CN112040951A - 具有nampt抑制剂的抗体药物缀合物(adc) - Google Patents

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Abstract

具有下式的结合剂的缀合物(A)：
Figure 322521DEST_PATH_IMAGE001
(A)其中AB代表结合剂，Z'代表连接子，和D代表式(I)的活性组分：

Description

具有NAMPT抑制剂的抗体药物缀合物(ADC)
本发明的应用领域
本发明涉及结合剂或其衍生物与一个或多个活性组分分子的新的缀合物，其中所述活性组分为NAMPT抑制剂，其经由如本文所描述和定义的连接子Z'与结合剂缀合，以及涉及它们的制备方法、它们用于治疗和/或预防疾病、特别是过度增殖性病症的用途。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是一种生物学上重要的辅酶，其在许多细胞代谢相关的转化和细胞信号传导中起关键作用[Lin, S-J.; Guarente L. Current OpinionCell Biol. 2003, 15, 241–146；Ziegler M. Eur. J. Biochem. 2000, 267, 1550–1564]。
在哺乳动物细胞中，从烟酰胺(NAM)对NAD+的两步回收-烟酰胺途径-是与从必需氨基酸L-色氨酸从头合成NAD+（主要发生在肝脏中）相比最有效的方法 [Schramm V. L.等人， PNAS 2009, 106, 13748–13753]。NAMPT(烟酰胺磷酸核糖转移酶也称为前B细胞集落增强因子(PBEF)和内脂素、NMPRT、NMPETase或NAmPRTase，国际命名法E.C.2.4.2.12)催化该方法的第一步，NAM磷酸核糖化为NMN(烟酰胺单核苷酸)，其进一步通过NMNAT(烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶)转化为NAD+。NAMPT是NAD+产生中的限速酶，且其抑制导致NAD+的快速消耗[Deng Y. 等人， Bioanalysis 2014, 6, 1145–1457]。
通常，改变的细胞代谢是Otto Heinrich Warburg假设的癌细胞的基本特征之一[Warburg, O. Über den Stoffwechsel der Carcinomzelle. Klin. Wochenschr. 4,534–536(1925)]。随着癌细胞持续增殖，这些细胞不得不适应应激的和动态的微环境。这导致癌细胞对能量、大分子的需求增加和对细胞氧化还原状态的维持[Cairns R. A. 等人，Nature Rev. 2011, 11, 85–95]。
在这方面，NAD+在糖酵解中用作电子载体，由于Warburg效应，糖酵解在癌细胞中被上调，和在线粒体氧化磷酸化中一样。此外，NAD+作为几种酶的底物，例如聚ADP-核糖聚合酶(PARP)和去乙酰化酶(sirtuins，SIRT)，其参与DNA修复和基因表达、通常在癌细胞中异常调节并导致NAD+的消耗的过程[Berger F 等人， 2004 Trends Biochem. Sci. 29,111–118]。NAD+/NADH的磷酸化形式也存在，并且除了产生能量之外，经常用于生物合成和/或细胞保护目的。它们还参与对氧化应激的细胞应答[Massudi H. Redox Rep. 2012, 17,28–46]。
由于这些原因，许多癌细胞对NAD+具有增加的需求，并且其合成是不断需要的，使得癌细胞对NAMPT抑制特别敏感。
此外，已证明NAMPT涉及遗传毒性或氧化应激期间细胞活力的调节，并且NAMPT抑制剂可能用于治疗例如炎症、代谢性病症和癌症[Tong L. 等人， Expert Opin. Ther.Targets 2007, 11, 695–705； Galli, M. 等人， Cancer Res. 2010, 70, 8–11， J.Med. Chem 2013, 56, 6279–6296]。
Daporinad也称为APO866、FK866、WK175或WK22((E)-N-[4-(1-苯甲酰基哌啶-4-基)丁基]-3-(吡啶-3-基)-丙烯酰胺)是NAMPT的高度有效和选择性的抑制剂，其干扰NAD生物合成、ATP产生并诱导细胞死亡。在鼠肾细胞癌模型RENCA中显示了daporinad的体内功效[Drevs J. 等人，Anticancer Res 2003, 23, 4853-4858]。已经完成了daporinad用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTL)和晚期黑素瘤的临床试验，[ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00435084、 NCT00431912、 NCT00432107]。
CHS-828也称为GMX1778(N-[6-(4-氯苯氧基)己基]-N'-氰基-N''-4-吡啶基胍)，一种NAMPT抑制剂以及NF-κB途径活性抑制剂[Hassan S. B. 等人， Anticancer Res2006, 26, 4431-4436]，在人乳腺和肺癌细胞系衍生的体内模型中在体内和体外显示出高度细胞毒效果[Hijarnaa PJ 等人， Cancer Res. 1999, 59, 5751–5757]。2002年发表了该化合物在实体瘤患者中的I期研究[Hovstadius P 等人， ClinCancerRes 2002, 9,2843–2850]。在临床试验中最好的观察到的应答是稳定的疾病。因此，已经假定在临床试验中缺乏显著活性可能是由于剂量限制性毒性而不能将NAMPT抑制剂给药至更高的药物暴露量所致[Sampath D. 等人， Pharmacology and Therapeutics 2015, 151, 16–31]。例如通过使用结合剂或抗体将细胞毒性药物结合靶向癌细胞可以改善治疗窗，并且可以因此导致更好的耐受性和更好的临床应答。
本发明涉及结合剂或其衍生物与一个或多个活性组分分子的新型缀合物，其中所述活性组分是NAMPT抑制剂，其经由连接子缀合至结合剂。
许多化学化合物已显示用作NAMPT抑制剂。例如，Bioorganic & MedicinalChemistry Letters(2013), 23, 4875–4885；WO2014111871和WO2013067710公开了作为NAMPT抑制剂的1,3-二氢-2H-异吲哚类。
DE10010423、WO9206087和WO2006064189公开了1-烷基-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基衍生物，其可以分别用于治疗贫血、心血管和二脂酰甘油酰基转移酶(diglycerideacyltransferase（DGAT）)介导的病症(例如糖尿病)。
WO2012067965公开了4-氧代-3,4-二氢酞嗪苯基环脲衍生物，其可用作NAMPT和ROCK抑制剂。
尽管在过去的几十年中在治疗人和动物中不受控制的增殖细胞过程如癌症疾病中取得了进展，但是仍然存在对扩展治疗选项，尤其是基于选择性地解决新靶的新药物的巨大的未满足的医学需要。
发明内容
因此，NAMPT抑制剂代表有价值的化合物，其应该或作为单一药剂或与其它药物结合补充治疗选项，特别是相对于其它生物靶具有增加的选择性的那些NAMPT抑制剂。因此，本发明的一个目的是提供对癌症治疗可能有益的物质。
为了实现这一目的，本发明提供了结合剂或其衍生物与一个或多个活性化合物分子的缀合物，所述活性化合物分子是经由连接子Z'与结合剂连接的NAMPT抑制剂。结合剂优选是结合剂蛋白或肽，特别优选人、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的缀合物可以由以下通式表示：
Figure 667614DEST_PATH_IMAGE001
其中AB代表结合剂，Z'代表连接子，n代表1和50之间的数，且D代表式(I-D)的活性组分：
Figure 647071DEST_PATH_IMAGE002
其中：
§1或§2代表与连接子Z'的连接点，条件是：
当连接子Z'在§1处连接时，则§2代表R5a，和
当连接子Z'在§2处连接时，则连接子Z'与环Het的碳或氮原子连接，并且§1代表R5b；
Het代表任选被一个或多个独立地选自R5的基团取代的杂芳基；
R1彼此独立地代表卤素、羟基、C1-C3-烷基、C1-C3-卤代烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-N(H)R6、-N(R6)R7或-NH2；
t是0、1或2；
R2代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基，
其中苯基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-N(H)R6和-N(R6)R7；
R3代表H、C1-C3-烷基或C1-C3-卤代烷基；和
R4代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基；
或，
R2和R3与它们所连接的碳一起形成C3-C6-环烷基或含有一个含杂原子基团的5-至7-元杂环烷基，所述含杂原子基团选自O、NR8、S、S(=O)、S(=O)2、S(=NR8)(=NR9)和S(=O)(=NR8)；和
R4代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基；
或，
R2代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基，
其中苯基任选地被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-N(H)R6和-N(R6)R7；且
R3和R4一起形成键；
R5彼此独立地代表卤素、羟基、C1-C3-烷基、C1-C3-卤代烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-N(H)R6、-N(R6)R7或NH2；4-至7-元杂环烷基、-SR8、-S(=O)R8、-S(=O)2R8和-S(=O)(=NR8)R9；
R5a代表R5、氢或不存在；
R5b代表氢或选自以下的基团：
甲基、C2-C6-烷基、(1,3-二氧戊环-2-基)-(C1-C6-烷基)-、(1,3-二噁烷-2-基)-(C1-C6-烷基)-、氮杂环丁烷-3-基、(氮杂环丁烷-3-基)-(C1-C6-烷基)-、氧杂环丁烷-3-基、(氧杂环丁烷-3-基)-(C1-C6-烷基)-、C3-C6-环烷基、(C3-C6-环烷基)-(C1-C6-烷基)-、5-至7-元杂环烷基、(5-至7-元杂环烷基)-(C1-C6-烷基)、苯基、苯基-(C1-C6-烷基)-、5-至6-元杂芳基和(5-至6-元杂芳基)-(C1-C6-烷基)-，
其中5-至7-元杂环烷基和5-至6-元杂芳基分别经由5-至7-元杂环烷基环的碳原子或经由5-至6-元杂芳基环的碳原子与分子的其余部分连接；
其中C2-C6-烷基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、羟基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、氧代(=O)、-NH2、-N(H)R6、-N(R6)R7、-C(=O)OR8、-SR8、-S(=O)R8、-S(=O)2R8和-S(=O)(=NR8)R9；
其中氮杂环丁烷-3-基和氧杂环丁烷-3-基任选被一个或两个独立地选自以下的取代基取代：
C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C1-C4-烷氧基、C1-C4-卤代烷氧基、(C1-C3-烷氧基)-(C1-C4-烷基)-、C3-C6-环烷基和C3-C6-环烷基氧基；
其中C3-C6-环烷基和5-至7-元杂环烷基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
羟基、卤素、氰基、C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C1-C4-烷氧基、C1-C4-卤代烷氧基、(C1-C3-烷氧基)-(C1-C4-烷基)-、C3-C6-环烷基、C3-C6-环烷基氧基、-N(R5)R6、-C(=O)OH、氧代(=O)和-N(H)C(=O)-(C1-C3-烷基)；
其中苯基和5-至6-元杂芳基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基-、C1-C3-卤代烷氧基-、-N(H)R6、-N(R6)R7、-C(=O)OH和-C(=O)O(C1-C6-烷基)；
q是0、1、2或3,
m是0、1、2或3,
条件是q+m是2、3或4；
Figure 426809DEST_PATH_IMAGE003
代表选自以下的基团：
Figure 822018DEST_PATH_IMAGE004
其中*和＃代表所述基团与式(I)化合物的其余部分的连接点，
所述基团任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、R6(H)N-和-N(R6)R7；
R6、R7彼此独立地代表C1-C3-烷基、C3-C6-环烷基、苯基、-C(=O)-O-(C1-C4-烷基)或-C(=O)-(C1-C3-烷基)，
其中所述苯基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-NH2、-N(H)R6和-N(R6)R7；
R8、R9彼此独立地代表氢、C1-C3-烷基、C3-C6-环烷基、苯基或C1-C3-卤代烷基，
其中所述苯基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-NH2、-N(H)R6和-N(R6)R7；
或所述化合物的N-氧化物、盐、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐。
本发明人已发现许多将结合剂连接到NAMPT抑制剂上以实现上文所提及的目的的方法。
根据本发明，NAMPT抑制剂可在式(I)中的位置§1或§2处经由连接子Z'连接到结合剂上。
根据本发明的缀合物可以具有化学上不稳定的连接子、酶促地不稳定的连接子或稳定的连接子。
连接子-Z'-可以代表以下通式结构(i)至(iii)之一：
Figure 636390DEST_PATH_IMAGE005
其中
§1、§2代表与D的连接点；
§§代表与AB的连接点；
SG代表体内可裂解基团，L1和L1'彼此独立地代表体内不可裂解有机基团，和L2代表连接基团。
SG可以代表2-8寡肽基，优选二肽基或三肽基，或二硫化物、腙、糖苷、缩醛或缩醛胺。
L1、L1'可以彼此独立地代表具有1至40个碳原子的直链或支链烃链，其可以被一个或多个独立地选自下列的基团间断一次或多次：
-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-NHCO-、-CONH-、-CONHNH-、亚芳基、杂亚芳基、直链C1-C6-亚烷基、支链C1-C6-亚烷基、C3-C7-环亚烷基和具有至多4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的5-至10-元杂环基；
任选被一个或多个选自卤素、-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸的取代基取代。
L2可以代表：
Figure 271902DEST_PATH_IMAGE006
其中
# 1代表与结合剂的连接点，
# 2代表与基团L1、L1'或SG的连接点。
本发明还提供了制备根据本发明的缀合物的方法，以及用于所述制备的前体和中间体。
根据本发明的缀合物的制备经常包括以下步骤：
(i)制备任选带有保护基的连接子前体；
(ii)将连接子前体与低分子量NAMPT抑制剂(优选具有式(I)的NAMPT抑制剂)的衍生物(其任选带有保护基)缀合，得到任选带有保护基的NAMPT抑制剂/连接子缀合物；
(iii)将反应性基团与NAMPT抑制剂/连接子缀合物连接；
(iv)除去NAMPT抑制剂/连接子缀合物中存在的任何保护基，和
(v)将结合剂与NAMPT抑制剂/连接子缀合物缀合，得到根据本发明的结合剂/ NAMPT抑制剂缀合物。
反应基团的连接也可在连接子前体的制备期间(例如在上述步骤(i)期间)而不是在任选保护的NAMPT抑制剂/连接子前体缀合物的构建之后进行。
取决于连接子，琥珀酰亚胺连接的ADC可以在缀合后根据方案A1或方案A2转化为开链琥珀酰胺，其可以具有有利的稳定性特征。
如上文所说明的，连接子前体与低分子量NAMPT抑制剂的缀合可发生在式(I)中的位置§1或§2处。在缀合前的合成步骤中，存在的任何官能团也可以以受保护的形式存在。在缀合步骤之前，通过肽化学的已知方法除去这些保护基。缀合可以通过各种途径化学地发生。特别地，任选地可能修饰低分子量NAMPT抑制剂以与连接子缀合，例如通过引入保护基或离去基团以促进取代。
在连接子Z'中，基团L2的#1位优选与结合剂AB上的氨基或巯基反应形成共价键，优选与AB的蛋白中的半胱氨酸或赖氨酸残基反应。蛋白中的半胱氨酸残基可以当然地天然存在于蛋白中，可以通过生物化学方法引入，或优选地可以通过预先还原结合剂的二硫化物而产生。
发明详述
定义
除非另有说明，如本文所述任选取代的组分可在任何可能的位置彼此独立地被取代一次或多次。当任何变量在任何组分中或不同组分中出现一次以上时，每个定义是独立的。例如，对于其中R1、R5、R6、R7、R8和/或R9出现一次以上的任何式(I)组分，R1、R6、R7、R8和R9的每个定义是独立的。
如果一个组分由多于一个部分组成，则可能的取代基的位置可以在这些部分的任何合适位置。在组分的开始或结束处的连字符标记了与分子其余部分的连接点。如果环被取代，则一个或多个取代基可以在环的任何合适位置，如果合适的话，也可以在环氮原子上。
术语“包含”当用于说明书中时包括“由…组成”。
如果在说明书中提到“如上文所述（as mentioned above）”、“上文所述（mentioned above）”或“在前（supra）”，则其指的是在说明书中的任何在前页中进行的任何公开。
在本发明的意义内，“合适的”意指通过技术人员的知识范围内的方法化学上可能进行。
在说明书通篇例如“本发明的化合物”、“本发明化合物”、“本发明的前述化合物”、“本文所述的化合物”、“在前文定义的化合物”、“本文定义的化合物”中使用的术语“化合物”是指用于制备本发明的ADC缀合物以及本发明的ADC缀合物的代谢物的NAMPT抑制剂(例如式(I)的NAMPT抑制剂(D))和中间体(例如通式(III)的NAMPT抑制剂-连接子-中间体)。
本文中提及的术语优选具有以下含义：
术语“卤素原子”、“卤代-（halo-） ”或“卤化-（Hal-） ”应理解为意指氟、氯、溴或碘原子。
术语“C1-C6-烷基”应理解为意指具有1、2、3、4、5或6个碳原子的直链或支链饱和一价烃基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基，或其异构体。特别地，所述基团具有1、2、3或4个碳原子(“C1-C4-烷基”)，例如甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基，更特别地具有1、2或3个碳原子(“C1-C3-烷基”)，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基。
术语“C1-C4-卤代烷基”应理解为意指直链或支链、饱和、一价烃基，其中术语“C1-C4-烷基”如前文定义，且其中一个或多个氢原子被相同或不同的卤素原子替代，即一个卤素原子独立于另一个卤素原子。特别地，所述卤素原子是F。所述C1-C4-卤代烷基是例如-CF3、-CHF2、-CH2F、-CF2CF3、-CH2CH2F、-CH2CHF2、-CH2CF3、-CH2CH2CF3或-CH(CH2F)2。特别地，所述基团具有1、2或3个碳原子。
术语“C1-C4-烷氧基”应理解为意指式-O-(C1-C4-烷基)的直链或支链饱和一价烃基，其中术语“C1-C4-烷基”如前文定义，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基或叔丁基，或其异构体。特别地，所述基团具有1、2或3个碳原子。
术语“C1-C4-卤代烷氧基”应理解为意指如前文定义的直链或支链饱和一价C1-C4-烷氧基，其中一个或多个氢原子被相同或不同的卤素原子替代。特别地，所述卤素原子是F。所述C1-C4-卤代烷氧基是例如-OCF3、-OCHF2、-OCH2F、-OCF2CF3或-OCH2CF3。特别地，所述基团具有1、2或3个碳原子。
术语“C3-C6-环烷基”应理解为意指饱和的、一价的、单环烃环，其含有3、4、5或6个碳原子(“C3-C6-环烷基”)。所述C3-C6-环烷基是例如单环烃环，例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基环。特别地，所述基团具有3个碳原子(“C3-环烷基”)，即环丙基。
术语“5-至7-元杂环烷基”应理解为意指饱和或部分不饱和的一价单环或双环烃环，其含有3、4、5或6个碳原子，和一个或两个含杂原子基团，所述基团选自O、N、NR8、S、S(=O)2、S(=NR8)(=NR9)和S(=O)(=NR8)，优选O、N、NR8、S、S(=O)、S(=O)2，更优选O、N、NR8，其中R8和R9如本文所定义，所述杂环烷基经由杂环烷基环的碳原子或氮原子（如果存在的话）与分子的其余部分连接。
特别地，但不限于此，所述杂环烷基可以是5-元环，如但不限于四氢呋喃基、吡咯烷基或吡咯啉基；或6-元环，如但不限于四氢吡喃基、哌啶基、吗啉基或哌嗪基；或7-元环，如但不限于例如氮杂环庚烷基环。任选地，所述杂环烷基可以是苯并稠合的。
如前文所述，所述5-至7-元杂环烷基可以是部分不饱和的，即它可以含有一个或多个双键，如但不限于例如2,5-二氢-1H-吡咯基，或它可以是苯并稠合的，如但不限于例如二氢异喹啉基环。
术语“含杂原子基团”应理解为意指杂原子，如O和S；或含杂原子的基团，如NR8、S(=O)、S(=O)2、S(=NR8)(=NR9)和S(=O)(=NR8)。
如本文通篇所用，例如在“C1-C6-烷基”的定义的上下文中，术语“C1-C6”应理解为意指具有1至6个，即1、2、3、4、5或6个碳原子的有限碳原子数的烷基。还应理解，所述术语“C1-C6”应解释为其中包括的任何子范围，例如C1-C6、C2-C5、C3-C4、C1-C2、C1-C3、C1-C4、C1-C5；特别是C1-C2、C1-C3、C1-C4、C1-C5、C1-C6；更特别是C1-C4。
此外，如本文所用，如本文通篇所用，例如在“C3-C6-环烷基”的定义的上下文中，术语“C3-C6”应理解为意指具有3至6个，即3、4、5或6个碳原子的有限碳原子数的环烷基。还应理解，所述术语“C3-C6”应解释为其中包括的任何子范围，例如C3-C6、C4-C5、C3-C5、C3-C4、C4-C6、C5-C6；特别是C3-C6。
术语“取代的”意指指定原子上的一个或多个氢被选自指定基团的基团取代，条件是不超过指定原子在现有情况下的正常化合价，并且取代产生稳定的化合物。取代基和/或变量的组合是允许的，只要这样的组合产生稳定的化合物。
术语“任选取代的”意指用指定的基团（group）、基团（radical）或部分（moiety）的任选取代。
环系取代基意指连接到芳族或非芳族环系上的取代基，例如，取代环系上的可用氢。
如本文所用，例如在本发明通式化合物的取代基的定义中，术语“一个或多个”应理解为意指“一个、两个、三个、四个或五个，特别是一个、两个、三个或四个，更特别是一个、两个或三个，甚至更特别是一个或两个”。
本发明还包括本发明化合物的所有合适的同位素变体。本发明化合物的同位素变体定义为其中至少一个原子被具有相同原子序数但原子质量不同于通常或主要在自然界中发现的原子质量的原子替代的化合物。可掺入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘的同位素，如分别为2H (氘)、3H (氚)、11C、13C、14C、 15N、17O、18O、32P、 33P、 33S、34S、35S、 36S、18F、 36Cl、 82Br、123I、 124I、 125I、129I和131I。本发明化合物的某些同位素变体，例如其中掺入了一种或多种放射性同位素如3H或14C的那些，可用于药物和/或底物组织分布研究。氚化的和碳-14，即14C同位素，由于其易于制备和检测而特别优选。此外，用同位素如氘的取代可提供某些治疗益处，这是由于更大的代谢稳定性，例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求，因此在一些情况下是优选的。本发明化合物的同位素变体一般可通过本领域技术人员已知的常规方法制备，例如通过说明性方法或通过下文实施例中描述的制备，使用合适试剂的适当同位素变体。
当本文使用词语缀合物、化合物、盐、多晶型物、水合物、溶剂化物等的复数形式时，这被认为也意指单一缀合物、化合物、盐、多晶型物、异构体、水合物、溶剂化物等。
“稳定的化合物”意指足够稳固以经受从反应混合物分离至有用纯度并配制成有效治疗剂的化合物。
本发明的化合物任选地含有一个或多个不对称中心，这取决于所需的各种取代基的位置和性质。不对称碳原子以(R)或(S)构型存在，在单一不对称中心的情况下产生外消旋混合物，和在多个不对称中心的情况下产生非对映体混合物。在某些情况下，由于围绕给定键的受限的旋转，也可能存在不对称性，例如，指定化合物的邻接两个取代的芳环的中心键。
本发明的化合物任选地含有不对称的硫原子，如具有以下结构的不对称亚砜：
Figure 538935DEST_PATH_IMAGE007
，例如，
其中，*指示分子的其余部分可以结合到其上的原子。
环上的取代基也可以顺式或反式存在。所有这样的构型(包括对映异构体和非对映异构体)都意图包括在本发明的范围内。
优选的化合物是产生更理想的生物活性的那些。本发明化合物的分离的、纯的或部分纯化的异构体和立体异构体或外消旋或非对映异构体混合物也包括在本发明的范围内。这样的物质的纯化和分离可以通过本文提供的技术或通过本领域已知的(其它)标准技术来完成。
光学异构体可以通过根据常规方法拆分外消旋混合物来获得，例如通过使用光学活性酸或碱形成非对映异构体盐或形成共价非对映异构体。合适的酸的实例是酒石酸、二乙酰酒石酸、二甲苯酰酒石酸和樟脑磺酸。非对映异构体的混合物可以根据它们的物理和/或化学差异通过本领域已知的方法，例如通过色谱或分级结晶分离成它们的单独的非对映异构体。然后从分离的非对映异构体盐中释放光学活性的碱或酸。用于分离光学异构体的不同方法包括使用手性色谱(例如手性HPLC柱)，使用或不使用常规衍生化，最优化选择以使对映异构体的分离最大化。合适的手性HPLC柱由Daicel制造，例如尤其是Chiracel OD和Chiracel OJ等，所有这些都是常规可选择的。有或没有衍生化的酶分离也是有用的。本发明的光学活性化合物同样可以利用光学活性原料通过手性合成获得。
为了限制彼此不同类型的异构体，参考IUPAC规则E部分(Pure Appl Chem45,11-30,1976)。
本发明包括本发明化合物的所有可能的立体异构体，如单一立体异构体、或所述立体异构体的任何混合物，例如R-或S-异构体，或E-或Z-异构体，以任何比例。本发明化合物的单一立体异构体，例如单一对映异构体或单一非对映异构体的分离通过本领域方法的任何合适状态，如色谱，尤其是手性色谱来实现。
此外，本发明的化合物可以互变异构体的形式存在。
本发明包括本发明化合物的所有可能的互变异构体，如单一的互变异构体，或是所述互变异构体的任何混合物，以任何比例。
此外，本发明的化合物可以以N-氧化物的形式存在，其定义为本发明化合物的至少一个氮被氧化。本发明包括所有这样的可能的N-氧化物。
因此，本发明包括NAMPT抑制剂或其前体的所有可能的盐、多晶型物、代谢物、水合物、溶剂化物、前药(例如酯)和非对映异构体形式，为其单盐、多晶型物、代谢物、水合物、溶剂化物、前药(例如酯)或非对映异构体形式，或为多于一种盐、多晶型物、代谢物、水合物、溶剂化物、前药(例如酯)或以任何比例的非对映异构体形式的混合物。
本发明的化合物可以作为水合物或作为溶剂化物存在，其中本发明的化合物含有极性溶剂，特别是例如水、甲醇或乙醇作为化合物晶格的结构要素。极性溶剂，特别是水的量可以以化学计量或非化学计量比率存在。在化学计量溶剂化物的情况下，例如水合物，半-（hemi-）、(半-)(semi-)、单-、倍半-、二-、三-、四-、五-等溶剂化物或水合物分别是可能的。本发明包括所有这样的水合物或溶剂化物。
此外，本发明的化合物可以以游离形式存在，例如作为游离碱，或作为游离酸，或作为两性离子，或可以盐的形式存在。所述盐可以是任何盐，或有机或无机加成盐，特别是药学中常用的任何药学可接受的有机或无机加成盐。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的相对无毒的无机或有机酸加成盐，例如，参见S. M. Berge, 等人， “Pharmaceutical Salts,” J. Pharm. Sci. 1977, 66,1-19。
本发明化合物的合适的药学上可接受的盐可以是例如在链或在环中带有足够碱性的氮原子的本发明化合物的酸加成盐，如与无机酸或与有机酸形成的酸加成盐，所述无机酸诸如例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、bisulfuric、磷酸或硝酸，所述有机酸诸如例如甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)-苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、二葡糖酸（digluconic）、3-羟基-2-萘甲酸、烟酸、双羟萘酸、果胶酯酸、过硫酸、3-苯基丙酸、苦味酸、新戊酸、2-羟基乙磺酸盐、衣康酸、氨基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、己二酸、藻酸、马来酸、富马酸、D-葡糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚糖酸（glucoheptanoic）、甘油磷酸、天冬氨酸、磺基水杨酸、半硫酸或硫氰酸。
此外，另一种具有足够酸性的本发明化合物的合适的药学上可接受的盐是碱金属盐（例如钠盐或钾盐）、碱土金属盐（例如钙盐或镁盐）、铵盐或与提供生理学上可接受的阳离子的有机碱形成的盐，例如与N-甲基-葡糖胺、二甲基-葡糖胺、乙基-葡糖胺、赖氨酸、二环己胺、1,6-己二胺、乙醇胺、葡糖胺、肌氨酸、丝氨醇、三羟甲基氨基甲烷、氨基丙二醇、sovak-碱（sovak-base）、1-氨基-2,3,4-丁三醇形成的盐。另外，碱性含氮基团可以用试剂季铵化，所述试剂例如低级烷基卤化物，例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸酯，如二甲基、二乙基和二丁基硫酸酯，和二戊基硫酸酯；长链卤化物如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物，芳烷基卤化物如苄基和苯乙基溴化物等。
本领域技术人员还将认识到，所要求保护的化合物的酸加成盐可以通过化合物与合适的无机酸或有机酸经由许多已知方法中的任一种来制备。或者，本发明酸性化合物的碱金属和碱土金属盐通过使本发明化合物与适当的碱经由各种已知方法反应来制备。
本发明包括本发明化合物的所有可能的盐，如单一盐，或所述盐的任何混合物，以任何比例。
在本文中，特别是在实验部分，对于中间体和本发明的实施例的合成，当化合物被提及为与相应的碱或酸的盐形式时，通过相应的制备和/或纯化方法获得的所述盐形式的精确化学计量组成在大多数情况下是未知的。
除非另有说明，否则化学名称或结构式的后缀诸如例如“盐酸盐”、“三氟乙酸盐”、“钠盐”或“xHCl”、“xCF3COOH”、“xNa+”应理解为不是化学计量的说明，而仅是盐形式。
所述盐包括水不溶性盐，且特别是水溶性盐。
这类似地适用于其中通过所描述的制备和/或纯化方法获得作为溶剂化物，如具有(如果定义)未知化学计量组成的水合物的合成中间体或实施例化合物或其盐的情况。
此外，本发明涵盖了本文所描述的缀合物的衍生物及其盐，其在生物系统中转化为本文所描述的缀合物或其盐(生物前体或前药)。所述生物系统是例如哺乳动物生物体，特别是人类主体。生物前体，例如，通过代谢过程被转化成如本文所描述的缀合物或其盐。
此外，本发明包括本发明的缀合物的所有可能的结晶形式或多晶型物，其为单一多晶型物或多于一种多晶型物以任何比例的混合物。
在本发明的缀合物的性质的上下文中，术语“药代动力学特性”意指一个单一参数或其组合，包括渗透性、生物利用度、暴露和药效学参数（如药理作用的持续时间或大小），如在合适的实验中测量的。具有改善的药代动力学特性的缀合物可以例如以较低剂量使用以实现相同的作用，可以实现更长的作用持续时间，或可以实现两种作用的组合。
本发明中的术语“组合产品（combination）”如本领域技术人员已知的使用，并且可以作为固定组合产品、非固定组合产品或成套试剂盒（kit-of-parts）存在。
本发明中的“固定组合产品”如本领域技术人员已知的使用，并定义为其中所述第一活性成分和所述第二活性成分一起存在于一个单位剂量中或存在于单一实体中的组合产品。“固定组合产品”的一个实例是药物组合物，其中所述第一活性成分和所述第二活性成分以混合物形式存在用于同时给药，如在制剂中。“固定组合产品”的另一个实例是药物组合产品，其中所述第一活性成分和所述第二活性成分存在于一个单位中而不是以混合物形式存在。
本发明中的非固定组合产品或“成套试剂盒”如本领域技术人员已知的那样使用，并定义为其中所述第一活性成分和所述第二活性成分以多于一个单位存在的组合产品。非固定组合产品或成套试剂盒的一个实例是其中所述第一活性成分和所述第二活性成分分开存在的组合产品。非固定组合产品或成套试剂盒的组分可以单独、依次、同时、并行或按时间顺序交错施用。本发明的式(I)化合物与如下所定义的抗癌剂的任何这样的组合产品都是本发明的实施方案。
术语“(化疗)抗癌剂”包括但不限于：
131I-chTNT、阿巴瑞克（abarelix）、阿比特龙（abiraterone）、阿克拉霉素（aclarubicin）、阿达木单抗（adalimumab）、曲妥珠单抗-美坦新偶联物（ado-trastuzumabemtansine）、阿法替尼（afatinib）、阿普西柏（aflibercept）、阿地白介素（aldesleukin）、阿来替尼（alectinib）、阿仑单抗（alemtuzumab）、阿仑膦酸（alendronic acid）、阿利维A酸（alitretinoin）、六甲蜜胺（altretamine）、氨磷汀（amifostine）、氨鲁米特（aminoglutethimide）、己基氨基乙酰丙酸（hexyl aminolevulinate）、氨柔比星（amrubicin）、安吖啶（amsacrine）、阿那曲唑（anastrozole）、安塞司亭（ancestim）、anethole dithiolethione、雷安妥人单抗（anetumab ravtansine）、血管紧张素II（angiotensin II）、抗凝血素III（antithrombin III）、阿瑞匹坦（aprepitant）、阿西莫单抗（arcitumomab）、阿格拉宾（arglabin）、三氧化二砷（arsenic trioxide）、天冬酰胺酶（asparaginase）、阿特珠单抗（atezolizumab）、阿昔替尼（axitinib）、阿扎胞苷（azacitidine）、巴利昔单抗（basiliximab）、倍罗替康（belotecan）、苯达莫司汀（bendamustine）、贝索单抗（besilesomab）、贝利司他（belinostat）、贝伐单抗（bevacizumab）、贝沙罗汀（bexarotene）、比卡鲁胺（bicalutamide）、比生群（bisantrene）、博莱霉素（bleomycin）、博纳吐单抗（blinatumomab）、硼替佐米（bortezomib）、布舍瑞林（buserelin）、博舒替尼（bosutinib）、本妥昔单抗（brentuximab vedotin）、白消安（busulfan）、卡巴他赛（cabazitaxel）、卡博替尼（cabozantinib）、降钙素（calcitonine）、亚叶酸钙（calcium folinate）、左亚叶酸钙（calcium levofolinate）、卡培他滨（capecitabine）、卡罗单抗（capromab）、卡马西平（carbamazepine）卡铂（carboplatin）,卡波醌（carboquone）、卡非佐米（carfilzomib）、卡莫氟（carmofur）、卡莫司汀（carmustine）、卡妥索单抗（catumaxomab）、塞来昔布（celecoxib）、西莫白介素（celmoleukin）、色瑞替尼（ceritinib）、西妥昔单抗（cetuximab）、苯丁酸氮芥（chlorambucil）、氯地孕酮（chlormadinone）、氮芥（chlormethine）、西多福韦（cidofovir）、西那卡塞（cinacalcet）、顺铂（cisplatin）、克拉屈滨（cladribine）、氯膦酸（clodronic acid）、氯法拉滨（clofarabine）、考比替尼（cobimetinib）、库潘尼西（copanlisib、天冬酰胺酶（crisantaspase）、克唑替尼（crizotinib）、环磷酰胺（cyclophosphamide）、环丙孕酮（cyproterone）、阿糖胞苷（cytarabine）、达卡巴嗪（dacarbazine）、放线菌素（dactinomycin）、达雷木单抗（daratumumab）、达依泊汀α（darbepoetin alfa）、达拉非尼（dabrafenib）、达沙替尼（dasatinib）、柔红霉素（daunorubicin）、地西他滨（decitabine）、地加瑞克（degarelix）、地尼白介素2（denileukin diftitox）、地诺单抗（denosumab）、地普奥肽（depreotide）、地洛瑞林（deslorelin）、二去水卫矛醇（dianhydrogalactitol）、右雷佐生（dexrazoxane）、二溴螺氯铵（dibrospidium chloride）、二去水卫矛醇（dianhydrogalactitol）、双氯芬酸（diclofenac）、地努图希单抗（dinutuximab）、多西他赛（docetaxel）、多拉司琼（dolasetron）、多西氟尿啶（doxifluridine）、阿霉素（doxorubicin）、阿霉素+雌酚酮（doxorubicin + estrone）、屈大麻酚（dronabinol）、依库珠单抗（eculizumab）、依决洛单抗（edrecolomab）、依利醋铵（elliptinium acetate）、埃罗妥珠单抗（elotuzumab）、艾曲波帕（eltrombopag）、内皮抑素（endostatin）、依诺他宾（enocitabine）、恩杂鲁胺（enzalutamide）、表阿霉素（epirubicin）、环硫雄醇（epitiostanol）、依泊汀α（epoetin alfa）、依泊汀β（epoetin beta）、依泊汀ζ（epoetinzeta）、依铂（eptaplatin）、艾日布林（eribulin）、埃罗替尼（erlotinib）、埃索美拉唑（esomeprazole）、雌二醇（estradiol）、雌莫司汀（estramustine）、炔雌醇（ethinylestradiol）、依托泊苷（etoposide）、依维莫司（everolimus）,依西美坦（exemestane）、法倔唑（fadrozole）、芬太尼（fentanyl）、非格司亭（filgrastim）、氟氧睾酮（fluoxymesterone）、氟尿苷（floxuridine）、氟达拉滨（fludarabine）、氟尿嘧啶（fluorouracil）、氟他胺（flutamide）、亚叶酸（folinic acid）、福美司坦（formestane）、福沙匹坦（fosaprepitant）、福莫司汀（fotemustine）、氟维司琼（fulvestrant）、钆布醇（gadobutrol）、钆特醇（gadoteridol）、钆特酸葡胺（gadoteric acid meglumine）、钆弗塞胺（ gadoversetamide）、钆塞酸（gadoxetic acid）、硝酸镓（gallium nitrate）、加尼瑞克（ganirelix）、吉非替尼（gefitinib）、吉西他滨（gemcitabine）、吉妥珠单抗（gemtuzumab）、谷卡匹酶（Glucarpidase）、谷胱甘肽(氧化型)二钠盐（glutoxim）、GM-CSF、戈舍瑞林（goserelin）、格拉司琼（granisetron）、粒细胞集落刺激因子（granulocyte colonystimulating factor）、组胺二盐酸盐（histamine dihydrochloride）、组氨瑞林（histrelin）、羟基脲（hydroxycarbamide）、I-125粒子（I-125 seeds）、兰索拉唑（lansoprazole）、伊班膦酸（ibandronic acid）、替伊莫单抗（ibritumomab tiuxetan）、依鲁替尼（ibrutinib）、伊达比星（idarubicin）、异环磷酰胺（ifosfamide）、伊马替尼（imatinib）、咪喹莫特（imiquimod）、英丙舒凡（improsulfan）、吲地司琼（indisetron）、伊班膦酸（incadronic acid）、巨大戟醇甲基丁烯酸酯（ingenol mebutate）、干扰素α（interferon alfa）、干扰素β（interferon beta）、干扰素γ（interferon gamma）、碘比醇（iobitridol）、碘苄胍 (123I)（iobenguane (123I)）、碘美普尔（iomeprol）、易普利姆玛（ipilimumab）、伊立替康（irinotecan）、伊曲康唑（Itraconazole）、伊沙匹隆（ixabepilone）、伊沙佐米（ixazomib）、兰瑞肽（lanreotide）、兰索拉唑（lansoprazole）、拉帕替尼（lapatinib）、Iasocholine、来那度胺（lenalidomide）、乐伐替尼（lenvatinib）、来格司亭（lenograstim）、香菇多糖（lentinan）、来曲唑（letrozole）、亮丙瑞林（leuprorelin）、左旋咪唑（levamisole）、左炔诺孕酮（levonorgestrel）、左旋甲状腺素钠（levothyroxine sodium）、利修来得（lisuride）、洛铂（lobaplatin）、洛莫司汀（lomustine）、氯尼达明（lonidamine）、马索罗酚（masoprocol）、甲羟孕酮（medroxyprogesterone）、甲地孕酮（megestrol）、美拉胂醇（melarsoprol）、马法兰（melphalan）、美雄烷（mepitiostane）、巯基嘌呤（mercaptopurine）、美司钠（mesna）、美沙酮（methadone）、氨甲蝶呤（methotrexate）、甲氧沙林（methoxsalen）、氨基乙酰丙酸甲酯（methylaminolevulinate）、甲泼尼松（methylprednisolone）、甲泼尼龙（methyltestosterone）、甲酪氨酸（metirosine）、米伐木肽（mifamurtide）、米替福新（miltefosine）、米铂（miriplatin）、二溴甘露醇（mitobronitol）、丙脒腙（mitoguazone）、二溴卫矛醇（mitolactol）、丝裂霉素（mitomycin）、米托坦（mitotane）、米托蒽醌（mitoxantrone）、mogamulizumab、莫拉司亭（molgramostim）、莫哌达醇（mopidamol）、盐酸吗啡（morphine hydrochloride）、硫酸吗啡（morphine sulfate）、大麻隆（nabilone）、nabiximols、那法瑞林（nafarelin）、纳络酮+喷他佐辛（naloxone + pentazocine）、盐酸纳曲酮（naltrexone）、那托司亭（nartograstim）、耐昔妥珠单抗（necitumumab）、奈达铂（nedaplatin）、奈拉滨（nelarabine）、奈立膦酸（neridronic acid）、奈妥吡坦/帕洛诺司琼（netupitant/palonosetron）、纳武利尤单抗（nivolumab）、喷曲肽（pentetreotide）、尼罗替尼（nilotinib）、尼鲁米特（nilutamide）、尼莫拉唑（nimorazole）、尼妥珠单抗（nimotuzumab）、尼莫司汀（nimustine）、尼达尼布（nintedanib）、尼曲吖啶（nitracrine）、纳武利尤单抗（nivolumab）、奥滨尤妥珠单抗（obinutuzumab）、奥曲肽（octreotide）、奥法木单抗（ofatumumab）、奥拉帕尼（olaparib）、奥拉单抗（olaratumab）、高三尖杉酯碱（omacetaxine mepesuccinate）、奧美拉唑（omeprazole）、昂丹司琼（ondansetron）、奥普瑞白介素（oprelvekin）、超氧化物歧化酶（orgotein）、奥瑞莫德（orilotimod）、奥希替尼（osimertinib）、奥沙利铂（oxaliplatin）、羟考酮（oxycodone）、羟甲烯龙（oxymetholone）、ozogamicine、p53 基因治疗（p53 gene therapy）、紫杉醇（paclitaxel）、帕博西尼（palbociclib）、帕利夫明（palifermin）、钯-103粒子（palladium-103 seed）、帕洛诺司琼（palonosetron）、帕米膦酸（pamidronic acid）、帕尼单抗（panitumumab）、帕比司他（panobinostat）、泮托拉唑（pantoprazole）、帕唑帕尼（pazopanib）、培门冬酶（pegaspargase）、PEG-依泊汀β （甲氧基PEG-依泊汀β）（（PEG-epoetin beta (methoxyPEG-epoetin beta)）、帕博利珠单抗（pembrolizumab）、培非格司亭（pegfilgrastim）、聚乙二醇干扰素α-2b（peginterferon alfa-2b）、帕博利珠单抗（pembrolizumab）、培美曲塞（pemetrexed）、喷他佐辛（pentazocine）、喷司他丁（pentostatin）、培洛霉素（peplomycin）、全氟丁烷（Perflubutane）、培磷酰胺（perfosfamide）、帕妥珠单抗（Pertuzumab）、picibanil、匹鲁卡品（pilocarpine）、吡柔比星（pirarubicin）、匹杉琼（pixantrone）、普乐沙福（plerixafor）、普卡霉素（plicamycin）、壳聚糖（poliglusam）、聚雌二醇磷酸酯（polyestradiol phosphate）、聚乙烯吡咯烷酮+透明质酸钠（polyvinylpyrrolidone + sodium hyaluronate）、云芝多糖-K（polysaccharide-K）、泊马度胺（pomalidomide）、普纳替尼（ponatinib）、卟吩姆钠（porfimer sodium）、pralatrexate、普拉曲沙（prednimustine）、泼尼莫司汀（prednisone）、丙卡巴肼（procarbazine）、丙考达唑（procodazole）、普萘洛尔（propranolol）、喹高利特（quinagolide）、雷贝拉唑（rabeprazole）、racotumomab、氯化镭-223（radium-223chloride）、拉多替尼（radotinib）、雷洛昔芬（raloxifene）、雷替曲塞（raltitrexed）、雷莫司琼（ramosetron）、雷莫芦单抗（ramucirumab）、雷莫司汀（ranimustine）、拉布立酶（rasburicase）、雷佐生（razoxane）、瑞法替尼（refametinib，BAY 86-9766，RDEA 119）、瑞戈非尼（regorafenib）、利塞膦酸（risedronic acid）、羟乙磷酸铼-186（rhenium-186etidronate）、利妥昔单抗（rituximab）、罗拉呲坦（rolapitant）、罗米地辛（romidepsin）、罗米司亭（romiplostim）、罗莫肽（romurtide）、芦卡帕尼（rucaparib）、来昔屈南钐(153Sm)（samarium (153Sm) lexidronam）、沙格司亭（sargramostim）、沙妥莫单抗（satumomab）、促胰液素（secretin）、司妥昔单抗（siltuximab）、西普鲁塞-T（sipuleucel-T）、西佐喃（sizofiran）、索布佐生（sobuzoxane）、甘氨双唑钠（sodium glycididazole）、索尼得吉（sonidegib）、索拉非尼（sorafenib）、司坦唑醇（stanozolol）、链脲霉素（streptozocin）、舒尼替尼（sunitinib）、他拉泊芬（talaporfin）、T-VEC（talimogene laherparepvec）、他米巴罗汀（tamibarotene）、他莫昔芬（tamoxifen）、他喷他多（tapentadol）、他索尔明（tasonermin）、替西白介素（teceleukin）、莫诺非莫单抗锝(99mTc)（technetium (99mTc)nofetumomab merpentan）、99mTc-HYNIC-[Tyr3]-奥曲肽（99mTc-HYNIC-[Tyr3]-octreotide）、替加氟（tegafur）、替加氟+吉莫斯特+氧嗪酸（tegafur + gimeracil +oteracil）、替莫卟吩（temoporfin）、替莫唑胺（temozolomide）、西罗莫司脂化物（temsirolimus）、替尼泊苷（teniposide）、睾酮素（testosterone）、替曲膦（tetrofosmin）、沙利度胺（thalidomide）、噻替哌（thiotepa）、胸腺法新（thymalfasin）、促甲状腺激素α（thyrotropin alfa）、硫鸟嘌呤（tioguanine）、托珠单抗（tocilizumab）、拓扑替康（topotecan）、托瑞米芬（toremifene）、托西莫单抗（tositumomab）、曲贝替定（trabectedin）、曲美替尼（trametinib）、曲马多（tramadol）,曲妥珠单抗（trastuzumab）、恩美曲妥珠单抗（trastuzumab emtansine）、曲奥舒凡（treosulfan）、维A酸（tretinoin）、曲氟尿苷+替匹嘧啶（trifluridine + tipiracil）、曲洛司坦（trilostane）、曲普瑞林（triptorelin）、曲美替尼（trametinib）、曲磷胺（trofosfamide）、血小板生成素（thrombopoietin）、色氨酸（tryptophan）、乌苯美司（ubenimex）、瓦拉替尼（valatinib、戊柔比星（valrubicin）、凡德他尼（vandetanib）、伐普肽（vapreotide）、威罗菲尼（vemurafenib）、长春花碱（vinblastine）、长春新碱（vincristine）、长春地辛（vindesine）、长春氟宁（vinflunine）、长春瑞滨（vinorelbine）、维莫德吉（vismodegib）、伏立诺他（vorinostat）、伏氯唑（vorozole）、钇-90玻璃微球（yttrium-90 glassmicrospheres）、净司他丁（zinostatin）、净司他丁斯酯（zinostatin stimalamer）、唑来膦酸（zoledronic acid）、佐柔比星（zorubicin）。
本发明提供了结合剂或其衍生物与一个或多个活性化合物分子的缀合物，所述活性化合物分子是经由连接子Z'与结合剂连接的NAMPT抑制剂。
根据第一方面，本发明涉及结合剂或其衍生物与一个或多个活性化合物分子的缀合物，其具有下式：
Figure 737835DEST_PATH_IMAGE008
其中AB代表结合剂，Z'代表连接子，n代表1和50之间的数，优选1.2至20，特别优选2至8，和
D代表式(I-D)的活性组分：
Figure 406714DEST_PATH_IMAGE009
其中：
§1或§2代表与连接子Z'的连接点，条件是：
当连接子Z'在§1处连接时，则§2代表R5a，和
当连接子Z'在§2处连接时，则连接子Z'与环Het的碳或氮原子连接，并且§1代表R5b；
Het代表任选被一个或多个独立地选自R5的基团取代的杂芳基；
R1彼此独立地代表卤素、羟基、C1-C3-烷基、C1-C3-卤代烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-N(H)R6、-N(R6)R7或-NH2；
t是0、1或2；
R2代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基，
其中苯基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-N(H)R6和-N(R6)R7；
R3代表H、C1-C3-烷基或C1-C3-卤代烷基；和
R4代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基；
或，
R2和R3与它们所连接的碳一起形成C3-C6-环烷基或含有一个含杂原子基团的5-至7-元杂环烷基，所述含杂原子基团选自O、NR8、S、S(=O)、S(=O)2、S(=NR8)(=NR9)和S(=O)(=NR8)；和
R4代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基；
或，
R2代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基，
其中苯基任选地被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-N(H)R6和-N(R6)R7；和
R3和R4一起形成键；
R5彼此独立地代表卤素、羟基、C1-C3-烷基、C1-C3-卤代烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-N(H)R6、-N(R6)R7或 -NH2；4-至7-元杂环烷基、-SR8、-S(=O)R8、-S(=O)2R8和-S(=O)(=NR8)R9；
R5a代表R5、氢或不存在；
R5b代表氢或选自以下的基团：
甲基、C2-C6-烷基、(1,3-二氧戊环-2-基)-(C1-C6-烷基)-、(1,3-二噁烷-2-基)-(C1-C6-烷基)-、氮杂环丁烷-3-基、(氮杂环丁烷-3-基)-(C1-C6-烷基)-、氧杂环丁烷-3-基、(氧杂环丁烷-3-基)-(C1-C6-烷基)-、C3-C6-环烷基、(C3-C6-环烷基)-(C1-C6-烷基)-、5-至7-元杂环烷基、(5-至7-元杂环烷基)-(C1-C6-烷基)、苯基、苯基-(C1-C6-烷基)-、5-至6-元杂芳基和(5-至6-元杂芳基)-(C1-C6-烷基)-，
其中5-至7-元杂环烷基和5-至6-元杂芳基分别经由5-至7-元杂环烷基环的碳原子或经由5-至6-元杂芳基环的碳原子与分子的其余部分连接；
其中C2-C6-烷基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、羟基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、氧代(=O)、-NH2、-N(H)R6、-N(R6)R7、-C(=O)OR8、-SR8、-S(=O)R8、-S(=O)2R8和-S(=O)(=NR8)R9；
其中氮杂环丁烷-3-基和氧杂环丁烷-3-基任选被一个或两个独立地选自以下的取代基取代：
C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C1-C4-烷氧基、C1-C4-卤代烷氧基、(C1-C3-烷氧基)-(C1-C4-烷基)-、C3-C6-环烷基和C3-C6-环烷基氧基；
其中C3-C6-环烷基和5-至7-元杂环烷基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
羟基、卤素、氰基、C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C1-C4-烷氧基、C1-C4-卤代烷氧基、(C1-C3-烷氧基)-(C1-C4-烷基)-、C3-C6-环烷基、C3-C6-环烷基氧基、-N(R5)R6、-C(=O)OH、氧代(=O)和-N(H)C(=O)-(C1-C3-烷基)；
其中苯基和5-至6-元杂芳基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基-、C1-C3-卤代烷氧基-、-N(H)R6、-N(R6)R7、-C(=O)OH和-C(=O)O(C1-C6-烷基)；
q是0、1、2或3,
m是0、1、2或3,
条件是q+m是2、3或4；
Figure 400078DEST_PATH_IMAGE003
代表选自以下的基团：
Figure 216724DEST_PATH_IMAGE004
其中*和＃代表所述基团与式(I)化合物的其余部分的连接点，
所述基团任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、R6(H)N-和-N(R6)R7；
R6、R7彼此独立地代表C1-C3-烷基、C3-C6-环烷基、苯基、-C(=O)-O-(C1-C4-烷基)或-C(=O)-(C1-C3-烷基)，
其中所述苯基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-NH2、-N(H)R6和-N(R6)R7；
R8、R9彼此独立地代表氢、C1-C3-烷基、C3-C6-环烷基、苯基或C1-C3-卤代烷基，
其中所述苯基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-NH2、-N(H)R6和-N(R6)R7；
或所述化合物的N-氧化物、盐、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐。
结合剂优选是结合剂肽或蛋白，诸如例如抗体。此外，如果n大于1，则连接子优选与结合剂肽或蛋白或其衍生物的相同化学性质的不同氨基酸连接。特别优选与结合剂的不同半胱氨酸或赖氨酸残基结合，甚至更优选与结合剂的不同半胱氨酸残基结合。
下面描述根据本发明可使用的结合剂、根据本发明可使用的NAMPT抑制剂和根据本发明可使用的连接子，它们可以组合使用而没有任何限制。特别地，在每种情况下被表示为优选或特别优选的结合剂可以与在每种情况下被表示为优选或特别优选的NAMPT抑制剂组合使用，任选与在每种情况下被表示为优选或特别优选的连接子组合使用。
NAMPT抑制剂
尽管已知多种NAMPT抑制剂的事实，但仍需要用于治疗疾病如过度增殖性病症的选择性NAMPT抑制剂，其提供一种或多种优点，如：
• 改善的活性和/或功效，允许例如剂量减少
• 改善的副作用特性，如更少的不期望的副作用、更低的副作用强度或降低的(细胞)毒性
• 改善的物理化学性质，如在水、体液和含水制剂中的溶解度，例如对于静脉内施用
• 改善的药代动力学性质，允许例如剂量减少或更容易的给药方案
• 改善的作用持续时间，例如通过改善的药代动力学和/或改善的靶停留时间
• 更容易制备药物物质，例如通过更短的合成途径或更容易纯化。
用于根据本发明的结合剂药物缀合物的NAMPT抑制剂优选在肿瘤细胞系中显示抗增殖活性，所述肿瘤细胞系诸如例如THP-1、U251 MG、MDA-MB-453和REC-1。
根据本发明，NAMPT抑制剂(D)通过式(I-D)描述：
Figure 953736DEST_PATH_IMAGE010
其中：
§1或§2代表与连接子Z'的连接点，条件是：
当连接子Z'在§1处连接时，则§2代表R5a，和
当连接子Z'在§2处连接时，则连接子Z'与环Het的碳或氮原子连接，并且§1代表R5b；
Het代表任选被一个或多个独立地选自R5的基团取代的杂芳基；
R1彼此独立地代表卤素、羟基、C1-C3-烷基、C1-C3-卤代烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-N(H)R6、-N(R6)R7或-NH2；
t是0、1或2；
R2代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基，
其中苯基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-N(H)R6和-N(R6)R7；
R3代表H、C1-C3-烷基或C1-C3-卤代烷基；和
R4代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基；
或，
R2和R3与它们所连接的碳一起形成C3-C6-环烷基或含有一个含杂原子基团的5-至7-元杂环烷基，所述含杂原子基团选自O、NR8、S、S(=O)、S(=O)2、S(=NR8)(=NR9)和S(=O)(=NR8)；和
R4代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基；
或，
R2代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基，
其中苯基任选地被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-N(H)R6和-N(R6)R7；且
R3和R4一起形成键；
R5彼此独立地代表卤素、羟基、C1-C3-烷基、C1-C3-卤代烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-N(H)R6、-N(R6)R7或 -NH2；4-至7-元杂环烷基、-SR8、-S(=O)R8、-S(=O)2R8和-S(=O)(=NR8)R9；
R5a代表R5、氢或不存在；
R5b代表氢或选自以下的基团：
甲基、C2-C6-烷基、(1,3-二氧戊环-2-基)-(C1-C6-烷基)-、(1,3-二噁烷-2-基)-(C1-C6-烷基)-、氮杂环丁烷-3-基、(氮杂环丁烷-3-基)-(C1-C6-烷基)-、氧杂环丁烷-3-基、(氧杂环丁烷-3-基)-(C1-C6-烷基)-、C3-C6-环烷基、(C3-C6-环烷基)-(C1-C6-烷基)-、5-至7-元杂环烷基、(5-至7-元杂环烷基)-(C1-C6-烷基)、苯基、苯基-(C1-C6-烷基)-、5-至6-元杂芳基和(5-至6-元杂芳基)-(C1-C6-烷基)-，
其中5-至7-元杂环烷基和5-至6-元杂芳基分别经由5-至7-元杂环烷基环的碳原子或经由5-至6-元杂芳基环的碳原子与分子的其余部分连接；
其中C2-C6-烷基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、羟基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、氧代(=O)、-NH2、-N(H)R6、-N(R6)R7、-C(=O)OR8、-SR8、-S(=O)R8、-S(=O)2R8和-S(=O)(=NR8)R9；
其中氮杂环丁烷-3-基和氧杂环丁烷-3-基任选被一个或两个独立地选自以下的取代基取代：
C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C1-C4-烷氧基、C1-C4-卤代烷氧基、(C1-C3-烷氧基)-(C1-C4-烷基)-、C3-C6-环烷基和C3-C6-环烷基氧基；
其中C3-C6-环烷基和5-至7-元杂环烷基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
羟基、卤素、氰基、C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C1-C4-烷氧基、C1-C4-卤代烷氧基、(C1-C3-烷氧基)-(C1-C4-烷基)-、C3-C6-环烷基、C3-C6-环烷基氧基、-N(R5)R6、-C(=O)OH、氧代(=O)和-N(H)C(=O)-(C1-C3-烷基)；
其中苯基和5-至6-元杂芳基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基-、C1-C3-卤代烷氧基-、-N(H)R6、-N(R6)R7、-C(=O)OH和-C(=O)O(C1-C6-烷基)；
q是0、1、2或3,
m是0、1、2或3,
条件是q+m是2、3或4；
Figure 477121DEST_PATH_IMAGE003
代表选自以下的基团：
Figure 906966DEST_PATH_IMAGE004
其中*和＃代表所述基团与式(I)化合物的其余部分的连接点，
所述基团任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、R6(H)N-和-N(R6)R7；
R6、R7彼此独立地代表C1-C3-烷基、C3-C6-环烷基、苯基、-C(=O)-O-(C1-C4-烷基)或-C(=O)-(C1-C3-烷基)，
其中所述苯基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-NH2、-N(H)R6和-N(R6)R7；
R8、R9彼此独立地代表氢、C1-C3-烷基、C3-C6-环烷基、苯基或C1-C3-卤代烷基，
其中所述苯基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-NH2、-N(H)R6和-N(R6)R7；
或所述化合物的N-氧化物、盐、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐。
在第二方面，本发明涉及如前文所述的缀合物，
其中：
§1或§2代表与连接子Z'的连接点，条件是：
当连接子Z'在§1处连接时，则§2代表R5a，和
当连接子Z'在§2处连接时，则连接子Z'与环Het的碳或氮原子连接，并且§1代表R5b；
Het代表任选被一个或多个独立地选自R5的基团取代的杂芳基；
t是0；
R2代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基，
R3代表H；和
R4代表H、C1-C4-烷基或C1- C2-卤代烷基；
或，
R2代表H；且
R3和R4一起形成键；
R5彼此独立地代表卤素、羟基、C1-C3-烷基、C1-C3-卤代烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-N(H)R6、-N(R6)R7或-NH2；4-至7-元杂环烷基、-SR8、-S(=O)R8、-S(=O)2R8和-S(=O)(=NR8)R9；
R5a代表R5、氢或不存在；
R5b代表氢或选自以下的基团：
甲基、C2-C6-烷基、(1,3-二氧戊环-2-基)-(C1-C6-烷基)-、(1,3-二噁烷-2-基)-(C1-C6-烷基)-、氮杂环丁烷-3-基、(氮杂环丁烷-3-基)-(C1-C6-烷基)-、氧杂环丁烷-3-基、(氧杂环丁烷-3-基)-(C1-C6-烷基)-、C3-C6-环烷基、(C3-C6-环烷基)-(C1-C6-烷基)-、5-至7-元杂环烷基、(5-至7-元杂环烷基)-(C1-C6-烷基)、苯基、苯基-(C1-C6-烷基)-、5-至6-元杂芳基和(5-至6-元杂芳基)-(C1-C6-烷基)-，
其中5-至7-元杂环烷基和5-至6-元杂芳基分别经由5-至7-元杂环烷基环的碳原子或经由5-至6-元杂芳基环的碳原子与分子的其余部分连接；
其中C2-C6-烷基任选被一个或多个独立选自以下的取代基取代：
卤素、羟基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、氧代(=O)、-C(=O)OH和-N(R6)R7；
其中C3-C6-环烷基和5-至7-元杂环烷基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
羟基、卤素、氰基、C1-烷基、C1-卤代烷基、C1-烷氧基、C1-卤代烷氧基和氧代(=O)；
其中苯基和5-至6-元杂芳基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基-、C1-C3-卤代烷氧基-、-C(=O)OH和-C(=O)O(C1-C6-烷基)；
q是1，
m是1，
Figure 148591DEST_PATH_IMAGE011
代表基团
Figure 423715DEST_PATH_IMAGE012
；
其中*和＃代表所述基团与式(I)化合物的其余部分的连接点，
R6、R7彼此独立地代表C1-C3-烷基、C3-C6-环烷基、苯基或-C(=O)-(C1-C3-烷基)；
R8代表氢、C1-C3-烷基、C3-C6-环烷基、苯基或C1-C3-卤代烷基；
其中所述苯基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-NH2、-N(H)R6和-N(R6)R7；
或所述化合物的N-氧化物、盐、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐。
在第三方面，本发明涉及如前文所述的缀合物，
其中：
§1或§2代表与连接子Z'的连接点，条件是：
当连接子Z'在§1处连接时，则§2代表R5a，和
当连接子Z'在§2处连接时，则连接子Z'与环Het的氮原子连接，且§1代表R5b；
Het代表任选被一个或多个独立地选自R5的基团取代的杂芳基；
t是0；
R2代表H，
R3代表H；和
R4代表H、C1-烷基或C1-卤代烷基；
或，
R2代表H；且
R3和R4一起形成键；
R5彼此独立地代表卤素、羟基、C1-烷基；5-至6-元杂环烷基、-SR8、-S(=O)R8和-S(=O)2R8；
R5a代表氢或不存在；
R5b代表氢或选自以下的基团：
甲基、C2-C3-烷基，
其中C2-C3-烷基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素；
q是1,
m是1,
Figure 880235DEST_PATH_IMAGE013
代表基团
Figure 215401DEST_PATH_IMAGE014
；
其中*和＃代表所述基团与式(I)化合物的其余部分的连接点，
R8代表氢、C1-C3-烷基或苯基；
其中所述苯基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
C1-烷基；
或所述化合物的N-氧化物、盐、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐。
在第四方面，本发明涉及如前文所述的缀合物，
其中：
§1或§2代表与连接子Z'的连接点，条件是：
当连接子Z'在§1处连接时，则§2代表R5a，和
当连接子Z'在§2处连接时，则连接子Z'与环Het的氮原子连接，且§1代表R5b；
Het代表任选被一个或多个独立地选自R5的基团取代的杂芳基；
t是0；
R2代表H，
R3代表H；和
R4代表H或C1-卤代烷基；
或，
R2代表H；且
R3和R4一起形成键；
R5彼此独立地代表C1-烷基；6-元杂环烷基和-S(=O)2R8；
R5a代表氢或不存在；
R5b代表氢或选自以下的基团：
任选被一个或多个氟原子取代的C2-烷基；
q是1，
m是1，
Figure 944323DEST_PATH_IMAGE015
代表基团
Figure 23137DEST_PATH_IMAGE016
；
其中*和＃代表所述基团与式(I)化合物的其余部分的连接点，
R8代表任选被一个或多个C1-烷基取代的苯基；
或所述化合物的N-氧化物、盐、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐。
根据另一方面，本发明涉及如前文所述的缀合物，
其中：
§1或§2代表与连接子Z'的连接点，条件是：
当连接子Z'在§1处连接时，则§2代表R5a，和
当连接子Z'在§2处连接时，则连接子Z'与环Het的氮原子连接，且§1代表R5b；
Het代表任选被一个或多个独立地选自R5的基团取代的杂芳基；
t是0；
R2代表H，
R3代表H；和
R4代表H；
或，
R2代表H；且
R3和R4一起形成键；
R5代表C1-烷基；
R5a代表氢或不存在；
R5b代表基团-CH2CF3；
q是1，
m是1，
Figure 521115DEST_PATH_IMAGE017
代表基团
Figure 355079DEST_PATH_IMAGE018
；
其中*和＃代表所述基团与式(I)化合物的其余部分的连接点，
或所述化合物的N-氧化物、盐、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐。
在另一方面，NAMPT抑制剂(D)通过式(II-D)描述：
Figure 305717DEST_PATH_IMAGE019
其中R1、R2、R3、R4、§1、Het、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义。
另一方面，NAMPT抑制剂(D)通过式(III-D)描述：
Figure 188222DEST_PATH_IMAGE020
其中R1、R2、R3、R4、§2、Het、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，
其中：
§1或§2代表与连接子Z'的连接点，条件是：
当连接子Z'在§1处连接时，则§2代表R5a，和
当连接子Z'在§2处连接时，则连接子Z'与环Het的碳或氮原子连接，且§1代表R5b。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
Het代表任选被一个或多个独立地选自R5的基团取代的杂芳基。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R1彼此独立地代表卤素、羟基、C1-C3-烷基、C1-C3-卤代烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-N(H)R6、-N(R6)R7或-NH2。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
t是0、1或2。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
t是0或1。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
t是0。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R2代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基，
其中苯基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-N(H)R6和-N(R6)R7；
R3代表H、C1-C3-烷基或C1-C3-卤代烷基；和
R4代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R2代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基，
R3代表H；和
R4代表H、C1-C4-烷基或C1-C2-卤代烷基。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R2代表H，
R3代表H；和
R4代表H、C1-烷基或C1-卤代烷基。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R2代表H，
R3代表H；和
R4代表H或C1-卤代烷基。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R2代表H，
R3代表H；和
R4代表H。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R2和R3与它们所连接的碳一起形成C3-C6-环烷基或含有一个含杂原子基团的5-至7-元杂环烷基，所述含杂原子基团选自O、NR8、S、S(=O)、S(=O)2、S(=NR8)(=NR9)和S(=O)(=NR8)；且
R4代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R2代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基，
其中苯基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-N(H)R6和-N(R6)R7；且
R3和R4一起形成键。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R2代表H；且
R3和R4一起形成键。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R5彼此独立地代表卤素、羟基、C1-C3-烷基、C1-C3-卤代烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-N(H)R6、-N(R6)R7、-NH2、4-至7-元杂环烷基、-SR8、-S(=O)R8、-S(=O)2R8或-S(=O)(=NR8)R9。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R5彼此独立地代表卤素、羟基、C1-烷基、C1-卤代烷基、C1-烷氧基、C1-卤代烷氧基、-N(H)R6、-N(R6)R7或-NH2、4-至7-元杂环烷基、-SR8、-S(=O)R8、-S(=O)2R8和-S(=O)(=NR8)R9。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R5彼此独立地代表卤素、羟基、C1-烷基、5-至6-元杂环烷基、-SR8、-S(=O)R8或-S(=O)2R8。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R5彼此独立地代表C1-烷基、6-元杂环烷基或-S(=O)2R8。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R5代表C1-烷基。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R5a代表R5、氢或不存在。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R5a代表氢或不存在。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R5b代表氢或选自以下的基团：
甲基、C2-C6-烷基、(1,3-二氧戊环-2-基)-(C1-C6-烷基)-、(1,3-二噁烷-2-基)-(C1-C6-烷基)-、氮杂环丁烷-3-基、(氮杂环丁烷-3-基)-(C1-C6-烷基)-、氧杂环丁烷-3-基、(氧杂环丁烷-3-基)-(C1-C6-烷基)-、C3-C6-环烷基、(C3-C6-环烷基)-(C1-C6-烷基)-、5-至7-元杂环烷基、(5-至7-元杂环烷基)-(C1-C6-烷基)、苯基、苯基-(C1-C6-烷基)-、5-至6-元杂芳基和(5-至6-元杂芳基)-(C1-C6-烷基)-，
其中5-至7-元杂环烷基和5-至6-元杂芳基分别经由5-至7-元杂环烷基环的碳原子或经由5-至6-元杂芳基环的碳原子与分子的其余部分连接；
其中C2-C6-烷基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、羟基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、氧代(=O)、-NH2、-N(H)R6、-N(R6)R7、-C(=O)OR8、-SR8、-S(=O)R8、-S(=O)2R8和-S(=O)(=NR8)R9；
其中氮杂环丁烷-3-基和氧杂环丁烷-3-基任选被一个或两个独立地选自以下的取代基取代：
C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C1-C4-烷氧基、C1-C4-卤代烷氧基、(C1-C3-烷氧基)-(C1-C4-烷基)-、C3-C6-环烷基和C3-C6-环烷基氧基；
其中C3-C6-环烷基和5-至7-元杂环烷基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
羟基、卤素、氰基、C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C1-C4-烷氧基、C1-C4-卤代烷氧基、(C1-C3-烷氧基)-(C1-C4-烷基)-、C3-C6-环烷基、C3-C6-环烷基氧基、-N(R5)R6、-C(=O)OH、氧代(=O)和-N(H)C(=O)-(C1-C3-烷基)；
其中苯基和5-至6-元杂芳基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基-、C1-C3-卤代烷氧基-、-N(H)R6、-N(R6)R7、-C(=O)OH和-C(=O)O(C1-C6-烷基)。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R5b代表氢或选自以下的基团：
甲基、C2-C6-烷基、(1,3-二氧戊环-2-基)-(C1-C6-烷基)-、(1,3-二噁烷-2-基)-(C1-C6-烷基)-、氮杂环丁烷-3-基、(氮杂环丁烷-3-基)-(C1-C6-烷基)-、氧杂环丁烷-3-基、(氧杂环丁烷-3-基)-(C1-C6-烷基)-、C3-C6-环烷基、(C3-C6-环烷基)-(C1-C6-烷基)-、5-至7-元杂环烷基、(5-至7-元杂环烷基)-(C1-C6-烷基)、苯基、苯基-(C1-C6-烷基)-、5-至6-元杂芳基和(5-至6-元杂芳基)-(C1-C6-烷基)-，
其中5-至7-元杂环烷基和5-至6-元杂芳基分别经由5-至7-元杂环烷基环的碳原子或经由5-至6-元杂芳基环的碳原子与分子的其余部分连接；
其中C2-C6-烷基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、羟基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、氧代(=O)、-C(=O)OH和-N(R6)R7；
其中C3-C6-环烷基和5-至7-元杂环烷基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
羟基、卤素、氰基、C1-烷基、C1-卤代烷基、C1-烷氧基、C1-卤代烷氧基和氧代(=O)；
其中苯基和5-至6-元杂芳基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基-、C1-C3-卤代烷氧基-、-C(=O)OH和-C(=O)O(C1-C6-烷基)。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R5b代表氢或选自以下的基团：
甲基、C2-C3-烷基，
其中C2-C3-烷基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R5b代表氢或选自以下的基团：
任选被一个或多个氟原子取代的C2-烷基。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R5b代表基团-CH2CF3。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R5b代表氢或选自以下的基团：
甲基、C2-C6-烷基、C3-C6-环烷基和(C3-C6-环烷基)-(C1-C6-烷基)-，
其中C2-C6-烷基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、羟基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、氧代(=O)、-C(=O)OH和-N(R6)R7；
其中C3-C6-环烷基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
羟基、卤素、氰基、C1-烷基、C1-卤代烷基、C1-烷氧基、C1-卤代烷氧基和氧代(=O)。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R5b代表氢或选自以下的基团：
甲基、C2-C6-烷基、C3-C6-环烷基和(C3-C6-环烷基)-(C1-C6-烷基)-，
其中C2-C6-烷基任选被一个或多个卤素原子取代，
其中C3-C6-环烷基任选被一个或多个卤素原子取代。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
q是0、1、2或3，
m是0、1、2或3，
条件是q+m是2、3或4。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
q是1，
m是1。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
Figure 540706DEST_PATH_IMAGE021
代表选自以下的基团：
Figure 483255DEST_PATH_IMAGE022
其中*和＃代表所述基团与式(I)化合物的其余部分的连接点，
所述基团任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、R6(H)N-和-N(R6)R7。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
Figure 731309DEST_PATH_IMAGE023
代表基团
Figure 151926DEST_PATH_IMAGE024
；
其中*和＃代表所述基团与式(I)化合物的其余部分的连接点。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R6、R7彼此独立地代表C1-C3-烷基、C3-C6-环烷基、苯基、-C(=O)-O-(C1-C4-烷基)或-C(=O)-(C1-C3-烷基)，
其中所述苯基任选被一个或多个独立地选自下列的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-NH2、-N(H)R6和-N(R6)R7。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R6、R7彼此独立地代表C1-C3-烷基、C3-C6-环烷基、苯基或-C(=O)-(C1-C3-烷基)。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R8、R9彼此独立地代表氢、C1-C3-烷基、C3-C6-环烷基、苯基或C1-C3-卤代烷基，
其中所述苯基任选被一个或多个独立地选自下列的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-NH2、-N(H)R6和-N(R6)R7。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R8代表氢、C1-C3-烷基、C3-C6-环烷基、苯基或C1-C3-卤代烷基；
其中所述苯基任选被一个或多个独立地选自下列的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-NH2、-N(H)R6和-N(R6)R7。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R8代表氢、C1-C3-烷基或苯基；
其中所述苯基任选被一个或多个独立地选自下列的取代基取代：
C1-烷基。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中：
R8代表任选被一个或多个C1-烷基取代的苯基。
本发明的另一方面是如前文所述的缀合物，它们以其盐的形式存在。
本发明的另一方面是如前文所述的缀合物，其中所述盐是药学上可接受的盐。
应理解，本发明涉及如前文所述的缀合物的本发明的任何实施方案或方面内的任何亚组合。
甚至更特别地，本发明涵盖在下文本文的实施例部分中公开的缀合物。
根据另一方面，本发明涵盖制备本发明的缀合物的方法，所述方法包括如本文实验部分中所述的步骤。
连接子
文献公开了将有机分子共价偶联(缀合)到结合剂诸如例如抗体的各种选项(参见，例如，K. Lang 和 J. W. Chin，Chem. Rev. 2014, 114, 4764-4806, M. Rashidian 等人，Bioconjugate Chem. 2013, 24, 1277-1294)。根据本发明，优选经由抗体的半胱氨酸残基的一个或多个硫原子和/或经由抗体的赖氨酸残基的一个或多个NH基团将NAMPT抑制剂与抗体缀合，所述半胱氨酸残基已经作为游离硫醇存在或通过二硫键的还原产生。然而，也可能经由酪氨酸残基、经由谷氨酰胺残基、经由非天然氨基酸残基、经由游离羧基或经由抗体的糖残基将NAMPT抑制剂连接到抗体。对于偶联，使用连接子。连接子可以分为可体内裂解的连接子和体内稳定的连接子(参见L. Ducry 和B. Stump，Bioconjugate Chem. 21, 5-13(2010))。可在体内裂解的连接子具有可在体内裂解的基团，其中，转而，可在体内化学可裂解的基团和在体内酶促可裂解的基团之间进行区分。“体内化学可裂解”和“体内酶促可裂解”意指连接子或基团在靶细胞处或靶细胞中被其中化学或酶促的不同环境(例如，更低的pH；升高的谷胱甘肽浓度；溶酶体酶如组织蛋白酶或纤溶酶，或糖苷酶诸如例如β-葡萄糖醛酸酶的存在)裂解，从而释放低分子量NAMPT抑制剂或其衍生物。在体内可被化学裂解的基团特别是二硫化物、腙、缩醛和缩醛胺基团；在体内可被酶促裂解的基团特别是2-8-寡肽基，尤其是二肽基、三肽基或糖苷基团。肽裂解位点公开于Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869和 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8 (1998) 3341-3346以及还有Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626中。2002,13,855-。1998,9,618-626。这些包括，例如，缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-赖氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、丙氨酸-赖氨酸和苯丙氨酸-赖氨酸(任选地具有另外的酰胺基团)。
在体内稳定的连接子的特征在于高稳定性(优选在血浆中24小时后小于5%的代谢物)并且不具有本文提及的体内化学或酶促可裂解的基团。
根据第五方面，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中连接子-Z'-代表以下通式结构(i)至(iii)之一：
Figure 624495DEST_PATH_IMAGE025
其中
§1、§2代表与D的连接点；
§§代表与AB的连接点；
SG代表体内可裂解基团，L1和L1'彼此独立地代表体内不可裂解有机基团，和L2代表连接基团。
连接基团L2代表与结合剂的偶联基团或单键。这里，优选偶联于结合剂的半胱氨酸残基或赖氨酸残基。或者，偶联可以是与结合剂的酪氨酸残基、谷氨酰胺残基或非天然氨基酸的偶联。非天然氨基酸可含有例如醛或酮基团(诸如例如甲酰甘氨酸)或叠氮化物或炔基(参见Lan & Chin，Cellular Incorporation of Unnatural Amino Acids andBioorthogonal Labeling of Proteins，Chem.Rev. 2014, 114, 4764-4806)。
根据第六方面，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中体内可裂解基团SG代表2-8寡肽基，优选二肽基或三肽基，或二硫化物、腙、糖苷、缩醛或缩醛胺。
根据第七方面，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中L1和L1'彼此独立地代表具有1至40个碳原子的直链或支链烃链，其可被一个或多个独立地选自以下的基团间断一次或多次：
-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-NHCO-、-CONH-、-CONHNH-、亚芳基、杂亚芳基、直链C1-C6-亚烷基、支链C1-C6-亚烷基、C3-C7-环亚烷基和具有至多4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的5-至10-元杂环基；
任选被一个或多个选自卤素、-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸的取代基取代。
当连接子连接到半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基上时，L2优选衍生自与半胱氨酸的巯基反应的基团。这些包括卤代乙酰基、马来酰亚胺、氮杂环丙烷、丙烯酰基、芳基化化合物、乙烯基砜、吡啶基二硫化物、TNB硫醇和二硫化物-还原剂。这些基团一般以亲电方式与巯基键反应，形成硫化物(例如硫醚)或二硫键。
根据第八方面，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中L2代表：
Figure 737945DEST_PATH_IMAGE026
其中
# 1代表与结合剂的连接点，
# 2代表与基团L1、L1'或SG的连接点。
根据第九方面，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中连接子-Z'-代表以下通式结构(i)至(iii)之一：
Figure 663176DEST_PATH_IMAGE027
其中
§1、§2代表与D的连接点；
§§代表与AB的连接点；
SG代表2-8寡肽基，优选二肽基或三肽基，或二硫化物、腙、糖苷、缩醛或缩醛胺；
L1、L1'彼此独立地代表具有1至40个碳原子的直链或支链烃链，其可以被一个或多个独立地选自下列的基团间断一次或多次：
-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-NHCO-、-CONH-、-CONHNH-、亚芳基、杂亚芳基、直链C1-C6-亚烷基、支链C1-C6-亚烷基、C3-C7-环亚烷基和具有至多4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的5-至10-元杂环基；
任选被一个或多个选自卤素、-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸的取代基取代。
L2代表：
Figure 949800DEST_PATH_IMAGE028
其中
#1代表与结合剂的连接点，
#2代表与基团L1、L1'或SG的连接点。
根据第十方面，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中L2代表以下三个化学式中的一个或多个：
Figure 11297DEST_PATH_IMAGE029
其中
#1代表与结合剂的连接点，
#2代表与基团L1、L1'或SG的连接点，
其中在优选的实施方案中，相对于连接子与结合剂的连接总数，超过60%的与结合剂的连接点、甚至更优选超过80%的与结合剂的连接点、优选超过90%的与结合剂的连接点、优选超过95%的与结合剂的连接点由以下两个结构之一代表：
Figure 295648DEST_PATH_IMAGE030
其中，在特别优选的实施方案中，#2处的酰胺基团经由基团-CH2-C(O)-与L1、L1'或SG连接。
根据第十一方面，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中SG是2-8寡肽。
根据第十二方面，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中2-8寡肽包括选自下组的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、瓜氨酸和缬氨酸。
根据第十三方面，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中L1和L1'彼此独立地代表具有1至20个碳原子的直链或支链烃链，其可被一个或多个独立地选自以下的基团间断一次或多次：
-O-、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-；
其中*和＃代表所述基团与化合物的其余部分的连接点，
任选被一个或多个独立地选自-F、-Cl、-COOH、-OH和-NH2的取代基取代。
根据第十四方面，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中L1和L1'彼此独立地代表通式结构(iv)或(v)之一：
Figure 708175DEST_PATH_IMAGE031
其中：
A'代表C1-C6烷基、(C1- C2烷基)-(亚苯基)和(C1-C3烷基)-(NR11)-( C2烷基)；
任选被一个或多个独立地选自-F和-Cl的取代基取代；
B'代表具有1至20个碳原子的直链或支链烃链，其可以被一个或多个独立地选自以下的基团间断一次或多次：-O-、-NH-、-CO-、-NHCO-和-CONH-；
任选被-COOH取代；
R10、R11彼此独立地代表氢或C1-C3烷基；或
R10、R11与它们所连接的氮一起形成6-元含氮杂环烷基。
根据第十五方面，本发明涉及如前文所述的缀合物，
其中连接子-Z'-代表通式结构(vi)至(vii)之一：
Figure 736174DEST_PATH_IMAGE032
§1、§2代表与D的连接点；
§§代表与AB的连接点；
L2如权利要求8至10中任一项所定义；
SG'任选存在，并且当存在时，代表：
如在前权利要求中任一项所定义的SG，或
一个氨基酸(赖氨酸、天冬酰胺)，其任选被-[CH2-CH2O]oCH3；-C(=O)[CH2-CH2O]oCH3；-NHC(=O)[CH2-CH2O]oCH3取代，
o代表3至9的整数，优选4至8；
A2代表C1-C6-烷基；任选被一个或多个独立地选自-F、-Cl和-COOH的取代基取代；
B2代表具有1至20个碳原子的直链或支链烃链，其可以被一个或多个独立地选自-O-、-NH-、-CO-、-NHCO-和-CONH-的基团间断一次或多次；
任选被-COOH取代；
R10代表氢或C1-C3烷基。
根据另一方面，本发明涉及通式(II)的缀合物：
Figure 730806DEST_PATH_IMAGE033
其中AB代表结合剂，Z'代表连接子，n代表1和50之间的数，优选1.2至20，特别优选2至8；
其中：
其中R1、R2、R3、R4、Het、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义或如权利要求1-4中任一项所定义；
-Z'-代表以下通式结构(i)至(iii)之一：
Figure 920479DEST_PATH_IMAGE034
其中
§1代表与哒嗪酮环的连接点；
§§代表与AB的连接点；
SG代表2-8寡肽基，优选二肽基或三肽基，或二硫化物、腙、糖苷、缩醛或缩醛胺；
L1、L1'彼此独立地代表具有1至40个碳原子的直链或支链烃链，其可被以下中的一个或多个间断一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-NHCO-、-CONH-、-CONHNH-、亚芳基、杂亚芳基、环亚烷基和具有至多4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的5-至10-元杂环基；
其中*和＃代表所述基团与化合物的其余部分的连接点，
任选被一个或多个选自以下的取代基取代：卤素、-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸；
L2代表：
Figure 820302DEST_PATH_IMAGE035
其中
#1代表与结合剂的连接点，
#2代表与基团L1、L1'或SG的连接点；
或其对映异构体、非对映异构体、盐、溶剂化物或溶剂化物的盐。
根据另一方面，本发明涉及通式(III)的缀合物：
Figure 386412DEST_PATH_IMAGE036
其中AB代表结合剂，Z'代表连接子，n代表1和50之间的数，优选1.2至20，且特别优选2至8；
其中：
其中R1、R2、R3、R4、R5b、Het、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义或如权利要求1至4中任一项所定义；
-Z'-代表以下通式结构(i)至(iii)之一：
Figure 688080DEST_PATH_IMAGE037
其中
§2代表与环Het的连接点；
§§代表与AB的连接点；
SG代表2-8寡肽基，优选二肽基或三肽基，或二硫化物、腙、糖苷、缩醛或缩醛胺；
L1、L1'彼此独立地代表具有1至40个碳原子的直链或支链烃链，其可被以下中的一个或多个间断一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-NHCO-、-CONH-、-CONHNH-、亚芳基、杂亚芳基、环亚烷基和具有至多4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的5-至10-元杂环基；
其中*和＃代表所述基团与化合物的其余部分的连接点，
任选被一个或多个选自以下的取代基取代：卤素、-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸；
L2代表：
Figure 110972DEST_PATH_IMAGE038
其中
#1代表与结合剂的连接点，
#2代表与基团L1、L1'或SG的连接点；
或其对映异构体、非对映异构体、盐、溶剂化物或溶剂化物的盐。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，其中L1和L1'彼此独立地为下文那些，其中r在每种情况下彼此独立地代表1至20、优选1至15、特别优选2至20、尤其优选2至10的数。应理解，以下基团L1和L1'从左至右读取，这意味着下表A中的左手符号
Figure 498091DEST_PATH_IMAGE039
(或虚线) 表示与§1-、§1-L1-SG-、§2-或§2-L1-SG-的连接位点并且下表A中的右手符号
Figure 867892DEST_PATH_IMAGE039
(或虚线)表示与-SG-L2-§§、-SG-L1'-L2-§§或-L2-§§的连接位点。
表A
Figure 758488DEST_PATH_IMAGE040
Figure 555542DEST_PATH_IMAGE041
彼此独立的连接子部分L1和L1'的其它实例在下表中给出。应理解，下面的基团L1或L1'是从左到右读取的，这意味着下面的表B中的左手符号
Figure 977428DEST_PATH_IMAGE039
表示与§1-、§1-L1-SG-、§2-或§2-L1-SG-的连接位点，并且下面的表B中的右手符号
Figure 150920DEST_PATH_IMAGE042
表示与-SG-L2-§§、SG-L1'-L2-§§或-L2-§§的连接位点。
表B
Figure 161601DEST_PATH_IMAGE043
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，
其中SG包含2-6个选自下组的氨基酸：
丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、瓜氨酸和缬氨酸。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，
其中SG包含2-3个选自下组的氨基酸：
丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、瓜氨酸和缬氨酸。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，
其中SG包含2-3个选自下组的氨基酸：
丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、瓜氨酸和缬氨酸。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，
其中SG包含2个选自下组的氨基酸：
丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、瓜氨酸和缬氨酸。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，
其中SG包含2个选自下组的氨基酸：
丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、瓜氨酸和缬氨酸。
下表C提供了显示连接子Z'的优选组合的实例：
Figure 129557DEST_PATH_IMAGE044
其中，r在每种情况下彼此独立地代表1至15、优选1至10、特别优选1至8的数，应理解，下面的基团L1和L1'是从左到右读取的，这意味着下面的表C中的左手符号
Figure 225689DEST_PATH_IMAGE039
分别代表与§1-、§1-L1-SG-、§2-或§2-L1-SG-的连接位点，并且下面的表C中的右手符号
Figure 999610DEST_PATH_IMAGE039
代表与-SG-L1'-L2-§§、-SG-L1'-L2-§§或-L2-§§的连接位点。应理解SG和L1'任选存在。
Figure 864798DEST_PATH_IMAGE045
Figure 3655DEST_PATH_IMAGE046
其中对于基团L2
#1代表与结合剂的连接点，
#2代表与基团L1、L1'或SG的连接点。
下表D提供了显示连接子Z'的更优选组合的实例：
Figure 587083DEST_PATH_IMAGE047
其中，r在每种情况下彼此独立地代表1至15、优选1至10、特别优选1至8的数，应理解，下面的基团L1和L1'从左到右读取，这意味着下面的表D中的左手符号
Figure 836799DEST_PATH_IMAGE039
分别表示与§1-、§1-L1-SG-、§2-或§2-L1-SG-的连接位点，并且下面的表D中的右手符号
Figure 635122DEST_PATH_IMAGE039
表示与-SG-L2-§§、-SG-L1'-L2-§§或-L2-§§的的连接位点。
Figure 944881DEST_PATH_IMAGE048
Figure 15605DEST_PATH_IMAGE049
Figure 69011DEST_PATH_IMAGE050
其中对于基团L2
#1代表与结合剂的连接点，
#2代表与基团L1、L1'或SG的连接点。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，
其中SG包含缬氨酸和丙氨酸。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，
其中SG包含缬氨酸和瓜氨酸。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，
其中SG包含丙氨酸-缬氨酸。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，
其中SG包含瓜氨酸-丙氨酸。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，
其中SG包含(C-末端)-Ala-Val-(N-末端)或(C-末端)-Cit-Val-(N-末端)。
在上述方面的进一步实施方案中，本发明涉及如前文所述的缀合物，
其中SG是(C-末端)-Ala-Val-(N-末端)或(C-末端)-Cit-Val-(N-末端)。
根据另一方面，本发明涉及结合剂或其衍生物与一个或多个活性组分分子的缀合物，其中所述活性组分是NAMPT抑制剂，其经由连接子Z'与结合剂缀合。
根据另一方面，本发明涉及选自下组的化合物：
N-{4-[6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]丁基}氨基甲酸叔丁酯，
N-{4-[1-(4-氨基丁基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基甲酸叔丁酯，
N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-(4-氨基丁基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基羰基)氨基]苯基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基]丁基}氨基甲酸叔丁酯，
N-{4-[1-(4-氨基丁基)-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基甲酸叔丁酯，
N-{4-[1-(6-氨基己基)-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-(6-氨基己基)-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[(5R)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{4-[(5R)-3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]丁基}氨基甲酸叔丁酯，
N-{4-[(5R)-1-(4-氨基丁基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{6-[(3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基甲酸叔丁酯，
N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-[4-(5-{1-[氧杂环己烷-2-基（oxan-2-yl）]-1H-吲唑-5-基}-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)苯基]-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(1H-吲唑-5-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(1H-吲唑-5-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺-盐酸盐，
N-{4-[5-(1H-吲唑-5-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-[4-(5-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-4-基}-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)苯基]-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(1H-吲唑-4-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-4-基}-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(1H-吲唑-4-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-(4-{5-[1-(4-甲基苯-1-磺酰基)-1H-吲哚-5-基]-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(1H-吲哚-5-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(1H-吲哚-5-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-5-基}-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(1H-吲唑-5-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-4-基}-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(1H-吲唑-4-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)哒嗪-1(6H)-基]丁基}氨基甲酸叔丁酯，
N-{4-[1-(4-氨基丁基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-(4-{5-[1-(4-甲基苯-1-磺酰基)-1H-苯并咪唑-4-基]-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(1H-苯并咪唑-4-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
[(2S)-1-({4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]丁基}氨基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基甲酸叔丁酯，
[(1S)-2-[4-[3-[4-(1,3-二氢吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基氨基)苯基]-6-氧代-5-(5-喹啉基)哒嗪-1-基]丁基氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]铵三氟乙酸盐，
N-(叔丁氧羰基)-L-缬氨酰-N-{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]丁基}-L-丙氨酰胺，
[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-[3-[4-(1,3-二氢吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基氨基)苯基]-6-氧代-5-(5-喹啉基)哒嗪-1-基]丁基氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]铵三氟乙酸盐，
[(2S)-1-({4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]丁基}氨基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基甲酸叔丁酯，
[(1S)-2-[4-[3-[4-(1,3-二氢吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基氨基)苯基]-6-氧代-5-(5-喹啉基)-4,5-二氢哒嗪-1-基]丁基氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]铵三氟乙酸盐，
N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酰-N-{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]丁基}-L-丙氨酰胺，
[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-[3-[4-(1,3-二氢吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基氨基)苯基]-6-氧代-5-(5-喹啉基)-4,5-二氢哒嗪-1-基]丁基氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-2-甲基丙基]铵三氟乙酸盐，
2或3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-{[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-4-氧代丁酸，
{(32S)-40-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]-26,33-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27,34-二氮杂四十烷-32-基}氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯，
N-{4-[6-氧代-1-(6-{[N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基]氨基}己基)-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{(32S)-40-[(5S)-3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]-26,33-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27,34-二氮杂四十烷-32-基}氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯，
N-{4-[6-氧代-1-(6-{[N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基]氨基}己基)-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{(26S)-34-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]-20,27-二氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂-21,28-二氮杂三十四烷-26-基}氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯，
N-{4-[6-氧代-1-(6-{[N6-(20-氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十烷-20-基)-L-赖氨酰基]氨基}己基)-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{(20S)-28-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]-14,21-二氧代-2,5,8,11-四氧杂-15,22-二氮杂-二十八烷-20-基}氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯，
N-{4-[6-氧代-1-(6-{[N6-(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)-L-赖氨酰基]氨基}己基)-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基甲酸叔丁酯，
N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺-盐酸盐
{(26S)-34-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)哒嗪-1(6H)-基]-20,27-二氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂-21,28-二氮杂三十四烷-26-基}氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯，
N-{4-[6-氧代-1-(6-{[N6-(20-氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十烷-20-基)-L-赖氨酰基]氨基}己基)-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基甲酸叔丁酯，
N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺盐酸盐，
N2-(叔丁氧基羰基)-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-D-天冬酰胺叔丁酯，
N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-D-天冬酰胺，
[(2S)-1-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基甲酸叔丁酯，
N-{4-[1-[6-(L-丙氨酰氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酰-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-L-丙氨酰胺，
L-缬氨酰-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-L-丙氨酰胺，
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-N-{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]丁基}-L-丙氨酰胺，
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-N-{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]丁基}-L-丙氨酰胺，
N-{4-[1-(6-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}己基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-(4-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}丁基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-(4-{1-[6-({N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-[6-({N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-[6-({N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N6-(20-氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十烷-20-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-[6-({N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N6-(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-L-缬氨酰-N-{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]丁基}-L-丙氨酰胺，
N-(4-{1-[6-({N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N6-(20-氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十烷-20-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-D-天冬酰胺，
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-L-丙氨酰胺，
(6-{5-[6-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-3-氧代-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢哒嗪-4-基]-1H-吲唑-1-基}己基)氨基甲酸叔丁酯，
N-(4-{5-[1-(6-氨基己基)-1H-吲唑-5-基]-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-(4-{5-[2-(6-氨基己基)-2H-吲唑-5-基]-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
(6-{4-[6-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基羰基)氨基]苯基}-3-氧代-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢哒嗪-4-基]-1H-吲唑-1-基}己基)氨基甲酸叔丁酯，
N-(4-{5-[1-(6-氨基己基)-1H-吲唑-4-基]-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-(4-{5-[2-(6-氨基己基)-2H-吲唑-4-基]-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-1H-吲唑-5-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(2-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-2H-吲唑-5-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-1H-吲唑-4-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(2-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-2H-吲唑-4-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，和
N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
或所述化合物的N-氧化物、盐、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐。
在本发明的另一方面，这些化合物中的一个或多个可以用作中间体以提供如前文所述的缀合物。
在本发明的另一方面，这些化合物中的一个或多个可以是通过裂解如前文所述的缀合物可获得的代谢物。
根据另一方面，本发明涉及如前文所述的缀合物，其选自：
Figure 908791DEST_PATH_IMAGE051
Figure 451768DEST_PATH_IMAGE052
Figure 744209DEST_PATH_IMAGE053
Figure 601307DEST_PATH_IMAGE054
Figure 295593DEST_PATH_IMAGE055
Figure 947155DEST_PATH_IMAGE056
Figure 802591DEST_PATH_IMAGE057
Figure 197800DEST_PATH_IMAGE058
Figure 746593DEST_PATH_IMAGE059
Figure 834635DEST_PATH_IMAGE060
Figure 101668DEST_PATH_IMAGE061
Figure 362885DEST_PATH_IMAGE062
其中n是1至50的数，且所述抗体是人、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段，特别是抗-HER2-抗体、抗-CXCR5-抗体、抗-B7H3-抗体、抗-C4.4a-抗体或其抗原结合片段。
NAMPT抑制剂-连接子-中间体和缀合物的制备
通过首先提供具有连接子的低分子量NAMPT抑制剂来制备本发明的缀合物。然后将以这种方式获得的中间体与结合剂(优选抗体)反应。
NAMPT抑制剂-连接子-中间体是通式(II-DL)或(III-DL)的缀合物：
Figure 766185DEST_PATH_IMAGE063
Figure 25128DEST_PATH_IMAGE064
其中Z'代表如本文或权利要求中定义的连接子，并且R1、R2、R3、R4、R5b、Het、t、q、m、V、W、Z和Y如本文定义或如权利要求1至4中任一项定义。
优选地，为了偶联半胱氨酸残基，缀合物1-51或1-52之一与含半胱氨酸的结合剂如抗体反应，其任选为此目的而被部分还原：
Figure 779457DEST_PATH_IMAGE065
其中R1、R2、R3、R4、Het、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义或如权利要求中任一项所定义，且Q代表以下通式结构(i)至(iii)之一：
Figure 516469DEST_PATH_IMAGE066
其中
§代表与哒嗪酮环的连接点；
§§代表与马来酰亚胺基团的连接点；
并且L1、SG和L1'如本文所定义或如权利要求中任一项所定义。
Figure 852903DEST_PATH_IMAGE067
其中R1、R2、R3、R4、R5b、Het、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义，Q代表以下通式结构(i)至(iii)之一：
Figure 282748DEST_PATH_IMAGE068
其中
§代表与环Het的连接点；
§§代表与马来酰亚胺基团的连接点；
并且L1、SG和L1'如本文所定义或如权利要求中任一项所定义。
缀合物可以例如以其三氟乙酸盐的形式使用。对于与结合剂诸如例如抗体的反应，优选以相对于结合剂2至20倍摩尔过量，优选以5至16倍摩尔过量使用缀合物。
对于与半胱氨酸残基偶联的中间体，反应可以说明如下：
Figure 258794DEST_PATH_IMAGE069
其中R1、R2、R3、R4、Het、t、q、m、V、W、Z、Y和Q如本文所定义；或
Figure 799497DEST_PATH_IMAGE070
其中R1、R2、R3、R4、R5b、Het、t、q、m、V、W、Z、Y和Q如本文所定义。
优选地，PBS缓冲液与DMSO一起使用，其中所述DMSO不超过总体积的10%。
根据本发明，这优选产生通式(II)或(III)的缀合物：
Figure 442968DEST_PATH_IMAGE071
Figure 840451DEST_PATH_IMAGE072
其中R1、R2、R3、R4、R5b、Het、t、q、m、V、W、Z、Y和Q如本文所定义。
AB代表经由半胱氨酸或赖氨酸残基连接的抗体，且n是1至50的数，特别优选AB是人、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段，特别是抗-HER2-抗体、抗-CXCR5-抗体、抗-B7H3-抗体、抗-C4.4a-抗体或其抗原结合片段。
根据连接子，琥珀酰亚胺连接的ADC可以在缀合后转化为开链琥珀酰胺(方案A1和方案A2)，其可以具有有利的稳定性特性。
Figure 569372DEST_PATH_IMAGE073
方案A1：Z代表§1-L1-SG-、§1-L1-SG-L1'-或§1-L1-。§1代表与哒嗪酮环的连接点。
方案A1中代表的开链琥珀酰胺将共同如下代表：
Figure 648187DEST_PATH_IMAGE074
Figure 146164DEST_PATH_IMAGE075
方案A2：Z代表§2-L1-SG-、§2-L1-SG-L1'-或§2-L1-。§2代表与环Het的连接点。
方案A2中代表的开链琥珀酰胺将共同如下代表：
Figure 652232DEST_PATH_IMAGE076
该反应(开环)可以在pH7.5至9，优选pH8，在20℃至37℃的温度，例如通过搅拌进行。优选的搅拌时间为8至30小时。
在以上化学式中，R1、R2、R3、R4、R5b、Het、n、t、q、m、V、W、Z和Y具有与本文所述相同的含义。AB是经由半胱氨酸残基或赖氨酸残基偶联的抗体。特别优选，AB是抗-HER2-抗体、抗-CXCR5-抗体、抗-B7H3-抗体、抗-C4.4a-抗体或其抗原结合片段。
结合剂
在最广泛的意义上，术语“结合剂”应理解为意指与存在于待由结合剂/活性化合物缀合物寻址的特定靶细胞群体处的靶分子结合的分子。术语结合剂应以其最广泛的含义理解，并且还包括例如凝集素、能够结合某些糖链的蛋白和磷脂结合蛋白。这样的结合剂包括，例如，高分子量蛋白(结合蛋白)、多肽或肽(结合肽)、非肽(例如适配子(US5,270,163)，由Keefe AD., 等人综述，Nat. Rev. Drug) Discov. 2010；9:537-550)，或维生素）以及所有其他细胞结合分子或物质。结合蛋白是例如抗体和抗体片段或抗体模拟物，诸如例如亲合体、adnectins、抗运载蛋白（anticalins）、DARPins、avimers、纳米抗体（nanobodies）（由Gebauer M. 等人综述，Curr. Opinion in Chem. Biol. 2009；13:245-255；Nuttall S.D.等人， Curr. Opinion in Pharmacology 2008；8:608-617）。结合肽是例如配体/受体对的配体，诸如例如配体/受体对VEGF/KDR的VEGF、如配体/受体对转铁蛋白/转铁蛋白受体的转铁蛋白，或细胞因子/细胞因子受体的配体，如配体/受体对TNFα/TNFα受体的TNFα。
文献还公开了有机分子与抗体共价偶联(缀合)的各种选项。根据本发明，优选的是经由抗体半胱氨酸残基的一个或多个硫原子和/或经由抗体赖氨酸残基的一个或多个NH基团将毒性基团（toxophore）与抗体缀合。然而，也可能经由游离羧基或经由抗体的糖残基将毒性基团与抗体相结合。
在本发明的一个实施方案中，缀合物的连接子Z'与结合剂AB上的半胱氨酸侧链相结合。
结合剂或其衍生物可以是结合肽或结合蛋白或结合肽或结合蛋白的衍生物。
在本发明的进一步实施方案中，活性组分的每个分子分别经由连接子与结合肽或结合蛋白或它们的衍生物的不同氨基酸相结合。
根据本发明的一个方面，缀合物平均为每结合剂1.2至50个活性组分分子。
根据本发明的进一步方面，结合肽或蛋白代表抗体，或其中结合肽或结合蛋白的衍生物分别地包含以下基团之一：
Figure 868450DEST_PATH_IMAGE077
。
在本发明的一个方面，结合剂与癌症靶分子相结合。
在本发明的另一方面，结合剂与细胞外靶分子相结合。
在与细胞外靶分子结合之后，结合剂可以在靶分子的表达细胞中内化并在细胞内加工，优选通过溶酶体途径加工。
在一个实施方案中，结合肽或结合蛋白是人、人源化或嵌合单克隆抗体，或其抗原结合片段。
优选地，结合肽或结合蛋白是抗-HER2-抗体、抗-CXCR5-抗体、抗-B7H3-抗体、抗-C4.4a-抗体或其抗原结合片段。
“靶分子”在最广泛的意义上应理解为意指存在于靶细胞群中的分子，且其可以是蛋白(例如生长因子的受体)或非肽分子(例如糖或磷脂)。其优选为受体或抗原。
术语“细胞外”靶分子描述附着于细胞的位于细胞外部的靶分子，或位于细胞外部的靶分子的部分，即结合剂可以在完整细胞上与其细胞外靶分子结合。细胞外靶分子可以锚定在细胞膜中或者是细胞膜的组分。本领域技术人员知道鉴定细胞外靶分子的方法。对于蛋白，这可以通过确定跨膜结构域和膜中蛋白的取向来进行。这些数据通常被保存在蛋白数据库(例如SwissProt)中。
术语“癌症靶分子”描述了在一种或多种癌细胞种类上比在相同组织类型的非癌细胞上更丰富存在的靶分子。优选地，与相同组织类型的非癌细胞相比，癌症靶分子选择性地存在于一种或多种癌细胞种类上，其中选择性地描述了与相同组织类型的非癌细胞相比癌细胞上至少两倍的富集(“选择性癌症靶分子”)。癌症靶分子的使用允许使用根据本发明的缀合物选择性治疗癌细胞。
结合剂可以经由键与连接子连接。结合剂的连接可经由结合剂的杂原子。根据本发明的可用于连接的结合剂的杂原子是硫(在一个实施方案中，经由结合剂的巯基)、氧(根据本发明，以结合剂的羧基或羟基的方式)和氮(在一个实施方案中，经由结合剂的伯或仲胺基团或酰胺基团)。这些杂原子可存在于天然结合剂中，或通过化学方法或分子生物学方法引入。根据本发明，结合剂与毒性基团的连接对该结合剂相对于靶分子的结合活性仅具有微小影响。在优选的实施方案中，连接对结合剂相对于靶分子的结合活性没有影响。
根据本发明，术语“抗体”应以其最广泛的含义理解，并且包含免疫球蛋白分子，例如完整的或修饰的单克隆抗体、多克隆抗体或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。免疫球蛋白分子优选包含具有四条多肽链（典型地通过二硫键连接的两条重链(H链)和两条轻链(L链)）的分子。每条重链包含重链的可变结构域(缩写为VH)和重链的恒定结构域。重链的恒定结构域可以例如包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含可变结构域(缩写为VL)和恒定结构域。轻链的恒定结构域包含结构域(缩写为CL)。VH和VL结构域可以进一步细分为具有高变性的区域，也称为互补决定区(缩写为CDR)和具有低序列可变性的区域(框架区，缩写为FR)。通常，每个VH和VL区由三个CDR和多达四个FR组成。例如从氨基末端到羧基末端，按以下顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗体可以从任何合适的物种获得，例如兔、美洲驼、骆驼、小鼠或大鼠。在一个实施方案中，抗体是人或鼠来源的。抗体可以是例如人的、人源化的或嵌合的。
术语“单克隆”抗体是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即群体的个体抗体是相同的，除了天然存在的突变，其中可能存在少量突变。单克隆抗体以高特异性识别单个抗原结合位点。术语单克隆抗体不涉及特定的制备方法。
术语“完整的”抗体是指包含轻链和重链的抗原结合结构域和恒定结构域二者的抗体。恒定结构域可以是天然存在的结构域或其具有许多修饰的氨基酸位置的变体。
术语“修饰的完整”抗体是指经由其氨基末端或羧基末端与不是来源于抗体的另外的多肽或蛋白通过共价键(例如肽键)融合的完整抗体。此外，抗体可被修饰，使得在定义的位置引入反应性半胱氨酸以促进与毒性基团的偶联(参见Junutula等人，NatBiotechnol. 2008 Aug；26(8)：925-32)。
术语“人”抗体是指可从人获得的抗体或合成的人抗体。“合成的”人抗体是基于人抗体序列的分析，从合成序列部分或完全地由计算机模拟（ in silico）可获得的抗体。人抗体可以由例如分离自人起源的抗体序列信息库的核酸编码。这样的抗体的例子可以在Söderlind等人，Nature Biotech. 2000，18:853-856中找到。
术语“人源化的”或“嵌合的”抗体描述由序列的非人和人部分组成的抗体。在这些抗体中，人免疫球蛋白(受体)的部分序列被非人免疫球蛋白(供体)的序列部分替代。在许多情况下，供体是鼠免疫球蛋白。在人源化抗体的情况下，受体CDR的氨基酸被供体的氨基酸替代。有时，构架的氨基酸也被供体的相应氨基酸替代。在一些情况下，人源化抗体含有既不存在于受体中也不存在于供体中的氨基酸，其是在抗体优化期间引入的。在嵌合抗体的情况下，供体免疫球蛋白的可变区与人抗体的恒定区融合。
本文所用的术语互补决定区(CDR)是指与抗原结合所需的可变抗体结构域的那些氨基酸。通常，每个可变区具有三个CDR区，称为CDR1、CDR2和CDR3。每个CDR区可以包含根据Kabat定义的氨基酸和/或根据Chotia定义的高可变环的氨基酸。根据Kabat的定义包括，例如，从大约可变轻链的氨基酸位置24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)和可变重链的31-35(CDR1)、50-65(CDR2)和95-102(CDR3)起的区域(Kabat 等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。根据Chotia的定义包括，例如，从大约可变轻链的氨基酸位置26-32(CDR1)、50-52(CDR2)和91-96(CDR3)以及可变重链的26-32(CDR1)、53-55(CDR2)和96-101(CDR3)起的区域(Chothia 和 Lesk; J Mol Biol 196:901-917 (1987))。在一些情况下，CDR可包含来自根据Kabat和Chotia定义的CDR区的氨基酸。
根据重链恒定结构域的氨基酸序列，抗体可以分为不同的类别。有五种主要类别的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几个可以被进一步分成亚类。(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的重链恒定结构域被称为[alpha/ α]、[delta/ δ]、[epsilon/ ε]、[gamma/ γ]和[my/ μ]。抗体的三维结构和亚单位结构都是已知的。
术语抗体/免疫球蛋白的“功能片段”或“抗原-结合抗体片段”定义为抗体/免疫球蛋白的片段(例如IgG的可变结构域)，其仍然包含抗体/免疫球蛋白的抗原结合结构域。抗体的“抗原结合结构域”通常包含抗体的一个或多个高变区，例如CDR、CDR2和/或CDR3区。然而，抗体的“框架”或“骨架”区也可在抗体与抗原结合期间起作用。构架区形成CDR的骨架。优选地，抗原结合结构域至少包含可变轻链的氨基酸4至103和可变重链的氨基酸5至109，更优选可变轻链的氨基酸3至107和可变重链的氨基酸4至111，特别优选完整的可变轻链和重链，即VL的氨基酸1-109和VH的氨基酸1至113(根据WO97/08320编号)。
本发明的“功能片段”或“抗原-结合抗体片段”非结论性地包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、双链抗体、单域抗体(DAB)、线性抗体、抗体的个体链(单链Fv，缩写为scFv)；和多特异性抗体，诸如例如二和三特异性抗体，由抗体片段形成。C.A.K Borrebaeck，editor(1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), OxfordUniversity Press； R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) AntibodyEngineering (Springer Laboratory Manual)， Springer Verlag。“多特异性”或“多功能”抗体以外的抗体是具有相同结合位点的那些。多特异性抗体可以是抗原的不同表位特异性的，或者可以是多于一种抗原的表位特异性的(参见，例如WO 93/17715； WO 92/08802； WO 91/00360； WO 92/05793； Tutt, 等人，1991， J. Immunol. 147:60 69；美国专利No. 4,474,893； 4,714,681 ； 4,925,648； 5,573,920； 5,601,819；或Kostelny 等人， 1992， J. Immunol. 148: 1547 1553)。可以构建F(ab')2或Fab分子，从而减少或完全阻止在Ch1和CL结构域之间发生的分子间二硫化物相互作用的数量。
“表位”是指能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的蛋白决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团组成，所述分子如氨基酸或糖侧链或其组合，并且通常具有特定的3维结构性质以及特定的电荷性质。
“功能片段”或“抗原-结合抗体片段”可以与不是源自抗体的另一多肽或蛋白经由其氨基末端或羧基末端，借助于共价键(例如肽键)融合。此外，抗体和抗原结合片段可通过在确定的位置引入反应性半胱氨酸来修饰，以便促进与毒性基团的偶联(参见Junutula 等人， Nat Biotechnol. 2008 Aug； 26(8):925-32)。
多克隆抗体可以通过本领域普通技术人员已知的方法制备。单克隆抗体可通过本领域普通技术人员已知的方法制备(Köhler 和Milstein，Nature，256， 495-497， 1975)。人和人源化单克隆抗体可通过本领域普通技术人员已知的方法制备(Olsson 等人， MethEnzymol. 92, 3-16 或 Cabilly 等人， US 4,816,567或 Boss 等人， US 4,816,397)。
本领域普通技术人员知道制备人抗体及其片段的多种方法，诸如例如借助于转基因小鼠(N Lonberg 和D Huszar， Int Rev Immunol. 1995； 13(1):65-93) 或PhageDisplay Technologien (Clackson 等人， Nature；1991 Aug 15;352(6336):624-8)。本发明的抗体可以从重组抗体库获得，所述重组抗体库由例如从大量健康志愿者收集的多种抗体的氨基酸序列组成。抗体也可通过已知的重组DNA技术产生。抗体的核酸序列可以通过常规测序获得，或者可以从公众可获得的数据库获得。
“分离的”抗体或结合剂已经被纯化以除去细胞的其它成分。可能干扰诊断或治疗用途的细胞的污染成分为，例如酶、激素或细胞的其它肽或非肽成分。优选的抗体或结合剂是已经纯化到相对于抗体或结合剂超过95重量%的程度的抗体或结合剂(例如通过Lowry方法、UV-Vis光谱法或通过SDS毛细管凝胶电泳测定)。此外，抗体已被纯化到可以确定氨基末端或内部氨基酸序列的至少15个氨基酸的程度，或已被纯化到同质，同质性通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下确定(检测可以通过考马斯亮蓝染色或优选通过银染确定)。然而，抗体通常通过一个或多个纯化步骤制备。
术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指结合预定抗原/靶分子的抗体或结合剂。抗体或结合剂的特异性结合通常描述具有至少10-7M的亲和力(作为Kd值；即优选具有比 10-7M更小的Kd值的那些)的抗体或结合剂，其中抗体或结合剂对预定抗原/靶分子的亲和力比对非特异性抗原/靶分子(例如牛血清白蛋白或酪蛋白)的亲和力高至少两倍，所述非特异性抗原/靶分子不是预定抗原/靶分子或密切相关的抗原/靶分子。抗体优选具有至少10- 7M的亲和力(作为Kd值；换句话说，优选具有比10-7M更小的Kd值的那些)，优选至少10-8M，更优选在10-9M至10-11M的范围内。Kd值可以例如借助于表面等离子体共振光谱确定。
本发明的抗体-药物缀合物同样在这些范围内显示亲和力。亲和力优选基本上不受药物缀合的影响(一般而言，亲和力降低小于一个数量级，换句话说，例如，至多从10-8M到10-7M)。
根据本发明使用的抗体还优选以高选择性而值得注意。当本发明的抗体对靶蛋白的亲和力比对独立的其它抗原如人血清白蛋白的亲和力好至少1倍，优选4倍或更优选9倍时，存在高选择性(亲和力可借助于例如表面等离子体共振光谱确定)。
此外，所用的本发明抗体优选是交叉反应性的。为了能够促进和更好地解释临床前研究，例如毒理学或活性研究(例如在异种移植小鼠中)，如果根据本发明使用的抗体不仅结合人靶蛋白而且结合用于研究的物种中的物种靶蛋白，则是有利的。在一个实施方案中，除了人靶蛋白之外，根据本发明使用的抗体对至少一种其它物种的靶蛋白是交叉反应的。对于毒理学和活性研究，优选使用啮齿类、狗和非人灵长类家族的物种。优选的啮齿类物种是小鼠和大鼠。优选的非人灵长类是恒河猴、黑猩猩和长尾猕猴。
在一个实施方案中，除了人靶蛋白之外，根据本发明使用的抗体与选自小鼠、大鼠和长尾猕猴(Macaca fascicularis)的至少一个其它物种的靶蛋白是交叉反应的。尤其优选的是根据本发明使用的抗体，其除了人靶蛋白之外，至少与小鼠靶蛋白是交叉反应的。优选交叉反应性抗体，其对其它非人物种的靶蛋白的亲和力与对人靶蛋白的亲和力相差不超过50倍，更特别地不超过十倍。
针对癌症靶分子的抗体
结合剂例如抗体或其抗原结合片段所针对的靶分子优选地是癌症靶分子。术语“癌症靶分子”描述了在一种或多种癌细胞种类上比在相同组织类型的非癌细胞上更丰富存在的靶分子。优选地，与相同组织类型的非癌细胞相比，癌症靶分子选择性地存在于一种或多种癌细胞种类上，其中选择性地描述了与相同组织类型的非癌细胞相比癌细胞上至少两倍的富集(“选择性癌症靶分子”)。癌症靶分子的使用允许使用根据本发明的缀合物选择性治疗癌细胞。
本领域普通技术人员可以利用他或她熟悉的方法(诸如例如重组表达)制备或可商购获得(诸如例如从Merck KGaA，Germany)对抗原(例如癌细胞抗原)特异性的抗体。在癌症治疗中已知的可商购获得的抗体的实例是Erbitux® (西妥昔单抗（cetuximab）， MerckKGaA)、 Avastin® (贝伐单抗（bevacizumab），Roche) 和 Herceptin® (曲妥珠单抗（trastuzumab）， Genentech)。曲妥珠单抗是IgG1κ型的重组人源化单克隆抗体，在基于细胞的测定(Kd =5 nM)中，它以高亲和力结合人表皮生长受体的胞外结构域。该抗体在CHO细胞中重组产生。
在优选的实施方案中，靶分子是选择性癌症靶分子。
在特别优选的实施方案中，靶分子是蛋白。
在一个实施方案中，靶分子是细胞外靶分子。在一个优选的实施方案中，细胞外靶分子是蛋白。
癌症靶分子是本领域技术人员已知的。这些的例子列于下面。
可应用的癌症靶分子的实例是：
靶 靶全称 NCBI　基因ID
ACVR1 活化素A受体1型，ALK2 90
ADAM17 ADAM金属肽酶结构域17 6868
ADAM9 ADAM金属肽酶结构域9 8754
ADGRE2 含有粘蛋白样、激素受体样2的egf-样模块 30817
AFP 甲胎蛋白 174
ALCAM 活化的白细胞粘附分子，CD166 214
ANPEP 丙氨酰(膜)氨肽酶，CD13 290
ANXA1 膜联蛋白A1 301
ASPH 天冬氨酸β-羟化酶 444
ASTL 虾红素样金属肽链内切酶(M12家族) 431705
AXL AXL受体酪氨酸激酶 558
BCAN 短缩素 63827
BDNF 脑源性神经营养因子 627
BMPR1B 骨形态发生蛋白受体1B型 658
BSG 基础免疫球蛋白（basigin）(Ok血型) 682
C16orf54 染色体16可读框54 283897
CA9 碳酸酐酶9 768
CCR3 C-C基序趋化因子受体3 1232
CCR8 CKR-L1；趋化因子(C-C基序)受体8 1237
CD180 CD180分子 4064
CD19 CD19分子 930
CD22 CD22分子 933
CD206 甘露糖受体C-型1 4360
CD248 CD248分子 57124
CD274 CD274分子 29126
CD276 CD276分子，B7H3 80381
CD33 CD33分子 945
CD37 CD37分子 951
CD38 CD38分子 952
CD3D CD3d分子 915
CD3E CD3e分子 916
CD44 CD44分子(印度血型) 960
CD46 CD46分子 4179
CD48 CD48分子 962
CD5 CD5分子 921
CD52 CD52分子 1043
CD6 CD6分子 923
CD70 CD70分子 970
CD72 CD72分子 971
CD74 CD74分子 972
CD79A CD79a分子 973
CD79B CD79b分子 974
CD99 CD99分子 4267
CDH15 钙粘素15 1013
CDH3 钙粘素3 1001
CDH6 钙粘素6 1004
CEACAM5 癌胚抗原相关细胞粘附分子5 1048
CEACAM6 癌胚抗原相关细胞粘附分子6 4680
CHL1 细胞粘附分子L1-样 10752
CLDN6 紧密连接蛋白（claudin）6 9074
CLEC12A C型凝集素结构域家族12成员A 160364
CLEC14A C型凝集素结构域家族14成员A 161198
CP 铜蓝蛋白(亚铁氧化酶（ferroxidase）) 1356
CR2 补体成分3D受体2 1380
CSPG4 硫酸软骨素蛋白聚糖4 1464
CT83 癌症/睾丸抗原83 203413
CTHRC1 胶原三螺旋重复蛋白1 115908
CTLA4 细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4 1493
CXCR4 C-X-C基序趋化因子受体4 7852
CXCR5 C-X-C基序趋化因子受体5 643
DKK1 dickkopfWNT信号传导途径抑制剂1 22943
DLL3 δ样Canonical notch配体（Canonical notch ligand）3 10683
DPEP1 二肽酶1 (肾脏的) 1800
DPEP3 二肽酶3 64180
EDNRB 内皮素受体B型 1910
EFNA4 肝配蛋白A4 1945
EGFR 表皮生长因子受体 1956
EMP2 上皮细胞膜蛋白2 2013
ENG 内皮糖蛋白 2022
ENPP3 外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3 5169
EPCAM 上皮细胞粘附分子 4072
EPHA2 EPH受体A2 1969
EPHB2 EPH受体B2 2048
ERBB2 erb-B2受体酪氨酸激酶2，HER2 2064
ERBB3 erb-B2受体酪氨酸激酶3 2065
F3 凝血因子III，组织因子 2152
FAP 成纤维细胞活化蛋白α 2191
FAT1 FAT非典型钙粘蛋白1 2195
FCGR1A IgG受体Ia的Fc片段 2209
FCGR2B IgG受体IIb的Fc片段 2213
FCRL1 Fc受体样1 115350
FCRL2 Fc受体样2 79368
FCRL5 Fc受体样5 83416
FGFR2 成纤维细胞生长因子受体2 2263
FGFR3 成纤维细胞生长因子受体3 2261
FGFR4 成纤维细胞生长因子受体4 2264
FLT1 fms相关酪氨酸激酶1 2321
FLT3 fms相关酪氨酸激酶3 2322
FLT4 fms相关酪氨酸激酶4 2324
FN1 纤连蛋白1 2335
FOLH1 叶酸水解酶(前列腺特异性膜抗原) 1 2346
FOLR1 叶酸受体1 2348
FOLR2 叶酸受体2 2350
FSHR 促卵泡激素受体 2492
FUT3 岩藻糖基转移酶3 (Lewis血型) 2525
GABRP γ-氨基丁酸(GABA) A受体，π 2568
GD2 神经节苷脂GD2 na
GD3 神经节苷脂D3 na
GPA33 糖蛋白A33 10223
GPC1 磷脂酰肌醇蛋白聚糖1
GPC3 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 2719
GPNMB 糖蛋白nmb 10457
GRPR 胃泌素释放肽受体 2925
GUCY2C 鸟苷酸环化酶2C 2984
HAVCR1 甲型肝炎病毒细胞受体1 26762
HAVCR2 甲型肝炎病毒细胞受体2 84868
HLA-DOB 主要组织相容性复合体，II类抗原DOB 3112
HLA-DRB1 主要组织相容性复合体，II类，DRβ1 3123
HMMR 瞬时受体电位阳离子通道，亚家族M，成员8 3161
HPN 丝氨酸穿膜蛋白酶(Hepsin) 3249
HSPA5 热休克蛋白家族A (Hsp70)成员5 3309
ICAM1 细胞间粘附分子1，CD54 3383
IGF1R 胰岛素样生长因子1受体 3480
IL1RAP 白细胞介素1受体辅助蛋白 3556
IL2 白细胞介素2 3558
IL20RA 白细胞介素20受体亚单位α 53832
IL2RA 白细胞介素2受体亚单位α 3559
IL3RA 白细胞介素3受体亚单位α 3563
IL6 白细胞介素6 3569
IL7R 白细胞介素7受体 3575
ITGA4 整合素亚单位α4 3676
ITGAV 整合素亚单位αV 3685
ITGB1 整合素亚单位β1 3688
ITGB6 整合素亚单位β6 3694
JAG1 锯齿状的1 182
JAG2 锯齿状的2 3714
KAAG1 肾相关抗原1 353219
KDR 血管内皮生长因子受体2 3791
KISS1R KISS1受体 84634
KIT KIT原癌基因受体酪氨酸激酶 3815
KLK2 激肽释放酶相关的肽酶2 3817
KLK3 激肽释放酶相关肽酶3 354
LAMP1 溶酶体相关膜蛋白1 3916
Lewis Y Lewis Y抗原 na
LGR5 含有富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5 8549
LHFPL3 脂肪瘤HMGIC融合伴侣样3 375612
LRRC15 含有富含亮氨酸重复序列的15 131578
LY6E 淋巴细胞抗原6复合物，位点E 4061
LY6G6D 淋巴细胞抗原6复合物，位点G6D 58530
LY75 γ-氨基丁酸(GABA) A受体，π，CD205 4065
LYPD1 含有LY6/PLAUR结构域的1 116372
LYPD3 含有LY6/PLAUR结构域的3，C4.4a 27076
MCAM 黑素瘤细胞粘附分子(CD146)，MUC18 4162
MELTF 黑素转铁蛋白MFI2 4241
MET MET原癌基因受体酪氨酸激酶 4233
MMP11 瞬时受体电位阳离子通道，亚家族M，成员8 4320
MMP16 基质金属肽酶16 4325
MRC1 甘露糖受体，CD206 4360
MRC<sub>2</sub> ENDO180；甘露糖受体，C型2 9902
MS4A1 跨膜4-结构域A1、CD20 931
MSLN 间皮素 10232
MST1R 巨噬细胞刺激1受体，RON 4486
MTX2 Metaxin2 10651
MUC1 粘蛋白1，细胞表面相关的 4582
MUC16 粘蛋白16，细胞表面相关的 94025
NCAM1 神经细胞粘附分子1 4684
NECTIN4 粘连蛋白细胞粘附分子4，PVRL4 81607
NOTCH1 notch 1 4851
NOTCH3 notch 3 4854
NPY1R 神经肽Y受体Y1 4886
NPY2R 神经肽Y受体Y2 4887
NPY4R 神经肽Y受体Y4 5540
NPY5R 神经肽Y受体Y5 4889
OR51E2 嗅觉受体家族51亚家族E成员2 81285
P2RX5 嘌呤能受体P2X5 5026
PDCD1 程序性细胞死亡1 5133
PDGFRB 血小板衍生生长因子受体β 5159
PRLR 催乳素受体 5618
PRNP 朊病毒蛋白 5621
PROM1 prominin 1 8842
PRR4 富含脯氨酸4 (泪的) 11272
PSCA 前列腺干细胞抗原 8000
PTK7 蛋白酪氨酸激酶7 (无活性) 5754
PTPRC 蛋白酪氨酸磷酸酶，受体类型C 5788
RNF43 RING型E3泛素转移酶 54894
ROR1 受体酪氨酸激酶样孤儿受体1 4919
SDC1 多配体聚糖1 6382
SEMA5B 脑信号蛋白5B 54437
Sialyl-Tn 糖表位 na
SLAMF6 SLAM家族成员6，CD352 114836
SLAMF7 SLAM家族成员7 57823
SLC16A3 溶质载体家族16，成员3 (一元羧酸转运蛋白4) 9123
SLC34A2 溶质载体家族34成员2 10568
SLC39A6 溶质载体家族39成员6 25800
SLC44A4 溶质载体族44成员4 80736
SLC5A1 溶质载体家族5 (钠/葡萄糖协同转运蛋白)，成员1 6523
SLC7A11 溶质载体家族7，(阳离子氨基酸转运蛋白，y+系统)成员11 23657
SLC7A5 溶质载体家族7成员5 8140
SLITRK6 SLIT和NTRK样家族成员6 84189
SPON2 脊椎蛋白（spondin）2，Mindin 10417
SSTR1 生长抑素受体1 6751
SSTR2 生长抑素受体2 6752
SSTR5 生长抑素受体5 6755
ST14 致瘤性抑制剂14蛋白，蛋白裂解酶（matriptase） 6768
STEAP1 前列腺六次跨膜上皮抗原1 26872
STEAP2 STEAP2金属还原酶 261729
SULF2 硫酸酯酶2 55959
TACSTD2 肿瘤相关钙信号转导蛋白2，TROP2 4070
TAX1BP3 Tax1（人T细胞白血病病毒Ⅰ型）结合蛋白3 30851
TDGF1 畸胎癌衍生生长因子1，CRIPTO 6997
TFRC 转铁蛋白受体，CD71 7037
TM4SF1 跨膜4L六家族成员1 4071
TMEFF2 具有EGF样和两个卵泡抑素样结构域的跨膜蛋白2 23671
TNC 腱生蛋白C 3371
TNFRSF10A TNF受体超家族成员10 a 8797
TNFRSF12A FN14，TWEAKR 51330
TNFRSF13C TNF受体超家族成员13C，BAFFR 115650
TNFRSF17 TNF受体超家族成员17，BCMA/CD269 608
TNFRSF4 TNF受体超家族成员4 7293
TNFRSF8 TNF受体超家族成员8，CD30 943
TNFSF11 RANKL 8600
TNFSF13B 肿瘤坏死因子超家族成员13 b 10673
TNFSF9 肿瘤坏死因子超家族成员9 8744
TPBG 滋养层糖蛋白 7162
TRPM4 瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员4 54795
TRPM8 瞬时受体电位阳离子通道，亚家族M，成员8 79054
UPK1B 尿溶蛋白（uroplakin）1B 7348
VCAM1 血管细胞粘附分子1 7412
VEGFA 血管内皮生长因子A 7422
VTCN1 含有V-SET结构域的T细胞活化抑制剂1，B7H4 79679
在一个实施方案中，结合剂是结合蛋白。在优选的实施方案中，结合剂是抗体、抗原-结合抗体片段、多特异性抗体或抗体模拟物。
优选的抗体模拟物是亲合体、adnectins、抗运载蛋白（anticalins）、DARPins、avimers或纳米抗体（nanobodies）。优选的多特异性抗体是二特异性和三特异性抗体。
在优选的实施方案中，结合剂是抗体或抗原-结合抗体片段，更优选分离的抗体或分离的抗原-结合抗体片段。
优选的抗原-结合抗体片段是Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、双特异性抗体、DAbs、线性抗体和scFv。特别优选的是Fab、双特异性抗体和scFv。
在特别优选的实施方案中，结合剂是抗体。特别优选的是单克隆抗体或其抗原-结合抗体片段。进一步特别优选的是人、人源化或嵌合抗体或其抗原-结合抗体片段。
本领域普通技术人员可以使用已知的方法，诸如例如化学合成或重组表达，制备结合癌症靶分子的抗体或抗原-结合抗体片段。癌症靶分子的结合剂可以商购获得，或者可以由本领域普通技术人员使用已知的方法例如化学合成或重组表达制备。制备抗体或抗原-结合抗体片段的其它方法描述于WO2007/070538(参见第22页“抗体”)中。本领域技术人员知道如何汇编诸如噬菌体表面呈现库的方法(例如Morphosys HuCAL Gold)并将其用于发现抗体或抗原-结合抗体片段(参见WO 2007/070538，第24页及其后和第70页的AK实施例1、第72页的 AK 实施例 2)。使用来自B细胞的DNA库制备抗体的其它方法例如在第26页中描述(WO2007/070538)。人源化抗体的方法在WO2007070538的第30-32页有描述，并在Queen等人, Pros. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033, 1989 或WO 90/0786中有详细描述。此外，一般而言重组表达蛋白和特别是抗体的方法是本领域技术人员已知的(参见，例如，Berger和Kimrnel(Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods inEnzymology, Vo1. 152, Academic Press, Inc.)；Sambrook, 等人, (MolecularCloning: A Laboratory Manual, (Second Edition, Cold Spring Harbor LaboratoryPress; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. 1-3)；Current Protocols inMolecular Biology, (F. M. Ausabel 等人，[编辑], Current Protocols, GreenPublishing Associates, Inc. / John Wiley & Sons, Inc.)；Harlow 等人，,(Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1988, Paul[编辑]); Fundamental Immunology, (Lippincott Williams &Wilkins (1998))； 和Harlow, 等人， (Using Antibodies: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press (1998))。本领域技术人员知道表达蛋白/抗体所必需的相应载体、启动子和信号肽。常见的方法也描述于WO2007/070538第41-45页。制备IgG1抗体的方法描述于例如WO2007/070538的实施例6第74页及其后。允许在结合其抗原后确定抗体内化的方法是本领域技术人员已知的，并且描述于例如WO2007/070538第80页中，本领域技术人员能够使用WO2007/070538中描述的方法，其已经用于制备碳酸酐酶IX (Mn)抗体，类似于制备具有不同靶分子特异性的抗体。
抗-EGFR抗体
结合癌症靶分子EGFR的抗体的实例是西妥昔单抗(INN号7906)、帕尼单抗(INN号8499)、尼妥珠单抗(INN号8545)、“TPP-4030”和“TPP-5653”。西妥昔单抗(药物库登录号DB00002)是一种嵌合抗EGFR1抗体，其在SP2/0小鼠骨髓瘤细胞中产生，由ImClone SystemsInc/Merck KgaA/Bristol-Myers Squibb Co.销售。西妥昔单抗适用于治疗转移性、EGFR表达性、具有野生型K-Ras基因的结肠直肠癌。亲和力为10-10M。
在优选的实施方案中，抗EGFR抗体选自西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、扎鲁木单抗（zalutumumab）、耐昔妥珠单抗（necitumumab）、马妥珠单抗、RG-716、GT-MAB 5.2-GEX、ISU-101、ABT-806、SYM-004、MR1-1、SC-100、MDX-447、DXL-1218、“TPP-4030”和“TPP-5653”。
在特别优选的实施方案中，抗-EGFR抗体选自西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、扎鲁木单抗、耐昔妥珠单抗和马妥珠单抗。
本领域技术人员知道可用于从上述抗体的CDR区通过序列变异制备其它抗体的方法，这些其它抗体对靶分子具有相似或更好的亲和力和/或特异性。
抗-HER2抗体
根据本发明，使用抗-HER2抗体或其抗原-结合片段。与癌症靶分子Her2结合的抗体的实例是曲妥珠单抗(Genentech)。曲妥珠单抗是一种尤其用于治疗乳腺癌的人源化抗体。TPP-1015是曲妥珠单抗的变体。
表述“抗-HER2抗体”或“特异性结合HER2的抗体”涉及结合癌症靶分子HER2(ERBB2，UniProtKB/Swiss-Prot参考文献P04626)的抗体，优选具有足以用于诊断和/或治疗应用的亲和力。在具体的实施方案中，抗体结合的解离常数(KD)≤1μM、≤100 nM、≤10nM、≤1 nM、≤0.1 nM、≤0.01 nM、或≤0.001 nM。
与HER2结合的抗体的其它实例是，除了曲妥珠单抗(INN7637，CAS号：RN：180288-69-1)和帕妥珠单抗 (CAS号：380610-27-5)之外，还有WO2009/123894-A2、WO200/8140603-A2或WO2011/044368-A2中公开的抗体。抗-HER2缀合物的实例是曲妥珠单抗-emtansine(INN号9295)。通过引用，这些抗体及其抗原-结合片段并入本文，并且它们可以用于本发明的上下文中。
抗-TWEAKR抗体
抗-TWEAKR抗体和抗原-结合片段的实例描述于WO 2014/198817(A1)和WO 2015/189143(A1)中。通过引用，WO 2014/198817(A1)和WO 2015/189143(A1)的所有抗体都并入本发明的说明书中，且它们可用于本发明。抗体的序列示于WO 2014/198817(A1)的表31和表32中。优选的是称为TPP-2090和TPP-2658的抗体、衍生自所述抗体的抗原-结合片段和抗体的变体。在另一个实施方案中，抗-TWEAKR抗体或抗原-结合抗体片段包含WO2014/198817(A1)表31或表32中所列抗体的至少一个、两个或三个CDR氨基酸序列。
另外，与TWEAKR结合的抗体是本领域技术人员已知的，参见例如WO2009/020933(A2)(例如PDL-192)或WO2009140177(A2)(例如BIIB036(P4A8))。
抗-TWEAKR抗体和抗原-结合片段的其它实例是ITEM-4和ITEM-4衍生抗体。ITEM-4是由Nakayama等人描述（Nakayama,等人, 2003, Biochem Biophy Res Comm, 306:819-825）的抗-TWEAKR抗体。基于CDR移植的该抗体的人源化变体由Zhou等人（Zhou等人, 2013,J Invest Dermatol. 133(4):1052-62）并且在WO2009/020933中描述。ITEM-4是中等竞争地（agonistically）或竞争地作用的抗-TWEAKR抗体。
抗-CD123-抗体
本领域技术人员熟悉与CD123结合的抗体。
Sun等人(Sun等人，1996，Blood 87(1)：83-92）描述了单克隆抗体7G3的产生和性质，其与IL-3Rα、CD123的N-末端结构域结合。美国专利号6,177,078(Lopez)涉及抗-CD123抗体7G3。该抗体的嵌合变体(CSL360)描述于WO2009/070844中，且人源化形式(CSL362)描述于WO2012/021934中。7G3抗体的序列公开于EP2426148中。
WO2013/173820中公开了称为12F1的另一种抗-CD123抗体。
抗-CXCR5抗体
根据本发明，使用抗-CXCR5抗体。
表述“抗-CXCR5抗体”或“特异性与CXCR5结合的抗体”涉及结合癌症靶分子CXCR5(NCBI参考序列：NP _001707.1)的抗体，优选具有足以用于诊断和/或治疗应用的亲和力。在具体的实施方案中，抗体结合的解离常数(KD)≤1μM、≤100 nM、≤10 nM、≤1 nM、≤0.1nM、≤0.01 nM或≤0.001 nM。
与CXCR5结合的抗体和抗原-结合片段的实例是本领域技术人员已知的，并且描述于例如EP2195023中。
大鼠抗体RF8B2(ACC2153)的杂交瘤细胞购自DSMZ，且通过标准方法鉴定抗体序列。制备了在67位(S67F)具有点突变的该抗体的嵌合变体TPP-9024。此外，大鼠抗体序列构成了通过CDR移植到人框架中获得的人源化抗体的起点。
这些抗体和抗原-结合片段可用于本发明的上下文中。
在本发明的上下文中特别优选人源化抗-CXCR5抗体TPP-9574。
抗-B7H3-抗体
根据本发明，使用抗-B7H3抗体。
表述“抗-B7H3抗体”或“特异性与B7H3结合的抗体”涉及结合癌症靶分子B7H3的抗体(UniProtKB/Swiss-Prot参考：Q5ZPR3)，优选具有足以用于诊断和/或治疗应用的亲和力。在具体的实施方案中，抗体结合的解离常数(KD)≤1μM、≤100 nM、≤10 nM、≤1 nM、≤0.1 nM、≤0.01 nM或≤0.001 nM。
例如，通过筛选重组鼠B7H3(鼠CD276；基因ID：102657)和人B7H3(人CD276；基因ID：80381)表达细胞的噬菌体表面呈现库，产生抗-B7H3抗体。特别地， 抗体TPP-8382是优选的实例。将以这种方式获得的抗体转换为（be reformatted into）人IgG1格式。这两种抗体用于本文所述的工作实施例。此外，与B7H3结合的抗体是本领域技术人员已知的。
在本发明的上下文中特别优选人源化抗-B7H3抗体TPP-8382。
抗-C4.4a-抗体
根据本发明，使用C4.4a抗体。
表述“抗-C4.4a抗体”或“特异性与C4.4a结合的抗体”涉及结合癌症靶分子C4.4a(LYPD3，UniProtKB/Swiss-Prot参照：O95274)的抗体，优选具有足以用于诊断和/或治疗应用的亲和力。在具体的实施方案中，抗体结合的解离常数(KD)≤1μM、≤100 nM、≤10 nM、≤1 nM、≤0.1 nM、≤0.01 nM或≤0.001 nM。
抗-C4.4a抗体和抗原-结合片段的实例描述于WO2012/143499A2中。通过参考，WO2012/143499A2的所有抗体均引入本发明的说明书中，且它们可用于本发明。抗体的序列在WO2012/143499A2的表1中给出，其中每行在列1中显示出所列出的抗体的可变轻链或可变重链的各自CDR氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗-C4.4a抗体或其抗原-结合抗体片段在与表达C4.4a的细胞结合后被所述细胞内化。
在另一个实施方案中，抗-C4.4a抗体或抗原-结合抗体片段包含WO2012/143499A2的表1或WO2012/143499A2的表2中所列抗体的至少一个、两个或三个CDR氨基酸序列。这样的抗体的优选实施方案同样列于WO2012/143499A2中，并通过引用并入本文。
在本发明的上下文中特别优选人源化抗-C4.4a抗体TPP-509和TPP-668。
抗体序列
在本申请中，参考下表中所示的优选抗体：
Figure 564004DEST_PATH_IMAGE078
TPP-509是抗-C4.4a抗体，其包含可变重链，所述可变重链包含如SEQ ID NO:2所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:3所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:4所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO:6所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:7所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:8所示的轻链的可变CDR3序列。
TPP-668是抗-C4.4a抗体，其包含可变重链，所述可变重链包含如SEQ ID NO:12所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:13所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:14所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO:16所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:17所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:18所示的轻链的可变CDR3序列。
TPP-1015是抗-HER2抗体，其包含可变重链，所述可变重链包含如SEQ ID NO:22所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:23所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:24所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO:26所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:27所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:28所示的轻链的可变CDR3序列。
TPP-8382是抗-B7H3抗体，其包含可变重链，所述可变重链包含如SEQ ID NO:32所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:33所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:34所示的重链的可变CDR3序列，以及
可变轻链，其包含如SEQ ID NO:36所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:37所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:38所示的轻链的可变CDR3序列。
TPP-9574是抗-CXCR5抗体，其包含可变重链，所述可变重链包含如SEQ ID NO:42所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:43所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:44所示的重链的可变CDR3序列，以及
可变轻链，其包含如SEQ ID NO:46所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:47所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:48所示的轻链的可变CDR3序列。
TPP-509是一种抗体，其优先包含如SEQ ID NO:1所示的重链可变区(VH)和SEQ IDNO:5所示的轻链可变区(VL)。
TPP-668是一种抗体，其优先包含如SEQ ID NO：11所示的重链可变区(VH)和SEQID NO:15所示的轻链可变区(VL)。
TPP-1015是一种抗体，其优先包含如SEQ ID NO:21所示的重链可变区(VH)和SEQID NO:25所示的轻链可变区(VL)。
TPP-8382是一种抗体，其优先包含如SEQ ID NO：31所示的重链可变区(VH)和如SEQ ID NO：35所示的轻链可变区(VL)。
TPP-9574是一种抗体，其优先包含如SEQ ID NO：41所示的重链可变区(VH)和如SEQ ID NO：45所示的轻链可变区(VL)。
TPP-509是一种抗体，其优先包含如SEQ ID NO:9所示的重链区域和如SEQ ID NO:10所示的轻链区域。
TPP-668是一种抗体，其优先包含如SEQ ID NO:19所示的重链区域和SEQ ID NO:20所示的轻链区域。
TPP-1015是一种抗体，其包含如SEQ ID NO:29所示的重链区域和如SEQ ID NO:30所示的轻链区域。
TPP-8382是一种抗体，其优先包含如SEQ ID NO:39所示的重链区域和如SEQ IDNO:40所示的轻链区域。
TPP-9574是一种抗体，其优先包含如SEQ ID NO：49所示的重链区域和如SEQ IDNO:50所示的轻链区域。
本发明的DNA分子
本发明还涉及编码本发明抗体或其抗原-结合片段的DNA分子。在某些情况下，这些序列被优化用于哺乳动物表达。本发明的DNA分子不限于本文公开的序列，还包括其变体。本发明的DNA变体可以参照它们在杂交中的物理性质来描述。技术人员将认识到，DNA可以用于鉴定其补体，并且由于DNA是双链的，所以使用核酸杂交技术是相当或同源的。还将认识到杂交可以以小于100%的互补性发生。然而，如果适当选择条件，杂交技术可用于根据DNA序列与特定探针的结构相关性对所述DNA序列进行区分。关于这样的条件的指导参见Sambrook等人，1989（见前文）和Ausubel等人，1995 (Ausubel, F. M.，Brent, R.，Kingston, R. E.， Moore, D. D.， Sedman, J. G.， Smith, J. A., & Struhl, K. 编辑(1995)。Current Protocols in Molecular Biology。 New York: John Wiley andSons)。
两个多核苷酸序列之间的结构相似性可以表达为两个序列彼此杂交的条件的“严格性”的函数。如本文所用，术语“严格性”是指条件不利于杂交的程度。严格的条件强烈不利于杂交，并且在这样的条件下仅结构最相关的分子将彼此进行杂交。相反，非严格条件有利于显示较低程度结构相关性的分子进行杂交。因此，杂交严格性与两个核酸序列的结构关系直接相关。
杂交严格性与许多因素相关，包括总的DNA浓度、离子强度、温度、探针大小和破坏氢键的试剂的存在。促进杂交的因素包括高DNA浓度、高离子强度、低温、较长的探针尺寸和不存在破坏氢键的试剂。杂交通常分两个阶段进行：“结合”阶段和“洗涤”阶段。
功能上等同的DNA变体
本发明范围内的另一类DNA变体可以参考它们编码的产物来描述。这些功能上等同的多核苷酸的特征在于由于遗传密码的简并性使它们编码相同的肽序列的事实。
认识到本文提供的DNA分子的变体可以以几种不同的方式构建。例如，它们可以构建为完全合成的DNA。有效合成寡核苷酸的方法是广泛可用的。参见Ausubel等人，章节2.11，附录（Supplement）21 (1993)。重叠寡核苷酸可以以由Khorana等人，J. Mol. Biol.72:209-217 (1971)（还参见 Ausubel 等人，见前文，章节8.2）首次报道的方式合成和装配。合成的DNA优选设计成在基因的5'和3'末端具有方便的限制性位点，以便于克隆到合适的载体中。
如所示出的，产生变体的方法是从本文公开的DNA之一开始，然后进行定点诱变。参见Ausubel等人，见前文，第八章, 附录 37 (1997)。在通常的方法中，将靶DNA克隆到单链DNA噬菌体载体中。分离单链DNA并与含有所需一种或多种核苷酸改变的寡核苷酸杂交。合成互补链，并将双链噬菌体导入宿主中。一些所得的子代将含有所需的突变体，这可以使用DNA测序来确认。此外，各种方法可供使用来增加子代噬菌体是期望突变体的可能性。这些方法是本领域技术人员熟知的，用于产生这些突变体的试剂盒是可商购获得的。
重组DNA构建体和表达
本发明还提供了重组DNA构建体，其包含编码本发明优选抗体的一个或多个核苷酸序列。本发明的重组构建体可以与载体，如质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体结合使用，向其中插入编码本发明抗体或其抗原-结合片段或其变体的DNA分子。
本文提供的抗体、抗原结合部分或其变体可以通过在宿主细胞中重组表达编码轻链和重链或其部分的核酸序列来制备。为了重组表达抗体、抗原结合部分或其变体，可以用一种或多种携带编码轻链和/或重链或其部分的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，使得轻链和重链在宿主细胞中表达。使用标准重组DNA方法制备和/或获得编码重链和轻链的核酸，将这些核酸整合到重组表达载体中，并将载体导入宿主细胞中，如Sambrook,Fritsch和Maniatis (编辑), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, SecondEdition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)，Ausubel, F. M.等人(编辑) CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)以及在Boss等人的美国专利 No. 4,816,397中所描述的那些。
此外，编码重链和/或轻链可变区的核酸序列可以被转化成例如编码全长抗体链、Fab片段的核酸序列，或转化成scFv。VL-或VH-编码DNA片段可以可操作地连接(使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列符合读框)至编码例如抗体恒定区或柔性连接子的另一个DNA片段。人重链和轻链恒定区的序列是本领域已知的(参见例如Kabat, E. A.,等人 (1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)，并且包含这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。
为了产生编码scFv的多核苷酸序列，可将VH-和VL-编码核酸与编码柔性连接子的另一片段可操作地连接，以使VH和VL序列可被表达为连续的单链蛋白，VL和VH区通过柔性连接子连接(参见例如Bird 等人， (1988) Science 242:423-426； Huston等人(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883； McCafferty 等人， Nature (1990) 348:552-554)。
为了表达抗体、其抗原结合片段或其变体，可以使用标准的重组DNA表达方法(参见，例如，Goeddel; Gene Expression Technology。 Methods in Enzymology 185,Academic Press, San Diego, Calif. (1990))。例如，可将编码所需多肽的DNA插入表达载体，然后转染到合适的宿主细胞中。合适的宿主细胞是原核和真核细胞。原核宿主细胞的实例是例如细菌，真核宿主细胞的实例是酵母、昆虫和昆虫细胞、植物和植物细胞、转基因动物、或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，将编码重链和轻链的DNA插入到分开的载体中。在其它实施方案中，将编码重链和轻链的DNA插入相同的载体中。应当理解，表达载体的设计，包括调节序列的选择，受诸如宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平以及表达是组成型还是诱导型等因素的影响。
因此，本发明的实施方案也是包含载体或核酸分子的宿主细胞，其中宿主细胞可以是高等真核宿主细胞（如哺乳动物细胞）、低等真核宿主细胞（如酵母细胞），并且可以是原核细胞（如细菌细胞）。
本发明的另一个实施方案是使用宿主细胞产生抗体和抗原结合片段的方法，包括在合适的条件下培养宿主细胞并回收所述抗体。
因此，本发明的另一个实施方案是用本发明的宿主细胞产生根据本发明的抗体，并将这些抗体纯化到至少95%重量的同质性。
细菌表达
通过将编码所需蛋白的DNA序列与合适的翻译起始和终止信号一起插入到具有功能启动子的可操作阅读相中，构建了用于细菌用途的有用表达载体。载体将包含一个或多个表型可选择标记物和复制起点以确保载体的维持，并且如果需要，提供宿主内的扩增。用于转化的合适的原核宿主包括但不限于大肠杆菌（E. coli.）、枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）、鼠伤寒沙门氏菌（salmonella typhimurium）和假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属内的各种物种。
细菌载体可以是例如基于噬菌体、质粒或噬菌粒的。这些载体可以含有可选择标记物和细菌复制起点，其来源于通常含有公知克隆载体pBR322 (ATCC 37017)的要素的商购可获得的质粒。在转化合适的宿主菌株并使宿主菌株生长至合适的细胞密度后，通过合适的方法(例如，温度转换或化学诱导)将选择的启动子去抑制/诱导，并将细胞培养额外的时间。通常通过离心收获细胞，通过物理或化学方法破碎，保留所得粗制提取物用于进一步纯化。
在细菌系统中，根据被表达的蛋白的打算的用途，可以有利地选择许多表达载体。例如，当要生产大量这样的蛋白时，为了产生抗体或筛选肽库，例如，指导容易纯化的高水平融合蛋白产物表达的载体可能是理想的。
因此，本发明的一个实施方案是包含编码本发明的新抗体的核酸序列的表达载体。
本发明的抗体或其抗原-结合片段或其变体包括天然纯化的产物、化学合成方法的产物和通过重组技术从原核宿主产生的产物，所述原核宿主包括例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属内的各种物种，优选来自大肠杆菌细胞。
哺乳动物表达
用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导哺乳动物细胞中蛋白表达的高水平的病毒要素，如衍生自巨细胞病毒(CMV) (如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。抗体的表达可以是组成型的或调节的(例如通过添加或去除小分子诱导物如与Tet系统结合的四环素诱导)。关于病毒调节要素及其序列的进一步描述，参见例如Stinski的U.S. 5,168,062、Bell等人的U.S. 4,510,245和Schaffner等人的U.S. 4,968,615。重组表达载体也可包括复制起点和可选择标记物(参见例如U.S.4,399,216、4,634,665和U.S. 5,179,017)。合适的可选择标记物包括在载体已经被引入的宿主细胞上赋予对药物如G418、嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟菌素、吉欧霉素（zeocin）/博莱霉素或氨甲蝶呤的抗性的基因，或利用营养缺陷型的可选择标记物如谷氨酰胺合成酶(Bebbington等人，Biotechnology (N Y)。 1992 Feb;10(2):169-75)。例如，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因赋予对氨甲蝶呤的抗性，新霉素抗性基因（neo gene）赋予对G418的抗性，来自土曲霉（Aspergillus terreus）的bsd基因赋予对杀稻瘟菌素的抗性，嘌呤霉素N-乙酰转移酶赋予对嘌呤霉素的抗性，Sh ble基因产物赋予对吉欧霉素的抗性，并且对潮霉素的抗性由大肠杆菌潮霉素抗性基因(hyg或hph)赋予。可选择标记物如DHFR或谷氨酰胺合成酶也可用于与MTX和MSX联合的扩增技术。
表达载体转染入宿主细胞可以使用标准技术进行，如电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、脂转染、基于聚阳离子的转染如基于聚乙烯亚胺(PEI)的转染和DEAE-葡聚糖转染。
用于表达本文提供的抗体、其抗原结合片段或其变体的合适的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)，如CHO-K1、CHO-S、CHO-K1SV[包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220和Urlaub等人，Cell. 1983 Jun;33(2):405-12，与DHFR选择性标记物（例如，如在R. J. Kaufman和P. A.Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621中的描述）一起使用；以及Fan等人, BiotechnolBioeng. 2012 Apr;109(4):1007-15中示例性的其它敲除细胞]、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞、HEK293细胞、HKB11细胞、BHK21细胞、CAP细胞、EB66细胞和SP2细胞。
在表达系统中，表达也可以是瞬时的或半稳定的，所述表达系统如HEK293、HEK293T、HEK293-EBNA、HEK293E、HEK293-6E、HEK293-Freestyle、HKB11、Expi293F、293EBNALT75、CHO Freestyle、CHO-S、CHO-K1、CHO-K1SV、CHOEBNALT85、CHOS-XE、CHO-3E7或CAP-T细胞(例如Durocher等人，Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15;30(2):E9)。
在一些实施方案中，表达载体被设计成使得表达的蛋白被分泌到宿主细胞在其中生长的培养基中。可以使用标准蛋白纯化方法从培养基中回收抗体、其抗原结合片段或其变体。
纯化
本发明的抗体或其抗原-结合片段或其变体可以通过公知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化，所述方法包括但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、蛋白A色谱、蛋白G色谱、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。高效液相色谱(“HPLC”)也可用于纯化。参见例如Colligan，CurrentProtocols in Immunology，或Current Protocols in Protein Science，John Wiley &Sons,NY, N.Y., (1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章，其各自通过引用整体并入本文。
本发明的抗体或其抗原-结合片段或其变体包括天然纯化的产物、化学合成步骤的产物和通过重组技术从真核宿主产生的产物，所述真核宿主包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。根据重组生产过程中所用的宿主，本发明的抗体可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。这样的方法描述于许多标准实验室手册，如Sambrook， 见前文，章节17.37-17.42； Ausubel， 见前文， 第10、12、13、16、18 和20章。
在优选的实施方案中，将抗体纯化(1)至大于95%重量的抗体，如例如通过Lowry方法、UV-Vis光谱法或通过SDS-毛细管凝胶电泳(例如在Caliper LabChip GXII、GX90或Biorad Bioanalyzer装置上)所确定的，并且在进一步优选的实施方案中，大于99%重量，(2)至足以获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染通过SDS-PAGE至同质。分离的天然存在的抗体包括重组细胞内原位的抗体，因为抗体的天然环境的至少一种成分将不存在。然而，通常地，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。
代谢物
在将ADC引入肿瘤细胞并随后解离缀合物后，可形成细胞毒性代谢物，其在肿瘤细胞内释放并可在其中直接和选择性地呈现其作用。
为了本发明的目的，术语代谢物理解为根据本发明的结合剂或其衍生物的缀合物的(例如，酶促或化学)裂解的产物。
本发明因此还涉及通过裂解本文描述的任何缀合物可获得的代谢物。
因此，代谢物将包含活性组分的分子，其中所述活性组分是NAMPT抑制剂。
在一个实施方案中，如果根据本发明的缀合物包含稳定的连接子，那么NAMPT抑制剂的代谢物本身包含结合剂蛋白或肽的氨基酸残基，优选半胱氨酸或赖氨酸残基。
在另一个实施方案中，如果根据本发明的缀合物包含可裂解的连接子，那么NAMPT抑制剂的代谢物本身可能仅与连接子部分的一部分连接，即NAMPT抑制剂的代谢物本身不包含结合剂蛋白或肽的半胱氨酸和/或赖氨酸残基。
一般程序
根据本发明的缀合物可以根据以下方案1至制备。
下面描述的方案和程序示出了本发明式(I)化合物的合成途径，且并非意图限制性的。对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以以各种方式修改方案中示例性的转化顺序。因此，在方案中示例性的转化的顺序并非意图限制性的。此外，任何取代基R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、V、W、Y、Z和Het的互变可在示例性的转化之前和/或之后实现。这些修饰可以是如引入保护基、裂解保护基、还原或氧化官能团、卤化、金属化、取代或本领域技术人员已知的其它反应。这些转化包括引入允许取代基进一步互变的官能度的那些。合适的保护基及其引入和裂解是本领域技术人员公知的(参见例如T.W. Greene和P.G.M. Wuts在Protective Groups in Organic Synthesis,第三版, Wiley 1999中)。具体的实施例在随后的段落中描述。
二氢哒嗪酮类的外消旋和手性合成描述于以下代表性专利和期刊中：WO2011138427；US4666902；US20080027041；EP185964；EP196005；EP175363；EP240026；EP400519；EP344634；DE10010423；WO2001064652；DE10010426；DE10010430；DE2304977；Chem. Pharm. Bull. 46(1), 84-96 (1998)；J. Med. Chem. 39, 297-303 (1996)； J.Med. Chem. 50, 3242-3255 (2007)； Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 21,5493-5497 (2011)。
制备式(Ia)化合物的一种途径描述于方案1中。
Figure 916488DEST_PATH_IMAGE079
方案1：制备式(Ia)化合物的途径，其中R1、R2、R3、R4、q、m、t、V、W、Y、Z和Het具有如前文对于通式(I)所给出的含义。
B1代表离去基团，诸如例如卤代烷基，诸如例如三氯甲基，或酰亚胺，诸如例如吡咯烷-2,5-二酮或对硝基苯基。
此外，取代基R1、R2、R3、R4、V、W、Y、Z和Het中任一个的互变可在示例性转化之前和/或之后实现。这些修饰可以是如引入保护基、裂解保护基、还原或氧化官能团、卤化、金属化、取代或本领域技术人员已知的其它反应。这些转化包括引入允许取代基的进一步互变的官能度的那些。合适的保护基及其引入和裂解是本领域技术人员公知的(参见例如T.W.Greene and P.G.M. Wuts在Protective Groups in Organic Synthesis, 第三版, Wiley1999中)。具体的实施例在随后的段落中描述。
化合物1-1、1-2、1-7和1-9可以商购得到，或者可以按照本领域技术人员可理解的公共领域可供的程序制备。具体的实施例在随后的段落中描述。
通式(1-1)的适当取代的芳香酮，诸如例如1-(4-硝基苯基)乙酮，可以与适当的杂芳基羰基化合物(1-2)（诸如例如喹啉-5-甲醛），在碱接着是酸存在下（诸如例如乙酸铵接着甲酸），在适当的溶剂体系（诸如例如THF）中，在0℃至各自溶剂的沸点范围的温度缩合，优选反应在0℃进行，以提供通式(1-3)的烯酮。
通式(1-3)的烯酮可以通过与适当的氰化物（诸如例如丙酮氰醇）反应，在适当的催化剂（诸如例如(9S)-1-[3,5-双(三氟甲基)苄基]-6',9-二甲氧基辛可宁-1-鎓（dimethoxycinchonan-1-ium）溴化物）存在下，在适当的溶剂体系（诸如例如甲苯）中，在-20℃至各自溶剂的沸点范围的温度，优选反应在0℃至40℃之间进行，从而转化为通式(1-4)的氰基酮。
通式(1-4)的中间体可以与适当的肼（诸如例如肼一水合物）在适当的酸（诸如例如乙酸）存在下，在适当的溶剂体系（诸如例如乙醇）中，在0℃至各自溶剂的沸点的温度反应，优选反应在100℃进行，以提供通式(1-5)的中间体。
通式(1-5)的中间体可以还原成通式(1-6)的中间体。用氢在适当的催化剂(例如钯炭)存在下，在适当的溶剂体系(诸如例如乙醇)中，在0℃至各自溶剂的沸点范围的温度，优选在室温进行反应，得到通式(1-6)的中间体。
在适当的碱（诸如例如N,N-二甲基吡啶-4-胺）存在下，在适当的溶剂体系（诸如例如DMF）中，在0℃至各自溶剂的沸点之间的温度，用通式(1-7)的碳酸酯（诸如例如1,1'-[羰基二(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮）处理通式(1-6)的中间体，优选反应在室温进行，以形成所需的通式(1-8)的中间体。
通式(1-8)的中间体可以通过与通式(1-11)的适当取代的胺（诸如例如2,3-二氢-1H-吡咯并[3,4-c]吡啶）在适当的碱（诸如例如三乙胺）存在下，在适当的溶剂体系（诸如例如DMF）中，在0℃至各自溶剂的沸点范围的温度反应，优选反应在室温进行，从而转化为式(Ia)的化合物。
制备式(Ia)化合物的可替代途径描述于方案2中。
Figure 859037DEST_PATH_IMAGE080
方案2：制备式(Ia)化合物的途径，其中R1、R2、R3、R4、q、m、t、V、W、Y、Z和Het具有前文对于通式(I)给出的含义。
B1代表离去基团，诸如例如卤代烷基（如例如三氯甲基），或酰亚胺（诸如例如吡咯烷-2,5-二酮）。
PG1代表胺保护基，诸如例如乙酰基。
此外，取代基R1、R2、R3、R4、B1、m、q、t、V、W、Y、Z和Het中任何取代基的互变可在示例性转化之前和/或之后实现。这些修饰可以是如引入保护基、裂解保护基、还原或氧化官能团、卤化、金属化、取代或本领域技术人员已知的其它反应。这些转化包括引入允许取代基进一步互变的官能度的那些。合适的保护基及其引入和裂解是本领域技术人员公知的(参见例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts， Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，Wiley 1999)。具体的实施例在随后的段落中描述。
化合物1-7、1-10和1-12可以商购得到，或者可以按照本领域技术人员可理解的公共领域可供的程序制备。具体的实施例在随后的段落中描述。
通式(1-10)的适当取代的芳香酮（诸如例如(4-乙酰基苯基)氨基甲酸叔丁酯），可以用适当的溴化试剂（诸如例如N-溴代琥珀酰亚胺），在适当的溶剂体系（诸如例如THF和水）中，在-20℃至各自溶剂的沸点范围的温度溴化，优选反应在0℃进行，以提供通式(1-11)的α-溴酮。
通式(1-11)的α-溴酮可与通式(1-12)的中间体(诸如例如2-(5-甲基-1,3,4-氧杂二唑-2-基)乙酸乙酯)在适当的碱(诸如例如二(三甲基甲硅烷基酰胺)钾)存在下，在适当的溶剂体系(诸如例如THF)中，在-20℃至各自溶剂的沸点范围的温度反应，优选反应在0℃进行，以提供通式(1-13)的酮酯。
通式(1-13)的酮酯可以与适当的肼（诸如例如肼一水合物）在适当的酸（诸如例如乙酸）存在下，在适当的溶剂体系（诸如例如二氯甲烷）中，在0℃至各自溶剂的沸点范围的温度反应，优选反应在40℃进行，以提供通式(1-14)的中间体。
通式(1-14)的中间体可以与适当的布朗斯台德酸（诸如例如三氟乙酸）在适当的溶剂体系（诸如例如二氯甲烷）中，在0℃至各自溶剂的沸点范围的温度反应，优选该反应在室温进行，以提供通式(1-6)的中间体。
在适当的碱（诸如例如N,N-二甲基吡啶-4-胺）存在下，在适当的溶剂体系（诸如例如DMF）中，在0℃至各自溶剂的沸点之间的温度，用通式(1-7)的碳酸酯（诸如例如1,1'-[羰基二(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮）处理通式(1-6)的中间体，优选反应在室温进行，以形成所需的通式(1-8)的中间体。
通式(1-8)的中间体可以通过与通式(1-9)的适当取代的胺（诸如例如2,3-二氢-1H-吡咯并[3,4-c]吡啶）在适当的碱（诸如例如三乙胺）存在下，在适当的溶剂体系（诸如例如DMF）中，在0℃至各自溶剂的沸点范围的温度反应，优选反应在室温进行，从而转化为式(Ia)的化合物。
制备式(Ia)化合物的可替代途径描述于方案3中。
Figure 296971DEST_PATH_IMAGE081
方案3：制备式(1a)化合物的方法，其中R1、R2、B1、m、q、t、V、W、Y、Z和Het具有前文对通式(I)给出的含义，R3和R4代表氢。
B1代表离去基团，例如卤代烷基（诸如例如三氯甲基）或酰亚胺（诸如例如吡咯烷-2,5-二酮或对硝基苯基）。
PG2代表硼酸保护基，诸如例如乙基或与第二个PG2组合。2,3-取代的2,3-二甲基丁烷。
此外，取代基R1、R2、R4、B1、m、q、t、V、W、Y、Z和Het中任一个的互变可在示例性转化之前和/或之后实现。这些修饰可以是如引入保护基、裂解保护基、还原或氧化官能团、卤化、金属化、取代或本领域技术人员已知的其它反应。这些转化包括引入允许取代基进一步互变的官能度的那些。合适的保护基及其引入和裂解是本领域技术人员公知的(参见例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，Wiley1999)。具体的实施例在随后的段落中描述。
化合物1-7、1-9、1-15、1-17和1-19可以商购得到，或者可以根据本领域技术人员可理解的公共领域可供的方法制备。具体的实施例在随后的段落中描述。
通式(1-15)的适当取代的芳香卤化物（诸如例如7-溴喹啉）可以与适当的二硼试剂(1-16)（诸如例如4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-二-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷）在适当的钯催化剂（诸如例如双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯）和适当的弱碱（诸如例如乙酸钾）存在下，在适当的溶剂体系（诸如例如二噁烷）中，在20℃至各自溶剂的沸点的范围的温度反应，优选反应在110℃进行，以提供通式(1-17)的中间体。
通式(1-17)的中间体可以与通式(1-18)的溴代哒嗪酮在适当的钯催化剂（诸如例如双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯）和适当的碱（诸如例如碳酸钾）存在下，在适当的溶剂体系（诸如例如二噁烷和水）中，在20℃至各自溶剂的沸点的范围的温度偶联，优选反应在90℃进行，以提供通式(1-19)的中间体。
通式(1-19)的中间体可以与通式(1-20)的硼酸衍生物在适当的钯催化剂(诸如例如双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯)和适当的碱(诸如例如乙酸钾)存在下，在适当的溶剂体系(诸如例如二噁烷)中，在20℃至各自溶剂的沸点的范围的温度偶联，优选反应在100℃进行，以提供通式(1-21)的中间体。
通式(1-20)的中间体可以通过与式(1-7)的适当的肼(诸如例如一水合肼)在适当的溶剂体系(诸如例如丙-1-醇)中，在-20℃至各自溶剂的沸点的范围的温度反应而转化为通式(1-19)的中间体，优选该反应在80℃进行。
通式(1-19)的中间体可以与适当的取代的氨基甲酸酯（诸如例如氨基甲酸叔丁酯(1-20)），在适当的碱（诸如例如碳酸铯）和适当的钯催化剂（诸如例如双(二亚苄基丙酮)-钯(0)）存在下，在适当的配体（诸如例如9(9,9-二甲基-9H-呫吨-4,5-二基)双(二苯基膦)）存在下，在适当的溶剂体系（诸如例如1,4-二噁烷）中，在室温至各自溶剂的沸点的范围的温度反应，优选该反应在110℃进行，以提供式(1-21)的化合物。或者，可以使用以下钯催化剂：
氯化烯丙基合钯二聚体、双(苄腈)二氯钯(II)、乙酸钯(II)、氯化钯(II)、四(三苯基膦)钯(0)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)、氯(2'-氨基-1,1'-联苯-2-基)钯(II)二聚体、(2'-氨基-1,1'-联苯-2-基)甲磺酸钯(II)二聚体、反式-二(μ-乙酸根合)双[邻-(二-邻甲苯基膦基)苄基]二钯(II)[cataCXium® C]、烯丙基氯化[1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)咪唑-2-亚基（ylidene）]钯(II)、烯丙基氯[1,3-双(2,6-二异丙基苯基)咪唑-2-亚基]钯(II)、氯[(1,3-二均三甲苯基咪唑-[1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)-1,3-二氢-2H-咪唑-2-亚基](氯){2-[(二甲基氨基)甲基]苯基}钯、氯[ (1,2,3-N) -3-苯基-2-丙烯基] [1,3-双(2,6-二-异丙基苯基)咪唑-2-亚基]钯(II)、[2- (乙酰氨基)苯基] {1,3-双[2,6-二(丙烷-2-基)苯基] -1,3-二氢-2H-咪唑-2-亚基}氯化钯、{1,3-双[2,6-二(丙烷-2-基)苯基]-1,3-二氢-2H-咪唑-2-亚基} (氯) {2- [ (二甲基氨基)甲基]苯基}钯、{1,3-双[2,6-二(丙烷-2-基)苯基] -2,3-二氢-1H-咪唑-2-基} (二氯) (3-氯吡啶-κN)钯、[1,3-双(2,6-二异丙基苯基)咪唑-2-亚基] (3-氯吡啶基)钯（II）二氯化物、 [2- (乙酰氨基)-4-甲氧基苯基]{1,3-双[2,6-二(丙烷-2-基)苯基] -1,3-二氢-2H-咪唑-2-亚基}氯化钯、 {1,3-双[2,6-二(丙烷-2-基)苯基] -1,3-二氢-2H-咪唑-2-亚基} (氯) {2- [ (二甲基氨基)甲基] -3,5-二甲氧基苯基}钯、二氯[1,3-双(2,6-二-3-戊基苯基)咪唑-2-亚基] (3-氯吡啶基)钯(II)、二氯(二-μ-氯)双[1,3-双(2,6-二-异丙基苯基)咪唑-2-亚基]二钯(II)、2- (2' -二叔丁基膦)联苯钯(II) 乙酸盐、氯[二环己基(2',6' -二甲氧基联苯-2-基) -λ5-磷烷基] [2-(苯基- κC2)乙酰胺基（ethanaminato）-κN]钯、[2- (2-氨基乙基)苯基] (氯)钯-二叔丁基[2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基]磷烷、{二环己基[2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基]磷烷} {2- [2- (甲基氮烷（methylazanidyl）-κN)乙基]苯基-κC1}钯、氯(2-二环己基膦基-2',6' -二甲氧基-1,1' -联苯) (2' -氨基-1,1' -联苯-2-基)钯(II)、[2',6' -二(丙烷-2-基氧基)联苯-2-基] (二环己基)磷烷- [2- (2-氨基乙基)苯基] (氯)钯、[2-(2-氨基乙基)苯基] (氯) {二环己基[2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基] –λ5-磷烷亚基}钯、 2' - (二环己基磷烷基)- N,N,N’,N’-四甲基联苯-2,6 -二胺-（2' -氨基联苯-2-基）(氯)钯、氯(2-二环己基膦基-2',6' -二-异丙氧基-1,1' -联苯) (2-氨基-1,1' -联苯-2-基)钯(II)、[2' - (氮烷基-κN)联苯-2-基-κC2] (氯) {二环己基[2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基] -λ5-磷烷基}钯、(2' -氨基联苯-2-基) (甲磺酸根合-κO)钯-二-叔丁基[2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基]磷烷、(2' -氨基联苯-2-基)钯（1+）甲磺酸盐-二-叔丁基[2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基]磷烷、二环己基[3,6-二甲氧基-2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基]磷烷-2- (2' -氨基乙基)苯基]（氯）钯、(2' -氨基联苯-2-基)钯（1+）甲磺酸盐- 2' - (二环己基磷烷基)- N,N,N’,N’-四甲基联苯-2,6 -二胺、2' -(二环己基磷烷基) -2,6-二甲氧基联苯-3-磺酸钠- (2' -氨基联苯-2-基) (氯)钯、氯(2-二环己基膦基-2',4',6' -三异丙基-1,1' -联苯) [2- (2-氨基乙基)苯基]钯(II)、(2' -氨基联苯-2-基) (甲磺酸根合-κO)钯- [2',6' -双(丙烷-2-基氧基)联苯-2-基] (二环己基)磷烷、(2' -氨基联苯-2-基) (甲磺酸根合-κO)钯-二环己基[2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基]磷烷、(2' -氨基联苯-2-基)钯(1+)甲磺酸根合-二环己基[2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基]磷烷、二环己基[3,6-二甲氧基-2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基]磷烷- (2' -氨基联苯-2-基) (氯)钯、(2' -氨基联苯-2-基) (甲磺酸根合-κO)钯-二叔丁基[3,6-二甲氧基-2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基]磷烷、(2' -氨基联苯-2-基) (甲磺酸根合-κO)钯-二环己基[3,6-二甲氧基-2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基]磷烷或以下配体：
外消旋-2,2' -双(二苯基膦基) -1,1' -联萘、外消旋-BINAP、1,1' -双(二苯基膦基)二茂铁、双(2-二苯基膦基苯基)醚、二叔丁基甲基鏻四氟硼酸盐、2- (二叔丁基膦基)联苯、三叔丁基鏻四氟硼酸盐、三-2-呋喃基膦、三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸酯、三邻甲苯基膦、(9,9-二甲基-9H-呫吨-4,5-二基)双(二苯基膦)、二环己基(2',4',6' -三异丙基-3,6-二甲氧基联苯-2-基)膦、二叔丁基(2',4',6' -三异丙基-3,6-二甲氧基联苯-2-基)膦、二叔丁基(2',4',6' -三异丙基联苯- 2-基)膦、二环己基(2',4',6' -三异丙基联苯-2-基)膦、二叔丁基(2',4',6' -三异丙基-3-甲氧基-6-甲基联苯-2-基)膦、二叔丁基(2',4',6' -三异丙基-3,4,5,6-四甲基联苯-2-基)膦、金刚烷-1-基(金刚烷-2-基) (2',4',6' -三异丙基-3,6-二甲氧基联苯-2-基)膦、二环己基(2',6' -二甲氧基联苯-2-基)膦、二环己基(2',6' -二异丙氧基联苯-2-基)膦、2' - (二环己基膦基) -N,N-二甲基-联苯-2-胺、2' - (二叔丁基膦基) -N,N-二甲基联苯-2-胺、2' - (二苯基膦基) -N,N,N ',N ' -四甲基联苯-2,6-二胺、二叔丁基(2',4',6' -三环己基-3,6-二甲氧基联苯-2-基)膦、双[3,5-双(三氟甲基)苯基] (2',4',6' -三异丙基-3,6-二甲氧基联苯-2-基)膦、联苯-2-基(二叔丁基)膦、二环己基(2' -甲基联苯-2-基)膦、联苯-2-基(二环己基)膦、2' - (二环己基膦基) -N,N-二甲基联苯-2-胺、2' - (二环己基膦基) -N,N,N ',N ' -四甲基联苯-2,6-二胺、2'- (二环己基膦基) -2,6-二异丙基联苯-4-磺酸钠、2' - (二环己基膦基) -2,6-二甲氧基联苯-3-磺酸钠、1,1' -联萘-2-基(二叔丁基)膦。
通式(1-21)的中间体可以通过与适当的布朗斯台德酸(诸如例如三氟乙酸)在适当的溶剂体系(诸如例如二氯甲烷)中在-20℃至各自溶剂的沸点的范围的温度反应而转化为通式(1-8)的中间体，优选该反应在室温进行。
在适当的碱（诸如例如N,N-二甲基吡啶-4-胺）存在下，在适当的溶剂体系（诸如例如DMF）中，在0℃和各自溶剂的沸点之间的温度，用通式(1-7)的碳酸酯（诸如例如1,1'-[羰基二(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮）处理通式(1-21)的中间体，优选反应在室温进行，以形成所需的通式(1-22)的中间体。
通式(1-22)的中间体可以通过与通式(1-9)的适当取代的胺（诸如例如2,3-二氢-1H-吡咯并[3,4-c]吡啶）在适当的碱（诸如例如三乙胺）存在下，在适当的溶剂体系（诸如例如DMF）中，在0℃至各自溶剂的沸点的范围的温度反应，优选反应在室温进行，从而转化为式(Ib)的化合物。
通式(Ib)化合物可通过与适当的还原剂在适当的溶剂如在乙酸中的锌中，在25℃和各自溶剂的沸点之间的温度反应，而转化为式(Ia)化合物。
制备式(1-6)化合物的途径描述于方案4中。
Figure 717588DEST_PATH_IMAGE082
方案4：制备式(1-6)化合物的途径，其中R2、R3、R4、V、W、Y、Z和Het具有前文对通式(I)给出的含义。
X2代表离去基团，诸如例如Cl或Br原子，或芳基磺酸酯，诸如例如对甲苯磺酸酯，或烷基磺酸酯，诸如例如甲磺酸酯或三氟甲磺酸酯(三氟甲磺酸酯基团)。
PG1代表胺保护基，诸如例如乙酰基。
此外，任何取代基R2、R3、V、W、Y和Z的互变可在示例性转化之前和/或之后实现。这些修饰可以是如引入保护基、裂解保护基、还原或氧化官能团、卤化、金属化、取代或本领域技术人员已知的其它反应。这些转化包括引入允许取代基进一步互变的官能度的那些。合适的保护基及其引入和裂解是本领域技术人员公知的(参见例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，Wiley 1999)。具体的实施例在随后的段落中描述。
化合物1-10和1-23可以商购得到，或者可以按照本领域技术人员可理解的公共领域的可供程序制备。具体的实施例在随后的段落中描述。
在适当的碱（诸如例如1,1,1,3,3,3-六甲基二硅氮烷-2-锂）存在下，在适当的溶剂体系（诸如例如THF）中，在-100℃至各自溶剂的沸点的范围的温度，通式(1-10)的适当的取代芳香酮（诸如例如N-(4-丙酰基苯基)乙酰胺）可以与通式(1-23)的适当的取代中间体（诸如例如溴乙酸乙酯）反应，优选反应在-78℃进行，以提供通式(1-24)的中间体。
通式(1-24)的中间体可以通过与式(1-7)的适当的肼(诸如例如一水合肼)在适当的溶剂体系(诸如例如丙-1-醇)中在-20℃至各自溶剂的沸点的范围的温度反应而转化为通式(1-14)的中间体，优选该反应在0℃进行。
通式(1-14)的中间体可以与适当的布朗斯台德酸（诸如例如盐酸或硫酸），在0℃至各自布朗斯台德酸的沸点的范围的温度反应，优选该反应在100℃进行，以提供通式(1-8)的中间体。
制备式(Ia)化合物的可替代途径描述于方案5中。
Figure 252475DEST_PATH_IMAGE083
方案5：制备式(Ia)化合物的途径，其中R1、R2、R3、R4、q、m、V、W、Y、Z和Het具有前文通式(Ia)中给出的含义。X2代表离去基团(诸如例如Cl、Br或I原子) 、或芳基磺酸酯（诸如例如对甲苯磺酸酯）、或烷基磺酸酯（诸如例如甲磺酸酯或三氟甲磺酸酯(三氟甲磺酸酯基团)）。
此外，取代基R1、R2、R3、R4、V、W、Y、Z和Het中任一个的互变可在示例性转化之前和/或之后实现。这些修饰可以是如引入保护基、裂解保护基、还原或氧化官能团、卤化、金属化、取代或本领域技术人员已知的其它反应。这些转化包括引入允许取代基进一步互变的官能度的那些。合适的保护基及其引入和裂解是本领域技术人员公知的(参见例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，Wiley1999)。具体的实施例在随后的段落中描述。
通式(1-24)的中间体可以与通式(1-25)的适当的脲（诸如例如4-(吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酰胺）在适当的碱（诸如例如碳酸铯）和适当的钯催化剂（诸如例如双(二亚苄基丙酮)-钯(0)）存在下，在适当的配体（诸如例如9(9,9-二甲基-9H-呫吨-4,5-二基)双(二苯基膦)）存在下，在适当的溶剂体系（诸如例如1,4-二噁烷）中，在室温至各自溶剂的沸点的范围的温度反应，优选该反应在110℃进行，以提供式(Ia)的化合物。或者，可以使用以下钯催化剂：
氯化烯丙基合钯二聚体、双(苄腈)二氯钯(II)、乙酸钯(II)、氯化钯(II)、四(三苯基膦)钯(0)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)、氯(2'-氨基-1,1'-联苯-2-基)钯(II)二聚体、(2'-氨基-1,1'-联苯-2-基)甲磺酸钯(II)二聚体、反式-二(μ-乙酸根合)双[邻-(二-邻甲苯基膦基)苄基]二钯(II)[cataCXium® C]、烯丙基氯化[1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)咪唑-2-亚基]钯(II)、烯丙基氯[1,3-双(2,6-二异丙基苯基)咪唑-2-亚基]钯(II)、氯[(1,3-二均三甲苯基咪唑-[1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)-1,3-二氢-2H-咪唑-2-亚基](氯){2-[(二甲基氨基)甲基]苯基}钯、氯[ (1,2,3-N) -3-苯基-2-丙烯基] [1,3-双(2,6-二-异丙基苯基)咪唑-2-亚基]钯(II)、[2- (乙酰氨基)苯基] {1,3-双[2,6-二(丙烷-2-基)苯基] -1,3-二氢-2H-咪唑-2-亚基}氯化钯、{1,3-双[2,6-二(丙烷-2-基)苯基] -1,3-二氢-2H-咪唑-2-亚基} (氯) {2- [ (二甲基氨基)甲基]苯基}钯、{1,3-双[2,6-二(丙烷-2-基)苯基]-2,3-二氢-1H-咪唑-2-基} (二氯) (3-氯吡啶-κN)钯、[1,3-双(2,6-二异丙基苯基)咪唑-2-亚基] (3-氯吡啶基)钯（II）二氯化物、 [2- (乙酰氨基)-4-甲氧基苯基]{1,3-双[2,6-二(丙烷-2-基)苯基] -1,3-二氢-2H-咪唑-2-亚基}氯化钯、 {1,3-双[2,6-二(丙烷-2-基)苯基] -1,3-二氢-2H-咪唑-2-亚基} (氯) {2- [ (二甲基氨基)甲基] -3,5-二甲氧基苯基}钯、二氯[1,3-双(2,6-二-3-戊基苯基)咪唑-2-亚基] (3-氯吡啶基)钯(II)、二氯(二-μ-氯)双[1,3-双(2,6-二-异丙基苯基)咪唑-2-亚基]二钯(II)、2- (2' -二叔丁基膦)联苯钯(II) 乙酸盐、氯[二环己基(2',6' -二甲氧基联苯-2-基) -λ5-磷烷基] [2- (苯基- κC2)乙酰胺基（ethanaminato）-κN]钯、[2- (2-氨基乙基)苯基] (氯)钯-二叔丁基[2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基]磷烷、{二环己基[2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基]磷烷} {2- [2- (甲基氮烷（methylazanidyl）-κN)乙基]苯基-κC1}钯、氯(2-二环己基膦基-2',6' -二甲氧基-1,1' -联苯) (2' -氨基-1,1' -联苯-2-基)钯(II)、[2',6' -二(丙烷-2-基氧基)联苯-2-基] (二环己基)磷烷- [2- (2-氨基乙基)苯基] (氯)钯、[2- (2-氨基乙基)苯基] (氯) {二环己基[2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基] –λ5-磷烷亚基}钯、2' - (二环己基磷烷基)- N,N,N’,N’-四甲基联苯-2,6 -二胺-（2' -氨基联苯-2-基）(氯)钯、氯(2-二环己基膦基-2',6' -二-异丙氧基-1,1' -联苯) (2-氨基-1,1' -联苯-2-基)钯(II)、[2' - (氮烷基-κN)联苯-2-基-κC2] (氯) {二环己基[2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基] -λ5-磷烷基}钯、(2' -氨基联苯-2-基) (甲磺酸根合-κO)钯-二-叔丁基[2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基]磷烷、(2' -氨基联苯-2-基)钯（1+）甲磺酸盐-二-叔丁基[2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基]磷烷、二环己基[3,6-二甲氧基-2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基]磷烷-2- (2' -氨基乙基)苯基]（氯）钯、(2' -氨基联苯-2-基)钯（1+）甲磺酸盐- 2' - (二环己基磷烷基)- N,N,N’,N’-四甲基联苯-2,6 -二胺、2' - (二环己基磷烷基) -2,6-二甲氧基联苯-3-磺酸钠- (2' -氨基联苯-2-基) (氯)钯、氯(2-二环己基膦基-2',4',6' -三异丙基-1,1' -联苯) [2- (2-氨基乙基)苯基]钯(II)、(2' -氨基联苯-2-基) (甲磺酸根合-κO)钯- [2',6' -双(丙烷-2-基氧基)联苯-2-基] (二环己基)磷烷、(2' -氨基联苯-2-基) (甲磺酸根合-κO)钯-二环己基[2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基]磷烷、(2' -氨基联苯-2-基)钯(1+)甲磺酸根合-二环己基[2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基]磷烷、二环己基[3,6-二甲氧基-2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基]磷烷- (2' -氨基联苯-2-基) (氯)钯、(2' -氨基联苯-2-基) (甲磺酸根合-κO)钯-二叔丁基[3,6-二甲氧基-2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基]磷烷、(2' -氨基联苯-2-基) (甲磺酸根合-κO)钯-二环己基[3,6-二甲氧基-2',4',6' -三(丙烷-2-基)联苯-2-基]磷烷或以下配体：
外消旋-2,2' -双(二苯基膦基) -1,1' -联萘、外消旋-BINAP、1,1' -双(二苯基膦基)二茂铁、双(2-二苯基膦基苯基)醚、二叔丁基甲基鏻四氟硼酸盐、2- (二叔丁基膦基)联苯、三叔丁基鏻四氟硼酸盐、三-2-呋喃基膦、三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸酯、三邻甲苯基膦、(9,9-二甲基-9H-呫吨-4,5-二基)双(二苯基膦)、二环己基(2',4',6' -三异丙基-3,6-二甲氧基联苯-2-基)膦、二叔丁基(2',4',6' -三异丙基-3,6-二甲氧基联苯-2-基)膦、二叔丁基(2',4',6' -三异丙基联苯- 2-基)膦、二环己基(2',4',6' -三异丙基联苯-2-基)膦、二叔丁基(2',4',6' -三异丙基-3-甲氧基-6-甲基联苯-2-基)膦、二叔丁基(2',4',6' -三异丙基-3,4,5,6-四甲基联苯-2-基)膦、金刚烷-1-基(金刚烷-2-基) (2',4',6' -三异丙基-3,6-二甲氧基联苯-2-基)膦、二环己基(2',6' -二甲氧基联苯-2-基)膦、二环己基(2',6' -二异丙氧基联苯-2-基)膦、2' - (二环己基膦基) -N,N-二甲基-联苯-2-胺、2' - (二叔丁基膦基) -N,N-二甲基联苯-2-胺、2' - (二苯基膦基) -N,N,N ',N ' -四甲基联苯-2,6-二胺、二叔丁基(2',4',6' -三环己基-3,6-二甲氧基联苯-2-基)膦、双[3,5-双(三氟甲基)苯基] (2',4',6' -三异丙基-3,6-二甲氧基联苯-2-基)膦、联苯-2-基(二叔丁基)膦、二环己基(2' -甲基联苯-2-基)膦、联苯-2-基(二环己基)膦、2' - (二环己基膦基) -N,N-二甲基联苯-2-胺、2' - (二环己基膦基) -N,N,N ',N ' -四甲基联苯-2,6-二胺、2'- (二环己基膦基) -2,6-二异丙基联苯-4-磺酸钠、2' - (二环己基膦基) -2,6-二甲氧基联苯-3-磺酸钠、1,1' -联萘-2-基(二叔丁基)膦。
制备式(Ia)化合物的可替代途径描述于方案6中。
Figure 100345DEST_PATH_IMAGE084
方案6：制备式(I)化合物的途径，其中R1、R2、R3、R4、q、m、t、V、W、Y和Z具有前文对通式(Ia)给出的含义。
此外，取代基R1、R2、R3、R4、m、n、t、V、W、Y、Z和Het中任一个的互变可在示例性转化之前和/或之后实现。这些修饰可以是如引入保护基、裂解保护基、还原或氧化官能团、卤化、金属化、取代或本领域技术人员已知的其它反应。这些转化包括引入允许取代基进一步互变的官能度的那些。合适的保护基及其引入和裂解是本领域技术人员公知的(参见例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts ，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，Wiley1999)。具体的实施例在随后的段落中描述。
化合物1-11和1-26可以是商购可得的，或者可以按照本领域技术人员可理解的公共领域可供的程序制备。具体的实施例在随后的段落中描述。
通式(1-6)的中间体可以通过与通式(1-26)的适当氯甲酸酯(诸如例如氯甲酸4-硝基苯基酯)在适当的碱(诸如例如三乙胺)存在下，在适当的溶剂体系(诸如例如甲苯)中，在-20℃至各自溶剂沸点的范围的温度反应，转化为通式(1-27)的中间体，优选反应在室温进行。
通式(1-27)的中间体可以通过与通式(1-11)的适当的胺（诸如例如1-(吡啶-3-基)哌嗪）在适当的溶剂体系（诸如例如乙醇）中在-20℃至各自溶剂的沸点的范围的温度反应而转化为式(Ia)的化合物，优选该反应在79℃进行。
制备式(1-10)化合物的一种途径描述于方案7中。
Figure 25576DEST_PATH_IMAGE085
方案7：制备式(1-10)化合物的途径，其中PG1、R2、R3、V、W、Y和Z具有前文对通式(I)给出的含义。
X3代表卤素原子，诸如例如Cl或Br原子。
PG1代表胺保护基，例如芴基甲氧基羰基、苄氧基羰基、烯丙氧基羰基或叔丁氧羰基。
此外，任何取代基PG1、R2、R3、V、W、Y和Z的互变可在示例性转化之前和/或之后实现。这些修饰可以是如引入保护基、裂解保护基、还原或氧化官能团、卤化、金属化、取代或本领域技术人员已知的其它反应。这些转化包括引入允许取代基进一步互变的官能度的那些。合适的保护基及其引入和裂解是本领域技术人员公知的(参见例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，Wiley 1999)。具体的实施例在随后的段落中描述。
化合物1-27、1-28和1-30可以商购得到，或者可以按照本领域技术人员可理解的公共领域可供的程序制备。具体的实施例在随后的段落中描述。
在1-羟基-7-氮杂苯并三唑存在下，在适当的溶剂 (诸如例如N,N-二甲基甲酰胺)中，在适当的碱(诸如例如三乙胺)存在下，在-10℃至各自溶剂的沸点的温度范围内，使式(1-27)化合物与上述式(1-28)化合物和肽偶联剂(例如N- (3-二甲基氨基丙基) -N'-乙基碳二亚胺盐酸盐)反应，优选反应在室温进行，以提供式(1-29)化合物。
合适的肽合成方法及其应用是本领域技术人员公知的(参见例如 N. LeoBenoiti，Chemistry of Peptide Synthesis, CRC Press 2005； John Jones，AminoAcids and Peptide Synthesis, Oxford University Press, 2002以及Norbert Sewald和Hans-Dieter Jakubke，Peptides: Chemistry and Biology, Wiley-VCH, 2009)。
通式(1-29)的中间体可以通过与通式(1-30)的适当格氏试剂(诸如例如氯化苄基镁)在适当的溶剂体系(诸如例如四氢呋喃)中在-20℃至各自溶剂的沸点的范围的温度反应而转化为通式(1-10)的化合物，优选该反应在0℃进行。
本领域技术人员已知，如果在起始或中间体化合物上存在许多反应中心，则可能需要通过保护基暂时封闭一个或多个反应中心，以便允许反应在所需的反应中心处特异性地进行。关于使用大量已证实的保护基的详细描述可参见，例如，T.W.Greene，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，John Wiley & Sons，1999，第三版 或P. Kocienski,Protecting Groups, Thieme Medical Publishers, 2000。
根据本发明的化合物以本身已知的方式分离和纯化，例如通过真空蒸除溶剂并从适当的溶剂中重结晶所得残余物或将其进行常规纯化方法之一，如在适当的载体材料上进行色谱。此外，具有足够碱性或酸性官能度的本发明化合物的反相制备型HPLC可以导致盐的形成，如在本发明化合物具有足够碱性的情况下，例如三氟乙酸盐或甲酸盐，或者，在本发明化合物具有足够酸性的情况下，例如铵盐。这种类型的盐可以通过本领域技术人员已知的各种方法分别转化为其游离碱或游离酸形式，或者在随后的生物学测定中用作盐。另外，在本发明化合物分离过程中的干燥过程可能不能完全除去痕量的助溶剂，尤其是如甲酸或三氟乙酸，以得到溶剂化物或包合物。本领域技术人员将认识到，哪些溶剂化物或包合物对于用于随后的生物学测定是可接受的。应理解，如本文所述分离的本发明化合物的特定形式(例如盐、游离碱、溶剂化物、包合物)不一定是所述化合物可应用于生物测定以定量特定生物活性的唯一形式。
根据本发明式(Ia)或(Ib)化合物的盐可通过将游离化合物溶解在含有所需酸或碱或然后向其中加入所需酸或碱的合适溶剂(例如酮如丙酮、甲乙酮或甲基异丁基酮，和醚如乙醚、四氢呋喃或二噁烷，氯化烃如二氯甲烷或氯仿，或低分子量脂肪醇如甲醇、乙醇或异丙醇)中而获得。根据涉及的是一元或多元酸或碱以及根据需要哪种盐，酸或碱可以以等摩尔的数量比或与其不同的数量比用于盐的制备。通过过滤、再沉淀、用非溶剂沉淀或通过蒸发溶剂获得盐。所得的盐可转化为游离化合物，其转而可被转化为盐。以这种方式，可以通过本领域技术人员已知的方法将药学上不可接受的盐转化为药学上可接受的盐，所述药学上不可接受的盐可以例如作为工业规模生产中的工艺产物获得。特别优选的是盐酸盐和实施例部分中使用的方法。
根据本发明的化合物及其盐的纯非对映异构体和纯对映异构体可例如通过不对称合成、通过在合成中使用手性起始化合物以及通过将合成中获得的对映异构体和非对映异构体混合物拆分而获得。
对映异构体和非对映体异构混合物可通过本领域技术人员已知的方法拆分成纯对映异构体和纯非对映异构体。优选地，通过结晶（特别是分级结晶）或色谱分离非对映异构体混合物。对映异构体混合物可以例如通过与手性助剂形成非对映异构体、拆分所获得的非对映异构体并除去手性助剂来分离。作为手性助剂，例如，手性酸可用于分离对映异构碱，如扁桃酸，手性碱可用于经由形成非对映异构盐来分离对映异构酸。此外，非对映异构体衍生物如非对映异构体酯可分别由醇的对映异构体混合物或酸的对映异构体混合物形成，分别使用手性酸或手性醇作为手性助剂。另外，非对映异构体复合物或非对映异构体包合物可以用于分离对映异构体混合物。或者，可以在色谱中使用手性分离柱拆分对映异构体混合物。另一种合适的分离对映异构体的方法是酶分离。
任选地，式(Ia)或(Ib)化合物可转化为其盐，或任选地，式(Ia)或(Ib)化合物的盐可转化为游离化合物。相应的方法是本领域技术人员惯用的。
任选地，式(Ia)或(Ib)化合物可转化为其N-氧化物。N-氧化物也可以通过中间体的方式引入。N-氧化物可以通过用氧化剂如间-氯过苯甲酸在合适的溶剂如DCM中，在适当的温度如0℃至40℃处理合适的前体来制备，其中通常优选室温。形成N-氧化物的其它相应方法是本领域技术人员常用的。
本发明的一个优选方面是制备根据实施例的缀合物和化合物的方法，以及用于它们的制备的中间体。
式(II-D)和(III-D)的NAMPT抑制剂：
Figure 249884DEST_PATH_IMAGE086
其中§1和§2代表与连接子Z'的连接点，并且R1、R2、R3、R4、R5b、q、m、t、V、W、Y、Z和Het如本文所定义，可以根据本申请中所描述的任何方法、或可替代地根据WO2012067965中所描述的任何方法(WO2012067965的方法中的每一种通过引用并入本文)来制备。
合成根据结构(IIa)的化合物的方法是如方案8中所述的将化合物I(意指结构(Ia)或(Ib)的化合物)在哒嗪酮NH上用1-31型化合物烷基化。
Figure 576960DEST_PATH_IMAGE087
方案8：经由式Ia化合物的烷基化制备式(I)化合物的方案，其中R1、R2、R3、R4、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义，且Het可被适当地保护。X1代表离去基团（诸如例如Cl、Br或I）、或芳基磺酸酯（诸如例如对甲苯磺酸酯）、或烷基磺酸酯（诸如例如甲磺酸酯或三氟甲磺酸酯(三氟甲磺酸酯基团)）。
该烷基化的条件可以是本领域技术人员已知的典型条件，如在适当的溶剂体系（诸如例如DMF）中用适当的碱（诸如例如氢化钠）处理Ia，然后在-20℃至各自溶剂的沸点的范围的温度加入结构1-31的烷基化化合物，优选反应在0℃和室温之间进行。
合成根据结构(IIb)的化合物的方法是如方案9中所述的化合物I(意指结构(Ic)的化合物，其中NH基团存在于Het上)用1-31型化合物的烷基化。
Figure 674360DEST_PATH_IMAGE088
Figure 86887DEST_PATH_IMAGE089
方案9：经由式Ic化合物的顺序烷基化制备式(IIb)化合物的方案，其中R1、R2、R3、R4、R5b、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义，且Het带有可被适当保护和脱保护的NH。X1和X2代表离去基团（诸如例如Cl、Br或I）、或芳基磺酸酯（诸如例如对甲苯磺酸酯）、或烷基磺酸酯（诸如例如甲磺酸酯或三氟甲磺酸酯(三氟甲磺酸酯基团)）。
第一烷基化的条件可以是本领域技术人员已知的典型条件，如在合适的溶剂体系（诸如例如DMF）中用合适的碱（诸如例如氰化钠）处理Ia，然后在-20℃至各自溶剂的沸点的范围的温度加入结构1-32的烷基化化合物，优选反应在0℃和室温之间进行。
PG2代表杂环基-NH保护基，例如保护吲唑-NH的四氢吡喃基、保护苯并咪唑-NH的对甲苯酰磺酰基或保护吲哚-NH的2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基。
此外，任何取代基PG2、R2、R3、V、W、Y和Z的互变可在示例性转化之前和/或之后实现。这些修饰可以是如引入保护基、裂解保护基、还原或氧化官能团、卤化、金属化、取代或本领域技术人员已知的其它反应。
如上所述，式(1-33)化合物可以用脱保护剂脱保护，例如在四氢吡喃基保护的吲唑的情况下，用盐酸在合适的溶剂(诸如例如环戊基甲基醚和水的混合物)中，在-10℃至各自溶剂的沸点的温度范围内进行脱保护，优选反应在室温进行，以提供式(1-34)的化合物。
化合物(1-34)的杂环基-NH的第二烷基化的条件可以是本领域技术人员已知的典型条件，如在合适的溶剂体系(诸如例如DMF)中用合适的碱(诸如例如氢化钠)处理Ia，然后在-20℃至各自溶剂的沸点的温度范围内加入结构1-31的烷基化化合物，优选反应在0℃和室温之间进行。
结构1-37化合物，即其中L1带有氨基取代基的通式(II)化合物，可通过方案10所述的途径制备，通式结构(Ia)的哒嗪酮与其中R13是保护的胺基（如NH-PG1、邻苯二甲酰亚胺、硝基或叠氮化物）的结构1-35的烷基化剂在本领域技术人员已知的条件下反应，得到结构1-36的N-烷基化的化合物。这些方法包括在合适的溶剂体系（诸如例如DMF）中用合适的碱（诸如例如氢化钠）处理(Ia)，然后在-20℃至各自溶剂的沸点的范围的温度加入结构1-35的烷基化化合物，优选反应在0℃至室温之间进行。然后通过本领域技术人员已知的方法将N-保护的部分R13转化为NH2，将得到的结构1-36的化合物转化为结构1-37的胺，所述方法如用TFA或盐酸酸性裂解Boc基团、用肼或甲胺裂解邻苯二甲酰亚胺基团、或用铁/乙酸或在氢气氛下用钯炭催化剂氢化还原硝基、或在氢气氛下通过用钯炭催化剂氢化或用三苯基膦的施陶丁格型（Staudinger-type）还原而还原叠氮基，得到结构1-37的化合物。
Figure 849306DEST_PATH_IMAGE090
方案10：制备式1-37化合物的途径，其中R1、R2、R3、R4、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义。X1代表离去基团（诸如例如Cl、Br或I）、或芳基磺酸酯（诸如例如对甲苯磺酸酯）、或烷基磺酸酯（诸如例如甲磺酸酯或三氟甲磺酸酯(三氟甲磺酸酯基团)）。R13代表-NHPG1基团，且PG1代表胺保护基，诸如例如乙酰基或叔丁氧羰基。
在连接子中具有聚乙二醇(PEG)侧链的结构1-42的化合物，其是通式结构1-37的亚类，可以如方案10中所述合成。
Figure 30889DEST_PATH_IMAGE091
方案10：合成结构1-42的化合物的途径，其中R1、R2、R3、R4、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义，且o为1至5和p为1至12。
通过本领域技术人员已知的酰胺形成方法将结构1-38的α-胺保护的氨基酸与结构1-39的聚乙烯乙醇酸活性酯偶联。然后，将如此形成的结构1-40的游离酸与胺1-37偶联，得到相应的结构1-41的聚乙二醇化酰胺，将胺基脱保护(方法见上文)，然后得到结构1-42的相应的胺。
如方案11所描述，可以合成在连接子中具有肽部分的结构1-48的化合物，其是通式结构1-37的亚类。
Figure 486141DEST_PATH_IMAGE092
方案11：合成结构1-48的化合物的途径，其中R1、R2、R3、R4、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义，且RA和RB代表天然α-氨基酸的α-取代基。
胺1-37可通过本领域技术人员已知的肽偶联方法与结构1-43的α-氨基保护的氨基酸偶联，如例如HATU。对于其它肽偶联方法，参见上文。然后，如此形成的结构1-44的肽可以通过本领域技术人员已知的方法(见上文)在胺基上脱保护，得到化合物1-45。然后，在通过本领域技术人员已知的方法脱保护后，可以用结构1-46的第二个α-氨基保护的氨基酸重复上述序列，以得到通式结构1-48的胺。
结构1-50的化合物，即通式结构(II)的化合物，其中L1带有氨基取代基，可通过方案12中描述的途径制备。将通式结构1-34的杂环基-NH化合物与结构1-35的烷基化剂反应，其中R13为保护的胺基，如NH-PG1、邻苯二甲酰亚胺、硝基或叠氮化物，在本领域技术人员已知的条件下得到结构1-49的N-烷基化的化合物。这些方法包括在适当的溶剂体系（诸如例如DMF）中用适当的碱（诸如例如氢化钠）处理1-34，然后在-20℃至各自溶剂的沸点的温度范围内加入结构1-35的烷基化化合物，优选反应在0℃和室温之间进行，然后将得到的结构1-49的化合物转化为结构1-50的胺，通过以本领域技术人员已知的方法（如用TFA或盐酸酸性裂解Boc基团、用肼或甲胺裂解邻苯二甲酰亚胺基团、用铁/乙酸或在氢气气氛下用钯炭还原硝基、或在氢气氛下通过用钯炭氢化或用三苯基膦的施陶丁格型（Staudinger-type）还原而还原叠氮基）将N-保护的部分R13转化为NH2，而得到结构1-50的化合物。
Figure 448281DEST_PATH_IMAGE093
方案12：制备式1-50化合物的途径，其中R1、R2、R3、R4、R5b、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义，和Het带有可被适当保护和脱保护的NH。X1代表离去基团（诸如例如Cl、Br或I）、或芳基磺酸酯（诸如例如对甲苯磺酸酯）、或烷基磺酸酯（诸如例如甲磺酸酯或三氟甲磺酸酯(三氟甲磺酸酯基团)）。R13代表-NHPG1基团，和PG1代表胺保护基，诸如例如乙酰基或叔丁氧羰基。
具有如下通式结构的抗体-药物缀合物：
Figure 14391DEST_PATH_IMAGE094
可以通过使活化部分Z''-D与抗体AB反应来合成，其中连接子Z''代表以下通式结构(i)至(iii)之一：
Figure 50481DEST_PATH_IMAGE095
其中
§1和§2代表与D的连接点；
§§代表与AB的连接点；
SG代表体内可裂解基团，L1和L1'彼此独立地代表体内不可裂解有机基团，和L2'代表活化连接基团。
对于半胱氨酸连接的抗体-药物缀合物的合成，L2'是硫醇-反应性基团，选自
Figure 676634DEST_PATH_IMAGE096
其中#2代表与基团L1、L1'或SG的连接点，和X1代表离去基团（诸如例如Cl、Br或I）、或芳基磺酸酯（例如对甲苯磺酸酯）、或烷基磺酸酯（诸如例如甲磺酸酯或三氟甲磺酸酯(三氟甲磺酸酯基团)）。
更优选地，用于合成半胱氨酸连接的抗体-药物缀合物的活化部分Z''-D带有马来酰亚胺，如通式结构1-51和1-52
Figure 63753DEST_PATH_IMAGE097
其中R1、R2、R3、R4、R5b、Het、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义，且Q代表以下通式结构(i)至(iii)之一：
Figure 978095DEST_PATH_IMAGE098
其中
§代表与D的连接点；
§§代表与L2'的连接点；
SG代表体内可裂解基团，L1和L1'彼此独立地代表体内不可裂解有机基团，且L2'代表活化连接基团。
如方案13所示，通过使通式结构1-37的胺与结构1-54的活化酯反应，可以合成通式结构1-54的马来酰亚胺，其为通式结构1-51的亚类。
Figure 134270DEST_PATH_IMAGE099
方案13：合成结构1-54的化合物的途径，其中R1、R2、R3、R4、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义，且R12为C1- C10烷基，优选C1-C5-烷基。
通过本领域技术人员已知的方法，使通式结构1-37的胺与结构1-53的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，得到通式结构1-54的马来酰亚胺，这些方法包括加入碱（如例如三乙胺或二异丙基乙胺）和适当的溶剂（如DMF或THF）。可替代的方法包括在如上文所述的本领域技术人员已知的肽偶联条件下，将胺1-37与结构1-133的相应游离酸偶联。
如方案14所示，通过使通式结构1-37的胺与结构1-54的活化酯反应，可以合成通式结构1-55的马来酰亚胺，其为通式结构1-52的亚类。
Figure 931324DEST_PATH_IMAGE100
方案14：合成结构1-54的化合物的途径，其中R1、R2、R3、R4、R5b、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义，且R12为C1- C10烷基，优选C1-C5烷基。
通过本领域技术人员已知的方法，使通式结构1-50的胺与结构1-53的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，得到通式结构1-55的马来酰亚胺，这些方法包括加入碱（如例如三乙胺或二异丙基乙胺）和合适的溶剂（如DMF或THF）。可替代的方法包括在如上所述的本领域技术人员已知的肽偶联条件下，将胺1-37与结构1-50的相应游离酸偶联。
对于赖氨酸连接的抗体-药物缀合物的合成， L2'是选自以下的胺反应性基团：
Figure 540160DEST_PATH_IMAGE101
其中#2代表与基团L1、L1'或SG的连接点，X1代表离去基团（诸如例如Cl、Br或I）、或芳基磺酸酯（诸如例如对甲苯磺酸酯）、或烷基磺酸酯（诸例如甲磺酸酯或三氟甲磺酸酯(三氟甲磺酸酯基团)）。
更优选地，对于赖氨酸连接的抗体-药物缀合物的合成，活化部分Z''-D带有N-羟基琥珀酰亚胺酯，如通式结构1-56和1-57：
Figure 713653DEST_PATH_IMAGE102
其中R1、R2、R3、R4、R5b、Het、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义，且Q代表以下通式结构(i)至(iii)之一：
Figure 786651DEST_PATH_IMAGE103
其中
§代表与D(1-56中的哒嗪酮环和1-57中的环Het)的连接点；
§§代表与L2'（在其羰基处）的连接点；
SG代表体内可裂解基团，L1和L1'彼此独立地代表体内不可裂解有机基团，和L2'代表活化连接基团。
合成通式结构1-59的N-羟基琥珀酰亚胺酯的方法如方案15所示，该酯是通式结构1-56的亚结构。
Figure 754607DEST_PATH_IMAGE104
方案15：合成结构1-59的化合物的途径，其中R1、R2、R3、R4、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义，且其中R12为C1- C10烷基，优选C1-C5-烷基。
通过本领域技术人员已知的方法，使通式结构1-37的胺与结构1-58的双-N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，得到通式结构1-59的马来酰亚胺，这些方法包括加入碱（如例如三乙胺或二异丙基乙胺）和合适的溶剂（如DMF或THF）。可替代的方法包括在如上所述的本领域技术人员已知的肽偶联条件下，将胺1-37与结构1-58的相应游离酸偶联。
合成通式结构1-60的N-羟基琥珀酰亚胺酯的方法如方案16所示，该酯是通式结构1-57的亚结构。
Figure 850739DEST_PATH_IMAGE105
方案16：合成结构1-59的化合物的途径，其中R1、R2、R3、R4、R5b、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义，且其中R12为C1- C10烷基，优选C1-C5烷基。
通过本领域技术人员已知的方法，使通式结构1-50的胺与结构1-58的双-N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，得到通式结构1-60的马来酰亚胺，这些方法包括加入碱（如例如三乙胺或二异丙基乙胺）和合适的溶剂（如DMF或THF）。可替代的方法包括在如上文所述的本领域技术人员已知的肽偶联条件下，将胺1-50与结构1-58的相应游离酸偶联。
示例性的带有不可裂解的连接子的抗体-药物缀合物的代谢物可以由通式结构1-61描述为半胱氨酸连接的ADC，并且由1-60描述为赖氨酸连接的缀合物。
Figure 296764DEST_PATH_IMAGE106
其中Z'和D如本文所定义。
更具体地，具有经由琥珀酰亚胺连接的不可裂解连接子的半胱氨酸连接的抗体-药物缀合物递送通式结构1-64或1-65的代谢物。通式结构1-64和1-65的代谢物可通过如下合成：在0-40℃的温度范围，优选在25℃，在合适的溶剂如DMF中，使通式结构1-的马来酰亚胺与半胱氨酸1-63反应，得到半胱氨酸-代谢物1-64或1-65，如方案17中所描述。
Figure 427531DEST_PATH_IMAGE107
方案17：合成结构1-64或1-65的半胱氨酸代谢物的途径，其中R1、R2、R3、R4、R5b、Q、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义。
琥珀酰亚胺环也可以如方案18中所示的通式结构1-64a或1-65a所述的开放形式存在。
Figure 379437DEST_PATH_IMAGE108
方案18：具有结构1-64a和1-65a的开放琥珀酰亚胺环形式的半胱氨酸代谢物，其中R1、R2、R3、R4、R5b、Q、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义。
具有经由酰胺键连接的不可裂解连接子的赖氨酸连接的抗体-药物缀合物递送通式结构1-68的代谢物。通式结构1-68的代谢物可如下合成：使通式结构1-56的N-羟基琥珀酰亚胺酯与α-氨基，α-羧基-双保护的赖氨酸(1-66)在合适的溶剂如DMF或THF和合适的碱如三乙胺或二异丙基乙胺中在0-40℃的温度范围（优选在25℃）反应，以产生如方案42中所述的通式结构1-67的α-氨基，α-羧基-双保护的赖氨酸-代谢物。通过如上文已经描述的本领域技术人员已知的方法在赖氨酸缀合物1-67的α-氨基和α-羧基处去保护递送通式结构1-68的赖氨酸代谢物。用于合成1-67的可替代方法包括在如上文所述的本领域技术人员已知的肽偶联条件下将α-氨基，α-羧基-双保护的赖氨酸(1-66)与结构1-56的相应游离酸偶联。
Figure 962865DEST_PATH_IMAGE109
方案19：合成结构1-68的半胱氨酸代谢物的途径，其中R1、R2、R3、R4、Het、Q、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义。
具有如下通式结构的抗体-药物缀合物
Figure 212581DEST_PATH_IMAGE110
可以通过将通式结构Z''-D的活化部分与抗体反应来合成。
更具体地，可以根据方案20合成半胱氨酸连接的抗体-药物缀合物。
Figure 197855DEST_PATH_IMAGE111
方案20：合成半胱氨酸连接的抗体-药物缀合物的途径，其中AB、n、R1、R2、R3、R4、R5b、Het、Q、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义。
用三羧基乙基膦(TCEP)还原抗体AB以还原抗体的链内二硫化物，所述还原在合适的溶剂如pH7.2的PBS缓冲液中，浓度范围在1 mg/ml和20 mg/ml之间，优选在约10 mg/ml至15 mg/ml的范围内，在4℃和30℃之间的温度，优选在20℃进行，然后加入溶解在合适的溶剂如DMSO、DMF、异丙醇或PBS缓冲液中（优选在DMSO中）的马来酰亚胺1-51或1-52，而溶剂的量不应超过总体积的10%。
对于合成具有相应的开环琥珀酰亚胺的半胱氨酸连接的抗体-药物缀合物，可通过加入合适的碱或缓冲液如PBS缓冲液pH8将反应混合物碱化至pH8。
如果Q带有可还原的部分如二硫化物，则在还原步骤之后，在加入马来酰亚胺1-51或1-52之前，通过合适的方法如经由Sephadex®柱的尺寸排阻色谱除去TCEP。
赖氨酸连接的抗体-药物缀合物可根据方案21合成。
Figure 507613DEST_PATH_IMAGE112
方案21：合成半胱氨酸连接的抗体-药物缀合物的途径，其中AB、n、R1、R2、R3、R4、R5b、Het、Q、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义。
抗体AB与通式结构1-56或1-57的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，溶解在合适的溶剂如DMSO、DMF、异丙醇或PBS缓冲液中，优选DMSO中，而溶剂的量不应超过总体积的10%，在合适的溶剂如PBS缓冲液中，在pH7.2，浓度范围在1 mg/ml和20 mg/ml之间，优选约10 mg/ml至15 mg/ml的范围内，在4℃和30℃之间，优选20℃的温度。
位点特异性缀合
可以使用位点特异性缀合，其中已知数量的连接子-药物一致地缀合至确定的位点。
文献中描述了用于位点特异性缀合的各种方法(Agarwal等人, Bioconjug. Chem. 26, 176-192 (2015)； Cal等人, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53, 10585-10587(2014)； Behrens等人, MAbs 6, 46-53 (2014)；Panowski 等人, MAbs 6, 34-45(2014))。位点特异性缀合的方法特别包括酶促方法，例如使用转谷氨酰胺酶(TGase)、糖基转移酶或甲酰甘氨酸生成酶(Sochaj等人, Biotechnology Advances, 33, 775-7842015)。
使用转谷氨酰胺酶(TGase)进行这种连接的一种方式是文献描述的使用转谷氨酰胺酶处理结合剂的位点特异性缀合的方法。转谷氨酰胺酶(TGase)，包括细菌转谷氨酰胺酶(BTG)(EC2.3.2.13)，是催化谷氨酰胺的γ-羰基酰胺基团与赖氨酸的伯胺之间形成共价键的酶家族。由于一些TGase也接受赖氨酸以外的底物作为胺供体，它们已用于修饰蛋白，包括在合适的受体谷氨酰胺残基处的抗体(Jeger等人, Angewandte Chemie Int. Ed. Engl 49, 9995-9997 (2010)；Josten 等人，J. Immunol. Methods 240, 47-54 (2000)； Mindt等人, Bioconjugate Chem. 19, 271-278 (2008)； Dennler等人, in Antibody Drug Conjuagtes (Ducry, L., 编辑), pp 205-215, Humana Press. (2013))。一方面，转谷氨酰胺酶用于将药物与带有遗传上人工谷氨酰胺标签的抗体偶联，所述标签是通过遗传工程引入的转谷氨酰胺受体谷氨酰胺(Strop等人, Chem. Biol. 20, 161-167 (2013))。另一方面，据报道，位于重链恒定结构域中的保守谷氨酰胺Q295(IgG的Kabat编号系统)是无糖基化IgG1骨架内细菌转谷氨酰胺酶(EC 2.3.2.13)的唯一γ-羰基酰胺供体，而IgG1中的骨架中不存在在重链的位置N297(Kabat编号)被糖基化的受体谷氨酰胺(Jeger等人,Angewandte Chemie Int. Ed. Engl 49, 9995-9997 (2010))。总之，细菌转谷氨酰胺酶可用于将连接子/药物的胺基缀合至抗体的受体谷氨酰胺残基。这样的受体谷氨酰胺可通过突变改造抗体或通过产生非糖基化抗体而引入。这样的非糖基化抗体可以通过使用N-糖苷酶F(PNGaseF)去糖基化或通过将重链糖基化位点的N297(Kabat编号)突变成任何其它氨基酸来产生。对于带有突变N297D、N297Q（Jeger 等人，Angewandte Chemie Int. Ed. Engl 49, 9995-9997 (2010)）或N297S（参见专利申请WO2013092998A1和WO2013092983A2）的无糖基化抗体变体，描述了这样的无糖基化抗体的酶促缀合。使用转谷氨酰胺酶对这样的非糖基化抗体进行酶促缀合提供了DAR通常为2的ADC，其中两条重链均在Q295位(Kabat编号)被位点特异性地官能化。抗体的突变N297Q在每个重链处提供1个额外的缀合位点，导致例如DAR为4的ADCS，其中两个重链均在位置Q295和Q297(Kabat编号)位点特异性地官能化。带有突变Q295N和N297Q的抗体变体在位置Q297提供一个受体谷氨酰胺残基(Simone Jeger,Site specific conjugation of tumour targeting antibodies usingtransglutaminase, Dissertation at ETH Zurich (2009))。文献中有几个实例描述了无糖基化抗体经由转谷氨酰胺酶的位点特异性缀合(例如Dennler等人, Bioconjugate Chemistry 19, 569-578 (2014)； Lhospice 等人，Molecular Pharmaceutics 12, 1863-1871 (2015))。
使用方法
根据本发明的缀合物和化合物显示出有价值的药理学和药代动力学作用谱，这是无法预知的。
因此，它们适合用作治疗和/或预防人和动物疾病的药物。
在本发明的范围内，术语“治疗”包括预防。
商业效用
已经令人惊讶地发现本发明的缀合物和化合物有效地抑制最终导致细胞死亡（例如凋亡）的NAMPT，并因此可用于治疗或预防不受控制的细胞生长、增殖和/或存活，不适当的细胞免疫应答或不适当的细胞炎症应答的疾病，或伴随不受控制的细胞生长、增殖和/或存活，不适当的细胞免疫应答或不适当的细胞炎症应答的疾病，特别是其中所述不受控制的细胞生长、增殖和/或存活、不适当的细胞免疫应答或不适当的细胞炎症应答通过NAMPT介导的疾病；诸如例如良性和恶性瘤，更具体地是血液肿瘤、实体瘤和/或其转移，例如白血病和骨髓增生异常综合征、恶性淋巴瘤、包括脑肿瘤和脑转移的头颈肿瘤、包括非小细胞和小细胞肺肿瘤的胸部肿瘤、胃肠肿瘤、内分泌肿瘤、乳腺和其它妇科肿瘤、包括肾、膀胱和前列腺肿瘤的泌尿科肿瘤、皮肤肿瘤和肉瘤、和/或其转移；尤其是血液肿瘤、以下的实体瘤和/或转移：乳腺、膀胱、骨、脑、中枢和周围神经系统、宫颈、结肠、内分泌腺（例如甲状腺和肾上腺皮质）、内分泌腺肿瘤、子宫内膜、食道、肠胃肿瘤、生殖细胞、肾脏、肝脏、肺、喉头和下咽部、间皮瘤、卵巢、胰脏、前列腺、直肠、肾脏、小肠、软组织、胃、皮肤、睾丸、输尿管、阴道和外阴，以及恶性瘤，包括所述器官中的原发性肿瘤和远处器官中的相应继发性肿瘤（“肿瘤转移”）。血液肿瘤可以例如通过侵袭性和进展缓慢形式的白血病和淋巴瘤举例说明，即非霍奇金病、慢性和急性髓性白血病（CML/ AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、霍奇金病、多发性骨髓瘤和T细胞淋巴瘤。还包括的有骨髓增生异常综合征、浆细胞瘤、类肿瘤综合征、和原发部位不明癌以及AIDS相关的恶性肿瘤。
本发明的一个方面是前文所述缀合物或化合物用于治疗急性髓细胞白血病(AML)的用途，以及治疗AML的方法，包括施用有效量的本发明缀合物或化合物。用于研究AML的公知的和经常使用的癌细胞系是例如THP-1(人单核细胞白血病细胞系)。
本发明的一个方面是前文所述缀合物或化合物用于治疗乳腺癌（包括HER2-阳性乳腺癌）的用途，以及治疗乳腺癌（包括HER2-阳性乳腺癌）的方法，包括施用有效量的本发明缀合物或化合物。用于研究乳腺癌（包括HER2-阳性乳腺癌）的公知的和经常使用的癌细胞系是MDA-MB-453乳腺癌细胞系[Cailleau R等人，In vitro 14 (11):911-915, 1978]。
本发明的一个方面是前文所述缀合物或化合物用于治疗脑肿瘤（包括成胶质细胞瘤）的用途，以及治疗脑肿瘤（包括成胶质细胞瘤）的方法，包括施用有效量的本发明的缀合物或化合物。用于研究成胶质细胞瘤的公知的和经常使用的癌细胞系是例如U251 MG(以前称为U-373 MG)成胶质细胞瘤星形细胞瘤细胞(Pontén, J., Macintyre, E. H. ActaPathol Microbiol Scand A. 74, 465-486, 1968)。
本发明的一个方面是前文所述缀合物或化合物用于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)(包括套细胞淋巴瘤(MCL))的用途，以及治疗NHL(包括MCL)的方法，包括施用有效量的本发明的缀合物或化合物。用于研究NHL(包括MCL)的公知的和经常使用的癌细胞系是例如REC-1(人套细胞淋巴瘤(B细胞非霍奇金淋巴瘤))。
本发明的一个方面是前文所述缀合物或化合物用于治疗肺癌的用途，以及治疗肺癌的方法，包括施用有效量的本发明的缀合物或化合物。用于研究肺癌的公知的和经常使用的癌细胞系是例如A549(人肺上皮细胞)。
因此，根据本发明的一个方面，本发明涉及如前文所述和定义的缀合物或化合物，或所述缀合物或化合物的N-氧化物、盐、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐，特别是其药学上可接受的盐，或其混合物，如本文所述和定义，用于治疗或预防疾病，尤其用于治疗疾病。
因此，本发明的另一个具体方面是前文所述的缀合物或化合物，或其立体异构体、互变异构体、N-氧化物、水合物、溶剂化物或盐，特别是其药学上可接受的盐，或它们的混合物，用于预防或治疗对诱导细胞死亡即细胞凋亡有应答的过度增殖性疾病和/或病症的用途。
在本发明的上下文中，特别是在“不适当的细胞免疫应答或不适当的细胞炎症应答”的上下文中，如本文所用的术语“不适当的”应理解为优选地意指小于或大于正常的应答，并且其与所述疾病的病理学相关、负责或导致所述疾病的病理学。
优选地，所述用途是治疗对诱导细胞死亡有应答的过度增殖性病症和/或病症，其中所述疾病是癌症疾病、血液肿瘤、实体瘤和/或其转移，例如白血病和骨髓增生异常综合征、恶性淋巴瘤、头颈肿瘤（包括脑肿瘤和脑转移）、胸部肿瘤（包括非小细胞和小细胞肺肿瘤）、胃肠肿瘤、内分泌肿瘤、乳腺和其它妇科肿瘤、泌尿科肿瘤（包括肾、膀胱和前列腺肿瘤）、皮肤肿瘤和肉瘤，和/或其转移。
优选的方面是如前文所述的缀合物或化合物用于预防和/或治疗急性骨髓性白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(特别是套细胞淋巴瘤)、乳腺癌(特别是HER2阳性乳腺癌)、脑肿瘤(特别是成胶质细胞瘤)和肺癌、和/或其转移的用途。
本发明的另一方面是如前文所述的缀合物或化合物或其立体异构体、互变异构体、N-氧化物、水合物、溶剂化物或盐，特别是其药学上可接受的盐，或它们的混合物，如本文所述，在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，其中所述疾病是对诱导细胞死亡（例如细胞凋亡）有应答的过度增殖性病症或病症。在一个实施方案中，所述疾病是血液肿瘤、实体瘤和/或其转移瘤，例如白血病和骨髓增生异常综合征、恶性淋巴瘤、头颈肿瘤（包括脑肿瘤和脑转移）、胸部肿瘤（包括非小细胞和小细胞肺肿瘤）、胃肠肿瘤、内分泌肿瘤、乳腺和其它妇科肿瘤、泌尿科肿瘤（包括肾、膀胱和前列腺肿瘤）、皮肤肿瘤和肉瘤，和/或其转移。在优选的实施方案中，所述疾病是急性髓性白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(特别是套细胞淋巴瘤)、乳腺癌(特别是HER2阳性乳腺癌)、脑肿瘤(特别是成胶质细胞瘤)和肺癌，和/或其转移。
治疗过度增殖性病症的方法
本发明涉及使用如前文所述的缀合物或化合物及其组合物治疗哺乳动物过度增殖性病症的方法。缀合物和化合物可用于抑制、阻断、减少等细胞增殖和/或细胞分裂，和/或产生细胞死亡（例如细胞凋亡）。该方法包括向有需要的哺乳动物（包括人）施用一定量的如前文所述的缀合物或化合物，或其药学上可接受的盐、异构体、多晶型物、代谢物、水合物、溶剂化物或酯；等，其对治疗该病症有效。过度增殖性病症包括但不限于例如牛皮癣、瘢痕瘤和其它影响皮肤的增生、良性前列腺增生(BPH)、实体瘤（如乳腺癌、呼吸道癌、脑癌、生殖器官癌、消化道癌、泌尿道癌、眼癌、肝癌、皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌和它们的远处转移）。那些疾病还包括淋巴瘤、肉瘤和白血病。
乳腺癌的实例包括但不限于浸润性导管癌、浸润性小叶癌、导管原位癌和小叶原位癌。
呼吸道癌症的实例包括但不限于小细胞和非小细胞肺癌，以及支气管腺瘤和胸膜肺母细胞瘤（pleuropulmonary blastoma）。
脑癌的实例包括但不限于脑干和下丘脑胶质瘤、小脑和大脑星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤以及神经外胚层和松果体肿瘤。
雄性生殖器官的肿瘤包括但不限于前列腺癌和睾丸癌。雌性生殖器官的肿瘤包括但不限于子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌和外阴癌，以及子宫肉瘤。
消化道肿瘤包括但不限于肛门癌、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、胆囊癌、胃癌、胰腺癌、直肠癌、小肠癌和唾液腺癌。
泌尿道肿瘤包括但不限于膀胱癌、阴茎癌、肾癌、肾盂癌、输尿管癌、尿道癌和人乳头状肾癌。
眼癌包括但不限于眼内黑素瘤和视网膜母细胞瘤。
肝癌的实例包括但不限于肝细胞癌(具有或不具有纤维板层变体的肝细胞癌)、胆管癌(肝内胆管癌)和混合肝细胞胆管癌。
皮肤癌包括，但不限于鳞状细胞癌、卡波西肉瘤、恶性黑素瘤、梅克尔细胞皮肤癌和非黑素瘤皮肤癌。
头颈癌包括但不限于喉癌、下咽癌、鼻咽癌、口咽癌、唇癌和口腔癌以及鳞状细胞癌。淋巴瘤包括但不限于AIDS相关淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金病和中枢神经系统淋巴瘤。
肉瘤包括但不限于软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤。
白血病包括但不限于急性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病和毛细胞白血病。
这些病症在人类中已经被很好地表征，但在其它哺乳动物中也以类似的病因学存在，并且可以通过施用本发明的药物组合物来治疗。
如贯穿本文件所陈述的术语“治疗（treating）”或“治疗（treatment）”是常规使用的，例如，为了对抗、减轻、减少、缓解、改善疾病或病症如癌的状况等的目的而管理或护理主体。
治疗NAMPT病症的方法
本发明还提供了治疗与异常NAMPT活性相关的病症的方法。
这样的病症包括但不限于与NF-KB激活相关的病症、炎症和组织修复病症；特别是类风湿性关节炎、炎性肠病、哮喘和COPD(慢性阻塞性肺病)、骨关节炎、骨质疏松症和纤维化疾病；皮肤病，包括银屑病、特应性皮炎和紫外线诱导的皮肤损伤；自身免疫性疾病，包括系统性红斑狼疮、多发性硬化、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、组织和器官排斥、阿尔茨海默病、中风、动脉粥样硬化、再狭窄、糖尿病、肾小球肾炎、癌症（包括但不限于乳腺、前列腺、肺、结肠、宫颈、卵巢、皮肤、CNS、膀胱、胰腺的癌症；白血病；淋巴瘤或霍奇金病）、恶病质、与感染和某些病毒感染相关的炎症（包括获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、成人呼吸窘迫综合征和共济失调毛细血管扩张、心力衰竭、肝肿大、心肿大、糖尿病、囊性纤维化、异种移植物排斥的症状、脓毒性休克或哮喘）。
在WO97/48696中描述了NAMPT参与癌症的治疗。在WO97/48397中描述了NAMPT参与免疫抑制。在WO2003/80054中描述了NAMPT参与治疗涉及血管生成的疾病。在WO2008/025857中描述了NAMPT参与治疗类风湿性关节炎和脓毒性休克。WO2009/109610中描述了NAMPT参与预防和治疗局部缺血。
有效量的本发明的缀合物或化合物可用于治疗这样的病症，包括上文背景技术部分中提及的那些疾病(例如癌症)。尽管如此，这样的癌症和其它疾病可以用本发明的缀合物或化合物治疗，且不论NAMPT与病症之间的作用机制和/或关系。
短语“异常NAMPT活性”包括编码酶的基因或其编码的多肽的任何异常表达或活性。这样的异常活性的实例包括但不限于基因或多肽的过表达；基因扩增；产生组成性活性或高活性酶活性的突变；基因突变、缺失、取代、添加等。
本发明还提供抑制NAMPT活性的方法，包括施用有效量的本发明的缀合物或化合物，包括其盐、多晶型物、代谢物、水合物、溶剂化物、前药(例如酯)及其非对映异构体形式。NAMPT活性可在细胞中(例如体外)或在哺乳动物主体(尤其是需要治疗的人类患者)的细胞中被抑制。
治疗血管生成病症的方法
本发明还提供了治疗与过度和/或异常血管生成相关的病症和疾病的方法。
血管生成的不适当和异位表达对生物体可能是有害的。许多病理状况与外部血管的生长有关。这些包括，例如糖尿病性视网膜病、缺血性视网膜-静脉阻塞和早产儿视网膜病[Aiello等人， New Engl. J. Med. 1994, 331, 1480 ；Peer等人， Lab. Invest.1995, 72, 638]，年龄相关性黄斑变性[AMD；参见Lopez 等人， Invest. Opththalmol.Vis. Sci. 1996, 37, 855]、新生血管性青光眼、银屑病、晶状体后纤维组织形成、血管纤维瘤、炎症、类风湿性关节炎(RA)、再狭窄、支架内再狭窄、血管移植物再狭窄等。此外，与癌和瘤组织相关的血液供应增加促进生长，导致肿瘤快速增大和转移。此外，肿瘤中新的血管和淋巴管的生长为叛徒细胞（renegade cell）提供了逃逸途径，促进了癌症的转移和后果性扩散（consequence spread）。因此，本发明的缀合物和化合物可用于治疗和/或预防任何上述血管生成病症，例如通过抑制和/或减少血管形成；通过抑制、阻断、减少、降低等内皮细胞增殖或其它参与血管生成的类型；以及引起细胞死亡，例如这样的细胞类型的凋亡。
优选地，所述方法的疾病是血液肿瘤、实体瘤和/或其转移。
本发明的缀合物和化合物可特别用于治疗和预防（即预防），尤其是治疗肿瘤生长和转移，尤其是治疗所有适应症和阶段的实体瘤，其中有或没有预处理肿瘤生长。
治疗诊断为或怀疑患有烟酸途径缺陷癌症的患者的方法
本发明还提供了治疗诊断为或怀疑患有烟酸途径缺陷的癌症的患者的方法。
所述方法包括向患者施用以下物质的步骤：
(a)有效量的本发明的缀合物或化合物；和
(b)有效量的烟酸。
任选地，所述方法还包括向患者施用以下物质的步骤：
(c)DNA损伤剂。
确定癌症是否缺乏烟酸途径的方法是技术人员已知的(例如在WO2009/072004中，其通过引用整体并入本文)。
合适的DNA损伤剂包括但不限于本文所述的那些。对于每个患者，特异性DNA损伤剂将根据由主治诊断医生确定的病症的性质和严重性、所用的特定缀合物或化合物的活性、患者的年龄和一般状况、施用时间、施用途径、药物的排泄速率、药物组合产品等而变化。
本发明还包括与烟酸组合的本发明的缀合物或化合物，其用于治疗诊断为或怀疑患有烟酸途径缺陷的癌症的患者。
本发明还包括本发明的缀合物或化合物与烟酸组合在制备用于治疗被诊断为或怀疑患有烟酸途径缺陷的癌症的患者的药物中的用途。
在一个实施方案中，静脉内施用有效量的烟酸。
在另一个实施方案中，口服施用有效量的烟酸。
在一个实施方案中，烟酸在本发明的缀合物或化合物施用之前或之后施用。
在一个实施方案中，烟酸与本发明的缀合物或化合物的施用同时施用。
预测施用烟酸降低用NAMPT抑制剂治疗癌症的副作用的严重性的功效的方法
本发明还提供了根据施用烟酸以降低使用根据本发明的NAMPT抑制剂治疗癌症的副作用的严重性的功效对患者进行分层的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定所述主体的癌症中烟酸磷酸核糖基转移酶(NAPRT)的水平；和
b)1)在如上述步骤a)中确定的NAPRT水平低于预定阈值的情况下，选择所述个体以便用i)有效量的如前文所述的缀合物或化合物和ii)有效量的烟酸、烟酸前体或烟酸前药的序贯或同时治疗；以及
2)在如上述步骤a)中所测定的NAPRT水平高于或等于预定阈值的情况下，选择所述个体以便用i)有效量的如前文所述的缀合物或化合物的治疗，所述治疗不存在与ii)有效量的烟酸、烟酸前体或烟酸前药的序贯或同时治疗。
本发明还包括用于治疗或减轻主体中癌症症状的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定所述主体中烟酸磷酸核糖基转移酶(NAPRT)的水平；和
b)1)在如上述步骤a)中确定的NAPRT水平低于预定阈值的情况下，用i)如前文所述的缀合物或化合物和ii)有效量的烟酸、烟酸前体或烟酸前药序贯或同时治疗所述主体；以及
2)在如上文步骤a)中确定的NAPRT水平高于或等于预定阈值的情况下，用i)如前文所述的缀合物或化合物治疗所述主体，所述治疗不存在与ii)有效量的烟酸、烟酸前体或烟酸前药的序贯或同时治疗。
上述方法任选地包括另外的步骤c)：向所述主体施用有效量的DNA损伤剂。
在上述方法的一个实施方案中，确定所述主体的肿瘤组织中的NAPRT水平。
在上述方法的一个实施方案中，烟酸磷酸核糖基转移酶(NAPRT)的水平根据编码NAPRT的核酸的水平来确定，如通过RT-PCR或DNA甲基化的定量(合适的方法提供于例如Shames等人，Clin Cancer Res； 19(24)； 6912–23中,其通过引用整体并入本文)。
在上述方法的一个实施方案中，烟酸磷酸核糖基转移酶(NAPRT)的水平根据蛋白的水平来确定，如在基于对NAPRT的特异性抗体或其它特异性结合配偶体的测定中。
本发明还涉及根据本发明的缀合物或化合物，其用于治疗或减轻主体的癌症症状的方法中，所述方法包括前文的步骤a)和b)。
本发明还涉及用作生物标志物的NAPRT，所述生物标志物可用于预测施用烟酸、烟酸前体或烟酸前药以降低用根据本发明的缀合物或化合物进行癌症治疗的副作用的严重性的功效的方法中。
本发明还涉及NAPRT作为生物标志物在选择对使用i)有效量的如前文所述的缀合物或化合物，和ii)有效量的烟酸、烟酸前体或烟酸前药序贯或同时治疗有应答的患者中的用途。
本发明进一步涉及烟酸磷酸核糖基转移酶(NAPRT)作为生物标志物在选择在不存在用有效量的烟酸、烟酸前体或烟酸前药序贯或同时治疗的情况下受益于用有效量的如前文所述的缀合物或化合物治疗的患者中的用途。
主体的分层是基于预定阈值的。建立预定阈值的适当方法是本领域技术人员已知的(例如在WO2011006988中或在US8,912,184中，其通过引用整体并入本文)。预定阈值可以例如由执业医生基于来自多个患者的数据来设置，例如至少5个患者、或至少20个患者、或甚至至少50个患者。因此，为了建立设置阈值的基础，将有必要首先建立或从现有患者群获得数据以确定他们的肿瘤组织中的NAPRT水平。肿瘤组织中的NAPRT水平可通过直接测量NAPRT或以更间接的方式与所讨论的组织中的NAPRT水平相关(或预期相关)的许多方法之一来确定。参照的组群期望与肿瘤类型、年龄、性别或疾病的严重性（特别是肿瘤类型）中的一个或多个相匹配。然而，在一个变体中，可以基于与人类群体中的肿瘤组织不同的组织类型的NAPRT的水平来设置阈值。这可以是相似或相同的患者，或者可以替代地是健康主体。然而，优选地，阈值基于相同组织中的NAPRT水平而设置，如肿瘤组织，如所讨论的肿瘤组织，并且从具有相同癌症适应症的多个患者获得。
使细胞对辐射敏感的方法
在本发明的不同的实施方案中，本发明的缀合物或化合物可用于使细胞对辐射敏感。即，在辐射处理细胞之前用本发明的缀合物或化合物处理细胞使得细胞比在没有用本发明的缀合物或化合物进行任何处理的情况下对DNA损伤和细胞死亡更敏感。在一个方面，用至少一种本发明的缀合物或化合物处理细胞。
因此，本发明还提供了杀死细胞的方法，其中将本发明的一种或多种缀合物或化合物与常规放射疗法组合施用于细胞。
本发明还提供了使细胞对细胞死亡更敏感的方法，其中在处理细胞以引起或诱导细胞死亡之前用一种或多种本发明的缀合物或化合物处理细胞。一方面，在用一种或多种本发明的缀合物或化合物处理细胞后，用至少一种缀合物或化合物或至少一种方法或其组合处理细胞，以便引起DNA损伤，目的是抑制正常细胞的功能或杀死细胞。
在一个实施方案中，通过用至少一种DNA损伤剂处理细胞来杀死细胞。即，在用一种或多种本发明的缀合物或化合物处理细胞以使细胞对细胞死亡敏感后，用至少一种DNA损伤剂处理细胞以杀死细胞。本发明中有用的DNA损伤剂包括但不限于化疗剂(例如顺铂)、电离辐射(X-射线、紫外线辐射)、致癌剂和诱变剂。
在另一个实施方案中，通过用至少一种引起或诱导DNA损伤的方法处理细胞来杀死细胞。这样的方法包括但不限于，当途径被激活时导致DNA损伤的细胞信号传导途径的激活，当途径被抑制时导致DNA损伤的细胞信号途径的抑制，以及诱导细胞中的生物化学变化，其中所述变化导致DNA损伤。经由非限制性实例，可以抑制细胞中的DNA修复途径，从而防止DNA损伤的修复并导致细胞中DNA损伤的异常积累。
在本发明的一个方面，在辐射或其它使细胞中的DNA损伤的诱导之前，将本发明的缀合物或化合物施用于细胞。在本发明的另一方面，将本发明的缀合物或化合物与辐射或其它使细胞中的DNA损伤的诱导同时施用于细胞。在本发明的再另一方面，在细胞中辐射或其它使细胞中的DNA损伤的诱导开始后，立即将本发明的缀合物或化合物施用于细胞。
在另一个方面，细胞是体外的。在另一个实施方案中，细胞是体内的。
本发明化合物的药物组合物
本发明还涉及含有一种或多种本发明的缀合物或化合物的药物组合物。这些组合物可通过施用于有需要的患者而用于实现所需的药理学作用。对于本发明的目的，患者是需要治疗特定病况或疾病的哺乳动物，包括人。
因此，本发明包括药物组合物，其包含如前文所定义的缀合物或化合物，以及至少一种药学上可接受的载体或辅助剂。
本发明的另一方面是药物组合物，其包含药学上可接受的载体或辅助剂和药学上有效量的本发明的缀合物或化合物或其盐。
本发明的另一方面是用于治疗前文所述疾病，尤其是用于治疗血液肿瘤、实体瘤和/或其转移的药物组合物，其包含药学有效量的如前文所定义的缀合物或化合物和药学可接受的辅助剂。
本发明的另一方面是用于治疗血液肿瘤、实体瘤和/或其转移的药物组合物，其包含如前文所定义的缀合物或化合物和药学上可接受的辅助剂。
药学上可接受的载体或辅助剂优选是在与活性成分的有效活性一致的浓度下对患者无毒和无害的载体，以便任何归因于载体的副作用不会破坏活性成分的有益作用。载体和辅助剂是帮助组合物适于施用的各种添加剂。
缀合物或化合物的药学有效量优选是对所治疗的特定病症产生结果或发挥预期影响的量。
本发明的缀合物和化合物可以与本领域熟知的药学上可接受的载体或辅助剂一起使用任何有效的常规剂量单位形式施用，包括立即、缓慢和定时释放制剂。
本发明的缀合物和化合物可以以缀合物或化合物的可注射剂量肠胃外施用，即皮下、静脉内、眼内、滑膜内、肌内或腹膜内（interperitoneally）施用，优选在生理学上可接受的稀释剂中与药物载体一起施用，所述药物载体可以是无菌液体或液体混合物，所述液体如水、生理盐水、葡萄糖水溶液和相关的糖溶液，醇如乙醇、异丙醇或十六烷醇，二醇如丙二醇或聚乙二醇，甘油缩酮如2,2-二甲基-1,1-二氧戊环-4-甲醇、醚如聚(乙二醇)400、油、脂肪酸、脂肪酸酯或脂肪酸甘油酯或乙酰化脂肪酸甘油酯，加入或不加入药学上可接受的表面活性剂例如皂或洗涤剂，悬浮剂如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素，或乳化剂和其它药学佐剂。
可用于本发明肠胃外制剂的示例性的油是石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、矿脂和矿物油。合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸、异硬脂酸和肉豆蔻酸。合适的脂肪酸酯是例如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。合适的皂类包括脂肪酸碱金属盐、铵盐和三乙醇胺盐，且合适的洗涤剂包括阳离子洗涤剂，例如二甲基二烷基卤化铵、烷基卤化吡啶鎓和烷基胺乙酸盐；阴离子洗涤剂，例如烷基、芳基和烯烃磺酸盐，烷基、烯烃、醚和单甘油酯硫酸盐，以及磺基琥珀酸盐；非离子洗涤剂，例如脂肪胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和聚(氧乙烯-氧丙烯)或环氧乙烷或环氧丙烷共聚物；和两性洗涤剂，例如烷基-β-氨基丙酸酯和2-烷基咪唑啉季铵盐，以及混合物。
本发明的肠胃外组合物将典型地在溶液中含有约0.5%至约25重量%的活性组分。也可有利地使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除注射部位的刺激，这样的组合物可以含有亲水-亲脂平衡(HLB)优选为约12至约17的非离子表面活性剂，这样的制剂中表面活性剂的量优选为约5至约15重量%的范围。表面活性剂可以是具有上述HLB的单一组分，或者可以是具有所需HLB的两种或更多种组分的混合物。
用于肠胃外制剂的表面活性剂的例子是聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯类，例如脱水山梨糖醇单油酸酯和环氧乙烷与疏水性基（hydrophobic base）的高分子量加合物，其通过环氧丙烷与丙二醇缩合形成。
药物组合物可以是无菌可注射水性混悬剂的形式。这样的混悬剂可以根据已知方法使用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂来配制，所述助悬剂诸如例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂，其可以是天然存在的磷脂如卵磷脂、环氧烷烃与脂肪酸的缩合产物（例如聚氧乙烯硬脂酸酯）、环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物（例如十七乙烯氧基鲸蜡醇（heptadecaethyleneoxycetanol ））、环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物（如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯）、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物（如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯）。
无菌可注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液。可以使用的稀释剂和溶剂是例如水、林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和等渗葡萄糖溶液。此外，无菌的不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸可用于注射剂的制备中。
用于肠胃外施用的控释制剂包括本领域已知的脂质体、聚合物微球和聚合物凝胶制剂。
本发明的组合物还可以根据需要或要求含有其它常规的药学上可接受的复合成分，通常称为载体或稀释剂。可以使用制备适当剂型的这样的组合物的常规方法。
这样的成分和步骤包括在以下参考文献中描述的那些，这些参考文献中的每一篇通过引用并入本文：Powell, M.F等人, "Compendium of Excipients for ParenteralFormulations" PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 1998, 52(5),238-311 ； Strickley, R.G "Parenteral Formulations of Small MoleculeTherapeutics Marketed in the United States (1999)-Part-1" PDA Journal ofPharmaceutical Science & Technology 1999, 53(6), 324-349；和Nema, S等人，"Excipients and Their Use in Injectable Products" PDA Journal ofPharmaceutical Science & Technology 1997, 51(4), 166-171。
本发明的药物组合物可以如下举例说明：
静脉内（i.v.）溶液：
将根据本发明的缀合物以低于饱和溶解度的浓度溶解在生理学可接受的溶剂(例如等渗盐水溶液、D-PBS或在添加聚山梨酯80的柠檬酸盐缓冲液中含有甘氨酸和氯化钠的制剂)中。将溶液进行无菌过滤，并分配到无菌且无热原的注射容器中。
静脉内（i.v.）溶液：
根据本发明的缀合物可以转化为所提及的施用形式。这可以以本身已知的方式通过“与”惰性的、无毒的、药学上合适的赋形剂(例如缓冲物质、稳定剂、增溶剂、防腐剂)“混合”或“溶解在”惰性的、无毒的、药学上合适的赋形剂中来实现。例如，可以存在以下物质：氨基酸（甘氨酸、组氨酸、蛋氨酸、精氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸等等）、糖和相关化合物（葡萄糖、蔗糖（saccharose）、甘露醇、海藻糖、蔗糖（sucrose）、甘露糖、乳糖、山梨醇）、甘油、钠盐、钾盐、铵盐和钙盐（例如氯化钠、氯化钾或磷酸氢二钠以及许多其它的盐)、乙酸盐/乙酸缓冲体系、磷酸盐缓冲体系、柠檬酸和柠檬酸盐缓冲体系、氨丁三醇（TRIS和TRIS盐）、聚山梨酯（例如聚山梨酯80和聚山梨酯20）、泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188和泊洛沙姆171)、聚乙二醇(PEG衍生物，例如3350)、Triton X-100、EDTA盐、谷胱甘肽、白蛋白(例如人)、尿素、苯甲醇、苯酚、氯甲酚、间甲酚、苯扎氯铵以及许多其它的物质。
用于随后转化成静脉内、皮下（s.c.）或肌内（i.m.）溶液的冷冻干产物：
或者，本发明的化合物可以被转化为稳定的冷冻干产物(可能借助于上述赋形剂)，并且在施用之前，用合适的溶剂(例如注射级水、等渗盐水溶液)重构并施用。
剂量和施用
基于已知用于评价治疗过度增殖性病症和血管生成病症的化合物的标准实验室技术，通过标准毒性试验和通过标准药理学测定用于确定哺乳动物中上述鉴定的病况的治疗，并通过将这些结果与用于治疗这些病况的已知药物的结果进行比较，可以容易地确定本发明的缀合物和化合物用于治疗每种需要的适应症的有效剂量。在治疗这些病况之一中，要施用的活性成分的量可以根据以下考虑因素而广泛地变化，如所用的特定缀合物或化合物和剂量单位、施用模式、治疗周期、所治疗患者的年龄和性别以及所治疗病况的性质和程度。
要施用的活性成分的总量一般为每天约0.001 mg/kg至约200 mg/kg体重，且优选每天约0.01 mg/kg至约20 mg/kg体重。临床上有用的给药方案将从一天给药一次至三次到每四周给药一次。此外，患者在一定时间内没有给药的“休药期”可能对药理作用和耐受性之间的总体平衡有益。单位剂量可以含有约0.5 mg至约1500 mg的活性成分，并且可以每天一次或多次或少于每天一次施用。通过注射，包括静脉内、肌内、皮下和肠胃外注射，以及使用输注技术施用的平均每日剂量优选为0.01至200 mg/kg总体重。
当然，对于每个患者的具体初始和持续剂量方案将根据由主治诊断医生确定的病况的性质和严重性、所用具体化合物的活性、患者的年龄和一般状况、施用时间、施用途径、药物的排泄速率、药物组合产品等而变化。本发明化合物或其药学上可接受的盐或酯或组合物的所需治疗模式和给药次数可由本领域技术人员使用常规治疗试验确定。
组合疗法
本发明的缀合物和化合物可以作为唯一的药学试剂或与一种或多种其它药学试剂组合施用，其中所述组合产品不引起不可接受的副作用。那些组合的药学试剂可以是具有抗增殖作用的其它药剂，诸如例如用于治疗血液肿瘤、实体瘤和/或其转移，和/或用于治疗不希望的副作用的药剂。本发明还涉及这样的组合产品。
适用于本发明组合物的其它抗过度增殖药剂包括但不限于那些在Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics(第九版)，编辑Molinoff等人，McGraw-Hill出版第1225-1287页（其以引用方式并入本文）中公认用于治疗肿瘤性疾病的化合物，尤其是如前文所定义的（化疗）抗癌剂。视情况而定，组合产品可以是非固定组合产品或固定剂量组合产品。
测试特定药理学或药学性质的方法是本领域技术人员公知的。
本发明的另一个实施方案是如权利要求部分中公开的根据权利要求的缀合物和化合物，其中定义根据以下公开的优选或更优选的定义或具体公开的示例性缀合物和化合物的残基及其子组合来限定。
以下实施例更详细地说明本发明，但不限制本发明。本发明的其它缀合物和化合物，其制备没有明确描述，可以以类似的方式制备。
在实验部分中的术语“根据”以所提及的程序以“类似于”的形式使用的意义使用。
实验部分
下表列出了本段以及中间体和实施例部分中使用的缩写，因而未对它们在正文中进行解释。
缩写 含义
DMSO 二甲基亚砜
DME 1,2-二甲氧基乙烷
NMR 核磁共振
DMF <i>N,N</i>-二甲基甲酰胺
MS 质谱
R<sub>t</sub> 保留时间
HPLC，LC 高效液相色谱
MPLC 中压液相色谱
h 小时
min 分钟
r.t. 室温(18–25°C)
ppm 化学位移δ，以百万分之（ppm）计
br. 宽信号(在NMR数据中)
s 单峰
d 双重峰
dd 双重双重峰
m 多重峰
ELSD 蒸发光散射检测器
ESI 电喷雾电离
pos 正的
neg 负的
DAD 二极管阵列检测器
m/z 质荷比（在质谱中）
EtOAc 乙酸乙酯
HATU 1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐
氨基酸缩写
Ala =丙氨酸
Arg =精氨酸
Asn =天冬酰胺
Asp =天冬氨酸
Cys =半胱氨酸
Glu =谷氨酸
Gln =谷氨酰胺
Gly =甘氨酸
His =组氨酸
Ile=异亮氨酸
Leu =亮氨酸
Lys =赖氨酸
Met =蛋氨酸
Phe =苯丙氨酸
Pro =脯氨酸
Ser =丝氨酸
Thr =苏氨酸
Trp =色氨酸
Tyr =酪氨酸
Cit =瓜氨酸
Val =缬氨酸。
本发明的化合物任选地含有可裂解基团SG。如本文所用，当SG是肽时，构成所述肽的氨基酸残基在本文中通过其三字母码、氨基酸或氨基酸残基(例如，-Ala-Val-、-丙氨酸-缬氨酸-或-丙氨酰-缬氨酰-)不加区别地指代。应当理解，氨基酸残基的开始和/或末尾处的连字符标记了与分子其余部分的连接点。除非另有说明，所述连字符可连接到与其连接的氨基酸残基的N-末端或C-末端。本发明包括所有这样的可能的连接方式(例如，-Ala-Val-、-丙氨酸-缬氨酸-或-丙氨酰-缬氨酰-包括(C-末端)-Ala-Val-(N-末端)和(N-末端)-Ala-Val-(C-末端)两者)。类似地，当所述连字符不存在时，应理解肽链的末端氨基酸残基可经由末端氨基酸残基的N末端或C末端与分子的其余部分连接(例如，当SG是Ala-Val-、丙氨酸-缬氨酸-或-丙氨酰-缬氨酰-时，它包括(C末端)-Ala-Val-(N末端)和(N末端)-Ala-Val-(C末端)两者)。除非另外指出，本发明包括所有这样的可能的连接模式。
本文未指定的其它缩写具有其对于技术人员而言通常的含义。
本申请中描述的本发明的各个方面通过以下实施例来说明，这些实施例不以任何方式限制本文所述的本发明的全部范围。
具体实验说明
以下具体实验描述中的NMR峰形当其在光谱中出现时被陈述，可能的更高阶效应尚未被考虑。化学位移（δ）以ppm给出。除非另有说明，通过将DMSO信号设定为2.50 ppm来校正化学位移。
所选化合物的1H-NMR数据以1H-NMR峰列表的形式列出。其中，对于每个信号峰，给出以ppm计的δ值，随后是在圆括号中报告的信号强度。来自不同峰的δ值-信号强度对由逗号分隔。因此，通过以下一般形式描述峰列表：δ1（强度1）、δ2（强度2）、...、δi（强度i）、...、δn（强度n）。
在打印出的NMR谱中，尖锐信号的强度与信号的高度（以cm计）相关。当与其它信号比较时，该数据可能与信号强度的真实比率相关。在宽信号的情况下，示出了与光谱中显示的最强信号相比，多于一个峰、或信号的中心以及它们的相对强度。1H-NMR峰列表与经典的1H-NMR读数相似，并因此通常含有经典NMR解析中列出的所有峰。此外，与经典的1H-NMR输出相似，峰列表可以显示溶剂信号、源自特定目标化合物的立体异构体的信号、杂质峰、13C伴峰和/或旋转边带。与目标化合物（例如，具有>90%的纯度）的峰相比，立体异构体的峰和/或杂质的峰通常显示具有较低的强度。这样的立体异构体和/或杂质对于具体的制备方法可以是典型的，并因此它们的峰可以有助于基于“副产物指纹”鉴定制备方法的再现。通过已知方法（MestReC、ACD模拟，或通过使用经验评价的期望值）计算目标化合物的峰的专家可以根据需要分离目标化合物的峰，任选使用另外的强度过滤器。这样的操作与经典1H-NMR解析中的峰提取相似。以峰列表形式报告NMR数据的详细描述可在出版物“Citation ofNMR Peaklist Data within Patent Applications”（参见http://www.researchdisclosure.com/searching-disclosuresResearch Disclosure DatabaseNumber 605005, 2014, 01 Aug 2014）中找到。在峰值提取例行程序中，如在研究公开数据库第605005号（Research Disclosure Database Number 605005）中所述，参数“MinimumHeight”可以在1%和4%之间调整。然而，根据化学结构和/或根据所测量的化合物的浓度，将参数“MinimumHeight”设置为＜1%可能是合理的。
使用微波辐射的反应可以用 Biotage Initator®微波炉进行，该微波炉任选地装有机械单位（robotic unit）。所报道的使用微波加热的反应时间应理解为达到指出的反应温度后的固定反应时间。根据本发明的方法产生的化合物和中间体可能需要纯化。有机化合物的纯化是本领域技术人员公知的，并且可以有几种纯化相同化合物的方法。在一些情况下，可能不需要纯化。在一些情况下，化合物可以通过结晶纯化。在一些情况下，可以使用合适的溶剂将杂质排出来（stirred out）。在一些情况下，化合物可以通过色谱纯化，特别是快速柱色谱，使用例如预包装的硅胶小圆柱（catridge），例如来自Separtis的如Isolute® Flash硅胶（“SiO2”）或Isolute® Flash NH2硅胶（“胺-涂布的SiO2”）与Isolera 自动纯化仪（Biotage）和洗脱剂如例如己烷/乙酸乙酯或二氯甲烷/甲醇的梯度组合。在一些情况下，化合物可以通过制备型HPLC纯化，使用例如装备有二极管阵列检测器的Waters自动纯化仪和/或在线电喷雾离子化质谱仪与合适的预装反相柱和洗脱剂组合，所述洗脱剂如水和乙腈的梯度（其可以含有添加剂如三氟乙酸、甲酸或氨水）。在一些情况下，如上所述的纯化方法可以提供盐形式的具有足够碱性或酸性官能度的那些本发明化合物，如在本发明化合物足够碱性的情况下，例如三氟乙酸盐或甲酸盐，或者在本发明化合物足够酸性的情况下，例如铵盐。这种类型的盐可以通过本领域技术人员已知的各种方法分别转化为其游离碱或游离酸形式，或者在随后的生物学测定中以盐的形式使用。应理解，如本文所述分离的本发明化合物的特定形式（例如盐、游离碱等）不一定是所述化合物可应用于生物测定以量化特定生物活性的唯一形式。
如果没有另外说明，中间体和实施例的纯度≥95%，如通过LC/MS或1H-NMR光谱认定的。
在以下实施例中报道的产率百分数是基于以最低摩尔量使用的起始组分。空气和湿气敏感的液体和溶液经由注射器或套管转移，并通过橡胶隔膜引入反应容器。使用商品级试剂和溶剂而不进一步纯化。术语"减压浓缩"是指在最小压力为约15 mm Hg使用Buchi旋转蒸发器。所有温度以摄氏度（℃）为单位未校正地报告。
为了更好地理解本发明，给出以下实施例。这些实施例仅用于说明的目的，不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。本文提及的所有出版物均全文引入作为参考。
分析LC-MS条件
在随后的具体实验描述中给出的LC-MS-数据涉及（除非另有说明）以下条件：
方法：
方法1：（仪器：Waters Acquity UPLC-MS SQD；柱：Acquity UPLC BEH C18 1.750x2.1mm；洗脱液A：水+0.1体积%甲酸(99%)，洗脱液B：乙腈；梯度：0-1.6 min 1-99% B，1.6-2.0 min 99% B；速率0.8 mL/min；温度：60℃；注射：1μL；DAD扫描：210-400 nm；ELSD；
方法2：仪器：Waters Acquity UPLC-MS SQD；柱：Acquity UPLC BEH C18 1.750x2.1mm；洗脱液A：水+ 0.2体积% NH3 (32%)，洗脱液B：乙腈；梯度：0-1.6 min 1-99% B，1.6-2.0 min 99% B；速率0.8 mL/min；温度：60℃；注射：1μL；DAD扫描：210-400 nm；ELSD；
方法3：仪器：Waters Acquity二元泵，QDA，PDA；柱：CSH C18 1.7μm 50 x2.1mm；洗脱液A：水+0.1体积%甲酸(99%)，洗脱液B：乙腈+0.1体积%甲酸(99%)；梯度：0-1.6 min 2-95% B，1.2-1.4 min95% B；速率0.8 mL/min；温度：40℃；注射：2μL；
方法4：仪器：Waters Acquity二元泵，QDA，PDA；柱：CSH C18 1.7μm 50 x2.1mm；洗脱液A：水+0.1体积%甲酸(99%)，洗脱液B：乙腈+0.1%体积%甲酸(99%)；梯度：0-4.0min 2-95% B，4.0-4.4min95% B；速率0.8 mL/min；温度：40℃；注射：2μL；
方法5：仪器：Waters Acquity四元泵，QDA，PDA；柱：XBridge BEH C18 2.5μm 50x2.1mm；洗脱液A：10 mM碳酸氢铵pH10，洗脱液B：乙腈；梯度：0-1.2min 2-98% B，1.2-1.4min 98% B；速率0.8 mL/min；温度：40℃；注射：2μL；
方法6：仪器：Waters Acquity四级泵，QDA，PDA；柱：XBridge BEH C18 2.5 µm50x2.1mm；洗脱液A：10 mM碳酸氢铵pH10，洗脱液B：乙腈；梯度：0-4.0min 2-98% B，4.0-4.6min 98% B；速率0.8 mL/min；温度：40℃；注射：2μL；
快速柱色谱条件
如在随后的具体实验描述中所述的“通过(快速)柱色谱纯化”是指使用BiotageIsolera纯化系统。对于技术规范，参见www.biotage.com上的“Biotage产品目录（Biotageproduct catalogue）”。
抗体/活性化合物缀合物(ADC)的制备
产生不同抗-靶抗体的一般方法
人源化
通过将CDR转移到人抗体骨架中，将7G3抗体的鼠抗体序列人源化。关于根据Kabat的CDR的定义，参见在Antibody Engineering (Springer Lab Manuals)，编辑: Duebel, S.和Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg中的Andre C.R. Martin, “Proteinsequence and structure analysis of antibody variable domains”。在将鼠框架序列(没有CDR)与人种系序列比较后，选择相似的频繁出现的人框架序列。在这种情况下，是具有J序列IGHJ4-03的重链IGHV1-46-01和具有J片段IGKJ2的轻链IGKV4-1-01。种系序列起源于VBASE2数据库(Retter I, Althaus HH, Münch R, Müller W: VBASE2，an integrativeV gene database，Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1；33(数据库发行):D671-4)。序列使用IMGT系统命名(Lefranc, M.-P., Giudicelli, V., Ginestoux, C., Jabado-Michaloud,J., Folch, G., Bellahcene, F., Wu, Y., Gemrot, E., Brochet, X., Lane, J.,Regnier, L., Ehrenmann, F., Lefranc, G. 和 Duroux, P. IMGT®, theinternational ImMunoGeneTics information system®，Nucl. Acids Res, 37, D1006-D1012 (2009); doi:10.1093/nar/gkn838)。本文所述的抗体变体TPP-5969携带不同于人种系序列的、可能影响其特性的各种点突变。
例如，通过筛选重组鼠B7H3 (鼠CD276；基因ID：102657)和人B7H3 (人CD276；基因ID：80381)表达细胞的噬菌体展示基因库，产生其它抗-B7H3抗体。将以这种方式获得的抗体转换为人IgG1格式并用于本文所述的工作实施例。此外，与B7H3结合的抗体是本领域技术人员已知的。
在哺乳动物细胞中表达抗-靶抗体的一般方法
通过如Tom等人，Methods Express中的第12章: 由Michael R. Dyson 和 YvesDurocher编辑的Expression Systems，Scion Publishing Ltd, 2007中所述，抗体，例如TPP-8382、TPP-509、TPP-668、TPP-9574和TPP-1015是在瞬时哺乳动物细胞培养物中产生的。
从细胞上清液纯化抗体的一般方法
从细胞培养上清液获得抗体，例如TPP-8382、TPP-509、TPP-668、TPP-9574和TPP-1015。通过离心细胞澄清细胞上清液。然后通过MabSelect Sure (GE Healthcare)色谱柱上的亲和色谱纯化细胞上清液。为此，在DPBS pH7.4 (Sigma/Aldrich)中平衡柱，施用细胞上清液，并且用约10柱体积的DPBS pH7.4+500 mM氯化钠洗涤柱。将抗体在50 mM乙酸钠pH3.5+500 mM氯化钠中洗脱，并且然后在Superdex 200柱(GE Healthcare)上在DPBS pH7.4中通过凝胶过滤色谱进一步纯化。
检查ADC的抗原-结合
偶联发生后，检查结合剂与靶分子结合的能力。本领域技术人员熟悉可用于该目的各种方法；例如，可以使用ELISA技术或表面等离子体共振分析(BIAcore™测量)来检查缀合物的亲和力。缀合物浓度可以由本领域技术人员使用常规方法测量，例如对于抗体缀合物通过蛋白确定。(也参见Doronina等人；Nature Biotechnol. 2003； 21:778-784 和Polson 等人，Blood 2007；1102:616-623)。
以下抗体用于偶联反应：
抗体 缩写
抗-HER2 TPP-1015 A
抗-CXCR5 TPP-9574 B
抗-B7H3 TPP-8382 C
抗-C4.4a TPP-509 D
抗-C4.4a TPP-668 E
ADC实施例编号中的字母描述了相应的抗体部分。字母“M”表示在ADC的抗体和/或连接子部分细胞内降解后衍生自ADC的相应活性代谢物。如果一些制剂由某种抗体-药物缀合物制成，则不同的制剂通过另外的小写字母（a、b、c等）来区分。为了说明，实施例36Ca是指抗-B7H3 TPP-8382-缀合物的制剂“a”，而实施例36Cb是指相同抗-B7H3 TPP-8382-缀合物的制剂“b”。
程序1：与半胱氨酸侧链偶联的一般方法
将溶解在PBS缓冲液中的2和8之间的当量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)加入到PBS缓冲液中的适当抗体的溶液中，浓度范围在1 mg/mL和20 mg/mL之间，优选在约10 mg/mL到15 mg/mL的范围内，并在室温搅拌混合物1h。为此目的，所用的各抗体溶液可以工作实施例中所述的浓度使用，或者它任选地也可以用PBS缓冲液稀释至所述起始浓度的约一半，以便达到优选的浓度范围。随后，根据预期的载量，可以以DMSO中的溶液形式加入2-20当量，优选约5-16当量的待偶联的马来酰亚胺前体化合物或卤化物前体化合物。这里，DMSO的量不应超过总体积的10%。在马来酰亚胺前体的情况中，在室温搅拌反应60-240min，然后施用到PBS平衡的PD10柱(Sephadex® G-25, GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液洗脱。一般地，除非另有说明，PBS缓冲液中的5 mg所讨论的抗体用于还原和随后的偶联。在PD10柱上纯化因此在每种情况下提供了各自ADC在3.5 mL PBS缓冲液中的溶液。然后通过超速离心浓缩样品，并任选用PBS缓冲液再次稀释。如果需要，为了更好地除去低分子量组分，在用PBS缓冲液再稀释后重复超滤浓缩。对于生物学试验，如果需要，任选地通过再稀释将最终ADC样品的浓度调节至0.5-15 mg/mL的范围。确定在工作实施例中所述的ADC溶液的各自的蛋白浓度。此外，用程序5所描述的方法确定抗体负载(药物/mAb比率)。
通常在缀合反应中使用3.0当量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）和8.0当量的相应马来酰亚胺。为了产生具有更高药物/抗体比率(＞4)的种类，在缀合反应中通常使用8.0当量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)和16.0当量的相应马来酰亚胺。
通常，使用以下一般程序用于5 mg抗体的缀合：
在氩气氛下，将0.029 mg TCEP在50μl PBS缓冲液(pH7.2)中的溶液加入到在0.5 mLPBS缓冲液(pH7.2)中的5 mg所讨论的抗体中(c～10 mg/mL)。将反应混合物在室温搅拌30min，然后加入溶解在50μl DMSO中的0.27μmol马来酰亚胺前体化合物。在室温再搅拌1.5h-2h后，将反应用1900μl PBS缓冲液(pH7.2)稀释。然后将该溶液施用到已经用PBS缓冲液(pH7.2)平衡的PD10柱(Sephadex G-25，GE Healthcare)并用PBS缓冲液(pH7.2)洗脱。然后将洗脱液以10℃/4G离心5min，然后通过超速离心浓缩上清液，并用PBS缓冲液(pH7.2)再稀释至2.5 mL的体积。
通常，使用以下一般程序用于35 mg抗体的缀合：
在氩气氛下，将0.201 mg TCEP在200μl PBS缓冲液(pH7.2)中的溶液加入到在2.5 PBS缓冲液(pH7.2)中的35 mg所讨论的抗体中(c～15 mg/mL)。将反应在室温搅拌30min，然后加入溶解在200μl DMSO中的1.17μmol马来酰亚胺前体化合物。在室温再搅拌1.5h-2h后，用PBS缓冲液(pH7.2)稀释反应物至总体积为5.0 mL。然后将该溶液施用到已经用PBS缓冲液(pH7.2)平衡的PD10柱(Sephadex®G-25，GE Healthcare)并用PBS缓冲液(pH7.2)洗脱。然后将洗脱液以10℃/4G离心5min，然后通过超速离心浓缩上清液，并用PBS缓冲液(pH7.2)再稀释至3.5 mL的体积。
除非另有说明，否则实施例中所示的免疫缀合物通过该方法制备。根据连接子，实施例中所示的ADC还可以以更低或更高的程度以与抗体连接的水解开链琥珀酰胺的形式存在。两种异构体形式都可以存在。
其中连接子通过水解开链琥珀酰胺与抗体连接的ADC可以任选地还通过如下示例性程序以靶向方式制备：
程序2：用开环马来酰亚胺与半胱氨酸侧链偶联的一般方法
通常使用以下一般程序：
在氩气氛下，将0.029 mg TCEP在50μl PBS缓冲液(pH7.2)中的溶液加入到在0.5 mLPBS缓冲液(pH8)中的5 mg所讨论抗体中(c～10 mg/mL)。将反应在室温搅拌30min，然后加入溶解在50μl DMSO中的0.27μmol马来酰亚胺前体化合物。在室温再搅拌1.5h-2h后，将反应用1900μl PBS缓冲液(pH8)稀释。然后将该溶液施用到已经用PBS缓冲液pH8平衡的PD10柱(Sephadex® G-25, GE Healthcare)并用PBS缓冲液pH8洗脱，然后将洗脱液在室温在氩气氛下搅拌过夜。此后然后将洗脱液以10℃/4G离心5min，然后通过超速离心浓缩上清液，并用PBS缓冲液(pH7.2)再稀释至2.5 mL的体积。确定在工作实施例中所述的ADC溶液的各自的蛋白浓度。此外，用程序5所描述的方法确定抗体负载(药物/mAb比率)。
工作实施例中与抗体桥接的其它潜在水解敏感性硫杂环己烷基（thianyl）琥珀酰亚胺含有以下连接子亚结构，其中#1代表与抗体的硫醚键和#2代表与修饰的有效载荷的连接点：
这些连接子亚结构代表了对抗体的连接单位，并且(除了连接子组成之外)对肿瘤细胞中形成的代谢物的结构和分布具有显著影响。
程序3：与赖氨酸侧链偶联的一般方法
向浓度范围在1mg/mL和20 mg/mL之间，优选在约10 mg/mL至15 mg/mL范围内的PBS缓冲液中的适当抗体的溶液中加入相应的最终中间体(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯)在DMSO中的溶液，通常为2-10当量。在室温搅拌30min至6h后，再次加入相应的最终中间体(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯) 在DMSO中的溶液(通常为2-10当量)，并将混合物在室温再搅拌30min至6h。优选地，加入的DMSO量不应超过总体积的10%。之后，将混合物施用到PBS平衡的PD10柱(Sephadex G-25，GE Healthcare)，并用PBS缓冲液洗脱。一般地，除非另有说明，PBS缓冲液中的5 mg所讨论抗体用于还原和随后的偶联。在PD10柱上纯化因此在每种情况下提供了各自ADC在3.5 mL PBS缓冲液中的溶液。然后通过超速离心浓缩样品，并任选用PBS缓冲液再次稀释。如果需要，为了更好地除去低分子量组分，在用PBS缓冲液再稀释后重复超滤浓缩。对于生物学试验，如果需要，任选地通过再稀释将最终ADC样品的浓度调节至0.5-15 mg/mL的范围。确定在工作实施例中所述的ADC溶液的各自的蛋白浓度。此外，用程序5所描述的方法确定抗体负载(药物/mAb比率)。
通常，使用以下一般程序用于5 mg抗体的缀合：
在氩气氛下，将0.175μmol最终中间体(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯)在25μl DMSO中的溶液加入到在0.5 mL PBS缓冲液(pH7.2) 中的5 mg所讨论抗体中(c～10 mg/mL)。将反应在室温搅拌1h，并再次加入0.175μmol最终中间体在25μl DMSO中的溶液。再搅拌1h后，用PBS缓冲液(pH7.2)稀释反应至总体积为2.5 mL。然后将该溶液施用到已经用PBS缓冲液(pH7.2)平衡的PD10柱(Sephadex G-25，GE Healthcare)并用PBS缓冲液(pH7.2)洗脱。然后将洗脱液以10℃/4G离心5min，然后通过超速离心浓缩上清液，并用PBS缓冲液(pH7.2)再稀释至2.5 mL的体积。
通常，使用以下一般程序用于35 mg抗体的缀合：
在氩气氛下，将1.17μmol最终中间体(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯)在300μl DMSO中的溶液加入到在5 mL PBS缓冲液(pH7.2) 中的35 mg所讨论抗体中(c～7 mg/mL)。将反应在室温搅拌1h，并再次加入1.17μmol最终中间体在300μl DMSO中的溶液。再搅拌1h后，用PBS缓冲液(pH7.2)稀释反应物至总体积为7.5 mL。然后将该溶液施用到已经用PBS缓冲液(pH7.2)平衡的PD10柱(Sephadex G-25，GE Healthcare)并用PBS缓冲液(pH7.2)洗脱。然后将洗脱液以10℃/4G离心5min，然后通过超速离心浓缩上清液，并用PBS缓冲液(pH7.2)再稀释至3.5 mL的体积。
程序4：如果最终中间体带有可还原部分（例如二硫化物），与半胱氨酸侧链偶联的一般方法
如果最终中间体带有可还原部分例如二硫化物，来自抗体还原步骤的剩余TCEP也可能裂解最终中间体中的可还原部分，并因此应当被除去。因此，应该调整用于与半胱氨酸侧链缀合的一般方法。通常使用以下一般程序：
在氩气氛下，将0.029 mg TCEP在50μl PBS缓冲液(pH7.2)中的溶液加入到在0.5 mlPBS缓冲液(pH8)中的5 mg所讨论抗体中(c～10 mg/ml)。将反应在RT搅拌30min，然后施用到已经用PBS缓冲液(pH7.2)平衡的PD10柱(Sephadex® G-25, GE Healthcare)并用PBS缓冲液(pH7.2)洗脱。然后向洗脱液中加入0.27μmol溶解在50μl DMSO中的马来酰亚胺前体化合物。在室温搅拌另外1.5h-2h后，用1900μl PBS缓冲液(pH8)稀释反应。然后将该溶液施用到已经用PBS缓冲液(pH7.2)平衡的PD10柱(Sephadex® G-25, GE Healthcare)并用PBS缓冲液(pH7.2)洗脱。然后将洗脱液以10℃/4G离心5min，然后通过超速离心浓缩上清液，并用PBS缓冲液(pH7.2)再稀释至2.5 mL的体积。然后将该溶液施用到已经用pH8的PBS缓冲液平衡的PD10柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)并用pH8的PBS缓冲液洗脱，然后将洗脱液在氩气氛下于RT搅拌过夜。然后将洗脱液以10℃/4G离心5min，然后通过超速离心浓缩上清液，并用PBS缓冲液(pH7.2)再稀释至2.5 mL的体积。确定在工作实施例中所述的ADC溶液的各自的蛋白浓度。此外，用程序5所描述的方法确定抗体负载(药物/mAb比率)。
程序5：抗体同一性、毒性基团负载(DAR)和ADC浓度的确定
对于蛋白鉴定，除了去糖基化和/或变性后的分子量确定之外，还进行胰蛋白酶消化，其在变性、还原和衍生化后，经由发现的胰蛋白酶肽确认蛋白的身份。
如下确定工作实施例中描述的缀合物的毒性基团负载：
通过质谱确定单个缀合物种类的分子量来确定赖氨酸偶联的ADC的毒性基团负载(如果不是通过UV分析进行，见下文)。这里，首先使用PNGaseF将缀合物去糖基化，酸化，并在经短C4柱(GromSil 300 Butyl-1 ST, 5µm, 5mmx500µm) HPLC分离/脱盐后，使用系统的ESI-QT（ESI-QTof System） (Bruker Daltonik)通过质谱法分析。TIC (总离子色谱图)中的信号的所有光谱被相加，并且基于MaxEnt去卷积计算不同缀合物种类的分子量。然后，从毒性基团数目加权偶联的种类的总和除以每个种类的单一加权积分结果的总和计算DAR (=药物/抗体比率)。
半胱氨酸偶联的ADC的确定(如果不是通过UV分析进行，见下文)通过质谱确定还原后单个缀合物种类的分子量来进行。将盐酸胍(GuHCl) (28.6 mg)和DL-二硫苏糖醇(DTT)溶液(500 mM，3μL)加入ADC溶液(1mg/mL，50μL)。将混合物在55℃培养1h，然后在在线脱盐后使用Bruker Daltonik的ESI-QT通过质谱进行分析。对于DAR确定，TIC (总离子色谱图)中的信号的所有光谱被相加，并且基于轻链和重链的MaxEnt去卷积计算不同缀合物种类的分子量。从通过积分确定的峰面积计算具有毒性基团的抗体的平均负载，其为HC-负载和LC-负载的总和的两倍，而HC-负载是所有重链(HC)峰的毒性基团数加权积分结果的总和除以HC-峰的单一加权积分结果的总和，并且其中LC-负载是轻链(LC)峰的毒性基团数加权积分结果的总和除以所有LC峰的单一加权积分结果的总和。
为了确定半胱氨酸加合物的开环百分比，测定1倍缀合轻链(对于轻链和重链也是可能的)的闭环和开环半胱氨酸加合物的分子量峰面积(分子量18 Da中的δ)。所有变体的平均值给出开环半胱氨酸加合物的百分比。
或者，在尺寸排阻色谱(SEC)过程中通过UV吸收确定载药量。在此，通过尺寸排阻色谱分析50μL的ADC溶液。分析在Agilent 1260 HPLC系统上进行，在280 nm检测，且在毒性基团相关波长检测。使用来自GE Healthcare的Superdex 20010/300 GL (批号：10194037)(10×310 mm，13μm粒度)，流速为1 ml/min，使用等度条件。流动相由PBS缓冲液(pH7.2)组成。为了确定SEC分布中的载药量，确定了在药物特异性波长(λ药物)和在280 nm处的单体峰的峰面积的比率R。由于该比率R，DAR可以如下计算：
Figure 640654DEST_PATH_IMAGE113
而ε代表抗体(Ab)和药物(D)的摩尔消光系数。
实验确定抗体在280 nm和药物波长下的消光系数。使用不同抗体的平均值用于计算。对于Nampt毒性基团(没有额外连接子的化合物)，消光系数通过实验确定。确定下列波长和消光系数并用于DAR计算：
Figure 694061DEST_PATH_IMAGE114
Figure 533841DEST_PATH_IMAGE115
在实验部分，经由UV吸收确定的载药量(药物/mAb比率)用“(UV)”标记。
通过测量280nm处的吸收来确定ADC的浓度。使用各抗体的吸收系数计算浓度。为了考虑毒性基团在280nm的吸光度，在一些情况下，使用以下等式校正浓度：
浓度=初步浓度/ ((1+ DARUV*(ε毒性基团 280nm /ε抗体280nm))
而“初步浓度”是仅使用抗体的消光系数计算的浓度，DARUV是通过UV吸收确定的各自ADC的载药量，且ε毒性基团 280nm和ε抗体280nm分别是在280nm的毒性基团和抗体的消光系数。
对以下实施例进行浓度校正：
35C、35D、36C、36D、36E、30A、35A、36A、41A、42E、42 A。
中间体1-1
(2E)-3- (喹啉-5-基) -1- (4-硝基苯基)丙-2-烯-1-酮
Figure 14501DEST_PATH_IMAGE116
向在THF (49 mL)和乙醇(240 mL)中的1- (4-硝基苯基)乙酮(CAS 100-19-6，3.00g，18.2 mmol)中加入喹啉-5-甲醛(CAS22934-41-4、3.43g、21.8 mmol)和乙酸铵(1.34g、17.4mmol)。将混合物加热至70℃保持3天。然后冷却混合物，并在60℃加入甲酸(69 mL，1.8mol)。搅拌混合物1h，直到达到室温。滤出形成的沉淀，用乙醇洗涤，得到第一批。将滤液减压浓缩，并加入乙醇(80 mL)和THF (12 mL)。将所得混合物搅拌过夜，滤出形成的沉淀，用乙醇洗涤，得到第二批。将所得滤液减压浓缩，并通过快速色谱(SiO2，己烷/乙酸乙酯 梯度0% -45% -70%)纯化，得到第三批。将所有批次合并，得到3.15g (85%纯度，50%产率)标题化合物。
Figure 306942DEST_PATH_IMAGE117
中间体1-2
4- (4-硝基苯基) -4-氧代-2- (喹啉-5-基)丁腈
Figure 977089DEST_PATH_IMAGE118
在压力管中，将(2E)-1-(4-硝基苯基)-3-(喹啉-5-基)丙-2-烯-1-酮(2.00g，6.57mmol)悬浮于1,4-二噁烷（20 mL)中，并用氩气脱气。然后加入碳酸铯(10.7 mg，32.9μmol)、三甲基氰硅烷(1.3 mL，9.9 mmol)和水(590μl)，并再次用氩气脱气。将混合物加热至100℃保持2.5天，2h、20h和2天后，加入另外的三甲基氰硅烷(各0.4 mL，3.3 mmol)。冷却至室温后，将混合物小心倒在冰水(200 mL)上，并用乙酸乙酯萃取(4次)，用盐水洗涤合并的有机相，经水分离滤器过滤，减压浓缩。粗制产物通过柱色谱(SiO2，己烷/乙酸乙酯 梯度0% -100%)纯化，得到682 mg (90%纯度，29%产率)标题化合物。
Figure 671375DEST_PATH_IMAGE119
中间体1-3
6- (4-硝基苯基) -4- (喹啉-5-基) -4,5-二氢哒嗪-3(2H) -酮
Figure 322937DEST_PATH_IMAGE120
在0℃，向4- (4-硝基苯基)-4-氧代-2- (喹啉-5-基)丁腈(650 mg，1.96 mmol)在乙醇(6.9 mL)中的混合物中加入水合肼(3.4 mL，69 mmol)，并将该混合物加热至50℃保持15min。然后将混合物冷却至室温，倾倒在水(22 mL)上并搅拌30min。滤出形成的沉淀，向收集的固体中加入乙醇(22 mL)和水(22 mL)。将所得混合物加热至90℃保持26h，然后加入乙酸(560μl，9.8 mmol)，并将该混合物在90℃再搅拌10h，冷却至室温后向该混合物中加入水(5 mL)。将形成的细小沉淀滤出，用水洗涤，得到405 mg (72%纯度，60%产率)标题化合物。
Figure 368253DEST_PATH_IMAGE121
中间体1-4
6- (4-氨基苯基) -4- (喹啉-5-基) -4,5-二氢哒嗪-3(2H) -酮
Figure 763462DEST_PATH_IMAGE122
向甲醇(13 mL)中的4- (4-硝基苯基) -4-氧代-2- (喹啉-5-基)丁腈(440 mg，1.27mmol)中加入钯炭催化剂(68 mg，10%)。将混合物在氢气氛下于50℃搅拌3h，并在室温搅拌22h，加入另外的钯炭催化剂(53 mg，10%)，并继续搅拌2天。将氢气氛换为氩气，并将混合物通过短路径的硅藻土过滤，然后用温热的乙酸乙酯甲醇混合物(1:1)彻底洗涤。用乙酸乙酯甲醇混合物在60℃重复萃取硅藻土，得到400 mg (67%纯度，67%产率)标题化合物，其含有6- (4-硝基苯基) -4- (喹啉-5-基) -哒嗪-3(2H) -酮为微量杂质。
Figure 374572DEST_PATH_IMAGE123
中间体1-5
{4-[6-氧代-5- (喹啉-5-基) -1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}氨基甲酸4-硝基苯基酯
Figure 462614DEST_PATH_IMAGE124
在室温，向在THF (15 mL)中的6- (4-氨基苯基) -4- (喹啉-5-基) -4,5-二氢哒嗪-3(2H) -酮(234 mg，740μmol)中加入氯甲酸4-硝基苯基酯(CAS-No. 7693-46-1，298 mg，1.48 mmol)，并将混合物加热至60℃。在1h后重复加入氯甲酸4-硝基苯基酯(298 mg，1.48mmol)，并在60℃继续搅拌30min。冷却至室温后，将混合物减压浓缩，得到830 mg (50%纯度，定量)粗制标题化合物，其直接用于下一步骤。
Figure 729647DEST_PATH_IMAGE125
实施例1
N-{4-[6-氧代-5- (喹啉-5-基) -1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c ]吡啶-2-甲酰胺
Figure 662968DEST_PATH_IMAGE126
将2,3-二氢-1H-吡咯并[3,4-c ]吡啶二盐酸盐(CAS-No. 6000-50-6，214 mg，1.11mmol)加入粗制的{4-[6-氧代-5- (喹啉-5-基) -1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}氨基甲酸4-硝基苯基酯(356 mg，740μmol)在二氯甲烷(14 mL)和N,N-二异丙基乙胺(640μl，3.7mmol)中的悬浮液中。在室温搅拌2h后，将混合物冷却至-20℃，静置12h后滤出沉淀，并用冷二氯甲烷洗涤。将沉淀物在氢氧化钠水溶液(20 mL，1M)中搅拌，过滤，用水洗涤并减压干燥，得到175 mg (67%纯度，51%产率)标题化合物，其含有N-{4-[6-氧代-5- (喹啉-5-基) -1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c ]吡啶-2-甲酰胺为微量杂质。
Figure 331847DEST_PATH_IMAGE127
中间体2-1
{4-[ 3-{4-[ (1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c ]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基) -5,6-二氢哒嗪-1(4H) -基]丁基}氨基甲酸叔丁酯
Figure 590790DEST_PATH_IMAGE128
在氩气氛下，于-10℃向N-{4-[6-氧代-5- (喹啉-5-基) -1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c ]吡啶-2-甲酰胺(参见实施例1，25 mg，54μmol)在DMF(0.5 mL)和DMSO (0.2 mL)中的溶液中添加氢化钠(4.5 mg，在矿物油中60%，114μmol)。在该温度搅拌混合物10min。然后加入四正丁基碘化铵(2.0 mg，5.4μmol)。之后，每10min后分3份添加(4-溴丁基)氨基甲酸叔丁酯(23.1 mg，92μmol)。在-10℃再搅拌30min后，将混合物用水稀释，用含有10%乙醇的二氯甲烷萃取。将有机萃取物通过硅胶过滤器过滤并在减压下浓缩，且将粗制产物通过柱色谱(SiO2，二氯甲烷/乙醇梯度)、接着通过制备型HPLC纯化，得到7.4 mg (90%纯度，20%产率)标题化合物和4.1 mg N-{4-[6-氧代-5- (喹啉-5-基) -1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c ]吡啶-2-甲酰胺和2.1 mg N-{4-[6-氧代-5- (喹啉-5-基) -1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c ]吡啶-2-甲酰胺(实施例4)，其为氧化副产物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：YMC-Actus-ODS-AQ-HG 10μm，150×20mm。洗脱液A：水+ 0.1%氨；洗脱液B：乙腈；梯度：0-14min 1-30% B，14-20 min30% B，20-25 min 30-50% B。速率60 mL/min，温度25℃。
Figure 892589DEST_PATH_IMAGE129
实施例2
N-{4-[1- (4-氨基丁基) -6-氧代-5- (喹啉-5-基) -1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c ]吡啶-2-甲酰胺
Figure 895180DEST_PATH_IMAGE130
将{4-[3-{4-[ (1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c ]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基) -5,6-二氢哒嗪-1(4H) -基]丁基}氨基甲酸叔丁酯与N-{4-[6-氧代-5- (喹啉-5-基) -1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c ]吡啶-2-甲酰胺(组合的：220mg，347μmol)、三氟乙酸(530μl，6.9mmol)和二氯甲烷(3.4ml)的混合物在室温搅拌2h，然后将混合物用甲苯稀释，在减压下浓缩，并将粗制产物通过制备型HPLC纯化，得到37.0mg(90%纯度，18%产率)标题化合物和88.8mg(93%纯度，45.1%产率)的N-{4-[1- (4-氨基丁基) -6-氧代-5- (喹啉-5-基) -1，6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1，3-二氢-2H-吡咯并[3，4-c ]吡啶-2-甲酰胺作为第二产物(实施例5)。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μm 120×30 mm。洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-7min1-7% B，7-15min 7-20% B，速率150 mL /min，温度25℃。
Figure 418566DEST_PATH_IMAGE131
中间体3-1
{6-[3-{4-[ (1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c ]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基) -5,6-二氢哒嗪-1(4H) -基]己基}氨基甲酸叔丁酯
Figure 582831DEST_PATH_IMAGE132
在氩气氛下，在0℃，向N-{4-[6-氧代-5- (喹啉-5-基) -1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c ]吡啶-2-甲酰胺(参见实施例1，220 mg，478μmol)在DMF(7.2 mL)和DMSO (4.4 mL)中的溶液中加入氢化钠(47.8 mg，在矿物油中60%，1.19 mmol)。在该温度搅拌混合物40min。然后加入四正丁基碘化铵(17.6 mg，47.8μmol)。之后，每4min后分3份加入(6-溴己基)氨基甲酸叔丁酯(290μL，1.2 mmol)。在0℃搅拌另外2h后，将混合物用饱和氯化铵水溶液稀释，并用含10%乙醇的二氯甲烷萃取。将有机萃取物通过硅胶过滤器过滤，在减压下浓缩，且将粗制产物通过柱色谱(SiO2，二氯甲烷/乙醇梯度)纯化，得到231 mg (20%纯度，16%产率)标题化合物，在与N-{4-[6-氧代-5- (喹啉-5-基) -1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c ]吡啶-2-甲酰胺(作为主要杂质)的混合物中。
Figure 824456DEST_PATH_IMAGE133
实施例3
N-{4-[1- (6-氨基己基) -6-氧代-5- (喹啉-5-基) -1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c ]吡啶-2-甲酰胺
Figure 427476DEST_PATH_IMAGE134
将{6-[3-{4-[ (1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c ]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基) -5,6-二氢哒嗪-1(4H) -基]己基}氨基甲酸叔丁酯与N-{4-[6-氧代-5- (喹啉-5-基) -1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c ]吡啶-2-甲酰胺(组合的：231 mg，349μmol)和三氟乙酸(540μl，7.0 mmol)在二氯甲烷(3.4 mL)中混合物在室温搅拌2h，然后将混合物用甲苯稀释，在减压下浓缩，并将粗制产物通过制备型HPLC纯化，得到73.4 mg标题化合物(94%纯度，35%产率)和120.3 mg (93%纯度，56%产率)的 N-{4-[1-(4-氨基丁基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺作为第二产物(实施例6)，为它们的甲酸盐。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μm 120×30 mm。洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-7min1-7% B，7-15min 7-20% B 速率150 mL /min，温度25℃。
Figure 805368DEST_PATH_IMAGE135
实施例4
N-{4-[6-氧代-5- (喹啉-5-基) -1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c ]吡啶-2-甲酰胺
Figure 406113DEST_PATH_IMAGE136
标题化合物作为副产物从{4-[-3-{4-[ (1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c ]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5- (喹啉-5-基) -5,6-二氢哒嗪-1(4H) -基]丁基}氨基甲酸叔丁酯(参见中间体2-1)的制备中分离出2.1 mg (90%纯度，8%产率)。
Figure 869456DEST_PATH_IMAGE137
实施例5
N-{4-[1- (4-氨基丁基)-6-氧代-5- (喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c ]吡啶-2-甲酰胺
Figure 213849DEST_PATH_IMAGE138
从N-{4-[1- (4-氨基丁基) -6-氧代-5- (喹啉-5-基) -1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺的制备(参见实施例2)中分离出标题化合物，其为第二产物88.8 mg (93%纯度，45.1%产率)。
Figure 545384DEST_PATH_IMAGE139
实施例6
N-{4-[1- (6-氨基己基) -6-氧代-5- (喹啉-5-基) -1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c ]吡啶-2-甲酰胺
Figure 51452DEST_PATH_IMAGE140
从N-{4-[1- (6-氨基己基) -6-氧代-5- (喹啉-5-基) -1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c ]吡啶-2-甲酰胺的制备(参见实施例3)分离出标题化合物，为第二产物120.3 mg (93%纯度，56%产率)。
Figure 267669DEST_PATH_IMAGE141
中间体7-1
4-{4-[ (叔丁氧基羰基)氨基]苯基}-2- (5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基) -4-氧代丁酸乙酯
Figure 150175DEST_PATH_IMAGE142
在0℃，向在THF (45 mL)中的2- (5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)乙酸乙酯(烯胺EN300-159964，948 mg，5.57 mmol)加入双(三甲基甲硅烷基酰胺)在甲苯中的溶液(13.4 mL，0.5M)，并将该混合物在0℃搅拌30min，在0℃加入[4- (溴乙酰基)苯基]氨基甲酸酯(CAS-885269-70-5，2.5g，5.57 mmol)在THF (25 mL)中的溶液，并再搅拌1h。将混合物用饱和氯化铵水溶液稀释，用乙酸乙酯萃取，将合并的有机相经硫酸钠干燥，并在减压下浓缩。粗制产物通过柱色谱(SiO2，己烷/乙酸乙酯梯度)随后通过制备型HPLC纯化，得到1004 mg (95%纯度，42%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：YMC-ODS-AQ 10μm 280x51 mm。洗脱液A：水+ 0.1%氨；洗脱液B：乙腈；梯度：0-20min，30-70%B，速率250 mL /min，温度25℃。
Figure 502659DEST_PATH_IMAGE143
中间体7-2
{4-[5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}氨基甲酸叔丁酯
Figure 241944DEST_PATH_IMAGE144
在乙酸(17μL，300μmol)及水合肼: (29 µL，590 µmol)存在下，将4-{4-[(叔丁氧羰基)胺基]苯基}-2-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-4-氧代丁酸乙酯(200 mg 496μmol)在二氯甲烷(5 mL)中加热，在密闭容器中于40℃保持11天。将混合物减压浓缩，粗制产物通过柱色谱(SiO2,己烷/乙酸乙酯梯度)纯化，得到120 mg(95%纯度，62%产率)标题化合物。
Figure 679879DEST_PATH_IMAGE145
中间体7-3
6-(4-氨基苯基)-4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-4,5-二氢哒嗪-3(2H)-酮
Figure 366075DEST_PATH_IMAGE146
在室温搅拌{4-[(5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}氨基甲酸叔丁酯(120 mg，323μmol)和三氟乙酸(250μL，3.2 mmol)在二氯甲烷(5.0mL)中的悬浮液1h，然后将另外的三氟乙酸(250μL，3.2 mmol)加入到黄色溶液中并继续搅拌1h，用甲苯稀释混合物，减压浓缩并在高真空干燥，得到145 mg(60%纯度，定量)粗制标题化合物，其直接用于下一步骤。
Figure 573066DEST_PATH_IMAGE147
中间体7-4
{4-[5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}氨基甲酸4-硝基苯基酯
Figure 686515DEST_PATH_IMAGE148
在室温，向在THF(6.5 mL)中的6-(4-氨基苯基)-4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-4,5-二氢哒嗪-3(2H)-酮(145 mg，60%纯度，323μmol)加入氯甲酸4-硝基苯基酯(CAS-No.7693-46-1，129 mg，641μmol)并将混合物加热至60℃。1h后，将混合物在减压下浓缩，得到粗制标题化合物(定量)，其直接用于下一步骤。
实施例7
N-{4-[5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 611746DEST_PATH_IMAGE149
将2,3-二氢-1H-吡咯并[3,4-c]吡啶二盐酸盐(CAS-No.6000-50-6, 92.2mg，478μmol)加入到粗制{4-[5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}氨基甲酸4-硝基苯基酯(参见中间体7-4, 323μmol)在二氯甲烷(6.6 mL)和N,N-二异丙基乙胺(280μl, 1.6 mmol)中的悬浮液中。在室温搅拌3h后，将混合物减压浓缩并通过制备型HPLC纯化，得到52.0 mg(95%纯度， 37%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-3000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 4000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.15，Prepcon 5软件。柱：ChromatorexC18 10μm 125×30 mm。洗脱液A：水+ 0.1%氨；洗脱液B：乙腈；梯度：0-6min10-50% B，6-8min 50-100% B，速率150 mL /min，温度25℃。
Figure 649103DEST_PATH_IMAGE150
中间体8-1
{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基羰基)氨基]苯基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基]丁基}氨基甲酸叔丁酯
Figure 976179DEST_PATH_IMAGE151
在0℃氩气氛下，向N-{4-[5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见实施例7，113 mg，270μmol)在DMF(1.8 mL)和DMSO(1.8 mL)中的溶液中加入氢化钠(9.70 mg，在矿物油中60%，404μmol)，并在该温度下搅拌混合物20min。然后将四正丁基碘化铵(9.95 mg，27.0μmol)和(4-溴丁基)氨基甲酸叔丁酯(109 mg，431μmol)在总共10min内以5份加入。在0℃再搅拌1h后，混合物以饱和氯化铵水溶液稀释，并在减压下浓缩，残留物悬浮于DMSO中，过滤，滤液通过制备型HPLC纯化，产生65.6mg(95%纯度，39.4%产率)的标题化合物，以及23.9mg(95%纯度，21.3%产率)的N-{4-[5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(实施例9)。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C 18 10μm 125×30 mm。洗脱液A：水+0.1%氨；洗脱液B：乙腈；梯度：0-6min10-50% B，6-8min 50-100% B，速率150 mL /min，温度25℃。
Figure 260530DEST_PATH_IMAGE152
实施例8
N-{4-[1-(4-氨基丁基)-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 407478DEST_PATH_IMAGE153
将{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基]丁基}氨基甲酸叔丁酯(96.7 mg，165μmol)与三氟乙酸(200μl，2.6 mmol)一起在二氯甲烷(2 mL)中搅拌。1h后，将混合物减压浓缩，并通过制备型HPLC纯化，得到80.4 mg(95%纯度，95%产率)的标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：ChromatorexC18 10μm 125×30 mm。洗脱液A：水+0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-6min10-50% B，6-8min 50-100% B，速率150 mL/min，温度25℃。
Figure 435477DEST_PATH_IMAGE154
实施例9
N-{4-[5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 679376DEST_PATH_IMAGE155
标题化合物从{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基羰基)氨基]苯基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基]丁基}氨基甲酸叔丁酯的制备(参见中间体8-1)中分离，为第二产物23.9 mg(95%纯度，21.3%产率)。
Figure 134628DEST_PATH_IMAGE156
中间体10-1
{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基甲酸叔丁酯
Figure 34451DEST_PATH_IMAGE157
在室温在氩气氛下，向N-{4-[5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见实施例7， 74.0 mg，177μmol)在DMF(1.7 mL)和DMSO(1.7 mL)中的悬浮液中加入氢化钠(14.9 mg，在矿物油中60%，372μmol)。将混合物在室温搅拌20min，然后加入四正丁基碘化铵(6.55 mg，17.7μmol)和(6-溴己基)氨基甲酸叔丁酯(89μl，380μmol)。在室温搅拌4h后，将混合物用饱和氯化铵水溶液稀释，并在减压下浓缩，将残余物悬浮于乙腈DMSO混合物中，过滤，并将浓缩的滤液通过制备型HPLC纯化，得到115 mg(60%纯度，63%产率)标题化合物，在与{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基甲酸叔丁酯（为微量第二产物）的混合物中。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 4000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μm 125×30 mm；洗脱液A：水+0.1%氨；洗脱液B：乙腈；梯度：0-7min30-70% B，速率150 mL/min，温度25℃。
Figure 600562DEST_PATH_IMAGE158
实施例10
N-{4-[1-(6-氨基己基)-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 636651DEST_PATH_IMAGE159
在室温，将{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基甲酸叔丁酯，{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基甲酸叔丁酯的混合物(合并的115 mg, 187 µmol)及三氟乙酸(230 µL, 3.0 mmol)在二氯甲烷(2.3 mL)中的混合物搅拌3h，混合物在减压下浓缩，并通过制备型HPLC纯化，产生40.4 mg(95%纯度，39%产率)标题化合物，连同11.5mg(80%纯度，9.5%产率)N-{4-[1-(6-氨己基)-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(实施例11)。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：ChromatorexC18 10μm 125×30 mm。洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-6min5-30% B，速率150 mL /min，温度25℃。
Figure 75853DEST_PATH_IMAGE160
实施例11
N-{4-[1-(6-氨基己基)-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 197393DEST_PATH_IMAGE161
标题化合物从N-{4-[1-(6-氨基己基)-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺的制备(参见实施例10)分离作为第二产物，11.5 mg(80%纯度，9.5%产率)。
Figure 567195DEST_PATH_IMAGE162
中间体12-1
2,2,2-三氟-1-(喹啉-5-基)乙-1-酮
Figure 723370DEST_PATH_IMAGE163
在-70℃，将5-溴喹啉(CAS4964-71-0, 6.15g，29.6 mmol)分批加入正丁基锂(1,6M，在己烷中，37 mL)在THF(150 mL)和乙醚(150 mL)中的溶液中，搅拌30min后，加入-70℃的冷的N,N-二乙基-2,2,2-三氟乙酰胺(4.2 mL，30 mmol)在THF(50 mL)中的溶液，并将混合物在-78℃搅拌1h，将反应用饱和氯化铵水溶液淬灭，温热至室温，并用乙酸乙酯萃取。有机萃取物用盐水洗涤，浓缩，粗制产物通过柱色谱(SiO2,己烷/乙酸乙酯梯度)纯化，得到3.77g(95%纯度，50%产率)部分水合的标题化合物。
Figure 520424DEST_PATH_IMAGE164
中间体12-2
(2Z)-4,4,4-三氟-1-(4-硝基苯基)-3-(喹啉-5-基)丁-2-烯-1-酮
Figure 191577DEST_PATH_IMAGE165
向1-(4-硝基苯基)乙-1-酮(CAS 100-19-6，240 mg，1.45 mmol)和2,2,2-三氟-1-(喹啉-5-基)乙-1-酮(600 mg，60%纯度，1.60 mmol)在THF(3.5 mL)中的混合物中加入1,8-二氮杂双环(5.4.0)十一碳-7-烯(220μl，1.5 mmol)。在室温搅拌混合物16h，然后在搅拌的同时经一天加热至50℃保持8h并冷却至室温。将混合物减压浓缩，且粗制产物通过柱色谱(SiO2，己烷/乙酸乙酯梯度)纯化，得到148 mg(60%纯度，16%产率)标题化合物。
Figure 912539DEST_PATH_IMAGE166
中间体12-3
(2R)-4-(4-硝基苯基)-4-氧代-2-(喹啉-5-基)-2-(三氟甲基)丁腈
Figure 985538DEST_PATH_IMAGE167
将(2Z)-4,4,4-三氟-1-(4-硝基苯基)-3-(喹啉-5-基)丁-2-烯-1-酮(590 mg，1.58mmol)溶解于THF(66 mL)中，用氮气脱气。然后在0℃加入碳酸钾(657 mg，4.75 mmol)、(9S)-1-{[3,5-双(三氟甲基)苯基]甲基}-6',9-二甲氧基辛可宁-1-鎓溴化物(根据Eur.J. Org. Chem. 2013, 5398–5413制备，205 mg， 317 µmol)。将混合物温热至室温并搅拌一天。在减压下浓缩混合物后，将溶剂换成乙酸乙酯。用饱和氯化铵水溶液和盐水洗涤有机相。减压浓缩有机相，并将粗制产物通过柱色谱(SiO2，己烷/乙酸乙酯梯度0% -40%)纯化，得到370 mg(90%纯度，53%产率)标题化合物。
Figure 953494DEST_PATH_IMAGE168
中间体12-4
(2R)-4-亚肼基-4-(4-硝基苯基)-2-(喹啉-5-基)-2-(三氟甲基)丁酰胺
Figure 49626DEST_PATH_IMAGE169
在0℃，向乙醇(2.2 mL)中的(2R)-4-(4-硝基苯基)-4-氧代-2-(喹啉-5-基)-2-(三氟甲基)丁腈(370 mg，927μmol)中加入水合肼(1.6 mL，32 mmol)，并将混合物加热至50℃保持15min。然后将混合物冷却至室温，加入水(10 mL)。通过在减压下浓缩混合物分离形成的沉淀，得到粗制标题化合物490 mg(57%纯度，70%产率)，其直接用于下一步骤。
Figure 761230DEST_PATH_IMAGE170
中间体12-5
(4R)-6-(4-硝基苯基)-4-(喹啉-5-基)-4-(三氟甲基)-4,5-二氢哒嗪-3(2H)-酮
Figure 891997DEST_PATH_IMAGE171
向乙醇(12 mL)和水中的(2R)-4-亚肼基-4-(4-硝基苯基)-2-(喹啉-5-基)-2-(三氟甲基)丁酰胺(480 mg，1.11 mmol)中加入乙酸(320μl，5.6 mmol)，将混合物在90℃搅拌10h。冷却至室温后将混合物减压浓缩，并将粗制产物通过制备型HPLC纯化，得到40.0 mg(95%纯度，8%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μm 125×30 mm；洗脱液A：水+ 0.1%氨；洗脱液B：乙腈；梯度：0-7min30-70% B，速率150 mL/min，温度25℃。
Figure 840974DEST_PATH_IMAGE172
中间体12-6
(4R)-6-(4-氨基苯基)-4-(喹啉-5-基)-4-(三氟甲基)-4,5-二氢哒嗪-3(2H)-酮
Figure 158823DEST_PATH_IMAGE173
向在乙酸乙酯(5.0mL)中的(4R)-6-(4-硝基苯基)-4-(喹啉-5-基)-4-(三氟甲基)-4,5-二氢哒嗪-3(2H)-酮(40.0mg，96.5µmol)添加钯炭催化剂(20mg，10%)。将混合物在氢气气氛下在室温搅拌2h，将氢气气氛换成氩气，并将混合物通过短硅藻土通道过滤，然后用乙酸乙酯彻底洗涤。将合并的滤液减压浓缩，得到29.3 mg(70%纯度，55%产率)标题化合物。
Figure 674118DEST_PATH_IMAGE174
中间体12-7
{4-[(5R)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}氨基甲酸4-硝基苯基酯
Figure 659391DEST_PATH_IMAGE175
在室温向在THF(6.5 mL)中的(4R)-6-(4-氨基苯基)-4-(喹啉-5-基)-4-(三氟甲基)-4,5-二氢哒嗪-3(2H)-酮(29.3 mg，70%纯度，76.2μmol)中加入氯甲酸4-硝基苯基酯(CAS-No. 7693-46-1，30.7 mg，152μmol)，并将混合物加热到60℃。在1.5h之后，在减压下浓缩混合物，得到粗制标题化合物(定量)，其直接用于下一步骤中。
Figure 969150DEST_PATH_IMAGE176
实施例12
N-{4-[(5R)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 836612DEST_PATH_IMAGE177
将2,3-二氢-1H-吡咯并[3,4-c]吡啶二盐酸盐(CAS-No. 6000-50-6，22.1 mg，115μmol)加入到粗制{4-[(5R)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}氨基甲酸4-硝基苯基酯(参见中间体12-7，42.0 mg，76.2μmol)在二氯甲烷(1.6mL)和N,N-二异丙基乙胺(67μl，380μmol)中的悬浮液中。在室温搅拌3h并在-20℃储存16h后，将混合物减压浓缩并通过制备型HPLC纯化，得到18.6 mg(90%纯度，41%产率)的标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μm 125×30 mm。洗脱液A：水+0.1%氨；洗脱液B：乙腈；梯度：0-6min15-55% B，6-8min 55-100% B，速率150 mL /min，温度25℃。
Figure 890018DEST_PATH_IMAGE178
手性LC：仪器：Agilent HPLC1260；柱：Chiralpak IB 3μ100x4,6 mm；洗脱液A：水+0.1体积%磷酸(85%)，洗脱液B：乙腈；梯度：0-7 min 20-90% B；流速1.4 mL/min；温度：25℃；DAD@325 nm：Rt=2.63min，ee =99%。
中间体13-1
{4-[(5R)-3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]丁基}氨基甲酸叔丁酯
Figure 729798DEST_PATH_IMAGE179
在0℃，向N-{4-[(5R)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见实施例12，13.0 mg，24.5μmol)在DMF(0.5 mL)中的溶液中加入氢化钠(2.06 mg，在矿物油中60%，55.5μmol)。在该温度搅拌混合物5min。然后加入四正丁基碘化铵(910μg，2.5μmol)。之后，加入(4-溴丁基)氨基甲酸叔丁酯(10.5 mg，41.7μmol)。在室温搅拌4h后，将混合物通过制备型HPLC纯化，得到9.6 mg(95%纯度，57%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μm 125×30 mm。洗脱液A：水+0.1%氨；洗脱液B：乙腈；梯度：0-7min30-70% B，速率150 mL /min，温度25℃。
Figure 210458DEST_PATH_IMAGE180
实施例13
N-{4-[(5R)-1-(4-氨基丁基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 768478DEST_PATH_IMAGE181
将{4-[(5R)-3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]丁基}氨基甲酸叔丁酯(9.60 mg，13.7μmol)与三氟乙酸(105μL，1.35 mmol)一起在二氯甲烷(800μL)中搅拌，所述三氟乙酸经3h分三份加入。将混合物减压浓缩，并通过制备型HPLC纯化，得到8.7 mg(90%纯度，95%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：YMC-Actus-ODS-AQ-HG 10μm 150x20 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-14min 15-55% B，14-17min 55-100% B，速率60 mL /min，温度25℃。
Figure 173046DEST_PATH_IMAGE182
中间体14-1
4-(4-硝基苯基)-4-氧代-2-(喹啉-5-基)-2-(三氟甲基)丁腈
Figure 132912DEST_PATH_IMAGE183
将(2Z)-4,4,4-三氟-1-(4-硝基苯基)-3-(喹啉-5-基)丁-2-烯-1-酮(参见中间体12-2，800 mg，2.15 mmol)溶于THF(66 mL)中。然后在室温加入碳酸钾(891 mg，6.45 mmol)、(8α，9R)-1-{[3,5-双(三氟甲基)苯基]甲基}-6',9-二甲氧基辛可宁-1-鎓溴化物(类似于Eur. J. Org. Chem. 2013, 5398–5413制备, 347 mg，80%纯度，430μmol)。在减压下浓缩混合物后，将溶剂换成乙酸乙酯。用饱和氯化铵水溶液和盐水洗涤有机相。减压浓缩有机相，粗制产物通过柱色谱(SiO2，己烷/乙酸乙酯梯度0% -50%)纯化，得到593 mg(90%纯度，62%产率)标题化合物。
Figure 784473DEST_PATH_IMAGE184
中间体14-2
4-亚肼基-4-(4-硝基苯基)-2-(喹啉-5-基)-2-(三氟甲基)丁酰胺
Figure 564210DEST_PATH_IMAGE185
在0℃，向乙醇(9.1 mL)中的4-(4-硝基苯基)-4-氧代-2-(喹啉-5-基)-2-(三氟甲基)丁腈(780 mg，1.95 mmol)中加入水合肼(3.3 mL，68 mmol)，并将该混合物加热至50℃保持3h。将混合物减压浓缩，得到843 mg(定量)粗制标题化合物，其可直接用于下一步。
Figure 959419DEST_PATH_IMAGE186
中间体14-3
6-(4-硝基苯基)-4-(喹啉-5-基)-4-(三氟甲基)-4,5-二氢哒嗪-3(2H)-酮
Figure 836109DEST_PATH_IMAGE187
向在乙醇(22 mL)和水(22 mL)中的4-亚肼基-4-(4-硝基苯基)-2-(喹啉-5-基)-2-(三氟甲基)丁酰胺(粗制中间体14-2，843 mg，1.95 mmol)中加入乙酸(560μl，9.8 mmol)，并将混合物在90℃下搅拌2天。冷却至室温后，将混合物减压浓缩并将粗制产物通过制备性HPLC纯化得到57 mg(80%纯度，5.6 %产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：ChromatorexC18 10μm 125×30 mm。洗脱液A：水+ 0.1%氨；洗脱液B：乙腈；梯度：0-7min30-70% B，6, 速率150 mL /min，温度25℃。
Figure 658571DEST_PATH_IMAGE188
中间体14-4
6-(4-氨基苯基)-4-(喹啉-5-基)-4-(三氟甲基)-4,5-二氢哒嗪-3(2H)-酮
Figure 925604DEST_PATH_IMAGE189
向甲醇(2.8 mL)和乙酸乙酯(5.0 mL)中的6-(4-硝基苯基)-4-(喹啉-5-基)-4-(三氟甲基)-4,5-二氢哒嗪-3(2H)-酮(57.0 mg，138μmol)中添加在活性炭上的铂/钒/(26.8 mg，Pt1%/V2%)。在室温，在氢气气氛下搅拌混合物5h，然后加入另外的在活性炭上的铂/钒(14mg，Pt1/V2%)，并在氢气下继续搅拌7h，将氢气气氛换成氩气，并通过短硅藻土通道过滤混合物，然后用甲醇和THF彻底洗涤。将合并的滤液减压浓缩，得到66 mg(70%纯度，87%产率)标题化合物。
Figure 124505DEST_PATH_IMAGE190
中间体14-5
{4-[6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}氨基甲酸4-硝基苯基酯
Figure 793383DEST_PATH_IMAGE191
在室温将氯甲酸4-硝基苯基酯(CAS-No. 7693-46-1，62.3 mg，309μmol)以四等份加入在THF(3.1 mL)中的6-(4-硝基苯基)-4-(喹啉-5-基)-4-(三氟甲基)-4,5-二氢哒嗪-3(2H)-酮(64.0 mg，154μmol)中，和同时将混合物加热至60℃。在1.5h后将混合物在减压下浓缩，得到粗制标题化合物(定量)，其直接用于下一步骤。
实施例14
N-{4-[6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 599796DEST_PATH_IMAGE192
将2,3-二氢-1H-吡咯并[3,4-c]吡啶二盐酸盐(CAS-No. 6000-50-6，45 mg，232μmol)悬浮于二氯甲烷(1.0 mL)和N,N-二异丙基乙胺(130μl，770μmol)中，并在搅拌1h后，加入到粗制{4-[6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}氨基甲酸4-硝基苯基酯(中间体14-5，85.0 mg，155μmol)在二氯甲烷(2.2 mL)中的悬浮液中。在室温搅拌30min后，将混合物减压下浓缩并通过制备型HPLC纯化，得到30 mg(85%纯度，31%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：ChromatorexC18 10μm 125×30 mm。洗脱液A：水+ 0.1%氨；洗脱液B：乙腈；梯度：0-6min15-55% B，6-8min 55-100% B，速率150 mL/min，温度25℃。
Figure 354126DEST_PATH_IMAGE193
手性LC：仪器：Agilent HPLC1260；柱：Chiralpak IG 3μ100x4,6 mm；洗脱液A：己烷+ 0.1体积%二乙胺；洗脱液B：乙醇；梯度：在7min内 20-50% B；流速1.4 mL/min；温度：25℃；DAD @ 254 nm：Rt =2.86min(37.5%)+ 3.12min(38.1%)，外消旋混合物。
中间体15-1
{6-[(3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基甲酸叔丁酯
Figure 356717DEST_PATH_IMAGE194
向N-{4-[6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见实施例14, 27.2 mg，51.3μmol)在DMSO(490μl)/DMF(490μl)中的悬浮液中，在室温加入氢化钠(4.31 mg，在矿物油中60%，108μmol)，并搅拌20min。然后在0℃加入四正丁基碘化铵(1.89 mg，5.13μmol)和(6-溴己基)氨基甲酸叔丁酯(26μl，110μmol)。在室温搅拌1h后向混合物中加入水和DMSO，并将其通过制备型HPLC纯化，得到8.2 mg(90%纯度，19%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：ChromatorexC18 10μm 125×30 mm。洗脱液A：水+ 0.1%氨；洗脱液B：乙腈；梯度：0-7min30-70% B，速率150 mL /min，温度25℃。
Figure 880102DEST_PATH_IMAGE195
实施例15
N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 44367DEST_PATH_IMAGE196
将{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基甲酸叔丁酯(12.2mg，16.7μmol)与三氟乙酸(21μL，270μmol)一起在二氯甲烷(210μL)中搅拌3h，在减压下浓缩混合物，并通过制备型HPLC纯化，得到5.50mg(95%纯度，50%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：YMC-Actus-ODS-AQ-HG 10μm 150x20 mm洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-14min 10-50% B，速率60 mL /min，温度25℃。
Figure 348310DEST_PATH_IMAGE197
中间体16-1
5-溴-1-(氧杂环己烷-2-基)-1H-吲唑
Figure 889012DEST_PATH_IMAGE198
向5-溴-1H-吲唑(CAS 53857-57-1，2.0g，10.15 mmol)在二氯甲烷(40 mL)中的溶液中加入3,4-二氢-2H-吡喃(CAS 110-87-2，1.85 mL，20.3 mmol)和4-甲苯磺酸一水合物(0.96g， 5.07 mmol)，并将反应在室温搅拌3h。向该混合物中加入饱和碳酸氢钠溶液并收集二氯甲烷层，用水、盐水洗涤并经硫酸钠干燥。将有机层真空浓缩，并将粗制产物通过硅胶60上的快速色谱纯化(洗脱液：乙酸乙酯-庚烷1:7，1:6)，得到1.6g(98%纯度，55%产率)和1g(85%纯度，30%产率)两批标题化合物。
Figure 266904DEST_PATH_IMAGE199
中间体16-2
1-(氧杂环己烷-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吲唑
Figure 867650DEST_PATH_IMAGE200
将5-溴-1-(氧杂环己烷-2-基)-1H-吲唑(1.6g，5.69 mmol)、4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基-4'，4'，5'，5'-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(1.59g，6.26mmol)、乙酸钾(1.67g，17.0 mmol)和双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(208 mg，0.28mmol)在干燥的二噁烷(30 mL)中的混合物在氩气下脱气。将混合物在110℃加热5h，将该混合物通过硅藻土过滤，用乙酸乙酯洗涤。将滤液在真空下浓缩，得到粗制产物。通过快速色谱(SiO2，乙酸乙酯/庚烷，梯度)纯化，得到2.4g(84%纯度，79%产率)所需产物，为无色油。
Figure 330992DEST_PATH_IMAGE201
中间体16-3
4-溴-6-氯哒嗪-3(2H)-酮
Figure 488435DEST_PATH_IMAGE202
将6-氯哒嗪-3(2H)-酮(CAS 19064-67-6,10.0g，76.6mmol)悬浮于水(100ml)中，在室温加入溴化钾(27.3g，230mmol)及乙酸钠(9.43g，115mmol)，加入溴（12mL，230mmol）并将橙色悬浮液回流下加热2h。2h后，使混合物冷却至室温，并过滤固体，以亚硫酸钠(10%水溶液)及水洗涤。然后将其真空干燥，得到12.78g标题化合物(95%纯度，75%产率)，为米色固体。
Figure 720833DEST_PATH_IMAGE203
中间体16-4
6-氯-4-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-5-基}哒嗪-3(2H)-酮
Figure 492480DEST_PATH_IMAGE204
将4-溴-6-氯哒嗪-3(2H)-酮(参见中间体16-3， 397 mg，1.89 mmol)、1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吲唑(参见中间体16-2，622 mg，1.89 mmol)、碳酸钾(393 mg，2.84 mmol)的混合物悬浮于二噁烷/水(5:1，48mL)中，并将混合物脱气10min。加入双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(69 mg，0.095mmol)，将混合物加热至90℃保持2h。LC-MS显示86%的产物面积。该混合物不经纯化直接用于下一步骤。
中间体16-5
6-(4-氨基苯基)-4-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-5-基}哒嗪-3(2H)-酮
Figure 443119DEST_PATH_IMAGE205
向得自中间体16-4的反应混合物中加入4-氨基苯基硼酸频哪醇酯(497 mg，2.27mmol)和双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(69 mg，0.095 mmol)，并将该混合物在110℃下加热16h，然后将其冷却至室温，并在乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠溶液之间分配。乙酸乙酯层用盐水洗涤，硫酸钠干燥并浓缩得到粗制产物，将其通过快速色谱纯化(洗脱剂：庚烷/乙酸乙酯1:1,乙酸乙酯-甲醇95:5)，得到460 mg所需产物(92%纯度，58%产率)，为浅黄色固体。
Figure 325624DEST_PATH_IMAGE206
中间体16-6
[4-(5-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-5-基}-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)苯基]氨基甲酸4-硝基苯基酯
Figure 740425DEST_PATH_IMAGE207
在室温在氩气氛下将6-(4-氨基苯基)-4-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-5-基}哒嗪-3(2H)-酮(460 mg，1.19 mmol)溶解于二氯甲烷(44 mL)和二甲基甲酰胺(20 mL)的混合物中，并添加吡啶(190μl，2.4 mmol)。在1min内分批加入氯甲酸4-硝基苯基酯(287 mg，1.42 mmol)。在室温搅拌混合物直到所有的起始材料被消耗。该混合物直接用于中间体16-7的实验。
中间体16-7
N-[4-(5-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-5-基}-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)苯基]-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 682973DEST_PATH_IMAGE208
在室温，在氩气氛下，将N,N-二异丙基乙胺(1.02 mL，5.9 mmol)，然后将2,3-二氢-1H-吡咯并[3,4-c]吡啶盐酸盐(455 mg，2.36 mmol)加入到得自中间体16-6的实验的反应混合物中。将混合物在室温搅拌5h。将该混合物在真空下浓缩。将残余物用水/乙醇混合物研磨，通过过滤收集形成的固体，用乙酸乙酯、乙醚洗涤并干燥，得到510 mg所需产物(99%纯度，80%产率)，为浅黄色固体。
Figure 120908DEST_PATH_IMAGE209
实施例16
N-{4-[5-(1H-吲唑-5-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺-盐酸盐
Figure 807104DEST_PATH_IMAGE210
向N-(4-{5-[1-(氧杂环己烷-2-基)-1H-吲唑-5-基]-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(50.0 mg，93.7μmol)在4M HCl /二噁烷(5.0 mL)中的混合物中加入水，并在室温搅拌4h，将混合物真空下浓缩，并将残余物用甲醇研磨，干燥后，得到30 mg所需产物(95%纯度，63%产率)，为盐酸盐。
Figure 14094DEST_PATH_IMAGE211
实施例17
N-{4-[5-(1H-吲唑-5-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 127544DEST_PATH_IMAGE212
将N-{4-[5-(1H-吲唑-5-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见实施例16，80.0 mg，178μmol)溶于乙酸(5 mL)中。在90℃在预热浴中剧烈搅拌2min加热该混合物。加入锌粉(58 mg，0.89 mmol)，并将混合物在90℃加热，将混合物在真空下浓缩，将得到的残余物溶解在DMSO中并过滤。滤液通过MDAP((Xbridge C18，19×150mm，5μm，在水-乙腈中的0.1%甲酸；经11min 35%等度的)纯化，随后冷冻干燥得到31 mg所需产物(97%纯度，37%产率)，为淡黄色胶状物。
Figure 862894DEST_PATH_IMAGE213
中间体18-1
4-溴-1-(氧杂环己烷-2-基)-1H-吲唑
Figure 87202DEST_PATH_IMAGE214
将4-溴-lH-吲唑(CAS 186407-74-9, 2.0g，5.07 mmol)溶于无水四氢呋喃(50 mL)。向该溶液中加入3,4-二氢-2H-吡喃(CAS 110-87-2, 1.85 mL，20.3 mmol)和甲苯磺酸一水合物(0.96g，5.07 mmol)。将反应混合物回流16h，加入饱和碳酸氢盐，和水层用乙酸乙酯(3×50 mL)萃取。将有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩，得到粗制产物。将其通过快速色谱(洗脱液：乙酸乙酯-庚烷1:9)纯化，得到2.65g无色油状的所需产物(77%纯度，72%产率)，其在静置时固化。
Figure 414278DEST_PATH_IMAGE215
中间体18-2
1-(氧杂环己烷-2-基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吲唑
Figure 433050DEST_PATH_IMAGE216
将5-溴-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吲唑(2.60g，9.25 mmol)、4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-双-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(2.59g，10.2 mmol)、乙酸钾(2.71g，17.1mmol)和双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(338 mg，0.46 mmol)在48.0 mL 1,4-二噁烷中的混合物用氩气脱气10min。将反应混合物在110℃加热5h，冷却至室温，并且通过硅藻土过滤，用乙酸乙酯洗涤。浓缩滤液，并与由5-溴-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吲唑1.00g(3.56 mmol)开始的另一批合并。通过柱色谱(45g；ZIP Sphere Silica Biotage柱，乙酸乙酯/庚烷梯度)纯化，得到所需产物2.40g((97%纯度，79%产率)。
Figure 845577DEST_PATH_IMAGE217
中间体18-3
6-氯-4-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-4-基}哒嗪-3(2H)-酮
Figure 935892DEST_PATH_IMAGE218
4-溴-6-氯哒嗪-3(2H)-酮(参见中间体16-3，600 mg，2.86 mmol)、1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吲唑(参见中间体18-1
4-溴-1-(氧杂环己烷-2-基)-1H-吲唑
Figure 117475DEST_PATH_IMAGE219
将4-溴-lH-吲唑(CAS 186407-74-9, 2.0g，5.07 mmol)溶于无水四氢呋喃(50 mL)。向该溶液中加入3,4-二氢-2H-吡喃(CAS 110-87-2，1.85 mL，20.3 mmol)和甲苯磺酸一水合物(0.96g，5.07 mmol)。将反应混合物回流16h，加入饱和碳酸氢盐，并用乙酸乙酯(3×50mL)萃取水层。将有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩，得到粗制产物。将其通过快速色谱(洗脱液：乙酸乙酯-庚烷1:9)纯化，得到2.65g无色油状的所需产物(77%纯度，72%产率)，其在静置时固化。
Figure 572727DEST_PATH_IMAGE220
将中间体18-2,940 mg，2.86 mmol)、碳酸钾(594 mg，4.29 mmol)悬浮于二噁烷/水(5:1，72 mL)中，将混合物脱气10min。加入双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(104 mg，0.14 mmol)，将混合物加热至90℃保持2h，该混合物直接用于中间体18-4的实验以进行第二次Suzuki偶联。
中间体18-4
6-(4-氨基苯基)-4-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-4-基}哒嗪-3(2H)-酮
Figure 206971DEST_PATH_IMAGE221
向得自中间体18-3的实验的反应混合物中加入4-氨基苯基硼酸频哪醇酯(753 mg，3.44 mmol)和双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(104 mg，0.14 mmol)，并将该混合物在110℃下加热5h，冷却至室温后，将其在乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠溶液之间分配，乙酸乙酯层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩，得到粗制产物。将其通过快速色谱(洗脱液：庚烷-乙酸乙酯1:1,乙酸乙酯-甲醇95:5)纯化，得到所需产物，2批360 mg(87%纯度，28%产率)和330 mg(76%纯度，22%产率)。
Figure 773081DEST_PATH_IMAGE222
中间体18-5
N-[4-(5-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-4-基}-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)苯基]-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 887799DEST_PATH_IMAGE223
在氩气氛下向6-(4-氨基苯基)-4-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-4-基}哒嗪-3(2H)-酮(360 mg，0.929 mmol)在二氯甲烷(34.3 mL)中的溶液中加入吡啶(150μL，1.86mmol)，接着经1min分批加入氯甲酸4-硝基苯基酯(225 mg，1.12 mmol)，并将反应混合物在室温搅拌5h。在氩气氛下，向该粗制反应混合物中加入N,N二异丙基乙胺(809μL，4.65mmol)，然后加入2,3-二氢-1H-吡咯并[3,4-c]吡啶二盐酸盐(359 mg，1.86 mmol)，并将反应混合物在室温搅拌5h。将反应混合物与另一批起始自(4-{6-氧代-5-[1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吲唑-4-基]-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)氨基甲酸4-硝基苯基酯(0.852 mmol)的反应混合物合并，并浓缩，而得残余物。将粗制残余物用水-乙醇研磨，并通过过滤收集沉淀，用乙酸乙酯、乙醚洗涤并干燥，得到所需产物580 mg(经两步的合并产率61%，纯度88%)。
Figure 513952DEST_PATH_IMAGE224
实施例18
N-{4-[5-(1H-吲唑-4-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 635492DEST_PATH_IMAGE225
向N-[4-(5-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-4-基}-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)苯基]-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(50.0 mg，93.7μmol)在4M HCl /二噁烷(5.0 mL)中的混合物中加入水(2.0 mL)，并将混合物在室温搅拌4h，将混合物真空下浓缩，将残余物溶解于DMSO中，并通过制备型HPLC纯化，随后冷冻干燥，得到9 mg所需产物(98%纯度，21%产率)，为无色固体。
HPLC：仪器：Waters质量导向的自动净化系统，泵压头/梯度模块：2545二元梯度模块，馏分收集器：2767 Waters样品管理器，2998光电二极管阵列检测器，MassLynx软件。柱：Xbridge C18，19×150mm，5μm；洗脱液A：水中的0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：经10min15-20%；速率20 mL/min，温度25℃。
Figure 5294DEST_PATH_IMAGE226
中间体19-1
N-{4-[5-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-4-基}-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 161468DEST_PATH_IMAGE227
将N-[4-(5-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-4-基}-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)苯基]-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见中间体18-，100 mg，187μmol)溶解于乙酸(10 mL)中，并将混合物在预热浴中于90℃剧烈搅拌下加热2min。加入锌粉(61.3mg，937μmol)，并将混合物于90℃加热，将混合物通过硅藻土过滤，用乙酸洗涤，并将滤液在真空下浓缩。残余物通过制备型HPLC纯化，然后冷冻干燥，得到30 mg无色固体状的所需产物(95%纯度，28%产率)。
HPLC：仪器：Waters质量导向的自动净化系统，泵压头/梯度模块：2545二元梯度模块，馏分收集器：2767 Waters样品管理器，2998光电二极管阵列检测器，MassLynx软件。柱：Xbridge C18，19×150mm，5μm；洗脱液A：水中的0.1%氢氧化铵；洗脱液B：乙腈；30%等度的；速率20 mL/min，温度25℃。
Figure 20840DEST_PATH_IMAGE228
实施例19
N-{4-[5-(1H-吲唑-4-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 629676DEST_PATH_IMAGE229
向N-{4-[5-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-4-基}-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(23.0 mg，42.9μmol)在盐酸(4M，在1,4-二噁烷中)5.00 mL中的混合物中加入水2.00 mL，并将反应混合物在室温搅拌4h，然后浓缩，得到残余物。粗制残余物用MDAP(XSelect CSH C18,19×150mm，5μm，水-乙腈中的0.1%甲酸；经10min15-20%)纯化，得到8.00 mg(99%纯度，49%产率)的所需产物。
HPLC：仪器：Waters质量导向的自动净化系统，泵压头/梯度模块：2545二元梯度模块，馏分收集器：2767 Waters样品管理器，2998光电二极管阵列检测器，MassLynx软件。柱：Xselect CSH C18，19×150mm，5μm；洗脱液A：水中的0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：经10min15-20%；速率20 mL/min，温度25℃。
Figure 537589DEST_PATH_IMAGE230
中间体20-1
1-(4-甲基苯-1-磺酰基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吲哚
Figure 548270DEST_PATH_IMAGE231
将5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吲哚(CAS269410-24-4，1.0g，4.1 mmol)加入到圆底烧瓶中，在氩气氛下向其中加入四氢呋喃(50 mL)。加入氢化钠(矿物油中的60%分散体，246 mg，6.17 mmol)，并搅拌30min。然后将反应混合物冷却至0℃，加入甲苯磺酰氯(941 mg，4.93 mmol)。使混合物温热至室温并搅拌16h，然后将粗制混合物用饱和氯化铵溶液淬灭并在真空下浓缩。将残余物在水和二氯甲烷之间分配。收集二氯甲烷层，经硫酸钠干燥并真空浓缩。粗制产物通过Isolera(45g，洗脱液：庚烷/乙酸乙酯，9:1，3:1)纯化，得到1.0g为无色固体的所需产物(99%纯度，61%产率)。
Figure 516226DEST_PATH_IMAGE232
中间体20-2
6-(4-氨基苯基)-4-[1-(4-甲基苯-1-磺酰基)-1H-吲哚-5-基]哒嗪-3(2H)-酮
Figure 425408DEST_PATH_IMAGE233
将4-溴-6-氯哒嗪-3(2H)-酮(中间体16-3，451 mg，2.16 mmol)、1-[(4-甲基苯基)磺酰基]-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吲哚(856 mg，2.16 mmol)和碳酸钾(447 mg，3.23 mmol)在1,4-二噁烷(50.0 mL)和水(10.0 mL)中的混合物用氩气脱气10min。加入双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(78.8 mg，0.108 mmol)，并将反应混合物在90℃加热2h。向该粗制反应混合物中加入4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯胺(567 mg，2.59 mmol)和双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(78.0mg，0.11 mmol)，并将反应混合物在110℃加热22h。将反应混合物冷却至室温，并与另一批(0.50 mmol)合并。将合并的反应混合物在乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠溶液之间分配，分离有机层并浓缩，得到残余物。粗制残余物通过柱色谱(45g；ZIP Sphere Silica Biotage柱，乙酸乙酯/庚烷梯度)纯化，得到300 mg所需产物(96%纯度，21%合并的产率)，为淡棕色固体。
Figure 137012DEST_PATH_IMAGE234
中间体20-3
N-(4-{5-[1-(4-甲基苯-1-磺酰基)-1H-吲哚-5-基]-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 2200DEST_PATH_IMAGE235
向6-(4-氨基苯基)-4-{1-[(4-甲基苯基)磺酰基]-1H-吲哚-5-基}哒嗪-3(2H)-酮(200mg，0.438 mmol)在二氯甲烷(16.2 mL)和N,N-二甲基甲酰胺(4.00 mL)中的溶液中加入吡啶(71.0μL，0.876 mmol)，随后经1min分批添加氯甲酸4-硝基苯基酯(106 mg，0.526mmol)，且在室温搅拌反应混合物1h。在氩气氛下，向该反应混合物中加入N,N-二异丙基乙胺(381μL，2.19 mmol)，然后加入2,3-二氢-1H-吡咯并[3,4-c]吡啶二盐酸盐(169 mg，0.876 mmol)，并将反应混合物在室温搅拌16h。将反应混合物与另一批料(0.219 mmol)合并，浓缩，得到残余物。将粗制残余物用水-乙醇研磨，通过过滤收集所得沉淀，用乙酸乙酯、乙醚洗涤并干燥，得到246 mg(90%纯度，经两步的63%的合并产率)所需产物，为浅黄色固体。
Figure 141057DEST_PATH_IMAGE236
实施例20
N-{4-[5-(1H-吲哚-5-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 724485DEST_PATH_IMAGE237
将N-(4-{5-[1-(4-甲基苯-1-磺酰基)-1H-吲哚-5-基]-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(50.0mg，83.0μmol)在乙醇(10mL)和NaOH(210μl，2.0M，410μmol)中的混合物回流(80℃)16h，将其冷却至室温，并以2M HCl酸化，并再次以饱和碳酸钠溶液碱化。将混合物在真空下浓缩以除去挥发物，并将残余物用水稀释。通过过滤收集所得固体，用少量乙醇洗涤并干燥，得到粗制产物。通过制备型HPLC纯化，然后在冷冻干燥机上干燥，得到15.00 mg所需产物(99%纯度，40%产率)。
HPLC：仪器：Waters质量导向的自动净化系统，泵压头/梯度模块：2545二元梯度模块，馏分收集器：2767 Waters样品管理器，2998光电二极管阵列检测器，MassLynx软件。柱：Xselect CSH C18，19×150mm，5μm；洗脱液A：水中的0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：经10min 10-50% B；速率20 mL/min，温度25℃。
Figure 302097DEST_PATH_IMAGE238
实施例21
N-{4-[5-(1H-吲哚-5-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 21791DEST_PATH_IMAGE239
将N-{4-[5-(1H-吲哚-5-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见实施例20，10.0mg，0.022mmol)溶解于乙酸(2ml)中。在预热浴中在90℃伴随剧烈搅拌加热该混合物2min。加入锌粉(7.2 mg，0.11 mmol)，并将混合物在90℃加热，将混合物真空下浓缩，并将残余物溶解在DMSO中并过滤。滤液经制备型HPLC纯化，然后冷冻干燥，得到2.5 mg无色固体状的所需产物(100%纯度，25%产率)。
HPLC：仪器：Waters质量导向的自动净化系统，泵压头/梯度模块：2545二元梯度模块，馏分收集器：2767 Waters样品管理器，2998光电二极管阵列检测器，MassLynx软件。柱：Xselect CSH C18，19×150mm，5μm；洗脱液A：水中的0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：经10min 16-20%；速率20 mL/min，温度25℃。
Figure 331550DEST_PATH_IMAGE240
中间体22-1
N-{4-[5-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-5-基}-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 402274DEST_PATH_IMAGE241
将N-(4-{6-氧代-5-[1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吲唑-5-基]-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见中间体16-7，500 mg，0.94mmol)、三氟甲磺酸2,2,2-三氟乙酯(0.16 mL，1.12 mmol)和碳酸钾(259 mg，1.87 mmol)在DMF(20 mL)中的混合物在室温搅拌16h，将混合物倒入水中，并通过过滤收集所得固体，得到410 mg所需产物(92%纯度，65%产率)，为淡黄色固体。
Figure 455681DEST_PATH_IMAGE242
实施例22
N-{4-[5-(1H-吲唑-5-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 108510DEST_PATH_IMAGE243
将N-{4-[5-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-5-基}-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(50.0 mg，81.2μmol)在3M HCl/CPME(5.0 mL)和水中的混合物在室温搅拌2h，将混合物在真空下浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化，接着在真空下浓缩，得到9 mg所需产物(99%纯度，21%产率)，为无色固体。
HPLC：仪器：Waters质量导向的自动净化系统，泵压头/梯度模块：2545二元梯度模块，馏分收集器：2767 Waters样品管理器，2998光电二极管阵列检测器，MassLynx软件。柱：Xselect CSH C18，19×150mm，5μm；洗脱液A：水中的0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：经10min 20-40%；速率20 mL/min，温度25℃。
Figure 589170DEST_PATH_IMAGE244
中间体23-1
N-{4-[5-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-4-基}-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 147190DEST_PATH_IMAGE245
将N-[4-(5-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-4-基}-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)苯基]-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见中间体18-，500 mg，0.94 mmol)、三氟甲磺酸2,2,2-三氟乙酯(0.16 mL，1.12 mmol)和碳酸钾(259 mg，1.87 mmol)在DMF(20mL)中的混合物在室温搅拌16h，将此混合物倒入水中，并通过过滤收集所得固体。粗制残余物通过柱色谱(Biotage Isolera，30g；ZIP Sphere Silica Biotage柱，乙酸乙酯/甲醇梯度)纯化，得到所需产物235 mg。通过制备型HPLC将其进一步纯化，得到120 mg(99%纯度，20%产率)的所需产物。
HPLC：仪器：Waters UV引导的自动纯化系统，泵压头/梯度模块2545二元梯度模块，馏分收集器：2767 Waters样品管理器，2996光电二极管阵列检测器，MassLynx软件。柱：X-bridge C18，19×150 mm，5μm洗脱液A：水中的0.1%氨；洗脱液B：乙腈；梯度：经10min 30-60% B；速率20 mL/min，温度25℃。
Figure 738708DEST_PATH_IMAGE246
实施例23
N-{4-[5-(1H-吲唑-4-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 432995DEST_PATH_IMAGE247
将N-{4-[5-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-4-基}-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(120 mg，0.19mmol)在氯化氢(4M，在1,4-二噁烷中，5 mL)和水(0.5 mL)中的混合物在室温搅拌2h。将粗制混合物与另一批起始自N-{4-[5-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-4-基}-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(20 mg，32.5μmol)的混合物合并，并滗析溶剂。将残余物用饱和碳酸氢钠水溶液处理，通过过滤收集所得固体并干燥，得到所需产物100 mg(93%纯度，89%合并产率)。
Figure 412452DEST_PATH_IMAGE248
中间体24-1
7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)喹啉
Figure 192190DEST_PATH_IMAGE249
将7-溴喹啉(CAS4965-36-0，2g，9.60 mmol)、4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基-4',4',5',5'-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(2.68g，10.5 mmol)、乙酸钾(2.83g，28.8 mmol)和双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(351 mg，0.48 mmol)在干燥的二噁烷(50 mL)中的混合物在氩气氛下脱气。将混合物在110℃加热5h，将该混合物通过硅藻土过滤，用乙酸乙酯洗涤，并将滤液真空下浓缩，得到4.2g粗制产物(通过1H NMR测定为50%纯度)。通过使用isolera(80g柱，洗脱液：庚烷-乙酸乙酯，1:9，5CV，10-60%梯度10CV)纯化2.9g粗制产物，得到1.5g所需产物(95%纯度，58%产率)。
Figure 587399DEST_PATH_IMAGE250
中间体24-2
6-(4-氨基苯基)-4-(喹啉-7-基)哒嗪-3(2H)-酮
Figure 401771DEST_PATH_IMAGE251
将4-溴-6-氯哒嗪-3(2H)-酮(中间体16-3，1.00克，4.77mmol)、7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)喹啉(1.22克，4.77mmol)和碳酸钾(989mg，7.16mmol)在1,4-二噁烷(75.0ml)和水(15.0ml)中的混合物用氩气脱气10min。加入双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(174 mg，0.24 mmol)，将混合物在90℃加热7h。加入4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯胺(1.25g，5.73 mmol)和双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)，175 mg(0.24 mmol)。在100℃加热混合物16h。将混合物冷却至室温。过滤收集沉淀出的固体，用乙酸乙酯洗涤并干燥，得到所需产物，0.93g(95%纯度，59%产率)。浓缩滤液，并将残余物用乙酸乙酯-甲醇研磨，得到所需产物0.75g(67%纯度，33%产率)。
Figure 224234DEST_PATH_IMAGE252
实施例24
N-{4-[6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 491267DEST_PATH_IMAGE253
向6-(4-氨基苯基)-4-(喹啉-7-基)哒嗪-3(2H)-酮(800 mg，2.54 mmol)在四氢呋喃(160 mL)中的溶液中加入氯甲酸4-硝基苯基酯(615 mg，3.05 mmol)。将反应混合物在60℃加热5h，并在真空下浓缩。将残余物溶于N,N二甲基甲酰胺20 mL，并加入到2,3-二氢-1H-吡咯并[3,4-c]吡啶二盐酸盐(588 mg，2.54 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(2.21 mL，12.7mmol)在二氯甲烷(60 mL)中的溶液中，并在室温搅拌16h。通过过滤收集沉淀物，用水洗涤并干燥，得到所需产物850 mg(98%纯度，经两步的产率65%)。
产物：
Figure 500287DEST_PATH_IMAGE254
中间体25-1
{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)哒嗪-1(6H)-基]丁基}氨基甲酸叔丁酯
Figure 169165DEST_PATH_IMAGE255
将N-{4-[6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见实施例24，278 mg，604μmol)、2-(4-溴丁基)-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮(278 mg，0.60 mmol)和碳酸钾(166 mg，1.2 mmol)在DMF(32 mL)中的混合物在室温搅拌16h，然后将混合物在50℃加热6h，将反应混合物倒入水(50 mL)中并搅拌1h，通过过滤收集所得固体，并通过Isolera(10g Zispere，洗脱液在DCM中的5%甲醇，3 CV，5-20%10CV)纯化，得到100 mg所需产物(97%纯度，25%产率)。
Figure 162529DEST_PATH_IMAGE256
实施例25
N-{4-[1-(4-氨基丁基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 916858DEST_PATH_IMAGE257
将{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)哒嗪-1(6H)-基]丁基}氨基甲酸叔丁酯(96.0 mg，152μmol)在二氯甲烷(4.0 mL，62 mmol)中与三氟乙酸(180μl，2.3 mmol)一起搅拌1天。将混合物减压下浓缩，并通过制备型HPLC纯化，得到64.8 mg标题化合物(95%纯度，76%产率)。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：ChromatorexC18 10μm 125×30 mm。洗脱液A：水+ 0.1%氨；洗脱液B：乙腈；梯度：0-6min10-50% B，速率150 mL /min，温度25℃。
Figure 716187DEST_PATH_IMAGE258
中间体26-1
4-溴-1-(4-甲基苯-1-磺酰基)-1H-苯并咪唑
Figure 239572DEST_PATH_IMAGE259
将4-溴-1H-苯并咪唑(CAS 83741-35-9，1.0g，5.07 mmol)加入到圆底烧瓶中，在氩气氛下向其中加入四氢呋喃(50 mL)。加入氢化钠(在矿物油中的60%分散体，304 mg，7.6mmol)，搅拌30min。然后将反应混合物冷却至0℃，加入甲苯磺酰氯(1.16g，6.10 mmol)。将混合物温热至室温并搅拌16h，完成后，将粗制混合物用饱和氯化铵溶液淬灭并真空浓缩。将残余物在水和乙酸乙酯之间分配。收集乙酸乙酯层，经硫酸钠干燥并浓缩。粗制产物通过Isolera(30g，洗脱液：庚烷/乙酸乙酯，梯度)纯化，得到1.0g所需产物(99%纯度，55%产率)，为淡棕色固体。
Figure 669417DEST_PATH_IMAGE260
中间体26-2
1-(4-甲基苯-1-磺酰基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-苯并咪唑
Figure 911042DEST_PATH_IMAGE261
将4-溴-1-(4-甲基苯-1-磺酰基)-1H-苯并咪唑(800 mg，2.27 mmol)、4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基-4',4',5',5'-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(636mg，2.50 mmol)、乙酸钾(670 mg，6.83 mmol)和双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(83.3mg，0.11 mmol)在无水二噁烷(40 mL)中的混合物在氩气氛下脱气10min。将混合物在100℃加热16h，将该反应混合物通过Isolera(45g，Zip Sphere柱)(洗脱剂：庚烷-乙酸乙酯，梯度)纯化，得到900 mg所需产物(80%纯度，80%产率)。
Figure 999215DEST_PATH_IMAGE262
中间体26-3
6-氯-4-[1-(4-甲基苯-1-磺酰基)-1H-苯并咪唑-4-基]哒嗪-3(2H)-酮
Figure 642686DEST_PATH_IMAGE263
将4-溴-6-氯哒嗪-3(2H)-酮(参见中间体16-3，340 mg，1.62 mmol)、1-[(4-甲基苯基)磺酰基]-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-苯并咪唑(参见中间体26-2，800 mg，1.62 mmol)、碳酸钾(337 mg，2.44 mmol)的混合物悬浮于二噁烷/水(5:1，42mL)中，并将混合物脱气10min。加入双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(59 mg，0.081mmol)，并将混合物加热至90℃保持16h。将混合物冷却至室温，通过过滤收集固体，用水和乙酸乙酯洗涤，得到200 mg所需产物(97%纯度，30%产率)，为无色固体。
Figure 977852DEST_PATH_IMAGE264
中间体26-4
6-(4-氨基苯基)-4-[1-(4-甲基苯-1-磺酰基)-1H-苯并咪唑-4-基]哒嗪-3(2H)-酮
Figure 706774DEST_PATH_IMAGE265
将6-氯-4-[1-(4-甲基苯-1-磺酰基)-1H-苯并咪唑-4-基]哒嗪-3(2H)-酮(240 mg，0.60 mmol)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯胺(157 mg，0.72mmol)、碳酸钾(165 mg，1.19 mmol)的混合物悬浮在二噁烷/水(5:1，48 mL)中。将混合物脱气10min，加入双(二苯基膦基)二茂铁]-二氯化钯(22 mg，0.03 mmol)，并在100℃加热16h，将混合物冷却至室温，并在乙酸乙酯和水之间分配，通过过滤收集所得固体，用甲醇洗涤，得到140 mg所需产物(95%纯度，46%产率)，为棕色固体。
Figure 785589DEST_PATH_IMAGE266
中间体26-5
(4-{5-[1-(4-甲基苯-1-磺酰基)-1H-苯并咪唑-4-基]-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)氨基甲酸4-硝基苯基酯
Figure 283566DEST_PATH_IMAGE267
在室温在氩气氛下将6-(4-氨基苯基)-4-[1-(4-甲基苯-1-磺酰基)-1H-苯并咪唑-4-基]哒嗪-3(2H)-酮(140 mg，0.31 mmol)加入到二氯甲烷(10 mL)和DMF(2 mL)的混合物中。加入吡啶(49μl，0.61mmol)，然后加入氯甲酸4-硝基苯基酯(74mg，0.36mmol)。将混合物在室温搅拌4h，再加入氯甲酸4-硝基苯基酯(0.37 mmol)，并再搅拌混合物2h。将该混合物直接用于中间体26-6的实验。
中间体26-6
N-(4-{5-[1-(4-甲基苯-1-磺酰基)-1H-苯并咪唑-4-基]-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 117530DEST_PATH_IMAGE268
在室温，在氩气氛下，将N,N-二异丙基乙胺(0.27 mL，1.53 mmol)，然后将2,3-二氢-1H-吡咯并[3,4-c]吡啶盐酸盐(118 mg，0.61 mmol)加入到来自中间体26-5的实验的反应混合物中。将混合物在室温搅拌16h，将混合物真空浓缩，并将粗制残余物用水和乙醇的混合物研磨。通过过滤收集所得固体，用二氯甲烷洗涤并干燥，得到140 mg所需产物(63%纯度，48%产率)。将其通过制备型HPLC纯化，然后真空浓缩，得到40 mg所需产物(99%纯度，21%产率)，为无色固体。
HPLC：仪器：Waters质量导向的自动净化系统，泵压头/梯度模块：2545二元梯度模块，馏分收集器：2767 Waters样品管理器，2998光电二极管阵列检测器，MassLynx软件。柱：XSelect CSH C18，19×150 mm，5μm；洗脱液A：在水中的0.1%氨；洗脱液B：乙腈；梯度：经10min 30-70%；速率20 mL/min，温度25℃。
Figure 68168DEST_PATH_IMAGE269
实施例26
N-{4-[5-(1H-苯并咪唑-4-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 950674DEST_PATH_IMAGE270
将N-(4-{5-[1-(4-甲基苯-1-磺酰基)-1H-苯并咪唑-4-基]-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(30mg，0.05mmol)在乙醇(5ml)和氢氧化钠水溶液(2M，0.12ml，0.25mmol)中的混合物在60℃加热16h，将反应混合物冷却至室温，用盐酸水溶液(2M)酸化，并再次用饱和碳酸钠溶液碱化。过滤收集所得固体，用少量乙醇洗涤，干燥，得到45 mg所需产物。将其通过制备型HPLC纯化，并在真空下浓缩，得到8 mg(95%纯度，34%产率)的所需产物，为无色固体。
HPLC：仪器：Waters质量导向的自动净化系统，泵压头/梯度模块：2545二元梯度模块，馏分收集器：2767 Waters样品管理器，2998光电二极管阵列检测器，MassLynx软件。柱：XSelect CSH C18，19×150 mm，5μm；洗脱液A：在水中的0.1%氨；洗脱液B：乙腈；梯度：经10min 10-50%；速率20 mL/min，温度25℃。
Figure 303158DEST_PATH_IMAGE271
中间体27-1
[(2S)-1-({4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]丁基}氨基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基甲酸叔丁酯
Figure 245706DEST_PATH_IMAGE272
在15min搅拌后，向N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸(27.2 mg，144μmol)、4-甲基吗啉(28μL，250μmol)和HATU(47.9 mg，126μmol)在DMF(0.65 mL)中的混合物中加入N-{4-[1-(4-氨基丁基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见实施例5，50.0 mg，94.1μmol)。在室温继续搅拌3h，然后将反应混合物用在水(0.1 mL)和DMSO中的甲酸(9.6μl，250μmol)稀释，并通过制备型HPLC纯化，得到46.3 mg(90%纯度，63%产率)的标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μm 120x30 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-6 min5-7% B，6-12 min 7-25% B，12-14 min 25% B；速率150 mL/min，温度25℃。
Figure 496690DEST_PATH_IMAGE273
中间体27-2
[(1S)-2-[4-[3-[4-(1,3-二氢吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基氨基)苯基]-6-氧代-5-(5-喹啉基)哒嗪-1-基]丁基氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]铵三氟乙酸盐
Figure 917307DEST_PATH_IMAGE274
将[(2S)-1-({4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]丁基}氨基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基甲酸叔丁酯(43.7 mg，62.2μmol)和在二氯甲烷(0.88 mL)中的三氟乙酸(130μl，1.7 mmol)在室温搅拌2h，然后将该混合物用甲苯稀释，减压浓缩，得到65.0 mg(66%纯度，96%产率)标题化合物。
Figure 389876DEST_PATH_IMAGE275
中间体27-3
N-(叔丁氧羰基)-L-缬氨酰-N-{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]丁基}-L-丙氨酰胺
Figure 503326DEST_PATH_IMAGE276
在搅拌20min后，向N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸(19.9 mg，91.6μmol)、4-甲基吗啉(16μL，150μmol)和HATU(30.7 mg，80.8μmol)在DMF(0.3 mL)中的混合物中加入在4-甲基吗啉(10μL，100μmol)和DMF(0.39 mL)中的粗制[(1S)-2-[4-[3-[4-(1,3-二氢吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基氨基)苯基]-6-氧代-5-(5-喹啉基)哒嗪-1-基]丁基氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]铵三氟乙酸盐 (参见中间体27-2，65.0 mg，66%纯度，59.9μmol)。在室温继续搅拌6h，然后将反应混合物用在水(0.1 mL)和DMSO中的甲酸(9.0μl，240μmol)稀释，并通过制备型HPLC纯化，得到27.0 mg(90%纯度，51%产率)的标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μM 120×30 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-8min 7% B，8-20 min 7-25% B，20-25 min25% B；速率150 mL/min，温度25℃。
Figure 428557DEST_PATH_IMAGE277
中间体27-4
[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-[3-[4-(1,3-二氢吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基氨基)苯基]-6-氧代-5-(5-喹啉基)哒嗪-1-基]丁基氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]铵三氟乙酸盐
Figure 715181DEST_PATH_IMAGE278
将N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酰-N-{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]丁基}-L-丙氨酰胺(27.0 mg，33.7μmol)和三氟乙酸(70μL，910μmol)在二氯甲烷(0.48 mL)中的混合物在室温搅拌2h，然后将混合物用甲苯稀释，减压浓缩(与甲苯的共沸蒸馏进行两次)，得到26.0 mg(95%产率)标题化合物。
Figure 776678DEST_PATH_IMAGE279
最终中间体27-5
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-N-{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]丁基}-L-丙氨酰胺
Figure 61029DEST_PATH_IMAGE280
将[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-[3-[4-(1,3-二氢吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基氨基)苯基]-6-氧代-5-(5-喹啉基)哒嗪-1-基]丁基氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]铵三氟乙酸盐(25.4 mg，31.1μmol)、1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮(13.4 mg，43.3μmol)和N,N-二异丙基乙胺(13μl，72μmol)在DMF(0.56 mL)中的混合物在室温搅拌4h，然后将反应混合物用在水(0.2 mL)和DMSO中的甲酸(2.7μl，70μmol)稀释，并通过制备型HPLC纯化，得到7.13 mg(80%纯度，17%产率)的标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μM 120×30 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-8min 10% B，8-11 min 10-20% B，11-12.5 min 20% B，12.5-19 min 20-40% B；速率150mL/min，温度25℃。
Figure 473556DEST_PATH_IMAGE281
实施例27C
Figure 501555DEST_PATH_IMAGE282
根据程序1，将5 mg抗-B7H3 TPP-8382(15.1mg/mL)与最终中间体27-5 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-N-{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]丁基}-L-丙氨酰胺(300μg，80%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：2.08 mg/mL
药物/mAb比率：1.8(UV)。
中间体28-1
[(2S)-1-({4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]丁基}氨基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基甲酸叔丁酯
Figure 496187DEST_PATH_IMAGE283
向N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸(54.2 mg，287μmol)、4-甲基吗啉(56μL，510μmol)和HATU(96.2 mg，253μmol)在DMF(1.3 mL，17 mmol)中的混合物(其已搅拌15min)中加入N-{4-[1-(4-氨基丁基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见实施例2，100 mg，187μmol)并将合并的混合物在室温继续搅拌4h，然后将反应混合物用在水(0.1 mL)和DMSO中的甲酸(19μL，510μmol)稀释，并通过制备型HPLC纯化，得到73.4 mg(95%纯度，53%产率)的标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μM 120×30 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-6min 5-7% B，6-12 min 7-25% B，12-14 min 25% B；速率150 mL/min，温度25℃。
Figure 685860DEST_PATH_IMAGE284
中间体28-2
[(1S)-2-[4-[3-[4-(1,3-二氢吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基氨基)苯基]-6-氧代-5-(5-喹啉基)-4,5-二氢哒嗪-1-基]丁基氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]铵三氟乙酸盐
Figure 585682DEST_PATH_IMAGE285
将[(2S)-1-({4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]丁基}氨基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基甲酸叔丁酯(73.4mg，104µmol)和三氟乙酸(220μl，2.8mmol)在二氯甲烷(0.88ml)中的混合物在室温搅拌2h，然后将混合物用甲苯稀释，在减压下浓缩(与甲苯的共沸蒸馏进行两次)，得到72.0mg(95%纯度，91%产率)标题化合物。
Figure 151793DEST_PATH_IMAGE286
中间体28-3
N-(叔丁氧羰基)-L-缬氨酰-N-{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]丁基}-L-丙氨酰胺
Figure 453461DEST_PATH_IMAGE287
向N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸(34.6 mg，159μmol)、4-甲基吗啉(29μL，260μmol)和HATU(53.5 mg，141μmol)在DMF(0.70 mL)中的混合物(其已搅拌15min)中加入在DMF(0.7mL)(含有4-甲基吗啉(16μL，155μmol)中的[(1S)-2-[4-[3-[4-(1,3-二氢吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基氨基)苯基]-6-氧代-5-(5-喹啉基)-4,5-二氢哒嗪-1-基]丁基氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]铵三氟乙酸盐(74.9 mg，104μmol)，并将合并的混合物继续在室温搅拌3h。然后加入4-甲基吗啉（46 µl, 420 µmol）并且在2h后重复在DMF（0.50mL）中的N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸(34.6 mg, 159 µmol)、4-甲基吗啉(46μL，420μmol)和HATU（53.5mg，141μmol）的添加。用在水（0.1mL）和DMSO(3mL)中的甲酸（59μl，1.6mmol）稀释反应混合物，并且通过制备型HPLC纯化，以给出78.4mg的标题化合物（90%纯度，84%产率）。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μm 120x30 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-8 min7% B，8-20 min 7-25% B，20-25 min 25% B；速率150 mL/min，温度25℃。
Figure 876352DEST_PATH_IMAGE288
中间体28-4
[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-[3-[4-(1,3-二氢吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基氨基)苯基]-6-氧代-5-(5-喹啉基)-4,5-二氢哒嗪-1-基]丁基氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]铵三氟乙酸盐
Figure 263471DEST_PATH_IMAGE289
将N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酰-N-{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]丁基}-L-丙氨酰胺(24.2mg，30.1μmol)和三氟乙酸(63μL，810μmol)在二氯甲烷(0.43 mL)中的混合物在室温搅拌4.5h，然后将混合物用甲苯稀释，并在减压下浓缩(与甲苯的共沸蒸馏进行两次)，得到22.8mg标题化合物(90%纯度，83%产率)。
Figure 633273DEST_PATH_IMAGE290
最终中间体28-5
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-N-{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]丁基}-L-丙氨酰胺
Figure 523869DEST_PATH_IMAGE291
将[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-[3-[4-(1,3-二氢吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基氨基)苯基]-6-氧代-5-(5-喹啉基)-4,5-二氢哒嗪-1-基]丁基氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]铵三氟乙酸盐(24.7 mg，30.3μmol)、1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮(13.0 mg，42.1μmol)和N,N-二异丙基乙胺(12μl，70μmol)在DMF(0.54 mL)中的混合物在室温搅拌4h，然后将反应混合物用在水(0.2 mL)和DMSO中的甲酸(2.6μl，70μmol)稀释，并通过制备型HPLC纯化，得到2.54 mg标题化合物（90%纯度，6%产率%）。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μm 120x30 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-8 min10% B，8-11 min 10-20% B，11-12.5 min 20% B，12.5-19 min 20-40% B；速率150 mL/min，温度25℃。
Figure 320923DEST_PATH_IMAGE292
实施例28D
Figure 929759DEST_PATH_IMAGE293
根据程序1，将5 mg抗-C4.4a TPP-509(9.87 mg/mL)与最终中间体28-5 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-N-{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]丁基}-L-丙氨酰胺(270μg，90%纯度，0.27μmol)在磷酸钾缓冲液(0.1M)中偶联，并在Sephadex纯化后，通过超速离心浓缩反应，并用磷酸钾缓冲液(0.1M)再稀释。
蛋白浓度：1.01 mg/mL
药物/mAb比率：2.7(LCMS)。
最终中间体29-1
N-{4-[1-(6-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}己基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 913371DEST_PATH_IMAGE294
在室温，将N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见实施例6，23.0mg，41.1μmol)、1{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮(15.2mg，49.3μmol)和N,N-二异丙基乙胺(14μl，82μmol)在DMF(630μl)中的混合物搅拌4h，然后将水(0.2mL)和甲酸(3.1μl，82μmol)加入到反应溶液中，过滤混合物，并通过制备型HPLC纯化，得到8mg标题化合物(80%纯度，20%产率)。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μM 120×30 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-6min 5-7% B，6-12 min 7-30% B，12-15 min 30% B；速率150 mL/min，温度25℃。
Figure 924052DEST_PATH_IMAGE295
实施例29C
Figure 892008DEST_PATH_IMAGE296
根据程序1,将5 mg抗-B7H3 TPP-8382(15.1mg/mL)与最终中间体29-1 N-{4-[1-(6-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}己基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(250μg，80%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.70 mg/mL
药物/mAb比率：0.7(UV)。
实施例29D
根据程序1，将5 mg抗-C4.4a TPP-509(9.87 mg/mL)与最终中间体29-1 N-{4-[1-(6-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}己基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(250μg，80%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白浓度：0.98 mg/mL
药物/mAb比率：3.9(UV)。
实施例29M
S-{1-[6-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基)-6-氧代己基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸
Figure 988140DEST_PATH_IMAGE297
在室温，将L-半胱氨酸(390μg，3.2μmol)加入N-{4-[1-(6-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}己基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见最终中间体29-1，3.00 mg，80%纯度，3.19μmol)在DMF(260μL)和水(26μL)中的溶液，并将混合物在该温度搅拌4h。之后，将混合物通过制备型HPLC纯化，得到2.01 mg标题化合物(95%纯度，69%产率)。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：YMC-Actus-ODS-AQ-HG 10μm 150x20 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-14min 5-30% B，14-17min 30% B，速率60 mL /min，温度25℃。
Figure 699744DEST_PATH_IMAGE298
最终中间体30-1
N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 627249DEST_PATH_IMAGE299
将N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见实施例3， 23.5 mg，95%纯度，39.7μmol)、1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(10.0 mg，39.7μmol)和N,N-二异丙基乙胺(14μl，79μmol)在DMF(760μl)中的混合物在室温搅拌10min。然后将甲苯(50 mL)和甲酸(3.0μl，79μmol)加入到反应溶液中，并将混合物在真空下浓缩。粗制产物通过Isolera(4g 15μm硅胶，洗脱剂：二氯甲烷/异丙醇，梯度)纯化，得到22 mg所需产物(95%纯度，74%产率)。
Figure 766106DEST_PATH_IMAGE300
实施例30 Aa
Figure 349535DEST_PATH_IMAGE301
根据程序2,将5 mg抗-HER2 TPP-1015(c=12.2 mg/mL)与最终中间体30-1 N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(200μg，95%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.34 mg/mL
药物/mAb比率：4.3(UV)。
实施例30 Ab
根据程序2,将5 mg抗-HER2 TPP-1015(c=12.2 mg/mL)与最终中间体30-1 N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(590μg，95%纯度，0.80μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：0.66 mg/mL
药物/mAb比率：9.4(UV)。
实施例30Ca
根据程序2，将5 mg抗-B7H3 TPP-8382(c=15.1 mg/mL)与最终中间体30-1 N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(210μg，90%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.47 mg/mL
药物/mAb比率：4.5(UV)。
实施例30 Cb
根据程序2，将5 mg抗-B7H3 TPP-8382(c=15.1 mg/mL)与最终中间体30-1 N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(390μg，95%纯度，0.53μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：0.75 mg/mL
药物/mAb比率：8.4(UV)。
实施例30D
根据程序2，将5 mg抗-C4.4a TPP-509(c=9.87 mg/mL)与最终中间体30-1 N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(210μg，90%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：0.84 mg/mL
药物/mAb比率：3.0(UV)。
实施例30E
根据程序2，将5 mg抗-C4.4a TPP-668(c=11.62 mg/mL)与最终中间体30-1 N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(210μg，90%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.80 mg/mL
药物/mAb比率：3.2(UV)。
中间体30-2
N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸
Figure 599250DEST_PATH_IMAGE302
将L-半胱氨酸(CAS52-90-4，470 mg，3.88 mmol)、1-({[2-(三甲基甲硅烷基)-乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮(CAS 78269-85-9，1.16g，4.46 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(2.0 mL，12 mmol)在DMF(12 mL)中的混合物在室温搅拌3天。然后，向反应溶液中加入甲苯(100 mL)，减压浓缩混合物(与甲苯的共沸蒸馏进行两次)。将粗制产物溶解在DMSO中，通过制备型HPLC纯化，得到770 mg标题化合物(90%纯度，67%产率)。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μM290×51 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-20min 10-70% B，20-25 min 70% B；速率250 mL/min，温度25℃。
Figure 584524DEST_PATH_IMAGE303
中间体30-3
S-{1-[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸
Figure 707332DEST_PATH_IMAGE304
向N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见最终中间体30-1，13.0 mg，17.7μmol)在DMF(2.0 mL)中的溶液中加入N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸(参见中间体30-2，9.38 mg，35.3μmol)，并将混合物在室温搅拌4h，然后在6℃搅拌3天，然后向反应溶液中加入甲苯，并将混合物在减压下浓缩(与甲苯的共沸蒸馏进行两次)，得到粗制产物(定量)，将其直接用于下一步骤。
Figure 778056DEST_PATH_IMAGE305
中间体30-4
2或3-{[(2R)-2-羧基-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)乙基]硫烷基}-4-{[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-4-氧代丁酸
Figure 831463DEST_PATH_IMAGE306
向在四氢呋喃/水中的S-{1-[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸(参见粗制中间体30-3，18.0μmol)中加入在水(1.2 mL)中的氢氧化锂(2.59 mg，108μmol)，并将混合物在室温搅拌1h，将混合物用甲酸(5.4μL，140μmol)中和，并通过制备型HPLC纯化，得到11.5 mg的标题化合物(95%纯度，62%产率)。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：YMC-Actus-ODS-AQ-HG 10μm 150x20 mm。洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-14min 15-55% B，14-17min 55-100% B，速率60 mL /min，温度25℃。
Figure 671243DEST_PATH_IMAGE307
实施例30M
2或3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-{[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-4-氧代丁酸
Figure 151903DEST_PATH_IMAGE308
向在2,2,2-三氟乙醇(1.6 mL)中的2或3-{[(2R)-2-羧基-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)乙基]硫烷基}-4-{[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-4-氧代丁酸(参见中间体30-4，11.5 mg，11.7μmol)中添加无水氯化锌(6.38 mg，46.8μmol)并在50℃搅拌17h，然后将混合物冷却至室温，加入2,2',2'',2'''-(乙烷-1,2-二基二次氮基)四乙酸(13.7 mg，46.8μmol)，甲酸水溶液（0.1%，1 mL） 和二甲亚砜，并通过制备型HPLC纯化得到3.9mg标题化合物（90%纯度，36%产率）。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：YMC-Actus-ODS-AQ-HG 10μm 150x20 mm。洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-7.5min 1-16.7% B，7.5-8.5min 16.7% B，8.5-14.5min 16.7-30% B，14.5-20min 30% B，速率60 mL /min，温度25℃。
Figure 506661DEST_PATH_IMAGE309
Figure 363758DEST_PATH_IMAGE310
最终中间体31-1
N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 58045DEST_PATH_IMAGE311
将N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见实施例6，30.0mg，95%纯度，50.9μmol)、6-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(12.8mg，50.9μmol)和N,N-二异丙基乙胺(18μl，100μmol)在DMF(3.4 mL)中的混合物在室温搅拌1h，然后向反应溶液中加入甲苯(100 mL)和甲酸(3.8μl，100μmol)，并将混合物在真空下浓缩。粗制产物通过柱色谱(SiO2，洗脱剂：二氯甲烷/异丙醇)纯化，得到13.2 mg所需产物(90%纯度，33%产率)。
Figure 709606DEST_PATH_IMAGE312
实施例31C
Figure 754922DEST_PATH_IMAGE313
根据程序2，将5 mg抗-B7H3 TPP-8382(c=15.1 mg/mL)与最终中间体31-1 N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(210μg，90%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：2.20 mg/mL
药物/mAb比率：3.3(UV)。
实施例31D
根据程序2，将5 mg抗-C4.4a TPP-509(c=9.87 mg/mL)与最终中间体31-1 N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(210μg，90%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.84 mg/mL
药物/mAb比率：2.5(UV)。
实施例31E
根据程序2，将5 mg抗-C4.4a TPP-668(c=11.62 mg/mL)与最终中间体31-1 N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(210μg，90%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：2.40 mg/mL
药物/mAb比率：2.5(UV)。
中间体31-2
S-{1-[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸
Figure 963181DEST_PATH_IMAGE314
向N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见最终中间体31-1，(10.0 mg，13.6μmol)在DMF(2.6 mL)中的溶液中加入N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸(参见中间体30-2，7.24 mg，27.3μmol)，并将混合物在室温搅拌4h，并在6℃搅拌3天，然后向反应溶液中加入甲苯，并将混合物在减压下浓缩，得到13.0 mg(90%纯度，89%产率)的粗制产物，其直接用于下一步骤。
Figure 511974DEST_PATH_IMAGE315
中间体31-3
2或3-{[(2R)-2-羧基-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)乙基]硫烷基}-4-{[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-4-氧代丁酸
Figure 600016DEST_PATH_IMAGE316
向在四氢呋喃/水(1:1，1.8 mL)中的S-{1-[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸(参见粗制中间体31-2，13.0 mg，13.5μmol)中加入在水(850μL)中的氢氧化锂(1.29 mg，54.0μmol)，并将混合物在室温搅拌2h，重复添加在水(850μL)中的氢氧化锂(1.29 mg，54.0μmol)，并继续搅拌1h，将混合物用甲酸(4μL，108μmol)中和并通过制备型HPLC纯化，得到7.0 mg 标题化合物（90% 纯度，48%产率）。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：YMC-ODS-AQ 10μm 280x51 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-22min 30-80% B；速率150 mL/min，温度25℃。
Figure 867049DEST_PATH_IMAGE317
实施例31M
2或3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-{[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-4-氧代丁酸
Figure 65949DEST_PATH_IMAGE318
向在2,2,2-三氟乙醇(850μL)中的2或3-{[(2R)-2-羧基-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)乙基]硫烷基}-4-{[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-4-氧代丁酸(参见中间体31-3，6.00 mg，6.12μmol)中加入无水氯化锌(3.34 mg，24.5μmol)，并将悬浮液在50℃搅拌4h，接着在室温搅拌20h。在50℃再过4h后，将混合物冷却至室温，并且加入2,2',2'',2'''-(乙烷-1,2-二基二次氮基)四乙酸(7.16 mg，24.5μmol)、甲酸水溶液(0.1%，1 mL)和二甲亚砜，并将混合物通过制备型HPLC纯化，得到1.79 mg标题化合物(90%纯度，31%产率)。
HPLC：仪器：Labomatic HD-3000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 4000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.15，Prepcon 5软件。柱：YMC-Actus-ODS-AQ-HG 10μm 150x20 mm。洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-14 min 1-30% B，14-20 min 30% B；速率60 mL/min，温度25℃。
Figure 531565DEST_PATH_IMAGE319
最终中间体32-1
N-{4-[1-(4-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}丁基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 790508DEST_PATH_IMAGE320
在室温，将N-{4-[1-(4-氨基丁基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见实施例25，30.0mg，56.4μmol)、1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮(20.9mg，67.7μmol)和N,N-二异丙基乙胺(20μl，110μmol)在DMF(870μl)中的混合物搅拌2h，然后向反应溶液中加入甲苯和甲酸(4.3μl，110μmol)，并将混合物在真空下浓缩。粗制产物用Isolera(4g硅胶，洗脱液：二氯甲烷/异丙醇，梯度)纯化，得到11.6 mg所需产物(80%纯度，23%产率)。
Figure 544838DEST_PATH_IMAGE321
实施例32C
Figure 281850DEST_PATH_IMAGE322
根据程序1，将5 mg抗-B7H3 TPP-8382(15.1mg/mL)与最终中间体32-1 N-{4-[1-(4-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}丁基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(240μg，80%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：2.27 mg/mL
药物/mAb比率：1.0(LC-MS)。
实施例32E
根据程序1，将5 mg抗-C4.4a TPP-668(11.62 mg/mL)与最终中间体32-1 N-{4-[1-(4-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}丁基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(240μg，80%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：2.33 mg/mL
药物/mAb比率：0.4(LC-MS)。
最终中间体33-1
N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 805235DEST_PATH_IMAGE323
将N-{4-[1-(6-氨基己基)-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见实施例11，7.60 mg，14.7μmol)、马来酰亚胺乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(3.71 mg，14.7μmol)和N,N-二异丙基乙胺(5.1μl，29μmol)在DMF(280μl)中的混合物在室温搅拌30min。然后将甲酸(1.1μL，29μmol)加入到反应溶液中，并将混合物在真空下浓缩。粗制产物通过柱色谱(SiO2，洗脱液：二氯甲烷/异丙醇)纯化，得到2.2 mg所需产物(80%纯度，18%产率)。
Figure 48128DEST_PATH_IMAGE324
实施例33C
Figure 24175DEST_PATH_IMAGE325
根据程序2，将5mg抗-B7H3 TPP-8382(c=15.1mg/ml)与最终中间体33-1 N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(220μg，80%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.86 mg/mL
药物/mAb比率：4.8(UV)。
最终中间体34-1
N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 564878DEST_PATH_IMAGE326
将N-{4-[1-(6-氨基己基)-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见实施例10，38.7 mg，75.2μmol)、马来酰亚胺乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(19.0 mg，75.2μmol)和N,N-二异丙基乙胺(26μl，150μmol)在DMF(1.4 mL)中的混合物在室温搅拌30min。然后将甲酸(5.7μL，150μmol)加入到反应溶液中，并将混合物在真空下浓缩。粗制产物通过Isolera(4g硅胶，(洗脱液：二氯甲烷/异丙醇)纯化，得到19.4 mg(93%纯度，37%产率)所需产物。
Figure 208348DEST_PATH_IMAGE327
实施例34 Ca
Figure 543515DEST_PATH_IMAGE328
根据程序2，将5mg抗-B7H3 TPP-8382(c=15.1mg/mL)与最终中间体34-1 N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(220μg，80%纯度，0.27µmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：0.67 mg/mL
药物/mAb比率：4.0(UV)。
实施例34 Cb
根据程序2，将5mg抗-B7H3 TPP-8382(c=15.1mg/mL)与最终中间体34-1 N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(430μg，80%纯度，0.53μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：0.99 mg/mL
药物/mAb比率：8.4(UV)。
实施例34 Da
根据程序2，将5 mg抗-C4.4a TPP-509(c=9.87 mg/mL)与最终中间体34-1 N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(220μg，80%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：2.35 mg/mL
药物/mAb比率：3.4(UV)。
实施例34 Db
根据程序2，将5 mg抗-C4.4a TPP-509(c=9.87 mg/mL)与最终中间体34-1 N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(430μg，80%纯度，0.53μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：2.44 mg/mL
药物/mAb比率：6.4(UV)。
实施例34 Ea
根据程序2，将5 mg抗-C4.4a TPP-668(c=11.62 mg/mL)与最终中间体34-1 N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(220μg，80%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：2.70 mg/mL
药物/mAb比率：3.3(UV)。
实施例34 Eb
根据程序2，将5 mg抗-C4.4a TPP-668(c=11.62 mg/mL)与最终中间体34-1 N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(430μg，80%纯度，0.53μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：2.96 mg/mL
药物/mAb比率：6.4(UV)。
中间体34-2
S-{1-[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸
Figure 334753DEST_PATH_IMAGE329
向N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见最终中间体34-1，12.5 mg，19.2μmol)在DMF(3.7 mL)的溶液中加入N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸(参见中间体30-2，10.2 mg，38.4μmol)，并将混合物在室温搅拌23h。然后向反应溶液中加入甲苯，并将混合物在减压下浓缩(进行两次与甲苯的共沸蒸馏)，得到23 mg标题化合物，为粗制产物(77%纯度，99%产率)，其直接用于下一步骤。
中间体34-3
2或3-{[(2R)-2-羧基-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)乙基]硫烷基}-4-{[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-4-氧代丁酸
Figure 413568DEST_PATH_IMAGE330
向在四氢呋喃/水(1:1，2.5 mL)中的S-{1-[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸(参见中间体34-2，22.7 mg，77%纯度，19.1μmol)中加入氢氧化锂水溶液(38μL，4.0M，150μmol)，并将混合物在室温搅拌2.5h，将混合物在减压下浓缩，通过制备型HPLC纯化，得到7.7 mg标题化合物(99%纯度，43%产率)。
HPLC：仪器：Labomatic HD-3000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 4000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.15，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μm 125×30 mm，洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-6min15-55% B，6-8min 55-100% B，速率150 mL /min，温度25℃。
Figure 911545DEST_PATH_IMAGE331
实施例34M
2或3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-{[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-4-氧代丁酸
Figure 417613DEST_PATH_IMAGE332
向在2,2,2-三氟乙醇(1.1 mL)中的2或3-{[(2R)-2-羧基-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)乙基]硫烷基}-4-{[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-4-氧代丁酸(参见中间体34-3，7.70 mg，8.23μmol)中加入无水氯化锌(4.49 mg，32.9μmol)并在50℃搅拌3h，然后将混合物冷却至室温，加入乙二胺四乙酸(10 mg)、甲酸(0.1%，1 mL)和二甲亚砜，并通过制备型HPLC纯化混合物，得到2.3 mg标题化合物（90%纯度，32%产率）。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：YMC-Actus-ODS-AQ-HG-10μm 12nm 150x20 mm，洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-6min 10-50% B，6-8min 50-100% B，速率150 mL /min，温度25℃。
Figure 633831DEST_PATH_IMAGE333
中间体35-1
N 2 -{[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}-N 6 -(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酸
Figure 326456DEST_PATH_IMAGE334
向在DMF(8.6 mL)中的1-[(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮(CAS 756525-90-3，500 mg，981μmol)中加入N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酸(CAS 105047-45-8，350 mg，1.08 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(600μL，3.4 mmol)。将混合物在室温搅拌1h，然后用在DMSO(9 mL)中的甲酸(130μL，3.4 mmol)稀释，并通过制备型HPLC纯化，得到560 mg(90%纯度，67%产率)的标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μM 120×30 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-8min5-60% B，8-13min 60% B，速率150 mL /min，温度25℃。
Figure 678940DEST_PATH_IMAGE335
中间体35-2
{(32S)-40-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]-26,33-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27,34-二氮杂四十烷-32-基}氨基甲酸 (9H-芴-9-基)甲基酯
Figure 621488DEST_PATH_IMAGE336
向在DMF(0.65 mL)中的N2-{[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}-N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酸(149 mg，195μmol)中加入4-甲基吗啉(41μL，380μmol)和HATU(71.5 mg，188μmol)，并将混合物在室温搅拌20min。然后将混合物加入到N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(78.0 mg，139μmol)在DMF(0.8 mL)中的悬浮液中，并在室温继续搅拌30min。然后加入甲酸(14μl，380μmol)，并将反应混合物用DMSO稀释。通过制备型HPLC纯化，得到102 mg(90%纯度，50%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μM 120×30 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-7.5min 1-25% B，7.5-9min 25% B。9-16min 25-60% B；速率150 mL/min，温度25℃。
Figure 59422DEST_PATH_IMAGE337
中间体35-3
N-{4-[6-氧代-1-(6-{[N 6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基]氨基}己基)-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 480039DEST_PATH_IMAGE338
向在DMF(510μl)中的{(32S)-40-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]-26,33-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27,34-二氮杂四十烷-32-基}氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯(102 mg，78.2μmol)中加入哌啶(130μl，1.3 mmol)，并将混合物在室温搅拌20min。然后加入甲酸(50μl，1.3 mmol)，并将反应混合物用DMSO稀释。通过制备型HPLC纯化，得到57.4 mg(90%纯度，61%产率)的标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μM 120×30 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-12min 1-30% B，12-14 min 30% B，14-20 min 30-50% B；速率150 mL/min，温度25℃。
Figure 952609DEST_PATH_IMAGE339
最终中间体35-4
N-(4-{1-[6-({N 2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N 6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 862796DEST_PATH_IMAGE340
将N-{4-[6-氧代-1-(6-{[N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基]氨基}己基)-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见中间体35-3，30.0 mg，26.3μmol)、马来酰亚胺乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(7.30 mg，29.0μmol)和N,N-二异丙基乙胺(9.2μL，53μmol)在DMF(0.55mL)中的混合物在室温搅拌30min。然后将反应用甲酸(2.0μl，53μmol)在甲苯(30 mL)中稀释，并将混合物在真空下浓缩。粗制产物通过柱色谱(SiO2，二氯甲烷/异丙醇，含有10%DMSO的梯度)纯化，得到5.14 mg(90%纯度，14%产率)标题化合物。
Figure 788027DEST_PATH_IMAGE341
Figure 12335DEST_PATH_IMAGE342
实施例35A
Figure 339411DEST_PATH_IMAGE343
根据程序2，将5 mg抗-HER2 TPP-1015(c=12.2 mg/mL)与最终中间体35-4 N-(4-{1-[6-({N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(340μg，95%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：0.82 mg/mL
药物/mAb比率：5.6(UV)。
实施例35C
根据程序2，将5 mg抗-B7H3 TPP-8382(c=15.1 mg/mL)与最终中间体35-4 N-(4-{1-[6-({N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(380μg，85%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.5 mg/mL
药物/mAb比率：2.0(UV)。
实施例35D
根据程序2，将5 mg抗-C4.4a TPP-509(c=9.87 mg/mL)与最终中间体35-4 N-(4-{1-[6-({N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(380μg，85%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.57 mg/mL
药物/mAb比率：1.7(UV)。
中间体36-1
{(32S)-40-[(5S)-3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]-26,33-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27,34-二氮杂四十烷-32-基}氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯
Figure 623762DEST_PATH_IMAGE344
向在DMF(1.0 mL)中的N2-{[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}-N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酸(参见中间体35-1，262 mg，344μmol)中加入4-甲基吗啉(73μL，660μmol)和HATU(126 mg，332μmol)，并将混合物在室温搅拌20min。然后将该混合物加入到N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见实施例3，138 mg，246μmol)在DMF(1.5 mL)中的悬浮液中，并在室温继续搅拌2h，同时在1h后，加入另外的甲基吗啉(36μl，320μmol)和HATU(32 mg，84μmol)。然后加入甲酸(25μl，660μmol)，并用DMSO稀释反应混合物。通过制备型HPLC纯化，得到112.4 mg(85%纯度，30%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μM 120×30 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-7.5min 1-25% B，7.5-9min 25% B，9-16min 25-60% B；速率150 mL/min，温度25℃。
Figure 849338DEST_PATH_IMAGE345
中间体36-2
N-{4-[6-氧代-1-(6-{[N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基]氨基}己基)-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 611758DEST_PATH_IMAGE346
向在DMF(560μL)中的{(32S)-40-[(5S)-3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]-26,33-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27,34-二氮杂四十烷-32-基}氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯(112 mg，85.7μmol)中加入哌啶(140μL，1.4 mmol)，并将混合物在室温搅拌20min。然后加入甲酸(55μl，1.5 mmol)，并将反应混合物用DMSO稀释。通过制备型HPLC纯化，得到56.9 mg(80%纯度，49%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μM 120×30 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-12min 1-30% B，12-14 min 30% B，14-20 min 30-50% B；速率150 mL/min，温度25℃。
Figure 793340DEST_PATH_IMAGE347
最终中间体36-3
N-{4-[1-[6-({N 2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N 6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 248592DEST_PATH_IMAGE348
在氩气氛下在室温，将N-{4-[6-氧代-1-(6-{[N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基]氨基}己基)-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(41.2 mg，36.1μmol)、1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(10.0 mg，39.7μmol)和N,N-二异丙基乙胺(13μL，72μmol)在DMF(0.69 mL)中的混合物搅拌30min。然后将反应混合物用在甲苯(50 mL)中的甲酸(2.7μl，72μmol)稀释，并将混合物在真空下浓缩。粗制产物通过柱色谱(SiO2，二氯甲烷/异丙醇，含有10% DMSO的梯度)纯化，得到8.7 mg(95%纯度，18%产率)标题化合物。
Figure 148415DEST_PATH_IMAGE349
实施例36A
Figure 776843DEST_PATH_IMAGE350
根据程序2，将5 mg抗-HER2 TPP-1015(c=12.2 mg/mL)与最终中间体36-3 N-{4-[1-[6-({N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(340μg，95%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.19 mg/mL
药物/mAb比率：6.8(UV)。
实施例36 Ca
根据程序2，将5 mg抗-B7H3 TPP-8382(c=15.1 mg/mL)与最终中间体36-3 N-{4-[1-[6-({N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢-哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(340μg，95%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.58 mg/mL
药物/mAb比率：4.3(UV)。
实施例36 Cb
根据程序2，将5 mg抗-B7H3 TPP-8382(c=14.1 mg/mL)与最终中间体36-3 N-{4-[1-[6-({N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(690μg，95%纯度，0.53μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.71 mg/mL
药物/mAb比率：9.8(UV)。
实施例36 Da
根据程序2，将5 mg抗-C4.4a TPP-509(c=9.87 mg/mL)与最终中间体36-3 N-{4-[1-[6-({N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N 6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(340μg，95%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.22 mg/mL
药物/mAb比率：3.8(UV)。
实施例36 Db
[(32S，39S)-39-羧基-32-({6-[(5S)-3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基甲酰基)-26,34,37-三氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27,33,36-三氮杂三十九烷-39-基]硫烷二基
根据程序2，将5 mg抗-C4.4a TPP-509(c=9.87 mg/mL)与最终中间体36-3 N-{4-[1-[6-({N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢-哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(690μg，95%纯度，0.53μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.59 mg/mL
药物/mAb比率：7.3(UV)。
实施例36 Ea
根据程序2，将5 mg抗-C4.4a TPP-668(c=11.62 mg/mL)与最终中间体36-3 N-{4-[1-[6-({N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(340μg，95%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.28 mg/mL
药物/mAb比率：4.1(UV)。
实施例36 Eb
根据程序2，将5 mg抗-C4.4a TPP-668(c=11.62 mg/mL)与最终中间体36-3 N-{4-[1-[6-({N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(690μg，95%纯度，0.53μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.48 mg/mL
药物/mAb比率：8.0(UV)。
中间体36-4
S-{1-[(32S)-32-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基甲酰基)-26,34-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27,33-二氮杂三十五烷-35-基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸
Figure 812932DEST_PATH_IMAGE351
向N-{4-[1-[6-({N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见最终中间体36-3，61.1 mg，50.0μmol)在DMF(3.8 mL)中的溶液中加入N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸(参见中间体30-2，26.5 mg，100μmol)，并将混合物在室温搅拌1.5h。然后将甲苯加入到反应溶液中，并将混合物减压浓缩（与甲苯的共沸蒸馏进行两次），得到标题化合物作为粗制产物，将其直接用于下一步骤。
Figure 439085DEST_PATH_IMAGE352
中间体36-5
N-[(8R)-8,11-二羧基-2,2-二甲基-6,13-二氧代-5-氧杂-10-硫杂-7-氮杂-2-硅杂十三烷-13-基]甘氨酰基-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰胺
Figure 826204DEST_PATH_IMAGE353
向S-{1-[(32S)-32-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基甲酰基)-26,34-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27,33-二氮杂三十五烷-35-基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸(74.3 mg，50.0μmol)在THF /水的混合物1:1(3.0 mL)中的溶液中加入在水(0.27 mL)中的氢氧化锂(7.8 mg，325μmol)。在室温搅拌1h后，将混合物用DMSO稀释，并通过加入甲酸(23μl，600μmol)将溶液的pH调节至5。通过制备型HPLC纯化，得到55.5 mg(92%纯度，69%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：YMC-Actus-ODS-AQ-HG 10μm 150x20 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-14min 10-50% B，14-22min 50% B；速率60 mL/min，温度25℃。
Figure 930426DEST_PATH_IMAGE354
实施例36M
N-[2或3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-3-羧基丙酰基]甘氨酰基-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-N 6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰胺
Figure 899651DEST_PATH_IMAGE355
向2,2-三氟乙醇(4.7 mL)中的N-[(8R)-8,11-二羧基-2,2-二甲基-6,13-二氧代-5-氧杂-10-硫杂-7-氮杂-2-硅杂十三烷-13-基]甘氨酰基-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰胺(参见中间体36-5，51.0 mg，33.9μmol)中加入无水氯化锌(18.5 mg，136μmol)，并将混合物于50℃搅拌4h，并在室温搅拌16h。加入无水氯化锌(9 mg，68μmol)，并在50℃继续搅拌5h。然后将混合物冷却至室温，加入乙二胺四乙酸(10 mg)和在水中的甲酸(0.1%，1 mL)，并将混合物减压下浓缩。残余物用二甲基亚砜稀释，并通过制备型HPLC纯化，得到31.7 mg标题化合物(90%纯度，62%产率)。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μm 125×30 mm。洗脱液A：水+ 0.1%氨；洗脱液B：乙腈；梯度：0-6min10-50% B，速率150 mL /min，温度25℃。
Figure 696705DEST_PATH_IMAGE356
中间体37-1
(6-{5-[6-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-3-氧代-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢哒嗪-4-基]-1H-吲唑-1-基}己基)氨基甲酸叔丁酯
Figure 305541DEST_PATH_IMAGE357
在氩气氛下，在0℃，向N-{4-[5-(1H-吲唑-5-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺盐酸盐(参见实施例22，使用HPLC纯化前的粗产物，100 mg，176μmol)在DMF(1.9 mL)中的悬浮液中加入氢化钠(14.8 mg，在矿物油中60%，370μmol)。在该温度搅拌混合物30min。然后加入四正丁基碘化铵(6.50 mg，17.6μmol)和(6-溴己基)氨基甲酸叔丁酯(41μl，180μmol)。在0℃再搅拌2h后，将混合物用氯化铵水溶液稀释，并通过制备型HPLC直接纯化，得到24.3 mg(80%纯度，15%产率)标题化合物和17.4 mg(95%纯度，13%产率)作为第二产物的(6-{5-[6-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基羰基)氨基]苯基}-3-氧代-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢哒嗪-4-基]-2H-吲唑-2-基}己基)氨基甲酸叔丁酯。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μm 125×30 mm。洗脱液A：水+ 0.1%氨；洗脱液B：乙腈；梯度：0-6min40-80% B，6-8min 80-100% B，速率150 mL /min，温度25℃。
Figure 479033DEST_PATH_IMAGE358
第二产物：(6-{5-[6-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基羰基)氨基]苯基}-3-氧代-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢哒嗪-4-基]-2H-吲唑-2-基}己基)氨基甲酸叔丁酯
Figure 489715DEST_PATH_IMAGE359
中间体37-2
N-(4-{5-[1-(6-氨基己基)-1H-吲唑-5-基]-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 519988DEST_PATH_IMAGE360
将(6-{5-[6-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-3-氧代-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢哒嗪-4-基]-1H-吲唑-1-基}己基)氨基甲酸叔丁酯(23.0 mg，31.5μmol)和三氟乙酸(150μl，1.9 mmol)在二氯甲烷(1.4 mL)中的混合物在室温搅拌30min。然后，在减压下浓缩混合物，并通过制备型HPLC纯化粗产物，得到16.2 mg(95%纯度，78%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：YMC-Actus-ODS-AQ-HG 10μm 150x20 mm。洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-14min 15-55% B，14-17min 55-100% B，速率60 mL /min，温度25℃。
Figure 616120DEST_PATH_IMAGE361
最终中间体37-3
N-{4-[5-(1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-1H-吲唑-5-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 62145DEST_PATH_IMAGE362
在氩气氛下在室温，将N-(4-{5-[1-(6-氨基己基)-1H-吲唑-5-基]-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(15.1mg，23.9μmol)、1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(6.04 mg，23.9μmol)和N,N-二异丙基乙胺(8.3μl，48μmol)在DMF(0.46 mL)中的混合物搅拌30min。然后加入甲酸(1.8μL，48μmol)，并将混合物在真空下浓缩。粗制产物通过制备型HPLC纯化，得到5.35 mg(75%纯度，22%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：YMC-Actus-ODS-AQ-HG-10μm 12 nm 150x20 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-14min 15-55% B，14-17min 55-100% B；速率60 mL/min，温度25℃。
Figure 192912DEST_PATH_IMAGE363
实施例37A
Figure 331769DEST_PATH_IMAGE364
根据程序2，将5 mg抗-HER2 TPP-1015(c=12.2 mg/mL)与N-{4-[5-(1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-1H-吲唑-5-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见最终中间体37-3，230μg，90%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：0.99 mg/mL
药物/mAb比率：3.1(LC-MS)。
实施例37C
根据程序2，将5 mg抗-B7H3 TPP-8382(c=14.08 mg/mL)与N-{4-[5-(1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-1H-吲唑-5-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见最终中间体37-3，230μg，90%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：2.98 mg/mL
药物/mAb比率：3.7(UV)。
实施例37D
根据程序2，将5 mg抗-C4.4a TPP-509(c=9.87 mg/mL)与N-{4-[5-(1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-1H-吲唑-5-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见最终中间体37-3，230μg，90%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：0.23 mg/mL
药物/mAb比率：1.0(LC-MS)。
实施例37E
根据程序2，将5 mg抗-C4.4a TPP-668(c=11.62 mg/mL)与N-{4-[5-(1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-1H-吲唑-5-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见最终中间体37-3，230μg，90%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.48 mg/mL
药物/mAb比率：1.7(LC-MS)。
中间体38-1
N-(4-{5-[2-(6-氨基己基)-2H-吲唑-5-基]-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 728246DEST_PATH_IMAGE365
将(6-{5-[6-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-3-氧代-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢哒嗪-4-基]-2H-吲唑-2-基}己基)氨基甲酸叔丁酯(参见中间体37-1第二产物，16.0 mg，21.9μmol)和三氟乙酸(100μL，1.3 mmol)在二氯甲烷(1.0 mL)中的混合物在室温搅拌30min。然后，在减压下浓缩混合物，并通过制备型HPLC纯化粗制产物，得到12.8 mg(95%纯度，88%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：YMC-Actus-ODS-AQ-HG 10μm 150x20 mm。洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-14min 15-55% B，14-17min 55-100% B，速率60 mL /min，温度25℃。
Figure 977962DEST_PATH_IMAGE366
最终中间体38-2
N-{4-[5-(2-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-2H-吲唑-5-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 963236DEST_PATH_IMAGE367
在室温，将N-(4-{5-[2-(6-氨基己基)-2H-吲唑-5-基]-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(11.8 mg，18.7μmol)、1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(4.72 mg，18.7μmol)和N,N-二异丙基乙胺(6.5μl，37μmol)在DMF(0.36 mL)中的混合物搅拌30min。然后加入甲酸(1.4μL，37μmol)，并将混合物减压浓缩。粗制产物通过制备型HPLC纯化，得到2.97 mg(75%纯度，16%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：YMC-Actus-ODS-AQ-HG-10μm 12 nm150x20 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-14min 15-55% B，14-17min 55-100% B；速率60 mL/min，温度25℃。
Figure 272994DEST_PATH_IMAGE368
实施例38A
Figure 343718DEST_PATH_IMAGE369
根据程序2，将5 mg抗-HER2 TPP-1015(c=12.2 mg/mL)与N-{4-[5-(2-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-2H-吲唑-5-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见最终中间体38-2，230μg，90%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：2.73 mg/mL
药物/mAb比率：4.0(LC-MS)。
实施例38B
根据程序2，将5 mg抗-CXCR5 TPP-9574(c=10.65 mg/mL)与N-{4-[5-(2-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-2H-吲唑-5-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(最终中间体38-2，230μg，90%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.88 mg/mL
药物/mAb比率：3.1(LC-MS)。
实施例38C
根据程序2，将5 mg抗-B7H3 TPP-8382(c=14.08 mg/mL)与N-{4-[5-(2-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-2H-吲唑-5-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见最终中间体38-2，230μg，90%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：2.37 mg/mL
药物/mAb比率：3.7(UV)。
中间体39-1
(6-{4-[6-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基羰基)氨基]苯基}-3-氧代-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢哒嗪-4-基]-1H-吲唑-1-基}己基)氨基甲酸叔丁酯
Figure 459442DEST_PATH_IMAGE370
在氩气氛下，在0℃，向N-{4-[5-(1H-吲唑-4-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺盐酸盐(参见实施例23，使用碳酸氢钠水溶液处理之前的干燥粗制产物，96.0 mg，169μmol)在DMF(1.8 mL)中的悬浮液中加入氢化钠(14.2 mg，在矿物油中60%，355μmol)。在该温度搅拌混合物30min。然后加入四正丁基碘化铵(6.24 mg，16.9μmol)和(6-溴己基)氨基甲酸叔丁酯(40μl，170μmol)。在室温再搅拌3h后，将混合物用氯化铵水溶液稀释，并通过制备型HPLC直接纯化，得到50.8 mg(75%纯度，31%产率)标题化合物和33.4 mg(95%纯度，26%产率)作为第二产物的(6-{4-[6-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-3-氧代-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢哒嗪-4-基]-2H-吲唑-2-基}己基)氨基甲酸叔丁基酯。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μm 125×30mm。洗脱液A：水+ 0.1%氨；洗脱液B：乙腈；梯度：0-6min40-80% B，6-8min 80-100% B，速率150 mL /min，温度25℃。
Figure 299222DEST_PATH_IMAGE371
第二产物：(6-{4-[6-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-3-氧代-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢哒嗪-4-基]-2H-吲唑-2-基}己基)氨基甲酸叔丁酯：
Figure 779882DEST_PATH_IMAGE372
中间体39-2
N-(4-{5-[1-(6-氨基己基)-1H-吲唑-4-基]-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 72323DEST_PATH_IMAGE373
将(6-{4-[6-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-3-氧代-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢哒嗪-4-基]-1H-吲唑-1-基}己基)氨基甲酸叔丁酯(51.8 mg，70.9μmol)和三氟乙酸(330μL，4.3 mmol)在二氯甲烷(3.2 mL)中的混合物在室温搅拌30min。然后，在减压下浓缩混合物，并通过制备型HPLC纯化粗制产物，得到26.4 mg(95%纯度，56%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μm 125×30mm。洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-6min15-55% B，6-8min 55-100% B，速率150 mL /min，温度25℃。
Figure 929420DEST_PATH_IMAGE374
最终中间体39-3
N-{4-[5-(1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-1H-吲唑-4-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 433827DEST_PATH_IMAGE375
在氩气氛下在室温，将N-(4-{5-[1-(6-氨基己基)-1H-吲唑-4-基]-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(26.4mg，41.9μmol)、1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(10.6 mg，41.9μmol)和N,N-二异丙基乙胺(15μL，84μmol)在DMF(0.81 mL)中的混合物搅拌30min。然后加入甲酸(3.2μL，84μmol)，并将混合物在真空下浓缩。粗制产物通过制备型HPLC纯化，得到5.70 mg(70%纯度，12%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：YMC-Actus-ODS-AQ-HG 10μm 150x20 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-14min 15-55% B，14-17min 55-100% B；速率60 mL/min，温度25℃。
Figure 85388DEST_PATH_IMAGE376
实施例39A
Figure 130704DEST_PATH_IMAGE377
根据程序2，将5 mg抗-HER2 TPP-1015(c=12.2 mg/mL)与N-{4-[5-(1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-1H-吲唑-4-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见最终中间体39-3，290μg，70%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.66 mg/mL
药物/mAb比率：0.6(LC-MS)。
实施例39C
根据程序2，将5 mg抗-B7H3 TPP-8382(c=14.08 mg/mL)与N-{4-[5-(1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-1H-吲唑-4-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见最终中间体39-3，290μg，70%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.55 mg/mL
药物/mAb比率：0.5(UV)。
中间体40-1
N-(4-{5-[2-(6-氨基己基)-2H-吲唑-4-基]-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 525913DEST_PATH_IMAGE378
将(6-{4-[6-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基羰基)氨基]苯基}-3-氧代-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢哒嗪-4-基]-2H-吲唑-2-基}己基)氨基甲酸叔丁酯(中间体39-1，第二产物33.4 mg，45.7μmol)和三氟乙酸(210μL，2.7 mmol)在二氯甲烷(2.1 mL)中的混合物在室温搅拌30min。然后，在减压下浓缩混合物，并通过制备型HPLC纯化粗制产物，得到11.3 mg(95%纯度，37%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μm 125×30mm。洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-6min15-55% B，6-8min 55-100% B；速率150 mL/min，温度25℃。
Figure 74706DEST_PATH_IMAGE379
最终中间体40-2
N-{4-[5-(2-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-2H-吲唑-4-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 162748DEST_PATH_IMAGE380
在氩气氛下在室温，将N-(4-{5-[2-(6-氨基己基)-2H-吲唑-4-基]-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(11.3mg，17.9μmol)、1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(4.52 mg，17.9μmol)和N,N-二异丙基乙胺(6.2μl，36μmol)在DMF(0.34 mL)中的混合物搅拌30min。然后加入甲酸(1.4μL，36μmol)，并将混合物在真空下浓缩。粗制产物通过制备型HPLC纯化，得到8.00 mg(65%纯度，38%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：YMC-Actus-ODS-AQ-HG 10μm 150x20 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-6min 15-55% B，6-8min 55-100% B；速率60 mL/min，温度25℃。
Figure 492098DEST_PATH_IMAGE381
实施例40A
Figure 425419DEST_PATH_IMAGE382
根据程序2，将5 mg抗-HER2 TPP-1015(c=12.2 mg/mL)与N-{4-[5-(2-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-2H-吲唑-4-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见最终中间体，40-2，310μg，65%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.70 mg/mL
药物/mAb比率：3.5(LC-MS)。
实施例40B
根据程序2，将5 mg抗-CXCR5 TPP-9574(c=10.65 mg/mL)与N-{4-[5-(2-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-2H-吲唑-4-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见最终中间体40-2，310μg，65%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：0.26 mg/mL
药物/mAb比率：5.5(LC-MS)。
实施例40D
根据程序2，将5 mg抗-C4.4a TPP-509(c=9.87 mg/mL)与N-{4-[5-(2-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-2H-吲唑-4-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见最终中间体40-2，310μg，65%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：0.91 mg/mL
药物/mAb比率：4.7(LC-MS)。
实施例40E
根据程序2，将5 mg抗-C4.4a TPP-668(c=11.62 mg/mL)与N-{4-[5-(2-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-2H-吲唑-4-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见最终中间体40-2，310μg，65%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：0.78 mg/mL
药物/mAb比率：3.3(LC-MS)。
中间体41-1
N 2-{[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}-N 6-(20-氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十烷-20-基)-L-赖氨酸
Figure 94298DEST_PATH_IMAGE383
向在DMF(10 mL)中的1-[(20-氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十烷-20-基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮(CAS 1449390-12-8，500 mg，1.19 mmol)中加入N2-[(9H-芴-9-基)甲基]-L-赖氨酸(CAS 105047-45-8，481 mg，1.31 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(720μL，4.2 mmol)。将混合物在室温搅拌30h，然后用在DMSO(10 mL)中的甲酸(160μL，4.2 mmol)稀释，并通过制备型HPLC纯化，得到522 mg(90%纯度，59%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μm 120x30 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-8min5-60% B，8-11min 60% B，速率150 mL /min，温度25℃。
Figure 353241DEST_PATH_IMAGE384
中间体41-2
{(26S)-34-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]-20,27-二氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂-21,28-二氮杂三十四烷-26-基}氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯
Figure 655041DEST_PATH_IMAGE385
向在DMF(0.9 mL)中的N2-{[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}-N6-(20-氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十烷-20-基)-L-赖氨酸(202 mg，299μmol)中加入4-甲基吗啉(63μL，580μmol)和HATU(110 mg，288μmol)，并将混合物在室温搅拌30min。然后将混合物加入到N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(实施例3，120 mg，214μmol)在DMF(1.23 mL)中的悬浮液中，并在室温继续搅拌30min。然后加入甲酸(22μl，580μmol)，并用DMSO稀释反应混合物。通过制备型HPLC纯化，得到123 mg(85%纯度，40%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μm 120x30 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-7.5min 1-25% B，7.5-9min 25% B。9-16min 25-60% B；速率150 mL/min，温度25℃。
Figure 657632DEST_PATH_IMAGE386
中间体41-3
N-{4-[6-氧代-1-(6-{[N 6-(20-氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十烷-20-基)-L-赖氨酰基]氨基}己基)-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 181017DEST_PATH_IMAGE387
向在DMF(640μl)中的{(26S)-34-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]-20,27-二氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂-21,28-二氮杂三十四烷-26-基}氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯(120 mg，98.5μmol)中加入哌啶(160μl，1.6 mmol)，并将混合物在室温搅拌20min。然后加入甲酸(63μl，1.7 mmol)，并将反应混合物用DMSO稀释。通过制备型HPLC纯化，得到85.2 mg(90%纯度，78%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μM 120×30 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-7.5min 1-25% B，7.5-9min 25% B。9-16min 25-60% B；速率150 mL/min，温度25℃。
Figure 345282DEST_PATH_IMAGE388
最终中间体41-4
N-{4-[1-[6-({N 2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N 6 -(20-氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十烷-20-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 586907DEST_PATH_IMAGE389
在氩气氛下在室温，将N-{4-[6-氧代-1-(6-{[N 6 -(20-氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十烷-20-基)-L-赖氨酰基]氨基}己基)-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(40.0 mg，38.1μmol)、1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(10.6 mg，42.0μmol)和N,N-二异丙基乙胺(13μL，76μmol)在DMF(0.73 mL)中的混合物搅拌30min。然后将反应混合物用甲酸(2.9μl，76μmol)在甲苯(50 mL)中稀释，并将混合物在真空下浓缩。粗制产物通过柱色谱(SiO2，二氯甲烷/异丙醇，含有10% DMSO的梯度)纯化，得到27.1 mg(95%纯度，60%产率)标题化合物。
Figure 127610DEST_PATH_IMAGE390
实施例41A
Figure 567819DEST_PATH_IMAGE391
根据程序2，将5 mg抗-HER2 TPP-1015(c=12.2 mg/mL)与N-{4-[1-[6-({N 2 -[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N 6-(20-氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十烷-20-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见最终中间体41-4，320μg，95%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：0.56 mg/mL
药物/mAb比率：4.8(UV)。
中间体42-1
N2-{[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}-N6-(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)-L-赖氨酸
Figure 168564DEST_PATH_IMAGE392
向在DMF(21 mL)中的1-[(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮(CAS 622405-78-1，1.00g，3.00 mmol)中加入N 2 -[(9H-芴-9-基)甲基]-L-赖氨酸(CAS 105047-45-8，1.22g，3.30 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.8 mL，10 mmol)。将混合物在室温搅拌1h，然后用在DMSO(18 mL)中的甲酸(400μL，10 mmol)稀释，并通过制备型HPLC纯化，得到1.49g(95%纯度，80%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μM 120×30 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-8min5-60% B，8-11min 60% B，速率150 mL /min，温度25℃。
Figure 631907DEST_PATH_IMAGE393
中间体42-2
{(20S)-28-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]-14,21-二氧代-2,5,8,11-四氧杂-15,22-二氮杂二十八烷-20-基}氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯
Figure 976300DEST_PATH_IMAGE394
向在DMF(0.9 mL)中的N 2 -{[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}-N 6 -(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)-L-赖氨酸(175 mg，299μmol)中加入4-甲基吗啉(63μL，580μmol)和HATU(110 mg，288μmol)，并将混合物在室温搅拌20min。然后将该混合物加入到N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见实施例3，120 mg，214μmol)在DMF(1.2 mL)中的悬浮液中，并在室温继续搅拌30min。然后加入甲酸(22μl，580μmol)，并用DMSO稀释反应混合物。通过制备型HPLC纯化，得到115 mg(95%纯度，45%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μM 120×30 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-7.5min 1-25% B，7.5-9min 25% B。9-16min 25-60% B；速率150 mL/min，温度25℃。
Figure 474278DEST_PATH_IMAGE395
Figure 793395DEST_PATH_IMAGE396
中间体42-3
N-{4-[6-氧代-1-(6-{[N 6 -(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)-L-赖氨酰基]氨基}己基)-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 9613DEST_PATH_IMAGE397
向在DMF(650μl)中的{(20S)-28-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]-14,21-二氧代-2,5,8,11-四氧杂-15,22-二氮杂二十八烷-20-基}氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯(113 mg，100μmol)中加入哌啶(160μl，1.6 mmol)，并将混合物在室温搅拌20min。然后加入甲酸(64μl，1.7mmol)，并将反应混合物用DMSO稀释。通过制备型HPLC纯化，得到67.3 mg(90%纯度，67%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μM 120×30 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-7.5min 1-25% B，7.5-9min 25% B。9-16min 25-60% B；速率150 mL/min，温度25℃。
Figure 892118DEST_PATH_IMAGE398
最终中间体42-4
N-{4-[1-[6-({N 2 -[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N 6 -(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 244602DEST_PATH_IMAGE399
在氩气氛下在室温，将N-{4-[6-氧代-1-(6-{[N6-(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)-L-赖氨酰基]氨基}己基)-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见中间体42-3，30.0 mg，95%纯度，31.3μmol)、1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(8.69 mg，34.4μmol)和N,N-二异丙基乙胺(11μL，63μmol)在DMF(600μL)中的混合物搅拌30min。然后将反应用在甲苯(50 mL)中的甲酸(2.4μl，63μmol)稀释，并将混合物在真空下浓缩。粗制产物通过柱色谱(SiO2，二氯甲烷/异丙醇，含有10% DMSO的梯度)纯化，得到17.5 mg(95%纯度，51%产率)标题化合物。
Figure 921571DEST_PATH_IMAGE400
实施例42A
Figure 421822DEST_PATH_IMAGE401
根据程序2，将5 mg抗-HER2 TPP-1015(c=12.2 mg/mL)与N-{4-[1-[6-({N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N6-(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见最终中间体42-4，290μg，95%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.34 mg/mL
药物/mAb比率：5.4(UV)。
实施例42E
Figure 108019DEST_PATH_IMAGE402
根据程序2，将5 mg抗-C4.4a TPP-668(c=11.62 mg/mL)与N-{4-[1-[6-({N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N6-(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂-十四烷-14-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见最终中间体42-4，290μg，95%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.40 mg/mL
药物/mAb比率：4.3(UV)。
最终中间体43-1
N-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-L-缬氨酰-N-{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]丁基}-L-丙氨酰胺
Figure 315009DEST_PATH_IMAGE403
在氩气氛下，在室温将1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基)双(氧基)]二(吡咯烷-2,5-二酮)(12.3 mg，37.6μmol)和N,N-二异丙基乙胺(11μL，63μmol)在DMF(0.1 mL)中的混合物搅拌30min，同时经该期间缓慢加入在DMF(0.9 mL)中的L-缬氨酰-N-{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]丁基}-L-丙氨酰胺(参见中间体27-4，22.0 mg，31.3μmol)。再搅拌15min后，将反应物用在甲苯(50 mL)中的甲酸(2.4μl，63μmol)稀释，并将混合物在真空下浓缩。粗制产物通过柱色谱(SiO2，二氯甲烷/异丙醇，梯度)纯化，得到7.00 mg(87%纯度，21%产率)标题化合物。
Figure 428459DEST_PATH_IMAGE404
实施例43D
Figure 353689DEST_PATH_IMAGE405
根据程序3，将5 mg抗-C4.4a TPP-509(c=9.87 mg/mL)与N-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-L-缬氨酰-N-{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)-氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]丁基}-L-丙氨酰胺(参见最终中间体43-1，350μg，87%纯度，0.33μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.59 mg/mL
药物/mAb比率：0.9(UV)。
实施例43E
根据程序3，将5 mg抗-C4.4a TPP-668(c=11.62 mg/mL)与N-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-L-缬氨酰-N-{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)-氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]丁基}-L-丙氨酰胺(参见最终中间体43-1，350μg，87%纯度，0.33μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.70 mg/mL
药物/mAb比率：1.1(UV)。
中间体44-1
{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基甲酸叔丁酯
Figure 391047DEST_PATH_IMAGE406
将碳酸钾(0.48克，3.47μmol)加入到N-{4-[6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见实施例24，800mg，1.74μmol)在DMF(32mL)中的混合物中，并搅拌10min。然后加入(6-溴己基)氨基甲酸叔丁酯(0.58g，2.08 mmol)，并将混合物在室温搅拌48h。将混合物倒入水中，通过过滤收集所得固体，得到所需粗制产物，为浅黄色固体。沉淀物通过柱色谱(SiO2，二氯甲烷/甲醇梯度)纯化，得到0.55g(95%纯度，45%产率)所需产物。
Figure 718123DEST_PATH_IMAGE407
中间体44-2
N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺-盐酸盐
Figure 2473DEST_PATH_IMAGE408
将{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基甲酸叔丁酯(300 mg，0.45 mmol)和在环戊基甲基醚中的HCl(3M，10 mL)和乙醇(1 mL)的混合物在室温搅拌2h。形成的固体通过过滤收集，用庚烷洗涤并干燥，得到240 mg(96%纯度，83%产率)的所需产物，为黄色固体。
Figure 149421DEST_PATH_IMAGE409
中间体44-3
{(26S)-34-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)哒嗪-1(6H)-基]-20,27-二氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂-21,28-二氮杂三十四烷-26-基}氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯
Figure 177420DEST_PATH_IMAGE410
向在DMF(1.0 mL)中的N 2 -{[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}-N 6 -(20-氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十碳三烷-20-基)-L-赖氨酸(参见中间体41-1，179 mg，266μmol)中加入4-甲基吗啉(83μL，760μmol)和HATU(97.4 mg，256μmol)，并且将混合物在室温搅拌30min。然后将混合物加入到N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺盐酸盐(参见中间体44-2，120 mg，190μmol)在DMF(1.0 mL)中的悬浮液中，并在室温继续搅拌30min。然后加入甲酸(29μL，760μmol)，并用DMSO稀释反应混合物。通过制备型HPLC纯化，得到70.0 mg(90%纯度，27%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μM 120×30 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-7.5min 1-25% B，7.5-9min 25% B。9-16min 25-60% B；速率150 mL/min，温度25℃。
Figure 421319DEST_PATH_IMAGE411
中间体44-4
N-{4-[6-氧代-1-(6-{[N 6 -(20-氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十烷-20-基)-L-赖氨酰基]氨基}己基)-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 876572DEST_PATH_IMAGE412
向在DMF(390μL)中的{(26S)-34-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)哒嗪-1(6H)-基]-20,27-二氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂-21,28-二氮杂三十四烷-26-基}氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯(72.0 mg，59.2μmol)中加入哌啶(97μL，980μmol)，并将混合物在室温搅拌20min。然后加入甲酸(38μL，1.0mmol)，并将反应混合物用DMSO稀释。通过制备型HPLC纯化，得到32.3 mg(90%纯度，49%产率)标题化合物。
HPLC：仪器：Labomatic HD-5000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 2000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.1S，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μM 120×30 mm；洗脱液A：水+ 0.1%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-7.5min 1-25% B，7.5-9min 25% B。9-16min 25-60% B；速率150 mL/min，温度25℃。
Figure 776394DEST_PATH_IMAGE413
Figure 342505DEST_PATH_IMAGE414
最终中间体44-5
N-(4-{1-[6-({N 2 -[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N 6 -(20-氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十烷-20-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 378594DEST_PATH_IMAGE415
在氩气氛下在室温，将N-{4-[6-氧代-1-(6-{[N 6 -(20-氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十烷-20-基)-L-赖氨酰基]氨基}己基)-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(21.0 mg，20.1µmol)、1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(5.57mg，22.1µmol)和N,N-二异丙基乙胺(7.0μL，40μmol)在DMF(390L)中的混合物搅拌30min。然后将反应物用在甲苯(10 mL)中的甲酸(1.5μl，40μmol)稀释，并将混合物在真空下浓缩(与甲苯的共沸蒸馏进行两次)。粗制产物通过柱色谱(SiO2，二氯甲烷/异丙醇，含有10% DMSO的梯度)纯化，得到8.90 mg(80%纯度，31%产率)标题化合物。
Figure 814867DEST_PATH_IMAGE416
实施例44A
Figure 936407DEST_PATH_IMAGE417
根据程序2，将5 mg抗-HER2 TPP-1015(c=12.2 mg/mL)与N-(4-{1-[6-({N 2 -[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N 6 -(20-氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十烷-20-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见最终中间体44-5，380μg，80%纯度，0.27μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：2.31 mg/mL
药物/mAb比率：6.9(UV)。
中间体45-1
{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基甲酸叔丁酯
Figure 306208DEST_PATH_IMAGE418
将在乙酸(9mL)中的{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基羰基)氨基]-苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基甲酸叔丁酯(参见中间体44-1，180 mg，0.273 mmol)加热至90℃，并加入锌粉，89.1 mg(1.36 mmol)。在该温度将混合物加热另外1h。将反应混合物冷却至室温，通过硅藻土过滤并减压浓缩。将粗制残余物通过制备型HPLC(XSelect C18，19×150 mm，5μm，在水-乙腈中的0.1%甲酸，20-33%，经10min)纯化，并冻干得到所需产物，100 mg(55%产率)。
Figure 462383DEST_PATH_IMAGE419
实施例45
N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺盐酸盐
Figure 259438DEST_PATH_IMAGE420
将{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基甲酸叔丁酯(参见中间体45-1，170mg，0.257mmol)在氯化氢(3M，在环戊基甲基醚中，20mL)和乙醇(2mL)中的混合物在室温搅拌5h。将粗制反应混合物与另一批起始自{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基甲酸叔丁酯(50.0mg，75.6μmol)的物质合并，且通过过滤收集固体，用庚烷洗涤且干燥，得到190mg所需产物(97%纯度，88%产率)。
Figure 868274DEST_PATH_IMAGE421
最终中间体46-1
N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 838504DEST_PATH_IMAGE422
将N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺盐酸盐(参见实施例45，15.0 mg，23.6μmol)、马来酰亚氨基乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(5.96 mg，23.6μmol)、DIPEA(18μL，95μmol)和DMF(360μL)的混合物在室温搅拌14h。之后，过滤混合物，并通过制备型HPLC纯化，得到标题化合物(8.00 mg，48%产率)。
HPLC：仪器：Labomatic HD-3000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 4000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.15,Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μM 120×30 mm。洗脱液A：水+ 0.1体积-% HCOOH；洗脱液B：乙腈；梯度：0-20min 10-50% B。速率150 mL /min，温度25℃。
Figure 849185DEST_PATH_IMAGE423
实施例46A
Figure 817141DEST_PATH_IMAGE424
根据程序2，将5 mg抗-HER2 TPP-1015(c=12.2 mg/mL)与N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(参见最终中间体46-1，370μg，0.53μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：1.92 mg/mL
药物/mAb比率：7.2(UV)。
中间体47-1
N 2 -(叔丁氧基羰基)-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-D-天冬酰胺叔丁酯
Figure 913273DEST_PATH_IMAGE425
将4-甲基吗啉(55μl，500μmol)在室温加入到(3R)-4-叔丁氧基-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸(36.0 mg，124μmol)在DMF(1.9 mL)中的混合物中，并将该混合物在该温度搅拌30min。之后加入HATU(56.8 mg，149μmol)，并将混合物在室温再搅拌30min，之后加入N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺盐酸盐(参见实施例45，79.0 mg，124μmol)。在室温搅拌14h后，将混合物用二氯甲烷/异丙醇稀释，用水洗涤。将有机相用盐水洗涤，通过相分离过滤器过滤，并减压浓缩。粗制产物通过制备型HPLC纯化，得到标题化合物(67.0 mg，65%产率)。
HPLC：仪器：Labomatic HD-3000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 4000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.15，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μm 120×30 mm。洗脱液A：水+ 0.1体积-%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-20min 15-55% B。速率150 mL /min，温度25℃。
Figure 624877DEST_PATH_IMAGE426
中间体47-2
N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-D-天冬酰胺
Figure 568694DEST_PATH_IMAGE427
将N 2 -(叔丁氧基羰基)-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-D-天冬酰胺叔丁酯(67.0mg，80.4μmol)、TFA(93μL，1.2 mmol)和二氯甲烷(780μL)的混合物在室温搅拌14h之后，将混合物减压浓缩，并用甲苯共蒸发两次，得到标题化合物(40.0 mg，73%产率)。
最终中间体47-3
N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-N 2 -[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-D-天冬酰胺
Figure 707551DEST_PATH_IMAGE428
将N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-D-天冬酰胺(40.0 mg，59.1μmol)、马来酰亚胺乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(14.9 mg，59.1μmol)、DIPEA(31μL，180μmol)和DMF(680μL)的混合物在室温搅拌14h。之后，将混合物过滤，并通过制备型HPLC纯化，得到标题化合物(11.0 mg，23%产率)。
HPLC：仪器：Labomatic HD-3000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 4000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.15，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18 10μM 120×20 mm。洗脱液A：水；洗脱液B：乙腈；梯度：0-22min 10-50%B。速率50 mL /min，温度25℃。
Figure 25400DEST_PATH_IMAGE429
实施例47A
Figure 540695DEST_PATH_IMAGE430
根据程序2，将5 mg抗-HER2 TPP-1015(c=12.2 mg/mL)与N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-D-天冬酰胺(参见最终中间体47-3，430μg，0.53μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：2.11 mg/mL
药物/mAb比率：6.2(UV)。
实施例47D
根据程序2，将5 mg抗-C4.4a TPP-509(c=11.88 mg/mL)与N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢-哒嗪-1(4H)-基]己基}-N 2 -[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-D-天冬酰胺(参见最终中间体47-3，430μg，0.53μmol)偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓度：0.21 mg/mL
药物/mAb比率：6.2(UV)。
中间体48-1
[(2S)-1-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基甲酸叔丁酯
Figure 525968DEST_PATH_IMAGE431
在室温向N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸(22.7 mg，120μmol)在DMF(1.8 mL)中的溶液中加入4-甲基吗啉(53μL，480μmol)和HATU(47.8 mg，126μmol)，并将混合物在该温度搅拌30min。然后加入N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺-盐酸盐(实施例45，76.0 mg，120μmol)，并将混合物再搅拌14h。之后将混合物加入二氯甲烷/甲醇/水中，分离各层，并将有机相通过硅胶过滤器过滤，并在减压下浓缩，得到标题化合物(100 mg，90%纯度，定量)。
Figure 898044DEST_PATH_IMAGE432
中间体48-2
N-{4-[1-[6-(L-丙氨酰基氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺
Figure 703189DEST_PATH_IMAGE433
将[(2S)-1-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基甲酸叔丁酯(100 mg，136μmol)、三氟乙酸(160μl，2.0 mmol)和二氯甲烷(1.8 mL)的混合物在室温搅拌14h。之后将混合物减压浓缩，并与甲苯共蒸发两次。粗制产物通过制备型HPLC纯化，得到标题化合物(30.0 mg，34%产率)。
HPLC：仪器：Labomatic HD-3000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 4000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.15，Prepcon 5软件。柱：xBridge C18,5μM，100x30 mm。洗脱液A：水+ 0.1体积-%氨；洗脱液B：乙腈；梯度：0-20min15-55% B。速率60 mL /min，温度25℃。
Figure 756595DEST_PATH_IMAGE434
中间体48-3
N-(叔丁氧羰基)-L-缬氨酰-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-L-丙氨酰胺
Figure 596375DEST_PATH_IMAGE435
在室温，向N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸(11.3 mg，52.2μmol)在DMF(730μL)中的溶液中加入4-甲基吗啉(18μL，170μmol)和HATU(19.8 mg，52.2μmol)，并将混合物在该温度下搅拌30min。然后加入N-{4-[1-[6-(L-丙氨酰氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺(30.0mg，47.4µmol)，并将混合物再搅拌14h。之后过滤混合物，并通过制备型HPLC纯化，得到标题化合物(7.0mg，18%产率)。
HPLC：仪器：Labomatic HD-3000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 4000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.15，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18，10μM，120×30 mm。洗脱液A：水+ 0.1体积-%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-20min 15-55% B。速率150 mL /min，温度25℃。
Figure 77035DEST_PATH_IMAGE436
中间体48-4
L-缬氨酰-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-L-丙氨酰胺
Figure 448105DEST_PATH_IMAGE437
将N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酰-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-L-丙氨酰胺(7.00 mg，8.41μmol)、三氟乙酸(9.7μL，130μmol)和二氯甲烷(160μL)的混合物在室温搅拌4h。然后，将混合物减压下浓缩，并与甲苯共蒸发两次，得到粗制产物，其直接用于下一步骤。
Figure 39623DEST_PATH_IMAGE438
最终中间体48-5
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-L-丙氨酰胺
Figure 999489DEST_PATH_IMAGE439
在室温，向L-缬氨酰-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]-苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-L-丙氨酰胺(6.66mg，9.09μmol)在DMF(140μL)中的溶液中加入DIPEA(6.3μL，36μmol)和1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(2.52mg，10.0μmol)，并将混合物在该温度搅拌14h。之后再加入1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(2.29 mg，9.09μmol)和DIPEA(27μmol)，并将混合物再搅拌3h。然后将混合物过滤并通过制备型HPLC纯化，得到标题化合物(6.0 mg，76%产率)。
HPLC：仪器：Labomatic HD-3000，泵压头HDK-280，梯度模块NDB-1000，馏分收集器Labomatic Labocol Vario 4000，Knauer UV检测器Azura UVD 2.15，Prepcon 5软件。柱：Chromatorex C18，10μM，120×20 mm。洗脱液A：水+ 0.1体积-%甲酸；洗脱液B：乙腈；梯度：0-20min 15-55% B。速率50 mL /min，温度25℃。
Figure 651050DEST_PATH_IMAGE440
实施例48A
Figure 430787DEST_PATH_IMAGE441
根据程序2，将5 mg抗-HER2 TPP-1015 (c =12.2 mg/mL)与N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基] -L-缬氨酰-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-L-丙氨酰胺（参见最终中间体48-5，460μg，0.53μmol）偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓缩：0.92 mg/mL
药物/ mAb比率：1.4(UV)。
实施例48C
根据程序2，将5 mg抗-B7H3 TPP-8382(c =15.1 mg/mL)与N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基] -L-缬氨酰-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c ]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-L-丙氨酰胺（参见最终中间体48-5， 460μg，0.53μmol）偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓缩：0.95 mg/mL
药物/ mAb比率：1.6(UV)。
实施例48D
根据程序2，将5 mg抗-C4.4a TPP-509(c =11.88 mg/mL)与N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基] -L-缬氨酰-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c ]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-L-丙氨酰胺（参见最终中间体48-5，460μg，0.53μmol）偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白浓缩：0.34 mg/mL
药物/ mAb比率：0.8(UV)。
NAMPT-ADC和NAMPT-SMOL的细胞增殖测定
Cell Titer Glo(CTG)方法
将细胞以指定的细胞数（表1）铺板于96孔板（白色/透明底，(#10775584，PerkinElmer)中的75μL生长培养基/孔中，将板在37℃培养过夜，在接种细胞24小时后将测试化合物在生长培养基中连续稀释，并将25μL四倍浓缩稀释液/孔加入测试板。对于抗体-药物-缀合物，通常使用一式三份地从300 nM至0.03 nM的半对数稀释物。将化合物处理的板在37℃培养72或96h，如所示出的。与测试化合物的加入相平行地，在姐妹板中测量在时间为0时的Cell Titer Glo 发光细胞活力测定（Luminescent Cell Viability Assay） (CTG) 水平。为此向姐妹板中的细胞中加入75μL/孔CTG溶液（Promega，目录# G755 B和G756B)，培养10min，并且在VICTOR V仪器(Perkin Elmer)上测量发光。在测试化合物的存在下培养72或96h后（表1），将100μl/孔CTG溶液加入所有测试孔中，培养10min，并且在VICTOR V仪器上测量发光。使用BELLA-Dose Response Curve (DRC) 电子制表软件产生剂量响应曲线并计算IC50值（对增殖的50%抑制）。DRC软件是Biobook电子制表软件（Biobook Spreadsheet），其由IDBS E-Workbook Suite平台（IDBS：ID Business Solutions Ltd., Guildford, UK)上的Bayer AG和Bayer Business Services研发。
表1：细胞增殖测定中细胞系的测定条件
Figure 888314DEST_PATH_IMAGE442
NAMPT生化测定（hNAMPT IC50）
使用如下段落中描述的级联分析定量本发明化合物的烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)抑制活性。该测定将通过NAMPT将烟酰胺(NAM)转化为烟酰胺单核苷酸(NMN)与通过烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1 (NMNAT1)将NMN转化为烟碱腺嘌呤二核苷酸(NAD +)以及随后的通过商业检测试剂盒(来自Promega的NAD/NADH-Glo™测定，# G9072)定量产生的NAD +进行偶联。
将N-末端His6-标记的重组全长人NAMPT和N-末端His6标记的重组全长人NMNAT1用作酶，二者均在大肠杆菌中表达并经由NiNTA-亲和色谱和连续尺寸排阻色谱纯化。
为了测定，将50 nl的DMSO中的测试化合物的100倍浓缩溶液移液至白色低体积384孔微量滴定板（Greiner Bio-One，Frickenhausen，Germany）中，加入2.5μl的NAMPT在水性的含NMNAT1的测定缓冲液[50 mM Tris/HCl pH7.5、12 mM MgCl2、0.6 mM三磷酸腺苷(ATP)、1 nM NMNAT1、0.02% (w/v)牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich # P7906)、0.001% (v/v)吐温-20 (Sigma-Aldrich # P7949) ]中的溶液，并将混合物在22℃培养15min，以允许在酶反应开始之前测试化合物与酶预结合。然后通过在测定缓冲液中加入2.5μl NAM的溶液（300 nM = >最终浓度，在5μl测定体积中为150 nM，Sigma-Aldrich #47865)和5-磷酸核糖-1-焦磷酸五钠盐(PRPP，1.2μM = >最终浓度，在5μl测定体积中为0.6μM，Sigma-AldrichP8296)开始反应，并将所得混合物在22℃培养20min的反应时间，根据酶批次的活性调节NAMPT的浓度，并选择合适的浓度以使测定处于线性范围，在5μl测定体积中的典型最终浓度为0.16 nM。通过在检测试剂溶液(NAD/NADH-Glo™检测试剂[ Promega ]在水中的1:4.5倍稀释)中加入2.5μl 的600 nM FK866的溶液（一种可商购获得的NAMPT抑制剂(例如，来自Selleckchem)停止NAM转化，并开始检测产生的NAD+。
将所得混合物在22℃培养2h以允许检测系统处于稳态。随后在合适的发光读数器（例如Viewlux™ (Perkin-Elmer)）中测量产生的发光，并作为产生的NAD+的量度。将数据归一化(无抑制剂的酶反应= 0%抑制，所有其它测定组分但无NAMPT = 100%抑制)。通常，在相同的微量滴定板上以20μM至0.1 nM 范围内(20μM、5.9μM、1.7μM、0.51μM、0.15μM、44 nM、13 nM、3.8 nM、1.1 nM、0.33 nM和0.1 nM，在测定之前通过连续1:3.4稀释以在DMSO中100倍浓缩溶液的水平分别制备的稀释系列)的11种不同浓度测试化合物，对每种浓度以重复的值测试，并通过4参数拟合计算IC50值。
Figure 702686DEST_PATH_IMAGE443
Figure 525148DEST_PATH_IMAGE444
Figure 792182DEST_PATH_IMAGE445
Figure 991082DEST_PATH_IMAGE446
Figure 473010DEST_PATH_IMAGE447
以下表3列出了代表性ADC增殖测定的IC50值
Figure 466374DEST_PATH_IMAGE448
Figure 220703DEST_PATH_IMAGE449
序列表
<110> Bayer Aktiengesellschaft
<120> 具有NAMPT抑制剂的抗体药物缀合物（ADCs）
<130> BHC173054 WO
<160> 50
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 1
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 2
Asn Ala Trp Met Ser
1 5
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 3
Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 4
Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Tyr
1 5
<210> 5
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 5
Glu Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg
85 90 95
Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 6
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 7
Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 8
Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu Asn Gly Pro Val
1 5 10
<210> 9
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 9
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 10
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 10
Glu Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Arg
85 90 95
Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
130 135 140
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
145 150 155 160
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
165 170 175
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
180 185 190
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
195 200 205
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 11
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 11
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 12
Ser Ala Trp Met Ser
1 5
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 13
Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 14
Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Tyr
1 5
<210> 15
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 15
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Tyr Asp Asp Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 16
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His
1 5 10
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 17
Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 18
Ala Ala Tyr Asp Asp Ser Leu Ser Gly Pro Val
1 5 10
<210> 19
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 19
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Leu Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 20
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 20
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Tyr Asp Asp Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
130 135 140
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
145 150 155 160
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
165 170 175
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
180 185 190
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
195 200 205
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 21
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 22
Asp Thr Tyr Ile His
1 5
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 23
Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 24
Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 26
Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 27
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 28
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 29
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 30
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 31
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 31
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Thr Gly Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 32
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 33
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 34
Leu Thr Gly Thr Ser Phe Asp Tyr
1 5
<210> 35
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 35
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Ser Ser Leu
85 90 95
Lys Lys Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 36
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 36
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Pro Val Asn
1 5 10
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 37
Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 38
Gln Ser Phe Asp Ser Ser Leu Lys Lys Val
1 5 10
<210> 39
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 39
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Thr Gly Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 40
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 40
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Ser Ser Leu
85 90 95
Lys Lys Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 41
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Gly Phe Val Tyr Ala Asp Ala Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Glu Ala Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 42
Thr Ser Gly Met His
1 5
<210> 43
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 43
Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Gly Phe Val Tyr Ala Asp Ala Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 44
Ser Glu Ala Ala Phe
1 5
<210> 45
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 45
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gln Lys Ser Arg Leu Ser Arg
20 25 30
Met Gly Ile Thr Pro Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Phe
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 46
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 46
Arg Ser Gln Lys Ser Arg Leu Ser Arg Met Gly Ile Thr Pro Leu Asn
1 5 10 15
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 47
Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 48
Ala Gln Phe Leu Glu Tyr Pro Pro Thr
1 5
<210> 49
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Gly Phe Val Tyr Ala Asp Ala Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Glu Ala Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
115 120 125
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
180 185 190
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
340 345 350
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 50
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 50
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gln Lys Ser Arg Leu Ser Arg
20 25 30
Met Gly Ile Thr Pro Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Phe
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (54)

1.结合剂或其衍生物与一个或多个活性化合物分子的缀合物，其具有下式：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中AB代表结合剂，Z'代表连接子，n代表1和50之间的数，优选1.2至20，且尤其优选2至8，和
D代表式(I-D)的活性组分：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中：
§1或§2代表与连接子Z'的连接点，条件是：
当连接子Z'在§1处连接时，则§2代表R5a，和
当连接子Z'在§2处连接时，则连接子Z'与环Het的碳或氮原子连接，且§1代表R5b；
Het代表任选被一个或多个独立地选自R5的基团取代的杂芳基；
R1彼此独立地代表卤素、羟基、C1-C3-烷基、C1-C3-卤代烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-N(H)R6、-N(R6)R7或-NH2；
t是0、1或2；
R2代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基，
其中苯基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-N(H)R6和-N(R6)R7；
R3代表H、C1-C3-烷基或C1-C3-卤代烷基；和
R4代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基；
或者，
R2和R3与它们所连接的碳一起形成C3-C6-环烷基或含有一个含杂原子基团的5-至7-元杂环烷基，所述含杂原子基团选自O、NR8、S、S(=O)、S(=O)2、S(=NR8)(=NR9)和S(=O)(=NR8)；和
R4代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基；
或者，
R2代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基，
其中苯基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-N(H)R6和-N(R6)R7；且
R3和R4一起形成键；
R5彼此独立地代表卤素、羟基、C1-C3-烷基、C1-C3-卤代烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-N(H)R6、-N(R6)R7 -NH2、4-至7-元杂环烷基、-SR8、-S(=O)R8、-S(=O)2R8或-S(=O)(=NR8)R9；
R5a代表R5、氢或不存在；
R5b代表氢或选自以下的基团：
甲基、C2-C6-烷基、(1,3-二氧戊环-2-基)-(C1-C6-烷基)-、(1,3-二噁烷-2-基)-(C1-C6-烷基)-、氮杂环丁烷-3-基、(氮杂环丁烷-3-基)-(C1-C6-烷基)-、氧杂环丁烷-3-基、(氧杂环丁烷-3-基)-(C1-C6-烷基)-、C3-C6-环烷基、(C3-C6-环烷基)-(C1-C6-烷基)-、5-至7-元杂环烷基、(5-至7-元杂环烷基)-(C1-C6-烷基)、苯基、苯基-(C1-C6-烷基)-、5-至6-元杂芳基和(5-至6-元杂芳基)-(C1-C6-烷基)-，
其中5-至7-元杂环烷基和5-至6-元杂芳基分别经由5-至7-元杂环烷基环的碳原子或经由5-至6-元杂芳基环的碳原子与分子的其余部分连接；
其中C2-C6-烷基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、羟基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、氧代(=O)、-NH2、-N(H)R6、-N(R6)R7、-C(=O)OR8、-SR8、-S(=O)R8、-S(=O)2R8和-S(=O)(=NR8)R9；
其中氮杂环丁烷-3-基和氧杂环丁烷-3-基任选被一个或两个独立地选自以下的取代基取代：
C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C1-C4-烷氧基、C1-C4-卤代烷氧基、(C1-C3-烷氧基)-(C1-C4-烷基)-、C3-C6-环烷基和C3-C6-环烷基氧基；
其中C3-C6-环烷基和5-至7-元杂环烷基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
羟基、卤素、氰基、C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C1-C4-烷氧基、C1-C4-卤代烷氧基、(C1-C3-烷氧基)-(C1-C4-烷基)-、C3-C6-环烷基、C3-C6-环烷基氧基、-N(R5)R6、-C(=O)OH、氧代(=O)和-N(H)C(=O)-(C1-C3-烷基)；
其中苯基和5-至6-元杂芳基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基-、C1-C3-卤代烷氧基-、-N(H)R6、-N(R6)R7、-C(=O)OH和-C(=O)O(C1-C6-烷基)；
q是0、1、2或3，
m是0、1、2或3，
条件是q+m是2、3或4；
Figure DEST_PATH_IMAGE003
代表选自以下的基团：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
其中*和＃代表所述基团与式(I)化合物的其余部分的连接点，
所述基团任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、R6(H)N-和-N(R6)R7；
R6、R7彼此独立地代表C1-C3-烷基、C3-C6-环烷基、苯基、-C(=O)-O-(C1-C4-烷基)或-C(=O)-(C1-C3-烷基)，
其中所述苯基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-NH2、-N(H)R6和-N(R6)R7；
R8、R9彼此独立地代表氢、C1-C3-烷基、C3-C6-环烷基、苯基或C1-C3-卤代烷基，
其中所述苯基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-NH2、-N(H)R6和-N(R6)R7；
或所述化合物的N-氧化物、盐、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中：
§1或§2代表与连接子Z'的连接点，条件是：
当连接子Z'在§1处连接时，则§2代表R5a，和
当连接子Z'在§2处连接时，则连接子Z'与环Het的碳或氮原子连接并且§1代表R5b；
Het代表杂芳基，其任选被一个或多个独立地选自R5的基团取代；
t是0；
R2代表H、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或苯基，
R3代表H；和
R4代表H、C1-C4-烷基或C1-C2-卤代烷基；
或者，
R2代表H；且
R3和R4一起形成键；
R5彼此独立地代表卤素、羟基、C1-C3-烷基、C1-C3-卤代烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-N(H)R6、-N(R6)R7、-NH2、4-至7-元杂环烷基、-SR8、-S(=O)R8、-S(=O)2R8或-S(=O)(=NR8)R9；
R5a代表R5、氢或不存在；
R5b代表氢或选自以下的基团：
甲基、C2-C6-烷基、(1,3-二氧戊环-2-基)-(C1-C6-烷基)- 、(1,3-二噁烷-2-基)-(C1-C6-烷基)- 、氮杂环丁烷-3-基、(氮杂环丁烷-3-基)-(C1-C6-烷基)- 、氧杂环丁烷-3-基、(氧杂环丁烷-3-基)-(C1-C6-烷基)- 、C3-C6-环烷基、(C3-C6-环烷基)-(C1-C6-烷基)- 、5-至7-元杂环烷基、(5-至7-元杂环烷基)-(C1-C6-烷基)-、苯基、苯基-(C1-C6-烷基)- 、5-至6-元杂芳基和(5-至6-元杂芳基)-(C1-C6-烷基)-，
其中5-至7-元杂环烷基和5-至6-元杂芳基分别经由5-至7-元杂环烷基环的碳原子或经由5-至6-元杂芳基环的碳原子与分子的其余部分连接；
其中C2-C6-烷基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、羟基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、氧代(=O)、-C(=O)OH和-N(R6)R7；
其中C3-C6-环烷基和5-至7-元杂环烷基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
羟基、卤素、氰基、C1-烷基、C1-卤代烷基、C1-烷氧基、C1-卤代烷氧基和氧代(=O)；
其中苯基和5-至6-元杂芳基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基-、C1-C3-卤代烷氧基-、-C(=O)OH和-C(=O)O(C1-C6-烷基)；
q是1，
m是1，
Figure DEST_PATH_IMAGE005
代表基团
Figure DEST_PATH_IMAGE006
；
其中*和＃代表所述基团与式(I)化合物的其余部分的连接点，
R6、R7彼此独立地代表C1-C3-烷基、C3-C6-环烷基、苯基或-C(=O)-(C1-C3-烷基)；
R8代表氢、C1-C3-烷基、C3-C6-环烷基、苯基或C1-C3-卤代烷基；
其中所述苯基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、C1-C3-卤代烷氧基、-NH2、-N(H)R6和-N(R6)R7；
或所述化合物的N-氧化物、盐、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐。
3.根据权利要求1或2所述的缀合物，其中：
§1或§2代表与连接子Z'的连接点，条件是：
当连接子Z'在§1处连接时，则§2代表R5a，和
当连接子Z'在§2处连接时，则连接子Z'与环Het的氮原子连接并且§1代表R5b；
Het代表任选被一个或多个独立地选自R5的基团取代的杂芳基；
t是0；
R2代表H，
R3代表H；且
R4代表H、C1-烷基或C1-卤代烷基；
或者，
R2代表H；且
R3和R4一起形成键；
R5彼此独立地代表卤素、羟基、C1-烷基、5-至6-元杂环烷基、-SR8、-S(=O)R8或-S(=O)2R8；
R5a代表氢或不存在；
R5b代表氢或选自以下的基团：
甲基、C2-C3-烷基，
其中C2-C3-烷基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
卤素；
q是1,
m是1,
Figure DEST_PATH_IMAGE007
代表基团
Figure DEST_PATH_IMAGE008
；
其中*和＃代表所述基团与式(I)化合物的其余部分的连接点，
R8代表氢、C1-C3-烷基或苯基；
其中所述苯基任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：
C1-烷基；
或所述化合物的N-氧化物、盐、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的缀合物，其中：
§1或§2代表与连接子Z'的连接点，条件是：
当连接子Z'在§1处连接时，则§2代表R5a，和
当连接子Z'在§2处连接时，则连接子Z'与环Het的氮原子连接并且§1代表R5b；
Het代表任选被一个或多个独立地选自R5的基团取代的杂芳基；
t是0；
R2代表H，
R3代表H；且
R4代表H或C1-卤代烷基；
或者，
R2代表H；且
R3和R4一起形成键；
R5彼此独立地代表C1-烷基、6-元杂环烷基或-S(=O)2R8；
R5a代表氢或不存在；
R5b代表氢或选自以下的基团：
任选被一个或多个氟原子取代的C2-烷基；
q是1，
m是1，
Figure DEST_PATH_IMAGE009
代表基团
Figure DEST_PATH_IMAGE010
；
其中*和＃代表所述基团与式(I)化合物的其余部分的连接点，
R8代表任选被一个或多个C1-烷基取代的苯基；
或所述化合物的N-氧化物、盐、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的缀合物，其中所述连接子-Z'-代表以下通式结构(i)至(iii)之一：
Figure DEST_PATH_IMAGE011
其中
§1、§2代表与D的连接点；
§§代表与AB的连接点；
SG代表体内可裂解基团，L1和L1'彼此独立地代表体内不可裂解有机基团，和L2代表连接基团。
6.根据权利要求5所述的缀合物，其中所述体内可裂解基团SG代表2-8寡肽基，优选二肽基或三肽基，或者二硫化物、腙、糖苷、缩醛或缩醛胺。
7.根据权利要求5或6所述的缀合物，其中L1和L1'彼此独立地代表具有1至40个碳原子的直链或支链烃链，其可以被一个或多个独立地选自以下的基团间断一次或多次：
-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-NHCO-、-CONH-、-CONHNH-、亚芳基、杂亚芳基、直链C1-C6-亚烷基、支链C1-C6-亚烷基、C3-C7-环亚烷基和具有至多4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的5-10元杂环基；
任选被一个或多个选自卤素、-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸的取代基取代。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的缀合物，其中L2代表：
Figure DEST_PATH_IMAGE012
其中
#1代表与结合剂的连接点，
#2代表与基团L1、L1'或SG的连接点。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中所述连接子-Z'-代表以下通式结构(i)至(iii)之一：
Figure DEST_PATH_IMAGE013
其中
§1、§2代表与D的连接点；
§§ 代表与AB的连接点；
SG代表2-8寡肽基，优选二肽基或三肽基，或者二硫化物、腙、糖苷、缩醛或缩醛胺；
L1、L1'彼此独立地代表具有1至40个碳原子的直链或支链烃链，其可以被一个或多个独立地选自以下的基团间断一次或多次：
-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-NHCO-、-CONH-、-CONHNH-、亚芳基、杂亚芳基、直链C1-C6-亚烷基、支链C1-C6-亚烷基、C3-C7-环亚烷基和具有至多4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的5-至10-元杂环基；
任选被一个或多个选自卤素、-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸的取代基取代；
L2代表：
Figure DEST_PATH_IMAGE015
其中
#1代表与结合剂的连接点，
#2代表与基团L1、L1'或SG的连接点。
10.根据权利要求6至10中任一项所述的缀合物，其中L2代表以下三个结构式中的一个或多个：
Figure DEST_PATH_IMAGE016
其中
#1代表与结合剂的连接点，
#2代表与基团L1、L1'或SG的连接点，
其中在优选的实施方案中，相对于连接子与结合剂的连接总数，超过60%的与结合剂的连接点，甚至更优选超过80%的与结合剂的连接点，优选超过90%的与结合剂的连接点，优选超过95%的与结合剂的连接点由以下两个结构之一代表：
Figure DEST_PATH_IMAGE017
其中，在特别优选的实施方案中，#2处的酰胺基团经由基团-CH2-C(O)-与L1、L1'或SG连接。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的缀合物，其中SG是2-8寡肽。
12.根据权利要求11所述的缀合物，其中所述2-8寡肽由选自以下的氨基酸组成：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、瓜氨酸和缬氨酸。
13.根据权利要求5至14中任一项所述的缀合物，其中L1和L1'彼此独立地代表具有1至20个碳原子的直链或支链烃链，其可以被一个或多个独立地选自以下的基团间断一次或多次：
-O-、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-；
其中*和＃代表所述基团与化合物的其余部分的连接点，
任选被一个或多个独立地选自-F、-Cl、-COOH、-OH和-NH2的取代基取代。
14.根据权利要求5至13中任一项所述的缀合物，其中L1和L1'彼此独立地代表通式结构(iv)或(v)之一：
Figure DEST_PATH_IMAGE018
其中：
A'代表C1-C6烷基、(C1-C2 烷基)-(亚苯基)和(C1-C3烷基)-(NR11)-(C2烷基)；
任选被一个或多个独立地选自-F和-Cl的取代基取代；
B'代表具有1至20个碳原子的直链或支链烃链，其可以被一个或多个独立地选自以下的基团间断一次或多次：-O-、-NH-、-CO-、-NHCO-和-CONH-；
任选被-COOH取代；
R10、R11彼此独立地代表氢或C1-C3烷基；或
R10、R11与它们所连接的氮一起形成6-元含氮杂环烷基。
15.根据权利要求5至13中任一项所述的缀合物，其中所述连接子-Z'-代表通式结构(vi)至(vii)之一：
Figure DEST_PATH_IMAGE019
§1、§2代表与D的连接点；
§§ 代表与AB的连接点；
L2如权利要求8至10中任一项所定义；
SG'任选存在，并且当存在时，代表：
如前述权利要求中任一项所定义的SG，或
任选被-[CH2-CH2O]oCH3取代的一个氨基酸(赖氨酸、天冬酰胺)；-C(=O)[CH2-CH2O]oCH3；-NHC(=O)[CH2-CH2O]oCH3，
o代表3至9的整数，优选4至8；
A2代表C2-C6-烷基；任选被一个或多个独立地选自-F、-Cl和-COOH的取代基取代；
B2代表具有1至20个碳原子的直链或支链烃链，其可以被一个或多个独立地选自-O-、-NH-、-CO-、-NHCO-和-CONH-的基团间断一次或多次；
任选被-COOH取代；
R10代表氢或C1-C3烷基。
16.通式(II)的缀合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE020
其中AB代表结合剂，Z'代表连接子，n代表1和50之间的数，优选1.2至20，且尤其优选2至8；
其中：
其中R1、R2、R3、R4、Het、t、q、m、V、W、Z和Y如权利要求1至4中所定义；
-Z'-代表以下通式结构(i)至(iii)之一：
Figure DEST_PATH_IMAGE021
其中
§1代表与哒嗪酮环的连接点；
§§ 代表与AB的连接点；
SG代表2-8寡肽基，优选二肽基或三肽基，或者二硫化物、腙、糖苷、缩醛或缩醛胺；
L1、L1'彼此独立地代表具有1至40个碳原子的直链或支链烃链，其可被-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-NHCO-、-CONH-、-CONHNH-、-亚芳基、杂亚芳基、环亚烷基和具有至多4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的5-10元杂环基中的一个或多个间断一次或多次；
其中*和＃代表所述基团与化合物的其余部分的连接点，
任选被一个或多个选自卤素、-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸的取代基取代；
L2代表：
Figure DEST_PATH_IMAGE022
其中
#1代表与结合剂的连接点，
#2代表与基团L1、L1'或SG的连接点；
或其对映异构体、非对映异构体、盐、溶剂化物或溶剂化物的盐。
17.根据上述权利要求中任一项或全部所述的缀合物，其选自：
Figure DEST_PATH_IMAGE024
Figure DEST_PATH_IMAGE025
Figure DEST_PATH_IMAGE026
Figure DEST_PATH_IMAGE027
Figure DEST_PATH_IMAGE028
Figure DEST_PATH_IMAGE029
Figure DEST_PATH_IMAGE030
Figure DEST_PATH_IMAGE031
Figure DEST_PATH_IMAGE032
Figure DEST_PATH_IMAGE033
其中n是1至50的数，优选1.2至20，和尤其优选2至8，且所述抗体优选选自抗-HER2-抗体、抗-CXCR5-抗体、抗-B7H3-抗体、抗-C4.4a-抗体或其抗原结合片段。
18.通式(III)的缀合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE034
其中AB代表结合剂，Z'代表连接子，n代表1和50之间的数，优选1.2至20，且尤其优选2至8；
其中：
其中R1、R2、R3、R4、R5b、Het 、t、q、m、V、W、Z和Y如权利要求1至4中任一项所定义；
-Z'-代表以下通式结构(i)至(iii)之一：
Figure DEST_PATH_IMAGE035
其中
§2代表与环Het的连接点；
§§代表与AB的连接点；
SG代表2-8寡肽基，优选二肽基或三肽基，或者二硫化物、腙、糖苷、缩醛或缩醛胺；
L1、L1'彼此独立地代表具有1至40个碳原子的直链或支链烃链，其可被-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-NHCO-、-CONH-、-CONHNH-、-亚芳基、杂亚芳基、环亚烷基和具有至多4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的5-至10-元杂环基中的一个或多个间断一次或多次；
其中*和＃代表所述基团与化合物的其余部分的连接点，
任选被一个或多个选自卤素、-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸的取代基取代；
L2代表：
Figure DEST_PATH_IMAGE036
其中
#1代表与结合剂的连接点，
#2代表与基团L1、L1'或SG的连接点；
或其对映异构体、非对映异构体、盐、溶剂化物或溶剂化物的盐。
19.根据上述权利要求中任一项或全部所述的缀合物，其选自：
Figure DEST_PATH_IMAGE037
Figure DEST_PATH_IMAGE038
其中n是1至50的数，优选1.2至20，和尤其优选2至8，且所述抗体优选选自抗-HER2-抗体、抗-CXCR5-抗体、抗-B7H3-抗体、抗-C4.4a-抗体或其抗原结合片段。
20.根据上述权利要求中任一项所述的缀合物，其中连接子Z'如权利要求5至19中任一项所定义。
21.根据上述权利要求中任一项所述的缀合物，其中结合剂AB如权利要求17或19中任一项所定义。
22.根据上述权利要求中任一项所述的缀合物，其中连接子Z'代表以下通式结构(i)至(iii)之一：
Figure DEST_PATH_IMAGE039
其中
§1、§2代表与D的连接点；
§§代表与AB的连接点；
L1和L1'彼此独立地如表A或表B的任一行中所定义；
r彼此独立地代表1至20的数，优选1至15，特别优选2至20，尤其优选2至10；且
SG和L2如上述权利要求中任一项所定义。
23.根据上述权利要求中任一项所述的缀合物，其中连接子Z'代表以下通式结构(i)至(iii)之一：
Figure DEST_PATH_IMAGE040
其中
§1、§2代表与D的连接点；
§§ 代表与AB的连接点；
且L1、SG、L1'和L2如表C或表D的任一行中所定义。
24.根据上述权利要求中任一项所述的缀合物，其中SG包含(C-末端)-Ala-Val-(N-末端)或(C-末端)-Cit-Val-(N-末端)，特别地SG是(C-末端)-Ala-Val-(N-末端)。
25.根据上述权利要求中任一项所述的缀合物，其中Het代表选自喹啉-5-基、1,3,4-噁二唑-2-基、1H-吲唑-5-基、1H-吲唑-4-基、喹啉-7-基、1H-苯并咪唑-4-基的杂芳基，所述基团任选被一个或多个独立地选自R5的基团取代。
26.根据上述权利要求中任一项或全部所述的缀合物，其中连接子Z'与结合剂AB上的半胱氨酸侧链结合。
27.根据上述权利要求中任一项或全部所述的缀合物，其中结合剂或其衍生物是结合肽或结合蛋白或结合肽或结合蛋白的衍生物。
28.根据上述权利要求中任一项或全部所述的缀合物，其中活性组分的每个分子经由连接子分别与结合肽或结合蛋白或它们的衍生物的不同氨基酸结合。
29.根据上述权利要求中任一项或全部所述的缀合物，其中缀合物平均为每结合剂1.2至50个活性组分的分子。
30.根据权利要求28至31中任一项所述的缀合物，其中结合肽或结合蛋白代表抗体，或者其中结合肽或结合蛋白的衍生物分别地包括以下基团之一：
Figure DEST_PATH_IMAGE041
。
31.根据上述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物与癌症靶分子结合。
32.根据权利要求31所述的缀合物，其中结合剂与胞外靶分子结合。
33.如权利要求32所述的缀合物，其中结合剂在与胞外靶分子结合之后内化在靶分子的表达细胞中并在胞内加工，优选通过溶酶体途径。
34.根据上述权利要求中任一项所述的缀合物，其中结合肽或结合蛋白是人、人源化或嵌合单克隆抗体，或其抗原结合片段。
35.根据上述权利要求中任一项所述的缀合物，其中结合肽或结合蛋白是抗-HER2-抗体、抗-CXCR5-抗体、抗-B7H3-抗体、抗-C4.4a-抗体；或其抗原结合片段。
36.代谢物，其可通过裂解权利要求1至35中任一项所定义的缀合物而获得。
37.根据权利要求36所述的代谢物，其中所述代谢物不包含结合剂蛋白或肽的半胱氨酸和/或赖氨酸残基。
38.根据权利要求36或37所述的代谢物，其选自：
S-{1-[6-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基)-6-氧代己基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸
2-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-{[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-4-氧代丁酸，
3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-{[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-4-氧代丁酸，
2-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-{[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-4-氧代丁酸，
3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-{[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-4-氧代丁酸，
2-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-{[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-4-氧代丁酸，
3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-{[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-4-氧代丁酸，
N-[2-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-3-羧基丙酰基]甘氨酰基-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰胺，
N-[3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-3-羧基丙酰基]甘氨酰基-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-N6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰胺，
或所述代谢物的N-氧化物、盐、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐。
39.化合物，其选自：
Figure DEST_PATH_IMAGE042
其中R1、R2、R3、R4、Het、t、q、m、V、W、Z和Y如前述权利要求中任一项所定义；
Figure DEST_PATH_IMAGE043
其中R1、R2、R3、R4、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如前述权利要求中任一项所定义，并且
当Het代表含NH的杂芳基，诸如例如吲唑基、苯并咪唑基或吲哚基时，所述NH任选地用氨基保护基保护，所述氨基保护基例如四氢吡喃基、对甲苯酰基磺酰基或2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基；
Figure DEST_PATH_IMAGE044
其中R1、R2、R3、R4、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如前述权利要求中任一项所定义；
Figure DEST_PATH_IMAGE045
其中R1、R2、R3、R4、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如前述权利要求中任一项所定义，和o是1-5，和p是1-12，PG1代表胺保护基，诸如例如芴基甲基氧基羰基、苄氧基羰基、烯丙氧基羰基或叔丁氧羰基；
Figure DEST_PATH_IMAGE046
R1、R2、R3、R4、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如前述权利要求中任一项所定义，和o是1至5，和p是1至12；
Figure DEST_PATH_IMAGE047
其中R1、R2、R3、R4、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如前述权利要求中任一项所定义，PG1代表胺保护基，诸如例如芴基甲基氧基羰基、苄氧基羰基、烯丙氧基羰基或叔丁氧羰基，和
RA代表氢(甘氨酸)或选自以下的基团：
-CH3(丙氨酸)、-C(H)(CH3)2(缬氨酸)、-(CH2)2CH3(正缬氨酸)、-CH2C(H)(CH3)2(亮氨酸)、-C(H)(CH3)CH2CH3 (异亮氨酸)、-(CH2)3CH3(正亮氨酸)、-C(CH3)3(2-叔丁基甘氨酸)、苄基(苯丙氨酸)、4-羟基苄基(酪氨酸)、-(CH2)3NH2(鸟氨酸)、-(CH2)4NH2(赖氨酸)、 -(CH2)2C(H)(OH)CH2NH2 (羟赖氨酸)、-CH2OH (丝氨酸)、-(CH2)2OH(高丝氨酸)、-C(H)(OH)CH3 (苏氨酸)、-(CH2)3N(H)C(=NH)NH2 (精氨酸)、-(CH2)3N(H)C(=O)NH2 (瓜氨酸)、-CH2C(=O)NH2 (天冬酰胺)、-CH2C(=O)OH(天冬氨酸)、-(CH2)2C(=O)OH(谷氨酸)、 -(CH2)2C(=O)NH2 (谷氨酰胺)、-CH2SH (半胱氨酸)、-(CH2)2SH(高半胱氨酸)、-(CH2)2SCH3(蛋氨酸)、-CH2SCH3(S-甲基半胱氨酸)、(1H-咪唑-4-基)甲基-(组氨酸)、(1H-吲哚-3-基)甲基-(色氨酸)、-CH2NH2(2,3-二氨基丙酸)和-(CH2)2NH2(2,4-二氨基丁酸)；
Figure DEST_PATH_IMAGE048
其中R1、R2、R3、R4、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如前述权利要求中任一项所定义，和
RA代表氢(甘氨酸)或选自以下的基团：
-CH3(丙氨酸)、-C(H)(CH3)2(缬氨酸)、-(CH2)2CH3(正缬氨酸)、-CH2C(H)(CH3)2(亮氨酸)、-C(H)(CH3)CH2CH3 (异亮氨酸)、-(CH2)3CH3(正亮氨酸)、-C(CH3)3(2-叔丁基甘氨酸)、苄基(苯丙氨酸)、4-羟基苄基(酪氨酸)、-(CH2)3NH2(鸟氨酸)、-(CH2)4NH2(赖氨酸)、 -(CH2)2C(H)(OH)CH2NH2 (羟赖氨酸)、-CH2OH (丝氨酸)、-(CH2)2OH(高丝氨酸)、-C(H)(OH)CH3 (苏氨酸)、-(CH2)3N(H)C(=NH)NH2 (精氨酸)、-(CH2)3N(H)C(=O)NH2 (瓜氨酸)、-CH2C(=O)NH2 (天冬酰胺)、-CH2C(=O)OH(天冬氨酸)、-(CH2)2C(=O)OH(谷氨酸)、 -(CH2)2C(=O)NH2 (谷氨酰胺)、-CH2SH (半胱氨酸)、-(CH2)2SH(高半胱氨酸)、-(CH2)2SCH3(蛋氨酸)、-CH2SCH3(S-甲基半胱氨酸)、(1H-咪唑-4-基)甲基-(组氨酸)、(1H-吲哚-3-基)甲基-(色氨酸)、-CH2NH2(2,3-二氨基丙酸)和-(CH2)2NH2(2,4-二氨基丁酸)；
Figure DEST_PATH_IMAGE049
其中R1、R2、R3、R4、Het 、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如前述权利要求中任一项所定义，PG1代表胺保护基，诸如例如芴基甲基氧基羰基、苄氧基羰基、烯丙氧基羰基或叔丁氧羰基，且
RA和RB彼此独立地代表氢(甘氨酸)或选自以下的基团：
-CH3(丙氨酸)、-C(H)(CH3)2(缬氨酸)、-(CH2)2CH3(正缬氨酸)、-CH2C(H)(CH3)2(亮氨酸)、-C(H)(CH3)CH2CH3 (异亮氨酸)、-(CH2)3CH3(正亮氨酸)、-C(CH3)3(2-叔丁基甘氨酸)、苄基(苯丙氨酸)、4-羟基苄基(酪氨酸)、-(CH2)3NH2(鸟氨酸)、-(CH2)4NH2(赖氨酸)、 -(CH2)2C(H)(OH)CH2NH2 (羟赖氨酸)、-CH2OH (丝氨酸)、-(CH2)2OH(高丝氨酸)、-C(H)(OH)CH3 (苏氨酸)、-(CH2)3N(H)C(=NH)NH2 (精氨酸)、-(CH2)3N(H)C(=O)NH2 (瓜氨酸)、-CH2C(=O)NH2 (天冬酰胺)、-CH2C(=O)OH(天冬氨酸)、-(CH2)2C(=O)OH(谷氨酸)、 -(CH2)2C(=O)NH2 (谷氨酰胺)、-CH2SH (半胱氨酸)、-(CH2)2SH(高半胱氨酸)、-(CH2)2SCH3(蛋氨酸)、-CH2SCH3(S-甲基半胱氨酸)、(1H-咪唑-4-基)甲基-(组氨酸)、(1H-吲哚-3-基)甲基-(色氨酸)、-CH2NH2(2,3-二氨基丙酸)和-(CH2)2NH2(2,4-二氨基丁酸)；
Figure DEST_PATH_IMAGE050
其中R1、R2、R3、R4、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如前述权利要求中任一项所定义，且
RA和RB彼此独立地代表氢(甘氨酸)或选自以下的基团：
-CH3(丙氨酸)、-C(H)(CH3)2(缬氨酸)、-(CH2)2CH3(正缬氨酸)、-CH2C(H)(CH3)2(亮氨酸)、-C(H)(CH3)CH2CH3 (异亮氨酸)、-(CH2)3CH3(正亮氨酸)、-C(CH3)3(2-叔丁基甘氨酸)、苄基(苯丙氨酸)、4-羟基苄基(酪氨酸)、-(CH2)3NH2(鸟氨酸)、-(CH2)4NH2(赖氨酸)、 -(CH2)2C(H)(OH)CH2NH2 (羟赖氨酸)、-CH2OH (丝氨酸)、-(CH2)2OH(高丝氨酸)、-C(H)(OH)CH3 (苏氨酸)、-(CH2)3N(H)C(=NH)NH2 (精氨酸)、-(CH2)3N(H)C(=O)NH2 (瓜氨酸)、-CH2C(=O)NH2 (天冬酰胺)、-CH2C(=O)OH(天冬氨酸)、-(CH2)2C(=O)OH(谷氨酸)、 -(CH2)2C(=O)NH2 (谷氨酰胺)、-CH2SH (半胱氨酸)、-(CH2)2SH(高半胱氨酸)、-(CH2)2SCH3(蛋氨酸)、-CH2SCH3(S-甲基半胱氨酸)、(1H-咪唑-4-基)甲基-(组氨酸)、(1H-吲哚-3-基)甲基-(色氨酸)、-CH2NH2(2,3-二氨基丙酸)和-(CH2)2NH2(2,4-二氨基丁酸)；
Figure DEST_PATH_IMAGE051
其中R1、R2、R3、R4、Het、t、q、m、V、W、Z和Y如前述权利要求中任一项所定义，且Q代表以下通式结构(i)至(iii)之一：
Figure DEST_PATH_IMAGE052
其中
§ 代表与哒嗪酮环的连接点；
§§ 代表与马来酰亚胺基团的连接点；
SG代表体内可裂解基团，L1和L1'彼此独立地代表如前述权利要求中任一项所定义的体内不可裂解有机基团；
Figure DEST_PATH_IMAGE053
其中R1、R2、R3、R4、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如前述权利要求中任一项所定义，且R12是C1-C10-烷基，优选C1-C5-烷基；
Figure DEST_PATH_IMAGE054
其中R1、R2、R3、R4、Het、t、q、m、V、W、Z和Y如前述权利要求中任一项所定义，且Q代表以下通式结构(i)至(iii)之一：
Figure DEST_PATH_IMAGE055
其中
§ 代表与哒嗪酮环的连接点；
§§代表与羰基的连接点；
SG代表体内可裂解基团，L1和L1'彼此独立地代表如前述权利要求中任一项所定义的体内不可裂解有机基团；以及
Figure DEST_PATH_IMAGE056
其中R1、R2、R3、R4、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如前述权利要求中任一项所定义，且其中R12是C1- C10-烷基，优选C1-C5-烷基，
或所述化合物的N-氧化物、盐、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐。
40.根据权利要求39所述的化合物，其选自：
N-{4-[6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]丁基}氨基甲酸叔丁酯，
N-{4-[1-(4-氨基丁基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基甲酸叔丁酯，
N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-(4-氨基丁基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基羰基)氨基]苯基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基]丁基}氨基甲酸叔丁酯，
N-{4-[1-(4-氨基丁基)-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基甲酸叔丁酯，
N-{4-[1-(6-氨基己基)-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-(6-氨基己基)-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[(5R)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{4-[(5R)-3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]丁基}氨基甲酸叔丁酯，
N-{4-[(5R)-1-(4-氨基丁基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{6-[(3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基甲酸叔丁酯，
N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5-(三氟甲基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-[4-(5-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-5-基}-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)苯基]-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(1H-吲唑-5-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(1H-吲唑-5-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺-盐酸盐，
N-{4-[5-(1H-吲唑-5-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-[4-(5-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-4-基}-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)苯基]-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(1H-吲唑-4-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-4-基}-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(1H-吲唑-4-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-(4-{5-[1-(4-甲基苯-1-磺酰基)-1H-吲哚-5-基]-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(1H-吲哚-5-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(1H-吲哚-5-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-5-基}-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(1H-吲唑-5-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-{1-[氧杂环己烷-2-基]-1H-吲唑-4-基}-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(1H-吲唑-4-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)哒嗪-1(6H)-基]丁基}氨基甲酸叔丁酯，
N-{4-[1-(4-氨基丁基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-(4-{5-[1-(4-甲基苯-1-磺酰基)-1H-苯并咪唑-4-基]-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(1H-苯并咪唑-4-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
[(2S)-1-({4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]丁基}氨基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基甲酸叔丁酯，
[(1S)-2-[4-[3-[4-(1,3-二氢吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基氨基)苯基]-6-氧代-5-(5-喹啉基)哒嗪-1-基]丁基氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]铵三氟乙酸盐，
N-(叔丁氧羰基)-L-缬氨酰-N-{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]丁基}-L-丙氨酰胺，
[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-[3-[4-(1,3-二氢吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基氨基)苯基]-6-氧代-5-(5-喹啉基)哒嗪-1-基]丁基氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]铵三氟乙酸盐，
[(2S)-1-({4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]丁基}氨基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基甲酸叔丁酯，
[(1S)-2-[4-[3-[4-(1,3-二氢吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基氨基)苯基]-6-氧代-5-(5-喹啉基)-4,5-二氢哒嗪-1-基]丁基氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]铵三氟乙酸盐，
N-(叔丁氧羰基)-L-缬氨酰-N-{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]丁基}-L-丙氨酰胺，
[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-[3-[4-(1,3-二氢吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基氨基)苯基]-6-氧代-5-(5-喹啉基)-4,5-二氢哒嗪-1-基]丁基氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-2-甲基丙基]铵三氟乙酸盐，
2或3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-{[2-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-4-氧代丁酸，
{(32S)-40-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]-26,33-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27,34-二氮杂四十烷-32-基}氨基甲酸 (9H-芴-9-基)甲基酯，
N-{4-[6-氧代-1-(6-{[N 6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基]氨基}己基)-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{(32S)-40-[(5S)-3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]-26,33-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27,34-二氮杂四十烷-32-基}氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯，
N-{4-[6-氧代-1-(6-{[N 6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基]氨基}己基)-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{(26S)-34-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]-20,27-二氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂-21,28-二氮杂三十四烷-26-基}氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯，
N-{4-[6-氧代-1-(6-{[N 6-(20-氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十烷-20-基)-L-赖氨酰基]氨基}己基)-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{(20S)-28-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]-14,21-二氧代-2,5,8,11-四氧杂-15,22-二氮杂二十八烷-20-基}氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯，
N-{4-[6-氧代-1-(6-{[N 6-(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)-L-赖氨酰基]氨基}己基)-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)哒嗪-1(6H)-基]己基}氨基甲酸叔丁酯，
N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺-盐酸盐
{(26S)-34-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)哒嗪-1(6H)-基]-20,27-二氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂-21,28-二氮杂三十四烷-26-基}氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯，
N-{4-[6-氧代-1-(6-{[N 6-(20-氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十烷-20-基)-L-赖氨酰基]氨基}己基)-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基甲酸叔丁酯，
N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-(6-氨基己基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺盐酸盐，
N 2-(叔丁氧羰基)-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-D-天冬酰胺叔丁酯，
N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-D-天冬酰胺，
[(2S)-1-({6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}氨基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基甲酸叔丁酯，
N-{4-[1-[6-(L-丙氨酰基氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-(叔丁氧羰基)-L-缬氨酰-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-L-丙氨酰胺，
L-缬氨酰-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-L-丙氨酰胺，
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-N-{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]丁基}-L-丙氨酰胺，
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰-N-{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]丁基}-L-丙氨酰胺，
N-{4-[1-(6-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}己基)-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-(4-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}丁基)-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-5-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-(4-{1-[6-({N 2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N 6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-[6-({N 2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N 6-(26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-[6-({N 2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N 6-(20-氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十烷-20-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-[6-({N 2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N 6-(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-5-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-L-缬氨酰-N-{4-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-5-基)哒嗪-1(6H)-基]丁基}-L-丙氨酰胺，
N-(4-{1-[6-({N 2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-N 6-(20-氧代-2,5,8,11,14,17-六氧杂二十烷-20-基)-L-赖氨酰基}氨基)己基]-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-N 2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-D-天冬酰胺，
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰-N-{6-[3-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-5,6-二氢哒嗪-1(4H)-基]己基}-L-丙氨酰胺，
或所述化合物的N-氧化物、盐、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐。
41.化合物，其选自：
Figure DEST_PATH_IMAGE057
其中R1、R2、m、q、t、V、W、Y、Z和Het如前述权利要求中任一项所定义；
Figure DEST_PATH_IMAGE058
R1、R2、R3、R4、R5b、Het 、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如前述权利要求中任一项所定义；
Figure DEST_PATH_IMAGE059
R1、R2、R3、R4、R5b、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如前述权利要求中任一项所定义；
Figure DEST_PATH_IMAGE060
其中R1、R2、R3、R4、R5b、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如前述权利要求中任一项所定义，R13代表-NHPG1，并且PG1代表胺保护基，诸如例如芴基甲基氧基羰基、苄氧基羰基或叔丁氧羰基；
Figure DEST_PATH_IMAGE061
其中R1、R2、R3、R4、R5a、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如前述权利要求中任一项所定义；
Figure DEST_PATH_IMAGE062
其中R1、R2、R3、R4、R5b、Het、t、q、m、V、W、Z和Y如本文所定义，且Q代表以下通式结构(i)至(iii)之一：
Figure DEST_PATH_IMAGE063
其中
§ 代表与环Het的连接点；
§§ 代表与马来酰亚胺基团的连接点；
SG代表体内可裂解基团，L1和L1'彼此独立地代表如前述权利要求中任一项所定义的体内不可裂解有机基团；
Figure DEST_PATH_IMAGE064
其中R1、R2、R3、R4、R5b、Het、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如前述权利要求中任一项所定义，且R12是C1- C10-烷基，优选C1-C5-烷基；
Figure DEST_PATH_IMAGE065
其中R1、R2、R3、R4、R5b、Het、t、q、m、V、W、Z和Y如前述权利要求中任一项所定义，且Q代表以下通式结构(i)至(iii)之一：
Figure DEST_PATH_IMAGE066
其中
§ 代表与环Het的连接点；
§§ 代表与羰基的连接点；
SG代表体内可裂解基团，L1和L1'彼此独立地代表如前述权利要求中任一项所定义的体内不可裂解有机基团；和
Figure DEST_PATH_IMAGE067
其中R1、R2、R3、R4、R5b、Het 、L1、t、q、m、V、W、Z和Y如前述权利要求中任一项所定义，且其中R12是C1- C10烷基，优选C1-C5烷基，
或所述化合物的N-氧化物、盐、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐。
42.根据权利要求41所述的化合物，其选自：
(6-{5-[6-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]苯基}-3-氧代-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢哒嗪-4-基]-1H-吲唑-1-基}己基)氨基甲酸叔丁酯，
N-(4-{5-[1-(6-氨基己基)-1H-吲唑-5-基]-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-(4-{5-[2-(6-氨基己基)-2H-吲唑-5-基]-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
(6-{4-[6-{4-[(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基羰基)氨基]苯基}-3-氧代-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢哒嗪-4-基]-1H-吲唑-1-基}己基)氨基甲酸叔丁酯，
N-(4-{5-[1-(6-氨基己基)-1H-吲唑-4-基]-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-(4-{5-[2-(6-氨基己基)-2H-吲唑-4-基]-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基}苯基)-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-1H-吲唑-5-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(2-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-2H-吲唑-5-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-1H-吲唑-4-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[5-(2-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-2H-吲唑-4-基)-6-氧代-1-(2,2,2-三氟乙基)-1,6-二氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
N-{4-[1-{6-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基]己基}-6-氧代-5-(喹啉-7-基)-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基]苯基}-1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-甲酰胺，
或所述化合物的N-氧化物、盐、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐。
43.根据权利要求39至42中任一项所述的化合物用于制备根据前述权利要求中任一项所述的缀合物的用途。
44.根据以下反应方案中的任一制备权利要求1至35中任一项的缀合物的方法：
Figure DEST_PATH_IMAGE068
其中AB、n、R1、R2、R3、R4、R5、L1、L1'、t、q、m、V、W、Z和Y如前述权利要求中任一项所定义，Q代表以下通式结构(i)至(iii)之一：
Figure DEST_PATH_IMAGE069
其中
§ 代表与哒嗪酮环的连接点；
§§ 代表与马来酰亚胺(式1-51的化合物)或琥珀酰亚胺(式1-69的化合物)基团的连接点、或与羰基(式1-56和1-71的化合物)的连接点；
SG代表体内可裂解基团，L1和L1'彼此独立地代表如前述权利要求中任一项所定义的体内不可裂解有机基团。
45.根据以下反应方案中的任一制备权利要求1至35中任一项的缀合物的方法：
Figure DEST_PATH_IMAGE070
Figure DEST_PATH_IMAGE071
其中AB、n、R1、R2、R3、R4、R5、L1、L1'、t、q、m、V、W、Z和Y如前述权利要求中任一项所定义，Q代表以下通式结构(i)至(iii)之一：
Figure DEST_PATH_IMAGE072
其中
§代表与Het的连接点；
§§代表与马来酰亚胺(式1-52的化合物)或琥珀酰亚胺(式1-70的化合物)基团的连接点、或与羰基(式1-57和1-72的化合物)的连接点；
SG代表体内可裂解基团，L1和L1'彼此独立地代表如前述权利要求中任一项所定义的体内不可裂解有机基团。
46.根据上述权利要求中任一项或全部所述的缀合物或化合物用于治疗或预防疾病的用途。
47.根据权利要求46所述的缀合物或化合物的用途，其中所述疾病是对细胞死亡的诱导应答的过度增殖性疾病和/或病症。
48.根据权利要求47所述的缀合物或化合物的用途，其中所述对细胞死亡的诱导应答的过度增殖性疾病和/或病症是血液肿瘤、实体瘤和/或其转移。
49.根据权利要求48所述的缀合物或化合物的用途，其中所述过度增殖性疾病和/或病症是癌症疾病。
50.根据权利要求49所述的缀合物或化合物的用途，其中所述癌症选自急性髓性白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(特别是套细胞淋巴瘤)、乳腺癌(特别是HER2阳性乳腺癌)、脑肿瘤(特别是成胶质细胞瘤)和肺癌、和/或其转移。
51.根据权利要求46至50中任一项所述的缀合物或化合物的用途，其中所述肿瘤或癌症疾病是烟酸途径有缺陷的肿瘤/癌症。
52.药物组合物，其包含根据上述权利要求中任一项或全部所述的缀合物或化合物，以及至少一种药学上可接受的载体或助剂。
53.根据权利要求52所述的组合物，其用于治疗血液肿瘤、实体瘤和/或其转移。
54.药物组合产品，其包含一种或多种第一活性成分，所述第一活性成分选自根据上述权利要求中任一项或全部所述的缀合物或化合物，和：
a)一种或多种选自化疗抗癌剂和靶特异性抗癌剂的第二活性成分；
b)放射治疗；和/或
c)引起或诱导DNA损伤的方法或药剂。
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