EA022803B1 - ПОЛИМЕРНЫЕ КОНЪЮГАТЫ ПАКЛИТАКСЕЛЯ И ДОЦЕТАКСЕЛЯ С КОНТРОЛИРУЕМЫМ ПОД ДЕЙСТВИЕМ pH ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ КАНЦЕРОСТАТИЧЕСКОГО АГЕНТА - Google Patents

Abstract

Изобретение описывает полимерный конъюгат, состоящий из производного цитостатического агента, выбранного из группы таксанов, в частности паклитакселя (РТХ), доцетакселя (DTX) или ларотакселя (LTX), а также полимерного носителя, приготовленного на основе линейного или биодеградируемого привитого сополимера, состоящего из единиц основного сополимера N-(2-гидроксипропил)метакриламида (НРМА) и единиц, содержащих метакрилоилированные гидразоны аминокислот или олигопептиды. Изобретение также относится к способу получения упомянутого выше полимерного конъюгата, при котором полимерный носитель подвергают превращению, аналогичному полимерному, путем взаимодействия со сложным эфиром оксокислоты и цитостатического агента. Полимерный конъюгат применяют для изготовления медикамента для лечения опухолевых заболеваний.

Description

Изобретение относится к структуре и свойствам водорастворимых полимерных терапевтических агентов (пролекарств) на основе производных паклитакселя (РТХ), доцетакселя (ЭТХ) и ларотакселя (ЬТХ), предназначенных в основном для лечения солидных опухолей в терапии опухолевых заболеваний в человеческой медицине.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время тенденции разработки лекарств очень часто фокусируются на разработке лекарственных форм, активирующих специфический эффект лекарства только в месте желаемого терапевтического эффекта. Биологически активные вещества, обладающие таким направленным действием, главным образом наносят в области, где нежелательные побочные эффекты лекарства могут повредить здоровые части организма. Эта опасность, в частности, связана с лечением цитостатическими веществами при химиотерапии опухолевых заболеваний. Известно, что присоединение цитостатического агента к водорастворимому полимерному носителю с помощью химической связи делает возможным повышение растворимости иным образом нерастворимых или плохо растворимых лекарств и значительно снижает их прямую токсичность. Высокая молекулярная масса полимеров предотвращают быструю экскрецию лекарства из организма путем клубочковой фильтрации, обеспечивая более длительное время циркуляции в крови и присутствие в организме, и, таким образом, более длительное время биологической доступности лекарства.

В прошлом изготавливали и изучали многие полимерные конъюгаты канцеростатических агентов, в которых лекарство, обладающее действием против рака, присоединяли к полимеру при помощи нерасщепляемой ковалентной связи, гидролитически нестабильной ионной связи и/или ковалентной связи, позволяющей контролируемое высвобождение лекарства и, таким образом, его активацию, на основе ферментативного или простого химического гидролиза этой связи. Системы полимерных носителей обычно конструируются таким образом, чтобы происходило высвобождение терапевтически активного канцеростатического агента из носителя в опухоль или, более специфически, непосредственно в опухолевую клетку. Важная группа полимерных терапевтических агентов представлена полимерными лекарствами, изготовленными на основе сополимеров Ы-(2-гидроксипропил)метакриламида (НРМА), большое количество которых активно направлено на опухоли путем того, что нацеливающая структура присоединена к полимеру (антителу, лектину, гормону) [Эипсап 1985, РПюха 2000, Коресек 2001, 2000, Эипсап, 2005; §а!сЫ-Рашато е! а1., 2006]. Однако их синтез очень сложен. Во время разработки полимерных канцеростатических агентов было доказано, что для специфического транспорта лекарства в место нахождения опухоли нет необходимости применять активно нацеливающий носитель, но значительно повышенного накопления полимерных цитостатических агентов, особенно в солидных опухолях, можно достичь путем повышения молекулярной массы полимерного лекарственного средства выше предела выделения носителя почками (т.е. пассивное нацеливание на солидные опухоли). Эта способность макромолекул накапливаться в солидных опухолях была названа эффектом ЕРК (Повышенная Проницаемость и Удерживание), и было доказано, что этот эффект значительно проявляется у носителей на основе сополимеров НРМА [ЫодисЫ е! а1., 1998; §еушоит е! а1., 1995].

Одна из главных проблем применения сополимеров НРМА в качестве пассивно нацеливающих высокомолекулярных носителей возникает из-за нерасщепляемой углеродной цепи, и единственные полимеры, чья молекулярная масса не превышает 40-50000 г/мол., могут выводиться из организма. Это означает, что если накопление полимера в организме после повторного введения лекарства не происходит, и если молекулярная масса носителя является настолько высокой, насколько это возможно для осуществления пассивного нацеливания настолько эффективно, насколько это возможно, полимерный носитель нужно конструировать как разрушающийся в организме. Такие полимерные носители на основе сополимеров НРМА были недавно разработаны, и их структура была запатентована [СЬуШ е! а1., 2008; ЕПусЬ е! а1., 2008, СЬуШ РУ 2006-207, ЕйусЬ РУ 2006-592].

В литературе упоминают огромное количество информации о изготовлении и исследовании свойств полимеров, несущих канцеростатический агент, прикрепленный к полимеру с помощью связи, чувствительной к гидролизу в водной среде |Кга1/ 1999]. Среди них сополимеры НРМА, несущие канцеростатический агент доксорубицин, связанный с полимерной цепью с помощью гидролитически расщепляемой гидразоновой связи, занимают важное место [Е1тусЬ 2002, ШЬпсН 2004а, ШЬпсН 2004Б, ШЬпсН ра! С2 293787 В6]. Эта связь относительно стабильна в среде кровотока (на пути транспорта в организме) и гидролитически нестабильна в слабокислой окружающей среде живой клетки. Скорость гидролиза этой связи также управляет скоростью высвобождения лекарства и, следовательно, концентрацией активного вещества в месте желаемого эффекта. При проведении испытаний ш уйто, а также ш утуо у мышей такие полимерные канцеростатические агенты проявляли значительно более выраженное противоопухолевое действие против большого числа опухолевых линий, чем свободное лекарство, и в большом количестве случаев их применение приводило к полному восстановлению тестируемого животного даже в случае терапевтического способа введения [КШоуа 2001, ЕПусЬ 2001]. Повышение молекулярной массы носителя (биодеградируемые привитые полимеры, мицеллярные и наногелевые системы) всегда приводит к повышению эффективности противоопухолевого действия лекарства, проверенного в ш утуо системах.

- 1 022803

Паклитаксель и доцетаксель относятся к группе таксанов, лекарств против рака, обычно применяемых для лечения опухолей яичников и молочной железы, легких, предстательной железы и других опухолей [УаиЬоеГег а! а1., 1997]. Кроме их вторичной токсичности, обычной для канцеростатических агентов, они обладают другим недостатком, очень низкой растворимостью в водных растворах, что приводит к необходимости введения в разных вспомогательных веществах, особенно в СгеторЬог ЕЬ, который также приводит к другим побочным эффектам лекарственной формы. В некоторых схемах введения таксанов в СгеторЬог ЕЬ может быть даже значительно снижена эффективность терапии [Ν§ а! а1., 2006]. При связывании этих лекарств с полимерными носителями (РЕО, НРМА сополимер, поли(глютаминовая кислота)) получают очень хорошо растворимые в воде неактивные формы лекарства, обладающие повышенным временем циркуляции в организме и повышенным накоплением в солидных опухолях. Их противораковую активность проверяли ίη У1уо на животных моделях и в некоторых случаях клинически. Таким образом, паклитаксель (РТХ) ковалентно связывали с полиэтиленгликолем (РЕО) с помощью нерасщепляемой сложноэфирной или 7-карбаматной связи (С2-ОН группа) или с помощью гидролитически нестабильного аминокислотного спейсера (А1а, О1у) [ОгееитаМ е! а1., 1995; ОгееитаШ, 2001; ОгееитаШ е! а1., 2003; Репбп е! а1., 1998]. Было показано, что противоопухолевая активность конъюгатов зависит от структуры связи, применяемой между полимером и лекарством, и что молекулярная масса носителя является другим важным фактором. Конъюгат с РТХ тестировали в фазе I клинических испытаний [Ба1сЫРа1иаго е! а1., 2006], но очевидно, что с небольшим успехом.

Конъюгат паклитакселя с поли(глютаминовой кислотой) (Хуо!ах), как оказалось, является более успешным в клинических испытаниях ЦУииег 2005, Кга!/ е! а1., 2008]. В этом конъюгате РТХ связан с полиаминокислотным носителем с помощью сложноэфирной связи через -ОН группу в положении 2. Лекарство высвобождается из-за деградации полимерной цепи, образования О1и производных РТХ и их последующего гидролиза. В настоящее время этот конъюгат находится в фазе III клинических испытаний.

Паклитаксель также соединяли с сополимерами НРМА с помощью эфирной связи с использованием биодеградируемого олигопептидного О1уРЬеЬеиО1у спейсера. Продемонстрировали, что РТХ после инкубирования с лизосомальными ферментами высвобождается из носителя, и это высвобождение важно для достижения противораковой активности ίη У1уо. ΡΝυ166945 представляет собой конъюгат сополимера НРМА, связанного эфирной связью с РТХ, который клинически тестировали в фазе I [Тегоод! е! а1., 2000; Теглуод! е! а1., 2001], однако после этой фазы дальнейшее тестирование прекратили. Описанные выше результаты показывают, что конъюгация паклитакселя с полимерным носителем приводит к значительному улучшению свойств лекарства (растворимости, улучшенной биологической доступности). Однако, если лекарство применяют для лечения людей, то структуру и молекулярную массу носителя, так же как структуру спейсера между полимером и лекарством, контролирование уровня и, таким образом, концентрации лекарства в месте желаемого эффекта следует тщательно выбирать и готовить индивидуально. При разработке оптимальных структур важно проверять функцию этих структур в подходящих ίη У1уо моделях.

Описание изобретения

Полимерное лекарство в соответствии с настоящим изобретением характеризуется тем, что канцеростатический агент из группы таксанов, паклитаксель (РТХ), доцетаксель (ΌΤΧ) или ларотаксель (ЬТХ) (здесь и далее лекарства) связан с водорастворимым полимерным носителем, изготовленным на основе линейного или привитого сополимера НРМА. Лекарство связано с полимерными цепями через сложноэфирную группу, образующуюся при ацилировании группы -ОН в позиции 2 с помощью спейсеров, содержащих чувствительные к рН расщепляемые гидразоновые связи. Эти спейсеры могут состоять из кислотных остатков различных оксокислот, с помощью которых карбонильную группу внедряют в структуру лекарства, связанную с остатками индивидуальных аминокислот, олигопептидов или других структур, позволяя тем самым завершение боковых цепей полимерного носителя гидразоновой группой. В случае линейного полимера молекулярную массу полимерной цепи выбирают ниже предела выведения сополимеров НРМА из организма, предпочтительно в диапазоне 10-50000 г/моль. В случае привитого сополимера выбранная молекулярная масса находится в диапазоне 50-250000 г/моль. Полимерное лекарство по настоящему изобретению предназначено для внутривенного (инъекция или инфузия) введения в растворе, но его также можно ввести внутрь опухоли или внутрибрюшинно, и оно предназначено для лечения солидных опухолей. Полимер с химически связанным цитостатическим агентом конструируется таким образом, чтобы оставаться стабильным во время циркуляции в кровотоке и для предотвращения гидролиза гидразоновой связи между данным таксаном и полимером, или, возможно, сохранять уровень гидролиза во время транспорта через организм настолько низким, насколько это возможно (при значении рН 7,4 в кровотоке), таким образом, чтобы цитотоксический эффект высвобождаемого лекарства или его производного не мог проявиться. Цельную систему конструируют как двухфазную систему. Благодаря подходящему выбору молекулярной массы носителя, позволяющего просачивание, а также эффективное накопление в опухолевой ткани, взаимодействие с клеточной мембраной должно происходить после первичного накопления лекарства в опухолевой ткани, и молекулярно растворенное полимерное лекарство должно проникнуть в отдельные опухолевые клетки путем пиноцитоза. Внутри клеток-мишеней должен

- 2 022803 происходить немедленный гидролиз гидразоновой связи и высвобождение лекарства или его производного из носителя благодаря снижению рН с внешнего значения (7,4) до внутриклеточного значения (5-6). На следующей стадии гидролиз сложноэфирной связи производного лекарства, уже выделившего из полимера, должен осуществляться путем химического гидролиза, или, более специфически, с помощью эффекта внутриклеточных ферментов, например карбоксиэстераз. Осуществимость описанного выше механизма действия полимерных лекарств по изобретению доказана в экспериментах с моделью высвобождения лекарств из полимерного носителя. Результаты этих тестов, включая тесты на активность против рака, приведены в экспериментальной части заявки на изобретение.

Полимерные конъюгаты с направленным эффектом против рака по изобретению отличаются тем, что цитостатический агент (таксол, доцетаксель, ларотаксель) прикреплен с помощью сложноэфирной связи и спейсера к полимерному носителю, образованному линейным [Е!тусЬ ра! ΟΖ 297827 В6, риЫ. 2008] или привитым [Е!тусЬ ра! ΟΖ 298945 (В6), риЫ. 2008] сополимером НРМА через гидролитически нестабильную гидразоновую группу, образованную путем взаимодействия карбонильной группы молекулы производного лекарства с гидразидной группой полимерного носителя. Полимерные носители готовят, главным образом, путем радикальной сополимеризации НРМА с сомономерами, соответствующими желаемой композиции. Связывание соответствующего таксана с полимерным носителем приводит к заметному снижению цитотоксичности, заметному повышению молекулярной массы лекарства и, таким образом, увеличению времени циркуляции в кровотоке; т.е. увеличению общей продолжительности пребывания лекарства в организме и, следовательно, повышению его биологической доступности. Полимерное лекарство согласно изобретению далее характеризуется тем, что связь лекарства с полимерным носителем относительно стабильна в ходе транспорта в кровотоке и жидкостях тела, и она гидролитически расщепляема в слабокислой окружающей среде опухоли и особенно внутри опухолевых клеток мишеней в эндосомах, характеризующихся слабокислым значением рН. Это означает, что лекарство транспортируется через кровоток в инактивированной форме, связанной с полимером, и оно высвобождается и активируется преимущественно после проникновения в опухолевые клетки-мишени. Факт, что лекарство активируется только в клетках-мишенях, устраняет побочные эффекты токсических цитостатических агентов и направляет их действие преимущественно на опухолевые клетки. Существует полимерный носитель, приготовленный на основе сополимеров НРМА, чьи молекулярные массы, т.е. эффективность накопления в опухолевой ткани, могут контролироваться путем изменения в структуре скелета полимерного носителя (не способный к расщеплению линейный полимер, высоко молекулярный биодеградируемый привитой полимер), который отвечает за направленный (пассивный) транспорт к опухоли или опухолевым клеткам.

Область применения настоящего изобретения включает применение полимерных лекарств по изобретению для лечения солидных опухолей при злокачественных заболеваниях человека.

Синтез и структуры полимерных конъюгатов

Синтез полимерных конъюгатов согласно изобретению проводят в несколько стадий; подробная конечная структура конъюгата сильно зависит от выбранного способа синтеза. На первой стадии синтеза основных мономеров синтезируют: НРМА, метакрилоилированные производные аминокислот и олигопептидов, оканчивающиеся гидразидной (ί'.ΌΝΗΝΗ₂) группой, или, возможно, заканчивающиеся гидразидной группой, защищенной трет-бутилоксикарбонильной группой (Вос).

На второй стадии синтезируют полимерные предшественники, т.е. сополимеры НРМА, несущие функциональные группы (статистические сополимеры), служащие в качестве полимерных носителей для лекарства. Полимерный предшественник, несущий функциональные гидразидные группы вдоль цепи, можно приготовить с помощью радикальной сополимеризации упомянутых выше функциональных мономеров с НРМА или с помощью превращения основного сополимера, несущего функциональные группы, аналогичного полимерному. Привитые сополимеры готовят из многовалентных и полутелехелатных сополимеров НРМА в соответствии со способом, описанным в |Е1гусН 2008 ра!, риЫ.].

Основной сополимер (предшественник) представляет собой сополимер НРМА и метакрилоилированных гидразидов аминокислот или олигопептидов, выбранных из группы глицила, глицилглицила, βаланила, 6-аминогексаноила (АН), 4-аминобензоила, или смешанного ацила, происходящего из олигопептидов С1уРНсС1у. О1уЬеиО1у, О1уЬеиРЬеО1у и О1уРЬеЬеиО1у, характеризующегося тем, что он содержит 70-98 моль.% НРМА и 2-30 моль.% единиц с гидразидными функциональными группами (см. схему 2 со спейсером, состоящим из 6-аминогексаноила).

Производное лекарства представляет собой соединение лекарства (РТХ, ΌΤΧ или ЬТХ), полученное путем ацилирования гидроксильной группы в положении 2 лекарства, с соответствующей оксокислотой. Предпочтительно применяли следующие оксокислоты: левулиновую кислоту, 4-(2оксопропил)бензойную кислоту, 4-оксопенто-2-еноевую кислоту и 5-оксогекса-2-еноевую и 6-оксогепта2-еноевую кислоту (см. схему 1).

Полимерный конъюгат представляет собой соединение полимерного предшественника с производным лекарства, где производное лекарства связано с полимерным предшественником гидразоновой связью, образованной при взаимодействии карбонильной группы производного лекарства с гидразидными группами полимера, характеризующегося тем, что он содержит 70-98 моль.% НРМА, 1,5-29,5 моль.%

- 3 022803 единиц с гидразидными функциональными группами и 0,5-10 моль.% единиц с производным лекарства, связанным с гидразоном (см. схему 3 со спейсером, состоящим из 6-аминогексаноиловой и левулиновой кислот).

Описание фигур

Фиг. 1 - диаграмма уровня высвобождения РТХ и его производных из линейных полимерных конъюгатов в буфере со значением рН 5 (модель внутриклеточной окружающей среды).

Фиг. 2 - диаграмма уровня высвобождения РТХ и его производных из линейных полимерных конъюгатов в буфере со значением рН 7,4 (модель кровотока).

Фиг. 3 - уровень выживания мышей С57ВЬ/6 с ЕЬ-4 лимфомой, которым вводили ΌΤΧ, производное ЬЕУ-ОТХ и ΡΗΡΜΑ-ΑΗ-ΝΗ-Ν=ΌΤΧ-ΕΕν линейный полимерный конъюгат. Дозы лекарства составляли 2x20 мг эквивалента ΌΤΧ/кг, конъюгат ΡΗΡΜΑ-ΑΗ-ΝΗ-Ν=ΌΤΧ-ΕΕν вводили в дозах 2x20 и 2x40 мг эквивалента ΌΤΧ/кг.

Фиг. 4 - уровень выживания мышей С57ВЬ/6 с ЕЬ-4 лимфомой, которым вводили производное паклитакселя ΕΕν-ΡΤΧ и ΡΗΡΜΑ-ΑΗ-ΝΗ-Ν=ΡΤΧ-ΕΕν линейный полимерный конъюгат. Из-за ограниченной растворимости РТХ не могли вводить в свободной форме.

Фиг. 5 - уровень выживания мышей ВЛЬВ/е с 4Т1 карциномой молочной железы, которым на 8 и 12 сутки вводили паклитаксель, производное паклитакселя ΕΕν-ΡΤΧ и ΡΗΡΜΑ-ΑΗ-ΝΗ-Ν=ΡΤΧ-ΕΕν линейный полимерный конъюгат. РТХ и ΡΤΧ-ΕΕν инъецировали в дозе 2x30 мг эквивалента РТХ/кг на 8 и 12 сутки (смотри текст) и конъюгат ΡΗΡΜΑ-ΑΗ-ΝΗ-Ν=ΡΤΧ-ΕΕν в дозе 2x60 мг эквивалента РТХ/кг.

Фиг. 6 - уровень выживания мышей С57ВЬ/6 с ΕΕ-4 лимфомой, которым на 9 и 13 сутки вводили ΡΗΡΜΑ-ΑΗ-ΝΗ-^ΌΤΧ-ΕΕν линейные полимерные конъюгаты с содержанием ΌΤΧ 8,2 и 16,3% в дозе 2x30 мг эквивалента ΌΤΧ.

Примеры.

Примеры проведения синтеза промежуточных соединений и конъюгатов по изобретению.

Пример 1. Синтез мономеров и производных лекарств.

НРМА готовили в соответствии с ранее описанным способом [ШЪгюй с1 а1., 2000]. Элементарный анализ: вычислено 58,8% С, 9,16% Н, 9,79% Ν; найдено 58,98% С, 9,18% Н, 9,82% Ν. Продукт был хроматографически чистым.

6-(Метакрилоиламино)гексаноилгидразин (Ν¹ -(6-гидразино-6-оксогексил)-2-метилакриламид) (ΜΑΑΗ-ΝΗΝΗ₂) готовили в соответствии с ранее описанным способом [патенты и1Ъг1сП. патент ΕΙγ^όΗ|.

Эфир левулиновой кислоты и паклитакселя (в положении-ОН 2) (ΕΕν-ΡΤΧ) готовили путем взаимодействия левулиновой кислоты с паклитакселем путем карбодиимидного способа (дициклогексилкарбодиимид, ЭСС) в Ν,Ν'-диметилформамиде (ΌΜΡ).

Левулиновую кислоту (19,4 мг, 0,167 ммоль) и ЭСС (37,5 мг, 0,182 ммоль) растворяли каждый в 0,15 мл ΌΜΡ при температуре лаборатории. Оба раствора охлаждали до -18°С и смешивали. Через 20 мин раствор паклитакселя (100 мг, 0,117 ммоль) и Ν,Ν-диметиламинопиридина (ΌΜΑΡ) (14 мг, 0,117 ммоль) в 0,3 мл ΌΜΡ добавляли к этому раствору. Взаимодействие происходило при -18°С в течение 30 мин и при 4°С в течение 16 ч. За ходом реакции наблюдали с помощью планшетов на силикагеле для ΤΕΕ’ (тонкослойной хроматографии) - 60 Р₂₅₄ (этилацетат:гексан 1:1, Κί(ΡΤΧ)=0,25, ΡΓ(^ΕV-РТХ)=0.15. ΡΓ(левулиновой кислоты)=0,45). Продукт очищали от низкомолекулярных примесей с помощью хроматографии на колонке (60x4 см), заполненной силикагелем в этилацетате. Фракцию, содержащую продукт ΡΤΧ-ΕΕν, собирали и концентрировали до 0,4 мл, и продукт осаждали с 20 мл диэтилового эфира. Продукт отбирали, промывали небольшим количеством эфира и сушили в условиях вакуума до постоянной массы. Выход составлял 98 мг продукта (84%) с точкой плавления от 136 до 138°С. ТСХ (этилацетат:гексан 1:1): одно пятно с РГ=0,15. ΜΑΣΌΙ-ΤΟΡ Μδ: 970 (Μ+№).

Чистоту мономеров и производных лекарства проверяли с использованием системы ВЭЖХ [система ВЭЖХ δΐιίιηαύζιι. оборудованная обращенно-фазовой колонкой СЬготоШЬ ЕсгГогтапсс ΡΡ-18ο (100x4,6 мм) и υν-νΐδ детектором - δΐιίιηαύζιι δΡΌ- ΙΟΑννρ (230 нм); элюент: вода-ацетонитрил с градиентом 50-100 об.% ацетонитрила, скорость потока жидкости 0,5 мл мин^-1].

Эфир левулиновой кислоты и доцетакселя (в позиции 2 -ОН) (ΌΕν-ΌΤΧ) готовили по аналогии с ΕΕν-ΡΤΧ путем карбодиимидного способа (ЭСС) в ΌΜΡ.

Левулиновую кислоту (38 мг, 0,327 ммоль) и ЭСС (100 мг, 0,487 ммоль) растворяли каждый в 0,25 мл ΌΜΡ при температуре лаборатории. Оба раствора охлаждали до -18°С и смешивали. Через 20 мин раствор доцетакселя (200 мг, 0,247 ммоль) и Ν,Ν-диметиламинопиридин (ΌΜΑΡ) (28 мг, 0,229 ммоль) в 0,6 мл ΌΜΡ добавляли к этому раствору. Взаимодействие происходило при -18°С в течение 30 мин и при 4°С в течение 16 ч. За ходом реакции наблюдали с помощью пластин силикагеля для ТСХ (тонкослойная хроматография) 60 Р₂₅₄ (этилацетат:гексан 1:1, ΚΓ(ΌΤΧ)=0,3, ΡΓ(ΕΕν-ΌΤΧ)=0,2, ΡΓ(левулиновой кислоты)=0,45). Продукт очищали от низкомолекулярных примесей дважды с использованием колоночной хроматографии (60x4 см), заполненной силикагелем в этилацетате. Фракцию, содержащую продукт ΌΤΧ-ΌΕν, собирали каждый раз и концентрировали до 0,6 мл, а продукт осаждали с 20 мл диэтилового эфира. Продукт отбирали, промывали небольшим количеством диэтилового эфира и сушили в условиях

- 4 022803 вакуума до постоянной массы. Выход продукта составлял 179 мг продукта (80%) с точкой плавления от 86 до 89°С. ТСХ (этилацетат:гексан 1:1): одно пятно с Κί=0,20. ΜΑΡΌΙ-ТОР (время-пролетная ионизация лазерной десорбцией с использованием матрицы) Μδ: 929 (Μ+Ыа).

Структуры сложных эфиров левулиновой кислоты и 4-(2-оксопропил)бензойной кислоты с паклитакселем и доцетакселем: А) эфир левулиновой кислоты и паклитакселя, ЬЕУ-РТХ; В) эфир 4-(2оксопропил)бензойной кислоты и паклитакселя, ОРВ-РТХ; С) эфир левулиновой кислоты и доцетакселя, ЬЕУ-ОТХ.

Сложный эфир 4-(2-оксопропил)бензойной кислоты и паклитакселя (в положении 2 -ОН) (ОРВРТХ) готовили с помощью такого же вышеописанного способа для приготовления ЬЕУ-РТХ, а именно путем взаимодействия 4-(2-оксопропил)бензойной кислоты и паклитакселя с использованием реагента для конъюгации ЭСС в ΌΜΡ. Выход продукта составил 85%. Точка плавления от 143 до 145°С. ТЬС (этилацетат:гексан 1:1): одно пятно с Κί=0,25. ΜΑΣΌΙ-ТОР Μδ: 1032 (Μ+Ыа).

Сложный эфир 4-(2-оксопропил)бензойной кислоты и доцетакселя (в положении 2 -ОН) (ОРВ-РТХ) готовили с помощью такого же вышеописанного способа для приготовления ΌΤΧ-ЬЕУ, а именно путем взаимодействия 4-(2-оксопропил)бензойной кислоты с доцетакселем с использованием ЭСС в ΌΜΡ. Выход продукта составил 81%. Точка плавления от 94 до 96°С. ТЬС (этилацетат:гексан 1:1): одно пятно с Κί=0,28. ΜΑΣΌΙ-ТОР Μδ: 990 (Μ+Ыа).

Сложный эфир 4-оксопентеноевой [3-ацетилакриловой] кислоты и паклитакселя (в положении 2 ОН) (ААК-РТХ) готовили с помощью такого же вышеописанного способа для приготовления ЬЕУ-РТХ, а именно путем взаимодействия 4-оксопентеноевой кислоты с паклитакселем с использованием ЭСС в ΌΜΡ. Выход составлял 86%. Точка плавления от 138 до 139°С, ТСХ (этилацетат:гексан 3:1): одно пятно с Ρί=0,6. ΜΑΣΌΙ-ТОР Μδ: 968 (Μ+Ыа).

Сложный эфир 5-оксогексеновой кислоты и паклитакселя (в положении 2 -ОН) (ОНЕ-РТХ) готовили с помощью такого же вышеописанного способа для приготовления РТХ-ЬЕУ, а именно путем взаимодействия 5-оксогексеновой кислоты с паклитакселем с использованием реагента для конъюгации ЭСС в ΌΜΡ. Выход составлял 85%. Точка плавления от 132 до 134°С, ТСХ (этилацетат:гексан 3:1): одно пятно с Ρί=,65. ΜΑΣΌΙ-ТОР Μδ: 982 (Μ+Ыа).

Сложный эфир 5-оксогексеновой кислоты и доцетакселя (в положении 2 -ОН) (ОНЕ-ОТХ) готовили с помощью такого же вышеописанного способа для приготовления ЭТХ-БРУ. а именно путем взаимодействия 5-оксогексеновой кислоты с доцетакселем с использованием реагента для конъюгации ЭСС в ΌΜΕ. Выход продукта составлял 86%. Точка плавления от 84 до 86°С. ТСХ (этилацетат:гексан 3:1): одно пятно с Κί=0,7. ΜΑΡΌΙ-ТОР Μδ: 940 (Μ+Ыа).

Пример 2. Синтез полимерного предшественника - сополимера ΗΡΜΑ с ΜΑ-ΑΗ-ΝΗΝΗ₂.

Поли(ΗРΜΑ-СО-ΜΑ-ΑΗ-NΗNΗ₂) сополимер готовили путем радикальной сополимеризации НРМА и ΜΑ-ΑΗ-ΝΗΝΗ₂ в метаноле при 60°С в соответствии с описанным ранее способом [патент ЕйусЬ].

Структуры предшественника полимера, поли(НРМА-со-МА-АН-МНМН₂) сополимер.

- 5 022803

Пример 3. Получение полимерных конъюгатов, содержащих производные лекарств (ΡΗΡΜΑ-ΑΗ-ΝΗΝ=ΕΕν-ΡΤΧ, ΡΗΡΜΑ-ΑΗ-ΝΗ-Ν=ΕΕν-ΌΤΧ, ΡΗΡΜΑ-ΑΗ-ΝΗ-Ν=ΟΡΒ-ΡΤΧ, ΡΗΡΜΑ-ΑΗ-ΝΗ-Ν=ΟΡΒΌΤΧ, ΡΗΡΜΑ-ΑΗ-ΝΗ-Ν=ΟΗΕ-ΡΤΧ, ΡΗΡΜΑ-ΑΗ-ΝΗ-Ν=ΟΗΕ-ΌΤΧ, ΡΗΡΜΑ-ΑΗ-ΝΗ-Ν=ΑΚΚ-ΡΤΧ и ΡΗΡΜΑ-ΑΗ-ΝΗ-Ν=ΑΚΚ(-ΌΤΧ).

Сополимеры с производными РТХ, ΌΤΧ и ΕΤΧ, связанные с носителем РНРМА с помощью гидролитически расщепляемой гидразоновой связью, получали путем взаимодействия предшественников полимеров, содержащих гидразиновые группы, с соответствующими производными лекарств в метаноле в условиях катализа уксусной кислотой.

Раствор 100 мг поли(НРМА-со-МА-АН-NΗNΗ2) сополимера в 1,1 мл метанола смешивали с раствором ΕΕν-ΡΤΧ в 0,2 мл метанола. Через 1 мин к перемешиваемой реакционной смеси при 25°С добавляли 40 мкл уксусной кислоты. За ходом реакции (утрата ΕΕν-ΡΤΧ) наблюдали с помощью ТСХ (пластины силикагеля 60Р₂₅₄, этилацетат, Ρί(ΕΕν-ΡΤΧ)=0,8). Через 2 ч реакционную смесь очищали от свободных производных лекарств путем гель-фильтрации на колонке, заполненной Сефадексом ΕΗ-20 в метаноле. Полимерную фракцию выделяли, концентрировали в вакуумном испарителе, и продукт осаждали 50 мл этилацетата, выделяли с помощью фильтрации на фритте 84, отмывали 150 мл этилацетата и высушивали до постоянной массы.

Содержание общего РТХ или его производных в полимерном конъюгате определяли с помощью способа ВЭЖХ (система для ВЭЖХ δΐιίιηαύζιι) после полного гидролиза полимерного конъюгата в растворе Η0 (рН 2) при 37°С в течение 1 ч и экстракции производного РТХ хлороформом. Μ_ν и распределение молекулярной массы определяли с помощью жидкостной хроматографии (колонка Τ8ΚΟβ1 4000 (300x10 мм), 20% 0,3М ацетатный буфер (ΕΗ₃ΕΟΟΝα/ΕΗ₃ΕΟΟΗ: рН 6,5; 0,5 г/л ΝαΝ₃) и 80% метанол, скорость потока 0,5 мл/мин, детекцию осуществляли с помощью дифференциального рефрактометра, детектора рассеивания света (ΌΑνΝ-ΌΞΡ-Ρ, \УуаЦ Τοαίιηοίοβν, υ8Α) и УФ-детектора (250 нм). Описание полимерного лекарства: общий выход реакции связывания лекарства 96 мг (88%), содержание общего ΕΕν-ΡΤΧ составило 9,2 мас.%, содержание свободного РТХ<0,2% от общего содержания РТХ. Способ связывания производного РТХ с предшественниками полимеров с помощью гидразоновой связи являлся таким же, как и для всех типов предшественников и производных лекарств.

Схема 3.

Структуры полимерного конъюгата ΡΗΡΜΑ-ΑΗ-ΝΗ-Ν=ΌΤΧ-ΕΕν со связывающим производным, сложным эфиром левулиновой кислоты и доцетакселем.

Пример 4. Высвобождение РТХ, ΌΤΧ или их производных из полимерных конъюгатов. Количества РТХ, ΌΤΧ или их производных, высвобождающихся из полимерных конъюгатов, измеряли после их инкубации в фосфатном буфере со значением рН 5,0 (0,1М фосфатный буфер, содержащий 0,05 М Ν;·ιΟ), имитирующем внутриклеточную среду, и в фосфатном буфере со значением рН 7,4, имитирующем среду кровотока. Количества высвобождающихся лекарств или их производных в растворах для инкубации определяли с помощью ВЭЖХ (δΐιίιηαύζιι). Через определенные временные интервалы 200 мкл дозы растворов для инкубации отбирали и после экстракции высвободившегося лекарства и его производных хлороформом их количества определяли с использованием системы ВЭЖХ [система ВЭЖХ δΐιίιηαύζιι, оборудованная обращенно-фазовой колонкой СйгошоШЪ ΡοιΤοπηαηοο ΚΡ-18β (100x4,6 мм) и детектором υν-νΐ8 - δΐιίιηαύζιι 8ΡΌ - 10Αννρ (230 нм); элюент:вода-ацетонитрил с градиентом 50-100 об.% ацетонитрила, скорость потока 0,5 мл мин^-1.

После инкубации конъюгатов (концентрация 5 мг/мл) в физиологической окружающей среде при 37°С (фосфатный буфер, рН 7,4) лекарства (РТХ и ΌΤΧ) (или их производные) высвобождались значительно медленнее (фиг. 2), чем в слабокислой среде с рН 5,0, имитирующей среду эндосом и лизосом опухолевых клеток (фиг. 1). Для обоих лекарств на уровень высвобождения из полимерного конъюгата и пропорцию выделенных компонентов (лекарств и их производных) принципиально влияла структура оксокислотного спейсера. Спейсер, состоящий из левулиновой кислоты или 4-(2-оксопропил)бензойной кислоты, позволял очень быстрое высвобождение производного лекарства при рН 5; однако гидролиз эфирной связи между лекарством и кислотой происходил очень медленно. С другой стороны, спейсер,

- 6 022803 состоящий из 4-оксопентеновой кислоты, стабилизировал и гидразоновую, и эфирную связь, таким образом, что не происходило значительного высвобождения лекарства или его производного. Во время инкубации в физиологической среде с рН 7,4 происходил частичный гидролиз гидразоновой связи в случае полимерного конъюгата со спейсером, состоящим из левулиновой кислоты или 4-(2оксопропил)бензойной кислоты, со значительно более низким уровнем по сравнению со средой со значением рН 5. Доказано, что стабильность сложноэфирной связи между левулиновой кислотой и лекарством при рН 7,4 ниже, и свободные лекарства высвобождаются в объеме одной трети. С другой стороны, в случае спейсера, состоящего из 4-(2-оксопропил)бензойной кислоты, высвобождается только производное лекарства, эфирная связь стабильна. Распад производного лекарства до свободного лекарства или прямого расщепления лекарства из полимерного конъюгата предположительно происходит из-за действия ферментов, в основном карбоксиэстераз.

Пример 5. Демонстрация биологической активности ίη νίίτο линейных полимерных конъюгатов доцетакселя и паклитакселя во время инкубации с клетками опухолевых линий; ЕЬ-4 Т клеточной лимфомы и 4Т1 карциномы молочной железы.

Таблица 1

Значения 1С₅₀ (в нг/мл).

Пример 6. Демонстрация биологической активности ίη νίνο линейных полимерных конъюгатов доцетакселя и паклитакселя у мышей, иноколурованных ЕЬ4 Т клетками лимфомы.

Для демонстрации ίη νίνο активности конъюгатов доцетакселя и палитакселя применяли модель мышиной изогенной Т клеточной лимфомы ЕЬ-4. На 0 сутки мышам линии С57ВЬ/6 (самки) подкожно имплантировали 1х10⁵ ЕЬ-4 опухолевых клеток. Лекарства вводили внутривенно (ί.ν.) двумя дозами, которые вводили на 8 и 12 сутки после трансплантации опухолевых клеток. Первую дозу вводили, когда опухоли были хорошо развиты, прощупываемы, размером приблизительно 300 мм³. В эксперименте наблюдали размер опухоли, массу тела мыши, общее состояние здоровья и уровень выживания. Эффект конъюгата все время сравнивали с эффектом свободного лекарства (ЭТХ, РТХ) и его производных (ЭТХ-ЬБУ, РТХ-ЬЕУ). Средняя продолжительность жизни контрольных мышей с лимфомой ЕЬ-4, которым ничего не вводили, составило 31,3 суток (8Ό (3Ό 3,66, средняя продолжительность жизни 30,5 суток). ΌΤΧ, РТХ, а также производные ЭТХ-ЬБУ, РТХ-ЬЕУ растворяли для внутривенного введения в смеси Сгеторйог ЕЬ (Зщта. ИЗА) и этанола (1:1); после растворения лекарства объем дополняли 4 объемными частями РВЗ (физиологического раствора, забуференного фосфатом). Конъюгаты РНРМА-АНХН-Х=ПТХ-ЬЕУ, РНРМА-АН-ХН-Х=РТХ-ЬЕУ растворяли в РВЗ. Объем каждой отдельной дозы лекарства составлял 0,2 мл. Применяли следующие дозы лекарственных средств: ЭТХ и производное ЭТХЬЕУ-2х20 мг эквивалента ЭТХ/кт, конъюгат РНРМА-АН-ХН-Х=ПТХ-ЬЕУ - 2x20 и 2x40 мг эквивалента ЭТХ/кт, РТХ и производное РТХ-ЬЕУ - 2x30 мг эквивалента РТХ/кг, конъюгат РНРМА-АН-ХН-Х=РТХЬЕУ - 2x60 мг эквивалента РТХ/кг.

A. Противораковая активность конъюгата РНРМА-АН-ХН-Н=ПТХ-ЬЕУ (фиг. 3).

Свободный ЭТХ привел к полной регрессии опухолей ЕЬ-4 у 4 мышей из 7 тестируемых мышей. Производное ЬЕУ-ЭТХ обладало более слабым эффектом и привело к полной регрессии опухоли ЕЬ-4 у 1 из 8 тестируемых мышей. Конъюгат РНРМА-АН-ХН-Х=ПТХ-ЬЕУ в дозе, эквивалентной свободному ЭТХ (2x20 мг эквивалента ЭТХ/кг), также вылечил 1 мышь из группы, состоящей из 8 мышей. Однако удвоение дозы конъюгата (2x40 мг эквивалента ЭТХ/кг) привело к исцелению 7 мышей из группы (η=8). Ни в одной из тестируемых групп не наблюдали потери массы (как индикатора токсичности лекарства). У мышей, у которых произошла полная регрессия опухоли, не наблюдали никаких симптомов роста опухоли или токсичности до 94 суток, когда им снова трансплантировали клетки ЕЬ-4 в той же (т.е. летальной) дозе, и мыши были оставлены без лечения. Эту вторую трансплантацию проводили для доказательства иммунологически опосредованной устойчивости против опухоли. Статистически значимая часть мышей, которых лечили с помощью конъюгата РНРМА-АН-№Н-К=ЭТХ-ЬЕУ (2x40 мг экв. ЭТХ/кг), была устойчива к ЕЬ-4 опухоли (5 устойчивых мышей из 7, т.е. 71%). Среди мышей, которых лечили свободным ЭТХ, также обнаружилась сходная часть устойчивых индивидуумов (3 мыши из 4 вылеченных были устойчивы).

Вывод: конъюгат РНРМА-АН-ХН-Х=ПТХ-ЬЕУ обладает значительным противораковым эффектом у мышей С57ВЬ/6 с ЕЬ-4 лимфомой, его введение не сопровождалось токсическими побочными эффектами и способствовало установлению устойчивости к опухоли в 71% излеченных индивидуумов.

B. Противораковая активность конъюгата РНРМА-АН-ХН-Н=РТХ-ЬЕУ (фиг. 4).

- 7 022803

Невозможно вводить свободный РТХ мышам из-за его очень ограниченной растворимости (мыши погибали немедленно после инъекции). Производное ΡΤΧ-ΌΕν не обладало противораковым действием на ЕЬ-4 лимфому (оно не продлевало среднюю продолжительность жизни, ни одна мышь не была вылечена; п=8). Конъюгат ΡΗΡΜΑ-ΑΗ-ΝΗ-Ν=ΡΤΧ-ΕΕν в дозе 2x60 мг эквивалента РТХ/кг не вылечил ни одной мыши или не продлил среднее времени жизни (п=8). Ни в одной группе не было отмечено потери массы как индикатора токсичности лекарства.

Вывод: производное ΡΤΧ-ΕΕν (2x30 мг экв. РТХ/кг) или конъюгат, содержащий производное РТХ (2x60 мг экв. РТХ/кг), не обладали никаким лечебным эффектом при лечении изогенной ЕЬ-4 лимфомы у мышей.

Пример 7. Демонстрация биологической активности ίη νίνο линейного полимерного конъюгата паклитакселя у мышей, инокулированных 4Т1 карциномой молочной железы (фиг. 5).

Применяли модель мышиной изогенной карциномы молочной железы 4Т1. Мышам линии ВАЬВ/с (самкам) подкожно имплантировали 1х 10⁶ 4Т1 клеток карциномы на 0 сутки. Лекарства вводили внутривенно (ΐ.ν.) двумя дозами на 8 и 12 день после трансплантации опухолевых клеток. Первую дозу вводили, когда опухоль была хорошо развита, прощупывалась, с размером приблизительно 300 мм³. В ходе эксперимента наблюдали за размером опухоли, массой тела мышей, общим состоянием здоровья и уровнем выживания. Эффект конъюгата всегда сравнивали с эффектом свободного лекарства (РТХ) и его производного (ΡΤΧ-ΕΕν). Среднее время выживания контрольных мышей, которым не водили лекарства, составило 34,9 суток (8Ό 2,59; среднее время выживания 35 суток).

РТХ, ΡΤΧ-ΕΕν и конъюгат ΡΗΡΜΑ-ΑΗ-ΝΗ-Ν=ΡΤΧ-ΕΕν готовили для внутривенного введения таким же способом, как упоминалось выше (см. пример 6 А, В). Вводили следующие дозы: РТХ и ΡΤΧΕΕν в дозе 2x30 мг эквивалента РТХ/кг, конъюгат ΡΗΡΜΑ-ΑΗ-ΝΗ-Ν=ΡΤΧ-ΕΕν в дозе 2x60 мг эквивалента РТХ/кг.

Конъюгат ΡΗΡΜΑ-ΑΗ-ΝΗ-Ν=ΡΤΧ-ΕΕν полностью вылечил 3 из 8 тестируемых мышей. После введения производного ΡΤΧ-ΕΕν регрессия 4Т1 опухоли произошла у 1 из 8 мышей. Введение свободного лекарства (РТХ) сопровождалось значительными побочными эффектами: внутривенное введение второй дозы вызывало тяжелые реакции (спазмы, позднее плохое общее состояние - поднятая дыбом шерсть, вялость, которая продолжалась по меньшей мере 24 ч) у первой половины мышей. Для других мышей в группе вторую дозу уменьшили на 10% и вводили внутрибрюшинно вместо внутривенного введения. Вылечилась только одна мышь, которой вводили дозу лекарства внутривенно, у других мышей не было обнаружено лечебного эффекта РТХ. Ни в какой тестируемой группе не отмечали потерю массы в качестве индикатора токсичности.

Для проверки устойчивости к 4Т1 опухоли вылеченным мышам через 129 суток после первой трансплантации снова трансплантировали опухолевые клетки. Во второй раз инъецировали О10⁵ 4Т1 клеток подкожно, и мышей оставляли без лечения. У всех этих мышей (3 вылеченных конъюгатом РНРΜΑ-ΑΗ-ΝΗ-Ν=ΡΤΧ-ΕΕν, 1 вылеченная ΡΤΧ-ΕΕν) опухоли не росли, что означает, что эти мыши были устойчивы к данной опухоли.

Вывод: конъюгат ΡΗΡΜΑ-ΑΗ-ΝΗ-Ν=ΡΤΧ-ΕΕν обладает значительным противораковым эффектом у мышей ΒΑΌΒ/с с 4Т1 карциномой молочной железы, его введение не сопровождалось никаким побочным токсическим эффектом и способствовало установлению устойчивости к опухоли у 38% вылеченных индивидуумов.

Пример 8. Демонстрация биологической активности ίη νίνο линейного полимерного конъюгата доцетакселя с различным содержанием лекарства у мышей, инокулированных Т клетками ΕΕ4 лимфомы (рис. 6).

Применяли опухолевую модель ΕΕ-4 лимфомы, описанную выше (пример 6). Конъюгаты ΡΗΡΜΑΑΗ-ΝΗ-Ν=ΌΤΧ-ΕΕν с содержанием лекарства ΌΤΧ 8,2 мас.% (9,1 мас.% ΌΤΧ-ΌΕν) и 16,3 мас.% ΌΤΧ (18,0 мас.% ΌΤΧ-ΕΕν) растворяли в ΡΒδ (0,2 мл) для введения, и субоптимальную дозу 2x30 мг эквивалента ΌΤΧ/кг вводили внутривенно на 9 и 13 сутки после трансплантации опухолевых клеток.

Конъюгат с более низким содержанием лекарства (8,2% ΌΤΧ) вылечил 1 из 8 тестируемых мышей, и у других он продлил время выживания статистически значимым образом (не обработанные контроли: средняя продолжительность жизни 27,25 суток, δΌ 1,64, среднее 28 суток; обработанные мыши: среднее 41,75 суток, δΌ 6,54, медиана 45 суток; р<0.01). Конъюгат с более высоким содержанием лекарства (16,3% ΌΤΧ) также привел к вылечиванию 1 из 8 тестированных мышей, но время жизни других мышей не было значительно увеличено.

Вывод: содержание производного лекарства в конъюгате ΡΗΡΜΑ-ΑΗ-ΝΗ-Ν=ΌΤΧ-ΕΕν оказывало значительное влияние на противораковый эффект у мышей С57ВЬ/6 с ΕΌ-4 лимфомой при введении в субоптимальной дозе 2x30 мг эквивалента ΌΤΧ/кг. Полимерный конъюгат с более низким содержанием обеспечил более высокую противораковую активность.

- 8 022803

Список литературы

Р. Оипсап, ΰ.Β. 1_1оус1, к Коресек, Р. Ре)тапоуа, ΰ. 81гоЬа1т, К. и1ЬпсН, В. Ρίίιονθ, V. СЬу(гу, ЗуШЬейС Ро1утепс Огидз (1985). СгесЬ. РУ 0095/85, Аиз(гаНа 589587, СапаРа 130053, Оептагк 164485, Еигоре 0187547, 1)5 5,037,883,1арап 000137/86.

Р. Оипсап, Ы-(2-НуРгохургору1)те1Масгу1ат1ре соро1утег соп]ида1ез, ίη ) Зу/агЬпск (еР), Огидз апР (Ье РНагтасеийиРса! Заепсез: Воса Ра(оп, Тау1ог & Ргапс15, р. 1-92 (2005).

Т. Е1гусЬ, М. ЗеПпкоУЭ, В. Рктоуа, К. 1ПЬпсЬ К., Νβνν НРМА соро1утегз соп1а1П1пд РохогиЬюп ЬоипР νίβ рН зепзкуе Ипкаде. Зуп1Ьез13, ίη νίίΓΟ апР ίη νίνο Ью1од1са1 ргорегЬез. ϋ. Соп1го11еР Ре1еазе 73,89-102 (2001).

Т. Е1гусЬ, Р. СЬуМ, М. ЬейпИоуа, В. ΡίΚονβ, К. 1НЬпсЬ, Зуп1Ьез!5 οΐ НРМА Соро1ушег8 Соп1а1П1пд ОохогиЬгап ВоипР νίβ а НуРгагопе ипкаде. ЕЯес1 οί Зрасег оп Огид Ре1еазе апР ίη νίίΓΟ Су1о1ох1С0у. Масгото1еси1аг Вюзск 2, 43-52 (2002).

Т. Е1гусЬ, Р. СЬуМ, М. РесЬаг, М. 51иРепоУзку, В. Ρίίιονθ, К. БИЬпсЬ, гризоЬ рпргауу ро1утегп1сИ коцидаШ РохогиЬюпи з рН-Ьгепут иуо1поуап1т Ιβανθ, ΟΖ 297 827 В6.

Т. Е1гусЬ, Р, СЬуЫ, К. БНЬпсЬ, Т. Мгкуап, В. Р+оуа, Ро1утегтн Ιθοίνο а гризоЬ )еГо уугоЬу. ΟΖ 298945 В6.

Т. Е1гусЬ, К. ШЬпсЬ: Ро1утет1 коп)ида1у РохогиЬгапи з рН-Ьгепут υνοίηονθπίιτι 1еота а гризоЬ ίβίίοίι рпргауу. ΟΖ РУ-2006-505, ΟΖ ра(. 299053 В6

Т. Е1гусН, Р. СЬуЫ, Т. Мгкуап, М. Зкоуа, В. Ρίίιονβ, К. (ЛЬпсЬ, Соп|ида1ез οί РохогиЬгап ννίΙΚ дгаЙ НРМА соро1утегз (ог раззке (итог 1агдеЬпд: Ьоита οΐ СотгоПеР Ре1еазе 132,184-192(2008)

Р.В. 6геепжа1Р, РЕС Огидз: ап оуегаечу, Ьоигпа1 οί Соп(го11еР Ре1еазе 74, 159-171 (2001).'

Р.В. Сгееп«/аЮ, Υ. Н. Сбое, 1. МсСике, СО. Сопоуег, ЕЯесМуе Огид РеНуегу Ьу РЕСу1а1еР Огид соп|ида1ез. АруапсеР Огид ϋβίίνβιγ Ρθνίβνβ 55, ρ. 217-250 (2003).

Р.В. СгеептаЮ, А. РепРп, О. ΒοίίΙοΙ, НдЫу Ма(ег-Зо1иЫе Тахо! ОепуаЙуез - 7-Ро1уе1Ьу1епе 61усо1 СагЬата1ез апР СагЬопа(ез, Зоита! οί Огдапю СЬет1з1гу 60, 331-336 (1995).

Р. СЬуЫ, Т. ЕЬусЬ, М. НгиЬу, К. 1ЛЬпсЬ, В. Ρίήονθ: М|се1агп1 поз1се Ιβοίν з ргойпарогоуои ак!м1ои. ΟΖ РУ 2006-207.

Р. СНуМ, Т, Е1гусЬ, С. Копак, М. 5(гоуа, Т. Мгкуап, ϋ. Воисек, В. Ρίίιονθ, К. ШЬпсЬ, Νβνν НРМА соро1утег-ЬазеР Огид сагпегз ννίΐίι соуа)епЙу ЬоипР ЬуРгорЬоЫс зиЬзЫиеп1з (ог 3θΙίΡ (итоиг (агдеЙпд, Ьоита1 οί Соп1го11еР Ре1еазе 127, 121-130 (2008).

ϋ. Коресек, Р Корескоуа, Т, Мюко, Ζ. Би, НРМА Соро1утег-Апйсапсег Огид Соп|ида(ез: Оез1дп, Асйуйу апР МесЬап1зт οί Асйоп. Еигор. ϋ. РЬагт. ВюрЬагт. 50, 61 - 81 (2000).

к Коресек, Р. Корескоуа, Т. Μίη ко, Ζ. Би, СМ. Ре(егзоп, \Л/а(ег зо1иЫе ро1утегз ίη (итог 1агде(еР РеНуегу, к СоШгоНеР Ре1еазе 74,165-173 (2001).

Е, Кга(г, и. Веуег, М.Т. ЗсЬийе, Огид-ро1утег соп)ида(ез ооп(аю1пд ас1рс1еауаЫе ЬопРз, Сп(. Реу. ТЬег. Огид Сагпег Зуз1. 16, 245-288 (1999).

Е. Кга(г, БА. МиИег, С Рурра, А. У/агпеске, РгоРгид з(га(ед1ез ίη апЬсапсег сЬето(Ьегару, СЬеттеРсЬет 3, 20-53 (2003).

3. Ид, А. ЗраггеЬоот, Υ. ЗЬакеР, С Бее, 3. Мап, Ν. 0еза1, Р. Зооп-ЗЬюпд, νν. ϋ. Р|дд, Р. КогЬеЬ 1п(1иепсе οί Еогти1а1юп\/еЫс1е опМе(гопоггнс Тахапе СЬетоШегару: А1Ьит1п-ВоипР уегзиз СгеторЬог ЕБ-ВазеР РасН(ахе1, СНп Сапсег Рез 26; 4331-4338, 2006

Υ. ЫодисЬ!, к УУи, Р. Оипсап, 3. 5(гоЬа1т, К. ШЬпсЬ, Т. Ака1ке, Н. МаеРа,

- 9 022803

ЕаИу рРазе (итог ассити1айоп οί тасгото1еси1ез: а дгеа( йНТегепсе ίη с1еагапсе га(е ЬеМееп (итог апй погта! Иззиез, Йрп. Л.Сапсег Рез. 89, 307-314 (1998).

A. Репйп, СО. Сопоуег, К.В. Сгеепжак!, Апй(итог ас(м(у οί расН1ахе1-2 '-д1уапа(е соп|ида(ей (о ро!у(е(Ру1епе д!усо1): а та(ег-зо1иЫе ргос!гид, Апй-Сапсег Огид 0ез|дп 13, 387-395 (1998).

B. ΡίΡονθ, М. ЙеНпкоуа, ϋ. 31гоРа1т, V. 5иЬг, ϋ. Р1осоуэ, О. Ноуогка, М.

Моуа к, ϋ. Р1ипйгоуа, Υ. Сегтапо, К. ШЬпсР, Ро1утепс Огидз Вазе<1 оп Соп]ида1ез οί 5уп(РеНс апй Ыа1ига1 Масгото1еси1ез II. Апй-сапсег АсйуКу οί апйЬойу ог (РаЬ')2-(агде(ей Соп|ида(ез апй СотЫпей ТРегару ννί(Ρ 1ттипотойи1а(огз. й.

СопйоПей Рек 64, 241-261 (2000)

В. гайоуа, Т. Е(гусР, М. РесРаг, М, ЙеНпкоуа, М. 5('аз1пу, О. Ноуогка, М.

Κονθί, К. ШЬпсР, ОохогиЬюп Ьоипй (о а НРМА соро1утег сагпег (РгоидР Руйгагопе Ьопй ίε ейесйуе а1зо ίη а сапсег сеН Нпе ууКР а НтКей соп(еп( οί 1узозотез, й. Соп(го11ей Ре1еазе 74,225-232 (2001)

Р. 5а(сР|-Ра1паго. Р. Оипсап, С Ватез, Ро1утег (Регареийсз Тог сапсег:

Сиггеп( з(а(из апй 1и(иге сРаНепдез, ίη Р За(сР|-Ра1паго апй Р Оипсап (ейз),

Айуапсез ίη Ро1утег Зс1епсе , Ро1утег ТРегареийсз II: ВегНп / Не1йе1Ьегд,

Зрппдег, р. 1-65 (2006).

1_.\Л/. Зеутоиг, Υ. М1уато(о, Н. Маейа, М. Вгегейэп, й. 3(гоРа1т, К. ШЬпсР,

Р. Оипсап, 1пйиепсе οί Мо1еси1аг-Ме1дР( оп Разз1уе Титог Ассити1айоп οί А Зо1иЫе Масгото1еси1аг Огид Сагпег. Еиг.Й.Сапсег 31 А, 766-770 (1995).

й.М.М. Тептодк νν.Τ. Ни1Шпк. й.Н.М. ЗсРеНепз, М. ЗсРо1,Ι.Α.Μ, Мапй)ез, М.

ΖυΠο, М. РоссРе(й, Н. Розтд, Р. й. Коортап, Й.Н. Вецпеп, РРазе I сРп1са1 апй ррагтасок1пейс з(ийу οί ΡΝΙ1166945, а ηονβΙ та(ег-зо!иЫе ро1утег-соп]ида(ей ргойгид οί расН(ахек АпЙ-Сапсег Огидз 12,315-323(2001).

Й.М.М. Теплюд(, Н. Розпд, М. РоссРе(й, Е. Рпдепо, ϋ, Рга1ег, Рй. Коортап,

Й.Н.М. ЗсРеНепз, νν.Τ, Ни(п1пк, Й.Н. Вецпеп, Н1дР-рег1огтапсе Нйик1 сРготаЮдгарРю те(Ройз Тог (Ре йе(егпгапайоп οί а ηονβΙ ро1утег-Ьоипй расН(ахе1 йепуайуе апй 1гее расН(ахе1 ίη Ритап р1азта, й.!йй.СРгота(одг.Ре1а(.ТесРпо1. 23,

1233-1251 (2000).

К, ШЬпсР, V. ЗиЬг, й. 5(гоРа1т, О. Р1осоуа, М. йеНпкоуа, В, ΡίΡονθ,

Ро1утепс Огидз Вазей оп Соп|ида(ез οί Зуп(Рейс апй 14а(ига1 Масгото1еси1ез I.

5уп(Рез13 апй РРузюо-сРет1са1 СРагайепзайоп. й. Соп(го11ей Рек 64,63-79 (2000)

К. ШЬпсР, Т. Е(гусР, Р. СРуШ, М. ЙеНпкоуа, В. ΡίΡονβ, АпИЬойу-Тагде(ей Ро1утег-ОохогиЬ1С1п СофидаТез ιλί(Ρ рН-Соп(гоНей Асйуайоп, й. Огид Тагдейпд 12,

477-489 (2004) (А).

К. ШЬпсР, V. ЗиЬг, Ро1утепс Апйсапсег Огидз ννίΐΡ рН-Соп(гоНей Асйуайоп,

Айу. Огид Оейуегу Реу. 56/7,1025-1052 (2004) (В).

К. ШЬпсР, Т. Е(гусР, В. Р|Роуа, М. ЙеНпкоуа, Μ. Κονθί: рН ββηζίίίνηί ро1утепга коп;ида(у ап(гасукНпоуеРо капсегоз(айка рго сНепои (егарН. СИ 293787 В6

1Й. УапРоеТег, е( ак, Сотрагайуе апй(итог екйсасу οί йосе(ахе1 апй расН(ахе! ίη пийе тисе Ьеаппд Ритап (итог хеподгаЙз (Ра( оуегехргезз (Ре тиШйгид гез15(апсе ρηοίβίη (МРР), Аппа1з οί Опсо1оду 8,1221 - 1228 (1997).

Й.УУ. ννίηίθΓ, РасНйхе! роНд1итех (ΧΥΟΤΑΧ, СТ-2103): А тасгото1еси!аг (ахапе, йоита! οί Соп(гоНей Ре1еазе 109,120-126 (2005).

Claims (5)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Полимерный конъюгат, состоящий из производного цитостатического агента, представляющего собой таксан, выбранный из паклитакселя (РТХ) и доцетакселя (^ΤX), и полимерного носителя, содержащего линейный или биодеградируемый привитой сополимер, состоящий из единиц N-(2гидроксипропил)метакроиламида (НРМА) и единиц, содержащих метакрилоилированные гидразоны аминокислот или олигопептидов, где указанное производное цитостатического агента получено путем ацилирования вторичных гидроксильных групп цитостатического агента с оксокислотой, выбранной из группы, состоящей из левулиновой кислоты и 4-(2-оксопропил)бензойной кислоты, и оно связано с но- 10 022803 сителем с помощью гидролитически нестабильной гидразоновой связи, и где указанные аминокислоты или олигопептиды выбраны из группы, состоящей из глицила, глицилглицила, β-аланила, 6аминогексаноила (АН), 4-аминобензоила и смешанных ацилов, являющихся производными олигопептидов С1уРйеС1у, О1уЬеиО1у, С1уРеиРйеС1у и С1уРйеРеиС1у.
2. 2. Полимерный конъюгат по п.1, отличающийся тем, что он содержит 70-98 мол.% основного сополимера НРМА, 0,5-10 мол.% единиц с производным цитостатического агента, связанным гидразоновой связью, и дополнительно содержит 1,5-29,5 мол.% единиц с гидразидными функциональными группами.
3. 3. Полимерный конъюгат по любому из пп.1, 2, отличающийся молярной массой, составляющей 1050000 г/мол. в случае линейного полимера и 50-250000 г/мол. в случае привитого сополимера.
4. 4. Способ получения полимерного конъюгата по пп.1-3, отличающийся тем, что полимерный носитель, содержащий линейный или биодеградируемый привитой сополимер, состоящий из единиц N-(2гидроксипропил)метакроиламида (НРМА) и единиц, содержащих метакрилоилированные гидразиды аминокислот или олигопептидов, подвергают полимераналогичному превращению путем взаимодействия со сложным эфиром паклитакселя и доцетакселя с оксокислотой, выбранной из группы, состоящей из левулиновой кислоты и 4-(2-оксопропил)бензойной кислоты, и где указанные аминокислоты или олигопептиды выбраны из группы, состоящей из глицила, глицилглицила, β-аланила, 6-аминогексаноила (АН), 4-аминобензоила и смешанных ацилов, являющихся производными олигопептидов С1уРйеС1у, С1уРеиС1у, С1уРеиРйеС1у и С1уРйеРеиС1у.
5. 5. Применение полимерного конъюгата по пп.1-3 для изготовления лекарственного средства для лечения опухолевых заболеваний, выбранных из опухолей яичников, молочной железы, легкого, предстательной железы и карциномы молочной железы 4Т1, или для лечения лимфом.