CZ200985A3 - Polymerní konjugáty paclitaxelu a docetaxelu s pH rízeným uvolnováním kancerostatika - Google Patents

Polymerní konjugáty paclitaxelu a docetaxelu s pH rízeným uvolnováním kancerostatika Download PDF

Info

Publication number
CZ200985A3
CZ200985A3 CZ20090085A CZ200985A CZ200985A3 CZ 200985 A3 CZ200985 A3 CZ 200985A3 CZ 20090085 A CZ20090085 A CZ 20090085A CZ 200985 A CZ200985 A CZ 200985A CZ 200985 A3 CZ200985 A3 CZ 200985A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
polymeric
ptx
drug
dtx
lev
Prior art date
Application number
CZ20090085A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ303072B6 (cs
Inventor
Etrych@Tomáš
Ulbrich@Karel
Ríhová@Blanka
Šírová@Milada
Original Assignee
Zentiva, K.S.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zentiva, K.S. filed Critical Zentiva, K.S.
Priority to CZ20090085A priority Critical patent/CZ303072B6/cs
Priority to UAA201115172A priority patent/UA104187C2/ru
Priority to EP10716267A priority patent/EP2413973A1/en
Priority to EA201190315A priority patent/EA022803B1/ru
Priority to PCT/CZ2010/000014 priority patent/WO2010091650A1/en
Publication of CZ200985A3 publication Critical patent/CZ200985A3/cs
Publication of CZ303072B6 publication Critical patent/CZ303072B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

V predloženém rešení je popsán polymerní konjugát, sestávající z derivátu cytostatika zvolených ze skupiny taxanu, jmenovite paclitaxelu (PTX), docetaxelu (DTX) nebo larotaxelu (LTX) a polymerního nosice pripraveného na bázi lineárního nebo biodegradabilního roubovaného kopolymeru tvoreného jednotkami základního kopolymeru N-(2-hydroxypropyl)methakroylamidu (HPMA) a jednotkami obsahujícími methakryloylovaný hydrazon aminokyselin nebo oligopeptidu. Dále rešení obsahuje zpusob prípravy uvedeného polymerního konjugátu, pricemž polymerní nosic je podroben polymeranalogické premene nosice reakci s esterem oxo-kyseliny a cytostatika. Polymerní konjugát se používá pro prípravu léciva k lécbe nádorových onemocnení.

Description

Polymerní konjugáty paclitaxelu a docetaxelu s pH řízeným uvolňováním kancerostatika
OBLAST TECHNIKY
Vynález se týká struktury a vlastností vodorozpustných polymemích terapeutik (pro-drug) na bázi derivátů paclitaxelu (PTX), docetaxelu (DTX) a Larotaxelu (LTX) určených především pro léčbu pevných nádorů při terapii nádorových onemocnění v humánní medicíně.
DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY
Trendy vývoje léčiv se v poslední době velmi často zaměřují na vývoj lékových forem umožňujících specifický účinek léčiva pouze v místě požadovaného terapeutického efektu. Takto cíleně působící biologicky aktivní látky nalézají uplatnění zejména v oblastech, kdy nežádoucí vedlejší účinky léčiva mohou vést k poškození zdravých částí organizmu. Toto nebezpečí je zvláště aktuální pří léčbě cytotoxickými látkami při chemoterapii nádorových onemocnění. Je známo, že připojení cytostatika k vodorozpustnému polymemímu nosiči chemickou vazbou umožňuje zvýšit rozpustnost jinak nerozpustných nebo málo rozpustných léčiv a výrazně snížit jejich přímou toxicitu. Vysoká molekulová hmotnost polymeru zabraňuje rychlému vyloučení léčiva z organizmu glomerulámí filtrací, a tím zajišťuje prodlouženou dobu cirkulace v krvi a setrvání v organizmu a tím i časově delší biologickou využitelnost léčiva.
V minulosti bylo připraveno a studováno mnoho polymemích konjugátů kancerostatik s rozpustnými polymery, ve kterých bylo léčivo s protinádorovým účinkem připojeno k polymeru neštěpitelnou kovalentní vazbou, hydrolyticky nestabilní iontovou vazbou a nebo kovalentní vazbou umožňující řízené uvolnění léčiva a tím i jeho aktivaci na základě enzymatické či prosté chemické hydrolýzy této vazby. Obecně jsou polymerní nosičové systémy konstruovány tak, aby byly schopné uvolnit terapeuticky aktivní kancerostatikum z nosiče buď v nádoru, nebo i více specificky, přímo v nádorové buňce. Významnou skupinu polymemích terapeutik tvoří polymerní léčiva připravená na bázi kopolymerů N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA), z nichž je řada aktivně směrována k nádorům prostřednictvím k polymeru připojené směrující struktury (protilátky, lektinu, hormonu). [Duncan 1985, Říhová 2000, Kopeček 2001, 2000, Duncan, 2005;Satchi-Fainaro et al., 2006]. Jejich syntéza je však značně složitá. Při vývoji polymemích kancerostatik bylo rovněž ukázáno, že pro specifickou dopravu léčiva do místa výskytu nádoru není nutné použít aktivně směrovaného nosiče, ale výrazně zvýšené akumulace polymemích cytostatik, zvláště v pevných nádorech, může být dosaženo zvýšením molekulové hmotnosti polymemího terapeutika nad vylučovací mez nosiče ledvinami (t.zv. pasivní směrování do pevných nádorů). Tato schopnost makromolekul akumulovat se v pevných nádorech byla nazvána EPR efektem (Enhanced Permeability and Retention) a bylo ukázáno, že se tento efekt významně projevuje i u nosičů na bázi kopolymerů HPMA [Noguchi et al., 1998;Seymour et al., 1995].
Jedním z hlavních problémů použití HPMA kopolymerů jako pasivně směrovaných vysokomolekulámích nosičů je jejich neštěpitelný uhlíkatý řetězec a z organizmu vyloučitelné jsou pouze polymery nepřesahující molekulovou hmotnost 40 - 50 000 g/mol. To znamená, že nemá-li dojít po opakovaném podání léčiva k hromadění polymeru v organizmu a má-li být molekulová hmotnost nosiče co nejvyšší, aby bylo pasivní směrování co nejúčinnější, musí být polymemí nosič konstruován jako v organizmu degradovatelný. Takové polymemí nosiče na bázi HPMA kopolymerů byly nedávno vyvinuty a jejich struktura byla patentována [Chytil et al., 2008;Etrych et al., 2008, Chytil PV 2006-207, Etrych PV 2006 - 592],
V literatuře existuje celá řada informací o přípravě a studiu vlastností polymerů nesoucích kancerostatikum připojené k polymeru vazbou náchylnou k hydrolýze ve vodném prostředí [Kratz 1999]. Mezi nimi zaujímají významné postavení kopolymery HPMA, nesoucí kancerostatikum doxorubicin vázaný k polymemímu řetězci hydrolyticky štěpitelnou hydrazonovou vazbou [Etrych 2002, Ulbrich 2004a, Ulbrich 2004b, Ulbrich pat CZ 293787 B6]. Tato vazba je relativně stálá v prostředí krevního řečiště (v průběhu transportu v organizmu) a hydrolyticky labilní v mírně kyselém prostředí živé buňky. Rychlost hydrolýzy této vazby řídí i rychlost uvolňování léčiva, a tedy i koncentraci aktivní látky v místě požadovaného účinku. Takováto polymemí kancerostatika vykazovala při in vitro i in vivo testech na myších podstatně vyšší protinádorovou účinnost proti řadě nádorových linií nežli volné léčivo a v řadě případů vedlo jejich použití k úplnému vyléčení pokusných zvířat i při terapeutickém způsobu podání. [Říhová 2001, Etrych 2001], Zvýšení molekulové hmotnosti nosiče (biodegradovatelné roubované polymery, micelámí a nanogelové systémy) vždy vedlo ke zvýšení účinnosti protinádorové aktivity léčiva ověřované v in vivo systémech.
Paclitaxel a docetaxel patří do skupiny taxanů, protinádorových léčiv rutině používaných při léčbě ovariálních nádorů a nádorů prsu, plic, prostaty a dalších [Vanhoefer at al., 1997], Kromě vedlejší toxicity běžné u kancerostatik je jejich další nevýhodou velmi malá rozpustnost ve vodných roztocích a tedy nezbytnost podání v různých excipientech, především v Cremoforu EL, což rovněž vede k dalším vedlejším účinkům lékové formy. Při některých schématech podání může dokonce podání taxanů v Cremophoru EL významně snižovat efekt léčby [Ng at al., 2006],
Vazbou těchto léčiv na polymemí nosiče (PEG, HPMA kopolymer, poly(glutamová kyselina) byla získána ve vodě velmi dobře rozpustná pro-léčiva, s prodlouženou dobou cirkulace v organizmu a zvýšenou akumulací v pevných nádorech. Jejich protinádorová aktivita byla ověřována in vivo na zvířecích modelech a v některých případech i klinicky. Tak paclitaxel (PTX) byl kovalentně vázán na poly(ethylenglykol) (PEG) neštěpitelnou esterovou nebo 7-karbamátovou vazbou (C2 -OH skupina) a nebo pomocí hydrolyticky labilní aminokyselinové spojky (Ala, Gly) [Greenwald et al., 1995;Greenwald, 2001;Greenwald et al., 2OO3;Pendri et al., 1998]. Bylo ukázáno, že protinádorová aktivita konjugátu závisí na struktuře použité vazby mezi polymerem a léčivem a že významným faktorem je i molekulová hmotnost nosiče. Konjugát s PTX byl testován ve fázi I klinických testů [Satchi-Fainaro et al., 2006], ale zřejmě s malým úspěchem.
Mnohem úspěšnější v klinických testech se ukazuje být konjugát paclitaxelu s poly(glutamovou kyselinou) (Xyotax) [Winter 2005, Kratz et al., 2008], V tomto konjugátu je PTX vázán na polyaminokyselinový nosič esterovou vazbou přes -OH skupinu v pozici 2. K uvolnění léčiva dochází v důsledku degradace polymemího řetězce, vzniku Glu derivátu PTX a jeho následné hydrolýzy. V současné době je tento konjugát ve fázi III klinických testů.
Paclitaxel byl rovněž vázán na HPMA kopolymery esterovou vazbou za použití biodegradovatelné oligopeptidové GlyPheLeuGly spojky. Bylo ukázáno, že PTX se po inkubaci s lysozomálními enzymy uvolňuje z nosiče a toto uvolnění je důležité pro dosažení protinádorové aktivity in vivo. PNU166945 je konjugát HPMA kopolymeru s esterově vázaným PTX, který byl klinicky testován ve fázi I [Terwogt et al., 2000;Terwogt et al., 2001], po této fázi však bylo další testování zastaveno. Z výše uvedených výsledků je zřejmé, že konjugace paclitaxelu s polymemím nosičem vede k výraznému zlepšení vlastností léčiva (rozpustnost, zlepšená biologická využitelnost). Má-li však léčivo najít uplatnění v humánní medicíně, je třeba pečlivě volit a na míru připravit jak strukturu a molekulovou hmotnost nosiče, tak i strukturu spojky mezi polymerem a léčivem řídící rychlost a tedy i koncentraci léčiva v místě požadovaného účinku. Při vývoji optimálních struktur je nezbytné ověřit funkci těchto struktur ve vhodných in vivo modelech.
PODSTATA VYNÁLEZU
Polymemí léčivo podle vynálezu se vyznačuje tím, že je na vodorozpustný polymemí nosič připravený na bázi lineárního nebo roubovaného kopolymeru HPMA navázáno kancerostatikum ze skupiny taxanů, paclitaxel (PTX), docetaxel (DTX) nebo larotaxel (LTX) (dále léčiva). Léčivo je připojené kpolymemím řetězcům přes esterovou skupinu vzniklou acylací -OH skupiny v poloze 2 pomocí spojek (spacerů) obsahujících pH-senzitivní hydrolyticky štěpítelné hydrazonové vazby. Tyto spojky mohou být tvořeny kyselinovými zbytky různých oxokyselin, kterými je do struktury léčiv zavedena karbonylová skupina, spojených se zbytky jednotlivých aminokyselin, oligopeptidů a nebo dalšími strukturami dovolujícími zakončení postranních řetězců polymemího nosiče hydrazonovou skupinou. Molekulová hmotnost polymemího řetězce je v případě lineárního polymeru volena pod vylučovací mezí HPMA kopolymeru z organizmu, s výhodou v rozmezí 10 - 50 000 g/mol. V případě roubovaného kopolymeru je molekulová hmotnost volena v rozmezí 50 - 250 000 g/mol.
Polymemí léčivo podle vynálezu je připraveno pro intravenózní (injekce nebo ínfuze) podání v roztoku, může být ale podáno i intratumorálně či intraperitoneálně a je určeno pro léčbu pevných nádorů. Polymer s chemicky vázaným cytostatikem je konstruován tak, aby byl stabilní v průběhu cirkulace v krevním řečišti a nedocházelo k hydrolýze hydrazonové vazby mezi daným taxanem a polymerem, případně, aby byla rychlost hydrolýzy v průběhu transportu organizmem minimální (při pH v krevním řečišti 7,4) tak, aby se nemohl projevit cytotoxický efekt uvolněného léčiva či jeho derivátu. Celý systém je konstruován jako systém působící dvoufázově. Díky vhodné volbě molekulové hmotnosti nosiče, umožňující extravasaci ale i účinnou akumulaci v nádorové tkáni, by mělo po počáteční akumulaci léčiva v nádorové tkáni dojít k interakci s buněčnou membránou a k průniku molekulárně rozpuštěného polymemího léčiva do jednotlivých nádorových buněk pinocytózou. Uvnitř cílových buněk by mělo dojít v důsledku poklesu pH z vnějšího pH (7,4) na intracelulámí pH (5 - 6) k rychlé hydrolýze hydrazonové vazby a k uvolnění léčiva nebo jeho derivátu z nosiče. V následném kroku by mělo dojít k hydrolýze esterové vazby již z polymeru uvolněného derivátu léčiva chemickou hydrolýzou a nebo specifičtěji účinkem intracelulámích enzymů, např karboxyesteráz. Reálnost výše navrženého mechanizmu působení polymerních léčiv podle vynálezu je doložena experimenty modelového uvolňování léčiv zpolymemího nosiče. Výsledky těchto testů, včetně testů protinádorové aktivity, jsou uvedeny v příkladové části přihlášky.
Polymemí konjugáty s cíleným protinádorovým účinkem podle vynálezu se vyznačují tím, že cytostatikum (taxol, docetaxel, larotaxel) je připojeno prostřednictvím esterové vazby a spaceru na polymemí nosič tvořený lineárním [Etrych pat CZ 297827 B6, publ 2008] a nebo roubovaným [Etrych pat CZ 298945 (B6), publ 2008] HPMA kopolymerem prostřednictvím hydrolyticky labilní hydrazonové skupiny vzniklé reakcí karbonylové skupiny derivátu molekuly léčiva s hydrazidovou skupinou polymemího nosiče. Polymemí nosiče jsou připraveny zpravidla radikálovou roztokovou kopolymerizací HPMA s komonomery odpovídajícími požadovanému složeni. Vazbou příslušného taxanu na polymemí nosič dojde k výraznému snížení jeho cytotoxicity, výraznému zvýšení molekulové hmotnosti léčiva a tím k prodloužení doby cirkulace v krevním oběhu, dojde k prodloužení celkové doby setrvání léčiva v organizmu a tedy i ke zvýšení jeho biologické využitelnosti (bioavailability). Polymemí léčivo podle vynálezu se dále vyznačuje tím, že vazba léčiva k polymemímu nosiči je relativně stálá v průběhu transportu v krevním řečišti a tělních tekutinách a je hydrolyticky štěpitelná v mírně kyselém prostředí nádoru a zejména uvnitř cílových nádorových buněk v endozómech vyznačujících se mírně kyselým pH. To znamená, že léčivo je transportováno krevním řečištěm v neaktivní, na polymer vázané formě, a k jeho uvolnění a aktivaci dojde především až po průniku do cílových nádorových buněk. Aktivace léčiva až v cílových buňkách vede k eliminaci vedlejších účinků jinak toxických cytostatik a k zacílení jejich účinku přednostně na nádorové buňky. Za cílený (pasivní) transport do nádoru či nádorových buněk je odpovědný polymemí nosič připravený na bázi kopolymerů HPMA, jehož molekulová hmotnost a tedy i účinnost akumulace v nádorové tkáni může být řízena změnami ve struktuře skeletu polymemího nosiče (nedegradovatelný lineární polymer, vysokomolekulámí biodegradovatelný roubovaný polymer).
Oblastí použití předloženého vynálezu je použití polymemích léčiv podle vynálezu pro léčbu solidních nádorů při maligních onemocněních v humánní medicíně.
Syntéza a struktury polymemích konjugátů
Syntéza polymemích konjugátů podle vynálezu je prováděna v několika krocích, detailní finální struktura konjugátu významně záleží na zvolené syntetické cestě.
V prvním kroku syntézy jsou syntetizovány základní monomery: HPMA, methakryloylované deriváty aminokyselin a oligopeptidů zakončené hydrazidovou (CONHNH2) skupinou, případně zakončené hydrazidovou skupinou chráněnou t.-butyloxykarbonylovou skupinou (Boc).
Ve druhém kroku jsou syntetizovány polymemí prekurzory, tj, HPMA kopolymery nesoucí funkční skupiny (random copolymers) sloužící jako polymemí nosiče pro léčiva,
Polymerní prekurzor nesoucí podél řetězce funkční hydrazidové skupiny je možné připravit buď radikálovou kopolymerizací výše uvedených funkčních monomerů s HPMA, nebo polymeranalogickou přeměnou základního kopolymeru nesoucího funkční skupiny.
Roubované kopolymery jsou připraveny z multivalentních a semitelechelických HPMA kopolymerů podle postupu popsaného v [Etrych 2008 pat, publ ].
Základní kopolymer (prekurzor) je kopolymer HPMA a methakryloylovaných hydrazidů aminokyselin nebo oligopeptidů vybraných ze skupiny glycyl, glycylglycyl, β-alanyl, 6-aminohexanoyl (AH), 4-aminobenzoyl a nebo složený acyl vycházející z oligopeptidů GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly a GlyPheLeuGly) vyznačující se tím, že obsahuje 70 - 98 mol % HPMA a 2 - 30 % mol jednotek s hydrazidovými funkčními skupinami (viz Schéma 2. se spojkou tvořenou 6-aminohexanoylcm).
Derivát léčiva je sloučenina léčiva (PTX, DTX nebo LTX) vzniklá acylací hydroxylové skupiny v pozici 2 léčiva pnslusnou oxokyselinou. S výhodou byly použity následující oxokyseliny: kyselina levulová, 4-(2-oxopropyl) benzoová kyselina, 4-oxo-pent-2-enová a kyselina 5-oxo-hex-2-enová a 6-oxo-hept-2-enová (viz Schéma 1.).
Polymerní konjugát je sloučenina polymemího prekurzoru s derivátem léčiva, kde derivát léčiva je navázán na polymemí prekurzor hydrazonovou vazbou připravenou reakcí karbonylové skupiny derivátu léčiva s hydrazidovými skupinami polymeru, vyznačující se tím, že obsahuje 70- 98 mol % HPMA, 1,5 - 29,5 mol % jednotek s hydrazidovými funkčními skupinami a 0,5-10 mol % jednotek s hydrazonově navázaným derivátem léčiva (viz Schéma 3. se spojkou tvořenou 6-aminohexanoylem a kyselinou levulovou).
PŘEHLED OBRÁZKŮ
Obr. 1: Graf rychlosti uvolňování PTX a jeho derivátů z lineárních polymemích konjugátů v pufru o pH 5 (model intracelulámího prostředí).
Obr. 2: Graf rychlosti uvolňování PTX a jeho derivátů z lineárních polymemích konjugátů v pufru o pH 7,4 (model krevního řečiště).
Obr. 3: Přežiti myší C57BL/6 s lymfomem EL-4, kterým byl podán DTX, derivát LEV-DTX a lineární polymemí konjugát PHPMA-AH-NH-N=DTX-LEV. Dávky léčiv byly 2x20 mg ekvivalentu DTX/kg, konjugát PHPMA-AH-NH-N=DTX-LEV byl podán v dávce 2x20 a 2x40 mg ekvivalentu DTX/kg.
Obr. 4: Přežiti myší C57BL/6 s lymfomem EL-4, kterým byl podán derivát paclitaxelu LEVPTX a lineární polymemí konjugát PHPMA-AH-NH-N-PTX-LEV. Pro omezenou rozpustnost nemohl být podán PTX ve volné formě.
Obr. 5: Přežiti myší BALB/c s karcinomem mléčné žlázy 4T1, kterým byl podán paclitaxel, derivát paclitaxelu LEV-PTX a lineární polymemí konjugát PHPMA-AH-NH-N=PTX-LEV. PTX a PTX-LEV byly injikovány v dávce 2x30 mg ekvivalentu PTX v den 8 a 12 (viz. text), a konjugát PHPMA-AH-NH-N=PTX-LEV v dávce 2x60 mg ekvivalentu PTX/kg v den 8 a 12.
Obr. 6: Přežiti myší C57BL/6 s lymfomem EL-4, kterým byl podány lineární polymemí konjugáty PHPMA-AH-NH-N=DTX-LEV s obsahem DTX 8,2 % a 16,3 %, v dávce 2x30 mg ekvivalentu DTX i.v., den 9 a 13.
PŘÍKLADOVÁ PROVEDENÍ
Příklady provedení syntézy meziproduktů a konjugátů podle vynálezu
Příklad 1: Syntéza monomerů a derivátů léčiv
HPMA byl připraven podle dříve popsaného postupu [Ulbrich a kol. 2000]. Elementární analýza: vypočteno 58,8 % C, 9,16 % H, 9,79 % N; nalezeno 58,98 % C, 9,18 % H, 9,82 % N. Produkt byl chromatograficky čistý.
6-(Methakryloylamino)hexanoylhydrazin (Ařl-(6-hydrazino-6-oxohexyl)-2-methylakrylamid) (MA-AH-NHNH2) byl připraven podle dříve popsaného postupu [Ulbrich patenty, Etrych patent].
Ester kyseliny levulové a paclitaxelu (v pozici -OH 2) (LEV-PTX) byl připraven reakcí kyseliny levulové s paclitaxelem pomocí karbodiimidové metody (dicyklohexylkarbodiitnid, DCC) v A(N'-dimethylformamidu (DMF).
Kyselina levulová (19,4 mg, 0,167 mmol) a DCC (37,5 mg, 0,182 mmol) byly při laboratorní teplotě rozpuštěny každý v 0,15 mL DMF. Oba roztoky byly ochlazeny na -18 °C a smíchány. Po 20 minutách byl k tomuto roztoku přidán roztok paclitaxelu (100 mg, 0,117 mmol) a ΎΛ-dimethylaminopyridinu (DMAP) (14 mg, 0,117 mmol) v 0,3 mL DMF. Reakce probíhala 30 minut při -18 °C a 16 h při 4 °C. Průběh reakce sledován na TLC - destičky Silikagel 60 F2S4 (ethylacetát: hexan 1:1, Rf(PTX)= 0,25, Rf(LEV-PTX)= 0,15, Rf(Levulic acid)= 0,45). Produkt byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí pomocí chromatografie na koloně (60cm x 4cm) naplněné Silikagelem v ethylacetátu. Frakce obsahující produkt PTX-LEV byla zachycena a zahuštěna na 0,4 mL a produkt vysrážen do 20 mL diethyleteru. Produkt byl odsát, promyt malým množstvím diethyleteru a vakuově sušen do konstantní hmotnosti. Výtěžek činil 98 mg produktu (84 %) sbodem tání 136 až 138 °C. TLC (ethylacetát: hexan 1:1) jedna skvrna při Rf = 0,15. MALDI-TOF MS: 970 (M+Na),
Čistota všech monomerů a derivátů léčiv byla stanovena pomocí HPLC systému [Shimadzu HPLC systém vybavený kolonou s reverzní fází Chromolith Performance RP-18e (100x 4,6 mm) a UV—VIS detektoru Shimadzu SPD- lOAVvp (230 nm); eluent voda—acetonitril s gradientem 50- 100 vol.% acetonitrilu, průtok 0.5 mL-min-1],
Ester kyseliny levulové a docetaxelu (v pozici -OH 2) (LEV-DTX) byl připraven obdobně jako LEV-PTX reakcí kyseliny levulové s docetaxelem karbodiimidovou metodou (DCC) v DMF.
Kyselina levulová (38 mg, 0,327 mmol) a DCC (100 mg, 0,487 mmol) byly při laboratorní teplotě rozpuštěny každý v 0,25 mL DMF. Oba roztoky byly ochlazeny na -18 °C a smíchány. Po 20 minutách byl k tomuto roztoku přidán roztok docetaxelu (200 mg, 0,247 mmol) a A.AMimethylaminopyridinu (DMAP) (28 mg, 0,229 mmol) v 0,6 mL DMF. Reakce probíhala 30 minut při -18 °C a 16 h při 4 °C. Průběh reakce sledován na TLC - destičky Silikagel 60 F254 (ethylacetát: hexan 1:1, Rf(DTX) = 0,3, Rf(LEV-DTX) = 0,2, Rf(LevulÍc acid) = 0,45). Produkt byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí dvakrát pomocí chromatografie na koloně (60cm x 4cm) naplněné Silikagelem v ethylacetátu. Frakce obsahující produkt DTX-LEV byla pokaždé zachycena a zahuštěna na 0,6 mL a produkt vysrážen do 20 mL diethyleteru. Produkt byl odsát, promyt malým množstvím diethyleteru a vakuově sušen do konstantní hmotnosti. Výtěžek činil
179 mg produktu (80 %) s bodem tání 86 až 89 °C. TLC (ethylacetát; hexan 1:1) jedna skvrna při Rf = 0,20. MALDI-TOF MS: 929 (M+Na).
Schéma 1 struktury esterů kyseliny levulové a 4-(2-oxopropyl)benzoové s paclitaxelem a docetaxelem: A) Ester kyseliny levulové a paclitaxelu, LEV-PTX; B) Ester 4-(2-oxopropyl)benzoové kyseliny a paclitaxelu, OPB-PTX; C) Ester kyseliny levulové a docetaxelu, LEV-DTX.
Ester 4-(2-oxopropyl)benzoové kyseliny a paclitaxelu (v pozici -OH 2) (OPB-PTX) byl připraven stejným výše popsaným postupem pro přípravu LEV-PTX, a to reakcí 4-(2-oxopropyl) benzoové kyseliny s paclitaxelem pomocí konjugačního činidla DCC v DMF.
Výtěžek činil 85 %. Bod tání 143 až 145 °C. TLC (ethylacetát: hexan 1:1) jedna skvrna při Rf - 0,25. MALDI-TOF MS: 1032 (M+Na).
Ester 4-(2-oxopropyl)benzoové kyseliny a docetaxelu (v pozici -OH 2) (OPB-DTX) byl připraven stejným výše popsaným postupem pro přípravu DTX-LEV, a to reakcí 4-(2-oxopropyl) benzoové kyseliny s docetaxelem pomocí DCC v DMF.
Výtěžek činil 81 %. Bod tání 94 až 96 °C. TLC (ethylacetát: hexan 1:1) jedna skvrna při Rf = 0,28. MALDI-TOF MS: 990 (M+Na).
Ester 4-oxo-pentenové [3-acetylakrylové] kyseliny a paclitaxelu (v pozici -OH 2) (AAK-PTX) byl připraven stejným výše popsaným postupem pro přípravu LEV-PTX, a to reakcí 4-oxo-pentenové kyseliny s paclitaxelem pomocí DCC v DMF.
Výtěžek činil 86 %. Bod tání 138 až 139 °C. TLC (ethylacetát: hexan 3:1) jedna skvrna při Rf = 0,6. MALDI-TOF MS: 968 (M+Na).
Ester 5-oxo-hexenové kyseliny a paclitaxelu (v pozici -OH 2) (OHE-PTX) byl připraven stejným výše popsaným postupem pro přípravu PTX-LEV, a to reakcí 5-oxo-hexenové kyseliny s paclitaxelem pomocí konjugačního činidla DCC v DMF.
Výtěžek činil 85 %. Bod tání 132 až 134 °C. TLC (ethylacetát: hexan 3:1) jedna skvrna při Rf = 0,65. MALDI-TOF MS: 982 (M+Na).
Ester 5-oxo-hexenové kyseliny a docetaxelu (v pozici -OH 2) (OHE-DTX) byl připraven stejným výše popsaným postupem pro přípravu DTX-LEV, a to reakcí 5-oxo-hexenové kyseliny s docetaxelem pomocí konjugačního činidla DCC v DMF.
Výtěžek činil 86 %. Bod tání 84 až 86 °C. TLC (ethylacetát: hexan 3:1) jedna skvrna při Rf = 0,7. MALDI-TOF MS: 940 (M+Na).
Příklad 2: Syntéza polymerního prekurzoru - kopolymeru HPMA s MA-AH-NHNHi
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA a MA-AH-NHNH2 v methanolu při 60 °C podle dříve popsaného postupu [Etrych patent].
L CH,Jn CHjJo
Schéma 2 struktury polymerního prekurzoru, kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNHj).
Příklad 3 Příprava polymemích konjugátu obsahujících deriváty léčiv (PHPMA-AH-NH-N=LEV-PTX , PHPMA-AH-NH-N=LEV-DTX, PHPMA-AH-NH-N=OPB-PTX, PHPMA-AH-NH-N=OPB-DTX, PHPMA-AH-NH-N=OHE~PTX, PHPMA-AH-NH-N=OHE-DTX, PHPMA-AH-NH-N-AKK-PTX a PHPMA-AH-NH-N=AKK-DTX)
Kopolymery $ deriváty PTX, DTX a LTX navázanými k PHPMA nosiči hydrolyticky štěpitelnou hydrazonovou vazbou byly připraveny reakcí polymemích prekurzorů obsahujících hydrazidové skupiny s příslušným derivátem léčiva v methanolu za katalýzy kyselinou octovou.
Roztok 100 mg kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNHj) v 1,1 mL methanolu byl smíchán s roztokem LEV-PTX v 0,2 mL methanolu. Do míchané reakční směsi bylo při 25 °C po 1 minutě přidáno 40 pL kyseliny octové. Průběh reakce (úbytek LEV-PTX) byl sledován pomocí TLC (destičky Silikagel 60 F254 , ethylacetát, Rf(LEV-PTX)= 0,8). Po 2 h byla reakční směs čištěna gelovou filtrací od volného derivátu léčiva na koloně naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu. Polymerní frakce byla izolována, zahuštěna na vakuové odparce a produkt srážen do 50 mL ethylacetátu, izolován filtrací na fritě S4, promyt 150 mL ethylacetátu a sušen do konstantní hmotnosti. Obsah celkového PTX nebo jeho derivátu vpolymemím konjugátu byl stanoven pomocí HPLC stanovení (HPLC Shimadzu systém) po úplné hydrolýze polymerního konjugátu v roztoku HC1 (pH 2) po dobu 1 h při 37°C a extrakci derivátu PTX do chloroformu.
<MW> a distribuce molekulových hmotností byly zjištěny pomocí kapalinové chromatografie (kolona TSKGel 4000 (300x10 mm), 20% 0,3 M octanový pufr (CH3COONa/CH3COOH; pH 6,5; 0,5 g/L NaN3) a 80% methanol, průtok 0,5 mL/mín, detekce diferenciálním refraktometrem, detektorem rozptylu světla (DAWN-DSP-F, Wyatt Technology, USA) a UV detektorem (250 nm). Charakterizace polymemího léčiva: Celkový výtěžek reakce vazby léčiva: 96 mg (88 %), obsah celkového LEV-PTX 9,2 % váhových, obsah volného PTX <0,2 % z celkového obsahu PTX. Postup vazby derivátu PTX na polymemí prekurzory hydrazonovou vazbou byl stejný pro všechny typy prekurzorů a derivátů léčiv.
Schéma 3 struktury polymemího konjugátu PHPMA-AH-NH-bMDTX-LEV s navázaným derivátem, esterem kyseliny levulové a docetaxelu.
Příklad 4: Uvolňování PTX, DTX nebo jejich derivátů z polymemích konjugátů
Bylo měřeno množství PTX, DTX nebo jejich derivátů uvolněných z polymemích konjugátů po jejich inkubaci ve fosfátovém pufru o pH 5,0 (0,1 M fosfátový pufr obsahujícím 0,05 M NaCl) modelujícím intracelulámí prostředí a fosfátovém pufru pH 7,4 modelujícím prostředí krevního řečiště. Množství uvolňovaných léčiv nebo jejich derivátů v inkubačním roztoku bylo stanoveno pomoci HPLC (Shimadzu). V předem určených časových intervalech bylo odebíráno 200 pL inkubačního roztoku a po extrakci uvolněných léčiv a jejich derivátů do chloroformu bylo jejich množství stanoveno pomocí HPLC systému [Shimadzu HPLC systém vybavený kolonou s reverzní fází Chromolith Performance RP-18e (100>< 4,6 mm) a UV-VIS detektoru Shimadzu SPD- lOAVvp (230 nm); eluent voda-acetonitril s gradientem 50- 100 vol.% acetonítrilu, průtok 0.5 mL-min1.
Po inkubaci konjugátů (koncentrace 5 mg/mL) ve fyziologickém prostředí při 37 °C (fosfátový pufr, pH 7,4) se uvolňují léčiva PTX a DTX (či jejich deriváty) významně pomaleji (Obr. 2) než v mírně kyselém prostředí při pH 5,0 modelujícím prostředí v endozomech a lysozomech nádorových buněk (Obr. 1). U obou léčiv má na rychlost uvolňování zpolymemího konjugátu a poměr uvolněných složek (léčivo a jeho derivát) zásadní vliv struktura oxokyselinové spojky. Spojka tvořená kyselinou levulovou nebo 4-(2-oxopropyl)benzoovou umožňuje velmi rychlé uvolnění derivátu léčiva v pH 5, k hydrolýze esterové vazby mezi léčivem a kyselinou ovšem dochází jen velmi pomalu. Naproti tomu spojka tvořená kyselinou 4-oxo-pentenovou stabilizuje jak hydrazonovou vazbu tak vazbu esterovou, nedochází k významnému uvolnění léčiva ani jeho derivátu. Při inkubaci ve fyziologickém prostředí o pH 7,4 dochází u polymemích konjugátů se spojkou tvořenou kyselinou levulovou nebo 4-(2-oxopropyl)benzoovou k částečné hydrolýze hydrazonové vazby, ve srovnání s prostředním o pH 5 významně nižší rychlostí. V pH 7,4 je patrné, že stabilita esterové vazby mezi kyselinou levulovou a léčivem je nižší a z jedné třetiny se uvolňuje volné léčivo. Naproti tomu v případě spojky tvořené 4-(2-oxopropyl)benzoovou kyselinou se uvolňuje jen derivát léčiva, esterová vazba je stabilní. Rozpad derivátu léčiva na volné léčivo nebo přímé odštěpení léčiva z polymemího konjugátu je předpokládáno účinkem enzymů a to především karboxy esteráz.
Příklad 5: Ukázka in vitro biologické aktivity lineárních polymerních konjugátů docetaxelu a paclitaxelu při inkubaci s buňkami nádorových linií; T buněčného lymfomu EL-4 a karcinomu mléčné žlázy 4T1.
Tabulka 1 Hodnoty IC50 (v ng/ml)
EL 4 4T1
DTX 0.0001 0.0004
DTX-LEV 0.015 0.0031
PHPMA-AH-NH-N=DTX-LEV 3.9 0.750
PTX 0.0013 0.0003
PTX-LEV 0.19 0.0054
PHPMA-AH-NH-N=PTX-LEV 33.6 8.90
Příklad 6: Ukázka in vivo biologické aktivity lineárních polymerních konjugátů docetaxelu a paclitaxelu u myší inokulovaných T buněčným lymfomem EL4
Pro in vivo demonstraci aktivity konjugátů docetaxelu a paclitaxelu byl použit model myšího syngenního T buněčného lymfomu EL-4. Myším kmene C57BL/6 (samice) bylo v den 0 subkutánně implantováno 1x105 nádorových buněk EL-4. Léčiva byla podána intravenózně (i.v,), a to ve dvou dávkách podaných v den 8 a den 12 po transplantaci nádorových buněk. První dávka byla podána v době, kdy byly nádory dobře vyvinuté, hmatatelné, o velikosti zhruba 300 mm3. V pokusu byla sledována velikost nádorů, tělesná váha myší, celkový zdravotní stav a přežití. Efekt konjugátu byl vždy porovnáván s efektem volného léčiva (DTX, PTX) a jeho derivátů (DTX-LEV, PTX-LEV). Průměrná doba přežití neléčených kontrolních myší s lymfomem EL-4 byla 31,3 dne (SD 3,66, střední doba přežití 30,5 dne).
DTX, PTX a deriváty DTX-LEV, PTX-LEV byly pro i.v. aplikaci rozpouštěny ve směsi Cremophor EL (Sigma, USA) a etanol (1:1), po rozpuštění léčiva byl objem doplněn 4 objemovými díly PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok). Konjugáty PHPMA-AH-NHN-DTX-LEV, PHPMA-AH-NH-N-PTX-LEV byly rozpouštěny v PBS. Objem každé jednotlivé dávky léčiva byl 0,2 ml. Aplikovány byly následující dávky léčiv: DTX a derivát DTX-LEV
2x20 mg ekvivalentu DTX/kg, konjugát PHPMA-AH-NH-N=DTX-LEV v dávce 2x20 a 2x40 mg DTX ekvivalentu/kg, PTX a derivát PTX-LEV v dávce 2x30 mg ekvivalentu PTX/kg, konjugát PHPMA-AH-NH-N=PTX-LEV v dávce 2x60 mg ekvivalentu PTX /kg.
A. Protinádorová účinnost konjugátu PHPMA-AH-NH-N=DTX-LEV (Obr. 3)
Volný DTX indukoval úplnou regresi nádorů EL-4 u 4 myší ze 7 testovaných. Derivát LEV-DTX měl nižší efekt a indukoval úplnou regresi nádoru EL-4 u 1 z 8 testovaných myší. Konjugát PHPMA-AH-NH-N=DTX-LEV v dávce ekvivalentní volnému DTX (2x20 mg ekvivalentu DTX/kg) vyléčil také 1 myš ze skupiny 8 myší. Zvýšení dávky konjugátu na dvojnásobek (2x40 mg DTX ekvivalentu DTX/kg) však vedlo k vyléčení 7 myší ze skupiny (n=8). V žádné testované skupině nebyl zaznamenán úbytek váhy Qakožto znak toxicity léčiva). Myši, u nichž došlo k úplné regresi nádoru, zůstaly bez známek nádorového růstu či toxicity do dne 94, kdy jim byly znovu transpantovány nádorové buňky EL-4 ve stejné (tj. letální) dávce, a myši byly ponechány bez léčby. Tato druhá transplantace byla provedena pro průkaz imunologicky zprostředkované resistence proti nádoru. Statisticky významný podíl myší vyléčených konjugátem PHPMA-AHNH-N=DTX-LEV (2x40 mg eq. DTX/kg) byl resistentní vůči nádoru EL-4 (5 myší resistentních ze 7, tj. 71 %). Odpovídající podíl resistentních jedinců byl i mezi myšmi vyléčenými volným DTX (ze 4 vyléčených myší byly 3 myši resistentní).
Závěr: Konjugát PHPMA-AH-NH-N=DTX-LEV měl významný protinádorový účinek u myší C57BL/6 s lymfomem EL-4, jeho podání nebylo provázeno vedlejšími toxickými efekty a umožnilo ustavení resistence proti nádoru u 71 % vyléčených jedinců.
B. Protinádorová účinnost konjugátu PHPMA-AH-NH-N=PTX-LEV (Obr.4)
Volný PTX se pro velmi omezenou rozpustnost nepodařilo myším podat (myší ihned po injekci hynuly). Derivát PTX-LEV neměl protinádorový efekt u lymfomu EL-4 (neprodloužil průměrné přežití, žádná myš se nevyléčila; n=8). Konjugát PHPMA-AH-NH-N=PTX-LEV v dávce 2x60 mg ekvivalentu PTX/kg nevyléčil žádnou myš ani neprodloužil průměrné přežití (n=8), V žádné skupině nebyl zaznamenán pokles váhy jako příznak toxicity léčiva.
Závěr: Derivát PTX-LEV (2x30 mg PTX eq./kg) ani konjugát obsahující derivát PTX (2x60 mg ekvivalentu PTX/kg) neměly při léčení syngenního myšího lymfomu EL-4 terapeutický efekt.
Příklad 7: Ukázka in vivo biologické aktivity lineárního polymerního konjugátu paclitaxelu u myši inokulovaných karcinomem mléčné žlázy 4T1 (Obr.5)
Byl použit model myšího syngenního karcinomu mléčné žlázy 4T1. Myším kmene BALB/c (samice) bylo v den 0 subkutánně implantováno IxlO6 nádorových buněk 4T1. Léčiva byla podána intravenózně (i .v.), a to ve dvou dávkách podaných v den 8 a den 12 po transplantaci nádorových buněk. První dávka byla podána v době, kdy byly nádory dobře vyvinuté, hmatatelné, o velikosti zhruba 300 mm3. V pokusu byla sledována velikost nádorů, tělesná váha myší, celkový zdravotní stav a přežití. Efekt konjugátu byl porovnáván s efektem volného léčiva (PTX) a jeho derivátu (PTX-LEV). Průměrné přežití neléčených kontrolních myší bylo 34,9 dní (SD 2,59; střední doba přežití 35 dní),
PTX, PTX-LEV a konjugát PHPMA-AH-NH-N=PTX-LEV byly pro i.v. aplikaci připraveny stejně jak uvedeno výše (viz. Příklad 6 A, B) Aplikovány byly tyto dávky: PTX a derivát PTX-LEV v dávce 2x30 mg ekvivalentu PTX/kg, konjugát PHPMA-AH-NH-N=PTX-LEV v dávce 2x60 mg ekvivalentu PTX /kg.
Konjugát PHPMA-AH-NH-N=PTX-LEV úplně vyléčil 3 z 8 testovaných myší. Po aplikaci derivátu PTX-LEV došlo k regresi nádoru 4T1 u 1 z 8 myší, Aplikace volného léčiva (PTX) byla provázena významnými nežádoucími účinky: aplikace druhé dávky i,v. vyvolala prudkou reakci (křeče, později špatný celkový stav - naježená srst, ochablost, který trval nejméně 24 hodin) u první z myši. Ostatním myším ve skupině pak byla druhá dávka snížena o 10%. a aplikována intraperitoneálně místo i.v. Vyléčila se pouze jedna myš, které byla dávka injikována i.v., u ostatních se neprojevil žádný léčebný efekt PTX. V žádné pokusné skupině se neprojevilo snížení váhy jako příznak toxicity léčiva.
Pro zjištění resistence vyléčených myší proti nádoru 4T1 byly vyléčené myši znovu transplantovány 129 dní po první transplantaci nádorových buněk. Podruhé bylo injikováno IxlO5 buněk 4T1 s.c. a myši byly ponechány bez léčby, U všech těchto myší (3 vyléčené konjugátem PHPMA-AH-NH-N=PTX-LEV, 1 vyléčená PTX-LEV) nádory nerostly, to znamená, že tyto myši byly resistentní vůči danému nádoru.
Závěr: Konjugát PHPMA-AH-NH-N=PTX-LEV měl významný protinádorový účinek u myší BALB/c $ karcinomem mléčné žlázy 4T1, jeho podání nebylo provázeno vedlejšími toxickými efekty a umožnilo ustavení resistence proti nádoru u 38 % vyléčených jedinců.
Příklad 8: Ukázka in vivo biologické aktivity lineárních polymerních konjugátů docetaxelu s různým obsahem léčiva u myší inokulovaných T buněčným lymfomem EL4 (Obr.6)
Byl použit nádorový model lymfomu EL-4, popsaný výše (Příklad 6). Konjugáty PHPMA-AH-NH-N=DTX-LEV s obsahem léčiva 8,2 hmotn. % DTX (9,1 hmotn. % DTX-LEV) a 16,3 hmotn. % DTX (18,0 hmotn. % DTX-LEV) byly pro aplikaci rozpuštěny v PBS (0,2 ml), a byla použita suboptimální dávka 2x30 mg ekvivalentu DTX/kg intravenózně, den 9 a 13 po transplantaci nádorových buněk.
Konjugát s nižším obsahem léčiva (8,2 % DTX) vyléčil 1 myš z 8 testovaných a u ostatních statisticky významně prodloužil přežití (neléčené kontroly púměr přežití 27,25 dne, SD 1,64, medián 28 dní; léčené myši průměr 41,75 dne, SD 6,54, medián 45 dní; p<0,01). Konjugát s vyšším obsahem léčiva (16,3 % DTX) vyléčil také 1 z 8 testovaných myší, ale přežití ostatních myší ve skupině nebylo významně prodlouženo.
Závěr: Obsah derivátu léčiva v konjugátu PHPMA-AH-NH-N=DTX-LEV měl významný vliv na protinádorový účinek u myší C57BL/6 s lymfomem EL-4 při podání suboptimální dávky 2x30 mg ekvivalentu DTX/kg. Polymerné konjugát s nižším obsahem prokázal vyšší protinádorovou aktivitu.
Literatura.
R. Duncan, J.B. Lloyd, J. Kopeček, P. Rejmanová, J. Strohalm, K. Ulbrich, B. Říhová, V. Chytrý, Synthetic Polymeric Drugs (1985). Czech. PV 0095/85, Australia 589587, Canada 130053, Denmark 164485, Europe 0187547, US 5,037,883, Japan 000137/86.
R. Duncan, N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamide copolymer conjugates, inj Swarbrick (ed), Drugs and the Pharmaceutiutical Sciences: Boca Raton, Taylor & Francis, p. 1-92 (2005).
T. Etrych, M. Jelínková, B. Říhová, K. Ulbrich K., New HPMA copolymers containing doxorubicin bound via pH sensitive linkage. Synthesis, in vitro and in vivo biological properties. J. Controlled Release 73, 89-102 (2001).
T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, K. Ulbrich, Synthesis of HPMA Copolymers Containing Doxorubicin Bound via a Hydrazone Linkage. Effect of Spacer on Drug Release and in vitro Cytotoxicity. Macromolecular Biosci. 2,43-52 (2002).
T. Etrych, P. Chytil, M. Pechar, M. Studenovský, B. Říhová, K. Ulbrich, Způsob přípravy polymemích konjugátů doxorubicinu s pH-řízeným uvolňováním léčiva, CZ 297 827 B6.
T. Etrych, P. Chytil, K. Ulbrich, T. Mrkvan, B. Říhová, Polymemí léčivo a způsob jeho výroby. CZ 298945 B6.
T. Etrych, K. Ulbrich: Polymemí konjugáty doxorubicinu s pH-řizeným uvolňováním léčiva a způsob jejich přípravy. CZ PV-2006-505, CZ pat. 299053 B6
T. Etrych, P. Chytil, T. Mrkvan, M. Sírová, B. Říhová, K. Ulbrich, Conjugates of doxorubicin with graft HPMA copolymers for passive tumor targeting: Journal of Controlled Release 132, 184-192(2008)
R.B. Greenwald, PEG drugs: an overview, Journal of Controlled Release 74, 159-171 (2001).
R.B. Greenwald, Y. H. Choe, J. McGuire, C.D. Conover, Effective drug delivery by PEGylated drug conjugates, Advanced Drug Delivery Reviews 55, p. 217-250 (2003).
R.B. Greenwald, A. Pendri, D. Bolikal, Highly Water-Soluble Taxol Derivatives - 7-Polyethylene Glycol Carbamates and Carbonates, Journal of Organic Chemistry 60, 331-336 (1995).
P. Chytil, T. Etrych, M. Hrubý, K. Ulbrich, B. Říhová: Micelámí nosiče léčiv s protinádorovou aktivitou. CZ PV 2006-207.
P. Chytil, T. Etrych, Č. Koňák, M. Sírová, T. Mrkvan, J. Bouček, B. Říhová, K. Ulbrich, New HPMA copolymer-based drug carriers with covalently bound hydrophobic substituents for solid tumour targeting, Journal of Controlled Release 127, 121-130 (2008).
J. Kopeček, P Kopečková, T. Minko, Z. Lu, HPMA Copolymer-Anticancer Drug Conjugates: Design, Activity and Mechanism of Action. Europ. J. Pharm. Biopharm. 50, 61 - 81 (2000).
J. Kopeček, P. Kopečková, T. Minko, Z. Lu, C.M. Peterson, Water soluble polymers in tumor targeted delivery, J. Controlled Release 74,165-173 (2001).
F. Kratz, U. Beyer, M.T. Schutte, Drug-polymer conjugates containing acid-cleavable bonds, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 16,245-288 (1999).
F. Kratz, I.A. Muller, C. Ryppa, A. Warnecke, Prodrug strategies in anticancer chemotherapy, Chemmedchem 3,20-53 (2003).
S. Ng, A. Sparreboom, Y. Shaked, C. Lee, S. Man, N. Desai, P. Soon-Shiong, W. D. Figg, R. Korbel, Influence of Formulation Vehicle onMetronomic Taxane Chemotherapy: AlbuminBound versus Cremophor EL-Based Paclitaxel, Clin Cancer Res 26; 4331-4338, 2006
Y. Noguchi, J. Wu, R. Duncan, J. Strohalm, K. Ulbrich, T. Akaike, H. Maeda, Early phase tumor accumulation of macromolecules: a great difference in clearance rate between tumor and normal tissues, Jpn. J.Cancer Res. 89, 307-314 (1998).
A. Pendri, C.D. Conover, R.B. Greenwald, Antitumor activity of paclitaxel-2 '-glycinate conjugated to polyethylene glycol): a water-soluble prodrug, Anti-Cancer Drug Design 13, 387395 (1998).
B. Říhová, M. Jelínková, J. Strohalm, V. Šubr, D. Plocová, O. Hovorka, M. Novák, D. Plundrová, Y. Germano, K. Ulbrich, Polymeric Drugs Based on Conjugates of Synthetic and Natural Macromolecules II, Anti-cancer Activity of antibody or (Fab’ji-targeted Conjugates and Combined Therapy with Immunomodulators, J. Controlled Rei. 64, 241-261 (2000)
B. Říhová, T. Etrych, M. Pechar, M. Jelínková, M. Šťastný, O. Hovorka, M. Kovář, K, Ulbrich, Doxorubicin bound to a HPMA copolymer carrier through hydrazone bond is effective also in a cancer cell line with a limited content of lysosomes, J. Controlled Release 74,225-232 (2001)
R. Satchi-Fainaro, R. Duncan, C. Barnes, Polymer therapeutics for cancer: Current status and future challenges, in R Satchi-Fainaro and R Duncan (eds), Advances in Polymer Science, Polymer Therapeutics II: Berlin I Heidelberg , Springer, p. 1-65 (2006).
L.W. Seymour, Y. Miyamoto, H. Maeda, M. Brereton, J. Strohalm, K. Ulbrich, R. Duncan, Influence of Molecular-Weight on Passive Tumor Accumulation of A Soluble Macromolecular Drug Carrier, Eur.J.Cancer 31A, 766-770 (1995).
J.M.M. Terwogt, W.T. Huinink, J.H.M. Schellens, M. Schot, I.A.M. Mandjes, M. Zurlo, M.
Rocchetti, H. Rosing, F.J. Koopman, J.H. Beijnen, Phase I clinical and pharmacokinetic study of PNU166945, a novel water-soluble polymer-conjugated prodrug of paclitaxel, Anti-Cancer Drugs 12,315-323 (2001).
J.M.M. Terwogt, H. Rosing, M. Rocchetti, E. Frigerio, D. Fraier, F.J. Koopman, J.H.M.
Schellens, W.T. Huinink, J.H. Beijnen, High-performance liquid chromatographic methods for the determination of a novel polymer-bound paclitaxel derivative and free paclitaxel in human plasma, J.Liq.Chromatogr.RelatTechnoL 23, 1233-1251 (2000),
K. Ulbrich, V. Šubr, J. Strohalm, D. Plocová, M. Jelínková, B. Říhová, Polymeric Drugs Based on Conjugates of Synthetic and Natural Macromolecules I. Synthesis and Physico-chemical Characterisation. J. Controlled Rei. 64, 63-79 (2000)
K. Ulbrich, T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, Antibody-Targeted PolymerDoxorubicin Conjugates with pH-Controlled Activation, J. Drug Targeting 12, 477-489 (2004) (A).
K. Ulbrich, V. Šubr, Polymeric Anticancer Drugs with pH-Controlled Activation, Adv. Drug Delivery Rev. 56/7,1025-1052 (2004) (B).
K. Ulbrich, T. Etrych, B. Říhová, M. Jelínková, M. Kovář: pH Senzitivní polymemí konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii. CZ 293787 B6
U. Vanhoefer, et al., Comparative antitumor efficacy of docetaxel and paclitaxel in nude mice bearing human tumor xenografts that overexpress the multidrug resistance protein (MRP), Annals of Oncology 8, 1221 - 1228 (1997).
J.W. Winter, Paclitaxel poliglumex (XYOTAX, CT-2103): A macromolecular taxane, Journal of Controlled Release 109,120- 126 (2005).

Claims (9)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Polymemí konjugát sestávající z derivátu cytostatika ze skupiny taxanů, jmenovitě paclitaxelu (PTX), docetaxelu (DTX) nebo larotaxelu (LTX) a polymemího nosiče připraveného na bázi lineárního nebo biodegradabilního roubovaného kopolymerů tvořeného jednotkami základní, o kopolymerů Y-(2-hydroxypropyl)methakroylamidu (HPMA) a jednotkami obsahujícími methakryloylovaný hydrazon aminokyselin nebo oligopeptidů.
  2. 2. Polymemí konjugát podle nároku 1 vyznačující se tím, že derivát cytostatika je připraven acylací sekundárních hydroxylových skupin cytostatika oxo-kyselinou a je připojen k nosiči prostřednictvím hydrolyticky labilní hydrazonové vazby.
  3. 3. Polymemí konjugát podle nároku 1 a 2 vyznačující se tím, že oxokyselina je volena ze skupiny: kyselina levulová, 4-(2-oxopropyl) benzoová kyselina, kyselina 4-oxo-pent-2enová a kyselina 5-oxo-hex-2-enová a 6-oxo-hept-2-enová.
  4. 4. Polymemí konjugát podle nároku 1 a 2 vyznačující se tím, že jsou příslušné aminokyseliny popřípadě oligopeptidy vybrány z řady glycyl, glycylglycyl, β-alanyl, 6-aminohexanoyl (AH), 4-aminobenzoyl a nebo složený acyl vycházející z oligopeptidů GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly a GlyPheLeuGly).
  5. 5. Polymemí konjugát podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že obsahuje 70 až 98 mol % základního kopolymerů HPMA, 1,5 až 29,5 % mol jednotek s hydrazidovými funkčními skupinami a 0,5 až 10 % mol jednotek s hydrazonové navázaným derivátem cytostatika.
  6. 6. Polymemí konjugát podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se molámí hmotností 10 až 50 000 g/mol v případě lineárního polymeru a 50 až- 250 000 g/mol v případě roubovaného kopolymerů .
  7. 7. Způsob přípravy polymemího konjugátu podle nároků 1 až 6 vyznačující se tím, že je použit polymer získaný radikálovou kopolymerací HPMA s komonomery s obsahem cytostatika vázaného prostřednictvím oxokyseliny v poměru, jež odpovídá požadovanému složení.
  8. 8. Způsob přípravy polymemího konjugátu podle nároků 1 až 6 vyznačující se tím, že polymemí nosič je podroben polymeranalogické přeměně nosiče reakcí s esterem oxo-kyseliny a cytostatika.
  9. 9. Použití polymemího konjugátu podle nároku 1 až 6 pro přípravu léčiva k léčbě nádorových onemocnění, jako jsou ovariální nádory, nádory prsu, plic, prostaty, zejména pak pro léčbu lymfomů a karcinomu mléčné žlázy 4T1
CZ20090085A 2009-02-13 2009-02-13 Polymerní konjugáty paclitaxelu a docetaxelu s pH rízeným uvolnováním kancerostatika CZ303072B6 (cs)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20090085A CZ303072B6 (cs) 2009-02-13 2009-02-13 Polymerní konjugáty paclitaxelu a docetaxelu s pH rízeným uvolnováním kancerostatika
UAA201115172A UA104187C2 (ru) 2009-02-13 2010-02-09 Полимерные конъюгаты паклитакселя и доцетакселя с рн-контролируемым высвобождением средства, которое оказывает статическое действие на злокачественные новообразования
EP10716267A EP2413973A1 (en) 2009-02-13 2010-02-09 Polymeric conjugates of paclitaxel and docetaxel with ph-controlled releasing of the cancerostatic agent
EA201190315A EA022803B1 (ru) 2009-02-13 2010-02-09 ПОЛИМЕРНЫЕ КОНЪЮГАТЫ ПАКЛИТАКСЕЛЯ И ДОЦЕТАКСЕЛЯ С КОНТРОЛИРУЕМЫМ ПОД ДЕЙСТВИЕМ pH ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ КАНЦЕРОСТАТИЧЕСКОГО АГЕНТА
PCT/CZ2010/000014 WO2010091650A1 (en) 2009-02-13 2010-02-09 Polymeric conjugates of paclitaxel and docetaxel with ph-controlled releasing of the cancerostatic agent

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20090085A CZ303072B6 (cs) 2009-02-13 2009-02-13 Polymerní konjugáty paclitaxelu a docetaxelu s pH rízeným uvolnováním kancerostatika

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ200985A3 true CZ200985A3 (cs) 2010-08-25
CZ303072B6 CZ303072B6 (cs) 2012-03-21

Family

ID=42309667

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20090085A CZ303072B6 (cs) 2009-02-13 2009-02-13 Polymerní konjugáty paclitaxelu a docetaxelu s pH rízeným uvolnováním kancerostatika

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP2413973A1 (cs)
CZ (1) CZ303072B6 (cs)
EA (1) EA022803B1 (cs)
UA (1) UA104187C2 (cs)
WO (1) WO2010091650A1 (cs)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2612857B1 (en) 2010-05-27 2017-07-26 Shenzhen Salubris Pharmaceuticals Co., Ltd. Chemical synthesis and anti-tumor and anti-metastatic effects of dual functional conjugate
WO2016187147A1 (en) 2015-05-15 2016-11-24 Fl Therapeutics Llc Docetaxel and human serum albumin complexes
GB2551979A (en) * 2016-06-30 2018-01-10 Rs Arastirma Egitim Danismanlik Llac Sanayi Ticaret Ltd Cleavable polymer drug conjugates
WO2018081520A1 (en) 2016-10-27 2018-05-03 Zhuhai Beihai Biotech Co., Ltd. Neutral ph compositions of docetaxel and human serum albumin
RU2753479C1 (ru) * 2020-10-14 2021-08-17 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Пермская государственная фармацевтическая академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации 2-Амино-1-бензамидо-5-[2-(нафталин-1-ил)-2-оксоэтилиден]-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамид, обладающий цитотоксическими и проапоптогенными свойствами в отношении клеток солидных опухолей человека, в том числе резистентных к химиопрепаратам
CN114588272B (zh) * 2022-04-08 2023-05-26 皖西学院 一种负载no的多西紫杉醇纳米药物及其制备方法和应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9213077D0 (en) * 1992-06-19 1992-08-05 Erba Carlo Spa Polymerbound taxol derivatives
EP1389090A2 (en) * 2001-04-26 2004-02-18 Board of Regents, The University of Texas System Diagnostic imaging compositions, their methods of synthesis and use
CZ2006207A3 (cs) * 2006-03-28 2008-01-16 Zentiva, A. S. Micelární nosiče léčiv s protinádorovou aktivitou
CZ299053B6 (cs) * 2006-08-09 2008-04-09 Zentiva, A. S. Polymerní konjugáty doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva a zpusob jejich prípravy
CZ298945B6 (cs) * 2006-09-18 2008-03-19 Zentiva, A. S. Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby
US8017141B2 (en) * 2006-12-15 2011-09-13 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Coatings of acrylamide-based copolymers
CA2675014C (en) * 2007-01-17 2016-03-29 Immunomedics, Inc. Polymeric carriers of therapeutic agents and recognition moieties for antibody-based targeting of disease sites
CZ301004B6 (cs) * 2007-06-27 2009-10-07 Ústav experimentální botaniky AV CR v. v. i. Cílené deriváty paclitaxelu, jejich zpusob výroby a jejich použití

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010091650A1 (en) 2010-08-19
CZ303072B6 (cs) 2012-03-21
UA104187C2 (ru) 2014-01-10
EP2413973A1 (en) 2012-02-08
EA022803B1 (ru) 2016-03-31
EA201190315A1 (ru) 2012-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Nakamura et al. Two step mechanisms of tumor selective delivery of N-(2-hydroxypropyl) methacrylamide copolymer conjugated with pirarubicin via an acid-cleavable linkage
Etrych et al. HPMA copolymer-doxorubicin conjugates: The effects of molecular weight and architecture on biodistribution and in vivo activity
EP2131866B1 (en) Dual acting prodrugs
JP6013424B2 (ja) Ｈｐｍａ−ドセタキセルコンジュゲートおよびその使用
Nakamura et al. Comparison between linear and star-like HPMA conjugated pirarubicin (THP) in pharmacokinetics and antitumor activity in tumor bearing mice
EP2063914B1 (en) Grafted macromolecular conjugates of doxorubicin with anticancer activity and method of their preparation
WO2009116509A1 (ja) 生理活性物質の高分子結合体
CZ200985A3 (cs) Polymerní konjugáty paclitaxelu a docetaxelu s pH rízeným uvolnováním kancerostatika
ES2749746T3 (es) Inhibidores de fumagilol metap2 modificados o conjugados con polímeros para uso en el tratamiento de la obesidad
Greco et al. Polysialic acid as a drug carrier: evaluation of a new polysialic acid–epirubicin conjugate and its comparison against established drug carriers
KR20150058554A (ko) 항암제의 전달을 위한 폴리머 시스템
Etrych et al. High-molecular weight star conjugates containing docetaxel with high anti-tumor activity and low systemic toxicity in vivo
SK2912004A3 (en) pH-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline cancerostatic drug for targeted therapy
Pechar et al. Polymer nanomedicines with enzymatically triggered activation: A comparative study of in vitro and in vivo anti-cancer efficacy related to the spacer structure
Mero et al. A biodegradable polymeric carrier based on PEG for drug delivery
Hudecz et al. Drug targeting by macromolecules without recognition unit?
JP5734209B2 (ja) プロドラッグ
CZ22175U1 (cs) Polymerní konjugáty paclitaxelu a docetaxelu s pH řízeným uvolňováním kancerostatika
CZ308419B6 (cs) Blokový kopolymer pro překonání lékové rezistence nádorů k chemoterapii, jeho polymerní konjugát s léčivem, farmaceutická kompozice je obsahující, způsob jejich přípravy a jejich použití
KR101732796B1 (ko) 당화합물(sugar chemical compound)-탁산화합물(taxane compound) 접합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 제조 방법
EP2349343B1 (en) Polymeric composition with synergistic effect in treatment of tumour diseases
WO2021121446A1 (en) Copolymer with hydrolytic release of cancerostatic agent cytarabine, method of its preparation and use thereof
CZ293886B6 (cs) pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20190213