BG106096A - Fap - активирани противотуморни съединения - Google Patents

Fap - активирани противотуморни съединения Download PDF

Info

Publication number
BG106096A
BG106096A BG106096A BG10609601A BG106096A BG 106096 A BG106096 A BG 106096A BG 106096 A BG106096 A BG 106096A BG 10609601 A BG10609601 A BG 10609601A BG 106096 A BG106096 A BG 106096A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
compound
group
formula
cyt
cytotoxic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
BG106096A
Other languages
English (en)
Inventor
- CHESA Pilar GARIN
Martin Lenter
John Park
Stefan Peters
Wolfgang Rettig
Raymond Firestone
Dietmar Leipert
Juergen Mack
Leila Telan
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boehringer Ingelheim Pharma GmbH Co KG
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Pharma GmbH Co KG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Pharma GmbH Co KG filed Critical Boehringer Ingelheim Pharma GmbH Co KG
Publication of BG106096A publication Critical patent/BG106096A/bg
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A61K47/67—Enzyme prodrug therapy, e.g. gene directed enzyme drug therapy [GDEPT] or VDEPT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/252—Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1019—Tetrapeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1024—Tetrapeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до пролекарство, което може да бъде превърнато в лекарство чрез каталитичното действие на човешки фибробластен активиращ протеин (FAPалфа). Пролекарството има място на разцепване, което се разпознава от FAP, посоченото лекарство е цитотоксично или цитостатично при физиологични условия.

Description

Настоящето изобретение се отнася до лечението на тумори чрез прилагане на пролекарство, което се преобразува до лекарство на мястото на тумора. В частност, изобретението се отнася до пролекарства, които могат да бъдат преобразувани в лекарство чрез ¢1 каталитичното действие на FAPa, до тяхното изготвяне и фармацевтична употреба.
Предшестващо състояние на техниката
Човешкият фибробластен активиращ протеин (FAPa) е клетъчноповърхностна молекула с М 95 000, първоначално идентифициран с моноклонално антитяло (mAb) F19 (Rettig et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 3110-3114; Rettig et al., 1993, Cancer Res. 53, 3327-3335). сДНК на FAPa кодира тип II интегрално-мембранен протеин с голяма извънклетъчна част, трансмембранен сегмент и къса цитоплазмена ф опашка (Scanlan et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5657-5661;
WO 97/34927). FAPa има 48%-на идентичност на аминокиселинна последователност с Т-клетъчния активиращ антиген CD26, познат още като дипептидил-пептидаза IV (DPPIV; ЕС 3.4.14.5), който е мембранно свързан протеин с дипептидил-пептидазна активност (Scanlan et al., loc. cit.). FAPa има ензимна активност и е член на семейството серинови протеази, като серин 624 е критичен за тяхната ензимна функция (WO 97/34927). При използване на мембранно-покривен анализ е установено, че FAPa-димерите могат да разцепят А1а-Рго-7-амино-4трифлуорометил-кумариновите, О1у-Рго-7-амино-4-трифлуорометил кумариновите и 1уз-Рго-7-амино-4-трифлуорометил-кумариновите дипептиди (WO 97/34927).
FAPa селективно се експресира в реактивни стромални фибробласти от различни хистологични типове на човешки епителни тумори, в гранулационната тъкан на зарастващи рани и в злокачествени клетки на някои костни и мекотъканни саркоми. Нормалните тъкани у възрастни индивиди по принцип са лишени от откриваем FAPa, но някои фетални мезенхимни тъкани преходно © експресират молекулата. Обратно, повечето от честите видове епителни тумори, вкл. над 90% от карциномите на млечната жлеза, дребно-клетъчния белодробен карцином и колоректалните карциноми съдържат FAPa-реактивни стромални фибробласти (Scanlan et al., loc. cit.). Тези РАРа+-фибробласти придружават новообразувани кръвоносни съдове в тумора, образувайки отделен клетъчен компартимент, включен между туморния капилярен ендотел и базалната част на струпванията от злокачествени епителни клетки (Welt et aal., 1994, J Clin. Oncol. 12(6), 1193-1203). Докато стромални РАРа+-фибробласти се откриват както в първични, така и в © метастатични карциноми, изследвани доброкачествени и предракови епителни лезии (Welt et al., loc. cit.), като например фиброаденом на млечната жлеза и колоректални аденоми, само рядко съдържат стромални РАРа+-клетки. Поради този ограничен патерн на разпространение на FAPa в нормалните тъкани и неговата еднотипна експресия в поддържащата строма на много злокачествени тумори, клинични проучвания с 1311-маркиран mAb F19 са започнали при пациенти с метастатични карциноми на дебелото черво (Welt et al., loc. cit.).
В новите терапии на злокачествени новообразувания чрез цитотоксични и цитостатични медикаменти основното съображение е да се увеличи терапевтичният индекс на цитотоксични или цитостатични агенти чрез подобряване ефективността на умъртвяване на туморната тъкан и/или чрез намаляване на токсичността за нормалната тъкан. За да се увеличи специфичността на умъртвяването на туморната тъкан и да се намали токсичността в нормални тъкани, се разработват пускови механизми по начин, по който токсичните агенти, синтезирани като пролекарства или неактивни форми, да станат активни когато и където е необходимо, и най-вече в туморните тъкани (Panchai 1998, Biochem. Pharmacol. 55, 247-252). Пусковите механизми могат да включват или екзогенни фактори, като напр. светлина или химикали, или ендогенни клетъчни фактори, като напр. ензими с ограничена експресия в туморни тъкани. Друга концепция, която се развива, е наречена “терапия с антитяло-насочено ензимно пролекарство” (ADEPT) или “антитяло-насочена катализа” (ADC) (Huennekens 1994, Trends Biotechnol., 12, 234-239; Bagshawe 1994, Clin. Pharmacokinet. 27, 368-376; Wang et al. 1992, Cancer Res. 52, 4484-4491; Sperker et al., 1997, Clin. Pharmacokinet. 33(1), 18-31). При ADEPT едно антитяло, насочено срещу туморно-свързан антиген, се използва за насочване на специфичен ензим към туморното място. Туморно-локализпраният ензим преобразува пролекарство, приложено след това, в активен цитотоксичен агент. Съединението антитялоензим (АЕС) се свързва с прицелния антиген от клетъчни мембрани или със свободен антиген в екстрацелуларната течност (ECF). Интервалът от време между прилагането на АЕС и пролекарствота позволява на АЕС да бъде изчистен от нормалните тъкани, така че пролекарството не се активира в нормални тъкани или кръв. Въпреки това, някои недостатъци на ADEPT съ свързани с качествата на АЕС (Bagshawe, /ос. с/ί.). Така например при хора само малка част от шммн приложената доза на прицелното АЕС се свързва с туморна тъкан, а остатъкът се разпределя в телесните течности, от които се изчиства със значително закъснение във времето. Дори много ниски концентрации на несвързания ензим могат да катализират достатъчно количество пролекарство, която да има токсични ефекти поради това, че плазменият и нормалният ECF обеми са много по-големи, отколкото тези на туморната ECF. АЕС могат освен това да бъдат имуногенни, което в много случаи не позволява повторно приложение.
Международните патенти WO 97/12624 и WO 97/14416 представят олигопептиди, включително следните пента- и хексапептиди (SEQ.ID.NOs.: 151 и 177: hArg-Tyr-GIn-Ser-Ser-Pro; hArgTyr-GIn-Ser-Pro;), съдържащи аминокиселинни последователности, които биват разпознавани и протеолитично разцепвани от свободен простатен специфичен антиген (PSA) и терапевтични агенти, които съдържат съединения на такива олигопептиди с познати терапевтични или цитотоксични агенти. Тези олигопептидни съединения, които съдържат поне една глутамин-серин-ова група са полезни само при лечението на рака на простатата.
Проблемът, разглеждан в настоящото изобретение, е да се осигурят методи и средства за подобряване на поносимостта на нормалните тъкани към цитотоксични или цитостатични агенти с позната ефективност срещу голям брой ту морни тъкани.
Техническа същност на изобретението
Настоящото изобретение се отнася до ензимно-активирани противотуморни съединения. В частност, изобретението осигурява пролекарства, които могат да бъдат преобразувани до лекарства чрез каталитичното действие на ендогенен фибробластен активиращ протен алфа (FAPa), локализиран в тъкани на човешки тумори. За предпочитане пролекарството в настоящото изобретение може да бъде преобразувано в лекарство чрез каталитичното действие на FAPa, като посоченото пролекарство има място на разцепване, разпознавано от FAPa, и посоченото съединение е цитотоксично или цитостатично срещу ракови клетки при физиологични условия.
В контекста на това изобретение “лекарство” означава химично © съединение, което може да бъде прилагано при хора или животни като спомагателно средство в лечението на болестта. В частност, лекарството е активен фармакологичен агент.
Терминът “цитотоксично съединение” означава химическо съединение, което е токсично спрямо живи клетки, в частност лекарство, което разрушава или убива клетки. Терминът “цитостатично съединение” означава съединение, което потиска растежа на клетки и тяхното размножаване и така потиска пролиферацията на клетки. Примери за цитотоксични или цитостатични съединения, подходящи за © настоящото изобретение, са антрациклинови производни, като напр.
доксорубицин, аналози на метотрексата, като напр. метотрексат, притрексим, триметрексат или DDMP, мелфалан, аналози на цисплатината, като напр. цисплатина, JM216, JM335, бис(платина) или карбоплатина, пуринови и пиримидинови аналози, като напр. цитарабин, гемцитабин, азацитидин, 6-тиогуанин, флурдарабин или 2деоксокоформицин, и аналози на други химиотерапевтични агенти, като 9-аминокамптотецин, О,1_-аминоглутетимид, триметоприм, пириметамин, митомицин С, митоксантрон, циклофосфанамид, 5флуороурацил, екстрамустин, подофилотоксин, блеомицин или таксол.
“Пролекарство” означава съединение, което при прилагането му трябва да подлежи на химическо преобразуване чрез метаболитни процеси преди да стане активен фармакологичен агент. В частност, пролекарството е значимо по-малко цитотоксично или цитостатично, отколкото лекарството, в което се превръща чрез каталитичното действие на FAPa. Специалистът познава методите на определяне на цитотоксичността на съединение, напр. в пример 6, посочен тук, или Mosmann ((1983, J. Immun. Meth. 65, 55-630). За предпочитане пролекарството има поне три пъти по-ниска цитотоксичност в сравнение с лекарството при анализ ин витро.
‘’Лекарство, което е цитотоксично или цитостатично при физиологични условия” означава химично съединение, което е цитотоксично или цитостатично в живо човешко или животинско тяло, в частност съединение, което убива клетки или потиска пролиферация на клетки в живо човешко или животинско тяло.
“Пролекарство, имащо място на разцепване, разпознавано от FAPa” означава пролекарство, което може да действа като субстрат за ензимното действие на FAPa. В частност, ензимната активност на FAPa може да катализира разкъсването на ковалентна връзка в пролекарството при физиологични условия. Чрез разкъсване на тази ковалентна връзка пролекарството се преобразува в лекарството директно или индиректно. Индиректна активация ще е налице в случай, че продуктът на разцепване в катализирания от FAPa етап не е фармакологично активният агент, но подлежи на следващи реакционни стъпки, напр. хидролиза, за да стане активен. Особено предпочитано е мястото на разцепване да се разпознава от FAPa, но не от други протеолитични ензими, налични в човешкото или животинско тяло. За
Ί предпочитане е, освен това, мястото на разцепване да бъде специфично разпознавано от FAPa, но не от протеолитични ензими в течностите на човешкото или животинско тяло и особено в плазмата. В особено предпочитан вариант пролекарството е стабилно в плазмата, други телесни течности или тъкани, в които няма или не се открива биологично активен FAPa. За предпочитане е, при анализ ин витро, както е проведен в пример 7, повече от 50%, много предпочитано повече от 80%, и особено предпочитано повече от 90% от пролекарството да са все още налични в разтвор, съдържащ 10% (обем/обем) човешка плазма след 8 часа при 37°С. За предпочитане мястото на разцепване трябва да бъде специфично за FAPa. В предпочитания вариант мястото на разцепване включва остатък от Lпролин, свързан с цитотоксично или цитостатично лекарство посредством амидна връзка. Пример за такова е конюгатът доксорубицин-пептид. FAPa може да катализира разцепването на пептидната връзка между С-крайния аминокиселинен остатък на пептида, който предпочитано е L-пролин, и цитотоксичното или цитостатично съединение.
Предпочитани съединения показват поне 10% превръщане в свободно лекарство при стандартните условия, посочени по-долу. Попредпочитани са тези съединения, които показват поне 20% превръщане в свободно лекарство при стандартни условия. Особено предпочитани са съединения, които показват поне 50% превръщане в свободно лекарство при стандартни условия. В този контекст стандартни условия се дефинират, както следва: всяко съединение се разтваря в 50тМ Hepes-буфер, 150 mM NaCl, pH 7.2, при крайна концентрация от 5 μΜ и инкубация с 100 ng CD8FAPa (виж пример 4) за часа при температура 37°С. Освобождаването на свободното лекарство от CD8FAPa се определя, както е описано в пример 5.
За предпочитане настоящото изобретение се отнася до съединение от формула (I)
или негови фармацевтично приемливи соли, където
R1 представлява една амино-алканоилна, олигопептидоилна, в частност ди- или трипептидоилна група,
N-крайната амино-функция на което може да бъде свързана към предпазваща група;
Ra и Rb, заедно с междинната N-С-група образуват евентуално заместен бензо- или циклохексано-кондензиран, 3- до 7-членен наситен или ненаситен хетероцикличен пръстен, в който една или две СН2-групи могат да бъдат заменени с NH, О или S;
R4 представлява Н, Ct-Сб-алкил, С3-С8-циклоалкил, арил или хетероарил;
и Cyt представлява остатъка от цитотоксично или цитостатично съединение, с уговорката, че се изключват
М2-ацетил-1-хомоаргинил-[_-тирозил-1_-глутаминил-1_-серил-М-[2,3,6тридеокси-1-О-[(18,35)-1,2,3,4,6,11-хексахидро-3,5,12-трихидрокси-3(хидроксиацетил)-10-метокси-6,11 -диоксо-1 -нафтаценил]-.алфа.-1_ликсо-хексопирано-3-ил]-1_-пролинамид;
и
М2-ацетил-1_-хомоаргинил-1.-тирозил-1--глутаминил-1--серил-1--серил-М[2,3,6-тридеокси-1-О-[(18,38)-1,2,3,4,6,11-хексахидро-3,5,129 трихидрокси-3-(хидроксиацетил)-10-метокси-6,11-диокси-1нафтаценил]-.алфа.-[_-ликсо-хексопирано-3-ил]-[_-пролинамид.
Особено предпочитани са тези съединения от формула I, където R1 е остатък от формулата Cg-A, Сд-В-А Cg-(D)m-B-A, в която Сд представлява водороден атом или предпазваща група, избрана от групата, включваща R5-CO, R5-O-CO-, R5-NH-CO-, R5-SO2-, или R5 е евентуално заместена СгС6-алкил-, С3-С8-циклоалкил-, арил-, аралкилили хетероарил-група;
предпочитано Сд е ацетил-, бензоил-, D-аланил-, (R)-H2NCH(CH3)Н2МСОСН2СН2-заместител или друга предпазваща група за защита на N-крайната аминофункция;
А, В и D представляват независимо един от друг радикали, проихождащи от амино-карбоксилни киселини от формулата -[NR6(Х)Р-СО1-, където X представлява CR7R8 и където R6, R7 и R8 представляват независимо един от друг водороден атом, евентуално заместена Ci-Ce-алкил-, С3-С8-циклоалкил-, арил- или хетероарилгрупа, и р е 1, 2, 3, 4, 5; или
А, В и D представляват независимо един от друг радикали, произхождащи от циклични аминокарбоксилни киселини от формулата (R9)r
където
R9 представлява С^Сб-алкил, ОН или NH2, п е цяло число от 1 до 10, мМ q е 0,1 или 2; и г е 0, 1 или 2.
Освен това, предпочитани са тези съединения от формула I, в които R6, R7 и R8 независимо един от друг представляват водороден атом или СН3-, СН3СН2-, СН3СН2СН2-, (СН3)2СН-, СН3СН2СН2СН2-, (СН3)2СН СНг, СН3СН2СН(СН3)-, (СН3)зС-, НОСН2-, СН3СН(ОН)-, СН3СН(ОН) СН2СН2-, НОСН2СН2СН2СН2-, H2NCH2CH2CH2-, H2NCH2CH2CH2CH2-, H2NCH2CH(OH)CH2CH2-, H2NC(=NH)NHCH2CH2CH2-, hsch2-, CH3SCH2CH2-, HOOCCH2-, HOOCCH2CH2-, H2NC(=O)CH2-, © H2NC(=O)CH2CH2-, бензил-, пара-хидрокси-бензил-,
или циклохексил-, фенил-, р е 1, и където конфигурацията към CR7R8 може да бъде R или S; ако R7 е различно от Н, тогава R8 за предпочитане е Н; R6 предпочитано е Н; ако р е по-голямо от едно, R7 и R8 предпочитано са Н;
Друг предпочитан вариант на настоящото изобретение са тези съединения от формула I, в които хетероцикличният пръстен, образуван от Ra, Rb и междинния N-С, е заместен от R2 и R3, където R2 и R3 независимо един от друг представляват водороден или халогенен атом или СгСб-алкил, СгС6-алкиламино-, ди-С!-С6-алкиламино-, СГС6алкокси-, тиол, СгСе-алкилтио-, оксо-, имино-, фомил-, СгСе-алкоксикарбонил-, С3-С8-циклоалкил-, арил или хетероарил-група.
Ако не е посочено другояче, простите стереоизомери, както и смеси или рацемати на стереоизомерите, са включени в изобретението.
“СгСб-алкил” обикновено представлява прав или разклонен въглеводороден радикал с 1 до 6 въглеродни атома.
Терминът “евентуално заместен” е използван по-горе или подолу по отношение на група или радикал, които евентуално могат да бъдат заместени с един или повече халогенни атоми, хидроксил-, амино-, СгСб-алкиламино-, ди-СтСб-алкиламино-, С1-С6-алкил-окси-, тиол, СгСе-алкил-тио-, =0, =NH, -СООН, - CONH2, NHC(=NH)NH21 С3Св-циклоалкил-, арил- или хетероарил-група.
Следните радикали могат да бъдат споменати като примери:
Метил, етил, пропил, 1-метилетил (изопропил), бутил, 1-метилпропил, 2-метилпропил, 1,1-диметилетил, n-пентил, 1-метилбутил, 2метилбутил, 3-метилбутил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил,
2.2- диметилпропил, 1-етилпропил, хексил, 1-метилпентил, 2метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 1,1-диметилбутил, 1,2диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 2,3-диметилбутил,
3.3- диметилбутил, 1-етилбутил, 2-етилбутил, 1,1,2-триметилпропил,
1,2,2-триметилпропил, 1-етил-1-метилпропил и 1-етил—2-метилпропил, Н0СН2-, СНзСН(ОН)-, СН3СН(ОН)СН2СН2-, Н0СН2СН2СН2СН2-, H2NCH2CH2CH2-, H2NCH2CH2CH2CH2-, H2NCH2CH(OH)CH2CH2-, H2NC(=NH)NHCH2CH2CH2-, hsch2-, ch3sch2ch2-, hoocch2-, HOOCCH2CH2-, H2NC(=O)CH2-, H2NC(=O)CH2CH2-, бензил, napaхидрокси-бензил,
или
Ако Cj-Сб-алкил ната група е заместена, заместителите предпочитано са хидроксил-, амино-, диметиламино-, диетиламино-, тиол-, метил-тиол-, метокси-, етокси-, =0, =NH, -СНО, -СООН, СООСНз, -СООСН2СНз, -CONH2, NHC(=NH)NH2, циклохексил-, фенил-, бензил-, пара-хидрокси-бензил,
Н
СН2или
Ако СгСе-алкилната група е заместена с арил или хетероарил, СгСв-алкил- предпочитано е Съ особено предпочитано метиленова група.
Терминът “амино-алканоил” и “олигопептидоил”, включително “ди- или трипептидоил” се използва по-горе или по-долу по отношение на радикал R1 и обозначава радикал, в който една аминокиселина или един олигомер, съдържащ до 12, за предпочитане 2 или 3 аминокиселинни радикали, е прикрепен С-крайно към азотния атом на хетероцикличния пръстен чрез амидна връзка.
Човек с обичайните познания в химията на аминокиселините и олигопептидите ще прецени, че някои аминокиселини могат да бъдат заместени от други хомоложни, изостерични и/или изолектронни аминокиселини, в които биологичната активност на оригиналната аминокиселина или олигопептид е съхранена чрез модификация. Някои неестествени и модифицирани природни аминокиселини могат също така да бъдат използвани за заместване на съответната природна аминокиселина. Следователно, например, тирозин може да бъде заместен от 3-йодотирозин, 2- или 3-метилтирозин, 3флуоротирозин.
Терминът “предпазваща група” се използва по-горе или по-долу по отношение на група, която е свързана към N-крайния азотен атом на аминоалканоилната или олигопетидоилната група на радикал R1 , и дефинира група или радикал, който намалява или елиминира ензимната деградация на съединенията от настоящото изобретение от аминопептидази, налични в кръвната плазма на топлокръвни животни. Подходящи предпазващи групи включват СгСю-алканоил-, С6-С18арил-СгСю-алканоил-, Сб-Схз-арил-СгС-ю-алкилсулфонил-. Такива предпазващи групи също така включват хидрофилни блокиращи групи, избрани по наличието на хидрофилна функционалност. Такива предпазващи групи увеличават хидрофилността на съединенията в настоящото изобретение и по този начин повишават тяхната разтворимост във водна среда. Тези повишаващи хидрофилността предпазващи групи предпочитано се избират между хидроксилириран алканол, полихидроксилиран алканоил, хидроксилиран ароил, хидроксилиран арилалканоил, полихидроксилиран ароил, полихидроксилиран арилалканоил, полиетиленгликол, гликозилати, захари и “краун”-етери.
“С3-С8-циклоалкил” обикновено представлява цикличен въглеводороден радикал с 3 до 8 въглеродни атома, който евентуално може да бъде заместен с един или няколко хидроксил-, амино-, СгС6алкил-амино, ди-СгС6-алкил-амино-, СгС6-алкил-, СгС8-алкокси-, тиол-, СгСе-алкил-тио-, =0, =NH, -СНО, -СООН, -СООСН3, -СООСН2СНз, -CONH2, -NHC(=NH)NH2i или халогенни заместители, които могат да бъдат еднакви или да се различават.
“Хетероцикличен пръстен” се използва по-горе или по-долу по U отношение на групата, образувана от Ra, Rb и междинния N-С, като обикновено представлява 3- до 7-членна, за предпочитане 4-, 5- или 6членна система от неароматни пръстени, съдържаща един азотен атом и евентуално 1 или 2 допълнителни хетероатоми, избрани от групата на азот, кислород и сяра, които може да бъдат заместени с един или няколко халогенни атома или С-|-С6-алкил, Ci-Ce-алкиламино-, ди-С-ιС6-алкиламино-, С-гС6-алкокси-, тиол, СгСб-алкилтио-, оксо-, имино, фомил-, СрСб-алкокси-карбонил-, аминокарбонил, С3-С8-циклоалкил-, арил или хетероарил-групи, които могат да бъдат еднакви или да се различават, и които евентуално могат да бъдат бензо- или £ циклохексано-кондензирани. Такива хетероциклични пръстени предпочитано са азетидин или са производни на пълно или частично хидрогенирани пирол-, пиридин-, тиазол-, изоксазол-, пиразол-, имидазол-, индол-, бензимидазол-, индазол-, пиридазин-, пиримидин-, пиразин-ова групи. Най-предпочитани са азитидин, пиролидин, 3,4дехидропиролидин, пиперидин, хексахидро-1Н-азепин, октахидроиндол, имидазолидин, тиазолидин.
Ако такъв хетероцикличен пръстен е заместен, заместителите предпочитано са метил, етил, пропил, 1-метилетил (изопропил), бутил, 1-метилпропил, 2-метилпропил, 1,1-диметилетил, хидроксил, амино, диметил-амино, диетил-амино, тиол, метил-тиол, метокси, етокси, СНО, -СООН, -СООСНз, -СООСН2СНз или -CONH2.
“Арил” обикновено представлява система от ароматни пръстени с 6 до 10, предпочитано с 6 въглеродни атома, които евентуално могат да бъдат заместени с един или повече хидроксил, амино, СгС6алкиламино-, ди-СгСб-алкиламино-, СгС6-алкил, CrCe-алкокси-, тиол, Cj-Сб-алкилтио-, -СНО, -СООН, -СООСН3, -СООСН2СН3 , -CONH2 или халогенни заместители, които могат да бъдат еднакви или да се различават и които евентуално могат да бъдат бензо-кондензирани. Арилни заместители могат предпочитано да са производни на бензен, като предпочитан пример са фенил, 2-хидрокси-фенил, 3-хидроксифенил, 4-хидрокси-фенил, 4-амино-фенил, 2-амино-фенил, 3-аминофенил.
Ако арил е заместен, заместителите предпочитано са метил, етил, пропил, 1-метилетил (изопропил), бутил, 1-метилпропил, 2метилпропил, 1,1-диметилетил, хидроксил, амино, диметил-амино, диетил-амино, тиол, метил-тиол, метокси, етокси, -СНО, -СООН, СООСН3, -СООСН2СН3 или -CONH2.
“Хетероарил” обикновено представлява 5- до 10-членна система от ароматни хетероциклични пръстени, съдържащи 1 до 5 хетероатоми, избрани от групата на азот, кислород или сяра, които евентуално могат да бъдат заместени с един или няколко хидроксил-, амино-, СгСе-алкиламино-, ди-СгС6-алкиламино-, CrCe-алкил-, Ci-C6алкокси-, тиол-, СгС6-алкил-тио-, -СНО, -СООН, -СООСН3) СООСН2СН3 , -CONH2 или халогенни заместители, които могат да бъдат еднакви или да се различават и които евентуално могат да бъдат бензо-кондензирани. Хетероарилни заместители предпочитано могат да бъдат производни на фуран, пирол, тиофен, пиридин, тиазол, изоксазол, пиразол, имидазол, бензофуран, тианафтен, индол, бензимидазол, индазол, хинолин, пиридазин, пиримидин, пиразин, хиназолин, пиран, пурин, аденин, гуанин, тимин, цитозин, урацил.
Ако хетероарилът е заместен, заместителите предпочитано са метил, етил, пропил, 1-метилетил (изопропил), бутил, 1-метилпропил, 2-метилпропил, 1,1-диметилетил, хидроксил, амино, диметил-амино, диетил-амино, тиол, метил-тиол, метокси, етокси, -СНО, -СООН, СООСНз, -СООСН2СН3 или -CONH2.
“Остатък от цитотоксично или цитостатично съединение” означава, че съединението H2N-Cyt', което се освобождава чрез разкъсване на амидната връзка, показана във формула (I), е цитотоксично или цитостатично само по себе си или може да бъде преобразувано в цитотоксично или цитостатично съединение в следващ етап.
Във втория случай -Cyt’ може да бъде остатък от формулата -LCyt”, където L е по-малък остатък, производен от бифункционална молекула, напр. от диамин H2N-L’-NH2 , от аминоалкохол H2N-L’-OH, напр. р-амино-бензилов алкохол (РАВОН), от аминокарбонат, например
ОН или от една неестествена аминокарбоксилна киселина. Ако -Cyt’ е от формулата -L-Cyt”, съединението H2N-L’-Cyt” е образувано чрез ензимното разкъсване на амидната връзка във формула (I). Съединението H2N-L’-Cyt” може да бъде цитотоксично или цитостатично само по себе си или свързващият остатък да бъде отцепен от Cyt” в следващ етап, освобождаващ цитотоксичния или цитостатичния агент. Например съединението H2N-L’-Cyt” може да бъде хидролизирано при физиологични условия до съединението H2NL’-OH и цитотоксичното или цитостатично съединение H-Cyt”, което е активният терапевтичен агент (по-нататък, за опростяване само обозначението Cyt’ се използва както за Cyt’, така и за Cyt”, и само обозначението L се използва за L и L’).
Фармацевтично приемливите соли на съединенията в настоящото изобретение включват обичайните нетоксични соли, образувани от нетоксични неорганични или органични киселини. Напр., такива обичайни нетоксични соли включват тези от неорганични киселини, като солна, бромоводородна, сярна, сулфамова, фосфорна, азотна и други; и солите, изготвени от органични киселини като оцетна, пропионова, янтарна, гликолова, стеаринова, млечна, ябълчна, винена, лимонена, аскорбинова, малеинова, фенилоцетна, глутаминова, бензоева, салицилова, сулфанилова, оксалова, трифлуороцетна и други.
Предпочитани съединения от формула I са тези от формула IA
(IA) където R2, R3, R4, Cyt’ са дефинирани както по-горе,
R1 представлява една аминоалканоилна или олигопептидоилна група, и Х-Y представлява CHR2-CH2, CR2=CH, NH-CH2, CHrNH, -CR2-, СНгCHR2-CH2; при условие, че R1 представлява аминоалканоилна, ди- или трипептидоилна група или R1 представлява олигопептидоил с повече от три аминокиселинни радикали, които не съдържат аминокиселинната последователност Gln-Ser, в случай, че X-Y представлява СН2-СН2 група.
Предпочитано α-въглеродният атом от цикличния аминокиселининен остатък е рацемичен, т.е. с (R/S) конфигурация, най-предпочитано с (S) конфигурация; в частност се предпочита вариант, при който α-въглеродният атом е с (S) конфигурация и R2 е Н. Ако R2 е ОН, предпочитано е той да е в транс-позиция.
R2, R3 предпочитано представляват водороден атом или метил-, етил-, пропил-, изопропил-, фенил-, метокси-, етокси- или хидроксигрупа, особено предпочитано водороден атом. R4 предпочитано е водороден атом или метил-, етил-, пропил-, изопропил- или фенилгрупа, особено предпочитано водороден атом.
Особено предпочитани съединения от формула IA са избрани от формулите IA1, IA2, IA3, IA4 и IA5
(IA2)
H2N-Cyt’ предпочитано е антрациклиново производно от формула II
където Rc представлява С^Сб-алкил, СгСб-хидроксиалкилалкил или
С-|-Сб-алканоилокси С-|-С6-алкил, в частност метил, хидроксиметил, диетоксиацетоксиметил или бутирилоксиметил;
Rd представлява водород, хидрокси или CrCe-алкокси, в частност метокси;
един от Re и Rf представлява видороден атом; и останалите представляват водороден атом или хидрокси- или тетрахидропиран-2илокси- (ОТНР)- група.
Особено предпочитани са следните съединения от формула II:
Rc Rd R® Rf Cyt
CH2OH OCH3 н ОН Доксорубицин
CH3 ОСНз н он Даунорубицин
CH2OH ОСНз он н Епирубицин
CH3 Η н он Идарубицин
CH2OH ОСНз н ОТНР ТНР
CH2OH ОСНз н н Езорубицин
CH2OCOCH(OC2H5)2 ОСНз н он Деторубицин
CH2OH н н он Карминорубицин
CH2OCOC4H9 ОСНз н он
Най-предпочитан е доксорубицин (Dox). Други цитотоксични или цитостатични остатъци Cyt могат да бъдат производни, напр., от метотрексат, триметрексат, пиритрексим, 5,10дидеазатетрахидрофолатпириметамин, триметоприм,10-пропаргил-5,8дидеазафолат-2,4-диамино-5(3’,4’-дихлорофеил)-6-метилпиримидин, аминоглутетимид, горесерилин, мелфалан, хлорамбуцил, аналози на други химиотерапевтични агенти като 9-аминокамптотецин (за примери виж Burris НА, г. d. and S. М. Fields (1994). “Topoisomerase I inhibitors. An overview of the camptothecin analogs. [Review].“ Hematol. Oncol. Clin.
North. Am. 8(2): 333-355; Iyer, L. and M. J. Ratain (1988). “Clinical pharmacology of camptothecins. [Review][137 refs].“ Cancer Chemother.
Pharmacol. 42 Suppl: S31-S43.)
Във формула (I) Cyt’ може също да бъде биологична ефекторна молекула, който влияе директно или индиректно върху разпада на туморни клетки, като напр. TNFa.
Предпочитани примери за аминокарбоксилни киселини, от които могат да са производни А, В и D единиците, са глицин (Gin), или D- или по-предпочитано L-формата на аланин (Ala), валин (Val), левцин (Leu), изолевцин (Не), фенилаланин (Phe), тирозин (Туг), триптофан (Тгр), цистеин (Cys), метионин (Met), серин (Ser), треонин (Thr), лизин (Lys), аргинин (Arg), хистидин (His), аспартатова киселина (Asp), глутамова киселина (Glu), аспарагин (Asn), глутамин (Gin), пролин (Pro), транс-4хидрокси-пролин (Нур), 5-хидрокси-лизин (Hyl), норлевцин (Nle), 5хидроксинорлевцин, б-хидроксинорлевцин (Нуп), орнитин (Огп), циклохексилглицин (Chg), фенилглицин (Phg), глутамин (Gin), циклохексилаланин (Cha), метионин-Б-оксид (Met), βциклопропилаланин (Сра), четвъртичен левцин (Tie) или хомо-серин (Hse).
Предпочитаните съединения имат общата формула (I), където А-единицата произлиза от аланин (Ala), валин (Val), левцин (Leu), изолевцин (Пе), фенилаланин (Phe), тирозин (Туг), триптофан (Тгр), цистеин (Cys), метионин (Met), серин (Ser), треонин (Thr), лизин (Lys), аргинин (Arg), хистидин (His), аспартатова киселина (Asp), глутамова киселина (Glu), аспарагин (Asn), глутамин (Gin), пролин (Pro), транс-4хидрокси-пролин (Нур), 5-хидрокси-лизин (Hyl), норлевцин (Nle), 522 хидроксинорлевцин, циклохексилглицин
6-хидроксинорлевцин (Нуп) (Chg), фенилглицин (Phg), орнитин глутамин циклохексилаланин (Cha), метионин-8-оксид (Met(O)), (Orn), (Gin), βциклопропилаланин (β-Сра), четвъртичен левцин (Tie) или хомо-серин (Hse).
Особено предпочитани са тези съединения от формула (I), в които R1 е група, избрана от формулите (1) до (34):
H-Chg (1) H-Tle (18)
h-Lys (2) H-Hyl (19)
h-Nle (3) H-Hse (20)
Η-Ala (4) Cg-Gly (21)
H-Hyn (5) Cg-Nle (22)
H-Pro (6) Cg-Val (23)
H-Phg (7) Cg-Met (24)
H-GIn (8) H-Xxx-Lys (25)
H-trans-Hyp (9) H-Xxx-Hyn (26)
H-Val (10) H-Xxx-Pro (27)
H-Cha (11) H-Xxx-His (28)
H-Met (12) H-Xxx-Met (29)
H-Nva (13) H-Xxx-Ala (30)
H-Met(O) (14) Cg-Xxx-Hyn (31)
Η-β-Сра (15) Cg-Xxx-Ala-Gly (32)
H-lle (16) Cg-(Xxx)m-Xxx-Ala-Gly (33)
H-Ser (17) Cg-(Xaa)m-Xaa-Gly (34)
където
Сд представлява водороден атом или предпазваща група, избрана между бензоилоксикарбонил, фенилацетил, фенилметилсулфонил и бензиламинокарбонил; Хаа представлява радикал, произхождащ от аминокарбоксилна киселина, за предпочитане избрана от групата на природните аминокиселини, в частност от групата, включваща Ala, Pro, Tyr, Phe, His, Ser, Thr, Hyp и Lys; и m е число от 1 до 6.
Предпочитани предпазващи Cg-групи са ацетил (Ас), сукцинимидил (Sue), D-аланил, бензилоксикарбонил (Cbz или Z) или макромолекули като например полиетиленгликол.
Предпочитани антрациклинови пролекарства са съединенията от формула 111
където Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf и R1 са според дефинираните по-горе.
Най-предпочитани съединения в изобретението са доксорубицинова производни от формулите (IIIA) до (IIIF):
Ако частта Cg-B-A или Cg-(D)m-B-A от формула (I) съдържа два или повече серни атома, съединението от изобретението може да съдържа една или повече дисулфидни връзки.
Един клас цитотоксични или цитостатични съединения, който може да бъде използван по настоящото изобретение има първична амино-функция, която е достъпна за образуване на амидна връзка, както е показано във формула (I), и такъв е например доксорубицин. В този случай не е необходима свързваща молекула L. Ако цитостатичното или цитотоксично съединение няма такава аминофункция, такава функция може да бъде създадена в подобно съединение по пътя на химичната модификация, напр. чрез включване или преобразуване на функционална група или чрез свързване на Lмолекула към съединението. Свързваща молекула може също така да бъде включена между олигомерната част (т.е, частта, съдържаща аминокарбоксилните остатъци) и цитостатичната или цитотоксична част на съединението от изобретението, за да се осигури или оптимизира разкъсването на амидната връзка между олигомерната част и цитотоксичната или цитостатична част. Ако свързваща молекула е налице, т.е в съединения, съдържащи структурата L-Cyt’, връзката между L и Cyt’ е предпочитано амидна или естерна връзка. В предпочитания вид такава свързваща молекула е отхидролизирана от цитостатичното или цитотоксично съединение при физиологични условия след ензимното разкъсване и така се създава свободно цитостатично или цитотоксично съединение. Във всеки случай съединението в изобретението трябва да има свойството да се разкъсва от каталитичното действие на FAPa и като директно или индиректно следствие от това разкъсване да освобождава при физиологични условия цитотоксично или цитостатично съединение.
В по-нататъшен аспект, настоящото изобретение се отнася до пролекарство, което е способно да бъде преобразувано до лекарство чрез каталитичното действие на FAPa, като посоченото пролекарство има място на разцепване, което се разпознава от FAPa и посоченото съединение е цитотоксично или цитостатично при физиологични условия. Такова пролекарство за предпочитане съдържа олигомерна част, включваща 2 или повече аминокарбоксилни остатъка и цитотоксична или цитостатична част, в която аминокарбоксилния остатък при С-края на олигомерната част е 3- до 7-членна природна или неестествена циклична аминокиселина, за предпочитане D- или Lпролин, или D- или L-хидроксипролин, и С-крайната карбоксилната функция е свързана с цитотоксичната или цитостатична част чрез амидна връзка, която може да бъде разкъсана от каталитичното дейстрие на FAPa. Олигомерната част предпочитано е пептид. Предпочитано, олигомерната част съдържа два, три, четири, пет, шест, седем, осем, девет, десет, единадесет или дванадесет аминокарбоксилно-киселинни остатъка, по-предпочитано два, три или четири аминокарбоксилни остатъка. Амино-функцията при N-края предпочитано е защитена чрез предпазваща група.
Съединенията от изобретението могат да бъдат синтезирани чрез процеси, познати в областта (Е. Wunsch, Syntheses von Peptiden, в “Methoden der organischen Chemie”, Houben-Weyl (Eds. E. Muller, O. Bayer), том XV, част 1 и 2, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974). Например, съединенията могат да бъдат синтезирани по блоковосинтетичен начин чрез кондензиране на крайната карбокси-функция на олигомерната част, където X може да е ОН или активираща отцепваща се група, с амино-групата на цитотоксичната или цитостатична молекула H2N-Cyt’, образувайки амидна формация.
Ако е необходим свързващ остатък (L) между олигомерната част и цитотоксичния или цитостатичен агент блоковата синтеза може да бъде извършена по същия начин.
-нх1
+ X1OC—Cyt' ----- НХ1 + x1oc-cyt' ----*
- НХ1
Ако цитотоксичният или цитостатичен реагент носи карбоксиФ функция за свързването към олигомерната част, свързваща молекула може да бъде имино- или амино-алкохол и блоковата синтеза на такива съединения може да бъде извършена по подобен начин чрез реакция на активирания XOC-Cyt’ с хидроксилния или аминокомпонент.
Ако цитотоксичният или цитостатичен реагент има хидроксифункция, която е подходяща за свързване към олигомерната част, свързващият остатък може да бъде аминокарбоксилна киселина и блоковият синтез може да бъде извършен по сходен начин.
Ако е необходимо, други функционални групи в единиците Cyt’, L, хидроксипролин, А, В и D, които ще реагират по време на образуването на прицелните молекули, могат да бъдат защитени чрез подходящи защитни групи. Подходящи защитни групи са добре известни от състоянието на техниката (Р. G. Wuts, “Protective groups in organic synthesis”, John Wiley and Sons Inc., New York 1991). Тези защитни групи са отделят в края на синтеза.
Посочени само като пример, подходящи амино-защитни групи могат да включват Ci-Сю-алканоилни групи като формил, ацетил, дихлороацетил, пропионил, 3,3-диетилхексаноил и подобни, СгСюалкоксикарбонилни групи и С6-С-|7-аралкилоксикарбонилни групи като четвъртичен бутоксикарбонил, бензилоксикарбонил (ВОС), флуоренилметоксикарбонил и подобни. Най-предпочитан е флуоренил метоксикарбонил (FMOC).
Подходящи карбокси-защитни групи могат да включват, например, СгСю-алкилни групи като метил, четвъртичен бутил; Св-С17аралкил като бензил, 4-метоксибензил, дифенилметил, трифенилметил, флуоренил; три-(С1-С10-алкил)силил или (СгСюалкил)-диарилсилил като триметилсилил, диметил-четвъртиченбутилсилил, дифенил-четвъртичен-бутилсилил и други подобни групи.
За да се получат такива естерни или амидни образувания, може да бъде необходимо да се активира карбонилната група на карбоксилната киселина за нуклеофилна атака на амин или алкохол, т.е. X да е активираща или отцепваща се група, която е подходяща за заместване от амино-група. Тази активация може да бъде извършена чрез превръщане на карбоксилната киселина в кисел хлорид или кисел флуорид, или чрез превръщане на карбоксилната киселина в активиран естер, напр. N-хидроксисукцинимидилов естер или пентафлуорфенилов естер. Друг метод на активация е трансформацията в симетричен или несиметричен анхидрид. Алтернативно, образуването на амидната или естерна връзка може да бъде постигнато чрез използването на in situ свързващи реагенти, като бензотриазол-1-ил-окси-трис-пиролидино-фосфониев хексафлуорофосфат (РуВОР) (Е. Frerot et al., Tetrahedron, 1991, 47, 259-70), 1,1’карбонилдимидазол (CDI) (K. Akaji et al., THL, 35, 1994, 3315-18), 2— (1 Н-бензотриазол -1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурониев тетрафлуороборат (TBTU) (R. Knorr et al., THL, 30, 1989, 1927-30), 1-(мезитилен-2сулфонил)-3-нитро-1 H-1,2,4-триазол (MSNT) (В. Blankenmeyer-Menge et al., THL, 31, 1990, 1701-04).
Като алтернатива на блоковия синтез молекулите от общата формула (I) могат да бъзат свързани чрез поетапен метод, започвайки от дясната страна чрез постепенна кондензационна реакция на съответните мономери Cyt’, L, цикличната аминогрупа, образувана от Ra, Rb и вмъкнатата N-С група, в частност пролин или хидроксипролин, А, В и D. За кондензационната реакция могат да бъдат приложени същите методи на свързване, споменати по-горе. Тъй като единиците L, продин/хидроксипролин, А, В и D са поне бифункционални молекули, съдържащи една амино- (поне единиците А, В, D и цикличната аминогрупа, образувана от Ra, Rb и вмъкнатата N-С група, в частност пролин/хидроксипролин) и една карбокси-група, амино-групата трябва да бъде блокирана от защитната група (PG) преди активацията на карбоксилната функция. За защитата на амино-групите може да се използва групата ВОС или предпочитано групата FMOC. След реакцията на свързване амино-защитната група трябва да бъде отделена и може да се извърши свързването със следващата FMOCили ВОС-защитена единица. Ако е необходимо, други функционални групи в единиците Cyt’, L, цикличната аминогрупа, образувана от Ra, Rb и междинната N-С група, в частност хидроксипролин, А, В и D, които няма да реагират по време на свързването на прицелните молекули, могат да бъдат защитени чрез подходящи защитни групи. Тези защитни групи се отделят на края на синтеза.
Предпазващи групи, дефинирани в контекста на формула (I), могат също така да служат като защитни групи, в частност когато се добавя последната (N-крайна) аминокарбоксилно-киселинна единица. В последния случай защитната група не се отделя и е част от прицелната молекула. Алтернативно, предпазващата група може да бъде добавена след като последната аминокарбоксилно-киселинна единица е свързана и освободена от защита.
Поетапният синтез е скициран в следващите схеми. Втората схема е пример как свързващият остатък, както и Cyt’-остатъкът могат да съдържат други функционални групи, посочени в тази схема (виж по-горе):
Ο Η 2Νχ ANxCyt'
Η
-PG
-PG
Cyt'
Съответно, друг аспект на изобретението е процесът на производство на съединение от формула (I), характеризиращ се с това, че съединение от общата формула (V)
където R1, Ra и Rb са както определени по-горе, X1 представлява ОН или отцепваща се група, подходяща за заместване от амино-група, реагира със съединението HN(R4)-Cyf, където Cyf е остатъкът от цитотоксичното или цитостатично съединение и R4 е според определението по-горе.
Предпочитано, X1 от формула (V) е отцепваща се група, напр. -CI, -F, N-хидроксисукцинимидил, пентафлуорофенил или карбоксилат. Алтернативно, X1 може да бъде ОН и кондензирането се постига чрез използването на in situ свързващ реагент, напр. бензотриазол-1-илокси-трис-пиролидино-фосфониев хексафлуоро-фосфат (РуВОР), 1,1’карбонилдимидазол (CDI), 2-( 1 Н-бензотриазол-1 -ил)-1,1,3,3 тетраметилурониев тетрафлуороборат (TBTU) или 1-(мезитилен-2сулфонил)-3-нитро-1 Н-1,2,4-триазол (MSNT).
Друг аспект на изобретението е процес на производство на съединение от формула (I), характеризиращ се с това, че съединението от общата формула (VI)
(VI) където R1, Ra и Rb са както определени в претенция 1, Y1 представлява L-COX2, където L е свързващ остатък и X2 представлява ОН или отцепваща се група, подходяща за заместване от амино- или хидрокси-група, реагира със съединението H2N-Cyt’ или със съединението HO-Cyt’, където Cyt’ е остатъкът от цитотоксичното или цитостатично съединение.
Предпочитано X2 от формула (VI) е отцепваща се група, напр. -CI, -F, N-хидроксисукцинимидил, пентафлуорофенил или карбоксилат. Алтернативно, X2 може да бъде ОН и кондензирането се постига чрез използването на in situ свързващ реагент, напр. бензотриазол-1-илокси-трис-пиролидино-фосфониев хексафлуоро-фосфат (РуВОР), 1,1’карбонилдимидазол (CDl), 2-(1 Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3тетраметилурониев тетрафлуороборат (TBTU) или 1-(мезитилен-2сулфснил)-3-нитро-1 Н-1,2,4-триазол (MSNT).
Друг аспект на изобретението е процесът на производство на съединение от формула (I), характеризиращ се с това, че съединение от общата формула (VII)
(VII) където R1, Ra и Rb са както определени в претенция 1, Y2 е от формулата L-ОН или L-NH2, където L е свързващ остатък, реагира със съединението X3OC-Cyt’, където X3 може да бъде ОН или отцепваща се група, подходяща за заместване от амино- или хидроксигрупа, и където Cyt’ е остатъкът от цитотоксичното или цитостатично съединение.
Предпочитано X3 от формула (VI) е отцепваща се група, напр. -CI, -F, N-хидроксисукцинимидил, пентафлуорофенил или карбоксилат. Алтернативно, X3 може да бъде ОН и кондензирането се постига чрез използването на in situ свързващ реагент, напр. бензотриазол-1-илокси-трис-пиролидино-фосфониев хексафлуоро-фосфат (РуВОР), 1,1’карбонилдимидазол (CDI), 2-(1Н-бензотриазол-1-ил )-1,1,3,3тетраметилурониев тетрафлуороборат (TBTU) или 1-(мезитилен-2сулфонил)-3-нитро-1Н-1,2,4-триазол (MSNT).
Друг аспект на изобретението е процес на производство на съединение от формула (I), характеризиращ се с това, че съединението H2N-Cyt’ се кондензира поетапно с единиците, образувайки съединението от формула (I). Преди всеки етап на свързване може да е необходимо да се отдели защитната група PG, ако има такава.
Съответно, друг аспект на изобретението е процес на производство на съединение от формула (I), характеризиращ се с това, че съединение от общата формула (VIII)
PG« О (VIII) където PG1 е защитна група, а другите заместители имат значението, посочено по-горе, реагира със съединението HN(R4)-Cyt’, където Cyt’ е остатъкът от цитотоксичното или цитостатично съединение;
защитната PG1 група след това се отделя и получаващото се съединение от формула (VI НА)
О (VIIIA) след това реагира със съединение PG2-A-X4, където PG2 представлява защитна група и X4 представлява ОН или отцепваща се група, подходяща за заместване от амино- или хидроксигрупа;
като се провеждат и други стъпки на свързване, ако е необходимо, до получаване на пълното съединение.
PG1 и PG2 могат да бъдат, например, ВОС или за предпочитане FMOC.
Съответно, друг аспект на изобретението е процес на производство на съединение от формула (I), характеризиращ се с това, че PG3-N(R4)-LСОХ3, където PG3 е защитна група, а другите заместители имат значението, посочено по-горе, реагира със съединението Y4-Cyt’, където Cyt’ е остатъкът от цитотоксичното или цитостатично съединение;
Y4 представлява H2N или НО;
защитната група РС3след това се отделя; и полученото съединение HN(R4)-L-Y4-Cyt’ реагира със съединение от формула (VIII)
защитната група PG1 се отделя и полученото съединение от формулата
N-L-Y4-Cyt
R4 йиам след това реагира със съединение PG4-A-X4, където PG4 е защитна група, a X4 може да бъде ОН или отцепваща се група, подходяща за заместване от амино-група;
като могат да бъдат извършени и други стъпка на свързване, ако е необходимо, докато се получи пълната молекула.
Друг аспект на изобретението е процес за производство на съединение от формула (I), характеризиращ се с това, че съединение от формулата PG5-N(R4)-L-Y5, в която
PG5 представлява защитна група, Y5,представлява ОН или NH2 и заместителите имат значението, посочено по-горе, реагира със съединение от формула X5OC-Cyt’, в която
Cyt’ е остатъкът от цитотоксично или цитостатично съединение и X5 е ОН или подходяща отцепваща се група;
защитната група РС5след това се отделя и полученото съединение HN(R4)-L-Y5-CO- Cyt’ реагира със съединение от формула (VIII)
PG< О (VIII) като защитната група се отделя и полученото съединение
след това реагира със съединение PG2-A-X4, където PG2 е защитна група, a X4 представлява ОН или отцепваща се група, подходяща за заместване от амино-група;
като се извършват и други стъпка на свързване, докато се получи пълната молекула.
Друг аспект на настоящото изобретение са новите междинни съединения от формула VIIIA,
О (VIIIA) в която Ra, Rb, R4 и Cyf са според дефинициите по-горе.
Съединенията от изобретението са за употреба в медицинската практика. В частност, тези съединения са подходящи за лечението на тумори, които се характеризират със фибробласти в стромата, експресиращи FAPa, и които по принцип не се лекуват оптимално с наличните цитотоксични и/или цитостатични агенти. Тумори с такова свойство са например епителни карциноми като тези на белия дроб, млечната жлеза и на дебелото черво. Тумори, като например саркоми на костите и на меките тъкани, които експресират FAPa, също така могат да бъдат лекувани с тези съединения.
Следователно, друг аспект на настоящото изобретение са фармацевтични състави, включващи съединение от настоящото изобретение и евентуално един или повече подходящи и фармацевтично приемливи ексципиенти, както са посочени примерно в: Remington: the science and practice of pharmacy. 19fh ed. Easton: Mack Publ., 1995. Фармацевтичните състави могат да бъдат изготвени като твърди вещества или разтвори. Твърдите форми могат да бъдат предназначени за изготвяне на разтвор преди инжекция. Предпочитано, фармацевтичните състави от изобретението са разтвори за инжектиране. Те могат да бъдат прилагани системно, напр. чрез интравенозна инжекция, или локално, напр. чрез директно инжектиране в мястото на тумора. Дозировката следва да бъде уточнена съгласно фактори като телесното тегло и здравословното състояние на пациента, характерът на основното заболяване, терапевтичният прозорец на прилаганото съединение, разтворимостта му и други подобни. Познанията на специалиста ще дадат възможност за правилно определяне на дозировката. За доксорубицинови производни, например, дозата предпочитано ще бъде в границите от 10 мг/м2 до 1350 мг/ м2, но може да се наложи използването и на помалки или по-големи дози.
Съответно, друг аспект на настоящото изобретение е използването на съединение от изобретението в изготвянето на фармацевтичен състав за лечение на карцином. Освен това, аспект на изобретението е метод за лечение на карцином, включващ прилагането при пациент на ефективно количество от фармацевтичен състав според изобретението. Индикациите включват лечението на карциноми, особено
1) Лечението на епителни карциноми, включително на млечната жлеза, белия дроб, колоректални, на главата и шията, панкреаса, яйчниците, жлъчния мехур, стомаха, кожата, ендометриума, тестисите, хранопровода, простатата и с бъбречен произход;
2) Саркоми на костите и меките тъкани: остеосаркоми, хондросаркоми, фибросаркови, злокачествен фиброзен хистиоцитом (MFH), лейомиосарком;
3) Хематопоетични злокачествени заболявания: Ходжкинов и НеХоджкинови лимфоми;
4) Невроектодермални тумори: тумори на периферните нерви, астроцитоми, меланоми;
5) Мезотелиоми.
Включва се и лечението на хронични възпалителни състояния като ревматоиден артрит, остеоартрит, чернодробна цироза, белодробна фиброза, артериосклероза и абнормно заздравяване на рани.
Друг аспект на изобретението е метод за лечение на карциноми, при който на пациента се прилага пролекарство и това пролекарство може да бъде преобразувано в цитотоксично или цитостатично лекарство чрез ензимна активност, а посочената ензимна активност е продуктът на експресия на клетки, свързани с туморната тъкан. Предпочитано, тази ензимна активност е протеолитичната активност на FAPa.
Методът за прилагане на съединенията предпочитано е интравенозната инфузия. Други възможни пътища на прилагане включват интраперитонеалната (като болус или инфузия), интрамускулна или интратуморна инжекция. Ако е удачно, възможно е осъществяването и на директно приложение (например при белодробна фиброза).
Фигури
Фигура 1: Разцепване на доксорубицин-пептидните конюгати от FAPa. Хроматограми за ZGP-Dox (Z-Gly-(L)-Pro-Doxorubicin) след инкубация с пречистен FAPmCD8 фузионен протеин (А) или с буфер (В). Виж пример 5.
Фигура 2: Намаляване на доксорубициновата цитотоксичност чрез конюгиране на доксорубицина към пептиди, разкъсвани от FAPa. Виж пример 6.
Фигура 3: Демонстрация на цитотоксичността на доксорубицин, освободен от разцепени от FAPa доксорубицин-пептидни конюгати в FAPa-експресиращи клетки НТ1080 клон 33 спрямо родоначални НТ 1080 клетки. Виж пример 8.
Фигура 4: Плазмена стабилност на A/-Cbz-Gly-(L)-Pro-Doxorubicin и NCbz-(L)-Pro-(L)-Ala-Gly-(L)-Pro-Doxorubicin в плазма на мишка и човек. Виж пример 9.
Фигура 5: Демонстрация на FAPa-ензимната активност и потвърждение на неговото молекулно тегло в проби от човешка туморна тъкан. Виж пример 12.
Специалист в областта ще прецени, че специфичните реагенти и реакционните условия са само скицирани в следващите примери, като могат да бъдат направени модификации, считани за част от областта на действие на изобретението. Следващите примери, следователно, са с цел да илюстрират изобретението и не са ограничаващи.
Примери за изпълнение на изобретението
Пример 1: Процедури за синтеза на доксорубицинови конюгати
N-Cbz-Gly-Pro-Doxorubicin: /V-Cbz-Gly-Рго (116.1 мг, 0.37 ммол) и Nхидрокси-сукцинимид (44 мг, 0.37 ммол) се измерват и се поставят в двугърлена плоскодънна колба в азот. Добавя се безводен Ν,Νдиметилформамид (20 мл) и колбата се изстудява до 0°С в ледена баня. Добавя се дициклохексилкарбодиимид (78 мг, 0.37 ммол) като 1 мл. разтвор в Л/,Л/-диметилформамид. Разтворът се бърка при 0°С за 40 минути.
Измерва се Doxorubicin«HCI (100 мг, ммол), разбърква се с малка пръчка в стъкленица и се поставя в азот. Λ/,/У-диметилформамид (3 мл) и Л/,Л/-диизопропилетиламин (33.1 μπ, 0.19 ммол) се добавят при бъркане в стъкленицата. Доксорубициновият разтвор се добавя чрез спринцовка към пептидния разтвор и стъкленицата се изплаква с допълнителни 2 мл А/,А/-диметилформамид. Премахва се ваничката с лед и реакционната смес се бърка за около 48 часа при стайна температура.
Реакционният разтвор се извлича с етилацетат (500 мл). Етилацетатът се промива последователно с 10% воден разтвор на лимонена киселина (250 мл), наситен воден разтвор на натриев бикарбонат (250 мл) и солен разтвор (250 мл). Органичният екстракт се изсушава с безводен MgSO4 и солвентът се отделя с ротационен изпарител. Продуктът, който е значително контаминиран с DMF, се хроматографира върху обратно-фазова С-18 колона с 8:2 метанол, като водата е елуент. Изолира се оранжево петно с rf ® 0.3, което флуоресцира при дълговълнова UV-светлина. Метанолът се отделя чрез ротационен изпарител и последните следи от разтворителя се отстраняват за една нощ чрез високовакуумна помпа.
/V-Cbz^Pro-Ala-Gly-Pro: A/-Cbz-Pro-Ala (5 гр., 15 ммол) и карбонилдиимидазол (2.43 гр., 15 ммол) се поставят в 250-мл-ова тригърлена плоскодънна колба в аргонова атмосфера. Добавя се безводен тетрахидрофуран (50 мл) и разтворът се бърка при стайна температура за около 45 мин. Наблюдава се мощно образуване на газ (СО2). В отделна колба се претегля Gly-Pro-OCH3»HCI (2,9 гр., 15 ф ммол). Добавят се тетрахидрофуран (5 мл) и Ν,Νдиизопропилетиламин (5.23 мл, 30 ммол) и разтворът се бърка няколко минути. Разтвореният материал се добавя чрез спринцовка към активирания пептид, останалият материал се разтваря в минимално количество СН2С12 и също така се добавя към активирания пептид чрез спринцовка.
Реакционният разтвор се бърка за една нощ при стайна температура (15 часа) и на сутринта се установяват големи количества бял преципитат. Реакционната смес се промива с 10% воден разтвор на ф лимонена киселина (300 мл) е се екстрахира с етилацетат (500 мл).
Етилацетатът се промива с наситен воден разтвор на бикарбонат (300 мл) и се изсушава със солен разтвор (300 мл) и безводен MgSO4. Етилацетатът се отделя с ротационен изпарител до получаване на 5 гр. безцветно масло, което има задоволителни характеристики.
Суровото масло на A/-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro-OCH3 (5 гр., 12 ммол) се разтваря в метанол (20 мл) в кръгла плоскодънна колба. Колбата се поставя във водна баня при температура на околната среда. 1N разтвор на натриев хидроксид (12 мл) се добавя внимателно.
Разтворът се бърка за 3.5 часа, след което се добавя 1N HCI разтвор (12 мл). Разтворът се концентрира в ротационен изпарител и се добавят още няколко капки 1N HCI до получаване на pH от 1.5 върху pH хартия. Водата се отстранява с вакуумната помпа до получаване на масло, което прекристализира бавно от етанол.
/V-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro-Doxorubicin: /V-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro (180 мг, 0.38 ммол) се разтваря в безводен Л/,Л/-диметилформамид (15 мл). 1хидроксибензотриазол (51.3 мг, 38 ммол) и дициклохексилкарбодиимид (78 мг, 38 ммол) се разтварят поотделно в по 1 мл Λ/,/νдиметилформамид и се добавят като разтвори към пептида. Реакционната смес се бърка при стайна температура за 45 минути.
Doxorubicin*HCI (116 мг, 20 ммол) се претегля в отделна стъкленица и се разтваря в Л/,Л/-диметилформамид (3 мл). Ν,Νдиизопропилетиламин (34.8 μη, 20 ммол) се вкарва чрез спринцовка в стъкленицата, съдържаща доксорубицина, и съдържанието се бърка за няколко минути, за да се получи пълно разтваряне. Разтворът на доксорубицин се добавя чрез спринцовка към активирания пептид. Разтворът се бърка за 48 часа при стайна температура.
Продуктът се екстрахира с етилацетат (2 л) и се промива с 10% воден разтвор на лимонена киселина (500 мл). Етилацетатният слой се отделя, изсушава се с MgSO4n се концентрира с ротационен изпарител до получаване на масло. Маслото се хроматографира върху С-18 обратно-фазов кварцов гел, който дава оранжево, UV-дълговълново флуоресценцтно петно при rf = 0.25. Крайният продукт има задоволителни характеристики.
Пример 2: Изготвяне на FAPa-експресиращи клетъчни линии
Изготвят се клетъчни линии от бозайници, експресиращи рекомбинантен FAPa. Фибросаркомни НТ 1080 клетки, широко известни и достъпни от DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany) под DSMZ номер ACC 315, ce държат в DMEM/F12 смес 50:50, съдържаща 10% фетален говежди серум в атмосфера от 95% въздух и 5% СО2. НТ 1080 клетките се трансфектират с FAP.38 вектор (WO 97/34927, Scanlan et al„ /ос. cit.), използвайки липофектиновия метод съгласно инструкциите на производителя (Gibco/BRL). Трансфектантите се селектират за резистентност към антибиотици (200 цгр/мл Geneticin) и след това се държат в среда, съдържаща Geneticin. Вземат се отделни колонии от резистентни клетки, които нарастват до конфлуиране в 10 см.-петри за тъканни култури и се тестуват за FAPa-експресия в имунофлуоресцентен анализ, използвайки FAPa-специфичното моноклонално антитяло F19, както е описано (Garin-Chesa et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(18), 7235-7239). Родоначалната HT 1080 клетъчна линия не показва FAPa-експресия при този имунофлуоресцентен анализ, докато един клон, упоменаван след това като НТ 1080 клон 33, е положителен за FAPa.
По сходен начин човешки ембрионални бъбречни 293 клетки, широко известни и достъпни от American Tissue Type Collection (Rockville, MD) се държат в DMEM, съдържащ 10% фетален говежди серум, в атмосфера от 95% въздух и 5% СО2. Клетките се трансфектират с FAPa-експресионен вектор, pFAP.38, използвайки трансфекция с калциев фосфат, както е описано (Park, J.E., Chen, Η. Н., Houck, Κ. A. & Ferrara, N. (1994). Placenta growth factor. Potentiation of vascular endothelial growth factor bioactivity, in vitro and in vivo, and high affinity шмм·· binding to Flt-1 but not to Flk-1/KDR. J. Biol. Chem. 269(41), 25646-25654). Трансфектантите са избрани и анализирани, както е описано по-горе за FΑΡα-експресията. Родоначалната 293 клетъчна линия не показва FAPa-експресия. Един клон, упоменаван по-долу като 293-I/2, е FAPaположителен.
Пример 3: Изпитване на FAPa-експресия в трансфектирани клетъчни линии
FAPa-експресия е изпитвана при НТ 1080 и НТ 1080 клон 33 клетки. Метаболитно маркиране, имунопреципитации и флуорография са извършени основно по описаните начини (Park et al, (1991) Somatic Cell Mol. Gent. 17(2), 137-150). HT 1080 и HT 1080 клон 33 клетки са маркирани метаболитно с 358-метионин. Детергентни екстракти от тези клетки са имунопреципитирани с моноклонално антитяло F19 или с lgG1 антитяло като отрицателна контрола. Преципитатите са сварени в буферна проба и отделени чрез електрофореза с натриев додецилсулфатен гел (както е описано от Laemmli (1970) Nature 227(259), 680685). Извършеният флуорографски анализ на образувания гел е доказал, че НТ 1080 клон 33 клетки произвеждат FAPa протеин. Не е установен FAPa протеин в екстракти от родоначалните НТ 1080 клетки, нито в имунопреципитати с lgG1 от мишки.
Пример 4: Разтворим рекомбинантен FAPa
Изготвена е разтворима рекомбинантна форма на FAPa по следния начин. (ДНК, кодираща екстрацелуларната област (ECD) на миша CD8a (Genbank Μ12825), състояща се от 189 аминокиселини при Νкрая на CD8a, е свързана към сДНК, кодираща екстрацелуларната област на FAPa (аминокиселини 27 до 760), образувайки фузионна протеинова конструкция FAPmCD8, сходна по структура с CD8a-CD40 лигандния фузионен протеин, както е описано (Lane et al. (1993) J. Exp. Med. 177(4), 1209-1213). сДНК са ферифицирани чрез установяване на последователностите и включени в pVL1393 вектора. Извършени са трансфекция на Sf9 клетки и амплификация на получения рекомбинантен бакуловирус според описания способ (O’Reilly (1994) Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press, New York). Културелният супернатант от High Five-клетки, инфектирани c рекомбинантен FAPmCD8 бакуловирус са събирани в рамките на четири дни и са пречиствани чрез ултрацентрофугиране. FAPmCD8 фузионният протеин е пречистен от такива супернатанти чрез анти-FAPa моноклонално антитяло, имобилизирано върху активирани агарозни зърна (Pierce Chemical, Indianapolis, IN, USA). Културелният супернатант е прекаран през антитяло-афинитетна колона и елуиран чрез pH-изместване посредством 0.1 М цитратен буфер. Пробите са неутрализирани незабавно с наситен Tris-разтвор (Sigma Chemicals, St. Louis, МО) и протеин-съдържащите фракции са обединени.
Пример 5: Измерване на разцепването на доксорубицин-пептидните конюгати
Пробите са разделяни чрез обратнофазова високоефективна течна хроматография (HPLC), като анализът е извършен за оценка и измерване на разцепването на доксорубицин-пептидните конюгати. HPLC-системата се е състояла от уред за вземане на проби тип Waters 717 autosampler, оборудван с 100-микролитрова (цп) дозираща тръбичка (бримка) и две помпи модел Waters 510 за вкарване на разтворителя. Сепарациите са извършвани при изократни условия при скорост на потока 0.7 мл/мин върху Nucleosil С-18 колона, с дължина 100 мм х 4 мм I.D. и 5 цм размер на частиците (Dr. Ing. Н. Knauer GmbH, Berlin). Подвижната фаза се е състояла от метанол:вода (70:30, обем/обем), съдържаща 0.2 амониев ацетат при pH 3.2. Свободният доксорубицин и доксорубицин-пептидните конюгати са откривани чрез флуоресценция (възбуждане 475 мм; излъчване 585 мм) посредством Waters 474 флуоресцентен детектор. Инжектирането, вкарването на разтворителя, получаването на данните и тяхната обработка са извършвани чрез софтуерния хроматографски пакет Millenium 2010 (Waters Corp., Milford, MA, USA). Субстанциите за тестуване първо са разтваряни в диметил-сулфоксид в концентрация 5тМ и след това разреждани във воден разтвор преди поставянето им върху HPLCколоната.
Изследвана е способността на разтворимия рекомбинантен FAPaензим да отделя свободен доксорубицин от доксорубицин-пептидни конюгати. Изходни разтвори на доксорубицин-пептидни конюгати (5 тМ) са разредени с Hepes-буфериран солен разтвор с pH 7.4 до крайна концентрация от 50 до 100 μΜ. Двадесет μπ от получения разтвор са смесени с 50 μπ пречистен FAPmCD8 фузионен протеин (около 20 нгр.), описан по-горе, и с 30 μπ Hepes-буфериран солен разтвор с pH 7.4. Сместа е инкубирана при 37°С за 1 ден и отделянето на свободен доксорубицин е измерено в описания HPLC-анализ. Областите под всеки пик са определяни количествено чрез софтуерния пакет, посочен по-горе, и началната стойност е определена на 100%. Степента на отделяне на свободен доксорубицин е измерена чрез появата на пик със същото време на задържане, както за свободния доксорубицин при тези HPLC-условия. Областите под всеки пик са използвани за изчисляване на относителните количества свободен доксорубицин към доксорубицин-пептидния конюгат. Извършено е интегриране на пиковите области, за да се определи процентното отделяне, като е използван софтуерния хроматографски пакет
Millenium 2010, посочен по-горе. Както се вижда на хроматограмите за ZGP-Dox (/V-Cbz-Gly-Pro-Doxorubicin), показани на фигура 1, доксорубицин-пептидният конюгат може да бъде преобразуван до свободен доксорубицин след инкубация с пречистен FAPmCD8 фузионен протеин, като времето на задържане на конюгата не е променено от инкубацията с буфер.
Пример 6: Намаляване цитотоксичността на доксорубицин чрез конюгиране с FAPa-отцепвани пептиди
Определена е способността на FAPa-отцепвани пептиди да блокират цитотрксичното действие на доксорубицин върху FAPa-негативни, доксорубицин-чуствителни клетки. К562 клетки, налични в American Type Tissue Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC Number: CCL243) са засяти в 96 ямкови плата (Greiner Scientific) при плътност от 1000 клетки/гнездо. Свободна от серум клетъчно-културелна среда, съдържаща различни концентрации свободен доксорубицин или еквивалентни моларни концентрации доксорубицин-пептидни конюгати, са добавени към клетките. След 4 дни е определен клетъчният брой чрез автоматизиран брояч на клетки CASY™ (Scharfe System GmbH, Reutlingen, Germany). Резултатите са показани на Фигура 2.
Пример 7: Отделяне на свободен доксорубицин от клетъчно-свързан FAPa
Изследвана е способността на клетъчно-свързан FAPa ензим да освобождава доксорубицин от доксорубицин-пептидни конюгати. Всяко съединение е разтворено в свободна от серум клетъчно-културелна среда при крайна концентрация от 1 μΜ. Десет милилитра от този разтвор е добавен към конфлуиращи единични слоеве от НТ1080 или
НТ1080 клон 33 клетки в блюда с 10 см. тъканна култура за 19 часа при
37°С. Средата е отделена и освобождаването на доксорубицин е измерено според описаното в пример 5. FAPa-експресиращата клетъчна линия, НТ1080 клон 33, е преобразувала 81% и 43% от ZGPDox (N-Cbz-Gly-Pro-Doxorubicin) и ZPAGP-Dox (A/-Cbz-Pro-Ala-Gly-ProDoxorubicin) конюгатите в свободен доксорубицин при същите условия. Наблюдавано е малко или липсващо превръщане на ZPAGP-Dox в свободен доксорубицин от родоначалната НТ1080 клетъчна линия при тези условия.
Пример 8: Убиване на чуствителни клетки от FAPa-освободен доксорубицин
Определена е способността на FAPa да създава свободен доксорубицин, способен да убива доксорубицин-чуствителни клетки. К562 клетки, налични в American Type Tissue Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC Number: CCL-243) са засяти в 96 ямкови плата (Greiner Scientific) при плътност от 1000 клетки/гнездо. Свободна от серум клетъчно-културелна среда, съдържаща 1 μΜ доксорубицинпептиден конюгат, е добавена към блюда с НТ1080 или НТ1080 клон 33 клетки за 19 часа при 37°С. Средата е отделена и освобождаването на доксорубицин е доказано както в пример 5. Шестдесет и шест милилитра от тази среда след това е добавена към гнездо с К562 клетки. След 4 дни броят на клетките е определен чрез автоматизиран брояч на клетки CASY™. Резултатите са показани във Фигура 3.
Пример 9: Плазмена стабилност на доксорубицин-пептидни конюгати
Плазмената стабилност на доксорубицин-пептидни конюгати е измерена чрез методите, описани в пример 5. Проби, съдържащи доксорубицин-пептидни конюгати (при концентрация 1 μΜ) са iiMfessa»;
инкубирани в присъствието на 10% (обем/обем) миша или човешка плазма за времена, посочени при 37°С. Резултатите за ZGP-Dox и ZPAGP-Dox в миша и човешка плазма са показани на Фигура 4.
Пример 10: FAPa-катализирано разкъсване на селектирани 4метокси-р-нафтиламид-пептидни конюгати
За да се определят предпочитани FAPa-пептидни субстрати, са синтезирани олигомери, съставени от природни и/или неестествени аминокарбоксилни киселини, и те са свързани с пролин-4-метокси-3нафтиламид (Pro-MNA) чрез методите, известни в областта (Е. Wiinsch, Synthese von Peptiden, in Methoden der organischen Chemie, Houben-Weyl (Eds. E. Muller, 0. Bayer), Vol. XV, раздел 1 и 2, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974).
Синтез на Рго-Рго-4-метокси-р-нафтиламид:
Boc-Pro (32 мг, 0,15 ммол), 2-(1 Н-бензотриазол-1-ил )-1,1,3,3тетраметилуорониев тетрафлуороборат (53 мг, 0.15 ммол) и Рго-4метокси-р-нафтиламид-хидрохлорид (46 мг, 0.15 ммол) са разтворени в безводен Ν,Ν-диметилформамид/тетрахидрофуран 1:1 (4 мл). Добавен е N-етилдиизопропиламин (0.26 мл, 0.44 ммол), разтворен в Nметилпиролидон (1.7 моларен), и сместа е бъркана при стайна температура за една нощ.
Разтворителят е отделен чрез ротационен изпарител и остатъкът е разтворен в етилацетат (10 мл) и екстрахиран трикратно с вода. Органичният слой е изсушен с безводен Na2SO4 и разтворителят е отделен с ротационен изпарител. Остатъкът е разтворен в трифлуороцетна киселина/дихлорометан (1:4, 25 мл) и оставен да
реагира за 1 час. Разтворителят е отделен с ротационен изпарител и полученото масло е изсушено с азотен поток. Суровият продукт е пречистен с препаративна обратно-фазова HPLC, използвайки градиент ацетонитрил/вода. Продуктът е имал задоволителни аналитични данни (NMP и мас-спектри).
След това е измерено отделянето на свободен MNA от пептидите в флуорим^тър Cytofluor (Per-Septive Biosystems, Inc.) чрез филтърна система с 355 nm възбуждане/405 nm излъчване. Кинетичните параметри на ензима (Michaelis-Menten Km и kcat - стойностите) са изчислени посредством методите, известни в областта (вж. напр. Yun, S. L. & Suelter, С. Н. (1977). A simple method for calculating Km and V from a single enzyme reaction progress curve. Biochem. Biophys. Acta 480(1), 113), чрез FAPa ензим от мембранни екстракти на 293-I/2 трансфектирани клетки от пример 2.
Таблица 1: Кт и kcat - стойности за FAPa-катализирано разцепване на селектирани 4-метокси-р-нафтиламид (М!ЧА)-пептидни конюгати
Субстрати Km Kcat Кщ I Kcat
[μΜ] [s'1] X104 [M 1 s1]
Chg-Pro-MNA 75 53.7 71.6
Hyn-Pro-MNA 69 27.4 39.7
Pro-Prp-MNA 154 49.5 32.1
Val-Pro-MNA 95 27.7 29.2
Met-Pro-MNA 127 27.9 22.0
Arg-Pro-MNA 278 50.6 18.2
trans-Hyp-Pro-MNA 254 37.9 14.9
Gln-Pro-MNA 273 40.5 14.8
Ala-Pro-MNA 267 35.7 13.4
Lys-Pro-MNA 530 57.1 10.8
lle-Pro-MNA 43 12.6 8.8
Met(O) -Pro-MNA 378 26.9 7.1
Ser-Pro-MNA 872 28.3 3.3
Chg = циклохексилглицин, Hyn = 6-хидроксинорлевцин, trans-Hyp = транс-4-хидроксипролин, Met(O) = метионин-8-оксид
Пример 11: Специфичност на MNA-свързани пептиди за FAPa спрямо DPP-IV
Сред известните членове на семейството на пролил-специфични серинови олигопептидази най-близкият ензим до FAPa е DPP-IV. Тъй като активен DPP-IV се открива в плазмата и в много различни клетъчни типове, е необходимо оптимизиране на относителната (незадължителна) селективност на пептидни пролекарства за FAPa в сравнение с DPP-IV, за да се намали нежеланото преобразуване на пролекарството на места, различни от това на тумора (напр. в плазмата). За да се идентифицират пептиди, специфични за FAPa, разцепването на MNA-свързани пептиди от FAPa е сравнено със способността на DPP-IV да разкъсва същите пептидни конюгати. Освобождаването на свободен MNA е измерено според описаното в пример 9.
Резултатите са показани в таблица 2.
Таблица 2: Сравнение на селективността на разкъсване на MNAпептидни конюгати от FAPa и DPP-IV
Специфичност на разцепване
FAP DPPIV
Ala-Pro-MNA + +
Z-Gly-Pro-MNA + -
Z-Pro-Ala-Gly-Pro-MNA + -
+ показва, че ензимът е способен да разцепи субстрата
- показва липса на разцепване
Пример 12: FAPa-активност в туморни проби
Ензимната активност на FAPa е измерена в проби от човешки тумори. 96 ямкови ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) плата (Costar, Corning, NY) са покрити за една нощ при 4°С с 1 gg/ml F19 антитяло или контролно антитяло във фосфатно-буфериран солен разтвор (PBS), pH 7.4. Гнездата след това са изплакнати с буфер (PBS, 0.1% Tween 20, pH 7.4) и излишните места на свързване са блокирани с блокиращ буфер (5 % говежди серум-албумин в PBS, pH 7.4) за 1 час при стайна температура. FAPa-активността е измерена в туморна тъкан (затворени символи) или равностойна нормална контролна тъкан (съответни отворени символи) от Concavalin А-обогатени мембранни екстракти (Фигура 5А). Туморните проби са включвали карцином на млечната жлеза (★, х), на дебелото черво (·), на метастази от дебело черво в черния дроб (♦) и на белодробен карцином (А, [). Екстрактите са добавени към покрити с F19 плата и са инкубирани за 1 час при стайна температура, Несвързаният материал е отстранен, гнездата са били добре измити трикратно с промивен буфер и ензимната активността на FAPa е анализирана чрез 100 μΙ Ala-Pro-AFC, както е описано (WO 97/34927) за един час при 37°С. Първите две фракции Concavalin А от всеки екстракт са измерени и всяка стойност е нанесена поотделно. Основната флуоресценция (измерена посредством покрити с контролно антитяло плата) са извадени от всяка стойност.
Независимо биохимично потвърждение на ензимната активност на FAPa и неговата молекулната маса в туморни екстракти са получени чрез маркиране на по-горе посочените тъканни екстракти с 14Смаркиран диизопропилфлуорофосфат (DFP; NEN-DuPont, Cologne, Germany). Известно е, че DFP се свързва ковалентно и необратимо към серините на активните места на много серинови протеази, предотвратявайки по този начин по-нататъшното катализиране (Hayashi, R., Bai, Y, & Hata, T. (1975). Further confirmation of carboxypeptidase Y as a metal-free enzyme having a reactive serine residue. J. Biochem. 77(6), 1313-1318; Wahlby, S. & Engstrom, L. (1968). Studies on Streptomyces griseus protease. II. The amino acid sequence around the reactive serine residue of DFP-sensitive components with esterase activity. Biocem. Boiphys. Acta. 151(2), 402-408). Маркирането c 14C-DFP на FAPa, имуно-пречистен от тумор (T), съответстващ на проба от дебело черво · от Фигура 5а, е показано на Фигура 5Ь. Електрофореза с натриев додецил-сулфат-полиакриламиден гел (Laemmli, U, К. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227(259), 680-685) и последваща авторадиография (Park, J. E., Draper, R. K. & Brown, WQ. J. (1991). Biosynthesis of lysosomal enzymes in cells of the End3 complementation group conditionally defective in endosomal acidification. Somatic Cell Mol. Genet. 17(2), 137-150) са установили наличие на маркиран 95 kD протеин в проба от рак на дебелото черво. Не са установени радиологично маркирани ивици в нормални контролни имунопреципитати (N) нито пък с контролни антитела. Молекулната маса на имуно-пречистения 14С-маркиран протеин, показана на Фигура 5Ь, съответства с данните от предишни публикации върху FAPa (Rettig,
W. J., $u, S. L., Fortunato, S. R., Scanlan, M. J., Mohan Raj, В. K., GarinChesa, P., Healey, J. H. & Old, L. J. (1994). Fibroblast activation protein: Purification, epitope mapping and induction by growth factors. Int. J. Cancer 58(3), 385-392; WO 97/34927).
Пример 13: Изготвяне на защитени олигопептиди
Защитени олигопептиди са изготвени или в разтвор, съгласно познатите от състоянието на техниката протоколи (напр. М. Bodansky and A. Bodansky, “The practice of Peptide Synthesis”, 2nd edtion, Springer, New York, 1994), или чрез твърдо-фазов синтез в автоматизиран пептиден синтезатор Applied Biosystems модел 430А. Премахването на защитата и отделянето на олигопептида от поддържащата смола е постигнато чрез третиране със смеси на трифлуороцетна киселина и често използвани очистващи добавки. Пречистването е извършено чрез препаративна високоефективна течна хроматография върху обратно-фазови С18 силициеви колони последством воден градиент 0.1% трифлуороцетна киселина / ацетонитрил. Идентичността и хомогенността на пептидите е потвърдена чрез високоефективна течна хроматография и анализ на мас-спектрите. Олигопептидите, изготвени по този начин, са показани в таблица 3.
Таблица 3: Олигопептиди
Z-Gly-Pro-OH Z-Pro-Ala-Gly-Pro-OH Fmoc-Pro-Ala-Gly-Pro-OH Fmoc-Chg-Pro-OH Fmoc-Nle-Pro-OH Fmoc-Hyn-Pro-OH
Fmoc-Pro-Pro-OH
Fmoc-Ser-Ala-Hyn-Pro-OH
Fmoc-Ser-Ala-Nle-Pro-OH
Fmoc-Ser-Ala-Chg-Pro-OH
Gly-Ser-Ala-Glu-Рго-ОН
Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Рго-ОН
Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Рго-ОН
Ser-Glu-Asn-Arg-Lys-Val-Pro-OH
Gly-Tyr-Ser-Arg-Met-Pro-OH
Gln-Gly-Tyr-Ser-Arg-Met-Pro-OH
Gly-Gly-Gly-T rp-Pro-OH
Asn-Arg-Lys-Val-Pro-OH
Glu-Asn-Arg-Lys-Val-Pro-OH
Ser-Glu-Asn-Arg-Lys-Val-Pro-OH
Ala-His-Met-His-Pro-OH
Tyr-Ala-Phe-His-Pro-OH
Ser-T yr-Ala-Phe-His-Pro-OH
Leu-Asn-Leu-T yr-Met-Pro-OH
Gly-Ser-Ala-Glu-Pro-OH
Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Pro-OH
Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Pro-OH
Z е бензилоксикарбонил
Fmoc е 9-флуоренилметоксикарбонил
Chg е L-циклохексилглицил
Nle е Ьнорлевцинил
Нуп е L-6-хидроксинорлевцинил
Пример 14: Изготвяне на Fmoc-Pro-Ala-Gly-Pro-Dox Fmoc-Pro-Ala-Gly-Pro-Dox (44 мг, 0,078 мм) е разтворен в безводен Ν,Νдиметилформамид (10 мл) и е достигнато pH от 7.5 с Ν,Νдиизопропилетиламин. Добавен е N-хидроксисукцинимид (1 М в DMF, 78 μΙ, 0.078 ммол) и сместа е изстудена в лед. При разбъркване е добавен дициклохексилкарбодиимид (1 М в DMF, 87 μΙ, 0.078 ммол) и разтворът е разбъркван при 0°С за 1 час.
Доксорубицин*НС1 (25 мг, 0.043 ммол) е разтворен в 20 мл безводен DMF и е добавен Ν,Ν-диизопропилетиламин (8.2 μΙ, 0.048 ммол). Тази ф смес е поставена със спринцовка към активирания пептид.
Реакционната смес е оставена да се затопли до стайна температура и е разбърквана 48 часа.
След това разтворителят е отделен и продуктът е пречистен чрез препаративна RP-HPLC върху С18 чрез градиент вода/ацетонитрил с 0.1% трифлуороцетна киселина.
Аналитична HPLC >90%; ES-MS 1110.5 ([M+Na]+); 674.4
Пример 15: Изготвяне на H-Pro-Ala-Gly-Pro-Dox
Fmoc-PAGP-Dox (изготвен в пример 14, 44 мг, 0.040 ммол) е разтворен ф в THF/диетиламин (2:1, 20мл) при 0°С и е бъркан 2 часа. След това разтворителят е отделен и продуктът е пречистен чрез RP-HPLC върху С18 чрез градиент вода/ацетонитрил с 0.1% трифлуороцетна киселина. Аналитична HPLC >90%; ES-MS 866.6 ([М+Н]+); 452.4
Пример 16: Изготвяне на H-Chg-Pro-Dox
Fmoc-Chg-Pro-OH (46 мг, 0.096 ммол) е разтворен в безводен Ν,Νдиметилформамид (10 мл) и е достигнато pH от 7.5 с Ν,Νдиизопропилетиламин. Добавен е N-хидроксисукцинимид (1 М в DMF, μΙ, 0.096 ммол) и сместа е изстудена в ледена баня. При разбъркване е добавен дициклохексилкарбодиимид (1 М в DMF, 107 μΙ, 0.107 ммол) и разтворът е разбъркван при 0°С за 1 час.
Доксорубицин*НС1 (31 мг, 0.053 ммол) е разтворен в 20 мл безводен DMF и е добавен Ν,Ν-диизопропилетиламин (10 μΙ, 0.059 ммол). Тази смес е поставена със спринцовка към активирания пептид. Реакционната смес е оставена да се затопли до стайна температура и е разбърквана 48 часа.
След това разтворителят е отделен и продуктът е пречистен чрез препаративна RP-HPLC върху С18 чрез градиент вода/ацетонитрил с 0.1% трифлуороцетна киселина.
Лиофилизираният продукт е разтворен в THF/диетиламин (2:1, 20мл) при 0°С и е бъркан 2 часа. След това разтворителят е отделен и продуктът е пречистен чрез RP-HPLC върху С18 чрез градиент вода/ацетонитрил с 0.1% трифлуороцетна киселина.
Аналитична HPLC >90%; ES-MS 780.2 ([М+Н]+); 366.4
Следващата таблица показва пептид-доксорубициновите конюгати, което са изготвени по аналогичен начин, и включва данните за разкъсване от FAPa (след 20 часа).
Таблица 4
R1 Разкъсване от FAPa
Z-Gly- > 95%
Z-Pro-Ala-Gly- > 95%
Fmoc-Pro-Ala-Gly > 95%
H-Pro-Ala-Gly- Около 11 %
Н-Chg- > 95%
H-Nle- > 95%
H-Hyn- > 95%
Z е бензилоксикарбонил, Fmoc е 9-флуоренилметоксикарбонил, Chg е L-циклохексилглицил, Nle е L-норлевцинил, Нуп е L-6-хидроксинорлевцинил
Пример 17: Получаване на N-Cbz-Gly-Pro-Melphalan
N-Cbz-Gly-Pro-OH (22 мг, 0.072 ммол) е разтворен в безводен Ν,Νдиметилформамид (8 мл) и е достигнато pH 7.5 с Ν.Νдиизопропилетиламин. Добавен е N-хидроксисукцинимид (1 М в DMF, 72 μΙ, 0.072 ммол) и сместа е изстудена на ледена баня. При разбъркване е добавен дициклохексилкарбодиимид (1 М в DMF, 67 μΙ, 0.67 ммол) и разтворът е разбъркван при 0°С за 2 час.
Мелфалан (14.7 мг, 0.048 ммол) е разтворен в 30 мл безводен DMF и е добавен Ν,Ν-диизопропилетиламин (12.3 μΙ, 0.072 ммол). Тази смес е поставена със спринцовка към активирания пептид. Реакционната смес е оставена да се затопли до стайна температура и е разбърквана 24 часа.
След това разтворителят е отделен и продуктът е пречистен чрез препаративна RP-HPLC върху С18 чрез градиент вода/ацетонитрил с 0.1% трифлуороцетна киселина.

Claims (30)

1. Съединение от формула (I) или неговата фармацевтично приемлива сол, където
R1 представлява остатък аминоалканоилна или олигопептидоилна група, чиято аминофункция при N-края може да бъде свързана към предпазваща група;
Ra и Rb, заедно с междинната N-С група образуват евентуално заместен, евентуално бензо-или циклохексано-кондензиран, 3-7 членен наситен или ненаситен хетероцикличен пръстен, в който едно или две СН2-групи могат също да бъдат заместени с NH, О или S,
R4 представлява Н, СтСб-алкил-, С3-С8-циклоалкил-, арил- или хетероарил-; и
СуГ представлява остътъка от цитотоксично или цитостатично съединение; при условие, че се изключват М2-ацетил-1_хомоаргинил-1_-тирозил-1_-глутаминил-1_-серил-М-[2,3,6-тридеокси1-0-((1 S,3S)-1,2,3,4,6,11-хексахидро-3,5,12-трихидрокси-3(хидроксиацетил)-10-метокси-6,11 -диоксо-1 -нафтаценил]-.алфа.1_-ликсо-хексопиранос-3-ил]-1_-пролинамид; и М2-ацетил-1_-хомоаргинил-1.-тирозил-1_-глутаминил-1_-серил-1_серил-М-[2,3,6-тридеокси-1-О-[(1 S,3S)-1,2,3,4,6,11-хексахидро3,5,12-трихидрокси-3-(хидроксиацетил)-10-метокс-6,11 -диоксо-1 нафтаценил]-.алфа.-!_-ликсо-хексопиранос-3-ил]-1_-пролинамид.
2. Съединение от формула (I), съогласно претенция 1, в което
R1 представлява остатък от формула Cg-A, Сд-В-А Cg-(D)m-B-A, в която Сд представлява водороден атом или ....група, избрана от група, включваща R5-CO, R5-O-CO-, R5-NH-CO-, R5-SO2- или R5-, където R5 е евентуално заместен СгС6-алкил-,С3-Св-циклоалкил-, арил-, аралалкил-, или хетероарил-група;
А, В и D представляват радикали, произлезли от аминокарбоксилни киселини от формулата -[NR6-(X)P-CO], където X представлява CR7R8 и където R6, R7, R8 представляват водороден атом, евентуално заместена СгС8-алкил-, С3-С8-циклоалкил-, арил- или хетероарилгрупа, и р е 1, 2 ,3, 4, 5; или
А, В и D представляват радикали, произлезли от циклични аминокарбоксилни киселини от формула където
R9 представлява Ct-Ce-алкил-, ОН или NH2 m е число от 1 до 10;
q е 0, 1 или 2, и г е 0, 1 или 2;
3. Съединение от формула I, съгласно претенция 1 или 2, където хетероцикличният пръстен, образуван от Ra , Rb и междинната N-C група, е заместен с R2 и R3 *, където R2 и R3 представляват водороден или халогенен атом или СгС6-алкил-, С^Се-алкиламино-, ди-СгС665 алкиламино-, Ci-Ce-алкокси-, тиол-, СтСб-алкилтио-, оксо-, имино-, фомил-, СгСб-алкоксикарбонил-, аминокарбонил, С3-С8циклоалкилалкил-, арил- или хетероарил-група.
4. Съединение от формула IA (IA) където където R2, R3 и R4, Cyt’ са според определението им в която и да е от предните претенции, R1 представлява аминоалканоилна или олигопептидоилна група и Х-Y представлява CHR2-CH2, CR2=CH, NHСН2, CH2-NH, -CR2-, CH2-CR2-CH2; при условие, че R1 представлява аминоалканоилна, ди- или трипептидоилна група или че R1 представлява олигопептидоил, имащ повече от три аминокиселинни радикали, които не съдържат аминокиселинната последователност Gln-Ser, като Х-Y представлява СН2-СН2-група.
5. Съединение, избрано от формула IA1
R.
(IA1) където R1 представлява аминоалканоилна, ди- или трипептидоилна група и Cyt’ е според определението, дадено във всяка от предходните претенции.
6. Съединение, избрано от формули IA2, IA3, IA4 и IA5 (IA2) (IA5) където R1 и Cyt’ са дефинирани във всяка от предходните претенции.
7. Съединение, съгласно всяка от предходните претенции, където R1 представлява аминоалканоилна или олигопептидоилна група, произлезла от глицин (Gly) или от D- или L-формите на аланин (Ala), валин (Val), левцин (Leu), изолевцин (Не), фенилаланин (Phe), тирозин (Туг), триптофан (Тгр), цистеин (Cys), метионин (Met), серин (Ser), треонин (Thr), лизин (Lys), аргинин (Arg), хистидин (His), аспартатова киселина (Asp), глутамова киселина (Glu), аспарагин (Asn), глутамин (Gin), пролин (Pro), 4-хидрокси-пролин (Нур), 5-хидрокси-лизин (Hyl), норлевцин (Nle), 5-хидроксинорлевцин, 6-хидроксинорлевцин (Нуп), орнитин (Огп) или циклохексилглицин (Chg), при условие, че де изключват олигопептидоилни групи с повече от три аминокиселинни единици, в което Gln-групата е директно свързана с Ser-групата.
8. Съединение от формула I, съгласно всяка от предходните претенции, в което единицата А произлиза от L-пролин, глицин, Lнорлевцин, L-циклохексилглицин, L-5-хидроксинорлевцин, L-6хидроксинорлевцин, L-5-хидроксилизин, L-аргинин или L-лизин.
9. Съединение, съгласно всяка от предходните претенции, в което R1 е група, избрана от формулите (1) до (34):
H-Chg (1) H-Tle (18) h-Lys (2) H-Hyl (19) h-Nle (3) H-Hse (20) Η-Ala (4) Cg-Gly (21) H-Hyn (5) Cg-Nle (22) H-Pro (6) Cg-Val (23) H-Phg (7) Cg-Met (24) H-GIn (8) H-Xxx-Lys (25) H-trans-Hyp (9) H-Xxx-Hyn (26) H-Val (10) H-Xxx-Pro (27) H-Cha (11) H-Xxx-His (28) H-Met (12) H-Xxx-Met (29) H-Nva (13) H-Xxx-Ala (30)
H-Met(O) (14) Cg-Xxx-Hyn (31) Η-β-Сра (15) Cg-Xxx-Ala-Gly (32) Н-Пе (16) Cg-(Xxx)m-Xxx-Ala-Gly (33) H-Ser (17) Cg-(Xaa)m-Xaa-Gly (34)
където
Cg представлява водороден атом или предпазваща група, избрана между бензоилоксикарбонил, фенилацетил, фенилметилсулфонил и бензиламинокарбонил;
Хаа представлява радикал, произхождащ от аминокарбоксилна киселина; и m е число от 1 до 6.
10. Съединение съгласно претенция 9, в което аминоалканоилнокиселинните радикали са в L-конфигурация.
11. Съединение съгласно всяка от претенции 1 до 10, в което H2NCyt’ е антрациклиново производно.
12. Съединение съгласно претенция 11, избрано от формулите (IIIA) до (IIIF):
(HIB)
13. Пролекарство, което може да бъде превърнато в лекарство чрез каталитичното действие на FAPa, като посоченото пролекарство има място на разцепване, което се разпознава от FAPa, и посоченото лекарство е цитотоксично или цитостатично при физиологични условия.
14. Пролекарство съгласно претенция 13, включващо олигомерна част, съдържаща до 13 аминокарбоксилни остатъци, и цитотоксична или цитостатична част, като аминокарбоксилният остатък при Скрая на олигомерната част е евентуално заместена, евентуално бензо- или циклохексано-кондензирана 3- до 7-членна циклична аминокиселина, и карбокси-функцията при С-края е свързана с цитотоксичната или цитостатична част чрез амидна връзка.
15. Пролекарство от претенция 14, в което аминокарбоксилният остатък при С-края е избран от D-пролин, L-пролин, Dхидроксипролин и L-хидроксипролин.
16. Пролекарство от претенция 15, в което олигомерната част съдържа два, три или четири аминокарбоксилно-киселинни остатъка.
17. Пролекарствота от претенции 14, 15 или 16, в която аминофункцията при N-края е защитена чрез предпазваща група.
18. Съединение съгласно всяка една от предходните претенции за използване в медицината.
19. Фармацевтичен състав, включващ съединение съгласно всяка една от претенциите 1 др 18 и евентуално един или повече фармацевтично приемливи ексципиенти.
20. Използване на съединение съгласно всяка от претенциите 1 до 18 за изготвяне на фармацевтичен състав за лечение на карциноми.
21. Процес за изготвяне на съединение съгласно всяка от претенциите 1 до 18, характеризиращ се с това, че съединение от формула (V) в което R1, Ra и Rb са дефинирани в претенция 1, X1 представлява ОН или отцепваща се група, която е подходяща за заместване от аминогрупа, и което реагира със съединение HN(R4)-Cyt’, в което Cyt’ е остатък от цитотоксично или цитостатично съединение и R4 е дефиниран в претенция 1.
22. Процес за производство на съединение съгласно всяка от претенциите 1 до 18, характеризиращ се с това, че съединение от формула (VI) (VI) в което R1, Ra и Rb са дефинирани в претенция 1, Y1 представлява LСОХ2, като L е свързващ остатък, и X2 представлява ОН или отцепваща се група, която е подходяща за заместване от амино-група, и коетр реагира със съединение H2N-Cyt’ или HO-Cyt’, като Cyt’ е остатък от цитотоксично или цитостатично съединение.
23. Процес за производство на съединение съгласно всяка от претенциите 1 до 18, характеризиращ се с това, че съединение от формула (VII) (VII) в което R1, Ra и Rb са дефинирани в претенция 1, Y2 има формула L-OH или L-NH2, като L е свързващ остатък, и което реагира със съединение X3OC-Cyt’, като X3 представлява ОН или отцепваща се група, която е подходяща за заместване от аминогрупа, като Cyt’ е остатък от цитотоксично или цитостатично съединение.
24. Процес за производство на съединение съгласно всяка от претенциите 1 до 18, характеризиращ се стова, че съединение от формула (VIII) (VIII) където PG1 е защитна група, а другите заместители имат значението, посочено по-горе, реагира със съединението HN(R4)-Cyt’, където Cyt’ е остатъкът от цитотоксично или цитостатично съединение;
защитната PG1 група след това се отделя и получаващото се съединение от формула (VI НА) (VIIIA) след това реагира със съединение PG2-A-X4, където PG2 представлява защитна група и X4 представлява ОН или отцепваща се група, подходяща за заместване от амино-група;
като се провеждат и други стъпки на свързване, ако е необходимо, до получаване на пълното съединение.
25. Процес на производство на съединение съгласно всяка от претенциите 1 до 18, характеризиращ се с това, че PG3-N(R4)-LСОХ3, където PG3 е защитна група, а другите заместители имат значението, посочено по-горе, реагира със съединението Y4-Cyt’, където Cyt’ е остатъкът от цитотоксичното или цитостатично съединение; и Y4 представлява H2N или НО;
защитната група PG3 след това се отделя; и полученото съединение HN(R4)-L-Y4rCyt’ реагира със съединение от формула (VIII)
Ra защитната група PG1 формулата (VIII) се отделя и полученото съединение от след това реагира със съединение PG4-A-X4, където
PG4 е защитна група, a X4 може да бъде ОН или отцепваща се група, подходяща за заместване от амино-група;
като могат да бъдат извършени и други стъпка на свързване, ако е необходимо, докато се получи пълната молекула.
26. Процес за производство на съединение от формула (I), характеризиращ се с това, че съединение от формулата PG5-N(R4)L-Y5, в която
PG5 представлява защитна група, Y5 представлява ОН или NH2 и заместителите имат значението, посочено по-горе, реагира със съединение от формула X5OC-Cyt’, в която
Cyt’ е остатъкът от цитотоксично или цитостатично съединение и X5 е ОН или подходяща отцепваща се група;
защитната група PG5 след това се отделя и полученото съединение HN(R4)-L-Y5-CO-Cyt’ реагира със съединение от формула (VIII) като защитната група се отделя и полученото съединение след това реагира със съединение PG2-A-X4, където
PG2 е защитна група, a X4 представлява ОН или отцепваща се група, подходяща за заместване от амино-група;
като се извършват и други стъпка на свързване, докато се получи пълната молекула.
27. Съединение от формула VIIIА
Rb R4 (VIIIA) в която Ra, Rb, R4 и Cyt’ са според дефинициите в претенция 1.
28. Метод за лечение на карциноми, включващ прилагане при пациент на фармацевтичен състав съгласно претенция 19.
29. Метод за лечение на карциноми, при който на пацента се прилага пролекарство, като посоченото пролекарство може да бъде превърнато в цитотоксично или цитостатично лекарство чрез ензимна активност, като ензимната активност е тази на FAPa.
30. Използване на пролекарство, което може да бъде превърнато в цитотоксично или цитостатично лекарство чрез ензимна активност, като посочената ензимна активност е активността на FAPa, за изготвяне на медикамент за лечение на карциноми.
1. Съединение от формула (I)
Патентни претенции (I) или негова фармацевтично приемлива сол, като
R1 представлява остатък с формула Cg-A, Сд-В-А Cg-(D)m-B-A, където Сд представлява предпазваща група, избрана от групата, включваща R5-CO, R5-O-CO-, R5-NH-GO-, R5-SO2- или R5-, където R5 е евентуално заместен СгСб-алкил-, С3-С8-циклоалкил-, арил-, аралалкил-, или хетеррарил-група;
А е прризводно на L-пролин, глицин, L-норлевцин, Lциклохексилглицин, L-5-хидроксинорлевцин, L-6хидроксинорлевцин, L-5-хидроксилизин, L-аргинин или L-лизин; и
В и D представляват радикали, произлезли от аминокарбоксилни киселини от формулата -[NR6-(X)P-CO], където X представлява CR7R8 и където R6, R7, R8 представляват водороден атом, евентуално заместена СтСе-алкил-, С3-С8-циклоалкил-, арил- или хетероарилгрупа, и р е 1, 2 ,3, 4, 5; или
В и D представляват радикали, произлезли от циклични аминокарбоксилни киселини от формула където
R9 представлява СгСб-алкил-, ОН или NH2 m е число от 1 до 10;
q е 0, 1 или 2, и г е 0, 1 или2;
Ra и Rb, заедно с междинната N-С група образуват евентуално заместен, евентуално бензо-или циклохексано-кондензиран, 3-7 членен наситен или ненаситен хетероцикличен пръстен, в който едно или две СН2 групи могат също да бъдат заместени с NH О или S,
R4 представлява Н, Ст-Се-алкил-, С3-С8-циклоалкил-, арил- или хетероарил-; и
Cyt’ представлява остътъка от цитотоксично или цитостатично съединение.
2. Съединение от формула V съгласно претенция 1, където хетероцикличният пръстен, образуван от Ra, Rb и вмъкнатата N-C група, е заместен с R2 и R3, където R2 и R3 представляват водороден или халогенен атом или CrCe-алкил-, СгС6-алкиламино-, ди-СгСбалкиламино-, СгСб-алкокси-, тиол-, С-|-С6-алкилтио-, оксо-, имино-, фомил-, СгС^-алкоксикарбонил-, аминокарбонил, С3-С8циклоалкилалкил-, арил- или хетероарил-група.
3. Съединение от формула IA (IA) където R1, R2, R3n R4, Cyt’ са според определението им в която и да е от предните претенции, и Х-Y представлява CHR2-CH2, CR2=CH, NHСН2, CH2-NH, -CR2-, CH2-CR2-CH2.
4. Съединение от формула IA1 където R1n Cyt’ са както са определени в една от предните претенции.
5. Съединение, избрано от формулите IA2,1АЗ, IA4 и IA5 (IA2) (IA3) (IA4) (IA5) където R1n Cyt’ са както са определени в една от предните претенции.
6. Съединение, съгласно всяка от предходните претенции, където R1e група, избрана от формулите (21), (22) и (34):
Cg-Gly(21)
Cg-Nle(22)
Cg-(Xaa)m-Xaa-Gly(34), където Cg представлява водороден атом или предпазваща група, избрана между бензоилоксикарбонил, фенилацетил, фенилметилсулфонил и бензиламинокарбонил;
Хаа представлява радикал, произхождащ от аминокарбоксилна киселина; и m е число от 1 до 6.
7. Съединение, съгласно претенция 6, в което амино-алканоилните киселинни радикали са в (1_)-конфигурация.
8. Съединение съгласно всяка от претенции 1 до 7, в което H2N-Cyt’ е антрациклиново производно.
9. Съединение съгласно претенция 8, избрано от формулите (IIIA), (IIIB), (ШЕ) и (II1F):
мм·
Μ—
10. Пролекарство, което е може да бъде превърнато в лекарство от каталитичното действие на FAPa, като посоченото пролекарство има място на разцепване, което се разпознава от FAPa, но не от протеолитичните ензими в течностите на човешкото или животинското тяло, и което включва една олигомерна част от два, три или четири аминокарбоксилни остатъци, и цитотоксична или цитостатична част, в която N-крайната аминофункцията е защитена от предпазваща група и С-крайният аминокарбоксилен остатък при на олигомерната част е избран между D-пролин, L-пролин, Dхидроксипролин и L-хидроксипролин, а С-крайната карбоксилна функция е свързана с цитотоксичната или цитостатична част чрез амидна връзка;
като посоченото лекарство е цитотоксично или цитостатично при физиологични условия.
11. Съединение съгласно всяка от предходните претенции за медицинска употреба.
12. Фармацевтичен състав, включващ съединение съгласно всяка от претенциите 1 до 10 и един или повече фармацевтично приемливи ексципиенти.
13. Използване на съединение съгласно всяка от претенции 1 до 10 за изготвяне на фармацевтичен състав за лечение на карцином.
14. Процес за изготвяне на съединение съгласно всяка от претенциите 1 до 18, характеризиращ се с това, че съединение от формула (V) (V) в което R1, Ra и Rb са дефинирани в претенция 1, X1 представлява ОН или отцепваща се група, която е подходяща за заместване от аминогрупа, и което реагира със съединение HN(R4)-Cyt’, в което Cyt’ е остатък от цитотоксично или цитостатично съединение и R4 е дефиниран в претенция 1.
15. Процес за производство на съединение съгласно всяка от претенциите 1 до 10, характеризиращ се с това, че съединение от формула (VI) (VI) в която R1, Ra и Rb са дефинирани в претенция 1, Y1 представлява LСОХ2, като L е свързващ остатък, и X2 представлява ОН или отцепваща се група, която е подходяща за заместване от амино-група, и което реагира със съединение H2N-Cyt’ или HO-Cyt’, като Cyt’ е остатък от цитотоксично или цитостатично съединение.
16. Процес за производство на съединение съгласно всяка от претенциите 1 до 10, характеризиращ се с това, че съединение от формула (VII) (VII) в което R1, RaM Rb са дефинирани в претенция 1, Y2 има формула L-OH или L-NH2) като L е свързващ остатък, и което реагира със съединение X3OC-Cyt’, като X3 представлява ОН или отцепваща се група, която е подходяща за заместване от аминогрупа, като Cyt’ е остатък от цитотоксично или цитостатично съединение.
17. Процес за производство на съединение съгласно всяка от претенциите 1 до 10, характеризиращ се стова, че съединение от формула (VIII) където PG1 е защитна група, а другите заместители имат значението, посочено по-горе, реагира със съединението HN(R4)-Cyt’, където Cyt’ е остатъкът от цитотоксично или цитостатично съединение;
защитната PG1 група след това се отделя и получаващото се съединение от формула (VIПА)
Ο
Rb R4 (VIIIA) след това реагира със съединение PG2-A-X4 , където PG2 представлява защитна група и X4 представлява ОН или отцепваща се група, подходяща за заместване от амино-група;
като се провеждат и други стъпки на свързване, ако е необходимо, до получаване на пълното съединение.
18. Процес на производство на съединение съгласно всяка от претенциите 1 до 10, характеризиращ се с това, че PG3-N(R4)-LСОХ3, където PG3 е защитна група, а другите заместители имат значението, посочено по-горе, реагира със съединението Y4-Cyt’, където Cyt’ е остатъкът от цитотоксичното или цитостатично съединение; и Y4 представлява H2N или НО;
защитната група PG3cnefl това се отделя; и полученото съединение ΗΝ(Ρ4)-Ι_-Υ4-Ογί’ реагира съ съединение от формула (VIII)
PG! 0 защитната група PG1 се отделя и полученото съединение от формулата (VIII) след това реагира със съединение PG4-A-X4, където
PG4 е защитна група, a X4 може да бъде ОН или отцепваща се група, подходяща за заместване от амино-група;
като могат да бъдат извършени и други стъпка на свързване, ако е необходимо, докато се получи пълната молекула.
19. Процес за производство на съединение от формула (I), характеризиращ се с това, че съединение от формулата PG5-N(R4)L-Y5, в която
PG5 представлява защитна група, Y5 представлява ОН или NH2 и заместителите имат значението, посочено по-горе, реагира със съединение от формула X5OC-Cyt’, в която
Cyt’ е остатъкът от цитотоксично или цитостатично съединение и X5 е ОН или подходяща отцепваща се група;
защитната група PG5 след това се отделя и полученото съединение HN(R4)-L-Y5-CO-Cyt’ реагира със съединение от формула (VIII) (VIII) като защитната група се отделя и полученото съединение след това реагира със съединение PG2-A-X4, където
PG2 е защитна група, a X4 представлява ОН или отцепваща се група, подходяща за заместване от амино-група;
като се извършват и други стъпка на свързване, докато се получи пълната молекула.
20. Съединение от формула VIIIA /СуГ RD *4 (VIIIA) в която Ra, Rb, R4 и Cyt’ са според дефинициите в претенция 1.
21. Метод за лечение на карцином, включващ приложение при пациент на фармацевтичен състав съгласно претенция 12.
22. Метод за лечение на карцином, в която на пацента се прилага пролекарство съгласно претенция 10.
23. Използване на пролекарство съгласно претенция 10 за изготвяне на медикамент за лечение на карциноми.
BG106096A 1999-05-14 2001-11-09 Fap - активирани противотуморни съединения Pending BG106096A (bg)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13413699P 1999-05-14 1999-05-14
PCT/EP2000/004261 WO2000071571A2 (en) 1999-05-14 2000-05-11 Fap-activated anti-tumor compounds

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BG106096A true BG106096A (bg) 2002-05-31

Family

ID=22461925

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG106096A Pending BG106096A (bg) 1999-05-14 2001-11-09 Fap - активирани противотуморни съединения

Country Status (28)

Country Link
US (1) US6613879B1 (bg)
EP (1) EP1180116A2 (bg)
JP (1) JP3607201B2 (bg)
KR (1) KR20020030270A (bg)
CN (1) CN1213058C (bg)
AR (1) AR033792A1 (bg)
AU (1) AU777521B2 (bg)
BG (1) BG106096A (bg)
BR (1) BR0010564A (bg)
CA (1) CA2369933A1 (bg)
CO (1) CO5170516A1 (bg)
CZ (1) CZ20014097A3 (bg)
EA (1) EA005204B1 (bg)
EE (1) EE200100600A (bg)
HK (1) HK1048642B (bg)
HU (1) HUP0202367A3 (bg)
IL (1) IL145798A0 (bg)
MX (1) MXPA01011401A (bg)
MY (1) MY125939A (bg)
NO (1) NO20015536L (bg)
NZ (1) NZ516075A (bg)
PL (1) PL351680A1 (bg)
SK (1) SK16452001A3 (bg)
TW (1) TWI248444B (bg)
UA (1) UA73506C2 (bg)
WO (1) WO2000071571A2 (bg)
YU (1) YU80901A (bg)
ZA (1) ZA200109151B (bg)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SK12872002A3 (sk) 2000-03-15 2003-05-02 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Cielené antineoplastické lieky a ich terapeutické použitie
GB0027551D0 (en) * 2000-11-10 2000-12-27 Boehringer Ingelheim Pharma Anti-tumor compounds
GB0027552D0 (en) * 2000-11-10 2000-12-27 Boehringer Ingelheim Pharma Anti-tumor compounds
US7163923B2 (en) * 2001-05-09 2007-01-16 Celmed Oncology (Usa), Inc. Peptide deformylase activated prodrugs
US7091186B2 (en) * 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
US20030211979A1 (en) * 2002-01-30 2003-11-13 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg FAP-activated anti-tumor compounds
EP1333033A1 (en) * 2002-01-30 2003-08-06 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG FAP-activated anti-tumor compounds
WO2003088913A2 (en) * 2002-04-18 2003-10-30 Celmed Oncology (Usa), Inc. Peptide deformylase activated prodrugs
US20040033957A1 (en) * 2002-05-10 2004-02-19 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg FAP-activated anti-tumor prodrugs
EP1506221A2 (en) * 2002-05-10 2005-02-16 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG Fap-activated anti-tumor prodrugs
US20040001801A1 (en) * 2002-05-23 2004-01-01 Corvas International, Inc. Conjugates activated by cell surface proteases and therapeutic uses thereof
BR0315537A (pt) * 2002-11-14 2005-09-27 Celmed Oncology Usa Inc Pró-drogas ativadas por peptìdeo desformilase
GB0310593D0 (en) * 2003-05-08 2003-06-11 Leuven K U Res & Dev Peptidic prodrugs
JP2007511467A (ja) 2003-05-14 2007-05-10 タケダ サン ディエゴ インコーポレイテッド ジペプチジルペプチダーゼインヒビター
US7169926B1 (en) 2003-08-13 2007-01-30 Takeda Pharmaceutical Company Limited Dipeptidyl peptidase inhibitors
US7678909B1 (en) 2003-08-13 2010-03-16 Takeda Pharmaceutical Company Limited Dipeptidyl peptidase inhibitors
US7732446B1 (en) 2004-03-11 2010-06-08 Takeda Pharmaceutical Company Limited Dipeptidyl peptidase inhibitors
JP2008501714A (ja) 2004-06-04 2008-01-24 武田薬品工業株式会社 ジペプチジルペプチダーゼインヒビター
WO2006019965A2 (en) 2004-07-16 2006-02-23 Takeda San Diego, Inc. Dipeptidyl peptidase inhibitors
WO2006073167A1 (ja) * 2005-01-07 2006-07-13 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. ピロリジン誘導体
AU2006246719A1 (en) 2005-05-19 2006-11-23 Genentech, Inc. Fibroblast activation protein inhibitor compounds and methods
US8067248B2 (en) * 2005-12-14 2011-11-29 Luwig Institute for Cancer Research Method for diagnosing rheumatoid arthritis via assaying myofibroblast-like synoviocytes for fibroblast activation protein
WO2007087131A2 (en) * 2006-01-05 2007-08-02 The Johns Hopkins University Peptide prodrugs
WO2007112347A1 (en) 2006-03-28 2007-10-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Dipeptidyl peptidase inhibitors
WO2008005479A2 (en) * 2006-07-06 2008-01-10 University Of Wyoming Charge reversible polymers
US20100184706A1 (en) * 2007-03-20 2010-07-22 Bachovchin William W Fap-activated chemotherapeutic compounds, and methods of use thereof
EP2343973B1 (en) * 2008-09-12 2016-02-17 Cadila Pharmaceuticals Ltd. Prodrugs of Sitagliptin
EP2525830B1 (en) 2010-01-22 2016-05-11 Ascendis Pharma A/S Dipeptide-based prodrug linkers for aliphatic amine-containing drugs
EP2525829A1 (en) 2010-01-22 2012-11-28 Ascendis Pharma A/S Dipeptide-based prodrug linkers for aromatic amine-containing drugs
US20150335761A1 (en) * 2012-02-16 2015-11-26 Raymond Firestone Compositions and methods for contraception
PL2938360T3 (pl) 2012-12-28 2020-05-18 Cobiores Nv Minimalnie toksyczne proleki
EP2987794B1 (en) * 2013-04-19 2018-05-30 Jinan University Vinblastine derivatives, preparation method therefor and application thereof
EP3066091B1 (en) * 2013-11-05 2019-04-03 Astrazeneca AB Nmda antagonist prodrugs
CN113956325A (zh) * 2014-06-13 2022-01-21 塔夫茨大学信托人 Fap激活的治疗剂以及其相关用途
WO2015192124A1 (en) * 2014-06-13 2015-12-17 Trustees Of Tufts College Fap-activated therapeutic agents, and uses related thereto
CN105524141B (zh) * 2015-11-12 2019-11-26 中山大学 一种FAPa激活式肿瘤诊断多肽磁珠复合物的制备与应用
EP3222292A1 (en) 2016-03-03 2017-09-27 Heidelberg Pharma GmbH Amanitin conjugates
CN107043456B (zh) * 2017-04-19 2019-05-17 川北医学院 对氧环己酮与l-苯丙氨酸氮芥共聚物及其应用
CN110128501A (zh) * 2019-05-21 2019-08-16 北京海美源医药科技有限公司 一种靶向fap酶的喜树碱类化合物及其制备方法和应用
CN110128506B (zh) * 2019-05-22 2021-03-30 中国药科大学 一种寡肽及其应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3915800A (en) * 1972-03-30 1975-10-28 Kelco Co Polysaccharide and bacterial fermentation process for its preparation
FR2546163B1 (fr) * 1983-05-16 1987-10-09 Centre Nat Rech Scient Nouveaux derives acyles hydrosolubles de peptides ou d'amino-acides, leur preparation et leur application
US5047401A (en) * 1985-09-09 1991-09-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Use of dipeptide alkyl esters to treat GVHD
DE3783966T2 (de) 1986-07-29 1993-05-27 Sunstar Inc Reagens zur pruefung von periodentalen erkrankungen.
US5776892A (en) * 1990-12-21 1998-07-07 Curative Health Services, Inc. Anti-inflammatory peptides
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5866679A (en) 1994-06-28 1999-02-02 Merck & Co., Inc. Peptides
DE19512484A1 (de) * 1995-04-04 1996-10-17 Bayer Ag Kohlenhydratmodifizierte Cytostatika
JP2000506494A (ja) 1995-10-18 2000-05-30 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド 良性前立腺過形成の治療に有用な複合体
AU3224997A (en) 1996-05-29 1998-01-05 Prototek, Inc Prodrugs of thalidomide and methods for using same as modulators of t-cell function
US5952294A (en) 1996-07-31 1999-09-14 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Peptidyl prodrugs and methods of making and using the same
WO1998013059A1 (en) 1996-09-27 1998-04-02 Bristol-Myers Squibb Company Hydrolyzable prodrugs for delivery of anticancer drugs to metastatic cells
DE19640970A1 (de) * 1996-10-04 1998-04-16 Bayer Ag Modifizierte Cytostatika
NZ512171A (en) 1998-12-11 2004-07-30 Medarex Inc Prodrug compound comprising a therapeutic agent, an oligopeptide with a non-genetically encoded amino acid, a stabilizing group and optionally a linker group
AU772074B2 (en) 1999-04-28 2004-04-08 Vectramed, Inc. Enzymatically activated polymeric drug conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
TWI248444B (en) 2006-02-01
CA2369933A1 (en) 2000-11-30
AR033792A1 (es) 2004-01-07
CO5170516A1 (es) 2002-06-27
SK16452001A3 (sk) 2002-03-05
NZ516075A (en) 2004-03-26
EA200101155A1 (ru) 2002-10-31
WO2000071571A3 (en) 2001-09-07
HK1048642A1 (en) 2003-04-11
HK1048642B (zh) 2005-10-28
NO20015536L (no) 2002-01-10
AU777521B2 (en) 2004-10-21
NO20015536D0 (no) 2001-11-13
PL351680A1 (en) 2003-06-02
WO2000071571A2 (en) 2000-11-30
CZ20014097A3 (cs) 2002-02-13
EA005204B1 (ru) 2004-12-30
ZA200109151B (en) 2002-12-17
JP3607201B2 (ja) 2005-01-05
HUP0202367A2 (hu) 2002-11-28
JP2003500417A (ja) 2003-01-07
WO2000071571A8 (en) 2002-03-07
EE200100600A (et) 2003-02-17
CN1213058C (zh) 2005-08-03
UA73506C2 (en) 2005-08-15
BR0010564A (pt) 2002-02-19
KR20020030270A (ko) 2002-04-24
AU6559100A (en) 2000-12-12
YU80901A (sh) 2005-07-19
US6613879B1 (en) 2003-09-02
MXPA01011401A (es) 2002-06-04
IL145798A0 (en) 2002-07-25
CN1374969A (zh) 2002-10-16
HUP0202367A3 (en) 2003-10-28
EP1180116A2 (en) 2002-02-20
MY125939A (en) 2006-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6613879B1 (en) FAP-activated anti-tumour compounds
US20030055052A1 (en) FAP-activated anti-tumor compounds
US20020155565A1 (en) FAP-activated anti-tumor compounds
JP2005523264A (ja) Ｆａｐ活性化抗腫瘍化合物
EP1144011B1 (en) Prodrug compounds and process for preparation thereof
JP2004501875A (ja) トリペプチドプロドラッグ化合物
JP2004510702A (ja) イソロイシンを有するプロドラッグ化合物
SK57399A3 (en) Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
WO2002038590A1 (en) Fap-alpha-activated anti-tumor compounds
US20030232742A1 (en) FAP-activated anti-tumor compounds
CN113507961A (zh) FAPα特异性的双环肽配体
JP2023518954A (ja) Ｎｇｒコンジュゲート及びその使用
EP1506221A2 (en) Fap-activated anti-tumor prodrugs
US20040033957A1 (en) FAP-activated anti-tumor prodrugs
US20030211979A1 (en) FAP-activated anti-tumor compounds
WO2002038591A1 (en) Fap-activated anti-tumor compounds
WO2002038187A1 (en) Fap-activated anti-tumour prodrug
AU714288B2 (en) Novel peptides