KR20240067085A - 항체 약물 접합체에 사용하기 위한 링커 - Google Patents

항체 약물 접합체에 사용하기 위한 링커 Download PDF

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KR20240067085A
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네이선 피쉬킨
천 바이
쿨루드 타크루리
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오름테라퓨틱 주식회사
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Abstract

본 개시내용은 단백질-단백질 상호작용 유도제를 세포 결합제에 연결할 수 있는, 흔적이 없는 링커를 제공한다. 또한 연결된 화합물을 포함하는 조성물이 제공된다. 화합물 및 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체의 암과 같은 질병을 치료하는 데 유용하다.

Description

항체 약물 접합체에 사용하기 위한 링커
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 9월 8일자로 출원된 미국 가출원 제63/241,914호; 2021년 12월 23일자로 출원된 미국 가출원 제63/293,591호; 2022년 6월 13일자로 출원된 미국 가출원 제63/351,639호; 및 2022년 9월 1일자로 출원된 미국 가출원 제63/374,282호의 우선권 이익을 주장하며, 이들의 전체 내용은 참고로 본원에 포함된다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원과 함께 제출된 전자적으로 제출된 서열 목록(이름 4547_020PC03_Seqlisting_ST26; 크기: 52,902 바이트; 및 작성일: 2022년 9월 6일)의 내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 단백질-단백질 상호작용 유도제를 세포 결합제에 연결할 수 있는 흔적이 없는 링커를 제공한다. 연결된 화합물을 포함하는 조성물도 제공된다. 화합물 및 조성물은 이를 필요로 하는 대상체의 질병을 치료하는 데 유용하다.
단백질-단백질 상호작용(PPI)은 세포 내부 및 외부 모두에서의 대규모 치료 표적 부류를 나타낸다. PPI는 모든 생물학적 과정의 핵심이며 질병에서 종종 조절 장애가 발생한다. 인간 생물학에서 PPI의 중요성에도 불구하고, 이 표적 부류는 치료제로 전환하는 데 극히 어려움이 있었다. 따라서 PPI를 효과적으로 유도하고 암과 같은 질병을 치료할 수 있는 새로운 화합물에 대한 지속적인 요구가 있다.
현재 약물 단백질에 대해 표적화하고 어렵게 분해하는 데 사용될 수 있는 분자의 부류로서, 표적화된 단백질 분해제가 연구되고 있다. 가장 잘 알려진 표적화된 단백질 분해제는 단백질분해 표적화 키메라(PROTAC) 기반의 단백질 분해를 활용하며, 효소 활성을 나타내지 않고 고전적인 저해에 순응할 수 없는 '약물로 치료할 수 없는' 단백질을 표적화하는 데 상당한 가망성을 지닌 신흥 분야이다. PROTAC은 표적 단백질 및 E3 리가제에 동시에 결합하여 표적의 유비퀴틴화 및 후속 분해를 야기하는 이종이작용기성 소분자이다. 분자 아교(glue)는 E3 리가제에 결합하여 리가제 표면의 모양을 변경하고 리가제가 표적 단백질에 결합할 수 있도록 하여 표적의 유비퀴틴화 및 분해를 야기한다는 점에서 PROTAC과 상이한 또 다른 유형의 표적화된 단백질 분해제이다. 표적화된 단백질 분해제는 효소 또는 신호전달 활성과 무관한 방식으로 단백질을 조정하는 흥미로운 기회를 제공하지만, 상이한 유형의 세포를 구별하는 화합물을 준비하는 것은 어려울 수 있다.
항체 약물 접합체는 단클론 항체의 독특하고 높은 특이성을 종종 전신 투여에 부적합한 소분자 약물의 강력한 활성과 조합한 혁신적인 치료 적용예이다. 두 작용제는 전형적으로 표적 부위에서 절단되는 링커를 통해 묶여 있다.
항체 약물 접합체에 흔적이 없는 링커의 사용은 링커 부착의 증거 없이 치료용 페이로드의 방출을 허용한다. 이상적으로, 링커는 접합된 분자가 조기 절단 없이 목적지에 국재화하기에 충분한 안정성을 보유해야 한다. 링커는 또한 빠르게 절단되어 표적 세포에 내재화되는 즉시 페이로드를 방출하는 능력을 보유해야 한다. 흔적이 없는 링커의 알려진 예는 활성화를 위해 UV 광을 필요로 하거나, 몇 분 내지 몇 시간의 안정성 반감기를 갖거나 활성화 시 덜 활성인 부산물의 혼합물을 제공하는 화학적 트리거를 사용한다.
진행 중인 작업에도 불구하고, 단백질 분해를 유도하는 것을 포함하여 바람직한 단백질-단백질 상호작용을 유도할 수 있는 화합물을 사용하여 이전에 '약물로 치료할 수 없는' 것으로 간주되었던 단백질뿐만 아니라 질병에 걸린 조직 및 세포를 선택적으로 표적화하는 필요성은 여전히 지속되고 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학식 (XX)의 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
여기서:
a는 1 내지 10이고;
n은 0 또는 1이고;
R1은 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물이고;
R2는 수소, -(CH2CH2O)v-CH3, C2-C6알케닐, C1-C6알킬; C2-C6알키닐, 벤질, C3-C6사이클로알킬, 및 C3-C6사이클로알킬(C1-C3알킬)로부터 선택되고, 여기서 v는 1 내지 24이고;
각각의 Y는 독립적으로 S 또는 O이고;
L은 절단 가능한 링커이고;
Bm은 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 모이어티이다. 일부 측면에서, 단백질은 세포 표면에 있는 것이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학식 (XXXII)의 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
여기서:
a는 1 내지 10이고;
A'는 또는 이고, 여기서,
n은 0 또는 1이고;
각각의 Y는 독립적으로 S 또는 O이고;
은 R1에 대한 부착 지점을 나타내며;
는 메틸렌 기에 대한 부착 지점을 나타내고;
R1은 A'와 함께 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물이고;
R2는 수소, R1-A'에 안정성을 제공하는 기, R1-A'에 용해성을 제공하는 기, 및 R1-A'에 안정성 및 용해성을 제공하는 기로부터 선택되며;
L은 절단 가능한 링커이고;
Bm은 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 모이어티이다. 일부 측면에서, 단백질은 세포 표면에 있는 것이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 결합 모이어티가 항체, 항체 단편 또는 항원 결합 단편인, 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 a가 2 내지 8인 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 링커가 프로테아제에 의해 절단 가능한 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, 여기서 L은 하기 식으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
여기서:
q는 2 내지 10이고;
Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5는 각각 독립적으로 부재하거나 L- 또는 D-배열의 자연 발생 아미노산 잔기이고, 단, Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5 중 적어도 2개는 아미노산 잔기이며;
는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이고;
는 결합 모이어티에 대한 부착 지점이다.
일부 측면에서, Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5는 독립적으로 부재하거나, L-발린, D-발린, L-시트룰린, D-시트룰린, L-알라닌, D-알라닌, L-글루타민, D-글루타민, L-글루탐산, D-글루탐산, L-아스파르트산, D-아스파르트산, L-아스파라긴, D-아스파라긴, L-페닐알라닌, D-페닐알라닌, L-라이신, D-라이신 및 글리신으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 단, Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5 중 적어도 2개는 아미노산 잔기이다.
일부 측면에서:
Z1은 부재하거나 글리신이고;
Z2는 부재하거나, L-글루타민, D-글루타민, L-글루탐산, D-글루탐산, L-아스파르트산, D-아스파르트산, L-알라닌, D-알라닌 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Z3은 L-발린, D-발린, L-알라닌, D-알라닌, L-페닐알라닌, D-페닐알라닌 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Z4는 L-시트룰린, D-시트룰린, L-아스파라긴, D-아스파라긴, L-리신, D-리신, L-페닐알라민, D-페닐알라닌 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Z5는 부재하거나 글리신이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, 여기서 L은 다음 식이다:
.
일부 측면에서, q는 4이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 L이 생체환원성 링커인 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
일부 측면에서, L은 다음 식으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
여기서:
q는 2 내지 10이고;
R, R', R'' 및 R'''는 각각 독립적으로 수소, C1-C6알콕시C1-C6알킬, (C1-C6)2NC1-C6알킬 및 C1-C6알킬로부터 선택되거나, 2개의 같은 자리 R 기는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 사이클로부틸 또는 사이클로프로필 고리를 형성할 수 있으며;
는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이고;
는 결합 모이어티에 대한 부착 지점이다.
일부 측면에서, L은 이다.
일부 측면에서, q는 2이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, 여기서 L은 클릭-방출(click-to-release) 링커이다.
일부 측면에서, L은 이고;
여기서:
q는 2 내지 10이고;
는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이며;
는 결합 모이어티에 대한 부착 지점이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 L이 베타-글루쿠로니다제 절단성 링커인 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
일부 측면에서, L은 이고;
여기서:
q는 2 내지 10이고;
----는 부재하거나 결합이며;
는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이고;
는 결합 모이어티에 대한 부착 지점이다.
특정 측면에서, L은 Bm 내 시스테인, 라이신, 티로신 또는 글루타민에 부착된다. 특정 측면에서, 시스테인 또는 라이신은 조작된 시스테인 또는 라이신이다. 일부 측면에서, 시스테인 또는 라이신은 Bm에 내인성이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, 여기서 Bm은 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 특정 측면에서, L은 EU 넘버링에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 중쇄 위치 S239 및/또는 K334에서 조작된 시스테인에 부착된다. 일부 측면에서, L은 EU 넘버링에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 중쇄 위치 295에서 글루타민에 부착된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, 여기서 Bm이 결합하는 단백질은 표면 항원이고, 선택적으로 표면 항원에 대한 Bm의 결합은 세포 내로 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 내재화를 초래한다.
일부 측면에서, 표면 항원은 5T4, ACE, ADRB3, AKAP-4, ALK, AOC3, APP, Axin1, AXL, B7H3, B7-H4, BCL2, BCMA, bcr-abl, BORIS, BST2, C242, C4.4a, CA 125, CA6, CA9, CAIX, CCL11, CCR5, CD123, CD133, CD138, CD142, CD15, CD15-3, CD171, CD179a, CD18, CD19, CD19-9, CD2, CD20, CD22, CD23, CD24, CD25, CD27L, CD28, CD3, CD30, CD31, CD300LF, CD33, CD352, CD37, CD38, CD4, CD40, CD41, CD44, CD44v6, CD5, CD51, CD52, CD54, CD56, CD62E, CD62P, CD62L, CD70, CD71, CD72, CD74, CD79a, CD79b, CD80, CD90, CD97, CD125, CD138, CD141, CD147, CD152, CD154, CD326, CEA, CEACAM5, CFTR, 응집 인자, cKit, Claudin 3, Claudin 18.2, CLDN6, CLEC12A, CLL-1, cll3, c-MET, Crypto 1 성장 인자, CS1, CTLA-4, CXCR2, CXORF61, Cyclin Bl, CYP1B1, Cadherin-3, Cadherin-6, DLL3, E7, EDNRB, EFNA4, EGFR, EGFRvIII, ELF2M, EMR2, ENPP3, EPCAM, EphA2, Ephrin A4, Ephrin B2, EPHB4, ERBB2 (Her2/neu), ErbB3, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), ETBR, ETV6-AML, FAP, FCAR, FCRL5, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FLT3, 엽산 수용체 알파, 엽산 수용체 베타, FOLR1, Fos-관련 항원 1, 푸코실 GM1, GCC, GD2, GD3, GloboH, GM3, GPC1, GPC2, GPC3, gplOO, GPNMB, GPR20, GPRC5D, GUCY2C, HAVCR1, HER2, HER3, HGF, HMI.24, HMWMAA, HPV E6, hTERT, 인간 텔로머라제 역전사효소, ICAM, ICOS-L, IFN-α, IFN-γ, IGF-I 수용체, IGLL1, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-13Ra2, IL-l lRa, IL-1 수용체, IL-12 수용체, IL-23 수용체, IL-13 수용체, IL-22 수용체, IL-4 수용체, IL-5 수용체, IL-6 수용체, 인터페론 수용체, 인테그린(α4, αvβ3, αvβ5, αvβ6, α1β4, α4β1, α4β7, α5β1, α6β4, αIIbβ3 인터진 포함), 인테그린 알파V, 장 카르복실 에스테라제, KIT, LAGE-la, LAIR1, LAMP-1, LCK, 레구메인, 루이스Y, LFA-1(CD11a), L-셀렉틴(CD62L), LILRA2, LIV-1, LMP2, LRRC15, LY6E, LY6K, LY75, MAD-CT-1, MAD-CT-2, MAGE Al, 멜란A/MARTl, 메소텔린, ML-IAP, MSLN, 뮤신, MUC1, MUC16, mut hsp70-2, MYCN, 미오스타틴, NA17, NaPi2b, NCA-90, NCAM, 넥틴-4, NGF, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, NY-BR-1, NY-ESO-1, o-아세틸-GD2, OR51E2, OY-TES1, p53, p53 돌연변이체, PANX3, PAP, PAX3, PAX5, p-CAD, PCTA-1/갈렉틴 8, PD-L1, PD-L2, PDGFR, PDGFR-베타, 포스파티딜세린, PIK3CA, PLAC1, 폴리시알산, 프로스타제, 전립선 암종 세포, 프로스테인, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 광견병, 서바이빈 및 텔로머라제, PD-1, PRSS21, PSCA, PSMA, PTK7, RAGE-1, RANKL, Ras 돌연변이체, 호흡기 세포융합 바이러스, 적모원숭이 인자, RhoC, RON, ROR1, ROR2, RU1, RU2, 육종 전좌 중단점, SART3, SLAMF7, SLC44A4, sLe, SLITRK6, 정자 단백질 17, 스핑고신-1-포스페이트, SSEA-4, SSX2, STEAP1, TAG72, TARP, TCRβ, TEM1/CD248, TEM7R, 테나신 C, TF, TGF-1, TGF-β2, TNF-α, TGS5, Tie 2, TIM-1, Tn Ag, TRAC, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TROP-2, TRP-2, TRPV1, TSHR, 종양 항원 CTAA16.88, 티로시나제, UPK2, VEGF, VEGFR1, VEGFR2, 비멘틴, WTl, XAGE1, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 표면 항원은 HER2, CD20, CD38, CD33, BCMA, CD138, EGFR, FGFR4, GD2, PDGFR, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 표면 항원은 CD79b를 포함한다. 일부 측면에서, 표면 항원은 PSMA를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 Bm이 핵 호르몬 수용체에 결합하는 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다. 일부 측면에서, 핵 호르몬 수용체는 안드로겐 수용체(AR) 또는 에스트로겐 수용체(ER)이다.
일부 측면에서, 항체는 리툭시맙, 트라스투주맙, 젬투주맙, 퍼투주맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 다라투무맙, STI-6129, 린투주맙, huMy9-6, 발란타마브, 인다툭시맙, 세툭시맙, 디누툭시맙, 항-CD38 A2 항체, huAT15/3 항체, 알렘투주맙, 이브리투모맙, 토시투모맙, 베바시주맙, 파니투무맙, 트레멜리무맙, 티실리무맙, 카투막소맙, 오레고보맙 및 벨투주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 항체는 리툭시맙, 트라스투주맙, 퍼투주맙, huMy9-6, 린투주맙 또는 젬투주맙이다. 일부 측면에서, 항체는 폴라투주맙, J591 또는 벨란타맙이다. 일부 측면에서, 항체는 CD33-D이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 R2가 접합체에 안정성을 제공하는 기인 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다. 일부 측면에서, R2는 C2-C6알케닐, C1-C6알킬; C2-C6알키닐, 벤질, C3-C6사이클로알킬 및 C3-C6사이클로알킬(C1-C3알킬)로부터 선택된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 R2가 수소 또는 C1-C6알킬인 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다. 일부 측면에서, R2는 메틸이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 R2가 메틸인 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 R2가 접합체에 용해성을 제공하는 기인 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다. 일부 측면에서, R2는 다음 중에서 선택된다:
여기서:
각 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
각 y는 독립적으로 1 또는 2이고;
각 R은 독립적으로 수소, C6H11O5, C12H21O10, C18H31O15, 또는 C24H41O20이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 각 Y가 O인 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 R1이 PPI 조절제인 화학식 (XX)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 R1-A'가 PPI 조절제인 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 R1이 표적화된 단백질 분해제인 화학식 (XX)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 R1-A'가 표적화된 단백질 분해제인 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다. 일부 측면에서, 표적화된 단백질 분해제는 치환된 아이소인돌린이다. 일부 측면에서, 표적화된 단백질 분해제는 5'-치환된 아이소인돌린이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, 여기서 R1은 하기 화학식을 갖는다:
여기서:
은 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점을 나타내고;
A는 페닐 또는 C4-C10사이클로알킬 고리이며;
R10은 수소 및 할로로부터 독립적으로 선택되고;
U는 NH 및 CF2로부터 선택되고;
R20은 -CH3, -C(O)R3, -N(R4)2, -(CH2)nOH, -(CH2)nN(R4)2, -(CH2)nQ'(CH2)mOH, -(CH2)nQ'(CH2)mSH, 및 -(CH2)nQ'(CH2)mN(R4)2로부터 선택되며; 여기서
R3은 수소 또는 C1-C6알킬이고;
각각의 R4는 독립적으로 수소 또는 C1-C6알킬이고;
Q'는 O, S 또는 NR4이고;
n은 1-6이고;
m은 2-5이다.
일부 측면에서:
A는 페닐이고;
U는 NH이고;
R10은 할로이고;
R20은 메틸이다.
일부 측면에서:
A는 페닐이고;
U는 NH이고;
R10은 할로이고;
R20은 -(CH2)2O(CH2)2NHCH3이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 R1이 단백질분해 표적화 키메라(PROTAC)인 화학식 (XX)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 R1-A'가 단백질분해 표적화 키메라(PROTAC)인 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, 여기서 R1은 하기 화학식을 갖는다:
POI-L100-CBN;
여기서:
POI는 관심 단백질에 결합하는 화합물이고;
L100은 PROTAC 링커이고;
CBN은 세레블론 결합 모이어티이다.
일부 측면에서, 관심 단백질은 핵 호르몬 수용체, 해독 종결 인자, 전사 인자, 사이클린-의존성 키나제, 티로신 키나제, 세린/트레오닌 키나제 또는 E3 리가제이다. 일부 측면에서, 관심 단백질은 CD33, GSPT1, BRD4, AR, ER, IKZF1/3, CK1a, BCL-XL, IKZF2, IRAK4, BTK, STAT3, BTK 및 iMiD, BRD9, TRK, MDM2, CDK2/CDK9, CD97b 및 EGFR로부터 선택된다.
일부 측면에서, L100은 글리콜, 알킬, 알키닐, 트리아졸릴, 피페라지닐, 피페리디닐 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 작용기를 포함한다.
일부 측면에서, CBN은 다음으로부터 선택된다:
여기서:
는 A'에 대한 부착 지점을 나타내고;
는 L100에 대한 부착 지점을 나타낸다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, 여기서 R1은 다음으로부터 선택된다:
여기서, 는 A'에 대한 부착 지점을 나타낸다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학식 (XXI)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
여기서:
a는 1 내지 10이고;
Bm은 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 모이어티이다. 일부 측면에서, 단백질은 세포 표면에 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 a가 2 내지 8인 화학식 (XXI)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 Bm이 항체 또는 이의 항원 결합 부분인 화학식 (XXI)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 결합 모이어티가 특이적으로 결합하는 단백질이 표면 항원인 화학식 (XXI)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XXI)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, 여기서 표면 항원은 5T4, ACE, ADRB3, AKAP-4, ALK, AOC3, APP, Axin1, AXL, B7H3, B7-H4, BCL2, BCMA, bcr-abl, BORIS, BST2, C242, C4.4a, CA 125, CA6, CA9, CAIX, CCL11, CCR5, CD123, CD133, CD138, CD142, CD15, CD15-3, CD171, CD179a, CD18, CD19, CD19-9, CD2, CD20, CD22, CD23, CD24, CD25, CD27L, CD28, CD3, CD30, CD31, CD300LF, CD33, CD352, CD37, CD38, CD4, CD40, CD41, CD44, CD44v6, CD5, CD51, CD52, CD54, CD56, CD62E, CD62P, CD62L, CD70, CD71, CD72, CD74, CD79a, CD79b, CD80, CD90, CD97, CD125, CD138, CD141, CD147, CD152, CD154, CD326, CEA, CEACAM5, CFTR, 응집 인자, cKit, Claudin 3, Claudin 18.2, CLDN6, CLEC12A, CLL-1, cll3, c-MET, Crypto 1 성장 인자, CS1, CTLA-4, CXCR2, CXORF61, Cyclin Bl, CYP1B1, Cadherin-3, Cadherin-6, DLL3, E7, EDNRB, EFNA4, EGFR, EGFRvIII, ELF2M, EMR2, ENPP3, EPCAM, EphA2, Ephrin A4, Ephrin B2, EPHB4, ERBB2 (Her2/neu), ErbB3, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), ETBR, ETV6-AML, FAP, FCAR, FCRL5, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FLT3, 엽산 수용체 알파, 엽산 수용체 베타, FOLR1, Fos-관련 항원 1, 푸코실 GM1, GCC, GD2, GD3, GloboH, GM3, GPC1, GPC2, GPC3, gplOO, GPNMB, GPR20, GPRC5D, GUCY2C, HAVCR1, HER2, HER3, HGF, HMI.24, HMWMAA, HPV E6, hTERT, 인간 텔로머라제 역전사효소, ICAM, ICOS-L, IFN-α, IFN-γ, IGF-I 수용체, IGLL1, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-13Ra2, IL-l lRa, IL-1 수용체, IL-12 수용체, IL-23 수용체, IL-13 수용체, IL-22 수용체, IL-4 수용체, IL-5 수용체, IL-6 수용체, 인터페론 수용체, 인테그린(α4, αvβ3, αvβ5, αvβ6, α1β4, α4β1, α4β7, α5β1, α6β4, αIIbβ3 인터진 포함), 인테그린 알파V, 장 카르복실 에스테라제, KIT, LAGE-la, LAIR1, LAMP-1, LCK, 레구메인, 루이스Y, LFA-1(CD11a), L-셀렉틴(CD62L), LILRA2, LIV-1, LMP2, LRRC15, LY6E, LY6K, LY75, MAD-CT-1, MAD-CT-2, MAGE Al, 멜란A/MARTl, 메소텔린, ML-IAP, MSLN, 뮤신, MUC1, MUC16, mut hsp70-2, MYCN, 미오스타틴, NA17, NaPi2b, NCA-90, NCAM, 넥틴-4, NGF, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, NY-BR-1, NY-ESO-1, o-아세틸-GD2, OR51E2, OY-TES1, p53, p53 돌연변이체, PANX3, PAP, PAX3, PAX5, p-CAD, PCTA-1/갈렉틴 8, PD-L1, PD-L2, PDGFR, PDGFR-베타, 포스파티딜세린, PIK3CA, PLAC1, 폴리시알산, 프로스타제, 전립선 암종 세포, 프로스테인, 슈도모나스 아에루기노사, 광견병, 서바이빈 및 텔로머라제, PD-1, PRSS21, PSCA, PSMA, PTK7, RAGE-1, RANKL, Ras 돌연변이체, 호흡기 세포융합 바이러스, 적모원숭이 인자, RhoC, RON, ROR1, ROR2, RU1, RU2, 육종 전좌 중단점, SART3, SLAMF7, SLC44A4, sLe, SLITRK6, 정자 단백질 17, 스핑고신-1-포스페이트, SSEA-4, SSX2, STEAP1, TAG72, TARP, TCRβ, TEM1/CD248, TEM7R, 테나신 C, TF, TGF-1, TGF-β2, TNF-α, TGS5, Tie 2, TIM-1, Tn Ag, TRAC, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TROP-2, TRP-2, TRPV1, TSHR, 종양 항원 CTAA16.88, 티로시나제, UPK2, VEGF, VEGFR1, VEGFR2, 비멘틴, WTl, XAGE1, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 표면 항원은 HER2, CD20, CD38, CD33, BCMA, CD138, EGFR, FGFR, GD2, PDGFR, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 표면 항원은 CD79b를 포함한다. 일부 측면에서, 표면 항원은 PSMA를 포함한다.
일부 측면에서, 항체는 리툭시맙, 트라스투주맙, 젬투주맙, 퍼투주맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 다라투무맙, STI-6129, 린투주맙, huMy9-6, 벨란타맙, 인다툭시맙, 세툭시맙, 디누툭시맙, 항-CD38 A2 항체, huAT15/3 항체, 알렘투주맙, 이브리투모맙, 토시투모맙, 베바시주맙, 파니투무맙, 트레멜리무맙, 티실리무맙, 카투막소맙, 오레고보맙 또는 벨투주맙을 포함한다. 일부 측면에서, 항체는 로보투주맙을 포함한다. 일부 측면에서, 항체는 사시투주맙을 포함한다.
일부 측면에서, 항체는 리툭시맙, 트라스투주맙, 퍼투주맙, huMy9-6, 린투주맙 또는 젬투주맙이다. 일부 측면에서, 항체는 폴라투주맙, J591 또는 벨란타맙이다. 일부 측면에서, 항체는 CD33-D이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, 여기서 (a) Bm이 결합하는 단백질은 CD33이고 R1은 마우스 이중 극미 2 동족체(MDM2)에 결합하거나, (b) Bm이 결합하는 단백질은 전립선 특이 막 항원(PSMA)이고 R1은 안드로겐 수용체(AR)에 결합하거나, (c) Bm이 결합하는 단백질은 CD33이고 R1은 브로모도메인 함유 단백질 4(BRD4)에 결합하거나, (d) Bm이 결합하는 단백질은 HER2이고 R1은 G1에서 S 단계 전이 1(GSPT1)에 결합하거나, 또는 (e) Bm이 결합하는 단백질은 CD33이고 R1은 GSPT1에 결합한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 Bm이 결합하는 단백질이 CD79b이고 R1이 IRAK4에 결합하는 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 Bm이 결합하는 단백질이 HER2이고 R1이 BRD4에 결합하는 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 Bm이 결합하는 단백질이 BCMA이고 R1이 BRD4에 결합하는 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 Bm이 결합하는 단백질이 HER2이고 R1이 ER에 결합하는 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 치료가 필요한 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체에게 본원에 기술된 접합체 또는 조성물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 약제학적으로 허용되는 양을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 암은 고형 종양이다. 일부 측면에서, 암은 혈액학적 종양이다. 일부 측면에서, 암은 유방암, 위암, 림프종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 두경부암, 편평 세포 암종 및/또는 간세포 암종이다. 일부 측면에서, 암은 전립선암, 유방암, 위암, 비소세포폐암, 담관암, 결장암, 난소암, 폐암, 또는 뉴레굴린-1(NRG1)-양성 암이다. 일부 측면에서, 암은 비호지킨 림프종(NHL)이다. 일부 측면에서, 암은 B세포 비호지킨 림프종이다. 일부 측면에서, 암은 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)이다. 일부 측면에서, 방법은 본원에 기재된 접합체 또는 조성물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 투여 전, 후 또는 동시에 대상체에게 약제학적으로 허용되는 양의 추가 작용제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 추가 작용제는 세포독성제 또는 면역 반응 조절제이다. 일부 측면에서, 면역 반응 조절제는 관문 저해제이다. 일부 측면에서, 관문 저해제는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, CTLA-4 저해제, TIM3 저해제 및/또는 LAG-3 저해제를 포함한다.
방법의 일부 측면에서, (a) Bm이 결합하는 단백질은 CD33이고, R1은 MDM2 또는 G1에서 S 단계 전이 1(GSPT1)에 결합하고, 암은 급성 골수성 백혈병이거나, (b) Bm이 결합하는 단백질은 전립선 특이 막 항원(PSMA)이고, R1은 안드로겐 수용체(AR)에 결합하며, 암은 전립선암이거나, (c) Bm이 결합하는 단백질은 CD33이고, R1은 브로모도메인 함유 단백질 4(BRD4)에 결합하고, 암은 급성 골수성 백혈병이거나, 또는 (d) Bm이 결합하는 단백질은 HER2이고, R1은 G1에서 S 단계 전이 1(GSPT1)에 결합하고, 암은 유방암, 위암, 비소세포폐암, 담관암, 결장암, 난소암, 또는 뉴레굴린-1(NRG1) 양성 암이다. 방법의 일부 측면에서, Bm이 결합하는 단백질은 CD79b이고, R1은 IRAK4에 결합하며, 암은 비호지킨 림프종(NHL), 예를 들어 B 세포 비호지킨 림프종 또는 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)이다. 일부 측면에서, Bm이 결합하는 단백질은 HER2이고, R1은 BRD4에 결합하며, 암은 유방암, 위암, 비소세포폐암, 담관암, 결장암, 난소암 또는 뉴레굴린-1(NRG1) 양성 암이다. 일부 측면에서, Bm이 결합하는 단백질은 BCMA이고, R1이 BRD4에 결합하며, 암은 다발성 골수종이다.
방법의 일부 측면에서, 방법은 본원에 기술된 접합체 또는 조성물의 투여 전, 후 또는 동시에 추가 작용제의 약제학적으로 허용되는 양을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 추가 작용제는 세포독성제 또는 면역 반응 조절제이다. 일부 측면에서, 면역 반응 조절제는 관문 저해제이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학식 (XXII)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
여기서:
n은 0 또는 1이고;
R1은 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물이고;
R2는 수소, -(CH2CH2O)v-CH3, C2-C6알케닐, C1-C6알킬; C2-C6알키닐, 벤질, C3-C6사이클로알킬, 및 C3-C6사이클로알킬(C1-C3알킬)로부터 선택되고, 여기서 v는 1 내지 24이고;
각각의 Y는 독립적으로 S 또는 O이고;
L*은 결합 모이어티에 접합하는 절단 가능한 링커 전구체이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학식 (XXXI)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
여기서:
A'는 또는 이고, 여기서,
n은 0 또는 1이고;
각각의 Y는 독립적으로 S 또는 O이고;
은 A'에 대한 부착 지점을 나타내며;
는 메틸렌 기에 대한 부착 지점을 나타내고;
R1은 A'와 함께 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물이고;
R2는 수소, R1-A'에 안정성을 제공하는 기, R1-A'에 용해성을 제공하는 기, 및 R1-A'에 안정성 및 용해성을 제공하는 기로부터 선택되며;
L은 결합 모이어티에 접합하는 절단 가능한 링커 전구체이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 L*가 프로테아제 절단 가능한 링커 전구체인, 화학식 (XXII) 또는 화학식 (XXXI)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XXII) 또는 화학식 (XXXI)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, 여기서 L*은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
여기서:
q는 2 내지 10이고;
Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5는 각각 독립적으로 부재하거나 L- 또는 D-배열의 자연 발생 아미노산 잔기이고, 단, Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5 중 적어도 2개는 아미노산 잔기이며;
는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이다.
일부 측면에서, Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5는 독립적으로 부재하거나, L-발린, D-발린, L-시트룰린, D-시트룰린, L-알라닌, D-알라닌, L-글루타민, D-글루타민, L-글루탐산, D-글루탐산, L-아스파르트산, D-아스파르트산, L-아스파라긴, D-아스파라긴, L-페닐알라닌, D-페닐알라닌, L-라이신, D-라이신 및 글리신으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 단, Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5 중 적어도 2개는 아미노산 잔기이다.
일부 측면에서:
Z1은 부재하거나 글리신이고;
Z2는 부재하거나, L-글루타민, D-글루타민, L-글루탐산, D-글루탐산, L-아스파르트산, D-아스파르트산, L-알라닌, D-알라닌 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Z3은 L-발린, D-발린, L-알라닌, D-알라닌, L-페닐알라닌, D-페닐알라닌 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Z4는 L-시트룰린, D-시트룰린, L-아스파라긴, D-아스파라긴, L-리신, D-리신, L-페닐알라민, D-페닐알라닌 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Z5는 부재하거나 글리신이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XXII) 또는 화학식 (XXXI)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, 여기서 L*은 하기 식이다;
여기서, 는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이다.
일부 측면에서, q는 4이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 L*이 생체환원성 링커 전구체인 화학식 (XXII) 또는 화학식 (XXXI)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 L*이 다음 식으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화학식 (XXII) 또는 화학식 (XXXI)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
여기서,
q는 2 내지 10이고;
R, R', R'' 및 R'''는 각각 독립적으로 수소, C1-C6알콕시C1-C6알킬, (C1-C6)2NC1-C6알킬 및 C1-C6알킬로부터 선택되거나, 2개의 같은 자리 R 기는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 사이클로부틸 또는 사이클로프로필 고리를 형성할 수 있으며;
는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 L*이 하기 식인, 화학식 (XXII) 또는 화학식 (XXXI)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
일부 측면에서, q는 2이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XXII) 또는 화학식 (XXXI)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, 여기서 L*은 클릭-방출 링커 전구체이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 L*이 하기 식인, 화학식 (XXII) 또는 화학식 (XXXI)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
여기서:
q는 2 내지 10이고;
는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 L*이 베타-글루쿠로니다제 절단 가능한 링커 전구체인, 화학식 (XXII) 또는 화학식 (XXXI)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 L*이 하기 식인, 화학식 (XXII) 또는 화학식 (XXXI)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
여기서:
q는 2 내지 10이고;
----는 부재하거나 결합이며;
는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XXXI)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, 여기서 R2는 R1-A'에 안정성을 제공하는 기이다. 일부 측면에서, R2는 C2-C6알케닐, C1-C6알킬; C2-C6알키닐, 벤질, C3-C6사이클로알킬 및 C3-C6사이클로알킬(C1-C3알킬)로부터 선택된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XXII) 또는 화학식 (XXXI)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, R2는 수소 또는 C1-C6알킬이다. 일부 측면에서, R2는 메틸이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 R2가 R1-A'에 용해성을 제공하는 기인 화학식 (XXXI)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
일부 측면에서, R2는 다음으로부터 선택된다:
여기서:
각 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
각 y는 독립적으로 1 또는 2이고;
각 R은 독립적으로 수소, C6H11O5, C12H21O10, C18H31O15, 또는 C24H41O20임.
일부 측면에서, 본 개시내용은 각 Y가 O인, 화학식 (XXII) 또는 화학식 (XXXI)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 R1-A'가 PPI 조절제인, 화학식 (XXXI)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XXII)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, R1은 표적화된 단백질 분해제이다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XXXI)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, R1-A'는 표적화된 단백질 분해제이다. 일부 측면에서, 표적화된 단백질 분해제는 치환된 아이소인돌린이다. 일부 측면에서, 표적화된 단백질 분해제는 5'-치환된 아이소인돌린이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XXII) 또는 (XXXI)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, 여기서 R1은 화학식 (XXX)의 화합물이다:
여기서:
는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점을 나타내고;
A는 페닐 또는 C4-C10사이클로알킬 고리이고;
R10은 수소 및 할로로부터 독립적으로 선택되고;
U는 NH 및 CF2로부터 선택되고;
R20은 -CH3, -C(O)R3, -N(R4)2, -(CH2)nOH, -(CH2)nN(R4)2, -(CH2)nQ'(CH2)mOH, -(CH2)nQ'(CH2)mSH 및 -(CH2)nQ'(CH2)mN(R4)2로부터 선택되고; 여기서
R3은 수소 또는 C1-C6알킬이고;
각 R4는 독립적으로 수소 또는 C1-C6알킬이고;
Q'는 O, S 또는 NR4이고;
n은 1-6이고;
m은 2-5이다.
일부 측면에서,
A는 페닐이고;
U는 NH이고;
R10은 할로이고;
R20은 메틸이다.
일부 측면에서,
A는 페닐이고;
U는 NH이고;
R10은 할로이고;
R20은 -(CH2)2O(CH2)2NHCH3이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XXII)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, R1은 단백질분해 표적화 키메라(PROTAC)이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XXII)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, R1-A'는 단백질분해 표적화 키메라(PROTAC)이다.
일부 측면에서, R1은 하기 화학식을 갖는다:
POI-L100-CBN;
여기서:
POI는 관심 단백질에 결합하는 화합물이고;
L100은 PROTAC 링커이며;
CBN은 세레블론 결합 모이어티이다.
일부 측면에서, 관심 단백질은 핵 호르몬 수용체, 해독 종결 인자, 전사 인자, 사이클린-의존성 키나제, 티로신 키나제, 세린/트레오닌 키나제 또는 E3 리가제이다. 일부 측면에서, 관심 단백질은 CD33, GSPT1, BRD4, AR, ER, IKZF1/3, CK1a, BCL-XL, IKZF2, IRAK4, BTK, STAT3, BTK 및 iMiD, BRD9, TRK, MDM2, CDK2/CDK9, CD97b 및 EGFR로부터 선택된다.
일부 측면에서, L100은 글리콜, 알킬, 알키닐, 트리아졸릴, 피페라지닐, 피페리디닐 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 작용기를 포함한다.
일부 측면에서, CBN은 다음으로부터 선택된다;
여기서:
은 A'에 대한 부착 지점을 나타내고;
은 L100에 대한 부착 지점을 나타낸다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XXII) 또는 화학식 (XXXI)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, R1은 다음 식으로부터 선택되고:
여기서, 은 A'에 대한 부착 지점을 나타낸다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학식 (XXXII)의 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제조하는 방법을 제공하며:
여기서:
a는 1 내지 10이고;
A'는 또는 이고, 여기서
n은 0 또는 1이고;
각 Y는 독립적으로 S 또는 O이고;
는 R1에 대한 부착 지점을 나타내며;
는 메틸렌 기에 대한 부착 지점을 나타내고;
R1은 A'와 함께 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물이고;
R2는 수소, R1-A'에 안정성을 제공하는 기, R1-A에 용해성을 제공하는 기, 및 R1-A'에 안정성 및 용해성을 제공하는 기로부터 선택되며;
L은 절단 가능한 링커이고;
Bm은 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 모이어티이고;
방법은:
화학식 (XXXI)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 모이어티와 반응시키는 단계를 포함한다:
여기서:
A', R1 및 R2는 위에서 정의한 바와 같고,
L*은 절단 가능한 링커 전구체이다.
일부 측면에서, L*은 Bm 내 시스테인, 라이신, 티로신 또는 글루타민에 부착된다. 일부 측면에서, 시스테인 또는 라이신은 조작된 시스테인 또는 라이신이다. 일부 측면에서, 시스테인 또는 라이신은 Bm에 내인성이다.
일부 측면에서, 결합 모이어티는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 측면에서, L*은 EU 넘버링에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 중쇄 위치 S239 및/또는 K334에서 조작된 시스테인에 부착된다. 일부 측면에서, L*는 EU 넘버링에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 중쇄 위치 295에서 글루타민에 부착된다. 일부 측면에서, 부착은 부위-특이적 접합을 통해 이루어진다.
방법의 일부 측면에서, (a) Bm이 결합하는 단백질은 CD33이고 R1은 마우스 이중 극미 2 동족체(MDM2)에 결합하거나, (b) Bm이 결합하는 단백질은 전립선 특이적 막 항원(PSMA)이고 R1은 안드로겐 수용체(AR)에 결합하거나, (c) Bm이 결합하는 단백질은 CD33이고 R1은 브로모도메인 함유 단백질 4(BRD4)에 결합하거나, (d) Bm이 결합하는 단백질은 HER2이고, R1은 G1에서 S 단계 전이 1(GSPT1)에 결합하거나, 또는 (e) Bm이 결합하는 단백질은 CD33이고 R1은 GSPT1에 결합한다. 방법의 일부 측면에서, Bm이 결합하는 단백질은 CD79b이고 R1은 IRAK4에 결합한다. 방법의 일부 측면에서, Bm이 결합하는 단백질은 HER2이고 R1은 BRD4에 결합한다. 방법의 일부 측면에서, Bm이 결합하는 단백질은 BCMA이고 R1은 BRD4에 결합한다. 방법의 일부 측면에서, Bm이 결합하는 단백질은 HER2이고 R1은 ER에 결합한다.
방법의 일부 측면에서, R1-A'는 표적화된 단백질 분해제이다. 일부 측면에서, R1은 다음 식을 갖는다:
POI-L100-CBN;
여기서:
POI는 관심 단백질에 결합하는 화합물이고;
L100은 PROTAC 링커이며;
CBN은 세레블론 결합 모이어티이다.
일부 측면에서, 관심 단백질은 핵 호르몬 수용체, 해독 종결 인자, 전사 인자, 사이클린-의존성 키나제, 티로신 키나제, 세린/트레오닌 키나제 또는 E3 리가제이다. 일부 측면에서, 관심 단백질은 CD33, GSPT1, BRD4, AR, ER, IKZF1/3, CK1a, BCL-XL, IKZF2, IRAK4, BTK, STAT3, BTK 및 iMiD, BRD9, TRK, MDM2, CDK2/CDK9, CD97b 및 EGFR로부터 선택된다.
일부 측면에서, L100은 글리콜, 알킬, 알키닐, 트리아졸릴, 피페라지닐, 피페리디닐 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 작용기를 포함한다.
일부 측면에서, CBN은 다음으로부터 선택된다:
여기서:
는 A'에 대한 부착 지점을 나타내고;
는 L100에 대한 부착 지점을 나타낸다.
일부 측면에서, R1은 다음 식으로부터 선택된다:
여기서, 은 A'에 대한 부착 지점을 나타낸다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 방법에 의해 만들어진 접합체를 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 접합체를 세포로 전달하는 방법을 제공하며, 이 방법은 세포를 본원에 기재된 접합체 또는 조성물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학식 (XXXII)의 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 세포로 전달하는 방법을 제공한다:
여기서:
a는 1 내지 10이고;
A'는 또는 이고, 여기서
n은 0 또는 1이고;
각 Y는 독립적으로 S 또는 O이고;
는 R1에 대한 부착 지점을 나타내며;
는 메틸렌 기에 대한 부착 지점을 나타내고;
R1은 A'와 함께 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물이고;
R2는 수소, R1-A'에 안정성을 제공하는 기, R1-A'에 용해성을 제공하는 기, 및 R1-A'에 안정성 및 용해성을 제공하는 기로부터 선택되며; L은 절단 가능한 링커이고;
Bm은 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 모이어티이며;
방법은 화학식 (XXXII)의 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다.
도 1은 4℃, pH 5.5에서, 그리고 24시간 동안 37℃, pH 7.5에서 인큐베이션한 후의 퍼투주맙-화합물(I) 접합체(DAR = 8)의 LCMS 스펙트럼을 도시한다.
도 2a 및 2b는 37℃, pH 7.4에서 24시간 동안 인큐베이션한 후 퍼투주맙-화합물(VIII) 접합체(DAR = 8)의 LCMS 스펙트럼을 도시한다.
도 3은 37℃, pH 7.5에서 24시간 동안 인큐베이션한 후 퍼투주맙-화합물(X) 접합체(DAR = 3.66)의 LCMS 스펙트럼을 도시한다.
도 4는 37℃, pH 7.5에서 24시간 동안 인큐베이션한 후 퍼투주맙-화합물(XI) 접합체(DAR = 3.74)의 LCMS 스펙트럼을 도시한다.
도 5는 시스테인 프로테아제 파파인으로의 처리 전 및 후의 퍼투주맙-화합물(XI) 접합체(DAR = 3.74) 및 neoDegrader P1의 RP-LC-UV 프로파일을 도시하며, 또한 시스테인 프로테아제 파파인으로의 처리 전 및 후의 접합체의 LCMS를 도시한다.
도 6은 BT-474 유방암 세포주에 대한 대표적인 접합체의 시험관내 활성을 도시한다. X 축은 로그 항체 농도(M)를 보여준다. Y 축은 퍼투주맙-화합물(X) 접합체(삼각형, 실선) 및 리툭시맙-화합물(X) 접합체(원, 점선)로 처리된 BT-474 세포의 생존율 %를 보여준다.
도 7은 NCI-N87 암 세포주에 대한 대표적인 접합체의 시험관내 활성을 도시한다. X 축은 로그 항체 농도(M)를 보여준다. Y 축은 퍼투주맙-화합물(X) 접합체(삼각형, 실선) 및 리툭시맙-화합물(X) 접합체(원, 점선)로 처리된 NCI-87 세포의 생존율 %를 보여준다.
도 8은 BT-474 유방암 세포주에 대한 대표적인 접합체의 시험관내 활성을 도시한다. X 축은 로그 항체 농도(M)를 보여준다. Y 축은 퍼투주맙-화합물(XI) 접합체(삼각형) 및 리툭시맙-화합물(XI) 접합체(원)로 처리된 BT-474 세포의 생존율 %를 보여준다.
도 9는 NCI-H929 암 세포주에 대한 대표적인 접합체의 시험관내 활성을 도시한다. X 축은 로그 항체 농도(M)를 보여준다. Y 축은 벨란타맙-화합물(XIV) 접합체(원), 시나기스-화합물(XIV) 접합체(사각형), 벨란타맙(직각 삼각형) 및 비접합 화합물(XIII)(하향 삼각형)로 처리된 NCI-H929 세포의 생존율 %를 보여준다.
도 10은 SK-BR-3 세포(HER2+)의 부재 및 존재 하에 Jurkat HiBiT 표지된 세포(HER2-)에 대한 대표적인 접합체의 시험관내 활성을 도시한다. X축은 로그 페이로드 농도(M)를 보여준다. Y 축은 퍼투주맙-화합물(X) 접합체로 처리된 SK-BR-3 세포의 존재(원, 실선) 및 부재(사각형, 점선)에서 Jurkat HiBiT 세포의 생존율 %를 보여준다.
도 11은 BT-474 유방암 세포주에 대한 대표적인 접합체의 시험관내 활성을 도시한다. X 축은 로그 항체 농도(M)를 보여준다. Y 축은 퍼투주맙-화합물(XVIII) 접합체(원), 퍼투주맙-화합물(XI) 접합체(사각형) 및 리툭시맙-화합물(XVIII) 접합체(삼각형)로 처리된 BT-474 세포의 생존율 %를 보여준다.
도 12는 BT-474 유방암 세포주에 대한 대표적인 접합체의 시험관내 활성을 도시한다. X 축은 로그 항체 농도(M)를 보여준다. Y 축은 퍼투주맙-화합물(XLI) 접합체(원), 퍼투주맙-화합물(Ie) 접합체(사각형), 퍼투주맙-화합물(XIX) 접합체(상향 삼각형), 퍼투주맙-화합물(Ii) 접합체(하향 삼각형), 퍼투주맙-화합물(Ia) 접합체(마름모형), 리툭시맙-화합물(XLI) 접합체(육각형) 및 리툭시맙-화합물(XIX) 접합체(별)로 처리된 BT-474 세포의 생존율 %를 보여준다.
도 13은 MV-411 AML 세포주에 대한 대표적인 접합체의 시험관내 활성을 도시한다. X 축은 로그 항체 농도(M)를 보여준다. Y 축은 젬투주맙-화합물(XL) 접합체(원), 젬투주맙-화합물(XL) 접합체 + 젬투주맙(사각형), 젬투주맙-화합물(XL) 접합체 + 트라스투주맙(상향 삼각형), 화합물 40-3(하향 삼각형), 젬투주맙(마름모형) 및 트라스투주맙(별)으로 처리된 BT-474 세포의 생존율 %를 보여준다.
도 14는 화합물 (XL) 및 화합물 40-3에 의한 BRD4 단백질의 분해를 도시한다.
도 15a는 3 mg/kg 또는 10 mg/kg의 퍼투주맙-화합물(Ia)(각각 사각형 및 상향 삼각형), 및 3 mg/kg 또는 10 mg/kg의 퍼투주맙 화합물(XI)(각각 하향 삼각형 및 마름모형)으로 처리된 HCC1569(유방암) 종양 부피의 시간 경과에 따른 변화를 도시한다.
도 15b는 3 mg/kg 또는 10 mg/kg의 퍼투주맙-화합물(Ia)(각각 사각형 및 상향 삼각형), 및 3 mg/kg 또는 10 mg/kg의 퍼투주맙 화합물(XI)(각각 하향 삼각형 및 마름모형)로 처리된 HCC1569(유방암) 종양이 있는 마우스의 시간 경과에 따른 체중 변화를 도시한다.
도 16은 DAR이 4인 Cys-돌연변이-화합물(XV) 내인성 시스테인 접합체에 의한 항-PSMA 항체의 SEC 크로마토그램을 도시한다.
도 17은 DAR이 1.85인 S239C 돌연변이-화합물(XV) 부위-특이적 조작된 시스테인 접합체에 의한 J591 항체의 SEC 크로마토그램을 도시한다.
도 18은 화합물(XIX)의 HPLC 크로마토그램을 도시한다.
도 19a는 화합물 (XIX)가 시스테인으로 처리된 반응 혼합물의 HPLC 크로마토그램을 도시한다. 화합물(XIX)은 완전히 소비되었으며, 유일하게 식별된 생성물은 체류 시간이 2.41분이었다.
도 19b는 체류 시간 2.4분에서 피크를 나타내는 MS 데이터를 도시하며, 이는 화합물 18-6에 상응한다.
도 20은 DAR이 3.3인 HER2-A 항체(야생형 서열)-화합물(XLII) 접합체의 SEC 크로마토그램을 도시한다.
도 21은 DAR이 2.0인 HER2-A 항체(부위 특이적 접합을 위한 시스테인 돌연변이체 함유)-화합물(XLII) 접합체의 SEC 크로마토그램을 도시한다.
도 22는 10 mg/kg의 CD33-D 항체-화합물(XL) 접합체(사각형), 0.4 mg/kg의 BRD4 이종이작용기성 분해제 소분자(Xia mg, W. et al. Biorganic Chemistry 2021, volume 115의 화합물 15)(상향 삼각형), 10 mg/kg ARV-825(하향 삼각형) 및 비히클(원)로 처리된 MV-4-11 종양 부피의 시간 경과에 따른 변화를 도시한다.
도 23은 도 22에 도시된 각 그룹에 대한 시간 경과에 따른 개별 종양 부피를 도시한다.
도 24는 도 22에 도시된 연구에 사용된 마우스의 시간 경과에 따른 체중 변화를 도시한다.
도 25는 3개의 상이한 DAR(닫힌 원, 상향 삼각형 및 마름모), Synagis N297A(열린 원) 및 CD79b-A 항체(사각형)를 갖는 CD79b-A 항체-화합물(XLIII) 접합체의 CD79b 결합 친화성을 도시한다.
도 26은 CD79b-A 항체-화합물(XLIII) 접합체, 비접합 페이로드 및 비접합 CD79b-A 항체에 의한 IRAK4의 분해(β-액틴 대조군과 비교)를 보여주는 웨스턴 블롯을 도시한다.
도 27은 CD79b-A 항체-화합물(XLIII) 접합체, 비접합 CD79b-A 항체, 또는 둘 모두의 CD79b-A 항체-화합물(XLIII) 접합체 및 비접합 CD79b-A 항체의 존재 하에 IRAK4의 양(β-액틴 대조군과 비교)을 보여주는 웨스턴 블롯을 도시한다.
본 개시내용은 하기 화학식 (XX)의 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다:
여기서:
a는 1 내지 10이고;
n은 0 또는 1이고;
R1은 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물이고;
R2는 수소, -(CH2CH2O)v-CH3, C2-C6알케닐, C1-C6알킬; C2-C6알키닐, 벤질, C3-C6사이클로알킬, 및 C3-C6사이클로알킬(C1-C3알킬)로부터 선택되고, 여기서 v는 1 내지 24이고;
각 Y는 독립적으로 S 또는 O이고;
L은 절단 가능한 링커이고;
Bm은 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 모이어티이다. 일부 측면에서, 단백질은 세포 표면 위에 있다.
일부 측면에서, R2는 메틸이다.
본 개시내용은 추가로 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다:
여기서
a는 1 내지 10이고;
A'는 또는 이고, 여기서
n은 0 또는 1이고;
각 Y는 독립적으로 S 또는 O이고;
는 R1에 대한 부착 지점을 나타내며;
는 메틸렌 기에 대한 부착 지점을 나타내고;
R1은 A'와 함께 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물이고;
R2는 수소, R1-A'에 안정성을 제공하는 기, R1-A'에 용해성을 제공하는 기, 및 R1-A'에 안정성 및 용해성을 제공하는 기로부터 선택되고;
L은 절단 가능한 링커이고;
Bm은 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 모이어티이다. 일부 측면에서, 단백질은 세포 표면 위에 있다.
본 개시내용은 또한 접합체를 포함하는 조성물, 접합체를 사용하는 방법, 및 결합 모이어티에 접합된 상기 화합물을 제공한다.
본원에 기술된 레트로-만니히 반응을 겪을 수 있는 스페이서를 포함하는 것은 글루투라미드 또는 다이하이드로우라실 함유 분해제를 항체 또는 다른 세포 결합 작용제에 연결하고 방출하는 데 적합한 일반적인 해법이다. 이 기술을 사용하면 암세포로 항체 기반 전달을 수행하기 위해 추가적인 화학적 단서가 도입되어야 할 필요가 없다.
I. 정의
본 설명을 보다 쉽게 이해할 수 있기 위해, 특정 용어를 먼저 정의한다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다.
용어 "a" 또는 "an" 실체는 하나 이상의 해당 실체를 지칭하는 것에 유의해야 한다; 예를 들어, "뉴클레오타이드 서열"은 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 나타내는 것으로 이해한다. 따라서, "a"(또는 "an"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"라는 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 청구범위는 임의의 선택적 요소를 배제하도록 작성될 수 있다는 점도 유의해야 한다. 따라서, 이 진술은 청구범위 요소의 인용이나 부정적인 제한의 사용과 관련하여 "유일하게", "단지" 등과 같은 배타적인 용어를 사용하기 위한 선행 근거로서 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 명세서에 사용된 "및/또는"은 서로의 유무에 관계없이 2개의 특정 특징 또는 구성요소 각각의 구체적인 개시로서 간주되어야 한다. 따라서, 본 명세서에서 "A 및/또는 B"와 같은 문구에 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B"(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 문구에 사용된 용어 "및/또는"은 다음 측면을 각각 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); C(단독).
본 명세서에서 "포함하는"이라는 표현으로 본원에 설명되는 측면 어디에서나, "이루어지는" 및/또는 "본질적으로 이루어지는"이라는 용어로 설명되는 다른 유사한 측면도 제공되는 것으로 이해한다.
다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 관련되는 기술 분야의 기술자라면 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed, 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 Oxford Dictionary of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 기술자에게 본 개시내용에 사용된 많은 용어의 일반적인 사전을 제공한다.
단위, 접두사 및 기호는 SI(Systeme International de Unites) 승인된 형식으로 표시된다. 숫자 범위에는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 값의 범위가 언급되는 경우, 해당 범위의 언급된 상한과 하한 사이에 각각 개재되는 정수 값 및 이의 각 분수가 또한 이들 값 사이의 각 하위범위와 함께 구체적으로 개시되는 것으로 이해되어야 한다. 임의의 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 범위에 포함되거나 배제될 수 있으며, 범위 중 어느 하나가 포함되거나, 둘 모두가 포함되지 않거나, 또는 둘 모두가 포함되는 각 범위도 본 개시내용 내에 포괄되어 있다. 따라서, 본원에 언급된 범위는 언급된 종점을 포함하여 해당 범위 내의 모든 값에 대한 약기인 것으로 이해한다.
값이 명시적으로 언급되는 경우, 언급된 값과 거의 동일한 수량 또는 양인 값도 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 이해되어야 한다. 조합이 개시되는 경우, 해당 조합 중 요소의 각각의 하위조합도 구체적으로 개시되며 이는 본 개시내용의 범위 내에 있는 것이다. 반대로, 상이한 요소 또는 요소의 그룹이 개별적으로 개시되는 경우에도 이들의 조합이 또한 개시된 것이다. 개시내용의 임의의 요소가 복수의 대안예를 가진 것으로 개시되는 경우, 각 대안이 단독으로 배제되거나 다른 대안과 임의의 조합으로 배제되는 해당 개시내용의 예도 또한 본원에 개시되는 것이며; 개시내용의 하나 초과의 요소가 그러한 배제를 가질 수 있으며, 이러한 배제를 갖는 요소들의 모든 조합이 본원에 개시되는 것이다.
본원에 사용된 용어 "표적화된 단백질 분해제" 및 "neoDegrader"는 분해를 위해 단백질을 표적화할 수 있는 E3 유비퀴틴 리가제와 3원 복합체를 형성하는 분자를 지칭한다. 예로는 분자 아교 및 PROTAC을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 분자 아교의 예에는 CC-90009, 레날리도마이드, 포말리도마이드, DKY709 및 WO2021/198965에 기술된 화합물 P1을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 또한 전체 길이 면역글로불린 분자 또는 전체 길이 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 관심 표적 항원 또는 이의 일부에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 지칭하며, 이러한 표적으로는 암세포 또는 자가면역 질환과 연관된 자가면역 항체를 생성하는 세포를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 개시된 면역글로불린은 면역글로불린 분자의 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위클래스일 수 있다. 면역글로불린은 모든 종에서 유래될 수 있다. 그러나, 한 측면에서 면역글로불린은 인간, 뮤린 또는 토끼 기원인 것이다.
나노바디로도 알려져 있는 용어 "단일 도메인 항체"는 약 12 kDa 내지 약 15 kDa의 분자량을 갖는 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 이루어지는 항체 단편이다. 단일 바디 항체는 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄를 기반으로 할 수 있다. 단일 도메인 항체의 예로는 VHH 단편 및 VNAR 단편을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 일반적으로 이의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 다이아바디; 선형 항체; Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 항-아이디오타입(항-Id) 항체, CDR(상보성 결정 영역), 및 암세포 항원, 바이러스 항원 또는 미생물 항원에 면역특이적으로 결합하는 상기 임의의 것의 에피토프 결합 단편, 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
"온전한 항체"는 항원 결합 가변 영역뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인(CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 항체이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인(예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 수득되는 항체를 지칭하며, 즉 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 매우 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대해 유도된다. 또한, 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 유도되는 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 달리, 각 단클론 항체는 항원의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 이들의 특이성 외에도, 단클론 항체는 다른 항체에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "단클론"은 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 개시내용에 따라 사용될 단클론 항체는 하이브리도마 방법에 의해 만들어질 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 만들어질 수 있다. "단클론 항체"는 또한 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수도 있다.
본원의 단클론 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 반면, 사슬(들)의 나머지는 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 또 다른 종에서 유래하거나 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체, 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편에 있는 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체를 포함한다. 본원에서 관심 있는 키메라 항체로는 비인간 영장류(예를 들어 구대륙 원숭이, 유인원 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원 결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화된" 항체를 포함한다.
단클론 항체(MAb)를 생산하기 위해 다양한 방법이 사용되었다. 단일 유형의 항체를 생산하는 클로닝된 세포주를 지칭하는 하이브리도마 기술은 마우스(뮤린), 햄스터, 랫트, 및 인간을 포함하는 다양한 종의 세포를 사용한다. MAb를 제조하는 또 다른 방법은 재조합 DNA 기술을 포함하는 유전자 조작을 사용한다. 이러한 기술로부터 만들어진 단클론 항체는 무엇보다도 키메라 항체 및 인간화 항체를 포함한다. 키메라 항체는 1가지 유형의 종 초과로부터의 DNA 암호화 영역을 조합한다. 예를 들어, 키메라 항체는 가변 영역이 마우스로부터 유래하고 불변 영역이 인간으로부터 유래할 수 있다. 인간화 항체는 비인간 부분을 함유할지라도 주로 인간으로부터 유래된다. 키메라 항체와 마찬가지로, 인간화 항체는 완전한 인간 불변 영역을 함유할 수 있다. 그러나, 키메라 항체와 달리 가변 영역은 인간으로부터 부분적으로 유래될 수 있다. 인간화 항체의 비인간 합성 부분은 종종 뮤린 항체의 CDR에서 유래한다. 어쨌든, 이 영역들은 항체가 특정 항원을 인식하고 결합할 수 있도록 하는 데 중요하다. 뮤린 항체는 진단 및 단기 치료법에는 유용하지만, 유해한 면역원성 반응의 위험을 증가시킴이 없이 사람에게 장기간 투여될 수 없다. 인간 항마우스 항체(HAMA)라고 불리는 이 반응은, 인간의 면역 체계가 뮤린 항체를 외부 항체로 인식하고 공격할 때 발생한다. HAMA 반응은 독성 쇼크 또는 심지어 사망까지 유발할 수 있다.
키메라 및 인간화 항체는 투여된 항체의 비인간 부분을 최소화함으로써 HAMA 반응의 가능성을 감소시킨다. 더욱이, 키메라 및 인간화 항체는 항체 의존성 세포의 세포독성과 같은 2차 인간 면역 반응을 활성화하는 데 추가적인 이점을 가질 수 있다.
온전한 항체는 항체의 Fc 영역(천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인할 수 있는 해당 생물학적 활성을 지칭하는 하나 이상의 "이펙터 기능"을 가질 수 있다. 항체 이펙터 기능의 예로는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예: B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 온전한 항체는 다양한 "클래스"로 배정될 수 있다. 온전한 항체에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 주요 클래스가 있으며 이들 중 몇몇은 "서브클래스"(아이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 다양한 클래스의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 하위단위 구조 및 3차원 구성은 잘 알려져 있다.
용어 "약"은 대략적으로, 대충, 주위, 또는 영역내를 의미하기 위해 본원에 사용된다. "약"이라는 용어가 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 제시된 수치 값 위와 아래로 경계를 확장하여 해당 범위를 수식한다. 일반적으로, "약"이라는 용어는 언급된 값의 위 및 아래의 수치 값을 위 또는 아래(더 높거나 더 낮은)로 예를 들어 10%의 분산에 의해 수식할 수 있다.
용어 "투여", "투여하는" 및 이의 문법적 변형은 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소좀)와 같은 조성물을 약제학적으로 허용되는 경로를 통해 대상체에게 도입시키는 것을 지칭한다. 본 개시내용의 EV(예를 들어, 엑소좀)와 같은 조성물을 대상체에게 도입시키는 것은 종양내, 경구, 폐, 비강내, 비경구(정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내, 또는 피하), 직장, 림프내, 척수강내, 안구 주위 또는 국소를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 이루어진다. 투여는 자가 투여와 또 다른 것에 의한 투여를 포함한다. 적합한 투여 경로는 조성물 또는 작용제가 의도된 기능을 수행하도록 허용한다. 예를 들어, 적합한 경로가 정맥내인 경우, 대상체의 정맥에 조성물 또는 작용제를 도입시킴에 의해 조성물이 투여된다.
본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 천연이거나 또는 부분적으로 또는 전적으로 합성 생산되든지 간에, 면역글로불린 및 이의 단편을 포괄한다. 이 용어는 또한 면역글로불린 결합 도메인과 상동성인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 포함한다. "항체"는 항원에 특이적으로 결합하고 이를 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 이의 단편으로부터의 프레임워크 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 항체라는 용어의 사용은 전체 항체, 다클론성, 단클론성 및 재조합 항체, 이들의 단편을 포함하는 것을 의미하며, 추가로 단일쇄 항체, 인간화 항체, 뮤린 항체, 키메라, 마우스-인간, 마우스-영장류, 영장류-인간 단클론 항체, 항-아이디오타입 항체, 항체 단편, 예를 들어 scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb 및 Fd 단편, 다이아바디, 및 항체 관련 폴리펩타이드를 포함한다. 항체는 원하는 생물학적 활성 또는 기능을 나타내는 한, 이중특이적 항체와 다중특이적 항체를 포함한다. 본 개시내용의 일부 측면에서, 생물학적 활성 분자는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 분자이다.
용어 "항체-약물 접합체" 및 "ADC"는 상호교환적으로 사용되며 치료 작용제(때때로 본원에서 작용제, 약물 또는 활성 약제학적 성분으로 지칭됨) 또는 작용제들에, 예를 들어 공유적으로, 연결된 항체를 지칭한다. 본 개시내용의 일부 측면에서, 생물학적 활성 분자는 항체-약물 접합체이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 하나 이상의 관심 값에 적용되는 용어 "대략적으로"는 언급된 기준 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 측면에서, "대략적으로"라는 용어는 문맥에서 달리 언급되거나 달리 명백하지 않은 한(이러한 수가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외함), 언급된 기준 값의 어느 한 방향(초과 또는 미만)으로 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하에 속하는 값의 범위를 지칭한다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전성 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타 분지화 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하는 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 관련 기술분야에 정의되어 있다. 따라서, 폴리펩타이드의 아미노산이 동일한 측쇄 패밀리의 또 다른 아미노산으로 대체되는 경우, 치환은 보존적인 것으로 간주된다. 또 다른 측면에서, 일련의 아미노산은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로 유사한 일련의 아미노산으로 보존적으로 대체될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "보존된"은 비교되는 2개 이상의 서열의 동일한 위치에서 변경됨이 없이 발생하는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 폴리펩타이드 서열인, 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 폴리펩타이드 서열 각각의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기를 지칭한다. 상대적으로 보존된 뉴클레오타이드 또는 아미노산은 서열의 다른 곳에 나타나는 뉴클레오타이드 또는 아미노산보다 더 관련된 서열 간에 보존되는 것이다.
일부 측면에서, 2개 이상의 서열은 서로 100% 동일한 경우 "완전히 보존된" 또는 "동일한" 것이라고 한다. 일부 측면에서, 2개 이상의 서열은 서로 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 것이라면 "고도로 보존된"이라고 한다. 일부 측면에서, 2개 이상의 서열은 서로 적어도 약 30% 동일한, 적어도 약 40% 동일한, 적어도 약 50% 동일한, 적어도 약 60% 동일한, 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일하다면, "보존된"이라고 한다. 서열의 보존은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 전체 길이에 적용될 수 있거나 이의 일부, 영역 또는 특징에 적용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "연결하는" 및 "접합하는"은 상호교환적으로 사용되며, 각각 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 하나 이상의 화합물 및 결합 모이어티를 포함하는 2개 이상의 모이어티의 공유 또는 비공유 부착을 지칭한다. 일부 측면에서 연결하는 또는 접합하는은 링커를 포함할 수 있다.
"아미노산 서열 변이체"라는 용어는 천연 서열 폴리펩타이드와 어느 정도 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일상적으로, 아미노산 서열 변이체는 천연 항체의 적어도 하나의 수용체 결합 도메인 또는 천연 수용체의 적어도 하나의 리간드 결합 도메인과 적어도 약 70% 서열 동일성을 보유할 것이며, 전형적으로 이러한 수용체 또는 리간드 결합 도메인과 적어도 약 80%, 보다 전형적으로 적어도 약 90% 서열 상동성일 것이다. 아미노산 서열 변이체는 천연 아미노산 서열의 아미노산 서열 내의 특정 위치에 치환, 결실 및/또는 삽입을 보유한다. 아미노산은 통상적인 이름, 1문자 및 3문자 코드로 표시된다.
"서열 동일성"은 서열을 정렬하고 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 필요한 경우 갭을 도입한 후 동일한 아미노산 서열 변이체 잔기의 백분율로서 정의된다. 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램 중 하나가 Genentech, Inc.에서 제작한 "Align 2"이며, 이는 1991년 12월 10일자로 워싱턴 D.C. 20559에 소재하는 미국 저작권청에 사용자 문서와 함께 제출되었다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술하기 위해 사용된다. 예시적인 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하는 것일 수 있으며 Fc.감마.RI, Fc.감마.RII 및 Fc.감마.RIII 서브클래스의 수용체, 예를 들어, 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함한다. Fc.감마.RII 수용체는 Fc.감마.RIIA("활성화 수용체") 및 Fc.감마.RIIB("저해 수용체")를 포함하며, 이들은 주로 세포질 도메인에 차이가 있는 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 Fc.감마.RIIA는 이의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 Fc.감마.RIIB는 이의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM)를 함유한다. 향후 확인될 FcR을 포함한 다른 FcR은 본원의 용어 "FcR"에 의해 포괄된다. 이 용어는 또한 모체의 IgG를 태아에게 전달하는 데 책임이 있는 신생아 수용체인 FcRn도 포함한다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적을 용해시키는 분자의 능력을 지칭한다. 보체 활성화 경로는 동족 항원과 복합체화된 분자(예: 항체)에 대한 보체 시스템의 제1 구성요소(C1q)가 결합함으로써 시작된다. 보체 활성화를 평가하기 위해 CDC 검정이 수행될 수 있다.
"천연 항체"는 일반적으로 2개의 동일한 경쇄(L)와 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되는 반면, 이황화 연결의 수는 상이한 면역글로불린 아이소타입의 중쇄에 따라 변동된다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 이황화물 가교를 갖는다. 각 중쇄는 한쪽 끝에 가변 도메인(VH) 및 그 뒤로 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 한쪽 끝에 가변 도메인(VL) 및 다른 쪽 끝에는 불변 도메인을 갖는다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 여겨진다.
"가변"이라는 용어는 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 사이에서 서열이 광범위하게 다르고 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 고르게 분포되지 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 초가변 영역이라고 불리는 3개의 분절에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역(FR)이라고 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 베타-시트 구조를 연결하고 몇몇 경우에는 그의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 베타-시트 구조를 주로 채택하는 4개의 FR을 포함한다. 각 사슬에서 초가변 영역은 FR에 의해 밀접하게 함께 유지되고, 다른 사슬의 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하는 것이 아니라, 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC)에서 항체의 참여와 같이 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원 결합에 책임이 있는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 및 중쇄 가변 도메인의 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); Kabat et al 상기 문헌 참조) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 해당 잔기(예를 들어, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3) 및 중쇄 가변 도메인에서 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3))를 포함한다. "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 초가변 영역 잔기 외에 다른 해당 가변 도메인 잔기이다.
항체의 파파인 분해는 각각 단일 항원 결합 부위를 갖는 "Fab" 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 이름이 쉽게 결정화하는 능력을 반영하는 잔여 "Fc" 단편을 생성한다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교할 수 있는 F(ab')2 단편을 산출한다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 긴밀한 비공유 연합으로 하나의 중쇄와 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 이러한 구성에서, 각 가변 도메인의 3개의 초가변 영역은 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면 상의 항원 결합 부위를 한정한다. 종합적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)조차도 전체 결합 부위보다 낮은 친화성일지라도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇몇 잔기가 첨가되어 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 적어도 하나의 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 알려져 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체의 "경쇄"는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파(.kappa.) 및 람다(.lamda.)라고 불리는 2개의 명확하게 구별되는 유형 중 하나로 배정될 수 있다.
"단일 사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. Fv 폴리펩타이드는 scFv가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성할 수 있게 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함할 수 있다.
용어 "다이아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하며, 이 단편은 동일한 폴리펩타이드 사슬(VH-VL)에서 가변 경쇄 도메인(VL)에 연결된 가변 중쇄 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 사슬에서 2개의 도메인 사이에 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용하면, 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 쌍을 이룰 수 밖에 없어 2개의 항원 결합 부위를 생성한다.
비인간(예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화된" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 인간화는 뮤린 항원 결합 정보를 비면역원성 인간 항체 수용자에게 전달하는 방법으로, 치료적으로 유용한 많은 약물을 초래했다. 인간화 방법은 일반적으로 모두 6개의 뮤린 상보성 결정 영역(CDR)을 인간 항체 프레임워크로 전달함으로써 시작된다. 이러한 CDR 이식 항체는 일반적으로 항원 결합에 대한 원래의 친화성을 유지하지 않으며, 사실상 친화성은 종종 심각하게 손상된다. CDR 외에도, 적절한 CDR 형태를 유지하기 위해 선별된 비인간 항체 프레임워크 잔기도 혼입되어야 한다. 이식된 CDR의 구조적 형태를 지원하기 위해 인간 수용자에 대한 주요 마우스 프레임워크 잔기의 전달은 항원 결합 및 친화성을 회복시키는 것으로 밝혀졌다. 대부분의 경우, 인간화된 항체는 수혜자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성, 및 용량을 갖는 마우스, 랫트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종(공여자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수혜자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 더욱이, 인간화 항체는 수혜자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 초가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부는 비인간 면역글로불린의 루프에 상응하고 FR의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 FR이다. 인간화 항체는 또한 선택적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 해당 부분을 포함할 것이다.
"단리된" 항체는 자연 환경의 구성요소로부터 식별 및 분리 및/또는 회수된 항체이다. 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해할 수 있는 물질이며, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 결정된 항체 95 중량% 초과, 또는 99 중량% 초과로, (2) 기체상 단백질 시퀀서를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 실버 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질성으로 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경 중 적어도 하나의 구성요소가 존재하지 않을 것이므로, 재조합 세포 내에서 동일계내 항체를 포함한다. 그러나, 보통 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"암"은 신체 내 비정상 세포의 제어되지 않는 성장을 특징으로 하는 다양한 질병의 광범위한 그룹을 지칭한다. 조절되지 않은 세포 분열 및 성장은 주변 조직을 침범하는 악성 종양의 형성을 초래하고 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 먼 부분으로 전이될 수도 있다. 본 명세서에 사용된 "암"은 원발성, 전이성 및 재발성 암을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "면역 반응"은 외래 작용제에 대한 척추동물 내의 생물학적 반응을 지칭하며, 여기서 반응은 이들 작용제 및 이들 작용제에 의해 유발된 질병으로부터 유기체를 보호한다. 면역 반응은 면역 체계의 세포(예를 들어, T 림프구, B 림프구, 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 호산구, 비만세포, 수지상 세포 또는 호중구) 및 임의의 이들 세포 또는 간에 의해 생성된 가용성 거대분자(예를 들어, 항체, 사이토카인, 및 보체)의 작용에 의해 매개되고, 이는 침입하는 병원체, 병원체에 감염된 세포 또는 조직, 암성 또는 기타 비정상적인 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우에 정상적인 인간 세포 또는 조직에 대한 척추동물 신체로부터의 선택적인 표적화, 결합, 손상, 파괴 및/또는 제거를 초래한다. 면역 반응은, 예를 들어 T 세포, 예를 들어 이펙터 T 세포 또는 Th 세포, 예컨대 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 활성화 또는 저해, 또는 Treg 세포의 저해를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "T 세포" 및 "T 림프구"는 상호교환 가능하며 흉선에 의해 생산되거나 프로세싱되는 임의의 림프구를 지칭한다. 일부 측면에서, T 세포는 CD4+ T 세포이다. 일부 측면에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다. 일부 측면에서, T 세포는 NKT 세포이다.
"대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. "비인간 동물"이라는 용어는 비인간 영장류, 양, 개, 및 설치류, 예컨대 마우스, 랫트 및 기니 피그와 같은 척추동물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 측면에서, 대상체는 인간이다. "대상체" 및 "환자"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "치료 유효량" 또는 "치료 유효 투여량"은 원하는 생물학적, 치료적 및/또는 예방적 결과를 제공하는 작용제(예를 들어, 본원에 개시된 접합체)의 양을 지칭한다. 그 결과는 질병의 징후, 증상 또는 원인 중 하나 이상의 감소, 호전, 완화, 약화, 지연 및/또는 경감, 또는 생물학적 시스템의 임의의 다른 원하는 변경일 수 있다. 고형 종양과 관련하여, 유효량은 종양을 수축시키고/시키거나 종양의 성장 속도를 감소시키거나(종양 성장을 억제하는 것과 같이) 또는 다른 원치 않는 세포 증식을 예방하거나 지연시키기에 충분한 양을 포함한다. 일부 측면에서, 유효량은 종양 발달을 지연시키기에 충분한 양이다. 일부 측면에서, 유효량은 종양 재발을 예방하거나 지연시키기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 조성물의 유효량은, 예를 들어 (i) 암세포 수를 감소시키고; (ii) 종양 크기를 감소시키고; (iii) 말초 기관으로 암세포 침윤을 저해하고, 지연시키고, 어느 정도 둔화시키고, 중단시킬 수 있고; (iv) 종양 전이를 저해(즉, 어느 정도 둔화)하고 중단시킬 수 있으며; (v) 종양 성장을 저해하고; (vi) 종양의 발생 및/또는 재발을 방지 또는 지연시키고; 및/또는 (vii) 암과 연관된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화시킬 수 있다.
일부 측면에서, "치료 유효량"은 암의 상당한 감소 또는 진행성 고형 종양과 같은 암 진행의 둔화(퇴행)에 영향을 미치는 것으로 임상적으로 입증된 접합체의 양이다. 질병 퇴행을 촉진하는 치료제의 능력은 숙련된 의사에게 공지된 다양한 방법, 예를 들어 임상 시험 동안의 인간 대상체에서, 인간에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관내 검정에서 작용제의 활성을 검정함으로써 평가될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "표준 치유"는 의료 전문가에 의해 특정 유형의 질병에 대한 적절한 치료로서 인정되고 의료 전문가가 널리 사용하는 치료를 지칭한다. 이 용어는 "모범 사례", "표준 의료적 치유" 및 "표준 치료법"과 같은 용어와 상호 교환하여 사용할 수 있다.
예를 들어, "항암제"는 대상체에서 암 퇴행을 촉진하거나 추가 종양 성장을 예방한다. 특정 측면에서, 치료 유효량의 약물은 암을 제거한 시점까지 암 퇴행을 촉진한다.
치료와 관련하여 용어 "효과적인" 및 "유효성"은 약리학적 유효성 및 생리학적 안전성을 모두 포함한다. 약리학적 유효성은 환자의 암 퇴행을 촉진하는 약물의 능력을 지칭한다. 생리학적 안전성은 약물 투여로 인해 초래되는 세포, 기관 및/또는 유기체 수준에서의 독성 또는 기타 불리한 생리학적 효과(부작용)의 수준을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "면역 관문 저해제"는 하나 이상의 관문 단백질을 전적으로 또는 부분적으로 감소, 저해, 방해 또는 조절하는 분자를 지칭한다. 관문 단백질은 T 세포 활성화 또는 기능을 조절한다. CTLA-4 및 이의 리간드 CD80 및 CD86; 및 PD-1 및 이의 리간드 PD-L1 및 PD-L2와 같은 수많은 관문 단백질이 알려져 있다. Pardoll, D.M., Nat Rev Cancer 12(4):252-64 (2012). 이들 단백질은 T 세포 반응의 공동자극 또는 저해 상호작용에 책임이 있다. 면역 관문 단백질은 자가 관용 및 생리적 면역 반응의 지속 기간 및 진폭을 조절하고 유지한다. 면역 관문 저해제는 항체를 포함하거나 항체에서 유래된다.
"치료하다" 또는 "치료"라는 용어는 치료적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 모두를 지칭하며, 여기서 목적은 바람직하지 않은 생리적 변화 또는 장애, 예를 들어 암의 발생 또는 확산을 방지하거나 지연(약화)시키는 것이다. 본 개시내용의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 임상 결과는 증상의 경감, 질병 정도의 축소, 질병의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질병 진행의 지연 또는 둔화, 질병 상태의 호전 또는 완화, 및 관해(부분적 또는 전체적이든지 간에)를 검출 가능하든지 또는 검출 불가능하든지 간에 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우 예상되는 생존과 비교하여 생존 연장을 의미할 수도 있다. 치료를 필요로 하는 자는 이미 상태 또는 장애를 가진 자뿐만 아니라 상태 또는 장애를 가지기 쉬운 자, 또는 상태 또는 장애가 방지되어야 하는 자를 포함한다.
II. 단백질-단백질 상호작용 유도제
본 개시내용은 하기 화학식 (XX)의 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
여기서, R1은 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물이다.
본 개시내용은 추가로 화학식 (XXXII)의 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
여기서
A'는 또는 이고, 여기서
n은 0 또는 1이고;
각 Y는 독립적으로 S 또는 O이고;
는 R1에 대한 부착 지점을 나타내고;
는 메틸렌 기에 대한 부착 지점을 나타내고;
R1은 A'와 함께 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물이다.
단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물은 문헌[Biophysical Reviews 2019, 11: 559-581]에 설명된 것과 같은 단백질-단백질 상호작용 조절제를 포함한다.
특정 측면에서, 단백질-단백질 상호작용 유도제는 바람직하지 않은 단백질을 해체하고 붕괴시킬 수 있는 표적화된 단백질 분해제를 포함한다.
일부 측면에서, 표적화된 단백질 분해제는 치환된 아이소인돌 화합물을 포함한다. 일부 측면에서, 표적화된 단백질 분해제는 5'-치환된 아이소인돌 화합물을 포함한다. 특정 측면에서, R1은 하기에 제시된 화학식 (XXX)의 화합물이다:
여기서:
는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이고;
A는 페닐 또는 C4-C10사이클로알킬 고리이고;
U는 NH 및 CF2로부터 선택되고;
R10은 수소 및 할로로부터 독립적으로 선택되고;
R20은 -CH3, -C(O)R3, -N(R4)2, -(CH2)nOH, -(CH2)nN(R4)2, -(CH2)nQ'(CH2)mOH, -(CH2)nQ'(CH2)mSH 및 -(CH2)nQ'(CH2)mN(R4)2로부터 선택되고; 여기서
R3은 수소 또는 C1-C6알킬이고;
각 R4는 독립적으로 수소 또는 C1-C6알킬이고;
Q'는 O, S 또는 NR4이고;
n은 1-6이고;
m은 2-5이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XXX)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, 여기서
A는 페닐 고리 또는 C4-C10사이클로알킬 고리이고;
U는 NH이고;
R10은 수소 및 할로로부터 선택되고;
R20은 -(CH2)nQ'(CH2)mN(R4)2, -(CH2)nOH, -N(R4)2, 및 -C(O)R3으로부터 선택되고;
여기서:
m은 2이고;
n은 2이며;
Q'는 -O-이고;
R3은 메틸이고;
각 R4는 수소 및 메틸로부터 독립적으로 선택된다.
본원에 사용된 용어 "C1-C6알콕시"는 산소 원자를 통해 모 분자 모이어티에 부착된 C1-C6알킬기를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "C1-C6알콕시C1-C6알킬"은 C1-C6알킬 기를 통해 모 분자 모이어티에 부착된 C1-C6알콕시 기를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "C1-C6알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 포화 탄화수소로부터 유래된 기를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "C4-C10사이클로알킬"은 4 내지 10개의 탄소 원자 및 0개의 헤테로원자를 갖는 포화 모노사이클릭 탄화수소 고리 시스템을 지칭한다. 사이클로알킬 기의 대표적인 예로는 사이클로부틸, 사이클로펜틸 및 사이클로헥실을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 7 내지 10개의 원자를 함유하는 사이클로알킬 기는 모노사이클릭 또는 융합된, 스피로사이클릭, 또는 가교된 바이사이클릭 구조일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "할로"는 F, Cl, Br 또는 I를 지칭한다.
일부 측면에서, 화학식 (XXX)의 화합물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물이다:
일부 측면에서, 표적화된 단백질 분해제는 단백질분해 표적화 키메라(PROTAC)를 포함한다. PROTAC의 예는 관련 기술분야에 알려져 있다(예를 들어, Acta Pharmaceutica Sinica B, 2020; 10(2): 207-238 참조).
특정 측면에서, PROTAC은 하기 화학식을 갖는다:
POI-L100-CBN;
여기서:
POI는 관심 단백질에 결합하는 화합물이고;
L100은 PROTAC 링커이고;
CBN은 세레블론 결합 모이어티이다.
여러 다양한 단백질 클래스는 PROTAC 표적으로서 보고되어 있다. 특정 측면에서, 관심 단백질은 핵 호르몬 수용체, 해독 종결 인자, 전사 인자, 사이클린-의존성 키나제, 티로신 키나제, 세린/트레오닌 키나제, 또는 E3 리가제일 수 있다.
다양한 단백질 클래스 내에는 본원에 기술된 PROTACS에 의해 표적화될 수 있는 여러 관심 단백질이 있다. 특정 측면에서, 관심 단백질은 CD33, GSPT1, BRD4, 안드로겐 수용체(AR), 에스트로겐 수용체(ER), IKZF1/3, CK1a, BCL-XL, IKZF2, IRAK4, BTK, STAT3, BTK 및 iMiD, BRD9, TRK, MDM2, CDK2/CDK9, CD97b 및 EGFR로부터 선택될 수 있다. 일부 측면에서, 관심 단백질은 BRD4, ER 및 IRAK4로부터 선택될 수 있다. 일부 측면에서, 관심 단백질은 BTK, BRD9, TRK, CDK2/CDK9 및 STAT3으로부터 선택될 수 있다.
특정 측면에서, PROTAC은 링커 L100을 포함한다. PROTAC 링커는 관련 기술분야에서 깊히 연구되어 있다(예를 들어 Troup RI, Fallan C, Baud MGJ. "Current strategies for the design of PROTAC linkers: a critical review." Explor Target Antitumor Ther. 2020;1:273-312. https://doi.org/10.37349/etat.2020.00018).
특정 측면에서, L100은 알킬 링커를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 알킬 링커는 2 내지 30개의 원자를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 알킬 링커는 5 내지 25개의 원자를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 알킬 링커는 10 내지 20개의 원자를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 알킬 링커는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 원자를 포함할 수 있다.
특정 측면에서, L100은 글리콜 링커를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 글리콜 링커는 3 내지 30개의 원자를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 글리콜 링커는 5 내지 25개의 원자를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 알킬 링커는 10 내지 20개의 원자를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 알킬 링커는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 원자를 포함할 수 있다.
특정 측면에서, L100은 글리콜 및 알킬 링커를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 링커는 5 내지 35개의 원자를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 알킬 링커는 10 내지 30개의 원자를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 알킬 링커는 15 내지 25개의 원자를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 알킬 링커는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35개의 원자를 포함할 수 있다.
특정 측면에서, L100은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 대체 글리콜 기, 예를 들어 프로필렌 글리콜, 알킬, 알키닐, 트리아졸릴, 피페라지닐, 피페리디닐, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 하나 이상의 작용기를 포함할 수 있다. 적절한 PROTAC 링커는 숙련된 실무자에게 공지된 방법을 사용하여 선택될 수 있음이 이해되어야 한다. 일부 측면에서, 링커는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35개의 원자를 포함할 수 있다.
전형적으로, 특정 실시양태에서, PROTAC는 세레블론 결합 모이어티(CNB)를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 세레블론 결합 모이어티는 다음으로부터 선택될 수 있다:
여기서:
은 A'에 대한 부착 지점을 나타내고;
은 L100에 대한 부착 지점을 나타낸다.
일부 측면에서, PROTAC는 하기 화학식을 갖는 화합물일 수 있다:
;
여기서, 은 A'에 대한 부착 지점을 나타낸다.
III. 안정성 및 용해성 향상제
본원에 기술된 접합체의 안정성 및/또는 용해성은 R2에서의 작용기화를 통해 개선될 수 있다. 특정 측면에서, 안정성 및/또는 용해성의 개선이 필요하지 않은 경우, R2는 수소일 수 있다. 다른 측면에서, 추가적인 안정성 및/또는 용해성이 요구되는 경우, R2는 수소 외에 다른 기일 수 있다.
특정 측면에서, R2는 접합체에 안정성을 부여하는 기일 수 있다. 일부 측면에서, R2는 C2-C6알케닐, C1-C6알킬; C2-C6알키닐, 벤질, C3-C6사이클로알킬 및 C3-C6사이클로알킬(C1-C3알킬)로부터 선택된다. 일부 측면에서, R2는 C1-C6알킬이다. 일부 측면에서, R2는 메틸이다.
특정 측면에서, R2는 접합체에 용해성을 부여하는 기일 수 있다. 일부 측면에서 R2는 다음 중에서 선택될 수 있다:
여기서:
각 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
각 y는 독립적으로 1 또는 2이고;
각 R은 독립적으로 수소, C6H11O5, C12H21O10, C18H31O15, 또는 C24H41O20이다.
IV. 접합체
본 개시내용은 하나 이상의 단백질-단백질 상호작용 유도제, 링커 및 결합 모이어티의 접합체를 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
여기서:
a는 1 내지 10이고;
n은 0 또는 1이고;
R1은 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물이고;
R2는 수소, -(CH2CH2O)v-CH3, C2-C6알케닐, C1-C6알킬; C2-C6알키닐, 벤질, C3-C6사이클로알킬, 및 C3-C6사이클로알킬(C1-C3알킬)로부터 선택되고, 여기서 v는 1 내지 24이고;
각 Y는 독립적으로 S 또는 O이고;
L은 절단 가능한 링커이고;
Bm은 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 모이어티이다. 일부 측면에서, 단백질은 세포 표면 위에 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 화학식 (XXXII)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
여기서
a는 1 내지 10이고;
A'는 또는 이고, 여기서
n은 0 또는 1이고;
각 Y는 독립적으로 S 또는 O이고;
는 R1에 대한 부착 지점을 나타내고;
는 메틸렌 기에 대한 부착 지점을 나타내며;
R1은 A'와 함께 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물이고;
R2는 수소, R1-A'에 안정성을 제공하는 기, R1-A'에 용해성을 제공하는 기, 및 R1-A'에 안정성 및 용해성을 제공하는 기로부터 선택되고;
L은 절단 가능한 링커이고;
Bm은 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 모이어티이다. 일부 측면에서, 단백질은 세포 표면 위에 있다.
일부 측면에서, Bm이 결합하는 단백질은 HER2이고 R1은 G1에서 S 단계 전이 1(GSPT1)에 결합한다. 일부 측면에서, Bm이 결합하는 단백질은 CD33이고 R1은 마우스 이중 극미 2 동족체(MDM2)에 결합한다. 일부 측면에서, Bm이 결합하는 단백질은 전립선 특이 막 항원(PSMA)이고 R1은 안드로겐 수용체(AR)에 결합한다. 일부 측면에서, Bm이 결합하는 단백질은 CD33이고 R1은 브로모도메인 함유 단백질 4(BRD4)에 결합한다. 일부 측면에서, Bm이 결합하는 단백질은 CD33이고 R1은 GSPT1에 결합한다. 일부 측면에서, Bm이 결합하는 단백질은 CD79b이고 R1은 IRAK4에 결합한다. 일부 측면에서, Bm이 결합하는 단백질은 HER2이고 R1은 BRD4에 결합한다. 일부 측면에서, Bm이 결합하는 단백질은 BCMA이고 R1은 BRD4에 결합한다. 일부 측면에서 Bm이 결합하는 단백질은 HER2이고 R1은 ER에 결합한다.
일부 측면에서, 본원에 기술된 접합체는 종양 세포주에 대해 시험관내 항증식 활성을 갖는다. 일부 측면에서, 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 하나 이상의 화합물 및 결합 모이어티를 포함하는 접합체는 화합물(들) 또는 결합 모이어티 단독보다 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100% 더 높은 시험관내 항증식 활성을 갖는다. 일부 측면에서, 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 하나 이상의 화합물 및 결합 모이어티를 포함하는 접합체는 화합물(들) 또는 결합 모이어티 단독보다 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배 더 높은 시험관내 항증식 활성을 갖는다.
일부 측면에서, 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 하나 이상의 화합물 및 결합 모이어티를 포함하는 접합체는 BT-474 유방암 세포주에 대해 시험관내 항증식 활성, 예를 들어 화합물(들) 단독 또는 결합 모이어티 단독에 비해, BT-474 유방암 세포주에 대해 더 높은 항증식 활성을 갖는다. 일부 측면에서, 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 하나 이상의 화합물 및 결합 모이어티를 포함하는 접합체는 SK-BR-3 유방암 세포주에 대해 시험관내 항증식 활성, 예를 들어 화합물(들) 단독 또는 결합 모이어티 단독에 비해 SK-BR-3 유방암 세포주에 대해 더 높은 항증식 활성을 갖는다. 일부 측면에서, 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 1종 이상의 화합물 및 결합 모이어티를 포함하는 접합체는 NCI-N87 위암 세포주에 대해 시험관내 항증식 활성, 예를 들어 화합물(들) 단독 또는 결합 모이어티 단독에 비해 NCI-N87 위암 세포주에 대해 더 높은 항증식 활성을 갖는다. 일부 측면에서, 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 1종 이상의 화합물 및 결합 모이어티를 포함하는 접합체는 다우디 림프종 세포주에 대해 시험관내 항증식 활성, 예를 들어 화합물(들) 단독 또는 결합 모이어티 단독에 비해 다우디 림프종 세포주에 대해 더 높은 항증식 활성을 갖는다. 일부 측면에서, 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 하나 이상의 화합물 및 결합 모이어티를 포함하는 접합체는 HL-60 급성 골수성 백혈병 세포주에 대해 시험관내 항증식 활성, 예를 들어 화합물(들) 단독 또는 결합 모이어티 단독에 비해 HL-60 급성 골수성 백혈병 세포주에 대해 더 높은 항증식 활성을 갖는다. 일부 측면에서, 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 하나 이상의 화합물 및 결합 모이어티를 포함하는 접합체는 라모스 비호지킨 림프종 세포주에 대해 시험관내 항증식 활성, 예를 들어 화합물(들) 단독 또는 결합 모이어티 단독에 비해 라모스 비호지킨 림프종 세포주에 대해 더 높은 항증식 활성을 갖는다. 일부 측면에서, 본원에 기술된 접합체는 인간 혈청의 존재 하에 항증식 활성을 유지할 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 기술된 접합체는 암 치료에 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 제공된 접합체는 유방암, 위암, 비소세포폐암, 담관암, 결장암, 난소암 또는 뉴레굴린-1(NRG1) 양성 암의 치료에 사용될 수 있고, 예를 들어, 여기서 Bm이 결합하는 단백질은 HER2이고, R1은 G1에서 S 단계 전이 1(GSPT1)에 결합한다. 일부 측면에서, 본원에 제공된 접합체는 급성 골수성 백혈병의 치료에 사용될 수 있으며, 예를 들어 Bm이 결합하는 단백질은 CD33이고 R1은 MDM2, GSPT1 또는 브로모도메인-함유 단백질 4(BRD4)에 결합한다. 일부 측면에서, 본원에 제공된 접합체는 전립선 암의 치료에 사용될 수 있고, 예를 들어 여기서 Bm이 결합하는 단백질이 전립선 특이적 막 항원(PSMA)이고 R1은 안드로겐 수용체(AR)에 결합한다. 일부 측면에서, 본원에 제공된 접합체는 NHL, 예를 들어 B 세포 NHL 또는 DLBCL의 치료에 사용될 수 있으며, 예를 들어 여기서 Bm이 결합하는 단백질은 CD79b이고 R1은 IRAK4에 결합한다.
III.A. 링커
단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물(들)은 본원에 기술된 바와 같이 글루타르미드 또는 다이하이드로우라실 고리를 통해 결합 모이어티에 연결될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "링커"는 화학식 (XX) 또는 화학식 (XXX)의 화합물 내의 글루타르아미드 또는 다이하이드로우라실 고리의 질소 원자에 결합 모이어티(Bm)를 연결할 수 있는 임의의 화학적 모이어티를 지칭한다.
특정 측면에서, 링커는 이종이작용기성 기를 함유할 수 있다. 본 개시내용에서, "이종이작용기성 기"란 용어는 이의 일부인 링커를 결합 모이어티에 연결하는 화학적 모이어티를 지칭한다. 이종이작용기성 기는 화학적 모이어티의 어느 한쪽 끝에서 서로 다른 반응성 기를 갖는 것을 특징으로 한다. "Bm"에 대한 부착은 화학적 또는 효소적 접합 또는 이 둘의 조합을 통해 달성될 수 있다. 화학적 접합은 이종이작용기성 기 상의 반응 단서와 결합 모이어티의 표면 상의 접근 가능한 아미노산 잔기의 제어된 반응을 수반한다. 화학적 접합의 예로는 라이신 아미드 커플링, 시스테인 커플링, 및 유전자 조작에 의해 혼입된 비천연 아미노산을 통한 커플링을 포함하지만 이에 제한되지는 않으며, 여기서 원하는 반응 단서를 가진 비천연 아미노산 잔기가 "Bm" 위에 설치된다. 효소적 접합에서, 효소는 결합 모이어티 상의 접근 가능한 아미노 잔기와 링커의 커플링을 매개한다. 효소적 접합의 예로는 분류효소(sortase)를 사용한 트랜스펩타이드화, 미생물 트랜스글루타미나제를 사용한 트랜스펩타이드화 및 N-글리칸 조작을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 화학적 접합 및 효소적 접합은 또한 순차적으로 사용될 수도 있다. 예를 들어, 효소적 접합은 후속 화학적 접합에 활용될 "Bm" 상에 고유한 반응 단서를 설치하기 위해 사용될 수도 있다.
일부 측면에서, 이종이작용기성 기는 다음으로부터 선택된다:
여기서
는 링커의 나머지 부분에 대한 부착 지점이고;
는 Bm에 대한 부착 지점이다.
특정 측면에서 링커는 절단될 수 있다. 일부 측면에서, 링커는 단백질-단백질 상호작용 유도 화합물(들) 및/또는 결합 모이어티가 활성을 유지할 수 있는 조건에서 산 유도 절단, 광 유도 절단, 생물환원 절단, 효소 절단 등에 민감할 수 있다.
일부 측면에서, 절단 가능한 링커는 효소적으로 절단될 수 있다. 일부 측면에서, 절단 가능한 링커는 프로테아제, 펩티다제, 에스테라제, β-글루쿠로니다제, 글리코시다제, 포스포다이에스테라제, 포스파타제, 피로포스파타제 또는 리파제에 의해 절단될 수 있다.
일부 측면에서, 절단 가능한 링커는 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 프로테아제의 예로는 카텝신 B, VAGP 테트라펩타이드 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
특정 측면에서, 절단 가능한 링커는 펩타이드를 함유한다. 일부 측면에서, 펩타이드는 링커의 절단 부위이고, 이로써 리소좀 효소와 같은 세포내 프로테아제에 노출 시 약물의 방출을 용이하게 한다. 펩타이드는 특정 효소, 예를 들어 종양 연관 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단을 위해 설계되고 최적화될 수 있다. 2개의 아미노산을 갖는 펩타이드의 예로는 알라닌-알라닌(ala-ala), 발린-알라닌(val-ala), 발린-시트룰린(vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌(af 또는 ala-phe); 페닐알라닌-리신(fk 또는 phe-lys); 페닐알라닌-호모리신(phe-homolys); 및 N-메틸-발린-시트룰린(Me-val-cit)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 3개의 아미노산을 갖는 펩타이드의 예로는 글리신-발린-시트룰린(gly-val-cit), 아스파르트산-발린-시트룰린(asp-val-cit), 알라닌-알라닌-아스파라긴(ala-ala-asn), 알라닌-페닐알라닌-리신(ala-phe-lys), 글리신-글리신-페닐알라닌(gly-gly-phe), 및 글리신-글리신-글리신(gly-gly-gly)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 4개의 아미노산을 갖는 펩타이드의 예는 글리신-글리신-발린-시트룰린(gly-gly-val-cit) 및 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신(gly-gly-phe-gly)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 5개의 아미노산을 갖는 펩타이드의 예는 글리신-글리신-발린-시트룰린-글리신(gly-gly-val-cit-gly) 및 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신-글리신(gly-gly-phe-gly-gly)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 위의 아미노산 조합은 역순으로 존재할 수도 있다(즉, cit-val).
본 개시내용의 펩타이드는 아미노산 잔기의 L- 또는 D-이성질체를 포함할 수 있다. "자연 발생 아미노산"이라는 용어는 Ala, Asp, Asx, Cit, Cys, Glu, Phe, Glx, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr을 지칭한다. "D-"는 자연 발생("L-") 아미노산의 배열과 대조적으로 "D"(우선성) 배열을 갖는 아미노산을 지칭한다. 본원에 기술된 아미노산은 상업적으로 구입하거나(Sigma Chemical Co., Advanced Chemtech), 또는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 합성할 수 있다.
특정 측면에서, 링커("L")는 다음으로부터 선택되는 프로테아제 절단 가능한 링커이다:
여기서:
q는 2 내지 10이고;
Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5는 각각 독립적으로 부재하거나 L- 또는 D-배열의 자연 발생 아미노산 잔기이고, 단, Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5 중 적어도 2개는 아미노산 잔기이며;
는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이고;
는 결합 모이어티에 대한 부착 지점이다.
특정 측면에서, Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5는 독립적으로 부재하거나, L-발린, D-발린, L-시트룰린, D-시트룰린, L-알라닌, D-알라닌, L-글루타민, D-글루타민, L-글루탐산, D-글루탐산, L-아스파르트산, D-아스파르트산, L-아스파라긴, D-아스파라긴, L-페닐알라닌, D-페닐알라닌, L-라이신, D-라이신 및 글리신으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 단, Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5 중 적어도 2개는 아미노산 잔기이다.
일부 측면에서, Z1은 부재하거나 글리신이고; Z2는 부재하거나, L-글루타민, D-글루타민, L-글루탐산, D-글루탐산, L-아스파르트산, D-아스파르트산, L-알라닌, D-알라닌 및 글리신으로부터 선택되고; Z3은 L-발린, D-발린, L-알라닌, D-알라닌, L-페닐알라닌, D-페닐알라닌 및 글리신으로부터 선택되고; Z4는 L-시트룰린, D-시트룰린, L-아스파라긴, D-아스파라긴, L-리신, D-리신, L-페닐알라민, D-페닐알라닌 및 글리신으로부터 선택되고; Z5는 부재하거나 글리신이다.
일부 측면에서, L은 다음 화학식이다:
.
일부 측면에서, q는 4이다.
특정 측면에서, L은 베타-글루쿠로니다제 절단 가능한 링커이다.
일부 측면에서, L은 다음 식인 베타-글루쿠로니다제 절단 가능한 링커이다:
여기서:
q는 2 내지 10이고;
----는 부재하거나 또는 결합이고;
는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이고;
는 결합 모이어티에 대한 부착 지점이다.
일부 관점에서, 링커는 생물환원성이다. 생물환원성 링커는 혈장 대비 세포내 구획에서 환원 잠재성의 차이를 이용한다. 종양 세포의 세포질에 존재하는 환원된 글루타치온은 정상 세포의 세포질에 존재하는 것보다 최대 1000배 더 높고, 종양 세포는 또한 세포 구획에서 환원에 기여할 수 있는 효소를 함유하기도 한다. 링커는 전신 순환 동안 접합체를 온전하게 유지하고, 글루타치온의 높은 세포내 농도에 의해 선택적으로 절단되어 비독성 전구약물로부터 종양 부위에서 활성 약물을 방출한다.
일부 측면에서, L은 다음으로부터 선택되는 생물환원성 링커이다:
여기서, q는 2 내지 10이고;
R, R', R'' 및 R'''는 각각 독립적으로 수소, C1-C6알콕시C1-C6알킬, (C1-C6)2NC1-C6알킬 및 C1-C6알킬로부터 선택되거나, 2개의 같은 자리 R 기는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 사이클로부틸 또는 사이클로프로필 고리를 형성할 수 있고;
는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이고;
는 결합 모이어티에 대한 부착 지점이다.
특정 측면에서, L은 하기 식인 생물환원성 링커이다:
특정 측면에서, L은 클릭-방출 링커이고, 여기서 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물의 방출은 테트라진 또는 관련 화합물에 의해 화학적으로 촉발된다.
일부 측면에서, L은 하기 식인 클릭-방출 링커이다:
여기서:
q는 2 내지 10이고;
는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이고;
는 결합 모이어티에 대한 부착 지점이다.
일부 측면에서, 결합 모이어티에 대한 부착 지점은 결합 모이어티의 시스테인, 리신, 티로신 또는 글루타민이다. 일부 측면에서, 결합 모이어티에 대한 부착 지점은 시스테인이다. 일부 측면에서, 결합 모이어티에 대한 부착 지점은 라이신이다. 일부 측면에서, 결합 모이어티에 대한 부착 지점은 티로신이다. 일부 측면에서, 결합 모이어티에 대한 부착 지점은 글루타민이다.
시스테인 또는 라이신은 예를 들어 부위 특이적 접합을 위해 조작된(즉, 결합 모이어티에 대해 내인성이 아닌) 시스테인 또는 라이신일 수 있다. 부위 특이적 접합은 결합 모이어티(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 부분) 상의 고유의 한정된 부위를 통한 부착을 지칭한다. 부위 특이적 접합은, 예를 들어 문헌[Zhou, Qun. "Site-Specific Antibody Conjugation for ADC and Beyond." Biomedicines vol. 5,4 64. 9 Nov.2017, doi:10.3390/biomedicines5040064]에서 논의되며, 이 문헌은 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
부착 지점인 시스테인 또는 리신은 결합 모이어티에 대해 내인성인 시스테인 또는 라이신일 수 있다.
III.B. 결합 모이어티
본 개시내용은 결합 모이어티에 접합된 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 하나 이상의 화합물을 제공한다. 본원에 사용된 용어 "결합 모이어티"는 세포 표면 마커 또는 수용체를 인식하고 이에 결합하는 임의의 분자를 지칭한다. 특정 측면에서, 결합 모이어티는 폴리펩타이드 모이어티에 제한되지 않는 단백질에 결합한다. 특정 세포, 조직 또는 위치로 화합물(들)을 표적화하는 것 외에도 결합 모이어티는 또한 표적 세포 또는 경로에 대한 항증식(세포증식 억제 및/또는 세포독성) 활성과 같은 특정 치료 효과를 가질 수도 있다. 특정 측면에서, 결합 모이어티는 카르복실산, 아민, 티올, 또는 화학적 반응성 아미노산 모이어티 또는 측쇄와 같은 적어도 하나의 화학적 반응성 기를 포함할 수 있거나 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 측면에서, 결합 모이어티는 주어진 표적 세포 집단에 대해 세포 표면 수용체 또는 항원과 같은 세포 표면 분자와 결합하거나 복합체를 형성하는 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 수용체와의 특이적 결합 또는 복합체화 후, 세포는 표적화 모이어티 또는 접합체의 흡수에 허용적이며, 이는 이후 세포 내로 내재화된다.
일부 측면에서, "Bm" 기는 세포 표면 수용체 또는 항원에 결합하는 펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
특정 측면에서, "Bm" 기는 항체, 항체 단편, 또는 항원-결합 단편일 수 있다. 항체는 특정 항원을 인식하고 이에 결합할 수 있는 면역 체계에 의해 생성되는 단백질이다. 표적 항원은 일반적으로 다수의 항체 상의 CDR에 의해 인식되는 에피토프라고도 불리는 수많은 결합 부위를 갖고 있다. 서로 다른 에피토프에 특이적으로 결합하는 각 항체는 다른 구조를 갖는다. 따라서, 하나의 항원은 하나보다 많은 상응하는 항체를 가질 수 있다. 본원에서 "항체"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며 특히 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 단클론 항체, 단일 도메인 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체(예: 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 포함한다. 항체는 뮤린, 인간, 인간화, 키메라 항체이거나, 또는 다른 종에서 유래될 수 있다.
화합물(들)에 접합될 수 있는 단클론 항체는 특정 항원 결정인자(예: 암세포 항원, 바이러스 항원, 미생물 항원, 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 화학물질, 핵산 또는 이의 단편)에 대한 항체의 동종 집단이다. 관심 항원에 대한 단클론 항체(mAb)는 배양물 중 연속 세포주에 의한 항체 분자의 생산을 제공하는 관련 기술분야에 공지된 임의의 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 이들에는 하이브리도마 기술, 인간 B 세포 하이브리도마 기술, 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하는 임의의 면역글로불린 클래스 및 이의 임의의 서브클래스일 수 있다. 본 개시내용에 사용하기 위해 mAb를 생산하는 하이브리도마는 시험관내 또는 생체내에서 배양될 수 있다.
유용한 단클론 항체로는 인간 단클론 항체, 인간화 단클론 항체, 항체 단편, 또는 키메라 인간-마우스(또는 다른 종) 단클론 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 인간 단클론 항체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수많은 기술에 의해 제조될 수 있다.
항체는 또한 이중특이적 항체일 수도 있다. 이중특이적 항체를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 전체 길이의 이중특이적 항체의 전통적인 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현을 기반으로 하며, 여기서 2개의 사슬은 서로 다른 특이성을 갖고 있다. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 모음으로 인해, 이들 하이브리도마(쿼드로마)는 10개의 서로 다른 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생산하며, 그 중 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계를 사용하여 수행되는 올바른 분자의 정제는 다소 번거롭고 생성물 수율이 낮다.
다른 접근법에 따르면, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인(항체-항원 조합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 이루어질 수 있다. 제1 중쇄 불변 영역(CH1)은 융합체 중 적어도 하나에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유할 수 있다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및 원하는 경우 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 서열을 갖는 핵산은 별도의 발현 벡터에 삽입되고 적합한 숙주 유기체에 공동 형질감염된다. 이는 작제에 사용된 3개의 폴리펩타이드 사슬의 불균등한 비율이 최적의 수율을 제공하는 경우의 측면에서 3개의 폴리펩타이드 단편의 상호 비율을 조정하는 데 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 적어도 2개의 폴리펩타이드 사슬을 동일한 비율로 발현시켜 높은 수율을 초래하거나 그 비율이 특별한 의미가 없는 경우 하나의 발현 벡터에서 2개 또는 모두 3개의 폴리펩타이드 사슬에 대한 암호 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
이중특이적 항체는 한쪽 암(arm)에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 쪽 암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성 제공)을 가질 수 있다. 이러한 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 사슬 조합으로부터 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는데, 이는 이중특이적 분자의 절반에만 있는 면역글로불린 경쇄의 존재가 용이한 분리 방식을 제공하기 때문이다. 이러한 기술을 사용하여, 본원에 정의된 질병의 치료 또는 예방에서 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물에 접합시키기 위한 이중특이적 항체가 제조될 수 있다.
하이브리드 또는 이작용기성 항체는 생물학적으로, 즉 세포 융합 기술에 의해 유도되거나, 또는 화학적으로, 특히 가교제 또는 이황화-가교 형성 시약을 사용하여 유도될 수 있으며, 이는 전체 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
항체는 암세포 항원, 바이러스 항원, 미생물 항원 또는 종양 세포 또는 기질에 결합된 다른 항체에 면역특이적으로 결합하는 항체의 기능적으로 활성인 단편, 유도체 또는 유사체일 수 있다. 이와 관련하여, "기능적으로 활성"은 단편, 유도체 또는 유사체가 단편, 유도체 또는 유사체가 유래된 항체가 인식하는 것과 동일한 항원을 인식하는 항-항-아이디오타입 항체를 유도해낼 수 있음을 의미한다. 구체적으로, 예시적인 측면에서, 면역글로불린 분자의 아이디오타입의 항원성은 항원을 특이적으로 인식하는 CDR 서열의 C-말단인 프레임워크 및 CDR 서열의 결실에 의해 향상될 수 있다. 어떤 CDR 서열이 항원에 결합하는지 결정하기 위해, CDR 서열을 함유하는 합성 펩타이드는 관련 기술분야에 공지된 임의의 결합 검정 방법에 의해 항원과의 결합 검정에 사용될 수 있다.
다른 유용한 항체는 항체 단편, 예컨대 비제한적으로 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있는 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CH1 도메인을 함유하는 F(ab')2 단편, 및 F(ab')2 단편의 이황화 가교를 환원시켜 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함한다. 다른 유용한 항체는 항체의 중쇄 및 경쇄 이량체, 또는 이의 임의의 최소 단편, 예컨대 Fv 또는 단일 사슬 항체(SCA), 또는 항체와 동일한 특이성을 갖는 임의의 다른 분자이다.
추가적으로, 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 만들 수 있는 인간 및 비인간 부분을 모두 포함하는 키메라 및 인간화 단클론 항체와 같은 재조합 항체는 유용한 항체이다. 키메라 항체는 뮤린 단클론성 및 인간 면역글로불린 불변 영역에서 유래한 가변 영역을 갖는 것과 같이 서로 다른 동물 종에서 서로 다른 부분이 유래된 분자이다. 인간화 항체는 비인간 종 유래의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자 유래의 프레임워크 영역을 갖는 비인간 종 유래의 항체 분자이다. 이러한 키메라 및 인간화 단클론 항체는 관련 기술분야에 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다.
완전한 인간 항체는 내인성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 없지만 인간 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생산될 수 있다. 트랜스제닉 마우스는 선택된 항원, 예를 들어 본 개시내용의 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 사용하여 정상적인 방식으로 면역화된다. 항원에 대해 유도된 단클론 항체는 기존의 하이브리도마 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 트랜스제닉 마우스에 의해 수용된 인간 면역글로불린 전이유전자는 B 세포 분화 동안 재배열되고 이어서 클래스 전환 및 체세포 돌연변이를 겪는다. 따라서, 이러한 기술을 사용하면 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산하는 것이 가능하다. 인간 항체를 생산하기 위한 이 기술의 개요에 대해서는 Lonberg and Huszar(1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93)를 참조한다. 다른 인간 항체는 예를 들어 Abgenix, Inc.(캘리포니아주 프리먼트) 및 Genpharm(캘리포니아주 새너제이)에서 상업적으로 입수할 수 있다.
선택된 에피토프를 인식하는 완전 인간 항체는 "유도된 선택"으로 지칭되는 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 이 접근법에서 선택된 비인간 단클론 항체, 예를 들어 마우스 항체는 동일한 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체의 선택을 유도하는 데 사용된다. 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하여 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다.
항체는 항체 또는 이의 기능적 활성 단편의 융합 단백질일 수 있으며, 예를 들어, 여기서 항체는 항체가 아닌 다른 단백질(또는 이의 부분, 예컨대 단백질의 적어도 10개, 20개 또는 50개 아미노산 부분)에 대해 N-말단 또는 C-말단에서 공유 결합(예를 들어, 펩타이드 결합)을 통해 융합된다. 항체 또는 이의 단편은 불변 도메인의 N-말단에서 다른 단백질에 공유 연결될 수 있다.
항체는 변형되는, 즉 공유 부착이 항체가 이의 항원 결합 면역특이성을 유지하도록 하는 한, 임의의 유형의 분자의 공유 부착에 의해 변형되는 유사체 및 유도체를 포함한다. 예를 들어, 하지만 제한하려는 것은 아닌, 항체의 유도체 및 유사체는 추가로 변형된, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 세포 항체 단위 또는 다른 단백질에 대한 연결 등에 의해 변형된 것을 포함한다. 특정 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신 존재 하의 대사 합성 등을 포함하되 이에 제한되지 않는 공지된 기술에 의해 임의의 수많은 화학적 변형이 수행될 수 있다. 추가적으로, 유사체 또는 유도체는 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유할 수 있다.
접합체 내의 항체는 Fc 수용체와 상호작용하는 아미노산 잔기에 변형(예를 들어, 치환, 결실 또는 첨가)을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 특히, 항체는 항-Fc 도메인과 FcRn 수용체 사이의 상호작용에 관여하는 것으로 식별된 아미노산 잔기에 변형이 있는 항체를 포함한다. 암세포 항원에 면역특이적인 항체는, 예를 들어 Genentech(캘리포니아주 샌프란시스코)로부터 상업적으로 입수할 수 있거나, 예를 들어 화학적 합성 또는 재조합 발현 기술과 같은 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 암세포 항원에 대해 면역특이적인 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어 GenBank 데이터베이스 또는 이와 유사한 데이터베이스, 문헌 간행물로부터 또는 일상적인 클로닝 및 시퀀싱에 의해 수득될 수 있다.
특정 측면에서, 접합체의 항체는 단클론 항체, 예를 들어 뮤린 단클론 항체, 키메라 항체, 또는 인간화 항체일 수 있다. 일부 측면에서, 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fab 단편일 수 있다.
암의 치료 또는 예방에 공지된 항체는 본원에 기술된 화합물(들)에 접합될 수 있다. 암세포 항원에 대해 면역특이적인 항체는 상업적으로 입수할 수 있거나, 예를 들어 재조합 발현 기술과 같은 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 암세포 항원에 대해 면역특이적인 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어 GenBank 데이터베이스 또는 이와 유사한 데이터베이스, 문헌 간행물로부터 또는 일상적인 클로닝 및 시퀀싱에 의해 수득될 수 있다. 암 치료에 이용가능한 항체의 예로는 전이성 유방암 환자의 치료를 위한 인간화 항-HER2 단클론 항체; 비호지킨 림프종 환자의 치료를 위한 키메라 항-CD20 단클론 항체인 RITUXAN®(리툭시맙; Genentech); 난소암 치료용 뮤린 항체인 OVAREX®(오레고보맙; AltaRex Corporation, MA); 결장직장암 치료용 뮤린 IgG2a 항체인 Panorex(에드레콜로맙, Glaxo Wellcome, NC); 두경부암과 같은 표피 성장 인자 양성 암 치료를 위한 항-EGFR IgG 키메라 항체인 Cetuximab Erbitux(세툭시맙, Imclone Systems Inc., NY); 육종 치료용 인간화 항체인 Vitaxin(에타라시주맙, MedImmune, Inc., MD); 만성 림프구성 백혈병(CLL)의 치료를 위한 인간화 IgG1 항체인 Campath I/H(알렘투주맙, Leukosite, MA); 급성 골수성 백혈병(AML) 치료를 위한 인간화 항-CD33 IgG 항체인 Smart MI95(Protein Design Labs, Inc., CA); 비호지킨 림프종 치료를 위한 인간화 항-CD22 IgG 항체인 LymphoCide(에프라투주맙, Immunomedics, Inc., NJ); 비호지킨 림프종 치료를 위한 인간화 항-HLA-DR 항체인 Smart ID10(Protein Design Labs, Inc., CA); 비호지킨 림프종의 치료를 위한 방사선표지된 뮤린 항-HLA-Dr10 항체인 Oncolym(Techniclone, Inc., CA); 호지킨병 또는 비호지킨 림프종의 치료를 위한 인간화 항-CD2 mAb인 Allomune(BioTransplant, CA); 폐암 및 결장직장암 치료를 위한 항-VEGF 인간화 항체인 Avastin(베바시주맙, Genentech, Inc., CA); 비호지킨 림프종의 치료를 위한 항-CD22 항체인 Epratuzamab(Immunomedics, Inc., NJ 및 Amgen, CA); 및 결장직장암 치료를 위한 인간화 항-CEA 항체인 CEAcide(Immunomedics, NJ)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
접합체에 유용한 다른 항체로는 트라스투주맙, 젬투주맙, 퍼투주맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 다라투무맙, STI-6129, 린투주맙, huMy9-6, 벨란타맙, 인다툭시맙, 디누툭시맙, 항-CD38 A2 항체, buAT15/3 H3s 항체, 이브리투모맙, 토시투모맙, 파니투무맙, 트레멜리무맙, 티실리무맙, 카투막소맙 및 벨투주맙을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 측면에서, 항체는 리툭시맙, 트라스투주맙, 퍼투주맙, huMy9-6, 린투주맙 및 젬투주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 접합체에 유용한 다른 항체로는 폴라투주맙, J591, 로보투주맙 및 사시투주맙을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
접합체에 유용한 다른 항체로는 다음 항원에 대한 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: CA125(난소), CA15-3(암종), CA19-9(암종), L6(암종), 루이스 Y(암종), 루이스 X(암종), 알파 태아단백질(암종), CA 242(결장직장), 태반 알칼리성 포스파타제(암종), 전립선 특이 항원(전립선), 전립선 산성 포스파타제(전립선), 표피 성장 인자(암종), MAGE-1(암종), MAGE-2(암종), MAGE-3(암종), MAGE-4(암종), 항트랜스페린 수용체(암종), p97(흑색종), MUC1-KLH(유방암), CEA(결장직장), gp100(흑색종), MART1(흑색종), PSA(전립선), IL-2 수용체(T세포 백혈병 및 림프종), CD20(비호지킨 림프종), CD52(백혈병), CD33(백혈병), CD22(림프종), 인간 융모막 성선 자극 호르몬(암종), CD38(다발성 골수종), CD40(림프종), 뮤신(암종), P21(암종), MPG(흑색종) 및 Neu 종양유전자 산물(암종). 일부 특이적이고 유용한 항체로는 BR96 mAb(Trail, P. A., et al Science (1993) 261, 212-215), BR64(Trail, PA, et al Cancer Research (1997) 57, 100-105), S2C6 mAb와 같은 CD40 항원에 대한 mAb(Francisco, J. A., et al Cancer Res. (2000) 60:3225-3231), 1F6 mAb와 같은 CD70 항원에 대한 mAb, 및 AC10과 같은 CD30 항원에 대한 mAb를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 종양 연관 항원에 결합하는 많은 다른 내재화 항체가 사용될 수 있으며 검토되었다.
본 접합체가 결합할 수 있는 다른 항원으로는 5T4, ACE, ADRB3, AKAP-4, ALK, AOC3, APP, Axin1, AXL, B7H3, B7-H4, BCL2, BCMA, bcr-abl, BORIS, BST2, C242, C4.4a, CA 125, CA6, CA9, CAIX, CCL11, CCR5, CD123, CD133, CD138, CD142, CD15, CD15-3, CD171, CD179a, CD18, CD19, CD19-9, CD2, CD20, CD22, CD23, CD24, CD25, CD27L, CD28, CD3, CD30, CD31, CD300LF, CD33, CD352, CD37, CD38, CD4, CD40, CD41, CD44, CD44v6, CD5, CD51, CD52, CD54, CD56, CD62E, CD62P, CD62L, CD70, CD71, CD72, CD74, CD79a, CD79b, CD80, CD90, CD97, CD125, CD138, CD141, CD147, CD152, CD154, CD326, CEA, CEACAM5, CFTR, 응집 인자, cKit, Claudin 3, Claudin 18.2, CLDN6, CLEC12A, CLL-1, cll3, c-MET, Crypto 단백질, CS1, CTLA-4, CXCR2, CXORF61, Cyclin Bl, CYP1B1, Cadherin-3, Cadherin-6, DLL3, E7, EDNRB, EFNA4, EGFR, EGFRvIII, ELF2M, EMR2, ENPP3, EPCAM, EphA2, Ephrin A4, Ephrin B2, EPHB4, ERBB2 (Her2/neu), ErbB3, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), ETBR, ETV6-AML, FAP, FCAR, FCRL5, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FLT3, 엽산 수용체 알파, 엽산 수용체 베타, FOLR1, Fos-관련 항원 1, 푸코실 GM1, GCC, GD2, GD3, GloboH, GM3, GPC1, GPC2, GPC3, gplOO, GPNMB, GPR20, GPRC5D, GUCY2C, HAVCR1, HER2, HER3, HGF, HMI.24, HMWMAA, HPV E6, hTERT, 인간 텔로머라제 역전사효소, ICAM, ICOS-L, IFN-α, IFN-γ, IGF-I 수용체, IGLL1, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-13Ra2, IL-l lRa, IL-1 수용체, IL-12 수용체, IL-23 수용체, IL-13 수용체, IL-22 수용체, IL-4 수용체, IL-5 수용체, IL-6 수용체, 인터페론 수용체, 인테그린(α4, αvβ3, αvβ5, αvβ6, α1β4, α4β1, α4β7, α5β1, α6β4, αIIbβ3 인터진 포함), 인테그린 알파V, 장 카르복실 에스테라제, KIT, LAGE-la, LAIR1, LAMP-1, LCK, 레구메인, 루이스Y, LFA-1(CD11a), L-셀렉틴(CD62L), LILRA2, LIV-1, LMP2, LRRC15, LY6E, LY6K, LY75, MAD-CT-1, MAD-CT-2, MAGE Al, 멜란A/MARTl, 메소텔린, ML-IAP, MSLN, 뮤신, MUC1, MUC16, mut hsp70-2, MYCN, 미오스타틴, NA17, NaPi2b, NCA-90, NCAM, 넥틴-4, NGF, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, NY-BR-1, NY-ESO-1, o-아세틸-GD2, OR51E2, OY-TES1, p53, p53 돌연변이체, PANX3, PAP, PAX3, PAX5, p-CAD, PCTA-1/갈렉틴 8, PD-L1, PD-L2, PDGFR, PDGFR-베타, 포스파티딜세린, PIK3CA, PLAC1, 폴리시알산, 프로스타제, 전립선 암종 세포, 프로스테인, 슈도모나스 아에루기노사, 광견병, 서바이빈 및 텔로머라제, PD-1, PRSS21, PSCA, PSMA, PTK7, RAGE-1, RANKL, Ras 돌연변이체, 호흡기 세포융합 바이러스, 적모원숭이 인자, RhoC, RON, ROR1, ROR2, RU1, RU2, 육종 전좌 중단점, SART3, SLAMF7, SLC44A4, sLe, SLITRK6, 정자 단백질 17, 스핑고신-1-포스페이트, SSEA-4, SSX2, STEAP1, TAG72, TARP, TCRβ, TEM1/CD248, TEM7R, 테나신 C, TF, TGF-1, TGF-β2, TNF-α, TGS5, Tie 2, TIM-1, Tn Ag, TRAC, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TROP-2, TRP-2, TRPV1, TSHR, 종양 항원 CTAA16.88, 티로시나제, UPK2, VEGF, VEGFR1, VEGFR2, 비멘틴, WTl, 및/또는 XAGE1을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
CD40, OX40L, Endoglin, DEC-205, 4-1BBL, CD36, CD36, CD204, MARCO, DC-SIGN, CLEC9A, CLEC5A, Dectin 2, CLEC10A, CD206, CD64, CD32A, CD1A, HVEM, CD32B, PD-L1, BDCA-2, XCR-1 및 CCR2과 같은 항원 제시 세포와 연관된 항원에 결합하는 항체도 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물(들)에 접합될 수 있다.
본원에 기재된 접합체의 항체는 활성화된 림프구 상에서 발현되는 수용체 또는 수용체 복합체 둘 모두에 결합할 수 있다. 수용체 또는 수용체 복합체는 면역글로불린 유전자 슈퍼패밀리 구성원, TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원, 인테그린, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체, 주요 조직적합성 단백질, 렉틴 또는 보체 제어 단백질을 포함할 수 있다. 적합한 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원의 비제한적인 예는 CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD22, CD28, CD79, CD90, CD152/CTLA-4, PD-1 및 ICOS이다. 적합한 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원의 비제한적 예는 CD27, CD40, CD95/Fas, CD134/OX40, CD137/4-1BB, TNF-R1, TNFR-2, RANK, TACI, BCMA, 오스테프로테게린, Apo2/TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4 및 APO-3이다. 적합한 인테그린의 비제한적 예는 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD29, CD41, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD103 및 CD104이다. 적합한 렉틴의 비제한적 예는 C-유형, S-유형 및 I-유형 렉틴이다.
일부 측면에서, 본 개시내용에 유용한 항체로는 3F8, 8H9, 아바고보맙, 압식시맙(REOPRO®), 아비투주맙, 아브레제키맙, 아브릴루맙, 액톡수맙, 아달리무맙(HUMIRA®), 아데카투무맙, 아두카누맙, 아파세비쿠맙, 아펠리모맙, 아푸투주맙, 알라시주맙, ALD518, 알렘투주맙(CAMPATH®), 알리로쿠맙(PRALUENT®), 알투모맙, 아마툭시맙, 아나투모맙, 안데칼릭시맙, 아네투맙, 아니프롤루맙, 안루킨주맙, 아폴리주맙, 아프루투맙, 아르시투모맙(CEA-SCAN®), 아스크린바쿠맙, 아셀리주맙, 아티도톡수맙, 아틀리주맙(토실리주맙, ACTEMRA®, ROACTEMRA®), 아테졸리주맙(TECENTRIQ®), 아티누맙, 아토롤리무맙, 아벨루맙(Bavencio), 아진툭시주맙, 벨란타맙, 바피뉴주맙, 바실릭시맙(SIMULECT®), 바비툭시맙, BCD-100, 벡투모맙(LYMPHOSCAN®), 베겔로맙, 벨란타맙, 벨리무맙(BENLYSTA®), 베마리투주맙, 벤랄리주맙(FASENRA®), 베르메키맙, 베르산리맙, 베르틸리무맙, 베실레소맙(SCINITIMUN®), 베바시주맙(AVASTIN®), 베즐로톡수맙(ZINPLAVA®), 비시로맙(FIBRISCINT®), 비마그루맙, 비메키주맙, 비르타미맙, 비바투주맙, 블레셀루맙, 블리나투모맙, 블론투베트맙, 블로소주맙, 보코시주맙, 브라지쿠맙, 브렌툭시맙, 브리아키누맙, 브로달루맙(SILIQ™), 브로루시주맙(BEOVU® 브론틱투주맙, 부로수맙 (CRYSVITA®), 카비랄리주맙, 카플라시주맙(CABLIVI®), 카미단루맙, 캄렐리주맙, 카나키누맙(ILARIS®), 칸투주맙, 카프로맙, 칼루맙, 카로툭시맙, 카투막소맙(REMOVAB®), cBR96, CC49, 세델리주맙, 세미플리맙(LIBTAYO®), 세르구투주맙, 서트렐리맙, 세르톨리주맙, 세툭시맙(ERBITUX®), 시비사타마브, 시름투주맙, 시타투주맙, 식수투무맙, 클라자키주맙, 클레놀릭시맙, 클리바투주맙, 코드리투주맙, 코페투주맙, 콜툭시맙, 코나투무맙, 콘시주맙, 코스프로빅시맙, CR6261, 크레네주맙, 크리잔리주맙(ADAKVEO®), 크로테두맙, 쿠사투주맙, 다세투주맙, 다클리주맙(ZINBRYTA®), 달로투주맙, 다피롤리주맙, 다라투무맙(DARZALEX®), 덱트레쿠맙, 뎀시주맙, 데닌투주맙, 데노수맙(PROLIA®), 데파툭시주맙, 데를로툭시맙, 데투모맙, 데자미주맙, 디누툭시맙(UNITUXIN®), 디리다부맙, 도마그로주맙, 도스타리맙, 도리모맙, 도르릭시주맙, 드로지투맙, DS-8201, 둘리고투주맙, 두필루맙(DUPIXENT®), 더발루맙(IMFINZI®), 두시기투맙, 에크로멕시맙, 에쿨리주맙(SOLIRIS®), 에도바코맙, 에드레콜로맙(PANOREX®), 에팔리주맙(RAPTIVA®), 에펑구맙(MYCOGRAB®), 엘델루맙, 엘레자누맙, 엘젬투맙, 엘로투주맙(EMPLICITI®), 엘실리모맙, 에막투주맙 에마팔루맙(GAMIFANT®), 에미베투주맙, 에미시주맙(HEMLIBRA®), 에나포타마브, 에나바투주맙, 엔포투맙(PADCEV®), 엔리모맙, 에노블리투주맙, 에노키주맙, 에노티쿠맙, 엔시툭시맙, 에피투모맙, 엡티네주맙(VYEPTI® 에프라투주맙, 에레누맙(AIMOVIG®), 에를리주맙, 에르투막소맙(REXOMUN®), 에타라시주맙(ABEGRIN®), 에티길리맙, 에트롤리주맙, 에비나쿠맙, 에볼로쿠맙(REPATHA®), 엑스비비루맙, 파놀레소맙(NEUTROSPEC®), 파라리모맙, 파리시맙, 파레투주맙, 파시누맙, FBTA05, 펠비주맙, 페자키누맙, 피바투주맙, 피클라투주맙, 피기투무맙, 피리부맙, 플란보투맙, 플레티쿠맙, 플로테투주맙, 폰톨리주맙(HUZAF®), 포랄루맙, 포라비루맙, 프레마네주맙(AJOVY®), 프레솔리무맙, 프로보시맙, 프루네베트맙, 풀란우맙, 후툭시맙, 갈카네주맙 (EMGALITY®), 갈릭시맙, 간코타맙, 가니투맙, 간테네루맙, 가빌리모맙, 제디부맙, 젬투주맙, 게보키주맙, 길베트맙, 짐실루맙, 기렌툭시맙, 글렘바투무맙, 골리무맙(SIMPONI®), 고밀릭시맙, 구셀쿠맙(TREMFYA®), huMy9-6, 이아나루맙, 이발리주맙 (TROGARZO®), IBI308, 이브리투모맙, 이크루쿠맙, 이다루시주맙(PRAXBIND®), 이파보투주맙, 이고보맙(INDIMACIS-125), 일라다투주맙, IMAB362, 이말루맙, 이마프렐리맙, 임시로맙(MYOSCINT®), 임가투주맙, 인클라쿠맙, 인다툭시맙, 인두사투맙, 이네빌리주맙, 인플릭시맙(REMICADE®), 인테투무맙, 이노리모맙, 이노투주맙, 이오맙-B, 이필리무맙, 이라투무맙, 이사툭시맙(SARCLISA®), 이스칼리맙, 이스티라투맙, 이톨리주맙, 익세키주맙(TALTZ®), 켈릭시맙, 라베투주맙(CEA-CIDE™), 락노투주맙, 라디라투주맙, 람팔리주맙, 라나데루맙(TAKHZYRO®), 란도그로주맙, 라프리툭시맙, 라르카빅시맙, 레브리키주맙, 레말레소맙, 렌달리주맙, 렌베르비맙, 렌질루맙, 레르델리무맙, 레론리맙, 레소파부맙, 레톨리주맙, 렉사투무맙, 리비비루맙, 리파스투주맙, 리겔리주맙, 릴로토맙, 린투주맙, 리릴루맙, 로델시주맙, 로키베트맙, 론카스툭시맙, 로보투주맙, 로사툭시맙, 루카투무맙, 루리주맙, 루밀릭시맙, 룸레투주맙, 루파르투맙, 루티키주맙, 마파투무맙, 마게툭시맙, 마르스타시맙, 마슬리모맙, 마투주맙, 마브릴리무맙, 메폴리주맙(NUCALA®), 메텔리무맙, 밀라투주맙, 민레투모맙, 미리키주맙, 미르베툭시맙, 미투모맙, 모도툭시맙, 몰랄리주맙, 모가물리주맙(POTELIGEO®), 모롤리무맙, 모수네투주맙, 모타비주맙(NUMAX®), 목세투모맙(LUMOXITI®), 무로모나브-CD3(ORTHOCLONE OKT3®), 나콜로맙, 나밀루맙, 나프투모맙, 나라툭시맙, 나르나투맙, 나탈리주맙(TYSABRI®), 나비식시주맙, 나비부맙, 낙시타맙, 네바쿠맙, 네시투무맙(PORTRAZZA®), 네모리주맙, NEOD001, 네렐리모맙, 네스바쿠맙, 네타키맙, 니모투주맙(THERACIM®), 니르세비맙, 니볼루맙, 노페투모맙, 오빌톡사시맙(ANTHIM®), 오비누투주맙, 오카라투주맙, 오크렐리주맙(OCREVUS®), 오둘리모맙, 오파투무맙(ARZERRA®), 올라라투맙(LARTRUVO®), 올레클루맙, 올렌달리주맙, 올로키주맙, 오말리주맙(XOLAIR®), 옴부르타맙, OMS721, 오나르투주맙, 온테시주맙, 온툭시주맙, 온바틸리맙, 오피시누맙, 오포투주맙, 오레고보맙(OVAREX), 오르티쿠맙, 오텔릭시주맙, 오틸리맙, 오틀레르투주맙, 옥셀루맙, 오자네주맙, 오조가미신, 오조랄리주맙, 파기박시맙, 팔리비주맙(SYNAGIS®), 팜레블루맙, 파니투무맙(VECTIBIX®), 판코마브, 파노바쿠맙, 파사투주맙, 파스코리주맙, 파소툭시주맙, 파테클리주맙, 파트리투맙, PDR001, 펨브롤리주맙, 펨투모맙(THERAGYN®), 페라키주맙, 퍼투주맙(OMNITARG®), 펙셀리주맙, 피딜리주맙, 피나투주맙, 핀투모맙, 플라쿨루맙, 폴라투주맙(폴리비), 프레잘루맙, 플로잘리주맙, 포갈리주맙, 포네주맙, 포르가빅시맙, 프라시네주맙, 프레잘리주맙, 프릴릭시맙, 프리톡사시맙, 프리투무맙, PRO 140, 퀼리주맙, 라코투모맙, 라드레투맙, 라피비루맙, 랄판시주맙, 라무시루맙, 라네베트맙, 라니비주맙(LUCENTIS®), 라바갈리맙, 라불리주맙(ULTOMIRIS®), 락시바쿠맙, 레파네주맙, 레가비루맙, REGN-EB3, 레나트리맙, 렘톨루맙, 레슬리주맙(CINQAIR®), 릴로투무맙, 리누쿠맙, 리산키주맙(SKYRIZI®), 리툭시맙(RITUXAN®), 리바바주맙, rmab, 로바투무맙, 롤레두맙, 로밀키맙, 로모소주맙(EVENITY®), 론탈리주맙, 로스만투주맙, 로발피투주맙, 로벨리주맙(LEUKARREST®), 로자놀릭시주맙, 루플리주맙(ANTOVA), SA237, 사시투주맙, 사말리주맙, 삼로타맙, 사릴루맙(KEVZARA®), 사트랄리주맙, 사투모맙 펜데타이드, 세쿠키누맙(COSENTYX®), 셀리크렐루맙, 세리반투맙, 세톡사시맙, 세트루수맙, 세비루맙, SGN-CD19A, SHP647, 시브로투주맙, 시팔리무맙, 실툭시맙, 심투주맙, 시플리주맙, 시르트라투맙, 시루쿠맙, 소피투주맙, 솔라네주맙, 솔리토맙, 소넵시주맙, 손투주맙, 스파탈리주맙, 스타물루맙, STI-6129, 술레소맙(LEUKOSCAN®), 섭타부맙, 수팀리맙, 수비주맙, 수브라톡수맙, 타발루맙, 타카투주맙(AFP-CIDE®), 타도시주맙, 탈라코투주맙, 탈리주맙, 탐투베트맙, 타네주맙, 타플리투모맙 파톡스, 타렉스투맙, 타볼리맙, 테피바주맙(AUREXIS®), 텔리모맙, 텔리소투주맙, 테시돌루맙, 테트라세탄, 테툴로맙, 테나투모맙, 테넬릭시맙, 테프로투무맙(TEPEZZA®), 테플리주맙, 테제펠루맙, TGN1412, 티불리주맙, 티실리무맙(TREMELIMUMAB®), 티가투주맙, 티미구투주맙, 티모루맙, 티라골루맙, 티라고투맙, 티슬레리주맙, 티소투맙, 티욱세탄, 틸드라키주맙(ILUMYA®), TNX-650, 토실리주맙(아틀리주맙, ACTEMRA®), 토무조툭시맙, 토랄리주맙, 토사톡수맙, 토시투모맙(BEXXAR®), 토베투맙, 트랄로키누맙, 트라스투주맙(HERCEPTIN®), TRBS07, 트레갈리주맙, 트레멜리무맙, 트레보그루맙, 투코투주맙, 투비루맙, 우르톡사주맙, 우스테키누맙(STELERA®), 유블리툭시맙, 울로쿠플루맙, 우레루맙, 유토밀루맙, 바다스툭시맙, 바날리맙, 반도르투주맙, 반틱투맙, 바누시주맙, 바팔릭시맙, 바리사쿠맙, 바릴루맙, 바텔리주맙, 베돌리주맙, 벨투주맙, 베팔리모맙, 베센쿠맙, 비실리주맙 (NUVION®), 보바릴리주맙, 볼록식시맙(HUMASPECT®), 본레롤리주맙, 보프라텔리맙, 보세투주맙, 보투무맙, 부나키주맙, 젠투주맙, XMAB-5574, 잘루투무맙(HuMEX-EGFr), 자놀리무맙(HuMAX-CD4), 자툭시맙, 제노쿠투주맙, 지랄리무맙, 졸베툭시맙 또는 졸리모맙을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 측면에서, 본 개시내용에 유용한 항체는 J591 및 벨란타맙을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 측면에서, 결합 모이어티는 표 A에 있는 항체의 6개 CDR(즉, 가변 중쇄 또는 중쇄의 3개 CDR 및 동일한 항체의 가변 경쇄 또는 경쇄의 3개 CDR)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다.
용어 "Kabat 넘버링" 및 유사한 용어는 관련 기술분야에서 인식되어 있고 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 잔기를 넘버링하는 시스템을 지칭한다. 일부 측면에서, CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다(예를 들어, Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391 및 Kabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조). Kabat 넘버링 시스템을 사용하면, 항체 중쇄 분자 내의 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 31 내지 35로서, 이는 선택적으로 35 다음에 1개 또는 2개의 추가적인 아미노산(Kabat 넘버링 체계에서 35A 및 35B로 지칭됨)을 포함할 수 있는 것(CDR1), 아미노산 위치 50 내지 65(CDR2), 및 아미노산 위치 95 내지 102(CDR3)에 존재한다. Kabat 넘버링 시스템을 사용하면 항체 경쇄 분자 내의 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 24 내지 34(CDR1), 아미노산 위치 50 내지 56(CDR2) 및 아미노산 위치 89 내지 97(CDR3)에 존재한다. 일부 측면에서, 결합 모이어티는 표 A에 있는 항체의 6개 Kabat-정의된 CDR(즉, 가변 중쇄 또는 중쇄의 3개 Kabat-정의된 CDR 및 동일한 항체의 가변 경쇄 또는 경쇄의 3개 Kabat-정의된 CDR)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CDR은 면역글로불린 구조 루프의 위치를 지칭하는 Chothia 넘버링 체계에 따라 결정될 수 있다(예를 들어, Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C et al., (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A et al., (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82; 및 미국 특허 제7,709,226호 참조). 전형적으로, Kabat 넘버링 규약을 사용하는 경우 Chothia CDR-H1 루프는 중쇄 아미노산 26 내지 32, 33 또는 34에 존재하고, Chothia CDR-H2 루프는 중쇄 아미노산 52 내지 56에 존재하며, Chothia CDR-H3 루프는 중쇄 아미노산 95 내지 102에 존재하는 반면, Chothia CDR-L1 루프는 경쇄 아미노산 24 내지 34에 존재하고, Chothia CDR-L2 루프는 경쇄 아미노산 50 내지 56에 존재하며, Chothia CDR-L3 루프는 경쇄 아미노산 89 내지 97에 존재한다. Kabat 넘버링 규약을 사용하여 넘버링한 경우 Chothia CDR-H1 루프의 끝은 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 달라진다(이것은 Kabat 넘버링 체계가 H35A 및 H35B에 삽입을 배치하기 때문이며; 35A와 35B가 모두 없다면, 루프는 32에서 끝나고; 35A만 있다면, 루프는 33에서 끝나며; 35A와 35B가 모두 있다면 루프는 34에서 끝남).
일부 측면에서, 결합 모이어티는 표 A에 있는 항체의 6개 Chotia-정의된 CDR(즉, 가변 중쇄 또는 중쇄의 3개 Chotia-정의된 CDR 및 동일한 항체의 가변 경쇄 또는 경쇄의 3개 Chotia-정의된 CDR)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 측면에서, 결합 모이어티는 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이며, 여기서 Chotia 및 Kabat CDR은 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 측면에서, 결합 모이어티는 표 A에 있는 항체의 Kabat CDR과 Chothia CDR의 조합을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다.
일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CDR은 문헌[Lefranc M-P, (1999) The Immunologist 7: 132-136 및 Lefranc M-P et al., (1999) Nucleic Acids Res 27: 209-212]에 기술된 바와 같은 IMGT 넘버링 체계에 따라 결정될 수 있다. IMGT 넘버링 체계에 따르면, VH-CDR1은 위치 26 내지 35에 있고, VH-CDR2는 위치 51 내지 57에 있고, VH-CDR3은 위치 93 내지 102에 있고, VL-CDR1은 위치 27 내지 32에 있고, VL-CDR2는 위치 50 내지 52에 있고, VL-CDR3은 위치 89 내지 97에 있다. 일부 측면에서, 결합 모이어티는 표 A에 있는 항체의 6개 IMGT-정의된 CDR(즉, 가변 중쇄 또는 중쇄의 3개의 IMGT-정의된 CDR 및 동일한 항체의 가변 경쇄 또는 경쇄의 3개의 IMGT-정의된 CDR), 예를 들어 상기 문헌 Lefranc M-P (1999) 및 상기 문헌 Lefranc M-P et al., (1999)에 기재된 것을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다.
일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CDR은 문헌[MacCallum RM et al., (1996) J Mol Biol 262: 732-745]에 따라 결정될 수 있다. 또한, 예를 들어, 문헌[Martin A. "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," in Antibody Engineering, Kontermann and Dubel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001)]을 참조한다. 일부 측면에서, 결합 모이어티는 표 A에 있는 항체의 6개 MacCallum-정의된 CDR(즉, 가변 중쇄 또는 중쇄의 3개의 MacCallum-정의된 CDR 및 동일한 항체의 가변 경쇄 또는 경쇄의 3개의 MacCallum-정의된 CDR), 예를 들어 MacCallum RM 등의 방법에 의해 결정된 것을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다.
일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CDR은 Kabat CDR과 Chothia 구조 루프 사이의 절충을 나타내는 AbM 초가변 영역을 지칭하는 AbM 넘버링 체계에 따라 결정될 수 있으며, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어(Oxford Molecular Group, Inc.)에 의해 사용된다. 일부 측면에서, 결합 모이어티는 AbM 넘버링 체계에 의해 결정된 표 A에 있는 항체의 6개의 AbM-정의된 CDR(즉, 가변 중쇄 또는 중쇄의 3개의 AbM-정의된 CDR 및 동일한 항체의 가변 경쇄 또는 경쇄의 3개의 AbM-정의된 CDR)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다.
일부 측면에서, 결합 모이어티는 CD33에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD33에 결합하고 본원에 전체 내용이 참고로 포함되는 미국 특허 제10,711,062호에 개시된 항-CD33 항체의 6개 CDR을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD33에 결합하고 미국 특허 제10,711,062호에 개시된 항-CD33 항체의 VH 및 VL을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD33에 결합하고, 본원에 전체 내용이 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2021/0047404호에 개시된 항-CD33 항체의 6개 CDR을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD33에 결합하고 미국 특허 출원 공개 제2021/0047404호에 개시된 항-CD33 항체의 VH 및 VL을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD33에 결합하고, 본원에 전체 내용이 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2020/0297764호에 개시된 항-CD33 항체의 6개 CDR을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD33에 결합하고 미국 특허 출원 공개 제2020/0297764호에 개시된 항-CD33 항체의 VH 및 VL을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD33에 결합하고 표 A에 제공된 항-CD33 항체(예를 들어, CD33-A, CD33-B 또는 CD33-C)의 6개 CDR을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD33에 결합하고 표 A에 제공된 항-CD33 항체 CD33-D의 6개 CDR을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD33에 결합하고 표 A에 제공된 항-CD33 항체 CD33 huMy9-6의 6개 CDR을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD33에 결합하고 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD33에 결합하고, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD33에 결합하고, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD33에 결합하고, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD33에 결합하고, 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD33에 결합하고, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 측면에서, 결합 모이어티는 PSMA에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 PSMA에 결합하고 본원에 전체 내용이 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2019/0022205호에 개시된 항-PSMA 항체의 6개 CDR을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 PSMA에 결합하고 미국 특허 출원 공개 제2019/0022205호에 개시된 항-PSMA 항체의 VH 및 VL을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 PSMA에 결합하고 본원에 전체 내용이 참고로 포함되는 미국 특허 제10,100,126호에 개시된 항-PSMA 항체의 6개 CDR을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 PSMA에 결합하고 미국 특허 제10,100,126호에 개시된 항-PSMA 항체의 VH 및 VL을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 PSMA에 결합하고 본원에 전체 내용이 참고로 포함되는 미국 특허 제8,470,330호에 개시된 항-PSMA 항체의 6개 CDR을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 PSMA에 결합하고 미국 특허 제8,470,330호에 개시된 항-PSMA 항체의 VH 및 VL을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 PSMA에 결합하고 표 A에 제공된 항-PSMA 항체(즉, PSMA-A, PSMA-B 또는 PSMA-C)의 6개 CDR을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 PSMA에 결합하고 표 A에 제공된 항-PSMA 항체 PSMA-D의 6개 CDR을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 PSMA에 결합하고 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 PSMA에 결합하고 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 PSMA에 결합하고, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 PSMA에 결합하고, 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 측면에서, 결합 모이어티는 HER2에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 HER2에 결합하고, 본원에 전체 내용이 참고로 포함되는 미국 특허 제7,862,817호에 개시된 항-HER2 항체의 6개 CDR을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 HER2에 결합하고 미국 특허 제7,862,817호에 개시된 항-HER2 항체의 VH 및 VL을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 HER2에 결합하고, 본원에 전체 내용이 참고로 포함되는 미국 특허 제7,850,966호에 개시된 항-HER2 항체의 6개 CDR을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 HER2에 결합하고 미국 특허 제7,850,966호에 개시된 항-HER2 항체의 VH 및 VL을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 HER2에 결합하고, 본원에 전체 내용이 참고로 포함되는 PCT 국제 공개 번호 WO2016/201051에 개시된 항-HER2 항체의 6개 CDR을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 HER2에 결합하고 PCT 국제 공개 번호 WO2016/201051에 개시된 항-HER2 항체의 VH 및 VL을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 HER2에 결합하고 표 A에 제공된 항-HER2 항체(즉, HER2-A, HER2-B 또는 HER2-C)의 6개 CDR을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 HER2에 결합하고, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 HER2에 결합하고, 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 HER2에 결합하고, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 측면에서, 결합 모이어티는 CD20에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD20에 결합하고 표 A에 제공된 항-CD20 항체 CD20-A의 6개 CDR을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD20에 결합하고 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 측면에서, 결합 모이어티는 CD79b에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD79b에 결합하고 표 A에 제공된 항-CD79b 항체 CD79b-A의 6개 CDR을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD79b에 결합하고 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 측면에서, 결합 모이어티는 BCMA에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 BCMA에 결합하고 표 A에 제공된 항-BCMA 항체 BCMA-A의 6개 CDR을 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 BCMA에 결합하고 서열번호 35 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 불변 영역을 포함한다. 링커는 불변 영역의 아미노산에 부착될 수 있다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CH1 도메인을 포함한다. 링커는 CH1 도메인의 아미노산에 부착될 수 있다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CH2 도메인을 포함한다. 링커는 CH2 도메인의 아미노산에 부착될 수 있다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CH3 도메인을 포함한다. 링커는 CH3 도메인의 아미노산에 부착될 수 있다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CL 도메인을 포함한다. 링커는 CL 도메인의 아미노산에 부착될 수 있다.
일부 측면에서, 불변 영역, CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 또는 CL 도메인은 조작된 불변 영역, CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 또는 CL 도메인이다.
일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 중쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 중쇄 불변 영역을 포함한다. 링커는 중쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 중쇄 불변 영역의 아미노산에 부착될 수 있다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 IgG 중쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 IgG 중쇄 불변 영역을 포함한다. 링커는 IgG 중쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 IgG 중쇄 불변 영역의 아미노산에 부착될 수 있다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 IgG1 중쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함한다. 링커는 IgG1 중쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산에 부착될 수 있다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 IgG4 중쇄 불변 영역을 포함한다. 링커는 IgG4 중쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 IgG4 중쇄 불변 영역의 아미노산에 부착될 수 있다.
일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 경쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 경쇄 불변 영역을 포함한다. 링커는 경쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 경쇄 불변 영역의 아미노산에 부착될 수 있다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 카파 경쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다. 링커는 카파 경쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 카파 경쇄 불변 영역의 아미노산에 부착될 수 있다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 감마 경쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 감마 경쇄 불변 영역을 포함한다. 링커는 감마 경쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 감마 경쇄 불변 영역의 아미노산에 부착될 수 있다.
일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 EU 넘버링에 따른 중쇄 위치 S239에 조작된 시스테인을 포함한다. S239C에는 링커가 부착될 수 있다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 EU 넘버링에 따른 중쇄 위치 K334에 조작된 시스테인을 포함한다. K334C에는 링커가 부착될 수 있다.
따라서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 서열번호 19, 서열번호 20, 또는 서열번호 21의 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
항체 또는 이의 항원 결합 부분은 서열번호 26의 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
항체 또는 이의 항원 결합 부분은 서열번호 37의 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 링커는 EU 넘버링에 따라 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 중쇄 Q295에 부착될 수 있다.
분자 표적 또는 관심 항원에 "결합하는" 항체는 항체가 항원을 발현하는 세포를 표적화하는 데 유용하도록 충분한 친화성으로 해당 항원에 결합할 수 있는 것이다.
본 개시내용에서, "Bm" 기는 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 하나보다 많은 화합물에 접합될 수 있다. 일부 측면에서, "Bm"은 1 내지 10개의 화합물에 접합될 수 있다. 일부 측면에서, "Bm"은 1 내지 9개의 화합물에 접합될 수 있다. 일부 측면에서, "Bm"은 1 내지 8개의 화합물에 접합될 수 있다. 일부 측면에서, "Bm"은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 화합물에 접합될 수 있다. 일부 측면에서, "Bm"은 7개 또는 8개의 화합물에 접합될 수 있다. 일부 측면에서, "Bm"은 5개의 화합물에 접합된다. 일부 측면에서, "Bm"은 6개의 화합물에 접합된다. 일부 측면에서, "Bm"은 7개의 화합물에 접합된다. 일부 측면에서, "Bm"은 8개의 화합물에 접합된다. 일부 측면에서, "Bm"은 9개의 화합물에 접합된다.
V. 조성물 및 사용 방법
본원에 기재된 접합체 및/또는 화합물은 약제학적으로 또는 약제학적으로 허용되는 염의 형태일 수 있다. 일부 측면에서, 이러한 염은 무기 또는 유기 산 또는 염기로부터 유도된다.
적합한 산 부가 염의 예로는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠 술포네이트, 바이술페이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캠퍼 술포네이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 다이글루코네이트, 도데실술페이트, 에탄술포네이트, 푸마레이트, 루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 2-하이드록시에탄술포네이트, 락테이트, 말리에이트, 메탄술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 3-페닐-프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트 및 운데카노에이트를 포함한다.
적합한 염기 부가염의 예로는 암모늄염; 나트륨염 및 칼륨염과 같은 알칼리 금속염; 칼슘염 및 마그네슘염과 같은 알칼리 토금속염; 다이사이클로헥실아민 염, N-메틸-D-글루카민과 같은 유기 염기와의 염; 아르기닌, 라이신 등과 같은 아미노산과의 염을 포함한다.
예를 들어, Berge는 다음과 같은 FDA 승인된 시판 염을 나열한다: 음이온 아세테이트, 베실레이트(벤젠술포네이트), 벤조에이트, 바이카르보네이트, 바이타르트레이트, 브롬화물, 칼슘 에데테이트(에틸렌다이아민테트라아세트산), 캄실레이트(캠퍼술포네이트), 카르보네이트, 염화물, 시트레이트, 이염산염, 에데테이트(에틸렌다이아민테트라아세테이트), 에디실레이트(1,2-에탄다이술포네이트), 에스톨레이트(라우릴 술페이트), 에실레이트(에탄술포네이트), 푸마레이트, 글루셉테이트(글루코헵토네이트), 글루코네이트, 글루타메이트, 글리콜릴아르사닐레이트(글리콜아미도페닐아르소네이트), 헥실레조시네이트, 하이드라바민(N,N'-다이(데하이드로아비에틸)에틸렌다이아민), 브롬화수소산염, 염산염, 하이드록시나프토에이트, 요오드화물, 이세티오네이트(2-하이드록시에탄술포네이트), 락테이트, 락토비오네이트, 말레이트, 말리에이트, 만델레이트, 메실레이트(메탄술포네이트), 메틸브로마이드, 메틸니트레이트, 메틸술페이트, 뮤케이트, 나프실레이트(2-나프탈렌술포네이트), 니트레이트, 파모에이트(엠보네이트), 판토테네이트, 포스페이트/다이포스페이트, 폴리갈락투로네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 수바세테이트, 숙시네이트, 술페이트, 탄네이트, 타르트레이트, 테오클레이트(8-클로로테오필리네이트) 및 트리에티오다이드; 유기 양이온 벤자틴(N,N'-다이벤질에틸렌다이아민), 클로로프로카인, 콜린, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 메글루민(N-메틸글루카민) 및 프로카인; 및 금속 양이온 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 및 아연.
Berge는 추가적으로 다음과 같은 비-FDA 승인 시판(미국 이외의 지역) 염을 나열한다: 음이온 아디페이트, 알기네이트, 아미노살리실레이트, 안하이드로메틸렌시트레이트, 아레콜린, 아스파르테이트, 바이술페이트, 부틸브로마이드, 캠포레이트, 다이글루코네이트, 다이하이드로브로마이드, 다이숙시네이트, 글리세로포스페이트, 헤미술페이트, 불화수소산염, 요오드화수소산염, 메틸렌비스(살리실레이트), 나파디실레이트(1,5-나프탈렌다이술포네이트), 옥살레이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 페닐에틸바르비투레이트, 피크레이트, 프로피오네이트, 티오시아네이트, 토실레이트 및 운데카노에이트; 유기 양이온 베네타민(N-벤질펜에틸아민), 클레미졸(1-p-클로로벤질-2-피롤리딘-1'-일메틸벤즈이미다졸), 다이에틸아민, 피페라진 및 트로메타민(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄); 및 금속성 양이온 바륨 및 비스무트.
본원에 기술된 접합체를 포함하는 약제학적 조성물은 또한 투여 방식에 따라 달라질 수 있는 적합한 담체, 부형제 및 보조제를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 약제학적 조성물은 적합한 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다. 상기 제형은 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 약제학적 조성물은 혈류로, 근육으로, 또는 기관으로 직접 투여될 수 있다. 비경구 투여에 적합한 수단으로는 정맥내, 동맥내, 복강내, 척수강내, 뇌실내, 요도내, 흉골내, 두개내, 근육내 및 피하를 포함한다. 비경구 투여에 적합한 장치로는 바늘 주사기, 무침 주사기, 및 주입 기술을 포함한다.
비경구 조성물은 전형적으로 염, 탄수화물 및 완충제와 같은 부형제를 함유할 수 있는 수성 용액이다. 그러나, 조성물은 또한 멸균 비수성 용액으로 제형화되거나 발열원이 없는 멸균수와 같은 적합한 비히클과 함께 사용되기 위해 건조 형태로 제형화될 수 있다.
예를 들어, 동결건조에 의한 멸균 조건 하의 비경구 조성물의 제조는 관련 기술분야의 기술자에게 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 용이하게 달성될 수 있다.
비경구 투여용 조성물은 즉시 및/또는 변형 방출되도록 제형화될 수 있다. 변형 방출 제형으로는 지연 방출, 지속 방출, 펄스 방출, 제어 방출, 표적 방출 및 프로그램된 방출을 포함한다. 따라서, 조성물은 활성제의 변형 방출을 제공하는 이식 저장소로서 투여하기 위한 고체, 반고체 또는 요변성 액체로 제형화될 수 있다.
비경구 제형은 비경구 투여 형태에 사용되는 다른 적합한 약제학적으로 허용되는 부형제, 예를 들어 비제한적으로 보존제와 혼합될 수 있다.
또 다른 측면에서, 약제학적 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 펠릿, 현탁액, 용액, 에멀젼 등과 같은 적합한 경구 투여 형태로 제형화될 수 있다. 다른 적합한 담체, 예컨대 붕해제, 희석제, 킬레이트화제, 결합제, 활택제, 윤활제, 충전제, 증량제, 부착 방지제 등이 존재할 수 있다.
경구 투여 제형은 또한 감미제, 비히클/습윤제, 착색제, 향미제, 보존제, 점도 향상제/증점제 등과 같은 다른 적합한 약제학적 부형제를 함유할 수 있다.
본원에 기재된 접합체는 다양한 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 개시내용의 특정 접합체는 효능 발현, 약동학(예를 들어, 흡수, 분포, 대사, 배설), 용해성(예를 들어, 수용성), 다른 약제와의 상호작용(예를 들어, 약물 대사 효소 저해 작용), 안전성(예를 들어, 급성 독성, 만성 독성, 유전자 독성, 생식 독성, 심장 독성, 발암성, 중추 독성) 및/또는 안정성(예를 들어, 화학적 안정성, 효소에 대한 안정성) 측면에서 우수할 수 있고 약제로서 유용할 수 있다.
본 개시내용의 접합체는 질병, 예를 들어 암 - 예를 들어 결장직장암(예: 결장직장암, 직장암, 항문암, 가족성 결장직장암, 유전성 비용종증 결장직장암, 위장관 간질 종양), 폐암(예: 비소세포폐암, 소세포 폐암, 악성 중피종), 중피종, 췌장암(예: 췌관암종, 췌장 내분비 종양), 인두암, 후두암, 식도암, 위/위암(예: 유두 선암종, 점액 선암종, 선편평 암종), 십이지장암, 소장암, 유방암(예: 침윤성 관암종, 비침습성 관암종, 염증성 유방 암), 난소암(예: 난소 상피암, 생식선외 생식세포 종양, 난소 생식세포 종양, 난소 저악성 잠재 종양), 고환 종양, 전립선암(예: 호르몬 의존성 전립선암, 비호르몬 의존성 전립선암, 거세 저항성 전립선암), 간암(예: 간세포암, 원발성 간암, 간외 담관암), 갑상선암(예: 갑상선 수질암종), 신장암(예: 신장세포암(예: 투명 세포 신장 세포암), 신우 및 요관의 이행상피세포암), 자궁암(예: 자궁경부암, 자궁체부암, 자궁 육종), 임신성 융모막암종, 뇌종양(예: 수모세포종, 신경교종, 송과체 성상세포종양, 선모세포성 성상세포종, 미만성 성상세포종, 역형성 성상세포종, 뇌하수체 선종), 망막모세포종, 피부암(예: 기저종, 악성 흑색종), 육종(예: 횡문근육종, 평활근육종, 연조직 육종, 방추세포 육종), 악성 골종양, 방광암, 혈액학적 암/혈액암 (예: 다발성 골수종, 백혈병(예: 급성 골수성 백혈병), 악성 림프종, 호지킨병, 만성 골수증식성 질환), 원발성 불명의 암의 예방 또는 치료용 작용제; 암 성장 저해제; 암 전이 저해제; 아폽토시스 촉진제; 전암성 병변(예: 골수이형성증후군) 치료용 작용제 등의 약제로서 사용될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용의 접합체는 유방암, 위암, 난소암, 자궁암, 폐암, 췌장암, 간암, 림프종 또는 혈액학적 암에 대한 약제로서 사용될 수 있다. 특정 측면에서, 본 개시내용의 접합체는 전립선암, 유방암, 위암, 비소세포폐암, 담관암, 결장암, 난소암 또는 뉴레굴린-1(NRG1)-양성 암에 대한 약제로서 사용될 수 있다. 특정 측면에서, 본 개시내용의 접합체는 비호드킨 림프종(NHL), 예를 들어 B 세포 비호지킨 림프종 또는 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)에 대한 약제로 사용될 수 있다.
또한, 본 개시내용의 접합체는 비약물 요법과 동시에 사용될 수 있다. 정확하게 말하면, 접합체는 (1) 수술, (2) 안지오텐신 II 등을 이용한 고혈압 화학 요법, (3) 유전자 요법, (4) 온열 요법, (5) 냉동 요법, (6) 레이저 소작 및 (7) 방사선 요법 등의 비약물 요법과 조합할 수 있다.
예를 들어, 전술한 수술 등의 전 또는 후에 본 개시내용의 접합체를 사용하면, 저항 발생 방지, 무질병 생존 연장, 암 전이 또는 재발의 억제, 생명 연장 등의 효과가 제공될 수 있다.
또한, 본 개시내용의 접합체를 이용한 치료는 지지 요법: (i) 각종 감염성 질환의 합병증에 대한 항생제(예를 들어, 판스포린 등과 같은 β-락탐 유형, 클라리스로마이신과 같은 마크롤라이드 유형 등)의 투여, (ii) 영양실조 개선을 위한 고칼로리 수혈, 아미노산 제제 또는 일반 비타민 제제의 투여, (iii) 통증 완화를 위한 모르핀 투여, (iv) 오심, 구토, 식욕부진, 설사, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 헤모글로빈 농도 감소, 탈모, 간장병, 신장병, DIC, 발열 등의 부작용을 호전시키기 위한 약제의 투여 및 (v) 암의 다중 약물 저항 등을 억제하기 위한 약제의 투여와 조합하는 것이 가능하다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 접합체는 표준 치유 요법, 예를 들어 하나 이상의 치료제(예를 들어 항암제 및/또는 면역조절제)와 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 특정 측면에서, 본원에 개시된 종양을 치료하는 방법은 하나 이상의 추가 치료제와 조합하여 본 개시내용의 접합체를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 접합체는 면역 경로의 다중 요소가 표적화될 수 있도록 하나 이상의 항암제와 조합으로 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 항암제는 면역 관문 저해제(즉, 특정 면역 관문 경로를 통한 신호전달을 차단함)를 포함한다. 본 방법에 사용될 수 있는 면역 관문 저해제의 비제한적인 예는 CTLA-4 길항제(예: 항-CTLA-4 항체), PD-1 길항제(예: 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체), TIM-3 길항제(예를 들어, 항-TIM-3 항체), 또는 이들의 조합을 포함한다. 면역 관문 저해제의 추가적인 예로는 T 세포 면역글로불린 및 ITIM 도메인(TIGIT) 길항제, T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제(VISTA) 길항제, B 및 T 세포 림프구 감쇠제(BTLA) 길항제, 및 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3) 길항제를 포함한다. 조합 치료의 포괄적이고 비제한적인 목록은 본 출원의 조합 치료 섹션에 자세히 개시되어 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 접합체는 추가적인 치료제의 투여 전 또는 후에 대상체에게 투여된다. 다른 측면에서, 본 개시내용의 접합체는 추가적인 치료제와 동시에 대상체에게 투여된다. 특정 측면에서, 본 개시내용의 접합체 및 추가적인 치료제는 약제학적으로 허용되는 담체에서 단일 조성물로서 동시에 투여될 수 있다. 다른 측면에서, 본 개시내용의 접합체 및 추가적인 치료제는 별도의 조성물로서 동시에 투여된다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 접합체로 치료될 수 있는 대상체는 비인간 동물, 예컨대 랫트 또는 마우스이다. 일부 측면에서, 치료될 수 있는 대상체는 인간이다.
VI. 화합물 및 접합체의 제조 방법
본 개시내용은 접합체를 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은 하기 화학식 (XXII)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 결합 모이어티를 반응시키는 단계를 포함한다:
여기서:
n은 0 또는 1이고;
R1은 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물이고;
R2는 수소, -(CH2CH2O)v-CH3, C2-C6알케닐, C1-C6알킬; C2-C6알키닐, 벤질, C3-C6사이클로알킬, 및 C3-C6사이클로알킬(C1-C3알킬)로부터 선택되고, 여기서 v는 1 내지 24이고;
각각의 Y는 독립적으로 S 또는 O이고;
L*은 결합 모이어티에 접합하는 절단 가능한 링커 전구체이다.
또한, 본 개시내용은 하기 화학식 (XXXII)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제조하는 방법을 제공하고:
여기서:
a는 1 내지 10이고;
A'는 또는 이고, 여기서
n은 0 또는 1이고;
각 Y는 독립적으로 S 또는 O이고;
는 R1에 대한 부착 지점을 나타내며;
는 메틸렌 기에 대한 부착 지점을 나타내고;
R1은 A'와 함께 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물이고;
R2는 수소, R1-A'에 안정성을 제공하는 기, R1-A에 용해성을 제공하는 기, 및 R1-A'에 안정성 및 용해성을 제공하는 기로부터 선택되며;
L은 절단 가능한 링커이고;
Bm은 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 모이어티이고;
방법은:
화학식 (XXXI)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 모이어티와 반응시키는 단계를 포함한다:
여기서:
A', R1 및 R2는 위에서 정의한 바와 같고,
L*은 절단 가능한 링커 전구체이다.
본원에 기재된 바와 같이, 링커 전구체는 결합 모이어티에 연결되는 이종이작용기성 기를 함유한다.
일부 측면에서, 링커 전구체는 프로테아제에 의해 절단 가능하다. 일부 측면에서, 링커 전구체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
여기서:
q는 2 내지 10이고;
Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5는 각각 독립적으로 부재하거나 L- 또는 D-배열의 자연 발생 아미노산 잔기이고, 단, Z1, Z2, Z3, 및 Z4 중 적어도 2개는 아미노산 잔기이며;
는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이다.
Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5는 독립적으로 부재하거나, L-발린, D-발린, L-시트룰린, D-시트룰린, L-알라닌, D-알라닌, L-글루타민, D-글루타민, L-글루탐산, D-글루탐산, L-아스파르트산, D-아스파르트산, L-아스파라긴, D-아스파라긴, L-페닐알라닌, D-페닐알라닌, L-라이신, D-라이신 및 글리신으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 단, Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5 중 적어도 2개는 아미노산 잔기이다.
일부 측면에서, Z1은 부재하거나 글리신이고; Z2는 부재하거나, L-글루타민, D-글루타민, L-글루탐산, D-글루탐산, L-아스파르트산, D-아스파르트산, L-알라닌, D-알라닌 및 글리신으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; Z3은 L-발린, D-발린, L-알라닌, D-알라닌, L-페닐알라닌, D-페닐알라닌 및 글리신으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; Z4는 L-시트룰린, D-시트룰린, L-아스파라긴, D-아스파라긴, L-리신, D-리신, L-페닐알라민, D-페닐알라닌 및 글리신으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; Z5는 부재하거나 글리신이다.
일부 측면에서, L*은 다음 화학식이다:
여기서, 는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이다.
일부 측면에서, q는 4이다.
특정 측면에서, L*은 생물환원성 링커 전구체이다. 일부 측면에서, 생물환원성 링커 전구체는 다음 식으로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
여기서:
q는 2 내지 10이고;
R, R', R'' 및 R'''는 각각 독립적으로 수소, C1-C6알콕시C1-C6알킬, (C1-C6)2NC1-C6알킬 및 C1-C6알킬로부터 선택되거나, 2개의 같은 자리 R 기는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 사이클로부틸 또는 사이클로프로필 고리를 형성할 수 있고;
는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이다.
일부 측면에서, L*은 하기 식인 생물환원성 링커이다:
특정 측면에서, L*은 클릭-방출 링커 전구체이다. 일부 측면에서, L*은 하기 식이다;
여기서:
q는 2 내지 10이고;
는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이다.
일부 측면에서, L*은 베타-글루쿠로니다제 절단 가능한 링커 전구체이다. 일부 측면에서, L*은 하기 식이다:
여기서:
q는 2 내지 10이고;
----는 부재하거나 결합이고;
는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이다.
특정 측면에서, R2는 접합체에 안정성을 제공하는 기이다. 일부 측면에서, R2는 C2-C6알케닐, C1-C6알킬; C2-C6알키닐, 벤질, C3-C6사이클로알킬 및 C3-C6사이클로알킬(C1-C3알킬)로부터 선택된다. 일부 측면에서, R2는 C1-C6알킬이다. 일부 측면에서, R2는 메틸이다.
특정 측면에서, R2는 접합체에 용해성을 제공하는 기이다. 일부 측면에서, R2는 다음 중에서 선택된다:
여기서:
각 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
각 y는 독립적으로 1 또는 2이고;
각 R은 독립적으로 수소, C6H11O5, C12H21O10, C18H31O15 또는 C24H41O20이다. 일부 측면에서, R1은 화학식 (XXX)의 화합물이다:
여기서:
는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점을 나타내며;
A는 페닐 또는 C4-C10사이클로알킬 고리이고;
R10은 수소 및 할로로부터 독립적으로 선택되고;
U는 NH 및 CF2로부터 선택되고;
R20은 -C(O)R3, -N(R4)2, -(CH2)nOH, -(CH2)nN(R4)2, -(CH2)nQ'(CH2)mOH, -(CH2)nQ'(CH2)mSH 및 -(CH2)nQ'(CH2)mN(R4)2로부터 선택되고; 여기서
R3은 수소 또는 C1-C6알킬이고;
각 R4는 독립적으로 수소 또는 C1-C6알킬이고;
Q'는 O, S 또는 NR4이고;
n은 1-6이고;
m은 2-5이다.
일부 측면에서,
A는 페닐이고;
U는 NH이고;
R10은 할로이고;
R20은 메틸이다.
일부 측면에서, A는 페닐이고;
U는 NH이고;
R10은 할로이고;
R20은 -(CH2)2O(CH2)2NHCH3이다.
일부 측면에서, 화학식 (XXX)의 화합물은 다음 식으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물이다:
일부 측면에서, R1-A'는 단백질분해 표적화 키메라(PROTAC)이다. 특정 측면에서, R1은 다음 식을 갖는다:
POI-L100-CBN;
여기서:
POI는 관심 단백질에 결합하는 화합물이고;
L100은 PROTAC 링커이고;
CBN은 세레블론 결합 모이어티이다.
일부 측면에서, 관심 단백질은 핵 호르몬 수용체, 해독 종결 인자, 전사 인자, 사이클린-의존성 키나제, 티로신 키나제, 세린/트레오닌 키나제 또는 E3 리가제이다. 일부 측면에서, 관심 단백질은 CD33, GSPT1, BRD4, AR, ER, IKZF1/3, CK1a, BCL-XL, IKZF2, IRAK4, BTK, STAT3, BTK 및 iMiD, BRD9, TRK, MDM2, CDK2/CDK9, CD97b 및 EGFR로부터 선택된다.
특정 측면에서, L100은 글리콜, 알킬, 알키닐, 트리아졸릴, 피페라지닐, 피페리디닐 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 작용기를 포함한다.
일부 측면에서, CBN은 다음으로부터 선택된다;
여기서:
는 A'에 대한 부착 지점을 나타내고;
는 L100에 대한 부착 지점을 나타낸다.
특정 실시양태에서, R1은 다음 식으로부터 선택된다:
여기서, 은 A'에 대한 부착 지점을 나타낸다.
일부 측면에서, 결합 모이어티는 화학식 (XXII) 또는 (XXXI)의 화합물과 반응하기 전에 전처리된다. 특정 측면에서, 화학식 (XXII) 또는 (XXXI)의 화합물은 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 결합 모이어티와 반응한다. 결합 모이어티가 항체인 측면에서, 항체는 화학식 (XXII) 또는 (XXXI)의 화합물과 반응하기 전에 사슬간 이황화물을 환원시키기 위해 전처리될 수 있다.
링커의 말레이미드 구성요소를 통해 Bm의 시스테인에 화학식 (XXII) 또는 화학식 (XXXI)의 화합물을 접합시키기 위한 일반적인 방법은 반응식 I-I에 제시된다. R1, R2 및 Y는 본원에 정의되어 있고 L**은 본원에 정의된 링커의 일부이다.
링커의 N-하이드록시숙신이미드 구성요소를 통해 Bm의 리신에 화학식 (XXII) 또는 화학식 (XXXI)의 화합물을 접합시키는 일반적인 방법은 반응식 I-2에 제시된다. R1, R2 및 Y는 본원에 정의되어 있고 L**은 본원에 정의된 링커의 일부이다.
화학식 (XX) 및 화학식 (XXX)의 화합물을 제조하는 방법 및 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물을 방출하기 위한 세포내 활성화는 반응식 I-3에 제시되어 있다. R1, R2 및 Y는 본원에 정의되어 있고 L**은 본원에 정의된 링커의 일부이다.
단계 1에서 링커 내의 이종이작용기성 기는 활성화된다. 단계 2에서, 보호된 링커는 고리 A의 질소에 부착된다. 단계 3은 아민의 탈보호를 보여주고, 단계 4는 Bm 기의 부착을 보여주며, 단계 5는 PPI-링커 모이어티에 대한 Bm의 접합을 보여준다(반응식 I-1 및 I-2에 제시됨). 단계 6은 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 활성 화합물을 방출하는 레트로-만니히 반응을 통한 암세포에서의 접합체의 활성화를 묘사한다.
실시예
일반 합성 방법 및 중간체
본 개시내용의 화합물은 본 개시내용 및 관련 기술분야의 지식에 비추어 및/또는 이하에 제시된 반응식 및 합성 실시예를 참조하여 관련 기술분야의 기술자에 의해 제조될 수 있다. 일부 시약 및 중간체는 관련 기술분야에 알려져 있다. 다른 시약 및 중간체는 쉽게 이용 가능한 물질을 사용하여 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예시적인 합성 경로는 이하 반응식 및 실시예에 제시되어 있다. 다음 반응식 및 실시예에 나타나는 변수(예: "R" 기)는 본 출원의 다른 곳에 나타나는 변수와 독립적으로 판독되어야 한다는 점을 이해해야 한다. 관련 기술분야의 기술자는 아래 제시된 반응식 및 실시예가 본원에 기재된 화합물의 제조를 어떻게 예시하는지 쉽게 이해할 것이다.
반응식에 사용된 약어는 일반적으로 관련 기술분야에서 사용되는 규약을 따른다. 본 명세서 및 실시예에 사용된 화학적 약어는 다음과 같이 정의된다:
트리메틸아민에 대한 "Et3N" 및 "TEA"; N,N-다이메틸포름아미드에 대한 "DMF"; 실온 또는 체류 시간(문맥에 따라 결정됨)에 대한 "r.t." 또는 "rt" 또는 "RT"; 시간에 대한 "h"; 분에 대한 "min"; 1,1'-카르보닐다이이미다졸에 대한 "CDI"; N,N-다이메틸아미노피리딘에 대한 "DMAP"; 테트라부틸 암모늄 브로마이드에 대한 "TBAI"; 1-[비스(다이메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트 또는 N-[(다이메틸아미노)-1H-1,2,3-트리아졸로-[4,5-b]피리딘-1-일메틸렌]-N-메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥사이드에 대한 "HATU"; 다이아이소프로필에틸아민에 대한 "DIEA" 및 "iPrNEt2"; 아세토니트릴에 대한 "ACN"; 다이클로로메탄에 대한 "DCM"; 메탄올에 대한 "MeOH"; 메틸에 대한 "Me"; 석유 에테르에 대한 "PE"; 트리플루오로아세트산에 대한 "TFA"; "BOC" 또는 "Boc" 다이메틸술폭사이드에 대한 "DMSO"; 카르보벤질옥시에 대한 "Cbz"; 에탄올에 대한 "EtOH"; 1-하이드록시벤조트리아졸 수화물에 대한 "HOBt" 또는 "HOBT"; N-브로모숙신이미드에 대한 "NBS"; 트리메틸실릴에 대한 "TMS"; 및 테트라하이드로푸란에 대한 "THF";
단계 1. 화합물 1-3의 합성
H2O(25mL) 중의 Gly-Gly-Gly(화합물 1-1, 5.00g, 25.1 mmol, 1.00당량)의 교반 혼합물에 TEA(7.6g, 75.1 mmol, 2.99당량)를 0℃에서 적가했다. 상기 혼합물에 DMF(25 mL) 중 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥사노에이트(화합물 1-2, 9.29 g, 30.1 mmol, 1.20 당량)를 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 추가 3시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 혼합물을 HCl(2N, aq.)을 사용하여 pH 4로 산성화했다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔(330g, 20-40um); 이동상, 물(0.05% TFA 함유), ACN(30분 내 0% 내지 20% 구배); 검출기, UV 220 nm. 이는 (2-[2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도]-아세트아미도)아세트산(화합물 1-3, 1g, 8%)을 백색 고체로 제공했다. LCMS(ES, m/s): 383 [M+H]+
단계 1A: 화합물 1-4의 합성
단계 a: 1:3-(5-브로모-1-옥소아이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-다이온
DMF(120 ml) 중 메틸 4-브로모-2-(브로모메틸)벤조에이트(60.0 g, 194.8 mmol, 1.00 당량) 및 3-아미노피페리딘-2,6-다이온 염산염(38.48 g, 233.8 mmol, 1.20 당량)의 교반 혼합물에 TEA(67.70 mL, 669.0 mmol, 2.50당량)를 질소 대기 하에 25℃에서 적가했다. 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 교반했다. 이어서 25℃에서 H2O(120 mL), AcOH(46 mL) 및 Et2O(120 mL)를 차례로 첨가했다. 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 침전된 고체를 여과하여 수집하고 Et2O(60 mL)로 세척했다. 이로써 3-(5-브로모-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일)피페리딘-2,6-다이온(40.0 g, 63%)이 백색 고체로서 초래되었다. LCMS(ESI, ms): 323,325 (M+H)+. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.00(s, 1H), 7.90 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.74-7.66 (m, 2H), 5.15-5.10(m, 1H), 4.51-4.32(m, 2H), 2.93-2.85(m, 1H), 2.74-2.56(m, 1H), 2.43-2.32(m, 1H), 2.06-1.99(m, 1H).
단계 b: 2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소아이소인돌린-5-카르보니트릴
DMF(40.00 mL) 중 3-(5-브로모-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일)피페리딘-2,6-다이온(2.00 g, 6.19 mmol, 1.00당량)의 교반 용액에 Zn(CN)2(872 mg, 7.42 mmol, 1.20 당량) 및 Pd(PPh3)4(715 mg, 0.62 mmol, 0.10 당량)를 실온에서 질소 대기 하에 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물은 질소 대기 하에 80℃에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 혼합물을 물(120.00 mL)에 첨가하고 30분 동안 교반했다. 침전된 고체를 여과로 수집하고 물(3x20 mL) 및 EtOAc(3x20 mL)로 세척했다. 결과적으로 생성된 고체를 햇빛 램프 아래에서 건조시켰다. 이로써 2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-카르보니트릴(1.2 g, 72%)이 백색 고체로서 초래되었다. LCMS(ESI, ms): 270 (M+H)+; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.03(s, 1H), 8.17 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 8.00-7.91 (m, 2H), 5.18-5.13(m, 1H), 4.57-4.40(m, 2H), 2.92-2.88(m, 1H), 2.74-2.56(m, 1H), 2.48-2.37(m, 1H), 2.07-1.99(m, 1H).
단계 c: 3-(5-(아미노메틸)-1-옥소아이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-다이온 염산염
MeOH(67.00 mL) 중 2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)1-옥소-3H-아이소인돌-5-카르보니트릴(8.00 g, 29.7 mmol, 1.00 당량)의 슬러리에 HCl(12M, 9.60mL) 및 PtO2(3.30 g, 14.5 mmol, 0.49당량)를 25℃에서 첨가했다. 혼합물을 수소 벌룬을 사용하여 수소 대기 하에 실온에서 16시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응물을 여과하고 MeOH(2x30 mL)로 세척했다. 여액을 감압 하에 증발 건조시켰다. 결과적으로 생성된 고체를 DCM:MeOH(3:1)(3x30 mL)로 세척했다. 이에 따라 3[5-(아미노메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]피페리딘-2,6-다이온 염산염(5.08 g, 57%)이 백색 고체로서 초래되었다. LCMS(ESI, ms): 274 (M+H-HCl)+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.88(d, J = 8.0Hz, 1H), 7.68(s, 1H), 7.62(d, J = 8.0Hz, 1H), 5.19-5.15(m, 1H), 4.55-4.53(m, 2H), 4.26(s, 2H), 2.95-2.88(m, 1H), 2.81-2.80(m, 1H), 2.55-2.45(m, 1H), 2.22-2.16(m, 1H).
단계 2. 화합물 1-5의 합성
DMF(10.00 mL) 중 3-[5-(아미노메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]피페리딘-2,6-다이온(화합물 1-4, 1.00 g, 3.66 mmol, 1.00 당량)의 교반 혼합물에 CDI(0.59 g, 3.66 mmol, 1.00 당량) 및 TEA(0.37 g, 3.66 mmol, 1.00 당량)를 0℃에서 질소 대기 하에 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 0℃에서 2시간 동안 교반했다. 상기 혼합물에 DMAP(1.34 g, 10.98 mmol, 3.00당량) 및 3-클로로-p-톨루이딘(0.52 g, 3.66 mmol, 1.00당량)을 실온에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 60℃에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응은 실온에서 물/얼음으로 켄칭시켰다. 침전된 고체는 여과로 수집하고 DCM 및 물로 세척했다. 이로써 1-(3-클로로-4-메틸페닐)-3-[[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸]우레아(화합물 1-5, 1.0g, 51%)를 연갈색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/s): 441,443[M+1]+.
단계 3. 화합물 1-6의 합성
DMF(5.00 mL) 중 1-(3-클로로-4-메틸페닐)-3-[[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸]우레아(화합물 I-5, 500.00 mg, 1.13 mmol, 1.00당량)의 교반된 혼합물에 K2CO3(500.0 mg, 3.62 mmol, 3.19당량)를 0℃에서 질소 대기 하에 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 0℃에서 30분 동안 교반했다. 상기 혼합물에 TBAI(100.0 mg, 0.27 mmol, 0.24 당량), NaI(200.0 mg, 1.34 mmol, 1.18 당량) 및 클로로메틸 4-니트로페닐 카르보네이트(801.0 mg, 3.46 mmol, 3.05 당량)를 0℃에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 암실에서 0℃에서 추가 1시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물은 아무런 처리 없이 다음 단계에 사용했다. LCMS(ES, m/s): 636,638 [M+H]+
단계 4. 화합물 1-7의 합성
DMF(5.00 mL) 중 [3-[5-([[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노]메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 4-니트로페닐 카르보네이트(화합물 1-6, 500 mg, 0.78 mmol, 1.00당량) 및 K2CO3(500 mg, 3.62 mmol, 4.60당량)의 교반 혼합물에 tert-부틸 N-(2-아미노에틸)카르바메이트(400 mg, 2.50 mmol, 3.18당량)를 질소 대기 하에 0℃에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응은 물로 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 다이에틸 에테르(3 x 20 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(20 mL)로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 여과 후, 여액을 감압하에 농축했다. 잔류물을 Prep-TLC(EA)로 정제하여 [3-[5-([[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노]메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 N-[2-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]에틸]-카르바메이트(화합물 1-7, 270 mg, 44%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/s): 657,659 [M+H]+.
단계 5. 화합물 1-8의 합성
1,4-다이옥산(4 M)(1.5mL)에서 HCl(기체) 중 [3-[5-([[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노]메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 N-[2-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]에틸]-카르바메이트(화합물 1-7, 100 mg, 0.13 mmol, 1.00 당량)의 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 이로써 [3-[5-([[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노]메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 N-(2-아미노에틸)카르바메이트 염산염(화합물 1-8, 100 mg, 61%)이 백색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/s): 557,559[M+H]+.
단계 6. 화합물 (I)의 합성
DMF(3.5 mL) 중 (2-[2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도]-아세트아미도)아세트산(화합물 1-3, 64 mg, 0.17 mmol, 1.10당량))의 교반 혼합물에 HATU(69 mg, 0.18 mmol, 1.20당량)를 0℃에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 20분 동안 교반했다. 상기 혼합물에 [3-[5-([[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노]메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 N-(2-아미노에틸)카르바메이트 염산염(화합물 1-8, 100 mg, 0.15 mmol, 1.00당량) 및 DIEA(49 mg, 0.37 mmol, 2.50 당량)를 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 추가 16시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 미정제 생성물을 Prep-HPLC에 의해 다음 조건으로 정제했다: 컬럼, XSelect CSH Prep C18 OBD 컬럼, 19 x 250 mm, 5 um; 이동상, 물(0.05% TFA 함유) 및 ACN(7분 내 24% 내지 43%까지); 검출기, UV 254 nm. 수집한 분획을 동결건조하여 [3-[5-([[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노]메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 N-[2-[2-(2-[2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]-아세트아미도]아세트아미도)아세트아미도]에틸]카르바메이트(화합물 (I), 18.2 mg, 12%). LCMS(ES, m/z): 921,923 [M+H]+. 1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) δ (ppm): 7.76 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.56-7.48 (m, 3H), 7.13-7.12 (m, 2H), 6.76 (s, 2H), 5.75-5.71 (m, 2H), 5.25-5.20 (m, 1H), 4.51-4.46 (m, 4H), 3.85-3.80 (m, 6H), 3.46-3.42 (m, 2H), 3.28-3.26 (m, 2H), 3.23-3.21 (m, 2H), 3.08-2.86 (m, 2H), 2.66-2.39 (m, 1H), 2.27-2.21 (m, 6H), 1.61-1.51 (m, 4H), 1.28-1.24 (m, 2H).
단계 1. 화합물 2-2의 합성
DCM(3.00 mL) 및 MeOH(3.00 mL) 중 2-메틸-2-술파닐프로판-1-올(화합물 2-1, 1.00 g, 9.41 mmol, 1.00 당량)의 교반 혼합물에 5-니트로-2-[(5-니트로피리딘-2-일)다이술파닐]피리딘(1.46g, 4.70 mmol, 0.50당량)을 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반했다. 상기 혼합물에 MnO2(1.50 g, 17.25 mmol, 1.83 당량)를 실온에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 추가 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 DCM(20 mL)으로 세척했다. 여액을 감압 하에 농축했다. 잔류물을 PE/EtOAc(8:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 2-메틸-2-[(5-니트로피리딘-2-일)다이술파닐]프로판-1-올(화합물 2-2, 1.4 g, 57%)을 주황색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, ms): 261[M+H]+
단계 2. 화합물 2-3의 합성
DCM(20.00 mL) 중 2-메틸-2-[(5-니트로피리딘-2-일)다이술파닐]프로판-1-올(화합물 2-2, 1.20 g, 4.61 mmol, 1.00 당량) 및 피리딘(0.90 g, 11.38 mmol, 2.47 당량)의 교반 혼합물에 DCM(2.00 mL) 중 클로로메틸 클로로포르메이트(0.60 g, 4.65 mmol, 1.01 당량)를 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반했다. LCMS를 통해 30% 원하는 생성물이 검출되었다. 반응을 물/얼음으로 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 DCM(3 x 20 mL)으로 추출했다. 합한 유기층을 염수(20 mL)로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 여과 후, 여액을 감압하에 농축했다. 잔류물을 PE/EtOAc(10:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 클로로메틸 2-메틸-2-[(5-니트로피리딘-2-일)다이술파닐]프로필 카르보네이트(화합물 2-3, 330 mg, 20%)를 연황색 오일로서 제공했다. LCMS(ESI, ms): 353,355[M+H]+
단계 3. 화합물 2-4의 합성
THF(10.00mL) 중의 3-클로로-p-톨루이딘(102 mg, 0.72 mmol, 0.99당량)의 교반 혼합물에 다이포스겐(145.00 mg, 0.73 mmol, 1.00당량)을 0℃에서 질소 대기 하에 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 1시간 동안 교반했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. DMF(10.00mL) 중 3-[5-(아미노메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]피페리딘-2,6-다이온(화합물 1-4에 대해 기술된 절차에 따라 제조된 INT, 200 mg, 0.73 mmol, 1.00당량) 및 TEA(61.00 mg, 0.60 mmol, 0.82당량)의 교반 혼합물에 DMF(15.00mL) 중 상기 혼합물을 질소 대기 하에 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 3시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.1% FA) 중 ACN, 40분 내 0% 내지 80% 구배; 검출기, UV 254 nm. 이로써 1-(3-클로로-4-메틸페닐)-3-[[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸]우레아(8화합물 2-45 mg,26.34%)가 백색 고체로서 초래되었다. 생성물을 다음 조건으로 Prep-HPLC로 정제했다: 컬럼: XBridge Shield RP18 OBD 컬럼, 19 x 250mm, 10um; 이동상 A:물(0.05% TFA), 이동상 B: ACN; 유속: 25 mL/분; 구배: 18분 내 25B 내지 38B; 220nm; RT 1:14.25; 수집한 분획은 동결건조하여 1-(3-클로로-4-메틸페닐)-3-[[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸]우레아(화합물 2-4, 21.4 mg, 7%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, ms): 441,443 [M+H]+
단계 4. 화합물 2-5의 합성
DMF(0.50mL) 중 1-(3-클로로-4-메틸페닐)-3-[[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸]우레아(화합물 2-5, 300.00 mg, 0.68 mmol, 1.00당량) 및 K2CO3(180 mg, 1.30 mmol, 1.91당량)의 교반 혼합물에 클로로메틸 2-메틸-2-[(5-니트로피리딘-2-일)다이술파닐]프로필 카르보네이트(600 mg, 1.70 mmol, 2.50당량), TBAI(119.00 mg, 0.46 mmol, 0.67당량)를 실온에서 질소 대기 하에 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 잔류물은 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.1% FA) 중 ACN, 40분 내 00% 내지 85% 구배; 검출기, UV 254 nm. 이로써 [3-[5-([[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노]메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 2-메틸-2-[(5-니트로피리딘-2-일)다이술파닐]프로필 카르보네이트(85 mg, 14.85%)가 갈색 고체로서 초래되었다. 미정제 생성물은 다음 조건으로 추가로 정제했다: 컬럼: XBridge Prep OBD C18 컬럼, 19x250mm,5um; 이동상 A:물(0.05% TFA), 이동상 B:ACN; 유속: 25 mL/분; 구배: 10분 내 53B에서 68B까지; 220nm; RT1:9.80; 수집한 분획을 동결건조하여 [3-[5-([[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노]메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 2-메틸-2-[(5-니트로피리딘-2-일)다이술파닐]프로필카르보네이트(화합물 2-5, 8.5 mg)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI): 757,757 [M+H]+; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 9.23 (d, J = 2.4Hz, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.58 (d, J = 2.7Hz, 1H), 8.05 (d, J = 8.7Hz, 1H), 7.72-7.6 (m, 2H), 7.53 (s, 1H), 7.46(d, J = 6.3Hz, 1H), 7.25-7.11 (m, 2H), 6.82-6.78 (m, 1H), 5.68-5.63 (m, 2H), 5.35-5.28 (m, 1H), 4.52-4.30 (m, 4H), 4.08 (s, 2H), 3.12-3.06 (m, 1H), 2.87-2.73 (m, 1H), 2.49-2.44 (m, 1H), 2.28 (s, 3H), 2.10-2.00 (m, 1H), 1.33 (s, 6H).
단계 5. 화합물 (II)의 합성
DCM(14.00mL) 중 [3-[5-([[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노]메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 2-메틸-2-[(5-니트로피리딘-2-일)다이술파닐]프로필 카르보네이트(화합물 2-5, 70.00 mg, 0.092 mmol, 1.00 당량) 및 나트륨 메틸 술피네이트(28.00 mg, 0.27 mmol, 2.97당량)의 교반 혼합물에 Br2(14 mg, 0.087 mmol, 0.95당량)를 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반했다. 상기 교반된 혼합물에 나트륨 메틸 술피네이트(28.00 mg, 0.27 mmol, 2.97당량) 및 Br2(14 mg, 0.087 mmol, 0.95당량)를 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 DCM(20 mL)으로 세척했다. 여액을 감압 하에 농축했다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수중 ACN, 40분 내 5% 내지 85% 구배; 검출기, UV 254 nm. 미정제 생성물을 다음 조건으로 정제했다: 컬럼: YMC-Actus Triart C18, 30x250,5um; 이동상 A: 물(0.05%TFA), 이동상 B: ACN; 유속: 25 mL/분; 구배: 7분 내 55B에서 75B까지; 220nm; RT1:6.35. 수집한 분획을 동결건조하여 1-(3-클로로-4-메틸페닐)-3-[(2-[1-[([[2-(메탄술포닐술파닐)-2-메틸프로폭시]카르보닐]옥시)-메틸]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일]-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일)메틸]우레아(화합물 (II), 3.3 mg, 5.05%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI): 681,683[M+H]+ 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8.75(s, 1H), 7.73-7.66(m, 2H), 7.53(s, 1H), 7.47(d, J = 7.8Hz, 1H), 7.20-7.12 (m, 2H), 6.82-6.79(m, 1H), 5.75-5.66(m, 2H), 5.33-5.27(m, 1H), 4.51-4.29(m, 6H), 3.35(s, 3H), 3.11-3.06(m, 1H), 2.87-2.73(m, 1H), 2.49-2.44 (m, 1H), 2.28(s, 3H), 2.10-2.00(m, 1H), 1.48(s, 6H).
단계 1. 화합물 3-2의 합성
DCM(3.00mL) 및 MeOH(3.00mL) 중 2-메틸-2-술파닐프로판-1-올(1.00g, 9.41 mmol, 1.00당량)의 교반 혼합물에 5-니트로-2-[(5-니트로피리딘-2-일)다이술파닐]피리딘(1.46 g, 4.70 mmol, 0.50당량)을 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반했다. 상기 혼합물에 MnO2(1.50 g, 17.25 mmol, 1.83 당량)를 실온에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 추가 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 DCM(20 mL)으로 세척했다. 여액을 감압 하에 농축했다. 잔류물을 PE/EtOAc(8:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 2-메틸-2-[(5-니트로피리딘-2-일)다이술파닐]프로판-1-올(화합물 3-2, 1.4 g, 57%)을 주황색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, ms): 261 [M+H].
단계 2. 화합물 3-3의 합성
DCM(20.00 mL) 중 2-메틸-2-[(5-니트로피리딘-2-일)다이술파닐]프로판-1-올(화합물 3-2, 1.20 g, 4.61 mmol, 1.00 당량) 및 피리딘(0.90 g, 11.38 mmol, 2.47당량)의 교반 혼합물에 DCM(2.00 mL) 중 클로로메틸 클로로포르메이트(0.60 g, 4.65 mmol, 1.01당량)를 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반했다. LCMS는 30% 원하는 생성물을 검출했다. 반응을 물/얼음으로 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 DCM(3 x20 mL)으로 추출했다. 합한 유기층을 염수(20 mL)로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조했다. 여과 후, 여액을 감압하에 농축했다. 잔류물은 PE/EtOAc(10:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 클로로메틸 2-메틸-2-[(5-니트로피리딘-2-일)다이술파닐]프로필 카르보네이트(화합물 3-3, 330 mg, 20%)를 연황색 오일로서 제공했다. LCMS(ESI, ms): 353,355 [M+H]+.
단계 3. 화합물 3-4의 합성
THF(10.00 mL) 중 3-클로로-p-톨루이딘(102 mg, 0.72 mmol, 0.99당량)의 교반 혼합물에 다이포스겐(145.00 mg, 0.73 mmol, 1.00당량)을 0℃에서 질소 대기 하에 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 1시간 동안 교반했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. DMF(10.00mL) 중 3-[5-(아미노메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]피페리딘-2,6-다이온(화합물 1-4에 대해 기술된 절차에 따라 제조된 INT, 200 mg, 0.73 mmol, 1.00당량) 및 TEA(61.00 mg, 0.60 mmol, 0.82당량)의 교반 혼합물에 DMF(15.00 mL) 중의 상기 혼합물을 0℃에서 질소 대기 하에 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 3시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.1% FA)중 ACN, 40분 내 0% 내지 80% 구배; 검출기, UV 254 nm. 이로써 1-(3-클로로-4-메틸페닐)-3-[[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸]우레아(화합물 3-4, 85 mg, 26.34%)가 백색 고체로서 초래되었다. 생성물은 다음 조건으로 Prep-HPLC로 정제했다: 컬럼: XBridge Shield RP18 OBD 컬럼, 19x250 mm,10 um; 이동상 A:물(0.05%TFA), 이동상 B:ACN; 유속: 25mL/분; 구배: 18분 내 25B 내지 38B; 220nm; RT 1:14.25; 수집한 분획은 동결건조하여 1-(3-클로로-4-메틸페닐)-3-[[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸]우레아(화합물 3-4, 21.4 mg, 7%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, ms): 441,443[M+H]+
단계 4. 화합물 (III)의 합성
DMF(0.50 mL) 중 1-(3-클로로-4-메틸페닐)-3-[[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일] 메틸]우레아(화합물 3-4, 300.00 mg, 0.68 mmol, 1.00당량) 및 K2CO3(180 mg, 1.30 mmol, 1.91당량)의 교반된 혼합물에 클로로메틸 2-메틸-2-[(5-니트로피리딘-2-일)다이술파닐]프로필 카르보네이트(화합물 3-3, 600 mg, 1.70 mmol, 2.50당량), TBAI(119.00 mg, 0.46 mmol, 0.67당량)를 실온에서 질소 대기 하에 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 잔류물은 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.1% FA)중 ACN, 40분 내 0% 내지 85% 구배; 검출기, UV 254 nm. 이로써 [3-[5-([[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노]메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 2-메틸-2-[(5-니트로피리딘-2-일)다이술파닐]프로필 카르보네이트(화합물 (III), 85 mg, 14.85%)가 갈색 고체로서 초래되었다. 미정제 생성물을 다음 조건에 의해 추가로 정제했다: 컬럼: XBridge Prep OBD C18 컬럼, 19x250mm,5um; 이동상 A:물(0.05%TFA), 이동상 B:ACN; 유속: 25 mL/분; 구배: 10분 내 53B 내지 68B; 220nm; RT1:9.80; 수집한 분획은 동결건조하여 [3-[5-([[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노]메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 2-메틸-2-[(5-니트로피리딘-2-일)다이술파닐]프로필 카르보네이트(8.5 mg)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI): 757,757[M+H]+; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 9.23 (d, J = 2.4Hz, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.58 (d, J = 2.7Hz, 1H), 8.05(d, J = 8.7Hz, 1H), 7.72-7.6 (m, 2H), 7.53 (s, 1H), 7.46 (d, J = 6.3Hz, 1H), 7.25-7.11 (m, 2H), 6.82-6.78 (m, 1H), 5.68-5.63 (m, 2H), 5.35-5.28 (m, 1H), 4.52-4.30 (m, 4H), 4.08 (s, 2H), 3.12-3.06 (m, 1H), 2.87-2.73 (m, 1H), 2.49-2.44 (m, 1H), 2.28 (s, 3H), 2.10-2.00 (m, 1H), 1.33 (s, 6H).
단계 1. 화합물 (IV)의 합성
DMF(2.00 mL) 중 1-(3-클로로-4-메틸페닐)-3-[[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸]우레아(화합물 1-5에 대해 기재된 절차에 따라 제조된 화합물 4-1, 200.00 mg, 0.45 mmol, 1.00 당량)의 교반 혼합물에 K2CO3(200.00 mg, 1.44 mmol, 3.19 당량)을 암실에서 0℃에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반했다. 상기 혼합물에 NaI(80 mg, 0.53 mmol, 1.18당량), TBAI(40 mg, 0.10 mmol, 0.24당량) 및 클로로메틸 4-니트로페닐 카르보네이트(화합물 4-2, 320 mg, 1.38 mmol, 3.05당량)를 암실에서 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 0℃에서 추가 1시간 동안 교반했다. 상기 혼합물에 DMF(0.10 mL) 중의 tert-부틸 N-메틸-N-[2-(메틸아미노)에틸]카르바메이트(화합물 4-3, 180 mg, 0.95 mmol, 2.11 당량)를 암실에서 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 암실에서 0℃에서 추가 3시간 동안 교반했다. LCMS를 통해 24%의 원하는 생성물을 검출할 수 있었다. 반응 혼합물은 다음 조건으로 정제했다: 컬럼: Kinetex EVO C18 컬럼, 30x150, 5um; 이동상 A:물(0.05%TFA), 이동상 B:ACN; 유속: 25mL/분; 구배: 14분 내 20B 내지 45B, 210nm; RT1:12.93분. 수집한 분획은 동결건조하여 [3-[5-([[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]-아미노]메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 N-[2-[(tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노]에틸]-N-메틸카르바메이트(화합물 (IV), 23.9 mg, 7%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS: (ms, ESI): 707,709 [M+Na]+, 585,587 [M+H-100]+ 1HNMR: (400 MHz, DMSO-d6): 8.81 (s, 1H), 7.71-7.66 (m, 2H), 7.51 (s, 1H), 7.45 (d, J=8.0Hz, 1H), 7.18-7.11 (m, 2H), 6.86 (t, J=6.0Hz, 1H), 5.61-5.56 (m, 2H), 5.27-5.24 (m, 1H), 4.49-4.26 (m, 4H), 3.29 (s, 3H), 3.21 (s, 1H), 3.08-3.03 (m, 1H), 2.83-2.66 (m, 7H), 2.42-2.38 (m, 1H), 2.22 (s, 3H), 2.07-2.05 (m, 1H), 1.35 (s, 9H).
단계 1. 화합물 5-2의 합성
MeOH(27.00 mL) 중 2-카르복시벤즈알데하이드(화합물 5-1, 2.00 g, 12.65 mmol, 1.00 당량)의 교반 혼합물에 H2O(4.00mL) 중 CH3NH2.HCl(0.79 g, 25.30 mmol, 2.00 당량)을 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반했다. 상기 혼합물에 NaBH4(0.24 g, 6.33 mmol, 0.50당량)를 25℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 추가 0.5시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 실온에서 아세톤(20 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 잔류물을 아세톤(30 mL)으로 분쇄하여 정제했다. 이로써 2-[(메틸아미노)메틸]벤조산(화합물 5-2, 2g, 86%)이 백색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 166 [M+H]+
단계 2. 화합물 5-3의 합성
다이옥산(27.00 mL) 중 2-[(메틸아미노)메틸]벤조산(화합물 5-2, 1.00g, 5.44 mmol, 1.00당량), H2O 중 NaOH(1M)(20.00 mL)의 교반 혼합물에 (Boc)2O(2.38 g, 10.88 mmol, 2.00당량)를 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 잔류물은 HCl(1N, aq.)을 사용하여 pH 3으로 산성화했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 EtOAc(3 x 30 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(30 mL)로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조했다. 여과 후, 여액은 감압하에 농축했다. 미정제 생성물은 추가 정제 없이 다음 단계에 사용했다. LCMS(ES, m/z): 266 [M+H]+
단계 3. 화합물 5-4의 합성
DCM(6 mL) 중 2-([[(tert-부톡시)카르보닐](메틸)아미노]메틸)벤조산(화합물 5-3, 500 mg, 1.70 mol, 1 당량) 및 H2O(7.5mL)의 교반 혼합물에 NaHCO3(570 mg, 6.78 mmol, 4당량) 및 테트라부틸암모늄 수소 황산염(57 mg, 0.17 mmol, 0.10당량)을 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반했다. 상기 혼합물에 클로로메탄술포닐 클로라이드(303 mg, 2.04 mol, 1.20당량)를 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 추가 3시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 실온에서 물(20 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 CH2Cl2(3 x 30 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(21 mL)로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 여과 후, 여액을 감압하에 농축했다. 이로써 클로로메틸 2-([[(tert-부톡시)카르보닐](메틸)아미노]메틸)벤조에이트(화합물 5-4, 250 mg, 42%)를 황색 오일로서 초래했다. LCMS(ES, m/z): 314,316 [M+H]+, 214,216 [M+H-100]+
단계 4. 화합물 (V)의 합성
DMF(2.00 mL) 중 1-(3-클로로-4-메틸페닐)-3-[[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-2,3-다이하이드로-1H-아이소인돌-5-일]메틸]우레아(화합물 1-5에 대해 기재된 절차에 따라 제조된 화합물 5, 100 mg, 0.20 mmol, 1.00 당량) 및 K2CO3 (84 mg, 0.61 mmol, 3.00 당량)의 교반 혼합물에 클로로메틸 2-([[(tert-부톡시)카르보닐](메틸)아미노]메틸)벤조에이트(화합물 5-4, 128 mg, 0.40 mmol, 2 당량)를 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 실온에서 물(10 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 EtOAc(3 x 20 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(20 mL)로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 여과 후, 여액을 감압하에 농축했다. 잔류물을 PE/EtOAc(1:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제했다. 미정제 생성물을 Prep-HPLC에 의해 다음 조건으로 정제했다: 컬럼, XSelect CSH 플루오로 페닐, 30 mm x 150 mm, 5 um; 이동상, 물(0.1%FA) 및 ACN(10분 내 45% 내지 58%); 검출기, UV 254 nm. 수집한 분획은 동결건조하여 [3-[5-([[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노]메틸)-1-옥소-2,3-다이하이드로-1H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 2-([[(tert-부톡시)카르보닐](메틸)아미노]메틸)벤조에이트(화합물 (V), 9.4 mg, 6%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 716,718 [M-H]- 1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ (ppm): 8.83 (br s, 1H), 7.83-7.80 (m, 1H), 7.71-7.61 (m, 3H), 7.51-7.38 (m, 3H), 7.19-7.11 (m, 3H), 6.90 (br s, 1H), 5.93-5.82 (m, 2H), 5.35-5.30 (m, 1H), 4.67 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 4.46-4.29 (m, 4H), 3.20-3.05 (m, 1H), 2.96-2.86 (m, 4H), 2.44-2.43 (m, 1H), 2.22 (s, 3H), 2.08-2.06 (m, 1H), 1.43-1.26 (m, 9H).
단계 1. 화합물 6-2의 합성
DCM(20.00 mL) 중 tert-부틸 N-[2-(메틸아미노)에틸]카르바메이트(화합물 6-1, 2.00 g, 11.48 mmol, 1.00 당량) 및 TEA(1.40 g, 13.83 mmol, 1.21 당량)의 교반 혼합물에 DCM(5.00 mL) 중 CbzCl(2.05 g, 12.01 mmol, 1.05당량)을 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 물을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 CH2Cl2(3 x 20 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(20 mL)로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 여과 후, 여액을 감압하에 농축했다. 이로써 tert-부틸 N-(2-[[(벤질옥시)카르보닐](메틸)아미노]에틸)카르바메이트(화합물 6-2, 3.5 g, 98%)가 담황색 오일로서 초래되었다. LCMS(ms, ESI):309 [M+H]+,331 [M+Na]+
단계 2. 화합물 6-3의 합성
DCM(20.00 mL) 중 tert-부틸 N-(2-[[(벤질옥시)카르보닐]-(메틸)아미노]에틸)카르바메이트(화합물 6-2, 1.50 g)의 교반 용액에 1,4-다이옥산(20.00 mL) 중 HCl(4N)을 질소 대기 하에 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축하여 벤질 N-(2-아미노에틸)-N-메틸카르바메이트 염산염(화합물 6-3, 1.4 g, 미정제물)을 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, ms):209[M+H]+
단계 3. 화합물 6-5의 합성
ACN(150 mL) 중 벤질 N-(2-아미노에틸)-N-메틸카르바메이트 염산염(화합물 6-3, 1.20 g, 4.90 mmol, 1.00 당량) 및 K2CO3(2.03 g, 14.71 mmol, 3.00 당량)의 교반 용액에 KI(0.41 g, 2.45 mmol, 0.50 당량) 및 에탄올, 2-(2-클로로에톡시)-(0.73 g, 5.88 mmol, 1.20 당량)를 실온에서 질소 대기 하에 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 60℃에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 MeCN(3x100 mL)으로 세척했다. 여액을 감압 하에 농축했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 추가 정제 없이 바로 다음 단계에 사용했다. LCMS(ESI, ms):297[M+H]+
단계 4. 화합물 6-6의 합성
THF(14.00 mL) 및 H2O(14.00 mL) 중 벤질 N-(2-[[2-(2-하이드록시에톡시)에틸]아미노]에틸)-N-메틸카르바메이트(화합물 6-5, 1.40 g, 4.72 mmol, 1.00 당량) 및 NaHCO3(396 mg, 4.72 mmol, 1.00당량)의 교반 용액에 Boc2O(1.03 g, 4.72 mmol, 1.00당량)를 0℃에서 질소 대기 하에 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 EtOAc(3 x 20 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(3x20 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 여과 후, 여액을 감압 농축하여 벤질 N-[2-[(tert-부톡시카르보닐)[2-(2-하이드록시에톡시)에틸]아미노]에틸]-N-메틸카르바메이트(화합물 6-6, 1.4 g, 74%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, ms):397[M+H]+ 1H NMR(300MHz, 클로로포름-d) δ 7.42-7.29(m, 5H), 5.13(s, 2H), 3.81-3.31(m, 12H), 2.97(t, J = 2.7Hz, 3H), 1.46(s, 9H).
단계 5. 화합물 6-7의 합성
EtOH(65.00 mL) 중 벤질 N-[2-[(tert-부톡시카르보닐)[2-(2-하이드록시에톡시)에틸]아미노]에틸]-N-메틸카르바메이트(화합물 6-6, 1.30 g, 3.28 mmol, 1.00당량)의 교반 용액에 Pd/C(26 mg, 10%)를 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 H2 대기 하에 실온에서 밤새 교반했다. LCMS는 완전한 반응을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 EtOH(3x10mL)로 세척했다. 여액을 감압 하에 농축하여 tert-부틸 N-[2-(2-하이드록시에톡시)에틸]-N-[2-(메틸아미노)에틸]카르바메이트(800 mg, 93%)를 회백색 고체로서 제공했다. 1H NMR (300 MHz, 클로로포름-d) δ 3.70-3.64 (m, 2H), 3.59 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 3.55-3.50 (m, 2H), 3.39 (s, 4H), 3.11 (s, 1H), 2.77 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.41 (s, 3H), 1.44 (s, 9H).
단계 6. 화합물 (VI)의 합성
DMF(2.00mL) 중 1-(3-클로로-4-메틸페닐)-3-[[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸]우레아(화합물 6-7, 200 mg, 0.45 mmol, 1.00당량)의 교반된 용액에 K2CO3(188 mg, 1.36 mmol, 3.00당량)를 실온에서 질소 대기 하에 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 30분 동안 교반했다. 상기 혼합물에 클로로메틸 4-니트로페닐 카르보네이트(105 mg, 0.45 mmol, 1.00당량), NaI(34 mg, 0.22 mmol, 0.50당량) 및 TBAI(167 mg, 0.45 mmol, 1.00당량)를 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 추가 1시간 동안 교반했다. 이어서, tert-부틸 N-[2-(2-하이드록시에톡시)에틸]-N-[2-(메틸아미노)에틸]카르바메이트 (238 mg, 0.90 mmol, 2.00 당량)를 첨가했다, 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 질소 대기 하에 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물은 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.1%FA) 중 ACN, 40분 내 10% 내지 80% 구배; 검출기, UV 254 nm. 수집한 분획을 동결건조했다. 이로써 [3-[5-([[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노]메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 N-[2-[(tert-부톡시카르보닐)[2-(2-하이드록시에톡시)에틸]아미노]에틸]-N-메틸카르바메이트(화합물 (VI), 50 mg, 14.52%)가 백색 고체로서 초래되었다. 미정제 생성물(50 mg)을 Prep-HPLC에 의해 다음 조건으로 정제했다: 컬럼, XSelect CSH 플루오로 페닐, 30 mm X 150 mm, 5um; 이동상, 물(0.05%FA) 및 ACN(7분 내 43% 상B 내지 최대 63%); 검출기, UV 254nm. 수집한 분획을 동결건조하여 [3-[5-([[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노]메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 N-[2-[(tert-부톡시카르보닐)[2-(2-하이드록시에톡시)-에틸]아미노]에틸]-N-메틸카르바메이트(13.3 mg, 3.86%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, ms): 759,761[M+H]+, 559,561[M+H-100]+ 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.75 (s, 1H), 7.75 - 7.60 (m, 2H), 7.54 - 7.41 (m, 2H), 7.23 - 7.10 (m, 2H), 6.80 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 5.64 - 5.47 (m, 2H), 5.26-5.22 (m, 2H), 4.56 (br s, 1H), 4.50 - 4.28 (m, 4H), 3.46 (d, J = 5.2 Hz, 4H), 3.42-3.41 (m, 2H), 3.29-3.28 (m, 2H), 3.28 - 3.17 (m, 4H), 3.07-3.05 (m, 1H), 2.87 - 2.76 (m, 4H), 2.49-2.47(m, 1H), 2.23 (s, 3H), 2.07 (s, 1H), 1.36 (s, 9H).
단계 1. 화합물 7-3의 합성
DMF(10 mL) 중 3-[5-(아미노메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]피페리딘-2,6-다이온(화합물 1-4에 대해 기재된 절차에 따라 제조된 화합물 7-1, 1.00 g, 3.66 mmol, 1.00 당량) 및 TEA(0.37 g, 3.66 mmol, 1.00 당량)의 교반 용액에 CDI(0.59 g, 3.66 mmol, 1.00 당량)를 0℃에서 질소 대기 하에 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 2시간 동안 교반했다. 상기 혼합물에 DMAP(1.34 g, 10.98 mmol, 3.00 당량) 및 3-클로로-p-톨루이딘(0.52 g, 3.66 mmol, 1.00 당량)을 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 60℃에서 추가 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 혼합물은 실온으로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 얼음/물에 부었다, 그 다음, 결과적으로 생성된 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 MeCN(3x50 mL)으로 세척했다. 여과된 케이크는 적외선 하에서 건조했다. 이로써 1-(3-클로로-4-메틸페닐)-3-[[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸]우레아(화합물 7-3, 1.1g, 68%)가 백색 고체로서 초래되었다. LCMS(ESI, ms): 441,443[M+H]+.
단계 2. 화합물 (VII)의 합성
DMF(2.00mL) 중 1-(3-클로로-4-메틸페닐)-3-[[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸]우레아(화합물 7-3, 200.00 mg, 0.45 mmol, 1.00당량)의 교반된 용액에 K2CO3(188 mg, 1.36 mmol, 3.00당량)를 실온에서 질소 대기 하에 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 30분 동안 교반했다. 상기 혼합물에 클로로메틸 4-니트로페닐 카르보네이트(화합물 7-4, 315 mg, 1.36 mmol, 3.00당량), TBAI(84 mg, 0.23 mmol, 0.50 당량) 및 NaI(68 mg, 0.45 mmol, 1.00 당량)를 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 추가 1시간 동안 교반했다. 이어서, tert-부틸 (2S)-2-[(메틸아미노)메틸]피롤리딘-1-카르복실레이트(화합물 7-5, 194 mg, 0.91 mmol, 2.00 당량)를 첨가했다. 최종 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물은 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.1%FA) 중 ACN, 40분 내 10% 내지 80% 구배; 검출기, UV 254 nm. 수집한 분획을 진공 하에 농축하여 tert-부틸 (2S)-2-([[([3-[5-([[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노]메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메톡시)카르보닐](메틸)아미노]메틸)피롤리딘-1-카르복실레이트(화합물 (VII), 5 mg, 2%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, ms):711,713[M+H]+,611,613[M+H-100]+. 1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 8.75(s, 1H), 7.71-7.60(m, 2H), 7.52-7.46(m, 2H), 7.19-7.13(m, 2H), 6.80(s, 1H), 5.61-5.47(m, 2H), 5.32-5.18(m, 1H), 4.60(s, 1H), 4.52-4.26(m, 4H), 3.46-3.40(m, 4H), 3.39(s, 1H), 3.30-3.22(m, 4H), 3.14-3.08(m, 1H), 2.91-2.78(m, 4H), 2.33(s, 1H), 2.22(s, 3H), 2.07(s, 1H), 1.36(s, 9H).
단계 1. 화합물 8-2의 합성
MeOH(100 mL) 중 2-카르복시벤즈알데하이드(화합물 8-1, 10 g, 63.27 mmol, 1.00 당량)의 교반 혼합물에 H2O(20mL) 중 CH3NH2(65.0 mL, 129.72 mmol, THF 중 2N, 2.05 당량)를 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반했다. 상기 혼합물에 NaBH4(1.20 g, 31.72 mmol, 0.50당량)를 25℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 추가 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 실온에서 아세톤(100 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 잔류물을 아세톤(100 mL)으로 분쇄하여 정제했다. 이로써 2-[(메틸아미노)메틸]벤조산(화합물 8-2, 10.4 g, 84%)이 회백색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 166 [M+H]+.
단계 2. 화합물 8-3의 합성
다이옥산(90 mL) 중 2-[(메틸아미노)메틸]벤조산(화합물 8-2, 9 g, 54.48 mmol, 1.00 당량)의 교반 혼합물에 H2O(1 M) 중 NaOH(90 mL) 및 (Boc)2O(24g, 108.96 mmol, 2.00당량)를 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 4시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 잔류물을 HCl(aq.)을 사용하여 pH 3으로 산성화했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 CH2Cl2(3 x 300 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(30 mL)로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 여과 후, 여액을 감압 농축하여 2-[[(tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노]메틸]벤조산(화합물 8-3, 12g, 81%)을 황색 오일로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 266 [M+H]+, 166 [M+H-100]+.
단계 3. 화합물 8-4의 합성
DCM(80 mL) 및 H2O(80mL) 중 2-([[(tert-부톡시)카르보닐](메틸)아미노]메틸)벤조산(화합물 8-3, 8 g, 27.14 mmol, 1.00 당량)의 교반 혼합물에 NaHCO3(9 g, 108.55 mmol, 4.00 당량), 테트라부틸암모늄 수소 황산염(0.92g, 2.71 mmol, 0.10당량) 및 클로로메탄술포닐 클로라이드(4.9 g, 32.82 mmol, 1.2당량)를 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 추가 5시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 실온에서 물(20 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 CH2Cl2(3 x 100 mL)로 추출했다. 잔류물을 PE/EtOAc(3:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 클로로메틸 2-([[(tert-부톡시)카르보닐](메틸)아미노]메틸)벤조에이트(화합물 8-4, 6.6 g, 65%)를 황색 오일로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 314 [M+H]+, 214 [M+H-100]+. 1H NMR(300MHz, CDCl3): 8.06(t, J=3Hz,1H), 7.62-7.57(m, 1H), 7.39-7.30(m, 2H), 5.95(s, 2H), 4.87(s, 2H), 2.92(d, J=3Hz, 3H), 1.61-1.25(m, 9H).
단계 4. 화합물 8-6의 합성
DMF(10 mL) 중 1-(3-클로로-4-메틸페닐)-3-[[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-2,3-다이하이드로-1H-아이소인돌-5-일]메틸]우레아(화합물 1-5에 대해 기재된 절차에 따라 제조된 화합물 8-5, 500 mg, 1.13 mmol, 1.00 당량) 및 K2CO3(470 mg, 3.40 mmol, 3.00당량)의 교반된 혼합물에 클로로메틸 2-([[(tert-부톡시)카르보닐](메틸)아미노]메틸)벤조에이트(화합물 8-4, 712 mg, 2.29 mmol, 2.00 당량)를 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반했다. LCMS를 통해 원하는 생성물이 검출될 수 있었다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상 TFA, 수중 ACN, 40분 내 10% 내지 80% 구배; 검출기, UV 254 nm. 수집한 분획은 농축하여 [3-[5-([[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노]메틸)-1-옥소-2,3-다이하이드로-1H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 2-([[(tert-부톡시)카르보닐](메틸)아미노]-메틸)벤조에이트(화합물 8-6, 200 mg, 24%)를 반고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 618,620 [M+H-100]+, 718,720 [M+H]+.
단계 5. 화합물 8-7의 합성
1,4-다이옥산(4 mL)에서 HCl(기체) 중 [3-[5-([[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노]메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 2-[[(tert-부톡시카르보닐)(메틸)-아미노]메틸]벤조에이트(화합물 8-6, 200 mg, 0.28 mmol, 1.00 당량)의 교반 혼합물에 실온에서 질소 대기 하에 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 1시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 진공하에 농축했다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상 TFA, 수중 ACN, 30분 내 10% 내지 50% 구배; 검출기, UV 254 nm. 혼합물은 동결건조하여 [3-[5-([[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노]메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 2-[(메틸아미노)메틸]벤조에이트(화합물 8-7, 80 mg, 41%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 618,620[M+H]+, 640,642[M+Na]+.
단계 6. 화합물 8-9의 합성
DMF(15 mL) 중 (2S)-2-(2-[2-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]아세트아미도]-아세트아미도)-3-페닐프로판산(화합물 8-8, 1.50 g, 3.95 mmol, 1.00당량)의 교반된 혼합물에 HATU(2.25 g, 5.92 mmol, 1.50 당량), HOBT(0.53 g, 3.92 mmol, 0.99 당량), 글리신(0.36 g, 4.79 mmol, 1.21 당량) 및 DIEA(1.53 g, 11.84 mmol, 2.99 당량)를 0℃에서 첨가했다. 생성된 혼합물은 25℃에서 밤새 교반했다. LCMS는 12%의 원하는 생성물을 검출했다. 반응 혼합물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상 FA(0.1%), 수중 ACN, 40분 내 10% 내지 50% 구배; 검출기, UV 254 nm. 결과적으로 생성된 혼합물을 진공 하에 농축하여 [(2S)-2-(2-[2-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]아세트아미도]아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]아세트산(화합물 8-9, 300 mg, 15%)을 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 437 [M+H]+, 337 [M+H-100]+.
단계 7. 화합물 8-10의 합성
0℃, 1,4-다이옥산(6.0mL)에서 HCl(기체) 중 [(2S)-2-(2-[2-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]-아세트아미도]아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]아세트산(화합물 8-9, 290 mg, 0.66 mmol, 1.00당량)의 교반된 혼합물에. 결과적으로 생성된 혼합물은 25℃에서 추가 3시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 결과적으로 생성된 혼합물은 진공 하에 농축하여 [(2S)-2-[2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도]-3-페닐프로판아미도]아세트산 염산염(화합물 8-10, 330 mg, 93%)을 백색 고체로서 제공했다. 미정제 생성물은 아무런 정제 없이 다음 단계에 사용했다. LCMS(ES, m/z): 337 [M+H]+.
단계 8. 화합물 8-12의 합성
DMSO(6 mL) 중 [(2S)-2-[2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도]-3-페닐프로판아미도]아세트산 염산염(화합물 8-10, 320 mg, 0.86 mmol, 1.00당량)의 교반 혼합물에 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥사노에이트(화합물 8-11, 318 mg, 1.03 mmol, 1.20 당량) 및 DIEA(333 mg, 2.58 mmol, 3.0 당량)을 질소 대기 하 실온에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 추가 3시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 잔류물은 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상 TFA(0.5%), 수중 ACN, 30분 내 10% 내지 50% 구배; 검출기, UV 254 nm. 수집한 분획은 동결건조하여 [(2S)-2-(2-[2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도]아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]아세트산(화합물 8-12, 330 mg, 68%)을 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 530 [M+H]+, 552 [M+Na]+. 1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ: 8.36-8.30(m, 1H), 8.11-8.06 (m, 2H), 8.06-7.97 (m, 1H), 7.26-7.15 (m, 5H), 6.99 (s, 2H), 4.57-4.49 (m, 1H), 3.79-3.59 (m, 6H), 3.37 (t, J=6Hz, 2H), 3.04(t, J=9Hz, 1H), 2.82-2.77(m, 1H), 2.11(t, J=9Hz, 2H), 1.52-1.44(m, 4H), 1.24-1.16(m, 2H).
단계 9. 화합물 (VIII)의 합성
DMF(2 mL) 중 [(2S)-2-(2-[2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]-아세트아미도]아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]아세트산(화합물 8-7, 60 mg, 0.11 mmol, 1.00당량) 및 HATU(65 mg, 0.17 mmol, 1.50당량)의 교반된 혼합물에 HOBT(15 mg, 0.11 mmol, 1.0당량), [3-[5-([[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노]메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 2-[(메틸아미노)메틸]벤조에이트(70 mg, 0.11 mmol, 1.00당량) 및 DIEA(44 mg, 0.34 mmol, 3.0당량)를 질소 대기 하 실온에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 미정제 생성물은 Prep-HPLC로 다음 조건으로 정제했다(컬럼: YMC-Actus Triart C18, 30mm X 150mm, 5um; 이동상 A:물(0.05%TFA), 이동상 B:ACN; 유속: 60mL/분;). 수집한 분획은 동결건조하여 [3-[5-([[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노]메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 2-([2-[(2S)-2-(2-[2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도]아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]-N-메틸아세트아미도]메틸)벤조에이트(화합물 (VIII), 40 mg, 30%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 566 [M/2+1]+, 1129, 1131[M+1]+, 1151,1153[M+Na]+. 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6)　δ: 8.77 (s, 1H),　8.28-7.80 (m, 5H), 7.73-7.40 (m, 6H), 7.30-7.10 (m, 8H),　6.99 (s, 2H), 6.85-6.80 (m, 1H), 5.95-5.84 (m, 2H), 5.36-5.30 (m, 1H),　4.88-4.82 (m, 2H), 4.62-4.25 (m, 5H),　4.12 (d, J=3 Hz, 1H), 3.89 (d, J=3 Hz, 1H), 3.70-3.65 (m, 5H), 3.36 (t, J=6 Hz, 2H), 3.20-2.70 (m, 7H),　2.23 (s, 3H),　2.10 (t, J=9 Hz, 3H), 1.50-1.44 (m, 4H), 1.28-1.10 (m, 2H).
단계 1. 화합물 9-2의 합성
THF(100 mL) 중 (2-클로로-4-니트로페닐)아세트산(화합물 9-1, 10 g, 46.38 mmol, 1.00 당량)의 교반 용액에 BH3-Me2S(8.8 g, 115.97 mmol, 2.50 당량)를 질소 대기 하에 실온에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 70℃에서 2시간 동안 교반했다. TLC는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 농축 건조시켰다. 잔류물을 PE/EtOAc(2:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 2-(2-클로로-4-니트로페닐)에탄올(화합물 9-2, 6.4g, 68%)을 적색 오일로서 제공했다. 1H NMR(300MHz, CDCl3) δ 8.22(s, 1H), 8.07-8.03(m, 1H), 7.51(d, J = 3Hz, 1H), 3.92(t, J = 6Hz, 2H), 3.09(t, J = 6Hz, 2H).
단계 2. 화합물 9-3의 합성
DCM(120 mL) 중 2-(2-클로로-4-니트로페닐)에탄올(화합물 9-2, 6.4 g, 31.74 mmol, 1.00 당량)의 교반 용액에 NBS(8.48 g, 47.64 mmol, 1.50 당량) 및 PPh3(12.50 g, 47.62 mmol, 1.50 당량)을 실온에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반했다. TLC 추적은 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응물을 진공하에 농축 건조시켰다. 잔류물은 PE/EtOAc(4:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 1-(2-브로모에틸)-2-클로로-4-니트로벤젠(7.0 g, 66%)을 적색 오일로서 제공했다. 1H NMR(화합물 9-3, 300MHz, CDCl3) δ 8.28(d, J = 2.4Hz, 1H), 8.13(d, J = 9.0Hz, 1H), 7.51(d, J = 3Hz, 1H), 3.66(t, J = 6.0Hz, 2H), 3.42(t, J = 6.0Hz, 2H).
단계 3. 화합물 9-4의 합성
EtOH(60 mL) 중 1-(2-브로모에틸)-2-클로로-4-니트로벤젠(화합물 9-3, 6 g, 22.68 mmol, 1.00 당량)의 교반 혼합물에 나트륨 메탄티올레이트(1.92 g, 27.45 mmol, 1.21 당량)를 질소 대기 하에 0℃에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물은 질소 대기 하에 실온에서 3시간 동안 교반했다. LCMS에서는 원하는 생성물을 검출할 수 없었으나 TLC(PE:EA=10:1)에서는 새로운 지점이 나타났다. 생성된 혼합물은 진공하에 농축했다. 잔류물은 PE/EtOAc(9:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 2-클로로-1-[2-(메틸술파닐)에틸]-4-니트로벤젠(화합물 9-4, 1.7 g, 32%)을 황색 고체로서 제공했다. 1H NMR(300MHz, CDCl3): 8.28(t, J=3Hz,1H), 8.10(d, J=3Hz,1H), 7.45(d, J=9Hz,1H), 3.14(t, J=6Hz, 2H), 2.80(t, J=3Hz, 2H), 2.18(s, 3H).
단계 4. 화합물 9-5의 합성
EtOH(60 mL) 중 2-클로로-1-[2-(메틸술파닐)에틸]-4-니트로벤젠(화합물 9-4, 2 g, 8.63 mmol, 1.00 당량) 및 Fe(1.45 g, 25.96 mmol, 3.01 당량)의 교반된 혼합물에 H2O(20 mL) 중 NH4Cl(4.6 g, 86.32 mmol, 10.00 당량)을 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 90℃에서 3시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 CH2Cl2로 세척했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 진공하에 농축했다. 잔류물은 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상 TFA(0.05%), 수중 ACN, 40분 내 10% 내지 50% 구배; 검출기, UV 254 nm. 수집한 분획을 농축하여 3-클로로-4-[2-(메틸술파닐)에틸]아닐린(화합물 9-5, 2.0 g, 69%)을 황색 오일로서 제공했다. LCMS(ESI, ms): 202,204[M+H]+,243,245[M+H+ACN]+.
단계 5. 화합물 9-6의 합성
DMF(25 mL) 중 3-[5-(아미노메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]피페리딘-2,6-다이온(화합물 1-4에 대해 기재된 절차에 따라 제조된 INT1, 1.4 g, 4.96 mmol, 1.00당량)의 교반된 혼합물에 CDI(0.80 g, 4.96 mmol, 1.00당량) 및 TEA(0.50 g, 4.94 mmol, 1.00당량)를 질소 대기 하에 0℃에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 3시간 동안 교반했다. 상기 혼합물에 3-클로로-4-[2-(메틸술파닐)에틸]아닐린(화합물 9-5, 1 g, 4.96 mmol, 1.00 당량) 및 DMAP(1.82 g, 14.90 mmol, 3.00 당량)을 실온에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 60℃에서 밤새 교반했다. LCMS를 통해 58% 원하는 생성물을 검출할 수 있었다. 반응 혼합물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상 TFA(0.05%), 수중 ACN, 40분 내 10% 내지 70% 구배; 검출기, UV 254 nm. 수집한 분획을 농축하여 1-[3-클로로-4-[2-(메틸술파닐)에틸]페닐]-3-[[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸]우레아(화합물 9-6, 700 mg, 27%)를 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z):501,503[M+H]+. 1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 10.98(s, 1H), 8.79(s, 1H), 7.71-7.67(m, 2H), 7.52-7.25(m, 2H), 7.25-7.15(m, 2H), 6.82(t, J=6Hz, 1H), 5.14-5.08(m, 1H), 4.49-4.29(m, 4H), 2.98-2.84(m, 3H), 2.84-2.63(m, 3H), 2.42-2.34(m, 1H), 2.09(s, 3H), 2.03-1.90(m, 1H).
단계 6. 화합물 9-7의 합성
DMF(10 mL) 중 1-[3-클로로-4-[2-(메틸술파닐)에틸]페닐]-3-[[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸]우레아(화합물 9-6, 700 mg, 1.40 mmol, 1.00 당량) 및 K2CO3(579 mg, 4.19 mmol, 3.00 당량)의 교반 혼합물에 클로로메틸 2-[[(tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노]메틸]벤조에이트(화합물 8-4, 526 mg, 1.68 mmol, 1.20당량)를 실온에서 질소 대기 하에 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 2일 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상 TFA(0.05%), 수중 ACN, 40분 내 30% 내지 80% 구배; 검출기, UV 254 nm. 수집한 분획을 동결건조하여 [3-(5-[[([3-클로로-4-[2-(메틸술파닐)에틸]페닐]카르바모일)아미노]메틸]-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일)-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 2-[[(tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노]메틸]벤조에이트(화합물 9-7, 260 mg, 21%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z):778,780[M+H]+,678,780[M+H-100]+.
단계 7. 화합물 9-8의 합성
1,4-다이옥산(5 mL)에서 HCl(기체) 중 [3-(5-[[([3-클로로-4-[2-(메틸술파닐)에틸]페닐]카르바모일)아미노]메틸]-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일)-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 2-[[(tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노]메틸]벤조에이트(화합물 9-7, 250 mg, 0.32 mmol, 1.00당량)의 교반 혼합물에 실온에서 질소 대기 하에 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 1시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 진공하에 농축했다. 미정제 생성물을 역플래시 크로마토그래피에 의해 다음 조건으로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상 TFA(0.05%), 수중 ACN, 40분 내 10% 내지 50% 구배; 검출기, UV 254 nm. 혼합물을 동결건조하여 [3-(5-[[([3-클로로-4-[2-(메틸술파닐)에틸]페닐]카르바모일)아미노]메틸]-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일)-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 2-[(메틸아미노)메틸]벤조에이트(화합물 9-8, 132 mg, 56%)를 황색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z):678,680[M+H]+,700,702[M+Na]+.
단계 8. 화합물 (IX)의 합성
DMF(2.00mL) 중 [(2S)-2-(2-[2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도]아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]아세트산(화합물 8-12, 100 mg, 0.19 mmol, 1.00당량) 및 HATU(108 mg, 0.28 mmol, 1.5당량)의 교반 혼합물에 HOBT(26 mg, 0.19 mmol, 1.0당량), [3-(5-[[([3-클로로-4-[2-(메틸술파닐)에틸]페닐]카르바모일)아미노]메틸]-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일)-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 2-[(메틸아미노)메틸]벤조에이트(화합물 9-8, 115 mg, 0.17 mmol, 0.90당량) 및 DIEA(73 mg, 0.57 mmol, 3.0당량)를 실온에서 질소 대기 하에 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 미정제 생성물을 다음 조건(컬럼: XSelect CSH Prep C18 OBD 컬럼, 19x250mm,5um; 이동상 A:물(0.05%TFA), 이동상 B:ACN; 유속: 25mL/분;)으로 Prep-HPLC로 정제했다. 수집한 분획은 동결건조하여 [3-(5-[[([3-클로로-4-[2-(메틸술파닐)에틸]페닐]카르바모일)아미노]메틸]-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일)-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸 2-([2-[(2S)-2-(2-[2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도)]아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]-N-메틸아세트아미도]메틸)벤조에이트(화합물(IX), 52.1 mg, 23%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z):596[M/2+1]+,1189,1191[M+1]+. 1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 8.82(s, 1H), 8.12-7.83(m, 5H), 7.73-7.38(m, 6H), 7.26-7.15(m, 8H), 6.99(s, 2H), 6.83(t, J=6Hz, 1H), 5.98-5.84(m, 2H), 5.32(t, J=6Hz, 1H), 4.884.81(m, 2H), 4.65-4.30(m, 5H), 4.12(d, J=3Hz, 1H), 3.94-3.85(m, 4H), 3.72-3.59(m, 3H), 3.36(t, J=6Hz, 2H), 3.20-2.95(m, 4H), 2.89-2.74(m, 4H), 2.62-2.50(m, 2H), 2.12-2.05(m, 6H), 1.58-1.40(m, 4H), 1.28-1.10(m, 2H).
단계 1. 화합물 10-2의 합성
H2O(70 mL) 중 Gly-Gly(10 g, 75.69 mmol, 1.00 당량) 및 NaHCO3(12.72 g, 151.3 mmol, 2 당량)의 교반 혼합물에 THF(35mL) 중 클로로(프로프-2-엔-1-일옥시)메타논(10.95g, 90.82 mmol, 1.2당량)을 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 5시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 혼합물을 HCl(수성 1N)을 사용하여 pH 5로 산성화했다. 침전된 고체를 여과로 수집하고 HCl(수성 1N)(2 x 5mL)로 세척했다. 이로써 (2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}아세트아미도)아세트산(화합물 10-2, 9 g, 55%)이 백색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 217 [M+H]+
단계 2. 화합물 10-3의 합성
THF(220 mL) 중 (2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}아세트아미도)아세트산(화합물 10-2, 9 g, 41.62 mmol, 1.00 당량)과 Cu(OAc)2(0.76 g, 4.16 mmol, 0.1 당량)의 혼합물을 질소 대기 하에 60℃에서 1시간 동안 교반했다. 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 상기 혼합물에 Pb(OAc)4(22.15 g, 49.9 mmol, 1.2 당량)를 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 추가 1시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 MeOH(3 x 50 mL)로 세척했다. 여액을 감압 하에 농축했다. 잔류물을 PE/EA(1:10)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}아세트아미도)메틸 아세테이트(화합물 10-3, 5 g, 52%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 231 [M+H]+
단계 3. 화합물 10-4의 합성
DCM(40 mL) 중 (2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}아세트아미도)메틸 아세테이트(화합물 10-3, 1 g, 4.34 mmol, 1.00 당량)의 교반 혼합물에 TMSCl(1.89 g, 17.37 mmol, 4 당량)을 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반했다. LCMS(LCMS용 MeOH로 켄칭)는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 미정제 생성물을 추가 정제 없이 직접 다음 단계에 사용했다. 이로써 프로프-2-엔-1-일 N-[(클로로메틸카르바모일)메틸]카르바메이트(화합물 10-3, 1 g, 77%)가 황색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 203 [M+H]+(MeOH로 켄칭됨)
단계 4. 화합물 10-6의 합성
NMP(15.00 mL) 중 1-(3-클로로-4-메틸페닐)-3-{[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸}우레아(화합물 1-5에 기재된 절차에 따라 제조된 화합물 10-5, 750 mg, 1.70 mmol, 1.00당량) 및 Ag2CO3(938 mg, 3.40 mmol, 2당량)의 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 교반했다. 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 상기 혼합물에 프로프-2-엔-1-일 N-[(클로로메틸카르바모일)메틸]카르바메이트(화합물 10-4, 703 mg, 3.40 mmol, 2.00당량)를 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 60℃에서 추가 36시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 잔류물을 YMC-Actus Triart C18 ExRS, 30 x 150 mm; 이동상 A: 물(0.05%TFA), 이동상 B: ACN; 유속: 60 mL/분; 구배: 10분 내 27% B 내지 53% B, 53% B; 파장: 254nm; RT1(분): 9.22분으로 정제되었다. 이로써 프로프-2-엔-1-일 N-{[({3-[5-({[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노}메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌- 2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일}메틸)카르바모일]메틸}카르바메이트(화합물 10-6, 100 mg, 8%)가 황색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 611,613 [M+H]+
단계 5. 화합물 10-7의 합성
THF(1.50mL) 중 프로프-2-엔-1-일 N-{[({3-[5-({[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노}메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일}메틸)카르바모일]메틸}카르바메이트(화합물 10-6, 100 mg, 0.17 mmol, 1.00당량) 및 Pd(PPh3)4(19 mg, 0.017 mmol, 0.10당량)의 교반 혼합물에 페닐실란(36 mg, 0.34 mmol, 2.00당량)을 질소 대기 하에 25℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 25℃에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 물(0.05% TFA), ACN(30분 내 5% 내지 50% 구배); 검출기, UV 254 nm. 이로써 2-아미노-N-({3-[5-({[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노}메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일}메틸)아세트아미드(화합물 10-7, 70 mg, 79%)가 황색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 527,529 [M+H]+
단계 6. 화합물 (X)의 합성
DMF(650 uL) 중 [(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]아세트산(화합물 8-12에 대해 기재된 절차에 따라 제조된 화합물 10-8, 65 mg, 0.12 mmol, 1당량) 및 HATU(56 mg, 0.14 mmol, 1.2당량), HOBT(20 mg, 0.14 mmol, 1.2당량)의 교반 혼합물에 2-아미노-N-({3-[5-({[(3-클로로-4-메틸페닐)카르바모일]아미노}메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일}메틸)아세트아미드(화합물 10-7, 65 mg, 0.12 mmol, 1.00당량) 및 DIEA(47 mg, 0.36 mmol, 3당량)를 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 물(0.5% TFA 함유), 30분 내 ACN 10% 내지 50% 구배; 검출기, UV 254 nm. 미정제 생성물을 Prep-HPLC에 의해 다음 조건으로 다시 정제했다. 컬럼: Kinetex EVO prep C18, 30 x 150, 5 um; 이동상 A: 물(0.05% TFA), 이동상 B: ACN; 유속: 60mL/분; 구배: 17분 내 25% B 내지 35% B, 35% B; 파장: 254nm; RT1(분): 16. 수집한 분획은 동결건조하여 N-{[({[(1S)-1-{[({[({3-[5-({[(3-클로로-4-메틸페닐))카르바모일]아미노}메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일}메틸)카르바모일]메틸}카르바모일)메틸]카르바모일}-2-페닐에틸]카르바모일}메틸)카르바모일]메틸}-6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미드(화합물 (X), 11.4 mg, 8.84%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 1038,1040 [M+H]+. 1H-NMR(DMSO, 400MHz) δ(ppm): 8.75(s, 1H), 8.31-8.29(m, 1H), 8.19-8.16(m, 1H), 8.12-8.05(m, 2H), 7.99-7.94(m, 2H), 7.71-7.66(m, 2H), 7.52(s, 1H), 7.44(d, J = 8.0Hz, 1H), 7.24-7.08(m, 7H), 6.99-6.86(m, 2H), 6.82-6.79(m, 1H), 5.20-5.13(m, 2H), 4.99-4.95(m, 1H), 4.49-4.40(m, 4H), 4.31-4.27(m, 1H), 3.76-3.56(m, 8H), 3.37-3.30(m, 2H), 3.07-2.97(m, 2H), 2.79-2.67(m, 2H), 2.40-2.30(m, 1H), 2.22(s, 3H), 2.11-2.02(m, 3H), 1.49-1.42(m, 4H), 1.23-1.14(m, 2H).
단계 1. 화합물 11-2의 합성
DMF(20 mL) 중 3-[5-(아미노메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]피페리딘-2,6-다이온(화합물 1-4에 대해 기재된 절차에 따라 제조된 INT, 1.99g, 7.29 mmol, 1.2당량)의 교반 혼합물에 CDI(0.99g, 6.08 mmol, 1당량), TEA(0.62g, 6.08 mmol, 1당량)를 0℃에서 질소 대기 하에 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 0℃에서 1시간 동안 교반했다. 상기 혼합물에 tert-부틸 N-{2-[2-(4-아미노-2-클로로페닐)에톡시]에틸}-N-메틸카르바메이트(화합물 11-1, 2 g, 6.08 mmol, 1.00 당량)를 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 60℃에서 추가 16시간 동안 교반했다. LCMS는 60%의 원하는 생성물을 나타냈다. 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 실온에서 물(20 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 EtOAc(3 x 30 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(30 mL)로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 여과 후, 여액을 감압하에 농축했다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 물(0.05% TFA), ACN(30분 내 5% 내지 50% 구배); 검출기, UV 254 nm. 이로써 tert-부틸 N-[2-(2-{2-클로로-4-[({[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일)]메틸}카르바모일)아미노]페닐}에톡시)에틸]-N-메틸카르바메이트(화합물 11-2, 2 g, 52%)가 황색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 628,630 [M+H]+
단계 2. 화합물 11-4의 합성
DCM(40 mL) 중 (2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}아세트아미도)메틸 아세테이트(화합물 11-3, 1 g, 4.34 mmol, 1.00 당량)의 교반 혼합물에 TMSCl(1.89 g, 17.37 mmol, 4 당량)을 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 이로써 프로프-2-엔-1-일 N-[(클로로메틸카르바모일)메틸]카르바메이트(화합물 11-4, 0.8 g, 89%)가 백색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 203 [M+H]+(LCMS용 MeOH로 켄칭됨)
단계 3. 화합물 11-5의 합성
NMP(16 mL) 중 tert-부틸 N-[2-(2-{2-클로로-4-[({[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸}카르바모일)아미노]페닐}에톡시)에틸]-N-메틸카르바메이트(화합물 11-2, 1g, 1.59 mmol, 1.00당량) 및 K2CO3(0.44g, 3.18 mmol, 2당량)의 교반 혼합물에 프로프-2-엔-1-일 N-[(클로로메틸카르바모일)메틸]카르바메이트(화합물 11-4, 0.82 g, 3.98 mmol, 2.5 당량)를 25℃에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 60℃에서 16시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 실온에서 물(20 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 EtOAc(3 x 30 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(30 mL)로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 여과 후, 여액을 감압하에 농축했다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 물(0.05% TFA), ACN(30분 내 5% 내지 50% 구배; 검출기, UV 254 nm. 이로써 tert-부틸 N-(2-{2-[2-클로로-4-({[(2-{2,6-다이옥소-1-[(2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}아세트아미도)메틸]피페리딘-3-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일)메틸]카르바모일}아미노)페닐]에톡시}에틸)-N-메틸카르바메이트 화합물 11-5, (0.5 g, 39%)가 황색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 798,800 [M+H]+
단계 4. 화합물 11-6의 합성
THF(6 mL) 중 tert-부틸 N-(2-{2-[2-클로로-4-({[(2-{2,6-다이옥소-1-[(2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}아세트아미도)메틸]피페리딘-3-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일)메틸]카르바모일}아미노)페닐]에톡시}에틸)-N-메틸카르바메이트(화합물 11-5, 500 mg, 0.62 mmol, 1.00 당량)의 교반 혼합물에 Pd(PPh3)4(72 mg, 0.063 mmol, 0.1 당량), 페닐실란(136 mg, 1.25 mmol, 2 당량)을 질소 대기 하에 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 25℃에서 3시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 실온에서 물(20 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 EtOAc(3 x 30 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(30 mL)로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 여과 후, 여액을 감압하에 농축했다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 물(0.05% TFA), ACN(30분 내 5% 내지 50% 구배); 검출기, UV 254 nm. 이로써 tert-부틸 N-(2-{2-[4-({[(2-{1-[(2-아미노아세트아미도)메틸]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일)메틸]카르바모일}아미노)-2-클로로페닐]에톡시}에틸)-N-메틸카르바메이트(화합물 11-6, 400 mg, 89%)가 황색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 714,716 [M+H]+
단계 5. 화합물 11-8의 합성
DMF(3 mL) 중 [(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]아세트산(화합물 8-12에 대해 기재된 절차에 따라 제조된 화합물 11-7, 163 mg, 0.30 mmol, 1.1당량), HATU(159 mg, 0.42 mmol, 1.5당량) 및 HOBT(57 mg, 0.42 mmol, 1.5당량)의 교반 혼합물에 tert-부틸 N-(2-{2-[4-({[(2-{1-[(2-아미노아세트아미도)메틸]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일)메틸]카르바모일}아미노)-2-클로로페닐]에톡시}에틸)-N-메틸카르바메이트(화합물 11-6, 200 mg, 0.28 mmol, 1.00당량), DIEA(108 mg, 0.84 mmol, 3당량)를 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 5시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 물(10 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 침전된 고체를 여과하여 수집하고 물(11mL)로 세척했다. 이로써 tert-부틸 N-(2-{2-[2-클로로-4-({[(2-{1-[(2-{2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]아세트아미도}아세트아미도)메틸]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일)메틸]카르바모일}아미노)페닐]에톡시}에틸)-N-메틸카르바메이트(화합물 11-8, 100 mg, 29%)가 황색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 1225,1227 [M+H]+
단계 6. 화합물 (XI)의 합성
DCM(0.8 mL) 중 tert-부틸 N-(2-{2-[2-클로로-4-({[(2-{1-[(2-{2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]아세트아미도}아세트아미도)메틸]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일)메틸]카르바모일}아미노)페닐]에톡시}에틸)-N-메틸카르바메이트(화합물 11-8, 100 mg, 0.08 mmol, 1.00당량)의 교반된 혼합물에 TFA(0.2 mL)를 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 4시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 미정제 생성물을 다음 조건으로 Prep-HPLC로 정제했다. 컬럼: XBridge Shield RP18 OBD 컬럼, 30 x 150 mm, 5 μm; 이동상 A: 물(0.05% TFA), 이동상 B: ACN; 유속: 60 mL/분; 구배: 7분 내에 20% B 내지 40% B, 40% B; 파장: 254nm; RT1(분): 5.7분. 수집한 분획은 동결건조하여 N-{[({[(1S)-1-{[({[({3-[5-({[(3-클로로-4-{2-[2-(메틸아미노))에톡시]에틸}페닐)카르바모일]아미노}메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일}메틸)카르바모일]메틸}카르바모일)메틸]카르바모일}-2-페닐에틸]카르바모일}메틸)카르바모일]메틸}-6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미드; 트리플루오로아세트산(화합물 (XI), 30.5 mg, 29%)을 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 1125,1127 [M+H]+. 1H-NMR(DMSO, 400MHz) δ(ppm): 8.88(s, 1H), 8.39(br s, 2H), 8.33-8.29(m, 1H), 8.21-8.17(m, 1H), 8.13-8.06(m, 2H), 8.01-7.94(m, 2H), 7.71(d, J = 7.6Hz, 1H), 7.72(d, J = 2.0Hz, 1H), 7.51(s, 1H), 7.44(d, J = 8.0Hz, 1H), 7.26-7.14(m, 7H), 6.99(s, 2H), 6.93-6.90(m, 1H), 5.26-5.08(m, 2H), 5.02-4.88(m, 1H), 4.58-4.39(m, 4H), 4.35-4.18(m, 1H), 3.76-3.56(m, 12H), 3.37-3.34(m, 2H), 3.10-3.00(m, 4H), 2.90-2.87(m, 2H), 2.81-2.75(m, 2H), 2.57-2.54(m, 3H), 2.42-2.32(m, 1H), 2.11-2.08(m, 2H), 2.06-1.99(m, 1H), 1.49-1.43(m, 4H), 1.19-1.16(m, 2H).
단계 1. 화합물 12-3의 합성
DMF(31 mL) 및 TEA(31 mL) 중 3-(4-브로모-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일)피페리딘-2,6-다이온(화합물 12-1, 3 g, 9.28 mmol, 1.00 당량) 및 tert-부틸 N-(펜트-4-인-1-일)카르바메이트(화합물 12-2, 3.06 g, 16.71 mmol, 1.8 당량)의 교반 혼합물에 CuI(0.35 g, 1.85 mmol, 0.2 당량) 및 Pd(PPh3)2Cl2(0.65 g, 0.92 mmol, 0.1 당량)를 실온에서 질소 대기 하에 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 80℃에서 16시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 실온에서 물(100 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 EtOAc(3 x 50 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(3 x 50 mL)로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 여과 후, 여액을 감압하에 농축했다. 잔류물은 CH2Cl2/MeOH(10:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 tert-부틸 N-{5-[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-4-일]펜트-4-인-1-일}카르바메이트(화합물 12-32g, 50%)를 갈색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 426 [M+H]+
단계 2. 화합물 12-5의 합성
DCM(38mL) 중 (2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}아세트아미도)메틸 아세테이트(화합물 10-3에 대해 기재된 절차에 따라 제조된 화합물 12-4, 0.9g, 3.90 mmol, 1.00당량)의 교반 혼합물에 TMSCl(1.9mL, 14.86 mmol, 3.80당량)을 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 미정제 생성물은 추가 정제 없이 직접 다음 단계에 사용했다. 이로써 프로프-2-엔-1-일 N-[(클로로메틸카르바모일)메틸]카르바메이트(화합물 12-5, 0.8 g, 99%)가 백색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 203 [M+H]+(메탄올로 유도체화됨)
단계 3. 화합물 12-6의 합성
NMP(24 mL) 중 tert-부틸 N-{5-[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-4-일]펜트-4-인-1-일}카르바메이트(화합물 12-3, 1 g, 2.35 mmol, 1.00 당량) 및 프로프-2-엔-1-일 N-[(클로로메틸카르바모일)메틸]카르바메이트(화합물 12-5, 0.73 g, 3.52 mmol, 1.5 당량)의 교반 혼합물에 K2CO3(0.65 g, 4.70 mmol, 2 당량)을 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 60℃에서 16시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 실온에서 물(30 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 EtOAc(3 x 30 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(3 x 30 mL)로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 여과 후, 여액을 감압하에 농축했다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 물(0.05% TFA), ACN(30분 내 5% 내지 50% 구배; 검출기, UV 254 nm. 이로써 tert-부틸 N-[5-(2-{2,6-다이옥소-1)-[(2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}아세트아미도)메틸]피페리딘-3-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-4-일)펜트-4-인-1-일]카르바메이트(화합물 12-6, 1.2 g, 85%)가 황색 오일로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 596 [M+H]+
단계 4. 화합물 12-7의 합성
THF(30 mL) 중 tert-부틸 N-[5-(2-{2,6-다이옥소-1-[(2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}아세트아미도)메틸]피페리딘-3-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-4-일)펜트-4-인-1-일]카르바메이트(화합물 12-6, 1.4 g, 2.35 mmol, 1.00 당량) 및 Pd(PPh3)4(0.27 g, 0.23 mmol, 0.1 당량)의 교반 혼합물에 질소 대기 하에 페닐실란(0.51 g, 4.70 mmol, 2 당량)을 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 25℃에서 3시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 실온에서 물(1 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 물(0.05% TFA), ACN 5% 내지 50% 구배(30분); 검출기, UV 254 nm. 이로써 tert-부틸 N-[5-(2-{1-[(2-아미노아세트아미도)메틸]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-4-일)펜트-4-인-1-일]카르바메이트; 트리플루오로아세트산(화합물 12-7, 500 mg, 34%)이 황색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 512 [M+H]+
단계 5. 화합물 12-9의 합성
DMF(6.00 mL) 중 [(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]아세트산(화합물 8-12에 대해 기재된 절차에 따라 제조된 화합물 12-8, 279.33 mg, 0.52 mmol, 1.1 당량)의 교반 혼합물에 HATU(218.80 mg, 0.57 mmol, 1.2 당량) 및 HOBT(77.76 mg, 0.57 mmol, 1.2당량)를 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 30분 동안 교반했다. 상기 혼합물에 tert-부틸 N-[5-(2-{1-[(2-아미노아세트아미도)메틸]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-4-일)펜트-4-인-1-일]카르바메이트; 트리플루오로아세트산(화합물 12-7, 300 mg, 0.48 mmol, 1.00당량) 및 DIEA(185.93 mg, 1.44 mmol, 3 당량)을 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 추가 16시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 실온에서 물(0.5 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 물(0.05% TFA), ACN(30분 내 5% 내지 50% 구배); 검출기, UV 254 nm. 이로써 tert-부틸 N-[5-(2-{1-[(2-{2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일))헥산아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]아세트아미도}아세트아미도)메틸]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-4-일)펜트-4-인-1-일]카르바메이트(화합물 12-9, 300 mg, 61%)가 황색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 1023 [M+H]+
단계 6. 화합물 12-10의 합성
DCM(3.00 mL) 중 tert-부틸 N-[5-(2-{1-[(2-{2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]아세트아미도}아세트아미도)메틸]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-4-일)펜트-4-인-1-일]카르바메이트(화합물 12-9, 300 mg, 0.29 mmol, 1.00당량)의 교반 혼합물에 TFA(0.75mL)를 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 3시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 이로써 N-{[({[(1S)-1-{[({[({3-[4-(5-아미노펜트-1-인-1-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일}메틸)카르바모일]메틸}카르바모일)메틸]카르바모일}-2-페닐에틸]카르바모일}메틸)카르바모일]메틸}-6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미드; 트리플루오로아세트산(화합물 12-10, 300 mg, 98%)이 황색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 923 [M+H]+
단계 7. 화합물 12-12의 합성
DMA(8 mL) 중 (3'S,4'R,5'S)-6''-클로로-4'-(3-클로로-2-플루오로페닐)-2''-옥소-1''H-다이스피로[사이클로헥산-1,2'-피롤리딘-3',3''-인돌]-5'-카르복실산(화합물 12-11, J. Med. Chem. 2014, 57, 10486-10498300 mg, 0.64 mmol, 1.00 당량) 및 메틸 4-아미노벤조에이트(117 mg, 0.77 mmol, 1.2 당량)의 교반 혼합물에 DIEA(100 mg, 0.77 mmol, 1.2 당량)를 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반했다. 상기 혼합물에 HATU(295 mg, 0.77 mmol, 1.2당량)를 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 추가 16시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 실온에서 물(0.5 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 잔류물은 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 물(0.05% TFA), ACN(30분 내 5% 내지 50% 구배; 검출기, UV 254 nm. 이로써 메틸 4-[(3'S,4'R,5'S)-6''-클로로-4'-(3-클로로-2-플루오로페닐)-2''-옥소-1''H-다이스피로[사이클로헥산-1,2'-피롤리딘-3',3''-인돌]-5'-일아미도]벤조에이트(화합물 12-12, 200 mg, 51%)가 황색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 596,598 [M+H]+
단계 8. 화합물 12-13의 합성
THF(2mL) 중 메틸 4-[(3'S,4'R,5'S)-6''-클로로-4'-(3-클로로-2-플루오로페닐)-2''-옥소-1''H-다이스피로[사이클로헥산-1,2'-피롤리딘-3',3''-인돌]-5'-일아미도]벤조에이트(화합물 12-12, 190 mg, 0.31 mmol, 1.00당량)의 교반 혼합물에 H2O(2 mL) 중 NaOH(12 mg, 0.31 mmol, 1 당량) 및 LiOH(15 mg, 0.63 mmol, 2 당량)를 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 4시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 혼합물을 HCl(수성)을 사용하여 pH 6으로 산성화했다. 잔류물은 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 물(0.05% TFA), 30분 후 ACN 5% 내지 50% 구배; 검출기, UV 254 nm. 이로써 4-[(3'S,4'R,5'S)-6''-클로로-4'-(3-클로로-2-플루오로페닐)-2''-옥소-1''H-다이스피로[사이클로헥산-1,2'-피롤리딘-3',3''-인돌]-5'-일아미도]벤조산(화합물 12-13, 50 mg, 26%)이 황색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 582,584 [M+H]+
단계 9. 화합물 (XII)의 합성
DMF(0.9 mL) 중 4-[(3'S,4'R,5'S)-6''-클로로-4'-(3-클로로-2-플루오로페닐)-2''-옥소-1''H-다이스피로[사이클로헥산-1,2'-피롤리딘-3',3''-인돌]-5'-일아미도]벤조산(화합물 12-13, 50 mg, 0.086 mmol, 1.00 당량)의 교반 혼합물에 HATU(36 mg, 0.095 mmol, 1.1당량)를 0℃에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반했다. 상기 혼합물에 N-{[({[(1S)-1-{[({[({3-[4-(5-아미노펜트-1-인-1-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일}메틸)카르바모일]메틸}카르바모일)메틸]카르바모일}-2-페닐에틸]카르바모일}메틸)카르바모일]메틸}-6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미드; 트리플루오로아세트산(화합물 12-10, 98 mg, 0.095 mmol, 1.10당량) 및 DIEA(33 mg, 0.25 mmol, 3당량)를 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 추가 16시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 실온에서 물(0.1 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 미정제 생성물을 다음 조건으로 Prep-HPLC로 정제했다. 컬럼: XBridge Shield RP18 OBD 컬럼, 30 x 150 mm, 5 μm; 이동상 A: 물(0.1% FA), 이동상 B: ACN; 유속: 60mL/분; 구배: 10분 내에 37% B 내지 53% B, 11분 내에 53% B 내지 53% B; 파장: 254nm; RT1(분): 10.52. 수집한 분획은 동결건조하여 (3'R,4'S,5'R)-6''-클로로-4'-(3-클로로-2-플루오로페닐)-N-(4-{[5-(2-{1-[(2-{2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]아세트아미도}아세트아미도)메틸]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-4-일)펜트-4-인-1-일]카르바모일}페닐)-2''-옥소-1''H-다이스피로[사이클로헥산-1,2'-피롤리딘-3',3''-인돌]-5'-카르복스아미드(화합물 (XII), 24.1 mg, 18%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 1486,1488 [M+H]+ 1H-NMR(DMSO, 400MHz) δ(ppm): 10.59(s, 1H), 10.23(s, 1H), 8.47-8.44(m, 1H), 8.36-8.26(m, 1H), 8.25-7.90(m, 5H), 7.80(d, J = 8.8Hz, 2H), 7.76-7.58(m, 5H), 7.53-7.45(m, 2H), 7.37-7.34(m, 1H), 7.26-7.13(m, 6H), 7.05-6.99(m, 3H), 6.68(d, J = 2.0Hz, 1H), 5.32-5.10(m, 2H), 5.02-4.90(m, 1H), 4.77-4.68(m, 2H), 4.50-4.46(m, 2H), 4.36-4.32(m, 1H), 3.76-3.60(m, 9H), 3.42-3.36(m, 4H), 3.06-3.02(m, 2H), 2.82-2.70(m, 2H), 2.55-2.54(m, 2H), 2.46-2.43(m, 1H), 2.11-2.04(m, 4H), 1.84-1.80(m, 3H), 1.68-1.52(m, 4H), 1.49-1.36(m, 6H), 1.19-1.15(m, 2H), 1.05-0.96(m, 1H), 0.92-0.82(m, 1H).
단계 1. 화합물 13-3의 합성
DMF(10 mL) 중 [(9S)-7-(4-클로로페닐)-4,5,13-트리메틸-3-티아-1,8,11,12-테트라아자트리사이클로[8.3.0.0^{2,6}]트리데카-2(6),4,7,10,12-펜타엔-9-일]아세트산(화합물 13-1, 1.00g, 2.50 mmol, 1.00당량) 및 HATU(1.90g, 4.99 mmol, 2.00당량)의 용액을 실온에서 0.5시간 동안 교반했다. 이어서 메틸 6-아미노헥사노에이트 염산염(화합물 13-2, 0.54g, 2.994 mmol, 1.2당량) 및 DIEA(1.93g, 14.97 mmol, 6.00당량)를 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 물(100mL)로 희석하고, EA(50 mLx3)로 추출하고, 합한 유기층을 물(50mL), 염수(50mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 진공 하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(DCM:MeOH=13:1)로 정제하여 메틸 6-{2-[(9S)-7-(4-클로로페닐)-4,5,13-트리메틸-3-티아-1,8,11,12-테트라아자트리사이클로[8.3.0.0^{2,6}]트리데카-2(6),4,7,10,12-펜타엔-9-일]아세트아미도}헥사노에이트(화합물 13-3, 1.22 g, 91%)를 갈색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 528,530 [M+H]+
단계 2. 화합물 13-4의 합성
THF(10 mL) 및 H2O(5 mL) 중 메틸 6-{2-[(9S)-7-(4-클로로페닐)-4,5,13-트리메틸-3-티아-1,8,11,12-테트라아자트리사이클로[8.3.0.0^{2,6}트리데카-2(6),4,7,10,12-펜타엔-9-일]아세트아미도}헥사노에이트(화합물 13-3, 1.20g, 2.27 mmol, 1.00 당량}의 용액에 LiOH.H2O(65 mg, 2.73 mmol, 1.20 당량)을 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 용매를 진공하에 제거했다. 잔류물을 EA(100ml) 및 물(300mL)에 용해시켰다. 유기층을 분리했다. 수상을 EA(100 mLx3)로 추출했다. 합한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고 진공 하에 농축 건조하여 6-{2-[(9S)-7-(4-클로로페닐)-4,5,13-트리메틸-3-티아-1,8,11,12-테트라아자트리사이클로[8.3.0.0^{2,6}]트리데카-2(6),4,7,10,12-펜타엔-9-일]아세트아미도}헥산산(화합물 13-4, 1 g, 84%)을 황색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 514,516 [M+H]+
단계 3. 화합물 13-6의 합성
DMSO(25.00 mL) 중 IR[DF(CF3)PPY]2(DTBPY)PF6(166 mg, 0.15 mmol, 0.10당량), 니켈(2+), 테트라아쿠아[4,4'-비스(1,1-다이메틸에틸)-2,2'-바이피리딘-κN1,κN1']-염화물(69 mg, 0.15 mmol, 0.10당량), 4-브로모-2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)아이소인돌-1,3-다이온(화합물 13-5, 500 mg, 1.48 mmol, 1.00 당량) 및 [(tert-부톡시카르보닐)아미노]아세트산(390 mg, 2.22 mmol, 1.50 당량)의 용액에 2-tert-부틸-1,1,3,3-테트라메틸구아니딘(381 mg, 2.22 mmol, 1.50 당량)을 실온에서 첨가했다. 반응 바이알을 밀봉하고 반응 혼합물에 5분 동안 질소 기체를 살포했다. 그 다음, 교반 반응 혼합물을 청색 LED(365 nm)로 24시간 동안 조사했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응은 병렬로 2회 진행시켰다. 반응물을 물(250mL)로 희석하고, EA(75mLx3)로 추출하고, 합한 유기층을 물(75mL), 염수(75mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 진공 하에서 농축 건조시켰다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.1% FA) 중 ACN, 30분 내에 0% 내지 60% 구배; 검출기, UV 254 nm. 수집한 분획을 농축하여 tert-부틸 N-{[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소아이소인돌-4-일]메틸}카르바메이트(화합물 13-6, 300 mg, 22%)를 황색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 388 [M+H]+, 288 [M+H-Boc]+, 329 [M+H-Boc+ACN]+
단계 4. 화합물 13-7의 합성
1,4-다이옥산(15 mL)에서 HCl(가스) 중 tert-부틸 N-{[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소아이소인돌-4-일]메틸}카르바메이트 용액(화합물 13-6, 300 mg, 0.77 mmol, 1.00 당량)의 용액을 실온에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응은 진공 하에 농축 건조하여 4-(아미노메틸)-2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)아이소인돌-1,3-다이온(화합물 13-7, 380 mg, 미정제물)을 황색 고체로서 제공했다. 미정제 생성물을 추가 정제 없이 다음 단계에 사용했다. LCMS(ES, m/z): 288 [M+H]+
단계 5. 화합물 (XIII)의 합성
DMF(5 mL) 중 6-{2-[(9S)-7-(4-클로로페닐)-4,5,13-트리메틸-3-티아-1,8,11,12-테트라아자트리사이클로[8.3.0.0^{2,6}]트리데카-2(6),4,7,10,12-펜타엔-9-일]아세트아미도}헥산산(화합물 13-4, 390 mg, 0.76 mmol, 1.00 당량)의 용액에 4-(아미노메틸)-2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)아이소인돌-1,3-다이온(화합물 13-7, 376 mg, 0.76 mmol, 1.00 당량, 58%), HATU(577 mg, 1.52 mmol, 2.00당량), DIEA(294 mg, 2.28 mmol, 3.00당량)를 공기 중 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 물(50 mL)로 희석하고, EA(50 mLx3)로 추출하고, 합한 유기층을 염수(50 mL), 물(50 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 진공 하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 Prep-TLC(DCM:MeOH=10:1)로 정제하여 6-{2-[(9S)-7-(4-클로로페닐)-4,5,13-트리메틸-3-티아-1,8,11,12-테트라아자트리사이클로[8.3.0.0^{2,6}]트리데카-2(6),4,7,10,12-펜타엔-9-일]아세트아미도}-N-{[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소아이소인돌-4-일]메틸}헥산아미드(화합물 (XIII), 330 mg, 52%)를 황색 고체로서 제공했다. MS: (ES, m/s): 783,785 [M+H]+ 1H NMR (400MHz, DMSO-d 6 ) δ11.14(s, 1H), 8.45(t, J= 5.6Hz, 1H), 8.18(t, J=4.4Hz, 1H), 7.85-7.77(m, 2H), 7.67(d, J=7.6Hz, 1H), 7.50-7.40(dd, J=8.8Hz, 20.8Hz, 4H), 5.22- 5.16(m, 1H), 4.71-4.72(m, 2H), 4.53-4.49(m, 1H), 3.30-3.06(m, 4H), 2.95-2.87(m, 1H), 2.67-2.51(m, 5H), 2.41(s, 1H), 2.20(t, J=7.2Hz, 2H), 2.08-2.04(m, 2H), 1.62(s, 1H), 1.53-1.59(m, 2H), 1.48-1.42(m, 2H), 1.35-1.29 (m, 2H).
단계 1. 화합물 14-2의 합성
DCM(10 mL) 중 (2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}아세트아미도)-메틸 아세테이트(화합물 10-3에 대해 기재된 절차에 따라 제조된 화합물 14-1, 100 mg, 0.44 mmol, 1.00 당량)의 용액에 TMSCl(70 mg, 0.66 mmol, 1.50 당량)을 실온에서 첨가했다. 반응물을 실온에서 0.5시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응물을 진공하에 농축 건조시키고, 잔류물을 다음 단계에 직접 사용했다. LCMS(ES, m/z): 203 [M+H]+(메탄올로 유도체화됨)
단계 2. 화합물 14-4의 합성
DMF(5 mL) 중 6-{2-[(9S)-7-(4-클로로페닐)-4,5,13-트리메틸-3-티아-1,8,11,12-테트라아자트리사이클로[8.3.0.0^{2,6}]트리데카-2(6),4,7,10,12-펜타엔-9-일]아세트아미도}-N-{[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소아이소인돌-4-일]메틸}헥산아미드(화합물 (XIII), 100 mg, 0.12 mmol, 1.00 당량) 및 프로프-2-엔-1-일 N-[(클로로메틸카르바모일)메틸]카르바메이트(화합물 14-3, 106 mg, 0.52 mmol, 4.00 당량)의 용액에 K2CO3(70 mg, 0.52 mmol, 4.00 당량)을 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.1%FA) 중 ACN, 30분 내에 0% 내지 60% 구배; 검출기, UV 254 nm 및 220 nm. 수집한 분획을 농축하여 프로프-2-엔-1-일 N-({[(3-{4-[(6-{2-[(9S)-7-(4-클로로페닐)-4,5,13-트리메틸-3-티아-1,8,11,12-테트라아자트리사이클로[8.3.0.0^{2,6}]트리데카-2(6),4,7,10,12-펜타엔-9-일]아세트아미도}헥산아미도)메틸]-1,3-다이옥소아이소인돌-2-일}-2,6-다이옥소피페리딘-1-일)메틸]카르바모일}메틸)카르바메이트(화합물 14-4, 110 mg, 83%)를 황색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 953,955 [M+H]+
단계 3. 화합물 14-5의 합성
THF(5 mL) 중 프로프-2-엔-1-일 N-({[(3-{4-[(6-{2-[(9S)-7-(4-클로로페닐)-4,5,13-트리메틸-3-티아-1,8,11,12-테트라아자트리사이클로[8.3.0.0^{2,6}]트리데카-2(6),4,7,10,12-펜타엔-9-일]아세트아미도}헥산아미도)메틸]-1,3-다이옥소아이소인돌-2-일}-2,6-다이옥소피페리딘-1-일)메틸]카르바모일}메틸)카르바메이트(화합물 14-4, 100 mg, 0.11 mmol, 1.00당량)의 용액에 페닐실란(23 mg, 0.21 mmol, 2.00 당량) 및 Pd(PPh3)4(12 mg, 0.01 mmol, 0.10 당량)를 N2 하에 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 (화합물 14-5, 55 mg, 57%)을 담황색 고체로서 제공했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.1%FA) 중 ACN, 30분 내에 0% 내지 60% 구배; 검출기, UV 254 nm 및 220 nm. LCMS(ES, m/z): 869,871 [M+H]+
단계 4. 화합물 (XIV)의 합성
DMF(3 mL) 중 N-[(2-{1-[(2-아미노아세트아미도)메틸]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일}-1,3-다이옥소아이소인돌-4-일)메틸]-6-{2-[(9S)-7-(4-클로로페닐)-4,5,13-트리메틸-3-티아-1,8,11,12-테트라아자트리사이클로[8.3.0.0^{2,6}]트리데카-2(6),4,7,10,12-펜타엔-9-일]아세트아미도}헥산아미드(화합물 14-5, 50 mg, 0.06 mmol, 1.00 당량), [(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]아세트산(화합물 8-12에 대해 기재된 절차에 따라 제조된 화합물 14-4, 34 mg, 0.06 mmol, 1.10당량)의 용액에 HOBT(16 mg, 0.12 mmol, 2.00당량), HATU(44 mg, 0.12 mmol, 2.00당량) 및 DIEA(67 mg, 0.52 mmol, 9.00당량)를 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 다음 컬럼으로 정제하여 6-{2-[(9S)-7-(4-클로로페닐)-4,5,13-트리메틸-3-티아-1,8,11,12-테트라아자트리사이클로[8.3.0.0^{2,6}]트리데카-2(6),4,7,10,12-펜타엔-9-일]아세트아미도}-N-[(2-{1-[(2-{2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]아세트아미도}아세트아미도)메틸]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일}-1,3-다이옥소아이소인돌-4-일)메틸]헥산아미드(화합물 (XIV), 14.4 mg, 17%)를 연황색 고체로서 제공했다: XSelect CSH Prep C18 OBD 컬럼, 19*150 mm, 5μm; 이동상 A: 물(0.05%FA), 이동상 B: ACN; 유속: 25mL/분; 구배: 7분 내에 29% B 내지 59% B, 59% B; 파장: 254nm; RT1(분): 6.8. LCMS(ES, m/z): 1380,1382 [M+H]+ 1H NMR(400MHz, DMSO-d 6 ) δ8.47-8.44(m, 1H), 8.29-8.21(m, 2H), 8.19-8.15(m, 1H), 8.13-8.04(m, 2H), 8.00-7.92(m, 2H), 7.89-7.72(m, 2H), 7.68-7.66(m, 1H), 7.50-7.41(m, 4H), 7.35-7.23(m, 4H), 7.20-7.11(m, 1H), 6.99(s, 2H), 5.25-5.12(m, 2H), 5.08-5.00(m, 1H), 4.72(d, J=6Hz, 2H), 4.53-4.50(m, 2H), 3.76-3.69(m, 5H), 3.68-3.65(m, 4H), 3.36(t, J=7.2Hz, 2H), 3.24-3.20(m, 2H), 3.10-3.03(m, 4H), 2.82-2.78(m, 2H), 2.60(s, 3H), 2.41(s, 3H), 2.23-2.19(m, 2H), 2.19-2.01(m, 3H), 1.62(s, 3H), 1.59-1.55(m, 2H), 1.50-1.42(m, 6H), 1.33-1.31(m, 2H), 1.20-1.16(m, 2H).
단계 1. 화합물 15-2의 합성
DCM(30mL) 중 (2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}아세트아미도)메틸 아세테이트(화합물 10-3에 대해 기재된 절차에 따라 제조된 화합물 15-1, 736 mg, 3.19 mmol, 1당량)의 교반 혼합물에 TMSCl(1389 mg, 12.78 mmol, 4.00당량)을 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 이로써 프로프-2-엔-1-일 N-[(클로로메틸카르바모일)메틸]카르바메이트(화합물 15-2, 736 mg, 89%)가 백색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 203 [M+H]+(MeOH에 의해 유도체화됨).
단계 2. 화합물 15-4의 합성
DMF(8 mL) 중 6-[4-({4-[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-6-플루오로-1,3-다이옥소아이소인돌-5-일]피페라진-1-일}메틸)피페리딘-1-일]-N-[(1r,4r)-4-(3-클로로-4-시아노페녹시)사이클로헥실]피리다진-3-카복사미드(화합물 15-3, 500 mg, 0.61 mmol, 1 당량)의 교반 혼합물에 NaH(37 mg, 0.92 mmol, 1.50 당량, 60%)를 0℃에서 질소 대기 하에 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 0℃에서 30분 동안 교반했다. 상기 혼합물에 프로프-2-엔-1-일 N-[(클로로메틸카르바모일)메틸]카르바메이트(화합물 15-2, 254 mg, 1.23 mmol, 2 당량)를 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 추가 16시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응은 실온에서 물(1 mL)을 첨가하여 켄칭시켰다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 물(0.05% TFA), 30분 내에 ACN 5% 내지 50% 구배; 검출기, UV 254 nm. 이로써 프로프-2-엔-1-일 N-{[({3-[5-플루오로-1,3-다이옥소-6-(4-{[1-(6-{[(1r,4r)-4-(3-클로로-4-시아노페녹시)사이클로헥실]카르바모일}피리다진-3-일)피페리딘-4-일]메틸}피페라진-1-일)아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일}메틸)카르바모일]메틸}카르바메이트(화합물 15-4, 130 mg, 21%)가 황색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 982,984 [M+H]+
단계 3. 화합물 15-5의 합성
THF(1.2 mL) 중 프로프-2-엔-1-일 N-{[({3-[5-플루오로-1,3-다이옥소-6-(4-{[1-(6-{[ (1r,4r)-4-(3-클로로-4-시아노페녹시)사이클로헥실]카르바모일}피리다진-3-일)피페리딘-4-일]메틸}피페라진-1-일)아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일}메틸)카르바모일]메틸}카르바메이트(화합물 15-4, 120 mg, 0.12 mmol, 1당량) 및 Pd(PPh3)4(14 mg, 0.012 mmol, 0.1당량)의 교반 혼합물에 페닐실란(26 mg, 0.24 mmol, 2 당량)을 실온에서 질소 대기 하에 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 25℃에서 3시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 물(0.05% TFA), 30분 내 ACN 5% 내지 50% 구배; 검출기, UV 254 nm. 이로써 6-(4-{[4-(2-{1-[(2-아미노아세트아미도)메틸]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일}-6-플루오로-1,3-다이옥소아이소인돌-5-일)피페라진-1-일]메틸}피페리딘-1-일)-N-[(1r,4r)-4-(3-클로로-4-시아노페녹시)사이클로헥실]피리다진-3-카르복스아미드(화합물 15-5, 40 mg, 36%)가 황색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 899,901 [M+H]+
단계 4. 화합물 (XV)의 합성
DMF(0.4 mL) 중 [(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]아세트산(화합물 8-12에 대해 기재된 절차에 따라 제조된 화합물 15-6, 21 mg, 0.040 mmol, 1당량) 및 HATU(18 mg, 0.048 mmol, 1.2당량), HOBT(7 mg, 0.048 mmol, 1.2당량)의 교반 혼합물에 6-(4-{[4-(2-{1-[(2-아미노아세트아미도)메틸]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일}-6-플루오로-1,3-다이옥소아이소인돌-5-일)피페라진-1-일]메틸}피페리딘-1-일)-N-[(1r,4r)-4-(3-클로로-4-시아노페녹시)사이클로헥실]피리다진-3-카르복스아미드(화합물 15-5, 40 mg, 0.040 mmol, 1 당량) 및 DIEA(16 mg, 0.12 mmol, 3 당량)를 0℃, 질소 대기 하에 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 25℃에서 16시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 미정제 생성물을 다음 조건의 Prep-HPLC로 정제했다. 컬럼: XBridge Shield RP18 OBD 컬럼, 30 x 150 mm, 5 μm; 이동상 A: 물(0.1% FA), 이동상 B: ACN; 유속: 60mL/분; 구배: 10분 내에 23% B 내지 43% B, 43% B; 파장: 254nm; RT1(분): 8.92; 수집한 분획을 동결건조하여 6-(4-{[4-(2-{1-[(2-{2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]아세트아미도}아세트아미도)메틸]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일}-6-플루오로-1,3-다이옥소아이소인돌-5-일)피페라진-1-일]메틸}피페리딘-1-일)-N-[(1r,4r)-4-(3-클로로-4-시아노페녹시)사이클로헥실]피리다진-3-카르복스아미드(화합물 (XV), 7.2 mg, 10%)를 황색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 1409,1411 [M+H]+. 1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ (ppm): 8.59 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.28-8.24 (m, 2H), 8.13-8.06 (m, 2H), 7.99-7.92 (m, 2H), 7.86-7.73 (m, 3H), 7.39-7.31 (m, 3H), 7.24-7.21 (m, 4H), 7.17-7.12 (m, 2H), 6.99 (s, 2H), 5.17-5.14 (m, 3H), 4.53-4.47 (m, 4H), 3.74-3.50 (m, 11H), 3.37-3.59 (m, 2H), 3.30-3.22 (m, 3H), 3.07-2.76 (m, 7H), 2.62-2.52 (m, 3H), 2.32-2.00 (m, 7H), 1.91-1.83 (m, 5H), 1.65-1.62 (m, 2H), 1.52-1.43 (m, 6H), 1.20-1.14 (m, 4H).
단계 1. 화합물 17-7의 합성
DCM(5 mL) 중 (2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}아세트아미도)메틸 아세테이트(화합물 17-6, 100 mg, 0.43 mmol, 1.00 당량)의 용액에 TMSCl(71 mg, 0.65 mmol, 1.50당량)을 실온에서 첨가했다. 반응물을 실온에서 0.5시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응물을 진공하에 농축 건조시키고, 잔류물을 다음 단계에 직접 사용했다. LCMS(ES, m/z): 203 [M+H]+(메탄올에 의해 유도체화됨)
단계 2. 화합물 17-8의 합성
NMP(2500uL) 중 1-{3-클로로-4-[2-(메틸술파닐)에틸]페닐}-3-{[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸}우레아(화합물 9-6, 50 mg, 0.100 mmol, 1.00 당량), 프로프-2-엔-1-일 N-[(클로로메틸카르바모일)메틸]카르바메이트(화합물 17-7, 82 mg, 0.40 mmol, 4.00당량) 및 K2CO3(41 mg, 0.30 mmol, 3.00당량)의 용액을 50℃에서 24시간 동안 교반했다. 그런 다음 NMP(0.5mL) 중 프로프-2-엔-1-일 N-[(클로로메틸카르바모일)메틸]카르바메이트(82 mg, 0.40 mmol, 4.00당량) 및 K2CO3(14 mg, 0.10 mmol, 1.00당량)를 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응은 병렬로 8회 진행시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 다음 조건으로 Prep-HPLC로 정제하여 생성물의 프로프-2-엔-1-일 N-[({[3-(5-{[({3-클로로-4-[2-(메틸술파닐)에틸]페닐}카르바모일)아미노]메틸}-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일)-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸}카르바모일)메틸]카르바메이트(화합물 17-8, 64 mg, 11%)를 황색 고체로서 제공했다: 컬럼: Sunfire Prep C18 OBD 컬럼, 19*250mm, 10μm; 이동상 A: 물(0.1%FA), 이동상 B: ACN; 유속: 25mL/분; 구배: 10분 내에 41% B 내지 57% B, 57% B; 파장: 254nm; RT1(분). LCMS(ES, m/z): 671 [M+H]+
단계 3. 화합물 17-9의 합성
THF(5 mL) 및 페닐실란(21 mg, 0.19 mmol, 2.00 당량) 중 프로프-2-엔-1-일 N-[({[3-(5-{[({3-클로로-4-[2-(메틸술파닐)에틸]페닐}카르바모일)아미노]메틸}-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일)-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸}카르바모일)메틸]카르바메이트(화합물 17-8, 64 mg, 0.10 mmol, 1.00당량)의 용액에 Pd(PPh3)4(11 mg, 0.01 mmol, 0.10 당량)를 N2 하에 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 여과 후, 반응 혼합물을 다음 조건을 사용하여 역플래시 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.1%FA) 중 ACN, 30분 내에 0% 내지 60% 구배; 검출기, UV 254 nm. 수집한 분획을 동결건조하여 2-아미노-N-{[3-(5-{[({3-클로로-4-[2-(메틸술파닐)에틸]페닐}카르바모일)아미노]메틸}-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일)-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸}아세트아미드(화합물 17-9, 32 mg, 51%)를 회백색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 587 [M+H]+
단계 4. 화합물 XVII의 합성
DMF(3 mL) 중 [(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]아세트산(화합물 17-9, 32 mg, 0.06 mmol, 1.20 당량), HOBT(7 mg, 0.05 mmol, 1.00 당량) 및 HATU(19 mg, 0.05 mmol, 1.00 당량)의 용액을 실온에서 1시간 동안 교반했다. 이어서 2-아미노-N-{[3-(5-{[({3-클로로-4-[2-(메틸술파닐)에틸]페닐}카르바모일)아미노]메틸}-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일)-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸}아세트아미드(화합물 8-12에 대해 기재된 절차에 따라 제조된 화합물 17-10, 30 mg, 0.05 mmol, 1.00당량) 및 DIEA(26 mg, 0.20 mmol, 4.00 당량)를 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응물은 다음 조건을 사용하여 역플래시 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼: Kinetex EVO C18, 21.2*250mm, 5μm; 이동상 A: 물(0.1%FA), 이동상 B: ACN; 유속: 25mL/분; 구배: 7분 내에 34% B 내지 64% B, 64% B; 파장: 254nm; RT1(분): 6. 수집한 분획을 동결건조하여 N-{[({[(1S)-1-[({[({[3-(5-{[({3-클로로-4-[2-(메틸술파닐)에틸]페닐}카르바모일)아미노]메틸}-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일)-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸}카르바모일)메틸]카르바모일}메틸)카르바모일]-2-페닐에틸]카르바모일}메틸)카르바모일]메틸}-6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미드(화합물 (XVII), 6.5 mg, 10.57%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 1098 [M+H]+ 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.80 (s, 1H), 8.35-8.28 (m, 1H), 8.19-8.17 (m, 1H), 8.12-8.10 (m, 1H), 8.07-8.06 (m, 1H), 8.02-7.98 (m, 1H), 7.97-7.92 (m, 1H), 7.73-7.67 (m, 2H),7.53 (s, 1H), 7.47-7.45 (m, 1H), 7.24-7.22 (m, 5H), 7.20-7.15 (m, 2H), 7.00 (s, 2H), 6.84-6.80 (m, 1H), 5.22-4.96 (m, 3H), 4.55-4.50 (m, 1H), 4.44-4.41 (m, 2H), 4.34-4.28 (m, 1H), 3.73-3.66 (m, 7H), 3.37-3.36 (m, 4H), 3.10-2.95 (m, 2H), 2.90-2.70 (m, 4H), 2.69-2.62 (m, 3H), 2.15-2.00 (m, 5H), 2.09-2.00 (m, 1H), 1.50-1.45 (m, 4H), 1.21-1.19 (m, 2H).
단계 1. 화합물 18-2의 합성
H2O(70 mL) 중 Gly-Gly(10 g, 75.68 mmol, 1.00 당량) 및 NaHCO3(12.72 g, 151.37 mmol, 2 당량)의 교반 혼합물에 THF(35mL) 중 클로로(프로프-2-엔-1-일옥시)메탄온(10.95g, 90.82 mmol, 1.2당량)을 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 5시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 혼합물을 HCl(수성 1N)을 사용하여 pH 5로 산성화했다. 침전된 고체를 여과 수집하고 HCl(수성 1N)(2x50 mL)로 세척했다. 이로써 (2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}아세트아미도)아세트산(화합물 18-2, 9 g, 55%)이 백색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 217[M+H]+.
단계 2. 화합물 18-3의 합성
THF(220mL) 중 (2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}아세트아미도)아세트산(화합물 18-2, 9 g, 41.62 mmol, 1.00 당량) 및 Cu(OAc)2(0.76g, 4.16 mmol, 0.1당량)의 혼합물을 질소 대기 하에 60℃에서 1시간 동안 교반했다. 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 상기 혼합물에 Pb(OAc)4(22.15 g, 49.95 mmol, 1.2 당량)를 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 추가 1시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 결과적으로 생성된 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 MeOH(3x50 mL)로 세척했다. 여액을 감압 하에 농축했다. 잔류물을 PE/EA(1:10)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}아세트아미도)메틸 아세테이트(화합물 18-3, 5 g, 52%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS: (ES, m/z): 253 [M+Na]+.
단계 3. 화합물 18-4의 합성
DCM(1 mL) 중 (2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}아세트아미도)메틸 아세테이트(화합물 18-3, 100 mg, 0.43 mmol, 1 당량)의 교반 용액에 TMSCl(188 mg, 1.73 mmol, 4 당량)을 질소 대기 하에 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 0℃에서 2시간 동안 교반했다. 반응 혼합물은 LCMS 테스트를 위해 메탄올로 유도체화했다. 결과적으로 생성된 혼합물은 진공하에 농축하여 미정제 생성물 프로프-2-엔-1-일 N-[(클로로메틸카르바모일)메틸]카르바메이트(화합물 18-4, 80 mg, 89%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z):203[M+H]+(메탄올 유도체)
화합물 18-5의 합성
단계 5.
THF(610 mL) 중의 (2-클로로-4-니트로페닐)아세트산(40.7g, 188.78 mmol, 1.00당량)의 교반 용액에 BH3-Me2S(47mL, 10N, 470 mmol, 2.5당량)를 실온에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 70℃에서 3시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 실온으로 두고 감압 하에 농축했다. 잔류물을 PE/EA(1:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 2-(2-클로로-4-니트로페닐)에탄올(35g, 91%)을 황색 고체로서 제공했다. 1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 8.25(s, 1H), 8.16-8.12(m, 1H), 7.68-7.65(m, 1H), 4.87-4.84(m, 1H), 3.71-3.65(m, 2H), 2.9-2.95(m, 2H).
단계 6.
질소 대기 하 실온에서 DCM(60 mL) 중 2-(2-클로로-4-니트로페닐)에탄올(6.0 g, 29.76 mmol, 1 당량) 및 1-(4-메틸벤젠술포닐)아지리딘(5.87 g, 29.75 mmol, 1.0 당량)의 교반 혼합물에. 결과적으로 생성된 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반했다. 상기 혼합물에 AMBERLYST 15(H)(12.0 g)를 0℃에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 추가 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 45% 생성물임을 나타냈다. 상기 혼합물에 1-(4-메틸벤젠술포닐)아지리딘(8.81g, 44.64 mmol, 1.5당량)을 0℃에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 추가 10분 동안 ℃에서 교반했다. 상기 혼합물에 AMBERLYST 15(H)(12.0 g)를 0℃에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 추가 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 고체는 여과에 의해 여과하고 DCM(3x50 mL)으로 세척했다. 유기물은 진공하에 농축 건조했다. 잔류물은 PE/EA(1:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 N-{2-[2-(2-클로로-4-니트로페닐)에톡시]에틸}-4-메틸벤젠술폰아미드(6.8 g, 57%)를 회백색 오일로서 제공했다. LCMS:(ES.m/z):399,401[M+1]+. 1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 8.25(s, 1H), 8.14-8.10(m, 1H), 7.68-7.59(m, 4H), 7.39-7.36(m, 2H), 3.61-3.57(m, 2H), 3.41-3.33(m, 2H), 3.00-2.97(m, 2H), 2.89-2.85(m, 2H), 2.37(s, 3H).
단계 7.
DMF(68 mL) 중 N-{2-[2-(2-클로로-4-니트로페닐)에톡시]에틸}-4-메틸벤젠술폰아미드(6.8 g, 17.04 mmol, 1.00 당량)의 교반 혼합물에 K2CO3(4.71 g, 34.08 mmol, 2.00 당량)을 실온에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반했다. 상기 혼합물에 MeI(3.7 g, 26.06 mmol, 1.53 당량)을 실온에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 물(132mL)로 희석하고 EtOAc(3 x 150 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 물 및 염수(150 mL)로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 여과 후, 여액을 감압하에 농축했다. 잔류물을 PE/EA(1:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 N-{2-[2-(2-클로로-4-니트로페닐)에톡시]에틸}-N,4-다이메틸벤젠술폰아미드(7.3 g, 미정제물)를 황색 오일로서 제공했다. LCMS:(ES.m/z):413,415[M+1]+.
단계 8.
EtOH(133 mL) 중 N-{2-[2-(2-클로로-4-니트로페닐)에톡시]에틸}-N,4-다이메틸벤젠술폰아미드(7.3 g, 미정제물)의 교반 혼합물에 Fe(5.55 g, 99.30 mmol)을 분할로, 그리고 H2O(27 mL) 중 NH4Cl(3.19 g, 59.58 mmol)을 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 80℃에서 4시간 동안 교반했다. 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 EtOH(3x20mL)로 세척했다. 여액을 감압 하에 농축했다. 잔류물을 PE/EA(1:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 N-{2-[2-(4-아미노-2-클로로페닐)에톡시]에틸}-N,4-다이메틸벤젠술폰아미드(4.4 g, 2 단계 동안 57%)를 황색 고체로서 제공했다. LCMS:(ES.m/z):382,384[M+1]+.
단계 9.
DMF(48 mL) 중 3-[5-(아미노메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]피페리딘-2,6-다이온(3.14g, 11.49 mmol, 1.1당량)의 교반 혼합물에 CDI(1.86 g, 11.49 mmol, 1.1 당량)를 분할로, 그리고 TEA(1.06 g, 10.47 mmol, 1.00 당량)를 적가하여 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 중간체(MS=368)로 완전히 전환되었음을 나타냈다. 상기 혼합물에 N-{2-[2-(4-아미노-2-클로로페닐)에톡시]에틸}-N,4-다이메틸벤젠술폰아미드(4.0 g, 10.44 mmol, 1 당량) 및 DMAP(3.83 g, 31.34 mmol, 3당량)를 실온에서 10분에 걸쳐 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 60℃에서 밤새 추가로 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 실온으로 방치했다. 반응 혼합물을 다음 조건을 사용하여 역플래시 크로마토그래피로 정제했다: C18 컬럼; 이동상, 수(0.10% FA) 중 ACN, 45분 내에 10% 내지 60% 구배; 검출기, UV 254/220 nm. 수집한 분획은 진공하에 농축했다. 이로써 1-(3-클로로-4-{2-[2-(N-메틸4-메틸벤젠술폰아미도)에톡시]에틸}페닐)-3-{[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸}우레아(화합물 18-5, 3.2 g, 45%)가 황색 고체로서 초래되었다. LCMS:(ES, m/z): 682,684[M+1]+.
단계 4. 화합물 18-6의 합성
HBr(AcOH 중 30%, 86 mL) 중 1-(3-클로로-4-{2-[2-(N-메틸4-메틸벤젠술폰아미도)에톡시]에틸}페닐)-3-{[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸}우레아(화합물 18-5, 4.3 g, 6.30 mmol, 1 당량)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 진공하에 농축했다. 혼합물을 포화 NaHCO3(수성)을 사용하여 pH 7로 염기화했다. 혼합물을 DCM(3×50mL)으로 추출했다. 합한 유기층을 진공하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 다음 조건을 사용하여 역플래시 크로마토그래피로 정제했다: C18 컬럼; 이동상, 수(0.1% FA) 중 ACN, 40분 내에 10% 내지 50% 구배; 검출기, UV 254 nm. 수집한 분획을 감압 하에 농축했다. 이로써 1-(3-클로로-4-{2-[2-(메틸아미노)에톡시]에틸}페닐)-3-{[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸}우레아(화합물 18-6, 2.5g, 75%)가 황색 고체로서 초래되었다. LCMS:(ES.m/z):528[M+1]+.
단계 5. 화합물 18-7의 합성
THF(7mL) 중 1-(3-클로로-4-{2-[2-(메틸아미노)에톡시]에틸}페닐)-3-{[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸}우레아(화합물 18-6, 700 mg, 1.32 mmol, 1당량)의 교반 혼합물에 포화 NaHCO3을 질소 대기 하에서 0℃에서 pH=8 내지 9까지 적가했다. 상기 혼합물에 Boc2O(450 mg, 2.06 mmol, 1.56당량)를 0℃에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 추가 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 혼합물을 DCM(3*50 mL)으로 추출했다. 합한 유기층을 진공하에 농축 건조했다. 잔류물을 CH2Cl2/MeOH(10:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 tert-부틸 N-[2-(2-{2-클로로-4-[({[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸}카르바모일)아미노]페닐}에톡시)에틸]-N-메틸카르바메이트(화합물 18-6, 402 mg, 48%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS:(ES.m/z):528[M+1-100]+,572[M+1-56]+.
단계 6. 화합물 18-8의 합성
NMP(5 mL) 중 tert-부틸 N-[2-(2-{2-클로로-4-[({[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸}카르바모일)아미노]페닐}에톡시)에틸]-N-메틸카르바메이트(화합물 18-7, 500 mg, 0.79 mmol, 1당량) 및 K2CO3(220.0 mg, 1.59 mmol, 2당량)의 교반 용액에 실온에서 30분 동안 질소 대기 하에 교반했다. 상기 혼합물에 프로프-2-엔-1-일 N-[(클로로메틸카르바모일)메틸]카르바메이트(328 mg, 1.59 mmol, 2당량)를 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 추가로 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.05%TFA) 중 ACN, 40분 내에 5% 내지 80% 구배; 검출기, UV 254 nm. 이로써 미정제 생성물(300 mg)이 백색 고체로서 초래되었다. 미정제 생성물(300 mg)을 다음 조건(컬럼: XBridge Shield RP18 OBD 컬럼, 30*150 mm, 5μm; 이동상 A: 물(0.1%FA), 이동상 B: ACN; 유속: 60 mL/분, 구배: 10분 내에 30% B 내지 53% B, 53% B, 파장: 254 nm, RT1(분): 9.18으로 Prep-HPLC로 정제했다; 수집한 분획을 동결건조하여 tert-부틸 N-(2-{2-[2-클로로-4-({[(2-{2,6-다이옥소-1-[(2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}아세트아미도)메틸]피페리딘-3-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일)메틸]카르바모일}아미노)페닐]에톡시}에틸)-N-메틸카르바메이트(화합물 18-8, 140 mg, 20%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, ms):798[M+H]+.
단계 7. 화합물 18-9의 합성
THF(6 mL) 중 tert-부틸 N-(2-{2-[2-클로로-4-({[(2-{2,6-다이옥소-1-[(2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}아세트아미도)메틸]피페리딘-3-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일)메틸]카르바모일}아미노)페닐]에톡시}에틸)-N-메틸카르바메이트(화합물 18-8, 500 mg, 0.62 mmol, 1.00 당량)의 교반 혼합물에 Pd(PPh3)4(72 mg, 0.06 mmol, 0.1 당량), 페닐실란(135 mg, 1.25 mmol, 2 당량)을 질소 대기 하에 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 25℃에서 3시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 물(0.05% TFA), ACN(30분 내 5% 내지 50% 구배); 검출기, UV 254 nm. 이로써 tert-부틸 N-(2-{2-[4-({[(2-{1-[(2-아미노아세트아미도)메틸]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일)메틸]카르바모일}아미노)-2-클로로페닐]에톡시}에틸)-N-메틸카르바메이트(화합물 18-7, 400 mg, 89%)가 황색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 714 [M+H]+.
화합물 18-10의 합성
단계 4.
DMF(18 mL) 중 (2S)-2-[2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도]-3-페닐프로판산(1.00g, 3.58 mmol, 1.00당량) 및 DIEA(0.66g, 5.10 mmol, 1.50당량)의 교반 혼합물에 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥사노에이트(1.10 g, 3.57 mmol, 1.11 당량)를 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 다음 조건을 사용하여 역플래시 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔(330g, 20-40um); 이동상, 물(0.1% FA 함유), ACN(30분 내 5% 내지 50% 구배); 검출기, UV 254 nm. 이로써 (2S)-2-(2-[2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도]아세트아미도)-3-페닐프로판산(화합물 18-10, 500 mg, 29%)이 백색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 473 [M+H]+
단계 8. 화합물 18-11의 합성
DMF(4 mL) 중 (2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3-페닐프로판산(화합물 18-10, 158 mg, 0.33 mmol, 1.20 당량) 및 HATU(127 mg, 0.33 mmol, 1.2 당량)의 교반 용액에 HOBT(37 mg, 0.28 mmol, 1 당량)를 0℃에서 질소 대기 하에 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 0℃에서 30분 동안 교반했다. 상기 혼합물에 tert-부틸 N-(2-{2-[4-({[(2-{1-[(2-아미노아세트아미도)메틸]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일)메틸]카르바모일}아미노)-2-클로로페닐]에톡시}에틸)-N-메틸카르바메이트(화합물 18-9, 200 mg, 0.28 mmol, 1 당량) 및 DIEA(72 mg, 0.56 mmol, 2당량)를 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 ℃에서 추가 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수중 ACN, 40분 내에 5% 내지 80% 구배; 검출기, UV 254 nm. 수집한 분획을 동결건조하여 tert-부틸 N-{2-[2-(2-클로로-4-{[({2-[1-({2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]아세트아미도}메틸)-2,6-다이옥소피페리딘-3-일]-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일}메틸)카르바모일]아미노}페닐)에톡시]에틸}-N-메틸카르바메이트(화합물 18-8, 175 mg, 53%)를 황색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, ms):1168[M+H]+.
단계 9. 화합물 (XVIII)의 합성
DCM(700 uL) 중 tert-부틸 N-{2-[2-(2-클로로-4-{[({2-[1-({2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]아세트아미도}메틸)-2,6-다이옥소피페리딘-3-일]-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일}메틸)카르바모일]아미노}페닐)에톡시]에틸}-N-메틸카르바메이트(화합물 18-11, 70 mg, 0.06 mmol, 1 당량)의 교반 용액에 TFA(140 uL)를 0℃에서 질소 대기 하에 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 0℃에서 1시간 동안 교반했다. LCMS는 완전한 반응을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 미정제 생성물(50 mg)을 다음 조건으로 Prep-HPLC로 정제했다(컬럼: XSelect CSH Prep C18 OBD 컬럼, 19*250mm, 5μm; 이동상 A: 물(0.1%FA), 이동상 B: ACN; 유속: 25 mL/분; 구배: 7분 내에 19% B 내지 49% B, 49% B; 파장: 254 nm; RT1(분): 5; 수집한 분획은 동결건조하여 N-{[({[(1S)-1-({[({3-[5-({[(3-클로로-4-{2-[2-(메틸아미노)에톡시]에틸}페닐)카르바모일]아미노}메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일}메틸)카르바모일]메틸}카르바모일)-2-페닐에틸]카르바모일}메틸)카르바모일]메틸}-6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미드(화합물 (XVIII), 11.5 mg, 17%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, ms):1068[M+H-FA]+ 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.90(s, 1H), 8.40(br s, 1H), 8.22-8.18(m, 1H), 8.14-8.06 (m, 3H), 7.99-7.95(m, 1H), 7-72-7.66 (m, 2H), 7.49-7.42 (m, 2H), 7.27-7.16 (m, 7H), 6-99(s, 2H), 6.91 (t, J=5.7 Hz, 1H), 5.21-5.14(m, 2H), 4.98-4.94(m, 1H), 4.48-4.39(m, 5H), 3.77-3.53(m, 10H), 3.09-3.01(m, 5H), 2.89(t, J=7.2 Hz, 2H), 2.78-2.73(m, 2H), 2.55-2.50(m, 3H), 2.37-2.26(m, 2H), 2.07-2.03(m, 3H), 1.50-1.43(m, 4H), 1.20-1.15(m, 2H).
단계 1. 화합물 19-3의 합성
DMF(160 mL) 중 메틸 4-플루오로-3-니트로벤조에이트(10 g, 50.21 mmol, 1 당량) 및 K2CO3(13.88 g, 100.43 mmol, 2 당량)의 교반 혼합물에 벤질 머캅탄(12.47 g, 100.43 mmol, 2 당량)을 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 3시간 동안 교반했다. TLC는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 0℃에서 물(450 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 침전된 고체를 여과로 수집하고 물(3 x 150mL)로 세척했다. 고체를 PE(300 mL)로 분쇄하여 정제했다. 이로써 메틸 4-(벤질술파닐)-3-니트로벤조에이트(화합물 19-3, 10 g, 65%)가 황색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 304 [M+H]+
단계 2. 화합물 19-4의 합성
DCM(200 mL) 중 [4-(벤질술파닐)-3-니트로페닐]메탄올(화합물 19-3, 10 g, 36.32 mmol, 1 당량)의 교반 혼합물에 HCl(200 mL, 4N) 및 NaClO(100mL, 30%)를 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 CH2Cl2(3 x 20 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(300mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조했다. 여과 후, 여액을 감압하에 농축했다. 잔류물을 PE/EA(1:4)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 메틸 4-(클로로술포닐)-3-니트로벤조에이트(화합물 19-4, 8g, 78%)를 황색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 278[M-H]-
단계 3. 화합물 19-5의 합성
THF(60 mL) 중 메틸 4-(클로로술포닐)-3-니트로벤조에이트(화합물 19-4, 5 g, 17.87 mmol, 1 당량)의 교반 혼합물에 CH3NH2(60 mL, THF 중 1N)를 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 3시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 잔류물을 PE/EA(1:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 메틸 4-(메틸술파모일)-3-니트로벤조에이트(화합물 19-5, 2.5g, 50%)를 황색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 273[M-H]-
단계 4. 화합물 19-6의 합성
DCM(15 mL) 중 메틸 4-(메틸술파모일)-3-니트로벤조에이트(화합물 19-5, 600 mg, 2.18 mmol, 1 당량)의 교반 혼합물에 TMSCl(475 mg, 4.37 mmol, 2 당량)을 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 3시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 이로써 메틸 4-[클로로메틸(메틸)술파모일]-3-니트로벤조에이트(화합물 19-6, 600 mg, 84%)가 백색 고체로서 초래되었다. 미정제 생성물은 추가 정제 없이 다음 단계에 사용했다. LCMS(ES, m/z): 341 [M+Na]+, (MeOH 유도체).
단계 5. 화합물 19-8의 합성
DMF(15mL) 중 tert-부틸 N-[2-(2-{2-클로로-4-[({[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸}카르바모일)아미노]페닐}에톡시)에틸]-N-메틸카르바메이트(화합물 11-2에 대해 기재된 바와 같이 제조된 화합물 19-7, 583 mg, 0.92 mmol, 1 당량) 및 Cs2CO3(302 mg, 0.92 mmol, 1당량)의 교반된 혼합물에 메틸 4-[클로로메틸(메틸)술파모일]-3-니트로벤조에이트(600 mg, 1.85 mmol, 2당량)를 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 0℃에서 0.5시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 물(0.05% TFA), 30분 내에 ACN 5% 내지 100% 구배; 검출기, UV 254 nm. 이로써 메틸 4-{[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노]에톡시}에틸)-3-클로로페닐]카르바모일}아미노)메틸]-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일}-2,6-다이옥소피페리딘-1-일)메틸](메틸)술파모일}-3-니트로벤조에이트(화합물 19-8, 250 mg, 26%)가 백색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 814 [M+H-Boc]+
단계 6. 화합물 19-9의 합성
THF(0.8 mL) 중 메틸 4-{[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노]에톡시}에틸)-3-클로로페닐]카르바모일}아미노)메틸]-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일}-2,6-다이옥소피페리딘-1-일)메틸](메틸)술파모일}-3-니트로벤조에이트(화합물 19-8, 200 mg, 0.21 mmol, 1 당량)의 교반 혼합물에 HCl(6 N, 0.8 mL)을 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 혼합물은 다음 조건으로 역플래시 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 물(0.05% TFA), 30분 내에 ACN 5% 내지 50% 구배; 검출기, UV 254 nm. 이로써 4-[({3-[5-({[(3-클로로-4-{2-[2-(메틸아미노)에톡시]에틸}페닐)카르바모일]아미노}메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일}메틸)(메틸)술파모일]-3-니트로벤조산(화합물 19-9, 60 mg, 30%)이 백색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 800 [M+H]+
단계 7. 화합물 (XIX)의 합성
DMF(0.5mL) 중 4-[({3-[5-({[(3-클로로-4-{2-[2-(메틸아미노)에톡시]에틸}페닐)카르바모일]아미노}메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일}메틸)(메틸)술파모일]-3-니트로벤조산(55 mg, 0.069 mmol, 1당량), 1-(2-아미노에틸)피롤-2,5-다이온(10 mg, 0.076 mmol, 1.1당량) 및 DIEA(26 mg, 0.20 mmol, 3당량)의 교반 혼합물에 HATU(31 mg, 0.083 mmol, 1.2당량)를 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 4시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 잔류물은 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 물(0.05% TFA), 30분 내에 ACN 5% 내지 50% 구배; 검출기, UV 254 nm. 미정제 생성물을 다음 조건의 Prep-HPLC로 정제했다. 컬럼: Xselect CSH F-페닐 OBD 컬럼, 19 x 250 mm, 5 μm; 이동상 A: 물(0.05% TFA), 이동상 B: ACN; 유속: 25mL/분; 구배: 8분 내에 21% B 내지 41% B, 41% B; 파장: 254nm; RT1(분): 7.27; 수집한 분획을 동결건조시켜 4-[({3-[5-({[(3-클로로-4-{2-[2-(메틸아미노)에톡시]에틸}페닐)카르바모일]아미노}메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일}메틸)(메틸)술파모일]-N-[2-(2,5-다이옥소피롤-1-일)에틸]-3-니트로벤즈아미드; 트리플루오로아세트산(화합물 (XIX), 4.3 mg, 5%)을 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 922 [M+H]+.　1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) (ppm): 8.27-7.88 (m, 3H), 7.82-7.46 (m, 4H), 7.23 (d, J = 1.2 Hz, 2H), 6.79 (s, 2H), 5.47-5.25 (m, 2H), 5.15-5.10 (m, 1H), 4.63-4.28 (m, 4H), 3.80-3.70 (m, 6H), 3.65-3.54 (m, 2H), 3.25-3.15 (m, 2H), 3.09 (d, J = 2.4 Hz, 3H), 3.04-2.96 (m, 2H), 2.96-2.86 (m, 2H), 2.71 (s, 3H), 2.48-2.26 (m, 1H), 2.24-2.03 (m, 1H).
단계 1. 화합물 40-2의 합성
DCM(8 mL) 중 (2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}아세트아미도)메틸 아세테이트(화합물 40-1, 400 mg, 1.73 mmol, 1 당량)의 교반 용액에 TMSCl(755 mg, 6.94 mmol, 4 당량)을 질소 대기 하에 0℃에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 미정제 생성물 혼합물을 추가 정제 없이 직접 다음 단계에 사용했다. LCMS(ES, m/z): 203 [M+H]+(메탄올에 의해 유도체화됨).
단계 2. 화합물 40-4의 합성
DMF(7mL) 중 N'-[4-(2,4-다이플루오로페녹시)-3-{6-메틸-7-옥소-1H-피롤로[2,3-c]피리딘-4-일}페닐]-N-(4-{[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소아이소인돌-4-일]아미노}부틸)헥산다이아미드(https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2021.105238에 기재된 절차에 따라 제조된 화합물 40-3, 300 mg, 0.36 mmol, 1당량) 및 K2CO3(151 mg, 1.09 mmol, 3당량)의 교반 혼합물에 프로프-2-엔-1-일 N-[(메톡시메틸카르바모일)메틸]카르바메이트(147 mg, 0.73 mmol, 2 당량)를 질소 대기 하에 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 60℃에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.05% TFA) 중 ACN, 30분 내에 10% 내지 50% 구배; 검출기, UV 254 nm. 이로써 프로프-2-엔-1-일 N-[({[3-(4-{[4-(5-{[4-(2,4-다이플루오로페녹시)-3-{6-메틸-7-옥소-1H-피롤로[2,3-c]피리딘-4-일}페닐]카르바모일}펜탄아미도)부틸]아미노}-1,3-다이옥소아이소인돌-2-일)-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸}카르바모일)메틸]카르바메이트(화합물 40-4, 200 mg, 56%)가 황색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 992 [M+H]+
단계 3. 화합물 40-5의 합성
THF(1 mL) 중 프로프-2-엔-1-일 N-[({[3-(4-{[4-(5-{[4-(2,4-다이플루오로페녹시)-3-{6-메틸-7-옥소-1H-피롤로[2,3-c]피리딘-4-일}페닐]카르바모일}펜탄아미도)부틸]아미노}-1,3-다이옥소아이소인돌-2-일)-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸}카르바모일)메틸]카르바메이트(화합물 40-4, 100 mg, 0.10 mmol, 1당량) 및 Pd(PPh3)4(11 mg, 0.01 mmol, 0.1당량)의 교반 혼합물에 페닐실란(21 mg, 0.20 mmol, 2 당량)을 질소 대기 하에 실온에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 잔류물은 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.05% TFA) 중 ACN, 30분 내에 10% 내지 50% 구배; 검출기, UV 254 nm. 이로써 N-{4-[(2-{1-[(2-아미노아세트아미도)메틸]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일}-1,3-다이옥소아이소인돌-4-일)아미노]부틸}-N'-[4-(2,4-다이플루오로페녹시)-3-{6-메틸-7-옥소-1H-피롤로[2,3-c]피리딘-4-일}페닐]헥산다이아미드(80 mg, 87%)가 황색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 930 [M+Na]+
단계 4. 화합물 (XL)의 합성
DMF(0.4mL) 중 (2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3-페닐프로판산(화합물 18-10에 기술된 대로 제조된 화합물 40-6, 18 mg, 0.040 mmol, 1.2당량)의 교반 용액에 HATU(15 mg, 0.04 mmol, 1.2당량)를 0℃에서 질소 대기 하에 적가했다. 상기 혼합물에 N-{4-[(2-{1-[(2-아미노아세트아미도)메틸]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일}-1,3-다이옥소아이소인돌-4-일)아미노]부틸}-N'-[4-(2,4-다이플루오로페녹시)-3-{6-메틸-7-옥소-1H-피롤로[2,3-c]피리딘-4-일}페닐]헥산다이아미드(화합물 40-5, 30 mg, 0.033 mmol, 1당량) 및 DIEA(13 mg, 0.10 mmol, 3당량)를 실온에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 추가 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 잔류물은 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.05% TFA) 중 ACN, 30분 내에 10% 내지 50% 구배; 검출기, UV 254 nm. 이로써 N'-[4-(2,4-다이플루오로페녹시)-3-{6-메틸-7-옥소-1H-피롤로[2,3-c]피리딘-4-일}페닐]-N-[4-({2-[1-({2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]아세트아미도}메틸)-2,6-다이옥소피페리딘-3-일]-1,3-다이옥소아이소인돌-4-일}아미노)부틸]헥산다이아미드; 트리플루오로아세트산(3.5 mg, 7%)이 황색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 682 [M/2]+, 1362 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.04 (s, 1H), 9.98 (s, 1H), 8.24-8.11 (m, 2H), 8.09-7.99 (m, 2H), 7.97-7.83 (m, 1H), 7.83-7.79 (m, 2H), 7.58-7.52 (m, 2H), 7.35-7.30(m, 1H), 7.29-7.28(m, 2H), 7.25-7.19 (m, 4H), 7.18-7.18(m, 1H), 7.17-7.15(m, 1H), 7.10-7.03(m, 4H),6.99-6.90(m, 1H), 6.55 (s, 1H), 6.26(s, 1H), 5.13-5.03 (m, 3H),4.49-4.45 (m, 1H), 3.76-3.65 (m, 5H), 3.29-3.20 (m, 5H), 3.07-2.97 (m, 5H), 2.80-2.74 (m, 2H), 2.33-2.27 (m, 3H), 2.12-2.06 (m, 6H), 1.53-1.44 (m, 12H), 1.23-1.16 (m, 3H)
반응식 20: 화합물 (XLI)의 제조
단계 1. 화합물 41-1의 합성
DMSO(50 mL) 중 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 3-(2,5-다이옥소피롤-1-일)프로파노에이트(5.0 g, 18.78 mmol, 1.0 당량)의 교반 용액에 β-알라닌(화합물 41-17, 2.01g, 22.53 mmol, 1.2당량)을 질소 대기 하 실온에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 6시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물은 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.1% FA) 중 ACN, 30분 내에 0% 내지 10% 구배; 검출기, UV 220 nm. 수집한 분획을 동결건조하여 3-[3-(2,5-다이옥소피롤-1-일)프로판아미도]프로판산(화합물 41-1, 3.0 g, 61%)을 백색 고체로서 제공했다. LCMS: (ES, m/s): 241 [M+H]+, 263 [M+Na]+.
화합물 41-2의 합성
ACN(100mL, 190.24 mmol, 75.00당량) 중 4-포르밀-2-니트로페놀(4.21g, 25.19 mmol, 1.00당량) 및 Ag2O(7.00g, 30.20 mmol, 1.20당량)의 교반 용액에 메틸 (2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-트리스(아세틸옥시)-6-브로모옥산-2-카르복실레이트 (10.00 g, 25.17 mmol, 1.00 당량)를 N2 대기 하 실온에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 N2 대기 하에 실온에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 DCM(50 mlx3)으로 세척했다. 여액을 감압 하에 농축했다. 잔류물을 PE/EA(PE:EA=1:2)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 메틸(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-트리스(아세틸옥시)-6-(4-포르밀-2-니트로페녹시)옥산-2-카르복실레이트(화합물 41-2, 10.5g, 86%)를 백색 고체로서 제공했다. H-NMR 분석 결과, 이는 원하는 생성물인 것으로 나타났다. LCMS(ES, m/z):484 [M+1]+. 1H-NMR(300MHz, CDCl3) δ 10.00(s, 1H), 8.34(s, 1H), 8.13-8.09(m, 1H), 7.52(d, J=3.0Hz, 1H), 5.47-5.29(m, 4H),
단계 2. 화합물 41-3의 합성
MeOH(800mL) 중 메틸 (2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-트리스(아세틸옥시)-6-(4-포르밀-2-니트로페녹시)옥산-2-카르복실레이트(화합물 41-2, 54.6g, 112.95 mmol, 1.00당량)의 교반 용액에 NaBH4(3.4g, 90.36 mmol, 0.80당량)를 실온에서 N2 대기 하에 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 N2 대기 하에 실온에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응은 실온에서 HCl(0.02 mol/L)로 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 CH2Cl2(3 x 300mL)로 추출했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 진공 하에 농축하여 메틸 (2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-트리스(아세틸옥시)-6-[4-(하이드록시메틸)-2-니트로페녹시]옥산-2-카르복실레이트(화합물 41-3, 44g, 64%)를 녹색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 486 [M+H]+, 508 [M+Na]+.
단계 3. 화합물 41-4의 합성
DMF(300 mL) 중 메틸 (2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-트리스(아세틸옥시)-6-[4-(하이드록시메틸)-2-니트로페녹시]옥산-2-카르복실레이트(화합물 41-3, 28 g, 57.68 mmol, 1.00 당량)의 교반 용액에 이미다졸(5.89 g, 86.52 mmol, 1.50 당량) 및 TBDMS-Cl(13.04 g, 86.52 mmol, 1.50 당량)을 실온에서 N2 대기 하에 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 N2 대기 하에 실온에서 4시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응은 실온에서 물로 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 CH2Cl2(3 x 300mL)로 추출했다. 합한 유기물을 진공하에 농축했다. 잔류물을 PE/EA(1:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 메틸 (2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-트리스(아세틸옥시)-6-(4-{[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]메틸}-2-니트로페녹시)옥산-2-카르복실레이트(30 g, 80%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 600 [M+H]+, 622 [M+Na]+; 1H-NMR(300MHz, DMSO-d6): 7.80(d, J=9Hz,1H), 7.65-7.61(m, 1H), 7.42(d, J=9Hz,1H), 5.72(d, J= 9Hz,1H), 5.47(t, J=9Hz,1H), 5.15-5.05(m, 2H), 4.74(d, J=4.5Hz,3H), 3.65(s, 3H), 2.02(t, J=9Hz, 9H), 0.91(t, J=9Hz, 9H), 0.09(s, 6H).
단계 4. 화합물 41-5의 합성
MeOH(600 mL) 중 메틸 (2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-트리스(아세틸옥시)-6-(4-{[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]메틸}-2-니트로페녹시)옥산-2-카르복실레이트(화합물 41-4, 30 g, 50.02 mmol, 1.00 당량)의 교반 용액에 NaOMe(16.19 g, 299.68 mmol, 6.0 당량)을 실온에서 N2 대기 하에 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 N2 대기 하에 실온에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 진공하에 농축했다. 잔류물은 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.1% FA) 중 ACN, 30분 내에 0% 내지 10% 구배; 검출기, UV 220 nm. 수집한 분획을 진공 하에 농축하여 (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]메틸}-2-니트로페녹시)-3,4,5-트리하이드록시옥산-2-카르복실산(화합물 41-5, 28g, 92%)를 황색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 477 [M+H2O]+, 482[M+Na]+.
단계 5. 화합물 41-6의 합성
DMF(300 mL) 중 (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]메틸}-2-니트로페녹시)-3,4,5-트리하이드록시옥산-2-카르복실산(화합물 41-5, 28 g, 46.30 mmol, 1.00 당량, 76%)의 교반 용액에 DBU(14.10 g, 92.61 mmol, 2.00 당량) 및 알릴 브로마이드(16.8 g, 138.92 mmol, 3.00 당량)를 N2 대기 하 실온에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 N2 대기 하에 40℃에서 밤새 교반했다. LCMS를 통해 원하는 생성물을 검출할 수 있었다. 결과적으로 생성된 혼합물을 진공하에 농축했다. 반응을 실온에서 물로 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 CH2Cl2(3 x 200 ml)로 추출했다. 합한 유기층을 감압 하에 농축했다. 잔류물을 CH2Cl2/MeOH(9:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]메틸}-2-니트로페녹시)-3,4,5-트리하이드록시옥산-2-카르복실레이트(19g, 41%)를 연한 적색 오일로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 517 [M+H2O]+, 522 [M+Na]+.
단계 6. 화합물 41-7의 합성
피리딘(300 mL) 중 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]메틸}-2-니트로페녹시)-3,4,5-트리하이드록시옥산-2-카르복실레이트(화합물 41-6, 19 g, 38.03 mmol, 1.00 당량)의 교반 용액에 알릴 클로로카르보네이트(137.47 g, 1140.55 mmol, 29.99 당량)를 질소 대기 하에 실온에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 4시간 동안 교반했다. LCMS를 통해 약 60%의 원하는 생성물이 검출될 수 있었다. 반응은 실온에서 물로 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 CH2Cl2(3 x 100mL)로 추출했다. 합한 유기층을 세척하고 감압하에 농축했다. 잔류물을 PE/EA(3:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]메틸}-2-니트로페녹시)-3,4,5-트리스({[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]옥시})옥산-2-카르복실레이트(화합물 41-7, 13.9 g, 43%)를 연한 적색 오일로서 제공했다. LCMS: (ES, m/s): 769 [M+H2O]+, 774 [M+Na]+.
단계 7. 화합물 41-8의 합성
THF(280 mL) 중 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]메틸}-2-니트로페녹시)-3,4,5-트리스({[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]옥시})옥산-2-카르복실레이트(화합물 41-7, 13.9 g, 18.48 mmol, 1.00 당량)의 교반 용액에 HF-피리딘(65 mL, 65%)을 실온에서 질소 대기 하에 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응을 실온에서 물로 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 CH2Cl2(3 x 500mL)로 추출했다. 혼합물을 감압 하에 농축했다. 잔류물을 PE/EA(2:3)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[4-(하이드록시메틸)-2-니트로페녹시]-3,4,5-트리스({[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]옥시})옥산-2-카르복실레이트(화합물 41-8, 10.5 g, 80%)를 연한 황색 오일로서 제공했다. LCMS: (ES, m/s): 655 [M+H2O]+, 660 [M+Na]+.
단계 8. 화합물 41-9의 합성
DMF(100 mL) 중 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[4-(하이드록시메틸)-2-니트로페녹시]-3,4,5-트리스({[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]옥시})옥산-2-카르복실레이트(10.5 g, 16.46 mmol, 1.00 당량)의 교반 용액에 비스(4-니트로페닐)카르보네이트(7.52g, 24.71 mmol, 1.50당량) 및 DIEA(6.39g, 49.44 mmol, 3.00당량)를 실온에서 질소 대기 하에 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 6시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응을 실온에서 물로 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 CH2Cl2(3 x 500 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 감압 하에 농축했다. 잔류물을 PE/EA(3:2)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-니트로-4-{[(4-니트로페녹시카르보닐)옥시]메틸}페녹시)-3,4,5-트리스({[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]옥시})옥산-2-카르복실레이트(10.6 g, 74%)를 연한 황색 반고체로서 제공했다. LCMS: (ES, m/s): 820 [M+H2O]+, 825 [M+Na]+.
단계 9. 화합물 41-10의 합성
DMF(1.0 mL) 중 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-니트로-4-{[(4-니트로페녹시카르보닐)옥시]메틸}페녹시)-3,4,5-트리스({[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]옥시})옥산-2-카르복실레이트(화합물 41-9, 1 g, 1.24 mmol, 1.0 당량)의 교반 용액에 DIEA(0.48 g, 3.73 mmol, 3.0 당량) 및 메틸아민 염산염(0.12 g, 1.86 mmol, 1.5 당량)을 질소 대기 하에 0℃에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 30분 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.1% FA) 중 ACN, 30분 내에 10% 내지 70% 구배; 검출기, UV 220 nm. 결과적으로 생성된 혼합물을 CH2Cl2(3 x 200mL)로 추출했다. 합한 유기층을 감압 하에 농축하여 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(메틸카르바모일)옥시]메틸}-2-니트로페녹시-3,4,5-트리스({[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]옥시})옥산-2-카르복실레이트(화합물 41-10, 900 mg, 95%)를 반고체로서 제공했다. LCMS: (ES, m/s): 712 [M+H2O]+, 717 [M+Na]+.
단계 10. 화합물 41-11의 합성
DCM(10mL) 중 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(메틸카르바모일)옥시]메틸}-2-니트로페녹시)-3,4,5-트리스({[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]옥시})옥산-2-카르복실레이트(화합물 41-10, 500 mg, 0.72 mmol, 1.0당량)의 교반 용액에 파라포름알데하이드(129 mg, 1.44 mmol, 2.00 당량) 및 TMSCl(234 mg, 2.16 mmol, 3.00 당량)을 실온에서 질소 대기 하에 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 1시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다(MeOH 유도체). 결과적으로 생성된 혼합물을 진공하에 농축하여 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[4-({[클로로메틸(메틸)카르바모일]옥시}메틸)-2-니트로페녹시]-3,4,5-트리스({[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]옥시})옥산-2-카르복실레이트(화합물 41-11, 500 mg, 93%)를 미정제 생성물로서 제공했다. 미정제 생성물을 추가 정제 없이 직접 다음 단계에 사용했다. LCMS: (ES, m/s): 756 [M+H2O]+,761 [M+Na]+(MeOH 유도체)
단계 11. 화합물 41-12의 합성
질소 대기 하에 0℃에서 DMF(6.0 mL) 중 tert-부틸 N-[2-(2-{2-클로로-4-[({[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸}카르바모일)아미노]페닐}에톡시)에틸]-N-메틸카르바메이트(화합물 41-11, 338 mg, 0.53 mmol, 1.0당량) 및 Cs2CO3(175 mg, 0.53 mmol, 1.0당량)의 교반 용액에. 상기 혼합물에 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[4-({[클로로메틸(메틸)카르바모일]옥시}메틸)-2-니트로페녹시]-3,4,5-트리스({[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]옥시})옥산-2-카르복실레이트(400 mg, 0.53 mmol, 1.0당량)를 0℃에서 30분에 걸쳐 분할 첨가했다. 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 0℃에서 30분 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 다음 조건을 사용하여 역플래시 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.1%FA) 중 ACN, 30분 내에 10% 내지 100% 구배; 검출기, UV 254 nm. 결과적으로 생성된 혼합물을 진공하에 농축하여 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노]에톡시}에틸)-3-클로로페닐]카르바모일}아미노)메틸]-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일}-2,6-다이옥소피페리딘-1-일)메틸](메틸)카르바모일}옥시)메틸]-2-니트로페녹시}-3,4,5-트리스({[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]옥시})옥산-2-카르복실레이트(화합물 41-12, 310 mg, 38%)를 고체로서 제공했다. LCMS: (ES, m/s): 1334 [M+H]+, 1234 [M+H-100]+.
단계 12. 화합물 41-13의 합성
메탄올(8.0 mL) 중 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노]에톡시}에틸)-3-클로로페닐]카르바모일}아미노)메틸]-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일}-2,6-다이옥소피페리딘-1-일)메틸](메틸)카르바모일}옥시)메틸]-2-니트로페녹시}-3,4,5-트리스({[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]옥시})옥산-2-카르복실레이트(화합물 41-12, 430 mg, 0.32 mmol, 1.0당량)의 교반 용액에 AcOH(8.0mL) 및 Zn(210 mg, 3.22 mmol, 10.00당량)을 실온에서 질소 대기 하에 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 진공하에 농축했다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 수(0.05%TFA)중 이동상 ACN, 30분 내에 10% 내지 80% 구배; 검출기, UV 254 nm. 수집한 분획을 동결건조하여 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{2-아미노-4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노]에톡시}에틸)-3-클로로페닐]카르바모일}아미노)메틸]-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일}-2,6-다이옥소피페리딘-1-일)메틸](메틸)카르바모일}옥시)메틸]페녹시}-3,4,5-트리스({[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]옥시})옥산-2-카르복실레이트(화합물 41-13, 360 mg, 77%)를 녹색 고체로서 제공했다. LCMS: (ES, m/s): 1304 [M+H]+,653 [M/2+H]+,1326 [M+Na]+.
단계 13. 화합물 41-14의 합성
DMF(6.0 mL) 중 3-[3-(2,5-다이옥소피롤-1-일)프로판아미도]프로판산(화합물 41-13, 110 mg, 0.46 mmol, 1.5 당량) 및 HATU(175 mg, 0.46 mmol, 1.5 당량)의 교반 용액에 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-아미노-4-{[({[3-(5-{[({3-클로로-4-[2-(2-{메틸[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}에톡시)에틸]페닐}카르바모일)아미노]메틸}-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일)-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸}(메틸)카르바모일)옥시]메틸}페녹시)-3,4,5-트리스({[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]옥시})옥산-2-카르복실레이트(750 mg, 0.58 mmol, 1.0당량) 및 DIEA(118 mg, 0.92 mmol, 3.0당량)를 실온에서 질소 대기 하에 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 수(0.05%TFA)중 이동상 ACN, 30분 내에 10% 내지 70% 구배; 검출기, UV 254 nm 및 220 nm. 결과적으로 생성된 혼합물을 동결건조시켜 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노]에톡시}에틸)-3-클로로페닐]카르바모일}아미노)메틸]-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일}-2,6-다이옥소피페리딘-1-일)메틸](메틸)카르바모일}옥시)메틸]-2-{3-[3-(2,5-다이옥소피롤-1-일)프로판아미도]프로판아미도}페녹시}-3,4,5-트리스({[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]옥시})옥산-2-카르복실레이트(화합물 41-14, 300 mg, 57%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS: (ES, m/s): 1527 [M+H]+,1427 [M+H-100]+,1549 [M+Na]+.
단계 14. 화합물 41-15의 합성
THF(20 mL) 중 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{4-[({[(3-{5-[({[4- (2-{2-[(tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노]에톡시}에틸)-3-클로로페닐]카르바모일}아미노)메틸]-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일}-2,6-다이옥소피페리딘-1-일)메틸](메틸)카르바모일}옥시)메틸]-2-{3-[3-(2,5-다이옥소피롤-1-일)프로판아미도]프로판아미도}페녹시}-3,4,5-트리스({[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]옥시})옥산-2-카르복실레이트(화합물 41-14, 200 mg, 0.13 mmol, 1.0 당량)의 교반 용액에 TEA(53 mg, 0.52 mmol, 4.0당량), 포름산(18 mg, 0.39 mmol, 3.00당량), Pd(PPh3)4(60 mg, 0.05 mmol, 0.4당량)을 실온에서 질소 대기 하에 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 4시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 진공하에 농축했다. 미정제 생성물을 추가 정제 없이 직접 다음 단계에 사용했다. LCMS: (ES, m/s): 1134 [M+H-100]+, 1234 [M+H]+, 1256 [M+Na]+.
단계 15. 화합물 (XLI)의 합성
DCM(5.0mL) 중 (2S,3S,4S,5R,6S)-6-{4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(tert)-부톡시카르보닐)(메틸)아미노]에톡시}에틸)-3-클로로페닐]카르바모일}아미노)메틸]-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일}-2,6-다이옥소피페리딘-1-일)메틸](메틸)카르바모일}옥시)메틸]-2-{3-[3-(2,5-다이옥소피롤-1-일)프로판아미도]프로판아미도}페녹시}-3,4,5-트리하이드록시옥산-2-카르복실산 (200 mg, 0.16 mmol, 1.0당량)의 교반 용액에 TFA(1.0mL)를 0℃에서 질소 대기 하에 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.1% FA) 중 ACN, 30분 내에 0% 내지 50% 구배; 검출기, UV 254 nm. 수집한 분획을 동결건조하여 미정제 생성물을 제공했다. 미정제 생성물을 다음 조건의 Prep-HPLC에 의해 재정제했다. 컬럼: XBridge Prep OBD C18 컬럼, 19*250 mm, 5μm; 이동상 A: 물(0.1%FA), 이동상 B: ACN; 유속: 25mL/분; 구배: 7분 내에 24% B 내지 44% B, 44% B; 파장: 254nm; RT1(분): 4.63; 수집한 분획을 동결건조하여 (2S,3S,4S,5R,6S)-6-[4-({[({3-[5-({[(3-클로로-4-{2-[2-(메틸아미노)에톡시]에틸}페닐)카르바모일]아미노}메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일}메틸)(메틸)카르바모일]옥시}메틸)-2-{3-[3-(2,5-다이옥소피롤-1-일)프로판아미도]프로판아미도}페녹시]-3,4,5-트리하이드록시옥산-2-카르복실산 (화합물 (LXI), 7.3 mg, 3%)을 백색 고체로서 제공했다. LCMS: (ES, m/s): 1134 [M+H]+, 568　[M/2+H]+; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 10.7-10.5(m, 1H), 9.17 (s, 1H), 8.90-8.30(m, 1H), 8.15-8.10 (m, 2H), 7.73-7.68(m, 2H), 7.65-7.40　(m, 2H),　7.35-7.00　(m, 4H),　6.97　(s, 2H),　5.78　(br s, 1H), 5.40-4.75　(m, 6H),　4.70-4.00　(m, 5H),　3.61-3.48　(m, 8H),　3.25-3.20　(m, 3H), 3.06-3.00　(m, 3H), 2.97-2.70　(m, 7H), 2.58　(s, 3H), 2.40-2.20　(m, 3H),　2.08-1.88 (m, 1H).
반응식 21: 화합물 (XLII)의 제조
단계 1. 화합물 42-2의 합성
DCM(1L) 중 6-하이드록시-3,4-다이하이드로-2H-나프탈렌-1-온(화합물 42-1, 30g, 184.97 mmol, 1당량)과 tert-부틸-2,2,2-트리클로로에탄이미데이트(40.42g, 184.97 mmol, 1당량)의 교반 혼합물에 PPTS(4.65g, 18.50 mmol, 0.1당량)를 0℃에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 72시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축하고 잔류물을 PE/EA(1:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 6-(tert-부톡시)-3,4-다이하이드로-2H-나프탈렌-1-온(화합물 42-2, 9g, 22%)을 황색 오일로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 219 [M+H]+.
단계 2. 화합물 42-3의 합성
THF(150 mL) 중 6-(tert-부톡시)-3,4-다이하이드로-2H-나프탈렌-1-온(화합물 42-2, 10 g, 45.81 mmol, 1 당량)의 교반 혼합물에 질소 대기 하에 -78℃에서 LDA(9 mL, 1.5 당량, 68.71 mmol, THF 중 2.0 M)를 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 -78℃에서 1시간 동안 교반했다. 상기 혼합물에 1,1,1-트리플루오로-N-페닐-N-트리플루오로메탄술포닐메탄술폰아미드(19.6g, 54.87 mmol, 1.20당량)를 -78℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 추가 16시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 포화 NH4Cl(aq.)을 실온에서 첨가하여 켄칭시키고 EtOAc(3 x 200mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(200 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 PE/EA(5:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 6-(tert-부톡시)-3,4-다이하이드로나프탈렌-1-일 트리플루오로메탄술포네이트(화합물 42-3, 9.0 g, 56%)를 황색 오일로서 제공했다. LCMS:(ES.m/z):351[M+H]+; 1H-NMR(300MHz, CDCl3): 7.45(d, J=8.4Hz, 1H), 6.91-6.86(m, 1H), 6.71-6.66(m, 1H), 5.94(t, J=4.8Hz, 1H), 2.86-2.81(m, 2H), 2.54-2.48(m, 2H), 1.38(s, 9H).
단계 3. 화합물 42-4의 합성
다이옥산(250 mL) 및 H2O(50 mL) 중 6-(tert-부톡시)-3,4-다이하이드로나프탈렌-1-일 트리플루오로메탄술포네이트(화합물 42-3, 16g, 45.67 mmol, 1당량), 4-하이드록시페닐보론산(7.56g, 54.80 mmol, 1.2 당량), K2CO3(12.62 g, 91.34 mmol, 2 당량) 및 Pd(dppf)Cl2(3.34 g, 4.57 mmol, 0.1 당량)의 혼합물을 질소 대기 하에 100℃에서 4시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 물(200 mL)로 켄칭하고 EtOAc(3 x 200 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(200 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 PE/EA(3:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 4-[6-(tert-부톡시)-3,4-다이하이드로나프탈렌-1-일]페놀(화합물 42-4, 11g, 82%)을 황색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 295 [M+H]+; 1H-NMR(400MHz, CDCl3): 7.27-7.16(m, 2H), 7.00-6.92(m, 1H), 6.91-6.83(m, 3H), 6.76-6.74(m, 1H), 5.97(t, J =4.8Hz, 1H), 2.82-2.80(m, 2H), 2.39-2.35(m, 2H), 1.40(s, 9H).
단계 4. 화합물 42-5의 합성
ACN(250mL) 중 4-[6-(tert-부톡시)-3,4-다이하이드로나프탈렌-1-일]페놀(화합물 42-4, 11g, 37.36 mmol, 1당량)의 교반 혼합물에 NBS(5.99g, 33.63 mmol, 0.9당량)를 실온에서 첨가했다. 반응물을 25℃에서 1.5시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 잔류물을 PE/EA(3:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 4-[2-브로모-6-(tert-부톡시)-3,4-다이하이드로나프탈렌-1-일]페놀(화합물 42-5, 9 g, 64%)을 황색 오일로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 373[M+H]+; 1H-NMR(400MHz, CDCl3): 7.21-7.00 (m, 2H), 6.98-6.87(m, 2H), 6.85-6.74(m, 1H), 6.68-6.64(m, 1H), 6.59(d, J=8.4Hz, 1H), 3.08-2.82(m, 4H), 1.37(s, 9H).
단계 5. 화합물 42-6의 제조
다이옥산(100 mL) 및 H2O(20 mL) 중 4-[2-브로모-6-(tert-부톡시)-3,4-다이하이드로나프탈렌-1-일]페놀(화합물 42-5, 9 g, 24.11 mmol, 1 당량), 페닐 보론산(3.09g, 25.32 mmol, 1.05당량), K2CO3(6.66g, 48.22 mmol, 2당량) 및 Pd(dppf)Cl2(1.76g, 2.41 mmol, 0.1당량)의 혼합물을 질소 대기 하에 100℃에서 12시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 EtOAc(3 x 100 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(60 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 PE/EA(3:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 4-[6-(tert-부톡시)-2-페닐-3,4-다이하이드로나프탈렌-1-일]페놀(화합물 42-6, 6 g, 67%)을 황색 오일로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 371 [M+H]+; 1H-NMR(400MHz, CDCl3): 7.24-7.15 (m, 2H), 7.10-7.01(m, 3H), 6.98-6.92(m, 2H), 6.87-6.85(m, 1H), 6.76-6.68(m, 4H), 2.95-2.91(m, 2H), 2.83-2.80(m, 2H), 1.39(s, 9H).
단계 6. 화합물 42-7의 제조
MeOH(200 mL) 중 4-[6-(tert-부톡시)-2-페닐-3,4-다이하이드로나프탈렌-1-일]페놀(화합물 42-6, 6 g, 16.20 mmol, 1 당량)의 용액에 Pd(OH)2/C(20%, 1.8g)를 500mL 둥근 바닥 플라스크에서 질소 대기 하에 첨가했다. 혼합물을 수소 벌룬을 사용하여 수소 대기 하에 실온에서 16시간 동안 수소화했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 혼합물을 규조토(Celite™) 패드를 통해 여과하고 감압 하에 농축했다. 잔류물을 PE/EA(1:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 4-[6-(tert-부톡시)-2-페닐-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-1-일]페놀(화합물 42-7, 4 g, 66%)을 황색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 371[M-H]-.
단계 7. 화합물 42-7a 및 42-7b의 제조
4-[6-(tert-부톡시)-2-페닐-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-1-일]페놀(화합물 42-7, 3.5 g)은 다음 조건의 SFC-HPLC로 분리했다: 컬럼: CHIRALPAK IG, 3*25cm, 5μm; 이동상 A: CO2, 이동상 B: MEOH(0.1% 2M NH3-MEOH); 유속: 70mL/분; 구배: 등용매 35% B; 컬럼 온도(℃): 35; 배압(bar): 100; 파장: 220nm; RT1(분): 3.08; RT2(분): 3.94; 샘플 용매: MeOH:DCM=1:2; 주입량: 1.8mL; 제2 용출 이성질체(RT2=3.94분)는 농축 건조하여 4-[(1R,2S)-6-(tert-부톡시)-2-페닐-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-1-일]페놀(화합물 42-7b, 1.5g)을 제공했다. LCMS(ES, m/z): 371 [M-H]-; 1H-NMR(300MHz, CDCl3): 7.15-7.10 (m, 3H), 6.89-6.67(m, 5H), 6.43-6.30(m, 2H), 6.28-6.15(m, 2H), 4.24-4.20(m, 1H), 3.36-3.34(m, 1H), 3.05-3.01(m, 2H), 2.28-2.05(m, 1H), 1.93-1.73(m, 1H), 1.37(s, 9H).
단계 8. 화합물 42-8의 제조
ACN(10 mL) 및 THF(10 mL) 중 4-[(1R,2S)-6-(tert-부톡시)-2-페닐-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-1-일]페놀(화합물 42-7, 1.8 g, 4.83 mmol, 1 당량) 및 퍼플루오로부탄술포닐 플루오라이드(1.46 g, 4.83 mmol, 1.00 당량)의 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 진공하에 농축했다. 잔류물을 PE/EA(10:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 4-[(1R,2S)-6-(tert-부톡시)-2-페닐-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-1-일]페닐 1,1,2,2,3,3,4,4,4-노나플루오로부탄-1-술포네이트(화합물 42-8, 2.1g, 59%)를 무색 오일로서 제공했다. LCMS: (ES, m/z): 655[M+H]+; 1H-NMR(400MHz, CDCl3): 7.18-7.10 (m, 3H), 6.97-6.87(m, 3H), 6.85-6.74(m, 4H), 6.54-6.37(m, 2H), 4.35-4.31(m, 1H), 3.49-3.45(m, 1H), 3.19-2.98(m, 2H), 2.21-2.09(m, 1H), 1.96-1.84(m, 1H), 1.40(s, 9H).
단계 9. 화합물 42-10의 제조
MeOH(20 mL) 중 벤질 4-포르밀피페리딘-1-카르복실레이트(화합물 42-9, 10 g, 40.43 mmol, 1.0 당량)의 교반 용액에 DCM = 2.2 mL 중 TiCl4(0.38 g, 2.02 mmol, 0.05 당량)를 질소 대기 하에 실온에서 분할 첨가했다. 상기 혼합물에 TEA(0.41g, 4.04 mmol, 0.1당량)를 실온에서 30분에 걸쳐 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 추가로 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 진공하에 농축했다. 잔류물을 PE/EA(1:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 벤질 4-(다이메톡시메틸)피페리딘-1-카르복실레이트(화합물 42-10, 11g, 83%)를 오일로서 제공했다. LCMS: (ES, m/z): 294 [M+H]+; 1H-NMR(300MHz, CDCl3): 7.47-7.26 (m, 5H), 5.14(s, 2H), 1.20-4.16(m, 2H), 4.04(d, J=6.6Hz, 1H), 3.37(s, 6H), 2.756-2.73(m, 2H), 1.85-1.66(m, 3H), 1.41-1.04(m, 2H).
단계 10. 화합물 42-11의 제조
MeOH(100 mL) 중 벤질 4-(다이메톡시메틸)피페리딘-1-카르복실레이트(화합물 42-10, 10 g, 34.08 mmol, 1.0 당량)의 교반 용액에 Pd(OH)2/C(0.96 g, 20%)를 수소 대기 하에 실온에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 수소 대기 하에 실온에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 MeOH(2 x 5 mL)로 세척했다. 여액을 감압 하에 농축하여 4-(다이메톡시메틸)피페리딘(5.6 g, 100%)을 무색 오일로서 제공했다. 미정제 생성물을 추가 정제 없이 직접 다음 단계에 사용했다. LCMS: (ES, m/z): 160 [M+H]+; 1H-NMR(300MHz, CDCl3): 4.13-3.88(m, 3H), 3.35(s, 6H), 3.19-3.16(m, 2H), 2.63-2.60(m, 2H), 1.76-1.73(m, 3H), 1.47-1.12(m, 2H).
단계 11. 화합물 42-12의 제조
톨루엔(5 mL) 중 4-[(1R,2S)-6-(tert-부톡시)-2-페닐-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-1-일]페닐 1,1,2,2,3,3,4,4,4-노나플루오로부탄-1-술포네이트(화합물 42-8, 500 mg, 0.76 mmol, 1당량) 및 4-(다이메톡시메틸)피페리딘(화합물 42-11, 175 mg, 1.10 mmol, 1.44 당량)의 교반 혼합물에 Xphos(76 mg, 0.16 mmol, 0.21 당량) 및 Pd(OAc)2(26 mg, 0.11 mmol, 0.15 당량)를 실온에서 질소 대기 하에 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 90℃에서 밤새 교반했다. LCMS를 통해 30%의 원하는 생성물이 검출되었다. 혼합물은 실온으로 냉각시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 잔류물을 PE/EA(8:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 1-{4-[(1R,2S)-6-(tert-부톡시)-2-페닐-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-1-일]페닐}-4-(다이메톡시메틸)피페리딘(화합물 42-12, 300 mg, 76%)을 황색 고체로서 제공했다. LCMS: (ES, m/z): 514[M+H]+
단계 12. 화합물 42-13의 제조
H2SO4(20 mL) 및 THF(20 mL) 중 1-{4-[(1R,2S)-6-(tert-부톡시)-2-페닐-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-1-일]페닐}-4-(다이메톡시메틸)피페리딘(화합물 42-12, 1g, 1.94 mmol, 1당량)의 혼합물을 질소 대기 하에 70℃에서 1시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 혼합물을 포화 NaHCO3(aq.)을 사용하여 pH 8로 염기화했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 EtOAc(3 x 40 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(40 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 이로써 1-{4-[(1R,2S)-6-하이드록시-2-페닐-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-1-일]페닐}피페리딘-4-카르브알데하이드(화합물 42-13, 650 mg, 81%)가 백색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z):412[M+H]+.
단계 13. 화합물 42-14의 제조
DMF(8mL) 중 1-{4-[(1R,2S)-6-하이드록시-2-페닐-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-1-일]페닐}피페리딘-4-카르브알데하이드(화합물 42-13, 350 mg, 0.85 mmol, 1당량)의 교반 용액에 TBSCl(153 mg, 1.02 mmol, 1.2당량) 및 이미다졸(174 mg, 2.55 mmol, 3당량)을 질소 대기 하에 실온에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 3시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응물은 실온에서 물로 켄칭하고 EtOAc(3 x 15mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(3x10mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축시켰다. 이로써 1-{4-[(1R,2S)-6-[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]-2-페닐-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-1-일]페닐}피페리딘-4-카르브알데하이드(380 mg, 84%)가 백색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 526 [M+H]+.
단계 14. 화합물 42-16의 제조
DMSO(100 mL) 중 메틸 2-시아노-4-플루오로벤조에이트(화합물 42-15, 10 g, 55.82 mmol, 1 당량) 및 tert-부틸 피페라진-1-카르복실레이트(화합물 42-19, 12.5 g, 67.11 mmol, 1.20 당량)의 교반 혼합물에 DIEA(28.5 g, 220.51 mmol, 3.95 당량)를 실온에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 120℃에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물(500 mL)로 희석하고, EtOAc(3 x 500mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(500 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 PE/EA(1:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 tert-부틸 4-[3-시아노-4-(메톡시카르보닐)페닐]피페라진-1-카르복실레이트(화합물 42-16, 12g, 59%)를 황색 고체로서 제공했다. LCMS: (ES, m/z): 346[M+H]+; 1HNMR(400MHz, DMSO-d6) δ 7.91(d, J = 8.8Hz, 1H), 7.43(d, J = 2.8Hz, 1H), 7.22(dd, J = 8.8, 2.8Hz, 1H), 3.83(s, 3H), 3.59-3.38(m, 8H), 1.42(s, 9H).
단계 15. 화합물 42-17의 제조
H2O(10 mL) 중 tert-부틸 4-[3-시아노-4-(메톡시카르보닐)페닐]피페라진-1-카르복실레이트(화합물 42-16, 10 g, 28.95 mmol, 1 당량) 및 AcOH(10 mL, 174.51 mmol, 6.03 당량)의 교반 혼합물에 차아인산나트륨(25.50 g, 289.84 mmol, 10.01 당량) 및 Raney-Ni(7.49 g, 87.42 mmol, 3.02 당량)을 실온에서 질소 대기 하에 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 60℃에서 48시간 동안 교반했다. LCMS는 약 50%의 생성물 및 남아 있는 약 30%의 출발 물질을 나타냈다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 진공하에 농축시켰다. 반응물을 실온에서 물/얼음으로 켄칭하고 EtOAc(3 x 100mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(100mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 PE/EA(1:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 tert-부틸 4-[3-포르밀-4-(메톡시카르보닐)페닐]피페라진-1-카르복실레이트(화합물 42-17, 4.8g, 43%)를 황색 고체로서 제공했다. LCMS: (ES, m/z): 349[M+H]+.
단계 16. 화합물 42-18의 제조
MeOH(170 mL) 중 tert-부틸 4-[3-포르밀-4-(메톡시카르보닐)페닐]피페라진-1-카르복실레이트(화합물 42-17, 6.0 g, 17.22 mmol, 1 당량) 및 tert-부틸(4S)-4-아미노-4-카르바모일부타노에이트 염산염(4.93 g, 20.67 mmol, 1.20 당량)의 교반 혼합물에 AcOH(1.50 g, 24.97 mmol, 1.45 당량) 및 STAB(14.42 g, 68.03 mmol, 3.95 당량)를 질소 대기 하에 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 혼합물을 포화 NaHCO3(aq.)을 사용하여 pH 7로 중화시키고 EtOAc(3 x 50 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(60 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 PE/EA(1:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 tert-부틸 4-{2-[(1S)-4-(tert-부톡시)-1-카르바모일-4-옥소부틸]-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일}피페라진-1-카르복실레이트(화합물 42-18, 1.5g, 17%)를 황색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 503[M+H]+.
단계 17. 화합물 42-19의 제조
ACN(20 mL) 중 tert-부틸 4-{2-[(1S)-4-(tert-부톡시)-1-카르바모일-4-옥소부틸]-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일}피페라진-1-카르복실레이트(화합물 42-18, 1.5 g, 2.98 mmol, 1 당량) 및 벤젠술폰산(0.94 g, 5.97 mmol, 2 당량)의 혼합물을 85℃에서 16시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 EtOAc(10 mL)로 분쇄하여 정제했다. 이로써 (3S)-3-[1-옥소-5-(피페라진-1-일)-3H-아이소인돌-2-일]피페리딘-2,6-다이온; 벤젠술폰산(1.3g, 89%)이 황색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 329 [M+H]+.
단계 18. 화합물 42-21의 제조
DCM 중 (2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}아세트아미도)메틸 아세테이트(화합물 42-20, 500 mg, 2.17 mmol, 1당량)의 교반 용액에 TMSCl(944 mg, 8.69 mmol, 4 당량)을 질소 대기 하에 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 0℃에서 1시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 미정제 생성물 혼합물을 추가 정제 없이 직접 다음 단계에 사용했다.
단계 19. 화합물 42-22의 제조
DCM(7 mL) 및 MeOH(7 mL) 중 (3S)-3-[1-옥소-5-(피페라진-1-일)-3H-아이소인돌-2-일]피페리딘-2,6-다이온; 벤젠술폰산(화합물 42-19, 422 mg, 0.87 mmol, 1.2 당량)의 교반 용액에 NaOAc(119 mg, 1.44 mmol, 2 당량)를 실온에서 질소 대기 하에 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 0.5시간 동안 교반했다. 상기 혼합물에 1-{4-[(1R,2S)-6-[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]-2-페닐-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-1-일]페닐}피페리딘-4-카르브알데하이드(화합물 42-14, 380 mg, 0.72 mmol, 1당량) 및 NaBH3CN(136 mg, 2.17 mmol, 3당량)을 실온에서 적가하고, 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 추가 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 잔류물을 CH2Cl2/MeOH(10:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (3S)-3-(5-{4-[(1-{4-[(1R,2S)-6-[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]-2-페닐-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-1-일]페닐}피페리딘-4-일)메틸]피페라진-1-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일)피페리딘-2,6-다이온(화합물 42-22, 255 mg, 42%)을 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 824 [M+H]+.
단계 20. 화합물 42-23의 제조
DMF(5mL) 중 (3S)-3-(5-{4-[(1-{4-[(1R,2S)-6-[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]-2-페닐-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-1-일]페닐}피페리딘-4-일)메틸]피페라진-1-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일)피페리딘-2,6-다이온(화합물 42-22, 250 mg, 0.29 mmol, 1당량)의 교반 혼합물에 K2CO3(82 mg, 0.59 mmol, 2당량)를 실온에서 질소 대기 하에 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 30분 동안 교반했다. 상기 혼합물에 프로프-2-엔-1-일 N-[(클로로메틸카르바모일)메틸]카르바메이트(화합물 42-21, 123 mg, 0.59 mmol, 2당량)를 실온에서 적가하고, 결과적으로 생성된 혼합물을 추가로 밤새 30℃에서 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 혼합물을 진공 하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.05% TFA) 중 ACN, 30분 내에 10% 내지 60% 구배; 검출기, UV 254 nm. 이로써 프로프-2-엔-1-일 N-[({[(3S)-3-(5-{4-[(1-{4-[(1R,2S)-6-[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]-2-페닐-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-1-일]페닐}피페리딘-4-일)메틸]피페라진-1-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일)-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸}카르바모일)메틸]카르바메이트(60 mg, 20%)가 백색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 1008 [M+H]+.
단계 21. 화합물 42-24의 제조
THF(50mL) 중 프로프-2-엔-1-일 N-[({[(3S)-3-(5-{4-[(1-{4-[(1R,2S)-6-[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]-2-페닐-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-1-일]페닐}피페리딘-4-일)메틸]피페라진-1-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일)-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸}카르바모일)메틸]카르바메이트(화합물 42-23, 50 mg, 0.050 mmol, 1당량) 및 Pd(PPh3)4(10 mg, 0.009 mmol, 0.17당량)의 교반 용액에 페닐실란(10 mg, 0.092 mmol, 1.86당량)을 실온에서 질소 대기 하에 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 30분 동안 교반했다. LCMS를 통해 원하는 생성물을 검출할 수 있었다. 잔류물은 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수중 MeCN(0.1% TFA), 30분 내에 5% 내지 50% 구배; 검출기, UV 254 nm. 이로써 2-아미노-N-{[(3S)-3-(5-{4-[(1-{4-[(1R,2S)-6-[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]-2-페닐-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-1-일]페닐}피페리딘-4-일)메틸]피페라진-1-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일)-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸}아세트아미드(15 mg, 32.73%)가 백색 고체로서 초래되었고, LCMS(ES, m/z): 924 [M+H]+, 그리고 2-아미노-N-{[(3S)-3-(5-{4-[(1-{4-[(1R,2S)-6-하이드록시-2-페닐-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-1-일]페닐}피페리딘-4-일)메틸]피페라진-1-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일)-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸}아세트아미드(화합물 42-24, 20 mg, 49%)가 백색 고체로서 초래되었다. LCMS(ES, m/z): 810 [M+H]+.
단계 22. 화합물 (XLII)의 제조
DMF(2 mL) 중 (2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3-페닐프로판산(화합물 40-6, 10 mg, 0.021 mmol, 1.01 당량) 및 HATU(10 mg, 0.026 mmol, 1.25 당량)의 교반 혼합물에 HOBT(3 mg, 0.022 mmol, 1.06 당량), 2-아미노-N-{[(3S)-3-(5-{4-[(1-{4-[(1R,2S)-6-하이드록시-2-페닐-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-1-일]페닐}피페리딘-4-일)메틸]피페라진-1-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일)-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸}아세트아미드(화합물 42-24, 17 mg, 0.021 mmol, 1.0당량) 및 DIEA(10 mg, 0.077 mmol, 3.69당량)를 실온에서 질소 대기 하에 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 1시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 다음 조건으로 Prep-HPLC로 정제했다(컬럼: XSelect CSH Prep C18 OBD 컬럼, 19*250mm, 5μm; 이동상 A: 물(0.05%TFA), 이동상 B: ACN; 유속: 25 mL/분; 구배: 10분 내에 25% B 내지 40% B, 40% B; 파장: 254 nm; RT1(분): 9.38; 수집한 분획을 동결건조하여 6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)-N-{[({[(1S)-1-{[({[(3S)-3-(5-{4-[(1-{4-[(1R,2S)-6-하이드록시-2-페닐-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-1-일]페닐}피페리딘-4-일)메틸]피페라진-1-일}-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일)-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸}카르바모일)메틸]카르바모일}-2-페닐에틸]카르바모일}메틸)카르바모일]메틸}헥산아미드; 트리플루오로아세트산(화합물 (XLII), 8.5 mg, 29%)을 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z):1265[M+H-TFA]+, 633 [M/2+H-TFA]+; 1H-NMR(300MHz, DMSO-d6): 9.37(br s, 1H), 9.14(br s, 1H), 8.23-8.08(m, 5H), 7.60-7.58(m, 1H), 7.25-7.23(m, 4), 7.17-7.14(m, 5H), 7.10(s, 1H), 6.99-6.97(m, 3H), 6.85-6.83(m, 2H), 6.65-6.61(m, 3H), 6.45-6.42(m, 1H), 6.25-6.23(m, 1H), 5.15-4.90(m, 3H), 4.50-4.41(m, 1H), 4.47-4.44(m, 1H), 4.28-4.15(m, 2H), 4.05-3.95(m, 2H), 3.80-3.65(m, 5H), 3.60-3.56(m, 3H), 3.38-3.31(m, 4H), 3.25-2.90(m, 10H), 2.85-2.75(m, 2H), 2.70-2.61(m, 2H), 2.35-2.31(m, 1H), 2.15-2.08(m, 3H), 2.05-1.90(m, 2H), 1.85-1.70(m, 3H), 1.47-1.45(m, 4H), 1.35-1.12(m, 5H).
반응식 22: 화합물 (XLIII)의 제조
단계 1. 화합물 43-3의 합성
DMF(5 mL) 중의 tert-부틸 4-하이드록시피페리딘-1-카르복실레이트(화합물 43-1, 1.00 g, 4.96 mmol, 1 당량)의 혼합물을 NaH(0.24 g, 5.96 mmol, 1.2 당량, 60%)로 0℃에서 분할 처리했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 0℃에서 30분 동안 교반했다. 이어서, 상기 혼합물에 프로파르길 브로마이드(화합물 43-2, 0.59g, 4.96 mmol, 1당량)를 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 추가 2시간 동안 교반했다. TLC는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 0℃에서 물(10 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 EA(3 x 10 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(15ml)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과 후, 여액을 감압하에 농축했다. 잔류물을 PE/EA(3:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 tert-부틸 4-(프로프-2-인-1-일옥시)피페리딘-1-카르복실레이트(화합물 43-3, 350 mg, 29%)를 황색 오일로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z): 240 [M+H]+.
단계 2. 화합물 43-5의 제조
DCM(240 mL) 중 3-하이드록시-1-[(4-메톡시페닐)메틸]피페리딘-2,6-다이온(화합물 43-4, 6.00 g, 24.07 mmol, 1 당량) 및 피리딘(3.81 g, 48.14 mmol, 2 당량)의 교반 혼합물에 (트리플루오로메탄)술포닐 트리플루오로메탄술포네이트(10.18 g, 36.10 mmol, 1.5 당량)를 질소 대기 하에 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 0℃에서 1.5시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 용매를 감압 하에 제거했다. 잔류물을 PE/EA(3:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 1-[(4-메톡시페닐)메틸]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일 트리플루오로메탄술포네이트(화합물 43-5, 7.2 g, 78%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z): 404 [M+Na]+.
단계 3. 화합물 43-7의 제조
THF(170 mL) 중 7-브로모-1-메틸-3H-1,3-벤조디아졸-2-온(화합물 43-6, 2.98g, 13.11 mmol, 1당량) 및 칼륨 tert-부톡사이드(1.77g, 15.73 mmol, 1.2 당량)의 혼합물을 질소 대기 하에 0℃에서 30분 동안 교반했다. THF(30 mL) 중 1-[(4-메톡시페닐)메틸]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일 트리플루오로메탄술포네이트(화합물 43-5, 5.00 g, 13.11 mmol, 1 당량)를 상기 혼합물에 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 30분 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 염화암모늄 용액(100 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 EA(3 x 200 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과 후, 여액을 감압하에 농축했다. 잔류물은 다음 조건으로 역상 플래쉬로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔, 120 g, 20-35 um; 이동상, 0.5% NH4HCO3이 함유된 물 및 ACN(50분 내에 0% 내지 100% 구배); 검출기, UV 254 nm. 용출액을 농축하여 3-(4-브로모-3-메틸-2-옥소-1,3-벤조디아졸-1-일)-1-[(4-메톡시페닐)메틸]피페리딘-2,6-다이온(화합물 43-7, 1.1 g, 18%)을 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z): 458,460 [M+H]+.
단계 4. 화합물 43-8의 제조
톨루엔(30 mL) 중 3-(4-브로모-3-메틸-2-옥소-1,3-벤조디아졸-1-일)-1-[(4-메톡시페닐)메틸]피페리딘-2,6-다이온의 혼합물(화합물 43-7, 4.00 g, 8.72 mmol, 1 당량) 및 CH3SO3H(11.33 mL, 174.56 mmol, 20 당량)의 혼합물을 120℃에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 용매를 감압 하에 제거했다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔, 80 g, 20-35 um; 이동상, 0.1% NH4HCO3이 함유된 물 및 ACN(50분 내에 5% 내지 95% 구배); 검출기, UV 254 nm. 용출액을 농축하여 3-(4-브로모-3-메틸-2-옥소-1,3-벤조디아졸-1-일)피페리딘-2,6-다이온(화합물 43-8, 1.5g, 50%)을 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z): 338,340 [M+H]+.
단계 5. 화합물 43-9의 제조
DMF(35 mL) 중 3-(4-브로모-3-메틸-2-옥소-1,3-벤조디아졸-1-일)피페리딘-2,6-다이온(화합물 43-8, 1.5 g, 4.43 mmol, 1 당량), tert-부틸 4-(프로프-2-인-1-일옥시)피페리딘-1-카르복실레이트(화합물 43-3, 1.59 g, 6.65 mmol, 1.5 당량), 다이클로로팔라듐; 비스(트리페닐포스판)(0.62 g, 0.88 mmol, 0.2 당량), CuI(0.17 g, 0.88 mmol, 0.2 당량) 및 탄산세슘(5.78 g, 17.74 mmol, 4 당량)의 혼합물을 2시간 동안 질소 대기 하에 80℃에서 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 반응을 물(50 mL)로 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 EA(3 x 50 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(50mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과 후, 여액을 감압하에 농축했다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔, 80 g, 20-35 um; 이동상, 0.1% TFA 함유 물 및 ACN(50분 내에 0% 내지 100% 구배); 검출기, UV 254 nm. 용출액을 농축하여 tert-부틸 4-({3-[1-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-1,3-벤조디아졸-4-일]프로프-2-인-1-일}옥시)피페리딘-1-카르복실레이트(화합물 43-9, 700 mg, 31%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z): 497 [M+H]+.
단계 6. 화합물 43-10의 제조
DCM(20 mL) 중 tert-부틸 4-({3-[1-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-1,3-벤조디아졸-4-일]프로프-2-인-1-일}옥시)피페리딘-1-카르복실레이트(화합물 43-9, 700 mg, 1.41 mmol, 1 당량)의 교반 혼합물에 TFA(4 mL)를 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 용매를 감압 하에 제거하여 미정제 3-{3-메틸-2-옥소-4-[3-(피페리딘-4-일옥시)프로프-1-인-1-일]-1,3-벤조디아졸-1-일}피페리딘-2,6-다이온(화합물 43-10, 800 mg, 미정제물)을 황색 오일로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z): 397 [M+H]+.
단계 7. 화합물 43-13의 제조
ACN(200.00mL) 중 에틸 5-클로로피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-카르복실레이트(화합물 43-11, 10.00 g, 44.32 mmol, 1 당량) 및 (1R,4R)-2-옥사-5-아자바이사이클로[2.2.1]헵탄(6.59g, 66.48 mmol, 1.5당량)의 교반 혼합물에 DIEA(22.91g, 177.28 mmol, 4당량)를 0℃에서 공기 대기 하에 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 공기 대기 하에 60℃에서 1시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 물(400mL)로 희석했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 EtOAc(3 x 400 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(3x100mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 여과 후, 여액을 감압하에 농축했다. 이로써 에틸 5-[(1R,4R)-2-옥사-5-아자바이사이클로[2.2.1]헵탄-5-일]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-카르복실레이트(화합물 43-13, 10g, 78%)가 황색 고체로서 초래되었다. LCMS:(ES.m/z): 289[M+H]+.
단계 8. 화합물 43-14의 제조
MeOH(100mL) 중 에틸 5-[(1R,4R)-2-옥사-5-아자바이사이클로[2.2.1]헵탄-5-일]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-카르복실레이트(화합물 43-13, 10g, 34.68 mmol, 1당량)의 교반 용액에 H2O(20mL) 및 LiOH(4.15g, 173.42 mmol, 5당량)를 0℃에서 공기 대기 하에 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 공기 대기 하에 60℃에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 감압 하에 농축했다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수중 TFA(0.05% TFA), 30분 내에 0% 내지 50% 구배; 검출기, UV 254 nm. 이로써 5-[(1R,4R)-2-옥사-5-아자바이사이클로[2.2.1]헵탄-5-일]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-카르복실산(화합물 43-14, 3.7 g, 40%)이 황색 고체로서 초래되었다. LCMS:(ES.m/z):261[M+1]+.
단계 9. 화합물 43-16의 제조
DCM(150mL) 중 메틸(1s,4s)-4-하이드록시사이클로헥산-1-카르복실레이트(화합물 43-15, 6.00g, 37.92 mmol, 1당량) 및 트리에틸아민(1.15g, 113.78 mmol, 3당량)의 교반 혼합물에 메탄술포닐 클로라이드(5.21g, 45.51 mmol, 1.2당량)를 질소 대기 하에 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반했다. TLC는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 물(50 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 DCM(3 x 150 mL)으로 추출했다. 합한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과 후, 여액을 감압 농축하여 메틸 (1s,4s)-4-(메탄술포닐옥시)사이클로헥산-1-카르복실레이트(화합물 43-16, 6.1g, 68%)를 황색 오일로서 제공했다. GCMS:(ES.m/z):236[M]+.
단계 10. 화합물 43-18의 제조
DMF(25 mL) 중 3-(다이플루오로메틸)-4-니트로-1H-피라졸(화합물 43-17, 1.70 g, 10.42 mmol, 1 당량), 메틸(1s,4s)-4-(메탄술포닐옥시)사이클로헥산-1-카르복실레이트(2.46 g, 10.42 mmol, 1 당량) 및 K2CO3(2.88 g, 20.84 mmol, 2 당량)의 혼합물을 80℃에서 24시간 동안 교반했다. LCMS는 약 50%의 생성물이 생산되었음을 나타냈다. 용매는 감압 하에 제거했다. 잔류물은 물(25 mL)로 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물은 EA(3 x 30 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(30mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과 후, 여액을 감압하에 농축했다. 잔류물을 PE/EA(3:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 메틸(1r,4r)-4-[3-(다이플루오로메틸)-4-니트로피라졸-1-일]사이클로헥산-1-카르복실레이트(화합물 43-18, 1.1 g, 34%)를 황색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z): 304 [M+H]+.
단계 11. 화합물 43-19의 제조
THF(30mL) 중 메틸 (1r,4r)-4-[3-(다이플루오로메틸)-4-니트로피라졸-1-일]사이클로헥산-1-카르복실레이트(화합물 43-18, 900 mg, 2.96 mmol, 1당량)의 교반 혼합물에 Pd/C(240 mg, 10%)를 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 수소 대기 하에 25℃에서 4시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 고체를 여과 제거했다. 여액을 감압 하에 농축하여 미정제 메틸 (1r,4r)-4-[4-아미노-3-(다이플루오로메틸)피라졸-1-일]사이클로헥산-1-카르복실레이트(화합물 43-19, 890 mg, 미정제물)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z): 274 [M+H]+.
단계 12. 화합물 43-20의 제조
MeOH(3mL) 및 THF(18mL) 중 메틸 (1r,4r)-4-[4-아미노-3-(다이플루오로메틸)피라졸-1-일]사이클로헥산-1-카르복실레이트(화합물 43-19, 850 mg, 3.11 mmol, 1당량)의 교반 혼합물에 LiBH4(3.10mL, 6.22 mmol, 2당량)를 0℃에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 60℃에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 25℃에서 물(10 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 EA(3 x 20 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 잔류물을 DCM/MeOH(96:4)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 [(1r,4r)-4-[4-아미노-3-(다이플루오로메틸)피라졸-1-일]사이클로헥실]메탄올(화합물 43-20, 550 mg, 72%)을 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z): 246 [M+H]+.
단계 13. 화합물 43-21의 제조
ACN(15mL) 중 5-[(1R,4R)-2-옥사-5-아자바이사이클로[2.2.1]헵탄-5-일]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-카르복실산(화합물 43-14, 230 mg, 0.89 mmol, 1 당량), [클로로(다이메틸아미노)메틸리덴]다이메틸아자늄; 헥사플루오로-λ5-포스파누이드(300 mg, 1.07 mmol, 1.2당량) 및 1-메틸-1H-이미다졸(260 mg, 3.13 mmol, 3.5당량)의 혼합물을 25℃에서 30분 동안 교반했다. 이어서, [(1r,4r)-4-[4-아미노-3-(다이플루오로메틸)피라졸-1-일]사이클로헥실]메탄올(화합물 43-20, 220 mg, 0.89 mmol, 1당량)을 상기 혼합물에 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 용매를 감압 하에 제거했다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔, 80 g, 20-35 um; 이동상, 0.1% TFA 함유 물 및 ACN(50분 내에 0% 내지 100% 구배); 검출기, UV 254 nm. 용출액을 감압 하에 농축하여 N-[3-(다이플루오로메틸)-1-[(1r,4r)-4-(하이드록시메틸)사이클로헥실]피라졸-4-일]-5-[(1R,4R)-2-옥사-5-아자바이사이클로[2.2.1]헵탄-5-일]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-카르복스아미드(화합물 43-21, 200 mg, 45.74%)를 황색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z): 488 [M+H]+.
단계 14. 화합물 43-22의 제조
DCM(20mL) 중 N-[3-(다이플루오로메틸)-1-[(1r,4r)-4-(하이드록시메틸)사이클로헥실]피라졸-4-일]-5-[(1R,4R)-2-옥사-5-아자바이사이클로[2.2.1]헵탄-5-일]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-카르복스아미드(화합물 43-21, 1.00g, 2.05 mmol, 1당량)의 교반 혼합물에 1,1-비스(아세틸옥시)-3-옥소-3H-1λ5,2-벤지오다옥솔-1-일 아세테이트(960 mg, 2.25 mmol, 1.1당량)를 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 1.5시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응물을 포화 중탄산나트륨 용액(15 mL)으로 켄칭시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 DCM(3 x 15 mL)으로 추출했다. 합한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과 후, 여액을 감압하에 농축했다. 잔류물을 DCM/MeOH(96:4)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 N-[3-(다이플루오로메틸)-1-[(1r,4r)-4-포르밀사이클로헥실]피라졸-4-일]-5-[(1R,4R)-2-옥사-5-아자바이사이클로[2.2.1]헵탄-5-일]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-카르복스아미드(화합물 43-22, 600 mg, 60%)를 황색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z): 486 [M+H]+.
단계 15. 화합물 43-23의 제조
DMF(3 mL) 및 THF(15 mL) 중 N-[3-(다이플루오로메틸)-1-[(1r,4r)-4-포르밀사이클로헥실]피라졸-4-일]-5-[(1R,4R)-2-옥사-5-아자바이사이클로[2.2.1]헵탄-5-일]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-카르복스아미드(화합물 43-22, 600 mg, 1.23 mmol, 1당량), 3-{3-메틸-2-옥소-4-[3-(피페리딘-4-일옥시)프로프-1-인-1-일]-1,3-벤조디아졸-1-일}피페리딘-2,6-다이온(화합물 43-10, 490 mg, 1.23 mmol, 1 당량) 및 AcOK(240 mg, 2.47 mmol, 2 당량)의 혼합물을 25℃에서 30분 동안 교반했다. 이어서, STAB(520 mg, 2.47 mmol, 2당량)를 상기 혼합물에 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 1시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 용매를 감압 하에 제거했다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔, 80 g, 20-35 um; 이동상, 0.1% TFA 함유 물 및 ACN(50분 내에 0% 내지 100% 구배); 검출기, UV 254 nm. 용출액을 농축하여 N-[3-(다이플루오로메틸)-1-[(1r,4r)-4-{[4-({3-[1-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-1,3-벤조디아졸-4-일]프로프-2-인-1-일}옥시)피페리딘-1-일]메틸}사이클로헥실]피라졸-4-일]-5-[(1R,4R)-2-옥사-5-아자바이사이클로[2.2.1]헵탄-5-일]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-카르복스아미드(600 mg, 56%)를 황색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 866 [M+H-TFA]+.
단계 16. 화합물 43-25의 제조
DCM(5 mL) 중 (2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}아세트아미도)메틸 아세테이트(화합물 43-24, 300 mg, 1.30 mmol, 1당량) 및 클로로트리메틸실란(565 mg, 5.21 mmol, 4 당량)의 혼합물을 질소 대기 하에 0℃에서 1시간 동안 교반했다. 분석 샘플을 MeOH로 켄칭했고 질량 신호는 203을 나타냈다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 용매를 감압 하에 제거하여 미정제 프로프-2-엔-1-일 N-[(클로로메틸카르바모일)메틸]카르바메이트(화합물 43-25, 350 mg, 미정제물)를 백색 고체로서 제공했다. 미정제 생성물을 어떠한 정제 없이 다음 단계에 사용했다.
단계 17. 화합물 43-26의 제조
DMF(7.5mL) 중 N-[3-(다이플루오로메틸)-1-[(1r,4r)-4-{[4-({3-[1-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-3-메틸-2-옥소-1,3-벤조디아졸-4-일]프로프-2-인-1-일}옥시)피페리딘-1-일]메틸}사이클로헥실]피라졸-4-일]-5-[(1R,4R)-2-옥사-5-아자바이사이클로[2.2.1]헵탄-5-일]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-카르복스아미드(화합물 43-23, 500 mg, 0.57 mmol, 1당량) 및 탄산칼륨(160 mg, 1.15 mmol, 2당량)의 혼합물을 질소 대기 하에 0℃에서 20분 동안 교반했다. 이어서, 프로프-2-엔-1-일 N-[(클로로메틸카르바모일)메틸]카르바메이트(화합물 43-25, 240 mg, 1.15 mmol, 2당량)를 상기 혼합물에 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 25℃에서 1.5시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 시스템을 다음 조건을 사용하여 역플래시 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔, 80 g, 20-35 um; 이동상, 0.1% TFA 함유 물 및 ACN(50분 내에 0% 내지 100% 구배); 검출기, UV 254 nm. 용출액을 감압 하에 농축하여 프로프-2-엔-1-일 N-[({[3-(3-메틸-2-옥소-4-{3-[(1-{[(1r,4r)-4-[3-(다이플루오로메틸)-4-{5-[(1R,4R)-2-옥사-5-아자바이사이클로[2.2.1]헵탄-5-일]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-아미도}피라졸-1-일]사이클로헥실]메틸}피페리딘-4-일)옥시]프로프-1-인-1-일}-1,3-벤조디아졸-1-일)-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸}카르바모일)메틸]카르바메이트(화합물 43-26, 400 mg, 66%)를 황색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z): 1036 [M+H]+.
단계 18. 화합물 43-27의 제조
THF(7.5mL) 중 프로프-2-엔-1-일 N-[({[3-(3-메틸-2-옥소-4-{3-[(1-{[(1r,4r)-4-[3-(다이플루오로메틸)-4-{5-[(1R,4R)-2-옥사-5-아자바이사이클로[2.2.1]헵탄-5-일]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-아미도}피라졸-1-일]사이클로헥실]메틸}피페리딘-4-일)옥시]프로프-1-인-1-일}-1,3-벤조디아졸-1-일)-2,6-다이옥소피페리딘-1-일]메틸}카르바모일)메틸]카르바메이트(화합물 43-26, 150 mg, 0.14 mmol, 1당량), Pd(PPh3)4(17 mg, 0.014 mmol, 0.1당량) 및 페닐실란(32 mg, 0.29 mmol, 2 당량)의 혼합물을 질소 대기 하에 0℃에서 1시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 용매를 감압 하에 제거했다. 잔류물을 다음 조건으로 역플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔, 80 g, 20-35 um; 이동상, 0.1% FA 함유 물 및 ACN(50분 내에 0% 내지 100% 구배); 검출기, UV 254 nm. 용출액을 농축하여 N-[3-(다이플루오로메틸)-1-[(1r,4r)-4-[(4-{[3-(1-{1-[(2-아미노아세트아미도)메틸]]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일}-3-메틸-2-옥소-1,3-벤조디아졸-4-일)프로프-2-인-1-일]옥시}피페리딘-1-일)메틸]사이클로헥실]피라졸-4-일]-5-[(1R,4R)-2-옥사-5-아자바이사이클로[2.2.1]헵탄-5-일]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-카르복스아미드(화합물 43-27, 105 mg, 76%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z): 952 [M+H]+.
단계 19. 화합물 (XLIII)의 제조
DMF(3 mL) 중 (2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3-페닐프로판산(화합물 40-6, 47 mg, 0.10 mmol, 1 당량), HATU(57 mg, 0.15 mmol, 1.5 당량) 및 HOBT(14 mg, 0.10 mmol, 1 당량)의 혼합물을 0℃에서 5분 동안 교반했다. 그런 다음 N-[3-(다이플루오로메틸)-1-[(1r,4r)-4-[(4-{[3-(1-{1-[(2-아미노아세트아미도)메틸]-2,6-다이옥소피페리딘-3-일}-3-메틸-2-옥소-1,3-벤조디아졸-4-일)프로프-2-인-1-일]옥시}피페리딘-1-일)메틸]사이클로헥실]피라졸-4-일]-5-[(1R,4R)-2-옥사-5-아자바이사이클로[2.2.1]헵탄-5-일]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-카르복스아미드(화합물 43-27, 95 mg, 0.10 mmol, 1 당량)을 상기 혼합물에 첨가한 후 DIEA(26 mg, 0.20 mmol, 2 당량)를 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 시스템을 다음 조건으로 prep-HPLC로 정제했다: 컬럼: XSelect CSH Prep C18 OBD 컬럼, 19*150mm, 5μm; 이동상 A: 물(0.05%TFA), 이동상 B: ACN; 유속: 25mL/분; 구배: 7분 내에 24% B 내지 44% B, 44% B; 파장: 254nm; RT1(분): 6.23;. 수집한 분획을 동결건조하여 N-[3-(다이플루오로메틸)-1-[(1r,4r)-4-({4-[(3-{1-[1-({2-[(2S)- 2-(2-{2-[6-(2,5-다이옥소피롤-1-일)헥산아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3-페닐프로판아미도]아세트아미도}메틸)-2,6-다이옥소피페리딘-3-일]-3-메틸-2-옥소-1,3-벤조디아졸-4-일}프로프-2-인-1-일)옥시]피페리딘-1-일}메틸)사이클로헥실]피라졸-4-일]-5-[(1R,4R)-2-옥사-5-아자바이사이클로[2.2.1]헵탄-5-일]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-카르복스아미드(25.4 mg, 18%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z): 1406 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.52 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 9.00-8.80 (m, 2H), 8.41 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 8.30-8.15 (m, 3H), 8.15-7.95 (m, 3H), 7.27-7.11 (m, 9H), 7.06-6.99 (m, 2H) 6.68 (dd, J = 164, 7.8 Hz, 1H), 5.50 (dd, J = 13.2, 5.2 Hz, 1H), 5.31-5.09 (m, 3H), 4.78 (d, J = 22.0 Hz, 1H), 4.55-4.48 (m, 3H), 4.30-4.23 (m, 1H), 3.86-3.74 (m, 5H), 3.73-3.52 (m, 10H), 3.48-3.27 (m, 4H), 3.04-2.95 (m, 6H), 2.89-2.60 (m, 3H), 2.27-2.03 (m, 8H), 2.03-1.87 (m, 5H), 1.85-1.75 (m, 2H), 1.51-1.40 (m, 4H), 1.25-1.10 (m, 4H).
반응식 23: 화합물 (XLIV)의 제조
단계 1. 화합물 44-2의 제조
N,N-다이메틸포름아미드(170 mL) 중 메틸 (2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-트리스(아세틸옥시)-6-[4-(하이드록시메틸)-2-니트로페녹시]옥산-2-카르복실레이트(화합물 44-1, 17 g, 35.02 mmol, 1 당량) 및 이미다졸(3.58 g, 52.53 mmol, 1.5 당량)의 교반 용액에 tert-부틸다이메틸실릴 클로라이드(7.92 g, 52.53 mmol, 1.5 당량)를 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 물(600mL)로 희석했다. 침전된 고체를 여과로 수집하고 Et2O(3x50mL)로 세척했다. 이로써 메틸 (2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-트리스(아세틸옥시)-6-(4-{[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]메틸}-2-니트로페녹시)옥산-2-카르복실레이트(화합물 44-2, 16.1g, 76%)가 회백색 고체로서 초래되었다. LCMS(ESI, m/z):617[M+H+NH3]+.
단계 2. 화합물 44-3의 제조
메탄올(320 mL) 중 메틸 (2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-트리스(아세틸옥시)-6-(4-{[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]메틸}-2-니트로페녹시)옥산-2-카르복실레이트(화합물 44-2, 16 g, 26.68 mmol, 1 당량)의 교반 용액에 나트륨 메톡사이드(8.65 g, 160.09 mmol, 6.00 당량)를 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 진공하에 농축했다. 이로써 (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]메틸}-2-니트로페녹시)-3,4,5-트리하이드록시옥산-2-카르복실산(화합물 44-3, 10g, 81%)이 회백색 고체로서 초래되었다. LCMS(ESI, m/z):477[M+H+NH3]+; 1H NMR(400MHz, DMSO-d 6) δ 8.50(s, 1H), 7.76(d, J=2.0Hz, 1H), 7.57-7.49(m, 1H), 7.41(d, J=8.8Hz, 1H), 5.05(d, J=7.2Hz, 1H), 4.72(s, 2H), 3.49(d, J=10.2Hz, 1H), 3.30-3.08(m, 6H), 0.91(s, 9H), 0.09(s, 6H).
단계 3. 화합물 44-4의 제조
N,N-다이메틸포름아미드(100 mL) 중 (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]메틸}-2-니트로페녹시)-3,4,5-트리하이드록시옥산-2-카르복실산(화합물 44-3, 10 g, 21.76 mmol, 1.00 당량)의 교반 용액에 알릴 브로마이드(6.58 g, 54.40 mmol, 2.50 당량)를 N2 대기 하에 실온에서 분할 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 40℃에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 결과적으로 생성된 혼합물을 물(500mL)로 희석했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 에틸 아세테이트(3 x 200 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(5 x 200mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 감압 하에 농축했다. 잔류물을 석유 에테르/에틸 아세테이트(12:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]메틸}-2-니트로페녹시)-3,4,5-트리하이드록시옥산-2-카르복실레이트(화합물 44-4, 10g, 91%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ES, m/z): 517 [M+H+NH3]+, 522 [M+Na]+
단계 4. 화합물 44-5의 제조
피리딘(200 mL) 중 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]메틸}-2-니트로페녹시)-3,4,5-트리하이드록시옥산-2-카르복실레이트(화합물 44-4, 10 g, 20.01 mmol, 1 당량)의 교반 용액에 프로프-2-엔-1-일 카르보노클로리데이트(72.38 g, 600.48 mmol, 30당량)를 0℃에서 적하했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 물(500mL)로 희석했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 에틸 아세테이트(3 x 200 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(5x200mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축했다. 잔류물을 석유 에테르/에틸 아세테이트(3:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]메틸}-2-니트로페녹시)-3,4,5-트리스({[프로프-2-엔-1-일옥시]카르보닐}옥시)옥산-2-카르복실레이트(화합물 44-5, 11.7 g, 83%)를 황색 오일로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z):769[M+H+NH3]+.
단계 5. 화합물 44-6의 제조
테트라하이드로푸란(240 mL) 중 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(tert-부틸다이메틸실릴)옥시]메틸}-2-니트로페녹시)-3,4,5-트리스({[프로프-2-엔-1-일옥시]카르보닐}옥시)옥산-2-카르복실레이트(화합물 44-5, 11.6 g, 15.42 mmol, 1 당량)의 교반 용액에 불화수소 피리딘(60 mL)을 0 ℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 1시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 진공하에 농축했다. 잔류물을 석유 에테르/에틸 아세테이트(1:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[4-(하이드록시메틸)-2-니트로페녹시]-3,4,5-트리스({[(프로프-2-엔-1-일옥시]카르보닐}옥시)옥산-2-카르복실레이트(화합물 44-6, 8.9 g, 90%)를 황색 오일로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z):655[M+H+NH3]+.
단계 6. 화합물 44-7의 제조
N,N-다이메틸포름아미드(190 mL) 중 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[4-(하이드록시메틸)-2-니트로페녹시]-3,4,5-트리스({[프로프-2-엔-1-일옥시]카르보닐}옥시)옥산-2-카르복실레이트(화합물 44-6, 8.8 g, 13.80 mmol, 1 당량) 및 비스(4-니트로페닐) 카르보네이트(4.62 g, 15.18 mmol, 1.1 당량)의 교반 용액에 N,N-다이아이소프로필에틸아민(3.57 g, 27.60 mmol, 2 당량)을 실온에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 물(600mL)로 희석하였다. 결과적으로 생성된 혼합물을 에틸 아세테이트(3 x 200 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(3x200mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축했다. 잔류물을 석유 에테르/에틸 아세테이트(3:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-니트로-4-{[(4-니트로페녹시카르보닐)옥시]메틸}페녹시)-3,4,5-트리스({[프로프-2-엔-1-일옥시]카르보닐}옥시)옥산-2-카르복실레이트(화합물 44-7, 8 g, 72%)를 황색 오일로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z):802[M+H]+.
단계 7. 화합물 44-8의 제조
N,N-다이메틸포름아미드(35 mL) 중 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-니트로-4-{[(4-니트로페녹시카르보닐)옥시]메틸}페녹시)-3,4,5-트리스({[프로프-2-엔-1-일옥시]카르보닐}옥시)옥산-2-카르복실레이트(화합물 44-6, 3.5 g, 4.36 mmol, 1 당량)의 교반 용액에 2-프로피닐아민(0.48 g, 8.72 mmol, 2 당량)을 0℃에서 첨가했다. 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 혼합물은 다음 조건으로 역상 플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.05% TFA) 중 아세토니트릴, 30분 내에 5% 내지 80% 구배; 검출기, UV 254 nm. 수집한 분획을 동결건조하여 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[2-니트로-4-({[(프로프-2-인-1-일)카르바모일]옥시}메틸)페녹시]-3,4,5-트리스({[프로프-2-엔-1-일옥시]카르보닐}옥시)옥산-2-카르복실레이트(화합물 44-8, 1.6 g, 51%)를 황색 오일로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z):736[M+H+NH3]+
단계 8. 화합물 44-9의 제조
다이클로로메탄(140 mL) 중 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[2-니트로-4-({[(프로프-2-인-1-일)카르바모일]옥시}메틸)페녹시]-3,4,5-트리스({[프로프-2-엔-1-일옥시]카르보닐}옥시)옥산-2-카르복실레이트(화합물 44-8, 1.4 g, 1.94 mmol, 1 당량) 및 파라포름알데하이드(0.12 g, 3.89 mmol, 2 당량)의 교반 용액에 트리메틸실릴 클로라이드(0.42 g, 3.89 mmol, 2 당량)를 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 2시간 동안 교반했다. LCMS 테스트를 위해 반응 혼합물을 메탄올로 유도체화했다. 생성된 혼합물을 감압 하에 농축하여 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[4-({[클로로메틸(프로프-2-인-1-일)카르바모일]옥시}메틸)-2-니트로페녹시]-3,4,5-트리스({[프로프-2-엔-1-일옥시]카르보닐}옥시)옥산-2-카르복실레이트(화합물 44-9)를 제공했다. 미정제 생성물을 추가 정제 없이 직접 다음 단계에 사용했다. LCMS(ESI, m/z):763[M+H]+(MeOH에 의해 유도체화됨).
단계 9. 화합물 44-11의 제조
N,N-다이메틸포름아미드(13mL) 중 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[4-({[클로로메틸(프로프-2-인-1-일)카르바모일)]옥시}메틸)-2-니트로페녹시]-3,4,5-트리스({[프로프-2-엔-1-일옥시]카르보닐}옥시)옥산-2-카르복실레이트(화합물 44-9, 1.3 g, 1.69 mmol, 1당량) 및 tert-부틸 N-[2-(2-{2-클로로-4-[({[2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1-옥소-3H-아이소인돌-5-일]메틸}카르바모일)아미노]페닐}에톡시)에틸]-N-메틸카르바메이트(화합물 11-2, 1.06g, 1.69mmol, 1당량)의 교반 용액에 탄산세슘(0.55g, 1.69mmol, 1당량)을 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 1시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 혼합물을 다음 조건으로 역상 플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.05% TFA) 중 아세토니트릴, 30분 내에 5% 내지 80% 구배; 검출기, UV 254 nm. 수집한 분획을 동결건조하여 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노]에톡시}에틸)-3-클로로페닐]카르바모일}아미노)메틸]-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일}-2,6-다이옥소피페리딘-1-일)메틸](프로프-2-인-1-일)카르바모일}옥시)메틸]-2-니트로페녹시}-3,4,5-트리스({[프로프-2-엔-1-일옥시]카르보닐}옥시)옥산-2-카르복실레이트(화합물 44-11, 360mg, 15%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z):1358[M+H]+
단계 10. 화합물 44-12의 제조
MeOH(3 mL) 및 아세트산(3 mL) 중 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노]에톡시}에틸)-3-클로로페닐]카르바모일}아미노)메틸]-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일}-2,6-다이옥소피페리딘-1-일)메틸](프로프-2-인-1-일)카르바모일}옥시)메틸]-2-니트로페녹시}-3,4,5-트리스({[프로프-2-엔-1-일옥시]카르보닐}옥시)옥산-2-카르복실레이트(화합물 44-11, 350 mg, 0.25 mmol, 1 당량)의 교반 용액에 Zn(125 mg, 1.91 mmol, 10 당량)을 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 메탄올(3x5mL)로 세척했다. 여액을 감압 하에 농축했다. 잔류물을 다음 조건으로 역상 플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.05% TFA) 중 아세토니트릴, 30분 내에 5% 내지 80% 구배; 검출기, UV 254 nm. 수집한 분획을 동결건조하여 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{2-아미노-4-[({[(3-{5-[({ [4-(2-{2-[(tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노]에톡시}에틸)-3-클로로페닐]카르바모일}아미노)메틸]-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일}-2,6-다이옥소피페리딘-1-일)메틸](프로프-2-인-1-일)카르바모일}옥시)메틸]페녹시}-3,4,5-트리스({[프로프-2-엔-1-일옥시]카르보닐}옥시)옥산-2-카르복실레이트(화합물 44-12, 110 mg, 32.14%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z):1328[M+H]+; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.81 (s, 1H), 7.77 - 7.66 (m, 2H), 7.53 (s, 1H), 7.45 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.19 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.84 (s, 2H), 6.70 (s, 1H), 6.57 (s, 1H), 6.26 (s, 1H), 6.09 (s, 1H), 5.90-5.88 (m, 4H), 5.47 - 5.17 (m, 12H), 4.93 (s, 3H), 4.81 (s, 2H), 4.79 - 4.55 (m, 9H), 4.42 (d, J = 5.6 Hz, 3H), 3.99 (s, 2H), 3.55-3.51 (m, 5H), 3.31 - 3.14 (m, 4H), 2.85-2.75 (m, 6H), 1.38 (s, 9H).
단계 11. 44-14의 제조
아세토니트릴(2 mL) 중 화합물 44-12(110 mg, 0.08 mmol, 1 당량) 및 3-[3-(2,5-다이옥소피롤-1-일)프로판아미도]프로판산(화합물 44-13, 40 mg, 0.16 mmol, 2 당량)의 교반 용액에 1-메틸이미다졸(27 mg, 0.33 mmol, 4 당량)을 실온에서 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 진공하에 농축했다. 잔류물을 다음 조건으로 역상 플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.1% FA) 중 MeCN, 30분 내에 5% 내지 80% 구배; 검출기, UV 254 nm. 수집한 분획을 동결건조하여 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노]에톡시}에틸)-3-클로로페닐]카르바모일}아미노)메틸]-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일}-2,6-다이옥소피페리딘-1-일)메틸](프로프-2-인-1-일)카르바모일}옥시)메틸]-2-{3-[3-(2,5-다이옥소피롤-1-일)프로판아미도]프로판아미도}페녹시}-3,4,5-트리스({[프로프-2-엔-1-일옥시]카르보닐}옥시)옥산-2-카르복실레이트(화합물 44-14, 70 mg, 54%)를 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z):1550[M+H]+
단계 12. 화합물(44-15)의 합성
테트라하이드로푸란(5 mL) 중 프로프-2-엔-1-일(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노]에톡시}에틸)-3-클로로페닐]카르바모일}아미노)메틸]-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일}-2,6-다이옥소피페리딘-1-일)메틸](프로프-2-인-1-일)카르바모일}옥시)메틸]-2-{3-[3-(2,5-다이옥소피롤-1-일)프로판아미도]프로판아미도}페녹시}-3,4,5-트리스({[프로프-2-엔-1-일옥시]카르보닐}옥시)옥산-2-카르복실레이트(화합물 44-14, 50 mg, 0.03 mmol, 1당량) 및 트리에틸아민(13 mg, 0.12 mmol, 4 당량)의 교반 용액에 포름산(5 mg, 0.09 mmol, 3 당량) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(15 mg, 0.012 mmol, 0.4 당량)을 실온에서 질소 대기 하에 첨가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 진공하에 농축했다. 잔류물은 다음 조건으로 역상 플래쉬 크로마토그래피로 정제했다: 컬럼, C18 실리카겔; 이동상, 수(0.05% TFA) 중 MeCN, 30분 내에 5% 내지 80% 구배; 검출기, UV 254 nm. 수집한 분획을 동결건조하여 (2S,3S,4S,5R,6S)-6-{4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노]에톡시}에틸)-3-클로로페닐]카르바모일}아미노)메틸]-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일}-2,6-다이옥소피페리딘-1-일)메틸](프로프-2-인-1-일)카르바모일}옥시)메틸]-2-{3-[3-(2,5-다이옥소피롤-1-일)프로판아미도]프로판아미도}페녹시}-3,4,5-트리하이드록시옥산-2-카르복실산(화합물 44-15, 10 mg, 24%)을 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z):1258[M+H]+
단계 13. 화합물 (XLIV)의 제조
다이클로로메탄(1 mL) 중 (2S,3S,4S,5R,6S)-6-{4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노]에톡시}에틸)-3-클로로페닐]카르바모일}아미노)메틸]-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일}-2,6-다이옥소피페리딘-1-일)메틸](프로프-2-인-1-일)카르바모일}옥시)메틸]-2-{3-[3-(2,5-다이옥소피롤-1-일)프로판아미도]프로판아미도}페녹시}-3,4,5-트리하이드록시옥산-2-카르복실산(화합물 44-15, 10 mg, 0.008 mmol, 1당량)의 교반 용액에 트리플루오로아세트산(0.2mL)을 0℃에서 적가했다. 결과적으로 생성된 혼합물을 질소 대기 하에 0℃에서 2시간 동안 교반했다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 결과적으로 생성된 혼합물을 진공하에 농축했다. 미정제 생성물(10 mg)을 다음 조건으로 Prep-HPLC로 정제했다(컬럼: XSelect CSH Prep C18 OBD 컬럼, 19*150mm, 5μm; 이동상 A: 물(0.1%TFA), 이동상 B: ACN; 유속: 25 mL/분; 구배: 10분 내에 18% B 내지 38% B, 38% B; 파장: 254 nm; RT1(분): 7.75; 주입량: 0.7 mL; 수집한 분획은 동결건조하여 (2S,3S,4S,5R,6S)-6-[4-({[({3-[5-({[(3-클로로-4-{2-[2-(메틸아미노)에톡시])에틸}페닐)카르바모일]아미노}메틸)-1-옥소-3H-아이소인돌-2-일]-2,6-다이옥소피페리딘-1-일}메틸)(프로프-2-인-1-일)카르바모일]옥시}메틸)-2-{3-[3-(2,5-다이옥소피롤-1-일)프로판아미도]프로판아미도}페녹시]-3,4,5-트리하이드록시옥산-2-카르복실산 (화합물 (XLIV), 1.2 mg, 13%)을 백색 고체로서 제공했다. LCMS(ESI, m/z):1158[M+H-FA]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.20 (s, 1H), 7.78(d, J=4.0Hz, 1H), 7.57(s, 2H), 7.51(d, J=8.0Hz, 1H), 7.23(s, 2H), 7.22-7.13(m, 2H), 6.72(s, 2H), 5.58-5.35(m, 2H), 5.26-5.20(m, 1H), 5.12-5.11(m, 2H), 4.54(s, 2H), 4.48-4.22(m, 2H), 4.17(br s, 2H), 3.95-3.88(m, 1H), 3.76-3.70(m, 6H), 3.68-3.59(m, 3H), 3.55-3.42(m, 3H), 3.21-3.19(m, 2H), 3.02-2.85(m, 4H), 2.75-2.70(m, 4H), 2.60(s, 2H), 2.46-2.25(m, 3H), 2.18-2.05(m, 1H).
반응식 24: 수용성 치환기를 갖는 화합물의 제조
28.75 μL의 탈기된 무수 DMA를 함유하는 건조 바이알에 건조 탈기된 DMA 중 20mM 스톡 용액으로서 25μL 화합물(XLIV)(0.5μmol, 최종 농도 5mM), 5μL CuBr(0.1μmol), 10μL N,N',N'',N''-펜타메틸다이에틸렌트리아민(0.2 μmol) 및 31.25 μL(0.625 μmol) R-N3을 첨가했고, 여기서 R은 임의의 고도 수용성 기이다(소수성 분해제의 접합에 도움을 주기 위해). 반응물은 질소 하에 주위 온도에서 교반하고 LC-MS로 모니터링했다. 화합물(XLIV)이 소모되면 반응은 완료된 것으로 판단하고, 미정제 생성물은 상기 절차에 따라 접합을 위해 정제 없이 사용한다.
실시예 2: 항체 접합체 제조를 위한 일반적인 절차
50 mM EPPS, 5 mM EDTA pH 7.0 완충액 중 항체를 12 몰 당량의 TCEP로 처리하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하여 사슬간 이황화물을 완전히 환원시켰다. 환원된 항체를 Zeba 40K 컬럼을 이용하여 겔여과를 통해 50mM EPPS, 5mM EDTA pH 7.0으로 정제했다. 12 몰 당량의 링커-페이로드는 DMA 중의 스톡 용액으로서 첨가하여 DMA의 최종 농도가 10% v/v가 되도록 하고, 결과적으로 생성된 반응 혼합물을 주위 온도에서 2시간 동안 인큐베이션했다. 결과적으로 생성된 접합체는 Zeba 40K 컬럼을 사용하여 겔 여과에 의해 20 mM 숙시네이트, 8% 수크로스, 0.01% Tween-20 pH 5.5 제형 완충액으로 정제한 다음, Slide-a-Lyzer 10K 카세트를 사용하여 제형 완충액에 대해 투석했다. 정제된 ADC는 LC-MS에 의해 평균 8.1 약물/Ab를 갖고; SEC에 따르면 98.8%의 단량체로 이루어지고; 역상 HPLC에 따르면 < 1.2% 비접합된 링커-페이로드를 함유하는 것으로 발견되었다. 다른 항체 및 링커-페이로드를 사용하는 유사한 절차는 상응하는 완전 로딩된 ADC를 제공한다.
실시예 2-1: CD33-D 항체 - 화합물(XL) 접합체의 제조
50mM EPPS, 5mM EDTA pH 7.0 중 8 mg/mL의 CD33-D 항체를 12 당량의 TCEP로 처리하고 37℃에서 인큐베이션하여 사슬간 이황화물을 환원시켰다. 환원된 항체를 Zeba 40K 탈염 컬럼을 사용한 탈염에 의해 50mM EPPS, 5mM EDTA pH 7.0으로 정제했다. 항체를 희석하고 12 당량의 화합물 (XL)을 DMA 중 스톡 용액으로서 첨가하여 최종 반응 혼합물이 50 mM EPPS, 5 mM EDTA pH 7.0 + 20% DMA 중 2 mg/mL 환원 항체 + 12 당량의 화합물 (XL)로 이루어지도록 접합을 수행했다. 반응물을 주위 온도에서 인큐베이션했다. 접합체는 Zeba 40K 탈염 컬럼을 사용하여 20mM 숙시네이트, 8% 수크로스, 0.01% Tween-20 pH 5.5 제형 완충액으로 정제했다. 이 시점에 접합체는 LC-MS를 통해 6.0 화합물(XL)/항체를 갖는 것으로 발견되었다.
약물 로딩을 증가시키기 위해, 접합체 용액의 pH를 0.1 부피의 1M Tris pH 7.5를 첨가하여 조정했고, 추가 5 당량의 화합물 (XL)을 DMA 중의 스톡 용액으로서 첨가하여 최종 DMA 농도가 10%가 되도록 했다. 1시간 후, 접합체는 Zebra 40K 탈염 컬럼을 사용하여 탈염에 의해 20 mM 숙시네이트, 8% 수크로스, 0.01% Tween-20 pH 5.5 제형 완충액으로 정제했다.
잔류 유리 약물을 제거하기 위해, 활성탄 250 mg을 물 1mL로 3회 세척한 다음, 제형 완충액 1mL에 현탁시켰다. 0.1 부피의 이 활성탄 슬러리를 접합체에 첨가하고 주위 온도에서 1시간 동안 빙글빙글 회전시켜 혼합했다. 활성탄은 0.22um 필터를 통해 여과하여 제거했다.
접합체는 LC-MS에 의해 8.0 화합물 (XL)/항체; SEC를 통해 87% 단량체; 및 HISEP 컬럼을 사용한 혼합 모드 HPLC를 통해 <1.7% 유리 약물을 갖는 것으로 발견되었다.
실시예 2-2: CD33-D 항체 - 화합물 (XIV) 접합체의 제조
50mM EPPS, 5mM EDTA 중 5 mg/mL의 CD33-D 항체를 12당량의 TCEP로 처리하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하여 사슬간 이황화물을 환원시켰다. 환원된 항체를 Zeba 40K 탈염 컬럼을 사용하여 50mM EPPS, 5mM EDTA pH 7.0으로 정제했다.
항체를 희석하고 화합물 (XIV)를 DMA 중의 스톡 용액으로서 첨가하여 최종 반응 혼합물이 50 mM EPPS, 5 mM EDTA pH 7.0 + 10% DMA 중 4.0 mg/mL 환원 항체 + 12 당량의 화합물 (XIV)로 이루어지도록 접합을 수행했다. 반응물을 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 접합체는 Zebra 40K 탈염 컬럼을 사용하여 20mM 숙시네이트, 8% 수크로스, 0.01% Tween-20 pH 5.5로 정제했다.
접합체는 LC-MS를 통해 7.9 화합물(XIV)/항체; SEC에 의해 98.9% 단량체; 및 HISEP 컬럼을 사용한 혼합 모드 HPLC에 의해 <0.6% 유리 약물을 갖는 것으로 발견되었다.
실시예 2-3: 벨란타맙-화합물 (XIV) 접합체의 제조
20 mM 히스티딘, 250 mM 수크로스, pH 6.5 중 11 mg/mL의 벨란타맙을 15 당량의 TCEP로 처리하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 사슬간 이황화물을 환원시켰다. 환원된 항체는 Zebra 40K 탈염 컬럼을 사용하여 50mM EPPS, 5mM EDTA pH 7.0으로 정제했다.
항체를 희석하고 화합물 (XIV)를 DMA 중의 스톡 용액으로서 첨가하여 최종 반응 혼합물이 50 mM EPPS, 5 mM EDTA pH 7.0 + 10% DMA 중 3.0 mg/mL 환원 항체 + 12 당량의 화합물 (XIV)로 이루어지도록 접합을 수행했다. 반응물을 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 0.01 부피의 100 mM N-아세틸시스테인으로 켄칭시켰다.
접합체는 NAP 탈염 컬럼을 사용한 겔 여과 2회 라운드를 통해 정제했다. 제1 라운드에서, 컬럼은 평형화하고 20 mM 숙시네이트, 8% 수크로스, 0.01% Tween-20 pH 5.5 + 10% DMA로 용출시켰다. 제2 라운드에서, 컬럼은 평형화하고 20mM 숙시네이트, 8% 수크로스, 0.01% Tween-20 pH 5.5로 용출시켰다. 마지막으로, 접합체는 50K MWCO Amicon 원심분리 농축기를 사용하여 농축시켰다.
접합체는 LC-MS에 의해 8 화합물 (XIV)/항체; SEC에 의해 98.4% 단량체; HISEP 컬럼을 사용한 혼합 모드 HPLC에 의해 2.5% 유리 약물을 갖는 것으로 발견되었다.
실시예 2-4: HER2-B 항체-화합물 (XIV) 접합체의 제조
50mM EPPS, 5mM EDTA 중 4.4 mg/mL의 HER2-B 항체를 15당량의 TCEP로 처리하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하여 사슬간 이황화물을 환원시켰다. 환원된 항체는 Zeba 40K 탈염 컬럼을 사용하여 50mM EPPS, 5mM EDTA pH 7.0으로 정제했다.
항체를 희석하고 화합물 (XIV)를 DMA 중의 스톡 용액으로서 첨가하여 최종 반응 혼합물이 50 mM EPPS, 5 mM EDTA pH 7.0 + 10% DMA 공용매 중 4.0 mg/mL 환원 항체 + 12 당량의 화합물 (XIV)로 이루어지도록 접합을 수행했다. 반응물을 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 그 다음 Zebra 40K 탈염 컬럼을 사용하여 20mM 숙시네이트, 8% 수크로스, 0.01% Tween-20 pH 5.5로 정제했다.
접합체는 LC-MS를 통해 7.9 화합물(XIV)/항체; SEC에 의해 98.8% 단량체; 및 HISEP 컬럼을 사용한 혼합 모드 HPLC에 의해 <0.6% 유리 약물을 갖는 것으로 발견되었다.
실시예 2-4: HER2-A 항체-화합물(XLII) 접합체의 제조
50mM EPPS, 5mM EDTA pH 7.0 중 8 mg/mL의 HER2-A 항체를 2.25 당량의 TCEP로 처리하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하여 사슬간 이황화물을 부분적으로 환원시켰다. 주위 온도로 냉각시킨 후, 환원된 항체를 희석하고 화합물 (XLII)를 DMA 중의 스톡 용액으로서 첨가하여 최종 반응 혼합물이 50mM EPPS, 5mM EDTA pH 7.0 + 20% DMA 공용매 중 2.0 mg/mL 환원 항체 + 7 당량의 화합물 (XLII)로 이루어지도록 접합을 수행했다. 반응물을 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 접합체는 Zeba 40K 컬럼을 사용하여 20mM 숙시네이트, 8% 수크로스, 0.01% Tween-20 pH 5.5 제형 완충액으로 정제한 후, 10K MWCO Slide-a-Lyzer 카세트를 사용하여 제형 완충액에 대해 투석했다. 접합체는 LC-MS에 의해 3.3 화합물(XLII)/Ab, 및 SEC에 의해 48.6%의 단량체를 갖는 것으로 발견되었다(도 20 참조). 천연 시스테인에 대한 접합은 항체의 상당한 응집을 유발하는 것으로 발견되었다.
실시예 2-5: HER2-A 항체 - 화합물 (XLII) 접합체의 제조
HER2-A 항체는 Zeba 40K 탈염 컬럼을 사용하여 PBS pH 7.4로 완충액 교환했다. 6.5 mg/mL의 항체는 12 당량의 TCEP로 처리하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하여 완전히 환원시켰다. 주위 온도로 냉각한 후, 환원된 항체는 Zebra 40K 탈염 컬럼을 사용하여 50mM HEPES, 1mM EDTA pH 7.5로 정제했다. 환원된 항체 5 mg/mL를 20 당량의 데하이드로아스코르브산(DMSO에 50mM 스톡 용액으로서 첨가)으로 처리하고, 주위 온도에서 2시간 동안 인큐베이션하여 사슬간 이황화물을 재산화했다. 환원/재산화된 항체 용액의 pH는 0.015 부피의 1M 아세테이트 pH 5.0을 사용하여 7로 조정하고, 4 당량의 화합물 (XLII)를 DMA 중의 스톡 용액으로서 첨가하여 최종 반응 혼합물이 50mM HEPES, 1mM EDTA pH 7 + 20% DMA 중 2 mg/mL Ab + 4 당량의 화합물 (XLII)로 이루어지도록 접합을 수행했다. 반응물은 밤새 주위 온도에서 인큐베이션했다.
접합체는 NAP5 탈염 컬럼을 사용하여 20 mM 숙시네이트, 8% 수크로스, 0.01% Tween-20 pH 5.5로 정제하고, 4 mL로 희석하고, 50K MWCO Amicon 원심분리 농축기를 사용하여 약 0.25 mL로 농축했다.
접합체는 환원성 RPLC-MS에 따르면 2.0 SMol00408/항체; SEC에 따르면 97.1% 단량체(도 21 참조)를 갖고; HISEP 컬럼을 사용하는 혼합 모드 HPLC에 따르면 유리 약물이 검출 가능하지 않은 것으로 발견되었다. 각각의 중쇄 도메인에서 시스테인 돌연변이체로 조작된 퍼투주맙 항체는 사슬간 시스테인을 통해 확률적으로 접합된 WT 퍼투주맙과 비교하여 mal-GGFG-ARV-471에 접합되었을 때 유의미하게 개선된 단량체 %를 보여주었다. 높은 단량체 상태를 갖는 항체 접합체는 높은 응집을 갖는 것보다 더 긴 순환 반감기 및 더 적은 조기 제거율을 갖는 경향이 있어, 더 큰 전임상 치료 지수를 야기한다.
실시예 2-6: CD79b-A 항체 - 화합물 (XLIII) 접합체의 제조
50mM MES, 5mM EDTA pH 6.0 중 5 mg/mL의 CD79b-A 항체는 3.25 당량의 TCEP로 처리하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하여 사슬간 이황화물을 부분적으로 환원시켰다. 주위 온도로 냉각한 후, 환원된 항체를 희석하고 화합물 (XLIII)을 DMA 중 스톡 용액으로 첨가하여 최종 반응 혼합물이 50mM MES, 5mM EDTA pH 6.0 + 15% DMA 중 2.0 mg/mL 환원된 항체 + 7 당량의 화합물 (XLIII)로 이루어지도록 접합을 수행했다. 접합체는 NAP 탈염 컬럼을 사용한 겔 여과 2회 라운드를 통해 정제했다. 제1 라운드에서, 컬럼은 평형화하고 20 mM 숙시네이트, 8% 수크로스, 0.01% Tween-20 pH 5.5 + 10% DMA로 용출시켰다. 제2 라운드에서, 컬럼은 평형화하고 20mM 숙시네이트, 8% 수크로스, 0.01% Tween-20 pH 5.5로 용출시켰다. 마지막으로, 접합체는 50K MWCO Amicon 원심분리 농축기를 사용하여 농축시켰다. 접합체는 LC-MS에 의해 4.6 화합물 (XLIII)/Ab; 98.4% 단량체를 갖고; HISEP 컬럼을 사용한 혼합 모드 HPLC에 의해 검출 가능한 유리 약물이 없는 것으로 발견되었다.
실시예 3: 일반적인 안정성 연구
퍼투주맙-화합물(I) 접합체(DAR=8, 상기 기재된 일반 절차에 따라 화합물 (I)로부터 제조됨)는 37℃, pH7.5에서 24시간 동안 인큐베이션했다. 도 1의 상단 프레임에 표시된 바와 같이, 결과적으로 생성된 생성물의 LCMS 분석은 -496 amu에서 위성 피크의 유의미한 증가를 보여주었으며, 이는 카르바메이트 절단을 나타내고 이 링커를 함유하는 화합물은 생리학적 조건 하에서 일반적으로 안정하지 않음을 입증한다. 반대로, 도면의 하단 패널에 도시된 바와 같이, 퍼투주맙-화합물(I) 접합체가 pH 5.5(대조 조건)에서 4℃에서 밤새 보관된 경우에는 -496 amu 피크가 전혀 관찰되지 않았다.
유사하게, 도 2a 및 도 2b에 도시된 바와 같이, 퍼투주맙-화합물(VIII) 접합체(DAR=8, 상기 기재된 일반적인 절차에 따라 화합물(VIII)로부터 제조되고 경쇄 및 중쇄 서브유닛으로 환원됨)는 37℃, pH 7.5에서 24시간 후, -452 amu에서 LCMS 위성 피크의 증가를 보여주었고, 이는 에스테르 가수분해가 일어났음을 나타낸다. 각 프레임의 맨 윗줄은 pH 5.5에서 유지되고 4℃에서 보관된 접합체의 스펙트럼을 보여주며, 중간 줄은 pH5.5에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션된 접합체의 스펙트럼을 보여주고, 아래쪽 줄은 pH7.5에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션된 접합체의 스펙트럼을 보여준다. 아래쪽 줄에서 -452 amu 피크의 존재는 에스테르 가수분해를 나타내며 에스테르 링커를 함유하는 이 접합체가 생리학적 조건 하에서 일반적으로 안정하지 않다는 증거를 제공한다.
반대로, 퍼투주맙-화합물 (X) 접합체는 동일한 조건 하에서 인큐베이션한 후에도 안정하게 유지되었다. 도 3에 도시된 바와 같이, 접합체는 경쇄 및 중쇄 서브유닛으로 환원되었으며, pH7.5에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션되었다. 링커 절단의 증거는 LC-MS에 의해 관찰되지 않았으며, 이는 접합체가 생리학적 조건 하에서 안정하다는 것을 보여준다.
유사하게, 퍼투주맙-화합물 (XI) 접합체는 동일한 조건 하에 인큐베이션한 후에도 안정하게 유지되었다. 도 4에 도시된 바와 같이, 예상된 종(경쇄, 경쇄+화합물(XI); 중쇄, 중쇄+화합물(XI), 중쇄+2·화합물(XI), 및 중쇄+3 화합물(XI) 만이 관찰되었다. 링커 절단을 나타내는 경쇄 + 링커 단편 또는 중쇄 + 링커 단편과 일치하는 질량을 갖는 피크는 관찰되지 않았다.
실시예 4: 흔적이 없는 링커의 효소적 절단
파파인 분해 1
퍼투주맙-화합물(XI) 접합체는 1:16의 효소 대 접합체의 비율에 따라 파파인으로 실온에서 3시간 동안 분해시켰다. 방출된 페이로드는 빙냉 아세토니트릴로 추출하고 건조시킨 후 95:5:0.1 H2O:아세토니트릴:포름산으로 재구성한 후, LC-MS 분석을 위해 제출했다.
LC-MS 분석:
Waters ACQUITY UPLC가 장착된 Waters SQD2 질량 분석기는 다음 설정으로 활용했다: 양성 검출 모드, 전체 조사 스캔 및 SIR 스캔(neoDegrader P1의 분자 이온에 대해 m/z 528.3을 목표로 하는 선택된 이온 모니터링 스캔). UPLC 구배는 유속 0.8 mL/분에서 다음과 같다. UPLC의 용출액은 각각 UV 및 질량 분석기로 분할되었다. 주입량은 각각 10uL이다. 이동상 A는 0.1% 트리플루오르아세트산을 함유한 HPLC 등급 물이고 이동상 B는 0.1% 트리플루오르아세트산을 함유한 아세토니트릴이다.
도 5는 파파인을 이용한 분해가 하기 구조를 보여주는 neoDegrader P1의 형성과 일치하는 피크를 제공한다는 것을 보여준다. 파파인 처리가 없는 퍼투주맙-화합물(XI)의 대조 샘플 및 neoDegrader P1 표준(214 nm 추적)에 대한 크로마토그램도 보여준다. 또한, 도 5는 neoDegrader P1 표준 및 파파인 처리된 접합체 샘플의 neoDegrader P1에 대한 MS 스펙트럼을 보여준다.
반응식 6은 제안된 neoDegrader 형성 메커니즘을 보여준다.
상기 실시예에 나타낸 바와 같이, 청구된 흔적이 없는 링커만이 절단 조건 하에 충분한 안정성 및 원하는 neoDegrader(화합물 18-6)를 제공했다.
파파인 분해 2
10μM의 화합물(XL), 화합물(XI), 화합물(XIV), 화합물(XV), 화합물(XII) 또는 화합물(XVII)(PBS pH 7.4, 5% DMA 공용매)을 부드러운 진탕하에 실온에서 2시간 동안 파파인(2몰 당량)과 인큐베이션했다. 분해물은 5 부피의 빙냉 아세토니트릴로 추출하고 건조시킨 후 95:5:0.1 물:아세토니트릴:포름산으로 재구성했다. 샘플은 LC-MS 분석(Thermo Exploris 240)을 위해 제출했고 적절한 참조 표준을 사용하여 방출된 페이로드 및/또는 불완전하게 절단된 링커 부산물을 식별하고 정량화했다. 결과는 하기 표 1에 제시된다.
표 1에서 나타나는 바와 같이, 파파인에 의해 화합물 (XL) 및 (XVIII)의 처리는 원하는 페이로드를 우수한 수율로 방출시켰다. 모두 GGFGG 링커를 함유하는 화합물(XIV), (XV), (XII) 및 (XVII)은 원하는 페이로드의 더 낮은 수율을 제공했다. 특정 이론에 얽매이지 않고, 파파인은 이 링커를 효율적으로 절단하는 데 있어서 비효율적인 여겨진다. 이 이론은 GGFG 링커를 함유하는 화합물 (XVIII)의 퍼투주맙 접합체와 GGFGG 링커를 함유하는 화합물 (XI)의 퍼투주맙 접합체 둘 모두가 BT-474 암세포에 대해 우수한 활성을 보여주었으므로 도 11에 제시된 결과에 의해 뒷받침되며, 이는 생리학적 조건 하에서 두 링커의 효과적인 생체내 절단을 나타낸다.
β-글루쿠로니다제 분해
10μM 화합물(XLI)을 β-글루쿠로니다제(Sigma, 유형 IX-A; PBS 중 1 mg/mL 용액, ng당 2U)와 함께 인큐베이션하고 반응 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션했다. 분해물은 5 부피의 빙냉 아세토니트릴로 추출하고 건조시킨 후, 95:5:0.1 물:아세토니트릴:포름산으로 재구성했다. 샘플은 LC-MS 분석(Thermo Exploris 240)을 위해 제출했고, 적절한 참조 표준을 사용하여 방출된 페이로드 및/또는 불완전하게 절단된 링커 부산물을 식별하고 정량화했다. 결과는 표 2에 제시된다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 화합물(XLI)을 β-글루쿠로니다아제로 처리하면 원하는 페이로드가 우수한 수율로 방출되었다.
시스테인 분해
1mM 화합물(XIX)을 10 몰 당량의 L-시스테인(PBS pH 7.4 + 20% DMA)과 함께 37℃에서 24시간 동안 부드러운 진탕하에 인큐베이션했다. 분해물을 5X 빙냉 아세토니트릴로 추출하고 건조시킨 후 95:5:0.1 물:아세토니트릴:포름산으로 재구성했다. 샘플을 LC-MS 분석(Waters, SQD2)을 위해 제출하고 적절한 참조 표준을 사용하여 방출된 페이로드 및/또는 불완전하게 절단된 링커 부산물을 식별하고 정량화했다. 결과는 표 3에 제시되어 있다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 화합물(XIX)을 시스테인으로 처리하면 원하는 페이로드가 우수한 수율로 방출되었다. 화합물 18-6의 방출에 대한 분광학적 증거는 도 18, 19a 및 19b에 제시된다. 도 18은 체류 시간이 3.4분인 모 화합물(XIX)의 HPLC 크로마토그램을 묘사한다. 도 19a는 화합물 (XIX)가 시스테인으로 처리된 경우 반응 혼합물의 HPLC 크로마토그램을 묘사한다. 화합물(XIX)은 완전히 소모되었으며, 유일하게 식별된 생성물은 체류 시간이 2.41분이었다. 도 19b는 화합물 18-6에 상응하는 체류 시간 2.4분에서의 피크의 질량 스펙트럼, m/z 528.4를 묘사한다.
실시예 5A: 시험관내 항증식 검정에 대한 일반적인 절차
세포 성장을 저해하는 청구된 접합체의 능력은 시험관내 항증식 검정을 사용하여 측정했다. 표적 세포를 100μL의 완전 세포 성장 배지(RPMI 1640, 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신)에 웰당 4,000-5,000개의 세포로 플레이팅했다. 접합체는 3배 연속 희석을 사용하여 완전 세포 성장 배지에 희석하고 웰당 100 μL를 첨가했다. 최종 농도는 전형적으로 1 x 10-9 M 내지 1.52 x 10-13 M 또는 1 x 10-6 M 내지 1.53 x 10-11 M 범위였다. 세포는 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃로 5분간 인큐베이션했다. 남은 세포의 생존율은 비색 WST-8 검정(Dojindo Molecular Technologies, Inc., 미국 매릴랜드주 락빌)에 의해 결정되었다. WST-8은 최종 부피의 10%에 첨가했고 플레이트는 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 2-4시간 동안 인큐베이션했다. 멀티웰 플레이트 판독기에서 450 nm 흡광도(A450)를 측정하여 플레이트를 분석했다. 배지 및 WST-8만이 포함된 웰의 배경 A450 흡광도를 모든 값에서 감산했다. 처리된 각 샘플 값을 미처리 세포가 포함된 웰의 평균 값으로 나누어 생존율 퍼센트를 계산했다. 생존율 퍼센트 값은 각 처리에 대한 세미로그 플롯에서 테스트 샘플 농도에 대해 플롯팅했다. IC50 값은 자동으로 계산되었다.
BT-474 유방암 세포주에 대한 화합물 (X)의 리툭시맙 및 퍼투주맙 접합체의 항증식 활성은 도 6에 제시된다. 도면에 제시된 바와 같이, 비세포-결합 대조군 접합체 리툭시맙-화합물 (X)는 BT-474 세포에 대해 상당히 덜 활성인 것으로 발견되었다.
NCI-N87 위암 세포주에 대한 화합물 (X)의 리툭시맙 및 퍼투주맙 접합체의 항증식 활성은 도 7에 제시된다. 도면에 제시된 바와 같이 비세포-결합 대조 접합체 리툭시맙-화합물 (X)는 NCI-N87 세포에 대해 상당히 덜 활성인 것으로 발견되었다.
BT-474 유방암 세포주에 대한 화합물 (XI)의 리툭시맙 및 퍼투주맙 접합체의 항증식 활성은 도 8에 제시된다. 도면에 제시된 바와 같이, 비세포 결합 대조 접합체 리툭시맙-화합물 (X)는 BT-474 세포에 대해 상당히 덜 활성인 것으로 발견되었다.
NCI-N87 위암 세포주에 대한 화합물 (XI)의 리툭시맙 및 퍼투주맙 접합체의 항증식 활성은 도 9에 제시된다. 도면에 제시된 바와 같이, 비세포-결합 대조 접합체 리툭시맙-화합물 (X)는 NCI-N87 세포에 대해 상당히 덜 활성인 것으로 발견되었다.
BT-474 유방암 세포주에 대한 화합물 (XVIII) 및 화합물 (XI)의 퍼투주맙 접합체의 항증식 활성은 도 11에 제시된다. 도면에 제시된 바와 같이, 비세포 결합 대조 접합체 리툭시맙-화합물 (XVIII)은 BT-474 세포에 대해 상당히 덜 활성인 것으로 발견되었다.
BT-474 유방암 세포주에 대한 WO2021/198965에 기재된 바와 같은 화합물 (XLI), 화합물 (XIX), 화합물 (Ie) 및 (Ii)의 퍼투주맙 접합체의 항증식 활성은 도 12에 제시된다. 도면 및 이하 상응하는 표에 제시된 바와 같이, 글루타르이미드 고리를 통해 퍼투주맙에 연결된 분해제는 말단 페닐 고리의 치환을 통해 연결된 분해제와 마찬가지로 BT-474 세포에 대해 유사한 활성을 갖는다. 대조적으로, 비세포 결합 대조 접합체 또는 리툭시맙은 BT-474 세포에 대해 상당히 덜 활성인 것으로 발견되었다. 이는 본원에 기술된 레트로-만니히 반응을 겪을 수 있는 스페이서를 포함하는 것이 글루투르아미드 또는 다이하이드로우라실 함유 분해제를 항체 또는 다른 세포 결합제에 연결하고 방출하는 데 적합한 일반적인 해법임을 입증한다. 이 기술을 사용하면 암세포에 항체 기반 전달을 수행하기 위해 추가적인 화학적 취급방법을 도입할 필요가 없다.
실시예 5B: 시험관내 MV-4-11 항증식 검정에 대한 절차
MV-4-11 세포의 세포 성장을 저해하는 청구된 접합체의 능력은 시험관내 항증식 검정을 사용하여 측정했다. MV-4-11 세포는 1 μM의 차단 항체 젬투주맙 또는 트라스투주맙의 유무 하에 다양한 농도의 접합체 또는 항체에 4일 동안 노출시켰다. 세포의 생존율은 알라마블루(alamarBlue)에 의해 결정되었다. 화합물 (XL)의 젬투주맙 접합체 및 비접합 BRD4 분해제 소분자 화합물 40-3의 항증식 활성은 도 13에 제시된다. 도면에 제시된 바와 같이, 화합물 (XL)의 젬투주맙 접합체는 단독으로 활성이 높았으나, CD33 표면 항원이 젬투주맙에 의해 사전포화된 경우에는 활성이 약 1000배 적었다. 트라스투주맙(항HER2 항체, MV-4-11에서 HER2 발현 없음)을 사용한 사전차단은 접합체 활성에 영향을 미치지 않았다. BRD4 분해자 소분자 화합물 40-3도 매우 활성적이었다. 항체만으로는 최대 1 mM까지 활성화되지 않았다.
실시예 5C: 시험관내 BRD4 단백질 분해 검정을 위한 절차
BRD4를 분해하는 청구된 접합체의 능력은 시험관내 분해 검정을 사용하여 측정했다. MV4-11 세포는 테스트 물품과 함께 밤새 인큐베이션했다. 단백질은 4-12% NuPAGE Bis-Tris 겔에 로딩했다. 토끼 항-BRD4 Ab(Cell Signaling #13440)를 사용한 웨스턴 블롯은 1:1,000 희석으로 수행했고, β-액틴 HRP(Cell Signaling #5125)를 사용한 재블로팅은 1:1,000으로 수행했다. 젬투주맙 접합체 화합물(XL) 및 비접합 BRD4 분해제 소분자 화합물 40-3의 분해 활성은 도 14에 제시된다. 화합물 40-3은 10nM에서 BRD4 단백질 밴드 강도를 >90% 감소시켰다. 화합물 (XL)의 젬투주맙 접합체는 10 nM에서 BRD4 단백질 밴드 강도를 >70% 감소시켰고, BRD4 고갈은 접합체 농도에 의존적이었다.
실시예 5D: 대표적인 암 세포주에 대한 접합체의 결합을 결정하기 위한 시험관내 검정
실시예 10에 기술된 절차를 사용하여, 대표적인 암 세포주에 대한 접합체 및 비접합 항체의 결합을 나타내는 대표적인 IC50 값을 계산했다. 결과는 표 5에 제시된다.
표에 제시된 바와 같이, 링커-페이로드에 대한 접합은 항체의 표적 세포 결합 친화성에 유의미한 영향을 미치지 않았다.
실시예 6: 방관자 세포 사멸 검정을 위한 일반적인 절차
비표적화 세포(Jurkat HiBiT) 성장을 저해하는 표적 세포로부터 방출된 접합체로부터의 약물의 능력은 방관자 활성 검정을 사용하여 측정했다. 웰당 2,000개 세포의 표적 세포 및 웰당 1,000개 세포의 Jurkat HiBiT를 100μL의 완전 세포 성장 배지(RPMI 1640, 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신)에 플레이팅했다. 3배 연속 희석을 사용하여 접합체를 완전 세포 성장 배지에 희석하고 웰당 100 μL를 첨가했다. 최종 농도 범위는 3 x 10-8 M 내지 1.37 x 10-11 M 범위였다. 세포는 5일 동안 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션했다. 나머지 Jurkat HiBiT 세포의 생존율은 NanoGlo HiBiT 용해 시약(Promega N3030)을 사용하여 결정했다. NanoGlo HiBiT 용해 시약 80μL를 플레이트에 첨가하고 실온에서 20분 동안 인큐베이션했다. 멀티웰 플레이트 판독기에서 발광을 측정하여 플레이트를 분석했다. 배지 및 NanoGlo HiBiT 용해 시약만이 포함된 웰의 배경 발광은 모든 값에서 감산했다. 처리된 각 샘플 값을 처리되지 않은 세포가 포함된 웰의 평균 값으로 나누어 생존율 퍼센트를 계산했다. 생존율 퍼센트 값은 각 처리에 대한 반로그 플롯에서 테스트 샘플 농도에 대해 플롯팅했다. IC50 값은 자동으로 계산했다.
Jurkat HiBiT의 존재 및 부재 하에 SK-BR-3 유방암 세포주에 대한 화합물 (X)의 퍼투주맙 접합체의 항증식 활성은 도 10에 제시된다. 도면에 제시된 바와 같이, 접합체는 SK-BR3(Her 2+) 세포가 있는 경우에만 Jurkat HiBiT 표지된 세포(HER 2-)의 생존율을 감소시켜 방관자 세포 사멸을 입증한다.
실시예 7: 생체내 유방암 종양 모델에 대한 접합체의 활성 결정
5주 내지 8주령 암컷 ICR SCID 마우스는 Taconic에서 공급받았다. 마우스의 사타구니 지방 패드에 Matrigel과 배양 배지의 혼합물에 현탁된 1e7 HCC1569 인간 유방암 세포를 정위적으로 이식했다. 종양의 성장은 캘리퍼스를 사용하여 주당 여러 번 모니터링하고 마우스를 치료 그룹에 무작위로 할당하여 대략 100-150mm3의 시작 종양 부피를 달성했다. 그룹 할당 후, 마우스는 WO2021/198965에 기술된 바와 같이 퍼투주맙-화합물(XI) 접합체 또는 퍼투주맙-화합물(Ia) 접합체를 3 mg/kg 또는 10 mg/kg씩 단일 측면 꼬리 정맥 주사 10 ml/kg으로 처리했다. 주사 후, 마우스는 매일 모니터링하고 체중 및 종양 부피에 대해 주 2회 측정했다. 종양 부피는 (a x b2)/2의 표준 계산 방법을 사용하여 결정했고, 여기서 'b'는 가장 작은 직경이고 'a'는 가장 큰 직경이다. 결과는 도 14 및 15에 제시된다.
도 15a에 제시된 바와 같이, 접합체의 두 유형은 모두 비히클에 비해 종양 크기를 감소시키거나 종양 성장을 지연시켰으며, 이는 글루타르이미드 고리를 통해 항체에 연결된 분해제 및 말단 페닐 고리에서의 치환을 통해 연결된 분해제가 둘 다 효과적인 종양 치료법임을 보여준다.
도 15b에 제시된 바와 같이, 둘 중 어느 한 유형의 접합체를 사용한 치료는 비히클 대조군에 비해 또는 투약 전에 기록된 초기 체중과 비교할 때 시간 경과에 따라 그룹 평균 체중 변화를 유의미하게 변경시키지 않았다. 접합체를 이용한 마우스의 치료는 부작용을 생성하지 않았고 연구 중에 인도적인 개입을 필요로 하지 않았다. 따라서, 위에서 설명한 접합체의 두 유형 모두를 사용한 치료는 매우 관용적이었다.
실시예 7-1: 생체내 골수성 백혈병 종양 모델에 대한 접합체의 활성 결정
피하 종양 모델 - MV-4-11 인간 급성 골수성 백혈병 세포(0.1mL 중 1 x 107개 세포)를 암컷 무흉선 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종했다. 종양 크기가 100-150 mm3에 도달했을 때 각 테스트 물품으로 마우스를 치료했다. 10 mg/kg의 CD33-D 항체-화합물(XL) 접합체(20mM 숙시네이트, 8% 수크로스, 0.01% Tween-20 pH 5.5 중)를 2주 동안 매주 1회 정맥내 투여(IV)로 전달했다. 1.5mg/mL, 5% Kolliphor, HS15 WFI 완충액 중 0.4 mg/kg의 화합물(XL)(5% NMP, 45% PEG300, 20mM NaPi pH 6.5 중) 및 10 mg/kg의 ARV-825(Liu et al. Chemistry & Biology 2015, volume 22, pages 755-763에 기술됨)를 14일 동안 1일 1회 복강내 투여(IP)로 치료했다. 종양 크기 및 마우스 체중은 주당 2회 측정했다. 피하 종양 부피(mm3)는 다음 식을 사용하여 계산했다: (a x b2/2) 여기서 'b'는 가장 작은 직경이고 'a'는 가장 큰 직경이다. 연구 엔드포인트는 각각의 종양 부피가 1,000mm3 이상이거나 60일 중 먼저 도래하는 날 이후에 개별 마우스를 안락사시켰을 때이다.
1일차 및 8일차에 투여된 CD33-D 항체-화합물(XL) 접합체(자가 희생 스페이서 및 본 발명의 방법을 사용하여 제조함)는 22일에 걸쳐 MV-4-11 종양 성장 지연을 보여주었다(도 22). 매일 투여(접합 페이로드 용량과 동등함)된 상응하는 BRD4 이종이작용기성 분해제 소분자(Xiamg, W. et al., Biorganic Chemistry 2021, volume 115의 화합물 15)는 비활성이었다. 잘 프로파일링된 BRD4 PROTAC인 ARV-825는 이의 공개된 투약 요법(https://doi.org/10.3389/fonc.2020.574525; Blood (2016) 128 (22): 748.)에 따라 투여했을 때에도 비활성이었다. 도 23은 각 용량 그룹에 대한 시간 경과에 따른 개별 종양 부피를 보여주며, 도 24는 연구 과정에 걸쳐 각 용량 그룹의 마우스에 대한 평균 체중을 보여준다.
실시예 8: J591 내인성 시스테인 접합
Cys 돌연변이가 있는 항-PSMA 항체(50mM EPPS, 5mM EDTA pH 7.0 완충액 중 6.1 mg/mL)는 2.5 당량의 TCEP로 처리하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하여 사슬간 이황화 결합을 부분적으로 환원시켰다. 주위 온도로 냉각시킨 후, 8 당량의 화합물(XV)을 DMA 중 스톡 용액으로서 환원된 항체에 첨가하여 10% (v/v) DMA가 포함된 50 mM EPPS, 5 mM EDTA pH 7.0 중의 5.5 mg/mL 환원된 항체 + 8 당량의 화합물(XV)로 이루어지는 최종 반응 혼합물을 제공했다. 반응물은 주변 온도에서 2시간 동안 인큐베이션했다. 접합체는 Zeba 40K 탈염 컬럼을 사용하는 겔 여과에 의해 20mM 숙시네이트, 8% 수크로스, 0.01% Tween-20 pH 5.5로 정제했다. 접합체는 도 16에 제시된 바와 같이 LC-MS에 의해 평균 4.0 약물/항체 및 25.8% 단량체를 갖는 것으로 발견되었다.
실시예 9: J591 S239C 부위-특이적 조작된 시스테인 접합
20mM 히스티딘, 250mM 수크로스 pH 6.5에서 중쇄에 S239C 돌연변이가 있는 J591 항체를 0.1부피의 1M Tris, 200mM EDTA pH 8.0으로 처리하여 pH를 약 7.5로 조정했다. 항체는 9.4 mg/mL 용액을 100 당량의 DTT로 처리하고 주위 온도에서 밤새 인큐베이션하여 환원시켰다. 환원된 항체는 Zeba 탈염 컬럼을 사용하여 탈염함으로써 50mM Tris, 100mM NaCl pH 8.0으로 정제했다. 10 mg/mL의 환원된 항체 용액은 20당량의 데하이드로아스코르브산으로 처리하고 주위 온도에서 2시간 동안 인큐베이션하여 사슬간 이황화 결합을 개조하여 중쇄에 짝을 이루지 않은 시스테인을 갖는 항체 중간체를 제공했다. 이 중간체는 20mM 숙시네이트, 150mM NaCl, pH 5.5로 용출되는 HiLoad 16/200 Superdex 200pg 컬럼을 사용하여 SEC로 정제했다. 중간체의 pH를 0.1 부피의 1M Tris pH 7.5를 사용하여 약 7로 조정하고, 프로필렌 글리콜을 첨가하고, DMA 중 스톡 용액으로서 6 당량의 화합물 (XV)를 첨가하여 최종 반응 혼합물이 50%(v/v) 프로필렌 글리콜 공용매를 사용하여 pH 7.0으로 조정된 20mM 숙시네이트, 150mM NaCl 중 2 mg/mL 항체 + 6 당량의 화합물 (XV)로 이루어지도록 접합을 수행했다. 반응 혼합물은 주위 온도에서 2시간 동안 인큐베이션했다. 접합체는 Zeba 40K 탈염 컬럼을 사용한 겔 여과에 의해 20 mM 숙시네이트, 8% 수크로스, 0.01% Tween-20 pH 5.5로 정제했다. 도 17에 제시된 바와 같이, 접합체는 1.85 약물/항체, 96.7% 단량체 및 <2.5% 비접합 페이로드를 갖는 것으로 발견되었다.
실시예 10: CD79b-A 항체-화합물(XLIII) 접합체에서 표적 항원 결합 잔류 확인
CD79b-A 항체-화합물(XLIII) 접합체의 접합이 항체 부분의 표적 항원 결합 특성에 영향을 미치지 않도록 하기 위해, CD79b-A 항체-화합물(XLIII) 접합체를 이의 CD79b 결합 친화성에 대해 CD79b-A 항체(폴라투주맙)와 비교하여 테스트했다. B세포 비호지킨 림프종 세포주인 Ramos는 이의 성장 배지로부터 원심분리 및 유세포분석 완충액(PBS 중 5% FBS)에 재현탁에 의해 헹구었다. 그런 다음 세포를 96웰 플레이트에 파종하고 CD79b-A 항체, CD79b-A 항체-화합물(XLIII) 접합체 접합체의 3가지 다른 DAR(2.0, 3.2 및 4.6) 또는 비결합 대조 항체, Synagis N297A와 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 세포를 원심분리한 후 유세포분석 완충액에 재현탁시켜 세척했다. 2회 세척 후, 세포를 항인간 Alexa Fluor™ 488-접합 2차 항체(Invitrogen, A11013)에 2μg/mL 농도로 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 세포를 2회 세척하고 Attune™ NxT 유세포 분석기(ThermoFisher Scientific)에서 유세포 분석으로 분석했다. 도 25에 제시된 바와 같이, CD79b-A 항체-화합물(XLIII) 접합체 접합체의 3가지 DAR은 모두 CD79b-A 항체와 유사한 방식으로 CD79b에 결합하였으므로, 접합은 항원 결합 친화성에 미미한 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 비결합 대조군인 Synagis N297A는 상대적으로 무시할만한 신호 강도를 보여주었다.
실시예 11: CD79b-A 항체-화합물(XLIII) 접합체에 의한 IRAK 분해 확인
IRAK4를 분해하는 CD79b-A 항체-화합물(XLIII) 접합체의 능력을 보여주기 위해, Ramos 세포를 6-웰 세포 배양 플레이트에 파종하고 3가지 다른 DAR(2.0, 3.2, 및 4.6)의 CD79b-A 항체-화합물(XLIII) 접합체를 사용하여 성장 배지(RPMI1640 + 10% 열 불활성화 FBS) 중 0 내지 50 nM의 농도 범위로 처리했다. WO2021247897 A1에 기술된 비접합 페이로드는 비접합 항체 대조군인 CD79b-A 항체와 마찬가지로 비교를 위해 포함시켰다. 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 수확하고 원심분리하여 헹군 다음, 빙냉 PBS에 재현탁했다. 2회 세척 후, 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고 프로테아제 및 포스파타제 저해제를 함유하는 RIPA(ThermoFisher Scientific, 78440)를 사용하여 용해시켰다. 보다 철저한 용해 과정을 위해 샘플을 초음파 처리했다. 4℃에서 20분간 인큐베이션한 후, 샘플은 12,000rcf에서 20분간 원심분리하고 상청액은 수집했다. 각 샘플의 단백질 함량은 제조업체의 프로토콜에 따라 Pierce BCA 검정 키트(ThermoFisher Scientific, 23227)를 사용하여 결정했다. BoltTM LDS 샘플 완충액(ThermoFisher Scientific, B0007) 및 베타-머캅토에탄올(Bio-Rad Laboratories, 1610710)을 각각 25% 및 2.5%의 최종 v/v 비율로 첨가했다. 10% 폴리아크릴아미드 겔(ThermoFisher Scientific, NW00105BOX)의 각 웰에 총 10μg의 단백질을 첨가하고, 150V에서 50분간 전기영동을 실시했다. 전이 과정은 iBlot 2 Dry Blotting System(ThermoFisher Scientific)을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 실시했다. 전이 과정 후, PVDF 멤브레인은 RT에서 1시간에 걸쳐 TBST 중 5% 탈지유와 인큐베이션하여 차단시켰다. IRAK4에 대한 1차 항체(Abcam, ab119942)를 차단 용액에 1:1000의 희석 비율로 사용하여 RT에서 1시간 동안 막을 염색했다. 막은 TBST에서 각각 5분 동안 3회 세척한 후, HRP-접합된 2차 항체(Cell Signaling, 7076)로 1:5000의 희석률로 RT에서 1시간 동안 염색했다. 멤브레인은 iBright™ FL1500 이미징 시스템(ThermoFisher Scientific)에서 ECL을 사용하여 이미지화했다. 로딩 대조를 위해 동일한 절차를 사용했지만 멤브레인은 1:5000 희석률의 HRP-접합 항-β-액틴 항체(Cell Signaling, 5125)로 대신 염색했다.
도 26에 도시된 바와 같이, CD79b-A 항체-화합물(XLIII) 접합체로 처리된 세포는 IRAK4의 용량 의존적 분해를 보여주었고, 더 높은 DAR은 더 강력한 분해를 나타냈다. CD79b-A 항체-화합물(XLIII) 접합체의 비접합 페이로드도 IRAK4의 용량 의존적 분해를 보여주었다. 비접합 항체 대조군인 CD79b-A 항체는 IRAK4 수준에 영향을 미치지 않았다.
실시예 12: CD79b-A 항체-화합물(XLIII) 접합체의 표적 항원 특이적 결합 확인
CD79b-A 항체-화합물(XLIII) 접합체에 의해 관찰된 IRAK4의 분해가 CD79b-결합에 의해 매개되는지 확인하기 위해, CD79b-A 항체-화합물(XLIII) 접합체가 처리 기간 동안 CD79b-결합에 대해 CD79b-A 항체와 경쟁하도록 허용하는 차단 실험을 수행했다. Ramos 세포주는 12웰 세포 배양 플레이트에 파종하고 0.05nM 내지 5μM의 CD79b-A 항체와 함께 실온에서 15분간 사전인큐베이션했다. 배지를 교환함이 없이, CD79b-A 항체-화합물(XLIII) 접합체를 10nM의 농도로 상부에 첨가했다. 미처리 세포, CD79b-A 항체만으로 처리된 세포, 및 10nM의 CD79b-A 항체-화합물(XLIII) 접합체만으로 처리된 세포는 대조군으로서 첨가되었다. 세포는 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션했다. 모든 세포는 처리 종료 시 수확했고, 각 조건에서 IRAK4 수준은 로딩 대조군으로서 β-액틴과 함께 웨스턴 블롯(이전 실시예에 기술한 대로)을 사용하여 결정했다.
도 27에 제시된 바와 같이, CD79b-A 항체-화합물(XLIII) 접합체의 항원-특이적 결합은 공동-처리 조건에서 CD79b-A 항체 농도가 증가함에 따라 IRAK4 밴드 강도가 증가함으로써 확인되었다. 5μM의 CD79b-A 항체에서, CD79b-A 항체-화합물(XLIII) 접합체는 미처리 조건과 유사한 밴드 강도에 의해 증명되는 바와 같이 IRAK4에 거의 영향을 미치지 않았다. 10nM의 CD79b-A 항체로 처리된 세포는 IRAK4 분해를 보여주지 않았고, CD79b-A 항체-화합물(XLIII) 접합체만으로 처리된 세포는 가장 강력한 분해를 보여주었다.
발명의 내용 및 요약서 섹션이 아닌 상세한 설명 섹션은 청구범위를 해석하기 위한 용도인 것으로 의도된 것임이 이해되어야 한다. 발명의 내용 및 요약서 섹션은 발명자(들)가 고려한 본 개시내용의 모든 예시적인 측면은 아니지만, 하나 이상의 예시적인 측면을 설명할 수 있고, 따라서 본 개시내용 및 첨부된 청구범위를 어떤 방식으로든 제한하려는 의도는 아니다.
본 개시내용은 특정된 기능 및 이의 관계의 구현을 예시하는 기능적 빌딩 블록의 도움을 받아 위에서 설명되었다. 이러한 기능적 빌딩 블록의 경계는 설명의 편의를 위해 본원에서 임의로 정의되었다. 특정된 기능 및 이의 관계가 적절하게 수행되는 한 대체 경계가 정의될 수 있다.
특정 측면에 대한 전술한 설명은 다른 사람들이 관련 기술분야의 기술 내의 지식을 적용함으로써 본 개시내용의 일반적인 개념에서 벗어나지 않고 과도한 실험 없이 이러한 특정 측면을 다양한 적용예에 대해 쉽게 수정 및/또는 적응할 수 있도록 본 개시내용의 일반적인 성질을 충분히 드러낼 것이다. 따라서, 이러한 적응 및 수정은 본원에 제시된 교시 및 안내에 기초하여 개시된 측면의 등가물의 의미 및 범위 내에 있도록 의도된다. 본원의 어법 또는 용어는 설명을 위한 것이지 제한을 위한 것이 아니므로, 본 명세서의 용어 또는 어법은 교시 및 안내에 비추어 관련 기술분야의 기술자에 의해 해석되어야 하는 것으로 이해되어야 한다.
본 개시내용의 폭 및 범위는 위에 설명된 예시적인 측면 중 임의의 것에 의해 제한되어서는 안 되며, 다음의 청구범위 및 그 등가물에 따라서만 정의되어야 한다.
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Claims (117)

  1. 화학식 (XXXII)의 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:

    여기서:
    a는 1 내지 10이고;
    A'는 또는 이고, 여기서
    n은 0 또는 1이고;
    각 Y는 독립적으로 S 또는 O이고;
    는 R1에 대한 부착 지점을 나타내며;
    는 메틸렌 기에 대한 부착 지점을 나타내고;
    R1은 A'와 함께 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물이고;
    R2는 수소, R1-A'에 안정성을 제공하는 기, R1-A'에 용해성을 제공하는 기, 및 R1-A'에 안정성 및 용해성을 제공하는 기로부터 선택되며;
    L은 절단 가능한 링커이고;
    Bm은 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 모이어티임.
  2. 화학식 (XX)의 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:

    여기서:
    a는 1 내지 10이고;
    n은 0 또는 1이고;
    R1은 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물이고;
    R2는 수소, -(CH2CH2O)v-CH3, C2-C6알케닐, C1-C6알킬; C2-C6알키닐, 벤질, C3-C6사이클로알킬, 및 C3-C6사이클로알킬(C1-C3알킬)로부터 선택되고, 여기서 v는 1 내지 24이고;
    각각의 Y는 독립적으로 S 또는 O이고;
    L은 절단 가능한 링커이고;
    Bm은 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 모이어티임.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 결합 모이어티가 항체, 항체 단편, 또는 항원 결합 단편인, 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, a가 2 내지 8인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 프로테아제에 의해 절단 가능한, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  6. 제5항에 있어서, L이 다음 식으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:

    여기서:
    q는 2 내지 10이고;
    Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5는 각각 독립적으로 부재하거나 L- 또는 D-배열의 자연 발생 아미노산 잔기이고, 단, Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5 중 적어도 2개는 아미노산 잔기이며;
    는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이고;
    는 결합 모이어티에 대한 부착 지점임.
  7. 제6항에 있어서, Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5가 독립적으로 부재하거나, L-발린, D-발린, L-시트룰린, D-시트룰린, L-알라닌, D-알라닌, L-글루타민, D-글루타민, L-글루탐산, D-글루탐산, L-아스파르트산, D-아스파르트산, L-아스파라긴, D-아스파라긴, L-페닐알라닌, D-페닐알라닌, L-라이신, D-라이신 및 글리신으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 단, Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5 중 적어도 2개는 아미노산 잔기인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  8. 제7항에 있어서,
    Z1은 부재하거나 글리신이고;
    Z2는 부재하거나, L-글루타민, D-글루타민, L-글루탐산, D-글루탐산, L-아스파르트산, D-아스파르트산, L-알라닌, D-알라닌 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Z3은 L-발린, D-발린, L-알라닌, D-알라닌, L-페닐알라닌, D-페닐알라닌 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Z4는 L-시트룰린, D-시트룰린, L-아스파라긴, D-아스파라긴, L-리신, D-리신, L-페닐알라민, D-페닐알라닌 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Z5는 부재하거나 글리신인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, L이 다음 식인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    .
  10. 제9항에 있어서, q가 4인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, L이 생체환원성 링커인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  12. 제11항에 있어서, L이 다음 식으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:

    여기서:
    q는 2 내지 10이고;
    R, R', R'' 및 R'''는 각각 독립적으로 수소, C1-C6알콕시C1-C6알킬, (C1-C6)2NC1-C6알킬 및 C1-C6알킬로부터 선택되거나, 2개의 같은 자리 R 기가 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 사이클로부틸 또는 사이클로프로필 고리를 형성할 수 있으며;
    는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이고;
    는 결합 모이어티에 대한 부착 지점임.
  13. 제12항에 있어서, L이 다음 식인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    .
  14. 제13항에 있어서, q가 2인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, L이 클릭-방출 링커인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  16. 제15항에 있어서, L이 다음 식인 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:

    여기서,
    q는 2 내지 10이고;
    는 상기 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이며;
    는 상기 결합 모이어티에 대한 부착 지점임.
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, L이 베타-글루쿠로니다제 절단성 링커인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  18. 제15항에 있어서, L이 다음 식인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    ;
    여기서:
    q는 2 내지 10이고;
    ----는 부재하거나 결합이며;
    는 상기 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점이고;
    는 상기 결합 모이어티에 대한 부착 지점임.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, L이 Bm 내 시스테인, 라이신, 티로신 또는 글루타민에 부착되는, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  20. 제19항에 있어서, 상기 시스테인 또는 라이신이 조작된 시스테인 또는 라이신인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  21. 제19항에 있어서, 상기 시스테인 또는 라이신은 상기 Bm에 내인성인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, Bm이 항체 또는 이의 항원 결합 부분인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  23. 제22항에 있어서, L이 EU 넘버링에 따른 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 중쇄 위치 S239 및/또는 K334에서 조작된 시스테인에 부착되는, 접합체.
  24. 제22항에 있어서, L이 EU 넘버링에 따른 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 중쇄 위치 295에서 글루타민에 부착되는, 접합체.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Bm이 결합하는 단백질은 표면 항원이고, 선택적으로 상기 표면 항원에 대한 상기 Bm의 결합이 세포 내로 상기 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 내재화를 초래하는, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  26. 제25항에 있어서, 상기 표면 항원이 5T4, ACE, ADRB3, AKAP-4, ALK, AOC3, APP, Axin1, AXL, B7H3, B7-H4, BCL2, BCMA, bcr-abl, BORIS, BST2, C242, C4.4a, CA 125, CA6, CA9, CAIX, CCL11, CCR5, CD123, CD133, CD138, CD142, CD15, CD15-3, CD171, CD179a, CD18, CD19, CD19-9, CD2, CD20, CD22, CD23, CD24, CD25, CD27L, CD28, CD3, CD30, CD31, CD300LF, CD33, CD352, CD37, CD38, CD4, CD40, CD41, CD44, CD44v6, CD5, CD51, CD52, CD54, CD56, CD62E, CD62P, CD62L, CD70, CD71, CD72, CD74, CD79a, CD79b, CD80, CD90, CD97, CD125, CD138, CD141, CD147, CD152, CD154, CD326, CEA, CEACAM5, CFTR, 응집 인자, cKit, Claudin 3, Claudin 18.2, CLDN6, CLEC12A, CLL-1, cll3, c-MET, Crypto 1 성장 인자, CS1, CTLA-4, CXCR2, CXORF61, Cyclin Bl, CYP1B1, Cadherin-3, Cadherin-6, DLL3, E7, EDNRB, EFNA4, EGFR, EGFRvIII, ELF2M, EMR2, ENPP3, EPCAM, EphA2, Ephrin A4, Ephrin B2, EPHB4, ERBB2 (Her2/neu), ErbB3, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), ETBR, ETV6-AML, FAP, FCAR, FCRL5, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FLT3, 엽산 수용체 알파, 엽산 수용체 베타, FOLR1, Fos-관련 항원 1, 푸코실 GM1, GCC, GD2, GD3, GloboH, GM3, GPC1, GPC2, GPC3, gplOO, GPNMB, GPR20, GPRC5D, GUCY2C, HAVCR1, HER2, HER3, HGF, HMI.24, HMWMAA, HPV E6, hTERT, 인간 텔로머라제 역전사효소, ICAM, ICOS-L, IFN-α, IFN-γ, IGF-I 수용체, IGLL1, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-13Ra2, IL-l lRa, IL-1 수용체, IL-12 수용체, IL-23 수용체, IL-13 수용체, IL-22 수용체, IL-4 수용체, IL-5 수용체, IL-6 수용체, 인터페론 수용체, 인테그린(α4, αvβ3, αvβ5, αvβ6, α1β4, α4β1, α4β7, α5β1, α6β4, αIIbβ3 인터진 포함), 인테그린 알파V, 장 카르복실 에스테라제, KIT, LAGE-la, LAIR1, LAMP-1, LCK, 레구메인, 루이스Y, LFA-1(CD11a), L-셀렉틴(CD62L), LILRA2, LIV-1, LMP2, LRRC15, LY6E, LY6K, LY75, MAD-CT-1, MAD-CT-2, MAGE Al, 멜란A/MARTl, 메소텔린, ML-IAP, MSLN, 뮤신, MUC1, MUC16, mut hsp70-2, MYCN, 미오스타틴, NA17, NaPi2b, NCA-90, NCAM, 넥틴-4, NGF, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, NY-BR-1, NY-ESO-1, o-아세틸-GD2, OR51E2, OY-TES1, p53, p53 돌연변이체, PANX3, PAP, PAX3, PAX5, p-CAD, PCTA-1/갈렉틴 8, PD-L1, PD-L2, PDGFR, PDGFR-베타, 포스파티딜세린, PIK3CA, PLAC1, 폴리시알산, 프로스타제, 전립선 암종 세포, 프로스테인, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 광견병, 서바이빈 및 텔로머라제, PD-1, PRSS21, PSCA, PSMA, PTK7, RAGE-1, RANKL, Ras 돌연변이체, 호흡기 세포융합 바이러스, 적모원숭이 인자, RhoC, RON, ROR1, ROR2, RU1, RU2, 육종 전좌 중단점, SART3, SLAMF7, SLC44A4, sLe, SLITRK6, 정자 단백질 17, 스핑고신-1-포스페이트, SSEA-4, SSX2, STEAP1, TAG72, TARP, TCRβ, TEM1/CD248, TEM7R, 테나신 C, TF, TGF-1, TGF-β2, TNF-α, TGS5, Tie 2, TIM-1, Tn Ag, TRAC, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TROP-2, TRP-2, TRPV1, TSHR, 종양 항원 CTAA16.88, 티로시나제, UPK2, VEGF, VEGFR1, VEGFR2, 비멘틴, WTl, XAGE1, 또는 이들의 조합을 포함하고, 선택적으로 여기서 CD33에 결합하는 상기 Bm은 서열번호 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 22 및 23, 24 및 25, 또는 27 및 28의 아미노산 서열을 포함하거나, 여기서 PSMA에 결합하는 상기 Bm은 서열번호 7 및 8, 9 및 10, 11 및 12, 또는 29 및 30의 아미노산 서열을 포함하거나, 여기서 HER2에 결합하는 상기 Bm은 서열번호 13 및 14, 15 및 16, 또는 17 및 18의 아미노산 서열을 포함하거나, 여기서 CD20에 결합하는 상기 Bm은 서열번호 31 및 32의 아미노산 서열을 포함하거나, 여기서 CD79b에 결합하는 상기 Bm은 서열번호 33 및 34의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 여기서 BCMA에 결합하는 상기 Bm은 서열번호 35 및 36의 아미노산 서열을 포함하는, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  27. 제25항에 있어서, 상기 표면 항원은 HER2, CD20, CD38, CD33, BCMA, CD138, EGFR, FGFR4, GD2, PDGFR, 또는 이의 조합을 포함하는, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  28. 제22항에 있어서, 상기 항체가 리툭시맙, 트라스투주맙, 젬투주맙, 퍼투주맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 다라투무맙, STI-6129, 린투주맙, huMy9-6, 벨란타맙, 인다툭시맙, 세툭시맙, 디누툭시맙, 항-CD38 A2 항체, huAT15/3 항체, 알렘투주맙, 이브리투모맙, 토시투모맙, 베바시주맙, 파니투무맙, 트레멜리무맙, 티실리무맙, 카투막소맙, 오레고보맙, 벨투주맙, 폴라투주맙, J591, 로보투주맙 및 사시투주맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  29. 제28항에 있어서, 상기 항체가 리툭시맙, 트라스투주맙, 퍼투주맙, huMy9-6, 린투주맙, 젬투주맙, 또는 CD33-D인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  30. 제1항 또는 제3항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 상기 접합체에 안정성을 제공하는 기인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  31. 제1항 또는 제3항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 C2-C6알케닐, C1-C6알킬; C2-C6알키닐, 벤질, C3-C6사이클로알킬, 및 C3-C6사이클로알킬(C1-C3알킬)로부터 선택되는, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  32. 제1항 또는 제3항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 C1-C6알킬인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  33. 제1항 또는 제3항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 메틸인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  34. 제1항 또는 제3항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 상기 접합체에 용해성을 제공하는 기인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  35. 제1항, 제3항 내지 제29항, 또는 제34항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 다음 식으로부터 선택되고:


    여기서:
    각 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
    각 y는 독립적으로 1 또는 2이고;
    각 R은 독립적으로 수소, C6H11O5, C12H21O10, C18H31O15, 또는 C24H41O20인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 각 Y가 O인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  37. 제1항 또는 제3항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, R1-A'가 PPI 조절제인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  38. 제1항 또는 제3항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, R1-A'가 표적화된 단백질 분해제인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  39. 제1항 또는 제3항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, R1-A'가 분자 아교인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  40. 제1항, 또는 제3항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, R1-A'가 치환된 아이소인돌린인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  41. 제1항, 또는 제3항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, R1-A'가 5'-치환된 아이소인돌린인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 화학식 (XXX)의 화합물인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:

    여기서:
    는 상기 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점을 나타내고;
    A는 페닐 또는 C4-C10사이클로알킬 고리이고;
    R10은 수소 및 할로로부터 독립적으로 선택되고;
    U는 NH 및 CF2로부터 선택되고;
    R20은 -CH3, -C(O)R3, -N(R4)2, -(CH2)nOH, -(CH2)nN(R4)2, -(CH2)nQ'(CH2)mOH, -(CH2)nQ'(CH2)mSH 및 -(CH2)nQ'(CH2)mN(R4)2로부터 선택되고; 여기서
    R3은 수소 또는 C1-C6알킬이고;
    각 R4는 독립적으로 수소 또는 C1-C6알킬이고;
    Q'는 O, S 또는 NR4이고;
    n은 1-6이고;
    m은 2-5임.
  43. 제42항에 있어서,
    A는 페닐이고;
    U는 NH이고;
    R10은 할로이고;
    R20은 메틸인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  44. 제42항에 있어서,
    A는 페닐이고;
    U는 NH이고;
    R10은 할로이고;
    R20은 -(CH2)2O(CH2)2NHCH3인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  45. 제1항, 또는 제3항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, R1-A'가 단백질분해 표적화 키메라(PROTAC)인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  46. 제1항 내지 제38항 또는 제45항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 다음 식을 갖는, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    POI-L100-CBN;
    여기서:
    POI는 관심 단백질에 결합하는 화합물이고;
    L100은 PROTAC 링커이며;
    CBN은 세레블론 결합 모이어티임.
  47. 제46항에 있어서, 상기 관심 단백질이 핵 호르몬 수용체, 해독 종결 인자, 전사 인자, 사이클린-의존성 키나제, 티로신 키나제, 세린/트레오닌 키나제 또는 E3 리가제인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 관심 단백질이 CD33, GSPT1, BRD4, AR, ER, IKZF1/3, CK1a, BCL-XL, IKZF2, IRAK4, BTK, STAT3, BTK 및 iMiD, BRD9, TRK, MDM2, CDK2/CDK9, CD97b 및 EGFR로부터 선택되는, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, L100이 글리콜, 알킬, 알키닐, 트리아졸릴, 피페라지닐, 피페리디닐 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 작용기를 포함하는, 접합체.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, CBN이 다음 식으로부터 선택되는, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:

    여기서,
    는 A'에 대한 부착 지점을 나타내고;
    는 L100에 대한 부착 지점을 나타냄.
  51. 제1항 내지 제36항, 제38항, 또는 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 다음 식으로부터 선택되는, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:





    ;
    여기서, 는 A'에 대한 부착 지점을 나타냄.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 CD33이고 R1은 마우스 이중 극미 2 동족체(MDM2)에 결합하거나, (b) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 전립선 특이적 막 항원(PSMA)이고 R1은 안드로겐 수용체(AR)에 결합하거나, (c) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 CD33이고 R1은 브로모도메인 함유 단백질 4(BRD4)에 결합하거나, (d) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 HER2이고, R1은 G1에서 S 단계 전이 1(GSPT1)에 결합하거나, (e) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 CD33이고 R1은 GSPT1에 결합하거나, (f) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 CD79b이고 R1은 IRAK4에 결합하거나, (g) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 HER2이고 R1은 BRD4에 결합하거나, (h) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 BCMA이고 R1은 BRD4에 결합하거나, 또는 (i) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 HER2이고 R1은 ER에 결합하는, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 기재된 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  54. 치료를 필요로 하는 대상체의 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 약제학적으로 허용되는 양의 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 접합체 또는 조성물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 암이 유방암, 위암, 림프종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 두경부암, 편평세포암종, 간세포암종, 전립선암, 비소세포폐암, 결장암, 난소암, 뉴레굴린-1(NRG1) 양성 암, 폐암 또는 비호지킨 림프종인, 방법.
  56. 제54항에 있어서, (a) Bm이 결합하는 단백질은 CD33이고, R1은 MDM2에 결합하며, 상기 암은 급성 골수성 백혈병이거나, (b) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 전립선 특이적 막 항원(PSMA)이고, R1은 안드로겐 수용체(AR)에 결합하고, 상기 암은 전립선암이거나, (c) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 CD33이고, R1은 브로모도메인 함유 단백질 4(BRD4)에 결합하고 상기 암은 급성 골수성 백혈병이고, (d) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 HER2이고, R1은 G1에서 S단계 전이 1(GSPT1)에 결합하며, 상기 암은 유방암, 위암, 비소세포폐암, 담관암, 결장암, 난소암 또는 뉴레굴린-1(NRG1) 양성 암이거나, (e) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 CD79b이고, R1은 IRAK4에 결합하며, 상기 암은 비호지킨 림프종이거나, (f) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 HER2이고, R1은 BRD4에 결합하며 상기 암은 유방암, 위암, 비소세포폐암, 담관암, 결장암, 난소암 또는 뉴레굴린-1(NRG1) 양성 암이거나, 또는 (g) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 BCMA이고, R1은 BRD4에 결합하며, 상기 암은 다발성 골수종인, 방법.
  57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 접합체 또는 조성물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 투여 전, 후, 또는 동시에 약제학적으로 허용되는 양의 추가 작용제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 추가 작용제가 세포독성제 또는 면역 반응 조절제인, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 면역 반응 조절제가 관문 저해제인, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 관문 저해제가 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, CTLA-4 저해제, TIM3 저해제 및/또는 LAG-3 저해제를 포함하는, 방법.
  61. 화학식 (XXII)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    ,
    여기서:
    n은 0 또는 1이고;
    R1은 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물이고;
    R2는 수소, -(CH2CH2O)v-CH3, C2-C6알케닐, C1-C6알킬; C2-C6알키닐, 벤질, C3-C6사이클로알킬, 및 C3-C6사이클로알킬(C1-C3알킬)로부터 선택되고, 여기서 v는 1 내지 24이고;
    각각의 Y는 독립적으로 S 또는 O이고;
    L*은 상기 결합 모이어티에 접합하는 절단 가능한 링커 전구체임.
  62. 화학식 (XXXI)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:

    여기서:
    A'는 또는 이고, 여기서,
    n은 0 또는 1이고;
    각각의 Y는 독립적으로 S 또는 O이고;
    은 R1에 대한 부착 지점을 나타내며;
    는 상기 메틸렌 기에 대한 부착 지점을 나타내고;
    R1은 A'와 함께 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물이고;
    R2는 수소, R1-A'에 안정성을 제공하는 기, R1-A'에 용해성을 제공하는 기, 및 R1-A'에 안정성 및 용해성을 제공하는 기로부터 선택되며;
    L은 상기 결합 모이어티에 접합하는 절단 가능한 링커 전구체임.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, L*가 프로테아제 절단 가능한 링커 전구체인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  64. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, L*가 다음 식으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:

    여기서:
    q는 2 내지 10이고;
    Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5는 각각 독립적으로 부재하거나 L- 또는 D-배열의 자연 발생 아미노산 잔기이고, 단, Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5 중 적어도 2개는 아미노산 잔기이며;
    는 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점임.
  65. 제64항에 있어서, Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5가 독립적으로 부재하거나, L-발린, D-발린, L-시트룰린, D-시트룰린, L-알라닌, D-알라닌, L-글루타민, D-글루타민, L-글루탐산, D-글루탐산, L-아스파르트산, D-아스파르트산, L-아스파라긴, D-아스파라긴, L-페닐알라닌, D-페닐알라닌, L-라이신, D-라이신 및 글리신으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 단, Z1, Z2, Z3, Z4, 및 Z5 중 적어도 2개는 아미노산 잔기인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  66. 제65항에 있어서,
    Z1은 부재하거나 글리신이고;
    Z2는 부재하거나, L-글루타민, D-글루타민, L-글루탐산, D-글루탐산, L-아스파르트산, D-아스파르트산, L-알라닌, D-알라닌 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Z3은 L-발린, D-발린, L-알라닌, D-알라닌, L-페닐알라닌, D-페닐알라닌 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Z4는 L-시트룰린, D-시트룰린, L-아스파라긴, D-아스파라긴, L-리신, D-리신, L-페닐알라민, D-페닐알라닌 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Z5는 부재하거나 글리신인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  67. 제61항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, L*이 다음 식인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:

    여기서, 는 상기 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점임.
  68. 제67항에 있어서, q가 4인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  69. 제61항 또는 제62항에 있어서, L*이 생체환원성 링커 전구체인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  70. 제61항, 제62항 또는 제69항 중 어느 한 항에 있어서, L*이 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:

    여기서,
    q는 2 내지 10이고;
    R, R', R'' 및 R'''는 각각 독립적으로 수소, C1-C6알콕시C1-C6알킬, (C1-C6)2NC1-C6알킬 및 C1-C6알킬로부터 선택되거나, 2개의 같은 자리 R 기는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 사이클로부틸 또는 사이클로프로필 고리를 형성할 수 있으며;
    는 상기 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점임.
  71. 제70항에 있어서, L*이 다음 식인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    .
  72. 제71항에 있어서, q가 2인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  73. 제61항 또는 제62항에 있어서, L*이 클릭-방출 링커 전구체인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  74. 제73항에 있어서, L*이 다음 식인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:

    여기서:
    q는 2 내지 10이고;
    는 상기 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점임.
  75. 제61항 또는 제62항에 있어서, L*이 베타-글루쿠로니다제 절단 가능한 링커 전구체인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  76. 제75항에 있어서, L*이 하기 식인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:

    여기서:
    q는 2 내지 10이고;
    ----는 부재하거나 결합이며;
    는 상기 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점임.
  77. 제62항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 R1-A'에 안정성을 제공하는 기인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  78. 제62항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 C2-C6알케닐, C1-C6알킬; C2-C6알키닐, 벤질, C3-C6사이클로알킬, 및 C3-C6사이클로알킬(C1-C3알킬)로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  79. 제62항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 C1-C6알킬인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  80. 제62항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 메틸인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  81. 제62항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 R1-A'에 용해성을 제공하는 기인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  82. 제62항 내지 제76항 또는 제81항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 다음 식으로부터 선택되는, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:


    여기서:
    각 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
    각 y는 독립적으로 1 또는 2이고;
    각 R은 독립적으로 수소, C6H11O5, C12H21O10, C18H31O15, 또는 C24H41O20임.
  83. 제61항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 각 Y가 O인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  84. 제62항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, R1-A'가 PPI 조절제인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  85. 제62항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, R1-A'가 표적화된 단백질 분해제인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  86. 제62항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, R1-A'가 분자 아교인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  87. 제62항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, R1-A'가 치환된 아이소인돌린인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  88. 제62항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, R1-A'가 5'-치환된 아이소인돌린인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  89. 제61항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 다음 식을 갖는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:

    여기서:
    는 상기 모 분자 모이어티에 대한 부착 지점을 나타내고;
    A는 페닐 또는 C4-C10사이클로알킬 고리이고;
    R10은 수소 및 할로로부터 독립적으로 선택되고;
    U는 NH 및 CF2로부터 선택되고;
    R20은 -CH3, -C(O)R3, -N(R4)2, -(CH2)nOH, -(CH2)nN(R4)2, -(CH2)nQ'(CH2)mOH, -(CH2)nQ'(CH2)mSH 및 -(CH2)nQ'(CH2)mN(R4)2로부터 선택되고; 여기서
    R3은 수소 또는 C1-C6알킬이고;
    각 R4는 독립적으로 수소 또는 C1-C6알킬이고;
    Q'는 O, S 또는 NR4이고;
    n은 1-6이고;
    m은 2-5임.
  90. 제89항에 있어서,
    A는 페닐이고;
    U는 NH이고;
    R10은 할로이고;
    R20은 메틸인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  91. 제89항에 있어서,
    A는 페닐이고;
    U는 NH이고;
    R10은 할로이고;
    R20은 -(CH2)2O(CH2)2NHCH3인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  92. 제62항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, R1-A'가 단백질분해 표적화 키메라(PROTAC)인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  93. 제61항 내지 제85항 또는 제92항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 다음 식을 갖는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    POI-L100-CBN;
    여기서:
    POI는 관심 단백질에 결합하는 화합물이고;
    L100은 PROTAC 링커이며;
    CBN은 세레블론 결합 모이어티임.
  94. 제93항에 있어서, 상기 관심 단백질이 핵 호르몬 수용체, 해독 종결 인자, 전사 인자, 사이클린-의존성 키나제, 티로신 키나제, 세린/트레오닌 키나제 또는 E3 리가제인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  95. 제93항 또는 제94항에 있어서, 상기 관심 단백질이 CD33, GSPT1, BRD4, AR, ER, IKZF1/3, CK1a, BCL-XL, IKZF2, IRAK4, BTK, STAT3, BTK 및 iMiD, BRD9, TRK, MDM2, CDK2/CDK9, CD97b 및 EGFR로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  96. 제93항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, L100이 글리콜, 알킬, 알키닐, 트리아졸릴, 피페라지닐, 피페리디닐 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 작용기를 포함하는, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  97. 제93항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, CBN이 다음 식으로부터 선택되는, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:

    여기서:
    은 A'에 대한 부착 지점을 나타내고;
    은 L100에 대한 부착 지점을 나타냄.
  98. 제62항 내지 제85항 또는 제92항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 다음 식으로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:





    ;
    여기서, 은 A'에 대한 부착 지점을 나타냄.
  99. 화학식 (XXXII)의 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제조하는 방법으로서,

    여기서:
    a는 1 내지 10이고;
    A'는 또는 이고, 여기서
    n은 0 또는 1이고;
    각 Y는 독립적으로 S 또는 O이고;
    는 R1에 대한 부착 지점을 나타내며;
    는 메틸렌 기에 대한 부착 지점을 나타내고;
    R1은 A'와 함께 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물이고;
    R2는 수소, R1-A'에 안정성을 제공하는 기, R1-A'에 용해성을 제공하는 기, 및 R1-A'에 안정성 및 용해성을 제공하는 기로부터 선택되며;
    L은 절단 가능한 링커이고;
    Bm은 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 모이어티이며;
    상기 방법은:
    화학식 (XXXI)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 모이어티와 반응시키는 단계를 포함하는 방법:

    여기서:
    A', R1 및 R2는 위에서 정의한 바와 같고,
    L*은 절단 가능한 링커 전구체임.
  100. 제99항에 있어서, 상기 Bm 내 시스테인, 라이신, 티로신 또는 글루타민에 L*을 부착시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  101. 제100항에 있어서, 상기 시스테인 또는 라이신은 조작된 시스테인 또는 라이신인, 방법.
  102. 제100항에 있어서, 상기 시스테인 또는 라이신은 상기 Bm에 내인성인, 방법.
  103. 제99항에 있어서, 상기 결합 모이어티가 항체 또는 이의 항원 결합 부분인, 방법.
  104. 제103항에 있어서, L*은 EU 넘버링에 따른 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 중쇄 위치 S239 및/또는 K334에서 조작된 시스테인에 부착되는, 방법.
  105. 제103항에 있어서, L*는 EU 넘버링에 따른 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 중쇄 위치 295에서 글루타민에 부착되는, 방법.
  106. 제100항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부착시키는 단계가 부위-특이적 접합을 통해 이루어지는, 방법.
  107. 제100항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 CD33이고 R1은 마우스 이중 극미 2 동족체(MDM2)에 결합하거나, (b) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 전립선 특이적 막 항원(PSMA)이고 R1은 안드로겐 수용체(AR)에 결합하거나, (c) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 CD33이고 R1은 브로모도메인 함유 단백질 4(BRD4)에 결합하거나, (d) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 HER2이고, R1은 G1에서 S 단계 전이 1(GSPT1)에 결합하거나, (e) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 CD33이고 R1은 GSPT1에 결합하거나, (f) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 CD79b이고 R1은 IRAK4에 결합하거나, (g) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 HER2이고 R1은 BRD4에 결합하거나, (h) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 BCMA이고 R1은 BRD4에 결합하거나, 또는 (i) 상기 Bm이 결합하는 단백질은 HER2이고 R1은 ER에 결합하는, 방법.
  108. 제99항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, R1-A'는 표적화된 단백질 분해제인, 방법.
  109. 제108항에 있어서, R1은 다음 식을 갖는, 방법:
    POI-L100-CBN;
    여기서:
    POI는 관심 단백질에 결합하는 화합물이고;
    L100은 PROTAC 링커이며;
    CBN은 세레블론 결합 모이어티임.
  110. 제109항에 있어서, 상기 관심 단백질은 핵 호르몬 수용체, 해독 종결 인자, 전사 인자, 사이클린-의존성 키나제, 티로신 키나제, 세린/트레오닌 키나제 또는 E3 리가제인, 방법.
  111. 제109항 또는 제110항에 있어서, 상기 관심 단백질은 CD33, GSPT1, BRD4, AR, ER, IKZF1/3, CK1a, BCL-XL, IKZF2, IRAK4, BTK, STAT3, BTK 및 iMiD, BRD9, TRK, MDM2, CDK2/CDK9, CD97b 및 EGFR로부터 선택되는, 방법.
  112. 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, L100은 글리콜, 알킬, 알키닐, 트리아졸릴, 피페라지닐, 피페리디닐 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 작용기를 포함하는, 접합체.
  113. 제109항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, CBN은 다음 식으로부터 선택되는, 방법:

    여기서:
    는 A'에 대한 부착 지점을 나타내고;
    는 L100에 대한 부착 지점을 나타냄.
  114. 제109항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 다음 식으로부터 선택되는, 방법:





    및
    ;
    여기서, 는 A'에 대한 부착 지점을 나타냄.
  115. 제99항 내지 제114항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 접합체.
  116. 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 접합체를 세포로 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 세포를 제1항 내지 제53항 또는 제115항 중 어느 한 항의 접합체 또는 조성물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  117. 화학식 (XXXII)의 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 세포로 전달하는 방법으로서,

    여기서:
    a는 1 내지 10이고;
    A'는 또는 이고, 여기서
    n은 0 또는 1이고;
    각 Y는 독립적으로 S 또는 O이고;
    는 R1에 대한 부착 지점을 나타내며;
    는 메틸렌 기에 대한 부착 지점을 나타내고;
    R1은 A'와 함께 단백질-단백질 상호작용을 유도하는 화합물이고;
    R2는 수소, R1-A'에 안정성을 제공하는 기, R1-A'에 용해성을 제공하는 기, 및 R1-A'에 안정성 및 용해성을 제공하는 기로부터 선택되며;
    L은 절단 가능한 링커이고;
    Bm은 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 모이어티이고;
    상기 방법은 상기 세포를 화학식 (XXXII)의 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
KR1020247011575A 2021-09-08 2022-09-07 항체 약물 접합체에 사용하기 위한 링커 KR20240067085A (ko)

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