CN1741808A - 能抑制血管生成、细胞迁移、细胞侵入和细胞增殖的肽及其组合物和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明主要涉及能抑制血管生成、细胞迁移、细胞侵入和细胞增殖的肽，能抑制血管生成、细胞迁移、细胞侵入和细胞增殖的肽的制备方法，这些肽的药物组合物以及应用这些肽和这些肽的药物组合物治疗与异常血管化有关的疾病的方法。
Description
技术领域
本发明主要涉及能抑制血管生成、细胞迁移、细胞侵入和细胞增殖的肽，能抑制血管生成、细胞迁移、细胞侵入和细胞增殖的肽的制备方法，这些肽的药物组合物以及应用这些肽及其药物组合物治疗与异常血管化(aberrant vascularization)有关的疾病的方法。
背景技术
大多数形式的癌症是由实体瘤衍化而来(Shockley et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.1991，617：367-382)，所述实体瘤已经临床证明，应用如单克隆抗体和免疫毒素的疗法是具有抗药性的。抗-血管生成性疗法用于癌症的治疗是基于实体瘤需要维持生长的血管生成(即新血管的形成)的认识发展而来的(Folkman，Ann.Surg.1972，175：409-416；Folkman，Mol.Med.1995，1(2)：120-122；Folkman，Breast Cancer Res.Treat.1995，36(2)：109-118；Hanahan et al.，Cell 1996，86(3)：353-364)。抗-血管生成性疗法在动物模型中的疗效已经在本领域得到证明(Millauer et al.，Cancer Res.1996，56：1615-1620；Borgstrom et al.，Prostrate 1998，35：1-10；Benjamin et al.，J.Clin.Invest.1999，103：159-165；Merajver et al.，Proceedings of Special AACRConference on Angiogenesis and Cancer 1998，Abstract & num；B-11，January22-24)。没有血管生成的情况下，实体瘤的内细胞层是营养不足的。而且，可以看出血管生成(即异常血管化)对于非固体的血液肿瘤的生长是必需的，它也牵涉到多种其他疾病(例如：眼睛新血管疾病、黄斑变性和类风湿性关节炎等)。
相反，正常的组织除了在特殊情况(例如创伤修复、月经周期中的子宫内壁增生等)下，不需要血管生成。因此需要血管生成是肿瘤细胞与正常组织之间一个显著的差异。重要地，与正常细胞相比，肿瘤细胞对血管生成的依赖在数量上远远大于正常组织和肿瘤组织在细胞复制与细胞死亡上的差异，而后者常为癌症治疗所利用。
肿瘤血管生成可由细胞因子，如血管内皮生长因子和/或纤维母细胞生长因子初始化，这些细胞因子在低含氧量的条件下，可与局部的脉管系统的内皮细胞中的特异性的受体结合。活化的肉皮细胞分泌酶，它们可改造关联组织的基质并调节如整联蛋白等粘附分子的表达。基质降解之后，内皮细胞增生和向肿瘤迁移，这会导致新血管的产生和成熟。
有趣地，抑制血管生成的蛋白片段，如内皮抑制素(endostatin)、kringle5和PEX等由基质蛋白的降解产生(O′Reilly et al.，Cell 1997，88：277-285；O′Reilly et al.，Cell，1994，79：315-328；Brooks et al.，Cell，1998，92：391-400)因此，这些蛋白片段可以抑制新的血管生成，这样就可以阻止实体瘤的生长和转移。
然而，这些蛋白片段的应用有很大的弱点(即大量生产难度大且昂贵、较差的药理性质和易于降解等等)。已有一种方法用于识别这些大蛋白中的小肽片段，它们仍然保持母体蛋白质中很大一部分抗血管生成的活性。
尽管通过寻找抑制血管生成的多肽，已提供了对于预防新血管生长有显著效果的化合物，但是仍然需要具有高活性谱的分子。因此需要新型肽来全面发掘肽在预防血管生成方面的潜力。新型肽与本领域所描述的肽相比会具有更长的血浆半衰期、更强的抗降解能力、提高的生物利用率、更高的亲和力和更大的选择性等等(Livant，美国专利号.6,001,965；Livant，美国专利号6,472,369)。这样的新型肽在治疗如细胞迁移、细胞侵入和细胞增生等与血管生成相关的各种疾病方面会很有效。
发明内容
本发明通过提供可以抑制血管生成、细胞迁移、细胞侵入和细胞增生的肽，制备这些肽的方法，这些肽的药物组合物以及应用这些肽及这些肽的药物组合物治疗与异常血管化有关的疾病的方法来满足这些或其他需要。
第一方面，本发明提供了一种如结构式(I)所示的化合物：
或它的一种药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或氮氧化物，其中：
a，b，x，y和z为0或1；
A为环状氨基酸；
B为碱性氨基酸；
C为小型(small)氨基酸；
R1是烃基、取代的烃基、酰基、取代的酰基、烷基磺酰基，取代的烷基磺酰基、芳基烃基、取代的芳基烃基、芳基磺酰基、取代的芳基磺酰基、杂烃基、取代的杂烃基、杂芳基磺酰基、取代的杂芳基磺酰基、杂芳基烃基、取代的杂芳基烃基、氧羰基、取代的氧羰基；
R2为烃基，-(CH2)mS(O)nR5，-(CH2)mS(O)n-S(O)oR5或-(CMe)mS(O)nR5
m为1，2，3或4；
n和o独立地是0，1或2；
R3为CH2CONH2或CH2CH2CONH2；
R4为烃基，-NR6R7或-OR8；
R5为烃基、取代的烃基、酰基、取代的酰基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烃基、杂烃基、取代的杂烃基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烃基、取代的杂芳基烃基、氧羰基或取代的氧羰基；
R6和R7独立地为氢或烃基；且
R8为烃基、取代的烃基、芳基、取代的芳基、芳基烃基、取代的芳基烃基、杂烃基、取代的杂烃基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烃基或取代的杂芳基烃基；
满足条件为：
当m为1时，R5不是甲基；
仅当A是脯氨酸、B是组氨酸、C是丝氨酸时，a为1；且当a为0时b为0；而且
仅当b，x，y和z是1时，R2为-(CH2)mS(O)nR5或-(CH2)mS(O)n-S(O)oR5；
第二方面，本发明提供了化合物的药物组合物。药物混合物主要包含一种或多种化合物或它们药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或氮氧化物以及一种药学上可接受的载体。载体的选择除其他的因素之外依赖于所需要的给药方式。
第三方面，本发明提供了治疗或预防以异常血管化为特征的疾病或失调的方法。该方法主要涉及对需要这种治疗或预防的患者施用在治疗上有效量的化合物和/或它的药物组合物。
附图说明
图1-5显示出本发明示例性化合物。
发明详述
定义
“烃基”，它本身或作为其他取代基的一部分是指饱和的或不饱和的、支链的、直链的或环状的，从母体烷烃、烯烃或炔中的一个碳原子上去掉一个氢原子而衍生的一价的碳氢化合物基团。典型的烃基包括但不仅限于，甲基；乙基如乙烷基、乙烯基、乙炔基；丙基如丙烷-1-基、丙烷-2-基、环丙-1-基、丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、环丙-1-烯-1-基、环丙-2-烯-1-基、丙-1-炔-1-基、丙-2-炔-1-基等等；丁基如丁烷-1-基、丁烷-2-基、2-甲基丙烷-1-基、2-甲基丙烷-2-基、环丁烷-1-基、丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1，3-二烯-1-基、丁-1，3-二烯-2-基、环丁-1-烯-1-基、环丁-1-烯-3-基、环丁-1，3-二烯-1-基、丁-1-炔-1-基、丁-1-炔-3-基、丁-3-炔-1-基等；等等。
术语“烃基”特指包括具有任何饱和度程度或水平的基团，即仅具有碳-碳单键的基团、具有一个或多个碳-碳双键的基团、具有一个或多个碳-碳三键的基团和具有碳-碳单键、双键、三键的混合的基团。指明特定饱和度水平的地方，采用“烷基(alkanyl)”、“烯基”、“炔基”的表达。优选地，一个烃基基团包含1-20个碳原子，比较优选的是1-10个碳原子，更优选的是1-6个碳原子。
“烷基(alkanyl)”，它本身或作为其他取代基的一部分是指饱和支链的、直链的或环状的烃基基团，从母体烷烃中的一个碳原子上去掉一个氢原子衍生而来。典型的烷基包括但不仅限于，甲烷基；乙烷基；丙烷基如丙烷-1-基、丙烷-2-基(异丙基)、环丙烷-1-基等；丁烷基如丁烷-1-基、丁烷-2-基(仲丁基)、2-甲基丙烷-1-基(异丁基)、2-甲基丙烷-2-基(叔丁基)、环丁烷-1-基等；等等。
“烯基”，它本身或作为其他取代基的一部分是指不饱和的支链的、直链的或环状的至少具有一个碳-碳双键的烃基基团，从母体烯烃中的一个碳原子上去掉一个氢原子衍生而来。基团可为双键的顺式或反式构型。典型的烯基包括但不仅限于，乙烯基；丙烯基如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、丙-2-烯-2-基、环丙-1-烯-1-基、环丙-2-烯-1-基；丁烯基如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基-丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1，3-二烯-1-基、丁-1，3-二烯-2-基、环丁-1-烯-1-基、环丁-1-烯-3-基、环丁-1，3-二烯-1-基等；等等。
“炔基”，它本身或作为其他取代基的一部分是指不饱和的支链的、直链的或环状的至少具有一个碳-碳三键的烃基基团，从母体炔烃中的一个碳原子上去掉一个氢原子衍生而来。典型的炔基包括但不仅限于，乙炔基；丙炔基如丙-1-炔-1-基、丙-2-炔-1-基等；丁炔基如丁-1-炔-1-基、丁-1-炔-3-基、丁-3-炔-1-基等；等等。
“酰基”，它本身或作为其他取代基的一部分是指-C(O)R30基团，其中R30为此处定义的氢、烃基、环烃基、环杂烃基、芳基、芳基烃基、杂烃基、杂芳基、杂芳基烃基。代表实例包括但不仅限于，甲酰基、乙酰基、环己酰基、环己甲酰基、苯甲酰基等、苯乙酰基等等。
“烷氧基”，它本身或作为其他取代基的一部分是指-OR31基团，其中R31代表此处定义的烃基或环烃基。代表实例包括但不仅限于，甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环己基氧基等等。
“烃基磺酰基”，是指-S(O)2R32基团，其中R32代表此处定义的烃基或环烃基基团。代表实例包括但不仅限于，甲磺酰基、乙磺酰基、丙磺酰基、丁磺酰基等等。
“芳基”，它本身或作为其他取代基的一部分是指一个一价的芳香族碳氢化合物基团，由母体芳香族的环状体系的一个碳原子上去掉一个氢原子衍生而来。典型的芳基基团包括但不仅限于，由乙酰亚蒽、乙酰亚萘、乙酰亚菲、蒽、薁、苯、、六苯并苯、荧蒽、芴、并六苯、己芬、hexalene、as-indacene、s-indacene、二氢化茚、茚、萘、八并苯、八苯、氯甲桥萘、卵苯、戊-2，4-二烯、五并苯、并环戊二烯、二苯并菲、二萘嵌苯(perylene)、苯乙肼(phenalene)、菲、苉、七曜烯、芘、皮蒽、玉红省、9，10-苯稠菲、三萘等等衍生而来的基团。优选地，一个烃基基团包含6-20个碳原子，比较优选的是6-12个碳原子。
“芳基烃基”，它本身或作为其他取代物的一部分是指一个非环状的烃基基团，其中与一个碳原子，典型的为一个末端碳原子或sp3碳原子，相连的氢原子中的一个被芳基取代。典型的芳基烃基基团包括但不仅限于，苄基、2-苯乙烷-1-基、2-苯乙烯-1-基、萘甲基、2-萘乙烷-1-基、2-萘乙烯-1-基、萘并苄基、2-萘并苯乙烷-1-基等等。当指的是特定的芳基烃基时，可采用术语芳烷基、芳烯基和/或芳炔基。优选地，一个芳基烃基基团为C6-C30的芳基烃基，例如芳基烃基基团中的芳烷基、芳烯基、芳炔基部分为C1-C10，而芳基部分为C6-C20，更优选地，一个芳基烃基基团为C6-C20的芳基烃基，例如芳基烃基基团中的芳烷基、芳烯基、芳炔基部分为C1-C8，而芳基部分为C6-C12。
“诊断有效量”指一种化合物的量，是为了检测某种疾病向患者给药时，足够的检测出疾病的量。“诊断有效量”会根据化合物、治疗患者的疾病及其严重性、年龄、体重等等而有所变化。
“有效量”指一种化合物的量，当给药以检测、诱导或抑制某种特定的性质或病症时，足够检测出待测物、足够诱导或抑制某种特定的性质或病症的量。“有效量”会根据抗体和某种特殊的性质或条件而有所变化。
“化合物”指此处公开的化合物，包括此处公开的结构通式所包含的化合物和此处公开结构的化合物。这些化合物特别包括此处公开的氨基酸序列的任何多聚体形式、它的治疗偶合物和诊断偶合物。这些化合物可以由它们的化学结构和/或化学名称确定。当化学结构和化学名称冲突的时候，化学结构对于确定化合物具有决定性的作用。化合物中可包含一个或几个手性中心和/或双键，因此可能以立体异构体的形式存在，如双键异构体(即几何异构体)、对映异构体或非对映异构体等。相应的，当没有指明手性中心的立体化学结构时，此处描述的化学结构包括在那些手性中心所有可能的构型，包括纯立体异构体的形式(例如，纯几何异构体、纯对映异构体或纯非对映异构体)以及对映异构体和立体异构体的混合物。应用本领域所熟知的分离技术或手性合成技术可以将对映异构体和立体异构体的混合物分解为它们的对映异构体或立体异构体成分。化合物以几种互变异构形式存在，包括烯醇式、酮式及其混合物。相应地，这里描述的化学结构包括图示化合物所有可能的互变异构形式。化合物也包括同位素标记的化合物，其中一个或多个原子的原子量与自然界中发现的通常的原子量不同。同位素的实例可能整合在发明的化合物中，它包括，但不仅限于2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、31P、32P和35S。化合物可能以非溶剂化形式和溶剂化形式，包括水合形式和作为氮氧化物存在。大体上，水合的、溶剂化的和氮氧化物等形式均包含在本发明的范围中。某些化合物可能以多种结晶或无定形的形式存在。一般地，对于本发明预期的应用来说，所有物理形式都是相等的且意图包含在本发明的范围内。此外，应该理解，当对化合物的局部结构进行图解时，括号表示局部结构与分子其他部分的附着点。
“环烃基”，它本身或作为其他取代基的一部分是指饱和的或不饱和的环状烃基基团。指明特定的饱和度水平时，可采用术语环烷基或环烯基。典型的环烃基基团包括，但不仅限于，由环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷等等衍生的基团。优选地，环烃基基团为C3-C10的环烃基，更优选地，为C3-C7的环烃基。
“环杂烃基”，它本身或作为其他取代基的一部分是指饱和的或不饱和的环状烃基基团，其中一个或几个碳原子(和任何相关的氢原子)独立地被相同或不同的杂原子所取代。典型的取代碳原子的杂原子包括，但不仅限于，N、P、O、S、Si等等。特指特定的饱和度水平时，可采用术语“环杂烷基”或“环杂烯基”。典型的环杂烃基基团包括，但不仅限于，由环氧化物、氮杂丙环(azirines)、硫杂丙环、咪唑烯、吗啉、哌嗪、哌啶、吡唑烷、吡咯烷、奎宁环等等衍生的基团。
“
杂烃基、杂烷基、杂烯基和杂炔基”，它们本身或作为其他取代基的一部分是分别指烃基、烷基、烯基和炔基基团，其中一个或几个碳原子(和任何相关的氢原子)独立地被相同或不同的杂原子所取代。可被包含在这些基团中的典型杂原子基团包括，但不仅限于，-O-、-S-、-O-O-、-S-S-、-O-S-、-NR34R35-、-＝N-N＝-、-N＝N-、-N＝N-NR36R37、-PR38-、-P(O)2-、-POR39-、-O-P(O)2-、-SO-、-SO2、-SnR40R41-等等，这里R34、R35、R36、R37、R38、R39、R40和R41独立的为氢、烃基、取代的烃基、芳基、取代的芳基、芳基烃基、取代的芳基烃基、环烃基、取代的环烃基、环杂烃基、取代的环杂烃基、杂烃基、取代的杂烃基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烃基、取代的杂芳基烃基。
“
杂芳基”，它本身或作为其他取代基的一部分是指一种通过从一个母体杂芳环体系的单个原子中，去除一个氢原子衍生而来的一价的杂芳香基团。典型的杂芳基基团包括，但不仅限于，由吖啶、砷杂茚(arsindole)、咔唑、β-咔啉、色烷、色烯、噌啉、呋喃、咪唑、吲唑、吲哚、二氢吲哚、吲嗪、异苯并呋喃、异色烯、异吲哚、异二氢吲哚、异喹啉、异噻唑、异噁唑、萘啶、噁二唑、噁唑、啶(perimidine)、菲啶、菲啰啉、吩嗪、酞嗪、蝶啶、嘌呤、吡喃、吡嗪、吡唑、哒嗪、吡啶、嘧啶、吡咯、吡咯嗪、喹唑啉、喹啉、喹嗪、喹喔啉、四唑、噻重氮、噻唑、噻吩、三唑、夹氧杂蒽等等衍生的基团。优选地，杂芳基基团来自5-20元杂芳基，更优选地，来自5-10元杂芳基。优选的杂芳基基团是由噻吩、吡咯、苯并噻吩、苯并呋喃、吲哚、吡啶、喹啉、嘛唑、噁唑和吡嗪衍生而来的。
“
杂芳磺酰基”是指一种-S(O)2R42基团，其中，R42是一种如这里定义的杂芳基基团。代表实例包括，但不仅限于，吡啶基磺酰基、吲哚基磺酰基、咪唑基磺酰基等等。
“
杂芳基烃基”，它本身或作为其他取代基的一部分是指一种无环烃基基团，其中它的连接某个碳原子(典型为末端碳原子或sp3碳原子)的其中一个氢原子被一个杂芳基基团所取代。指明特定的烃基部分时，可采用术语杂芳烷基、杂芳烯基和/或杂芳炔基。在优选的实施方式中，杂芳基烃基基团为一个6-30元杂芳基烃基，例如，杂芳基烃基中的烷基、烯基、炔基部分为1-10元的，而杂芳基部分为一个5-20元的杂芳基，更优选地，为一个6-20元杂芳基烃基，例如，杂芳基烃基中的烷基、烯基、炔基部分为1-8元的，而杂芳基部分为一个5-12元的杂芳基。
“
氧羰基”，它本身或作为其他取代基的一部分是指一种-C(O)OR43基团，其中，R43，代表一种如这里定义的烃基、取代的烃基、芳基、取代的芳基、芳基烃基、取代的芳基烃基、环烃基、取代的环烃基、环杂烃基、取代的环杂烃基、杂烃基、取代的杂烃基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烃基、或取代的杂芳基烃基基团。代表实例包括，但不仅限于，甲氧羰基、哌啶氧羰基、苯氧羰基、苄氧羰基等等。
“
母体芳环系统”指一种不饱和环状的或多环的具有共轭π电子系统的环状系统。“母体芳环系统”的定义中特别包括融合的环状体系，其中一个或多个环为芳香族的且一个或多个环为饱和或不饱和的，例如：芴、茚满、茚、phenalene等。典型的母体芳环系统包括，但不仅限于，醋亚蒽、苊烯、醋亚菲、蒽、甘菊环、苯、、晕苯、荧蒽、芴、并六苯、己芬、hexalene、as-indacene、s-indacene、二氢化茚(indane)、茚、萘、八并苯(octacene)、八苯(octaphene)、氯甲桥萘(octalene)、卵苯、戊-2，4-二烯、戊省、并环戊二烯(pentalene)、二苯并菲(pentaphene)、二萘嵌苯(perylene)、苯乙肼、菲、苉、七曜烯(pleiadene)、芘、皮蒽、玉红省(rubicene)、9，10-苯稠菲(triphenylene)、三萘(trinaphthalene)等等。
“
母体杂芳环系统”指一种母体芳环系统，其中一个或多个碳原子(及任何相关的氢原子)独立地被相同或不同的杂原子取代。典型的取代碳原子的杂原子包括，但不仅限于，N、P、O、S、Si等。“母体杂芳环系统”的定义中特别包括融合的环状体系，其中一个或多个环为芳香族的且一个或多个环为饱和或不饱和的，例如：砷杂茚(arsindole)、哌氧环烷、苯并呋喃、色烷、色烯、吲哚、二氢吲哚、夹氧杂蒽等。典型的母体杂芳环系统包括，但不仅限于，砷杂茚(arsindole)、咔唑、β-咔啉、色烷、色烯、噌啉、呋喃、咪唑、吲唑、吲哚、二氢吲哚、吲嗪、异苯并呋喃、异色烯、异吲哚、异二氢吲哚、异喹啉、异噻唑、异噁唑、萘啶、噁二唑、噁唑、啶(perimidine)、菲啶、菲啰啉、吩嗪、酞嗪、蝶啶、嘌呤、吡喃、吡嗪、吡唑、哒嗪、吡啶、嘧啶、吡咯、吡咯嗪、喹唑啉、喹啉、喹嗪、喹喔啉、四唑、噻重氮、噻唑、噻吩、三唑、夹氧杂蒽等等。
“
药物组合物”指最少一种化合物和一种药学上可接受的载体，通过载体可将化合物向患者给药。
“
药学上可接受的盐”指一种化合物的盐，其具有母体化合物的所需药理活性。这样的盐类包括：(1)加酸盐，由无机酸形成，如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等或由有机酸形成，如乙酸、丙酸、己酸、环戊基丙酸(cyclopentanepropionic acid)、羟基乙酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰)苯甲酸、肉桂酸、苯基乙醇酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基二环[2.2.2]-庚-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸，三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基磺酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、己二烯二酸等等；或(2)当母体化合物中存在的一个产生酸性的质子被一个金属离子，如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子取代或者与一种有机碱如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡萄糖胺等进行配位而形成的盐。
“
药学上可接受的载体”是指一种用于化合物给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或者传递体。
“患者”包括人。“人”和“患者”这两个名词这里可以替换使用。
“防止”或“预防”是指降低获得某种疾病或者失调的风险(即，使疾病的至少一种临床症状，不在一个可能遭受或者倾向于该种疾病，但还没有经受或显示该疾病的症状的患者身上发展)。
“前体药物”是指一种药物分子的衍生物，它需要在身体内以转化释放活性药物。前体药物在转化为母体药物之前，常常而不一定没有药理活性。一种含有羟基的药物可能转化为例如一种磺酸、酯或者碳酸盐前体药物，它们可在体内水解以提供羟基化合物。一种含有氨基的药物可能转化为例如氨基甲酸盐、酰胺、烯胺、亚胺、N-膦酰、N-磷酰或N-次磺酰药物前体，它们可以在体内水解以提供氨基化合物。一种羧酸药物可以转化为一种酯(包括甲硅烷酯和硫酯)、酰胺或酰肼药物前体，它们可以在体内水解以提供羧酸化合物。官能团不同于上述列举的药物，其药物前体是本领域技术人员所熟知的。
“前体部分(Promoiety)”是指保护基团的一种形式，当用于掩蔽一个药物分子中的官能团时能将药物转化为前体药物。典型地，前体部分可通过键附着于药物，此键能在体内用酶法或者非酶法切开。
“保护基团”是指一组原子，当它附着于一个分子中的反应官能团时，可掩蔽、降低或者阻碍该官能团的反应能力。保护基团的实例可以在Greenet al.“Protective Groups in Organic Chemistry”，(Wiley，2nd ed.1991)和Harrisonet al.“Compendium of Synthetic Organic Methods”，Vols.1-8(John Wiley andSons，1971-1996)中找到。代表性的氨基保护基团包括，但不仅限于，甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、苯甲基、苄氧羰基(“CBZ”)、叔丁氧羰基(“Boc”)、三甲硅烷基(“TMS”)、2-三甲硅烷基-乙磺酰基(“SES”)、三苯甲基和取代的三苯甲基基团、烯丙氧羰基、9-芴甲氧羰基(“FMOC”)、硝基-藜芦氧羰基(“NVOC”)等等。代表性的羟基保护基团包括，但不仅限于，那些羟基基团或被酰化或被烷基化的基团如苄基，和三苯甲基醚及其他烃基醚，四氢吡喃基醚、三烃基甲硅烷基醚和烯丙基醚。
“取代的”是指一个基团，其中一个或多个氢原子独立地被相同的或不同的取代基代替。典型的取代基包括，但不仅限于，-M、-R60、-O-、＝O、-OR60、-SR60、-S-、＝S、-NR60R61、＝NR60、-CF3、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-S(O)2O-、-S(O2)OH、-S(O)2R60、-OS(O2)O-、-OS(O)2R60、-P(O)(O-)2、-P(O)(OR60)(O-)、-OP(O)(OR60)(OR61)、-C(O)R60、-C(S)R60、-C(O)OR60、-C(O)NR60R61、-C(O)O-、-C(S)OR60、-NR62C(O)NR60R61、-NR62C(S)NR60R61-NR62C(NR63)NR60R61和-C(NR62)NR60R61。其中M独立的为卤素；R60、R61、R62和R63独立的为氢、烃基、取代的烃基、烷氧基、取代的烷氧基、环烃基、取代的环烃基、环杂烃基、取代的环杂环基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基，或者可选择地，R60与R61和与它们相连的氮原子一起形成一种环杂烃基或取代的环杂烃基的环。并且R64和R65独立的为氢、烃基、取代的烃基、芳基、环烃基、取代的环烃基、环杂烃基、取代的环杂烃基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基，或者可选择地，R64与R65和与它们相连的氮原子一起形成一种杂环烃基或取代的杂环烃基环。优选地，取代基包括-M、-R60、＝O、-OR60、-SR60、-S-、＝S、-NR60R61、＝NR60、-CF3、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-S(O)2R60、-OS(O2)O-、-OS(O)2R60、-P(O)(O-)2、-P(O)(OR60)(O-)、-OP(O)(OR60)(OR61)、-C(O)R60、-C(S)R60、-C(O)OR60、-C(O)NR60R61、-C(O)O-、-NR62C(O)NR60R61，比较优选地，-M、-R60、＝O、-OR60、-SR60、-NR60R61、-CF3、-CN、-NO2、-S(O)2R60、-P(O)(OR60)(O-)、-OP(O)(OR60)(OR61)、-C(O)R60、-C(O)OR60、-C(O)NR60R61、-C(O)O-。最优选地-M、-R60、＝O、-OR60、-SR60、-NR60R61、-CF3、-CN、-NO2、-S(O)2R60、-OP(O)(OR60)(OR61)、-C(O)R60、-C(O)OR60、-C(O)O-，其中，R60、R61和R62与前面定义一致。
任何疾病或失调的“
治疗”或“
疗法”是指在一个实施方式中，对于疾病或失调的改善(即，停止或减轻疾病的发展或该病的至少一种临床症状)。在另一实施方式中，“治疗”或“疗法”是指在改善至少一种也许患者辨别不到的身体参数。在又一实施方式中，“治疗”或“疗法”是指从身体上(如，可辨别症状的稳定性)，或从生理上(如，身体参数的稳定性)，或者从身体或生理上，抑制疾病或失调。在又一实施方式上，“治疗”或“疗法”是指延迟疾病或失调的发病。
“
治疗有效量”的意思是一种化合物的量，当为了治疗某种病而向患者给药时，足够对于疾病产生这样的疗效。治疗有效量会依据化合物、待治疗患者的疾病及其严重性以及年龄、体重等的不同而变化。
对于本发明中优选实施例的参考文献，现在可以详细地给出。当一同描述本发明和优选实施例时，应该理解为并非有意将本发明限制于这些优选实施例之内，而正相反，有意涵盖可选择体、修饰体和可以包括在本发明的实质和范围里的由附加的权利要求确定的等价体。
化合物
在第一个方面，本发明提供了如结构式(I)所示的化合物：
或它的药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或氮氧化物，其中：
a、b、x、y和z为0或1；
A为环状氨基酸；
B为碱性氨基酸；
C为小型氨基酸；
R1是烃基、取代的烃基、酰基、取代的酰基、烃基磺酰基，取代的烃基磺酰基、芳基烃基、取代的芳基烃基、芳基磺酰基、取代的芳基磺酰基、杂烃基、取代的杂烃基、杂芳基磺酰基、取代的杂芳基磺酰基、杂芳基烃基、取代的杂芳基烃基、氧羰基、或取代的氧羰基；
R2为烃基，-(CH2)mS(O)nR5，-(CH2)mS(O)n-S(O)oR5或-(CMe)mS(O)nR5
m为1、2、3或4；
n和o独立地为0、1或2；
R3为-CH2CONH2或-CH2CH2CONH2；
R4为烃基，-NR6R7或-OR8；
R5为烃基、取代的烃基、酰基、取代的酰基、芳基、取代的芳基、芳基烃基、取代的芳基烃基、杂烃基、取代的杂烃基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烃基、取代的杂芳基烃基、氧羰基、或取代的氧羰基；
R6和R7独立的为氢或烃基；且
R8为烃基、取代的烃基、芳基、取代的芳基、芳基烃基、取代的芳基烃基、杂烃基、取代的杂烃基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烃基或取代的杂芳基烃基；
满足条件为：
当m为1时，R5不是甲基；
仅当A是脯氨酸、B是组氨酸、C是丝氨酸时，a为1；且当a为0时b为0；且
仅当b、x、y和z为1时，R2为-(CH2)mS(O)nR5或-(CH2)mS(O)n-S(O)oR5。
环状氨基酸包括，例如天然氨基酸(如脯氨酸)和非天然氨基酸(如四元和六元的脯氨酸类似物)。碱性氨基酸包括，但不仅限于，天然氨基酸如精氨酸、组氨酸和赖氨酸和非天然氨基酸如高赖氨酸和鸟氨酸。小型氨基酸包括，例如甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。
非天然氨基酸在化合物中的用途是特别考虑的。这样的氨基酸包括，例如天然存在的氨基酸的D-氨基酸、β-丙氨酸、3-氨基丙酸、2，3-二氨基丙酸、4-氨基丁酸等、肌氨酸、鸟氨酸、N-甲基甘氨酸、瓜氨酸、叔丁基丙氨酸、高精氨酸等。
化合物中的一个或酰胺键可能会选择性地被诸如-CH2-NH-、-CH2-S-、-CH2-S(O)-、-CH2-S(O)2-、-COCH2-、-CH＝CH-、-CH(OH)CH2等本领域技术人员所熟知的等排体替代(参见，例如，Spatola，“Chemistry and Biochemistryof Amino Acids，Peptides and Proteins，”B.Weinstein，(eds.)，Marcel Dekker，NewYork，1983；Spatola et al.，Life Sci.1986，38：1243-1249；Almquist et al.，J.Med.Chem.1980，23：1392；Holladay et al.，Tetrahedron Lett.1983，24：4401；Hruby，Life Sci.1982，4；189：199；Jennings-White et al.，Tetrahedron Lett.1982，23：327-384；Moore et al.，Adv.In Pharmacol 1995，33：91-141；Giannis et al.，1997，Adv.In Drug Res.29：1-78)。如Olson et al.，J.Med.Chen.1993，36：3039和Chorev et al.，Science 1979，204：1210中所述的那样，这些肽中也可能包含肽的类似物。
在第二种实施方案中，A为脯氨酸，B为组氨酸，C为丝氨酸且R3为-CH2CONH2。
优选地，在这前两种实施方案中，R1为酰基、取代的酰基、芳基烃基、取代的芳基烃基、氧羰基或取代的氧羰基。更优选地，R1为酰基、取代的酰基、氧羰基或取代的氧羰基。
在前两种实施方案的-种实施方案中，R2为-(CH2)mS(O)nR5或-(CH2)mS(O)n-S(O)oR5且m为1或2。在前两种实施方案的另一种实施方案中，R4为NR7R8且R7和R8为氢。
在第一种实施方案的一种实施方案中，a、b、x、y和z为1。在另一种实施方案中，x为0，a、b、y和z为1。在又一种实施方案中，x和y为0，a、b和z为1。在又一种实施方案中，x、y和z为0，a和b为1。在又一种实施方案中，x、z、a和b为1，y为0。在又一种实施方案中，x、a和b为1，y和z为0。在又一种实施方案中，y、a和b为1，x和z为0。在又一种实施方案中，x、y、z和a为1，b为0。在又一种实施方案中，y、z和a为1，x和b为0。在又一种实施方案中，x、y、z和b为1，a为0。在又一种实施方案中，z和a为1，x、y和b为0。在又一种实施方案中，a为1，x、y、z和b为0。在又一种实施方案中，A为D氨基酸。在又一种实施方案中，A、B和C为L氨基酸且分别与R2和R3相邻的α碳具有L构型。
在第三种实施方案中，A为脯氨酸、B为组氨酸、C为丝氨酸且R3为-CH2CONH2，R1为酰基、取代酰基、氧羰基和取代的氧羰基，a、b、x、y和z为1，m为1或2，且R4为NR7R8且R7和R8为氢。优选地，R1为酰基，更优选地，R1为-C(O)CH3，而R2是烃基。优选地，R2是烯丙基或甲基。
在第三种实施方案的更特殊的实施方案中，R1为-C(O)CH3，R2为-(CH2)mS(O)nR5且m为1。在一种实施方案中，n为0且R5为烃基或取代的烃基。在另一种实施方案中，n为0且R5为芳基烃基或取代的芳基烃基。在又一种实施方案中，n为0且R5为酰基或取代的酰基。在又一种实施方案中，n为0且R5为氧羰基或取代的氧羰基。
在第三种实施方案的另一更特殊的实施方案中，R1为-C(O)CH3、R2为-(CH2)mS(O)n-S(O)oR5且m为1。优选地，n和0为0且R5为烃基或芳基。
在第三种实施方案的另一更特殊的实施方案中，R1为-C(O)CH3、R2为-(CH2)mS(O)n-S(O)oR5且m为2。在一种实施方案中，n为0且R5为烃基或芳基烃基。在另一种实施方案中，n为1或2且R4为烃基。在又一种实施方案中，n为0且R5为酰基。
在第四种方案中，A为脯氨酸，B为组氨酸，C为丝氨酸且R3为-CH2CONH2，R1为酰基、取代的酰基、氧羰基和取代的氧羰基，m为1或2且R4为NR7R8且R7和R8为氢。在另一种实施方案中，x为0，a、b、y和z为1。在又一种实施方案中，x和y为0，a、b和z为1。在又一种实施方案中，x、y和z为0，a和b为1。在又一种实施方案中，y为0，a、b、x和z为1。在又一种实施方案中，y和z为0，a、b和x为1。在又一种实施方案中，x和z为0，a、b和y为1。在又一种实施方案中，b为0，a、x、y和z为1。在又一种实施方案中，b和x为0，a、y和z为1。在又一种实施方案中，b、x和y为0，a和z为1。在又一种实施方案中，b、x、y和z为0，a为1。优选地，在上述实施方案中，R1为酰基，R2为-(CH2)mS(O)nR5，m为1且R5为烃基。
在第五种实施方案中，A为脯氨酸，B为组氨酸，C为丝氨酸且R3为-CH2CONH2，a为0且b、x、y和z为1。
图1-5图示了结构式(I)的模型化合物。本发明的其他模型化合物为Ac-Pro-His-Ser-Cys(β，β-二甲基)-Asn-NH2。
式(I)所示的化合物的共价修饰包含在本发明的范围内，并可能提高溶解度、吸收率、生物半衰期等等。这些修饰可能通过特异的氨基酸残基与有机试剂发生的选择性反应而产生。例如，组氨酸残基可能与焦碳酸二乙酯在pH5.5-7或者与对-溴苯甲酰甲基溴在pH6.0发生选择性的反应。包含自由氨基基团的残基可与羧酸酸酐、亚氨酸酯、磷酸吡哆醛、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2，4-戊二酮、乙醛酸等发生选择性的反应。精氨酰基残基可与苯乙二醛和多种二酮发生选择性反应。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基可以在温和的酸性条件下去氨基化以提供相应的谷氨一酰基和天冬氨一酰基。脯氨酸和赖氨酸可以选择性地发生羟基化，而丝氨酸和苏氨酸残基可以选择性地发生磷酰化。组氨酸和赖氨酸的α-氨基基团可以选择性的发生甲基化(Creighton，Proteins：Structure and MoleculeProperties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，pp.79-86(1983))。
与双功能的交联剂(例如，1-双(偶氮乙酰)-2-乙苯、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、4-叠氮水杨酸的酯、同(基)双功能亚氨酸酯(例如二琥珀酰亚胺酸酯类，如3，3′-二硫双(琥珀酰亚胺丙酸酯))、双功能马来酰亚胺(例如，双-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷等)的衍生作用可能用来连接化合物和水不溶性的支持基质或其他大分子载体。光敏化试剂如甲基-3-[(对-叠氮苯基)二硫]丙酰亚胺酸酯也可能用于将化合物附着于水不溶性的支持基质。可选择地，化合物可直接与反应活性的水不溶性的基质反应(例如，溴化氰-活化的碳水化合物)。
本发明也包括更长链的肽，包含结构式(I)所示化合物的氨基酸序列中的重复单位。在一种实施方案中，这样一种多聚体的重复单位为一种化合物的氨基酸序列，其中a、b、x、y和z为1。在另一种实施方案中，重复序列为结构式(I)所示化合物的氨基酸序列，其中只有a、b、x、y和z其中之一为0，其余为1。
一种多聚体可包含由结构式(I)所示化合物的氨基酸序列组成的重复单位的相同或不同种组合。这样的多聚体肽可通过化学合成，也可通过重组DNA技术生产，然后进行半胱氨酸残基的化学修饰。优选地，合成的多聚体有核心肽序列的2-12个重复单位，更优选地，有2-8个重复单位。因此，多聚体中氨基酸的总数不应超过大约110个残基(或相当的个数，当多聚体中包含接头或间隔序列)。
优选的多聚体的有P1 n的结构式，其中P1为一种五肽，n为2-8。在另一个实施方案中，一种多聚体有(P1-Xm)n-P2的结构式，其中P1和P2为五肽。P1和P2可以相同也可以不同，且每个P1可代表结构式(I)所示的不同的五肽衍生物。X为C1-C5烃基、C1-C5含至多4个氧原子的聚醚或Glyz，其中，z＝1-6，m＝0或1且n＝1-7。
优选的重组生产的肽多聚体具有(P1-Glyz)n-P2的结构式，其中P1和P2为相同或者不同的五肽，而且多聚体中的每个P1可能为不同的五肽，n＝1-100且z＝0-6。多聚体可在N末端和C末端选择性地功能化。
只要修饰不会阻碍或抑制生物学功能，(即，血管生成的抑制和阻碍、细胞侵入、细胞增殖等)结构式(I)所示的化合物可由任何形式的分子以共价连接的方式修饰。举例来说，结构式(I)所示的化合物可通过糖基化、乙酰化、pegylation、磷酸化、酰胺化、蛋白水解切割、与细胞配体或蛋白的连接等等方式进行修饰。优选地，结构式(I)所示的化合物与一种治疗剂或一种诊断剂直接或者通过一种连接部分结合。
优选地，连接部分首先与一个诊断或治疗试剂连接以形成一种连接部分中间体，然后此中间体进一步与结构式(I)所示的化合物连接。对于本领域的技术人员来说，显然连接部分也可以首先与结构式(I)所示的化合物连接以形成连接部分中间体，然后再与诊断试剂或治疗试剂相连接。
典型地，一种连接部分会包含一种接头和用于将一种治疗试剂或诊断试剂结合到肽上的一种连接基团。接头的性质，如接头是亲水性的还是疏水性的、长的还是短的、坚硬的还是柔软的，取决于特定的应用以及需要的偶联方式。接头可由一个或多个相同或不同的连接基团随意替换，从而提供多价的连接部分，它们能将多种治疗剂或诊断剂与一种抗体偶联。
广泛多样性的接头为本领域所熟知，所述接头包含适合将氨基氮化合物与连接基团隔开的稳定的键，作为实例而不是限制包括：烃基、杂烃基、非环状杂原子桥、芳基、芳基芳基、芳基烃基、杂芳基、杂芳基-杂芳基、取代的杂芳基-杂芳基，杂芳基烃基、杂芳基-杂烃基等等。这样，接头可包括碳-碳单键、碳-碳双键、碳-碳三键或芳族碳-碳键、氮-氮键、碳-氮键、碳-氧键和/或碳-硫键。因此，接头中可能包含功能基团如羰基、醚、硫醚、羧胺、磺胺、脲、氨基甲酸乙酯、肼等。
选择一种合适的接头是本领域的技术人员力所能及的。例如，当需要一种坚硬的接头时，接头可能为坚硬的聚不饱和烃基或一种芳基、二芳基、杂芳基等等。当需要一种柔软的接头时，接头可能是柔软的肽如Gly-Gly-Gly或一种柔软的饱和烃基或杂烷基。亲水性接头可为，例如聚乙醇或聚醚如聚乙二醇。疏水性接头可为，例如烃基或芳基。
优选地，一种连接基团具有促使与结构式(I)所示的化合物的附属的活性功能基团形成共价键的能力，以提供与肽偶联的治疗剂或诊断剂。因此，连接基团可以是任何本领域技术人员所熟知的活性功能基团，它们可以与肽的普通化学基团反应(例如，氨基、巯基、羟基、羧化物、酰亚胺酰基、胍、酰胺等等)。因此，连接基团可为，例如一种光化学激活的基团、一种电化学激活的基团、一种自由基团供体、一种自由基团受体、一种亲核基团或者一种亲电子基团。然而，本领域的技术人员会认识到许多在某种反应条件下，典型无活性的功能基团可被激活变为有活性的。可被激活的基团包括，例如：醇类、羧酸和酯类，包括它们的盐。
连接基团可为-NHR1、-NH2、-OH、-SH、卤素、-CHO、-R1CO、-SO2H、-PO2H、-N3、-CN、-CO2H、-SO3H、-PO3H、-PO2(OR1)H、-CO2R1、-SO3R1或-PO(OR1)2，其中R1为烃基。优选地，连接基团为-NHR1、-NH2、-OH、-SH、-CHO、-CO2H、R1CO-、卤素和-CO2R1。
接头和连接基团的一些实施方案包括。例如，接头为-(CH2)n-的化合物，n为1-8的整数，连接基团为-NH2、-OH、-CO2H和-CO2R1以及相应的任何合适的氢被取代的类似物。连接部分的其它实施方案包括任何的氨基酸，例如它可以是一种D型或L型氨基酸。这样，连接部分可为由氨基酸任何组合组成的二肽、三肽或四肽。这些肽中肽键的极性可为C-N或N-C。
治疗剂和诊断剂可直接应用本领域的技术人员所知的多种常规反应与结构式(I)所示的化合物连接。例如，浓缩剂(例如，碳化二亚胺、羰二咪唑等等)可用于形成一种酰胺键，连接一种治疗或诊断试剂的氨基基团和如谷氨酸、天冬氨酸残基上的羧酸基团及结构式(I)所示化合物的C-末端羧基基团。
类似的方法可用于将含有接头和连接基团的治疗剂和诊断剂连接到结构式(I)所示的化合物上。例如，应用本领域的技术人员所知的常规方法，可将含有接头和连接基团的诊断剂和治疗剂连接在赖氨酸的氨基基团、谷氨酸和天冬氨酸的羧基基团、半胱氨酸的巯基基团、苏氨酸和丝氨酸的羟基基团和结构式(I)所示化合物中的芳香氨基酸上的各部分上。大体上，选择一种合适的策略，或直接或通过一种接头和连接基团将治疗剂和诊断剂连接到结构式(I)所示的化合物上，这些都在技术人员的能力范围之内。
可与结构式(I)所示的化合物偶联的治疗剂包括，但不仅限于，放射性核素、蛋白毒素(例如蓖麻毒素、假单胞菌外毒素、白喉毒素、皂草素、美洲商陆抗病毒蛋白、bouganin等)、细胞毒性癌症试剂、喜树碱(例如，9-硝基喜树碱(9NC)、9-氨基喜树碱(9AC)、10-氨基喜树碱、9-氯喜树碱、10，11-亚甲基二氧喜树碱、irinothecin、芳香喜树碱酯类、烃基喜树碱酯类、托泊替康、(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯[去]吡喃[3′，4′:6，7]吲嗪[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮甲磺酸酯二水合物(DX-8951f)、7-[(2-三甲基-甲硅烷基)乙基]-20(S)喜树碱(BNP1350)、卢比替康、依沙替康、勒托替康、Diflomotecan和其他的同型喜树碱等)、紫杉烷类(例如紫杉醇)、环硫酮(epithilones)、刺孢霉素、羟基脲、阿糖胞苷、环磷酰胺(cyclophosamide)、异膦酰胺、硝基脲、顺-二氯二氨络铂、丝裂霉素、美坦生、卡铂、氮烯唑胺、丙卡巴肼、依托泊苷、tenoposide、争光霉素、阿霉素(doxurobicin)、2-吡咯啉阿霉素(2-pyrrolinodoxurobicin)、道诺霉素、伊达比星(idarubican)、柔红霉素(daunorubicin)、更生霉素(dactinomycin)、普卡霉素(plicamycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、门冬酰胺酶(asparginase)、二羟基炭疽霉素二酮(dihydroxy anthracine dione)、光神霉素(mithrimycin)、放线菌素D(actinomycin D)、1-去氢睾酮(1-dehydrotestosterone)、细胞松驰素(cytochlasins)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春瑞滨(vinorelbine)、紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)、短杆菌肽D(gramicidinD)、糖皮质激素(glucocorticoids)、蒽环类抗生素(anthracyclines)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(teracaine)、利多卡因(lidocaine)、萘氧丙醇安(propanolol)、嘌罗霉素(puromycin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine)、芥子毒素(mustard toxins)、anthyrimycin、紫杉醇(paclitaxel)、烷基化剂(例如双氯甲氨(mechoremethamine)、thioepa chlorambucil、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)、loustine、cyclothospamide、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链唑霉素(streptozotocin)等)同系物和它们的类似物。优选地，治疗剂为一种细胞毒素癌症试剂，例如紫杉烷、喜树碱、epithilone或蒽环类抗生素。在一种实施方案中，治疗剂为多柔比星。在另一种实施方案中，治疗剂为放射性核素。
术语“诊断性标记”表示一种结构式(I)所示的化合物具有一种附加的可以诊断上检测的特征的标记。多种不同的标记在本领域存在，标记的方法是本领域技术人员所熟知的。本发明中采用的标记其一般类别包括但不仅限于，放射性同位素、顺磁性同位素、可以通过正电子发射断层扫描术(PET)成像的化合物、荧光的或有色的化合物、可以通过磁共振成像的化合物、化学发光化合物、生物发光化合物等。适合的可检测的标记包括，但不仅限于，放射性标记、荧光标记、荧光发生标记或生色标记。可以简单地通过γ计数器、闪烁计数器或放射自显影术进行检测的有用的放射性标记(放射性核素)包括，但不仅限于，3H、125I、131I、35S和14C。
将金属络合到肽上的方法和组合物为本领域所熟知。这些金属为优选的可以检测的包括放射性核素在内的金属原子，并可络合到蛋白和其他分子上(参见，例如，美国专利Nos.5,627,286、5,618,513、5,567,408、5,443,816和5,561,220)。
常用的荧光标记包括，但不仅限于，荧光素钠、若丹明、丹酰、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、o-邻苯二醛和胺荧(Haugland，Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals，Sixth Ed.，Molecular Probes，Eugene，OR，1996)，它们可用于标记结构式(I)所示的化合物。荧光素、荧光素衍生物和荧光素样分子如俄勒冈绿和它的衍生物、若丹明绿和罗多尔绿，它们利用异硫氰酸酯、琥珀酰亚胺酯或二氯三吖嗪酰活性基团与胺类基团耦合。类似地，荧光团也可利用马来酰亚胺、碘乙酰胺和吖丙啶反应性基团与巯基耦合。长波长若丹明，它主要为取代氮原子的若丹明绿衍生物，是优选的标记试剂。这个基团包括四甲基若丹明、X-若丹明和德克萨斯红衍生物。其他优选的荧光团是那些被紫外光激发的荧光团。实例包括，但不仅限于，瀑布蓝、香豆素衍生物、萘类(丹磺酰氯为其成员)、芘和吡啶基唑衍生物。
无机材料如半导体纳米晶体(Bruchez，et al.，1998，Science281：2013-2016)和量子点，例如包覆硫化锌的硒化镉(Chan，et al.，Science 1998，281：2016-2018)也可用作诊断标记。
结构式(I)所示的化合物也可以用荧光发射金属如152Eu或其他镧系金属进行标记。这些金属可以通过酰基螯合基团如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)等，与结构式(I)所示的化合物连接。
放射性核素可以与结构式(I)所示的化合物直接连接或利用酰基螯合基团如DTPA和EDTA间接连接以用于体内诊断。螯合化学是本领域所熟知的，不同范围的肽螯合剂可用于提供被标记的肽。当然，被标记的肽必须保持天然肽的生物活性。
任何具有诊断和治疗价值的放射性核素可以在本发明中用作放射性标记。在优选的实施方案中，放射性核素为一种γ发射或β发射的放射性核素，例如，一种选自镧系或者锕系元素的元素。正电子发射的放射性核素，例如68Ga或64Cu，也可以利用。合适的γ发射的放射性核素包括那些在诊断影像学应用中有用的放射性核素。γ发射的放射性核素优选地具有1小时-40天的半衰期，更优选地为12小时-3天。合适的γ发射的放射性核素实例包括67Ga、111In、99mTc、169Yb和186Re。最优选的放射性核素为99mTc。
优选的放射性核素的实例(以原子序号排列)为、67Cu、67Ga、68Ga、72As、89Zr、90y、97Ru、99Tc、111In、123I、125I、131I、169yb、186Re、和201T1。虽然关于正电子发射的放射性金属作为标记只做了有限的工作，但是某种蛋白质如铁传递蛋白和人血清白蛋白，已经用68Ga进行了标记。
许多金属(不是放射性同位素)可用于磁共振成像术，包括钆、锰、铜、铁、金和铕。钆是最优选的。一般地，被标记的肽用于诊断中达到检测限所需的量会根据如患者的年龄、状态、性别和病变范围、禁忌症(如果有的话)以及其他因素的变化而变化，而且可由个别的医生或诊断专家进行调节。药量可以从0.01mg/kg到100mg/kg变化。
如本领域的技术人员所熟知，结构式(I)所示的化合物也可以通过与一种磷光化合物或一种化学发光化合物的耦合进行检测。
优选的化学发光化合物包括，但不仅限于，鲁米诺、异鲁米诺、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。相似地，生物发光化合物可用于检测抗体和/或它的偶联物，包括但不仅限于，荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。
基于具有或能生成高消光系数的生色团的生色化合物的色度检测法也可用于检测如结构式(I)所示的化合物。
合成如结构式(I)所示的化合物
结构式(I)所示的化合物可以通过传统合成方法获得。用于制备化合物及其中间体的起始原料是可以买到的或者可通过熟知的合成方法进行制备。
肽可利用如Merrifield，J.Amer.Che z.Soc.1963，85：2149-54大体描述的固相合成方法，利用可以从化学品供应商(例如Applied Biosystems，FosterCity，CA)处购买的自动化装置进行制备。固相肽合成可以通过将一个被保护的α氨基酸(用丁氧基肼基甲酸酯(Boc)或9-芴甲氧羰基(FMOC)保护)耦联到一种合适的树脂上，从肽的C末端初始化。
制备这样的原料可以将一种α-氨基保护的氨基酸通过一种酯链连接到一种氯甲基化树脂、羟甲基化树脂、BHA树脂、MBHA树脂或一种Rink树脂上。这个本领域所熟知的方法已经在例如美国专利No.5,994,309中公开了。可选择地，化合物可利用被保护的α-氨基酸通过溶液相合成制得(参见，例如，Bodanszky，“Methods of Peptide Synthesis，”Springer Verlag，NewYork，1984)。显然，对于本领域的技术人员来说，非天然氨基酸可容易地用在上述化学合成的标准方法中而且可由本领域的技术人员所熟知的传统方法制备。
本领域的技术人员会懂得，合成如结构式(I)所示的化合物存在两种通常的合成策略。带有含硫氨基酸的化合物，既可以通过将适当的含硫氨基酸通过上面描述的一种标准化学合成方法直接合成，又可以通过将合适的含巯基的肽前体的选择性功能化并且，如果需要的话，再将生成的含硫醚的肽选择性氧化间接合成。多种有机功能基存在的条件下，自由巯基的选择性功能化方法(例如，选择性烃基化、酰化、形成二硫化物等)为本领域的技术人员所熟知，如将硫化物氧化为硫氧化物(如NaBO3、乙腈∶水，NalO4、乙腈∶水等)和砜类(如H2O2、HCO2H)的方法。
化合物的测定
本领域技术人员应理解本文所述测定化合物活性的体外和体内实验是示例性的而不是全面的。
内皮细胞迁移的测定
对于内皮细胞(EC)迁移，通过可转移孔(transwell)加入200μL胶原蛋白溶液用I型胶原(50μg/mL)包被所述可转移孔，然后在37℃保温过夜。将所述可转移孔置于24-孔板中，并将化学引诱剂(例如FGF-2)加入底部小室中总体积为0.8mL的介质中。将EC诸如人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用胰蛋白酶从单层培养物分离出来以后，用无血清培养基将其稀释到终浓度约106细胞/mL，并将0.2mL这种细胞悬液加入每个可转移孔的上方小室中。可将待检测的抑制物加入上方和下方的小室，并在潮湿环境下在37℃允许迁移持续5小时。将所述可转移孔从24-孔板中取出并用DiffQuik染色。用棉签刮落去除上方小室中没有迁移的细胞，并将膜剥离，覆于载玻片上，在高倍视野(400x)下计数以确定发生迁移的细胞数目。
抗-侵入活性的生物测定法
诸如EC或肿瘤细胞(例如，PC-3人前列腺癌)等的细胞在已知为Matrige侵入实验系统的实验中侵袭穿过重构的基底膜(Matrigel)的能力已经在现有技术中详细描述(Kleinman et al.，Biochemistry 1986，25：312-318；Parish et al.，1992，Int.J.Cancer 52：378-383)。Matrigel是一种重构的基底膜，它含有IV型胶原，层粘连蛋白，硫酸肝素蛋白多糖诸如基底膜蛋白多糖。Matrigel可结合并使bFGF，玻璃粘连蛋白(vitronectin)以及转化型生长因子-β(TGFβ)，尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)，组织纤溶酶原激活物(tPA)以及已知为I型纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)的丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)(Chambers et al.，Canc.Res.1995，55：1578-1585)局部化。本领域认可对靶向细胞外受体或酶化合物的这种测定法所得的结果可预测这些化合物在体内的效力(Rabbani et al.，Int.J.Cancer 1995，63：840-845)。
所述测定法采用可转移孔组织培养插入物。侵袭性细胞可定义为这样的细胞，其可穿过Matrigel以及聚碳酯膜的上面(upper aspect)并粘附于该膜的底面。含有聚碳酯膜(孔径8.0μm)的可转移孔(Costar)用Matrigel(Collaborative Research)包被，所述Matrigel已经在无菌PBS中稀释到终浓度75μg/mL(每插入物60μL稀释的Matrigel，并置于24-孔板的孔中。将所述膜在生物学安全的箱(biological safety cabinet)内干燥过夜然后通过加入100μL含抗生素的DMEM并在摇床上保持1小时而再水合。通过吸出从各个插入物中去除DMEM，并将0.8mL DMEM/10％FBS/抗生素加入所述24-孔板的每个孔中使得其包围可转移孔的外部(“下方小室”)。将新鲜DMEM/抗生素(100μL)，人Glu-纤溶酶原(5μg/mL)，以及任何待检的抑制物加入上方，可转移孔内部(“上方小室”)。待检测的细胞通过胰蛋白酶消化并重悬于DMEM/抗生素中，然后将其以终浓度800,000细胞/mL加入可转移孔的上方小室。将上方小室的终体积调节到200μL。将安装好的板在潮湿的、5％CO2环境下保温72小室。保温后，固定所述细胞并用DiffQuik(Giemsa染色)染色，然后用棉签刮擦上方小室以去除Matrigel以及任何没有侵入穿过该膜的细胞。利用X-acto刀片将该膜从可转移孔剥离，利用Permount和盖玻片放置在载玻片上，然后在高倍(400x)视野下计数。发生侵入的细胞的平均数通过计数5-10个视野确定并作为抑制物浓度的函数作图。
抗血管增生活性的血管形成实验(Tube-Formation Assay)
内皮细胞例如可制备或购得的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)或人微血管内皮细胞(HMVEC)以2×105细胞/mL的浓度与纤维蛋白原(5mg/mL)在磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中以1∶1(v/v)比率混合。加入凝血酶(5单位/mL终浓度)并将混合物立即转移到24-孔板(0.5mL每孔)。允许纤维蛋白凝胶形成，将VEGF和bFGF(各为5ng/mL的终浓度)以及受试化合物加入所述孔。将所述细胞在37℃、5％CO2中保温4天，在此期间计数每个孔中的细胞并将所述细胞分类为圆形的，伸长型并没有分枝，以及伸长型有一个分枝，或伸长型有两个或两个以上的分枝。结果表示为5个不同孔中每一化合物浓度的平均值。通常，如存在血管生成抑制物，细胞保持圆形或形成未分化的管(tube)(例如0或1个分枝)。本领域认可该实验可预测体内的血管生成(或抗血管生成)效力(Min et al.，Cancer Res.1996，56：2428-2433)。
在另一实验中，内皮细胞管形成(endothelial cell tube formation)在内皮细胞于Matrigel上培养时观察到(Schnaper et al.，J.Cell.Physiol.1995，165：107-118)。内皮细胞(1×104细胞/孔)被转移到Matrigel-包被的24-孔板上，并于48小时以后定量所述管形成。通过与内皮细胞同时加入抑制物或在加入内皮细胞后的各个时间点加入抑制物来检测该抑制物。也可通过加入(a)血管生成生长因子诸如bFGF或VEGF，(b)分化刺激剂(例如，PMA)或(c)这些物质的组合刺激管形成。
不受任何理论限制，该实验通过将具体类型的基底膜呈给内皮细胞而模拟了血管生成，所述基底膜是发生迁移并分化的内皮细胞首先遭遇的基质层。除了结合的生长因子以外，在Matrigel(以及在基底膜原位)或其蛋白水解产物中发现的基质组分也可刺激内皮细胞管形成，这使得该模型与已经描述的纤维蛋白凝胶血管生成模型(Blood et al.，Biochim.Biophys.Acta1990，1032：89-118；Odedrat al.，Pharmac.Ther.1991，49：111-124)互补。
增殖抑制测定
化合物抑制EC增殖的能力在96孔模式中测定。用I型胶原(明胶)包被该板的各孔(PBS中0.1-1mg/mL，0.1mL每孔，室温30分钟)。洗涤该板(用PBS三次)以后，将3-6,000细胞铺于每孔并允许其在内皮生长培养基(EGM；Clonetics)或M199培养基(含0.1-2％FBS)中粘附4小时(37℃/5％CO2)。4小时末，去除所述培养基以及任何未被粘附的细胞，并将含有bFGF(1-10ng/mL)或VEGF(1-10mg/mL)的新鲜培养基加入各孔。最后加入待检测的化合物，允许该板保温(37℃/5％CO2)24-48小时。将MTS(Promega)加入每个孔并允许其保温1-4小时。测定在490mm的吸收(与细胞数呈比例)以便确定对照孔和含有受试化合物的孔的增殖差异。利用经培养的粘附性肿瘤细胞建立类似的测定系统。然而，在该模式中省去胶原。将肿瘤细胞(例如，3,000-10,000/孔)铺板并允许其粘附过夜。将无血清培养基加入所述孔，并使得所述细胞同步化24小时。随后将含有10％FBS的培养基加入各孔以刺激增殖。待检测的化合物包含在一些孔中。24小时以后，将MTS加入该板并如上所述进行测定并读取数值。
细胞毒性测定
测定化合物对各种细胞类型的抗增殖和细胞毒效应，所述细胞包括肿瘤细胞，EC，成纤维细胞和巨噬细胞。这在检测已经与治疗部分诸如放射治疗剂或毒素偶联化合物时尤其有用。例如，所述化合物之一与用131I碘化的Bolton-Hunter试剂的偶联物预期可抑制表达PHSCN结合位点/受体的细胞的增殖(很可能通过诱导凋亡)。预期可对肿瘤细胞以及经过刺激的内皮细胞产生抗增殖效应，但有时所述效应不针对静止的内皮细胞或正常人皮肤纤维母细胞。在正常细胞中观察到的任何抗增殖或细胞毒效应可代表所述偶联物的非特异性毒性。常见的测定法包括将细胞以每孔5-10,000细胞的密度铺于96孔板。待检测的化合物以10× IC50(结合实验中检测到的)(有赖于偶联物)的浓度加入，并允许其与所述细胞一起保温30分钟。所述细胞用培养基洗涤三次，然后将含[3H]胸苷(1μCi/mL)的新鲜培养基加入所述细胞，并允许它们在37℃、5％CO2中保温24和48小时。在各个时间点利用1MNaOH溶解细胞，并利用β-计数仪确定每孔计数。利用MTS试剂或CyQuant通过非放射活性法测定增殖来测定总细胞数。对于细胞毒测定(测定细胞裂解)，利用Promega96孔细胞毒试剂盒。如果没有抗增殖活性的证据，可利用TumorTACS(Genzyme)测定对凋亡的诱导。
Caspase-3活性
化合物促进EC凋亡的能力可通过测定caspase-3的活化来确定。用I型胶原(明胶)包被P100板，并将5×105EC接种于含有10％FBS的EGM中。24小时(37℃、5％CO2中)后，用含有2％FBS，10ng/ml bFGF以及所需受试化合物的EGM置换培养基。6小时后收获细胞，在1％Triton中制备细胞裂解物并用EnzChekCasqp
角膜血管生成模型
所用方案与Volpert et al.，J.Clin.Invest.1996，98：671-679所述基本相同。简而言之，麻醉雌性Fischer大鼠(120-140克)并且将包含Hydron，bFGF(150nM)以及待检测化合物的沉淀(5μl)植入距边缘1.0-1.5mm角膜处的微小切口中。植入后5和7天评估新生血管形成。第7天，麻醉动物，并输注染料诸如胶态炭等对血管进行染色。随后处死动物，用福尔马林固定角膜，使角膜平整并对其进行照相来评估新生血管化的程度。新生血管可通过对总血管面积或长度成像或简单地通过对血管进行计数来定量。
Matrigel
栓测定
该测定法基本上如Passaniti et al.，1992，Lab Invest.67：519-528所述进行。将冰冷的Matrigel(例如，500μL)(Collaborative Biomedical Products，Inc.，Bedford，MA)与肝素(例如，50μg/ml)，FGF-2(例如，400ng/ml)以及受试化合物混合。在一些测定中，bFGF可用肿瘤细胞代替作为血管生成刺激物。将Matrigel混合物经皮下注入4-8周龄无胸腺裸鼠腹中线附近的部位，优选每只小鼠注射3次。注入的Matrigel形成可触知的固体凝胶。选择注射位点使得每只动物接受阳性对照栓(诸如FGF-2+肝素)，阴性对照栓(例如，缓冲液+肝素)，以及包括待检测其对血管生成的效应的化合物的栓，例如，(FGF-2+肝素+化合物)。所有处理优选以一式三份进行。在注射约7天后或其它适合观察血管生成的时间，通过颈错位处死动物。沿腹中线剥离小鼠皮肤，回收Matrigel栓并在高分辨率下立刻扫描。将所述栓分散在水中，并在37℃保温过夜。血色素(Hb)水平利用Drabkin溶液(例如得自Sigma)根据生产商说明测定。Hb在栓中的含量是血管生成的间接测定，这是由于它反映了样品中血的量。此外，或可选，可在处死动物前对其注射0.1ml缓冲液(优选PBS)，所述缓冲液含有与荧光团偶联的高分子量葡聚糖。通过荧光计测定的、在分散的栓中的荧光量也作为该栓中血管生成的测定法。利用抗-CD31单克隆抗体(CD31是“血小板-内皮细胞粘附分子或PECAM”)的染色也可用于确定所述栓中新生血管形成和微血管密度。
小鸡绒毛尿囊膜(CAM)血管生成测定
该测定法基本如Nguyen et al.，Microvascular Res.1994，47：31-40所述进行。含有血管生成因子(bFGF)或肿瘤细胞以及抑制物的网状物被置于8日龄鸡胚的CAM上，并在植入所述样品以后观察所述CAM3-9天。血管生成通过测定网状物中含有血管的方格的百分比来定量。
利用肿瘤细胞的Matrigel
栓实验体内血管生成抑制和抗肿瘤效应的
评估
在该实验中，将肿瘤细胞，例如3LL Lewis肺癌或大鼠前列腺癌细胞系MatLyLu的1-5×106个细胞与Matrigel混合，然后根据上文B部分所述的方案注入小鼠肋腹部。约5-7天后，可在该栓中观察到肿瘤细胞块和强血管生成反应。在真正的肿瘤环境中化合物的抗肿瘤和抗血管生成作用可通过将该化合物包含在所述栓中进行评估。然后测定肿瘤重量，Hb水平或荧光水平(对于处死前注入的葡聚糖-荧光团偶联物)。为测定Hb或荧光，所述栓首先用组织匀浆器匀浆化。
皮下(s.c.)肿瘤生长异种移植模型
用MDA-MB-231细胞(人乳癌)或另一种适宜的人肿瘤细胞系以及Matrigel(0.2mL中有1×106细胞)皮下接种动物的右肋腹侧。肿瘤生长到200mm3，用开始用受试化合物的治疗(100□g/动物/天，q.b.IP给药)。每隔一天测定肿瘤体积并在治疗2-6周后处死动物。切下肿瘤，称重并用石蜡包埋。肿瘤的组织切片通过苏木精伊红，抗-CD31，Ki-67，TUNEL，CD6或其它免疫组织化学染色进行分析。
转移的异种移植模型
利用实验转移模型检测化合物对晚期转移的抑制(Crowley et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，905021-5025)。晚期转移涉及的步骤有：肿瘤细胞的附着和溢出，局部侵入，种植，增生和血管生成。用转染了报道基因(优选绿色荧光蛋白(GFP)基因)的人前列腺癌细胞(PC-3)接种裸鼠，所述细胞也可用编码酶氯霉素乙酰转移酶(CAT)，萤光素酶或LacZ的基因转染。该方法允许利用这些标记物(GFP的荧光检测或酶活性的组织化学比色检测)来追踪这些细胞的命运。注入所述细胞，优选静脉内，约14天后鉴定转移，具体是在肺中但也见于局部淋巴结，股骨和脑。这模拟了人前列腺癌天然出现的转移的器官向性。例如，表达GFP的PC-3细胞(1×106细胞每只小鼠)经静脉注入裸(nu/nu)小鼠的尾静脉。用受试化合物以100μg/动物/天、q.d.IP给药对动物进行处理。单个转移细胞和病灶通过荧光显微镜或光学显微镜组织化学法或通过研磨组织以及对可检测标记的定量比色测定得以定量。
通过PHSCN和功能衍生物抑制自发体内转移
大鼠同基因的乳癌系统采用Mat BIII大鼠乳癌细胞(Xing et al.，Int.J.Cancer 1996，67：423-429)。将肿瘤细胞，例如约106悬浮于0.1mL PBS中，接种于雌性Fisher大鼠的乳腺脂肪垫中。接种时，将14-日Alza渗透微型泵植入腹腔内以分散受试化合物。该化合物溶于PBS(例如，200mM母液)中，经无菌过滤并置于微型泵中以达到约4mg/kg/天的释放率。对照动物接受微型泵中的单独的载体(PBS)或载体对照肽。约14天时处死动物。在用本发明化合物治疗的大鼠中，观察到原代肿瘤的体积以及脾、肺、肝、肾和淋巴结中的转移数(作为分离病灶计数)明显减小。组织学和免疫组织化学分析显示，受处理动物肿瘤中坏死和细胞程序死亡迹象增加。大的坏死区可见于缺乏新生血管化的肿瘤中。与131I偶联的人或兔PHSCN及其衍生物(每个分子肽1或2个原子)是有效的放射治疗剂，并发现它们的效力为未偶联的多肽的效力的至少两倍。反之，利用对照肽进行处理不能导致肿瘤体积或转移的明显改变。
3LL Lewis肺癌：原代肿瘤生长
该肿瘤系作为C57BL/6小鼠中的肺癌自发出现(Malave等，J.Nat′l.Canc.Inst.1979，62：83-88)。其通过皮下(sc)接种在C57BL/6小鼠中传代而得以增殖，并在半同种异体的C57BL/6×DBA/2F1小鼠或同种异体C3H小鼠中检测。通常对于皮下(sc)植入为6只动物一组，对于肌内(im)植入为10只动物一组。将肿瘤作为2-4mm的片段皮下植入，或作为约0.5-2×106细胞的悬浮细胞接种物肌内或皮下植入。植入24小时后开始治疗，并持续到具体体积的肿瘤(通常约400mg)可触知。每天ip给药受试化合物，持续11天。
通过测体重，触诊，和肿瘤体积测定对动物进行随诊。在肌内接种后第12天未经治疗的对照受试鼠中肿瘤的重量通常为500-2500mg。通常，半数存活时间为18-28天。使用阳性对照化合物例如环磷酰胺，其以20mg/kg/注射每天、在第1-11天使用。计算出的结果包括平均动物体重，肿瘤体积，肿瘤重量，存活时间。为了确定治疗活性，受试化合物应在两次多剂量测定中检测。
3LL Lewis肺癌：原代生长和转移模型
该实验在本领域已知(Gorelik et al.，J.Nat′l.Canc.Inst.1980，65：1257-1264；Gorelik et al.，Rec.Results Canc.Res.1980，75：20-28；Isakov et al.，Invasion Metas.2：12-32(1982)；Talmadge et al.，J.Nat′l.Canc.Inst.1982，69：975-980；Hilgard et al.，Br.J.Cancer 1977，35：78-86)。受试小鼠为雄性C57BL/6小鼠，2-3月龄。皮下，肌内或足垫内植入后，该肿瘤发生转移，优选在肺内。对于一些肿瘤系，原代肿瘤显示抗转移效应并且必须在研究转移期之前必须首先被切除(见美国专利5,639,725)。
单细胞悬浮物可通过用0.3％胰蛋白酶溶液处理切碎的肿瘤组织从实体瘤制备。细胞用PBS(pH7.4)洗涤3次，并悬于PBS中。以这种方式制备的3LL细胞存活率通常为约95-99％(通过锥虫蓝染料排除检测)。悬浮于0.05ml PBS中的存活的肿瘤细胞(3×104-5×106)经皮下注入C57BL/6小鼠的背部或一后足垫中。可见到的肿瘤在背部sc注入106细胞以后3-4天出现。肿瘤出现的日子和所建立的肿瘤的直径每两天用卡钳测定。将所述治疗作为每周的1-5个剂量的肽或衍生物给药。另一实施方案中，所述肽通过渗透微型泵递送。
在涉及背部肿瘤的肿瘤切除的实验中，当肿瘤体积达约1500mm3时，将小鼠随机分成两组：(1)原代肿瘤完全切除；或(2)进行假手术并保持肿瘤完整。尽管500-3000mm3的肿瘤抑制转移物的生长，1500mm3是可被安全切除且生存率较高而不会有局部再生长的原代肿瘤的最大体积。21天后，处死所有小鼠并进行尸检。
取出肺并称重。在Bouin′s溶液中固定肺，并记录可见转移的数量。转移物的直径也利用装置有含千分尺的双目镜立体镜(binocular stereoscope)在8倍放大率下通过目视测定。在记录的直径的基础上，可能计算每处转移物的体积。为测定每个肺中的转移物总体积，用可观察到的转移物的平均数乘以转移物的平均体积。为了进一步测定转移物生长，可测定125IdUrd掺入肺细胞(Thakur et al.，J.Lab.Clin.Med.1977，89：217-288)。肿瘤切除10天后，将25μg荧光脱氧尿苷接种到带有肿瘤的腹膜中(并且如果使用为肿瘤切除后的小鼠)。30分钟后，给予小鼠1μCi125IdUrd(碘代脱氧尿苷)。一天后，去除肺和脾并称重，利用γ计数器测定125IdUrd掺入的程度。
有具有足垫肿瘤的小鼠中，当肿瘤直径达约8-10mm时，将小鼠随机分成2组：(1)在膝关节以上结扎后截除具有肿瘤的腿；或(2)使小鼠作为不进行切除的带有未切除肿瘤的对照。(切除肿瘤携带型小鼠中的无肿瘤腿对于随后的转移没有已知的影响，这排除了麻醉，应激或手术的可能影响)。截肢后10-14天处死小鼠。如上所述评估转移。
统计学：代表转移发生率以及其在肿瘤携带型小鼠肺内的生长的值并非正态分布。因此，非参数统计学诸如Mann-Whitney U-检验可用于分析。
Gorelik et al.对该模型的研究(见上文)显示肿瘤细胞接种物的体积决定了转移生长的程度。接受手术后小鼠肺内转移的速率与携带原代肿瘤的小鼠中的转移速率不同。因此，在于其中诱导了原代肿瘤的小鼠肺中，转移物数量低于未经手术的肿瘤携带型小鼠中的转移物数量，但前者的转移物体积高于未经手术的对照鼠中的转移物体积，所述原代肿瘤的诱导使通过接种大量3LL细胞(1-5×106)然后手术切除来进行的。利用125IdUrd掺入作为肺转移的测定法，没有发现肿瘤切除的小鼠和肿瘤携带型小鼠的肺之间有显著差异，所述小鼠最初用1063LL细胞接种。切除接种105肿瘤细胞后产生的肿瘤显著加速转移物生长。这些结果与切除局部肿瘤后小鼠的存活一致。切除局部肿瘤后转移物生长加速的现象已经反复观察到(例如见美国专利5,639,725)。这些观察提示接受癌症手术的患者的预后。
重组DNA方法
分子生物学的一般方法已经在现有技术中充分描述(Sambrook等Molecular Cloning：A Laboratofy Manual，2nd(or later)Edition，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1989；Ausube et al.，Current Protocols inMolecular Biology，Vol.2，Wiley-Interscience，New York，(current edition)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；Glover，DM，editor，DNA Cloning：A Practical Approach，vol.I & II，IRL Press，1985；Alberts et al.，Molecular Biology of the Cell，2nd(or later)Ed.，GarlandPublishing，Inc.，New York，NY(1989)；Watson et al.，Recombinant DNA，2nd(orlater)Ed.，Scientific American Books，New York，1992；and Old et al.，Principlesof Gene Manipulation：An Introduction to Genetic Engineering，2nd(or later)Ed.，University of California Press，Berkeley，CA(1981))。
除非另有说明，具体的核酸序列意图包含其保守取代变体(例如，简并密码子取代)和互补序列。术语“核酸”与“多核苷酸”同义，并意图包含基因，cDNA分子，mRNA分子，以及这些物质任一的片段诸如寡核苷酸，以及其等同物(在下文更详细描述)。核酸的大小可表示为千碱基(kb)或碱基对(bp)。这些是由对使用者确定的或公开的核酸序列的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)得来的推测。蛋白大小表示为分子量千道尔顿(kDa)或表示为长度(氨基酸残基数)。蛋白大小可从PAGE，测序，基于编码核酸序列推定的氨基酸序列或从公开的氨基酸序列估计。
具体地，编码对应于本发明肽多聚物或其活性变体的氨基酸序列的DNA分子可通过聚合酶链反应(PCR)(见，例如，美国专利4,683,202)，利用来自本发明公开的序列的引物来合成。这些cDNA序列可随后组装入真核或原核表达载体，并可利用产生的载体通过适宜的宿主细胞指导合成融合多肽或其片段或衍生物，所述宿主细胞例如COS或CHO细胞。
本文术语“核酸”意图包括所述片段或等同物。本发明的核酸序列可为DNA或RNA。经转化或转染而表达所述多聚物的原核或真核宿主细胞在本发明的范围内。例如，所述多肽多聚物可表达在以下细胞中：细菌细胞诸如大肠杆菌，昆虫细胞(杆状病毒)，酵母或哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞(优选用于经转染的细胞对人类的治疗)。本领域已知其它适宜的宿主。在真核细胞中的表达导致重组多肽的部分或完全糖基化和/或相关链间或链内二硫键形成。在酵母酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的载体的实例包括pYepSecl(Baldari et al.，1987，EMBO J.6：229-234)，pMFa(Kurjanet al.，1982 Cell 30：933-943)，pJRY88(Schultz et al.，1987，Gene 54：113-123)，和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.)。用于在培养的昆虫细胞(SF9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith et al.，1983，Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow et al.，(1989)Virology 170：31-39)。通常，COS细胞(Gluzman，1981 Cell 23：175-182)与诸如pCDM8的载体联用(Aruffo et al.，见上文)，用于在哺乳动物细胞中的瞬时扩增/表达，而CHO(dhfr-阴性CHO)细胞与诸如pMT2PC(Kaufman et al.，1987，EMBO J.6：187-195)的载体联用，用于在哺乳动物细胞中稳定扩增/表达。NSO骨髓瘤细胞系(谷氨酰胺合成酶表达系统)可得自Celltech Ltd。
含有所需编码和对照序列的适宜载体的构建采用标准连接和限制技术，所述技术是本领域已知的。分离的质粒，DNA序列或合成的寡核苷酸被切割，剪接，并以所需形式进行再连接。形成载体的DNA序列可得自多种来源。骨架载体(backbone vector)和对照系统通常可见于可得“宿主”载体，所述载体用于构建中的大部分序列。对于相关编码序列，初始构建可以并通常是从cDNA或基因组DNA文库获取适宜序列。然而，一旦所述序列被公开，可能从单个核苷酸衍生物开始在体外合成整个基因序列。大小可测定(例如500-100bp)的基因的整个基因序列可通过以下方法制备：合成单个重叠互补寡核苷酸，利用DNA聚合在存在脱氧核糖核苷酸三磷酸的条件下填满单链非重叠部分。该方法已经成功用于构建已知序列的数种基因。见例如Edge，Nature 1981，292：756；Nambair et al.，Science 1984，223：1299；andJay，J Biol.Chem.1984，259：6311。
合成寡核苷酸可通过磷酸三酯法(如上述文献所述)或亚膦酰胺法(如Beaucage et al.，Tetrahedron Lett.1981，22：1859；和Matteucci et al.，J.Am.Chem.Soc.1981，103：3185所述)制备，并可利用可购得的自动化寡核苷酸合成仪制备。退火以前或为了标记而用激酶处理单链可利用已知方法实现。
一旦所需载体的组分可得，可利用标准限制和连接方法切下所述组分并连接。位点特异性DNA切割通过用适宜的一或多种限制酶在本领域通常理解的条件下进行处理来实施，其细节由这些可购得的限制酶的生产商说明。见，例如，New England Biolabs，产品目录。如需要，经切割的片段的大小分离可通过聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶利用标准技术实施。大小分离的常见描述见于Meth.Enzymol.(1980)65：499-560。
可用于将突变导入编码序列以产生变体的多种方法中的任何一种都可使用，条件是所述变体是重组产生的。这些突变包括简单的缺失或插入，碱基簇的系统性缺失，插入或取代或者单个碱基的取代。DNA序列的修饰可通过定点诱变这种已知的技术(其方案和试剂可购得)产生(zoller et al.，Nucleic Acids Res.1982，10：6487-6500和Adelman et al.，DNA1983，2：183-193))。所述分离的DNA通过限制分析和/或通过Sanger，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1977，74：5463)所述以及Messing et al.，Nucleic Acids Res.1981，9：309进一步描述的双脱氧核苷酸法，或通过Maxam et al.，Meth.Enzymol.所述的方法(见上文)进行测序。
载体DNA可通过常规技术而被导入哺乳动物细胞中，所述技术诸如磷酸钙或氯化钙共沉淀，DEAE-葡聚糖介导的转染，脂转染或电穿孔。转化宿主细胞的适宜方法见于Sambrook等(上文)以及其它标准教科书。在融合表达载体中，将蛋白水解位点引入报道物组和靶蛋白的接点以便在纯化该融合蛋白后将该靶蛋白从报道物组中分离出来。用于这种裂解的蛋白水解酶以及其识别序列包括因子Xa，凝血酶以及肠激酶。
治疗用途
根据本发明，化合物和/或其药物组合物可给药患有特征为异常血管化的疾病的患者，优选人。异常血管化包括异常新生血管化诸如新生血管、大血管、分支更多的血管的形成以及其它机制，具有不适当或增加的将血液携带到患病组织或位点的能力。所述化合物和/或其药物组合物可用于治疗异常血管化。
优选，特征为异常血管化的疾病包括癌症(例如，任何血管化的肿瘤，优选实体瘤，包括但不限于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食管癌、睾丸癌、肝癌、腮腺癌、胆道癌、结肠癌、直肠癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、甲状腺癌、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、黑素瘤、胶质瘤、神经母细胞癌、肉瘤(例如血管肉瘤，软骨肉瘤))，关节炎，糖尿病，动脉硬化，动静脉畸形，角膜移植物新生血管化，伤口愈合延迟，糖尿病视网膜病，老年性黄斑病变，肉芽形成，烧伤，血友病性关节，类风湿性关节炎，肥厚性疤痕，新生血管性青光眼，不联合性骨折，Osier Weber综合征，牛皮癣，脓性肉芽肿，晶状体后纤维组织形成(retrolental fibroplasias)，翼状胬肉，硬皮病，沙眼，血管粘连，眼新生血管化，寄生虫性疾病，术后过度生长(hypertrophy following surgery)，毛发生长抑制，黄斑变性(包括湿性和干性)，类风湿性关节炎和骨性关节炎。更优选，特征为异常血管化的疾病包括癌症，黄斑变性和类风湿性关节炎。
还涉及用于治疗患有不良细胞迁移，侵入，增殖相关性疾病或紊乱的患者的方法，所述方法包括给药受试者治疗有效量的化合物和/或其药物组合物。在上述方法中，所述患者患有肿瘤，且血管生成抑制导致肿瘤体积或生长速率减小或肿瘤的破坏。优选，所述受试者是人。
上述方法可能有效的疾病和病症的其它实例包括实体瘤的原代生长，白血病或淋巴瘤，肿瘤侵入，转移或肿瘤转移物生长；良性增生；动脉粥样硬化，心肌血管增生；球囊血管成型术后血管再狭窄，血管损伤后新生内膜形成，血管移植物再狭窄，冠脉侧枝循环形成(coronary collateralformation)，深静脉血栓，缺血性四肢血管生成；毛细管扩张，化腔性肉芽肿，角膜疾病，虹膜红变(rubeosis)，新生血管性青光眼(neovascularglaucoma)，糖尿病性和其它视网膜病，晶状体后纤维组织形成，糖尿病性新生血管化，黄斑变性，子宫内膜炎，关节炎，与慢性炎性疾病相关的纤维化，外伤性脊髓损伤包括缺血、疤痕形成和纤维化，肺纤维化，化疗诱导的纤维化；外伤愈合同时的疤痕形成和纤维化，胃溃疡，骨折，瘢痕瘤，或血管生成性疾病，血细胞生成性疾病，与病理性细胞侵入或血管生成相关的排卵，月经，妊娠或胎盘形成。
优选用上述方法治疗的疾病或病症是肿瘤生长，侵入或转移，具体是脑肿瘤。这种脑肿瘤的实例是星形细胞瘤，恶性星形细胞瘤(anaplasticastrocytoma)。胶质母细胞瘤，多形性胶质母细胞瘤，纤维状细胞性星形细胞瘤(pilocytic astrocytoma)，多形性黄色星形细胞瘤(pleiomorphicxanthoastrocytoma)，室管膜下巨细胞星形细胞瘤(subependymal giant cellastrocytoma)，原纤维性星形细胞瘤(fibrillary astrocytoma)，肥胖细胞型星形细胞瘤(gemistocytic astrocytoma)，原浆型星形细胞瘤(protoplasmicastrocytoma)，寡突胶质瘤(oligodendroglioma)，分化不良性寡突胶质瘤(anaplastic oligodendroglioma)，室管膜瘤(ependymoma)，分化不良性室管膜瘤(anaplastic ependymoma)，粘液乳头状室管膜瘤(myxopapillaryependymoma)，室管膜下瘤(subependymoma)，混合型寡星形细胞瘤(mixedoligoastrocytoma)和恶性寡星形细胞瘤(malignant oligoastrocytoma)。
上述方法也可用于治疗子宫疾病诸如子宫内膜易位以及病理性眼新生血管化，后者与以下疾病相关或导致以下疾病：增生性糖尿病性视网膜病(proliferative diabetic retinopathy)，新生血管性老年性黄斑病变(neovascularage-related macular degeneration)，幼年视网膜病(retinopathy of prematurity)，镰刀细胞视网膜病(sickle cell retinopathy)或视网膜静脉堵塞(retinal veinocclusion)。
此外，在具体的实施方案中，将化合物和/或其药物组合物给药患者，优选人，作为针对以异常血管化为特征的各种疾病或病症的预防性措施。因此，可将化合物和/或其药物组合物作为预防性措施给予患者，所述患者具有患以异常血管化为特征的疾病的倾向。因此，所述化合物和/或其药物组合物可用来预防一种疾病或病症同时治疗另一种(例如在治疗癌症的同时预防关节炎)。
所述化合物和/或其药物组合物在治疗或预防以异常血管化为特征的各种疾病或病症中的适宜性可通过本文所述或本领域已知的方法测定。因此，本领域技术人员可测定并利用所述化合物和/或其药物组合物来治疗并预防以异常血管化为特征的疾病或病症。
诊断用途和方法
将化合物和/或其药物组合物以诊断有效量给药患者，优选人，以便检测或描述诸如上述5.6部分所述的疾病。此外，化合物和/或其药物组合物可用于通过给药患者诊断有效量的化合物和/或其药物组合物来检测或描述与不良细胞迁移，侵入或增生相关的疾病(如5.6部分所述)。
化合物可被诊断性标记并用于例如检测细胞迁移，细胞侵入和细胞增生。在结合期间和结合后化合物的分布可利用适宜方法检测所述标记而在体外或体内追踪。诊断性标记的化合物可用于体内来进行诊断和预后，例如用来显示潜隐的转移灶或用于其它类型的原位评估。对于诊断应用，化合物可包括结合的接头部分，这是本领域技术人员已知的。
被标记的化合物的原位检测可通过从受试者取出组织学样品，并通过显微镜在适宜条件下检测所述样品以检测所述标记来实施。本领域技术人员可轻易理解多种组织学方法(诸如染色方法)的任一种可被修饰以便实现所述原位检测。
对于诊断性体内放射显影，可用的检测装置的类型是选择放射性核素中的主要因素。所选放射性核素必须具有一种类型的衰变，所述衰变可通过具体的装置检测。通常，任何用于显示诊断性显像的常规方法可根据本发明使用。选择放射性核素用于体内诊断的另一因素是其半寿期要足够长，以便使得在靶组织的最大吸收时仍可检出该标记，但同时也足够短使得对宿主有害的辐射被最小化。在一个优选实施方案中，用于体内显像的放射性核素不发射粒子，但产生大量140-200keV范围内的光子，其可通过常规γ照相机轻易检测。
体内显像被用于检测潜隐的转移，其不能通过其它方法检出。本发明的化合物可用于对所需动物种类的任何适宜的细胞、组织、器官或生物样品进行诊断、预后或研究步骤。术语“生物样品”指来自正常或患病受试者的身体的任何液体或其它物质，诸如血液，血清，血浆，淋巴液，尿液，唾液，泪液，脑脊液，乳汁，羊膜液，胆汁，腹水，脓液等。该术语还包括器官或组织提取物以及培养液，来自受试者的任何细胞或组织制备物已经在其中保湿。
有用的剂量被定义为化合物对于具体诊断措施的有效量。因此，有效量指足以利用适宜检测系统例如磁共振显像检测仪，γ照相机等而被检出的量。最低可检出量有赖于与肿瘤(信号)特异性结合的经标记化合物的量与非特异性结合或游离于血浆或细胞外液中的标记的化合物的量之比。
待给药的组合物量有赖于所选的具体组合物，疾病或病症，给药途径，显像领域技术人员的判断。通常，用于诊断的化合物的可检测量有赖于如下因素：诸如患者年龄，疾病，性别以及患病程度，禁忌病(如果有的话)，以及其它变量，并可通过个体内科医师或诊断医师来调节。剂量可为0.01mg/kg-100mg/kg。
治疗性/预防性给药
所述化合物和/或其药物组合物可优选用于人类用药。如前部分5.6所述，结构式(I)的化合物和/或其药物组合物可用于治疗或预防多种以异常血管化为特征的疾病或病症。
当用于治疗或预防上述疾病或病症时，化合物和/或其药物组合物可单独给药或应用，或与其它试剂联合用药。所述化合物和/或其药物组合物也可单独给药或应用，与其它药物活性剂(例如，其它抗癌药剂，其它抗血管生成药剂诸如鳌合剂例如锌，青霉胺，thiomolybdate等)，包括其它化合物联用。
本发明提供通过给药患者治疗有效量的化合物和/或其药物组合物来治疗或预防的方法。所述患者可以是动物，更优选是哺乳动物，更优选是人。
本发明的化合物和/或其药物组合物可口服给药。所述化合物和/或其药物组合物也可通过任何其它常规途径给药，例如通过输注或药团推注，通过上皮或粘膜皮肤层(例如口腔粘膜，直肠和小肠粘膜等)吸收。给药可为系统或局部的。各种递送系统(例如包囊化在脂质体、微粒、微胶囊、胶囊等中)也可用于给药化合物和/或其药物组合物。给药方法包括，但不限于，经皮内，经肌内，经腹腔内，经静脉内，经皮下，经鼻内，经硬膜外，口服，经舌下，经鼻内，经脑内，经阴道内，透皮，经直肠，通过吸入或局部给药，具体可给药耳，鼻，眼或皮肤。给药的优选模式由实施者来判断，并部分有赖于给药位点的情况。在大多数情况下，给药将导致所述化合物和/或其药物组合物释放到血液中。
在具体实施方案中，需要将一或多种化合物和/或其药物组合物局部给药需要治疗的区域。这可通过，例如但不限于以下途径实现：在手述过程中局部输注，局部应用，例如术后与伤口敷料一同应用，通过注射，经导管，经由栓剂，或经由植入物，所述植入物为多孔的、无孔的或凝胶状物质，包括膜诸如sialastic膜，或纤维。一个实施方案中，给药可通过在癌症或关节炎位点(或模型(former)位点)直接注射给药。
在具体实施方案中，可将一或多种化合物和/或其药物组合物通过任何适宜途径(包括经脑室内，经鞘内和经硬膜外注入)导入中枢神经系统。经脑室内诸如可通过例如附着于脑池诸如Ommaya脑池的脑室内导管而得以易化。
化合物和/或其药物组合物也可通过吸入直接给药肺。对于通过吸入给药，化合物和/或其药物组合物可通过多种不同装置方便地给药肺。例如，计量的剂量吸入器(Metered Dose Inhaler)(″MDI″)，其利用含有适宜低沸点推进剂(例如，二氟二氯甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或任何其它适宜气体)的罐可被用于将化合物直接递送给肺。
可选，干粉吸入器(Dry Powder Inhaler)(″DPI″)装置可用于将化合物和/或其药物组合物给药肺。DPI装置通常利用这样的机制，其使得气体释放在容器内产生干粉云，其随后可由患者吸入。DPI装置在本领域也是已知的。常见的改变是多剂量DPI(″MDDPI″)系统，其允许递送一个以上治疗剂量。MDDPI装置可得自诸如Astra Zeneca，Glaxo Wellcome，IVAX，ScheringPlough，Skye Pharma和Vectura等公司。例如，用于吸入器或吹入器中的凝胶质胶囊和药筒可配制成含有化合物以及适宜用于这些系统的粉状基质诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。
可用于递送化合物和/或其药物组合物其它形式的装置是例如由Aradigm Corporation，Hayward，CA提供的液体喷雾装置。液体喷雾系统利用非常小的喷嘴孔使得液体药物配制剂气溶胶化，并随后直接吸入肺。
一个实施方案中，利用雾化器将化合物和/或其药物组合物递送到肺。雾化器通过利用例如超声能量以形成可轻易吸入的细微颗粒而从液体药物配制剂产生气溶胶(见例如，Verschoyle et al.，British J.Cancer，1999，80，Suppl.2，96，包含在本文作为参考)。雾化器的实例包括Batelle PulmonaryTherapeutics，Columbus，OH(见，Armer et al.，美国专利5,954,047；van derLinden et al.，United States Patent No.5,950,619；van der Linden et al.，美国专利5,970,974)提供的装置。
另一实施方案中，电流体力学(electrohydrodynamic)(″EHD″)气溶胶装置用于将化合物和/或其药物组合物递送到肺。EHD气溶胶装置利用电能将液体药物溶液或悬液气溶胶化(见例如，Noakes et al.，美国专利4,765,539)。所述配制剂的电化学性质在利用EHD气溶胶装置将化合物和/或其药物组合物递送到肺时是重要的可优化参数，且所述优化通常由本领域技术人员实施。EHD气溶胶装置可比已知的肺递送技术更有效地将药物递送到肺。
另一实施方案中，所述化合物和/或其药物组合物可在囊泡具体是脂质体中递送(见Langer，1990，Science，249：1527-1533；Treat et al.，in″Liposomesin the Therapy of Infectious Disease and Cancer，″Lopez-Berestein andFidler(eds.)，Liss，New York，pp.353-365(1989)；一般地见″Liposomes in theTherapy of Infectious Disease and Cancer，″Lopez-Berestein and Fidler(eds.)，Liss，New York，pp.353-365(1989))。
另一实施方案中，所述化合物和/或其药物组合物可经由持续释放系统优选口服持续释放系统来递送。一个实施方案中，可利用泵(Langer，supra；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Bronzed.Eng.14：201；Saudek et al.，1989，N.Engl.JMed.321：574)。
一个实施方案中，可利用聚合物材料(见″Medical Applications ofControlled Release，″Langer and Wise(eds.)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；″Controlled Drug Bioavailability，″Drug Product Design andPerformance，Smolen and Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；Langertal.，1983，JMacromol.Sci.Rev.Macromol Chem.23：61；Levy et al.，1985，Science228：190；During et al.，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard et al.，1989，JNeurosurg.71：105)。另一实施方案中，聚合物材料可用于口服持续释放型递送。优选的聚合物包括羧甲基纤维素纳，羟基丙基纤维素，羟基丙基甲基纤维素和羟基乙基纤维素(最优选，羟基丙基甲基纤维素)。其它优选纤维素酯已经有所描述(Alderman，Int.J.Pharm.Tech.& Prod.Mfr.1984，5(3)1-9)。影响药物释放的因素是本领域已知的并已经在现有技术中描述(Bamba et al.，Int.J.Plzarm.1979，2，307)。
另一实施方案中，肠包衣制剂可用于口服持续释放给药。优选的包衣材料包括具有pH依赖性溶解性(即，pH-控制的释放)的聚合物，具有缓慢或pH依赖性膨胀、溶解或侵蚀速率的聚合物，(即，时间控制的释放)，通过酶降解的聚合物(即，酶控制的释放)以及形成可通过压力升高而被破坏的坚固层的聚合物(即，压力控制的释放)。
在另一实施方案中，渗透性递送系统可用于口服持续释放给药(Vermaet al.，Drug Dev.Ind.Pharm.2000，26：695-708)。在另一实施方案中，OROSTM渗透装置可用于口服持续释放递送装置(Theeuwes et al.，United States PatentNo.3,845,770；Theeuwes et al.，美国专利3,916,899)。
在另一实施方案中，控制释放的系统可置于所述化合物和/或其药物组合物的靶附近，由此仅需要部分系统剂量(见，例如Goodson，in″MedicalApplications of Controlled Release，″supra，vol.2，pp.115-138(1994))。其它在Langer，1990，Science249：1527-1533中描述的控制释放系统也可被使用。
药物组合物
本发明的药物组合物含有治疗有效量的一或多种化合物，优选是纯化的形式，并含有适宜量的药学上可接受载体，以提供给药患者的适宜形式。当给药患者时，所述化合物以及药学上可接受的载体优选无菌。当所述化合物经静脉内给药时水是优选的载体。盐水溶液和含水葡聚糖以及甘油溶液也可用作液体赋形剂，尤其对于可注射的溶液而言更加如此。适宜的药用载体还包括赋形剂，诸如淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明胶，麦芽糖，大米，面粉，白尘粉，硅胶，硬脂酸钠，单硬脂酸甘油，滑石，氯化钠，干燥的脱脂奶，甘油，丙烯，乙二醇，水，乙醇等。本发明的药物组合物在需要时可包括较少量的湿化或乳化剂，或pH缓冲剂。此外，辅助性的稳定剂、稠化剂、润滑剂和着色剂也可使用。
包含化合物的药物组合物也可通过常规的混合，溶解，粒化，糖衣丸制备，磨细，乳化，胶囊化，包陷或冻干法来制备。药物组合物可利用一或多种生理上可接受的载体，稀释剂，赋形剂或辅助剂以常规方式配制，所述物质可促进将化合物加工成药学上可接受的制备物。正确的配制有赖于所选给药途径。
本发明药物组合物可以是溶液，悬液，乳液，片剂，丸剂，小药丸，胶囊，含液体的胶囊，粉末，持续释放的配制剂，栓剂，乳液，气溶胶，喷雾剂，悬液或其它适宜使用的形式。一个实施方案中，所述药学上可接受的载体是胶囊(例如Grosswald et al.，美国专利5,698,155)。其它适宜的药物载体的实例也在本领域描述(见Remington′s Pharmaceutical Sciences，Philadelphia College of Pharmacy and Science，19th Edition，1995)。
对于局部给药，可将化合物配制成溶液，凝胶，油膏，乳膏，悬液等，如本领域已知的。系统性配制剂包括被设计为通过注射例如经皮下，经静脉内，经肌内，经鞘内或经腹膜内注射给药的那些，以及被设计为经皮，经粘膜，口服或对肺给药的那些。系统性配制剂可以和其它活性剂配置在一起，后者改善气道粘液的粘膜纤毛清洁作用或降低粘液粘性。这些活性剂包括，但不限于，钠通道阻断剂，抗生素，N-乙酰半胱氨酸，同型半胱氨酸和磷脂。
一个实施方案中，所述化合物根据常规方法作为用于经静脉内给药人的药物组合物进行配制。通常，用于经静脉内给药的化合物是位于无菌等张含水缓冲液中的溶液。为了注射，化合物可配制在含水溶液中，优选在生理上相容的缓冲液诸如Hank′s溶液，林格氏液，或生理盐水缓冲液中。所述溶液可含有配制用试剂诸如悬浮化，稳定化和/或分散化剂。必要时，所述药物组合物还可包含增溶剂。用于经静脉内给药的药物组合物可选包括局部麻醉剂诸如利多卡因来缓解注射部位的疼痛。通常，所述成分可分别给药或混合在单位剂型中给药，例如作为在标有活性剂的量的密封容器诸如安瓿或小袋中的冻干的粉末或无水浓缩物。当所述化合物通过输注给药时，其可用含有无菌的药用级水或盐水的输注瓶配制。当化合物通过注射给药时，可提供含注射用无菌水或盐水的安瓿使得所述成分在给药前得以混合。
对于经粘膜给药，适宜待穿透屏障的穿透剂被用于配制剂中。这种穿透剂通常是本领域已知的。
用于口服给药的药物组合物的形式可以是例如片剂，锭剂，含水或含油悬液，颗粒，粉末，乳剂，胶囊，糖浆或酏剂。口服给药的药物组合物可含有一或多种可选试剂，例如甜味剂诸如果糖，天冬氨酰苯丙氨酸甲酯或糖精；调味剂诸如薄荷油，冬青油，或樱桃色着色剂以及防腐剂，以提供药学上可口的制备物。此外，当为片剂或丸剂形式时，所述组合物可被包被以延缓在胃肠道的崩解和吸收，从而在延长的时间内提供持续的作用。包绕渗透活性驱动化合物的选择性可渗透膜也适宜口服给药用化合物。在这些后述的平台(platform)中，来自所述胶囊周围环境的液体被所述驱动化合物吸收，后者膨胀并通过开口取代所述药剂或药剂组合物。这些递送平台可提供基本上0级递送图谱(zero order delivery profile)，这与立即释放的配制剂的有峰的图谱相反。时间延迟物质诸如单硬脂酸甘油或硬脂酸甘油也可使用。口服组合物可包括标准载体，诸如甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等。所述载体优选是药用级别的。
对于口服液体制备物诸如悬液，酏剂和溶液，适宜的载体，赋形剂或稀释剂包括水，盐水，亚烷基甘油(例如丙二醇)，聚亚烷基甘油(例如聚丙二醇)油，乙醇，微酸性的缓冲液(pH4-6)(例如约5.0mM-约50.0mM的乙酸，柠檬酸，抗坏血酸盐)等。此外，可加入调味剂，防腐剂，着色剂，胆盐，酰基肉毒碱等。
对于经颊给药，所述药物组合物可以为片剂，锭剂等形式，其可以常规方式配制。
适宜通过雾化器和液体喷雾装置以及EHD气溶胶装置使用的液体药物配制剂通常包括具有药学上可接受载体的化合物。优选，药学上可接受的载体是液体诸如乙醇，水，聚乙二醇或全氟碳。可选，可加入另一种物质来改变所述化合物的溶液或悬液的气溶胶性质。优选，该物质是液体，诸如乙醇，乙二醇，聚乙二醇或脂肪酸。其它配制适宜用于气溶胶装置的液体药物溶液或悬液的方法是本领域已知的(见，例如，Biesalski，美国专利5,112,598；Biesalski，美国专利5,556,611)。
化合物也可配制成直肠或阴道用药物组合物，诸如栓剂或储留型灌肠剂(retention enema)，例如含有常规栓剂基质诸如可可油或其它甘油酯。
除了前述配制剂以外，化合物也可配制成储留型制备物。所述长期作用的配制剂可通过植入(例如经皮下或肌内)或通过肌内注射给药。因此，例如化合物可与适宜的聚合或疏水物质(例如作为在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制在一起，或作为几乎不溶的衍生物，例如作为几乎不溶的盐。
当化合物为酸性时，其可包含在上述配制剂任何一种当中作为游离酸或药学上可接受的盐。基本上保持游离酸的活性的药学上可接受盐可通过与碱反应制备，并其倾向于在含水和其它质子溶剂中的溶解度高于其相应的游离酸形式。
剂量
化合物和/或其药物组合物将通常以有效量使用以便获得所需的目的。为了治疗或预防以异常血管化(aberrant vascularization)为特征的疾病或病症，将化合物和/或其药物组合物以治疗有效量给药或应用。
可有效治疗本发明公开的具体疾病的化合物的量有赖于所述疾病或病症的性质，并可通过如前所述的本领域已知的标准临床技术确定。此外，可选采用体外或体内实验来辅助鉴定优化剂量范围。所给药化合物的量当然有赖于待治疗的受试者，受试者的体重，疾痛的严重性，给药方式以及给药医师的判断和其它因素。
例如，所述剂量可通过单次给药，多次应用或有控制的释放在药物组合物中递送。一个实施方案中，通过口服持续释放给药来递送化合物。优选，一个实施方案中，本发明的化合物以每天两次(更优选每天一次)给药。可间歇性重复给药，单次给药或者与其它药物联合用药，并且如果需要对疾病状态或疾病的有效治疗可持续给药。
口服给药的适宜剂量有赖于药物的效力，但通常为约0.001mg-约200mg本发明化合物每千克体重。剂量范围可由本领域普通技术人员已知的方法轻易确定。
用于经静脉内(i.v.)给药的剂量范围为约0.01mg-约100mg每千克体重。适宜经鼻内给药的剂量范围通常为约0.01mg/kg体重到10mg/kg体重。栓剂通常含有约0.01毫克-约50毫克本发明的化合物每千克体重，并包含重量为约0.5％-约10％的活性成分。推荐的经皮内、经肌内、经腹腔内、皮下、经硬膜外、舌下或经脑内给药的剂量为约0.001mg-约200mg每千克体重。有效的剂量可从体外或动物模型实验系统所得的剂量-反应曲线外推而来。这样的动物模型和系统在本领域是已知的。
在将本发明化合物用于人以前，优选在体外和体内如上述检测本发明化合物的所需治疗或预防活性。例如，可利用体外实验测定给药具体化合物或化合物的组合是否是治疗癌症所优选的。也可用动物模型系统证实化合物是有效且安全的。
优选，本文所述化合物的治疗有效量将提供治疗益处而不会导致实质上的毒性。化合物的毒性可利用标准药物方法确定并由本领域技术人员轻易确定。毒性和疗效之间的剂量比即治疗指数。化合物优选在治疗疾病和病症时显示非常高的治疗指数。本文所述化合物的剂量将优选在包含毒性很小或没有毒性的有效剂量的循环浓度的范围内。
联合用药治疗
在具体实施方案中，所述化合物和/或其药物组合物可与至少一种其它治疗剂联合用药。所述化合物和/或其药物组合物以及所述治疗剂的作用可为相加性的，或更优选为协同性的。一个实施方案中，化合物和/或其药物组合物可与另一种治疗剂同时给药，后者可以是相同药物组合物的一部分或不同药物组合物。另一实施方案中，药物组合物在给药另一种治疗剂以前或以后给药。
具体地，一个优选的实施方案中，化合物和/或其药物组合物可与其它化疗剂(例如，烷化剂(例如，氮芥类(nitrogen mustards)(例如，环磷酰胺，异环磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，美法仑(melphalen)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，六氯环己烷(hexamethylmelamine)，硫替派(thiotepa))，烷基磺酸盐(例如，白消安(busulfan)，亚硝基脲，三嗪类)，抗代谢物(例如，叶酸类似物，嘧啶类似物(例如，氟尿嘧啶(fluorouracil)，5-氟脱氧尿苷(floxuridine)，胞嘧啶阿拉拍糖苷(cytosine arabinoside)等)，嘌呤类似物(例如，6-巯基嘌呤(mercaptopurine)，硫代鸟嘌呤(thiogunaine)，喷司他丁(pentostatin)等)，天然产物(例如，长春花碱(vinblastine)，长春新碱(vincristine)，依托泊苷(etoposide)，tertiposide，更生霉素(dactinomycin)，柔红霉素(daunorubicin)，doxurubicin，博来霉素(bleomycin)，光辉霉素(mithnnycin)，丝裂霉素C(mitomycin C)，L-天冬酰胺酶，干扰素α)，铂配位络合物(例如，顺铂，卡铂(carboplatin)等)，光托蒽醌(mitoxantrone)，羟基脲(hydroxyurea)，丙卡巴肼(procarbazine)，激素和拮抗剂(例如，泼尼松，己酸羟孕酮(hydroxyprogesterone caproate)，甲羟孕酮酸酯(medroxyprogesterone acetate)，醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)，己烯雌酚(diethylstilbestrol)，炔雌醇(ethinylestradiol)，炔雌醇(tamoxifen)，丙酸睾丸酮(testosterone propionate)，氟氢甲睾酮(fluoxymesterone)，氟他米特(flutamide)，醋酸亮丙瑞林(leuprolide)等，抗血管生成剂或抑制剂(例如，血管他丁(angiostatin)，视黄酸(retinoic acid)和紫杉醇(paclitaxel)，雌二醇衍生物(estradiol derivatives)，噻唑嘧啶衍生物(thiazolopyrimidine derivatives)等)，凋亡诱导剂(例如，阻断抑凋亡的癌基因的反义核苷酸，肿瘤抑制物，TRAIL，TRAIL多肽，Fas-结合的因子1，白介素-1β-转化酶，磷酸酪氨酸抑制剂，RXR类视黄醇受体激动剂，喹诺酮衍生物(carbostyril derivatives)等以及鳌合剂(青霉胺(penicillamine)，锌(zinc)，曲恩汀(trientine)等))。
治疗性试剂盒
本发明提供了治疗性试剂盒，其包含本发明的化合物和/或其药物组合物。该治疗性试剂盒也包含其它化合物(例如，化疗剂，天然产品，激素或拮抗剂，抗血管增生剂或抑制剂，凋亡诱导剂或鳌合剂)和/或这些其它化合物的药物组合物。
治疗性试剂盒具有单个容器，其含有化合物及其药物组合物，并含有或不含有其它组分(例如其它化合物或这些其它化合物的药物组合物)，或者每种组分具有单独的容器。优选，本发明的试剂盒包括化合物和/或其药物组合物，包装起来用于与第二种化合物(优选，化疗剂，天然产物，激素或拮抗剂，抗血管生成剂或抑制剂，凋亡诱导剂或鳌合剂)和/或其药物组合物的联合使用。所述试剂盒的组分可以是预先复合的(pre-complexed)或者每种组分在给药患者以前可以位于分离的不同容器中。
该试剂盒的组分可在一或多种溶液提供，所述溶液优选含水溶液，更优选无菌水溶液。该试剂盒的组分也可作为固体提供，其可通过加入适宜的溶剂而转化成液体，所述溶剂优选在另一种不同的容器中提供。
治疗性试剂盒的容器可以是管型瓶，试管，烧瓶，罐(bottle)，注射器或其它任何密闭固体或液体的装置。通常，当存在一种以上组分时，所述试剂盒含有第二个管型瓶或其它容器，其允许分别配制。该试剂盒也可含有另一容纳药学上可接受液体的容器。
优选，治疗性试剂盒将包含装置(例如，一或多个针头，注射器，滴眼剂，移液管等)，其使得能够给药该试剂盒的组分。
实施例
本发明还通过参考以下详细描述的实施例、本发明化合物的制备以及用于检测生物活性的方法来进一步说明。本领域技术人员应理解可对材料和方法实施许多修饰而不偏离本发明的范围。
以下实施例中，以下缩写具有以下含义。如果没有定义任何缩写，则其含义是通常接受的含义。
AcCN＝乙腈
Boc＝叔-丁基氧羰基
CPM＝每分钟计数
DMF＝N，N-二甲基甲酰胺
DMSO＝二甲基亚砜
Fomoc＝9-芴基甲基氧羰基
g＝克
h＝小时
HBTU＝O-苯并三唑，N，N，N，N-四甲基脲阳离子六氟代磷酸酯(O-Benzotriazole，N，N，N，N-tetramethyl uranium hexafluoro phosphate)
HBSS＝Hank′s缓冲盐水溶液
HPLC＝高压液相色谱
L＝升
LC/MS＝液相色谱/质谱
M＝摩尔
min＝分
mL＝毫升
mmol＝毫摩尔
NHS＝N-羟基琥珀酰亚胺
NMM＝N-甲基吗啉
TFA＝三氟代乙酸
TIS＝三异丙基硅烷
TLC＝薄层色谱
μL＝微升
μM＝微摩尔
v/v＝体积比
实施例1：标准树脂结合型氨基酸偶联
用DMF中的20％哌啶(1mL每100mg树脂)在搅拌下处理Rink AmideAM树脂(Novabiochem)3分钟，过滤反应混合物并用DMF洗涤一次。再重复该步骤两次。随后用DMF三次，甲醇三次、二氯甲烷三次洗涤Rink树脂。由所需的Fmoc保护的，三苯甲基化的氨基酸(4当量)，HBTU(4当量)，HOBT(4当量)溶于DMF中(1mL每100mg树脂)并加入上述树脂，然后加入(NMM)(8当量)并搅动所述混合物1小时。过滤所述反应混合物并用DMF三次，甲醇三次，二氯甲烷三次洗涤树脂。重复该偶联步骤直到肽合成完整。N末端乙酰化可通过以下方法实施：与Ac-Pro-OH(4当量)，HBTU(4当量)，HOBT(4当量)和NMM(8当量)偶联或对末端Fmoc基团去保护化并用醋酸酐(5当量)和吡啶(5当量)加帽(capping)。Rink Amide AM树脂上的N-乙酰化肽用TFA/TIS/水(95∶2.5∶2.5，1mL每100mg树脂)处理并搅动1小时。过滤反应混合物，该树脂用TFA/TIS/水一次、二氯甲烷三次洗涤。在真空中去除溶剂并用醚消化(titurate)所得残基三次。
实施例2：肽的纯化
溶于少量甲醇和水的粗肽利用制备型逆相HPLC(Beckman)用Phenomenex Synergi水逆相C18柱(250mm×21.2mm)进行纯化。利用0-50％B的梯度以流率20mL/分钟洗脱所述肽15分钟，其中溶剂A是含0.1％TFA的水而溶剂B是含有0.1％TFA的乙腈。在220nm进行检测。混合分析型HPLC分析(Phenomenex水合型逆相柱(250mm×4.6mm)，利用梯度6-66％)＞95％纯的级分，通过在真空中蒸发浓缩至约2-4ml的体积并冻干。将样品重新溶于水并转移至配衡的2打兰容器中，再次冻干。通常对于这些肽观察到肩样凸起(shoulder)并推定为是由构象异构体导致。
实施例3：肽的纯化
将溶于最小量甲醇和水的粗肽上样到制备型柱Phenomenex Synergihydro-RP C18，(250mm×21.2mm)。利用0-50％AcN/0.1％TFA和milliQH2O/0.1％TFA的梯度洗脱所述肽。将经分析性HPLC分析(Phenomenex hydro RP 250MM×4.6mm，利用梯度6-66％AcN/0.1TFA和milliAQH2O/0.1％TFA)确定为纯度大于95％的级分混合，通过循环蒸发浓缩至体积为约2-4ml，并对其进行冻干。将样品重新溶于在配衡的2打兰容器的水中再次冻干。
实施例4：标准树脂结合型氨基酸偶联
Rink Amide AM树脂(Novabiochem)用DMF中的20％哌啶(1mL每100mg树脂在氮搅拌或振动(nitrogen agitation or Vibration)的条件下处理三分钟，过滤反应混合物并用DMF洗涤一次。将所述步骤再重复两次。用DMF三次，甲醇三次、二氯甲烷三次洗涤树脂。由所需的Fmoc保护的氨基酸(4当量)，HBTU(4当量)，HOBT(4当量)溶于DMF中(1mL每100mg树脂)并加入上述树脂，然后加入NMM(8当量)并搅动所述混合物1小时。过滤所述反应混合物并用DMF三次，甲醇三次、二氯甲烷三次洗涤树脂。重复氨基酸偶联步骤。N末端乙酰化可通过以下方法实施：用Ac-Pro-OH(4当量)，HBTU(4当量)，HOBT(7当量)和NMM(8当量)偶联或通过对末端Fmoc基团去保护化并用醋酸酐(5当量)和吡啶(5当量)加帽(capping)。RinkAmide AM树脂上的N-乙酰化多肽用TFA/TIS/水(95∶2.5∶2.5，1mL每100mg树脂)处理并氮搅拌或振动1小时。过滤反应混合物，该树脂用TFA/TIS/水一次、二氯甲烷三次洗涤。在真空中去除溶剂并用醚消化(titurate)所得残基三次。
实施例5：肽的酰基化
使适宜的N-酰基肽酰胺悬浮于DMF(0.05M)中，加入NMM(2.0当量)然后加入酰氯(4.0当量)。悬浮液在约10分钟以后变为均质的。分析性HPLC指示起始物质在1小时后丧失。所述混合物在真空条件下得以浓缩，溶于水/甲醇(如果需要可加热以便溶解)并通过制备性HPLC纯化(见实施例2和3中的标准纯化步骤)。
实施例6：肽的烃基化
使适宜的N-酰基肽酰胺悬浮于DMF(0.05M)中，加入碳酸铯(2.0当量)然后加入烃基溴化物(1.0当量)。一旦通过分析性HPLC判断反应完成，将所述混合物在真空条件下得以浓缩，溶于1N HCl并通过制备性HPLC纯化(见实施例2和3中的标准纯化步骤)。
实施例7：二硫化物形成
将适当的N-酰基肽酰胺悬浮于DMF(0.05M)。加入可购得的硫代硫酸酯(1.2当量)。一旦通过分析性HPLC判断反应完成，将所述混合物在真空条件下得以浓缩，溶于水/甲醇并通过制备性HPLC纯化(见实施例2和3中的标准纯化步骤)。
实施例8：硫代碳酸酯的形成
将适当的N-乙酰基肽酰胺溶解于5％含水NaHCO3(0.05M)中并在冰水浴中冷却。加入适当的氯甲酸酯(1.2当量)。1小时后，将反应混合物从冰水浴中取出，并在室温再搅拌2小时(形成沉淀)。用1N HCl处理所述反应物直到pH＜4(纸)并通过制备性HPLC直接纯化(见实施例2和3中的标准纯化步骤)。
实施例9：标准树脂结合型氨基酸偶联
适当的Rink Amide AM树脂结合的Fmoc氨基酸被加入带侧壁的布氏漏斗中，用DMP中的20％哌啶(1ml每100mg树脂)在氮搅拌的条件下处理5分钟，过滤反应混合物并重复该步骤。用DMF三次，二氯甲烷三次洗涤该树脂。将DMP(1mL每100mg树脂)，所需的Fmoc保护的氨基酸(侧链用三苯甲基保护)(4当量)，HBTU(4当量)，HOBT(4当量)加入所述树脂。加入N-甲基吗啉(8当量)并用氮气搅动所述混合物1小时。过滤所述反应混合物并用DMF三次，二氯甲烷三次洗涤树脂。最后的偶联利用Ac-Pro-OH(4当量)来实施以提供加乙酰基帽的肽。通过用TFA，TIS，H2O(95∶2.5∶2.5，1-5mL每100mg树脂)在氮搅拌下处理1小时将所述肽从树脂上切割下来。过滤反应混合物，该树脂用少量TFA洗涤一次。在真空中浓缩溶液并用乙醚消化(titurate)所得残余物三次。
实施例10：乙酰基-Pro-His-Ser-Cys(苯甲基)-Asn-NH2
该化合物根据实施例1和2中的方法制备，产生作为细白色粉末的标题化合物(74mg，97％)。NMR数据提示约80：20比例的两种物质的混合物：
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.96，
8.95(d，d，1H，J＝1.2Hz)，7.90-8.45(m，4H)，7.23-7.39(m，7H)，7.13(s，1H)，7.01(s，1H)，6.91(s，1H)，5.08(bs，1H)，4.60-4.80(m，1H)，4.25-4.53(m，5H)，3.77(s，2H)，3.64-3.66(m，2H)，3.15-3.20(m，1H)，2.93-3.01(m，1H)，2.78-2，84(dd，1H，J＝5.4，14.1Hz)，2.56-2.67(m，1H)，2.38-2.49(dd，1H，J＝7.5，15.6Hz)，2.00(s，3H)，1.84(m，3H)；13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ172.57，171.8，171.5，170.2，169.7，169.6，169.2，138.2，133.6，129.4，128.9，128.3，126.8，117.0，61.6，59.3，55.2，52.7，51.2，49.8，47.8，36.8，35.3，32.8，29.3，24.3，22.2，21.8；MS m/z(C30H41N9O8S+H)+688.8；C30H41N9O8S的分析性计算：N，18.33.发现：N，14.52(肽含量：79％).
实施例11：乙酰基-Pro-His-Ser-Cys(4-甲基-苯甲基)-Asn-NH2
该化合物根据实施例1和2中的方法制备，产生作为细白色粉末的标题化合物(87mg，99％)。NMR数据提示约80：20比例的两种物质的混合物：
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.96(m，1H)，7.90-8.45(m，4H)，6.91-7.09(m，7H)，7.00(s，1H)，6.91(s，1H)，5.10(bs，1H)，4.60-4.75(m，1H)，4.46-4.50(m，2H)，4.27-4.40(m，2H)，3.72(s，2H)，3.64(m，2H)，3.50(m，2H)，3.15-3.21(m，1H)，2.93-3.02(m，1H)，2.76-2.82(m，1H)，2.56-2.65(m，1H)，2.37-2.45(m，1H)，2.62(s，3H)，1.99(s，3H)，1.73-1.86(m，3H)；13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ172.5，171.8，171.5，170.1，169.6，169.5，169.1，135.8，135.0，133.6，129.3，128.8，128.7，116.8，61.6，59.2，55.1，52.6，51.2，49.7，47.7，36.8，34.9，32.7，29.2，24.2，22.1，21.8，20.6；MS m/z(C31H43N9O8S+H)+703.0；C31H43N9O8S的分析性计算：N，17.96.发现：N，14.21(肽含量：79％).
实施例12：乙酰基-Pro-His-Ser-Met(O)-Asn-NH2
该化合物根据实施例1和2中的方法制备，产生作为细白色粉末的标题化合物(30mg，29％)。NMR数据提示约80∶20比例的两种物质的混合物：
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.97(s，1H)，7.95-8.44(m，5H)，7.40(s，1H)，7.35(s，1H)，7.09(s，2H)，6.91(s，1H)，4.59-4.77(m，1H)，4.25-4.49(m，4H)，3.45-3.54(m，1H)，3.26-3.37(m，1H)，3.14-3.21(m，1H)，2.95-3.03(m，1H)，2.64-2.83(m，2H)，2.52(m，3H)，2.38-2.45(m，1H)，2.00(s，3H)，1.84-2.06(m，2H)，1.68-1.83(m，4H)；13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ172.7，171.8，171.5，170.3，170.1，169.7，169.2，133.6，129.3，116.9，61.4，59.3，55.1，52.0，51.2，49.7，49.0，47.8，37.8，36.8，29.3，26.4，24.9，24.3，22.3；MS m/z(C25H39N9O9S+H)+642.0；C25H39N9O9S的分析性计算：N，19.64.发现：N，14.79(肽含量：75％).
实施例13：乙酰基-Pro-His-Ser-Met(O2)-Asn-NH2
该化合物根据实施例1和2中的方法制备，产生作为细白色粉末的标题化合物(92.5mg，88％)。NMR数据提示约80∶20比例的两种物质的混合物：
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.68(d，1H，J＝1.4Hz)，7.38(m，1H)，4.73-4.86(m，2H)，4.65(dd，1H，J＝5.3，3.5Hz)，4.50(t，1H，J＝5.4Hz)，4.41(dd，1H，J＝5.1，3.6Hz)，3.93(t，2H，J＝5.7Hz)，3.68(t，2H，J＝7.0Hz)，3.37-3.42(m，3H)，3.21-3.29(m，1H)，3.18(s，3H)，2.75-2.94(m，2H)，2.42-2.47(m，1H)，2.24-2.35(m，2H)，2.17(s，3H)，1.86-2.04(m，4H)；13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ174.2，174.1，173.9，172.7，171.3，171.2，171.1，132.9，127.9，116.7，60.4，59.6，55.1，51.6，51.4，49.8，49.5，48.2，39.2，35.7，29.3，25.5，23.7，23.1，20.9；MSm/z(C25H39N9O10S+H)+658.7；C25H39N9O10S的分析性计算：N，19.17.发现：N，14.80(肽含量，77％).
实施例14：乙酰基-His-Ser-Cys(甲基)-NH2
该化合物根据实施例1和2中的方法制备，产生作为细白色粉末的标题化合物(121.6mg，61％)：
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)14.1(bs，1H)，8.96(s，1H)，8.18-8.21(d，2H，J＝8.13Hz)，8.10(d，1H，J＝6.8Hz)，7.42(s，1H)，7.37(bs，1H)，7.25(s，1H)，5.19(bs，1H)，4.65-4.72(m，1H)，4.32-4.42(m，2H)，3.57-3.71(m，2H)，2.68-3.13(m，4H)，2.09(s，3H)，1.85(s，3H)；13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ171.9，170.1，169.9，169.5，129.3，116.8，61.5，55.0，52.4，51.4，35.3，27.1，22.4，15.2；MSm/z(C15H24N5O5S+H)+401/.5.C15H24N6O5S的分析性计算：N，20.99.发现：N，15.23(肽含量，72％).
实施例15：乙酰基-Cys(甲基)-NH2
该化合物根据实施例1和2中的方法制备，产生作为细白色粉末的标题化合物(9.7mg，26％)：
1H NMR(300MHz，D2O)δ4.55(dd，1H，J＝4.9，3.4Hz)，2.90-3.08(m，1H)，2.20(s，3H)，2.12(s，3H)；13C NMR(75MHz，D2O)δ174.8，173.9，52.0，34.4，21.2，14.1；MS m/z(C6H12N2O2S+Na)+199.3；C6H12N2O2S的分析性计算：N，15.90.发现：N，13.04(肽含量：82％).
实施例16：乙酰基-Pro-His-Ser-Cys(甲基)-NH2
该化合物根据实施例1和2中的方法制备，产生作为细白色粉末的标题化合物(106.1mg，43％)：
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.96-8.97(m，1H)，7.85-8.46(m，3H)，7.34-7.41(m，2H)，7.24(s，1H)，4.59-4.78(m，1H)，4.25-4.42(m，3H)3.64-3.69(m，1H)，3.15-3.21(m，1H)，2.93-3.02(m，1H)，2.85(dd，1H，J＝5.0，13.7Hz)，2.65-2.72(m，1H)，2.07(s，3H)，2.00(s，3H)，1.67-1.85(m，4H)；13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ171.9，171.8，169.8，169.7，169.1，129.3，116.6，61.6，60.2，59.2，55.0，52.3，51.2，47.7.38.6，35.4，29.3，24.3，22.3，15.2；MSm/z/(C20H31N7O6S+H)+498.6；C20H31N7O6S的分析性计算：N，19.71.发现：N，14.79(肽含量：75％).
实施例17：乙酰基-Ser-Cys(甲基)-NH2
该化合物根据实施例1和2中的方法制备，产生作为细白色粉末的标题化合物(32.1mg，49％)：
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.03(d，1H，J＝8.2Hz)，7.98(1H，J＝7.6Hz)，7.35(s，1H)，7.21(s.1H)，5.03(bs，1H)，4.27-4.38(m，2H)，3.49-3.61(m，2H)，2.85(dd，1H，J＝4.9，13.7Hz)，2.69(dd，1H，J＝8.5，13.7Hz)，2.06(s，3H)，1.87(s，3H)；13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ172.0，170.2，169.5，61.7，55.0，52.2，35，3，22.5，15.1；MS m/z(C9H17N3O4S+Na)+286.2；C9H17N3O4S的分析性计算：N，15.96.发现：N，15.31(肽含量：96％).
实施例18：乙酰基-Pro-His-Ser-Cys(4-MeO-苯基)-Asn-NH2
该化合物根据实施例1和2中除外以下修饰的方法制备：单体Fmoc-Cys(4-MeO-苯基)自Fmoc-Cys(4-MeO-苯甲基)-OH以两步合成。标题化合物作为细白色粉末(28.0mg，50％)分离：
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.90-8.92(m，1H)，8.42-8.51(m，1H)，8.30(d，1H，J＝1Hz)，8.90(d，1H，J＝1H)，7.88(m，1H)，7.33-7.39(m，4H)，712(s，1H)，6.98(s，1H)，6.90(m，2H)，6.51(bs，1H)，5.04-5.19(m，1H)，4.58-4.82(m，2H)，4.23-4.47(m，4H)，3.75(s，3H)，3.59-3.71(m，2H)，2.95-3.03(m，2H)，2.36-2.44(m，1H)，2.00(s，3h)，1.67-1.95(m，4H)；13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ172.5，171.9，171.6，170.3，169.8，169.4，169.1，158.7，133.1，129.5，125.0，116.9，114.8，61.6，59.3，55.2，52.6，51.3，49.8，47.8，36.9，36.7，29.3，26.5，24.3，22.2；MSm/z(C30H41N9O9S+H)+704.8；C30H41N9O9S的分析性计算：N，17.91.发现：N，13.11(肽含量：73％).
实施例19：乙酰基-Pro-His-Ser-NH2
该化合物根据实施例1和2中的方法制备，产生作为细白色粉末的标题化合物(37.7mg，50％)：
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.96(d，1H，J＝1.3Hz)，8.24-8.43(m，1H)，7.77-7.82(m，1H)，7.37-7.42(m，2H)，7.19(m，1H)，4.57-4.76(m，2H)，4.15-4.34(m，2H)，3.63-3.64(m，2H)，3.14-3.24(m，2H)，2.95-3.05(m，1H)，2.01(S，3h)，1.67-1.91(m，4H)；13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ171.9，171.8，169.5，169.2，129.3，116.9，61.5，59.3，55.1，51.4，47.8，29.3，26.4，24.3，22.2；MSm/z(C16H24N6O5+H)+381.4；C16H24N6O5的分析性计算：N，22.09.发现：N，14.50(肽含量：66％)
实施例20：Ac-Pro-His-Ser-Cys(pMeOBzl)-Asn-NH2
该化合物根据实施例1和2中的方法制备，产生作为白色粉末的标题化合物(79.1mg(46％))，且其为67∶33比例的两种化合物的混合物：
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.96(s，1H)，8.55-8.42(m，1H)，8.31(d，J＝8.3Hz，1H)，8.17(d，J＝7.9Hz，1H)，7.98-7.81(m，1H)，7.40-7.28(m，6H)，7.24-7.17(m，1H)，7.12(s，1H)，7.00(s，1H)，6.91(s，1H)，4.79-4.60(m，2H)，4.48.4.25(m，6H，与水的峰值重叠)，3.71-3.46(m，4H)，3.42-3.28(m，2H)，3.23-3.08(m，2H)，3.05-2.93(m，1H)，2.56-2.35(m，2H，与DMSO的峰值重叠)，2.00(s，3H)，1.89-1.65(m，4H)；13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ172.4，172.0，171.8，171.5，170.3，169.74，169.6，169.2，169.15，169.08，168.5，158.1，157.7，135.5，133.8，133.5，129.4，129.3，129.0，128.6，126.0，116.8，61.5，60.2，59.2，55.1，54.8，52.5，51.24，51.17，49.7，47.4，36.7，34.6，31.5，29.2，26.8，26.4，24.2，22.23，22.16.21.7；ES MS m/z(M+H)+674.6.C29H39N9O8S的分析性计算：N，18.71.发现：N，13.52(肽含量：72％).
实施例21：Ac-ProHis-Ser-Cys(Ph)-Asn-NH2
该化合物根据实施例1和2的方法制备，但Fmoc-Cys(Ph)-OH与树脂结合型三苯甲基化天冬酰胺的偶联利用实施例1中所给出试剂的一半当量实施。分离标题化合物(36.9mg，29％)其为白色粉末，并且是比例为63∶35的两种化合物的混合物：
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.96(s，1H)，8.55-8.42(m，1H)，8.31(d，J＝8.3Hz，1H)，8.17(d，J＝7.9Hz，1H)，7.98-7.81(m，1H)，7.40-7.28(m，6H)，7.24-7.17(m，1H)，7.12(s，1H)，7.00(s，1H)，6.91(s，1H)，4.79-4.60(m，2H)，4.48-4.25(m，6H，与水的峰值重叠)，3.71-3.46(m，4H)，3.42-3.28(m，2H)，3.23-3.08(m，2H)，3.05-2.93(m，1H)，2.56-2.36(m，2H，与DMSO的峰值重叠)，2.00(s，3H)，1.89-1.65(m，4H)；13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ172.4，172.0，171.8，171.5，170.3，169.74，169.66，169.2，169.15，169.08，168.5，158.1，157.7，135.5，133.8，133.5，129.4，129.3，129.0，128.6，126.0，116.8，61.5，60.2，59.2，55.1，54.8，52.5，51.24，51.17，49.7，47.7，36.7，34.6，31.5，29.2，26.8，26.4，24.2，22.23，22.16.21.7；ESMS m/z(M+H)+674.7.C29H39N9O8S的分析性计算：N，18.71.发现：N，13.52(肽含量：72％).
实施例22：乙酰基-Pro-His-Ser-Cys(S-tBu)-Asn-NH2
该化合物根据实施例1和3中的方法制备，产生作为细白色粉末的标题化合物。NMR数据提示约2∶1比例的两种物质的混合物：
1H NMR(300MHz，MeOD-d4)主要构象异构体δ8.77(d，1H，J＝1.4)，7.41(br，1H)，4.77-4.57(m，3H)，4.46-4.36(m，2H)，3.95-3.80(m，2H)，3.70-3.57(m，2H)，3.39-3.14(m，2H)，3.07-2.97(m，1H)，2.79-2.65(m，3H)，2.26-1.86(m，4H)，2.21(s，3H)，1.35(s，9H)对于次要构象异构体8.78(d，J＝1.4)，1.34(s，9)；13C NMR(75MHz，MeOD-d6)δ175.0，173.3，172.7(2C)，172.2，172.0(2C)，135.0，130.8，119.1，62.9，61.6，57.5，57.2，53.5，51.7，42.3，42.2，37.7(2C)，31.1，30.4(3C)，28.0，26.0，22.5；MS m/z(C27H43N9O8S2+H)+686.8；的分析性计算C27H43N9O8S2：N，18.38，发现：N，13.87(肽含量：76％).
实施例23：乙酰基-Pro-His-Ser-Cys(tBu)-Asn-NH2
该化合物根据实施例1和3中的方法制备，产生作为细白色粉末的标题化合物(18.5mg，23％)。NMR数据提示两种物质的混合物：
1H NMR(300MHz，MeOD-d4)主要构象异构体δ8.78(brs，1H)，7.42(brs，1H)，4.75-4.71(m，1H)，4.54-4.34(m，4)，3.90(dd，1H，J＝11，6)，3.82(dd，1H，J＝11，6)，3.71-3.57(m，2H)，3.36(dd，1H，J＝15，5)，3.17(dd，1H，J＝15，5)，3.05(dd，1H，J＝11，6)，2.93(dd，1H，J＝11.6)，2.81(m，2H)，2.25-1.86(m，4H)，2.11(s，3H)，1.33(s，9H)，次要构象异构体的数据2.01(s，3H)，1.30(s，9H)；13CNMR(75MHz，MeOD-d6)δ175.5，175，3，175.0，173.0，172.7，172.4，172.0，135.0，62.9，61.6，57.1，55.8，53.5，51.6，49.8，43.8，37.7，31.3(3C)，30.8，27.9，26.0，24.3，22.5；MS m/z(C27H43N9O8S+H)+654.7；C27H43N9O8S的分析性计算：N，19.28.发现：N，16.25(肽含量：73％).
实施例24：Ac-Pro-Cys(SMe)-Asn-NH2
该化合物根据实施例2和4中的方法制备，起始物质为Fmoc-Asn-AM树脂(SMO-072-054，200mg，0.41mmol/g)，产生作为细白粉末的13mg(18.5摩尔，22.5％)终产物。NMR数据提示约2∶1比例的两种物质的混合物：
1H NMR(300MHz，D2O)δ4.78-4.72(m，1H)，4.66-4.56(m，1H)，4.49-4.45(m，1H)，3.73-3.67(m，2H)，3.07-3.01(m，1H)，2.96-2.78(m，3H)，2.40-2.28(m，1H)，2.19(d，3H)，2.17(s，3H)，2.08-1.98(m，3H)；13C NMR(75MHz，D2O)δ177.4(主要)，177.4(次要)，177.1，175.9，174.9，62.7，55.4，52.9，51.3，38.7，36.8，34.4，32.5，26.9，24.0(主要)，24.0(次要)，17.2(主要)，17.1(次要)；MSm/z(C15H25N5O5S+H)+704；C15H25N5O5S的分析性计算：N，18.08.发现：N，13.56(肽含量：75.0％).
实施例25：Ac-His-His-Cys(SMe)-Asn-NH2
该化合物根据实施例2和4中的方法制备，起始物质为Fmoc-Asn-AM树脂(200mg，0.41mmol/g)，产生23mg(40.8μmole，49.7％)作为细白粉末的终产物：
1H NMR(300MHz，D2O)δ8.68-8.67(m，1H)，7.32(s，2H)，4.78-4.72(m，2H)，4.70-4.65(dd，J＝8.82，5.91Hz，1H)，4.60-4.55(dd，J＝7.92，6.18Hz，1H)，3.36-3.19(m，2H)，3.16-3.11(m，1H)，3.04-2.99(m，2H)，2.97-2.77(m，2H)，2.17(d，3H)，2.00(s，3H)；13C NMR(75MHz，D2O)δ176.0，175.7，175.2，173.1，173.0，172.5，134.8，134.7，129.7，129.5，118.6，118.4，53.9，53.6，53.5，51.6，37.4，35.9，27.5，27.4，22.8，15.9；MS m/z(C22H32N10O6S+H)+565；C22H32N10O6S的分析性计算：N，24.81.发现：N，14.74(肽含量：59.4％).
实施例26：Ac-His-Ser-Cys(SMe)-Asn-NH2
该化合物根据实施例2和4中的方法制备，起始物质为Fmoc-Asn-AM树脂(200mg，0.41mmol/g)，产生14.1mg(27.4μmol，33.4％)作为细白粉末的终产物：
1H NMR(300MHz，D2O)δ8.67(d，J＝1.32Hz，1H)，7.36(s，1H)，4.78-4.72(m，2H)，4.64-4.60(dd，J＝7.71，6.03Hz，1H)，4.55(t，J＝5.49Hz，1H)，3.98-3.85(m，2H)，3.34(dd，J＝15.51，5.97Hz，1H)，3.19(dd，J＝15.57，8.37Hz，1H)，3.04(dd，J＝13.98，6.00Hz，1H)，2.96-2.75(m，2H)，2.18(s，3H)，2.05(s，3H)；13CNMR(75MHz，D2O)δ176.0，175.7，175.4，173.2(2C)，173.0，134.8，129.7，118.5，62.3，56.6，54.2，53.7，51.6，37.5，35.8，27.7，23.0，16.0；MSm/z(C19H30N8O7S+H)+515；C19H30N8O7S的分析性计算：N，21.78.发现：N，14.53(肽含量：66.7％).
实施例27：Ac-Ser-Cys(SMe)-Asn-NH2
该化合物根据实施例2和4中的方法制备，起始物质为Fmoc-Asn-AM树脂(200mg，0.41mmol/g)，产生6.5mg(17.2μmole，21.0％)作为细白粉末的终产物：
1H NMR(300MHz，D2O)δ4.78-4.74(dd，J＝8.22，5.61Hz，1H)，4.66-4.62(dd，J＝7.74，6.18Hz，1H)，4.52(t，J＝5.61Hz，1H)，3.97-3.82(m，2H)，3.09-2.76(m，4H)，2.19(s，3H)，2.13(s，3H)；13C NMR(75MHz，D2O)δ176.0，175.8，175.7，173.5，173.4，62.3，56.8，54.2，51.6，37.5，35.7，23.0，16.0；MSm/z(C13H23N5O6S+Na)+400；C13H23N5O6S的分析性计算：N，18.56.发现：N，15.96(肽含量：86.0％).
实施例28：Ac-Cys(SMe)-Asn-NH2
该化合物根据实施例2和4中的方法制备，起始物质为Fmoc-Asn-AM树脂(SMO-072-054，200mg，0.41mmol/g)，产生8.9mg(30.7μmol，37.4％)作为细白粉末的终产物WHY-36：
1H NMR(300MHz，D2O)δ4.79-4.73(m，1H)，4.58-4.54(dd，J＝7.98，6.60Hz，1H)，3.05-2.78(dd，J＝14.01，6.09Hz，4H)，2.19(s，3H)，2.11(s，3H)；13CNMR(75MHz，D2O)δ176.0，175.9，175.8，173.8，54.3，51.6，37.4，35.8，23.0，16.0；MS m/z/(C10H18N4O4S+Na)+313；C10H18N4O4S的分析性计算：N，19.30.发现：N，16.80(肽含量：87.4％).
实施例29：Ac-Pro-His-Ser-Cys(SO2Bn)-Asn-NH2
将10mg实施例11的化合物(14.5μmol)溶于2mL甲酸(96％)，在室温加入0.4mLH2O2(在H2O中，30％)并搅拌该混合物过夜。在真空条件下去除溶剂并根据实施例2的方法纯化所得的白色固体，产生7.1mg作为细白色粉末的(9.87μmol，68％)所需砜WHY-37。NMR数据提示约5∶1比例的两种物质的混合物：
1H NMR(300MHz，D2O)δ8.66(d，J＝1.35Hz，1H，次要)，8.62(d，J＝1.38Hz，1H，主要)，7.55-7.50(m，4H)，7.38(s，1H，次要)，7.34(s，1H，主要)，5.12-5.07(dd，J＝8.52，4.41Hz，1H)，4.90-4.83(m，1H)，4.77-4.72(m，1H)，4.67(s，2H)，4.52(t，J＝5.49Hz，1H)，4.41-4.37(dd，J＝8.82，5.13Hz，1H)，3.76-3.64(m，3H)，3.76-3.64(m，3H)，3.40-3.17(m，2H)，2.93-2.74(m，2H)，2.31-2.23(m，1H)，2.15(s，3H)，2.05-1.84(m，4H)；13C NMR(75MHz，D2O)δ175.9，175.7，174.5，172.8，172.7，170.9，164.5，134.7，132.5，130.8，130.4，129.7，127.5，118.5，62.2，61.4，61.0，56.7，53.4，52.7，51.8，50.0，49.3，37.4，31.1，27.4，25.6，22.7；MSm/z(C30H41N9O10S+H)+720；C30H41N9O10S的分析性计算：N，17.51.发现：N，10.72(肽含量：61.2％).
实施例30：Ac-Pro-His-Ser-HoCys(SO2Ph)-Asn-NH2
该化合物根据实施例29中的方法制备，起始物质为10mg(14.5μmol)硫化物前体物质，产生3.3mg(4.58μmol，31.6％)作为细白色粉末的所需砜。NMR数据提示约6∶1比例的两种物质的混合物：
1H NMR(300MHz，D2O)δ8.71(d，J＝1.41Hz，1H，次要)，8.68(d，J＝1.41Hz，1H.主要)，8.02-7.99(m，2H)，7.90-7.85(m，1H)，7.78-7.73(m，2H)，7.40(bs，1H，次要)，7.37(bs，1H，主要)，4.87-4.δ2(m，1H)，4.73-4.68(m，1H)，4.60-4.55(dd，J＝8.85，5.10Hz，1H)，4.48-4.44(m，1H)，4.40-4.35(dd，J＝8.70，5.16Hz，1H)，3.96-3.85(m，2H)，3.69(t，J＝6.66Hz，2H)，3.51(t，J＝7.38Hz，2H)，3.41-3.34(dd，J＝15.45，5.55Hz，1H)，3.27-3.19(dd，J＝15.69，8.70Hz，1H)，2.90-2.83(dd，J＝15.6，5.49Hz，1H)，2.80-2.72(dd，J＝15.6，8.28Hz，1H)，2.34-2.25(m，2H)，2.16(s，3H)，2.13-2.11(m，1H)，2.08-1.82(m，4H)；13C NMR(75MHz，D2O)δ175.9，175.7，174.5，172.8，172.7，170.9，164.5，134.7，132.5，130.8，130.4，129.7，127.5，118.5，62.2，61.4，61.0，56.7，53.4，52.7，51.8，50.0，49.3，37.4，31.1，27.4，25.6，22.7；MS m/z(C30H41N9O10S+H)+720.
实施例31：Ac-Pro-His-Ser-HoCys(SOBn)-Asn-HN2
将10mg实施例11的化合物(14.5μmol)溶于1mL乙腈和0.5mL MilliQ水，在室温加入2.5mgNaBO3·4H2O并搅拌该混合物过夜。根据实施例2的方法纯化反应混合物，产生3.6mg(5.11μmole，35.2％)所需的亚砜。NMR数据提示约4∶1比例的两种物质的混合物：
1H NMR(300MHz，D2O)δ8.65(d，J＝6.21Hz，1H，次要)，8.62(d，J＝6.21Hz，1H，主要)，7.52-7.43(m，4H)，7.36(s，1H，次要)，7.34(s，1H，主要)，4.95-4.84(m，1H)，4.76-4.72(m，1H)，4.53-4.49(m，1H)，4.43-4.35(s，1H)，4.27-4.21(dd，J＝13.2，5.88Hz，1H)，4.00-3.88(m，2H)，3.67(m，3H)，3.37-3.17(m，4H)，2.92-2.74(m，2H)，2.33-2.24(m，1H)，2.16(s，3H)，2.05-1.83(m，4H)；13CNMR(75MHz，D2O)δ175.9(2C)，175.7，174.5，172.9，172.9，171.8，134.7，131.8，130.4，130.2，129.7，118.6，118.5，62.2，61.4，57.9，56.7，53.4，51.7，50.0，37.5，31.1，27.4，25.6，22.7；MS m/z(C30H41N9O9S+H)+704.
实施例32：Ac-Pro-His-Ser-HoCys(SOBn)-Asn-NH2
10mg硫化物(14.5μmol)溶于2mL乙腈/水(3∶5)。加入NalO4水溶液(6.2mg/100μL)并在室温搅拌混合物24小时。将反应混合物浓缩到大约1mL并根据实施例2的方法进行纯化产生5.7(8.10μ摩尔，55.9％)所需亚砜。NMR数据提示约6∶1比例的两种物质的混合物：
1H NMR(300MHz，D2O)δ8.69(bs，1H，次要)，8.66(m，1H，次要)，7.75-7.68(m，5H)，7.36(bs，1H，次要)，7.34(bs，1H，主要)，4.86-4.82(m，1H)，4.74-4.68(m，1H)，4.61-4.46(m，2H)，4.36-4.34(m，1H)，3.93-3.86(m，2H)，3.67(t，J＝6.69Hz，2H)，3.38-3.31(dd，J＝15.33，5.61Hz，4H)，3.24-3.13(m，3H)，2.91-2.71(m，2H)，2.33-2.24(m，2H)，2.16(s，3H)，2.13-1.83(m，5H)；13CNMR(75MHz，D2O)δ175.9，175.8，174.4，172.9，172.8(2C)，137.7，136.1，134.7，130.9(2C)，129.7，129.0(2C)，118.4，62.1，61.3，56.8，53.3，53.0，52.6，51.4，49.9，37.4，31.0，25.5，25.4，22.5；MS m/z(C30H41N9O9S+H)+704.
实施例33：Ac-PHSC(Bz)N-NH2
该化合物根据实施例2和5的方法自Ac-PHSCN-NH2(50mg，0.083mmol)和苯甲酰氯(8.6μL，0.075mmol)制备的，但DMF是被乙腈取代的且在第一小时以后加入苯甲酰氯的第二个当量以及NMM。产量：18.7mg(31.7％)。
1H NMR(300MHz，D2O)δ1.81-1.892(m，4H)，2.13(s，3H)，2.27(m，1H)，2.83(m，2H)，3.15(m，2H)，3.49-3.72(m，4H)，3.89(m，2H)，4.35(dd，J＝8.5Hz，J＝5.6Hz，1H)，4.51(m，1H)，7.27和7.28(s，s，1H)，7.56(t，J＝7.5Hz，2H)，7.72(t，J＝7.5Hz，1H)，7.99(d，J＝7.5Hz，2H)，8.61-8.64(m，1H)；13C NMR(75MHz，D2O)δ22.5，25.4，27.2，30.8，30.9，37.3，49.8，5114，53.1，54.3，56.7，61.2，62.0，118.3，128.3(2C)，129.5，130.1(2C)，134.5，135.6，137.0，172.2，172.6，172.9，174.3，175.5，175.6，175.7，195.5；ES MS m/z(M+H)+calcd 702，obsd 702.C30H39N9O9S的分析性计算：N，17.96.发现：N，12.91(肽含量：71.8％).
实施例34：Ac-PHSC((苯硫(phenylthio))乙酰基)N-NH2
该化合物根据实施例2和5的方法自Ac-PHSCN-NH2(25mg，0.042mmol)和(苯硫)乙酰氯(12.0μL，0.084mmol)制备。产量：16.1mg(51.2％)。
1H NMR(300MHz，D2O)δ1.93(m，4H)，2.15(s，3H)，2.23(m，1H)，2.76(m，2H)，3.23-3.48(m，4H)，3.65(m，2H)，3.86(m，2H)，4.03(s，2H)，4.42(m，2H)，4.57(m，1H)，4.70(m，1H)，7.28-7.41(m，6H)，8.72-9.0(m，1H)；13C NMR(75MHz，D2O)δ22.5，25.8，27.5，31.0，31.2，37.7，45.3，49.8，51.6，53.4，54.7，57.0，61.5，62.6，118.7，128.3，130.4(2C)，130.5，130.6(2C)，134.7，135.7，171.7，172.3，172.8，173.4，175.2(2C)，175.4，199.1；ES MS m/z(M+H)+calcd 748，obsd 748.
实施例35：Ac-PHSC(Alloc)N-NH2
该化合物根据实施例2和8的方法自Ac-PHSCN-NH2(25mg，0.042mmol)和烯丙基氯甲酸酯(4.2μL，0.050mmol)制备。产量：4.3mg(15.0％)。
1H NMR(300MHz，D2O)δ1.85-1.93(m，4H)，2.16(s，3H)，2.28(m，1H)，2.82(m，2H)，3.21-3.53(m，4H)，3.68(m，2H)，3.91(m，2H)，4.41(m，1H)，4.51(m，1H)，5.37(m，2H)，6.00(m，1H)，7.38和7.41(s，s，1H)，8.68-8.71(m，1H)；13C NMR(75MHz，D2O)δ21.4，24.3，26.1，29.8，31.6，36.3，48.7，50.3，52.1，53.2，55.4，60.0，61.0，68.9，117.2，119.2，128.4，131.2，133.5，170.9，171.5，171.64，171.68，173.2，174.4，174.5；ESMS m/z(M+H)+calcd 682，obsd 682.
实施例36：Ac-PHSC(Piv)N-NH2
该化合物根据实施例2和5的方法自Ac-PHSCN-NH2(100mg，0.167mmol)和新戊酰氯化物(41.0μL，0.334mmol)制备。产量：65.7mg(57.7％)。
1H NMR(300NHz，D2O)δ1.25(s，9H)，1.84-2.03(m，4H)，2.16(s，3H)，2.28(m，1H)，2.82(m，2H)，3.29(m，2H)，3.90(m，2H)，3.67(m，2H)，3.89(m，2H)，4.41(m，1H)，4.50(m，1H)，4.63(m，1H)，4.76(m，1H)，4.85(m，1H)，7.39和7.42(s，s，1H)，8.68-8.72(m，1H)；13C NMR(75MHz，D2O)δ21.5，24.4，26.2，26.6，29.3，29.9，36.4，46.5，48.8，50.4，52.2，53.2，55.5，60.2，61.2，117.3，128.6，133.6，171.2，171.6，171.6，173.3，174.5，174.7，174.7，210.8；ES MS m/z(M+H)+calcd.682，obsd 682.
实施例37：Ac-PHSC(环己酰)N-NH2
该化合物根据方法E-B自Ac-PHSCN-NH2(100mg，0.167mmol)和环己酰氯(45.0μL，0.334mmol)制备。产量：70.7mg(59.8％)。
1H NMR(300MHz，D2O)δ1.37(m，5H)，1.75-2.04(m，9H)，2.16(s，3H)，2.31(m，1H)，2.66(m，1H)，2.84(m，2H)，3.25-3.32(m，2H)，3.37-3.43(m，2H)，3.68(m，2H)，3.90(m，2H)，4.41(m，1H)，4.49(m，1H)，4.65(m，1H)，7.39和7.42(s，s，1H)，8.69-8.73(m，1H)；13C NMR(75MHz，D2O)δ21.5，24.4，25.0，29.2，29.4，29.9，36.4，48.8，50.4，52.2，52.4，53.3，55.5，60.2，61.1，117.4，128.6，133.6，171.2，171.4，171.6，173.3，174.5，174.7，207.3；ES MS m/z(M+H)+calcd 708，obsd 708.Anal.Calc for C30H45N9O9S：N，17.81.发现：N，14.14(肽含量：79.4％).
实施例38：Ac-PHSC(烟酰)N-NH2
该化合物根据实施例2和5的方法自Ac-PHSCN-NH2(100mg，0.167mmol)和烟酰氯化物(59mg，0.334mmol)制备。产量：49.5mg(42.0％)。
1H NMR(300MHz，D2O/MeOD)δ1.80-2.01(m，4H)，2.13(s，3H)，2.28(m，1H)，2.81(m，2H)，3.23(m，1H)，3.33(m，1H)，3.64(m，3H)，3.78(dd，J＝15Hz，J＝6Hz，1H)，3.89(m，2H)，4.39(m，1H)，4.48(m，1H)，4.74(m，1H)，7.36和7.39(s，s，1H)，8.27(t，J＝6Hz，1H)，8.66和8.70(s，s，1H)，9.07(m，2H)，9.36(s，1H)；13C NMR(75MHz，D2O)δ21.0，24.4，26.0，29.9，30.1，36.4，48.8，50.5，52.2，52.8，55.6，60.3，61.2，117.3，127.9，128.7，133.6，135.0，140.9，144.7，145.2，170.8，171.7，171.7，173.4，174.5，174.6，174.7，188.9；ES MS m/z(M+H)+calcd 703，obsd 703.Anal.Calc forC29H38N10O9S：N，19.93.发现：N，13.95(肽含量：70.0％).
实施例39：Ac-PHSC(噻吩-2-羰基)N-NHz
该化合物根据实施例2和5的方法自Ac-PHSCN-NH2(100mg，0.167mmol)和2-噻吩羰基氯化物(36.0μL，0.334mmol)制备。产量：35.6mg(30.1％)。
1H NMR(300MHz，D2O)δ1.83-2.04(m，4H)，2.14(s，3H)，2.28(m，1H)，2.83，(m，2H)，3.13-3.31(m，2H)，3.52(m，1H)，3.68(m，3H)，3.90(m，2H)，4.39(m，1H)，4.51(m，1H)，7.24(t，J＝4.2Hz，1H)，7.32和7.33(s，s，1H)，7.92(d，J＝4.5Hz，1H)，7.98(d，J＝3.0Hz)，8.64和8.67(s，br s，1H)；13C NMR(75MHz，D2O)δ21.3，24.2，26.1，29.7，29.8，36.2，48.6，50.2，52.0，53.3，55.5，60.0，60.9，117.2，128.4，128.7，133.1，133.4，135.0，140.1，171.0，171.5，171.7，173.1，174.4，174.5(2C)，185.9；ES MS m/z(M+H)+calcd 708，obsd 708.Anal.Calc for C28H37N9O9S2：N，
17.81.发现：N，13.66(肽含量：76.6％).
实施例40：Ac-PHSC(烯丙基)N-NH2
该化合物根据实施例2和6的方法自Ac-PHSCN-NH2(25mg，0.042mmol)和烯丙基溴化物(3.6μL，0.042mmol)制备，但所述产物被预纯化两次。产量：11.9mg(44.5％)。
1H NMR(300MHz，D2O)δ1.83-2.02(m，4H)，2.15(s，3H)，2.74-3.00(m，4H)，3.23-3.36(m，4H)，3.66(m，2H)，3.90(m，2H)，4.39(m，1H)，4.54(m，1H)，4.59(m，1H)，5.20(m，2H)，5.87(m，1H)，7.36和7.40(s，s，1H)，8.66-8.70(m，1H)；13C NMR(75MHz，D2O/MeOD)δ22.5，25.4，27.2，30.9，32.3，35.3，37.3，49.8，51.4，53.3，54.3，56.5，61.2，62.2，118.4，119.1，129.7，134.6，134.7，172.6(2C)，172.7，172.8，174.2，175.5，175.7；ES MS m/z(M+H)+calcd 638，obsd 638.Anal.Calc ror C26H39N9O8S：N，19.77.发现：N，14.5(肽含量：73.3％).
实施例41：Ac-PHSC(甲氧基乙烷)N-NH2
该化合物根据实施例2和6的方法自Ac-PHSCN-NH2(50mg，0.083mmol)和2-溴乙基甲基醚(8.0μL，0.083mmol)制备。产量：22.4mg(41.1％)。
1H NMR(300MHz，D2O)δ1.82-2.03(m，4H)，2.14(s，3H)，2.25(m，1H)，2.78-3.35(m，8H)，3.39(s，3H)，3.66(m，2H)，3.90(br m，2H)，4.38(m，1H)，4.52(m，1H)，4.61(m，1H)，4.71(m，1H)，7.36和7.39(s，s，1H)，8.66和8.69(s，s，1H)；13C NMR(75MHz，D2O)δ22.5，25.4，27.2，31.0，32.3，33.7，37.4，49.8，51.4，53.3，54.5，56.6，59.0，61.2，62.2，71.7，118.4，129.7，134.6，172.7(2C)，172.9，174.4，175.6，175.8，175.9；ES MS m/z(M+H)+calcd 656，obsd 656.Anal.Calc for C26H41N9O9S：N，19.22.发现：N，13.83(肽含量：72.0％).
实施例42：Ac-PHSC(SMe)N-NH2
该化合物根据实施例2和7的方法自Ac-PHSCN-NH2(25mg，0.042mmol)和S-甲基甲烷硫代磺酸盐(4.3μL，0.042mmol)制备。产量：13.8mg(51.1％)。
1H NMR(300MHz，D2O)δ1.84-2.03(m，4H)，2.15(s，3H)，2.27(m，1H)，2.46(s，3H)，2.79-2.86(m，2H)，3.07(m，1H)，3.24-3.36(m，3H)，3.67(m，2H)，3.92(m，2H)，4.41(m，1H)，4.54(m，1H)，7.36和7.39(s，s，1H)，8.67和8.70(s，s，1H)；13C NMR(75MHz，D2O)δ22.5，23.1，25.4，27.2，31.0，37.4，38.5，49.8，51.5，53.3，54.0，56.5，61.2，62.2，118.4，129.7，134.6，172.6，172.9(2C)，174.3，175.5，175.7(2C)；ES MS m/z(M+H)+calcd 644，obsd 644.Anal.Calc for C24H37N9O8S2：N，19.58.发现：N，14.41(肽含量：73.6％).
实施例43：Ac-PHSC(SPh)N-NH2
该化合物根据实施例2和7的方法自Ac-PHSCN-NH2(25mg，0.042mmol)和S-苯基苯硫代磺酸盐(10.5mg，0.042mmol)制备。产量：9.9mg(33.4％)-90％纯，通过以下数据确定：
1H NMR(300MHz，D2O)δ1.83-2.04(m，4H)，2.15(s，3H)，2.26(m，1H)，2.74-2.89(m，2H)，3.07-3.42(m，4H)，3.66(m，2H)，3.88(m，2H)，4.39(m，1H)，4.41(m，1H)，4.73(m，1H)，7.35-7.45(m，4H)，7.63(s，1H)，7.66(s，1H)，8.64和8.67(s，s，1H)；13C NMR(75MHz，D2O)δ22.5，25.5，27.3，31.0，37.4，39.8，49.8，51.5，53.3，54.1，56.3，61.2，62.3，62.4，118.4，129.0，129.6(2C)，129.7，130.6(2C)，134.6，137.2，172.5，172.61，172.66，174.4，175.6，175.7，175.8；ESMS m/z(M+H)+calcd 708，obsd 708.
实施例44：Ac-PHSC(SCH2-(R)-CH(NH2)CO2H)N-NH2
该化合物根据实施例2和7的方法自Ac-PHSCN-NH2(50mg，0.083mmol)和半胱氨酸甲基硫代磺酸盐(Toronto Research Chemicals)(16.6mg，0.083mmol)制备。产量：37.2mg(62.6％)。
1HNMR(300MHz，D2O)δ1.83-2.01(m，4H)，2.14(s，3H)，2.25(m，1H)，2.78-3.35(m，8H)，3.65(m，2H)，3.91(m，2H)，4.38(m，1H)，4.48(m，lH)，4.52(m，1H)，4.73(m，1H)，7.35和7.38(s，s，1H)，8.66和8.69(s，s，1H)；13C NMR(75MHz，D2O)δ22.5，25.4，27.1，31.0，37.4，38.1，38.9，49.8，51.5，53.0，53.3，53.8，56.6，61.3，62.2，118.4，129.7，134.6，171.7，172.6，172.8，172.9，174.5，175.5，175.7，175.8；ES MS m/z(M+H)+calcd 717，obsd 717.Anal.Calc for C26H40N10O10S2：N，19.54.发现：N，11.89(肽含量：60.9％).
实施例45：Ac-PHSHoC(Bz)N-NH2
该化合物根据实施例2和5的方法自粗Ac-PHSHoCN-NH2(50mg，0.082mmol)和苯甲酰氯(19.0μL，0.163mmol)制备。产量：9.8mg(16.7％)。
1H NMR(300MHz，D2O)δ1.83-2.00(m，4H)，2.14和2.15(s，s，3H)，2.26(m，2H)，2.77-2.88(m，2H)，3.14-3.31(m，4H)，3.64(m，2H)，3.93(m，2H)，4.38(m，1H)，4.53(m，2H)，7.31-7.35(s，1H)，7.58(m，2H)，7.72(m，1H)，7.99(m，2H)，8.61-8.65(s，1H)；13C MR(75MHz，D2O)δ22.6，22.7，26.2(2C)，27.2，27.3，31.1，31.6，31.8，37.6(2C)，50.0(2C)，51.5，51.6，53.4，54.1，54.5，56.8，57.0，61.4(2C)，62.3，62.4，118.4，128.3，129.7，129.8，130.2，134.7，135.6(2C)，137.6(2C)，172.8，172.9，173.0，173.1，174.0，174.2，174.5，174.55，175.6，175.7，175.9，176.0，176.2；ES MS m/z(M+H)+ calcd716，obsd 716.Anal.Calc for C31H41N9O9S：N，17.61.发现.：N，11.81(肽含量：67.1％).
实施例46：Ac-PHSHoC(Piv)N-NH2
该化合物根据实施例2和5的方法自粗Ac-PHSHoCN-NH2(SAH-15)(50mg，0.082mmol)和新戊酰氯化物(20.0tL，0.163mmol)制备。产量：12.5mg(22.2％)。
1H NMR(300MHz，D2O)δ1.25(s，9H)，1.83-2.09(m，4H)，2.15(s，3H)，2.30(m，1H)，2.78-2.95(m，4H)，3.31(m，2H)，3.64(m，2H)，3.91(m，2H)，4.40-4.52(m，3H)，7.66m(m，1H)，8.66(m，1H)；13C NMR(75MHz，D2O)δ22.6，25.5，25.55，27.2，27.7，31.0，31.6，31.7，37.4，37.5，47.5，49.9，51.42，51.47，53.3，54.0，54.2，56.6，56.8，61.3，62.25，62.26，118.4，129.7，134.6，172.7，172.9，173.9，174.2，174.4，175.5，175.6，175.85，175.89，176.1，212.8；ES MS m/z(M+H)+calcd 696，obsd 696.Anal.Calc for C29H45N9O9S：N，18.12.发现：N，13.77(肽含量：76.0％).
实施例47：Ac-PHSHoC(噻吩-2-羰基)N-NH2
该化合物根据实施例2和5的方法自粗Ac-PHSHoCN-NH2(SAH-15)(50mg，0.082mmol)和2-噻吩羰基氯化物(17.5μL，0.163mmol)制备。产量：11.4mg(19.5％)。
1H NMR(300MHz，D2O)δ1.84-2.01(m，4H)，2.15和2.16(s，s，3H)，2.12-2.30(m，3H)，2.78-2.89(m，2H)，3.20(m，3H)，3.66(m，2H)，3.93(m，2H)，4.56(m，1H)，4.79(m，2H)，7.27(m，1H)，7.34-7.37(m，1H)，7.92(m，1H)，7.97(m，1H)，8.64-8.68(m，1H)；13C NMR(75MHz，D2O/MeOD)δ22.5，25.4，26.2，27.1，27.2，30.9，31.7，31.8，37.4，37.5，49.8，51.3，51.4，53.3，53.9，54.2，54.3，56.6，56.9，61.2，62.1，62.2，64.9，118.3，129.7，129.7，133.7，134.5，135.6，141.8，172.6，172.7，172.9，172.94，173.7，173.9，174.2，175.4，175.5，175.6，175.7，176.0，187.9；ES MS m/z(M+H)+calcd 722，obsd 722.Anal.Calc for C29H39N9O9S2：N，17.46.发现：N，13.54(肽含量：77.6％).
实施例48：Ac-PHSHoC(甲氧基乙烷)N-NH2
该化合物根据实施例2和5的方法自粗Ac-PHSHoCN-NH2(100mg，0.163mmol)和2-溴乙基甲基醚(15.5μL，0.163mmol)制备。产量：53.3mg(48.8％)。
1H NMR(300MHz，D2O)δ1.83-2.29(m，7H)，2.14(s，3H)，2.71-2.88(m，6H)，3.23-3.39(m，2H)，3.39(s，3H)，3.65(m，4H)，3.88(m，2H)，4.39(m，1H)，4.49(m，1H)，7.33-7.37(m，1H)，8.64-8.69(m，1H)；13C NMR(75MHz，D2O)δ22.5，25.4，27.2，28.5，31.0，31.6，37.4，37.5，49.9，51.4，53.3，53.4，56.7，58.9，61.3，62.2，62.3，71.9，118.4，129.6，129.7，134.6，172.7，172.8，172.9，173.0，174.2，174.4(2C)，175.5，175.6，175.8，175.87，176.1，176.2；ES MS m/z(M+H)+calcd 670，obsd 670.Anal.Calc for C27H43N9O9S：N，1882.发现：N，14.64(肽含量：77.8％).
实施例49：Ac-PHSHoC(Bn)N-NH2
该化合物根据实施例2和6的方法自粗Ac-PHSHoCN-NH2(SAH-15)(76.2mg，0.124mmol)和苯甲基溴化物(14.8μL，0.124mmol)制备，但反应混合物在加入BnBr前在冰水浴中冷却。产量：29.4mg(33.7％)。
1H NMR(300MHz，D2O)δ1.84-2.07(m，5H)，2.15(s，3H)，2.29(m，1H)，2.54-2.90(m，4H)，3.23-3.34(m，2H)，3.66(m，2H)，3.84-3.91(m，4H)，4.38-4.48(m，3H)，4.73(m，1H)，7.34-7.45(m，6H)，8.64-8.66(m，1H)；13C NMR(75MHz，D2O)δ22.6，25.4，27.2，27.9(2C)，31.0，31.3，36.33，36.36，37.4，37.5，49.8，51.3，51.4，53.3(2C)，54.0，54.3，56.6，56.7，61.3，62.2，62.3，118.4，128.4，129.6(2C)，130.00，130.08，134.6，139.6，172.7，172.8，172.9，174.1，174.3，174.4(2C)，175.5，175.6，175.8(3C)，176.1；ES MS m/z(M+H)+calcd 702，obsd 702.Anal.Calc for C31H43N9O8S：N，17.96.发现：N，13.07(肽含量：72.2％).
实施例50：Ac-PHSHoC(SMe)N-NH2
该化合物根据实施例2和7的方法自粗Ac-PHSHoCN-NH2(50mg，0.081mmol)和S-甲基甲烷硫代磺酸盐(8.4μL，0.081mmol)制备。产量：24.6mg(46.2％)。
1H NMR(300MHz，D2O)δ1.84-2.33(m，7H)，2.15(s，3H)，2.46(s，3H)，2.72-2.95(m，4H)，3.19-3.41(m，2H)，3.67(m，2H)，3.91(m，2H)，4.39(m，1H)，4.48-4.58(m，2H)，4.73(m，1H)，7.35-7.39(m，1H)，8.66-8.70(m，1H)；13C NMR(75MHz，D2O)δ22.6，23.3，25.5，27.2，31.0，31.1，33.9，34.0，37.4，37.5，49.9，51.42，51.47，53.3，53.4，53.7，24.0，56.71，56.78，61.3，62.1，62.2，118.4，129.6，134.6，172.7，172.8，172.9，173.0，174.1，174.4，175.5，175.6，175.83，175.88，176.2；ES MS m/z(M+H)+ calcd 658，obsd 658.Anal.Calc for C25H39N9O8S2：N，19.16.发现：N，14.48(肽含量：75.6％).
实施例51：Ac-PHSHoC(SPh)N-NH2
该化合物根据实施例2和7的方法自粗Ac-PHSHoCN-NH2(SAH-15)(50mg，0.081mmol)和S-苯基苯硫代磺酸盐(20.5mg，0.081mmol)制备。产量：20.8mg(35.6％)。
1H NMR(300MHz，D2O)δ1.83-2.31(m，7H)，2.14(s，3H)，2.66-2.93(m，4H)，3.15-3.35(m，2H)，3.65(m，2H)，3.85(m，2H)，4.36-4.52(m，3H)，7.32-7.47(m，4H)，7.62(m，1H)，8.64和8.67(s，s，1H)；13CNMR(75MHz，D2O)δ22.6，25.5，27.2，30.9，31.0，35.1，35.3，37.4，37.5，49.8，51.3，51.4，53.3，53.6，53.9，56.6，56.8，61.3，62.23，62.27，118.3，128.7，129.33，129.39，129.6，130.6，130.61，134.6，137.7，137.8，172.7(2C)，172.8，173.9，174.1，174.42，174.44，175.5，175.6，175.7，175.85，175.88，176.1；ES MS m/z(M+H)+calcd 720，obsd 720.Anal.Calc forC30H41N9O8S2：N，17.51.发现：N，12.93(肽含量：73.9％).
实施例52：Fmoc-S-苯甲基-L-半胱氨酸砜-OH
S-苯甲基-L-半胱氨酸砜(cysteine sulfone)(Toronto Research Chemicals)(1.0g，4.11mmol)溶解于1，4-二噁烷(3.0mL)和10％Na2CO3(4.3mL，4.11mmol)中。向该溶液中通过加样漏斗加入溶解于5.0mL 1，4-二噁烷中的Fmoc-OSu(1.3g，3.90mmol)。反应混合物形成浓稠的白浆。搅拌3小时以后，加入1N HCl直到pH约3.0。固体是不可过滤的，所以加入乙酸乙酯并在分液漏斗中震摇形成的层。倾倒出上方的有机层使其与底部的沉淀分离。将有机物在降低的压力下通过NMR浓缩成合理纯度的固体，用于随后的偶联中。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ3.45(dd，J＝9.33Hz，J＝14.55Hz，1H)，3.59(dd，J＝3.0Hz，J＝14.5Hz，1H)，4.23-4.33(m，3H)，4.50(m，3H)，7.30(q，J＝8.97Hz，J＝16.3Hz，4H)，7.38(br s，5H)，7.69(d，J＝7.39Hz，2H)，7.86(d，J＝7.35Hz，2H)；ES MS m/z(M+Na)+calcd 488，obsd 488.
实施例53：Ac-PHSA(β-SO2Bn)N-NH2
该化合物根据实施例2和9的方法自200mg(0.63mmol/g)Fmoc-Asn(trt)-Rink制备，但其被预纯化两次。Fmoc-Ala(β-SO2Bn)-OH(SAH-13)直接与Asn偶联。产量：22.9mg(25.2％)。
1H NMR(300MHz，D2O)δ1.83-2.01(m，3H)，2.15(s，1H)，2.27(m，1H)，2.79-2.90(m，2H)，3.19-3.37(m，2H)，3.63-3.75(m，3H)，3.89-3.96(m，3H)，4.39(m，1H)，4.52(m，1H)，4.66(s，2H)，5.10(m，1H)，7.34和7.37(s，s，1H)，7.51(br s，5H)，8.62-8.66(m，1H)；13C NMR(75MHz，D2O)δ22.7，25.5，27.3，31.1，37.4，49.3，50.0，51.8，52.7，53.3，56.7，60.9，61.4，62.2，118.5，127.5，129.7，130.4，130.7，132.5，134.7，170.9，172.7，172.8，173.0，174.5，175.7，175.9；ES MS m/z(M+H)+calcd 721，obsd 721.Anal.Calc forC30H41N9O10S：N，19.17.发现：N，12.70(肽含量：66.3％).
实施例54：Ac-PHSHoCN-NH2
该化合物根据实施例2和9的方法自2.0g(0.63mmol/g)Fmoc-Asn(trt)-Rink制备，产生764.5mg(79.3％)粗物质。Fmoc-HoC(trt)-OH(Chem-Impex)与Asn偶联。所述肽占峰的1∶1混合物的＞90％，所述峰通过分析型HPLC、0.1分钟而分离。推定这两个峰是构型异构体。将粗物质用于类似物合成。ES MSm/z(M+H)+calcd 612，obsd 612。
实施例55：2-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基硫烷基-丁酸烯丙基酯
用氮充满圆底烧瓶并加入NaSPh(61.5mg，0.465mmol)和DMF(1mL)。将混合物置于冰水浴中冷却并加入溶于DMF(1mL)的4-溴-2-叔-丁氧羰基氨基丁酸烯丙基酯(100mg，0.310mmol)。将该混合物转移到0-5℃冰箱并放置过夜。第二天早晨(16h)，将所述溶液在真空条件下浓缩并将残余物在EtOAc和水稀释。分离各层，并用水、0.1M KHSO4和盐水洗涤有机层，并用Na2SO4干燥。除去乙酸乙酯，产生油：95.7mg(87.8％)。不必进一步纯化即可使用该化合物。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.51(s，9H)，2.02(m，1H)，2.24(m，1H)，3.0(m，2H)，4.50(br s，1H)，4.67(t，J＝1.29Hz，1H)，4.69(t，J＝1.29Hz，1H)，5.20(br s，1H)，5.34(m，2H)，5.93(m，1H)，7.25-7.41(m，5H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ22.2，29.5，31.0，33.7，61.6，67.2，120.2，127.5，129.2，130.2，130.6，130.9，132.6，156.5，173.0.
实施例56：2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-4-苯基硫烷基-丁酸
将(L)-4-苯基硫烷基-丁酸的TFA盐(156.6mg，0.481mmol)溶于水中(1.0ml)。加入Na2CO3(102mg，0.962mmol)，立即形成沉淀。将溶于二噁烷(2.0mL)中的FmocOSu(162.2mg，0.481mmol)加入氨基酸。另外加入2.0mL水以稀释该稠的浆。1小时以后，再加入二噁烷(0.5mL)中的0.1当量FmocOSu(16.2mg，0.0481mmol)。1.5小时以后，用乙酸乙酯稀释反应物，并用1N HCl和盐水洗涤。将有机层浓缩至残余物(residue)并进行层析(6.0gSiO2，10％MeOH/CH2Cl2)，产生淡黄色的固体：164.4mg(78.8％)。通过NMR测定所述物质的纯度为90％：
1H NMR(300MHz，CDCl3/MeOD)δ1.95(m，1H)，2.14(m，1H)，2.83(m，1H)，4.17(br t，J＝6.78Hz，1H)，4.36(m，3H)，7.13-7.72(m，13H).
实施例57：Ac-PHSHoC(Ph)N-NH2
该化合物根据实施例2和9的方法自Fmoc-Asn(trt)-Rink(215mg，0.63mmol/g)制备，其中实施例55的化合物与Asn偶联。产量：29.4mg(33.7％)。
1H NMR(300MHz，D2O)δ1.83-2.32(m，6H)，2.14(s，3H)，2.71-2.90(m，2H)，3.02-3.37(m，4H)，3.65(m，2H)，3.90(m，2H)，4.36(m，1H)，4.48(m，1H)，4.61(m，1H)，4.73(m，1H)，7.29-7.48(m，6H)，8.64-8.67(m，1H)；13CNMR(75MHz，D2O)δ22.6，25.4，27.2，30.2，31.0，31.3，37.4，49.8，51.4，53.4，53.9，56.6，61.3，62.1，118.3，127.9，129.6，130.5，130.59，134.6，135.7，172.7，172.9，174.0，174.4，175.6，175.8；ES MS m/z(M+H)+calcd 688，obsd 688.Anal.Calc for C30H41N9O8S：N，18.33.发现：N，13.30(肽含量：72.5％).
实施例58：Ac-Pro-His-Ser-Cys(β，β-二甲基)-Asn-NH2
该化合物根据实施例1和2的方法自Rink amide AM树脂(0.550mg，载样量0.74mmol/g，0.407mmol)制备，但在双重偶联中利用以下当量数：2当量的氨基酸，2当量的HBTU，2当量的HOBt和4当量的NMM。PLG-94(108mg，43％)作为白色、绒毛样(fluffy)固体分离，其作为比例为84∶16的两种化合物的混合物：
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.98-8.96(m，1H)，8.46-8.19(m，2H)，8.14-7.93(m，2H)，7.39-7.34(m，2H)，7.07(s，2H)，6.92(s，1H)，4.78-4.25(m，4H)，3.23-3.12(m，1H)，3.05-2.93(m，2H)，2.58-2.38(m，2H，与DMSO的峰值重叠)，2.07-1.97(m，3H)，1.90-1.62(m，3H)，1.37(s，3H)，1.32(s，3H)；ES MS m/z(M+H)+626.6；Anal.calcd forC25H39N9O8S：N，20.15.发现：14.84(肽含量，74％).
实施例59：肽对体外侵入的影响
检测肽在Matrigel栓模型中体内抑制FGF-2介导的血管生成作用的能力。以1μM的浓度将受试天然肽或受试衍生肽加入Matrigel栓。结果显示于下表。
| 化合物 | ％抑制(±StdDev). |
| PHSSN | 20.8±34.1 |
| PHSSN | 47.5±13.6 |
| 15 | 71.7±41.9 |
| 6 | 74.9±5.8 |
| 3 | 25.3±8.6 |
| 4 | 75.8±38.3 |
| 16 | 72.0±31.9 |
| 13 | 81.0±50.0 |
| 14 | 73.3±34.5 |
| 7 | 56.6±22.4 |
| 1 | 88.2±42.9 |
实施例60：Ac-PFSCNGGK(生物素)-NH2的定位
用MatrigelTM中的1×106Lewis肺癌(3LL)细胞接种小鼠，每只小鼠两个。5天后，将50μgAc-PFSCNGGK(生物素)-NH2或PFSCN通过尾静脉注入小鼠。等待两小时以清除未结合的肽以后，处死动物并取出所述栓和不同器官并将其置于锌固定剂中24小时，制备4mm石蜡包埋的切片。一些实验中，在注射4小时后将动物处死。在二甲苯中对切片进行脱石蜡化，重新水化并在1％BSA中封闭30分钟。将所述切片与PBS中以1∶50稀释的大鼠抗CD31单克隆抗体(BD Biosciences)以及以1∶500稀释的抗生物素小鼠单克隆Cy3偶联的抗体(Sigma)一起保温。在其它实验中，使用抗生物素山羊多克隆FITC偶联的抗体(Sigma)。将所述样品与在PBS以及DAPI(300nM)中以1∶500稀释的第二抗体即抗大鼠IgG FITC偶联的抗体(BDBiosciences)一同保温2小时。将PBS中40μM的Ac-PFSCNGGK(生物素)-NH2与以1∶500稀释的抗生物素山羊多克隆FITC偶联的抗体(Sigma)在冰上一起保温30分钟。将该混合物加于B16黑素瘤细胞中，所述细胞已经铺于在6孔板中的盖玻片上并在冰上保温4小时。固定所述细胞并在显微镜下观察，显示Ac-PFSCNGGK(生物素)-NH2定位于肿瘤的CD31阳性新生血管，并且不位于其它细胞中，并显示Ac-PFSCNGGK(biotin)-NH2在注射4小时以后仍保持与肿瘤内皮细胞结合。
最后，应注意还有其它实施本发明的方法。因此，本实施方案被认为是说明性而非限制性的，且本发明不限于给出的细节，但可在所附权利要求的范围和对等范围内进行修饰。所引用的所有公开出版物和专利文献包含在本文中作为参考。
Claims (65)
1.结构式(1)的化合物
或其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物或氮氧化物，其中：
a，b，x，y和z是0或1；
A是环状氨基酸；
B是碱性氨基酸；
C是小氨基酸；
R1是烃基，取代的烃基，酰基，取代的酰基，烃基磺酰基，取代的烃基磺酰基，芳基烃基，取代的芳基烃基，芳基磺酰基，取代的芳基磺酰基，杂烃基，取代的杂烃基，杂芳基磺酰基，取代的杂芳基磺酰基，杂芳基烃基，取代的杂芳基烃基，氧羰基或取代的氧羰基；
R2是烃基，-(CH2)mS(O)nR5，-(CH2)mS(O)n-S(O)oR5或-(CMe)mS(O)nR5
m是1，2，3或4；
n和o独立地是0，1或2；
R3是-CH2CONH2或-CH2CH2CONH2；
R4是烃基，-NR6R7或-OR8；
R5是烃基，取代的烃基，酰基，取代的酰基，芳基，取代的芳基，芳基烃基，取代的芳基烃基，杂烃基，取代的杂烃基，杂芳基，取代的杂芳基，杂芳基烃基，取代的杂芳基烃基，氧羰基或取代的氧羰基；
R6和R7独立地是氢或烃基；和
R8是烃基，取代的烃基，芳基，取代的芳基，芳基烃基，取代的芳基烃基，杂烃基，取代的杂烃基，杂芳基，取代的杂芳基，杂芳基烃基或取代的杂芳基烃基；
条件是：
m为1时R5不是甲基；
仅当A是脯氨酸，B是组氨酸，C是丝氨酸时a是1且当a是0时b是0；和
仅当b，x，y且z是1时R2是-(CH2)mS(O)nR5或-(CH2)mS(O)n-S(O)oR5。
2.权利要求1的化合物，其中A是脯氨酸，B是组氨酸，C是丝氨酸且R3是-CH2CONH2。
3.权利要求1或2的化合物，其中R1是酰基，取代的酰基，芳基烃基，取代的芳基烃基，氧羰基或取代的氧羰基。
4.权利要求1或2的化合物，其中R1是酰基，取代的酰基，氧羰基和取代的氧羰基。
5.权利要求1或2的化合物，其中R2是-(CH2)mS(O)nR5或-(CH2)mS(O)n-S(O)oR5且m是1或2。
6.权利要求1或2的化合物，其中R4是NR7R8且R7和R8是氢。
7.权利要求1的化合物，其中a，b，x，y且z是1。
8.权利要求1的化合物，其中x是0且a，b，y和z是1。
9.权利要求1的化合物，其中x和y是0且a，b和z是1。
10.权利要求1的化合物，其中x，y和z是0且a和b是1。
11.权利要求1的化合物，其中x，z，a和b是1且y是0。
12.权利要求1的化合物，其中x，a和b是1且y和z是0。
13.权利要求1的化合物，其中y，a和b是1且x和z是0。
14.权利要求1的化合物，其中x，y，z和a是1且b是0。
15.权利要求1的化合物，其中y，z和a是1且x和b是0。
16.权利要求1的化合物，其中x，y，z和b是1且a是0。
17.权利要求1的化合物，其中z和a是1且x，y和b是0。
18.权利要求1的化合物，其中a是1且x，y，z和b是0。
19.权利要求1的化合物，其中A是D氨基酸。
20.权利要求1的化合物，其中A，B和C是L氨基酸，且分别与R2和R3相邻的α-碳具有L构型。
21.权利要求2的化合物，其中
R1是酰基，取代的酰基，氧羰基和取代的氧羰基；
a，b，x，y和z是1；
m是1或2；和
R4是NR7R8且R7和R8是氢。
22.权利要求21的化合物，其中R1是酰基。
23.权利要求22的化合物，其中R1是-C(O)CH3且R2是烃基。
24.权利要求23的化合物，其中R2是甲基或烯丙基。
25.权利要求22的化合物，其中R1是-C(O)CH3，R2是-(CH2)mS(O)nR5且m是1。
26.权利要求25的化合物，其中n是0且R5是烃基或取代的烃基。
27.权利要求26的化合物，其中R5是乙基，叔丁基或-CH2NHC(O)CH3。
28.权利要求25的化合物，其中n是0且R5是芳基烃基或取代的芳基烃基。
29.权利要求28的化合物，其中R5是
30.权利要求25的化合物，其中n是0且R5是酰基或取代的酰基。
31.权利要求30的化合物，其中R5是
32.权利要求25的化合物，其中n是0且R5是氧羰基或取代的氧羰基。
33.权利要求32的化合物，其中R5是
34.权利要求22的化合物，其中R1是-C(O)CH3，R2是-(CH2)mS(O)n-S(O)oR5且m是1。
35.权利要求34的化合物，其中n和o是0且R5是烃基或芳基。
36.权利要求35的化合物，其中R5是甲基，乙基或苯基。
37.权利要求22的化合物，其中R1是-C(O)CH3，R2是-(CH2)mS(O)nR5且m是2。
38.权利要求37的化合物，其中n是0且R5是烃基或芳基烃基。
39.权利要求38的化合物，其中R5是甲基或苯甲基。
40.权利要求37的化合物，其中n是1或2且R5是烃基。
41.权利要求40的化合物，其中R5是甲基。
42.权利要求37的化合物，其中n是0且R5是酰基。
43.权利要求42的化合物，其中R5是新戊酰或
44.权利要求2的化合物，其中：
R1是酰基，取代的酰基，氧羰基或取代的氧羰基；
m是1或2；和
R4是NR7R8且R7和R8是氢。
45.权利要求44的化合物，其中x是0且a，b，y和z是1。
46.权利要求44的化合物，其中x和y是0且a，b和z是1。
47.权利要求44的化合物，其中x，y和z是0且a和b是1。
48.权利要求44的化合物，其中y是0且a，b，x和z是1。
49.权利要求44的化合物，其中y和z是0且a，b和x是1。
50.权利要求44的化合物，其中x和z是0且a，b和y是1。
51.权利要求44的化合物，其中b是0且a，x，y和z是1。
52.权利要求44的化合物，其中b和x是0且a，y和z是1。
53.权利要求44的化合物，其中b，x和y是0且a和z是1。
54.权利要求44的化合物，其中b，x，y和z是0且a是1。
55.权利要求45-54任一项的化合物，其中R1是酰基，R2是-(CH2)mS(O)nR5，m是1且R5是烃基。
56.权利要求55的化合物，其中R1是-C(O)CH3且R5是甲基。
57.权利要求44的化合物，其中a是0且b，x，y和z是1。
58.权利要求57的化合物，其中R1是-C(O)CH3。
59.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1或2的化合物以及药学上可接受的稀释剂、赋型剂或佐剂。
60.治疗或预防患者中的癌症的方法，包含将治疗有效量的权利要求1或2的化合物给药需要所述治疗的患者。
61.治疗或预防患者中的癌症的方法，包含将治疗有效量的权利要求59的药物组合物给药需要所述治疗的患者。
62.权利要求61的方法，进一步包含对需要所述治疗的患者给药治疗有效量的另一抗癌剂，或包含其它抗癌剂以及药学上可接受的稀释剂、赋型剂或佐剂的药物组合物。
63.权利要求60的方法，进一步包含对需要所述治疗的患者给药治疗有效量的另一抗癌剂，或包含其它抗癌剂以及药学上可接受的稀释剂、赋型剂或佐剂的药物组合物。
64.权利要求60的方法，其中所述癌症是乳腺癌，肾癌，脑癌，结肠癌，前列腺癌，软骨肉瘤或血管肉瘤。
65.权利要求61的方法，其中所述癌症是乳腺癌，肾癌，脑癌，结肠癌，前列腺癌，软骨肉瘤或血管肉瘤。
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