PT98783A - Processo para a preparacao de um polimero contendo acido poliaspartico apropriado para inibir a nefrotoxicidade do aminoglicosido - Google Patents

Description

"PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM POLÍMERO CONTENDO ÃCIDO POLIASPÃRTICO APROPRIADO PARA INIBIR A NEFROTOXICIDADE DO AMINOGLICOSIDO" A presente invenção refere-se à utilização de um sub--grupo seleccionado de agentes protectores polímeros de ácido poli-aspártico para inibir a nefrotoxicidade associada à utilização de aminoglicósidos antibióticos. A presente invenção abrange também as composições farmacêuticas que contêm esses agentes protectores e aminoglicósidos para utilização clínica, quando administrados em simultâneo.

Os antibióticos aminoglicosldicos foram utilizados a seguir ao isolamento, em 1944, da estreptomicina, o primeiro aminoglicósido clinicamente utilizável. Apesar de os aminogli cosidos serem particularmente úteis devido à sua rápida acção bactericida em infecções provocadas por organismos sensíveis a este tipo de antibiótico, a sua utilização limita-se a infecções mais graves e complicadas, principalmente, devido aos seus efeitos secundários ototóxicos e nefrotóxicos. Por este motivo se considera que os aminoglicósidos possuem uma propor ção, acção terapêutica/risco, baixa, comparativamente a outros antibióticos utilizados por via sistémica.

Os efeitos nefrotóxicos provocados pela utilização de aminoglicósidos encontram-se bem documentados na literatura.

Pode encontrar-se uma descrição recente sobre as reacções adversas dos aminoglicósidos e precauções que devem ser toma- -2- νΛ’ das em "Drugs Evaluation", AMA and W.B. Saunders Co., Filadélfia, PA# 63 ed., 1986, pp. 1433-1435.

Referiram-se diversas substâncias como sendo úteis na inibição dos danos renais induzidos pelos aminoglicósidos, par ticularmente, derivados de aminoãcidos.

Meister e outros, na patente de invenção norte-americana nQ 4 758 551, referiram ^“-glutamil-aminoácidos como ag^ tes não tóxicos utilizáveis no combate da toxicidade renal cau sada pelos fármacos nefrotóxicos. Shiokori e outros, na paten te de invenção norte-americana nQ 4 757 066, descrevem a utilização de aminoacidos N-acilados em associação com antibióti. cos penemo ou carbapenemo para reduzir a toxicidade renal cau sada pela utilização do próprio antibiótico. Na patente de in venção WO 8804-925A (Tulane E. Fund Administration), referem--se, entre outros agentes, precursores biossintéticos de peque nos piptidos oxidáveis, tais como Glu-Cys ou (Gly-Cys-S)2> pa ra evitar o efeito nefrotóxico dos aminoglicósidos.

Noutros agentes, menos relacionados com a presente in venção, incluem-se, entre outros, D-glucaratos (por exemplo, patentes de invenção norte-americana nQ 3 928 583enQ4 112 171) e amilorido (patente de invenção norte-americana nQ 4 654 325). A descoberta mais pertinente parecia ser a de Williams e outros, na patente de invenção norte-americana nQ 4 526 888, em que se descreve a utilização de determinados poliaminoáci-dos neutros e aniónicos para reduzir a nefrotoxicidade induzi, da pelos aminoglicósidos. Os aminoácidos específicos referidos por Williams e outros eram a aspargina, os polímeros de ácido aspártico e os seus copolímeros. -3- \Λ' Ο trabalho de Williams e outros, referido em The J. of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 237/3 (1986) 919--925 foi confirmado em estudos efectuados em ratazanas, noutras publicações. Ver: Gilbert e outros, The J. of Infectious Diseases, 159/5, (Maio, 1989) 945-953; Ramsommy e outros, The J, of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 250/1, (1989) 149-153.

Nestes estudos referindo a utilização de ácido polias^ pártico em modelos animais, para tratar a nefrotoxicidade dos aminoglicósidos, utilizava-se o ácido poli-L-aspártico, comer cialmente disponível (Sigma Chemical Company). O ácido poliaspãrtico comercialmente disponível caracte riza-se apenas por um peso molecular médio, que se determina a partir das determinações da viscosidade ou, mais recentemen te, mediante técnicas de viscosidade e de dispersão da luz de um raio laser num pequeno ângulo. A partir do nome do composto (ácido poli-L-aspártico) e do mátodo de síntese proporcionado no catálogo ("... polimerização iniciada com base do N--carboxi-anidrido correspondente."), pode esperar-se que estes polímeros sejam constituídos por unidades repetitivas de ácido L-aspártico ligadas umas às outras através de ligações de amida que envolvem o grupo ácido alfa-carboxílico do ácido as[ pártico com um peso molecular médio de acordo com o fornecido para cada amostra. Além disso, os estudos experimentais que de monstram a protecção foram efectuados utilizando pelo menos 1,65 a 33 partes em peso de poliaspartato por parte de amino-glicõsido.

Quando a requerente examinou lotes de ácido poli-L-ajs pártico de outras fontes, incluindo a síntese habitual, num mo -4

U delo de nefrotoxicidade induzida por aminoglicõsidos numa ratazana, observou uma inexplicável variabilidade na potência inibidora do ácido poli-L-aspártico. No decurso da determinação da origem desta variabilidade da potência inibidora do ãci do poli-L-aspártico proveniente de outras fontes, descobriu--se que havia um sub-grupo de polímeros de ácido aspãrtico, não caracterizados previamente, incorporado no ácido poli-L-aspár tico comercial, e que essas substâncias contaminantes possuíam uma potência inibidora contra a nefrotoxicidade muito superior à do ácido poli-L-aspártico puro (isto ê, ácido poliaspártico constituído predominantemente por resíduos de ácido-L-aspártjl co ligados por ligações de amida que envolviam o grupo ácido alfa-carboxllico do ácido aspãrtico). A presente invenção é, portanto, o resultado da desco berta surpreendente de produtos polimêricos de poliaspartato com uma actividade inibidora muito superior â dos poli-L-aspar tatos "puros" nos quais se incorporam este novo componente des^ coberto. No decurso da presente invenção, caracterizou-se o sub -conjunto aperfeiçoado de poliaspartatos inibidores.

Nenhuma das substâncias ou referências anteriormente mencionadas revela ou sugere os produtos de poliaspartato que não tinham sido caracterizados anteriormente, os quais englobam os inibidores aperfeiçoados da nefrotoxicidade dos amino-glicósidos, como aqui se descreve e reivindica. A presente invenção resulta da descoberta de que a pre sença de substâncias contaminantes, poliaspartatos, no ácido poli-L-aspártico comercial é responsável pela potente inibição da nefrotoxicidade que se atribui ao ácido poli-L-aspártico.

Assim, são objectivos da presente invenção proporcionar um mé u todo melhorado para utilização de antibióticos aminoglicosíd_i cos que contenham os poliaspartatos, agora caracterizados,ini bidores mais potentes para prevenção ou redução da nefrotoxi-cidade induzida pelos aminoglicósidos e proporcionar composições antibióticas farmacêuticas aperfeiçoadas, com uma nefro-toxicidade muito menor do que a dos agentes antibióticos indi. vidualmente, mas que necessitam de menor quantidade de políme ro inibidor.

Os polímeros aperfeiçoados, contendo ácido aspãrtico, de acordo com a presente invenção, caracterizam-se pelo facto de serem solúveis na água, estarem neutralizados até um pH fi siologicamente aceitável, terem um peso molecular médio conpre endido entre cerca de 600 e 9 000, em relação ao ácido livre e por terem um "factor J&-D" de pelo menos 30. O "factor j^-D" deriva da adição das percentagens de ligações beta e das unidades de ácido D-aspártico nos polímeros. A pesquisa da razão da variabilidade de diferentes lo tes de ácido poli-L-aspãrtico, para inibir a nefrotoxicidade aminoglicosídica, conduziu à descoberta de um sub-conjunto e£3 trutural de ácido poliaspártico contendo polímeros com uma po tente actividade inibidora, em comparação com a do ácido poLi -L-aspártico puro. Os poliaspartatos.-; podem diferir na estrutura, não apenas devido â incorporação de unidades (D) - ou (L)--monoméricas, mas também de acordo com a ligação de amida específica das unidades. 6-

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Isõmero D (R)-(-)-ácido aspártico

Isomero l (S)-(+)-ácido aspártico

CO? CO? cdf coÇ Z t Zcom^\^com ccf CO' & tudo ligações 0( tudo ligações t A caracterização dos poliaspartatos da presente inven ção levou ao reconhecimento da função dos resíduos D e das li gações β nos poliaspartatos preferenciais. 0 método aperfeiçoado para inibir a nefrotoxicidade de um antibiótico aminoglicosídico consiste em administrar pelo me nos 1 parte em peso de polímero de ácido aspártico solúvel em água e parcialmente neutralizado, para 2 partes em peso de um aminoglicósido. 0 polímero inibidor pode ser um homopolímero de ácido aspártico ou um copolímero constituído por ácido aspártico e por uma quantidade menor de um comonómero farmaceuticamente aceitável. 0 termo "polímero", no contexto da presente invenção, aplica-se tanto aos homopolímeros como aos copolímeros de ácido aspártico.

Os polímeros de aspartatos seleccionados para utiliza ção no método melhorado têm pesos moleculares médios, em rela ção ao ácido livre, compreendidos entre cerca de 600 e 9 000 -7-

-7- U e, de preferência, entre cerca de 800 e 6 000; e tem um "factor jà-D" de pelo menos 30. O "factor j^-D" deriva da soma das percentagens de ligações beta e de unidades de ácido D-aspártico nos polímeros. Qualquer polímero de ácido aspártico pode ter 0 a 100% de ligações beta e 0 a 100% de resíduos D. Deste modo, o "factor ^-D" pode variar entre 0 e 200 para estes polímeros. Enquanto os polímeros poliaspartatos com um "factor p-D" inferior a 30 têm uma potência de inibição da nefrotoxi-cidade relativamente baixa, os que possuem diversos valores de "factor p-D" superiores a 30 parecem ter uma eficácia compara vel como inibidores da nefrotoxicidade. Deste modo, não é necessário seleccionar um poliaspartato com um "factor p-D" máxi^ mo de 200 (isto é, um ρ-D-poliaspartato "puro"). Este facto constitui uma vantagem económica potencial, uma vez que alguns dos mais simples, eficazes e pouco dispendiosos processos de polimerização de ácido aspártico produzem, por inerência, um polímero que contêm uma mistura de resíduos D e L e ligações A administração do inibidor melhorado, poliaspartato, pode ser efectuada separadamente mas concorrentemente com a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antibiótico aminoglicosídico. A administração de inibidores po de também efectuar-se antes ou depois e pode também ser menos frequente. Pode combinar-se o inibidor e o antibiótico e admi nistrarem-se conjuntamente com um veículo aceitável sob o pon to de vista farmacêutico.

Neutralizaram-se os poliaspartatos aperfeiçoados até proporcionarem um pH fisiologicamente aceitável, quando dissoL vidos no veículo de administração. Este pH está geralmente com -8- -8-

preendido entre cerca de 6 e 8, sendo de preferência cerca de 7. Efectua-se a neutralização com uma base adequada, tal como NaOH, KOH, NH^OH, etc., aumentando assim a solubilidade destes polímeros de ácido aspártico polianiônicos, na água. Quando se utiliza NaOH como agente de neutralização, aproximadamente 70 a 80% dos grupos carboxilato estão sob a forma de sal de sódio. O ácido poliaspártico na forma de ácido livre nao é estável.

Os pesos moleculares dos poliaspartatos inibidores va riam com o teor de sal de sódio.

Unidade de ácido Peso Molecular aspártico Acido livre 70% de sal de sódio 100% de sal de sódio 10 1169 1338 1411 12 1399 1599 1685 20 2320 2643 2781 40 4622 5253 5523 80 9225 10472 11006

Pode utilizar-se, conjuntamente com os polímeros inibidores da nefrotoxicidade da presente invenção qualquer anti^ biótico aminoglicosídico. Como exmemplos destes antibióticos aminoglicosídicos podem citar-se a canamicina (Merck Index 11 § ed.// 5161), gentamicina (Merck Index, 113 ed,$ 4283), amicaci na (Merck Index lis ed.//416), dibecacina (Merck Index, 113 ed. $2987), tobramicina (Merck Index, 11§ ed.$ 6989), estreptomi-cina (Merck Index, 113 ed.$ 8786/8787), paromicina (Merck índex 113 ed .ff 6989), sisomicina (Merck índex, 113 ed.$8498), isepamicina (Merck Index, 113 ed.$ 4989), neomicina (Merck In dex, 113 ed.jf 6369) , fortimicina (Merck Index 113 ed.$4165) e netilmicina (Merck Index 113 ed.//6389) , todos conhecidos na especialidade. Os antibióticos utilizáveis englobam as diver- -9-

sas variantes estruturais dos compostos anteriores (como, por exemplo, canamicina A, B e C; gentamicina A, C^, C^a, C2 e D; neomicina B e C e similares).

Todos os antibióticos aminoglicosídicos ensaiados até agora se acumulam no tecido renal e possuem um determinado po tencial nefrotóxico [Luft e outros, J. Inf. Dis., 138(4)(1978) 541-595]. Deste modo, a presente invenção é utilizável com qualquer antibiótico aminoglicosidico. Na prática, utilizamrse os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis destes antibióticos aminoglicosídicos.

No que se refere à presente descrição, a designação "sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável" signifi ca um mono ou um poli-sal formados pela interacção de uma molécula de antibiótico aminoglicosidico com uma ou mais moles de um ácido farmaceuticamente aceitável.

Entre esses ácidos, encontram-se os ácidos acético, cio rídrico, sulfúrico, maleico, fosfórico, nítrico, bromídrico, ascórbico, málico, cítrico e os outros ácidos normalmente uti_ lizados para a preparação de sais de produtos farmacêuticos que contêm grupos amina.

De acordo com uma aplicação especial da presente inven ção, podem utilizar-se os grupos ácido carboxílico do ácido po liaspãrtico, para formar sais de adição de ácido dos grupos amina do aminoglicõsido. Se necessário, pode neutralizar-se o sal resultante aminoglicósido-ácido poliaspãrtico, tanto com uma base farmaceuticamente aceitável, como com um ácido farma ceuticamente aceitável.

Os inibidores da toxicidade renal, da presente invenção, utilizados conjuntamente com os aminoglicósidos nefrotóxi -10- cos, são sais, solúveis na água, de polímeros de ácido polias-pártico, incluindo homopolímeros e copolímeros farmaceuticamen te aceitáveis de ácido poliaspártico com menores quantidades de comonómeros. Os polímeros de ácido poliaspártico utilizáveis têm características físicas que proporcionam as seguintes propriedades, que constituem um pré-requisito para os polímeros: solúveis na água: todos ou um número suficiente de radicais de ácidos orgânicos (isto é, grupos carboxílicos) encontram-se na forma iénica devido à formação de sal com um ca-tião farmaceuticamente aceitável e solúvel na água (Na+; K+; NH^+; e similares), pelo que o polímero se dissolve facilmente na água. Não é necessário para todos os radicais de ácidos orgânicos no polímero se encontram sob a forma de um sal ióni-co; - polianiõnicos (devido aos radicais funcionais de ácidos orgânicos ionizados, por exemplo, um carboxilato). - peso molecular suficientemente pequeno para passar através dos glomérulos; suficientemente grande para formar complexos com o aminoglicósido sob condições fisiológicas adequadas; - suficientemente estável (resistente ao metabolismo do hospedeiro).

Os pesos moleculares medidos, são a "média" dos pesos moleculares dos poliaspartatos polidispersos. São do conhecimento do especialista as técnicas e diferentes métodos para de terminar o peso molecular do polímero e a sua caracterização ejs trutural.

Os poliaspartatos inibidores da presente invenção e os aminoglicósidos podem ser utilizados conjuntamente, de acordo -11- -11-

com diversos modos. Pode combinar-se o antibiótico aminoglico-sidico e o polímero inibidor numa única forma de dosagem, de pre ferência com um veiculo farmaceuticamente aceitável, como, por exemplo, uma co-solução ou dispersão num dissolvente ounumagen te de dispersão inerte, farmaceuticamente aceitável, ou com um veículo similar. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser quaisquer dos habitualmente utilizados ou compatíveis com o antibiótico aminoglicosídico.

Como alternativa, pode formular-se separadamente o po liaspartato inibidor com substâncias farmaceuticamente aceita veis e administra-lo quer separadamente, quer em simultâneo com o antibiótico aminoglicosídico, antes ou após a administração do antibiótico aminoglicosídico.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a com posições farmacêuticas que ou são constituídas apenas por polí^ meros que contêm ácido poliaspártico da presente invenção como ingrediente activo, ou por polímeros que contêm ácido poliaspár tico em combinação com um aminoglicosido, como ingredientes act± vos, associados a um ou mais veículos, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. 0 modo de administração, dose e a frequência da dosagem dependem do modo de administração e das considerações em re lação as doses convencionalmente utilizadas para os antibióticos aminoglicosídicos. Deste modo, podem administrar-se, por exemplo, diversas associações da presente invenção, por via in travenosa, intramuscular ou por outras vias, de acordo com a prática médica farmacológica, relativa à utilização pretendida para o antibiótico em causa. A quantidade de poliaspartato inibidor utilizada conjuntamente com o antibiótico aminoglicosídico, é uma quantida- -12- -12-

de que reduz a nefrotoxicidade do antibiótico aminoglicosí-dico. As quantidades variam consoante o aminoglicõsido utiliza do. Habitualmente/ a quantidade de poliaspartato inibidor utilizado é pelo menos, cerca de 1 parte em peso para duas partes do antibiótico aminoglicosídico. 0 limite máximo também é influenciado por considerações de natureza prática e económica. Quantidades tão elevadas como 33 partes de poliaspartato da pre sente invenção por parte de antibiótico têm-se mostrado eficazes, mas parecem ser desnecessárias, uma vez que níveis muito inferiores parecem proporcionar uma excelente inibição. Uma re lação preferida entre o poliaspartato inibidor e o aminoglicó-sido está compreendida entre cerca de 0,5 e 4 partes de inibidor por parte em peso de antibiótico.

Devido à maior potência inibidora dos poliaspartatos aperfeiçoados, com base no peso, é necessário menos polímero pa ra conseguir o efeito protector. Este facto é importante não só do ponto de vista económico, mas também terapêutico, uma vez que uma menor quantidade de qualquer medicamento reduz a probabili dade de ocorrência de reacções indesejáveis com essa medicação.

Pode verificar-se que utilizando os poliaspartatos ini bidores, aperfeiçoados, solúveis na água e parcialmente neutra lizados, com o peso molecular médio e o valor do "factor j&-D" especificados, sob a forma de um sal farmaceuticamente aceitável, se podem atingir os dois objectivos da presente invenção. 1. Descreve-se aqui um método para evitar ou reduzir a nefrotoxicidade de um antibiótico aminoglicosídico, que consiste em administrar uma dose eficaz de uma mistura de poliaspartatos sob a forma de um sal solúvel na água, com o peso molecular mé dio compreendido entre cerca de 600 e 9 000. Os poliaspartatos -13- -13-

são constituídos por unidades polimerizadas de ácido aspãrtico: isoladamente (homopolímero) ou misturadas com quantidades meno res de comonómero farmaceuticamente aceitável (copollmero). 2. 0 segundo objectivo da presente invenção ê proporcionar com posições de aminoglicõsidos aperfeiçoadas que possuem nefroto-xicidade reduzida, como resultado da incorporação dos poliaspar tatos aperfeiçoados, inibidores da nefrotoxicidade, de acordo com a presente invenção. Estas composições farmacêuticas contêm quantidades eficazes de antibióticos aminoglicosídicos, quantd. dades inibidoras da nefrotoxicidade de polímeros poliaspartatos aperfeiçoados, tal como já anteriormente se descreveu, e devei culos e/ou excipientes que serão familiares ao especialista. As quantidades de aminoglicõsido realmente utilizadas encontrar-se -ão de acordo com as indicadas nas referências convencionais pa ra prescrição de medicamentos (por exemplo, Physicians Desk Re-ference, 423 edição, 1988; Drugs Evaluatior& AMA, 63 edição, 1986). Devido ao reduzido risco de nefrotoxicidade destas compo sições, ê possível administrar doses superiores do aminoglicõsido do que as normalmente recomendadas.

Demonstraram-se os efeitos inibidores da nefrotoxicidade dos polímeros de poliaspartato, da presente invenção, numa ratazana modelo com nefrotoxicidade induzida por gentamici-na. Um período de 10 dias de administração de gentamicina (50 mg/Kg/dia) originou de forma reprodutível uma nefrotoxicidade grave, demonstrada por níveis aumentados de azoto de ureia (BUN) e de creatininano soro como se verificou por análise microscópi ca do rim. A administração conjunta dos poliaspartatos aperfeiçoa dos da presente invenção evitou ou melhorou significativamente -14 a nefrotoxicidade induzida pela gentamicina.

Exemplo 1

Estudo NO I:

Grupos de tratamento constituídos por cinco ratazanas macho Fischer 344, aos quais foram administrados, duas injecções subcutâneas por dia de: a. 7,36% de NaCl em água, 1,0 ml/Kg b. 25 mg/Kg de gentamicina em 7,36% de NaCl em água c. . 25 mg/Kg de gentamicina e 25 mg/Kg de poliaspartato de sódio d. 25 mg/Kg de gentamicina e 200 mg/Kg de poliaspartato de sódio.

Utilizaram-se grupos de tratamento adicionais para os protocolos de tratamento c e d, com objectivo de estudar o "factor p-D". Estudaram-se 5 amostras de poliaspartato com diferentes valores de "factor jJ-D".

Propriedades das várias amostras de poliaspartato de sódio no Estudo NO I:

Amostra NO % de ligações % de resíduos D Factor p-D beta (% beta + % D) 1 5 9 14 2 8 10 18 3 54 20 74 4 63 22 85 5 62 24 86

Deste modo, existia um total de 5 grupos de tratamento para cada protocolo de administração c e d.

Prolongaram-se as injecções durante 10 dias. No 11Q dia, sacrificaram-se as ratazanas e submeteram-se os rins a -15

exame histológico. No Quadro que se segue, pode observar-se o registo do número de ratazanas em cada um dos grupos histopato lógicos, seguintes: A. Alterações degenerativas marcadas e moderadas B. Alterações necróticas moderadas C. Alterações regenerativas marcadas e moderadas D. Necrose e degenerescência tubulares moderadas B. Regeneração e hipertrofia tubulares marcadas e moderadas. -16-ο •Η u '0•μ οησιοοοοσιοοσιοττο CN i—I i—I rH γΗ

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Conclusões:

As amostras 1 e 2 apenas forneceram protecção parcial no nível de dose elevado (protocolo d), enquanto as amostras 3, 4 e 5 proporcionaram uma protecgão completa no nível de dose mais ele vado. No nível de dose baixo (protocolo c), as amostras 3,4 e 5 proporcionaram uma protecção parcial, enquanto as amostras 1 e 2 proporcionaram muito pouca protecção.

Exemplo 2 Estudo No II

Os grupos de tratamento eram iguais aos utilizados no Estudo NQ I, com excepção de em cada um dos grupos de tratamen to haver quatro ratazanas F344.

Propriedades das diversas amostras de poliaspartato de sódio no Estudo · H H Ol :¾ Factor J3-D Amostra NQ % de ligação beta % de resíduos D (% de beta+%D) 6 11 19 30 7 71 23 94 8 75 50 125 9 77 49 126

Submeteram-se os rins das ratazanas de ensaio a exame histopatológico e classificou-se cada um dos rins de acordo ccm umaesca la de 0 a 4 (4=grave, 3= moderada, 2=ligeira, l=mínima e 0=ausência) em cada uma das categorias histopatológicas de degenerescência (DEG), necrose (NEC) e regeneração (REG). No Quadro que se segue, -18- w indica-se, o valor médio, para cada um dos grupos em cada uma das categorias histopatológicas.

Grupo Valor médio Valor médio Valor médio Tratamento de DEG de NEC de REG Somatório a 0 0 0,1 0,1 b 4,0 3,0 3,6 10,6 c (6) 1/5 0,5 1,0 3,0 d(6) 0 0 0 0 c(7) 1,9 1,2 2,0 5,1 d (7) 0 0 0 0 c (8) 2,0 1,2 1,8 5,0 d (8) 0 0 0 0 c (9) 1,5 0,2 o σ\ 2,3 d (9) 0 0 0 0

Conclusões:

Todas as amostras proporcionaram uma protecção comple ta, no nível de dose elevado (protocolo d) e protecção parcial no nível de dosagem baixo (protocolo c). Síntese de Polímeros de Ãcido aspãrtico

Pode efectuar-se a síntese de polímeros de ácido aspãrtico, de acordo com diversos métodos familiares ao especialista em química de polímeros. Apresenta-se a seguir um resumo dos mé todos mais importantes que se podem utilizar para a preparação dos agentes protectores polímeros de ãcido poliaspártico da presente invenção. -19- 1. Podem preparar-se polímeros de ácido aspártico com valores definidos de comprimento, proporção de isómeros L e D e de ligações ^ e |3 e teor de copolímeros de acordo com técnicas normais de síntese de péptidos, segundo as quais se juntam unidades monoméricas sequencialmente à cadeia peptídica em cres cimento. A metodologia preferencial para esta abordagem é a síntese de péptidos em fase sólida, amplamente descrita, por exemplo, por J. M. Stewart e J. D. Young, Solide Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, 2§. edição, 1984. 2. De acordo com um método extensivamente investigado, para a preparação de homopolímeros e de copolímeros de aminoácidos, utiliza-se como composto intermédio um anidrido de N-carboxi- -aminoácido (ver, por exemplo, E. Katchalski, Adv. Prot. Chem., 6, (1951) 123). Quando se aplica esta técnica ao ácido aspártico, o grupo ácido -carboxílico é bloqueado sob a forma de um éster (muitas vezes um éster benzílico) forma--se o intermédio anidrido de grupo N-carboxi, efectua-se uma polimerização iniciada por base e removem-se os grupos de bloqueio para se obter o ácido poliaspártico. Modificando o composto inicial e as condições de polimerização e de desbloqueio é possível obterem-se amostras de ácido poliaspártico com valo res diferentes de peso molecular, teor de isómeros D e L e teor de ligações Oi e B . V. Saudek e outros, Biopolymers, 20 (1981) 1615 , demonstraram que modificando as condições de desbloqueio se podia obter um teor de ligações jS compreendido entre <^10% e 75% e um teor de isómero D compreendido entre 0% e 50% (pode fazer-se variar o teor de isómero D, como ê evidente, utilizando compostos iniciais contendo a percentagem -20-

desejada de isómero D). Neste estudo, determinou-se o teor de ligação

(ver H. Pivcova e outros, Biopolymers 20, (1981) 1605) (pode também determinar-se o teor de ligações jÓ por titulação potenciométrica-ver V. Saudek e J. Drobnik, Polymer Buli., 4 (1981) 473, determinou-se o teor de isómero D por hidrólise e rotação óptica e os pesos moleculares dos po límeros foram determinados por meio de medições de viscosidade (um método preferencial para determinação do peso molecular dos polímeros é a dispersão da luz de um raio laser em pequeno ângulo, LALLS-ver P. J. Wyatt e outros, Amer. Laboratory, 20, (1988) 86. Pode controlar-se o peso molecular dos polímeros por ajustamento da quantidade de iniciador de polimerização e da temperatura de polimerização - ver E. Katchalski, loc cit. Também se pode utilizar este método para preparar copolímeros, efectuando a reacção de polimerização com uma mistura de ani-dridos N-carboxi (ver, por exemplo, Y. Kobayashi e outros, Ma-cromolecules, 10 (1977) 1271. 3. Um método que é especialmente eficaz para a preparação de polímeros de ácido aspãrtico, é a condensação térmica (ver J. Kovacs e outros, Experientia, 9 (1953) 459; J. Kovacs e outros. J. Orq. Chem., 26 (1961) 1084. De acordo com esta téc nica, aquece-se ácido aspãrtico ou um seu derivado, para se formar poli-succinimida, que depois se hidrolisa para formar ácido poliaspãrtico. As condições destas transformações conduzem a ácidos poliaspãrticos que contêm um teor de isómero D compreendido entre cerca de 20% e cerca de 80% (dependendo de se ter utilizado isómero D ou isómero L como composto inicial -- ver E. Kokufuta e outros, Buli, Soc. Chem. Japan, 51 (1978)1555) -21-

e um teor de ligações P compreendido entre cerca de 50% e cerca de 80% (V. Saudek e J. Drobnik, Polymer Buli,, 4 (1981) 473; H. Picova e outros, Polymer, 28 (1982) 1237) . Pode controlar-se o peso molecular do polímero por modificações nas condições de polimerização - ver E. Kokufuta e outros, loc. cit., P. Ne-ri e outros, J. Med. Chem. 16 (1973) 893. Também se pode utilizar este método para a preparação de copolímeros de ácido ajs pãrtico - ver S. W. Fox e K. Karada, Analytical Methods in Pro-tein Chemistry, P. Alexander e Η. P. Lundgren, eds., Pergamon Press, 1961, 129. 4. Foram ainda descritos outros métodos para a preparação de ácidos poliaspárticos. T. Munegumi e outros, Buli. Soc. Chem. Japàn, 62 (1989) 2748, descreveram a polimerização do anidrido de ácido aspártico formado a partir do anidrido do ácido N-car bobenziloxiaspãrtico. A preparação de ácido poli- |3-L-aspárti co mediante a polimerização de L-aspartato de ^d.-benzil- ^-N--succinimidilo, foi descrita por P. M. Hardy e outros, J. Chem. Soc. Perkin I, (1972) 605.

Os Exemplos que se seguem ilustram os métodos preferen ciais para a preparação dos poliaspartatos inibidores aperfeiçoados da presente invenção. Deve ter-se em conta que estes exemplos têm fins meramente ilustrativos, não podendo, de modo algum, limitar o âmbito da presente invenção.

Exemplo 3 A. Derivado N-carboxi-anidrido de L-aspartato de r-benzilo

(2,23 g A uma suspensão de L-aspartato de -22- W' 10 mmoles) em THF seco (30 ml) adicionou-se cloroformato de triclorometilo (0,67 ml, 5,5 mmoles) a 45°C sob atmosfera de argon. Agitou-se a solução límpida, durante 1 hora à temperatura de 45°C, destilou-se o dissolvente s<±> pressão reduzida, à temperatura de 30°C, adicionou-se acetato de etilo (20 ml) ao resíduo e filtrou-se. Adicionou-se hexano (50 ml) ao fil trado e separou-se o precipitado volumoso, lavou-se com hexa no (2 x 50 ml) e secou-se sob vazio obtendo-se um sólido bran co com um aspecto penugento (2,3 g ; 93%).

[IV (nujol) 1730, 1800 cm"1. RMN ΧΗ (CDC13) b 7,37-7,33 (m, 5H, fenilo), 6,18 (s largo, 1H, NH), 5,17 (s, 2H, OCH2 éster), 4,58 (ddd, 1H, H-l , J1_6=3,27 Hz, J1_6,=9,33 Hz, J=l,17 Hz, (não exibido após tratamento com D20), 3,08 (dd, 1H, H-6, J6 6,= = 17,7 Hz), 2,82 (dd, 1H, H-61)· RMN ΧΗ (acetona-dg) b 7,41--7,29 (m, 5H, fenilo), 5,16 (s, 2H, OCH2 éster), 4,81 (t, 1H, H-l,

Jl-6f Jl-6,=4'77 Hz)' 3'14 (dd' lH' H-6' Jg_g,=17,76 Hz). RMN 13C (CDC13) b 169,36, 168,24 (2 x C=0), 151,29 (C-3), 134,67 (iso-fenilo), 128,85 , 128,79, 128,56 (fenilo), 67,81 (00Η2, éster), 53,86 (C-l), 36,09 (C-6). Espectro de massa (BAR, glicerol) m/e (intensidade relativa) 342 (M+H+glicerol, 33), 298 (342-C02, 40), 270 (298-CO, 78), 250 (M+H, 21), 185 (2 glicerol + H, 100)]. B. L-aspartato de dibenzilo

Submeteu-se a refluxo durante 18 horas uma mistura de ácido L-aspártico (33,27 g, 0,25 mole), álcool benzílico (100 ml) e de mono-hidrato de ácido £-toluenossulfõnico (48,5 g , 0,225 mole) em benzeno (50 ml) utilizando um sifão de Dean -23- -23- W-

Stark para reter a agua destilada azeotropicamente. Adicionou-se à mistura benzeno (200 ml) e éter anidro (600 ml) e deixou-se repousar à teperatura de 4°C. Filtrou-se o sal crijs talino de ácido £-toluenossulfónico, lavou-se com éter anidro e recristalizou em uma mistura de metanol e éter. Dissolveu--se o sal (15 g, 30,8 mmoles) numa mistura a 1:1 de acetona e de água (300 ml) e alcalinizou-se mediante a adição progressiva de K2C°3" Extralu-se a mistura com EtOAc (2 x 150 ml), reu niram-se os extractos orgânicos, lavou-se com água (100 ml), secou-se sobre Na^O^ anidro e concentrou-se para se obter um óleo (9,5 g, 98%). [RMN 1H (CDC13) ^ 7,37-7,24 (m, 10H, fe nilo), 5,11, 5,08 (s, 4H, OCH2 éster), 3,84 (dd, 1H, H,

JqI" =5,0 HZ, J0t^l=6,9 Hz), 2,86 (dd, 1H, C H, Jgem=16,5 Hz), 2,75 (dd, 1H, C£H'). RMN 13C (CDC13) à 173,79, 170,72 (2 x C=0), 135,4, 135,3 (2 x ipso-fenilo), 128,39, 128,21 , 128,09 (fenilo), 66,84, 66,39 (2 x 0CH2), 51,11 (Cy) , 38,76 (Cp) 1 · C. Procedimento geral para a polimerizagão de NCA (N-carboxi--anidrido).

A uma solução de N-carboxi-anidrido derivado de L-as-partato de jâ -benzilo (10 g, 40 mmoles), em CH3CN seco (200 ml), adicionou-se uma solução de L-aspartato de dibenzilo (0,25 g, 0,8 mmoles) em 5 ml do mesmo dissolvente, sob atmosfera de argon. Agitou-se vigorosamente a mistura, à temperatura ambiente durante 120 horas, sob atmosfera de argon, para eliminar o anidrido carbónico formado durante a reacção. Se parou-se o precipitado, lavou-se, sucessivamente, com CH3CN -24- (200 ml) e n-hexano (200 ml) e secou-se sob vazio sobre PnOir

Z D (4,83 g, 59%). [RMN XH (DMSOrCD^Cl^ & 8,5-7,9 (largo, 1H, NH), 7,4-7,1 (m, 5H, fenilo), 5,0 (s, 2H, OCH2 éster) ,

4,6-4,4 (largo, 1H, C^H) , 3,0-2,6 (m, 2H, Cj£H,H'). RMN 13C (CD2C12) i 172,18, 171,12 (C=0), 136,45, 136,18 (ispo-feni- / lo), 128,84, 128,47 (fenilo), 66,74 (OCH2, éster), 51,76 fc^) , 34,17 (C^). D. Colocaram-se no recipiente de reacção o produto de poli-merização da secção C (0,3 g), sulfureto de etilo e metilo (6,5 ml) e £-cresol (1 g) e ligou-se à linha de HF. Arrefeceu-se o recipiente até -78°C durante 30 minutos e evacuou-se rapidamente a linha. Destilou-se HF no recipiente até um nível previamente marcado (2,5 ml). Equilibrou-se, então, rapi damente a reacção até 0°C, com um banho de gelo e agitou-se vigorosamente durante 2 horas. Destilou-se HF e sulfureto de etilo e metilo, cuidadosamente, a 0°C sob pressão reduzida. Dissolveu-se o resíduo em solução aquosa a 10% de (NH^^CO^ (20 ml), extraíu-se com EtOAc (3 x 50 ml) e liofilizou-se obtendo-se uma goma (0,35 g). Dissolveu-se a goma em água e fez-se passar através de uma coluna com um leito constituído por uma mistura de resinas de permuta de iões (Dowex 50W-X8, forma iónica H+ e Rexyn 203 (OH), forma iõnica OH ) para remover o subproduto sal de sulfónio. A mistura das fracções adequadas e a sua liofilização deram o ácido puro e desbloqueado (0,06 g, 43%) que se converteu no sal de sódio, fazendo-o passar através de uma coluna de resina de permuta de iões Dowex 50W-X8 (forma iónica Na+) . RMN ^H (D20 4,66 (t, 1H, Cq^H, J , pH=6,44 Hz), 2,85, 2,72 (m, 2H, C^H, Η', ^em=16'8 Hz) : -25- -25-

(CR)· Este poliaspartato de sódio corresponde ao Exemplo

W NQ 1 e tem um Factor

Exemplo 4

Poliaspartato de sódio (processo de polimerizagão térmica)

Submeteu-se a refluxo de uma suspensão de ácido D,L--aspártico finamente pulverizado (30 g, 0,225 mole) em tetra lina (300 ml) , durante 96 horas, para remover a água por destjL lagão azeotrópica. Separou-se o precipitado cor de bronze obtido, lavou-se com éter e triturou-se com uma solução saturada de NaHC03 (3 x 100 ml). O produto que inicialmente possuía um aspecto granular, transformou-se num pó fino em cada uma das triturações. Filtrou-se o produto e/ou centrifugou-se, confojc me o grau de dificuldade encontrado durante cada filtração. La vou-se o produto com água, com ácido clorídrico a 1% e, finalmente, com água até o filtradoo se encontrar isento de sal (tes^ te de AgNOj). A produção de ácido anidro-poliaspãrtico, de cor amarela clara foi de 16 g. Tratou-se uma suspensão deste produto (9,5 g) em água (30 ml), gota a gota com uma solução de NaOH 2M (C^45 ml), enquanto se agitava a mistura até se atingir um pH de cerca de 10. Aqueceu-se a mistura até cerca de 95°C durante 15 minutos, para assegurar uma hidrólise completa, e ajustou-se finalmente o pH para cerca de 8 com HC1 IN. Filtrou-se solução, fez-se passar através de uma coluna Sephadex G-25 (5 cm de diâmetro, 100 cm de altura) com o objectivo de obter um fraccionamento parcial e uma completa dessalinização. Após analisar as fracções por HPLC misturaram-se para se obterem duas -26- -26-

grandes fracções que se liofilizaram posteriormente. RMN 1H (D20) ^ 4,68 (s largo, C^LHoL-pêptido, 30%), 4,49 (s, largo, Ctf-H, β -péptido, ^ 70%), 2,77 (m largo, 2H, C^H, H'). RMN 13C (D20, pd^lO) ζ 177,81 (C=0, β -péptido), 177,37 (=0, -péptido), 172,72, 172,62 (CONH) , cL -péptido), 172,02, 171,89 (CONH, β -péptido), 51,83, (C cL , β -pépti do), 51,38 (C dL,c/L -péptido), 39,0 (C β , ^-péptido), 37,69 (C β , β -péptido). Este produto, poliaspartato de sódio cor responde ã Amostra NQ 8 e tem um Factor P -D de 125.

Claims (4)

1 Μ' REIVINDICAÇÕES 1.- Processo para a preparação de um polimero conten do ácido poliaspártico, o qual possui as seguintes característi-cas: a) solubilidade em água; b) um pH farmaceuticamente aceitável quando dissolvido no veículo de administração; c) um peso molecular médio de cerca de 600 a 9000 numa base de acido livre; e d) um"factor f^-D^e pelo menos 30, sendo o "factor fb_D» derivado por adição das percentagens de ligações beta e 2

% unidades de .(D)-ácido aspãrtico nos polímeros^ sendo o processo caracterizado por se formar uma ligação amida entre as próprias unidades de ácido aspártico para formar homo-polímeros ou entre unidades de ácido aspártico e unidades de um comonõmero farmaceuticamente aceitável para formar copolímeros; e por em seguida se neutralizar o polímero ácido com uma base farmaceuticamente aceitável para ajustar o pH para um valor com preendido entre ρΗβ e pH8.

2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado por se preparar um homopolímero de ácido poliaspãrti-co.

3.- Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado por se preparar um copolímero de ácido aspártico e uma quantidade menor de um comonõmero farmaceuticamente aceitável.

4.- Estojo adaptado ã administração simultânea e se quencial, caracterizado por incorporar, numa forma farmaceuticamente aceitável: 1) um antibiótico de aminoglicosido e, 2) um polímero contendo ácido poliaspártico preparado pelo processo de acordo com as reivindicações 1 a 3. O Agente Ohcia! da Propriedade Hwrusrriai

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RESUMO "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM POLÍMERO CONTENDO ÃCIDO POLIAS PÁRTICO APROPRIADO PARA INIBIR A NEFROTOXICIDADE DO AMINOGLICOSI DO" A presente invenção refere-se à preparação âe um pol_í mero contendo ácido poliaspártico, o qual possui: a) solubilidade em água; b) um pH farmaceuticamente aceitável quando dissolvido no veículo de administração; c) um peso molecular médio compreendido entre 600 e 9000 numa base de ácido livre; e d) um "factor β-D" de pelo menos 30, sendo o"factor Φ-D" derivado por adição das percentagens de ligações beta e unidades de (D)-ácido aspártico nos polímeros, que consiste em formar uma ligação amida entre as próprias unidades de ácido aspártico para formar homopolímeros ou entre uni dades de ácido aspártico e unidades de um comonõmero farmaceuticamente aceitável para formar copolímeros; e em neutralizar em seguida o polímero ácido com uma base farmaceuticamente aceita- vel para ajustar o pH para um valor compreendido entre pH6 e pH8. Estes compostos são inibidores da nefrotoxicidade do aminoglicosido. O Agente Oficial da Propriedade Industria