TWI359665B - Hyaluronic acid/methotrexate compound - Google Patents

Description

1359665 (1) 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於透明質酸一胺甲蝶呤結合體、及其醫藥 用途。 【先前技術】

變形性關節炎（以下亦稱爲〇 A )會隨著年齡而發病 ，即所謂退化性疾病的一種。高齡化社會的今天，患者數 目逐漸增加中，但對於其診斷法、治療法尙未充分地確立 。0A最初所引起的病態變化被推測爲因隨著年齡增加之 機械性壓力成爲關節軟骨改性與磨耗之原因。此變化以極 緩慢的速度徐徐地進行至感到疼痛。 現今的0A藥物治療中，作爲全身治療法可使用1 )

.退燒鎭痛藥劑（乙醯胺酚）、及2 )非類固醇性消炎藥（ 以下亦稱爲N SAID s )，作爲局部治療法（關節內注入） 可使用3 )透明質酸（以下亦稱爲η A )製劑、及4 )類固 醇製劑。過去既使進行以NS AIDs爲主的全身治療法，亦 無法減輕關節局部疼痛或腫脹的情況時，可進行消炎作用 最優良的類固醇製劑之關節內注入法。然而，類固醇製劑 有著關節注入症候群（類固醇關節症）或全身性副作用等 安全面之問題。因此，取代類固醇製劑的安全關節內注入 劑之HA製劑的適用性受到重視。 HA係爲N-乙醯葡糖胺與葡糖醛酸之重複單位所構 成之活體內多醣。ha作爲構成關節液的主成分，可保持 -5- (2) (2)1359665 關節液的黏彈性、荷重吸收作用及潤滑作用。又，對於軟 骨基質而言’與軟骨蛋白多醣鍵結後形成稱爲蛋白聚醣之 聚合物’主要擔任水分保持能與黏彈性之維持的重要角色 〇 將分子量約60萬道爾頓以上的HA及其交聯物注入 膝關節內時可除去OA的疼痛，故HA製劑可作爲〇A治 療藥劑的一種而廣泛被利用。 又，與正常關節液中的HA分子量相近的高分子量型 HA製劑（商品名souvenir (註冊商標），製造商：中外 製藥股份有限公司）適用於消除日本人的關節風濕（以下 亦稱RA)所引起的膝蓋疼痛。且，HA的分子量與藥效的 強度有關，高分子量型的ΗA比低分子量型的HA於持續 性上較爲優良，而顯示更強的藥效。 —般HA製劑係爲藉由恢復因〇A (或稱爲關節風濕 (以下亦簡稱爲RA ))症狀所引起的受傷害關節液之黏 性與彈性’而消除疼痛。然而，由外部所加入的HA製劑 於自注入關節液起數日以內雖會消失，但效果可長時間地 持續’此可能與上述的關節液之黏彈性改善爲相異的機制 來除去疼痛。作爲如此機制之一，於後述的OA滑膜炎具 有抑制作用》 且’對於OA的疼痛或發炎症狀之發病機制雖有多處 未明瞭’但最近對於與軟骨改性所引起的滑膜炎之關連性 受到重視。0A滑膜炎不僅成爲關節水症或熱感等疼痛、 發炎症之主要原因’亦會促進因細胞素或自由基的產生所

-6- (D (3)1359665 引起的關節破壞，成爲0A發病之主要原因。又，〇A滑 膜炎並無如RA所見的顯著增殖性變化，但對於滑膜細胞 的增殖、血管新生與充血 '滑膜下浮腫及纖維化等與RA 滑膜炎之相通面爲多。如此可有效率地除去OA疼痛或發 炎，並防止發病的進展來看OA滑膜炎之控制極爲重要。

對於滑膜之HA作用雖未完全明瞭，但由使用同位素 實驗得知，與關節腔比較，HA較容易長時間聚集於滑膜 中。又，已有報告指出構成滑膜組織的滑膜細胞表層具備 可辨識 HA 的受體〔CD44 或RHAMM(receptorforHA-medi at ed motility)〕存在下，滑膜細胞藉由表層的CD44 將分子量200萬以上的ΗA導入細胞內之機制。由這些得 知至少一部份的HA疼痛除去作用可能爲藉由對滑膜之作 用而表現。然而，Η A製劑的作用並未到達可抑制〇 A滑 膜炎所引起的發炎症之程度，對於發炎症狀較強的OA或 RA而言並無決定性之充分效果。

另一方面，作爲抑制滑膜炎之藥物，已知有使用於 RA治療上稱爲修飾性抗風濕藥劑（以下稱爲DM ARD )之 藥物群。其中特別以胺甲蝶呤（以下稱爲MTX )具有優 良的藥效。然而，MTX僅可使用於全身投予上（現今於 曰本以醫藥品形式被承認的RA治療藥劑僅爲膠囊劑。於 曰本以外的國家，錠劑與注射劑已被接受），故已知對於 治療目的部位之關節以外的部位，其作用機制會引起嚴重 的副作用（肝障礙、造血障礙、肺障礙、消化管障礙等） 。其結果，對於使用時對於副作用之監視與副作用發病時 -7- ⑧ (4) 1359665 的對策不可或缺。因存在如此副作用之大問題，故對於 MTX爲主的滑膜炎抑制藥劑’並未確定其可適用於比Ra 輕症狀之0A等其他關節疾病上。換言之，若發現可減輕 MTX的全身性副作用之方法、或僅於藥效表現之必要部 位上表現MTX作用之方法，其不僅提供一種安全的Ra 治療法’對於廣範圍之關節疾病可使用MT]X>

作爲可減輕MTX的副作用，僅可發揮其藥效的方法 ’至今已嘗試過種種僅將ΜΤχ作用侷限於關節內或滑膜 之方法。例如已有單獨以ΜΤΧ進行局部投予（關節內投 予）的方法’ Μ Τ X .快速由關節消失，故無法充分地揮發 其藥效。又’亦有報告記載可藉由脂質體化ΜΤΧ，利用 經巨®細胞之吞噬能力而提高關節內貯藏性之方法，但並 未確定其臨床上的有用性。如此可減輕關節疾病治療藥的 Μ Τ X之副作用’且可發揮所望藥效的技術性改良爲必須 的。 如上述滑膜爲容易聚集ΗΑ的組織。又，滑膜細胞具 備著介由CD44等ΗΑ受體將ΗΑ導入細胞內之機構。因 此’ ΗΑ可能作爲將藥物聚集於滑膜之載體。至今，已有 報告指出利用ΗΑ作爲藥物之活體內載體的技術。然而， 至今幾乎無以ΜΤΧ作爲代表例的關節疾病治療藥、特別 爲適用於控制滑膜炎之藥物運送系統（drug delivery system ’以下簡稱爲DDS )之開創相關技術的應用例。 作爲至今的報告例，例如已知含的多醣體中藉由 狀鏈結合藥物的多醣體—藥物結合體（專利文獻I :特開 -8- (5) 1359665 平5-39306號，專利文獻2:國際公開WO 94/19376 )。這些皆爲限定癌組織移動性之抗癌劑的DDS技術 特開平5 - 3 93 〇6號中以作爲抗癌劑之目的使用 ，然而由缺乏對癌組織的移動性與長期體內殘留性之 來看，欲提高抗癌作用必須提高MTX的結合率（實 爲6.4〜19%)，且HA的分子量爲低（實施例中爲 爾頓）。又，於HA的羧基上以異尿基鍵結合肽鏈， 水溶液中的安定性較低。 另一方面，已有結合HA與藥物之結合體（conj )利用於關節疾病治療藥劑之報告。例如，國際公開 WO 99/59603號（專利文獻3)中，揭示介由伸丁基 (一 C4H8NH-)及伸辛基胺基（—C8H16NH —)等間 質（spacer)結合之HA與藥物的結合體。該專利文 .記載，該結合體被設定爲細胞外的藥效，藥物以結合 下表現藥效者。實際上該結合體中介由間隔物質的藥 H A的結合較爲強固，故難適用於如Μ T X無法由結合 離時則無法發揮其藥效之藥物上。 另外，該專利文獻係關於使用基質金屬蛋白酶阻 (以下亦稱爲ΜΜΡΙ )作爲藥物的結合體，所揭示的 例亦關於與ΜΜΡΙ的結合體者。對於使用ΜΤΧ作爲 之結合體並無具體揭示，亦無記載有關該醫藥的有用. 國際公開WO 02/442 1 8 (專利文獻4)中揭示使 —胺基一4，7, 10—二氧雜十三稀基上更與特殊基（ 燃）結合的間隔物質’藉由原菠烯與ΗΑ的殘基之酸 號等 〇 ΜΤΧ 特徵 施例 10道 故於 agate 胺基 隔物 獻中 狀態 物與 體游 礙劑 實施 藥物 性。 Ώ 13 原菠 醯胺 -9 - (6)1359665 鍵結的形成所生成的HA-藥物結合體。然而，該結合體 亦與專利文獻2相同，設定爲細胞外的藥效者，藥物爲結 合狀態下表現藥效。因此’故難適用於如MTX無法由結 合體游離時則無法發揮其藥效之藥物，例如難適用於 MTX上。且’專利文獻3係關於使用MMPI作爲藥物的 結合體者’對於使用ΜTX作爲藥物的結合體則完全無記 載。

如上所述，上述文獻中對於使用 ΜΤΧ的ΗΑ - ΜΤΧ 結合體完全無記載，對於使用ΗΑ-ΜΤΧ結合體作爲關節 疾病治療藥使用之內容亦無揭示。 又，本發明者已確認作爲先前技術已知的ΗΑ -藥物 結合物之合成方法，其合成過程中ΗΑ的分子量會大幅度 地降低，而損害到ΗΑ的藥效。過去的ΗΑ —藥物結合體 之合成方法中一般使用有機合成反應條件或後處理條件， 但調製高分子量的ΗΑ與藥物之結合體時必須進一步地改 良。

如此作爲醫藥品所使用的ΗΑ -藥物結合體，特別適 用於關節疾病治療上的高分子量Η Α -藥物結合體、使用 其之製劑、及該結合體的合成方法至今爲未知。 【專利文獻1】特開平5 -3 93 06號 【專利文獻2】國際公開WO 94/1 9376號文獻 【專利文獻3】國際公開WO 99/5 9603號文獻 【專利文獻4】國際公開WO 02/442 ] 8號文獻 (7)1359665 【發明內容】 發明所要解決的課題爲提供一種適用於關節疾病治療 藥劑上的透明質酸-胺甲蝶呤結合體。 本發明者發現於透明質酸的羧基上，介由含有肽鏈連 接體與胺甲蝶呤結合，透明質酸-胺甲蝶呤結合體作爲關 節疾病治療藥時具有卓越的效果，而完成本發明。

即本發明提供一種透明質酸-胺甲蝶呤結合體，其爲 於透明質酸之羧基上，藉由含有1〜8個胺基酸所成的肽 鏈之連接體（linker)與胺甲蝶呤結合者。本發明的另一 實施型態爲，該連接體爲含有1〜8個胺基酸所成之肽鏈 、及可插入1〜5個氧原子及/或可由羧基或Cl-6烷氧基 羰基取代之C 2 - 2 〇伸烷基二胺鏈者。 本發明的另一發明爲提供一種上述的透明質酸—胺甲 蝶B令結合體’其中結合於連接體的胺甲蝶呤爲式（I )、 (Π ) 、（ ΠΙ )或（IV )表示者；

〔化1〕

1359665

〔化3〕 C〇Ri L〇

Η 〔化4〕

COR-,

N^COR2 Η 〔式中，1^及表示各自獨立的羥基、胺基、C^-6烷氧 基、（：】_6烷基胺基、或二—C】—6烷基胺基； L〇表示連接體的結合位置〕。 本發明的另一發明爲提供上述的之透明質酸一胺甲蝶 -12 - 1359665 ⑼ 呤結合體，其中含有肽鏈之連接體及於該連接體所結合的 胺甲蝶呤爲，式（厂）或（II /)所示者； 〔化5〕

〔化6〕 Η

〔式中，1^及R2表示各自獨立的羥基、胺基、烷氧 基、c , - 6烷基胺基、或二一 Ct - 6烷基胺基； L表示式（X) 〔化7〕 —N—Q2-N——[HA] 1 i Κ11 Γ<12 (X) (式中’ Q!與所結合的一 NH——起形成1〜8個胺基酸所 成之肽鏈，含於該肽鏈的胺基酸之各殘基可獨立由1個以 -13- (10) 1359665 上選自C,-6·烷基、Ci-6烷基羰基、¢:,-6烷氧基羰基，甲 醯基、C,-6烷基磺醯基' 及可被取代之C6-1G芳基磺醯基 所成群之基取代或保護，含於該肽鏈之各醯胺鍵可獨立由 1個以上選自C^-6烷基及/或（^-6烷基羰基於氮原子上 取代，含於該殘基的各羧基可獨立由1或2個C!-6烷基 取代或亦可轉換成醯胺基；

Rii及R12表示各自獨立的氫原子或烷基；

Q2表不C2-20伸焼基，該伸院基可插入1〜5個氧原子、 及/或可由羧基或Ch 6烷氧基羰基取代； 〔HA〕表示與透明質酸之結合位置，該連接體與含 於該透明質酸的羧基形成醯胺鍵結）所表示的連接體〕。 本發明的另一發明爲提供一種醫藥組成物、及關節疾 病治療藥，其爲含有上述透明質酸-胺甲蝶呤結合體作爲 有效成分者。 本發明的另一發明爲提供一種化合物或其鹽，其徵爲

式（Va )或（Vb )所示者；

(11) 1359665

t式中，Ri及R2表示各自獨立的羥基、胺基、Ci— 6烷氧 基、Cl - 6院基胺基、或二— Cl - 6院基胺基；

Ll表示式（X，） 〔化 10〕

(X，）

(式中，Q!與所結合的—NH——起形成1〜8個胺基酸所 成之肽鏈’含於該肽鏈的胺基酸之各殘基可獨立由1個以 上選自C|-6垸基' Cl—6院基羯基' C|-6燒氧基羯基、.甲 醯基、¢:,-6烷基磺醯基、及可被取代之C6-1G芳基磺醯基 所成群之基取代或保護，含於該肽鏈之各醯胺鍵可獨立由 1個以上選自Ci-6烷基及/或C!-6烷基羰基於氮原子上 取代，含於該殘基的各羧基可獨立由1或2個（^-6烷基 取代或亦可轉換成醯胺基； 反11及R12表示各自獨立的示氫原子或C^-6烷基； Q2表示C2- 2〇伸烷基，該伸烷基可插入1〜5個氧原子、 -15- (12) 1359665 及/或可由羧基或C,-6烷氧基羰基取代）〕。 本發明的另一發明爲提供一種上述透明質酸-胺甲蝶 呤結合體之製造方法，其爲含有將式（Va)或（Vb)所 表示的化合物與透明質酸進行反應，該透明質酸的羧基轉 換成N-取代醯胺基之步驟。 以下對本發明做詳細說明。

本發明的透明質酸-胺甲蝶呤結合體（HA - Μ TX結 合體）係爲新穎化合物。本發明中作爲透明質酸（ΗΑ ) 與胺甲蝶呤（ΜΤΧ )結合之方法，可藉由採用於ΗΑ的羧 基上，介由含有肽鏈之連接體與Μ ΤΧ結合的結構，得到 可保持ΗΑ的疼痛去除作用，且同時具有ΜΤΧ的滑膜減 輕作用之HA — ΜΤΧ結合體。即，本發明的ΗΑ_ ΜΤΧ結 合體於滑膜聚集後，導入滑膜細胞內，於細胞內表現 ΜΤΧ的藥效。 因此，將本發明的ΗΑ— ΜΤΧ結合體投予於0Α或RA 患者之關節內時，與過去的ΗΑ製劑一樣，可表現ΗΑ所 具有特有疼痛除去作用下，可一邊聚集於滑膜組織，一邊 徐徐地導入滑膜細胞內，藉由解離ΜΤΧ可持續地表現滑 膜炎抑制作用。因此，與經口投予相比ΜΤΧ的投予量可 大幅度地減少，減輕因經口投予產生問題之全身性副作用 。又’對於投予部位，ΗΑ製劑與ΜΤΧ兩者爲表現相異作 用機制之藥理效果，故期待兩者之間的相乘藥效。 即，可藉由本發明的ΗΑ— Μ ΤΧ結合體，不僅具有作 爲關節注入劑的ΗΑ之作用，且僅投予於關節內時可安全 ' 16 - ⑧ (13) 1359665 下表現MTX之滑膜炎抑制作用，故提供一種過去未有的 優良關節疾病治療藥。 本發明的透明質酸-胺甲蝶呤結合體（HA - Μ TX結 合體）係爲，於透明質酸之羧基上，藉由含有肽鏈之連接 體與胺甲蝶呤結合者。

本發明所諝的「透明質酸（Η A )」，並無特別限定 ’但例如可具有平均分子量爲5萬〜1000萬道爾頓之葡 糖醛酸與N-乙醯葡糖胺所成之二醣聚合物。透明質酸的 鹽雖無特別限定，例如含有鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋁鹽、鋅 鹽、鐵鹽、銨鹽、四丁銨鹽等。透明質酸及其鹽、與這些 混合物之具體例子，例如可舉出商品名斯貝尼路（註冊 商標：製造販賣商中外製藥股份有限公司）；商品名 愛路茲（註冊商標：製造生化學工業股份有限公司，販 賣商科硏製藥股份有限公司）；商品名歐貝剛（註冊 商標：製造生化學工業股份有限公司，販賣商’科硏製 藥股份有限公司）等。本發明的「透明質酸衍生物」係爲 具有由HA衍生之HA骨架的物質。作爲透明質酸衍生物 ，雖無特別限定，可舉出Η A中一個以上之羧基被醋化的 物質（例如’苯甲基酯化HA (商品名 Hyaff (註冊商標 )、Fidia Advanced Biopolymers) )、HA 以甲醒交聯且 高分子化的物質（例如’商品名 S y n v i s e (註冊商標）、 Biomatrix) ) 、HA中1個以上的羥基被乙醯化之乙醯化 HA等。 本發明的HA— MTX結合體爲欲不損害HA的疼痛除 (14) (14)1359665 去作用，作爲HA — MTX結合體，其可保持於臨床上疼痛 除去作用已被確認的HA同等之分子量尺寸與黏彈性者爲 佳。又’分子量若過大則黏彈性會提高使得處理操作難以 進行’及若考慮到作爲活體內載體之HA的效果，具體而 S以作爲HA — MTX結合體之分子量爲60萬〜600萬道爾 頓爲佳’作爲HA— MTX結合體之分子量爲80.萬〜6〇〇萬 道爾頓爲較佳’作爲HA- MTX結合體之分子量爲100萬 〜5 00萬道爾頓爲特佳^ 其中，上述的原料HA的分子量、及HA— MTX結合 體的分子量係由極限黏度算出黏度平均分子量之方法進行 測定所得者。由極限黏度（〔77〕）算出黏度平均分子量 (Mw)時可使用下述算式。

Mw= ( [ η ) / 0.0003 6 ) 1282 本發明的含肽鏈之連接體的肽鏈係由胺基酸所構成。 該胺基酸係含有甘胺酸' 丙胺酸、絲胺酸、脯胺酸、纈胺 酸、蘇胺酸、胱胺酸、亮胺酸 '異亮胺酸、天冬醯胺、天 冬胺酸、離胺酸 '麩醯胺、麩胺酸 '蛋胺酸、組胺酸 '苯 基丙胺酸、精胺酸、酪胺酸、色胺酸等天然^ .一胺基酸等 ’其他亦含有具有烷基側鏈的α -胺基酸（例如戊胺酸、 己胺酸、第三亮胺酸等）、以環烷基取代之丙胺酸或甘胺 酸（例如環戊基丙胺酸、環己基丙胺酸、環己基甘胺酸等 )、或以芳基取代之丙胺酸或甘胺酸（例如吡啶丙胺酸、 噻吩基丙胺酸、萘基丙胺酸、取代苯基丙胺酸、苯基甘胺 酸等）等非天然α —胺基酸、/5 —丙胺酸等之万一胺基酸 -18- ⑧ (15) 1359665 、r -胺基丁酸等r -胺基酸、及牛磺酸等.胺基磺酸等。 本發明的連接體肚之胺基酸亦包含殘基受到適當取代或保 護者。例如該殘基上的官能基爲使用保護基所保護者β其 目的所使用的保護基爲該技術領域中公知者，其—部份的 例子記載於本說明書其他段落中。各取代基及保護基、特 別爲保護基的導入方法，可使用於該技術領域中爲公知者

該連接體可僅由胺基酸所構成、或亦可包含來自肽鏈 中或末端上來自胺基酸以外的部份。例如伸院基二胺、吗 伸院基二胺之二胺化合物或如琥珀酸之二羧酸化合物於肽 鏈中或末端結合者等亦含於該連接體中。肽鏈之中或末端 上含有胺基酸以外的化合物下，該連接體結合於ΜΤΧ之 羧基與透明酸的羥基時，如伸烷基二胺、哼伸烷基二胺之 二胺化合物存在於肽鏈的末端爲佳，特別爲4，7，1 0 -三鸣一 1，13—三癸基二胺存在於肽鏈的末端爲佳。又， 構成肽鏈的胺基酸雖無特別限定，但由對蛋白酶的親·合性 觀點來看，α -胺基酸爲佳，結合於含有肽鏈的連接體之 ΜΤΧ的末端爲ct 一胺基酸爲佳。 構成該肽鏈的胺基酸數目，雖無特別限定，但典型爲 1〜8，較佳爲]〜6，特佳爲1〜4。構成該肽鏈之胺基酸 各殘基可獨立地由1個以上的基進行適當的取代或保護。 如此基可舉出Ci-6烷基、Ci-6烷基羰基、Ci-6烷氧基羰 基（例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、（正或異）丙基氧基 羰基 '及（正 '第二或第三）丁氧基羰基）'甲醯基' -19- (16)1359665

Ci-6烷基磺醯基（例如甲磺醯基、乙磺醯基、及（ 異）丙磺醯基）、可被取代之C6-n)芳基磺醯基（例 苯磺醯基、（鄰、間或對）甲苯磺醯基、及（1 一或 )萘磺醯基），但不僅限定於此。例如藉由取代或保 含於該殘基的羧基可轉換成烷氧基羰基、羥基 換成C^-6烷氧基或C^-6烷基羰基氧基、胺基可轉 C!-6烷基胺基、二C】-6烷基胺基、C!-6烷基羰基或 C!-6烷基- (^-6烷基羰基胺基。又，含於該殘基的 可轉換成可由1或2個C^-6烷基所取代之醯胺。該 中含有如吲哚環或咪唑環等含氮雜環時，該環上的氮 亦可各自獨立由（^-6烷基或C!— 6烷基羰基保護。該 中存在脈基時，含於其中的氮原子亦可由C^-6烷基惑 C】-6烷基類基保護。作爲對氮原子的其他保護基， 特別限定但亦可選自如上述的Ci-6烷氧基羰基、甲 、C!- 6烷基磺醯基、可被取代之C6- IG芳基磺醯基之 使用者。硫醇基含於該殘基時，可由（^-6烷基或C, 基羰基保護。又，含於該肽鏈的醯胺鍵或肽鍵，其氮 上亦可由Ci-6烷基及/或C^-6烷基羰基取代，例如 轉換成—CON ( C】—6烷基）—。 .構成肽鏈的胺基酸序列雖無特別限定，但例如可 以下者。且存在著作爲標的之活體內蛋白酶，其基質 胺基酸爲已知時，亦可使用含有其辨識部位及/或切 位之胺基酸。 1個胺基酸所成的肽鍵.A 1 a、A r g、A s η、A .s p、 正或 如， 2 - 護， 可轉 換成 N - 羧基 殘基 原子 殘基 I 雖無 醯基 -般 -6院 原子 亦可 舉出 辨識 斷部 C y s 20- (17)1359665 、Gin ' G1 u ' G1 y ' His、lie、Leu、Lys、Met、-Phe、Pro 、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、等。較佳爲、Phe、Tyr、 Π e、G 1 u。 2個胺基酸所成的肽鏈：PhePhe、PheGly、PheLeu、 TyrPhe 、 TrpPhe 、 PheTrp 、 PheTyr 、 GlyPhe 、 GlyGly 、等 ° 較佳爲、PhePhe、 PheGly° 3個胺基酸所成的肽鏈：PheGlyGly、PheLenGly、 PhePheGly ' AsnPhePhe ' GlyPhePhe ' LeuPhePhe 、

LeuAlaLeu、AlaValAla、GlyAlaPhe、GlyPheAla、

GlylleAla、GlyllePhe、GlyLeuAla ' GlyValAla、

GlyValPhe、GlyGlyGly、等。較佳爲、AsnPhePhe。 4個胺基酸所成的肽鏈：GlyPheLeuGly、

GlyPhePheLeu ' G1yPhePheA 1 a、G1yPheTyrA1 a、 GJyPheGlyPhe 、 GlyPheGlyGly 、 GlyGlyPheGly 、

GlyGlyPheTyr ' G1yG1yG1yG1y、LeuA1 aLeuAI a '

AlaLeuAlaLeu ' AlaGlyValPhe、GluAsnPhePhe、等 ° 較佳..

爲、GlyPheLeuGly 。 本發明的連接體例如亦可具有上述式（χ)所示的結. 構，此時Q1與所結合的—NH——起形成如上述的1〜8 的胺基酸所成的肽鏈。又，Q2可插入1〜5個氧原子’或 可由羧基或Ci-6烷氧基羰基所取代之C2-2t)伸烷基。Q2 的具體例子爲乙—1’ 2-二基、丙一 1 ’ 3-二基、丁 一】 ’ 4 —二基 '戊—]’ 5 —二基、己一 1’ 6 — 一基、庚—】’ 7 —二基 '辛一1，8 —二基、壬一 ]，9一二基、癸一]’ -21 - ⑧ (18) 1359665 一二基、2 —甲基丙—1，3 —二基、2 —甲基丁 一 1，4 —二 基、3 -甲基丁一 1，4 —二基' 3 —甲基戊一1，5 —二基、

3 -乙基戊一1，5 -二基、2 -甲基己一1 ’ 6 —二基、3-甲基己一1，6-二基、4 —甲基庚一1，7 —二基、3 -鸣庚 —1，5 —二基、3 —嗎己一1，6 —二基 ' 4 — 口咢己一1，6 — 二基、3_ 哼庚一 1，7- 二基、4 — Df 庚—1，7 —二基、4 一卩等辛—1，8 -二基、3，6 —二鸣辛—1，8 —二基、3，6 一二噚壬一 1，9 —二基、3，6 —二鸣一4 —甲基壬—1，9 一二基、4，7 -二哼癸 一1，10— 二基、4，9—.二哼十二 烷一 1，12 -二基、4，7，10 —三哼三癸一1，13—二基等 ，較佳爲乙—1，2_二基、戊—1，5 —二基、3_哼戊—1 ，5 — 二基、3，6 —二哼辛一1，8-基、4，7 —二 nf 癸一 1 ，10 —二基、4，9一二噚十二烷 一1，12 - 二基、4，7， 10 —三卩f十三烷一1，13-二基等。 本發明的HA — MTX結合體僅爲於HA之羧基上介由 含有肽鏈的連接體結合MTX，該連接體與該透明質酸以 酸醯胺鍵結合者，任意結合方式皆可。即，含有肽鏈的連 接體爲 1) MTX的α位羧基； 2 ) ΜΤΧ的r位羧基；及 3 ) MTX的與胺基結合者，且這些結合方式爲複數混 合存在（例如，MTX的α位之羧基所鍵結的結合體.，與 Μ ΤΧ的7位羧基所鍵結的結合體混合存在）亦可。對於 蛋白酶之親合性與合成上的觀點來看，與含有肽鏈的連接 -22 - (19) (19)1359665 體Μ TX的α位之羧基及/或^位的羧基結合爲佳，該連 接體與ΜΤΧ的〇：位之羧基結合爲較佳。 本發明的HA-MTX結合體中，含有肽鏈的連接體及 其結合形式之特佳者爲，含有肽鏈的連接體中α -胺基所 成之肽鏈末端存在著二胺化合物者，該肽鏈的Ν末端爲 ΜΤΧ的α位之羧基上由酸醯胺鍵結合，該肽鏈c末端爲 介由二胺化合物由ΗΑ的羧基與酸醯胺鍵結結合者。 本發明的透明質酸〜胺甲蝶呤結合體中胺甲蝶呤（ ΜΤΧ)部分爲’經由連接體修飾以外，亦可介由公知方法 進行前驅藥物化。 本發明的C,— 6烷基爲’碳數丨〜6的直鏈或支鏈狀烷 基’例如包含甲基 '乙基、正丙基 '異丙基、正丁基、第 二丁基、第三丁基 '正戊基、3—甲基丁基' 2 —甲基丁基 、1—甲基丁基、1_乙基丙基、及正戊基等。 本發明的C,-6烷基羰基爲，碳數1〜6的直鏈或支鏈 狀烷基的烷基羰基’例如含有具有乙醯基、丙醯基、2-甲基丙醯基、2，2 -二甲基丙醯基等已定義的烷基作爲烷 基部分者。 本說明書中’ 院氧基表示碳數1〜6的直鍵或支 鏈狀的院氧基’例如含有具有甲氧基、乙氧基、正丙氧基 等已定義的烷基作爲烷基部分者。 本說明書中’ C,-6烷基胺基表示碳數I〜6的直鏈或 支鏈狀之烷基胺基，例如含有具有甲胺基、乙胺基、正丙 胺基等已定義的烷基作爲烷基部分者。 -23- (20) 1359665 本說明書中，二C,-6烷基胺基表示碳數1〜6的直鍵 或支鏈狀之二烷基胺基，例如含有具有二甲胺基、乙基甲 胺基、二乙基胺基、乙基正丙胺基等，可相同或相異之已 定義的烷基作爲烷基部分者》 本說明書中，C2-2〇伸烷基表示碳數2〜20的直鏈或 支鏈狀之伸烷基，例如含有伸乙基、伸丙基、伸丙基、伸 丁基、伸辛基、伸癸基等。

本說明書中，Ci-6烷氧基羰基表示碳數1〜6的直鏈 或支鏈狀的院.氧基羰基，例如含有具有甲氧基羰基、乙氧 基羰基、正丙氧基羰基等已定義的烷基作爲烷基部分者。 本說明書中，Ci-6烷基磺醯基表示碳數1〜6的直鏈 或支鏈狀之烷基磺醯基，·例如含有具有甲磺醯基、乙磺醯 基、正丙磺醯基等已定義的烷基作爲烷基部分者。 本發明中醯化表示含有C , - 6烷基羰基化；及苯醯化 ，該苯醯基可由C^-6烷基、鹵素原子、（^-6烷氧基等所 取代。 本發明的HA— MTX結合體之MTX的結合率以可發 揮藥效且可減輕副作用之範圍爲佳。本說明書中的MTX 結合率如下式： 〔化 1 1〕 (MTX的結合率（％)) = (結合於分子中的分之數）qqn (分子中的TV -乙醯葡糖胺部分之數） 所算出。MTX的結合率雖無特別限定，由藥效表現的觀 點來看以〇. 5 %以上爲佳，1 . 0 %以上爲較佳。另一方面’ 欲將MTX作用侷限於投予部分，減低MTX對於全身的副 (21) 1359665 作用時，結合率比1 Ο %小時爲佳，又，考慮到本發 ΗΑ—ΜΤΧ結合體的分子量較爲大，且ΜΤΧ的結合率 時會引起不溶化，而對合成產生不良影響時，ΜΤΧ 合率爲0.5%以上且小於4.5%爲佳，以1.0%以上且 %以下時爲特佳。 本發明的ΗΑ— ΜΤΧ結合體可作爲鹽類方式存在 若考慮到期用途以藥學上可被接受的鹽類爲佳。例如 出鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋁鹽'鋅鹽、鐵鹽、銨鹽、四 銨鹽等。. 本發明的ΗΑ_ ΜΤΧ結合體之合成爲，ΗΑ、含有 的連接體、ΜΤΧ以適當的順序結合所得。例如構築 ΗΑ—肽鏈的連接體後導入ΜΤΧ之製程、或構築含有 -肽鏈的連接體後導入ΗΑ的製程。該各結合反應爲 用於一般酸醯胺鍵結反應之溶劑、與縮合劑、若必須 應促進性的添加劑，於-2 0 °C〜4 0。(：的溫度下，經數 〜數天反應而進行。作爲溶劑例如可舉出水、N，N 甲基甲醯胺、N，N—二甲基乙醯胺、二甲基亞碾、 呋喃、二Π等烷、甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿等及這 合液體。作爲縮合劑例如可舉出1 —乙基一 3 - ( 3 -基胺基丙基）碳化二亞胺、二環己基碳化二亞胺、二 基碳化二亞胺等碳化二亞胺化合物或苯并三唑一 1 一 氧基一三（二甲胺）鱗六氟磷酸酯、〇一 （7~氮雜 三唑一 1_基）一1，1，3，3 —四甲基糖醛錙六氟磷 ' 1—乙氧基羰基一 2 -乙氧基一]，2-二氫喹啉等。， 明的 若高 的結 • 4.5 ，但 可舉 丁基 肽鏈 含有 MTX 使用 之反 分鐘 四氫 些混 二甲 異丙 基一 苯并 酸酯 作爲 -25-

(D (22) 1359665

反應促進性的添加劑，例如可舉出N --羥基琥珀銑醯亞胺 基、N —羥基一5 —原菠稀_2, 3_羧基亞胺基、】_羥基 苯并三哩基、1—羥基—7一氮雜苯幷三唑、3, 4 —二氫— 3 —羥基一 4_氧代—丨，2，3_苯幷三唑等活性酯劑、或 三乙胺、N-甲基嗎啉' N，N —二異丙基乙胺、三〔2_ (2 —甲氧基乙氧基）乙基〕胺等ρΗ調整劑。反應時胺 基側鏈等官能基’例如羥基、羧基、胺基等因應必須可使 用一般泛用於有機合成的保護基。 於此預防止ΗΑ分子量的降低，由可容易控制複合化 反應之觀點來看’構築含有ΜΤΧ —肽鏈之連接體後導入 Η Α的製程爲佳’溶劑可爲水、ν，Ν -二甲基甲醯胺.、四 氫肤喃、乙醇、及這些混合液爲佳，水與四氫呋喃的混合 液爲最佳’其混合比率爲1 : 1爲最佳。縮合劑爲水溶性 者爲佳’以1—乙基一 3 —（3 —二甲基胺基丙基）碳化二 亞胺爲最佳’其添加量爲對HA中的羧基而言爲0.1當量 爲最佳。反應促進性添加劑爲，作爲活性酯劑以3，4 -二氫—3 —羥基一 4 一氧代—1，2’ 3_苯并三唑爲最佳， 其添加量爲對HA中的羧基而言爲〇.1當量爲最佳。作爲 PH調整劑’以三〔2— (2 —甲氧基乙氧基）乙基〕胺爲 最佳，反應時的pH爲6〜7爲最佳。又，反應溫度爲一 ]〇°C〜3 0°C爲佳，〇°C〜15°C爲最佳。反應時間爲1小時 〜4 8小時爲佳，1 2小時〜2 4小時爲最佳。 本發明中所謂「關節疾病」具體而言爲關節軟骨損害 、變形性關節症（含有原因不明的一次性疾病、與原因已 -26- (23) (23)1359665 確認的二次性疾病）、肩關節周圍炎、風濕性關節炎、反 應性關節炎、病毒性關節炎、化膿性關節炎、結核性關節 炎、神經性關節炎等疾病，且包含這些疾病所引起的關節 痛（例如關節風濕之膝關節疼痛等）。又，「關節疾病治 療藥j不僅爲前述關節疾病的治療所使用的藥劑，亦包含 使用於預防的藥劑、疾病狀態進展抑制（惡化的防止或現 狀維持）等之藥劑6 本發明的HA — MTX結合體係爲’該有效量中添加適 宜且製藥上可被接受的載體、賦形劑、崩壞劑、滑澤劑、 結合劑、香料、著色劑等作爲醫藥組成物使用。本發明的 HA — MTX結合體作爲有效成分的醫藥組成物作爲關節疾 病治療藥使用爲佳，其中以作爲關節局部投予製劑使用爲 特佳。 本發明的Η A — Μ T X結合體作爲關節疾病治療藥劑進 行製劑化時，雖無特別限定，但可舉出生理食鹽水或磷酸 生理食鹽水等中溶解至所望濃度，作爲注射用製劑而製劑 化者。此時，若必要可藉由添加酸或鹼而使溶劑調整至所 望酸鹼度。又，添加如鈉鹽、鉀鹽等1價金屬鹽' 鎂鹽、 鈣鹽、錳鹽等2價金屬鹽等無機鹽類，調整溶液至所望的 鹽濃度。且，若必要可添加安定化劑等。亦可將如此經調 整之溶解本發明H A _ ΜΤΧ結合體之溶液，預先.塡充於定 量注射筒等注射器之形式下流通。將以本發明HA - MTX 結合體作爲有效成分之關節疾病治療藥劑進行投予時，本 發明HA— MTX結合體爲0.01%〜10%w/v的溶液濃度 -27- ⑧ (24) (24)1359665 ，較佳爲〇」％〜2.0%w/v的溶液濃度，特佳爲0.5%〜 1.5%w/v的溶液濃度者，可以1次丨〜3 ml的量投予於 患者。但該投予量依據醫師指示、投予對象之患者、或疾 病種類或其嚴重度、或HA— MTX結合體的分子量等，適 宜地增減各最適的投予量。 本發明的Η A — MTX結合體如下的實施例所說明，於 膝關節發病之關節炎模型進行關節內投予時，可表現未於 HA所見到的滑膜炎減輕作用。且本發明者發現，將此滑 膜炎症狀的減輕作用與低分子（分子量爲30萬道爾頓） 的HA — MTX結合體比較時，發現於60萬道爾頓以上， 特別爲分子量爲80萬道爾頓以上之HA—MTX結合體可 表現極高效果。 【賓施方式】 〔實施例〕 本發明由下述實施例作更詳細說明，但本發明未僅限 定於這些實施例。 〔實施例]-〗〕 2— ( N - ( N - ( N - ( 4 -〔 〔 （2，4 —二胺基-6—蝶 D定基）甲基〕甲基胺基〕苯甲醯基〕一 (〇5 —甲基 谷胺醯基）〕苯基丙氫醯基〕苯基丙氫醯基胺基〕乙基胺 :MTX — a-PhePhe_NH_C2H4 — Νί12(化合物 1)的製 (25)1359665 (a) Cbz— Phe~ NH— C2H4— NH— Boc (化合物 la)的製 造

將N -苯甲酯—L -苯基丙胺酸（Cbz — Phe: 7.16 g ，25.4 mmol)與N—第三丁氧基羰基-伸乙基二.胺鹽酸 鹽（5.00 g，25.4 mmol)與1—羥基苯并三唑基水合物（ HOBT ： 4.28 g，28.0 mmol)與 N —甲基嗎啉（NMM: 3.07 mL，28_〇 mmol)溶解於1〇〇 mL的二甲基甲醯胺（ DMF)，冰浴攪拌下加入1 一乙基一 3- (3 -二甲基胺基 丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC: 5.36 g，28.0 mmol)， 室溫下攪拌1天。反應液中加入1 ο %檸檬酸水溶.液，將 析出的固體溶解於氯仿與少量的甲醇中，以飽和碳酸氫鈉 水、飽和食鹽水洗淨後，以硫酸鈉乾燥。經減壓濃縮所得 之殘渣以矽膠管柱層析法（溶離溶劑氯仿：甲醇=95 : 5 )純化，得到9.69 g的白色固體的標題化合物。

】H-NMR( 270MHz、DMSO-d6) ： ¢5 1 .3 7 ( 9 Η ' s )、 2.69 - 3 . 1 9 ( 6Η ' m ) ' 4.12-4.22 ( 1H' m) 、4.93(2H

，dd、J = 12.9Hz' J = 15.1Hz) ' 6.75 ( 1H、br.t) 、7.22 -7.33 ( 10H、m) 、7.48 ( 1H、d、J=8.6Hz) .、8.05 ( 1 H ' br.t ) LC/MS ： 4 41.9 (M+H+ ) 464.1 (M+Na+ ) (b ) Cbz — PhePhe — NH — C2H4 — NH - Boc (化合物 lb) 的製造 溶解於2 0 0 ni L的 ⑧ 將化合物 1 a ( 9.6 9 g，2 ] . 9 m m o 1 ) -29- (26) I359665

甲醇，加入500 mg的10%鈀碳素，於氫氣環境下室溫中 攪拌1天。過濾反應混合物除去觸媒後減壓濃縮。將該殘 渣與 Cbz—Phe(6.92 g > 23.1 mmol)與 HOBT(3.17 g， 24.2 mmol)與 NMM( 2.66 mL，24.2 mmol)溶解於 50 mL的二甲基甲醯胺（DMF )，冰浴攪拌下加入EDC ( 4.64 g > 24.2 mmol)，室溫下攪拌1天。反應液中加入水 ，以1 〇 %檸檬酸水溶液、飽和碳酸氫鈉水、水洗淨後乾 燥。所得之殘渣以矽膠管柱層析法（溶離溶劑氯仿··甲 醇=9 0 : 1 0 )純化，得到1 2 · 8 g的白色固體的標題化合 物。 】H-NMR ( 270MHz、DMSO - d6) ： <5 1.37 ( 9H、s )、 2.62 — 3.18.( 8H、m) ' 4.18—4.29 ( 1H' m) '4.40 — 4.51 (]H，m) ' 4.9 3 ( 2H ' s ) 、6.72(lH、br.t)、 7.10 - 7.32 ( 15H' m) 、7.46 ( 1H、d、J = 8.6Hz)、 7.97 ( 1H ' br.t) 、8.11 ( 1H、d、J=7.9Hz) LC/MS: 588.8 ( M+H+) 611.】（M+Na+) (c) Cbz — G】u ( OMe) PhePhe-NH-C2H4-NH-Boc ( 化合物〗c )的製造

將化合物】b(]].l g，18.9 mmol)溶解於800 mL的 甲醇與50 mL的DMF與500 mL的THF，加入1_00 g的 ]0%鈀碳素’氫氣環境下室溫中攪拌】天。由反應混合過 濾觸媒後，減壓濃縮。將該殘渣與N —碳化苯甲酯基一 L 一谷胺酸一-7 —甲酯（Cbz— G】u(〇Me) : 5 58 g，189 -30 - ⑧ (27) 1359665 mmol)與 HOBT ( 3.18 g，20.8 mmol)與 NMM ( 2.29 mL ，20.8 mmol)溶解於100 mL的DMF，冰浴攪拌下EDC (3.99 g，20.8 mmol)，於室溫中攪拌2天。冰浴攪拌下 反應液中加入10%檸檬酸所產生的沈澱以5%碳酸氫鈉、 水洗淨後，以矽膠管柱層析法（溶離溶劑氯仿：甲醇= ίο: 1)純化，加入甲醇後產生沈澱，得到11.1 g的白色 粉末的標題化合物。 'H-NMR ( 270MHz ' DMSO- d6) ： <5 1 .3 6 ( 9 Η ' s )、

1.64 - 1.80 ( 2H ' m) ' 2.1 7 - 2.2 3 ( 2 H ' m ) ' 2.76 -3.12 ( 8H > m ) 、3.56(3H、S) ' 3.93- 4.03 ( 1H' m) 、4.40 - 4.5 8 ( 2H、m ) 、5.00 ( 2H、s) 、6.68 ( 1H、 br.t ) ' 7. 1 8 - 7.44 ( 1 6H ' m ) 、7.84-7.90 (2H、m)、 8 · 1 9(lH、d、J=7.7Hz) LC/MS ： 732.4 ( M + H+ ) 、754.4(M+Na+) (d) MTX — a - PhePhe — NH — C2H4— NH — Boc (化合物 Id)的製造 將化合物 lc(348 mg，0.476 mmol)懸浮於 10 mL 的甲醇與10 mL的四氫呋喃，加入33 mg的10%鈀碳素 ，於氫氣環境下室溫中攪拌1 .5小時。由反應混合物過濾 觸媒後減壓濃縮。將該殘渣與4 -〔 N - ( 2，4 —二胺基 —6 —蝶啶基）一N —甲胺〕安息香酸（197 mg，0.547 mmol )與 HOBT(76 mg，〇_499 mmol)溶解於 4 mL 的 N —甲基吡咯烷酮（NMP )，冰浴攪拌下加入N —甲基嗎啉 -31 - ⑧ (28)1359665 (MM，55 " L ’ 0.499 mmol )與 E D C ( 1 0 5 m g，0 · 5 4 7 mmol ) ’室溫中攪拌4天。反應液中加入5%碳酸氫鈉所 產生的沈癜以矽膠管柱層析法（溶離溶劑氯仿：甲醇= 1)純化，再以胺矽膠（NH— DM100，100-200 mesh ’富士西里西亞化學股份有限公司製）管柱層析法（溶離 溶劑氯仿··甲醇=I 〇 : I )純化，得到3 6 2 m g的黃色粉 末之標題化合物。 'H-NMR ( 270MHz ' DMSO- d6 ) ： <5 1.35 ( 9H ' s )、

1.78 — 1.94 ( 2H、m) 、2.23(2H、m) 、2.69— 3.10( 8H ，m) ' 3.22 ( 3H ' s ) 、3.55(3H、S) 、4.27-4.52 (

3 H ' m ) 、4.79(2H、s) 、6.63(2H、br‘s) 、6.70(1H

、br.t ) ' 6.82 ( 2H、d、J = 8.9Hz ) 、7.06 - 7.25 ( 1 OH ' m) 、7.46 ( 1H、br.s) 、7.66-7.88 ( 5H、m) '8.06 -8.17 (2H'm) 、8.56(lH、s) LC/ MS ： 905.5 ( M + H+ )

(e) MTX— α-PhePhe—NH— C2H4— NH2(化合物 1) 的製造 化合物1 d ( 3 6 0 m g，0.3 9 8 m m ο 1 )中冰浴下加入5 m L的三氟乙酸後攪拌1小時。反應亦經減壓濃縮後，將 殘渣以胺矽膠管柱層析法（溶離溶劑氯仿：甲醇=I 〇〇 :10，2次）進行純化’得到27 5 m g的黃色粉末的標題 化合物。

'H-NN4R ( 270MHz ' DMSO - d6) ： <5 1.80 - 1.96 ( 2H -32 - ⑧ (29)1359665

、m) ' 2.20 - 2.2 8 ( 2H ' m ) 、2.45(2H、t、J )' 2.70 - 3. 1 0 ( 6H ' m ) 、3.22(3H，s) '3.55 s ) 、4.26-4.52 ( 3H、m) '4.79(2H、s) 、6. 、br.s) 、6_82(2H、d、J=8.7Hz) ' 7.06 - 7.2 、m) 、7_46(lH、br.s) 、7.65-7.73 (3H、m) (lH、d'J=8.1Hz) 、8.08-8.16 (2H、m) 、8. ' s ) LC/ MS : 8 05.3 ( M + H+ )

=6.6Hz (3H、 61 ( 2H 1 ( 10H 、7.85 56 ( 1H

〔實施例1 — 2〕 4，7，]0 —三哼一13- 〔N- ( N - [ N - 〔4-〔 4 一二胺基-6-蝶啶基）甲基〕甲基胺基〕苯甲醯 α -(鄰5 -甲基谷胺醯基）〕苯基丙氫醯基〕苯 醯基胺基〕十三烯胺：ΜΤΧ - a - PhePhe -C10H2〇03— NH2(化合物2)的製造 (a) Cbz — Phe — NH - C1()H2〇03 — NH - Boc (化合彩 的製造 將N—苯甲酯一L-苯基丙胺酸（Cbz—Phe: ，2.85 mmol)與 N_第三丁氧基羰基—4，7，10 一1，13 -十三烷二胺（760 mg，2.37 mmol)與 1 苯并三唑基水合物（HOBT: 363 mg，2.37. mmol mL的二甲基甲醯胺（DMF )，冰浴攪拌下加入1 一 3- （3 -二甲基胺基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（ 5 4 6 m g > 2.85 mmol)，室溫下攪拌2天。反應液 〔（2， 基〕-基丙氫 • NH - d 2a) 8 5 2' mg —三哼. 一羥基 )與6 一乙基 EDC ： 中加入 (30) 1359665 乙酸乙酯、ί0%檸檬酸水溶液、5%碳酸氫鈉 '飽和食鹽 水洗淨後以硫酸鈉乾燥。經減壓濃縮所得之殘渣以矽膠管 柱層析法（溶離溶劑二氯甲烷：甲醇=1 0 0 : 3 )純化， 得到1.3 5g的油狀標題化合物。 'H-NMR (270MHz、CDC13) : <5 1 .43 ( 9H > s ) ' 1.56 -1.74( 4H ' m ) 、3.06(2H、d'J=6.8H2) 、3.17- 3.58(16H，m) ' 4.30 - 4.39 ( 1 Η ' m ) 、4.98(lH、br )、5.08 ( 2H、s ) 、5.50 ( I H ' br ) 、6.40 ( 1H、br )

' 7.16-7.32 ( 1 OH ' m ) LC/MS : 624.3 (M+Na+ ) (b) Cbz- PhePhe-NH - C1()H2〇03 - NH — Boc (化合物 2b )的製造 將化合物2a (1.35 g，2.24 mmol)溶解於12 mL的 甲醇，加入2 00 mg的10%鈀碳素，於氫氣環境下室溫中 攪拌4小時。過濾反應混合物除去觸媒後減壓濃縮。將該 殘渣與 Cbz-Phe(1.07g，3.57 mmol)與 HOBT(5】4 mg ，3.3 6 mmol )溶解於 10 mL的 DMF，冰浴攪拌下加入 EDC ( 688 mg，3.59 mmol)，室溫下攪拌 2天。反應液 中加入乙酸乙酯，以1 〇 %檸檬酸水溶液、-5 %飽和碳酸氫 鈉水、飽和食鹽水洗淨後以硫酸鈉乾燥。減壓濃縮所得之 殘渣以矽膠管柱層析法（溶離溶劑二氯甲烷：甲醇= 1 00 : 3 )純化。加入正己烷後產生白色沈澱物，過濾後得 到1 . 5 6 g的標題化合物。 (31)1359665 ’H-NMR( 270MHz、CDCl3) : o 1 .43 ( 9H ' s ) ' 1.60 —1.78 ( 4H' m) 、 2.96 — 3.60 ( 20H、m ) 、4.42—4.59 (2H，m ) 、4.96— 5.07 (3H、m) 、5.41 ( 1H、br.d)、 6.3 9 ( 1H' br) 、6.73 ( 1H、br.d) ' 7.08—7.31 ( 15H' m ) LC/ MS : 77 1 .3 ( M + Na+ ) (c) Cbz — Glu(OMe) Ph.ePhe — NH — Ci〇H2o〇3 — NH —

Boc (化合物2c )的製造 將化合物 2b ( 500 mg，0.668 mmol)溶解於 i〇 mL 的甲醇，加入150 mg的10%鈀碳素，氫氣環境下室溫中 攪拌1天。由反應混合過濾觸媒後，減壓濃縮。將該殘渣 與N —碳化苯甲酯基一 L -谷胺酸一了 一甲酯（Cbz— Glu (Ο M e ) : 2 1 7 m g，0.7 3 4 m m ο 1 )與 HOBT ( 102 mg.， 0.668 mmol)與溶解於5 mL的DMF，冰浴攪拌下EDC(

1 4 1 m g，0 · 7 3 4 m m ο 1 )，於室溫中攪拌1 6小時。反應液 中加入乙酸乙酯，以1 0 %檸檬酸水溶液、5 %碳酸氫鈉、 飽和食鹽水洗淨後，以硫酸鈉乾燥。減壓濃縮後所得之殘 渣以矽膠管柱層析法（溶離溶劑二氯甲烷：甲醇=〗〇〇 :5 )純化，加入正己烷後產生白色沈澱’過濾得到529 mg的標題化合物。 'H-NMR ( 270MHz ' DM SO - d6) ： <5 1 .3 6 ( 9H ' s )、 1.50 — 1.85 ( 6H、m) 、2.20(2H、t'J=7.9Hz) ' 2.70 -3.10 (8H，m) ' 3.25-3.48 ( 12H、m) 、3.56(3H' s -35 - (32)1359665

)' 3.93-4.02 ( 1H' m) 、4.20-4.60 ( 2H、m) 、5.0G (2H、s) ' 6.77 ( 1H ' br.t ) ' 7.10-7.45 (16H、m)、 7.82 ( 1H ' br.t ' J = 6.1 Hz ) 、7.91 ( 1H、d、J=7.9Hz) 、8.22 ( 1H ' d' J = 7.9Hz) LC/MS : 914.3 ( M + Na+ ) (d) Μ T X — a — PhePhe — NH — C i 〇 H 2 o 〇 3 — N H — Boc (化 合物2 d )的製造

將化合物 2c (514 mg，0.576 mmol)懸浮於 30 mL 的甲醇，加入100 mg的1.0%鈀碳素，於氫氣環境下室溫 中攪拌1 · 5小時。由反應混合物過濾觸媒後減壓濃縮。將 該殘渣與4—〔N— (2，4 —二胺基—6-蝶H定基）—N — 甲胺〕安息香酸（281 mg，0.864 mmol)與 ΗΟΒΤ (13 2 m g，0 · 8 6 4 m m ο 1 )溶解於5 m L的D M F，冰浴攪拌下加入 EDC( 166 mg，0.864 mmol)，室溫中攪拌2天。反應液 中加入 5 %碳酸氫鈉所產生的沈澱以胺矽膠（NH _ DM102 0，100— 200 mesh，富士西里西亞化學股份有限公 司製）管柱層析法（溶離溶劑第〗次，二氯甲院··甲醇 =1 0 0 : 7，第 2次，氯仿：甲醇=1 0 0 : 4 )純化’得到 4 1 5 m g的黃色粉末之標題化合物。 'H-NMR ( 270MHz ' DMSO - d6) : <5 1.3 6 ( 9H ' s )、 1.48- 1.61 ( 4 Η ' m ) 、1.81- 1.92 (2H、m) ' 2.24 ( 2H ，t、J=7.9Hz)、2.70 - 3.10 (8H、m)、3.22(3H、s) 、3.25—3.47 (12H、m) 、3_54(3H、s) ' 4.25 - 4.5 0 ( -36 - ⑧ (33) 1359665 ^ 3H ' m ) 、4_79(2H、s) 、6.61(2 H，、br.s) ' 6.76 -6.83 ( 3 Η ' m ) 、7 · Ο 6 - 7 · 2 4 ( 1 Ο Η、m ) 、7.45 ( 1Η、 br.s ) 、7.67-7.80 (4H、m ) ' 7.86 ( 1H' d' J = 8.1Hz )、8.09(lH、d、J=7.4Hz) 、8.15(lH、d、J=8.1Hz )' 8.56( lH、s) LC/MS: 1087.5 (M+Na+ )

(e) MTX - a -PhePhe — NH-C1()H2〇03-NH2 (化合物 2 )的製造 化合物 2d (413 mg，.0.388 mmol)中冰浴下加入 3 mL的三氟乙酸後攪拌40分鐘。反應亦經減壓濃縮後，將 殘渣以胺矽膠管柱層析法（溶離溶劑二氯甲烷：甲醇= 100： 7，2 次） 進行純化， '得 到 3 4 4 m g的: 黃色粉 末 的 標 題 化合物。 】H-: NMR (270MHz • DMSO -d6 ) : δ 1.49- 1.95 ( 4H m ) ' 1 . 8 1 — 1.92( 2H、 m )、2_ 24 (2H、 t、J = :1 r.9Hz ) 、2 .10 - 3.10 (8H， m ) > 3.22 ( 3 H ' s ) ' 3.25 — 3 . 47 ( 1 2H 、m )' ： 5.54 ( 3H、 s ) ' 4.2 5 - 4.5 0 (3H、 m ) 4. 79 ( 2H、 s ) ' 6.61 (2H ' br.s) ' 6 1.76- 6.83 ( 3H、 m ) 、7 • 06 - 7.24 (1 OH ' m ) ' 7.45 (1 H、br .s )、 7. 83 ( 1H、b r . t ' J = 5 .8Hz ) 、8. 0 1 (1 H、 d、 J = 7 • 9Hz ) 8. 09 C 1 Η、 d、 J = 7 .1 Hz ) 、8. 15 (]H、 d、 J = 7 _ 8Hz ) 8. 56 ( 1 Η、 s ) LC/ MS ：965 .5 ( M + H4 -37- ⑧ (34)1359665

〔實施例I - 3〕 MTX- a -PhePhe-NH-C1()H2()03-NH2 (化合物 3 製造 與實施例1 一 2相同方法下，取代N —第三丁氧 基—4，7，10 -三哼一1，13 -十三烷二胺使用 N-丁氧基羰基—4，9 —二鸣一 1’ 12 —十二烷二胺 2 2 1 mg的黃色粉末標題化合物。 ]H-NMR ( 400MHz、DMSO - d6 ) : δ 1.47-1.60 、m) ' 1 .8 0 - 1 .9 5 ( 2H ' . m ) 、2.20— 2.29 ( 2H、m 2.60 ( 2 H > t ) ' 2.70 - 3 . 1 0 ( 6H ' m ) 、3.22(3H、 、3.25-3.5 0'(8H、m) 、3.54(3H、s) 、4.25-4. 3H、m) 、4_79(2H、s) 、6.60(2H、br.s) 、6.81 、d、J=8.4Hz) > 7.0 6 - 7.2 0 ( 1 OH > m ) 、7.45( br.s) 、7.65(lH、br_s) 、7.70(2H、d) 、7.73( br.t) 、7.83( lH、d) 、8.10(lH、d) '8.11 ( 1 H ' ' 8.55 ( 1 H ' s ) LC/ MS : 949.5 ( M + H+ ) 〔實施例1 - 4〕 MTX— α — PhePhe - NH — C8Hl6〇2-NH2 (化合物 4 製造 與實施例1 一 2相同方法下，取代N—第三丁氧 基—4，7，] 0 —三哼一1，1 3 —十三烷二胺使用 N _ )的 基羰 第三 得到 (8H )' _ s ) 4 9 ( (2H 1 Η、 1 Η、 d ) )的 甘 碁银 第三 -38 - (35) 1359665 丁氧基羰基-4，7 -二噚-1，10 —癸二胺得到407 mg的 黃色粉末標題化合物。

1H-NMR ( 4 00MHz、DMSO - d6 ) ： δ 1.5 0 - 1.5 7 ( 4H 、m) 、1.85-1.91 (2H、m) 、2.21-2.28 (2H、m)、 2.60 ( 2H > t ) 、2.70-3.13 (6H、m) 、3.22(3H、s)

' 3.25-3.45 ( 8H、m) 、3.55 ( 3H、s) 、4.27-4.49 ( 3H、m) 、4.79(2H、s) 、6.60(2H、br.s) 、6.82(2H 、d、J=8.8Hz) ' 7.07-7.21 (10H、m) 、7.43(1H、

br.s ) 、7.69( lH、br.s) 、7.7I(2H、d、J=8.8Hz)、 7.75 ( 1 H ' br.t ) 、7.85(lH、d) 、8.08(lH、d)、 8.13 (lH、d) 、8.56(lH、s) LC/MS: 92 1.4 (M+H+) 〔實施例1 一 5〕 MTX — α - PhePhe - NH - C6H1202 - NH2 (化合物 5)的 製造 與實施例1- 2相同方法下，取代N-第三丁氧基羰 基一4，7，10 —三喟一1，13 -十三烷二胺使用 N -第三 丁氧基羰基—3，6 -二哼-1，8 -辛二胺得到1 4 8 m g的 黃色粉末標題化合物。 'H-NMR ( 2 7 0MHz ' DMSO- d6) ： δ 1.81—1.91 ( 2Η 、m) 、2·20— 2.25 (2H、m) 、2.61—2.64 (2H、t)、

2.70-2.97 (6H、m) 、3_22(3H、s) 、3.27-3.47 ( 8H 、m) 、3.55(3H、s) 、4.27— 4.47 ( 3H、m) 、4.79( -39 - ⑧ (36)1359665 、br.s ) 、6.82 ( 2H ' d ' J = 8.7Hz )

m ) ' 7.46 ( ] H ' br.s ) 、7.67 ( 1H 、d、J = 8.6Hz ) 、7.85 ( 1H、d )、 8_07 ( 1 H、d ) 、8.15 ( 1 H ' d )、 LC/ MS : 8 93.6 ( M + H+ ) 〔實施例1 - 6〕

MTX— a-PhePhe-NH-C4H80 — NH2(化合物 6)的製 造 與實施例1— 2相同方法下，取代N-第三丁氧基羰 基一4，7，10—三卩1，13 -十三烷二胺使用 N —第三 丁氧基羰基-3 —噚—1，5 —戊二胺得到52 mg的黃色粉 末標題化合物。 'H-NMR ( 2 70MHz > DMSO- d6) : δ 1.84 - 1 .92 ( 2Η 、m) 、2.20-2.27 (2H、m) 、2.60-2.64 (2H、t)、

2H、s) ' 6.62 ( 2H 、7.06 - 7_25 ( ] OH、 ' br. s ) ' 7.71 ( 2H 7.92 ( 1H' br.t)、 8 · 5 6 ( 1 H、s )

2.7 1-2.96 ( 6H ' m ) 、3.22(3H、s) ' 3.25 - 3.45 ( 4H ' m ) 、3.54(3H、s) 、4.27-4.50(3H、m) 、4.79( 2H、s) 、6.61 (2H、br.s) 、6.81(2H、d、J=8.4Hz) ' 7.05-7.21 ( 10H' m) 、7.45 (1H、br.s) > 7.65 ( 1 H ' br.s ) 、7.70(2H、d、J=8.6Hz) 、7.8 4( lH、d)、 7.9 1 ( 1 H ' br.t ) 、8_07(lH、d) 、8.I5(lH、d)、 8 . 5 5 ( 1 H、s )

D LC/ MS: 849.4 (M+H+) -40 - (37)1359665 〔實施例1 - 7〕 MTX — a— PhePhe— NH— C5H1()— NH2(化合物 7)的製 造 與實施例〗一1相同方法下，取代N -第三丁氧基羰 基一1，2 —伸乙二胺使用N -第三丁氧基羰基一1，5 —戊 二胺得到1 4 8 m g的黃色粉末標題化合物。

'H-NMR ( 2 7 0MHz ' DMSO- d6) ： <5 1.61- 1.56 ( 6H

、m) 、1.81-l_97(2H、m) 、2.21-2.29(2H、m)、 2.69-3.06 (6H、m) 、3,23(3H、s) 、3,55(3H、s) ' 4.2 5 - 4.50 ( 3 H ' m ) 、4.80(2H、s) 、6_65(2H、 br.s) 、6.82 ( 2H、d、J=8.6Hz) 、7.08-7.24 ( 10H、m )、7.50 (1H、br.s) 、7.60 - 7.89 ( 5H、m) 、8.]0- 8.16(2H'n〇 、8.55( lH、s) LC/ MS ： 847.4 ( M + H+ )

〔實施例1 — 8〕 MTX- α — PhePhe-Lys-OMe(化合物 8)的製造 與實施例1一 2相同方法下，取代N -第三丁氧基羰 基—4，7，10 —三鸣—1，13 —十三烷二胺使用 Ν— ε -第三丁氧基羰基-L-離胺酸甲酯得到178 mg的黃色粉末 標題化合物。 'H-NMR ( 270MHz > DMSO - d6) : ο 1.2 5 - 1,3 4 ( 4Η 、m ) > 1 . 5 6 - 1 . 6 9 ( 2 Η ' m ) ' 1 _ 7 5 - ] · 9 0 ( 2 Η、m )、 -41 - (38) 1359665 2.18 - 2.25 ( 2H > br.t) ' 2.50 - 2.60 ( 2H ' m) > 2.65-3.07 (4H、m) 、3.22(3H、s) 、3.54(3H、s) ' 3.60 (3H、s) 、4.15-4.60 (4H、m) 、4.79(2H、s)、 6.63 ( 2H、br.s) 、6.8 1 ( 2 H、d、J = 8.7 H z ) 、7.00- 7.25(10H、m) 、7.45( lH、br.s) 、7,62( lH'br.s)

、7.6 9 ( 2H ' d ' J = 8.6Hz ) 、7.80 ( 1H、d ).、8.05 ( 1H 、d) 、8_16(lH、d) 、8_30(lH、d) 、8.56(lH、s) LC/ MS : 905.4 ( M + H+ ) 〔實施例1 — 9〕 MTX— α - PheGly-NH- C1()H2〇03-NH2 (化合物 9)的 製造 取代實施例1 _ 2 ( a )的步驟之N _苯甲酯—L 一苯 基丙胺酸使用N -苯甲酯甘胺酸以外，其他:實施例1 - 2 相同方法下得到5 2 8 mg的黃色粉末標題化合物。

'H-NMR ( 270MHz > DMSO- d6) : (5 1.51- 1.64 ( 4H

、m) ' 1 .84 - 1 .94 ( 2H ' m ) 、2.21-2.3 0(2H、m)、 2.55 (2H，t、J=6_3Hz) ' 2.78-2.92 (lH'm) ' 3.03 -3.76(17H、m) 、3.22(3H、s) 、3.55(3H、s)、 4.26— 4.52(2H'm) 、4.79(2H、s) ' 6.63 ( 2H ' br.s )、6.82 ( 2H'd、J=8.7Hz) 、7.11— 7.24( 5H、m)、 7.47 ( 1H、br.s) 、7.62 - 7.72 ( 4H'm) ' 8.04 - 8.16 ( 2H、m) ' 8.28 ( 1 H ' br.t ) 、8.56( lH、s) LC/MS : 875.5 ( M + H+ ) -42 - (39)1359665 〔實施例1 - 1 〇〕 MTX— a - PheGly — NH — C1()H2()02-NH2(化合物 10)的 製造 與實施例1 一 9相同方法下，取代N -第三丁氧基羰 基一4，7，10 -三卩f—l，13 -十三烷二胺使用 N —第三 丁氧基羰基—4，9 -二nf — 1，12 —十二烷二胺得到300 mg的黃色粉末標題化合物。

1 H-NMR ( 400MHz、DMSO - d6 ) ： (5 1.47 - 1.50 ( 4H 、m) ' 1.54 - 1.60 ( 4H' m) 、：1.82-1.95 (2H、m)、 2.25-2.28 ( 2H、m) 、2.58(2H，t、J=6.6Hz) ' 2.82 -2.87( lH、m) 、3.02-3.07(3H、m) 、3.22(3H、s )、3_25— 3.41( 8H、m) 、3.55(3H、s) 、3.55-3.63 (2H ' m ) 、4.28— 4.47(2H、m) 、4.79(2 H、s)、

6.60 ( 2H ' br.s ) 、6.81 (2H、d、J=8.8Hz) ' 7.09-7.1 8 ( 5H ' m ) ' 7.45 ( 1 H ' br.s) 、7_59( lH、br.t)、 7.66 ( 1 H ' br.s ) 、7.70(2H、d、J=8.8Hz) ' 8.02( 1 H 、d) 、8.08( lH、d) 、8_26(lH、br.t) ' 8.56( IH、s ) LC/ MS ： 859.3 ( M + H + ) 〔實施例1 - ] 1〕 MTX— α — PheGly-NH — C8H1602 — NH2(化合物 II)的 製造 -43- ⑧ (40)1359665 與實施例1- 9相同方法下，取代N—第三丁氧基羰 基_4，7，10 —三鸣一1，13 —十三烷二胺使用 N-第三 丁氧基羰基—4，7 -二噚-1，10 -癸二胺得到3 00 mg的 黃色粉末標題化合物。

1H-NMR ( 400MHz、 DMSO - d6 ) : ¢5 1.5 3 - 1.62 ( 4H 、m) 、1.82-1.92 (2H'm) 、2·20— 2.27 (2H、m)、 2.50 - 2.60 ( 2Η，t) ' 2.81- 2.86 (1H' m) ' 2.97 -3.08( 3H、m) 、3.22(3H、s) 、3.25-3.47 ( 8H、m)

、3.55(3H、s) 、3.55-3.73 (2H、m) 、4.24 - 4.47 (

2 H ' m ) 、4.79(2H、s) 、6.60(2H、br.s) 、6.81(2H 、d) 、7.12— 7.21( 5H、m) 、7.45(lH、br.s) ' 7.60 (1 H ' br.t ) 、7.63(lH、br.s) 、7_69(2H、d) ' 8.03 (1 H ' d ) 、8.10( ]H、d ) 、8.28 ( 1H、br.t ) 、8.56 ( 1 H、s ) LC/ MS : 83 1 .3 ( M + H+ )

〔實施例〗—1 2〕 ΜΤΧ-α — PheGly-NH-C6H1202 — NH2(化合物 12)的 製造 與實施例1- 9相同方法下，取代N —第三丁氧基羰 基一4，7，10 —三鳄一1，13 —十三烷二胺使用N —第三 丁氧基羰基—3，6 —二哼—1，8 —辛二胺得到181 mg的 黃色粉末標題化合物。

'H-NMR ( 270MHz ' DMSO - d6) ： <5 1.83 - 1.92 ( 2H -44 - ⑧ (41)1359665 、m) ' 2.21-2.27 (2H' m) 、2·60— 2.65 ( 2H、i 2.75 - 3.10( 2H，m) 、3.22(3H、s) ' 3.23-3 10H、m) 、3.55(3H、s) 、3.55-3.75 (2H、m)、 -4.52 ( 2H ' m ) 、4.79(2H、s) 、6.61(2H'br.i 6.82 ( 2H ' d ' J - 8.6Hz ) 、7.10 — 7.20( 5H、m)、 (lH、br.s) 、7.63-7.72 ( 4H、m) 、8.00( lH、c 8_10(lH、d) ' 8.27 ( 1 H > br.t ) 、8.56(IH、s) LC/MS: 803.4 (M+H+) .46 ( 4.25 )、 7.45

〔實施例1 — 1 3〕 MTX- α - PheGly - NH - C4H802 — NH2 (化合物 13 製造 與實施例I_9相同方法下，取代N —第三丁氧 基_4，7，10—三卩f—l，13 -十三烷二胺使用 N — 丁氧基羰基-3 —哼-1，5 —戊二胺得到3 1 8 mg的黃 末標題化合物。 'H-NMR ( 270MHz ' DMSO - d6) : δ 1 .8 2 - 1.95 、m) 、2.22-2.27 ( 2H、m) 、2.59-2.64 ( 2H、t 2.73— 3.15 (2H，m) 、3.23(3H、s) ' 3.25-3.38 、m) 、3.55(3H、s) ' 3.46— 3.77 (2H、m) '4· 4.5 1 ( 2H ' m ) 、4·79 ( 2H、s) 、6.62 ( 2H、br.s 6.82(2H、d、J=8.6Hz) 、7.10 — 7.17( 5H、m)、 (1 H ' br.s ) 、7.63-7.75 (4H、m) 、8.02(lH、d 8.11 (lH、d) 、8.27 (1H、br.t) 、8.56(lH、.s) )的 甘細 基振 第三 色粉 (2H )、 (6H 23 - )、 7.47 -45 - ⑧ (42)1359665 LC/MS： 759.3 (M+H+) 〔實施例1 — 1 4〕 MTX - 〇: —PhePro-NH — C10H20〇3—NH2 (化合物 14)的 製造 取代實施例1— 2(a)的步驟之N —苯甲酯一L -苯 基丙胺酸使用N -苯甲酯-L -脯胺酸以外，其他實施例 1 — 2相同方法下得到3 82 mg的黃色粉末標題化合物。

'H-NMR ( 2 70MHz ' DMS〇-d6) : δ 1.49- 2.03 ( 1 0H 、m) ' 2.1 9 - 2.30 ( 2H ' m ) 、2.55(2H、t'J=6.6Hz )> 2.62 - 3.69 ( 21H> m) 、3.55(3H、s) 、4.28-4.38 (lH、m) ' 4.63-4.75 ( 1H' m) 、4.79(2H、s).、 6.60 ( 2H ' br.s ) 、6.82 ( 2H、d、J=8.6Hz) ' 7.14-7.29 (5H、m) 、7.47 (1H、br.s) 、7.66-7.72 (4H'm )' 7.94 - 8.10 (2H' m) 、8.56( lH、s) LC/ MS:915_3(M+H+)

〔實施例1 — 1 5〕 MTX — α - Phe冷 AU - NH - C10H2〇〇3 - NH2 (化合物 15) 的製造 取代實施例1 一 2(a)的步驟之N—苯甲酯—L 一苯 基丙胺酸使用N —苯甲酯-丙胺酸以外，其他實施例 1 _ 2相同方法下得到1 80 mg的黃色粉末標題化合物。 'H-NMR ( 270MHz ' DMSO - d6) ： <5 1 . 5 2 - 1 . 6 2 ( 4 Η (43)1359665

' m) ' 1.78- 1.95 (2H' m) ' 2.16-2.22 ( 2.56 ( 2H ' t ' J=7.3Hz) 、2.71-3.48 (21H、 (3H、s) ' 4.1 0 ( 2H ' br.s ) 、4.21-4.30( 4.38-4.49 ( lH、m) 、4.80(2H、s) ' 6.59 )、6.83(2H、d、J=8.6Hz) 、7.10-7.21( 7.43 ( 1 H ' br.s ) 、7.65-7.74 ( 3H、m) 、7. 2H、m) > 7.96 ( 1H ' br.t ) 、8.08(lH、d、 、8.56 ( 1 H ' s ) LC/ MS ： 8 8 9.5 ( M + H+ ) 〔實施例1 — 1 6〕 MTX- α - Phe；S Ala - NH - C2H4 — NH2 (化合 製造 取代實施例I— 1(a)的步驟之N —苯甲 基丙胺酸使用N—苯甲酯一 0 -丙胺酸以外，； 1 _]相同方法下得到1 94 m g的黃色粉末標題化 'H-NMR ( 2 7 0MHz ' DMSO- d6) ： δ 1.80- 、m) 、2.18-2.26 (4H、m) 、2_54(2H、t )' 2.74 - 3.0 8 ( 6H ' m ) 、3_32(3H、s)、： s ) 、4.24-4.48 ( 2H、m) 、4.80(2H、s) ' br.s ) 、6.83(2H、d、J=8.4Hz) 、7.13( 7.45 ( ] H、br.s ) ' 7.65 — 7.86 ( 5H、m ) 、7 br.t ) 、8.09( IH、d、J=6.8Hz) 、8.56(1H' LC/MS : 729.3 ( M + H+ ) 4 H ' m )、 m) ' 3.55 1 H、m )、 (2H、br.s 5H、m )、 83 - 7.89 ( J = 6.8Hz ) 物 1 6 )的 醋一 L —苯 其他實施例 :合物。 -1 .94 ( 2H 、J = 6.1Hz 5.55 ( 3H > 、6.59 ( 2H 5H ' s)、 ‘96 ( 1 Η ' s ) -47- (44)1359665 〔實施例1 -〗7〕 ΜΤΧ—α — Phe — NH — Ci〇H2〇〇3 — NH2(化合物 17)的製 造 省略實施例1 一 2 ( b )的步驟以外，其他實施例1 - 2 相同方法下得到496 mg的黃色粉末標題化合物。 'H-NMR ( 3 00MHz ' DMSO- d6) ： δ 1.49 - 1.5 9 ( 4Η 、m) 、1.82-1.89 (2H、m) 、2.19—2.27 (2H、m)、

2.55(2H、t、J=7.2Hz) 、2.73-3.10 (4H、m) ' 3.23 (3H、s) 、3.17— 3.48( 12H、m) 、3_55(3H、s)、

4.21-4.28 ( 1H ' m ) 、4.38-4.45 (lH、m) 、4.80(2H 、s) 、6.61(2H、br.s) 、6.83( 2H、d、J=9.3Hz)、 7.11— 7.20 ( 5H、m) 、7.46 ( 1H、br.s) 、7.66 ( 1H、 br.s ) 、7.73 (2H、d、J = 9.0Hz ) 、7.83 ( 1H、t)、 7.92 ( 1 H ' d ' J = 8.4Hz ) 、8.12(lH、d、J=7.5Hz)、 8.56 ( 1 H ' s)

LC/MS： 818.4 (M+H+) 〔實施例1 - ] 8〕 Μ T X 一 a — lie — NH — Ci〇H2〇〇3 — NH2(化合物 18)的製 造 與實施例]—17相同方法下，取代N-苯甲酯—L-苯基丙胺酸使用N-苯甲酯一L一異亮胺酸，得到5 62 mg 的黃色粉末標題化合物。 -48 - ⑧ (45)1359665

H-NMR ( 270MHz ' DMSO- d6) ： 5 0.76- ' m ) ' 0.99 — 1.10 ( 1H、 m ) 、1.36- -1.45 (1 1 · 49 — 1 .73 ( 5H ' m ) ' 1 .8 8 _ 2.07 ( 2H、 m ) 2. 3 8 ( 2H、 m ) 、2. 5 5 (2H、t 、J = 6 . 6Hz ) ' 2 ( 1 4H 、m ) ' 3.2 1 ( 3H、 S ) ' 3.56 (3H、 s ) 4 · 13 ( 1H、 m ) 、4. 40 -4.. 48 ( 1 H、m )、4. .78 ' 6 · 60 (2H \ b r · s ) ' 6.82 (2H 、d、J =8,4Hz ) ]Η、 b r. s ) 、 7 66 - 7. 72 ( 3H、 m )、’ 7.98 ( 1 H 8. 12 ( 1H、 d 1=7. 6Hz ) 、8.5 6 ( 1 H ' s ) LC/MS : 784.4 ( M + H + ) 0.80 ( 6H H、m )、 ' 2.33 -.98 - 3.48 、4.05 -(2H 、 s) 、7.46 ( 、b r · t )、.

〔實施例1 —〗9〕 MTX— α — lie— NH — C2H4 — NH2 (化合物 19) 與實施·例〗—1 8相同方法下，取代N -第三 基—4，7，10 —三噚一1，13-十三烷二胺使用 丁氧基羰基-1，2_伸乙基二胺得到320 mg的 標題化合物。 'H-NMR ( 3 00MHz ' DMSO- d6) ： <5 0.7 6 - 、m) 、0.96 - 1.08 (lH、m) 、1.34 - 1.48 ( 1: 1.62 - 1.70 ( 1H' m) 、1.85-2.03 (2H、m)、 、t、J=7.8Hz) 、2.95— 3.08 ( 2H、m) ' 3.21 、3.56 ( 3H、s) 、4.06-4.12 ( 1H、m) 、4.3: 1H ' m ) 、4.78(2H、s) 、6.61(2H、br.s)、 、d、J = 9.0Hz ) 、7.43 ( 1 H ' br. s ) 、7.64—7. 丁氧基羰 N -第三 黃色粉未 0.80 ( 6H Η ' m ) ' 2.36 ( 2H (3H ' s ) 3 - 4.45 ( 6.83 ( 2H 72 ( 4H、 ⑧ -49 - (46)1359665 m ) 、7.92( lH、t、J=5.7Hz) 、8_12(lH、d、J = 7.5Hz ) 、8.57 ( 1 H、s ) LC/ MS ： 624.2 ( M + H+ ) 〔實施例1 - 2 0〕 MTX - a - Glu ( OMe ) — NH—CioHwCh — NH2 (化合物 20 )的製造

與實施例1-17相同方法下，取代N -苯甲醋- L — 苯基丙胺酸使用N-苯甲酯-L -谷胺酸—r —甲醋，得 到600 mg的黃色粉末標題化合物。

'H-NMR ( 270MHz ' DMSO - d6) : δ 1.50 - 2.03 ( 8H 、m) 、2.24-2.31 (2H、t) 、2.34-2.40 ( 2H、t) 2.49 - 2.5 7 ( 2H ' t ) 、2.97 - 3.52 ( 14 H、m) 、3.21( 3 H ' s ) 、3.53(3H、s) 、3.55(3H、s)、4.15— 4.36(

2H ' m ) 、4_78(2H、s) 、6.61(2H、br.s) 、6.81(2H ' d ' J = 8.7 H z ) 、7.46 ( 1H、br.s) 、7.6 7( 1H、br.s)

、7.72 ( 2H ' d ' J = 8.6Hz ) 、7.84 ( 1H、br.t ) ' 7.95 ( lH、d) ' 8 .1 4 ( 1 H ' d ) > 8.5 5 ( 1 H ' s ) LC/ MS : 8 1 4.4 ( M + H+ ) 〔實施例1 — 2 1〕 MTX - a - Glu ( OMe ) - NH — C2H4 — NH2 (化合物 2 ]) 的製造 S) 與實施例1 一 20相同方法下，取代N -第三丁氧基羰 -50 - (47)1359665 基一 4，7，10-三卩f— 1，13 —十三烷二胺使 丁氧基羰基-1，2_伸乙基二胺得到2 83 mg 標題化合物。 1 H-NMR (2 70MHz、 DMSO - d6 ) ：δ 1 . 7 1 ' m ) ' 2, 28 ( 2H、t 、J = 7.6 H z ) 、2.39 ( 7 _6Hz )、 2.53 ( 2H ' 1 t、J = 6. 1 Hz ) 、2.99 m) ' 3.21 (3H、s )、 3.54 ( 3H ' s )' 3.5 6 4.14-4.36 (2H、m ) 、4.79 ( 2H ' s ) 、6 • 6

用N—第三 的黃色粉末 -2.09 ( 4H 2H、t、J = 3.05 ( 2H ' (3H、s )、 1 ( 2H ' br.s )r _ s ) 、7 · 6 5 、8.14 ( 1H 0 22 )的製 ε甲醋 — L — !j 1 3 3g 的 -1.62 ( 4H 2H > m )、 )'2.95— )' 6.82 ( 2H ' d ' J = 8.6Hz ) ' 7.43 ( 1 Η ' —7.79 ( 4Η、m) 、7.95 ( 1H、d、J=7.8Hz) 、d、J = 6.9Hz ) 、8.56 ( 1H ' s ) LC/MS: 654.1 (M+H+) 〔實施例1 _ 22〕 Μ T X — ol — Try — ΝΗ — C]〇H2〇〇3 - NH2 (化合导 造 與實施例1 — 1 7相同方法下，取代N - 3 苯基丙胺酸使用N—苯甲酯一 L —酪胺酸，得5 黃色粉末標題化合物。 'H-NMR ( 270MHz ' DMSO - d6) ： δ 1.5 1 、m) 、1.85-1.95 (2Η、m) 、2.23— 2.31 ( 2.51- 2.58 ( 2H、t ) 、2.63 - 2.91 ( 2H ' m 3 . 1 6 ( 2H ' m ) 、3.22(3H、s) 、3.27-3.54 ( 12H、m) (48)1359665 )、6.57(2H、d、J=8.IHz) 、6.6I(2H、br.s) 、6.82 (2H、d、J=8_7Hz) 、6.92(2H、d、J=8_lHz) ' 7.47 (1 H ' br.s ) ' 7.67— 7.88 (5H、m) 、8.13(lH、d)、 8.55 ( 1H、s) LC/ MS : 8 34.4 ( M + H+ ) 〔實施例1 — 2 3〕 MTX-a-Try-NH-C10H2〇03— NH2(化合物 23)的製

造 與實施例】-1 7相同方法下，取代N —苯甲.酯一 L -苯基丙:胺酸使用N —苯甲酯—L —色胺酸，得到17〗m g的 黃色粉末標題化合物。

1H-NMR ( 270MHz ' DMSO — d6 ) ： (51.50-1.61 ( 4H 、m) ' 1 . 84 - 1 .97 ( 2H ' m ) 、2.23-2.3 2(2H、m)、

2.50— 2.56(2H、t) 、2.92—3.15 (4H、m) 、.3·22 (3H

、s) 、3.29—3.45 ( 12H、m) 、3.55(3H、s) ' 4.29 - 4.49 ( 2H ' m) 、4.78 (2H、s ) 、6.64 (2H、br.s)、 6.80 (2H、d) ' 6.92 ( 1 H ' t ) 、7_04(lH、t) 、7.10( lH's) ' 7.26 ( 1 H ' d ) ' 7.44 ( 1 H > br.s ) ' 7.5 1 ( 1 H 、d) 、7.65 (IH、br.s) 、7_69(2H、d) 、7.82(1H、 br.t) 、7.93(lH、d) 、8.10(lH、d) 、8.55(lH、s) 、10.80 ( 1 H ' s ) LC/MS ： 857.5 ( M + H + ) ⑧ -52- (49) 1359665 〔實施例]—24〕 MTX - a - Ser — NH — CioHwCh - NH2 (化合物 24)的製 造 與實施例1— 17相同方法下，取代N —苯甲酯—L — 苯基丙胺酸使用N _苯甲酯_ L -絲胺酸，得到4 1 6 mg的 黃色粉末標題化合物。 'H-NMR ( 3 00MHz ' DMSO- d6) ： δ 1.50- 1.63 ( 4Η 、m) 、1‘90-2.08 ( 4H、m) 、2.39(2H、t、J=7.8Hz

)、2.55(2H、t、J=6.6Hz) 、3.05—3.48 ( 16H、m) 、3.2 1 ( 3H、s ) 、3_56 (3H、s ) 、4.13-4.20 ( IH、m )' 4.33-4.41 ( 1 H ' m ) 、4_78(2H、s) 、6.61(2H、 br.s ) 、6.82(2H、d、J=9.0Hz) 、7.44(lH、br.s)、 7.66-7.80 (5H、m) 、8.19(lH、d、J=6.9Hz) ' 8.56 (1 H、s ) LC/MS: 758.4 ( M+H+) 〔實施例1 — 2 5〕 ΜΤΧ-α— Leu-NH — <：1()}12。03-\}^2(化合物 25)的製 造 與實施例1— 17相同方法下，取代N_苯甲酯一L — 苯基丙胺酸使用N —苯甲酯-L-亮胺酸，得到283 mg的 黃色粉末標題化合物。

'H-NMR ( 270MHz ' DMSO - d6) : ο 0.80 - 0.87 ( 6H 、d) ' 1 . 4 3 - 1.64 ( 7 Η ' m ) 、：1.90-2.06 (2H、m)、 -53- ⑧ (50)1359665 2.3 4 - 2.3 0 ( 2 H ' t ) 、2.53-2.58 (2H、t) ' 3.04-3.08 (2H、m) 、3.21(3H、s) 、3.33-3.47 ( 12H、m)、 3.56 (3H、s) 、4.19— 4.37( 2H、m) 、4.78(2H、s) 、6.62(2H、br.s) 、6.82(2H、d、J=8.7Hz) 、7.45( lH、br.s) 、7.64-7.85 ( 5H、m) 、8.10(lH、d)、 8.55 ( 1 H、s) LC/MS : 784.4 ( M+H+ )

〔實施例1 — 2 6〕 MTX — α — Val— NH — C1()H2()03 — NH2(化合物 26)的製 造 與實施例1一17相同方法下，取代N_苯甲酯—L-苯基丙胺酸使用N—苯甲酯—L-纈胺酸，得到5 9 0 mg的 黃色粉末標題化合物。

'H-NMR ( 270MHz ' DM SO - d6) ： <5 0.79 ( 6H、d、J =6.8Hz ) 、1.52 - 1.59 ( 4H、m) 、1.85-2.04 ( 3H、m

)、2.33— 2.35 ( 2H、t) 、2.56-2.58 ( 2H、t) ' 2.93 -3.55 ( 1 4H > m ) 、3.21(3H、s) 、3.56. (3H、s)、 4.03 - 4.08 ( 1H' m) 、4.42-4.47 ( IH、m) 、4.78 (2H 、s ) ' 6.62 ( 2H ' br.s) 、6.82(2H、d、J=8_7Hz)、 7.45 ( 1 H ' br.s ) 、7.61-7.72 (4H、m) 、7.98(1H、 br.t ) 、8.13(lH、d) 、8.56(lH、s) LC/MS ： 770.4 ( M + H+ ) -54- (51)1359665

〔實施例1 - 2 7〕 ΜΤΧ— α - His — NH_C]〇H2〇〇3 — NH2 (化合物 造 與實施例1 — 1 7相同方法下，取代N -萍 苯基丙胺酸使用N —苯甲酯-L —組胺酸，得至I 黃色粉末標題化合物。 ^-NMR ( 3 00MHz ' DMSO- d6) ： <5 1.49 、d) 、1.90-2.04 (2H、m) 、2.39(2H、t )、2.55(2H、t、J=6.9Hz) 、2.83(2H、m

2H、m) 、3.16-3.47 (12H、m) ' 3.23 ( 3H (3H、s) 、4.22( lH、m) 、4.32(lH、m) 、s) 、6.61(2H、br.s) 、6.72(lH's) 、6 、J=8.4Hz) 、7.10 — 7.70( 5H、m) > 7.77 =8.7Hz ) 、8.36(lH、br) 、8.57(lH、s) LC/MS: 808.3 (M+H+) 〔實施例1 — 2 8〕 Μ T X — υ — Pro — ΝΗ — C10H20O3 — ΝΗ2 (化合物 造 與實施例〗一 17相同方法下，取代N-苯 苯基丙胺酸使用N -苯甲酯一 L —脯胺酸，得到 黃色粉末標題化合物。 'H-NMR ( 270MHz ' DMSO - d6) : 5 1.58( =6.5Hz ' J= 12.8Hz) 、 1.69— 2.10( 6H、m.

27 )的製 甲酯一L _ 8 1 m g 的 -1.58 ( 4H ' J = 6.6H z )、3.02 ( s) ' 3.57 、4.80 ( 2H 8 4 ( 2 H、d ，2H 、 d 、 J 28 )的製 甲醋— ιό 8 3 m g 的 4H 、 dd ' J )' 2.44 ( (52)1359665 2H、t、J=7.7Hz) 、2.60(2H、t、J=6.8Hz) ' 2.9 1- 3.75(19H'm) 、3.57(3H、s) ' 4.18-4.25 ( 1 H ' m ) ' 4.61-4.72 ( 1 H > m ) 、4.77(2H、s) 、6.61(2H、 br.s) 、6_80(2H、d'J=8.7Hz) 、7_44(lH、br.s)、 7.69 - 7.80 ( 4H、m) 、8.15(lH、d、J=7.IHz) ' 8.55 (1 H、s ) LC/MS: 768·3 (M+H+)

〔實施例I - 2 9〕 MTX - a -冷 Ala-NH - C】〇H20〇3 — NH2 (化合物 29)的 製造 與實施例1— 17相同方法下，取代N —苯甲酯_L-苯基丙胺酸使用N -苯甲酯—召一丙胺酸·，得到23 0 mg 的黃色粉末標題化合物。

'H-NMR ( 270MHz ' DMSO- d6) ： (5 1.49 - 1.62 ( 4H 、m ) 、1.79 - 2.02 ( 2H ' m ) 、2.21 (2H、t' J = 6.9Hz

)、2.32(2H、t、J=7.3Hz) 、2.56(2H、t、J=6.6Hz )、3.00-3.61 (19H、m) 、3.55(3H、s) 、4.29-4.38 (1 H ' m ) 、4.78(2H、s) 、6.6] (2H、br.s) 、6.81(

2H、d、J=8.6Hz) ' 7.43 ( 1H > br.s ) ' 7.61-7.91 (3H 、m) 、7.72(2H、d、J=8_6Hz) 、8.02(lH、d、J = 7.8Hz ) 、8.55 ( ] H、s ) LC/ MS ： 742.4 ( M + H 4 ) -56 - (53) 1359665 〔實施例1 - 3 Ο〕 Μ Τ X 一 7 — PhePhe — Ν Η — C ] 〇 Η 2 ο 〇 3 — ΝΗ2(化合物 30)的 製造 與 實施 例1 - 2 相 同方 法下， 取代 N - -苯甲 酯-L 一 谷 胺 酸― r - 甲酯使用 N - 苯甲酯 -L — 谷 胺酸 — a — 甲 酯 > 得到 3 12 mg的黃 色 粉末 標題化 合物 o 'H-NMR (2 70MH z ' DMSO-d 6 )： (5 1.49- -1.60 ( 4 Η % m ) ' 1.76-1.98 ( 2H ' m ) ' 2.09 - -2. 20 ( 2H ' m ) 2 . 56 ( 2H、 t、J — 6 • 6Hz ) ' 2.62 —3.1 6( 6H、 m )、 Λ 2 1 ( 3H、 s ) '3.27- 48 ( 12H、 m )、 3 . 59 ( 3H、s ). > 4 . 2 7- 4.53 (3H、m ) 、4 .78 ( 2H ' s ) ' 6.6 1 (2H、 b r. s ) 、6 · 81 ( 2H、d、 J =8 _6Hz )、 7.16 —1 ' .21 ( 1 OH > m ) ' 7.4 8 (1H 、b r . s ) 7.68 -7.74 (3H 、m )' 7.83 (: 1 H > br t ) 、8.0 1 ( 1 H、 d 、J : -7.9Hz )、 8 . 1 0(1 H、d、 J —

7.8Hz ) 、8.36(lH、d、J=6.8Hz) 、8.55(lH、s) LC/MS:965.5(M+H+) 〔實施例1 - 3 1〕 MTX - 7 — PhePhe-NH — 化合物 31)的 製造 與實施例1_5相同方法下，取代N_苯甲酯一 L —谷 胺酸一7 —甲酯使用N—苯甲酯一L -谷胺酸一α —甲酯 ，得到8 0 m g的黃色粉末標題化合物。 'H-NMR ( 270MHz ' DMSO - d6) ： 〇 1.7 5 - 1.9 7 ( 2 Η -57 - (54) 1359665 、m) 、2.08-2.17 (2H、m) ' 2.59-2.62 ( 2H、t)、

2.58-3.05 (6H、m) 、3.22(3H、s) 、3.15-3.52 (8H 、m) ' 3.59 (3H、s) 、4.23-4.52 (3H、m) 、4.78( 2H、s) ' 6.63 ( 2H ' br.s ) 、6.81(2H、d、J=8.7Hz)

' 7.11- 7.21( 1 OH ' m ) 、7.44 (1H、br.s) 、7.65(1H ' br.s ) 、7.70(2H、d) ' 7.94-8.12 (3H、m) '8.35 (1 H ' d ) ' 8.55 ( 1H ' s ) LC/ MS : 8 93,5 ( M + H+ )

〔實施例1 - 32〕 MTX - 7 - PhePhe — NH - c4h8 0 - nh2 (化合物 〇 · j . 2 ) 的 製 與 實施例1 -6 相同方法下 ，取代 N —苯甲 酯. -L — 谷 胺 酸一 r - -甲酯使月 ]N 一 苯甲 醋—L — 谷胺酸- -a 甲 酯 ， 得到 49 mg的 黃色 ，粉末 標題化合物。 1 H-NMR (2 70MH: z、DMSO - -d6 )： δ 1.73- 1 . 9 7 ( 2Η > m ) 、2 . 08 - 2.18 (2H 、m ) 、2.60 - -2.6 5.(： 2H ' t ：) 2. 59 - 3.02 (6H :、m )、3 .21 ( 3H、s ) '3.13 — 3 44 ( 4Η > m ) 、3. 59 ( 3H、 s ) > 4.25 -4.53 ( 3H、m ) 4. ,78 ( 2H、s )' 6.63 (2H 、br · S ) ' 6.8 1 ( 2H、d、J 一 * —< 8.7Hz ) 7.09 -7. 25 ( 1 OH 、m ) ' 7.43 ( 1 Η ' br.s)、 7. 6 6 ( 1 Η 、 br.s )、 7.72 (2H 、d、 J = 8 ‘ ,4Hz)、 7.95-8 • 10 ( 3 Η 、 m ) 、8_36(lH、d) 、8.55(lH、s) LC/MS: 849.5 (M+H+) (55)1359665 〔實施例1 — 3 3〕 MTX— 7 -PhePhe — NH-C1()H2〇03-NH2(化合物 33)的 製造 與實施例1一 9相同方法下，取代N—苯甲酯一L一谷 胺酸一7 —甲酯使用N—苯甲酯一L -谷胺酸一α —甲酯 ，得到6 9 3 m g的黃色粉末標題化合物。 'H-NMR ( 2 70MHz ' DMSO- d6) ： (5 1 . 5 0 - 1 . 6 8 ( 4 Η

> m ) ' 1.80-2.02 ( 2H'm) ' 2.12-2.27 (2H'm) ' 2.55(2H、t、J=6.4Hz) 、2.71— 2.79( lH、m) ' 2.96 -3.14 (3H、m) 、3.22(3H、s) 、3.38-3.74 ( 12H、m )、3.59(3H、s) 、4.28-4.48(2H、m) 、4_79(2H、 s ) 、6.62 ( 2H、br.s ) 、6.8 1 ( 2 H、d、J = 8 · 4 H z )、 7.14—7.28 ( 5H、m ) 、7.47 ( 1H、br.s ) 、7.6 3 - 7.73 ( 4H、m) ' 8. 1 9 ( 1 H ' d ' J = 7.6 Hz ) 、8.29-8.36 ( 2H、

m ) 、8.56(lH、s) LC/ MS ： 8 75.4 ( M + H+ ) 〔實施例1 — 3 4〕 MTX— r — Phe— NH — C1。H2。03-NH2(化合物 34)的製 造 與實施例1 — 1 7相同方法下，取代N _苯甲酯一· L — 谷胺酸一7—甲酯使用N_苯甲酯_L -谷胺酸—α_甲 酷，得到4 8 0 m g的黃色粉末標題化合物。 -59 - ⑧ (56)1359665

'H-NMR ( 300MHz ' DM SO - d6) : 5 1.49- 1.58 ( 4H 、m) ' 1 .79 - 2.00 ( 2H ' m ) 、2.10-2.27 (2H、m)、 2.55(2H、t、J=6.9Hz) '2.69— 2_93(2H、m) ' 2.96 -3.12 (2H、m) 、3_22(3H、s) 、3.26-3.48 ( 12H、m )、3_59(3H、s) ' 4.2 5 - 4.3 3 ( 1 H ' m ) 、4.38-4.46 (lH、m) 、4_79(2H、s) 、6.62(2H、br.s) 、6.81( 2H、d、J=8.7Hz) 、7.10-7.24 ( 5H、m) 、7.44 ( 1H、 br ) 、7_70(lH、br) 、7.72(2H、d、J=8.7Hz) ' 7.95

(lH、t) 、8.10(lH、d、J=8.1Hz) 、8.35(lH'd、J -6.9Hz ) 、8.56(1 H、s) LC/ MS : 8 1 8.4 ( M + H+ ) 〔實施例1 - 35〕 MTX - r -Glu ( OMe) —NH - C1()H2〇03-NH2 (化合物 35 )的製造

與實施例1 _ 2 0相同方法下，取代N —苯甲酯-L 一 谷胺酸一r 一甲酯使用N -苯甲酯一L —谷胺酸一《-甲 酯，得到4 3 8 m g的黃色粉末標題化合物。 'H-NMR ( 2 7 0MHz ' DMSO- d6) ： ό 1 . 5 2 - 2.0 6 ( 8 Η 、m) 、2.22— 2.30 (4H、m) ' 2.53-2.58 ( 2H't) ' 3.03- 3.15 ( 2H ' m ) 、3_22(3H、s) ' 3.2 5 - 3.5 4 ( 12H、m) 、3.56(3H、s) 、3_61(3H、s) 、4.13-4.40 (2H、m) 、4.79(2H、s) 、6.63(2H、br.s) ' 6.8 1 ( 2H > d ' J = 8.6Hz ) 、7.44 ( 1H、br.s) 、7.67:( 1H、br.s -60- (57)1359665 )、7.72 ( 2H、d ' J = 8,4Hz ) 、7.90 ( 1H、br.t.) 、7.99 (lH、d) 、8.37( ]H、d) 、8.56( lH、s) LC/MS: 814.5 (M+H+) 〔實施例1 - 3 6〕 MTX - a - D - Phe - D — Phe - NH - C10H20O3 - NH2 (化 合物3 6 )的製造

與實施例1 一 2相词方法下，取代N —苯甲酯—L -苯 基丙胺酸使用N -苯甲酯—D —苯基丙胺酸，得到3 Π mg 的黃色粉末標題化合物。

】H-NMR ( 270MHz、DMSO — d6 ) ： δ 1.40 - 1.5 9 ( 4H

、m) 、1.74-1.83 (2H、m) 、2.04-2.1 1(2H、m)、 2.56-2.58 (2H、t) 、2.59—3.12 (6H、m) 、3.21(3H 、s) 、3.17—3.51 (]2H、m) 、3.55(3H、s) ' 4.24- 4.44 ( 3 H ' m ) 、4.78(2H、s) 、6.62( 2H、br_s)、

6.8 1 ( 2H、d、J = 8.6Hz ) 、7.10 - 7.26 ( 10H ' m)、 7.45 (2H、m) 、7.64(lH、br.s) 、7.72(2H、d、J = 8.4Hz ) ' 8.1 8 ( 2H ' m ) 、8.43(lH、d) 、8.55(]H、s ) LC/MS ： 965.6 ( M+H+ ) 〔實施例1 - 3 7〕 MTX - γ - D - Phe - D — Phe - NH - CI0H20O3 - NH2 (化 合物3 7 )的製造 -61 - ⑧ (58)1359665 與實施例1_30相同方法下，取代N—苯甲酯一 L-苯基丙胺酸使用N -苯甲酯-D-苯基丙胺酸，得到85 mg的黃色粉末標題化合物。

'H-NMR ( 2 70MHz ' DMSO- d6) ： δ 1.51- 1.61 ( 4H 、m) 、1.74-2.02 (2H、m) 、2.11-2.16(2H、m)、

2.54 - 2.59 ( 2H、t) 、2.62— 3.12( 6H、m) > 3.22 ( 3H 、s) 、3.25-3.53 ( 12H、m) 、3.60(3H、s) ' 4.3 1- 4.46 ( 3 H > m ) 、4.79(2H、s) 、6.6l(2H、br.s)、

6.81 ( 2H、d、J = 8_6Ήζ) 、7.08- 7.26 ( 10H、m)、 7.44 ( 1 H ' br. s ) 、7.66-7.77 ( 4H、m) 、8.06(2H、m )、8.36(lH、d) ' 8.56 ( 1 H ' s ) L C / M S : 9 6 5 _ 6 ( M + H + ) 〔實施例1 — 3 8〕

MTX - a - AsnPhePhe - NH - (：1(^2。03- NH2 (化合物 38 )的製造 與實施例1 - 2相同下，依據一般的肽合成法延伸肽 鏈，得到]45 mg的黃色粉末標題化合物。

1 H-NMR ( 2 70MHz、DMS Ο - d6 ) ： δ 1.5 2 - 1.5 9 ( 4H 、m) ' 1 .87 - 2.02 ( 2H ' m ) 、2.32 - 3.48 ( 24H、m).

' 3.22 ( 3H ' s ) ' 3 .5 5 ( 3 H ' s ) 、4.24-4.56 (4H、m )' 4.79 ( 2H ' s ) ' 6.60 ( 2H ' br.s ) 、6.81(2H、d、J =8.6Hz ) 、7.04-7.75 ( 17H、m ) 、8.07-8.26 (4H、m )' 8.56( lH's) -62 - (59)Ϊ359665 LC/MS :. 1079.5 ( M + H+ ) 〔實施例I - 3 9〕 ^TX — cl / y — GlyPheLeuGly - NH - C10H20O3 — NH2 (化 合物3 9 )的製造

與實施例1 - 2相同下，依據一般的肽合成法延伸肽 鏈，得到723 mg的黃色粉末標題化合物。藉由LC/ MS 解析，確認以純化步驟產生異構化成爲α / τ的混合物（ a : 7 = 3 : 1 )(化合物 3 9 )。 LC/MS : 1045.7 ( Μ + Η+ ) 〔實施例2 —]〕 ΜΤΧ- a -PhePhe— NHC2H4NH-HA 的製造

於透明質酸鈉鹽（5 0 0 rag，分子量：約230萬）中加 入四氫呋喃（THF) (10 mL)之懸浮液中，添加溶解於 超純水與THF之等量混合液（20 mL)之3 —羥基-3’ 4 —二氫一4-氧代一1，2，3 -苯并三嗪（HOCTBt )( 0-125 mmol)及實施例1一1所得之化合物（0.031 )之溶液後，添加溶解於超純水與T H F的等量混合液（ 10 mL)之三〔2— (2 —甲氧基乙氧基）乙基〕胺基（ ⑧ 0.094 mmol)之溶液，於5°C下擾泮。擾梓.30分鐘後 添加溶解於超純水（〗〇 mL)之1 一乙基—3 一（3 —二甲 基胺基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC) (0-125 mm〇l) 之溶液’於5 °C下攪拌2 0小時。該反應液中添加0.0 9 Ν -63- (60)1359665

的氫氧化鈉水溶液（220 mL)，於5°C下攪拌3.5小時。 該溶液中添加1 N的鹽酸（20 mL )進行中和，再添加溶 解於超純水（45 mL)的氯化鈉（9 g)的溶液時滴下乙醇 (6 00 mL )進行乙醇析出，析出物以離心分離進行分離。 析出物溶解於超純水（40 mL )中，得到標題的 HA -MTX結合體水溶液。透明質酸作爲標準物質之膠體過濾 法所得之分子量約爲1 95萬。又，所得之結合體的MTX 結合率由紫外線吸收（259 nm)測定下算出2.1%。

該水溶液中，添加溶解於超純水（160 mL)的氯化鈉 (6 g )水溶液時滴入乙醇（400 mL )進行乙醇析出，析 出物以離心分離進行分離。析出物溶解於超純水（5 0 0 m L )中，添加氯化鈉（1 5 g )時，以0.45 // m的過濾器（司 貼力別克斯HV ·· minipore )過濾後，於無菌狀態下濾液 中滴入乙醇（1 000 mL )進行乙醇析出，過濾取出析出物 後進行真空乾燥。該析出物溶解於磷酸緩衝液.（2 mM磷 酸鈉，1 5 4 m Μ氯化鈉，p Η 7.2 ) ( 40 mL)，得到標題的 Η A — MTX結合體水溶液。透明質酸作爲標準物質之膠體 過濾法所得之分子量約爲1 8 6萬。又，所得之結合體的 Μ T X結合率由紫外線吸收（2 5 9 n m )測定下算出2 · 1 %。 ^-NMR ( 500MHz ' D2〇) ： ό 1 .83 ( m ) 、2 01(br_s )' 2.13 ( m) ' 2.49 ( m ) 、2.68(m) > 2.95 ( m)、 3.35 (br.s) 、3.51 (br.s) ' 3.56( br.s) 、3.71 (br.s) ' 3.82 ( br.s) 、4.16 ( t) ' 4.46 ( br.s ) 、4.54 ( br.d) '4.88(d) 、4.99(d) '6.63(d) 、6.87-7.11 (ni) (61) (61)

1359665 、7.73(d) ' 8.69 ( s ) 〔實施例2 _ 2〕 MTX- a —PhePhe— NHC2H4NH— HA 的製造 與實施例2 - 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽！ mg，分子量：約2 3 0萬）與實施例1 — 1所得之化合 (0.03 1 mmol )進行反應，得到標題的HA — MTX結 之水溶液。與實施例2 - 1相同方法求得分子量約爲 萬，MTX的結合率爲1.9%。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化， 標題的 HA - MTX結合體之無菌水溶液。與實施例 相同方法求得分子量約爲2 1 8萬，MTX的結合率爲1 〇 'H-NMR ( 5 00MHz ' D2〇) : δ 1.84 ( m ) 、2.01( )' 2.13 ( m ) ' 2.49 ( t ) ' 2.68 ( m ) 、2.95(m 3.36 ( br.d ) > 3.5 1 ( br.d ) 、3.56(br.s) ' 3.7 1 ( bi 、3.83 ( br.s) 、 4.16 ( t) 、 4.46 ( br.d) 、 4.55 ( br '4.88(d) 、4.98(d) 、6.63(d) ' 6.87 - 7.13 ( '7.74(d) '8.70(s) 〔實施例2 — 2 /〕 Μ T X - a — P h e P h e - N H C 2 H 4 N H - H A 的製造 與實施例2 - 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（ m g，分子量：約2 3 0萬）.與實施例1 — 1所得之化合 〔500 物1 合體 22 8 得到· 2-1 .9% br.s )、 r. s ) • d ) m ) 500 物】 -65- (62)1359665 (0.03 1 mmol )進行反應，得到標題的HA - MTX結合體 之水溶液。與實施例2- 1相同方法求得分子量.約爲219 萬，MTX的結合率爲2.2%。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化，得到 標題的MTX結合體之無菌水溶液。與實施例 相同方法求得分子量約爲206萬，MTX的結合率爲2 3% *H-NMR ( 500MHz > D2〇 ) ： δ 1.83 ( m ) 、2.01 ( br

)' 2.14 ( m ) ' 2.52 ( m) ' 2.70 ( m) ' 2.96 ( m)、 3.35 ( br.s) 、3.51 ( br.s) 、3.57 ( br.s) 、3.71 ( br.s) 、3.83 ( br.s) 、4.16 ( t) 、4.46 ( br.s) ' 4.55 ( br.s) 、4.87 (d) '4.97(d) 、6.66(d) ' 6.88 - 7.09 ( m) ' 7.72(d) 、8.69 ( s ) 〔實施例2 — 3〕 ΜΤΧ-α— PhePhe— NHC2H4NH— HA 的製造

於透明質酸鈉鹽（500mg，分子量：約230萬）中加 入四氫呋喃（THF ) ( 1 0 mL )之懸浮液中，添加溶解於: 超純水與THF之等量混合液.（20 mL )之3 —羥基—3 .，4 —二氫一 4-氧代—1，2，3-苯并三嗪（HOOBt ) ( 0 · 1 2 5 m m ο 1 )及實施例1 — 1所得之化合物（〇 . 〇 〇 8 m m 〇 ] )之溶液後，添加溶解於超純水與THF的等量混合液（ 10 mL)之三〔2— (2 —甲氧基乙氧基）乙基〕胺基（ 0 .] 1 8 ni m ο I )之溶液，於 5 °C下攪拌。攪拌3 0分鐘後， -66 - ⑧ (63)1359665

添加溶解於超純水（10 mL)之1-乙基—3 -（3-二甲 基胺基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC) (0.125 mmol) 之溶液，於5°C下攪拌20小時。該反應液中添加0.09 N 的氫氧化鈉水溶液（2 2 0 m L )，於5。(：下攪拌3 · 5小時。 該溶液中添加1N的鹽酸（20 mL)進行中和，再添加溶 解於超純水（45 mL)的氯化鈉（9 g)的溶液時滴下乙醇 (6 00 mL )進行乙醇析出’析出物以離心分離進行分離。 析出物溶解於超純水（40 mL )中，得到標題的 HA — ΜTX結合體水溶液。透明質酸作爲標準物質之.膠體過濾 法所得之分子量約爲2 3 2萬。又，所得之結合體的μ Τ X,., 結合率由紫外線吸收（2 5 9 nm )測定下算出〇 . 6 %。 該水溶液以與實施例2 —】相同方法進行純化，得到 標題的Η A - MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2 _ 1 相同方法求得分子量約爲217萬，MTX的結合率爲〇,5%

丨 H-NMR( 500MHz、D20) ： <5 2.0 1 ( b r. s ) 、2_52(n )' 2.69 ( m ) ' 2.95 ( m ) 、3.34(br.d) ' 3.51( br.s) ' 3.57 ( br.s) 、3.71 (br.s) 、3.83 ( br.s) 、4.16 (t) ' 4.46 ( br.s ) 、4.55 ( br.s) ' 6.66 ( d ) '6.87 — 7.10 ( m ) '7.72(d) ' 8.69 ( s ) 〔實施例2 - 4〕 MTX— α — PhePhe — NHC2H4NH — HA 的製造 於透明質酸鈉鹽（5 00 mg，分子量：約2 3 0萬）中加 -67- ⑧ (64) 1359665 入四氫呋喃（THF ) ( 1 0 mL )之懸浮液中，添加溶解於 超純水與THF之等量混合液（20 mL )之3 —羥基_ 3，4 -二氫一 4 —氧代一 1，2，3-苯并三嗪（HOOBt )( 0.125 mmol)及實施例 1— 1所得之化合物（0.015 mmol )之溶液後，添加溶解於超純水與THF的等量混合液（ 10 mL)之三〔2— (2 —甲氧基乙氧基）乙基〕胺基（

0.110 mmol)之溶液，於5它下攪拌。攪拌30分鐘後， 添加溶解於超純水（10 mL)之1-乙基一3 —（3 —二甲 基胺基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC) ( 0.125 mmol ) 之溶液，於5°C下攪拌20小時。該反應液中添加0.09 N 的氫氧化鈉水溶液（220 mL)，於5。〇下攪拌3.5小時。 該溶液中添加1N的鹽酸（20 mL)進行中和，再添加溶 解於超純水（45 mL)的氯化鈉（9 g)的溶液時滴下乙醇 (6 0 0 m L )進行乙醇析出’析出物以離心分離進行分離。 析出物溶解於超純水（40 mL)中，得到標題的ha_ MTX結合體水溶液。透明質酸作爲標準物質之膠體過據 法所得之分子量約爲232萬。又’所得之結合體的MTX 結合率由紫外線吸收（ 259 η ηι)測定下算出1 1%。 ，得到 2-1 1 -1 % 該水ί谷液以與貫施例2 - 1相同方法進行純化 標題的ΗΑ-ΜΤΧ結合體之無菌水溶液。與實施例 相同方法求得分子量約爲2 2 3萬，ΜΤΧ的結合率爲 H-NMR ( 500MHz ^ D20) : , K84 ( m } ^ 2 〇] ( br § ‘ 2.13 ( m )、2.52 ( m )、2.70 ( m )、2.96 ( m )、 (|) (65) 1359665 3.35 ( br.s ) 、3.51 ( br.s) 、3.57( br.s) 、3.71( br-s) ' 3.83 ( br.s ) ' 4.16 ( t ) ' 4.46( br.s ) 、4.55 (br.s) ' 6.66(d) ' 6.88 - 7.09 ( m) 、7.72(d) ' 8.69 ( s ) 〔實施例2 — 5〕 MTX - α — PhePhe - NHC2H4NH — HA 的製造 於透明質酸鈉鹽（500 mg，分子量：約230萬）中加 入四氫呋喃（THF ) ( 1 0 mL )之懸浮液中’添加溶解於

超純水與THF之等量混合液（20 mL)之3-羥基一 3 ’4 —二氮—4 —氧代—1，2，3 —苯并三曉（HOOBt)( 0.125 mmol)及實施例1-1所得之化合物（0.020 mmol )之溶液後，添加溶解於超純水與THF的等量混合液（ 10 mL)之三〔2- (2 -甲氧基乙氧基）乙基〕胺基（ 0.105 mmol)之溶液，於5t下攪拌。攪拌30分鐘後， 添加溶解於超純水（10 mL)之1—乙基一 3— (3 -二甲 基胺基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC ) ( 0.125 mmol )

之溶液’於5°C下攪拌2〇小時。該反應液中添加0.09 N 的氫氧化鈉水溶液（2 2 0 mL )，於5 °C下攪拌3 . 5小時。 該溶液中添加1N的鹽酸（20 mL )進行中和，再添加溶 解於超純水（45 mL)的氯化鈉（9 g)的溶液時滴下乙醇 (600 mL )進行乙醇析出，析出物以離心分離進行分離。 析出物溶解於超純水（4 0 · m L )中，得到標題的Η A — MTX結合體水溶液。透明質酸作爲標準物質之膠體過濾 法所得之分子量約爲2 2 7萬。又，所得之結合體的Μ T X -69- (66) 1359665 結合率由紫外線吸收（2 5 9 n m )測定下算出丨4 %。 該水溶液以與實施例2 _ 1相同方法進行純化，得到 標題的HA — MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2_ 1 相同方法求得分子量約爲209萬，ΜΤχ的結.合率爲13% 〇 ’H-NMR ( 500MHz、D20) : <5 1.84 ( m) 、2.01 ( br.s )、2.13 ( m>、2.49 ( t )、2.68 ( m )、2.95 ( m )、 3.36 (br.s)、3.51 (br.s)、3.56 (br_s)、3.71(br.s) 、3.83 ( br.s) 、4.16 ( t)、4.46 ( br.s)、4_55 ( br.d) 、4.88(d) '4.98(d) 、6.63(d) > 6.87—7.13 (m) 、7.74 ( d ) 、8.70 ( s ) 〔實施例2 — 6〕 MTX - ο： — PhePhe — NHC2H4NH — HA 的製造

於透明質酸鈉鹽（5 00 mg，分子量：約230萬）中加 入四氫呋喃（THF ) ( 1 0 mL )之懸浮液中，添加溶解於 超純水與THF之等量混合液（20 mL)之.3 —經基_3，4 -二氫—4-氧代一 1，2，3 -苯并三嗪（HOOBt)( 0 · 1 2 5 m m ο 1 )及實施例1 —]所得之化合物（〇 · 〇 6 3 mmo 1 )之溶液後，添加溶解於超純水與THF的等量混合液（ 10 mL)之三〔2— (2 —甲氧基乙氧基）乙基〕胺基（ 0.063 mmo】）之溶液，於5°C下攪拌。攪拌30分鐘後， 添加治解於超純水（10 mL)之1 一乙基—3— (3'—二甲 基胺基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC) ( 0.125 mmol) -70- ⑧ (67) 1359665 之溶液’於5°C下攪拌20小時。該反應液中添加0 09 n 的氫氧化鈉水溶液（2 2 0 m L )，於5 °C下攪拌3 · 5小時。 該溶液中添加1N的鹽酸（20 mL)進行中和，再添加溶 解於超純水（45 mL)的氯化鈉（9g)的溶液時滴下乙醇 (6 0 0 m L )進行乙醇析出，析出物以離心分離進行分離。 析出物溶解於超純水（40 mL)中，得到標題的HA — MTX結合體水溶液。透明質酸作爲標準物質之膠體過濾 法所得之分子量約爲205萬。又，所得之結合體的ΜTX 結合率由紫外線吸收（2 5 9 n m )測定下算出3.9 % 1 該水溶液以與實施例2- 1相同方法進行純化，得到 標題的H A - MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2 - 1 相同方法求得分子量約爲191萬，MTX的結合率爲3.8% 'H-NMR ( 500MHz ' D20) ： <5 1 · 8 4 ( m ) 、2.0 2 ( b r. s )' 2.15 ( m ) ' 2.53 ( t ) 、2.70(m) ' 2.96 ( m )、 3.35 (br.s) ' 3.51 (br.s) 、3.57 ( br.s) 、3.71 (br.s)

、3.83 ( br.s) 、4.16 ( t ) 、4.46 ( br.s) 、4.55 (br.s) 、4.89(s) 、4.96(d) 、6.66(d) 、6.87-7.10 (m) '7.72(d) ' 8.68 ( s ) 〔實施例2 — 7〕 MTX- α — PhePhe— NHC2H4NH— HA 的製造 於透明質酸鈉鹽（500 mg’分子量：約230萬）中加 入四氫呋喃（THF ) ( 1 0 mL )之懸浮液中，添加溶解於

(D -71 - (68) 1359665

超純水與THF之等量混合液（20 mL)之3—羥基一 3，4 —二氫_4_氧代一1，2，3 —苯并三嗪（HOOBt)( 0_125mmol)及實施例1-1所得之化合物（〇.125 mmol )之溶液後，添加超純水與THF的等量混合液（10 mL) ，於5 °C下攪拌。攪拌3 0分鐘後，添加溶解於超純水（ 10 mL)之1 一乙基一3— (3 —二甲基胺基丙基）碳化二 亞胺鹽酸鹽（EDC) (0.125 mmol)之溶液，於下攪 拌2 0小時。該反應液中添加0 . 〇 9 N的氫氧化鈉水溶液（ 220 mL)，於5°C下攪拌3.5小時。該溶液中添加IN的 鹽酸（20 mL)進行中和，再添加溶解於超純水（45 mL )的氯化鈉（9g )的溶液時滴下乙醇（600 mL )進行乙醇 析出，析出物以離心分離進行分離。析出物溶解於超純水 (40 mL )中，得到標題的HA — MTX結合體水溶液。透 明質酸作爲標準物質之膠體過濾法所得之分子量約爲197 萬。又，所得之結合體的MTX結合率由紫外線吸收（259 nm)測定下算出4.5%。 該水溶液以與實施例2 — 1相同方法進行純化，得到 標題的HA — MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2 - 1 相同方法求得分子量約爲174萬，MTX的結合率爲.4.4% 〇 'H-NMR ( 500MHz ' D2O) : δ 1.83 ( m) ' 1.93 ( m) 、2.02 (br.s) 、 2.14( m) 、2.53(t) 、 2.69 (m)、 2.95 ( m ) 、3.35 ( br.s) 、3.51( br.s) 、3.57( br.s)、 3_7 1 ( br.s) ' 3.83 ( br.s) ' 4_16 ( t) 、.4.46 ( br.s)、 -72- ⑧ (69) 1359665 4.55 ( br.d)、4.87 ( d)、4.95 ( d)、6.67 ( d) ' 6.87 -7.10 ( m) 、7.7 1 ( d) ' 8.68 ( s ) 〔實施例2 ~ 8〕 MTX — α ~?}^?1^->^(：21^4^[只一11八的製造

與實施例2 _ 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（5〇〇 mg，分子量：約230萬）與實施例1— 2所得之化合物2 (0.031 mmol)進行反應’得到標題的ha - MTX結合體 之水溶液。與實施例2 — 1相同方法求得分子量約爲2 j j 萬’ MTX的結合率爲1.6%。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化，得到 標題的HA — MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2 —】 相同方法求得分子量約爲198萬，MTX的結合率爲1.4% 〔實施例2 — 9〕 MTX — a — PhePhe— NHCi〇H2〇〇2NH— HA 的製造 與實施例2-1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（500 m g，分子量：約2 3 0萬）與實施例1 — 3所得之化合物3 (0.031 mmol)進行反應’得到標題的HA— MTX結合體 之水溶液。與實施例2— 1相同方法求得分子量約爲183 萬，MTX的結合率爲1.8%。 該水溶液以與實施例2 _ 1相同方法進行純化，得到 標題的Η A - Μ T X結合體之無菌水溶液。與實施例2 一 1 (70) 1359665 相同方法求得分子量約爲155萬，MTX的結合率爲I7% 〔實施例2 - 1 0〕 MTX — 〇： — Ρ1^Ρ1ΐ6_ΝΗ(：8Η16〇2ΝΉ_ΙίΑ 的製造 與實施例2— 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（5〇〇 m g ’分子量：約2 3 0萬）與實施例1 _ 4所得之化合物4 (〇_〇3 1 mmol)進行反應’得到標題的ha— mtx結合體 之水溶液。與實施例2- 1相同方法求得分子量約爲189 萬，MTX的結合率爲1.6%。 該水溶液以與實施例2 ~ 1相同方法進行純化，得到 標題的HA — MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2— j 相同方法求得分子量約爲162萬，MTX的結合率爲ι.6%

〔實施例2 - 1 1〕 MTX- α — PhePhe-NHC6Hl202NH - HA 的製造 與實施例2 — 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（500 m g ’分子量：約2 3 0萬）與實施例1 — 5所得之化合物5 (0.03 1 mm〇i )進行反應，得到標題的HA — MTX結合體 之水溶液。與實施例2 - 1相同方法求得分子量約爲1 92 萬，MTX的結合率爲19%。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化，得到 標題的HA ~ ΜTX結合體之無菌水溶液。與實施例2-1 S) -74- (71) 1359665 相同方法求得分子量約爲1 62萬，MTX的結合率爲2 . Ο % H-NMR ( 500MHz ' D20) ： <5 1.77 - 1-85 (m) ' 2.02 (br.s ) ' 2.16 - 2.24 ( m) ' 2.5 1 ( m ) ' 2.66 ( m )、 2.92 (m) ' 3.00 ( m ) ' 3.35 ( br.s ) 、3.51 (.br.s)、 3.57 ( br.s) 、3.72 ( br.s) ' 3.83 ( br.s) ' 4.20 ( m )、 4.46 ( br.s) 、4.55 ( br.s) 、6.68 ( d ) 、6.95— 7.18 ( m )、7.76 ( d ) 、8.72 ( s)

〔實施例2 — 1 2〕 MTX— α — PhePhe— NHC4H8ONH-HA 的製造 與實施例2 - 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（500 m g ’分子量：約2 3 0萬）與實施例1 一 6所得之化合物6 (〇_〇31 mm〇1)進行反應，得到標題的HA— MTX結合體 之水溶液。與實施例2 - 1相同方法求得分子量約爲1 72 萬，MTX的結合率爲2.0%。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化，得到 標題的HA — ΜTX結合體之無菌水溶液。與實施例2-1 相同方法求得分子量約爲149萬，ΜΤΧ的結合率爲1 .9% H-NMR ( 50 0MHz ' D2〇 ) : (5 1 .7 7 - 1 .8 4 ( m ) ' 2.01 (br.s) ' 2.20 - 2.28 ( m) ' 2.49 ( m ) ' 2.64 ( m )、 2_93 ( m) 、3.00 ( m) ' 3.35 ( br.s ) 、3.52 ( br.s)、 3.58 ( br.s) 、3.73 ( br.s )、3.83 ( br.s )、4.2 0 ( t ) ⑧ -75- (72) (72)1359665 4.47 ( br.s ) 、4.55 ( br.s ) 、4.92 ( d ) ' 5.06 ( d )、 6.64(d) ' 6.94 - 7.19 ( m) 、7.77(d) 、8.73(s) 〔實施例2 - 1 3〕 MTX — α - PhePhe - NHCsH, 〇NH - HA 的製造 與實施例2 - 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（5(){) mg，分子量：約23〇萬）與實施例1— 7所得之化合物7 (0.031 mmol)進行反應，得到標題的HA— Μ TX結合體 之水溶液。與實施例2 — 1相同方法求得分子量約爲2 j 4 萬，ΜΤΧ的結合率爲1.4%。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化，得至 標題的HA — ΜΤΧ結合體之無菌水溶液。.與實施例2__ 1 相同方法求得分子量約爲196萬，ΜΤΧ的結合率爲1.2% 〔實施例2- 1 4〕 ΜΤΧ — a - PhePhe — Lys — ΗΑ 的製造 與實施例2 - 1相同方法下，使透明質酸鈉.鹽（5 Ο Ο mg，分子量：約230萬）與實施例1 - 8所得之化合物8 (0.03 1 mmol)進行反應，得到標題的HA— MTX結合體 之水溶液。與實施例2 _ 1相同方法求得分子量約爲1 8 9 萬，MTX的結合率爲1.4%。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化，得到 標題的HA — MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2 — 1 · -76- ⑧ (73) (73) 172萬，MTX的結合率爲〗.4% 相同方法求得分子量約馬 〔實施例2 ~ 1 5〕 Μ TX —- —α — PheGly— NHC1()H2〇03NH— HA 的製造

與實施例2— 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（5 00 mg’分子量：約80萬）與實施例1_2所得之化合物2( 0·〇31 mm〇i)進行反應，得到標題的ha— MTX結合體之 水溶液。與實施例2— 1相同方法求得分子量約爲83萬， MTX的結合率爲1.4% » 該水溶液以與實施例2 — 1相同方法進行純化，得到 標題的HA—MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2一1 相同方法求得分子量約爲80萬，MTX的結合率爲1 .4% 〔實施例2 — 1 6〕 MTX— a - PheGly-NHC1()H2〇03NH-HA 的製造 於透明質酸鈉鹽（500 mg，分子量：約80萬）中加 入四氫呋喃（THF ) ( 1 〇 mL )之懸浮液中’添加溶解於 超純水與THF之等量混合液（20 mL )之3 ’键基—3 ’ —二氫一4 -氧代—1，2’ 3 —苯并三卩秦（H00Bt )( 0.125 mmol)及實施例1 一 2所得之化合物2 (〇_009 mnl01 )之溶液後，添加溶解於超純水與THF㈤等里混合液（ 10 mL)之三〔2— (2—甲氧基乙氧基）乙基〕胺（0.11 -77- (74) (74)1359665 m m ο 1 )之溶液，於5 °C下攪拌。攪拌3 0分鐘後，添加溶 解於超純水（10 mL)之1—乙基—3 —（3 —二甲基胺基 丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC) ( 0.125 mmol )之溶液 ，於5°C下攪拌20小時。該反應液中添加0.09 N的氫氧 化鈉水溶液（220 mL)，於5°C下攪拌3.5小時。該溶液 中添加1 N的鹽酸（20 mL)進行中和，再添加溶解於超 純水（45 mL)的氯化鈉（9g)的溶液時滴下乙醇（600 mL )進行乙醇析出，析出物以離心分離進行分離。析出 物溶解於超純水（40 mL )中，得到標題的HA — MTX結 合體水溶液。透明質酸作爲標準物質之膠體過濾法所得之 分子量約爲83萬。又，所得之結合體的MTX結合率由紫 外線吸收（2 59nn〇測定下算出0.5%。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化，得到 標題的HA — MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2 - 1 相同方法求得分子量約爲8 1萬，MTX的結合率爲〇 . 5 % 〔實施例2 _ 1 7〕 MTX — a — PheGly — NHCi〇H2〇03NH— HA 的製造 於透明質酸鈉鹽（500 mg，分子量：約8Ό萬）中加 入四氫呋喃（THF ) ( 1 〇 mL )之懸浮液中，添加溶解於 超純水與THF之等量混合液（20 mL )之3 -羥基一 3，4 一二氫—4 —氧代—I，2，3 —苯并三嗪（HOOBt)( 0 · 1 2 5 m m ο 1 )及實施例1 — 2所得之化合物2 ( 〇 . 1 2 5 m m ο 1 - -78- (75) (75)1359665 )之溶液後，添加超純水與THF的等量混合液（l〇 mL) ’於5 °C下攪拌。攪拌3 0分鐘後，添加溶解於超純水（ 10 mL)之1—乙基一3- (3 —二甲基胺基丙基）碳化二 亞胺鹽酸鹽（EDC) (0.125 mmol)之溶液，於5。(：下攪 拌20小時。該反應液中添加〇.〇9N的氫氧化鈉水溶液（ 220 mL)，於5°C下攪拌3.5小時。該溶液中添加1 N的 鹽酸（20 mL)進行中和，再添加溶解於超純水（45 mL )的氯化鈉（9 g)的溶液時滴下乙醇（600 mL)進行乙 醇析出，析出物以離心分離進行分離。析出物溶解於超純 水（40 mL )中，得到標題的HA - MTX結合體水溶液。 透明質酸作爲標準物質之膠體過濾法所得之分子量約爲 萬。又’所得之結合體的MTX結合率由紫外線吸收（ 259 nm)測定下算出3.4%。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化，得到 標題的HA - MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2 — 1 相同方法求得分子量約爲76萬，MTX的結合率爲3.4% 〔實施例2 - I 8〕 MTX— α — PheGly— NHC1()H2〇03NH— HA 的製造 與實施例2 — 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（5 00 mg，分子量：約23 0萬）與實施例1 — 9所得之化合物9 (0.031 mmol)進行反應，得到標題的HA—MTX結合體 之水溶液。與實施例2 - 1相同方法求得分子量約爲I 99 -79- ③ (76) 1359665 萬，MTX的結合率爲1 .5%。 該水溶液以與實施例2 — 1相同方法進行純化，得到 標題的HA— MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2_】 相同方法求得分子量約爲186萬，MTX的結合率爲14% 'H-NMR ( 500MH ' 1.90 - 1.95 (m) 2.99 - 3.14 ( m)、 )、3.57 ( br.s )、 )' 4.46 ( br.s) ' 、7.13 - 7.20( m)

z、D20) : ό 1.59 ( m) . 1.78 ( m ). 、2.02 ( br.s )、2_13 — 2.23 ( m )、 3.28 ( s) > 3.35 ( br.s) ,3.51( br.s 3-71( br.s ) 、3.83 ( br.s ) 、4.26 ( t 4.54 ( br.s)、4.92 ( s)、6 93 ( d) 、7.66(d) ' 8.69 ( s ) 〔實施例2- 1 9〕 MTX 一 cl 一 PhcG1 y — NHC 10H20O2NH — HA 的製造

與實施例2 - 1相同方法下，使透明質酸鈉·鹽（5 〇 〇 m g，分子量：約2 3 0萬）與實施例1 — 1 〇所得之化合物 10(0.031 mmol)進行反應，得到標題的HA-MTX結合 體之水溶液。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化，得到 標題的HA - MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2 _ 1 相同方法求得分子量約爲144萬，MTX的結合率爲1 8% 'H-NMR ( 500MHz > D2〇) : δ 1.49 ( m ) 、1.60 ( m) ' 1 .7 6 ( m ) 、2.01 (br.s) ' 2.09-2.15 (m) 、2.20 — -80- (77) 1359665 2.28 ( m ) 、2.99-3.09 (m) ' 3.10 - 3.17 (m) 、3.33( br.s) ' 3.51 ( b r. s ) ' 3.57 ( br.s) ' 3.71. (br.s) ' 3.83 (br.s) ' 4.30 ( m ) 、4.46 (br.s) ' 4.55 ( br.d) ' 4.97 (s ) 、6.91(d) ' 7.13 ( m ) 、7.17-7.21 (m) ' 7.67 (d) 、8_73 ( s ) 〔實施例2 — 2 0〕

MTX— α — PheGly-NHC8H1602NH-HA 的製造 與實施例2 _ 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（500 mg，分子量：約23 0萬）與實施例1 - 1 1所得之化合物 1 1 ( 0.03 1 mmol )進行反應，得到標題的HA - MTX結合 體之水溶液。與實施例2 - 1相同方法求得分子量約爲 173萬，MTX的結合率爲1.6%。 該水溶液以與實施例2 _ 1相同方法進行純化，得到 標題的HA — MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2 - 1 相同方法求得分子量約爲150萬，MTX的結合率爲1.6% ’H-NMR ( 500MHz、D20) : 5 1_64 ( m) 、1.78 ( m) ' 2.01 (br.s) ' 2.09—2.17 ( m) ' 2.24 ( m ) 、3.0】（m )' 3.08 ( m ) ' 3.16 ( m ) 、3.34 (br.s) 、3:51 (br.s) 、3.56 ( br.s) 、3.71 ( br.s) 、3.83 ( br.s) 、4.31 ( m ) 、4.46 ( br.s) 、4.54 (br.s) ' 4.97 ( s ) '6.91(d)、 7.11 ( m ) ' 7.14-7.21 (m) 、7.67(d) 、8.72(s) -81 - ⑧ (78) 1359665 〔實施例2 - 2 1〕 MTX- a -PheGly-NHC6H1202NH— HA 的製造 與實施例2—1相同方法下’使透明質酸鈉鹽（500 mg，分子量：約230萬）與實施例1一 12所得之化合物 12(0.031 mmol)進行反應，得到標題的HA—MTX結合 體之水溶液。與實施例2 - 1相同方法求得分子量約爲 150萬，MTX的結合率爲2.3%。

該水溶液以與實施例2 _ 1相同方法進行純化，得到 標題的HA— MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2一 1 相同方法求得分子量約爲139萬’ MTX的結合率爲.2... 3 % 〔實施例2 — 22〕 MTX— a - PheGly-NHC4H8〇NH— HA 的製造 與實施例2 — 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽.（500 m g，分子量：約2 3 0萬）與實施例1 — 1 3所得之化合物 13 (0.031 mmol)進行反應’得到標題的HA-MTX結合 體之水溶液。與實施例2 - 1相同方法求得分子量約爲 156萬，MTX的結合率爲2.0%。 .該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化，得到 標題的Η A - Μ TX結合體之無菌水溶液。與實施例2 一 1 相同方法求得分子量約爲】4 0萬’ Μ Τ X的結合率爲2.2 % ⑧ (79) 1359665 〔實施例2 - 23〕 ΜΤΧ— α — PheGly — NHC10H2〇〇3NH — HA 的製造 與實施例2 - 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（500 mg，分子量：約230萬）與實施例1-14所得之化合物 14 ( 0.03 1 mmol)進行反應，得到標題的HA - MTX結合 體之水溶液。與實施例2-1相同方法求得分子量約爲 166萬’ MTX的結合率爲^ 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化，得到 標題的HA - MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2-1 相同方法求得分子量約爲152萬，MTX的結合率爲1.6% 〔實施例2 — 2 4〕 MTX— α - Phe^ Ala — NHCl0H20O3NH - HA 的製造

與實施例2—1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（500 mg ’分子量：約23〇萬）與實施例1 _ 15所得之化合物 15 (0.0 31 mmol)進行反應，得到標題的ha-MTX結合 體之水溶液。 該水溶液以與實施例2 — 1相同方法進行純化，得到 標題的HA - MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2 — 1 相同方法求得分子量約爲i 5 2萬，MTX的結合率爲1 . 5 % 〔實施例2 - 2 5〕 -83- ⑧ (80) 1359665 MTX— α - PheyS Ala - NHC2H4NH — HA 的製造 與實施例2— 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（5〇〇 mg’分子量：約230萬）與實施例1— 16所得之化合物 16(0.031 mmol)進行反應，得到標題的HA— MTX結合 體之水溶液。與實施例2 - 1相同方法求得分子量約爲 209萬，MTX的結合率爲2.3%。

該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化，得到 標題的H A _ MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2 - 1 相同方法求得分子量約爲198萬，MTX的結合率爲2.3% 〔實施例2 - 26〕 MTX— a -Phe-NHC10H20O3NH— HA 的製造 與實施例2 — 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（.500 mg，分子量：約230萬）與實施例1 — 1 7所得之化合物 17 (0.031 mmol)進行反應，得到標題的HA-MTX結合 體之水溶液。與實施例2 — I相同方法求得分子量約爲' 213萬，MTX的結合率爲1.7%。 該水溶液以與實施例2- 1相同方法進行純化’得到 標題的Η A — MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2-1 相同方法求得分子量約爲179萬，MTX的結合率爲1 .7% •H-NMR ( 500MHz ' D2〇 ) : δ 1.63 ( m ) ' 1 .7 9 ( ηι ) 、2.0 2 ( b r · s ) > 2.20 ( m ) 、2 _ 2 8 ( m ) 、3.0.8 ( m )、 3.10 - 3.20 ( m) 、3.31(s) 、3.35(br.s) ' 3.52 ( br.s

-84- (D (81) 1359665 )、3.56 ( br.s ) 、3.72 ( br.s ) 、3.84 ( br_s) 、4.28 ( t )、4.47 ( br.s ) 、4.54 ( br.s ) 、4.97 ( s ) 、6.94 ( d ) ' 7.06 ( t ) 、7.13(d) 、7.67(d) 、8‘73(s) 〔實施例2 - 2 7〕 MTX— α — Ile_NHCl()H2〇03NH-HA 的製造

與實施例2 - 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（500 mg，分子量：約23 0萬）與實施例1 - 18所得之化合物 18 ( 0.031 mmol)進行反應，得到標題的HA — MTX結合 體之水溶液。與實施例 2-1相同方法求得分子量約爲 192萬，MTX的結合率爲1.7%。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化，得到 標題的HA - MTX結合體之無菌水溶液。與賓施例2 - 1 相同方法求得分子量約爲162萬，MTX的結合率爲1.7% 'H-NMR ( 500MHz > D2〇) ： <5 0.8 4 ( t ) 、0.89(d)、 1.18 ( m ) ' 1.47 ( m ) 、1.78(m) ' 1 .83 - 1 .90 ( m )、 2.02 ( br.s) 、2.36 ( m ) 、3.24 ( s ) 、3.35 ( br.s)、 3.51 ( br.s) 、3.57( br.s) 、3.63 (br.s) 、3.71 (br.s) 、3.83 ( br.s) ' 4.09 ( d ) 、4.45 ( br.s ) 、4.55 ( br.s ) 、4.93(s) 、6.92(d) ' 7.72(d) > 8.68 ( s ) 〔實施例2 — 2 8〕 MTX — α — lie — NHC2H4NH — HA 的製造 -85- ⑧ (500 (82) (500 (82)

1359665 與實施例2 - 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽 mg ’分子量：約23 0萬）與實施例1 ~ ] 9所得之化

19 ( 0.031 mmol)進行反應’得到標題的ha _ MTX 體之水溶液。與實施例2- 1相同方法求得分子量 231萬’ MTX的結合率爲2.1%。. 該水溶液以與實施例2 — 1相同方法進行純化， 標題的HA_ MTX結合體之無菌水溶液。與實施例 相R方法求得分子量約爲202萬，MTX的結合率爲 〔實施例2 _ 2 9〕 Μ T X — α — G1 u - N H C ] 〇 Η 2 〇 Ο 3 N Η — Η A 的製造 與實施例2-1相同方法下，使透明質酸鈉鹽 mg’分子量：約230萬）與實施例丨—20所得之仲 20 ( 0.031 mmol)進行反應，得到標題的HA—MTX 體之水溶液。與實施例2 - 1相同方法求得分子量 201萬，MTX的結合率爲1.5%。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化， 標題的HA — MTX結合體之無菌水溶液。與實施例 相同方法求得分子量約爲1 8 3萬，Μ TX的結合率爲 1H-NMR ( 50 0MHz、D20 ) : <5 1.57 ( m ) ' 1 .77 、2_02 ( br.s) ' 2.25 ( m ) 、 2.37 ( t) 、 3.24 ( 3.25 ( s ) 、3.3 5 ( br.s ) 、3.51 ( br.s ) 、3.56 ( br. ,合物 結合 約爲 得到 2-1 2.1% (5 00 合物 結合 約爲 得到 2-1 1.5% -86- (83) 1359665 3.71 ( b r. s ) 、3.83 ( br.s) 、4.13 ( m ) 、4.22 ( m )、 4.36 ( m ) 、4.46 ( br.s) ' 4.55 ( br.s). > 4.91 ( s)、 6.94(d) 、7.76(d) 、8_66(s) 、8.68 ( s > 注：底線記號部分爲糖醛鎗，由此可推斷其爲α體與 Τ體的混合物。 〔實施例2 - 3 0〕

ΜΤΧ — a - Glu - NHC2H4NH — ΗΑ 的製造 與實施例2 - 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（500 mg，分子量：約230萬）與實施例1—21所得之化合物 2 ] ( 0.03 1 mmol )進行反應，得到標題的HA — MTX結合 體之水溶液。與實施例2-1相同方法求得分子量約爲 226萬，MTX的結合率爲2.1%。 該水溶液以與實施例2 — 1相同方法進行純化，得到 標題的HA— MTX結合體之無菌水溶液。.與實施例2-1 相同方法求得分子量約爲206萬’ MTX的結合率爲2.1% 〔實施例2 — 3 1〕 ΜΤΧ- α — Tyr—NHC,〇H2〇03NH— HA 的製造 與實施例2 - 1相同方法下’使透明質酸鈉鹽5 0 0 nig ’分子量：約230萬）與實施例1 — 22所得之化合物 22 ( 〇.〇3 1 mmol )進行反應，得到標題的HA - MTX結合 體之水溶液。與實施例2 -1相同方法求得分子量約爲 -87- (84) 1359665 190萬，MTX的結合率爲1.6%。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化，得到 標題的HA — MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2 - 1 相同方法求得分子量約爲176萬，MTX的結合率爲1.7% 〇 1 H-NMR ( 500MHz ' D2〇 ) : δ 1.63 ( m ) 、l_77(m)

' 2.02 ( br.s) ' 2.23 — 2.35 ( m) ' 2.95 ( m ) ' 3.03 — 3.21 ( m ) 、3.34 ( br.s) 、3.51 ( br.s) 、3.58 ( br.s)、 3.71 ( br.s) 、3.83 ( br.s) 、4.28 ( m ) 、4.47 (br.d)、 4.54 ( br.s) 、4.92 ( s ) 、6.58 ( d ) 、6.94 ( d ) 、7.66 (d) ' 8.68 ( s ) 〔實施例2 - 3 2〕 MTX — α — Typ — NHC1C)H2〇03NH — HA 的製造 與實施例2 — 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（500 mg，分子量：約23 0萬）與實施例1 一 23所得之化合物 23 ( 0.0 3 1 mmol)進行反應，得到標題的HA— MTX結合 體之水溶液。與實施例2 - 1相同方法求得分子量約爲 187萬，Μ TX的結合率爲1.9%。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化，得到 標題的H A - ΜΤΧ結合體之無菌水溶液。與實施例2 — 1 相同方法求得分子量約爲139萬，MTX的結合率爲1.9% H-NMR ( 500MHz、D20) : (5 1.5 3 ( m ) 、：1.74 ( m) -88- ⑧ (85) 1359665 ' 2.01 ( br. s ) ' 2.09 - 2.15 ( m) ' 2.46 ( m ) ' 2.85 ( m )' 3.05 ( m ) ' 3.35 ( br.s ) ' 3.52 ( br.s) ' 3.58 ( br. s )、3.74 ( br.s) 、3.83 ( br.s) 、4.27 ( m) 、4.48 ( br.d )' 4.55 ( br.s) '6.83(d) 、6.99(s) ' 7.0 5 ( s )、 7.15(d) '7.43(d) 、7.49(s) ' 8.74 ( s ) 〔實施例2— 33〕

Μ T X — α — S e r — N H C ! ο Η 2。〇 3 N Η — H A 的製造 與實施例2 — 1相同方法下’使透明質酸.鈉鹽（500 mg，分子量：約230萬）與實施例1一 24所得之化合物 24 ( 0.03 1 mmol )進行反應，得到標題的HA - MTX結合 體之水溶液。與實施例2 - 1相同方法求得分子量約爲 186萬，MTX的結合率爲1.7%。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化，得到 標題的HA—MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2— 1 相同方法求得分子量約爲165萬，MTX的結合率爲1.7% H-NMR ( 50 0MHz ^ 〇2〇 ) ： (5 1.61 ( m) 、1.76 ( m 3-25 ( s) ^ 3.35 ( br.s) . 3.50 ( br.s) ^ 3.56 ( br.s). 3.58 ( br.s ) ^3.71( br.s ) ^ 3.83 ( br.s ) 、4.28 ( m ) ' 4.39(n〇、4.46(br.s)、4.54(br.s)、4.91(s)、 6.93 ( d )、2^70 ( d , 7.76 ( d ) .、8.66 (.s )、8·68 ( s

-89- (86) 1359665 〔實施例2 _ 3 4〕 MTX — a -Leu~NHCi〇H2〇〇3NH — HA 的製造 與實施例2— 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（500 mg’分子量：約230萬）與實施例I— 25所得之化合物 25 ( 0.031 mmol)進行反應，得到標題的ha - MTX結合 體之水溶液。與實施例2— 1相同方法求得分子量約爲 189萬，MTX的結合率爲1.7%。

該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化，得到 標題的HA — MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2 — 1 相同方法求得分子量約爲1 4 7萬，MTX的結合率爲1.7 % 1H-NMR ( 500MHz ' D2〇 ) : 5 0.84(d) 、0.89 ( d) ' 1.52-- 1.68 (m) 、1.72-1.83 (m) 、2.01 (br.s)、 2.45 ( t ) 、3.34 ( br.s) 、3.50 ( br.s) > 3.57 ( br.s)、 3.72( br.s ) '3.83 (br.s) 、4.28(m) ' 4.45 ( br.d )、 4.54 ( br.s ) > 4.95 ( s ) '6.91(d) 、7.7 2(d) ' 8.69 (s) 〔實施例2 - 3 5〕 MTX- α — Val — NHCi〇H2〇〇3NH— HA 的製造 與實施例2 - 1相同方法下’使透明質酸鈉鹽（500 m g，分子量：約2 3 0萬）與實施例1 — 2 6所得之化合物 26 ( 0·0 3〗mmol )進行反應’得到標題的HA - MTX結合 -90- ⑧ (87) 1359665 體之水溶液。與實施例2 - 1相同方法求得分子量約爲 1 8 7萬，Μ TX的結合率爲1 _ 7 %。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化，得到 標題的ΗΑ— ΜΤΧ結合體之無菌水溶液。與實施例2— 1 相同方法求得分子量約爲156萬，ΜΤΧ的結合率爲1.7% 'H-NMR ( 5 00MHz ' D2〇 ) ： 5 0.93 ( m ) 、1.78 ( m) ' 2.01 ( br.s ) ' 2.11- 2.19 ( m) 、2.47(m) 、3.24(s

)、3.34 ( br.s) 、3.51 ( br.s) 、3.57 ( br.s) 、3.63 ( br.s) ' 3.72 (br.s) 、3.83 (br.s) 、4.02(d) 、4.47( br.d ) 、4.54( br.s) 、4.95(s) 、6.91(d) 、7.72(d) 、8.69 ( s ) 〔實施例2 - 3 6〕 Μ T X _ α - H i s — N H C , 〇 Η 2。Ο 3 N Η — H A 的製造 與實施例 2 — 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（5 00 mg，分子量：約23 0萬）與實施例1 _ 27所得之化合物 27 ( 0.03 1 mmol)進行反應，得到標題的HA—MTX結合 體之水溶液。與實施例2 - 1相同方法求得分子量約爲 191萬，MTX的結合率爲1.2%。 該水溶液以與實施例2 — 1相同方法進行純化，得到 標題的 HA — MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2 — 1 相同方法求得分子量約爲162萬，MTX的結合率爲1.2% ⑧ -91 - (88) 1359665 1H-NMR ( 500MHz ' D2〇 ) : δ 1.70 ( m ) 、1.79(m) ' 2.0 1 ( br.s ) 、2.23-2.36 (m) 、3.13-3.22 (m)、 3.26 ( s ) 、3.34 ( br.s) 、3.50 ( br.s) 、3.56 ( br.s)、 3.61 ( br.s) 、3.71 ( br.s) 、3.83 ( br.s) 、4.33 ( t )、 4.46 ( br.d ) 、 4.54 ( br.s ) 、 4.96 ( s ) 、 6.92 ( d )、 7.30 ( s ) ' 7.73(d) ' 8.57 ( s ) 、8.70(s)

〔實施例2 — 3 7〕 MTX_ a — Pro— NHCi〇H2〇〇3NH— HA 的製造 與實施例2 _ 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（500 mg，分子量：約23 0萬）與實施例1 — 28所得之化合物 2 8 ( 0.0 3 1 mmol )進行反應，得到標題的HA - MTX結合 體之水溶液。與實施例2 - 1相同方法求得分子量約爲 167萬，MTX的結合率爲1.5%。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化’得到 標題的HA — MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2— 1 相同方法求得分子量約爲1 5 2萬’ MTX的結合率爲1 · 6 % 〔實施例2 — 3 8〕 MTX — α — 召 Ala— NHCi0H20O3NH — HA 的製造 與實施例2 _ 1相同方法下’使透明質酸鈉鹽（5〇〇 mg，分子量：約230萬）與實施例1 — 29所得之化合物 2 9 ( 0.03 1 mmol )進行反應，得到標題的HA_ MTX結合 -92 - (89) (89)

1359665 體之水溶液。與實施例2 - 1相同方法 191萬，MTX的結合率爲1.7%。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方控 標題的HA - Μ TX結合體之無菌水溶液 相同方法求得分子量約爲143萬，ΜΤΧ 】H-NMR ( 50 0MHz、D20 ) : δ 1.60 ( 、1.79 ( m) ' 2.01 ( br.s ) 、2.42 ( m〕 3.09 ( t ) 、3. 14 ( t ) 、3.34 ( br.s )、 3.57 ( br.s) ' 3.73 ( br.s) 、3.82 ( br.s 、4.54 ( br.d) 、4.96 ( s) 6.92 ( d: 8.70 ( s ) 〔實施例2 _ 3 9〕 MTX- r - PhePhe- NHC10H20O3NH- HA 與實施例2 - 1相同方法下，使透1 mg’分子量：約230萬）與實施例 1 — 30 ( 0.03 1 mmol)進行反應，得到標題的 體之水溶液。與實施例2 - 1相同方法 209禹’ MTX的結合率爲1.5%。 該水溶液以與實施例2 - I相同方法 標題的Η A - Μ TX結合體之無菌水溶液 相同方法求得分子量約爲188萬，Μτχβ 求得分子量約爲 丨進行純化，得到 。與實施例2 _ 1 拉結合率爲1.7% m ) 、1 .67 ( m ) ' 2.47 ( m)、 3.51 ( br.s)、 )' 4.47 ( br.s ) 1 、 7.73 ( d )、 的製造 3月質酸鈉鹽（500 3〇所得之化合物 I HA— MTX 結合 求得分子量約爲 :進行純化，得到 。與實施例2 — 1 :勺結合率爲].5 % -93- ⑧ (90) (90)1359665 'H-NMR ( 500MHz ' D2〇) : o 1.52 ( m ) 、1.81 ( m) ' 2.02 ( br.s) ' 2.16 — 2.29 ( m) 、2.60(m) ' 2.76 ( m )' 2.99 ( m ) ' 3.07 ( m ) ' 3.18 - 3.26 (m) 、3.32(s )' 3.35 ( br.s) '3.52 (br.s) 、3.56 (br.s) 、3.66( br.s ) ' 3.73 ( br.s ) > 3.84 ( br.s ) 、4.15(t) > 4.27 ( t )、4.3 6(m) ' 4.47( br.s ) 、4.55(br.d) ' 6.86(d) 、6.92-6.99 (m) > 7.02- 7.16 (m) ' 7.79 ( d ) > 8.71 (s) 〔實施例2 - 40〕 MTX- r —PhePhe— NHC6H12〇2NH-HA 的製造 與實施例2 - 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（5 0 0 mg，分子量：約23 0萬）與實施例1 一 3 1所得之化合物 31 ( 0.03 1 mmol )進行反應，得到標題的HA - MTX結合 體之水溶液。與實施例2 - 1相同方法求得分子量約爲 1 89萬，MTX的結合率爲2.0%。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化，得到 標題的H A - MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2 - 1 相同方法求得分子量約爲176萬，MTX的結合率爲2.0% 〇 1 H-NMR ( 5 00MHz、D20 ) ： δ 2.02 ( br.s ) '2.15- 2.24 ( m ) ' 2.60 ( m ) 、2.74-2.83 (m) 、3.12-3.19( m) 、3.20-3.23 (m) 、3.29(s) ' 3.35 ( br.s ) > 3.5 1 (br.s) 、 3.57 ( br.s) 、 3.71 ( br.s) 、 3.83 ( br.s)、 -94 - (91) 1359665 4.2 1 ( t ) 、4.26 ( t ) 、4.32 ( m) 、4.46 ( br.s ) 、4.5 5 (br.d ) 、6.84 ( s) 、6.93 ( d) 、7.00 - 7· 1 3 ( m )、 7.76(d) ' 8.64 ( s ) 〔實施例2 - 4 1〕 MTX- 7 — PhePhe- NHC4H8ONH— HA 的製造

與實施例2 — 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（500 mg，分子量：約230萬）與實施例1 一 32所得之化合物 3 2 ( 0.0 3 1 mmo 1 )進行反應，得到標題的H A - MTX結合 體之水溶液。與實施例2 - 1相同方法求得分子量約爲 1 96萬’ MTX的結合率爲2. 1 %。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化，得到 標題的 HA—MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2— 1 相同方法求得分子量約爲1 80萬，MTX的結合率爲2.01 % 。 〔實施例2 — 42〕 M.TX— 7 — PheGly— NHCi〇H2〇〇3NH_HA 的製造 與實施例2 ~ 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（500 mg’分子量：約230萬）與實施例1— 33所得之化合物 3 3 ( 0.0 3 1 m m ο 1 )進行反應，得到標題的Η A — Μ T X結合 體之水溶液。與實施例2 一 1相同方法求得分子量約爲 190萬，ΜΤΧ的結合率爲1.4%。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化’得到 -95- ⑧ (92) 1359665 標題的Η A — Μ TX結合體之無菌水溶液。與實施例2 — 1 相同方法求得分子量約爲172萬，ΜΤΧ的結合率爲1.5% 1H-NMR ( 500MHz、D20 ) ： ¢5 1.69 ( m ) v 1.79 ( m ) ' 2.02 ( br.s ) 、2.19-2.26 (m) 、2.29(m) 、2.66 ( m )> 2.82 ( m) ' 3.13 ( m ) 、3_20(m) 、3.29(s)、 3.34 (br.s) ' 3.51 ( br.s) 、3.56 (br.s) 、3.71 ( br.s) ' 3.83 ( br.s) ' 4.16 ( t ) 、4.33(m) ' 4.46 ( br.s)、

4.54 ( br.s) 、4.94(d) 、6.82(s) 、6.99—7.08 (m) '7.75(d) ' 8.68 ( s ) 〔實施例2 - 43〕 MTX— 7 -Phe— NHC1()H2()03NH_HA 的製造 與實施例2 - 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（5 00 mg，分子量：約2 3 0萬）與實施例1 _ 3 4所得之化合物 3 4 ( 0.0 3 1 mmol)進行反應，得到標題的HA- MTX結合 體之水溶液。與實施例2 - 1相同方法求得分子量約爲 1 8 7萬，Μ TX的結合率爲1 . 7 %。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化，得到 標題的 Η A — Μ ΤΧ結合體之無菌水溶液。與實施例2 - 1 相同方法求得分子量約爲165萬，ΜΤΧ的結合率爲1.7% 1.80 ( m H-NMR ( 500MHz、D20) : <5 1.44 (m 2.02 ( br.s 2.31 ( m ) ' 2.53 ( m 2.68 ( m ) -96- (93) 1359665 、3 ‘ 1 8 ( m ) 3.58 ( br.s) 、4.02 ( t ) 、4.86 ( d ) 、7.78 ( d ) ' 3.31 ( ' 3.63 ( 、4.37 ( 4.98 ( d 8.72 ( s 2.88 ( m ) ' 3.01 ( m ) 、3_13(m) s ) 、3.35 ( br.s) ' 3.51 ( br.s)、 br.s) ' 3.72 ( br.s) 、3.84 ( br.s) m ) 、4.47 ( br.s) ' 4.55 ( br.s) )' 6.76(d) > 7.02 - 7.09 ( m)

〔實施例2_ 44〕 MTX— r — Glu— NHC1()H2〇03NH— HA 的製造 與實施例2— 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（500 mg，分子量：約23 0萬）與實施例1 - 35所得之化合物 3 5 ( 0.0 3 1 mmol)進行反應，得到標題的HA — MTX結合 體之水溶液。與實施例2 - 1相同方法求得分子量約爲 179萬，Μ TX的結合率爲1.6%。 該水溶液以與實施例2 — 1相同方法進行純化，得到 標題的 ΗΑ — ΜΤΧ結合體之無菌水溶液。與實施例2 — 1 相同方法求得分子量約爲149萬，MTX的結合率爲1.7% 'H-NMR ( 500MHz ' D2〇) : 5 1.61— 1.71 ( m) ' 1.73 -1.88 ( m ) ' 2.0 1 ( br.s ) 、2.23 ( m) '2.32 ( t )、 2.38— 2.55 (m) 、3.07 ( m ) 、3.34 (br.s) 、3.51 (br.s )、3.56 (br.s) 、3.73 (br.s) ' 3.83 ( br.s) 、4.15(m )、4.46 (br.s) ' 4.55 ( br.s ) 、4.95(s) 、6.91(d) 、7.70(d) ' 8.7 1 ( s ) ⑧ (94) (94)

1359665 [實施例2 — 4 5〕

MTX- a - D- Phe- D- Phe - N H C , 〇 H 2 〇 〇 3 N H - HA 造 與貫施例2~i相同方法下，使透明質酸鈉鹽 mg，分子量：約230萬）與實施例丨―36所得之仆

36 ( 0.031 mmol)進行反應’得到標題的ha— MTX 體之水溶液。與實施例2 _ 1相同方法求得分子量 148萬，MTX的結合率爲。 該水溶液以與實施例2 - 1相同方法進行純化， 標題的HA — MTX結合體之無菌水溶液。與實施例 相同方法求得分子量約爲135萬，MTX的結合率爲 〔實施例2 — 46〕

Μ TX — 7 — D — Phe — D — Phe — NHC|〇H2〇03NH — HA 造 與實施例2 — 1相同方法下，使透明質酸銷.鹽 mg，分子量：約230萬）與實施例1— 37所得之化 3 7 ( 0.03 1 mmol )進行反應，得到標題的HA — MTX 體之水溶液。與實施例2 - 1相同方法求得分子量 160萬，MTX的結合率爲1.4%。 該水溶液以與實施例2 -〗相同方法進行純化， 標題的ΗA — MTX結合體之無菌水溶液。與實施例 的製 (500 ，合物 結合 約爲 得到 2—1 1.4% 的製 (500 合物 結合 約爲 得到 2-1 -98- (95) ^359665 相同方法求得分子量約爲141萬，MTX的結合率爲ι3% 〔實施例2 - 47〕 MTX — cl — AsnPhePhe — NHC10H20O3NH — HA .的製造

與實施例2 _ 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（5 00 m g ’分子量：約2 3 0萬）與實施例1 一 3 8所得之化合物 38 ( 0.03 1 mm〇l)進行反應，得到標題的ha — MTX結合 體之水溶液。與實施例2-1相同方法求得分子暈約爲 210萬，MTX的結合率爲1.3%。 該水溶液以與實施例2 — 1相同方法進行純化，：得到 標題的HA— MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2— 1 相同方法求得分子量約爲178萬，MTX的結合率爲〗.2 % 1H-NMR ( 500MHz > D2〇 ) : δ 1.60 ( m ) 、1.8〇(m) ' 2.02( br.s ) > 2.34 ( m ) ' 2.54 ( m ) ' 2.60 - 3.05 ( m )、3.35 (br.s) ' 3.52 ( br.s) 、3.57 (br.s) 3.64( br.s) ' 3.72( br.s) 、3.83 (br.s) 、4.28( m) 、4.4 6( br.s) ' 4.55 ( br.s) 、 6.61 ( d) 、 6.77 ( t ) 、 6.82— 7.36 ( m ) 、7.76(d) 、7.80(d) ' 8.61 ( s ) 、8.64 ( _s 注：底線記號部分爲負訊息，由此可推斷其爲α體與 τ體的混合物。 -99- ⑧ (96) 1359665 〔實施例2 _ 4 8〕 MTX— a / r — GlyPheLeuGly — NHCi〇H2〇〇3NH — HA 的製 造 與實施例2 — 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽（5 00 mg，分子量：.約230萬）與實施例1— 39所得之化合物 39 ( 0.031 mmol)進行反應，得到標題的HA-MTX結合 體之水溶液。與實施例2 - 1 .相同方法求得分子量約爲 206萬，MTX的結合率爲1.4%。 該水溶液以與實施例2 _ 1相同方法進行純化，得到 標題的HA - MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2 — 1 相同方法求得分子量約爲185萬，MTX的結合率爲1.3% 1H-NMR ( 5 00MHz > D20 ) ： (5 0.72 (d) 、0.77 ( d) 、〇_81(d) 、1.32(m) 、1.50(m) ' 1.67 - 1.82 (m) ' 2.01 ( b r. s ) ' 2.23 ( m ) 、2.33(m) ' 2.75 - 3.03 ( m

)' 3.51 ( br.s) 、3.58 ( br.s) 、3.71 ( br.s) ' 3.83 ( br.s) 、4.16 — 4.28( m) 、4.46 (br.s) 、4.54 (br.s)、 6.85(d) 、6.92-7.06 (m) 、7.75(d) 、. 7.78(d)、 8.63 ( s ) 、8.65 ( s ) 注：底線記號部分爲負訊息，由此可推斷其爲α體與 7體的混合物。 〔實施例2 - 4 9〕 MTX — a PhePhe-NHCl0H20O3NH — HA 的製造 -100- ⑧ (97) 1359665 與貫施例2— 1相同方法下’使透明質酸鈉鹽（500 mg’分子量：約230萬）與實施例丨—2所得之化合物2 (0.031 mmol)進丫了反應’得到標題的ha— MTX結合體 之水溶液。 該水溶液以與實施例2 — 1相同方法進行純化，得到 標題的HA — MTX結合體之無菌水溶液。與實施例2_ ! 相同方法求得分子量約爲33萬，MTX的結合率爲1.1%

JH-NMR ( 500MHz、D2O) : ο 1.67 ( m) '1.79 ( m ) ' 1.84 — 1.94 ( m) 、2.02 (. br.s) ' 2.12 — 2；20 ( m)、 2.59 ( m ) ' 2.77 ( m ) 、2.91(m) ' 2.99 ( m ) ^ 3.12-3.25 ( m ) ' 3.35 ( br.s) ' 3.49 ( br.s ) ' 3.51 (br.s)、 3.57 (br.s) '3.71 (br.s) '3.83 (br.s) '-4.18 (t) ' 4.45 ( br.d) 、4.5 5 ( br.d ) ' 4.88 ( d) > 4.96 ( d)、 6.76(d) 、6.95-7.10 (m) '7.72(d) ' 8.6 8 .( s ) 〔實施例2 — 50〕 ；. MTX — a PhePhe - NHC2H4NH — HA 的製造： 與實施例2 - 1相同方法下，使透明質酸鈉鹽.（5 0 0 mg，分子量：約23 0萬）與實施例1 — 1所得之化合物1 (0 · 0 3 1 m m ο 1 )進行反應，得到標題的Η A — MTX結合體 之水溶液。與實施例2 — 1相同方法求得分子量約爲3 4， MTX的結合率爲2.0%。 該水溶液以與實施例2 — 1相同方法進行純化’得到 -101 - (98) (98)

1359665 標題的HA - MTX結合體之無菌水溶液。與實施 同 方 法求得分子量約爲34 萬 i MTX 的結合率 爲 'H-NMR ( 500MH z ' D2 0 ) ： δ 1 .83 (m ) 、2. 0 1 、 2. 1 2 ( m ) 、2 • 52 ( t ) ' 2 .69 ( m ) 、2.95 ( 34 ( b r. d ) 、3.49 (b r · d )、 3 . 57 (br .s ) '3.70 ( 3 · 83 (b r . s )' 4. 16 ( t )、 4.45 (br. d) ' 4.54 ( 4. 87 (d ) 、4.96 (d ) 、6 • 66 ( d ) > 6.88-7. 09 7. 72 (d) 、8.68 (s) 上述實施例2-1〜2_50所得之本發明的HA 結合體歸納如下表。

! 2-1 1.9% (b r . s m )、 b r. s ) br . d ) (m ) -MTX

⑧ -102- 1359665

〔一嗽〕 無菌水溶液 Φ Β Μ m m g έ 186萬 218萬 7=4 v〇 ο CN 217萬 223萬 209萬 191萬 174萬 198萬 155萬 162萬 162萬 149萬 196萬 (N 卜 ψ ， 80萬 76萬 MTX之 結合率(％) (N ON m CN o oo m 寸 寸 寸 卜 r Ή VO 〇 CN 〇 <N 寸 寸 ο 寸 ΓΟ 水溶液 結合體之分子量 (道爾頓） 195萬 228萬 219萬 232萬 232萬 227萬 205萬 197萬 211萬 183萬 189萬 192萬 172萬 214萬 189萬 83萬 83萬 77萬 MTX之結 合率(％) ψ ' i CN 〇> CN (N o 寸 寸 〇〇 v〇 〇 oi 寸 > 1 · 寸 Ο 寸 含有肽鏈的連接體 -Phe-Phe-NH-C2H4-NH- -Phe-Phe-NH-C2H4-NH- -Phe-Phe-NH-C2H4-NH- -Phe-Phe-NH-C2H4-NH- -Phe-Phe-NH-C2H4-NH- •Phe-Phe-NH-C2H4-NH- -Phe-Phe-NH-C2H4-NH- -Phe-Phe-NH-C2H4-NH- -Phe-Phe-NH-Ci〇H2〇〇3-NH- -Phe-Phe-NH-C,〇H2〇〇2-NH- -Phe-Phe-NH-C8Hi6〇2-NH- -Phe-Phe-NH-C6H12〇2-NH- -Phe-Phe-NH-C4H80-NH- -Phe-Phe-NH-C5H,〇-NH- 1 CO 1 Ό ja Oh 1 (L> jC Oh 1 -Phe-Phe-NH-C,〇H2〇〇3-NH- -Phe-Phe-NH-C,〇H2〇〇3-NH- -Phe-Phe-NH-C10H2〇03-NH- 結合位置 (a / r ) ¢5 ㈡ 實施例2-1 實施例2-2 實施例2_2^ 實施例2_3 實施例2_4 實施例2-5 實施例2-6 實施例2-7 實施例2-8 實施例2-9 實施例2-10 實施例2-11 實施例2-12 實施例2-13 實施例2-14 實施例2-15 實施例2-16 實施例2-17 -103- ⑧ 1359665

〔z—i〕 186萬 144萬 150萬 139萬 140萬 152萬 152萬 198萬 179萬 162萬 202萬 183萬 206萬 176萬 139萬 165萬 卜 ψ -H 156萬 162萬 152萬 143萬 188萬 176萬 180萬 寸 oo VO > *" cn (N CN (N VO m <N 卜 1-- 卜 r < <N (N 卜 〇\ 卜 v〇 卜 (N Ό 卜 〇 <N 199萬 Η 173萬 150萬 156萬 166萬 NT 209萬 213萬 192萬 231萬 201萬 226萬 190萬 187萬 186萬 189萬 187萬 191萬 167萬 191萬 209萬 189萬 196萬 Η NT cn (N o CN v〇 H 2 <N 卜 卜 (N (Ν r-H Os * A 卜 t i 卜 η r- I·1， (N 卜 (N I· i (N -Phe-Gly-NH-Ci〇H2〇03-NH- 1 X 1 ίΝ Ο (Ν Ο υ 1 X 2 1 δ 1 <υ Ο ι 1 ffi Z 1 0 v〇 X 00 u 1 Z 1 >% 0 1 <υ Qh 1 -Phe-Gly-NH-C6H1202-NH- -Phe-Gly-NH-C4H80-NH- -Phe-Pro-NH-C,〇H2〇〇3-NH- -Phe-yS Ala-NH-C|〇H2〇03-NH- -Phe-^ Ala-NH-C2H4-NH- -Phe-NH-C,〇H2〇〇3-NH- -Ile-NH-C,〇H2〇〇3-NH- -Ile-NH-C2H4-NH- -G1u-NH-C|〇H2〇〇3-NH- -G1u-NH-C2H4-NH- -Tyr-NH-Ci〇H2〇03-NH- 1 ffi 1 rn Ο ο (Ν X Ο υ 1 X ζ 1 G, 1 -Ser-NH-Ci〇H2〇03-NH- -Leu-NH-C 10H20O3-NH- -Val-NH-C,〇H2〇03-NH- -His-NH-Ci〇H2〇〇3-NH- -Pro-NH-C,〇H2〇〇3-NH- -β Ala-NH-Ci〇H2〇〇3-NH- -Phe-Phe-NH-Ci〇H2〇03-NH- -Phe-Phe-NH-C6H,2〇2-NH- -Phe-Phe-NH-C4H80-NH- ¢3 a I y 實施例2-18 實施例2-19 |實施例2-20 I 實施例2-21 實施例2-22 實施例2-23 實施例2-24 實施例2-25 實施例2-26 實施例2-27 實施例2-28 實施例2-29 實施例2-30 實施例2-31 實施例2_32 實施例2-33 實施例2-34 實施例2-35 實施例2-36 實施例2-37 實施例2-3 8 實施例2-39 實施例2-40 實施例2-41 -104- (101)1359665

172萬 165萬 149萬 1_ 135萬 141萬 178萬 185萬 您 m m 34萬 ίΠ 卜 寸 Η m (N τ—Η CO ψ^* On f—Η 濉 濉 濉 摊: 濉 濉 Η Ο 〇\ ψ - 卜 〇〇 Os 卜 »-H 〇〇 寸 o Ο τ—Η (Ν v〇 〇 CN 寸 V〇 寸 寸 m Η 〇 i ·Η —·Η CN 1 ffi 1 1 X 1 ffi X ζ 1 2 1 1 Ζ, 〇 ffi Z X ffi r^i 〇 m q ΓΟ Ο ο (Ν O rJ % 1 ά o o ffi o 2 ffi m Ο rt o o fN ffi Ο ΓΜ ffi 〇 X Ο u 1 ο fM ffi τΤ X r4 X fS K o u o υ 1 X Ο u u ο 1 ffi 1 K X 1 ο 1 ΐ u u z 1 <υ 2； 1 (U 1 ffi 2 X X 0) 0 1 1 0) P-. 工 CLh Pu I <υ X, Ρη 〇 1 <υ r； <υ Λ 〇Η 0 Q 1 (U Q 1 (U fj <ϋ Ρη hJ 1 0) I (υ <υ -JC Ρμ CU 1 晒 1 C ζ〇 < 1 CU 1 0 1 Ρη I 卜 卜 —. ¢3 ζ3 CN 呀 t (N 琴 m 寸 1 (Ν 寸 1 (N Φ 寸 1 (N 莩 寸 1 (N 卜 寸 1 (Ν Φ 00 寸 1 (N 匡 Ον 寸 1 (Ν Ο t ΓΜ m 習 4^> m ·» 翠 驾 μ=? 習 ·» {|ϋ IK IK IK tt 1¾ IK IK -105 - (102) 1359665 〔實驗例1〕 黏彈性的測定 透明質酸（分子量爲190萬，80萬）與實施例2— 1 ^ 2-8' 2-18' 2-27及2 - 29之結合體的無菌水溶液 的黏彈性，以CSL500型壓力控制式測量器（Carri - Med 公司製）使用直徑4cm的圓盤於37°C下進行測定。如圖 1所示，各結合體爲分子量80萬與190萬之透明質.酸的

〔實驗例2〕 滑膜細胞增殖抑制作用

使用人類滑膜細胞（HFLS )，對於以TNF — α刺激 之細胞增殖亢進的本發明HA- ΜΤΧ結合體的影響作檢討 。關節風濕（RA )的主病巢爲滑膜組織，已知作爲其特 徵之一爲滑膜細胞對異常增殖而形成肉芽組織，破壞關節 軟骨•骨。又，變形性關節症（ΟΑ )亦會出現二次性滑 膜炎。對於ΟΑ，沒有如RA所見到的滑膜細胞之顯著增 殖變化，但滑膜炎成爲膝蓋ΟΑ的特徵之關節水症或疼痛 、發熱之發炎症狀的原因（宮坂信之們編輯，「骨•關節 疾病」2003年，朝倉書店）。因此，阻礙以發炎性細胞 素之TNF — α亢進之滑膜細胞的增殖的化合物爲，可抑制 或治療RA及ΟΑ的病症進行之藥劑。

作爲被驗物質使用實施例3的ΗΑ — ΜΤΧ結合體之無 菌水溶液。HFLS爲來自RA患者之人類滑膜細胞（HFLS -106- (103) 1359665 -OA，CA400- 05，Lot No. ： 1 442 )由 CELL APPLICATIONS INS.購得。

使用HFLS以96孔皿（Falcon)進行5000細胞/孔 的播種’以含有 3%FBS、lx Antibiotic-antimycotic ( GIBCO)之 IMDM ( Iscove's modified Dulbecco's medium )培養基進行3小時培養。細胞附著後，添加TNF — a ( 最終濃度爲l〇ng/mL)、各濃度的HA— MTX結合體後 經5天培養。培養結束前2天，加入37 kBq/ well的 〔3H〕一脫氧尿苷（MORAVEK )，進對細胞內的〔3H〕 一脫氧尿苷吸入量（放射活性）以閃爍計數器進行。細胞 的回收以〇.〇5%胰蛋白酶一0.2% EDTA剝開細胞進行。 各實驗所測定的各被驗物質之放射活性爲，以未添加 被驗物質所培養的群之放射活性作爲對照組下算出相對値 (% ofcontrol) °HA—MTX結合體的MTX濃度爲，因 lmg/rnL的透明質酸中游離的羧基爲2.49xlO_3moI/L (lg/401/L:401爲N —乙醯葡糖胺+葡糖醛酸的分子 量），故該値乘上MTX的結合率而求得。（MTX結合率 爲1 %的HA — MTX結合體爲lmg/ mL時，MTX的濃度 爲 2.49 X 1 0 * 5mol / L )使用所得的値以 4 parameter logistic 法（解析軟體 GraphPad Prism 3.02 及 4.02)算出 細胞增殖阻礙活性（IC5Q値）。 HFLS— RA的HA— MTX結合體之IC5。値如表2所示 -107- ⑧ (104) 1359665 〔表 2 - 1〕

表2經TNF - α刺激之人類滑膜細胞的增殖抑制作用 結合位置 含有肽鏈的連接體 MTX之結 結合體之分 IC5〇 (a/r) 合率(％) 子量(道爾頓) (mol/lL) 實施例2-1 a -Phe-Phe-NH-C2H4-NH- 2.1 186萬 3.6E-07 實施例2-2 a -Phe-Phe-NH-C2H4-NH- 1.9 218萬 1.4E-07 實施例2-2, a -Phe-Phe-NH-C2H4-NH- 2.3 206萬 7.2E-07 實施例2-4 a -Phe-Phe-NH-C2H4-NH- 1.1 223萬 1.1E-05 實施例2-5 a -Phe-Phe-NH-C2H4-NH- 1.3 209萬 1.1E-06 實施例2-6 a -Phe-Phe-NH-C2H4-NH- 3.8 191萬 9.1E-08 實施例2-8 a -Phe-Phe-NH-C,〇H2〇〇3-NH- 1.4 198萬 8.4E-07 實施例2-9 a -Phe-Phe-NH-C, 〇H2〇02-NH- 1.7 155萬 1.3E-06 實施例2-]0 a -Phe-Phe-NH-CsH, 6〇2-NH- 1.6 162萬 1.2E-06 實施例2-11 a -Phe-Phe-NH-C6Hi2〇2-NH- 2.0 162萬 2.5E-07 實施例2-12 a -Phe-Phe-NH-C4H80-NH- 1.9 149萬 3.0E-07 實施例2-13 a -Phe-Phe-NH-C5H10-NH- 1.2 196萬 1.5E-06 實施例2-14 a -Phe-Phe-Lys- 1.4 172萬 1.5E-05 實施例2-15 a -Phe-Phe-NH-C i 〇H2〇03-NH- 1.4 80萬 4.8E-07 實施例2-16 a -Phe-Phe-NH-Ci〇H2〇03-NH- 0.5 81萬 1.3E-05 實施例2-17 a -Phe-Phe-NH-C, 〇H2〇〇3-NH- 3.4 76萬 1.3E-05 實施例2-18 a -Phe-G]y-NH-C,〇H2〇〇3-NH- 1.4 186萬 9.2E-06 實施例2-19 a -Phe-Gly-NH-C, 〇H2〇02-NH- 1.8 144萬 5.4E-06 108- (105)1359665

〔表 2- 2〕 實施例2-20 a -Phe-Gly_NH-C8H 16OrNH- 1.6 150萬 1.8E-05 實施例2-21 a -Phe-Gly-NH-C6H, 2〇2-NH- 2.3 139萬 8.3E-07 實施例2-22 a -Phe-Gly-NH-C4H8〇-NH- 2.2 140萬 3.0E-06 實施例2-23 a -Phe-Pro-NH-C 丨 〇H2〇03-NH- 1.6 152萬 1.2E-05 實施例2-24 a -Phe- β Ala-NH-Ci〇H2〇〇3-NH- 1.5 152萬 3.5E-06 實施例2-25 a -Phe- β Ala-NH-C2H4-NH- 2.3 198萬 2.9E-07 實施例2-26 a -Phe-NH-Ci〇H2〇03-NH- 1.7 Π9萬 1.7E-06 實施例2-27 a -Ile-NH-C,〇H2〇03-NH- 1.7 162萬 3.1E-06 實施例2-28 a -Ile-NH-C2H4-NH- 2.1 202萬 1.2E-05 實施例2-29 a -G1u-NH-Ci〇H2〇03-NH- 1.5 183萬 8.4E-06 實施例2-30 a -G1u-NH-C2H4-NH- 2.1 206萬 5.4E-05 實施例2-3.1 a -Tyr-NH-C,〇H2〇〇3-NH- 1.7 176萬 7.0E-06 實施例2-32 a -Trp-NH-Ci〇H2〇〇3-NH- 1.9 139萬 4.7E-06 實施例2-33 a -Ser-NH-Ci〇H2〇03-NH- 1.7 165萬 3.6E-05 實施例2-34 a -Leu-NH-Ci〇H2〇03-NH- 1.6 H7萬 3.6E-06 實施例2-35 a -Val-NH-Ci〇H2〇〇3-NH- 1.7 156萬 1.1E-05 實施例2-36 a -His-NH-Ci〇H2〇〇3-NH- 1.2 162萬 1.7E-05 實施例2-39 r -Phe-Phe-NH-C, 〇H2〇03-NH- 1.5 188萬 3.2E-06 實施例2-42 r -Phe-Gly-NH-C, 〇H2〇〇3-NH- 1.5 172萬 1.4E-05 實施例2-47 α/γ -Asn-Phe-Phe-NH-Ci〇H2〇〇3-NH- 1.2 178萬 1.1E-06 實施例2-48 a/r -GJy-Phe-Leu-Gly-NH-Ci〇H2〇〇3-NH- 1.3 】85萬 】.3E-06 實施例2-49 a -Phe-Phe-NH-C,0H20O3-NH- 1.1 33萬 1.3E-05 MTX單獨 — — — 5.5E-08 (106) 1359665 由表2確認任一 Η A - MTX結合體皆具有可抑制經 TNF— α刺激之HFLS的細胞增殖亢進之作用. 〔實驗例3〕 對於mBSA誘導單關節炎模型之膝關節腫脹抑制效果

本發明HA - MTX結合體之活體內滑膜炎抑制作用， 以老鼠 mBSA ( methylated bovine serum albumin)誘導單 關節炎模型之膝關節腫脹的抑制效果作評估。本實驗所使 用的mBSA誘導單關節炎模型係作爲抗原誘發關節炎模型 而被泛用者，已知其可誘發滑膜炎（Sven E. And erss on， et al. The Journal of Rheumatology ( 1 998 ) 25 : 9，1 772-7 )’故本模型若被確認具有活體內關節腫脹抑制效果時， 表示可推衍其具有滑膜炎抑制作用。於活體內可抑制滑膜 炎的化合物爲，可適用於滑膜炎所引起的關節病（RA或 〇 A等）之治療藥上。 動物使用LEW/ Crj系老鼠（日本查爾斯•里貝，6 週齡，雄）。於誘導關節炎的21天及14天前，將2mg/ mL的mBSA(Calbiochem)水溶液與等量的Freund's完 全助劑（Difco )所製成的〇.5 mL乳濁液皮下投予於老鼠 的下腹。關節炎爲，2mg / mL的50gL之mBSA水溶液 投予於右膝關節內進行誘導。左膝關節爲無處理下作爲各 個體的對照組。被驗物質（無菌水溶液）及對照藥之.透明 質酸於關節炎誘導7天及1天前與7天後，進行5 0 # L的 右膝關節投予。 -110- (107) (107)1359665 膝關節腫脹的測定爲兩膝關節的幅度以游標測定，有 左右差（右膝直徑-左膝直徑）時表示膝關節腫脹。進行 關節炎誘導前至2週間，每週進行2次的頻率測定膝關節 幅度’此經時性變化算出AUC( Area Under the Curve的 略稱’亦稱爲曲線下面積，此表示關節腫脹的經時性曲線 下之面積）。測定時算出AUC的平均値及標準偏差，進 行被驗物質投予群與HA投予群下無對應的t檢定，判斷 出危險率未達5%時有顯著差。統計解析爲使用S.AS. version 6.12或8.02( SAS因司第佳日本）。又，各被驗 物質之AUC係以HA投予群作爲對照組，.算出各被驗物 質的相對値（％ ofcontrol)。 本發明的各HA _MTX結合體之效果以上述方法所檢 討之結果如表3所示。

⑧ 1359665 08) 1 /(\

ο- P<0.0001 P<0.0001 1 P<0.005 1 ^auc (%對照組） 体均値土SEM) CO in ΐΐ OQ g in un 叫 sodvd S0.69 L§L sodvd 10000>〇. loooovd loooovd S 00·0>〇. sdvd sovd sooodvd sova. sooovd sdvd sooodvd sodvd sodvd sooovd soodvd I of sodvd -of ?0·0>〇. ooiins 9.S· 一寸 8_ 寸+ISXO寸

1.6TS 6.6+ISO9 ms z.oo+ls i-19 9-6+ΙΓ59 1亡 /:9+100009 r9+la9 i.69 2+lrL9 S3 9·π+ι°ο^ 〔τε〕

⑧ (109) (109)

1359665 由表3結果得知，本次所檢討的HA — HA投予群比較’皆顯示對關節炎模型之膝 顯著的抑制作用。又，若注意到結合於Η A 率之影響時，特別於MTX的結合率爲0.5】 例1〜7 )時，與HA投予群相比對於關節炎 腫脹更顯示顯著的抑制作用。 〔實驗例4〕 依據實施例3的方法，以驗證本發明的 合體之有用性爲目的，1)實施例2— 2所 ΜTX結合體（無菌水溶液）之投予群、2 ) —ΜΤΧ結合體所含的ΜΤΧ等量之ΜΤΧ的 、及3)含有與該結合體所含之等量ΜΤΧ ΗΑ )的混合物（HA + ΜΤΧ )之投予群，比 間的關節腫脹抑制作用。本試驗的膝關節腫 化如圖2所示，及A U C如圖3所示。圖2 果可確認，與MTX單體及MTX與HA的混 一 MTX結合體具有對關節炎模型之關節腫 的抑制作用。因此，MTX與HA的結合可丨 的關節腫脹抑制作用已明朗化。 由上述得知，本發明的HA — MTX結 HA時未被確認的活體外經TNF - α刺激所 膜細胞增殖之抑制作用，及活體內減輕已發 炎之作用。又，關節炎模型中’對於ΜΤΧ ΜΤΧ結合體與 關節腫脹具有 的ΜΤΧ結合 巨4.4% (實施 模型的膝關節 丨HA - ΜΤΧ結 調製的ΗΑ — 含有與該ΗΑ 溶液之.投予群 及透明質酸（ 較這些投予群 脹之經時性變 及圖3所示結 合物相比，ΗΑ 脹具有·顯著強 顙著提高ΜΤΧ 合體爲具有於 引起的人類滑 病模型的滑膜 單獨及ΗΑ與 -113- ⑧ (110) 1359665 MTX的混合物無法充分顯示滑膜炎之減輕作用而言，Ha - MTX結合體則可發揮強力的滑膜炎減輕作用已明朗化 〔實施例5〕 對膠原關節炎模型之影響

對於HA — MTX結合體之活體內滑膜炎抑制作用，以 使用被泛用的老鼠膠原關節炎模型（金氏們，「關節外科 」（1 998 ) 、Vol. 17, No.2 ’ 111-21)作爲關節風濕（RA )模型進行評估。本模型中可抑制發炎的本發明化合物可 適用於以RA作爲代表的自身抗原誘發之免疫疾病治療上

動物爲使用DA/Slc老鼠（日本SLC (股），11週 齡’雌）。將牛II型膠原（膠原技術硏修會）溶解於 〇·〇1 mol/L乙酸水溶液至1.5mg/mL，力卩入等量的 Freund’s完全助劑（Difco )製成乳濁液。將此乳濁液對 老鼠背部皮內4處，以1處投予約0.1 mL的合計0.4 mL 量進行投予，誘發關節炎。實施例3- 7的被驗物質（無 菌水溶液）及對照藥劑的透明質酸（Η A )與生理食鹽水 (Saline )於.，於敏化日開始每5天1次，將5〇 # l僅投 予於右膝關節內。左膝關節則作爲無處理群。又，作爲病 態模型的對照組，對未誘導關節炎的動物（n〇rmal )之右 膝關節內投予生理食鹽水。 膝關節腫脹的變化爲，兩膝的關節幅度以游標測定， ⑧ (111) 1359665 再與正常群的關節幅度比較觀察。關節炎誘導前至23天 後進行一週2次的觀察。對於膝關節幅度的測定値，算出 每測定時的平均値及標準誤差，進行被驗物質群與HA投 予群下無對應的t檢定，判斷出危險率未達5%時有顯著 差。統計解析爲使用SASversion8.02(SAS因司第佳日 本）。 本發明的HA-MTX結合體之效果以上述方法進行檢 討的結果如圖4所示。 圖4所示結果得知，本發明的HA — MTX結合體與 HA投予群相比，對於膠原關節炎的誘導所引起的腫脹關 節幅度有著顯著抑制作用，其關節幅度之經時性變化幾乎 與正常群同等水準。又，該效果僅於投予HA - MTX結合 體之部位（右膝）觀察到，對於非投予部位（左膝）則無 被觀察到。如此表示本發明的化合物的表現作用僅限於投 予部位。

〔實驗例6〕 對於膠原酶誘導關節炎（OA )模型之關節腫脹抑制效果 將Η A - MTX結合體之活體內之滑膜炎抑制作用以膠 原酶誘導0A模型老鼠進行評估。膠原酶誘導0A模型爲 ，關節內注入膠原酶水溶液，而直接消化軟骨組織的膠原 ’於關節內誘發發炎的模型。該模型顯示與關節軟骨變性 或滑膜炎等人類0A病態類似之病理組織學性變化，適用 於 0A 治療藥之評估上（Takanori K. et al.，Osteoarthritis -115- (112) 1359665 and Cartilage ( 1998) 6，177-86)。因此，可抑制本模型 之發炎的化合物可適用於0A治療藥上。 動物爲使用SD/ Crj老鼠（日本查爾斯•里貝，6週 齡’雄）。將50/zL的1.5% 膠原酶（SIGMA)溶液僅 投予於右膝關節腔內誘導出關節炎。左膝關節因作爲各個 體的對照組故未進行任何處理。被驗物質於關節炎誘導的 7天及1天前作1週1次比率將50yL投予於右膝關節內 〇 膝關節腫脹的測定爲兩膝關節的幅度以游標測定，有 左右差（右膝直徑-左膝直徑）時表示膝關節腫脹。進行 關節炎誘導前至20天，每週進行2次的頻率測定膝關節 幅度，此經時性變化算出AUC。測定時算出AUC的平均 値及標準偏差，進行被驗物質投予群與HA投予群下無對 應的t檢定，判斷出危險率未達5%時有顯著差。

本發明的各HA_ MTX結合體之效果以上述方法所檢 討之結果如圖5與表4所示。圖5中的左圖顯示HA — MTX結合體的典型關節腫脹經時性變化，表4中顯示經 檢討的被驗物質的結果。

(D -116- 1359665

〔寸谳〕 匡eMθίΝϋφ^X12— VH s Ml 1U5£副^<(<0)絮温||鳓饀韙蚝_^菡寸锻 Oh P<0_0001 P<0.001 P<0.0001 P<0.0001 Ρ<0.05 AUC (%對照組） (平均値±5£1^1) 45·7±3·9 48_9±3.7 54.8±5.9 65.9±3.5 82.6±5·2 結合體之分子量 (道爾頓） 186萬 218萬 198萬 186萬 162萬 MTX之結 合率(％) (Ν O'. 寸 寸 τ < 含有肽鏈的連接體 i -Phe-Phe-NH-C2H4-NH- -Phe-Phe-NH-C2H4-NH- -Phe-Phe-NH-Ci〇H2〇03-NH- 1 X Ζ 1 m Ο ο (Ν X Ο υ 1 Ε 7U 1 Ο 1 <υ 〇Η 1 -Ile-NH-C10H2〇〇3-NH- 結合位置 (a / r ) 實施例2-1 實施例2-2 實施例2-8 實施例2-18 實施例2-27 (114) (114)1359665 由上述結果知，本次所檢討的ΗΑ_ΜΤχ結合體與 任一 HA投予群比較，皆顯示對膠原酶誘導關節炎模型之 膝關節腫脹具有顯著的抑制作用。 〔實驗例7〕 對於膠原酶誘導關節炎（〇A)模型之關節軟骨破壞抑制 效果 如實驗例6的標題所示，已知膠原酶誘導關節炎（ 0A)模型可使用於〇A治療藥之評估上，故可抑制本模型 的發炎’且可抑制軟骨變性之化合物可適用於0A治療藥 上。 動物爲使用SD/ Crj老鼠（日本查爾斯·里貝，6週 齡，雄）。將50 v L的1 .5%膠原酶（SIGMA )溶液僅投. 予於右膝關節腔內誘導出關節炎。左膝關節因作爲各個體 的對照組故未進行任何處理。被驗物質於關節炎.誘導的7 天及1天前作1週〗次比率將50#L投予於右膝關節內。 欲評估膝關節軟骨破壞程度，於關節炎誘導後第28 天採出右膝關節，將小腿骨內顆部之關節軟骨之變性像以 掃猫型電子顯微鏡（sEM)攝影。攝影後進行*.，·由各個 體的SEM像排出關節軟骨變性之程度順序。數據固定後 ，開錠盲檢化，算出各群的順序平均。生理食鹽水投予群 與被驗物質投予群之間’進行Wi〗C〇X〇n檢定’危險率未 達5%作爲顯著差。統計解析使用MS version 8.02 ( SAS 因司第佳日本） -118 - ⑧ (115〉 (115〉1359665 本發明的HA - MTX結合體之效果以上述方法進行檢 討的結果如圖6所示。 由圖6所示結果得知，本發明的HA - MTX結合體與 生理食鹽水投予群相比，對於膠原酶誘導0A模型的軟骨 變形顯示顯著的抑制作用。由該結果得知HA- MTX結合 體不僅對於關節炎模型的關節腫脹，對於關節軟骨的破壞 亦可抑制》因此，本發明的Η A - MTX結合體適用於關節 軟骨變性或關節軟骨損害所引起的關節疾病治療上。 〔產業上可利用性〕 本發明的HA - MTX結合體不僅具有作爲關節注入劑 之HA作用，且將MTX的滑膜炎抑制作用安全地僅表現 於投予關節內，提供具有過去未有的效果之優良關節疾病 治療藥劑。 【圖式簡單說明】 〔圖1〕圖1表示各被撿物質及對照（分子量爲1 90 萬的透明質酸及分子量爲80萬之透明質酸）的黏彈性之 測定結果。 〔圖2〕圖2表示各被驗物質投予群及對照群（HA 及vehicle)中，將mBSA溶液投予於膝關節內時所測定 出的膝關節腫脹經時性變化。 〔圖3〕圖3表示對於圖2的各被驗物質投予群及對 照群之圖表的AUC。 -119 ⑧ (116) 1359665 〔圖4〕圖4表示膠原關節炎模型之膝關節幅度的經 時性變化。左圖表示對於實施例3 ~ 7的化合物或對照藥 (HA或Vehicle)僅投予於右膝關節內的群，膠原關節炎 的誘導後馬上測定的右膝關節（投予部位）幅度之經時性 變化。右圖表示投予部位的左膝關節幅度的經時性變化。

〔圖4〕圖4表示實施例1投予群及對照組（ha及 Saline)中，誘導膠原關節炎後之膝關節幅度之經時性變 化。左圖表示投予部位的右膝關節的經時性變化，右圖表 示非投予部位的左膝關節之經時性變化。條狀爲平均土標 準誤差。 〔圖5〕圖5表示實施例1投予群及對照組（HA及 Saline )中，將膠原酶〇A模型的關節炎於誘導後至20.天 後的膝關節腫脹之經時性變化。條狀爲平均±標準誤差。 〔圖6〕實施例2- 2投予群及生理食鹽水群之膠原 酶OA模型之小腿骨內顆部位之軟骨變性程度。條狀爲平 均土標準誤差。 -120- ⑧

Claims (1)

1359665_ 〃公告本 第094106691號專利申請案中文申請專利範圍修正本 民國100年8月 10 日修正 十、申請專利範圍 1. 一種透明質酸一胺甲蝶呤結合體，其特徵爲於透 明質酸、透明質酸衍生物或此等鹽之羧基上，介由含有1 〜8個胺基酸所成的肽鏈之連接體（linker )與胺甲蝶呤 所結合者。 φ 2.如申請專利範圍第1項之透明質酸一胺甲蝶呤結 合體，其中連接體爲含有1〜8個胺基酸所成之肽鏈、及 C2-2Q伸烷基二胺鏈，該伸烷基二胺鏈爲可插入1〜5個 氧原子，及/或可由殘基或Ci-6院氧基羯基取代者。 3. 如申請專利範圍第1項之透明質酸-胺甲蝶呤結 合體，其中對透明質酸之總羧基的胺甲蝶呤之結合率爲 0.5% 〜4.5%。 4. 如申請專利範圍第1項之透明質酸_胺甲蝶呤結 φ 合體，其中透明質酸的分子量爲60萬道爾頓以上。 5 .如申請專利範圍第1項之透明質酸-胺甲蝶呤結 合體，其中結合於連接體的胺甲蝶呤爲式（I) 、（II) '(III)或（IV)表示者； 1359665

Η

-2- 135-9665 〔化4

(TV) CORr 〔式中，Ri及R2表示各自獨立的羥基、胺基、Ci-6烷氧 基、Ci-6院基胺基、或—· — Ci-6垸基胺基； L〇表示連接體的結合位置〕。 6.如申請專利範圍第1項之透明質酸一胺甲蝶呤結 合體，其中含有肽鏈之連接體及於該連接體所結合的胺甲 蝶呤爲，式（I > )或（II / )所示者； 〔化5〕 COR!

1359665

〔式中，1^及R2表示各自獨立的羥基、胺基、C^-6烷氧 基、q-6烷基胺基、或二一C^-6烷基胺基； L表示式（X) 〔化7〕 —Qi-N^Q2-^—[HA] ^12 (X) (式中，Qi與所結合的-NH——起形成1〜8個胺基酸所 成之肽鏈，含於該肽鏈的胺基酸之各殘基可獨立由1個以 上選自（^-6烷基、（^-6烷基羰基、（^-6烷氧基羰基、甲 醯基、烷基磺醯基、及C6-1()芳基磺醯基所成群之基 取代或保護，含於該肽鏈之各醯胺鍵可獨立由1個以上選 自C—6烷基及/或Ci-6烷基羰基於氮原子上取代，含於 該殘基的各羧基可獨立由1或2個¢:,-6烷基取代或亦可 轉化成醯胺基； Rn及Ru表示各自獨立的氫原子或C丨-6烷基： Q2表示C2- 2〇伸烷基，該伸烷基可插入1〜5個氧原子、 -4- 135*9665 及/或可由羧基或Ci-6烷氧基羰基取代； 〔HA〕表示與透明質酸結合位置，該連接體與含於該透 明質酸之羧基形成醯胺鍵結）所表示的連接體〕。 7. 一種醫藥組成物，其特徵爲含有如申請專利範圍 第1項至第6項中任一項之透明質酸一胺甲蝶呤結合體作 爲有效成分者。 8- 一種關節病治療藥，其特徵爲含有如申請專利範 φ 圍第1項至第6項中任一項之透明質酸—胺甲蝶呤結合體 作爲有效成分者。 9.如申請專利範圍第8項之關節病治療藥，其爲關 節局部投予製劑》 10.—種化合物’其特徵爲式（Va)或（Vb)所示

(Va) 1359665 〔化9〕 Η

〔式中，尺1及R2表示各自獨立的羥基、胺基、Ci-6烷氧 基、Ci-6院基胺基、或二一 Ci-6院基胺基； L,表示式（X / ) 〔化 1 〇〕 —Q-j—Ν~〇2—N—Η Rii R.12 (X') (式中，Qi與所結合的-NH——起形成1〜8個胺基酸所 成之肽鏈，含於該肽鏈的胺基酸之各殘基可獨立由1個以 上選自<^-6烷基、（：,-(；烷基羰基、Ci-6烷氧基羰基、甲 醯基、（^-6烷基磺醯基、及C6-l()芳基磺醯基所成群之基 取代或保護，含於該肽鏈之各醯胺鍵可獨立由1個以上選 自烷基及/或C^-6烷基羰基於氮原子上取代，含於 該殘基的各羧基可獨立由1或2個¢^-6烷基取代或亦可 轉換成醯胺基； R12表示各自獨立的氫原子或C^-6烷基： Q2表示C2-20伸院基，該伸院基可插入1〜5個氧原子） -6 - 1359665 11. 一種如申請專利範圍第1項之透明質酸_胺甲蝶 呤結合體之製造方法，其特徵爲含有式（Va)或（Vb) 所示者； 〔化8〕

〔化9〕 Η

C 院氧 〔式中，1及R2表示各自獨立的羥基、胺基 基、Ci-6烷基胺基、或二—（^-6烷基胺基； L!表示式（X / ) 〔化 1 〇〕 Όί-Ν·~(¾-T|J—Η ^12 (X，) 1359665 (式中，Q!與所結合的-NH——起形成1〜8個胺基酸所 成之肽鏈，含於該肽鏈的胺基酸之各殘基可獨立由1個以 上選自烷基、Ci-6烷基羰基、C,-6烷氧基羰基、甲 醯基、<^-6烷基磺醯基、及C6-,«芳基磺醯基所成群之基 取代或保護，含於該肽鏈之各醯胺鍵可獨立由1個以上選 自CH6烷基及/或C^-6烷基羰基於氮原子上取代’含於 該殘基的各羧基可獨立由1或2個（^-6烷基取代或亦可 轉換成醯胺基； Rn及Ri2表示各自獨立的氫原子或Ci-6院基； Q2表示C2-20伸烷基，該伸烷基可插入1〜5個氧原子、及 /或可由羧基或C!- 6烷氧基羰基取代）〕之化合物與透明 質酸反應，將該透明質酸的羧基轉換成N-取代醯胺基的 步驟。 -8-