TW202345808A - 效應ｔ細胞之活化劑 - Google Patents

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Abstract

本揭示案提供抗體藥物接合物及將該等接合物遞送至效應T細胞之方法。亦揭示新穎Cbl-b抑制劑。該等化合物及接合物可用於治療有需要之個體之疾病。

Description

效應Ｔ細胞之活化劑
本揭示案提供抗體藥物接合物及將該等接合物遞送至效應T細胞之方法。亦揭示新穎Cbl-b抑制劑。該等化合物及接合物可用於治療有需要之個體之疾病。
效應T細胞為引導免疫系統執行免疫功能之主要參與者。此等細胞循環直至其遭遇其特異性抗原。因此，該等細胞對免疫性起關鍵作用。免疫系統為對抗許多疾病及病症(包括例如癌症)之強有力武器，且已顯示活化效應T細胞之化合物，諸如E3泛素連接酶卡西塔斯B譜系淋巴瘤b(Casitas B-lineage lymphoma-b，Cbl-b)之抑制劑，增加源自T細胞之細胞介素分泌及增殖且可具有抗癌活性。然而，需要改良之Cbl-b抑制劑。
此外，活化效應T細胞之化合物有可能引起細胞介素釋放症候群或其他脫靶免疫反應。已提議藉由將免疫活化藥物接合至特異性識別腫瘤抗原之抗體以使免疫活化藥物特異性靶向癌細胞可能避免此類脫靶免疫反應。(參見例如Ackerman, S.E., Pearson, C.I., Gregorio, J.D.等Immune-stimulating antibody conjugates elicit robust myeloid activation and durable antitumor immunity. Nat Cancer 2, 18-33 (2021). doi.org/10.1038/s43018-020-00136-x。)然而，此類提議並不表明直接靶向免疫系統本身。因此，儘管此項工作正在進行中，但仍需要活化T細胞，尤其效應T細胞，例如用於治療癌症，同時使脫靶免疫反應降至最低。
在某些態樣中，本揭示案提供式(I)化合物： (I)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： n為0、1或2； X及Y各自獨立地為CH或N； Z係選自CH(CH 3)、O及SO 2；或 Z係選自CH(CH 3)、NH、N(CH 3)、O及SO 2； R 1係選自氫、-CN、-NHR z、-R a、-NR aR b、-OR a、-NHC(O)R a、-NHC(S)R a、-NHC(O)NHR a、-NHC(S)NHR a、-SR a、C 3-C 6環烷基及3至6員雜環基環；其中 R z係選自 ； R a及R b係獨立地選自氫、C 2-C 6烯基、C 1-C 6烷基、醯胺基(C 1-C 6烷基)、胺基(C 1-C 6烷基)、疊氮基(C 1-C 6烷基)、C 2-C 6炔基、羧基(C 1-C 6烷基)、氰基(C 1-C 6烷基)、視情況經氰基取代之C 3-C 6環烷基、二甲基胺基(C 1-C 6烷基)、3至6員雜環基環、3-6員雜環基(C 1-C 3烷基)、羥基(C 1-C 6烷基)、甲氧基(C 1-C 6烷基)、甲基胺基(C 1-C 6烷基)、NR cR d(C 1-C 6烷基)、HS(C 1-C 6烷基)及CH 3S(C 1-C 6烷基)，其中R c及R d係獨立地選自氫、C 2烯基羰基及甲基；或， R a及R b與其所連接之氮原子一起形成視情況含有一個額外氮原子之五或六員環，其中該環視情況經一個選自R a、-C(O)R a、-SO 2R a、疊氮基及氰基之基團取代； 其中各C 3-C 6環烷基、各3至6員雜環基環及該3至6員雜環基(C 1-C 3烷基)環之該雜環基部分視情況經一個、兩個或三個獨立地選自C 1-C 3烷基、C 2炔基、醯胺基、疊氮基、羧基、氰基、二甲基胺基、羥基、甲氧基、甲基胺基、HS-及CH 3S-之基團取代；且 R 2係選自 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ；其中 m為0、1、2或3； m''為0、1、2、3或4； B'為視情況含有一或兩個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的3-7員飽和或不飽和環；其中該環視情況經一或兩個獨立地選自-OH、-CH 2SH、CH 2SCH 3、-CH 2OH、-CH 2NH 2及-CH 2NHCH 3之取代基取代； 各R 500係獨立地選自氫、C 1-C 6烷基、鹵基、-OH及-CH 2OH；且 X 50係選自O、NH、NCH 3及S； R 3係選自氫、乙醯基、胺基、C 1-C 6烷基胺基、C 1-C 6烷基胺基甲基、C 1-C 6烷基羰基、胺基C 1-C 6烷基、胺基羰基、胺基甲基、羧基、氰基、C 3環烷基、甲醯基、羥基、羥基C 1-C 6烷基、甲氧基、噁唑基、-SH、-SCH 3、-SOCH 3、-SO 2CH 3、-SO(=NH)CH 3、四唑基、噻唑基及三氟甲基，其中該C 3環烷基視情況經羥基取代； R 4係選自氫、甲基、-CH 2OH、-CH 2SH及-CH 2SCH 3； R 5係選自氫、羥基、-CH 2SH、-CH 2SCH 3及甲基； 視情況前提條件為，當R 5為羥基或甲基，且R 4為氫時，則R 1不為C 3-C 6環烷基、3至6員雜環基環、羥基、羥基(C 1-C 6烷基)、-OR a，其中R a為C 1-C 6烷基、3至6員雜環基環或羥基(C 1-C 6烷基)；或-NR aR b，其中R a及R b係獨立地選自由氫、C 1-C 6烷基、C 3-C 6環烷基、羥基(C 1-C 6烷基)、3至6員雜環基環組成之群，或其中R a及R b與其所連接之氮原子一起形成視情況含有一個額外氮原子之五或六員環，其中該環視情況經一個選自C 1-C 6烷基或羥基(C 1-C 6烷基)之基團取代；且 R 6及R 6'係獨立地選自氫、環丙基、-CH 2OH、-CH 2SH、-CH 2SCH 3及-CH 2R 200，其中R 200為視情況含有一或兩個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的3-7員飽和或不飽和環。
在一些態樣中，R 4呈「R」構型。在一些態樣中，R 4呈「S」構型。
在某些態樣中，本揭示案提供式(IA-1)化合物： (IA-1)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： n為0、1或2； X及Y各自獨立地為CH或N； Z係選自CH(CH 3)、O及SO 2； R 1係選自氫、-CN、-NHR z、-R a、-NR aR b、-OR a、-NHC(O)R a、-NHC(S)R a、-NHC(O)NHR a、-NHC(S)NHR a、-SR a、C 3-C 6環烷基及3至6員雜環基環；其中 R z係選自 ； R a及R b係獨立地選自氫、C 2-C 6烯基、C 1-C 6烷基、醯胺基(C 1-C 6烷基)、胺基(C 1-C 6烷基)、疊氮基(C 1-C 6烷基)、C 2-C 6炔基、羧基(C 1-C 6烷基)、氰基(C 1-C 6烷基)、C 3-C 6環烷基、二甲基胺基(C 1-C 6烷基)、3至6員雜環基環、3-6員雜環基(C 1-C 3烷基)、羥基(C 1-C 6烷基)、甲氧基(C 1-C 6烷基)、甲基胺基(C 1-C 6烷基)、NR cR d(C 1-C 6烷基)、HS(C 1-C 6烷基)及CH 3S(C 1-C 6烷基)，其中R c及R d係獨立地選自氫、C 2烯基羰基及甲基；或， R a及R b與其所連接之氮原子一起形成視情況含有一個額外氮原子之五或六員環，其中該環視情況經一個選自R a、-C(O)R a、-SO 2R a、疊氮基及氰基之基團取代； 其中各C 3-C 6環烷基、各3至6員雜環基環及該3至6員雜環基(C 1-C 3烷基)環之該雜環基部分視情況經一個、兩個或三個獨立地選自C 1-C 3烷基、C 2炔基、醯胺基、疊氮基、羧基、氰基、二甲基胺基、羥基、甲氧基、甲基胺基、HS-及CH 3S-之基團取代；且 R 2為 或 ；其中 m為0、1、2或3； R 3係選自氫、乙醯基、胺基、C 1-C 6烷基胺基、C 1-C 6烷基胺基甲基、胺基C 1-C 6烷基、胺基羰基、胺基甲基、羧基、氰基、C 3環烷基、甲醯基、羥基、羥基C 1-C 6烷基、甲氧基、噁唑基、-SH、-SCH 3、四唑基、噻唑基及三氟甲基，其中該C 3環烷基視情況經羥基取代； R 4及R 6係獨立地選自氫、-CH 2SH及-CH 2SCH 3；且 R 5係選自羥基、-CH 2SH、-CH 2SCH 3及甲基； 視情況前提條件為，當R 5為羥基或甲基，且R 4為氫時，則R 1不為C 3-C 6環烷基、3至6員雜環基環、羥基、羥基(C 1-C 6烷基)、-OR a，其中R a為C 1-C 6烷基、3至6員雜環基環或羥基(C 1-C 6烷基)；或-NR aR b，其中R a及R b係獨立地選自由氫、C 1-C 6烷基、C 3-C 6環烷基、羥基(C 1-C 6烷基)、3至6員雜環基環組成之群，或其中R a及R b與其所連接之氮原子一起形成視情況含有一個額外氮原子之五或六員環，其中該環視情況經一個選自C 1-C 6烷基或羥基(C 1-C 6烷基)之基團取代。
在一些態樣中，R 4呈「R」構型。在一些態樣中，R 4呈「S」構型。
在某些態樣中，本揭示案提供式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中： X為N； Y為CH；且 R 2為 。
在一些態樣中，R 4呈「R」構型。在一些態樣中，R 4呈「S」構型。
在某些態樣中，Z為O。在一些態樣中，Z為CH(CH 3)。
在一些態樣中，本揭示案提供式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中 R 3為三氟甲基； R 4及R 6為氫；且 R 5為甲基。
在某些態樣中，R 1係選自-NR aR b、-NHC(O)R a、-NHC(S)NHR a及-SR a。在一些態樣中，其中R 1為-SCH 2CH 3。在一些態樣中，R 1為-NH(CH 2) 2CN。在一些態樣中，R 1為-NH(CH 2) 2N 3。
在一些態樣中，本揭示案提供式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，該化合物係選自： 、 及 。
在一些態樣中，式(I)化合物為卡西塔斯B譜系淋巴瘤原癌基因b (Cbl-b)之抑制劑。
在某些態樣中，化合物與人類Cbl-b之His152相互作用；使IL-2自T細胞之分泌相對於背景增加約0.8至約1.4倍；使IFN-y分泌相對於背景增加約1.1至約2倍；及/或使CD69水準相對於背景增加約0.81至約1.1倍。
在某些態樣中，本揭示案提供一種接合物或其醫藥學上可接受之鹽，該接合物或其醫藥學上可接受之鹽包含能夠特異性結合至效應T細胞之表面上之標靶的結合部分及能夠活化效應T細胞之有效負荷，其中該結合部分直接連接至該有效負荷或經連接子連接至該有效負荷。在一些態樣中，結合部分經連接子連接至有效負荷。在某些態樣中，結合部分能夠特異性結合效應T細胞表面上之蛋白質或醣蛋白。在一些態樣中，結合部分能夠特異性結合至程式性細胞死亡蛋白1 (PD1)。
在某些態樣中，本揭示案提供一種接合物或其醫藥學上可接受之鹽，該接合物或其醫藥學上可接受之鹽包含能夠特異性結合至PD1之結合部分及能夠活化效應T細胞之有效負荷，其中該結合部分直接連接至該有效負荷或經連接子連接至該有效負荷。
在一些態樣中，本揭示案提供一種接合物或其醫藥學上可接受之鹽，該接合物或其醫藥學上可接受之鹽包含能夠特異性結合至PD1之結合部分及作為卡西塔斯B譜系淋巴瘤原癌基因b (Cbl-b)之抑制劑的有效負荷。
在一些態樣中，本文所述之接合物具有式(I)： Bm-[L-P] a(I)， 其中： a為1至50之整數； P為有效負荷； L為連接子；且 Bm為結合部分。
在一些態樣中，有效負荷為卡西塔斯B譜系淋巴瘤原癌基因b (Cbl-b)之抑制劑。在一些態樣中，Cbl-b抑制劑為式(I)化合物，該化合物經共價鍵連接至結合部分或連接子。在一些態樣中，Cbl-b抑制劑為 、 或 。
在一些態樣中，Cbl-b抑制劑為化合物146、化合物147、化合物148或NX-1607。
在一些態樣中，有效負荷為toll樣受體7 (TLR-7)及/或toll樣受體8 (TLR-8)之促效劑。在一些態樣中，有效負荷為TLR-7/TLR-8促效劑T785。在一些態樣中，有效負荷為TLR-7/TLR-8促效劑MEDI9197。
在一些態樣中，有效負荷為造血祖細胞激酶1 (HPK-1)之抑制劑。
在一些態樣中，有效負荷為STING、磷脂肌醇-3-激酶γ (PI3Kγ)、CXCR4、CCR5或促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)路徑蛋白之抑制劑，視情況其中該MAPK路徑蛋白為MEK或B-raf。
在一些態樣中，有效負荷為干擾素基因刺激因子(STING)之促效劑。
在一些態樣中，有效負荷為小分子。在一些態樣中，有效負荷為肽。
在某些態樣中，本揭示案提供如上文所述之接合物，其中L為不可裂解連接子。在一些態樣中，L係選自由以下組成之群： 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ； 其中： p為1至10之整數； p*為1至10之整數； Y係選自氫及C 1-C 6烷基； 為與有效負荷之連接點；且 為與結合部分之連接點。
在一些態樣中，L係選自 、 及 ； 其中： p為1至10之整數； p*為1至10之整數； 為與有效負荷之連接點；且 為與結合部分之連接點。
在一些態樣中，L為可裂解連接子。在一些態樣中，可裂解連接子由蛋白酶可裂解。在某些態樣中，L係選自 ； ； ； ； ； ； ； ； ；及 ； 其中： q為2至10之整數； Z 1、Z 2、Z 3及Z 4各自獨立地不存在或為L構型或D構型中天然存在之胺基酸殘基，前提條件為Z 1、Z 2、Z 3及Z 4中之至少兩者為胺基酸殘基； 為與有效負荷之連接點；且 為與結合部分之連接點。
在一些態樣中，Z 1、Z 2、Z 3及Z 4獨立地不存在或係選自由L-纈胺酸、D-纈胺酸、L-瓜胺酸、D-瓜胺酸、L-丙胺酸、D-丙胺酸、L-麩醯胺、D-麩醯胺、L-麩胺酸、D-麩胺酸、L-天冬胺酸、D-天冬胺酸、L-天冬醯胺、D-天冬醯胺、L-苯丙胺酸、D-苯丙胺酸、L-離胺酸、D-離胺酸及甘胺酸組成之群；前提條件為Z 1、Z 2、Z 3及Z 4中之至少兩者為胺基酸殘基。
在一些態樣中： Z 1不存在或為甘胺酸； Z 2不存在或係選自由L-麩醯胺、D-麩醯胺、L-麩胺酸、D-麩胺酸、L-天冬胺酸、D-天冬胺酸、L-丙胺酸、D-丙胺酸及甘胺酸組成之群； Z 3係選自由L-纈胺酸、D-纈胺酸、L-丙胺酸、D-丙胺酸、L-苯丙胺酸、D-苯丙胺酸及甘胺酸組成之群；且 Z 4係選自由L-丙胺酸、D-丙胺酸、L-瓜胺酸、D-瓜胺酸、L-天冬醯胺、D-天冬醯胺、L-離胺酸、D-離胺酸、L-苯丙胺酸、D-苯丙胺酸及甘胺酸組成之群。
在某些態樣中，L係選自 、 、 、 及 ， 其中： q為2至10之整數； 為與有效負荷之連接點；且 為與結合部分之連接點。
在某些態樣中，L為生物可還原連接子。在一些態樣中，L係選自 其中： q為2至10之整數； R、R'、R''及R'''係各自獨立地選自氫、C 1-C 6烷氧基C 1-C 6烷基、(C 1-C 6) 2NC 1-C 6烷基及C 1-C 6烷基，或兩個偕位R基團與其所連接之碳原子一起可形成環丁基或環丙基環； 為與有效負荷之連接點；且 為與結合部分之連接點。
在一些態樣中，L係選自 及 ； 其中： q為2至10之整數； R、R'、R''及R'''係各自獨立地選自氫、C 1-C 6烷氧基C 1-C 6烷基、(C 1-C 6) 2NC 1-C 6烷基及C 1-C 6烷基，或兩個偕位R基團與其所連接之碳原子一起可形成環丁基或環丙基環； 為與有效負荷之連接點；且 為與結合部分之連接點。
在某些態樣中，L為酸可裂解連接子。
在一些態樣中，L係選自由以下組成之群： ； 其中： q為2至10之整數； 為與有效負荷之連接點；且 為與結合部分之連接點。
在一些態樣中，L為點擊釋放連接子。在一些態樣中，L係選自 ； 其中： q為2至10之整數； 為與有效負荷之連接點；且 為與結合部分之連接點。
在一些態樣中，L為焦磷酸酶可裂解連接子。在一些態樣中，L為 ； 其中： q為2至10之整數； 為與有效負荷之連接點；且 為與結合部分之連接點。
在一些態樣中，L為β-葡萄糖醛酸苷酶可裂解連接子。在一些態樣中，L係選自 、 、 及 ； 其中： q為2至10之整數； ----不存在或為一鍵； 為與有效負荷之連接點；且 為與結合部分之連接點。
在一些態樣中，L為 ； 其中： q為2至10之整數； ----不存在或為一鍵； 為與有效負荷之連接點；且 為與結合部分之連接點。
在一些態樣中，本揭示案提供一種接合物，該接合物係選自： ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ；及 。
在一些態樣中，接合物之連接子連接至Bm中之半胱胺酸、離胺酸、酪胺酸或麩醯胺。在一些態樣中，半胱胺酸或離胺酸為經工程改造之半胱胺酸或離胺酸。在一些態樣中，半胱胺酸或離胺酸對於Bm而言為內源的。
在一些態樣中，結合部分為抗體或其抗原結合片段。
在某些態樣中，本揭示案提供接合物，其中L連接至根據EU編號在抗體或其抗原結合部分之重鏈位置S239及/或K334處的經工程改造之半胱胺酸。
在一些態樣中，L連接至根據EU編號在抗體或其抗原結合部分之重鏈位置295處的麩醯胺。
在某些態樣中，結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：SEQ ID NO:10之胺基酸31-35、50-66及99-109以及SEQ ID NO:11之胺基酸24-38、54-60及93-101的CDR序列。
在一些態樣中，結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之可變重鏈及包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列之可變輕鏈。
在一些態樣中，結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列之輕鏈。
在一些態樣中，結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：SEQ ID NO:12之胺基酸31-35、50-66及99-102以及SEQ ID NO:13之胺基酸24-34、50-56及89-97的重鏈及輕鏈CDR序列。
在一些態樣中，結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之可變重鏈及包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之可變輕鏈。
在一些態樣中，結合部分能夠特異性結合至CD25。
在一些態樣中，結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：SEQ ID NO: 4之胺基酸31-35、50-66及99-111以及SEQ ID NO:5之胺基酸24-34、50-56及89-97的CDR序列。
在一些態樣中，結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之可變重鏈及包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之可變輕鏈。
在一些態樣中，結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：SEQ ID NO: 6之胺基酸31-35、50-65及98-108以及SEQ ID NO:7之胺基酸24-33、49-55及88-96的CDR序列。
在一些態樣中，結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之可變重鏈及包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列之可變輕鏈。
在一些態樣中，結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：SEQ ID NO:8之胺基酸31-35、50-65或98-108以及SEQ ID NO:9之胺基酸24-33、49-55及88-96的CDR序列。
在一些態樣中，結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之可變重鏈及包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之可變輕鏈。
在一些態樣中，結合部分能夠特異性結合至CD7。
在一些態樣中，結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：SEQ ID NO:14之胺基酸31-35、50-66及99-112以及SEQ ID NO:15之胺基酸23-36、52-58及91-99的CDR序列。
在一些態樣中，結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之可變重鏈及包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列之可變輕鏈。
在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段包含重鏈恆定區。
在一些態樣中，重鏈恆定區包含Fc緘默突變。
在一些態樣中，重鏈恆定區為IgG重鏈恆定區。
在一些態樣中，IgG重鏈恆定區為IgG1重鏈恆定區。
在一些態樣中，重鏈恆定區包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列。
在一些態樣中，IgG重鏈恆定區為IgG4重鏈恆定區。
在一些態樣中，重鏈恆定區包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列。
在一些態樣中，本揭示案提供如本文所述之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中(a)結合部分為派姆單抗(pembrolizumab)，或(b)結合部分為納武單抗(Nivolumab)。
在一些態樣中，本揭示案提供如本文所述之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中(a)結合部分為a686，(b)結合部分為MA251，或(c)結合部分為人源化MA251。
在一些態樣中，結合部分為小分子。
在一些態樣中，本揭示案提供如本文所述之接合物，其中a為1至40。在一些態樣中，a為1至10。在一些態樣中，a為2至8。
在一些態樣中，本揭示案提供如本文所述之接合物，該接合物能夠增加效應T細胞活性。
在一些態樣中，本揭示案提供如本文所述之接合物，該接合物能夠增加效應T細胞增殖。
在一些態樣中，本揭示案提供如本文所述之接合物，該接合物能夠增加效應T細胞向腫瘤細胞之遷移。
在一些態樣中，本揭示案提供如本文所述之接合物，該接合物能夠減少效應T細胞耗竭。
在一些態樣中，本揭示案提供如本文所述之接合物，該接合物使IFN-y自T細胞之分泌相對於背景增加約2.5至約3倍；及/或使IL-2自T細胞之分泌相對於背景增加約6至約8倍。
在一些態樣中，本揭示案提供一種組合物，該組合物包含如本文所述之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些態樣中，本揭示案提供一種組合物，該組合物包含如本文所述之接合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在某個態樣中，本揭示案提供一種治療有需要之個體之癌症的方法，該方法包括向該個體投與本文所述之化合物、本文所述之接合物或本文所述之組合物。在一些態樣中，癌症(i)對於抗PD1療法具有抵抗性或難治性，視情況其中該抗PD1療法為納武單抗、派姆單抗及/或西米普利單抗(cemiplimab)；及/或(ii)對於抗PDL1療法具有抵抗性或難治性，視情況其中該抗PDL1療法為德瓦魯單抗(durvalumab)、阿特珠單抗(atezolizumab)及/或阿維魯單抗(avelumab)。
在一些態樣中，本揭示案提供一種治療有需要之個體中將受益於免疫反應增加之疾患的方法，該方法包括向該個體投與本文所述之化合物、本文所述之接合物或本文所述之組合物。在一些態樣中，疾患為感染，視情況其中該感染為病毒感染、細菌感染或寄生蟲感染、免疫抑制性疾病或病症或多發性硬化症。
在一些態樣中，本揭示案提供一種增加免疫細胞之活性的方法，該方法包括使該免疫細胞與本文所述之化合物、本文所述之接合物或本文所述之組合物接觸。
在一些態樣中，本揭示案提供一種增加免疫細胞之增殖的方法，該方法包括使免疫細胞與本文所述之化合物、本文所述之接合物或本文所述之組合物接觸。
在一些態樣中，本揭示案提供一種增加免疫細胞向腫瘤細胞之遷移的方法，該方法包括使免疫細胞與本文所述之化合物、本文所述之接合物或本文所述之組合物接觸。
在一些態樣中，本揭示案提供減少免疫細胞之耗竭的方法，該方法包括使免疫細胞與本文所述之化合物、本文所述之接合物或本文所述之組合物接觸。
在一些態樣中，本揭示案提供一種增加IFN-y或IL-2自免疫細胞之分泌的方法，該方法包括使該免疫細胞與本文所述之化合物、本文所述之接合物或本文所述之組合物接觸。在一些態樣中，免疫細胞為T細胞，視情況其中該T細胞為效應T細胞。在一些態樣中，免疫細胞為自然殺手(NK)細胞。
在一些態樣中，本揭示案提供一種增強及/或維持T細胞之抗原回憶反應的方法，該方法包括使該T細胞與本文所述之化合物、本文所述之接合物或本文所述之組合物接觸。
在一些態樣中，本揭示案提供一種將能夠活化效應T細胞之有效負荷遞送至免疫細胞的方法，該方法包括使效應T細胞與本文所述之接合物或包含本文所述之接合物的組合物接觸。在一些態樣中，接觸係在活體外。在一些態樣中，接觸係在個體體內，視情況其中該個體患有癌症或將受益於免疫反應增加之疾患。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2022年3月9日提出申請之美國臨時申請案第63/318,278號、2022年12月23日提出申請之美國臨時申請案第63/477,053號及2023年3月3日提出申請之美國臨時申請案第63/488,211號之優先權益，該等臨時申請案以全文引用之方式併入本文中。 以電子方式提交之序列表之引用
與本申請案一起歸檔之以電子方式提交之.XML檔案之序列表(名稱：4547_023PC03_SeqListing_ ST26.xml：大小：42,283位元組；及創建日期：2023年3月7日)的內容以全文引用之方式併入本文中。 (I)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： n為0、1或2； X及Y各自獨立地為CH或N； Z係選自CH(CH 3)、O及SO 2；或 Z係選自CH(CH 3)、NH、N(CH 3)、O及SO 2； R 1係選自氫、-CN、-NHR z、-R a、-NR aR b、-OR a、-NHC(O)R a、-NHC(S)R a、-NHC(O)NHR a、-NHC(S)NHR a、-SR a、C 3-C 6環烷基及3至6員雜環基環；其中 R z係選自 ； R a及R b係獨立地選自氫、C 2-C 6烯基、C 1-C 6烷基、醯胺基(C 1-C 6烷基)、胺基(C 1-C 6烷基)、疊氮基(C 1-C 6烷基)、C 2-C 6炔基、羧基(C 1-C 6烷基)、氰基(C 1-C 6烷基)、視情況經氰基取代之C 3-C 6環烷基、二甲基胺基(C 1-C 6烷基)、3至6員雜環基環、3-6員雜環基(C 1-C 3烷基)、羥基(C 1-C 6烷基)、甲氧基(C 1-C 6烷基)、甲基胺基(C 1-C 6烷基)、NR cR d(C 1-C 6烷基)、HS(C 1-C 6烷基)及CH 3S(C 1-C 6烷基)，其中R c及R d係獨立地選自氫、C 2烯基羰基及甲基；或， R a及R b與其所連接之氮原子一起形成視情況含有一個額外氮原子之五或六員環，其中該環視情況經一個選自R a、-C(O)R a、-SO 2R a、疊氮基及氰基之基團取代； 其中各C 3-C 6環烷基、各3至6員雜環基環及該3至6員雜環基(C 1-C 3烷基)環之該雜環基部分視情況經一個、兩個或三個獨立地選自C 1-C 3烷基、C 2炔基、醯胺基、疊氮基、羧基、氰基、二甲基胺基、羥基、甲氧基、甲基胺基、HS-及CH 3S-之基團取代；且 R 2係選自 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ；其中 m為0、1、2或3； m''為0、1、2、3或4； B'為視情況含有一或兩個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的3-7員飽和或不飽和環；其中該環視情況經一或兩個獨立地選自-OH、-CH 2SH、CH 2SCH 3、-CH 2OH、-CH 2NH 2及-CH 2NHCH 3之取代基取代； 各R 500係獨立地選自氫、C 1-C 6烷基、鹵基、-OH及-CH 2OH；且 X 50係選自O、NH、NCH 3及S； R 3係選自氫、乙醯基、胺基、C 1-C 6烷基胺基、C 1-C 6烷基胺基甲基、C 1-C 6烷基羰基、胺基C 1-C 6烷基、胺基羰基、胺基甲基、羧基、氰基、C 3環烷基、甲醯基、羥基、羥基C 1-C 6烷基、甲氧基、噁唑基、-SH、-SCH 3、-SOCH 3、-SO 2CH 3、-SO(=NH)CH 3、四唑基、噻唑基及三氟甲基，其中該C 3環烷基視情況經羥基取代； R 4係選自氫、甲基、-CH 2OH、-CH 2SH及-CH 2SCH 3； R 5係選自氫、羥基、-CH 2SH、-CH 2SCH 3及甲基； 視情況前提條件為，當R 5為羥基或甲基，且R 4為氫時，則R 1不為C 3-C 6環烷基、3至6員雜環基環、羥基、羥基(C 1-C 6烷基)、-OR a，其中R a為C 1-C 6烷基、3至6員雜環基環或羥基(C 1-C 6烷基)；或-NR aR b，其中R a及R b係獨立地選自由氫、C 1-C 6烷基、C 3-C 6環烷基、羥基(C 1-C 6烷基)、3至6員雜環基環組成之群，或其中R a及R b與其所連接之氮原子一起形成視情況含有一個額外氮原子之五或六員環，其中該環視情況經一個選自C 1-C 6烷基或羥基(C 1-C 6烷基)之基團取代；且 R 6及R 6'係獨立地選自氫、環丙基、-CH 2OH、-CH 2SH、-CH 2SCH 3及-CH 2R 200，其中R 200為視情況含有一或兩個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的3-7員飽和或不飽和環。
在一些態樣中，R 4呈「R」構型。在一些態樣中，R 4呈「S」構型。
在某些態樣中，本揭示案係關於式(IA-1)之Cbl-b抑制劑： (IA-1)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： n為0、1或2； X及Y各自獨立地為CH或N； Z係選自CH(CH 3)、O及SO 2； R 1係選自氫、-CN、-NHR z、-R a、-NR aR b、-OR a、-NHC(O)R a、-NHC(S)R a、-NHC(O)NHR a、-NHC(S)NHR a、-SR a、C 3-C 6環烷基及3至6員雜環基環；其中 R z係選自 ； R a及R b係獨立地選自氫、C 2-C 6烯基、C 1-C 6烷基、醯胺基(C 1-C 6烷基)、胺基(C 1-C 6烷基)、疊氮基(C 1-C 6烷基)、C 2-C 6炔基、羧基(C 1-C 6烷基)、氰基(C 1-C 6烷基)、C 3-C 6環烷基、二甲基胺基(C 1-C 6烷基)、3-6員雜環基環、3-6員雜環基(C 1-C 3)烷基、羥基(C 1-C 6烷基)、甲氧基(C 1-C 6烷基)、甲基胺基(C 1-C 6烷基)、NR cR d(C 1-C 6烷基)、HS(C 1-C 6烷基)及CH 3S(C 1-C 6烷基)，其中R c及R d係獨立地選自氫、C 2烯基羰基及甲基；或， R a及R b與其所連接之氮原子一起形成視情況含有一個額外氮原子之五或六員環，其中該環視情況經一個選自R a、-C(O)R a、-SO 2R a、疊氮基及氰基之基團取代； 其中各C 3-C 6環烷基、各3-6員雜環基環及該3-6員雜環基(C 1-C 3烷基)之該雜環基部分視情況經一個、兩個或三個獨立地選自C 1-C 3烷基、C 2炔基、醯胺基、疊氮基、羧基、氰基、二甲基胺基、羥基、甲氧基、甲基胺基、HS-及CH 3S-之基團取代；且 R 2為 或 ；其中 m為0、1、2或3； R 3係選自氫、乙醯基、胺基、C 1-C 6烷基胺基、C 1-C 6烷基胺基甲基、胺基C 1-C 6烷基、胺基羰基、胺基甲基、羧基、氰基、C 3環烷基、甲醯基、羥基、羥基C 1-C 6烷基、甲氧基、噁唑基、-SH、-SCH 3、四唑基、噻唑基及三氟甲基，其中該C 3環烷基視情況經羥基取代； R 4及R 6係獨立地選自氫、-CH 2SH及-CH 2SCH 3；且 R 5係選自羥基、-CH 2SH、-CH 2SCH 3及甲基。
在一些態樣中，R 4呈「R」構型。在一些態樣中，R 4呈「S」構型。
本揭示案亦提供活化效應T細胞之接合物，且進一步提供治療癌症之方法、增加T細胞活性之方法、增加T細胞增殖之方法、增加T細胞向腫瘤細胞之遷移的方法、減少T細胞耗竭之方法及使用接合物遞送能夠活化效應T細胞之有效負荷的方法。 I. 定義
為更容易地理解本發明描述，首先定義某些術語。額外定義在整個[實施方式]中闡述。
應注意，術語「一個」或「一種」實體係指彼實體中之一或多者；例如，「核苷酸序列」應理解為代表一或多個核苷酸序列。因此，術語「一個」(或「一種」)、「一或多個(種)」及「至少一個(種)」在本文中可互換使用。應進一步注意，可草擬申請專利範圍以排除任何視情況存在之要素。因此，此陳述意欲充當使用與主張要素之敘述相關聯之諸如「唯一」、「僅」及類似排他性術語或使用否定式限制的前置基礎。
此外，本文所用之「及/或」應視為特定揭示兩種指定特徵或組分中之每一者與另一者或不與另一者一起。因此，如本文在諸如「A及/或B」之片語中所用之術語「及/或」意欲包括「A及B」、「A或B」、「A」(單獨)及「B」(單獨)。同樣地，如在諸如「A、B及/或C」之片語中所用之術語「及/或」意欲涵蓋以下態樣中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。
應了解，在本文中用語言「包含」描述態樣之情況下，亦提供以「由……組成」及/或「基本上由……組成」之術語描述之其他方面類似之態樣。
除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本揭示案相關技術者通常所理解之含義相同之含義。舉例而言，Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 第2版, 2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 第3版, 1999, Academic Press；及Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, 修訂版, 2000, Oxford University Press，向熟習此項技術者提供本揭示案中所用之許多術語之綜合字典。
單位、前綴及符號以其系統國際單位制(Système International de Unites，SI)認可之形式表示。數值範圍包括定義該範圍之數值。在敘述值之範圍的情況下，應了解，亦特定揭示介於彼範圍之所敘述之上限與下限之間的各居間整數值及其各分數，以及介於此類值之間的各子範圍。範圍中可獨立地包括或排除任何範圍之上限及下限，且本揭示案內亦涵蓋包括任一界限、不包括兩個界限或包括兩個界限之各範圍。因此，本文所敘述之範圍應理解為該範圍內之所有值的簡寫，所敘述之端點包括在內。
在明確敘述一個值之情況下，應了解，與所敘述之值約為相同數量或量之值亦在本揭示案之範疇內。在揭示組合之情況下，亦特定揭示彼組合之要素之各子組合且在本揭示案之範疇內。反之，在個別地揭示不同要素或要素組之情況下，亦揭示其組合。在將本揭示案之任何要素揭示為具有複數個替代物之情況下，特此亦揭示單獨地或以與其他替代物之任何組合形式排除各替代物之彼揭示內容的實例；揭示內容之多於一個要素可具有此類排除情況，且特此揭示具有此類排除情況之要素之所有組合。
術語「效應T細胞」、「T效應細胞」、「Teff」及「T-eff」可互換使用。在一些態樣中，「效應T細胞」為CD8+細胞毒性T細胞。
效應T細胞之「活化劑」係指能夠促進效應T細胞之一或多種功能的分子。效應T細胞之活化劑可促進效應T細胞功能，例如，藉由促進效應T細胞之增殖、存活及/或遷移，藉由促進效應細胞介素及/或細胞毒性介體自效應T細胞之產生，及/或藉由減少效應T細胞之耗竭。效應T細胞之「活化劑」亦能夠活化一或多種其他細胞類型，例如，一或多種其他T細胞類型，只要該活化劑能夠活化效應T細胞即可。如本文所用，術語「介白素-2受體次單位α」、「IL2-RA」、「IL2RA」、「CD-25」或「CD25」係指哺乳動物CD25多肽，包括但不限於原生CD25多肽及CD25多肽同功型。此等術語涵蓋全長未加工之CD25多肽以及由細胞內加工產生之CD25多肽形式。
如本文所用，術語「人類CD25」係指包含SEQ ID NO:1之胺基酸22-272之多肽。SEQ ID NO:1提供成熟人類CD25 (胺基酸22-272)之序列以及其信號序列(胺基酸1-21，下文加下劃線)。 MDSYLLMWGLLTFIMVPGCQAELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEYQVAVAGCVFLLISVLLLSGLTWQRRQRKSRRTI (SEQ ID NO:1)
「CD25多核苷酸」、「CD25核苷酸」或「CD25核酸」係指編碼CD25多肽之多核苷酸。
如本文所用，術語「程式性細胞死亡蛋白1」、「PD-1」或「PD1」係指哺乳動物PD1多肽，包括但不限於原生PD1多肽及PD1多肽同功型。此等術語涵蓋全長未加工之PD1多肽以及由細胞內加工產生之PD1多肽形式。
如本文所用，術語「人類PD1」係指包含SEQ ID NO:2之胺基酸24-288之多肽。SEQ ID NO:2提供成熟人類PD1 (胺基酸24-288)之序列以及其信號序列(胺基酸1-23，下文加下劃線)。 MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL (SEQ ID NO:2)。
「PD1多核苷酸」、「PD1核苷酸」或「PD1核酸」係指編碼PD1多肽之多核苷酸。
如本文所用，術語「T細胞抗原CD-7」、「CD-7」或「CD7」係指哺乳動物CD7多肽，包括但不限於原生CD7多肽及CD7多肽同功型。此等術語涵蓋全長未加工之CD7多肽以及由細胞內加工產生之CD7多肽形式。
如本文所用，術語「人類CD7」係指包含SEQ ID NO:3之胺基酸26-240之多肽。SEQ ID NO:3提供成熟人類CD7 (胺基酸26-240)之序列以及其信號序列(胺基酸1-25，下文加下劃線)。 MAGPPRLLLLPLLLALARGLPGALAAQEVQQSPHCTTVPVGASVNITCSTSGGLRGIYLRQLGPQPQDIIYYEDGVVPTTDRRFRGRIDFSGSQDNLTITMHRLQLSDTGTYTCQAITEVNVYGSGTLVLVTEEQSQGWHRCSDAPPRASALPAPPTGSALPDPQTASALPDPPAASALPAALAVISFLLGLGLGVACVLARTQIKKLCSWRDKNSAACVVYEDMSHSRCNTLSSPNQYQ (SEQ ID NO:3)。
「CD7多核苷酸」、「CD7核苷酸」或「CD7核酸」係指編碼CD7多肽之多核苷酸。
如本文所用，術語「卡西塔斯B譜系淋巴瘤原癌基因b」、「E3泛素-蛋白質連接酶Cbl-b」或「Cbl-b」係指哺乳動物Cbl-b多肽，包括但不限於原生Cbl-b多肽及Cbl-b多肽同功型。此等術語涵蓋全長未加工之Cbl-b多肽以及由細胞內加工產生之Cbl-b多肽形式。
如本文所用，術語「人類Cbl-b」係指包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之多肽。 MANSMNGRNPGGRGGNPRKGRILGIIDAIQDAVGPPKQAAADRRTVEKTWKLMDKVVRLCQNPKLQLKNSPPYILDILPDTYQHLRLILSKYDDNQKLAQLSENEYFKIYIDSLMKKSKRAIRLFKEGKERMYEEQSQDRRNLTKLSLIFSHMLAEIKAIFPNGQFQGDNFRITKADAAEFWRKFFGDKTIVPWKVFRQCLHEVHQISSGLEAMALKSTIDLTCNDYISVFEFDIFTRLFQPWGSILRNWNFLAVTHPGYMAFLTYDEVKARLQKYSTKPGSYIFRLSCTRLGQWAIGYVTGDGNILQTIPHNKPLFQALIDGSREGFYLYPDGRSYNPDLTGLCEPTPHDHIKVTQEQYELYCEMGSTFQLCKICAENDKDVKIEPCGHLMCTSCLTAWQESDGQGCPFCRCEIKGTEPIIVDPFDPRDEGSRCCSIIDPFGMPMLDLDDDDDREESLMMNRLANVRKCTDRQNSPVTSPGSSPLAQRRKPQPDPLQIPHLSLPPVPPRLDLIQKGIVRSPCGSPTGSPKSSPCMVRKQDKPLPAPPPPLRDPPPPPPERPPPIPPDNRLSRHIHHVESVPSRDPPMPLEAWCPRDVFGTNQLVGCRLLGEGSPKPGITASSNVNGRHSRVGSDPVLMRKHRRHDLPLEGAKVFSNGHLGSEEYDVPPRLSPPPPVTTLLPSIKCTGPLANSLSEKTRDPVEEDDDEYKIPSSHPVSLNSQPSHCHNVKPPVRSCDNGHCMLNGTHGPSSEKKSNIPDLSIYLKGDVFDSASDPVPLPPARPPTRDNPKHGSSLNRTPSDYDLLIPPLGEDAFDALPPSLPPPPPPARHSLIEHSKPPGSSSRPSSGQDLFLLPSDPFVDLASGQVPLPPARRLPGENVKTNRTSQDYDQLPSCSDGSQAPARPPKPRPRRTAPEIHHRKPHGPEAALENVDAKIAKLMGEGYAFEEVKRALEIAQNNVEVARSILREFAFPPPVSPRLNL (SEQ ID NO:25)
「Cbl-b多核苷酸」、「Cbl-b核苷酸」或「Cbl-b核酸」係指編碼Cbl-b多肽之多核苷酸。
如本文所用，術語「抗體」係指免疫特異性結合所關注之標靶(諸如蛋白質、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂質或前述之組合)或其部分之免疫球蛋白分子。如本文所用，術語「抗體」涵蓋完整多株抗體、完整單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體、多特異性抗體、包含抗體之融合蛋白及任何其他經修飾之免疫球蛋白分子，只要該等抗體展現所需生物活性即可。本文所揭示之抗體可屬於任何類別(例如，IgG、IgE、IgM、IgD及IgA)或子類(同型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。不同類別之免疫球蛋白具有不同且熟知之次單位結構及三維構型。免疫球蛋白可來源於任何物種。在一個態樣中，免疫球蛋白具有人類、鼠類或兔來源。抗體可為裸抗體或接合至其他分子，諸如效應T細胞之活化劑，包括效應T細胞之小分子活化劑。
「完整抗體」為包含抗原結合可變區以及輕鏈恆定結構域(CL)及重鏈恆定結構域CH1、CH2及CH3之抗體。恆定結構域可為原生序列恆定結構域(例如，人類原生序列恆定結構域)或其胺基酸序列變異體。
「抗體片段」包含完整抗體之一部分。「抗原結合片段」、「抗原結合結構域」或「抗原結合區」係指完整抗體中結合至抗原之部分。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab') 2及Fv片段；微型雙功能抗體(diabody)；線性抗體；由Fab表現文庫產生之片段、抗獨特型(抗Id)抗體、CDR (互補決定區)及免疫特異性結合至所關注之標靶的上述任一者之抗原決定基結合片段、單鏈抗體分子；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個相同抗原結合片段，稱為「Fab」片段，各自具有單個抗原結合位點；及殘餘「Fc」片段，其名稱反映其容易結晶之能力。胃蛋白酶處理得到具有兩個抗原結合位點且仍能夠交聯抗原之F(ab')2片段。
「Fv」為含有完整抗原識別及抗原結合位點之最小抗體片段。此區域由緊密非共價締合之一個重鏈及一個輕鏈可變結構域之二聚體組成。在此構型中，各可變結構域之三個高變區相互作用以界定VH-VL二聚體表面上之抗原結合位點。共同地，六個高變區向抗體或其抗原結合片段賦予抗原結合特異性。然而，即使單個可變結構域(或僅包含三個對抗原具有特異性之高變區的一半Fv)亦具有識別及結合抗原之能力，但親和力低於整個結合位點。
Fab片段亦含有輕鏈之恆定結構域及重鏈之第一恆定結構域(CH1)。Fab'片段與Fab片段之不同之處為在包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸的重鏈CH1結構域之羧基端添加數個殘基。Fab'-SH在本文中為其中恆定結構域之半胱胺酸殘基帶有至少一個游離硫醇基之Fab'的命名。F(ab')2抗體片段最初作為Fab'片段對產生，該等片段對之間具有鉸鏈半胱胺酸。抗體片段之其他化學偶合亦為已知的。
術語「單結構域抗體」亦稱為單域抗體(nanobody)，為由具有約12 kDa至約15 kDa分子量之單個單體可變抗體結構域組成的抗體片段。單結構域抗體可基於重鏈可變結構域或輕鏈。單結構域抗體之實例包括但不限於V HH片段及V NAR片段。
「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體之VH及VL結構域，其中此等結構域存在於單個多肽鏈中。Fv多肽可進一步包含介於VH與VL結構域之間的多肽連接子，該連接子使scFv能夠形成用於抗原結合之所需結構。
術語「微型雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包含連接至同一多肽鏈中之可變輕結構域(VL)之可變重結構域(VH)(VH-VL)。藉由使用過短而無法使同一鏈上之兩個結構域之間配對的連接子，迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域配對且產生兩個抗原結合位點。
「原生抗體」通常為約150,000道爾頓之異四聚醣蛋白，由兩個相同輕(L)鏈及兩個相同重(H)鏈組成。各輕鏈係由共價二硫鍵連接至重鏈，而二硫鏈聯之數目在不同免疫球蛋白同型之重鏈之間有所不同。各重鏈及輕鏈亦具有規則間隔之鏈內二硫橋。各重鏈在一端具有可變結構域(VH)，繼之以多個恆定結構域。各輕鏈在一端具有可變結構域(VL)且在其另一端具有恆定結構域。輕鏈之恆定結構域與重鏈之第一恆定結構域對準，且輕鏈可變結構域與重鏈之可變結構域對準。據信特定胺基酸殘基形成輕鏈與重鏈可變結構域之間的界面。
如本文所用，術語「單株」抗體或其抗原結合片段係指自實質上均質抗體或其抗原結合片段之群體獲得之抗體或其抗原結合片段，亦即，構成該群體之個別抗體或其抗原結合片段除可微量存在之可能天然存在之突變以外皆為相同的。單株抗體或其抗原結合片段針對單個抗原位點為高度特異性的。此外，與包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑成對比，各單株抗體或其抗原結合片段針對抗原上之單個決定子。除其特異性以外，單株抗體或其抗原結合片段之有利之處在於其可經合成而不受其他抗體或其抗原結合片段污染。修飾語「單株」指示自抗體或其抗原結合片段之實質上均質群體獲得之抗體或其抗原結合片段的特徵，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體或其抗原結合片段。舉例而言，有待根據本揭示案使用之單株抗體或其抗原結合片段可藉由融合瘤方法製得，或可藉由重組DNA方法製得。「單株」抗體或其抗原結合片段亦可自噬菌體抗體文庫分離。
單株抗體及其抗原結合片段在本文中特定地包括「嵌合」抗體及其抗原結合片段，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體或其抗原結合片段中之相應序列相同或同源，而該(該等)鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中之相應序列相同或同源，以及此類抗體之片段，只要該等片段展現所需生物活性即可。所關注之嵌合抗體及其抗原結合片段在本文中包括包含來源於非人類靈長類動物(例如，舊大陸猴、猿等)之可變結構域抗原結合序列及人類恆定區序列的「靈長類化」抗體及其抗原結合片段。
非人類(例如，嚙齒動物)抗體及其抗原結合片段之「人源化」形式為含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體及其抗原結合片段。人源化為將鼠類抗原結合資訊轉移至非免疫原性人類抗體接受者之方法，且已產生許多治療上可用之藥物。人源化方法一般藉由將全部六個鼠類互補決定區(CDR)轉移至人類抗體或抗原結合片段構架上而開始。此等CDR接枝之抗體或其抗原結合片段一般不保留其對抗原結合之初始親和力，且實際上，親和力常常嚴重受損。除CDR以外，亦必須併入所選非人類抗體構架殘基以維持適當CDR構形。關鍵小鼠構架殘基向人類接受者轉移以支持接枝CDR之結構構形已顯示恢復抗原結合及親和力。在大多數情況下，人源化抗體或其抗原結合片段為人類免疫球蛋白或其片段(接受體抗體或其片段)，其中來自接受體高變區之殘基由來自具有所需特異性、親和力及能力之非人類物種(供體抗體或其片段)之高變區之殘基置換，該非人類物種諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物。在一些情況下，人類免疫球蛋白之構架區(FR)殘基由相應非人類殘基置換。此外，人源化抗體或其抗原結合片段可包含接受體或供體抗體或其片段中未發現之殘基。進行此等修飾以進一步改善抗體或其抗原結合片段效能。一般而言，人源化抗體或其抗原結合片段將包含實質上全部之至少一個且典型地兩個可變結構域，其中全部或實質上全部高變環對應於非人類免疫球蛋白之彼等且全部或實質上全部FR為人類免疫球蛋白序列之彼等。人源化抗體或其抗原結合片段視情況亦將包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，典型地為人類免疫球蛋白之恆定區。
嵌合及人源化抗體及其抗原結合片段藉由使所投與抗體之非人類部分最小化來降低人抗小鼠抗體(HAMA)反應之可能性。此外，嵌合及人源化抗體及其抗原結合片段可具有活化次級人類免疫反應之額外效益，諸如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
抗體或其抗原結合片段可具有一或多種「效應功能」，係指可歸因於抗體或其抗原結合片段之Fc區(原生序列Fc區或胺基酸序列變異體Fc區)之彼等生物活性。效應功能之實例包括C1q結合；補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體；BCR)下調，等。抗體或其抗原結合片段亦可為「Fc緘默的」，係指不結合至Fc受體或不具有ADCC功能之抗體或抗原結合片段。
取決於其重鏈之恆定結構域之胺基酸序列，抗體及其抗原結合片段可指定為不同「類別」。存在五種主要類別之完整抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之數種可進一步分為「子類」 (同型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgA2。對應於不同類別之抗體的重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同類別之免疫球蛋白之次單位結構及三維構型為熟知的。
如本文所用，術語「可變區」或「可變結構域」可互換使用且在此項技術中為常用的。可變區典型地係指抗體或其抗原結合片段之一部分，一般為輕鏈或重鏈之一部分，典型地為成熟重鏈中之胺基端約110至120個胺基酸或110至125個胺基酸及成熟輕鏈中之約90至115個胺基酸，該等胺基酸在抗體及其抗原結合片段之間序列有廣泛不同且在特定抗體或其抗原結合片段對其特定抗原之結合及特異性中使用。序列變異性集中於稱為互補決定區(CDR)之彼等區域，而可變結構域中更高度保守之區域稱為構架區(FR)。不希望受任何特定機制或理論約束，據信輕鏈及重鏈之CDR主要負責抗體或其抗原結合片段與抗原之相互作用及特異性。在一些態樣中，可變區為人類可變區。在一些態樣中，可變區包含嚙齒動物或鼠類CDR及人類構架區(FR)。在一些態樣中，可變區為靈長類動物(例如，非人類靈長類動物)可變區。在一些態樣中，可變區包含嚙齒動物或鼠類CDR及靈長類動物(例如，非人類靈長類動物)構架區(FR)。
術語「VL」及「VL結構域」可互換使用以指代抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區。
術語「VH」及「VH結構域」可互換使用以指代抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區。
術語「Kabat編號」及類似術語在此項技術中為公認的且係指對抗體或其抗原結合片段之重鏈及輕鏈可變區中之胺基酸殘基進行編號之系統。在一些態樣中，CDR可根據Kabat編號系統(參見例如Kabat EA及Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391，及Kabat EA等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開案第91-3242號)確定。使用Kabat編號系統，抗體重鏈分子內之CDR典型地存在於胺基酸位置31至35處，視情況可包括35之後的一或兩個額外胺基酸(在Kabat編號方案中稱作35A及35B)(CDR1)，胺基酸位置50至65處(CDR2)，及胺基酸位置95至102處(CDR3)。使用Kabat編號系統，抗體輕鏈分子內之CDR典型地存在於胺基酸位置24至34處(CDR1)、胺基酸位置50至56處(CDR2)及胺基酸位置89至97處(CDR3)。
Chothia替代地係指結構環之位置(Chothia及Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。當使用Kabat編號規約進行編號時Chothia CDR-H1環之末端在H32與H34之間變化，此取決於環之長度(此係因為Kabat編號方案將插入置於H35A及H35B處；若35A及35B均不存在，則環終止於32；若僅存在35A，則環終止於33；若35A及35B均存在，則環終止於34)。AbM高變區代表Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷，且由Oxford Molecular之AbM抗體建模軟體使用。
如本文所用，術語「恆定區」或「恆定結構域」為可互換的且具有其在此項技術中常用之含義。恆定區為抗體部分，例如，輕鏈及/或重鏈之羧基端部分，該部分不直接涉及抗體或其抗原結合片段與抗原之結合，但可展現各種效應功能，諸如與Fc受體之相互作用。免疫球蛋白分子之恆定區一般具有相對於免疫球蛋白可變結構域更保守之胺基酸序列。
如本文所用，術語「特異性結合」係指分子之間的相互作用，其中(i)當分子之一的濃度相對於另一分子增加時結合變得飽和，及(ii)因過量相互作用分子之一的存在可對結合進行競爭。能夠「特異性結合」至效應T細胞表面上之標靶的分子(例如，結合結構域，諸如抗體或其抗原結合片段)亦可結合至可溶形式之標靶及/或不同位置中(例如，另一細胞之表面上)之標靶。能夠「特異性結合」至來自一種物種(例如，人類)之標靶的分子(例如，結合結構域，諸如抗體或其抗原結合片段)亦可結合至來自另一物種(例如，食蟹猴、小鼠及/或大鼠)之彼標靶，但與無關標靶之結合程度小於與該標靶之結合的約10%。
如本文所用，術語「免疫特異性結合」指示抗體或其抗原結合片段經由其抗原結合結構域結合至抗原決定基且結合需要抗原結合結構域與抗原決定基之間的一些互補性。因此，「免疫特異性結合」至人類蛋白質，例如人類PD1之抗體亦可結合至來自其他物種(例如，食蟹猴、小鼠及/或大鼠PD1)之彼蛋白質或結合至相關蛋白質，但與無關蛋白質之結合程度小於如所量測之抗體與PD1之結合的約10%。「免疫特異性結合」所關注之抗原的抗體為能夠以足夠親和力結合彼抗原之抗體，使得該抗體可用於靶向表現該抗原之細胞。
術語「降低(reduction/reduce)」或「抑制(inhibition/inhibit)」係指任何表型特徵之減少或中斷或者彼特徵之發生率、程度或可能性之減少或中斷。「降低」或「抑制」為與參考相比減少、降低或遏止活性、功能及/或量。在一些態樣中，「降低」或「抑制」意指引起20%或更大之總體減少的能力。在一些態樣中，「降低」或「抑制」意指引起50%或更大之總體減少的能力。在一些態樣中，「降低」或「抑制」意指引起75%、85%、90%、95%或更大之總體減少的能力。在一些態樣中，在一定時間段內上文所提及之量相對於相同時間段內之對照抑制或減少。
作為標靶之「抑制劑」的分子與不存在抑制劑之情況下標靶之活性、功能及/或量相比可減少標靶之活性、功能及/或量。因此，作為「Cbl-b抑制劑」之分子、化合物或有效負荷與不存在分子、化合物或有效負荷之情況下Cbl-b之活性、功能及/或量相比可減少Cbl-b之活性、功能及/或量。
作為標靶之「促效劑」的分子與不存在促效劑之情況下標靶之活性、功能及/或量相比可增加標靶之活性、功能及/或量。
術語「約」在本文中使用以意指近似、大致、大約或在……左右。當術語「約」與數值範圍聯合使用時，其藉由擴展邊界高於及低於所闡述之數值來修飾彼範圍。一般而言，術語「約」可由例如10%上下(更高或更低)之變異數來修飾高於及低於所述值之數值。應了解，在本文中用語言「約」或「近似」描述態樣之情況下，亦提供其他方面類似，但係指特定數值或範圍(無「約」)之數值或範圍。如本文所用，術語「投與(administer/administering)」、「投藥(administration)」及類似術語係指可用於能夠實現藥物，例如效應T細胞活化劑(例如，小分子或抗體藥物接合物)向所需生物作用部位之遞送的方法。可與本文所述之劑及方法一起採用之投藥技術見於例如Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 現行版, Pergamon；及Remington's, Pharmaceutical Sciences, 現行版, Mack Publishing Co., Easton, Pa中。
術語「抗體-藥物接合物」及「ADC」可互換使用且係指例如共價連接至一或多種治療劑(在本文中有時稱作劑、藥物或活性醫藥成分)之抗體或其抗原結合片段。在本揭示案之一些態樣中，生物活性分子為抗體-藥物接合物。在一些態樣中，ADC包含共價連接至能夠活化效應T細胞之有效負荷之抗體或其抗原結合片段。具有能夠活化效應T細胞之有效負荷之ADC亦能夠活化一或多種其他細胞類型，例如，一或多種其他T細胞類型，只要該ADC能夠活化效應T細胞即可。
「保守胺基酸取代」為其中胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換之取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基家族已在此項技術中定義，包括鹼性側鏈(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，若多肽中之胺基酸經來自同一側鏈家族之另一胺基酸置換，則取代應視為保守的。在另一個態樣中，一系列胺基酸可經側鏈家族成員之次序及/或組成不同之結構上類似之系列保守置換。
如本文所用，術語「保守的」分別係指多核苷酸序列或多肽序列之核苷酸或胺基酸殘基，其為在所比較之兩個或更多個序列之相同位置中未發生改變之彼等。相對保守之核苷酸或胺基酸為在比序列中別處出現之核苷酸或胺基酸更加相關之序列當中保守之彼等。
在一些態樣中，若兩個或更多個序列彼此100%一致，則據稱該等序列為「完全保守的」或「一致的」。在一些態樣中，若兩個或更多個序列彼此至少約70%一致、至少約80%一致、至少約90%一致或至少約95%一致，則據稱該等序列為「高度保守的」。在一些態樣中，若兩個或更多個序列彼此至少約30%一致、至少約40%一致、至少約50%一致、至少約60%一致、至少約70%一致、至少約80%一致、至少約90%一致或至少約95%一致，則據稱該等序列為「保守的」。序列保守可適用於多核苷酸或多肽之整個長度，或可適用於其一部分、區域或特徵。
如本文所用，術語「連接」及「接合」可互換使用且各自係指兩個或更多個部分之共價或非共價連接，該等部分包含一或多種能夠活化效應T細胞之化合物及結合部分。在一些態樣中，連接或接合可包含連接子。
術語「胺基酸序列變異體」係指具有在一定程度上不同於原生序列多肽之胺基酸序列的多肽。通常，胺基酸序列變異體將與原生抗體之至少一個受體結合結構域或與原生受體之至少一個配位體結合結構域具有至少約70%序列一致性，且典型地，其將與此類受體或配位體結合結構域至少約80%，更典型地至少約90%序列同源。胺基酸序列變異體在原生胺基酸序列之胺基酸序列內之某些位置處具有取代、缺失及/或插入。胺基酸由慣用名稱、單字母及三字母代碼來指定。
「序列一致性」定義為在比對序列且必要時引入空位以達成最大序列一致性百分比之後胺基酸序列變異體中一致之殘基的百分比。用於比對之方法及電腦程式在此項技術中為熟知的。一種此類電腦程式為由Genentech, Inc.編寫之「Align 2」，該電腦程式於1991年12月10日與用戶文件一起在美國版權局(United States Copyright Office, Washington, D.C. 20559)歸檔。
術語「Fc受體」或「FcR」用於描述結合至抗體或其抗原結合片段之Fc區的受體。示例性FcR為原生序列人類FcR。此外，FcR可為結合IgG抗體或其抗原結合片段之FcR (γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體，包括對偶基因變異體及此等受體之選擇性剪接形式。FcγRII受體包括具有類似胺基酸序列且不同之處主要在於其細胞質結構域之FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB (「抑制受體」)。活化受體FcγRIIA在其細胞質結構域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質結構域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制模體(ITIM)。其他FcR在本文中由術語「FcR」涵蓋。該術語亦包括新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指在補體存在下分子使標靶溶解之能力。補體活化路徑係藉由補體系統之第一組分(C1q)與同源抗原復合之分子(例如，抗體或其抗原結合片段)之結合而起始。為評估補體活化，可進行CDC檢定。
來自任何脊椎動物物種之抗體或其抗原結合片段之「輕鏈」可基於其恆定結構域之胺基酸序列指定為兩種明顯不同之類型(稱為κ及λ)之一。
「分離之」抗體或其抗原結合片段為已經鑒定且自其天然環境之組分分離及/或回收之抗體或其抗原結合片段。其天然環境之污染物組分為將干擾抗體或其抗原結合片段之診斷或治療用途之材料，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在某些態樣中，抗體或其抗原結合片段將純化(1)至如藉由勞立法(Lowry method)確定之大於95重量%或大於99重量%之抗體或其抗原結合片段，(2)至足以獲得藉由使用氣相蛋白質定序儀測得之N端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度，或(3)至藉由在還原或非還原條件下使用考馬斯藍(Coomassie blue)或銀染色劑進行SDS-PAGE測得之均質性。分離之抗體或其抗原結合片段包括重組細胞內之原位抗體或其抗原結合片段，此係因為抗體或其抗原結合片段之天然環境之至少一種組分將不存在。通常，然而，分離之抗體或其抗原結合片段將藉由至少一個純化步驟製備。
「癌症」係指一大批以體內異常細胞之不受控生長為特徵之各種疾病。不受調控之細胞分裂及生長導致惡性腫瘤形成，該等惡性腫瘤侵入鄰近組織且亦可經淋巴系統或血流轉移至身體之遠端部分。如本文所用，「癌症」係指原發性、轉移性及復發性癌症。
如本文所用，術語「免疫反應」係指脊椎動物內針對外來作用物之生物反應，該反應保護生物體免受此等作用物及由其引起之疾病侵害。免疫反應係由免疫系統之細胞(例如，T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜酸性球、肥大細胞、樹突狀細胞或嗜中性球)及由此等細胞中之任一者或肝臟產生之可溶性巨分子(包括抗體、細胞介素及補體)之作用介導，該作用得以選擇性靶向、結合至、損傷、破壞及/或自脊椎動物體內消除侵入之病原體、受病原體感染之細胞或組織、癌細胞或其他異常細胞或者在自體免疫或病理炎症之情況下的正常人類細胞或組織。免疫反應包括例如活化或抑制T細胞，例如效應T細胞或Th細胞，諸如CD4 +或CD8 +T細胞，或抑制Treg細胞。如本文所用，術語「T細胞」及「T淋巴細胞」為可互換的且係指由胸腺產生或加工之任何淋巴細胞。在一些態樣中，T細胞為CD4+ T細胞。在一些態樣中，T細胞為CD8+ T細胞。在一些態樣中，T細胞為NKT細胞。
「個體」包括任何人類或非人類動物。術語「非人類動物」包括但不限於脊椎動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、犬，及嚙齒動物，諸如小鼠、大鼠及天竺鼠。在一些態樣中，個體為人。術語「個體」及「患者」在本文中可互換使用。
術語「治療有效量」或「治療有效劑量」係指提供所需生物、治療及/或預防結果之劑(例如，本文所揭示之接合物)的量。彼結果可為疾病之一或多種徵象、症狀或病因之減少、改善、緩和、減輕、延遲及/或緩解，或生物系統之任何其他所需改變。關於實體腫瘤，有效量包含足以引起腫瘤縮小及/或降低腫瘤生長速率(諸如抑制腫瘤生長)或防止或延遲其他不當細胞增殖之量。在一些態樣中，有效量為足以延遲腫瘤發展之量。在一些態樣中，有效量為足以防止或延遲腫瘤復發之量。可在一或多次投藥中投與有效量。組合物之有效量可例如(i)減少癌細胞之數目；(ii)減小腫瘤大小；(iii)抑制、阻礙、在一定程度上減緩且可終止癌細胞浸潤至外周器官中；(iv)抑制，亦即，在一定程度上減緩且可終止腫瘤轉移；(v)抑制腫瘤生長；(vi)防止或延遲腫瘤發生及/或復發；及/或(vii)在一定程度上緩解一或多種與癌症相關之症狀。
在一些態樣中，「治療有效量」為臨床上證實實現癌症之顯著減少或癌症(諸如晚期實體腫瘤)之進展減緩(消退)之接合物的量。可使用技術熟練之開業者已知之多種方法，諸如在臨床試驗期間之人類個體中、在預測人類中之功效的動物模型系統中，或藉由檢定活體外檢定中劑之活性來評價治療劑促進疾病消退之能力。
如本文所用，術語「照護標準」係指醫學專家公認為用於某種類型疾病之適當治療且由健康照護專業人員廣泛使用之治療。該術語可與以下術語中之任一者可互換使用：「最佳實踐」、「標準醫療照護」及「標準療法」。
舉例而言，「抗癌劑」促進個體之癌症消退或防止進一步腫瘤生長。在某些態樣中，治療有效量之藥物促進癌症消退達到消除癌症之程度。
關於治療之術語「有效的」及「有效性」包括藥理有效性及生理安全性。藥理有效性係指藥物促進患者之癌症消退的能力。生理安全性係指因投與藥物引起的在細胞、器官及/或生物體層面上之毒性或其他不良生理作用(不良作用)之水準。
如本文所用，術語「免疫檢查點抑制劑」係指完全或部分減少、抑制、干擾或調節一或多種檢查點蛋白之分子。檢查點蛋白調控T細胞活化或功能。眾多檢查點蛋白為已知的，諸如CTLA-4及其配位體CD80及CD86；及PD1與其配位體PDL1及PDL2。Pardoll, D.M., Nat Rev Cancer12(4):252-64 (2012)。此等蛋白質負責T細胞反應之共刺激或抑制性相互作用。免疫檢查點蛋白調控及維持生理免疫反應之自身耐受性以及持續時間及幅度。免疫檢查點抑制劑包括抗體及其抗原結合片段。
術語「治療(treat/treatment)」係指治療性處理及預防性或防禦性措施，其中目的在於預防或減緩(減輕)非所需之生理變化或病症，諸如癌症之發展或擴散。出於本揭示案之目的，有益或所需臨床結果包括但不限於症狀緩解、疾病程度減輕、疾病狀態穩定(亦即，不惡化)、疾病進展延遲或減緩、疾病狀態改善或緩和，及緩解(部分抑或完全)，無論為可偵測抑或不可偵測的。「治療」亦可意謂與不接受治療之預期存活期相比延長存活期。需要治療者包括已患有疾患或病症者以及易患有疾患或病症者或有待預防疾患或病症者。
在未特別指定之情況下，本文所述之化合物內之立體中心可為R或S立體化學且可如本揭示案中別處所述經取代。應了解，當未指定立體化學時，本揭示案涵蓋具有抑制Cbl-b及/或活化T細胞之能力的所有立體化學異構形式或其混合物。化合物之個別立體異構物可自含有掌性中心之市售起始物質以合成方式製備，或藉由製備鏡像異構產物之混合物，繼之以分離，諸如轉化為非鏡像異構物之混合物，繼之以分離或再結晶、層析技術或在掌性層析管柱上直接分離鏡像異構物來製備。特定立體化學之起始化合物為市售的或可藉由此項技術中已知之技術製得及解析。 II. Cbl-b 抑制劑
在某些態樣中，本揭示案提供式(I)之Cbl-b抑制劑： (I)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： n為0、1或2； X及Y各自獨立地為CH或N； Z係選自CH(CH 3)、O及SO 2；或 Z係選自CH(CH 3)、NH、N(CH 3)、O及SO 2； R 1係選自氫、-CN、-NHR z、-R a、-NR aR b、-OR a、-NHC(O)R a、-NHC(S)R a、-NHC(O)NHR a、-NHC(S)NHR a、-SR a、C 3-C 6環烷基及3至6員雜環基環；其中 R z係選自 ； R a及R b係獨立地選自氫、C 2-C 6烯基、C 1-C 6烷基、醯胺基(C 1-C 6烷基)、胺基(C 1-C 6烷基)、疊氮基(C 1-C 6烷基)、C 2-C 6炔基、羧基(C 1-C 6烷基)、氰基(C 1-C 6烷基)、視情況經氰基取代之C 3-C 6環烷基、二甲基胺基(C 1-C 6烷基)、3至6員雜環基環、3-6員雜環基(C 1-C 3烷基)、羥基(C 1-C 6烷基)、甲氧基(C 1-C 6烷基)、甲基胺基(C 1-C 6烷基)、NR cR d(C 1-C 6烷基)、HS(C 1-C 6烷基)及CH 3S(C 1-C 6烷基)，其中R c及R d係獨立地選自氫、C 2烯基羰基及甲基；或， R a及R b與其所連接之氮原子一起形成視情況含有一個額外氮原子之五或六員環，其中該環視情況經一個選自R a、-C(O)R a、-SO 2R a、疊氮基及氰基之基團取代； 其中各C 3-C 6環烷基、各3至6員雜環基環及該3至6員雜環基(C 1-C 3烷基)環之該雜環基部分視情況經一個、兩個或三個獨立地選自C 1-C 3烷基、C 2炔基、醯胺基、疊氮基、羧基、氰基、二甲基胺基、羥基、甲氧基、甲基胺基、HS-及CH 3S-之基團取代；且 R 2係選自 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ；其中 m為0、1、2或3； m''為0、1、2、3或4； B'為視情況含有一或兩個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的3-7員飽和或不飽和環；其中該環視情況經一或兩個獨立地選自-OH、-CH 2SH、CH 2SCH 3、-CH 2OH、-CH 2NH 2及-CH 2NHCH 3之取代基取代； 各R 500係獨立地選自氫、C 1-C 6烷基、鹵基、-OH及-CH 2OH；且 X 50係選自O、NH、NCH 3及S； R 3係選自氫、乙醯基、胺基、C 1-C 6烷基胺基、C 1-C 6烷基胺基甲基、C 1-C 6烷基羰基、胺基C 1-C 6烷基、胺基羰基、胺基甲基、羧基、氰基、C 3環烷基、甲醯基、羥基、羥基C 1-C 6烷基、甲氧基、噁唑基、-SH、-SCH 3、-SOCH 3、-SO 2CH 3、-SO(=NH)CH 3、四唑基、噻唑基及三氟甲基，其中該C 3環烷基視情況經羥基取代； R 4係選自氫、甲基、-CH 2OH、-CH 2SH及-CH 2SCH 3； R 5係選自氫、羥基、-CH 2SH、-CH 2SCH 3及甲基； 視情況前提條件為，當R 5為羥基或甲基，且R 4為氫時，則R 1不為C 3-C 6環烷基、3至6員雜環基環、羥基、羥基(C 1-C 6烷基)、-OR a，其中R a為C 1-C 6烷基、3至6員雜環基環或羥基(C 1-C 6烷基)；或-NR aR b，其中R a及R b係獨立地選自由氫、C 1-C 6烷基、C 3-C 6環烷基、羥基(C 1-C 6烷基)、3至6員雜環基環組成之群，或其中R a及R b與其所連接之氮原子一起形成視情況含有一個額外氮原子之五或六員環，其中該環視情況經一個選自C 1-C 6烷基或羥基(C 1-C 6烷基)之基團取代；且 R 6及R 6'係獨立地選自氫、環丙基、-CH 2OH、-CH 2SH、-CH 2SCH 3及-CH 2R 200，其中R 200為視情況含有一或兩個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的3-7員飽和或不飽和環。
在一些態樣中，R 4呈「R」構型。在一些態樣中，R 4呈「S」構型。在某些態樣中，本揭示案提供式(IA-1)之Cbl-b抑制劑： (IA-1)； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： n為0、1或2； X及Y各自獨立地為CH或N； Z係選自CH(CH 3)、O及SO 2； R 1係選自氫、-CN、-NHR z、-R a、-NR aR b、-OR a、-NHC(O)R a、-NHC(S)R a、-NHC(O)NHR a、-NHC(S)NHR a、-SR a、C 3-C 6環烷基及3至6員雜環基環；其中 R z係選自 ； R a及R b係獨立地選自氫、C 2-C 6烯基、C 1-C 6烷基、醯胺基(C 1-C 6烷基)、胺基(C 1-C 6烷基)、疊氮基(C 1-C 6烷基)、C 2-C 6炔基、羧基(C 1-C 6烷基)、氰基(C 1-C 6烷基)、C 3-C 6環烷基、二甲基胺基(C 1-C 6烷基)、3-6員雜環基環、3-6員雜環基(C 1-C 3)烷基、羥基(C 1-C 6烷基)、甲氧基(C 1-C 6烷基)、甲基胺基(C 1-C 6烷基)、NR cR d(C 1-C 6烷基)、HS(C 1-C 6烷基)及CH 3S(C 1-C 6烷基)，其中R c及R d係獨立地選自氫、C 2烯基羰基及甲基；或， R a及R b與其所連接之氮原子一起形成視情況含有一個額外氮原子之五或六員環，其中該環視情況經一個選自R a、-C(O)R a、-SO 2R a、疊氮基及氰基之基團取代； 其中各C 3-C 6環烷基、各3-6員雜環基環及該3-6員雜環基(C 1-C 3烷基)之該雜環基部分視情況經一個、兩個或三個獨立地選自C 1-C 3烷基、C 2炔基、醯胺基、疊氮基、羧基、氰基、二甲基胺基、羥基、甲氧基、甲基胺基、HS-及CH 3S-之基團取代；且 R 2為 或 ；其中 m為0、1、2或3； R 3係選自氫、乙醯基、胺基、C 1-C 6烷基胺基、C 1-C 6烷基胺基甲基、胺基C 1-C 6烷基、胺基羰基、胺基甲基、羧基、氰基、C 3環烷基、甲醯基、羥基、羥基C 1-C 6烷基、甲氧基、噁唑基、-SH、-SCH 3、四唑基、噻唑基及三氟甲基，其中該C 3環烷基視情況經羥基取代； R 4及R 6係獨立地選自氫、-CH 2SH及-CH 2SCH 3；且 R 5係選自羥基、-CH 2SH、-CH 2SCH 3及甲基； 視情況前提條件為，當R 5為羥基或甲基，且R 4為氫時，則R 1不為C 3-C 6環烷基、3至6員雜環基環、羥基、羥基(C 1-C 6烷基)、-OR a，其中R a為C 1-C 6烷基、3至6員雜環基環或羥基(C 1-C 6烷基)；或-NR aR b，其中R a及R b係獨立地選自由氫、C 1-C 6烷基、C 3-C 6環烷基、羥基(C 1-C 6烷基)、3至6員雜環基環組成之群，或其中R a及R b與其所連接之氮原子一起形成視情況含有一個額外氮原子之五或六員環，其中該環視情況經一個選自C 1-C 6烷基或羥基(C 1-C 6烷基)之基團取代。
在一些態樣中，R 4呈「R」構型。在一些態樣中，R 4呈「S」構型。
式(I)化合物不包括WO2019/148005、WO2020/210508及WO2021/021761中所揭示之彼等。
在一些態樣中，本揭示案提供式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中： X為N； Y為CH；且 R 2為 。
在一些態樣中，R 4呈「R」構型。在一些態樣中，R 4呈「S」構型。
在一些態樣中，本揭示案提供式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中Z為O。
在一些態樣中，本揭示案提供式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中Z為CH(CH 3)。
在一些態樣中，本揭示案提供式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中： R 3為三氟甲基； R 4及R 6為氫；且 R 5為甲基。
在一些態樣中，本揭示案提供式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R 1係選自-NR aR b、-NHC(O)R a、-NHC(S)NHR a及-SR a。
在一些態樣中，本揭示案提供式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R 1為-SCH 2CH 3。
在一些態樣中，本揭示案提供式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R 1為-NH(CH 2) 2CN。
在一些態樣中，本揭示案提供式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R 1為-NH(CH 2) 2N 3。
如本文所用，術語「乙醯基」係指-C(O)CH 3。
如本文所用，術語「C 2烯基」係指-CH=CH 2。
如本文所用，術語「C 2-C 6烯基」係指來源於含有兩個至六個碳原子且含有至少一個雙鍵之直鏈或支鏈烴之基團。
如本文所用，術語「C 2烯基羰基」係指經羰基連接至母體分子部分之C 2烯基。
如本文所用，本文所用之術語「C 1-C 6烷氧基」係指經氧原子連接至母體分子部分之C 1-C 6烷基。
如本文所用，術語「C 1-C 6烷氧基C 1-C 6烷基」係指經C 1-C 6烷基連接至母體分子部分之C 1-C 6烷氧基。
如本文所用，術語「C 1-C 6烷基」係指來源於含有一個至六個碳原子之直鏈或支鏈飽和烴之基團。
如本文所用，術語「C 1-C 6烷基胺基」係指-NHR，其中R為C 1-C 6烷基。
如本文所用，術語「C 1-C 6烷基胺基甲基」係指經亞甲基連接至母體分子部分之C 1-C 6烷基胺基。
如本文所用，術語「C 2炔基」係指 。
如本文所用，術語「C 2-C 6炔基」係指來源於含有兩個至六個碳原子且含有至少一個雙鍵之直鏈或支鏈烴之基團。
如本文所用，術語「醯胺基」係指-C(O)NH 2。
如本文所用，術語「醯胺基(C 1-C 6烷基)」係指經C 1-C 6烷基連接至母體分子部分之醯胺基。
如本文所用，術語「胺基」係指-NH 2。
如本文所用，術語「胺基(C 1-C 6烷基)」係指經C 1-C 6烷基連接至母體分子部分之胺基。
如本文所用，術語「胺基羰基」係指經羰基連接至母體分子部分之胺基。
如本文所用，術語「胺基甲基」係指經亞甲基連接至母體分子部分之胺基。
如本文所用，術語「疊氮基」係指-N 3。
如本文所用，術語「疊氮基(C 1-C 6烷基)」係指經C 1-C 6烷基連接至母體分子部分之疊氮基。
如本文所用，術語「羰基」係指-C(O)-。
如本文所用，術語「羧基」係指-CO 2H。
如本文所用，術語「羧基(C 1-C 6烷基)」係指經C 1-C 6烷基連接至母體分子部分之羧基。
如本文所用，術語「氰基」係指-CN。
如本文所用，術語「氰基(C 1-C 6烷基)」係指經C 1-C 6烷基連接至母體分子部分之氰基。
如本文所用，術語「C 3環烷基」係指環丙基。
如本文所用，術語「C 3-C 6環烷基」係指具有三個至六個碳原子及零個雜原子之飽和單環烴環系統。環烷基之代表性實例包括但不限於環丁基、環戊基及環己基。
如本文所用，術語「二甲基胺基(C 1-C 6烷基)」係指經C 1-C 6烷基連接至母體分子部分之二甲基胺基。
如本文所用，術語「甲醯基」係指-CHO。
如本文所用，術語「鹵基」係指F、Cl、Br或I。
如本文所用，術語「3至6員雜環基」係指含有一個、兩個、三個或四個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的三員、四員、五員或六員飽和或不飽和基團。3至6員雜環基之代表性實例包括但不限於氧雜環丁烷、吡咯啶、噻唑、吡啶及哌啶。
如本文所用，術語「3至6員雜環基(C 1-C 3烷基)」係指經C 1-C 3烷基連接至母體分子部分之3至6員雜環基環。
如本文所用，術語「羥基」係指-OH。
如本文所用，術語「羥基C 1-C 6烷基」係指經一個、兩個或三個羥基取代之C 1-C 6烷基。
如本文所用，術語「甲氧基(C 1-C 6烷基)」係指經C 1-C 6烷基連接至母體分子部分之甲氧基。
如本文所用，術語「甲基胺基(C 1-C 6烷基)」係指經C 1-C 6烷基連接至母體分子部分之甲基胺基。
如本文所用，術語「NR cR d(C 1-C 6烷基)」係指經C 1-C 6烷基連接至母體分子部分之NR cR d基團。R c及R d如本文所定義。
如本文所用，術語「HS(C 1-C 6烷基)」係指經C 1-C 6烷基連接至母體分子部分之-SH基團。
在一些態樣中，式(I)化合物為選自由以下組成之群的化合物： 、 及 。
在一些態樣中，式(I)化合物能夠治療個體之癌症。在一些態樣中，式(I)化合物能夠增加效應T細胞活性及/或效應T細胞增殖。在一些態樣中，式(I)化合物能夠增加效應T細胞向腫瘤細胞之遷移。在一些態樣中，式(I)化合物能夠減少效應T細胞耗竭。
在一些態樣中，式(I)化合物競爭性地抑制包含接合至Cbl-b抑制劑(參見WO20200264398中之實例54)之BODIPY-FL螢光團之探針與Cbl-b之結合，例如，如使用本文實例2中所述之檢定所評估。在一些態樣中，式(I)化合物以約1 nM至約5 nM之IC50競爭性地抑制。在一些態樣中，式(I)化合物以約5.01 nM至約20 nM之IC50競爭性地抑制。在一些態樣中，式(I)化合物以約20.01 nM至約100 nM之IC50競爭性地抑制。在一些態樣中，式(I)化合物以約100.01 nM至約1 mM之IC50競爭性地抑制。
在一些態樣中，式(I)化合物能夠增加IL-2自T細胞之分泌，例如，如使用本文實例3中所述之檢定所評估。在一些態樣中，式(I)化合物使IL-2分泌相對於背景增加約0.8至約1.4倍。在一些態樣中，式(I)化合物使IL-2分泌相對於背景增加約0.31至約0.79倍。在一些態樣中，式(I)化合物使IL-2分泌相對於背景增加約0.1至約0.3倍。
在一些態樣中，式(I)化合物能夠增加IFN-y自T細胞之分泌，例如，如使用本文實例3中所述之檢定所評估。在一些態樣中，式(I)化合物使IFN-y分泌相對於背景增加約1.1至約2倍。在一些態樣中，式(I)化合物使IFN-y分泌相對於背景增加約0.31至約1倍。在一些態樣中，式(I)化合物使IFN-y分泌相對於背景增加約0.1至約0.3倍。
在一些態樣中，式(I)化合物能夠增加CD69水準，例如，如使用本文實例3中所述之檢定所評估。在一些態樣中，式(I)化合物使CD69水準相對於背景增加約1.11至約1.5倍。在一些態樣中，式(I)化合物使CD69水準相對於背景增加約0.81至約1.10倍。在一些態樣中，式(I)化合物使CD69水準相對於背景增加約0.81至約1.1倍。在一些態樣中，式(I)化合物使CD69水準相對於背景增加約0.61至約0.8倍。在一些態樣中，式(I)化合物使CD69水準相對於背景增加約0.3至約0.6倍。
在一些態樣中，式(I)化合物與人類Cbl-b之His152相互作用。在一些態樣中，式(I)化合物在包含末端氮原子之R 1處包含基團。在一些態樣中，基團R 1之末端氮原子與Cbl-b之His152之間的距離在化合物與人類Cbl-b之晶體結構中為約1至約5埃。基團R 1之末端氮原子與Cbl-b之His152之間的距離在化合物與人類Cbl-b之共晶結構中為約1至約4埃。在一些態樣中，基團R 1之末端氮原子與Cbl-b之His152之間的距離在化合物與人類Cbl-b之共晶結構中為約2至約5埃。在一些態樣中，基團R 1之末端氮原子與Cbl-b之His152之間的距離在化合物與人類Cbl-b之共晶結構中為約2至約4埃。在一些態樣中，基團R 1之末端氮原子與Cbl-b之His152之間的距離在化合物與人類Cbl-b之共晶結構中為約2.5至約5埃。在一些態樣中，基團R 1之末端氮原子與Cbl-b之His152之間的距離在化合物與人類Cbl-b之共晶結構中為約2.5至約4埃。 III. 接合物
本揭示案提供接合物，該等接合物包含能夠特異性結合至效應T細胞之表面上之標靶的結合部分(例如，抗體或其抗原結合片段)及能夠活化效應T細胞之有效負荷。結合部分可直接連接至有效負荷或可經連接子連接至有效負荷。在某些態樣中，有效負荷可經共價鍵連接至連接子或結合部分。
在某些態樣中，在有效負荷為式(I)化合物之情況下： (I)； 式(I)化合物可經與基團R 1中之雜原子的共價鍵連接至連接子。
在一些態樣中，在有效負荷為式(Ia)化合物之情況下： (Ia)； 式(Ia)化合物可經與R 1、R 3、R 4、R 5、R 6或哌啶環之氮原子的共價鍵連接至連接子。
在一些態樣中，R 4呈「R」構型。在一些態樣中，R 4呈「S」構型。
在一些態樣中，在有效負荷為式(Ib)化合物之情況下： (Ib)； 式(Ib)化合物可經與R 1、R 3、R 4、R 5、R 6或哌啶環之氮原子的共價鍵連接至連接子。
在一些態樣中，R 4呈「R」構型。在一些態樣中，R 4呈「S」構型。
在一些態樣中，在有效負荷為式(Ic)化合物之情況下： (Ic)； 式(Ic)化合物可經與R 1、R 3、R 4、R 5、R 6或哌啶環之氮原子的共價鍵連接至連接子。
在一些態樣中，R 4呈「R」構型。在一些態樣中，R 4呈「S」構型。
在一些態樣中，在有效負荷為式(Id)化合物之情況下： (Id)， 式(Id)化合物可經與R 1、R 3、R 4、R 5、R 6、R 6'或哌啶環之氮原子的共價鍵連接至連接子。
在一些態樣中，R 4呈「R」構型。在一些態樣中，R 4呈「S」構型。
在一些態樣中，在有效負荷為式(Ie)化合物之情況下： (Ie) 式(Ie)化合物可經與R 1、R 3、R 4、R 500、B'或哌啶環之氮原子的共價鍵連接至連接子。
在一些態樣中，R 4呈「R」構型。在一些態樣中，R 4呈「S」構型。
在一些態樣中，在有效負荷為式(If)化合物之情況下： (If)， 式(If)化合物可經與R 1、R 3、R 4、B'或哌啶環之氮原子的共價鍵連接至連接子。
在一些態樣中，R 4呈「R」構型。在一些態樣中，R 4呈「S」構型。
在一些態樣中，在有效負荷為式(Ig)化合物之情況下： (Ig)， 式(Ig)化合物可經與R 1、R 3、R 4、R 500、B'或連接至B'之氮原子的共價鍵連接至連接子。
在一些態樣中，R 4呈「R」構型。在一些態樣中，R 4呈「S」構型。
在一些態樣中，在有效負荷為式(Ih)化合物之情況下： (Ih)， 式(Ig)化合物可經與R 1、R 3、R 4、B'或哌啶環之氮原子的共價鍵連接至連接子。
在一些態樣中，R 4呈「R」構型。在一些態樣中，R 4呈「S」構型。
在一些態樣中，在有效負荷為式(Ii)化合物之情況下： (Ii)， 式(Ii)化合物可經與R 1、R 3、R 4、B'或哌啶環之氮原子的共價鍵連接至連接子。
在一些態樣中，R 4呈「R」構型。在一些態樣中，R 4呈「S」構型。
在一些態樣中，在有效負荷為式(Ij)化合物之情況下： (Ij)， 式(Ii)化合物可經與R 1、R 3、R 4、B'或哌嗪環之任一氮原子的共價鍵連接至連接子。
在一些態樣中，R 4呈「R」構型。在一些態樣中，R 4呈「S」構型。
在一些態樣中，在有效負荷為式(Ik)化合物之情況下： (Ik)， 式(Ik)化合物可經與R 1、R 3、R 4、R 6、R 6'或哌啶環之氮原子的共價鍵連接至連接子。
在一些態樣中，R 4呈「R」構型。在一些態樣中，R 4呈「S」構型。
在一些態樣中，在有效負荷為式(Il)化合物之情況下： (Il)， 式(Ik)化合物可經與R 1、R 3、R 4、R 6、R 6'或哌啶環之氮原子的共價鍵連接至連接子。
在一些態樣中，R 4呈「R」構型。在一些態樣中，R 4呈「S」構型。
在一些態樣中，本文所提供之接合物包含能夠特異性結合至PD1之結合部分(例如，抗體或其抗原結合片段)及能夠活化效應T細胞之有效負荷。在一些態樣中，本文所提供之接合物包含能夠特異性結合至PD1之結合部分(例如，抗體或其抗原結合片段)及作為卡西塔斯B譜系淋巴瘤原癌基因b (Cbl-b)之抑制劑的有效負荷。
在一些態樣中，本文所提供之接合物包含能夠特異性結合至CD25 (IL2RA)之結合部分(例如，抗體或其抗原結合片段)及能夠活化效應T細胞之有效負荷。在一些態樣中，本文所提供之接合物包含能夠特異性結合至PD1之結合部分(例如，抗體或其抗原結合片段)及作為卡西塔斯B譜系淋巴瘤原癌基因b (Cbl-b)之抑制劑的有效負荷。
在一些態樣中，本文所提供之接合物包含能夠特異性結合至PD1之結合部分(例如，抗體或其抗原結合片段)及作為卡西塔斯B譜系淋巴瘤原癌基因b (Cbl-b)之抑制劑的有效負荷。
在一些態樣中，本文所提供之接合物具有式(II)：Bm-[L-P] a(II)，其中a為1至50之整數；P為有效負荷；L為連接子；且Bm為結合部分(例如，抗體或其抗原結合片段)。在一些態樣中，a為約1至約40。在一些態樣中，a為約1至約10。在一些態樣中，a為約2至約8。
在一些態樣中，本文提供一種組合物(例如，醫藥組合物)，該組合物包含本文所提供之接合物(例如，至少2個接合物)。在一些態樣中，組合物包含每個結合部分平均約1至約50個有效負荷。在一些態樣中，組合物包含每個結合部分平均約1至約10個有效負荷。在一些態樣中，組合物包含每個結合部分平均約2至約8個有效負荷。
在一些態樣中，本文所提供之接合物或組合物能夠治療個體之癌症。在一些態樣中，本文所提供之接合物或組合物能夠增加效應T細胞活性及/或效應T細胞增殖。在一些態樣中，本文所提供之接合物或組合物能夠增加效應T細胞向腫瘤細胞之遷移。在一些態樣中，本文所提供之接合物或組合物能夠減少效應T細胞耗竭。在一些態樣中，本文所提供之接合物或組合物能夠將能夠活化效應T細胞之有效負荷遞送至效應T細胞。
在一些態樣中，本文所提供之接合物或組合物能夠阻斷PD1/PDL1，例如，如使用本文實例7中所述之檢定所量測。在一些態樣中，接合物或組合物使得PD1/PDL1相對於背景阻斷約3.51至約5.49倍。在一些態樣中，接合物或組合物使得PD1/PDL1相對於背景阻斷約2.5至約3.5倍。在一些態樣中，接合物或組合物使得PD1/PDL1相對於背景阻斷約2至約2.49倍。在一些態樣中，接合物或組合物使得PD1/PDL1相對於背景阻斷約1.5至約1.99倍。在一些態樣中，接合物或組合物使得PD1/PDL1相對於背景阻斷約1.1至約1.49倍。
在一些態樣中，本文所提供之接合物或組合物能夠增加IFN-y自T細胞之分泌，例如，如使用本文實例7中所述之檢定所評估。在一些態樣中，接合物或組合物使IFN-y分泌相對於背景增加約1至約1.4倍。在一些態樣中，接合物或組合物使IFN-y分泌相對於背景增加約1至約1.49倍。在一些態樣中，接合物或組合物使IFN-y分泌相對於背景增加約1.5至約1.99倍。在一些態樣中，接合物或組合物使IFN-y分泌相對於背景增加約2至約2.49倍。在一些態樣中，接合物或組合物使IFN-y分泌相對於背景增加約2.5至約3倍。
在一些態樣中，本文所提供之接合物或組合物能夠增加IL-2自T細胞之分泌，例如，如使用本文實例7中所述之檢定所評估。在一些態樣中，接合物或組合物使IL-2分泌相對於背景增加約2至約4倍。在一些態樣中，接合物或組合物使IL-2分泌相對於背景增加約4至約4.99倍。在一些態樣中，接合物或組合物使IL-2分泌相對於背景增加約5至約5.99倍。在一些態樣中，接合物或組合物使IL-2分泌相對於背景增加約6至約8倍。 III.A. 有效負荷
本揭示案之接合物可包含連接至結合部分(亦即，「Bm」)之有效負荷。有效負荷可為能夠活化效應T細胞之分子(例如，小分子、肽或核酸)。在一些態樣中，有效負荷能夠促進效應T細胞之增殖、存活及/或遷移，促進效應細胞介素及/或細胞毒性介體自效應T細胞之產生，及/或減少效應T細胞之耗竭。
在一些態樣中，有效負荷為卡西塔斯B譜系淋巴瘤原癌基因b (Cbl-b)、造血祖細胞激酶1 (HPK-1)、磷脂肌醇-3-激酶γ (PI3Kγ)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)路徑蛋白(例如，MEK及/或B-raf)、CXCR4或CCR5之抑制劑，或toll樣受體7 (TLR-7)、toll樣受體8 (TLR-8)或干擾素基因刺激因子(STING)之促效劑。
在一些態樣中，有效負荷為Cbl-b抑制劑。在一些態樣中，本文所提供之接合物中之有效負荷為上述式(I)化合物，該化合物經共價鍵連接至結合部分或連接子。在一些態樣中，有效負荷係選自由化合物146、化合物147及化合物148組成之群。在一些態樣中，有效負荷為NX-1607。
在一些態樣中，有效負荷為toll樣受體7 (TLR-7)及/或toll樣受體8 (TLR-8)之促效劑。TLR-7及/或TLR-8之促效劑在此項技術中為已知的且包括例如T785 (如例如Ackerman S.等人, Nature Cancer 2: 18-33 (2021)中所論述，該文獻以全文引用之方式併入本文中)及MEDI9197 (如例如Huck B.等人, Angew. Chem. Int. Ed. 57: 4412-4428 (2018)中所論述，該文獻以全文引用之方式併入本文中)。
在一些態樣中，有效負荷為造血祖細胞激酶1 (HPK-1)之抑制劑。HPK-1抑制劑在此項技術中為已知的且在例如Linney, I.D.及Kaila N., Expert Opin. Ther. Pat. 31(10): 893-910 (2021)中評述，該文獻以全文引用之方式併入本文中。
在一些態樣中，有效負荷為STING促效劑。STING促效劑，諸如( R,R)-S2-CDA、ADU-S100、MIW815 (Aduro BioTech/Novartis)及環狀二核苷酸MK-1454，在此項技術中為已知的且在例如Huck B.等人, Angew. Chem. Int. Ed. 57: 4412-4428 (2018)中論述，該文獻以全文引用之方式併入本文中。
在一些態樣中，有效負荷為PI3Kγ抑制劑。PI3Kγ抑制劑，諸如IPI-549，在此項技術中為已知的且在例如Huck B.等人, Angew. Chem. Int. Ed. 57: 4412-4428 (2018)中論述，該文獻以全文引用之方式併入本文中。
在一些態樣中，有效負荷為促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)路徑蛋白(例如，MEK及/或B-raf)之抑制劑。MAPK路徑蛋白抑制劑，諸如曲美替尼(trametinib)、考比替尼(cobimetinib)、比美替尼(binimetinib)、達拉非尼(dabrafenib)、維莫非尼(vemurafenib)及恩考非尼(encorafenib)，在此項技術中為已知的且在例如Huck B.等人, Angew. Chem. Int. Ed. 57: 4412-4428 (2018)中論述，該文獻以全文引用之方式併入本文中。
在一些態樣中，有效負荷為CCR4及/或CCR5之抑制劑。CCR4及/或CCR5之抑制劑，諸如BL-8040、X4P-001、LY2510924及BMS-813160，在此項技術中為已知的且在例如Huck B.等人, Angew. Chem. Int. Ed. 57: 4412-4428 (2018)中論述，該文獻以全文引用之方式併入本文中。
在一些態樣中，本文所提供之接合物中之有效負荷為小分子、肽或核苷酸(例如，siRNA)。在一些態樣中，本文所提供之接合物中之有效負荷為小分子。在一些態樣中，本文所提供之接合物中之有效負荷為肽。示例性肽有效負荷在例如EP公開案第EP3254701號中揭示，該文獻以全文引用之方式併入本文中。在一些態樣中，本文所提供之接合物中之有效負荷為核苷酸(例如，siRNA)。示例性核苷酸有效負荷在例如美國公開案第US20150313931號中揭示，該文獻以全文引用之方式併入本文中。 III.B. 連接子
本揭示案之接合物可包含連接子。如本文所用，術語「連接子」係指能夠將結合部分(亦即，「Bm」)連接至有效負荷(「P」)之任何化學部分。
在某些態樣中，連接子可含有異雙官能基團。在本揭示案中，術語「異雙官能基團」係指將作為其一部分之連接子連接至結合部分之化學部分。異雙官能基團之特徵為在化學部分之任一端具有不同反應性基團。與結合部分之連接可經由化學或酶促接合或兩者之組合來實現。化學接合涉及結合部分表面上之可及胺基酸殘基與異雙官能基團上之反應手柄的受控反應。化學接合之實例包括但不限於離胺酸醯胺偶合、半胱胺酸偶合及經由藉由基因工程改造併入之非天然胺基酸之偶合，其中具有所需反應手柄之非天然胺基酸殘基安置於結合部分上。在酶促接合中，酶介導連接子與結合部分上之可及胺基殘基之偶合。酶促接合之實例包括但不限於使用分選酶之轉肽作用、使用微生物轉麩醯胺酸酶之轉肽作用及N-聚醣工程改造。亦可依序使用化學接合及酶促接合。舉例而言，酶促接合亦可用於將獨特反應手柄安置於結合部分上以在後續化學接合中利用。
在一些態樣中，異雙官能基團係選自： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 其中 為與連接子其餘部分之連接點；且 為與Bm之連接點。
在某些態樣中，連接子「L」為不可裂解的。如本文所用，術語「不可裂解連接子」為能夠以穩定共價方式將結合部分連接至有效負荷且不屬於本文中定義為「可裂解連接子」之種類的任何化學部分。因此，不可裂解連接子實質上對酸誘導之裂解、光誘導之裂解、生物還原性裂解、肽酶誘導之裂解、酯酶誘導之裂解及二硫鍵裂解具抗性。「實質上對裂解具抗性」意謂至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%、甚至更佳至少95%且最佳至少99%之接合物群體中處於連接子中或毗鄰連接子之化學鍵保持不可由酸、光不穩定裂解劑、生物還原劑、肽酶、酯酶或者化學或生理化合物裂解，在用上文所述劑中之任一者處理數小時至數天內，使可裂解連接子中之化學鍵(例如，二硫鍵)裂解。在某些態樣中，在有效負荷及/或結合部分可保持活性之條件下，連接子不易發生酸誘導之裂解、光誘導之裂解、生物還原性裂解、酶促裂解或類似裂解。自不可裂解連接子產生之ADC分解代謝物含有來自抗體之殘餘胺基酸。此等分解代謝物在其所遞送之靶細胞中可發揮獨特且意想不到之特性。
一般熟習此項技術者將容易區分不可裂解連接子與可裂解連接子。
不可裂解連接子之實例包括但不限於SMCC (4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯)連接子、丁二醯亞胺硫醚連接子及諸如以下之連接子： 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ； 其中： p為1至10之整數； p*為1至10之整數； Y係選自氫及C 1-C 6烷基； 為與有效負荷之連接點；且 為與結合部分之連接點。
在一些態樣中，連接子為： 、 及 ； 其中： p為1至10之整數； p*為1至10之整數； 為與有效負荷之連接點；且 為與結合部分之連接點。
在某些態樣中，連接子可為可裂解的。在一些態樣中，在有效負荷及/或結合部分可保持活性之條件下，連接子可易發生酸誘導之裂解、光誘導之裂解、生物還原性裂解、酶促裂解或類似裂解。
在一些態樣中，可裂解連接子可酶促裂解。在一些態樣中，可裂解連接子可由蛋白酶、肽酶、酯酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、醣苷酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、焦磷酸酶或脂酶裂解。
在一些態樣中，可裂解連接子可由蛋白酶裂解。蛋白酶之實例包括但不限於組織蛋白酶B、VAGP四肽及類似物。
在某些態樣中，可裂解連接子含有肽。在一些態樣中，肽為連接子之裂解位點，從而在暴露於細胞內蛋白酶(諸如溶酶體酶)後有助於藥物釋放。肽可經設計及最佳化以由特定酶，例如腫瘤相關蛋白酶、組織蛋白酶B、C及D或胞漿素蛋白酶進行酶促裂解。具有兩個胺基酸之肽之實例包括但不限於丙胺酸-丙胺酸(ala-ala)、纈胺酸-丙胺酸(val-ala)、纈胺酸-瓜胺酸(vc或val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(af或ala-phe)；苯丙胺酸-離胺酸(fk或phe-lys)；苯丙胺酸-高離胺酸(phe-homolys)；及N-甲基-纈胺酸-瓜胺酸(Me-val-cit)。具有三個胺基酸之肽之實例包括但不限於甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(gly-val-cit)、天冬胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(asp-val-cit)、丙胺酸-丙胺酸-天冬醯胺(ala-ala-asn)、丙胺酸-苯丙胺酸-離胺酸(ala-phe-lys)、甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸(gly-gly-phe)及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(gly-gly-gly)。具有四個胺基酸之肽之實例包括但不限於甘胺酸-甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(gly-gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸(gly-gly-phe-gly)。上述胺基酸組合亦可按相反次序存在(亦即，cit-val)。
本揭示案之肽可包含胺基酸殘基之L-異構物或D-異構物。術語「天然存在之胺基酸」係指Ala、Asp、Asx、Cit、Cys、Glu、Phe、Glx、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp及Tyr。「D-」指定具有「D」(右旋)構型之胺基酸，與天然存在之(「L-」)胺基酸中之構型相反。本文所述之胺基酸可市售購得(Sigma Chemical Co., Advanced Chemtech)或使用此項技術中已知之方法合成。
在某些態樣中，連接子(「L」)為選自以下之蛋白酶可裂解連接子： ； ； ； ； ； ； ； ； ；及 ； 其中： q為2至10之整數； Z 1、Z 2、Z 3及Z 4各自獨立地不存在或為L構型或D構型中天然存在之胺基酸殘基，前提條件為Z 1、Z 2、Z 3及Z 4中之至少兩者為胺基酸殘基； 為與有效負荷之連接點；且 為與結合部分之連接點。
在某些態樣中，Z 1、Z 2、Z 3及Z 4獨立地不存在或係選自由L-纈胺酸、D-纈胺酸、L-瓜胺酸、D-瓜胺酸、L-丙胺酸、D-丙胺酸、L-麩醯胺、D-麩醯胺、L-麩胺酸、D-麩胺酸、L-天冬胺酸、D-天冬胺酸、L-天冬醯胺、D-天冬醯胺、L-苯丙胺酸、D-苯丙胺酸、L-離胺酸、D-離胺酸及甘胺酸組成之群；前提條件為Z 1、Z 2、Z 3及Z 4中之至少兩者為胺基酸殘基。
在一些態樣中，Z 1不存在或為甘胺酸；Z 2不存在或係選自L-麩醯胺、D-麩醯胺、L-麩胺酸、D-麩胺酸、L-天冬胺酸、D-天冬胺酸、L-丙胺酸、D-丙胺酸及甘胺酸；Z 3係選自L-纈胺酸、D-纈胺酸、L-丙胺酸、D-丙胺酸、L-苯丙胺酸、D-苯丙胺酸及甘胺酸；且Z 4係選自L-丙胺酸、D-丙胺酸、L-瓜胺酸、D-瓜胺酸、L-天冬醯胺、D-天冬醯胺、L-離胺酸、D-離胺酸、L-苯丙胺酸、D-苯丙胺酸及甘胺酸。
在一些態樣中，L係選自 、 、 、 及 ， 其中： q為2至10之整數； 為與有效負荷之連接點；且 為與結合部分之連接點。
在一些態樣中，連接子為生物可還原的。生物可還原連接子利用細胞內區室對比血漿中之還原潛力之差異。存在於腫瘤細胞之細胞質中之還原麩胱甘肽比存在於正常細胞之細胞質中之還原麩胱甘肽高至多1000倍，且腫瘤細胞亦含有可促成細胞區室中之還原的酶。連接子使接合物在全身循環期間保持完整，且由高細胞內濃度之麩胱甘肽選擇性裂解，從而在腫瘤部位自無毒性前藥釋放活性藥物。
在一些態樣中，L為選自以下之生物可還原連接子： 其中： q為2至10之整數； R、R'、R''及R'''係各自獨立地選自氫、C 1-C 6烷氧基C 1-C 6烷基、(C 1-C 6) 2NC 1-C 6烷基及C 1-C 6烷基，或兩個偕位R基團與其所連接之碳原子一起可形成環丁基或環丙基環； 為與有效負荷之連接點；且 為與結合部分之連接點。
在一些態樣中，L係選自 及 ； 其中： q為2至10之整數； R、R'、R''及R'''係各自獨立地選自氫、C 1-C 6烷氧基C 1-C 6烷基、(C 1-C 6) 2NC 1-C 6烷基及C 1-C 6烷基，或兩個偕位R基團與其所連接之碳原子一起可形成環丁基或環丙基環； 為與有效負荷之連接點；且 為與結合部分之連接點。
在某些態樣中，L為 ； 其中Q*為可連接至結合部分之基團，且 為與有效負荷之連接點。
在一些態樣中，本揭示案提供式L**之連接子 L** 其中Q*為可連接至結合部分之基團，且 為與有效負荷之連接點。在一些態樣中，連接子可用於將任何有效負荷連接至任何結合部分。
在某些態樣中，連接子為酸可裂解的。酸可裂解連接子經特定設計以在血液循環之中性pH下保持穩定，但在細胞區室之酸性環境中經歷水解且釋放細胞毒性藥物。
在一些態樣中，L為選自以下之酸可裂解連接子： ； 其中： q為2至10之整數； 為與有效負荷之連接點；且 為與結合部分之連接點。
在某些態樣中，L為點擊釋放連接子，其中由四嗪或相關化合物在化學上觸發有效負荷之釋放。
在一些態樣中，L為選自以下之點擊釋放連接子： ； 其中： q為2至10之整數； 為與有效負荷之連接點；且 為與結合部分之連接點。
在某些態樣中，L為焦磷酸酶可裂解連接子。
在一些態樣中，L為焦磷酸酶可裂解連接子，該連接子為： ； 其中： q為2至10之整數； 為與有效負荷之連接點；且 為與結合部分之連接點。
在某些態樣中，L為β-葡萄糖醛酸苷酶可裂解連接子。
在一些態樣中，L為選自以下之β-葡萄糖醛酸苷酶可裂解連接子： 、 、 及 ； 其中： q為2至10之整數； ----不存在或為一鍵； 為與有效負荷之連接點；且 為與結合部分之連接點。
在某些態樣中，L為 ； 其中： q為2至10之整數； ----不存在或為一鍵； 為與有效負荷之連接點；且 為與結合部分之連接點。
在一些態樣中，與結合部分之連接點為結合部分中之半胱胺酸、離胺酸、酪胺酸或麩醯胺。在一些態樣中，與結合部分之連接點為半胱胺酸。在一些態樣中，與結合部分之連接點為離胺酸。在一些態樣中，與結合部分之連接點為酪胺酸。在一些態樣中，與結合部分之連接點為麩醯胺(例如，根據EU編號在抗體或其抗原結合部分之重鏈位置295處之麩醯胺)。
半胱胺酸或離胺酸可為經工程改造(亦即，對於結合部分而言內源)之半胱胺酸或離胺酸，例如，用於位點特異性接合。位點特異性接合係指經結合部分(例如，抗體或其抗原結合部分)上之獨特及規定位點連接。位點特異性接合在例如Zhou, Qun. 「Site-Specific Antibody Conjugation for ADC and Beyond.」 Biomedicines 第5(4)卷, 64. 2017年11月9日, doi:10.3390/ biomedicines5040064中論述，該文獻以全文引用之方式併入本文中。在一些態樣中，經工程改造之半胱胺酸根據EU編號在抗體或其抗原結合部分之重鏈位置S239及/或K334處。
作為連接點之半胱胺酸或離胺酸可為對於結合部分而言內源之半胱胺酸或離胺酸。 III.C. 結合部分
如本文所證明，結合部分(Bm)可將有效負荷，例如效應T細胞活化劑遞送至效應T細胞。
如本文所用，術語「結合部分」係指識別並結合至標靶之任何分子。能夠特異性結合效應T細胞表面上之標靶的結合部分係指識別並結合至存在於效應T細胞上之標靶的任何分子。標靶亦可存在於其他細胞(例如，其他T細胞)之表面上。
在一些態樣中，標靶在T細胞(包括效應T細胞)上表現，但不在並非T細胞之其他細胞上表現。在一些態樣中，標靶在效應T細胞上之表現與標靶在其他T細胞上之表現相比增強。舉例而言，在一些態樣中，標靶在效應T細胞上之表現在效應T細胞上比在調控性T細胞上高至少5倍。舉例而言，在一些態樣中，標靶在效應T細胞上之表現在效應T細胞上比在調控性T細胞上高至少10倍。舉例而言，在一些態樣中，標靶在效應T細胞上之表現在效應T細胞上比在調控性T細胞上高至少20倍。
在一些態樣中，標靶在調控性T細胞及效應T細胞上表現。在一些態樣中，在標靶在調控性T細胞及效應T細胞上表現之情況下，標靶在調控性T細胞上之表現高於在效應T細胞上之表現。在一些態樣中，在標靶在調控性T細胞及效應T細胞上表現之情況下，標靶在調控性T細胞上之表現高於在輔助T細胞上之表現。在一些態樣中，在標靶在調控性T細胞及效應T細胞上表現之情況下，標靶在調控性T細胞上之表現高於在效應T細胞上之表現且高於在輔助T細胞上之表現。
在一些態樣中，標靶為效應T細胞表面上之蛋白質、醣蛋白、脂質、醣脂或碳水化合物。在一些態樣中，標靶為蛋白質或醣蛋白。
除將化合物靶向特定細胞、組織或位置以外，結合部分亦可對效應T細胞具有治療作用(例如，增殖作用或遷移作用)。在結合部分與效應T細胞表面上之標靶特異性結合之後，效應T細胞可內化包含結合部分、連接至結合部分之有效負荷及/或標靶之接合物。
在某些態樣中，結合部分可包含或可經工程改造以包含至少一個化學反應性基團，諸如羧酸、胺、硫醇或化學反應性胺基酸部分或側鏈。
在一些態樣中，結合部分(Bm)可為結合至細胞表面受體或抗原之肽或蛋白質。
在某些態樣中，基團「Bm」可為抗體或其抗原結合片段。在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段為單株抗體或其抗原結合片段。抗體或其抗原結合片段之示例性序列在本文之表2-4中提供。抗體或其抗原結合片段可屬於任何免疫球蛋白類別，包括IgG、IgM、IgE、IgA及IgD，及其任何子類。在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段為IgG抗體。在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段為IgG1或IgG4抗體或其抗原結合片段。在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段為IgG1抗體或其抗原結合片段。在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段為IgG4抗體或其抗原結合片段。
可用之單株抗體或其抗原結合片段包括但不限於人類單株抗體或其抗原結合片段、人源化單株抗體或其抗原結合片段，或嵌合人類-小鼠(或其他物種)單株抗體或其抗原結合片段。人類單株抗體或其抗原結合片段可藉由此項技術中已知之眾多方法中之任一者製得。
抗體之可用抗原結合片段包括F(ab')2片段，該等片段含有可變區、輕鏈恆定區及重鏈CH1結構域，且可藉由抗體分子之胃蛋白酶消化而產生；及Fab片段，該等片段可藉由使F(ab')2片段之二硫橋還原而產生。其他可用之抗體及其抗原結合片段為重鏈與輕鏈二聚體，或其任何最小片段，諸如Fv或單鏈抗體(SCA)，或與抗體具有相同特異性之任何其他分子。
另外，包含人類及非人類部分且可使用標準重組DNA技術製得之重組抗體及其抗原結合片段，諸如嵌合及人源化單株抗體及其抗原結合片段，為可用之抗體及其抗原結合片段。
可使用不能表現內源免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因，但可表現人類重鏈及輕鏈基因之基因轉殖小鼠來產生完全人類抗體或其抗原結合片段。用所選抗原，例如本揭示案之多肽之全部或一部分以正常方式使基因轉殖小鼠免疫。可使用慣用融合瘤技術獲得針對抗原之單株抗體或其抗原結合片段。基因轉殖小鼠所帶有之人類免疫球蛋白轉殖基因在B細胞分化期間重排，且隨後經歷類別轉換及體細胞突變。因此，使用此種技術，有可能產生治療上可用之IgG、IgA、IgM及IgE抗體或其抗原結合片段。對於產生人類抗體或其抗原結合片段之此種技術之綜述，參見Lonberg及Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93)。其他人類抗體可自例如Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.)及Genpharm (San Jose, Calif.)購得。
可使用稱作「導向選擇」之技術產生識別所選抗原決定基之完全人類抗體或其抗原結合片段。在此種方法中，所選非人類單株抗體或其抗原結合片段，例如小鼠抗體或其抗原結合片段，用於引導識別相同抗原決定基之完全人類抗體或其抗原結合片段之選擇。亦可使用此項技術中已知之各種技術，包括噬菌體顯示文庫來產生人類抗體或其抗原結合片段。
抗體或其抗原結合片段可為抗體或其抗原結合片段之融合蛋白，例如，其中抗體或片段經由共價鍵(例如，肽鍵)在N端或C端融合至並非抗體或片段之另一種蛋白質(或其部分，諸如蛋白質之至少10、20或50個胺基酸之部分)之胺基酸序列。抗體或其抗原結合片段可在恆定結構域之N端共價連接至其他蛋白質。
抗體及其抗原結合片段包括經修飾，亦即，藉由共價連接任何類型之分子的類似物及衍生物，只要此種共價連接允許抗體或抗原結合片段保留其抗原結合免疫特異性即可。舉例而言但不受限制，抗體及其抗原結合片段之衍生物及類似物包括已進一步經修飾之彼等，例如，藉由醣基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、藉由已知之保護基/阻隔基衍生化、蛋白水解性裂解、連接至細胞抗體單元或其他蛋白質等。可藉由已知技術進行眾多化學修飾中之任一者，該等技術包括但不限於特定化學裂解、乙醯化、甲醯化、在衣黴素(tunicamycin)存在下之代謝合成等。另外，類似物或衍生物可含有一或多種非天然胺基酸。
接合物中之抗體或其抗原結合片段可包括在與Fc受體相互作用之胺基酸殘基中具有修飾(例如，取代、缺失或添加)之抗體或其抗原結合片段。特別地，抗體或其抗原結合片段包括在鑒定為涉及抗Fc結構域與FcRn受體之間的相互作用之胺基酸殘基中具有修飾之抗體或其抗原結合片段。能夠特異性結合至效應T細胞表面上之標靶的抗體或其抗原結合片段可購得或藉由熟習此項技術者已知之任何方法產生，諸如化學合成或重組表現技術。編碼能夠特異性結合至效應T細胞表面上之標靶的抗體或其抗原結合片段之核苷酸序列可獲自例如GenBank資料庫或其類似資料庫、文獻出版物，或藉由常規選殖及定序獲得。
在某些態樣中，接合物之抗體或其抗原結合片段可為單株抗體或其抗原結合片段，例如，鼠類單株抗體或其抗原結合片段、嵌合抗體或其抗原結合片段或人源化抗體或其抗原結合片段。在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段可為例如Fab片段。
如本文所提供，結合至效應T細胞表面上之標靶(抗原)的結合部分(例如，抗體或其抗原結合片段)可接合至有效負荷。舉例而言，此種結合部分(Bm)，例如抗體或其抗原結合片段，可結合至PD1、CD25 (IL2RA)或CD7。
在一些態樣中，結合部分(Bm)，例如抗體或其抗原結合片段，可特異性結合CD25(亦稱為介白素-2受體次單位α (IL2RA))。此類結合部分在本文中亦稱作「抗IL2RA結合部分」、「IL2RA結合部分」、「抗CD25結合部分」或「CD25結合部分」，例如，抗IL2RA抗體或其抗原結合片段、IL2RA抗體或其抗原結合片段、抗CD25抗體或其抗原結合片段或CD25抗體或其抗原結合片段。抗IL2RA或抗CD25抗體或其抗原結合片段之示例性序列在表2中提供。在一些態樣中，抗IL2RA或抗CD25抗體或其抗原結合片段分別包含SEQ ID NO:4及5之重鏈及輕鏈CDR序列(例如，Kabat、Chothia或AbM定義之CDR)(例如，SEQ ID NO:4之胺基酸31-35、50-66及99-111以及SEQ ID NO:5之胺基酸24-34、50-56及89-97)。在一些態樣中，抗IL2RA或抗CD25抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之可變重鏈及/或包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之可變輕鏈。在一些態樣中，抗IL2RA或抗CD25抗體或其抗原結合片段分別包含SEQ ID NO:6及7之重鏈及輕鏈CDR序列(例如，Kabat、Chothia或AbM定義之CDR) (例如，SEQ ID NO:6之胺基酸31-35、50-65及98-108以及SEQ ID NO:7之胺基酸24-33、49-55及88-96)。在一些態樣中，抗IL2RA或抗CD25抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之可變重鏈及/或包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列之可變輕鏈。在一些態樣中，抗IL2RA或抗CD25抗體或其抗原結合片段分別包含SEQ ID NO:8及9之重鏈及輕鏈CDR序列(例如，Kabat、Chothia或AbM定義之CDR)(例如，SEQ ID NO:8之胺基酸31-35、50-65及98-108以及SEQ ID NO:9之胺基酸24-33、49-55及88-96)。在一些態樣中，抗IL2RA或抗CD25抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之可變重鏈及/或包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之可變輕鏈。在一些態樣中，抗IL2RA或抗CD25抗體或其抗原結合片段分別包含SEQ ID NO:16及17之重鏈及輕鏈CDR序列(例如，Kabat、Chothia或AbM定義之CDR) (例如，SEQ ID NO:16之胺基酸31-35、50-66及99-103以及SEQ ID NO:17之胺基酸24-39、55-61及94-102)。在一些態樣中，抗IL2RA或抗CD25抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列之可變重鏈及/或包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之可變輕鏈。
在一些態樣中，結合部分(Bm)，例如抗體或其抗原結合片段，可特異性結合PD1。此類結合部分在本文中亦稱作「抗PD1結合部分」或「PD1結合部分」，例如，抗PD1抗體或其抗原結合片段或PD1抗體或其抗原結合片段。抗PD1抗體或其抗原結合片段之示例性序列在表3中提供。在一些態樣中，抗PD1抗體或其抗原結合片段分別包含SEQ ID NO:10及11之重鏈及輕鏈CDR序列(例如，Kabat、Chothia或AbM定義之CDR)(例如，SEQ ID NO:10之胺基酸31-35、50-66及99-109以及SEQ ID NO:11之胺基酸24-38、54-60及93-101)。在一些態樣中，抗PD1抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之可變重鏈及/或包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列之可變輕鏈。在一些態樣中，抗PD1抗體或其抗原結合片段分別包含SEQ ID NO:12及13之重鏈及輕鏈CDR序列(例如，Kabat、Chothia或AbM定義之CDR) (例如，SEQ ID NO:12之胺基酸31-35、50-66及99-102以及SEQ ID NO:13之胺基酸24-34、50-56及89-97)。在一些態樣中，抗PD1抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之可變重鏈及/或包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之可變輕鏈。在一些態樣中，抗PD1抗體或其抗原結合片段分別包含SEQ ID NO:18及19之重鏈及輕鏈CDR序列(例如，Kabat、Chothia或AbM定義之CDR) (例如，SEQ ID NO:18之胺基酸31-35、50-68及101-110以及SEQ ID NO:19之胺基酸24-33、49-55及88-100)。在一些態樣中，抗PD1抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之可變重鏈及/或包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列之可變輕鏈。在一些態樣中，抗PD1抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之重鏈及/或包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列之輕鏈。
在一些態樣中，結合部分(Bm)，例如抗體或其抗原結合片段，可特異性結合CD7。此類結合部分在本文中亦稱作「抗CD7結合部分」或「CD7結合部分」，例如，抗CD7抗體或其抗原結合片段或CD7抗體或其抗原結合片段。抗CD7抗體或其抗原結合片段之示例性序列在表4中提供。在一些態樣中，抗CD7抗體或其抗原結合片段分別包含SEQ ID NO:14及15之重鏈及輕鏈CDR序列(例如，Kabat、Chothia或AbM定義之CDR) (例如，SEQ ID NO:14之胺基酸31-35、50-66及99-112以及SEQ ID NO:15之胺基酸23-36、52-58及91-99)。在一些態樣中，抗CD7抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之可變重鏈及/或包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列之可變輕鏈。
在一些態樣中，抗體或其抗原結合部分包含恆定區。連接子可連接至恆定區中之胺基酸。在一些態樣中，抗體或其抗原結合部分包含CH1結構域。連接子可連接至CH1結構域中之胺基酸。在一些態樣中，抗體或其抗原結合部分包含CH2結構域。連接子可連接至CH2結構域中之胺基酸。在一些態樣中，抗體或其抗原結合部分包含CH3結構域。連接子可連接至CH3結構域中之胺基酸。在一些態樣中，抗體或其抗原結合部分包含CL結構域。連接子可連接至CL結構域中之胺基酸。
在一些態樣中，恆定區、CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域或CL結構域為經工程改造之恆定區、CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域或CL結構域。
在一些態樣中，抗體或其抗原結合部分包含重鏈恆定區，例如，人類重鏈恆定區。連接子可連接至重鏈恆定區，例如人類重鏈恆定區中之胺基酸。在一些態樣中，抗體或其抗原結合部分包含IgG重鏈恆定區，例如，人類IgG重鏈恆定區。連接子可連接至IgG重鏈恆定區，例如人類IgG重鏈恆定區中之胺基酸。在一些態樣中，抗體或其抗原結合部分包含IgG1重鏈恆定區，例如，人類IgG1重鏈恆定區。連接子可連接至IgG1重鏈恆定區，例如人類IgG1重鏈恆定區中之胺基酸。在一些態樣中，抗體或其抗原結合部分包含IgG4重鏈恆定區。連接子可連接至IgG4重鏈恆定區，例如人類IgG4重鏈恆定區中之胺基酸。
在一些態樣中，抗體或其抗原結合部分包含輕鏈恆定區，例如，人類輕鏈恆定區。連接子可連接至輕鏈恆定區，例如人類輕鏈恆定區中之胺基酸。在一些態樣中，抗體或其抗原結合部分包含κ輕鏈恆定區，例如，人類κ輕鏈恆定區。連接子可連接至κ輕鏈恆定區，例如人類κ輕鏈恆定區中之胺基酸。在一些態樣中，抗體或其抗原結合部分包含γ輕鏈恆定區，例如，人類γ輕鏈恆定區。連接子可連接至γ輕鏈恆定區，例如人類γ輕鏈恆定區中之胺基酸。
在一些態樣中，抗體或其抗原結合部分根據EU編號在重鏈位置S239處包含經工程改造之半胱胺酸。連接子可連接至S239C。在一些態樣中，抗體或其抗原結合部分根據EU編號在重鏈位置K334處包含經工程改造之半胱胺酸。連接子可連接至K334C。
因此，抗體或其抗原結合部分可包含SEQ ID NO:20-24中之任一者之重鏈恆定區。 IgG1重鏈恆定區 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:20) IgG1 N297A恆定區(CH1-鉸鏈-CH2-CH3) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:21) IgG4 S228P恆定區(CH1-鉸鏈-CH2-CH3) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO:22) IgG1重鏈恆定區S239C ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP C VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:23) IgG1重鏈恆定區K334C ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE C TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:24)
在一些態樣中，抗體或其抗原結合部分可包含SEQ ID NO:28之重鏈恆定區。 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:28)
在一些態樣中，連接子可連接至根據EU編號之抗體或其抗原結合部分之重鏈Q295。
在本揭示案中，基團「Bm」可接合至多於一種能夠活化效應T細胞之化合物。在一些態樣中，「Bm」可接合至1至10種化合物。在一些態樣中，「Bm」可接合至1至9種化合物。在一些態樣中，「Bm」可接合至1至8種化合物。在一些態樣中，「Bm」可接合至1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種化合物。在一些態樣中，「Bm」可接合至7或8種化合物。在一些態樣中，「Bm」接合至5種化合物。在一些態樣中，「Bm」接合至6種化合物。在一些態樣中，「Bm」接合至7種化合物。在一些態樣中，「Bm」接合至8種化合物。在一些態樣中，「Bm」接合至9種化合物。 IV. 組合物及使用方法
本文所述之接合物及/或化合物可呈醫藥學上或醫藥學上可接受之鹽形式。在一些態樣中，此類鹽來源於無機或有機酸或鹼。
適合酸加成鹽之實例包括乙酸鹽、己二酸鹽、海藻酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡萄糖庚酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙烷磺酸鹽、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、丁二酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽及十一烷酸鹽。
適合鹼加成鹽之實例包含銨鹽；鹼金屬鹽，諸如鈉鹽及鉀鹽；鹼土金屬鹽，諸如鈣鹽及鎂鹽；與有機鹼之鹽，諸如二環己胺鹽、 N-甲基-D-還原葡糖胺；及與諸如精胺酸、離胺酸及類似物之胺基酸之鹽。
舉例而言，Berge列出以下FDA核准之市售鹽：陰離子類乙酸鹽、苯磺酸鹽(besylate/ benzenesulfonate)、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、酒石酸氫鹽、溴化物、依地酸鈣(calcium edetate) (乙二胺四乙酸鹽)、樟腦磺酸鹽(camsylate/camphorsulfonate)、碳酸鹽、氯化物、檸檬酸鹽、二鹽酸鹽、依地酸鹽(乙二胺四乙酸鹽)、乙二磺酸鹽(1,2-乙烷二磺酸鹽)、月桂基硫酸鹽(estolate/lauryl sulfate)、乙烷磺酸鹽(esylate/ethanesulfonate)、反丁烯二酸鹽、葡萄糖庚酸鹽(gluceptate/ glucoheptonate)、葡萄糖酸鹽、麩胺酸鹽、羥乙醯胺基苯胂酸鹽(glycollylarsanilate/glycollamidophenylarsonate)、己基間苯二酚鹽、哈胺(hydrabamine)( N,N'-二(去氫樅基)乙二胺)、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、羥基萘甲酸鹽、碘化物、依西酸鹽(isethionate)(2-羥基乙烷磺酸鹽)、乳酸鹽、乳糖酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、杏仁酸鹽、甲烷磺酸鹽(mesylate/methanesulfonate)、甲基溴化物、甲基硝酸鹽、甲基硫酸鹽、黏液酸鹽、萘磺酸鹽(2-萘磺酸鹽)、硝酸鹽、雙羥萘酸鹽(恩波酸鹽(embonate))、泛酸鹽、磷酸鹽/二磷酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、次乙酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、鞣酸鹽、酒石酸鹽、茶氯酸鹽(8-氯茶鹼鹽)及三乙基碘化物；有機陽離子類苯乍生(benzathine)( N,N'-二苯甲基乙二胺)、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺( N-甲基還原葡糖胺)及普魯卡因(procaine)；及金屬陽離子類鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉及鋅。
Berge另外列出以下非FDA核准之市售(在美國以外)鹽：陰離子類己二酸鹽、海藻酸鹽、胺基水楊酸鹽、脫水亞甲基檸檬酸鹽、檳榔鹼、天冬胺酸鹽、硫酸氫鹽、丁基溴化物、樟腦酸鹽、二葡萄糖酸鹽、二氫溴酸鹽、二丁二酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、氫氟酸鹽、氫碘酸鹽、亞甲基雙(水楊酸鹽)、萘二磺酸鹽(1,5-萘二磺酸鹽)、草酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、苯乙基巴比妥酸鹽、苦味酸鹽、丙酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽及十一烷酸鹽；有機陽離子類苯那敏(benethamine)( N-苯甲基苯乙胺)、克立咪唑(clemizole) (1-對氯苯甲基-2-吡咯啶-1'-基甲基苯并咪唑)、二乙胺、哌嗪及三木甲胺(tromethamine) (參(羥甲基)胺基甲烷)；及金屬陽離子類鋇及鉍。
包含本文所述之接合物之醫藥組合物亦可包含適合之載劑、賦形劑及助劑，該等劑可能取決於投藥模式而不同。
在一些態樣中，可將醫藥組合物調配成適合之非經腸劑型。可藉由此項技術中已知之各種方法製備該等調配物。可向血流中直接投與醫藥組合物。用於非經腸投藥之適合方式包括靜脈內投藥。
非經腸組合物典型地為可含有諸如鹽、碳水化合物及緩衝劑之賦形劑的水溶液。然而，亦可將組合物調配成無菌非水溶液或乾燥形式以與諸如無菌無熱原水之適合媒劑聯合使用。
可使用熟習此項技術者熟知之標準技術容易地實現在無菌條件下，例如藉由凍乾製備非經腸組合物。
可將非經腸調配物與非經腸劑型中所用之其他適合醫藥學上可接受之賦形劑(諸如但不限於防腐劑)混合。
本文所述之化合物及接合物可用於治療將受益於免疫反應增加之各種疾患，包括但不限於癌症。本揭示案之某些化合物及接合物在功效表現、藥物動力學(例如，吸收、分佈、代謝、排洩)、可溶性(例如，水溶性)、與其他藥劑之相互作用(例如，藥物代謝酶抑制作用)、安全性(例如，急性毒性、慢性毒性、遺傳毒性、生殖毒性、心臟毒性、致癌性、中樞毒性)及/或穩定性(例如，化學穩定性、對酶之穩定性)方面可為優越的，且可用作藥劑。因此，本文提供本揭示案之化合物及接合物，以及包含其之組合物，用於製備藥劑，例如，用以治療將受益於免疫反應增加之疾患(包括但不限於癌症)的藥劑。本文亦提供本揭示案之化合物及接合物，以及包含其之組合物，用於治療將受益於免疫反應增加之疾患，包括但不限於癌症。
本揭示案之化合物及接合物可用作藥劑，諸如用於預防或治療疾病，例如癌症之劑。在一些態樣中，癌症為實體腫瘤癌症。在一些態樣中，癌症為血液惡性病。在一些態樣中，癌症係選自由以下組成之群：不可切除性或轉移性微衛星高度不穩定(MSI-H)實體腫瘤、錯配修復缺陷(dMMR)實體腫瘤、黑色素瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、惡性胸膜間皮瘤、腎細胞癌(RCC)、典型霍奇金淋巴瘤(classical Hodgkin lymphoma，cHL)、頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)、尿路上皮癌、結腸直腸癌、肝細胞癌(HCC)、食管癌、胃癌、胃食管連接部癌、食管癌、食管腺癌及頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、原發性縱隔大b細胞淋巴瘤(PMBCL)、微衛星高度不穩定或錯配修復缺陷癌症、微衛星高度不穩定或錯配修復缺陷結腸直腸癌(CRC)、胃癌、子宮頸癌、默克爾細胞癌(merkel cell carcinoma，MCC)、子宮內膜癌、腫瘤突變高負荷(TMB-H)癌症、皮膚鱗狀細胞癌(cSCC)、三陰性乳癌(TNBC)及基底細胞癌(BCC)。
在一些態樣中，癌症對於抗PD1療法具有抵抗性。抗PD1療法可為例如納武單抗、派姆單抗及/或西米普利單抗。
在一些態樣中，癌症對於抗PD1療法具有難治性。抗PD1療法可為例如納武單抗、派姆單抗及/或西米普利單抗。
在一些態樣中，癌症對於抗PD1療法具有敏感性。抗PD1療法可為例如納武單抗、派姆單抗及/或西米普利單抗。
在一些態樣中，癌症對於抗PDL1療法具有抵抗性。抗PDL1療法可為例如德瓦魯單抗、阿特珠單抗及/或阿維魯單抗。
在一些態樣中，癌症對於抗PDL1療法具有難治性。抗PDL1療法可為例如德瓦魯單抗、阿特珠單抗及/或阿維魯單抗。
在一些態樣中，癌症對於抗PDL1療法具有敏感性。抗PDL1療法可為例如德瓦魯單抗、阿特珠單抗及/或阿維魯單抗。
在一些態樣中，本揭示案之化合物或接合物可與標準照護療法，例如一或多種治療劑(例如，抗癌劑及/或免疫調節劑)組合使用。因此，在某些態樣中，本文所揭示之治療腫瘤之方法包括投與本揭示案之化合物或接合物與一或多種額外治療劑之組合。在一些態樣中，本揭示案之化合物或接合物可與一或多種抗癌劑組合使用，使得可靶向免疫路徑之多個要素。在一些態樣中，抗癌劑包括免疫檢查點抑制劑(亦即，阻斷經由特定免疫檢查點路徑之信號傳導)。可用於本發明方法中之免疫檢查點抑制劑之非限制性實例包括CTLA-4拮抗劑(例如，抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段)、PD1拮抗劑(例如，抗PD1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段)、TIM-3拮抗劑(例如，抗TIM-3抗體或其抗原結合片段)，或其組合。免疫檢查點抑制劑之額外實例包括T細胞免疫球蛋白及ITIM結構域(TIGIT)拮抗劑、T細胞活化V結構域Ig抑制因子(VISTA)拮抗劑、B及T細胞淋巴細胞衰減因子(BTLA)拮抗劑及淋巴細胞活化基因-3 (LAG-3)拮抗劑。
在一些態樣中，在投與額外治療劑之前或之後向個體投與本揭示案之化合物或接合物。在其他態樣中，與額外治療劑同時向個體投與本揭示案之化合物或接合物。在某些態樣中，可作為單一組合物於醫藥學上可接受之載劑中同時投與本揭示案之化合物或接合物及額外治療劑。在其他態樣中，作為獨立組合物同時投與本揭示案之化合物或接合物及額外治療劑。
本揭示案之化合物及接合物可用作藥劑，諸如用於預防或治療將受益於免疫反應增加之額外疾患的劑。將受益於免疫反應增加之疾患包括例如感染(例如，病毒、細菌及/或寄生蟲感染)、免疫抑制性疾病或病症及多發性硬化症。
在一些態樣中，可用本揭示案之化合物接合物治療之個體為非人類動物，諸如大鼠或小鼠。在一些態樣中，可治療之個體為人。
在一些態樣中，本揭示案之化合物或接合物可用於增加免疫細胞活性(例如，自然殺手(NK)細胞活性或T細胞活性，包括效應T細胞活性)，例如，藉由使免疫細胞與本揭示案之化合物或接合物接觸。接觸可在活體外或活體內。在活體內接觸之態樣中，接觸可在個體中，例如，患有將受益於免疫反應增加之癌症或另一種疾患之人類個體。免疫細胞活性增加可治療將受益於免疫反應增加之癌症或其他疾患。
在一些態樣中，本揭示案之化合物或接合物可用於增加免疫細胞(例如，NK細胞或T細胞，包括效應T細胞)增殖，例如，藉由使免疫細胞與本揭示案之化合物或接合物接觸。接觸可在活體外或活體內。在活體內接觸之態樣中，接觸可在個體中，例如，患有將受益於免疫反應增加之癌症或另一種疾患之人類個體。免疫細胞增殖增加可治療將受益於免疫反應增加之癌症或其他疾患。
在一些態樣中，本揭示案之化合物或接合物可用於增加免疫細胞(例如，NK細胞或T細胞，包括效應T細胞)向腫瘤細胞之遷移，例如，藉由使免疫細胞與本揭示案之化合物或接合物接觸。接觸可在活體外或活體內。在活體內接觸之態樣中，接觸可在個體中，例如，患有癌症之人類個體。免疫細胞遷移增加可治療癌症。
在一些態樣中，本揭示案之化合物或接合物可用於減少免疫細胞(例如，NK細胞或T細胞，包括效應T細胞)之耗竭，例如，藉由使免疫細胞與本揭示案之化合物或接合物接觸。接觸可在活體外或活體內。在活體內接觸之態樣中，接觸可在個體中，例如，患有將受益於免疫反應增加之癌症或另一種疾患之人類個體。免疫細胞耗竭減少可治療將受益於免疫反應增加之癌症或其他疾患。
在一些態樣中，本揭示案之化合物或接合物可用於增加IFN-y或IL-2自免疫細胞(例如，NK細胞或T細胞，包括效應T細胞)之分泌，例如，藉由使免疫細胞與本揭示案之化合物或接合物接觸。接觸可在活體外或活體內。在活體內接觸之態樣中，接觸可在個體中，例如，患有將受益於免疫反應增加之癌症或另一種疾患之人類個體。IFN-y或IL-2之分泌增加可治療將受益於免疫反應增加之癌症或其他疾患。
在上述態樣中之一些態樣中，免疫細胞為效應T細胞。因此，在一些態樣中，本揭示案之化合物或接合物可用於增加效應T細胞活性，例如，藉由使效應T細胞與本揭示案之化合物或接合物接觸。接觸可在活體外或活體內。在活體內接觸之態樣中，接觸可在個體中，例如，患有癌症之人類個體。效應T細胞活性增加可治療癌症。
在一些態樣中，本揭示案之化合物或接合物可用於增加效應T細胞增殖，例如，藉由使效應T細胞與本揭示案之化合物或接合物接觸。接觸可在活體外或活體內。在活體內接觸之態樣中，接觸可在個體中，例如，患有癌症之人類個體。效應T細胞增殖增加可治療癌症。
在一些態樣中，本揭示案之化合物或接合物可用於增加效應T細胞向腫瘤細胞之遷移，例如，藉由使效應T細胞與本揭示案之化合物或接合物接觸。接觸可在活體外或活體內。在活體內接觸之態樣中，接觸可在個體中，例如，患有癌症之人類個體。效應T細胞遷移增加可治療癌症。
在一些態樣中，本揭示案之化合物或接合物可用於減少效應T細胞耗竭，例如，藉由使效應T細胞與本揭示案之化合物或接合物接觸。接觸可在活體外或活體內。在活體內接觸之態樣中，接觸可在個體中，例如，患有癌症之人類個體。效應T細胞耗竭減少可治療癌症。
在一些態樣中，本揭示案之接合物可用於將能夠活化效應T細胞之有效負荷遞送至效應T細胞，例如，藉由使效應T細胞與本揭示案之接合物接觸。接觸可在活體外或活體內。在活體內接觸之態樣中，接觸可在個體中，例如，患有癌症之人類個體。有效負荷向效應T細胞之遞送可治療癌症。 V. 製備接合物之方法
本揭示案進一步提供製備接合物之方法，該過程包括使結合部分與如本文所述之有效負荷或有效負荷-連接子前驅物反應。如本文所用，術語「連接子前驅物」係指當與如本文所述之結合部分反應時，將結合部分連接至有效負荷之化合物。
在某些態樣中，連接子前驅物可選自： 、 、 、 、 、 、 及 ；其中 p為1至10之整數； p*為1至10之整數；且 為與有效負荷之連接點。
在某些態樣中，連接子前驅物可選自： ； ； ； ； ； ； ； ； ；及 ； 其中： q為2至10之整數； Z 1、Z 2、Z 3及Z 4各自獨立地不存在或為L構型或D構型中天然存在之胺基酸殘基，前提條件為Z 1、Z 2、Z 3及Z 4中之至少兩者為胺基酸殘基；且 為與有效負荷之連接點。
在某些態樣中，Z 1、Z 2、Z 3及Z 4獨立地不存在或係選自由L-纈胺酸、D-纈胺酸、L-瓜胺酸、D-瓜胺酸、L-丙胺酸、D-丙胺酸、L-麩醯胺、D-麩醯胺、L-麩胺酸、D-麩胺酸、L-天冬胺酸、D-天冬胺酸、L-天冬醯胺、D-天冬醯胺、L-苯丙胺酸、D-苯丙胺酸、L-離胺酸、D-離胺酸及甘胺酸組成之群；前提條件為Z 1、Z 2、Z 3及Z 4中之至少兩者為胺基酸殘基。
在一些態樣中，Z 1不存在或為甘胺酸；Z 2不存在或係選自由L-麩醯胺、D-麩醯胺、L-麩胺酸、D-麩胺酸、L-天冬胺酸、D-天冬胺酸、L-丙胺酸、D-丙胺酸及甘胺酸組成之群；Z 3係選自由L-纈胺酸、D-纈胺酸、L-丙胺酸、D-丙胺酸、L-苯丙胺酸、D-苯丙胺酸及甘胺酸組成之群；且Z 4係選自由L-丙胺酸、D-丙胺酸、L-瓜胺酸、D-瓜胺酸、L-天冬醯胺、D-天冬醯胺、L-離胺酸、D-離胺酸、L-苯丙胺酸、D-苯丙胺酸及甘胺酸組成之群。
在一些態樣中，連接子前驅物可選自： 、 、 、 及 ， 其中： q為2至10之整數； 為與有效負荷之連接點。
在某些態樣中，連接子前驅物可選自 其中： q為2至10之整數； R、R'、R''及R'''係各自獨立地選自氫、C 1-C 6烷氧基C 1-C 6烷基、(C 1-C 6) 2NC 1-C 6烷基及C 1-C 6烷基，或兩個偕位R基團與其所連接之碳原子一起可形成環丁基或環丙基環；且 為與有效負荷之連接點。
在某些態樣中，連接子前驅物可選自 ； 其中： q為2至10之整數；且 為與有效負荷之連接點。
在某些態樣中，連接子前驅物可選自 ； 其中： q為2至10之整數； 為與有效負荷之連接點。
在一些態樣中，連接子前驅物可選自 ； 其中： q為2至10之整數；且 為與有效負荷之連接點。
在一些態樣中，連接子前驅物可為 ； 其中： q為2至10之整數； 為與有效負荷之連接點。
在某些態樣中，連接子前驅物可選自 、 、 及 ； 其中： q為2至10之整數； ----不存在或為一鍵； 為與有效負荷之連接點。
在一些態樣中，連接子前驅物可為 ； 其中： q為2至10之整數； ----不存在或為一鍵；且 為與有效負荷之連接點。
在一些態樣中，結合部分在與有效負荷或有效負荷-連接子前驅物反應之前經預處理。在某些態樣中，有效負荷或有效負荷-連接子前驅物與包含抗體或其抗原結合部分之結合部分反應。在結合部分為抗體之態樣中，可對抗體進行預處理以在與有效負荷或有效負荷-連接子前驅物反應之前減少鏈間二硫鍵。
藉由參考下文所示之實例進一步詳述本文所述之實施例。提供此等實例僅用於說明之目的且本文所述之實施例決不應解釋為限於此等實例。實際上，實施例應解釋為涵蓋作為本文所提供之教義之結果變得顯而易見的任何及所用變化。 實例 一般合成方法及中間物
可由一般熟習此項技術者鑒於本揭示案及此項技術中之知識及/或藉由參考下文所示之方案及合成實例來製備本揭示案之化合物。示例性合成途徑在下文之方案中及實例中闡述。應了解，在以下方案及實例中出現之變數(例如，「R」基團)應與本申請案中別處出現之彼等獨立地理解。一般熟習此項技術者將容易了解下文所示之方案及實例如何說明本文所述之化合物的製備。
方案中所用之縮寫一般遵循此項技術中所用之規約。本說明書及實例中所用之化學縮寫定義如下： 「DMF」代表N,N-二甲基甲醯胺；「DIBAL-H」或「DIBAl-H」代表氫化二異丁基鋁；「DCM」代表二氯甲烷；「Ph」代表苯基；「DEAD」代表偶氮二甲酸二乙酯；「NMO」代表N-甲基嗎啉N-氧化物；「THF」代表四氫呋喃；「t-Bu」代表三級丁基；「HATU」代表六氟磷酸1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-1 H-1,2,3-三唑并[4,5- b]吡啶鎓3-氧化物或六氟磷酸 N-[(二甲基胺基)-1 H-1,2,3-三唑并-[4,5- b]吡啶-1-基亞甲基]- N-甲基甲銨 N-氧化物；「DIEA」、「DIPEA」及「iPrNEt 2」代表二異丙基乙胺；「PE」代表石油醚；「EA」或「EtOAc」代表乙酸乙酯；「Ac」代表乙醯基；「BPO」代表過氧化苯甲醯；「AIBN」代表偶氮雙異丁腈；「o/n」代表隔夜；「r.t.」或「rt」或「RT」代表室溫或滯留時間(由上下文決定)；「IBX」代表2-碘醯基苯甲酸；「STAB」代表三乙醯氧基硼氫化鈉；「Me」代表甲基；「NBS」代表N-溴丁二醯亞胺；「dtbbpy」代表4,4'-二-三級丁基-2,2'-聯吡啶；「TFA」代表三氟乙酸；「DMA」代表N,N-二甲基乙醯胺；「Et 3N」及「TEA」代表三甲胺；「Ts」代表對甲苯磺醯基；「Trt」代表三苯基甲基；「TIPS」代表三異丙基矽基；「Et」代表乙基；「LiHMDS」代表六甲基二矽氮烷鋰；「MeCN」或「ACN」代表乙腈；「TMS」代表三甲基矽基；「NIS」代表N-碘丁二醯亞胺；「BOC」或「Boc」代表三級丁氧基羰基；「DMSO」代表二甲亞砜；且「HOBt」或「HOBT」代表水合1-羥基苯并三唑；「h」代表小時；且「min」代表分鐘。 實例1： 製備 Cbl-b 抑制劑 合成 INT3 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下於空氣氛圍下向2,4,6-三氯吡啶(化合物1，100 g，548.15 mmol，1當量)及丙二酸二甲酯(86.90 g，657.78 mmol，1.2當量)於DMF (1000 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(535.80 g，1644.46 mmol，3當量，粉末)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2天。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用EtOAc (3x500 mL)洗滌濾餅。用水(5x500 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。在真空下濃縮所得混合物，得到呈黃色油狀之2-(2,6-二氯吡啶-4-基)丙二酸1,3-二甲酯(化合物2，95 g，62%)。LCMS: (ES, m/s): 278,280 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在0℃下於空氣氛圍下向2-(2,6-二氯吡啶-4-基)丙二酸1,3-二甲酯(化合物2，95 g，341.61 mmol，1當量)及K 2CO 3(141.64 g，1024.84 mmol，3當量)於DMF (950 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加烯丙基溴(82.66 g，683.23 mmol，2當量)。在0℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用EtOAc (3x400 mL)洗滌濾餅。用水(4x400 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。此得到呈黃色油狀之2-(2,6-二氯吡啶-4-基)-2-(丙-2-烯-1-基)丙二酸1,3-二甲酯(化合物3，95 g，76%)。LCMS:(ES.m/z):318,320[M+1] +。 步驟 3. 合成化合物 4
在-40℃下於氮氣氛圍下向2-(2,6-二氯吡啶-4-基)-2-(丙-2-烯-1-基)丙二酸1,3-二甲酯(化合物3，70 g，220.02 mmol，1.00當量)於DCM (700 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加DIBAl-H (880.09 mL，1N，於DCM中，880.09 mmol，4當量)。在-40℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示完全反應。在室溫下藉由添加MeOH (20 mL)淬滅反應物。過濾所得混合物，用EtOAc (3x50 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液，得到呈黃色油狀之2-(2,6-二氯吡啶-4-基)-2-(丙-2-烯-1-基)丙烷-1,3-二醇(化合物4，50 g，69%)。LCMS (ESI, ms):262,264[M+H] + 步驟 4. 合成化合物 5
在0℃下於N 2氛圍下向2-(2,6-二氯吡啶-4-基)-2-(丙-2-烯-1-基)丙烷-1,3-二醇(化合物4，70 g，267.04 mmol，1當量)及PPh 3(140.09 g，534.08 mmol，2當量)於甲苯(700 mL)中之經攪拌混合物中逐份。在0℃下於N 2氛圍下攪拌所得混合物10分鐘。在0℃下向上述混合物中經30分鐘逐滴添加吉闌(ziram) (122.49 g，400.56 mmol，1.5當量)及DEAD (93.01 g，534.08 mmol，2當量)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用EtOAc (3x100 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (5:1)溶離，得到呈黃色油狀之2,6-二氯-4-[3-(丙-2-烯-1-基)氧雜環丁烷-3-基]吡啶(化合物5，37 g，50%)。LCMS:(ES.m/z):244,246[M+1] +。 步驟 5 ：合成化合物 6
在0℃下於空氣氛圍下向2,6-二氯-4-[3-(丙-2-烯-1-基)氧雜環丁烷-3-基]吡啶(化合物5，37 g，151.56 mmol，1當量)於THF (240 mL)及H 2O (120 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NMO (53.27 g，454.69 mmol，3當量)且逐份添加K 2OSO 4(2.8 g，9.00 mmol，0.05當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在0℃下用Na 2S 2O 3淬滅反應物。過濾所得混合物，用DCM (3x100 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。此得到呈黑色固體狀之3-[3-(2,6-二氯吡啶-4-基)氧雜環丁烷-3-基]丙烷-1,2-二醇(化合物6，38 g，90%)。LCMS:(ES.m/z):278,280 [M+1] +。 步驟 6 ：合成化合物 7
在室溫下於空氣氛圍下將NaIO 4(58.45 g，273.25 mmol，2.00當量)及二氧化矽(76 g)於H 2O (190 mL)中之混合物攪拌30分鐘。接著在室溫下逐滴添加3-[3-(2,6-二氯吡啶-4-基)氧雜環丁烷-3-基]丙烷-1,2-二醇(化合物6，38 g，136.62 mmol，1當量)於DCM (380 mL)中之經攪拌溶液。在室溫下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用DCM (3x150mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。此得到呈棕色固體狀之2-[3-(2,6-二氯吡啶-4-基)氧雜環丁烷-3-基]乙醛(化合物7，27 g，80%)。LCMS: (ES.m/z):246,248[M+1] +。 步驟 7 ：合成化合物 8
在0℃下於空氣氛圍下向2-[3-(2,6-二氯吡啶-4-基)氧雜環丁烷-3-基]乙醛(化合物7，27 g，109.71 mmol，1當量)於t-BuOH (270 mL)及H 2O (135 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaClO 2(34.73 g，384.00 mmol，3.5當量)及NaH 2PO 4(26.33 g，219.43 mmol，2當量)。在0℃下於氮氣氛圍下向經攪拌混合物中逐滴添加2-甲基-2-丁烯(142 mL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。用1N HCl將混合物酸化至pH 3。藉由過濾收集沈澱之固體且用Et 2O (3x100 mL)洗滌。在減壓下濃縮濾液。藉由用Et 2O (50 mL)濕磨純化殘餘物。此得到呈白色固體狀之[3-(2,6-二氯吡啶-4-基)氧雜環丁烷-3-基]乙酸(化合物8，14.4 g，50%)。LCMS:(ES.m/z):262,264 [M+1] +。 步驟 9 ：合成化合物 10
在0℃下於空氣氛圍下向[3-(2,6-二氯吡啶-4-基)氧雜環丁烷-3-基]乙酸(化合物8，14 g，53.41 mmol，1當量)及1-胺基-3-甲基硫脲(6.18 g，58.75 mmol，1.1當量)於DMF (120 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加HATU (24.37 g，64.10 mmol，1.2當量)且逐滴添加DIEA (20.71 g，160.25 mmol，3當量)。在室溫下攪拌所得混合物隔夜。在0℃下向上述混合物中經10分鐘逐滴添加NaOH (1N，100 mL)。在0℃下再攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。用1N HCl將混合物酸化至pH 3。用EtOAc (3x150 mL)萃取水層。在減壓下濃縮合併之有機物。藉由用Et 2O (80mL)濕磨純化殘餘物。此得到呈白色固體狀之5-{[3-(2,6-二氯吡啶-4-基)氧雜環丁烷-3-基]甲基}-4-甲基-1,2,4-三唑-3-硫醇(化合物10，14 g，77%)。LCMS: (ES.m/z): 331,333[M+1] +。 步驟 9 ：合成 INT3
在-20℃下於空氣氛圍下向5-{[3-(2,6-二氯吡啶-4-基)氧雜環丁烷-3-基]甲基}-4-甲基-1,2,4-三唑-3-硫醇(化合物10，12 g，36.23 mmol，1當量)及NaNO 2(7.50 g，108.69 mmol，3當量)於THF (120 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加HNO 3(1N，119.92 mL，119.92 mmol，3.31當量)。在0℃下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮反應混合物。用飽和Na 2CO 3(水溶液)將混合物鹼化至pH 8。用CH 2Cl 2(3 x 100mL)萃取所得混合物。用CH 2Cl 2(2x100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈白色固體狀之2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，5.6 g，47%)。LCMS: (ES.m/z):299,301[M+1] +； 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6) 8.37 (s, 1H), 7.58(s, 2H), 4.98-4.70 (m, 4H), 3.65 (s, 2H), 3.54 (s, 2H)。 合成 INT4 步驟 1 ：合成化合物 2
在10℃下於氮氣氛圍下向2-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(化合物1，44 g，201.67 mmol，1當量)於AcOH (286 mL)中之經攪拌混合物中經20分鐘逐滴添加HNO 3(127 g，2015.46 mmol，9.99當量)。在10℃下向上述混合物中經10分鐘逐滴添加Br 2(35.5 g，222.14 mmol，1.10當量)。在10℃下再攪拌所得混合物10分鐘。在10℃下向上述混合物中經25分鐘逐滴添加含AgNO 3(44.4 g，261.37 mmol，1.30當量)之水(105 mL) (2.5 mol/L)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。TLC指示反應完成。用飽和Na 2CO 3(水溶液)將混合物鹼化至pH 8。用EtOAc (3 x 800mL)萃取所得混合物。用水(3x100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (10:1)溶離，得到呈黃色油狀之5-溴-2-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(化合物2，42 g，70%)。 1H NMR (300MHz, DMSO-d 6) δ 8.32(s, 1H), 8.08(s, 1H), 3.87(s, 3H), 3.46-3.44(m, 3H)。 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下向5-溴-2-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(化合物2，42 g，141.38 mmol，1.00當量)及乙酸酐(21.7 g，212.56 mmol，1.50當量)於DMF (420 mL，5427.13 mmol，38.39當量)中之經攪拌混合物中逐份添加草酸(19.8 g，219.91 mmol，1.56當量)及Pd(OAc) 2(3.2 g，14.25 mmol，0.10當量)及Xantphos (16.5 g，28.51 mmol，0.20當量)。在室溫下向混合物中逐滴添加DIEA (42 mL，241.12 mmol，1.71當量)。在100℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物4小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。
用水(1L)淬滅所得混合物且用EtOAc (3 x 800 mL)萃取。用鹽水(2x100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之3-(甲氧基羰基)-4-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酸(化合物3，29 g，78.24%)。LCMS: (ES.m/z): 261 [M-1] -。 步驟 3 ：合成化合物 4
在室溫下向3-(甲氧基羰基)-4-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酸(29 g，110.60 mmol，1當量)於ACN (580 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加NBS (29.53 g，165.91 mmol，1.50當量)及BPO (8.03 g，33.18 mmol，0.3當量)。在80℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈黃色固體狀之4-(溴甲基)-3-(甲氧基羰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸(化合物4，32 g，84%)。LCMS: (ES.m/z):339[M-1] -。 1H NMR (300MHz, DMSO-d 6) δ 8.57 (s, 1H), 8.35 (s, 1H), 5.07 (s, 2H), 3.99 (s, 3H)。 步驟 4 ：合成化合物 5
在0℃下向3-(甲氧基羰基)-4-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酸(化合物4，32 g，122.05 mmol，1.00當量)於THF (320 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加BH 3-THF (235 mL，1 mol/L，235 mmol，2.0當量)。在室溫下攪拌所得混合物6小時。LCMS指示反應完成。用MeOH淬滅反應物且在室溫下攪拌1小時。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈黃色油狀之2-(溴甲基)-5-(羥甲基)-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(化合物5，23.49 g，58%)。LCMS:(ES.m/z):245[M-1-Br] -。 1H NMR (300MHz, DMSO-d 6) δ 8.05 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 5.04 (s, 2H), 4.63 (s, 2H), 3.92(s, 3H)。 步驟 5 ：合成化合物 6
在室溫下向2-(溴甲基)-5-(羥甲基)-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(化合物5，23.49 g，71.81 mmol，1.00當量)於EA (240 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加IBX (30.16 g，107.72 mmol，1.5當量)。在70℃下攪拌所得混合物3小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用EtOAc (3x50 mL)洗滌濾餅。用飽和Na 2S 2O4 (3x30 mL)洗滌濾液，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈黃色油狀之2-(溴甲基)-5-甲醯基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(化合物6，20 g，85%)。LCMS:(ES.m/z):323[M-1] -。 1H NMR (300MHz, DMSO-d 6) δ 10.13 (s, 1H), 8.57 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 5.08 (s, 2H), 3.97 (s, 3H)。 步驟 6 ：合成化合物 7
在0℃下向2-(溴甲基)-5-甲醯基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(化合物6，5.17 g，15.90 mmol，1.00當量)於DCM (31.7 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加(3S)-3-甲基哌啶鹽酸鹽(2.37 g，17.49 mmol，1.1當量)及STAB (13.48 g，63.61 mmol，4當量)。在室溫下攪拌所得混合物2小時。在0℃下藉由添加MeOH (5 mL)淬滅反應物。在減壓下濃縮所得混合物且用水(30 mL)淬滅。用DCM (3 x 30 mL)萃取所得混合物。用水(3x10 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：C18管柱，含ACN之水(0.1% NH 4HCO 3)，在50分鐘內10%至80%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈灰白色油狀之2-(溴甲基)-5-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(化合物8，3.0 g，46%)。LCMS:(ES.m/z): 408, 410[M+1] +。 步驟 7. 合成 INT4
在0℃下向2-(溴甲基)-5-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(化合物8，1.7 g，4.16 mmol，1當量)於含NH 3(g)之MeOH (7 M，17 mL，119 mmol)中之經攪拌混合物中。在室溫下攪拌所得混合物5小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：C18管柱；移動相，含ACN之水(0.05% NH 4HCO 3)，在40分鐘內10%至100%梯度；偵測器，UV 254 nm。在減壓下濃縮所得混合物。此得到呈黃色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，507.6 mg，38%)。LCMS:(ES.m/z):313[M+1] +。 1H NMR (300MHz, DMSO-d 6) δ 8.87 (s, 1H), 7.87 (d, J=11.4Hz, 2H), 4.53 (s, 2H), 3.61 (s, 2H), 2.72-2.67 (m, 2H), 1.99-1.87 (m, 1H), 1.77-1.40 (m, 5H), 0.90-0.60 (m, 4H)。 合成化合物 100 步驟 1 ：合成化合物 3
在室溫下於N 2下向乙二醇(化合物2，124 mg，2.01 mmol，3.00當量)於THF (10 mL)中之溶液中添加NaH (40 mg，60%，1.00 mmol，1.50當量)。在室溫下於N 2下攪拌所得混合物0.5小時。接著在室溫下於N 2下添加2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，200 mg，0.67 mmol，1.00當量)。在室溫下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。用水(20 mL)稀釋所得混合物。用EtOAc (3 x 20 mL)萃取所得混合物。用鹽水(20 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由製備型TLC (DCM:MeOH = 10:1)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之2-((6-氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)氧基)乙-1-醇(150 mg，65%)。LCMS (ES, m/z): 325,327 [M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 100
在120℃下於N 2下將2-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)氧基]乙醇(化合物3，140 mg，0.43 mmol，1.00當量)、6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，135 mg，0.43 mmol，1.00當量)、XantPhos (50 mg，0.09 mmol，0.2當量)、Cs 2CO 3(421 mg，1.29 mmol，3.00當量)及Pd(OAc) 2(10 mg，0.04 mmol，0.10當量)於二噁烷(8 mL)中之溶液攪拌1小時。LCMS指示反應完成。冷卻至室溫後，過濾反應物。將濾液在真空下濃縮至乾。藉由製備型TLC (DCM:MeOH = 10:1)純化殘餘物，得到80 mg呈白色固體狀之粗產物。藉由逆相急驟層析用以下條件再純化粗產物：管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.05%FA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內5% B至35% B，35% B；波長：254 nm；RT1(min)：5.4。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之2-[6-(2-羥基乙氧基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物100，52.5 mg，19%)。LCMS (ES, m/z): 601 [M+H] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.26 (s, 1H), 7.99-7.94 (m, 3H), 6.46 (s, 1H), 5.20 (s, 2H), 4.98-4.86 (s, 5 H), 4.28 (t, J=4.8Hz, 2H), 3.74 (s, 2H), 3.68 (s, 2H), 3.57 (s, 2H), 3.31 (s, 3H), 2.78-2.67 (m, 2H), 1.96-1.91 (m, 1H), 1.68-1.59 (m, 4H), 1.52-1.43 (m, 1H), 0.90-0.81 (m, 4H)。 合成化合物 101 步驟 1 ：合成化合物 3
在120℃下將2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，400 mg，1.34 mmol，1.00當量)、N-(胺甲醯基甲基)-N-甲基胺基甲酸三級丁酯(252 mg，1.34 mmol，1.00當量)、XantPhos (155 mg，0.27 mmol，0.20當量)、Cs 2CO 3(1307 mg，4.01 mmol，3.00當量)及Pd(OAc) 2(30 mg，0.13 mmol，0.10當量)於二噁烷(6 mL)中之溶液攪拌1小時。LCMS指示反應完成。冷卻至室溫後。過濾反應物。將濾液在真空下濃縮至乾。藉由製備型TLC (DCM:MeOH=10:1)純化殘餘物，得到呈綠色固體狀之N-{[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺甲醯基]甲基}-N-甲基胺基甲酸三級丁酯(化合物3，390 mg，63%)。LCMS (ES, m/z): 451,453 [M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 5
在120℃下將N-{[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺甲醯基]甲基}-N-甲基胺基甲酸三級丁酯(化合物3，280 mg，0.62 mmol，1.00當量)、6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，194 mg，0.62 mmol，1.00當量)、XantPhos (72 mg，0.12 mmol，0.20當量)、Cs 2CO 3(607 mg，1.86 mmol，3.00當量)及Pd(OAc) 2(14 mg，0.06 mmol，0.10當量)於二噁烷(6 mL)中之溶液攪拌2小時。LCMS指示反應完成。冷卻至室溫後。過濾反應物且在真空下濃縮至乾。藉由製備型TLC (DCM:MeOH=10:1)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之N-甲基-N-{[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺甲醯基]甲基}胺基甲酸三級丁酯(化合物5，200 mg，39%)。LCMS (ES, m/z): 727 [M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 101
在室溫下將含 N-甲基- N-{[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺甲醯基]甲基}胺基甲酸三級丁酯(化合物5，250 mg，0.34 mmol，1.00當量)之TFA (400 uL)及DCM (4 mL)攪拌2小時。LCMS指示反應完成。將反應物在真空下濃縮至乾。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1%FA)，在30分鐘內0%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)-2-(甲基胺基)乙醯胺；甲酸(化合物101，100 mg，41%)。LCMS (ES, m/z): 627 [M+H] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ8.24 (s, 1H), 8.20 (s, 2H), 8.08 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.75 (br, 1H), 5.19 (s, 2H), 4.98-4.81 (m, 4H), 3.65 (s, 2H), 3.59 (s, 2H), 3.52-3.50 (m, 2H), 3.33 (s, 3H), 2.74-2.67 (m, 2H), 2.42 (s, 3H), 1.97-1.92 (m, 1H), 1.68-1.59 (m, 4H), 1.52-1.46 (m, 1H), 0.88-0.81 (m, 4H)。 合成化合物 102 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，200 mg，0.66 mmol，1當量)及β-巰基乙醇(53 mg，0.67 mmol，1.01當量)於DMF (2 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加K 2CO 3(186 mg，1.34 mmol，2.01當量)。在70℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。過濾反應混合物，且藉由逆相急驟層析用以下條件純化濾液：C18管柱；移動相，含ACN之水(0.1%FA)，在40分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。在減壓下濃縮所收集之級分。此得到呈黃色油狀之2-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)硫烷基]乙醇(化合物1，130 mg，57%)。LCMS:(ES.m/z):341,343 [M+1] +。 步驟 2. 合成化合物 102
在室溫下向2-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)硫烷基]乙醇(化合物1，124 mg，0.36 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，124 mg，0.39 mmol，1.09當量)於二噁烷(3 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Xantphos (42 mg，0.073 mmol，0.20當量)及Pd(OAc) 2(8 mg，0.036 mmol，0.10當量)及Cs 2CO 3(354 mg，1.08 mmol，2.99當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：C18管柱；移動相，含ACN之水，在40分鐘內10%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。在減壓下濃縮所收集之級分。此得到呈灰白色固體狀之2-{6-[(2-羥乙基)硫烷基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物102，12.2 mg，5.40%)。LCMS:(ES.m/z):617[M+1] +； 1H NMR (300MHz, DMSO-d 6) δ 8.26 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 6.96 (s, 1H), 5.22 (s, 2H), 4.94-4.90 (m, 3H), 4.83-4.82 (m, 2H), 3.66-3.65 (m, 4H), 3.57 (s, 2H), 3.23-3.22 (m, 2H), 2.80-2.65 (m, 2H), 2.00-1.90 (m, 1H), 1.77-1.55 (m, 4H), 1.55-1.40 (m, 1H), 0.82-0.81 (m,4H)。 合成化合物 103 步驟1：合成化合物2
向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，100 mg，0.33 mmol，1.00當量)於DMF (2 mL)中之經攪拌混合物中添加2-(甲基硫烷基)乙胺鹽酸鹽(129 mg，1.01 mmol，3.02當量)及K 2CO 3(139 mg，1.01 mmol，3.0當量)。在100℃下於氮氣氛圍下攪拌反應混合物48小時。藉由LCMS可偵測到約20%所需產物。將反應混合物冷卻至室溫並過濾。將濾液在真空下濃縮至乾且藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% FA)，在30分鐘內10%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。將所收集之級分濃縮至乾，得到呈白色固體狀之6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-N-[2-(甲基硫烷基)乙基]吡啶-2-胺(化合物2，44 mg，35%)。LCMS: (ES, m/s): 354,356 [M+H] +。 步驟 2. 合成化合物 103
在室溫下於氮氣氛圍下向6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-N-[2-(甲基硫烷基)乙基]吡啶-2-胺(化合物2，38 mg，0.11 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，35 mg，0.11 mmol，1.05當量)於二噁烷(400 uL)中之經攪拌混合物中添加Cs 2CO 3(70 mg，0.22 mmol，2.00當量)、Xantphos (12 mg，0.021 mmol，0.20當量)及Pd(OAc) 2(24 mg，0.11 mmol，1.00當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。將反應混合物冷卻至室溫並過濾。將濾液在真空下濃縮至乾且藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Shield RP18 OBD管柱，19x250 mm，10μm；移動相A：水(0.05%FA)，移動相B：MeOH--HPLC；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內38% B至48% B，48% B；波長：254 nm)純化殘餘物；凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之2-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-{[2-(甲基硫烷基)乙基]胺基}吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物103，8.1 mg，11%)。LCMS:(ES, m/z): 630[M+1] +； 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6) 8.25 (s, 1H), 7.95-7.91(m, 2H), 7.45 (s, 1H), 6.89(t, J=5.7Hz, 1H), 5.95 (s, 1H), 5.17 (s, 2H), 4.90 (d, J=4.5Hz, 2H), 4.78 (d, J=4.5Hz,, 2H), 3.64 (s, 2H), 3.56-3.46 (m, 4H), 3.23 (s, 3H), 2.73-2.67 (m, 2H), 2.65-2.61 (m, 2H), 2.13 (s, 3H), 1.96-1.93 (m, 1H), 1.67-1.58 (m, 4H), 1.49-1.46(m, 1H), 0.87-0.81 (m, 4H)。 合成化合物 104 步驟 1. 合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，200 mg，0.66 mmol，1當量)及[(三級丁氧基羰基)(甲基)胺基]乙酸(190 mg，1.00 mmol，1.50當量)於DMSO (12 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加[Ir(dF(CF 3)ppy) 2(dtbbpy)]PF 6(150 mg，0.13 mmol，0.20當量)及[Ni(dtbbpy)(H 2O) 4]Cl 2(60 mg，0.13 mmol，0.19當量)且逐滴添加BTMG (170 mg，0.99 mmol，1.49當量)。在室溫下攪拌所得混合物且使用藍色LED燈(365nm)照射隔夜。LCMS指示反應有50% 2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶及50%所需產物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：C18管柱；移動相，含ACN之水(0.1%FA)，在40分鐘內10%至80%梯度；偵測器，UV 254 nm。在減壓下濃縮所得級分。此得到呈黃色油狀之N-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)甲基]-N-甲基胺基甲酸三級丁酯(化合物2，68 mg，24%)。LCMS:(ES.m/z):408,410[M+1] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下向N-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)甲基]-N-甲基胺基甲酸三級丁酯(化合物2，63 mg，0.15 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，50 mg，0.16 mmol，1.04當量)於二噁烷(0.5 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Pd(OAc) 2(4 mg，0.018 mmol，0.12當量)及Xantphos (18 mg，0.03 mmol，0.20當量)及Cs 2CO 3(152 mg，0.47 mmol，3.02當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。冷卻至室溫後，過濾反應混合物，且將濾液在減壓下濃縮至乾。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：C18管柱；移動相，含ACN之水(0.1% FA)，在40分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。在真空下濃縮所得混合物。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Shield RP18 OBD管柱，30*150 mm，5μm；移動相A：水(10 mmol/L NH 4HCO 3+0.1%NH 3.H 2O)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min；梯度：在7分鐘內33% B至56% B，56% B；波長：254 nm)再純化粗產物(37mg)；濃縮所收集之級分，得到呈灰白色固體狀之N-甲基-N-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)甲基]胺基甲酸三級丁酯(化合物3，12 mg，11%)。LCMS: (ES.m/z): 684 [M+1] +。 步驟 3 ：合成化合物 104
在室溫下向N-甲基-N-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)甲基]胺基甲酸三級丁酯(12 mg，0.018 mmol，1當量)於DCM (1200 uL)中之經攪拌混合物中逐滴添加TFA (300 uL)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。將反應混合物在真空下濃縮至乾。藉由凍乾乾燥所得固體。此得到呈無色油狀之2-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-[(甲基胺基)甲基]吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮；三氟乙酸(9.0 mg，69%)。LCMS: (ES.m/z): 584[M+1] +； 1H NMR (400MHz, CD 3OD) δ 8.87 (s, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.35 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 7.27 (s, 1H), 5.46 (s, 2H), 5.07-5.02 (m, 4H), 4.52 (s, 2H), 4.44 (s, 2H), 3.96 (s, 2H), 3.85 (s, 3H), 3.77-3.76 (m, 1H), 3.63-3.62 (m, 1H), 2.97-2.95 (m, 1H), 2.89 (s, 3H), 2.85-2.71 (m, 1H), 2.00-1.61 (m, 4H), 1.35-1.29 (m, 1H), 1.26-1.10 (m, 1H), 1.00 (s, 3H)。 合成化合物 105 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，100 mg，0.34 mmol，1.0當量)及2-甲基-2-(甲基硫烷基)丙-1-胺(48 mg，0.40 mmol，1.2當量)於DMA (2.0 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加DIEA (172 mg，1.33 mmol，4.00當量)。在80℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物4天。藉由LCMS可偵測到約30%所需產物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% FA)，在30分鐘內10%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。在真空下濃縮所得混合物，得到呈固體狀之6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-N-[2-甲基-2-(甲基硫烷基)丙基]吡啶-2-胺(化合物2，17 mg，13%)。LCMS: (ES, m/s): 382,384 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 105
在室溫下於氮氣氛圍下向6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-N-[2-甲基-2-(甲基硫烷基)丙基]吡啶-2-胺(化合物2，17 mg，0.04 mmol，1.0當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，14 mg，0.04 mmol，1.0當量)於二噁烷(1.5 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加Xantphos (10 mg，0.016 mmol，0.4當量)、Pd(OAc) 2(4 mg，0.016 mmol，0.4當量)及Cs 2CO 3(43 mg，0.13 mmol，3.0當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Shield RP18 OBD管柱，30*150 mm，5μm；移動相A：水(0.1%FA)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min；梯度：在7分鐘內23% B至43% B，43% B；波長：254 nm)純化反應混合物；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之2-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-{[2-甲基-2-(甲基硫烷基)丙基]胺基}吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮；甲酸(化合物105，2.6 mg，7%)。LCMS: (ES, m/s): 658 [M+H] +； 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6) 8.49 (br s, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.95-7.91(m, 2H), 7.39 (s, 1H), 6.78 (t, J=5.4 Hz, 1H), 6.15 (s, 1H), 5.16 (s, 2H), 4.96-4.83 (m, 2H), 4.81-4.77 (m, 2H), 3.62 (d, J=6.9 Hz, 2H), 3.56-3.48 (m, 4H), 3.20 (s, 3H), 2.70-2.68 (m, 2H), 2.06 (s, 3H), 1.99-1.92 (m, 1H), 1.70-1.40 (m, 5H), 1.28-1.15 (m, 6H), 0.95-0.75 (m, 4H)。 合成化合物 106 步驟 1 ：合成化合物 2
在0℃下向4-(羥甲基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(化合物1，10 g，46.44 mmol，1當量)於DCM (250 mL)中之經攪拌溶液中添加TsCl (17.71 g，92.89 mmol，2當量)及TEA (14.10 g，139.34 mmol，3當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在0℃下用MeOH淬滅反應物。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (5:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之4-{[(4-甲基苯磺醯基)氧基]甲基}哌啶-1-甲酸三級丁酯(化合物2，12 g，69%)。LCMS (ESI, m/z):370 [M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下向4-{[(4-甲基苯磺醯基)氧基]甲基}哌啶-1-甲酸三級丁酯(化合物2，5 g，13.53 mmol，1當量)及KI (2.25 g，13.53 mmol，1當量)於EtOH (50 mL)中之經攪拌混合物中添加甲硫醇鈉(1.90 g，27.06 mmol，2當量)。在80℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在室溫下用水淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 100 mL)萃取所得混合物。用鹽水(100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。此得到呈灰白色固體狀之4-[(甲基硫烷基)甲基]哌啶-1-甲酸三級丁酯(化合物3，2.8 g，84%)。LCMS (ESI, m/z):246[M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 4
在室溫下於氮氣氛圍下將4-[(甲基硫烷基)甲基]哌啶-1-甲酸三級丁酯(化合物3，560 mg，2.28 mmol，1當量)於HCl (g，4N，於MeOH中，5.6 mL)中之溶液攪拌1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。此得到呈黃色固體狀之4-[(甲基硫烷基)甲基]哌啶鹽酸鹽(370 mg，89%)。LCMS (ESI, m/z):146[M+H-HCl] + 步驟 4 ：合成化合物 5
在室溫下向4-[(甲基硫烷基)甲基]哌啶鹽酸鹽(化合物4，350 mg，1.92 mmol，1當量)於DCM (4 mL)中之經攪拌溶液中添加2-(溴甲基)-5-甲醯基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(來自用於製備INT4之程序之化合物6，626 mg，1.92 mmol，1當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在室溫下向上述混合物中逐份添加STAB (1.63 g，7.70 mmol，4當量)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在0℃下用MeOH淬滅反應物且攪拌30分鐘。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色油狀之2-(溴甲基)-5-({4-[(甲基硫烷基)甲基]哌啶-1-基}甲基)-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(化合物5，820 mg，93%)。LCMS (ESI, m/z):454,456 [M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 6
在室溫下向2-(溴甲基)-5-({4-[(甲基硫烷基)甲基]哌啶-1-基}甲基)-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(化合物5，400 mg，0.88 mmol，1當量)於NH 3(g，7N，於MeOH中，4 mL)中之經攪拌溶液中。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (14:1)溶離，得到呈白色固體狀之6-({4-[(甲基硫烷基)甲基]哌啶-1-基}甲基)-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物6，170 mg，53%)。LCMS (ESI, m/z):359 [M+H] +。 步驟 6 ：合成化合物 106
在室溫下於氮氣氛圍下向6-({4-[(甲基硫烷基)甲基]哌啶-1-基}甲基)-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物6，86 mg，0.24 mmol，1當量)及6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(如WO2020210508中所述製備，73 mg，0.24 mmol，1當量)於二噁烷(2 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(156 mg，0.48 mmol，2當量)、二-三級丁基([2-[2,4,6-參(丙-2-基)苯基]苯基])磷烷(10 mg，0.02 mmol，0.1當量)及tBuXPhos Pd G3 (19 mg，0.02 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS顯示45%產物。將反應混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% FA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之粗產物(40 mg)。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Shield RP18 OBD管柱，30*150 mm，5μm；移動相A：水(0.1%FA)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min；梯度：在7分鐘內19% B至39% B，39% B；波長：254 nm；RT1(min)：4.62)純化粗產物(40 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-({4-[(甲基硫烷基)甲基]哌啶-1-基}甲基)-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(10.8 mg，7%)。LCMS (ESI, ms):630[M+H] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.38 (s, 1H), 7.94-7.90 (m, 2H), 7.40 (s, 1H), 6.62 (t, J= 5.2 Hz, 1H), 5.89 (s, 1H), 5.14 (s, 2H), 4.90 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 4.78 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 3.65 (s, 2H), 3.49 (s, 2H), 3.24-3.17(m, 5H), 2.82-2.79 (m, 2H), 2.41 (d, J= 6.8 Hz, 2H), 2.02-1.96 (m, 5H), 1.75-1.72 (m, 2H), 1.46-1.44 (m, 1H), 1.26 - 1.10 (m, 5H)。 合成化合物 107 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，2 g，6.68 mmol，1當量)於DMF (20 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加(乙基硫烷基)鈉(0.62 g，7.35 mmol，1.1當量)。在50℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。用水(100 mL)稀釋所得混合物且用EtOAc (3 x 100 mL)萃取。用鹽水(3 x 100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含FA之水，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈黃色固體狀之2-氯-6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(化合物2，1.4 g，62%)。LCMS:(ES.m/z): 325,327 [M+1] +。 步驟 2 ：合成化合物 107
在室溫下向2-氯-6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(化合物2，120 mg，0.36 mmol，1.20當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，96 mg，0.30 mmol，1.00當量)於二噁烷(5 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(200 mg，0.61 mmol，2.00當量)及Xantphos (35 mg，0.06 mmol，0.20當量)及Pd(OAc) 2(6.90 mg，0.03 mmol，0.10當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用DCM (3x10 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用DCM/MeOH (10:1)溶離，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(17.7 mg，9%)。LCMS:(ES.m/z): 601[M+1] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.26 (s, 1H), 8.05-7.94 (m, 3H), 6.91 (d, J=1.2Hz, 1H), 5.23 (s, 2H), 4.92-4.82 (m, 4H), 3.63-3.57 (m, 4H), 3.34-3.30 (m, 5H), 3.14-3.12 (m, 2H), 2.74-2.68 (m, 2H), 1.98-1.90 (m, 1H), 1.65-1.62 (m, 4H), 1.50-1.45 (m, 1H), 1.35-1.32 (m, 3H), 0.82-0.81 (m, 4H)。 合成化合物 108 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，300 mg，1.00 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，328 mg，1.05 mmol，1.05當量)於二噁烷(6 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(653 mg，2.00 mmol，2當量)、XantPhos (116 mg，0.20 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(22 mg，0.10 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈白色固體狀之2-(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物1，250 mg，43%)。LCMS (ESI, ms): 575,577 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向2-(6-氯-4-{2-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丙烷-2-基}吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物1，250 mg，0.44 mmol，1當量)及2-[(三苯基甲基)硫烷基]乙胺鹽酸鹽(190 mg，0.53 mmol，1.2當量)於二噁烷(3 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(290 mg，0.89 mmol，2當量)、XantPhos (51 mg，0.08 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(10 mg，0.04 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之2-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-({2-[(三苯基甲基)硫烷基]乙基}胺基)吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物2，165 mg，43%)。LCMS (ESI, m/z): 858 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 108
在室溫下於氮氣氛圍下向2-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-({2-[(三苯基甲基)硫烷基]乙基}胺基)吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(165 mg，0.19 mmol，1當量)及TFA (2 mL)於DCM (4 mL)中之經攪拌溶液中添加參(丙-2-基)矽烷(200 uL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，矽膠；移動相，含MeCN之水(0.1%FA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之2-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-[(2-硫烷基乙基)胺基]吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物108，47.9 mg，37%)。LCMS: (ES.m/z): 616[M+H] +； 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.29-8.23 (m, 1H), 8.01-7.83 (m, 2H),7.44(s, 1H), 6.91 (t, J=5.7 Hz, 1H), 5.97 (s, 1H), 5.24 (s, 2H), 4.97-4.84 (m, 2H), 4.79-4.74 (m, 2H), 3.79-3.77 (m, 2H), 3.49 (s, 2H), 3.41 (s, 2H), 3.23 (s, 3H), 2.73-2.63 (m, 4H), 2.26 (t, J=7.8 Hz, 1H), 1.98-1.95 (m, 1H), 1.63-1.50 (m, 6H), 0.91-0.81 (m, 4H)。 合成化合物 109 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下向2,6-二氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶(INT3，235 mg，0.786 mmol，1當量)及(S)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(INT4，245 mg，0.786 mmol，1當量)於二噁烷(7 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(512 mg，1.57 mmol，2當量)及Xantphos (90.8 mg，0.157 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(17.6 mg，0.0786 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在室溫下用飽和碳酸氫鈉淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 50 ml)萃取所得混合物。在減壓下濃縮合併之有機層。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (9:1)溶離，得到呈綠色固體狀之(S)-2-(6-氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物2，300 mg，66.4%)。LCMS:(ES.m/z): 575,577 [M+1] +。 步驟 2 ：合成化合物 109
在室溫下向(S)-2-(6-氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物2，30 mg，0.052mmol，1當量)及炔丙胺(5.7 mg，0.10 mmol，2當量)於二噁烷(1 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(113 mg，0.34 mmol，2當量)及Xantphos (6.0 mg，0.01 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(1.2 mg，0.05 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物40分鐘。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物且按原樣加載於管柱上。在真空中乾燥管柱且藉由矽膠管柱層析純化，用CH 2Cl 2/MeOH (3:1)溶離，得到呈黃色固體狀之(S)-2-(4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)-6-(丙-2-炔-1-基胺基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物109，13 mg，42%)。LCMS:(ES.m/z):594[M+1] +； 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.30 (d, J= 1.5 Hz, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.86 (s, 1H), 6.97 (d, J= 1.5 Hz, 1H), 5.25 - 5.20 (m, 2H), 5.11 (d, J= 6.4 Hz, 2H), 5.05 (d, J= 6.4 Hz, 2H), 3.69 (s, 2H), 3.64 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 3.60 (s, 4H), 3.26 (s, 3H), 2.75 (dd, J= 17.3, 9.8 Hz, 2H), 1.95 (td, J= 11.1, 3.3 Hz, 1H), 1.47 (t, J= 7.2 Hz, 2H), 1.25 (s, 8H), 1.07 (s, 1H), 0.92 - 0.82 (m, 9H), 0.07 (s, 2H)。 合成化合物 110 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，1.0 g，3.34 mmol，1.0當量)及β-胺基丙腈(4.69 g，66.90 mmol，20.0當量)於DMA (4.0 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加K 2CO 3(0.92 g，6.68 mmol，2.0當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物兩天。藉由LCMS可偵測到約70%所需產物。將反應物冷卻至室溫且在室溫下用水淬滅。用CH 2Cl 2(3x100 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (5:1)溶離，得到呈淺綠色固體狀之3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺基]丙腈(600 mg，49%)。LCMS: (ES, m/s): 333,335 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 110
在室溫下於氮氣氛圍下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物2，47 mg，0.15 mmol，1.0當量)及3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺基]丙腈(INT4，50 mg，0.15 mmol，1.0當量)於二噁烷(2.0 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加Xantphos (34 mg，0.06 mmol，0.4當量)、Pd(OAc) 2(13 mg，0.06 mmol，0.4當量)及Cs 2CO 3(146 mg，0.45 mmol，3.0當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用ACN及DCM洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (5:1)溶離，得到粗產物。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：移動相A：水(0.1%FA)，移動相B：ACN)純化粗產物(50mg)。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之3-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基]丙腈；甲酸(化合物110，25 mg，25%)。LCMS: (ES, m/s): 609 [M+H] +, 305 [M/2+H] +； 1H NMR (300 MHz, DMSO- d 6) δ 8.24 (s, 1H), 7.95-7.91(m, 2H), 7.49 (s, 1H), 7.07 (t, J= 5.4 Hz, 1H), 6.05 (s, 1H), 5.20 (s, 2H), 4.91 (d, J= 6 Hz, 2H), 4.78 (d, J= 6 Hz, 2H), 3.64 (s, 2H), 3.53-3.50 (m, 4H), 3.25 (s, 3H), 2.81 (t, J= 6.3 Hz, 2H), 2.72 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 1.97-1.93 (m, 1H), 1.69-1.42 (m, 5H), 0.95-0.78 (m, 4H)。 合成化合物 111 步驟 1 ：合成化合物 2
在0℃下於氮氣氛圍下向(3S)-3-(羥甲基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(化合物10 g，46.44 mmol，1當量)及TEA (14 g，138.35 mmol，2.98當量)於DCM (100 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加TsCl (17.5 g，91.79 mmol，1.98當量)。在室溫下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (5:1)溶離，得到呈無色油狀之(3S)-3-{[(4-甲基苯磺醯基)氧基]甲基}哌啶-1-甲酸三級丁酯(化合物2，14.2 g，74.47%)。LCMS:370[M+H] +； 1H NMR (300 MHz, 氯仿-d) δ 7.86 - 7.70 (m, 2H), 7.45 - 7.30 (m, 2H), 3.94 - 3.77 (m, 4H), 2.84-2.80 (m, 1H), 2.64 (dd, J = 13.0, 9.7 Hz, 1H), 2.45 (s, 3H), 1.91 - 1.70 (m, 2H), 1.60-1.58 (m, 1H), 1.42 (s,9H)。 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下於氮氣氛圍下向(3S)-3-{[(4-甲基苯磺醯基)氧基]甲基}哌啶-1-甲酸三級丁酯(化合物2，5 g，13.53 mmol，1當量)及KI (2.25 g，13.53 mmol，1當量)於EtOH (50 mL)中之經攪拌溶液中添加(甲基硫烷基)鈉(1.90 g，27.06 mmol，2當量)。在80℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。將所得混合物冷卻降至室溫，用水(100 mL)稀釋，用EtOAc (3 x 100 mL)萃取。用鹽水(100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。此得到呈黃色油狀之(3S)-3-[(甲基硫烷基)甲基]哌啶-1-甲酸三級丁酯(3.1 g，93%)。LCMS (ESI, ms):246[M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 4
在室溫下於氮氣氛圍下將(3S)-3-[(甲基硫烷基)甲基]哌啶-1-甲酸三級丁酯(化合物3，800 mg，3.26 mmol，1當量)於HCl (氣體，4N，於1,4-二噁烷中，30 mL)中之經攪拌溶液攪拌1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。此得到呈白色固體狀之(3S)-3-[(甲基硫烷基)甲基]哌啶鹽酸鹽(化合物4，2.1 g，94%)。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS (ESI, ms): 146 [M+H-HCl] +。 步驟 4 ：合成化合物 5
在室溫下於氮氣氛圍下將(3S)-3-[(甲基硫烷基)甲基]哌啶鹽酸鹽(化合物4，2.1 g，11.55 mmol，1當量)及2-(溴甲基)-5-甲醯基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(3.01 g，9.24 mmol，0.8當量)於DCM (21 mL)中之經攪拌溶液攪拌30分鐘。在室溫下向上述混合物中添加STAB (9.80 g，46.22 mmol，4當量)。在室溫下再攪拌所得混合物12小時。LCMS指示反應完成。用MeOH淬滅反應物且在室溫下攪拌30分鐘。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (8:1)溶離，得到呈黃色油狀之2-(溴甲基)-5-{[(3S)-3-[(甲基硫烷基)甲基]哌啶-1-基]甲基}-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(化合物5，1.2 g，22%)。LCMS (ESI, ms): 454,456 [M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 6
在室溫下於氮氣氛圍下將2-(溴甲基)-5-{[(3S)-3-[(甲基硫烷基)甲基]哌啶-1-基]甲基}-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(化合物5，600 mg，1.32 mmol，1當量)於NH 3(g，7N，於MeOH中，6 mL)中之經攪拌溶液攪拌2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，矽膠；移動相，含MeCN之水(0.1FA%)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色油狀之6-{[(3S)-3-[(甲基硫烷基)甲基]哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物6，200 mg，42%)。LCMS (ESI, ms):359[M+H] + 步驟 6 ：合成化合物 111
在室溫下於氮氣氛圍下向6-{[(3S)-3-[(甲基硫烷基)甲基]哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物6，120 mg，0.33 mmol，1當量)及6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(103 mg，0.33 mmol，1當量)於二噁烷(2.4 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(218 mg，0.67 mmol，2當量)、RuPhos (31 mg，0.06 mmol，0.2當量)及RuPhos Palladacycle Gen. 3 (28 mg，0.03 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。將所得混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.1%FA)，在40分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈灰白色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-[(甲基硫烷基)甲基]哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(70.5 mg，31%)。LCMS (ESI, ms):630[M+H] +； 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6) 8.24 (brs, 1H), 7.95-7.91 (m, 2H), 7.40 (s, 1H), 6.63(t, J=4.8Hz, 1H), 5.88 (s, 1H), 5.31 (s, 2H), 4.91(d, J=6H, 2H), 4.79 (d, J=6.6Hz, 2H), 3.72-3.70 (m, 2H), 3.68(s, 2H), 3.22-3.18 (m, 5H), 2.85-2.82 (m, 1H), 2.72-2.69 (m, 1H), 2.40-2.38 (m, 2H), 2.02-2.00 (m, 4H), 1.82-1.80 (m, 3H), 1.78-1.55 (m, 2H), 1.12 -1.10(m, 3H),1.05-0.98 (m, 1H)。 合成化合物 112 步驟 1 ：合成化合物 2
在-70℃下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-甲基吡啶(化合物1，1.0 g，6.17 mmol，1.0當量)於THF (10.0 mL)中之經攪拌混合物中添加LiHMDS (1N，於THF中，8.02 mL)。在-70下於氮氣氛圍下攪拌反應混合物30分鐘。在-70℃下於氮氣氛圍下向上述混合物中添加碳酸二甲酯(1.0 g，11.10 mmol，1.80當量)。在-70℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。藉由LCMS可偵測到約50%所需產物。在0℃下用飽和NH 4Cl (水溶液，100 mL)淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3x200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (3:1)溶離，得到呈油狀之2-(2,6-二氯吡啶-4-基)乙酸甲酯(化合物2，590 mg，41%)。LCMS (ES, m/z): 220,222 [M+1]+。 步驟 2 ：合成化合物 3
在0℃下於氮氣氛圍下向2-(2,6-二氯吡啶-4-基)乙酸甲酯(化合物2，5.0 g，22.72 mmol，1.0當量)於DMF (50 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaH (2.73 g，68.16 mmol，3.00當量，60%)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在0℃下向上述混合物中添加1,3-二溴-2-甲基丙烷(7.36 g，34.08 mmol，1.5當量)。在10℃下再攪拌所得混合物2小時。藉由LCMS可偵測到約30%所需產物。在室溫下用水(200 mL)淬滅反應物。用濃HCl將混合物酸化至pH 6。用CH2Cl2 (3x300 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% FA)，在30分鐘內10%至70%梯度；偵測器，UV 254 nm。用CH 2Cl 2(3x300 mL)萃取溶離異構物。在真空下濃縮所得混合物，得到呈綠色油狀之1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸甲酯(化合物3，1.9 g，15%)。LCMS: (ES, m/s): 274,276 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 4
在室溫下於氮氣氛圍下向1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸甲酯(化合物3，1.8 g，6.56 mmol，1.0當量)於THF (18 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加LiOH (0.31 g，13.13 mmol，2.0當量) (H 2O=9.0 mL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。用1N HCL將反應混合物調節至pH=5。藉由逆相急驟層析用以下條件純化混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% FA)，在30分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。用CH 2Cl 2(3x300 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物，得到呈半固體狀之1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸(化合物4，2.0 g，83%)。LCMS: (ES, m/s): 260,262 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 5
在0℃下於氮氣氛圍下向1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸(化合物4，2.4 g，9.22 mmol，1.0當量)於DMF (24 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加HATU (5.26 g，13.84 mmol，1.5當量)、1-胺基-3-甲基硫脲(1.16 g，11.07 mmol，1.2當量)及DIEA (2.39 g，18.45 mmol，2.0當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在室溫下用水淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3x200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (2:3)溶離，得到呈白色固體狀之1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基-N-[(甲基硫代胺甲醯基)胺基]環丁烷-1-甲醯胺(2.5 g，70%)。LCMS: (ES, m/s): 347,349 [M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 6
在0℃下於氮氣氛圍下向1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基-N-[(甲基硫代胺甲醯基)胺基]環丁烷-1-甲醯胺(化合物5，2.3 g，6.62 mmol，1.0當量)於THF (11 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaOH (1.0 g，25.00 mmol，3.77當量) (H 2O=11 mL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS可偵測到約73%所需產物。用濃HCl將混合物酸化至pH 5。用CH 2Cl 2(3x200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈白色固體狀之5-[1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑-3-硫醇(化合物6，1.2 g，55%)。LCMS: (ES, m/s): 329,331 [M+H] +。 步驟 6 ：合成化合物 7
在0℃下於氮氣氛圍下向5-[1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑-3-硫醇(化合物6，1.2 g，3.64 mmol，1.0當量)於THF (12 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaNO 2(0.75 g，10.93 mmol，3.0當量)(H 2O=12 mL)及HNO 3(12 mL，1.0 mol/L)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在室溫下用水/冰淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3x200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，矽膠；移動相，含ACN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。用CH 2Cl 2(3x200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物，得到呈綠色固體狀之2,6-二氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(化合物7，900 mg，74%)。LCMS: (ES, m/s): 297,299 [M+H] +。 步驟 7 ：合成化合物 8
在0℃下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(化合物7，400 mg，1.346 mmol，1.0當量)及(乙基硫烷基)鈉(147 mg，1.75 mmol，1.3當量)於THF (12 mL)中之經攪拌溶液中。在80℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物5小時。LCMS指示反應完成。將所得混合物冷卻降至室溫且藉由逆相急驟層析用以下條件純化：管柱，矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% FA)，在30分鐘內10%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。在真空下濃縮所得混合物，得到呈淺綠色油狀之2-氯-6-(乙基硫烷基)-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(化合物8，300 mg，65%)。LCMS: (ES, m/s): 323,325 [M+H] +。 步驟 8 ：合成化合物 112
在室溫下於氮氣氛圍下向2-氯-6-(乙基硫烷基)-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(化合物8，150 mg，0.46 mmol，1.0當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，145 mg，0.46 mmol，1.0當量)於二噁烷(8.0 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加Xantphos (107 mg，0.18 mmol，0.4當量)、Pd(OAc) 2(41 mg，0.18 mmol，0.4當量)及Cs 2CO 3(454 mg，1.39 mmol，3.0當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。將所得混合物冷卻降至室溫且藉由逆相急驟層析用以下條件純化：管柱，C18矽膠；移動相TFA，含ACN之水，在10分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。在真空下濃縮所得混合物，得到化合物9。藉由掌性HPLC用以下條件(管柱：移動相A：Hex (0.1% 2M NH 3-MeOH)-HPLC，移動相B：EtOH--HPLC；流動速率：20 mL/min；梯度：在15.5分鐘內70% B至70% B；波長：220/254 nm；RT1(min)：10.35；RT2(min)：13.03；樣品溶劑：Hex(0.1% 2M NH 3-MeOH)-HPLC；注入體積：0.5 mL)分離產物；將第一溶離異構物(RT=10.35 min)濃縮至乾並凍乾，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基硫烷基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物112，16.1 mg，5.60%)。LCMS: (ES, m/s): 658 [M+H] +。 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6) 8.37 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.96 (d, J=14.8 Hz, 2H), 7.06 (s, 1H), 5.22 (s, 2H), 4.69-4.62 (m, 2H), 4.53 (t, J=7.2 Hz, 1H), 3.65 (s, 2H), 3.53 (s, 3H), 3.15-3.13 (m, 2H), 2.98-2.91 (m, 1H), 2.85-2.65 (m, 3H), 1.93 (d, J=9.6 Hz, 1H), 1.80-1.50 (m, 8H), 1.36-1.33 (m, 3H), 0.95-0.75 (m, 4H)。 合成化合物 113 步驟 1 ：合成化合物 2
在-70℃下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-甲基吡啶(化合物1，1.0 g，6.17 mmol，1.0當量)於THF (10.0 mL)中之經攪拌混合物中添加LiHMDS (1N，於THF中，8.02 mL)。在-70下於氮氣氛圍下攪拌反應混合物30分鐘。在-70℃下於氮氣氛圍下向上述混合物中添加碳酸二甲酯(1.0 g，11.10 mmol，1.80當量)。在-70℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。藉由LCMS可偵測到約50%所需產物。在0℃下用飽和NH 4Cl (水溶液，100 mL)淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3x200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (3:1)溶離，得到呈油狀之2-(2,6-二氯吡啶-4-基)乙酸甲酯(化合物2，590 mg，41%)。LCMS (ES, m/z): 220,222 [M+1] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在0℃下於氮氣氛圍下向2-(2,6-二氯吡啶-4-基)乙酸甲酯(化合物2，5.0 g，22.72 mmol，1.0當量)於DMF (50 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaH (2.73 g，68.16 mmol，3.00當量，60%)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在0℃下向上述混合物中添加1,3-二溴-2-甲基丙烷(7.36 g，34.08 mmol，1.5當量)。在10℃下再攪拌所得混合物2小時。藉由LCMS可偵測到約30%所需產物。在室溫下用水(200 mL)淬滅反應物。用濃HCl將混合物酸化至pH 6。用CH 2Cl 2(3x300 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% FA)，在30分鐘內10%至70%梯度；偵測器，UV 254 nm。用CH 2Cl 2(3x300 mL)萃取溶離異構物。在真空下濃縮所得混合物，得到呈綠色油狀之1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸甲酯(化合物3，1.9 g，15%)。LCMS: (ES, m/s): 274,276 [M+H] +。 步驟 3. 合成化合物 4
在室溫下於氮氣氛圍下向1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸甲酯(1.8 g，6.56 mmol，1.0當量)於THF (18 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加LiOH (0.31 g，13.13 mmol，2.0當量) (H 2O=9.0 mL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。用1N HCL將反應混合物調節至pH=5。藉由逆相急驟層析用以下條件純化混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% FA)，在30分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。用CH 2Cl 2(3x300 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物，得到呈半固體狀之1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸(化合物4，2.0 g，83%)。LCMS: (ES, m/s): 260,262 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 5
在0℃下於氮氣氛圍下向1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸(化合物4，2.4 g，9.22 mmol，1.0當量)於DMF (24 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加HATU (5.26 g，13.84 mmol，1.5當量)、1-胺基-3-甲基硫脲(1.16 g，11.07 mmol，1.2當量)及DIEA (2.39 g，18.45 mmol，2.0當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在室溫下用水淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3x200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (2:3)溶離，得到呈白色固體狀之1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基-N-[(甲基硫代胺甲醯基)胺基]環丁烷-1-甲醯胺(化合物5，2.5 g，70%)。LCMS: (ES, m/s): 347,349 [M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 6
在0℃下於氮氣氛圍下向1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基-N-[(甲基硫代胺甲醯基)胺基]環丁烷-1-甲醯胺(化合物5，2.3 g，6.62 mmol，1.0當量)於THF (11 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaOH (1.0 g，25.00 mmol，3.77當量) (H 2O=11 mL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS可偵測到約73%所需產物。用濃HCl將混合物酸化至pH 5。用CH 2Cl 2(3x200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈白色固體狀之5-[1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑-3-硫醇(化合物6，1.2 g，55%)。LCMS: (ES, m/s): 329,331 [M+H] +。 步驟 6 ：合成化合物 7
在0℃下於氮氣氛圍下向5-[1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑-3-硫醇(化合物6，1.2 g，3.64 mmol，1.0當量)於THF (12 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaNO 2(0.75 g，10.93 mmol，3.0當量) (H 2O=12 mL)及HNO 3(12 mL，1.0 mol/L)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在室溫下用水/冰淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3x200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，矽膠；移動相，含ACN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。用CH 2Cl 2(3x200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物，得到呈綠色固體狀之2,6-二氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(化合物7，900 mg，74%)。LCMS: (ES, m/s): 297,299 [M+H] +。 步驟 7 ：合成化合物 8
在0℃下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(化合物7，400 mg，1.346 mmol，1.0當量)及(乙基硫烷基)鈉(147 mg，1.75 mmol，1.3當量)於THF (12 mL)中之經攪拌溶液中。在80℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物5小時。LCMS指示反應完成。將所得混合物冷卻降至室溫且藉由逆相急驟層析用以下條件純化：管柱，矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% FA)，在30分鐘內10%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。在真空下濃縮所得混合物，得到呈淺綠色油狀之2-氯-6-(乙基硫烷基)-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(化合物8，300 mg，65%)。LCMS: (ES, m/s): 323,325 [M+H] +。 步驟 8. 合成化合物 113
在室溫下於氮氣氛圍下向2-氯-6-(乙基硫烷基)-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(化合物8，150 mg，0.46 mmol，1.0當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，145 mg，0.46 mmol，1.0當量)於二噁烷(8.0 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加Xantphos (107 mg，0.18 mmol，0.4當量)、Pd(OAc) 2(41 mg，0.18 mmol，0.4當量)及Cs 2CO 3(454 mg，1.39 mmol，3.0當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。將所得混合物冷卻降至室溫且藉由逆相急驟層析用以下條件純化：管柱，C18矽膠；移動相TFA，含ACN之水，在10分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。在真空下濃縮所得混合物，得到化合物9。藉由掌性HPLC用以下條件(管柱：移動相A：Hex(0.1% 2M NH 3-MeOH)-HPLC，移動相B：EtOH--HPLC；流動速率：20 mL/min；梯度：在15.5分鐘內70% B至70% B；波長：220/254 nm；RT1(min)：10.35；RT2(min)：13.03；樣品溶劑：Hex(0.1% 2M NH 3-MeOH)-HPLC；注入體積：0.5 mL)分離產物；將第二溶離異構物(RT=13.03min)濃縮至乾並凍乾，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基硫烷基)-4-[(1s,3r)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物113，39.4 mg，13.85%)。LCMS: (ES, m/s): 658 [M+H] +, 330 [M/2+H] +； 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6) 8.35 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.96-7.93 (m, 2H), 7.00 (s, 1H), 5.23 (s, 2H), 3.64 (s, 2H), 3.33 (s, 3H), 3.24 (s, 2H), 3.20-3.13 (m, 2H), 2.83-2.82(m, 1H), 2.73-2.70 (m, 2H), 2.56-2.54 (m, 2H), 1.96-1.89 (m, 1H), 1.75-1.42 (m, 5H), 1.40-1.32 (m, 3H), 1.16-1.02 (m, 3H), 0.95-0.70 (m, 4H)。 合成化合物 114A 及化合物 114B 步驟 1 ：合成化合物 2
在10℃下向丙二酸1-三級丁酯3-甲酯(化合物11，35.61 g，204.44 mmol，1.25當量)及Cs 2CO 3(106.58 g，327.11 mmol，2當量)於丙酮(550 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加2,4,6-三氯嘧啶(化合物1，30 g，163.55 mmol，1當量)。在25℃下攪拌所得混合物4小時。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用EtOAc (3 x 200 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。此得到呈黃色油狀之2-(2,6-二氯嘧啶-4-基)丙二酸1-三級丁酯3-甲酯(化合物2，30 g，57%)。LCMS (ES, m/z): 321,323 [M+H] +。 步驟 2. 合成化合物 3
在0℃下向2-(2,6-二氯嘧啶-4-基)丙二酸1-三級丁酯3-甲酯(化合物2，15 g，46.70 mmol，1當量)於DCM (150 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加TFA (30 mL)。在25℃下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。用飽和NaHCO 3(水溶液)將殘餘物鹼化至pH 8。用CH 2Cl 2(3 x 100 mL)萃取所得混合物。用鹽水(100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (6:1)溶離，得到呈黃色油狀之2-(2,6-二氯嘧啶-4-基)乙酸甲酯(化合物3，6 g，51%)。LCMS (ES, m/z): 221,223 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 4
在0℃下於氮氣氛圍下向2-(2,6-二氯嘧啶-4-基)乙酸甲酯(化合物3，5.6 g，25.33 mmol，1當量)於THF (80 mL)中之經攪拌混合物中添加LiHMDS (12.72 g，76.00 mmol，3當量)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。在0℃下向上述混合物中逐滴添加甲基1,3-二溴-2-甲基丙烷(化合物12，10.94 g，50.66 mmol，2當量)。在25℃下再攪拌所得混合物16小時。LCMS指示反應完成。在室溫下藉由添加水(100 mL)淬滅反應物。用EtOAc (3 x 100 mL)萃取所得混合物。用鹽水(100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (6:1)溶離，得到呈黃色油狀之1-(2,6-二氯嘧啶-4-基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸甲酯(化合物4，2.8 g，40%)。LCMS (ES, m/z): 275,277 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 5
在0℃下向1-(2,6-二氯嘧啶-4-基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸甲酯(化合物4，2.5 g，9.08 mmol，1當量)於THF (20 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加2.0 M乙胺於THF (20 mL)中之溶液。在25℃下攪拌所得混合物4小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (5:1)溶離，得到呈黃色油狀之1-[2-氯-6-(乙基胺基)嘧啶-4-基]-3-甲基環丁烷-1-甲酸甲酯(化合物5，2.3 g，70%)。LCMS (ES, m/z): 284,286 [M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 6
在0℃下向1-[2-氯-6-(乙基胺基)嘧啶-4-基]-3-甲基環丁烷-1-甲酸甲酯(化合物5，2.3 g，8.10 mmol，1當量)於THF (30 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加含LiOH (0.23 g，9.72 mmol，1.2當量)之H 2O (10 mL)。在25℃下攪拌所得混合物16小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。用HCl (水溶液)將混合物酸化至pH 5。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，水(0.05% TFA)，在30分鐘內ACN 5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈黃色固體狀之1-[2-氯-6-(乙基胺基)嘧啶-4-基]-3-甲基環丁烷-1-甲酸(化合物6，1.4 g，64%)。LCMS (ES, m/z): 270,272 [M+H] +。 步驟 6 ：合成化合物 7
在0℃下向1-[2-氯-6-(乙基胺基)嘧啶-4-基]-3-甲基環丁烷-1-甲酸(化合物5，1.2 g，4.44 mmol，1當量)及HATU (2.54 g，6.67 mmol，1.5當量)於DMF (24 mL)中之經攪拌混合物中添加1-胺基-3-甲基硫脲(0.56 g，5.33 mmol，1.2當量)及DIEA (1.73 g，13.34 mmol，3當量)。在25℃下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。反應混合物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS (ES, m/z): 357,359 [M+H] +。 步驟 7 ：合成化合物 8
在0℃下向1-[2-氯-6-(乙基胺基)嘧啶-4-基]-3-甲基-N-[(甲基硫代胺甲醯基)胺基]環丁烷-1-甲醯胺(化合物7)之上述經攪拌混合物中添加含NaOH (313.82 mg，7.84 mmol，2當量)之H 2O (50 mL)。在50℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。用EtOAc (3 x 100 mL)萃取所得混合物。用鹽水(3 x 100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈黃色固體狀之5-{1-[2-氯-6-(乙基胺基)嘧啶-4-基]-3-甲基環丁基}-4-甲基-1,2,4-三唑-3-硫醇(化合物8，0.6 g，45%)。LCMS (ES, m/z): 339,341 [M+H] +。 步驟 8 ：合成化合物 9
在0℃下向5-{1-[2-氯-6-(乙基胺基)嘧啶-4-基]-3-甲基環丁基}-4-甲基-1,2,4-三唑-3-硫醇(化合物8，0.58 g，1.71 mmol，1當量)於DCM (6 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加AcOH (1.5 g，24.97 mmol，14.59當量)、H 2O 2(0.5 g，14.70 mmol，8.59當量)。在室溫下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。用飽和NaHCO 3(水溶液)將反應混合物鹼化至pH 8。用EtOAc (3 x 30 mL)萃取所得混合物。用鹽水(30 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之2-氯-N-乙基-6-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]嘧啶-4-胺(化合物9，0.25 g，47%)。LCMS (ES, m/z): 307,309 [M+H] +。 步驟 9 ：化合物 114A 及化合物 114B
在120℃下於氮氣氛圍下將2-氯-N-乙基-6-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]嘧啶-4-胺(化合物9，240 mg，0.78 mmol，1當量)、6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，256 mg，0.82 mmol，1.05當量)、Pd(OAc) 2(17 mg，0.078 mmol，0.1當量)、Xantphos (90 mg，0.15 mmol，0.2當量)及Cs 2CO 3(764 mg，2.34 mmol，3當量)於二噁烷(5 mL)中之混合物攪拌3小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。過濾所得混合物，用EtOAc (3 x 20 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離。藉由逆相急驟層析用以下條件再純化粗產物：管柱，C18矽膠；移動相，水(0.05% TFA)，在30分鐘內ACN 5%至100%梯度；偵測器，UV 254 nm。藉由製備型SFC用以下條件分離產物：管柱：CHIRALPAK IA，3 x 25 cm，5 μm；移動相A：CO 2，移動相B：ACN:MeOH=1:1 (1% 2 M NH 3-MeOH)；流動速率：100 mL/min；梯度：等度30% B；管柱溫度：35℃；背壓(bar)：100；波長：220 nm；RT1(min)：3.58；RT2(min)：4.88；將第一溶離異構物(RT1=3.58 min)濃縮並凍乾，得到呈白色固體狀之2-[4-(乙基胺基)-6-[(1s,3R)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]嘧啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物114A，19.8 mg，4%)。LCMS (ES, m/z): 583 [M+H] +； 1H-NMR (CD 3OD, 400 MHz) δ (ppm): 8.40 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 6.20 (brs, 1H), 5.21 (s, 2H), 4.77-4.72 (m, 2H), 4.60-4.56 (m, 1H), 3.86-3.79 (m, 5H), 3.52 (brs, 1H), 3.08-2.84 (m, 4H), 2.12 (brs, 1H), 1.86-1.56 (m, 8H), 1.35-1.20 (m, 4H), 1.05-0.85 (m, 4H)。
將第二溶離異構物(RT1=4.88 min)濃縮並凍乾，得到呈無色油狀之2-[4-(乙基胺基)-6-[(1r,3S)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]嘧啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物114B，31.8 mg，6%)。LCMS (ES, m/z): 583 [M+H] +； 1H-NMR (CD 3OD, 400 MHz) δ (ppm): 8.56 (s, 1H), 8.35 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 6.42 (s, 1H), 5.32 (s, 2H), 4.70-4.68 (m, 2H), 4.56 (s, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.61-3.56 (m, 1H), 3.53-3.48 (m, 1H), 3.46-3.42 (m, 1H), 3.15-2.86 (m, 3H), 2.76-2.65 (m, 1H), 2.00-1.84 (m, 6H), 1.31-1.29 (m, 6H), 1.06-0.94 (m, 3H), 0.96-0.8 (m, 1H)。 合成化合物 115 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，1.05 g，3.52 mmol，1.10當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，1 g，3.20 mmol，1.00當量)於二噁烷(10 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(2.09 g，6.40 mmol，2當量)及Xantphos (0.37 g，0.64 mmol，0.2當量)及二噁烷(10 mL)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用CH 2Cl 2(3x20 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈綠色固體狀之2-(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物1，630 mg，29%)。LCMS (ES, m/z): 575,577 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 115
在室溫下於氮氣氛圍下向2-(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物1，300 mg，0.52 mmol，1當量)於DMF (2 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加Zn(CN) 2(73 mg，0.62 mmol，1.2當量)及Pd(PPh 3) 4(60 mg，0.05 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05%TFA)，在30分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。在真空下濃縮所收集之級分，得到呈灰白色固體狀之4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-甲腈(化合物115，270 mg，74%)。LCMS (ES, m/z): 566 [M+H-TFA] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 9.72 (br s, 1H), 8.84 (d, J=1.2Hz, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.32-8.26 (m, 2H), 7.94 (s, 1H), 5.31 (s, 2H), 4.93-4.87 (m, 4H), 4.63-4.54 (m, 2H), 3.71 (s, 2H), 3.49 (s, 3H), 3.40-3.37 (m, 1H), 3.30-3.28 (m, 1H), 2.88-2.85 (m, 1H), 2.62-2.57 (m, 1H), 1.87-1.63 (m, 4H), 1.09-1.05 (m, 1H), 0.94 (d, J=15.6Hz, 3H)。 合成化合物 116 步驟 1 ： 合成化合物 1
在室溫下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，1.05 g，3.52 mmol，1.10當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，1 g，3.20 mmol，1.00當量)於二噁烷(10 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(2.09 g，6.40 mmol，2當量)及Xantphos (0.37 g，0.64 mmol，0.2當量)及二噁烷(10 mL)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用CH 2Cl 2(3x20 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈綠色固體狀之2-(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(630 mg，29%)。LCMS (ES, m/z): 575,577 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向2-(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物1，300 mg，0.52 mmol，1當量)於DMF (2 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加Zn(CN) 2(73 mg，0.62 mmol，1.2當量)及Pd(PPh 3) 4(60 mg，0.05 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05%TFA)，在30分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。在真空下濃縮所收集之級分，得到呈灰白色固體狀之4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-甲腈(化合物2，270 mg，74%)。LCMS (ES, m/z): 566 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 3
在室溫下向4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-甲腈(化合物2，140 mg，0.24 mmol，1當量)於MeOH (4 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加雷氏鎳(Reney-Ni) (20 mg)。在室溫下於氫氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物且在減壓下濃縮濾液，得到呈黃色油狀之2-[6-(胺基甲基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物3，120 mg，85%)。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS (ES, m/z): 570 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 116
在0℃下向2-[6-(胺基甲基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物3，120 mg，0.21 mmol，1當量)於DCM (2 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加丙烯醯氯(28 mg，0.31 mmol，1.5當量)及TEA (64 mg，0.63 mmol，3當量)。在0℃下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Prep C18 OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.1%FA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內25% B至53% B，53% B；波長：254 nm；RT1(min)：6.30)純化殘餘物；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之N-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)甲基]丙-2-烯醯胺(化合物116，7.7 mg，5%)。LCMS (ES, m/z): 624 [M+H] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.66 (br s, 1H), 8.20 (s, 2H), 7.99-7.94 (m, 2H), 6.93 (s, 1H), 6.32-6.30 (m, 1H), 6.17-6.17 (s, 1H), 5.67-5.64 (m, 1H), 5.19 (s, 2H), 4.97 (d, J= 6.0Hz, 2H), 4.81 (m, d, J= 6.0Hz, 2H), 4.42 (d, J= 6.0Hz, 2H), 3.65 (s, 2H), 3.56 (s, 2H), 3.22 (s, 3H), 2.71-2.70 (m, 2H), 1.98-1.88 (m, 1H), 1.63-1.58(m,4H), 1.50-1.47 (m, 1H), 0.83-0.81 (m, 4H)。 合成化合物 117 步驟 1 ：合成化合物 3
在室溫下於氮氣氛圍下向4-(溴甲基)-3-(甲氧基羰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸(化合物1，6 g，17.5 mmol，1當量)於THF (300 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加4-甲氧基苯甲胺(化合物2，6.00 g，43.80 mmol，2.49當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。用水淬滅反應物。用EtOAc (3 x 100 mL)萃取所得混合物。用鹽水(100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。此得到呈淺黃色固體狀之2-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-甲酸(化合物3，1.6 g，45%)。LCMS (ESI, m/z):366 [M+H] + 步驟 2. 合成化合物 5
在室溫下向2-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-甲酸(化合物3，2.5 g，6.84 mmol，1當量)及HATU (4.01 g，10.54 mmol，1.54當量)於DMF (40 mL)中之經攪拌混合物中添加N,O-二甲基羥胺鹽酸鹽(化合物4，1.00 g，10.26 mmol，1.50當量)及DIEA (2.75 g，21.28 mmol，3.11當量)。在室溫下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。用水(5 mL)稀釋所得混合物。用EtOAc (3 x 5 mL)萃取所得混合物。用鹽水(5 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (5:1)溶離，得到呈無色油狀之N-甲氧基-2-[(4-甲氧基苯基)甲基]-N-甲基-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-甲醯胺(化合物5，2.5 g，89%)。LCMS: (ms, ESI): 409 [M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 6
在-5℃下於氮氣氛圍下向N-甲氧基-2-[(4-甲氧基苯基)甲基]-N-甲基-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-甲醯胺(化合物5，1 g，2.44 mmol，1當量)於THF (20 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加MeMgBr (5 mL，1 N，於THF中，5 mmol)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在室溫下藉由添加飽和NH 4Cl (水溶液) (20 mL)淬滅反應物。用EtOAc (3 x 20 mL)萃取所得混合物。用鹽水(20 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (5:1)溶離，得到呈黃色油狀之6-乙醯基-2-[(4-甲氧基苯基)甲基]-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物6，880 mg，98%)。LCMS:(ms, ESI):364 [M+H] + 步驟 4 ：合成化合物 7
在室溫下向6-乙醯基-2-[(4-甲氧基苯基)甲基]-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物6，880 mg，1.21 mmol，1當量，50%)於EtOH (10 mL)中之經攪拌混合物中添加CuBr 2(1350 mg，6.04 mmol，4.99當量)。在80℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。用水(20 mL)稀釋所得混合物。用EtOAc (3 x 20 mL)萃取所得混合物。用鹽水(20 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (3:1)溶離，得到呈黃色固體狀之6-(2-溴乙醯基)-2-[(4-甲氧基苯基)甲基]-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物7，380 mg，70%)。LCMS (ms, ESI): 442,444 [M+H] + 步驟 5 ：合成化合物 8
在0℃下於氮氣氛圍下向甲硫醇鈉(化合物7，114.23 mg，1.631 mmol，1.5當量)於MeOH (7 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加6-(2-溴乙醯基)-2-[(4-甲氧基苯基)甲基]-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(350 mg，1.08 mmol，1當量)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物10分鐘。LCMS指示反應完成。在0℃下用水/冰淬滅反應物。藉由過濾收集沈澱之固體且用Et 2O (3 x 10 mL)洗滌。此得到呈黃色固體狀之2-[(4-甲氧基苯基)甲基]-6-[2-(甲基硫烷基)乙醯基]-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物8，280 mg，86%)。LCMS (ESI, ms):410 [M+H] + 步驟 6 ：合成化合物 9
在0℃下於氮氣氛圍下向2-[(4-甲氧基苯基)甲基]-6-[2-(甲基硫烷基)乙醯基]-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物8，280 mg，0.48 mmol，1當量)於DCM (7 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaBH 4(36.96 mg，0.97 mmol，2當量)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在0℃下用水淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 10 mL)萃取所得混合物。用鹽水(50 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。此得到呈白色固體狀之6-[1-羥基-2-(甲基硫烷基)乙基]-2-[(4-甲氧基苯基)甲基]-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物9，200 mg，59%)。LCMS (ESI, ms):292 [M+H] + 步驟 7 ：合成化合物 10
在0℃下向6-[1-羥基-2-(甲基硫烷基)乙基]-2-[(4-甲氧基苯基)甲基]-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物9，200 mg，0.48 mmol，1當量)及DIEA (188 mg，1.45 mmol，3當量)於DCM (1 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加TsCl (139 mg，0.72 mmol，1.5當量)及DMAP (6 mg，0.05 mmol，0.1當量)。在25℃下攪拌所得混合物16小時。在室溫下藉由添加水(5 mL)淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 10 mL)萃取所得混合物。用鹽水(3 x 10 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈黃色固體狀之4-甲基苯磺酸1-{2-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基}-2-(甲基硫烷基)乙酯(化合物10，120 mg，43%)。LCMS (ES, m/z): 566 [M+H] + 步驟 8. 合成化合物 12
在0℃下向4-甲基苯磺酸1-{2-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基}-2-(甲基硫烷基)乙酯(化合物10，120 mg，0.21 mmol，1當量)及(3S)-3-甲基哌啶鹽酸鹽(43 mg，0.31 mmol，1.5當量)於DCM (3 mL)中之經攪拌混合物中添加TEA (42 mg，0.42 mmol，2當量)。在60℃下攪拌所得混合物16小時。LCMS指示反應完成。在室溫下藉由添加水(10 mL)淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 10 mL)萃取所得混合物。用鹽水(3 x 15 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之2-[(4-甲氧基苯基)甲基]-6-{1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]-2-(甲基硫烷基)乙基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物12，80 mg，76%)。LCMS (ES, m/z): 493 [M+H] + 步驟 9 ：合成化合物 13
在0℃下向2-[(4-甲氧基苯基)甲基]-6-{1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]-2-(甲基硫烷基)乙基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物12，75 mg，0.15 mmol，1當量)於DCM (100 uL)中之經攪拌混合物中添加TFA (30 uL)。在25℃下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，水0.05% TFA，在30分鐘內ACN 5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈黃色油狀之6-{1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]-2-(甲基硫烷基)乙基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮；三氟乙酸(化合物13，50 mg，67%)。LCMS (ES, m/z): 373 [M+H] + 步驟 10 ：合成化合物 117
在120℃下於氮氣氛圍下將6-{1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]-2-(甲基硫烷基)乙基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物13，40 mg，0.10 mmol，1當量)、6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(如WO2020210508中所述製備，36 mg，0.11 mmol，1.1當量)、Ruphos (20 mg，0.04 mmol，0.4當量)、RuPhos Palladacycle Gen.3 (18 mg，0.02 mmol，0.2當量)及Cs 2CO 3(70 mg，0.21 mmol，2當量)於二噁烷(1.2 mL)中之混合物攪拌16小時。LCMS指示反應完成。將所得混合物冷卻至室溫並過濾，用EtOAc (3 x 10 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，水(0.05% TFA)，在30分鐘內ACN 5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。藉由製備型HPLC用以下條件再純化粗產物：管柱：XBridge Shield RP18 OBD管柱，19 x 250 mm，10 μm；移動相A：水(0.05% TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內32% B至52% B，52% B；波長：254 nm；RT1(min)：4.03。凍乾所收集之級分，得到呈無色油狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]-2-(甲基硫烷基)乙基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮；三氟乙酸(化合物117, 8.8 mg，10%)。LCMS (ES, m/z): 644 [M+H] +； 1H-NMR (CD 3OD, 400 MHz) δ (ppm): 8.98-8.75 (m, 1H), 8.28 (s, 1H), 8.23-8.10 (m, 1H), 7.25-7.11 (m, 1H), 6.05-5.92 (m, 1H), 5.32 (s, 2H), 5.02-4.98 (m, 4H), 4.90 (s, 2H), 4.83-4.80 (m, 1H), 3.83-3.70 (m, 3H), 3.52-3.45 (m, 2H), 3.40-3.38 (m, 4H), 2.86-2.70 (m, 1H), 2.63-2.43 (m, 1H), 2.11 (s, 3H), 2.03-1.72 (m, 4H), 1.27-1.23 (m, 3H), 1.18-1.08 (m, 1H), 1.02-0.96 (m, 3H)。 合成化合物 118 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，1.05 g，3.52 mmol，1.10當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，1 g，3.20 mmol，1.00當量)於二噁烷(10 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(2.09 g，6.40 mmol，2當量)及Xantphos (0.37 g，0.64 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(112 mg，0.50 mmol，0.15當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用CH 2Cl 2(3x20 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈綠色固體狀之2-(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物2，630 mg，29%)。LCMS:(ES.m/z):575,577 [M+1] +。 步驟 2 ：合成化合物 118
在室溫下向2-(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物2，100 mg，0.17 mmol，1當量)及2-疊氮基乙胺(化合物1，22 mg，0.26 mmol，1.5當量)於二噁烷(1 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(113 mg，0.34 mmol，2當量)及Xantphos (20 mg，0.03 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(4 mg，0.02 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1.5小時。LCMS指示在LCMS上有50%產物。過濾所得混合物，用DCM (3x50 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到2-{6-[(2-疊氮基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(30 mg，粗物質)。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內20% B至35% B，35% B；波長：254 nm；RT1(min)：8.77)純化粗產物(30 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之2-{6-[(2-疊氮基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物118，8.5 mg，8%)。LCMS:(ES.m/z):625[M+1] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 9.81 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 8.27-8.19 (m, 2H), 7.44 (s, 1H), 6.98 (br s, 1H), 6.07 (s, 1H), 5.24 (s, 2H), 4.91-4.85 (m, 2H), 4.79-4.67 (m, 2H), 4.52 (s, 2H), 3.55 (s, 1H), 3.49-3.48 (m, 4H), 3.39-3.36 (m, 1H), 3.29-3.21 (m, 4H), 2.86-2.84 (m, 1H), 2.63-2.56 (m, 1H), 2.49-2.48 (m, 1H), 1.85-1.62 (m, 4H), 1.10-1.12 (m, 1H), 0.94 (d, J=5.6Hz, 3H) 合成化合物 119 步驟 1 ：合成化合物 4
向胺基乙腈鹽酸鹽(500 mg，5.4mmol，1當量)於二噁烷(10 mL)中之經攪拌溶液中添加1M NaOH水溶液(217mg，5.4mmol，1當量)。將反應物冷卻至0℃且逐滴添加溶解於5 mL二噁烷中之二碳酸二-三級丁酯(1.18 g，5.4 mmol，1當量)。劇烈攪拌反應混合物隔夜。早晨，TLC對照指示起始物質完全消耗。用飽和NaHCO 3水溶液淬滅反應物，且用二氯甲烷(3 x 100 mL)萃取。用鹽水(3 x 100 mL)洗滌合併之有機層，經Na 2SO 4乾燥，且在真空下濃縮，得到呈無色油狀之(氰基甲基)胺基甲酸三級丁酯(化合物4，800mg，95%)。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 5.03 (s, 1H), 4.06 (m, 2H), 1.44 (s, 9H)。 步驟 2 ：合成化合物 1
在室溫下向2,6-二氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶(INT3，235 mg，0.786 mmol，1當量)及(S)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(INT4，245 mg，0.786 mmol，1當量)於二噁烷(7 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(512 mg，1.57 mmol，2當量)及Xantphos (90.8 mg，0.157 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(17.6 mg，0.0786 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在室溫下用飽和碳酸氫鈉淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 50 ml)萃取所得混合物。在減壓下濃縮合併之有機層。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (9:1)溶離，得到呈綠色固體狀之(S)-2-(6-氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物1，300 mg，66.4%)。LCMS:(ES.m/z): 575,577 [M+1] +。 步驟 3 ：合成化合物 2
在室溫下向(S)-2-(6-氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物1，40 mg，0.07mmol，1當量)及(氰基甲基)胺基甲酸三級丁酯(化合物4，110 mg，0.7 mmol，10當量)於二噁烷(1.2 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(45 mg，0.14 mmol，2當量)及Xantphos (8.1 mg，0.014 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(1.6 mg，0.007 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物40分鐘。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈白色固體狀之(S)-(氰基甲基)(4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)-6-(6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-1-側氧基-4-(三氟甲基)異吲哚啉-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸三級丁酯(化合物2，25 mg，52%)。LCMS:(ES.m/z):695 [M+1] +。 步驟 4 ：合成化合物 119
將(S)-(氰基甲基)(4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)-6-(6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-1-側氧基-4-(三氟甲基)異吲哚啉-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸三級丁酯(化合物2，25mg，0.042mmmol)溶解於二噁烷/水之1/1混合物(1ml)中且在120C下於微波引發器中加熱15分鐘。用二氯甲烷萃取產物且藉由矽膠管柱層析純化，用CH 2Cl 2/MeOH (3:1)溶離，得到呈白色固體狀之(S)-2-((4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)-6-(6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-1-側氧基-4-(三氟甲基)異吲哚啉-2-基)吡啶-2-基)胺基)乙腈(7mg，30%)。LCMS:(ES.m/z):595[M+1] +； 1H NMR (300 MHz, DMSO- d 6) δ 8.25 (s, 1H), 7.95 (d, J= 17.2 Hz, 2H), 7.61 (d, J= 1.2 Hz, 1H), 7.29 (t, J= 5.8 Hz, 1H), 6.18 (d, J= 1.2 Hz, 1H), 5.27 - 5.22 (m, 2H), 4.92 (d, J= 6.1 Hz, 2H), 4.80 (d, J= 6.1 Hz, 2H), 4.29 (d, J= 5.7 Hz, 2H), 3.66 (s, 2H), 3.52 (s, 2H), 3.26 (s, 3H), 2.72 (d, J= 8.7 Hz, 2H), 2.01 - 1.88 (m, 1H), 1.66 (d, J= 13.1 Hz, 3H), 1.59 (s, 1H), 1.48 (d, J= 11.8 Hz, 1H), 1.23 (s, 4H), 0.89 (m, 4H)。 合成化合物 120 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，200 mg，0.66 mmol，1當量)及3-巰基丙烷-1,2-二醇(化合物1A，86 mg，0.80 mmol，1.2當量)於DMF (2 mL)中之經攪拌溶液中添加K 2CO 3(184 mg，1.33 mmol，2當量)。在50℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1%FA)，在30分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)硫烷基]丙烷-1,2-二醇(化合物2，190 mg，76%)。LCMS (ESI, ms): 370,372 [M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 120
在室溫下於氮氣氛圍下向3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)硫烷基]丙烷-1,2-二醇(化合物2，100 mg，0.27 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，92 mg，0.29 mmol，1.1當量)於1,4-二噁烷(2 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(263 mg，0.810 mmol，3當量)、XantPhos (31 mg，0.05 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(6 mg，0.03 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% FA)，在30分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之2-{6-[(2,3-二羥基丙基)硫烷基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮；甲酸(33.8 mg，17%)。LCMS (ESI, ms):646[M+H-FA] +； 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.25 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 6.96 (s, 1H), 5.24 (s, 2H), 4.92 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 4.84 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 3.67-3.64 (m, 4H), 3.57 (s, 3H), 3.48- 3.41 (m, 4H), 3.07-2.97 (m, 1H), 2.76- 2.70 (m, 2H), 1.96-1.93 (m, 1H), 1.72-1.50 (m, 5H), 0.88-0.75 (m, 4H)。 合成化合物 121
向先前在0℃下冷卻之(S)-2-(4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)-6-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物140，35 mg，0.056 mmol，1當量)及三乙胺(7.4 mg，0.073 mmol，1.3當量)於二氯甲烷(1.5 mL)中之經攪拌混合物中添加含丙烯醯氯(6.6 mg，0.073 mmol，1.3當量)之二氯甲烷(1.5 mL)。使所得混合物達到室溫且攪拌2小時。LCMS指示反應完成。在室溫下用飽和碳酸氫鈉淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 50 ml)萃取所得混合物。在減壓下濃縮合併之有機層。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (3:1)溶離，得到呈白色固體狀之(S)-2-(6-(4-丙烯醯基哌嗪-1-基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物121，15 mg，39%)。LCMS:(ES.m/z):679[M+1] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.72 (s, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.30 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.56 (d, J= 1.0 Hz, 1H), 6.88 (dd, J= 16.7, 10.4 Hz, 1H), 6.33 (s, 1H), 6.15 (dd, J= 16.7, 2.4 Hz, 1H), 5.71 (dd, J= 10.4, 2.4 Hz, 1H), 5.22 (s, 2H), 4.92 (d, J= 6.2 Hz, 2H), 4.84 (d, J= 6.2 Hz, 2H), 4.49 (s, 1H), 3.69 (s, 2H), 3.64 (s, 2H), 3.56 (s, 2H), 3.53 (s, 4H), 3.18 (d, J= 15.2 Hz, 4H), 3.06 (qd, J= 7.3, 4.8 Hz, 3H), 2.79 (s, 1H), 2.55 (s, 1H), 1.96 (s, 1H), 1.79 (s, 1H), 1.73 (d, J= 13.7 Hz, 2H), 1.25 - 1.14 (m, 6H), 0.85 (t, J= 5.0 Hz, 4H)。 合成化合物 122 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向3-氰基丙酸甲酯(化合物1，5.0 g，44.20 mmol，1.0當量)於THF (50 mL)中之經攪拌溶液中。在室溫下向上述混合物中逐份添加LiBH 4(0.58 g，26 mmol，0.6當量)。在80℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。TLC指示反應完成。在室溫下用水/冰淬滅反應物。用EA (3x300 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈淺色油狀之4-羥基丁腈(700 mg，18%)。 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6) 4.68 (t, J=6 Hz, 1H), 3.49-3.42 (m, 2H), 2.53-2.48 (m, 2H), 1.74-1.65 (m, 2H)。 步驟 2 ：合成化合物 3
在0℃下於氮氣氛圍下向4-羥基丁腈(化合物2，63 mg，0.73 mmol，1.10當量)於DMF (4.0 mL)中之經攪拌溶液中添加NaH (54 mg，1.33 mmol，2.00當量，60%)。在0℃下向上述混合物中經30分鐘逐份添加2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，200 mg，0.66 mmol，1.00當量)。在室溫下再攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，矽膠；移動相FA，含MeCN之水，在40分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。在真空下濃縮所得混合物，得到呈半固體狀之4-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)氧基]丁腈(化合物3，180 mg，69%)。LCMS: (ES, m/s): 348,350 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 122
在室溫下於氮氣氛圍下向4-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)氧基]丁腈(120 mg，0.34 mmol，1.0當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(107 mg，0.35 mmol，1.0當量)於二噁烷(5.0 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加Xantphos (79 mg，0.13 mmol，0.4當量)、Pd(OAc) 2(31 mg，0.13 mmol，0.4當量)及Cs 2CO 3(337 mg，1.03 mmol，3.0當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。將反應混合物冷卻降至室溫且藉由逆相急驟層析用以下條件純化：管柱，C18矽膠；移動相TFA (0.05%)，含ACN之水，在30分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。在真空下濃縮所得混合物，得到粗產物。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內25% B至45% B，45%)再純化粗產物。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之4-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)氧基]丁腈；三氟乙酸(化合物122，53 mg，20%)。LCMS: (ES, m/s): 624 [M+H] +, 646 [M+Na] +； 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6) 9.94 (br s, 1H), 8.58 (s, 1H), 8.26-8.22 (m, 2H), 7.97 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.29 (s, 2H), 4.92 (d, J=6 Hz, 2H), 4.83 (d, J=6 Hz, 2H), 4.80-4.75(m, 2H), 4.54 (s, 2H), 4.40-4.36 (m, 2H), 3.65 (s, 2H), 3.40 (s, 3H), 3.28-3.27 (m, 1H), 2.90-2.85 (m, 1H), 2.67-2.62 (m, 2H), 2.12-2.03 (m, 2H), 1.87-1.59 (m, 4H), 1.13-1.02 (m, 1H), 0.88 (d, J=6 Hz, 3H)。 合成化合物 123 步驟 1 ：合成化合物 2
在0℃下於空氣氛圍下向異丁醛(化合物1，5 g，69.34 mmol，1當量)於Et 2O (10 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加K 2CO 3(1.92 g，13.86 mmol，0.2當量)。接著在0℃下逐滴添加TMSCN (13.76 g，138.68 mmol，2當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物6小時。藉由GCMS可偵測到所需產物。在0℃下藉由添加NaHCO 3(20 mL)淬滅反應物。用Et 2O (3x40 mL)萃取水層。在真空下濃縮合併之有機層。在0℃下向上述混合物中經10分鐘逐滴添加HCl (1N，30 ml)。在室溫下再攪拌所得混合物2小時。GCMS指示反應完成。用Et 2O (3x40 mL)萃取水層。用NaHCO 3(水溶液，2x20 mL)洗滌有機層。在真空下濃縮合併之有機層。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈白色油狀之2-羥基-3-甲基丁腈(化合物2，5 g，72%)。GCMS:(ES.m/z):99[M]。 步驟 2 ：合成化合物 4
在0℃下於空氣氛圍下向2-羥基-3-甲基丁腈(化合物2，132 mg，1.33 mmol，2當量)於DMF (2 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaH (53 mg，1.33 mmol，60%，2當量)。在0℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。在室溫下向上述混合物中逐份添加2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，200 mg，0.66 mmol，1當量)。在50℃下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應有50%產物及14%起始物質。將反應混合物冷卻降至室溫且在室溫下用水/冰淬滅反應物。用EA (3x300 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈黃色固體狀之2-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)氧基]-3-甲基丁腈(化合物4，160 mg，66%)。LCMS:(ES.m/z): 362,364 [M+1]+。 步驟 3 ：合成化合物 123
在室溫下於氮氣氛圍下向2-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)氧基]-3-甲基丁腈(化合物4，150 mg，0.41 mmol，1.00當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，129 mg，0.41 mmol，1.00當量)於二噁烷(2 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs2CO3 (270 mg，0.83 mmol，2當量)及Xantphos (47 mg，0.08 mmol，0.2當量)及Pd(OAc)2 (9.31 mg，0.04 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應有44%產物。將反應混合物冷卻降至室溫且藉由逆相急驟層析用以下條件純化：管柱，C18矽膠；移動相FA (0.1%)，含ACN之水，在40分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之3-甲基-2-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)氧基]丁腈；甲酸(31.3 mg，10%)。LCMS: (ES.m/z): 638[M+1] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.26 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.96 (s, 1H), 6.68 (s, 1H), 5.59 (d, J=8Hz, 1H), 5.33-5.24 (m, 2H), 4.92-4.84 (m，4H), 3.67-3.59 (m, 4H), 3.36 (s, 3H), 2.75-2.71 (m, 2H), 2.41-2.32 (m, 1H), 1.97-1.94 (m, 1H), 1.68-1.59 (m, 5H), 1.14-1.11(m, 6H), 0.83-0.82(m, 4H)。 合成化合物 124 步驟 1 ：合成化合物 2
在60℃下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，500 mg，1.67 mmol，1當量)、3-巰基丙酸甲酯(化合物1A，301 mg，2.50 mmol，1.5當量)及K 2CO 3(461 mg，3.34 mmol，2當量)於DMF (8 ml)中之混合物攪拌3小時。LCMS指示反應完成。將反應物冷卻降至室溫且在室溫下藉由添加水(50mL)淬滅。用EtOAc (3 x 30mL)萃取所得混合物。用鹽水(3x30 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，矽膠；移動相，含ACN之水(0.05%TFA)，在30分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈黃色油狀之3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)硫烷基]丙酸甲酯(化合物2，300 mg，47%)。LCMS (ES, m/z): 383,385 [M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下於氮氣氛圍下向3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)硫烷基]丙酸甲酯(化合物2，300 mg，0.78 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，245 mg，0.78 mmol，1.00當量)於二噁烷(8 mL)中之混合物中逐份添加Cs 2CO 3(510 mg，1.56 mmol，2當量)、XantPhos (136 mg，0.23 mmol，0.3當量)及Pd(OAc) 2(26 mg，0.11 mmol，0.15當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。將反應物冷卻降至室溫且在室溫下藉由添加水(50mL)淬滅。用EtOAc (3 x 30mL)萃取所得混合物。用鹽水(3x30 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈白色固體狀之3-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)硫烷基]丙酸甲酯(化合物3，170 mg，33%)。LCMS (ES, m/z): 659[M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 124
在0℃下於氮氣氛圍下向含3-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)硫烷基]丙酸甲酯(150 mg，0.22 mmol，1當量)及LiOH (10 mg，0.45 mmol，2當量)之THF (1 ml)及H 2O (1 mL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05%TFA)，在30分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之3-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)硫烷基]丙酸(化合物124，6.5 mg，4%)。LCMS (ES, m/z): 645 [M+H] +； 1H-NMR (DMSO- d 6, 400 MHz) δ (ppm): 8.26 (s, 1H), 8.07-7.94 (m, 3H), 6.96 (s, 1H), 5.23 (s, 2H), 4.92-4.82 (m, 4H), 3.65-3.57 (m, 4H), 3.32-3.30 (m, 5H), 2.71-2.67 (m, 4H), 1.95-1.89 (m, 1H), 1.66-1.59 (m, 5H), 0.83-0.82 (m, 4H)。 合成化合物 125 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下向2,6-二氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶(INT3，235 mg，0.786 mmol，1當量)及(S)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(INT4，245 mg，0.786 mmol，1當量)於二噁烷(7 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(512 mg，1.57 mmol，2當量)及Xantphos (90.8 mg，0.157 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(17.6 mg，0.0786 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在室溫下用飽和碳酸氫鈉淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 50 ml)萃取所得混合物。在減壓下濃縮合併之有機層。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (3:1)溶離，得到呈綠色固體狀之(S)-2-(6-氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物1，300 mg，66.4%)。LCMS:(ES.m/z): 575,577 [M+1] +。 步驟 2 ：合成化合物 2
在室溫下向(S)-2-(6-氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物1，100 mg，0.17 mmol，1當量)及乙二胺(2.1 g，34.7 mmol，200當量)於二噁烷(3 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(113 mg，0.34 mmol，2當量)及Xantphos (20.74 mg，0.034 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(3.91 mg，0.017 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物40分鐘。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，在減壓下濃縮濾液。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN (0.1%TFA)之水(0.1%TFA)，在30分鐘內5%至95%梯度；偵測器，UV 254 nm，得到呈白色固體狀之(S)-2-(6-((2-胺基乙基)胺基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物2，50 mg，48%)。LCMS:(ES.m/z):599 [M+1] +。 步驟 3 ：合成化合物 125
向先前在0℃下冷卻之(S)-2-(6-((2-胺基乙基)胺基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物2，25 mg，0.042 mmol，1當量)及三乙胺(4.2 mg，0.042 mmol，1當量)於二氯甲烷(1.5 mL)中之經攪拌混合物中添加含丙烯醯氯(3.8 mg，0.042 mmol，1當量)之二氯甲烷(1.5 mL)。使所得混合物達到室溫且攪拌2小時。LCMS指示反應完成。在室溫下用飽和碳酸氫鈉淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 50 ml)萃取所得混合物。在減壓下濃縮合併之有機層。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (3:1)溶離，得到呈白色固體狀之(S)-N-(2-((4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)-6-(6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-1-側氧基-4-(三氟甲基)異吲哚啉-2-基)吡啶-2-基)胺基)乙基)丙烯醯胺(化合物125，15 mg，52%)。LCMS:(ES.m/z):653[M+1] +； 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 8.34 - 8.09 (m, 3H), 7.92 (d, J= 21.7 Hz, 1H), 7.41 (d, J= 1.3 Hz, 1H), 6.72 (s, 1H), 6.20 (dd, J= 17.1, 10.1 Hz, 1H), 6.12 - 5.89 (m, 2H), 5.55 (dd, J= 10.1, 2.2 Hz, 1H), 5.19 (d, J= 28.5 Hz, 2H), 4.89 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 4.77 (d, J= 6.1 Hz, 2H), 4.49 (s, 1H), 3.63 (s, 1H), 3.48 (s, 2H), 3.27 (d, J= 38.9 Hz, 22H), 3.07 (qd, J= 7.3, 4.5 Hz, 4H), 2.75 (d, J= 54.8 Hz, 2H), 1.92 (s, 2H), 1.86 - 1.45 (m, 4H), 1.18 (t, J= 7.3 Hz, 7H), 0.95 - 0.76 (m, 4H)。 合成化合物 126 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下於空氣氛圍下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(來自化合物130合成之化合物11，200 mg，0.61 mmol，1當量)於DMF (3 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加(甲基硫烷基)鈉(216 mg，3.09 mmol，5當量)。在室溫下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05%TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物1，80 mg，44%)。LCMS (ES, m/z): 291 [M+H] + 步驟 2. 合成化合物 2
在90℃下於氮氣氛圍下將2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，800 mg，2.67 mmol，1當量)於乙胺溶液(2.0 M，於THF中，10 mL)中之經攪拌溶液攪拌隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫且在真空下濃縮至乾。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(化合物2，450 mg，54%)。LCMS (ES, m/z): 308,310 [M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 126
在室溫下於氮氣氛圍下向6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(化合物2，65 mg，0.21 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物1，61 mg，0.21 mmol，1當量)於二噁烷(1 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(137 mg，0.42 mmol，2當量)且逐份添加Xantphos (24 mg，0.04 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(5 mg，0.02 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。過濾所得混合物，用DCM (3x20 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(45 mg，粗物質)。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Prep Phenyl OBD管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內25% B至55% B，55% B；波長：254 nm；RT1(min)：5.5)再純化粗產物(45mg)；凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物126，30.1 mg，24%)。LCMS (ES, m/z): 562 [M+H] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 9.66 (br s, 1H), 8.61 (s, 1H), 7.75-7.68 (m, 2H), 7.37 (s, 1H), 5.96 (s, 1H), 4.90-4.88(m, 4H), 4.80-4.78 (m, 2H), 4.43-4.42 (m, 2H), 3.57 (s, 2H), 3.38-3.32 (m, 1H), 3.30-3.21 (m, 6H), 2.84-2.81 (m, 1H), 2.64-2.51 (m, 4H), 1.86-1.63 (m, 4H), 1.16-1.04 (m, 4H), 0.94-0.88 (m, 3H)。 合成化合物 127
向(S)-2-(4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)-6-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物140，25 mg，0.04 mmol，1當量)及K 2CO 3(6.1 mg，0.044 mmol，1.1當量)於DMF (1 ml)中之經攪拌混合物中添加含炔丙基溴(14 mg，0.12 mmol，3當量)之DMF (1 mL)。攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在室溫下用飽和碳酸氫鈉淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 50 ml)萃取所得混合物。在減壓下濃縮合併之有機層。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (3:1)溶離，得到呈白色固體狀之(S)-2-(4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)-6-(4-(丙-2-炔-1-基)哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物127，15 mg，57%)。LCMS: (ES.m/z): 663 [M+1] +； 1H NMR (400 MHz, 丙酮) δ 8.06 (s, 1H), 7.65 (d, J= 1.1 Hz, 1H), 6.13 (s, 1H), 5.23 (s, 2H), 5.02 (d, J= 6.2 Hz, 2H), 4.94 (d, J= 6.1 Hz, 2H), 3.60 (s, 2H), 3.55 (t, J= 5.1 Hz, 4H), 3.37 (d, J= 2.4 Hz, 2H), 3.22 (s, 3H), 3.16 (d, J= 7.5 Hz, 5H), 2.78 (s, 6H), 2.73 (t, J= 2.4 Hz, 2H), 2.61 (t, J= 5.0 Hz, 4H), 1.74 (s, 1H), 1.59 (s, 1H), 1.38 (t, J= 7.3 Hz, 9H), 1.29 (s, 4H), 0.13 (s, 2H)。 合成化合物 128
向(S)-2-(4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)-6-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物140，37 mg，0.059 mmol，1當量)及K 2CO 3(4.1 mg，0.03 mmol，0.5當量)於DMF (1 ml)中之經攪拌混合物中添加含2-溴乙腈(21 mg，0.18 mmol，3當量)之DMF (1 mL)。攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在室溫下用飽和碳酸氫鈉淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 50 ml)萃取所得混合物。在減壓下濃縮合併之有機層。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (3:1)溶離，得到呈白色固體狀之(S)-2-(4-(4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)-6-(6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-1-側氧基-4-(三氟甲基)異吲哚啉-2-基)吡啶-2-基)哌嗪-1-基)乙腈(化合物128，15 mg，38%)。LCMS:(ES.m/z):664[M+1] +； 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.05 (s, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.68 - 7.63 (m, 1H), 5.76 - 5.71 (m, 1H), 5.17 - 5.08 (m, 4H), 5.04 (d, J= 6.3 Hz, 2H), 3.67 (s, 3H), 3.62 - 3.47 (m, 8H), 3.18 - 3.10 (m, 1H), 3.11 (s, 3H), 2.81 (s, 3H), 2.60 (t, J= 5.0 Hz, 4H), 1.74 (s, 3H), 1.45 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 1.25 (s, 2H), 0.87 (d, J= 6.0 Hz, 3H), 0.07 (s, 1H)。 合成化合物 129
向(S)-2-(6-((2-疊氮基乙基)胺基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物118，25 mg，0.04 mmol，1當量)及丙炔(24 mg，0.6 mmol，15當量)於DMF (1 ml)中之經攪拌混合物中添加含抗壞血酸鈉(3.2 mg，0.016mmol，0.4當量)之H2O (0.5 ml)，繼而逐滴添加含硫酸銅(6,4 mg，0.04 mmol，1當量)之H2O (0.5 mL)。攪拌所得混合物隔夜。早晨，添加丙炔(24 mg，0.6 mmol，15當量)且攪拌反應物1小時。LCMS指示反應完成。過濾反應物，在旋轉蒸發器上移除溶劑且藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (3:1)溶離，得到呈白色固體狀之(S)-2-(6-((2-(4-甲基-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙基)胺基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物129，12 mg，45%)。LCMS:(ES.m/z): 665 [M+1] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.23 (s, 1H), 7.93 (d, J= 14.8 Hz, 3H), 7.74 (s, 1H), 7.45 (d, J= 1.2 Hz, 2H), 6.87 (t, J= 5.8 Hz, 1H), 5.94 (d, J= 1.3 Hz, 1H), 5.20 (s, 2H), 5.00 - 4.66 (m, 4H), 4.48 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 3.65 (d, J= 4.9 Hz, 5H), 3.34 (s, 173H), 3.21 (s, 4H), 2.80 - 2.61 (m, 4H), 2.53 (s, 14H), 2.19 (s, 4H), 1.90 (s, 4H), 1.66 - 0.70 (m, 22H)。 合成化合物 130 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下將NIS (57.54 g，255.75 mmol，1.1當量)於H 2SO 4(200 mL)中之經攪拌溶液攪拌40分鐘。在0℃下向上述混合物中逐滴添加含3-溴-2-甲基苯甲酸(化合物1，50 g，232.50 mmol，1當量)之H 2SO 4(200 mL)且攪拌3小時。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在0℃下將反應物傾倒至水/冰(1000 mL)中。藉由過濾收集沈澱之固體且用Et 2O (3x50 mL)洗滌。藉由用DCM (100 mL)濕磨純化殘餘物。藉由過濾收集沈澱之固體且用DCM (3x50 mL)洗滌。此得到呈灰白色固體狀之3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸(化合物2，54.2 g，68%)。LCMS (ESI, ms):339[M-H]； 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.13 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 7.99 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 2.47 (s, 3H)。 步驟 2 ：合成化合物 3
在0℃下於氮氣氛圍下向3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸(化合物2，25 g，73.32 mmol，1當量)於MeOH (250 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加SOCl 2(43.61 g，366.63 mmol，5當量)。在70℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。TLC指示反應完成。使所得混合物冷卻至室溫且在減壓下濃縮。此得到呈灰白色固體狀之3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸甲酯(化合物3，23 g，88%)。 1H NMR (400 MHz, 氯仿-d) δ 8.03 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.02 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 2.56 (s, 3H)。 步驟 3 ：合成化合物 4
在70℃下於氮氣氛圍下向3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸甲酯(化合物3，15 g，42.25 mmol，1當量)及NBS (9.03 g，50.70 mmol，1.2當量)於ACN (150 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加AIBN (3.47 g，21.12 mmol，0.5當量)。LCMS及TLC顯示反應完成。無MS信號。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (6:1)溶離，得到呈白色固體狀之3-溴-2-(溴甲基)-5-碘苯甲酸甲酯(化合物4，16.5 g，90%)。 1H NMR (300 MHz, 氯仿-d) δ 8.20 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 5.06 (s, 2H), 1.73 (s, 3H)。 步驟 4 ：合成化合物 5
在室溫下於氮氣氛圍下將3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸甲酯(化合物4，14.5 g，40.84 mmol，1當量)於NH 3(7N，於MeOH中，15 mL)中之經攪拌溶液攪拌1小時。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物。藉由用水(50 mL)濕磨純化殘餘物。藉由過濾收集沈澱之固體且用Et 2O (3x20 mL)洗滌。此得到呈白色固體狀之4-溴-6-碘-2,3-二氫異吲哚-1-酮(11.2 g，81%)。LCMS (ESI, ms): 338,340 [M+H] + 步驟 5 ：合成化合物 7
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-碘-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物5，11.2 g，33.14 mmol，1當量)及乙烯基三氟硼酸鉀(化合物6，3.55 g，26.51 mmol，0.8當量)於1,4-二噁烷(120 mL)及H 2O (12 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(21.60 g，66.28 mmol，2當量)及Pd(dppf)Cl 2(2.43 g，3.31 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (12:1)溶離，得到呈棕色固體狀之4-溴-6-乙烯基-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物7，3.0 g，38%)。LCMS (ESI, ms):238,240[M+H] + 步驟 6 ：合成化合物 9
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-乙烯基-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物7，5 g，21.00 mmol，1當量)及NMO (7.38 g，63.00 mmol，3當量)於THF (50 mL)及H 2O (25 mL)中之經攪拌溶液中添加K 2OsO 4.2H 2O (0.77 g，2.10 mmol，0.1當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。在0℃下向上述混合物中添加NaIO 4(22.46 g，105.00 mmol，5當量)。在室溫下再攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在0℃下用水淬滅反應物。接著添加EA (100 mL)。藉由過濾收集沈澱之固體且用EtOAc (3x20 mL)洗滌。此得到呈白色固體狀之7-溴-3-側氧基-1,2-二氫異吲哚-5-甲醛(化合物9，4 g，79%)。LCMS (ESI, ms):240,242 [M+H] + 步驟 7 ：合成化合物 11
在室溫下於氮氣氛圍下向7-溴-3-側氧基-1,2-二氫異吲哚-5-甲醛(化合物9，4 g，16.66 mmol，1當量)於DCM (80 mL)中之經攪拌溶液中添加(3S)-3-甲基哌啶鹽酸鹽(化合物10，2.71 g，19.99 mmol，1.2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。在室溫下向上述混合物中添加STAB (17.66 g，83.31 mmol，5當量)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用CH 2Cl 2(3x20 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，矽膠；移動相，含MeCN之水(0.1%FA)，在30分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物11，1.2 g，228%)。LCMS (ESI, ms):323,325[M+H] + 步驟 8 ：合成化合物 12
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物11，500 mg，1.54 mmol，1當量)及甲胺(2N，於THF中，1.2 mL，2.40 mmol，1.5當量)於THF (5 mL)中之經攪拌溶液中添加t-BuONa (148 mg，1.54 mmol，1當量)及tBuXPhos Pd G3 (122 mg，0.15 mmol，0.1當量)。在70℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。過濾所得混合物，用DCM (3x10 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內50%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈灰白色固體狀之4-(甲基胺基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物11，200 mg，47.29%)。LCMS (ESI, ms):274 [M+H] + 步驟 9 ：合成化合物 13
在室溫下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，800 mg，2.67 mmol，1當量)於DMF (8 mL)中之經攪拌溶液中添加(乙基硫烷基)鈉(247 mg，2.94 mmol，1.1當量)。在50℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。用EtOAc (3 x 50 mL)萃取所得混合物。用水(4x50 mL)、鹽水(100 ml)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。此得到呈黃色固體狀之2-氯-6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(化合物13，570 mg，65%)。LCMS (ESI, ms):325,326[M+H] + 步驟 10 ：合成化合物 130
在室溫下於氮氣氛圍下向2-氯-6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(化合物13，200 mg，0.61 mmol，1當量)及4-(甲基胺基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物12，168 mg，0.61 mmol，1當量)於1,4-二噁烷(4 mL)中之經攪拌溶液中添加XantPhos (71 mg，0.12 mmol，0.2當量)、Cs 2CO 3(601 mg，1.84 mmol，3當量)及Pd(AcO) 2(13 mg，0.06 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物4小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05%TFA)，在30分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到40 mg呈黃色固體狀之粗產物。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：Xselect CSH F-Phenyl OBD管柱19*150mm 5μm，n；移動相A：水(0.1%FA)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min；梯度：在7分鐘內16% B至36% B，36% B；波長：254 nm；RT1(min)：6.40)純化粗產物(40 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-4-(甲基胺基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-3H-異吲哚-1-酮；甲酸(化合物130，17.8 mg，4.70%)。LCMS (ESI, ms):562[M+H-FA] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.27 (s, 1H), 8.21 (br s, 1H), 8.04 (s, 1H), 6.94 (s, 1H), 6.84 (d, J=1.2 Hz), 6.70 (s, 1H), 6.00 (br s, 1H), 4.90 (d, J=6.4 Hz, 2H), 4.84-4.82 (m, 4H), 3.56 (s, 2H), 3.51 (br s, 2H), 3.30 (s, 3H), 3.21-3.12 (m, 2H), 2.81-2.76 (m, 5H), 1.94-1.92(m, 1H), 1.63-1.53 (m, 4H), 1.53-1.47 (m, 1H), 1.32 (t, J=7.2 Hz, 3H), 0.87-0.81 (m, 4H)。 合成化合物 131
向(S)-2-(4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)-6-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物140，35 mg，0.056 mmol，1當量)、二異丙基乙胺(51 mg，0.39 mmol，7當量)、HATU (32 mg，0.084 mmol，1.5當量)於DMF/DCM之1:1混合物(1.5 ml)中之經攪拌混合物中添加含2-(1H-四唑-5-基)乙酸(7.2 mg，0.056 mmol，1當量)之DMF (0.5 ml)。攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在室溫下用飽和碳酸氫鈉淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 50 ml)萃取所得混合物。在減壓下濃縮合併之有機層。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (3:1)溶離，得到呈白色固體狀之(S)-2-(6-(4-(2-(1H-四唑-5-基)乙醯基)哌嗪-1-基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物131，15 mg，36%)。LCMS:(ES.m/z): 735 [M+1] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.24 (s, 1H), 7.97 - 7.89 (m, 3H), 7.52 (d, J= 1.1 Hz, 1H), 6.23 (s, 1H), 5.16 (s, 2H), 4.90 (d, J= 6.2 Hz, 2H), 4.83 (d, J= 6.2 Hz, 2H), 3.94 - 3.84 (m, 5H), 3.63 (d, J= 6.3 Hz, 7H), 3.51 (s, 14H), 3.15 (s, 4H), 3.00 - 2.91 (m, 3H), 2.88 (s, 2H), 2.79 - 2.65 (m, 6H), 2.53 (s, 16H), 1.98 - 1.90 (m, 2H), 1.90 (s, 6H), 1.62 (s, 3H), 1.57 (s, 2H), 1.51 - 1.42 (m, 3H), 1.24 - 1.07 (m, 25H), 1.06 (d, J= 1.9 Hz, 4H), 1.03 (d, J= 7.0 Hz, 3H), 0.88 - 0.78 (m, 7H), 0.76 (s, 2H)。 合成化合物 132
向(s)-2-(4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)-6-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物140，35 mg，0.056 mmol，1當量)、二異丙基乙胺(51 mg，0.39 mmol，7當量)、HATU (32 mg，0.084 mmol，1.5當量)於DMF/DCM之1:1混合物(1.5 ml)中之經攪拌混合物中添加含2-疊氮基乙酸(6.8 mg，0.067 mmol，1,2當量)之DMF (0.5 ml)。攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在室溫下用飽和碳酸氫鈉淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 50 ml)萃取所得混合物。在減壓下濃縮合併之有機層。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (3:1)溶離，得到呈白色固體狀之(S)-2-(6-(4-(2-疊氮基乙醯基)哌嗪-1-基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物132，18 mg，45%)。LCMS:(ES.m/z):708[M+1] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.23 (s, 1H), 8.01 - 7.90 (m, 2H), 7.55 (d, J= 1.0 Hz, 1H), 6.29 (d, J= 1.2 Hz, 1H), 5.16 (s, 2H), 4.91 (d, J= 6.2 Hz, 2H), 4.83 (d, J= 6.2 Hz, 2H), 4.20 (s, 2H), 3.75 (s, 6H), 3.66 (s, 2H), 3.61 - 3.49 (m, 4H), 3.50 (s, 16H), 3.35 (s, 8H), 3.18 (s, 2H), 3.03 (dq, J= 14.6, 7.3 Hz, 3H), 2.72 (s, 1H), 2.53 (s, 5H), 2.53 (d, J= 1.3 Hz, 1H), 2.04 - 1.91 (m, 2H), 1.89 (s, 2H), 1.67 (s, 1H), 1.58 (s, 1H), 1.45 (s, 1H), 1.30 - 1.09 (m, 19H), 1.05 (s, 1H), 1.04 (t, J= 7.0 Hz, 1H), 0.84 (s, 2H), 0.88 - 0.78 (m, 3H)。 合成化合物 133
向先前在0℃下冷卻之(S)-2-(4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)-6-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物140，35 mg，0.056 mmol，1當量)及三乙胺(17 mg，0.17 mmol，3當量)於二氯甲烷(1.5 mL)中之經攪拌混合物中添加含丙-2-烯-1-磺醯氯(9.5 mg，0.067 mmol，1.2當量)之二氯甲烷(1.5 mL)。使所得混合物達到室溫且攪拌2小時。LCMS指示反應完成。在室溫下用飽和碳酸氫鈉淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 50 ml)萃取所得混合物。在減壓下濃縮合併之有機層。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (3:1)溶離，得到呈白色固體狀之(S)-2-(6-(4-(烯丙基磺醯基)哌嗪-1-基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物133，15 mg，37%)。LCMS:(ES.m/z):729 [M+1] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.23 (s, 4H), 5.81 (dtt, J= 17.5, 10.4, 7.2 Hz, 2H), 5.58 - 5.30 (m, 2H), 5.19 (s, 2H), 5.09 - 4.91 (m, 3H), 4.91 - 4.76 (m, 3H), 3.98 - 3.86 (m, 3H), 3.54 (d, J= 13.4 Hz, 8H), 3.37 - 3.23 (m, 86H), 3.22 - 3.12 (m, 7H), 3.05 (q, J= 7.3 Hz, 6H), 2.53 (s, 11H), 1.18 (t, J= 7.3 Hz, 13H), 0.84 (d, J= 6.4 Hz, 4H)。 合成化合物 134
向先前在0℃下冷卻之(S)-2-(4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)-6-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物140，35 mg，0.056 mmol，1當量)及三乙胺(17 mg，0.17 mmol，3當量)於二氯甲烷(1.5 mL)中之經攪拌混合物中添加含丁-3-炔-1-磺醯氯(10 mg，0.067 mmol，1.2當量)之二氯甲烷(1.5 mL)。使所得混合物達到室溫且攪拌2小時。LCMS指示反應完成。在室溫下用飽和碳酸氫鈉淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 50 ml)萃取所得混合物。在減壓下濃縮合併之有機層。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (3:1)溶離，得到呈白色固體狀之(S)-2-(6-(4-(丁-3-炔-1-基磺醯基)哌嗪-1-基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物134，12 mg，29%)。LCMS:(ES.m/z):741 [M+1] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.23 (s, 1H), 7.94 (d, J= 15.3 Hz, 2H), 7.57 (d, J= 1.0 Hz, 1H), 6.37 - 6.32 (m, 1H), 5.16 (s, 1H), 4.91 (d, J= 6.2 Hz, 2H), 4.87 - 4.74 (m, 2H), 3.65 (s, 1H), 3.60 - 3.47 (m, 6H), 3.40 - 3.25 (m, 23H), 3.19 (s, 3H), 2.98 (dt, J= 7.8, 2.7 Hz, 1H), 2.71 (s, 1H), 2.64 - 2.60 (m, 1H), 2.60 - 2.51 (m, 3H), 2.04 - 1.94 (m, 1H), 1.65 (d, J= 14.5 Hz, 2H), 1.58 (s, 1H), 1.54 - 1.43 (m, 1H), 1.28 - 1.18 (m, 7H), 0.88 - 0.78 (m, 4H)。 合成化合物 135 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下向2,6-二氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶(INT3，235 mg，0.786 mmol，1當量)及(S)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(INT4，245 mg，0.786 mmol，1當量)於二噁烷(7 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(512 mg，1.57 mmol，2當量)及Xantphos (90.8 mg，0.157 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(17.6 mg，0.0786 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在室溫下用飽和碳酸氫鈉淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 50 ml)萃取所得混合物。在減壓下濃縮合併之有機層。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (3:1)溶離，得到呈綠色固體狀之(S)-2-(6-氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物1，300 mg，66.4%)。LCMS:(ES.m/z): 575,577 [M+1] +。 步驟 2 ：合成化合物 135
在室溫下向(S)-2-(6-氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物1，50 mg，0.087mmol，1當量)及3-胺基戊腈(43 mg，0.43 mmol，5當量)於二噁烷(1.5 ml)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(57 mg，0.17 mmol，2當量)及Xantphos (10 mg，0.017 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(2 mg，0.0087 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物40分鐘。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，在減壓下濃縮濾液。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1%TFA)，在30分鐘內5%至95%梯度；偵測器，UV 254 nm，得到呈白色固體狀之3-((4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)-6-(6-(((S)-3-甲基哌啶-1-基)甲基)-1-側氧基-4-(三氟甲基)異吲哚啉-2-基)吡啶-2-基)胺基)戊腈；三氟乙酸(化合物135，15 mg，27%)。LCMS:(ES.m/z):637[M+1] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.46 (s, 2H), 6.90 (d, J= 7.3 Hz, 2H), 6.15 (s, 2H), 5.30 (d, J= 47.5 Hz, 4H), 4.93 - 4.74 (m, 4H), 4.51 (s, 1H), 3.94 (d, J= 6.1 Hz, 2H), 3.52 (s, 1H), 2.89 (dd, J= 16.9, 5.8 Hz, 1H), 2.60 - 2.49 (m, 43H), 1.73 (d, J= 14.1 Hz, 2H), 1.64 (t, J= 8.0 Hz, 2H), 0.93 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 0.90 - 0.82 (m, 3H)。 合成化合物 136
向(S)-2-(4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)-6-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物140，32 mg，0.051 mmol，1當量)、二異丙基乙胺(46 mg，0.36 mmol，7當量)、HATU (23 mg，0.061 mmol，1.2當量)於DMF/DCM之1:1混合物(1.5 ml)中之經攪拌混合物中添加含4-疊氮基丁酸(7.9 mg，0.061 mmol，1.2當量)之DMF (0.5 ml)。攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在室溫下用飽和碳酸氫鈉淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 50 ml)萃取所得混合物。在減壓下濃縮合併之有機層。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (3:1)溶離，得到呈白色固體狀之(S)-2-(6-(4-(4-疊氮基丁醯基)哌嗪-1-基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物136，12 mg，32%)。LCMS:(ES.m/z):736[M+1] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.22 (s, 1H), 7.95 (d, J= 15.6 Hz, 2H), 7.55 (d, J= 1.0 Hz, 1H), 6.27 (d, J= 1.1 Hz, 1H), 5.16 (s, 2H), 4.91 (d, J= 6.2 Hz, 2H), 4.83 (d, J= 6.2 Hz, 2H), 3.59 - 3.49 (m, 10H), 3.46 - 3.40 (m, 11H), 3.34 (d, J= 3.2 Hz, 101H), 3.32 (s, 7H), 3.18 (s, 3H), 2.53 (s, 7H), 2.44 (t, J= 7.3 Hz, 11H), 1.77 (p, J= 7.1 Hz, 3H), 1.63 (t, J= 15.4 Hz, 4H), 1.19 (dt, J= 23.6, 7.3 Hz, 6H), 0.81 (d, J= 6.3 Hz, 5H)。 合成化合物 137
向(S)-2-(4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)-6-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物140，32 mg，0.051 mmol，1當量)、二異丙基乙胺(46 mg，0.36 mmol，7當量)、HATU (23 mg，0.061 mmol，1.2當量)於DMF/DCM之1:1混合物(1.5 ml)中之經攪拌混合物中添加含丁-2-炔酸(5.2 mg，0.061 mmol，1.2當量)之DMF (0.5 ml)。攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在室溫下用飽和碳酸氫鈉淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 50 ml)萃取所得混合物。在減壓下濃縮合併之有機層。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (3:1)溶離，得到呈白色固體狀之((S)-2-(6-(4-(丁-2-炔醯基)哌嗪-1-基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物137，14 mg，40%)。LCMS:(ES.m/z): 691[M+1] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.23 (s, 1H), 7.94 (d, J= 15.3 Hz, 2H), 7.57 (d, J= 1.0 Hz, 1H), 6.29 (d, J= 1.1 Hz, 1H), 5.16 (s, 2H), 4.91 (d, J= 6.2 Hz, 2H), 4.83 (d, J= 6.2 Hz, 2H), 3.76 (dd, J= 6.8, 3.7 Hz, 2H), 3.64 (s, 2H), 3.60 - 3.49 (m, 6H), 3.46 (dd, J= 7.0, 3.9 Hz, 2H), 3.40 - 3.32 (m, 1H), 3.18 (s, 3H), 2.71 (s, 1H), 2.10 - 1.98 (m, 4H), 1.98 - 1.87 (m, 1H), 1.65 - 1.55 (m, 3H), 1.47 (d, J= 12.1 Hz, 1H), 1.26 - 1.10 (m, 4H), 0.81 (d, J= 6.1 Hz, 4H)。 合成化合物 138 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下向2,6-二氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶(INT3，235 mg，0.786 mmol，1當量)及(S)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(INT4，245 mg，0.786 mmol，1當量)於二噁烷(7 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(512 mg，1.57 mmol，2當量)及Xantphos (90.8 mg，0.157 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(17.6 mg，0.0786 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在室溫下用飽和碳酸氫鈉淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 50 ml)萃取所得混合物。在減壓下濃縮合併之有機層。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (9:1)溶離，得到呈綠色固體狀之(S)-2-(6-氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物1，300 mg，66.4%)。LCMS:(ES.m/z): 575,577 [M+1] +。 步驟 2 ：合成化合物 2
在室溫下向(S)-2-(6-氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物1，270 mg，0.47mmol，1當量)於NH3/二噁烷(1.2 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(306 mg，0.93 mmol，2當量)、Xantphos (54.3 mg，0.095 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(10.5 mg，0.047 mmol，0.1當量)。在150℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物90分鐘。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈白色固體狀之(S)-2-(6-胺基-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物2，25 mg，52%)。LCMS:(ES.m/z):556[M+1] +。 步驟 3 ：合成化合物 138
將(S)-2-(6-胺基-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物2，30 mg，0.054mmmol)溶解於EtOH (1ml)中，添加異硫氰酸烯丙酯(0.27 mg，2.7mmol，50當量)且在90C下於微波引發器中加熱80分鐘。LCMS指示反應完成。移除溶劑且藉由矽膠管柱層析純化產物，用CH 2Cl 2/MeOH (2:1)溶離，得到呈白色固體狀之(S)-1-烯丙基-3-(4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)-6-(6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-1-側氧基-4-(三氟甲基)異吲哚啉-2-基)吡啶-2-基)硫脲(化合物138，7 mg，20%)。LCMS:(ES.m/z):655 [M+1] +； 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 10.98 (d, J= 5.5 Hz, 1H), 9.38 (s, 1H), 8.13 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.97 (d, J= 1.2 Hz, 1H), 7.89 (s, 1H), 6.64 (s, 1H), 6.12 - 5.98 (m, 1H), 5.58 (s, 1H), 5.40 - 5.28 (m, 2H), 5.23 (dd, J= 10.1, 1.4 Hz, 2H), 5.11 (d, J= 2.9 Hz, 4H), 5.06 (d, J= 21.1 Hz, 4H), 4.48 - 4.41 (m, 2H), 3.67 - 3.57 (m, 7H), 3.38 (s, 3H), 2.78 - 2.69 (m, 2H), 1.96 (s, 1H), 1.48 (t, J= 7.3 Hz, 4H), 1.26 (s, 9H), 1.08 (s, 1H), 0.89 (d, J= 6.3 Hz, 3H), 0.86 (d, J= 4.4 Hz, 7H), 0.14 - 0.03 (m, 8H)、-0.03 - -0.11 (m, 4H)。 合成化合物 140 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下向2,6-二氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶(INT3，235 mg，0.786 mmol，1當量)及(S)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(INT4，245 mg，0.786 mmol，1當量)於二噁烷(7 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(512 mg，1.57 mmol，2當量)及Xantphos (90.8 mg，0.157 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(17.6 mg，0.0786 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在室溫下用飽和碳酸氫鈉淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 50 ml)萃取所得混合物。在減壓下濃縮合併之有機層。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (3:1)溶離，得到呈綠色固體狀之(S)-2-(6-氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物1，300 mg，66.4%)。LCMS:(ES.m/z): 575,577[M+1] +。 步驟 2 ：合成化合物 140
在室溫下向(S)-2-(6-氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物1，105 mg，0.18 mmol，1當量)及哌嗪(157 mg，1.83 mmol，10當量)於二噁烷(3.2 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(119 mg，0.36 mmol，2當量)及Xantphos (21.1 mg，0.036 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(4.1 mg，0.018 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物40分鐘。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，在減壓下濃縮濾液。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN (0.1%TFA)之水(0.1%TFA)，在30分鐘內5%至95%梯度；偵測器，UV 254 nm
藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1%TFA)，在30分鐘內5%至95%梯度；偵測器，UV 254 nm，得到呈白色固體狀之(S)-2-(4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)-6-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮；三氟乙酸(化合物140，60 mg，53%)。LCMS:(ES.m/z):625[M+1] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.07 (s, 1H), 8.88 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 8.22 (d, J= 17.7 Hz, 2H), 7.64 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 5.22 (s, 2H), 4.91 (d, J= 6.2 Hz, 2H), 4.85 (d, J= 6.3 Hz, 2H), 4.52 (s, 1H), 3.69 (t, J= 5.2 Hz, 3H), 3.57 (s, 2H), 3.36 (d, J= 11.0 Hz, 1H), 3.29 (d, J= 4.9 Hz, 6H), 3.25 (s, 1H), 2.84 (d, J= 11.5 Hz, 1H), 2.59 (d, J= 10.1 Hz, 1H), 1.99 (q, J= 7.0 Hz, 1H), 1.83 (d, J= 15.0 Hz, 1H), 1.73 (d, J= 13.9 Hz, 1H), 1.63 (d, J= 13.6 Hz, 1H), 1.23 (s, 1H), 1.08 (dd, J= 25.2, 13.9 Hz, 1H), 0.96 - 0.80 (m, 3H)。 合成化合物 141 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下向2-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(化合物1，50 g，229.17 mmol，1.00當量)於AcOH (320 mL)中之經攪拌混合物中添加HNO 3(222 g，2291.74 mmol，10當量，65%)及Br 2(40.29 g，252.09 mmol，1.1當量)及AgNO 3(50.61 g，297.92 mmol，1.30當量)。在室溫下攪拌所得混合物6小時。TLC指示反應完成。用飽和NaHCO 3(水溶液)將混合物鹼化至pH 8。用EtOAc (3 x400 mL)萃取所得混合物。用水(400 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (10:1)溶離，得到呈無色油狀之5-溴-2-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(化合物2，57 g，83%)。 1H NMR (300MHz, DMSO-d 6) δ 8.08 (s, 1H), 7.97 (s, 1H), 3.87 (s, 3H), 2.45 (s, 3H)。 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下向5-溴-2-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(化合物2，50 g，168.31 mmol，1.00當量)及乙酸酐(25.77 g，252.46 mmol，1.50當量)於DMF (500.05 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加草酸(23.64 g，262.56 mmol，1.56當量)及Pd(OAc) 2(3.78 g，16.83 mmol，0.10當量)及Xantphos (19.48 g，33.66 mmol，0.20當量)。在室溫下向混合物中逐滴添加DIEA (50.13 mL，287.81 mmol，1.71當量)。在100℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物4小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。用水淬滅所得混合物且用EtOAc (3 x 800 mL)萃取。用鹽水(3 x 500 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之3-(甲氧基羰基)-4-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酸(化合物3，27 g，61%)。LCMS: (ES.m/z): 261 [M-1] -。 步驟 3 ：合成化合物 4
在室溫下於氮氣氛圍下向3-(甲氧基羰基)-4-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酸(化合物3，13.5 g，51.49 mmol，1.00當量)於CH 3CN (270 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加BPO (6.60 g，25.74 mmol，0.5當量)及NBS (13.75 g，77.23 mmol，1.5當量)。在80℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物5小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之4-(溴甲基)-3-(甲氧基羰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸(化合物4，10 g，56%)。LCMS:(ES.m/z):339[M-1] -。 步驟 4 ：合成化合物 5
在室溫下將4-(溴甲基)-3-(甲氧基羰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸(化合物4，12 g，35.18 mmol，1當量)於含NH 3(g)之MeOH (10 M，220 mL)中之混合物攪拌16小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。此得到呈黃色固體狀之3-側氧基-7-(三氟甲基)-1,2-二氫異吲哚-5-甲酸(8 g，92%)。LCMS (ESI, m/z): 244 [M-H] - 步驟 5 ：合成化合物 6
在0℃下向3-側氧基-7-(三氟甲基)-1,2-二氫異吲哚-5-甲酸(化合物5，7.8 g，31.81 mmol，1當量)及HATU (18.15 g，47.72 mmol，1.5當量)於DMF (150 mL)中之經攪拌混合物中添加N,O-二甲基羥胺(2.33 g，38.17 mmol，1.2當量)及DIEA (12.34 g，95.44 mmol，3當量)。在室溫下攪拌所得混合物3小時。在室溫下藉由添加水(100 mL)淬滅反應物。用EtOAc (3 x 150 mL)萃取所得混合物。用鹽水(3x100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之N-甲氧基-N-甲基-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1,2-二氫異吲哚-5-甲醯胺(化合物6，1.8 g，19%)。LCMS (ESI, m/z): 287 [M-H] - 步驟 6 ：合成化合物 7
在0℃下於氮氣氛圍下向N-甲氧基-N-甲基-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1,2-二氫異吲哚-5-甲醯胺(化合物6，1.8 g，6.24 mmol，1當量)於THF (45 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加MeMgBr (12.49 mL，12.49 mmol，1N，於THF中，2當量)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。LCMS指示完全反應。在0℃下用水淬滅反應物。用EtOAc (3 x 50 mL)萃取所得混合物。用鹽水(100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈粉紅色固體狀之6-乙醯基-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物7，900 mg，59%)。LCMS (ESI, ms):244[M+H] + 步驟 7 ：合成化合物 8
在室溫下於氮氣氛圍下向6-乙醯基-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物7，900 mg，3.70 mmol，1當量)於CHCl 3(12 mL)中之經攪拌溶液中添加Br 2(709 mg，4.44 mmol，1.2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示完全反應。在0℃下用水/冰淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x20 mL)萃取所得混合物。用鹽水(100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液，得到呈淺黃色固體狀之6-(2-溴乙醯基)-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物8，1 g，83%)。LCMS (ESI, ms):322, 324[M+H] + 步驟 8 ：合成化合物 9
在0℃下於氮氣氛圍下向甲硫醇鈉(326 mg，4.65 mmol，1.5當量)於MeOH (15 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加6-(2-溴乙醯基)-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物8，1 g，3.10 mmol，1當量)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物10分鐘。LCMS指示完全反應。在0℃下用水/冰淬滅反應物。用EtOAc (3 x 20 mL)萃取所得混合物。用鹽水(20 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:2)溶離，得到呈黃色固體狀之6-[2-(甲基硫烷基)乙醯基]-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物9，530 mg，57%)。LCMS (ESI, ms):290[M+H] + 步驟 9 ：合成化合物 10
在0℃下於氮氣氛圍下向6-[2-(甲基硫烷基)乙醯基]-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物9，500 mg，1.72 mmol，1當量)於DCM (5 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaBH 4(130 mg，3.45 mmol，2當量)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示完全反應。在0℃下用MeOH及水淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 10 mL)萃取所得混合物。用鹽水(50 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液，得到呈白色固體狀之6-[1-羥基-2-(甲基硫烷基)乙基]-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物10，400 mg，71%)。LCMS (ESI, ms):292[M+H] + 步驟 10 ：合成化合物 12
在0℃下向6-[1-羥基-2-(甲基硫烷基)乙基]-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物20，400 mg，1.37 mmol，1當量)於DCM (4 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加SOCl 2(300 mg，2.52 mmol，1.84當量)及DMF (2滴)。在25℃下攪拌所得混合物16小時。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈黃色固體狀之6-[1-氯-2-(甲基硫烷基)乙基]-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物12，400 mg，75%)。LCMS (ES, m/z): 310,312 [M+H] + 步驟 11 ：合成化合物 14
在0℃下向6-[1-氯-2-(甲基硫烷基)乙基]-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物12，400 mg，1.29 mmol，1當量)及(3S)-3-甲基哌啶鹽酸鹽(化合物13，250 mg，1.84 mmol，1.43當量)於DCM (5 mL)中之經攪拌混合物中添加TEA (400 mg，3.95 mmol，3.06當量)。在45℃下攪拌所得混合物16小時。LCMS指示反應完成。在室溫下藉由添加水(10 mL)淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 10 mL)萃取所得混合物。用鹽水(3x15 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之6-{1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]-2-(甲基硫烷基)乙基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物14，300 mg，59%)。LCMS (ES, m/z): 373 [M+H] + 步驟 12 ：合成化合物 141
在室溫下向6-{1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]-2-(甲基硫烷基)乙基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物14，100 mg，0.27 mmol，1當量)及6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(如WO2020210508中所述製備，90 mg，0.29 mmol，1.1當量)於二噁烷(2 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(175 mg，0.53 mmol，2當量)及RuPhos (25 mg，0.05 mmol，0.2當量)及RuPhos Palladacycle Gen.3 (22 mg，0.03 mmol，0.1當量)。在℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用DCM (3x30 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]-2-(甲基硫烷基)乙基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物15，80 mg，46%)。
藉由掌性HPLC用以下條件(管柱：CHIRAL ART Amylose-SA，2*25 cm，5 μm；移動相A：Hex(0.5% IPAmine)--HPLC，移動相B：EtOH--HPLC；流動速率：20 mL/min；梯度：在30分鐘內20% B至20% B；波長：220/254 nm；RT1(min)：14.97；RT2(min)：23.37；樣品溶劑：EtOH--HPLC)分離2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]-2-(甲基硫烷基)乙基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮產物(化合物15，80 mg，0.12 mmol，1當量)；將第一溶離異構物(RT = 14.97min)濃縮並凍乾，得到呈黃色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-[(1R)-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]-2-(甲基硫烷基)乙基]-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物141A，23.5 mg，29%)。LCMS (ESI, ms):644[M+H] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.25 (s, 1H), 7.94 (d, J=10.4Hz, 2H), 7.40 (s, 1H), 6.64-6.61 (m, 1H), 5.89 (s,1H), 5.17 (s, 2H), 4.91 (d, J=6.0Hz, 2H), 4.80 (d, J=6.0Hz, 2H), 4.02-3.98 (m, 1H), 3.49 (s, 2H), 3.24-3.14 (m, 6H), 3.12-3.02 (m, 1H), 2.85-2.81 (m, 2H), 2.01 (s, 3H), 1.85-1.81 (m, 1H), 1.55-1.35 (m, 5H), 1.14 (t, J =12Hz, 3H), 0.78-0.68 (m, 4H)。
將第二溶離異構物(RT=23.37min)濃縮並凍乾，得到呈黃色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-[(1s)-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]-2-(甲基硫烷基)乙基]-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(24.6 mg，30%)。LCMS (ESI, ms): 644[M+H] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.25 (s, 1H), 7.94 (d, J=10.4Hz, 2H), 7.40 (s, 1H), 6.64-6.61 (m, 1H), 5.89 (s,1H), 5.17 (s, 2H), 4.91 (d, J=6.0Hz, 2H), 4.80 (d, J=6.0Hz, 2H), 4.02-3.98 (m, 1H), 3.49 (s, 2H), 3.30-3.24 (m, 5H), 3.22-3.14 (m, 1H), 3.12-3.02 (m, 1H), 2.85-2.81 (m, 2H), 2.01 (s, 3H), 1.75-1.55 (m, 5H), 1.45-1.35 (m, 1H), 1.14 (t, J =12Hz, 3H), 0.78-0.68 (m, 4H) 合成化合物 142 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下向2,6-二氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶(INT3，235 mg，0.786 mmol，1當量)及(S)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(INT4，245 mg，0.786 mmol，1當量)於二噁烷(7 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(512 mg，1.57 mmol，2當量)及Xantphos (90.8 mg，0.157 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(17.6 mg，0.0786 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在室溫下用飽和碳酸氫鈉淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 50 ml)萃取所得混合物。在減壓下濃縮合併之有機層。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (9:1)溶離，得到呈綠色固體狀之(S)-2-(6-氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物1，300 mg，66.4%)。LCMS:(ES.m/z): 575,577 [M+1] +。 步驟 2 ：合成化合物 142
在室溫下向(S)-2-(6-氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(化合物1，35 mg，0.06 mmol，1當量)及3,3'-氮烷二基二丙腈(75 mg，0.61 mmol，10當量)於二噁烷(1.1 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(40 mg，0.12 mmol，2當量)及Xantphos (7 mg，0.012 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(1.4 mg，0.006 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物40分鐘。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，在減壓下濃縮濾液。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1%TFA)，在30分鐘內5%至95%梯度；偵測器，UV 254 nm，得到呈白色固體狀之(S)-3,3'-((4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)-6-(6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-1-側氧基-4-(三氟甲基)異吲哚啉-2-基)吡啶-2-基)氮烷二基)二丙腈；三氟乙酸(化合物142，15 mg，32%)。LCMS:(ES.m/z):662[M+1] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.72 (s, 1H), 8.47 (s, 2H), 8.21 (d, J= 17.3 Hz, 4H), 7.55 (d, J= 0.9 Hz, 2H), 6.42 (d, J= 1.1 Hz, 2H), 5.75 (s, 4H), 5.30 (s, 4H), 4.95 - 4.73 (m, 10H), 4.52 (s, 3H), 3.84 (q, J= 8.0 Hz, 7H), 3.60 (s, 4H), 3.40 - 3.26 (m, 10H), 3.16 (s, 2H), 2.81 (t, J= 6.8 Hz, 8H), 2.59 (q, J= 11.5 Hz, 3H), 2.07 (d, J= 4.1 Hz, 11H), 1.83 (d, J= 15.2 Hz, 3H), 1.73 (d, J= 13.9 Hz, 3H), 1.63 (d, J= 13.6 Hz, 2H), 1.25 - 0.98 (m, 6H), 0.96 - 0.80 (m, 8H)。 合成化合物 143 步驟 1 ：合成化合物 4
在室溫下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，500 mg，1.67 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，522 mg，1.67 mmol，1當量)於1,4-二噁烷(10 mL)中之經攪拌混合物中添加Cs 2CO 3(1089 mg，3.34 mmol，2當量)、Xantphos (193 mg，0.33 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(37 mg，0.16 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈綠色固體狀之2-(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物4，280 mg，29%)。LCMS (ESI, m/z): 575,577 [M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 143
在室溫下於氮氣氛圍下向2-(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物4，100 mg，0.17 mmol，1當量)及4-胺基丁腈(化合物3，29 mg，0.34 mmol，2當量)於二噁烷(2 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(113 mg，0.34 mmol，2當量)、Xantphos (20 mg，0.034 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(4 mg，0.017 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之粗產物(25 mg)。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內20% B至50% B，50% B；波長：254 nm；RT1(min)：5)再純化粗產物(25 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈灰白色固體狀之4-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基]丁腈；三氟乙酸(化合物143，3.1 mg，2%)。LCMS (ESI, m/z):623[M+H-TFA] +； 1H NMR (300 MHz, DMSO- d 6 ) δ 9.86 (br s, 1H), 8.59 (s, 1H), 8.22-8.19 (m, 2H), 7.40 (s, 1H), 6.02 (s, 1H), 5.23 (s, 2H), 4.91-4.78 (m, 4H), 4.52 (s, 2H), 3.31-3.26 (m, 7H), 2.85-2.82 (m, 1H), 2.60-2.56 (m, 3H), 1.86-1.62 (m, 8H), 1.08-1.05 (m, 1H), 0.89 (d, J=5.6Hz, 3H)。 合成化合物 144 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下將NIS (57.54 g，255.75 mmol，1.1當量)於H 2SO 4(200 mL)中之經攪拌溶液攪拌40分鐘。在0℃下向上述混合物中逐滴添加含3-溴-2-甲基苯甲酸(化合物1，50 g，232.50 mmol，1當量)之H 2SO 4(200 mL)且攪拌3小時。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在0℃下將反應物傾倒至水/冰(1000 mL)中。藉由過濾收集沈澱之固體且用Et 2O (3x50 mL)洗滌。藉由用DCM (100 mL)濕磨純化殘餘物。藉由過濾收集沈澱之固體且用DCM (3x50 mL)洗滌。此得到呈灰白色固體狀之3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸(化合物2，54.2 g，68%)。LCMS (ESI, ms):339[M-H] -； 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.13 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 7.99 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 2.47 (s, 3H)。 步驟 2 ：合成化合物 3
在0℃下於氮氣氛圍下向3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸(化合物2，25 g，73.32 mmol，1當量)於MeOH (250 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加SOCl 2(43.61 g，366.63 mmol，5當量)。在70℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。TLC指示反應完成。使所得混合物冷卻至室溫且在減壓下濃縮。此得到呈灰白色固體狀之3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸甲酯(化合物3，23 g，88%)。 1H NMR (400 MHz, 氯仿-d) δ 8.03 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.02 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 2.56 (s, 3H)。 步驟 3 ：合成化合物 4
在70℃下於氮氣氛圍下向3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸甲酯(15 g，42.25 mmol，1當量)及NBS (9.03 g，50.70 mmol，1.2當量)於ACN (150 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加AIBN (3.47 g，21.12 mmol，0.5當量)。LCMS及TLC顯示反應完成。無MS信號。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (6:1)溶離，得到呈白色固體狀之3-溴-2-(溴甲基)-5-碘苯甲酸甲酯(16.5 g，90%)。 1H NMR (300 MHz, 氯仿-d) δ 8.20 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 5.06 (s, 2H), 1.73 (s, 3H)。 步驟 4 ：合成化合物 5
在室溫下於氮氣氛圍下將3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸甲酯(化合物4，14.5 g，40.84 mmol，1當量)於NH 3(7N，於MeOH中，15 mL)中之經攪拌溶液攪拌1小時。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物。藉由用水(50 mL)濕磨純化殘餘物。藉由過濾收集沈澱之固體且用Et 2O (3x20 mL)洗滌。此得到呈白色固體狀之4-溴-6-碘-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物5，11.2 g，81%)。LCMS (ESI, ms): 338,340 [M+H] + 步驟 5 ：合成化合物 7
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-碘-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物5，11.2 g，33.14 mmol，1當量)及乙烯基三氟硼酸鉀(化合物6，3.55 g，26.51 mmol，0.8當量)於1,4-二噁烷(120 mL)及H 2O (12 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(21.60 g，66.28 mmol，2當量)及Pd(dppf)Cl 2(2.43 g，3.31 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (12:1)溶離，得到呈棕色固體狀之4-溴-6-乙烯基-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物7，3.0 g，38%)。LCMS (ESI, ms):238,240[M+H] + 步驟 6 ：合成化合物 9
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-乙烯基-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物7，5 g，21.00 mmol，1當量)及NMO (7.38 g，63.00 mmol，3當量)於THF (50 mL)及H 2O (25 mL)中之經攪拌溶液中添加K 2OsO 4.2H 2O (0.77 g，2.10 mmol，0.1當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。在0℃下向上述混合物中添加NaIO 4(22.46 g，105.00 mmol，5當量)。在室溫下再攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在0℃下用水淬滅反應物。接著添加EA (100 mL)。藉由過濾收集沈澱之固體且用EtOAc (3x20 mL)洗滌。此得到呈白色固體狀之7-溴-3-側氧基-1,2-二氫異吲哚-5-甲醛(化合物9，4 g，79%)。LCMS (ESI, ms):240,242 [M+H] + 步驟 7 ：合成化合物 11
在室溫下於氮氣氛圍下向7-溴-3-側氧基-1,2-二氫異吲哚-5-甲醛(化合物9，4 g，16.66 mmol，1當量)於DCM (80 mL)中之經攪拌溶液中添加(3S)-3-甲基哌啶鹽酸鹽(化合物10，2.71 g，19.99 mmol，1.2當量)及TEA (2.02 g，19.99 mmol，1.2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。在室溫下向上述混合物中添加STAB (17.66 g，83.31 mmol，5當量)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用CH 2Cl 2(3x20 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，矽膠；移動相，含MeCN之水(0.1%FA)，在30分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物11，1.2 g，22%)。LCMS (ESI, ms):323, 325 [M+H] + 步驟 8 ：合成化合物 12
在室溫下於N 2氛圍下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物11，200 mg，0.62 mmol，1當量)於DMF (2 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加Zn(CN) 2(145 mg，1.23 mmol，2當量)及Pd(PPh 3) 4(71 mg，0.06 mmol，0.1當量)。在145℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應有60%產物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-2,3-二氫異吲哚-4-甲腈(化合物12，50 mg，30%)。LCMS:(ES.m/z):270[M+H] +。 步驟 9 ：合成化合物 144
在室溫下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-2,3-二氫異吲哚-4-甲腈(化合物12，50 mg，0.18 mmol，1當量)及2-氯-6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(來自化合物107合成之化合物2，60 mg，0.18 mmol，1當量)於二噁烷(1 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(120 mg，0.37 mmol，2當量)及Pd(OAc) 2(4 mg，0.02 mmol，0.1當量)及Xantphos (21 mg，0.04 mmol，0.2當量)。在110℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1.5小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內22% B至42% B，42% B；波長：254 nm；RT1(min)：5.38)純化粗產物(50 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-3H-異吲哚-4-甲腈；三氟乙酸(化合物144，47.5 mg，37%)。LCMS:(ES.m/z):558[M+H-TFA] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 9.65(br s, 1H), 8.48-8.46 (m, 1H), 8.30 (s, 2H), 8.07 (s, 1H), 7.02 (s, 1H), 5.34 (s, 2H), 4.92 (d, J=8.0Hz, 2H), 4.85 (d, J=8.0Hz,2H), 4.52-4.48 (m, 2H), 3.63 (s, 2H), 3.39-3.37 (m, 4H), 3.30-3.27 (m, 1H), 3.21-3.16 (m, 2H), 2.86-2.83 (m, 1H), 2.60-2.57 (m, 1H), 1.86-1.62 (m, 4H), 1.38 (t, J=7.2Hz, 3H), 1.08-1.05 (m, 1H), 0.89 (d, J=6.4Hz, 1H)。 合成化合物 145
在0℃下於空氣氛圍下向2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-3H-異吲哚-4-甲腈(化合物144，20 mg，0.036 mmol，1當量)於DMSO (500 uL)中之經攪拌溶液中逐滴添加NaOH (3 mg，0.07 mmol，2當量)及H 2O (200 uL)。在0℃下向上述混合物中逐滴添加H 2O 2(6 mg，0.18 mmol，5當量)。在室溫下再攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應有70%產物。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內15% B至28% B，28% B；波長：254 nm；RT1(min)：8.5)純化反應混合物；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-3H-異吲哚-4-甲醯胺) (化合物145)。LCMS:(ES.m/z):576[M+H-TFA] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 9.63 (br s, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.19-8.07 (m, 4H), 7.77 (s, 1H), 6.96 (s, 1H), 5.37 (s, 2H), 4.92-4.83 (m, 4H), 4.44 (br s, 2H), 3.62 (s, 2H), 3.42-3.33(m, 5H), 3.16-3.15 (m, 2H), 2.84-2.82 (m, 1H), 2.61-2.56 (m, 1H), 1.82-1.62 (m, 4H), 1.37 (t, J=7.2Hz, 3H), 1.08-1.05 (m, 1H), 0.90 (d, J=6.4Hz, 1H)。 合成化合物 146
根據WO2020210508中所述之程序製備化合物146。 合成化合物 147
根據WO2020210508中所述之程序製備化合物147。 合成化合物 148
根據WO2020264398中所述之程序製備化合物148。 合成化合物 149 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下於空氣氛圍下向5-溴-3-甲基噻吩-2-甲酸甲酯(5 g，21.26 mmol，1當量)於ACN (100 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NBS (4.16 g，23.39 mmol，1.1當量)及AIBN (0.70 g，4.25 mmol，0.2當量)。在80℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (10:1)溶離，得到呈白色固體狀之5-溴-3-(溴甲基)噻吩-2-甲酸甲酯(5 g，74%)。LCMS: (ES.m/z): 314,316[M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下於空氣氛圍下向5-溴-3-(溴甲基)噻吩-2-甲酸甲酯(5 g，15.92 mmol，1當量)於NH 3(7N，於MeOH中，100 mL)中之經攪拌溶液中。在70℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色固體狀之2-溴-4H,5H-噻吩并[2,3-c]吡咯-6-酮(600 mg，17%)。LCMS:(ES.m/z): 218,220[M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 4
在室溫下於氮氣氛圍下向2-溴-4H,5H-噻吩并[2,3-c]吡咯-6-酮(400 mg，1.83 mmol，1當量)於NMP (8 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加CuCN (328 mg，3.66 mmol，2當量)。在165℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在30分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色固體狀之6-側氧基-4H,5H-噻吩并[2,3-c]吡咯-2-甲腈(200 mg，66%)。LCMS: (ES.m/z): 165[M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 5
在-70℃下於氮氣氛圍下向6-側氧基-4H,5H-噻吩并[2,3-c]吡咯-2-甲腈(200 mg，1.21 mmol，1當量)於DCM (4 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加Dibal-H (1M，於DCM中，4.8 mL，4當量)。在-70℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在0℃下藉由添加MeOH (2 mL)淬滅反應物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈棕色固體狀之6-側氧基-4H,5H-噻吩并[2,3-c]吡咯-2-甲醛(180 mg，88%)。LCMS:(ES.m/z):168[M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 6
向6-側氧基-4H,5H-噻吩并[2,3-c]吡咯-2-甲醛(200 mg，1.19 mmol，1當量)及(3S)-3-甲基哌啶鹽酸鹽(194 mg，1.43 mmol，1.2當量)及TEA (145 mg，1.43 mmol，1.2當量)於DCM (4 mL)中之經攪拌混合物中。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物15分鐘。在室溫下向上述混合物中逐份添加STAB (1014 mg，4.78 mmol，4當量)。在室溫下再攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在0℃下藉由添加MeOH (2 mL)淬滅反應物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色固體狀之2-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4H,5H-噻吩并[2,3-c]吡咯-6-酮(50 mg，16.69%)。LCMS:(ES.m/z):251[M+H] +。 步驟 6. 合成化合物 149
在室溫下向2-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4H,5H-噻吩并[2,3-c]吡咯-6-酮(50 mg，0.20 mmol，1當量)及6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(55 mg，0.18 mmol，0.9當量)於二噁烷(1 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(130 mg，0.40 mmol，2當量)及Xantphos (23 mg，0.04 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(4 mg，0.02 mmol，0.1當量)。在95℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1.5小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之5-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-2-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4H-噻吩并[2,3-c]吡咯-6-酮(15.6 mg，14%)。LCMS:(ES.m/z):522[M+H-TFA] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 10.00 (br s, 1H), 8.76 (s, 1H), 7.50 (s, 1H), 7.18 (s, 1H), 5.95 (s, 1H), 4.98 (s, 2H), 4.88 (d, J=8Hz, 2H), 4.80 (d, J=8Hz, 2H), 4.65 (s, 2H), 3.68-3.58 (m, 2H), 3.45-3.22 (m, 7H), 2.85-2.80 (m, 1H), 2.56-2.52 (m, 1H), 1.87-1.60 (m, 4H), 1.17-1.02 (m, 4H), 0.93-0.85 (m, 3H)。 合成化合物 150 步驟 1 ：合成化合物 3
在0℃下於氮氣氛圍下向2-(3-溴苯基)乙酸甲酯(48 g，209.54 mmol，1.00當量)及1,3-二溴-2-甲基丙烷(49.77 g，230.49 mmol，1.1當量)於二甲基甲醯胺(960 mL)中之經攪拌混合物中緩慢逐份添加NaH (20.95 g，513.850 mmol，2.5當量，60%)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在0℃下藉由添加飽和NH 4Cl (水溶液) (2 L)淬滅反應物。過濾所得混合物，用EtOAc (4x500 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (50:01)溶離，得到呈無色油狀之1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸甲酯(29 g，48%)。LCMS:(ESI, m/z): 283,285[M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 4
在室溫下向1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸甲酯水合肼(30 g，90.03 mmol，1.00當量)於EtOH (300 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加NH 2NH 2·H 2O (39.44 g，630.20 mmol，7當量)。在80℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2天。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。此得到呈無色油狀之1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁烷-1-甲醯肼(22 g，86%)。LCMS:(ESI, m/z): 283,285[M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 5
在室溫下向1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁烷-1-甲醯肼(30 g，105.94 mmol，1.00當量)於THF (900 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加異硫氰酸甲酯(23.24 g，317.83 mmol，3當量)。在80℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。所得混合物未經進一步處理即用於下一步驟中。LCMS:(ESI, m/z): 356,358[M+H] + 步驟 4 ：合成化合物 6
向上述混合物中添加NaOH (水溶液，1N，420 mL，420 mmol，4當量)。在40℃下攪拌所得混合物2天。LCMS指示反應完成。在0℃下用飽和NH 4Cl (水溶液)(1800 mL)淬滅反應物。藉由過濾收集沈澱之固體且用水(2x50 mL)洗滌。在紅外光下乾燥固體，得到呈灰白色固體狀之5-[1-(3-溴苯基)環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑-3-硫醇(22 g，兩個步驟61%)。LCMS:(ESI.m/z): 338,340 [M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 7
在0℃下於氮氣氛圍下向5-[1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑-3-硫醇(22 g，65.03 mmol，1.00當量)於THF (22 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加含NaNO 2(22.44 g，325.15 mmol，5當量)之水(22 mL)。在0℃下於氮氣氛圍下向混合物中逐滴添加HNO 3(1N，325 mL，325 mmol，5當量)。在40℃下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。用飽和NaHCO 3(水溶液)將混合物鹼化至pH 8。用EtOAc (3 x 200 mL)萃取所得混合物。用水(4x80 mL)洗滌合併之有機層。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之3-[1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑(10 g，50%)。LCMS:(ESI.m/z): 306,308[M+H] +。 步驟 6 ：合成化合物 8
藉由製備型SFC用以下條件(管柱：CHIRALPAK IH，3*25 cm，5 μm；移動相A：CO 2，移動相B：IPA (0.5% 2M NH 3-MeOH)；流動速率：100 mL/min；梯度：等度25% B；管柱溫度(℃)：35；背壓(bar)：100；波長：220 nm；RT1(min)：9.57；RT2(min)：11.78；樣品溶劑：MeOH (0.1% 2M NH 3-MeOH))分離3-[1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑混合物(10 g)；將第一溶離異構物濃縮並凍乾，得到呈灰白色固體狀之4-甲基-3-[(1r,3s)-1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁基]-1,2,4-三唑(6 g，60%)。 1H NMR (300 MHz, 氯仿-d) δ 8.00 (s, 1H),7.53 (s, 1H), 7.40-7.37(m, 1H), 7.24-7.21(m, 2H), 3.19 (s, 3H), 2.82-2.78(m, 2H), 2.67-2.63(m, 3H), 1.22 (d, J=8.0Hz, 3H)。 步驟 7 ：合成化合物 9
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(500 mg，1.54 mmol，1當量)於DMF (5 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加甲硫醇鈉(162 mg，2.32 mmol，1.5當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(410 mg，91%)。LCMS (ESI, m/z):291[M+H] + 步驟 8 ：合成化合物 150
在室溫下於氮氣氛圍下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(100 mg，0.34 mmol，1當量)及4-甲基-3-[(1r,3s)-1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁基]-1,2,4-三唑(105 mg，0.34 mmol，1當量)於二噁烷(2 mL)中之經攪拌混合物中添加Pd(OAc) 2(8 mg，0.03 mmol，0.1當量)及Cs 2CO 3(224 mg，0.68 mmol，2當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.1% TFA)，在30分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Prep OBD C18管柱，30*150 mm，5μm；移動相A：水(10 mmol/L NH4HCO3)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min；梯度：在7分鐘內48% B至68% B，68% B；波長：254 nm；RT1(min)：5.47)純化粗產物(50 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2-{3-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]苯基}-3H-異吲哚-1-酮(22.2 mg，12%)。LCMS(ESI, m/z): 516[M+H] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.30 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.72-7.70 (d, J=8Hz,1H), 7.49-7.40 (m, 3H), 7.10-7.08 (d, J=8Hz, 1H),4.89 (s, 2H), 3.57 (br s, 2H), 3.22 (s, 3H), 2.87-2.74 (m, 4H), 2.60-2.53 (m, 6H), 2.01-1.89 (m, 1H), 1.68-1.51 (m, 5H), 1.10-1.08 (d, J=8Hz, 3H), 0.83-0.82 (m, 4H) 合成化合物 151 步驟 1. 合成化合物 2
在0℃下於氮氣氛圍下向2-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(100 g，458.34 mmol，1當量)於AcOH (650 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加HNO 3(214 mL)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物15分鐘。在0℃下向上述混合物中逐滴添加Br 2(25.83 mL，504.18 mmol，1.1當量)。在0℃下再攪拌所得混合物15分鐘。在0℃下向上述混合物中逐份添加AgNO 3(101.22 g，595.85 mmol，1.3當量)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。GCMS及TLC指示反應完成。用水(1000 mL)稀釋所得混合物。用EtOAc (3 x 500 mL)萃取所得混合物。用鹽水(2x200 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈淺黃色油狀之5-溴-2-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(100 g，73%)。GCMS:(ES.m/z):296,298[M] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下於氮氣氛圍下向5-溴-2-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(20 g，67.32 mmol，1.00當量)及NBS (17.97 g，100.98 mmol，1.5當量)於1,2-二氯乙烷(200 mL)中之經攪拌溶液中添加BPO (3.45 g，13.46 mmol，0.2當量)。在80℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。GCMS指示完全反應。用EtOAc (3 x 200 mL)萃取所得混合物。用鹽水(500 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (50:1)溶離，得到呈黃色油狀之5-溴-2-(溴甲基)-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(19.7 g，77%)。 1H NMR (300 MHz, 氯仿-d) δ 8.18 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 5.04 (s, 3H), 3.99 (s, 3H)。 步驟 3 ：合成化合物 4
在0℃下於空氣氛圍下向5-溴-2-(溴甲基)-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(130 g，345.77 mmol，1當量)於NH 3(7N，於MeOH中，1200 mL)中之經攪拌溶液中逐滴。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由用H 2O (500 mL)及PE (500 mL)濕磨純化殘餘物。此得到呈棕色固體狀之6-溴-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(70 g，72%)。LCMS:(ES.m/z):280,282[M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 5
在室溫下向6-溴-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(40 g，142.83 mmol，1當量)及乙烯基三氟-λ4-硼烷鉀(22.96 g，171.40 mmol，1.2當量)於二噁烷(400 mL)及H 2O (80 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(93.08 g，285.67 mmol，2當量)及Pd(dppf)Cl 2(5.23 g，7.14 mmol，0.05當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用EtOAc (3x200 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之6-乙烯基-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(28 g，86%)。LCMS:(ES.m/z): 228 [M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 6
在室溫下於空氣氛圍下向6-乙烯基-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(2.8 g，12.32 mmol，1當量)於THF (30 mL)及H 2O (15 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NMO (4.33 g，36.97 mmol，3當量)及二水合鋨(VI)酸鉀(0.23 g，0.61 mmol，0.05當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色固體狀之6-(1,2-二羥基乙基)-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(2.1 g，65%)。LCMS: (ES.m/z):262 [M+H] +。 步驟 6 ：合成化合物 7
在室溫下於空氣氛圍下向6-(1,2-二羥基乙基)-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(9.7 g，37.13 mmol，1當量)於DCM (200 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加咪唑(5.06 g，74.27 mmol，2當量)且逐滴添加TBDPSCl (10.21 g，37.13 mmol，1當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。用水(30 mL)稀釋所得混合物。用CH 2Cl 2(3 x 40 mL)萃取所得混合物。用鹽水(2x10 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈粉紅色固體狀之6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-羥乙基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(8.3 g，44%)。LCMS:(ES.m/z): 500[M+H] +。 步驟 7. 合成化合物 8
在0℃下於空氣氛圍下向6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-羥乙基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(8.4 g，16.81 mmol，1當量)於DCM (120 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加SOCl 2(6.00 g，50.43 mmol，3當量)。在0℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應有50%產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-氯乙基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(4.2 g，48.22%)。LCMS: (ES.m/z): 518,520 [M+H] +。 步驟 8. 合成化合物 9
在室溫下於空氣氛圍下向6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-氯乙基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(2 g，3.861 mmol，1當量)及(3S)-3-甲基哌啶(0.46 g，4.63 mmol，1.2當量)於DCM (60 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加K 2CO 3(2.67 g，19.30 mmol，5當量)。在50℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。用水(300 mL)稀釋所得混合物。用EtOAc (3 x 200mL)萃取所得混合物。用鹽水(2x100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈黃色油狀之6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(1.5 g，66%)。LCMS:(ES.m/z): 581[M+H] +。 步驟 9. 合成化合物 10
在室溫下向6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(2 g，3.44 mmol，1當量)及4-甲基-3-[(1r,3s)-1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁基]-1,2,4-三唑(1054 mg，3.44 mmol，1當量)於二噁烷(20 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(2.24 g，6.88 mmol，2當量)及Xantphos (398 mg，0.68 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(77 mg，0.34 mmol，0.1當量)。在100℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應有60%產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-2-{3-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]苯基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(2.6 g，84%)。LCMS:(ES.m/z):806[M+H] +。 步驟 10 ：合成化合物 11
在0℃下於空氣氛圍下向6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-2-{3-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]苯基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(2.5 g，3.10 mmol，1當量)於THF (40 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TBAF (1N，於THF中，6 mL，2當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物6小時。LCMS指示反應有50%產物。將所得混合物施加於矽膠上且在減壓下濃縮。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到粗產物(1g，80%純度)。藉由矽膠管柱層析再純化粗產物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之6-{2-羥基-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-2-{3-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]苯基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(667.7 mg，37%)。LCMS:(ES.m/z): 568 [M+H] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.30 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 8.02-7.92 (m, 2H), 7.69 (d, J=7.8Hz, 1H), 7.46 (t, J= 8.0Hz, 1H), 7.14 (d, J=7.8Hz, 1H), 5.21 (s, 2H), 4.62 (br s, 1H), 3.83 (br s, 2H), 3.68 (br s, 1H), 3.22(s, 3H), 3.05-2.86 (m, 3H), 2.68-2.62 (m, 1H), 2.58-2.55 (m, 3H), 1.97-1.80 (m, 1H), 1.72-1.55 (m, 4H), 1.48-1.28 (m, 1H), 1.15-1.12 (m, 3H), 0.92-1.88 (m, 1H), 1.85-1.72 (m, 3H)。 步驟 11 ：合成化合物 151
在室溫下於空氣氛圍下向6-{2-羥基-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-2-{3-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]苯基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(50 mg，0.08 mmol，1當量)於ACN (1 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加t-BuOK (12 mg，0.11 mmol，1.2當量)及炔丙基溴(12 mg，0.11 mmol，1.2當量)。在80℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物6小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.1%FA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內10% B至40% B，40% B；波長：254 nm；RT1(min)：5.2)純化粗產物(50 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之6-{1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]-2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙基}-2-{3-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]苯基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(8.2 mg，12%)。LCMS:(ES.m/z): 606[M+H-TFA] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 10.07(s, 1H), 8.30-7.94 (m, 4H), 7.85-7.78 (m, 1H), 7.54-7.44 (m, 1H), 7.21-7.18 (d, J=12Hz, 1H), 5.36 (s, 2H), 5.25 (s, 2H), 5.16-5.07 (m,1H),3.94 (s, 1H), 3.88-3.84 (m, 1H), 3.70-3.67 (m, 1H), 3.45 (s, 3H), 3.10-2.80 (m, 4H), 2.76-2.60 (m, 4H), 2.35-2.15 (m, 1H), 2.07-1.85 (m, 1H), 1.68-1.43 (m, 4H), 1.23-1.11 (m, 3H), 0.92-0.62 (m, 4H) 合成實例 152 步驟 1 ：合成化合物 2
在0℃下於氮氣氛圍下向2-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(100 g，458.34 mmol，1當量)於AcOH (650 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加HNO 3(214 mL)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物15分鐘。在0℃下向上述混合物中逐滴添加Br 2(25.83 mL，504.18 mmol，1.1當量)。在0℃下再攪拌所得混合物15分鐘。在0℃下向上述混合物中逐份添加AgNO 3(101.22 g，595.85 mmol，1.3當量)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。GCMS及TLC指示反應完成。用水(1000 mL)稀釋所得混合物。用EtOAc (3 x 500 mL)萃取所得混合物。用鹽水(2x200 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈淺黃色油狀之5-溴-2-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(100 g，73%)。GCMS:(ES.m/z):296,298[M] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下於氮氣氛圍下向5-溴-2-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(20 g，67.32 mmol，1.00當量)及NBS (17.97 g，100.98 mmol，1.5當量)於1,2-二氯乙烷(200 mL)中之經攪拌溶液中添加BPO (3.45 g，13.46 mmol，0.2當量)。在80℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。GCMS指示完全反應。用EtOAc (3 x 200 mL)萃取所得混合物。用鹽水(500 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (50:1)溶離，得到呈黃色油狀之5-溴-2-(溴甲基)-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(19.7 g，77%)。 1H NMR (300 MHz, 氯仿-d) δ 8.18 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 5.04 (s, 3H), 3.99 (s, 3H)。 步驟 3 ：合成化合物 4
在0℃下於空氣氛圍下向5-溴-2-(溴甲基)-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(130 g，345.77 mmol，1當量)於NH 3(7N，於MeOH中，1200 mL)中之經攪拌溶液中逐滴。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由用H 2O (500 mL)及PE (500 mL)濕磨純化殘餘物。此得到呈棕色固體狀之6-溴-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(70 g，72%)。LCMS:(ES.m/z):280,282[M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 5
在室溫下向6-溴-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(40 g，142.83 mmol，1當量)及乙烯基三氟-λ4-硼烷鉀(22.96 g，171.40 mmol，1.2當量)於二噁烷(400 mL)及H 2O (80 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(93.08 g，285.67 mmol，2當量)及Pd(dppf)Cl 2(5.23 g，7.14 mmol，0.05當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用EtOAc (3x200 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之6-乙烯基-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(28 g，86%)。LCMS:(ES.m/z): 228 [M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 6
在室溫下於空氣氛圍下向6-乙烯基-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(2.8 g，12.32 mmol，1當量)於THF (30 mL)及H 2O (15 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NMO (4.33 g，36.97 mmol，3當量)及二水合鋨(VI)酸鉀(0.23 g，0.61 mmol，0.05當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色固體狀之6-(1,2-二羥基乙基)-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(2.1 g，65%)。LCMS:(ES.m/z):262 [M+H] +。 步驟 6 ：合成化合物 7
在室溫下於空氣氛圍下向6-(1,2-二羥基乙基)-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(9.7 g，37.13 mmol，1當量)於DCM (200 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加咪唑(5.06 g，74.27 mmol，2當量)且逐滴添加TBDPSCl (10.21 g，37.13 mmol，1當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。用水(30 mL)稀釋所得混合物。用CH 2Cl 2(3 x 40 mL)萃取所得混合物。用鹽水(2x10 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na2SO4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈粉紅色固體狀之6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-羥乙基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(8.3 g，44%)。LCMS:(ES.m/z): 500[M+H] +。 步驟 7 ：合成化合物 8
在0℃下於空氣氛圍下向6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-羥乙基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(8.4 g，16.81 mmol，1當量)於DCM (120 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加SOCl 2(6.00 g，50.43 mmol，3當量)。在0℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應有50%產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-氯乙基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(4.2 g，48.22%)。LCMS: (ES.m/z): 518,520 [M+H] +。 步驟 8 ：合成化合物 9
在室溫下於空氣氛圍下向6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-氯乙基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(2 g，3.861 mmol，1當量)及(3S)-3-甲基哌啶(0.46 g，4.63 mmol，1.2當量)於DCM (60 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加K 2CO 3(2.67 g，19.30 mmol，5當量)。在50℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。用水(300 mL)稀釋所得混合物。用EtOAc (3 x 200mL)萃取所得混合物。用鹽水(2x100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈黃色油狀之6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(1.5 g，66%)。LCMS:(ES.m/z): 581[M+H] +。 步驟 9 ：合成化合物 10
在室溫下向6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(2 g，3.44 mmol，1當量)及4-甲基-3-[(1r,3s)-1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁基]-1,2,4-三唑(1054 mg，3.44 mmol，1當量)於二噁烷(20 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(2.24 g，6.88 mmol，2當量)及Xantphos (398 mg，0.68 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(77 mg，0.34 mmol，0.1當量)。在100℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應有60%產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-2-{3-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]苯基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(2.6 g，84%)。LCMS:(ES.m/z):806[M+H] +。 步驟 10 ：合成化合物 152
在0℃下於空氣氛圍下向6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-2-{3-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]苯基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(2.5 g，3.10 mmol，1當量)於THF (40 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TBAF (1N，於THF中，6 mL，2當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物6小時。LCMS指示反應有50%產物。將所得混合物施加於矽膠上且在減壓下濃縮。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到粗產物(1g，80%純度)。藉由矽膠管柱層析再純化粗產物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之6-{2-羥基-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-2-{3-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]苯基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(667.7 mg，37%)。LCMS:(ES.m/z):568 [M+H] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.30 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 8.02-7.92 (m, 2H), 7.69 (d, J=7.8Hz, 1H), 7.46 (t, J= 8.0Hz, 1H), 7.14 (d, J=7.8Hz, 1H), 5.21 (s, 2H), 4.62 (br s, 1H), 3.83 (br s, 2H), 3.68 (br s, 1H), 3.22 (s, 3H), 3.05-2.86 (m, 3H), 2.68-2.62(m, 1H), 2.58-2.55 (m, 3H), 1.97-1.80 (m, 1H), 1.72-1.55 (m, 4H), 1.48-1.28 (m, 1H), 1.15-1.12 (m, 3H), 0.92-1.88 (m, 1H), 1.85-1.72 (m, 3H)。 合成化合物 153 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT5，300 mg，0.92 mmol，1當量)於DMA (3 mL)中之經攪拌溶液中添加甲硫醇鈉(97 mg，1.39 mmol，1.5當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈灰白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(210 mg，77%)。LCMS (ESI, m/z):291[M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下於氮氣氛圍下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(210 mg，0.72 mmol，1當量)及6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(222 mg，0.72 mmol，1當量)於二噁烷(6 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(471 mg，1.44 mmol，2當量)、Xantphos (83 mg，0.145 mmol，0.2當量)及Pd(OAC) 2(16.23 mg，0.072 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.1% TFA)，在10分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈黃色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(110 mg，27%)。LCMS (ESI, m/z):562[M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 153
在室溫下於氮氣氛圍下向2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(110 mg，0.19 mmol，1當量)於DMA (2 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加甲硫醇鈉(68 mg，0.98 mmol，5當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Prep OBD C18管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.1%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內22% B至48% B，48% B；波長：254 nm；RT1(min)：7.05)純化粗產物。凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-硫烷基-3H-異吲哚-1-酮(2.3 mg)。LCMS (ESI, m/z):548[M+H-TFA] +； 1H NMR (300 MHz, CD 3OD) δ 8.56-8.50 (m, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 5.94 (s, 1H), 5.11-4.96 (m, 6H), 4.44 (br s, 2H), 3.70 (s, 2H), 3.57-3.36 (m, 4H), 3.23-3.07 (m, 2H), 2.86-2.80 (m, 1H), 2.62-2.58 (m, 1H), 1.95-1.67 (m, 5H), 1.28-1.18 (m, 4H), 0.93-0.91 (m, 3H)。 合成化合物 154 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT5，500 mg，1.54 mmol，1當量)於DMF (5 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加甲硫醇鈉(162 mg，2.32 mmol，1.5當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(410 mg，91%)。LCMS (ESI, m/z):291[M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 154
在室溫下於氮氣氛圍下向3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺基]丙腈(50 mg，0.15 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(50 mg，0.16 mmol，1.1當量)於二噁烷(1 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(98 mg，0.30 mmol，2當量)、XantPhos (15 mg，0.03 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(4 mg，0.015 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈灰白色固體狀之粗產物。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Shield RP18 OBD管柱，19*250 mm，10μm；移動相A：水(0.1%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在8分鐘內19% B至49% B，49% B；波長：254 nm；RT1(min)：5.7)純化粗產物(20 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之3-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基]丙腈；三氟乙酸(5.1 mg，5%)。LCMS (ESI, m/z):587[M+H-TFA] +； 1H NMR (300 MHz, CD 3OD) δ 8.61(s, 1H), 7.64(s, 1H), 7.59(s, 1H), 7.41(s, 1H), 5.97(s, 1H), 5.00-4.87(m, 4H), 4.85(s, 2H), 4.43(s, 2H), 3.71-3.67(m, 4H), 3.49-3.36(m, 2H), 3.29(s, 3H), 2.96-2.92(m, 1H), 2.88-2.81(m, 2H), 2.79-2.70(m, 1H), 2.50(s, 3H), 1.98-1.70(m, 4H), 1.28-1.10(m, 1H), 0.89(d, J=6.6Hz, 3H)。 合成化合物 155 步驟 1 ：合成化合物 155
在室溫下於空氣氛圍下向3-({6-[6-甲醯基-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}胺基)丙腈(化合物160-A，100 mg，0.19 mmol，1當量)及4-環丙基哌啶-4-醇(32 mg，0.23 mmol，1.19當量)於DCM中之經攪拌溶液中逐份添加雙(乙醯氧基)硼烷基乙酸鈉(161 mg，0.76 mmol，3.99當量)。在室溫下攪拌混合物2小時。LCMS指示反應完成。在室溫下藉由添加MeOH (3 mL)淬滅反應物。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。將溶離物在真空下濃縮至乾。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Prep OBD C18管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.1%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內20% B至42% B，42% B；波長：254 nm；RT1(min)：6.95)純化粗產物；凍乾所收集之級分，得到呈淺黃色固體狀之3-[(6-{6-[(4-環丙基-4-羥基哌啶-1-基)甲基]-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基}-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺基]丙腈(9.1 mg，7.17%)。LCMS (MS, E/S): 651 [M+H-TFA] +；H-NMR (300MHz, CD 3OD): 8.70 (br s, 1H), 8.28 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.36 (s, 1H), 5.99 (s, 1H), 5.35 (s, 2H), 5.02-4.97 (m, 4H), 4.56 (s, 2H), 3.96-3.65 (m, 4H), 3.38-3.30 (m, 7H), 2.86-2.78 (m, 2H), 2.13-1.76 (m, 4H), 0.89-0.88 (m, 1H), 0.39-0.29 (m, 4H)。 合成化合物 156 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向3-硝基肉桂酸(50 g，258.86 mmol，1.00當量)於SOCl 2(250 mL)中之經攪拌溶液中。在80℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。藉由LCMS (添加MeOH)可偵測到所需產物。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物。藉由H-NMR (添加MeOH)進一步確認粗產物。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3, 含MeOH之衍生物) δ 8.39 (t, J = 3 Hz, 1H), 8.27-8.23 (m, 1 H), 7.86-7.83 (m, 1 H), 7.74 (d, J = 6 Hz, 1H), 7.61 (t, J = 6 Hz, 1H), 6.58 (d, J = 6 Hz, 1H), 3.85 (s, 3 H)。 步驟 2 ：合成化合物 4
在-70℃下於氮氣氛圍下向(4R)-4-苯基-1,3-噁唑啶-2-酮(23 g，141.75 mmol，1.00當量)於THF (300 mL)中之經攪拌混合物中添加LiHMDS (135 mL)。在-70℃下於氮氣氛圍下攪拌反應混合物1小時。向上述混合物中添加(2E)-3-(3-硝基苯基)丙-2-烯醯氯(30 g，141.78 mmol，1.00當量)(THF=300.00 mL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS及TLC可偵測到所需產物。LCMS指示反應完成。用NH 4Cl淬滅反應物。用DCM萃取水層。在真空下濃縮有機層，得到呈黃色固體狀之(4R)-3-[(2E)-3-(3-硝基苯基)丙-2-烯醯基]-4-苯基-1,3-噁唑啶-2-酮(32 g，50%)。LCMS (ES, m/z):339 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 5
在-40℃下於氮氣氛圍下向溴化銅(I)-二甲硫醚(29 g，141.90 mmol，1.50當量)於THF (160 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加MeMgBr (94 mL，3M，於THF中，283.77 mmol，3.00當量)。在-30℃至-20℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。在-40℃下於氮氣氛圍下向上述混合物中逐份添加BF 3.Et 2O (20 g，141.90 mmol，1.50當量)。在-30℃至-20℃下於氮氣氛圍下再攪拌所得混合物1小時。最後，在-40℃下於氮氣氛圍下向上述混合物中逐份添加(4R)-3-[(2E)-3-(3-硝基苯基)丙-2-烯醯基]-4-苯基-1,3-噁唑啶-2-酮(32 g，94.58 mmol，1.00當量)(THF (160 mL))。在-30℃至-20℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。LCMS指示反應完成。在室溫下用飽和NH 4Cl (水溶液)淬滅反應物。用EA (150 mL)萃取所得混合物。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EtOAc (4:1)溶離，得到呈固體狀之(4R)-3-[(3R)-3-(3-硝基苯基)丁醯基]-4-苯基-1,3-噁唑啶-2-酮(18 g，51%)。LCMS (ES, m/z): 355 [M+H] +, 377 [M+Na] +。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ 8.09-8.02 (m, 2 H), 7.63-7.54 (m, 1 H), 7.46-7.28 (m, 4 H), 7.27-7.12 (m, 2 H), 5.37-5.33 (m, 1 H), 4.66 (t, J=6 Hz, 1 H), 4.31-4.27 (m, 1 H), 3.52-3.12 (m, 3 H), 1.31 (t, J=9 Hz, 3 H)。 步驟 4 ：合成化合物 6
在室溫下於氮氣氛圍下向(4R)-3-[(3R)-3-(3-硝基苯基)丁醯基]-4-苯基-1,3-噁唑啶-2-酮(8 g，22.58 mmol，1.00當量)於THF (80 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加NH 2NH 2.H 2O (2.8 g，45.22 mmol，2.00當量，80%)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS可偵測到所需產物。在真空下濃縮所得混合物，得到(3R)-3-(3-硝基苯基)丁醯肼(9.0 g，粗物質)。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS (ES, m/z): 224 [M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 7
在室溫下於氮氣氛圍下向(3R)-3-(3-硝基苯基)丁醯肼(5 g，22.40 mmol，1.00當量)於DCM (80 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加DMF-DMA (5.30 g，44.80 mmol，2.00當量)。在50℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。在真空下濃縮所得混合物。粗產物用於進一步純化。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈半固體狀之(3R)-N'-[(1E)-(二甲基胺基)亞甲基]-3-(3-硝基苯基)丁醯肼(6.4 g，92%)。LCMS (ES, m/z): 279 [M+H] +。 步驟 6 ：合成化合物 8
在室溫下於氮氣氛圍下向(3R)-N'-[(1E)-(二甲基胺基)亞甲基]-3-(3-硝基苯基)丁醯肼(6.0 g，21.56 mmol，1.00當量)於AcOH (60 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加CH 3NH 2(1N，於THF中，120 mL)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。在室溫下用水/冰淬滅反應物。用飽和NaHCO 3(水溶液)將混合物中和至pH=8。用CH 2Cl 2及EA (3 x 30mL)萃取所得混合物。在減壓下濃縮混合物，得到呈固體狀之4-甲基-3-[(2R)-2-(3-硝基苯基)丙基]-1,2,4-三唑(5.7 g，54%)。LCMS (ES, m/z): 247 [M+H] +。 步驟 7 ：合成化合物 9
在氮氣氛圍下向4-甲基-3-[(2R)-2-(3-硝基苯基)丙基]-1,2,4-三唑(2.8 g，11.37 mmol，1當量)於50 mL EtOH中之溶液中添加Pd/C (10%，0.6g)。在室溫下於使用氫氣球之氫氣氛圍下氫化混合物隔夜，LCMS指示反應完成。經矽藻土墊過濾混合物且在減壓下濃縮。此得到呈黃色油狀之3-[(2R)-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)丙-2-基]苯胺(2.4 g，97%)。LCMS (ES, m/z):217 [M+H] + 步驟 8 ：合成化合物 11
在0℃下於氮氣氛圍下向6-氯-5-甲醯基吡啶-2-甲酸甲酯(5.0 g，25.05 mmol，1.00當量)於MeOH (50 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaBH 4(0.57 g，15.03 mmol，0.6當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。在室溫下用水淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3x100 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈白色固體狀之6-氯-5-(羥甲基)吡啶-2-甲酸甲酯(3.5 g，69%)。LCMS: (ES, m/s): 202 [M+H] +, 224 [M+Na] +。 步驟 9 ：合成化合物 12
在氮氣氛圍下向6-氯-5-(羥甲基)吡啶-2-甲酸甲酯(3.5 g，17.36 mmol，1.00當量)於甲苯(35.00 mL)及H 2O (14.00 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加環丙基三氟-λ4-硼烷鉀(7.71 g，52.08 mmol，3.0當量)、K 3PO 4(11.05 g，52.08 mmol，3.0當量)及Pd(dppf)Cl 2(2.54 g，3.47 mmol，0.2當量)。在100℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS可偵測到所需產物。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈淺黃色油狀之6-環丙基-5-(羥甲基)吡啶-2-甲酸甲酯(3.0 g，80%)。LCMS: (ES, m/s): 208 [M+H] +, 230 [M+Na] +。 步驟 10 ：合成化合物 13
在室溫下於氮氣氛圍下向6-環丙基-5-(羥甲基)吡啶-2-甲酸甲酯(3.0 g，14.47 mmol，1.00當量)於THF (30.00 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加LiOH (0.69 g，28.95 mmol，2.0當量)(H 2O=12.00 mL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。用濃HCl將混合物中和至pH 6-7。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相FA，含ACN之水，在20分鐘內0%至5%梯度；偵測器，UV 254 nm。在真空下濃縮所得混合物，得到呈白色固體狀之6-環丙基-5-(羥甲基)吡啶-2-甲酸(2.0 g，67%)。LCMS: (ES, m/s): 194 [M+H] +, 216 [M+Na] +。 步驟 11 ：合成化合物 14
在室溫下於氮氣氛圍下將6-環丙基-5-(羥甲基)吡啶-2-甲酸(2.1 g，10.86 mmol，1當量)及HATU (6.20 g，16.30 mmol，1.5當量)於DMF (21 mL)中之經攪拌溶液攪拌1小時。在0℃下向上述混合物中逐滴添加3-[(2R)-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)丙-2-基]苯胺(2.35 g，10.86 mmol，1當量)及DIEA (2.81 g，21.73 mmol，2當量)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。用CH 2Cl 2:MeOH (10:1) (3 x 100 mL)萃取所得混合物。用水(3x100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色油狀之6-環丙基-5-(羥甲基)-N-{3-[(2R)-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)丙-2-基]苯基}吡啶-2-甲醯胺(2.1 g，49%)。LCMS (ESI, m/z): 392[M+H] + 步驟 12 ：合成化合物 156
在室溫下於氮氣氛圍下向6-環丙基-5-(羥甲基)-N-{3-[(2R)-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)丙-2-基]苯基}吡啶-2-甲醯胺(2.1 g，5.36 mmol，1當量)於DCM (22 mL)中之經攪拌溶液中添加戴斯-馬丁試劑(Dess-Martin) (4.55 g，10.72 mmol，2當量)。LCMS指示反應完成。在0℃下用MeOH淬滅反應物。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之6-環丙基-5-甲醯基-N-{3-[(2R)-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)丙-2-基]苯基}吡啶-2-甲醯胺(1.1 g，47%)。LCMS (ESI, m/z):390[M+H] +； 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 10.50 (s, 1 H), 10.15 (s, 1H), 8.37 (d, J=7.8Hz, 1H), 8.28 (s, 1H), 8.04 (d, J=7.8Hz, 1H), 7.73-7.66 (,. 2J). 7.33-7.28 (m, 1H), 7.07-7.05 (m, 1H), 3.46 (s, 3H), 3.31-3.28 (m, 1H), 3.26-3.21 (m, 1H), 3.00 (d, J=7.5Hz, 2H), 1.48-1.46 (m, 2H), 1.43-1.28 (m, 3H), 1.16-1.14 (m, 2H) 合成化合物 157 步驟 1 ：合成化合物 2
在10℃下於氮氣氛圍下向2-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(44 g，201.67 mmol，1當量)於AcOH (286 mL)中之經攪拌混合物中經20分鐘逐滴添加HNO 3(127 g，2015.46 mmol，9.99當量)。在10℃下向上述混合物中經10分鐘逐滴添加Br 2(35.5 g，222.14 mmol，1.10當量)。在10℃下再攪拌所得混合物10分鐘。在10℃下向上述混合物中經25分鐘逐滴添加含AgNO 3(44.4 g，261.37 mmol，1.30當量)之水(105 mL) (2.5 mol/L)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。TLC指示反應完成。用飽和Na 2CO 3(水溶液)將混合物鹼化至pH 8。用EtOAc (3 x 800mL)萃取所得混合物。用水(3x100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (10:1)溶離，得到呈黃色油狀之5-溴-2-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(42 g，70%)。 1H NMR (300MHz, DMSO) δ 8.32 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.46-3.44 (m, 3H)。 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下向5-溴-2-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(42 g，141.38 mmol，1.00當量)及乙酸酐(21.7 g，212.56 mmol，1.50當量)於DMF (420 mL，5427.13 mmol，38.39當量)中之經攪拌混合物中逐份添加草酸(19.8 g，219.91 mmol，1.56當量)及Pd(OAc) 2(3.2 g，14.25 mmol，0.10當量)及Xantphos (16.5 g，28.51 mmol，0.20當量)。在室溫下向混合物中逐滴添加DIEA (42 mL，241.12 mmol，1.71當量)。在100℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物4小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。
用水(1L)淬滅所得混合物且用EtOAc (3 x 800 mL)萃取。用鹽水(2x100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之3-(甲氧基羰基)-4-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酸(29 g，78%)。LCMS: (ES.m/z): 261 [M-1] -。 步驟 3 ：合成化合物 4
在80℃下於氮氣氛圍下向3-(甲氧基羰基)-4-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酸(39 g，148.75 mmol，1當量)於乙腈中之經攪拌混合物中逐份添加NBS (38.92 g，218.66 mmol，1.47當量)及BPO (11.44 g，44.62 mmol，0.3當量)持續隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。用H 2O (300 mL)淬滅所得混合物且用EtOAc (3 x 300 mL)萃取。用鹽水(500 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (10:1)溶離，得到呈淺黃色固體狀之4-(溴甲基)-3-(甲氧基羰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸(56.5 g，95%)。LCMS (ESI, M/S): 339,341 [M-H] - 步驟 4 ：合成化合物 5
在0℃下向4-(溴甲基)-3-(甲氧基羰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸(20 g，58.63 mmol，1當量)於THF中之溶液中繼而逐滴添加BH 3-THF (150 mL，1N，於THF中，150 mmol，2.56當量)。在室溫下再攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在室溫下藉由添加MeOH (5 mL)淬滅反應物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (4:1)溶離，得到呈黃色油狀之2-(溴甲基)-5-(羥甲基)-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(15 g，78%)。LCMS: (ES, m/s): 245 [M-1-Br] -。 步驟 5 ：合成化合物 6
在室溫下於空氣氛圍下向2-(溴甲基)-5-(羥甲基)-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(15 g，45.85 mmol，1當量)之經攪拌溶液中逐份添加NH 3(7N，於MeOH中，100 mL)。在室溫下再攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物，得到呈淺棕色固體狀之6-(羥甲基)-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(9.0 g，84%)。LCMS:(ES, M/S): 232 [M+H] + 步驟 6 ：合成化合物 7
在60℃下將6-(羥甲基)-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(9 g，38.93 mmol，1當量)及IBX (32.70 g，116.79 mmol，3當量)於乙酸乙酯中之混合物攪拌隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。用H 2O (300 mL)淬滅所得混合物且用EtOAc (3 x 200mL)萃取。用鹽水(300 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:2)溶離，得到呈白色固體狀之3-側氧基-7-(三氟甲基)-1,2-二氫異吲哚-5-甲醛(4.72 g，41%)。LCMS:(ES, M/S): 230 [M+H] + 步驟 7 ：合成化合物 8
在室溫下於空氣氛圍下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(1 g，3.34 mmol，1當量)及β胺基丙腈(4.17 g，59.49 mmol，17.80當量)於DMA中之經攪拌溶液中逐份添加K 2CO 3(0.92 g，6.70 mmol，2.00當量)。在120℃下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫且用水淬滅。用EtOAc (3 x 30mL)萃取所得混合物。用鹽水(100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (8:1)溶離，得到呈橙色固體狀之3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺基]丙腈(610 mg，49%)。LCMS(ES, m/s): 333,335 [M+H] + 步驟 8 ：合成化合物 157
在室溫下於氮氣氛圍下向3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺基]丙腈(1.5 g，4.50 mmol，1當量)及3-側氧基-7-(三氟甲基)-1,2-二氫異吲哚-5-甲醛(1.14 g，4.95 mmol，1.1當量)於二噁烷(15 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(2.94 g，9.01 mmol，2當量)、XantPhos (0.52 g，0.90 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(0.10 g，0.45 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之3-({6-[6-甲醯基-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}胺基)丙腈(687.5 mg，29%)。LCMS (ES, m/s):526[M+H-TFA] +H-NMR (300MHz, DMSO-d 6): 10.21 (s, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.56 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.15-1.11 (m, 1H), 6.13 (s, 1H), 5.37 (s, 2H), 4.91-4.75 (m, 4H), 3.62 (s, 2H), 3.51 (br s, 2H), 3.36 (s, 3H), 2.84 (t, J= 6.6Hz, 2H)。 合成化合物 158 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(500 mg，1.54 mmol，1當量)於DMF (5 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加甲硫醇鈉(162 mg，2.32 mmol，1.5當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(410 mg，91%)。LCMS (ESI, m/z):291[M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(100 mg，0.34 mmol，1當量)及2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(113 mg，0.37 mmol，1.1當量)於二噁烷(2 mL)中之經攪拌溶液中添加Xantphos (39 mg，0.069 mmol，0.2當量)、Cs 2CO 3(224 mg，0.68 mmol，2當量)及Pd(OAc) 2(8 mg，0.034 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之2-(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(110 mg，57%)。LCMS (ESI, m/z): 553,555[M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 158
在室溫下於氮氣氛圍下向2-(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(100 mg，0.18 mmol，1當量)及2-疊氮基乙胺(18 mg，0.21 mmol，1.2當量)於二噁烷(200 uL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(117 mg，0.36 mmol，2當量)、Xantphos (20 mg，0.036 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(4 mg，0.018 mmol，0.1當量)。在100℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在10分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm，得到呈無色固體狀之粗產物。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Prep Phenyl OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.1%TFA)，移動相B：MeOH--HPLC；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內45% B至75% B，75% B；波長：254 nm；RT1(min)：7.32)純化粗產物(20 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之2-{6-[(2-疊氮基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮；三氟乙酸(5.1 mg，3.87%)。LCMS (ESI, m/z):603[M+H-TFA] +； 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 9.88-9.95 (m, 1H), 8.52-8.50 (m, 1H), 7.74-7.70 (m, 2H), 7.43-6.96 (m, 2H), 6.05 (s, 1H), 4.92-4.89 (m, 4H), 4.79-4.72 (m, 2H), 4.67-4.59 (m, 2H), 3.56-3.49 (, 6H), 3.39-3.35(m, 1H), 3.26-3.00 (m, 1H), 2.89-78 (m, 4H), 2.63-2.51 (m, 4H), 1.85-1.59 (m, 4H), 1.04-1.00 (m, 1H), 0.89 (d, J=6.6Hz, 3H)。 合成化合物 159 步驟 1 ：合成化合物 2
在90℃下於氮氣氛圍下將4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(300 mg，0.92 mmol，1當量)、Pd(PPh 3) 2Cl 2(65 mg，0.093 mmol，0.1當量)及三丁基(1-乙氧基乙烯基)錫烷(402 mg，1.11 mmol，1.2當量)於甲苯(5 mL)中之混合物攪拌4小時。LCMS指示反應完成。使反應物冷卻降至室溫。在減壓下移除溶劑。藉由製備型TLC (DCM/MeOH = 10:1)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之4-乙醯基-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮。LCMS (ESI, m/z): 315 [M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 3
在60℃下將4-(1-乙氧基乙烯基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(200 mg，0.63 mmol，1當量)於HCl (2N，3 mL)及THF (1.5 mL)中之溶液攪拌2小時。LCMS指示反應完成。使反應物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈白色固體狀之4-乙醯基-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(110 mg，54%)。LCMS: (MS, E/S): 287 [M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 159
在室溫下於氮氣氛圍下向4-乙醯基-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(110 mg，0.38mmol，1當量)及2-氯-6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(137 mg，0.42 mmol，1.1當量)於1,4-二噁烷中之經攪拌溶液中逐份添加Pd(OAc) 2(8 mg，0.038 mmol，0.10當量)、Cs 2CO 3(250 mg，0.76 mmol，2當量)及XantPhos (44 mg，0.077 mmol，0.2當量)。在90℃下攪拌混合物2小時。LCMS指示反應完成。使反應物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，水(0.05% TFA)，在30分鐘內ACN 5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈淺黃色固體狀之4-乙醯基-2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-3H-異吲哚-1-酮；三氟乙酸(20 mg，7%)。LCMS:(ES, M/S): 575 [M+H-TFA] + 1H-NMR(300MHz, DMSO-d 6): 10.67 (br s, 1H), 8.78-8.66(m, 2H), 8.22 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 6.99 (s, 1H), 5.33 (br s, 2H), 4.92-4.84 (m, 4H), 4.54 (s, 2H), 3.68 (s, 2H), 3.55-3.37(m, 3H), 3.30 (d, J=9.9 Hz,1H), 3.22-3.15(m, 2H), 2.92-2.90 (m, 1H), 2.80-2.53 (m, 5H), 2.02-1.88(m, 1H), 1.81-1.73 (m, 3H), 1.41 (t, J=6.9 Hz, 3H), 1.15-1.07 (m, 1H), 0.89 (d, J=6 Hz, 3H)。 合成化合物 160 步驟 1 ：合成化合物 2
在10℃下於氮氣氛圍下向2-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(44 g，201.67 mmol，1當量)於AcOH (286 mL)中之經攪拌混合物中經20分鐘逐滴添加HNO 3(127 g，2015.46 mmol，9.99當量)。在10℃下向上述混合物中經10分鐘逐滴添加Br 2(35.5 g，222.14 mmol，1.10當量)。在10℃下再攪拌所得混合物10分鐘。在10℃下向上述混合物中經25分鐘逐滴添加含AgNO 3(44.4 g，261.37 mmol，1.30當量)之水(105 mL) (2.5 mol/L)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。TLC指示反應完成。用飽和Na 2CO 3(水溶液)將混合物鹼化至pH 8。用EtOAc (3 x 800mL)萃取所得混合物。用水(3x100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (10:1)溶離，得到呈黃色油狀之5-溴-2-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(42 g，70%)。 1H NMR (300MHz, DMSO) δ 8.32 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.46-3.44 (m, 3H)。 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下向5-溴-2-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(42 g，141.38 mmol，1.00當量)及乙酸酐(21.7 g，212.56 mmol，1.50當量)於DMF (420 mL，5427.13 mmol，38.39當量)中之經攪拌混合物中逐份添加草酸(19.8 g，219.91 mmol，1.56當量)及Pd(OAc) 2(3.2 g，14.25 mmol，0.10當量)及Xantphos (16.5 g，28.51 mmol，0.20當量)。在室溫下向混合物中逐滴添加DIEA (42 mL，241.12 mmol，1.71當量)。在100℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物4小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。
用水(1L)淬滅所得混合物且用EtOAc (3 x 800 mL)萃取。用鹽水(2x100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之3-(甲氧基羰基)-4-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酸(29 g，78%)。LCMS:(ES.m/z):261 [M-1] -。 步驟 3 ：合成化合物 4
在80℃下於氮氣氛圍下向3-(甲氧基羰基)-4-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酸(39 g，148.75 mmol，1當量)於乙腈中之經攪拌混合物中逐份添加NBS (38.92 g，218.66 mmol，1.47當量)及BPO (11.44 g，44.62 mmol，0.3當量)持續隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。用H 2O (300 mL)淬滅所得混合物且用EtOAc (3 x 300 mL)萃取。用鹽水(500 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (10:1)溶離，得到呈淺黃色固體狀之4-(溴甲基)-3-(甲氧基羰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸(56.5 g，95%)。LCMS (ESI, M/S): 339,341 [M-H] - 步驟 4 ：合成化合物 5
在0℃下向4-(溴甲基)-3-(甲氧基羰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸(20 g，58.63 mmol，1當量)於THF中之溶液中繼而逐滴添加BH 3-THF (150 mL，1N，於THF中，150 mmol，2.56當量)。在室溫下再攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在室溫下藉由添加MeOH (5 mL)淬滅反應物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (4:1)溶離，得到呈黃色油狀之2-(溴甲基)-5-(羥甲基)-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(15 g，78%)。LCMS: (ES,m/s): 245[M-1-Br] -。 步驟 5 ：合成化合物 6
在室溫下於空氣氛圍下向2-(溴甲基)-5-(羥甲基)-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(15 g，45.85 mmol，1當量)之經攪拌溶液中逐份添加NH 3(7N，於MeOH中，100 mL)。在室溫下再攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物，得到呈淺棕色固體狀之6-(羥甲基)-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(9.0 g，84%)。LCMS:(ES, M/S): 232 [M+H] + 步驟 6 ：合成化合物 7
在60℃下將6-(羥甲基)-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(9 g，38.93 mmol，1當量)及IBX (32.70 g，116.79 mmol，3當量)於乙酸乙酯中之混合物攪拌隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。用H 2O (300 mL)淬滅所得混合物且用EtOAc (3 x 200mL)萃取。用鹽水(300 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:2)溶離，得到呈白色固體狀之3-側氧基-7-(三氟甲基)-1,2-二氫異吲哚-5-甲醛(4.72 g，41%)。LCMS:(ES, M/S): 230 [M+H] + 步驟 7 ：合成化合物 8
在室溫下於空氣氛圍下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(1 g，3.34 mmol，1當量)及β胺基丙腈(4.17 g，59.49 mmol，17.80當量)於DMA中之經攪拌溶液中逐份添加K 2CO 3(0.92 g，6.70 mmol，2.00當量)。在120℃下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫且用水淬滅。用EtOAc (3 x 30mL)萃取所得混合物。用鹽水(100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (8:1)溶離，得到呈橙色固體狀之3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺基]丙腈(610 mg，49%)。LCMS(ES, m/s): 333,335 [M+H] + 步驟 8 ：合成化合物 160-A
在室溫下於空氣氛圍下向3-側氧基-7-(三氟甲基)-1,2-二氫異吲哚-5-甲醛(207 mg，0.90 mmol，1.0當量)及3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺基]丙腈(300 mg，0.90 mmol，1.0當量)於1,4-二噁烷中之經攪拌混合物中逐份添加Xantphos (106 mg，0.18 mmol，0.20當量)、Pd(OAc) 2(2 mg，0.09 mmol，0.1當量)及Cs 2CO 3(53 mg，0.18 mmol，2當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌混合物3小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫且在真空下濃縮至乾。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈橙色固體狀之3-({6-[6-甲醯基-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}胺基)丙腈(170 mg，31%)。LCMS (ms, E/S): 526 [M+H] + 步驟 9 ：合成化合物 10
在室溫下於空氣氛圍下向6-(三級丁氧基羰基)-6-氮雜螺[2.5]辛烷-1-甲酸(1.0 g，3.91 mmol，1當量)及BH 3-Me 2S (1.20 mL，10N，於MesS中，12.0 mmol，3.06當量)於THF中之經攪拌混合物中。在70℃下於空氣氛圍下攪拌混合物3小時。TLC指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在室溫下用水淬滅反應物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈無色油狀之1-(羥甲基)-6-氮雜螺[2.5]辛烷-6-甲酸三級丁酯(810 mg，77%)。LCMS (MS, E/S): 242 [M+H] + 步驟 10 ：合成化合物 11
在室溫下將1-(羥甲基)-6-氮雜螺[2.5]辛烷-6-甲酸三級丁酯(400 mg，1.65 mmol，1當量)於HCl (4N，於二噁烷中，4 mL)中之混合物攪拌2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。粗產物未經純化即用於下一步驟。LCMS (MS, E/S): 142 [M+H] + 步驟 11 ：合成化合物 160
在室溫下於空氣氛圍下向3-({6-[6-甲醯基-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}胺基)丙腈(100 mg，0.19 mmol，1當量)及6-氮雜螺[2.5]辛-1-基甲醇(80 mg，0.56 mmol，2.98當量)於DCM中之經攪拌溶液中逐份添加TEA (38 mg，0.38 mmol，2當量)及STAB (160 mg，0.75 mmol，3.97當量)。在室溫下攪拌混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在℃下用MeOH淬滅反應物。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。將溶離物在真空下濃縮至乾。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Shield RP18 OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.1%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內8% B至39% B，39% B；波長：254 nm；RT1(min)：5.58)純化粗產物(25 mg)；凍乾溶離物，得到呈白色固體狀之3-{[6-(6-{[1-(羥甲基)-6-氮雜螺[2.5]辛-6-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]胺基}丙腈(8.8 mg，7%)。H-NMR (300MHz, DMSO-d 6): 9.74 (br s, 1H), 8.44 (s, 1H), 8.28-8.21(m, 2H), 7.49 (s, 1H), 7.16-7.11 (m, 1), 6.11 (s, 1H), 5.38 (s, 2H), 4.94 (d, J=6 Hz, 2H), 4.77 (d, J=6 Hz, 2H), 4.62-4.57 (m, 2H), 3.57-3.50 (m, 3H), 3.40-3.35 (m, 2H), 3.28 (s, 3H), 3.23-3.20 (m, 2H), 3.16-2.95 (m, 2H), 2.83 (t, J=6.6Hz, 2H), 2.04-1.95 (m, 2H), 1.58-1.46 (m, 1H), 1.17-1.05 (m, 1H), 1.01-0.94 (m, 1H), 0.57-0.52 (m, 1H), 0.28-0.26 (m, 1H)。 合成化合物 161 步驟 1 ：合成化合物 2
在0℃下於氮氣氛圍下向LiAlH 4(2.40 g，63.14 mmol，2.3當量)於THF (60 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加(3aR,7aS)-3a,4,7,7a-四氫-2H-異吲哚-1,3-二酮(4.15 g，27.45 mmol，1當量)。在60℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在0℃下藉由添加水(3 mL)及NaOH (1N，3 mL)淬滅反應物。在室溫下攪拌混合物1小時，接著經矽藻土墊過濾，用DCM (3x5 mL)洗滌。在減壓下濃縮濾液。此得到呈黃色油狀之(3aR,7aS)-2,3,3a,4,7,7a-六氫-1H-異吲哚(3 g，88%)。LCMS (ESI, m/z):124[M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 3
在0℃下於氮氣氛圍下向(3aR,7aS)-2,3,3a,4,7,7a-六氫-1H-異吲哚(3 g，24.35 mmol，1當量)及TEA (4.93 g，48.70 mmol，2當量)於DCM (30 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加Boc 2O (6.38 g，29.22 mmol，1.2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。藉由添加水(30 mL)淬滅反應物且用DCM (30 mL*3)萃取。用鹽水(30 mL)洗滌有機層且經Na 2SO 4乾燥。在真空下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (5:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之(3aR,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-六氫異吲哚-2-甲酸三級丁酯(4.5 g，82%)。LCMS (ESI, m/z):168[M+H-56] + 步驟 3 ：合成化合物 4
在0℃下於氮氣氛圍下向(3aR,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-六氫異吲哚-2-甲酸三級丁酯(2 g，8.95 mmol，1當量)於無水THF (35 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加BH 3-Me 2S (4.48 mL，8.95 mmol，1當量)且攪拌隔夜。將混合物冷卻至0℃，接著逐滴添加甲醇(2 mL)，繼而添加NaOH水溶液(1 mL，3 N)與H 2O 2(1 mL，30%)之混合物。在60℃下攪拌混合物1.5小時。LCMS指示反應完成。用水(50 mL)稀釋所得混合物。用EtOAc (3 x 50 mL)萃取所得混合物。用鹽水(50 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。此得到呈黃色油狀之(3aR,7aS)-5-羥基-八氫異吲哚-2-甲酸三級丁酯(700 mg，32%)。LCMS (ESI, m/z): 186 [M+H-56] + 步驟 4 ：合成化合物 5
在0℃下於氮氣氛圍下向(3aR,7aS)-5-羥基-八氫異吲哚-2-甲酸三級丁酯(700 mg，2.90 mmol，1當量)於DCM (3 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加HCl (4N，於1,4-二噁烷中，7 mL)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Prep Amide OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.05% HCl)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內90% B至70% B，70% B；波長：254 nm；RT1(min)：7.2)純化粗產物(600 mg)；濃縮溶離物，得到呈灰白色固體狀之(3aR,7aS)-八氫-1H-異吲哚-5-醇鹽酸鹽(300 mg，58%)。LCMS (ESI, m/z):142[M+H-HCl] + 步驟 5 ：合成化合物 161
在室溫下於氮氣氛圍下向3-({6-[6-甲醯基-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}胺基)丙腈(100 mg，0.19 mmol，1當量)及(3aR,7aS)-八氫-1H-異吲哚-5-醇(53 mg，0.38 mmol，2當量)於DCM (2 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TEA (38 mg，0.38 mmol，2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在室溫下向上述混合物中逐份添加STAB (161 mg，0.76 mmol，4當量)。在室溫下再攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在℃下用MeOH淬滅反應物。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮溶離物，得到呈淺黃色固體狀之3-{[6-(6-{[(3aR,7aS)-5-羥基-八氫異吲哚-2-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]胺基}丙腈；三氟乙酸(25 mg，16%)。
LCMS (ESI, m/z):651[M+H-TFA] +； 1H NMR (300 MHz, DMSO- d 6) δ 10.27 (br s, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.36-8.27 (m, 2H), 7.49 (s, 1H), 7.13 (br s, 1H), 6.12 (s, 1H), 5.26 (s, 2H), 4.91 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 4.80 (d, J= 6.3 Hz, 2H), 4.65-4.59 (m, 2H), 3.72-3.51 (m, 5H), 3.34-3.32 (m, 4H), 3.28-3.08 (m, 3H), 2.82 (t, J= 6.3 Hz, 2H), 2.42-5-2.42 (m, 1H), 2.25-2.20 (m, 1H), 1.86 - 1.45 (m, 5H), 1.27-1.23 (m, 2H)。 合成化合物 162 步驟 1 ：合成化合物 2
在壓力槽中向呋喃并[3,2-b]吡啶(200 mg，1.67 mmol，1當量)於10 mL MeOH及AcOH (2 mL)中之溶液中添加Pd/C (10%，0.5 g)。在80℃下於50 psi氫氣壓力下攪拌混合物隔夜。LCMS指示反應完成。經矽藻土墊過濾反應物且在減壓下濃縮。此得到呈棕色油狀之八氫呋喃并[3,2-b]吡啶(100 mg，46%)。LCMS (ESI, m/z):128[M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 162
在室溫下於氮氣氛圍下將3-({6-[6-甲醯基-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}胺基)丙腈(50 mg，0.09 mmol，1當量)、TEA (19 mg，0.19 mmol，2當量)及八氫呋喃并[3,2-b]吡啶(14 mg，0.11 mmol，1.2當量)於DCM (1 mL)中之經攪拌溶液攪拌30分鐘。在室溫下向上述混合物中逐份添加STAB (80 mg，0.38 mmol，4當量)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在0℃下用MeOH淬滅反應物。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05%TFA)，在30分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm及220 nm。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Shield RP18 OBD管柱，30*150 mm，5μm；移動相A：水(10 mmol/L NH 4HCO 3)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min；梯度：在7分鐘內30% B至60% B，60% B；波長：254 nm；RT1(min)：5.32)純化粗產物(30 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈灰白色固體狀之3-{[6-(6-{六氫-2H-呋喃并[3,2-b]吡啶-4-基甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]胺基}丙腈(4.5 mg，7%)。LCMS (ESI, m/z):637[M+H] + 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.24 (s, 1H), 7.95-7.90 (m, 2H), 7.49 (s, 1H), 7.07 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 6.06 (s, 1H), 5.19 (s, 2H), 4.91 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.79 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.10 - 3.93 (m, 2H), 3.82-3.74 (m, 2H), 3.53 - 3.44 (m, 5H), 3.25 (s, 3H), 2.83-2.73 (m, 3H), 2.56-2.52 (m, 1H), 2.13-2.11 (m, 1H), 2.08-1.87 (m, 2H), 1.81-1.78 (m, 1H), 1.58-1.52 (m, 2H), 1.48-1.32 (m, 1H)。 合成化合物 163 步驟 1 ：合成化合物 2
向3-({6-[6-甲醯基-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}胺基)丙腈(100 mg，0.19 mmol，1當量)及6-氧雜-2,9-二氮雜螺[4.5]癸烷-9-甲酸三級丁酯(55 mg，0.22 mmol，1.2當量)於DCM (2 mL)中之經攪拌混合物中。在空氣氛圍下攪拌所得混合物10分鐘。在室溫下向上述混合物中逐份添加STAB (161 mg，0.76 mmol，4當量)。在室溫下再攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm，得到呈黃色固體狀之2-[(2-{6-[(2-氰基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-6-氧雜-2,9-二氮雜螺[4.5]癸烷-9-甲酸三級丁酯(100 mg，69.90%)。LCMS:(ES.m/z):752[M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在0℃下於氮氣氛圍下向2-[(2-{6-[(2-氰基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-6-氧雜-2,9-二氮雜螺[4.5]癸烷-9-甲酸三級丁酯(100 mg，0.13 mmol，1當量)於DCM (2 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TFA (500 uL)。在室溫下再攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS:(ES.m/z):652[M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 163
在室溫下向3-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{6-氧雜-2,9-二氮雜螺[4.5]癸-2-基甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基]丙腈(60 mg，0.09 mmol，1當量)及TEA (27 mg，0.27 mmol，3當量)於DCM (1.2 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加HCHO (8 mg，0.27 mmol，3當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物15分鐘。在室溫下向上述混合物中逐份添加STAB (78 mg，0.36 mmol，4當量)。在室溫下再攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在0℃下藉由添加MeOH (1 mL)淬滅反應物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05%TFA)，在30分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm及220 nm。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Shield RP18 OBD管柱，30*150 mm，5μm；移動相A：水(10 mmol/L NH 4HCO 3)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min；梯度：在7分鐘內25% B至50% B，50% B；波長：254 nm；RT1(min)：5)純化粗產物(25 mg)；凍乾溶離物，得到呈白色固體狀之3-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-[6-({9-甲基-6-氧雜-2,9-二氮雜螺[4.5]癸-2-基}甲基)-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基]吡啶-2-基)胺基]丙腈(8.5 mg，13.80%)。LCMS:(ES.m/z): 666[M+H] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.24 (s, 1H), 7.96-7.93 (m, 2H), 7.50 (s, 1H), 7.09-7.06 (m, 1H), 6.05 (s, 1H), 5.20 (s, 2H), 4.91(d, J=8Hz, 2H), 4.80 (d, J=8Hz, 2H), 3.77 (s, 2H), 3.59-3.56 (m, 1H), 3.34-3.30 (m, 6H), 3.25 (s, 3H), 2.83-2.80 (m, 2H), 2.71-2.68 (m, 1H), 2.58-2.55 (m, 2H), 2.31-2.24 (m, 2H), 2.15-2.13 (m, 5H),1.80-1.77 (m, 2H)。 合成化合物 164
在25℃下將3-({6-[6-甲醯基-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}胺基)丙腈(70 mg，0.13 mmol，1當量)、{5-氟-3-氮雜雙環[3.1.1]庚-1-基}甲醇(19 mg，0.13 mmol，1當量)及STAB (56 mg，0.26 mmol，2當量)於DCM (2 mL)中之混合物攪拌3小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。藉由製備型HPLC用以下條件純化殘餘物：管柱：XBridge Prep C18 OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內18% B至48% B，48% B；波長：254 nm；RT1(min)：5.08；凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之3-{[6-(6-{[1-氟-5-(羥甲基)-3-氮雜雙環[3.1.1]庚-3-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]胺基}丙腈；三氟乙酸(23.3 mg，21.94%)。LCMS (ESI, m/z): 655[M+H-TFA] + 1H NMR (400 MHz, 甲醇-d 4) δ 8.72 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 7.38 (d, J= 1.2 Hz, 1H), 6.02 (d, J= 1.2 Hz, 1H), 5.31 (s, 3H), 5.02 (dd, J= 6.4, 2.4 Hz, 2H), 4.69 (s, 2H), 3.75 (s, 2H), 3.70-3.67 (m, 4H), 3.55 (s, 2H), 3.41 (s, 3H), 3.33 (s, 3H), 2.82 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 2.31-2.21 (m, 4H)。 合成化合物 165 步驟 1 ：合成化合物 3
在氮氣氛圍下將(3R)-3-甲醯基吡咯啶-1-甲酸三級丁酯(500 mg，2.50 mmol，1當量)及嗎啉(262 mg，3.01 mmol，1.2當量)於DCM (10 mL)中之經攪拌溶液攪拌30分鐘。在室溫下向上述混合物中逐份添加STAB (2.13 g，10.03 mmol，4當量)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在0℃下用MeOH淬滅反應物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈白色固體狀之(3S)-3-(嗎啉-4-基甲基)吡咯啶-1-甲酸三級丁酯(510 mg，75%)。LCMS (ESI, m/z):271[M+H] +, 215[M+H-56] + 步驟 2. 合成化合物 4
在0℃下於氮氣氛圍下將(3S)-3-(嗎啉-4-基甲基)吡咯啶-1-甲酸三級丁酯(500 mg，1.84 mmol，1當量)於HCl (4M，於1,4-二噁烷中，5 mL)中之溶液攪拌2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。此得到呈白色固體狀之4-[(3R)-吡咯啶-3-基甲基]嗎啉鹽酸鹽(210 mg，54%)。LCMS (ESI, m/z):171[M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 165
在室溫下將3-({6-[6-甲醯基-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}胺基)丙腈(40 mg，0.07 mmol，1當量)、TEA (15 mg，0.15 mmol，2當量)及4-[(3R)-吡咯啶-3-基甲基]嗎啉(15 mg，0.09 mmol，1.2當量)於DCM (2 mL)中之經攪拌溶液攪拌30分鐘。在室溫下向上述混合物中逐份添加STAB (64 mg，0.30 mmol，4當量)。在室溫下再攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在0℃下藉由添加MeOH (10mL)淬滅反應物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05%TFA)，在30分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm及220 nm。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內5% B至35% B，35% B；波長：254 nm；RT1(min)：5.55)純化粗產物(30 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之3-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3R)-3-(嗎啉-4-基甲基)吡咯啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基]丙腈；三氟乙酸(16.2 mg，26%)。LCMS (ESI, m/z):680[M+H-TFA] + 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 10.94 (br s, 1H), 8.47 (s, 1H), 8.25 (d, J = 11.1 Hz, 2H), 7.49 (s, 1H), 7.12 (br s, 1H), 6.12 (s, 1H), 5.26 (s, 2H), 4.92 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 4.80 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 4.64 (br s, 2H), 3.89-3.52 (m, 10H), 3.31-3.07 (m, 12H), 2.83 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.45-2.11(m, 1H),1.90-1.53 (m, 1H)。 合成化合物 166 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下於N 2氛圍下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(200 mg，0.62 mmol，1當量)於DMF (2 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加Zn(CN) 2(145 mg，1.23 mmol，2當量)及Pd(PPh 3) 4(71 mg，0.06 mmol，0.1當量)。在145℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應有60%產物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-2,3-二氫異吲哚-4-甲腈(50 mg，30%)。LCMS:(ES.m/z):270 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 166-A
在室溫下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-2,3-二氫異吲哚-4-甲腈(50 mg，0.18 mmol，1當量)及2-氯-6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(60 mg，0.18 mmol，1當量)於二噁烷(1 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(120 mg，0.37 mmol，2當量)及Pd(OAc) 2(4 mg，0.02 mmol，0.1當量)及Xantphos (21 mg，0.04 mmol，0.2當量)。在110℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1.5小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內22% B至42% B，42% B；波長：254 nm；RT1(min)：5.38)純化粗產物(50 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-3H-異吲哚-4-甲腈；三氟乙酸(47.5 mg，37%)。LCMS:(ES.m/z):558[M+H-TFA] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 9.65(br s, 1H), 8.48-8.46 (m, 1H), 8.30 (s, 2H), 8.07 (s, 1H), 7.02 (s, 1H), 5.34 (s, 2H), 4.92 (d, J=8.0Hz, 2H), 4.85 (d, J=8.0Hz,2H), 4.52-4.48 (m, 2H), 3.63 (s, 2H), 3.39-3.37 (m, 4H), 3.30-3.27 (m, 1H), 3.21-3.16 (m, 2H), 2.86-2.83 (m, 1H), 2.60-2.57 (m, 1H), 1.86-1.62 (m, 4H), 1.38 (t, J=7.2Hz, 3H), 1.08-1.05 (m, 1H), 0.89 (d, J=6.4Hz, 1H) 步驟 3 ：合成化合物 166
在室溫下向2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-3H-異吲哚-4-甲腈(40 mg，0.07 mmol，1當量)於EtOH (1 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加NaOH (28 mg，0.72 mmol，10當量)及H 2O (1 mL)。在85℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下將反應混合物濃縮至乾。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到粗產物(30 mg)。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內12% B至26% B，在11分鐘內26% B至26% B，26% B；波長：254 nm；RT1(min)：10.41)純化粗產物(30 mg)；凍乾溶離物，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-3H-異吲哚-4-甲酸；三氟乙酸(3.3 mg，6%)。LCMS:(ES.m/z):577[M+H-TFA] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 9.67 (br s, 1H), 8.40-8.38 (m, 2H), 8.20 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 6.97 (m, 1H), 5.37 (s, 2H), 4.95-4.82 (m, 4H), 4.64-4.43 (m,2H), 3.61 (s, 2H), 3.51-3.36 (m, 4H), 3.29-3.26 (m, 1H), 3.18-3.13 (m, 2H), 2.86-2.84 (m, 1H), 2.60-2.55 (m, 1H), 1.86-1.59 (m, 4H), 1.41 (t, J = 6.0Hz, 3H), 1.10-1.04 (m, 1H), 0.95 (d, J =6.0Hz, 3H)。 合成化合物 167 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下將NIS (57.54 g，255.75 mmol，1.1當量)於H 2SO 4(200 mL)中之經攪拌溶液攪拌40分鐘。在0℃下向上述混合物中逐滴添加含3-溴-2-甲基苯甲酸(50 g，232.50 mmol，1當量)之H 2SO 4(200 mL)且攪拌3小時，在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在0℃下將反應物傾倒至水/冰(1000 mL)中。藉由過濾收集沈澱之固體且用Et 2O (3x50 mL)洗滌。藉由用DCM (100 mL)濕磨純化殘餘物。藉由過濾收集沈澱之固體且用DCM (3x50 mL)洗滌。此得到呈灰白色固體狀之3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸(54.2 g，68%)。LCMS (ESI, ms): 339[M-H] - 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.13 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 7.99 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 2.47 (s, 3H)。 步驟 2 ：合成化合物 3
在0℃下於氮氣氛圍下向3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸(25 g，73.32 mmol，1當量)於MeOH (250 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加SOCl 2(43.61 g，366.63 mmol，5當量)。在70℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。TLC指示反應完成。使所得混合物冷卻至室溫且在減壓下濃縮。此得到呈灰白色固體狀之3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸甲酯(23 g，88%)。 1H NMR (400 MHz, 氯仿-d) δ 8.03 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.02 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 2.56 (s, 3H)。 步驟 3. 合成化合物 4
在70℃下於氮氣氛圍下向3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸甲酯(15 g，42.25 mmol，1當量)及NBS (9.03 g，50.70 mmol，1.2當量)於ACN (150 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加AIBN (3.47 g，21.12 mmol，0.5當量)。LCMS及TLC顯示反應完成。無MS信號。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (6:1)溶離，得到呈白色固體狀之3-溴-2-(溴甲基)-5-碘苯甲酸甲酯(16.5 g，90%)。 1H NMR (300 MHz, 氯仿-d) δ 8.20 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 5.06 (s, 2H), 1.73 (s, 3H)。 步驟 4 ：合成化合物 5
在室溫下於氮氣氛圍下將3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸甲酯(14.5 g，40.84 mmol，1當量)於NH 3(g，7N，於MeOH中，15 mL)中之經攪拌溶液攪拌1小時。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物。藉由用水(50 mL)濕磨純化殘餘物。藉由過濾收集沈澱之固體且用Et 2O (3x20 mL)洗滌。此得到呈白色固體狀之4-溴-6-碘-2,3-二氫異吲哚-1-酮(11.2 g，81%)。LCMS (ESI, ms):338,340 [M+H] + 步驟 5 ：合成化合物 7
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-碘-2,3-二氫異吲哚-1-酮(11.2 g，33.14 mmol，1當量)及乙烯基三氟硼酸鉀(3.55 g，26.51 mmol，0.8當量)於1,4-二噁烷(120 mL)及H 2O (12 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(21.60 g，66.28 mmol，2當量)及Pd(dppf)Cl 2(2.43 g，3.31 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (12:1)溶離，得到呈棕色固體狀之4-溴-6-乙烯基-2,3-二氫異吲哚-1-酮(3.0 g，38%)。LCMS (ESI, ms):238,240[M+H] + 步驟 6 ：合成化合物 9
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-乙烯基-2,3-二氫異吲哚-1-酮(5 g，21.00 mmol，1當量)及NMO (7.38 g，63.00 mmol，3當量)於THF (50 mL)及H 2O (25 mL)中之經攪拌溶液中添加K 2OsO 4.2H 2O (0.77 g，2.10 mmol，0.1當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。在0℃下向上述混合物中添加NaIO 4(22.46 g，105.00 mmol，5當量)。在室溫下再攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在0℃下用水淬滅反應物。接著添加EA (100 mL)。藉由過濾收集沈澱之固體且用EtOAc (3x20 mL)洗滌。此得到呈白色固體狀之7-溴-3-側氧基-1,2-二氫異吲哚-5-甲醛(4 g，79%)。LCMS (ESI, ms):240,242[M+H] + 步驟 7 ：合成化合物 11
在室溫下於氮氣氛圍下向7-溴-3-側氧基-1,2-二氫異吲哚-5-甲醛(4 g，16.66 mmol，1當量)於DCM (80 mL)中之經攪拌溶液中添加(3S)-3-甲基哌啶鹽酸鹽(2.71 g，19.99 mmol，1.2當量)及TEA (2.02 g，19.99 mmol，1.2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。在室溫下向上述混合物中添加STAB (17.66 g，83.31 mmol，5當量)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用CH2Cl2 (3x20 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，矽膠；移動相，含MeCN之水(0.1%FA)，在30分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(1.2 g，22%)。LCMS (ESI, ms):323, 325 [M+H]+ 步驟 8 ：合成化合物 12
在室溫下於N 2氛圍下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(200 mg，0.62 mmol，1當量)於DMF (2 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加Zn(CN) 2(145 mg，1.23 mmol，2當量)及Pd(PPh 3) 4(71 mg，0.06 mmol，0.1當量)。在145℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應有60%產物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-2,3-二氫異吲哚-4-甲腈(50 mg，30%)。LCMS:(ES.m/z):270 [M+H] +。 步驟 9. 合成化合物 167-A
在室溫下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-2,3-二氫異吲哚-4-甲腈(50 mg，0.18 mmol，1當量)及2-氯-6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(60 mg，0.18 mmol，1當量)於二噁烷(1 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(120 mg，0.37 mmol，2當量)及Pd(OAc) 2(4 mg，0.02 mmol，0.1當量)及Xantphos (21 mg，0.04 mmol，0.2當量)。在110℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1.5小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內22% B至42% B，42% B；波長：254 nm；RT1(min)：5.38)純化粗產物(50 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-3H-異吲哚-4-甲腈；三氟乙酸(47.5 mg，37%)。LCMS:(ES.m/z):558[M+H-TFA] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 9.65(br s, 1H), 8.48-8.46 (m, 1H), 8.30 (s, 2H), 8.07 (s, 1H), 7.02 (s, 1H), 5.34 (s, 2H), 4.92 (d, J=8.0Hz, 2H), 4.85 (d, J=8.0Hz,2H), 4.52-4.48 (m, 2H), 3.63 (s, 2H), 3.39-3.37 (m, 4H), 3.30-3.27 (m, 1H), 3.21-3.16 (m, 2H), 2.86-2.83 (m, 1H), 2.60-2.57 (m, 1H), 1.86-1.62 (m, 4H), 1.38 (t, J=7.2Hz, 3H), 1.08-1.05 (m, 1H), 0.89 (d, J=6.4Hz, 1H)。 步驟 10 ：合成化合物 167
在室溫下於空氣氛圍下向2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-3H-異吲哚-4-甲腈(45 mg，0.08 mmol，1當量)於DMF (1 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NH 4Cl (43 mg，0.81 mmol，10當量)。在室溫下向上述混合物中逐份添加NaN 3(52 mg，0.81 mmol，10當量)。在120℃下再攪拌所得混合物8小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到粗產物(25 mg)。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內13% B至27% B，在12分鐘內27% B至27% B，27% B；波長：254 nm；RT1(min)：10.83)純化粗產物(25 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(1H-1,2,3,4-四唑-5-基)-3H-異吲哚-1-酮(6 mg，12%)。LCMS:(ES.m/z):601[M+1] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 9.70 (br s, 1H), 8.54-8.48 (m, 1H), 8.17-8.10 (m, 2H), 6.99 (s, 1H), 5.48 (s, 2H), 4.93-4.85 (m, 4H), 4.58-4.51 (m, 2H), 3.64 (s, 2H), 3.51-3.33 (m, 5H), 3.23-3.17 (m, 2H), 2.89-2.80 (m, 1H), 2.67-2.63 (m, 1H), 1.86-1.64 (m, 4H), 1.43 (t, J=8.0Hz, 3H), 1.09-1.03 (m, 1H), 0.90 (d, J=8.0Hz, 3H) 合成化合物 168 步驟 1 ：合成化合物 2
在-70℃下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-甲基吡啶(1.0 g，6.17 mmol，1.0當量)於THF (10.0 mL)中之經攪拌混合物中添加LiHMDS (1N，於THF中，8.02 mL)。在-70下於氮氣氛圍下攪拌反應混合物30分鐘。在-70℃下於氮氣氛圍下向上述混合物中添加碳酸二甲酯(1.0 g，11.10 mmol，1.80當量)。在-70℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。藉由LCMS可偵測到約50%所需產物。在0℃下用飽和NH 4Cl (水溶液，100 mL)淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3x200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (3:1)溶離，得到呈油狀之2-(2,6-二氯吡啶-4-基)乙酸甲酯(590 mg，41%)。LCMS (ES, m/z): 220,222 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在0℃下於氮氣氛圍下向2-(2,6-二氯吡啶-4-基)乙酸甲酯(5.0 g，22.72 mmol，1.0當量)於DMF (50 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaH (2.73 g，68.16 mmol，3.00當量，60%)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在0℃下向上述混合物中添加1,3-二溴-2-甲基丙烷(7.36 g，34.08 mmol，1.5當量)。在10℃下再攪拌所得混合物2小時。藉由LCMS可偵測到約30%所需產物。在室溫下用水(200 mL)淬滅反應物。用濃HCl將混合物酸化至pH 6。用CH 2Cl 2(3x300 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% FA)，在30分鐘內10%至70%梯度；偵測器，UV 254 nm。用CH 2Cl 2(3x300 mL)萃取溶離異構物。在真空下濃縮所得混合物，得到呈綠色油狀之1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸甲酯(1.9 g，15%)。LCMS: (ES, m/s): 274,276 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 4
在室溫下於氮氣氛圍下向1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸甲酯(1.8 g，6.56 mmol，1.0當量)於THF (18 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加LiOH (0.31 g，13.13 mmol，2.0當量) (H 2O=9.0 mL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。用1N HCL將反應混合物調節至pH=5。藉由逆相急驟層析用以下條件純化混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% FA)，在30分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。用CH 2Cl 2(3x300 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物，得到呈半固體狀之1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸(2.0 g，83%)。LCMS: (ES, m/s): 260,262 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 5
在0℃下於氮氣氛圍下向1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸(2.4 g，9.22 mmol，1.0當量)於DMF (24 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加HATU (5.26 g，13.84 mmol，1.5當量)、1-胺基-3-甲基硫脲(1.16 g，11.07 mmol，1.2當量)及DIEA (2.39 g，18.45 mmol，2.0當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在室溫下用水淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3x200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (2:3)溶離，得到呈白色固體狀之1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基-N-[(甲基硫代胺甲醯基)胺基]環丁烷-1-甲醯胺(2.5 g，70%)。LCMS: (ES, m/s): 347,349 [M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 6
在0℃下於氮氣氛圍下向1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基-N-[(甲基硫代胺甲醯基)胺基]環丁烷-1-甲醯胺(2.3 g，6.62 mmol，1.0當量)於THF (11 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaOH (1.0 g，25.00 mmol，3.77當量) (H 2O=11 mL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS可偵測到約73%所需產物。用濃HCl將混合物酸化至pH 5。用CH 2Cl 2(3x200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈白色固體狀之5-[1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑-3-硫醇(1.2 g，55%)。LCMS: (ES, m/s): 329,331 [M+H] +。 步驟 6 ：合成化合物 7
在0℃下於氮氣氛圍下向5-[1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑-3-硫醇(1.2 g，3.64 mmol，1.0當量)於THF (12 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaNO 2(0.75 g，10.93 mmol，3.0當量)(H 2O=12 mL)及HNO 3(12 mL，1.0 mol/L)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在室溫下用水/冰淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3x200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，矽膠；移動相，含ACN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。用CH 2Cl 2(3x200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物，得到呈綠色固體狀之2,6-二氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(900 mg，74%)。LCMS: (ES, m/s): 297,299 [M+H] +。 步驟 7 ：合成化合物 8
在室溫下向2,6-二氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(250 mg，0.84 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(236 mg，0.75 mmol，0.9當量)於二噁烷(5.00 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(548 mg，1.68 mmol，2當量)且添加Pd(OAc) 2(19 mg，0.08 mmol，0.1當量)及Xantphos (97 mg，0.17 mmol，0.2當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應有50%產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之2-{6-氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(200 mg，41%)。LCMS:(ES.m/z): 573,575 [M+H] +。 步驟 8 ：合成化合物 9
在室溫下向2-{6-氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(200 mg，0.35 mmol，1當量)及2-疊氮基乙胺(36 mg，0.42 mmol，1.2當量)於二噁烷(4 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(227 mg，0.69 mmol，2當量)且添加Xantphos (40 mg，0.07 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(8 mg，0.03 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1.5小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之2-{6-[(2-疊氮基乙基)胺基]-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(90 mg，41%)。LCMS:(ES.m/z):623 [M+H] +。 步驟 9 ：合成化合物 168
藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內26% B至41% B，41% B；波長：254 nm；RT1(min)：8.08)純化2-{6-[(2-疊氮基乙基)胺基]-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(60 mg)；凍乾所收集之級分，得到45 mg純產物。藉由掌性HPLC用以下條件(管柱：CHIRALPAK IE，2*25 cm，5 μm；移動相A：Hex:DCM = 3:1 (0.5% 2M NH3-MeOH)--HPLC，移動相B：IPA--HPLC；流動速率：20 mL/min；梯度：在33分鐘內10% B至10% B；波長：220/254 nm；RT1(min)：25.218；RT2(min)：30.073；樣品溶劑：EtOH--HPLC；注入體積：0.6 mL)分離產物；將第一溶離異構物濃縮並凍乾，得到2-{6-[(2-疊氮基乙基)胺基]-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(30 mg，50%)。LCMS:(ES.m/z):623[M+H] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.35 (s, 1H), 7.95-7.91 (m, 2H), 7.76 (br s, 1H), 7.01 (br s, 1H),6.20 (br s, 1H), 5.20 (s, 2H), 3.64-3.51 (m, 6H), 3.23 (s, 3H), 2.75-2.73 (m, 4H), 2.61-2.54 (m, 3H), 1.95-1.93 (m, 1H), 1.64-1.49 (m, 5H), 1.10(d, J=8Hz, 3H), 0.85-0.80 (m, 4H)。 合成化合物 169 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(200 mg，0.62 mmol，1當量)於DMF (2 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加Zn(CN) 2(145 mg，1.23 mmol，2當量)及Pd(PPh 3) 4(71 mg，0.06 mmol，0.1當量)。在145℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應有60%產物。使混合物冷卻降至室溫。將反應物在真空下濃縮至乾。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-2,3-二氫異吲哚-4-甲腈(50 mg，30%)。LCMS: (ES.m/z): 270[M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 2
在-70℃下於空氣氛圍下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-2,3-二氫異吲哚-4-甲腈(100 mg，0.37 mmol，1當量)於DCM (1 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加DIBAL-H (1mol/L正己烷，1.20 mL，1.20 mmol，3.3當量)。在-70℃下再攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應有50%產物。在-10℃下藉由添加MeOH (1 mL)淬滅反應物。在減壓下濃縮所得混合物。將殘餘物溶解於乙腈(2 mL)中。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(10mmol/L NH 4HCO 3)，在30分鐘內0%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-2,3-二氫異吲哚-4-甲醛(45 mg，44%)。LCMS:(ES.m/z):273[M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 3
在50℃下將2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(300 mg，1.00 mmol，1當量)及(乙基硫烷基)鈉(92 mg，1.10 mmol，1.1當量)於DMF (5 mL)中之混合物攪拌3小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在室溫下藉由添加水(10 mL)淬滅反應物。用EtOAc (3 x 10 mL)萃取所得混合物。用鹽水(3 x 10 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na2SO4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH2Cl2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之2-氯-6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(190 mg，58%)。LCMS (ES, m/z): 325 [M+H]+。 步驟 4 ：合成化合物 169
在室溫下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-2,3-二氫異吲哚-4-甲醛(45 mg，0.16 mmol，1當量)及2-氯-6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(48 mg，0.15 mmol，0.9當量)於二噁烷(1 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(107 mg，0.33 mmol，2當量)及Xantphos (19 mg，0.03 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(4 mg，0.01 mmol，0.1當量)。在110℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到粗產物(40 mg)。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.05% TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內20% B至44% B，44% B；波長：254 nm；RT1(min)：5.4)純化粗產物(40 mg)；凍乾溶離物，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-3H-異吲哚-4-甲醛(28.3 mg，30%)。LCMS:(ES.m/z):561[M+H] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 10.26(s, 1H), 9.71 (br s, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.38 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.00 (s, 1H), 5.43 (s,2H), 4.92-4.84 (m, 4H), 4.58-4.51 (m, 2H), 3.65 (s, 2H), 3.43-3.40(m, 4H), 3.31-3.29 (m, 1H), 3.22-3.17 (m, 2H), 2.89-2.86 (m, 1H), 2.62-2.57 (m, 1H), 1.86-1.63 (m, 4H), 1.40 (t, J=7.2Hz, 3H), 1.08-1.04 (m,1H), 0.89 (d, J=8.0Hz, 3H) 合成化合物 170 步驟 1 ：合成化合物 2
在0℃下於空氣氛圍下向2-(3-溴苯基)乙酸甲酯(100 g，436.54 mmol，1當量)於DMF (1 L)中之經攪拌溶液中逐份添加NaH (26.19 g，1091.35 mmol，1.5當量，60%)。在0℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在0℃下向上述混合物中逐份添加1,3-二溴-2-甲基丙烷(103.68 g，480.19 mmol，1.1當量)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在0℃下藉由添加飽和NH 4Cl (水溶液) (1000 mL)淬滅反應物。用EtOAc (3 x 700 mL)萃取所得混合物。用鹽水(3x200 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (5:1)溶離，得到呈黃色油狀之1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸甲酯(100 g，81%)。LCMS:(ES.m/z): 283,284 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在0℃下向1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸甲酯(100 g，353.15 mmol，1當量)於THF (100 mL)中之經攪拌溶液中添加含LiOH (25.37 g，1059.45 mmol，3當量)之H 2O (1000 mL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物。用濃HCl將混合物酸化至pH 6。用EtOAc (3 x 200mL)萃取所得混合物。用鹽水(3x100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。此得到呈黃色固體狀之1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸(30 g，32%)。LCMS (ESI, m/z):267,269[M-H] -。 步驟 3 ：合成化合物 4
在室溫下向1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸(16.5 g，61.31 mmol，1當量)及1-胺基-3-甲基硫脲(7.74 g，73.57 mmol，1.2當量)於DMF (170 mL)中之經攪拌溶液中添加HATU (34.97 g，91.96 mmol，1.5當量)及DIEA (15.85 g，122.61 mmol，2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。反應混合物未經任何處理即用於下一步驟。LCMS:(ES.m/z):356,358 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 5
在室溫下向上述混合物中添加NaOH (170 mL)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。用1N HCl將混合物酸化至pH 6。用EtOAc (3 x100 mL)萃取所得混合物。用鹽水(5x100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色油狀之5-[1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑-3-硫醇(4.1 g，20%)。LCMS:(ES.m/z): 338,340[M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 6
在0℃下於氮氣氛圍下向5-[1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑-3-硫醇(22 g，65.03 mmol，1.00當量)於THF (22.02 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加NaNO 2(22.44 g，325.18 mmol，5當量)。在0℃下於氮氣氛圍下向混合物中逐滴添加HNO 3(325.18 mL，325.18 mmol，5當量，1N)。LCMS指示反應完成。用飽和NaHCO 3(水溶液)將混合物鹼化至pH 8。用EtOAc (3 x 200 mL)萃取所得混合物。用水(4x80 mL)洗滌合併之有機層。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之3-[1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑(10 g，50%)。LCMS: (ES.m/z): 306,308 [M+H] +。 步驟 6 ：合成化合物 7
藉由製備型SFC用以下條件(管柱：CHIRALPAK ID 2*25 cm，5um；移動相A：CO2，移動相B：IPA (1%-2M-NH3-MeOH)；流動速率：55 mL/min；梯度：等度20% B；管柱溫度(℃)：35；背壓(bar)：100；波長：220 nm；RT1(min)：12.13；RT2(min)：13.8；樣品溶劑：MEOH；注入體積：0.8 mL)分離產物(10 g)。濃縮第二級分(RT13.8min)，得到呈灰白色固體狀之4-甲基-3-[(1r,3s)-1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁基]-1,2,4-三唑(6 g，60%)。 1H NMR (300 MHz, 氯仿-d) δ 8.00 (s, 1H),7.53 (s, 1H), 7.40-7.37 (s, 1H),7.24-7.21 (m, 2H), 3.19 (s,3H), 2.82-2.78 (m, 2H), 2.67-2.63 (m, 3H), 1.22-1.12 (m, 3H)。 步驟 7. 合成化合物 9
在室溫下於氮氣氛圍下將NIS (57.54 g，255.76 mmol，1.1當量)於H 2SO 4(200 mL)中之經攪拌溶液攪拌40分鐘。在0℃下向上述混合物中逐滴添加含3-溴-2-甲基苯甲酸(50 g，232.51 mmol，1當量)之H 2SO 4(200 mL)且攪拌3小時。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示完全反應。LCMS指示完全反應。在0℃下將反應物傾倒至水/冰中。藉由過濾收集沈澱之固體且用Et 2O (3x20 mL)洗滌。藉由用DCM (100 mL)濕磨純化殘餘物。藉由過濾收集沈澱之固體且用DCM (3x50 mL)洗滌。在紅外下乾燥固體，得到呈灰白色固體狀之3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸(54.2 g，68%)。LCMS (ESI, ms):339,341[M-H] -。 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.13 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 2.47 (s, 3H) 步驟 8 ：合成化合物 10
在0℃下於氮氣氛圍下向3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸(30 g，87.99 mmol，1當量)於MeOH (300 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加SOCl 2(52.34 g，439.96 mmol，5當量)。在70℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。在0℃下用飽和NaHCO 3(水溶液)淬滅反應物。用EtOAc (3 x 100 mL)萃取所得混合物。用鹽水(100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。此得到呈灰白色固體狀之3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸甲酯(29.9 g，96%)。無MS信號。 1H NMR (400 MHz, 氯仿-d) δ 8.03 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.02 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 2.56 (s, 3H)。 步驟 9 ：合成化合物 11
在70℃下於氮氣氛圍下向3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸甲酯(15 g，42.25 mmol，1當量)及NBS (9.03 g，50.70 mmol，1.2當量)於ACN (150 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加AIBN (3.47 g，21.12 mmol，0.5當量)。LCMS及TLC顯示反應完成。無MS信號。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (6:1)溶離，得到呈白色固體狀之3-溴-2-(溴甲基)-5-碘苯甲酸甲酯(16.5 g，90%)。 1H NMR (300 MHz, 氯仿-d) δ 8.20 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 5.06 (s, 2H), 1.73 (s, 3H)。 步驟 10 ：合成化合物 12
在25℃下將3-溴-2-(溴甲基)-5-碘苯甲酸甲酯(51.5 g，118.70 mmol，1當量)及NH 3(7N，於MeOH中，500 mL)之混合物攪拌2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。殘餘物未經進一步純化即用於下一步驟。LCMS (ESI, ms): 338,340 [M+H] +。 步驟 11 ：合成化合物 13
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-碘-2,3-二氫異吲哚-1-酮(48 g，142.03 mmol，1當量)及乙烯基三氟硼酸鉀(15.22 g，113.62 mmol，0.8當量)於1,4-二噁烷(500 mL)及H 2O (100 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(92.56 g，284.07 mmol，2當量)及Pd(dppf)Cl 2(10.39 g，14.20 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (12:1)溶離，得到呈棕色固體狀之4-溴-6-乙烯基-2,3-二氫異吲哚-1-酮(11 g，32%)。LCMS (ESI, ms):238,240[M+H] +。 步驟 12 ：合成化合物 14
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-乙烯基-2,3-二氫異吲哚-1-酮(20 g，84.00 mmol，1當量)及NMO (29.52 g，252.00 mmol，3.00當量)於THF (200 mL)及水(100 mL)中之經攪拌溶液中添加K 2OsO 4.2H 2O (0.15 g，0.42 mmol，0.05當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除THF。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.1% TFA及ACN之水(在50分鐘內0%至100%梯度)；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈棕色固體狀之4-溴-6-(1,2-二羥基乙基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(6.7 g，29%)。LCMS (ESI, ms): 272,274 [M+H] +。 步驟 13. 合成化合物 15
在室溫下於空氣氛圍下向4-溴-6-(1,2-二羥基乙基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(5 g，18.37 mmol，1當量)於DCM (50 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加咪唑(2.50 g，36.75 mmol，2當量)及TBDPSCl (5.05 g，18.37 mmol，1當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈白色固體狀之4-溴-6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-羥乙基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(3.6 g，38%)。LCMS: (ES.m/z): 510,512[M+H] +。 步驟 14 ：合成化合物 16
在室溫下於空氣氛圍下向4-溴-6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-羥乙基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(3.5 g，6.85 mmol，1當量)於DCM (70 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加MsCl (0.94 g，8.22 mmol，1.2當量)及TEA (2.08 g，20.56 mmol，3當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。所得混合物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS:(ES.m/z):588,590[M+H] +。 步驟 15 ：合成化合物 17
在室溫下於空氣氛圍下向甲烷磺酸1-(7-溴-3-側氧基-1,2-二氫異吲哚-5-基)-2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]乙酯(3.5 g，5.94 mmol，1當量)及(3S)-3-甲基哌啶(0.71 g，7.13 mmol，1.2當量)於DMF (40 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加K 2CO 3(2.05 g，14.86 mmol，2.5當量)。在50℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在0℃下藉由添加水/冰(200 mL)淬滅反應物。用EtOAc (3 x 100mL)萃取所得混合物。用鹽水(3x5 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈黃色固體狀之4-溴-6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(2.8 g，79%)。LCMS: (ES.m/z):591,593[M+H] +。 步驟 16 ：合成化合物 18
在室溫下於空氣氛圍下向4-溴-6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(2 g，3.38 mmol，1當量)於DMF (20 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加(甲基硫烷基)鈉(0.36 g，5.07 mmol，1.5當量)。在100℃下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色油狀之6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(600 mg，32%)。LCMS:(ES.m/z):559[M+H] +。 步驟 17 ：合成化合物 19
在室溫下於氮氣氛圍下向6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(600 mg，1.074 mmol，1當量)及4-甲基-3-[(1r,3s)-1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁基]-1,2,4-三唑(394 mg，1.28 mmol，1.2當量)於二噁烷(12 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(699 mg，2.14 mmol，2當量)及Xantphos (124 mg，0.21 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(24 mg，0.10 mmol，0.1當量)。在110℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應有45%產物。使混合物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-4-(甲基硫烷基)-2-{3-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]苯基}-3H-異吲哚-1-酮(270 mg，32%)。LCMS:(ES.m/z): 784 [M+H] +。 步驟 18 ：合成化合物 170
在0℃下向6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-4-(甲基硫烷基)-2-{3-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]苯基}-3H-異吲哚-1-酮(200 mg，0.25 mmol，1當量)於THF (4 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加TBAF (133 mg，0.51 mmol，2當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應有30%產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Fluoro Phenyl，30*150 mm，5μm；移動相A：水(0.1%FA)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min；梯度：在8分鐘內5% B至35% B，35% B；波長：254；220 nm；RT1(min)：7.9)純化粗產物(40 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之6-{2-羥基-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-4-(甲基硫烷基)-2-{3-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]苯基}-3H-異吲哚-1-酮(23.7 mg，17%)。LCMS: (ES.m/z):546[M+H] +。
1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.29-8.25 (m, 2H), 8.05 (s, 1H), 7.71 (d, J=8Hz, 1H), 7.47 (s, 2H), 7.43 (t, J=8Hz, 1H), 7.09 (d, J=8Hz, 1H), 3.85-3.81 (m, 1H), 3.78-3.73 (m, 1H), 3.60-3.57 (m, 1H), 3.26 (s, 3H), 2.95-2.80 (m, 3H), 2.70-2.67 (m, 1H), 2.59-2.54 (m, 6H), 2.08-1.80 (m, 1H), 1.71-1.66 (m, 1H), 1.61-1.58 (m, 2H), 1.51-1.39 (m, 3H), 1.23-1.09 (m, 3H), 0.82-0.74 (m, 4H)。 合成化合物 171 步驟 1 ：合成化合物 1
在90℃下於氮氣氛圍下將2,6-二氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(3 g，10.09 mmol，1當量)於乙胺(2.0 M，於THF中，30 mL)中之經攪拌溶液攪拌2天。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (12:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之6-氯-N-乙基-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-胺(2.1 g，66%)。LCMS (ESI, m/z):306,308[M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 171
在室溫下於氮氣氛圍下向6-氯-N-乙基-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-胺(40 mg，0.13 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(45 mg，0.14 mmol，1.1當量)於二噁烷(1 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(85 mg，0.26 mmol，2當量)、Xantphos (15 mg，0.026 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(3 mg，0.013 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(31.5 mg，41%)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.34 (s, 1H), 7.93-7.90 (m, 2H), 7.70 (s, 1H), 6.69 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 6.13 (s, 1H), 5.16 (s, 2H), 3.63 (s, 2H), 3.30-3.25 (m, 2H), 3.27-3.224 (m, 5H), 2.75-2.71(m, 4H), 2.63-2.61(m, 3H), 1.95-1.90 (m, 1H), 1.67-1.64 (m, 4H), 1.59-1.49(m, 1H), 1.17 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.09 (d, J = 6.0Hz, 3H), 0.86 - 0.81 (m, 4H)。LCMS (ESI, m/z):582 [M+H] + 合成化合物 172 步驟 1 ：合成化合物 1
在90℃下於氮氣氛圍下將2,6-二氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(3 g，10.09 mmol，1當量)於乙胺(2.0 M，於THF中，30 mL)中之經攪拌溶液攪拌2天。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (12:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之6-氯-N-乙基-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-胺(2.1 g，66%)。LCMS (ESI, m/z): 306,308[M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(500 mg，1.54 mmol，1當量)於DMF (5 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaSMe (162 mg，2.32 mmol，1.5當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(410 mg，91%)。LCMS (ESI, m/z):291[M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 172-A
在室溫下於氮氣氛圍下向6-氯-N-乙基-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-胺(100 mg，0.33 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(104 mg，0.36 mmol，1.1當量)於二噁烷(2 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(213 mg，0.65 mmol，2當量)、Xantphos (38 mg，0.065 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(7 mg，0.033 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(50.4 mg，27%)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.34 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.46 (s, 2H), 6.66 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 6.09 (s, 1H), 4.87 (s, 2H), 3.55 (br s, 2H), 3.27-3.24 (m, 5H), 2.74-2.72 (m, 4H), 2.67-2.54 (m, 6H), 1.91-1.89 (m, 1H), 1.64-1.35 (m, 5H), 1.16 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.08 (d, J = 6.0Hz, 3H), 0.86 - 0.82 (m, 4H)。LCMS (ESI, m/z):560[M+H] + 步驟 4 ：合成化合物 172
在室溫下於空氣氛圍下向2-[6-(乙基胺基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(35 mg，0.06 mmol，1當量)於DCM (700 uL)中之經攪拌溶液中逐份添加mCPBA (21 mg，0.12 mmol，2當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Fluoro Phenyl，30*150 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min；梯度：在10分鐘內5% B至34% B，34% B；波長：254 nm；RT1(min)：8.5；操作次數)純化粗產物(35mg)：凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]-4-甲烷磺醯基-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-3H-異吲哚-1-酮；三氟乙酸(21.3 mg，47%)。LCMS:(ES.m/z):592[M+H-TFA] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 12.53 (br s, 1H), 8.87 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.66 (s, 1H),6.22 (s, 1H), 5.28(s, 2H), 5.06-4.99(m, 2H), 3.54-3.45 (m, 3H), 3.41-3.32 (m, 5H), 2.93 (s, 3H), 2.78-2.77 (m, 2H), 2.67-2.51 (m, 4H), 2.18-2.05 (m, 1H), 1.93-1.75 (m, 3H), 1.23-1.00 (m, 7H), 0.89 (d, J=6.6Hz, 3H)。 合成化合物 173 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下向4-溴-6-([(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基-2,3-二氫異吲哚-1-酮(2.05 g，6.34 mmol，1當量)於DMF (20 mL)中之經攪拌溶液中添加(甲基硫烷基)鈉(0.67 g，9.51 mmol，1.5當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(10mmol/L NH 4HCO 3)，在30分鐘內5%至80%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈灰白色固體狀之6-([(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(1.55 g，84%)。LCMS (ESI, m/z): 291[M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 2
在室溫下向2,6-二氯-4-(3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基吡啶(700 mg，2.34 mmol，1當量)、胺基甲酸三級丁酯(247 mg，2.10 mmol，0.9當量)及Cs 2CO 3(1524 mg，4.68 mmol，2當量)於二噁烷(14 mL)中之經攪拌溶液中添加Xantphos (270 mg，0.46 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(52 mg，0.23 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (12:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之N-(6-氯-4-(3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基吡啶-2-基)胺基甲酸三級丁酯(600 mg，67%)。LCMS (ESI, m/z):380,382[M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 3
在室溫下向N-(6-氯-4-(3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基吡啶-2-基)胺基甲酸三級丁酯(580 mg，1.52 mmol，1當量)、6-([(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(443 mg，1.52 mmol，1當量)及Cs 2CO 3(995 mg，3.05 mmol，2當量)於二噁烷(12 mL)中之經攪拌溶液中添加Xantphos (177 mg，0.30 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(34 mg，0.15 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (12:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之N-(4-(3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基-6-(6-([(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸三級丁酯(750 mg，77%)。LCMS (ESI, m/z):634[M+H] + 步驟 4 ：合成化合物 173
在0℃下向N-(4-(3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基-6-(6-([(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸三級丁酯(750 mg，1.18 mmol，1當量)於DCM (15 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TFA (8 mL)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(10mmol/L NH 4HCO 3)，在30分鐘內5%至80%梯度；偵測器，UV 254 nm。在真空下濃縮所收集之級分並凍乾，得到呈白色固體狀之2-(6-胺基-4-(3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基吡啶-2-基)-6-([(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(425 mg，65%)。LCMS (ESI, m/z):534[M+H] + 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.26 (s, 1H), 7.50-7.40 (m, 3H), 6.08-5.91 (m, 3H), 4.90 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 4.83-4.74 (m, 4H), 3.55-3.48 (m, 2H), 3.23 (s, 3H), 2.72 (t, J= 9.2 Hz, 2H), 2.59 (s, 3H), 1.90 (t, J= 10.0 Hz, 1H), 1.62 (m, 4H), 1.46-1.43 (m, 1H), 0.86-0.81 (m, 4H)。 合成化合物 174 步驟 1 ：合成化合物 2
在90℃下於氮氣氛圍下將2,6-二氯-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(800 mg，2.69 mmol，1當量)、BocNH 2(315 mg，2.69 mmol，1當量)、XantPhos (311 mg，0.54 mmol，0.2當量)、Pd(OAc) 2(120 mg，0.54 mmol，0.2當量)及Cs 2CO 3(1.75 g，5.38 mmol，2當量)於二噁烷(16 mL)中之混合物攪拌1小時。LCMS指示反應完成。使反應混合物冷卻降至室溫且在減壓下移除溶劑。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用DCM/MeOH (94:6)溶離，得到呈黃色固體狀之N-{6-氯-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}胺基甲酸三級丁酯(510 mg，50%)。LCMS (ESI, m/z): 378,380 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在120℃下於氮氣氛圍下將N-{6-氯-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}胺基甲酸三級丁酯(710 mg，1.88 mmol，1當量)、6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(545 mg，1.88 mmol，1當量)、Pd(OAc) 2(84 mg，0.37 mmol，0.2當量)、XantPhos (217 mg，0.37 mmol，0.2當量)及Cs 2CO 3(122 mg，0.37 mmol，0.2當量)於二噁烷(15 mL)中之混合物攪拌1小時。LCMS指示反應完成。使反應混合物冷卻降至室溫且在減壓下移除溶劑。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用DCM/MeOH (95:5)溶離，得到呈黃色固體狀之N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸三級丁酯(540 mg，45%)。LCMS (ESI, m/z): 632 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 174
在25℃下向N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸三級丁酯(440 mg，0.70 mmol，1當量)於DCM (8 mL)中之混合物中添加TFA (1.6 mL)。在25℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.1% NH 4HCO 3及ACN之水(在50分鐘內0%至100%梯度)；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之2-{6-胺基-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(300 mg，81%)。LCMS (ESI, m/z): 532 [M+H] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 8.35 (s, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.46-7.45 (m, 2H), 6.14-6.08 (m, 3H), 4.83 (s, 2H), 3.55 (s, 2H), 3.25 (s, 3H), 2.78-2.68 (m, 4H), 2.59 (s, 3H), 2.57-2.55 (m, 3H), 1.95-1.84 (m, 1H), 1.70-1.55 (m, 4H), 1.52-1.43(m, 1H), 1.09 (d, J= 56.0 Hz, 3H), 0.88-0.80 (m, 4H)。 合成化合物 175 步驟 1 ：合成化合物 2
在25℃下將7-溴-3-側氧基-1,2-二氫異吲哚-5-甲醛(600 mg，2.50 mmol，1當量)及哌啶(212 mg，2.50 mmol，1當量)於DCM (14 mL)中之混合物攪拌30分鐘。將STAB (1.58 g，7.50 mmol，3當量)添加至上述混合物中。攪拌所得混合物4小時。LCMS指示反應完成。藉由添加水(50 mL)淬滅反應物且用DCM (3 x 50 mL)萃取。經無水硫酸鈉乾燥合併之有機層。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由逆相急驟用以下條件(管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.1% NH 4HCO 3及ACN之水(在50分鐘內0%至100%梯度)；偵測器，UV 254 nm)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之4-溴-6-(哌啶-1-基甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(450 mg，58%)。LCMS (ESI, m/z): 309,311 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在90℃下將4-溴-6-(哌啶-1-基甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(290 mg，0.94 mmol，1當量)及MeSNa (164 mg，2.35 mmol，2.5當量)於DMF (4 mL)中之混合物攪拌1小時。LCMS指示反應完成。使反應混合物降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化混合物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.1% NH 4HCO 3及ACN之水(在50分鐘內0%至100%梯度)；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之4-(甲基硫烷基)-6-(哌啶-1-基甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(120 mg，46%)。LCMS (ESI, m/z): 277 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 175
在100℃下於氮氣氛圍下將4-(甲基硫烷基)-6-(哌啶-1-基甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(150 mg，0.54 mmol，1當量)、6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(167 mg，0.54 mmol，1當量)、XantPhos (62 mg，0.11 mmol，0.2當量)、Pd(OAc) 2(24 mg，0.11 mmol，0.2當量)及Cs 2CO 3(353 mg，1.08 mmol，2當量)於二噁烷(4 mL)中之混合物攪拌1小時。LCMS指示反應完成。使反應混合物降至室溫。經二氧化矽過濾反應物且濃縮濾液。藉由製備型HPLC用以下條件純化殘餘物：管柱：XBridge Prep OBD C18管柱，30*150 mm，5μm；移動相A：水(10mmol/L NH 4HCO 3+ 0.05%NH 3H 2O)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min mL/min；梯度：在8分鐘內32% B至62% B；波長：254nm/220nm nm；RT1(min)：7.4。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-4-(甲基硫烷基)-6-(哌啶-1-基甲基)-3H-異吲哚-1-酮(92.4 mg，30.71%)。LCMS (ES, m/z): 548 [M+H] +。
1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 8.24 (s, 1H), 7.46 (d, J= 5.2 Hz, 2H), 7.39 (d, J= 0.8 Hz, 1H), 6.56 (t, J= 5.2 Hz, 1H), 5.87 (d, J= 0.8 Hz, 1H), 4.89 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 4.84 (s, 2H), 4.78 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 3.55 (s, 2H), 3.48 (s, 2H), 3.22-3.18 (m, 5H), 2.59 (s, 3H), 2.40-2.30 (m, 4H), 1.56-1.46 (m, 4H), 1.44-1.37 (m, 2H), 1.13 (t, J= 7.2 Hz, 3H)。 合成化合物 176 步驟 1 ：合成化合物 2
在90℃下於氮氣氛圍下將3-溴-6H,7H-吡咯并[3,4-b]吡啶-5-酮(2 g，9.39 mmol，1當量)、乙烯基三氟硼酸鹽(890 mg，9.39 mmol，1當量)、Pd(dppf)Cl 2(1.37 g，1.88 mmol，0.2當量)及Cs 2CO 3(6.11 g，18.78 mmol，2當量)於二噁烷(40 mL)及水(10 mL)中之混合物攪拌1小時。LCMS指示反應完成。使反應混合物降至室溫且在減壓下移除溶劑。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用DCM/MeOH (95:5)溶離，得到呈黃色固體狀之3-乙烯基-6H,7H-吡咯并[3,4-b]吡啶-5-酮(1.1 g，73%)。LCMS (ESI, m/z): 161 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在25℃下於氮氣氛圍下將3-乙烯基-6H,7H-吡咯并[3,4-b]吡啶-5-酮(500 mg，3.12 mmol，1當量)、K 2OsO 4.2H 2O (115 mg，0.31 mmol，0.1當量)及NaIO 4(1.33 g，6.244mmol，2當量)於二噁烷(10 mL)及水(2.50 mL)中之混合物攪拌3小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用DCM/MeOH (92:8)溶離，得到呈黃色固體狀之5-側氧基-6H,7H-吡咯并[3,4-b]吡啶-3-甲醛(140 mg，28%)。LCMS (ESI, m/z): 163 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 6
在25℃下將5-側氧基-6H,7H-吡咯并[3,4-b]吡啶-3-甲醛(140 mg，0.86 mmol，1當量)、TEA (262 mg，2.59 mmol，3當量)及(3S)-3-甲基哌啶鹽酸鹽(140 mg，1.04 mmol，1.2當量)於DCM (3 mL)中之混合物攪拌30分鐘。接著在25℃下將STAB (365 mg，1.73 mmol，2當量)添加至上述混合物中。在25℃下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。用飽和碳酸氫鈉溶液淬滅反應物且在減壓下移除有機相。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.1% NH 4HCO 3及ACN之水(在30分鐘內0%至100%梯度)；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色固體狀之3-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-6H,7H-吡咯并[3,4-b]吡啶-5-酮(70 mg，33%)。LCMS (ES, m/z): 246 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 176
在100℃下於氮氣氛圍下將3-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-6H,7H-吡咯并[3,4-b]吡啶-5-酮(60 mg，0.24 mmol，1當量)、6-氯-N-乙基-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-胺(74 mg，0.24 mmol，1當量)、Pd(OAc) 2(11 mg，0.049 mmol，0.2當量)、XantPhos (28 mg，0.049 mmol，0.2當量)及Cs 2CO 3(160 mg，0.49 mmol，2當量)於二噁烷(2.5 mL)中之混合物攪拌1.5小時。LCMS指示反應完成。使反應混合物降至室溫且在減壓下移除溶劑。用MeOH (10 mL)溶解殘餘物且過濾所得混合物。濃縮濾液。藉由製備型HPLC用以下條件純化粗產物：管柱：XBridge Prep OBD C18管柱，30*150 mm，5μm；移動相A：水(10mmol/L NH4HCO 3+ 0.05%NH 3H 2O)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min mL/min；梯度：在8分鐘內33% B至63% B；波長：254nm/220nm nm；RT1(min)：6.8。凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之6-[6-(乙基胺基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]-3-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-7H-吡咯并[3,4-b]吡啶-5-酮(23.6 mg，18.58%)。LCMS (ESI, m/z): 515 [M+H] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 8.72 (d, J= 1.6 Hz, 1H), 8.34 (s, 1H), 7.99 (d, J= 1.6 Hz, 1H), 7.70 (d, J= 0.8 Hz, 1H), 6.68 (t, J= 5.2 Hz, 1H), 6.12 (d, J= 0.8 Hz, 1H), 5.04 (s, 2H), 3.59 (s, 2H), 3.32-3.26 (m, 2H), 3.24 (s, 3H), 2.79-2.65 (m, 4H), 2.63-2.52 (m, 3H), 1.96-1.86 (m, 1H), 1.70-1.55 (m, 4H), 1.53-1.40 (m, 1H) 1.16 (t, J= 7.1 Hz, 3H), 1.09 (d, J= 5.9 Hz, 3H), 0.88-0.75 (m, 4H)。 合成化合物 177 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(500 mg，1.55 mmol，1當量)及Zn(CN) 2(363 mg，3.09 mmol，2當量)於DMF (5 mL)中之經攪拌溶液中添加Pd(PPh 3) 4(178 mg，0.15 mmol，0.1當量)。在145℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈棕色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-2,3-二氫異吲哚-4-甲腈(400 mg，96%)。LCMS (ESI, m/z): 270[M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 2
在-70℃下於氮氣氛圍下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-2,3-二氫異吲哚-4-甲腈(320 mg，1.19 mmol，1當量)於DCM (10 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加DIBAl-H (3.6 mL，3.6 mmol，3.07當量，1 N，於DCM中)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在-20℃下藉由添加MeOH (5 mL)淬滅反應物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-2,3-二氫異吲哚-4-甲醛(320 mg，98%)。LCMS (ESI, m/z):273[M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 177
在室溫下於空氣氛圍下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-2,3-二氫異吲哚-4-甲醛(50 mg，0.18 mmol，1當量)及3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺基]丙腈(61 mg，0.18 mmol，1當量)於二噁烷(2 mL)中之經攪拌混合物中添加Cs 2CO 3(120 mg，0.37 mmol，2當量)、Xantphos (42 mg，0.036 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(8 mg，0.018 mmol，0.1當量)。在110℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1.5小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：YMC-Actus Triart C18 ExRS，20*250 mm，5μm；移動相A：水(10 mmol/L NH 4HCO 3)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內37% B至67% B，67% B；波長：254 nm；RT1(min)：6.05；注入體積：0.6 mL)純化殘餘物；凍乾所收集之級分，得到呈淺黃色固體狀之3-{[6-(4-甲醯基-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]胺基}丙腈(6.5 mg，6%)。LCMS (ESI, m/z):569[M+H] + 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 10.22 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.05 (t, J=6.4Hz, 1H), 6.05 (s, 1H), 5.30 (s, 2H), 4.91 (d, J=6.0Hz, 2H), 4.80 (d, J= 6.0Hz, 2H), 3.64 (s, 2H), 3.55-3.52 (m, 4H), 3.24 (s, 3H), 2.84 (t, J=8.0Hz, 2H), 2.73 (t, J=8.0Hz, 2H), 1.95 (t, J=8.0Hz, 1H), 1.64-1.61 (m, 4H), 1.50-1.47 (m, 1H), 0.90-0.80 (m, 4H)。 合成化合物 178 步驟 1 ：合成化合物 1
在90℃下於氮氣氛圍下將2,6-二氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(3 g，10.09 mmol，1當量)於乙胺(2.0 M，於THF中，30 mL)中之經攪拌溶液攪拌2天。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (12:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之6-氯-N-乙基-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-胺(2.1 g，66%)。LCMS (ESI, m/z): 306,308[M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(500 mg，1.54 mmol，1當量)於DMF (5 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaSMe (162 mg，2.32 mmol，1.5當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(410 mg，91%)。LCMS (ESI, m/z):291[M+H] +步驟3. 合成化合物178-A
在室溫下於氮氣氛圍下向6-氯-N-乙基-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-胺(100 mg，0.33 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(104 mg，0.36 mmol，1.1當量)於二噁烷(2 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(213 mg，0.65 mmol，2當量)、Xantphos (38 mg，0.065 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(7 mg，0.033 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(50.4 mg，27%)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.34 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.46 (s, 2H), 6.66 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 6.09 (s, 1H), 4.87 (s, 2H), 3.55 (br s, 2H), 3.27-3.24 (m, 5H), 2.74-2.72 (m, 4H), 2.67-2.54 (m, 6H), 1.91-1.89 (m, 1H), 1.64-1.35 (m, 5H), 1.16 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.08 (d, J = 6.0Hz, 3H), 0.86 - 0.82 (m, 4H)。LCMS (ESI, m/z):560[M+H] + 步驟 4 ：合成化合物 178
在室溫下於空氣氛圍下向2-[6-(乙基胺基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(100 mg，0.18 mmol，1當量)於DCM (2 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加mCPBA (36 mg，0.18 mmol，1當量，85%)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應有60%產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內15% B至45% B，45% B；波長：220/254 nm；RT1(min)：9.65)純化粗產物(100mg)；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]-4-甲烷亞磺醯基-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-3H-異吲哚-1-酮(64.2 mg，52%)。LCMS:(ES.m/z):576[M+H-TFA] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 12.30 (br s, 1H), 8.69 (s, 1H), 7.70-7.65 (m, 3H), 6.19 (s, 1H), 4.93 (s, 4H), 3.52-3.44 (m, 3H), 3.31 (s, 3H), 3.28-3.26 (m, 2H), 2.80-2.76 (m, 2H), 2.67-2.59 (m, 4H), 2.56-2.54 (m, 3H), 2.10 (br s, 1H), 1.93-1.87 (m, 1H), 1.82-1.75 (m, 2H), 1.23(t, J=7.2Hz,, 3H), 1.15-1.08(m, 4H), 0.90-0.88(d, J=8Hz, 3H)。 合成化合物 179 步驟 1 ：合成化合物 1
在25℃下用(甲基硫烷基)鈉(488 mg，6.96 mmol，1.5當量)處理4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(1.5 g，4.64 mmol，1當量)於DMF (30 mL)中之溶液。在90℃下攪拌溶液1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含8% NH 4HCO 3及ACN之水(在50分鐘內0%至50%梯度)；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(670 mg，50%)。LCMS (ES, m/z): 291 [M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 2
在90℃下於氮氣氛圍下將2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(800 mg，2.67 mmol，1當量)於乙胺溶液(2.0 M，於THF中，10 mL)中之經攪拌溶液攪拌隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫且在真空下濃縮至乾。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(450 mg，54%)。LCMS (ES, m/z): 308,310 [M+H] +步驟3. 合成化合物179-A
在室溫下向6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(900 mg，2.92 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基環己基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(846 mg，2.92 mmol，1當量)於二噁烷(18 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(1905 mg，5.84 mmol，2當量)、Xantphos (338 mg，0.58 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(66 mg，0.29 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮；三氟乙酸(800 mg)。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：Xselect CSH C18 OBD管柱30*150mm 5μm，n；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min；梯度：在9分鐘內10% B至30% B，30% B；波長：254；220 nm；RT1(min)：8.65)純化粗產物(800 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮；三氟乙酸(600 mg，30%)。LCMS (ES, m/z): 562 [M+H] + 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 9.66 (br s, 1H), 8.61 (s, 1H), 7.75-7.68 (m, 2H), 7.37 (s, 1H), 5.96 (s, 1H), 4.90-4.88(m, 4H), 4.80-4.78 (m, 2H), 4.43-4.42 (m, 2H), 3.57 (s, 2H), 3.38-3.32 (m, 1H), 3.30-3.21 (m, 6H), 2.84-2.81 (m, 1H), 2.64-2.51 (m, 4H), 1.86-1.63 (m, 4H), 1.16-1.04 (m, 4H), 0.94-0.88 (m, 3H) 步驟 4 ：合成化合物 179
在室溫下於空氣氛圍下向2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(100 mg，0.18 mmol，1當量)於DCM (2 ml)中之經攪拌溶液中逐份添加mCPBA (61 mg，0.36 mmol，2當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在真空下將混合物濃縮至乾。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：Xselect CSH C18 OBD管柱30*150mm 5μm，n；移動相A：水(0.1%FA)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min；梯度：在8分鐘內32% B至62% B，62% B；波長：254；220 nm；RT1(min)：7.5)純化粗產物；凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-4-甲烷磺醯基-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-3H-異吲哚-1-酮；甲酸(45.0 mg，38%)。LCMS (ES, m/z): 594 [M+H-FA] + 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.27-8.25 (m, 2H), 8.16 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.40 (s, 1H), 6.61 (t, J=5.2Hz, 1H), 5.88 (s, 1H), 5.23 (s, 2H), 4.90-4.77 (m, 7H), 3.49 (s, 2H), 3.45-3.14 (m, 7H), 3.12-3.03 (m, 1H), 2.90 (s, 3H), 2.22-2.10 (m, 1H), 2.05-1.95 (m, 1H), 1.73-1.66 (m, 2H), 1.13 (t, J= 7.2Hz, 3H), 1.06-0.99 (m, 1H), 0.85 (d, J=6.4Hz, 3H) 合成化合物 180 步驟 1 ：合成化合物 1
在25℃下用(甲基硫烷基)鈉(488 mg，6.96 mmol，1.5當量)處理4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(1.5 g，4.64 mmol，1當量)於DMF (30 mL)中之溶液。在90℃下攪拌溶液1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含8% NH 4HCO 3及ACN之水(在50分鐘內0%至50%梯度)；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(670 mg，50%)。LCMS (ES, m/z): 291 [M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 2
在90℃下於氮氣氛圍下將2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(800 mg，2.67 mmol，1當量)於乙胺溶液(2.0 M，於THF中，10 mL)中之經攪拌溶液攪拌隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫且在真空下濃縮至乾。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(450 mg，54%)。LCMS (ES, m/z): 308,310 [M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 180-A
在室溫下向6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(900 mg，2.92 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基環己基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(846 mg，2.92 mmol，1當量)於二噁烷(18 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(1905 mg，5.84 mmol，2當量)、Xantphos (338 mg，0.58 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(66 mg，0.29 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮；三氟乙酸(800 mg)。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：Xselect CSH C18 OBD管柱30*150mm 5μm，n；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min；梯度：在9分鐘內10% B至30% B，30% B；波長：254；220 nm；RT1(min)：8.65)純化粗產物(800 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮；三氟乙酸(600 mg，30%)。LCMS (ES, m/z): 562 [M+H] + 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 9.66 (br s, 1H), 8.61 (s, 1H), 7.75-7.68 (m, 2H), 7.37 (s, 1H), 5.96 (s, 1H), 4.90-4.88(m, 4H), 4.80-4.78 (m, 2H), 4.43-4.42 (m, 2H), 3.57 (s, 2H), 3.38-3.32 (m, 1H), 3.30-3.21 (m, 6H), 2.84-2.81 (m, 1H), 2.64-2.51 (m, 4H), 1.86-1.63 (m, 4H), 1.16-1.04 (m, 4H), 0.94-0.88 (m, 3H) 步驟 4 ：合成化合物 180
在室溫下於空氣氛圍下向2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(50 mg，0.089 mmol，1當量)於DCM (2 ml)中之經攪拌溶液中逐份添加mCPBA (15 mg，0.089 mmol，1當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。將混合物在真空下濃縮至乾。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：Xselect CSH C18 OBD管柱30*150mm 5μm，n；移動相A：水(0.1%FA)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min；梯度：在8分鐘內32% B至62% B，62% B；波長：254；220 nm；RT1(min)：7.5)純化粗產物；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-4-甲烷亞磺醯基-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-3H-異吲哚-1-酮(18 mg，33.95%)。LCMS (ES, m/z): 578 [M+H-FA] + 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.31 (br s, 1H), 8.25(s, 1H), 7.79 (s, 1H), 7..71(s, 1H), 7.38(s, 1H), 6.61(t, J=5.2Hz, 1H), 5.87(s, 1H), 4.90-4.86(m, 4H), 4.78-4.77(m, 4H), 3.48(s, 2H), 3.35-3.28(m, 2H), 3.24-3.17(m, 6H), 3.07-3.01(m, 1H), 2.57(s, 3H), 2.22-2.18(m, 1H), 2.12-1.95(m, 1H), 1.72-1.64(m, 2H), 1.14(t, J= 7.2Hz, 3H), 1.06-0.98(m, 1H), 0.85(d, J=6.4Hz, 3H)。 合成化合物 181 步驟 1 ：合成化合物 1
在90℃下於氮氣氛圍下將2,6-二氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(3 g，10.09 mmol，1當量)於乙胺(2.0 M，於THF中，30 mL)中之經攪拌溶液攪拌2天。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (12:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之6-氯-N-乙基-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-胺(2.1 g，66%)。LCMS (ESI, m/z): 306,308[M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(500 mg，1.54 mmol，1當量)於DMF (5 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaSMe (162 mg，2.32 mmol，1.5當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(410 mg，91%)。LCMS (ESI, m/z):291[M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 181
在室溫下於氮氣氛圍下向6-氯-N-乙基-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-胺(100 mg，0.33 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(104 mg，0.36 mmol，1.1當量)於二噁烷(2 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(213 mg，0.65 mmol，2當量)、Xantphos (38 mg，0.065 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(7 mg，0.033 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(50.4 mg，27%)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.34 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.46 (s, 2H), 6.66 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 6.09 (s, 1H), 4.87 (s, 2H), 3.55 (br s, 2H), 3.27-3.24 (m, 5H), 2.74-2.72 (m, 4H), 2.67-2.54 (m, 6H), 1.91-1.89 (m, 1H), 1.64-1.35 (m, 5H), 1.16 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.08 (d, J = 6.0Hz, 3H), 0.86 - 0.82 (m, 4H)。LCMS (ESI, m/z):560[M+H] +。 合成化合物 182 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下向2,6-二氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶(235 mg，0.786 mmol，1當量)及(S)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(245 mg，0.786 mmol，1當量)於二噁烷(7 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(512 mg，1.57 mmol，2當量)及Xantphos (90.8 mg，0.157 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(17.6 mg，0.0786 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在室溫下用飽和碳酸氫鈉淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 50 ml)萃取所得混合物。在減壓下濃縮合併之有機層。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (9:1)溶離，得到呈綠色固體狀之(S)-2-(6-氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(300 mg，66.4%)。LCMS:(ES.m/z):575,577 [M+1] +。 步驟 2 ：合成化合物 182
在室溫下向(S)-2-(6-氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(50 mg，0.087mmol，1當量)及(1H-1,2,3-三唑-4-基)甲胺鹽酸鹽(35 mg，0.26 mmol，3當量)於甲苯(2 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加磷酸鉀(55 mg，0.26 mmol，3當量)、(R)-1-[(SP)-2-(二環己基膦基)二茂鐵基]乙基二-三級丁基膦(24 mg，0.044 mmol，0.5當量)及Pd 2(dba) 3(16 mg，0.017 mmol，0.2當量)。在170℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物25分鐘。使反應物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。過濾混合物且藉由逆相急驟層析用以下條件純化：管柱，C18矽膠；移動相，含乙腈之水(0.1% TFA)，在30分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之(S)-2-(6-(((1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮；三氟乙酸(20 mg，36%)。LCMS (ESI, m/z):637 [M+H-TFA] +, 319 [M/2+H-TFA] + 1H NMR (500 MHz, MeOD) δ 8.46 - 8.40 (m, 2H), 8.30 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.85 (d, J= 1.3 Hz, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.16 - 5.08 (m, 4H), 4.54 (s, 2H), 4.43 (s, 2H), 3.83 (s, 2H), 3.52 (d, J= 1.1 Hz, 3H), 3.49 (s, 1H), 3.42 (d, J= 12.1 Hz, 1H), 2.96 (t, J= 12.2 Hz, 1H), 2.70 (t, J= 12.1 Hz, 1H), 1.96 (s, 1H), 1.89 (d, J= 12.8 Hz, 2H), 1.77 (d, J= 14.2 Hz, 1H), 1.21 (q, J= 13.0 Hz, 1H), 1.00 (d, J= 6.4 Hz, 3H)。 合成化合物 183
在室溫下於氮氣氛圍下向3-((6-(6-甲醯基-1-側氧基-4-(三氟甲基)異吲哚啉-2-基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)胺基)丙腈(40 mg，0.076 mmol，1當量)及十氫異喹啉-6-醇(35 mg，0.23 mmol，3當量)於DCM (3 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TEA (21uL，0.15 mmol，2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在室溫下向上述混合物中逐份添加STAB (48 mg，0.23 mmol，3當量)。在室溫下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在℃下用MeOH淬滅反應物。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% TFA)，在30分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 280nm，254 nm。凍乾溶離物，得到呈白色固體狀之3-((6-(6-((6-羥基八氫異喹啉-2(1H)-基)甲基)-1-側氧基-4-(三氟甲基)異吲哚啉-2-基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)胺基)丙腈；三氟乙酸(48 mg，95%)。LCMS (ESI, m/z):665 [M+H-TFA] +, 333 [M/2+H-TFA] +； 1H NMR (500 MHz, MeOD) δ 8.69 (s, 1H), 8.23 (d, J= 4.4 Hz, 1H), 8.16 (s, 1H), 7.38 (d, J= 1.4 Hz, 1H), 6.00 (d, J= 1.2 Hz, 1H), 5.33 (s, 2H), 5.04 - 4.97 (m, 4H), 4.54 (d, J= 13.7 Hz, 2H), 3.73 (s, 2H), 3.68 (t, J= 6.3 Hz, 2H), 3.62 (dd, J= 13.7, 8.5 Hz, 1H), 3.32 (s, 2H), 3.19 (d, J= 13.0 Hz, 1H), 2.81 (t, J= 6.3 Hz, 2H), 2.23 - 1.86 (m, 4H), 1.84 - 1.21 (m, 8H)。 合成化合物 184
在室溫下於氮氣氛圍下向3-((6-(6-甲醯基-1-側氧基-4-(三氟甲基)異吲哚啉-2-基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)胺基)丙腈(100 mg，0.19 mmol，1當量)及2-(哌嗪-1-基)苯酚(102 mg，0.57 mmol，3當量)於DCM (3 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TEA (53uL，0.38 mmol，2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在室溫下向上述混合物中逐份添加STAB (161 mg，0.76 mmol，4當量)。在室溫下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在℃下用MeOH淬滅反應物。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% TFA)，在30分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 280nm，254 nm。凍乾溶離物，得到呈白色固體狀之3-((6-(6-((4-(2-羥基苯基)哌嗪-1-基)甲基)-1-側氧基-4-(三氟甲基)異吲哚啉-2-基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)胺基)丙腈；三氟乙酸(25 mg，19%)。LCMS (ESI, m/z):689 [M+H-TFA] +, 345 [M/2+H-TFA] +； 1H NMR (500 MHz, MeOD) δ 8.64 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.39 (d, J= 1.2 Hz, 1H), 7.05 - 6.95 (m, 2H), 6.88 - 6.80 (m, 2H), 5.99 (d, J= 1.3 Hz, 1H), 5.35 (s, 2H), 5.04 - 4.97 (m, 4H), 4.62 (s, 2H), 3.74 - 3.65 (m, 4H), 3.49 (s, 7H), 2.81 (t, J= 6.3 Hz, 2H)。 合成化合物 185
在室溫下於氮氣氛圍下向3-((6-(6-甲醯基-1-側氧基-4-(三氟甲基)異吲哚啉-2-基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)胺基)丙腈(40 mg，0.076 mmol，1當量)及1,2,3,4-四氫異喹啉-7-醇(11 mg，0.076 mmol，1當量)於DCM (3 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TEA (21uL，0.15 mmol，2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在室溫下向上述混合物中逐份添加STAB (65 mg，0.3 mmol，4當量)。在室溫下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在℃下用MeOH淬滅反應物。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% TFA)，在30分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 280nm，254 nm。凍乾溶離物，得到呈白色固體狀之3-((6-(6-((7-羥基-3,4-二氫異喹啉-2(1H)-基)甲基)-1-側氧基-4-(三氟甲基)異吲哚啉-2-基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)胺基)丙腈；三氟乙酸(19 mg，38%)。LCMS (ESI, m/z):659 [M+H-TFA] +, 330 [M/2+H-TFA] +； 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.72 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 7.39 (d, J= 1.3 Hz, 1H), 7.09 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 6.77 (dd, J= 8.4, 2.6 Hz, 1H), 6.57 (d, J= 2.5 Hz, 1H), 6.01 (d, J= 1.3 Hz, 1H), 5.36 (s, 2H), 5.05 - 4.90 (m, 4H), 4.84 - 4.76 (m, 2H), 4.71 (s, 2H), 4.37 (s, 2H), 3.74 (s, 2H), 3.69 (t, J= 6.3 Hz, 2H), 3.32 (d, J= 10.9 Hz, 6H), 3.11 (d, J= 6.7 Hz, 2H), 2.81 (t, J= 6.3 Hz, 2H), 1.18 (t, J= 7.1 Hz, 1H)。 合成化合物 186
在室溫下於氮氣氛圍下向3-((6-(6-甲醯基-1-側氧基-4-(三氟甲基)異吲哚啉-2-基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)胺基)丙腈(40 mg，0.076 mmol，1當量)及2-(哌嗪-1-基)噻唑(52 mg，0.3 mmol，4當量)於DCM (3 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TEA (21uL，0.15 mmol，2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在室溫下向上述混合物中逐份添加STAB (65 mg，0.3 mmol，4當量)。在室溫下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在℃下用MeOH淬滅反應物。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% TFA)，在30分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 280nm，254 nm。凍乾溶離物，得到呈黃色固體狀之3-((4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)-6-(1-側氧基-6-((4-(噻唑-2-基)哌嗪-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-2-基)吡啶-2-基)胺基)丙腈；三氟乙酸(30 mg，58%)。LCMS (ESI, m/z):679 [M+H-TFA] +, 340 [M/2+H-TFA] +； 1H NMR (500 MHz, MeOD) δ 8.82 (s, 1H), 8.23 (d, J= 1.5 Hz, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.36 (d, J= 1.3 Hz, 1H), 7.25 (d, J= 3.7 Hz, 1H), 6.93 (d, J= 3.8 Hz, 1H), 6.03 (d, J= 1.3 Hz, 1H), 5.33 (d, J= 1.6 Hz, 2H), 5.01 (s, 4H), 4.49 (s, 2H), 3.76 (d, J= 10.8 Hz, 6H), 3.69 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 3.36 (d, J= 4.3 Hz, 8H), 2.81 (t, J= 6.3 Hz, 2H)。 合成化合物 187
向(S)-2-(6-(乙基胺基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(2.2mg，0.0038mmol)於2 ml乙腈/水混合物(7:3)中之經攪拌混合物中逐滴添加HCl (150uL，3%)。攪拌1小時後，再逐滴添加HCl (250uL，濃)。在室溫下攪拌混合物兩小時，接著凍乾反應物且得到呈白色固體狀之2-(4-(1-氯-3-羥基-2-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)丙-2-基)-6-(乙基胺基)吡啶-2-基)-6-(((S)-3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮；鹽酸(2 mg，85%)。LCMS (ESI, m/z): 620 [M+H-HCl] +, 310 [M/2+H-HCl] + 合成化合物 188
向(S)-2-(6-(乙硫基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(2mg，0.003mmol)於2 ml乙腈/水混合物(7:3)中之經攪拌混合物中逐滴添加HCl (150uL，3%)。攪拌1小時後，再逐滴添加HCl (250uL，濃)。在室溫下攪拌混合物兩小時，接著凍乾反應物且得到呈白色固體狀之2-(4-(1-氯-3-羥基-2-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)丙-2-基)-6-(乙硫基)吡啶-2-基)-6-(((S)-3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮；鹽酸(2.1mg，99%)。LCMS (ESI, m/z): 637 [M+H-HCl] +, 319 [M/2+H-HCl] + 合成化合物 189
在室溫下於氮氣氛圍下向3-((6-(6-甲醯基-1-側氧基-4-(三氟甲基)異吲哚啉-2-基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)胺基)丙腈(40 mg，0.076 mmol，1當量)及2-氮雜螺[3.3]庚-5-醇(17 mg，0.15 mmol，2當量)於DCM (3 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TEA (21uL，0.15 mmol，2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在室溫下向上述混合物中逐份添加STAB (65 mg，0.3 mmol，4當量)。在室溫下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在℃下用MeOH淬滅反應物。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% TFA)，在30分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 280nm，254 nm。凍乾溶離物，得到呈黃色固體狀之3-((6-(6-((5-羥基-2-氮雜螺[3.3]庚-2-基)甲基)-1-側氧基-4-(三氟甲基)異吲哚啉-2-基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)胺基)丙腈；三氟乙酸(37 mg，78%)。LCMS (ESI, m/z):623 [M+H-TFA] +, 312 [M/2+H-TFA] +； 1H NMR (500 MHz, MeOD) δ 8.88 - 8.79 (m, 1H), 8.19 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.36 (dt, J= 2.6, 1.2 Hz, 1H), 6.02 (d, J= 4.0 Hz, 1H), 5.32 (s, 2H), 5.00 (s, 4H), 4.72 (s, 1H), 4.59 (d, J= 3.4 Hz, 3H), 4.44 (s, 0H), 4.15 (dt, J= 29.6, 9.3 Hz, 4H), 3.75 (d, J= 3.8 Hz, 2H), 3.68 (t, J= 6.3 Hz, 2H), 3.38 - 3.33 (m, 4H), 2.81 (t, J= 6.3 Hz, 2H), 2.17 (d, J= 9.8 Hz, 1H), 2.06 - 1.97 (m, 1H), 1.83 (q, J= 10.5 Hz, 1H), 1.67 (p, J= 10.2 Hz, 1H)。 合成化合物 190 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下向2,6-二氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶(235 mg，0.786 mmol，1當量)及(S)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(245 mg，0.786 mmol，1當量)於二噁烷(7 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(512 mg，1.57 mmol，2當量)及Xantphos (90.8 mg，0.157 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(17.6 mg，0.0786 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在室溫下用飽和碳酸氫鈉淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 50 ml)萃取所得混合物。在減壓下濃縮合併之有機層。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (9:1)溶離，得到呈綠色固體狀之(S)-2-(6-氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(300 mg，66.4%)。LCMS:(ES.m/z): 575,577 [M+1] +。 步驟 2 ：合成化合物 190
在室溫下向(S)-2-(6-氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(30 mg，0.052mmol，1當量)及3-胺基環丁烷-1-甲腈鹽酸鹽(34 mg，0.26 mmol，5當量)於二噁烷(1 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(34 mg，0.1 mmol，2當量)、Xantphos (6.0 mg，0.01 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(1.2 mg，0.005 mmol，0.1當量)。在150℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物60分鐘。使反應物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。過濾混合物且藉由逆相急驟層析用以下條件純化：管柱，C18矽膠；移動相，含乙腈之水(0.1% TFA)，在30分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之(S)-3-((4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)-6-(6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-1-側氧基-4-(三氟甲基)異吲哚啉-2-基)吡啶-2-基)胺基)環丁烷-1-甲腈；三氟乙酸(8 mg，24%)。LCMS (ESI, m/z):635 [M+H-TFA] +, 318 [M/2+H-TFA] +； 1H NMR (500 MHz, MeOD) δ 8.54 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.38 (s, 1H), 5.92 (s, 1H), 5.30 (s, 2H), 4.99 (s, 4H), 4.51 (s, 3H), 3.97 (s, 2H), 3.27 (s, 2H), 3.53 - 3.36 (m, 3H), 2.76 - 2.60 (m, 2H), 2.43 (tdd, J= 9.8, 7.6, 2.5 Hz, 2H), 2.02 - 1.70 (m, 6H), 1.25 - 1.12 (m, 2H), 1.05 (d, J= 4.1 Hz, 3H)。 合成化合物 191 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下向2,6-二氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶(235 mg，0.786 mmol，1當量)及(S)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(245 mg，0.786 mmol，1當量)於二噁烷(7 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(512 mg，1.57 mmol，2當量)及Xantphos (90.8 mg，0.157 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(17.6 mg，0.0786 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在室溫下用飽和碳酸氫鈉淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 50 ml)萃取所得混合物。在減壓下濃縮合併之有機層。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (9:1)溶離，得到呈綠色固體狀之(S)-2-(6-氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(300 mg，66.4%)。LCMS:(ES.m/z): 575,577 [M+1] +。 步驟 2 ：合成化合物 191A 及化合物 191B
在室溫下向(S)-2-(6-氯-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮(40 mg，0.07mmol，1當量)及(1s,3s)-3-疊氮基環丁-1-胺鹽酸鹽(31 mg，0.21 mmol，3當量)於二噁烷(1 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(46 mg，0.14 mmol，2當量)、Xantphos (8.1 mg，0.014 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(1.6 mg，0.007 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物90分鐘。使反應物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。過濾混合物且藉由逆相急驟層析用以下條件純化：管柱，C18矽膠；移動相，含乙腈之水(0.1% TFA)，在30分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。LCMS (ESI, m/z): 652[M+H-TFA] +, 326 [M/2+H-TFA] + 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.53 (s, 1H), 8.24 (m, 2H), 8.17 (s, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.08 (s, 1H), 5.93 (s, 1H), 5.20 (s, 2H), 4.91 (s, 1H), 4.89 (s, 3H), 4.77 (d, J= 6.1 Hz, 2H), 4.52 (s, 2H), 4.27 (s, 1H), 4.18 (d, J= 3.9 Hz, 1H), 3.50 (s, 3H), 3.28 (d, J= 8.8 Hz, 2H), 3.24 (s, 4H), 2.85 (s, 1H), 2.59 (d, J= 10.6 Hz, 2H), 2.36 (dd, J= 7.7, 4.5 Hz, 3H), 1.82 (s, 2H), 1.64 (s, 1H), 1.23 (s, 2H), 1.05 (d, J= 13.2 Hz, 2H), 0.88 (d, J= 6.4 Hz, 3H)。
接著藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在20分鐘內5% B至95% B；波長：254 nm)純化物質(7 mg)。收集兩種級分：LCMS RT (min)： 化合物191A：1.71 (0.5 mg，1.1%)；LCMS (ESI, m/z): 651[M-TFA] +, 326 [M/2+H-TFA] +化合物191B：1.73 (1.2 mg，2.6%)。LCMS (ESI, m/z): 651[M-TFA] +, 326 [M/2+H-TFA] +
凍乾所收集之級分，得到2-(6-(((1r,3S)-3-(2λ4-三氮雜-1,2-二烯-1-基)環丁基)胺基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-(((S)-3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮；三氟乙酸及2-(6-(((1r,3S)-3-(2λ4-三氮雜-1,2-二烯-1-基)環丁基)胺基)-4-(3-((4-甲基-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氧雜環丁烷-3-基)吡啶-2-基)-6-(((S)-3-甲基哌啶-1-基)甲基)-4-(三氟甲基)異吲哚啉-1-酮；三氟乙酸。 合成化合物 192 步驟 1 ：合成化合物 2
在-70℃下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-甲基吡啶(1.0 g，6.17 mmol，1.0當量)於THF (10 mL)中之經攪拌混合物中添加LiHMDS (8.02 mL，8.02 mmol，1.3當量)，在-70℃下於氮氣氛圍下攪拌反應混合物30分鐘。此後，在-70℃下於氮氣氛圍下向上述混合物中添加碳酸二甲酯(1.0 g，11.10 mmol，1.80當量)。在-70℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。藉由LCMS可偵測到約50%所需產物。在0℃下用飽和NH 4Cl (水溶液)淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (3:1)溶離，得到呈油狀之2-(2,6-二氯吡啶-4-基)乙酸甲酯(590 mg，41.27%)。LCMS (ES, m/z): 220, 222 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在0℃下於氮氣氛圍下向2-(2,6-二氯吡啶-4-基)乙酸甲酯(5.0 g，22.72 mmol，1.0當量)於DMF (50 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaH (2.73 g，68.16 mmol，3.00當量，60%)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在0℃下向上述混合物中添加1,3-二溴-2-甲基丙烷(7.36 g，34.08 mmol，1.5當量)。在10℃下再攪拌所得混合物2小時。藉由LCMS可偵測到約30%所需產物。在室溫下用1 N HCl淬滅反應物。用1 N HCl將混合物酸化至pH 6。用CH 2Cl 2(3 x 300 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，水(0.1% FA)，ACN，在30分鐘內10%至70%梯度；偵測器，UV 254 nm。用CH2Cl2 (3x300 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物，得到呈黃色油狀之1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸甲酯(1.9 g，15.86%)。LCMS: (ES, m/s): 274, 276 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 4
在室溫下向1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸甲酯(1.8 g，6.56 mmol，1.0當量)於THF (18 mL)中之經攪拌溶液中添加LiOH (0.31 g，13.13 mmol，2.0當量) (H 2O = 9.0 mL)。在室溫下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，水(0.1% FA)，ACN，在30分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。用CH 2Cl 2(3 x 300 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物，得到呈半固體狀之1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸(2.0 g，83.14%)。LCMS: (ES, m/s): 260, 262 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 5
在0℃下向1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸(2.4 g，9.22 mmol，1.0當量)於DMF (24 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加HATU (5.26 g，13.84 mmol，1.5當量)、1-胺基-3-甲基硫脲(1.16 g，11.07 mmol，1.2當量)及DIEA (2.39 g，18.45 mmol，2.0當量)。在室溫下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在室溫下用水(50 mL)淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 100 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (2:3)溶離，得到呈白色固體狀之1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基-N-[(甲基硫代胺甲醯基)胺基]環丁烷-1-甲醯胺(2.5 g，70%)。LCMS: (ES, m/s): 347, 349 [M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 6
在0℃下於氮氣氛圍下向1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基-N-[(甲基硫代胺甲醯基)胺基]環丁烷-1-甲醯胺(2.3 g，6.62 mmol，1.0當量)於THF (11 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaOH (1.0 g，25.00 mmol，3.77當量) (H 2O = 11 mL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS可偵測到約73%所需產物。用1 N HCl將混合物酸化至pH 5。用CH 2Cl 2(3 x 200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈白色固體狀之5-[1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑-3-硫醇(1.2 g，55.03%)。LCMS: (ES, m/s): 329, 331 [M+H] +。 步驟 6 ：合成化合物 7
在0℃下於氮氣氛圍下向5-[1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑-3-硫醇(1.2 g，3.64 mmol，1.0當量)於THF (12 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaNO 2(0.75 g，10.93 mmol，3.0當量) (H 2O=12 mL)及HNO 3(12 mL，1.0 mol/L)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在室溫下用水/冰淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，矽膠；移動相，水(0.05% TFA)，ACN，在30分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。用CH 2Cl 2(3 x 200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物，得到呈綠色固體狀之2,6-二氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(900 mg，74.78%)。LCMS: (ES, m/s): 297, 299 [M+H] +。 步驟 7 ：合成化合物 8
在室溫下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(140 mg，0.47 mmol，1當量)及β胺基丙腈(660 mg，9.41 mmol，19.99當量)於DMA (3 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加K 2CO 3(130 mg，0.94 mmol，2.00當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在室溫下用水淬滅反應物。用EtOAc (3 x 20 mL)萃取所得混合物。用鹽水(20 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈淺黃色固體狀之3-({6-氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}胺基)丙腈(50 mg，28.87%)。LCMS:(ms,ESI): 331, 333[M+H] +。 步驟 8 ：合成化合物 9
在室溫下於氮氣氛圍下向3-({6-氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}胺基)丙腈(50 mg，0.15 mmol，1.2當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(40 mg，0.12 mmol，1.00當量)於二噁烷(1 mL)中之經攪拌混合物中添加Cs 2CO 3(83 mg，0.25 mmol，2當量)、xantphos (14 mg，0.02 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(3 mg，0.01 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，水(0.1% FA)，ACN，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm，得到呈黃色固體狀之3-({4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基}胺基)丙腈(50 mg，64.35%)。LCMS:(ES.m/z): 607 [M+H] +。 步驟 9 ：合成化合物 192
藉由掌性HPLC用以下條件(管柱：CHIRALPAK IE-3，4.6*50mm，3μm；移動相A：(Hex:DCM = 3:1) (0.1% DEA):EtOH = 95:5；流動速率：1 mL/min；梯度：0% B至0% B；注入體積：5ul mL)分離3-({4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基}胺基)丙腈(30 mg，0.049 mmol，1當量)。將第一峰之溶離物濃縮並凍乾，得到呈白色固體狀之3-{[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基}丙腈(7.1 mg，22.58%)。LCMS:(ES.m/z): 607 [M+H] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.35 (s, 1H), 8.01 (s, 2H), 7.76 (s, 1H), 7.17 (s, 1H), 6.26 (s, 1H), 5.24 (s, 2H), 3.54-3.51 (m, 2H), 3.45-3.35 (s, 4H), 3.24 (s, 3H), 2.86-2.70 (m, 6H), 2.60-2.54 (m, 2H), 1.80-1.45 (m, 5H), 1.09 (d, J= 4.9 Hz, 3H), 0.92-0.84 (m, 4H)。 合成化合物 193 步驟 1 ：合成化合物 2
在-70℃下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-甲基吡啶(1.0 g，6.17 mmol，1.0當量)於THF (10 mL)中之經攪拌混合物中添加LiHMDS (8.02 mL，8.02 mmol，1.3當量)，在-70℃下於氮氣氛圍下攪拌反應混合物30分鐘。此後，在-70℃下於氮氣氛圍下向上述混合物中添加碳酸二甲酯(1.0 g，11.10 mmol，1.80當量)。在-70℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。藉由LCMS可偵測到約50%所需產物。在0℃下用飽和NH 4Cl (水溶液)淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (3:1)溶離，得到呈油狀之2-(2,6-二氯吡啶-4-基)乙酸甲酯(590 mg，41.27%)。LCMS (ES, m/z): 220, 222 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在0℃下於氮氣氛圍下向2-(2,6-二氯吡啶-4-基)乙酸甲酯(5.0 g，22.72 mmol，1.0當量)於DMF (50 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaH (2.73 g，68.16 mmol，3.00當量，60%)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在0℃下向上述混合物中添加1,3-二溴-2-甲基丙烷(7.36 g，34.08 mmol，1.5當量)。在10℃下再攪拌所得混合物2小時。藉由LCMS可偵測到約30%所需產物。在室溫下用水/HCl淬滅反應物。用1 N HCl將混合物酸化至pH 6。用CH 2Cl 2(3 x 300 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，水(0.1% FA)，ACN，在30分鐘內10%至70%梯度；偵測器，UV 254 nm。用CH2Cl2 (3x300 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物，得到呈黃色油狀之1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸甲酯(1.9 g，15.86%)。LCMS: (ES, m/s): 274, 276 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 4
在室溫下向1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸甲酯(1.8 g，6.56 mmol，1.0當量)於THF (18 mL)中之經攪拌溶液中添加LiOH (0.31 g，13.13 mmol，2.0當量) (H 2O = 9.0 mL)。在室溫下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，水(0.1% FA)，ACN，在30分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。用CH 2Cl 2(3 x 300 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物，得到呈半固體狀之1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸(2.0 g，83.14%)。LCMS: (ES, m/s): 260, 262 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 5
在0℃下向1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸(2.4 g，9.22 mmol，1.0當量)於DMF (24 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加HATU (5.26 g，13.84 mmol，1.5當量)、1-胺基-3-甲基硫脲(1.16 g，11.07 mmol，1.2當量)及DIEA (2.39 g，18.45 mmol，2.0當量)。在室溫下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在室溫下用水(50 mL)淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 100 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (2:3)溶離，得到呈白色固體狀之1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基-N-[(甲基硫代胺甲醯基)胺基]環丁烷-1-甲醯胺(2.5 g，70%)。LCMS: (ES, m/s): 347, 349 [M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 6
在0℃下於氮氣氛圍下向1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基-N-[(甲基硫代胺甲醯基)胺基]環丁烷-1-甲醯胺(2.3 g，6.62 mmol，1.0當量)於THF (11 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaOH (1.0 g，25.00 mmol，3.77當量) (H 2O = 11 mL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS可偵測到約73%所需產物。用1 N HCl將混合物酸化至pH 5。用CH 2Cl 2(3 x 200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈白色固體狀之5-[1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑-3-硫醇(1.2 g，55.03%)。LCMS: (ES, m/s): 329, 331 [M+H] +。 步驟 6 ：合成化合物 7
在0℃下於氮氣氛圍下向5-[1-(2,6-二氯吡啶-4-基)-3-甲基環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑-3-硫醇(1.2 g，3.64 mmol，1.0當量)於THF (12 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加NaNO 2(0.75 g，10.93 mmol，3.0當量) (H 2O=12 mL)及HNO 3(12 mL，1.0 mol/L)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在室溫下用水/冰淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，矽膠；移動相，水(0.05% TFA)，ACN，在30分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。用CH 2Cl 2(3 x 200 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物，得到呈綠色固體狀之2,6-二氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(900 mg，74.78%)。LCMS: (ES, m/s): 297, 299 [M+H] +。 步驟 7 ：合成化合物 8
在室溫下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(140 mg，0.47 mmol，1當量)及β胺基丙腈(660 mg，9.41 mmol，19.99當量)於DMA (3 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加K 2CO 3(130 mg，0.94 mmol，2.00當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在室溫下用水淬滅反應物。用EtOAc (3 x 20 mL)萃取所得混合物。用鹽水(20 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈淺黃色固體狀之3-({6-氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}胺基)丙腈(50 mg，28.87%)。LCMS:(ms,ESI): 331,333 [M+H] +。 步驟 8 ：合成化合物 9
在室溫下於氮氣氛圍下向3-({6-氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}胺基)丙腈(50 mg，0.15 mmol，1.2當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(40 mg，0.12 mmol，1.00當量)於二噁烷(1 mL)中之經攪拌混合物中添加Cs 2CO 3(83 mg，0.25 mmol，2當量)、xantphos (14 mg，0.02 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(3 mg，0.01 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，水(0.1% FA)，ACN，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm，得到呈黃色固體狀之3-({4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基}胺基)丙腈(50 mg，64.35%)。LCMS:(ES.m/z): 607 [M+H] +。 步驟 9 ：合成化合物 193
藉由掌性HPLC用以下條件(管柱：CHIRALPAK IE-3，4.6*50mm，3μm；移動相A：(Hex:DCM = 3:1) (0.1% DEA):EtOH = 95:5；流動速率：1 mL/min；梯度：0% B至0% B；注入體積：5ul mL)分離3-({4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基}胺基)丙腈(30 mg，0.049 mmol，1當量)。將第二峰之溶離物濃縮並凍乾，得到呈白色固體狀之3-{[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1s,3r)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基}丙腈(3.1 mg，10.27%)。LCMS:(ES.m/z): 607 [M+H] +。
1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.41 (s, 1H), 7.95-7.80 (m, 2H), 7.66 (s, 1H), 7.16-7.13 (m, 1H), 6.09 (s, 1H), 5.20 (s, 2H), 3.64 (s, 2H),3.52-3.49 (m, 2H), 3.28-3.24 (m, 3H), 3.10-3.05 (m, 2H), 2.84-2.81 (m, 2H), 2.75-2.69 (m, 2H), 2.38-2.30 (m, 1H), 2.20-2.12 (m, 2H), 1.95-1.90 (m, 1H), 1.67-1.58 (m, 4H), 1.52-1.43 (m, 1H), 1.11 (d, J= 6.5 Hz, 3H), 0.87-0.81 (m, 4H)。 合成化合物 194 步驟 1 ：合成化合物 2
在0℃下將NIS (115.08 g，511.52 mmol，1.1當量)逐份添加至H 2SO 4(1000 mL)中。在0℃下攪拌所得混合物40分鐘。接著將含3-溴-2-甲基苯甲酸(100 g，465.02 mmol，1當量)之H 2SO 4(1000 mL)添加至上述混合物中且維持溫度低於5℃。在25℃下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。將混合物傾倒於碎冰(3000 g)上且用乙酸乙酯(3 x 2000 mL)萃取所得溶液。經無水硫酸鈉乾燥合併之有機層。過濾後，在減壓下濃縮濾液。用乙醚濕磨殘餘物。過濾並乾燥後，獲得呈白色固體狀之產物3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸(107 g，67%)。LCMS (ESI, m/z): 339[M-H] -； 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.13 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 7.99 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 2.47 (s, 3H)。 步驟 2 ：合成化合物 3
在0℃下於氮氣氛圍下向3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸(30.00 g，88.00 mmol，1當量)於MeOH (300 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加SOCl 2(52.34 g，439.96 mmol，5當量)。在70℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。將所得混合物冷卻降至室溫且在減壓下濃縮。在0℃下用飽和NaHCO 3(水溶液)淬滅反應物。用EtOAc (3 x100 mL)萃取所得混合物。用鹽水(100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。此得到呈灰白色固體狀之3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸甲酯(29.90 g，95%)。 1H NMR (400 MHz, 氯仿-d) δ 8.03 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.02 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 2.56 (s, 3H)。 步驟 3 ：合成化合物 4
在室溫下於氮氣氛圍下向3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸甲酯(30.00 g，84.51 mmol，1當量)及NBS (18.05 g，101.42 mmol，1.2當量)於CHCl 3(300 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加AIBN (6.94 g，42.26 mmol，0.5當量)。在70℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。將所得混合物冷卻降至室溫且在減壓下濃縮。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (20:1)溶離，得到呈白色固體狀之3-溴-2-(溴甲基)-5-碘苯甲酸甲酯(30.00 g，82%)。 1H NMR (300 MHz, 氯仿-d) δ 8.20 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 5.06 (s, 2H), 1.73 (s, 3H)。 步驟 4 ：合成化合物 5
在25℃下向3-溴-2-(溴甲基)-5-碘苯甲酸甲酯(50.30 g，115.94 mmol，1當量)於NH 3(g，7N，於MeOH中，750 mL)中之溶液中逐份。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌1小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。在減壓下濃縮所得混合物。用(1:1) 800 mL PE及水洗滌所得混合物。藉由過濾收集沈澱之固體且用Et 2O (3x380 ml)洗滌，得到呈白色固體狀之4-溴-6-碘-2,3-二氫異吲哚-1-酮(31.2 g，80%)。LCMS (ESI, ms):338,340[M+H] + 步驟 5 ：合成化合物 7
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-碘-2,3-二氫異吲哚-1-酮(5 g，14.80 mmol，1.0當量)及三丁基(1-乙氧基乙烯基)錫烷(3.74 g，10.36 mmol，0.7當量)於二噁烷(100 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Pd(dppf)Cl 2(3.25 g，4.44 mmol，0.3當量)。在110℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1.5小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (12:1)溶離，得到呈棕黃色固體狀之4-溴-6-(1-乙氧基乙烯基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(2.5 g，60%)。LCMS (ES. m/z): 282,284 [M+H] +。 步驟 6 ：合成化合物 8
在0℃下於空氣氛圍下向4-溴-6-(1-乙氧基乙烯基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(2.5 g，8.86 mmol，1.0當量)於THF (50 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加HCl (20 mL)。在60℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。用EtOAc (3x100 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (12:1)溶離，得到呈棕黃色固體狀之6-乙醯基-4-溴-2,3-二氫異吲哚-1-酮(1.8 g，80%)。LCMS:(ES. m/z):254,256 [M+H] +。 步驟 7 ：合成化合物 9
在室溫下於氮氣氛圍下向6-乙醯基-4-溴-2,3-二氫異吲哚-1-酮(1.9 g，7.48 mmol，1.0當量)於CHCl 3(100 mL)中之經攪拌溶液中添加Br 2(1.2 g，7.59 mmol，1.0當量)。藉由LCMS監測反應。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS可偵測到所需產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈黃色固體狀之4-溴-6-(2-溴乙醯基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(2.0 g，80%)。LCMS (ES, m/z): 332,334 [M+H] +。 步驟 8 ：合成化合物 10
在室溫下於空氣氛圍下向4-溴-6-(2-溴乙醯基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(1.94 g，5.83 mmol，1.0當量)及(甲基硫烷基)鈉(0.41 g，5.83 mmol，1.0當量)於MeOH (20 mL)中之經攪拌溶液中。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。藉由LCMS監測反應。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之4-溴-6-[2-(甲基硫烷基)乙醯基]-2,3-二氫異吲哚-1-酮(900 mg，51%)。LCMS (ES, m/z): 300,302 [M+H] +。 步驟 9 ：合成化合物 11
在0℃下於氮氣氛圍下向4-溴-6-[2-(甲基硫烷基)乙醯基]-2,3-二氫異吲哚-1-酮(800 mg，2.67 mmol，1.0當量)於THF (8 mL)中之經攪拌溶液中添加NaBH 4(120 mg，3.17 mmol，1.2當量)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。藉由LCMS監測反應。藉由LCMS可偵測到所需產物。在0℃下用MeOH淬滅反應物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之4-溴-6-[1-羥基-2-(甲基硫烷基)乙基]-2,3-二氫異吲哚-1-酮(410 mg，51%)。LCMS (ES, m/z): 302,304 [M+H] +。
1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.78 (s, 1H), 7.80 (d, J= 1.4 Hz, 1H), 7.69 (d, J= 1.4 Hz, 1H), 5.70 (d, J= 4.8 Hz, 1H), 4.84 (s, 1H), 4.29 (s, 2H), 2.76 (d, J= 6.4 Hz, 2H) 2.04 (s, 3H)。 步驟 10 ：合成化合物 12
在0℃下於氮氣氛圍下向4-溴-6-[1-羥基-2-(甲基硫烷基)乙基]-2,3-二氫異吲哚-1-酮(390 mg，1.29 mmol，1.0當量)及TEA (273 mg，2.70 mmol，2.1當量)於DCM (1 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加MsCl (233 mg，2.0 mmol，1.6當量)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。藉由LCMS監測反應。藉由LCMS可偵測到所需產物。用EtOAc (3 x 20 mL)萃取所得混合物。用鹽水(10 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液，得到呈黃色固體狀之4-溴-6-[1-氯-2-(甲基硫烷基)乙基]-2,3-二氫異吲哚-1-酮(300 mg，72%)。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS (ES, m/z): 320,322 [M+H] +。 步驟 11 ：合成化合物 13
在0℃下於氮氣氛圍下向4-溴-6-[1-氯-2-(甲基硫烷基)乙基]-2,3-二氫異吲哚-1-酮(300 mg，0.94 mmol，1.0當量)及TEA (189 mg，1.87 mmol，2.0當量)於DCM (10 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加(3S)-3-甲基哌啶鹽酸鹽(152 mg，1.12 mmol，1.2當量)。在40℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS監測反應。藉由LCMS可偵測到所需產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟用以下條件(含5-100% ACN之水，0.05% TFA)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之4-溴-6-{1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]-2-(甲基硫烷基)乙基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(160 mg，44%)。LCMS (ES, m/z): 383,385 [M+H] +。 步驟 12 ：合成化合物 15
向4-溴-6-{1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]-2-(甲基硫烷基)乙基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(140 mg，0.37 mmol，1.0當量)及(甲基硫烷基)鈉(31 mg，0.44 mmol，1.2當量)於DMF (2 mL)中之經攪拌溶液中。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。藉由LCMS可偵測到所需產物。藉由逆相急驟用以下條件(含5-100% ACN之水，0.05% TFA)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之6-{1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]-2-(甲基硫烷基)乙基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮。LCMS (ES, m/z): 351[M+H] +。 步驟 13 ：合成化合物 194
在室溫下於氮氣氛圍下向6-{1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]-2-(甲基硫烷基)乙基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(130 mg，0.37 mmol，1.0當量)、6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(114 mg，0.37 mmol，1.0當量)、Xantphos (171 mg，0.30 mmol，0.8當量)及Cs 2CO 3(362 mg，1.11 mmol，3.0當量)於二噁烷(4 mL)中之經攪拌溶液中添加Pd(OAc) 2(33 mg，0.15 mmol，0.4當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.1% TFA)，在30分鐘內5%至100%梯度；偵測器，UV 254 nm。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：Xselect CSH Prep C18 OBD管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.1%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內10% B至40% B；波長：254nm/220nm nm；RT1(min)：9.35)純化粗產物。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]-2-(甲基硫烷基)乙基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮；三氟乙酸(16.5 mg，6%)。LCMS (ES, m/z): 622 [M+H-TFA] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 8.25 (s, 1H), 7.48 (br s, 1H), 7.38 (s, 1H), 6.58 (t, J= 5.4 Hz, 1H), 5.88 (s, 1H), 4.99 - 4.83 (m, 4H), 4.78 (d, J= 6.2Hz, 2H), 4.0-3.75 (m, 3H), 3.48 (s, 2H), 3.28 - 3.17 (m, 5H), 3.15-3.05 (m, 2H), 2.9-2.76 (m, 2H), 2.61 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.80-1.40 (m, 5H), 1.14 (t, J= 7.2 Hz, 3H), 0.80-0.78 (m, 4H)。 合成化合物 195 步驟 1 ：合成化合物 3
用1-甲基環丁-1-胺鹽酸鹽(2.28 g，18.75 mmol，1.5當量)及TEA (3.79 g，37.50 mmol，3.0當量)處理7-溴-3-側氧基-1,2-二氫異吲哚-5-甲醛(3 g，12.50 mmol，1.0當量)於DCM (30 mL)中之溶液。在室溫下攪拌反應混合物30分鐘。向上述混合物中逐份添加STAB (7.95 g，37.50 mmol，3.0當量)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS可偵測到所需產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈白色固體狀之4-溴-6-{[(1-甲基環丁基)胺基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(3.6 g，74%)。LCMS (ES, m/z): 309,311 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 4
用NaHCO 3(飽和水溶液)將4-溴-6-{[(1-甲基環丁基)胺基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(3.60 g，11.64 mmol，1.0當量)於THF (36 mL)中之溶液鹼化至pH=9且用二碳酸二-三級丁酯(3.05 g，13.97 mmol，1.2當量)處理混合物。在室溫下攪拌所得混合物16小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈白色固體狀之N-[(7-溴-3-側氧基-1,2-二氫異吲哚-5-基)甲基]-N-(1-甲基環丁基)胺基甲酸三級丁酯(2.70 g，49%)。LCMS (ES, m/z): 409,411 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 5
用NaSMe (0.68 g，9.77 mmol，2.0當量)處理N-[(7-溴-3-側氧基-1,2-二氫異吲哚-5-基)甲基]-N-(1-甲基環丁基)胺基甲酸三級丁酯(2.0 g，4.89 mmol，1.0當量)於DMF (10 mL)中之溶液。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。使反應混合物冷卻降至室溫且在室溫下用水淬滅。用EtOAc (3 x 10 mL)萃取所得混合物。用水(10 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之N-(1-甲基環丁基)-N-{[7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1,2-二氫異吲哚-5-基]甲基}胺基甲酸三級丁酯(1.90 g，87%)。LCMS (ES, m/z): 377 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 7
在氮氣氛圍下用6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(327 mg，1.06 mmol，1.0當量)、Pd(OAc) 2(48 mg，0.21 mmol，0.2當量)、[5-(二苯基磷烷基)-9,9-二甲基-9H-二苯并哌喃-4-基]二苯基磷烷(246 mg，0.43 mmol，0.4當量)及Cs 2CO 3(692 mg，2.12 mmol，2.0當量)處理N-(1-甲基環丁基)-N-{[7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1,2-二氫異吲哚-5-基]甲基}胺基甲酸三級丁酯(400 mg，1.06 mmol，1.0當量)於二噁烷(5 mL)中之溶液。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1.5小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。使反應混合物冷卻降至室溫且在真空下濃縮至乾。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之N-({2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基}甲基)-N-(1-甲基環丁基)胺基甲酸三級丁酯(190 mg，22%)。LCMS (ES, m/z): 648 [M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 195
用TFA (1 mL)處理N-({2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基}甲基)-N-(1-甲基環丁基)胺基甲酸三級丁酯(90 mg，0.14 mmol，1.0當量)於DCM (3 mL)中之溶液。在室溫下攪拌所得混合物1小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。將反應混合物在真空下濃縮至乾。對殘餘物進行製備型HPLC純化(管柱：Xselect CSH Prep C 18管柱，30*150 mm，5 μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min mL/min；梯度：在10分鐘內10% B至40% B；波長：254nm/220nm nm；RT1(min)：8.68)且凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(1-甲基環丁基)胺基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮；三氟乙酸(25.50 mg，27%)。LCMS (ESI, m/z): 548 [M+H] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.30-8.88 (m, 3H), 7.74 (s, 2H), 7.36 (s, 1H), 6.00 (m, 1H), 4.94-4.77 (m, 6H), 4.27-4.21 (m, 2H), 3.66 (s, 2H), 3.41 (s, 3H), 3.27-3.22 (m, 2H), 2.63 (s, 3H), 2.47-2.43 (m, 2H), 1.96-1.86 (m, 4H), 1.57 (s, 3H), 1.14 (t, J=7.2Hz, 3H)。 合成化合物 196 步驟 1 ：合成化合物 3
用β-胺基丙腈(2.36 g，33.64 mmol，20.0當量)及K 2CO 3(465 mg，3.36 mmol，2.0當量)處理2,6-二氯-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(500 mg，1.68 mmol，1.0當量)於DMA (10 mL)中之溶液。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物16小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。使反應混合物冷卻降至室溫且藉由逆相急驟層析用以下條件純化：管柱，C 18，40 g，20-35 um；移動相，含0.08% NH 4HCO 3及ACN之水(在50分鐘內0%至50%梯度)；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈灰白色固體狀之3-({6-氯-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}胺基)丙腈(310 mg，48%)。LCMS (ESI, m/z): 331,333 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 5
用N-(1-甲基環丁基)-N-{[7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1,2-二氫異吲哚-5-基]甲基}胺基甲酸三級丁酯(341 mg，0.91 mmol，1.5當量)、Pd(OAc) 2(54 mg，0.24 mmol，0.4當量)、[5-(二苯基磷烷基)-9,9-二甲基-9H-二苯并哌喃-4-基]二苯基磷烷(140 mg，0.24 mmol，0.4當量)及Cs 2CO 3(1.58 g，4.84 mmol，8.0當量)處理3-({6-氯-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}胺基)丙腈(200 mg，0.61 mmol，1.0當量)於二噁烷(12 mL)中之溶液。在100℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1.5小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (20:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之N-[(2-{6-[(2-氰基乙基)胺基]-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基)甲基]-N-(1-甲基環丁基)胺基甲酸三級丁酯(120 mg，26%)。LCMS (ESI, m/z): 671 [M+H] +。 步驟 3. 合成化合物 196
用TFA (1 mL)處理N-[(2-{6-[(2-氰基乙基)胺基]-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基)甲基]-N-(1-甲基環丁基)胺基甲酸三級丁酯(40 mg，0.060 mmol，1.0當量)於DCM (3 mL)中之溶液。在室溫下攪拌所得混合物1小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。在室溫下攪拌所得混合物1小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。對殘餘物進行製備型HPLC純化(管柱：XBridge Prep OBD C 18管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min mL/min；梯度：在10分鐘內7% B至47% B；波長：254nm/220nm nm；RT1(min)：9.77)且凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之3-{[6-(6-{[(1-甲基環丁基)胺基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基}丙腈；三氟乙酸(20.40 mg，49%)。LCMS (ESI, m/z): 571 [M+H-TFA] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.20 (br s, 1H), 8.60 (s, 1H), 7.74 (d, J= 2.8 Hz, 3H), 7.34-6.99 (m, 1H), 6.30 (s, 1H), 4.97 (s, 2H), 4.22-4.20 (m, 2H), 3.56 (d, J= 5.6 Hz, 2H), 3.30 (s, 3H), 2.86 (t, J=7.6Hz, 2H), 2.79-2.77 (m, 2H), 2.64 (s, 3H), 2.57-2.53 (m, 3H), 2.47-2.40 (m, 2H), 1.92-1.84 (m, 4H), 1.57 (s, 3H), 1.10 (d, J= 4.8 Hz, 3H)。 合成化合物 197 步驟 1. 合成化合物 2
在0℃下於空氣氛圍下向2-(3-溴苯基)乙酸甲酯(100 g，436.54 mmol，1當量)於DMF (1 L)中之經攪拌溶液中逐份添加NaH (26.19 g，1091.35 mmol，1.5當量，60%)。在0℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在0℃下向上述混合物中逐份添加1,3-二溴-2-甲基丙烷(103.68 g，480.19 mmol，1.1當量)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在0℃下藉由添加飽和NH 4Cl (水溶液) (1000 mL)淬滅反應物。用EtOAc (3 x 700 mL)萃取所得混合物。用鹽水(3x200 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (5:1)溶離，得到呈黃色油狀之1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸甲酯(100 g，81%)。LCMS:(ES.m/z): 283,284 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在0℃下向1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸甲酯(100 g，353.15 mmol，1當量)於THF (100 mL)中之經攪拌溶液中添加含LiOH (25.37 g，1059.45 mmol，3當量)之H 2O (1000 mL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物。用濃HCl將混合物酸化至pH 6。用EtOAc (3 x 200mL)萃取所得混合物。用鹽水(3x100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。此得到呈黃色固體狀之1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸(30 g，32%)。LCMS (ESI, m/z):267,269[M-H] -。 步驟 3 ：合成化合物 4
在室溫下向1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸(16.5 g，61.31 mmol，1當量)及1-胺基-3-甲基硫脲(7.74 g，73.57 mmol，1.2當量)於DMF (170 mL)中之經攪拌溶液中添加HATU (34.97 g，91.96 mmol，1.5當量)及DIEA (15.85 g，122.61 mmol，2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。反應混合物未經任何處理即用於下一步驟。LCMS:(ES.m/z):356,358 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 5
在室溫下向上述混合物中添加NaOH (170 mL)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。用1N HCl將混合物酸化至pH 6。用EtOAc (3 x100 mL)萃取所得混合物。用鹽水(5x100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色油狀之5-[1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑-3-硫醇(4.1 g，20%)。LCMS:(ES.m/z): 338,340[M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 6
在0℃下於氮氣氛圍下向5-[1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑-3-硫醇(22 g，65.03 mmol，1.00當量)於THF (22.02 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加NaNO 2(22.44 g，325.18 mmol，5當量)。在0℃下於氮氣氛圍下向混合物中逐滴添加HNO 3(325.18 mL，325.18 mmol，5當量，1N)。LCMS指示反應完成。用飽和NaHCO 3(水溶液)將混合物鹼化至pH 8。用EtOAc (3 x 200 mL)萃取所得混合物。用水(4x80 mL)洗滌合併之有機層。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之3-[1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑(10 g，50%)。LCMS:(ES.m/z): 306,308 [M+H] +。 步驟 6 ：合成化合物 7
藉由製備型SFC用以下條件(管柱：CHIRALPAK ID 2*25 cm，5um；移動相A：CO2，移動相B：IPA (1%-2M-NH3-MeOH)；流動速率：55 mL/min；梯度：等度20% B；管柱溫度(℃)：35；背壓(bar)：100；波長：220 nm；RT1(min)：12.13；RT2(min)：13.8；樣品溶劑：MEOH；注入體積：0.8 mL)分離產物(10 g)。濃縮第二級分(RT13.8min)，得到呈灰白色固體狀之4-甲基-3-[(1r,3s)-1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁基]-1,2,4-三唑(6 g，60%)。 1H NMR (300 MHz, 氯仿-d) δ 8.00 (s, 1H),7.53 (s, 1H), 7.40-7.37(s, 1H),7.24-7.21(m, 2H), 3.19 (s,3H), 2.82-2.78(m, 2H), 2.67-2.63(m, 3H), 1.22-1.12 (m, 3H)。 步驟 7 ：合成化合物 9
在室溫下於氮氣氛圍下將NIS (57.54 g，255.76 mmol，1.1當量)於H 2SO 4(200 mL)中之經攪拌溶液攪拌40分鐘。在0℃下向上述混合物中逐滴添加含3-溴-2-甲基苯甲酸(50 g，232.51 mmol，1當量)之H 2SO 4(200 mL)且攪拌3小時。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示完全反應。LCMS指示完全反應。在0℃下將反應物傾倒至水/冰中。藉由過濾收集沈澱之固體且用Et 2O (3x20 mL)洗滌。藉由用DCM (100 mL)濕磨純化殘餘物。藉由過濾收集沈澱之固體且用DCM (3x50 mL)洗滌。在紅外下乾燥固體，得到呈灰白色固體狀之3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸(54.2 g，68%)。LCMS (ESI, ms):339,341[M-H] -。 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.13 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 2.47 (s, 3H)。 步驟 8 ：合成化合物 10
在0℃下於氮氣氛圍下向3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸(30 g，87.99 mmol，1當量)於MeOH (300 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加SOCl 2(52.34 g，439.96 mmol，5當量)。在70℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。在0℃下用飽和NaHCO 3(水溶液)淬滅反應物。用EtOAc (3 x 100 mL)萃取所得混合物。用鹽水(100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。此得到呈灰白色固體狀之3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸甲酯(29.9 g，96%)。無MS信號。 1H NMR (400 MHz, 氯仿-d) δ 8.03 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.02 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 2.56 (s, 3H)。 步驟 9 ：合成化合物 11
在70℃下於氮氣氛圍下向3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸甲酯(15 g，42.25 mmol，1當量)及NBS (9.03 g，50.70 mmol，1.2當量)於ACN (150 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加AIBN (3.47 g，21.12 mmol，0.5當量)。LCMS及TLC顯示反應完成。無MS信號。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (6:1)溶離，得到呈白色固體狀之3-溴-2-(溴甲基)-5-碘苯甲酸甲酯(16.5 g，90%)。 1H NMR (300 MHz, 氯仿-d) δ 8.20 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 5.06 (s, 2H), 1.73 (s, 3H)。 步驟 10 ：合成化合物 12
在25℃下將3-溴-2-(溴甲基)-5-碘苯甲酸甲酯(51.5 g，118.70 mmol，1當量)及NH 3(7N，於MeOH中，500 mL)之混合物攪拌2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。殘餘物未經進一步純化即用於下一步驟。LCMS (ESI, ms): 338,340 [M+H] +。 步驟 11 ：合成化合物 13
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-碘-2,3-二氫異吲哚-1-酮(48 g，142.03 mmol，1當量)及乙烯基三氟硼酸鉀(15.22 g，113.62 mmol，0.8當量)於1,4-二噁烷(500 mL)及H 2O (100 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(92.56 g，284.07 mmol，2當量)及Pd(dppf)Cl 2(10.39 g，14.20 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (12:1)溶離，得到呈棕色固體狀之4-溴-6-乙烯基-2,3-二氫異吲哚-1-酮(11 g，32%)。LCMS (ESI, ms):238,240[M+H] +。 步驟 12 ：合成化合物 14
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-乙烯基-2,3-二氫異吲哚-1-酮(20 g，84.00 mmol，1當量)及NMO (29.52 g，252.00 mmol，3.00當量)於THF (200 mL)及水(100 mL)中之經攪拌溶液中添加K 2OsO 4.2H 2O (0.15 g，0.42 mmol，0.05當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除THF。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.1% TFA及ACN之水(在50分鐘內0%至100%梯度)；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈棕色固體狀之4-溴-6-(1,2-二羥基乙基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(6.7 g，29%)。LCMS (ESI, ms): 272,274 [M+H] +。 步驟 13 ：合成化合物 15
在室溫下於空氣氛圍下向4-溴-6-(1,2-二羥基乙基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(5 g，18.37 mmol，1當量)於DCM (50 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加咪唑(2.50 g，36.75 mmol，2當量)及TBDPSCl (5.05 g，18.37 mmol，1當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈白色固體狀之4-溴-6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-羥乙基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(3.6 g，38%)。LCMS:(ES.m/z): 510,512[M+H] +。 步驟 14 ：合成化合物 16
在室溫下於空氣氛圍下向4-溴-6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-羥乙基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(3.5 g，6.85 mmol，1當量)於DCM (70 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加MsCl (0.94 g，8.22 mmol，1.2當量)及TEA (2.08 g，20.56 mmol，3當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。所得混合物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS:(ES.m/z):588,590[M+H] +。 步驟 15 ：合成化合物 17
在室溫下於空氣氛圍下向甲烷磺酸1-(7-溴-3-側氧基-1,2-二氫異吲哚-5-基)-2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]乙酯(3.5 g，5.94 mmol，1當量)及(3S)-3-甲基哌啶(0.71 g，7.13 mmol，1.2當量)於DMF (40 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加K 2CO 3(2.05 g，14.86 mmol，2.5當量)。在50℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在0℃下藉由添加水/冰(200 mL)淬滅反應物。用EtOAc (3 x 100mL)萃取所得混合物。用鹽水(3x5 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈黃色固體狀之4-溴-6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(2.8 g，79%)。LCMS: (ES.m/z):591,593[M+H] +。 步驟 16 ：合成化合物 18
在室溫下於空氣氛圍下向4-溴-6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(2 g，3.38 mmol，1當量)於DMF (20 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加(甲基硫烷基)鈉(0.36 g，5.07 mmol，1.5當量)。在100℃下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色油狀之6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(600 mg，32%)。LCMS:(ES.m/z):559[M+H] +。 步驟 17 ：合成化合物 20
在室溫下於氮氣氛圍下向6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(200 mg，0.35 mmol，1當量)於二噁烷(4 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(132 mg，0.43 mmol，1.2當量)、Cs 2CO 3(233 mg，0.71 mmol，2當量)及Xantphos (41 mg，0.07 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(8 mg，0.03 mmol，0.1當量)。在110℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1.5小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應有約40%產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (6:1)溶離，得到呈黃色固體狀之6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(70 mg，27%)。LCMS (ESI, m/z): 830 [M+H] +。 步驟 18 ：合成化合物 197
在0℃下向6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(60 mg，0.07 mmol，1當量)於THF (1 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加氫氟化吡啶(36 mg，0.36 mmol，5當量)。在室溫下攪拌所得混合物1.5小時。LCMS指示反應完成。將反應混合物在真空下濃縮至乾。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：Xselect CSH Prep C18 C18管柱，30*150 mm，5μm；移動相A：水(0.1%FA)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min mL/min；梯度：在10分鐘內3% B至33% B；波長：254nm/220nm nm；RT1(min)：8.68)純化殘餘物。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{2-羥基-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(14.5 mg，34%)。LCMS (ESI, m/z): 592 [M+H] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.24 (s, 1H), 7.47 (s, 2H), 7.38 (s, 1H), 6.58-6.55 (t, J= 6Hz, 1H), 5.87 (s, 1H), 4.90 (d, J= 4Hz, 2H), 4.85 (s, 2H), 4.78-4.76 (m, 2H), 3.84-3.73 (m, 2H), 3.62-3.59 (m, 1H), 3.48 (s, 2H), 3.25-3.19 (m, 6H), 2.97-2.90 (m, 1H), 2.70-2.68 (m, 1H), 2.59 (s, 3H), 2.02-1.83 (m, 1H), 1.74-1.45 (m, 5H), 1.15 (t, J= 6Hz, 3H), 0.83-0.74 (m, 4H)。 實例2： 實例 1 化合物對 Cbl-b 蛋白質之結合親和力
藉由化合物與包含接合至Cbl-b抑制劑之BODIPY-FL螢光團之探針競爭且置換該探針之能力來評估該等化合物與Cbl-b之結合活性(參見WO2020264398中之實例54)。在檢定中，在含鏈黴親和素-鋱(Cisbio)之20 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、0.01% Triton X-100、0.1% BSA、0.5 mM TCEP緩衝液中培育具有N端Avi標籤之Cbl-b之36-427 aa截短形式。在室溫下培育一小時後，將1 uM螢光探針及化合物中之每一者與反應混合物組合。具有Cbl-b結合活性之化合物競爭性地置換螢光團標記之抑制劑，從而中斷來自鋱-BODIPY-FL複合物之FRET信號。在室溫下再培育反應混合物一小時以允許抑制劑與候選化合物之間發生競爭。接著在520/620 nM (激發/發射)下使用Spectramax M5e板讀取器(Molecular Devices)讀取時間分辨FRET (TR-FRET)信號以量測探針置換。具有Cbl-b結合活性之化合物由於鋱-BODIPY-FL FRET複合物之中斷已減少FRET信號。PRISM中之標準方法用於自實驗數據計算化合物IC50值。將化合物按IC50分類為如下範圍「A」至「D」：「A」指示1 nM - 5 nM之範圍；「B」指示5.01 nM - 20 nM之範圍；「C」指示20.01 nM - 100 nM之範圍；且「D」指示100.01 nM - 1 µM之範圍。 實例3： Cbl-b 抑制劑對 T 細胞之活化
自市售冷凍外周血單核細胞(HemaCare Corporation)或自新鮮LeukoPaks (Research Blood Components)分離人類初級T細胞。經由使用陰性選擇套組根據製造商之方案(Miltenyi Biotec，人類泛T細胞分離套組，130-096-535)使非T細胞耗竭來分離T細胞。在37℃與5% CO 2下培養經分離之細胞隔夜且以每孔1x10 5個細胞於XVivo-15無血清培養基(Lonza, 04-418Q)中鋪於塗佈有抗CD3 (OKT3)抗體(ThermoFisher, 16-0037-85)之96孔板中。為塗佈板以用於捕獲T細胞，在PBS中以10 µg/mL稀釋抗CD3抗體且將100 µl添加至各孔中。將板在4℃下培育隔夜或在37℃下培育2小時且在使用前用PBS洗滌一次。將各化合物之連續稀釋液一式兩份添加至T細胞中以評估其對T細胞活化之作用。用5µg/mL CD28抗體(ThermoFisher, 16-0289-85)處理之T細胞或僅由CD3刺激之T細胞用作對照。在37℃與5% CO 2下將板與Cbl-b抑制劑一起培育48小時，且隨後分析上清液之活化誘導之分泌細胞介素IL-2或IFN-y的水準(BD Biosciences CBA Flex Beads, 558269, 558270)。另外用標記T細胞活化相關膜蛋白之抗CD69抗體(Invitrogen, 12-0699-42)對T細胞進行染色且藉由流式細胞術(ThermoFisher Attune NxT)量測表面表現。
為控制對於使用初級人類供體源性細胞所固有之T細胞反應的天然供體間變異性，將各測試化合物之分泌IL-2及IFN-y量測值報告為化合物處理水準相對於背景(僅抗CD3/CD28處理)之倍數增加，針對化合物141A所獲得之值進行正規化。將化合物處理誘導之CD69水準變化之結果類似地報告為歸因於化合物處理相對於僅抗CD3刺激之背景的倍數增加，針對化合物141A所獲得之值進行正規化。
將正規化T細胞IL-2反應分類為如下範圍：相對於背景之倍數值介於1.41與1.8之間：範圍「X」，介於0.80與1.40之間：範圍「A」，值介於0.31與0.79之間：範圍「B」，值介於0.10與0.30之間：範圍「C」，值介於0.01與0.09之間：範圍「D」。
將正規化T細胞IFN-y反應分類為如下範圍：相對於背景之倍數介於1.10與2.00之間：範圍「A」，值介於0.31與1.00之間：範圍「B」，值介於0.10與0.30之間：範圍「C」，及值介於0.01與0.09之間：範圍「D」。
類似地，將正規化CD69水準之數組分類為如下範圍：相對於背景之倍數值介於1.11與1.6之間：範圍「X」；值介於0.81與1.10之間：範圍「A」；值介於0.61與0.80之間：範圍「B」；值介於0.30與0.60之間：範圍「C」。 實例4： 代表性 Cbl-b 抑制劑與 Cbl-b 蛋白質之共結晶 步驟 1 ：產生 Cbl-b 蛋白質
如先前所述(參見Dou, H.等人, Nature Structural & Molecular Biology, 20 (8), 982-986)，以GST融合蛋白形式產生Cbl-b (對應於人類Cbl-b基因之第36-429個胺基酸，Uniprot Q13191)蛋白質。簡言之，在大腸桿菌BL21(DE3)中表現Cbl-b蛋白質，接著藉由麩胱甘肽-瓊脂糖親和層析進行純化。藉由TEV蛋白酶消化使GST標籤自Cbl-b裂解，且藉由S-瓊脂糖陽離子交換層析及尺寸排阻層析使用superdex S-200進一步純化。在儲存緩衝液(50 mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM DTT、10%甘油，pH 8.0)中以5mg/ml濃縮蛋白質。 步驟 2 ： X 射線共結晶及數據收集
將經純化之Cbl-b (5.3 mg/ml，116µM)與5倍莫耳過量之Cbl-b抑制劑混合，且藉由懸滴擴散法在含有0.1M Hepes (pH 7.0)或Tris (pH 8.0)、10-13% (w/v) PEG 3350之結晶緩衝液中進行結晶。在補充有25% (w/v)甘油作為冷凍保護劑之結晶緩衝液存在下由液氮急驟冷凍晶體。在11C光束線浦項加速器實驗室(Pohang Accelarator Laboratory)收集X射線繞射數據。用XDS (參見Kabsch, W. XDS. Acta Cryst.D66, 125-132 (2010))處理數據且藉由分子置換使用c-Cbl (PDB:2Y1M) (參見Dou, H.等人; Nature Structural & Molecular Biology, 19(2), 184-192.doi: 10.1038/nsmb.2231 (2012))作為搜索模型來解析結構。藉由Phenix (Liebschner, D.等人, Acta Crystallographica Section D: Structural Biology, 75(10), 861-877 (2019))進行分子置換及細化。 步驟 3 ：計算 Cbl-b 抑制劑與 Cbl-b 蛋白質之間的配位體 - 蛋白質相互作用分析
Cbl-b(36-427)與化合物146、化合物147、化合物148、化合物107、化合物118及化合物122之複合物結構的比較揭露配位體與Cbl-b之間的關鍵胺基酸相互作用。在所有化學品之間存在若干保守相互作用，諸如配位體之三唑環與Tyr363之間的π-π堆积相互作用、異吲哚啉環中之羰基與Phe263主鏈之相互作用及哌啶環中之質子化氮與Glu268之相互作用。
為確認此等配位體-蛋白質相互作用之維持，使用脫水蛋白質-配位體複合物進行10ns分子動力學(MD)模擬，且在模擬期間維持此等相互作用。
在自中心吡啶環具有更長取代基延伸之化合物118及化合物122之情況下，晶體結構中末端氮與His152之間的距離在2.9-3.0埃之範圍內，而化合物147之末端碳與His152之間的距離為6.5埃。在化合物118及化合物122中之10ns MD模擬期間配位體:His152距離維持於3-4埃之間。
藉由FEP+ (Schrodinger)[6]計算化合物147與化合物118之間的相對自由能差異。與化合物147相比，化合物118中疊氮基之添加使自由能減小1.3 kcal/mol，從而指示額外水分子之置換及與His152之相互作用可促成化合物118對Cbl-b之結合親和力增加。
圖1為展示Cbl-b與化合物118之間及Cbl-b與化合物147之間的蛋白質-配位體相互作用分數之直方圖。示出在整個MD軌跡中與配位體接觸之所有殘基且由量值及相互作用類型標示。將化合物118與化合物147 (技術化合物)進行比較。在MD模擬期間化合物118與Cbl-b之HIS152殘基相互作用比技術化合物化合物147更長。 實例5： 用於製備接合物前驅物之程序 合成化合物 200 步驟 1 ：合成化合物 3
在0℃下向(3S)-3-羥基吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(化合物1，0.79 g，3.57 mmol，1.00當量)於DMF (0.5 mL)中之溶液中添加NaH (0.17 g，60%，4.28 mmol，1.2當量)。在室溫下攪拌所得混合物0.5小時。接著在0℃下添加 N-(6-溴己基)胺基甲酸三級丁酯(化合物2，1 g，3.57 mmol，1.00當量)。在室溫下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。用飽和NH 4Cl水溶液(50 mL)淬滅反應物。用EA (25 mL x 3)萃取所得混合物。用鹽水(25 mL)洗滌合併之有機層，經無水硫酸鈉乾燥且在真空下濃縮至乾。藉由逆相管柱層析純化殘餘物，用(PE:EtOAc = 1:2)溶離，得到呈黃色油狀之(3S)-3-({6-[(三級丁氧基羰基)胺基]己基}氧基)吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(化合物3，650 mg，36%)。LCMS (ES, m/z): 421 [M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 4
在N 2下向(3S)-3-({6-[(三級丁氧基羰基)胺基]己基}氧基)吡咯啶-1-甲酸苯甲酯(550 mg，1.31 mmol，1.00當量)於EtOAc (27 mL)中之溶液中添加Pd/C (139 mg，10%)。接著在室溫下於H 2下攪拌反應混合物3小時。LCMS指示反應完成。過濾反應物且將濾液在真空下濃縮至乾，得到呈黃色油狀之N-{6-[(3S)-吡咯啶-3-基氧基]己基}胺基甲酸三級丁酯(345 mg，78%)。LCMS (ES, m/z): 287 [M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 6
在室溫下將N-{6-[(3S)-吡咯啶-3-基氧基]己基}胺基甲酸三級丁酯(化合物4，380 mg，1.33 mmol，1.00當量)及6-環丙基-4-甲醯基吡啶-2-甲酸甲酯(化合物5，如WO2019048005中所述製備，272 mg，1.33 mmol，1.00當量)於DCM (19 mL)中之溶液攪拌2小時，接著在室溫下添加STAB (562 mg，2.65 mmol，2.00當量)。在室溫下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。用甲醇淬滅反應物，在真空下濃縮至乾。藉由製備型TLC (DCM:EtOAc=1:1)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之4-{[(3S)-3-({6-[(三級丁氧基羰基)胺基]己基}氧基)吡咯啶-1-基]甲基}-6-環丙基吡啶-2-甲酸甲酯(化合物6，370 mg，55%)。LCMS (ES, m/z): 476 [M+H] + 步驟 4 ：合成化合物 7
在室溫下向4-{[(3S)-3-({6-[(三級丁氧基羰基)胺基]己基}氧基)吡咯啶-1-基]甲基}-6-環丙基吡啶-2-甲酸甲酯(化合物6，370 mg，0.78 mmol，1.00當量)於THF (5 mL)/水(1 mL)中之溶液中添加LiOH.H 2O (49 mg，1.17 mmol，1.5當量)。在室溫下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。用1N HCl將所得混合物酸化至3-4之pH值。在真空下移除溶劑。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1%FA)，在30分鐘內0%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。將所收集之級分濃縮至乾，得到呈黃色固體狀之4-{[(3S)-3-({6-[(三級丁氧基羰基)胺基]己基}氧基)吡咯啶-1-基]甲基}-6-環丙基吡啶-2-甲酸(化合物7，320 mg，74%)。LCMS (ES, m/z): 462 [M+H] + 步驟 5 ：合成化合物 9
在室溫下將4-{[(3S)-3-({6-[(三級丁氧基羰基)胺基]己基}氧基)吡咯啶-1-基]甲基}-6-環丙基吡啶-2-甲酸(化合物7，310 mg，0.67 mmol，1.00當量)及HATU (383 mg，1.01 mmol，1.5當量)於DMF (16 mL)中之溶液攪拌0.5小時。接著在室溫下添加3-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}苯胺(化合物8，如WO20201021761中所述製備，197 mg，0.81 mmol，1.20當量)及DIEA (260 mg，2.02 mmol，3.00當量)。在室溫下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。用水(150 mL)稀釋所得混合物，用EtOAc (50 mL*3)萃取，用鹽水(50 mL)洗滌合併之有機層，經無水硫酸鈉乾燥且在真空下濃縮至乾。藉由製備型TLC (DCM:MeOH = 10:1)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之N-(6-{[(3S)-1-({2-環丙基-6-[(3-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}苯基)胺甲醯基]吡啶-4-基}甲基)吡咯啶-3-基]氧基}己基)胺基甲酸三級丁酯(化合物9，280 mg，54%)。LCMS (ES, m/z): 688 [M+H] + 步驟 6 ：合成化合物 10
在室溫下向 N-(6-{[(3S)-1-({2-環丙基-6-[(3-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}苯基)胺甲醯基]吡啶-4-基}甲基)吡咯啶-3-基]氧基}己基)胺基甲酸三級丁酯(化合物9，270 mg，0.39 mmol，1.00當量)於DCM (10 mL)中之溶液中添加TFA (1 mL)。在室溫下攪拌所得混合物5小時。LCMS指示反應完成。將所得混合物添加至NaHCO 3水溶液(100 mL)中。分離出有機層。用DCM (30 mL*2)萃取水相。用水(30 mL)、鹽水(30 mL)洗滌合併之有機層，經無水硫酸鈉乾燥，得到呈黃色固體狀之4-{[(3S)-3-[(6-胺基己基)氧基]吡咯啶-1-基]甲基}-6-環丙基-N-(3-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}苯基)吡啶-2-甲醯胺(210 mg，85%)。LCMS (ES, m/z): 588 [M+H] + 步驟 7 ：合成化合物 200
在室溫下將4-{[(3S)-3-[(6-胺基己基)氧基]吡咯啶-1-基]甲基}-6-環丙基-N-(3-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}苯基)吡啶-2-甲醯胺(化合物10，100 mg，0.17 mmol，1.00當量)、3-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)丙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(化合物11，45 mg，0.17 mmol，1.00當量)及DIEA (44 mg，0.34 mmol，2.00當量)於DMF (0.5 mL)中之溶液攪拌1小時。LCMS指示反應完成。過濾後，藉由逆相急驟層析用以下條件純化濾液：XBridge Shield RP18 OBD管柱，19 x 150 mm，5μm；移動相A：水(0.05%FA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內13% B至43% B，43% B；波長：254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之(37.7 mg，28%)。LCMS (ES, m/z): 739 [M+H] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 10.13 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.90-7.88 (m, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.74 (d, J=9.2 Hz, 1H), 7.43-7.41 (m, 2H), 7.28 (t, J=7.6 Hz, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.66 (d, J=8.0 Hz, 1H), 4.95-4.86 (m, 4H), 4.00 (br, 1H), 3.71 (s, 2H), 3.59 (t, J=7.2Hz, 2H), 3.49 (s, 2H), 3.34-3.26 (m, 4H), 2.99-2.76 (m, 5H), 2.78-2.76 (m, 1H), 2.65-2.60 (m, 1H), 2.30 (t, J= 7.6 Hz, 2H), 2.26-2.22 (m, 1H), 2.04-2.03 (m, 1H), 1.78-1.72 (m, 1H), 1.47-1.43 (m, 2H), 1.35-1.28 (m, 2H), 1.28-1.21 (m, 4H), 1.17-1.13 (m, 2H), 1.06-1.01 (m, 2H)。 合成化合物 201 步驟 1 ：合成化合物 3
在室溫下於N 2下向N-(2-{2-[2-(2-羥基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺基甲酸三級丁酯(化合物2，294 mg，1.00 mmol，1.2當量)於THF (5 mL)中之密封管溶液中添加NaH (50 mg，60%，1.25 mmol，1.5當量)。在室溫下攪拌反應物0.5小時。接著在室溫下於N 2下添加2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，250 mg，0.84 mmol，1.00當量)。在80℃下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。冷卻至室溫後，過濾反應物，藉由逆相急驟層析用以下條件純化濾液：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1%FA)，在30分鐘內0%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈無色油狀之N-{2-[2-(2-{2-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}胺基甲酸三級丁酯(化合物3，270 mg，55%)。LCMS (ES, m/z): 556,558 [M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 5
在N 2下向N-{2-[2-(2-{2-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}胺基甲酸三級丁酯(化合物3，150 mg，0.27 mmol，1.00當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，84 mg，0.27 mmol，1.00當量)於二噁烷(8 mL)中之溶液中添加Cs 2CO 3(264 mg，0.81 mmol，3.00當量)、XantPhos (31 mg，0.05 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(6 mg，0.03 mmol，0.10當量)。在120℃下於N 2下攪拌所得混合物1。LCMS指示反應完成。冷卻至室溫後，過濾反應物，藉由製備型TLC (DCM:MeOH = 10:1)純化濾液，得到呈黃色固體狀之N-{2-[2-(2-{2-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S) -3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}胺基甲酸三級丁酯(化合物5，150 mg，62%)。LCMS (ES, m/z): 832 [M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 6
在室溫下將N-{2-[2-(2-{2-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}胺基甲酸三級丁酯(化合物5，90 mg，0.11 mmol，1.00當量)於TFA (450 uL)/DCM (4.5 mL)中之溶液攪拌隔夜。LCMS指示反應完成。將反應物在真空下濃縮至乾。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1%FA)，在30分鐘內0%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm及220 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色油狀之2-[6-(2-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物6，85 mg，96%)。MS: (ES, m/s): 732 [M+H] + 步驟 4 ：合成化合物 201
在室溫下向2-[6-(2-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物6，40 mg，0.06 mmol，1.00當量)於DMF (2 mL)中之溶液中添加DIEA (21 mg，0.17 mmol，3.00當量)及3-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)丙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(1.82 mg，0.01 mmol，1.00當量)。在室溫下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19 x 250 mm，5μm；移動相A：水(0.05%FA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內14% B至44% B，44% B；波長：254 nm；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之3-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)-N-{2-[2-(2-{2-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}丙醯胺(化合物201，14.6 mg，28%)。MS: (ES, m/s): 883 [M+H] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.25 (s, 1H), 8.03-7.94 (m, 4H), 7.00 (s, 2H), 6.48 (s, 1H), 5.21 (s, 2H), 4.92-4.82 (m, 4H), 4.40-4.38 (m, 2H), 3.79-3.76 (m, 2H), 3.65 (s, 2H), 3.60-3.47 (m, 12H), 3.36-3.35 (m, 5H), 3.15-3.11 (m, 2H), 2.74-2.67 (m, 2H), 2.31 (t, J=7.6Hz, 2H), 1.96-1.91 (m, 1H), 1.68-1.59 (m, 4H), 1.52-1.46 (m, 1H), 0.88-0.81 (m, 4H)。 合成化合物 202 步驟 1 ：合成化合物 3
在120℃下將2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，400 mg，1.34 mmol，1.00當量)、N-(胺甲醯基甲基)-N-甲基胺基甲酸三級丁酯(化合物2，252 mg，1.34 mmol，1.00當量)、XantPhos (155 mg，0.27 mmol，0.20當量)、Cs 2CO 3(1307 mg，4.01 mmol，3.00當量)及Pd(OAc) 2(30 mg，0.13 mmol，0.10當量)於二噁烷(6 mL)中之溶液攪拌1小時。LCMS指示反應完成。冷卻至室溫後。過濾反應物。將濾液在真空下濃縮至乾。藉由製備型TLC (DCM:MeOH=10:1)純化殘餘物，得到呈綠色固體狀之N-{[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺甲醯基]甲基}-N-甲基胺基甲酸三級丁酯(化合物3，390 mg，63%)。LCMS (ES, m/z): 451,453 [M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 5
在120℃下將N-{[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺甲醯基]甲基}-N-甲基胺基甲酸三級丁酯(化合物3，280 mg，0.62 mmol，1.00當量)、6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，194 mg，0.62 mmol，1.00當量)、XantPhos (72 mg，0.12 mmol，0.20當量)、Cs 2CO 3(607 mg，1.86 mmol，3.00當量)及Pd(OAc) 2(14 mg，0.06 mmol，0.10當量)於二噁烷(6 mL)中之溶液攪拌2小時。LCMS指示反應完成。冷卻至室溫後。過濾反應物且在真空下濃縮至乾。藉由製備型TLC (DCM:MeOH=10:1)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之N-甲基-N-{[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺甲醯基]甲基}胺基甲酸三級丁酯(化合物5，200 mg，39%)。LCMS (ES, m/z): 727 [M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 6
在室溫下將含N-甲基-N-{[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺甲醯基]甲基}胺基甲酸三級丁酯(化合物5，250 mg，0.34 mmol，1.00當量)之TFA (400 uL)及DCM (4 mL)攪拌2小時。LCMS指示反應完成。將反應物在真空下濃縮至乾。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1%FA)，在30分鐘內0%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)-2-(甲基胺基)乙醯胺；甲酸(化合物6，100 mg，41%)。LCMS (ES, m/z): 627 [M+H]+； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.24 (s, 1H), 8.20 (s, 2H), 8.08 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.75 (br, 1H), 5.19 (s, 2H), 4.98-4.81 (m, 4H), 3.65 (s, 2H), 3.59 (s, 2H), 3.52-3.50 (m, 2H), 3.33 (s, 3H), 2.74-2.67 (m, 2H), 2.42 (s, 3H), 1.97-1.92 (m, 1H), 1.68-1.59 (m, 4H), 1.52-1.46 (m, 1H), 0.88-0.81 (m, 4H)。 步驟 4 ：合成化合物 202
在室溫下向 N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)-2-(甲基胺基)乙醯胺(化合物6，65 mg，0.10 mmol，1.00當量)於DMF (2 mL)中之溶液中添加HOBT (84 mg，0.62 mmol，6.00當量)、吡啶(41 mg，0.52 mmol，5.00當量)、DIEA (67 mg，0.52 mmol，5.00當量)及碳酸{4-[(2S)-5-(胺甲醯基胺基)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]戊醯胺基]苯基}甲酯4-硝基苯酯(77 mg，0.10 mmol，1.00當量)。在室溫下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。藉由管柱純化所得混合物：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.1%FA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內15% B至35% B，35% B；波長：220 nm；凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之甲酸；N-甲基-N-{[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺甲醯基]甲基}胺基甲酸{4-[(2S)-5-(胺甲醯基胺基)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]戊醯胺基]苯基}甲酯(化合物202，22 mg，15%)。LCMS (ES, m/z): 1226 [M+H] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.47-8.44 (m, 1H), 8.29-8.21 (m, 2H), 8.19-8.15 (m, 1H), 8.13-8.04 (m, 2H), 8.00-7.92 (m, 2H), 7.89-7.72 (m, 2H), 7.68-7.66 (m, 1H), 7.50-7.41 (m, 4H), 7.35-7.23 (m, 4H), 7.20-7.11 (m, 1H), 6.99 (s, 2H), 5.25-5.12 (m, 2H), 5.08-5.00 (m, 1H), 4.72 (d, J=6Hz, 2H), 4.53-4.50 (m, 2H), 3.76-3.69 (m, 5H), 3.68-3.65 (m, 4H), 3.36 (t, J=7.2 Hz, 2H), 3.24-3.20 (m, 2H), 3.10-3.03 (m, 4H), 2.82-2.78 (m, 2H), 2.60 (s, 3H), 2.41 (s, 3H), 2.23-2.19 (m, 2H), 2.19-2.01 (m, 3H), 1.62 (s, 3H), 1.59-1.55 (m,2H), 1.50-1.42 (m, 6H), 1.33-1.31 (m, 2H), 1.20-1.16 (m, 2H)。 合成化合物 203 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]丙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(化合物1，5.0 g，17.46 mmol，1.0當量)於DMSO (50 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加甘胺酸(1.57 g，20.95 mmol，1.2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% FA)，在40分鐘內10%至30%梯度；偵測器，UV 224 nm及200 nm。在真空下濃縮所得混合物，得到呈淺黃色半固體狀之[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]丙醯胺基]乙酸(化合物2，1.2 g，25%)。LCMS: (ES, m/z): 247 [M+H] +,147 [M+H-100] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下於氮氣氛圍下向[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]丙醯胺基]乙酸(化合物2，1.1 g，4.46 mmol，1.0當量)於DMF (11 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加Cu(OAc) 2(0.16 g，0.89 mmol，0.2當量)及Pb(OAc) 4(5.94 g，13.40 mmol，3.0當量)。在60℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物6小時。LCMS指示反應完成。將反應混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% FA)，在30分鐘內10%至30%梯度；偵測器，UV 200 nm及220 nm。凍乾所得混合物，得到呈白色固體狀之乙酸[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]丙醯胺基]甲酯(化合物3，700 mg，60%)。LCMS: (ES, m/z): 283 [M+Na] +, 261 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 5
在室溫下於氮氣氛圍下向(2S)-2-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}丙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(25 g，61.21 mmol，1當量)於DMSO (250 mL)中之經攪拌溶液中添加D-丙胺酸(6.54 g，73.45 mmol，1.2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在0℃下用水/冰淬滅反應物。藉由過濾收集沈澱之固體且用Et 2O (3x50 mL)洗滌。藉由矽膠管柱層析純化沈澱之固體，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈白色固體狀之(2R)-2-[(2S)-2-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}丙醯胺基]丙酸(12.05 g，51%)。LCMS (ESI, m/z): 383 [M+H] + 步驟 4 ：合成化合物 6
在室溫下向(2R)-2-[(2S)-2-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}丙醯胺基]丙酸(化合物5，6 g，15.69 mmol，1當量)於THF (120 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加DEA (12 mL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物。將殘餘物溶解於水(50 mL)中。用EtOAc (3 x 20 mL)萃取所得混合物。在減壓下濃縮水層。藉由用MeCN (5mL)濕磨純化殘餘物。藉由過濾收集沈澱之固體且用MeCN (3x5 mL)洗滌。此得到呈白色固體狀之D-丙胺醯基-D-丙胺酸(化合物6，1.2 g，47%)。LCMS (ESI, m/z):161[M+H] + 步驟 5 ：合成化合物 8
在室溫下向D-丙胺醯基-D-丙胺酸(化合物6，1.2 g，7.49 mmol，1當量)於DMSO (24 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(化合物7，2.77 g，8.99 mmol，1.2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之(2R)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]丙醯胺基]丙酸(化合物8，1.4 g，52%)。LCMS (ESI, m/z):354[M+H] + 步驟 6 ：合成化合物 9
在90℃下於氮氣氛圍下將2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，1 g，3.34 mmol，1當量)、6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，1.04 g，3.34 mmol，1.0當量)、Xantphos (0.39 g，0.66 mmol，0.2當量)、Pd(OAc) 2(0.08 g，0.33 mmol，0.1當量)及Cs 2CO 3(2.18 g，6.68 mmol，2當量)於二噁烷(33 mL)中之混合物攪拌1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。過濾所得混合物，用MeOH (3x10 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之2-(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物9，1 g，52%)。LCMS (ES, m/z): 575,577 [M+H] + 步驟 7 ：合成化合物 10
在室溫下於氮氣氛圍下向2-(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物9，500 mg，0.87 mmol，1當量)及2-[(三苯基甲基)硫烷基]乙胺鹽酸鹽(371 mg，1.04 mmol，1.2當量)於1,4-二噁烷(5 mL)中之經攪拌混合物中添加XantPhos (100 mg，0.17 mmol，0.2當量)、Cs 2CO 3(566 mg，1.74 mmol，2當量)及Pd(AcO) 2(29 mg，0.13 mmol，0.15當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。用水(50 mL)稀釋所得混合物。用EtOAc (3 x 20 mL)萃取所得混合物。用鹽水(50 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈棕色固體狀之2-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-({2-[(三苯基甲基)硫烷基]乙基}胺基)吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物10，400 mg，53%)。LCMS (ESI, m/z):858[M+H] + 步驟 8 ：合成化合物 11
在室溫下向2-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-({2-[(三苯基甲基)硫烷基]乙基}胺基)吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物10，400 mg，0.46 mmol，1當量)於DCM (4 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TFA (2 mL)及參(丙-2-基)矽烷(200 uL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色固體狀之2-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-[(2-硫烷基乙基)胺基]吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物11，270 mg，94%)。LCMS (ESI, m/z):616[M+H] + 步驟 9 ：合成化合物 12
在室溫下向2-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-[(2-硫烷基乙基)胺基]吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物10，260 mg，0.42 mmol，1當量)及乙酸[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]丙醯胺基]甲酯(109 mg，0.42 mmol，1當量)於DCM (2.5 mL)中之經攪拌溶液中添加TFA (25 uL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。所得混合物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS (ESI, m/z):815[M+H] + 步驟 10 ：合成化合物 13
在0℃下於空氣氛圍下向N-[(1S)-1-{[({2-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基]乙基}硫烷基)甲基]胺甲醯基}乙基]胺基甲酸三級丁酯(化合物12，200 mg，0.24 mmol，1當量)於DCM (2 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TFA (1 mL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈灰白色固體狀之(2S)-2-胺基-N-[({2-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基]乙基}硫烷基)甲基]丙醯胺(化合物13，70 mg，39%)。LCMS (ESI, m/z):716[M+H] +步驟11：合成化合物203
在室溫下於氮氣氛圍下向(2R)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]丙醯胺基]丙酸(化合物13，32 mg，0.09 mmol，1.1當量)及HATU (38 mg，0.10 mmol，1.2當量)於DMF (1.0 mL)中之經攪拌溶液中添加HOBT (113 mg，0.08 mmol，1當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在0℃下向上述混合物中添加(2S)-2-胺基-N-[({2-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基]乙基}硫烷基)甲基]丙醯胺(60 mg，0.08 mmol，1當量)及DIEA (9 mg，0.067 mmol，0.8當量)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% FA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到粗產物(15 mg)。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Prep C18 OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.1%FA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內23% B至53% B，53% B；波長：254 nm；RT1(min)：5)純化粗產物(15 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1R)-1-{[(1S)-1-{[({2-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基]乙基}硫烷基)甲基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}乙基]己醯胺；甲酸(化合物203，8.8 mg，9%)。LCMS (ESI, ms):1051 [M+H-FA] +； 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.45-8.44 (m, 1H), 8.25 (s, 1H), 8.15-7.97 (m, 6H), 7.42 (s, 1H) 6.97 (s, 2H), 6.81 (br s, 1H), 6.03 (s, 1H), 5.19 (s, 2H), 4.89 (d, J=6.0Hz, 2H), 4.77 (d, J=6.0Hz, 2H), 4.27 (d, J=6.0Hz, 2H), 4.15-4.09 (m, 3H), 3.24-3.11 (m, 7H), 2.75-2.65 (m, 3H), 2.17-2.06 (m, 3H), 1.83-1.35 (m, 11H), 1.30-1.07 (m, 14H), 0.90-0.84 (m, 4H)。 合成化合物 204 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，1000 mg，3.34 mmol，1當量)及β-巰基乙醇(263 mg，3.37 mmol，1.01當量)於DMF (10 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加K 2CO 3(928 mg，6.71 mmol，2.01當量)。在70℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。過濾反應混合物且用EA洗滌固體。將濾液在真空下濃縮至乾。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (9:1)溶離，得到呈白色固體狀之2-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)硫烷基]乙醇(化合物1，1.1 g，88%)。LCMS:(ES.m/z):341,343 [M+1] + 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下向2-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)硫烷基]乙醇(化合物1，370 mg，1.08 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，369 mg，1.18 mmol，1.09當量)於二噁烷(8 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Xantphos (125 mg，0.21 mmol，0.20當量)及Pd(OAc) 2(24 mg，0.10 mmol，0.10當量)及Cs 2CO 3(1057 mg，3.24 mmol，2.99當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使所得混合物冷卻降至室溫且在減壓下濃縮。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (8:1)溶離，得到呈淺棕色固體狀之2-{6-[(2-羥乙基)硫烷基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物3，380 mg，56%)。LCMS:(ES.m/z):617[M+1] +； 1H NMR (300MHz, DMSO-d 6) δ 8.26 (s,1H), 8.04 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 6.96 (s, 1H), 5.22 (s, 2H), 3.94-3.90 (m, 3H), 3.83-3.82 (m, 2H), 3.66-3.65 (m, 2H), 3.57 (s, 2H), 3.11 (s, 2H), 3.25 (d, J= 9.6 Hz, 2H), 2.80-2.65 (m, 2H), 2.00-1.90 (m, 1H), 1.77-1.55 (m, 4H), 1.55-1.40 (m, 1H), 0.82-0.81 (m, 4H)。 步驟 3 ：合成化合物 4
在室溫下於氮氣氛圍下向2-{6-[(2-羥乙基)硫烷基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物3，240 mg，0.38 mmol，1當量)及乙酸[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]丙醯胺基]甲酯(202 mg，0.77 mmol，2當量)於DCM (7 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加PTSA (134 mg，0.77 mmol，2當量)。在50℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應有約40%產物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水，在40分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈棕色固體狀之N-[(1S)-1-[({2-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)硫烷基]乙氧基}甲基)胺甲醯基]乙基]胺基甲酸三級丁酯(化合物4，150 mg，37%)。LCMS: (ES.m/z):817[M+1]+。 步驟 4 ：合成化合物 5
在0℃下向N-[(1S)-1-[({2-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)硫烷基]乙氧基}甲基)胺甲醯基]乙基]胺基甲酸三級丁酯(化合物4，150 mg，0.18 mmol，1當量)於DCM (5 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加TFA (2.00 mL)。在0℃下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至40%梯度；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之(2S)-2-胺基-N-({2-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)硫烷基]乙氧基}甲基)丙醯胺(化合物5，110 mg，79%)。LCMS:717(M+H)+ 步驟 5 ：合成化合物 204
在0℃下於氮氣氛圍下向(2R)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]丙醯胺基]丙酸(化合物5，21 mg，0.060 mmol，1.22當量)及HATU (28 mg，0.074 mmol，1.51當量)於DMF (2 mL)中之經攪拌混合物中添加(2S)-2-胺基-N-({2-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)硫烷基]乙氧基}甲基)丙醯胺(化合物5，35 mg，0.049 mmol，1當量)及DIEA (4.67 mg，0.036 mmol，0.74當量)。在室溫下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% FA)，在40分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。將所收集之級分凍乾至乾。藉由以下條件再純化粗產物：管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19 x 250 mm，5 μm；移動相A：水(0.1% FA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內16% B至46% B，46% B；波長：254 nm；RT1(min)：6min；凍乾所收集之級分，得到呈灰白色固體狀之6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1R)-1-{[(1S)-1-[({2-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)硫烷基]乙氧基}甲基)胺甲醯基]乙基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}乙基]己醯胺(化合物204，5.8 mg，11%)。LCMS:(ms, ESI): 1052(M+H) +； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.60 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.24 - 8.10 (m, 2H), 8.10 - 7.91 (m, 4H), 6.97-6.96 (m, 3H), 5.24 (s, 2H), 4.90-4.82 (m, 4H), 4.61-4.59 (m, 2H), 4.27 - 4.09 (m, 3H), 3.74 - 3.57 (m, 5H), 3.35-3.30 (m, 8H), 2.72 (t, J = 10.1 Hz, 2H), 2.06 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.96-1.94 (m, 1H), 1.75 - 1.55 (m, 4H), 1.53 - 1.38 (m, 5H), 1.17-1.15 (m, 11H), 0.82-0.81 (m, 4H)。 合成化合物 205 步驟 1 ：合成化合物 2
在0℃下於空氣氛圍下向N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲酸三級丁酯(化合物1，400 mg，1.01 mmol，1當量)於DCM (5 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加HCl (g，4N，於二噁烷中，1 mL)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。將殘餘物再溶解於DCM (5 mL)中且在減壓下濃縮。粗產物混合物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS:(ES.m/z):294 [M+1] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在0℃下向(2S)-2-胺基-N-[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]-3-甲基丁醯胺(化合物2，400 mg，1.36 mmol，1當量)及6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(504 mg，1.63 mmol，1.2當量)於DMF (5 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加DIEA (352 mg，2.72 mmol，2當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物12小時。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，矽膠；移動相，含ACN之水(0.05%TFA)，在30分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色固體狀之6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4- (羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]己醯胺(化合物3，165 mg，24%)。LCMS:(ES.m/z):487[M+1] +。 步驟 3 ：合成化合物 4
在0℃下向6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]己醯胺(化合物3，160 mg，0.32 mmol，1當量)於DCM (2 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加SOCl 2(78 mg，0.65 mmol，2.00當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。此得到呈白色固體狀之N-[(1S)-1-{[(1S)-1- {[4-(氯甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺(化合物4，135 mg，75%)。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS:(ES.m/z):505,507[M+1] +。 步驟 4 ：合成化合物 205
在0℃下向N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(氯甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺(化合物4，129 mg，0.25 mmol，1.2當量)及2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物107，128 mg，0.21 mmol，1.00當量)於DMF (1 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加DIEA (55 mg，0.42 mmol，2當量)。在50℃下攪拌所得混合物2天。在LCMS上可發現約15%所需產物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05%TFA)，在40分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到粗產物(60 mg)。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Shield RP18 OBD管柱，30*150 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min；梯度：在7分鐘內27% B至52% B，52% B；波長：254 nm；RT1(min)：6.13)再純化粗產物(60mg)；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之(3S)-1-({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲基)-1-({2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓(化合物205，12.9 mg，6%)。LCMS:(ES.m/z):1069[M+1-TFA] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 10.4 (br s, 1H), 8.7-8.4 (m, 1H), 8.26-8.22 (m, 3H), 8.06 (s, 1H), 7.81-7.79 (m, 3H), 7.54 (s, 2H), 6.97 (s, 3H), 5.29 (s, 2H), 4.91-4.90 (m, 2H), 4.84-4.82 (m, 3H), 4.67-4.55 (m, 2H), 4.47-4.38 (m, 1H), 4.2-4.13 (m, 1H), 3.57-3.52 (m, 4H), 3.39-3.36 (m, 5H), 3.14-3.13 (m, 2H), 2.98-2.80 (m, 1H), 2.49-2.48 (m, 1H), 2.40-2.27 (m, 1H), 2.26-1.88 (m, 4H), 1.82-1.61 (m, 2H), 1.49-1.47 (m, 4H), 1.35-1.31 (m, 6H), 1.28-1.13 (m, 3H), 0.88-0.82 (m, 10H)。 合成化合物 206 步驟 1. 合成化合物 2
在0℃下向N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲酸三級丁酯(化合物1，400 mg，1.01 mmol，1當量)於DCM (5 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加HCl (g，4N，於二噁烷中，400 uL)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物。此得到呈黃色固體狀之(2S)-2-胺基-N-[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]-3-甲基丁醯胺(化合物2，270 mg，90%)。粗產物混合物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS:(ESI, m/z):294[M+1] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下向(2S)-2-胺基-N-[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]-3-甲基丁醯胺(化合物2，300 mg，1.02 mmol，1當量)及6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(346 mg，1.12 mmol，1.1當量)於DMF (1 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加DIEA (264 mg，2.04 mmol，2當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05%TFA)，在35分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈黃色固體狀之6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]己醯胺(化合物3，135 mg，26%)。LCMS:(ESI, m/z): 487 [M+1] +。 步驟 3 ：合成化合物 4
在0℃下於空氣氛圍下向6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)-N-[(1S)-1- {[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]己醯胺(化合物3，125 mg，0.25 mmol，1當量)於DCM (2 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加SOCl 2(61 mg，0.51 mmol，2當量)。在室溫下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。此得到呈黃色固體狀之N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(氯甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺(化合物4，120 mg，83%)。LCMS: (ESI, m/z): 505,507[M+1] +。 步驟 4 ：合成化合物 206
在0℃下於空氣氛圍下向N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(氯甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺(化合物4，99 mg，0.19 mmol，1.2當量)及3-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基]丙腈(化合物110，100 mg，0.16 mmol，1.00當量)於DMF (1 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加DIEA (84 mg，0.65 mmol，4當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應有28%產物及46%原料。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05%TFA)，在10分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。用以下條件再純化粗產物：管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內25% B至55% B，55% B；波長：254 nm；RT1(min)：5；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之(3S)-1-[(2-{6-[(2-氰基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓三氟乙酸鹽(7 mg，4%)。LCMS:(ES.m/z):1077[M+1-TFA] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 10.21(s, 1H), 8.33-8.20 (m, 4H), 7.79-7.77 (m, 3H), 7.52-7.49 (m, 3H), 7.25-7.07 (m, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.08 (s, 1H), 5.27 (s, 2H), 4.91-4.90 (m, 2H), 4.79-4.77 (m, 4H), 4.62-4.48 (m, 2H), 4.47-4.13 (m, 3H), 3.53-3.50 (m, 6H), 3.28-3.20 (m, 5H), 2.92-2.80 (m, 3H), 2.28-1.62 (m, 7H), 1.53-1.47 (m, 4H), 1.34-1.32 (m, 3H), 1.28-1.15 (m, 3H), 0.89-0.83 (m, 9H) 合成化合物 207 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，1.0 g，3.34 mmol，1.0當量)及β-胺基丙腈(化合物1A，4.69 g，66.90 mmol，20.0當量)於DMA (4.0 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加K 2CO 3(0.92 g，6.68 mmol，2.0當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物兩天。藉由LCMS可偵測到約70%所需產物。將反應物冷卻至室溫且在室溫下用水淬滅。用CH 2Cl 2(3x100 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (5:1)溶離，得到呈淺綠色固體狀之3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺基]丙腈(化合物2，600 mg，49%)。LCMS: (ES, m/s): 333,335 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下於氮氣氛圍下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物2，187 mg，0.60 mmol，1.0當量)及3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺基]丙腈(INT4，200 mg，0.60 mmol，1.0當量)於二噁烷(8.0 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加Xantphos (139 mg，0.24 mmol，0.4當量)、Pd(OAc) 2(54 mg，0.24 mmol，0.4當量)及Cs 2CO 3(587 mg，1.80 mmol，3.0當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用ACN及DCM洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (5:1)溶離，得到呈綠色固體狀之3-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基]丙腈；甲酸(化合物3，220 mg，53%)。LCMS:(ES,m/s): 609 [M+H] +, 631 [M+Na] +。 步驟 3 ：合成化合物 5
在室溫下於氮氣氛圍下向3-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基]丙腈(200 mg，0.32 mmol，1.0當量)於THF (4.0 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加三光氣(146 mg，0.49 mmol，1.5當量)。在室溫下再攪拌所得混合物30分鐘。在真空下濃縮所得混合物。在0℃下向含上述混合物之DCM (2 mL)中添加含N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲酸三級丁酯(116 mg，0.29 mmol，0.9當量)之DCM (8.0 mL)及TEA (97 mg，0.96 mmol，3.0當量)。在0℃下再攪拌所得混合物10分鐘。逐份添加DMAP (80 mg，0.65 mmol，2.0當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS可偵測到約10%所需產物。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相TFA，含ACN之水，在30分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm及220 nm。凍乾所收集之級分，得到呈綠色固體狀之N-(2-氰基乙基)-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(化合物5，49 mg，14%)。LCMS: (ES, m/s): 514 [M/2+H] +, 1028 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 6
在0℃下於氮氣氛圍下向N-(2-氰基乙基)-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(化合物5，50 mg，0.049 mmol，1.0當量)於DCM (2.5 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加TFA (0.5 mL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS: (ES, m/s): 465 [M/2+H] +, 928 [M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 207
在0℃下於氮氣氛圍下向N-(2-氰基乙基)-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(化合物6，50 mg，0.05 mmol，1.0當量)於DMF (2.0 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加DIEA (20 mg，0.16 mmol，3.0當量)及6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(16 mg，0.05 mmol，1.0當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：移動相A：水(0.1%FA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min)純化反應混合物。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之甲酸；N-(2-氰基乙基)-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(8.6 mg，13%)。LCMS: (ES, m/s): 562 [M/2+H] +, 1122 [M+H] +； 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6) 9.99 (s, 1H), 8.41-8.18 (m, 3H), 8.10-7.94 (m, 3H), 7.83 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.62 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.50-7.25 (m, 3H), 6.99 (s, 2H), 5.28 (s, 2H), 5.16 (s, 2H), 4.94 (d, J=6 Hz, 2H), 4.77 (d, J=6.3 Hz, 2H), 4.41-4.34 (m, 1H), 4.20-4.14 (m, 3H), 3.65 (s,2H), 3.50 (s, 2H), 3.21 (s, 3H), 2.96 (t, J=6.8 Hz, 2H), 2.71 (d, J=6 Hz, 2H), 2.23-2.06 (m, 2H), 1.99-1.90 (m, 2H), 1.66-1.58 (m, 4H), 1.49-1.45 (m, 5H), 1.30 (d, J=6.9 Hz, 3H), 1.23-1.15 (m, 2H), 0.95-0.60 (m, 12H)。 合成化合物 208 步驟 1 ：合成化合物 3
在室溫下向6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(2 g，6.48 mmol，1當量)於DMSO (10 ml)中之經攪拌溶液中逐份添加L-纈胺酸(化合物2，0.84 g，7.13 mmol，1.1當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應有31%產物及40%原料。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，矽膠；移動相，含ACN之水(0.05%TFA)，在45分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]-3-甲基丁酸(化合物3，600 mg，29%)。LCMS (ES, m/z): 311 [M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 6
在室溫下於氮氣氛圍下向(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]丙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(化合物4，10 g，34.93 mmol，1.0當量)於DMSO (100 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加D-丙胺酸(3.73 g，41.91 mmol，1.20當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% FA)，在30分鐘內10%至30%梯度；偵測器，UV 220 nm及200 nm。在真空下濃縮所得混合物，得到呈半固體狀之(2R)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]丙醯胺基]丙酸(化合物6，4.8 g，47%)。LCMS: (ES, m/z): 247 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 7
在0℃下於氮氣氛圍下向[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]丙醯胺基]乙酸(化合物6，2.4 g，9.74 mmol，1當量)於DMF (25 ml)中之經攪拌溶液中逐份添加Cu(OAc) 2(368 mg，1.85 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 4(1350 mg，4.15 mmol，0.4當量)。在60℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。使反應物冷卻降至室溫且在0℃下藉由添加水(70 mL)淬滅。用EtOAc (3x100 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈白色固體狀之乙酸[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]丙醯胺基]甲酯(化合物7，1.2 g，47%)。LCMS (ES, m/z): 261 [M+H] + 步驟 4 ：合成化合物 8
在0℃下於氮氣氛圍下向乙酸[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]丙醯胺基]甲酯(化合物7，200 mg，0.76 mmol，1當量)於DCM (2 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TMSCl (333 mg，3.07 mmol，4當量)。在0℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。用MeOH衍生化以進行LCMS，LCMS指示反應有25%產物。在真空下濃縮所得混合物。此得到呈白色固體狀之N-[(1S)-1-(氯甲基胺甲醯基)乙基]胺基甲酸三級丁酯(化合物8，150 mg，82.47%)。所得混合物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS (ES, m/z):233 [M+H] +(用MeOH衍生化) 步驟 5 ：合成化合物 10
在0℃下於氮氣氛圍下將N-[(1S)-1-(氯甲基胺甲醯基)乙基]胺基甲酸三級丁酯(化合物8，78 mg，0.33 mmol，2當量)及2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物107，100 mg，0.16 mmol，1.00當量)於丙酮(1 mL)中之經攪拌溶液攪拌2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之(3S)-1-{[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]丙醯胺基]甲基}-1-({2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓(化合物10，90 mg，67%)。LCMS (ES, m/z): 801 [M+H] + 步驟 6 ：合成化合物 11
在0℃下於空氣氛圍下向(3S)-1-{[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]丙醯胺基]甲基}-1-({2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓(化合物10，90 mg，0.11 mmol，1當量)於DCM (1 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TFA (200 uL)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應有30%產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色油狀之(3S)-1-{[(2S)-2-胺基丙醯胺基]甲基}-1-({2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓(化合物11，50 mg，63%)。LCMS (ES, m/z): 701 [M+H] + 步驟 7 ：合成化合物 208
在0℃下於空氣氛圍下向(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]-3-甲基丁酸(化合物3，53 mg，0.17 mmol，1.2當量)於DMF (1 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加HATU (65 mg，0.17 mmol，1.2當量)。在0℃下攪拌所得混合物10分鐘。在0℃下向上述混合物中逐滴添加(3S)-1-{[(2S)-2-胺基丙醯胺基]甲基}-1-({2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓(100 mg，0.14 mmol，1當量)及HOBT (19 mg，0.14 mmol，1當量)及DIEA (36 mg，0.28 mmol，2當量)。在0℃下再攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到30 mg呈黃色固體狀之粗產物。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內25% B至55% B，55% B；波長：254 nm；RT1(min)：5)純化粗產物(30 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之(3S)-1-{[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]甲基}-1-({2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓(化合物208，13.5 mg，9%)。LCMS (ES, m/z): 993 [M+H-TFA] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 9.97-9.90 (m, 2H), 9.35 (t, J=15.2 Hz, 1H), 8.29-8.20 (m, 3H), 8.14 (d, J=6.4 Hz, 1H), 7.78 (d, J=8.0Hz, 1H), 7.12-7.11 (m, 1H), 7.00-6.99 (m, 2H), 5.60-5.59 (m, 1H), 5.48-5.44 (m, 1H), 5.32 (s, 2H), 4.86-4.82 (m, 4H), 4.54 (br s, 2H), 4.21-4.09 (m, 2H), 3.85 (s, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.38-3.34 (m, 3H), 3.30-3.27 (m, 1H), 3.20-3.15 (m, 2H), 2.93-2.80 (m, 1H), 2.69-2.58 (m, 1H) 2.16-2.08 (m, 2H), 1.90-1.74 (m, 5H), 1.49-1.43 (m, 4H), 1.39-1.35 (m, 3H), 1.18-1.12 (m, 5H), 1.10-1.04 (m, 1H), 0.90-0.88 (m, 3H), 0.82-0.78 (m, 6H)。 合成化合物 383 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，1 g，3.34 mmol，1當量)於DMF (11 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加(乙基硫烷基)鈉(0.34 g，4.01 mmol，1.2當量)。在50℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之2-氯-6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(化合物1，600 mg，55%)。LCMS (ES, m/z): 325,327 [M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向2-氯-6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(化合物1，300 mg，0.92 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，288 mg，0.92 mmol，1當量)於二噁烷(9.3 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加Xantphos (160 mg，0.27 mmol，0.3當量)、Cs 2CO 3(601 mg，1.84 mmol，2當量)及Pd(OAc) 2(31 mg，0.13 mmol，0.15當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。過濾所得混合物，用EtOAc (3x30 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(230 mg，41%)。LCMS (ES, m/z): 601 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 5
在0℃下於氮氣氛圍下向6-溴己-1-胺氫溴酸鹽(化合物7，450 mg，1.72 mmol，1當量)於H 2O (7 mL)及飽和NaHCO 3(水溶液) (7 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加2,5-二側氧基吡咯-1-甲酸甲酯(化合物6，320 mg，2.06 mmol，1.2當量)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物40分鐘。在0℃下向上述混合物中逐份添加THF (7 mL)及飽和NaHCO 3(水溶液) (7 mL)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物40分鐘。LCMS指示反應完成。用濃HCl將混合物酸化至pH 6。用EtOAc (3 x 50mL)萃取所得混合物。用鹽水(3x50 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。此得到呈白色固體狀之1-(6-溴己基)吡咯-2,5-二酮(化合物5，360 mg，80%)。LCMS (ES, m/z): 260,262 [M+H] + 步驟 4 ：合成化合物 209
在室溫下於氮氣氛圍下向2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物2，50 mg，0.083 mmol，1當量)及1-(6-溴己基)吡咯-2,5-二酮(化合物5，108 mg，0.41 mmol，5當量)於DMF (3 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加KI (13 mg，0.083 mmol，1當量)。在60℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。將所收集之級分在真空下濃縮至乾。藉由以下條件再純化粗產物：管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19x250 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內27% B至57% B，57% B；波長：254 nm；RT1(min)：6；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之(3S)-1-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己基]-1-({2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓(化合物209，4.9 mg，5%)。LCMS (ES, m/z): 781 [M+H-TFA] +； 1H-NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ (ppm): 9.87 (s, 1H), 8.27-8.21 (m, 3H), 7.10-6.98 (m, 3H), 5.32 (s, 2H), 4.88-4.84 (m, 4H), 4.54-4.52 (m, 2H), 4.25-4.23 (m, 2H), 3.85-3.83 (m, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.32-3.20 (m, 5H), 2.90-2.85 (m, 1H), 1.90-1.65 (m, 6H), 1.36-1.25 (m, 6H), 1.20-1.00 (m, 5H), 0.89-0.88 (m, 4H)。 合成化合物 210 步驟 1 ：合成化合物 4
在0℃下向4-氟-3-硝基苯甲酸甲酯(化合物2，10 g，50.21 mmol，1當量)及K 2CO 3(13.88 g，100.43 mmol，2當量)於DMF (160 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加苯甲基硫醇(化合物3，12.47 g，100.43 mmol，2當量)。在25℃下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。在0℃下藉由添加水(450 mL)淬滅反應物。藉由過濾收集沈澱之固體且用水(3x150 mL)洗滌。藉由用PE (300 mL)濕磨純化固體。此得到呈黃色固體狀之4-(苯甲基硫烷基)-3-硝基苯甲酸甲酯(化合物4，10 g，65%)。LCMS (ES, m/z): 304 [M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 5
在0℃下向4-(苯甲基硫烷基)-3-硝基苯甲酸甲酯(化合物4，10 g，36.32 mmol，1當量)於DCM (200 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加HCl (6N，200 mL)及NaClO (100 mL)。在0℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。用CH 2Cl 2(3 x 20 mL)萃取所得混合物。用鹽水(300 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:4)溶離，得到呈黃色固體狀之4-(氯磺醯基)-3-硝基苯甲酸甲酯(化合物5，8 g，78%)。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ 8.51-8.46 (m, 2H), 8.38 (d, J=8.1Hz, 1H), 4.06 (s, 3H)。 步驟 3 ：合成化合物 6
在0℃下於空氣氛圍下向4-(氯磺醯基)-3-硝基苯甲酸甲酯(化合物5，1.2 g，4.29 mmol，1當量)於吡啶(12 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加對胺基苯甲醇(0.63 g，5.14 mmol，1.2當量)。在0℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。藉由LCMS發現50%所需產物。用1N HCl將混合物酸化至pH 3。藉由過濾收集沈澱之固體且用Et 2O (3x50 mL)洗滌。藉由矽膠管柱層析純化固體，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲酸甲酯(化合物6，850 mg，49%)。LCMS:(ES. m/z):349[M+ H -H 2O] +。 步驟 4 ：合成化合物 7
在0℃下向4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲酸甲酯(化合物6，850 mg，2.32 mmol，1當量)於THF (8 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加含LiOH (222 mg，9.28 mmol，4當量)之H 2O (4 mL)。在0℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。用1N HCl將反應混合物酸化至pH 3。藉由過濾收集沈澱之固體且用Et 2O (3x50 mL)洗滌。此得到呈黃色固體狀之4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲酸(化合物7，270 mg，29%)。LCMS:(ES. m/z): 335 [M+ H -H 2O] +。 步驟 5 ：合成化合物 8
在0℃下將4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲酸(化合物7，730 mg，2.07 mmol，0.97當量)及HATU (1220 mg，3.21 mmol，1.50當量)於DMF (20 mL)中之經攪拌混合物攪拌15分鐘。在0℃下向上述混合物中逐份添加1-(2-胺基乙基)吡咯-2,5-二酮(300 mg，2.14 mmol，1.00當量)且逐滴添加DIEA (1106 mg，8.56 mmol，4.00當量)。在0℃下再攪拌所得混合物2小時。藉由LCMS發現30%所需產物。在0℃下用水淬滅反應物。用EtOAc (3 x 80 mL)萃取所得混合物。用鹽水(2x30 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之N-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]-4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲醯胺(化合物8，190 mg，16%)。LCMS:(ES. m/z):457 [M+ H -H 2O] +。 步驟 6 ：合成化合物 9
在0℃下於空氣氛圍下向N-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]-4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲醯胺(25 mg，0.053 mmol，1當量)於DCM (4 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加SOCl 2(18 mg，0.16 mmol，3當量)。在0℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS: (ES. m/z): 493 [M+H] +。 步驟 9 ：合成化合物 210
在室溫下於空氣氛圍下向4-{[4-(氯甲基)苯基]胺磺醯基}-N-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]-3-硝基苯甲醯胺(40 mg，0.081 mmol，0.81當量)及2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物107，60 mg，0.10 mmol，1.00當量)於丙酮(5 mL)中之經攪拌混合物中。在0℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.1% TFA)，在30分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Prep OBD C18管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在11分鐘內32% B至52% B，52% B；波長：254 nm；RT1(min)：10.15)再純化粗產物；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之(3S)-1-{[4-(4-{[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]胺甲醯基}-2-硝基苯磺醯胺基)苯基]甲基}-1-({2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓三氟乙酸鹽(化合物210，7 mg，5%)。LCMS:(ms, ESI): 1057[M-TFA] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 11.10 (s, 1H), 10.25 (br s, 1H), 9.01 (t, J=5.4Hz, 1H), 8.27 (d, J=6.8Hz, 2H), 8.18 (s, 2H), 8.05(s, 2H), 7.30-7.26 (m, 2H), 7.17-7.05 (m, 3H), 6.99 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 5.32 (s, 2H), 4.84-4.80 (m, 4H), 4.70 (s, 2H), 3.81 (s, 2H), 3.66 (s, 3H), 3.64-3.63 (m, 2H), 3.39-3.38 (m, 2H), 3.37-3.36 (m, 1H), 3.18-3.16 (m, 2H), 2.85-2.83 (m, 1H), 2.60-2.58 (m, 1H), 1.85-1.65 (m, 4H), 1.38-1.35 (m, 3H), 1.08-1.05 (m, 1H), 0.88 (d, J=6.4Hz, 3H)。 合成化合物 211 步驟 1 ：合成化合物 3
在0℃下於氮氣氛圍下向5-甲醯基-2-羥基苯甲酸(化合物1，20 g，120.38 mmol，1.00當量)於DMF (200 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加EDCI (28 g，144.44 mmol，1.20當量)、HOBT (20 g，144.46 mmol，1.20當量)及N-(2-胺基乙基)胺基甲酸三級丁酯(化合物2，23 g，144.46 mmol，1.20當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。用水淬滅反應混合物且用EA (3x200 mL)萃取。用鹽水(200 mL)洗滌合併之有機物，經Na 2SO 4乾燥。過濾後，將濾液在真空下濃縮至乾。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (2:3)溶離，得到呈白色固體狀之N-[2-[(5-甲醯基-2-羥基苯基)甲醯胺基]乙基]胺基甲酸三級丁酯(化合物3，23 g，53%)。LCMS (ES, m/z): 209 [M+H-100] +, 309 [M+H] +, 331 [M+Na] +。 步驟 2 ：合成化合物 5
在0℃下於氮氣氛圍下向N-[2-[(5-甲醯基-2-羥基苯基)甲醯胺基]乙基]胺基甲酸三級丁酯(化合物3，23 g，74.59 mmol，1.00當量)於ACN (600 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加Ag 2O (34.57 g，149.17 mmol，2.00當量)及(2S,3S,4S, 5R,6R)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-溴環氧乙烷-2-甲酸甲酯(化合物4，32.6 g，82.05 mmol，1.10當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。過濾後，將濾液在真空下濃縮至乾。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:4)溶離，得到呈綠色固體狀之(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-[2-([2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基]胺甲醯基)-4-甲醯基苯氧基]環氧乙烷-2-甲酸甲酯(化合物5，38 g，76%)。LCMS (ES, m/z): 525 [M+H-100] +, 625 [M+H] +, 647 [M+Na] +。 步驟 3 ：合成化合物 6
在25℃下於氫氣氛圍下將(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-[2-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-甲醯基苯氧基]環氧乙烷-2-甲酸甲酯(化合物5，500 mg，0.80 mmol，1當量)及Pd/C (200 mg，10%)於EA (15 mL)中之混合物攪拌1小時。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物且用EA (15 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液，得到呈白色固體狀之(2S,3S,4S, 5R,6S)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-[2-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-(羥甲基)苯氧基]環氧乙烷-2-甲酸甲酯(化合物6，480 mg，95%)。LCMS (ESI, m/z): 627 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 7
在0℃下向(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-[2-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-(羥甲基)苯氧基]環氧乙烷-2-甲酸甲酯(化合物5，5 g，7.97 mmol，1當量)及DMF (0.3 g，4.10 mmol，0.51當量)於DCM (60 mL)中之混合物中逐滴添加亞硫醯氯(1.90 g，15.95 mmol，2當量)。在0℃下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在0℃下藉由添加水(10 mL)淬滅反應物，接著用飽和碳酸氫鈉溶液(30 mL)洗滌。經硫酸鈉乾燥有機層並濃縮。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用DCM/MeOH (96:4)溶離，得到呈白色固體狀之(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-[2-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-(氯甲基)苯氧基]環氧乙烷-2-甲酸甲酯(化合物7，3 g，58%)。LCMS (ESI, m/z): 627 [M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 8
在50℃下將2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物107，250 mg，0.41 mmol，1當量)、KI (138 mg，0.83 mmol，2當量)及(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-[2-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-(氯甲基)苯氧基]環氧乙烷-2-甲酸甲酯(化合物7，332 mg，0.51 mmol，1.24當量)於丙酮(10 mL)中之混合物攪拌6小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。藉由逆相急驟用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.1% TFA及ACN之水(在50分鐘內0%至100%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮溶離物，得到呈白色固體狀之(3S)-1-{[3-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-(甲氧基羰基)環氧乙烷-2-基]氧基}苯基]甲基}-1-({2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓(化合物8，200 mg，39%)。LCMS (ES, m/z): 1209 [M] +。 步驟 6 ：合成化合物 9
在25℃下將(3S)-1-{[3-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-(甲氧基羰基)環氧乙烷-2-基]氧基}苯基]甲基}-1-({2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓(化合物8，200 mg，0.16 mmol，1當量)及LiOH (40 mg，1.66 mmol，10.11當量)於MeOH (4 mL)中之混合物攪拌2小時。LCMS指示反應完成。用氮氣流移除溶劑，得到呈黃色固體狀之粗物質(3S)-1-{[3-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-基]氧基}苯基]甲基}-1-({2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓(化合物9，260 mg，粗物質)。LCMS (ESI, m/z): 1069 [M] +。 步驟 7 ：合成化合物 10
在25℃下將(3S)-1-{[3-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-基]氧基}苯基]甲基}-1-({2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓(化合物9，150 mg，0.14 mmol，1當量)及TFA (1.5 mL)於DCM (7.5 mL)中之混合物攪拌1小時。LCMS指示反應完成。用氮氣流移除溶劑。用水(2 mL)溶解殘餘物且用DCM (3 x 3 mL)洗滌。藉由凍乾乾燥水相，得到呈棕色固體狀之(3S)-1-({3-[(2-胺基乙基)胺甲醯基]-4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-基]氧基}苯基}甲基)-1-({2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓(化合物10，140 mg，對於兩個步驟87%)。LCMS (ESI, m/z): 969 [M] +。 步驟 8 ：合成化合物 211
在25℃下將(3S)-1-({3-[(2-胺基乙基)胺甲醯基]-4-{[(2S,3R,4S,5S,6S) -6-羧基-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-基]氧基}苯基}甲基)-1-({2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓(化合物10，120 mg，0.124 mmol，1當量)、6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(38 mg，0.12 mmol，1當量)及DIEA (95 mg，0.74 mmol，6當量)於DMF (3 mL)中之混合物攪拌1小時。LCMS指示反應完成。藉由製備型HPLC用以下條件純化反應物：管柱：Sunfire Prep C18 OBD管柱，19*250 mm，10μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在12分鐘內20% B至27% B，在20分鐘內27% B至27% B，27% B；波長：254 nm；RT1(min)：16.3；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之(3S)-1-[(4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-基]氧基}-3-({2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]乙基}胺甲醯基)苯基)甲基]-1-({2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓(化合物211，8.2 mg，5%)。LCMS (ES, m/z): 1162 [M-TFA] +； 1H NMR (400 MHz, 甲醇-d4) δ 8.34 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.89 (d, J= 2.0 Hz, 1H), 7.62-7.56 (m, 2H), 7.05 (s, 1H), 6.80 (s, 2H), 5.59-5.48 (m, 2H), 5.43-5.30 (m, 2H), 5.12-5.03 (m, 2H), 4.95-4.92 (m, 2H), 4.85-4.82 (m, 1H), 4.63-4.52 (m, 2H), 4.04-3.85 (m, 3H), 3.67-3.36 (m, 12H), 3.25-3.21 (m, 3H), 2.96-2.94 (s, 1H), 2.74-2.67 (m, 1H), 2.19-1.80 (m, 7H), 1.65-1.50 (m, 4H), 1.48-1.41 (m, 3H), 1.32-1.18 (m, 3H), 1.00 (d, J= 6.4 Hz, 3H)。 合成化合物 212 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，0.5 g，1.67 mmol，1.0當量)及β-胺基丙腈(化合物1，2.35 g，33.45 mmol，20.02當量)於DMA (4.0 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加K 2CO 3(0.46 g，3.34 mmol，2.0當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物兩天。在LCMS上約70%所需產物。將反應物冷卻降至室溫且用水淬滅。用CH 2Cl 2(3x100 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (5:1)溶離，得到呈淺綠色固體狀之3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺基]丙腈(化合物2，350 mg，57%)。LCMS: (ES, m/s): 333,335 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下於氮氣氛圍下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，330 mg，1.05 mmol，1.00當量)及3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺基]丙腈(化合物2，350 mg，1.05 mmol，1當量)於二噁烷(8 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加Xantphos (120 mg，0.20 mmol，0.20當量)、Pd(OAc) 2(25 mg，0.11 mmol，0.11當量)及Cs 2CO 3(860 mg，2.64 mmol，2.51當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用ACN及DCM洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (5:1)溶離，得到呈綠色固體狀之3-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基]丙腈；甲酸(化合物3，330 mg，43%)。LCMS: (ES, m/s): 609 [M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 5
在室溫下於氮氣氛圍下向3-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基]丙腈(化合物3，250 mg，0.41 mmol，1.0當量)於THF (25.00 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加三光氣(182 mg，0.61 mmol，1.5當量)。在室溫下再攪拌所得混合物30分鐘。在真空下濃縮所得混合物。將殘餘物再溶解於DCM (10 mL)中。在0℃下向上述混合物中添加N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲酸三級丁酯(化合物4，145 mg，0.37 mmol，0.9當量)及TEA (125 mg，1.23 mmol，3.0當量)。在0℃下再攪拌所得混合物10分鐘。最後，逐份添加DMAP (100 mg，0.82 mmol，2.00當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS可偵測到約10%所需產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.1% TFA)，在30分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之N-(2-氰基乙基)-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(化合物5，120 mg，28%)。LCMS: (ES, m/s): 514 [M/2+H] +, 1028 [M+H] + 步驟 4 ：合成化合物 6在0℃下於氮氣氛圍下向N-(2-氰基乙基)-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(化合物5，120 mg，0.11 mmol，1.0當量)於DCM (2.5 mL)中之經攪拌溶液中添加TFA (0.5 mL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS: (ES, m/s): 465 [M/2+H] +, 928 [M+H] + 步驟 5 ：合成化合物 212
在0℃下於氮氣氛圍下向N-(2-氰基乙基)-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(化合物6，25 mg，0.027 mmol，1當量)及戊二酸雙(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯(化合物7，10 mg，0.031 mmol，1.14當量)於DMF (2 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加DIEA (10 mg，0.077 mmol，2.87當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內20% B至40% B，40% B；波長：254 nm；RT1(min)：9.58)純化反應混合物；立即凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之4-{[(1S)-1- {[(1S)-1-{[4-({[(2-氰基乙基)(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺甲醯基}丁酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯;三氟乙酸(化合物212，6.3 mg，18%)。LCMS(ESI,m/z): 570 [M/2+H] +, 1139[M+H-TFA] +； 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 10.10 (s, 1H), 9.85 (br s, 1H), 8.53 (s, 1H), 8.49-8.22 (m, 3H), 8.04-7.90 (m, 2H), 7.63 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.41-7.39 (m, 3H), 5.33 (s, 2H), 5.17 (s, 2H), 4.94-4.93 (m, 2H), 4.78-4.76 (m, 2H), 4.67-4.38 (m, 4H), 4.28-4.19 (m, 3H), 3.68 (s, 2H), 3.39-3.26 (m, 4H), 2.97-2.88 (m, 3H), 2.81 (s, 4H), 2.68-2.65 (m, 3H), 2.29-2.10 (m, 2H), 1.98-1.60 (m, 7H), 1.31-1.24 (m, 3H), 1.07-1.04 (m, 1H), 0.88-0.82 (m, 9H)。 合成化合物 213 步驟 1 ：合成化合物 3
在0℃下於氮氣氛圍下向戊二酸(化合物1，200 mg，1.51 mmol，1當量)於DCM (10 mL)中之經攪拌混合物中添加(COCl) 2(384 mg，3.02 mmol，2當量)及DMF (3滴)。在室溫下攪拌所得混合物3小時。在減壓下濃縮所得混合物。將殘餘物再溶解於THF (5mL)中。在0℃下於氮氣氛圍下向2,3,5,6-四氟苯酚(化合物2，251 mg，1.51 mmol，1當量)及TEA (612 mg，6.05 mmol，4當量)於THF (10 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加上述混合物。在室溫下攪拌所得混合物隔夜。TLC顯示新斑點。用水(20 mL)稀釋所得混合物。用EtOAc (3 x 20 mL)萃取所得混合物。用鹽水(20 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (5:1)溶離，得到呈白色固體狀之戊二酸雙(2,3,5,6-四氟苯基)酯(化合物3，100 mg，13%)。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3): δ 7.07-6.95 (m, 2H), 2.89-2.84 (m, 4H), 2.30-2.20 (m, 2H)。 步驟 2 ：合成化合物 5
在室溫下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，0.5 g，1.67 mmol，1.0當量)及β-胺基丙腈(化合物4，2.35 g，33.45 mmol，20.02當量)於DMA (4.0 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加K 2CO 3(0.46 g，3.34 mmol，2.0當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物兩天。在LCMS上約70%所需產物。將反應物冷卻降至室溫且用水淬滅。用CH 2Cl 2(3x100 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (5:1)溶離，得到呈淺綠色固體狀之3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺基]丙腈(化合物5，350 mg，57%)。LCMS: (ES, m/s): 333,335 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 6
在室溫下於氮氣氛圍下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(化合物5，330 mg，1.05 mmol，1.00當量)及3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺基]丙腈(INT4，350 mg，1.05 mmol，1當量)於二噁烷(8 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加Xantphos (120 mg，0.20 mmol，0.20當量)、Pd(OAc) 2(25 mg，0.11 mmol，0.11當量)及Cs 2CO 3(860 mg，2.64 mmol，2.51當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用ACN及DCM洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (5:1)溶離，得到呈綠色固體狀之3-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基]丙腈；甲酸(330 mg，43%)。LCMS: (ES, m/s): 609 [M+H] + 步驟 4 ：合成化合物 8
在室溫下於氮氣氛圍下向3-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基]丙腈(化合物6，250 mg，0.41 mmol，1.0當量)於THF (25.00 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加三光氣(182 mg，0.61 mmol，1.5當量)。在室溫下再攪拌所得混合物30分鐘。在真空下濃縮所得混合物。將殘餘物再溶解於DCM (10 mL)中。在0℃下向上述混合物中添加N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲酸三級丁酯(化合物7，145 mg，0.37 mmol，0.9當量)及TEA (125 mg，1.23 mmol，3.0當量)。在0℃下再攪拌所得混合物10分鐘。最後，逐份添加DMAP (100 mg，0.82 mmol，2.00當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS可偵測到約10%所需產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.1% TFA)，在30分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之N-(2-氰基乙基)-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(化合物8，120 mg，28%)。LCMS: (ES, m/s): 514 [M/2+H] +, 1028 [M+H] + 步驟 5 ：合成化合物 9
在0℃下於氮氣氛圍下向N-(2-氰基乙基)-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(化合物8，120 mg，0.11 mmol，1.0當量)於DCM (2.5 mL)中之經攪拌溶液中添加TFA (0.5 mL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS: (ES, m/s): 465 [M/2+H] +, 928 [M+H] + 步驟 6 ：合成化合物 213
在0℃下於氮氣氛圍下向4-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(2-氰基乙基)(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺甲醯基}丁酸(25 mg，0.024 mmol，1當量)及HATU (10 mg，0.029 mmol，1.2當量)於DMF (1 mL)中之經攪拌混合物中添加HOBT (3 mg，0.024 mmol，1當量)、戊二酸雙(2,3,5,6-四氟苯基)酯(化合物3，4 mg，0.024 mmol，1當量)及DIEA (6 mg，0.048 mmol，2當量)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內22% B至45% B，在12分鐘內45% B至45% B，45% B；波長：254 nm；RT1(min)：11.59)純化反應混合物；立即凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之4-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(2-氰基乙基)(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺甲醯基}丁酸2,3,5,6-四氟苯酯;三氟乙酸(化合物213，8.3 mg，26%)。LCMS(ESI,m/z): 596 [M/2+H] +, 1190[M+H-TFA] +； 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 10.10 (s, 1H), 9.85 (br s, 1H), 8.36-7.92 (m, 6H), 7.64 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.41-7.39 (m, 2H), 5.33 (s, 2H), 5.16 (s, 2H), 4.95-4.93 (m, 2H), 4.78-4.76 (m, 2H),4.53 (s, 2H), 4.41-4.17 (m, 4H), 3.54 (s, 2H), 3.39-3.36 (m,1H), 3.25 (s, 3H), 2.99-2.73 (m, 5H), 2.55-2.50 (m, 2H), 2.31-2.17 (m, 2H), 1.99-1.62 (m, 7H), 1.32-1.04 (m, 4H), 0.89-0.83 (m, 9H)。 步驟 1. 合成化合物 2 ：
在90℃下於氮氣氛圍下將2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(INT3，1.55 g，5.18 mmol，1當量)於乙胺溶液(2.0 M，於THF中，15 mL)中之溶液攪拌隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(化合物2，798 mg，50%)。LCMS (ESI, ms): 308,310[M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下於氮氣氛圍下向6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(化合物2，200 mg，0.65 mmol，1.0當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(INT4，203 mg，0.65 mmol，1.0當量)於二噁烷(8.0 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加Xantphos (150 mg，0.26 mmol，0.4當量)、Pd(OAc) 2(58 mg，0.26 mmol，0.4當量)及Cs 2CO 3(635 mg，1.95 mmol，3.0當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫並過濾，用ACN洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% FA)，在30分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm及220 nm。在真空下濃縮所收集之級分，得到呈綠色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮；甲酸(化合物3，260 mg，61%)。LCMS: (ES, m/s): 584 [M+H] +。 1H-NMR(300MHz, DMSO-d 6): 8.25 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.41 (s, 1H), 6.62 (t, J=5.4 Hz,1H), 5.89 (s, 1H), 5.14 (s, 2H), 4.90 (d, J=6 Hz,2H), 4.78 (d, J=6 Hz,2H), 3.65 (s, 3H), 3.49 (s, 3H), 3.42-3.11 (m, 5H), 2.75-2.66 (m, 2H), 1.95-1.93 (m,1H), 1.70-1.53 (m, 4H), 1.53-1.40 (m, 1H), 1.13 (t, J=6 Hz,3H), 0.80 (d, J=3 Hz,3H)。 步驟 3 ：合成化合物 5
在室溫下向2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(化合物3，200 mg，0.34 mmol，1.00當量)於THF (5 mL)中之經攪拌溶液中添加三光氣(200 mg，0.67 mmol，1.97當量)。在室溫下再攪拌所得混合物30分鐘。在真空下濃縮所得混合物。將殘餘物再溶解於DCM (5 mL)中。在室溫下於氮氣氛圍下向上述混合物中逐份添加N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}-乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲酸三級丁酯(化合物4，200 mg，0.50 mmol，1.48當量)、TEA (200 mg，1.97 mmol，5.77當量)及DMAP (83 mg，0.68 mmol，2.0當量)。在50℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS可偵測到約20%所需產物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.1% FA)，在30分鐘內0%至70%梯度；偵測器，UV 254 nm。在真空下濃縮所收集之級分，得到呈半固體狀之N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(化合物5，100 mg，26%)。LCMS: (ES, m/s): 502 [M/2+H] +, 1003 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 6
在室溫下於氮氣氛圍下向N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(化合物5，100 mg，0.10 mmol，1.00當量)於DCM (2.00 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加TFA (0.4 mL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(化合物6，100 mg，91%)。LCMS: (ES, m/s): 903 [M+H] +, 925 [M+Na] +。 步驟 5 ：合成化合物 214
在室溫下於氮氣氛圍下向N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(100 mg，0.091 mmol，1.00當量，82%)於DMF (2 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(化合物7，32 mg，0.10 mmol，1.17當量)及DIEA (36 mg，0.28 mmol，3.06當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：Xselect Peptide CSH C18 19*150mm 5μm，1；移動相A：水(0.1%FA)，移動相B：MeOH--HPLC；流動速率：25 mL/min；梯度：在14分鐘內50% B至60% B，在16分鐘內60% B至60% B，60% B；波長：254 nm；RT1(min)：14.3)純化反應混合物；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(化合物214，5.1 mg，5%)。LCMS: (ES, m/s): 549 [M/2+H] +, 1096 [M+H] +。H-NMR (300MHz, DMSO-d 6): 10.02 (s, 1H), 8.40-8.22(m, 2H), 7.98-7.94 (m, 3H), 7.84 (d, J=8.4 Hz,1H), 7.62 (d, J=8.4 Hz,2H), 7.38 (d, J=8.4 Hz,2H), 7.23 (s, 1H), 6.99 (s, 2H), 5.18-5.13 (m, 4H), 4.94 (d, J=6 Hz,2H), 4.78 (d, J=6.3 Hz,2H), 4.35 (t, J=6.0 Hz,1H), 4.19 (t, J=6.0 Hz,1H), 3.92-3.87(m, 2H), 3.64 (s, 2H), 3.50 (s, 2H), 3.30-3.28(m, 2H), 3.19 (s, 3H), 2.75-2.60 (m, 2H), 2.27-2.10 (m, 2H), 2.08-1.89 (m, 2H), 1.70-1.44 (m, 9H), 1.35-1.15 (m, 9H), 0.92-0.80 (m, 9H)。 合成化合物 215 步驟 1 ：合成化合物 1
在90℃下於氮氣氛圍下將2,6-二氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(3 g，10.09 mmol，1當量)於2.0 M乙胺之THF溶液(30 mL)中之經攪拌溶液攪拌2天。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (12:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之6-氯-N-乙基-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-胺(2.1 g，66%)。LCMS (ESI, m/z): 306,308[M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(500 mg，1.54 mmol，1當量)於DMF (5 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加甲硫醇鈉(162 mg，2.32 mmol，1.5當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(410 mg，91%)。LCMS (ESI, m/z): 291[M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 3
在室溫下於氮氣氛圍下向6-氯-N-乙基-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-胺(1 g，3.27 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(0.95 g，3.27 mmol，1當量)於二噁烷(10 mL)中之經攪拌混合物中添加Pd(OAc) 2(0.07 g，0.32 mmol，0.1當量)及Xantphos (0.38 g，0.65 mmol，0.2當量)及Cs 2CO 3(2.13 g，6.54 mmol，2當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(360 mg，20%)。LCMS (ES, m/z): 560 [M+H] + 步驟 4 ：合成化合物 6
在室溫下於氮氣氛圍下將2-[6-(乙基胺基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(360 mg，0.64 mmol，1當量)及碳酸二-三氯甲酯(286 mg，0.96 mmol，1.5當量)於THF (32 mL)中之經攪拌溶液攪拌1小時。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物，得到粗產物4。在室溫下於氮氣氛圍下向N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲酸三級丁酯(253 mg，0.64 mmol，1當量)及TEA (195 mg，1.92 mmol，3當量)於DCM (10 mL)中之經攪拌溶液中添加含上述殘餘物(粗產物4)之DCM (3 mL)及DMAP (157 mg，1.28 mmol，2當量)。在40℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.1% TFA)，在30分鐘內5%至80%梯度；偵測器，UV 254 nm。在真空下濃縮所收集之級分並凍乾，得到呈灰白色固體狀之N-乙基-N-[6-(6-{[(3S)- 3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)- 2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(270 mg，42%)。LCMS (ESI, m/z):979[M+H] + 步驟 5 ：合成化合物 7
在0℃下向N-乙基-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(270 mg，0.27 mmol，1當量)於DCM (5 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TFA (1 mL)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物。產物未經進一步純化即用於下一步驟。LCMS (ESI, m/z):879[M+H] + 步驟 6 ：合成化合物 215
在0℃下向N-乙基-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(100 mg，0.11 mmol，1當量)及戊二酸雙(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯(44 mg，0.13 mmol，1.2當量)於DMF (2 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加DIEA (79 uL，0.45 mmol，4當量)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.1%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內24% B至49% B，49% B；波長：254 nm；RT1(min)：6.93)純化反應混合物；立即凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之4-{[(1S)-1-{[(1S)-1-({4-[({乙基[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺甲醯基)乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺甲醯基}丁酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯；三氟乙酸(46.1 mg，32%)。LCMS (ESI, m/z):1090[M+H-TFA] + 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 10.01 (m, 2H),9.62 (br s, 1H), 8.49 (s, 1H), 8.22 (d, J=6.8Hz, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.90 (d, J=8.4Hz, 1H), 7.71-7.52 (m, 5H), 7.38 (d, J= 8.4Hz, 2H), 5.14 (s, 2H), 4.94 (s, 2H), 4.42-4.37 (m, 3H), 4.21-4.19 (m, 1H), 3.98-3.97 (m, 2H), 3.40-2.35 (m, 1H), 3.32-3.25 (m, 1H), 3.20 (s, 3H), 2.81-2.77 (m, 5H), 2.70-2.62 (m, 7H), 2.25-2.50 (m, 3H), 2.49-2.48 (m, 1H), 2.32-2.28 (m, 2H), 2.00-1.90 (m, 1H), 1.86-65 (m, 6H), 1.31-1.26 (m, 6H), 1.07-1.05 (m, 4H), 0.89-0.83 (m, 9H)。 合成化合物216 步驟 1. 合成化合物 1
在90℃下於氮氣氛圍下將2,6-二氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(3 g，10.09 mmol，1當量)於2.0 M乙胺之THF溶液(30 mL)中之經攪拌溶液攪拌2天。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (12:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之6-氯-N-乙基-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-胺(2.1 g，66%)。LCMS (ESI, m/z): 306,308[M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(500 mg，1.54 mmol，1當量)於DMF (5 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加甲硫醇鈉(162 mg，2.32 mmol，1.5當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(410 mg，91%)。LCMS (ESI, m/z): 291[M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 3
在室溫下於氮氣氛圍下向6-氯-N-乙基-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-胺(1 g，3.27 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(0.95 g，3.27 mmol，1當量)於二噁烷(10 mL)中之經攪拌混合物中添加Pd(OAc) 2(0.07 g，0.32 mmol，0.1當量)及Xantphos (0.38 g，0.65 mmol，0.2當量)及Cs 2CO 3(2.13 g，6.54 mmol，2當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(360 mg，20%)。LCMS (ES, m/z): 560 [M+H] + 步驟 4 ：合成化合物 6
在室溫下於氮氣氛圍下將2-[6-(乙基胺基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(360 mg，0.64 mmol，1當量)及碳酸二-三氯甲酯(286 mg，0.96 mmol，1.5當量)於THF (32 mL)中之經攪拌溶液攪拌1小時。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物，得到粗產物4。在室溫下於氮氣氛圍下向N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲酸三級丁酯(253 mg，0.64 mmol，1當量)及TEA (195 mg，1.92 mmol，3當量)於DCM (10 mL)之經攪拌溶液中添加含上述殘餘物(粗產物4)之DCM (3 mL)及DMAP (157 mg，1.28 mmol，2當量)。在40℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.1% TFA)，在30分鐘內5%至80%梯度；偵測器，UV 254 nm。在真空下濃縮所收集之級分並凍乾，得到呈灰白色固體狀之N-乙基-N-[6-(6-{[(3S) -3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)- 2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(270 mg，42%)。LCMS (ESI, m/z):979[M+H] + 步驟 5 ：合成化合物 7
在0℃下向N-乙基-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(270 mg，0.27 mmol，1當量)於DCM (5 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TFA (1 mL)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物。產物未經進一步純化即用於下一步驟。LCMS (ESI, m/z):879 [M+H] + 步驟 6 ：合成化合物 216
在0℃下向N-乙基-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(100 mg，0.11 mmol，1當量)及6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(42 mg，0.13 mmol，1.2當量)於DMF (2 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加DIEA (79 uL，0.45 mmol，4當量)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.1%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內27% B至57% B，57% B；波長：254 nm；RT1(min)：5.13)純化反應混合物；凍乾反應混合物，得到呈白色固體狀之N-乙基-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯；三氟乙酸(61 mg，49%)。LCMS (ESI, m/z):1072 [M+H-TFA] + 1H NMR (400 MHz, CD 3OD) δ 8.76 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.64 (d, J=8.4, 2H), 7.53 (s, 1H), 7.39 (d, J=8.4Hz, 2H), 6.78 (s, 2H), 5.20 (s, 2H), 5.01 (s, 2H), 4.46-4.45 (m, 3H), 4.15-4.08 (m, 3H), 3.49-3.45 (m, 4H), 3.32 (s, 3H), 2.92-2.81 (m, 3H), 2.68-2.65 (m, 7H), 2.29-2.27 (m, 2H), 2.12-2.05 (m, 1H), 2.01-1.70 (m, 4H), 1.68-1.52 (m, 4H), 1.47 (d, J=6.8Hz, 3H), 1.37-1.34 (m, 6H), 1.16 (d, J=5.2Hz, 3H), 1.01-0.97 (m, 9H)。 合成化合物 217 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(0.5 g，1.67 mmol，1.0當量)及β-胺基丙腈(2.35 g，33.45 mmol，20.02當量)於DMA (4.0 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加K 2CO 3(0.46 g，3.34 mmol，2.0當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物兩天。在LCMS上約70%所需產物。將反應物冷卻降至室溫且用水淬滅。用CH 2Cl 2(3x100 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (5:1)溶離，得到呈淺綠色固體狀之3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺基]丙腈(350 mg，57%)。LCMS: (ES, m/s): 333,335 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下於氮氣氛圍下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(330 mg，1.05 mmol，1.00當量)及3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺基]丙腈(350 mg，1.05 mmol，1當量)於二噁烷(8 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加Xantphos (120 mg，0.20 mmol，0.20當量)、Pd(OAc) 2(25 mg，0.11 mmol，0.11當量)及Cs 2CO 3(860 mg，2.64 mmol，2.51當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用ACN及DCM洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (5:1)溶離，得到呈綠色固體狀之3-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基]丙腈；甲酸(330 mg，43%)。LCMS: (ES, m/s): 609 [M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 4
在50℃下將3-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基]丙腈(950 mg，1.56 mmol，1當量)、Boc 2O (1.36 g，6.24 mmol，4當量)、TEA (790 mg，7.80 mmol，5當量)及DMAP (95 mg，0.78 mmol，0.5當量)於THF (15 mL)中之混合物攪拌3小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.1% TFA及ACN之水(在50分鐘內0%至100%梯度)；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之N-(2-氰基乙基)-N-(4-{3- [(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸三級丁酯(600 mg，54%)。LCMS (ESI, m/z): 709 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 5
在0℃下向N-(2-氰基乙基)-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸三級丁酯(550 mg，0.77 mmol，1當量)及KI (260 mg，1.55 mmol，2當量)於DMF (5 mL)中之混合物中添加含4-{[4-(氯甲基)苯基]胺磺醯基}-N-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]-3-硝基苯甲醯胺(380 mg，0.77 mmol，1當量)之DMF (2 mL)。在25℃下攪拌所得混合物16小時。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應系統：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.1% TFA及ACN之水(在50分鐘內0%至100%梯度)；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之(3S)-1-[(2-{6-[(三級丁氧基羰基)(2-氰基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-{[4-(4-{[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]胺甲醯基}-2-硝基苯磺醯胺基)苯基]甲基}-3-甲基哌啶-1-鎓(200 mg，22%)。LCMS (ESI, m/z): 1165 [M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 217
在25℃下向(3S)-1-[(2-{6-[(三級丁氧基羰基)(2-氰基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-{[4-(4-{[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]胺甲醯基}-2-硝基苯磺醯胺基)苯基]甲基}-3-甲基哌啶-1-鎓(190 mg，0.16 mmol，1當量)於DCM (7.5 mL)中之混合物中添加TFA (1.5 mL)。在25℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。藉由製備型HPLC用以下條件純化殘餘物：管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.1%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內18% B至48% B，48% B；波長：254 nm；RT1(min)：5；凍乾收集物，得到呈灰白色固體狀之(3S)-1-[(2-{6-[(2-氰基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-{[4-(4-{[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]胺甲醯基}-2-硝基苯磺醯胺基)苯基]甲基}-3-甲基哌啶-1-鎓；三氟乙酸(84.9 mg，42%)。LCMS (ES, m/z): 1065 [M+H-TFA] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.06 (s, 1H), 10.04 (br s, 1H), 9.91 (s, 1H), 9.00 (t, J= 6.0 Hz, 1H), 8.28-8.19 (m, 3H), 8.08 (s, 2H), 7.50 (s, 1H), 7.37-7.30 (m, 2H), 7.21-7.10 (m, 3H), 7.01 (s, 2H), 6.27 (s, 1H), 5.47 (s, 2H), 5.28 (s, 2H), 4.83-4.79 (m, 4H), 4.54 (s, 2H), 3.75 (s, 2H), 3.63-3.50 (m, 7H), 3.41-3.25 (m, 4H), 2.90-2.81 (m, 3H), 2.68-2.55 (m, 1H), 1.86-1.64 (m, 4H), 1.08-1.03 (m, 1H), 0.88 (d, J= 6.4 Hz, 3H)。 合成化合物 218 步驟 1 ：合成化合物 3
在0℃下於氮氣氛圍下向4-氟-3-硝基苯甲酸甲酯(25 g，125.54 mmol，1當量)及K 2CO 3(34.70 g，251.08 mmol，2當量)於DMF (200 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加苯甲基硫醇(31.18 g，251.08 mmol，2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。在0℃下藉由添加水/冰(500mL)淬滅反應物。藉由過濾收集沈澱之固體且用PE (3x300 mL)洗滌。在紅外光下乾燥所得固體。此得到呈綠色固體狀之4-(苯甲基硫烷基)-3-硝基苯甲酸甲酯(34 g，89%)。LCMS (ES, m/z): 304 [M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 4
在0℃下於氮氣氛圍下向4-(苯甲基硫烷基)-3-硝基苯甲酸甲酯(25 g，82.42 mmol，1當量)於DCM (500 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加HCl (水溶液，6N，500 mL)及NaClO (13%，250 mL)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在0℃下用水/冰淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 500mL)萃取所得混合物。用鹽水(3x500 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈黃色固體狀之4-(氯磺醯基)-3-硝基苯甲酸甲酯(10 g，43%)。LCMS (ES, m/z): 260 [M-H-H 2O] - 步驟 3 ：合成化合物 5
在0℃下於氮氣氛圍下向對胺基苯甲醇(5.28 g，42.91 mmol，1.2當量)於DCM (100 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加吡啶(5.66 g，71.52 mmol，2當量)及4-(氯磺醯基)-3-硝基苯甲酸甲酯(10 g，35.76 mmol，1當量)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。LCMS指示反應完成。在0℃下用水/冰淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 100mL)萃取所得混合物。用鹽水(3x100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。此得到呈紅色固體狀之4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲酸甲酯(9 g，68%)。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS (ES, m/z): 349 [M+H-H 2O] + 步驟 4 ：合成化合物 6
在0℃下於氮氣氛圍下向4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲酸甲酯(7.5 g，20.47 mmol，1當量)於THF (750 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加LiOH (0.98 g，40.94 mmol，2當量)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。用濃HCl將混合物酸化至pH=3。藉由逆相急驟層析用以下條件純化所得混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05% TFA)，在10分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈紅色固體狀之4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲酸(3 g，42%)。LCMS (ES, m/z): 335 [M+H-H 2O] + 步驟 5 ：合成化合物 7
在0℃下於氮氣氛圍下向4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲酸(1.5 g，4.25 mmol，1當量)於DMF (15 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加HATU (2.43 g，6.38 mmol，1.5當量)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在0℃下向上述混合物中逐滴添加1-(2-胺基乙基)吡咯-2,5-二酮(0.72 g，5.108 mmol，1.2當量)及DIEA (1.64 g，12.75 mmol，3當量)。在室溫下再攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈棕色固體狀之N-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]-4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲醯胺(0.8 g，40%)。LCMS (ES, m/z): 457 [M+ H-H 2O] + 步驟 6 ：合成化合物 8
在0℃下向N-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]-4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲醯胺(150 mg，0.32 mmol，1當量)及DMF (0.1 mL，1.29 mmol，4.09當量)於THF (3 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加含SOCl 2(75 mg，0.63 mmol，2當量)之THF (0.05 mL)。在0℃下攪拌所得混合物30分鐘。LCMS指示反應完成。接著將水(3 mL)添加至上述混合物中且凍乾所得混合物，得到呈黃色固體狀之粗物質4-{[4-(氯甲基)苯基]胺磺醯基}-N-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]-3-硝基苯甲醯胺(170 mg，粗物質)。LCMS (ESI, m/z): 457 [M+H-HCl] +。 步驟 7 ：合成化合物 9
在室溫下於空氣氛圍下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(200 mg，0.61 mmol，1當量)於DMF (3 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加(甲基硫烷基)鈉(216 mg，3.09 mmol，5當量)。在室溫下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05%TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(80 mg，44%)。LCMS (ES, m/z): 291 [M+H] + 步驟 8 ：合成化合物 10
在90℃下於氮氣氛圍下將2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(800 mg，2.67 mmol，1當量)於乙胺溶液(2.0 M，於THF中，10 mL)中之經攪拌溶液攪拌隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫且在真空下濃縮至乾。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(450 mg，54%)。LCMS (ES, m/z): 308,310 [M+H] + 步驟 9 ：合成化合物 11
在室溫下於氮氣氛圍下向6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(65 mg，0.21 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(61 mg，0.21 mmol，1當量)於二噁烷(1 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(137 mg，0.42 mmol，2當量)且逐份添加Xantphos (24 mg，0.04 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(5 mg，0.02 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。過濾所得混合物，用DCM (3x20 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(45 mg，粗物質)。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Prep Phenyl OBD管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內25% B至55% B，55% B；波長：254 nm；RT1(min)：5.5)再純化粗產物(45mg)；凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(30.1 mg，24%)。LCMS (ES, m/z): 562 [M+H] + 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 9.66 (br s, 1H), 8.61 (s, 1H), 7.75-7.68 (m, 2H), 7.37 (s, 1H), 5.96 (s, 1H), 4.90-4.88(m, 4H), 4.80-4.78 (m, 2H), 4.43-4.42 (m, 2H), 3.57 (s, 2H), 3.38-3.32 (m, 1H), 3.30-3.21 (m, 6H), 2.84-2.81 (m, 1H), 2.64-2.51 (m, 4H), 1.86-1.63 (m, 4H), 1.16-1.04 (m, 4H), 0.94-0.88 (m, 3H) 步驟 10 ：合成化合物 218
在0℃下向2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(100 mg，0.178 mmol，1當量)及KI (59 mg，0.356 mmol，2當量)於DMF (1 mL)中之混合物中逐滴添加含4-{[4-(氯甲基)苯基]胺磺醯基}-N-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]-3-硝基苯甲醯胺(87 mg，0.178 mmol，1當量)之DMF (1 mL)。在25℃下攪拌所得混合物16小時。LCMS指示反應完成。藉由製備型HPLC用以下條件純化反應物：管柱：XBridge Prep OBD C18管柱，30*150 mm，5μm；移動相A：水(0.1%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min；梯度：在7分鐘內27% B至57% B，57% B；波長：254 nm；RT1(min)：5；操作次數：0。凍乾所收集之級分。將此批與下一批合併，得到呈黃色固體狀之N-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]-4-[(4-{[乙基(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基]甲基}苯基)胺磺醯基]-3-硝基苯甲醯胺(14.1 mg，15%)。LCMS (ESI, m/z): 1018 [M+H] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.78 (s, 1H), 9.65 (br s, 1H), 8.96 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 8.37 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 8.06-7.98 (m, 2H), 7.73-7.65 (m, 2H), 7.42 (s, 1H), 7.19-7.17 (m, 2H), 7.11-7.07 (m, 2H), 7.00 (s, 2H), 6.01 (s, 1H), 4.88 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.78 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.71 (s, 2H), 4.60 (s, 2H), 4.41 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 3.58-3.49 (m, 4H), 3.47-3.32 (m, 5H), 3.31-3.24(m, 1H), 3.17(s, 3H), 2.87-2.84 (m, 1H), 2.61-2.56 (m, 4H), 1.86-1.63 (m, 4H), 1.07-1.00 (m, 4H), 0.88 (d, J = 6.5 Hz, 3H)。 合成化合物 219 步驟 1. 合成化合物 2
在25℃下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(200 mg，0.62 mmol，1當量)於DMF (3 mL)中之經攪拌溶液中添加(甲基硫烷基)鈉(93 mg，0.93 mmol，1.5當量)。在90℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(80 mg，44%)。LCMS: (ES.m/z): 291 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 4
在90℃下將2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(1.3 g，4.34 mmol，1當量)於乙胺溶液(2.0 M，於THF中，13 mL)中之經攪拌溶液攪拌隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(440 mg，33%)。LCMS (ESI, ms): 308,310 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 5
在25℃下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(238 mg，0.82 mmol，1.0當量)及6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(250 mg，0.82 mmol，1.0當量)於二噁烷(4 mL)中之經攪拌混合物中添加Xantphos (94 mg，0.16 mmol，0.2當量)、Cs 2CO 3(530 mg，1.64 mmol，2當量)及Pd(OAc) 2(16 mg，0.082 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.1% TFA及ACN之水(在50分鐘內5%至95%梯度)；偵測器，UV 254 nm。凍乾溶離物，得到呈黃色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(230 mg，50%)。LCMS (ESI, m/z): 562 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 8
在室溫下於氮氣氛圍下向2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(900 mg，1.60 mmol，1當量)於THF (80 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加三光氣(713 mg，2.40 mmol，1.5當量)。在室溫下再攪拌所得混合物30分鐘。在真空下濃縮所得混合物。在0℃下向上述混合物中添加含N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲酸三級丁酯(630 mg，1.60 mmol，1當量)之DCM (20 mL)，添加TEA (486.37 mg，4.806 mmol，3當量)。在0℃下再攪拌所得混合物10分鐘。最後，逐份添加DMAP (391 mg，3.20 mmol，2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS可偵測到約10%所需產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.1% TFA)，在10分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(180 mg，10%)。LCMS: (ES, m/s): 981 [M+H]+。 步驟 5 ：合成化合物 9
在25℃下向N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(180 mg，0.18 mmol，1當量)於DCM (7.5 mL)中之混合物中添加TFA (1.5 mL)。在25℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。凍乾殘餘物，得到呈棕色固體狀之粗物質N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(180 mg，粗物質)。LCMS (ESI, m/z): 881 [M+H] + 步驟 6. 合成化合物 219
在0℃下於氮氣氛圍下向N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(170 mg，0.19 mmol，1當量)及戊二酸雙(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯(75 mg，0.23 mmol，1.19當量)於DMF (1 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加DIEA (100 mg，0.77 mmol，4.01當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Prep OBD C18管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.1%FA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內35% B至65% B，65% B；波長：254 nm；RT1(min)：8.2)純化反應混合物；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之4-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[乙基(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺甲醯基}丁酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯；三氟乙酸(11 mg，4%)。LCMS:(ms,ESI) 1092[M+H-TFA] + 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.00 (s, 1H), 8.32-8.18 (m, 2H), 7.96 (s, 1H), 7.89-7.87 (m, 1H), 7.62 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.48 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.19 (s, 1H), 5.14 (s, 2H),4.93-4.76 (m, 6H), 4.40-4.38 (m, 2H), 4.19-4.15 (m, 2H), 3.92-3.90 (m, 2H), 3.19 (s, 3H), 2.82 (s, 1H), 2.78-2.66 (m, 3H), 2.59-2.56 (m, 6H), 2.37-2.09 (m, 4H), 2.04-1.82 (m, 3H), 1.78 -1.42 (m, 7H), 1.31 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 1.22 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 0.93 - 0.75 (m, 10H)。 合成化合物220 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(5 g，16.82 mmol，1當量)於DMA (50 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加K 2CO 3(4.65 g，33.65 mmol，2當量)及β-胺基丙腈(23.59 g，336.50 mmol，20當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色固體狀之3-({6-氯-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}胺基)丙腈(3 g，54%)。LCMS:(ESI. m/z):331,333 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 2-1
在室溫下於氮氣氛圍下向3-({6-氯-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}胺基)丙腈(2.5 g，7.55 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(2.60 g，8.31 mmol，1.1當量)於二噁烷(50 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(4.92 g，15.11 mmol，2當量)及Pd(OAc) 2(0.17 g，0.75 mmol，0.1當量)及Xantphos (0.87 g，1.51 mmol，0.2當量)。在100℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1.5小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之3-{[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基}丙腈(1.3 g，28%)。LCMS:(ESI.m/z):607[M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 3
在室溫下於氮氣氛圍下向3-{[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基}丙腈(400 mg，0.66 mmol，1當量)於THF (45 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加三光氣(293 mg，0.99 mmol，1.5當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物，得到呈黃色固體狀之N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺甲醯氯(420 mg)。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS:(ESI.m/z):669[M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 5
在室溫下於空氣氛圍下向N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺甲醯氯(400 mg，0.598 mmol，1當量)及N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲酸三級丁酯(258 mg，0.65 mmol，1.1當量)於DCM (10 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加TEA (181 mg，1.79 mmol，3當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在室溫下向上述混合物中逐份添加N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺甲醯氯(420 mg，粗物質)及DMAP (146 mg，1.19 mmol，2當量)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在30分鐘內0%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(300 mg，兩個步驟48%)。LCMS:(ESI.m/z):1026[M+H] +, 514[M+H] +/2。 步驟 5 ：合成化合物 6
在0℃下於空氣氛圍下向N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(340 mg，0.33 mmol，1當量)於DCM (7 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TFA (1.5 mL)。在0℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。此得到呈黃色油狀之N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(300 mg，97%)。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS: (ESI.m/z):926[M+H] +。 步驟 6 ：合成化合物 220在0℃下於空氣氛圍下向N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(150 mg，0.16 mmol，1當量)及戊二酸雙(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯(79 mg，0.24 mmol，1.5當量)於DMF (3 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加DIEA (83 mg，0.65 mmol，4當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Prep OBD C18管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.1%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內35% B至65% B，65% B；波長：254 nm；RT1(min)：4.93)純化反應混合物；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之4-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-({[(2-氰基乙基)[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺甲醯基}丁酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯；三氟乙酸(27 mg，13%)。LCMS:(ESI.m/z): 1137.5[M+H-TFA] +, 569.5[M+H-TFA] +/2。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 10.02 (s, 1H), 9.84 (br s, 1H), 8.53-8.48 (m, 1H), 8.28-8.15 (m, 4H), 7.92-7.90 (d, J=8Hz, 1H),7.64-7.61 (m, 3H), 7.41 (d, J=8Hz, 2H), 5.35 (s, 2H), 5.17 (s, 2H), 4.53-4.50 (m, 2H), 4.40-4.37 (m, 1H), 4.30-4.19 (m, 3H), 3.50-3.26 (m, 2H), 3.19 (s, 3H),3.01-2.98 (m, 2H), 2.81 (s, 5H), 2.74-2.51 (m, 6H), 2.49-2.42 (m, 1H), 2.32-2.29 (m, 3H), 2.02-1.90 (m, 1H),1.87-1.57 (m, 6H), 1.31 (d, J=8Hz, 3H), 1.06-1.05 (m, 4H), 0.88-0.83 (m, 9H)。 合成化合物 221 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(5 g，16.82 mmol，1當量)於DMA (50 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加K 2CO 3(4.65 g，33.65 mmol，2當量)及β-胺基丙腈(23.59 g，336.50 mmol，20當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色固體狀之3-({6-氯-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}胺基)丙腈(3 g，54%)。LCMS:(ESI. m/z):331,333 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 2-1
在室溫下於氮氣氛圍下向3-({6-氯-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}胺基)丙腈(2.5 g，7.55 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(2.60 g，8.31 mmol，1.1當量)於二噁烷(50 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(4.92 g，15.11 mmol，2當量)及Pd(OAc) 2(0.17 g，0.75 mmol，0.1當量)及Xantphos (0.87 g，1.51 mmol，0.2當量)。在100℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1.5小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之3-{[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基}丙腈(1.3 g，28%)。LCMS:(ESI.m/z):607[M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 3
在室溫下於氮氣氛圍下向3-{[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基}丙腈(400 mg，0.66 mmol，1當量)於THF (45 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加三光氣(293 mg，0.99 mmol，1.5當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物，得到呈黃色固體狀之N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺甲醯氯(420 mg)。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS:(ESI.m/z):669[M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 5
在室溫下於空氣氛圍下向N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲酸三級丁酯(258 mg，0.65 mmol，1.1當量)於DCM (10 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加TEA (181 mg，1.79 mmol，3當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在室溫下向上述混合物中逐份添加N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺甲醯氯(420 mg，粗物質)及DMAP (146 mg，1.19 mmol，2當量)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在30分鐘內0%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(300 mg，兩個步驟48%)。LCMS:(ESI.m/z):1026[M+H] +, 514[M+H] +/2。 步驟 5 ：合成化合物 6
在0℃下於空氣氛圍下向N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(340 mg，0.33 mmol，1當量)於DCM (7 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TFA (1.5 mL)。在0℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。此得到呈黃色油狀之N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(300 mg，97%)。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS: (ESI.m/z): 926 [M+H] +。 步驟 6 ：合成化合物 221
在0℃下向N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(150 mg，0.16 mmol，1當量)及6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(75 mg，0.24 mmol，1.5當量)於DMF (3 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加DIEA (84 mg，0.64 mmol，4當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.1%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內28% B至50% B，50% B；波長：254 nm；RT1(min)：7.97)純化反應混合物；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之三氟乙酸；N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(60.1 mg，29%)。LCMS: (ESI.m/z): 1119 [M+H-TFA] +, 560[M+H-TFA] +/2。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 10.01 (m, 2H), 8.68 (m, 1H), 8.28-8.16 (m, 4H), 7.83-7.81 (d, J=8Hz, 1H), 7.70-7.62 (m, 3H),7.41-7.39 (m, 2H), 7.00 (s, 2H), 5.35 (s, 2H), 5.17 (s, 2H), 4.53 (s, 2H), 4.40-4.15 (m, 4H), 3.38-3.34 (m, 3H), 3.29-3.22 (m, 4H), 3.01-2.98 (m, 2H),2.75-2.51 (m, 6H), 2.44-2.42 (m, 1H), 2.18-1.96 (m, 3H), 1.94-1.72 (m, 4H), 1.51-1.43 (m, 4H), 1.31-1.29 (m, 3H), 1.22-1.18 (m, 2H), 1.16-1.05 (m, 4H), 0.89-0.81 (m, 9H)。 合成化合物 222 步驟 1 ：合成化合物 2
在25℃下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(200 mg，0.62 mmol，1當量)於DMF (3 mL)中之經攪拌溶液中添加(甲基硫烷基)鈉(93 mg，0.93 mmol，1.5當量)。在90℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(80 mg，44%)。LCMS: (ES.m/z): 291 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 4
在90℃下將2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(1.3 g，4.34 mmol，1當量)於乙胺溶液(2.0 M，於THF中，13 mL)中之經攪拌溶液攪拌隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(440 mg，33%)。LCMS (ESI, ms): 308,310 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 5
在25℃下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(238 mg，0.82 mmol，1.0當量)及6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(250 mg，0.82 mmol，1.0當量)於二噁烷(4 mL)中之經攪拌混合物中添加Xantphos (94 mg，0.16 mmol，0.2當量)、Cs 2CO 3(530 mg，1.64 mmol，2當量)及Pd(OAc) 2(16 mg，0.082 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.1% TFA及ACN之水(在50分鐘內5%至95%梯度)；偵測器，UV 254 nm。凍乾溶離物，得到呈黃色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(230 mg，50%)。LCMS (ESI, m/z): 562 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 8
在室溫下於氮氣氛圍下向2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(900 mg，1.60 mmol，1當量)於THF (80 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加三光氣(713 mg，2.40 mmol，1.5當量)。在室溫下再攪拌所得混合物30分鐘。在真空下濃縮所得混合物。在0℃下向上述混合物中添加含N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲酸三級丁酯(630 mg，1.60 mmol，1當量)之DCM (20 mL)，添加TEA (486.37 mg，4.806 mmol，3當量)。在0℃下再攪拌所得混合物10分鐘。最後，逐份添加DMAP (391 mg，3.20 mmol，2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS可偵測到約10%所需產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.1% TFA)，在10分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(180 mg，10%)。LCMS: (ES, m/s): 981 [M+H]+。 步驟 5 ：合成化合物 9
在25℃下向N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(180 mg，0.18 mmol，1當量)於DCM (7.5 mL)中之混合物中添加TFA (1.5 mL)。在25℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。凍乾殘餘物，得到呈棕色固體狀之粗物質N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(180 mg，粗物質)。LCMS (ESI, m/z): 881 [M+H] + 步驟 6 ：合成化合物 222
在25℃下將N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(160 mg，0.18 mmol，1.0當量)、DIEA (117 mg，0.91 mmol，5當量)及6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(56 mg，0.18 mmol，1.0當量)於DMF (3 mL)中之混合物攪拌1小時。LCMS指示反應完成。藉由製備型HPLC用以下條件純化反應混合物：管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在12分鐘內16% B至48% B，48% B；波長：254 nm；RT1(min)：11.53；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之三氟乙酸；N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(17.1 mg，8%)。LCMS (ESI, m/z): 1074 [M+H-TFA] + 1H NMR (400 MHz, 甲醇-d 4) δ 8.29 (s, 1H) 7.98 (s, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.66-7.63 (m, 3H), 7.42-7.40 (m, 2H), 7.16 (s, 1H), 6.79 (s, 2H), 5.21 (s, 2H), 5.07-4.96 (m, 6H), 4.50-4.43 (m, 3H), 4.15 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 4.10-4.05 (m, 2H), 3.63 (s, 2H), 3.52-3.48 (m, 4H), 3.18 (s, 3H), 3.000-2.95 (m, 1H), 2.73-2.69 (m, 1H), 2.62 (s, 3H), 2.29 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.12-2.08 (m, 1H), 2.02-1.74 (m, 4H), 1.70-1.53 (m, 4H), 1.46 (d, J= 7.1 Hz, 3H), 1.36-1.20 (m, 6H), 1.02-0.97 (m, 9H)。 合成化合物223 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(1.05 g，3.52 mmol，1.10當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(1 g，3.20 mmol，1.00當量)於二噁烷(10 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(2.09 g，6.40 mmol，2當量)及Xantphos (0.37 g，0.64 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(112 mg，0.50 mmol，0.15當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用CH 2Cl 2(3x20 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈綠色固體狀之2-(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(630 mg，29%)。LCMS:(ES.m/z):575,577[M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 2-1
在室溫下向2-(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(100 mg，0.17 mmol，1當量)及2-疊氮基乙胺(22 mg，0.26 mmol，1.5當量)於二噁烷(1 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(113 mg，0.34 mmol，2當量)及Xantphos (20 mg，0.03 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(4 mg，0.02 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1.5小時。LCMS指示在LCMS上有50%產物。過濾所得混合物，用DCM (3x50 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到2-{6-[(2-疊氮基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(30 mg，粗物質)。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內20% B至35% B，35% B；波長：254 nm；RT1(min)：8.77)純化粗產物(30 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之2-{6-[(2-疊氮基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(8.5 mg，8%)。LCMS:(ES.m/z):625[M+H] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 9.81 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 8.27-8.19 (m, 2H), 7.44 (s, 1H), 6.98 (br s, 1H), 6.07 (s, 1H), 5.24 (s, 2H), 4.91-4.85 (m, 2H), 4.79-4.67 (m, 2H), 4.52 (s, 2H), 3.55 (s, 1H), 3.49-3.48 (m, 4H), 3.39-3.36 (m, 1H), 3.29-3.21 (m, 4H), 2.86-2.84 (m, 1H), 2.63-2.56 (m, 1H), 2.49-2.48 (m, 1H), 1.85-1.62 (m, 4H), 1.10-1.12 (m, 1H), 0.94 (d, J=5.6Hz, 3H)。 步驟 3 ：合成化合物 3
在50℃下將2-{6-[(2-疊氮基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(100 mg，0.16 mmol，1.0當量)、(2S,3S,4S, 5R,6S)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-[2-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-(氯甲基)苯氧基]環氧乙烷-2-甲酸甲酯(103 mg，0.16 mmol，1.0當量)及碘化鉀(53 mg，0.32 mmol，2.0當量)於丙酮(2 mL)中之混合物攪拌4小時。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.1% TFA及ACN之水(在30分鐘內0%至100%梯度)；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色固體狀之(3S)-1-[(2-{6-[(2-疊氮基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-{[3-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-(甲氧基羰基)環氧乙烷-2-基]氧基}苯基]甲基}-3-甲基哌啶-1-鎓(95 mg，48%)。LCMS (ESI, m/z): 1233.50 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 4
向(3S)-1-[(2-{6-[(2-疊氮基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-{[3-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-{[(2S,3R,4S,5S, 6S)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-(甲氧基羰基)環氧乙烷-2-基]氧基}苯基]甲基}-3-甲基哌啶-1-鎓(90 mg，0.073 mmol，1.0當量)於MeOH (2 mL)中之混合物中添加氫氧化鋰(14 mg，0.58 mmol，8.0當量)。在25℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。濃縮反應物，得到呈白色固體狀之粗物質(3S)-1-[(2-{6-[(2-疊氮基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-{[3-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-基]氧基}苯基]甲基}-3-甲基哌啶-1-鎓(125 mg，粗物質)。LCMS (ESI, m/z): 1121.40 [M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 5
在25℃下向粗物質(3S)-1-[(2-{6-[(2-疊氮基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-{[3-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-基]氧基}苯基]甲基}-3-甲基哌啶-1-鎓(115 mg，0.105 mmol，1.0當量)於DCM (2.5 mL)中之混合物中添加TFA (0.5 mL)。在25℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。用以下條件純化殘餘物：管柱：XBridge Prep OBD C18管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.1%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在12分鐘內12% B至38% B，38% B；波長：254 nm；RT1(min)：10.53；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之(3S)-1-({3-[(2-胺基乙基)胺甲醯基]-4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-基]氧基}苯基}甲基)-1-[(2-{6-[(2-疊氮基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-3-甲基哌啶-1-鎓(15 mg，14%)。LCMS (ES, m/z): 1209.30 [M+H] +。 步驟 6 ：合成化合物 223
在0℃下向(3S)-1-({3-[(2-胺基乙基)胺甲醯基]-4-{[(2S,3R,4S,5S, 6S)-6-羧基-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-基]氧基}苯基}甲基)-1-[(2-{6-[(2-疊氮基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-3-甲基哌啶-1-鎓(12 mg，0.012 mmol，1.0當量)及DIEA (5 mg，0.036 mmol，3.0當量)於DMF (0.5 mL)中之混合物中添加戊二酸雙(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯(6 mg，0.018 mmol，1.5當量)。在25℃下攪拌所得物質2小時。LCMS指示反應完成。藉由製備型HPLC用以下條件純化反應系統：管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.1%TFA)，移動相B：MeOH--HPLC；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內33% B至63% B，63% B；波長：254 nm；RT1(min)：4.9；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之(3S)-1-[(2-{6-[(2-疊氮基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-[(4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-基]氧基}-3-[(2-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯胺基}乙基)胺甲醯基]苯基)甲基]-3-甲基哌啶-1-鎓；三氟乙酸(1.4 mg，7.93%)。LCMS (ESI, m/z): 1204.40 [M+H-TFA] +。 1H NMR (400 MHz, 甲醇-d 4) δ 8.31 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.60-7.56 (m, 1H), 7.43 (d, J= 8.6 Hz, 1H), 7.05 (d, J= 1.2 Hz, 1H), 6.21 (s, 1H), 5.61 (s, 2H), 5.27 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 5.10 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 4.99-4.91 (m, 5H), 4.61 (s, 2H), 4.04 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 3.81 (s, 2H), 3.66-3.58 (m, 3H), 3.57-3.42 (m, 10H), 3.42-3.38 (m, 2JH), 2.91 (s, 3H), 2.84-2.78 (m, 4H), 2.61 (t, J= 8.0 Hz, 2H), 2.31 (t, J= 8.0 Hz, 2H), 2.01-1.80 (m, 6H), 1.32-1.20 (m, 1H), 1.02-1.00 (m, 4H)。 合成化合物 224 步驟 1. 合成化合物 1
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(300 mg，0.92 mmol，1當量)於DMA (3 mL)中之經攪拌溶液中添加甲硫醇鈉(97 mg，1.39 mmol，1.5當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈灰白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(210 mg，77%)。LCMS (ESI, m/z):291[M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下於氮氣氛圍下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(210 mg，0.72 mmol，1當量)及6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(222 mg，0.72 mmol，1當量)於二噁烷(6 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(471 mg，1.44 mmol，2當量)、Xantphos (83 mg，0.145 mmol，0.2當量)及Pd(OAC) 2(16.23 mg，0.072 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.1% TFA)，在10分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈黃色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(110 mg，27%)。LCMS (ESI, m/z):562[M+H] + 步驟 3. 合成化合物 4
在室溫下於氮氣氛圍下向2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(110 mg，0.19 mmol，1當量)於DMA (2 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加甲硫醇鈉(68 mg，0.98 mmol，5當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈黃色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-硫烷基-3H-異吲哚-1-酮(55 mg，49%)。LCMS (ESI, m/z):548[M+H]+ 步驟 4. 合成化合物 224
在室溫下於氮氣氛圍下向2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-硫烷基-3H-異吲哚-1-酮(50 mg，0.091 mmol，1當量)及3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(34 mg，0.11 mmol，1.2當量)於DMF (500 uL)中之經攪拌溶液中逐滴添加。LCMS指示反應完成。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.1%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內15% B至37% B，37% B；波長：254 nm；RT1(min)：7.88)純化反應混合物；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之3-({2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-3H-異吲哚-4-基}二硫烷基)丙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(2.3 mg，3.36%)。LCMS (ESI, m/z):749[M+H-TFA] + 1H NMR (400 MHz, CD 3OD) δ 8.80-8.60(m, 1H), 8.13(s, 1H), 7.90(s, 1H), 7.20(s, 1H), 5.96(br s, 1H), 5.17-5.15(m, 2H), 5.02(s, 4H), 4.49(s, 2H), 3.74(s, 2H), 3.52-3.36(m, 4H), 3.23-3.11(m, 4H), 2.95-2.86(m, 1H), 2.82-2.80(m, 4H), 2.79-2.74(m, 2H), 1.97-1.74(m, 4H), 1.28-1.15(m, 4H), 1.02-1.00(m, 3H)。 合成化合物 225 步驟 1 ：合成化合物 2
在0℃下於空氣氛圍下向N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲酸三級丁酯(400 mg，1.01 mmol，1當量)於DCM (5 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加HCl (g，4N，於二噁烷中，1 mL)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。將殘餘物再溶解於DCM (5 mL)中且在減壓下濃縮。粗產物混合物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS:(ES.m/z):294[M+1] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在0℃下向(2S)-2-胺基-N-[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]-3-甲基丁醯胺(400 mg，1.36 mmol，1當量)及6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(504 mg，1.63 mmol，1.2當量)於DMF (5 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加DIEA (352 mg，2.72 mmol，2當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物12小時。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，矽膠；移動相，含ACN之水(0.05%TFA)，在30分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色固體狀之6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]己醯胺(165 mg，24%)。LCMS: (ES.m/z): 487 [M+1] +。 步驟 3 ：合成化合物 4
在0℃下於氮氣氛圍下向6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)-N-[(1S)-1- {[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]己醯胺(1.9 g，3.90 mmol，1當量)於DCM (19 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加SOCl 2(0.93 g，7.81 mmol，2當量)。在0℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈白色固體狀之N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(氯甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺(1 g，48%)。LCMS:(ES.m/z):505,507[M+1] +。 步驟 4 ：合成化合物 225
在室溫下向N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(氯甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]-6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺(200 mg，0.39 mmol，1當量)及2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(200 mg，0.33 mmol，0.84當量)於丙酮(8 mL)中之經攪拌混合物中添加KI (120 mg，0.72 mmol，1.83當量)。在50℃下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應有20%產物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.1% TFA)，在30分鐘內3%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Prep C18 OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在13分鐘內30% B至51% B，在14分鐘內51% B至51% B，51% B；波長：254 nm；RT1(min)：7.8/9.38/1)純化粗產物(100 mg)。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之(3S)-1-({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲基)-1-({2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓三氟乙酸鹽(47 mg，11%)。LCMS: (ES.m/z): 1069 [M+H-TFA] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 10.05-9.91 (m, 3H), 8.29-8.23 (m, 3H), 8.17 (d, J=6.8Hz, 1H), 7.84 (d, J=8.4Hz, 1H), 7.59(d, J=8.4Hz, 2H), 7.32 (d, J=8.4Hz, 2H),7.09-7.00 (m, 3H), 5.45 (s, 2H), 5.33 (s, 2H), 4.88-4.82 (m, 4H), 4.54 (s, 2H), 4.33 (t, J=6.8Hz, 1H), 4.15 (t, J=6.8Hz, 1H), 3.75-3.70 (m, 4H), 3.37-3.34 (m, 4H), 3.19-3.14 (m, 2H), 2.90-2.80 (m, 1H), 2.65-2.55 (m, 1H), 2.20-2.10 (m, 2H), 1.98-62 (m, 5H), 1.55-1.45 (m, 4H), 1.42-1.25 (m, 7H), 1.20-1.08 (m, 2H), 1.05-1.01 (m, 1H), 0.88-0.81 (m, 9H)。 合成化合物 226 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(1.0 g，3.34 mmol，1.0當量)及β-胺基丙腈(4.69 g，66.90 mmol，20.0當量)於DMA (4.0 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加K 2CO 3(0.92 g，6.68 mmol，2.0當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物兩天。藉由LCMS可偵測到約70%所需產物。將反應物冷卻至室溫且在室溫下用水淬滅。用CH 2Cl 2(3x100 mL)萃取水層。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (5:1)溶離，得到呈淺綠色固體狀之3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺基]丙腈(600 mg，49%)。LCMS: (ES, m/s): 333,335 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下於氮氣氛圍下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(187 mg，0.60 mmol，1.0當量)及3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺基]丙腈(200 mg，0.60 mmol，1.0當量)於二噁烷(8.0 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加Xantphos (139 mg，0.24 mmol，0.4當量)、Pd(OAc) 2(54 mg，0.24 mmol，0.4當量)及Cs 2CO 3(587 mg，1.80 mmol，3.0當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。過濾所得混合物，用ACN及DCM洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (5:1)溶離，得到呈綠色固體狀之3-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基]丙腈；甲酸(220 mg，53%)。LCMS: (ES,m/s): 609 [M+H] +, 631 [M+Na] +。 步驟 3 ：合成化合物 6
在0℃下向4-氟-3-硝基苯甲酸甲酯(10 g，50.21 mmol，1當量)及K 2CO 3(13.88 g，100.43 mmol，2當量)於DMF (160 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加苯甲基硫醇(12.47 g，100.43 mmol，2當量)。在25℃下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。在0℃下藉由添加水(450 mL)淬滅反應物。藉由過濾收集沈澱之固體且用水(3x150 mL)洗滌。藉由用PE (300 mL)濕磨純化固體。此得到呈黃色固體狀之4-(苯甲基硫烷基)-3-硝基苯甲酸甲酯(10 g，65%)。LCMS (ES, m/z): 304 [M+H] + 步驟 4 ：合成化合物 7
在0℃下向4-(苯甲基硫烷基)-3-硝基苯甲酸甲酯(10 g，36.32 mmol，1當量)於DCM (200 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加HCl (6N，200 mL)及NaClO (100 mL)。在0℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。用CH 2Cl 2(3 x 20 mL)萃取所得混合物。用鹽水(300 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:4)溶離，得到呈黃色固體狀之4-(氯磺醯基)-3-硝基苯甲酸甲酯(8 g，78%)。 1H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ 8.51-8.46(m, 2H), 8.38(d, J=8.1Hz, 1H), 4.06(s, 3H) 步驟 5 ：合成化合物 8
在0℃下於空氣氛圍下向4-(氯磺醯基)-3-硝基苯甲酸甲酯(1.2 g，4.29 mmol，1當量)於吡啶(12 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加對胺基苯甲醇(0.63 g，5.14 mmol，1.2當量)。在0℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。藉由LCMS發現50%所需產物。用1N HCl將混合物酸化至pH 3。藉由過濾收集沈澱之固體且用Et 2O (3x50 mL)洗滌。藉由矽膠管柱層析純化固體，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲酸甲酯(850 mg，49%)。LCMS:(ES. m/z):349[M+ H -H 2O] +。 步驟 6 ：合成化合物 9
在0℃下向4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲酸甲酯(850 mg，2.32 mmol，1當量)於THF (8 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加含LiOH (222 mg，9.28 mmol，4當量)之H 2O (4 mL)。在0℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。用1N HCl將反應混合物酸化至pH 3。藉由過濾收集沈澱之固體且用Et 2O (3x50 mL)洗滌。此得到呈黃色固體狀之4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲酸(270 mg，29%)。LCMS:(ES. m/z):335[M+ H -H 2O] +。 步驟 7 ：合成化合物 10
在0℃下於空氣氛圍下將4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲酸(1 g，2.83 mmol，1當量)及HATU (1.40 g，3.68 mmol，1.30當量)於DMF (10 mL)中之經攪拌混合物攪拌15分鐘。在0℃下向上述混合物中逐份添加1-(2-胺基乙基)吡咯-2,5-二酮(300 mg，2.14 mmol，1.00當量)且逐滴添加DIEA (1.10 g，8.51 mmol，3.00當量)。在0℃下再攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應有30%產物。在0℃下用水淬滅反應物。用EtOAc (3 x 80 mL)萃取所得混合物。用鹽水(2x30 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之N-{2-[(4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯基)甲醯胺基]乙基}胺基甲酸三級丁酯(0.8 g，510%)。LCMS:(ES.m/z):477[M+H-H 2O] +。 步驟 8 ：合成化合物 11
在0℃下於氮氣氛圍下向N-{2-[(4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯基)甲醯胺基]乙基}胺基甲酸三級丁酯(50 mg，0.10 mmol，1當量)於DCM (2.5 mL)中之經攪拌溶液中添加SOCl 2(25 mg，0.21 mmol，2.08當量)及1滴DMF。在0℃下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。平行進行反應兩次。LCMS: (ms,ESI): 477 [M+H-HCl] + 步驟 9 ：合成化合物 12
在0℃下將N-{2-[(4-{[4-(氯甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯基)甲醯胺基]乙基}胺基甲酸三級丁酯(50 mg，0.097 mmol，1當量)及3-[(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基]丙腈(55 mg，0.090 mmol，0.93當量)於丙酮(2 mL)中之溶液攪拌1小時。LCMS指示約20%所需產物。平行進行反應兩次。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.1% TFA)，在40分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈灰白色固體狀之(3S)-1-[(4-{4-[(2-胺基乙基)胺甲醯基]-2-硝基苯磺醯胺基}苯基)甲基]-1-[(2-{6-[(2-氰基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-3-甲基哌啶-1-鎓(20 mg，9%)。LCMS (ESI,ms): 985[M] + 步驟 10 ：合成化合物 226
在0℃下向(3S)-1-[(4-{4-[(2-胺基乙基)胺甲醯基]-2-硝基苯磺醯胺基}苯基)甲基]-1-[(2-{6-[(2-氰基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-3-甲基哌啶-1-鎓(20 mg，0.020 mmol，1當量)及戊二酸雙(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯(8.01 mg，0.024 mmol，1.21當量)於DMF (1 mL)中之經攪拌混合物中添加DIEA (8.00 mg，0.061 mmol，3.05當量)。在0℃下攪拌所得混合物2小時。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內20% B至37% B，37% B；波長：254 nm；RT1(min)：9.6)純化反應混合物；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之(3S)-1-[(2-{6-[(2-氰基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-[(4-{4-[(2-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯胺基}乙基)胺甲醯基]-2-硝基苯磺醯胺基}苯基)甲基]-3-甲基哌啶-1-鎓三氟乙酸鹽(5.8 mg，19%)。LCMS:(ESI, ms):1196[M-TFA] + 1H NMR (300 MHz, DMSO- d 6 ) δ 10.81(s, 1H), 10.03 (br s, 1H), 8.88 (s, 1H), 8.25-8.12 (m, 6H), 8.06-8.03 (m, 2H), 7.46 (s, 1H), 7.14-7.06 (m, 4H), 6.16 (s, 1H), 5.15 (s, 2H), 4.87 (d, J=6.3Hz, 2H), 4.73 (d, J=6.3Hz, 2H), 4.63 (s, 2H), 4.51 (s, 2H), 3.84 (s, 2H), 3.35-3.20 (m, 9H), 3.08 (s, 3H), 2.84-2.80 (m, 7H), 2.72-2.65 (m, 2H), 2.17-2.15 (m, 2H), 1.95-1.71 (m, 6H), 1.07-1.03 (m, 1H), 0.88 (d, J=6.3Hz, 3H)。 合成化合物227 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下於空氣氛圍下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(800 mg，2.67 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(835 mg，2.67 mmol，1當量)於二噁烷(10 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(1742 mg，5.34 mmol，2當量)且添加Xantphos (309 mg，0.53 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(60 mg，0.26 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應有85%產物。使混合物冷卻降至室溫。過濾所得混合物，用EtOAc (3x50 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之2-(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(500 mg，32%)。LCMS:(ES. m/z): 575,577 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下於空氣氛圍下向2-(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(800 mg，1.39 mmol，1當量)及2-疊氮基乙胺(143 mg，1.66 mmol，1.2當量)於二噁烷(8 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(906 mg，2.78 mmol，2當量)及Xantphos (161 mg，0.27 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(31 mg，0.14 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1.5小時。LCMS指示反應有50%產物。使混合物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之2-{6-[(2-疊氮基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-6-{[(3R)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮；三氟乙酸(220 mg，21%)。LCMS:(ES. m/z):625 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 6
在室溫下於氮氣氛圍下向2-{6-[(2-疊氮基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-1-酮(260 mg，0.41 mmol，1當量)於THF (13 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加三光氣(181 mg，0.61 mmol，1.47當量)。在室溫下再攪拌所得混合物30分鐘。在真空下濃縮所得混合物。將殘餘物再溶解於DCM (13 mL)中。在0℃下向上述混合物中添加N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲酸三級丁酯(129 mg，0.32 mmol，0.79當量)及TEA (130 mg，1.23 mmol，3.0當量)。在0℃下再攪拌所得混合物10分鐘。最後，逐份添加DMAP (104 mg，0.85 mmol，2.05當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS可偵測到約10%所需產物。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05%TFA)，在30分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm及220 nm。在真空下濃縮所得混合物。凍乾殘餘物，得到呈綠色固體狀之N-(2-疊氮基乙基)-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(120 mg，24%)。LCMS: (ES, m/s): 523 [M/2+H] +, 1044 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 6
在0℃下向N-(2-疊氮基乙基)-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(120 mg，0.11 mmol，1當量)於DCM (6 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加TFA (2 mL)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS:(ES, m/s): 944[M+H] + 步驟 5 ：合成化合物 227
在0℃下於氮氣氛圍下向N-(2-疊氮基乙基)-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(110 mg，0.11 mmol，1當量)及6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(44 mg，0.14 mmol，1.2當量)於DMF (2 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加DIEA (44 mg，0.34 mmol，2.92當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。藉由製備型HPLC用以下條件純化反應混合物：管柱：管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在12分鐘內26% B至41% B，41% B；波長：254 nm；RT1(min)：11.33；立即凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之三氟乙酸；N-(2-疊氮基乙基)-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3R)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(30.4 mg，19.60%)。LCMS:(ms, ESI): 569 [M/2+H] +, 1137[M+H] +H-NMR (300MHz, DMSO-d 6): 10.02 (s, 1H), 9.76 (br s, 1H), 8.47 (br s, 1H), 8.27-8.22 (m, 3H), 8.04 (s, 1H), 7.83-7.81 (m, 1H), 7.63-7.60 (m, 2H), 7.37-7.33 (m, 3H), 6.98 (s, 2H), 5.27 (s, 2H), 5.16 (s, 2H), 4.93 (d, J=6 Hz, 2H), 4.78 (d, J=6.3 Hz, 2H), 4.53-4.50 (m, 3H), 4.39-4.37 (m, 3H), 4.16-4.13 (m, 3H), 3.61-3.56 (m, 3H), 3.35-3.33 (m, 3H), 3.28-3.27 (m, 4H), 2.87-2.84 (m, 1H), 2.59-2.56 (m, 1H), 2.16-2.08 (m, 2H), 1.98-1.60 (m, 4H), 1.51-1.47 (m, 4H), 1.31-1.29 (m, 3H), 1.25-1.04 (m, 2H), 0.87-0.81 (m, 9H)。 合成化合物228 步驟 1. 合成化合物 2
在90℃下於氮氣氛圍下將2,6-二氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(3 g，10.09 mmol，1當量)於乙胺溶液(2.0 M，於THF中，30 mL)中之經攪拌溶液攪拌2天。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (12:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之6-氯-N-乙基-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-胺(2.1 g，66%)。
LCMS (ESI, m/z):306,308[M+H] + 步驟 2. 合成化合物 3
在室溫下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(4.5 g，13.92 mmol，1當量)於DMF (90 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加MeSNa (2.93 g，41.76 mmol，3當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(10mmol/L NH 4HCO 3)，在30分鐘內5%至80%梯度；偵測器，UV 254 nm。在真空下濃縮所收集之級分並凍乾，得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(3.1 g，77%)。LCMS (ESI, m/z):291[M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 4
在室溫下向6-氯-N-乙基-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-胺(1.7 g，5.56 mmol，1當量)、6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(1.78 g，6.12 mmol，1.1當量)及Cs 2CO 3(3.62 g，11.12 mmol，2當量)於二噁烷(34 mL)中之經攪拌溶液中添加Xantphos (0.64 g，1.12 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(0.12 g，0.56 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(770 mg，25%)。LCMS (ESI, m/z):560[M+H] + 步驟 4 ：合成化合物 5
在室溫下向2-[6-(乙基胺基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(450 mg，0.80 mmol，1當量)及TEA (162 mg，1.60 mmol，2當量)於THF (9 mL)中之經攪拌溶液中添加Boc 2O (263 mg，1.20 mmol，1.5當量)及DMAP (49 mg，0.40 mmol，0.5當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈棕色固體狀之N-乙基-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸三級丁酯(230 mg，43%)。LCMS (ESI, m/z):660[M+H] + 步驟 5 ：合成化合物 7
在0℃下向N-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]-4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲醯胺(250 mg，0.52 mmol，1當量)於DCM (5 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加SOCl 2(376 mg，3.16 mmol，6當量)及DMF (0.5 mL)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成(用MeOH衍生化)。在真空下濃縮所得混合物，得到呈灰白色固體狀之4-{[4-(氯甲基)苯基]胺磺醯基}-N-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]-3-硝基苯甲醯胺(250 mg，96%)。LCMS (ESI, m/z):488[M+H] + 步驟 6 ：合成化合物 8
在室溫下向N-乙基-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸三級丁酯(100 mg，0.15 mmol，1.00當量)及4-{[4-(氯甲基)苯基]胺磺醯基}-N-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]-3-硝基苯甲醯胺(90mg，0.18 mmol，1.20當量)於DMF (10 mL)中之經攪拌溶液中添加KI (100 mg，0.60 mmol，4當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2天。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.1% TFA)，在30分鐘內5%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈灰白色固體狀之(3S)-1-[(2-{6-[(三級丁氧基羰基)(乙基)胺基]-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-{[4-(4-{[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]胺甲醯基}-2-硝基苯磺醯胺基)苯基]甲基}-3-甲基哌啶-1-鎓(160 mg，94%)。LCMS (ESI, m/z):1116[M] + 步驟 7 ：合成化合物 228
在0℃下向(3S)-1-[(2-{6-[(三級丁氧基羰基)(乙基)胺基]-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-{[4-(4-{[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]胺甲醯基}-2-硝基苯磺醯胺基)苯基]甲基}-3-甲基哌啶-1-鎓(100 mg，0.08 mmol，1當量)於DCM (2 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TFA (1 mL)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.1%FA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內18% B至46% B，46% B；波長：254 nm；RT1(min)：9.35)純化粗產物；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之(3S)-1-{[4-(4-{[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]胺甲醯基}-2-硝基苯磺醯胺基)苯基]甲基}-1-({2-[6-(乙基胺基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓甲酸鹽(6.4 mg，6.50%)。LCMS (ESI, m/z):1016[M+H-FA] + 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 8.93 (t, J= 6.0 Hz, 1H), 8.22 (s, 1H), 8.14 (d, J= 10.4 Hz, 1H), 8.04-7.99 (m, 2H), 7.71 (s, 1H), 7.45 (d, J= 4.0 Hz, 2H), 7.16 (d, J= 8.4 Hz, 2H),7.04 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 6.97(s, 2H),6.06 (s, 1H), 4.76 (s, 2H), 4.58 (s, 2H), 3.59-3.55 (m, 7H),3.06 (s, 3H), 2.77-2.71 (m, 5H), 2.56 (s, 3H), 2.50-48 (m, 2H), 1.96(t, J= 11.2 Hz, 1H), 1.67-1.43-1.42 (m, 6H), 1.13-1.03 (m, 6H), 0.87-0.80 (m, 4H)。 合成化合物 229 步驟 1 ：合成化合物 1
在90℃下於氮氣氛圍下將2,6-二氯-4-[3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(3 g，10.09 mmol，1當量)於乙胺溶液(2.0 M，於THF中，30 mL)中之經攪拌溶液攪拌2天。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (12:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之6-氯-N-乙基-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-胺(2.1 g，66%)。LCMS (ESI, m/z):306,308[M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 2
在室溫下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(4.5 g，13.92 mmol，1當量)於DMF (90 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加(甲基硫烷基)鈉(2.93 g，41.76 mmol，3當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(10mmol/L NH 4HCO 3)，在30分鐘內5%至80%梯度；偵測器，UV 254 nm。在真空下濃縮所收集之級分並凍乾，得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(3.1 g，77%)。LCMS (ESI, m/z):291 [M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 3
在室溫下向6-氯-N-乙基-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-胺(1.7 g，5.55 mmol，1當量)、6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(1.78 g，6.11 mmol，1.1當量)及Cs 2CO 3(3.62 g，11.11 mmol，2當量)於二噁烷(34 mL)中之經攪拌溶液中添加Xantphos (0.64 g，1.11 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(0.12 g，0.55 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(770 mg，25%)。LCMS (ESI, m/z):560[M+H] + 步驟 4 ：合成化合物 6
在0℃下於氮氣氛圍下將5-甲醯基-2-羥基苯甲酸(40 g，240.77 mmol，1當量)、HOBT (36.04 g，288.92mmol，1.2當量)、(3-[[(乙基亞胺基)亞甲基]胺基]丙基)二甲胺鹽酸鹽(55.39 g，288.9mmol，1.2當量)及N-(2-胺基乙基)胺基甲酸三級丁酯(46.29 g，288.92 mmol，1.2當量)於DMF (400 mL)中之溶液攪拌隔夜。LCMS指示反應完成。用水淬滅反應物。用EtOAc (3 x 500mL)萃取所得混合物。用鹽水(5x 500mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (2:3)溶離，得到呈白色固體狀之N-{2-[(5-甲醯基-2-羥基苯基)甲醯胺基]乙基}胺基甲酸三級丁酯(66.4 g，71%)。LCMS (ESI, m/z):309[M+H] + 步驟 5 ：合成化合物 8
在0℃下於氮氣氛圍下用Ag 2O (92.89 g，400.86 mmol，2當量)處理N-{2-[(5-甲醯基-2-羥基苯基)甲醯胺基]乙基}胺基甲酸三級丁酯(61.8 g，200.43 mmol，1當量)於乙腈中之溶液，繼而在0℃下逐份添加(2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-溴環氧乙烷-2-甲酸甲酯(87.57 g，397.17 mmol，1.1當量)持續隔夜。LCMC指示反應完成。過濾所得混合物，用乙腈(3x10 mL)洗滌濾餅。在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:4)溶離，得到呈灰白色固體狀之(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-[2-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-甲醯基苯氧基]環氧乙烷-2-甲酸甲酯(68.3 g，54%)。LCMS (ESI, m/z):625[M+H] + 步驟 6 ：合成化合物 9
在室溫下向(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-[2-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-甲醯基苯氧基]環氧乙烷-2-甲酸甲酯(20 g，32.02 mmol，1.00當量)於EA (200 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加Pd/C (4.0 g，37.58 mmol，1.17當量，無水)。在室溫下於氫氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (19:1)溶離，得到呈白色固體狀之(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-[2-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-(羥甲基)苯氧基]環氧乙烷-2-甲酸甲酯(12.5 g，58%)。LCMS (ESI, m/z):627[M+H] + 步驟 7 ：合成化合物 10
在室溫下於氮氣氛圍下向2-[6-(乙基胺基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(400 mg，0.71 mmol，1當量)於THF (40 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加三光氣(318 mg，1.07 mmol，1.5當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在真空下濃縮所得混合物。在室溫下於氮氣氛圍下將殘餘物添加至(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-[2-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-(羥甲基)苯氧基]環氧乙烷-2-甲酸甲酯(672 mg，1.07 mmol，1.5當量)及TEA (217 mg，2.14 mmol，3當量)於DCM (40 mL)中之經攪拌溶液中攪拌30分鐘。在室溫下向上述混合物中添加DMAP (174 mg，1.43 mmol，2當量)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS顯示22%產物。在真空下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。在真空下濃縮所收集之級分並凍乾，得到呈灰白色固體狀之(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-[2-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-[({乙基[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺甲醯基}氧基)甲基]苯氧基]環氧乙烷-2-甲酸甲酯(200 mg，23%)。LCMS (ESI, m/z):1212[M+H] + 步驟 8 ：合成化合物 11
在室溫下向(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-[2-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-[({乙基[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺甲醯基}氧基)甲基]苯氧基]環氧乙烷-2-甲酸甲酯(200 mg，0.16 mmol，1當量)於MeOH (5 mL)中之經攪拌溶液中添加NaOMe (89 mg，1.65 mmol，10當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物。此得到呈淺黃色固體狀之(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[2-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-[({乙基[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺甲醯基}氧基)甲基]苯氧基]-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-甲酸(150 mg，84%)。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS (ESI, m/z):1072[M+H] + 步驟 9 ：合成化合物 12
在0℃下於空氣氛圍下向(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[2-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-[({乙基[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺甲醯基}氧基)甲基]苯氧基]-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-甲酸(150 mg，0.14 mmol，1當量)於DCM (2.8 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TFA (560 uL)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應有60%產物。在減壓下濃縮所得混合物，得到呈黃色固體狀之(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{2-[(2-胺基乙基)胺甲醯基]-4-[({乙基[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺甲醯基}氧基)甲基]苯氧基}-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-甲酸(120 mg，88%)。LCMS:(ES.m/z):972[M+H] +。 步驟 10 ：合成化合物 229
在0℃下於空氣氛圍下向(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{2-[(2-胺基乙基)胺甲醯基]-4-[({乙基[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺甲醯基}氧基)甲基]苯氧基}-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-甲酸(80 mg，0.08 mmol，1當量)於DMF (1.6 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(28 mg，0.09 mmol，1.1當量)及DIEA (32 mg，0.24 mmol，3當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應有50%產物。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：Xselect CSH Prep C18 C18管柱，30*150 mm，5μm；移動相A：水(0.05% TFA)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min mL/min；梯度：在20分鐘內9% B至39% B；波長：254nm/220nm nm；RT1(min)：17.03)純化粗產物(90 mg)。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[2-({2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]乙基}胺甲醯基)-4-[({乙基[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺甲醯基}氧基)甲基]苯氧基]-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-甲酸(13.3 mg，12%)。LCMS:(ES.m/z):1165[M+1] + 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.54 (br s, 1H), 8.44 (s, 1H), 8.30 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.86 - 7.84 (m, 2H), 7.74-7.69 (m, 2H), 7.56 - 7.53 (m, 2H), 7.26 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.99 (s, 2H), 5.19 (s, 2H), 5.14 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.94 (s, 2H), 4.41 (s, 2H), 3.99 - 3.97 (m, 3H), 3.92-3.93(m,3H), 3.46 - 3.25 (m, 9H), 3.22-3.16 (m, 6H), 2.84 - 2.70 (m, 2H), 2.64 (s, 3H), 2.55-2.52 (m, 1H), 2.04 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.84-1.64 (m, 4H), 1.48-1.42 (m, 4H), 1.30 - 1.23 (m, 3H), 1.17-1.13 (m, 2H), 1.06-1.03 (m, 4H), 0.88 (d, J = 6.4 Hz, 3H)。 合成化合物 230 步驟 1 ：合成化合物 1
在25℃下用(甲基硫烷基)鈉(488 mg，6.96 mmol，1.5當量)處理4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(1.5 g，4.64 mmol，1當量)於DMF (30 mL)中之溶液。在90℃下攪拌溶液1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含8% NH 4HCO 3及ACN之水(在50分鐘內0%至50%梯度)；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(670 mg，50%)。LCMS (ES, m/z): 291 [M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 2
在90℃下於氮氣氛圍下將2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(800 mg，2.67 mmol，1當量)於乙胺溶液(2.0 M，於THF中，10 mL)中之經攪拌溶液攪拌隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫且在真空下濃縮至乾。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(450 mg，54%)。LCMS (ES, m/z): 308,310 [M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 2-1
在室溫下向6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(900 mg，2.92 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基環己基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(846 mg，2.92 mmol，1當量)於二噁烷(18 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(1905 mg，5.84 mmol，2當量)、Xantphos (338 mg，0.58 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(66 mg，0.29 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮；三氟乙酸(800 mg)。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：Xselect CSH C18 OBD管柱30*150mm 5μm，n；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min；梯度：在9分鐘內10% B至30% B，30% B；波長：254；220 nm；RT1(min)：8.65)純化粗產物(800 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮；三氟乙酸(600 mg，30%)。LCMS (ES, m/z): 562 [M+H] + 步驟 4 ：合成化合物 3
在室溫下向2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(250 mg，0.44 mmol，1當量)於THF (5 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加TEA (90 mg，0.89 mmol，2當量)、DMAP (16 mg，0.13 mmol，0.3當量)及Boc 2O (388 mg，1.78 mmol，4當量)。在55℃下攪拌所得混合物隔夜。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈黃色固體狀之N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸三級丁酯(250 mg，85%)。LCMS:(ES.m/z):662[M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 6
在0℃下於氮氣氛圍下向4-氟-3-硝基苯甲酸甲酯(25 g，125.54 mmol，1當量)及K 2CO 3(34.70 g，251.08 mmol，2當量)於DMF (200 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加苯甲基硫醇(31.18 g，251.08 mmol，2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。在0℃下藉由添加水/冰(500mL)淬滅反應物。藉由過濾收集沈澱之固體且用PE (3x300 mL)洗滌。在紅外光下乾燥所得固體。此得到呈綠色固體狀之4-(苯甲基硫烷基)-3-硝基苯甲酸甲酯(34 g，89%)。LCMS (ES, m/z): 304 [M+H] + 步驟 6 ：合成化合物 7
在0℃下於氮氣氛圍下向4-(苯甲基硫烷基)-3-硝基苯甲酸甲酯(25 g，82.42 mmol，1當量)於DCM (500 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加HCl (水溶液，6N，500 mL)及NaClO (13%，250 mL)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在0℃下用水/冰淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 500mL)萃取所得混合物。用鹽水(3x500 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈黃色固體狀之4-(氯磺醯基)-3-硝基苯甲酸甲酯(10 g，43%)。LCMS (ES, m/z): 260 [M-H-H 2O] - 步驟 7 ：合成化合物 8
在0℃下於氮氣氛圍下向對胺基苯甲醇(5.28 g，42.91 mmol，1.2當量)於DCM (100 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加吡啶(5.66 g，71.52 mmol，2當量)及4-(氯磺醯基)-3-硝基苯甲酸甲酯(10 g，35.76 mmol，1當量)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。LCMS指示反應完成。在0℃下用水/冰淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 100mL)萃取所得混合物。用鹽水(3x100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。此得到呈紅色固體狀之4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲酸甲酯(9 g，68%)。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS (ES, m/z): 349 [M+H-H 2O] + 步驟 8 ：合成化合物 9
在0℃下於氮氣氛圍下向4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲酸甲酯(7.5 g，20.47 mmol，1當量)於THF (750 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加LiOH (0.98 g，40.94 mmol，2當量)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。用濃HCl將混合物酸化至pH=3。藉由逆相急驟層析用以下條件純化所得混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05% TFA)，在10分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈紅色固體狀之4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲酸(3 g，42%)。LCMS (ES, m/z): 335 [M+H-H 2O] + 步驟 9 ：合成化合物 10
在0℃下於氮氣氛圍下向4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲酸(1.5 g，4.25 mmol，1當量)於DMF (15 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加HATU (2.43 g，6.38 mmol，1.5當量)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在0℃下向上述混合物中逐滴添加1-(2-胺基乙基)吡咯-2,5-二酮(0.72 g，5.108 mmol，1.2當量)及DIEA (1.64 g，12.75 mmol，3當量)。在室溫下再攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈棕色固體狀之N-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]-4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲醯胺(0.8 g，40%)。LCMS (ES, m/z): 457 [M+ H-H 2O] + 步驟 10 ：合成化合物 11
在0℃下向N-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]-4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲醯胺(150 mg，0.32 mmol，1當量)及DMF (0.1 mL，1.29 mmol，4.09當量)於THF (3 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加含SOCl 2(75 mg，0.63 mmol，2當量)之THF (0.05 mL)。在0℃下攪拌所得混合物30分鐘。LCMS指示反應完成。接著將水(3 mL)添加至上述混合物中且凍乾所得混合物，得到呈黃色固體狀之粗物質4-{[4-(氯甲基)苯基]胺磺醯基}-N-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]-3-硝基苯甲醯胺(170 mg，粗物質)。LCMS (ESI, m/z): 457 [M+H-HCl] +。 步驟 11 ：合成化合物 12
在室溫下向N-乙基-N-(4-(3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基-6-(6-([(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸三級丁酯(175 mg，0.26 mmol，1當量)及4-([4-(氯甲基)苯基]胺磺醯基-N-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]-3-硝基苯甲醯胺(156 mg，0.31 mmol，1.2當量)於DMF (5 mL)中之經攪拌溶液中添加KI (88 mg，0.52 mmol，2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2天。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.1% TFA)，在30分鐘內5%至80%梯度；偵測器，UV 254 nm。在真空下濃縮所收集之級分並凍乾，得到呈白色固體狀之(3S)-1-[(2-(6-[(三級丁氧基羰基)(乙基)胺基]-4-(3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基吡啶-2-基-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-([4-(4-([2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]胺甲醯基-2-硝基苯磺醯胺基)苯基]甲基-3-甲基哌啶-1-鎓(100 mg，34%)。LCMS (ESI, m/z):1118[M] + 步驟 12 ：合成化合物 230
在0℃下向(3S)-1-[(2-(6-[(三級丁氧基羰基)(乙基)胺基]-4-(3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基吡啶-2-基-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-([4-(4-([2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]胺甲醯基-2-硝基苯磺醯胺基)苯基]甲基-3-甲基哌啶-1-鎓(100 mg，0.08 mmol，1當量)於DCM (3 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TFA (1.2 mL)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內17% B至47% B；波長：254 nm；RT1(min)：5.15)純化粗產物(50 mg)。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之(3S)-1-([4-(4-([2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]胺甲醯基-2-硝基苯磺醯胺基)苯基]甲基-1-((2-[6-(乙基胺基)-4-(3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基吡啶-2-基]-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓；三氟乙酸(12.7 mg，12%)。LCMS (ESI, m/z): 1018 [M+H-TFA] + 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.08 (s, 1H), 9.89 (s, 2H), 9.04 (t, J=6.0Hz, 1H), 8.25-8.08 (m, 3H), 7.71-7.50 (m, 2H), 7.37-7.28 (m, 3H), 7.22-7.08 (m, 2H), 7.01 (s, 2H), 6.12 (s, 1H), 5.47 (s, 2H), 4.91 (s, 2H), 4.84-4.71 (m, 4H), 4.43 (s, 2H), 3.72 (s, 2H), 3.60-3.56 (m, 6H), 3.39-3.22 (m, 6H), 2.87-2.77 (m, 1H), 2.58 (s, 3H), 1.84-1.64 (m, 4H), 1.16 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.10-0.99 (m, 1H), 0.88 (d, J = 6.4 Hz, 3H)。 合成化合物 231 步驟 1 ：合成化合物 2
在90℃下於氮氣氛圍下將2,6-二氯-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(800 mg，2.69 mmol，1當量)、BocNH 2(315 mg，2.69 mmol，1當量)、XantPhos (311 mg，0.54 mmol，0.2當量)、Pd(OAc) 2(120 mg，0.54 mmol，0.2當量)及Cs 2CO 3(1.75 g，5.38 mmol，2當量)於二噁烷(16 mL)中之混合物攪拌1小時。LCMS指示反應完成。使反應混合物冷卻降至室溫且在減壓下移除溶劑。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用DCM/MeOH (94:6)溶離，得到呈黃色固體狀之N-{6-氯-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}胺基甲酸三級丁酯(510 mg，50%)。LCMS (ESI, m/z): 378,380 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在120℃下於氮氣氛圍下將N-{6-氯-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}胺基甲酸三級丁酯(710 mg，1.88 mmol，1當量)、6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(545 mg，1.88 mmol，1當量)、Pd(OAc) 2(84 mg，0.37 mmol，0.2當量)、XantPhos (217 mg，0.37 mmol，0.2當量)及Cs 2CO 3(122 mg，0.37 mmol，0.2當量)於二噁烷(15 mL)中之混合物攪拌1小時。LCMS指示反應完成。使反應混合物冷卻降至室溫且在減壓下移除溶劑。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用DCM/MeOH (95:5)溶離，得到呈黃色固體狀之N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸三級丁酯(540 mg，45%)。LCMS (ESI, m/z): 632 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 4
在25℃下向N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸三級丁酯(440 mg，0.70 mmol，1當量)於DCM (8 mL)中之混合物中添加TFA (1.6 mL)。在25℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.1% NH4HCO3及ACN之水(在50分鐘內0%至100%梯度)；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之2-{6-胺基-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(300 mg，81%)。LCMS (ESI, m/z): 532 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 5
在25℃下於氮氣氛圍下向2-{6-胺基-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(50 mg，0.094 mmol，1當量)於THF (4.7 mL)中之混合物中添加三光氣(70 mg，0.235 mmol，2.5當量)。在25℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在5-10℃下於減壓下移除溶劑，得到呈白色固體狀之粗物質N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺甲醯氯(60 mg，107%)。殘餘物未經進一步純化即用於下一步驟。無質量信號。 步驟 5 ：合成化合物 7
將N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲酸三級丁酯(40 mg，0.10 mmol，1當量)及TEA (30 mg，0.30 mmol，3當量)於DCM (1.5 mL)中之混合物攪拌10分鐘。將所得混合物添加至含N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺甲醯氯(60 mg，0.10 mmol，1當量)之DCM (1.5 mL)中。在25℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示33%產物。在減壓下移除溶劑。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.1% TFA及ACN之水(在50分鐘內0%至100%梯度)；偵測器，UV 254 nm。平行進行反應四次。與其他四批合併，濃縮所收集之級分，得到呈黃色固體狀之N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(30 mg，對於兩個步驟6%)。LCMS (ESI, m/z): 951 [M+H] +。 步驟 6 ：合成化合物 8
在25℃下向N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(30 mg，0.031 mmol，1當量)於DCM (2.5 mL)中之混合物中添加TFA (0.5 mL)。在25℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。凍乾殘餘物，得到呈棕色固體狀之粗物質N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(25 mg)。LCMS (ESI, m/z): 851 [M+H] +。 步驟 7 ：合成化合物 8
在0℃下向N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(26 mg，0.031 mmol，1當量)及6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(11 mg，0.037 mmol，1.2當量)於DMF (1 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加DIEA (8 mg，0.062 mmol，2當量)。在0℃下攪拌所得混合物30分鐘。LCMS指示反應完成。藉由製備型HPLC用以下條件純化反應混合物：管柱：XBridge Prep Phenyl OBD管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在15分鐘內30% B至50% B；波長：254 nm；RT1(min)：11.95。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯。LCMS (ES, m/z): 523[M+H]/2, 1067 [M+Na] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 10.38 (s, 1H), 9.99 (s, 1H), 9.71-8.57(m, 1H), 8.47 (s, 1H), 8.18 (d, J= 6.8 Hz, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.83 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.70 (d, J= 5.2 Hz, 2H), 7.66-7.60 (m, 3H), 7.37 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 6.98 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.91 (s, 2H), 4.46-4.34 (m, 3H), 4.17 (t, J= 8.0 Hz, 1H), 3.36 (t, J= 8.0 Hz, 2H), 3.24 (s, 3H), 2.84-2.77 (m, 2H), 2.65-2.55 (m, 5H), 2.22-2.14 (m, 3H), 1.98-1.92 (m, 1H), 1.88-1.63 (m, 5H), 1.52-1.40 (m, 4H), 1.3-5-1.28 (m, 4H), 1.25-1.15 (m, 4H), 1.15-1.05 (m, 4 H), 0.90-0.85 (m, 6H), 0.82-0.81(m, 3H)。 合成化合物 232 步驟 1 ：合成化合物 1
在25℃下用(甲基硫烷基)鈉(488 mg，6.96 mmol，1.5當量)處理4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(1.5 g，4.64 mmol，1當量)於DMF (30 mL)中之溶液。在90℃下攪拌溶液1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含8% NH 4HCO 3及ACN之水(在50分鐘內0%至50%梯度)；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(670 mg，50%)。LCMS (ES, m/z): 291 [M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 2
在90℃下於氮氣氛圍下將2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(800 mg，2.67 mmol，1當量)於乙胺溶液(2.0 M，於THF中，10 mL)中之經攪拌溶液攪拌隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫且在真空下濃縮至乾。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(450 mg，54%)。LCMS (ES, m/z): 308,310 [M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 2-1
在室溫下向6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(900 mg，2.92 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基環己基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(846 mg，2.92 mmol，1當量)於二噁烷(18 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(1905 mg，5.84 mmol，2當量)、Xantphos (338 mg，0.58 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(66 mg，0.29 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮；三氟乙酸(800 mg)。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：Xselect CSH C18 OBD管柱30*150mm 5μm，n；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min；梯度：在9分鐘內10% B至30% B，30% B；波長：254；220 nm；RT1(min)：8.65)純化粗產物(800 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮；三氟乙酸(600 mg，30%)。LCMS (ES, m/z): 562 [M+H] + 步驟 4 ：合成化合物 3
在室溫下向2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(250 mg，0.44 mmol，1當量)於THF (5 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加TEA (90 mg，0.89 mmol，2當量)、DMAP (16 mg，0.13 mmol，0.3當量)及Boc 2O (388 mg，1.78 mmol，4當量)。在55℃下攪拌所得混合物隔夜。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈黃色固體狀之N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸三級丁酯(250 mg，85%)。LCMS:(ES.m/z):662[M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 5
在50℃下將N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸三級丁酯(600 mg，0.91 mmol，1當量)、(2S,3S,4S,5R, 6S)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-[2-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-(氯甲基)苯氧基]環氧乙烷-2-甲酸甲酯(584 mg，0.91 mmol，1當量)及KI (300 mg，1.81 mmol，2當量)於丙酮(24 mL)中之混合物攪拌16小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.1% TFA及ACN之水(在50分鐘內0%至100%梯度)；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之(3S)-1-[(2-{6-[(三級丁氧基羰基)(乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-{[3-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-{[(2S,3R,4S,5S, 6S)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-(甲氧基羰基)環氧乙烷-2-基]氧基}苯基]甲基}-3-甲基哌啶-1-鎓(215 mg，19%)。LCMS (ESI, m/z): 1170 [M] +。 步驟 6 ：合成化合物 6
在25℃下將(3S)-1-[(2-{6-[(三級丁氧基羰基)(乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-{[3-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-(甲氧基羰基)環氧乙烷-2-基]氧基}苯基]甲基}-3-甲基哌啶-1-鎓(200 mg，0.16 mmol，1當量)及LiOH (22 mg，0.94 mmol，6當量)於MeOH (3 mL)中之混合物攪拌1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.1% TFA及ACN之水(在50分鐘內0%至100%梯度)；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之(3S)-1-[(2-{6-[(三級丁氧基羰基)(乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-{[3-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-基]氧基}苯基]甲基}-3-甲基哌啶-1-鎓(105 mg，59%)。LCMS (ESI, m/z): 1130 [M] +。 步驟 7 ：合成化合物 7
在25℃下向(3S)-1-[(2-{6-[(三級丁氧基羰基)(乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-{[3-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-基]氧基}苯基]甲基}-3-甲基哌啶-1-鎓(100 mg，0.088 mmol，1當量)於DCM (3 mL)中之混合物中添加TFA (0.6 mL)。在25℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。凍乾殘餘物，得到呈黃色固體狀之粗物質(3S)-1-({3-[(2-胺基乙基)胺甲醯基]-4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-基]氧基}苯基}甲基)-1-({2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓(110 mg，粗物質)。LCMS (ESI, m/z): 930 [M] +。 步驟 8 ：合成化合物 232
在25℃下向(3S)-1-({3-[(2-胺基乙基)胺甲醯基]-4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)- 6-羧基-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-基]氧基}苯基}甲基)-1-({2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓(80 mg，0.086 mmol，1當量)及DIEA (55 mg，0.430 mmol，5當量)於DMF (2 mL)中之混合物中添加6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(39 mg，0.129 mmol，1.5當量)。在25℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。用以下條件純化反應混合物：管柱：XBridge Prep OBD C18管柱，19*250 mm，5μm；移動相A：水(0.1%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內17% B至35% B，35% B；波長：254 nm；RT1(min)：9；注入體積：0.3 mL；操作次數：5。凍乾所收集之級分，得到呈黃色半固體狀之(3S)-1-[(4-{[(2S,3R, 4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-基]氧基}-3-({2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]乙基}胺甲醯基)苯基)甲基]-1-({2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓(3.6 mg，2.07%)。LCMS (ESI, m/z): 1123 [M-TFA] +。 1H NMR (400 MHz, 甲醇- d 4) δ 7.96 (s, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.59 (dd, J= 8.6, 2.4 Hz, 1H), 7.38 (d, J= 8.6 Hz, 1H), 6.92 (s, 1H), 6.79 (s, 2H), 6.14 (s, 1H), 5.61 (s, 2H), 5.10 (d, J= 7.4 Hz, 1H), 5.03-4.83 (m, 8H), 4.51 (s, 2H), 4.04 (d, J= 9.6 Hz, 1H), 3.81 (s, 2H), 3.71-3.34 (m, 15H), 2.97-2.90 (m, 1H), 2.74-2.64 (m, 4H), 2.18 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.00-1.75 (m, 4H), 1.66-1.46 (m, 4H), 1.30-1.20 (m, 6H), 1.01 (d, J= 6.3 Hz, 3H)。 合成化合物 233 步驟 1 ：合成化合物 3
在0℃下於氮氣氛圍下向4-氟-3-硝基苯甲酸甲酯(25 g，125.54 mmol，1當量)及K 2CO 3(34.70 g，251.08 mmol，2當量)於DMF (200 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加苯甲基硫醇(31.18 g，251.08 mmol，2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。在0℃下藉由添加水/冰(500mL)淬滅反應物。藉由過濾收集沈澱之固體且用PE (3x300 mL)洗滌。在紅外光下乾燥所得固體。此得到呈綠色固體狀之4-(苯甲基硫烷基)-3-硝基苯甲酸甲酯(34 g，89%)。LCMS (ES, m/z): 304 [M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 4
在0℃下於氮氣氛圍下向4-(苯甲基硫烷基)-3-硝基苯甲酸甲酯(25 g，82.42 mmol，1當量)於DCM (500 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加HCl (水溶液，6N，500 mL)及NaClO (13%，250 mL)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在0℃下用水/冰淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 500mL)萃取所得混合物。用鹽水(3x500 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈黃色固體狀之4-(氯磺醯基)-3-硝基苯甲酸甲酯(10 g，43%)。LCMS (ES, m/z): 260 [M-H-H 2O] - 步驟 3 ：合成化合物 5
在0℃下於氮氣氛圍下向對胺基苯甲醇(5.28 g，42.91 mmol，1.2當量)於DCM (100 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加吡啶(5.66 g，71.52 mmol，2當量)及4-(氯磺醯基)-3-硝基苯甲酸甲酯(10 g，35.76 mmol，1當量)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。LCMS指示反應完成。在0℃下用水/冰淬滅反應物。用CH 2Cl 2(3 x 100mL)萃取所得混合物。用鹽水(3x100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。此得到呈紅色固體狀之4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲酸甲酯(9 g，68%)。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS (ES, m/z): 349 [M+H-H 2O] + 步驟 4 ：合成化合物 6
在0℃下於氮氣氛圍下向4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲酸甲酯(7.5 g，20.47 mmol，1當量)於THF (750 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加LiOH (0.98 g，40.94 mmol，2當量)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。用濃HCl將混合物酸化至pH=3。藉由逆相急驟層析用以下條件純化所得混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05% TFA)，在10分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈紅色固體狀之4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲酸(3 g，42%)。LCMS (ES, m/z): 335 [M+H-H 2O] + 步驟 5 ：合成化合物 7
在0℃下於氮氣氛圍下向4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲酸(1.5 g，4.25 mmol，1當量)於DMF (15 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加HATU (2.43 g，6.38 mmol，1.5當量)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在0℃下向上述混合物中逐滴添加1-(2-胺基乙基)吡咯-2,5-二酮(0.72 g，5.108 mmol，1.2當量)及DIEA (1.64 g，12.75 mmol，3當量)。在室溫下再攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含ACN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈棕色固體狀之N-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]-4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲醯胺(0.8 g，40%)。LCMS (ES, m/z): 457 [M+ H-H 2O] + 步驟 6 ：合成化合物 8
在0℃下向N-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]-4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲醯胺(150 mg，0.32 mmol，1當量)及DMF (0.1 mL，1.29 mmol，4.09當量)於THF (3 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加含SOCl 2(75 mg，0.63 mmol，2當量)之THF (0.05 mL)。在0℃下攪拌所得混合物30分鐘。LCMS指示反應完成。接著將水(3 mL)添加至上述混合物中且凍乾所得混合物，得到呈黃色固體狀之粗物質4-{[4-(氯甲基)苯基]胺磺醯基}-N-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]-3-硝基苯甲醯胺(170 mg，粗物質)。LCMS (ESI, m/z): 457 [M+H-HCl] +。 步驟 7 ：合成化合物 9
在室溫下向3-{[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基}丙腈(100 mg，0.16 mmol，1當量)於THF (2 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加DMAP (6 mg，0.05 mmol，0.3當量)及TEA (33 mg，0.33 mmol，2當量)及Boc 2O (79 mg，0.36 mmol，2.2當量)。在55℃下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在35分鐘內0%至70%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸三級丁酯(85 mg，77%)。LCMS: (ES.m/z): 707 [M+H] +。 步驟 8 ：合成化合物 10
在0℃下向N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸三級丁酯(130 mg，0.18 mmol，1當量)及KI (61 mg，0.37 mmol，2當量)於DMF (1.5 mL)中之混合物中添加含4-{[4-(氯甲基)苯基]胺磺醯基}-N-[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]-3-硝基苯甲醯胺(90 mg，0.18 mmol，1當量)之DMF (0.5 mL)。在50℃下攪拌所得混合物16小時。LCMS指示產生31%產物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.1% TFA及ACN之水(在50分鐘內0%至100%梯度)；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之(3S)-1-[(2-{6-[(三級丁氧基羰基)(2-氰基乙基)胺基]-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-{[4-(4-{[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]胺甲醯基}-2-硝基苯磺醯胺基)苯基]甲基}-3-甲基哌啶-1-鎓(68 mg，32%)。LCMS (ES, m/z): 1163 [M] +。 步驟 9 ：合成化合物 233
在25℃下向(3S)-1-[(2-{6-[(三級丁氧基羰基)(2-氰基乙基)胺基]-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-{[4-(4-{[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]胺甲醯基}-2-硝基苯磺醯胺基)苯基]甲基}-3-甲基哌啶-1-鎓(60 mg，0.052 mmol，1當量)於DCM (2.5 mL)中之混合物中添加TFA (0.5 mL)。在25℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。用以下條件純化殘餘物：管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在10分鐘內20% B至45% B，45% B；波長：254 nm；RT1(min)：7.5；操作次數：0。與先前批次合併，凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之(3S)-1-[(2-{6-[(2-氰基乙基)胺基]-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-{[4-(4-{[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙基]胺甲醯基}-2-硝基苯磺醯胺基)苯基]甲基}-3-甲基哌啶-1-鎓；三氟乙酸(27.2 mg，44%)。LCMS (ESI, m/z): 1063 [M-TFA] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 11.20 (s, 1H), 10.44 (br s, 1H), 10.01 (s, 1H), 9.02 (t, J= 5.8 Hz, 1H), 8.32 (d, J= 6.8 Hz, 2H), 8.22 (s, 1H), 8.16 (d, J= 8.2 Hz, 1H), 8.08 (d, J= 8.2, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.41 (d, J= 8.6 Hz, 2H), 7.33-7.24 (m, 3H), 7.01 (s, 2H), 6.48 (s, 1H), 5.61 (s, 2H), 5.28 (s, 2H), 4.52 (s, 2H), 3.60-3.52 (m, 4H), 3.47 (s, 3H), 3.39 (m, 4H), 3.30-3.22 (m, 1H), 2.91-2.74 (m, 5H), 2.64-2.53 (m, 3H), 1.99-1.69 (m, 4H), 1.13-1.00 (m, 4H), 0.87 (d, J= 6.6 Hz, 3H)。 合成化合物 234 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(1.5 g，4.64 mmol，1當量)及Zn(CN) 2(1.09 g，9.28 mmol，2當量)於DMF (30 mL)中之經攪拌溶液中添加Pd(PPh 3) 4(0.54 g，0.46 mmol，0.1當量)。在145℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈棕色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-2,3-二氫異吲哚-4-甲腈(400 mg，32%)。LCMS (ESI, m/z):270[M+H] + 步驟 2 ：合成化合物 2
在-70℃下於氮氣氛圍下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-2,3-二氫異吲哚-4-甲腈(800 mg，2.97 mmol，1當量)於DCM (10 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加DIBAl-H (9 mL，9.0 mmol，3.07當量，1 N，於DCM中)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在-20℃下藉由添加MeOH (5 mL)淬滅反應物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-2,3-二氫異吲哚-4-甲醛(650 mg，80%)。LCMS (ESI, m/z):273[M+H] + 步驟 3 ：合成化合物 4
在室溫下於空氣氛圍下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-2,3-二氫異吲哚-4-甲醛(600 mg，2.20 mmol，1當量)及3-[(6-氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基)胺基]丙腈(733 mg，2.20 mmol，1當量)於二噁烷(12 mL)中之經攪拌混合物中添加Cs 2CO 3(1435 mg，4.40 mmol，2當量)、Xantphos (255 mg，0.44 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(49 mg，0.22 mmol，0.1當量)。在110℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1.5小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之3-{[6-(4-甲醯基-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]胺基}丙腈(250 mg，20%)。LCMS (ESI, m/z):569[M+H] + 步驟 4 ：合成化合物 5
在室溫下於空氣氛圍下向3-{[6-(4-甲醯基-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]胺基}丙腈(100 mg，0.17 mmol，1當量)於EtOH (2 mL)中之經攪拌溶液中添加NH 2NH 2.H 2O (20 mg，0.35 mmol，2當量，85%)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。粗產物未經任何純化即用於下一步驟。LCMS (ESI, m/z):583[M+H] + 步驟 5 ：合成化合物 234
在0℃下於空氣氛圍下向N-順丁烯二醯基-6-胺基己酸(48 mg，0.22 mmol，1.2當量)於DMF (2 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加HATU (107 mg，0.28 mmol，1.5當量)。在室溫下攪拌所得混合物15分鐘。在0℃下向上述混合物中逐份添加3-{[6-(4-甲烷腙基-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]胺基}丙腈(110 mg，0.19 mmol，1當量)及DIEA (73 mg，0.56 mmol，3當量)。在室溫下再攪拌所得混合物1.5小時。LCMS指示反應有約50%產物。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Prep OBD C18管柱，30*150 mm，5μm；移動相A：水(10 mmol/L NH 4HCO 3)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min；梯度：在10分鐘內22% B至49% B，49% B；波長：254 nm；RT1(min)：8.58)純化反應混合物；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之N'-[(1E)-(2-{6-[(2-氰基乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-3H-異吲哚-4-基)亞甲基]-6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯肼(30.5 mg，20%)。LCMS:(ES. m/z):776 [M+H] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 11.55-11.44 (m, 1H), 8.28-8.17 (m, 2H), 7.77-7.68 (m, 2H), 7.52-7.48 (m, 1H), 7.09-6.84 (m, 2H), 6.06-6.02 (m, 1H), 5.21-5.17 (m, 2H), 4.91-4.78 (m, 4H), 3.57-3.49 (m, 7H), 3.40-3.39 (m, 1H), 3.27-3.24 (m, 4H), 2.92-2.91 (m, 1H), 2.76-2.68 (m, 4H), 2.25-2.21 (m, 1H),1.93-1.88 (m, 1H), 1.61-1.49 (m, 9H), 1.26-1.25 (m, 2H), 0.82-0.81 (m, 4H)。 合成化合物 235 步驟 1 ：合成化合物 2
在室溫下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(5 g，16.82 mmol，1當量)於DMA (50 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加K 2CO 3(4.65 g，33.65 mmol，2當量)及β-胺基丙腈(23.59 g，336.50 mmol，20當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色固體狀之3-({6-氯-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}胺基)丙腈(3 g，54%)。LCMS:(ES.m/z): 331,333 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 2-1
在室溫下於氮氣氛圍下向3-({6-氯-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}胺基)丙腈(2.0 g，6.04 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(三氟甲基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(2.08 g，6.65 mmol，1.1當量)於二噁烷(40.00 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(3.94 g，12.09 mmol，2當量)及Pd(OAc) 2(0.14 g，0.60 mmol，0.1當量)及Xantphos (0.70 g，1.21 mmol，0.2當量)。在100℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1.5小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之3-{[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基}丙腈(1.4 g，38%)。LCMS:(ES.m/z):607[M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 3
在室溫下於空氣氛圍下向3-{[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基}丙腈(550 mg，0.91 mmol，1當量)於THF (12 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加DMAP (33 mg，0.27 mmol，0.3當量)及TEA (183 mg，1.81 mmol，2當量)及Boc 2O (435 mg，1.99 mmol，2.2當量)。在55℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在35分鐘內0%至70%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸三級丁酯(580 mg，90%)。LCMS:(ES.m/z): 707[M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 5
在室溫下於空氣氛圍下向N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸三級丁酯(400 mg，0.56 mmol，1當量)於丙酮(8 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-[2-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-(氯甲基)苯氧基]環氧乙烷-2-甲酸甲酯(438 mg，0.68 mmol，1.2當量)及KI (188 mg，1.13 mmol，2當量)。在50℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2天。LCMS指示反應有50%產物及15% SM。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈灰白色固體狀之(3S)-1-[(2-{6-[(三級丁氧基羰基)(2-氰基乙基)胺基]-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-{[3-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)- 3,4,5-參(乙醯氧基)-6-(甲氧基羰基)環氧乙烷-2-基]氧基}苯基]甲基}-3-甲基哌啶-1-鎓(440 mg，59%)。LCMS:(ES.m/z): 1316[M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 6
在0℃下於空氣氛圍下向(3S)-1-[(2-{6-[(三級丁氧基羰基)(2-氰基乙基)胺基]-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-{[3-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-3,4,5-參(乙醯氧基)-6-(甲氧基羰基)環氧乙烷-2-基]氧基}苯基]甲基}-3-甲基哌啶-1-鎓(440 mg，0.33 mmol，1當量)於THF (200 uL)中之經攪拌溶液中逐份添加含LiOH (32 mg，1.34 mmol，4當量)之H 2O (4 mL)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內5%至70%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色固體狀之(3S)-1-[(2-{6-[(三級丁氧基羰基)(2-氰基乙基)胺基]-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-{[3-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-基]氧基}苯基]甲基}-3-甲基哌啶-1-鎓(300 mg，76%)。LCMS:(ES.m/z):1176 [M+H] +。 步驟 6 ：合成化合物 7
在0℃下於空氣氛圍下向(3S)-1-[(2-{6-[(三級丁氧基羰基)(2-氰基乙基)胺基]-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-{[3-({2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-基]氧基}苯基]甲基}-3-甲基哌啶-1-鎓(300 mg，0.26 mmol，1當量)於DCM (6 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TFA (1.2 mL)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物，得到呈黃色固體狀之(3S)-1-({3-[(2-胺基乙基)胺甲醯基]-4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-基]氧基}苯基}甲基)-1-[(2-{6-[(2-氰基乙基)胺基]-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-3-甲基哌啶-1-鎓(200 mg，80%)。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS:(ES.m/z):976 [M+H] +。 步驟 7 ：合成化合物 235
在0℃下於空氣氛圍下向(3S)-1-({3-[(2-胺基乙基)胺甲醯基]-4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-基]氧基}苯基}甲基)-1-[(2-{6-[(2-氰基乙基)胺基]-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-3-甲基哌啶-1-鎓(100 mg，0.10 mmol，1當量)及6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(38 mg，0.12 mmol，1.2當量)於DMF (1 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加DIEA (39 mg，0.30 mmol，3當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物1.5小時。LCMS指示反應完成。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Prep C18 OBD管柱，19*150 mm，5μm；移動相A：水(0.1%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min；梯度：在7分鐘內16% B至46% B，46% B；波長：254 nm；RT1(min)：5.2)純化反應混合物；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之(3S)-1-[(4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-羧基-3,4,5-三羥基環氧乙烷-2-基]氧基}-3-({2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]乙基}胺甲醯基)苯基)甲基]-1-[(2-{6-[(2-氰基乙基)胺基]-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-3-側氧基-7-(三氟甲基)-1H-異吲哚-5-基)甲基]-3-甲基哌啶-1-鎓(14.7 mg，14%)。LCMS:(ES.m/z):1169[M+H-TFA] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 10.00 (s, 1H), 9.89 (br s, 1H), 8.31 (t, J=6.4Hz, 1H), 8.23 (s, 2H), 7.94-7.83 (m, 3H), 7.65-7.62 (m, 1H), 7.37-7.35 (d, J=8Hz, 1H), 7.26-7.25 (m, 1H),7.00 (s, 2H), 6.30 (s, 1H), 5.67 (s, 2H), 5.49 (br s, 1H), 5.29 (s, 2H), 5.21-5.19 (m, 1H), 4.53 (s, 2H), 3.99-3.87 (m, 1H), 3.58-3.52 (m, 3H), 3.48 (s, 3H), 3.13-3.09 (m, 5H), 2.95-2.85 (m, 6H), 2.67-2.59 (m, 4H), 2.05 (t, J=6.4Hz, 2H), 1.86-1.64 (m, 4H), 1.47-1.40 (m, 4H), 1.24-1.08 (m, 8H), 0.90-0.88 (m, 4H)。 合成化合物 236 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下於氮氣氛圍下向3-{[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基}丙腈(400 mg，0.66 mmol，1當量)於THF (45 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加三光氣(293 mg，0.99 mmol，1.5當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物，得到呈黃色固體狀之N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺甲醯氯(420 mg)。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS:(ESI.m/z):669[M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在室溫下於空氣氛圍下向N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲酸三級丁酯(258 mg，0.65 mmol，1.1當量)於DCM (10 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加TEA (181 mg，1.79 mmol，3當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在室溫下向上述混合物中逐份添加N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺甲醯氯(420 mg，粗物質)及DMAP (146 mg，1.19 mmol，2當量)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水(0.05% TFA)，在30分鐘內0%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈白色固體狀之N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(300 mg，兩個步驟48%)。LCMS:(ESI.m/z):1026[M+H] +, 514[M+H] +/2。 步驟 3 ：合成化合物 236
在0℃下於空氣氛圍下向N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(200 mg，0.20 mmol，1當量)於DCM (4 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TFA (800 uL)。在0℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm，得到呈灰白色固體狀之三氟乙酸；N-(2-氰基乙基)-N-[6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-4-(三氟甲基)-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(127.6 mg，57%)。LCMS: (ES.m/z): 926 [M+H-TFA] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 10.22 (s, 1H), 9.83 (br s, 1H), 8.73-8.69 (m, 1H), 8.43 (s, 1H), 8.27-8.21 (m, 2H), 8.14 (s, 1H), 8.08-8.00 (m, 3H), 7.71-7.51 (m, 3H), 7.42-7.18 (m, 2H), 5.32 (s, 2H), 5.17 (s, 2H), 4.53-4.43 (m, 3H), 4.24-4.21 (m, 2H), 3.91-3.62 (m, 2H), 3.38-3.35 (m, 1H), 3.27-3.26 (m, 1H), 3.18 (s, 3H), 3.01-2.99 (m, 2H), 2.97-2.73 (m, 1H), 2.70-2.68 (m, 2H), 2.67-2.57 (m, 3H), 2.44-2.40 (m, 1H), 2.08-2.05 (m, 1H), 1.85-1.72 (m, 4H), 1.36 (d, J= 8 Hz, 3H), 1.05 (d, J= 4 Hz, 3H), 0.96-0.93 (m, 6H), 0.88 (d, J= 4 Hz, 2H)。 合成化合物 237 步驟 1 ：合成化合物 2
在25℃下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(200 mg，0.62 mmol，1當量)於DMF (3 mL)中之經攪拌溶液中添加(甲基硫烷基)鈉(93 mg，0.93 mmol，1.5當量)。在90℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應物：管柱，C18矽膠；移動相，含TFA之水，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(80 mg，44%)。LCMS: (ES.m/z): 291 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 4
在90℃下將2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(1.3 g，4.34 mmol，1當量)於乙胺溶液(2.0 M，於THF中，13 mL)中之經攪拌溶液攪拌隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在真空下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(440 mg，33%)。LCMS (ESI, ms): 308,310 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 5
在25℃下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(238 mg，0.82 mmol，1.0當量)及6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(250 mg，0.82 mmol，1.0當量)於二噁烷(4 mL)中之經攪拌混合物中添加Xantphos (94 mg，0.16 mmol，0.2當量)、Cs 2CO 3(530 mg，1.64 mmol，2當量)及Pd(OAc) 2(16 mg，0.082 mmol，0.1當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.1% TFA及ACN之水(在50分鐘內5%至95%梯度)；偵測器，UV 254 nm。凍乾溶離物，得到呈黃色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(230 mg，50%)。LCMS (ESI, m/z): 562 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 8
在室溫下於氮氣氛圍下向2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(900 mg，1.60 mmol，1當量)於THF (80 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加三光氣(713 mg，2.40 mmol，1.5當量)。在室溫下再攪拌所得混合物30分鐘。在真空下濃縮所得混合物。在0℃下向上述混合物中添加含N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲酸三級丁酯(630 mg，1.60 mmol，1當量)之DCM (20 mL)，添加TEA (486.37 mg，4.806 mmol，3當量)。在0℃下再攪拌所得混合物10分鐘。最後，逐份添加DMAP (391 mg，3.20 mmol，2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS可偵測到約10%所需產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.1% TFA)，在10分鐘內10%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(180 mg，10%)。LCMS: (ES, m/s): 981 [M+H]+。 步驟 5 ：合成化合物 9
在25℃下向N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(三級丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(180 mg，0.18 mmol，1當量)於DCM (7.5 mL)中之混合物中添加TFA (1.5 mL)。在25℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。凍乾殘餘物，得到呈棕色固體狀之粗物質N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(180 mg，粗物質)。LCMS (ESI, m/z): 881 [M+H] + 步驟 6 ：合成化合物 11
在室溫下於氮氣氛圍下向N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(90 mg，0.10 mmol，1.0當量)及DIEA (26 mg，0.20 mmol，2.0當量)於DMF (1 mL)中之經攪拌溶液中添加4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(40 mg，0.12 mmol，1.2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。藉由LCMS監測反應。藉由凍乾乾燥反應混合物，得到呈白色固體狀之N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-3-甲基-2-[4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁醯胺基]丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(90 mg，80%)。粗產物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS (ES, m/z) =1092 [M+H] + 步驟 7 ：合成化合物 237
在室溫下於空氣氛圍下向N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-3-甲基-2-[4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁醯胺基]丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(90 mg，0.082 mmol，1.0當量)及DTT (63 mg，0.41 mmol，5.0當量)於DMSO (1.5 mL)及PBS (pH=7.4，0.1N，0.5 mL)中之經攪拌溶液中。藉由LCMS監測反應。藉由LCMS可偵測到所需產物。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Prep OBD C18管柱，19*250 mm，5 μm；移動相A：水(0.1% FA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min mL/min；梯度：在15分鐘內17% B至47% B；波長：254 nm/220 nm nm；RT1(min)：14.1)純化粗產物(90 mg)且藉由凍乾移除溶劑，得到呈白色固體狀之N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-3-甲基-2-(4-硫烷基丁醯胺基)丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(17.4 mg，20.06%)。LCMS (ES, m/z) = 984 [M+H] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 10.00 (s, 1H), 8.22-8.20 (m, 2H), 7.97 (d, J= 1.2 Hz, 1H), 7.89 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.61 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.48 (t, J= 4.4 Hz, 2H), 7.39 -7.34 (m, 2H), 7.19 (s, 1H), 5.13 (s, 2H), 4.94-4.83 (m, 4H), 4.76 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 4.40-4.36 (m, 1H), 4.21-4.14 (m, 1H), 3.93-3.91 (m, 2H), 3.55 (s, 2H), 3.49 (s, 2H), 3.18 (s, 3H), 2.69-2.67 (m, 2H), 2.58 (s, 3H), 2.47 - 2.40 (m, 2H), 2.34 - 2.22 (m, 3H), 2.00 - 1.70 (m, 4H), 1.68 - 1.55 (m, 4H), 1.49-1.45 (m, 1H), 1.30 (d, J= 7.2 Hz, 3H), 1.21 (t, J= 7.2 Hz, 3H), 0.90 - 0.76 (m, 10H)。 合成化合物 238 步驟 1 ：合成化合物 3
用1-甲基環丁-1-胺鹽酸鹽(2.28 g，18.75 mmol，1.5當量)及TEA (3.79 g，37.50 mmol，3.0當量)處理7-溴-3-側氧基-1,2-二氫異吲哚-5-甲醛(3 g，12.50 mmol，1.0當量)於DCM (30 mL)中之溶液。在室溫下攪拌反應混合物30分鐘。向上述混合物中逐份添加STAB (7.95 g，37.50 mmol，3.0當量)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS可偵測到所需產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈白色固體狀之4-溴-6-{[(1-甲基環丁基)胺基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(3.6 g，74%)。LCMS (ES, m/z): 309,311 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 4
用NaHCO 3(飽和水溶液)將4-溴-6-{[(1-甲基環丁基)胺基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(3.60 g，11.64 mmol，1.0當量)於THF (36 mL)中之溶液鹼化至pH=9且用二碳酸二-三級丁酯(3.05 g，13.97 mmol，1.2當量)處理混合物。在室溫下攪拌所得混合物16小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈白色固體狀之N-[(7-溴-3-側氧基-1,2-二氫異吲哚-5-基)甲基]-N-(1-甲基環丁基)胺基甲酸三級丁酯(2.70 g，49%)。LCMS (ES, m/z): 409,411 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 5
用NaSMe (0.68 g，9.77 mmol，2.0當量)處理N-[(7-溴-3-側氧基-1,2-二氫異吲哚-5-基)甲基]-N-(1-甲基環丁基)胺基甲酸三級丁酯(2.0 g，4.89 mmol，1.0當量)於DMF (10 mL)中之溶液。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。使反應混合物冷卻降至室溫且在室溫下用水淬滅。用EtOAc (3 x 10 mL)萃取所得混合物。用水(10 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之N-(1-甲基環丁基)-N-{[7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1,2-二氫異吲哚-5-基]甲基}胺基甲酸三級丁酯(1.90 g，87%)。LCMS (ES, m/z): 377 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 7
在氮氣氛圍下用6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(327 mg，1.06 mmol，1.0當量)、Pd(OAc) 2(48 mg，0.21 mmol，0.2當量)、[5-(二苯基磷烷基)-9,9-二甲基-9H-二苯并哌喃-4-基]二苯基磷烷(246 mg，0.43 mmol，0.4當量)及Cs 2CO 3(692 mg，2.12 mmol，2.0當量)處理N-(1-甲基環丁基)-N-{[7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1,2-二氫異吲哚-5-基]甲基}胺基甲酸三級丁酯(400 mg，1.06 mmol，1.0當量)於二噁烷(5 mL)中之溶液。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1.5小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。使反應混合物冷卻降至室溫且在真空下濃縮至乾。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之N-({2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基}甲基)-N-(1-甲基環丁基)胺基甲酸三級丁酯(190 mg，22%)。LCMS (ES, m/z): 648 [M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 8
用TFA (1 mL)處理N-({2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基}甲基)-N-(1-甲基環丁基)胺基甲酸三級丁酯(90 mg，0.14 mmol，1.0當量)於DCM (3 mL)中之溶液。在室溫下攪拌所得混合物1小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。將反應混合物在真空下濃縮至乾。對殘餘物進行製備型HPLC純化(管柱：Xselect CSH Prep C 18管柱，30*150 mm，5 μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min mL/min；梯度：在10分鐘內10% B至40% B；波長：254 nm/220 nm nm；RT1(min)：8.68)且凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(1-甲基環丁基)胺基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮；三氟乙酸(25.50 mg，27%)。LCMS (ESI, m/z): 548 [M+H] +。 步驟 6 ：合成化合物 11
在室溫下用碳酸雙(4-硝基苯基)酯(300 mg，0.99 mmol，1.2當量)處理6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(羥甲基)苯基]胺甲醯基}乙基]胺甲醯基}-2-甲基丙基]己醯胺(400 mg，0.82 mmol，1.0當量)及DIEA (212 mg，1.64 mmol，2.0當量)於DMF (2 mL)中之溶液。在室溫下攪拌所得混合物1小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析純化殘餘物：含0.05% TFA及ACN之水(在50分鐘內0%至50%梯度)；偵測器，UV 254 nm。此得到呈灰白色固體狀之碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯4-硝基苯酯(350 mg，63%)。LCMS (ES, m/z): 652 [M+H] +。 步驟 7 ：合成化合物 238
用2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(1-甲基環丁基)胺基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(60 mg，0.11 mmol，1.0當量)處理碳酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯4-硝基苯酯(78 mg，0.12 mmol，1.1當量)於DMF (0.5 mL)中之溶液。在50℃下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS可偵測到所需產物。對反應混合物進行製備型HPLC純化(管柱：XBridge Prep OBD C 18管柱，30*150 mm，5 μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min mL/min；梯度：在10分鐘內27% B至57% B；波長：254 nm/220 nm nm；RT1(min)：8.83)且凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之三氟乙酸；N-({2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基}甲基)-N-(1-甲基環丁基)胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]丙醯胺基]苯基}甲酯(10.30 mg，7.97%)。LCMS (ESI, m/z): 1061 [M+H-TFA] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.96 (s, 1H), 9.10 (s, 1H), 8.16 (d, J= 6.8 Hz, 1H), 7.81 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.59 (br s, 2H), 7.42 (d, J=5.2 Hz, 2H), 7.29 (s, 2H), 7.00 (s, 2H), 6.00 (s, 1H), 5.03 (br s, 2H), 4.92-4.78 (m, 6H), 4.42-4.39 (m, 3H), 4.18-4.16 (m, 1H), 3.68 (s, 2H), 3.51 (s, 1H), 3.41-3.38 (m, 3H), 3.36 (d, J= 7.2 Hz, 2H), 3.26-3.24 (m, 2H), 2.52-2.51 (m, 2H), 2.49-2.48 (m, 2H), 2.23-2.05 (m, 4H), 2.01-1.83 (m, 3H), 1.75-1.61 (m, 2H), 1.55-1.48 (m, 4H), 1.41-1.28 (m, 6H), 1.23-1.17 (m, 5H), 0.85-0.82 (m, 6H)。 合成化合物 239 步驟 1. 合成化合物 2
在90℃下將2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(4 g，13.37 mmol，1當量)於2.0 M乙胺之THF溶液(60 mL)中之混合物攪拌隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(2.5 g，60%)。LCMS (ESI, m/z): 308,310 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 4
在25℃下用(甲基硫烷基)鈉(325 mg，4.64 mmol，1.5當量)處理4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(1 g，3.09 mmol，1當量)於DMF (15 mL)中之溶液。在90℃下攪拌溶液1小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。使反應物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.5% NH 4HCO 3及ACN之水(在50分鐘內0%至100%梯度)；偵測器，UV 254 nm。此得到呈白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(600 mg，67%)。LCMS (ES, m/z): 291 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 5
在室溫下於空氣氛圍下向6-氯-N-乙基-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-胺(500 mg，1.62 mmol，1當量)及6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(519 mg，1.79 mmol，1.1當量)於二噁烷(5.00 mL)中之經攪拌混合物中添加Cs 2CO 3(1.06 g，3.25 mmol，2當量)、Xantphos (376 mg，0.65 mmol，0.4當量)及Pd(OAc) 2(73 mg，0.32 mmol，0.2當量)。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使反應物冷卻降至室溫且在真空下濃縮至乾。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(770 mg，77%)。LCMS (ES, m/z): 562 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 6
在室溫下向2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-3H-異吲哚-1-酮(610 mg，1.09 mmol，1當量)於THF (26 mL)中之經攪拌溶液中添加TEA (440 mg，4.34 mmol，4當量)及DMAP (40 mg，0.32 mmol，0.3當量)及Boc 2O (950 mg，4.34 mmol，4當量)。在60℃下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化粗產物，用DCM/MeOH (95:5)溶離，得到呈黃色固體狀之N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸三級丁酯(220 mg，31%)。LCMS:(ES.m/z): 662 [M+1] +。 步驟 5 ：合成化合物 8
在0℃下向4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯甲酸(1 g，2.84 mmol，1當量)於DMF (15 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加HATU (1.62 g，4.26 mmol，1.50當量)。攪拌所得混合物30分鐘。接著在0℃下將N-(2-胺基乙基)胺基甲酸9H-茀-9-基甲酯鹽酸鹽(1.09 g，3.41 mmol，1.20當量)及DIEA (1.83 g，14.19 mmol，5當量)添加至上述混合物中。在0℃下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.1% TFA及ACN之水(在50分鐘內0%至100%梯度)；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色固體狀之N-{2-[(4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯基)甲醯胺基]乙基}胺基甲酸9H-茀-9-基甲酯(1.1 g，63%)。LCMS (ESI, m/z): 639 [M+Na] +。 步驟 6 ：合成化合物 9
在0℃下向N-{2-[(4-{[4-(羥甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯基)甲醯胺基]乙基}胺基甲酸9H-茀-9-基甲酯(200 mg，0.32 mmol，1當量)及DMF (20滴)於THF (4 mL)中之混合物中逐滴添加含SOCl 2(77 mg，0.65 mmol，2.00當量)之THF (0.4 mL)。在25℃下攪拌所得混合物30分鐘。LCMS指示反應完成。凍乾反應物，得到呈黃色固體狀之粗物質N-{2-[(4-{[4-(氯甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯基)甲醯胺基]乙基}胺基甲酸9H-茀-9-基甲酯(220 mg，粗物質)。LCMS (ESI, m/z): 657 [M+Na] +。 步驟 7 ：合成化合物 10
在0℃下向N-乙基-N-(4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}-6-(6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)吡啶-2-基)胺基甲酸三級丁酯(130 mg，0.20 mmol，1當量)及KI (65 mg，0.40 mmol，2.00當量)於DMF (3 mL)中之混合物中逐滴添加含N-{2-[(4-{[4-(氯甲基)苯基]胺磺醯基}-3-硝基苯基)甲醯胺基]乙基}胺基甲酸9H-茀-9-基甲酯(124 mg，0.20 mmol，1.00當量)之DMF (1 mL)。在50℃下攪拌所得混合物4小時。LCMS指示反應完成。使反應物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.05% TFA及ACN之水(在50分鐘內0%至100%梯度)；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之(3S)-1-[(2-{6-[(三級丁氧基羰基)(乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-[(4-{4-[(2-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}乙基)胺甲醯基]-2-硝基苯磺醯胺基}苯基)甲基]-3-甲基哌啶-1-鎓(100 mg，40%)。LCMS (ESI, m/z): 1260.80 [M] +。 步驟 8 ：合成化合物 11
在25℃下向(3S)-1-[(2-{6-[(三級丁氧基羰基)(乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基)甲基]-1-[(4-{4-[(2-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}乙基)胺甲醯基]-2-硝基苯磺醯胺基}苯基)甲基]-3-甲基哌啶-1-鎓(125 mg，0.099 mmol，1當量)於DMF (4 mL)中之混合物中添加二乙胺(1 mL)。在25℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.05% TFA及ACN之水(在50分鐘內0%至100%梯度)；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之(3S)-1-[(4-{4-[(2-胺基乙基)胺甲醯基]-2-硝基苯磺醯胺基}苯基)甲基]-1-[(2-{6-[(三級丁氧基羰基)(乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基)甲基]-3-甲基哌啶-1-鎓(80 mg，77%)。LCMS (ESI, m/z): 1038.6 [M] +。 步驟 9 ：合成化合物 12
在25℃下向(3S)-1-[(4-{4-[(2-胺基乙基)胺甲醯基]-2-硝基苯磺醯胺基}苯基)甲基]-1-[(2-{6-[(三級丁氧基羰基)(乙基)胺基]-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基}-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基)甲基]-3-甲基哌啶-1-鎓(75 mg，0.072 mmol，1當量)於DCM (5 mL)中之混合物中添加TFA (2 mL)。在25℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。凍乾殘餘物，得到呈黃色固體狀之粗物質(3S)-1-[(4-{4-[(2-胺基乙基)胺甲醯基]-2-硝基苯磺醯胺基}苯基)甲基]-1-({2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓(85 mg，粗物質)。LCMS (ESI, m/z): 938.6 [M] +。 步驟 10 ：合成化合物 239
在25℃下向(3S)-1-[(4-{4-[(2-胺基乙基)胺甲醯基]-2-硝基苯磺醯胺基}苯基)甲基]-1-({2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓(75 mg，0.080 mmol，1當量)及DIEA (41 mg，0.32 mmol，4當量)於DMF (1.5 mL)中之經攪拌混合物中添加戊二酸雙(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯(26 mg，0.080 mmol，1當量)。在25℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。藉由製備型HPLC用以下條件純化反應混合物：管柱：XBridge Prep Phenyl OBD C18管柱，19*250 mm，5 μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min mL/min；梯度：在20分鐘內10% B至40% B；波長：254nm/220nm nm；RT1(min)：22.57。凍乾所收集之級分，得到呈黃色固體狀之(3S)-1-[(4-{4-[(2-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯胺基}乙基)胺甲醯基]-2-硝基苯磺醯胺基}苯基)甲基]-1-({2-[6-(乙基胺基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基}甲基)-3-甲基哌啶-1-鎓；三氟乙酸鹽(11.8 mg，10.6%)。LCMS (ESI, m/z): 1149.5 [M] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 11.06 (s, 1H), 10.05 (br s, 1H), 9.91 (s, 1H), 8.91 (t, J= 5.2 Hz, 1H), 8.32 (s, 1H), 8.15 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 8.07 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.98 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 7.71 (d, J= 6.8 Hz, 2H), 7.37-7.30 (m, 3H), 7.13 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 6.11 (s, 1H), 5.47 (s, 2H), 4.91 (s, 2H), 4.83-4.77 (m, 4H), 4.43 (s, 2H), 3.72 (s, 2H), 3.56 (s, 3H), 3.41-3.16 (m, 8H), 2.95-2.82 (m, 5H), 2.70-2.60 (m, 6H), 2.18 (t, J= 7.2 Hz, 2H), 1.89-1.62 (m, 6H), 1.17 (t, J= 7.2 Hz, 3H), 1.09-1.02 (m, 1H), 0.88 (d, J= 6.4 Hz, 3H)。 合成化合物 240 步驟 1. 合成化合物 3
用β-胺基丙腈(2.36 g，33.64 mmol，20.0當量)及K 2CO 3(465 mg，3.36 mmol，2.0當量)處理2,6-二氯-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶(500 mg，1.68 mmol，1.0當量)於DMA (10 mL)中之溶液。在120℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物16小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。使反應混合物冷卻降至室溫且藉由逆相急驟層析用以下條件純化：管柱，C 18，40 g，20-35 um；移動相，含0.08% NH 4HCO 3及ACN之水(在50分鐘內0%至50%梯度)；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈灰白色固體狀之3-({6-氯-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}胺基)丙腈(310 mg，48%)。LCMS (ESI, m/z): 331,333 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 5
用N-(1-甲基環丁基)-N-{[7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1,2-二氫異吲哚-5-基]甲基}胺基甲酸三級丁酯(341 mg，0.91 mmol，1.5當量)、Pd(OAc) 2(54 mg，0.24 mmol，0.4當量)、[5-(二苯基磷烷基)-9,9-二甲基-9H-二苯并哌喃-4-基]二苯基磷烷(140 mg，0.24 mmol，0.4當量)及Cs 2CO 3(1.58 g，4.84 mmol，8.0當量)處理3-({6-氯-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}胺基)丙腈(200 mg，0.61 mmol，1.0當量)於二噁烷(12 mL)中之溶液。在100℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1.5小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (20:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之N-[(2-{6-[(2-氰基乙基)胺基]-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基)甲基]-N-(1-甲基環丁基)胺基甲酸三級丁酯(120 mg，26%)。LCMS (ESI, m/z): 671 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 6
用TFA (1 mL)處理N-[(2-{6-[(2-氰基乙基)胺基]-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基)甲基]-N-(1-甲基環丁基)胺基甲酸三級丁酯(40 mg，0.060 mmol，1.0當量)於DCM (3 mL)中之溶液。在室溫下攪拌所得混合物1小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。在室溫下攪拌所得混合物1小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。對殘餘物進行製備型HPLC純化(管柱：XBridge Prep OBD C 18管柱，19*250 mm，5 μm；移動相A：水(0.05%TFA)，移動相B：ACN；流動速率：25 mL/min mL/min；梯度：在10分鐘內7% B至47% B；波長：254 nm/220nm nm；RT1(min)：9.77)且凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之3-{[6-(6-{[(1-甲基環丁基)胺基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基}丙腈；三氟乙酸(20.40 mg，49%)。LCMS (ESI, m/z): 571 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 240
用碳酸{4-[(2S)-5-(胺甲醯基胺基)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]戊醯胺基]苯基}甲酯4-硝基苯酯(116 mg，0.16 mmol，1.0當量)及DIEA (102 mg，0.79 mmol，5.0當量)處理3-{[6-(6-{[(1-甲基環丁基)胺基]甲基}-4-(甲基硫烷基)-1-側氧基-3H-異吲哚-2-基)-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基]胺基}丙腈(90 mg，0.16 mmol，1.0當量)於DMF (0.5 mL)中之溶液。在50℃下攪拌所得混合物16小時。藉由LCMS可偵測到所需產物。對反應混合物進行製備型HPLC純化(管柱：254 nm/220nm；移動相A：XBridge Prep OBD C 18管柱，30*150 mm，5 μm，移動相B：水(10 nmol/LNH 4HCO 3+ 0.05%NH 3.H 2O)；梯度：等度60 mL/min；波長：254 nm/220 nm nm；RT1(min)：在20分鐘內35% B至65% B)且凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之N-[(2-{6-[(2-氰基乙基)胺基]-4-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]吡啶-2-基}-7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-1H-異吲哚-5-基)甲基]-N-(1-甲基環丁基)胺基甲酸{4-[(2S)-5-(胺甲醯基胺基)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]戊醯胺基]苯基}甲酯(20.70 mg，11%)。LCMS (ESI, m/z): 1169 [M+H] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.01 (s, 1H), 8.35 (s, 1H), 8.09 (d, J= 6.4 Hz, 1H), 7.81-7.79(m, 2H), 7.59 (br s, 2H), 7.43-7.41 (m, 2H), 7.34-7.32 (m, 1H), 7.11 (d, J= 5.2 Hz, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.18 (s, 1H), 5.98-5.96 (m, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.03 (s, 2H), 4.92 (s, 2H), 4.42-4.40 (m, 3H), 4.19 (t, J= 7.6Hz, 1H), 3.54-3.52 (m, 2H), 3.34-3.32 (m, 2H), 3.25 (s, 3H), 3.08-2.98 (m, 2H), 2.84 (t, J= 7.6Hz, 2H), 2.79-2.69 (m, 2H), 2.55-2.52 (m, 3H), 2.18-2.11 (m, 4H), 2.01-1.83 (m, 3H), 1.68-151 (m, 4H), 1.48-1.45 (m, 5H), 1.39-1.29 (m, 4H), 1.23-1.18 (m, 3H), 1.09-1.08 (m, 3H), 0.86-0.81 (m, 7H)。 合成化合物 241 步驟 1 ：合成化合物 2
在0℃下於空氣氛圍下向2-(3-溴苯基)乙酸甲酯(100 g，436.54 mmol，1當量)於DMF (1 L)中之經攪拌溶液中逐份添加NaH (26.19 g，1091.35 mmol，1.5當量，60%)。在0℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物30分鐘。在0℃下向上述混合物中逐份添加1,3-二溴-2-甲基丙烷(103.68 g，480.19 mmol，1.1當量)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在0℃下藉由添加飽和NH 4Cl (水溶液) (1000 mL)淬滅反應物。用EtOAc (3 x 700 mL)萃取所得混合物。用鹽水(3x200 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (5:1)溶離，得到呈黃色油狀之1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸甲酯(100 g，81%)。LCMS:(ES.m/z): 283,284 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 3
在0℃下向1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸甲酯(100 g，353.15 mmol，1當量)於THF (100 mL)中之經攪拌溶液中添加含LiOH (25.37 g，1059.45 mmol，3當量)之H 2O (1000 mL)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。在真空下濃縮所得混合物。用濃HCl將混合物酸化至pH 6。用EtOAc (3 x 200mL)萃取所得混合物。用鹽水(3x100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。此得到呈黃色固體狀之1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸(30 g，32%)。LCMS (ESI, m/z):267,269[M-H] -。 步驟 3 ：合成化合物 4
在室溫下向1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁烷-1-甲酸(16.5 g，61.31 mmol，1當量)及1-胺基-3-甲基硫脲(7.74 g，73.57 mmol，1.2當量)於DMF (170 mL)中之經攪拌溶液中添加HATU (34.97 g，91.96 mmol，1.5當量)及DIEA (15.85 g，122.61 mmol，2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。反應混合物未經任何處理即用於下一步驟。LCMS:(ES.m/z):356,358 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 5
在室溫下向上述混合物中添加NaOH (170 mL)。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。用1N HCl將混合物酸化至pH 6。用EtOAc (3 x100 mL)萃取所得混合物。用鹽水(5x100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色油狀之5-[1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑-3-硫醇(4.1 g，20%)。LCMS:(ES.m/z): 338,340[M+H] +。 步驟 5 ：合成化合物 6
在0℃下於氮氣氛圍下向5-[1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑-3-硫醇(22 g，65.03 mmol，1.00當量)於THF (22.02 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加NaNO 2(22.44 g，325.18 mmol，5當量)。在0℃下於氮氣氛圍下向混合物中逐滴添加HNO 3(325.18 mL，325.18 mmol，5當量，1N)。LCMS指示反應完成。用飽和NaHCO 3(水溶液)將混合物鹼化至pH 8。用EtOAc (3 x 200 mL)萃取所得混合物。用水(4x80 mL)洗滌合併之有機層。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之3-[1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁基]-4-甲基-1,2,4-三唑(10 g，50%)。LCMS:(ES.m/z):306,308[M+H] +。 步驟 6 ：合成化合物 7
藉由製備型SFC用以下條件(管柱：CHIRALPAK ID 2*25 cm，5um；移動相A：CO2，移動相B：IPA (1%-2M-NH3-MeOH)；流動速率：55 mL/min；梯度：等度20% B；管柱溫度(℃)：35；背壓(bar)：100；波長：220 nm；RT1(min)：12.13；RT2(min)：13.8；樣品溶劑：MEOH；注入體積：0.8 mL)分離產物(10 g)。濃縮第二級分(RT13.8min)，得到呈灰白色固體狀之4-甲基-3-[(1r,3s)-1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁基]-1,2,4-三唑(6 g，60%)。 1H NMR (300 MHz, 氯仿-d) δ 8.00 (s, 1H),7.53 (s, 1H), 7.40-7.37 (s, 1H),7.24-7.21 (m, 2H), 3.19 (s,3H), 2.82-2.78 (m, 2H), 2.67-2.63 (m, 3H), 1.22-1.12 (m, 3H)。 步驟 7 ：合成化合物 9
在室溫下於氮氣氛圍下將NIS (57.54 g，255.76 mmol，1.1當量)於H 2SO 4(200 mL)中之經攪拌溶液攪拌40分鐘。在0℃下向上述混合物中逐滴添加含3-溴-2-甲基苯甲酸(50 g，232.51 mmol，1當量)之H 2SO 4(200 mL)且攪拌3小時。在室溫下再攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示完全反應。LCMS指示完全反應。在0℃下將反應物傾倒至水/冰中。藉由過濾收集沈澱之固體且用Et 2O (3x20 mL)洗滌。藉由用DCM (100 mL)濕磨純化殘餘物。藉由過濾收集沈澱之固體且用DCM (3x50 mL)洗滌。在紅外下乾燥固體，得到呈灰白色固體狀之3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸(54.2 g，68%)。LCMS (ESI, ms):339,341[M-H] -。 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.13 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 2.47 (s, 3H)。 步驟 8 ：合成化合物 10
在0℃下於氮氣氛圍下向3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸(30 g，87.99 mmol，1當量)於MeOH (300 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加SOCl 2(52.34 g，439.96 mmol，5當量)。在70℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。在0℃下用飽和NaHCO 3(水溶液)淬滅反應物。用EtOAc (3 x 100 mL)萃取所得混合物。用鹽水(100 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。此得到呈灰白色固體狀之3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸甲酯(29.9 g，96%)。無MS信號。 1H NMR (400 MHz, 氯仿-d) δ 8.03 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.02 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 2.56 (s, 3H)。 步驟 9 ：合成化合物 11
在70℃下於氮氣氛圍下向3-溴-5-碘-2-甲基苯甲酸甲酯(15 g，42.25 mmol，1當量)及NBS (9.03 g，50.70 mmol，1.2當量)於ACN (150 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加AIBN (3.47 g，21.12 mmol，0.5當量)。LCMS及TLC顯示反應完成。無MS信號。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (6:1)溶離，得到呈白色固體狀之3-溴-2-(溴甲基)-5-碘苯甲酸甲酯(16.5 g，90%)。 1H NMR (300 MHz, 氯仿-d) δ 8.20 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 5.06 (s, 2H), 1.73 (s, 3H)。 步驟 10 ：合成化合物 12
在25℃下將3-溴-2-(溴甲基)-5-碘苯甲酸甲酯(51.5 g，118.70 mmol，1當量)及NH 3(7N，於MeOH中，500 mL)之混合物攪拌2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除溶劑。殘餘物未經進一步純化即用於下一步驟。LCMS (ESI, ms): 338,340 [M+H] +。 步驟 11 ：合成化合物 13
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-碘-2,3-二氫異吲哚-1-酮(48 g，142.03 mmol，1當量)及乙烯基三氟硼酸鉀(15.22 g，113.62 mmol，0.8當量)於1,4-二噁烷(500 mL)及H 2O (100 mL)中之經攪拌溶液中添加Cs 2CO 3(92.56 g，284.07 mmol，2當量)及Pd(dppf)Cl 2(10.39 g，14.20 mmol，0.1當量)。在90℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (12:1)溶離，得到呈棕色固體狀之4-溴-6-乙烯基-2,3-二氫異吲哚-1-酮(11 g，32%)。LCMS (ESI, ms):238,240[M+H] +。 步驟 12 ：合成化合物 14
在室溫下於氮氣氛圍下向4-溴-6-乙烯基-2,3-二氫異吲哚-1-酮(20 g，84.00 mmol，1當量)及NMO (29.52 g，252.00 mmol，3.00當量)於THF (200 mL)及水(100 mL)中之經攪拌溶液中添加K 2OsO 4.2H 2O (0.15 g，0.42 mmol，0.05當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物3小時。LCMS指示反應完成。在減壓下移除THF。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠，80 g，20-35 um；移動相，含0.1% TFA及ACN之水(在50分鐘內0%至100%梯度)；偵測器，UV 254 nm。凍乾所收集之級分，得到呈棕色固體狀之4-溴-6-(1,2-二羥基乙基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(6.7 g，29%)。LCMS (ESI, ms): 272,274 [M+H] +。 步驟 13 ：合成化合物 15
在室溫下於空氣氛圍下向4-溴-6-(1,2-二羥基乙基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(5 g，18.37 mmol，1當量)於DCM (50 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加咪唑(2.50 g，36.75 mmol，2當量)及TBDPSCl (5.05 g，18.37 mmol，1當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈白色固體狀之4-溴-6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-羥乙基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(3.6 g，38%)。LCMS:(ES.m/z): 510,512[M+H] +。 步驟 14 ：合成化合物 16
在室溫下於空氣氛圍下向4-溴-6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-羥乙基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(3.5 g，6.85 mmol，1當量)於DCM (70 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加MsCl (0.94 g，8.22 mmol，1.2當量)及TEA (2.08 g，20.56 mmol，3當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。所得混合物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS:(ES.m/z):588,590[M+H] +。 步驟 15 ：合成化合物 17
在室溫下於空氣氛圍下向甲烷磺酸1-(7-溴-3-側氧基-1,2-二氫異吲哚-5-基)-2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]乙酯(3.5 g，5.94 mmol，1當量)及(3S)-3-甲基哌啶(0.71 g，7.13 mmol，1.2當量)於DMF (40 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加K 2CO 3(2.05 g，14.86 mmol，2.5當量)。在50℃下於空氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。在0℃下藉由添加水/冰(200 mL)淬滅反應物。用EtOAc (3 x 100mL)萃取所得混合物。用鹽水(3x5 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用PE/EA (1:1)溶離，得到呈黃色固體狀之4-溴-6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(2.8 g，79%)。LCMS: (ES.m/z):591,593[M+H] +。 步驟 16 ：合成化合物 18
在室溫下於空氣氛圍下向4-溴-6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(2 g，3.38 mmol，1當量)於DMF (20 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加(甲基硫烷基)鈉(0.36 g，5.07 mmol，1.5當量)。在100℃下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。使混合物冷卻降至室溫。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色油狀之6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(600 mg，32%)。LCMS:(ES.m/z):559[M+H] +。 步驟 17 ：合成化合物 19
在室溫下於氮氣氛圍下向6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-4-(甲基硫烷基)-2,3-二氫異吲哚-1-酮(600 mg，1.074 mmol，1當量)及4-甲基-3-[(1r,3s)-1-(3-溴苯基)-3-甲基環丁基]-1,2,4-三唑(394 mg，1.28 mmol，1.2當量)於二噁烷(12 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(699 mg，2.14 mmol，2當量)及Xantphos (124 mg，0.21 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(24 mg，0.10 mmol，0.1當量)。在110℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應有45%產物。使混合物冷卻降至室溫。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈黃色固體狀之6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-4-(甲基硫烷基)-2-{3-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]苯基}-3H-異吲哚-1-酮(270 mg，32%)。LCMS:(ES.m/z):784 [M+H] +。 步驟 18 ：合成化合物 19-1
在0℃下向6-{2-[(三級丁基二苯基矽基)氧基]-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-4-(甲基硫烷基)-2-{3-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]苯基}-3H-異吲哚-1-酮(200 mg，0.25 mmol，1當量)於THF (4 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加TBAF (133 mg，0.51 mmol，2當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應有30%產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XSelect CSH Fluoro Phenyl，30*150 mm，5μm；移動相A：水(0.1%FA)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min；梯度：在8分鐘內5% B至35% B，35% B；波長：254；220 nm；RT1(min)：7.9)純化粗產物(40 mg)；凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之6-{2-羥基-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-4-(甲基硫烷基)-2-{3-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]苯基}-3H-異吲哚-1-酮(23.7 mg，17%)。LCMS: (ES.m/z): 546 [M+H] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.29-8.25 (m, 2H), 8.05 (s, 1H), 7.71 (d, J=8Hz, 1H), 7.47 (s, 2H), 7.43 (t, J=8Hz, 1H), 7.09 (d, J=8Hz, 1H), 3.85-3.81 (m, 1H), 3.78-3.73 (m, 1H), 3.60-3.57 (m, 1H), 3.26 (s, 3H), 2.95-2.80 (m, 3H), 2.70-2.67 (m, 1H), 2.59-2.54 (m, 6H), 2.08-1.80 (m, 1H), 1.71-1.66 (m, 1H), 1.61-1.58 (m, 2H), 1.51-1.39 (m, 3H), 1.23-1.09 (m, 3H), 0.82-0.74 (m, 4H) 步驟 19 ：合成化合物 21
在0℃下於空氣氛圍下向6-{2-羥基-1-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]乙基}-4-(甲基硫烷基)-2-{3-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]苯基}-3H-異吲哚-1-酮(200 mg，0.36 mmol，1當量)及乙酸{2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙醯胺基}甲酯(135 mg，0.55 mmol，1.5當量)於DCM (1 mL)中之經攪拌混合物中逐滴添加PTSA (126 mg，0.73 mmol，2當量)。在室溫下於空氣氛圍下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS偵測到30%所需產物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至60%梯度；偵測器，UV 254 nm，得到呈黃色固體狀之N-{[({2-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]-2-[7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-2-{3-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]苯基}-1H-異吲哚-5-基]乙氧基}甲基)胺甲醯基]甲基}胺基甲酸三級丁酯(65 mg，24%)。LCMS: (ES.m/z): 732 [M+H] +。 步驟 20 ：合成化合物 22
在0℃下向N-{[({2-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]-2-[7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-2-{3-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]苯基}-1H-異吲哚-5-基]乙氧基}甲基)胺甲醯基]甲基}胺基甲酸三級丁酯(60 mg，0.082 mmol，1當量)於DCM (1 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加TFA (200 uL)。在0℃下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。殘餘物未經進一步純化即直接用於下一步驟。LCMS: (ES.m/z): 632 [M+H] +。 步驟 21 ：合成化合物 241
在0℃下將(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯胺基]乙醯胺基}乙醯胺基)-3-苯基丙酸(41 mg，0.087 mmol，1當量)、HATU (50 mg，0.13 mmol，1.5當量)及HOBT (12 mg，0.087 mmol，1當量)於DMF (2.2 mL)中之混合物攪拌5分鐘。接著在0℃下將2-胺基-N-({2-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]-2-[7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-2-{3-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]苯基}-1H-異吲哚-5-基]乙氧基}甲基)乙醯胺(55 mg，0.087 mmol，1當量)及DIEA (28 mg，0.22 mmol，2.5當量)添加至上述混合物中。在0℃下再攪拌所得混合物1小時。用以下條件純化反應物：管柱：XselectCSH Prep OBD C18管柱，30*150 mm，5 μm；移動相A：水(0.1% FA)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min mL/min；梯度：在8分鐘內20% B至40% B；波長：254 nm/220nm nm；RT1(min)：7.62。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)-N-{[({[(1S)-1-({[({2-[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]-2-[7-(甲基硫烷基)-3-側氧基-2-{3-[(1r,3s)-3-甲基-1-(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)環丁基]苯基}-1H-異吲哚-5-基]乙氧基}甲基)胺甲醯基]甲基}胺甲醯基)-2-苯基乙基]胺甲醯基}甲基)胺甲醯基]甲基}己醯胺(2.6 mg，2.48%)。LCMS: (ES.m/z): 1086 [M+H] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.61 (br s, 1H), 8.37 (s, 1H), 8.32 (br s, 1H), 8.25-8.14 (m, 1H), 8.10-8.04 (m, 2H), 7.88 (s, 1H), 7.66-7.59 (m, 3H), 7.41 (t, J=8Hz, 1H), 7.28-7.22 (m, 4H), 7.78-7.12(m, 1H), 6.98 (s, 2H), 6.95 (d, J=4Hz, 1H), 4.86 (s, 2H), 4.57-4.48 (m, 3H), 3.91-3.66 (m, 8H), 3.34-3.26 (m, 7H), 3.15-3.01 (m, 3H), 2.85-2.75 (m, 2H), 2.62 (s, 3H), 2.38-2.25 (m, 3H), 2.12-2.08 (m, 3H), 1.63-1.61 (m, 3H), 1.49-1.44 (m, 5H), 1.20-1.16 (m, 3H), 1.11 (d, J=8Hz, 2H), 0.77 (s, 4H)。 合成化合物 242 步驟 1 ：合成化合物 1
在室溫下於氮氣氛圍下向2,6-二氯-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(1 g，3.34 mmol，1當量)於DMF (10 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加(乙基硫烷基)鈉(0.31 g，3.67 mmol，1.1當量)。在50℃下攪拌所得混合物2小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。用水(50 mL)淬滅所得混合物且用EtOAc (3 x 50 mL)萃取。用鹽水(2 x 20 mL)洗滌合併之有機層，經無水Na 2SO 4乾燥。過濾後，在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈灰白色固體狀之2-氯-6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(500 mg，46%)。LCMS: (ES.m/z): 325,327 [M+H] +。 步驟 2 ：合成化合物 2
在室溫下向4-溴-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-2,3-二氫異吲哚-1-酮(700 mg，2.16 mmol，1當量)於DMF (7 mL)中之經攪拌溶液中逐份添加Zn(CN) 2(508 mg，4.33 mmol，2當量)及Pd(PPh 3) 4(250 mg，0.21 mmol，0.1當量)。在145℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1.5小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。藉由逆相急驟層析用以下條件純化反應混合物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在30分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈灰白色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-2,3-二氫異吲哚-4-甲腈(360 mg，62%)。LCMS (ESI, m/z): 270 [M+H] +。 步驟 3 ：合成化合物 3
在-70℃下於氮氣氛圍下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-2,3-二氫異吲哚-4-甲腈(360 mg，1.33 mmol，1當量)於DCM (7 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加氫化二異丁基鋁(9.5 mL，7當量，1N，於DCM中)。在0℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應完成。在-20℃下藉由添加MeOH (5 mL)淬滅反應物。在減壓下濃縮所得混合物。藉由逆相急驟層析用以下條件純化殘餘物：管柱，C18矽膠；移動相，含MeCN之水(0.05% TFA)，在40分鐘內0%至50%梯度；偵測器，UV 254 nm。濃縮所收集之級分，得到呈黃色固體狀之6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-2,3-二氫異吲哚-4-甲醛(250 mg，68%)。LCMS (ESI, m/z): 273 [M+H] +。 步驟 4 ：合成化合物 4
在室溫下於氮氣氛圍下向6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-2,3-二氫異吲哚-4-甲醛(90 mg，0.33 mmol，1當量)及2-氯-6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶(97 mg，0.29 mmol，0.9當量)於二噁烷(1 mL)中之經攪拌混合物中逐份添加Cs 2CO 3(215 mg，0.66 mmol，2當量)及Xantphos (38 mg，0.06 mmol，0.2當量)及Pd(OAc) 2(7 mg，0.03 mmol，0.1當量)。在110℃下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。使混合物冷卻降至室溫。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，用CH 2Cl 2/MeOH (10:1)溶離，得到呈白色固體狀之2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-3H-異吲哚-4-甲醛(70 mg，14%)。LCMS:(ES.m/z): 561[M+1] +。 步驟 5 ：合成化合物 5
在0℃下於氮氣氛圍下向2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-3H-異吲哚-4-甲醛(70 mg，0.12 mmol，1當量)於EtOH (1 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加水合肼(12 mg，0.25 mmol，2當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物1小時。LCMS指示反應完成。在減壓下濃縮所得混合物。所得混合物未經進一步純化即直接用於下一步驟中。LCMS (ESI, m/z): 575 [M+H] +。 步驟 6 ：合成化合物 242
在0℃下於氮氣氛圍下向2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-4-甲烷腙基-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-3H-異吲哚-1-酮(50 mg，0.08 mmol，1當量)於DMF (1 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加HATU (44 mg，0.12 mmol，1.5當量)、N-順丁烯二醯基-6-胺基己酸(22 mg，0.10 mmol，1.2當量)及DIEA (34 mg，0.26 mmol，3當量)。在室溫下於氮氣氛圍下攪拌所得混合物2小時。LCMS指示反應有約40%產物。藉由製備型HPLC用以下條件(管柱：XBridge Prep Phenyl OBD C18管柱，30*150 mm，5 μm；移動相A：水(10 mmol/L NH 4HCO 3)，移動相B：ACN；流動速率：60 mL/min mL/min；梯度：在20分鐘內18% B至48% B；波長：254 nm/220 nm nm；RT1(min)：18.1)純化反應混合物。凍乾所收集之級分，得到呈白色固體狀之6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)-N'-[(1E)-{2-[6-(乙基硫烷基)-4-{3-[(4-甲基-1,2,4-三唑-3-基)甲基]氧雜環丁烷-3-基}吡啶-2-基]-6-{[(3S)-3-甲基哌啶-1-基]甲基}-1-側氧基-3H-異吲哚-4-基}亞甲基]己醯肼(7.7 mg，11%)。LCMS (ESI, m/z): 768 [M+H] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 11.51-11.42 (m, 1H), 8.26-8.17 (m, 2H), 8.08-8.02 (m, 1H), 7.80-7.72 (m, 2H), 7.00-6.82 (m, 3H), 5.24-5.18 (m, 2H), 4.93-4.90 (m, 2H), 4.85-4.84 (m, 2H), 3.58-3.55 (m, 4H), 3.40-3.35 (m, 2H), 3.29-3.26 (m, 3H), 3.08-3.07 (m, 1H), 2.72-2.66 (m, 3H), 2.25-2.20 (m, 1H), 1.95-1.89 (m, 1H), 1.67-1.49 (m, 9H), 1.34-1.24 (m, 6H), 0.90-0.82 (m, 4H)。 實例 6 ：製備接合物 製備抗體『 A 』 - 化合物 205 接合物
將16.9 mg/mL 2 mg抗體『A』於20 mM組胺酸、250 mM蔗糖pH 6.5中之混合物用40當量TCEP處理且在37℃下培育1小時以完全還原鏈間二硫鍵。使用NAP5去鹽管柱將還原抗體純化至50 mM EPPS、5 mM EDTA pH 7.0中。藉由稀釋抗體且添加12莫耳當量化合物205於DMA中之儲備溶液以得到由含2 mg/mL還原抗體 + 12當量化合物205之50 mM EPPS、5 mM EDTA pH 7.0 + 15% DMA組成之反應混合物來實現接合。在周圍溫度下培育反應物1小時。使用NAP10管柱將接合物純化至20 mM丁二酸鹽、8%蔗糖、0.01% Tween-20 pH 5.5中。將接合物(1.5 mL)收集至50K MWCO Amicon Ultra 4離心濃縮機中，用1 mL 20 mM丁二酸鹽、8%蔗糖、0.01% Tween-20 pH 5.5稀釋且濃縮至0.5-1.0 mL。重複此過程兩次，總計三個循環。藉由還原型LC-MS發現接合物為8藥物/抗體，藉由SEC發現97.9%單體，且藉由混合模式HPLC在HISEP管柱上未偵測到游離藥物。 製備抗體『 E 』 - 化合物 205 接合物
將7.5 mg/mL 1.5 mg抗體『E』於25 mM硼酸鈉、25 mM氯化鈉、1 mM EDTA pH 8.0中之混合物用20當量TCEP處理且在37℃下培育4小時以完全還原鏈間二硫鍵。使用Zeba 40K去鹽管柱將還原抗體純化至50 mM EPPS、5 mM EDTA pH 7.0中。藉由稀釋抗體且添加12莫耳當量化合物205於DMA中之儲備溶液以得到由含4.5 mg/mL還原抗體 + 12當量化合物205之50 mM EPPS、5 mM EDTA pH 7.0 + 10% DMA組成之反應混合物來實現接合。在周圍溫度下培育反應物1小時，接著用0.01體積N-乙醯基半胱胺酸淬滅。使用Zeba 40K去鹽管柱將接合物純化至20 mM丁二酸鹽、8%蔗糖、0.01% Tween-20 pH 5.5中，使用50K MWCO Amicon Ultra 4離心濃縮機濃縮。藉由還原型LC-MS發現接合物為8藥物/抗體，藉由SEC發現100%單體，且藉由混合模式HPLC在HISEP管柱上未偵測到游離藥物。 製備抗體『 A 』 - 化合物 214 接合物
將16.9 mg/mL抗體『E』於20 mM組胺酸、250 mM蔗糖pH 6.5中之混合物用10當量TCEP處理以完全還原鏈間二硫化物。使用Zeba 40K去鹽管柱將還原抗體純化至50 mM EPPS、5 mM EDTA pH 7.0中。藉由稀釋抗體且添加12莫耳當量化合物214於DMA中之儲備溶液以得到由含4.5 mg/mL還原抗體 + 12當量化合物214之50 mM EPPS、5 mM EDTA pH 7.0 + 10% DMA組成之反應混合物來實現接合。在周圍溫度下培育反應物1小時，接著用0.01體積N-乙醯基半胱胺酸淬滅。藉由使用Zeba 40K去鹽管柱進行兩個凝膠過濾循環將接合物純化至20 mM丁二酸鹽、8%蔗糖、0.01% Tween-20 pH 5.5中。藉由還原型LC-MS發現接合物具有6.5藥物/抗體，藉由SEC發現90.9%單體，且藉由混合模式HPLC在HISEP管柱上未偵測到游離藥物。 製備抗體『 E 』 - 化合物 214 接合物
將8 mg/mL抗體『A』於25 mM硼酸鹽、25 mM氯化鈉、1 mM EDTA pH 8.0中之混合物用20當量TCEP處理以完全還原鏈間二硫鍵。使用NAP去鹽管柱將還原抗體純化至50 mM EPPS、5 mM EDTA pH 7.0中。將還原抗體儲存於-80℃下並解凍以用於接合。藉由稀釋抗體且添加12莫耳當量化合物214於DMA中之儲備溶液以得到由含3.6 mg/mL還原抗體 + 12當量化合物214之50 mM EPPS、5 mM EDTA pH 7.0 + 10% DMA組成之反應混合物來實現接合。在周圍溫度下培育反應物2小時，接著用0.01體積N-乙醯基半胱胺酸淬滅。藉由使用NAP管柱進行兩輪凝膠過濾來純化接合物。在第一輪，平衡管柱且用20 mM丁二酸鹽、8%蔗糖、0.01% Tween-20 pH 5.5 + 10% DMA溶離接合物。在第二輪，平衡管柱且用20 mM丁二酸鹽、8%蔗糖、0.01% Tween-20 pH 5.5溶離接合物。最後，使用Amicon離心濃縮機濃縮接合物。藉由還原型LC-MS發現接合物具有8藥物/抗體，藉由SEC發現97.4%單體，且藉由混合模式HPLC在HISEP管柱上未偵測到游離藥物。 製備抗體『 E 』 - 化合物 212 ( 離胺酸接合 )
向抗體『E』於50 mM EPPS pH 8.0中之溶液中添加10莫耳當量化合物212於DMA中之儲備溶液，得到由含5 mg/mL抗體 + 10當量化合物212之50 mM EPPS pH 8.0 + 10% DMA組成之反應混合物。在周圍溫度下培育反應物3小時。使用Zeba 40K去鹽管柱將接合物純化至20 mM丁二酸鹽、8%蔗糖、0.01% Tween-20 pH 5.5調配緩衝液中。藉由非變性SEC-MS發現接合物具有2.4藥物/抗體之平均值且藉由SEC發現＞99%單體。 製備 IgG- 化合物 500 (TLR7/8 促效劑 )(T785) 接合物 ( 預示性實例 )
向5-10 mg/mL靶向免疫細胞之抗體於50 mM EPPS pH 8.0中之溶液中添加SATA於DMA中之儲備溶液，以使得最終DMA濃度為10% (v/v)。將SATA滴定至目標2.5莫耳接合連接子/莫耳抗體。在周圍溫度下培育反應物1小時。為使硫醇去保護，添加含0.1體積500 mM羥胺、25 mM EDTA之50 mM EPPS pH 8.0且在周圍溫度下培育反應物2小時。使用NAP去鹽管柱將硫醇化抗體中間物純化至50 mM EPPS、5 mM EDTA pH 7.0中。向硫醇化抗體中間物中添加3.75莫耳當量化合物500 (MCC-T785，描述於Ackerman, S.E., Pearson, C.I., Gregorio, J.D.等人 Nat Cancer 2, 18-33 (2021)中，https://doi.org/10.1038/s43018- 020-00136-x)，以使得DMA之最終濃度為10%。在周圍溫度下培育反應物2小時。使用NAP去鹽管柱將接合物純化至20 mM丁二酸鹽、8%蔗糖、0.01% Tween-20 pH 5.5中。 製備抗體「 I 」 - 化合物 221-DAR 8 接合物 ( 內源半胱胺酸接合 )
將13.38 mg/mL 2 mg抗體『I』於20 mM組胺酸、250 mM蔗糖pH 6.5中之混合物用過量TCEP ( 水溶液 )(2 uL 0.5 mM)處理且在37℃下培育1小時以完全還原鏈間二硫鍵。根據製造商之說明書使用NAP-5去鹽管柱(GE Healthcare)將還原抗體純化至50 mM EPPS、5 mM EDTA pH 7.0中。藉由用接合緩衝液『50 mM EPPS、5 mM EDTA pH 7.0』及DMA稀釋抗體，接著添加12莫耳當量順丁烯二醯亞胺官能化連接子有效負荷『化合物221』於DMA中之10 mM儲備溶液以得到由含4.44 mg/mL還原抗體、12當量化合物221之『50 mM EPPS、5 mM EDTA、15% DMA』組成之反應混合物來實現接合。在周圍溫度下培育反應物1小時。根據製造商之說明書使用NAP-5去鹽管柱(GE Healthcare)將接合物純化至20 mM丁二酸鹽、8%蔗糖、0.01% Tween-20 pH 5.5中，接著使用50K MWCO Amicon Ultra 4離心濃縮機濃縮，用1 mL 20 mM丁二酸鹽、8%蔗糖、0.01% Tween-20 pH 5.5稀釋，且濃縮至約0.5 mL。重複此過程兩次，總計三個循環。接著經由0.22 um PVDF注射器過濾器過濾濃縮物。獲得抗體「I」-化合物221接合物(1.64 mg，2.44 mg/mL)，74%產率，藉由還原型LC-MS測得8藥物/抗體比率，藉由SEC測得98.4%單體比率，且藉由混合模式HPLC在HISEP管柱上未偵測到游離藥物。 製備抗體「 I 」 - 化合物 220 接合物 ( 離胺酸接合 )
向1 mg抗體『I』於50 mM EPPS、5 mM EDTA pH 7.0中之溶液中添加10莫耳當量化合物220於DMA中之10 mM儲備溶液，得到由含3 mg/mL抗體 + 10當量化合物220之50 mM EPPS pH 7.0、5 mM EDTA、20% DMA組成之反應混合物。在周圍溫度下培育反應物5小時。根據製造商之說明書使用NAP5管柱(GE Healthcare)將接合物純化至調配緩衝液『20 mM丁二酸鹽、8%蔗糖、0.01% Tween-20 pH 5.5』中，接著使用50K MWCO Amicon Ultra 4離心濃縮機濃縮，用1 mL 20 mM丁二酸鹽、8%蔗糖、0.01% Tween-20 pH 5.5稀釋且濃縮至約0.5 mL。重複此過程兩次，總計三個循環。接著經由0.22 um PVDF注射器過濾器過濾濃縮物。以1.92 mg/mL獲得0.83 mg抗體『I』-化合物220接合物，83%產率，藉由非變性SEC-MS測得3.4藥物/抗體比率，藉由SEC測得100%單體比率，且藉由混合模式HPLC在HISEP管柱上測得2.5%游離藥物。 實例 7 ：接合物之生物活性 量測抗 PD1-Cbl-b 抑制劑接合物之活性的 PD1/PD-L1 阻斷檢定
將Jurkat NFAT/PD1報告細胞(Promega, J1252)於50 µl檢定培養基(補充有2% FBS之RPMI1640)中以3x10 4個細胞/孔接種至白色96孔板(ThermoFisher, 136101)中。在檢定培養基中製備派姆單抗(對照)或針對各種小分子之派姆單抗抗體藥物接合物(測試品)之連續稀釋液且一式兩份添加至細胞中。使用胰蛋白酶/EDTA收集CHO/PD-L1活化劑細胞(Promega, J1252)。接著用含10% FBS之RPMI1640洗滌CHO/PD-L1活化劑細胞，再懸浮於檢定培養基中且以2x10 4個細胞/孔添加至Jurkat NFAT/PD1細胞中。接著在37℃與5% CO 2下將板培育24小時。培育後，按照製造商之方案將BioGlo試劑(Promega, G7940)添加至細胞中且使用SpectraMax M5板讀取器(Molecular Devices)量測所產生之發光。
將結果報告為與來自相應對照孔之基線發光相比來自測試品處理之孔之發光細胞相對於背景的倍數變化。將化合物分類為如下範圍：值介於3.51與5.49之間：範圍「X」；值介於2.5與3.5之間：範圍「A」；值介於2.0與2.49之間：範圍「B」；值介於1.5與1.99之間：範圍「C」；及值介於1.1與1.49之間：範圍「D」。 抗 CD25/CD7-Cbl-b 抑制劑接合物對 T 細胞之活化
自市售冷凍外周血單核細胞(PBMC, HemaCare Corporation)或自新鮮LeukoPaks (Research Blood Components)分離人類初級T細胞。經由使用陰性選擇套組根據製造商之方案(Miltenyi Biotec，人類泛T細胞分離套組，130-096-535)使非T細胞耗竭來分離T細胞。用CD3/CD28 Dynabeads (ThermoFisher, 111.31D)以每2x10 5個T細胞2 µL預洗珠粒刺激經分離之T細胞48小時。用磁鐵(Miltenyi Biotec)自細胞培養物中移除珠粒且使用XVivo15培養基(Lonza, 04-418Q)洗滌經活化之T細胞兩次。將每孔5x10 4個細胞添加至塗佈有抗CD3 (OKT3)抗體之96孔板中。為塗佈板以用於捕獲T細胞，在PBS中以10 µg/mL稀釋抗CD3抗體且將100 µl添加至各孔中。將板在4℃下培育隔夜或在37℃下培育2小時且在使用前用PBS洗滌一次。將各接合物之連續稀釋液一式兩份添加至T細胞中以評估其對T細胞活化之作用。在37℃與5% CO 2下將板與非結合抗體藥物接合物(對照)或抗CD25或抗CD7抗體藥物接合物(測試品)或未接合抗體之連續稀釋液一起培育48小時，且隨後藉由流式細胞術(ThermoFisher Attune NxT)分析上清液之活化誘導之分泌細胞介素IL-2或IFN-y的水準(BD Biosciences CBA Flex Beads, 558269, 558270)。
將結果報告為相對於背景之倍數變化，其中背景為由用非結合對照接合物或相應未接合抗體處理之T細胞產生之IL-2或IFN-y濃度。將正規化T細胞IL-2及IFN-y反應分類為如下範圍：對於IFN-y，值介於1.00與1.49之間：範圍「D」；1.50-1.99：範圍「C」；2.00-2.49：範圍「B」；及值介於2.5與3.0之間：範圍「A」。對於IL-2，值介於2.00與4.00之間：範圍「D」；4.00-4.99：範圍「C」；5.00-5.99：範圍「B」；及值介於6.00與8.00之間：範圍「A」。 混合淋巴細胞反應
藉由根據製造商之方案(Miltenyi Biotec, CD14 MicroBeads, 130-050-201)對CD14 +細胞進行陽性選擇，自市售(HemaCare Corporation)購得之冷凍保存之PBMC中分離人類初級單核細胞。藉由根據製造商用於人類樹突狀細胞分化套組(R&D Systems, CDK004)之方案在GM-CSF及IL-4中培養7天，使單核細胞分化為成熟樹突狀細胞(刺激細胞)。收集刺激細胞且以每孔1x10 4個細胞接種於96孔平底組織培養板中。藉由根據製造商之方案(Miltenyi Biotec，CD4+ T細胞分離套組，130-096-533)進行陰性選擇，自同種異體供體中分離人類初級CD4+ T細胞。在37℃下於XVivo 15培養基(Lonza, 04-418Q)中將CD4+ T細胞(反應細胞)與刺激細胞以10:1比率共培養5天。在共培養開始時添加連續稀釋之接合物、未接合抗體或非結合抗體藥物接合物進行處理。為測試TGF-β抑制對處理之作用，以2 ng/mL添加重組人類TGF-β1 (R&D Systems, 240-B)。為評估接合物是否減輕Treg細胞對T細胞活化之抑制作用，在共培養開始時以10:3之CD4+ T細胞:Treg比率添加人類天然Treg細胞(iQ Biosciences, IQB-Hu1-nTr-1)。在5天結束時，收集上清液且藉由流式細胞術(ThermoFisher Attune NxT)定量分泌細胞介素IL-2或IFN-γ之誘導(BD Biosciences CBA Flex Beads, 558269, 558270)。結果示於圖2、圖3A及圖3B中。結果證明接合至Cbl-b抑制劑之靶向免疫細胞之抗體為能夠以劑量依賴性方式有效增強初級T細胞反應之方法，且該作用抵抗TGF-β1及Treg細胞兩者造成之T細胞抑制。 實例 8 ： Cbl-b 之小分子抑制劑對 T 細胞之活化
將冷凍保存之人類外周血泛T細胞(StemCell, 70024)解凍且再懸浮於Immunocult-XF T細胞擴增培養基(StemCell, 10981)中。在存在或不存在預塗佈之抗CD3 (OKT3)抗體(ThermoFisher, 16-0037-85)之情況下，將細胞以每孔8x10 5個細胞鋪於24孔板中。藉由將抗CD3抗體於PBS中稀釋至10 µg/mL且將1 ml添加至各孔中來完成板之預塗佈。將板在4℃下培育隔夜或在37℃下培育2小時且在使用前用PBS洗滌一次。添加各小分子cbl-b抑制劑之稀釋液。未處理之細胞用作對照。在37℃與5% CO 2下將板培育48小時。用細胞內固定及滲透緩衝液組(ThermoFisher, 88-8824)固定及滲透T細胞，且用表10中所列之PE接合抗體之一連續染色。接著藉由流式細胞術(ThermoFisher Attune NxT)分析經染色之T細胞。將各處理組之陽性細胞百分比用未處理之細胞正規化且分類為如下數組：相對於背景之倍數值10至14.9：範圍「A」；值5.0至9.9：範圍「B」：值2.0至4.9：範圍「C」；及值0.1至1.9：範圍「D」。僅對於Notch1，使用幾何平均值。結果在表11中報告。 實例 9 ：活體外 TIL 活化
藉由在含有ImmunoCult™-ACF樹突狀細胞分化補充劑(StemCell, 10988)之ImmunoCult™-ACF樹突狀細胞培養基(StemCell, 10986)中以一百體積之培養基培養，在解凍後自冷凍保存之人類單核細胞(StemCell, 70034)產生成熟樹突狀細胞(DC)。每2-3天更新含有分化補充劑之培養基持續一週，且將ImmunoCult™樹突狀細胞成熟補充劑(StemCell, 10989)以一百體積添加至培養基中以經3天使DC成熟。將冷凍之人類黑色素瘤塊體解離腫瘤細胞(DTC, Discovery Life Sciences)解凍且在96孔板中與成熟DC一起以每孔100 µl中5x10 4個DTC及1x10 4個DC共接種於Immunocult-XF T細胞擴增培養基(StemCell, 10981)中。同種異體成熟DC充當DTC中之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之刺激細胞。一式兩份在頂上添加各種稀釋液中當量體積之測試品。未處理之條件用作正規化對照。接著在37℃與5% CO 2下將板培育72小時。隨後分析上清液之IFN-γ水準(R&D systems, DY285B)，作為T細胞活化之量度。將在各條件下偵測之IFNγ水準針對未處理之條件正規化。結果示於圖4中。 實例 10 ：活體內活性
所使用之B-hPD-1+小鼠(Jiangsu Biocytogen Co. Ltd., China)為同型接合、基因工程改造之C57BL/6小鼠，其中內源小鼠 Pdcd1之胞外域區域由人類PD-1置換。根據機構動物照護與使用委員會(Institutioanl Animal Care and Use Committiee)之動物照護準則圈養及使用所有實驗小鼠。將B16F10鼠類黑色素瘤細胞株在Biocytogen Boston Corp維持於補充有10%胎牛血清之達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's medium，DMEM)中。收集在指數生長期生長之B16F10細胞且在0.1 mL無血清培養基中以0.5x10 6個腫瘤細胞於右側腹皮下接種。第4天將小鼠隨機分組，且以10 mg/kg靜脈內投與測試品。第7天及第10天再次向小鼠施用。每3-4天用測徑器進行腫瘤量測且以腫瘤體積(V)表示，其中V = W 2x L/2 (W=沿腫瘤之短軸量測之寬度；且L=沿腫瘤之長軸量測之長度)。在初始腫瘤接種後32天或在人道終點處死小鼠，且將腫瘤速凍以藉由相關qPCR進行基因表現評價。簡言之，使用 Quick-RNA微量製備套組(Zymo Research；目錄號R1051)分離總RNA。分別使用LunaScript RT超級混合套組及Luna Universal qPCR主混合物設置cDNA合成及qPCR反應。用於qPCR反應之Taqman探針列於表12中。結果示於圖5及圖6中。 實例11： 抗 PD-1-Cbl-b 抑制劑接合物對耗竭之 T 細胞之活化
使用MagCellect人類原初CD4+ T細胞分離套組(R&D systems, MAGH115)自冷凍保存之人類外周血T細胞(StemCell, 70024)分離CD4+ T細胞。在Dynabeads人類T活化劑CD3/CD28 (ThermoFisher, 11132D)存在下將CD4+ T細胞以每ml 5x10 5個細胞再懸浮於Immunocult-XF T細胞擴增培養基(StemCell, 10981)中。為製備耗竭之T細胞，每2-3天用活化劑再刺激CD4+ T細胞持續2週。將耗竭之CD4+ T細胞與CHO/PD-L1活化劑細胞(Promega, J1252)一起以2:1比率共培養。在開始前，使用胰蛋白酶/EDTA收集CHO/PD-L1活化劑細胞且於含10% FBS之RPMI1640中以每孔5x10 4個細胞鋪於24孔板中。使用前在37℃與5% CO 2下將板培育24小時。棄去上清液且用PBS洗滌，繼而添加500 µl含耗竭之CD4+ T細胞之無血清RPMI1640。添加當量體積之各測試品。未處理之條件用作對照。接著在37℃與5% CO 2下將板培育48小時。隨後分析上清液之IFN-γ水準(R&D systems, DY285B)。用細胞內固定及滲透緩衝液組(ThermoFisher, 88-8824)固定及滲透細胞，且用APC接合抗CD3 (ThermoFisher, 17-0038-42)及表10中所列之PE接合抗體之一連續染色。接著藉由流式細胞術(ThermoFisher Attune NxT)分析經染色之T細胞。結果在圖7中以未處理條件之相對於背景之倍數變化(FOB)報告。在用抗PD-1-Cbl-b抑制劑接合物處理後，不僅IFNγ之表現增加，而且與T細胞活化相關之生物標誌物之表現增加為顯而易見的。 實例12： CEF MHC 1 類限制之抗原回憶檢定
將人類PBMC (StemCell, ST70025)以每孔1 x 10 5個細胞接種於含每孔200 µL之DC分化培養基(StemCell, 10981及10986)之圓底96孔板中。在24小時培育後，棄去100 µL培養基。根據製造商推薦之濃度，將PepTivator CEF MHC I類(Miltenyi, 130-098-426)於Immunocult-XF T細胞擴增培養基(StemCell, 10981)中稀釋且以每孔100 µL添加至細胞中。將板培育72小時，且重複移除消耗之培養基及添加新鮮的含CEF之培養基。再繼續培育3天。移除100 µL培養基，且將100 µL含經稀釋之測試品之Immunocult-XF T細胞擴增培養基添加至各孔中。將細胞處理4天，且隨後分析上清液之IFN-γ水準(R&D systems, DY285B)。來自此檢定之結果(圖8)揭露抗PD-1-Cbl-b抑制劑接合物增強及維持用CMV、EBV及流感肽庫刺激2輪之T細胞之抗原回憶反應。
應了解，[實施方式]部分而非[技術領域]及[發明摘要]部分意欲用於解釋申請專利範圍。[技術領域]及[發明摘要]部分可闡述如本發明者所預期之本揭示案之一或多個而非所有示例性態樣，且因此不欲以任何方式限制本揭示案及隨附申請專利範圍。
本揭示案已在上文藉助於說明指定功能及其關係之實施的功能建構區塊來描述。為便於描述，已在本文中任意地定義此等功能建構區塊之界限。可定義替代界限，只要適當執行指定功能及其關係即可。
特定態樣之前述描述將如此全面地揭露本揭示案之一般性質，其他人可藉由應用此項技術之技能範圍內之知識容易地針對此類特定態樣之各種應用作出修改及/或調整，而無需過度實驗且不脫離本揭示案之一般概念。因此，基於本文所呈現之教義及導則，此類調整及修改意欲處於所揭示態樣之等效物之含義及範圍內。應理解，本文中之片語及術語係用於描述而非限制之目的，以使得本說明書之術語或片語應由技術人員鑒於教義及導則來解釋。
本揭示案之廣度及範疇不應受上文所述之示例性態樣中之任一者所限制，而應儘根據以下申請專利範圍及其等效物來定義。
[圖1]為展示Cbl-b與化合物147之間及Cbl-b與化合物118之間的蛋白質-配位體相互作用分數之直方圖。 [圖2]為展示接合物在混合淋巴細胞反應中之活性之圖。 [圖3A]為展示在存在及不存在TGF-β之情況下接合物在混合淋巴細胞反應中之活性之圖。 [圖3B]為展示在存在及不存在Treg細胞之情況下接合物在混合淋巴細胞反應中之活性之圖。 [圖4]為展示活體外腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)活化之圖。 [圖5]及[圖6]為展示與未接合抗體及媒劑對照相比，接合物對小鼠中之B16F10黑色素瘤細胞之活體內活性之圖。 [圖7]為展示抗PD-1 - Cbl-B抑制劑接合物對耗竭之T細胞之活化之圖。 [圖8]為展示用抗PD-1 - Cbl-B抑制劑接合物處理之T細胞之抗原回憶反應(如由IFN-γ水準所量測)之圖。
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Claims (110)

  1. 一種式(I)化合物， (I)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： n為0、1或2； X及Y各自獨立地為CH或N； Z係選自CH(CH 3)、O及SO 2；或 Z係選自CH(CH 3)、NH、N(CH 3)、O及SO 2； R 1係選自氫、-CN、-NHR z、-R a、-NR aR b、-OR a、-NHC(O)R a、-NHC(S)R a、-NHC(O)NHR a、-NHC(S)NHR a、-SR a、C 3-C 6環烷基及3至6員雜環基環；其中： R z係選自 ； R a及R b係獨立地選自氫、C 2-C 6烯基、C 1-C 6烷基、醯胺基(C 1-C 6烷基)、胺基(C 1-C 6烷基)、疊氮基(C 1-C 6烷基)、C 2-C 6炔基、羧基(C 1-C 6烷基)、氰基(C 1-C 6烷基)、視情況經氰基取代之C 3-C 6環烷基、二甲基胺基(C 1-C 6烷基)、3至6員雜環基環、3-6員雜環基(C 1-C 3烷基)、羥基(C 1-C 6烷基)、甲氧基(C 1-C 6烷基)、甲基胺基(C 1-C 6烷基)、NR cR d(C 1-C 6烷基)、HS(C 1-C 6烷基)及CH 3S(C 1-C 6烷基)，其中R c及R d係獨立地選自氫、C 2烯基羰基及甲基；或， R a及R b與其所連接之氮原子一起形成視情況含有一個額外氮原子之五或六員環，其中該環視情況經一個選自R a、-C(O)R a、-SO 2R a、疊氮基及氰基之基團取代； 其中各C 3-C 6環烷基、各3至6員雜環基環及該3至6員雜環基(C 1-C 3烷基)環之該雜環基部分視情況經一個、兩個或三個獨立地選自C 1-C 3烷基、C 2炔基、醯胺基、疊氮基、羧基、氰基、二甲基胺基、羥基、甲氧基、甲基胺基、HS-及CH 3S-之基團取代；且 R 2係選自 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ；其中 m為0、1、2或3； m''為0、1、2、3或4； B'為視情況含有一或兩個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的3-7員飽和或不飽和環；其中該環視情況經一或兩個獨立地選自-OH、-CH 2SH、CH 2SCH 3、-CH 2OH、-CH 2NH 2及-CH 2NHCH 3之取代基取代； 各R 500係獨立地選自氫、C 1-C 6烷基、鹵基、-OH及-CH 2OH；且 X 50係選自O、NH、NCH 3及S； R 3係選自氫、乙醯基、胺基、C 1-C 6烷基胺基、C 1-C 6烷基胺基甲基、C 1-C 6烷基羰基、胺基C 1-C 6烷基、胺基羰基、胺基甲基、羧基、氰基、C 3環烷基、甲醯基、羥基、羥基C 1-C 6烷基、甲氧基、噁唑基、-SH、-SCH 3、-SOCH 3、-SO 2CH 3、-SO(=NH)CH 3、四唑基、噻唑基及三氟甲基，其中該C 3環烷基視情況經羥基取代； R 4係選自氫、甲基、-CH 2OH、-CH 2SH及-CH 2SCH 3； R 5係選自氫、羥基、-CH 2SH、-CH 2SCH 3及甲基； 視情況前提條件為，當R 5為羥基或甲基，且R 4為氫時，則R 1不為C 3-C 6環烷基、3至6員雜環基環、羥基、羥基(C 1-C 6烷基)、-OR a，其中R a為C 1-C 6烷基、3至6員雜環基環或羥基(C 1-C 6烷基)；或-NR aR b，其中R a及R b係獨立地選自由氫、C 1-C 6烷基、C 3-C 6環烷基、羥基(C 1-C 6烷基)、3至6員雜環基環組成之群，或其中R a及R b與其所連接之氮原子一起形成視情況含有一個額外氮原子之五或六員環，其中該環視情況經一個選自C 1-C 6烷基或羥基(C 1-C 6烷基)之基團取代；且 R 6及R 6'係獨立地選自氫、環丙基、-CH 2OH、-CH 2SH、-CH 2SCH 3及-CH 2R 200，其中R 200為視情況含有一或兩個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的3-7員飽和或不飽和環。
  2. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中： X為N； Y為CH；且 R 2為 。
  3. 如請求項1或2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中Z為O。
  4. 如請求項1或2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中Z為CH(CH 3)。
  5. 如請求項1至4中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中： R 3為三氟甲基； R 4及R 6為氫；且 R 5為甲基。
  6. 如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R 1係選自-NR aR b、-NHC(O)R a、-NHC(S)NHR a及-SR a。
  7. 如請求項1至6中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R 1為-SCH 2CH 3。
  8. 如請求項1至6中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R 1為-NH(CH 2) 2CN。
  9. 如請求項1至6中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R 1為-NH(CH 2) 2N 3。
  10. 一種式(IA-1)化合物， (I)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： n為0、1或2； X及Y各自獨立地為CH或N； Z係選自CH(CH 3)、O及SO 2； R 1係選自氫、-CN、-NHR z、-R a、-NR aR b、-OR a、-NHC(O)R a、-NHC(S)R a、-NHC(O)NHR a、-NHC(S)NHR a、-SR a、C 3-C 6環烷基及3至6員雜環基環；其中： R z係選自 ； R a及R b係獨立地選自氫、C 2-C 6烯基、C 1-C 6烷基、醯胺基(C 1-C 6烷基)、胺基(C 1-C 6烷基)、疊氮基(C 1-C 6烷基)、C 2-C 6炔基、羧基(C 1-C 6烷基)、氰基(C 1-C 6烷基)、C 3-C 6環烷基、二甲基胺基(C 1-C 6烷基)、3至6員雜環基環、3-6員雜環基(C 1-C 3烷基)、羥基(C 1-C 6烷基)、甲氧基(C 1-C 6烷基)、甲基胺基(C 1-C 6烷基)、NR cR d(C 1-C 6烷基)、HS(C 1-C 6烷基)及CH 3S(C 1-C 6烷基)，其中R c及R d係獨立地選自氫、C 2烯基羰基及甲基；或， R a及R b與其所連接之氮原子一起形成視情況含有一個額外氮原子之五或六員環，其中該環視情況經一個選自R a、-C(O)R a、-SO 2R a、疊氮基及氰基之基團取代； 其中各C 3-C 6環烷基、各3至6員雜環基環及該3至6員雜環基(C 1-C 3烷基)環之該雜環基部分視情況經一個、兩個或三個獨立地選自C 1-C 3烷基、C 2炔基、醯胺基、疊氮基、羧基、氰基、二甲基胺基、羥基、甲氧基、甲基胺基、HS-及CH 3S-之基團取代；且 R 2為 或 ；其中 m為0、1、2或3； R 3係選自氫、乙醯基、胺基、C 1-C 6烷基胺基、C 1-C 6烷基胺基甲基、胺基C 1-C 6烷基、胺基羰基、胺基甲基、羧基、氰基、C 3環烷基、甲醯基、羥基、羥基C 1-C 6烷基、甲氧基、噁唑基、-SH、-SCH 3、四唑基、噻唑基及三氟甲基，其中該C 3環烷基視情況經羥基取代； R 4及R 6係獨立地選自氫、-CH 2SH及-CH 2SCH 3；且 R 5係選自羥基、-CH 2SH、-CH 2SCH 3及甲基； 視情況前提條件為，當R 5為羥基或甲基，且R 4為氫時，則R 1不為C 3-C 6環烷基、3至6員雜環基環、羥基、羥基(C 1-C 6烷基)、-OR a，其中R a為C 1-C 6烷基、3至6員雜環基環或羥基(C 1-C 6烷基)；或-NR aR b，其中R a及R b係獨立地選自由氫、C 1-C 6烷基、C 3-C 6環烷基、羥基(C 1-C 6烷基)、3至6員雜環基環組成之群，或其中R a及R b與其所連接之氮原子一起形成視情況含有一個額外氮原子之五或六員環，其中該環視情況經一個選自C 1-C 6烷基或羥基(C 1-C 6烷基)之基團取代。
  11. 如請求項1之化合物，該化合物係選自 及 或其醫藥學上可接受之鹽。
  12. 一種化合物，該化合物係選自： ； ；及 。
  13. 如請求項1至12中任一項之化合物，其中該化合物為卡西塔斯B譜系淋巴瘤原癌基因b (Casitas B-lineage lymphoma proto-oncogene b，Cbl-b)之抑制劑。
  14. 如請求項1至13中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該化合物與人類Cbl-b之His152相互作用；使IL-2自T細胞之分泌相對於背景增加約0.8至約1.4倍；使IFN-y分泌相對於背景增加約1.1至約2倍；及/或使CD69水準相對於背景增加約0.81至約1.1倍。
  15. 一種接合物或其醫藥學上可接受之鹽，該接合物或其醫藥學上可接受之鹽包含能夠特異性結合至效應T細胞之表面上之標靶的結合部分及能夠活化效應T細胞之有效負荷，其中該結合部分直接連接至該有效負荷或經連接子連接至該有效負荷。
  16. 如請求項15之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該結合部分經連接子連接至該有效負荷。
  17. 如請求項15或16之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該結合部分能夠特異性結合該效應T細胞之該表面上之蛋白質或醣蛋白。
  18. 如請求項17之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該結合部分能夠特異性結合至程式性細胞死亡蛋白1 (PD1)。
  19. 一種接合物或其醫藥學上可接受之鹽，該接合物或其醫藥學上可接受之鹽包含能夠特異性結合至PD1之結合部分及能夠活化效應T細胞之有效負荷，其中該結合部分直接連接至該有效負荷或經連接子連接至該有效負荷。
  20. 一種接合物或其醫藥學上可接受之鹽，該接合物或其醫藥學上可接受之鹽包含能夠特異性結合至PD1之結合部分及作為卡西塔斯B譜系淋巴瘤原癌基因b (Cbl-b)之抑制劑的有效負荷。
  21. 如請求項15至20中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該接合物具有式(I)： Bm-[L-P] a(I)， 其中： a為1至50之整數； P為該有效負荷； L為連接子；且 Bm為該結合部分。
  22. 如請求項15至19及21中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該有效負荷為卡西塔斯B譜系淋巴瘤原癌基因b(Cbl-b)之抑制劑。
  23. 如請求項22之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該Cbl-b抑制劑為如請求項1至10中任一項之化合物，該化合物經共價鍵連接至該結合部分或該連接子。
  24. 如請求項22之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中Cbl-b抑制劑為 或 。
  25. 如請求項22之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該Cbl-b抑制劑為化合物146、化合物147、化合物148或NX-1607。
  26. 如請求項15至19及21中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該有效負荷為toll樣受體7 (TLR-7)及/或toll樣受體8 (TLR-8)之促效劑。
  27. 如請求項26之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該有效負荷為TLR-7/TLR-8促效劑T785。
  28. 如請求項26之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該有效負荷為TLR-7/TLR-8促效劑MEDI9197。
  29. 如請求項15至19及21中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該有效負荷為造血祖細胞激酶1(HPK-1)之抑制劑。
  30. 如請求項15至19及21中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該有效負荷為STING、磷脂肌醇-3-激酶γ(PI3Kγ)、CXCR4、CCR5或促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)路徑蛋白之抑制劑，視情況其中該MAPK路徑蛋白為MEK或B-raf。
  31. 如請求項15至20中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該有效負荷為干擾素基因刺激因子(STING)之促效劑。
  32. 如請求項15至22、26或29至31中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該有效負荷為小分子。
  33. 如請求項15至22、26或29至31中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該有效負荷為肽。
  34. 如請求項21至33中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L為不可裂解連接子。
  35. 如請求項21至34中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L係選自由以下組成之群： 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ； 其中： p為1至10之整數； p*為1至10之整數； Y係選自氫及C 1-C 6烷基； 為與該有效負荷之連接點；且 為與該結合部分之連接點。
  36. 如請求項21至35中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L係選自 、 及 ； 其中： p為1至10之整數； p*為1至10之整數； 為與該有效負荷之連接點；且 為與該結合部分之連接點。
  37. 如請求項21至33中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L為可裂解連接子。
  38. 如請求項37之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該可裂解連接子由蛋白酶可裂解。
  39. 如請求項21至33、37及38中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L係選自 ； ； ； ； ； ； ； ； ；及 ； 其中： q為2至10之整數； Z 1、Z 2、Z 3及Z 4各自獨立地不存在或為L構型或D構型中天然存在之胺基酸殘基，前提條件為Z 1、Z 2、Z 3及Z 4中之至少兩者為胺基酸殘基； 為與該有效負荷之連接點；且 為與該結合部分之連接點。
  40. 如請求項39之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中Z 1、Z 2、Z 3及Z 4獨立地不存在或係選自由L-纈胺酸、D-纈胺酸、L-瓜胺酸、D-瓜胺酸、L-丙胺酸、D-丙胺酸、L-麩醯胺、D-麩醯胺、L-麩胺酸、D-麩胺酸、L-天冬胺酸、D-天冬胺酸、L-天冬醯胺、D-天冬醯胺、L-苯丙胺酸、D-苯丙胺酸、L-離胺酸、D-離胺酸及甘胺酸組成之群；前提條件為Z 1、Z 2、Z 3及Z 4中之至少兩者為胺基酸殘基。
  41. 如請求項39之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中： Z 1不存在或為甘胺酸； Z 2不存在或係選自由L-麩醯胺、D-麩醯胺、L-麩胺酸、D-麩胺酸、L-天冬胺酸、D-天冬胺酸、L-丙胺酸、D-丙胺酸及甘胺酸組成之群； Z 3係選自由L-纈胺酸、D-纈胺酸、L-丙胺酸、D-丙胺酸、L-苯丙胺酸、D-苯丙胺酸及甘胺酸組成之群；且 Z 4係選自由L-丙胺酸、D-丙胺酸、L-瓜胺酸、D-瓜胺酸、L-天冬醯胺、D-天冬醯胺、L-離胺酸、D-離胺酸、L-苯丙胺酸、D-苯丙胺酸及甘胺酸組成之群。
  42. 如請求項21至33、37及38中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L係選自 、 、 、 及 ， 其中： q為2至10之整數； 為與該有效負荷之連接點；且 為與該結合部分之連接點。
  43. 如請求項21至33中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L為生物可還原連接子。
  44. 如請求項21至33及43中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L係選自 其中： q為2至10之整數； R、R'、R''及R'''係各自獨立地選自氫、C 1-C 6烷氧基C 1-C 6烷基、(C 1-C 6) 2NC 1-C 6烷基及C 1-C 6烷基，或兩個偕位R基團與其所連接之碳原子一起可形成環丁基或環丙基環； 為與該有效負荷之連接點；且 為與該結合部分之連接點。
  45. 如請求項21至33、43及44中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L係選自 及 ； 其中： q為2至10之整數； R、R'、R''及R'''係各自獨立地選自氫、C 1-C 6烷氧基C 1-C 6烷基、(C 1-C 6) 2NC 1-C 6烷基及C 1-C 6烷基，或兩個偕位R基團與其所連接之碳原子一起可形成環丁基或環丙基環； 為與該有效負荷之連接點；且 為與該結合部分之連接點。
  46. 如請求項21至33中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L為酸可裂解連接子。
  47. 如請求項21至33及46中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L係選自由以下組成之群： ； 其中： q為2至10之整數； 為與該有效負荷之連接點；且 為與該結合部分之連接點。
  48. 如請求項21至33中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L為點擊釋放連接子。
  49. 如請求項21至33及48中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L係選自 ； 其中： q為2至10之整數； 為與該有效負荷之連接點；且 為與該結合部分之連接點。
  50. 如請求項21至33中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L為焦磷酸酶可裂解連接子。
  51. 如請求項21至33及50中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L為 ； 其中： q為2至10之整數； 為與該有效負荷之連接點；且 為與該結合部分之連接點。
  52. 如請求項21至33中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L為β-葡萄糖醛酸苷酶可裂解連接子。
  53. 如請求項21至33及52中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L係選自 、 、 及 ； 其中： q為2至10之整數； ----不存在或為一鍵； 為與該有效負荷之連接點；且 為與該結合部分之連接點。
  54. 如請求項21至33、52及53中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L為 ； 其中： q為2至10之整數； ----不存在或為一鍵； 為與該有效負荷之連接點；且 為與該結合部分之連接點。
  55. 如請求項21之接合物，該接合物係選自： ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ；及 。
  56. 如請求項15至55中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該連接子連接至該Bm中之半胱胺酸、離胺酸、酪胺酸或麩醯胺。
  57. 如請求項56之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該半胱胺酸或該離胺酸為經工程改造之半胱胺酸或離胺酸。
  58. 如請求項56之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該半胱胺酸或該離胺酸對於該Bm而言為內源的。
  59. 如請求項15至58中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該結合部分為抗體或其抗原結合片段。
  60. 如請求項59之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L連接至根據EU編號在該抗體或其抗原結合部分之重鏈位置S239及/或K334處的經工程改造之半胱胺酸。
  61. 如請求項59之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L連接至根據EU編號在該抗體或其抗原結合部分之重鏈位置295處的麩醯胺。
  62. 如請求項15至61中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：SEQ ID NO:10之胺基酸31-35、50-66及99-109以及SEQ ID NO:11之胺基酸24-38、54-60及93-101的CDR序列。
  63. 如請求項15至61中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：(i)包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之可變重鏈及包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列之可變輕鏈，或(ii)包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列之輕鏈。
  64. 如請求項15至61中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：SEQ ID NO:12之胺基酸31-35、50-66及99-102以及SEQ ID NO:13之胺基酸24-34、50-56及89-97的重鏈及輕鏈CDR序列。
  65. 如請求項15至61中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之可變重鏈及包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之可變輕鏈。
  66. 如請求項15至17及21至61中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該結合部分能夠特異性結合至CD25。
  67. 如請求項15至17、21至61及66中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：SEQ ID NO: 4之胺基酸31-35、50-66及99-111以及SEQ ID NO:5之胺基酸24-34、50-56及89-97的CDR序列。
  68. 如請求項15至17、21至61及66中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之可變重鏈及包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之可變輕鏈。
  69. 如請求項15至17、21至61及66中任一項之接合物，其中該結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：SEQ ID NO: 6之胺基酸31-35、50-65及98-108以及SEQ ID NO:7之胺基酸24-33、49-55及88-96的CDR序列。
  70. 如請求項15至17、21至61及66中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之可變重鏈及包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列之可變輕鏈。
  71. 如請求項15至17、21至61及66中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：SEQ ID NO:8之胺基酸31-35、50-65及98-108以及SEQ ID NO:9之胺基酸24-33、49-55及88-96的CDR序列。
  72. 如請求項15至17、21至61及66中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之可變重鏈及包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之可變輕鏈。
  73. 如請求項15至17及21至61中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該結合部分能夠特異性結合至CD7。
  74. 如請求項15至17、21至61及73中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：SEQ ID NO:14之胺基酸31-35、50-66及99-112以及SEQ ID NO:15之胺基酸23-36、52-58及91-99的CDR序列。
  75. 如請求項15至17、21至61及73中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該結合部分為包含以下之抗體或其抗原結合片段：包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之可變重鏈及包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列之可變輕鏈。
  76. 如請求項59至65、66至72、74及75中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈恆定區。
  77. 如請求項76之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該重鏈恆定區包含Fc緘默突變。
  78. 如請求項76或77之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該重鏈恆定區為IgG重鏈恆定區。
  79. 如請求項78之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該IgG重鏈恆定區為IgG1重鏈恆定區。
  80. 如請求項76至79中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該重鏈恆定區包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列。
  81. 如請求項78之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該IgG重鏈恆定區為IgG4重鏈恆定區。
  82. 如請求項76至78及81中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該重鏈恆定區包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列。
  83. 如請求項15至56、58、59及61中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中(a)該結合部分為派姆單抗(pembrolizumab)，或(b)該結合部分為納武單抗(Nivolumab)。
  84. 如請求項15至56、58、59及61中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中(a)該結合部分為a686，(b)該結合部分為MA251，或(c)該結合部分為人源化MA251。
  85. 如請求項15至55中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該結合部分為小分子。
  86. 如請求項21至85中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中a為1至40。
  87. 如請求項21至85中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中a為1至10。
  88. 如請求項21至85中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中a為2至8。
  89. 如請求項15至88中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該接合物能夠增加效應T細胞活性。
  90. 如請求項15至89中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該接合物能夠增加效應T細胞增殖。
  91. 如請求項15至90中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該接合物能夠增加效應T細胞向腫瘤細胞之遷移。
  92. 如請求項15至91中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該接合物能夠減少效應T細胞耗竭。
  93. 如請求項15至92中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該接合物使IFN-y自T細胞之分泌相對於背景增加約2.5至約3倍；及/或使IL-2自T細胞之分泌相對於背景增加約6至約8倍。
  94. 一種組合物，該組合物包含如請求項1至14中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
  95. 一種組合物，該組合物包含如請求項15至94中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽。
  96. 一種治療有需要之個體之癌症的方法，該方法包括向該個體投與如請求項1至14中任一項之化合物、如請求項15至93中任一項之接合物或如請求項94或95之組合物。
  97. 如請求項96之方法，其中該癌症(i)對於抗PD1療法具有抵抗性或難治性，視情況其中該抗PD1療法為納武單抗、派姆單抗及/或西米普利單抗(cemiplimab)；及/或(ii)對於抗PDL1療法具有抵抗性或難治性，視情況其中該抗PDL1療法為德瓦魯單抗(durvalumab)、阿特珠單抗(atezolizumab)及/或阿維魯單抗(avelumab)。
  98. 一種治療有需要之個體中將受益於免疫反應增加之疾患的方法，該方法包括向該個體投與如請求項1至14中任一項之化合物、如請求項15至93中任一項之接合物或如請求項94或95之組合物。
  99. 如請求項98之方法，其中該疾患為感染，視情況其中該感染為病毒感染、細菌感染或寄生蟲感染、免疫抑制性疾病或病症或多發性硬化症。
  100. 一種增加免疫細胞之活性的方法，該方法包括使該免疫細胞與如請求項1至14中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、如請求項15至93中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽或如請求項94或95之組合物接觸。
  101. 一種增加免疫細胞之增殖的方法，該方法包括使免疫細胞與如請求項1至14中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、如請求項15至93中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽或如請求項94或95之組合物接觸。
  102. 一種增加免疫細胞向腫瘤細胞之遷移的方法，該方法包括使免疫細胞與如請求項1至14中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、如請求項15至93中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽或如請求項94或95之組合物接觸。
  103. 一種減少免疫細胞之耗竭的方法，該方法包括使免疫細胞與如請求項1至14中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、如請求項15至93中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽或如請求項94或95之組合物接觸。
  104. 一種增加IFN-γ或IL-2自免疫細胞之分泌的方法，該方法包括使該免疫細胞與如請求項1至14中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、如請求項15至93中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽或如請求項94或95之組合物接觸。
  105. 如請求項100至104中任一項之方法，其中該免疫細胞為T細胞，視情況其中該T細胞為效應T細胞。
  106. 如請求項100至104中任一項之方法，其中該免疫細胞為自然殺手(NK)細胞。
  107. 一種增強及/或維持T細胞之抗原回憶反應的方法，該方法包括使該T細胞與如請求項1至14中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、如請求項15至93中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽或如請求項94或95之組合物接觸。
  108. 一種將能夠活化效應T細胞之有效負荷遞送至免疫細胞的方法，該方法包括使效應T細胞與如請求項15至93中任一項之接合物或其醫藥學上可接受之鹽或如請求項95之組合物接觸。
  109. 如請求項95至108中任一項之方法，其中該接觸係在活體外。
  110. 如請求項100至108中任一項之方法，其中該接觸係在個體體內，視情況其中該個體患有癌症或將受益於免疫反應增加之疾患。
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