMP 억제제의 예는, 예컨대, 일본특허공보 평 9-80825 호(1997), 특허 제 2736285 호, 및 Drug Discovery Today, 1, 16-26(1996) 등에 기재되어 있다.
히드록삼산은, N-히드록시아미드기를 갖는 화합물을 의미하고, 비제한적 구체예로서는, AG-3340 (아구론 제품), CDP-845 (제네카 제품), CGS-27023A (노바르티스), D5410(카이로사이언스 제품), L758354 (머크 제품), CH-138(카이로사이언스 제품), 마리마스타트(Marimastat, 등록상표, 브리티쉬 바이오테크 제품), 갈라르딘 (Galardin, 등록상표, 글리코메드 제품), Ro31-9790 (로슈 제품), Ro32-3555(로슈 제품), BAY12-9566 (베이어 제품) 및 RS 130830 (로슈 바이오사이언스) 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 결합체 중의 히드록삼산 잔기의 비제한적 구체예로서는, 예컨대, 화학식 1로 표시되는 히드록삼산 잔기를 들 수 있다:
[화학식 1]
[식중, R1은 수소원자, 히드록실기, 또는 탄소수 1 내지 8 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기를 나타내고 ;
R2는 탄소수 1 내지 8 의 직쇄 또는 측쇄이 알킬기를 나타내며 ;
R3은 시클로알킬기, 아릴기 또는 복소환기로 치환될 수 있는 탄소수 1 내지 8 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기를 나타내고 ;
R4는 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기를 나타낸다].
화학식 1 로 표시되는 MMP 억제제인 히드록삼산 잔기의 정의에 있어서, R1의 비제한적 구체예로서는, 수소원자, 히드록실기, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, sec-부틸기, 이소부틸기, tertert-부틸기, n-펜틸기, n-헥실기, n-헵틸기 및 n-옥틸기 등을 들 수 있으나, 바람직하게는 수소원자이다.
R2의 비제한적 구체예로서는, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, sec-부틸기, 이소부틸기, tertert-부틸기, n-펜틸기, n-헥실기, n-헵틸기, n-옥틸기 등을 들 수 있으나, 바람직하게는 이소부틸기이다.
R3에 있어서의, 시클로알킬기, 아릴기 또는 복소환기로 치환될 수 있는 탄소수 1 내지 8 의 직쇄 또는 측쇄 알킬기의 탄소수 1 내지 8 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기 중의 알킬기성분의 비제한적 구체예로서는, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, sec-부틸기, 이소부틸기, tertert-부틸기, n-펜틸기, n-헥실기, n-헵틸기, n-옥틸기 등을 들 수 있으나, 바람직하게는, 메틸기, 이소부틸기, tert-부틸기이다.
또한, 상기 알킬기상에 존재할 수 있는 시클로알킬기, 아릴기 또는 복소환기의 비제한적 구체예로서는 탄소수 3 내지 10, 바람직하게는 탄소수 5 내지 7 의 시클로알킬기 (예컨대, 시클로펜틸기, 시클로헥실기, 또는 시클로헵틸기 등); 히드록실기, 메톡시기 등의 치환기를 가질 수 있는 탄소수 6 내지 20, 바람직하게는 탄소수 6 내지 14 의 아릴기 (예컨대, 페닐기, p-히드록시페닐기, 또는 나프틸기 등) ; 및 질소원자, 황원자 또는 산소원자 중에서 선택되는 동일하거나 다른 1 개 이상, 바람직하게는 1 내지 3 개, 특히 바람직하게는 1 개의 헤테로원자를 함유하는, 원자수 5 내지 20, 바람직하게는 원자수 5 내지 10, 특히 바람직하게는 원자수 5, 6, 9 또는 10 의 포화 또는 불포화의 복소환 (예컨대, 피리딜기, 퀴놀린기, 또는 3-인돌릴기 등 ; 특히 바람직하게는 3-인돌릴기) 을 들 수 있다.
대표적으로는, R3은 아릴기 또는 복소환기로 치환되어 있는 탄소수 1 내지 5 의 직쇄상의 알킬기가 바람직하고, 그 중에서도 벤질기, p-히드록시벤질기, 3-인돌릴메틸기가 특히 바람직하고, 3-인돌릴메틸기가 가장 바람직하다.
R4의 비제한적 구체예로서는, 수소원자, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, sec-부틸기, 이소부틸기, tertert-부틸기를 들 수 있으나, 바람직하게는 수소원자이다.
화학식 1 로 표시되는 히드록삼산 잔기는 하나 이상의 비대칭 중심을 포함하지만, 각 비대칭 중심에 대하여, 그 절대배치가 R 배치 또는 S 배치가 본 발명에 포함된다.
매트릭스 메탈로프로테아제 억제제의 중량비는, 결합체 전체에 대하여 바람직하게는 0.01 내지 50% 이고, 특히 바람직하게는 0.1 내지 10% 이다.
또한, 본 발명의 하나 이상의 관절질환 치료제 및 히알루론산, 히알루론산 유도체 또는 그의 염의 결합체에 있어서, 바람직한 관절질환 치료제인 MMP 억제제는, 결합체의 합성과정 또는 합성 후에서, 그 구조가 변화하는 경우가 있을 수 있으나, 변화한 경우에서도, 본 명세서에 기재한 억제활성 (MMP 억제, 콜라겐분해억제, 및 TNFα의 유리억제 중의 하나 이상) 을 갖고 있으면, 본 발명에 포함된다.
본 발명에 있어서, "히알루론산(HA)"이란, 중량 평균 분자량 100,000 내지 10,000,000 을 갖는, 글루쿠론산 및 N-아세틸글루코사민으로 구성되는 이당 중합체, 및 이들의 혼합물을 의미한다. 히알루론산은, 점탄성의 강도의 점에서, 중량평균분자량 700,000 내지 10,000,000 을 갖는 히알루론산이 바람직하고, 중량평균분자량 1,000,000 내지 10,000,000 의 히알루론산이 특히 바람직하다.
본 발명에 있어서 "히알루론산유도체"란, 히알루론산으로부터 유도되는 히알루론산 골격을 갖는 모든 물질을 의미한다. 히알루론산 유도체의 비제한적 구체예는 하기를 포함한다:
(1) 당성분인 글루쿠론산 및/또는 N-아크릴글루코사민이 환원말단을 갖는 히알루론산 유도체;
(2) 히알루론산 중의 하나 이상의 히드록실기가 아세틸화되어 있는 아세틸화 히알루론산;
(3) 중량평균분자량 100,000 내지 10,000,000 을 갖는 글루쿠론산 및 N-아세틸글루코사민으로 이루어지는 이당 중합체를, 포름알데히드로 가교하여 더 고분자화한 유도체 (예컨대, 신비스크 (Synvisc, 등록상표, 바이오매트릭스 제품); 및
(4) 본 명세서중에 상기의 히알루론산, 히알루론산 유도체에 하나 이상의 약효성분, 예컨대 항암제 (예컨대, 알킬화제, 대사길항제, 알칼로이드 등), 면역억제제, 함염증제 (스테로이드, 비스테로이드계 항염증제 등), 항류머티즘제 또는 항균제 (β-락탐계 항생물질, 아미노글리코시드계 항생물질, 마크롤리드계 항생물질, 테트라사이클린계 항생물질, 신규 퀴놀론계 항생물질, 폴리펩티드계 항생물질, 술파제 등) 등을, 스페이서를 통하여 또는 통하지 않고 결합시킴으로써 얻어지는 유도체.
히알루론산 또는 히알루론산유도체의 염의 비제한적 구체예로서는, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염, 알루미늄염 등을 들 수 있다.
HA 유래에 특별히 제한은 없지만, 예컨대, 방선균 등의 박테리아, 인체, 돼지, 닭 등에서 유래하는 HA 를 사용할 수 있다.
히알루론산 및 그의 염의 비제한적 구체예로서는, 예컨대, 스베닐 (등록상표, 니혼 루셀), 알츠 (등록상표, 가켄 제약회사), 오페간 (등록상표, 산텐 제약회사), 히알간 (등록상표, 피디아), 오르토비스크 (등록상표, 아니카 쎄라퓨틱스), 히알론 (등록상표, 파마시아 ＆ 업죤) 등을 들 수 있다. 또한, 와꼬 퓨어 케미칼 인더스트리 사 등의 각종 시약메이커의 카타로그에 기재된 HA 및 이들의 염을 들 수도 있다.
본 발명의 결합체에 있어서는, 관절질환 치료제 (예컨대, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제) 는 히알루론산, 히알루론산 유도체 또는 그의 염에, 스페이서를 통하여 또는 통하지 않고 결합되어 있다. 관절질환 치료제 (예컨대, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제) 및 히알루론산 또는 히알루론 유도체 또는 그의 염 간의 결합양식으로서는, 스페이서를 통하지 않은 경우에는 아미드의 결합, 에테르결합 등이 사용될 수 있고, 또는 스페이서를 통하여 결합되어 있다. 바람직하게는, 관절질환 치료제 (예컨대, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제) 는 히알루론산 또는 히알루론 유도체 또는 그의 염에 스페이서를 통하여 결합되어 있다.
관절질환 치료제 (예컨대, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제) 가 히알루론산, 히알루론산 유도체 또는 그의 염이 스페이서를 통하지 않고 결합되어 있는 경우, 이들은 서로 이들의 활성을 손상시키지 않는 부위에 결합되어 있다. 또한, 관절질환 치료제 (예컨대 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제)가 히알루론산, 히알루론산 유도체 또는 그의 염에 스페이서를 통하여 결합되어 있는 본 발명의 바람직한 태양에 있어서는, 스페이서 및 관절질환 치료제, 또는 스페이서 및 히알루론산 또는 히알루론산 유도체 또는 그의 염은, 관절질환 치료제 및 HA, HA 유도체 또는 그의 염의 활성을 손상시키지 않는 부위에서 서로 결합하고 있다.
이와 같은 활성을 손상시키지 않는 부위로서, 관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제) 에 있어서는, 예컨대, 아미노기, 카르복실기, 히드록실기 및 티올기 등을 들 수 있다. 또한, MMP 억제제인 관절질환 치료제가 화학식 1 로 표시되는 히드록삼 잔기인 본 발명의 바람직한 태양의 경우, 그 말단에 위치하는 1차 또는 2차 아미노기를 들 수 있다. HA, HA 유도체 또는 그의 염에 있어서는, 예컨대, 히드록실기 또는 카르복실기를 들 수 있으나, 바람직하게는 카르복실기이다.
관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제) 및 HA, HA 유도체 또는 그의 염간의 결합의 종류, 스페이서 및 관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제)간의 결합의 종류, 및 스페이서 및 HA, HA 유도체 또는 그의 염 간의 결합의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 아미드결합, 에테르결합, 에스테르결합, 술피드결합이 사용될 수 있다.
HA, HA 유도체 또는 그의 염에 결합하는 관절질환 치료제는 1 종일 필요는 없고, 2 종 이상의 다른 관절질환 치료제가 사용될 수 있다. 또한, 하나의 결합체는 스페이서가 개입된 결합부위 및 스페이서가 개입되지 않은 결합부위 모두를 질 수 있다. 또한, 하나의 결합체 중에 존재하는 스페이서가 동일할 필요는 없다.
스페이서의 종류는, 관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제) 및 HA, HA 유도체 또는 그의 염의 활성에 중대한 영향을 주지않는 한 특별히 한정되지 않고, 그 비제한적 구체예로서는, 예컨대 화학식 2 로 표시되는 스페이서를 들 수 있다:
[화학식 2]
-R5-R6-R7-R8- (2)
[식중, R5는 탄소수 1 내지 8 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬렌기를 나타내고;
R6은 탄소수 1 내지 4 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기로 치환될 수 있는 메틸렌기 또는 이미노기, 또는 산소원자를 나타내고 ;
R7은 1 내지 3 개의 산소원자가 삽입될 수 있는 탄소수 1 내지 10 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬렌기를 나타내고 ;
R8은 산소원자, 황원자, 또는 NR9(여기에서, R9은 수소원자, 또는 탄소수 1 내지 4 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기를 나타낸다)].
상기 화학식 2 로 표시되는 스페이서는, R5-말단에서 관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제) 과 결합하고, R8-말단에서 HA, HA 유도체 또는 그의 염과 결합한다.
화학식 2 에서 나타나는 스페이서의 정의에 있어서, R5의 비제한적 구체예로서는, 메틸렌기, 에탄-1,2-디일기, 프로판-1,3-디일기, 부탄-1,4-디일기, 펜탄-1,5-디일기, 헥산-1,6-디일기, 헵탄-1,7-디일기, 옥탄-1,8-디일기, 2-메틸펜탄-1,3-디일기, 2-메틸부탄-1,4-디일기, 3-메틸부탄-1,4-디일기, 3-메틸펜탄-1,5-디일기, 3-에틸펜탄-1,5-디일기, 3-메틸헥산-1,6-디일기, 4-메틸헥산-1,6-디일기 및 4-메틸헵탄-1,7-디일기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 에탄-1,2-디일기, 프로판-1,3-디일기 및 부탄-1,4-디일기이다.
R6에 있어서의 탄소수 1 내지 4 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기로 치환될 수 있는 메틸렌기 또는 이미노기의, 탄소수 1 내지 3 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기로서는, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, sec-부틸기, tertert-부틸기를 들 수 있다.
대표적으로는 R6은 탄소수 1 내지 3 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기로 치환될 수 있는 메틸렌기, 및 산소원자가 바람직하고, 메틸렌기, 및 산소원자가 특히 바람직하다.
R7의 비제한적 구체예로서는, 메틸렌기, 에탄-1,2-디일기, 프로판-1,3-디일기, 부탄-1,4-디일기, 펜탄-1,5-디일기, 헥산-1,6-디일기, 헵탄-1,7-디일기, 옥탄-1,8-디일기, 노난-1,9-디일기, 옥탄-1,10-디일기, 2-메틸펜탄-1,3-디일기, 2-메틸부탄-1,4-디일기, 3-메틸부탄-1,4-디일기, 3-메틸펜탄-1,5-디일기, 3-에틸펜탄-1,5-디일기, 3-메틸헥산-1,6-디일기, 4-메틸헥산-1,6-디일기, 4-메틸헵탄-1,7-디일기, 1-옥사프로판-1,3-디일기, 2-옥사부탄-1,4-디일기, 3-옥사펜탄-1,5-디일기, 2-옥사헥산-1,6-디일기, 3-옥사헥산-1,6-디일기, 1,4-디옥사헥산-1,6-디일기, 3-옥사헵탄-1,7-디일기, 2,5-디옥사헵탄-1,7-디일기, 4-옥사옥탄-1,8-디일기, 2,6-디옥사옥탄-1,8-디일기, 3,6-디옥사노난-1,9-디일기., 3,6-디옥사-4-메틸노난-1,9-디일기, 3,6-디옥사-5-에틸노난-1,9-디일기, 1,4,7-트리옥사옥탄-1,10-디일기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 에탄-1,2-디일기, 프로판-1,3-디일기, 부탄-1,4-디일기, 3,6-디옥사노난-1,9-디일기 등을 들 수 있다.
R8의 비제한적 구체예로서는, 산소원자, 황원자, 이미노기, 메틸이미노기, 에틸이미노기, n-프로필이미노기, 이소프로필이미노기, n-부틸이미노기, sec-부틸이미노기, 이소부틸이미노기, tert-부틸이미노기 등을 들 수 있으나, 바람직하게는 이미노기 또는 메틸이미노기 등을 들 수 있고, 특히 바람직하게는 이미노기이다.
화학식 2 에서 나타나는 스페이서의 바람직한 구체예로서는, -(CH2)4-NH-, -(CH2)5-NH-, -(CH2)6-NH-, -(CH2)7-NH-, -(CH2)8-NH-, -(CH2)9-NH-, -(CH2)9NH-, -(CH2)10NH-, -(CH2)11NH-, -(CH2)12NH-, -(CH2)2-O-(CH2)2NH-, -(CH2)3-O-(CH2)3NH-, -(CH2)4-O-(CH2)4NH-, 및 -(CH2)3-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3NH- 등을 들 수 있다.
또한, 관절질환 치료제 (예컨대, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제) 및 히알루론산, 히알루론산 유도체 또는 그의 염이 스페이서를 통하여 결합되어 있는 결합체에 있어서, 관절질환 치료제 (예컨대, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제) 및 스페이서의 결합체의 바람직한 비제한적 구체예로서는, 화학식 3 으로 표시되는 결합체를 들 수 있다:
[화학식 3]
[식중, R12은 1 개의 이미노기 및/또는 1 내지 4 개의 산소원자가 삽입될 수 있는 탄소수 2 내지 23 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬렌기를 나타내고;
R13은 수소원자, 또는 탄소수 1 내지 4 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기를 나타낸다]
화학식 3 으로 표시되는 결합체 중, 히드록삼산 잔기부분은, 화학식 1 로 표시되는 바람직한 MMP 억제제의 예와 동일하다.
또한, R12의 비제한적 구체예로서는, 에탄-1,2-디일기, 프로판-1,3-디일기, 부탄-1,4-디일기, 펜탄-1,5-디일기, 헥산-1,6-디일기, 헵탄-1,7-디일기, 옥탄-1,8-디일기, 노난-1,9-디일기, 데칸-1,10-디일기, 운데칸-1,11-디일기, 도데칸-1,12-디일기, 2-메틸펜탄-1ㅡ3-디일기, 2-메틸부탄-1,4-디일기, 3-메틸부탄-1,4-디일기, 3-메틸펜탄-1,5-디일기, 3-에틸펜탄-1,5-디일기, 3-메틸헥산-1,6-디일기, 4-메틸헥산-1,6-디일기, 4-메틸헵탄-1,7-디일기, -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)3-, -(CH2)4-O-(CH2)4-, 및 -(CH2)3-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3- 등을 들 수 있고, 바람직하게는 부탄-1,4-디일기, 펜탄-1,5-디일기, 헥산-1,6-디일기, 헵탄-1,7-디일기, 옥탄-1,8-디일기, 노난-1,9-디일기, 데칸-1,10-디일기, 운데칸-1,11-디일기, 도데칸-1,12-디일기, -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)3-, -(CH2)4-O-(CH2)4-, 및 -(CH2)3-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3- 등을 들 수 있다. R13의 비제한적 구체예로서는, 수소원자, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, sec-부틸기, 이소부틸기, tert-부틸기 등을 들 수 있으나, 바람직하게는 수소원자 및 메틸기 등을 들 수 있고, 특히 바람직하게는 수소원자를 들 수 있다.
본 발명의 화학식 2 로 표시되는 스페이서, 및 화학식 3 으로 표시되는 결합체는, 분자내에 비대칭탄소원자를 갖는 경우가 있고, 그 절대배치가 R 배치, S 배치인 입체이성체가 존재하는 경우가 있으나, 그 각각, 또는 이들의 임의 비율의 구조단위 (스페이서 및 결합체) 의 어느 것이나 본 발명에 포함된다.
본 발명의 결합체의 제조방법으로서는, 예컨대, 관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제) 중의 활성에 영향을 주지않는 부위 (예컨대, 아미노기, 카르복실기, 히드록실기, 및 티올기 등) 와, HA, HA 유도체 또는 그의 염의 카르복실기, 히드록실기, 또는 환원말단유래의 알데히드기를, 화학반응에 의해 결합시키는 방법을 들 수 있다. 이들은, 공지 기술 (신생화학실험강좌 제 1 권 단백질I (동경화학동인), 단백질·효소의 기초실험법 (난꼬우도) 등에 기재) 으로 실시할 수 있다.
구체예는 하기와 같다:
(1) 탈수축합제를 사용하여, 관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제) 또는 HA, HA 유도체 또는 그의 염 중의 카르복실기를 활성화하고, 아미드결합, 에스테르결합 또는 티오에스테르결합을 형성시키는 방법;
(2) 관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제) 중의 히드록실기를 브롬화시안을 사용하여 활성화한 후, HA, HA 유도체 또는 그의 염 중의 아미노기와 결합시키는 방법, 및 HA, HA 유도체 또는 그의 염 중의 히드록실기를 브롬화시안을 사용하여 활성화한 후, 관절질환 치료제 (예컨대, MMP억제제) 중의 아미노기와 결합시키는 방법;
(3) 에피클로로히드린 등의 할로히드린 또는 1,4-부탄디올디글리시딜에테르 등의 디에폭시드, 또는 토실클로리드나 트레실클로리드 등의 술포닐클로리드를 사용하여, 관절질환 치료제 (예를들면, MMP 억제제) 혹은 HA, HA 유도체 또는 그의 염중의 히드록실기를 활성화하여 에테르결합이나 이미노결합 또는 술피드결합을 형성시키는 방법; 및
(4) HA, HA 유도체 또는 그의 염중의 환원말단을 환원하여 1차 히드록실기를 형성하고, 히드록실기를 산화하여 알데히드기를 형성하고, 그리고 생성된 알데히드를 관절질환 치료제 (예를 들면, MMP 억제제) 중의 아민과 환원적 알킬화를 실시하는 방법.
또한, (1) 부터 (4) 의 방법을 2개 이상 조합한 방법도 포함된다.
탈수축합제를 사용하여, 관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제) 혹은 HA, HA 유도체 또는 그의 염중의 카르복실기를 활성화하고, 아미드결합이나 에스테르결합 또는 티오에스테르결합을 형성시키는 방법의 경우, 일반적인 유기합성에 사용되는 축합제를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 카르보디이미드류, 포스포늄류, 우로늄류 등을 사용한다. 카르보디이미드류로서는, 디이소프로필카르보디이미드, 디시클로헥실카르보디이미드 등의 비수용성 카르보디이미드, 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 등의 수용성 카르보디이미드가 있고, 포스포늄류로서는, 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄헥사플루오로포스페이트, 7-아자벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄헥사플루오로포스페이트 등이 있고, 우로늄류로서는, O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N,N-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트, O-7-아자벤조트리아졸-1-일-N,N,N,N-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트 등이 있다.
또한, 이들 축합제에 반응촉진성의 첨가제를 추가할 수 있다. 첨가제로서, N-히드록시숙신이미드, N-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복시미드, p-니트로페놀, 펜타플루오로페놀, 1-히드록시벤조트리아졸, 및 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 등을 들 수 있다.
탈수축합제를 사용하여, 관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제) 혹은 HA, HA 유도체 또는 그의 염중의 카르복실기를 활성화하고, 아미드결합이나 에스테르결합 또는 티오에스테르결합을 형성시키는 방법의 비제한적 구체예인, 수용성 카르보디이미드에 의한 축합법에서는, 0.1 내지 1 % (중량/용량) 의 HA 수용액에 카르보디이미드를 첨가한 후, 아미노기를 갖는 관절질환 치료제 (MMP 억제제) 을 첨가하고, 0 내지 35 ℃ 에서 1 내지 96 시간 반응시킬 수 있다. 그 동안, 염산이나 인산 등의 산을 첨가하여, 반응액의 pH 를 4 내지 6 으로 유지할 수도 있다.
또한, 사용하는 관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제) 의, 물에 대한 용해성이 낮은 경우, 1 내지 50% 의 유기용매 (예컨대, N,N-디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈, 디옥산, 에탄올, 피리딘 등) 를 포함하는 수용액을 반응용매로 하는 것도 가능하고, 이 경우, 반응계에 관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제) 을 미리 첨가하여, 녹고 있는 것을 확인한 후, 카르보디이미드를 첨가하여도 된다.
원하는 경우, 반응촉진성의 첨가제 (예컨대, N-히드록시숙신이미드, N-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복시미드, p-니트로페놀, 펜타플루오로페놀, 1-히드록시벤조트리아졸, 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 등) 및 HA 가 미리 탈수축합제로 처리되어, HA 의 카르복실기를 활성에스테르로 전환하고, 이를 단리한 후, 관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제) 와 혼합할 수 있다.
관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제) 중의 히드록실기를 브롬화시안을 사용하여 활성화한 후, HA, HA 유도체 또는 그의 염중의 아미노기와 결합시키는 방법, 및 HA, HA 유도체 또는 그의 염중의 히드록실기를 브롬화 시안을 사용하여 활성화한 후, 관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제) 중의 아미노기를 결합시키는 방법의 비제한적 구체예로서 들 수 있는 것을 이하에 나타낸다.
HA, HA 유도체 또는 이들 염의 수용액에, 브롬화시안을 첨가하여, 0 내지 10 ℃ 에서 5 내지 30분간 반응시킨다. 그 동안, 수산화나트륨이나 인산완충액 등으로 pH 를 10 내지 12 로 유지할 수도 있다. 그 다음, 아세토니트릴을 반응 혼합물에 첨가하여 침전물을 형성하고, 과잉의 브롬화시안을 제거하고, 침전물을 다시 수용액으로 하여, 아미노기를 갖는 관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제) 와 혼합하고, 4 내지 25 ℃ 에서 1 내지 24 시간 반응시킨다. 그 동안, 중탄산나트륨, 수산화나트륨 등으로 반응액의 pH 를 8 내지 10 으로 유지할 수 있다.
HA, HA 유도체 또는 이들 염중의 환원말단을 환원하여 발생한 1 차 히드록실기를 산화하여 알데히드기로서, 관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제) 중의 아민과 환원적 알킬화를 실시하는 방법의 비제한적 구체예를 이하에 나타낸다 :
수소화붕소나트륨 등의 환원제로 처리한 후, 과요오드산나트륨 등의 산화제로 처리함으로써 얻어지는, 환원말단에 알데히드기를 갖는 HA, HA 유도체 또는 그의 염의 수용액에, 아미노기를 갖는 관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제) 를 첨가하고, 다시, 수소화시아노붕소나트륨을 첨가하고, 15 내지 30℃ 에서 1 내지 24 시간 반응시킨다. 그 동안, 아세트산, 염산, 인산 등의 산을 첨가하여, pH 를 4 내지 6 으로 유지할 수 있다.
어느 축합법에 있어서도, 반응후, 반응액에 에탄올, 아세톤 등의 유기용매를 첨가하여 침전시켜, 침전물을, 알코올침전, 겔여과, 투석, 이온교환 크로마토그래피 등의 수단에 의해 정제함으로써, 목적으로 하는 결합체를 얻을 수 있다.
본 발명의 관절질환 치료제 및 히알루론산과의 결합체를 약제 조성물로서 적용하는 경우, 본 발명의 결합체는, 약제학적으로 허용할 수 있는 부형제, 또는 안정제 등과 함께 제제화한 후 사용하는 것이 바람직하다.
약제 조성물의 투여형태는 특별히 제한되지 않고, 경구투여 또는 비경구투여일 수 있고, 전신투여 또는 국소투여일 수 있다. 일반적으로는, 본 발명의 의약은 비경구적으로 국소투여하는 것이 바람직하고, 예컨대, 주사제로서, 관절내, 정맥내, 근육내 또는 피하에 투여할 수 있거나, 또는 스프레이제, 국소용 크림 또는 연고로서 경피적으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제 조성물의 투여량은, 환자의 증상, 연령, 성별 등에 다라 적당히 선택할 수 있지만, 주사제로 사용하는 경우는 일반적으로는, 유효성분인 결합체의 양으로서 0.01㎎/체중㎏/일 내지 100㎎/체중㎏/일, 바람직하게는, 0.1㎎/체중㎏/일 내지 10㎎/체중㎏/일이다. 상기 1 일당의 투여량은, 1일에 수회로 나눠 투여될 수 있거나, 또는 1일 1 회, 또는 2 일 내지 28 일에 1 회 투여하여도 된다.
본 발명의 목적의 하나는, 관절질환 치료제 (예컨대, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제, 특히 히드록삼산을 관절강 내에 보유시킬 수 있는 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제; 또는 그 외의 비스테로이드 항염증제물, 시클로옥시게나아제 2 억제제, 질환수식성 항류머티즘제 또는 스테로이드) 및 히알루론산, 그의 유도체 또는 그의 염의 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 결합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 결합체를 함유하는 약제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, MMP 억제 활성을 갖는 히드록삼산이 인공 다당류의 일종인 아가로스에 커플링한 경우에서도, MMPs 에 대한 결합능을 유지하고 있는 것을 증명한 예가 있는 것 (Moore W.M.＆ Spilburg C.A.,Biochemistry 25, 5189-5195 (1986)), 및 지금까지 발현된 모든 MMPs 가 세포외 또는 세포표층에서 기능을 발현하는 효소인 것에 주목하였다. 상기 과제를 해결하기 위해 예의검토한 결과, 관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제, 또는 그 외의 비스테로이드 항염증제, 시클로옥시게나아제 2 억제제, 질환수식성 항류머티즘제 또는 스테로이드) 를 HA, HA 유도체 또는 그의 염에 화학적으로 결합시킴으로써 제조되는 결합체는 양자가 결합한 대로의 상태에서도 MMP 억제작용을 발현하는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
덧붙여, 본 발명자들은 관절강 내에 투여된 관절질환 치료제 및 HA, 그의 유도체 또는 염의 결합물은, HA 제제와 마찬가지로, 관절강 내에 장기간 보유되고, 그럼으로써 MMP 억제제에 수반되는 전신성의 부작용을 경감시킴과 동시에, 관절질환 치료제으로서의 HA 의 약효를 유지할 수 있다는 것; 즉, HA 및 관절 질환 치료제의 상승적인 약효를 국소 부위에서 기대할 수 있기 때문에, 생물학적 유용성이 개선된 약제로 될 수 있는 것을 발견하고, 이러한 발견을 기초로 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명의 제 1 측면에 의하면, (1) 하나 이상의 관절질환 치료제 및 (2) 히알루론산, 히알루론산 유도체 또는 그의 염의 결합체가 제공된다.
본 발명의 일 태양에서는, 관절질환 치료제 및 히알루론산, 히알루론산 유도체 또는 그의 염의 결합은 공유결합이다.
본 발명의 일 태양에서는, 관절질환 치료제는 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제이다.
본 발명의 또 다른 태양에서는, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제는 스페이서를 통하여 히알루론산, 히알루론산 유도체 또는 그의 염과 결합된다.
본 발명의 결합체에 있어서, 결합체 전체에 대한 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제의 중량비는 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는 0.01 내지 50%, 특히 바람직하게는 0.1 내지 10% 이다.
본 발명의 결합체에 있어서 바람직하게는, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제는 히드록삼산 잔기이다.
매트릭스 메탈로프로테아제 억제제는 특히 바람직하게는, 화학식 1로 나타낸 히드록삼산 잔기이다:
[식중, R1은 수소원자, 히드록실기, 또는 탄소수 1 내지 8 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기를 나타내고;
R2는 탄소수 1 내지 8 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기를 나타내며;
R3는 시클로알킬기, 아릴기 또는 복소환기로 치환될 수 있는 탄소수 1 내지 8 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기를 나타내고;
R4는 수소원자, 또는 탄소수 1 내지 4 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기를 나타낸다].
본 발명의 결합체에 있어서는, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제 및 히알루론산 성분의 간에 스페이서가 존재하는 경우, 스페이서는 특별히 바람직하게는, 화학식 2로 나타낸 것이 특히 바람직하다:
-R5-R6-R7-R8- (2)
[식중, R5는 탄소수 1 내지 8 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기를 나타내고 ;
R6는 탄소수 1 내지 4 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기로 치환될 수 있는 메틸렌기 또는 이미노기, 또는 산소원자를 나타내고 ;
R7은 1 내지 3 개의 산소원자가 삽입될 수 있는 탄소수 1 내지 10 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬렌기를 나타내고 ; R8은 산소원자, 황원자, 또는 NR9(여기에서, R9은 수소원자, 또는 탄소수 1 내지 4 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기를 나타낸다) 를 나타낸다].
본 발명의 결합체에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제 및 스페이서의 결합체의 특히 바람직한 예를 화학식 3으로 나타낸 것이다:
[식중, R12은 1 개의 이미노기 및/또는 1 내지 4 개의 산소원자가 삽입될 수 있는 탄소수 2 내지 23 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬렌기를 나타내고 ;
R13은 수소원자, 또는 탄소수 1 내지 4 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기를 나타낸다].
또한, 본 발명의 결합체를 생체에 투여한 경우, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제는 히알루론산, 히알루론산 유도체 또는 그의 염의 결합체 형태로 매트릭스 메탈로프로테아제를 억제한다.
본 발명의 제 2 측면에 의하면, 관절질환 치료제의 활성에 영향을 미치지 않는 부위를, 히알루론산, 히알루론산 유도체 또는 그의 염의 카르복실기, 히드록실기 또는 환원말단의 관능기에, 직접 화학반응에 의해 또는 스페이서를 통하여 결합시키는 것을 포함하는, 본 발명의 결합체의 제조방법에 제공된다. 그러므로, 상기의 제조방법에 있어서는, 관절질환 치료제 (예컨대, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제) 의 활성에 영향을 주지않는 부위에, 히알루론산, 히알루론산 유도체 또는 그의 염의 카르복실기, 히드록실기 또는 말단환원의 관능기를, 직접적인 화학반응에 의해 또는 스페이서를 통해 결합시키며; 스페이서를 통한 결합은 결합반응을 실시할 때, 관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제) 과 스페이서의 선단에 있는 반응점과의 사이에 공간이 발생하기 때문에, 관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제) 의 입체적 영향을 받지 않고 스페이서가 HA, 히알루론산 유도체 또는 그의 염과 반응하는 것, 및/또는 결합체에 있어서, HA, 히알루론산 유도체 또는 그의 염과 관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제) 와의 사이에 공간이 발생하기 때문에, MMP 가 HA, HA 유도체 또는 그의 염의 입체적 영향을 받지 않고 관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제) 에 접근하는 것, 즉, MMP 장해활성이 결합된 상태에서도 유지되는 것 등을 기대하여, 스페이서를 통하여 결합시키는 것이 포함된다.
본 발명의 제 3 측면에 의하면, 본 발명의 결합체를 함유하는 약제 조성물이 제공된다.
본 발명의 약제 조성물은, 특히 관절질환의 치료제, 더욱 구체적으로는 변형성관절증, 만성관절류머티즘 또는 어깨관절주위염의 치료제이다.
실시예 1 : MMP 억제제 합성
(a) N-벤질옥시카르보닐-1,4-디아미노부탄
1,4-디아미노부탄 (10g, 113 m㏖) 을 물/에탄올 (100 ㎖ : 300 ㎖) 에 용해하고, 빙냉교반하, 벤질옥시카르보닐클로리드 (19.35g, 113 m㏖) 의 1,2-디메톡시에탄 (50 ㎖) 용액을 약 30분간에 적하하였다. 2N 수산화나트륨수용액 2 ㎖ 를 첨가후, 그대로 3 시간 빙냉교반하고, 4℃ 에서 15 시간 교반하였다. 대부분의 용매를 감압으로 증류제거한 후, 물에 용해하고, 농염산으로 산성으로 하였다. 클로로포름 (100 ㎖ ×2) 세정후, 수층을 2N 수산화나트륨수용액에 알칼리성으로 하여 클로로포름으로 추출하였다. 얻어진 유기층을, 포화식염수로 세정하고, 황산나트륨으로 건조후, 용매를 감압으로 증류제거하여, 11.0g 의 유상물을 얻었다 (수율 44%).
(b) N-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐-L-트립토판-N-(4-N-벤질옥시카르보닐아미노부틸)아미드
빙냉교반하, N-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐트립토판 (2.22g, 4.5 m㏖), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.90g, 5.85 m㏖) 의 N,N-디메틸포름아미드(DMF) 용액 (20 ㎖) 에, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(EDC) (1.12g, 5.85 m㏖) 을 첨가하여 1 시간 교반하였다. 반응액에, 상기 얻어진 N-벤질옥시카르보닐-1,4-디아미노부탄 (1g, 4.5m㏖) 을 첨가하여, 그대로 빙냉하에서 교반후, 15 내지 30℃에서 15 시간 교반을 계속하였다. 대부분의 용매를 감압으로 증류제거한 후, 클로로포름 (100 ㎖) 에 옮겨 녹여, 0.5N 염산수용액 (40㎖ ×2), 포화탄산수소나트륨수용액 (50 ㎖), 및 포화식염수 (50 ㎖) 로 세정하였다. 유기층을 무수황산나트륨상에서 건조후, 농축하여 얻어진 잔류물을 클로로포름메탄올을 용출액으로 한 실리카겔칼럼크로마토그래피로 정제하여, 무색의 분말 2.1g 을 얻었다 (수율 74%)
(c) L-트립토판-N-(4-N-벤질옥시카르보닐아미노부틸)아미드
상기 (b) 에서 얻어진 축합체(2.1g)를 DMF(50 ㎖) 에 녹여, 피페리딘 (3 ㎖) 을 첨가하여 15 내지 30 ℃ 에서 30분간 교반하였다. 대부분의 용매를 감압으로 증류제거한 후, 잔류물을 클로로포름/메탄올을 용출액으로 한 실리카겔칼럼크로마토그래피로 정제하여, 투명의 유상물 1.0g 을 얻었다. (수율 74%)
MS: 408(M+)
(d) (4-(N-벤질옥시아미노)-2-이소부틸숙시닐)-L-트립토판-N-(4-N-벤질옥시카르보닐아미노부틸)아미드: (화합물 1a)
L-트립토판-N-(4-N-벤질옥시카르보닐아미노부틸)아미드 (1.18g, 2.9 m㏖) 를 DMF 30 ㎖ 에 용해시켜, 빙냉교반하, 공지의 방법 (일본공개특허공보 평6-145148) 에 근거하여 합성한 4-(N-벤질옥시아미노)-2-이소부틸숙신산 (732 ㎎, 2.6 m㏖) 과, EDC (552 ㎎, 2.9 m㏖) 를 순차적으로 첨가하여, 반응온도를 빙냉 내지 수냉으로 하여 3 일간 교반하였다. 반응액을 감압농축하여, 클로로포름으로 희석하고, 클로로포름층을 0.1N 염산, 포화탄산수소나트륨수용액, 포화식염수로 순차적으로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 여과후, 여과잔류물과 수층을 아세트산에틸로 재추출하고, 아세트산에틸층과 클로로포름층을 합하여 감압농축하였다. 얻어진 조생성물은 실리카겔칼럼크로마토그래피정제 (WAKO, C-200, 용출용매 클로로포름 및 클로로포름 : 아세톤 = 1:1) 를 실시하여, 얻어진 플렉션을 정리하여 감압농축, 건조하고, 표제화합물 (1a) 을 1.20g (68%) 얻었다.
MS : 670 (M＋H+)
(e) [4-(N-히드록시아미노)-2(R)-이소부틸숙시닐]-L-트립토판-N-(4-N-아미노부틸)아미드 : (화합물 2)
[4-(N-히드록시아미노)-2(S)-이소부틸숙시닐]-L-트립토판-N-(4-N-아미노부틸)아미드 : (화합물 3)
[4-(N-벤질옥시아미노)-2-이소부틸숙시닐]-L-트립토판-N-(4-벤젤옥시카르보닐아미노부틸)아미드 (화합물 1a) (1.20g, 1.8m㏖) 를 메탄올 50 ㎖ 에 용해시켜, 수소분위기 상압하, 10% Pd/C140 ㎎ 로 16 시간 접촉환원하였다. 반응액을 셀라이트 여과후, 감압농축하였다. 얻어진 조생성물을 역상 HPLC (칼럼 : YMC-Pack, ODS, 250 ㎜ ×20 ㎜ I.D., 용출용매 : 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA) 을 함유하는 물-아세토니트릴계, 유속 : 10 ㎖/분) 으로, 디아스텔레오머를 각각 분취정제하고, 동결건조를 실시하여, 표제화합물 2 (친수성측의 피크) 의 TFA 염 283 ㎎ 과, 표제화합물 3 (소수성측의 피크) 의 TFA 염 493 ㎎ 을 각각 얻었다.
화합물 2 :
(f) N-벤질옥시카르보닐-1,8-디아미노옥탄
상기 (a) 에 있어서의 N-벤질옥시카르보닐-1,4-디아미노부탄의 합성과 마찬가지로, 1,4-디아미노부탄 대신에, 1,8-디아미노옥탄을 출발원료로서 표제화합물을 유상물 6.8g 으로 얻었다 (수율 58%).
(g) N-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐-L-트립토판-N-(8-N-벤질옥시카르보닐아미노옥틸)아미드
빙냉교반하, N-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐트립토판 (7.8g, 15.8 m㏖), 1-히드록시벤조트리아졸 (3.15g, 20.5 m㏖) 의 DMF 용액 (100 ㎖) 에, EDC (3.90g, 20.5 m㏖) 을 첨가하여 1 시간 교반하였다. 반응액에, 상기 얻어진 N-벤질옥시카르보닐-1,8-디아미노옥탄 (4.4g, 15.8m㏖) 을 첨가하여, 그대로 빙냉하에서 교반후, 15 내지 30 ℃ 에서 15 시간 교반을 계속하였다. 대부분의 용매를 감압으로 증류제거한 후, 클로로포름 (200 ㎖) 에 옮겨 용해하여, 0.5N 염산수용액 (50 ㎖ ×3), 포화탄산수소나트륨수용액 (100 ㎖) 및 포화식염수 (50 ㎖) 로 세정하였다. 유기층을 무수황산나트륨상에서 건조후 농축하여, 정제하지 않고 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(h) L-트립토판-N-(8-N-벤질옥시카르보닐아미노옥틸)아미드
상기 (g) 에서 얻어진 축합체를 DMF (150 ㎖) 에 녹여, 피페리진 (10 ㎖) 을 첨가하여 15 내지 30℃ 에서 30분간 교반하였다. 대부분의 용매를 감압으로 증류제거한 후, 잔류물을 클로로포름/메탄올을 용출액으로 한 실리카겔칼럼크로마토그래피로 정제하여 황색의 유상물 6.1g 을 얻었다. (N-벤질옥시카르보닐-1,8-디아미노옥탄으로부터의 수율: 74%)
(i) [4-(N-벤질옥시아미노)-2-이소부틸숙시닐]-L-트립토판-N-(8-N-벤질옥시카르보닐아미노옥틸)아미드 : (화합물 4)
화합물 1a 의 합성예와 동일하게, L-트립토판-N-(4-N-벤질옥시카르보닐아미노부틸)아미드 대신에 L-트립토판-N-(8-N-벤질옥시카르보닐아미노옥틸)아미드 (2.07g, 4.5 m㏖) 를 원료로서, 표제화합물 2.5g 을 얻었다 (수율 85%). 단, 반응용매는 DMF 30 ㎖ 로 하고, 반응시간은 2 일간으로 하였다. 또한, 감압농축한 반응잔류물은 아세트산에틸로 희석하고, 재추출은 실시하지 않았다. 실리카겔칼럼크로마토그래피 정제의 용출용매에는, 클로로포름 및 1:1의 클로로포름 및 아세톤 혼합물을 사용하였다. 얻어진 표제화합물은, 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(j) [4-(N-히드록시아미노)-2(R)-이소부틸숙시닐]-L-트립토판-N-(8-N-아미노옥틸)아미드 : (화합물 5)
[4-(N-히드록시아미노)-2(S)-이소부틸숙시닐]-L-트립토판-N-(8-N-아미노옥틸)아미드 : (화합물 6)
화합물 2 및 화합물 3 의 합성예와 마찬가지로, (4-(N-벤질옥시아미노)-2-이소부틸숙시닐)-L-트립토판-N-(4-N-벤질옥시카르보닐아미노부틸)아미드 (1) 대신에 (4-(N-벤질옥시아미노)-2-이소부틸숙시닐)-L-트립토판-N-(8-N-벤질옥시카르보닐아미노옥틸)아미드 (화합물 4) 2.5g (3.4 m㏖) 을 원료로서, 표제화합물 5 및 표제화합물 6 의 디아스테레오 혼합물 (화합물 7) 1.7g 을 얻었다 (수율 100%). 이 디아스테레오 혼합물 중, 360 ㎎ 을 역상 HPLC 로, 디아스테레오머를 각각 분취정제하여, 동결건조를 실시하고, 표제화합물 5 (친수성측의 피크) 의 TFA 염 151 ㎎ 과, 표제화합물 6 (소수성측의 피크) 의 TFA 염 147 ㎎ 을, 각각 얻었다.]
화합물 5:
(k) N-벤질옥시카르보닐-4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민
상기 (a) 에 있어서의 N-벤질옥시카르보닐-1,4-디아미노부탄의 합성과 마찬가지로, 1,4-디아미노부탄 대신에, 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민을 출발원료로서 표제화합물을 유상물 5.0g 으로 얻었다 (수율 39%).
(l) N-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐-L-트립토판-N-(13-N-벤질옥시카르보닐아미노-4,7,10-트리옥사-트리데카닐)아미드
상기 (b) 에 있어서의 N-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐-L-트립토판-N-(4-N-벤질옥시카르보닐아미노부틸)아미드의 합성과 마찬가지로, N-벤질옥시카르보닐-1,4-디아미노부탄 대신에, N-벤질옥시카르보닐-4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민을 출발원료로서 표제화합물을 유상물 8.0g 으로서 얻었다 (수율 39%).
(m) L-트립토판-N-(13-N-벤질옥시카르보닐아미노-4,7,10-트리옥사-트리데카닐)아미드
상기 (c) 에 있어서의 L-트립토판-N-(4-N-벤질옥시카르보닐아미노부틸)아미드의 합성과 마찬가지로, N-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐-L-트립토판-N-(4-N-벤질옥시카르보닐아미노부틸)아미드 대신에, N-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐-L-트립토판-N-(13-N-벤질옥시카르보닐아미노-4,7,10-트리옥사-트리데카닐)아미드를 출발원료로서, 표제화합물을 유상물 4.2g 으로서 얻었다 (수율 78%).
(n)[4-(N-벤질옥시아미노)-(2R)-이소부틸숙시닐]-L-트립토판-N-(13-N-벤질옥시카르보닐아미노-4,7,10-트리옥사-트리데카닐)아미드 (화합물 8)
화합물 1a 의 합성예와 마찬가지로, L-트립토판-N-(4-N-벤질옥시카르보닐아미노부틸)아미드 대신에 L-트립토판-N-(13-N-벤질옥시카르보닐아미노-4,7,10-트리옥사-트리데카닐)아미드 (1.30g, 2.4m㏖) 와, 공지의 방법 (일본공개특허공보 평6-145148) 에 근거하여 합성한 4-(N-벤질옥시아미노)-(2R)-이소부틸숙신산 (0.56g, 2.0 m㏖) 을 원료로서, 표제화합물 8 을 1.15g (수율 72%) 의 무색 무정형 물질로 얻었다. 단, 반응용매는 DMF 20 ㎖ 로 하고, 반응온도는 15 내지 30℃, 반응시간은 6 시간으로 하였다. 또한, 감압농축한 반응잔류물은 아세트산에틸로 희석하고, 클로로포름층을 황산수소칼륨수용액, 물, 포화탄산칼륨수용액, 포화식염수로 순차 세정하고, 황산마그네슘으로 건조하였다. 실리카겔크로마토그래피 정제의 용출용매에는, 아세트산에틸 및 9:1의 디클로로메탄 및 메탄올의 혼합물을 사용하였다.
(o)[4-(N-히드록시아미노)-(2R)-이소부틸숙시닐]-L-트립토판-N-(13-N-아미노-4,7,10-트리옥사-트리데카닐)아미드 (화합물 9)
(4-(N-벤질옥시아미노)-(2R)-(이소부틸숙시닐)-L-트립토판-N-(13-N-벤질옥시카르보닐아미노-4,7,10-트리옥사-트리데카닐)아미드 (화합물 8) (1.90g, 2.4 m㏖) 을 메탄올 200 ㎖에 용해시켜, 탄산수소나트륨 200 ㎎ 을 첨가하여, 수소분위기 상압하, 10% Pd/C200㎎ 로 3 시간 접촉환원하였다. 반응액을 셀라이트로 여과하후, 감압농축하여 표제화합물 9 가 무색 무정형 물질로서 1.50g (수율 99%) 얻어졌다.
실시예 2 : 결합체의 합성예 1
MMP 억제제 (화합물 2) 70 ㎎ 에, N-메틸피롤리돈 0.49 ㎖ 과 피리딘 0.01 ㎖ 를 첨가하여 녹이고, 1M 염산 0.045 ㎖ 와 물로 pH 를 4.7 로 조정하고, 전량을 1 ㎖ 로 하였다. 이것을 히알루론산나트륨 5 ㎎ 에 첨가하여, 균일하게 하였다. 다시 pH 4.7 을 확인하고, 빙냉하, EDC 10㎎ 을 첨가하여 30 분간 교반하고, 그 후 15 내지 30 ℃에서 15 시간 교반하였다.
반응액에, 0.1M 중탄산나트륨 1 ㎖ 와 에탄올 6 ㎖ 를 첨가하여 침전시키고, 침전물은 알코올침전법 (침전을 0.2M 식염수 1 ㎖ 에 녹여, 에탄올 3 ㎖ 로 침전시켜, 침전을 원심분리한다) 을 3 회 반복함으로써 정제하여, 4.3 ㎎ 의 결합체 ("결합체 1") 을 얻었다.
인돌고리에서 유래하는 279㎚ 에서의 UV흡수로부터 산출된 결합율은, 0.84 중량% 이었다. 이것은, 0.76% 의 카르복실기가 반응된 것에 상당한다.
실시예 3 : 결합체의 합성예 2
MMP 억제제 (화합물 3) 70 ㎎ 에, N-메틸피롤리돈 0.49 ㎖ 과 피리딘 0.01 ㎖ 를 추가하여 녹여, 1M 염산 0.05 ㎖ 와 물로 pH 를 4.7 로 조정하고, 전량을 1 ㎖ 로 하였다. 이것을 히알루론산나트륨염 5 ㎎ 에 첨가하여, 균일하게 하였다. 다시 pH 4.7 을 확인하고, 빙냉하, EDC 10㎎ 을 첨가하여 30 분간 교반하고, 그 후 15 내지 30 ℃에서 20 시간 교반하였다.
반응액에, 0.1M 중탄산나트륨 1 ㎖ 와 에탄올 6 ㎖ 를 첨가하여 침전시키고, 침전물은 알코올침전법 (0.2M 식염수 1 ㎖ 에 녹여, 에탄올 3 ㎖ 로 침전시켜, 침전을 원심분리한다) 을 3 회 반복함으로써 정제하여, 3.5 ㎎ 의 결합체 ("결합체 2") 를 얻었다.
인돌고리에서 유래하는 279㎚ 에서의 UV흡수로부터 산출된 결합율은, 1.1 중량% 이었다. 이것은, 1.0% 의 카르복실기가 반응된 것에 상당한다.
실시예 4 : 결합체의 합성예 3
MMP 억제제 (화합물 7) 77 ㎎ 에, N-메틸피롤리돈 0.603 ㎖ 과 피리딘 0.012 ㎖ 를 추가하여 녹여, 1M 염산 0.105 ㎖ 와 물로 pH 를 4.7 로 조정하고, 전량을 1.23 ㎖ 로 하였다. 이것을 히알루론산나트륨 6.2 ㎎ 에 첨가하여, 균일하게 하였다. 다시 pH 4.7 을 확인하고, 빙냉하, EDC 24㎎ 을 첨가하여 4℃에서 3일간 교반하였다.
반응액에, 1 MNaOH 0.123 ㎖ 와 에탄올 0.5 ㎖ 를 첨가하여 빙냉하 30분간 교반한 후, 다시 에탄올 3 ㎖ 첨가하여 침전시키고, 침전물은 알코올침전법 (0.2M 식염수 1 ㎖ 에 녹여, 에탄올 3 ㎖ 로 침전시켜, 침전을 원심분리한다) 을 3 회 반복함으로써 정제하여, 6.0 ㎎ 의 결합체 ("결합체 3") 을 얻었다.
인돌고리에서 유래하는 279㎚ 에서의 UV흡수로부터 산출된 결합율은, 1.7 중량% 이었다. 이것은, 1.4% 의 카르복실기가 반응된 것에 상당한다.
실시예 5 : 결합체의 합성예 4
MMP 억제제 (화합물 7) 189 ㎎ 에, N-메틸피롤리돈 1.47 ㎖ 과 피리딘 0.03 ㎖ 를 추가하여 녹여, 1M 염산 0.24 ㎖ 와 물로 pH 를 4.7 로 조정하고, 전량을 3 ㎖ 로 하였다. 이것을 히알루론산나트륨 15 ㎎ 에 첨가하여, 균일하게 하였다. 다시 pH 4.7 을 확인하고, 빙냉하, EDC 87㎎ 을 첨가하여 4℃ 에서 24 시간 교반하였다.
반응액에, 0.1M 중조 1.5 ㎖ 와 에탄올 1.5 ㎖ 를 첨가하여 빙냉하 30 분간 교반한 후, 다시 에탄올 9 ㎖ 첨가하여 침전시키고, 침전물은 알코올침전법 (침전을 0.2M 식염수 3 ㎖ 에 녹여, 에탄올 9 ㎖ 로 침전시켜, 침전을 원심분리한다) 을 3 회 반복함으로써 정제하여, 13.9 ㎎ 의 결합체 ("결합체 4") 을 얻었다.
인돌고리에서 유래하는 279㎚ 에서의 UV흡수로부터 산출된 결합율은, 4.9 중량% 이었다. 이것은, 3.9% 의 카르복실기가 반응된 것에 상당한다.
실시예 6 : 결합체의 합성예 5
결합체의 합성예 3 과 동일한 원료나 시약을 사용하여, 동일한 조작을 실시한 바, 5.7 ㎎ 의 "결합체 5" 를 얻었다.
인돌고리에서 유래하는 279㎚ 에서의 UV흡수로부터 산출된 결합율은, 결합체의 합성예 3 일 때와 재현성좋게, 1.7 중량% 이었다. 이것은, 1.4% 의 카르복실기가 반응한 것에 상당한다.
실시예 7 : 결합체의 합성예 6
MMP 억제제 (화합물 9) 145 ㎎ 에, N-메틸피롤리돈 0.89 ㎖ 와 피리딘 0.02 ㎖ 를 추가하여 녹여, 6M 염산 0.09 ㎖ 와 물로 pH 를 4.7 로 조정하고, 전량을 1.82 ㎖ 로 하였다. 이것을 히알루론산나트륨 9.1 ㎎ 에 첨가하여, 균일하게 하였다. 다시 pH 4.7 을 확인하고, 빙냉하, EDC 35㎎ 을 첨가하여 4℃ 에서 24 시간 교반하였다.
반응액에, 0.1M 중탄산나트륨 0.375 ㎖ 와 에탄올 0.375 ㎖ 를 첨가하여 빙냉하 30 분간 교반한 후, 다시 에탄올 5 ㎖ 첨가하여 침전시키고, 침전물은 알코올침전법 (침전을 0.2M 식염수 2 ㎖ 에 녹여, 에탄올 6 ㎖ 로 침전시켜, 침전을 원심분리한다) 을 3 회 반복함으로써 정제하여, 8.2 ㎎ 의 결합체 ("결합체 6") 을 얻었다.
인돌고리에서 유래하는 279㎚ 에서의 UV흡수로부터 산출된 결합율은, 1.0 중량% 이었다. 이것은, 0.70% 의 카르복실기가 반응한 것에 상당한다.
실시예 8 : 결합체의 합성예 7
N-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복시미드 8.9 ㎎ 를 물에 녹여, 피리딘 0.01 ㎖ 와 염산 0.07 ㎖ 와 물로 pH 를 4.7 로 조정하고, 전량을 1 ㎖ 로 하였다. 이것을 히알루론산나트륨 5 ㎎ 에 더하여 균일하게 하였다. 빙냉하, EDC 9.6 ㎎ 을 첨가하여 4 ℃ 에서 17 시간 교반하였다. 빙냉하, 2% 아세트산나트륨완충액 (pH6) 0.5 ㎖ 를 첨가한 후, 아세톤 4 ㎖ 를 첨가하여 침전을 석출시켰다. 침전을 원심분리하여 감압으로 건조하였다.
MMP 억제제 (화합물 9) 의 TFA 염 (화합물 10) 86 ㎎ [MMP 억제제 (화합물 9) 를 0.1% TFA 를 함유하는 증류수에 현탁하고, 동결건조함으로써 얻었다] 을, N-메틸피롤리돈 0.49 ㎖ 와 피리딘 0.01 ㎖ 를 첨가하여 녹여, 1M 염산 0.035 ㎖ 와 물로 pH 를 8.0 으로 조정하고, 전량을 1 ㎖ 로 하였다. 이것을 상술의 침전물에 첨가하여, 4 ℃ 에서 3 일간 교반하였다.
반응액에, 2M 식염수 0.2 ㎖ 와 에탄올 3 ㎖ 를 첨가하여 침전시키고, 침전물을 원심분리하였다. 이 침전에 0.2M 식염수 1 ㎖ 와 1M 수산화나트륨수용액 0.06 ㎖ 를 첨가하여, 빙냉하 1 시간 교반하여 가용화시켜, 에탄올 3 ㎖ 로 침전을 석출시키고, 침전을 원심분리하였다. 다시, 이 침전에 0.2M 식염수 1 ㎖ 와 1M 수산화나트륨수용액 0.06 ㎖ 를 첨가하여, 빙냉하 3 시간 교반하여 가용화시키고, 에탄올 3 ㎖ 로 침전을 석출시키고, 침전을 원심분리하였다. 계속해서, 침전을 0.2M 식염수 1㎖ 에 녹여, 에탄올 3 ㎖ 로 침전시키고, 침전을 원심분리하고, 다시 이 침전을 90% 에탄올/물로 현탁하여 원심분리한 후, 물에 녹여 동결건조함으로써, 6.0 ㎎ 의 결합체 ("결합체 7") 를 얻었다.
인돌고리에서 유래하는 279 ㎚ 에서의 UV 흡수로부터 산출된 결합율은, 1.1 중량% 이었다. 이것은, 0.78% 의 카르복실기가 반응한 것에 상당한다.
실험예 1 : 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP) 억제활성
콜라게나아제-1, 스트로멜리신-1. 젤라티나아제 A 및 젤라티나아제 B 에 대한 "결합체 1", "결합체 7"및 HA 의 효소억제활성을 측정하였다. 또한, 콜라게나아제-1 과 스트로멜리신-1 에 대한 억제활성은, 야가이사제조의 I형 콜라게나아제활성 측정 키트와 스트로멜리신-1 측정키트를, 또한, 젤라티나아제A 와 젤라티나아제B 에 대한 억제활성은, 로슈·다이아그노스틱사 제조의 젤라티나아제활성 측정키트를 각각 사용하여 측정하였다. 결과는, 약물비첨가시의 효소활성을 100 으로 했을 때의 효소활성의 평균치로 표시하였다 (n=2). 도 1, 도 2, 도 8 및 도 9 에 나타낸 바와 같이, "결합체 1"및 "결합체 7"은 이들 4 종류의 어느 효소에 대해서도 억제활성을 갖고 있었지만, HA 는 억제활성을 나타내지 않았다.
이들의 실험결과로부터, "결합체 1"및 "결합체 7"은 HA 에는 없는, MMP 억제활성을 갖고 있는 것이 판명되었다.
실험예 2 : 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP) 억제활성에 대한 스페이서의 영향
특허 제 2736285 호 공보기재의 MMP 억제제 (N-[2-이소부틸-3-(N'-히드록시카르보닐아미드)-프로파노일]-L-트립토판메틸아미드 : 화합물1) 와 HA 간의 스페이서길이를 C4 로부터 C10 으로 변경한 4 종류의 결합체 ("결합체 1", "결합체 3", "결합체 4" 및 "결합체 6") 에 대하여, 젤라티나아제A 및 젤라티나아제B 에 대한 억제활성을 비교하였다. 결과는, 약물비첨가시의 효소활성을 50% 억제하는데 필요한 약물농도 (IC50값) 로 나타냈다 (하기 표 1). 스페이서가 길어짐에 따라, 젤라티나아제A 에 대한 억제활성이 강해지는 경향이 약간 보였지만, 이들 4 종류의 결합체간에서 억제활성에 큰 차이는 볼 수 없고, 이 결과로부터, 동일합성법 (HA 와 MMP 억제제를 혼합한 후, 축합제를 첨가하는 방법) 으로 조제한 결합체 1 내지 4 간에서 비교하면, 억제활성에 미치는 스페이서 길이의 영향은 적은 것으로 생각되었다.
또한, "결합체 6"과, HA 와 미리 활성에스테르로 한 후, MMP 억제제를 첨가하여 반응시키는 방법으로 합성한 "결합체 7"을 비교하면, 스페이서는 동일하면서 억제제의 결합량은 거의 동일함에도 불구하고, 젤라티나아제A 의 억제활성에는 약 10 배의 차이가 보였다. 이 것으로부터, 합성법의 차이에 따라, 결합후의 MMP 억제제의 억제활성은, 결합전의 억제활성으로부터 변화할 가능성이 시사되었다.
MMP 억제활성에 미치는 스페이서의 영향
결합체 스페이서 효소억제활성(IC50, mg.ml)
젤라티나아제 A 젤라티나아제 B
결합체1결합체3결합체4결합체6결합체7 C4H8-NH-C8H16-NH-C8H16-NH-C10H20O3-NH-C10H20O3-NH- 10.70.20.20.02 0.030.040.02NT0.01
실험예 3 : 콜라겐 필름 파괴에 대한 억제활성
Gavrilovic,J 등의 방법 (Cell. Biol. Int. Reports, 9, 1097-1107(1985)) 에 따라 실시하였다. 생후 3 내지 6 주된 토끼 무릎관절에서 콜라게나아제처리에 의해 회수한 관절연골세포를, 0.2% 의 락토알부민을 함유하는 500 ㎕ 의 Dulbeco's modified eagle's medium(DMEM) 에 부유시켜, 부유액 500 ㎕ 씩을,14C 로 라벨한 모르모트 피부유래 타입 I 형 콜라겐 필름으로 프레코트된 48 웰배양 플레이트상에 파종하였다. "결합체 3"또는 HA 를 인터루킨1 (1 ng/㎖) 과 플라스민 (100 ㎍/㎖) 존재하, 37℃ 의 CO2인큐베이터내에서 72 시간 배양하였다. 배양종료후, 배양상등액과, 잔존하는 콜라겐필름을 콜라게나아제처리한 소화액을 회수하고, 각각의 방사활성을 액체 신티레이션카운터로 측정하였다. 결과는 하기의 식에 따라, 파괴된 콜라겐 필름의 파괴율 (%) 의 평균치로서 산출하였다 (n=2).
콜라겐 필름 파괴율 (%) = [(배양상등액중의 방사활성)/(배양상등액중의 방사활성 + 잔존한 콜라겐 필름중의 방사활성)]×100
도 3 에 나타낸 바와 같이, "결합체 3"은 인터루킨1 과 플라스민에 의해 유도된 세포성의 콜라겐파괴를 억제하였으나, HA 는 억제효과를 나타내지 않았다.
이 결과로부터, HA 와 MMP 억제제와의 결합체는, HA 에서는 억제할 수 없는 관절연골세포에 의한 콜라겐파괴에 대해서도 우수한 억제효과를 갖는 것이 명확해졌다.
실험예 4 : 결합체의 결합안정성 1
"결합체 5"를 1 ㎎/㎖ 의 농도로 생리식염수에 용해 (이 시점에서의 pH=6.3 이었음) 하고, 37℃ 에서 항온배양하여, 겔여과 크로마토그래피로 결합체의 변화를 분석하였다.
칼럼은 TSKgelG4000PW (7.5㎜I.D.×30㎝, 도오소사 제조, 용출용매는 20% 에탄올을 포함하는 50 mM 인산완충액 (pH6), 컬럼온도는 40℃ (L-7300, 히타치사제), 유속은 0.7 ㎖/분 (L-7100, 히타찌사제), 검출에는 다이오드어레이검출기 (L-7450H, 히타찌사 제조) 를 사용하였다.
40 ㎕ 의 용해액을 주입했을 때의, 보이드의 인돌고리 유래의 279 ㎚ 에서의 흡수에 의한 면적을 0일, 2일, 5일로 추적한 바, 변화는 볼 수 없었다 (도 4). 또한, 이 5일간에, 저분자량 영역으로의 새로운 피크의 출현은 HPLC 상 볼 수 없었다.
이 결과로부터, "결합체 5"의 HA 와 MMP 억제제와의 사이의 결합이 양호한 결합안정성이 나타났다.
실험예 5 : 결합체의 결합안정성 2
화합물1, 화합물 1 과 HA 의 혼합물 및 "결합체 4"를, 각각 Millipore 사제의 막구멍 직경 25 ㎚ 의 반투막 (TypeHC) 으로 구분하여, 등장인산완충액 용액 (pH7.4) 를 채운 확산셀 (공여측 : 1.5 ㎖, 수용측 : 8.0 ㎖) 에 넣어, 공여측으로부터 수용측으로의 누출을 측정파장 350 ㎚ 의 형광강도로부터 산출하여, 투과율로서 나타냈다 (도 5). 여기에서 투과율 100% 란, 약물전량이 확산되어, 셀내가 균일해진 때의 농도를 의미한다.
1. 화합물1 50 n㏖
2. 화합물1 50 n㏖ 과 HA 0.5 ㎎ 의 혼합물
3. "결합체 4" 0.5 ㎎ (화합물 150 n㏖ 상당이 결합)
화합물1 및 화합물 1 과 HA 의 혼합물의 경우, 화합물 1 은 신속하게 막을 투과하여, 어셉터측으로 확산했으나, "결합체 4"는 8 시간까지 투과하지 않고, 24, 48 시간에 2.8, 3.6% 가 각각 투과하는데 그쳤다.
이 결과로부터 "결합체 4"의 HA 와 MMP 억제제와의 사이의 결합이 양호한 결합안정성이 나타났다.
실험예 6 : 관절내 보유성
생후 9 내지 10 주된 래트 (n=4내지10) 의 오른쪽 무릎관절내에 이하의 약물 (1 내지 3) 을 투여후, 시간의 경과에 따라 동물을 도살하여, 계 0.5 ㎖ 의 생리식염수로 관절강내를 세정하여 관절액을 회수하였다.
1. 화합물1 30 n㏖
2. 화합물1 30 n㏖ 과 HA 0.3 ㎎ 의 혼합물
3. "결합체 4"0.3 ㎎ (화합물 130 n㏖ 상당이 결합)
로슈·다이아그노스틱사 제조의 젤라티나아제활성 측정키트를 사용하여, 하기의 식에 의해, 관절액의 젤라티나아제B 에 대한 억제활성을 산출하였다.
젤라티나아제B 억제활성 (%) = [(관절액 비존재하의 효소활성 - 관절액 첨가시의 효소활성)/관절액 비존재하의 효소활성]×100
화합물1 과 "결합체 4"의 젤라티나아제B 에 대한 용량·억제곡선을 근거로, 화합물1 단독 및 화합물1 과 HA 의 혼합물 투여군에서는 화합물1 의 그 자체, "결합체 4"투여군에서는 "결합체 4"에 결합한 화합물1 상당량을 약물량으로서, 관절액중에 잔존하는 약물량을 산출하였다. 결과는 평균값으로 표시하였다. 도 6 에 나타낸 바와 같이, 화합물1 단독 및 화합물1 과 HA 의 혼합물투여군에서는, 관절내에 잔존한 약물량은, 모두 투여 2 시간후에는 투여량 (도면중의 0 시간째의 약물량) 의 약 1/3000 으로 감소하고, 화합물1 단독투여군에서는 투여 6 시간, 화합물 1/HA 의 혼합물 투여군에서는 투여 17 시간후에, 각각 투여량의 1/300000으로까지 감소되었다. 이것에 대하여 "결합체 4"투여군에서는, 투여 2 시간후에는 투여량의 2/5, 투여 17 시간후에서도 투여량의 1/10 정도의 약물이 잔존되어 있었다.
도 7 에는, 투여직후 (도면의 0 시간째), 2 시간 및 17 시간후에 각 약물투여군에서 회수된 관절액의 젤라티나아제B 억제활성을 나타냈다. 결과는 평균치 ±표준편차로 표시하였다. 화합물1 단독 및 화합물 1 과 HA 와의 혼합물 투여군의 관절액의 젤라티나아제B 억제활성은, 모두 투여 2 시간후에는 20%, 투여 17 시간후에는 5% 이하로까지 감소한 것에 대하여, "결합체 4"투여군에서는 투여 17 시간후에도 50% 정도 잔존하여 있었다.
이들의 결과로부터, HA 와 MMP 억제제와의 결합체는, 관절강내에서의 MMP 억제제의 보유성을 높이기 위한 수단으로서, 매우 우수한 수단이 되는 것이 밝혀졌다. 또한, HA 와 MMP억제제와의 결합체는, 관절강내에서도 장시간에 걸쳐 MMP 억제활성을 유지하고, 단회의 관절내투여에서도 장기에 걸쳐 관절파괴를 억제할 가능성이 시사되었다.
즉, 본 발명의 MMP 억제제와 HA 와의 결합체는, 각각 단독, 및 MMP 억제제와 HA 와의 합제보다도, 관절질환 치료제으로서의 효과 및 보유성이 우수한 것이 시사되었다.
실험예 7 : 관절연골 콜라겐 파괴에 대한 억제활성
Saito,S 등의 방법 (J.Biochem,122, 49-54(1997) 에 따라 실시하였다. 7주예의 토끼 무릎관절에서 관절연골의 소편 (약 10 ㎎) 을 조제하여, 48 웰배양 플레이트상에서 500 ㎕ 의 Dulbeco's modified eagle's medium (DMEM) 중, 24 시간 배양하였다. 배양액을 500 ㎕ 의 0.2% 락토알부민을 함유하는 DMEM 으로 교환후, "결합체 7"또는 HA 를 첨가하여, 인터루킨1 (1 ng/㎖) 과 플라스미노겐 (100 ㎍/㎖) 의 존재하, 37℃ 의 CO2인큐베이터내에서 10일간 배양하였다. 배양종료후, 배양상등액과, 연골잔류물을 파파인 처리한 소화액을 회수하고, 최종농도 6N 이 되도록 염산을 첨가하여, 110℃ 의 오토클레이브내에서 2 시간 가수분해를 실시하였다. N2가스분무에 의해 시료를 건고후, 5 mM 의 EDTA 를 함유하는 0.1M 인산완충액 (pH 6.5) 에 용해하고, 마이크로플레이트를 사용한 비색정량법에 의해, 히드록시프롤린량을 측정하였다. 결과는 하기의 식에 따라, 관절연골 소편중에서 배양액중으로의 히드록시프롤린양의 유리율 (%) 의 평균치 ±표준편차로 나타냈다 (n=4).
히드록시프롤린 유리율 (%) = [배양상등액중의 히드록시프로린양/(배양상등액중의 히드록시프롤린양 + 연골잔류물중의 히드록시프롤린양)]×100
도 10 에 나타낸 바와 같이, "결합체 7"은, 1㎎/㎖ 의 농도에 있어서, 인터루킨1 과 플라스미노겐에 의해 유도된 연골콜라겐의 파괴를 유의하게 억제하였는데, HA 는 유의하게 억제되지 않았다.
이 결과로부터, HA 와 MMP1 과의 결합체는, 직접의 표적조직인 관절연골의 파괴에 대해서도, 명확한 억제작용을 갖는 것이 나타났다.
또한, 본 출원이 주장하는 우선권의 기초가 되는 일본특허출원 평성10년 제 138329 호, 동평성10년 제 224187 호 및 동평성 11년 제 43064 호의 명세서에 기재의 내용은 전부 인용에 의해 본 명세서중에 삽입되는 것으로 한다.
본 발명의 결합체는, 예컨대, 투여된 관절강내에 있어서, 통상의 HA 제제와 마찬가지로 장기간 보유되고, 또한 분자중의 히드록삼산은 HA, HA 유도체 또는 그의 염에 결합된 상태로 국소의 MMP 를 억제한다. 따라서, 기존 기술에서는 이룰 수 없었던 관절질환 치료제 (예컨대, MMP 억제제) 의 투여부위 (예컨대, 무릎, 어깨 등의 관절을 들 수 있음) 에서의 국재의 장기화 및 투여회수의 저감이 가능하고, 종래의 전신투여에 비하여, 관절질환 치료제의 부작용을 대폭적으로 경감시키는 것이 기대된다.
또한, 투여부위에 있어서, HA 제제의 유효 성분인 HA, HA 유도체 또는 그의 염 또는 관절질환 치료제성분은 약효를 발휘하여, 해리, 분리되지 않고 그들의 활성을 나타낼 수 있는 목적한 상승효과를 기대할 수 있다.
이상의 점으로부터, 본 발명의 결합체는, 관절질환 치료제 (예컨대, 히드록삼산 등의 MMP 억제제) 및 HA, HA 유도체 또는 그의 염으로서의 유용성을 강화시키고, 그러므로, 관절파괴억제작용이 강화된 약제로서 유용하며, 상기 결합체는 변형성관절병, 만성관절 류머티즘 또는 어깨 관절주위염을 치료하는 효과적인 약물로서 기대된다.

Claims (17)

  1. (1) 하나 이상의 관절질환 치료제 및 (2) 히알루론산, 히알루론산 유도체 또는 그의 염의 결합체.
  2. 제 1 항에 있어서, 하나 이상의 관절질환 치료제 및 히알루론산, 히알루론산 유도체 또는 그의 염의 결합이 공유결합인 결합체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 관절질환 치료제가 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제인 결합체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제가 스페이서를 통하여 히알루론산, 히알루론산 유도체 또는 그의 염과 결합된 결합체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제의 중량비가 결합체 전체에 대하여 0.01 내지 50% 인 결합체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제가 히드록삼산 잔기인 결합체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제가, 화학식 1로 표시되는 히드록삼산 잔기인 결합체:
    [화학식 1]
    [식중, R1은 수소원자, 히드록실기, 또는 탄소수 1 내지 8 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기를 나타내고;
    R2는 탄소수 1 내지 8 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기를 나타내며;
    R3는 시클로알킬기, 아릴기 또는 복소환기로 치환될 수 있는 탄소수 1 내지 8 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기를 나타내고;
    R4는 수소원자, 또는 탄소수 1 내지 4 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기를 나타낸다].
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서가 화학식 2로 표시되는 결합체:
    [화학식 2]
    -R5-R6-R7-R8- (2)
    [식중, R5는 탄소수 1 내지 8 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬렌기를 나타내고;
    R6은 탄소수 1 내지 4 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기로 치환될 수 있는 메틸렌기 또는 이미노기, 또는 산소원자를 나타내고;
    R7은 1 내지 3 개의 산소원자가 삽입될 수 있는 탄소수 1 내지 10 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬렌기를 나타내고;
    R8은 산소원자, 황원자, 또는 NR9(여기에서, R9는 수소원자, 또는 탄소수 1 내지 4 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기를 나타낸다) 를 나타낸다]
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제 및 스페이서의 결합체가 화학식 3으로 표시되는 결합체:
    [화학식 3]
    [식중, R12은 1 개의 이미노기 및/또는 1 내지 4 개의 산소원자가 삽입될 수 있는 탄소수 2 내지 23 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬렌기를 나타내고 ; R13은 수소원자, 또는 탄소수 1 내지 4 의 직쇄 또는 측쇄의 알킬기를 나타낸다].
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제가 히알루론산, 히알루론산 유도체 또는 그의 염과의 결합체 형태로 생체내에서 매트릭스 메탈로프로테아제를 억제하는 결합체.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 관절질환 치료제의 활성에 영향을 미치지 않는 부위를, 히알루론산, 히알루론산 유도체 또는 그의 염의 카르복실기, 히드록실기 또는 환원말단의 관능기에, 직접 화학반응에 의해 또는 스페이서를 통하여 결합시키는 것을 포함하는 결합체의 제조방법.
  12. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 결합체를 함유하는 약제 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 관절질환 치료제인 약제 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 관절질환이 변형성관절증, 만성관절 류머티즘 또는 어깨관절 주위염인 약제 조성물.
  15. 약제 조성물의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 결합체의 용도.
  16. 관절질환 치료제의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 결합체의 용도.
  17. 약제학적으로 유효량의 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 결합체를 유효성분으로 함유하는 약제 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 관절질환을 갖는 환자의 치료방법.
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