CN117015381A - 新颖类固醇有效负载、类固醇接头、含有其的adc及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供新颖糖皮质激素、糖皮质激素‑接头和抗体药物偶联物(ADC)，所述抗体药物偶联物包含结合至免疫细胞上表达的抗原(任选地为人类免疫细胞上表达的抗原)的抗体或抗体片段。在一些情况下，所述ADC包含抗人VISTA(T细胞活化的V区含免疫球蛋白抑制因子(1))抗体或抗VISTA抗原结合抗体片段，其在生理pH下结合至VISTA表达细胞并且具有短血清半衰期(在人类VISTA敲入啮齿动物中约24‑72或24‑48或12‑24小时或更短时间，或者在人类或非人类灵长类动物中约1‑3.5天或更短时间)。在一些情况下，这些ADC快速起效并且长期有效，这是因为它们由大量免疫细胞极有效地内化，在所述免疫细胞中它们裂解而释放大量活性类固醇有效负载。本发明还涉及此类ADC和新颖类固醇用于治疗自身免疫性、过敏性和炎症性疾患的用途。本发明进一步涉及用于减少糖皮质激素受体激动剂的不良副作用和/或增强糖皮质激素受体激动剂的功效的方法，这是通过使用此类ADC将这些抗炎剂选择性地递送至靶免疫细胞，例如单核细胞、嗜中性粒细胞、B细胞、T细胞、Treg、嗜酸性粒细胞、NK细胞、巨噬细胞、骨髓细胞等，并且特别是骨髓细胞，从而降低对非靶细胞的潜在毒性。
Description
技术领域
本发明涉及新颖糖皮质激素、糖皮质激素-接头和抗体药物偶联物(ADC)，所述抗体药物偶联物包含结合至免疫细胞上表达的抗原(典型地为人类免疫细胞上表达的抗原)的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，ADC包含抗人VISTA(T细胞活化的V区含免疫球蛋白抑制因子(1))抗体或抗VISTA抗原结合抗体片段，例如，具有短血清半衰期(在人类VISTA敲入啮齿动物中约24-27小时或更短)的片段。主题ADC快速起效并且长期有效，这是因为它们由大量免疫细胞极有效地内化，在所述免疫细胞中它们裂解而释放大量活性类固醇有效负载。本发明还涉及此类ADC和新颖类固醇用于治疗自身免疫性、过敏性、炎症性和癌症疾患并且特别是急性和慢性自身免疫性、过敏性和炎症性疾患的用途。本发明进一步涉及用于减少糖皮质激素的不良副作用和/或增强糖皮质激素的功效的方法，这是通过使用此类ADC将这些抗炎剂选择性地递送至靶免疫细胞，典型地为人类免疫细胞，任选地为单核细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、Treg、嗜酸性粒细胞、B细胞、NK细胞等中的任一者，并且特别是骨髓细胞，或所治疗的自身免疫性、过敏性、炎症性或癌症疾患的病理学中所涉及的其他免疫细胞，从而降低对非靶细胞的潜在毒性。
背景技术
VISTA为NCR配体，其最接近的系统发育亲属为PD-L1。VISTA与PD-L1具有同源性，但表现出局限于造血区室的独特表达模式。具体而言，VISTA在CD11b高骨髓细胞上组成性地和高度表达，并且在CD4+和CD8+T细胞上以较低水平表达。如同PD-L1，VISTA为显著抑制免疫的配体，并且如同PD-L1，阻断VISTA允许在临床前肿瘤学模型中发展对癌症的治疗性免疫。尽管阻断VISTA会增强免疫，尤其是CD8+和CD4+介导的T细胞免疫，但使用VISTA细胞外结构域的可溶性Ig融合蛋白(VISTA-Ig)治疗会抑制免疫并且已显示阻抑自身免疫性疾病的多种鼠类模型的进展。基于前述内容，已报道使用拮抗剂抗VISTA抗体促进T细胞免疫并治疗受益于此的疾患，例如癌症和感染。反之，已报道使用激动剂抗VISTA抗体抑制T细胞免疫并治疗在治疗学上受益于此的疾患，例如自身免疫性、过敏性和炎症性疾患。不幸地，一些抗VISTA抗体(包括用于人类临床试验的一些抗体)具有极短血清半衰期，其在治疗例如癌症或自身免疫的慢性疾患的情形中通常不合需要，因为这需要极频繁给药，这对患者造成不便并且成本高。另外，已提出抗VISTA抗体和VISTA融合蛋白将有效负载(例如化学治疗剂)递送至癌细胞或肿瘤部位的潜在用途。
合成糖皮质激素受体激动剂(例如，地塞米松(dexamethasone)、泼尼松龙(prednisolone)、布地奈德(budesonide)、倍氯米松(beclomethasone)、贝他米松(betamethasone)、皮质醇(cortisol)、醋酸皮质酮(cortisone acetate)、16-α羟基泼尼松龙、地塞米松、二氟松(difluorasone)、氟米松(flumethasone)、氟尼缩松(flunisolide)、醋酸氟轻松(fluocinolone acetonide)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、环索奈德(ciclesonide)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、泼尼松(prednisone)、泼尼松龙、莫美他松(mometasone)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)等)为用于治疗炎症和与其相关的病症的一类强效小分子。尽管这些化合物对抑制与例如自身免疫性、过敏性和炎症性病症、癌症和感染性疾病的不同疾患相关的炎症极其有效，但所述化合物在炎症性、过敏性和自身免疫性疾病的慢性治疗中的效用因其严重副作用而受限。
基于前述内容，已探索若干方法来保留合成糖皮质激素的抗炎功效，同时已描述避免不当毒性(Rosen,J和Miner,J N Endocrine Reviews 26:452-64(2005))。特别是，已开发抗体药物偶联物(ADC)，其中此类化合物偶联至靶向由免疫细胞表达的抗原(包括CD40、CD163、CD74、PRLR和TNF)的抗体。尽管如此，在自身免疫性、过敏性和炎症性疾病的领域中仍需要改进的抗炎、自身免疫和过敏疗法以及开发改进的抗炎、自身免疫和过敏疗法，例如，与用于治疗此类疾患的现有疗法相比增强的功效、延长的功效和/或减少的副作用。
发明内容
本发明的一个目的是通过提供新颖类固醇、类固醇-接头和ADC来提供用于治疗或预防炎症和与其相关的病症的治疗剂，所述ADC包含靶向由免疫细胞(典型地为人类免疫细胞)表达的抗原并且在一些实施方案中为VISTA的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是在生理pH下结合至VISTA表达细胞的抗人VISTA抗体或抗人VISTA抗体片段。
本发明的一个具体目的是提供新颖抗体药物偶联物(ADC)，所述抗体药物偶联物包含在生理条件(约pH 7.5)下具有极短血清半衰期的抗VISTA抗体或抗体片段，所述血清半衰期在本文中定义为在人类VISTA敲入啮齿动物中1至72小时、1至32小时、1至16小时、1至8小时、1至4小时或1至2小时，或在食蟹猴中约3-4天或更短时间，所述VISTA抗体或抗体片段偶联至本文所公开的糖皮质激素受体激动剂或糖皮质激素受体激动剂-接头。
如下文所示，主题ADC具有优于先前ADC的独特优点组合，用于靶向抗炎剂(特别是类固醇)和引导所述抗炎剂内化至免疫细胞中，这是因为类固醇接头有效负载在其中的新颖特性，这提供大量活性有效负载的快速内化和一旦由免疫细胞内化即释放。
此外，主题ADC提供高药物抗体比率(DAR)，这是因为它们与包含糖皮质激素的先前ADC相比更不易聚集。
此外，主题ADC提供高效力，即使在较低DAR下也是如此，这是因为主题ADC与包含糖皮质激素的先前ADC相比，更有效地内化并且将更多活性糖皮质激素有效负载释放至靶免疫细胞中。
此外，在一些实施方案中，主题ADC具有本文所公开的类固醇接头有效负载与抗VISTA抗体或抗体片段的组合效益，特别是在生理pH下结合至表达VISTA的免疫细胞并且具有极短pK的抗体或抗体片段。特别地，这些ADC结合至表达VISTA的免疫细胞，例如在极高密度下并且尽管其PK极短，但长期(即，具有比其pK长得多的PD)有效(引发抗炎活性)，并且因此极其适于治疗慢性炎症性或自身免疫性或过敏性疾病，其中长期和重复施用是治疗上需要的。
此外，包含抗VISTA抗体或抗体片段的主题ADC靶向广泛范围的免疫细胞，包括活化和非活化T细胞、Treg、CD4 T细胞、CD8 T细胞、嗜中性粒细胞、骨髓细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、NK细胞和内皮细胞；因此，此类ADC可用于治疗涉及任何或所有这些类型的免疫细胞的炎症性或自身免疫性或过敏性疾病。然而，替代地，主题ADC可包含结合至其他免疫细胞抗原的抗体或抗体片段，优选为有效内化靶免疫细胞的抗体或抗体片段。
主题ADC具有快速起效的功效并且因此可用于处理急性治疗。在含有ADC的VISTA抗体的情况下，这些ADC不结合B细胞并且因此不应如游离类固醇一样具有免疫抑制作用。
此外，在含有ADC的VISTA抗体的情况下，主题ADC作用于作为负责类固醇功效的重要免疫细胞的Treg，并且作用于静止细胞和例如骨髓细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、Treg、CD8 T细胞、CD4 T细胞、免疫细胞，并且因此在炎症性和自身免疫性疾患的活跃期和缓解期均为活性的(引发抗炎活性)。
此外，在含有ADC的VISTA抗体的情况下，主题ADC作用于嗜中性粒细胞，所述免疫细胞对急性炎症至关重要。
此外，在含有ADC的VISTA抗体的情况下，主题ADC极快速地并且组成性地内化免疫细胞，这是因为VISTA细胞表面周转率高。
此外，在含有ADC的VISTA抗体的情况下，主题ADC具有极短半衰期(PK)并且选择性地靶向免疫细胞，因此主题ADC不应易于出现非靶细胞相关毒性和非所需的外周类固醇暴露(低非特异性损失效应)。
此外，在根据本发明的含有ADC的某种VISTA抗体的情况下，主题ADC的生物活性(抗炎作用)完全归因于抗炎有效负载(类固醇)，这是因为抗VISTA抗体是其中具有不引发免疫功能(不阻断任何VISTA生物学)的静默IgG的抗体。
本发明的一个具体目的是提供具有以下式(I)结构的新颖糖皮质激素激动剂化合物：
其中X选自苯基、螺[3.3]庚烷、3-6元杂环、环烷基、螺烷基、螺杂环烷基、双环烷基、杂双环烷基、[1.1.1]双环戊烷、双环[2.2.2]辛烷、金刚烷和立方烷，其各自可被1-4个独立地选自F、Cl、Br、I、N、S和O的杂原子取代，其中每个环结构可含有至少一个选自N、S和O的骨架杂原子，并且任选地进一步被1-4个C1-3烷基或C1-3全氟烷基取代；
Z选自苯基、螺[3.3]庚烷、3-6元杂环、环烷基、螺烷基、螺杂环烷基、双环烷基、杂双环烷基、[1.1.1]双环戊烷、双环[2.2.2]辛烷、金刚烷和立方烷，其各自可被1-4个独立地选自F、Cl、Br、I、N、S和O的杂原子取代，其中每个环结构可含有至少一个选自N、S和O的骨架杂原子，并且任选地进一步被1-4个C1-3烷基或C1-3全氟烷基取代；
Y选自CHR1、O、S和NR1；
E选自CH2和O；
G选自CH和N；
进一步其中当G为CH并且X为苯基时，Z不为苯基；
G与X的键联可任选地选自C1-3烷基和环氧乙烷，其各自可被1-4个独立地选自N、S和O的杂原子取代并且任选地进一步被1-4个C1-3烷基取代；
X与Z的键联可占据X和Z上的任何可用位置；
取代基NR1R2可占据Z上的任何可用位置；
R1选自H、1-8个碳的直链或支链烷基、芳基和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
当R1为H时，R2可选自H、1-8个碳的直链或支链烷基、芳基和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
当R1为H、1-8个碳的直链或支链烷基、或杂芳基时，R2可为选自以下的官能团：
[(C＝O)CH(W)NH]m-[C＝O]-[V]k-J，
(C＝O)OCH2-对氨基苯基-N-V-J，
(C＝O)OCH2-对氨基苯基-N-[(C＝O)CH(W)NH]m-[C＝O]-[V]k-J，和
[V]k-(C＝O)OCH2-对氨基苯基-N-[(C＝O)CH(W)NH]m-[C＝O]-J，
其中m＝1-6，k＝0-1，并且W的每个置换可独立地选自H、[(CH2)nR3](其中n＝1-4)、以R3为末端的支链烷基链，和包含1-13个单元的直链或支链聚环氧乙烷基团；
R3选自H、甲基、乙基、异丙基、OH、O-烷基、NH2、NH-烷基、N-二烷基、SH、S-烷基、胍、脲、羧酸、羧酰胺、羧酸酯、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基，其中所述芳基和杂芳基取代基可选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-；
V可选自1-8个碳的烷基链；包含1-13个单元的直链或支链聚环氧乙烷基团；包含1-8个碳的直链或支链烷基；-O-烷基；羧酸；羧酰胺；羧酸酯；烷基-C(O)O-；烷基氨基-C(O)-；二烷基氨基C(O)-；1-3个氨基酸的序列，其中每个氨基酸独立地选自Glu、Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、βAla、Phe、Val和Cit；芳基；和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-、二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
J是选自以下的反应基团：-NH2、N3、硫基、环辛炔、-OH、-CO2H、反式环辛烯、炔基、炔丙基、
其中R32选自Cl、Br、F、甲磺酸酯和甲苯磺酸酯，并且R33选自Cl、Br、I、F、OH、-O-N-丁二酰亚胺基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基，R34为H、Me、四嗪-H和四嗪-Me；
R5选自由-CH2OH、-CH2SH、-CH2Cl、-SCH2Cl、-SCH2F、-SCH2CF3、羟基、-OCH2CN、-OCH2Cl、-OCH2F、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH2CN和组成的组；
R6和R7独立地选自氢和C1-10烷基；
Q可为H、C(O)R8(其中R8为1-8个碳的直链或支链烷基)，或(C＝O)NR4CHnNR4(C＝O)OCH2-(V)n-J(其中n＝1-4并且R4＝H、烷基或支链烷基)，或P(O)OR4；
A1和A2独立地选自H和F；并且
除非另有规定，否则要求保护所有可能的立体异构体。
本发明的一个具体目的是提供根据前述的糖皮质激素激动剂化合物，其中X和Z独立地选自苯基、螺[3.3]庚烷、[1.1.1]双环戊烷和双环[2.2.2]辛烷；Y选自CH2和O；W的置换独立地选自CH2CH2CO2H和H，并且进一步其中当G为CH并且X为苯基时，Z不为苯基。
本发明的一个具体目的是提供根据前述的糖皮质激素激动剂化合物，其选自实施例3中公开的糖皮质激素激动剂化合物中的任一者或选自图11中所示的那些，不包括INX J和INX L。
本发明的一个具体目的是提供根据前述的糖皮质激素激动剂化合物，其选自本文所公开的INX-类固醇有效负载、INX-类固醇接头和INX-抗体药物偶联物(ADC)化合物，不包括INX J和INX L。
本发明的一个具体目的是提供根据前述的糖皮质激素激动剂化合物，其选自以下：
本发明的一个具体目的是提供根据前述的糖皮质激素激动剂化合物，其直接或间接连接到至少一个可裂解或不可裂解肽和/或非肽接头(即，“类固醇-接头有效负载”)。糖皮质激素激动剂化合物或类固醇-接头有效负载。
本发明的一个具体目的是提供包含以下的化合物(类固醇-接头有效负载)：至少一个可裂解或不可裂解接头(“L”)；任选地“Q”，“异双官能团”或“异三官能团”，其为任选地用于将化合物中的接头连接到抗体或抗体片段的化学部分；和至少一种抗炎剂(“AI”)，其中AI是根据前述任一项的糖皮质激素激动剂化合物，所述类固醇-接头有效负载可由以下结构表示：
Q-L-AI或AI-L-Q。
本发明的一个具体目的是提供根据前述的类固醇-接头有效负载，其中所述接头选自本文所公开的那些。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的类固醇-接头有效负载，所述类固醇-接头有效负载包含至少一个选自PAB和/或氨基酸或肽的可裂解或不可裂解接头，任选地为1-12个氨基酸，进一步任选地为二肽、三肽、四肽、五肽并且进一步任选地为Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、Phe、Cit、Val、Val-Cit、Val-Ala、Val-Gly、Val-Gln、Ala-Val、Cit-Cit、Lys-Val-Cit、Asp-Val-Ala、Ala-Ala-Asn、Asp-Val-Ala、Ala-Val-Cit、Ala-Asn-Val、βAla-Leu-Ala-Leu、Lys-Val-Ala、Val-Leu-Lys、Asp-Val-Cit、Val-Ala-Val和Ala-Ala-Asn；或任选地为GlcA、PAB和Glu-Gly中的至少一者。
本发明的一个具体目的是提供根据前述的类固醇-接头有效负载，所述类固醇-接头有效负载包含至少一个可裂解接头和/或牺牲型接头，直接或间接连接到糖皮质激素激动剂类固醇化合物。
本发明的一个更具体目的是提供根据前述任一项的糖皮质激素激动剂类固醇化合物或类固醇-接头有效负载或含有其的ADC，其选自实施例(例如，实施例3)中公开的糖皮质激素激动剂化合物或类固醇-接头有效负载化合物中的任一者和图118A-O中列举的化合物，不包括INX J和INX L。
本发明的一个具体目的是提供糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其选自：
(i)INX-SM-3-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-4-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-53-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-54-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-56-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-98-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-6-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-2-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-57-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-31-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-32-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-10-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-40-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-34-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-28-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-27-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-35-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-8-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-7-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-33-GluGly-烷氧基胺或糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中Glu-Gly被不同可裂解肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些的INX-SM有效负载；或
(ii)INX-SM-53-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-3-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-54-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-1-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-4-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-2-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-47-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-7-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-8-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-56-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-32-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-6-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-10-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-33-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-31-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-35-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-9-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-28-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-27-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-34-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-35-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-40-GluGly-溴乙酰基或糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中Glu-Gly被不同可裂解肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些的INX-SM有效负载；
(iii)INX-SM-53-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-1-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-4-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-54-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-7-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-8-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-2-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-57-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-40-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-34-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-28-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-27-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-35-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-9-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-10-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-31-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-32-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-33-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-56-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-6-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-3-GluGly-二苯并环辛炔或糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly被不同可裂解肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些的INX-SM有效负载；或
(iv)INX-SM-1-GluGly-NHS酯；INX-SM-31-GluGly-NHS酯；INX-SM-32-GluGly-NHS酯；INX-SM-33-GluGly-NHS酯；INX-SM-53-GluGly-NHS酯；INX-SM-7-GluGly-NHS酯；INX-SM-8-GluGly-NHS酯；INX-SM-2-GluGly-NHS酯；INX-SM-56-GluGly-NHS酯；INX-SM-6-GluGly-NHS酯；INX-SM-54-GluGly-NHS酯；INX-SM-4-GluGly-NHS酯；INX-SM-53-GluGly-NHS酯；INX-SM-3-GluGly-NHS酯；INX-SM-9-GluGly-NHS酯；INX-SM-40-GluGly-NHS酯；INX-SM-34-GluGly-NHS酯；INX-SM-28-GluGly-NHS酯；INX-SM-34-GluGly-NHS酯；INX-SM-28-GluGly-NHS酯；INX-SM-27-GluGly-NHS酯；INX-SM-35-GluGly-NHS酯；INX-SM-10-GluGly-NHS酯或糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly被不同可裂解肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些的INX-SM有效负载；
(v)INX-SM-1-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-3-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-4-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-8-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-2-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-7-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-56-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-6-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-54-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-53-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-33-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-35-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-40-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-34-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-28-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-27-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-35-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-9-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-10-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-31-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-32-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-57-GluGly-顺丁烯二酰亚胺或糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly被不同可裂解肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些的INX-SM有效负载；或
(vi)INX-SM-3-GluGly-四嗪、INX-SM-53-GluGly-四嗪、INX-SM-1-GluGly-四嗪、INX-SM-54-GluGly-四嗪、INX-SM-6-GluGly-四嗪、INX-SM-56-GluGly-四嗪、INX-SM-4-GluGly-四嗪、INX-SM-10-GluGly-四嗪、INX-SM-31-GluGly-四嗪、INX-SM-32-GluGly-四嗪、INX-SM-33-GluGly-四嗪、INX-SM-7-GluGly-四嗪、INX-SM-8-GluGly-四嗪、INX-SM-9-GluGly-四嗪、INX-SM-27-GluGly-四嗪、INX-SM-35-GluGly-四嗪、INX-SM-2-GluGly-四嗪、INX-SM-40-GluGly-四嗪、INX-SM-34-GluGly-四嗪、INX-SM-28-GluGly-四嗪、INX-SM-27-GluGly-四嗪或糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly被不同可裂解肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些的INX-SM有效负载；或
(vii)INX-SM-6-GluGly-胺、INX-SM-54-GluGly-胺、INX-SM-4-GluGly-胺、INX-SM-53-GluGly-胺、INX-SM-2-GluGly-胺、INX-SM-56-GluGly-胺、INX-SM-57-GluGly-胺、INX-SM-35-GluGly-胺、INX-SM-27-GluGly-胺、INX-SM-40-GluGly-胺、INX-SM-34-GluGly-胺、INX-SM-28-GluGly-胺、INX-SM-35-GluGly-胺、INX-SM-9-GluGly-胺、INX-SM-10-GluGly-胺、INX-SM-31-GluGly-胺、INX-SM-32-GluGly-胺、INX-SM-33-GluGly-胺、INX-SM-7-GluGly-胺、INX-SM-8-GluGly-胺、INX-SM-1-GluGly-胺、INX-SM-3-GluGly-胺或糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly被不同可裂解肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些的INX-SM有效负载；或
(viii)INX-SM-53-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-1-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-3-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-2-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-56-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-35-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-25-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-27-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-35-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-9-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-10-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-31-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-32-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-33-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-57-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-7-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-8-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-6-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-54-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-4-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-40-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-34-PAB-GluGly-烷氧基胺或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly和/或PAB被不同可裂解肽或非肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些的INX-SM有效负载；或
(ix)INX-SM-1-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-3-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-2-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-7-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-8-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-40-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-56-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-6-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-154PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-4-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-33-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-32-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-10-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-34-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-31-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-9-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-28-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-27-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-35-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-53-PAB-GluGly-溴乙酰基或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly和/或PAB被不同可裂解肽或非肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些的INX-SM有效负载；
(x)INX-SM-6-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-54-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-4-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-53-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-1-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-7-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-8-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-2-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-56-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-57-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-33-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-32-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-31-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-3-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-9-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-27-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-35-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-34-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-28-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-40-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-10-PAB-GluGly-二苯并环辛炔或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly和/或PAB被不同可裂解肽或非肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些的INX-SM有效负载；或
(xi)INX-SM-56-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-54-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-4-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-53-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-1-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-3-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-33-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-57-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-7-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-8-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-27-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-35-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-9-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-10-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-31-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-32-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-40-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-34-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-28-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-2-PAB-GluGly-NHS酯或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly和/或PAB被不同可裂解肽或非肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些的INX-SM有效负载；或
(xii)INX-SM-1-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-53-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-5-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-2-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-8-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-56-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-54-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-4-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-57-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-7-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-32-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-31-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-53-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-3-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-34-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-28-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-40-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-27-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-35-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-9-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-10-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly和/或PAB被不同可裂解肽或非肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些的INX-SM有效负载；或
(xiii)INX-SM-6-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-54-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-4-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-53-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-1-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-3-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-57-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-7-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-8-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-2-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-31-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-32-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-33-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-56-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-35-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-9-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-40-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-34-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-28-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-27-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-35-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-10-PAB-GluGly-四嗪或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly和/或PAB被不同可裂解肽或非肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些的INX-SM有效负载；或
(xiv)INX-SM-1-PAB-GluGly-胺、INX-SM-3-PAB-GluGly-胺、INX-SM-8-PAB-GluGly-胺、INX-SM-2-PAB-GluGly-胺、INX-SM-56-PAB-GluGly-胺、INX-SM-6-PAB-GluGly-胺、INX-SM-54-PAB-GluGly-胺、INX-SM-4-PAB-GluGly-胺、INX-SM-53-PAB-GluGly-胺、INX-SM-33-PAB-GluGly-胺、INX-SM-53-PAB-GluGly-胺、INX-SM-7-PAB-GluGly-胺、INX-SM-9-PAB-GluGly-胺、INX-SM-35-PAB-GluGly-胺、INX-SM-40-PAB-GluGly-胺、INX-SM-34-PAB-GluGly-胺、INX-SM-28-PAB-GluGly-胺、INX-SM-27-PAB-GluGly-胺、INX-SM-35-PAB-GluGly-胺、INX-SM-10-PAB-GluGly-胺、INX-SM-31-PAB-GluGly-胺、INX-SM-32-PAB-GluGly-胺或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly和/或PAB被不同可裂解肽或非肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些的INX-SM有效负载；或
(xv)INX-SM-1-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-35-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-9-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-10-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-54-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-31-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-32-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-33-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-57-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-7-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-8-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-2-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-56-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-6-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-4-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-53-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-27-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-40-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-34-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-28-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-3-PAB-GlcA-烷氧基胺或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GlcA和/或PAB被不同可裂解肽或非肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些的INX-SM有效负载；或
(xvi)INX-SM-3-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-4-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-56-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-54-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-4-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-53-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-7-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-8-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-2-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-40-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-57-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-33-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-10-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-34-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-31-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-32-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-35-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-9-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-28-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-27-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-1-PAB-GlcA-溴乙酰基或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly和/或PAB被不同可裂解肽或非肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些的INX-SM有效负载；或
(xvii)INX-SM-4-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-54-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-1-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-54-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-33-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-57-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-7-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-8-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-2-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-5-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-6-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-35-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-9-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-10-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-31-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-32-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-27-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-35-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-28-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-34-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-40-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-3-PAB-GlcA-二苯并环辛炔或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GlcA和/或PAB接头被不同可裂解肽或非肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些的INX-SM有效负载；或
(xviii)INX-SM-3-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-53-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-4-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-56-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-54-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-8-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-2-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-7-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-57-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-32-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-33-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-31-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-9-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-10-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-35-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-27-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-28-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-40-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-34-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-1-PAB-GlcA-NHS酯或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GlcA和/或PAB被不同可裂解肽或非肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些的INX-SM有效负载；或
(xix)INX-SM-3-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-4-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-53-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-31-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-32-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-33-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-53-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-7-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-8-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-2-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-56-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-6-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-54-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-1-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-9-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-35-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-27-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-28-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-34-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-40-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-10-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GlcA和/或PAB被不同可裂解肽或非肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些的INX-SM有效负载；或
(xx)INX-SM-33-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-57-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-7-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-8-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-2-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-56-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-6-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-54-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-4-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-9-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-35-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-27-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-28-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-34-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-40-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-10-PAB-GlcA-四嗪或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GlcAy和/或PAB接头被不同可裂解肽或非肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些的INX-SM有效负载；或
(xxi)INX-SM-1-PAB-GlcA-胺、INX-SM-3-PAB-GlcA-胺、INX-SM-53-PAB-GlcA-胺、INX-SM-6-PAB-GlcA-胺、INX-SM-54-PAB-GlcA-胺、INX-SM-8-PAB-GlcA-胺、INX-SM-2-PAB-GlcA-胺、INX-SM-56-PAB-GlcA-胺、INX-SM-4-PAB-GlcA-胺、INX-SM-35-PAB-GlcA-胺、INX-SM-8-PAB-GlcA-胺、INX-SM-10-PAB-GlcA-胺、INX-SM-31-PAB-GlcA-胺、INX-SM-32-PAB-GlcA-胺、INX-SM-33-PAB-GlcA-胺、INX-SM-57-PAB-GlcA-胺、INX-SM-27-PAB-GlcA-胺、INX-SM-35-PAB-GlcA-胺、INX-SM-34-PAB-GlcA-胺、INX-SM-28-PAB-GlcA-胺、INX-SM-40-PAB-GlcA-胺、INX-SM-7-PAB-GlcA-胺或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GlcA和/或PAB接头被不同可裂解肽或非肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些的INX-SM有效负载；或
(xxii)烷氧基胺-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或烷氧基胺-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或包含相同或不同肽或非肽接头的其他接头有效负载，其中接头经由C11-OH连接到相同或不同INX类固醇；
(xxiii)溴乙酰基-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或溴乙酰基--GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或包含相同或不同肽或非肽接头的其他接头有效负载，其中接头经由C11-OH连接到相同或不同INX类固醇；
(xxiv)二苯并环辛炔-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或二苯并环辛炔-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或包含相同或不同肽或非肽接头的其他接头有效负载，其中接头经由C11-OH连接到相同或不同INX类固醇；
(xxv)四嗪-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或四嗪-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或包含相同或不同肽或非肽接头的其他接头有效负载，其中接头经由C11-OH连接到相同或不同INX类固醇；
(xxvi)烷氧基胺-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或烷氧基胺-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或包含相同或不同接头的其他接头有效负载，其中接头经由C17连接到相同或不同INX类固醇有效负载；
(xxvii)溴乙酰基-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或溴乙酰基-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或包含相同或不同接头的其他接头有效负载，其中接头经由C17连接到相同或不同INX类固醇有效负载；
(xxviii)顺丁烯二酰亚胺-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或顺丁烯二酰亚胺-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或包含相同或不同接头的其他接头有效负载，其中接头经由C17连接到相同或不同INX类固醇有效负载；
(xxix)二苯并环辛炔-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或二苯并环辛炔-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或包含相同或不同接头的其他接头有效负载，其中接头经由C17连接到相同或不同INX类固醇有效负载；
(xxx)四嗪-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或四嗪-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或包含相同或不同接头的其他接头有效负载，其中接头经由C17连接到相同或不同INX类固醇有效负载；和
(xxxi)胺-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或胺-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或包含相同或不同接头的其他接头有效负载，其中接头经由C17连接到相同或不同INX类固醇有效负载。
13.一种抗体药物偶联物(ADC)，其选自以下：
(i)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(烷氧基胺+酮偶联(C11-OH连接)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM有效负载经由烷氧基胺+酮偶联而偶联至抗体并且经C11-OH连接；
(ii)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(叠氮化物+二苯并环辛炔偶联(C11-OH连接)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM有效负载经由叠氮化物+二苯并环辛炔偶联而偶联至抗体并且经C11-OH连接；
(iii)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(卤乙酰基+半胱氨酸偶联(C11-OH连接)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM有效负载经由叠氮化物+二苯并环辛炔偶联而偶联至抗体并且经C11-OH连接；
(iv)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(顺丁烯二酰亚胺+半胱氨酸偶联(C11-OH连接)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM有效负载经由叠氮化物+二苯并环辛炔偶联而偶联至抗体并且经C11-OH连接；
(v)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(四嗪+反式环辛烯偶联(C11-OH连接)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM有效负载经由四嗪+反式环辛烯偶联而偶联至抗体并且经C11-OH连接；
(vi)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(烷氧基胺+酮偶联(C11-OH连接))，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM有效负载经由烷氧基胺+酮偶联而偶联至抗体并且经C11-OH连接；
(vii)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(叠氮化物+二苯并环辛炔偶联(C17连接))，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM有效负载经由叠氮化物+二苯并环辛炔酮偶联而偶联至抗体并且经C17连接；
(viii)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(卤乙酰基+半胱氨酸偶联(C17连接))，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM有效负载经由叠氮化物+二苯并环辛炔酮偶联而偶联至抗体并且经C17连接；
(ix)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(四嗪+反式环辛烯偶联(C17连接))，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM接头有效负载经由四嗪+反式环辛烯偶联而偶联至抗体并且经C17连接；
(x)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(使用转谷氨酰胺酶的胺+谷氨酰胺偶联(C17连接))，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM接头有效负载经由使用转谷氨酰胺酶的胺+谷氨酰胺偶联而偶联至抗体并且经C17连接；
(xi)INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(烷氧基胺和酮偶联)(N-连接的有效负载)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM接头有效负载经由烷氧基胺和酮偶联而偶联至抗体并且经N连接；
(xii)INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(卤乙酰基偶联)(N-连接的有效负载)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM接头有效负载经由卤乙酰基偶联而偶联至抗体并且经N连接；
(xiii)INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(叠氮化物+二苯并环辛炔偶联)(N-连接的有效负载)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM接头有效负载经由叠氮化物+二苯并环辛炔偶联而偶联至抗体并且经N连接；
(xiv)INX-SM-3-GlcA-Ab或INX-SM-3-Glu-Gly-Ab(N-羟基丁二酰亚胺偶联)(N-连接的有效负载)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM接头有效负载经由N-羟基丁二酰亚胺偶联而偶联至抗体并且经N连接；
(xv)INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(叠氮化物+二苯并环辛炔偶联)(N-连接的有效负载)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM接头有效负载经由叠氮化物+二苯并环辛炔偶联而偶联至抗体并且经N连接；
(xvi)INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(N-羟基丁二酰亚胺偶联)(N-连接的有效负载)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM接头有效负载经由N-羟基丁二酰亚胺偶联而偶联至抗体并且经N连接；
(xvii)INX-SM-3-Glu-Gly-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(顺丁烯二酰亚胺偶联)(N-连接的有效负载)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM接头有效负载经由顺丁烯二酰亚胺偶联而偶联至抗体并且经N连接；
(xviii)INX-SM-3-Glu-Gly-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab或INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab(反式环辛烯+四嗪偶联)(N-连接的有效负载)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM接头有效负载经由反式环辛烯+四嗪偶联而偶联至抗体并且经N连接；
(xix)INX-SM-3-Glu-Gly-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab或INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab(胺偶联)(N-连接的有效负载)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM接头有效负载经由反式环辛烯+四嗪偶联而偶联至抗体并且经N连接。
本发明的另一个具体目的是提供一种抗体药物偶联物(ADC)，其选自以下：
其中，
Ab＝抗体，优选为结合至人类免疫细胞的抗体，优选为在生理pH下结合至人类VISTA免疫细胞的抗VISTA抗体；
L＝接头；
AA＝单、双或三氨基酸序列；
NH有效负载＝
REG独立地选自由氢、烷基、联苯、-CF3、-NO2、-CN、氟、溴、氯、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-组成的组；
Ab＝抗体；
L＝接头；
AA＝单、双或三氨基酸序列；
NH有效负载＝
REG独立地选自由氢、烷基、联苯、-CF3、-NO2、-CN、氟、溴、氯、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-组成的组；
Ab＝抗体；
L＝接头；
AA＝单、双或三氨基酸序列或不存在；
NH有效负载＝
REG独立地选自由氢、烷基、联苯、-CF3、-NO2、-CN、氟、溴、氯、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-组成的组；
RT＝AA或
Ab＝抗体，任选地为抗人VISTA抗体；
L＝接头；
AA＝单、双或三氨基酸序列；
O有效负载＝/>
Ab＝抗体，典型地为结合至免疫细胞(典型地为人类免疫细胞)上表达的抗原(例如VISTA)的抗体；
L＝接头；
AA＝单、双或三氨基酸序列或不存在；
O有效负载＝或
RT＝AA或
本发明的一个具体目的是提供根据前述的抗体药物偶联物(ADC)，其中接头包括可裂解或不可裂解肽或牺牲型接头。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的抗体药物偶联物(ADC)，所述ADC包含选自PAB和/或氨基酸或肽的接头，任选地为1-12个氨基酸，进一步任选地为二肽、三肽、四肽、五肽并且进一步任选地为Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、Phe、Cit、Val、Val-Cit、Val-Ala、Val-Gly、Val-Gln、Ala-Val、Cit-Cit、Lys-Val-Cit、Asp-Val-Ala、Ala-Ala-Asn、Asp-Val-Ala、Ala-Val-Cit、Ala-Asn-Val、βAla-Leu-Ala-Leu、Lys-Val-Ala、Val-Leu-Lys、Asp-Val-Cit、Val-Ala-Val和Ala-Ala-Asn。
本发明的一个具体目的是提供一种类固醇抗体偶联化合物，其选自以下结构：
其中n＝2-12、2-10、2-8、2-6、2-4并且A为抗体或其抗原结合片段，优选为结合至免疫细胞(优选为人类免疫细胞)上表达的抗原的抗体或抗体片段，并且在示例性实施方案中为抗人VISTA抗体。
本发明的一个具体目的是提供式(I)的糖皮质激素激动剂化合物：
其中
X选自苯基、螺[3.3]庚烷、3-6元杂环、环烷基、螺烷基、螺杂环烷基、双环烷基、杂双环烷基、[1.1.1]双环戊烷、双环[2.2.2]辛烷、金刚烷和立方烷，其各自可被1-4个独立地选自F、Cl、Br、I、N、S和O的杂原子取代，其中每个环结构可含有至少一个选自N、S和O的骨架杂原子，并且任选地进一步被1-4个C1-3烷基或C1-3全氟烷基取代；
Z选自苯基、螺[3.3]庚烷、3-6元杂环、环烷基、螺烷基、螺杂环烷基、双环烷基、杂双环烷基、[1.1.1]双环戊烷、双环[2.2.2]辛烷、金刚烷和立方烷，其各自可被1-4个独立地选自F、Cl、Br、I、N、S和O的杂原子取代，其中每个环结构可含有至少一个选自N、S和O的骨架杂原子，并且任选地进一步被1-4个C1-3烷基或C1-3全氟烷基取代；
Y选自CHR1、O、S和NR1；
E选自CH2和O；
G选自CH和N；
进一步其中当G为CH并且X为苯基时，Z不为苯基；
G与X的键联可任选地选自C1-3烷基和环氧乙烷，其各自可被1-4个独立地选自N、S和O的杂原子取代并且任选地进一步被1-4个C1-3烷基取代；
X与Z的键联可占据X和Z上的任何可用位置；
取代基NR1R2可占据Z上的任何可用位置；
R1选自H、1-8个碳的直链或支链烷基、芳基和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
当R1为H时，R2可选自H、1-8个碳的直链或支链烷基、芳基和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
当R1为H、1-8个碳的直链或支链烷基、或杂芳基时，R2可为选自以下的官能团：
[(C＝O)CH(W)NH]m-[C＝O]-[V]k-J，
(C＝O)OCH2-对氨基苯基-N-V-J，
(C＝O)OCH2-对氨基苯基-N-[(C＝O)CH(W)NH]m-[C＝O]-[V]k-J，和
[V]k-(C＝O)OCH2-对氨基苯基-N-[(C＝O)CH(W)NH]m-[C＝O]-J，
其中m＝1-6，k＝0-1，并且W的每个置换可独立地选自H、[(CH2)nR3](其中n＝1-4)、以R3为末端的支链烷基链，和包含1-13个单元的直链或支链聚环氧乙烷基团；
R3选自H、甲基、乙基、异丙基、OH、O-烷基、NH2、NH-烷基、N-二烷基、SH、S-烷基、胍、脲、羧酸、羧酰胺、羧酸酯、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基，其中所述芳基和杂芳基取代基可选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-；
V可选自1-8个碳的烷基链；包含1-13个单元的直链或支链聚环氧乙烷基团；包含1-8个碳的直链或支链烷基；-O-烷基；羧酸；羧酰胺；羧酸酯；烷基-C(O)O-；烷基氨基-C(O)-；二烷基氨基C(O)-；1-3个氨基酸的序列，其中每个氨基酸独立地选自Glu、Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、βAla、Phe、Val和Cit；芳基；和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-、二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
J为选自以下的反应基团：-NH2、N3、硫基、环辛炔、-OH、-CO2H、反式环辛烯、炔基、炔丙基、
并且其中R32选自Cl、Br、F、甲磺酸酯和甲苯磺酸酯，并且R33选自Cl、Br、I、F、OH、-O-N-丁二酰亚胺基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基，R34为H、Me、四嗪-H和四嗪-Me；
R5选自由-CH2OH、-CH2SH、-CH2Cl、-SCH2Cl、-SCH2F、-SCH2CF3、羟基、-OCH2CN、-OCH2Cl、-OCH2F、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH2CN和组成的组；
R6和R7独立地选自氢和C1-10烷基；
Q可为H、C(O)R8(其中R8为1-8个碳的直链或支链烷基)，或(C＝O)NR4CHnNR4(C＝O)OCH2-(V)n-J(其中n＝1-4并且R4＝H、烷基或支链烷基)，或P(O)OR4；
A1和A2独立地选自H和F；并且
除非另有规定，否则包括所有可能的立体异构体。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的糖皮质激素激动剂化合物，其中Z选自：
其各自可被1-4个独立地选自F、Cl、Br、I、N、S和O的杂原子取代，并且任选地进一步被1-4个C1-3烷基或C1-3全氟烷基取代；
其中每个环结构可含有至少一个选自N、S和O的额外骨架杂原子；并且
其中每个指示与式的其余部分的连接点，并且所述连接点中的每一者可经由选自N、S和O的额外杂原子共价键结至式的其余部分。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的糖皮质激素激动剂化合物，其中Z-NR1选自：
/>
其各自可被1-4个独立地选自F、Cl、Br、I、N、S和O的杂原子取代，并且任选地进一步被1至4个C1-3烷基或C1-3全氟烷基取代；
其中每个环结构可含有至少一个选自N、S和O的额外骨架杂原子；并且
其中每个指示与式的其余部分的连接点，并且所述连接点中的每一者可经由选自N、S和O的额外杂原子共价键结至式的其余部分。
本发明的一个具体目的是提供一种糖皮质激素激动剂化合物，其具有式(II)的结构：
其中
Y选自CH2和O；
E选自CH2和O；
G选自CH和N；
L选自H和F；
R5选自-CH2OH、-SCH2F和
A1和A2独立地选自H和F；
V可选自1-8个碳的烷基链；包含1-13个单元的直链或支链聚环氧乙烷基团；包含1-8个碳的直链或支链烷基；-O-烷基；羧酸；羧酰胺；羧酸酯；烷基-C(O)O-；烷基氨基-C(O)-；二烷基氨基C(O)-；1-3个氨基酸的序列，其中每个氨基酸独立地选自Glu、Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、βAla、Phe、Val和Cit；芳基；和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-、二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
J为选自以下的反应基团：-NH2、N3、硫基、环辛炔、-OH、-CO2H、反式环辛烯、炔基、炔丙基、
其中R32选自Cl、Br、F、甲磺酸酯和甲苯磺酸酯，并且R33选自Cl、Br、I、F、OH、-O-N-丁二酰亚胺基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基，R34为H、Me、四嗪-H和四嗪-Me。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的糖皮质激素激动剂化合物，其具有式(III)的结构：
其中
Y选自CH2和O；
E选自CH2和O；
G选自CH和N；
L选自H和F；
R5选自-CH2OH、-SCH2F和
A1和A2独立地选自H和F；
V可选自1-8个碳的烷基链；包含1-13个单元的直链或支链聚环氧乙烷基团；包含1-8个碳的直链或支链烷基；-O-烷基；羧酸；羧酰胺；羧酸酯；烷基-C(O)O-；烷基氨基-C(O)-；二烷基氨基C(O)-；1-3个氨基酸的序列，其中每个氨基酸独立地选自Glu、Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、βAla、Phe、Val和Cit；芳基；和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-、二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
J为选自以下的反应基团：-NH2、N3、硫基、环辛炔、-OH、-CO2H、反式环辛烯、炔基、炔丙基、
其中R32选自Cl、Br、F、甲磺酸酯和甲苯磺酸酯，并且R33选自Cl、Br、I、F、OH、-O-N-丁二酰亚胺基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基，R34为H、Me、四嗪-H和四嗪-Me。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的糖皮质激素激动剂化合物，其选自：
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的糖皮质激素激动剂化合物，即，式I、II或III，其中X或Z可为螺[3.3]庚烷或[1.1.1]双环戊烷并且Y可为CH2或O。
本发明的一个具体目的是提供一种抗体药物偶联物(ADC)，所述抗体药物偶联物包含抗体或其抗原结合片段，优选为结合至由免疫细胞(优选为人类免疫细胞)表达的抗原的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原其结合片段连接到至少一种根据前述实施方案中任一者的糖皮质激素激动剂化合物。
本发明的一个具体目的是提供一种ADC，所述ADC选自：
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
优选地其中n＝2-12、2-10、2-8、2-6或2-4并且A为结合至由免疫细胞(优选为人类免疫细胞)表达的抗原的抗体，并且在一些示例性实施方案中为抗人VISTA抗体。
本发明的一个具体目的是提供一种组合物，所述组合物包含至少一种根据前述任一项的式I、II或III的糖皮质激素激动剂化合物或类固醇-接头偶联物或含有其的ADC和药学上可接受的载剂。
本发明的一个具体目的是提供如上文所阐述的组合物，所述组合物适合于向有需要的受试者体内施用。
本发明的一个具体目的是提供如上文所阐述的组合物，所述组合物包含至少一种赋形剂。
本发明的一个具体目的是提供如上文所阐述的组合物，所述组合物包含至少一种稳定剂或缓冲剂。
本发明的一个具体目的是提供如上文所阐述的组合物，所述组合物适合于肠胃外施用，任选地通过注射施用。
本发明的一个具体目的是提供如上文所阐述的组合物，所述组合物适合于注射至有需要的受试者，任选地经由静脉内、皮下、肌内、瘤内或鞘内施用。
本发明的一个具体目的是提供如上文所阐述的组合物，所述组合物可皮下、肌内或静脉内施用。
本发明的一个具体目的是提供如上文所阐述的组合物，所述组合物包含于提供皮下施用的装置中，所述装置选自由注射器、注射装置、输注泵、注射笔、无针装置、自动注射器和皮下贴剂递送系统组成的组，任选地为向患者递送固定剂量的糖皮质激素受体激动剂或含有其的ADC的装置。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的糖皮质激素激动剂化合物或类固醇-接头偶联物或ADC或含有其的组合物的用途，其用于治疗、预防或抑制有需要的受试者的炎症、过敏或自身免疫。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的式I、II或III的糖皮质激素激动剂化合物或类固醇-接头偶联物或含有其的ADC或含有其的组合物，其用于制备用以治疗、预防或抑制有需要的受试者的炎症或自身免疫或过敏反应的药剂。
本发明的一个具体目的是提供一种治疗和/或预防方法，所述方法包括向有需要的患者施用至少一种根据前述任一项的式I、II或III的糖皮质激素激动剂化合物或类固醇-接头偶联物或含有其的ADC或含有其的组合物。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其用于治疗过敏、自身免疫、移植、基因疗法、炎症、GVHD或败血症，或用以治疗或预防人类受试者中与前述疾患中的任一者相关的炎症性、自身免疫性或过敏性副作用。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其用于急性使用。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其用于慢性使用。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其用于维持疗法。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其用于治疗或预防急性或慢性炎症和与其相关的自身免疫性和炎症性适应症，其中所述疾患任选地包括获得性再生障碍性贫血+、获得性血友病+、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)+、急性出血性白质脑炎(AHLE)/赫斯特氏病(Hurst's disease)+、原发性无丙种球蛋白血症+、斑秃+、强直性脊柱炎(AS)、抗NMDA受体脑炎+、抗磷脂综合征(APS)+、动脉硬化、自闭症谱系障碍(ASD)、自身免疫性艾迪森氏病(Autoimmune Addison's disease，AAD)+、自身免疫性自主神经功能障碍/自身免疫性自主神经节病(AAG)、自身免疫性脑炎+、自身免疫性胃炎、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)+、自身免疫性肝炎(AIH)+、自身免疫性高脂血症、自身免疫性垂体炎/淋巴细胞性垂体炎+、自身免疫性内耳病(AIED)+、自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)+、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎+、自身免疫性睾丸炎+、自身免疫性胰腺炎(AIP)/免疫球蛋白G4相关疾病(IgG4-RD)+、I型、II型和III型自身免疫性多腺体综合征+、自身免疫性黄体酮皮炎+、自身免疫性突发性感觉神经性听力损失(SNHL)弛缓不能、艾迪森氏病、成人斯蒂尔病(Adult Still's disease)、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性自主神经功能障碍、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性荨麻疹、轴突与神经元神经病(AMAN)、巴洛病(disease)、白塞病(Behcet'sdisease)、良性粘膜类天疱疮、大疱性类天疱疮、卡斯特莱曼病(Castleman disease，CD)、乳糜泻、恰加斯病(Chagas disease)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、查格-史特劳斯综合征(Churg-Strauss Syndrome，CSS)或嗜酸性肉芽肿病(EGPA)、瘢痕性类天疱疮、科根氏综合征(Cogan's syndrome)、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎(Coxsackie myocarditis)、CREST综合征、1型糖尿病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克病(Devic's disease)(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德莱斯勒氏综合征(Dressler's syndrome)、子宫内膜异位症、嗜酸性食管炎(EoE)、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、原发性混合冷球蛋白血症、伊文氏综合征(Evans syndrome)、纤维肌痛、纤维化肺泡炎、纤维化肺泡炎、巨细胞心肌炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征(Goodpasture'ssyndrome)、肉芽肿性多血管炎、格雷夫斯病(Graves'disease)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、溶血性贫血、亨诺-许兰紫癜(Henoch-Schonlein purpura，HSP)、妊娠疱疹或妊娠期类天疱疮(PG)、化脓性汗腺炎(HS)(反常性痤疮)、低丙种球蛋白血症、IgA肾病、IgG4相关硬化性疾病、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、包涵体肌炎(IBM)、间质性膀胱炎(IC)、青少年关节炎、青少年糖尿病(1型糖尿病)、青少年肌炎(JM)、川崎病(Kawasaki disease)、兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eaton syndrome)、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、木样结膜炎、线状IgA疾病(LAD)、狼疮(包括肾炎和皮肤型)、慢性莱姆病(Lyme disease chronic)、梅尼埃病(Meniere's disease)、显微镜下多血管炎(MPA)、混合性结缔组织疾病(MCTD)、莫伦氏溃疡(Mooren's ulcer)、穆哈-哈伯曼病(Mucha-Habermann disease)、多灶性运动神经病(MMN)或MMNCB、多发性硬化、重症肌无力、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体紊乱、肌炎、嗜睡症、新生儿狼疮、视神经脊髓炎、嗜中性白细胞减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、视阵挛-肌阵挛综合征(OMS)、回纹型风湿病(PR)、PANDAS、副肿瘤性小脑变性(PCD)、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、帕罗综合征(Parry Romberg syndrome)、睫状体扁平部炎(外周葡萄膜炎)、帕桑-特纳综合征(Parsonage-Turner syndrome)、天疱疮、外周神经病、静脉周脑脊髓炎、恶性贫血(PA)、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I型、II型、III型多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、黄体酮皮炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、纯红细胞再生障碍性贫血(PRCA)、坏疽性脓皮病、雷诺氏现象(Raynaud's phenomenon)、反应性关节炎、反射性交感神经营养不良、复发性多软骨炎、不宁腿综合征(RLS)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、类肉瘤病、施密特综合征(Schmidt syndrome)、巩膜炎、硬皮病、休格伦氏综合征(/>syndrome)、精子与睾丸自身免疫、僵人综合征(SPS)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克氏综合征(Susac's syndrome)、交感性眼炎(SO)、高安氏动脉炎(Takayasu's arteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、甲状腺眼病(TED)、托洛萨-亨特综合征(Tolosa-Hunt syndrome，THS)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、未分化结缔组织疾病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、伏格特-小柳-原田病(Vogt-Koyanagi-Harada Disease)和其他。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其用于治疗或预防急性或慢性炎症和与其相关的自身免疫性和炎症性和过敏性适应症或副作用，其中疾患任选地包括严重哮喘、巨细胞动脉炎、ANKA血管炎和IBD(结肠炎和克罗恩病(Crohns))。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其用于治疗或预防选自以下的疾患：类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、成人克罗恩病、小儿克罗恩病、溃疡性结肠炎、斑块状牛皮癣、化脓性汗腺炎、葡萄膜炎、白塞病、脊柱关节病或牛皮癣。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其用于治疗或预防包括以下一者或多者的患者：
(i)慢性、急性、阵发性过敏性、炎症性或炎症性疾患，例如慢性、急性、阵发性和/或缓解/复发性疾患；
(ii)主要仅用高剂量的类固醇可有效治疗的疾患，任选地为哮喘、COPD、风湿性多肌痛和/或巨细胞动脉炎，所述患者任选地已接受治疗或正经历高类固醇剂量的治疗；
(iii)伴有限制类固醇使用的合并症的疾患，任选地为糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、病态肥胖、无血管性坏死/骨坏死(AVN)、青光眼、类固醇诱发的高血压、严重皮肤脆弱和/或骨关节炎；
(iv)其中安全的长期治疗剂可用，但其中需要用高剂量的类固醇诱导数月的疾患，任选地为AAV、多肌炎、皮肌炎、狼疮、炎症性肺病、自身免疫性肝炎、炎症性肠病、免疫性血小板减少症、自身免疫性溶血性贫血、痛风患者，其中在治疗上需要用高剂量的类固醇诱导数月；
(v)需要短期/长期治疗，任选地需要不确定的治疗或持续时间和/或不存在类固醇施用的有效替代方案的皮肤疾患，任选地为史蒂文斯-约翰逊病(Stevens Johnson)、其他严重药疹疾患、涉及广泛接触性皮炎的疾患、其他严重免疫相关皮肤病疾患，例如PG、LCV、红皮病等；
(vi)用高剂量的皮质类固醇治疗突发/复发的疾患，任选地为COPD、哮喘、狼疮、痛风、假痛风；
(vii)免疫相关的神经疾病，例如小纤维神经病、MS(亚组)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、重症肌无力等；
(viii)血液/肿瘤适应症，任选地其中高剂量的类固醇将潜在地在治疗上有需要或有益；
(ix)眼科疾患，任选地为葡萄膜炎、虹膜炎、巩膜炎等；
(x)与永久或极长期肾上腺机能不足或继发性肾上腺机能不足相关的疾患，任选地为医源性艾迪森危象(latrogenic Addisonian crisis)；
(xi)常用长期、低剂量类固醇治疗的疾患，任选地为狼疮、RA、psA、血管炎等；或
(xii)前述任一项的任何组合。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其用于治疗或预防在类固醇治疗中有毒性风险的特殊类别的患者中的患者，例如怀孕/哺乳妇女、儿科患者，任选地为患有生长障碍或白内障的那些患者，其中患者正用另一种活性剂进一步治疗。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中患者正用免疫调节性抗体或融合蛋白进一步治疗，所述免疫调节性抗体或融合蛋白任选地选自靶向CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA中的一者或多者的免疫抑制性抗体或融合蛋白和/或靶向CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS中的一者或多者的激动性抗体或融合蛋白。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含特异性结合至人类T细胞活化V-结构域Ig抑制因子(人类VISTA)(“A”)的抗原结合区，其中当向有需要的受试者施用时，ADC优先递送至表达VISTA的免疫细胞，任选地为单核细胞、骨髓细胞、T细胞、Treg、NK细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、NK细胞和内皮细胞中的一者或多者，并且引起抗炎剂功能性内化至所述免疫细胞中的一者或多者中。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含在生理pH(约7.5)下优先结合至VISTA表达细胞的抗人VISTA抗体或抗体片段；所述ADC在人类VISTA敲入啮齿动物中任选地具有至多70小时的pK。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，所述ADC在食蟹猴或人类中在生理pH下具有至多3.5±0.5天，更典型地至多48小时、至多36小时、至多24小时或至多18小时或至多12小时的pK。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，所述ADC在食蟹猴或人类中在生理pH下具有至多2.8或2.3或1.5天或1天或12小时或8小时±0.5天的pK。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，所述ADC在人类VISTA啮齿动物中在生理pH下具有至多6-12小时的pK。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，所述ADC包含接头，在ADC内化至表达VISTA的免疫细胞(任选地为活化或非活化T细胞、CD4或CD8 T细胞、Treg、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、骨髓细胞、树突状细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和内皮细胞中的一者或多者)中之后，所述接头裂解，从而在免疫细胞中释放治疗有效量的抗炎剂(糖皮质激素激动剂)，其中所述抗炎剂引发抗炎活性。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗VISTA抗体或抗原结合片段在灵长类动物(任选地为食蟹猴)中在生理pH(约pH 7.5)下具有约2.3天的体内血清半衰期。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中抗VISTA抗体或抗原结合片段在人类VISTA敲入啮齿动物中在生理pH(约pH 7.5)下在血清中具有不超过70小时、不超过60小时、不超过50小时、不超过40小时、不超过30小时、不超过24小时、不超过22-24小时、不超过20-22小时、不超过18-20小时、不超过16-18小时、不超过14-16小时、不超过12-14小时、不超过10-12小时、不超过8-10小时、不超过6-8小时、不超过4-6小时、不超过2-4小时、不超过1-2小时、不超过0.5至1.0小时或不超过0.1-0.5小时的体内血清半衰期。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中在人类VISTA敲入啮齿动物或人类或非人类灵长类动物(任选地为食蟹猴)中当在体内使用时ADC的PD/PK比率为至少2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或更高。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中在啮齿动物或人类或非人类灵长类动物(任选地为食蟹猴)中的任一者中ADC的PD为至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天、2-4周、1个月或更长时间。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含特异性地结合至人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述抗体包含具有受损FcR结合或完整FcR结合的Fc区。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含靶向人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含具有受损FcR结合或完整FcR结合的人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含特异性地结合至人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含具有受损FcR结合的人类IgG1 Fc区。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含特异性地结合至人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含人类或非人类灵长类动物恒定区或Fc区，所述区经修饰以削弱或消除与至少2个原生人类Fcγ受体的结合。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含特异性地结合至人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含人类或非人类灵长类动物恒定区或Fc区，所述区经修饰以削弱或消除与以下FcR中的任一者、两者、三者、四者或全部五者的结合：hFcγRI(CD64)、FcyRIIA或hFcyRIIB(CD32或CD32A)和FcγRlllA(CD16A)或FcγRlllB(CD16B)。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含特异性地结合至人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含人类IgG2κ主链，任选地在Fc区中具有V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S静默突变。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含特异性地结合至人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含人类IgG1/κ主链，所述主链在Fc区中具有L234A/L235A静默突变并且任选地具有削弱补体(C1Q)结合的突变。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含特异性地结合至人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含人类IgG1/κ主链，任选地在Fc区中具有L234A/L235A静默突变以及E269R和E233A突变。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含特异性地结合至人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗人VISTA抗体或抗体片段，其中抗体或抗原结合片段与免疫细胞的结合不直接激动或拮抗所述免疫细胞表达抗原介导的免疫作用，例如VISTA介导的免疫作用。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含特异性地结合至人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含其中内源FcR结合未受损的人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含特异性地结合至人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含原生(未修饰)的人类IgG2 Fc区。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含特异性地结合至人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含在24℃或37℃下通过表面等离子体共振(SPR)确定的在0.0001nM至10.0nM、0.001至1.0nM或0.01至0.7或更小的范围内的KD。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含特异性地结合至人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含在24℃或37℃下通过表面等离子体共振(SPR)确定的0.13至0.64nM的KD。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC任选地包含特异性地结合至人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗人VISTA抗体或抗体片段，其中药物抗体比率在约1:1-12:1的范围内。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC任选地包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中药物抗体比率在约2-12:1、2-8:1、4-8:1或6-8:1的范围内。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含特异性地结合至人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗人VISTA抗体或抗体片段，其中药物抗体比率为约8:1(n＝8)或约4:1(n＝4)。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含特异性地结合至人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段内化单核细胞、骨髓细胞、T细胞、Treg、巨噬细胞和嗜中性粒细胞中的一者或多者。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含特异性地结合至人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段不会明显内化B细胞。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含特异性地结合至人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗人VISTA抗体或抗体片段，当向有需要的受试者施用时，所述ADC与以裸(非偶联)形式施用的相同剂量的抗炎剂相比促进抗炎剂的功效和/或减少与抗炎剂相关的不良副作用(例如毒性)。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC任选地包含特异性地结合至人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗人VISTA抗体或抗体片段，其中糖皮质激素任选地经由链间二硫键偶联至抗体或抗原结合片段。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含特异性地结合至人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含酯酶敏感性接头。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含特异性地结合至人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗人VISTA抗体或抗体片段，其中可裂解接头易发生酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解中的一者或多者。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含特异性地结合至人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗人VISTA抗体或抗体片段，其中ADC中包含的抗VISTA抗原结合片段包含Fab、F(ab')2或scFv抗体片段。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所含的抗VISTA抗体或抗体片段为包含与具有图8、图10或图12中的序列的抗体相同的CDR的抗体或任选地选自以下的抗体：
(i)包含SEQ ID NO:100、101和102的VH CDR和SEQ ID NO:103、104和105的VL CDR；
(ii)包含SEQ ID NO:110、111和112的VH CDR和SEQ ID NO:113、114和115的VLCDR；
(iii)包含SEQ ID NO:120、121和122的VH CDR和SEQ ID NO:123、124和125的VLCDR；
(iv)包含SEQ ID NO:130、131和132的VH CDR和SEQ ID NO:133、134和135的VLCDR；
(v)包含SEQ ID NO:140、141和142的VH CDR和SEQ ID NO:143、144和145的VL CDR；
(vi)包含SEQ ID NO:150、151和152的VH CDR和SEQ ID NO:153、154和155的VLCDR；
(vii)包含SEQ ID NO:160、161和162的VH CDR和SEQ ID NO:163、164和165的VLCDR；
(viii)包含SEQ ID NO:170、171和172的VH CDR和SEQ ID NO:173、174和175的VLCDR；
(ix)包含SEQ ID NO:180、181和182的VH CDR和SEQ ID NO:183、184和185的VLCDR；
(x)包含SEQ ID NO:190、191和192的VH CDR和SEQ ID NO:193、194和195的VL CDR；
(xi)包含SEQ ID NO:200、201和202的VH CDR和SEQ ID NO:203、204和205的VLCDR；
(xii)包含SEQ ID NO:210、211和212的VH CDR和SEQ ID NO:213、214和215的VLCDR；
(xiii)包含SEQ ID NO:220、221和222的VH CDR和SEQ ID NO:223、224和225的VLCDR；
(xiv)包含SEQ ID NO:230、231和232的VH CDR和SEQ ID NO:233、234和235的VLCDR；
(xv)包含SEQ ID NO:240、241和242的VH CDR和SEQ ID NO:243、244和245的VLCDR；
(xvi)包含SEQ ID NO:250、251和252的VH CDR和SEQ ID NO:253、254和255的VLCDR；
(xvii)包含SEQ ID NO:260、261和262的VH CDR和SEQ ID NO:263、264和265的VLCDR；
(xviii)包含SEQ ID NO:270、271和272的VH CDR和SEQ ID NO:273、274和275的VLCDR；
(xix)包含SEQ ID NO:280、281和282的VH CDR和SEQ ID NO:283、284和285的VLCDR；
(xx)包含SEQ ID NO:290、291和292的VH CDR和SEQ ID NO:293、294和295的VLCDR；
(xxi)包含SEQ ID NO:300、301和302的VH CDR和SEQ ID NO:303、304和305的VLCDR；
(xxii)包含SEQ ID NO:310、311和312的VH CDR和SEQ ID NO:313、314和315的VLCDR；
(xxiii)包含SEQ ID NO:320、321和322的VH CDR和SEQ ID NO:323、324和325的VLCDR；
(xxiv)包含SEQ ID NO:330、331和332的VH CDR和SEQ ID NO:333、334和335的VLCDR；
(xxv)包含SEQ ID NO:340、341和342的VH CDR和SEQ ID NO:343、344和345的VLCDR；
(xxvi)包含SEQ ID NO:350、351和352的VH CDR和SEQ ID NO:353、354和355的VLCDR；
(xxvii)包含SEQ ID NO:360、361和362的VH CDR和SEQ ID NO:363、364和365的VLCDR；
(xxviii)包含SEQ ID NO:370、371和372的VH CDR和SEQ ID NO:373、374和375的VLCDR；
(xxix)包含SEQ ID NO:380、381和382的VH CDR和SEQ ID NO:383、384和385的VLCDR；
(xxx)包含SEQ ID NO:390、391和392的VH CDR和SEQ ID NO:393、394和395的VLCDR；
(xxxi)包含SEQ ID NO:400、401和402的VH CDR和SEQ ID NO:403、404和405的VLCDR；
(xxxii)包含SEQ ID NO:410、411和412的VH CDR和SEQ ID NO:413、414和415的VLCDR；
(xxxiii)包含SEQ ID NO:420、421和422的VH CDR和SEQ ID NO:423、424和425的VLCDR；
(xxxiv)包含SEQ ID NO:430、431和432的VH CDR和SEQ ID NO:433、434和435的VLCDR；
(xxxv)包含SEQ ID NO:440、441和442的VH CDR和SEQ ID NO:443、444和445的VLCDR；
(xxxvi)包含SEQ ID NO:450、451和452的VH CDR和SEQ ID NO:453、454和455的VLCDR；
(xxxvii)包含SEQ ID NO:460、461和462的VH CDR和SEQ ID NO:463、464和465的VLCDR；
(xxxviii)包含SEQ ID NO:470、471和472的VH CDR和SEQ ID NO:473、474和475的VL CDR；
(xxxix)包含SEQ ID NO:480、481和482的VH CDR和SEQ ID NO:483、484和485的VLCDR；
(xl)包含SEQ ID NO:490、491和492的VH CDR和SEQ ID NO:493、494和495的VLCDR多肽；
(xli)包含SEQ ID NO:500、501和502的VH CDR和SEQ ID NO:503、504和505的VLCDR多肽；
(xlii)包含SEQ ID NO:510、511和512的VH CDR和SEQ ID NO:513、514和515的VLCDR多肽；
(xliii)包含SEQ ID NO:520、521和522的VH CDR和SEQ ID NO:523、524和525的VLCDR多肽；
(xliv)包含SEQ ID NO:530、531和532的VH CDR和SEQ ID NO:533、534和535的VLCDR多肽；
(xlv)包含SEQ ID NO:540、541和542的VH CDR和SEQ ID NO:543、544和545的VLCDR多肽；
(xlvi)包含SEQ ID NO:550、551和552的VH CDR和SEQ ID NO:553、554和555的VLCDR多肽；
(xlvii)包含SEQ ID NO:560、561和562的VH CDR和SEQ ID NO:563、564和565的VLCDR；
(xlviii)包含SEQ ID NO:570、571和572的VH CDR和SEQ ID NO:573、574和575的VLCDR；
(xlix)包含SEQ ID NO:580、581和582的VH CDR和SEQ ID NO:583、584和585的VLCDR；
(l)包含SEQ ID NO:590、591和592的VH CDR和SEQ ID NO:593、594和595的VL CDR；
(li)包含SEQ ID NO:600、601和602的VH CDR和SEQ ID NO:603、604和605的VLCDR；
(lii)包含SEQ ID NO:610、611和612的VH CDR和SEQ ID NO:613、614和615的VLCDR；
(liii)包含SEQ ID NO:620、621和622的VH CDR和SEQ ID NO:623、624和625的VLCDR；
(liv)包含SEQ ID NO:630、631和632的VH CDR和SEQ ID NO:633、634和635的VLCDR；
(lv)包含SEQ ID NO:640、641和642的VH CDR和SEQ ID NO:643、644和645的VLCDR；
(lvi)包含SEQ ID NO:650、651和652的VH CDR和SEQ ID NO:653、654和655的VLCDR；
(lvii)包含SEQ ID NO:660、661和662的VH CDR和SEQ ID NO:663、664和665的VLCDR；
(lviii)包含SEQ ID NO:670、671和672的VH CDR和SEQ ID NO:673、674和675的VLCDR；
(lix)包含SEQ ID NO:680、681和682的VH CDR和SEQ ID NO:683、684和685的VLCDR；
(lx)包含SEQ ID NO:690、691和692的VH CDR和SEQ ID NO:693、694和695的VLCDR；
(lxi)包含SEQ ID NO:700、701和702的VH CDR和SEQ ID NO:703、704和705的VLCDR；
(lxii)包含SEQ ID NO:710、711和712的VH CDR和SEQ ID NO:713、714和715的VLCDR；
(lxiii)包含SEQ ID NO:720、721和722的VH CDR和SEQ ID NO:723、724和725的VLCDR；
(lxiv)包含SEQ ID NO:730、731和732的VH CDR和SEQ ID NO:733、734和735的VLCDR；
(lxv)包含SEQ ID NO:740、741和742的VH CDR和SEQ ID NO:743、744和745的VLCDR；
(lxvi)包含SEQ ID NO:750、751和752的VH CDR和SEQ ID NO:753、754和755的VLCDR；
(lxvii)包含SEQ ID NO:760、761和762的VH CDR和SEQ ID NO:763、764和765的VLCDR；
(lxviii)包含SEQ ID NO:770、771和772的VH CDR和SEQ ID NO:773、774和775的VLCDR；
(lxix)包含SEQ ID NO:780、781和782的VH CDR和SEQ ID NO:783、784和785的VLCDR；
(lxx)包含SEQ ID NO:790、791和792的VH CDR和SEQ ID NO:793、794和795的VLCDR；
(lxxi)包含SEQ ID NO:800、801和802的VH CDR和SEQ ID NO:803、804和805的VLCDR；
(lxxii)包含SEQ ID NO:810、811和812的VH CDR和SEQ ID NO:813、814和815的VLCDR。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的抗体药物偶联物(ADC)，其中ADC包含抗VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含与VSTB92、VSTB56、VSTB95、VSTB103和VSTB66中的任一者相同的CDR。
本发明的一个具体目的是前述任一项的抗体药物偶联物(ADC)，其中ADC包含抗VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含分别与包含以下VH多肽和VL多肽的抗体的那些具有至少90％、95％或100％序列同一性的VH多肽和VL多肽并且进一步其中CDR未经修饰：
(i)包含SEQ ID NO:106同一性的VH多肽和SEQ ID NO:108的VL多肽的抗体；
(ii)包含SEQ ID NO:116的VH多肽和SEQ ID NO:118的VL多肽的抗体；
(iii)包含SEQ ID NO:126的VH多肽和SEQ ID NO:128的VL多肽的抗体；
(iv)包含SEQ ID NO:136的VH多肽和SEQ ID NO:138的VL多肽的抗体；
(v)包含SEQ ID NO:146的VH多肽和SEQ ID NO:148的VL多肽的抗体；
(vi)包含SEQ ID NO:156的VH多肽和SEQ ID NO:158的VL多肽的抗体；
(vii)包含SEQ ID NO:166的VH多肽和SEQ ID NO:168的VL多肽的抗体；
(viii)包含SEQ ID NO:176的VH多肽和SEQ ID NO:178的VL多肽的抗体；
(ix)包含SEQ ID NO:186的VH多肽和SEQ ID NO:188的VL多肽的抗体；
(x)包含SEQ ID NO:196的VH多肽和SEQ ID NO:198的VL多肽的抗体；
(xi)包含SEQ ID NO:206的VH多肽和SEQ ID NO:208的VL多肽的抗体；
(xii)包含SEQ ID NO:216的VH多肽和SEQ ID NO:218的VL多肽的抗体；
(xiii)包含SEQ ID NO:226的VH多肽和SEQ ID NO:228的VL多肽的抗体；
(xiv)包含SEQ ID NO:236的VH多肽和SEQ ID NO:238的VL多肽的抗体；
(xv)包含SEQ ID NO:246的VH多肽和SEQ ID NO:248的VL多肽的抗体；
(xvi)包含SEQ ID NO:256的VH多肽和SEQ ID NO:258的VL多肽的抗体；
(xvii)包含SEQ ID NO:266的VH多肽和SEQ ID NO:268的VL多肽的抗体；
(xviii)包含SEQ ID NO:276的VH多肽和SEQ ID NO:278的VL多肽的抗体；
(xix)包含SEQ ID NO:286的VH多肽和SEQ ID NO:288的VL多肽的抗体；
(xx)包含SEQ ID NO:296的VH多肽和SEQ ID NO:298的VL多肽的抗体；
(xxi)包含SEQ ID NO:306的VH多肽和SEQ ID NO:308的VL多肽的抗体；
(xxii)包含SEQ ID NO:316的VH多肽和SEQ ID NO:318的VL多肽的抗体；
(xxiii)包含SEQ ID NO:326的VH多肽和SEQ ID NO:328的VL多肽的抗体；
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(xxv)包含SEQ ID NO:346的VH多肽和SEQ ID NO:348的VL多肽的抗体；
(xxvi)包含SEQ ID NO:356的VH多肽和SEQ ID NO:358的VL多肽的抗体；
(xxvii)包含SEQ ID NO:366的VH多肽和SEQ ID NO:368的VL多肽的抗体；
(xxviii)包含SEQ ID NO:376的VH多肽和SEQ ID NO:378的VL多肽的抗体；
(xxix)包含SEQ ID NO:386的VH多肽和SEQ ID NO:388的VL多肽的抗体；
(xxx)包含SEQ ID NO:396的VH多肽和SEQ ID NO:398的VL多肽的抗体；
(xxxi)包含SEQ ID NO:406的VH多肽和SEQ ID NO:408的VL多肽的抗体；
(xxxii)包含SEQ ID NO:416的VH多肽和SEQ ID NO:418的VL多肽的抗体；
(xxxiii)包含SEQ ID NO:426的VH多肽和SEQ ID NO:428的VL多肽的抗体；
(xxxiv)包含SEQ ID NO:436的VH多肽和SEQ ID NO:438的VL多肽的抗体；
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(xxxvi)包含SEQ ID NO:456的VH多肽和SEQ ID NO:458的VL多肽的抗体；
(xxxvii)包含SEQ ID NO:466的VH多肽和SEQ ID NO:468的VL多肽的抗体；
(xxxviii)包含SEQ ID NO:476的VH多肽和SEQ ID NO:478的VL多肽的抗体；
(xxxix)包含SEQ ID NO:486的VH多肽和SEQ ID NO:488的VL多肽的抗体；
(xl)包含SEQ ID NO:496的VH多肽和SEQ ID NO:498的VL多肽的抗体；
(xli)包含SEQ ID NO:506的VH多肽和SEQ ID NO:508的VL多肽的抗体；
(xlii)包含SEQ ID NO:516的VH多肽和SEQ ID NO:518的VL多肽的抗体；
(xliii)包含SEQ ID NO:526的VH多肽和SEQ ID NO:528的VL多肽的抗体；
(xliv)包含SEQ ID NO:536的VH多肽和SEQ ID NO:533、534和535的VL多肽的抗体；
(xlv)包含SEQ ID NO:546的VH多肽和SEQ ID NO:548的VL多肽的抗体；
(xlvi)包含SEQ ID NO:556的VH多肽和SEQ ID NO:558的VL多肽的抗体；
(xlvii)包含SEQ ID NO:566的VH多肽和SEQ ID NO:568的VL多肽的抗体；
(xlviii)包含SEQ ID NO:576的VH多肽和SEQ ID NO:578的VL多肽的抗体；
(xlix)包含SEQ ID NO:586的VH多肽和SEQ ID NO:588的VL多肽的抗体；
(l)包含SEQ ID NO:596的VH多肽和SEQ ID NO:598的VL多肽的抗体；
(li)包含SEQ ID NO:606的VH多肽和SEQ ID NO:608的VL多肽的抗体；
(lii)包含SEQ ID NO:616的VH多肽和SEQ ID NO:618的VL多肽的抗体；
(liii)包含SEQ ID NO:626的VH多肽和SEQ ID NO:628的VL多肽的抗体；
(liv)包含SEQ ID NO:636的VH多肽和SEQ ID NO:638的VL多肽的抗体；
(lv)包含SEQ ID NO:646的VH多肽和SEQ ID NO:648的VL多肽的抗体；
(lvi)包含SEQ ID NO:656的VH多肽和SEQ ID NO:658的VL多肽的抗体；
(lvii)包含SEQ ID NO:666的VH多肽和SEQ ID NO:668的VL多肽的抗体；
(lviii)包含SEQ ID NO:676的VH多肽和SEQ ID NO:678的VL多肽的抗体；
(lix)包含SEQ ID NO:686的VH多肽和SEQ ID NO:688的VL多肽的抗体；
(lx)包含SEQ ID NO:696的VH多肽和SEQ ID NO:698的VL多肽的抗体；
(lxi)包含SEQ ID NO:706的VH多肽和SEQ ID NO:708的VL多肽的抗体；
(lxii)包含SEQ ID NO:716的VH多肽和SEQ ID NO:718的VL多肽的抗体；
(lxiii)包含SEQ ID NO:726的VH多肽和SEQ ID NO:728的VL多肽的抗体；
(lxiv)包含SEQ ID NO:736的VH多肽和SEQ ID NO:738的VL多肽的抗体；
(lxv)包含SEQ ID NO:746的VH多肽和SEQ ID NO:748的VL多肽的抗体；
(lxvi)包含SEQ ID NO:756的VH多肽和SEQ ID NO:758的VL多肽的抗体；
(lxvii)包含SEQ ID NO:766的VH多肽和SEQ ID NO:768的VL多肽的抗体；
(lxviii)包含SEQ ID NO:776的VH多肽和SEQ ID NO:778的VL多肽的抗体；
(lxix)包含SEQ ID NO:786的VH多肽和SEQ ID NO:788的VL多肽的抗体；
(lxx)包含SEQ ID NO:796的VH多肽和SEQ ID NO:798的VL多肽的抗体；
(lxxi)包含SEQ ID NO:806的VH多肽和SEQ ID NO:808的VL多肽的抗体；和
(lxxii)包含SEQ ID NO:816的VH多肽和SEQ ID NO:818的VL多肽的抗体。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中抗VISTA抗体或抗体片段包含与VSTB92、VSTB56、VSTB95、VSTB103和VSTB66中的一者相同的可变区。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，任选地具有图8、图10或图12中的一者的CDR或可变序列，其中抗VISTA抗体或抗体片段包含在Fc区中具有V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S静默突变的人类IgG2κ主链。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的用途、药剂、组合物或方法，其中ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，任选地具有图8、图10或图12中的一者的CDR或可变序列，其中抗VISTA抗体或抗体片段包含人类IgG1/κ主链，所述主链在Fc区中具有L234A/L235A静默突变。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的ADC，其中糖皮质激素激动剂或接头偶联物经由其链间二硫键偶联至特异性地结合至人类免疫细胞表达抗原的抗体或抗体片段，例如抗VISTA抗体或抗原结合片段。
本发明的一个具体目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的至少一种根据前述任一项的抗体药物偶联物(ADC)或类固醇激动剂或类固醇-接头和药学上可接受的载剂。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的组合物，所述组合物可经由注射途径施用，任选地为静脉内、肌内、鞘内或皮下施用。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的组合物，所述组合物可皮下施用。
本发明的一个具体目的是提供一种装置，所述装置包含根据前述任一项的糖皮质激素激动剂、接头偶联物、ADC、组合物或药剂并且提供皮下施用，其选自由注射器、注射装置、输注泵、注射笔、无针装置、自动注射器和皮下贴剂递送系统组成的组。
本发明的一个具体目的是提供如上文所阐述的装置，所述装置向患者递送固定剂量的糖皮质激素受体激动剂或其功能衍生物，任选地进一步包括告知患者如何施用其中包含的ADC组合物和给药方案的说明书。
本发明的一个具体目的是提供一种治疗和/或预防方法，所述方法包括向有需要的患者施用至少一种根据前述任一项的抗体药物偶联物(ADC)或类固醇或组合物，其中所述组合物可在根据前述任一项的装置中。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的治疗和/或预防方法，所述方法用于治疗过敏、自身免疫、移植、基因疗法、炎症、GVHD或败血症，或用以治疗或预防人类受试者中与前述疾患中的任一者相关的炎症性、自身免疫性或过敏性副作用，任选地其中炎症与癌症或感染(任选地为病毒或细菌感染)相关。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的治疗和/或预防方法，其中患者包含选自以下的疾患：类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、成人克罗恩病、小儿克罗恩病、溃疡性结肠炎、斑块状牛皮癣、化脓性汗腺炎、葡萄膜炎、白塞病、脊柱关节病或牛皮癣。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的治疗和/或预防方法，其中患者包括以下一者或多者：
(i)慢性、急性、阵发性过敏性、炎症性或炎症性疾患，例如慢性、急性、阵发性、缓解/复发性；
(ii)主要仅用高剂量的类固醇可有效治疗的疾患，任选地为风湿性多肌痛和/或巨细胞动脉炎，所述患者任选地已接受治疗或正经历高类固醇剂量的治疗；
(iii)伴有限制类固醇使用的合并症的疾患，任选地为糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、病态肥胖、无血管性坏死/骨坏死(AVN)、青光眼、类固醇诱发的高血压、严重皮肤脆弱和/或骨关节炎；
(iv)其中安全的长期治疗剂可用，但其中需要用高剂量的类固醇诱导数月的疾患，任选地为AAV、多肌炎、皮肌炎、狼疮、炎症性肺病、自身免疫性肝炎、炎症性肠病、免疫性血小板减少症、自身免疫性溶血性贫血、痛风患者，其中在治疗上需要用高剂量的类固醇诱导数月；
(v)需要短期/长期治疗，任选地需要不确定的治疗或持续时间和/或不存在类固醇施用的有效替代方案的皮肤疾患，任选地为史蒂文斯-约翰逊病、其他严重药疹疾患、涉及广泛接触性皮炎的疾患、其他严重免疫相关皮肤病疾患如PG、LCV、红皮病等；
(vi)用高剂量的皮质类固醇治疗突发/复发的疾患，任选地为COPD、哮喘、狼疮、痛风、假痛风；
(vii)免疫相关的神经疾病，例如小纤维神经病、MS(亚组)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、重症肌无力等；
(viii)血液/肿瘤适应症，任选地其中高剂量的类固醇将潜在地在治疗上有需要或有益；
(ix)眼科疾患，任选地为葡萄膜炎、虹膜炎、巩膜炎等；
(x)与永久或极长期肾上腺机能不足或继发性肾上腺机能不足相关的疾患，任选地为医源性艾迪森危象；
(xi)常用长期、低剂量类固醇治疗的疾患，任选地为狼疮、RA、psA、血管炎等；
(xii)特殊类别的患者，例如怀孕/哺乳妇女、儿科患者，任选地为患有生长障碍或白内障的那些患者，或前述的任何组合。
本发明的一个目的是提供根据前述任一项的方法、药剂或用途，其中患者正用另一种活性剂进一步治疗。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的治疗和/或预防方法，其中患者正用免疫调节性抗体或融合蛋白进一步治疗，所述免疫调节性抗体或融合蛋白任选地选自靶向CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA中的一者或多者的免疫抑制性抗体或融合蛋白和/或靶向CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS中的一者或多者的激动性抗体或融合蛋白。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的ADC或类固醇的离体用途，其中使来自患者或供体的免疫细胞与根据前述任一项的ADC或类固醇接触，接着输注至有需要的患者，例如患有先前鉴定的疾患中的一者或多者的患者。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的ADC，其中接头为带正电荷、负电荷或中性电荷的可裂解肽，任选地为酯酶可裂解的。
本发明的一个具体目的是提供前述任一项的ADC，其中药物抗体比率在约1:1-12:1或1:1-10:1的范围内。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的ADC，其中药物抗体比率在约2-8:1、4-8:1或6-8:1的范围内。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的ADC，其中药物抗体比率为约8:1(n＝8)或4:1(n＝4)。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的ADC，所述ADC内化活化或非活化的单核细胞、骨髓细胞、B细胞、NK细胞、T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、Treg、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞以及其他免疫细胞类型中的一者或多者。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的ADC，所述ADC不会明显内化活化或非活化的B细胞。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的ADC，当向有需要的受试者施用时，所述ADC与以裸(非偶联)形式施用的相同剂量的抗炎剂相比促进糖皮质激素受体激动剂的功效和/或减少与糖皮质激素受体激动剂相关的不良副作用。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的ADC，其中糖皮质激素受体激动剂经由链间二硫键偶联至抗体或抗原结合片段。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的ADC，所述ADC包含酯酶敏感性接头。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的ADC，所述ADC包含可裂解接头，所述可裂解接头易发生酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解中的一者或多者。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的ADC，所述ADC包含不可裂解接头，所述不可裂解接头基本上对酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解中的一者或多者具有抗性。
本发明的一个具体目的是提供根据前述任一项的ADC，其中ADC中包含的抗VISTA抗原结合片段包含Fab、F(ab')2或scFv抗体片段。
本发明的一个具体目的是提供一种治疗和/或预防方法，所述方法包括向有需要的患者施用至少一种抗体药物偶联物(ADC)或组合物，其中所述组合物可在根据前述任一项的装置中。
本发明的一个具体目的是提供一种治疗和/或预防方法，所述方法包括向有需要的患者施用至少一种抗体药物偶联物(ADC)或组合物，其中所述组合物可在根据前述任一项的装置中，用于治疗过敏、自身免疫、移植、基因疗法、炎症、GVHD或败血症，或用以治疗或预防人类受试者中与前述疾患中的任一者相关的炎症性、自身免疫性或过敏性副作用。
本发明的一个具体目的是提供一种治疗和/或预防方法，所述方法包括向有需要的患者施用至少一种抗体药物偶联物(ADC)或组合物，其中所述组合物可在根据前述任一项的装置中，用于治疗包含选自以下的疾患的患者：类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、成人克罗恩病、小儿克罗恩病、溃疡性结肠炎、斑块状牛皮癣、化脓性汗腺炎、葡萄膜炎、白塞病、脊柱关节病或牛皮癣。
本发明的一个具体目的是提供一种治疗和/或预防方法，所述方法包括向有需要的患者施用至少一种抗体药物偶联物(ADC)或组合物，其中所述组合物可在根据前述任一项的装置中，用于治疗包括以下一者或多者的患者：
(i)主要仅用高剂量的类固醇可有效治疗的疾患，任选地为风湿性多肌痛和/或巨细胞动脉炎，所述患者任选地已接受治疗或正经历高类固醇剂量的治疗；
(ii)伴有限制类固醇使用的合并症的疾患，任选地为糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、病态肥胖、无血管性坏死/骨坏死(AVN)、青光眼、类固醇诱发的高血压、严重皮肤脆弱和/或骨关节炎；
(iii)其中安全的长期治疗剂可用，但其中需要用高剂量的类固醇诱导数月的疾患，任选地为AAV、多肌炎、皮肌炎、狼疮、炎症性肺病、自身免疫性肝炎、炎症性肠病、免疫性血小板减少症、自身免疫性溶血性贫血、痛风患者，其中在治疗上需要用高剂量的类固醇诱导数月；
(iv)需要短期/长期治疗，任选地需要不确定的治疗或持续时间和/或不存在类固醇施用的有效替代方案的皮肤疾患，任选地为史蒂文斯-约翰逊病、其他严重药疹疾患、涉及广泛接触性皮炎的疾患、其他严重免疫相关皮肤病疾患如PG、LCV、红皮病等；
(v)用高剂量的皮质类固醇治疗突发/复发的疾患，任选地为COPD、哮喘、狼疮、痛风、假痛风；
(vi)免疫相关的神经疾病，例如小纤维神经病、MS(亚组)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、重症肌无力等；
(vii)血液/肿瘤适应症，任选地其中高剂量的类固醇将潜在地在治疗上有需要或有益；
(viii)眼科疾患，任选地为葡萄膜炎、虹膜炎、巩膜炎等；
(ix)与永久或极长期肾上腺机能不足或继发性肾上腺机能不足相关的疾患，任选地为医源性艾迪森危象；
(x)常用长期、低剂量类固醇治疗的疾患，任选地为狼疮、RA、psA、血管炎等；和
(xi)特殊类别的患者，例如怀孕/哺乳妇女、儿科患者，任选地为患有生长障碍或白内障的那些患者。
本发明的一个具体目的是提供一种治疗和/或预防方法，所述方法包括向有需要的患者施用至少一种抗体药物偶联物(ADC)或组合物，其中所述组合物可在根据前述任一项的装置中，用于治疗正用另一种活性剂进一步治疗的患者。
本发明的一个具体目的是提供一种治疗和/或预防方法，所述方法包括向有需要的患者施用至少一种抗体药物偶联物(ADC)或组合物，其中所述组合物可在根据前述任一项的装置中，用于治疗正用免疫调节性抗体或融合蛋白进一步治疗的患者，所述免疫调节性抗体或融合蛋白任选地选自靶向CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA中的一者或多者的免疫抑制性抗体或融合蛋白和/或靶向CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS中的一者或多者的激动性抗体或融合蛋白。
本发明的一个具体目的是提供一种治疗和/或预防方法，所述方法包括向有需要的患者施用至少一种抗体药物偶联物(ADC)或组合物，其中所述组合物可在根据前述任一项的装置中，用于治疗或预防急性或慢性炎症和与其相关的自身免疫性和炎症性适应症，其中疾患任选地包括严重哮喘、巨细胞动脉炎、ANKA血管炎和IBD(结肠炎和克罗恩病)。
本发明的一个具体目的是提供一种治疗和/或预防方法，所述方法包括向有需要的患者施用至少一种抗体药物偶联物(ADC)或组合物，其中所述组合物可在根据前述任一项的装置中，用于治疗或预防选自以下的疾患：类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、成人克罗恩病、小儿克罗恩病、溃疡性结肠炎、斑块状牛皮癣、化脓性汗腺炎、葡萄膜炎、白塞病、脊柱关节病或牛皮癣。
本发明的一个具体目的是提供一种用于实现类固醇内化至骨髓细胞、T细胞、CD4T细胞、CD8 T细胞、Treg、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、B细胞、NK细胞、骨髓细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞以及其他免疫细胞类型中的一者或多者中的方法，所述方法包括向受试者施用根据前述任一项的ADC或使所述细胞与根据前述任一项的ADC离体接触。
本发明的一个具体目的是提供一种用于实现类固醇内化至骨髓细胞、NK细胞、B细胞、T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、Treg、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、骨髓细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞中的一者或多者中的方法，所述方法包括向受试者施用根据前述任一项的ADC或使所述细胞与根据前述任一项的ADC离体接触，所述方法是离体实现的，并且使包含免疫细胞或包含一种或多种特定类型的免疫细胞的经纯化或富集的组合物与根据前述任一项的ADC离体接触并且此后引入有需要的患者体内，所述免疫细胞选自细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、Treg、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、骨髓细胞、肥大细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞以及其他免疫细胞类型。
本发明的一个具体目的是提供一种用于实现类固醇内化至骨髓细胞、NK细胞、B细胞、T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、Treg、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞、骨髓细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞中的一者或多者中的方法，所述方法包括向受试者施用根据前述任一项的ADC或使所述细胞与根据前述任一项的ADC离体接触；用于治疗涉及骨髓细胞、NK细胞、B细胞、T细胞、Treg、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、骨髓细胞、树突状细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞中的任何一者或多者的炎症性或自身免疫性或过敏性疾患的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据前述任一项的ADC。
附图说明
图1A-B：该图显示通过胰蛋白酶消化获得的对照VISTA抗体767-IgG1.3的肽图谱。具有已鉴定的胰蛋白酶肽的767-IgG1.3的确定序列加下划线(A)轻链(85.6％覆盖率)(B)重链(76.1％覆盖率)。
图2A-B：该图显示使用Lys-C消化获得的767-IgG1.3的确定序列。在图中，Lys-C肽加下划线(A)轻链(63.3％覆盖率)(B)重链(76.3％覆盖率)。
图3：该图含有结合实验的结果，确认经合成的对照抗体767-IgG1.3和INX200表现出相反的pH依赖性结合特征。
图4A-C：该图含有结合研究的结果，揭示DAR 8与接头A偶联不影响VISTA与(A)INX200(B)INX201或(C)767-IgG1.3的结合。
图5：该图含有ConA实验的结果，其中向雌性hVISTA敲入动物施用不同裸和Dex偶联的抗VISTA抗体，所述实验检测在ConA后6小时外周血中的G-CSF变化。使用小鼠7-plex(SEM；n＝5/组)(给药：Dex-0.2＝0.2mg/Kg，Dex-2＝2mg/Kg，INX210和INX210A(10mg/Kg)，[INX210A提供0.2mg/kg dex有效负载])测量血浆浓度。
图6：该图含有ConA研究的结果，其中向雄性hVISTA敲入动物施用不同裸和Dex偶联的抗VISTA抗体。在图中的实验中，在ConA后6小时外周血中的细胞因子变化。使用小鼠7-plex(SEM；n＝10/组，常规单因素ANOVA，与仅ConA组相比)(给药：Dex(0.2或5mg/Kg)，INX210和INX210A(10mg/Kg))测量血浆浓度。
图7：该图含有ConA实验的结果，其中向动物施用不同裸和Dex偶联的抗VISTA抗体，并且检测在ConA后6小时外周血中的细胞因子变化。使用ELISA测定(SD；n＝6/组；单因素ANOVA，与仅ConA组相比)(给药：Dex(0.02、0.2或2mg/Kg)，INX200A(10、5和1mg/Kg))测量血浆浓度。
图8含有INX200、INX201和INX210的可变重和轻和恒定区的序列和序列图例。
图9描绘示例性布地奈德(budenoside)衍生物。
图10A-10JJ含有包含示例性抗人VISTA抗体VSTB49-VSTB116(其在啮齿动物和灵长类动物中在生理条件(pH≈7.5)下具有短血清半衰期)的CDR、可变重和轻序列、框架序列和恒定结构域的序列表和表位信息。
图11A-11C含有来自实施例3中公开的那些的示例性类固醇结构。
图12A-C含有实施例中公开的示例性抗VISTA抗体和对照抗体的序列。
图13含有INX200和767-IgG1.3对比人类IgG1si的结合研究。与连续稀释的测试抗体(0-333nM)一起温育的单核细胞测量的中位荧光强度；黑色虚线对应于未染色细胞的自体荧光；n＝1。
图14描绘由免疫细胞内化的抗VISTA抗体(INX200)的分数。经60分钟的时程绘制细胞结合抗体的细胞内库；对于每个数据点，将荧光针对时间0分钟时INX200的荧光归一化；平均值±SD，n＝2名供体。
图15含有评估INX200抗体的内化率的实验结果。经60分钟的时程在单核细胞中评估INX200抗体的内化率；抗CD45抗体在任何时间点均未内化；显示为平均值±SD，n＝2名供体。
图16：含有INX200、INX200A对比人类IgG1的PK研究。在标注的时间点在hVISTA KI小鼠(SD；n＝5/组)中抗体的血浆浓度。
图17：含有767-IgG1.3、767-IgG1.3A对比人类IgG1的PK研究。在标注的时间点在hVISTA KI小鼠(SD；n＝5/组)中抗体的血浆浓度。
图18含有评估根据本发明的ADC偶联物的效力的实验结果。在实验中，评估Dex(左)和ADC INX201J(右)处理后腹膜驻留巨噬细胞和脾单核细胞中的FKBP5转录活化。在以2mg/Kg进行1次单次腹膜内注射后4小时和24小时评价Dex(左)作用。在以10mg/Kg进行1次单次腹膜内注射以递送0.2mg/Kg GC有效负载后24、48、72和96小时分析ADC(右)作用。通过实时PCR测量FKBP5转录水平并呈现为Log2倍数变化对比PBS对照组。将每组四只小鼠汇集在一起，以产生足够材料用于RNA制备。
图19含有体内实验的结果，显示Dex处理防止PRM中促炎细胞因子的离体诱导。在以2mg/Kg进行1次单次腹膜内注射后2小时评价Dex作用；使用小鼠32-plex(n＝4只小鼠/组；未配对T检验)对细胞上清液(在1小时收集)评价IL-6和TNFα。
图20含有评估INX201J或Dex处理对PRM中的TNFα的体内作用的实验结果。结果显示INX201J或Dex处理防止PRM中TNFα的离体诱导。在这些实验中，在以2和0.2mg/Kg进行1次单次腹膜内注射后2小时评价Dex作用；在以10mg/Kg(等效于0.2mg/Kg有效负载)注射后1天(d-1)、2天(d-2)和4天(d-4)评价INX201J作用。在2小时收集细胞上清液。使用ELISA(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比)测量TNFα。
图21含有评估根据本发明的示例性ADC的长期作用的实验结果。结果显示所有测试的ADC均对PRM中TNFα和IL-6的离体诱导引发长期影响。在以2mg/Kg进行1次单次腹膜内注射后2小时评价Dex作用；在以10mg/Kg进行1次单次腹膜内注射后4天(-4)和7天(-7)评价INX201J、INX231J、INX234J和INX240 J作用。在2小时收集细胞上清液。使用ELISA(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比)测量TNFα和IL-6。
图22含有评估根据本发明的示例性ADC偶联物(即，INX231J、INX234J和INX240 J)的效力的实验结果。结果指示INX231J、INX234J和INX240 J ADC对防止PRM中TNFα和IL-6的离体诱导具有相当的效力。在以2mg/Kg进行1次单次腹膜内注射后2小时评价Dex作用；在以10、3或1mg/Kg(0.2、0.06和0.02mg/Kg GC有效负载)进行1次单次腹膜内注射后7天评价INX231J、INX234J和INX240 J作用。在2小时收集细胞上清液。使用ELISA(参见方法章节)(n＝4只小鼠/组，PBS组(n＝1)除外，出于技术原因；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比)测量TNFα和IL-6。
图23含有实验，显示INX201J、INX201P、INX231J、INX234J和INX240J ADC的效力对防止PRM中TNFα和IL-6的离体诱导是相当的。在1次单次腹膜内注射后7天评价INX201J、INX201P、INX231J、INX234J、INX240 J和Dex作用；以10mg/Kg(0.2mg/Kg GC有效负载)给与ADC并且以2mg/Kg给与Dex。在2小时收集细胞上清液。使用ELISA(n＝4只小鼠/组，PBS和Dex组(n＝3)除外，出于技术原因；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比)测量TNFα和IL-6。
图24：INX201J、INX231P、INX234P和INX240P ADC对防止PRM中TNFα的离体诱导具有相当的效力。在1次单次腹膜内注射后7天评价ADC作用；以10mg/Kg(0.2mg/Kg GC有效负载)给与ADC。在2小时收集细胞上清液。使用ELISA(参见方法章节)(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比，SEM)测量TNFα。
图25：INX231P、INX231R、INX233P和INX234P对防止PRM中TNFα和IL-6的离体诱导具有相当的效力。在1次单次腹膜内注射后7天评价ADC作用；以10mg/Kg(0.2mg/Kg GC有效负载)给与ADC。在24小时收集细胞上清液。使用ELISA(参见方法章节)(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比，SEM)测量TNFα和IL-6。
图26：GC接头有效负载INX R、INX O、INX S、INX V和INX W对比偶联至INX231的INX P对防止PRM中TNFα和IL-6的离体诱导的效力评价。在1次单次腹膜内注射后7天评价ADC作用；以0.2mg/Kg GC有效负载给与ADC。在24小时收集细胞上清液。使用ELISA(参见方法章节)(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比，SEM)测量TNFα和IL-6。
图27：GC有效负载INX231S、INX231V和INX231W对比INX231P对诱导PRM中的FKBP5转录的效力评价。在1次单次腹膜内注射后1、7和14天评价ADC作用；以0.2mg/Kg GC有效负载给与ADC。通过定量实时PCR测量FKBP5表达并呈现为Log2倍数变化对比PBS对照组(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比，SEM)。
图28：GC有效负载INX231S、INX231V和INX231W对比INX231P对防止PRM中TNFα和IL-6的离体诱导的效力评价。在1次单次腹膜内注射后1、7和14天评价ADC作用；以0.2mg/KgGC有效负载给与ADC。在24小时收集细胞上清液。使用ELISA(参见方法章节)(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比，SEM)测量TNFα和IL-6。
图29：GC有效负载INX234A3、INX234A4、INX234T、INX201L和INX231S对诱导腹膜驻留巨噬细胞(上排)和脾细胞(下排)中的FKBP5转录的效力评价。在1次单次腹膜内注射后1、7和14天评价ADC作用；以0.2mg/Kg GC有效负载给与ADC。通过定量实时PCR测量FKBP5表达并呈现为Log2倍数变化对比PBS对照组(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比，SEM)。
图30：GC有效负载INX234A3、INX234A4、INX234T、INX201L和INX231S对防止PRM中TNFα和IL-6的离体诱导的效力评价。在1次单次腹膜内注射后1、7和14天评价ADC作用；以0.2mg/Kg GC有效负载给与ADC。在24小时收集细胞上清液。使用ELISA(参见方法章节)(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比，SEM)测量TNFα和IL-6。
图31：GC有效负载INX234V、INX234A5和INX234A11对诱导腹膜驻留巨噬细胞中的FKBP5转录的效力评价。在1次单次腹膜内注射后7和14天评价ADC作用；以0.2mg/Kg GC有效负载给与ADC。通过定量实时PCR测量FKBP5表达并呈现为Log2倍数变化对比PBS对照组(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比，SEM)。
图32：GC有效负载INX234V、INX234A5和INX234A11对防止PRM中TNFα和IL-6的离体诱导的效力评价。在1次单次腹膜内注射后14天评价ADC作用；使用ELISA(参见方法章节)(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比，SEM)测量ADC TNFα和IL-6。
图33：GC有效负载INX234V、INX231A7、INX231A12和INX231A23对诱导腹膜驻留巨噬细胞中的FKBP5转录的效力评价。在1次单次腹膜内注射后7和21天评价ADC作用；以0.2mg/Kg GC有效负载给与ADC，以0.08mg/Kg有效负载给与的INX231A7除外。通过定量实时PCR测量FKBP5表达并呈现为Log2倍数变化对比PBS对照组(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比，SEM)。
图34：GC有效负载INX234V、INX231A7、INX231A12和INX231A23对防止PRM中TNFα和IL-6的离体诱导的效力评价。在1次单次腹膜内注射后7、14和21天评价ADC作用；以0.2mg/Kg GC有效负载给与ADC。在24小时收集细胞上清液。使用ELISA(参见方法章节)(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比，SEM)测量TNFα和IL-6。
图35：在LPS后2小时(左)和4小时(右)外周血中的IL-12p40变化。使用小鼠multi-plex测量血浆浓度；给药：在LPS刺激前2小时以0.02、0.2、2和5mg/Kg给与Dex(正方形)，在LPS注射前2或17小时以10mg/Kg给与INX201J(圆形)，提供0.2mg/Kg GC。仅PBS组(灰色实心三角形)指示不存在刺激下的基线细胞因子水平；PBS+LPS(黑色实心三角形)(SEM；n＝5/组，除非技术故障排除在分析之外；常规单因素ANOVA，与PBS+LPS组相比)。
图36：在LPS后2小时外周血中的细胞因子变化。使用小鼠5-plex测量血浆浓度；给药：在LPS刺激前2小时以0.002、0.02、0.2、2mg/Kg(正方形)或在LPS前17小时以2mg/Kg(黑色实心正方形)给与Dex，在LPS注射前17小时以0.02、0.06、0.2mg/Kg GC有效负载给与INX201J(圆形)。仅PBS组(实心灰色三角形)指示不存在刺激下的基线细胞因子水平；PBS+LPS(实心黑色三角形)(SEM；n＝5/组，除非技术故障排除在分析之外；常规单因素ANOVA，与PBS+LPS组相比)。
图37显示在LPS后2小时外周血中的TNFα变化。使用ELISA测量TNFα血浆浓度；给药：在LPS刺激前2小时以0.2和2mg/Kg给与Dex(正方形)，在LPS注射前17小时以0.06和0.2mg/Kg GC有效负载给与INX201J(圆形)。PBS组(实心黑色三角形)在LPS前2小时接受PBS。IgG1siJ(G1siJ)组(三角形)在LPS前17小时接受偶联至0.2mg/Kg有效负载的GC的人类IgG1静默体。(SEM；n＝5/组，除非技术故障排除在分析之外；常规单因素ANOVA，与PBS组相比)。
图38显示在LPS后2小时外周血中的TNFα变化。通过ELISA测量TNFα血浆浓度；给药：在LPS刺激前2小时以0.2和2mg/Kg给与Dex(正方形)，在LPS注射前17小时以0.2mg/KgGC有效负载给与INX201J(圆形)和INX201N(倒三角形)。PBS组在LPS前2小时接受PBS(实心黑色三角形)。(SEM；n＝5/组，除非技术故障排除在分析之外；常规单因素ANOVA，与PBS组相比)。
图39显示在LPS后2小时外周血中的TNFα(左)和IL-12p40(右)变化。通过ELISA测量细胞因子血浆浓度；给药：在LPS注射前17小时以0.2mg/Kg GC有效负载给与PBS(实心圆形)、INX201J(正方形)、INX231J(三角形)、INX234J(菱形)和INX201P(倒三角形)(SEM；n＝5/组；常规单因素ANOVA，与PBS组相比)。
图40显示在LPS后2小时外周血中的TNFα(左)和IL-12p40(右)变化。通过ELISA测量细胞因子血浆浓度；给药：在LPS注射前17小时以0.2mg/Kg GC有效负载给与PBS(实心三角形)、INX201J(圆形)、INX201O(正方形)和INX201P(菱形)(SEM；n＝5/组，除非技术故障排除在分析之外；常规单因素ANOVA，与PBS组相比)。
图41显示在LPS后2小时外周血中的TNFα(右)和IL-12p40(左)变化。通过ELISA测量细胞因子血浆浓度；给药：在LPS注射前17小时以0.2mg/Kg GC有效负载给与PBS、INX201J(圆形)、INX201O(正方形)和INX201P(菱形)(SEM；n＝5/组，除非技术故障排除在分析之外；常规单因素ANOVA，与PBS组(实心黑色三角形)相比)。
图42显示在LPS后2小时外周血中的TNFα(右)和IL-12p40(左)变化。通过ELISA测量细胞因子血浆浓度；在LPS注射前20小时以0.2mg/Kg GC有效负载给与所有ADC和PBS(INX231P(正方形)、INX231R(三角形)、INX233P(菱形))(SEM；n＝5/组，除非技术故障排除在分析之外；常规单因素ANOVA，与PBS组(实心圆形)相比)。
图43显示在LPS后2小时外周血中的TNFα(右)和IL-12p40(左)变化。通过ELISA测量细胞因子血浆浓度；在LPS注射前20小时以0.2mg/Kg GC有效负载给与所有ADC和PBS(INX231P(实心正方形)、INX231R(实心三角形)、INX201O(实心菱形)、INX231S(圆形)、INX231V(正方形)、INX231W(三角形))(SEM；n＝4/组，INX231S除外，其中2个技术故障排除在分析之外；常规单因素ANOVA，与显示非有效数据的PBS组(实心圆形)相比)。
图44显示在ADC处理后4天在腹膜驻留者中ADC处理后的FKBP5转录活化。第0天腹膜内注射ADC，各自递送0.2mg/Kg GC有效负载；第3天分离PRM。通过实时PCR测量FKBP5转录水平并呈现为Log2倍数变化对比PBS对照组(SEM，常规单因素ANOVA，与PBS组相比，n＝4)。
图45：在LPS后2小时外周血中的TNFα(右)和IL-12p40(左)变化。通过ELISA测量细胞因子血浆浓度；在LPS注射前20小时以0.2mg/Kg GC有效负载给与所有ADC和PBS(SEM；n＝5/组，INX234P、INX234A4和INX234T除外，其中每组记录1个技术故障；常规单因素ANOVA，与PBS组相比)。
图46：在LPS后2小时外周血中的TNFα(右)和IL-12p40(左)变化。通过ELISA测量细胞因子血浆浓度；在LPS注射前20小时以0.2mg/Kg GC有效负载给与所有ADC和PBS(INX234V(实心正方形)、INX234A5(实心三角形)、INX234A11(实心菱形))(SEM；n＝5/组，有例外；常规单因素ANOVA，与PBS(实心圆形)组相比)。
图47：在LPS后2小时外周血中的TNFα(右)和IL-12p40(左)变化。通过ELISA测量细胞因子血浆浓度；在LPS注射前20小时以0.2mg/Kg GC有效负载给与所有ADC和PBS，以0.08mg/Kg有效负载给与的INX231A7除外(INX234V(实心正方形)、INX231A7(实心三角形)、INX231A12(实心菱形)、INX231A23(圆形)、INX234A1(正方形)、INX234A13(三角形))(SEM；n＝5/组，有例外；常规单因素ANOVA，与PBS组相比)。
图48：在LPS后2小时外周血中的TNFα(右)和IL-12p40(左)变化。通过ELISA测量细胞因子血浆浓度；在LPS注射前20小时以0.2mg/Kg GC有效负载给与所有ADC和PBS(SEM；n＝5/组，除非出于技术原因在PBS、INX234P、INX201V组中必须有1个样品被审查并且在INX234A9组中有2个样品被审查，常规单因素ANOVA，与PBS组相比)。
图49含有检测不同细胞上的VISTA表达的实验结果。如其中所示，VISTA在肝内皮细胞中高度表达。CD45-CD31+非免疫内皮细胞从hVISTA敲入小鼠肝脏中分离并用抗人VISTA染色(红线，右移)或未染色(实心灰色)。
图50含有检测在INX201J注射后肾上腺、脑、肝和脾中的FKBP5转录活化的实验结果。如其中所示，在以0.3、3、10mg/Kg(分别递送0.006、0.06和0.2mg/Kg有效负载)进行1次单次腹膜内注射后20小时测量INX201J作用。在以0.2或2mg/Kg进行单次腹膜内注射后2小时测量Dex作用。通过实时PCR测量FKBP5转录水平并呈现为Log2倍数变化对比PBS对照组的平均值(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比)。
图51：INX-SM-3、INX-SM-4和INX-SM-1抑制IL-1β(左)和IL-6(右)产生。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-1nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以<1nM绘制无处理对照；n＝1名供体，根据技术重复绘制标准偏差。
图52：INX-SM-1、INX-SM-3、INX-SM-4和INX-SM-6抑制IL-1β产生。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-1nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以<1nM绘制无处理对照；n＝1名供体，根据技术重复绘制标准偏差。
图53：INX-SM-9、INX-SM-31和INX-SM-35抑制IL-1β(上)和IL-6(下)产生。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.2nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.2nM绘制无处理对照；n＝2名供体，示出代表性供体。根据技术重复绘制标准偏差。
图54：INX-SM-32抑制IL-1β(上)和IL-6(下)产生。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(500-1nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以<1nM绘制无处理对照；n＝2。示出代表性供体。根据技术重复绘制标准偏差。
图55：INX-SM-10对IL-1β(上)和IL-6(下)产生显示出强有力抑制。INX-SM-33展示出细胞因子产生的适度抑制。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.5nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.5nM绘制无处理对照；n＝1名供体，根据技术重复绘制标准偏差。
图56：INX-SM-2和INX-SM-7显示对IL-1β的抑制。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.16nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的平均细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.16nM绘制无处理对照；n＝1，根据技术重复绘制标准偏差。
图57显示C6和C9两者的卤化而非单独C9的卤化提供增加的效力。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.16nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的平均细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.16nM绘制无处理对照；n＝1，根据技术重复绘制标准偏差。
图58：针对其他表面靶标的INX P偶联的抗体保留抗VISTA偶联物的抗炎作用。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(8,000-0.26nM偶联有效负载)的糖皮质激素偶联物一起温育的人类PBMC的平均细胞因子水平；n＝1，技术重复的平均值。
图59：INX-SM-43显示对huIL1-β的中度抑制。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(100-0.032nM)的糖皮质激素有效负载一起温育的人类PBMC的平均细胞因子水平；n＝1，技术重复的平均值。
图60：INX-SM-44显示对huIL1-β的中度抑制。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.32nM)的糖皮质激素有效负载一起温育的人类PBMC的平均细胞因子水平；n＝1，技术重复的平均值。
图61：INX-SM-25和INX-SM-3对IL-1β产生显示出强有力抑制。INX-SM-45和INX-SM-46展示出细胞因子产生的更适度抑制。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.5nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.5nM绘制无处理对照；n＝1名供体，绘制技术重复的平均值。
图62：INX231V相比于INX231P和INX231J的效力大幅增加。在24小时测量与1ng/mLLPS和连续稀释(1000-0.16nM)的偶联类固醇接头有效负载一起温育的人类PBMC的A.huIL-1βB.huIL-6的平均细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.16nM绘制无处理对照；n＝1，根据技术重复绘制标准偏差。高于ULOQ(对于IL-1b为12,500pg/mL并且对于IL-6为150,000pg/mL)的值绘制为外推值。
图63：INX231V具有实质性效力，并且INX231P的适度效力超过INX231J。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.16nM)的偶联类固醇接头有效负载一起温育的人类PBMC的IL-1β的平均细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.16nM绘制无处理对照；n＝1，绘制技术重复的平均值
图64：INX231S、INX234T和INX234A3相比于INX231J的效力增强。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.16nM)的偶联类固醇接头有效负载一起温育的人类PBMC的IL-1β的平均细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.16nM绘制无处理对照；n＝1，绘制技术重复的平均值。
图65：INX201对比INX231可引起偶联物的早期效力增强。在24小时测量与1ng/mLLPS和连续稀释(1000-0.16nM)的偶联类固醇接头有效负载一起温育的人类PBMC的IL-1β的平均细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.16nM绘制无处理对照；n＝1，绘制技术重复的平均值。
图66：INX V的类似物相对于INX231J为强效的。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.16nM)的偶联类固醇接头有效负载一起温育的人类PBMC的IL-1β的平均细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.16nM绘制无处理对照；n＝1，绘制技术重复的平均值。
图67：INX-SM-36、INX-SM-32(上)和INX-SM-3、INX-SM-J2(下)抑制IL-1β。INX-SM-32和INX-SM-36以与地塞米松类似的效力抑制IL-1β。INX-SM-3和INX-SM-J2具有与布地奈德类似的效力。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.5nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.5nM绘制无处理对照；n＝1名供体，绘制技术重复的平均值。
图68：INX-SM-32、INX-J2和INX-SM-3引发类似的IL-1β抑制，INX-SM-37弱抑制IL-1β。INX-SM-32、INX-J2和INX-SM-3以类似的效力抑制IL-1β。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.15nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.5nM绘制无处理对照；n＝1名供体，绘制技术重复的平均值。
图69：INX231V比其他INX231/INX234偶联物基本上更强效。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.16nM)的偶联类固醇接头有效负载一起温育的人类PBMC的IL-1β的平均细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.16nM绘制无处理对照；n＝1，绘制技术重复的平均值。
图70：INX V的磷酸化和卤化类似物相对于INX J为强效的。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.16nM)的偶联类固醇接头有效负载一起温育的人类PBMC的IL-1β的平均细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.16nM绘制无处理对照；n＝1，绘制技术重复的平均值。
图71：INX-SM-14、INX-SM-15和INX-J2对IL-1β(上)和IL-6(下)具有类似的抑制。INX-SM-17弱抑制IL-1β，但不抑制IL-6。INX-SM-14、INX-SM-15和INX-J2以类似的效力抑制IL-1β和IL-6。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.15nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以0.01nM绘制无处理对照；n＝1名供体，绘制技术重复的平均值
图72：INX-SM-40和INX-SM-34相对于INX-J2弱抑制IL-1β(上)和IL-6(下)。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.15nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以0.01nM绘制无处理对照；n＝1名供体，绘制技术重复的平均值。
图73：INX-SM-49和INX-SM-47相对于INX-J2弱抑制IL-1β(上)和IL-6(下)。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.15nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的细胞因子水平(IL1-β和IL-6)，在对数标度x轴上以0.01nM绘制无处理对照；n＝1名供体，绘制技术重复的平均值。
图74：INX231A9和INX201V相比于INX234J和INX201J对减少IL-1β产生显示增强的效力。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释的抗VISTA偶联物(关于偶联的有效负载浓度，1000-0.15nM)一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以0.1nM绘制无处理对照；n＝1名供体，绘制技术重复的平均值。
图75：等效或降低DAR的INX V和INX A23相比于INX J对减少IL-1β产生显示增强的效力。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释的抗VISTA偶联物(关于总ADC浓度，20-0.003μg/mL)一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以0.001μg/mL绘制无处理对照；n＝1名供体，绘制技术重复的平均值
图76：INX V偶联物相比于INX J偶联物甚至在降低的DAR下对IL-1β的影响也具有增强的效力。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释的抗VISTA偶联物(关于总ADC浓度，20-0.003μg/mL)一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以0.001μg/mL绘制无处理对照；n＝1名供体，绘制技术重复的平均值
图77含有比较示例性本发明抗体INX200与人类IgG1的PK特性的实验结果。如其中所示，在标注的时间点在hVISTA KI小鼠(SD；n＝5/组)中抗体的血浆浓度。
图78含有比较767-IgG1.3与人类IgG1的PK特性的实验结果。如其中所示，在标注的时间点在hVISTA KI小鼠(SD；n＝5/组)中抗体的血浆浓度。
图79含有比较根据本发明的其他示例性抗VISTA抗体，即，INX231、INX234、INX237和INX240的PK值的实验结果。如其中所示，在标注的时间点在hVISTA KI小鼠(SD；n＝5/组)中抗体的血浆浓度。左图在Log10中显示y轴和x轴，而对于右图，仅y轴在Log10中。
图80含有比较根据本发明的示例性抗VISTA抗体，即，INX901、INX904、INX907和INX908的PK值的实验结果。在标注的时间点在hVISTA KI小鼠(SD；n＝5/组)中抗体的血浆浓度。
图81含有比较根据本发明的不同ADC，即，INX201J、INX231J、INX234J和INX240J的PK值的实验结果。在标注的时间点在hVISTA KI小鼠(SD；n＝4/组)中抗体的血浆浓度。
图82含有测定用示例性VISTA Ab ADC偶联物INX201J和地塞米松长期处理对皮质酮水平的影响的实验结果。该图显示血浆皮质酮水平的变化。(SEM，单因素ANOVA，n＝8，右图中的PBS对照组(n＝6)除外)。
图83显示在实施例12的实验1中免疫后第6天来自外周血的Ag特异性CD8 T细胞数。(SEM，单因素ANOVA，n＝5)。
图84显示在实施例12的实验2中免疫后第6天来自外周血的Ag特异性CD8 T细胞数。左图显示包括所有样品的PBS对照组，右图显示去除一个异常值的PBS对照组(SEM，单因素ANOVA，n＝5，初始除外；一个样品由于免疫失败而排除在0.2mg/Kg Dex的组之外)。
图85显示在实施例12的实验3中免疫后第6天来自外周血的Ag特异性CD8 T细胞数。在此实验中，由于处理期间的技术问题必须排除多个样品：PBS组n＝3，2mg/Kg Dex n＝2，0.2mg/Kg Dex n＝3，INX201J D-1n＝5，INX201J D-7n＝2，INX231J D-7n＝3，INX234JD-7n＝5，INX240 J D-7n＝4(SEM，单因素ANOVA，D＝天)。
图86显示在实施例12的实验3中免疫后第6天来自外周血的Ag特异性CD8 T细胞数。出于技术原因，2个样品排除在PBS、INX231P和INX234P组之外；对于所有其他组n＝5(SEM，单因素ANOVA)。
图87显示2种实验方案中外周血中的绝对细胞数的变化。第14天至第18天和第21天至第25天的OVA攻击(SEM，单因素ANOVA，n＝10，初始组(n＝5)除外)。
图88显示2种实验方案中外周血中的免疫球蛋白产生的变化。第14天至第18天(第1部分)和第21天至第25天(第2部分)的OVA攻击(SEM，单因素ANOVA，n＝10，初始组(n＝5)除外)。
图89A-89B显示2种实验方案中BAL中的免疫浸润液的变化。第14天至第18天(第1部分)和第21天至第25天(第2部分)的OVA攻击；A)骨髓浸润液的变化；B)淋巴细胞浸润液的变化(SEM，单因素ANOVA，n＝10，在对照组中审查2个样品，在Dex组和INX201J组中均审查3个样品；对于初始组n＝5)。
图90显示2种实验方案中BAL中的细胞因子水平的变化。第14天至第18天(第1部分)和第21天至第25天(第2部分)的OVA攻击(SEM，单因素ANOVA，n＝10，在对照组中审查2个样品，在Dex组和INX201J组中均审查3个样品；对于初始组n＝5)。
图91显示研究第1部分的肺病评分。(SEM，单因素ANOVA，n＝10，初始组(n＝5)除外)。
图92显示INX231J注射后脾(左)和血(右)细胞中的FKBP5转录活化。在以5mg/Kg(递送0.1mg/Kg有效负载)进行1次单次静脉内注射后20小时测量INX231J作用和hIgG1siJ(灰色)。在以2mg/Kg进行单次腹膜内注射后2小时测量Dex作用。通过实时PCR测量FKBP5转录水平并呈现为Log2倍数变化对比PBS对照组的平均值。(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比)。
图93显示INX231P注射后C57Bl/6小鼠中的FKBP5转录活化。在以10mg/Kg(递送0.2mg/Kg有效负载)进行1次单次静脉内注射后20小时测量INX231P作用。在以2mg/Kg进行单次腹膜内注射后2小时测量Dex作用。通过实时PCR测量FKBP5转录水平并呈现为Log2倍数变化对比PBS对照组的平均值。(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比)。
图94含有显示INX231P注射后C57Bl/6或hVISTA KI小鼠中的FKBP5转录活化的实验结果。在以10mg/Kg(递送0.2mg/Kg有效负载)进行1次单次静脉内注射后20小时测量INX231P作用。在以2mg/Kg进行单次腹膜内注射后2小时测量Dex作用。通过实时PCR测量FKBP5转录水平并呈现为Log2倍数变化对比PBS对照组的平均值。(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比)。
图95含有显示体内Dex处理引起离体单核细胞对LPS的炎症反应降低的实验结果。向小鼠腹膜内注射2mg/Kg或0.2mg/Kg的PBS或Dex。2小时后，分离脾单核细胞，置于培养中并经受0、10和100ng/ml的LPS刺激。在Luminex 32-plex上分析24小时上清液(n＝5只小鼠/组，但样品1、2、3和4、5汇集为2个样品)。
图96含有显示用INX231P体内处理对离体单核细胞对LPS的炎症反应有影响的实验结果。在细胞分离前2小时、2天或6天向小鼠腹膜内注射2mg/Kg的PBS或Dex；在细胞分离前1天、3天和7天静脉内注射10mg/Kg的INX231P和INX901。分离后，将脾单核细胞置于培养中并经受0或10ng/ml的LPS刺激(仅示出10ng/ml)。通过ELISA分析24小时上清液(n＝4只小鼠/组；仅对第1天(D1)样品进行与PBS处理组相比的单因素ANOVA)。
图97含有显示用INX231P体内处理对离体单核细胞对LPS的炎症反应有影响的实验结果。在细胞分离前2小时向小鼠腹膜内注射2mg/Kg的PBS或Dex；在细胞分离前24小时静脉内注射10mg/Kg的INX231P和INX901。将脾单核细胞置于培养中并经受10和100ng/ml的LPS刺激。通过ELISA分析24小时上清液(n＝4只小鼠/组；独立常规单因素ANOVA，对于每个LPS剂量与PBS处理组相比)。
图98显示B细胞或单核细胞中的FKBP5转录活化。用20nM游离J有效负载或等摩尔量的偶联至INX201(INX201J)或同型对照(huIgG1si J)的有效负载处理细胞。以技术重复分析转录物水平。
图99显示单核细胞中的FKBP5转录活化。用渐增量的INX201J([0-100nM有效负载])处理细胞。0有效负载表示单独用与100nM有效负载INX201J剂量中的抗体量相同的未偶联INX201抗体处理。以技术重复分析转录物水平。
图100显示来自用20nM INX-SM-3(游离有效负载)或摩尔有效负载当量的INX231P(偶联有效负载)处理的2名供体的T reg中的FKBP诱导。产生样品并以单份进行分析。如通过流式细胞术评估，分离的Treg纯度≥75％。
图101显示相对于20nM有效负载当量的huIgG1si J，来自用20nM有效负载当量的INX201J处理的1名供体的T reg中的FKBP5诱导。以技术重复分析样品。如通过流式细胞术评估，分离的Treg纯度≥75％。
图102汇总不同免疫细胞针对VISTA和其他ADC靶标(CD40、TNFα、CD74、CD163(PRLR))的报告的共有RNA表达水平，基于报告的“每百万转录物”(TPM)，其中TPM<10表示(最小/无表达“-”)；TPM 10-100表示(低/中等表达“+”)；和TPM>100(高表达“++”)。
图103A-E汇总VISTA、CD74、CD163和mTNFα在鉴定的细胞群体上的抗原密度的定量A)单核细胞表达VISTA、CD74和CD163；B)B细胞表达CD74；C)CD4+T细胞；D)CD4+T reg；和E)CD8+T细胞表达VISTA(平均值±SD，n＝5名供体)。
图104A-F显示VISTA、CD74、CD163和mTNFα在人类血液中鉴定的细胞群体上的抗原密度的定量A)单核细胞表达VISTA、CD74和CD163；B)B细胞表达CD74；C)嗜中性粒细胞表达VISTA；D)CD4+T细胞；E)CD4+T reg；和F)CD8+T细胞表达VISTA(平均值±SD，n＝3)。
图105含有显示骨骼中的类固醇反应基因受游离Dex显著影响，而VISTA ADC(INX231P)具有有限影响的数据。在该图中，Fkpb5示于左图，RANKL示于中左图，ddit4示于中右图，并且Fam107a示于最右图。在实验中，在以10mg/Kg(递送0.2mg/Kg有效负载)进行1次单次腹膜内注射后20小时测量INX231P作用。在以2mg/Kg进行单次腹膜内注射后2小时测量Dex作用。通过RNAseq测量基因转录水平并且呈现为归一化计数。(n＝5只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比)。
图106含有比较VISTA ADC(INX234P)相对于媒介物对照对食蟹猴外周血细胞中的类固醇反应基因表达的作用的实验结果。在这些实验中，在10mg/Kg(递送0.2mg/Kg有效负载)的1次单次静脉内剂量后24小时测量INX234P作用。通过RNAseq测量基因转录水平并且呈现为归一化计数。(n＝2媒介物，n＝6ADC/组；未配对t检验对比媒介物)。
图107含有评价VISTA ADC(INX234P)对特异性非靶细胞的作用的实验结果。如数据所示，INX234P对白色脂肪、脑和骨骼中的FKBP5具有有限影响乃至无影响。在实验中，在10mg/Kg(递送0.2mg/Kg有效负载)或D8(媒介物)的1次单次静脉内剂量后24小时测量INX234P作用。通过RNAseq测量基因转录水平并且呈现为归一化计数。(n＝2媒介物，n＝3ADC/组(对于组织)；未配对t检验对比媒介物-INX234P不显著)。
图108含有评价ADC对类固醇反应基因的作用的实验结果。数据显示在24小时白色脂肪组织中有一些残留Dex作用；ADC基因表达类似于媒介物对照。在1次单次静脉内剂量后24小时或在第8天(媒介物)测量游离Dex(2mg/Kg)和INX234P(10mg/Kg-递送0.2mg/Kg有效负载)作用。通过RNAseq测量基因转录水平并且呈现为归一化计数。(n＝2媒介物，n＝2地塞米松，n＝3ADC/组(对于组织)；未配对t检验对比媒介物)。
图109A-D：含有显示在24小时经INX234P处理的猴中活性有效负载(INX-SM-3)的高积累与VISTA表达组织相关联的实验结果。图(A)显示释放的有效负载(INX-SM-3)，并且图(B)显示半胱氨酸修饰的接头/有效负载(INXP-cys)，并且图(C)显示地塞米松，在INX234P(10mg/kg-递送0.2mg/Kg有效负载)或游离地塞米松(2mg/kg)的1次单次静脉内剂量后24小时测量。图(D)显示第8天，释放的有效负载(INX-SM-3)在INX234P处理的猴中的VISTA表达组织中持续存在。通过LC-MS/MS测量累积的化合物水平并且呈现为ng化合物/g组织(n＝3ADC/组(对于INX234P)，第8天骨髓除外，由于样品有限n＝2，n＝2Dex)(Duod＝十二指肠)。
图110比较活化免疫细胞(单核细胞)上VISTA与其他蛋白质(特别是已用其他类固醇ADC靶向的蛋白质)的表达。在实验中，用LPS(在U底96孔板中每孔100μL；1μg/mL LPS；在37℃下2小时)活化来自健康供体的人类全血。通过流式细胞术评估活化的免疫细胞(单核细胞)上的细胞表面蛋白质表达水平。在这些实验中用于染色的直接偶联抗体包括抗VISTA克隆GG8、CD163克隆GHI/61、CD74克隆332516和mTNFα克隆mAb11。如所示，VISTA表达模式类似于非活化细胞上所观测的表达水平，而其他蛋白质表达水平较低。具体而言，mTNFαMFI仅略高于FMO(荧光减一)对照。
图111含有评估食蟹猴中根据本发明的ADC，即INX234P的PK的实验结果。以15mg/Kg静脉内给与INX234P。在指定时间点对动物进行放血，分离血清并且测量抗体水平(n＝4只食蟹猴，SEM)。
图112显示由一剂INX234P诱导的血液学变化。在这些实验中，以15mg/Kg静脉内给与INX234P。在指定时间点对动物进行放血，完成血涂片并对不同细胞群体进行计数(n＝4只食蟹猴，SEM)(WBC＝白细胞，NEUT＝嗜中性粒细胞，LYMPH＝淋巴细胞，MONO＝单核细胞，EOS＝嗜酸性粒细胞，BASO＝嗜碱性粒细胞，RBC＝红细胞，Retic＝网织红细胞)。
图113含有检测个别动物中由一剂INX234P诱导的皮质醇变化的实验结果。在这些实验中，以15mg/Kg静脉内给与INX234P。在指定时间点对动物进行放血，分离血清并通过ELISA测量皮质醇水平(n＝4只食蟹猴)。
图114含有检测PBL中接头有效负载(P-cys)与释放的有效负载(SM3)的PK的实验结果。以15mg/Kg静脉内给与INX234P。在指定时间点对动物进行放血，分离PBL并通过MS进行分析(n＝4只食蟹猴，SEM)。
图115含有检测血清中接头有效负载(P-cys)与释放的有效负载(SM3)的PK的PK测定结果。以15mg/Kg静脉内给与INX234P。在指定时间点对动物进行放血，分离血清并通过MS进行分析(n＝4只食蟹猴，SEM)。
图116含有显示PBL中的类固醇反应基因由INX234P上调的结果。在这些实验中，以15mg/Kg静脉内给与INX234P。在指定时间点对动物进行放血，分离PBL并经受RNA分离，通过RNAseq测量基因转录水平并且呈现为对比放血前的倍数变化(n＝4只食蟹猴)。
图117含有显示截至4小时人类PBMC中INX201J、INX231P和INX231V对FKBP5诱导的作用的实验。在实验中，如通过RT PCR相对于GAPDH测量，在4小时检测与1μM偶联的有效负载一起温育的人类PBMC中的FKBP5诱导；其中n＝1名供体。
图118A-O含有示例性糖皮质激素激动剂化合物以及式I、II和III的糖皮质激素激动剂-接头化合物的专有和化学名称和结构。
图119含有显示INX234P处理降低人类PBMC扩增的GVHD实验结果。在这些实验中，第21天收集外周血并且通过流式细胞术定量人类CD45阳性细胞。从第0天至第34天每周一次向小鼠给药(SEM；n＝8/组)(以10mg/Kg给药，INX234P提供0.2mg/kg INX P接头有效负载)。
图120含有显示INX234P处理改善小鼠存活的GVHD实验结果。从第0天至第34天每周一次向小鼠腹膜内给与10mg/Kg(或0.2mg/Kg INX P接头有效负载)。左上图显示以初始体重百分比表示的平均重量变化；3幅下图显示个别小鼠的体重减轻％；右上图为卡普兰-迈耶存活曲线(Kaplan-Meyer survival curve)；上方(下图)或下方(上图)的灰色条指示处理时段(SEM；n＝8/组)。
图121含有显示INX234V/P处理降低人类T细胞扩增的GVHD实验。转移后第15天开始每周收集外周血并且通过流式细胞术定量人类CD45+CD3+阳性细胞。从第0天每周一次向小鼠给药(SEM；n＝8/组)(以10mg/Kg给药，INX234V和INX234P分别提供0.2mg/kg INX V或INX P接头有效负载)。
图122含有在GVHD模型中获得的数据，其显示INX234V/P处理改善小鼠存活。第0天开始每周一次向小鼠腹膜内给与10mg/Kg(或0.2mg/Kg INX V或INX P接头有效负载)。左上图显示以初始体重百分比表示的平均重量变化；3幅下图显示个别小鼠的体重减轻％；右上图为卡普兰-迈耶存活曲线。
图123含有在结肠炎模型中获得的数据，其显示INX234P处理改善小鼠存活。在实验中，从第0天至第61天每周一次向小鼠腹膜内给与10mg/Kg(和0.2mg/Kg INX P接头有效负载(适当时))的INX234P和INX234。左上图显示以初始体重百分比表示的平均重量变化；3幅下图显示个别小鼠的体重减轻％；右上图为卡普兰-迈耶存活曲线；上方(下图)或下方(上图)的灰色条指示处理时段(SEM；n＝10/组，INX234P组(n＝9)除外)。
图124含有在结肠炎模型中获得的数据，显示高剂量地塞米松处理改善小鼠存活。在实验中，从第0天至第61天每周一次向小鼠腹膜内给与2(高)或0.2(低)mg/Kg。左上图显示以初始体重百分比表示的平均重量变化；3幅下图显示个别小鼠的体重减轻％；右上图为卡普兰-迈耶存活曲线；上方(下图)或下方(上图)的灰色条指示处理时段(SEM；n＝10/组)。
图125含有在结肠炎模型中获得的数据，显示INX234V处理改善小鼠存活。在实验中，从第21天至第80天每周一次向小鼠腹膜内给与10mg/Kg(和0.2mg/Kg INX V接头有效负载(适当时))的INX234V和INX234。左上图显示以初始体重百分比表示的平均重量变化；3幅下图显示个别小鼠的体重减轻％；右上图为卡普兰-迈耶存活曲线；上方(下图)或下方(上图)的灰色条指示处理时段(SEM；n＝10/组，INX234处理组(n＝5)除外)。
图126含有在结肠炎模型中获得的数据，显示低剂量地塞米松处理改善小鼠存活。在实验中，从第21天至第80天每周一次向小鼠腹膜内给与2(高)或0.2(低)mg/Kg。左上图显示以初始体重百分比表示的平均重量变化；3幅下图显示个别小鼠的体重减轻％；右上图为卡普兰-迈耶存活曲线；上方(下图)或下方(上图)的灰色条指示处理时段(SEM；n＝10/组)。
图127含有在结肠炎模型中获得的数据，显示INX234V处理防止T细胞扩增和活化。在实验中，从第21天至第80天每周一次向小鼠腹膜内给与10mg/Kg(和0.2mg/Kg V有效负载(适当时))的INX234V或INX234和2(高)或0.2(低)mg/Kg的Dex。左上图显示INX234V和INX234对比PBS(左)以及高剂量和低剂量的Dex对比PBS(右)的血液中的初始T细胞数；左下图和右下图指示同一组的CD45RB+CD4+T细胞的频率；上方的灰色条指示处理时段(SEM；n＝10/组，INX234处理组(其中n＝5)除外)。
具体实施方式
本文提供新颖糖皮质激素、糖皮质激素-接头和抗体药物偶联物(ADC)，所述抗体药物偶联物包含结合至免疫细胞上表达的抗原(典型地为人类免疫细胞上表达的抗原)的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，ADC包含抗人VISTA(T细胞活化的V区含免疫球蛋白抑制因子(1))抗体或抗VISTA抗原结合抗体片段，例如，具有短血清半衰期(在人类VISTA敲入啮齿动物中约24-27小时或更短)的片段。在示例性实施方案中，主题ADC快速起效并且长期有效，这是因为它们由大量免疫细胞极有效地内化，在所述免疫细胞中它们裂解而释放大量活性类固醇有效负载。本发明还涉及此类ADC和新颖类固醇用于治疗自身免疫性、过敏性和炎症性疾患的用途。本发明进一步涉及用于减少糖皮质激素的不良副作用和/或增强糖皮质激素的功效的方法，这是通过使用此类ADC将这些抗炎剂选择性地递送至靶免疫细胞，例如单核细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、Treg、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞等，并且特别是骨髓细胞，从而降低类固醇化合物否则会引发的对非靶细胞的潜在毒性。
本文具体提供包含以下的ADC：抗VISTA抗体或抗体片段，典型地其中抗体或抗体片段在生理条件(pH≈7.5)下具有极短血清半衰期，通常血清半衰期在生理条件(约pH7.5)下在人类VISTA敲入啮齿动物中为至72小时、1至32小时、1至16小时、1至8小时、1至4小时或1-2小时±0.5小时或在灵长类动物(食蟹猴)中为约3.5、3、2.5或2.3天±0.5天；和本文所公开的式(I)、(II)或(III)中任一者的糖皮质激素受体激动剂，所述激动剂任选地经由接头连接，例如肽或非肽接头，其任选地在特定条件下可裂解，例如酯酶可裂解的二肽接头，并且所述激动剂任选地经由异双官能团或异三官能团直接或间接连接到抗体，其中此类ADC在向有需要的受试者施用时将此种糖皮质激素受体激动剂递送至靶免疫细胞，例如单核细胞、T细胞、嗜中性粒细胞、Treg、CD8 T细胞、CD4T细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、NK细胞、巨噬细胞或骨髓细胞，并且引起糖皮质激素受体激动剂在其中功能性内化，在所述细胞中激动剂引发对炎症的所需抑制作用，而不会引发不良副作用或引发基本上减少的不良副作用，例如对非靶细胞的毒性。进一步提供制备此类ADC的方法和其使用方法，特别是用于治疗自身免疫性、过敏性和炎症性疾患，例如先前鉴定的那些。
更具体地提供具有以下式(I)结构的糖皮质激素激动剂化合物：
X选自苯基、螺[3.3]庚烷、3-6元杂环、环烷基、螺烷基、螺杂环烷基、双环烷基、杂双环烷基、[1.1.1]双环戊烷、双环[2.2.2]辛烷、金刚烷和立方烷，其各自可被1-4个独立地选自F、Cl、Br、I、N、S和O的杂原子取代，其中每个环结构可含有至少一个选自N、S和O的骨架杂原子，并且任选地进一步被1-4个C1-3烷基或C1-3全氟烷基取代；
Z选自苯基、螺[3.3]庚烷、3-6元杂环、环烷基、螺烷基、螺杂环烷基、双环烷基、杂双环烷基、[1.1.1]双环戊烷、双环[2.2.2]辛烷、金刚烷和立方烷，其各自可被1-4个独立地选自F、Cl、Br、I、N、S和O的杂原子取代，其中每个环结构可含有至少一个选自N、S和O的骨架杂原子，并且任选地进一步被1-4个C1-3烷基或C1-3全氟烷基取代；
Y选自CHR1、O、S和NR1；
E选自CH2和O；
G选自CH和N；
进一步其中当G为CH并且X为苯基时，Z不为苯基；
G与X的键联可任选地选自C1-3烷基和环氧乙烷，其各自可被1-4个独立地选自N、S和O的杂原子取代并且任选地进一步被1-4个C1-3烷基取代；
X与Z的键联可占据X和Z上的任何可用位置；
取代基NR1R2可占据Z上的任何可用位置；
R1选自H、1-8个碳的直链或支链烷基、芳基和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
当R1为H时，R2可选自H、1-8个碳的直链或支链烷基、芳基和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
当R1为H、1-8个碳的直链或支链烷基、或杂芳基时，R2可为选自以下的官能团：
[(C＝O)CH(W)NH]m-[C＝O]-[V]k-J，
(C＝O)OCH2-对氨基苯基-N-V-J，
(C＝O)OCH2-对氨基苯基-N-[(C＝O)CH(W)NH]m-[C＝O]-[V]k-J，和
[V]k-(C＝O)OCH2-对氨基苯基-N-[(C＝O)CH(W)NH]m-[C＝O]-J，
其中m＝1-6，k＝0-1，并且W的每个置换可独立地选自H、[(CH2)nR3](其中n＝1-4)、以R3为末端的支链烷基链，和包含1-13个单元的直链或支链聚环氧乙烷基团；
R3选自H、甲基、乙基、异丙基、OH、O-烷基、NH2、NH-烷基、N-二烷基、SH、S-烷基、胍、脲、羧酸、羧酰胺、羧酸酯、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基，其中所述芳基和杂芳基取代基可选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-；
V可选自1-8个碳的烷基链；包含1-13个单元的直链或支链聚环氧乙烷基团；包含1-8个碳的直链或支链烷基；-O-烷基；羧酸；羧酰胺；羧酸酯；烷基-C(O)O-；烷基氨基-C(O)-；二烷基氨基C(O)-；1-3个氨基酸的序列，其中每个氨基酸独立地选自Glu、Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、βAla、Phe、Val和Cit；芳基；和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-、二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
J为选自以下的反应基团：-NH2、N3、硫基、环辛炔、-OH、-CO2H、反式环辛烯、炔基、炔丙基、
其中R32选自Cl、Br、F、甲磺酸酯和甲苯磺酸酯，并且R33选自Cl、Br、I、F、OH、-O-N-丁二酰亚胺基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基，R34为H、Me、四嗪-H和四嗪-Me；
R5选自由-CH2OH、-CH2SH、-CH2Cl、-SCH2Cl、-SCH2F、-SCH2CF3、羟基、-OCH2CN、-OCH2Cl、-OCH2F、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH2CN和组成的组；
R6和R7独立地选自氢和C1-10烷基；
Q可为H、C(O)R8(其中R8为1-8个碳的直链或支链烷基)，或(C＝O)NR4CHnNR4(C＝O)OCH2-(V)n-J(其中n＝1-4并且R4＝H、烷基或支链烷基)，或P(O)OR4；
A1和A2独立地选自H和F；并且
除非另有规定，否则要求保护所有可能的立体异构体。
进一步提供具有式(II)结构的糖皮质激素激动剂化合物：
其中
Y选自CH2和O；
E选自CH2和O；
G选自CH和N；
L选自H和F；
R5选自-CH2OH、-SCH2F和
A1和A2独立地选自H和F；
V可选自1-8个碳的烷基链；包含1-13个单元的直链或支链聚环氧乙烷基团；包含1-8个碳的直链或支链烷基；-O-烷基；羧酸；羧酰胺；羧酸酯；烷基-C(O)O-；烷基氨基-C(O)-；二烷基氨基C(O)-；1-3个氨基酸的序列，其中每个氨基酸独立地选自Glu、Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、βAla、Phe、Val和Cit；芳基；和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-、二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
J为选自以下的反应基团：-NH2、N3、硫基、环辛炔、-OH、-CO2H、反式环辛烯、炔基、炔丙基、
其中R32选自Cl、Br、F、甲磺酸酯和甲苯磺酸酯，并且R33选自Cl、Br、I、F、OH、-O-N-丁二酰亚胺基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基，R34为H、Me、四嗪-H和四嗪-Me。
还提供具有式(III)结构的糖皮质激素激动剂化合物：
其中
Y选自CH2和O；
E选自CH2和O；
G选自CH和N；
L选自H和F；
R5选自-CH2OH、-SCH2F和
A1和A2独立地选自H和F；
V可选自1-8个碳的烷基链；包含1-13个单元的直链或支链聚环氧乙烷基团；包含1-8个碳的直链或支链烷基；-O-烷基；羧酸；羧酰胺；羧酸酯；烷基-C(O)O-；烷基氨基-C(O)-；二烷基氨基C(O)-；1-3个氨基酸的序列，其中每个氨基酸独立地选自Glu、Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、βAla、Phe、Val和Cit；芳基；和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-、二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
J为选自以下的反应基团：-NH2、N3、硫基、环辛炔、-OH、-CO2H、反式环辛烯、炔基、炔丙基、
其中R32选自Cl、Br、F、甲磺酸酯和甲苯磺酸酯，并且R33选自Cl、Br、I、F、OH、-O-N-丁二酰亚胺基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基，R34为H、Me、四嗪-H和四嗪-Me。
还提供糖皮质激素激动剂-接头化合物，所述化合物包含连接到可裂解或不可裂解接头的具有式(I)、(II)或(III)结构的糖皮质激素激动剂。
进一步提供ADC，所述ADC包含结合至免疫细胞抗原(例如VISTA)的抗体，所述抗体连接到具有式(I)、(II)或(III)结构的糖皮质激素激动剂，所述激动剂继而连接到可裂解或不可裂解接头。
另外提供包含所述糖皮质激素激动剂、糖皮质激素激动剂-接头和含有其的ADC的组合物和药剂。
进一步提供此类糖皮质激素激动剂、糖皮质激素激动剂-接头和含有其的ADC的治疗和预防用途，尤其是用于治疗炎症性、过敏性和自身免疫性疾患。
除非另有定义，否则在一般理解下，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等效的方法和材料可用于本发明或本发明的测试中，但本文描述适合的方法和材料。材料、方法和实施例仅为说明性的，并且不旨在具有限制性。本文所述的与分析化学、合成有机化学和药物与医药化学相结合利用的命名法以及实验室程序和技术是本领域中熟知和常用的那些。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者治疗。
定义
为有助于理解本公开，下文定义许多术语和短语。
除非上下文另有明确规定，否则如本文的描述和所附权利要求书通篇所用，“一个”、“一种”和“所述”的含义包括多个指示物。
在本公开中，术语“糖皮质激素”或“类固醇”是指与糖皮质激素受体相互作用的天然存在或合成的类固醇激素。非限制性示例性糖皮质激素包括尤其WO 2009/069032、US20180126000、WO05/028495中所述的那些并且优选是指式I、II或III的新颖糖皮质激素激动剂，以及本文所公开的糖皮质激素激动剂-接头和含有其的ADC。已知糖皮质激素的非限制性实例包括：
WO 2009/069032中描述其他已知糖皮质激素。糖皮质激素的具体实例包括16-α羟基泼尼松龙、地塞米松、二氟松、氟米松、氟尼缩松、醋酸氟轻松、丙酸氟替卡松、环索奈德、甲基泼尼松龙、泼尼松、泼尼松龙、莫美他松、曲安奈德和式I、II或III的新颖糖皮质激素激动剂，以及本文所公开的糖皮质激素激动剂-接头和含有其的ADC。
“糖皮质激素衍生物”是通过添加或去除一个或多个原子或官能团所得的化合物，以促进“糖皮质激素衍生物”与另一部分，例如接头和/或抗体或抗体片段的连接。通常，这种添加或去除不会阻碍“糖皮质激素衍生物”的活性，即，其在由免疫细胞内化后引发抗炎活性的能力。“糖皮质激素衍生物”具体包括“糖皮质激素的基团”或“糖皮质激素基团”。
“糖皮质激素的基团”或“糖皮质激素基团”是通过从母体糖皮质激素去除一个或多个原子，即氢原子而产生，以促进母体糖皮质激素与另一部分(典型地为接头)的连接。例如，可从母体糖皮质激素的任何适合的-NH2基团中去除氢原子；可从母体糖皮质激素的任何适合的-OH基团中去除氢原子；可从任何适合的-SH基团中去除氢原子；可从任何适合的-N(H)-基团中去除氢原子；从母体糖皮质激素的任何适合的-CH3、-CH2-或-CH＝基团中去除氢原子。
在本公开中，术语“异双官能团”或术语“异三官能团”是指任选地可用于连接接头和抗VISTA抗体或抗体片段的化学部分(本文所公开的ADC的通式中的“Q”)。异双官能团和异三官能团的特征在于在化学部分的任一端具有不同反应基团。非限制性示例性异双官能团在美国公开第20180126000号(通过引用并入本文)中公开，并且在示例性实施方案章节中和实施例(例如实施例3)中公开的ADC偶联物中和本申请的图118A-O的化合物中进一步示例。
异双官能团和异三官能团在本领域中熟知用于特异性地产生蛋白质偶联物和抗体药物偶联物(ADC)。这些部分的特征在于在化学部分的任一端具有不同反应基团。非限制性示例性异双官能团包括：
示例性异三官能团
基团为：
如本文所用，术语“抗体”和“多个抗体”是技术术语并且在本文中可互换使用并且是指具有特异性地结合抗原的抗原结合位点的分子。
术语“抗体”意指经由免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性地结合至靶标如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述的组合的免疫球蛋白分子。如本文所用，术语“抗体”涵盖完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、包含抗体的融合蛋白和任何其他经修饰的免疫球蛋白分子，只要抗体表现出所需生物活性即可。抗体可属于免疫球蛋白的任何五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其子类(同型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，这是基于其重链恒定结构域的身份，分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白具有不同和熟知的亚基结构和三维构型。抗体可为裸的或偶联至其他分子，例如毒素、放射性同位素等。如本文所用，术语“抗体”涵盖双特异性和多特异性抗体。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分。“抗原结合片段”是指结合至抗原的完整抗体的一部分。抗原结合片段可含有完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体和单链抗体。“抗原结合片段”可为双特异性或多特异性抗原结合片段。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体为抑制或降低其结合的抗原如VISTA的生物活性的抗体。在一些实施方案中，阻断抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。生物活性可降低10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。
“促进”抗体或“增强”抗体、“激动剂”抗体是增强或增加其结合的抗原如VISTA的生物活性的抗体。在一些实施方案中，阻断抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。生物活性可降低10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。
术语“抗VISTA抗体”或“结合至VISTA的抗体”是指以足够的亲和力特异性地结合VISTA(通常为人类VISTA)的抗体，使得所述抗体适用于靶向表达VISTA的免疫细胞。如通过例如放射免疫测定(RIA)所测量，抗VISTA抗体与无关的非VISTA蛋白质的结合程度可小于抗体与VISTA的结合的约10％。在某些实施方案中，结合至VISTA的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。主题ADC中所包含的示例性抗VISTA抗体和片段将包含与VSTB94或VSTB49-116中相同的CDR和/或相同的可变重链和轻链多肽，即，分别具有图8、图10和图12中所示的序列。
“单克隆”抗体或其抗原结合片段是指单个抗原决定子或表位的高度特异性识别和结合中所涉及的同质抗体或抗原结合片段群体。这与典型地包括针对不同抗原决定子的不同抗体的多克隆抗体成对比。术语“单克隆”抗体或其抗原结合片段涵盖完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白，和包含抗原识别位点的任何其他经修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆”抗体或其抗原结合片段是指以许多方式制备的此类抗体和其抗原结合片段，所述方式包括但不限于杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物。
术语“人源化”抗体或其抗原结合片段是指非人类(例如鼠类)抗体或抗原结合片段的形式，其为特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其含有最小非人类(例如鼠类)序列的片段。典型地，人源化抗体或其抗原结合片段为人类免疫球蛋白，其中来自互补决定区(CDR)的残基被来自非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠)的CDR的具有所需特异性、亲和力和能力的残基代替(“CDR移植”)(Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science 239:1534-1536(1988))。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被来自非人类物种的具有所需特异性、亲和力和能力的抗体或片段中的相应残基代替。人源化抗体或其抗原结合片段可通过取代Fv框架区中和/或被代替的非人类残基内的额外残基来进一步修饰以改进和优化抗体或其抗原结合片段的特异性、亲和力和/或能力。一般而言，人源化抗体或其抗原结合片段将包含基本上全部的至少一个并且典型地两个或三个可变结构域，所述可变结构域含有全部或基本上全部对应于非人类免疫球蛋白的CDR区，而全部或基本上全部的FR区为人类免疫球蛋白共有序列的那些区。人源化抗体或其抗原结合片段还可包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，典型地为人类免疫球蛋白的至少一部分。用于产生人源化抗体的方法的实例描述于美国专利第5,225,539号；Roguska等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91(3):969-973(1994)；和Roguska等人,Protein Eng.9(10):895-904(1996)中。在一些实施方案中，“人源化抗体”为表面重修的抗体。
抗体的“可变区”是指单独或组合的抗体轻链可变区或抗体重链可变区。重链和轻链的可变区各自由四个框架区(FR)组成，所述框架区(FR)由三个互补决定区(CDR)，也称为高变区连接。每个链中的CDR由FR紧密相连，并且与来自另一条链的CDR一起有助于形成抗体的抗原结合位点。至少有两种用于确定CDR的技术：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即，Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第5版,1991,National Institutes of Health,Bethesda Md.))；和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani等人,(1997)J.Molec.Biol.273:927-948))。另外，这两种方法的组合有时在本领域中用于确定CDR。
当提及可变结构域中的残基时通常使用Kabat编号系统(大约为轻链的残基1-107和重链的残基1-113)(例如Kabat等人,Sequences of Immunological Interest.第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。除非另有明确指示，否则本文所用的编号系统是Kabat编号系统。
Kabat中的氨基酸位置编号是指Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)中用于抗体汇编的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这种编号系统，实际线性氨基酸序列可含有对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入的较少或额外氨基酸。例如，重链可变结构域可包括在H2的残基52之后的单个氨基酸插入物(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后插入的残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。通过抗体序列的同源区域与“标准”Kabat编号序列进行比对，可确定给定抗体的残基的Kabat编号。取而代之地，Chothia是指结构环的位置(Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。当使用Kabat编号规约编号时，Chothia CDR-H1环的末端取决于环的长度而在H32与H34之间变化(这是因为Kabat编号方案将插入置于H35A和H35B处；如果35A和35B都不存在，则环在32处结束；如果仅35A存在，则环在33处结束；如果35A和35B都存在，则环在34处结束)。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，并且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。
在某些方面，抗体或其抗原结合片段的CDR可根据Chothia编号方案确定，所述编号方案是指免疫球蛋白结构环的位置(参见例如Chothia C和Lesk A M,(1987),J MolBiol 196:901-917；Al-Lazikani B等人,(1997)J Mol Biol 273:927-948；Chothia C等人,(1992)J Mol Biol227:799-817；Tramontano A等人,(1990)J Mol Biol 215(1):175-82；和美国专利第7,709,226号)。典型地，当使用Kabat编号规约时，Chothia CDR-H1环存在于重链氨基酸26至32、33或34处，Chothia CDR-H2环存在于重链氨基酸52至56处，并且Chothia CDR-H3环存在于重链氨基酸95至102处，而Chothia CDR-L1环存在于轻链氨基酸24至34处，Chothia CDR-L2环存在于轻链氨基酸50至56处，并且Chothia CDR-L3环存在于轻链氨基酸89至97处。当使用Kabat编号规约编号时，Chothia CDR-H1环的末端取决于环的长度而在H32与H34之间变化(这是因为Kabat编号方案将插入置于H35A和H35B处；如果35A和35B都不存在，则环在32处结束；如果仅35A存在，则环在33处结束；如果35A和35B都存在，则环在34处结束)。
在某些方面，抗体或其抗原结合片段的CDR可根据Lefranc M-P,(1999)TheImmunologist 7:132-136和Lefranc M-P等人,(1999)Nucleic Acids Res 27:209-212中所述的IMGT编号系统确定。根据IMGT编号方案，VH-CDR1在位置26至35处，VH-CDR2在位置51至57处，VH-CDR3在位置93至102处，VL-CDR1在位置27至32处，VL-CDR2在位置50至52处，并且VL-CDR3在位置89至97处。
在某些方面，抗体或其抗原结合片段的CDR可根据MacCallum R M等人,(1996)JMol Biol 262:732-745确定。还参见例如Martin A.“Protein Sequence and StructureAnalysis of Antibody Variable Domains”,Antibody Engineering,Kontermann和Dubel编,第31章,第422-439页,Springer-Verlag,Berlin(2001)。
在某些方面，抗体或其抗原结合片段的CDR可根据AbM编号方案确定，所述编号方案涉及AbM高变区，所述AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，并且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件(Oxford Molecular Group,Inc.)使用。
抗体的“恒定区”是指单独或组合的抗体轻链恒定区或抗体重链恒定区。
术语“人类”抗体意指由人类产生的抗体或具有对应于通过使用本领域中已知的任何技术人工产生的抗体的氨基酸序列的抗体。人类抗体的此定义包括完整或全长抗体、其片段和/或包含至少一个人类重链和/或轻链多肽的抗体，例如包含鼠类轻链和人类重链多肽的抗体。
术语“嵌合”抗体是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两个或更多个物种的抗体。典型地，轻链和重链的可变区对应于来源于哺乳动物的一个物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特异性、亲和力和能力的抗体可变区，而恒定区与来源于另一个物种(通常为人类)的抗体中的序列同源以避免在所述物种中引发免疫反应。
术语“表位”或“抗原决定子”在本文中可互换使用并且是指能够由特定抗体识别并特异性地结合的抗原部分。当抗原为多肽时，表位可从通过蛋白质的三级折叠而并列的连续氨基酸和非连续氨基酸形成。从连续氨基酸形成的表位典型地在蛋白质变性后保留，而通过三级折叠形成的表位典型地在蛋白质变性后损失。表位典型地包括至少3个并且更通常为至少5个或8-10个呈独特空间构象的氨基酸。图10中鉴定示例性抗VISTA抗体可结合的VISTA上的优选表位。
“结合亲和力”通常是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域中已知的常用方法测量，包括本文所述的那些。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且趋于易解离，而高亲和力抗体通常较快地结合抗原并且趋于结合较长时间。测量结合亲和力的多种方法在本领域中是已知的，其中任一方法可用于本公开的目的。此类方法包括表面等离子体共振(BIAcore)、ELISA、Kinexa生物传感器、闪烁邻近测定、ORIGEN免疫测定(IGEN)、荧光淬灭、荧光转移和/或酵母展示。还可使用适合的生物测定来筛选结合亲和力。在本申请中，示例性ADC中包含的示例性抗VISTA抗体的Kd是通过表面等离子体共振(SPR)方法在ProteOn仪器上确定。
当在本文中用于指结合亲和力时，“或更好”是指分子与其结合伴侣之间更强的结合。当在本文中使用时，“或更好”是指更强的结合，由更小的Kd数值表示。例如，抗体对抗原的亲和力为“0.6nM或更好”，所述抗体对抗原的亲和力<0.6nM，即，0.59nM、0.58nM、0.57nM等或小于0.6nM的任何值。
“特异性地结合”通常意指抗体经由其抗原结合结构域结合至表位，并且所述结合需要抗原结合结构域与表位之间的某种互补性。根据此定义，当抗体相比结合至随机无关表位更易于经由其抗原结合结构域结合至某种表位时，据称抗体“特异性地结合”至所述表位。术语“特异性”在本文中用于限定某种抗体结合至某种表位的相对亲和力。例如，可认为抗体“A”对给定表位比抗体“B”具有更高的特异性，或者可据称抗体“A”以比对相关表位“D”所具有的特异性更高的特异性结合至表位“C”。
“优先结合”意指抗体相比结合至相关、相似、同源或类似的表位更易于特异性地结合至某种表位。因此，“优先结合”至给定表位的抗体相比相关表位将更可能结合至所述表位，即使此种抗体可能与相关表位交叉反应。
如果抗体优先结合至给定表位或重叠表位达到其在一定程度上阻断参考抗体与所述表位的结合的程度，则据称抗体“竞争性地抑制”参考抗体与所述表位的结合。竞争性抑制可通过本领域中已知的任何方法确定，例如竞争ELISA测定。可据称抗体竞争性地使参考抗体与给定表位的结合抑制至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。
“同型”在本文中是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM、IgG1、IgG3、IgG3或IgG4)。
如本文所用，“K-assoc”或“Ka”泛指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而如本文所用，术语“Kdiss”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。
如本文所用，术语“KD”旨在是指解离常数，其从Kd与Ka的比率(即，Kd/Ka)获得并表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可使用本领域中充分确立的方法确定，例如等离子体共振ELISA和KINEXA。用于确定抗体的KD的优选方法是通过使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统，例如/>系统，或通过ELISA。典型地，这些方法在25℃或37℃下实施。在25℃或37℃下通过表面等离子体共振确定时，用于治疗用途的抗体通常将具有50nM或更小或更典型地为1nM或更小的KD。
短语“Kd”在本文中是指抗体与其抗原之间的平衡解离常数Kd，所计算的Koff/Kon比率。缔合常数(Kon)用于表征抗体结合至其靶标的速度。在本文中，抗体Kd是通过表面等离子体共振(SPR)使用Proteon仪器确定。
短语“PK”在本文中是指以下物质的一半量保留于血清中的外周循环中的体内半衰期或持续时间(时间)：抗体或抗体片段或抗体药物偶联物(ADC)，优选为根据发明的抗VISTA或抗体片段(即，包含在生理pH下结合至VISTA表达细胞的抗VISTA抗体或抗体片段)和抗炎剂(AI)，所述AI为需要细胞内化以实现功效(抗炎活性)的小分子并且典型地为类固醇并且更典型地为式I、II或III的糖皮质激素激动剂。PK可在施用抗体或抗体片段或ADC的受试者中体内确定，例如人类VISTA敲入啮齿动物或灵长类动物(例如人类或食蟹猴)。如下文所指出，根据本发明的ADC中包含的抗VISTA抗体典型地将包括短PK，即，通常在食蟹猴中约为2.3±0.7天并且典型地至多约2.5天，并且更典型地在人类VISTA敲入啮齿动物中仅一天、数小时或更短时间。
短语“PD”在本文中是指根据本发明的抗体或抗体药物偶联物(ADC)的剂量的持续时间(时间)，例如包含在生理pH下结合至VISTA表达细胞的抗VISTA抗体或抗体片段和抗炎剂(AI)，所述AI为需要细胞内化以实现功效(抗炎活性)的小分子并且典型地为类固醇并且更典型地包含式I、II或III的糖皮质激素激动剂，其在内化至靶细胞后引发功效(抗炎活性)。如本文所公开的类固醇，例如式I、II或III的糖皮质激素激动剂或糖皮质激素激动剂-接头和含有其的ADC的PD可通过不同测定来确定。例如，根据本发明的VISTA ADC的PD可使用与ADC接触的表达VISTA的免疫细胞体外确定，或可在施用ADC剂量的受试者，例如啮齿动物或灵长类动物(例如人类或食蟹猴)中体内确定。另外，因为示例性抗VISTA ADC结合至不同免疫细胞(例如T细胞、Treg、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞)，并且进一步因为这些ADC基于在所述免疫细胞上与其结合的抗原的相对表达(例如VISTA表达)而不同地内化不同类型的免疫细胞，并且进一步因为此类免疫细胞的周转率不同，所以如果使用不同类型的免疫细胞，例如表达VISTA的免疫细胞体外确定，则PD值将不同。通常在本文中，在抗VISTA ADC的情况下，PD是基于由巨噬细胞引发的抗炎活性的持续时间表示，这是因为这些细胞存在于循环中并且(令人惊讶地)已证明根据本发明的包含VISTA抗体的ADC在巨噬细胞中引发延长的抗炎活性，例如在ADC施用后数周或甚至一个月。然而，如果ADC相比于VISTA靶向不同免疫细胞，例如B或NK细胞，则PD潜在地将通过检测这些细胞中的炎性活动来确定，这是因为糖皮质激素激动剂的内化将在这些细胞中。
短语“PD/PK比率”在本文中是指在特定物种的免疫细胞中或在动物模型中体外或体内确定的根据本发明的ADC的PD和PK比率值，例如在抗VISTA ADC的情况下在人类VISTA敲入啮齿动物中或灵长类动物(例如人类或食蟹猴)中。[如下文所示，已证明根据本发明的抗VISTA ADC的PD/PK比率高得惊人，即，已证明在VISTA敲入啮齿动物和食蟹猴中高达14:1或28:1。此外，预计在人类和其他非人类灵长类动物中获得类似或更高的PD/PK比率，这是因为在啮齿动物和人类和灵长类动物中不同免疫细胞对VISTA的表达极为相似，并且进一步因为药物代谢在啮齿动物中通常比在人类和非人类灵长类动物中更快地发生。尽管申请人不希望受此理论约束；但在根据本发明的包含VISTA抗体的ADC的情况下，据认为主题ADC以极高的量内化特定类型的VISTA表达细胞，这是因为这些免疫细胞上高密度的表面VISTA表达明显产生“贮库效应”，即，内化ADC的贮库极缓慢地代谢，从而提供治疗有效(抗炎)量的抗炎剂(例如类固醇，例如式I、II或III的糖皮质激素激动剂或糖皮质激素激动剂-接头或含有其的ADC)的令人惊讶的延长释放。
“起效”是指治疗剂，例如类固醇或ADC偶联物的功效体内开始的时间。在本发明中，这可在施用根据本发明的式I、II或III的糖皮质激素激动剂或糖皮质激素激动剂-接头或ADC偶联物的受试者中，使用检测类固醇的抗炎功效的已知体内测定来检测。如下文所公开，已显示根据本发明的抗VISTA ADC快速起效，即，在人类VISTA敲入啮齿动物中约2小时。
如本文所用，短语“基本上相似”或“基本上相同”表示两个数值之间足够高的相似度(通常，一个数值与本公开的抗体相关，并且另一个数值与参考/比较抗体相关)，使得本领域技术人员将认为两个值之间的差异在由所述值(例如Kd值)测量的生物特征的情形中具有极少或无生物和/或统计显著性。所述两个值之间的差异基于参考/比较抗体的值可小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％或小于约10％。
“经分离”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物为自然界中未发现的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。经分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已纯化至不再呈自然界中发现的形式的程度的那些。在一些实施方案中，分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。
如本文所用，“基本上纯”是指至少50％纯(即，不含污染物)、至少90％纯、至少95％纯、至少98％纯或至少99％纯的材料。
如本文所用，术语“免疫偶联物”、“偶联物”、“抗体-药物偶联物”或“ADC”是指连接到抗VISTA抗体或其片段的化合物或其衍生物和抗炎剂(例如糖皮质激素激动剂)和通常介入的接头，其可由通式：(AI-L-Q)n-A表示，其中AI＝抗炎剂，通常为小分子糖皮质激素受体激动剂，例如本文所公开的根据式1、II或III的糖皮质激素激动剂化合物，L＝接头，Q＝异双官能团、异三官能团或不存在，并且A＝在生理pH下优先结合至人类VISTA并且通常具有如前所述的短pK的抗VISTA抗体或其VISTA结合片段，并且n为大于1，任选地1-10的整数。免疫偶联物也可由相反次序的通式定义：A-(Q-L-AI)n。
在本公开中，术语“接头”是指能够将抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)或功能等效物连接到抗炎剂药物，通常为糖皮质激素受体激动剂，例如式I、II或III的糖皮质激素激动剂的任何化学部分。接头可能易发生裂解(“可裂解接头”)，从而有助于释放抗炎剂，例如糖皮质激素。例如，在使得糖皮质激素和/或抗体在内化至免疫细胞如嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、T细胞、树突状细胞、Treg、NK细胞、B细胞、肥大细胞、巨噬细胞或骨髓细胞以及其他免疫细胞类型中之前或之后保持活性的条件下，此类可裂解接头可能易发生酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解。或者，接头可基本上对裂解具有抗性(“不可裂解接头”)。
不可裂解接头包括能够以稳定的共价方式将抗炎剂如式I、II或III的糖皮质激素激动剂连接到抗体并且不属于上文对于可裂解接头所列出的种类的任何化学部分。因此，不可裂解接头基本上对酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解具有抗性。此外，在糖皮质激素和/或抗体在内化至免疫细胞如单核细胞或骨髓细胞中之前或之后不会损失其活性的条件下，不可裂解是指接头中或与接头相邻的化学键耐受由酸、光不稳定性裂解剂、肽酶、酯酶或使二硫键裂解的化学或生理化合物诱导的裂解的能力。
一些可裂解接头由肽酶裂解(“肽酶可裂解接头”)。仅某些肽在细胞内或细胞外易裂解，参见例如Trout等人,79Proc.Natl.Acad.Sci.USA,626-629(1982)和Umemoto等人,43Int.J.Cancer,677-684(1989)。此外，肽由α-氨基酸单元和肽键组成，所述肽键在化学上为一个氨基酸的羧酸酯与第二个氨基酸的氨基之间的酰胺键。其他酰胺键，例如羧酸酯与赖氨酸的α氨基酸基团之间的键，应理解为并非肽键并且视为不可裂解的。
一些接头由酯酶裂解(“酯酶可裂解接头”)。仅某些酯可由存在于细胞内或细胞外的酯酶裂解。酯是通过羧酸与醇的缩合形成。简单酯是用简单醇(例如脂族醇)和小环醇和小芳族醇产生的酯。
在一些实施方案中，可裂解接头组分可包含含有一至十个氨基酸残基的肽。在这些实施方案中，肽允许接头由蛋白酶裂解，从而有助于在暴露于细胞内蛋白酶如溶酶体酶后释放抗炎剂，例如糖皮质激素(Doronina等人,(2003)Nat.Biotechnol.21:778-784)。示例性肽包括但不限于二肽、三肽、四肽和五肽。示例性二肽包括但不限于丙氨酸-丙氨酸(ala-ala)、缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)；苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)；苯丙氨酸-高赖氨酸(phe-homolys)；和N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。示例性三肽包括但不限于甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)以及“示例性实施方案”章节中鉴定和本申请的实施例3中实施的特定接头。
肽可包括天然存在和/或非天然的氨基酸残基。术语“天然存在的氨基酸”是指Ala、Asp、Cys、Glu、Phe、Gly、His、He、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr。“非天然氨基酸”(即，氨基酸不天然存在)包括(作为非限制性实例)高丝氨酸、高精氨酸、瓜氨酸、苯甘氨酸、牛磺酸、碘酪氨酸、硒半胱氨酸、正亮氨酸(“Nle”)、正缬氨酸(“Nva”)、β-丙氨酸、L-萘丙氨酸或D-萘丙氨酸、鸟氨酸(“Orn”)等。可对肽进行设计和优化以由特定酶，例如肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D或纤溶酶蛋白酶进行酶促裂解。
氨基酸还包括天然和非天然氨基酸的D型。“D-”指定具有“D”(右旋)构型的氨基酸，与天然存在的(“L-”)氨基酸中的构型相反。天然和非天然氨基酸可商业购买(SigmaChemical Co.,Advanced Chemtech)或使用本领域中已知的方法合成。
术语“药物抗体比率”或“DAR”是指抗炎剂或功能衍生物(即，来源于小分子糖皮质激素受体激动剂，例如式I、II或III的糖皮质激素的基团)的数目。因此，在具有通式(AI-L-Q)n-A或相反通式的免疫偶联物中，DAR由变量“n”定义。典型地，在主题ADC中“n”在1-12范围内。
当提及代表个别免疫偶联物的具有式(AI-L-Q)n-A的化合物时，DAR是指发炎剂或功能衍生物(例如来源于小分子糖皮质激素受体激动剂，例如糖皮质激素如地塞米松或布地奈德或式I、II或III的新颖糖皮质激素的基团)的数目，其连接到A(例如，n任选地为1至12的整数或分数)，连接到特定A(例如，n为1至12的整数)。
当提及代表多种免疫偶联物的具有式(AI-L-Q)n-A的化合物时，DAR是指由接头连接的抗炎剂或功能衍生物(例如来源于小分子糖皮质激素受体激动剂，例如糖皮质激素如式I、II或III的新颖类固醇的基团)的平均数目，其连接到A(例如，n为1至12的整数或分数)。因此，举例来说，包含每个A具有3个AI的第一免疫偶联物和每个A具有4个AI的第二免疫偶联物的具有式(AI-L-Q)n-A的化合物将具有3.5的DAR(即，“n”)。
术语“受试者”是指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人类、非人类灵长类动物、啮齿动物等，其将成为特定治疗的接受者。典型地，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用以指代人类受试者。
术语“药物制剂”是指如下制剂：其呈允许活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对将施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的额外组分。制剂可为无菌的。
如本文所公开的ADC或糖皮质激素受体激动剂的“有效量”为足以实现特别规定的目的的量。可根据规定的目的确定“有效量”。
术语“治疗有效量”是指有效“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或病症的免疫偶联物或糖皮质激素受体激动剂的量。“预防有效量”是指有效实现所需预防结果的量。
例如“治疗”或“治疗法”或“以治疗”或“缓解”或“以缓解”等术语是指治愈、减缓、减轻所诊断的病理疾患或病症的症状和/或停止所述病理疾患或病症的进展的治疗措施。因此，需要治疗的那些包括已诊断为患有或疑似患有病症的那些。预防或防治措施是指防止和/或减缓所靶向的病理疾患或病症的发展。因此，需要预防或防治措施的那些包括易患有病症的那些和有待预防病症的那些。
如本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或可由DNA或RNA聚合酶并入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和其类似物。如果存在，则可在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可间插有非核苷酸组分。多核苷酸可在聚合后进一步修饰，例如通过与标记组分偶联。其他类型的修饰包括例如“帽”；用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，例如具有不带电荷的键联(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和具有带电荷的键联(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些；含有侧基部分，例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的那些；具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的那些；含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些；含有烷基化剂的那些；具有经修饰的键联(例如，α变旋异构核酸等)的那些；以及未修饰形式的多核苷酸。此外，通常存在于糖中的羟基中的任一者可例如由膦酸酯基团、磷酸酯基团代替，由标准保护基团保护，或经活化以制备与额外核苷酸的额外键联，或可偶联至固体支撑物。5'和3'末端OH可被磷酸化或被胺或1至20个碳原子的有机封端基团部分取代。其他羟基也可衍生为标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域中通常已知的类似形式的核糖或脱氧核糖，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-变旋异构糖、差向异构糖(例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物(例如甲基核苷)。一个或多个磷酸二酯键联可由替代性连接基团代替。这些替代性连接基团包括但不限于其中磷酸酯由P(O)S(“硫代酯”)、P(S)S(“二硫代酯”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲缩醛”)代替的实施方案，其中每个R或R'独立地为H或任选地含有醚(--O--)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基的被取代或未被取代的烷基(1-20C)。多核苷酸中并非所有键联都需要相同。前述描述适用于本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
术语“载体”意指能够在宿主细胞中递送和任选地表达一个或多个所关注的基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体、囊封于脂质体中的DNA或RNA表达载体，和某些真核细胞，例如生产细胞。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指代任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可为线性或分支的，其可包含经修饰的氨基酸，并且其可间插有非氨基酸。所述术语还涵盖已天然地或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记组分的偶联。所述定义还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域中已知的其他修饰的多肽。应了解，因为本公开的多肽是基于抗体，所以在某些实施方案中，多肽可作为单链或缔合链存在。
在两个或更多个核酸或多肽的情形中，术语“同一”或“同一性”百分比是指两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，当进行比较和比对(必要时，引入空位)以获得最大对应时，不考虑将任何保守氨基酸取代作为序列同一性的一部分。同一性百分比可使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量。本领域中已知可用于获得氨基酸或核苷酸序列比对的各种算法和软件。序列比对算法的一个此种非限制性实例为Karlin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:2264-2268(1990)中所述的算法，如在Karlin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,90:5873-5877(1993)中进行修改，并且并入NBLAST和XBLAST程序(Altschul等人,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402(1991))中。在某些实施方案中，可如Altschul等人,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997)中所述使用带空位BLAST。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等人,Methods in Enzymology,266:460-480(1996))、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,Calif.)或Megalign(DNASTAR)是可用于比对序列的额外公开可用的软件程序。在某些实施方案中，使用GCG软件中的GAP程序(例如使用NWSgapdna.CMP矩阵，以及40、50、60、70或90的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重)确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。在某些替代性实施方案中，GCG软件包中结合Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))的算法的GAP程序可用于确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比(例如使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5的长度权重)。或者，在某些实施方案中，使用Myers和Miller(CABIOS,4:11-17(1989))的算法确定核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比。例如，可使用ALIGN程序(版本2.0)和使用带有残基表的PAM120、12的空位长度罚分和4的空位罚分来确定同一性百分比。本领域技术人员可通过特定比对软件确定最大比对的适当参数。在某些实施方案中，使用比对软件的默认参数。在某些实施方案中，第一氨基酸序列与第二序列氨基酸的同一性百分比“X”计算为100倍(Y/Z)，其中Y为在第一序列与第二序列的比对(通过目视检查或特定序列比对程序进行比对)中评定为同一匹配的氨基酸残基数，并且Z为第二序列中的残基总数。如果第一序列的长度长于第二序列，则第一序列与第二序列的同一性百分比将长于第二序列与第一序列的同一性百分比。
作为非限制性实例，在某些实施方案中，可使用Bestfit程序(WisconsinSequence Analysis Package,Version 8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575Science Drive,Madison,Wis.53711)确定任何特定多核苷酸是否与参考序列具有一定序列同一性百分比(例如至少80％同一、至少85％同一、至少90％同一，并且在一些实施方案中至少95％、96％、97％、98％或99％同一)。Bestfit使用Smith和Waterman(Advances in Applied Mathematics2:482 489(1981))的局部同源性算法以发现两个序列之间的最优选同源性区段。当使用Bestfit或任何其他序列比对程序来确定特定序列是否与根据本公开的参考序列具例如95％同一性时，设置参数以使得同一性百分比在参考核苷酸序列的整个长度上计算并且允许高达参考序列中的核苷酸总数的5％的同源性空位。
在一些实施方案中，当比较和比对最大对应时，如使用序列比较算法或通过目视检查所测量，本公开的两个核酸或多肽基本上同一，意指其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％并且在一些实施方案中至少95％、96％、97％、98％、99％核苷酸或氨基酸残基同一性。同一性可存在于长度为至少约10个、约20个、约40-60个残基或其之间的任何整数值的序列区域上，并且可存在于比60-80个残基更长，例如至少约90-100个残基的区域上，并且在一些实施方案中，序列在所比较的序列的整个长度(例如核苷酸序列的编码区)上基本上同一。
“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被另一个具有类似侧链的氨基酸残基代替的取代。本领域中已定义具有类似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，苯丙氨酸取代酪氨酸是保守取代。在一些实施方案中，本公开的多肽和抗体的序列中的保守取代不会消除含有氨基酸序列的抗体与抗体所结合的抗原(例如VISTA)的结合。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法在本领域中是熟知的(参见例如Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人,Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997))。
如本文所用，“基本上纯”是指至少50％纯(即，不含污染物)、更优选至少90％纯、更优选至少95％纯、更优选至少98％纯、更优选至少99％的材料。
“宿主细胞”包括个别细胞或细胞培养物，其可成为或已成为用于并入多核苷酸插入物的载体的接受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，并且归因于天然、偶然或有意突变，子代可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态或基因组DNA互补方面)。宿主细胞包括用本发明的多核苷酸体内转染的细胞。
术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区。“Fc区”可为原生序列Fc区或变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能不同，但人类IgG重链Fc区通常定义为从位置Cys226或Pro230的氨基酸残基延伸到其羧基末端。Fc区中的残基编号为Kabat中的EU索引的编号。Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构域CH2和CH3。
如本文所用，“Fc受体”和“FcR”描述结合至抗体Fc区的受体。优选的FcR为原生序列人类FcR。此外，优选的FcR为结合IgG抗体(γ受体)的FcR并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRII子类的受体，包括这些受体的等位基因变体和交替剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有类似氨基酸序列，主要在其细胞质结构域中不同。FcR评述于Ravetch和Kinet,1991,Ann.Rev.Immunol.,9:457-92；Capel等人,1994,ImmunoMethods,4:25-34；和de Haas等人,1995,J.Lab.Clin.Med.,126:330-41中。“FcR”还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人,1976,J.Immunol.,117:587；和Kim等人,1994,J.Immunol.,24:249)。
“补体依赖性细胞毒性”和“CDC”是指在补体存在下靶标的溶解。补体活化途径由补体系统的第一组分(C1q)与同源抗原复合的分子(例如抗体)结合而启动。为评估补体活化，可进行CDC测定，例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods,202:163(1996)中所述。
“功能性Fc区”具有原生序列Fc区的至少一种效应功能。示例性“效应功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应功能通常需要将Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，并且可使用本领域中已知用于评价此类抗体效应功能的各种测定进行评估。
“原生序列Fc区”或“内源性FcR”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列同一的氨基酸序列。“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰而不同于原生序列Fc区的氨基酸序列，但仍保留原生序列Fc区的至少一种效应功能的氨基酸序列。优选地，变体Fc区与原生序列Fc区或亲本多肽Fc区相比具有至少一个氨基酸取代，例如在原生序列Fc区中或亲本多肽Fc区中约1个至约10个氨基酸取代，并且优选约1个至约5个氨基酸取代。本文中的变体Fc区将优选与原生序列Fc区和/或与亲本多肽Fc区具有至少约80％序列同一性，并且最优选与其具有至少约90％序列同一性，更优选与其具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％序列同一性。
如本文所用，“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上所结合的抗体并且随后引起靶细胞溶解。所关注的分子的ADCC活性可使用体外ADCC测定来评估，例如美国专利第5,500,362号或第5,821,337号中所述。适用于此类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和NK细胞。或者或另外，所关注的分子的ADCC活性可在体内，例如在例如Clynes等人,1998,PNAS(USA),95:652-656中所公开的动物模型中评估。
在本公开中，单独或作为另一基团的一部分使用的术语“卤基”是指-Cl、-F、-Br或-I。例如，卤基为-Cl或-F。
在本公开中，单独或作为另一基团的一部分使用的术语“羟基”是指-OH。
在本公开中，单独或作为另一基团的一部分使用的术语“硫醇”或术语“巯基”是指-SH。
在本公开中，单独或作为另一基团的一部分使用的术语“烷基”是指未被取代的直链或支链脂族烃，其含有一至十二个碳原子，即C1-12烷基；或指定碳原子数，例如C1烷基(例如甲基)、C2烷基(例如乙基)、C3烷基(例如丙基或异丙基)、C1-3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)，等等。例如，烷基为C1-10烷基。在另一个实例中，烷基为C1-6烷基。在另一个实例中，烷基为C1-4烷基。在另一个实例中，烷基为直链C1-10烷基。在另一个实例中，烷基为支链C3-10烷基。在另一个实例中，烷基为直链C1-6烷基。在另一个实例中，烷基为支链C3-6烷基。在另一个实例中，烷基为直链C1-4烷基。在另一个实例中，烷基为支链C3-4烷基。在另一个实例中，烷基为直链或支链C3-4烷基。非限制性示例性C1-10烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基、3-戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基。非限制性示例性C1-4烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基和异丁基。
在本公开中，单独或作为另一基团的一部分使用的术语“任选地被取代的烷基”是指未被取代或被一个、两个或三个取代基取代的烷基，所述取代基独立地选自由以下组成的组：硝基、羟基、氰基、卤烷氧基、芳氧基、烷硫基、磺酰胺基、烷基羰基、芳基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、羧基、羧酰胺基、烷氧羰基、硫醇、--N(H)C(＝O)NH2和--N(H)C＝NH)NH2、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基。例如，任选地被取代的烷基被两个取代基取代。在另一个实例中，任选地被取代的烷基被一个取代基取代。在另一个实例中，任选地被取代的烷基未被取代。非限制性示例性被取代的烷基包括--CH2OH、--CH2SH、--CH2Ph、--CH2(4-OH)Ph、--CH2(咪唑基)、--CH2CH2CO2H、--CH2CH2SO2CH3、--CH2CH2COPh和--CH2OC(＝O)CH3。
在本公开中，单独或作为另一基团的一部分使用的术语“环烷基”是指未被取代的饱和或部分不饱和(例如含有一个或两个双键)环状脂族烃，其含有一至三个具有三至十二个碳原子(即，C3-12环烷基)或指定碳数的环。在一个实例中，环烷基具有两个环。在另一个实例中，环烷基具有一个环。在另一个实例中，环烷基为饱和的。在另一个实例中，环烷基为不饱和的。在另一个实例中，环烷基为C3-8环烷基。在另一个实例中，环烷基为C3-6环烷基。术语“环烷基”意在包括其中环--CH2--被--C(＝O)--代替的基团。非限制性示例性环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、降冰片基、十氢萘、金刚烷基、环己烯基、环戊烯基和环戊酮。
在本公开中，单独或作为另一基团的一部分使用的术语“任选地被取代的环烷基”是指未被取代或被一个、两个或三个取代基取代的环烷基，所述取代基独立地选自由以下组成的组：卤基、硝基、氰基、羟基、烷基羰氧基、环烷基羰氧基、氨基、卤烷基、羟基烷基、烷氧基、卤烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰胺基、磺酰胺基、烷基羰基、芳基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、羧基、羧基烷基、任选地被取代的烷基、任选地被取代的环烷基、烯基、炔基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的杂环、烷氧基烷基、(氨基)烷基、(羧酰胺基)烷基、(杂环)烷基和--OC(＝O)-氨基。术语任选地被取代的环烷基包括具有稠合的任选地被取代的芳基(例如苯基)或稠合的任选地被取代的杂芳基(例如吡啶基)的环烷基。具有稠合的任选地被取代的芳基或稠合的任选地被取代的杂芳基的任选地被取代的环烷基可在环烷基环上的任何可用碳原子处连接到分子的其余部分。在一个实例中，任选地被取代的环烷基被两个取代基取代。在另一个实例中，任选地被取代的环烷基被一个取代基取代。在另一个实例中，任选地被取代的环烷基未被取代。
在本公开中，单独或作为另一基团的一部分使用的术语“芳基”是指具有六至十四个碳原子的未被取代的单环或双环芳族环系，即，C6-14芳基。非限制性示例性芳基包括苯基(缩写为“Ph”)、萘基、菲基、蒽基、茚基、甘菊环基、联苯基、亚联苯基和芴基。在一个实例中，芳基为苯基或萘基。
在本公开中，本文中单独或作为另一基团的一部分使用的术语“任选地被取代的芳基”是指未被取代或被一至五个取代基取代的芳基，所述取代基独立地选自由以下组成的组：卤基、硝基、氰基、羟基、硫醇、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、任选地被取代的烷基、卤烷基、羟基烷基、烷氧基、卤烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰胺基、磺酰胺基、烷基羰基、芳基羰基、烷基磺酰基、卤烷基磺酰基、环烷基磺酰基、(环烷基)烷基磺酰基、芳基磺酰基、杂芳基磺酰基、杂环磺酰基、羧基、羧基烷基、任选地被取代的环烷基、烯基、炔基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的杂环、烷氧羰基、烷氧基烷基、(氨基)烷基、(羧酰胺基)烷基和(杂环)烷基。
在一个实例中，任选地被取代的芳基是任选地被取代的苯基。在另一个实例中，任选地被取代的苯基具有四个取代基。在另一个实例中，任选地被取代的苯基具有三个取代基。在另一个实例中，任选地被取代的苯基具有两个取代基。在另一个实例中，任选地被取代的苯基具有一个取代基。在另一个实例中，任选地被取代的苯基未被取代。非限制性示例性被取代的芳基包括2-甲基苯基、2-甲氧基苯基、2-氟苯基、2-氯苯基、2-溴苯基、3-甲基苯基、3-甲氧基苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、4-甲基苯基、4-乙基苯基、4-甲氧基苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、2,6-二氟苯基、2,6-二氯苯基、2-甲基、3-甲氧基苯基、2-乙基、3-甲氧基苯基、3,4-二甲氧基苯基、3,5-二氟苯基3,5-二甲基苯基、3,5-二甲氧基、4-甲基苯基、2-氟-3-氯苯基、3-氯-4-氟苯基、4-(吡啶-4-基磺酰基)苯基。术语任选地被取代的芳基包括具有稠合的任选地被取代的环烷基或稠合的任选地被取代的杂环基的苯基。具有稠合的任选地被取代的环烷基或稠合的任选地被取代的杂环基的任选地被取代的苯基可在苯基环上的任何可用碳原子处连接到分子的其余部分。
在本公开中，单独或作为另一基团的一部分使用的术语“烯基”是指含有一个、两个或三个碳碳双键的烷基。在一个实例中，烯基具有一个碳碳双键。在另一个实例中，烯基为C2-6烯基。在另一个实例中，烯基为C2-4烯基。非限制性示例性烯基包括乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、仲丁烯基、戊烯基和己烯基。
在本公开中，本文中单独或作为另一基团的一部分使用的术语“任选地被取代的烯基”是指未被取代或被一个、两个或三个取代基取代的烯基，所述取代基独立地选自由以下组成的组：卤基、硝基、氰基、羟基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、卤烷基、羟基烷基、烷氧基、卤烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰胺基、磺酰胺基、烷基羰基、芳基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、羧基、羧基烷基、任选地被取代的烷基、任选地被取代的环烷基、烯基、炔基、任选地被取代的芳基、杂芳基和任选地被取代的杂环。
在本公开中，单独或作为另一基团的一部分使用的术语“炔基”是指含有一至三个碳碳三键的烷基。在一个实例中，炔基具有一个碳碳三键。在另一个实例中，炔基为C2-6炔基。在另一个实例中，炔基为C2-4炔基。非限制性示例性炔基包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、2-丁炔基、戊炔基和己炔基。
在本公开中，本文中单独或作为一部分使用的术语“任选地被取代的炔基”是指未被取代或被一个、两个或三个取代基取代的炔基，所述取代基独立地选自由以下组成的组：卤基、硝基、氰基、羟基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、卤烷基、羟基烷基、烷氧基、卤烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰胺基、磺酰胺基、烷基羰基、芳基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、羧基、羧基烷基、任选地被取代的烷基、环烷基、烯基、炔基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、和杂环。
在本公开中，单独或作为另一基团的一部分使用的术语“卤烷基”是指被一个或多个氟、氯、溴和/或碘原子取代的烷基。在一个实例中，烷基被一个、两个或三个氟和/或氯原子取代。在另一个实例中，卤烷基为C1-4卤烷基。非限制性示例性卤烷基包括氟甲基、2-氟乙基、二氟甲基、三氟甲基、五氟乙基、1,1-二氟乙基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、3,3,3-三氟丙基、4,4,4-三氟丁基和三氯甲基。
在本公开中，单独或作为另一基团的一部分使用的术语“烷氧基”是指连接到末端氧原子的任选地被取代的烷基、任选地被取代的环烷基、任选地被取代的烯基或任选地被取代的炔基。在一个实例中，烷氧基是连接到末端氧原子的任选地被取代的烷基。在一个实例中，烷氧基是连接到末端氧原子的C1-6烷基。在另一个实例中，烷氧基是连接到末端氧原子的C1-4烷基。非限制性示例性烷氧基包括甲氧基、乙氧基和叔丁氧基。
在本公开中，单独或作为另一基团的一部分使用的术语“烷硫基”是指连接到末端硫原子的任选地被取代的烷基。在一个实例中，烷硫基是C1-4烷硫基。非限制性示例性烷硫基包括--SCH3和--SCH2CH3。
在本公开中，单独或作为另一基团的一部分使用的术语“卤烷氧基”是指连接到末端氧原子的卤烷基。非限制性示例性卤烷氧基包括氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基和2,2,2-三氟乙氧基。
在本公开中，术语“杂芳基”是指具有5至14个环原子的未被取代的单环和双环芳族环系，即，5至14元杂芳基，其中一个环的至少一个碳原子被独立地选自由氧、氮和硫组成的组的杂原子代替。在一个实例中，杂芳基含有1、2、3或4个独立地选自由氧、氮和硫组成的组的杂原子。在一个实例中，杂芳基具有三个杂原子。在另一个实例中，杂芳基具有两个杂原子。在另一个实例中，杂芳基具有一个杂原子。在另一个实例中，杂芳基为5至10元杂芳基。在另一个实例中，杂芳基为5或6元杂芳基。在另一个实例中，杂芳基具有5个环原子，例如噻吩基，具有四个碳原子和一个硫原子的5元杂芳基。在另一个实例中，杂芳基具有6个环原子，例如吡啶基，具有五个碳原子和一个氮原子的6元杂芳基。非限制性示例性杂芳基包括噻吩基、苯并[b]噻吩基、萘并[2,3-b]噻吩基、噻蒽基、呋喃基、苯并呋喃基、吡喃基、异苯并呋喃基、苯并噁唑酮基(benzooxazonyl)、色烯基、呫吨基、2H-吡咯基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、异喹啉基、酞嗪基、萘啶基、噌啉基、喹唑啉基、蝶啶基、4aH-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、噻唑基、异噻唑基、吩噻唑基、异噁唑基、呋咱基和吩噁嗪基。在一个实例中，杂芳基选自由以下组成的组：噻吩基(例如噻吩-2-基和噻吩-3-基)、呋喃基(例如2-呋喃基和3-呋喃基)、吡咯基(例如1H-吡咯-2-基和1H-吡咯-3-基)、咪唑基(例如2H-咪唑-2-基和2H-咪唑-4-基)、吡唑基(例如1H-吡唑-3-基、1H-吡唑-4-基和1H-吡唑-5-基)、吡啶基(例如吡啶-2-基、吡啶-3-基和吡啶-4-基)、嘧啶基(例如嘧啶-2-基、嘧啶-4-基和嘧啶-5-基)、噻唑基(例如噻唑-2-基、噻唑-4-基和噻唑-5-基)、异噻唑基(例如异噻唑-3-基、异噻唑-4-基和异噻唑-5-基)、噁唑基(例如噁唑-2-基、噁唑-4-基和噁唑-5-基)、异噁唑基(例如异噁唑-3-基、异噁唑-4-基和异噁唑-5-基)和吲唑基(例如1H-吲唑-3-基)。术语“杂芳基”还意在包括可能的N-氧化物。非限制性示例性N-氧化物为吡啶基N-氧化物。
在一个实例中，杂芳基为5或6元杂芳基。在一个实例中，杂芳基为5元杂芳基，即，杂芳基为具有5个环原子的单环芳族环系，其中环的至少一个碳原子被独立地选自氮、氧和硫的杂原子代替。非限制性示例性5元杂芳基包括噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基和异噁唑基。在另一个实例中，杂芳基为6元杂芳基，例如，杂芳基为具有6个环原子的单环芳族环系，其中环的至少一个碳原子被氮原子置换。非限制性示例性6元杂芳基包括吡啶基、吡嗪基、嘧啶基和哒嗪基。
在本公开中，单独或作为另一基团的一部分使用的术语“任选地被取代的杂芳基”是指未被取代或被一个、两个、三个或四个取代基取代的杂芳基，所述取代基独立地选自由以下组成的组：卤基、硝基、氰基、羟基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、卤烷基、羟基烷基、烷氧基、卤烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰胺基、磺酰胺基、烷基羰基、芳基羰基、烷基磺酰基、卤烷基磺酰基、环烷基磺酰基、(环烷基)烷基磺酰基、芳基磺酰基、杂芳基磺酰基、羧基、羧基烷基、任选地被取代的烷基、任选地被取代的环烷基、烯基、炔基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的杂环、烷氧基烷基、(氨基)烷基、(羧酰胺基)烷基和(杂环)烷基。在一个实例中，任选地被取代的杂芳基具有一个取代基。在另一个实例中，任选地被取代的杂芳基未被取代。任何可用的碳或氮原子可被取代。术语任选地被取代的杂芳基包括具有稠合的任选地被取代的环烷基或稠合的任选地被取代的杂环基的杂芳基。具有稠合的任选地被取代的环烷基或稠合的任选地被取代的杂环基的任选地被取代的杂芳基可在杂芳基环上的任何可用碳原子处连接到分子的其余部分。
在本公开中，单独或作为另一基团的一部分使用的术语“杂环”是指未被取代的饱和和部分不饱和(例如含有一个或两个双键)环状基团，其含有一个、两个或三个具有三至十四个环成员的环，即，3至14元杂环，其中一个环的至少一个碳原子被杂原子代替。每个杂原子独立地选自由氧、硫(包括亚砜和砜)和/或氮原子组成的组，其可被氧化或季铵化。术语“杂环”包括其中环--CH2--被--C(＝O)--代替的基团，例如环状脲基，例如2-咪唑烷酮，和环状酰胺基，例如β-内酰胺、γ-内酰胺、δ-内酰胺、ε-内酰胺和哌嗪-2-酮。术语“杂环”还包括具有稠合的任选地被取代的芳基的基团，例如吲哚啉基或色满-4-基。在一个实施方案中，杂环基为含有一个环和一个或两个氧和/或氮原子的C4-6杂环，即，4、5或6元环状基团。在一个实施方案中，杂环基为含有一个环和一个氮原子的C4-6杂环。杂环可任选地经由任何可用的碳或氮原子连接到分子的其余部分。非限制性示例性杂环基包括氮杂环丁烷基、二噁烷基、四氢吡喃基、2-氧代吡咯烷-3-基、哌嗪-2-酮、哌嗪-2,6-二酮、2-咪唑烷酮、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、吡咯烷基和吲哚啉基。
在本公开中，本文中单独或作为另一基团的一部分使用的术语“任选地被取代的杂环”是指未被取代或被一个、两个、三个或四个取代基取代的杂环，所述取代基独立地选自由以下组成的组：卤基、硝基、氰基、羟基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、卤烷基、羟基烷基、烷氧基、卤烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰胺基、磺酰胺基、烷基羰基、环烷基羰基、烷氧羰基、CF3C(═O)--、芳基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、羧基、羧基烷基、烷基、任选地被取代的环烷基、烯基、炔基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的杂环、烷氧基烷基、(氨基)烷基、(羧酰胺基)烷基或(杂环)烷基。取代可在任何可用的碳或氮原子或两者上发生。
在本公开中，单独或作为另一基团的一部分使用的术语“氨基”是指式--NROaRb的基团，其中Ra和Rb各自独立地选自由氢、任选地被取代的烷基、和芳烷基组成的组，或Ra和Rb一起形成3至8元任选地被取代的杂环。非限制性示例性氨基包括--NH2和--N(H)(CH3)。
在本公开中，单独或作为另一基团的一部分使用的术语“羧酰胺基”是指式--C(＝O)NRaRb的基团，其中Ra和Rb各自独立地选自由氢、任选地被取代的烷基、羟基烷基和任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂环和任选地被取代的杂芳基组成的组，或Ra和Rb与其所连接的氮一起形成3至8元任选地被取代的杂环基。在一个实施方案中，Ra和Rb各自独立地为氢或任选地被取代的烷基。在一个实施方案中，Ra和Rb与其所连接的氮一起形成3至8元任选地被取代的杂环基。非限制性示例性羧酰胺基包括--CONH2、--CON(H)CH3和--CON(CH3)2。
在本公开中，单独或作为另一基团的一部分使用的术语“烷氧羰基”是指被烷氧基取代的羰基，即，--C(═O)--。在一个实施方案中，烷氧基为C1-4烷氧基。非限制性示例性烷氧羰基包括--C(＝O)OMe、--C(＝O)OEt和--C(＝O)OtBu。
在本公开中，单独或作为另一基团的一部分使用的术语“羧基”是指式--CO2H的基团。
在本公开中，术语“自我牺牲型基团”或“牺牲型基团”或“牺牲型接头”是指可裂解接头的全部或部分并且包含如下双官能化学部分：其能够将两个间隔的化学部分共价连接成通常稳定的三方分子，可利用酶促裂解从三方分子中释放间隔的化学部分之一；并且在酶促裂解之后，可自发地从分子的其余部分裂解以释放另一个间隔的化学部分，例如式I、II或III的糖皮质激素。在一些实施方案中，牺牲型接头包含对氨基苯甲基单元。在一些此类实施方案中，对氨基苯甲醇经由酰胺键连接到氨基酸单元，并且在苯甲醇与药物之间形成氨基甲酸酯、甲基氨基甲酸酯或碳酸酯(Hamann等人,(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15:1087-1103)。在一些实施方案中，牺牲型接头为对氨基苯甲氧羰基(PAB)。(参见本申请的实施例3和示例性实施方案章节)。
在本公开中，术语“保护基团”或“PG”是指在对分子的其他官能团或部分进行反应的同时封闭(即，保护)官能团(例如胺官能团)的基团。本领域技术人员将熟悉胺保护基团的选择、连接和裂解，并且将了解许多不同保护基团在本领域中是已知的，一个或另一个保护基团的适用性取决于所计划的特定合成方案。关于所述主题的论文可供查阅，例如Wuts,P.G.M.；Greene,T.W.,“Greene's Protective Groups in Organic Synthesis”,第4版,J.Wiley&Sons,N Y,2007。适合的保护基包括苯甲氧羰基(Cbz)、叔丁氧羰基(BOC)、9-芴基甲氧羰基(FMOC)和苯甲基(Bn)基团。在一个实施方案中，保护基团为BOC基团。
在本公开中，术语“乙二醇”是指式-OCH2CH2O-的化学物。
在本公开中，术语“环氧乙烷”是指式-CH2CH2O-的化学物。
除非上下文另有明确规定，否则如本公开和权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个形式。
应了解，在本文中用语言“包含”描述实施方案的任何情况下，还提供以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他方面类似的实施方案。
本文中在例如“A和/或B”的短语中所用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。同样地，在例如“A、B和/或C”的短语中所用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
如本文所用，“自身免疫”或“自身免疫性疾病或疾患”泛指起因于并且针对个体自身组织或其共分离物或表现形式或由此产生的疾患的疾病或病症，并且包括。本文中的自身免疫性疾患包括炎症性或过敏性疾患，例如以宿主针对潜在地与组织破坏相关的自身抗原的免疫反应为特征的慢性疾病，例如以炎症为特征和/或其中类固醇为有效治疗的类风湿性关节炎。
“过敏性疾病或疾患”或“过敏反应”为由免疫系统对环境中典型无害的物质或抗原超敏所引起的疾患。这些疾病包括例如异位性皮炎、过敏性哮喘、原发性免疫缺陷、慢性鼻窦炎、嗜酸性粒细胞相关疾病和涉及过敏应答或反应的其他疾患。
如本文所用，“免疫细胞”泛指具有造血起源并且在免疫反应中发挥作用的细胞。免疫细胞包括但不限于淋巴细胞，例如B细胞和T细胞；自然杀伤细胞；树突状细胞和骨髓细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和颗粒细胞以及其他免疫细胞类型。
如本文所用，“免疫相关疾病(或病症或疾患)”应理解为涵盖选自包括但不限于以下的组的任何疾病病症或疾患：与移植物移植排斥反应相关的自身免疫性疾病、炎症性病症和免疫性病症，例如器官移植、同种异体干细胞移植、自体干细胞移植、骨髓移植和移植物抗宿主病的急性和慢性排斥反应。
在本文中可互换使用的“炎症性病症”、“炎症性疾患”和/或“炎症”泛指慢性或急性炎症性疾病，并且明确包括炎症性自身免疫性疾病和炎症性过敏性疾患。这些疾患包括例如炎症性异常，其特征在于对例如病原体、受损细胞或刺激物的有害刺激的免疫反应失调。炎症性病症为多种人类疾病的基础。病因学起源于炎症性过程的非免疫疾病包括癌症、动脉粥样硬化和缺血性心脏病。与炎症相关的病症的实例包括：慢性前列腺炎、肾小球肾炎、超敏反应、盆腔炎症性疾病、再灌注损伤、结节病、血管炎、间质性膀胱炎、正常补体性荨麻疹性血管炎、心包炎、肌炎、抗合成酶综合征、巩膜炎、巨噬细胞活化综合征、白塞氏综合征(Syndrome)、PAPA综合征、布劳氏综合征(Blau's Syndrome)、痛风、成人和青少年斯蒂尔病、冷吡啉病(cryropyrinopathy)、马克尔-韦尔斯综合征(Muckle-Wellssyndrome)、家族性寒冷诱发的自身炎症性综合征、新生儿发作型多系统炎症性疾病、家族性地中海热、慢性婴儿神经、皮肤和关节综合征、全身性青少年特发性关节炎、高IgD综合征、施尼茨勒综合征(Schnitzler's syndrome)、TNF受体相关周期性综合征(TRAPSP)、牙龈炎、牙周炎、肝炎、肝硬化、胰腺炎、心肌炎、血管炎、胃炎、痛风、痛风性关节炎，和选自由牛皮癣、异位性皮炎、湿疹、酒渣、荨麻疹和痤疮组成的组的炎症性皮肤病症。
如本文所用，“哺乳动物”泛指哺乳动物纲的任何和所有温血脊椎动物，包括人类，其特征在于皮肤上覆盖有毛发并且在雌性中具有产奶乳腺以滋养幼儿。哺乳动物的实例包括但不限于羊驼、犰狳、水豚、猫、骆驼、黑猩猩、栗鼠、牛、狗、山羊、大猩猩、仓鼠、马、人、狐猴、美洲驼、小鼠、非人类灵长类动物、猪、大鼠、绵羊、地鼠、松鼠、貘和田鼠。哺乳动物包括但不限于牛、狗、马、猫、鼠、绵羊、猪、灵长类动物和啮齿动物物种。哺乳动物还包括在华盛顿特区史密森学会国家自然历史博物馆维护的世界哺乳动物物种中列出的任何和所有哺乳动物。
“患者”或“受试者”或“接受者”、“个体”或“所治疗的个体”在本文中可互换使用，并且泛指需要治疗以减轻疾病状态或防止疾病状态发生或复发的任何动物。此外，如本文所用，“患者”泛指具有疾病的风险因素、疾病史、易感性、症状和体征，先前诊断出疾病，有疾病风险，或成为疾病的患者群体中的成员的任何动物。患者可为临床患者，例如人类或兽医患者，例如伴侣、驯养、家畜、外来或动物园动物。
在本文中的疗法或诊断的情形中，“受试者”或“患者”或“个体”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等，即，适合根据本发明治疗的任何动物包括但不限于鸟类和哺乳动物受试者，并且优选为哺乳动物。需要根据本发明治疗的任何哺乳动物受试者均为适合的。可根据本发明治疗两种性别和处于任何发育阶段(即，新生儿、婴儿、青少年、青年和成人)的人类受试者。本发明也可对动物受试者，特别是哺乳动物受试者如小鼠、大鼠、狗、猫、牛、山羊、绵羊和马进行，以用于兽医目的以及用于药物筛选和药物开发目的。“受试者”与“个体”和“患者”可互换使用。
如本文所用，“疗法”、“治疗性”、“治疗”或“治疗法”泛指治疗疾病，阻止或减少疾病或其临床症状的发展，和/或缓解疾病，促使疾病或其临床症状消退。疗法涵盖预防、治疗、补救、减少、减轻和/或缓解疾病、体征和/或疾病症状。疗法涵盖减轻具有持续疾病体征和/或症状(例如炎症、疼痛)的患者的体征和/或症状。疗法还涵盖“预防”。出于疗法的目的，术语“减少”泛指体征和/或症状的临床显著减少。疗法包括治疗反复或复发性体征和/或症状(例如炎症、疼痛)。疗法涵盖但不限于排除体征和/或症状随时出现以及减少现有体征和/或症状和消除现有体征和/或症状。疗法包括治疗慢性疾病(“维持”)和急性疾病。例如，治疗包括治疗或预防体征和/或症状(例如炎症、疼痛)的反复或复发。
在定义本申请中所用的某些术语和短语后，下文进一步描述根据本发明的新颖糖皮质激素类固醇激动剂、糖皮质激素类固醇激动剂-接头和含有其的ADC、其生产方法和用途。
本发明涉及包含直接或经由接头间接连接到抗体或抗体片段的式I、II或III的新颖糖皮质激素激动剂的ADC，所述抗体或抗体片段包含结合至免疫细胞抗原，典型地为人类免疫细胞抗原，例如人类T细胞活化V-结构域Ig抑制因子(VISTA)的抗原结合区。然而，本文中显示根据本发明的包含糖皮质激素类固醇激动剂和糖皮质激素类固醇激动剂-接头的ADC当偶接至除VISTA以外的免疫细胞抗原的抗体或片段时也是有效的。
在一些示例性实施方案中，ADC包含在生理pH条件(约pH 7.5)下具有短血清半衰期的抗体或片段，例如，其中抗体或片段在啮齿动物(人类VISTA敲入)中的血清半衰期通常在生理条件(约pH 7.5)下在人类VISTA敲入啮齿动物中为1至72小时、1至32小时、1至16小时、1至8小时、1至4小时或1-2小时±0.5小时或在灵长类动物(食蟹猴)中为约3.5、3、2.5或2.3天±0.5天，所述抗人VISTA抗体或抗体片段直接或经由接头间接连接到抗炎剂，例如，如本文所公开的式I、II或III的类固醇或皮质类固醇受体激动剂或含有其的皮质类固醇受体激动剂-接头或其功能衍生物或基团，即，当向受试者，例如人类或其他哺乳动物施用时，在内化至免疫细胞后从含有其的ADC中释放时引发所需抗炎作用的衍生物。
特别地，在包含抗VISTA抗体或抗体片段的ADC的情况下，ADC将在生理pH下特异性地结合至表达VISTA的免疫细胞，并且式I、II或III的皮质类固醇受体激动剂将在内化至靶标(免疫)细胞后从ADC中释放，所述细胞例如嗜中性粒细胞、单核细胞如骨髓细胞、巨噬细胞、T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、Treg和存在于外周血中的其他免疫细胞。皮质类固醇受体激动剂的这种释放显然是由酶(例如酯酶)引发，所述酶在ADC由靶免疫细胞内化后提供ADC的裂解。皮质类固醇受体激动剂在内化至免疫细胞后从含有其的ADC中的释放接着在表达由ADC结合的抗原(例如VISTA)的免疫细胞中选择性地引发所需抗炎作用。如先前所指出，皮质类固醇受体激动剂的功效(抗炎活性)仅在此种类固醇化合物由细胞内化后获得，所述细胞为例如表达VISTA或由ADC结合的其他抗原的免疫细胞。
在优选实施方案中，抗体或片段，例如抗VISTA抗体或片段将包含静默(即，突变以削弱FcR结合)的Fc区，例如静默IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，最典型地为静默IgG2或静默IgG1，或者抗体或片段可缺少Fc区或包含不结合至FcR的Fc片段。示例性静默Fc区在下文中公开。因此，包含结合至免疫细胞抗原的抗体或片段，例如抗VISTA抗体或片段，同时在一些情况下结合至表达抗原的免疫细胞并且内化至所述免疫细胞中的ADC不会引发对由此结合的抗原(例如VISTA)的调节作用，即，其不会激动或拮抗其所结合的抗原的作用，例如，其不会激动或拮抗VISTA对免疫的抑制作用。相反，由ADC引发的治疗作用将单独或主要归因于与其结合的抗炎剂，即，式I、II或III的皮质类固醇受体激动剂，当包含于ADC中时，其在施用后内化并释放至免疫细胞中并且仅或优先在表达由ADC结合的抗原的靶免疫细胞中引发所需抗炎作用。
因为主题ADC(例如抗VISTA ADC)选择性地结合至靶免疫细胞，例如骨髓细胞、T细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞等，所以主题ADC在许多免疫细胞中将为强效的，但仍将减轻或防止由许多抗炎剂引发的不良副作用，所述抗炎剂为例如皮质类固醇受体激动剂，例如地塞米松、布地奈德和其他类固醇，当此类类固醇化合物由非靶细胞内化时可能发生这些副作用。
此外，选择性地结合并内化初始和活化的表达VISTA的靶免疫细胞，例如初始和活化的单核细胞、巨噬细胞、T细胞、T reg、CD4 T细胞、CD8 T细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、NK细胞和骨髓细胞的主题ADC(例如抗VISTA ADC)与常规游离类固醇如地塞米松、布地奈德和其他类固醇(例如先前鉴定和本领域中通常已知)相比，可促进使用减少剂量的本发明皮质类固醇受体激动剂。此外，式I、II或III的主题皮质类固醇受体激动剂化合物或含有其的皮质类固醇受体激动剂-接头化合物当结合至靶向其他免疫细胞抗原的抗体时可用于治疗其中任何或所有这些特定类型的表达此种抗原的免疫细胞与疾病病理学有关的疾患。
在包含式I、II或III的主题皮质类固醇受体激动剂化合物或含有其的皮质类固醇受体激动剂-接头化合物的VISTA ADC的特定情况下，主题ADC相对于先前报道的ADC具有独特的优点组合，用于靶向和指导内化抗炎剂，特别是用于实现类固醇内化至免疫细胞中的那些，例如靶向CD74、CD163、TNF和PRLR的ADC；这是由于VISTA作为ADC靶标的组合效益和包含于主题ADC中的抗VISTA抗体的特定特性(即，在生理pH下结合至表达VISTA的免疫细胞并且具有极短pK，但仍引发长PD)和本文所提供的式I、II或III的新颖主题皮质类固醇受体激动剂化合物的优点。
特别地，在VISTA ADC的特定情况下，主题ADC在极高密度下结合至表达VISTA的免疫细胞，并且尽管其PK极短，但在所述细胞中长期有效(引发抗炎活性)，并且因此极其适于治疗慢性炎症性或自身免疫性或过敏性疾病，其中类固醇的长期和重复施用为治疗上需要的。
此外，在抗VISTA ADC的特定情况下，主题ADC靶向大范围的免疫细胞，包括嗜中性粒细胞、骨髓细胞、T细胞、Treg、巨噬细胞和内皮细胞；或结合至过敏性、炎症性和自身免疫性反应和疾患中所涉及的免疫细胞上表达的其他抗原的ADC，因此主题ADC可用于治疗例如炎症性或自身免疫性或过敏性疾病的疾病，以及与炎症相关的疾患如心脏病、ARDS、癌症和涉及任何或所有这些类型的免疫细胞的感染。例如，主题ADC可用于治疗或预防与细菌或病毒感染如COVID-19、流感病毒、肺炎(病毒或细菌)感染等相关的炎症。然而，本发明不限于VISTA ADC，这是因为申请人已表明，本文所提供的式(I)、(II)和(III)的新颖糖皮质激素类固醇激动剂-接头当连接到靶向其他免疫抗原的抗体时也有效内化并且在其中释放活性类固醇有效负载。
此外，因为主题ADC具有快速起效的功效，例如，其可在施用2小时内引发抗炎活性，所以它们可用于急性治疗，这在以下情形中可能尤其有益：治疗/预防与细菌或病毒感染如COVID-19和其他冠状病毒、流感病毒、肺炎(病毒或细菌)感染等相关的炎症，如果不快速治疗，则可能引起细胞因子风暴、ARDS并且在最坏情况下引起败血症或败血性休克。
此外，在抗VISTA ADC的特定情况下，与一些其他ADC靶抗原不同，VISTA仅由免疫细胞表达；因此，主题ADC将不易内化非靶细胞。
此外，在抗VISTA ADC的特定情况下，主题ADC不结合B细胞，它们不应如同游离类固醇一样具有免疫抑制性，而应有益于反复和/或长时间接受主题ADC的受试者，这是因为长期使用类固醇与一些癌症、感染和其他疾患相关联，这可能是长期使用类固醇引起的长期免疫抑制的意外结果。然而，应了解，主题ADC当结合至靶向其他抗原的抗体时，这些ADC可用于治疗其中任何或所有这些特定类型的与其结合的免疫细胞与疾病病理学有关的疾患。
另外，在包含式I、II或III的主题皮质类固醇受体激动剂化合物或含有其的皮质类固醇受体激动剂-接头化合物的VISTA ADC的特定情况下，主题ADC作用于Treg，Treg为负责类固醇功效的重要免疫细胞，因此，所述主题ADC可能广泛或具体地更有效，特别是治疗与包含皮质类固醇受体激动剂化合物的先前ADC相关的自身免疫性、过敏性或炎症性疾患或涉及Treg的炎症。
此外，在包含式I、II或III的主题皮质类固醇受体激动剂化合物或含有其的皮质类固醇受体激动剂-接头化合物的VISTA ADC的特定情况下，主题ADC作用于静止(初始)和活化的免疫细胞两者，例如单核细胞、巨噬细胞、T细胞、T reg、CD4 T细胞、CD8 T细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、NK细胞和骨髓细胞(VISTA在其上组成性地表达)，并且因此主题ADC将在过敏性、炎症性和自身免疫疾患的活跃期和缓解期中均保持活性(引发抗炎活性)。
此外，因为包含式I、II或III的主题皮质类固醇受体激动剂化合物的VISTA ADC作用于嗜中性粒细胞，所述免疫细胞对急性炎症至关重要，所以主题ADC将适用于治疗以不常见或散发性炎症发作为特征的急性炎症和/或炎症性或自身免疫性或过敏性疾患。
此外，包含式(I)、(II)或(III)的新颖糖皮质激素类固醇激动剂-接头的主题ADC有利地快速内化免疫细胞并递送大量活性类固醇有效负载，从而产生快速和长期功效。
在VISTA ADC的特定情况下，由于VISTA细胞表面周转率高，因此ADC已显示极快速地(例如在约半小时内)内化免疫细胞，这进一步指示主题ADC极其适于治疗以不常见或散发性炎症发作为特征的急性炎症和/或炎症性或自身免疫性或过敏性疾患。
此外，在一些情况下，主题ADC将具有极短半衰期(PK)并且仅结合免疫细胞；因此，与包含常规(较长)pK的抗体(例如Humira)的其他ADC相比，主题ADC不应更倾向于靶向相关毒性和非所需的外周类固醇暴露(低非特异性损失效应)。
此外，在一些实施方案中，主题ADC的生物活性(抗炎作用)完全归因于其中包含的抗炎有效负载(类固醇)，即，在抗体(例如抗VISTA抗体)具有静默IgG，例如静默IgG1或IgG2Fc区的情况下，其不引发VISTA介导的免疫功能(不阻断任何VISTA生物学)。
至少基于前述优点组合，主题ADC应极其适于急性和慢性用途，并且将适合于治疗和预防用途，即，用于减少或抑制炎症、预防炎症发作、延长疾病的非活跃期，和用于治疗多种不同类型的炎症性、过敏性和自身免疫性疾病。
如所提及，在一些实施方案中，主题ADC包含抗VISTA抗体，所述抗体在生理pH条件下结合至表达VISTA(通常为人类VISTA)的免疫细胞并且具有短半衰期或PK。典型地，这些抗体将包含静默Fc或不含Fc，并且ADC与VISTA表达细胞的结合不会引发对VISTA信号传导的任何作用或VISTA介导的对免疫的作用。
相比之下，在一些实施方案中，ADC中的抗体，例如抗VISTA抗体或靶向另一免疫细胞抗原的抗体将包含功能性IgG，例如功能性IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在包含功能性IgG2的抗VISTA抗体的情况下，此种ADC可促进VISTA或其他免疫细胞抗原介导的信号传导或VISTA或其他免疫细胞抗原相关功能，例如抑制T细胞增殖和T细胞活性以及抑制一些促炎细胞因子。这可能对炎症、过敏反应和/或自身免疫的抑制产生相加或协同作用。
示例性抗VISTA抗体和抗体片段的CDR和可变序列可见于图8、图10和图12中，即，具有在生理pH条件(约pH 7.5)下具有短血清半衰期的片段，例如，其中抗体或片段在食蟹猴或人类中的血清半衰期通常在生理条件(约pH 7.5)下在啮齿动物(人类VISTA敲入)中为约2.3天±0.7天或更短，并且通常在人类VISTA敲入啮齿动物中为1至72小时、1至32小时、1至16小时、1至8小时、1至4小时或1-2小时±0.5小时，或在灵长类动物(食蟹猴)中为约3.5、3、2.5或2.3天±0.5天。
可并入本发明ADC中的示例性发炎剂，即，可例如经由接头和任选地进一步通过异双官能团偶联至抗VISTA抗体和抗VISTA抗体片段的发炎剂包括类固醇或皮质类固醇受体激动剂，例如先前通常描述的皮质类固醇并且更具体地为布地奈德、倍氯米松、倍他米松、环索奈德、皮质醇、皮质酮、醋酸皮质酮、16-α羟基泼尼松龙、地塞米松、二氟松、乙米松(ethamethasoneb)、氟米松、氟尼缩松、醋酸氟轻松、氟氢可的松(fludrocortisone)、丙酸氟替卡松(FloventTM、FlonaseTM)、氢化可的松(hydrocortisone)、环索奈德、甲基泼尼松龙、泼尼松、泼尼松龙、莫美他松、普米克(Pulmicort)、去炎松(triamcinolone)、曲安奈德或另一种具有抗炎或类固醇活性的类固醇化合物或其衍生物，并且特别是包括根据本发明的式I、II或III的新颖类固醇和类固醇-接头和其功能衍生物。根据本发明的优选示例性ADC、类固醇和类固醇-接头在下文的实施例中公开，特别是在实施例3中、在示例性实施方案章节中，并且在图118A-O中描绘。
预期主题ADC可用于治疗受试者，例如人类或非人类哺乳动物，所述受试者患有其中在治疗上需要通过使用例如类固醇的抗炎剂减轻炎症的任何疾患。此类疾患可能与急性或慢性炎症相关，例如散发性或阵发性的。在一些优选实施方案中，受试者将患有需要重复和/或高剂量的抗炎剂如皮质类固醇受体激动剂的疾患，其中在常规条件下给药，即，其中抗炎剂为裸的或未偶联的，药物可能引发不合需要的副作用，例如对非靶向细胞的毒性。此类疾患包括自身免疫性和炎症性疾患。此类疾患的非限制性实例包括过敏、自身免疫、移植、基因疗法、炎症、GVHD或败血症、感染、癌症或治疗或预防与人类受试者的前述疾患中的任一者相关的炎症性、自身免疫性或过敏性副作用。
在一些其他优选实施方案中，受试者将患有急性或慢性炎症性疾患或发作，其中快速起效的功效是治疗上需要的，例如以频繁或不频繁的反复急性炎症性发作为特征的炎症性疾患，任选地其中在治疗上需要重复和/或高剂量的抗炎剂如皮质类固醇受体激动剂，并且任选地其中在常规条件下给药，即，其中抗炎剂为裸的或未偶联的，药物可能引发不合需要的副作用，例如对非靶向细胞的毒性。此类疾患包括自身免疫性和炎症性疾患、癌症和与炎症相关的感染性疾患，例如以急性和/或严重炎症性发作为特征。
此类疾患的非限制性实例包括过敏、自身免疫、移植、基因疗法、炎症、癌症、GVHD或败血症、感染(例如细菌、病毒、真菌、寄生虫)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或治疗或预防与人类受试者的前述疾患中的任一者相关的炎症性、自身免疫性或过敏性副作用。
其中使用主题ADC可能有益的其他具体示例性疾患包括类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、成人克罗恩病、小儿克罗恩病、溃疡性结肠炎、斑块状牛皮癣、化脓性汗腺炎、葡萄膜炎、白塞病、脊椎关节病或牛皮癣。
其中使用主题ADC可能在治疗上有益的其他示例性疾患和实例包括：
(i)主要仅用高剂量的类固醇可有效治疗的疾患，任选地为风湿性多肌痛和/或巨细胞动脉炎，所述患者任选地已接受治疗或正经历高类固醇剂量的治疗；
(ii)伴有限制类固醇使用的合并症的疾患，任选地为糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、病态肥胖、无血管性坏死/骨坏死(AVN)、青光眼、类固醇诱发的高血压、严重皮肤脆弱和/或骨关节炎；
(iii)其中安全的长期治疗剂可用，但其中需要用高剂量的类固醇诱导数月的疾患，任选地为AAV、多肌炎、皮肌炎、狼疮、炎症性肺病、自身免疫性肝炎、炎症性肠病、免疫性血小板减少症、自身免疫性溶血性贫血、痛风患者，其中在治疗上需要用高剂量的类固醇诱导数月；
(iv)需要短期/长期治疗，任选地需要不确定的治疗或持续时间和/或不存在类固醇施用的有效替代方案的皮肤疾患，任选地为史蒂文斯-约翰逊病、其他严重药疹疾患、涉及广泛接触性皮炎的疾患、其他严重免疫相关皮肤病疾患如PG、LCV、红皮病等；
(v)用高剂量的皮质类固醇治疗突发/复发的疾患，任选地为COPD、哮喘、狼疮、痛风、假痛风；
(vi)免疫相关的神经疾病，例如小纤维神经病、MS(亚组)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、重症肌无力等；
(vii)血液/肿瘤适应症，任选地其中高剂量的类固醇将潜在地在治疗上有需要或有益；
(viii)眼科疾患，任选地为葡萄膜炎、虹膜炎、巩膜炎等；
(ix)与永久或极长期肾上腺机能不足或继发性肾上腺机能不足相关的疾患，任选地为医源性艾迪森危象；
(x)常用长期、低剂量类固醇治疗的疾患，任选地为狼疮、RA、psA、血管炎等；和
(xi)特殊类别的患者，例如怀孕/哺乳妇女、儿科患者，任选地为患有生长障碍或白内障的那些患者。
含有ADC或根据本发明的式I、II或II的新颖糖皮质激素或含有其的类固醇-接头的组合物可单独或与其他治疗剂相结合使用，尤其是用于治疗自身免疫性、过敏性和炎症性疾患的其他免疫抑制分子或抗炎剂或其他治疗剂，例如用于治疗例如以下疾病的药物：后天性免疫缺乏综合征(AIDS)、后天性脾萎缩、急性前葡萄膜炎、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性痛风性关节炎、急性坏死性出血性白质脑炎、急性或慢性鼻窦炎、急性化脓性脑膜炎(或其他中枢神经系统炎症性病症)、急性严重炎症、艾迪森氏病、肾上腺炎、成人发作型糖尿病(II型糖尿病)、成人发作型特发性甲状旁腺机能减退(AOIH)、无丙种球蛋白血症、无颗粒白细胞增多症、血管炎病(包括血管炎，任选地为大血管血管炎)、任选地风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏)关节炎、过敏性疾患、过敏性接触性皮炎、过敏性皮炎、过敏性肉芽肿性血管炎、过敏性超敏症、过敏性神经炎、过敏反应、斑秃、全秃、阿尔波特氏综合征(Alport's syndrome)、肺泡炎(任选地为过敏性肺泡炎或纤维化肺泡炎)、阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)、淀粉样变性、肌萎缩性侧索硬化(ALS；路格里克氏病(LouGehrig's disease))、嗜酸性粒细胞相关病症(任选地为嗜酸性粒细胞增多症)、过敏症、强直性脊柱炎、血管扩张、抗体介导的肾炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、抗磷脂抗体综合征、抗磷脂综合征(APS)、口疮、口疮口炎、再生不良性贫血、心律不齐、动脉硬化、动脉硬化性病症、关节炎(任选地为类风湿性关节炎如急性关节炎或慢性类风湿性关节炎、慢性进行性关节炎、变形性关节炎)、蛔虫症、曲菌瘤、含有嗜酸性粒细胞的肉芽肿、曲菌病、无精子症(aspermiogenese)、哮喘(任选地为细支气管哮喘、支气管哮喘或自身免疫性哮喘)、共济失调毛细管扩张症、共济失调性硬化、动脉粥样硬化、自闭症、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性再生不良性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性糖尿病、睾丸和卵巢的自身免疫性疾病(包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎)、与胶原病相关的自身免疫性病症、自身免疫性自主神经障碍、自身免疫性耳病(任选地为自身免疫性内耳病(AGED))、自身免疫性内分泌疾病(包括甲状腺炎，例如自身免疫性甲状腺炎)、自身免疫性肠病综合征、自身免疫性性腺衰竭、自身免疫性听力损失、自身免疫性溶血、自身免疫性肝炎、自身免疫性血液病症、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺乏、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌病、I型自身免疫性多腺体综合征、自身免疫性视网膜病、自身免疫性血小板减少性紫癫(ATP)、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性荨麻疹、自身免疫介导的胃肠病、轴突和神经元神经病、巴娄病(Balo disease)、白塞病、良性家族性和缺血再灌注损伤、良性淋巴细胞性血管炎、伯格氏病(Berger's disease)(IgA肾病)、养鸟者肺、失明、倍克氏病(Boeck's disease)、对比NSIP的阻塞性细支气管炎(非移植)、支气管炎、支气管肺曲菌病、布鲁顿氏综合征(Bruton's syndrome)、大疱性类天疱疮、卡普兰氏综合征(Caplan's syndrome)、心肌病、心血管缺血、卡斯特曼综合征(Castleman's syndrome)、乳糜泻、口炎性腹泻(谷蛋白肠病)、小脑变性、大脑缺血和伴随血管形成的疾病、恰加斯病、通道病(任选地为癫痫、CNS通道病)、脉络膜视网膜炎、脉络膜炎、自身免疫性血液病症、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎、慢性接触性皮炎、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、慢性疲劳综合征、慢性肝炎、慢性超敏性肺炎、慢性炎症性关节炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性难治性炎症、慢性粘膜皮肤念珠菌病、慢性神经病(任选地为IgM多发性神经病或IgM介导的神经病)、慢性阻塞性气道疾病、慢性肺部炎症性疾病、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、慢性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎、查格-史特劳斯综合征、疤痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮、冠状病毒介导的感染(例如SARS-CoV-2(COVID-19)、SARS-CoV、MERS、SARS-CoV-2和相关副作用)、CNS炎症性病症、CNS血管炎、乳糜泻、科根氏综合征、冷凝集素病、息肉状结肠炎、结肠炎(例如溃疡性结肠炎、结肠炎溃疡、胶原性结肠炎)、涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的疾患、先天性心脏传导阻滞、先天性风疹感染、库姆氏阳性贫血(Coombs positive anemia)、冠状动脉疾病、柯萨奇心肌炎(Coxsackiemyocarditis)、CREST综合征(钙沉着症、雷诺氏现象)、克罗恩病、冷凝球蛋白血症、库兴氏综合征(Cushing's syndrome)、睫状体炎(任选地为慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎或富克氏睫状体炎(Fuch's cyclitis))、囊性纤维化、细胞因子诱发的毒性、耳聋、退行性关节炎、脱髓鞘病(任选地为自身免疫性脱髓鞘病)、脱髓鞘性神经病、登革热、疱疹样皮炎和异位性皮炎、包括接触性皮炎的皮炎、皮肌炎、具有急性炎症性组分的皮肤病、德维克病(Devic's disease)(视神经脊髓炎)、糖尿病性大动脉病症、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、狄-布二氏贫血(Diamond Blackfan anemia)、弥漫性间质性肺纤维化、扩张性心肌病、盘状狼疮、涉及白细胞渗出的疾病、德莱斯勒氏综合征、杜普宜特朗氏挛缩(Dupuytren's contracture)、艾科病毒感染(echovirus infection)、包括过敏性或异位性湿疹的湿疹、脑炎(例如罗斯苗逊氏脑炎(Rasmussen's encephalitis)和边缘和/或脑干脑炎)、脑脊髓炎(任选地为过敏性脑脊髓炎或变态反应性脑脊髓炎和实验性过敏性脑脊髓炎(EAE))、子宫内膜增生、心内膜炎、内分泌性眼病、子宫内膜异位、心肌内膜纤维化、晶状体过敏性眼内炎、眼内炎、过敏性肠炎、嗜酸性粒细胞增多症-肌痛综合征、嗜酸性粒细胞性肌膜炎、流行性角膜结膜炎、后天性水疱性表皮松解(EBA)、上巩膜、上巩膜炎、爱泼斯坦-巴尔病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、持久隆起性红斑、多形性红斑、麻风性结节性红斑、结节性红斑、胎儿红细胞母细胞增多症、食管运动功能障碍、原发性混合性冷凝球蛋白血症、筛骨、伊文氏综合征、实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)、因子VIII缺乏、农夫肺、风湿热、费尔提氏综合征(Felty's syndrome)、纤维肌痛、纤维化肺泡炎、丝虫病、局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、食物中毒、额、胃萎缩、巨细胞关节炎(颞关节炎)、巨细胞肝炎、巨细胞多肌痛、肾小球肾炎、伴有和不伴有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)(例如慢性或急性肾小球肾炎(例如原发性GN))、古德帕斯丘综合征、痛风性关节炎、颗粒细胞输血相关综合征、包括淋巴瘤样肉芽肿病、肉芽肿性多血管炎(GPA)、肉芽肿性葡萄膜炎的肉芽肿病、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、滴状牛皮癣、阵发性血红蛋白尿、哈曼-里奇病(Hamman-Rich'sdisease)、桥本氏病、桥本氏脑炎、桥本氏甲状腺炎、血色素沉着症、溶血性贫血或免疫溶血性贫血(包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、溶血性贫血)、A型血友病、亨-舒二氏紫癜(purpura)、妊娠疱疹、人类免疫缺乏病毒(HIV)感染、痛觉过敏、低丙种球蛋白血症、性腺机能减退、甲状旁腺机能减退、特发性尿崩症、特发性面神经麻痹、特发性甲状腺机能减退、特发性IgA肾病、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、特发性肾病综合征、特发性肺纤维化、特发性口疮、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、IgE介导的疾病(任选地为过敏症和过敏性或异位性鼻炎)、IgG4相关硬化性疾病、局部性回肠炎、免疫复合物性肾炎、与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏相关的免疫反应、免疫介导的GN、免疫调控性脂蛋白(包括成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS))、包涵体肌炎、感染性关节炎、因抗精子抗体所致的不育、全部或部分葡萄膜的炎症、炎症性肠病(IBD)、炎症性过度增生性皮肤病、炎症性肌病、胰岛素依赖性糖尿病(1型)、胰岛炎、间质性膀胱炎、间质性肺病、间质性肺纤维化、虹膜炎、缺血再灌注障碍、关节炎症、青少年关节炎、青少年皮肌炎、青少年糖尿病、青少年发作型(I型)糖尿病(包括小儿胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、青少年发作型类风湿性关节炎)、川崎综合征、干燥性角膜结膜炎、锥虫病、兰伯特-伊顿综合征、利什曼体病、麻疯、白细胞减少症、白细胞粘附分子缺乏症、白细胞破碎性血管炎、白细胞减少症、扁平苔藓、硬化性苔藓、木样结膜炎、线性IgA皮肤病、线性IgA疾病(LAD)、吕弗勒氏综合征(Loffler's syndrome)、类狼疮性肝炎、狼疮(包括肾炎、大脑炎、小儿、非肾性、肾外、盘状、秃发)、狼疮(SLE)、播散性红斑性狼疮、莱姆关节炎(Lyme arthritis)、莱姆病、淋巴样间质性肺炎、疟疾、男性和女性自身免疫性不育、上颌、中血管血管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎)、膜性或膜性增生性GN(MPGN)(包括I型和II型，和快速进行性GN、膜性GN(膜性肾病))、梅尼埃病、脑膜炎、显微镜下结肠炎、显微镜下多血管炎、偏头痛、微小病变性肾病、混合性结缔组织疾病(MCTD)、感染性单核细胞增多症、莫伦氏溃疡、穆哈-哈伯曼病、多灶性运动神经病、多发性内分泌衰竭、多器官损伤综合征(例如继发于败血症、创伤或出血的那些)、多器官损伤综合征、多发性硬化(MS)(例如脊髓-视神经MS、多发性硬化)、腮腺炎、肌肉病症、重症肌无力(例如胸腺瘤相关的重症肌无力、重症肌无力)、心肌炎、肌炎、嗜睡病、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎和自身免疫性炎症性肠病、坏死性、皮肤性或超敏性血管炎、新生儿狼疮综合征(NLE)、肾病、肾病综合征、神经疾病、视神经脊髓炎(德维克病)、视神经脊髓炎、神经性肌强直、嗜中性白细胞减少症、非癌性淋巴细胞增多症、非肉芽肿性葡萄膜炎、非恶性胸腺瘤、眼部和眼眶炎症性病症、眼部疤痕性类天疱疮、卵巢炎、交感性眼炎、视阵挛肌阵挛综合征(OMS)、视阵挛或视阵挛肌阵挛综合征(OMS)和感觉神经病、视神经炎、肉芽肿性睾丸炎、骨关节炎、回纹型风湿病、胰腺炎、泛血球减少症、PANDAS(与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神障碍)、副肿瘤性小脑变性、副肿瘤综合征、副肿瘤综合征(包括神经性副肿瘤综合征，任选地为兰伯特-伊顿肌无力综合征或兰伯特-伊顿综合征)、寄生虫病(例如利什曼原虫)、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、帕罗综合征、睫状体扁平部炎(外周葡萄膜炎)、帕桑-特纳综合征、细小病毒感染、类天疱疮(例如大疱性内天疱疮和皮肤内天疱疮)、天疱疮(包括寻常型天疱疮)、红斑性天疱疮、落叶型天疱疮、天疱疮粘膜性类天疱疮、天疱疮、消化性溃疡、周期性麻痹、外周神经病、静脉周脑脊髓炎、恶性贫血(恶性贫血症)、恶性贫血、晶状体抗原性葡萄膜炎、肺硬变、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I型、II型和III型慢性原发性多动脉炎、多软骨炎(例如难治性或复发性多软骨炎)、多内分泌自身免疫性疾病、多内分泌衰竭、多腺体综合征(任选地为自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌病综合征))、风湿性多肌痛、多肌炎、多肌炎/皮肌炎、多发性神经病、急性多神经根炎、心脏切开术后综合征、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、链球菌后肾炎、疫苗接种后综合征、早老性痴呆、原发性胆汁性肝硬化、原发性甲状腺机能减退、原发性特发性粘液水肿、原发性淋巴细胞增多症(包括单克隆B细胞淋巴细胞增多症，任选地为良性单克隆丙种球蛋白病和意义不明的单克隆丙种球蛋白病MGUS)、原发性粘液水肿、原发性进行性MS(PPMS)和复发缓解型MS(RRMS)、原发性硬化性胆管炎、孕酮性皮炎、进行性全身性硬化、增生性关节炎、牛皮癣(例如斑块状牛皮癣、牛皮癣、牛皮癣性关节炎)、肺泡蛋白沉着症、肺嗜酸性粒细胞增多性浸润、纯红细胞贫血或发育不良(PRCA)、纯红细胞再生障碍性贫血、化脓性或非化脓性鼻窦炎、脓疱型牛皮癣和指甲牛皮癣、肾盂炎、坏疽性脓皮病、奎汶氏甲状腺炎(Quervain's thyroiditis)、雷诺氏现象、反应性关节炎、复发性流产、血压反应降低、反射性交感神经营养不良、难治性口疮、雷特氏病(Reiter's disease)或综合征、复发性多软骨炎、心肌或其他组织再灌注损伤、再灌注损伤、呼吸窘迫综合征、不宁腿综合征、视网膜自身免疫、腹膜后纤维化、雷诺氏综合征、风湿性疾病、风湿热、风湿病、类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、风疹病毒感染、山姆特氏综合征(Sampter's syndrome)、类肉瘤病、血吸虫病、施密特综合征、SCID和爱泼斯坦-巴尔病毒相关疾病、巩膜、巩膜炎、指端硬化、硬皮病(任选地为全身性硬皮病)、硬化性胆管炎、播散性硬化、硬化(例如全身性硬化)、感觉神经性听力损失、血清阴性脊柱关节病、席汉氏综合征(Sheehan's syndrome)、舒尔曼氏综合征(Shulman's syndrome)、硅沉着病、休格伦氏综合征、精子与睾丸自身免疫、蝶窦炎、史蒂文斯-约翰逊综合征、僵人(或僵体)综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、亚急性皮肤性红斑狼疮、突发性听力损失、苏萨克氏综合征、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham's chorea)、交感性眼炎、全身性红斑狼疮(SLE)或系统性红斑狼疮、皮肤性SLE、全身性坏死性血管炎、ANCA相关血管炎(任选地为查格-史特劳斯血管炎或综合征(CSS))、脊髓痨、高安氏动脉炎、毛细管扩张症、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血栓闭塞性血管炎、血小板减少症(包括血栓性血小板减少性紫癫(TTP)和自身免疫或免疫介导的血小板减少症，例如特发性血小板减少性紫癫(ITP)，包括慢性或急性ITP、血小板减少性紫癫(TTP))、甲状腺中毒症、组织损伤、托洛萨-亨特综合征、中毒性表皮坏死松解、中毒性休克综合征、输血反应、婴儿暂时性低丙种球蛋白血症、横贯性脊髓炎、横断性脊髓炎、热带肺嗜酸性粒细胞增多症、结核病、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织疾病(UCTD)、荨麻疹(任选地为慢性过敏性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫性荨麻疹)、葡萄膜炎、前葡萄膜炎、葡萄膜视网膜炎、心瓣膜炎、血管功能障碍、血管炎、椎骨关节炎、水疱性皮肤病、白斑病、韦格纳肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)(肉芽肿性多血管炎(GPA))、维斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)或x连锁高IgM综合征。
主题ADC和式I、II或III的新颖皮质类固醇和含有其的皮质类固醇-接头可用于炎症和与炎症相关的疾病的预防性和/或治疗性治疗，包括例如自身免疫性病症、炎症性病症、感染性疾病和癌症。主题ADC的优选应用为用于治疗与炎症相关的慢性疾病。此外，在包含ADC的VISTA抗体的特定情况下，如实施例中所示，已相当意外地发现这些ADC相对于抗体的更短半衰期(pK)在更长时段(PD)内维持效力，尽管其中包含的抗VISTA抗体具有短pK(其在生理条件下结合至VISTA表达细胞并且未经工程化以改变或优化pH结合或增加半衰期)，即，pK在食蟹猴中典型地为约2.3天或更短并且在人类VISTA工程化小鼠中典型地仅为数小时。
如本文所示，根据本发明的VISTA ADC偶联物当在体外和体内模型中评价时已证明在免疫细胞中提供至少14:1和甚至28:1或更长的PD/PK比率。(实际上，PD/PK比率可能更高，这是因为在确定PD时对啮齿动物或非人类灵长类动物实施安乐死，因此不允许对效力进行更长时间评估)。
尽管申请人不希望受其观念束缚，但理论上包含式I、II或III的主题皮质类固醇受体激动剂化合物的VISTA ADC以极高的量递送至靶标VISTA表达细胞中，例如巨噬细胞、T细胞和Treg以及其他表达VISTA的免疫细胞，包括具有长细胞周转期(数周、数月或更长时间)的免疫细胞。本质上，似乎在特定类型的免疫细胞内产生贮库效应，即，大量或“贮库”的主题ADC内化至此类表达VISTA的免疫细胞中，例如巨噬细胞和骨髓细胞，这是因为所述细胞具有极高VISTA表面表达。这进而明显使得此种包含内化ADC的贮库在免疫细胞内缓慢代谢或裂解，例如由细胞酶裂解。本文所公开的体内研究指示，根据本发明的内化ADC的代谢或裂解显然可在啮齿动物或灵长类动物中发生超过一周、2周、4周或更长时间，从而提供治疗有效量的类固醇有效负载在宿主免疫细胞内逐步和长期释放。尽管如此，届时(由于ADC和其中的抗体具有短pK)血清中不应保留可观量的ADC(即，基于ADC的短pK，无足够的ADC分子仍保留于外周循环中，以对免疫引发治疗上显著的影响)。
此外，尽管这些观测结果极其令人惊讶；但预测由于药物代谢在啮齿动物中通常比在灵长类动物中快得多(即，药物代谢在人类中比在啮齿动物中慢得多)；并且进一步由于VISTA表达的水平和表达VISTA的免疫细胞在啮齿动物中以及人类和非人类灵长类动物中为类似的，因此主题ADC在人类和其他灵长类动物中将具有类似或甚至更高的PD/PK比率。因此，主题ADC应极其适于需要或必需延长药物功效的治疗应用。
此外，申请人已发现，与先前报道的ADC相比，根据本发明的ADC具有内在优点，这是因为式(I)、(II)和(III)的新颖糖皮质激素和类固醇激动剂-接头(即，含有其的ADC)所提供的特性似乎不易聚集，并且提供高DAR，而且极有效地内化免疫细胞并且在其中递送大量活性有效负载，从而产生快速和长期的功效。尽管有上述内容，但根据本发明的具有低DAR，例如4.0或更低的DAR的ADC在本文中也显示良好效力，并且可替代地用于疗法中，例如，因为其可具有更佳的可开发特性。
如所提及，主题ADC和式I、II或III的新颖糖皮质激素的另一个优选用途为用于急性用途，即，用于治疗急性炎症。如实施例中所示，根据本发明的式I、II或III的糖皮质激素和含有其的ADC具有快速起效的功效，例如，它们可在施用后2小时内快速引发抗炎作用。主题抗VISTA ADC的急性用途是进一步有利的，这是因为主题抗VISTA ADC已证明有效靶向和内化其中ADC引发抗炎作用的嗜中性粒细胞，而不为非靶细胞。这在急性用途中是尤其有益的，因为嗜中性粒细胞参与炎症反应的早期阶段，因此式I、II或III的主体糖皮质激素和含有其的ADC也极其适于治疗急性炎症性适应症。
主题ADC和式I、II或III的新颖皮质类固醇的另一个优选用途是用于维持疗法。在VISTA ADC的特定情况下，因为VISTA在活化和非活化(初始)免疫细胞上表达，例如单核细胞、巨噬细胞、T细胞、T reg、CD4 T细胞、CD8 T细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、NK细胞和骨髓细胞(VISTA由其组成性地表达)，所以可在延长的时间段内周期性地施用主题ADC，并且当治疗的受试者处于炎症反应的活动阶段时以及当受试者处于疾病缓解状态时，此种施用将引发抗炎活性。这在治疗上是有益的，因为已知许多慢性自身免疫性、过敏性和炎症性病症的特征在于其中患者经历炎症和其他症状或与疾病相关的病理反应的活动期或发作，以及其中包括炎症的疾病症状和与疾病相关的其他症状或病理反应不存在或不太严重的缓解期(即，缓解/复发或发作)。预期因为主题ADC结合至活化和非活化的免疫细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、T细胞、T reg、CD4 T细胞、CD8 T细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、NK细胞和骨髓细胞，所以用主题ADC治疗的患者可更有效地维持疾病缓解，即，缓解期应更长和/或疾病活动期可能以不太严重的形式表现，这是因为在疾病活动期和缓解期间，主题ADC对靶免疫细胞维持抗炎功效。
此外，主题ADC应极其适于长期或慢性用途，这是因为它们对非靶细胞(即，非免疫细胞)不存在任何作用。如下文的实施例中所示，主题ADC几乎完全对靶免疫细胞而不对非免疫细胞起作用(在肝脏中检测到一些抗炎活性，然而，这可能由肝脏包含免疫细胞来解释)。
此外，在主题ADC具有短pK(但令人惊讶地仍具有长PD)的实施方案中，主题ADC不长时间保持血清，即，其快速结合至免疫细胞并且由免疫细胞内化，其中ADC递送其抗炎有效负载并且长时间有效，这显然是因为ADC由免疫细胞有效而快速地大量吸收并且在这些免疫细胞内缓慢代谢。因此，由于主题ADC仅短时间存在于外周循环中，因此与具有长pK的ADC相比，主题ADC与非靶细胞相互作用的机会有限，这是因为其中包含的抗体具有长PK(其对于大多数治疗性抗体而言是常规的)。特定实例为包含Humira的ADC，Humira如同大多数常规治疗性抗体一样具有长pK，即，约一个月。
更进一步地，主题ADC应极其适于长期或慢性用途，这是因为在一些实施方案中，根据本发明的ADC(特别是根据本发明的包含经工程化以削弱FcR和补体结合的Fc区的抗VISTA ADC)的功效完全可归因于抗炎有效负载，例如式(I)、(II)或(III)的类固醇。本质上，抗体，例如抗VISTA抗体在此种情况下仅提供靶向功能，即，其促进ADC由靶免疫细胞结合和内化。然而，此种ADC与表达VISTA的免疫细胞的结合不调节VISTA的活性，即，包含经工程化以排除Fc交联的Fc的抗VISTA抗体不拮抗或激动VISTA活性。[这将与用于递送类固醇的包含在结合至靶抗原后引发生物作用的抗体的现有ADC(例如Humira ADC)成对比]。从给药的角度来看，这应为有益的，因为ADC效力仅取决于抗炎有效负载。此外，这在治疗上是进一步有益的，因为抗VISTA或其他免疫细胞抗原靶向抗体否则在一些情况下可能引发促炎细胞因子反应，所述反应在以减轻炎症为目的的药物的情形下可能不合需要。
其中可使用主题ADC的急性和慢性自身免疫和炎症性适应症此前已提及并且包括获得性再生障碍性贫血+、获得性血友病+、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)+、急性出血性白质脑炎(AHLE)/赫斯特氏病+、原发性无丙种球蛋白血症+、斑秃+、强直性脊柱炎(AS)、抗NMDA受体脑炎+、抗磷脂综合征(APS)+、动脉硬化、自闭症谱系障碍(ASD)、自身免疫性艾迪森氏病(AAD)+、自身免疫性自主神经功能障碍/自身免疫性自主神经节病(AAG)、自身免疫性脑炎+、自身免疫性胃炎、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)+、自身免疫性肝炎(AIH)+、自身免疫性高脂血症、自身免疫性垂体炎/淋巴细胞性垂体炎+、自身免疫性内耳病(AIED)+、自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)+、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎+、自身免疫性睾丸炎+、自身免疫性胰腺炎(AIP)/免疫球蛋白G4相关疾病(IgG4-RD)+、I型、II型和III型自身免疫性多腺体综合征+、自身免疫性黄体酮皮炎+、自身免疫性突发性感觉神经性听力损失(SNHL)弛缓不能、艾迪森氏病、成人斯蒂尔病、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性自主神经功能障碍、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性荨麻疹、轴突与神经元神经病(AMAN)、巴洛病、白塞病、良性粘膜类天疱疮、大疱性类天疱疮、卡斯特莱曼病(CD)、乳糜泻、恰加斯病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、查格-史特劳斯综合征(CSS)或嗜酸性肉芽肿病(EGPA)、瘢痕性类天疱疮、科根氏综合征、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎、CREST综合征、1型糖尿病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克病(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德莱斯勒氏综合征、子宫内膜异位症、嗜酸性食管炎(EoE)、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、原发性混合冷球蛋白血症、伊文氏综合征、纤维肌痛、纤维化肺泡炎、纤维化肺泡炎、巨细胞心肌炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征、肉芽肿性多血管炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、亨诺-许兰紫癜(HSP)、妊娠疱疹或妊娠期类天疱疮(PG)、化脓性汗腺炎(HS)(反常性痤疮)、低丙种球蛋白血症、IgA肾病、IgG4相关硬化性疾病、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、包涵体肌炎(IBM)、间质性膀胱炎(IC)、青少年关节炎、青少年糖尿病(1型糖尿病)、青少年肌炎(JM)、川崎病、兰伯特-伊顿综合征、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、木样结膜炎、线状IgA疾病(LAD)、狼疮(包括肾炎和皮肤型)、慢性莱姆病、梅尼埃病、显微镜下多血管炎(MPA)、混合性结缔组织疾病(MCTD)、莫伦氏溃疡、穆哈-哈伯曼病、多灶性运动神经病(MMN)或MMNCB、多发性硬化、重症肌无力、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体紊乱、肌炎、嗜睡症、新生儿狼疮、视神经脊髓炎、嗜中性白细胞减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、视阵挛-肌阵挛综合征(OMS)、回纹型风湿病(PR)、PANDAS、副肿瘤性小脑变性(PCD)、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、帕罗综合征、睫状体扁平部炎(外周葡萄膜炎)、帕桑-特纳综合征、天疱疮、外周神经病、静脉周脑脊髓炎、恶性贫血(PA)、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I型、II型、III型多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、黄体酮皮炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、纯红细胞再生障碍性贫血(PRCA)、坏疽性脓皮病、雷诺氏现象、反应性关节炎、反射性交感神经营养不良、复发性多软骨炎、不宁腿综合征(RLS)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、类肉瘤病、施密特综合征、巩膜炎、硬皮病、休格伦氏综合征、精子与睾丸自身免疫、僵人综合征(SPS)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克氏综合征、交感性眼炎(SO)、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、甲状腺眼病(TED)、托洛萨-亨特综合征(THS)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、未分化结缔组织疾病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、伏格特-小柳-原田病和其他。
其中ADC应在治疗上有效的优选适应症包括严重哮喘、COPD、巨细胞动脉炎、ANKA血管炎和IBD(结肠炎(例如溃疡性)和克罗恩病)。当然应了解，本文鉴定的疾病疾患旨在为示例性的而非详尽的。
主题ADC可与可在相同或不同组合物中、在相同或不同时间施用的其他治疗剂组合。例如，可在治疗方案中施用主题ADC，所述治疗方案包括施用PD-1或PD-L1激动剂、CTLA4-Ig、细胞因子、细胞因子激动剂或拮抗剂、或另一种免疫抑制受体激动剂或拮抗剂。
可与根据本发明的ADC组合的特定免疫抑制分子的其他实例包括阻断共刺激信号(例如针对CD28或ICOS)的抗体、经由CTLA4活化抑制信号的抗体，和/或针对其他免疫细胞标志物(例如针对CD40、CD40配体或细胞因子)、融合蛋白(例如CTLA4-Fc或PD-1-Fc)和免疫抑制药物(例如雷帕霉素、环孢菌素A或FK506)的抗体。
根据本发明的ADC中经修饰的Fc区
如所提及，在本发明的一些优选实施方案中，ADC包含Fc，所述Fc可被工程化以在Fc区内包括修饰，典型地以改变抗体的一种或多种功能特性，例如补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，在本发明的一些实施方案中，ADC可被化学修饰(例如，一个或多个化学部分可连接到抗体)或经修饰以改变其糖基化，再次改变抗体的一种或多种功能特性。此类实施方案将在下文进一步描述。Fc区中的残基编号为Kabat的EU索引的编号。
在一个实施方案中，CH1的铰链区经修饰，使得铰链区中半胱氨酸残基的数目改变，例如增加或减少。这种方法在Bodmer等人的美国专利第5,677,425号中进一步描述。改变CHI铰链区中半胱氨酸残基的数目以例如促进轻链和重链的组装或者增加或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，使抗体的Fc铰链区突变以进一步降低抗体的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区中，使得抗体相对于原生Fc铰链结构域SpA结合具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。这种方法在Ward等人的美国专利第6,165,745号中进一步详细描述。
在其他实施方案中，通过用不同氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来改变Fc区以改变抗体的效应功能。例如，可用不同氨基酸残基代替一个或多个选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的氨基酸，使得抗体对效应配体的亲和力改变，但保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和力改变的效应配体可为例如Fc受体、或补体的Cl组分。这种方法在Winter等人的美国专利第5,624,821号和第5,648,260号中进一步详细描述。
在另一个实例中，可用不同氨基酸残基代替一个或多个选自氨基酸残基329、331和322的氨基酸，使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这种方法在Idusogie等人的美国专利第6,194,551号中进一步详细描述。
在另一个实例中，改变氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。这种方法在Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中进一步描述。
在又一个实例中，修饰ADC中的Fc区以通过修饰以下位置处的一个或多个氨基酸来增加抗体对Fγ受体的亲和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。这种方法在Presta的PCT公开WO 00/42072中进一步描述。此外，已绘制人类IgG1上对FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点并且已描述具有改善的结合的变体(参见Shields,R.L.等人,(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。在位置256、290、298、333、334和339处的特异性突变显示改善与FcγRIII的结合。另外，以下组合突变体显示改善FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。此外，例如M252Y/S254T/T256E或M428L/N434S的突变改善与FcRn的结合并且增加抗体循环半衰期(参见Chan CA和CarterPJ(2010)Nature Rev Immunol 10:301-316)。
在又一个实施方案中，可修饰ADC中的抗体以消除体内Fab臂交换。具体而言，此过程涉及在其他IgG4抗体之间交换IgG4半分子(一条重链加一条轻链)，从而有效地产生功能上单价的特异性抗体。重链的铰链区和恒定结构域的突变可消除这种交换(参见Aalberse,RC,Schuurman J.,2002,Immunology 105:9-19)。
在又一个实施方案中，ADC中抗体的糖基化经修饰。例如，可制备去糖基化抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可进行一个或多个氨基酸取代，这消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除所述位点处的糖基化。此种去糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。此方法在Co等人的美国专利第5,714,350号和第6,350,861号中进一步详细描述。
另外或替代地，可制备ADC中具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有减少的岩藻糖基残基量的低岩藻糖基化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。此类改变的糖基化模式已证明增加抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化机制的细胞在本领域中已有描述并且可用作宿主细胞，在所述宿主细胞中表达根据本发明的至少一些实施方案的重组抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8((1,6)岩藻糖基转移酶)，使得Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其碳水化合物上缺乏岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709 FUT8细胞系是通过使用两种置换型载体靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因来产生(参见Yamane等人的美国专利公开第20040110704号，和Yamane-Ohnuki等人,(2004)Biotechnol Bioeng 87:614-22)。作为另一个实例，Hanai等人的EP 1,176,195描述了具有功能性破坏的编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因的细胞系，使得此种细胞系中表达的抗体通过减少或消除1,6键相关酶而表现出低岩藻糖基化。Hanai等人还描述了具有低酶活性用于将岩藻糖添加至与抗体的Fc区结合的N-乙酰葡萄糖胺或不具有酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了变异CHO细胞系Lecl3细胞，其将岩藻糖连接到Asn(297)连接的碳水化合物的能力降低，也引起所述宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(也参见Shields,R.L.等人,(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开WO 99/54342描述了经工程化以表达糖蛋白修饰糖基转移酶(例如P(l,4)-N-乙酰葡萄糖氨基转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得工程化细胞系中表达的抗体表现出增加的二等分GlcNac结构，这引起抗体的ADCC活性增加(也参见Umana等人,(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。或者，可使用岩藻糖苷酶裂解去除抗体的岩藻糖残基。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体中去除岩藻糖基残基(Tarentino,A.L.等人,(1975)Biochem.14:5516-23)。
如示例性实施方案中所提及，使抗体的Fc区突变以削弱FcR结合并且任选地削弱补体结合。这些突变包括其示例性抗体中所包含的那些突变。这些突变包括任何或所有L234A/L235A和L234A/L235A/E269R/K322A(IgG1 Fc)；和V234A/G237A/P238s.V309L/A330S/P331S(IgG2 Fc)。
根据本发明的ADC的离体用途
根据至少一些实施方案，免疫细胞，例如单核细胞或骨髓细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、肥大细胞、树突状细胞、Treg和其他造血细胞以及其他免疫细胞类型可离体与主题ADC接触以引发抗炎反应，接着将接触的细胞输注至患者，例如患有过敏性、自身免疫性或炎症性疾患的患者，其中炎症的减轻是治疗上需要的以调节免疫反应。
主题ADC和含有其的药物组合物用于治疗自身免疫性疾病的示例性用途
本文所述的式I、II或III的ADC和新颖类固醇可用于治疗免疫系统相关疾病。任选地，免疫系统相关疾患包括自身免疫性或炎症性疾病，例如先前鉴定的那些，例如移植排斥反应、严重哮喘、结肠炎或IBD、移植物抗宿主病。任选地，治疗与适用于治疗免疫相关疾患的另一个部分组合。
因此，使用主题ADC治疗多发性硬化可与例如用于治疗多发性硬化的任何已知治疗剂或方法组合，任选地如本文所述。
因此，使用主题ADC治疗类风湿性关节炎或其他关节炎疾患可与例如用于治疗类风湿性关节炎的任何已知治疗剂或方法组合，任选地如本文所述。
因此，使用主题ADC治疗IBD可与例如用于治疗IBD的任何已知治疗剂或方法组合，任选地如本文所述。
因此，使用主题ADC治疗牛皮癣可与例如用于治疗牛皮癣的任何已知治疗剂或方法组合，任选地如本文所述。
因此，使用主题ADC治疗1型糖尿病可与例如用于治疗1型糖尿病的任何已知治疗剂或方法组合，任选地如本文所述。
因此，使用主题ADC治疗葡萄膜炎可与例如用于治疗葡萄膜炎的任何已知治疗剂或方法组合，任选地如本文所述。
因此，使用主题ADC治疗牛皮癣可与例如用于治疗牛皮癣的任何已知治疗剂或方法组合，任选地如本文所述。
因此，使用主题ADC治疗休格伦氏综合征可与例如用于治疗休格伦氏综合征的任何已知治疗剂或方法组合，任选地如本文所述。
因此，使用主题ADC治疗全身性红斑狼疮可与例如用于治疗全身性红斑狼疮的任何已知治疗剂或方法组合，任选地如本文所述。
因此，使用主题ADC治疗GVHD可与例如用于治疗GVHD的任何已知治疗剂或方法组合，任选地如本文所述。
因此，使用主题ADC治疗慢性或急性感染和/或与其相关的肝毒性(例如肝炎)可与例如用于治疗慢性或急性感染和/或与其相关的肝毒性的任何已知治疗剂或方法组合，任选地如本文所述。
因此，使用主题ADC治疗慢性或急性严重哮喘可与例如用于治疗严重哮喘的任何已知治疗剂或方法组合，任选地如本文所述。
因此，使用主题ADC治疗慢性或急性巨细胞动脉炎可与例如用于治疗巨细胞动脉炎的任何已知治疗剂或方法组合，任选地如本文所述。
因此，使用主题ADC治疗慢性或急性ANKA血管炎可与例如用于治疗ANKA血管炎的任何已知治疗剂或方法组合，任选地如本文所述。
因此，使用主题ADC治疗慢性或急性IBD(结肠炎和克罗恩病)可与例如用于治疗ANKA血管炎的任何已知治疗剂或方法组合，任选地如本文所述。
再次，应了解，本文鉴定的疾病疾患和使用主题皮质类固醇化合物、皮质类固醇-接头化合物和含有其的ADC的建议治疗旨在为示例性的而非详尽的。
在上述疗法中，优选地将向患有前述或其他自身免疫性或炎症性疾患之一的受试者施用根据本发明的ADC，从而预防或改善疾病症状。
药物组合物
在另一个方面，本发明提供一种组合物，例如药物组合物，所述组合物含有根据本发明的ADC或式I、II或III的新颖类固醇或皮质类固醇-接头化合物和任选地另一种免疫抑制剂或其他活性剂。因此，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的根据本发明的ADC或式I、II或III的新颖类固醇或含有其的皮质类固醇-接头化合物。特别是，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效[抗炎]量的至少一种根据本发明的式I、II或III的新颖类固醇或含有其的皮质类固醇-接头化合物或含有其的ADC。
术语“治疗有效量”是指有效治疗哺乳动物的疾病或病症的根据本发明的药剂的量。本发明的治疗剂可单独或作为药物组合物的一部分提供给受试者，在药物组合物中所述治疗剂与药学上可接受的载剂混合。在许多情况下，根据本发明的ADC将与适用于治疗特定疾患的其他免疫治疗剂或其他治疗剂组合使用。
如果接受患者可耐受组合物的施用，则称所述组合物为“药学上可接受的”。如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。优选地，载剂适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊椎或表皮施用(例如通过注射或输注)。
此类组合物包括无菌水、缓冲盐水(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度以及任选地添加剂，例如清洁剂和增溶剂(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、偏亚硫酸钠)、防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇)和填充物质(例如乳糖、甘露糖醇)。如下文详述，还可使用非水性溶剂或媒介物。
可用于根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物中的适合水性和非水性载剂的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其适合的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。可例如通过使用包衣材料(例如卵磷脂)，在分散液的情况下通过维持所需粒度，和通过使用表面活性剂来维持适当流动性。取决于施用途径，活性化合物，即，单克隆或多克隆抗体和抗原结合片段和含有其的偶联物，和/或特异性地结合任一种VISTA蛋白或双特异性分子的替代性支架可包裹于材料中以保护化合物免受酸和可能使化合物失活的其他自然条件的作用。根据本发明的至少一些实施方案的药物化合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性并且不赋予任何非所需的毒理学作用的盐(参见例如Berge,S.M.等人,(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等的盐，以及衍生自无毒有机酸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的烷酸、羟基烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等的盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属如钠、钾、镁、钙等，以及衍生自无毒有机胺如N,N'-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因(procaine)等的盐。
根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物还可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、a-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
这些组合物也可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过上述灭菌程序以及通过包括各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等两种方式来确保防止微生物存在。还可能需要在组合物中包括等张剂，例如糖、氯化钠等。此外，可通过包括延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。
药学上可接受的载剂包括无菌水性溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域中是已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则预期其在根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物中的用途。补充性活性化合物也可并入组合物中。
治疗性组合物典型地必须为无菌的并且在制造和储存条件下是稳定的。组合物可配制成溶液、微乳液、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。载剂可为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合混合物。可例如通过使用包衣(例如卵磷脂)，在分散液的情况下通过维持所需粒度，和通过使用表面活性剂来维持适当流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等张剂，例如糖、多元醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收剂，例如单硬脂酸盐和明胶来延长可注射组合物的吸收。可通过将所需量的活性化合物，视需要与上文所列成分中的一者或组合一起并入适当溶剂中，继而进行灭菌微滤来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备分散液，所述媒介物含有基础分散介质和来自上文所列的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何额外所需成分的粉末。
可通过将所需量的活性化合物，视需要与上文所列成分中的一者或组合一起并入适当溶剂中，继而进行灭菌微滤来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备分散液，所述媒介物含有基础分散介质和来自上文所列的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何额外所需成分的粉末。
本发明的组合物可使用本领域中已知的多种方法中的一者或多者经由一种或多种施用途径来施用。如本领域技术人员将了解，施用途径和/或模式将根据所需结果而变化。根据本发明的至少一些实施方案的治疗剂的优选施用途径包括血管内递送(例如注射或输注)、静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊椎、口服、经肠、直肠、肺(例如吸入)、鼻、局部(包括透皮、经颊和舌下)、膀胱内、玻璃体内、腹膜内、阴道、脑部递送(例如脑室内、脑内和对流增强扩散)、CNS递送(例如鞘内、脊椎周和脊椎内)或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)、经粘膜(例如舌下施用)、经由植入物施用或施用，或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注，或本领域中已知的其他递送途径和/或施用形式。如本文所用，短语“肠胃外施用”意指除经肠和局部施用以外的施用模式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊椎内、硬膜外和胸骨内注射和输注。在一个特定实施方案中，根据本发明的至少一些实施方案的蛋白质、治疗剂或药物组合物可经腹膜内或静脉内施用。
或者，根据本发明的ADC可经由非肠外途径施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部。
可用本领域中已知的医疗装置施用包含根据本发明的ADC的治疗性组合物。例如，在一个优选实施方案中，可用针头皮下注射装置施用根据本发明的至少一些实施方案的治疗性组合物，例如美国专利第5,399,163号、第5,383,851号、第5,312,335号、第5,064,413号、第4,941,880号、第4,790,824号或第4,596,556中所公开的装置。适用于本发明的众所周知的植入物和模块的实例包括：美国专利第4,487,603号，其公开了用于以受控速率分配药物的植入式微型输注泵；美国专利第4,486,194号，其公开了用于经皮肤施用药剂的治疗装置；美国专利第4,447,233号，其公开了用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利第4,447,224号，其公开了用于连续药物递送的可变流量植入式输注设备；美国专利第4,439,196号，其公开了具有多室隔室的渗透药物递送系统；和美国专利第4,475,196号，其公开了渗透药物递送系统。这些专利通过引用并入本文。许多其他此类植入物、递送系统和模块对于本领域技术人员是已知的。
在某些实施方案中，可配制ADC以确保体内适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水性化合物。为确保根据本发明的至少一些实施方案的治疗性化合物穿过BBB(必要时)，可将其配制于例如脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见例如美国专利第4,522,811号、第5,374,548号和第5,399,331号。脂质体可包含一种或多种选择性地转运至特定细胞或器官中的部分，由此增强靶向药物递送(参见例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括叶酸盐或生物素(参见例如Low等人的美国专利第5,416,016号)；甘露糖苷(Umezawa等人,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等人,(1995)FEBSLett.357:140；M.Owais等人,(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人,(1995)Am.J Physiol.1233:134)；pl20(Schreier等人,(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion和I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。优选地，载剂适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊椎或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于施用途径，活性化合物，即，根据本发明的ADC可包裹于材料中以保护化合物免受酸和可能使化合物失活的其他自然条件的作用。根据本发明的至少一些实施方案的药物化合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。
“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性并且不赋予任何非所需的毒理学作用的盐(参见例如Berge,S.M.等人,(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等的盐，以及衍生自无毒有机酸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的烷酸、羟基烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等的盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属如钠、钾、镁、钙等，以及衍生自无毒有机胺如N,N'-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的盐。
根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物还可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、a-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。可用于根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物中的适合水性和非水性载剂的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其适合的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。可例如通过使用包衣材料(例如卵磷脂)，在分散液的情况下通过维持所需粒度，和通过使用表面活性剂来维持适当流动性。
这些组合物还可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过上述灭菌程序以及通过包括各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等两种方式来确保防止微生物存在。还可能需要在组合物中包括等张剂，例如糖、氯化钠等。此外，可通过包括延迟吸收剂如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。
药学上可接受的载剂包括无菌水性溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域中是已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则预期其在根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物中的用途。补充性活性化合物也可并入组合物中。
治疗性组合物典型地必须是无菌的并且在制造和储存条件下是稳定的。组合物可配制成溶液、微乳液、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。载剂可为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合混合物。可例如通过使用包衣(例如卵磷脂)，在分散液的情况下通过维持所需粒度，和通过使用表面活性剂来维持适当流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等张剂，例如糖、多元醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收剂，例如单硬脂酸盐和明胶来延长可注射组合物的吸收。可通过将所需量的活性化合物，视需要与上文所列成分中的一者或组合一起并入适当溶剂中，继而进行灭菌微滤来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备分散液，所述媒介物含有基础分散介质和来自上文所列的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何额外所需成分的粉末。
可通过将所需量的活性化合物，视需要与上文所列成分中的一者或组合一起并入适当溶剂中，继而进行灭菌微滤来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备分散液，所述媒介物含有基础分散介质和来自上文所列的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥(冻干)，从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何额外所需成分的粉末。
可与载剂材料组合以产生单一剂型的活性成分，即，根据本发明的ADC或新颖类固醇化合物的量将根据所治疗的受试者和特定施用模式而变化。可与载剂材料组合以产生单一剂型的活性成分，即，根据本发明的ADC或新颖类固醇化合物的量通常将为产生治疗作用的组合物的量。通常，在百分之百当中，此量将在约0.01％至约99％，优选约0.1％至约70％、最优选约1％至约30％的与药学上可接受的载剂组合的活性成分的范围内。
调整剂量方案以提供最佳所需反应(例如治疗反应)。例如，可施用单次推注，可随时间施用若干分次剂量，或者可由治疗情况的紧急性所指示按比例减少或增加剂量。将肠胃外组合物配制成易于施用和剂量均匀的剂量单位形式是尤其有利的。如本文所用，剂量单位形式是指适合作为用于待治疗受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有预定量的活性化合物，所述预定量经计算以与所需药物载剂相结合产生所需治疗作用。根据本发明的至少一些实施方案的剂量单位形式的规格由以下规定并且直接根据以下而定：(a)活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗作用；和(b)混配此种活性化合物用于治疗受试者敏感性的技术中的固有限制。
对于本文所公开的ADC的施用，在一些实施方案中，与常规类固醇化合物如地塞米松或布地奈德经由常规途径施用时的功效所需的量相比，即，在常规途径中类固醇以裸或未偶联形式施用以治疗特定疾患，剂量范围通常将包括施用一定量的ADC，其递送相同或更少量的抗炎剂，例如式I、II或III的类固醇，用于实现治疗功效。在示例性实施方案中，相比经由常规途径施用AI，即，在常规途径中类固醇以裸或未偶联形式施用以治疗特定疾患，剂量范围通常将包括施用一定量的ADC，其递送减少量的抗炎剂，例如抗炎剂(例如地塞米松或布地奈德)的10-90％，用于实现治疗功效，正如基于迄今获得的结果预期，本发明ADC除减少或消除AI(例如类固醇)的不良副作用以外，将更有效地递送至所需靶免疫细胞并且将不太容易到达非靶细胞，从而减少所需类固醇有效剂量和/或减少对非靶细胞的作用。
本文所公开的ADC可多次施用。单次剂量之间的时间间隔可为例如每3-5天、每周、每两周、每2-3周等。在一些方法中，调整剂量以达到所需水平的血浆类固醇浓度。与其中抗体引发生物或治疗作用的其他ADC相比，确定使用主题ADC进行治疗或预防的有效给药方案应相对容易，这是因为主题ADC的治疗活性在一些情况下完全由抗炎有效负载主导。(本质上，在一些情况下，抗体仅靶向和指导主题ADC内化至特定免疫细胞中并且本身不引发对免疫的作用)。
或者，ADC可作为持续释放制剂施用，在此种情况下需要较低频率施用。施用的剂量和频率可根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防应用中，可被长时间段以相对不频繁的时间间隔施用相对低剂量。一些患者可能会在余生中继续接受治疗。在治疗应用中，有时需要以相对短的时间间隔使用相对高剂量，直至疾病进展减少或终止，并且优选直至患者显示出疾病症状的部分或完全改善。此后，可向患者施用预防方案。如所提及，主题ADC优选用于此类用途，这是因为它们在外周循环中保留极短的持续时间，不结合至非免疫细胞，并且不明显引发对非靶细胞的毒性。
可改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得有效实现特定患者、组合物和施用模式的所需治疗反应，而对患者无毒的活性成分的量。所选的剂量水平将取决于多种药物动力学因素，包括所采用的本发明的特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所采用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所采用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、状态、一般健康状况和既往病史，以及医学领域中熟知的类似因素。
示例性实施方案
本发明提供包含以下的抗体药物偶联物(ADC)：包含特异性地结合至免疫细胞抗原，例如人类T细胞活化V-结构域Ig抑制因子(人类VISTA)的抗原结合区的抗体或抗原结合片段(“A”)；可裂解和/或不可裂解接头(“L”)；和至少一种小分子抗炎剂(“AI”)；任选地“Q”，“异双官能团”或“异三官能团”，其为任选地用于将接头连接到抗VISTA抗体或抗体片段和至少一种小分子抗炎剂(“AI”)(典型地为类固醇)的化学部分，所述ADC由下式表示：
“A-(Q-L-AI)n”或“(AI-L-Q)n-A”
其中“n”为至少1并且可高达12或更大，并且其中当向有需要的受试者施用时，ADC或含有其的组合物优先递送至表达抗体结合的抗原的细胞，例如表达VISTA的免疫细胞，任选地为单核细胞、骨髓细胞、T细胞、Treg、嗜酸性粒细胞、CD4或CD8 T细胞、嗜中性粒细胞；并且使得小分子抗炎剂任选地在生理条件(约pH 7.5)下功能性内化至所述免疫细胞中，优选地其中抗体或抗体片段，例如抗VISTA抗体或抗原结合片段在生理pH(约pH 7.5)下在血清中具有短体内血清半衰期，任选地在生理pH(约pH 7.5)下在啮齿动物(人类VISTA敲入小鼠或大鼠)的血清中的体内血清半衰期不超过约70小时、不超过约60小时、不超过50小时、不超过40小时、不超过30小时、不超过24小时、不超过22-24小时、不超过20-22小时、不超过18-20小时、不超过16-18小时、不超过14-16小时、不超过12-14小时、不超过10-12小时、不超过8-10小时、不超过6-8小时、不超过4-6小时、不超过2-4小时、不超过1-2小时、不超过0.5至1.0小时或不超过0.1-0.5小时，和/或在灵长类动物(例如人类或食蟹猴)中不超过约3、2.5或2.3±0.7天。
可并入主题ADC中的示例性可裂解和不可裂解接头先前已在本文中鉴定并且在本领域中是熟知的。可用于根据本发明的ADC中的此种类型接头的特定类型和实例在下文进一步鉴定。
如所提及，尽管类固醇化合物对抑制与例如自身免疫性、过敏性和炎症性病症、癌症和感染性疾病的不同疾患相关的炎症极其有效，但所述化合物在疾病的慢性治疗中的效用因严重副作用而受限，当将其并入根据本发明的ADC中时所述副作用将减轻。
特别是，本发明包括根据本发明的ADC，其中AI包含类固醇(糖皮质激素激动剂)，所述类固醇包含以下通式结构：
具体而言，本文提供具有以下式(I)结构的糖皮质激素激动剂化合物：
其中X选自苯基、螺[3.3]庚烷、3-6元杂环、环烷基、螺烷基、螺杂环烷基、双环烷基、杂双环烷基、[1.1.1]双环戊烷、双环[2.2.2]辛烷、金刚烷和立方烷，其各自可被1-4个独立地选自F、Cl、Br、I、N、S和O的杂原子取代，其中每个环结构可含有至少一个选自N、S和O的骨架杂原子，并且任选地进一步被1-4个C1-3烷基或C1-3全氟烷基取代；
Z选自苯基、螺[3.3]庚烷、3-6元杂环、环烷基、螺烷基、螺杂环烷基、双环烷基、杂双环烷基、[1.1.1]双环戊烷、双环[2.2.2]辛烷、金刚烷和立方烷，其各自可被1-4个独立地选自F、Cl、Br、I、N、S和O的杂原子取代，其中每个环结构可含有至少一个选自N、S和O的骨架杂原子，并且任选地进一步被1-4个C1-3烷基或C1-3全氟烷基取代；
Y选自CHR1、O、S和NR1；
E选自CH2和O；
G选自CH和N；
进一步其中当G为CH并且X为苯基时，Z不为苯基；
G与X的键联可任选地选自C1-3烷基和环氧乙烷，其各自可被1-4个独立地选自N、S和O的杂原子取代并且任选地进一步被1-4个C1-3烷基取代；
X与Z的键联可占据X和Z上的任何可用位置；
取代基NR1R2可占据Z上的任何可用位置；
R1选自H、1-8个碳的直链或支链烷基、芳基和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
当R1为H时，R2可选自H、1-8个碳的直链或支链烷基、芳基和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
当R1为H、1-8个碳的直链或支链烷基、或杂芳基时，R2可为选自以下的官能团：
[(C＝O)CH(W)NH]m-[C＝O]-[V]k-J，
(C＝O)OCH2-对氨基苯基-N-V-J，
(C＝O)OCH2-对氨基苯基-N-[(C＝O)CH(W)NH]m-[C＝O]-[V]k-J，和
[V]k-(C＝O)OCH2-对氨基苯基-N-[(C＝O)CH(W)NH]m-[C＝O]-J，
其中m＝1-6，k＝0-1，并且W的每个置换可独立地选自H、[(CH2)nR3](其中n＝1-4)、以R3为末端的支链烷基链，和包含1-13个单元的直链或支链聚环氧乙烷基团；
R3选自H、甲基、乙基、异丙基、OH、O-烷基、NH2、NH-烷基、N-二烷基、SH、S-烷基、胍、脲、羧酸、羧酰胺、羧酸酯、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基，其中所述芳基和杂芳基取代基可选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-；
V可选自1-8个碳的烷基链；包含1-13个单元的直链或支链聚环氧乙烷基团；包含1-8个碳的直链或支链烷基；-O-烷基；羧酸；羧酰胺；羧酸酯；烷基-C(O)O-；烷基氨基-C(O)-；二烷基氨基C(O)-；1-3个氨基酸的序列，其中每个氨基酸独立地选自Glu、Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、βAla、Phe、Val和Cit；芳基；和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-、二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
J为选自以下的反应基团：-NH2、N3、硫基、环辛炔、-OH、-CO2H、反式环辛烯、炔基、炔丙基、
其中R32选自Cl、Br、F、甲磺酸酯和甲苯磺酸酯，并且R33选自Cl、Br、I、F、OH、-O-N-丁二酰亚胺基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基，R34为H、Me、四嗪-H和四嗪-Me；
R5选自由-CH2OH、-CH2SH、-CH2Cl、-SCH2Cl、-SCH2F、-SCH2CF3、羟基、-OCH2CN、-OCH2Cl、-OCH2F、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH2CN和组成的组；/>
R6和R7独立地选自氢和C1-10烷基；
Q可为H、C(O)R8(其中R8为1-8个碳的直链或支链烷基)，或(C＝O)NR4CHnNR4(C＝O)OCH2-(V)n-J(其中n＝1-4并且R4＝H、烷基或支链烷基)，或P(O)OR4；
A1和A2独立地选自H和F；并且除非另有规定，否则要求保护所有可能的立体异构体，并且进一步任选地，X和Z独立地选自苯基、螺[3.3]庚烷、[1.1.1]双环戊烷和双环[2.2.2]辛烷；Y选自CH2和O；W的置换独立地选自CH2CH2CO2H和H，并且进一步其中当G为CH并且X为苯基时，Z不为苯基；
或者
具有式(II)结构的糖皮质激素激动剂化合物：
其中
Y选自CH2和O；
E选自CH2和O；
G选自CH和N；
L选自H和F；
R5选自-CH2OH、-SCH2F和
A1和A2独立地选自H和F；
V可选自1-8个碳的烷基链；包含1-13个单元的直链或支链聚环氧乙烷基团；包含1-8个碳的直链或支链烷基；-O-烷基；羧酸；羧酰胺；羧酸酯；烷基-C(O)O-；烷基氨基-C(O)-；二烷基氨基C(O)-；1-3个氨基酸的序列，其中每个氨基酸独立地选自Glu、Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、βAla、Phe、Val和Cit；芳基；和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-、二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
J为选自以下的反应基团：-NH2、N3、硫基、环辛炔、-OH、-CO2H、反式环辛烯、炔基、炔丙基、
其中R32选自Cl、Br、F、甲磺酸酯和甲苯磺酸酯，并且R33选自Cl、Br、I、F、OH、-O-N-丁二酰亚胺基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基，R34为H、Me、四嗪-H和四嗪-Me；
或者
具有式(III)结构的糖皮质激素激动剂化合物：
其中
Y选自CH2和O；
E选自CH2和O；
G选自CH和N；
L选自H和F；
R5选自-CH2OH、-SCH2F和
A1和A2独立地选自H和F；
V可选自1-8个碳的烷基链；包含1-13个单元的直链或支链聚环氧乙烷基团；包含1-8个碳的直链或支链烷基；-O-烷基；羧酸；羧酰胺；羧酸酯；烷基-C(O)O-；烷基氨基-C(O)-；二烷基氨基C(O)-；1-3个氨基酸的序列，其中每个氨基酸独立地选自Glu、Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、βAla、Phe、Val和Cit；芳基；和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-、二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
J为选自以下的反应基团：-NH2、N3、硫基、环辛炔、-OH、-CO2H、反式环辛烯、炔基、炔丙基、
其中R32选自Cl、Br、F、甲磺酸酯和甲苯磺酸酯，并且R33选自Cl、Br、I、F、OH、-O-N-丁二酰亚胺基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基，R34为H、Me、四嗪-H和四嗪-Me。
I.示例性接头
如所提及，可将不同接头并入根据本发明的ADC中。此类接头先前已在其中定义“接头”的定义章节中鉴定。另外，下文鉴定可并入根据本发明的ADC中的示例性接头：
A.牺牲型接头ADC
(I)
其中，
Ab＝抗体，优选为结合至人类免疫细胞的抗体，优选为在生理pH下结合至人类VISTA免疫细胞的抗VISTA抗体；
L＝接头；
AA＝单、双或三氨基酸序列；
NH有效负载＝
REG独立地选自由氢、烷基、联苯、-CF3、-NO2、-CN、氟、溴、氯、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-组成的组；
Ab＝抗体；
L＝接头；
AA＝单、双或三氨基酸序列；
NH有效负载＝
REG独立地选自由氢、烷基、联苯、-CF3、-NO2、-CN、氟、溴、氯、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-组成的组；
Ab＝抗体；
L＝接头；
AA＝单、双或三氨基酸序列或不存在；
NH有效负载＝
REG独立地选自由氢、烷基、联苯、-CF3、-NO2、-CN、氟、溴、氯、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-组成的组；
RT＝AA或
Ab＝抗体，任选地为抗人VISTA抗体；
L＝接头；
AA＝单、双或三氨基酸序列；
O有效负载＝/>
Ab＝抗体；
L＝接头；
AA＝单、双或三氨基酸序列或不存在；
O有效负载＝
RT＝AA或
B.氨基酸(AA)接头
(I)由组织蛋白酶裂解的序列
a.单氨基酸接头
b.二肽接头
/>
/>
c.三肽接头
/>
/>
/>
(I)豆荚蛋白(Legumain)可裂解接头
其中，
L＝接头
Ab＝抗体
指示与有效负载或牺牲型接头的连接点。
II.示例性抗体偶联策略
可使用不同偶联策略将抗VISTA抗体偶联至接头和有效负载(类固醇或其他抗炎化合物)。实施例中提供用于产生示例性ADC和接头有效负载的详细合成方法。另外，下文提供示例性偶联策略：
(I)有效负载-接头-J
其中有效负载为：
接头＝Q、R1或R2
J为适合与Ab上的互补官能团反应以形成抗体-药物偶联物的官能团。
J选自：
指示J与选自Q、R1或R2的接头的连接点。
其中R32为Cl、Br、F、甲磺酸酯或甲苯磺酸酯，R33为Cl、Br、I、F、OH、-O-N-丁二酰亚胺基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基，并且R34为H、Me或吡啶基；
-OH基团可用抗体上，例如天冬氨酸或谷氨酸侧链上的羧基酯化；
-CO2H基团可用-OH基团酯化或用抗体上的氨基(例如赖氨酸侧链上)酰胺化；
N-羟基丁二酰亚胺基在功能上是活化的羧基，并且可便利地通过与氨基(例如来自赖氨酸)反应而酰胺化；
在迈克尔加成反应(Michael addition reaction)中，顺丁烯二酰亚胺基可与抗体上的-SH基团(例如来自半胱氨酸或来自抗体的化学修饰以引入巯基官能团)偶联；
在抗体不具有可用于偶联的半胱氨酸-SH的情况下，赖氨酸残基侧链中的ε-氨基可与2-亚氨基硫杂环戊烷或N-丁二酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(“SPDP”)反应以引入游离硫醇(-SH)基团，从而产生半胱氨酸替代物。硫醇基可与顺丁烯二酰亚胺或其他亲核体接受基团反应以实现偶联。
抗体Ab可用4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-羟基丁二酰亚胺酯(“SMCC”)或其磺化变体磺基-SMCC(两者均可获自Sigma-Aldrich)修饰，以向其中引入顺丁烯二酰亚胺基。接着，可用在接头上具有-SH基团的药物-接头化合物实现偶联。
无铜“点击化学”，其中叠氮基(-N3)添加至应变环辛炔上以形成1,2,3-三唑环。叠氮化物可位于抗体上并且环辛炔可位于药物-接头部分上，反之亦然。优选环辛炔基团是二苯并环辛炔(DBCO)。
将非天然氨基酸引入抗体中，所述非天然氨基酸提供与药物部分中的反应性官能团偶联的功能。例如，可将非天然氨基酸对乙酰基苯丙氨酸并入抗体或其他多肽中。对乙酰基苯丙氨酸中的酮基可经由与接头-药物部分上的羟氨基形成肟而成为偶联位点。或者，可将非天然氨基酸对叠氮基苯丙氨酸(或对叠氮基甲基-l-苯丙氨酸)并入抗体中以提供叠氮基官能团，用于经由点击化学与DBCO偶联形成1,2,3-三唑环。
另一个实例将为并入含有应变烯烃降冰片烯、反式环辛烯或环丙烯的非天然氨基酸，所述非天然氨基酸可与四嗪发生反电子需求狄尔斯-阿尔德(Diels Alder)“点击化学”反应以形成双环二嗪产物。
另一种偶联技术使用酶类转谷氨酰胺酶(优选为来自茂原链霉菌(Streptomycesmobaraensis)或BTG的细菌转谷氨酰胺酶)。BTG在谷氨酰胺(胺接受体)的侧链羧酰胺与亚烷基氨基(胺供体)之间形成酰胺键，所述亚烷基氨基可为例如赖氨酸的ε-氨基或5-氨基-正戊基。在典型偶联反应中，谷氨酰胺残基位于抗体上，而亚烷基氨基位于接头-药物部分上。
III.示例性抗体偶联物
可使用上文所述和如实施例中所公开的详细合成方法来产生根据本发明的ADC偶联物，任选地包含靶向所需免疫细胞抗原的抗体或片段，例如抗VISTA抗体(其任选地在生理pH下结合至人类VISTA并且具有如先前所定义的短PK)，一个或多个可裂解和/或不可裂解接头，和任选地连接到牺牲型接头的一个或多个有效负载(类固醇或其他抗炎化合物)。下文提供一些示例性ADC结构和偶联方法：
(I)优选实例
/>
/>
指示与抗体或其抗原结合片段的连接点
指示经由半胱氨酸残基的硫原子与抗体或其抗原结合片段的连接点；或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体和/或立体异构体的混合物。
指示与接头或AA的连接点
IV.示例性有效负载-接头结构
可使用上文所述和如实施例中所公开的详细合成方法来产生连接到接头的不同有效负载(类固醇或其他抗炎化合物)。下文以及图118A-O中提供示例性有效负载-接头结构：
(I)有效负载-接头-J
其中，
接头＝蛋白酶可裂解序列(AA)
J＝烷氧基胺
/>
/>
其中，
接头＝蛋白酶可裂解序列(AA)J＝溴乙酰基
/>
其中，
接头＝蛋白酶可裂解序列(AA)J＝二苯甲基环辛炔
/>
/>
/>
其中，
接头＝蛋白酶可裂解序列(AA)J＝羟基丁二酰亚胺
/>
/>
/>
其中，
接头＝蛋白酶可裂解序列(AA)J＝顺丁烯二酰亚胺
/>
/>
/>
其中，
接头＝蛋白酶可裂解序列(AA)J＝四嗪
/>
/>
/>
/>
其中，
接头＝蛋白酶可裂解序列(AA)J＝TG偶联
/>
/>
(II)有效负载-接头-J
其中，
接头＝蛋白酶可裂解序列(AA)+牺牲型接头对氨基苯甲基(PAB)J＝烷氧基胺
/>
/>
/>
其中，
接头＝蛋白酶可裂解序列(AA)+牺牲型接头对氨基苯甲基(PAB)J＝溴乙酰基
/>
/>
/>
其中，
接头＝蛋白酶可裂解序列(AA)+牺牲型接头对氨基苯甲基(PAB)
J＝二苯并环辛炔
/>
/>
/>
其中，
接头＝蛋白酶可裂解序列(AA)+牺牲型接头对氨基苯甲基(PAB)J＝羟基丁二酰亚胺
/>
/>
/>
其中，
接头＝蛋白酶可裂解序列(AA)+牺牲型接头对氨基苯甲基(PAB)J＝顺丁烯二酰亚胺
/>
/>
/>
其中，
接头＝蛋白酶可裂解序列(AA)+牺牲型接头对氨基苯甲基(PAB)J＝四嗪
/>
/>
/>
其中，
接头＝蛋白酶可裂解序列(AA)+牺牲型接头对氨基苯甲基(PAB)J＝胺
/>
/>
/>
(II)有效负载-接头-J
其中，
接头＝葡萄糖醛酸酶可裂解糖(GlcA)+牺牲型接头对氨基苯甲基(PAB)
J＝烷氧基胺
/>
/>
/>
/>
其中，
接头＝葡萄糖醛酸酶可裂解糖(GlcA)+牺牲型接头对氨基苯甲基(PAB)J＝溴乙酰基
/>
/>
/>
其中，
接头＝葡萄糖醛酸酶可裂解糖(GlcA)+牺牲型接头对氨基苯甲基(PAB)J＝二苯并环辛炔
/>
/>
/>
/>
其中，
接头＝葡萄糖醛酸酶可裂解糖(GlcA)+牺牲型接头对氨基苯甲基(PAB)J＝羟基丁二酰亚胺
/>
/>
/>
/>
其中，
接头＝葡萄糖醛酸酶可裂解糖(GlcA)+牺牲型接头对氨基苯甲基(PAB)J＝顺丁烯二酰亚胺
/>
/>
/>
/>
/>
其中，
接头＝葡萄糖醛酸酶可裂解糖(GlcA)+牺牲型接头对氨基苯甲基(PAB)J＝四嗪
/>
/>
/>
/>
其中，
接头＝葡萄糖醛酸酶可裂解糖(GlcA)+牺牲型接头对氨基苯甲基(PAB)J＝胺
/>
/>
/>
/>
(IV)有效负载-接头-J
接头-J连接到有效负载(C11-OH)的替代位点。
INX-SM-3用作有效负载实例
烷氧基胺
溴乙酰基
顺丁烯二酰亚胺
二苯并环辛炔
/>
四嗪
胺
(IV)有效负载-接头-J
接头-J连接到有效负载(C17)的替代位点。
INX-SM-3用作有效负载实例
烷氧基胺
/>
溴乙酰基
顺丁烯二酰亚胺
二苯并环辛炔
/>
四嗪
胺
V.示例性有效负载-接头-Ab偶联物(其中INX-SM-3为示例性有效负载)
可使用上文所述和如实施例中所公开的详细合成方法来产生包含以下的不同ADC偶联物：结合至免疫细胞表达的抗原的抗体或抗体片段，任选地为具有本文所述的pH结合/PK特性的抗VISTA抗体或片段，一个或多个接头，和一个或多个有效负载(类固醇或其他抗炎化合物)。下文提供包含示例性类固醇有效负载(INX-SM-3)的一些示例性ADC。其他示例性ADC在实施例中公开并且可进一步包含根据本发明的其他类固醇有效负载，即，包含如本文所公开的式I、II或III的类固醇化合物的那些。
烷氧基胺+酮偶联(C11-OH连接)
/>
叠氮化物+二苯并环辛炔偶联(C11-OH连接)
卤乙酰基+半胱氨酸偶联(C11-OH连接)
顺丁烯二酰亚胺+半胱氨酸偶联(C11-OH连接)
/>
四嗪+反式环辛烯偶联(C11-OH连接)
使用反式谷氨酰胺酶的胺+谷氨酰胺偶联(C11-OH连接)
烷氧基胺+酮偶联(C17)
/>
叠氮化物+二苯并环辛炔偶联(C17)
/>
卤乙酰与半胱氨酸偶联(C17)
顺丁烯二酰亚胺与半胱氨酸偶联(C17)
四嗪+反式环辛烯(C17)
/>
使用反式谷氨酰胺酶的胺+谷氨酰胺偶联(C17)
N-连接的有效负载-接头-Ab ADC
烷氧基胺+酮偶联
烷氧基胺+酮偶联
卤乙酰基偶联
烷氧基胺+酮偶联
卤乙酰基偶联
叠氮化物+二苯并环辛炔偶联
叠氮化物+二苯并环辛炔偶联
N-羟基丁二酰亚胺偶联
N-羟基丁二酰亚胺偶联
叠氮化物+二苯并环辛炔偶联
N-羟基丁二酰亚胺偶联
顺丁烯二酰亚胺偶联
顺丁烯二酰亚胺偶联
顺丁烯二酰亚胺偶联
反式环辛烯+四嗪偶联
反式环辛烯+四嗪偶联
反式环辛烯+四嗪偶联
胺偶联
/>
胺偶联
卤乙酰基偶联
式I、II和III的类固醇有效负载、类固醇-接头有效负载和含有其的ADC的治疗应
用
可如上文所述和在下文的实施例中产生包含根据本发明的合成糖皮质激素激动剂的ADC。在一些示例性实施方案中，其中所含的抗体将包括在生理pH下结合至免疫细胞并且此外具有短PK的抗人VISTA抗体或片段，或者可包括结合至另一种免疫细胞抗原的抗体或抗体片段，优选为有效地内化靶免疫细胞并且优选基本上不结合或内化非靶细胞的抗体或抗体片段。通常，主题ADC将包含式I、II或III的类固醇或含有其的类固醇-接头，和结合至特定类型的免疫细胞上表达的抗原的抗体或抗体片段，所述抗原优选为仅在靶免疫细胞上表达，或与表达抗原的非靶细胞相比在靶免疫细胞上以基本上更高的水平(例如高至少2倍、4倍、10倍或更高)表达的抗原。
这些ADC可用于炎症、过敏、自身免疫和与炎症、自身免疫或过敏相关的疾病的预防性和/或治疗性治疗，包括例如本文所公开的自身免疫性病症、炎症性病症、过敏性病症和癌症疾患。再次，主题ADC，包括那些包含式I、II或III的类固醇的ADC的优选应用为用于治疗与炎症或自身免疫相关的慢性疾病。
如本文所示，已发现主题VISTA靶向ADC相对于抗体的更短半衰期(PK)在长期时段(PD)内维持效力，尽管其中包含的在生理条件下结合至VISTA表达细胞并且未经工程化以改变或优化pH结合的抗VISTA抗体具有短pK，即，典型地在食蟹猴中为约2.3天或更短并且在人类VISTA工程化小鼠中不超过约70小时、不超过约60小时、不超过50小时、不超过40小时、不超过30小时、不超过24小时、不超过22-24小时、不超过20-22小时、不超过18-20小时、不超过16-18小时、不超过14-16小时、不超过12-14小时、不超过10-12小时、不超过8-10小时、不超过6-8小时、不超过4-6小时、不超过2-4小时、不超过1-2小时、不超过0.5至1.0小时或不超过0.1-0.5小时。
如本文所示，包含此类抗VISTA抗体或抗体片段的根据本发明的ADC偶联物当在体内模型中评价时已证明提供至少14:1和28:1的PD/PK比率。再次，尽管申请人不希望受其观念束缚，但理论上包含此类抗VISTA抗体或抗体片段的主题ADC以极高的量递送于靶标VISTA表达细胞中，例如具有长细胞周转期(数周、数月或更长时间)的巨噬细胞。本质上，似乎可产生贮库效应，即，大量的主题ADC内化至表达VISTA的免疫细胞中，即，由于VISTA的极高表达，因此ADC缓慢代谢或裂解(例如由细胞酶)，使得治疗有效量的类固醇有效负载在免疫细胞内逐步和长期释放。然而，应强调，包含根据本发明的类固醇有效负载(即，式I、II或III)的ADC可包含结合至其他抗原，典型地为人类免疫细胞上表达的抗原的抗体或抗体片段。实际上，在实施例中，申请人显示包含根据本发明的类固醇有效负载的ADC也具有所需效力特性，所述ADC包含靶向不同免疫细胞抗原的抗体。
在已描述本发明下，提供以下实施例以进一步说明本发明和其固有优点。
实施例
以下实施例描述本发明的示例性实施方案。
实施例中使用的缩写
Ab 抗体
AF488 Alexa Fluor 488
ADC 抗体药物偶联物
BSA 牛血清白蛋白，V级分
CD14 单核细胞分化抗原CD14
CD20 分化抗原CD20
CD4 T细胞表面糖蛋白CD4
CD8 T细胞表面糖蛋白CD8
CD66b 颗粒细胞GPI连接糖蛋白
SSC 侧向散射
CD25 IL-2Rα链
CD127 IL-7受体α链
ConA 刀豆球蛋白A
CPT 含0.05％Tween 20的柠檬酸/磷酸盐
CPTB： 含0.05％Tween 20和1％BSA的柠檬酸/磷酸盐
DAR 药物抗体比率
Dex 地塞米松
ECD 细胞外结构域
FA 甲醛
FACS 荧光活化细胞分选
FBS 胎牛血清
Fc 抗体的重链恒定区(铰链/CH2/CH3)
FMO 荧光减一对照(用所有荧光减一荧光团染色的实验细胞)
GC 糖皮质激素
h 小时
HIC 疏水性相互作用色谱法
HMW 高分子量
i.p. 腹膜内
i.v. 静脉内
KI 敲入
LAL 美洲鲎试剂(Limulus Amebocyte Lysate)
LOD 检测限
LOQ 定量限
LPS 脂多糖
M 摩尔浓度
mAb 单克隆抗体
MFI 中位荧光强度
min 分钟
MS 质谱法
mTNFα 膜肿瘤坏死因子α
pAb 多克隆抗体
PBS 磷酸盐缓冲盐水
PBMC 外周血单核细胞
PBS 磷酸盐缓冲盐水
PD 药效学
PK 药物动力学
PRM 腹膜驻留巨噬细胞
PT 含0.05％Tween 20的PBS
PTB 含0.05％Tween 20和1％BSA的PBS
PTS 便携式测试系统
QC 质量控制
RP-HPLC 反相-高压液相色谱法
RPMI RPMI 1640，基础培养基
RSV 呼吸道合胞病毒
RT 室温
SEC 尺寸排阻色谱法
SPR 表面等离子体共振
SSC 侧向散射
TMDD 靶标介导的药物处置
WB 全血
实施例1：示例性类固醇-抗VISTA抗体偶联物的合成和表征
A.合成
接头A的合成方案
程序
用于制备化合物2的一般程序
向化合物1(3.0g，7.64mmol，1.0当量)于二氯甲烷/乙腈(500mL/100mL)中的溶液中添加环酐(3.0g，30.58mmol，4.0当量)和DMAP(1.8g，15.29mmol，2.0当量)。在室温下搅拌反应混合物2小时并且在减压下浓缩混合物。通过柱色谱法在用DCM/MeOH(10％至15％)+0.1％AcOH洗脱的硅胶上纯化残余物，得到呈白色固体状的化合物2(3.2g，85％)。
TLC：DCM/MeOH＝10:1，UV
Rf(化合物1)＝0.45
Rf(化合物2)＝0.30
LC-MS:394.40(M+1)
/>
向2(220mg，0.45mmol)和3(230mg，0.67mmol)于NMP(4mL)中的溶液中添加HATU(342mg，0.90mmol)和DIPEA(232mg，1.8mmol)。在室温下搅拌混合物5小时。通过制备型HPLC(ACN/H2O，0.1％HCOOH)纯化混合物，得到接头A(122mg，39％)。
LCMS:703[M+H]，
1H NMR(CDCl3,300MHz)(δ,ppm)7.20(d,J＝9.0Hz,1H),6.73(s,2H),6.52(br,1H),6.33(d,J＝9.0Hz,1H),6.11(s,1H),4.91(q,J＝17.3Hz,2H),4.35(d＝9.3Hz,1H),3.76-3.42(m,10H),3.03(m,1H),2.79(m,2H),2.65-2.56(m,3H),2.42-2.06(m,7H),1.84-1.63(m,3H),1.22(m,1H),1.02(s,3H),0.90(d,J＝7.2Hz,3H)。
19F NMR(CDCl3)(δ,ppm)-166.09(q)。
用接头A制备偶联物的一般方案
为使每个抗体偶联八个接头A，将抗体以10mg/mL浓度进行缓冲液交换至PBS缓冲液(pH 7.4)中，此后添加7当量的TCEP并且在37℃下温育2小时。接着通过PD-10柱(GEHealthcare)用含有2mM EDTA的50mM硼酸盐缓冲液(pH 8.0)对还原的抗体进行缓冲液交换，此后添加12当量的接头A(在DMSO中新鲜制备成10mM储备溶液)，将反应物在环境温度下置于10rpm的管式旋转器中持续1小时。使用具有PBS缓冲液(pH 7.4)的PD-10脱盐柱纯化每个抗体含有八个接头-A的偶联物。洗脱之后，对偶联物进一步进行缓冲液交换并使用具有30kDa截留分子量(MWCO)的Amicon Ultra 15mL离心过滤器浓缩至所需浓度。质谱法为确定药物与抗体的比率(DAR)，在37℃下将偶联物与25mM DTT一起温育30分钟。将还原的偶联物在水中稀释50倍，并且在与Xevo G2-S QToF质谱仪相接的Waters ACQUITY UPLC上进行分析。使用Waters MassLynx 4.2软件获得解卷积质量。使用对应于每个载药种类的峰强度的加权平均值，使用以下公式计算药物与抗体的比率(DAR)：
DAR＝∑(具有药物负荷n的每个Ab的药物负荷分布(％))(n)/100
SEC方法
经由尺寸排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)使用20分钟等度法以0.2M磷酸钠、0.2M氯化钾、15w/v异丙醇(pH 6.8)的流动相来确定偶联物的纯度。以0.35mL/min的恒定流速将10μL的注射体积负载至TSKgel SuperSW3000柱。基于洗脱时间对色谱图进行积分以计算单体偶联物种类的纯度。
如上文所述合成抗体药物偶联物(ADC)后，裸抗体和ADC经历质量控制过程以评估和确认偶联、结合至VISTA的能力和内毒素水平。此外，合成了在生理条件下具有相对长的体内半衰期的对照pH依赖性结合抗VISTA抗体(767-IgG1.3抗体)，并且使用肽图谱进行分析以确认其序列同一性和其pH依赖性结合。
B.通过SEC确认药物抗体比率和纯度
在与接头A偶联之后评估偶联物的偶联水平、高分子量(HMW)聚集体的存在和内毒素水平(由Abzena进行的测定)。简言之，经由反相HPLC、质谱法或两者来评估偶联水平。经由尺寸排除柱评估HMW聚集体的水平。经由Charles River endosafe-PTS系统，使用LAL测试筒来评估内毒素水平。
将200μg对照抗人VISTA抗体(767-IgG1.3)在23℃下用胰蛋白酶(1/20胰蛋白酶/蛋白质)消化14小时或在37℃下用Lys-C(1/50Lys-C/蛋白质)消化14小时。通过质谱法在Agilent QTOF 6530B上分析80μg样品。使用BioConfirm 9.0进行序列搜索。
C.ELISA结果
1.用于确定pH特异性结合的ELISA
在室温(RT)下将96孔平底板(Thermo Scientific Nunc Immuno Maxisorp，目录号442404)用在PBS中稀释至1μg/mL的767-IgG1.3或INX200包被一小时。用PT(含0.05％Tween 20的PBS)将孔洗涤三次，接着在室温下用PTB(含0.05％Tween 20和1％BSA的PBS)封闭1.5小时。
在pH 6.1、6.7或7.5下在含0.05％Tween 20和1％BSA的柠檬酸/磷酸盐(CPTB)中在1000至0.001ng/mL的范围内稀释生物素化hIX50(人类VISTA ECD，在Aragen Bioscience生产，在ImmuNext进行生物素化)。在pH 6.1、6.7或7.5下用含0.05％Tween 20的柠檬酸/磷酸盐(CPT)将孔洗涤三次，接着将生物素化hIX50添加至孔中并在室温下温育一小时。
在pH 6.1、6.7或7.5下用CPT洗涤三次后，使用与HRP(Southern Biotech，目录号7100-05)偶接的链霉亲和素作为在pH 6.1、6.7或7.5下于CPTB中以1/2000稀释的检测试剂，并在室温下温育一小时。在pH 6.1、6.7或7.5下用CPT洗涤三次后，使用TMB(ThermoScientific，目录号34028)作为比色底物来显现ELISA反应。在室温下五分钟后，用1MH2S04终止反应。
2.用于确认裸抗体和药物偶联抗体的VISTA结合的ELISA
在室温下将96孔平底板(与上述相同)用含1μg/ml hIX50(人类VISTA ECD，在ImmuNext的Aragen Bioscience生产)的PBS包被一小时。洗涤三次后，在室温下用PTB将孔封闭一小时。
在PTB中在500至0.03、100至0.02或400或0.1ng/mL的范围内稀释INX200、INX200A、INX201、INX201A、767-IgG1.3或767-IgG1.3A。用PT将孔洗涤三次，接着将稀释的抗体添加至孔中并在室温下温育一小时。
用PT洗涤三次后，使用在PTB中以1/2000稀释的小鼠抗人κ-HRP(SouthernBiotech，目录号9230-05)作为检测试剂，在室温下温育1小时。洗涤三次后，使用TMB底物显现ELISA反应。在室温下5分钟后，用1M H2S04终止反应。
D.所评估的抗体的偶联水平和SEC纯度水平
接头A的偶联涉及链间二硫键的完全还原，继而用接头A进行完全修饰(如通过质谱法[MS]偶联评估所确认)。如通过尺寸排阻色谱法(SEC)所评估来检测最小HMW聚集体并报告为纯度％(参见下表1)。
表1：抗体偶联水平和SEC纯度水平(*基于MS的偶联水平[表格中的橙色栏]用于地塞米松当量的所有计算)
E.767-IgG1.3的肽图谱
如图1中所示，胰蛋白酶消化引起85.6％轻链序列覆盖率和76.1％重链序列覆盖率。该图显示具有已鉴定的胰蛋白酶肽的767-IgG1.3的序列加下划线(A)轻链(85.6％覆盖率)(B)重链(76.1％覆盖率)。
如图2中所示，Lys-C消化引起63.3％轻链序列覆盖率和76.3％重链序列覆盖率。该图显示具有已鉴定的Lys-C肽的767-IgG1.3的序列加下划线(A)轻链(63.3％覆盖率)(B)重链(76.3％覆盖率)。
胰蛋白酶与Lys-C消化策略之间的总组合序列覆盖率为91.7％轻链序列覆盖率和80.8％重链序列覆盖率。如WO 2018/169993 A1中所述，轻链和重链两者都匹配预期序列。基于此，我们确认经克隆和表达的序列为767-IgG1.3的序列。
F.在不同pH条件下抗VISTA抗体的VISTA结合的比较
如图3中所示，确认板结合的767-IgG1.3和INX200具有相反的抗VISTA pH依赖性结合特征。具体而言，图3显示，在pH 7.5(生理pH)下767-IgG1.3与可溶性VISTA的结合最小，在pH 6.7下与VISTA的结合明显更高，并且在pH 6.1(所测试的最低pH)下结合程度最高。相比之下，在生理pH下INX200与可溶性VISTA的结合程度最高，并且随着pH降低，INX200与可溶性VISTA的结合低得多(再次比较pH 6.7和pH 6.1下的相对结合)。因此，767-IgG1.3和INX200表现出相反的pH依赖性结合特征。
G.药物偶联对VISTA结合的影响
上文鉴定的抗VISTA抗体药物偶联物在体外和体内ADC研究中证明已经历链间二硫键的完全还原，以约DAR 8偶联至基于地塞米松的接头A。另外，如图4A-C中所示，与裸抗体相比，以DAR 8与接头A偶联显示对INX200A、INX201A或767-IgG1.3A与VISTA的结合具有可忽略的影响(图4A-C)。
H.结论
上文所述的实验和数据确认，对照767-IgG1.3抗体包含先前所述的767-IgG1.3抗体的相同序列和功能特征(pH依赖性结合)。这些数据进一步确认，所制备的所有抗VISTA抗体药物偶联物都经历完全半胱氨酸还原，并且使用基于地塞米松的接头A以DAR 8进行偶联引起最小HMW聚集体形成(如由SEC纯度所评估)，并且进一步显示此种偶联对抗体药物偶联物与人类VISTA的结合具有可忽略的影响。
实施例2：示例性抗VISTA药物偶联物的体内表征
A.ConA模型
再次，因为VISTA在大多数造血细胞上，特别在骨髓细胞上高度表达，所以我们选择其作为抗炎抗体药物偶联物(ADC)的潜在靶标。为评估其在开发潜在用于治疗自身免疫性和炎症性疾病的ADC中的潜在功效，在刀豆球蛋白A诱导的肝脏炎症(ConA诱导的肝炎)的短期模型中评价Dex-抗体药物偶联物的功效。
此模型涉及在小鼠中静脉内(iv)注射植物凝集素刀豆球蛋白A(ConA)，并且包括广泛使用的小鼠急性免疫介导的肝炎模型。与若干其他急性肝损伤模型成对比，ConA诱导的损伤主要由T细胞活化和向肝募集所驱动。因此，ConA模型在其发病机制方面具有独特特征，并且与人类免疫介导的肝炎具有重要相似性，例如自身免疫性肝炎、急性病毒性肝炎或引起免疫活化的不同药物毒性实体。ConA模型的特征在于可在注射后最早6小时监测到大量促炎细胞因子。截至24小时，仍检测到高水平的促炎细胞因子，并且通过组织病理学可观测到肝损伤/坏死。我们通过主要监测ConA注射后6小时的细胞因子反应来利用此模型。如下文所论述和附图中所示，这些研究显示地塞米松处理对G-CSF、IFNγ、IL-2、IL-6、IL-12p40、IL-12p70和KC具有剂量依赖性影响，所以我们的研究集中于测量这些细胞因子中的一些。
B.研究设计
在这些实验中，小鼠在疾病起始前约15小时接受抗体或Dex处理。调整刀豆球蛋白A给药以在6小时处产生急性但非致命性炎症，在初步实验中确立。ConA静脉内注射后6小时收集血液，并且分离血浆用于细胞因子分析。
体内研究的目的是评价在ConA诱导的肝炎中与游离Dex相比，经由酯酶敏感性接头偶联至地塞米松的这些INX人类VISTA抗体的相对功效。特别是，进行体内研究以评价在刀豆球蛋白A诱导的肝炎模型中裸的或偶联至地塞米松的抗人VISTA抗体(INX210[静默IgG2 Fc]、INX200[静默IgG1 Fc]和767.3-IgG1.3[对照pH敏感性抗体])的功效(分别为实验1、2和3)。
这些实验在人类VISTA敲入(hVISTA KI)小鼠中进行。hVISTA KI小鼠具有代替小鼠VISTA基因敲入的人类VISTA cDNA，并且在RNA和蛋白质水平上都表达人类VISTA。此外，为排除基于性别的差异无效，这些实验在雌性和雄性小鼠中进行。所有动物在刀豆球蛋白A(ConA)注射前15小时接受处理(抗体或地塞米松)。接着在ConA注射后6小时对小鼠进行放血，并且将细胞因子反应评价为疾病进展的标志。
C.方法和材料
抗VISTA抗体和偶联物
INX200：在Fc区中具有L234A/L235A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体，其在生理pH下具有极短血清半衰期(参见下文的表7)并且包含图8中所含的可变重和轻序列以及IgG1 Fc区。
INX200A：以约8的药物/抗体比率(DAR)经由链间二硫键偶联至地塞米松药物的INX200。接头/有效负载(A)由酯酶敏感性接头与地塞米松有效负载组成(如Graverson等人,2012所述)。
INX201：在Fc区中具有L234A/L235A/E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体，其在生理pH下具有极短血清半衰期(参见下文的表7)并且具有图8中所含的可变重和轻序列以及IgG1 Fc区。
INX201A：以8的药物/抗体比率(DAR)经由链间二硫键偶联至地塞米松药物的INX201抗体。接头/有效负载(A)再次由酯酶敏感性接头与地塞米松有效负载组成(如Graverson等人,2012所述)。
INX210：在具有可变重和轻序列的Fc区以及图8中所含的IgG1 Fc区中具有V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S静默突变的人类IgG2/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体，其具有极短血清半衰期(参见下文的表7)(Vafa等人,2014)。
INX210A：以约8的药物/抗体比率(DAR)经由链间二硫键偶联至药物的INX210抗体。接头/有效负载(A)再次由酯酶敏感性接头与地塞米松有效负载组成(如Graverson等人,2012所述)。
767-IgG1：在具有可变重和轻序列的Fc区以及图8中所含的IgG1 Fc区中具有L234A/L235E/G237A静默突变的人类IgG1/κ主链上的由Five Prime Therapeutics与Bristol-Myers Squibb Company开发的对照人源化抗人VISTA抗体，其在生理pH下具有长得多的血清半衰期(在啮齿动物和灵长类动物中超过24小时)。此抗体经设计以在低pH(例如pH 6)下结合VISTA，但在生理pH(pH 7.4)下具有最小结合(WO 2018/169993 A1)。
767-IgG1A：以约8的药物/抗体比率(DAR)经由链间二硫键偶联至药物的767-IgG1抗体。接头/有效负载(A)再次由酯酶敏感性接头与地塞米松有效负载组成(如Graverson等人,2012所述)。
抗体给药：
将所有抗体在PBS中稀释并以0.2ml的体积腹膜内(i.p.)注射以递送10mg/Kg的剂量。
地塞米松
将地塞米松(来自Phoenix的无菌注射剂，NDC 57319-519-05)在PBS中稀释并以5、2、0.2和0.02mg/Kg经由腹膜内注射而给药。
刀豆球蛋白A
刀豆球蛋白A获自Sigma Aldrich(C2010)。根据其批次而定，ConA可能或多或少有毒力，因此始终进行初步实验以定义最佳ConA给药，以在6小时处产生急性但非致命性炎症：对于实验1和2(批号SLBX7517)为15mg/Kg并且对于实验3和4(批号SLCC2664)为7.5mg/Kg。
小鼠
在Sage Labs(Boyertown,PA)饲养hVISTA小鼠。将8-12周龄的小鼠首先在我们的隔离设施中过渡3周，接着转移至常规设施。在实验起始前使所述小鼠适应1至2周。
抽血和制备
使用玻璃巴斯德移液管(Pasteur pipette)从眼眶后腔采集外周血，所述移液管首先用肝素冲洗以防止凝血。接着将血液以400rcf离心5分钟，并且收集血浆并在细胞因子分析之前储存于-80℃下。
血浆细胞因子分析
使用Millipore小鼠7-plex平台对25μl血浆进行细胞因子分析。
实验1和2：用于体内研究的分析中所包括的细胞因子为G-CSF、IL-2IFNγ、IL-6、IL-12p40、IL-12p70和KC。
实验3：对于体内实验3，经由ELISA使用用于G-CSF(DY414-05；预期<100,000pg/mL的G-CSF并且可能<50,000pg/mL-试剂盒检测水平：2000pg/mL-31.3pg/mL)和KC(DY453-05；预期<120,000pg/mL并且可能<50,000pg/mL-试剂盒检测水平：1000pg/mL-15.6pg/mL)的R&D Duo组仅分析G-CSF和KC。
D.结果
实验1：在雌性hVISTA KI小鼠的ConA诱导的肝炎中INX210A的功效
图5显示ConA后6小时雌性hVISTA KI小鼠的外周血中的G-CSF变化。使用小鼠7-plex(SEM；n＝5/组)(给药：Dex-0.2＝0.2mg/Kg，Dex-2＝2mg/Kg，INX210和INX210A(10mg/Kg)，[INX210A提供0.2mg/kg dex有效负载])测量血浆浓度。
如附图中所示，用INX210A处理在控制ConA诱导的G-CSF上调中显示一些功效(尽管不显著)，这与5mg/Kg的Dex处理相当。相比之下，以0.2mg/Kg(这是由INX210A递送的Dex的摩尔当量)施用的非Dex偶联抗体INX210或Dex不具有抗炎影响。
因为我们在ConA反应中观测到高水平的组内变异性，所以不包括来自6种其他细胞因子的数据，这是由于其变化过大而无法解释。这并不令人意外，因为当在雌性小鼠中进行实验时，ConA的作用高度依赖于动物的激素状态。尽管雌性小鼠可能对ConA显示更高易感性，但其疾病结果也显示更大变化。所有后续ConA实验都在雄性小鼠中进行。
实验2：在雄性hVISTA KI小鼠的ConA诱导的肝炎中INX210A的功效
图6显示ConA后6小时雄性hVISTA KI小鼠的外周血中的细胞因子变化。使用小鼠7-plex(SEM；n＝10/组，常规单因素ANOVA，与仅ConA组相比)(给药：Dex(0.2或5mg/Kg)，INX210和INX210A(10mg/Kg))测量血浆浓度。
如文献中先前所报道，雄性小鼠对ConA表现出更一致的细胞因子反应。在INX210A处理后6小时，与未处理的ConA组相比，所分析的7种细胞因子中有6种显示显著降低(1至3倍)(图6)。降低为介于Dex 0.2mg/kg(INX210A dex有效负载的摩尔当量)与Dex 5mg/kg之间的中间值。相比之下，在INX210处理组中未注意到功效。
实验3：INX200A对DDE1雄性小鼠的刀豆球蛋白A诱发的肝炎的剂量反应
图7显示ConA后6小时DDE1雄性小鼠的外周血中的细胞因子变化。在实验中，使用ELISA测定(SD；n＝6/组；单因素ANOVA，与仅ConA组相比)(给药：Dex(0.02、0.2或2mg/Kg)，INX200A(10、5和1mg/Kg))测量细胞因子血浆浓度。
为评价ADC INX200A是否赋予功效增强，将对各种Dex剂量的反应与来自ADC的等效Dex有效负载(0.2mg/Kg游离Dex＝10mg/Kg INX200A；0.02mg/Kg游离Dex＝1mg/KgINX200A)进行比较。如从图7中的数据可见，尽管0.02mg/Kg的游离Dex在控制细胞因子反应中失去功效，但1mg/Kg的INX200A仍有效。更一般而言，数据显示以下：
实验1
·在雌性hVISTA KI小鼠中，INX210当与Dex(INX210A)偶联时在控制ConA诱导的G-CSF反应中显示功效。
实验2
·雄性hVISTA KI小鼠对ConA损伤显示出更一致的反应。
·INX210当与Dex(INX210A)偶联时在控制ConA诱导的细胞因子反应中显示功效。裸抗体无功效。
·以10mg/Kg给与的INX210A递送约0.2mg/Kg Dex；用INX210A所观测的功效与0.2mg/Kg游离Dex的功效相当。
实验3
·剂量反应实验显示当经由ADC INX200A递送Dex有效负载时功效改善/增强：尽管0.02mg/Kg的游离Dex无功效，但经由ADC递送的摩尔当量显示高效力。
结论
我们显示，抗VISTA抗体(INX210)当偶联至Dex(INX210A)时可在Dex的等摩尔剂量下与游离Dex同样有效或更好地预防ConA诱发的炎症。未偶联的INX210无影响。我们还显示，将Dex偶联至抗VISTA抗体INX200改善Dex递送，因为我们显示0.02mg/Kg的游离Dex无功效，而经由ADC递送的摩尔当量具有高效力。
实施例3：示例性类固醇有效负载和抗体药物偶联物的合成
类固醇有效负载和偶联物的合成程序
在本实施例中，我们描述了根据本发明的新颖类固醇、其中所述类固醇偶接至接头和/或允许类固醇接头偶联物连接到抗体的双官能团或三官能团的偶联物，和包含偶接至接头的所述类固醇和/或偶接至抗体的双官能团或三官能团的抗体药物偶联物(ADC)的合成，所述抗体任选地为在生理pH下结合至人类VISTA并且包含短pK的抗VISTA抗体，或靶向免疫细胞(典型地为人类免疫细胞)上选择性表达的另一种抗原的抗体或抗体片段。
如先前所指出，这些类固醇通常将包含糖皮质激素激动剂化合物并且具有先前所公开的式I、II或III的结构。式I、II和III的示例性化合物在图118A-O中描绘。本文描述这些和其他示例性化合物的合成。
一般程序
以下一般程序用于液相色谱法(制备型或分析型)和核磁共振。
液相色谱法
除非另有注释，否则以下条件用于高压液相色谱法(HPLC)纯化或液相色谱-质谱法(LC-MS)：
LCMS方法A
根据此方法在具有OnyxTMMonolithic C18 LC柱(50x 2mm)的Agilent 1260LCMS-4-QUAD系统上进行样品分析。经6分钟使用5-95％A/B的梯度操作样品，其中A＝含0.05％AcOH的水/ACN(95:5v/v)并且B＝含0.05％AcOH的ACN。
LCMS方法B
根据此方法在具有1.7μm C18/>LC柱(50x2.1mm)的Waters AcquityLCMS-5-SQD系统上进行样品分析。经2.5分钟使用10-95％A/B的梯度操作样品，其中A＝含0.02％甲酸的水并且B＝含0.05％甲酸的ACN。
以下为用于分析最终靶标的LCMS方法：
LCMS方法-1：
柱详情：X-BRIDGE BEH 2.1*50mm 2.5μm
机器详情：-配备有PDA和Acquity SQ检测器的Water Acquity UPLC-H级，柱温：35℃，自动进样器温度：5℃，流动相A：含0.1％甲酸的Milli Q水(pH＝2.70)，流动相B：含0.1％甲酸的Milli Q水:乙腈(10:90)。
流动相梯度详情：T＝0分钟(97％A，3％B)流量：0.8mL/min；T＝0.75分钟(97％A，3％B)流量：0.8mL/min；梯度至T＝2.7分钟(2％A，98％B)流量：0.8mL/min；梯度至T＝3分钟(0％A，100％B)流量：1mL/min；T＝3.5分钟(0％A，100％B)流量：1mL/min；梯度至T＝3.51分钟(97％A，3％B)流量：0.8mL/min；T＝4分钟(97％A，3％B)运行结束，流速：0.8mL/min，流速：0.8mL/min，运行时间：4分钟，UV检测方法：PDA。
质量参数：
探针：ESI，电离模式：正和负，锥电压：30V和10V，毛细管电压：3.0KV，提取器电压：1V，Rf透镜：0.1V，源温度：120℃，去溶剂化温度：400℃。锥气体流量：100L/h，去溶剂化气体流量：800L/h。
LCMS方法-2：
柱详情：Xtimate C18 4.6*150mm 5μm
机器详情：配备有Waters微质量ZQ检测器的Waters 996光电二极管阵列检测器，柱温：35℃，自动进样器温度：15℃，流动相A：含5mM乙酸铵和0.1％甲酸(pH＝3.50)的MilliQ水，流动相B：甲醇
流动相梯度详情：T＝0分钟(90％A，10％B)；T＝7.0分钟(10％A，90％B)；梯度至T＝9.0分钟(0％A，100％B)；梯度至T＝14.00分钟(0％A，100％B)；T＝14.01分钟(90％A，10％B)；T＝17分钟(90％A，10％B)运行结束，流速：1.0mL/min，运行时间：17分钟，UV检测方法：PDA。
质量参数：
探针：ESI，电离模式：正和负，锥电压：30和10V，毛细管电压：3.0KV，提取器电压：2V，Rf透镜：0.1V，源温度：120℃，探针温度：400℃，锥气体流量：100L/h，去溶剂化气体流量：800L/h。
LCMS方法-3：
柱详情：Sunfire C18 150x4.6mm，3.5μm
机器详情：Agilent 1260Infinity-II和G6125C(LC/MSD)质量检测器，柱温：35℃，自动进样器温度：15℃，流动相A：含5mM乙酸铵和0.1％甲酸(pH＝3.50)的Milli Q水，流动相B：甲醇
流动相梯度详情：T＝0分钟(90％A，10％B)；T＝7.0分钟(10％A，90％B)；梯度至T＝9.0分钟(0％A，100％B)；梯度至T＝14.00分钟(0％A，100％B)；T＝14.01分钟(90％A，10％B)；T＝17分钟(90％A，10％B)运行结束，流速：1.0mL/min，运行时间：17分钟，UV检测方法：PDA。
质量参数：
探针：MMI，电离模式：(ESI)正和负，片段电压：30V和70V，毛细管电压：3000V，源气体温度：325℃，蒸发器温度：225℃，气体流量：12L/min，雾化器：50。
HPLC方法-1：
柱详情：Sunfire C18(150mm x4.6mm)，3.5μm
机器详情：具有PDA检测器的Agilent Technologies.1260系列Infinity-II，柱温：35℃，自动进样器温度：15℃，流动相A：含0.05％三氟乙酸的Milli Q水(pH＝2.2)，流动相B：乙腈。
流动相梯度详情：T＝0分钟(90％A，10％B)流量：1.0mL/min；T＝7.0分钟(10％A，90％B)流量：1.0mL/min；梯度至T＝9.0分钟(00％A，100％B)流量：1.0mL/min；梯度至T＝14分钟(00％A，100％B)流量：1.0mL/min；T＝14.01分钟(90％A，10％B)流量：1mL/min；T＝17分钟(90％A，10％B)运行结束流量：1.0mL/min，流速：1.0mL/min，运行时间：17分钟，UV检测方法：PDA。
HPLC方法-2
柱详情：Atlantis C18(150mm x4.6mm)，5.0μm或Welch C18(150mm x4.6mm)，5.0μm
机器详情：-具有2998PDA检测器的Waters Alliance e2695，柱温：35℃，自动进样器温度：15℃，流动相A：含0.1％氨的Milli Q水(pH＝10.5)，流动相B：乙腈。
流动相梯度详情：T＝0分钟(90％A，10％B)流量：1.0mL/min；T＝7.0分钟(10％A，90％B)流量：1.0mL/min；梯度至T＝9.0分钟(00％A，100％B)流量：1.0mL/min；梯度至T＝14分钟(00％A，100％B)流量：1.0mL/min；T＝14.01分钟(90％A，10％B)流量：1mL/min；T＝17分钟(90％A，10％B)运行结束流量：1.0mL/min，流速：1.0mL/min，运行时间：17分钟，UV检测方法：PDA。
HPLC详情：具有2998PDA检测器的Waters Alliance e2695；柱详情：Atlantis C18(150mm x4.6mm)，5.0μm或Welch C18(150mm x4.6mm)，5.0μm；流动相A：含0.1％氨的MilliQ水(pH＝10.5)，流动相B：乙腈；流速：1.0mL/min，运行时间：17分钟
NMR
以下条件用于获得质子核磁共振(NMR)光谱：在1H NMR(400MHz)BrukerAdvancer-III HD FT-NMR分光光度计(Bruker,USA)上记录NMR光谱。使用Topspin 3.6.3软件分析粗NMR数据。
从氘化NMR溶剂推断的TMS位置向低场以百万分率(ppm)报告化学位移。表观多重性报告为：单峰-s，双重峰-d，三重峰-t，四重峰-q，或多重峰-m。表现出加宽的峰进一步表示为br。积分为近似的。应提及，积分强度、峰形、化学位移和耦合常数可取决于溶剂、浓度、温度、pH和其他因素。
实验详情
除非另有规定，否则所有反应都在干燥氮气气氛下进行。所有关键化学品都按原样使用。所有其他可商购的材料，例如溶剂、试剂和催化剂无需进一步纯化即使用。通过薄层色谱法(TLC)使用预涂的Merck硅胶60F254铝片(Merck,Germany)监测反应。使用UV光、茚三酮喷雾和碘蒸气实现TLC板的可视化。使用230-400目、100-200目和60-120目硅胶或C18二氧化硅作为固定相并且使用适当流动相进行柱色谱分离。
合成S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸(INXJ)
反应方案
/>
合成(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX J.a)：
程序：
向圆底烧瓶中装入Fmoc-Gly-OSu(1.0g，2.535mmol，1.0当量)、H-Glu(OtBu)-OH(0.6183g，3.043mmol，1.2当量)和碳酸氢钠(0.4260g，5.07mmol，2.0当量)。添加水和1,4-二噁烷(1:1，26mL)的溶液并在室温下搅拌混合物过夜。通过LCMS确认起始材料消耗并且缩减溶剂，去除二噁烷但留下水。接着将混合物酸化至pH 2-3，添加至分液漏斗中，并用5:1乙酸异丙酯/异丙醇(3x100mL)萃取。合并的有机物经Na2SO4干燥，过滤，缩减，负载至IscoC18Aq 100g反相柱上，并用0-100％乙腈(0.05％AcOH添加剂)/H2O(0.05％AcOH添加剂)洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并冻干，得到0.9982g INX J.a，产率82％，呈白色固体状。LCMS方法B(ESI+):C26H31N2O7[M+H]+需要483.21，在1.14分钟时的实验值483.25。
合成(3-(4-甲酰基苯甲基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(INX J-1)：
程序：
用氩气回充圆底烧瓶并装入(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(4.2765g，13.40mmol，1.0当量)、4-溴甲基苯甲醛(4.0g，20.1mmol，1.5当量)、碳酸钾(9.2594g，67.0mmol，5.0当量)和[1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯-二氯甲烷络合物(0.3841g，0.469mmol，0.035当量)。将无水THF(84mL)添加至烧瓶中，接着配备回流冷凝器并加热至80℃持续16小时。通过LCMS确认起始材料消耗，接着冷却混合物，用水(200mL)稀释，添加至分液漏斗中，并用EtOAc(3x100mL)萃取。合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，缩减，并负载至Isco Rf Gold 80g SiO2柱上，并用0-100％EtOAc/己烷的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并并缩减，得到3.529g化合物INX J-1，产率85％，呈透明油状，其在减压下去除后结晶过夜。LCMS方法A(ESI-):C19H20NO3[M-H]-需要310.15，在3.080分钟时的实验值310.1。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-氨基苯甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX J-2)：
程序：
向圆底烧瓶中装入16-α-羟基泼尼松龙(3.30g，8.765mmol，1.0当量)、醛INX J-1(3.0023g，9.641mmol，1.1当量)和MgSO4(3.1659g，26.29mmol，3.0当量)。将固体悬浮于乙腈(88mL)中并且将混合物冷却至0℃，随之滴加三氟甲烷磺酸(3.9mL，43.83mmol，5.0当量)。10-20分钟后反应物变成粉红色，并且1小时后起始材料完全消耗。缩减溶剂并且分两批纯化粗物质，将每批负载至Isco C18 Aq 275g反相柱上，并用5-100％乙腈(0.05％AcOH添加剂)/H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的来自两批的级分合并，冷冻并冻干，得到2.50g INX J-2，产率50％，呈白色固体状。LCMS方法A(ESI+):C35H40NO6[M+H]+需要570.28，在2.572分钟时的实验值570.3。
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX J-3)：
程序：
将DMF(2.3mL)添加至装有双氨基酸INX J.a(0.3074g，0.6372mmol，1.1当量)的圆底烧瓶中。接着添加苯胺INX J-2(0.330g，0.579mmol，1.0当量)，继而添加三乙胺(0.24mL，1.73mmol，3.0当量)。将溶液冷却至0℃，随之添加50％丙烷膦酸酐于DMF中的溶液(0.70mL，1.1586mmol，2.0当量)。搅拌混合物16小时，同时升温至室温。一旦通过LCMS确认反应完成，将粗混合物直接负载至Isco C18 Aq 50g反相柱上，并用0-100％乙腈(0.05％AcOH添加剂)/H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并冻干，得到0.200g INX J-3，产率33％，呈白色固体状。LCMS方法A(ESI+):C61H68N3O12[M+H]+需要1034.47，在3.073分钟时的实验值1034.4。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯乙酸盐(INX J-4)：
程序：
向小瓶中装入化合物INX J-3(0.080g，0.0774mmol，1.0当量)，接着将其溶解于乙腈(0.50mL)和哌啶(62μL)中。搅拌混合物直至所有起始材料都脱保护，持续30分钟。缩减溶剂，将粗物质在DMSO中稀释，并负载至Isco C18 Aq 15.5g反相柱上，并用0-100％乙腈(0.05％AcOH添加剂)/H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并冻干，得到0.0423g INX J-4·AcOH，产率63％，呈透明油状。LCMS方法A(ESI+):C46H58N3O10[M+H]+需要812.40，在2.638分钟时的实验值812.4。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX J-5)：
程序：
向小瓶中装入2-溴乙酸(0.0092g，0.0665mmol，2.1当量)和DMF(0.33mL)。添加N-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(0.0156g，0.0632mmol，2.0当量)，并且搅拌混合物约90分钟。接着将胺INX J-4·AcOH(0.0270g，0.0309mmol，1.0当量)与碳酸氢钠(0.0140g，0.1665mmol，5.4当量)一起添加至溶液中，并且搅拌混合物2小时(直至所有INX J-4消耗)。一旦通过LCMS确认反应完成，将粗混合物直接负载至Isco C18 Aq 5.5g反相柱上，并用0-100％乙腈(0.05％AcOH添加剂)/H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并冻干，得到0.0100g INX J-5，产率35％，呈白色固体状。LCMS方法A(ESI+):C48H59BrN3O11[M+H]+需要932.33，在2.926分钟时的实验值932.2。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸(INXJ)：
程序：
向小瓶中装入叔丁酯INX J-5(0.010g，0.01072mmol，1.0当量)，将其溶解于50％TFA于DCM(0.200mL)中的溶液中并搅拌1小时。一旦通过LCMS确认反应完成，去除溶剂，将残余物溶解于DMSO中，并负载至Isco C18 Aq 5.5g反相柱上，并用0-100％乙腈(0.05％AcOH添加剂)/H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并冻干，得到0.0033g INX J，产率35％，呈白色固体状。LCMS方法A(ESI+):C44H51BrN3O11[M+H]+需要876.26，在2.524分钟时的实验值877.2。
合成S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸(INX L)
反应方案
合成(S)-5-(叔丁氧基)-2-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙酰胺基)-5-氧代戊酸(Boc-Gly-Glu(OtBu)-OH)：
/>
程序：
向圆底烧瓶中装入Boc-Gly-OSu(12.0g，44.07mmol，1.0当量)、H-Glu(OtBu)-OH(9.8524g，48.47mmol，1.1当量)和碳酸氢钠(7.4040g，88.14mmol，2.0当量)。添加水和1,4-二噁烷(1:1，220mL)的溶液并在室温下搅拌混合物过夜。通过LCMS确认起始材料消耗并缩减溶剂，去除二噁烷但留下水。接着将混合物酸化至pH 2-3，形成沉淀物，接着过滤沉淀物并在冻干器上干燥，得到14.0152g Boc-Gly-Glu(OtBu)-OH，产率88％，呈白色固体状。LCMS方法A(ESI+):C16H29N2O7[M+H]+需要361.19，在2.122分钟时的实验值361.2。
合成(S)-4-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX L-1)：
程序：
在惰性气氛下向烘干小瓶中装入胺INX J-2(0.8200g，2.63mmol，1.0当量)、Boc-Gly-Glu(OtBu)-OH(2.5916g，7.197mmol，2.73当量)、((7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐)(2.2515g，4.318mmol，1.64当量)和DMF(15mL)。紧接着，添加N,N-二异丙基乙胺(1.5mL，8.636mmol，3.3当量)，并且搅拌混合物直至所有胺消耗，持续1小时。接着将粗溶液直接添加至Isco C18 Aq 100g反相柱中，并用0-100％乙腈(0.05％TFA添加剂)/H2O(0.05％TFA添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并冻干，得到0.4404g INX L-1，产率34％，呈白色固体状。LCMS方法A(ESI+):C51H66N3O12[M+H]+需要912.46，在2.524分钟时的实验值912.4。
合成(S)-4-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX L-2)：
程序：
在惰性气氛下向烘干小瓶中装入叔丁酯INX L-1(0.200g，0.220mmol，1.0当量)和DMF(0.50mL)。紧接着，添加1-H四唑(0.1540g，2.20mmol，10当量)和N,N-二乙基亚磷酰胺二-叔丁酯(1.311g，5.265mmol，24.0当量)，并且搅拌混合物72小时以实现90％转化。添加过氧化氢(2mL)，并且搅拌混合物1小时，随后负载至Isco C18 Aq 50g反相柱上，并用0-100％乙腈(0.05％AcOH添加剂)/H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并冻干，得到0.120g INX L-2，产率49％，呈白色固体状。LCMS方法A(ESI+):C59H83N3O15P[M+H]+需要1104.55，在3.894分钟时的实验值1104.5。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸三氟乙酸盐(INX L-3)：
程序：
向圆底烧瓶中装入叔丁酯INX L-2(0.772g，0.7mmol，1.0当量)、DCM(10mL)、三氟乙酸(5mL)和三异丙基硅烷(1.2mL)。在室温下搅拌混合物8小时。通过LCMS确认起始材料消耗并缩减溶剂。将所得残余物溶解于DMF(4mL)中，负载至Isco C18 Aq 100g反相柱上，并用0-100％乙腈(0.05％TFA添加剂)/H2O(0.05％TFA添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并冻干，得到0.3976g INX L-3·TFA，产率54％，呈白色固体状。LCMS方法A(ESI+):C42H51N3O13P[M+H]+需要836.3，在2.053分钟时的实验值836.3。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸(INX L)：
程序：
向圆底烧瓶中装入2-溴乙酸(0.0250g，0.180mmol，3.5当量)、DMF(0.50mL)、(7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(0.0470g，0.090mmol，1.7当量)和N,N-二异丙基乙胺(0.0155g，0.120mmol，2.3当量)。在单独的小瓶中，将胺INX L-3·TFA(0.050g，0.052mmol，1.0当量)溶解于DMF(2.0mL)中并且添加至含有溴乙酸和偶合剂的容器中。搅拌混合物30分钟，并且通过LCMS确认起始材料消耗。通过制备型HPLC，用0-100％乙腈(0.05％AcOH添加剂)/H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相纯化粗混合物。将含有纯产物的级分合并，冷冻并冻干，得到0.030g INX L，产率60％，呈白色固体状。LCMS方法A(ESI+):C44H52BrN3O14P[M+H]+需要956.78，在2.323分钟时的实验值956.2。
合成INX-SM-1和INX N
反应方案
合成(S)-(1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸烯丙酯(INX- SM-1-1)：
程序：
在惰性气氛下向圆底烧瓶中装入4-(溴甲基)苯甲醛(1.465g，7.40mmol，1.2当量)、(5-(三丁基甲锡烷基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(3.00g，6.10mmol，1.0当量)、磷酸三钾(3.902g，18.40mmol，3.0当量)和(2-二环己基膦基-2′,6′-二甲氧基联苯)[2-(2′-氨基-1,1′-联苯)]钯(II)甲烷磺酸盐(1.148g，1.50mmol，20mol％)。将水(10mL)和THF(100mL)脱气，接着添加其并且使混合物回流过夜。完成(经由LCMS确定)后，将混合物冷却至室温，缩减并负载至Isco C18 Aq 450g反相柱上，并用0-100％乙腈(10mM NH4OAc添加剂)/H2O(10mM NH4OAc添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并冻干，得到1.064g INX-SM-1-1，产率55％，呈灰白色固体状。LCMS方法B(ESI+):C11H11N2OS[M-Boc+H]+需要219.10，在1.66分钟时的实验值219.04。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((2-氨基噻唑-5-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮乙酸盐(INX- SM-1)：
程序：
向圆底烧瓶中装入16-α-羟基泼尼松龙(1.1833g，3.143mmol，1.0当量)、醛INX-SM-1-1(1.10g，3.458mmol，1.1当量)和MgSO4(1.1355g，9.431mmol，3.0当量)。将固体悬浮于乙腈(31mL)中并且将混合物冷却至0℃，随之滴加三氟甲烷磺酸(1.4mL，15.718mmol，5.0当量)。10-20分钟后，反应物变成粉红色，并且1小时后起始材料消耗。缩减溶剂，将粗物质负载至Isco C18 Aq 275g反相柱上，并用0-100％乙腈(0.05％AcOH添加剂)/H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并冻干，得到1.059g INX-SM-1·AcOH，产率53％，呈白色固体状。LCMS方法B(ESI+):C32H37N2O6S[M+H]+需要577.23，在1.10分钟时的实验值577.93。
合成(S)-4-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)噻唑-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX N-1)：
程序：
向圆底烧瓶中装入INX-SM-1·AcOH(1.000g，1.57mmol，1.0当量)、Boc-Gly-Glu(OtBu)-OH(3.1212g，8.607mmol，5.5当量)和PyAOP(4.5210g，8.678mmol，5.5当量)。添加1:1DCM/DMF(总体积22mL)的混合物，继而添加DIPEA(3.0mL，17.356mmol，11.0当量)，并且搅拌混合物5小时。一旦大部分INX-SM-1消耗，缩减溶剂(仅有DMF)，并且将粗混合物负载至Isco C18 Aq 275g反相柱上，并用5-100％乙腈(0.05％AcOH添加剂)/H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并冻干，得到0.4050g INX N-1，产率28％，呈白色固体状。LCMS方法A(ESI+):C48H63N4O12S[M+H]+需要919.41，在3.089分钟时的实验值919.4。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)噻唑-2-基)氨基)-5-氧代戊酸三氟乙酸盐(INX N-2)：
程序：
向圆底烧瓶中装入叔丁酯INX N-1(0.200g，0.2177mmol，1.0当量)、MeCN(2.0mL)、三氟乙酸(2.0mL)和三异丙基硅烷(0.70mL，3.266mmol，15.0当量)。在室温下搅拌混合物3小时。通过LCMS确认起始材料消耗并缩减溶剂。将所得残余物负载至Isco C18 Aq 30g反相柱上，并用0-100％乙腈(0.10％TFA添加剂)/H2O(0.10％TFA添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并冻干，得到0.0954g INX N-2·TFA，产率50％，呈白色固体状。LCMS方法A(ESI+):C39H47N4O10S[M+H]+需要763.29，在1.732分钟时的实验值763.3。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)噻唑-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX N)：
程序：
向小瓶中装入2-溴乙酸(0.0127g，0.0913mmol，2.0当量)，将其溶解于DMF(0.500mL)中。添加N-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(0.0215g，0.0867mmol，1.9当量)，并且搅拌混合物90分钟。接着将胺INX N-2·TFA(0.040g，0.0457mmol，1.0当量)与碳酸氢钠(0.0230g，0.2739mmol，6.0当量)一起添加至溶液中，并且搅拌混合物2小时(直至所有INX N-2消耗)。一旦通过LCMS确认反应完成，将粗混合物直接负载至Isco C18 Aq 15.5g反相柱上，并用0-100％乙腈(0.05％AcOH添加剂)/H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并冻干，得到0.0091g INX N，产率22％，呈蓬松黄色固体状。LCMS方法A(ESI+):C41H48BrN4O11S[M+H]+需要883.21，在2.247分钟时的实验值883.2。
合成INX-SM-2和INX Q
反应方案
合成(4-(4-甲酰基苯甲基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-2-1)：
程序：
用氩气回充圆底烧瓶并且装入(4-(溴甲基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(0.150g，0.5115mmol，1.5当量)、(4-甲酰基苯基)硼酸(0.0511g，0.3411mmol，1.0当量)、碳酸钾(0.2357g，1.706mmol，5.0当量)和[1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯-二氯甲烷络合物(0.0279g，0.0341mmol，0.10当量)。将无水THF(2.5mL)添加至烧瓶中，接着配备回流冷凝器并加热至80℃持续16小时。通过LCMS确认起始材料消耗，接着冷却混合物，用水(10mL)稀释，添加至分液漏斗中，并用EtOAc(3x20mL)萃取。合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，缩减，并负载至Isco Rf Gold 24g SiO2柱上，并用0-100％EtOAc/己烷的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并并缩减，得到0.0082g化合物IN-SM-2-1，产率8％，呈透明油状，其在减压下去除后结晶过夜。LCMS方法A(ESI+):C16H19N2O3S[M+H]+需要319.10，在2.1716分钟时的实验值319.1。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((2-氨基噻唑-4-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮乙酸盐(INX- SM-2)：
/>
程序：
向圆底烧瓶中装入16-α-羟基泼尼松龙(0.1936g，0.5143mmol，1.0当量)、醛INX-SM-2-1(0.1800g，0.5659mmol，1.1当量)和MgSO4(0.1857g，1.5428mmol，3.0当量)。将固体悬浮于乙腈(5.1mL)中并且将混合物冷却至0℃，随之滴加三氟甲烷磺酸(0.23mL，2.571mmol，5.0当量)。10-20分钟后，反应物变成浅粉色，并且约1小时后起始材料消耗。缩减溶剂，将粗物质负载至Isco C18 Aq 30g反相柱上，并用0-100％乙腈(0.05％AcOH添加剂)/H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并冻干，得到0.1680g INX-SM-2·AcOH，产率52％，呈白色固体状。LCMS方法A(ESI+):C32H37N2O6S[M+H]+需要577.23，在1.974分钟时的实验值577.3。
合成(S)-4-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)噻唑-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX Q-1)：
程序：
向圆底烧瓶中装入INX-SM-2·AcOH(0.1125g，0.176mmol，1.0当量)、Boc-Gly-Glu(OtBu)-OH(0.0700g，0.1760mmol，1当量)和PyAOP(0.1220g，0.2340mmol，1.3当量)。添加DMF(1.6mL)，继而添加DIPEA(0.081mL，0.4686mmol，2.6当量)，并在室温下搅拌混合物2小时。一旦大部分INX-SM-2消耗，将粗混合物负载至Isco C18 Aq 15.5g反相柱上，并用0-100％乙腈(0.05％AcOH添加剂)/H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并冻干，得到0.060g INX Q-1，产率37％，呈白色固体状。LCMS方法A(ESI+):C48H63N4O12S[M+H]+需要919.41，在2.931分钟时的实验值919.4。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)噻唑-2-基)氨基)-5-氧代戊酸三氟乙酸盐(INX Q-2)：
/>
程序：
向圆底烧瓶中装入叔丁酯INX Q-1(0.0800g，0.0871mmol，1.0当量)、MeCN(1.0mL)、三氟乙酸(1.0mL)和三异丙基硅烷(0.178mL，0.871mmol，10.0当量)。在室温下搅拌混合物3小时。通过LCMS确认起始材料消耗并缩减溶剂。将所得残余物负载至Isco C18Aq 15.5g反相柱上，并用0-100％乙腈(0.10％TFA添加剂)/H2O(0.10％TFA添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并冻干，得到0.0100g INX Q-2·TFA，产率13％，呈白色固体状。LCMS方法A(ESI+):C39H47N4O10S[M+H]+需要763.29，在1.945分钟时的实验值763.2。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)噻唑-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX Q)：
程序：
向小瓶中装入2-溴乙酸(0.0036g，0.0262mmol，2.3当量)，将其溶解于DMF(0.500mL)中。添加N-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(0.0062g，0.0250mmol，2.2当量)，并且搅拌混合物90分钟。接着将胺INX Q-2·TFA(0.010g，0.0114mmol，1.0当量)与碳酸氢钠(0.0066g，0.0786mmol，6.9当量)一起添加至溶液中，并且搅拌混合物2小时(直至所有INX Q-2消耗)。一旦通过LCMS确认反应完成，将粗混合物直接负载至Isco C18 Aq 5.5g反相柱上，并用0-100％乙腈(0.05％AcOH添加剂)/H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并冻干，得到0.0036g INX Q，产率36％，呈蓬松黄色固体状。LCMS方法B(ESI+):C41H48BrN4O11S[M+H]+需要883.21，在1.20分钟时的实验值883.53。
合成INX-SM-3和INX-SM-53
反应方案
合成3-((叔丁氧羰基)氨基)双环[1.1.1]戊烷-1-甲酸甲酯(INX-SM-3-1)
程序：
在室温下向3-(甲氧羰基)双环[1.1.1]戊烷-1-甲酸(10g，58.76mmol)于叔丁醇(20mL)中的溶液中添加二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)(20.2mL，88.15mmol)和三乙胺(33.04mL，235.0mmol)。在80℃下加热反应混合物1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到粗产物。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：12:88)纯化粗物质，得到呈白色固体状的INX-SM-3-1(10g，70.55％)。1H NMR(CDCl3)δ:7.43(bs,1H),3.69(s,3H),2.30(s,6H),1.46(s,9H)。
合成(3-(羟甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-3-2)
程序：
在室温下向3-((叔丁氧羰基)氨基)双环[1.1.1]戊烷-1-甲酸甲酯(INX-SM-3-1)(5g，20.70mmol)于THF:MeOH(3:1)(20mL)中的搅拌溶液中添加硼氢化钠(3.9g，103.5mmol)并再搅拌16小时。TLC指示反应完成后，用稀HCl水溶液淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到INX-SM-3-2粗产物(4.3g，97.38％)。LCMS:214.0[M+H]+；1H NMR(CDCl3)δ:4.99(bs,1H),3.72(s,2H),1.95(s,6H),1.42(s,6H)。
合成(3-甲酰基双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-3-3)
程序：
在室温下向(3-(羟甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-3-2)(0.1g，0.46mmol)于DCM(2mL)中的搅拌溶液中添加戴斯-马丁高碘烷(Dess-Martinperiodinane，DMP)(0.40g，40.93mmol)并搅拌30分钟。TLC指示反应完成后，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到粗产物。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：40:60)纯化粗物质，得到呈白色固体状的INX-SM-3-3(0.050g，52％)。1H NMR(DMSO-d6)δ:9.59(s,1H),7.68(bs,1H),2.12(s,6H),1.37(s,9H)。
合成(3-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX- SM-3-4)
程序：
向(3-甲酰基双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-3-3)(0.40g，1.89mmol)于二噁烷(5mL)中的搅拌溶液中添加对甲苯磺酰肼(8.8g，47.20mmol)并在50℃下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到粗产物。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：30:70)纯化粗物质，得到呈白色固体状的INX-SM-3-4(0.28g，38.96％)。LCMS:324.5(M-56)；1HNMR(DMSO-d6)δ:11.07(s,1H),7.66(d,J＝8Hz,2H),7.40(d,J＝8Hz,2H),7.23(s,1H),2.38(s,3H),1.90(s,6H),1.36(s,9H)。
合成(3-(4-甲酰基苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-3-5)
程序：
在室温下向(3-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-3-4)(3.20g，8.43mmol)于二噁烷(30mL)中的搅拌溶液中添加(4-甲酰基苯基)硼酸(1.64g，8.43mmol)和K2CO3(1.74g，12.64mmol)并在110℃下再搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到粗产物。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：15:85)纯化粗物质，得到呈白色固体状的INX-SM-3-5(0.81g，31.87％)。LCMS:302.5(M+H)+；1H NMR(DMSO-d6)δ:9.97(s,1H),7.84(d,J＝7.6Hz,2H),7.33(d,J＝7.6Hz,2H),2.89(s,2H),1.68(s,6H),1.33(s,9H)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-3)；和
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-53)
程序：
向(3-(4-甲酰基苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-3-5)(1.0g，3.31mmol)和(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(1.24g，3.31mmol)于DCM(10mL)中的溶液中添加PTSA(0.95g，4.97mmol)并在室温下再搅拌16小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈异构体混合物形式的粗产物。通过制备型HPLC纯化粗物质，接着通过手性制备型HPLC(柱：IG 250*21μm，5微米，流动相：A＝含0.1％氨的庚烷，B＝IPA:ACN(70:30)，A:B＝60:40)分离异构体，得到异构体-1和异构体-2。这些异构体在停留时间6.72分钟(异构体-1)和11.87分钟(异构体-2)时洗脱。
INX-SM-3(异构体-1)：LCMS:561.0(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:5.45(s,1H,缩醛-H),5.07(d,J＝5.2Hz,1H,C16H)
INX-SM-53(异构体-2)：LCMS 561.1(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:6.13(s,1H,缩醛-H),5.41(d,J＝5.6Hz,1H,C16H)
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-P)
反应方案
合成(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-谷氨酸1-苯甲酯5-(叔丁基)酯(INX-P-1)
程序：
向500mL三颈圆底烧瓶中装入含(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(25g，58.82mmol)和碳酸氢钠(9.8g，116.66mmol)的DMF(200mL)。在室温下向此悬浮液中添加苯甲基溴(10.9g，63.74mmol)并在室温下搅拌16小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用水洗涤，经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。将粗物质与乙醚和戊烷一起湿磨，得到呈白色固体状的INX P-1(26g，85.83％)。LCMS:516.4(M+H)+。
合成L-谷氨酸1-苯甲酯5-(叔丁基)酯(INX-P-2)
程序：
向500mL单颈圆底烧瓶中装入(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-谷氨酸1-苯甲酯5-(叔丁基)酯(INX-P-1)(26g，50.42mmol)和THF(200mL)。向此溶液中添加二乙胺(36.8g，504.11mmol)并在室温下搅拌3小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，在真空下蒸发并与戊烷一起湿磨，得到呈浅黄色粘性的INX-P-2(28g)。粗物质直接用于下一步，而无任何分析数据。
合成(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基-L-谷氨酸1-苯甲酯5-(叔丁基)酯(INX-P-3)
程序：
向500mL单颈圆底烧瓶中装入(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酸(28.0g，94.27mmol)和DMF(200mL)。在室温下向此溶液中添加EDC.HCl(19.7g，102.76mmol)、HOBT(13.9g，102.76mmol)、DIPEA(24.2g，187.24mmol)和L-谷氨酸1-苯甲酯5-(叔丁基)酯(INX-P-2)(30.38g，103.25mmol)并搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到粗产物。通过柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，50:50)纯化粗物质，得到呈浅黄色的INX-P-3(12.0g，23.64％)。LCMS:574.4(M+H)+。
合成(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)
程序：
向500mL单颈圆底烧瓶中装入含(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基-L-谷氨酸1-苯甲酯5-(叔丁基)酯(INX-P-3)(12.0g，20.95mmol)的MeOH(120mL)。在室温下向此溶液中添加10％Pd/C(2.4g)并用氢气吹扫3-4小时。TLC指示反应完成后，经硅藻土床过滤反应混合物并在真空下蒸发滤液。通过反相柱色谱法(乙腈/水)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的INX-P-4(5g，49.45％)。LCMS:483.2(M+H)+。
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-P-5)
程序：
在室温下向50mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.47g，0.97mmol)、HATU(0.55g，1.45mmol)、DIPEA(0.25g，1.94mmol)和DMF(4mL)。在室温下向此溶液中添加(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-3)(0.59g，1.06mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈/水，50:50)纯化粗物质，得到呈浅黄色固体状的INX-P-5(0.42g，57.38％)。LCMS:1025.0(M+H)+。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-P-6)
程序：
向50mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-P-5)(0.40g，0.41mmol)和THF(4mL)。向此溶液中添加二乙胺(0.40g，4.10mmol)并在室温下搅拌3小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物，得到呈黄色固体状的INX-P-6(0.23g，73.43％)LCMS:802.1(M+H)+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-P-7)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-P-6)(0.23g，0.28mmol)和DCM(2mL)。在室温下向此溶液中添加Na2CO3(0.12g，0.57mmol)于水(1mL)中的溶液，继而添加溴乙酰溴(0.029g，0.28mmol)并搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈/水，50:50)纯化粗物质，得到呈淡黄色固体状的INX-P-7(0.090g，34.00％)。LCMS:922.9和924.8(M和M+2)。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-P)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-P-7)(0.090g，0.097mmol)和DCM(2mL)。向此溶液中添加TFA(0.055g，0.48mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC纯化粗物质以获得INX-P(柱：SUNFIRE Prep C18 OBD，19x250mm，5μm，流动相：A＝含0.1％FA的水，B＝乙腈；A:B，55:45)，停留时间15.51分钟，得到呈灰白色固体状的R-异构体(0.010g，11.83％)。LCMS:866.80和868.8(M和M+2)；1H NMR(400MHz,DMOS-d6,关键质子分配):δ:5.40(s,1H,缩醛-H),4.92(d,J＝4.8Hz,1H,C16H)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(3-(3-氨基苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-4)；和
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(3-(3-氨基苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-54)
反应方案
合成3-(羟甲基)双环[1.1.1]戊烷-1-甲酸甲酯(INX-SM-4-1)
程序：
在0℃下向3-(甲氧羰基)双环[1.1.1]戊烷-1-甲酸(10g，58.75mmol)于THF(15mL)中的溶液中滴加硼烷二甲基硫醚(BH3.DMS)(13.49mL，176.2mmol)。在0℃下再搅拌反应混合物30分钟。TLC指示反应完成后，通过缓慢添加稀HCl溶液淬灭反应混合物。用乙酸乙酯萃取产物，并且合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈胶粘固体状的标题化合物(8.2g，89.30％)。粗物质用于下一步。1H NMR(CDCl3)δ:3.68(s,3H),3.63(s,2H),3.07(bs,1H),2.05(s,6H)。
合成3-甲酰基双环[1.1.1]戊烷-1-甲酸甲酯(INX-SM-4-2)
程序：
在0℃下向3-(羟甲基)双环[1.1.1]戊烷-1-甲酸甲酯(INX-SM-4-1)(8.0g，56.27mmol)于DCM(240mL)中的搅拌溶液中添加戴斯-马丁高碘烷(DMP)(23.87g，56.27mmol)并在室温下再搅拌2小时。TLC指示反应完成后，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应混合物。用DCM萃取反应混合物。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈胶粘白色固体状的标题化合物(12g，粗物质)。粗产物未经纯化即用于下一步。
合成3-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)双环[1.1.1]戊烷-1-甲酸甲酯(INX-SM-4-3)
程序：
将3-甲酰基双环[1.1.1]戊烷-1-甲酸甲酯(INX-SM-4-2)(8g，51.88mmol)和对甲苯磺酰肼(9.66g，51.88mmol)于二噁烷(120mL)中的混合物在50℃下加热2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：60:40)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(10g，60.34％)。LCMS:323.2(M+H)+；1H NMR(DMSO-d6)δ:11.19(s,1H),7.66(d,J＝8Hz,2H),7.40(d,J＝8Hz,2H),7.20(s,1H),3.60(s,3H),2.38(s,3H),2.09(s,6H)。
合成3-(3-硝基苯甲基)双环[1.1.1]戊烷-1-甲酸甲酯(INX-SM-4-4)
程序：
在室温下向3-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)双环[1.1.1]戊烷-1-甲酸甲酯(INX-SM-4-3)(4g，12.42mmol)于二噁烷(30mL)中的搅拌溶液中添加(4-硝基苯基)硼酸(2.07g，12.42mmol)和K2CO3(2.57g，18.63mmol)并且在110℃下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：06:94)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.520g，16.04％)。1H NMR(DMSO-d6)δ:8.10(d,J＝6.4Hz,1H),8.01(s,1H),7.64-7.59(m,2H),3.55(s,3H),2.95(s,2H),1.82(s,6H)。
合成3-(3-硝基苯甲基)双环[1.1.1]戊烷-1-甲醛(INX-SM-4-5)
程序：
在-78℃下向3-(3-硝基苯甲基)双环[1.1.1]戊烷-1-甲酸甲酯(INX-SM-4-4)(0.490g，1.87mmol)于DCM(25mL)中的搅拌溶液中添加氢化二异丁基铝(1M，于甲苯中，3.2mL，3.75mmol)并再搅拌30分钟。TLC指示反应完成后，用稀HCl溶液淬灭反应混合物并且使其达到室温，接着用DCM萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：18:82)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.27g，62.26％)。1H NMR(DMSO-d6)δ:9.55(s,1H),8.12(d,J＝8Hz,1H),7.99(s,1H),7.51(t,J＝7.6Hz,1H),7.44(d,J＝7.6Hz,1H),2.95(s,2H),1.93(s,6H)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-10-(3-(3-硝基苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮
(INX-SM-4-6)
程序：
向3-(3-硝基苯甲基)双环[1.1.1]戊烷-1-甲醛(INX-SM-4-5)(0.27g，1.16mmol)于DCM(30mL)中的搅拌溶液中添加(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.351g，0.93mmol)和对甲苯磺酸(0.30g，1.76mmol)。在室温再搅拌反应混合物16小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈异构体混合物形式的标题化合物(0.470g，粗物质)。LCMS:590.93(M+H)+。
通过手性制备型HPLC(柱：IG 250*21μm，5微米，流动相：A＝含0.1％氨的庚烷，B＝IPA:ACN(70:30)，A:B＝75:25)进一步分离异构体，得到异构体-1和异构体-2。这些异构体在停留时间12.85分钟(异构体-1)和19.40分钟(异构体-2)时洗脱。
异构体-1：1H NMR(400MHz,CDCl3)Fr-1:δ4.94(d,1H,C16H),4.57(s,1H,缩醛-H)
异构体-2：1H NMR(400MHz,CDCl3)Fr-1:δ5.19(d,1H,C16H),5.08(s,1H,缩醛-H)
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(3-(3-氨基苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-4)；和
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(3-(3-氨基苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-54)
程序：
向(INX-SM-4-6，异构体混合物)(0.30g，0.50mmol)于乙醇(10mL)中的搅拌溶液中添加NH4Cl(0.22g，4.0mmol)和锌粉(0.26g，4.0mmol)。在80℃下搅拌反应混合物2小时。TLC指示反应完成后，过滤反应混合物，并在真空下蒸发滤液，得到呈异构体混合物形式的标题化合物(0.360g，粗物质)。
通过手性制备型HPLC(柱：IG 250*21μm，5微米，流动相：A＝含0.1％氨的庚烷，B＝IPA:ACN(70:30)，A:B＝82:18)进一步分离异构体，得到异构体-1和异构体-2。这些异构体在停留时间27.96分钟(异构体-1)和43.90分钟(异构体-2)时洗脱。
INX-SM-4(异构体-1)：LCMS:560.90(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配)δ:5.00-4.90(m,2H,缩醛和C16-H)
INX-SM-54(异构体-2)：LCMS:561.00(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配)δ:5.16(d,J＝7.2Hz,1H,C16-H),5.09(s,1H,缩醛-H)
合成S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-((3-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸(INX O)
反应方案
合成(S)-4-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-((3-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX O-1)：
程序：
向圆底烧瓶中装入INX-SM-4(0.050g，0.0894mmol，1.0当量)、Boc-Gly-Glu(OtBu)-OH(0.0805g，0.2235mmol，2.5当量)和PyAOP(0.1165g，0.2235mmol，2.5当量)。添加DMF(0.10mL)，继而添加DIPEA(0.078mL，0.4470mmol，5.0当量)，并且搅拌混合物45分钟。此时所有INX-SM-4消耗，并且存在2:1比率的所需产物与双Gly-Glu偶接化合物。将粗混合物负载至Isco C18 Aq 30g反相柱上，并用5-100％乙腈(0.05％AcOH添加剂)/H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并冻干，得到0.0220g INX O-1，产率28％，呈白色固体状。LCMS方法B(ESI+):C50H68N3O12[M+H]+需要902.47，在1.76分钟时的实验值902.88。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-((3-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸三氟乙酸盐(INX O-2)：
程序：
向圆底烧瓶中装入叔丁酯INX O-1(0.020g，0.022mmol，1.0当量)、MeCN(0.50mL)、三氟乙酸(1.0mL)和三异丙基硅烷(0.075mL，0.3662mmol，16.6当量)。在室温下搅拌混合物1小时。通过LCMS确认起始材料消耗并缩减溶剂。将所得残余物负载至Isco C18 Aq 30g反相柱上，并用0-100％乙腈(0.10％TFA添加剂)/H2O(0.10％TFA添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并冻干，得到0.0144g INX O-2·TFA，产率76％，呈白色固体状。LCMS方法A(ESI+):C41H52N3O10[M+H]+需要746.36，在2.088分钟时的实验值746.3。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-((3-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸(INX O)：
程序：
向小瓶中装入2-溴乙酸(0.0205g，0.1476mmol，2当量)，将其溶解于DMF(0.40mL)中。添加N-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(0.0347g，0.1402mmol，2当量)，并且搅拌混合物90分钟。接着将胺INX O-2·TFA(0.0622g，0.072mmol，1.0当量)与碳酸氢钠(0.0371g，0.4428mmol，6.15当量)一起添加至溶液中，并且搅拌混合物2小时(直至所有INX O-2消耗)。一旦通过LCMS确认反应完成，将粗混合物直接负载至Isco C18 Aq 5.5g反相柱上，并用0-100％乙腈(0.05％AcOH添加剂)/H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并冻干，得到0.0124g INX O，产率20％，呈蓬松白色固体状。LCMS方法A(ESI+):C43H53BrN3O11[M+H]+需要866.28，在2.174分钟时的实验值866.3。
合成INX-SM-6和INX-SM-56
反应方案
合成2-(3-硝基苯基)乙酰胺(INX-SM-6-1)
程序：
在0℃下向2-(3-硝基苯基)乙酸(0.5g，2.76mmol)于DCM(15mL)中的溶液中滴加草酰氯(0.71mL，8.28mmol)。在室温下再搅拌反应混合物1小时。TLC指示反应完成后，在真空下浓缩反应混合物，得到胶粘液体，将其溶解于DCM中并且在0℃下通入氨气。TLC指示反应完成后，用碳酸氢钠溶液淬灭反应混合物，并用乙酸乙酯萃取产物。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.3g，60.33％)。粗物质用于下一步。LCMS:181.1(M+H)+。
合成2-(3-硝基苯基)乙硫酰胺(INX-SM-6-2)
程序：
在室温下向2-(3-硝基苯基)乙酰胺(INX-SM-6-1)(3.0g，16.6mmol)于THF(50mL)中的搅拌溶液中添加劳森氏试剂(Lawesson's reagent)(13.4g，33.33mmol)，并且在回流温度下搅拌反应混合物14小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取产物。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：28:72)纯化粗物质，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(3.0g，91.76％)。LCMS:197.1(M+H)+；1H NMR(DMSO):9.62,9.54(2brs,2H),8.28(s,1H),8.13(d,J＝8.0Hz,1H),7.80(d,J＝7.6Hz,1H),7.63(t,J＝8.0Hz,1H),3.96(s,2H)。
合成2-氯-3-乙氧基-3-氧代丙-1-烯-1-醇钾(INX-SM-6-3)
程序：
在0℃下向甲酸甲基乙酯(0.5g，6.75mmol)和2-氯乙酸乙酯(0.824g，6.75mmol)于二异丙醚(25mL)中的溶液中添加叔丁醇钾(0.75g，6.75mmol)并在室温下搅拌3小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过与乙醚一起湿磨来纯化粗物质并在真空下干燥，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.55g，71.40％)。1H NMR(DMSO-d6)δ:8.94(s,1H),3.94(q,2H),1.11(t,3H)。
合成2-(3-硝基苯甲基)噻唑-5-甲酸乙酯(INX-SM-6-4)
程序：
将2-氯-3-乙氧基-3-氧代丙-1-烯-1-醇钾(INX-SM-6-3)(5.5g)用稀HCl处理并用乙酸乙酯萃取，并且经Na2SO4干燥并浓缩，得到2-氯-3-氧代丙酸乙酯的黄色半固体(3.0g)。向2-(3-硝基苯基)乙硫酰胺(INX-SM-6-2)(3g，15.30mmol)于乙醇(50mL)中的搅拌溶液中添加2-氯-3-氧代丙酸乙酯(2.75g，18.36mmol)和Na2SO4(8.03g，76.53mmol)并在80℃下搅拌12小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：30:70)纯化粗物质，得到呈浅黄色液体状的标题化合物(1.6g，35.80％)。LCMS:293.40(M+H)+；1H NMR(CDCl3)δ:8.34(s,1H),8.22-8.19(m,2H),7.70(d,J＝7.6Hz,1H),7.57(t,J＝8Hz,1H),4.49(s,2H),4.32(q,2H),1.31(t,3H)。
合成2-(3-硝基苯甲基)噻唑-5-甲醛(INX-SM-6-5)
程序：
在-78℃下向2-(3-硝基苯甲基)噻唑-5-甲酸乙酯(INX-SM-6-4)(1.6g，5.4mmol)于DCM(100mL)中的搅拌溶液中添加氢化二异丁基铝(DIBAL)(1M，于甲苯中，12.05ml，12.05mmol)并在-78℃下再搅拌20分钟。TLC指示反应完成后，用稀HCl溶液淬灭反应混合物并且使其达到室温。用DCM萃取产物。合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：10:90)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.400g，29.44％)。LCMS:249.29(M+H)+；1H NMR(DMSO-d6)δ:10.00(s,1H),8.62(s,1H),8.30(s,1H),8.17(d,J＝8.0Hz,1H),7.85(d,J＝7.6Hz,1H),7.67(t,J＝8Hz,1H),4.65(s,2H)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-10-(2-(3-硝基苯甲基)噻唑-5-基)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-6-7)；和
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-10-(2-(3-硝基苯甲基)噻唑-5-基)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-56-1)
程序：
向2-(3-硝基苯甲基)噻唑-5-甲醛((INX-SM-6-5)(0.4g,1.06mmol)于DCM(20mL)中的搅拌溶液中添加(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.211g，0.84mmol)和对甲苯磺酸(1.0g，5.30mmol)并在室温下搅拌8小时。TLC指示反应完成后，用碳酸氢盐溶液淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过快速色谱法(甲醇/DCM：6:94)纯化粗物质，得到呈非对映异构体混合物形式的化合物(INX-SM-6-6)。
通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart Prep C18-S，250X20mm S-10μm，12mm，流动相：A＝含0.05％氨的水，B＝含20％A-Line的ACN，A:B＝45:55)进一步分离非对映异构体。这些异构体在停留时间13.5分钟(INX-SM-6-7，异构体-1)(0.030g，8.8％)和18.50分钟(INX-SM-56-1，异构体-2)(0.040g，11.8％)时洗脱。
合成((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(2-(3-氨基苯甲基)噻唑-5-基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-6)
程序：
向(INX-SM-6-7，异构体-1)(0.030g，0.049mmol)于乙醇(2mL)中的搅拌溶液中添加NH4Cl(0.020g，0.39mmol)和锌金属(0.025g，0.39mmol)。在80℃下加热反应混合物2小时。TLC指示反应完成后，过滤反应混合物，并在真空下蒸发滤液。通过反相制备型HPLC(0.05％氨-乙腈)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.005g，17.8％)。
INX-SM-6(R-异构体)：LCMS:577.2(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:5.86(s,1H,缩醛-H),5.02(d,C-16H)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(2-(3-氨基苯甲基)噻唑-5-基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-56)
程序：
向(INX-SM-56-1，异构体-2)(0.040g，0.065mmol)于乙醇(2mL)中的搅拌溶液中添加NH4Cl(0.027g，0.52mmol)和锌金属(0.034g，0.52mmol)。在80℃下加热反应混合物2小时。TLC指示反应完成后，过滤反应混合物，并在真空下蒸发滤液。通过反相制备型HPLC(0.05％氨-乙腈)进一步纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.015g，39％)；LCMS:577.1(M+H)+。
INX-SM-56(S-异构体)：LCMS:577.2(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:6.40(s,1H,缩醛-H),5.33(d,J＝6.0Hz,C-16H)
合成INX-SM-7和INX-SM-57
反应方案
合成(2-溴噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-7-1)
程序：
向2-溴噻唑-5-甲酸(5.0g，24.0mmol)于t-BuOH(50mL)中的溶液中添加二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)(7.74mL，36.0mmol)和三乙胺(13.48ml，96.1mmol)并在80℃下搅拌12小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：10:90)纯化粗物质，得到呈棕色固体状的标题化合物(2.3g，34.28％)。LCMS:278(M+H)+；1HNMR(DMSO-d6):10.98(s,1H),7.09(s,1H)1.46(s,9H)。
合成(2-乙烯基噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-7-2)
程序：
在室温下向(2-溴噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-7-1)(1.5g，5.37mmol)于二噁烷(50mL)中的搅拌溶液中添加三丁基(乙烯基)锡(1.70g，5.37mmol)并用N2(g)脱气15分钟。将四三苯基膦钯(0)(0.310g，0.26mmol)添加至反应混合物中并且在100℃下搅拌反应混合物12小时。TLC指示反应完成后，经硅藻土过滤反应混合物并在真空下蒸发滤液。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：20:80)纯化粗物质，得到标题化合物(0.9g，74.2％)。LCMS:227.0(M+H)+；1H NMR(DMSO-d6):10.72(s,1H),7.26(s,1H),6.76(dd,J＝11.2和17.6Hz,1H),5.82(d,J＝17.6Hz,1H),5.42(d,J＝11.2Hz,1H),1.46(s,9H)。
合成(2-甲酰基噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-7-3)
程序：
向(2-乙烯基噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-7-2)(3.8g，16.8mmol)于二噁烷(50mL)中的溶液中添加K2OsO4.2H2O(0.179g，0.48mmol)于水(2ml)中的溶液。将NaIO4(18.15g，85.2mmol)溶解于水(10ml)中并添加至反应混合物中，在室温下搅拌3小时。TLC指示反应完成后，经硅藻土床过滤反应混合物并在真空下蒸发滤液。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯:己烷：15:85)纯化粗物质，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(2.5g，65.22％)。LCMS:229.0(M+H)+。
合成(2-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-7-4)
程序：
向(2-甲酰基噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-7-3)(2.5g，10.9mmol)于二噁烷(50mL)中的溶液中添加对甲苯磺酰肼(2.23g，12.0mmol)，并且在90℃下搅拌反应混合物5小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯:己烷：25:75)纯化粗物质，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(2.8g，64.48％)。LCMS:397.0(M+H)+。
合成(2-(4-甲酰基苯甲基)噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-7-5)
程序：
向(2-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-7-4)(2.8g，7.06mmol)于二噁烷(50mL)中的搅拌溶液中添加(4-甲酰基苯基)硼酸(1.16g，7.76mmol)和K2CO3(1.94g，14.12mmol)并在110℃下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：20:80)纯化粗物质，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.4g，17.79％)。LCMS:319.0(M+H)+。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((5-氨基噻唑-2-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-7)；和
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((5-氨基噻唑-2-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-57)
程序：
向(2-(4-甲酰基苯甲基)噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-7-5)(0.1g，0.31mmol)和(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.118g，0.31mmol)于DCM(50mL)中的搅拌溶液中添加三氟甲磺酸(0.15g，1.03mmol)于乙腈(6.2ml)中的溶液并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至饱和NaOH溶液中并用MDC萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈异构体混合物形式的标题化合物(0.060g，粗物质)。
通过制备型HPLC(柱：Xbridge prep，C18，OBD19*250mm，5微米，流动相：A＝含0.05％氨的水，B＝ACN(67:33)，A:B＝67:33)进一步分离非对映异构体，得到异构体-1和异构体-2。这些异构体在停留时间17.70分钟(异构体-1)和20.87分钟(异构体-2)时洗脱。
INX-SM-7(异构体-1，R-异构体)：(产量：0.010g，3％)。LCMS:577.4(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:5.47(s,1H,缩醛-H),5.06(d,J＝5.2Hz,1H,C16H)
INX-SM-57(异构体-2，S异构体)：(产量：0.003g，0.6％)。LCMS 577.4(M+H)+；1HNMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:6.03(s,1H,缩醛-H),5.41(d,J＝5.2Hz,1H,C16H)
合成INX-SM-13和INX-SM-63
反应方案
合成(6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-13)；和
(6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-63)
程序：
向(3-(4-甲酰基苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-3-5)(0.180g，0.597mmol)和(8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-9-氟-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(去炎松)(0.259g，0.656mmol)于DCM(2mL)中的溶液中添加对甲苯磺酸(0.908g，4.77mmol)并在室温下再搅拌16小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至饱和NaHCO3溶液中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈异构体混合物形式的粗产物化合物。进一步纯化粗产物并且通过反相制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart Prep C18-S，250X20mm S-10μm，12nm，流动相：A＝含0.05％氨的水，B＝ACN:MeOH(50:50))分离异构体。这些异构体在停留时间14分钟(异构体-1)和19.5分钟(异构体-2)时洗脱。
INX-SM-13(异构体-1)：(产量：0.038g，11.08％)。LCMS:578.20(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:5.47(s,1H,缩醛-H),5.05(d,J＝5.2Hz,1H,C16H)
INX-SM-63(异构体-2)：(产量：0.005g，1.45％)。LCMS 578.30(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:6.13(s,1H,缩醛-H),5.42(d,J＝6.8Hz,1H,C16H)
合成INX-SM-24和INX-SM-74
反应方案
合成(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-24)；和
(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-74)
程序：
向(3-(4-甲酰基苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-3-5)(0.500g，1.66mmol)和(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a,10,10-四甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(醋酸氟轻松)(0.716g，1.65mmol)于DCM(10mL)中的溶液中添加对甲苯磺酸(2.5g，13.26mmol)并在室温下再搅拌16小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至饱和NaHCO3溶液中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈异构体混合物形式的粗产物。进一步纯化粗产物并且通过反相制备型HPLC(柱：Unisil 10-120C18 Ultra，250x21.2mm x10μm，流动相：A＝含0.05％氨的水，B＝乙腈)分离异构体，得到异构体-1和异构体-2。这些异构体在停留时间13.5分钟(异构体-1)和19.5分钟(异构体-2)时洗脱。
INX-SM-24(R-异构体)：(产量0.100g，10.11％)。LCMS:596.20(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:5.48(s,1H,缩醛-H),5.06(d,J＝4.4Hz,1H,C16H)
INX-SM-74(S-异构体)：(产量0.020g，2.02％)。LCMS:596.20(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:6.17(s,1H,缩醛-H),5.43(d,J＝7.2Hz,1H,C16H)
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-氨基立方烷-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM- 9)
反应方案
合成4-((叔丁氧羰基)氨基)立方烷-1-甲酸甲酯(INX-SM-9-1)
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入4-甲氧羰基立方烷甲酸(2g，9.69mmol)和叔丁醇(60mL)。在室温下向此溶液中添加二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)(3.1mL，14.54mmol)和三乙胺(10.8mL，77.59mmol)并在室温下搅拌30分钟。在80℃下加热反应混合物1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：15:85)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.90g，33.46％)。1H NMR(CDCl3)δ:4.1(bs,6H),3.71(s,3H),1.46(s,9H)。
合成(4-(羟甲基)立方烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-9-2)
程序：
在氮气下向100mL三颈圆底烧瓶中装入4-((叔丁氧羰基)氨基)立方烷-1-甲酸甲酯(INX-SM-9-1)(0.9g，3.24mmol)和THF(40mL)。在-78℃下向此溶液中添加含1M氢化锂铝的THF(3.2mL，3.24mmol)并且再搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用1NNaOH溶液淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到粗产物(0.8g，98.88％)。1HNMR(DMSO-d6)δ:7.58(bs,1H),4.42(t,1H),3.80(bs,3H),3.57(bs,3H)3.48(d,2H,J＝5.2),1.37(s,9H)。
合成(4-甲酰基立方烷-1-基)氨基甲酸4-叔丁酯(INX-SM-9-3)
程序：
在氮气下向100mL三颈圆底烧瓶中装入(4-(羟甲基)立方烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-9-2)(0.9g，3.60mmol)和DCM(25mL)。在0℃下向此溶液中添加戴斯-马丁高碘烷(DMP)(3.06g，7.21mmol)并且搅拌1小时。TLC指示反应完成后，经硅藻土过滤反应混合物并用乙醚洗涤。在真空下蒸发合并的滤液，得到呈白色固体状的标题化合物(1.0g，粗物质，定量)。粗物质立即用于下一步。
合成(4-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)立方烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-9-4)
程序：
在氮气下向50mL单颈圆底烧瓶中装入(4-甲酰基立方烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-9-3)(1.0g，4.04mmol)和EtOH(30mL)。向此溶液中添加对甲苯磺酰肼(1.1g，6.06mmol)和催化量的AcOH，并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中。过滤固体并且在真空下干燥产物。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯:己烷，1:4)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.8g，47.61％)。LCMS:416.3(M+H)+；1HNMR(DMSO-d6)δ:11.07(s,1H),7.67(d,J＝8.4Hz,2H),7.40-7.38(m,3H),3.85-3.81(m,6H),2.38(s,3H),1.36(s,9H)。
合成(4-(4-甲酰基苯甲基)立方烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-9-5)
程序：
在氮气下向35mL小瓶中装入(4-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)立方烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-9-4)(0.50g，1.20mmol)和二噁烷(10mL)。用N2吹扫反应混合物10分钟。在室温下向此溶液中添加(4-甲酰基苯基)硼酸(0.36g，2.40mmol)和K2CO3(0.33g，2.41mmol)并在110℃下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，15:85)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.040g，9.85％)。1H NMR(DMSO-d6)δ:9.96(s,1H),7.83(d,J＝8Hz,2H),7.59(bs,1H),7.40(d,J＝7.6Hz,2H),3.76(bs,3H),3.58(bs,3H),2.96(s,2H),1.35(s,9H)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-氨基立方烷-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM- 9)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入((2r,3R,4s,5S)-4-(4-甲酰基苯甲基)立方烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-9-5)(0.035g，0.10mmol)和(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.038g，0.10mmol)、MgSO4(0.062g，0.51mmol)和DCM(10mL)。向此溶液中添加HClO4(0.157g，1.55mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应混合物并在真空下浓缩。将粗物质与冷水一起湿磨，并且过滤沉淀物并在真空下干燥。通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE PrepC18 OBD，19x250mm，5μm，流动相：A＝含0.1％FA的水，B＝ACN:MeOH:IPA(65:25:10)，A:B，67:33)纯化粗物质；停留时间15.14分钟，得到呈白色固体状的R-异构体(0.010g，16.18％)；LCMS:597.4(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:5.47(s,1H,缩醛-H),5.06(d,J＝4.8Hz,1H,C16H)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-32)
反应方案
合成(6-(羟甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-32-1)
程序：
在氮气下向50mL单颈圆底烧瓶中装入6-((叔丁氧羰基)氨基)螺[3.3]庚烷-2-甲酸甲酯(2.0g，7.43mmol)和THF:MeOH(15:5mL)。在0℃下向此溶液中逐份添加NaBH4(1.4g，37.17mmol)并在室温下再搅拌4小时。TLC指示反应完成后，用水稀释反应混合物并且用1NHCl调整中性pH。用乙酸乙酯萃取产物。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到粗产物(2.0g，定量)。LCMS:186.2(M+H-56)；1H NMR(CDCl3)δ:4.63(bs,1H),3.97(bs,1H),3.54(d,J＝6.8Hz,2H),2.50-2.25(m,3H),2.20-1.95(m,2H),1.90-1.40(m,5H),1.46(s,9H)。
合成(6-甲酰基螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-32-2)
程序：
在氮气下向50mL单颈圆底烧瓶中装入(6-(羟甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-32-1)(2.0g，8.30mmol)和DCM(20mL)。在0℃下向此溶液中添加戴斯-马丁高碘烷(DMP)(3.51g，8.30mmol)并搅拌2小时。TLC指示反应完成后，反应混合物经硅藻土过滤并用乙醚洗涤。在真空下蒸发合并的有机层。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，40:60)纯化粗物质，得到呈黄色固体状的标题化合物(1.7g，85.72％)。LCMS:184.2(M+H-56)。
合成(6-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯
(INX-SM-32-3)
程序：
在氮气下向50mL单颈圆底烧瓶中装入(6-甲酰基螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-32-2)(1.5g，6.27mmol)和EtOH(15mL)。向此溶液中添加对甲苯磺酰肼(1.16g，6.27mmol)和催化量的AcOH(0.2mL)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中。过滤固体并在真空下干燥，得到呈白色固体状的标题化合物(2.2g，86.13％)。LCMS:425.5(M+18)。
合成(6-(4-甲酰基苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-32-4)
程序：
在氮气下向35mL小瓶中装入(6-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-32-3)(1.0g，2.45mmol)和二噁烷(10mL)。在室温下向此溶液中添加(4-甲酰基苯基)硼酸(0.36g，2.45mmol)和K2CO3(0.51g，3.68mmol)并且在100℃下再搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，30:70)纯化粗物质，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.16g，19.79％)。LCMS:274.3(M+H-56)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-32)
程序：
向35mL小瓶中装入(6-(4-甲酰基苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-32-4)(0.16g，0.48mmol)、(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.13g，0.34mmol)、MgSO4(0.29g，2.43mmol)和DCM(4mL)。向此溶液中添加HClO4(0.40g，2.43mmol)并在室温下再搅拌2小时。TLC指示反应完成后，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应混合物并真空浓缩。将粗物质与冷水一起湿磨，并且过滤沉淀固体并在真空下干燥。
通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE Prep C18 OBD，19x250mm，5μm，流动相：A＝含0.1％FA的水，B＝乙腈，A:B，80:20)纯化粗物质，停留时间18.54分钟，得到呈白色固体状的R-异构体(0.045g，15.76％)；LCMS:588.4(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:5.45(s,1H,缩醛-H),5.05(d,J＝4.8Hz,1H,C16H)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛-7-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-31)
反应方案
合成7-甲酰基-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛烷-2-甲酸叔丁酯(INX-SM-31-1)
程序：
在氮气下向100mL三颈圆底烧瓶中装入7-(羟甲基)-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛烷-2-甲酸叔丁酯(1.0g，4.11mmol)和DCM(20mL)。在室温下向此溶液中添加戴斯-马丁高碘烷(DMP)(3.40，8.22mmol)并搅拌30分钟。TLC指示反应完成后，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈胶粘固体状的标题化合物(0.8g，78.71％)。1H NMR(DMSO-d6)δ:9.59(s,1H),4.08-4.04(m,1H),3.88-3.70(m,5H),3.21-3.19(m,1H),2.37-2.21(m,2H),1.36(s,9H)。
合成7-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛烷-2-甲酸叔丁酯(INX-SM-31-2)
程序：
在氮气下向50mL单颈圆底烧瓶中装入7-甲酰基-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛烷-2-甲酸叔丁酯(INX-SM-31-1)(0.8g，4.04mmol)和EtOH(30mL)。向此溶液中添加对甲苯磺酰肼(0.92g，4.97mmol)和催化量的AcOH并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中，并且过滤固体并在真空下干燥。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，20:80)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.7g，51.56％)。LCMS:410.8(M+H)+。
合成7-(4-甲酰基苯甲基)-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛烷-2-甲酸叔丁酯(INX-SM- 31-3)
程序：
在氮气下向35mL小瓶中装入7-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛烷-2-甲酸叔丁酯(INX-SM-31-2)(0.72g，1.76mmol)和二噁烷(10mL)。在室温下向此溶液中添加(4-甲酰基苯基)硼酸(0.26g，1.76mmol)和K2CO3(0.48g，3.52mmol)并在110℃下再搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，15:85)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.30g，52.96％)。LCMS:332.8(M+H)+。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛-7-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-31)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入7-(4-甲酰基苯甲基)-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛烷-2-甲酸叔丁酯(INX-SM-31-3)(0.30g，0.90mmol)、(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.34g，0.90mmol)、MgSO4(0.54g，4.52mmol)和DCM(5mL)。向此溶液中添加HClO4(0.45g，4.52mmol)并在室温下再搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。
合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE PrepC18 OBD，19x250mm，5μm，流动相：A＝含0.1％FA的水，B＝ACN:MEOH:IPA(65:25:10)；停留时间：16.40分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的R-异构体(0.022g，4.50％)；LCMS:591.3(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:5.44(s,1H,缩醛-H),5.06(d,J＝4.8Hz,1H,C16H)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基氧杂环丁烷-3-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-33)
反应方案
合成(3-甲酰基氧杂环丁烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-33-1)
程序：
在氮气下向100mL三颈圆底烧瓶中装入(3-(羟甲基)氧杂环丁烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(2.0g，9.84mmol)和DCM(20mL)。在0℃下向此溶液中添加戴斯-马丁高碘烷(DMP)(4.17g，9.84mmol)并搅拌2小时。TLC指示反应完成后，经硅藻土过滤反应混合物并用乙醚洗涤。在真空下蒸发合并的有机层，得到粗产物。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：45:55)纯化粗物质，得到呈黄色固体状的标题化合物(2.0g，定量)。1H NMR(CDCl3)δ:9.85(s,1H),5.50-5.42(m,1H),5.10-4.940(m,1H),4.86-4.84(d,2H),1.47(s,9H)。
合成(3-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)氧杂环丁烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM- 33-2)
程序：
在氮气下向50mL单颈圆底烧瓶中装入(3-甲酰氧杂环丁烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-33-1)(1.7g，8.44mmol)和EtOH(17mL)。向此溶液中添加对甲苯磺酰肼(1.57g，8.44mmol)和催化性AcOH并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到粗产物。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，50:50)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(2.5g，80.10％)。LCMS:387.4(M+18)。
合成(3-(4-甲酰基苯甲基)氧杂环丁烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-33-3)
程序：
在氮气下向50mL小瓶中装入(3-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)氧杂环丁烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-33-2)(2.5g，6.77mmol)和二噁烷(25mL)。在室温下向此溶液中添加(4-甲酰基苯基)硼酸(1.0g，6.77mmol)和K2CO3(1.4g，10.16mmol)并在100℃下再搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到粗产物。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，30:70)纯化粗物质，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.25g，12％)。LCMS:292.2(M+H)+。
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基氧杂环丁烷-3-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM- 33)
程序：
向35mL小瓶中装入(3-(4-甲酰基苯甲基)氧杂环丁烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-33-1)(0.080g，0.27mmol)、(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.073g，0.19mmol)、MgSO4(0.16g，1.37mmol)和DCM(2mL)。向此溶液中添加HClO4(0.23g，1.37mmol)并在室温下再搅拌4小时。TLC指示反应完成后，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应混合物并在真空下浓缩。将粗物质与冷水一起湿磨，并且过滤沉淀固体并在真空下干燥。通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE Prep C18OBD，19x250mm，5μm，流动相：A＝含0.1％FA的水，B＝乙腈；A:B，80:20)纯化粗物质；停留时间：8.70分钟，得到呈白色固体状的标题化合物的R-异构体(0.004g，2.65％)LCMS:551.3(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:5.48(s,1H,缩醛-H),5.07(d,J＝5.4Hz,1H,C16H)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-氨基双环[2.2.2]辛-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-10)
反应方案
合成4-异氰酸基双环[2.2.2]辛烷-1-甲酸甲酯(INX-SM-10-1)
程序：
向50mL单颈圆底烧瓶中装入4-(甲氧羰基)双环[2.2.2]辛烷-1-甲酸(1g，4.47mmol)和甲苯(20mL)。向此溶液中添加二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)(1.29g，4.47mmol)和三乙胺(0.47g，4.47mmol)。在110℃下加热反应混合物2小时。TLC指示反应完成后，在室温下冷却反应混合物，用乙酸乙酯稀释并且用10％柠檬酸溶液，接着用饱和碳酸氢盐溶液洗涤。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，10:90)纯化粗物质，得到呈无色液体状的标题化合物(0.45g，45.46％)。1H NMR(CDCl3)δ:3.62(s,3H),1.90-1.87(m,12H)。
合成4-氨基双环[2.2.2]辛烷-1-甲酸(INX-SM-10-2)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入4-异氰酸基双环[2.2.2]辛烷-1-甲酸甲酯(INX-SM-10-1)(0.45g，2.15mmol)和6N HCl(10mL)。在室温下再搅拌反应混合物12小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物，得到含有标题化合物的粗产物。将粗物质与正戊烯和乙醚一起湿磨，得到白色固体(0.45g，定量)。1H NMR(DMSO-d6)δ:12.21(bs,1H),8.20(s,3H),1.83-1.69(m,12H)。
合成4-氨基双环[2.2.2]辛烷-1-甲酸乙酯(INX-SM-10-3)
程序：
在氮气下向25mL三颈圆底烧瓶中装入乙醇(5mL)。在0℃下向此溶液中添加亚硫酰氯(0.62g，5.32mmol)，并且添加4-氨基双环[2.2.2]辛烷-1-甲酸(INX-SM-10-2)(0.45g，2.65mmol)并回流3小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物，得到粗产物。通过与正戊烯和乙醚一起湿磨来纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.55g，定量)。LCMS:198.20；1H NMR(DMSO-d6)δ:8.13(s,1H),7.68(s,2H),4.04-4.99(q,J＝6.8Hz,2H),1.82-1.71(m,12H)1.16-1.12(t,3H,J＝8Hz)。
合成(4-氨基双环[2.2.2]辛-1-基)甲醇(INX-SM-10-4)
程序：
在氮气下向25mL三颈圆底烧瓶中装入4-氨基双环[2.2.2]辛烷-1-甲酸乙酯(INX-SM-10-3)(0.55g，2.27mmol)和THF(5.5mL)。在-20℃下向此溶液中添加LiAlH4(1M，于THF中)(6.9mL，6.9mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，用10％NaOH溶液淬灭反应混合物并经硅藻土床过滤。经Na2SO4干燥滤液并在真空下蒸发。将粗物质与正戊烯和乙醚一起湿磨，得到呈白色固体状的标题化合物(0.30g，69.32％)。LCMS:156.1(M+H)+；1H NMR(DMSO-d6)δ:3.05(s,2H),1.48-1.37(m,12H)。
合成(4-(羟甲基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-10-5)
程序：
在氮气下向25mL单颈圆底烧瓶中装入(4-氨基双环[2.2.2]辛-1-基)甲醇(INX-SM-10-4)(0.30g，1.93mmol)和DCM(15mL)。在室温下向此溶液中添加Boc-酸酐(0.63g，2.90mmol)并再搅拌16小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用饱和碳酸氢盐溶液洗涤，经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。将粗物质与二异丙醚一起湿磨，得到呈白色固体状的标题化合物(0.45g，91.19％)。LCMS:200.2(M+H-56)；1H NMR(CDCl3)δ:4.34(bs,1H),3.27(s,2H),1.86＝1.82(m,6H),1.59-1.53(m,6H),1.43(s,9H)。
合成(4-甲酰基双环[2.2.2]辛-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-10-6)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入(4-(羟甲基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-10-5)(0.45g，1.76mmol)和THF(10mL)。在室温下添加戴斯-马丁高碘烷(DMP)(1.12g，2.64mmol)并在室温下搅拌1.5小时。TLC指示反应完成后，用NaHCO3水溶液淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈白色固体状的标题化合物(0.45g，粗物质)。LCMS:198.3(M+H-56)。
合成(4-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX- SM-10-7)
程序：
向10mL玻璃小瓶中装入(4-甲酰基双环[2.2.2]辛-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-10-6)(0.45g，1.77mmol)和乙醇(5mL)。在室温下向此溶液中添加对甲苯磺酰肼(0.39g，2.13mmol)和乙酸(0.05g，0.88mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中。过滤白色固体并在真空下干燥，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.38g，51.42％)。LCMS:422.3(M+H)+；1HNMR(DMSO-d6)δ:10.72(s,1H),7.65(d,J＝8.4Hz,2H),7.39(d,J＝8.0Hz,2H)7.02(s,1H),6.37(bs,1H),2.37(s,3H),1.71-1.69(m,6H),1.46-1.42(m,6H),1.34(s,9H)。
合成(4-(4-甲酰基苯甲基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-10-8)
程序：
向50mL单颈圆底烧瓶中装入(4-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-10-7)(1.0g，2.37mmol)和二噁烷(20mL)。在室温下添加(4-甲酰基苯基)硼酸(0.53g，3.55mmol)和K2CO3(0.49g，3.55mmol)并且在110℃下再搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：50:50)纯化粗物质，得到呈无色液体状的标题化合物(0.06g，7.36％)。LCMS:288.8(M+H-56)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-氨基双环[2.2.2]辛-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-10)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入(4-(4-甲酰基苯甲基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-10-8)(0.05g，0.145mmol)和(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.054g，0.14mmol)、MgSO4(0.080g，0.73mmol)和DCM(5mL)。向此溶液中添加HClO4(0.072g，0.73mmol)并在室温下再搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用饱和碳酸氢盐溶液淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE Prep C18 OBD，19x250mm，5μm，流动相：A＝含0.1％FA的水，B＝ACN:MEOH:IPA(65:25:10)；A:B，80:20)纯化粗物质；停留时间18.76分钟，得到呈白色固体状的标题化合物的R-异构体(0.015g，14.27％)；LCMS 603.52(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD关键质子分配)δ:5.46(s,1H,缩醛-H),5.06(d,J＝4.80Hz,1H,C16H)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((1-氨基-3,3-二氟环丁基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-35)
反应方案
合成(E)-(3,3-二氟-1-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)环丁基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-35-1)
程序：
在氮气下向30mL玻璃小瓶中装入(3,3-二氟-1-甲酰基环丁基)氨基甲酸叔丁酯(0.50g，2.12mmol)和二噁烷(5mL)。向此溶液中添加对甲苯磺酰肼(0.4g，2.12mmol)并在90℃下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到粗产物。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，30:70)纯化粗物质，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(0.55g，64.23％)。LCMS:348.1(M+H-56)。
合成(3,3-二氟-1-(4-甲酰基苯甲基)环丁基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-35-2)
程序：
在氮气下向30mL小瓶中装入(3,3-二氟-1-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)环丁基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-35-1)(0.50g，1.72mmol)和二噁烷(5mL)。在室温下向此溶液中添加(4-甲酰基苯基)硼酸(0.18g，1.72mmol)和K2CO3(0.25g，1.85mmol)并且在110℃下再搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，10:90)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.11g，24.80％)。LCMS:326.1(M+H)+。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((1-氨基-3,3-二氟环丁基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-35)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入(3,3-二氟-1-(4-甲酰基苯甲基)环丁基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-35-3)(0.11g，0.33mmol)、(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.1g，0.27mmol)、MgSO4(0.2g，1.69mmol)和DCM(3mL)。向此溶液中添加HClO4(0.16g，1.69mmol)并在室温下再搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart Prep C18-S，250X20mm S-5μm，12nm，流动相：A＝含0.05％氨的水，B＝乙腈；A:B，58:42)纯化粗物质，停留时间18.36分钟，得到呈白色固体状的标题化合物的R-异构体(Fr-1)(0.030g，15.58％)；LCMS:585.4(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:5.48(s,1H,缩醛-H),5.07(d,J＝5.2Hz,1H,C16H)。
合成INX-A1
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3,3-二氟-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环丁基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A1- 1)
程序：
在室温下向10mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.20g，0.41mmol)、HATU(0.24g，0.64mmol)、DMF(2mL)和DIPEA(0.11g，0.82mmol)。向此溶液中添加(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3,3-二氟-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环丁基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-SM-35)(0.25g，0.41mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到粗产物。通过反相柱色谱法(乙腈/水：50:50)纯化粗物质，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.24g，52.03％)。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3,3-二氟-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环丁基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A1-2)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3,3-二氟-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环丁基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A1-1)(0.2g，0.12mmol)和THF(3mL)。在室温下向此溶液中添加二乙胺(0.3g，0.24mmol)并搅拌3小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物并且与乙醚和戊烷一起湿磨，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.13g，68.74％)LCMS:827.6(M+1)。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3,3-二氟-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环丁基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A1-3)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3,3-二氟-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环丁基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A1-2)(0.1g，0.12mmol)和DCM(4mL)。在室温下向此溶液中滴加Na2CO3(0.048g，0.24mmol)于水(1mL)中的溶液和溴乙酰溴(0.005g，0.48mmol)并搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈/水：50:50)纯化粗物质，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.10g，67.10％)。LCMS:946.8,848.9(M和M+2)。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3,3-二氟-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环丁基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A1-1)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入含(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3,3-二氟-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环丁基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A1-3)(0.10g，0.01mmol)的DCM(2mL)。在室温下向此溶液中添加TFA(0.24g，2.10mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.090g，95.67％)。LCMS:890.90,893.0(M和M+2)。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-V)
反应方案
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX- V-1)
程序：
在室温下向10mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.25g，0.41mmol)和HATU(0.20g，0.41mmol)、DMF(2mL)和DIPEA(0.10g，0.82mmol)。向此溶液中添加(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-32)(0.25g，0.41mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈/水：50:50)纯化粗物质，得到呈淡黄色固体状的标题化合物。其立即用于下一步。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-V-2)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-V-1)(0.2g，0.19mmol)和THF(2mL)。在室温下向此溶液中添加二乙胺(0.14g，1.9mmol)并在室温下搅拌3小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物并且与乙醚一起湿磨，得到黄色固体(0.15g，90.12％)。LCMS:831.9(M+H)+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-V-3)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入含(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-V-2)(0.15g，0.28mmol)的DCM(3mL)。在室温下向此溶液中滴加Na2CO3(0.11g，0.57mmol)于水(1mL)中的溶液，继而滴加溴乙酰溴(0.037g，0.18mmol)并搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈/水：50:50)纯化粗物质，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.070g，40％)。LCMS:950.9,952.9(M和M+2)。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-V)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-V-3)(0.070g，0.07mmol)和DCM(2mL)。向此溶液中添加TFA(0.055g，0.71mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物，得到呈浅黄色固体状的粗产物。通过制备型HPLC(柱：Xbridge Prep，C18，OBD 19x250mm，5μm；流动相：A＝含0.1％FA的水，B＝乙腈；A:B，58:42)纯化粗物质，得到R-异构体，其在停留时间16.92分钟时洗脱得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.004g，11.83％)。LCMS:895.1和897.1(M和M+2)；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:5.44(s,1H,缩醛-H),5.05(d,J＝4.8Hz,1H,C16H)。
合成(S)-6-氨基-2-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-N-(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)己酰胺(INX-W)
反应方案
合成N2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基)-N6-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸苯甲酯(INX-W-1)
程序：
在室温下向250mL单颈圆底烧瓶中装入(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酸(8.8g，29.62mmol)、HATU(16.9g，44.67mmol)、DMF(100mL)和DIPEA(16g，89.28mmol)。向此溶液中添加N6-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸苯甲酯(10g，29.76mmol)并在室温下搅拌4小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过柱色谱法(乙酸乙酯:己烷，30:70)纯化粗物质，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(15g，81.96％)。LCMS:616.6(M+H)+。
合成N2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基)-N6-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸(INX-W-2)
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入N2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基)-N6-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸苯甲酯(INX-W-1)(5g，8.12mmol)和MeOH(50mL)。在室温下向此溶液中添加10％Pd/C(2.5g)并用氢气吹扫2小时。TLC指示反应完成后，经硅藻土过滤反应混合物并在真空下蒸发滤液。通过反相柱色谱法(乙腈:水，50:50)纯化粗物质，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.5g，23.43％)。LCMS:426.2(M+1-Boc)。
合成(2-(((S)-6-((叔丁氧羰基)氨基)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(INX-W-3)
程序：
在室温下向50mL单颈圆底烧瓶中装入N2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基)-N6-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸(INX-W-2)(0.5g，0.95mmol)、HATU(0.54g，1.42mmol)、DMF(25mL)和DIPEA(0.5mL，2.85mmol)。向此溶液中添加(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-3)(0.53g，0.95mmol)并在室温下搅拌4小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到粗产物。通过反相柱色谱法(乙腈:水，70:30)纯化粗物质，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.45g，44.32％)。LCMS:1067.7(M+H)+。
合成((S)-5-(2-氨基乙酰胺基)-6-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-W-4)
程序：
向50mL单颈圆底烧瓶中装入(2-(((S)-6-((叔丁氧羰基)氨基)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(INX-W-3)(0.45g，0.42mmol)和THF(20mL)。向此溶液中添加二乙胺(0.30g，4.21mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下浓缩反应混合物。通过与乙醚-己烷一起湿磨来纯化粗物质并在真空下干燥，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.35g，98.23％)。LCMS:845.6(M+H)+。
合成((S)-5-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-6-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-W-5)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入((S)-5-(2-氨基乙酰胺基)-6-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-W-4)(0.35g，0.41mmol)和DCM(5mL)。在室温下向此溶液中添加含Na2CO3(0.070g，0.82mmol)的水(1mL)，继而添加溴乙酰溴(0.1g，0.49mmol)并搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈/水，50:50)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.330g，82.48％)。LCMS:967.5(M+H)+。
合成(S)-6-氨基-2-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-N-(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)己酰胺(INX-W)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入((S)-5-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-6-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-W-5)(0.10g，0103mmol)和DCM(5mL)。向此溶液中添加TFA(0.059g，0.52mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE Prep C18 OBD，19x250mm，5μm，流动相：A＝含0.1％FA的水，B＝ACN:MeOH:IPA(65:25:10)；A:B，62:38)纯化粗物质INX-W；停留时间19.06分钟，得到呈白色固体状的R-异构体(0.008g，8.93％)；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:5.47(s,1H,缩醛-H),5.07(d,J＝4.8Hz,1H,C16H)。
合成(S)-2-(2-溴乙酰胺基)-N-((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)丙酰胺(INX-R)
反应方案
合成(叔丁氧羰基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酸甲酯(INX-R-1)
程序：
在氮气下向30mL玻璃小瓶中装入(叔丁氧羰基)-L-丙氨酸(5.0g，26.45mmol)、DIPEA(1.36mL，79.36mmol)和DMF(50mL)。在0℃下向此溶液中添加HATU(15.07g，39.67mmol)，继而添加L-丙氨酸甲酯盐酸盐(3.69g，26.45mmol)。在室温下搅拌反应混合物30分钟。TLC指示反应完成后，用冰冷水淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。将粗物质与己烷和DCM一起湿磨，得到呈白色固体状的标题化合物(5.5g，56.20％)。LCMS275.3(M+H)+。
合成(叔丁氧羰基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酸(INX-R2)
/>
程序：
向100mL玻璃密封小瓶中装入(叔丁氧羰基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酸酯(INX-R-1)(4.5g，16.42mmol)和THF-水(9:1)(55mL)。向此溶液中添加LiOH.H2O(20.69g，49.26mmol)并在60℃下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。将粗物质与己烷和DCM一起湿磨，得到呈白色固体状的标题化合物(4.0g，93.70％)。LCMS:261.20(M+H)+。
合成((S)-1-(((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-R- 3)
程序：
在氮气下向30mL玻璃小瓶中装入含(叔丁氧羰基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酸(INX-R-2)(0.33g，1.26mmol)的DMF(5mL)和DIPEA(0.65mL，3.78mmol)。在0℃下向此溶液中添加HATU(0.96g，2.52mmol)，继而添加(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-3)(0.70g，1.26mmol)。在室温下搅拌所得反应混合物1小时。TLC指示反应完成后，用冰冷水淬灭反应混合物。过滤固体并在真空下干燥。通过硅胶柱色谱法(甲醇/DCM：6:94)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.35g，34.42％)。LCMS:802.6(M+H)+。
合成(S)-2-氨基-N-((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)丙酰胺(INX-R-4)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入((S)-1-(((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-R-3)(0.35g，0.44mmol)和DCM(3mL)。向此溶液中添加含2M HCl的乙醚(3ml)并在室温下再搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物并与乙醚和正戊烷一起湿磨，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.3g，97.92％)。LCMS:702.5(M+H)+。
合成(S)-2-(2-溴乙酰胺基)-N-((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)丙酰胺(INX-R)
程序：
在氮气下向10mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-2-氨基-N-((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)丙酰胺(INX-R-4)(0.30g，0.43mmol)和DCM:水(8:2)(3.6mL)。向此溶液中添加Na2CO3(0.91g，0.855mmol)，继而添加溴乙酰溴(0.87g，0.43mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过制备型HPLC(柱：Xbridge Prep，C18，OBD 19x250mm，5μm，流动相：A＝含0.05％NH3的水，B＝乙腈；A:B，65:35)纯化粗标题化合物INX-R，停留时间24.10分钟，得到呈白色固体状的R-异构体(0.030g，8.53％)；LCMS:822.5,824.4(M和M+2)；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:5.46(s,1H,缩醛-H),5.05(d,J＝5.2Hz,1H,C16H)。
合成(S)-2-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-N1-(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)丁二酰胺(INX-X)
反应方案
合成(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基-L-天冬酰胺酸甲基叔丁酯(INX-X- 1)
程序：
在氮气下向100mL螺旋盖玻璃小瓶中装入(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酸(5.0g，16.83mmol)、DIPEA(8.68mL，50.50mmol)和DMF(50mL)。在0℃下向此溶液中添加HATU(7.67g，20.19mmol)，继而添加L-天冬酰胺酸叔丁酯(3.79g，20.19mmol)。在室温下搅拌反应混合物1小时。TLC指示反应完成后，用冰冷水淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。将粗物质与己烷和DCM一起湿磨，得到呈白色固体状的标题化合物(7.5g，95.41％)。LCMS412.83(M-56)。
合成(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基-L-天冬酰胺(INX-X2)
程序：
向250mL单颈圆底烧瓶中装入(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基-L-天冬酰胺酸甲基叔丁酯(INX-X-1)(2.0g，4.28mmol)和DCM(50mL)。向此溶液中添加TFA(40ml)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物并与乙醚和DCM一起湿磨，得到呈白色固体状的标题化合物(1.5g，85.22％)。LCMS:412.8(M+H)+。
合成(2-(((S)-4-氨基-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-1,4-二氧代丁-2-基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(INX-X-3)
程序：
在氮气下向30mL玻璃小瓶中装入(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基-L-天冬酰胺(INX-X-2)(0.4g，0.973mmol)、DMF(5mL)、HATU(0.96g，2.52mmol)和(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-3)(0.70g，1.26mmol)。向此溶液中添加DIPEA(0.50mL，2.91mmol)并在室温下搅拌30分钟。TLC指示反应完成后，用冰冷水淬灭反应混合物。过滤固体并在真空下干燥。将粗物质与乙醚和正戊烷一起湿磨，得到呈白色固体状的标题化合物(0.6g，64.72％)。LCMS:954.24(M+H)+。
合成(S)-2-(2-氨基乙酰胺基)-N1-(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)丁二酰胺(INX-X-4)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入(2-(((S)-4-氨基-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-1,4-二氧代丁-2-基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(INX-X-3)(0.30g，0.314mmol)和THF(5mL)。向此溶液中添加DEA(0.48mL，4.72mmol)并在室温下再搅拌4小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物并与己烷一起湿磨，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.20g，96.06％)。LCMS:731.0(M+H)+。
合成(S)-2-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-N1-(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)丁二酰胺(INX-X)
程序：
在氮气下向25mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-2-(2-氨基乙酰胺基)-N1-(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)丁二酰胺(INX-X-4)(0.20g，0.273mmol)和THF-水(8:2)(3.6mL)。向此反应混合物中添加Na2CO3(0.58g，0.55mmol)，继而添加溴乙酰溴(0.066g，0.33mmol)并在室温下搅拌4小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart Prep C18-S，250X20mm S-5μm，12nm，流动相：A＝含0.05％NH3的水，B＝乙腈；A:B 62:38)纯化粗标题化合物INX-X，停留时间17.79分钟，得到呈白色固体状的R-异构体(0.030g，8.53％)；LCMS:852.7(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:5.46(s,1H,缩醛-H),5.06(d,J＝5.2Hz,1H,C16H)。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-Y)
反应方案
/>
合成(6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-Y-1)
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入(8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-9-氟-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(去炎松)(1.0g，2.53mmol)和(3-(4-甲酰基苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-3-5)(0.76g，2.53mmol)和DCM(10mL)。向此溶液中添加MgSO4(1.51g，12.65mmol)并在室温下搅拌5分钟。将HClO4(1.2g，12.65mmol)添加至反应混合物中并在室温下再搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈/水；60:40)纯化粗物质，得到呈浅黄色的标题化合物(0.5g，34.14％)。LCMS:579.4(M+H)+
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-Y-2)
程序：
在室温下向50mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.42g，0.87mmol)、HATU(0.49g，1.30mmol)、DMF(4mL)和DIPEA(0.22g，1.74mmol)。在室温下向此溶液中添加(6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-Y-1)(0.50g，0.97mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈/水，50:50)纯化粗物质，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(0.65g，71.42％)。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-Y-3)
程序：
向50mL单颈圆底烧瓶中装入含(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-Y-2)(0.65g，0.62mmol)的THF(4mL)。在室温下向此溶液中添加二乙胺(0.40g，64.24mmol)并在室温下搅拌3小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物并与乙醚一起湿磨，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.42g，84.82％)。LCMS:821.4(M+H)+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-Y-4)
程序：
向50mL单颈圆底烧瓶中装入含(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-Y-3)(0.42g，0.51mmol)的DCM(10mL)。在室温下向此溶液中添加溶解于水(1ml)中的Na2CO3(0.11g，1.02mmol)，继而添加溴乙酰溴(0.10g，0.51mmol)并搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈:水，60:40)纯化粗物质，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.20g，41.45％)。LCMS:942.0(M+H)+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-Y)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-Y-4)(0.20g，0.20mmol)和DCM(2mL)。向此溶液中添加TFA(0.11g，1.01mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱：Xbridge Prep，C18，30x250mm，5μm，流动相：A＝含0.1％甲酸的水，B＝ACN:MeOH，50:50；A:B，47:53)纯化粗INX-Y；停留时间18.83分钟，得到呈白色固体状的R-异构体(Fr-1)(0.040g，22.37％)。LCMS:885.8(M+H)+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6,关键质子分配):δ:5.48(s,1H,缩醛-H),5.06(d,J＝4.8Hz,1H,C16H)。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-S)
反应方案
合成(6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-二氟-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(INX-S-1)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a,10,10-四甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(醋酸氟轻松)(1.0g)，并且添加50％HBF4水溶液(20ml)，接着在室温下再搅拌16小时。TLC指示反应完成后，过滤固体，用水洗涤并在真空下干燥，得到INX-S-1(1.0g，定量)。LCMS:413.3(M+H)+。
合成((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-S-2)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-二氟-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(INX-S-1)(1.0g，2.42mmol)和(3-(4-甲酰基苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(0.80g，2.66mmol)和DCM(10mL)。向此溶液中添加MgSO4(1.42g，12.14mmol)并在室温下再搅拌5分钟。添加HClO4(1.2g，12.14mmol)并在室温下再搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈/水，60:40)纯化粗物质，得到呈浅黄色的标题化合物(0.61g，42.28％)。LCMS:596.4(M+H)+。
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-S-3)
程序：
在室温下向50mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.45g，0.93mmol)、HATU(0.53g，1.40mmol)、DMF(4mL)和DIPEA(0.23g，1.86mmol)。在室温下向此溶液中添加((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-S-2)(0.61g，1.02mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈/水，50:50)纯化粗物质，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(0.40g，56.19％)。LCMS:1061.5(M+H)+。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-S-4)
程序：
向50mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-S3)(0.41g，0.39mmol)和THF(4mL)。在室温下向此溶液中添加二乙胺(0.28g，3.91mmol)并搅拌3小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.26g，82.24％)。LCMS:838.5(M+H)+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-S- 5)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入含(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-S4)(0.22g，0.26mmol)的DCM(2mL)。在室温下向此溶液中添加含Na2CO3(0.10g，0.53mmol)的水(1mL)，继而添加溴乙酰溴(0.030g，0.28mmol)并搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈/水：60:40)纯化粗物质，得到呈浅黄色的标题化合物(0.1g，39.72％)。LCMS:960.4(M+H)+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-S)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入含(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-S-5)(0.10g，0.10mmol)的DCM(2mL)。在室温下向此溶液中添加TFA(0.059g，0.52mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下直接蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE Prep C18 OBD，19x250mm，5μm，流动相：A＝含0.1％甲酸的水，B＝乙腈；A:B，65:35)纯化粗INX-S；停留时间17.7分钟，得到呈白色固体状的R-异构体(0.011g，11.68％)。LCMS:902.3,904.3(M和M+2)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,关键质子分配):δ:5.45(s,1H,缩醛-H),4.95(d,J＝4.8Hz,1H,C16H)。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-T)
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-T-1)
程序：
向10mL小瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-P-5)(0.20g，0.19mmol)和DMF(1mL)。在室温下向此溶液中添加1H-四唑(0.137g，1.950mmol)和(tBuO)2PNEt2(1.3g，4.68mmol)并在室温下搅拌79小时。TLC指示反应完成后，将过氧化氢(1.3g，4.68mmol)添加至溶液中。通过反相柱色谱法(乙腈:水，80:20)纯化粗物质，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(0.070g，29.47％)。其立即用于下一步。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-T-2)
程序：
向10mL玻璃小瓶中装入含(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-T-1)(0.070g，0.057mmol)的THF(1mL)。在室温下向此溶液中添加二乙胺(0.042g，0.57mmol)并在室温下搅拌16小时。TLC指示反应完成后，浓缩反应混合物。通过与乙醚和己烷一起湿磨来纯化粗物质，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.30g，52.44％)。其立即用于下一步。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-T-3)
程序：
向10mL玻璃小瓶中装入含(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-T-2)(0.030g，0.030mmol)的DCM(1mL)。向此溶液中添加Na2CO3(0.006g，0.060mmol)于水(0.1mL)中的溶液和溴乙酰溴(0.006g，0.030mmol)，在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈灰白色固体状的粗产物(0.040g，粗物质)
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-T)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入含(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-T-3)(0.001g，0.0089mmol)的DCM(1mL)。在室温下向此溶液中添加TFA(0.005g，0.043mmol)和催化性三异丙基硅烷并搅拌20分钟。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.006g，71％)。LCMS:946.2,948.2(M和M+2)。
合成INX-A
反应方案
程序：
向化合物INX-A-1(3.0g，7.64mmol，1.0当量)于二氯甲烷/乙腈(500mL/100mL)中的溶液中添加环酐(3.0g，30.58mmol，4.0当量)和DMAP(1.8g，15.29mmol，2.0当量)。在室温下搅拌反应混合物2小时并且在减压下浓缩混合物。通过柱色谱法在用DCM/MeOH(10％至15％)+0.1％AcOH洗脱的硅胶上纯化残余物，得到呈白色固体状的化合物INX-A-2(3.2g，85％)。TLC:DCM/MeOH＝10:1。Rf(化合物1)＝0.45。Rf(化合物2)＝0.30。LC-MS:(M+H)+＝394.40
合成INX-A
程序：
向INX-A-2(220mg，0.45mmol)和INX-A-3(230mg，0.67mmol)于NMP(4mL)中的溶液中添加HATU(342mg，0.90mmol)和DIPEA(232mg，1.8mmol)。在室温下搅拌混合物5小时。通过制备型HPLC(ACN/H2O，0.1％HCOOH)纯化混合物，得到接头INX-A(122mg，39％)。LCMS:[M+H]+＝703；1H NMR(CDCl3,300MHz)(δ,ppm)7.20(d,J＝9.0Hz,1H),6.73(s,2H),6.52(br,1H),6.33(d,J＝9.0Hz,1H),6.11(s,1H),4.91(q,J＝17.3Hz,2H),4.35(d＝9.3Hz,1H),3.76-3.42(m,10H),3.03(m,1H),2.79(m,2H),2.65-2.56(m,3H),2.42-2.06(m,7H),1.84-1.63(m,3H),1.22(m,1H),1.02(s,3H),0.90(d,J＝7.2Hz,3H)。19F NMR(CDCl3)(δ,ppm)-166.09(q)。
除非另有规定，否则下文所述的所有反应均在干燥氮气气氛下进行。所有关键化学品均按原样使用。所有其他可商购的材料，例如溶剂、试剂和催化剂无需进一步纯化即使用。通过薄层色谱法(TLC)使用预涂的Merck硅胶60F254铝片(Merck,Germany)监测反应。使用UV光、茚三酮喷雾和碘蒸气实现TLC板的可视化。在Bruker Advancer-III HD FT-NMR分光光度计(Bruker,USA)上记录1H NMR(400 MHz)并且人工解释。使用230-400目、100-200目和60-120目硅胶或C18二氧化硅作为固定相并且使用适当流动相进行柱色谱分离。
以下为用于分析最终靶标的LCMS方法。
LCMS方法-1
柱详情：X-BRIDGE BEH 2.1*50mm 2.5μm
机器详情：-配备有PDA和Acquity SQ检测器的Water Acquity UPLC-H级，柱温：35℃，自动进样器温度：5℃，流动相A：含0.1％甲酸的Milli Q水(pH＝2.70)，流动相B：含0.1％甲酸的Milli Q水:乙腈(10:90)。
流动相梯度详情：T＝0分钟(97％A，3％B)流量：0.8mL/min；T＝0.75分钟(97％A，3％B)流量：0.8mL/min；梯度至T＝2.7分钟(2％A，98％B)流量：0.8mL/min；梯度至T＝3分钟(0％A，100％B)流量：1mL/min；T＝3.5分钟(0％A，100％B)流量：1mL/min；梯度至T＝3.51分钟(97％A，3％B)流量：0.8mL/min；T＝4分钟(97％A，3％B)运行结束，流速：0.8mL/min，流速：0.8mL/min，运行时间：4分钟，UV检测方法：PDA。
质量参数：
探针：ESI，电离模式：正和负，锥电压：30V和10V，毛细管电压：3.0KV，提取器电压：1V，Rf透镜：0.1V，源温度：120℃，去溶剂化温度：400℃。锥气体流量：100L/h，去溶剂化气体流量：800L/h。
LCMS方法-2
柱详情：X-BRIDGE BEH 2.1*50mm 2.5μm
机器详情：-配备有PDA并且附接有QDA检测器的Waters Acquity超高效LC，柱温：35℃，自动进样器温度：5℃，流动相A：含0.1％甲酸的Milli Q水(pH＝2.70)，流动相B：含0.1％甲酸的Milli Q水:乙腈(10:90)。流动相梯度详情：T＝0分钟(97％A，3％B)流量：0.8mL/min；T＝0.75分钟(97％A，3％B)流量：0.8mL/min；梯度至T＝2.7分钟(2％A，98％B)流量：0.8mL/min；梯度至T＝3分钟(0％A，100％B)流量：1mL/min；T＝3.5分钟(0％A，100％B)流量：1mL/min；梯度至T＝3.51分钟(97％A，3％B)流量：0.8mL/min；T＝4分钟(97％A，3％B)运行结束，流速：0.8mL/min，运行时间：4分钟，UV检测方法：PDA。
质量参数：探针：ESI，电离模式：正和负，锥电压：30V和10V，毛细管电压：0.8KV，提取器电压：1V，Rf透镜：0.1V，源温度：120℃，探针温度：600℃，锥气体流量：默认，去溶剂化气体流量：默认。
LCMS方法-3
柱详情：Xtimate C18 4.6*50mm 5μm
机器详情：-与PDA连接并且配备有SQ检测器的Waters Acquity超高效LC，柱温：35℃，自动进样器温度：5℃，流动相A：含5mM碳酸氢铵(pH＝7.35)的Milli Q水，流动相B：乙腈。流动相梯度详情：T＝0分钟(97％A，3％B)流速＝1.0ml/min；T＝0.20分钟(97％A，3％B)流速＝1.0ml/min；梯度至T＝2.70分钟(20％A，80％B)流速＝1.0ml/min；梯度至T＝3.0分钟(0％A，100％B)流速＝1.2ml/min；T＝3.50分钟(0％A，100％B)流速＝1.2ml/min；T＝3.51分钟(97％A，3％B)流速＝1.0ml/min；T＝4.0分钟(97％A，3％B)运行结束，流速＝1.0ml/min，运行时间：4分钟，UV检测方法：PDA。
质量参数：探针：ESI，电离模式：正和负，锥电压：30和10V，毛细管电压：3.0KV，提取器电压：2V，Rf透镜：0.1V，源温度：120℃，探针温度：400℃，锥气体流量：100L/h，去溶剂化气体流量：800L/h。
LCMS方法-4
柱详情：Xtimate C18 4.6*150mm 5μm
机器详情：配备有Waters微质量ZQ检测器的Waters 996光电二极管阵列检测器，柱温：35℃，自动进样器温度：15℃，流动相A：含5mM乙酸铵和0.1％甲酸(pH＝3.50)的MilliQ水，流动相B：甲醇
流动相梯度详情：T＝0分钟(90％A，10％B)；T＝7.0分钟(10％A，90％B)；梯度至T＝9.0分钟(0％A，100％B)；梯度至T＝14.00分钟(0％A，100％B)；T＝14.01分钟(90％A，10％B)；T＝17分钟(90％A，10％B)运行结束，流速：1.0mL/min，运行时间：17分钟，UV检测方法：PDA。
质量参数：
探针：ESI，电离模式：正和负，锥电压：30和10V，毛细管电压：3.0KV，提取器电压：2V，Rf透镜：0.1V，源温度：120℃，探针温度：400℃，锥气体流量：100L/h，去溶剂化气体流量：800L/h。
LCMS方法-5
柱详情：Sunfire C18 150x4.6mm，3.5μm
机器详情：Agilent 1260Infinity-II和G6125C(LC/MSD)质量检测器，柱温：35℃，自动进样器温度：15℃，流动相A：含5mM乙酸铵和0.1％甲酸(pH＝3.50)的Milli Q水，流动相B：甲醇
流动相梯度详情：T＝0分钟(90％A，10％B)；T＝7.0分钟(10％A，90％B)；梯度至T＝9.0分钟(0％A，100％B)；梯度至T＝14.00分钟(0％A，100％B)；T＝14.01分钟(90％A，10％B)；T＝17分钟(90％A，10％B)运行结束，流速：1.0mL/min，运行时间：17分钟，UV检测方法：PDA。
质量参数：
探针：MMI，电离模式：(ESI)正和负，片段电压：30V和70V，毛细管电压：3000V，源气体温度：325℃，蒸发器温度：225℃，气体流量：12L/min，雾化器：50。
HPLC方法-1
柱详情：Sunfire C18(150mm x4.6mm)，3.5μm
机器详情：具有PDA检测器的Agilent Technologies.1260系列Infinity-II，柱温：35℃，自动进样器温度：15℃，流动相A：含0.05％三氟乙酸的Milli Q水(pH＝2.2)，流动相B：乙腈。
流动相梯度详情：T＝0分钟(90％A，10％B)流量：1.0mL/min；T＝7.0分钟(10％A，90％B)流量：1.0mL/min；梯度至T＝9.0分钟(0％A，100％B)流量：1.0mL/min；梯度至T＝14分钟(0％A，100％B)流量：1.0mL/min；T＝14.01分钟(90％A，10％B)流量：1mL/min；T＝17分钟(90％A，10％B)运行结束流量：1.0mL/min，流速：1.0mL/min，运行时间：17分钟，UV检测方法：PDA。
HPLC方法-2
柱详情：Atlantis C18(150mm x4.6mm)，5.0μm或Welch C18(150mm x4.6mm)，5.0μm
机器详情：-具有2998PDA检测器的Waters Alliance e2695，柱温：35℃，自动进样器温度：15℃，流动相A：含0.1％氨的Milli Q水(pH＝10.5)，流动相B：乙腈。流动相梯度详情：T＝0分钟(90％A，10％B)流量：1.0mL/min；T＝7.0分钟(10％A，90％B)流量：1.0mL/min；梯度至T＝9.0分钟(0％A，100％B)流量：1.0mL/min；梯度至T＝14分钟(0％A，100％B)流量：1.0mL/min；T＝14.01分钟(90％A，10％B)流量：1mL/min；T＝17分钟(90％A，10％B)运行结束流量：1.0mL/min，流速：1.0mL/min，运行时间：17分钟，UV检测方法：PDA。
HPLC详情：具有2998PDA检测器的Waters Alliance e2695；柱详情：Atlantis C18(150mm x4.6mm)，5.0μm或Welch C18(150mm x4.6mm)，5.0μm；流动相A：含0.1％氨的MilliQ水(pH＝10.5)，流动相B：乙腈；流速：1.0mL/min，运行时间：17分钟
HPLC方法-3
柱详情：Agilent 1260Infinity-II和G6125C(LC/MSD)质量检测器，柱温：35℃，自动进样器温度：15℃，流动相A：5mM乙酸铵+含0.1％甲酸的水(pH＝3.5)流动相B：MeOH。流动相梯度详情：T＝0分钟(90％A，10％B)；T＝7.0分钟(10％A，90％B)；梯度至T＝9分钟(0％A，100％B)；梯度至T＝14分钟(0％A，100％B)；梯度至T＝14.1分钟(90％A，10％B)；T＝17.0分钟(90％A，10％B)。流速：1mL/min，运行时间：17分钟。UV检测方法：PDA。质量参数：探针：MMI，电离模式：(ESI)正和负，片段电压：70V和30V，毛细管电压：3000V，源气体温度：325℃，蒸发器温度：225℃，气体流量：12L/min，雾化器：50。
合成(6-(4-甲酰基苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-43-1)
合成(6-(4-甲酰基苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-43-1)
程序：
在氮气下向10mL玻璃小瓶中装入含(6-羟基螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(0.050g，0.21mmol)和4-羟基苯甲醛(0.053g，0.43mmol)的THF(0.7mL)。向此溶液中添加三苯基膦(0.086g，0.32mmol)和DIAD(0.066g，0.32mmol)并在65℃下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，80:20)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.025g，35.9％)。LCMS:332.2[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMOS-d6)δ:9.84(s,1H),7.82(d,J＝8.8Hz,2H),7.10(br s,1H),7.01(d,J＝8.8Hz,2H),4.72(五重峰,1H),3.90-3.80(m,1H),2.60-2.40(m,4H),2.25-1.90(m,4H),1.35(s,9H)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)氧基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-43)
程序：
向10mL玻璃小瓶中装入含(6-(4-甲酰基苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-43-1)(0.1g，0.30mmol)和(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.113g，0.30mmol)的DCM(2mL)。向此溶液中添加MgSO4(0.181g，1.50mmol)，继而添加HClO4(0.459g，4.53mmol)，并在室温下再搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart Prep C18(250X20)mm，5μm，流动相：A＝含0.1％FA的水，B＝乙腈+10％MTBE；A:B＝80:20)，停留时间17.19分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.017g，8.91％)。LCMS:590.4[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ7.46(d,J＝10.0Hz,1H),7.34(d,J＝8.4Hz,2H),6.81(d,J＝8.4Hz,2H),6.26(d,J＝10.0Hz,1H),6.04(s,1H),5.41(s,缩醛-H,1H),5.04(d,J＝4.8Hz,C16H,1H),4.70-4.25(m,4H),3.67-3.63(m,1H),2.70-1.60(m,17H),1.51(s,3H),1.20-1.03(m,2H),0.99(s,3H)。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A4)
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX- A4-1)
程序：
在氮气下向50mL圆底烧瓶中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.8g，1.65mmol)、DIPEA(0.85mL，4.9mmol)和DMF(8mL)。在0℃下向此溶液中添加HATU(1.26g，3.31mmol)和(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)氧基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-43)(1.07g，1.82mmol)。在室温下搅拌反应混合物1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至冰冷水中，并且过滤沉淀固体并在真空下干燥。将粗固体与乙醚/正戊烷一起湿磨，得到呈白色固体状的标题化合物(1.3g，74.38％)。LCMS:1054.40[M+H]+。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A4-2)
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A4-1)(1.3g，1.23mmol)和THF(15mL)。在室温下向此溶液中添加DEA(2.5ml，23.97mmol)并搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物并与乙醚和DCM一起湿磨，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.9g，88.23％)。LCMS:832.39[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A4-3)
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A4-2)(0.8g，0.961mmol)和DCM-水(8:2，12mL)。向此溶液中添加Na2CO3(0.30g，2.88mmol)，继而添加溴乙酰溴(0.23g，1.15mmol)并在室温下搅拌4小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶色谱法(MeOH/DCM，5:95)纯化粗物质，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.4g，43.65％)。LCMS:954.61[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A4)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A4-3)(0.40g，0.420mmol)和DCM(10mL)。向此溶液中添加TFA(4mL)并在室温下再搅拌4小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物并与己烷一起湿磨。通过制备型HPLC(柱：Xbridge Prep，C18，OBD 19x250mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈，A:B＝72:28)纯化粗物质，停留时间16.39分钟，得到呈白色固体状的标题化合物(0.006g，1.59％)；LCMS:896.2[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ7.48(d,J＝10.0Hz,1H),7.36(d,J＝8.4Hz,2H),6.83(d,J＝8.4Hz,2H),6.29(d,J＝10.0Hz,1H),6.06(s,1H),5.43(s,缩醛-H,1H),5.00-3.50(m,11H),2.90-1.60(m,21H),1.53(s,3H),1.20-1.03(m,2H),0.91(s,3H)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)氧基)-2-氟苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-44)
合成(6-(3-氟-4-甲酰基苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-44- 1)
程序：
在氮气下向35mL玻璃小瓶中装入(6-羟基螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(0.50g，2.19mmol)、2-氟-4-羟基苯甲醛(0.61g，4.35mmol)、三苯基膦(0.86g，3.29mmol)和THF(7mL)。向此溶液中添加DIAD(0.66g，3.29mmol)并且在65℃下加热反应混合物2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过正相柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，20:80)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.40g，51.97％)。LCMS:350.1[M+H]+
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)氧基)-2-氟苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-44)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入含(6-(3-氟-4-甲酰基苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-44-1)(0.20g，0.57mmol)和(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(0.215g，0.57mmol)的DCM(5mL)。向此溶液中添加MgSO4(0.34g，2.86mmol)和HClO4(0.57g，5.72mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应混合物并在真空下浓缩。接着将粗物质与冷水一起湿磨，并且过滤沉淀固体并在真空下干燥。通过反相柱色谱法(水:乙腈，60:40)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.020g，5.75％)。LCMS:608.4[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:7.46-7.42(m,2H),6.67-6.55(m,2H),6.25(d,J＝10Hz,1H),6.27(s,1H),5.64(s,缩醛-H,1H),5.04-5.03(d,J＝4.8Hz,C16H,1H),4.63-4.29(m,4H),3.64-3.60(m,1H),2.70-1.73(m,17H),1.50(s,3H),1.30-1.12(m,2H),0.92(s,3H)。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(3-氟-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A5)
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(3-氟-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX- A5-1)
程序：
在氮气下向50mL圆底烧瓶中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(1.0g，2.07mmol)和DMF(10mL)并在0℃下冷却。在0℃下向此溶液中添加HATU(1.57g，4.14mmol)、(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)氧基)-2-氟苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-44)(1.25g，2.07mmol)，接着添加DIPEA(1.0mL，6.22mmol)。在室温下搅拌反应混合物1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至冰冷水中。过滤所得固体并在真空下干燥。将固体与乙醚和正戊烷一起湿磨，得到呈白色固体状的标题化合物(1.3g，59.09％)。LCMS:1072.8[M+H]+。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((6-(3-氟-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A5-2)
程序：
向50mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(3-氟-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A5-1)(1.3g，1.21mmol)和THF(10mL)。向此溶液中添加DEA(1.8ml，17.26mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物并与乙醚和DCM一起湿磨，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.9g，87.37％)。LCMS:850.5[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(3-氟-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A5-3)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((6-(3-氟-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A5-2)(0.9g，1.05mmol)和DCM-水(8:2，12mL)。向此溶液中添加Na2CO3(0.33g，3.17mmol)，继而添加溴乙酰溴(0.25g，1.27mmol)并在室温下搅拌4小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶色谱法(MeOH/DCM，5:95)纯化粗物质，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.5g，49.01％)。LCMS:C48H62 79BrFN3O12计算值(970.35)，实验值970.40[M+H]+；
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(3-氟-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A5)
/>
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(3-氟-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A5-3)(0.2g，0.0.205mmol)和DCM(7mL)。向此溶液中添加TFA(3mL)并在室温下搅拌4小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物并与己烷一起湿磨。通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE Prep C18OBD，19x250mm，5μm12nm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈，A:B＝45:55，停留时间12分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.006g，3.18％)；
LCMS:C44H54 79BrFN3O12计算值(914.29)，实验值914.5[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ7.47-7.42(m,2H),6.68(dd,J＝8.4和2Hz,1H),6.59(dd,J＝12.4和2.4Hz,1H),6.27(J＝10.0和2.0Hz,1H),6.04(s,1H),5.65(s,1H,缩醛-H),5.03(d,J＝5.2Hz,1H,C16H),4.64-4.55(m,2H),4.44-4.43(m,1H),4.34-4.30(m,2H),4.22-4.16(m,1H),3.95(d,2H),3.92-3.90(m,2H),2.80-1.80(m,21H),1.51(s,3H),1.25-1.15(m,2H),1.00(s,3H)。
合成(INX-J2)
合成(3-(4-甲酰基苯甲基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(INX-J2-A1)
程序：
向50ml单颈圆底烧瓶中装入4-(溴甲基)苯甲醛(0.5g，2.5mmol)和THF(5ml)。向此溶液中添加(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(1.2g,3.7mmol)和碳酸钾(0.8g，6.2mmol)并用N2吹扫15分钟。将PdCl2.dppf-DCM(0.3g，0.15mmol)添加至反应混合物中并在80℃下搅拌16小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯:己烷，5:95)纯化粗物质，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(0.32g，40.95％)。LCMS:312.4[M+H]+。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-氨基苯甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-J2-R)；和
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-氨基苯甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-J2-S)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(3-(4-甲酰基苯甲基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(INX-J2-A1)(0.30g，0.96mmol)、(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(16α-羟基泼尼松龙)(0.36g，0.96mmol)和DCM(10mL)。向此溶液中添加MgSO4(0.57g，4.8mmol)并在室温下搅拌5分钟。将HClO4(0.48g，4.82mmol)添加至反应混合物中并在室温下再搅拌3小时。TLC指示反应完成后，用NaHCO3溶液淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过制备型HPLC(柱：VIRDIS制备型二氧化硅，2EP-OBD，250X19mm S-5μm，流动相：A＝含0.1％氨的庚烷，B＝IPA:MTBE(70:30)；A:B，80:20)纯化粗物质，得到异构体-1和异构体-2。这些异构体在停留时间25.49分钟(INX-J2-S)和31.53分钟(INX-J2-R)时洗脱。
INX-J2-R(异构体-2，R-异构体)：(产量：0.10g，18.2％)。LCMS:570.4[M+H]+；1HNMR(400MHz,MeOD):δ:7.45(d,J＝10Hz,1H),7.35(d,J＝8.0Hz,2H),7,20(d,J＝7.6Hz,2H),7.00(t,1H),6.56-6.52(m,3H),6.27(d,J＝10Hz,H),6.03(s,1H),5.44(s,1H,缩醛-H),5.06(d,J＝5.2Hz,1H,C16H),4.63(d,J＝19.2Hz,1H),4.43(brs,1H),4.33(d,J＝19.2Hz,1H),3.85(s,2H),2.70-1.600(m,9H),1.51(s,3H),1.20-1.00(m,2H),0.93(s,3H)。
INX-J2-S(异构体-1，S-异构体)：(产量：0.010g，1.82％)。LCMS 570.4[M+H]+；1HNMR(400MHz,MeOD):δ:7.49(d,J＝10Hz,1H),7.23-7.17(m,4H),7.01(t,1H),6.57-6.52(m,3H),6.27(d,J＝10Hz,1H),6.12(s,缩醛-H,1H),6.04(s,1H),5.40(d,J＝6.4Hz,C16H,1H),4.43(br s,1H),4.33(d,J＝19.2Hz,1H),4.12(d,J＝19.2Hz,1H),3.85(s,2H),2.70-1.60(m,9H),1.52(s,3H),1.20-1.00(m,2H),0.93(s,3H)。
合成S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-J)
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-J-3)
程序：
在室温下于N2下向50mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.8g，1.65mmol)、HATU(0.94，2.47mmol)、DIPEA(0.42g，3.30mmol)和DMF(8mL)。在室温下向此溶液中添加(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-氨基苯甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-J-2-R)(0.93g，1.65mmol)并搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈/水：60:40)纯化粗物质，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(0.4g，23.31％)。LCMS:1034.8[M+H]+。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-J-4)
程序：
向50mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-J3)(0.4g，0.38mmol)和THF(4mL)。在室温下向此溶液中添加二乙胺(0.27g，3.8mmol)并搅拌3小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.3g，粗物质)LCMS:812.5[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-J-5)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-J-4)(0.3g，0.36mmol)和DCM(3mL)。在室温下向此溶液中添加溶解于水(0.5mL)中的Na2CO3(0.075g，0.72mmol)，继而添加溴乙酰溴(0.088g，0.43mmol)并且再搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过与乙醚一起湿磨来纯化粗物质，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.27g，78.29％)。LCMS:932.5[M+H]+
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-J)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入含(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-J5)(0.27g，0.28mmol)的DCM(2mL)。向此溶液中添加TFA(0.15g，1.40mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱：C18(250*21.2)mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈，A:B＝48:52)，停留时间12.5分钟)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.020g，10.62％)。LCMS:C44H51 79BrN3O11计算值(876.27)，实验值876.40[M+H]+；
1H NMR(400MHz,MeOD):δ7.47-7.36(m,5H),7.23-7.20(m,3H),6.96(d,1H),6.27(d,J＝10Hz,1H),6.04(s,1H),5.45(s,缩醛-H,1H),5.06(d,J＝5.2Hz,C16H,1H),4.70-4.20(m,4H),4.10-4.00(m,6H),2.70-1.60(m,13H),1.50(s,3H),1.10-1.02(m,2H),1.00(,3H)。
合成(S)-4-(2-(2-(((R)-2-氨基-2-羧乙基)硫基)乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-J-CYS)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-J)(0.2g，0.22mmol)和DMF(1mL)。向此溶液中添加L-半胱氨酸(0.041g，0.34mmol)并在室温下搅拌2小时。LCMS指示反应完成后，冻干反应混合物并且通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus TriartPrep C18-S，250x20mm S-5μm，12nm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈，A:B＝78:22)，停留时间20分钟)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.010g，4.78％)。LCMS:C47H57 79BrN4O13S计算值(917.36)，实验值917.4[M+H]+；
1H NMR(400MHz,MeOD):δ7.47-7.36(m,5H),7.24-7.20(m,3H),6.96(d,1H),6.27(d,J＝10Hz,1H),6.04(s,1H),5.45(s,缩醛-H,1H),5.06(d,J＝5.2Hz,C16H,1H),4.70-4.20(m,4H),4.10-3.90(m,5H),3.50-3.00(m,4H),2.70-1.60(m,13H),1.50(s,3H),1.10-1.02(m,2H),1.00(,3H)。
合成(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-25)
合成(6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-二氟-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(INX-SM-25-1)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入醋酸氟轻松(1g，2.23mmol)和氟硼酸(10mL)。在室温下搅拌混合物16小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中，并且过滤所得固体并在真空下干燥，得到呈白色固体状的标题化合物(0.8g，87.77％)。LCMS:413.2[M+H]+。
合成(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-25)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入(6-(4-甲酰基苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-32-4)(0.10g，0.33mmol)、(6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-二氟-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(INX-SM-25-1)(0.1g，0.24mmol)和DCM(3mL)。向此溶液中添加MgSO4(0.18g，1.59mmol)和HClO4(0.15g，1.59mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE Prep C18 OBD，19x250mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈，A:B＝70:30)，停留时间9.98分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.024g，13.40％)。LCMS:624.4[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ:8.55(br s,1H),7.36-7.33(m,3H),7.16(d,J＝8.0Hz,2H),6.36-6.33(m,2H),5.66-5.51(m,J＝45.6Hz,CHF,1H)5.48(s,缩醛-H,1H),5.07(d,J＝3.2Hz,C16H,1H),5.07-5.06(m,1H),4.63(d,J＝19.2Hz,1H),4.36-4.31(m,2H),3.58-3.54(m,1H),2.75-1.60(m,18H),1.60(s,3H),1.00(s,3H)。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A23)
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A23-1)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.38g，0.78mmol)、HATU(0.608g，1.6mmol)和DMF(5mL)。在室温下向此溶液中添加DIPEA(0.25g，2.0mmol)，继而添加(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-25)(0.5g，0.80mmol)并搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈/水：50:50)纯化粗物质，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(0.3g，34.39％)。LCMS 1088.6[M+H]+。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A23-2)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A23-1)(0.12g，0.11mmol)和THF(2mL)。在室温下向此溶液中添加二乙胺(0.08g，1.10mmol)并搅拌3小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物并与乙醚一起湿磨，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.08g，83.78％)LCMS:866.6[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A23-3)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A23-2)(0.08g，0.09mmol)和DCM(3mL)。向此溶液中添加溶解于水(1mL)中的Na2CO3(0.039g，0.36mmol)，继而添加溴乙酰溴(0.037g，0.18mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈:水，50:50)纯化粗物质，得到呈浅黄色的标题化合物(0.080g，40％)。LCMS:986.6[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A23)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A23-3)(0.080g，0.08mmol)和DCM(2mL)。向此溶液中添加TFA(0.048g，0.45mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE Prep C18 OBD，19x250mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈，A:B＝58:42)，停留时间14.62分钟)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.008g，10.60％)。LCMS:C45H54 79BrF2N3O11Na计算值(953.80)，实验值953.5[M+Na]+；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:7.36-7.34(m,3H),7.17(d,J＝8.0Hz,2H),6.38-6.35(m,2H),5.66-5.49(m,CHF,1H),5.48(s,1H,缩醛-H),5.07(d,J＝4.4Hz,1H,C16H),4.64(d,1H),4.37-4.32(m,2H),4.15-4.10(m,1H),3.94-3.90(m,4H),2.68(d,2H),2.50-1.65(m,22H),1.60(s,3H),0.90(s,3H)。
合成(S)-6-氨基-2-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-N-(6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)己酰胺(INX-A6)
合成((S)-5-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-6-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯(INX A6-1)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入N2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基)-N6-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸(INX-W-2)(0.25g，0.48mmol)、HATU(0.27g，0.72mmol)和DMF(3mL)。向此溶液中将DIPEA(0.12g，0.96mmol)和(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-25)(0.3g，0.48mmol)添加至反应混合物中并搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈:水，50:50)纯化粗物质，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(0.28g，51.46％)。LCMS:1131.7[M+H]+。
合成((S)-5-(2-氨基乙酰胺基)-6-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯(INX A6- 2)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入((S)-5-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-6-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯(INX A6-1)(0.25g，0.22mmol)和THF(3mL)。在室温下向此溶液中添加二乙胺(0.16g，2.0mmol)并搅拌3小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物并与乙醚一起湿磨，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.19g，94.21％)。LCMS:909.5[M+H]+。
合成((S)-5-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-6-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯(INX A6-3)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入((S)-5-(2-氨基乙酰胺基)-6-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯(INX A6-2)(0.19g，0.21mmol)和DCM(3mL)。向此溶液中添加溶解于水(1mL)中的Na2CO3(0.093g，0.83mmol)，继而添加溴乙酰溴(0.088g，0.41mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈:水，50:50)纯化粗物质，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(0.090g，41.81％)。LCMS:1029.7[M+H]+。
合成(S)-6-氨基-2-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-N-(6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)己酰胺2,2,2-三氟乙酸盐(INX A6)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入含((S)-5-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-6-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯(INX A6-3)(0.070g，0.067mmol)的DCM(4mL)。在室温下向此溶液中添加TFA(0.038g，0.33mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart Prep C18-S，250X20mm S-5μm，12nm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈，A:B＝50:50)，停留时间16分钟)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.005g，7.05％)。LCMS:929.59[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ7.36-7.34(m,3H),7.16(d,J＝8.0Hz,2H),6.38-6.34(m,2H),5.67-5.49(m,CHF,J＝48.8Hz,1H)5.49(s,缩醛-H,1H),5.08(d,J＝3.6Hz,C16H,1H),4.65(d,J＝19.6Hz,1H),4.37-4.32(m,3H),4.20-4.10(m,2H),3.97(s,2H),3.94(d,2H),3.00-2.90(m,2H),2.80-2.60(m,2H),2.50-1.55(m,20H),1.60(s,3H),1.55-1.40(m,2H),1.00(s,3H)。
合成(S)-2-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-N1-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)丁二酰胺(INX-A11)
合成(2-(((S)-4-氨基-1-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-1,4-二氧代丁-2-基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(INX-A11-1)
/>
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-32)(0.50g，0.85mmol)、(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基-L-天冬酰胺(INX-X-2)(0.52g，1.27mmol)和DMF(5mL)。在室温下向此溶液中添加HATU(0.64g，1.70mmol)和DIPEA(0.32g，2.55mmol)并搅拌16小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈:水，50:50)纯化粗物质，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(0.32g，38.34％)。LCMS:981.5[M+H]+。
合成(S)-2-(2-氨基乙酰胺基)-N1-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)丁二酰胺(INX-A11-2)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(2-(((S)-4-氨基-1-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-1,4-二氧代丁-2-基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(INX-A11-1)(0.32g，0.32mmol)和THF(5mL)。在室温下向此溶液中添加二乙胺(0.23g，3.23mmol)并搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物并与乙醚一起湿磨，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.20g，82.35％)。LCMS:759.5[M+H]+。
合成(S)-2-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-N1-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)丁二酰胺(INX-A11)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-2-(2-氨基乙酰胺基)-N1-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)丁二酰胺(INX-A11-2)(0.1g，0.13mmol)和DCM(3mL)。在室温下向此溶液中添加溶解于水(0.5mL)中的Na2CO3(0.055g，0.52mmol)，继而添加溴乙酰溴(0.053g，0.26mmol)并搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过制备型HPLC(柱：YMC C18120g，50μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈；A:B，55:45)，停留时间15.51分钟)纯化粗标题化合物，得到呈白色固体状的标题化合物(0.035g，30.5％)。LCMS:C44H56 79BrFN4O10计算值(879.32)，实验值879.4[M+H]+；
合成S-(2-((2-(((S)-4-氨基-1-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-1,4-二氧代丁-2-基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)-L-半胱氨酸化合物与2,2,2-三氟乙酸(INX-A11-CYS)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-2-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-N1-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)丁二酰胺(INX-A11)(0.1g，0.11mmol)和DMF(1mL)。向此溶液中添加L-半胱氨酸(0.026g，0.22mmol)并在室温下搅拌16小时。LCMS指示反应完成后，冻干反应混合物并且通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE Prep C18OBD，19x250mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈:MTBE，90:10，A:B＝60:40)，停留时间16分钟)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.0096g，9.61％)。LCMS:920.5[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):8.54(t,1H),8.34(d,1H),7.88(br d,3H),7.43(br s,1H),7.35-7.31(m,3H),7.15(d,J＝8.0Hz,2H),6.87(br s,1H),6.17(d,J＝10Hz 1H),5.94(s,1H),5.39(s,缩醛-H,1H),5.10(br s,1H),4.93(d,J＝5.2Hz,C16H,1H),4.80(br s,1H),4.53-4.43(m,2H),4.30-4.16(m,2H),4.01-3.98(m,1H),3.71(d,2H),2.90-3.00(m,2H),2.70-1.60(m,25H),1.40(s,3H),1.02-0.95(m,2H),0.87(s,3H)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基螺[3.3]庚-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-45)
合成(E)-(3-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)螺[3.3]庚-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX- SM-45-1)
程序：
在氮气下向50mL单颈圆底闪蒸器中装入(3-甲酰基螺[3.3]庚-1-基)氨基甲酸叔丁酯(1.0g，4.18mmol)和EtOH(25mL)。向此溶液中添加对甲苯磺酰肼(0.934g，6.276mmol)和催化量的AcOH(0.2mL)并在室温下搅拌0.5小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中，并且形成固体并干燥。在真空下干燥化合物，得到呈白色固体状的标题化合物(0.81g，46.94％)。LCMS:407.53[M+H]+
合成(3-(4-甲酰基苯甲基)螺[3.3]庚-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-45-2)
/>
程序：
在氮气下向35mL小瓶中装入(E)-(3-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)螺[3.3]庚-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-45-1)(0.5g，1.22mmol)和二噁烷(20mL)。在室温下向此溶液中添加(4-甲酰基苯基)硼酸(0.551g，3.68mmol)和K2CO3(0.508g，3.68mmol)并且在100℃下再搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到粗产物。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，30:70)纯化粗物质，得到呈黄色粘性固体状的标题化合物(0.180g，44.7％)。LCMS:330[M+H]+。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基螺[3.3]庚-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-45)
程序：
向50mL单颈圆底闪蒸器中装入(3-(4-甲酰基苯甲基)螺[3.3]庚-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-45-2)(0.400g，1.244mmol)和(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.457g，1.244mmol)。将其溶解于DCM(8mL)中并且将MgSO4(0.730g，6.07mmol)添加至溶液中。向此溶液中添加HClO4(0.405g，6.07mmol)并在室温下再搅拌2小时。TLC指示反应完成后，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应混合物并真空浓缩。接着将粗物质与冷水一起湿磨，并且过滤沉淀物并在真空下干燥，得到粗物质。通过制备型HPLC(柱：C18(250*21.2)MM，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈，A:B＝53:46，停留时间12分钟)纯化粗物质部分(0.10g)，得到标题化合物(0.013g，7％)。LCMS:588.4[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ7.47(d,J＝10.0Hz,1H),7.40(d,J＝8.0Hz,2H),7.28(d,J＝8.0Hz,2H),6.27(dd,J＝10.0和1.6Hz 1H),6.04(s,1H),5.49(s,缩醛-H,1H),5.08(d,J＝4.8Hz,C16H,1H),4.61(d,J＝19.2Hz,1H),4.44-4.43(m,1H),4.34(d,J＝19.2Hz,1H),3.05-2.95(m,1H),2.80-1.60(m,20H),1.52(s,3H),1.20-1.00(m,2H),1.01(s,3H)。
合成(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A8)
合成(4S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX- A8-1)
程序：
在室温下向25mL单颈圆底闪蒸器中装入含(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.410g，0.850mmol)和HATU(0.485g，1.27mmol)的DMF(5mL)，并且添加DIPEA(0.329g，2.55mmol)。在室温下向此溶液中添加(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基螺[3.3]庚-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-45)(0.5g，0.850mmol)并在室温下搅拌3小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到粗产物。通过正相柱色谱法(DCM:MeOH，90:10)纯化粗物质，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(0.3g，33.51％)。LCMS:1052.9[M+H]+
合成(4S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A8-2)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入含(4S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A8-1)(0.3g，0.285mmol)的THF(5mL)。在室温下向此溶液中添加二乙胺(0.208g，2.85mmol)并在室温下搅拌2.5小时。TLC指示反应完成后，直接真空浓缩反应混合物，得到粗产物，并且通过与DCM和己烷一起湿磨来纯化并在真空下干燥，得到呈白色固体状的标题化合物(0.175g，74％)。LCMS:831[M+H]+。
合成(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A8-3)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入含(4S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A8-2)(0.175g，0.210mmol)的DCM(5mL)。在室温下向此溶液中添加溶解于水(1ml)中的Na2CO3(0.044g，0.421mmol)，接着在室温下向其中添加溴乙酰溴(0.042g，0.210mmol)并搅拌1.5小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用MDC萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到粗产物。通过反相柱色谱法(乙腈/水：50:50)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.055g，27.43％)。LCMS:C49H65 79BrFN3O11计算值(950.38)，实验值950.6[M+H]+。
合成(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A8)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A8-3)(0.250g，0.262mmol)和DCM(15mL)。在室温下向此溶液中添加TFA(2.5mL)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱：C18，250*21.2mm，5μm，流动相：A＝含0.05％三氟乙酸的水，B＝乙腈，A:B＝65:25，停留时间4分钟)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.014g，5.95％)。LCMS:894.4[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ:7.47(d,J＝10.0Hz,1H),7.37(d,J＝8.4Hz,2H),7.25(d,J＝8.0Hz,2H),6.27(dd,J＝10.0和1.6Hz 1H),6.04(s,1H),5.46(s,缩醛-H,1H),5.07(d,J＝5.2Hz,C16H,1H),4.63(d,J＝19.6Hz,1H),4.45-4.43(m,2H),4.34(d,J＝19.6Hz,1H),4.10-3.90(m,5H),2.90-1.60(m,24H),1.52(s,3H),1.25-1.05(m,2H),1.00(s,3H)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[2.5]辛-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-46)
合成2-(4-((叔丁氧羰基)氨基)亚环己基)乙酸乙酯(INX-SM-46-1)
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入NaH(1.2g，30.5mmol)和THF(50mL)。在0℃下向此溶液中添加2-(二乙氧基磷酰基)乙酸乙酯(6.83g，30.5mmol)并在室温下搅拌30分钟。将(4-氧代环己基)氨基甲酸叔丁酯(5.0g，23.47mmol)于THF(5mL)中的溶液添加至反应混合物中并在室温下搅拌12小时。TLC指示反应完成后，用饱和NH4Cl溶液(100mL)淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈白色固体状的标题化合物(6.5g，97.78％)。LCMS:284.1[M+H]+。
合成6-((叔丁氧羰基)氨基)螺[2.5]辛烷-1-甲酸乙酯(INX-SM-46-2)
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入60％NaH(0.7g，17.6mmol)和DMSO(40mL)。在0℃下向此溶液中添加碘化三甲基氧化锍(3.8g，17.6mmol)并在室温下搅拌30分钟。将2-(4-((叔丁氧羰基)氨基)亚环己基)乙酸乙酯(INX-SM-46-1)(2.0g，7.06mmol)于DMSO(5mL)中的溶液添加至此溶液中并在室温下搅拌12小时。TLC指示反应完成后，用饱和NH4Cl溶液(100mL)淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯:己烷，20:80)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.75g，35.73％)。LCMS298.2[M+H]+。
合成(1-(羟甲基)螺[2.5]辛-6-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-46-3)
程序：
在氮气下向35mL玻璃小瓶中装入6-((叔丁氧羰基)氨基)螺[2.5]辛烷-1-甲酸乙酯(INX-SM-46-2)(0.1g，0.33mmol)和THF(5mL)。在0℃下向此溶液中添加LiBH4(3.3mL，67.3mmol)并在室温下搅拌12小时。TLC指示反应完成后，用稀HCl(30mL)淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，50:50)纯化粗物质，得到呈无色液体状的标题化合物(0.05g，58.22％)。LCMS:256.2[M+H]+。
合成(1-甲酰基螺[2.5]辛-6-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-46-4)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入(1-(羟甲基)螺[2.5]辛-6-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-46-3)(0.2g，0.78mmol)和THF(5mL)。在室温下向此溶液中添加DMP(0.498g，1.17mmol)并搅拌2小时。TLC指示反应完成后，用NaHCO3溶液淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈黄色液体状的标题化合物(0.2g，粗物质)，并且其未经进一步纯化即按原样用于下一步。
合成(E)-(1-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)螺[2.5]辛-6-基)氨基甲酸叔丁酯(INX- SM-46-5)
程序：
向10mL玻璃小瓶中装入(1-甲酰基螺[2.5]辛-6-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-46-4)(0.85g，3.35mmol)和乙醇(20mL)。向此溶液中添加对甲苯磺酰肼(0.74g，4.03mmol)和乙酸(0.05g，0.88mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中，并且过滤固体并在真空下干燥，得到呈白色固体状的标题化合物(1.0g，70.70％)。LCMS:422.3[M+H]+
合成(1-(4-甲酰基苯甲基)螺[2.5]辛-6-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-46-6)
程序：
向50mL单颈圆底烧瓶中装入(E)-(1-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)螺[2.5]辛-6-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-46-5)(0.5g，1.18mmol)、K2CO3(0.24g，1.78mmol)和二噁烷(15mL)，并且将混合物用N2脱气30分钟。向此溶液中添加(4-甲酰基苯基)硼酸(0.26g，1.78mmol)并且在110℃下加热2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水(50mL)中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯:己烷，1:1)纯化粗物质，得到呈无色液体状的标题化合物(0.27g，67.5％)。LCMS:344.21[M+H]+
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[2.5]辛-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-46)
程序：
向35mL小瓶中装入(1-(4-甲酰基苯甲基)螺[2.5]辛-6-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-46-6)(0.55g，1.60mmol)、(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.602g，1.60mmol)和DCM(5mL)。向此溶液中添加MgSO4(0.96g，8.01mmol)和HClO4(0.80g，8.01mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过制备型HPLC(柱：C18-(250x21.2mm)，5微米，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈:甲醇:IPA(65:25:10)；A:B，75:25)，停留时间13.67分钟)纯化粗物质部分(0.150g)，得到标题化合物(0.005g，2.8％)。LCMS:602.4[M+H]+；
1H NMR(400MHz,MeOD):δ:7.47(d,J＝10.0Hz,1H),7.39(d,J＝8.0Hz,2H),7.31(d,J＝8.0Hz,2H),6.27(dd,J＝10.0和2.4Hz 1H),6.04(s,1H),5.47(s,缩醛-H,1H),5.07(d,J＝5.2Hz,C16H,1H),4.70-4.60(m,2H),4.45(br s,1H),4.35(d,J＝19.2Hz,1H),3.00-0.80(m,22H),1.51(s,3H),1.00(s,3H),00.59-0.56(m,1H),.26-0.25(m,1H)。
合成(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[2.5]辛-6-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A9)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.32g，0.68mmol)、((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[2.5]辛-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-46)(0.4g，0.68mmol)和DMF(5mL)。向此溶液中添加DIPEA(0.13g，1.02mmol)和HATU(0.33g，1.02mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈/水，50:50)纯化粗物质，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.3g，42.31％)。LCMS:1066.41[M+H]+。
合成(4S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[2.5]辛-6-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A9-2)
程序：
向10mL玻璃小瓶中装入(4S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[2.5]辛-6-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A9-1)(0.3g，0.28mmol)和THF(3mL)。在室温下向此溶液中添加二乙胺(0.20g，2.81mmol)并搅拌3小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物并与乙醚和戊烷一起湿磨，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.16g，67.40％)LCMS:844.5[M+H]+。
合成(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[2.5]辛-6-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A9-3)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入(4S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[2.5]辛-6-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A9-2)(0.16g，0.18mmol)和DCM(10mL)。向此溶液中添加溶解于水(1mL)中的Na2CO3(0.040g，0.37mmol)和溴乙酰溴(0.038g，0.18mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用含10％甲醇的DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈/水，70:30)纯化粗物质，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.13g，74.8％)。LCMS:964.4[M+H]+。
合成(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[2.5]辛-6-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A9)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[2.5]辛-6-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A9-3)(0.13g，0.13mmol)和DCM(2mL)。向此溶液中添加TFA(0.38g，3.3mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物(0.11g，粗物质)。通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE Prep C18 OBD，19x250mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈；A:B，60:40)，停留时间14.4分钟)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.007g，5.72％)。LCMS:908.40[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ7.49-7.27(m,5H),6.28(d,J＝10Hz,1H),6.06(s,1H),5.48(s,缩醛-H,1H),5.08(d,J＝5.2Hz,C16H,1H),4.70-3.70(m,9H),3.00-0.90(m,26H),1.50(s,3H),1.10(s,3H),0.54-0.51(m,1H),0.19-0.17(m,1H)。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-Z)
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-Z-1)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.20g，0.41mmol)，并且将(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-氨基双环[2.2.2]辛-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-10)(0.28g，0.46mmol)溶于DMF(2mL)中。向此溶液中添加DIPEA(0.21g，1.6mmol)和HATU(0.44g，1.1mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈/水：50:50)纯化粗物质，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.1g，20.16％)。LCMS1066.9[M+H]+。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-Z-2)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(4S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-Z-1)(0.15g，0.14mmol)和THF(5mL)。向此溶液中添加二乙胺(0.10g，1.4mmol)并在室温下搅拌3小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物并且与乙醚和戊烷一起湿磨，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.08g，67.38％)。LCMS:844.6[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-Z-3)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(4S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-Z-2)(0.08g，0.094mmol)和DCM(2mL)。在室温下向此溶液中滴加Na2CO3(0.030g，0.28mmol)于水(1mL)中的溶液和溴乙酰溴(0.024g，0.12mmol)并且搅拌反应混合物1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.08g，88.2％)。LCMS:C50H6779BrN3O11计算值(964.40)，实验值964.6[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-Z)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-Z-3)(0.08g，0.08mmol)和DCM(2mL)。向此溶液中添加TFA(0.23g，2.10mmol)并在室温下搅拌反应混合物2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱YMC-Actus Triart Prep C18-S，250X20mm S-5μm，12nm，流动相：A＝含0.1％FA的水，B＝ACN:MEOH(50:50)，A:B＝35:65，停留时间20.17分钟)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.005g，6.64％)LCMS:C46H59 79BrN3O11计算值(908.33)，实验值908.4[M+H]+；
1H NMR(400MHz,MeOD)关键质子分配):1H NMR(400MHz,MeOD):δ7.46(d,J＝10.4Hz,1H),7.34(d,J＝7.6Hz,2H),7.09(d,J＝7.6Hz,2H),6.26(d,J＝9.6Hz,1H),6.04(s,1H),5.44(s,缩醛-H,1H),5.05(d,J＝5.2Hz,C16H,1H),5.00-4.10(m,9H),2.70-1.60(m,20H),1.51(s,3H),1.50-1.40(m,6H),1.25-1.05(m,2H),1.00(s,3H)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-氨基-2-氧杂双环[2.2.2]辛-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-36)
合成(E)-(1-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)-2-氧杂双环[2.2.2]辛-4-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-36-1)
程序：
在氮气下向50mL单颈圆底闪蒸器中装入(1-甲酰基-2-氧杂双环[2.2.2]辛-4-基)氨基甲酸叔丁酯(0.2g，0.78mmol)和EtOH(5mL)。向此溶液中添加对甲苯磺酰肼(0.218g，1.17mmol)和催化量的AcOH(0.1mL)，并在室温下搅拌反应混合物0.5小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中，并且过滤所得固体并在真空下干燥，得到呈白色固体状的标题化合物(0.30g，90.42％)。LCMS:424.23[M+H]+
合成(1-(4-甲酰基苯甲基)-2-氧杂双环[2.2.2]辛-4-基)氨基甲酸叔丁酯(INX- SM-36-2)
程序：
在氮气下向35mL玻璃小瓶中装入(E)-(1-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)-2-氧杂双环[2.2.2]辛-4-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-36-1)(0.1g，0.236mmol)和二噁烷(3mL)。向此溶液中添加(4-甲酰基苯基)硼酸(0.053g，0.354mmol)和K2CO3(0.048g，0.354mmol)并在100℃下搅拌3小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，30:70)纯化粗物质，得到呈黄色粘性固体状的标题化合物(0.030g，36.78％)。LCMS:346.2[M+H]+
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-氨基-2-氧杂双环[2.2.2]辛-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-36)
程序：
向50mL单颈圆底闪蒸器中装入(1-(4-甲酰基苯甲基)-2-氧杂双环[2.2.2]辛-4-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-36-2)(0.025g，0.072mmol)、(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.027g，0.072mmol)和DCM(2mL)。向此溶液中添加MgSO4(0.043g，0.3615mmol)和HClO4(0.036g，0.3615mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应混合物并在真空下浓缩。将粗物质与冷水一起湿磨，并且过滤沉淀固体并在真空下干燥。通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart Prep C18-S，250X20mm S-5μm，12nm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈；A:B＝75:25，停留时间12.52分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.008g，15.54％)。LCMS:604.4[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ:7.47(d,J＝10.0Hz,1H),7.37(d,J＝8.0Hz,2H),7.22(d,J＝8.0Hz,2H),6.27(dd,J＝10.0和1.6Hz 1H),6.04(s,1H),5.47(s,缩醛-H,1H),5.08(d,J＝4.8Hz,C16H,1H),4.65(d,J＝19.6Hz,1H),4.45-4.40(m 1H),4.33(d,J＝19.6Hz,1H),3.30(s,2H),2.73(s,2H),2.70-2.69(m,1H),2.50-1.60(m,16H),1.52(s,3H),1.20-1.04(m,2H),1.01(s,3H)。
合成((4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氧杂双环[2.2.2]辛-4-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A24)
合成(4S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氧杂双环[2.2.2]辛-4-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A24-1)
程序：
向50mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.263g，0.546mmol)、HATU(0.207g，0.546mmol)和DMF(3mL)。向此溶液中添加DIPEA(0.141g，0.109mmol)，继而添加(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-氨基-2-氧杂双环[2.2.2]辛-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-36)(0.330g，0.546mmol)并在室温下搅拌3小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(MeOH/DCM，10:90)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.3g，51.38％)。LCMS:1068.7[M+H]+
合成(4S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氧杂双环[2.2.2]辛-4-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A24-2)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入(4S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氧杂双环[2.2.2]辛-4-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A24-1)(0.5g，0.468mmol)和THF(5mL)。向此溶液中添加二乙胺(0.342g，4.68mmol)并在室温下搅拌2.5小时。TLC指示反应完成后，在真空下浓缩反应混合物。通过与DCM和己烷一起湿磨来纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.35g，88.38％)。LCMS:846.5[M+H]+。
合成(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氧杂双环[2.2.2]辛-4-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A24-3)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入(4S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氧杂双环[2.2.2]辛-4-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A24-2)(0.365g，0.431mmol)和DCM(5mL)。向此溶液中添加溶解于水(0.5mL)中的Na2CO3(0.091g，0.862mmol)，继而添加溴乙酰溴(0.087g，0.431mmol)并在室温下搅拌0.5小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.22g，52.8％)。LCMS:966.4[M+H]+
合成((4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氧杂双环[2.2.2]辛-4-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A24)
/>
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氧杂双环[2.2.2]辛-4-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A24-3)(0.2g，0.206mmol)和DCM(5mL)。向此溶液中添加TFA(0.5mL)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱：X-bridgePrep，C18，OBD(250x19)mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈:MeOH:IPA(65:25:10)；A:B＝70:30，停留时间15.88分钟)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.025g，13.32％)。LCMS:C45H57 79BrN3O12计算值(910.31)，实验值910.6[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ:7.47(d,J＝10.0Hz,1H),7.37(d,J＝8.0Hz,2H),7.20(d,J＝8.0Hz,2H),6.27(dd,J＝10.0,1H),6.04(s,1H),5.46(s,缩醛-H,1H),5.08(d,J＝5.2Hz,C16H,1H),4.64(d,J＝19.6Hz,1H),4.45-4.44(m 1H),4.34(d,J＝19.6Hz,1H),4.27-4.22(m,1H),3.98-3.89(m,6H),2.70(s,2H),2.50-1.55(m,21H),1.52(s,3H),1.20-1.04(m,2H),1.01(s,3H)。
合成(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氧杂双环[2.2.2]辛-4-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A25)
/>
合成(4S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氧杂双环[2.2.2]辛-4-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A25-1)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入(4S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氧杂双环[2.2.2]辛-4-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A24-1)(0.300g，0.280mmol)和DMF(0.6mL)。向此溶液中添加1H-四唑(0.196g，2.800mmol)和(tBuO)2PN(iPr)2(1.86g，6.741mmol)并在室温下搅拌24小时。将反应混合物冷却至0℃并且将过氧化氢(3mL)添加至反应混合物中。搅拌反应混合物，接着在真空下浓缩。通过反相柱色谱法(乙腈:水，70:30)纯化粗物质，获得呈白色固体状的标题化合物(0.140g，39.55％)。LC/MS:1260.7[M+H]+
合成(4S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氧杂双环[2.2.2]辛-4-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX- A25-2)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入(4S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氧杂双环[2.2.2]辛-4-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A25-1)(0.140g，0.111mmol)和EtOAc(2mL)。向此溶液中添加二乙胺(0.081g，1.111mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，用EtOAc稀释反应混合物并用H2O洗涤。有机层经Na2SO4干燥并在真空下浓缩。将粗物质与己烷一起湿磨，获得呈白色固体状的标题化合物(0.080g，69.37％)。LC/MS:1039.0[M+H]+
合成(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氧杂双环[2.2.2]辛-4-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A25-3)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入(4S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氧杂双环[2.2.2]辛-4-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A25-2)(0.080g，0.077mmol)和DCM(0.9mL)。在室温下向此溶液中添加溶解于水(0.1mL)中的Na2CO3(0.017g，0.154mmol)，继而添加溴乙酰溴(0.016g，0.077mmol)。在室温下搅拌反应混合物30分钟。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下浓缩(0.080g，89.57％)。LC/MS:1160.4[M+H]+
合成(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氧杂双环[2.2.2]辛-4-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A25)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氧杂双环[2.2.2]辛-4-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A25-3)(0.080g，0.069mmol)和DCM(2mL)。向此溶液中添加TFA(0.2mL)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart Prep C18-S，250X20mm S-5μm，12nm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈；A:B，70:30)；停留时间12.88分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.007g，10.24％)。LCMS:C45H58 79BrN3O15P计算值(990.28)，实验值990.5[M+H]+；
1H NMR(400MHz,MeOD):δ:7.51-7.47(m,1H),7.36(d,J＝8.4Hz,2H),7.20(d,J＝8.0Hz,2H),6.27(dd,J＝10.0和1.6Hz,1H),6.04(s,1H),5.52(s,缩醛-H,1H),5.07(d,J＝5.2Hz,C16H,1H),4.85-4.80(m,1H).4.50-4.40(m,1H),4.35-4.20(m,1H),4.00-3.80(m,6H),2.70-1.55(m,24H),1.52(s,3H),1.25-1.05(m,2H),1.03(s,3H)
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(3-氟-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A17)
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(3-氟-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX- A17-1)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)氧基)-2-氟苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-A5-1)(0.3g，0.280mmol)和DMF(1mL)。在室温下向此溶液中添加1H-四唑(0.19g，2.80mmol)和(tBuO)2PN(iPr)2(1.8g，6.72mmol)并搅拌16小时。TLC指示反应完成后，在0℃下添加过氧化氢(3ml)并搅拌2小时。对粗物质进行反相柱色谱法(乙腈:水，80:20)，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(0.18g，50.84％)。LCMS:1264.5[M+H]+
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((6-(3-氟-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A17-2)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(3-氟-4((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A17-1)(0.18g，0.17mmol)和THF(1mL)。向此溶液中添加二乙胺(0.125g，1.70mmol)并在室温下搅拌反应混合物16小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。将粗物质与乙醚和己烷一起湿磨，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.15g，粗物质)。LCMS:1042.9[M+H]+
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(3-氟-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A17-3)
程序：
向10mL玻璃小瓶中装入(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((6-(3-氟-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A17-2)(0.13g，0.14mmol)和DCM(1mL)。向此溶液中添加溶解于水(0.3mL)中的Na2CO3(0.030g，0.28mmol)，继而添加溴乙酰溴(0.043g，0.21mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈灰白色固体状的粗标题化合物(0.12g，73.69％)LCMS:1162.6[M+H]+
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(3-氟-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A17)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(3-氟-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A17-3)(0.1g，0.085mmol)和DCM(1mL)。在室温下向此溶液中添加TFA(0.049g，0.42mmol)并搅拌20分钟。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart Prep C18-S，250X20mm S-5μm，12nm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈；A:B，67:33，停留时间10.33分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.010g，11.71％)。LCMS:994.3[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ:7.49-7.42(m,2H),6.68(dd,J＝8.8和2Hz,1H),6.58-6.55(m,1H),6.28-6.25(dd,J＝10和1.6Hz,1H),6.04(s,1H),5.69(s,1H),5.03(d,J＝5.2Hz,1H),4.95-4.74(m,2H),4.63-4.60(m,1H),4.45-4.44(m,1H),4.35-4.31(m,1H),4.24-4.18(m,1H),3.95-3.90(m,4H),2.69-1.72(m,21H),1.52(s,3H),1.31-1.05(m,2H),1.02(m,3H)。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)-3-氟苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX- A18)
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)-3-氟苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A18-1)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)-3-氟苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A5-1)(0.3g，0.270mmol)和DMF(1mL)。向此溶液中添加1H-四唑(0.189g，2.70mmol)和(tBuO)2PNEt2(1.7g，6.48mmol)并搅拌16小时。将反应混合物冷却至0℃并且添加过氧化氢(1mL)。对反应混合物进行反相柱色谱法(乙腈:水，80:20)，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.15g，42.65％)。LCMS:1300.51[M+H]+。
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)-3-氟苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A18-2)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)-3-氟苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A18-1)(0.12g，0.09mmol)和THF(1mL)。向此溶液中添加二乙胺(0.067g，0.92mmol)并在室温下搅拌16小时。TLC指示反应完成后，浓缩反应混合物，将固体与乙醚和己烷一起湿磨，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.09g，92.74％)。LCMS:1078.8[M+H]+。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)-3-氟苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A18-3)
程序：
向10mL玻璃小瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS}-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)-3-氟苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A18-2)(0.090g，0.083mmol)和DCM(1mL)。向此溶液中添加溶解于水(0.3mL)中的Na2CO3(0.017g，0.166mmol)，继而添加溴乙酰溴(0.025g，0.12mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.090g，90.42％)LCMS:1199.6[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)-3-氟苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX- A18)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)-3-氟苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A18-3)(0.090g，0.075mmol)和DCM(1mL)。向此溶液中添加TFA(0.042g，0.37mmol)并在室温下搅拌20分钟。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart Prep C18-S，250X20mm S-5μm，12nm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈；A:B，67:33，停留时间11.32分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.010g，12.93％)。LCMS:1031.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,MeOD):δ7.44(t,J＝8.4Hz,1H),7.36(d,J＝10Hz,1H),6.68(m,J＝8.4和2Hz,1H),6.60-6.55(m,1H),6.37-6.33(m,2H),5.73(s,缩醛-H,1H),5.66-5.49(m,CH-F,1H),5.05(d,J＝4.4Hz,C16H,1H),4.80-4.74(m,2H),4.63-4.60(m,1H),4.35-4.31(m,2H),4.30-4.26(m,1H),3.95-3.90(m,4H),2.68-1.55(m,20H),1.50(s,3H),1.02(s,3H)。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A7)
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX- A7-1)
程序：
在N2下向35mL玻璃小瓶中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(1.14g，2.385mmol)、HATU(1.35g，3.577mmol)和DMF(14mL)。在室温下向此溶液中添加DIPEA(0.8ml，4.77mmol)，继而添加(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-32)(1.4g，2.385mmol)并搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中，并且过滤固体并在真空下干燥。通过硅胶柱色谱法(MeOH:DCM 5:95)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(1.6g，63.84％)。LCMS:1052.6[M+H]+。
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A7-2)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A7-1)(1.6g，1.520mmol)和DMF(2.5mL)。在室温下向此溶液中添加1H-四唑(1.06g，15.20mmol)和(tBuO)2PN(i-Pr)2(10.11g，36.501mmol)并搅拌24小时。将反应混合物冷却至0℃并且将过氧化氢(16mL)添加至反应混合物中并在室温下搅拌1小时。对反应混合物进行反相柱色谱法(乙腈:水，15:85)，得到呈白色固体状的标题化合物(1.2g，63.42％)。LCMS:1244.6[M+H]+。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A7-3)
程序：
向50mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A7-2)(1.2g，0.964mmol)和乙酸乙酯(12mL)。向此溶液中添加二乙胺(0.704g，9.64mmol)并在室温下搅拌反应混合物4小时。TLC指示反应完成后，用乙酸乙酯稀释反应混合物并用水洗涤，并且经Na2SO4干燥有机层并在真空下浓缩。将粗物质与己烷一起湿磨，得到呈白色固体状的标题化合物(0.650g，65.94％)。LCMS:1023.9[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX- A7-4)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A7-3)(0.650g，0.636mmol)和DCM(9mL)。在室温下向此溶液中添加溶解于水(1.0mL)中的Na2CO3(0.135g，1.272mmol)，继而添加溴乙酰溴(0.128g，0.636mmol)并搅拌30分钟。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并浓缩。通过反相柱色谱法(乙腈:水，40:60)纯化粗物质，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.25g，34.79％)。LCMS:1142.6[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A7)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A7-4)(0.250g，0.218mmol)和DCM(5mL)。向此溶液中添加TFA(0.5mL)并在室温下搅拌反应混合物2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart Prep C18-S，250X20mm S-5μm，12nm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈，A:B＝55:45，停留时间19.15分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.026g，12.20％)。LCMS:974.3[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ:7.47(d,J＝10.0Hz,1H),7.36(d,J＝8.0Hz,2H),7.16(d,J＝8.0Hz,2H),6.27(dd,J＝10.0和1.6Hz,1H),6.04(s,1H),5.51(s,缩醛-H,1H),5.06(d,J＝4.8Hz,C16H,1H),5.00--4.70(m,2H),4.46-4.45(m,1H),4.33-4.30(m,1H),4.15-4.09(m,1H),3.94-3.92(m,3H),2.68-1.72(m,20H),1.52(s,3H),1.18-1.05(m,2H),1.03(s,3H)。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A12)
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A12-1)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A23-1)(1.2g，1.10mmol)和DMF(2.0mL)。向此溶液中添加1H-四唑(0.771g，11.020mmol)和(tBuO)2PN(i-Pr)2(7.33g，26.46mmol)并在室温下搅拌24小时。将反应混合物冷却至0℃并且将过氧化氢(12mL)添加至反应混合物中并搅拌1小时。TLC指示反应完成后，对反应混合物进行反相柱色谱法(乙腈:水，70:30)，得到呈白色固体状的标题化合物(1.1g，77.91％)。LC/MS:1280.8[M+H]+
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A12-2)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A12-1)(1.1g，0.859mmol)和EtOAc(11mL)。在室温下向此溶液中添加二乙胺(0.628g，8.593mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，用EtOAc稀释反应混合物并用水洗涤。有机层经Na2SO4干燥并在真空下浓缩。将粗物质与己烷一起湿磨并在真空下干燥，得到呈白色固体状的标题化合物(0.550g，60.50％)。LC/MS:1058.8[M+H]+
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A12-3)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A12-2)(0.550g，0.519mmol)和DCM(9mL)。向此溶液中添加溶解于水(1.0mL)中的Na2CO3(0.110g，1.038mmol)和溴乙酰溴(0.105g，0.0.519mmol)，并在室温下搅拌反应混合物30分钟。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩，得到标题化合物(0.400g，65.27％)。LC/MS:1180.2[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A12)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A12-3)(0.250g，0.212mmol)和DCM(5mL)。向此溶液中添加TFA(0.5mL)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物，并且通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE Prep C18 OBD，19x250mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈；A:B，60:40)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.022g，10.27％)。LCMS:1010.4[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ7.37-7.34(m,3H),7.17(d,J＝8.0Hz,2H),6.38-6.35(m,2H),5.70-5.55(m,CHF,1H),5.54(s,缩醛-H,1H),5.07(d,J＝4.8Hz,C16H,1H),5.05-4.80(m,3H),4.35-4.30(m,2H),4.13-4.09(m,1H),3.94-3.89(m,3H),2.68-1.65(m,20H),1.60(s,3H),1.03(s,3H)
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A14)
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A14-1)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-S-3)(0.5g，0.471mmol)和DMF(1mL)。在室温下向此溶液中添加1H-四唑(0.33g，4.71mmol)和(tBuO)2PN(i-Pr)2(3.13g，11.31mmol)并搅拌24小时。在0℃下冷却反应混合物并且添加过氧化氢(10V)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，对反应混合物进行反相柱色谱法(乙腈:水，70:30)，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(0.28g，47.45％)。LCMS:1252.73[M+H]+。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A14-2)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A14-1)(0.28g，0.23mmol)和THF(2.8mL)。向此溶液中添加二乙胺(0.168g，2.31mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下浓缩反应混合物，并且通过与乙醚和己烷一起湿磨来纯化粗物质，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.19g，80.19％)。LCMS:1030.68[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A14-3)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A14-2)(0.190g，0.18mmol)和DCM(2mL)。向此溶液中添加溶解于水(0.4mL)中的Na2CO3(0.038g，0.36mmol)和溴乙酰溴(0.036g，0.18mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈粗粘性固体状的粗标题化合物(0.15g，72.39％)LCMS:1150.4[M+H]+
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A14)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A14-3)(0.15g，0.130mmol)和DCM(4mL)。向此溶液中添加TFA(0.074g，0.65mmol)并在室温下搅拌20分钟。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE Prep C18 OBD，19x250mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈；A:B，65:35)，停留时间12.76分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.012g，9.39％)。LCMS:982.3[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO:δ8.55(t,1H),8.35(s,1H),8.04(d,1H),7.35(d,2H),7.25(d,1H),7.10(d,2H),6.30(d,1H),6.13(s,1H),5.80-5.60(m,1H),5.50(s,缩醛-H,1H),4.96(d,J＝4.8Hz,C16H,1H),4.90-4.70(m,2H),4.30-4.10(m,3H),3.90(s,2H),3.75(d,2H),2.80(d,2H),2.50-1.55(m,18H),1.50(s,3H),1.30-1.10(m,2H),0.92(s,3H)。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A15)
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A15-1)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A4-1)(0.5g，0.42mmol)和DMF(2mL)。在室温下向此溶液中添加1H-四唑(0.33g，4.75mmol)和(tBuO)2PN(i-Pr)2(3.1g，11.20mmol)并且搅拌16小时。将反应混合物冷却至0℃并且将过氧化氢(10V)添加至反应混合物中并搅拌1小时。蒸发反应混合物并通过反相柱色谱法(乙腈:水，80:20)纯化，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.3g，57.30％)LCMS:1247.50[M+H]+。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A15-2)
程序：
向25mL圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A15-1)(0.3g，0.24mmol)和THF(5mL)。向此溶液中添加二乙胺(0.75g，2.4mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，浓缩反应混合物并且通过与乙醚和己烷一起湿磨来纯化，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.2g，81.13％)LCMS:1024.9[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX- A15-3)
/>
程序：
向10mL玻璃小瓶中装入(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A15-2)(0.2g，0.20mmol)和DCM(4mL)。向此溶液中添加溶解于水(0.3mL)中的Na2CO3(0.082g，0.89mmol)，继而将溴乙酰溴(0.082g，0.45mmol)添加至反应混合物中并搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈灰白色固体状的粗标题化合物INX-A15-3产物(0.18g，78.59％)LCMS:1145.4[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A15)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A15-3)(0.18g，0.17mmol)和DCM(5mL)。向此溶液中添加TFA(0.3mL)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物，得到粗产物。通过制备型HPLC(柱：YMC-PACK ODS-AQ Prep C18-S，250X20mm S-5μm，12nm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈:甲醇:2-丙醇(65:25:10)；A:B，55:45；停留时间15.60分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.021g，12.64％)LCMS:976.5[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,关键质子分配):1H NMR(400MHz,DMSO:δ7.31-7.28(m,3H),6.72(d,2H),6.16(d,J＝10.8Hz,1H),5.92(s,1H),5.41(s,缩醛-H,1H),4.95(d,C16H,1H),4,85-3.50(m,10H),2.72-1.60(m,21H),1.39(s,3H),1.10-0.98(m,2H),0.88(s,3H)。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A16)
合成(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)氧基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-A16-1)
/>
程序：
向50mL单颈圆底烧瓶中装入(6-(4-甲酰基苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-43-1)(1.1g，3.32mmol)、(6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-二氟-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(INX-S-1)(1.09g，2.65mmol)和DCM(20mL)。向此溶液中添加MgSO4(1.99g，16.61mmol)，继而添加HClO4(1.6g，16.61mmol)并在室温下搅拌3小时。TLC指示反应完成后，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(1.3g，粗物质)LCMS:625.9[M+H]+
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A16-2)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)氧基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-A16-1)(1.29g，2.08mmol)、(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(1.0g，2.08mmol)和DMF(10mL)。向此溶液中添加HATU(0.94g，2.49mmol)并且将DIPEA(0.89mL，5.20mmol)添加至反应混合物中并在室温下搅拌30分钟。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(水:乙腈46:54)纯化粗物质，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(0.8g，35.32％)LCMS:1091.5[M+H]+。
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A16-3)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A16-2)(0.38g，0.32mmol)和DMF(1.5mL)。向此溶液中添加1H-四唑(0.24g，3.40mmol)和(tBuO)2PN(i-Pr)2(2.3g，8.21mmol)并在室温下搅拌16小时。在0℃下冷却反应混合物并且将过氧化氢(4mL)添加至反应混合物中并在室温下搅拌1小时。对反应混合物进行反相柱色谱法(乙腈:水，80:20)，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.2g，48.73％)LCMS:1283.7[M+H]+。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX- A16-4)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A16-3)(0.17g，0.13mmol)和THF(3mL)。向此溶液中添加二乙胺(0.096g，1.3mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下浓缩反应混合物。将粗物质与乙醚和己烷一起湿磨，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.13g，94.32％)。LCMS:1060.8[M+H]+
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A16-5)
程序：
向10mL玻璃小瓶中装入(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A16-4)(0.13g，0.12mmol)和DCM(3mL)。向此溶液中添加溶解于水(0.3mL)中的Na2CO3(0.051g，0.49mmol)，继而添加溴乙酰溴(0.049g，0.24mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈灰白色固体状的粗标题化合物INX-A16-5产物(0.12g，84.66％)。LCMS1182.1[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A16)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A16-5)(0.12g，0.10mmol)和DCM(2mL)。向此溶液中添加TFA(0.057g，0.50mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE Prep C18 OBD(250x19)mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈；A:B＝64:36；停留时间12.86分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.013g，12.83％)LCMS:1012.4[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO:δ:8.54(t,1H),8.11-8.09(m,2H),7.33-7.25(m,3H),6.84(d,J＝8.4Hz,2H),6.30(dd,J＝10.4和1.6Hz,1H),6.13(s,1H),5.72-5.60(m,CH-F,1H),5.48(s,缩醛-H,1H),4.93(d,J＝4.8Hz,C16H,1H),4.90-4.91(m,1H),4.61-4.57(m,2H),4.30-4.00(m,5H),3.94(s,2H),3.00-1.67(m,20H),1.50-1.48(m,3H),0.89(s,3H)
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-47)
步骤-1：合成(E)-6-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸叔丁酯(INX-SM-47-1)
程序：
在氮气下向35mL玻璃小瓶中装入6-甲酰基-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸叔丁酯(0.2g，0.88mmol)和EtOH(10mL)。向此溶液中添加对甲苯磺酰肼(0.247g，1.333mmol)和催化量的AcOH(0.1mL)并在室温下搅拌0.5小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中，并且过滤固体并在真空下干燥，得到呈白色固体状的标题化合物(0.3g，86.6％)。LCMS:394.2[M+H]+
合成6-(4-甲酰基苯甲基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸叔丁酯(INX-SM-47-2)
程序：
在氮气下向35mL玻璃小瓶中装入(E)-6-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸叔丁酯(INX-SM-47-1)(0.3g，0.762mmol)和二噁烷(5mL)。向此溶液中添加(4-甲酰基苯基)硼酸(0.171g，1.143mmol)和K2CO3(0.158g，1.143mmol)，并且在100℃下搅拌反应混合物3小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，50:50)纯化粗物质，得到呈黄色粘性固体状的标题化合物(0.065g，27.03％)。LCMS:316.2[M+H]+
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-47)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入含6-(4-甲酰基苯甲基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸叔丁酯(INX-SM-47-2)(0.065g，0.206mmol)和(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.077g，0.206mmol)的DCM(2mL)。向此溶液中添加MgSO4(0.103g，1.03mmol)和HClO4(0.123g，1.03mmol)并在室温下再搅拌1.5小时。TLC指示反应完成后，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应混合物并在真空下浓缩。将粗物质与冷水一起湿磨并且过滤固体。通过制备型HPLC(柱：YMC-PACK ODS-AQ PrepC18-S，250X20mm S-5μm，12nm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈:甲醇:2-丙醇(65:25:10)，A:B＝58:42，停留时间12.23分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.025g，17.77％)。LCMS:574.4[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD:δ:7.47(d,J＝10.0Hz,1H),7.37(d,J＝8.0Hz,2H),7.18(d,J＝8.4Hz,2H),6.27(dd,J＝10.0和2.0Hz,1H),6.04(s,1H),5.46(s,缩醛-H,1H),5.06(d,J＝5.2Hz,C16H,1H),4.65-4.60(m,2H),4.44(d,J＝2.8Hz,1H),4.35-4.31(m,1H),4.03(s,2H),3.95(s,2H),2.70-1.60(m,15H),1.50(s,3H),1.17-1.04(m,2H),1.01(s,3H)
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-10-(4-((3-(甲基氨基)环丁基)甲基)苯基)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM- 49)
合成3-((叔丁氧羰基)氨基)环丁烷-1-甲酸氨基甲酸甲酯(INX-SM-49-1)
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入3-((叔丁氧羰基)氨基)环丁烷-1-甲酸(3.0g，13.95mmol)、碳酸钾(3.8g，27.90mmol)和DMF(20mL)。向此溶液中添加甲基碘(2.9g，20.92mmol)并在室温下再搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用H2O稀释反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈黄色固体状的标题化合物(2.2g，68.85％)。LCMS:230.20[M+H]+
合成3-((叔丁氧羰基)(甲基)氨基)环丁烷-1-甲酸甲酯(INX-SM-49-2)
INX-SM-49-2
程序：
在0℃下向100mL单颈圆底烧瓶中装入含3-((叔丁氧羰基)氨基)环丁烷-1-甲酸氨基甲酸甲酯(INX-SM-49-1)(2.2g，9.60mmol)和60％氢化钠(0.77g，19.21mmol)的DMF(20mL)。向此溶液中添加甲基碘(2.03g，14.40mmol)并在室温下再搅拌16小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈黄色固体状的标题化合物(1.8g，77.0％)。LCMS:244.20[M+H]+
合成(3-(羟甲基)环丁基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-49-3)
INX-SM-49-3
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入含3-((叔丁氧羰基)(甲基)氨基)环丁烷-1-甲酸甲酯(INX-SM-49-2)(1.8g，7.40mmol)的THF:MeOH(1:1，20mL)，添加硼氢化钠(1.3g，37.0mmol)并在室温下再搅拌5小时。TLC指示反应完成后，用水稀释反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈胶粘固体状的标题化合物(1.7g，粗物质)。LCMS:216.1[M+H]+
合成(3-甲酰基环丁基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-49-4)
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入含(3-(羟甲基)环丁基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-49-3)(1.7g，粗物质)的DCM(20mL)。在室温下向此溶液中添加DMP(5.02g，11.80mmol)并搅拌2小时。TLC指示反应完成后，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应混合物并用二氯甲烷萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈胶粘固体状的标题化合物(1.5g，89.06％)。粗物质立即用于下一步。
合成(E)-甲基(3-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)环丁基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-49-5)
程序：
向10mL玻璃小瓶中装入(3-甲酰基环丁基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-49-4)(1.5g，7.04mmol)和乙醇(20mL)。向此溶液中添加对甲苯磺酰肼(1.4g，7.7mmol)和乙酸(催化性)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中，并且过滤所得固体并在真空下干燥，得到呈白色固体状的标题化合物(2.0g 74.46％)。LCMS:382.22[M+H]+
合成(3-(4-甲酰基苯甲基)环丁基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-49-6)
程序：
向50mL单颈圆底烧瓶中装入(E)-甲基(3-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)环丁基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-49-5)(2.0g，5.24mmol)和二噁烷(20mL)。向此溶液中添加(4-甲酰基苯基)硼酸(1.17g，7.87mmol)和K2CO3(1.08g，7.87mmol)并在110℃下再搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：1:1)纯化粗物质，得到呈无色液体状的标题化合物(0.500g，31.45％)。LCMS:304.2[[M+H]+
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-10-(4-((3-(甲基氨基)环丁基)甲基)苯基)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM- 49)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入(3-(4-甲酰基苯甲基)环丁基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-49-6)(0.16g，0.52mmol)、(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.21g，0.58mmol)和DCM(2mL)。向此溶液中添加MgSO4(0.31g，2.6mmol)和HClO4(0.26g，2.6mmol)并在室温下再搅拌2小时。TLC指示反应完成后，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应混合物并用MDC萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到粗产物。通过制备型HPLC纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.050g，17.11％)。LCMS:562.4[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6-d2O:δ:7.37(d,J＝8.4Hz,2H),7.32(d,J＝10.0Hz,1H),7.17(d,J＝8.0Hz,2H),6.17(dd,J＝10和1.6Hz,1H),5.94(s,1H),5.41(s,缩醛-H,1H),4.93(d,J＝4.8Hz,C16H,1H),4.48(m,1H),4.31-4.29(m,1H),4.21-4.15(m,1H),3.50-3.40(m,1H),2.69-1.60(m,19H),1.40(s,3H),0.99-0.96(m,2H),0.87(s,3H)。
合成(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-(((2S,3R,4R,5S)-4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)立方烷-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A2)
合成(4S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(((2S,3R,4R,5S)-4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)立方烷-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A2-1)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.137g，0.285mmol)、HATU(0.163g，0.428mmol)和DMF(2mL)。向此溶液中添加DIPEA(0.110g，0.857mmol)和(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(((1s,2R,3S,8S)-4-氨基立方烷-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-9)(0.160g，0.0.285mmol)，并在室温下搅拌反应混合物2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法纯化粗物质，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.08g，26.39％)。LCMS:1060.7[M+H]+
合成(4S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-(((2S,3R,4R,5S)-4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)立方烷-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A2-2)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入(4S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(((2S,3R,4R,5S)-4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)立方烷-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A2-1)(0.08g，0.075mmol)和THF(3mL)。向此溶液中添加二乙胺(0.055g，0.75mmol)和1,8-二氮杂双环(5.4.0)十一碳-7-烯(DBU)(催化性)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下浓缩反应混合物。将粗物质与DCM和己烷一起湿磨，得到呈白色固体状的标题化合物(0.06g，95.46％)。LCMS:839.4[M+H]+。
合成(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-(((2S,3R,4R,5S)-4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)立方烷-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A2-3)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入(4S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(((2S,3R,4R,5S)-4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)立方烷-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A2-2)(0.09g，0.107mmol)和DCM(2mL)。在室温下向此溶液中添加溶解于水(0.1mL)中的Na2CO3(0.022g，0.21mmol)，继而添加溴乙酰溴(0.043g，0.021mmol)并且搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.065g，63.11％)。
LCMS:C50H6179BrN3O11计算值(958.35)，实验值958.2[M+H]+。
合成(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-(((2S,3R,4R,5S)-4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)立方烷-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A2)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-(((2S,3R,4R,5S)-4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)立方烷-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A2-3)(0.065g，0.067mmol)和DCM(3mL)。向此溶液中添加TFA(0.5mL)和三异丙基盐水(催化性)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物，得到呈灰白色固体状的粗标题化合物产物(0.055g粗物质)。LCMS 903.5[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-(((R)-2-氨基-2-羧乙基)硫基)乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-P-CYS)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-P-CYS)(0.1g，0.11mmol)和DMF(1mL)。向此溶液中添加L-半胱氨酸(0.003g，0.12mmol)并在室温下搅拌2小时。LCMS指示反应完成后，冻干反应混合物并且通过反相柱色谱法(乙腈:水，45:55)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.050g，50.11％)。LCMS:907.5[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD:δ:7.47(d,J＝10.4Hz,1H),7.38(d,J＝8.0Hz,2H),7.14(d,J＝8.0Hz,2H),6.28(d,J＝10.0Hz,1H),6.05(s,1H),5.46(s,缩醛-H,1H),5.06(d,J＝5.2Hz,C16H,1H),4.65(d,1H),4.46(m,1H),4.35(d,1H),4.18-4.16(m,1H),3.90(m,2H),3.79(m,1H),3.50-3.00(m,4H),3.00-1.60(m,21H),1.52(s,3H),1.30-1.07(m,2H),1.01(s,3H)。
合成(S)-4-(2-(2-(((R)-2-氨基-2-羧乙基)硫基)乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸化合物与2,2,2-三氟乙酸(INX-V-CYS)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-V)(0.1g，0.11mmol)和DMF(1.5mL)。向此溶液中添加L-半胱氨酸(0.0027g，0.223mmol)并在室温下搅拌16小时。LCMS指示反应完成后，冻干反应混合物。通过制备型HPLC(柱：YMC-ActusTriart Prep C18-S，250X20mm S-5μm，12nm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝MTBE:乙腈(10:90)，A:B＝75:25)纯化分离的粗物质，停留时间12.5分钟，得到呈白色固体状的标题化合物(0.012g，10.24％)。LCMS:935.5[M+H]+；
1H NMR(400MHz,MeOD:δ:7.46(d,J＝10.4Hz,1H),7.34(d,J＝8.0Hz,2H),7.15(d,J＝8.0Hz,2H),6.27(dd,J＝1.4Hz,10Hz,1H),6.04(s,1H),5.45(s,缩醛-H,1H),5.06(d,J＝5.2Hz,C16H,1H),4.66(d,1H),4.45-4.40(m,1H),4.36-4.31(m,2H),4.12(m,1H),4.00-3.92(m,3H),3.50-1.73(m,28H),1.52(s,3H),1.20-1.03(m,2H),1.00(s,3H)。
合成S-(2-((2-(((S)-6-氨基-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)-L-半胱氨酸化合物与2,2,2-三氟乙酸(INX-W-CYS)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入((S)-6-氨基-2-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-N-(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)己酰胺(INX-W)(0.2g，0.23mmol)和DMF(1mL)。向此溶液中添加L-半胱氨酸(0.041g，0.34mmol)并在室温下搅拌2小时。LCMS指示反应完成后，冻干反应混合物。通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE制备型二氧化硅，OBD，150-19mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈，A:B＝76:24)，停留时间19.5分钟)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.020g，8.49％)。LCMS:906.4[M+H]+；
1H NMR(400MHz,MeOD:δ:7.47(d,J＝10.4Hz,1H),7.38(d,J＝8.0Hz,2H),7.14(d,J＝8.0Hz,2H),6.28(d,1H),6.05(s,1H),5.48(s,缩醛-H,1H),5.07(d,J＝5.2Hz,C16H,1H),4.67(d,1H),4.50-4.32(m,3H),3,39(s,2H),3.40-3.00(m,2H),3.00-2.90(m,2H),2.85(s,2H),2.75-1.60(m,22H),1.52(s,3H),1.50-1.35(m,2H),1.20-1.05(m,2H),1.01(s,3H)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-4(2H)-酮2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-34)；和
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-甲酸化合物与2,2,2-三氟乙酸(INX-SM-42)
方案-1
方案-2
方案-3
合成乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-苯甲基-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-34-1)
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入(11β)-21-(乙酰氧基)-11-羟基孕甾-1,4,16-三烯-3,20-二酮(5.0g，13.0mmol)和1,4-二噁烷(50mL)。向此溶液中添加N-(甲氧基甲基)-N-(三甲基甲硅烷基甲基)苯甲胺(30.8g，13.0mmol)和TFA(0.10g，0.9mmol)，并且在110℃下加热反应混合物4小时。TLC指示反应完成后，浓缩反应混合物。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯:己烷，20:80)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(3.0g，44.56％)。LCMS 518.29[M+H]+
合成乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯盐酸盐(INX-SM-34-2)
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-苯甲基-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-34-1)(3.0g，5.79mmol)和乙腈(20mL)。向此溶液中添加NaHCO3(0.97g，11.5mmol)和氯甲酸1-氯乙酯(1.65g，11.59)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，用乙酸乙酯稀释反应混合物并经硅藻土床过滤。在真空下浓缩滤液并且将粗物质与正戊烯和乙醚一起湿磨，得到呈白色固体状的标题化合物(2.0g，74.38％)。LCMS 428.3[M+H]+。
合成(3-(4-溴苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-34-3)
程序：
向10mL玻璃小瓶中装入(E)-(3-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-3-4)(0.05g，0.13mmol)和1,4-二噁烷(2mL)。向此溶液中添加K2CO3(0.039g，0.19mmol)并用N2(g)吹扫1小时。反应混合物中观测到沉淀后，将(4-溴苯基)硼酸(0.039g，0.19mmol)添加至反应物中并在110℃下搅拌3小时。TLC指示反应完成后，用乙酸乙酯稀释反应混合物并用盐水洗涤。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：10:90)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.02g，43.0％)。1H NMR (CDCl3)δ:7.39(d,J＝6.4Hz,2H)),6.96(d,J＝6.4Hz 2H),2.79(s,2H),1.81(s,6H)1.44(s,9H)。
合成(3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-34-4)
程序：
在氮气下向25mL单颈圆底烧瓶中装入(3-(4-溴苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-34-3)(0.5g，1.42mmol)和1,4-二噁烷(10mL)。向此溶液中添加双频哪酮二硼烷(1.07g，4.26mmol)和乙酸钾(0.27g，2.84mmol)，用N2吹扫15分钟。将PdCl2(dppf).DCM(0.12g，0.14mmol)添加至反应混合物中并在110℃下加热2小时。TLC指示反应完成后，在室温下冷却反应混合物并用乙酸乙酯稀释。将其经硅藻土床过滤，并且合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：20:80)纯化粗物质，得到呈灰白色半固体状的标题化合物(0.8g，粗物质)。其用于下一步。
合成(4-((3-((叔丁氧羰基)氨基)双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)硼酸(INX- SM-34-5)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入(3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-34-4)(1.0g，2.5mmol)和丙酮:水(9:1)(10mL)。向此溶液中添加NaIO4(4.28g，20.0mmol)和乙酸铵(1.54g，20.0mmol)，并且在回流温度下搅拌反应混合物2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物冷却至室温，用乙酸乙酯稀释并经硅藻土床过滤。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。将粗物质与正戊烯和乙醚一起湿磨，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.4g，50.3％)。LCMS:262.2[M+1-t-Bu]
合成乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-((叔丁氧羰基)氨基)双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-34-6)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入含乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯盐酸盐(INX-SM-34-2)(0.1g，0.23mmol)和(4-((3-((叔丁氧羰基)氨基)双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)硼酸(INX-SM-34-5)(0.25g，0.81mmol)的乙腈(5mL)。向此溶液中添加KOH(0.13g，2.34mmol)和Cu(OAc)2(0.12g，0.70mmol)，并在室温下搅拌反应混合物2小时。TLC指示反应完成后，用乙酸乙酯稀释反应混合物并经硅藻土床过滤。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：30:70)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.15g，93.31％)。LCMS:699.5[M+H]+。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-4(2H)-酮2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-34)；和
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-甲酸化合物与2,2,2-三氟乙酸(INX-SM-42)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-((叔丁氧羰基)氨基)双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-34-6)(0.13g，0.18mmol)和甲醇(2mL)。向此溶液中添加K2CO3(0.038g，0.27mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用乙酸乙酯稀释反应混合物并经硅藻土床过滤。在真空下蒸发合并的有机层并溶解于DCM(2mL)中。向此溶液中添加TFA(0.2ml)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart Prep C18-S，250X20mm S-5μm，12nm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝MTBE:乙腈(90:10)，A:B＝78:22)纯化粗物质，得到INX-SM-34(0.010g，8.01％)。LCMS:557.30[M+H]+ ； 1H NMR(400MHz,MeOD:δ:7.49(d,J＝10.4Hz,1H),6.94(d,J＝8.8Hz,2H),6.62(d,J＝8.4Hz,2H),6.26(dd,J＝10.0和2.0Hz,1H),5.99(s,1H),4.60-4.25(m,3H),3.60-3.00(m,4H),2.77-1.55(m,18H),1.50(s,3H),1.15(s,3H),1.15-1.00(m,2H)。和INX-SM-42(0.0041g，3.36％)。LCMS:543.3[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD:δ:7.50(d,J＝10.4Hz,1H),6.94(d,J＝8.4Hz,2H),6.60(d,J＝8.4Hz,2H),6.26(dd,J＝10.0和2.0Hz,1H),5.99(s,1H),4.45(br s,1H),3.60-3.30(m,4H),2.77(s,2H),2.70-1.55(m,16H),1.50(s,3H),1.22(s,3H),1.15-1.00(m,2H)。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A13)
合成乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯2,2,2-三氟乙酸盐(INX-A13-1)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-((叔丁氧羰基)氨基)双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-34-6)(0.33g，0.47mmol)和DCM(5mL)。向此溶液中添加TFA(0.1mL)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。将粗物质与乙醚一起湿磨，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.28g，定量)。LCMS:599.5[M+H]+
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-乙酰氧基乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX- A13-2)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.24g，0.50mmol)、乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯2,2,2-三氟乙酸盐(INX-A13-1)(0.3g，0.50mmol)和DMF(2mL)。向此溶液中添加DIPEA(0.16g，1.25mmol)和HATU(0.22g，0.60mmol)并在室温下搅拌15分钟。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。将粗物质与乙醚一起湿磨，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.4g，74.99％)。LCMS:1063.7[M+H]+
合成(S)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-乙酰氧基乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A13-3)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-乙酰氧基乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A13-2)(0.4g，0.37mmol)和THF(5mL)。向此溶液中添加二乙胺(0.55g，7.5mmol)并搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物并与乙醚和戊烷一起湿磨，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.22g，粗物质)。其未经分析即用于下一步。
合成(S)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-乙酰氧基乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A13-4)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-乙酰氧基乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A13-3)(0.22g，0.26mmol)和DCM(4mL)。向此溶液中滴加NaHCO3(0.06g，0.78mmol)于水(1mL)中的溶液和溴乙酰溴(0.04g，0.20mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.24g，粗物质)。其未经纯化即用于下一步。LCMS:963.5[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A13-5)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-乙酰氧基乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A13-4)(0.12g，0.12mmol)和甲醇:H2O(9:1，5mL)。向此溶液中添加NaHCO3(0.020g，0.24mmol)并在室温下搅拌反应混合物6小时。TLC指示反应完成后，用乙酸乙酯稀释反应混合物并经硅藻土床过滤。在真空下蒸发合并的有机层，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.08g，72.46)。LCMS:920.5[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A13)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A13-5)(0.08g，0.08mmol)和DCM(5mL)。向此溶液中添加TFA(0.4ml)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(SUNFIRE Prep C18 OBD，19x250mm，5μm，流动相：A＝含0.1％FA的水，B＝乙腈，A:B＝58:42，停留时间13分钟)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.007g，10.12％)。LCMS:863.4[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ7.48(d,J＝10Hz,1H),6.95-6.80(m,3H),6.60(d,J＝8.8Hz,1H),6.26(d,1H),5.99(m,1H),4.51-3.50(m,8H),3.51-2.60(m,4H),2.50-2.00(s,8H),2.00-1.20(m,22H)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-4(2H)-酮(INX-SM-37)
合成(6-(4-溴苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-37-1)
程序：
向100ml单颈圆底闪蒸器中装入(E)-(6-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-32-3)(2.0g，0.49mmol)和二噁烷(80mL)。在室温下向此溶液中添加(4-溴苯基)硼酸(1.47g，0.73mmol)和K2CO3(1.0g，0.73mmol)并在100℃下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯:己烷，5:95)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.4g，21.43％)。LCMS:380[M+H]+。
步骤-5：(6-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-37-2)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入(6-(4-溴苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-37-1)(0.2g，0.5mmol)和二噁烷(6mL)。向此溶液中添加双(频哪醇合)二硼(0.39g，0.15mmol)和KOAc(0.1g，0.10mmol)并用N2吹扫30分钟。向此溶液中添加Pd(dppf)Cl2·CH2Cl2(0.04g，0.05mmol)并在100℃下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯:己烷，5:95)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.3g，定量)。LCMS:327.2[[M+H-Boc]+]。
合成(4-((6-((叔丁氧羰基)氨基)螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)硼酸(INX-SM-37- 3)
程序：
向25ml单颈圆底闪蒸器中装入(6-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-37-2)(IBIS-T-66-A2)(0.3g，0.70mmol)和丙酮:水(9:1，3mL)。在室温下向此溶液中添加NaIO4(1.2g，5.6mmol)和CH3COONH4(0.43g，0.56mmol)并在50℃下搅拌3小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.18g，74.87％)。LCMS:245.7[[M+H-Boc]+]。
合成乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-((叔丁氧羰基)氨基)螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-37-4)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯盐酸盐(INX-SM-34-2)(0.12g，0.28mmol)、(4-((6-((叔丁氧羰基)氨基)螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)硼酸(INX-SM-37-3)(0.29g，0.84mmol)和乙腈(12mL)。向此溶液中添加KOH(0.15g，2.80mmol)和Cu(OAc)2(0.15g，0.84mmol)，并在室温下搅拌反应混合物2小时。TLC指示反应完成后，用乙酸乙酯稀释反应混合物并经硅藻土过滤。收集的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，50:50)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.060g，31.91％)。LCMS:727.6[M+H]+。
合成(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-37-5)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-((叔丁氧羰基)氨基)螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-37-4)(0.06g，0.082mmol)和甲醇(1mL)。向此溶液中添加NaHCO3(0.013g，0.16mmol)并在室温下搅拌16小时。TLC指示反应完成后，浓缩反应混合物，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.060g，定量)。LCMS:585.4[[M+H]+-Boc]。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-4(2H)-酮(INX-SM-37)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-37-5)(0.050g)和DCM(2mL)。向此溶液中添加TFA(0.5ml)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart Prep C18-S，250X20mm S-5μm，12nm，流动相：A＝含0.1％FA的水，B＝乙腈；停留时间10.27分钟)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.011g，23.42％)。LCMS:585.4[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD)δ:7.48(d,J＝10Hz,1H),6.95-6.83(m,3H),6.58(d,J＝8.8Hz,1H),6.26(d,10.0Hz,1H),5.98(s,1H),4.50-3.00(m,8H),2.60-1.55(m,21H),1.50(s,3H),1.20-1.05(m,2H),1.06(s,3H)。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A10)
合成乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX- A10-1)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-((叔丁氧羰基)氨基)螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-37-4)(0.3g)和DCM(5mL)。向此溶液中添加TFA(1mL)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物，并且通过与乙醚一起湿磨来纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.30g，定量)。LCMS:627.41[M+H]+
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-乙酰氧基乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A10-2)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.230g，0.47mmol)、乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-A10-1)(0.3g，0.47mmol)和DMF(6mL)。向此溶液中添加DIPEA(0.185g，1.25mmol)和HATU(0.27g，0.71mmol)并在室温下搅拌15分钟。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中，并且过滤固体并在真空下干燥。通过硅胶柱色谱法(水/乙腈，13:87)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.380g，74.0％)。LCMS:1091.7[M+H]+。
合成(S)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-乙酰氧基乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A10-3)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-乙酰氧基乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A10-2)(0.3g，0.27mmol)和THF(54mL)。在室温下向此溶液中添加二乙胺(0.20g，2.7mmol)并搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物并与乙醚-戊烷一起湿磨，得到呈白色固体状的标题化合物(0.22g，93.75％)。LCMS:869.7[M+H]+。
合成(S)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-乙酰氧基乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A10-4)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-乙酰氧基乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A10-3)(0.22g，0.25mmol)和DCM(3mL)。在室温下向此溶液中添加溶解于水(1mL)中的NaHCO3(0.053g，0.50mmol)和溴乙酰溴(0.076g，0.37mmol)并搅拌30分钟。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.21g，84.8％)。LCMS:989.6[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A10-5)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-乙酰氧基乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A10-4)(0.210g，0.21mmol)和甲醇(2mL)。向此溶液中添加NaHCO3(0.035g，0.42mmol)并在室温下搅拌反应混合物16小时。TLC指示反应完成后，用乙酸乙酯稀释反应混合物并经硅藻土床过滤。浓缩合并的有机层，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.220g，定量)。LCMS:947.3[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A10)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A10-5)(0.220g，0.232mmol)和DCM(3mL)。向此溶液中添加TFA(1.5ml)并在室温下搅拌反应混合物1小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(SUNFIRE PrepC18 OBD(250x19)mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈，A:B＝55:45，停留时间：15.67分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.026g，12.56％)。LCMS:891.5[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD:δ:7.48(d,J＝10Hz,1H),6.95(d,J＝8.4Hz,2H),6.62(d,J＝8.4Hz,2H),6.26(dd,J＝10.0和2.0Hz,1H),5.99(s,1H),4.50-4.27(m,4H),4.20-3.80(m,5H),3.60-2.90(m,4H),2.50-1.55(m,25H),1.50(s,3H),1.20-1.00(m,2H),1.07(s,3H)。
合成(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-氨基苯甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-4(2H)-酮(INX-SM-28)
方案-1
方案-2
方案-3
合成乙酸2-((6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S)-6,9-二氟-11-羟基-10,13-二甲基-3-氧代-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15-十氢-3H-环戊二烯并[a]菲-17-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-28-1)
程序：
向100mL密封管中装入二氟泼尼酯(Difluprednate)(5.0g，9.84mmol)和DMF(50mL)。向此溶液中添加乙酸钾(7.71g，7.87mmol)并在100℃下搅拌16小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并且过滤固体，获得呈白色固体状的标题化合物(4.0g，96.76％)。LC/MS:421.3[M+H]+。
合成乙酸2-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-苯甲基-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-28-2)
/>
程序：
向100mL玻璃密封管中装入乙酸2-((6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S)-6,9-二氟-11-羟基-10,13-二甲基-3-氧代-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15-十氢-3H-环戊二烯并[a]菲-17-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-28-1)(4.0g，9.523mmol)和1,4-二噁烷(40mL)。向此反应混合物中添加TFA(0.076g，0.666mmol)并且将N-苯甲基-1-甲氧基-N-((三甲基硅烷基)甲基)甲胺(22.5g，95.23mmol)添加至反应混合物中，并在110℃下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下浓缩。通过硅胶柱色谱法(EtOAc/己烷，32:68)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(3.5g，66.45％)。LC/MS:554.3[M+H]+。
合成乙酸2-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-28-3)
程序：
向100mL玻璃密封管中装入乙酸2-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-苯甲基-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-28-2)(3.5g，6.329mmol)和乙腈(35mL)。在室温下向此溶液中添加NaHCO3(1.06g，12.66mmol)和氯甲酸1-氯乙酯(1.81g，12.658mmol)，并且在50℃下搅拌反应混合物4小时。TLC指示反应完成后，用EtOAc稀释反应混合物并用H2O洗涤。有机层经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。通过反相柱色谱法(乙腈:水，25:75)纯化粗物质，获得呈白色固体状的标题化合物(1.6g，54.60％)。LC/MS:464.3[M+H]+。
合成(4-溴苯基)(3-硝基苯基)甲酮(INX-SM-28-4)
程序：
向250mL单颈圆底烧瓶中装入3-硝基苯甲酰氯(10.0g，0.054mol)和溴苯(70mL)。在0℃下向此溶液中添加氯化铝(7.1g，0.054mmol)并在80℃下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，用H2O稀释反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，10:90)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(14.0g，84.64％)。1H NMR(DMSO-d6)δ8.51(d,J＝8.4Hz,1H),8.43(s,1H),8.16(d,J＝7.6Hz,1H),7.87-7.71(m,5H)。
合成(4-溴苯基)(3-硝基苯基)甲醇(INX-SM-28-5)
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入(4-溴苯基)(3-硝基苯基)甲酮(INX-SM-28-4)(13.0g，0.042mol)和THF(100mL)。在室温下向此溶液中添加硼氢化钠(1.5g，0.042mmol)并再搅拌2小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈胶粘固体状的标题化合物(13.0g，99.35％)。1H NMR(DMSO-d6)δ8.24(s,1H),8.10(d,J＝8.4Hz,1H),7.81(d,J＝7.6Hz,1H),7.60(dd,J＝8Hz,1H),7.53(d,J＝8.4Hz,2H),7.38(d,J＝8.4Hz,2H),6.35(brs,1H),5.88(s,1H)。
合成1-(4-溴苯甲基)-3-硝基苯(INX-SM-28-6)
程序：
向250mL单颈圆底闪蒸器中装入(4-溴苯基)(3-硝基苯基)甲醇(INX-SM-28-5)(14.0g，0.045mol)和氯仿(50mL)。在0℃下向此溶液中添加三氟甲磺酸(27.0g，0.18mol)和三乙基硅烷(5.27g，0.045mol)并且在0℃下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用NaHCO3溶液淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：10:90)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(8.0g，60.8％)。1H NMR(DMSO-d6)δ8.11(s,1H),8.08(d,J＝8.0Hz,1H),7.72(d,J＝7.6Hz,1H),7.59(dd,J＝8Hz,1H),7.51(d,J＝8.4Hz,2H),7.27(d,J＝8.0Hz,2H),4.08(s,2H)。
合成3-(4-溴苯甲基)苯胺(INX-SM-28-7)
程序：
向250mL单颈圆底闪蒸器中装入1-(4-溴苯甲基)-3-硝基苯(8.0g，0.027mol)和乙醇:水(1:1，100mL)。在室温下向此溶液中添加锌粉(14.0g，0.21mmol)和(INX-SM-28-6)氯化铵(11.8g，0.21mmol)并搅拌2小时。TLC指示反应完成后，经硅藻土过滤反应混合物并在真空下蒸发滤液，得到呈灰白色固体状的标题化合物(7.0g，98.8％)。LCMS:262.1[M+H]+。
合成(3-(4-溴苯甲基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-28-8)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入3-(4-溴苯甲基)苯胺(INX-SM-28-7)(7.0g，0.026mol)和THF(20mL)。在0℃下向此溶液中添加TEA(5.3g，0.053mol)和boc酸酐(8.7g，0.040mol)并在室温下搅拌16小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：10:90)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(14g，粗物质)。其未经进一步纯化即用于下一步。LCMS:361.7[[M+H片段化]。
合成(3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯甲基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-28-9)
程序：
在氮气下向25mL单颈圆底烧瓶中装入(3-(4-溴苯甲基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-28-8)(14.0g，0.038mol)和1,4-二噁烷(30mL)。向此溶液中添加双频哪酮二硼烷(14.4g，0.057mol)和乙酸钾(7.4g，0.076mol)，并用N2吹扫反应混合物15分钟。添加PdCl2(dppf).DCM(3.1g，0.0038mol)并在110℃下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在室温下冷却反应混合物，用乙酸乙酯稀释并经硅藻土床过滤。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：20:80)纯化粗物质，得到呈灰白色半固体状的标题化合物(20.0g，粗物质)。LCMS:410.4[M+H]+。
合成(4-(3-((叔丁氧羰基)氨基)苯甲基)苯基)硼酸(INX-SM-28-10)
程序：
向1000mL单颈圆底烧瓶中装入(3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯甲基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-28-9)(20.0g，0.048mol)和丙酮:水(9:1，200mL)。向此溶液中添加NaIO4(81.7g，0.38mol)和乙酸铵(29.26g，0.38mol)并在回流下加热2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物冷却至室温，用乙酸乙酯稀释并经硅藻土过滤。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。将粗物质与正戊烯和乙醚一起湿磨，得到呈灰白色固体状的标题化合物(15.0g，95.5％)。LCMS:328.2[[M+H]+
合成乙酸2-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-((叔丁氧羰基)氨基)苯甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-28-11)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入乙酸2-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-28-3)(0.320g，0.691mmol)和乙腈(35mL)。向此溶液中添加(4-(3-((叔丁氧羰基)氨基)苯甲基)苯基)硼酸(INX-SM-28-10)(1.01g，3.109mmol)、KOH(0.387g，6.910mmol)和Cu(OAC)2(0.375g，2.073mmol)，在60℃下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用EtOAc稀释反应混合物并且经硅藻土过滤并在真空下浓缩。通过二氧化硅柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，30:70)纯化粗物质，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.095g，18.59％)。
LC/MS:745.4[M+H]+。
合成(3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-28-12)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入乙酸2-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-((叔丁氧羰基)氨基)苯甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-28-11)(0.095g，0.127mmol)和甲醇(2mL)。向此溶液中添加碳酸钾(0.027g，0.191mmol)并在室温下搅拌反应混合物30分钟。TLC指示反应完成后，用EtOAc稀释反应混合物并用H2O洗涤。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下浓缩，得到呈黄色固体状的粗标题化合物产物(0.085g，95.2％)。LCMS:703.4[M+H]+
合成(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-氨基苯甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-4(2H)-酮(INX-SM-28)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入(3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-28-12)(0.085g，0.121mmol)和DCM(2mL)。向此溶液中添加TFA(0.1mL)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，在真空下浓缩反应混合物。通过制备型HPLC(柱：C18，250*21.2mm，5μm，流动相A＝含0.05％三氟乙酸的水，B＝乙腈:甲醇:IPA(65:25:10)，A:B＝65:35；停留时间15.32分钟)纯化粗物质，获得呈黄色固体状的标题化合物(0.005g，6.86％)。LC/MS:603.3[M+H]+
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-氨基苯甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-4(2H)-酮(INX-SM-40)
合成乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(4-((叔丁氧羰基)氨基)苯甲基)苯基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-40- 1)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入含乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯盐酸盐(INX-SM-34-2)(0.4g，0.93mmol)和(4-(3-((叔丁氧羰基)氨基)苯甲基)苯基)硼酸(INX-SM-28-10)(1.07g,3.27mmol)的乙腈(40mL)。向此溶液中添加KOH(0.52g，9.36mmol)和Cu(OAc)2(0.50g，2.81mmol)并在室温下搅拌反应混合物3小时。TLC指示反应完成后，用乙酸乙酯稀释反应混合物并经硅藻土过滤。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯:己烷，30:70)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.1g，15.8％)。LCMS:709.5[M+H]+。
合成(4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-40-2)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(4-((叔丁氧羰基)氨基)苯甲基)苯基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-40-1)(0.13g，0.18mmol)和甲醇:水(2mL)。向此溶液中添加NaHCO3(0.030g，0.36mmol)，在室温下搅拌反应混合物12小时。TLC指示反应完成后，用乙酸乙酯稀释反应混合物并经硅藻土过滤。蒸发合并的有机层，得到呈灰白色固体状的粗INX-SM-40-2产物(0.06g 49.98％)。MS:667.4[M+H]+。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-氨基苯甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-4(2H)-酮(INX-SM-40)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入(4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-40-2)(0.06g，0.08mmol)和DCM(2mL)。向此溶液中添加TFA(0.12mL)并在室温下搅拌反应混合物2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart Prep C18-S，250X20mm S-5μm，12nm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈，A:B＝66:34，停留时间14.5分钟)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.004g，8.82％)LCMS:567[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD:δ:7.48(d,J＝10Hz,1H),7.39(t,J＝8.0Hz,1H),7.25(d,J＝7.6Hz,1H),7.11(d,J＝7.6Hz 1H),7.06(s,1H),7.03(d,J＝8.4Hz,2H),6.62(d,J＝8.4Hz,2H),6.26(dd,J＝10.0和2.0Hz,1H),5.99(s,1H),4.60-4.30(m,3H),3.91(s,2H),3.60-3.00(m,4H),2.70-1.55(m,10H),1.50(s,3H),1.10(s,3H),1.10-0.95(m,2H)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-47)
合成(E)-6-((2甲苯磺酰亚肼基)甲基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸叔丁酯(INX- SM-47-1)
程序：
在氮气气氛下向35mL玻璃小瓶中装入6-甲酰基-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸叔丁酯(0.2g，0.880mmol)和EtOH(10mL)。向此溶液中添加对甲苯磺酰肼(0.247g，1.33mmol)和催化性AcOH(0.1mL)并在室温下搅拌0.5小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中，并且过滤固体沉淀物并在真空下干燥，得到呈白色固体状的标题化合物(0.3g，85.88％)。LCMS:394.2[M+H]+。
合成6-(4-甲酰基苯甲基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸叔丁酯(INX-SM-47-2)
/>
程序：
在氮气气氛下向35mL玻璃小瓶中装入(E)-6-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸叔丁酯(INX-SM-47-1)(0.3g，0.762mmol)和二噁烷(5mL)。在室温下向此溶液中添加(4-甲酰基苯基)硼酸(0.171g，1.14mmol)和K2CO3(0.158g，1.14mmol)并在100℃下再搅拌3小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：50:50)纯化粗物质，得到呈黄色胶粘固体状的标题化合物(0.065g，27.86％)。LCMS:316.2[M+H]+。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-47)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入6-(4-甲酰基苯甲基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸叔丁酯(INX-SM-47-2)(0.065g,0.206mmol)、(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.077g，0.206mmol)和DCM(2mL)。向此溶液中添加MgSO4(0.103g，1.03mmol)和HClO4(0.123g，1.03mmol)并在室温下再搅拌1.5小时。TLC指示反应完成后，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应混合物并在真空下浓缩。将粗物质与冷水一起湿磨，并且过滤沉淀物并在真空下干燥。通过制备型HPLC(柱：YMC-PACK ODS-AQPrep C18-S，250X20mm S-5μm，12nm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈:甲醇:2-丙醇(65:25:10)，A:B＝58:42，停留时间12.23分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.025g，17.77％)。LCMS:574.5[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ:7.47(d,J＝10.0Hz,1H),7.37(d,J＝8.0Hz,2H),7.18(d,J＝8.4Hz,2H),6.27(dd,J＝10.0和2.0Hz,1H),6.04(s,1H),5.46(s,缩醛H,1H),5.07(d,J＝5.2Hz,C16-H 1H),4.63(d,J＝19.6Hz,1H),4.45-4.44(s,1H),4.33(d,J＝19.6Hz 1H),4.07(s,2H),3.95(s,2H),2.75-1.73(m,16H),1.50(s,3H),1.05-1.05(m,2H),1.01(s,3H)。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基)-5-氧代戊酸(INX-A19)
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A19- 1)
程序：
向50mL单颈圆底闪蒸器中装入含(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.605g，1.25mmol)和HATU(0.596g,1.56mmol)的DMF(6mL)。在室温下向此溶液中添加DIPEA(0.405g，3.13mmol)，继而添加6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-47)(0.6g，1.04mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到粗产物。通过反相柱色谱法(ACN:水，70:30)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.20g，18.42％)。LCMS:1038.8[M+H]+。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A19-2)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A19-1)(0.2g，0.192mmol)和THF(2mL)。向此溶液中添加二乙胺(0.140g，1.92mmol)并在室温下搅拌2.5小时。TLC指示反应完成后，在真空下浓缩反应混合物。将粗物质与DCM和己烷一起湿磨，得到呈白色固体状的标题化合物(0.12g，76.34％)。LCMS:816.6[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A19-3)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A19-2)(0.120g，0.147mmol)和DCM(1mL)。在室温下向此溶液中添加溶解于水(0.1mL)中的Na2CO3(0.031g，0.294mmol)，继而添加溴乙酰溴(0.029g，0.147mmol)并搅拌0.5小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.095g，68.95％)。LCMS:C48H6379BrFN3O11计算值(936.36)，实验值936.4[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基)-5-氧代戊酸(INX-A19)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入含(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A19-3)(0.095g，0.101mmol)的DCM(3mL)。在室温下向此溶液中添加TFA(0.2ml)并搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱：新型X-bridge Prep，C18，OBD(250x19)mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝ACN，A:B＝68:32，停留时间13.59分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.006g，6.72％)。LCMS:C44H5579BrFN3O11计算值(880.3)，实验值880.2[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ7.47(d,J＝10.0Hz,1H),7.36(d,J＝7.6Hz,2H),7.20-7.17(m,2H),6.27(dd,J＝10.0和2.0Hz,1H),6.04(s,1H),5.45(s,1H),5.06(d,J＝5.2Hz,1H),5.00-3.80(m,12H),2.75-1.65(m,20H),1.51(s,3H),1.18-1.05(m,2H),1.03(s,3H)。
合成(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(((1r,4R)-4-氨基环己基)甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-14)
合成((1r,4r)-4-(羟甲基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-14-1)
程序：
在100mL单颈圆底烧瓶中，将(1r,4r)-4-((叔丁氧羰基)氨基)环己烷-1-甲酸(3.0g，12.34mmol)溶解于THF(30mL)中，并且在0℃下添加硼烷二甲硫醚(BH3.DMS)(3.0mL，6.17mmol)。在0℃下搅拌反应混合物30分钟。TLC指示反应完成后，用稀释液淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈白色固体状的标题化合物(3.0g，粗物质)。其未经纯化即用于下一步。LCMS:230.2[M+H]+。
合成((1r,4r)-4-甲酰基环己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-14-2)
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中添加((1r,4r)-4-(羟甲基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-14-1)(3.0g，13.08mmol)于DCM(30mL)中的溶液。在0℃下向此溶液中添加DMP(6.6g，15.72mmol)并在室温下再搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用NaHCO3溶液淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈白色固体状的粗标题化合物(3.0g，粗物质)。其未经分析即直接用于下一步。
合成((1r,4r)-4-((E)-(2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(INX- SM-14-3)
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入((1r,4r)-4-甲酰基环己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-14-2)(3.0g，13.21mmol)和乙醇(30mL)。向此溶液中添加对甲苯磺酰肼(3.6g，19.82mmol)和催化量的AcOH(0.1mL)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中，并且过滤形成的固体并在真空下干燥，得到呈白色固体状的标题化合物(3.5g，67.05％)。LCMS:396.2[M+H]+。
合成((1r,4r)-4-(4-甲酰基苯甲基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-14-4)
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入((1r,4r)-4-((E)-(2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-14-3)(2.0g，5.06mmol)和二噁烷(20mL)。向此溶液中添加K2CO3(1.0g，7.50mmol)并用N2吹扫反应混合物20分钟。向此溶液中添加(4-甲酰基苯基)硼酸(1.13g，7.58mmol)并且再回流2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：50:50)纯化粗物质，得到呈黄色粘性固体状的标题化合物(0.6g，37.38％)。LCMS:318.3[M+H]+。
合成(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(((1r,4R)-4-氨基环己基)甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-14)
程序：
向10ml玻璃小瓶中装入含((1r,4r)-4-(4-甲酰基苯甲基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-14-4)(0.10g，0.31mmol)和(6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-二氟-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(INX-SM-25-1)(0.13g，0.31mmol)的DCM(2mL)。在0℃下向此溶液中添加MgSO4(0.18g，1.50mmol)和HClO4(0.26g，2.6mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart Prep C18-S，250X20mm S-5μm，12nm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈；A:B＝70:30，停留时间15.92分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.015g，7.78％)。LCMS:612.3[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.62(brs,3H),7.35(d,J＝8Hz,2H),7.27(d,J＝9.6Hz,1H),7.18(d,J＝8Hz,2H),6.30(dd,J＝10Hz,1H),6.13(s,1H),5.70-5.60(m,1H),5.56(brs,1H),5.5.46(s,缩醛-H,1H),5.14(t,1H),5.09(d,J＝4.4Hz,C16-H,1H),4.53-4.48(m,1H),4,24-4.18(m,2H),2.94-2.88(m,1H),2.60-1.40(m,15H),1.45(s,3H),1.23-0.98(m,4H),0.87(s,3H)。
(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(((1s,4S)-4-氨基环己基)甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-15)的合成方案
/>
合成((1s,4s)-4-羟甲基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-15-1)
INX-SM-15-1
程序：
向50ml圆底烧瓶中装入(1s,4s)-4-((叔丁氧羰基)氨基)环己烷-1-甲酸(2.5g，10.28mmol)和THF(25mL)。在0℃下向此溶液中添加硼烷.DMS(2M，于THF中)(12.34mL，30.60mmol)并在室温下再搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用MeOH和稀HCl淬灭反应混合物。用乙酸乙酯萃取反应混合物。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈白色固体状的标题化合物(2.3g，97.61％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ6.67(d,J＝7.2Hz,1H),4.35(t,J＝5.6Hz,1H),3.44(br s,1H),3.25(t,J＝6.0Hz,1H),1.50-1.43(m,19H)。
合成((1s,4s)-4-甲酰基环己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-15-2)
程序：
向50ml单颈圆底烧瓶中装入((1s,4s)-4-羟甲基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-15-1)(2.3g，10.03mmol)和DCM(25mL)。在室温下向此溶液中添加DMP(6.4g，15.09mmol)并再搅拌2小时。TLC指示反应完成后，用NaHCO3溶液淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈淡黄色胶粘固体状的标题化合物(2.3g粗物质)。其未经分析即用于下一步。
合成((1s,4s)-4-((E)-(2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(INX- SM-15-3)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入((1s,4s)-4-甲酰基环己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-15-2)(2.3g，10.12mmol)和EtOH(25mL)。向此溶液中添加对甲苯磺酰肼(1.88g，10.12mmol)和乙酸(催化性)并在室温下再搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，1:1)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(2.5g，62.47％)。LCMS:394.4[M-H]+。
合成((1s,4s)-4-(4-甲酰基苯甲基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-15-4)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入((1s,4s)-4-((E)-(2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-15-3)(0.85g，2.15mmol)和二噁烷(10mL)。向此溶液中添加(4-甲酰基苯基)硼酸(0.30g，2.02mmol)和K2CO3(0.45g，3.23mmol)并在100℃再回流2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，1:1)纯化粗物质，得到呈淡黄色胶粘固体状的标题化合物(0.15g，21.99％)。LCMS:318.3[M+H]+。
合成(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(((1s,4S)-4-氨基环己基)甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-15)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入((1s,4s)-4-(4-甲酰基苯甲基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-15-4)(0.15g，0.47mmol)和DCM(3mL)。向此溶液中添加(6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-二氟-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(INX-SM-25-1)(0.15g，0.37mmol)、MgSO4(0.28g 2.36mmol)和HClO4(0.23g，2.36mmol)并在室温下搅拌3小时。TLC指示反应完成后，用NaHCO3淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过制备型HPLC(柱：新型X-bridge Prep，C18，OBD(250x19)mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈；A:B＝80:20，停留时间10.00分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.030g，10.38％)。LCMS:612.2[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ:7.69(br s,3H),7.36(d,J＝10.0,2H),7.28(d,J＝10.2,1H),7.19(d,J＝10.0,2H),6.30(dd,J＝10.0和2.0Hz,2H),5.74-5.60(m,2H),5.56(br s,1H),5.46(s,缩醛-H,1H),5.14(t,J＝6.0,1H),4.96(d,J＝4.4Hz,C16-H,1H),4.65-4.20(m,3H),3.25-3.10(m,1H),2.62-2.1.60(m,12H),1.50(s,3H),1.46-1.30(m,4H),1.20(s,3H)。
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯甲基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-4(2H)-酮(INX-SM-17)的合成方案
合成乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-((叔丁氧羰基)氨基)双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯甲基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯氨基甲酸盐(INX-SM-17-1)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入含乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(0.5g，1.17mmol)(INX-SM-34-2)和(3-(4-甲酰基苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(0.352g，1.17mmol)(INX-SM-3-5)的二噁烷(5mL)。向此溶液中添加AcOH(0.070g，1.16mmol)和NaCNBH3(0.088g，1.4mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用EtOAC萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯，30:70)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.1g，12％)。LCMS:713.7[M+H]+。
合成(3-(4-(((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)甲基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-17-2)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-((叔丁氧羰基)氨基)双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯甲基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯氨基甲酸盐(INX-SM-17-1)(0.1g，0.14mmol)和甲醇(2mL)。向此溶液中添加NaHCO3(0.023g，0.28mmol)并在室温下搅拌16小时。TLC指示反应完成后，用乙酸乙酯稀释反应混合物并经硅藻土过滤。浓缩合并的有机层，得到呈灰白色固体状的粗标题化合物产物(0.080g，85.01％)。LCMS:671.5[M+H]+。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯甲基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-4(2H)-酮2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-17)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(3-(4-(((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)甲基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-17-2)(0.080g)和DCM(2mL)。在室温下向此溶液中添加TFA(1mL)并搅拌1小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。将粗物质与乙醚和正戊烷一起湿磨，得到呈白色固体状的标题化合物(0.070g，定量)。LCMS:571.4[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ:7.47(d,J＝10.0Hz,1H),7.42(d,J＝8.0Hz,2H),7.25(d,J＝10.0Hz,2H),6.28(d,J＝9.2Hz,1H),6.05(s,1H),4.48-4.26(m,5H),3.87-3.77(m,2H),3.60-3.20(m,2H),2.96(s,2H),2.90-2.60(m,2H),2.50-2.00(m,4H),1.89(s,6H),1.70-1.55(m,2H),1.51(s,3H),1.30-1.19(m,3H),1.07(s,3H)
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A29)
合成乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-氨基苯甲基)苯基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-29-A-1)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(4-((叔丁氧羰基)氨基)苯甲基)苯基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-40-1)(0.38g，0.53mmol)和DCM(1mL)。向此溶液中添加TFA(1.2mL)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物并湿磨，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.22g，67.42％)。LCMS:609.4[M+H]+。
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-乙酰氧基乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-29-A-2)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.39g，0.85mmol)、乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-氨基苯甲基)苯基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-29A-1)(0.5g，0.85mmol)和DMF(2mL)。向此溶液中添加DIPEA(0.26g，2.05mmol)和HATU(0.37g，0.98mmol)并在室温下搅拌15分钟。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。将粗物质与乙醚一起湿磨，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.26g，29.47％)。LCMS1073.9[M+H]+。
合成(S)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-乙酰氧基乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)苯基)氨基)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-29-A-3)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-乙酰氧基乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-29-A-2)(0.26g，0.24mmol)和THF(5mL)。向此溶液中添加二乙胺(0.17g，2.4mmol)并搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物并与乙醚和戊烷一起湿磨，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.14g，67.89％)。LCMS:851[M+H]+。
合成(S)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-乙酰氧基乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)苯基)氨基)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-29-A-4)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-乙酰氧基乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)苯基)氨基)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-29-A-3)(0.14g，0.16mmol)和DCM(2mL)。在室温下向此溶液中滴加NaHCO3(0.04g，0.49mmol)于水(1mL)中的溶液和溴乙酰溴(0.05g，0.24mmol)并且搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.18g，定量)。LCMS:C51H6479BrFN4O10计算值(971.38)，实验值971.80[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-29-A-5)
INX-29-A-5
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-乙酰氧基乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)苯基)氨基)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-29-A-4)(0.18g，0.18mmol)和甲醇:H2O(9:1，2mL)。向此溶液中添加NaHCO3(0.03g，0.37mmol)并在室温下搅拌6小时。TLC指示反应完成后，用乙酸乙酯稀释反应混合物并经硅藻土床过滤。浓缩合并的有机层，得到呈灰白色固体状的粗标题化合物产物(0.17g 98.71％)。LCMS:C49H6279BrFN4O9计算值(929.37)，实验值929.70[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-29-A)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10(2H)-基)苯甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-29-A-5)(0.17g，0.18mmol)和DCM(1mL)。在室温下向此溶液中添加TFA(0.85mL)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(YMC-Actus Triart Prep C18-S，250X20mm S-5μm，12nm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝CAN，A:B＝55:45，停留时间14分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.025g 15.65％)。LCMS:C45H5479BrFN4O9计算值(873.31)，实验值873.20[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ:7.47(d,J＝10.0Hz,1H),7.42-7.37(m,2H),7.20(d,J＝8.0Hz,1H),7.03(d,J＝8.4Hz,2H),6.93(d,J＝7.2Hz,＝1H),6.64(d,J＝8.4Hz,＝2H),6.26(dd,J＝10.0和1.6Hz,1H),5.99(s,1H),4.53-4.26(m,4H),3.93-3.92(m,3H),3.83(s,2H),3.57-2.98(m,6H),2.70-1.56(m,12H),1.50(s,3H),1.07(m,5H)。
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯甲酰基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-4(2H)-酮(INX-SM-16)的合成方案
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入(E)-(3-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-3-4)(1.0g，2.64mmol)、二噁烷(20mL)和K2CO3(0.576g，3.95mmol)，用N2(g)脱气直至观测到白色沉淀物。添加4-(甲氧羰基)苯基)硼酸(0.75g，3.95mmol)并在110℃下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到粗产物。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷：1:1)纯化粗物质，得到呈无色液体状的标题化合物(0.4g，45.80％)。1HNMR(CDCl3)δ:7.97(d,J＝8.4Hz,2H),7.18(d,J＝8Hz,2H),4.89(s,1H),3.92(s,3H),2.89(s,2H),1.83(s,6H),1.46(s,9H)。
合成4-((3-((叔丁氧羰基)氨基)双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯甲酸(INX-SM-16- 2)
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入4-((3-((叔丁氧羰基)氨基)双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯甲酸甲酯(INX-SM-16-1)(0.9g，2.72mmol)和THF:H2O(1:1，6mL)。向此溶液中添加LiOH.H2O(0.65g，16.3mmol)并在50℃下搅拌5小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用10％MeOH:DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈白色固体状的标题化合物(0.8g，92.82％)。1H NMR(DMSO-d6)δ:12.56(brs,1H)7.85(d,J＝8.4Hz,2H),7.41(brs,1H),7.27(d,J＝8.4Hz,2H),2.85(s,2H),1.77(s,6H),1.23(s,9H)。
合成乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-((叔丁氧羰基)氨基)双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯甲酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-16-3)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入含4-((3-((叔丁氧羰基)氨基)双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯甲酸(INX-SM-16-2)(0.18g，0.56mmol)和乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-34-2)(0.29g，0.68mmol)的DMF(2mL)。在室温下向此溶液中添加DIPEA(0.8g，1.4mmol)和HATU(0.32g，0.85mmol)并搅拌15分钟。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。将粗物质与乙醚一起湿磨，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.19g，38.53％)。粗标题化合物按原样用于下一步。LCMS:727.43[M+H]+。
合成(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10-羰基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-16-4)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入乙酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-((叔丁氧羰基)氨基)双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯甲酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-16-3)(0.19g，0.26mmol)和甲醇(1mL)。向此溶液中添加NaHCO3(0.04g，0.53mmol)并在室温下搅拌12小时。TLC指示反应完成后，用乙酸乙酯稀释反应混合物并经硅藻土床过滤。浓缩合并的有机层，得到呈灰白色固体状的标题化合物粗产物(0.17g，粗物质)。LCMS:585.29[M+H-Boc]+。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯甲酰基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-4(2H)-酮(INX-SM- 16)
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-10-羰基)苯甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-16-4)(0.2g，0.29mmol)和DCM(1mL)。向此溶液中添加TFA(60.4ml)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱：新型X-bridge Prep，C18，OBD(250x19)mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝含20％A线的乙腈+5％四氢呋喃，A:B＝75:25)纯化粗物质，得到标题化合物(0.02g11.71％)。LCMS:585.50[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ:7.50-7.39(m,3H),7.23(d,J＝7.6Hz,2H),7.30-7.27(m,1H),6.04(s,1H),4.57-3.54(m,7H),2.97(s,2H),2.80-2.00(m,6H),1.90(s,6H),1.89-1.60(m,2H),1.50(s,3H),1.45-1.12(m,4H),1.10(s,3H)。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环丁基)(甲基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A21)
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环丁基)(甲基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX- A21-1)
程序：
在室温下向50mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.34g，1.65mmol)、HATU(0.40，1.05mmol)、DIPEA(0.18g，1.41mmol)和DMF(3mL)。向此溶液中添加(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-10-(4-((3-(甲基氨基)环丁基)甲基)苯基)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-49)(0.39g，0.7mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈/水：60:40)纯化粗物质，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(0.3g，42.10％)。LCMS:1026.92[M+H]+。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环丁基)(甲基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A21-2)
程序：
向50mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环丁基)(甲基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A-21-1)(0.3g，0.29mmol)和THF(4100mL)。在室温下向此溶液中添加二乙胺(0.21g，2.9mmol)并在室温下搅拌3小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.18g，76.59％)LCMS:804.41[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环丁基)(甲基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A21-3)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入含(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环丁基)(甲基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A21-2)(0.18g，0.22mmol)的DCM(2mL)。在室温下向此溶液中添加Na2CO3(0.046g，0.44mmol)于水(0.5mL)中的溶液，继而添加溴乙酰溴(0.067g，0.33mmol)并且搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。将粗物质与乙醚一起湿磨，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.18g，86.93％)。LCMS:C47H6379BrFN3O11计算值(924.36)，实验值924.70[M+H]+。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环丁基)(甲基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A21)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入含(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环丁基)(甲基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A21-3)(0.17g，0.18mmol)的DCM(2mL)。向此溶液中添加TFA(0.10g，0.91mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.021g，13.15％)；LCMS:C43H5579BrFN3O11计算值(868.30)，实验值868.40[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ:7.46(d,J＝10.0Hz,1H),7.38-7.36(m,2H),7.23-19(m,2H),6.27(dd,J＝10.0和2.0Hz,1H),6.04(s,1H),5,46(s,缩醛-H,1H),5.07(s,J＝5.2Hz,C16-H,1H),5.04-5.00(m,1H),4.46-4.15(m,4H),3.95-3.89(m,4H),3.30-1.60(m,23H),1.52(s,3H),1.08-1.05(m,2H)1.00(s,3H)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-10-(4-((八氢环戊二烯并[c]吡咯-5-基)甲基)苯基)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮2,2,2-三氟乙酸盐)(INX-SM-48)
合成5-(甲氧基亚甲基)六氢环戊二烯并[c]吡咯-2(1H)-甲酸叔丁酯(INX-SM-48- 1)
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入5-氧代六氢环戊二烯并[c]吡咯-2(1H)-甲酸叔丁酯(1.0g，4.44mmol)、叔丁醇钾(0.99g，8.88mmol)和THF(20mL)。向此溶液中添加氯化(甲氧基甲基)三苯基鏻(2.74g，7.99mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用氯化铵溶液稀释反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.8g，71.14％)，1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ:5.98(s,1H),3.48(s,3H),3.41-3.37(m,2H),2.98-2.90(m,2H),2.59-2.53(m,2H),2.41-2.33(m,2H),2.04-1.96(m,2H),1.38(s,9H)。
合成5-甲酰基六氢环戊二烯并[c]吡咯-2(1H)-甲酸叔丁酯(INX-SM-48-2)
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入含5-(甲氧基亚甲基)六氢环戊二烯并[c]吡咯-2(1H)-甲酸甲基叔丁酯(INX-SM-48-1)(0.55g，2.17mmol)的丙酮(5mL)。向此溶液中添加PTSA(0.41g，2.17mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，用NaHCO3水溶液淬灭反应混合物并用二氯甲烷萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到呈胶粘固体状的标题化合物(0.45g，95.28％)。粗物质未经任何分析即直接用于下一步。
合成(E)-5-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)六氢环戊二烯并[c]吡咯-2(1H)-甲酸叔丁酯(INX-SM-48-3)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入5-甲酰基六氢环戊二烯并[c]吡咯-2(1H)-甲酸叔丁酯(INX-SM-48-2)(0.45g，1.88mmol)和乙醇(5mL)。向此溶液中添加对甲苯磺酰肼(0.38g，2.06mmol)和乙酸(催化性)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中，并且过滤所得白色固体并在真空下干燥，得到标题化合物(0.58g 75.69％)。C20H30N3O4S的LCMS[M+H]+实验值408.3。
合成5-(4-甲酰基苯甲基)六氢环戊二烯并[c]吡咯-2(1H)-甲酸叔丁酯(INX-SM- 48-4)
程序：
向50mL单颈圆底烧瓶中装入(E)-5-((2-甲苯磺酰亚肼基)甲基)六氢环戊二烯并[c]吡咯-2(1H)-甲酸叔丁酯(INX-SM-48-3)(0.58g，1.44mmol)和二噁烷(10mL)。添加(4-甲酰基苯基)硼酸(0.21g，1.44mmol)和K2CO3(0.29g，2.16mmol)并且在110℃下搅拌反应混合物2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，50:50)纯化粗物质，得到呈无色液体状的标题化合物(0.17g，35.8％)。C16H20NO3的LCMS[(M+H)-tBu]+实验值273.8。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-10-(4-((八氢环戊二烯并[c]吡咯-5-基)甲基)苯基)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-48)
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入含5-(4-甲酰基苯甲基)六氢环戊二烯并[c]吡咯-2(1H)-甲酸叔丁酯(INX-SM-48-4)(0.16g，0.485mmol)和(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.19g，0.51mmol)的DCM(2mL)。向此溶液中添加MgSO4(0.30g，2.55mmol)和HClO4(0.25g，2.55mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过制备型HPLC(柱：YMC AQUA(250x19)mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈，A:B＝66:34，停留时间8.78分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.040g，11.74％)。C36H46NO6的LCMS[M+H]+实验值588.5；1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ:8.76(brs,1H),8.58(brs,1H),7.37-7.31(m,3H),7.22-7.16(m,2H),6.17(dd,J＝1.6Hz和10.0Hz,1H),5.94(s,1H),5.41(s,缩醛-H,1H),5.12-5.10(m,1H),4.92(d,J＝4.8Hz,C16-H,1H),4.82(brs,1H),4.53-4-47(m,1H),4.30(brs,1H),4.21-4.17(m,1H),3.20-3.00(m,2H),2.80-1.51(m,20H),1.38(s,3H),1.07-0.96(m,2H),0.87(s,3H)。
合成(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-(5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)六氢环戊二烯并[c]吡咯-2(1H)-基)-5-氧代戊酸(INX-A-20)
合成(4S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)六氢环戊二烯并[c]吡咯-2(1H)-基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A20-1)
程序：
在室温下向50mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.53g，1.10mmol)、HATU(0.62，1.64mmol)、DIPEA(0.28g，2.19mmol)和DMF(6mL)。向此溶液中添加(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-10-(4-((八氢环戊二烯并[c]吡咯-5-基)甲基)苯基)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-48)(0.64g，0.91mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈/水：60:40)纯化粗物质，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.32g，33.35％)。LCMS:C62H74N3O12的LCMS[M+H]+实验值1052.5。
合成(4S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-(5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)六氢环戊二烯并[c]吡咯-2(1H)-基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A20-2)
程序：
向50mL单颈圆底闪蒸器中装入(4S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)六氢环戊二烯并[c]吡咯-2(1H)-基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A20-1)(0.32g，0.30mmol)和THF(3mL)。向此溶液中添加二乙胺(0.22g，3.04mmol)并在室温下搅拌反应混合物3小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.24g，96.4％)。C47H64N3O10的LCMS[M+H]+实验值830.5。
合成(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-(5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)六氢环戊二烯并[c]吡咯-2(1H)-基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A20-3)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入含(4S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-(5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)六氢环戊二烯并[c]吡咯-2(1H)-基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A20-2)(0.24g，0.28mmol)的DCM(2mL)。向此溶液中添加Na2CO3(0.058g，0.56mmol)于水(0.5mL)中的溶液，继而添加溴乙酰溴(0.087g，0.43mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。将粗物质与乙醚一起湿磨，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.20g，75.1％)。LCMS:C49H65 79BrN3O11计算值(950.38)，实验值950.40[M+H]+
合成(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-(5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)六氢环戊二烯并[c]吡咯-2(1H)-基)-5-氧代戊酸(INX-A20)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(4S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-(5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)六氢环戊二烯并[c]吡咯-2(1H)-基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A20-3)(0.17g，0.18mmol)和DCM(2mL)。向此溶液中添加TFA(0.10g，0.91mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(新型Xbridge Prep，C18，OBD 19x250mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈，A:B＝90:10)纯化粗标题化合物，得到产物的两种异构体。
Fr-1(停留时间：18分钟)(0.0092g，5.75％，白色固体)LCMS:C45H57 79BrN3O11计算值(894.32)，实验值894.5[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ:7.46(d,J＝10.0Hz,1H),7.35(d,J＝7.6Hz,2H),7.19(d,J＝8.0Hz,2H),6.26(d,J＝10Hz,1H),6.04(s,1H),5.45(s,1H,缩醛-H),5.05(d,J＝5.2Hz,1H),4.76-4.44(m,4H),3.96-3.92(m,4H),3.80-3.40(m,4H),2.80-1.60(m,20H),1.51(s,3H),1.31-1.05(m,4H),1.00(s,3H)。
Fr-2(停留时间：19.5分钟)(0.0035g，2.19％，白色固体)。LCMS:C45H57 79BrN3O11计算值(894.3)，实验值894.3[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ:7.47(d,J＝10.0Hz,1H),7.36(d,J＝7.6Hz,2H),7.21-7.20(m,2H),6.27(d,J＝10Hz,1H),6.05(s,1H),5.44(s,1H,缩醛-H),5.06(d,J＝5.2Hz,1H),4.80-4.30(m,4H),4.00-3.70(m,4H),3.65-1.5(m,26H),1.54(s,3H),1.25-1.05(m,2H),1.00(s,3H)。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-(((1S,4R)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环己基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A-28)
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(((1S,4R)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环己基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A-28-1)
程序：
在室温下向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.39g，0.81mmol)和HATU(0.37g，0.924mmol)、DIPEA(0.26g，0.82mmol)和DMF(5mL)。向此溶液中添加(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(((1s,4S)-4-氨基环己基)甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-15)(0.5g，0.81mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈/水：50:50)纯化粗物质，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(0.45g，41.8％)。C61H72F2N3O12的LCMS[M+H]+实验值1077.0[M+1]+。
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-(((1S,4R)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环己基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A-28-2)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(((1S,4R)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环己基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A-28-1)(0.4g，0.37mmol)和THF(5mL)。向此溶液中添加二乙胺(0.27g，3.72mmol)并在室温下搅拌3小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物并且将粗物质与乙醚和戊烷一起湿磨，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.25g，79.1％)。C46H62F2N3O10的LCMS[M+H]+实验值854.8。
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-(((1S,4R)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环己基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A-28-3)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-(((1S,4R)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环己基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A-28-2)(0.25g，0.29mmol)和DCM(4mL)。向此溶液中添加溶解于水(0.5mL)中的Na2CO3(0.12g，1.17mmol)，继而将溴乙酰溴(0.117g，0.58mmol)添加至反应混合物中，并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈/水：50:50)纯化粗物质，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.2g，70.08％)。LCMS:C48H63 79BrF2N3O11计算值(974.36)，实验值974.4[M+H]+
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-(((1S,4R)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环己基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A-28)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入含(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-(((1S,4R)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环己基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A-28-3)(0.2g，0.20mmol)的DCM(4mL)。向此溶液中添加TFA(0.4mL)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱：X-bridge Prep，C18，OBD(250x19)mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈，A:B＝65:35，停留时间14.40分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.015g，8.16％)。LCMS:C44H55 79BrF2N3O11计算值(918.30)，实验值918.5[M+H]+；1H NMR(400MHz,CD3OD):δ:7.45-7.36(m,3H),7.22-7.20(m,2H),6.40-6.35(m,2H),5.66-5.50(m,1H,CH-F),5.48(s,1H,缩醛-H),5.07(d,J＝4.4Hz,1H),4.66(d,1H),4.43-4.30(m,3H),3.95(s,2H),3.92(s,2H),3.86(brs,1H),2.80-1.65(m,17H),1.55(s,3H),1.50-1.36(m,6H),1.01(s,3H)。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-氨基环己基)氧基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-18)
合成(4-羟基环己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-18-1)
程序：
在氮气下向100mL单颈圆底闪蒸器中装入(4-氧代环己基)氨基甲酸叔丁酯(5.0g，23.43mmol)和MeOH(50mL)。在0℃下向此溶液中逐份添加NaBH4(7.43g，117.16mmol)并在0℃下再搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水稀释反应混合物并且用1N HCl调整中性pH并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发，得到标题化合物(4.8g，95.10％)。C11H22NO3的LCMS[M+H]+实验值216.2。
合成(4-(4-甲酰基苯氧基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-18-2)
程序：
在氮气下向35mL玻璃小瓶中装入含(4-羟基环己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-18-1)(1g，4.64mmol)、4-羟基苯甲醛(0.680g，5.57mmol)和三苯基膦(1.82g，6.96mmol)的THF(10mL)。在0℃下向此溶液中添加DIAD(1.4g，6.967mmol)并且使反应混合物在65℃下回流16小时。TLC指示反应完成后，用10％NaOH溶液稀释反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，80:20)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(1.0g，67.40％)。C18H26NO4的LCMS[M+H]+实验值320.2。
合成(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-氨基环己基)氧基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-18)
程序：
向50mL单颈圆底闪蒸器中装入含(4-(4-甲酰基苯氧基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-18-2)(1g，3.13mmol)、(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(1.17g，3.13mmol)的DCM(10mL)。向此溶液中添加MgSO4(1.57g，15.65mmol)和HClO4(1.88g，15.65mmol)并在室温下再搅拌2小时。TLC指示反应完成后，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应混合物并在真空下浓缩。将粗物质与冷水一起湿磨，得到1.5g粗固体。通过制备型HPLC(柱：SHIM-PACK-GIST C18(2508(250X20)mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈，A:B＝70:30，停留时间11.80分钟)纯化一部分粗物质(308mg)，得到0.019g呈白色固体状的标题化合物，其将对应于0.092g(0.137mmol，4.38％)的总纯化质量。C34H43NO7的LCMS[M+H]+实验值578.4；1H NMR(400MHz,MeOD):δ:7.47(d,J＝10.0Hz,1H),7.40-7.36(m,2H),6.98-6.92(m,2H),6.27(dd,J＝1.6Hz,J＝10.0Hz,1H),6.04(s,1H),5.43(m,1H),5.04(d,J＝5.2Hz,1H),4.65(d,1H),4.44(brs,1H),4.36-4.30(m,2H),3.20(brs,1H),2.80-1.54(m,15H),1.49(s,3H),1.30-1.02(m,4H),1.00(s,3H)。
合成S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-(((1R,4S)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环己基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A27)
合成(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(((1R,4S)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环己基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A-27-1)
程序：
在室温下向50mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.39g，0.81mmol)、HATU(0.46，1.2mmol)、DIPEA(0.20g，1.62mmol)和DMF(3mL)。向此溶液中添加(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(((1r,4R)-4-氨基环己基)甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-14)(0.49g，0.81mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈/水：60:40)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.50g，57.48％)。LCMS:1076.7[M+H]+
合成(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-(((1R,4S)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环己基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A-27-2)
程序：
向50mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(((1R,4S)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环己基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A-27-1)(0.5g，0.46mmol)和THF(5mL)。向此溶液中添加二乙胺(0.32g，4.6mmol)并在室温下搅拌3小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.3g，75.61％)LCMS:854.64[M+H]+
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-(((1R,4S)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环己基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A-27-3)
程序：
向25mL单颈圆底闪蒸器中装入含(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-(((1R,4S)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环己基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A-27-2)(0.3g，0.35mmol)的DCM(2mL)。在室温下向此溶液中添加Na2CO3(0.073g，0.7mmol)于水(0.5mL)中的溶液，继而添加溴乙酰溴(0.10g，0.52mmol)并且搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用水淬灭反应混合物并用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。将粗物质与乙醚一起湿磨，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.30g，87.60％)。LCMS:C48H63 79BrF2N3O11计算值(974.36)，实验值974.69[M+H]+
合成(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-(((1R,4S)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环己基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A-27)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入含(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-(((1R,4S)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)环己基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A-27-3)(0.15g，0.15mmol)的DCM(2mL)。向此溶液中添加TFA(0.087g，0.76mmol)并在室温下搅拌2小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart Prep C18-S，250X20mm S-10μm，12nm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈，A:B＝60:40，停留时间16.00分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.010g，7.07％)，LCMS:C44H55 79BrF2N3O11计算值(918.30)，实验值918.20[M+H]+；1H NMR(400MHz,MeOD):δ:7.37-7.33(m,3H),7.17(d,J＝8.0Hz,2H),6.38-6.35(m,2H),5.66-5.50(m,1H,CH-F),5.48(s,1H),5.05(d,J＝4.8Hz,1H),4.65(d,1H),4.37-4.31(m,3H),3.94(s,2H),3.90(s,2H),3.60-3.50(m,1H),2.80-1.66(m,18H),1.62(s,3H),1.50-1.04(m,5H),1.00(s,3H)
合成6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-铵2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-38)
合成(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-38-1)
程序：
在室温下向100mL单颈圆底烧瓶中装入(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(1.0g，1.70mmol)(INX-SM-32)、TEA(0.47mL，3.40mmol)和DCM(10mL)-MeOH(0.5mL)。向此溶液中添加二碳酸二-叔丁酯(0.74g，3.40mmol)并在室温下搅拌反应混合物2小时。TLC指示反应完成后，在真空下直接蒸发反应混合物。通过反相柱色谱法(乙腈:水，70:30)纯化粗物质，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.25g，21.36％)。C41H54NO8的LCMS[M+H]+实验值688.5[M+H]+。
合成(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-38-2)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入含(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(0.25g，0.36mmol)(INX-SM-38-1)的DMF(0.5mL)。向此溶液中添加1H-四唑(0.254g，3.63mmol)和(tBuO)2PNEt2(2.42g，8.73mmol)并在室温下搅拌24小时。在-5至0℃下将过氧化氢(2.5mL)添加至反应混合物中并在室温下搅拌1小时。通过反相柱色谱法(乙腈:水，90:10)纯化粗物质，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.18g，56.81％)。C49H71NO11P的LCMS[M+H]+实验值880.6[M+H]+。
合成6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-铵2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-38)
程序：
向25ml单颈圆底闪蒸器中装入含(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(0.17g，0.193mmol)(INX-SM-38-2)的DCM(4mL)。在0℃下向此溶液中添加TFA(0.17mL)并且再搅拌1小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物。通过制备型HPLC(柱：新型X-bridge Prep，C18，OBD19x250mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈，A:B＝72:28，停留时间11.7分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.025g，16.93％)。C36H47NO9P的LCMS[M+H]+实验值668.4；1H NMR(400MHz,MeOD):δ:7.47(dd,J＝10和2.0,1H),7.35(d,J＝7.6Hz,2H),7.11(d,J＝8.0Hz,2H),6.23(d,1H),6.01(s,1H),5.52(s,1H),5.06(d,J＝4.8Hz,1H),5.00-4.70(m,2H),4 43(brs,1H),3.60-3.50(m,1H),1.80-1.60(m,20H),1.51(s,3H),1.20-1.10(m,1H),1.03(s,3H),1.00-0.95(m,1H)。
合成6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-铵2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-21)
合成(2-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a,10,10-四甲基-4-氧代-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氢-8bH-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-8b-基)-2-氧代乙基)磷酸二-叔丁酯(INX-SM- 21-1)
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a,10,10-四甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(1.0g，2.21mmol)、N,N-二异丙基亚磷酰胺二-叔丁酯(14.7g，53.0mmol)和DMF(1mL)。向此溶液中添加1H-四唑(1.5g，22.1mmol)并在室温下搅拌24小时。将反应混合物冷却至0℃并且添加过氧化氢(10V)并在室温下再搅拌2小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至饱和硫代硫酸钠溶液中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过反相柱色谱法(乙腈/水)纯化粗标题化合物，得到标题物(0.4g，28.08％)。C32H48F2O9P的LCMS[M+H]+实验值645.3[M+H]+。
合成6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-铵2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-21)
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入含(2-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a,10,10-四甲基-4-氧代-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氢-8bH-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-8b-基)-2-氧代乙基)磷酸二-叔丁酯(INX-SM-21-1)(0.2g，0.31mmol)和(6-(4-甲酰基苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(0.1g，0.30mmol)(INX-SM-32-4)的DCM(10mL)。在0℃下添加MgSO4(0.18g，1.5mmol)和HClO4(0.15g，1.5mmol)并在室温下搅拌4小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至饱和NaHCO3溶液中并用10％MeOH:DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过制备型HPLC(柱：Shim-Pack Gist C18，20X250mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈，A:B＝71:29，停留时间16.5分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.033g，15.6％)。C36H45F2NO9P的LCMS[M+H]+实验值704.3；1H NMR(400MHz,MeOD):δ:7.40-7.35(m,3H),7.15(d,J＝7.6Hz,2H),6.37-6.34(m,2H),5.67-5.52(m,1H),5.54(s,1H,缩醛-H),5.07(m,J＝3.6Hz,1H,C16-H),4.95-4.72(m,2H),4.35-4.30(m,1H),3.70-3.58(m,1H),2.78-1.63(m,19H),1.61(s,3H),1.03(s,3H)。
合成(S)-4-(2-(2-(((R)-2-氨基-2-羧乙基)硫基)乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INXA23-CYS)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A-23)(0.05g，0.053mmol)和DMF(1mL)。向此溶液中添加L-半胱氨酸(0.009g，0.074mmol)并且在室温下搅拌反应混合物2小时。LCMS指示反应完成后，冻干反应混合物并通过制备型HPLC(柱：新型Xbridge Prep，C18，OBD 19x250mm，5μm，流动相：A＝含0.1％TFA的水，B＝乙腈，A:B＝67:33，停留时间11.0分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.050g，15.98％)。C48H61F2N4O13S的LCMS[M+H]+实验值971.6；1H NMR(400MHz,MeOD):δ:7.36-7.34(m,3H),7.16(d,J＝8.0,2H),6.37-6.32(m,2H),5.70-5.48(m,1H),5.48(s,1H,缩醛-H),5.08(d,J＝4.0Hz,1H),4.65(d,1H),4.37-3.30(m,3H),4.13-4.09(m,1H),4.03-4.01(m,1H),3.92(s,2H),3.33(s,2H),3.30-3.27(m,1H),3.10-3.05(m,1H),2.80-1.64(m,23H),1.60(s,3H),0.92(s,3H)。
合成(S)-4-(2-(2-(((R)-2-氨基-2-羧乙基)硫基)乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A-12-CYS)
程序：
向10mL单颈圆底闪蒸器中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A-12)(0.2g，0.19mmol)和DMF(1mL)。向此溶液中添加L-半胱氨酸(0.035g，0.29mmol)并在室温下搅拌16小时。LCMS指示反应完成后，冻干反应混合物并且通过制备型HPLC(柱：新型Xbridge Prep，C18，OBD 19x250mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈，A:B＝70:30，停留时间11.2分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.025g，12.02％)。C48H62F2N4O16PS的LCMS[M+H]+实验值1052.4；1H NMR(400MHz,MeOD)δ:7.38-7.36(m,3H),7.15(d,J＝8.0Hz,2H),6.38-6.34(m,2H),5.68-5.50(m,1H,CH-F),5.53(s,1H,缩醛-H),5.05(d,J＝4.0Hz,1H),5.00-4.83(m,3H),4.34-4.30(m,2H),4.20-4.08(m,2H),3.91(s,2H),3.43(s,2H),3.11-3.05(m,1H),2.80-1.72(m,23H),1.61(s,3H),1.03(s,3H)
合成(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氢-8bH-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-8b-硫代甲酸S-(氰基甲基)酯2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-11)
合成(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a,10,10-四甲基-4-氧代-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氢-8bH-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-8b-甲酸(INX-SM-11-1)
程序：
向250mL圆底烧瓶中装入含(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a,10,10-四甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(醋酸氟轻松)(5.0g，11.06mmol)的1,4-二噁烷(80mL)。向此溶液中滴加含HIO4(3.2g，33.18mmol)的H2O(20mL)并在室温下搅拌16小时。TLC指示反应完成后，用三乙胺淬灭反应混合物并在减压下浓缩。将粗物质进一步倾倒至2M NaOH水溶液中并用乙酸乙酯洗涤。用1N HCl酸化水层并用EtOAc萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到呈黄色固体状的标题化合物(4.0g，82.56％)。C23H29F2O6的LCMS[M+H]+实验值439.2。
合成(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a,10,10-四甲基-4-氧代-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氢-8bH-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-8b-甲酸二甲基氨基甲酸硫代酸酐(INX-SM-11-2)
程序：
向100mL圆底烧瓶中装入(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a,10,10-四甲基-4-氧代-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氢-8bH-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-8b-甲酸(INX-SM-11-1)(4.0g，9.13mmol)和丙酮:H2O(40:1mL)。在室温下向此溶液中添加二甲基硫代氨基甲酰氯(2.24g，18.26mmol)、TEA(3.9mL，27.39mmol)和NaI(0.272g，1.826mmol)并搅拌16小时。TLC指示反应完成后，用DMA稀释反应混合物以使其变成澄清溶液，接着倾倒至冷水中。过滤所得固体并在真空下干燥，得到呈黄色固体状的标题化合物并且未经任何进一步纯化即用于下一步(2.0g，41.71％)。C26H34F2NO6S的LCMS[M+H]+实验值526.2。
合成(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a,10,10-四甲基-4-氧代-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氢-8bH-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-8b-硫代甲S-酸(INX-SM-11-3)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a,10,10-四甲基-4-氧代-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氢-8bH-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-8b-甲酸二甲基氨基甲酸硫代酸酐(INX-SM-11-2)(2.0g，3.809mmol)和DMA(20mL)。向此溶液中添加氢硫化钠(2.13g，38.095mmol)并在室温下搅拌1小时。TLC指示反应完成后，用1N HCl淬灭反应混合物并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在减压下浓缩，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.500g，28.91％)。C23H29F2O5S的LCMS[M+H]+实验值455.2。
合成(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a,10,10-四甲基-4-氧代-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氢-8bH-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-8b-硫代甲酸S-(氰基甲基)酯(INX-SM-11-4)
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a,10,10-四甲基-4-氧代-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氢-8bH-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-8b-硫代甲S-酸(INX-SM-11-3)(0.500g，1.101mmol)和1,4-二噁烷(5.0mL)。向此溶液中添加TEA(0.3mL，2.20mmol)和溴乙腈(0.197g，1.651mmol)并在室温下搅拌16小时。TLC指示反应完成后，将反应混合物倾倒至H2O中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。通过柱色谱法(乙酸乙酯:己烷，35:65)纯化粗物质，得到呈棕色固体状的标题化合物(0.17g，31.31％)。C25H30F2NO5S的LCMS[M+H]+实验值494.2。
合成(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氢-8bH-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-8b-硫代甲酸S-(氰基甲基)酯2,2,2-三氟乙酸盐(INX-SM-11)
/>
程序：
向35mL玻璃小瓶中装入(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a,10,10-四甲基-4-氧代-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氢-8bH-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-8b-硫代甲酸S-(氰基甲基)酯(INX-SM-11-4)(0.15g，0.30mmol)和DCM(3mL)。向此溶液中添加(6-(4-甲酰基苯甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-32-4)(0.100g，0.30mmol)、MgSO4(0.183g，1.52mmol)和HClO4(0.152g，1.520mmol)并在室温下搅拌16小时。TLC指示反应完成后，在真空下蒸发反应混合物并用饱和NaHCO3淬灭。过滤固体并通过制备型HPLC(柱：SHIM-PACK-GIST C18(2508(250X20)mm，5μm，流动相：A＝含0.05％TFA的水，B＝乙腈，A:B＝49:51，停留时间16.50分钟)纯化粗物质，得到呈白色固体状的标题化合物(0.010g，4.37％)。C37H43F2N2O5S的LCMS[M+H]+实验值665.5；1H NMR(400MHz,MeOD):δ:7.38-7.33(m,3H),7.19(d,J＝8.0Hz,2H),6.37-6.31(m,2H),5.67-5.50(m,2H),5.01(d,1H),4.35-4.25(m,1H),3.90(dd,J＝16.8Hz,2H),3.61--3.59(m,1H),2.70-1.67(m,19H),1.59(s,3H),1.12(s,3H)。
实施例4：抗VISTA抗体在生理pH下的结合和内化比较
最初为评估VISTA抗体是否会潜在有效地将类固醇或其他有效负载递送至靶免疫细胞中，进行研究以评价不同抗VISTA抗体在人类单核细胞中的内化。具体而言，比较了裸抗人VISTA抗体(分别为INX200、767IgG1,3(图12中的抗体序列))在人类单核细胞中的结合和内化。VISTA在大多数造血细胞上，特别在骨髓细胞上高度表达。基于此，我们推测快速内化与对相关细胞类型的高密度和选择性相结合可能使VISTA成为抗炎抗体药物偶联物(ADC)的理想靶标。
随着结合至EGFR的抗体快速内化至靶细胞中，已广泛研究与抗EGFR抗体的药物偶联物。文献详述了用于确定内化率的稳健方法。例如，在表达EGFR的细胞系中，针对EGFR的LA22 mAb在37℃下10分钟内达到65.8％的最大内化水平(Liu,Z.等人,(2009),“In-vitrointernalization and in-vivo tumor uptake of anti-EGFR monoclonal antibodyLA22 in A549 lung cancer cells and animal model”,Cancer Biother Radiopharm,15-20)，而截至15分钟时Ab033显示出54％内化(Durbin,K.R.等人,2018,“MechanisticModeling of Antibody-Drug Conjugate Internalization at the Cellprotonassignmentular Level Reveals Inefficient Processing Steps”,Mol Cancer Ther,1535-7163)。
本研究的目的是评价抗VISTA单克隆抗体INX200在人类单核细胞中的内化率，并且进一步评估767-IgG1,3的内化特性，与由Five Prime Therapeutics与Bristol-MyersSquibb Company开发的具有增强的血清PK半衰期的pH敏感性抗人VISTA相比(Johnston,R.J.等人,(2019),“VISTA is an acidic pH-selective ligand for PSGL-1”,Nature,574(7779),565-570)。
材料和方法
在本实验中，首先确定了抗VISTA抗体INX200和767-IgG1,3与人类单核细胞(来自新鲜分离的人类外周血单核细胞或PBMC)的结合曲线。其次，使用非内化抗体抗CD45作为阴性对照，定义这些不同抗体在人类单核细胞上的内化率。简言之，为仅检测内化抗体，首先将细胞与荧光标记的抗体一起在4℃下温育30分钟，在所述温度下发生极少乃至无内化。洗涤细胞并在25℃下温育以允许内化。接着在各个时间点处使用当量的抗AF488抗体淬灭细胞表面信号。随后，用抗CD14抗体将PBMC染色以鉴定单核细胞并通过流式细胞术进行分析。
测试剂和剂量
·INX200(Aragen，批号BP-2875-019-6.1)为在Fc区中具有L234A/L235A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。
·人类IgG1si(BioXcell参考，批号659518N1)为具有在Fc区中具有L234A/L235A静默突变的人类IgG1/κ主链的抗RSV(呼吸道合胞病毒)抗体。
·767-IgG1,3(Aragen，批号BP-2985-019-6)为由Five Prime Therapeutics与Bristol-Myers Squibb Company开发的在Fc区中具有L234A/L235E/G237A静默突变的人类IgG1/κ主链上的抗人VISTA抗体。此抗体经设计以在低pH(例如pH 6)下结合，但在生理pH(pH 7.4)下具有最小结合，并且因此由于不如其他抗VISTA抗体一样经受TMDD而具有增强的血清PK半衰期。此抗体如文件W02018169993A1中所述制备。经由ELISA格式确认抗体的pH敏感行为。简言之，767-IgG1,3或INX200与板结合并且在pH 6.1、6.7或7.5下滴定在含BSA的柠檬酸/tween缓冲液中稀释的hIX50-生物素(VISTA ECD)，并使用链霉亲和素-HRP偶联物/TMB读出进行检测。尽管在pH 7.5下观察到最大INX200结合，但在pH 7.5下观测到767-IgG1,3的最小结合，在pH 6.7下结合水平增加，并且在pH 6.1下甚至更大。
·CD45克隆HI30为抗人CD45单克隆抗体。
·抗Alexa Fluor 488(AF488)多克隆抗体(Life Technologies，编号A-11094)为用于淬灭AF488荧光信号的抗Alexa Fluor 488抗体。
除抗AF488以外，遵循制造商关于标记和纯化的说明书(Invitrogen目录号A10235)将所有抗体与AF488偶联。除非另有规定，否则在含有1％BSA的RPMI培养基中稀释抗体。
PBMC制备
在无菌条件下在达特茅斯希区柯克医疗中心(Dartmouth Hitchcock MedicalCenter)的供血者项目中从健康无关人类供体获得的单采锥(apheresis cone)分离出人类PBMC。将血液转移至50ml Falcon管中并用PBS稀释至30ml。将13ml Histopaque 1077(Sigma Aldrich)在血液下缓慢分层，并在室温下以850x g将管离心20分钟，同时缓缓加速并且无制动。从血浆/Ficoll界面收集单核细胞，重悬于50ml PBS中并以300x g离心5分钟。将细胞重悬于PBS中，接着进行计数。
抗体的荧光标记
遵循制造商关于标记和纯化的说明书(Invitrogen目录号A10235)将抗人VISTA抗体和huIgG1si与Alexa Fluor 488染料偶联。经由Nanodrop评估浓度和标记程度。标记程度对于INX200为5.9，并且对于767IgG1,3为7.1。偶联至AF488(Biolegend，编号304017)的抗人CD45(克隆H130)和针对APC的抗CD14(克隆M5E2，Biolegend，编号301808)按原样使用。
抗体结合分析
将PBMC以5x106个细胞/毫升重悬于含有人类Fc封闭试剂(eBioscience，14-9161-73)的RPMI/1％BSA缓冲液中，接着将50微升/孔的细胞分配至96孔板中。在RPMI/1％BSA缓冲液中从333nM(50μg/ml)起始以2x稀释系列(10种浓度)制备抗人VISTA抗体。将PBMC在冰上染色30分钟以限制内化，用PBS洗涤两次，并且在4℃下用含2％FA的PBS固定10分钟。在室温下于PBS/0.2％BSA中以1:400(v/v)将单核细胞用抗CD14 mAb标记20分钟。洗涤细胞，并通过FACS，使用Macsquant(Miltenyi)流式细胞仪和用于分析的FlowJo进行分析。用GraphPad(Prism)制作所有图。
抗体内化分析
将5x106个PBMC以1ml重悬于含有人类Fc封闭试剂(eBioscience，14-9161-73)的RPMI/1％BSA缓冲液中，并与133nM(20μg/ml)的抗人VISTA mAb一起在冰上温育30分钟。用3ml冰冷PBS洗涤细胞并以515x g离心2分钟。将PBMC重悬于1.25ml新鲜RPMI/1％BSA中并保持在室温下。减慢内化可产生稳健曲线。在每个时间点，将50μl细胞转移至含有50μl RPMI/1％BSA和抗CD14 APC的96孔板中以测量结合的总抗体。将细胞保持在冰上以阻断后续内化。
接着将50μl细胞转移至96孔板中，所述板含有50μl RPMI/1％BSA、266nM(40μg/ml)用以淬灭表面结合抗体的荧光的抗AF488抗体和用以标记单核细胞的抗CD14 APC。将细胞保持在冰上以阻断后续内化。以技术重复收集样品，并且追踪抗体内化直至60分钟。在时程结束时，用PBS洗涤所有样品并在4℃下用含2％FA的PBS固定10分钟。在PBS中最后一次洗涤后，通过FACS，使用Macsquant(Miltenyi)流式细胞仪和用于分析的FlowJo对细胞进行分析。测量抗VISTA或CD45 mAb的中位荧光强度(MFI)并绘制数据。
通过减去未处理细胞的背景荧光并且将MFI值针对时间＝0的MFI归一化来计算细胞内分数。将内化率计算为在每个时间点处细胞内信号与总细胞相关荧光的分数(参见以下等式)并且针对100％归一化(Liao-Chan,S.等人,(2015),“Quantitative assessmentof antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexafluorophores”,PLoS One,10(4):e012470)。
N1-在每个时间点(t1)处未淬灭的MFI
O1-在每个时间点(t1)处淬灭的MFI
N0-在0分钟(t0)时未淬灭的MFI
Q0-样品在0分钟(t0)时淬灭的MFI
裸抗VISTA抗体(INX200、767-IgG1,3)的结合
在图13中的实验中，测量与连续稀释的测试抗体(0-333nM)一起温育的单核细胞的中位荧光强度；其中黑色虚线对应于未染色细胞的自体荧光；n＝1。在每个浓度下进行单次测量。如其中所示，在7.3的生理pH下，INX200在CD14+PBMC上测试的范围(0-333nM)内显示出荧光的浓度依赖性增加(参见图13)。相比之下，当细胞与767-IgG1,3抗体一起温育时，未检测到信号。这正如预期，因为先前在ELISA格式中所确认的其在较低pH下结合的选择性。用于评估非特异性结合水平的人类IgG1si抗体即使在高抗体浓度下也显示出极少乃至无结合。
抗人VISTA抗体的内化
图14显示抗VISTA抗体的内化分数。在这些实验中，经60分钟的时程绘制细胞结合抗体的细胞内库；对于每个数据点，将荧光针对时间0分钟时INX200的荧光归一化；平均值±SD，n＝2名供体。为比较抗体的内化分数，通过减去未处理单核细胞的MFI针对背景荧光来校正每个时间点处的MFI值，并且针对t＝0时间点处INX200的总MFI进行归一化(图14)。与图13中所示的数据一致，在t＝0时767-IgG1,3相对于INX200显示出3.2％±4.5％的弱结合(图14)。
如其中所示，由人类IgG1si染色表示的非特异性信号在0分钟时评估为5.9％。当细胞与INX200一起温育时，随着时间推移观测到细胞内信号的明显增加，并且截至60分钟时细胞内分数为70.4％±9.2％。截至时程的40分钟，MFI值达到平台期。相比之下，在60分钟时，仅检测到5.3％±7.5％的767-IgG1,3为内部分数。在时程期间，人类IgG1si的细胞内信号在5-6％以内。
另外，在图15中，进行了另一个实验，其中经60分钟的时程评估单核细胞中INX200抗体的内化率并与抗CD45抗体HI30进行比较。如其中所示，抗CD45抗体在任何时间点均未内化；显示为平均值±SD，n＝2名供体。相比之下，截至20分钟，INX200以细胞内检测的表面抗体的一半有效内化(图15)。此外，在40分钟内，64.5％±11.2％的INX200在单核细胞中内化。相比之下，在所测试的任何时间点均未观测到抗CD45 mAb的内化。
数据显示抗人VISTA INX200以高亲和力结合并且截至40分钟以64％的最大内化水平内化。这有力地表明VISTA是向免疫细胞递送抗炎有效负载的唯一适合的靶标，因为这些结果表明大部分有效负载应在相对短的时间段内递送，鉴于CD45内化的缺乏而不显而易见并且不易实现。相比之下，pH敏感性抗体抗人VISTA 767.3-IgG1.3在生理pH下与单核细胞的结合有限。此外，与INX200相比，767-IgG,13在生理pH下显示出可忽略不计至有限的内化水平。
实施例5：抗VISTA抗体作为裸抗体或地塞米松偶联物的PK比较：示例性抗VISTA抗体在生理pH下的结合和内化
在人类VISTA敲入(hVISTA KI)小鼠中进行两个实验以比较第一个实验(实验1)中裸的或偶联至地塞米松(INX200A)的抗人VISTA抗体INX200与第二个实验(实验2)中裸的或偶联至地塞米松(767-IgG1.3A)的767-IgG1.3的药物动力学(PK)(Johnston等人,“VISTAis an acidic pH-selective ligand for PSGL-1.”Nature.2019年10月；574(7779):565-5702019)。这些小鼠具有代替小鼠VISTA基因敲入的人类VISTA cDNA，并且在RNA和蛋白质水平上表达人类VISTA。在雄性hVISTA KI小鼠中进行实验，并且在两项研究中，动物接受10mg/Kg抗体的1次剂量。在20分钟、4、24、48小时，接着在第5、8、14、21和28天(实验1)和第4、7、14、21和28天(实验2)定量外周血中的抗体量。
这2个实验的目的是评价添加8个接头-有效负载分子/抗体是否会修改PK并且确认由BMS/Five Prime Therapeutics所述的“pH敏感性”抗体和糖皮质激素连接形式具有与抗VISTA抗体显著不同的PK(与hIgG1相当)，抗VISTA抗体在生理和其相应糖皮质激素连接形式(相对于hIgG1较短)上结合至人类VISTA表达细胞。
材料和方法
实验1：INX200、INX200A(地塞米松偶联物)在人类VISTA KI小鼠中的PK研究
将hVISTA KI小鼠分为3个组，每组10只小鼠，在第0天分别用10mg/Kg的人类IgG1、INX200和INX200A处理。
实验2：767-IgG1.3、767-IgG1.3A(地塞米松偶联物)在人类VISTA KI小鼠中的PK研究
将hVISTA KI小鼠分为3个组，每组10只小鼠，在第0天分别用10mg/Kg的人类IgG1、767-IgG1.3和767-IgG1A处理。在两个实验中，在20分钟、4、24、48小时，接着在第5天和第8天(实验1)以及第4天和第7天(实验2)对小鼠进行眼眶后放血；通过ELISA定量循环抗体。
测试剂和剂量
·INX200(Aragen，批号BP-2875-019-6.1)为在Fc区中具有L234A/L235A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。
·INX200A(Abzena，批号JZ-0556-005)为具有8的药物/抗体比率并且经由链间二硫键偶联的INX200抗体。接头/有效负载(A)由酯酶敏感性接头与地塞米松有效负载组成。
·人类IgG1(BioXcell参考，批号659518N1)
·767-IgG1.3(Aragen，批号BP-2985-019-6)为由Five Prime Therapeutics与Bristol-Myers Squibb Company开发的在Fc区中具有L234A/L235E/G237A静默突变的人类IgG1/κ主链上的抗人VISTA抗体。此抗体经设计以在低pH(例如pH 6)下结合，但在生理pH(pH 7.4)下具有最小结合(1)。
·767-IgG1.3A(Abzena，批号JCC0624003)为具有8的药物/抗体比率并且经由链间二硫键偶联的767-IgG1.3抗体。接头/有效负载(A)由酯酶敏感性接头与地塞米松有效负载组成。
在PBS中稀释所有抗体，并且以0.2ml体积在小鼠尾静脉中静脉内注射，以递送10mg/Kg的剂量。
小鼠
在Sage Labs(Boyertown,PA)饲养hVISTA小鼠。将8-12周龄的小鼠首先在我们的隔离设施中过渡3周，接着转移至常规设施。在实验起始前使所述小鼠适应1至2周。
抽血和制备
每24小时对动物进行不超过一次放血。将各小鼠组分为2个子组，每组5只小鼠，在第0天交替放血。在注射后第0天在20分钟、4、24、48小时，接着在第5天和第8天(实验1)以及第4天和第7天(实验2)收集血液。在前24小时期间，基于静脉内注射的注册质量排除一些数据。对于后续时间点，仅对成功静脉内注射的动物进行放血。
使用玻璃巴斯德移液管从眼眶后腔采集外周血，所述移液管首先用肝素冲洗以防止凝血。接着将血液以400rcf离心5分钟，并且收集血浆并储存于-80℃下以供分析(参见上文)。
抗体血液浓度分析
用于检测人类IgG1的ELISA
首先，在室温(RT)下将96孔平底板(Thermo Scientific Nunc ImmunolMaxisorp，目录号442404)用含1μg/ml小鼠抗huIgG Fcγ(Jackson ImmunoResearch，目录号209-005-098)的PBS包被一小时。
用PT(含0.05％Tween 20的PBS)将孔洗涤3次，接着在室温下用PTB(含0.05％Tween20和1％BSA的PBS)封闭1小时。人类IgG(Southern Biotech，目录号0150-01)用作阳性对照，并且人类IgG1(BioXcell，目录号BE0297)用于构建标准曲线。用PT将孔洗涤3次，接着在室温下将血浆样品在PTB中以至多4种不同稀释度(以在标准曲线上拟合)温育1小时。
用PT洗涤3次后，以1/2000的稀释度使用偶接至HRP的小鼠抗人IgG Fcγ(JacksonImmunoResearch，目录号209-035-098)作为检测试剂，并在室温下温育1小时。洗涤3次后，使用TMB(Thermo Scientific，目录号34028)作为比色底物来显现ELISA反应。在室温下5-10分钟后，用1M H2S04终止反应。
用于检测INX200或INX200A的ELISA
首先，在室温下将96孔平底板(与前述相同)用含1μg/ml hIX50(人类VISTA ECD，在ImmuNext的Aragen Bioscience生产)的PBS包被一小时。洗涤3次后，在室温下用PTB将孔封闭一小时。INX908(在ImmuNext的Aragen Bioscience生产)用作阳性对照，并且INX200或INX200A用于构建标准曲线。用PT将孔洗涤3次，接着在室温下将血浆样品在PTB中以至多4种不同稀释度(以在标准曲线上拟合)温育1小时。
用PT洗涤3次后，以1/2000使用小鼠抗人κ-HRP(Southern Biotech，目录号9230-05)作为检测试剂，在室温下温育1小时。洗涤3次后，使用TMB底物显现ELISA反应。在室温下5分钟后，用1M H2S04终止反应。
用于检测767-IgG1.3或767-IgG1.3A的ELISA
首先，在室温下将96孔平底板(与上述相同)用含1μg/ml小鼠抗huIgG Fcγ(Jackson ImmunoResearch，目录号209-005-098)的PBS包被一小时。
洗涤3次后，在室温下用PTB将孔封闭一小时。人类IgG(Southern Biotech，目录号0150-01)用作阳性对照，并且767-IgG1.3或767-IgG1.3A用于构建标准曲线。用PT将孔洗涤3次，接着在室温下将血浆样品在PTB中以至多4种不同稀释度(以在标准曲线上拟合)温育1小时。
在PTB中洗涤3次后，以1/2000使用小鼠抗人IgG Fcγ-HRP(JacksonImmunoResearch，目录号209-035-098)作为检测试剂，在室温下温育1小时。洗涤3次后，遵循制造商的说明书使用TMB底物显现ELISA反应。在室温下5分钟后，用1M H2S04终止反应。使用PKsolver程序在静脉内推注后进行非隔室分析(NCA)来确定抗体半衰期。
结果
实验1：INX200裸抗体或偶联抗体血浆PK
收集来自用INX200、INX200A或hIgG1处理的组的血浆样品以确定抗体浓度并且随后确定其半衰期。INX200显示0.1天的半衰期，所述半衰期较短但与先前的PK数据(T1/2＝约0.3天)一致，并且抗体在24小时处低于定量水平。INX200A显示相同的PK。相比之下，人类IgG1具有7.2天的半衰期，所述半衰期较短但对于免疫球蛋白而言不是非典型的(图16)。该图显示在标注的时间点在hVISTA KI小鼠(SD；n＝5/组)中抗体的血浆浓度。
实验2：767-IgG1.3裸抗体或偶联抗体血浆PK
收集来自用767-IgG1.3、767-IgG1.3A或hIgG1处理的组的血浆样品以确定抗体浓度并且随后确定其半衰期。结果显示767-IgG1.3和767-IgG1.3A显示类似的半衰期，分别为3.5天和4天，并且在第7天仍可检测到。hIgG1半衰期为8.7天，类似于实验1中所观测的半衰期(参见图17，其含有767-IgG1.3、767-IgG1.3A对比人类IgG1的PK研究和其中在标注的时间点在hVISTA KI小鼠(SD；n＝5/组)中抗体的血浆浓度)。
结论
这2个实验的结果显示：
实验1
图16中的数据显示，归因于靶标介导的药物处置(TMDD)，在给药后24小时抗人VISTA抗体INX200(其在生理pH下结合至人类VISTA细胞)在血浆中不可定量，而人类IgG1对照显示出对于IgG更典型的延长半衰期。结果进一步显示，DAR＝8的地塞米松与INX200的偶联不影响其PK。
实验2
图17中的数据显示，pH敏感性抗人VISTA 767-IgG1.3表现出类似于人类IgG1对照抗体的PK，据称所述对照抗体与其VISTA靶标的结合有限并且不受TMDD影响。此外，DAR＝8的地塞米松与767-IgG1.3的偶联不影响其PK。
实施例6：抗体药物偶联物对离体巨噬细胞活化的长期影响
在本实施例中，进行实验以评估示例性本发明抗体药物偶联物(ADC)分子的长期功效，所述分子包含靶向VISTA的抗体、在大多数造血细胞(包括骨髓细胞和T细胞)上高度表达的细胞表面分子、和糖皮质激素(GC)药物。我们先前已显示(内部未公开的研究)，此类ADC在短期炎症模型中发挥强有力的抗炎活性。这些研究的目的是(i)评价连接到骨髓细胞中的糖皮质激素(GC)有效负载的各种抗体药物偶联物(ADC)和抗人VISTA单克隆抗体的药效范围；和(ii)评价示例性INX GC接头有效负载ADC的效力。
首先，我们评价了与腹膜驻留巨噬细胞(PRM)和脾单核细胞上的地塞米松(Dex)相比，ADC对早期GC反应基因FKBP5的长期体内影响(Vermeer等人,(2003)“Glucocorticoid-induced increase in lymphocytic FKBP51 messenger ribonucleic acid expression:a potential marker for glucocorticoid sensitivity,potency,andbioavailability”,J Clin Endocrinol Metab.88(1):277-84)。
基于此，我们开发了一个模型以允许评价ADC对特定靶标群体(例如PRM)的长期抗炎影响。简言之，经由腹膜内(i.p.)注射在体内递送ADC，并且在1至7天后分离PRM并置于培养中。在无GC处理的情况下，2小时后PRM变得高度活化，如细胞因子产生的增加所示。在PRM分离前2小时体内进行Dex处理强有力地减少细胞因子产生。这些研究的目的是评价与游离Dex相比，偶联至糖皮质激素有效负载的INX人类VISTA抗体的功效和药效范围。
材料和方法
用于评估ADC或Dex对PRM和脾单核细胞中FKBP5转录的影响的方法
在小鼠安乐死和细胞分离前2至24小时腹膜内注射Dex。接着在小鼠安乐死和细胞分离前17小时至7天注射ADC。
测试剂和剂量
抗体
·INX201(Aragen，批号BP-3200-019-6)为在Fc区中具有L234A/L235A/E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。
·INX201J(Abzena，批号JZ-0556-025-1、JZ-0556-027、JZ-0556-013)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX201抗体。接头/有效负载(J)是基于先前报道的接头/有效负载(US15/611,037)。其由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX J-2)组成。
·INX231J(Abzena，批号JZ-0556-013-1)为以8.0的DAR偶联的INX231。接头/有效负载(INX J)为带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX J-2)。
·INX234J(Abzena，批号JZ-0556-013-2)为以8.0的DAR偶联的INX234。接头/有效负载(INX J)为带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX J-2)。
·INX240J(Abzena，批号JZ-0556-013-3)为以8.0的DAR偶联的INX240。接头/有效负载(INX J)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX J-2)组成。
·INX201O(Abzena，批号JZ-0556-016-2)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX201。接头/有效负载(INX O)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-4)组成。
·INX201P(Abzena，批号JZ-0556-016-1)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX201。接头/有效负载(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX233(ATUM批号82276.1.a)为在Fc区中具有L234A/L235A/E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。
·INX233P(Abzena，批号PP-0924-001-3)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX233。接头/有效负载(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX231(ATUM批号72928.1.a)为在Fc区中具有L234A/L235A/E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。
·INX231P(Abzena，批号JZ-0556-017-1)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX231。接头/有效负载(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX234(ATUM批号72931.2.a)为在Fc区中具有L234A/L235A/E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。
·INX234P(Abzena，批号JZ-0556-017-2)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234。接头/有效负载(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX240(ATUM批号73419.2.a)为在Fc区中具有L234A/L235A/E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。
·INX240P(Abzena，批号JZ-0556-017-3)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX240。接头/有效负载(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX231R(Abzena，批号PP-0924-001-2)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX231。接头/有效负载(INX R)由中性蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX231S(Abzena，批号PP-0920-014-1)为具有6.9的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX231。接头/有效负载(INX S)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与醋酸氟轻松类似物有效负载(INX-SM-24)组成。
·INX231V(Abzena，批号PP-0920-014-2)为具有7.8的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX231。接头/有效负载(INX V)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX231W(Abzena，批号PP-0920-014-3)为具有7.5的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX231。接头/有效负载(INX W)由带正电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX234A3(Abzena，批号PP-0924-023-1)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A3)由带正电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX234A4(Abzena，批号PP-0924-023-2)为具有7.9的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A4)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-43)组成。
·INX234T(Abzena，批号PP-0924-023-3)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX T)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与磷酸化的布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX201L(Abzena，批号JZ-0556-026-1)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX201抗体。接头/有效负载(J)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与磷酸化的布地奈德类似物有效负载(INX J-2)组成。
·INX234V(Abzena，批号RJS-1054-003)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX V)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX234A5(Abzena，批号RJS-1054-002)为具有7.9的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A5)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-44)组成。
·INX234A11(Abzena，批号RJS-1054-001)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A11)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头(Asn/gly)与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX231A7(Abzena，批号RJS-1054-007-001)为具有7.8的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A7)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与磷酸化的布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX231A12(Abzena，批号RJS-1054-007-002)为具有6.99的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A12)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与磷酸化的醋酸氟轻松类似物有效负载(INX-SM-25)组成。
·INX231A23(Abzena，批号RJS-1054-006-001)为具有7.34的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A23)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与醋酸氟轻松类似物有效负载(INX-SM-25)组成。
·将抗体在PBS中稀释并以0.2ml的体积腹膜内(i.p.)注射以递送指定剂量。
地塞米松
将来自Phoenix的地塞米松无菌注射剂NDC 57319-519-05在PBS中稀释并且如所述经由腹膜内注射而给药。
小鼠
在现场(达特茅斯比较医学与研究中心(Center for Comparative Medicine andResearch at Dartmouth))饲养hVISTA小鼠。在9与15周龄之间录入的雌性小鼠中进行所有实验。
细胞分离
安乐死后，向小鼠腹腔中注射7ml PBS/0.5％BSA/2mM EDTA。对腹膜进行短暂按摩后，切开小切口并收集腹腔灌洗液。使用阴性选择(Miltenyi试剂盒，参考130-110-434)分离PRM。将脾机械解剖和分离；使用阴性选择(Stem Cell,EasySepTM小鼠CD11b阳性选择试剂盒II)分离单核细胞。
RNA制备和实时PCR
将来自不同组织的细胞团块重悬于0.4ml来自RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen，PN：74136)的RNeasy溶解缓冲液中，并用20G针头匀化5次。遵循制造商的说明书分离RNA，并且在30或40ml H2O(不含RNase/DNase)中洗脱RNA。在Nanodrop上评估RNA浓度。
使用Taqman反转录试剂(编号N8080234)并且遵循制造商的说明书进行反转录。使用Taqman主混合液2X试剂盒(编号4369016)和Taqman引物用于小鼠FKBP5(Mm00487401_m1)以及小鼠HPRT作为管家基因(Mm446968_m1)进行定量实时PCR，并且在来自AppliedBiosystem的QuantStudio3上运作。
将Ct数据转换为DCt(在样品内针对HPRT归一化的FKBP5)，接着转换为ΔΔCt(经处理样品对比PBS对照的FKBP5相对水平)，以获得相对于PBS的Log2倍数变化。
腹膜驻留巨噬细胞培养和细胞因子分析
培养条件
将PRM重悬于含10％FBS、10mM Hepes、青霉素/链霉素和谷氨酰胺的RPMI 1640中，并且将每孔100,000个细胞铺于96孔组织培养板中。在铺板后2和24小时收集上清液并储存于-80℃下。
使用Millipore平台进行细胞因子分析
使用Millipore小鼠32-plex平台对25ml血浆进行细胞因子分析。免疫监测实验室(IML，达特茅斯-希区柯克诺里斯柯顿癌症中心的共享资源)进行分析。
经由ELISA进行细胞因子分析
·BioLegend(目录号430904)ELISA MAX Deluxe Set小鼠TNF-α
·BioLegend(目录号431304)ELISA MAX Deluxe Set小鼠IL-6
遵循制造商所包括的方案进行ELISA。
结果
实验1：Dex处理后腹膜驻留巨噬细胞和脾单核细胞中的FKBP5转录活化
图18中的实验比较Dex(左)和ADC INX201J(右)处理后腹膜驻留巨噬细胞和脾单核细胞中的FKBP5转录活化作用。如其中所示，在以2mg/Kg进行1次单次腹膜内注射后4和24小时评价Dex(左)作用；在以10mg/Kg进行1次单次腹膜内注射以递送0.2mg/Kg GC有效负载后24、48、72和96小时分析ADC(右)作用。通过实时PCR测量FKBP5转录水平并呈现为Log2倍数变化对比PBS对照组。将每组四只小鼠汇集在一起，以产生足够材料用于RNA制备。图18中的数据显示，截至处理后4小时，Dex处理引起PRM和脾单核细胞中的FKBP5信使RNA显著增加，但转录影响截至24小时消失(图18，左)。相比之下，INX201J对FKBP5的影响是持久的，即，在PRM中最迟96小时和脾单核细胞中最迟72小时检测到FKBP5信使RNA的增加(图18，右)。
在无任何附加刺激的情况下，当PRM转移至组织培养板上时，其变得极快速活化并且大量增加众多促炎细胞因子的产生，所述细胞因子可在铺板后最早1小时从细胞上清液测量。
实验2：Dex处理防止PRM中促炎细胞因子的离体诱导
图19中的实验显示，Dex处理防止PRM中促炎细胞因子的离体诱导。在实验中，在以2mg/Kg进行1次单次腹膜内注射后2小时评价Dex作用；使用小鼠32-plex(参见方法章节)(n＝4只小鼠/组；未配对T检验)对细胞上清液(在1小时收集)评价IL-6和TNFα
这些结果显示，在细胞分离前2小时，体内Dex处理可强有力地切断离体PRM活化，此处以在细胞铺板后最早1小时IL-6和TNFα分泌为例。在培养24小时后仍明显检测到这种影响(未显示)。
实验3：ADC INX201J的药效学
在图20中所含的实验中，在分离PRM和离体刺激前第-4、-2和-1天注射ADC的情况下评价ADC INX201J的药效范围。在PRM分离前2小时注射Dex对照组。其中，在以2和0.2mg/Kg进行1次单次腹膜内注射后2小时评价Dex作用；在以10mg/Kg(等效于0.2mg/Kg有效负载)注射后1天(d-1)、2天(d-2)和4天(d-4)评价INX201J作用。在2小时收集细胞上清液。使用ELISA(参见方法章节)(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比)测量TNFα。以10mg/Kg或等效于0.2mg/Kg有效负载给与INX201J。
如图20中所示，INX201J处理在第-1天给药时对减少TNFα产生具有高度显著的影响。另外，替代地在第-2天或第-4天ADC的给药仍影响分泌的细胞因子水平，类似于Dex对照组。数据表明INX201J引发对PRM的长期(>4天)抗炎影响。值得注意的是，本实验中在上清液中检测的TNFα的量远低于先前实验，这可能归因于通过ELISA(替代Luminex)进行定量。当在其他实验中通过ELISA进行定量时，也观测到较低IL-6水平。
实验3：偶联至J有效负载的不同抗VISTA抗体的长期效力
在图21中的实验中，本发明人评价偶接至J有效负载的不同抗VISTA抗体的长期效力。在第-4天和第-7天以10mg/Kg(0.2mg/Kg有效负载)注射INX201J、INX234J和INX240J，而在细胞分离前2小时以2mg/Kg给与Dex。出于实际实验原因，在第-4天仅给与INX231J。
图21中的结果揭示，所测试的ADC对PRM中TNFα和IL-6的离体诱导具有长期影响。其中，在以2mg/Kg进行1次单次腹膜内注射后2小时评价Dex作用；在以10mg/Kg进行1次单次腹膜内注射后4天(-4)和7天(-7)评价INX201J、INX231J、INX234J和INX240J作用。在2小时收集细胞上清液。使用ELISA(参见方法章节)(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比)测量TNFα和IL-6。如图21中所示，对于TNFα和IL-6两者，所有4种ADC在第-4天或第-7天给药时都显示强效抗炎活性。
实验5：INX231J、INX234J和INX240 J对离体PRM活化的剂量依赖性影响
在图22中的实验中，评价INX231J、INX234J和INX240J对离体PRM活化的剂量依赖性影响。在这些实验中，在以2mg/Kg进行1次单次腹膜内注射后2小时评价Dex作用；在以10、3或1mg/Kg(0.2、0.06和0.02mg/Kg GC有效负载)进行1次单次腹膜内注射后7天评价INX231J、INX234J和INX240J作用。在2小时收集细胞上清液。使用ELISA(参见方法章节)(n＝4只小鼠/组，PBS组(n＝1)除外，出于技术原因；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比)测量TNFα和IL-6。
如所指出，在第-7天以不同剂量腹膜内注射所有ADC：10、3和1mg/Kg，分别递送0.2、0.06和0.02mg/Kg GC有效负载。在细胞分离前2小时以2mg/Kg给与Dex。结果显示在不同ADC之间未观测到显著差异，表明其具有类似效力(图22)。
实验6：与处理后第7天Dex相比的示例性本发明ADC和偶联至接头/有效负载P的INX201的效力
在图23中的实验中，评价1)与处理后第7天Dex相比的J连接的ADC，和2)偶联至接头/有效负载P的INX201的效力。图23中的结果指示INX201J、INX201P、INX231J、INX234J和INX240J ADC对防止PRM中TNFα和IL-6的离体诱导具有相当的效力。在实验中，在1次单次腹膜内注射后7天评价INX201J、INX201P、INX231J、INX234J、INX240J和Dex作用；以10mg/Kg(0.2mg/Kg GC有效负载)给与ADC并且以2mg/Kg给与Dex。在2小时收集细胞上清液。使用上文所述(n＝4只小鼠/组，PBS和Dex组(n＝3)除外，出于技术原因；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比)测量TNFα和IL-6。
如前指出，在第-7天腹膜内注射所有处理，Dex为2mg/Kg并且ADC为0.2mg/Kg有效负载。图23中的数据显示，尽管Dex在控制细胞因子反应中已失去所有功效，但所有携带J或P有效负载的ADC具有相当的效力。
实验7：与处理后第7天Dex相比的示例性本发明ADC和偶联至接头/有效负载P的INX201的效力
在图24中的本实验中，通过评估与INX201J相比偶联至不同抗VISTA抗体的INX P有效负载来评价改变抗VISTA CDR对延长效力的影响。在第-7天以0.2mg/Kg有效负载的剂量腹膜内注射所有ADC。
数据显示，所有携带INX J或INX P有效负载的抗VISTA ADC在延长的时段后具有相当的效力(图24)。图24显示INX201J、INX231P、INX234P和INX240P ADC对防止PRM中TNFα的离体诱导具有相当的效力。在1次单次腹膜内注射后7天评价ADC作用；以10mg/Kg(0.2mg/Kg GC有效负载)给与ADC。在2小时收集细胞上清液。使用ELISA(参见方法章节)(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比，SEM)测量TNFα。
实验8：偶联至INX231的INX R接头有效负载的长期效力。
在图25中的本实验中，评价偶联至INX231的INX R接头有效负载的长期效力。此偶联物类似于INX231P；然而，其含有中性二肽接头，其中INX231P具有带负电荷的二肽接头。还评价了含有额外抗VISTA抗体INX233的ADC的效力。作为比较物，使用INX231P和INX234P。在第-7天以0.2mg/Kg有效负载的剂量腹膜内注射所有ADC。如先前实验分析在24小时收集的细胞上清液。注意到在2小时或24小时收集的上清液之间无显著差异。
数据进一步显示，除显示低于常见效力的INX231P(参见实验6)以外，INX231R和INX233P具有与INX234P相当的效力(图25)。特别地，图25中的数据显示INX231P、INX231R、INX233P和INX234P对防止PRM中TNFα和IL-6的离体诱导具有相当的效力。在实验中，在1次单次腹膜内注射后7天评价ADC作用；以10mg/Kg(0.2mg/Kg GC有效负载)给与ADC。在24小时收集细胞上清液。使用ELISA(参见方法章节)(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比，SEM)测量TNFα和IL-6。
实验9：偶联至INX231的INX R接头有效负载的长期效力。
在图26中的本实验中，我们评价了偶联至INX231的若干其他INX接头有效负载的长期效力。在本实验中，独立地改变二肽接头(INX R、INX W对比INX P)的电荷、类固醇环(INX S对比INX P)的卤化和有效负载(INX V对比INX P)。也作为INX201偶联物评价了与INX P具有不同有效负载的接头有效负载INX O。在第-7天以0.2mg/Kg有效负载的剂量腹膜内注射所有ADC。我们分析了在24小时收集的细胞上清液。
如图26中的数据所示，偶联至INX231的接头有效负载INX S、INX V和INX W对控制细胞因子反应显示出明显的长期效力，而INX231P和INX231R显示出更有限但显著的长期效力；偶联至INX231的INX O有效负载对PRM细胞因子反应具有极小和不显著的影响。图26显示偶联至INX231的GC接头有效负载INX R、INX O、INX S、INX V和INX W对比INX P对防止PRM中TNFα和IL-6的离体诱导的功效评价。在1次单次腹膜内注射后7天评价ADC作用；以0.2mg/Kg GC有效负载给与ADC。在24小时收集细胞上清液。使用ELISA(参见方法章节)(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比，SEM)测量TNFα和IL-6。
实验10：有效负载INX S、INX V和INX W在1、7和14天药效范围内的效力。
在图27中的本实验中，评价了有效负载INX S、INX V和INX W在1、7和14天药效范围内的长期效力。在第-14、-7或-1天腹膜内注射INX231P、INX231S和INX231V，并且在-14天仅注射INX231W。以0.2mg/Kg有效负载的剂量施用所有ADC。在第0天收集PRM。一部分细胞用于RNA分离，而另一部分置于培养中。我们分析了在分离后24小时收集的细胞上清液。
如图27中的数据所示，在24小时(第1天/D1)或7天后，有效负载INX S和INX V显示出与INX P类似的FKBP5诱导水平。14天后，尽管在用INX P处理的组中FKBP5转录明显减少，但用有效负载INX S、V和W处理的组仍显示出高FKBP5转录物水平。图27含有GC有效负载INX231S、INX231V和INX231W对比INX231P对诱导PRM中的FKBP5转录的效力评价结果。在1次单次腹膜内注射后1、7和14天评价ADC作用；以0.2mg/Kg GC有效负载给与ADC。通过定量实时PCR测量FKBP5表达并呈现为Log2倍数变化对比PBS对照组(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比，SEM)。
图28中的实验进一步显示，在处理后24小时，有效负载INX P、INX S和INX V对防止巨噬细胞产生TNFα和IL-6具有类似的效力。7天前给药显示类似的数据，其中INX231S效力略强。14天前给药引起INX231P、INX231V和INX231W的功能活性损失，而INX231S保留一些活性(第14天IL-6的减少接近于显著性p＝0.0669)。图28中的数据特别显示GC有效负载INX231S、INX231V和INX231W对比INX231P对防止PRM中TNFα和IL-6的离体诱导的效力评价。在1次单次腹膜内注射后1、7和14天评价ADC作用；并且以0.2mg/Kg GC有效负载给与ADC。在24小时收集细胞上清液。使用ELISA(参见方法章节)(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比，SEM)测量TNFα和IL-6。
实验11：偶联物INX234A3、INX234A4、INX234T、INX201L和INX231S在1、7和14天的效力
在图29中的本实验中，评价了巨噬细胞测定中的5种其他有效负载INX234A3、INX234A4、INX234T、INX201L和INX231S在1、7和14天药效范围内的效力。在第-14、-7或-1天以0.2mg/Kg有效负载的剂量腹膜内注射所有ADC。在第0天收集PRM。一部分细胞用于RNA分离，而另一部分置于培养中。分析在分离后24小时收集的细胞上清液。还收集了分离的脾细胞并用于分析FKBP5表达水平。
图29中的数据显示，所有测试的有效负载在24小时诱导类似的高FKBP5转录物水平。7天后，所有组中的FKBP5转录总体下降；截至第14天，仅INX201L处理组显示FKBP5持续下降，而INX234A3、INX234A4、INX234T和INX231S似乎诱导稳定的FKBP5转录水平，与第7天相比无变化。
在先前实验中，当注射INX J和INX P有效负载偶联物后>4天分析时，观测到脾中极少乃至无FKBP5信号。极其有趣的是，图29中测试INX234A4、INX234T、INX201L和INX231S效力的实验显示在第7天FKBP5的显著诱导；此外，截至第14天，INX234T和INX231S仍诱导显著增加。更具体而言，图29显示GC有效负载INX234A3、INX234A4、INX234T、INX201L和INX231S对诱导腹膜驻留巨噬细胞(上排)和脾细胞(下排)中的FKBP5转录的效力评价。在1次单次腹膜内注射后1、7和14天评价ADC作用；以0.2mg/Kg GC有效负载给与ADC。通过定量实时PCR测量FKBP5表达并呈现为Log2倍数变化对比PBS对照组(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比，SEM)。
图30中的实验进一步显示，在处理后24小时，所有有效负载INX A3、INX A4、INXT、INX L和INX S对防止巨噬细胞产生TNFα和IL-6具有类似的效力。7天前给药显示与INX234A3类似的结果，其中INX231S效力略强。14天前给药引起INX234A4对控制TNFα和IL-6产生的功能活性损失，但有趣的是，INX234A3、INX234T、INX201L和INX231S仍显著降低TNFα产生。更特别地，图30中的实验评价GC有效负载INX234A3、INX234A4、INX234T、INX201L和INX231S对防止PRM中TNFα和IL-6的离体诱导的效力。在1次单次腹膜内注射后1、7和14天评价这些ADC作用；以0.2mg/Kg GC有效负载给与ADC。在24小时收集细胞上清液。使用ELISA(参见方法章节)(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比，SEM)测量TNFα和IL-6。
实验12：偶联物INX234A5和INX234A11对比INX234V在7天和14天的效力
在图31中的本实验中，评价了巨噬细胞测定中的2种其他有效负载，即INX234A5和INX234A11对比INX234V在7天和14天药效范围内的效力。在第0天以0.2mg/Kg有效负载的剂量腹膜内注射所有ADC。在第7天和第14天收集PRM。一部分细胞用于RNA分离，而另一部分置于培养中。评价在分离后24小时收集的细胞上清液。如图31中的数据所示，所有有效负载在注射后7天诱导类似的高FKBP5转录物水平。截至第14天，FKBP5转录总体下降，但与对照组相比仍有显著差异。
更具体而言，在图31中的实验中，评价了GC有效负载INX234V、INX234A5诱导腹膜驻留巨噬细胞中的FKBP5转录的效力，其中在1次单次腹膜内注射后7天和14天评价ADC作用；并且其中以0.2mg/Kg GC有效负载给与这些ADC。通过定量实时PCR测量FKBP5表达并呈现为Log2倍数变化对比PBS对照组(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比，SEM)。
图32中的实验进一步显示，在14天后，所有测试的ADC对防止巨噬细胞产生TNFα和IL-6保留类似的效力。特别地，图32中的实验比较了GC有效负载INX234V、INX234A5和INX234A11对防止PRM中TNFα和IL-6的离体诱导的效力。在1次单次腹膜内注射后14天评价这些ADC的作用；并且以0.2mg/Kg GC有效负载给与ADC。在24小时收集细胞上清液。使用ELISA(参见方法章节)(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比，SEM)测量TNFα和IL-6。
实验13：偶联物INX231A7、INX231A12和INX231A23对比INX234V在7、14和21天的效力
在图33中的本实验中，评价了巨噬细胞测定中的3种其他有效负载INX231A7、INX231A12和INX231A23对比INX234V在注射后7天和21天药效范围内的效力。在第0天以0.2mg/Kg有效负载的剂量腹膜内注射所有ADC，以0.08mg/Kg有效负载给与的INX231A7除外。在第7天收集PRM。一部分细胞用于RNA分离，而另一部分置于培养中。评价在分离后24小时收集的细胞上清液。更具体而言，在图33中的这些实验中，评估GC有效负载INX234V、INX231A7、INX231A12和INX231A23对诱导腹膜驻留巨噬细胞中的FKBP5转录的效力，其中在1次单次腹膜内注射后7天和21天评价ADC作用；以0.2mg/Kg GC有效负载给与ADC，以0.08mg/Kg有效负载给与的INX231A7除外。通过定量实时PCR测量FKBP5表达并呈现为Log2倍数变化对比PBS对照组(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比，SEM)。
如图33中的数据所示，所有测试的有效负载在注射后7天诱导类似的高FKBP5转录物水平，其中INX231A23效力略强。截至注射后第21天，与PBS处理组相比，仍检测到FKBP5转录的小而显著的增加，INX231A7处理组除外。
图34中所含的实验结果进一步显示，在7、14和21天后，所有测试的ADC对防止巨噬细胞产生TNFa和IL-6保留类似的效力，其中INX231A23再次为最有效的，特别是关于TNFa产生。在注射后14天，观测到所有测试的ADC的TNFa显著降低，并且截至给药后21天，用INX231A7、INX231A12和INX231A23处理的组的TNFa产生仍显著降低。
更具体而言，图34显示GC有效负载INX234V、INX231A7、INX231A12和INX231A23对防止PRM中TNFα和IL-6的离体诱导的效力评价结果。在这些实验中，在1次单次腹膜内注射后7、14和21天评价ADC作用；以0.2mg/Kg GC有效负载给与ADC。在24小时收集细胞上清液。使用ELISA(参见方法章节)(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比，SEM)测量TNFα和IL-6。特别值得注意的是，尽管仅以0.08mg/Kg有效负载给与INX231A7，但在21天后其对TNFa产生仍具有显著影响。
结论
数据显示：
·单次注射INX201J在PRM靶细胞群体中诱导GC报告转录物FKBP5的长期转录诱导，证明ADC具有>4天的药效范围，而截至24小时检测不到Dex的FKBP5转录诱导。
·接头有效负载INX S、INX V、INX W、INX A3、INX A4、INX A5、INX A11和INX T当在14天前给与时关于FKBP5诱导仍显示出显著效力。
·在第1、7和14天，在具有INX P类似物、特别是INX T(磷酸化)和INX S(在C6/C9处氟化)的脾细胞中观察到显著FKBP5诱导。INX A4以及文献先例INX L(INX J的磷酸化型式)仅在第1天和第7天展示出显著诱导。
在我们基于促炎症性IL-6和TNFα产生/分泌的PRM炎症状态的体内处理/离体评价的模型中：
-所测试的ADC(INX231J/INX234J/INX240J)即使当以0.02mg/Kg有效负载给与时在7天后仍显示出效力，比以2mg/Kg给与的Dex对照低100倍。
-所有测试的ADC(INX201J/INX201P/INX231J/INX234J/INX240J)基于TNFα和IL-6减少在PRM中具有药理范围≥7天，而Dex已失去所有效力。
-接头/有效负载INX R、INX P和INX J在7天前给与时显示出类似的效力。
-接头/有效负载INX S、INX V和INX W在7天前给与时似乎比有效负载INX P和INXR效力明显更强。对于INX V和INX W，这可能归因于增强的释放。对于INX S，这可能归因于在C6/C9处氟化的游离有效负载的效力。
-接头有效负载INX O当偶联至INX201时显示出极有限且不显著的效力。
-接头/有效负载INX S、INX V、INX A3、INX T、INX L、INX A5和INX A11当在14天前给与时对控制PRM中的细胞因子反应具有显著效力。
-接头/有效负载INX A7、INX A23和INX A12在注射后至少21天引发效力。
在这些测定中特别值得注意的是，所有含有螺[3.3]庚烷的INX V类似物基于其在离体PRM模型中引发FKBP5和细胞因子减少的能力，在注射后效力持续至少7天。显示效力持续至少7天的所测试类似物包括INX A3、INX A4、INX A5、INX A7、INX A11、INX A12和INXA23，并且另外包括以下：
-磷酸化类似物(INX A12/INX A7)
-双氟化类似物(INX A23/A12)
-苯环与螺[3.3]庚烷之间的亚甲基的醚变化(INX A4和INX A5)
-带负电荷的gly/glu接头的接头变体，包括带正电荷的lys/gly(INX A3)、带负电荷的Asn/gly(INX A11)
实施例7：抗体药物偶联物对LPS诱导的炎症的影响
进行了在本实施例中公开并在图35-48中显示结果的Fourtenn体内研究，以评估根据本发明的示例性抗体药物偶联物对LPS诱导的炎症的影响。
为评价ADC在自身免疫性疾病中的潜在功效，我们使用LPS诱导的全身炎症的短期模型。腹膜内(i.p.)注射脂多糖(LPS)广泛用作小鼠急性免疫反应(局部和全身)模型。LPS模型的特征在于注射后最早2小时可监测到血液循环中的大量促炎细胞因子。截至24小时，大多数细胞因子恢复至正常水平。我们通过主要监测LPS注射后2或4小时的细胞因子反应来利用此模型。初步研究显示，最早2小时可检测到地塞米松(Dex)处理对IL-12p40、TNFα、MIG、MIP-1α和IL-1β具有剂量依赖性作用，因此我们的研究集中于测量这5种细胞因子中的一者或多者。(参见Vermeer等人,(2003)Glucocorticoid-induced increase inlymphocytic FKBP51 messenger ribonucleic acid expression:a potential markerfor glucocorticoid sensitivity,potency,and bioavailability.J Clin EndocrinolMetab.1月；88(1):277-84)
研究的目的是评价与游离Dex相比，偶联至各种糖皮质激素有效负载的人类抗VISTA抗体的功效。
材料和方法
方法
在这些实验中，小鼠分别在LPS注射前约20小时或2-4小时接受抗体或Dex处理。Dex寿命短并且快速起作用，而ADC需要额外处理时间。选择这些时间点作为公平地比较ADC和Dex的峰值活性的方式。
LPS腹膜内注射后2或4小时收集血液，并且分离血浆用于细胞因子分析。
测试剂和剂量
抗体
·INX201(Aragen，批号BP-3200-019-6)为在Fc区中具有L234A/L235A/E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。
·huIgG1si(Aragen，批号BP-2211-018-6)为在Fc区中具有E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的抗RSV mAb。
·INX201J(Abzena，批号JZ-0556-025-1、JZ-0556-027、JZ-0556-013)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX201抗体。接头/有效负载(J)是基于先前报道的接头/有效负载(US15/611,037)。其由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX J-2)组成。
·huIgG1si J(Abzena，批号JZ-0556-025-2)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而与INX J接头/有效负载偶联的huIgG1si抗体。
·INX201N(Abzena，批号JZ-0556-028)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX201。接头/有效负载(INX N)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-1)组成。
·INX201O(Abzena，批号JZ-0556-016-2)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX201。接头/有效负载(INX O)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-4)组成。
·INX201P(Abzena，批号JZ-0556-016-1)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX201。接头/有效负载(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX233(ATUM批号82276.1.a)为在Fc区中具有L234A/L235A/E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。
·INX233P(Abzena，批号PP-0924-001-3)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX233。接头/有效负载(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX231(ATUM批号72928.1.a)为在Fc区中具有L234A/L235A/E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。
·INX231P(Abzena，批号JZ-0556-017-1)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX201。接头/有效负载(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX231R(Abzena，批号PP-0924-001-2)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX231。接头/有效负载(INX R)由中性蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX231S(Abzena，批号PP-0920-014-1)为具有6.9的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX231。接头/有效负载(INX S)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与醋酸氟轻松类似物有效负载(INX-SM-24)组成。
·INX231V(Abzena，批号PP-0920-014-2)为具有7.8的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX231。接头/有效负载(INX V)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX231W(Abzena，批号PP-0920-014-3)为具有7.5的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX231。接头/有效负载(INX W)由带正电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX231J(Abzena，批号JZ-0556-013-1)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX231抗体。接头/有效负载(J)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX J-2)组成。
·INX234J(Abzena，批号JZ-0556-013-3)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(J)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX J-2)组成。
·INX240J(Abzena，批号JZ-0556-013-3)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX240抗体。接头/有效负载(J)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX J-2)组成。
·INX234P(Abzena，批号HA-0853-02)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234。接头/有效负载(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX234A3(Abzena，批号PP-0924-023-1)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A3)由带正电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX234A4(Abzena，批号PP-0924-023-2)为具有7.9的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A4)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-43)组成。
·INX234T(Abzena，批号PP-0924-023-3)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX T)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与磷酸化的布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX234V(Abzena，RJS-1054-003)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX V)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX234A5(Abzena，批号RJS-1054-002)为具有7.9的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A5)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-44)组成。
·INX234A11(Abzena，批号RJS-1054-001)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A11)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头(Asn/gly)与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX231A7(Abzena，批号RJS-1054-007-001)为具有7.8的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A7)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与磷酸化的布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX231A12(Abzena，批号RJS-1054-007-002)为具有6.99的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A12)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与磷酸化的醋酸氟轻松类似物有效负载(INX-SM-25)组成。
·INX231A23(Abzena，批号RJS-1054-006-001)为具有7.34的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A23)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与醋酸氟轻松类似物有效负载(INX-SM-25)组成。
·INX234A13(Abzena，批号RJS-1054-007-003)为具有5.82的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A13)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-34)组成。
·INX234A1(Abzena，批号RJS-1054-004)为具有7.6的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A1)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-35)组成。
·靶标B-P(Abzena PP-0924-031)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的抗小鼠靶标B抗体。此抗体结合至除VISTA以外的免疫细胞特异性抗原，VISTA在不同免疫细胞类型上表达并且为内化抗体。接头/有效负载(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX201V(Abzena，批号SCG-1120-012-1)为具有7.86的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX201。接头/有效负载(INX V)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX234A9(Abzena，批号AF-1114-007-1)为具有7.3的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A9)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-46)组成。
将抗体在PBS中稀释并且以0.2ml的体积腹膜内(i.p.)注射以递送指定剂量。
地塞米松
将来自Phoenix的地塞米松无菌注射剂NDC 57319-519-05在PBS中稀释并且如所述经由腹膜内注射而给药。
LPS
LPS获自AMSBIO(编号9028)。向小鼠给与0.5mg/Kg。
小鼠
在现场(达特茅斯比较医学与研究中心)饲养hVISTA小鼠。在9与15周龄之间录入的雌性小鼠中进行所有实验。
抽血和制备
使用玻璃巴斯德移液管从眼眶后腔采集外周血，所述移液管首先用肝素冲洗以防止凝血。接着将血液以550rcf离心5分钟，并且收集血浆并在细胞因子分析之前储存于-80℃下。
血浆细胞因子分析
使用Millipore平台进行细胞因子分析
使用Millipore小鼠5或7-plex平台对25μl血浆进行细胞因子分析。对于ADC-INVIVO-30和35，免疫监测实验室(IML，达特茅斯-希区柯克诺里斯柯顿癌症中心的共享资源)进行分析。
分析中包括的细胞因子为MIP-1α、TNFα、IL-1β、IL-12p40和MIG，并且经由ELISA检测如下：
·BioLegend(目录号430904)ELISA MAX Deluxe Set小鼠TNF-α
·BioLegend(目录号431604)ELISA MAX Deluxe Set小鼠IL-12/IL-23(p40)
遵循制造商所包括的方案进行ELISA。
当低于20pg/ml阈值(对于IL-12p40)和/或10pg/ml阈值(对于TNF-α)时审查细胞因子数据，因为其指示LPS注射失败。
细胞分离
安乐死后，向小鼠腹腔中注射7ml PBS/0.5％BSA/2mM EDTA。对腹膜进行短暂按摩后，切开小切口并且收集腹腔灌洗液。使用阴性选择(Miltenyi试剂盒，参考130-110-434)分离PRM。将脾机械解剖和分离；使用阴性选择(Stem Cell,EasySepTM小鼠CD11b阳性选择试剂盒II)分离单核细胞。
RNA制备和实时PCR
将来自不同组织的细胞团块重悬于0.4ml来自RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen，PN：74136)的RNeasy溶解缓冲液中，并用20G针头匀化5次。遵循制造商的说明书分离RNA，并且在30或40μl H2O(不含RNase/DNase)中洗脱。通过UV光谱法使用Nanodrop评估RNA浓度。
使用Taqman反转录试剂(编号N8080234)并且遵循制造商的说明书进行反转录。
使用Taqman主混合液2X试剂盒(编号4369016)和Taqman引物用于小鼠FKBP5(Mm00487401_m1)以及小鼠HPRT作为管家基因(Mm446968_m1)进行定量实时PCR，并且在来自Applied Biosystem的QuantStudio3上运作。
将Ct数据转换为ΔCt(在样品内针对HPRT归一化的FKBP5)，接着转换为ΔΔCt(经处理样品对比PBS对照的FKBP5相对水平)，以获得相对于PBS的Log2倍数变化。
结果
实验1：LPS诱导的细胞因子释放中INX201J功效的体内功效评价
如图35中所示，用10mg/Kg INX201J处理对控制LPS诱导的IL-12p40释放显示出与2mg/Kg Dex类似的功效。值得注意的是，10mg/kg INX201J递送摩尔当量的0.2mg/Kg GC有效负载，在所述剂量下Dex仅具有部分功效。
在本实验中，我们也评价了ADC是否需要比游离Dex更多的处理时间。我们显示，与LPS前2小时相比，当在LPS注射前17小时给与ADC时功效改善。在LPS后2小时与4小时之间未发现细胞因子反应的差异，并且对于所有后续研究，我们仅在2小时时间点收集血浆。图35显示LPS后2小时(左)和4小时(右)外周血中的IL-12p40变化。使用小鼠multi-plex测量血浆浓度；给药：在LPS刺激前2小时以0.02、0.2、2和5mg/Kg给与Dex(正方形)，在LPS注射前2或17小时以10mg/Kg给与INX201J(圆形)，提供0.2mg/Kg GC。仅PBS组(灰色实心三角形)指示不存在刺激下的基线细胞因子水平；PBS+LPS(黑色实心三角形)(SEM；n＝5/组，除非技术故障排除在分析之外；常规单因素ANOVA，与PBS+LPS组相比)。数据显示，以10mg/Kg(递送约0.2mg/Kg GC有效负载)给药的INX201J对控制LPS诱导的IL-12p40反应显示出与以2或5mg/Kg给药的地塞米松类似的功效。
实验2：LPS诱导的细胞因子释放中的INX201J剂量反应
在本实验中，我们评估了更高稀释度下INX201J抗炎特性。如图36中所示，10mg/Kg(0.2mg/Kg有效负载)的INX201J对所有分析的细胞因子(MIG除外)具有与2mg/Kg Dex同等的功效，而0.2mg/Kg Dex与INX201J相比功效降低。INX201J当在0.06和0.02mg/Kg有效负载下稀释时仍显示出一些功效。
我们还测试了在LPS前17小时注射时Dex的功效，如同INX201J一样。更具体而言，图36中的实验数据显示在LPS后2小时外周血中的细胞因子变化。在这些实验中，使用小鼠5-plex测量血浆浓度；在LPS刺激前2小时以0.002、0.02、0.2、2mg/Kg(正方形)或在LPS前17小时以2mg/Kg(黑色实心正方形)给与Dex，并且在LPS注射前17小时以0.02、0.06、0.2mg/KgGC有效负载给与INX201J(圆形)。仅PBS组(实心灰色三角形)指示不存在刺激下的基线细胞因子水平；PBS+LPS(实心黑色三角形)(SEM；n＝5/组，除非技术故障排除在分析之外；常规单因素ANOVA，与PBS+LPS组相比)。正如预期，归因于Dex的短半衰期，与LPS前2小时给药的组相比，所述组中的效力有所损失，表明INX201J可能对细胞因子产生具有增加的药效学影响。数据显示，10mg/Kg(递送约0.2mg/Kg GC有效负载)的INX201J对控制LPS诱导的MIP-1α、TNFα、IL-1β、IL-12p40和MIG反应具有与2mg/Kg Dex相当的功效。可比较地，0.2mg/Kg Dex仅具有有限的功效。
实验3：LPS诱导的细胞因子释放中的INX201J剂量反应
在本实验中，比较了0.2和0.06mg/Kg GC有效负载的INX201J与2和0.2mg/Kg游离Dex的功效。具体而言，图37中的实验显示在LPS后2小时外周血中的TNFα变化。使用ELISA测量TNFα血浆浓度；给药：在LPS刺激前2小时以0.2和2mg/Kg给与Dex(正方形)，在LPS注射前17小时以0.06和0.2mg/Kg GC有效负载给与INX201J(圆形)。PBS组(实心黑色三角形)在LPS前2小时接受PBS。IgG1siJ(G1siJ)组(三角形)在LPS前17小时接受偶联至0.2mg/Kg有效负载的GC的人类IgG1静默体。(SEM；n＝5/组，除非技术故障排除在分析之外；常规单因素ANOVA，与PBS组相比)。
如图37中的数据所示，0.2mg/Kg GC有效负载的INX201J在控制TNFα对LPS的反应中显示出与2mg/Kg Dex相当的功效。0.06mg/Kg GC有效负载的INX201J仍显示出比0.2mg/Kg Dex更高的功效。注射偶联至相同有效负载的对照人类IgG1静默体的对照组对防止TNFα上调显示出一定水平的功效。剂量反应研究显示，当经由ADC INX201J递送GC有效负载时，功效改善/增强，而0.2mg/Kg的游离Dex对预防LPS诱导的TNFα上调无功效，经由ADC递送的GC有效负载的摩尔当量显示出高效力。值得注意的是：与GC偶联的人类IgG1静默体控制(与INX201J相同的接头和GC有效负载)似乎对LPS诱导的TNFα上调有微弱的影响。
实验4：INX201J对比地塞米松在LPS诱导的细胞因子释放中的体内功效评价
图38中的实验显示在LPS后2小时含不同ADC的外周血中的TNFα变化，其中通过ELISA测量TNFα血浆浓度；在LPS刺激前2小时以0.2和2mg/Kg给与Dex(正方形)，在LPS注射前17小时以0.2mg/Kg GC有效负载各自给与INX201J(圆形)和INX201N(倒三角形)；并且PBS组在LPS前2小时接受PBS(实心黑色三角形)。(SEM；n＝5/组，除非技术故障排除在分析之外；常规单因素ANOVA，与PBS组相比)。
如图38中的数据所示并且在上述实验中进一步观测到，0.2mg/Kg GC有效负载的INX201J对控制LPS诱导的细胞因子反应具有与2mg/Kg Dex类似的功效。另外，数据显示INX201N对控制TNFα反应无功效，这可能归因于此接头/有效负载体内释放的产物的低效裂解或微聚集体形成。当以10mg/Kg(约0.2mg/Kg GC有效负载)给药时，INX201J预防LPS诱导的TNFα上调，具有与2mg/Kg Dex相当的效力。相反，INX201N在该模型中显示无功效。
实验5：INX231J、INX234J和INX240J对比INX201J在LPS诱导的细胞因子释放中的体内功效评价
我们进一步评价了偶联至相同INX J有效负载的3种不同抗VISTA抗体。具体而言，图39中的实验显示在LPS后2小时外周血中的TNFα(左)和IL-12p40(右)变化，其中通过ELISA测量细胞因子血浆浓度；并且在LPS注射前17小时以0.2mg/Kg GC有效负载给与PBS(实心圆形)、INX201J(正方形)、INX231J(三角形)、INX234J(菱形)和INX201P(倒三角形)(SEM；n＝5/组；常规单因素ANOVA，与PBS组相比)。
如图39中的数据所示，INX231J、INX234J和INX240J对控制LPS诱导的细胞因子反应显示出与INX201J类似的效力。以10mg/Kg(递送约0.2mg/Kg GC有效负载)给药的所有ADC对控制LPS诱导的TNFα和IL-12p40反应显示出与INX201J相当的功效。
实验6：INX201O和INX201P对比INX201J在LPS诱导的细胞因子释放中的体内功效评价
在图40中的实验中，以10mg/Kg给与不同ADC以递送0.2mg/Kg有效负载，并且评估其对特定细胞因子的作用。具体而言，图40显示在LPS后2小时外周血中的TNFα(左)和IL-12p40(右)变化，其中通过ELISA测量细胞因子血浆浓度；并且其中在LPS注射前17小时以0.2mg/Kg GC有效负载给与PBS(实心三角形)、INX201J(圆形)、INX201O(正方形)和INX201P(菱形)(SEM；n＝5/组，除非技术故障排除在分析之外；常规单因素ANOVA，与PBS组相比)。
如图40中的数据所示，INX201P对控制LPS诱导的细胞因子反应显示出与INX201J类似的功效，而INX201O具有降低的功效。INX201P在10mg/Kg(递送约0.2mg/Kg GC有效负载)下对控制LPS诱导的TNFα和IL-12p40反应具有与INX201J相当的功效。可比较地，INX201O显示出降低的活性。
实验7：INX201O和INX201P对比INX201J在LPS诱导的细胞因子释放中的体内功效评价-剂量反应研究
在图41中的实验中，通过ELISA测量细胞因子血浆浓度；并且在LPS注射前17小时以0.2mg/Kg GC有效负载各自给与PBS、INX201J(圆形)、INX201O(正方形)和INX201P(菱形)(SEM；n＝5/组，除非技术故障排除在分析之外；常规单因素ANOVA，与PBS组(实心黑色三角形)相比)。具体而言，图41显示在LPS后2小时外周血中的TNFα(右)和IL-12p40(左)变化。
类似于先前实验6的结果，在这些实验中，INX201O与INX201J相比显示出降低的功效。相比之下，INX201P和INX201J在控制IL-12p40和TNFα对LPS的反应中都显示出类似的效力。同样值得注意的是，在0.06mg/Kg有效负载下，对细胞因子反应仍存在强效控制(图41)。在包括剂量反应比较的之前实验的此重复中，INX201P对控制LPS诱导的TNFα和IL-12p40反应显示出与INX201J相当的功效。INX201O再次显示出降低的活性。
实验8：INX231R、INX233P对比INX231P在LPS诱导的细胞因子释放中的体内功效评价
图42中的实验显示在LPS后2小时含不同ADC的外周血中的TNFα(右)和IL-12p40(左)变化。在这些实验中，通过ELISA测量细胞因子血浆浓度；在LPS注射前20小时以0.2mg/Kg GC有效负载给与所有ADC和PBS(INX231P(正方形)、INX231R(三角形)、INX233P(菱形))(SEM；n＝5/组，除非技术故障排除在分析之外；常规单因素ANOVA，与PBS组(实心圆形)相比)。
如图42可见，INX231R(中性二肽接头)对IL-12p40诱导显示出极小影响，但在LPS注射后TNFα显著降低。相比之下，INX233P具有与INX231P类似的功效(两者都具有带负电荷的二肽接头)。以10mg/Kg给与所有ADC，以递送0.2mg/Kg有效负载。INX231R和INX233P在10mg/Kg(递送约0.2mg/Kg GC有效负载)下对控制LPS诱导的TNFα和IL-12p40反应显示出与INX231P相当的功效。
实验9：INX231R、INX201O、INX231S、INX231V和INX231W对比INX231P在LPS诱导的细胞因子释放中的体内功效评价
图43中的实验显示在LPS后2小时外周血中的TNFα(右)和IL-12p40(左)变化。在这些实验中，通过ELISA测量细胞因子血浆浓度；在LPS注射前20小时以0.2mg/Kg GC有效负载给与所有ADC和PBS(INX231P(实心正方形)、INX231R(实心三角形)、INX201O(实心菱形)、INX231S(圆形)、INX231V(正方形)、INX231W(三角形))(SEM；n＝4/组，INX231S除外，其中2个技术故障排除在分析之外；常规单因素ANOVA，与显示非有效数据的PBS组(实心圆形)相比))。此外，在本实验中，一些ADC具有低于8的DAR，因此调整ADC剂量以递送0.2mg/Kg有效负载。
如实验8中所观测，在这些实验中，INX231R具有低于INX231P的功效并且INX231W表现类似，其主要对TNFα产生影响。另外，INX231S和INX231V显示出与INX231P类似的功效。最后，如先前两个实验中所观测，INX201O与其他ADC相比显示出降低的功效(图43)。INX231R、INX231S、INX231V和INX231W在10mg/Kg(递送约0.2mg/Kg GC有效负载)下对控制LPS诱导的TNFα和IL-12p40反应显示出与INX231P相当的功效。可比较地，INX201O显示出降低的活性。此外，除INX201O外所测试的所有ADC都强效递送其GC有效负载，如通过药效范围为至少4天的FKBP5转录诱导所表明。
实验10：INX231R、INX201O、INX231S、INX231V和INX231W对比INX231P对FKBP5转录的影响的比较
图44中的实验显示ADC处理后4天在腹膜驻留者中ADC处理后的FKBP5转录活化。在这些实验中，第0天腹膜内注射ADC，各自递送0.2mg/Kg GC有效负载；第3天分离PRM。通过实时PCR测量FKBP5转录水平并呈现为Log2倍数变化对比PBS对照组(SEM，常规单因素ANOVA，与PBS组相比，n＝4)。
如本文所示，腹膜驻留巨噬细胞(PRM)对ADC极其敏感，并且可通过实时定量PCR(RT-qPCR)测量GC对GC靶标FKBP5的影响。因此，在LPS处理后第3天(ADC给药后4天)分离PRM，提取RNA并且对FKBP5进行RT-qPCR。如图44中的数据所示，除INX201O以外，所有ADC都诱导强效FKBP5转录，证明GC有效负载的适当递送以及至少4天的药效范围)。INX234P、INX234A3和INX234A4在10mg/Kg(递送约0.2mg/Kg GC有效负载)下对控制LPS诱导的TNFα和IL-12p40反应显示出相当的功效。INX234T对TNFα仅具有有限的影响。INX231R、INX231S、INX231V和INX231W在10mg/Kg(递送约0.2mg/Kg GC有效负载)下对控制LPS诱导的TNFα和IL-12p40反应显示出与INX231P相当的功效。可比较地，INX201O显示出降低的活性。此外，除INX201O外所测试的所有ADC都强效递送其GC有效负载，如通过药效范围为至少4天的FKBP5转录诱导所表明。
实验11：INX234P、INX234A3、INX234A4、INX234T和靶标B-P对LPS诱导的细胞因子反应的体内功效评价
如图45中的实验所示，INX234P、INX234A3和INX234A4在10mg/Kg(递送约0.2mg/KgGC有效负载)下对控制LPS诱导的TNFα和IL-12p40反应显示出相当的功效。INX234T对TNFα仅具有有限影响。在本实验中，我们还评价了ADC靶标B-P，其为针对偶联至INX P有效负载的新靶标(靶标B)的小鼠型式的抗体；靶标B-P显示出与INX234T类似的功效，其中IL-12P40显著降低，但TNFα无变化。
更具体而言，图45中显示在LPS后2小时外周血中的TNFα(右)和IL-12p40(左)变化。通过ELISA测量细胞因子血浆浓度；在LPS注射前20小时以0.2mg/Kg GC有效负载给与所有ADC和PBS(SEM；n＝5/组，INX234P、INX234A4和INX234T除外，其中每组记录1个技术故障；常规单因素ANOVA，与PBS组相比)。包含与INX P有效负载偶联的针对另一种免疫细胞特异性抗原(VISTA除外)的抗体的ADC显示出与INX234T类似的功效，其中IL-12P40显著降低，但TNFα无变化。
实验12：INX234V、INX234A5、INX234A11对比PBS在短期LPS诱导的细胞因子释放中的功效评价
图46中的实验中显示在LPS后2小时外周血中细胞因子的TNFα(右)和IL-12p40(左)变化，其中通过ELISA测量细胞因子血浆浓度；并且在LPS注射前20小时以0.2mg/Kg GC有效负载给与所有ADC和PBS(INX234V(实心正方形)、INX234A5(实心三角形)、INX234A11(实心菱形))(SEM；n＝5/组，有例外；常规单因素ANOVA，与PBS组(实心圆形)相比)。图46中的数据显示INX234V、INX234A5和INX234A11在10mg/Kg(递送约0.2mg/Kg GC有效负载)下对控制LPS诱导的TNFα和IL-12p40反应显示出相当的功效。
实验13：INX231A7、INX231A12、INX231A23、INX234A1、INX234A13对比INX234V和PS在短期LPS诱导的细胞因子释放中的功效评价
图47中的实验显示施用不同ADC之后在LPS后2小时外周血中的TNFα(右)和IL-12p40(左)变化。在这些实验中，通过ELISA测量细胞因子血浆浓度；在LPS注射前20小时以0.2mg/Kg GC有效负载给与所有ADC和PBS(INX234V(实心正方形)、INX231A7(实心三角形，以0.08mg/Kg有效负载给与的INX231A7除外)、INX231A12(实心菱形)、INX231A23(圆形)、INX234A1(正方形)、INX234A13(三角形))(SEM；n＝5/组，有例外；常规单因素ANOVA，与PBS组相比)。
如图47中的结果所示，INX234V、INX231A12和INX231A23对控制IL-12p40和TNFα产生显示出类似的效力。INX2341A7具有较低效力，但仍驱使IL-12p40发生显著变化并且对于TNFα接近于显著(P＝0.052)。(然而，值得注意的是，以0.08mg/Kg有效负载给与INX231A7)。此外，INX234A1和INX234A13都对LPS诱导的细胞因子产生无影响。INX234V、INX231A12、INX231A23和INX234A1在10mg/Kg(递送约0.2mg/Kg GC有效负载)下对控制LPS诱导的TNFα和IL-12p40反应显示出相当的功效。INX231A7当以0.08mg/Kg给与时也显示出相当的功效。INX234A13和INX234A11都显示无功效
实验14：INX234P、INX234A9、INX201V对比PBS在短期LPS诱导的细胞因子释放中的功效评价
图48中的实验显示在LPS后2小时来源于不同ADC的外周血中的TNFα(右)和IL-12p40(左)变化。在这些实验中，通过ELISA测量细胞因子血浆浓度；在LPS注射前20小时以0.2mg/Kg GC有效负载给与所有ADC和PBS(SEM；n＝5/组，除非出于技术原因必须在PBS、INX234P、INX201V组中审查1个样品并且在INX234A9组中审查2个样品，常规单因素ANOVA，与PBS组相比)。
如图48中的数据所示，INX234A9和INX201V对防止细胞因子反应似乎效力低于INX234P；然而，效力降低由一个异常点驱动(同一动物对于两种细胞因子未显示出处理影响，这可能归因于注射失败)。
结论
如本文所公开，已合成包含不同抗VISTA抗体的不同ADC，所述抗体在生理pH下结合VISTA，而且全部具有短PK和不同互补决定区(CDR)和不同GC有效负载。
数据显示使用INX201、INX231、INX234、INX240或INX233中的每一者进行免疫细胞靶向的GC递送：
·有效降低LPS诱导的细胞因子反应
·允许基于mg/Kg有效负载在递送约低10倍的GC剂量下实现类似效力
·可能引起GC的药效持续时间增加。
另外，我们评价了类似于INX P接头有效负载的偶联物，其中二肽接头的电荷发生变化。这些包括正电荷(INX W)、中性电荷(INX R)和负电荷(INX P)。这些结果显示以下：
·带正电荷的INX W和中性INX R在此模型中都有效，然而，带负电荷的INX P更强效。
·如GC报告体FKBP5的高表达水平所证明，所有二肽接头变体(正性、负性和中性)都显示出至少4天的药效范围
我们进一步评价了除改变有效负载结构的初始INX J接头/有效负载外，具有4种布地奈德类似物接头/有效负载INX N、INX O、INX P和INX V的偶联物。这些结果显示以下：
·偶联的INX N接头/有效负载在短期LPS活化模型中无效力，这可能反映INX N的释放产物缺乏有效裂解或微聚集体形成。
·偶联的INX O接头/有效负载在此模型中具有影响，但与偶联的INX J、INX P或INX V接头/有效负载相比显示出降低的效力。
·偶联的INXP显示出与偶联的INX J和INX V接头/有效负载类似的功效。
·如GC报告基因FKBP5的高表达水平所证明，偶联的INX P、INX V和INX J接头有效负载显示出至少4天的药效范围。
·在不破坏效力的情况下，可容忍某些有效负载的改变。
我们评价了醋酸氟轻松类似物(INX S)与其布地奈德类似物对应物(INX P)相比较的偶联物。这些结果显示以下：
·INX231P和INX231S具有类似的功效
·如GC报告基因FKBP5的高表达水平所证明，INX231P和INX231S都显示出至少4天的药效范围。
·INX234P、INX234A3和INX234A4具有类似的效力，而INX234T对LPS诱导的TNFa产生显示出更有限(和非显著)的控制。
·INX234V、INX234A5和INX234A11对控制LPS诱导的IL-12p40和TNFa产生显示出类似的效力。
·INX231A7、INX231A12和INX231A23对控制LPS诱导的IL-12p40和TNFa产生显示出与INX234V类似的效力，而INX234A1和INX234A13无影响。
·INX234V、INX231A12、INX231A23和INX234A1在10mg/Kg(递送约0.2mg/Kg GC有效负载)下对控制LPS诱导的TNFα和IL-12p40反应显示出相当的功效。INX231A7当以0.08mg/Kg给与时也显示出相当的功效。相比之下，INX234A13和INX234A11显示无功效。
此外并且重要地，我们显示根据本发明的示例性有效负载，INX P有效负载，当与结合至不同靶标(非VISTA)的抗体偶联时，在递送至免疫细胞时保持其效力，所述不同靶标包含称作靶标B的抗原的鼠类异种同源物。结果指示INX P有效负载当与结合至另一种免疫细胞抗原的抗体偶联时，也由骨髓细胞有效内化，类似于当此相同有效负载与抗VISTA抗体偶联时所见的结果。基于此，我们预期根据本发明的有效负载可与结合至其他(非VISTA)免疫细胞抗原，例如由一种或多种类型的免疫细胞表达的其他抗原的其他抗体偶联，所述免疫细胞包括例如B、T、NK、骨髓、巨噬细胞、Treg、嗜中性粒细胞和树突状细胞以及其他免疫细胞类型，并且也有效地将根据本发明的有效负载递送至这些免疫细胞中。
此外，我们证明在裂解点附近含有螺旋中心的接头有效负载的两种偶联物INX234A9和INX201V对控制LPS诱导的IL-12p40和TNFa产生似乎效力低于INX234P，但效力降低由可能的异常数据点驱动(同一动物对于两种细胞因子未显示出处理影响，因此这些效力差异可能归因于注射失败)。
参考文献
1-Vermeer等人,(2003)Glucocorticoid-induced increase in lymphocyticFKBP51 messenger ribonucleic acid expression:a potential marker forglucocorticoid sensitivity,potency,and bioavailability.J Clin EndocrinolMetab.1月；88(1):277-84
2-McPherson MJ等人,(2017)Glucocorticoid receptor agonist andimmunoconjugates thereof,US15/611,037
实施例8：抗VISTA抗体药物偶联物对非VISTA表达细胞具有有限影响
在本实施例中所述的实验中评估示例性ADC对非靶标(非VISTA)表达细胞的影响并且示于图49中的实验中。这些研究的目的是验证与游离地塞米松(Dex)相比，本发明ADC对VISTA表达细胞/组织的靶向特异性。为监测/确认GC递送和活性，我们通过定量实时PCR(qRT-PCR)测量FKBP5的转录活化，FKBP5是一种敏感性和早期GC反应基因(Vermeer等人,(2003)Glucocorticoid-induced increase in lymphocytic FKBP51 messengerribonucleic acid expression:a potential marker for glucocorticoidsensitivity,potency,and bioavailability.J Clin Endocrinol Metab.1月；88(1):277-84)。在下文详细公开的这些实验中，经由腹膜内(i.p.)注射在体内递送INX201J或游离Dex，继而从肝、脑和肾上腺中分离表达VISTA的脾细胞和非VISTA表达细胞。接着提取RNA并且评价FKBP5转录水平。
材料和方法
方法
在小鼠安乐死和细胞分离前2小时腹膜内注射Dex，这对应于峰值FKBP5诱导。在小鼠安乐死和细胞分离前20小时注射INX201J，以提供足够的时间用于ADC处理和峰值FKBP5诱导。包括仅注射PBS的对照组以定义FKBP5转录物基线。
测试剂和剂量
抗体
·INX201(Aragen，批号BP-3200-019-6)为在Fc区中具有L234A/L235A/E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。
·INX201J(Abzena，批号JZ-0556-025-1、JZ-0556-027、JZ-0556-013)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX201抗体。接头/有效负载(J)是基于先前报道的接头/有效负载(US15/611,037)。其由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX J-2)组成。
将这些抗体在PBS中稀释并以0.2ml的体积腹膜内(i.p.)注射以递送指定剂量。
地塞米松
将来自Phoenix的地塞米松无菌注射剂NDC 57319-519-05在PBS中稀释并且如所述经由腹膜内注射而给药。
小鼠
在现场(达特茅斯比较医学与研究中心)饲养hVISTA KI小鼠。在9与15周龄之间录入的雌性小鼠中进行所有实验。
细胞分离
安乐死后，对脾、肝、肾上腺和脑进行机械解剖和分离。在40μm过滤器上通过后，将细胞团块重悬于RNA溶解缓冲液中(参见下文)。
RNA制备和实时PCR
将来自不同组织的细胞团块重悬于0.4ml来自RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen，PN：74136)的RNeasy溶解缓冲液中，并用20G针头匀化5次。遵循制造商的说明书分离RNA，并且在30或40μl H2O(不含RNase/DNase)中洗脱。在Nanodrop上评估RNA浓度。
使用Taqman反转录试剂(编号N8080234)并且遵循制造商的说明书进行反转录。使用Taqman主混合液2X试剂盒(编号4369016)和Taqman引物用于小鼠FKBP5(Mm00487401_m1)以及小鼠HPRT作为管家基因(Mm446968_m1)进行定量实时PCR，并且在来自AppliedBiosystem的QuantStudio3上运作。
将Ct数据转换为ΔCt和ΔΔCt或相对于PBS的Log2倍数变化。
结果
简言之，使用来自Miltenyi的肝解离试剂盒和肝内皮细胞分离试剂盒(分别为130-105-807和130-092-007)以从hVISTA KI小鼠中分离肝内皮细胞。如图49中的实验所示，CD45阴性(非免疫)CD31阳性(内皮)细胞表现出高VISTA表达水平(红线VISTA；实心灰色无抗体)。具体而言，图49显示VISTA在肝内皮细胞中高度表达，特别是从hVISTA敲入小鼠肝中分离的CD45-CD31+非免疫内皮细胞，并用抗人VISTA染色(红线，右移)或未染色(实心灰色)。
在图50中所示的实验中，我们评价了INX201J对比Dex对雌性hVISTA KI小鼠中的非VISTA表达组织(肾上腺、脑和肝)和表达VISTA的脾的影响。具体而言，如图50中所示，在肾上腺、脑、肝和脾中注射INX201J后FKBP5转录活化。在以0.3、3、10mg/Kg(分别递送0.006、0.06和0.2mg/Kg有效负载)进行1次单次腹膜内注射后20小时测量INX201J作用。在以0.2或2mg/Kg进行单次腹膜内注射后2小时测量Dex作用。通过实时PCR测量FKBP5转录水平并呈现为Log2倍数变化对比PBS对照组的平均值。(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比)。
如图50中的结果可见，注射INX201J后在肾上腺和脑中未检测到高于基线的信号，而2mg/Kg Dex引起肾上腺的FKBP5转录物略微增加和脑中强有力的增加。在肝中，以0.2mg/Kg有效负载的INX201J或Dex在类似水平下检测到FKBP5，并且以2mg/Kg Dex检测到水平升高。
此外，在脾中观测到INX201J的明显剂量依赖性诱导，与0.2mg/Kg有效负载的Dex相比，0.2mg/Kg有效负载的INX201J的FKBP5信号增加10倍。相比之下，仅在2mg/Kg下实现与Dex相当的反应。
结论
数据显示3和10mg/Kg(0.06和0.2mg/Kg有效负载)的INX201J诱导表达VISTA的脾细胞中的FKBP5表达，但不诱导肾上腺或脑中的表达(图49)。在肝中，INX201J当以3和10mg/Kg(0.06和0.2mg/Kg有效负载)给药时适度诱导FKBP5，这可能归因于此组织的免疫细胞丰度和肝内皮细胞中的强VISTA表达(图50)。相比之下，2mg/Kg治疗剂量的Dex诱导脾细胞中的FKBP5诱导，并且此相同剂量诱导脑和肝中的强FKBP5水平和肾上腺中的适度FKPB5水平。
实施例9：本发明类固醇有效负载和抗体糖皮质激素偶联物在人类外周血单核细胞中的体外效力
在本实施例中，我们在体外炎症模型中评估了人类外周血单核细胞类固醇中不同类固醇有效负载的体外效力。LPS的存在引起PBMC增殖和细胞因子释放(Jansky,L.,Reymanova,P.和Kopecky,J.(2003),“Dynamics of cytokine production in humanperipheral blood mononuclear cells stimulated by LPS,or infected byBorrelia”,Physiological Research,52(5),593-5981)。
材料和方法
方法
在LPS刺激的人类外周血单核细胞(PBMC)模型中评估新颖类固醇的效力。在此测定中刺激的PBMC产生多种促炎细胞因子1。在这些研究中，由相对于24小时无处理以剂量依赖性方式减少刺激相关细胞因子表达的能力来判断类固醇效力。
本研究的目的是评价在ImmuNext产生的新颖糖皮质激素(鉴定为INX-SM-GC)在良好表征的体外炎症模型中的效力，所述糖皮质激素是作为游离小分子或经肽接头偶联至抗体。当用LPS刺激时人类PBMC产生若干促炎细胞因子，并且此种细胞因子反应可由糖皮质激素(GC)显著抑制。在我们的研究中，我们使用布地奈德，一种极强效且临床相关的GC作为比较物。
材料和方法
实验设计
在以下所有实验中，用LPS刺激每项研究中从1-2名健康供体分离的人类PBMC，以诱导细胞因子产生。
用连续稀释的GC或GC偶联物(1000-0.2nM有效负载)处理细胞，以鉴定个别药物的剂量依赖性效力，其中布地奈德作为阳性对照。在添加游离有效负载后立即添加LPS，或者在偶联物的情况下，在添加偶联物后四小时添加LPS。
在我们的初步实验中，我们将IL-6和IL-1b鉴定为高度GC反应性细胞因子。因此，将PBMC与GC或抗体偶联的GC一起温育24小时后，收集细胞上清液并且经由ELISA评估IL-6和IL-1b细胞因子水平。
试剂
测试有效负载
·布地奈德：10mM，于DMSO中
·INX-SM-1(Abzena)：5mM，于DMSO中
·INX-SM-2(Abzena)：2mM，于DMSO中
·INX-SM-3(O2H)：10mM，于DMSO中
·INX-SM-53(O2H)：10mM，于DMSO中(INX-SM-3的S立体异构体)
·INX-SM-4(O2H)：20mM，于DMSO中
·INX-SM-54(O2H)：10mM，于DMSO中(INX-SM-4的S立体异构体)
·INX-SM-6(O2H)：10mM，于DMSO中
·INX-SM-56(O2H)：10mM，于DMSO中(INX-SM-6的S立体异构体)
·INX-SM-7(O2H)：2mM，于DMSO中
·INX-SM-9(O2H)：2mM，于DMSO中
·INX-SM-10(O2H)：2mM，于DMSO中
·INX-SM-13(O2H)：2mM，于DMSO中
·INX-SM-24(O2H)：2mM，于DMSO中
·INX-SM-31(O2H)：2mM，于DMSO中
·INX-SM-32(O2H)：2mM，于DMSO中
·INX-SM-33(O2H)：2mM，于DMSO中
·INX-SM-35(O2H)：2mM，于DMSO中
·INX-SM-74(O2H)：2mM，于DMSO中(INX-SM-24的S立体异构体)
·INX-SM-43(O2H)：20mM，于DMSO中
·INX-SM-44(O2H)：20mM，于DMSO中
·INX-SM-45(O2H)：20mM，于DMSO中
·INX-SM-46(O2H)：20mM，于DMSO中
·INX-SM-36(O2H)：20mM，于DMSO中
·INX-SM-37(O2H)：20mM，于DMSO中
·INX-SM-J2(O2H)：20mM，于DMSO中
·INX-SM-14(O2H)：20mM，于DMSO中
·INX-SM-15(O2H)：20mM，于DMSO中
·INX-SM-17(O2H)：20mM，于DMSO中
·INX-SM-34(O2H)：20mM，于DMSO中
·INX-SM-40(O2H)：20mM，于DMSO中
·INX-SM-47(O2H)：20mM，于DMSO中
·INX-SM-49(O2H)：20mM，于DMSO中
·INX-SM-18(O2H)：20mM，于DMSO中
·INX-SM-32(O2H)：20mM，于DMSO中
·INX-SM-48(O2H)：20mM，于DMSO中
·INX-J2(INX-SM-J2)(O2H)：20mM，于DMSO中
·地塞米松(Sigma目录号D4902)：20mM，于DMSO中
测试偶联物
·INX231J(Abzena，批号JZ-0556-013-1)为以8.0的药物/抗体比率(DAR)偶联并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX231。接头/有效负载(INX J)是基于公开的接头/有效负载(US15/611,037)。其由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX J2)组成。
·INX231P(Abzena，批号JZ-0556-017-1)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX231。接头/有效负载(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX231V(Abzena，批号PP-0920-014-2)为具有7.8的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX231。接头/有效负载(INX V)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX234P(Abzena，批号JZ-0556-017-2)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234。接头/有效负载(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX234A4(Abzena，批号PP-0924-023-2)为具有7.9的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A4)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-43)组成。
·INX231S(Abzena，批号PP-0920-014-1)为具有6.9的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX231。接头/有效负载(INX S)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与醋酸氟轻松类似物有效负载(INX-SM-24)组成。
·INX234T(Abzena，批号PP-0924-023-3)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX T)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与磷酸化的布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX234A3(Abzena，批号PP-0924-023-1)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A3)由带正电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX201J(Abzena，批号：JZ-0556-025-1、JZ-0556-027、JZ-0556-013)为经由链间二硫键的完全修饰而偶联至接头/有效负载并且具有8.0的DAR的INX201抗体。接头/有效负载(INX J)是基于公开的接头/有效负载(US15/611,037)。其由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX J2)组成。
·INX201L(Abzena，批号JZ-0556-026-1)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX201抗体。接头/有效负载(INX L)是基于公开的接头/有效负载(US15/611,037)。其由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与磷酸化的布地奈德类似物有效负载(INX J-2)组成。
·INX234A11(Abzena，批号RJS-1054-001)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A11)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头(Asn/gly)与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX234V(Abzena，批号RJS-1054-003)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX V)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX234A5(Abzena，批号RJS-1054-002)为具有7.9的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A5)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-44)组成。
·INX231A23(Abzena，批号RJS-1054-006-001)为具有7.34的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX231抗体。接头/有效负载(INX A23)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与醋酸氟轻松类似物有效负载(INX-SM-25)组成。
·INX231A12(Abzena，批号RJS-1054-007-002)为具有6.99的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX231抗体。接头/有效负载(INX A12)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与磷酸化的醋酸氟轻松类似物有效负载(INX-SM-25)组成。
·INX231A7(Abzena，批号RJS-1054-007-001)为具有7.8的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX231抗体。接头/有效负载(INX A7)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与磷酸化的布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX234A13(Abzena，批号RJS-1054-007-003)为具有5.82的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A13)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-34)组成。
·INX234A1(Abzena，批号RJS-1054-004)为具有7.6的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A1)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-35)组成。
·INX1302(ATUM，批号78597.2.a)为Fc静默抗人靶标B抗体
·INX1302P(Abzena，批号PP-0924-019-002)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的Fc静默抗人靶标B抗体INX1302。接头/有效负载(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX1400P(Abzena，批号PP-0924-019-001)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的Fc静默抗人靶标A抗体。接头/有效负载(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX234J(Abzena，批号JZ-0556-013-2)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX J)是基于公开的接头/有效负载(US15/611,037)。其由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX J2)组成。
·INX234A9(Abzena，批号AF-1114-007-1)为具有7.3的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A9)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-46)组成。
·INX201V(Abzena，批号SCG-1120-012-1)为具有7.86的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX201抗体。接头/有效负载(INX V)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX231V(Pearl River，批号101-1_02)为具有3.66的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX231抗体。接头/有效负载(INX V)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX201P(Pearl River，批号101-2_02)为具有4.52的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX201抗体。接头/有效负载(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX201A23(Pearl River，批号101-3_02)为具有4.34的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX201抗体。接头/有效负载(INX A23)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与醋酸氟轻松类似物有效负载(INX-SM-25)组成。
·INX201A23(Pearl River，批号101-4_01)为具有7.71的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX201抗体。接头/有效负载(INX A23)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与醋酸氟轻松类似物有效负载(INX-SM-25)组成。
·INX201V(Abzena，批号SCG-1120-032-1)为具有3.95的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX201抗体。接头/有效负载(INX V)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
细胞培养基
·不含L-谷氨酰胺的RPMI 1640(VWR目录号16750-084)
·青霉素/链霉素/谷氨酰胺(ThermoFisher目录号10378016)
·1M Hepes(Gibco目录号15630-080)
·人类AB血清(Valley Biomedical目录号HP1022HI)
其他试剂
·来自大肠杆菌O111:B4的脂多糖(Sigma目录号L2630)
·Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare目录号17-1440-03)
ELISA试剂盒
·人类IL-6ELISA MAX Deluxe(Biolegend目录号430504)
·人类IL-1βELISA MAX Deluxe(Biolegend目录号437004)
PBMC制备
在无菌条件下在达特茅斯希区柯克医疗中心的供血者项目中从去识别化健康人类供体获得的单采锥分离出人类PBMC。
将血液转移至50ml Falcon管中并用PBS稀释至30ml。将13ml Ficoll-Paque Plus(Sigma Aldrich)在血液下缓慢分层，并在室温下以850x g将管离心20分钟，同时缓缓加速并且无制动。
从血浆/Ficoll界面收集单核细胞，重悬于50ml PBS中并以300x g离心5分钟。将细胞重悬于PBS中并进行计数。
测定方案
将分离的PBMC重悬于含有10％人类A/B血清、10mM Hepes、1x青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺的RPMI 1640(测定培养基)中。
将细胞以150,000个细胞/孔的最终浓度铺于平底96孔板中，对于每个条件有技术重复。
将测试剂在测定培养基中连续稀释并添加至1,000nM-1nM或0.2nM的最终浓度，这取决于测定或作为无处理对照。
添加LPS刺激至1ng/ml的最终浓度。对于延迟LPS研究，在添加抗体药物偶联物(INX231J、INX231P、INX231V)后4小时添加LPS。
将细胞在37℃下置于5％CO2培养箱中24小时，随后收集上清液。
根据供应商的方案，对上清液使用人类IL-1β和IL-6ELISA试剂盒。
用GraphPad(Prism)制作所有图。
结果
实验1：类固醇有效负载INX-SM-3、INX-SM-53、INX-SM-4、INX-SM-54和INX-SM-1对LPS刺激的人类PBMC的细胞因子产生的抑制作用评估
在图51中所示的实验中，我们评价了新颖INX-GC有效负载INX-SM-3、INX-SM-4、INX-SM-1、INX-SM-53和INX-SM-54的抗炎效力。测试了来自一名供体的PBMC。如图51中所示，INX-SM-3、INX-SM-4和INX-SM-1抑制IL-1β和IL-6产生，INX-SM-3在这三者中似乎是最强效的化合物。相比之下，缩醛位置处的S立体异构体(INX-SM-53和INX-SM-54)不显示出抑制。
从图51中的数据可见，INX-SM-3、INX-SM-4和INX-SM-1抑制IL-1β(左)和IL-6(右)产生。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-1nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以<1nM绘制无处理对照；n＝1名供体，根据技术重复绘制标准偏差。
实验2：评估类固醇有效负载INX-SM-6和INX-SM-56的抑制作用并且确认INX-SM-1、INX-SM-3和INX-SM-4对LPS刺激的人类PBMC的细胞因子产生的作用
在图52中的实验中，我们确认新颖糖皮质激素有效负载INX-SM-3、INX-SM-4、INX-SM-1的抗炎效力并且评估额外化合物INX-SM-6和INX-SM-56的效力。测试了来自一名供体的PBMC。特别地，在图52中，在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-1nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以<1nM绘制无处理对照；n＝1名供体，根据技术重复绘制标准偏差。
如图52中所示，INX-SM-1、INX-SM-3、INX-SM-4和INX-SM-6显示出抑制IL-1β产生。INX-SM-3似乎再次为这些测试化合物中最强效的化合物。相比之下，缩醛位置处的S立体异构体(INX-SM-56)不显示出抑制。
实验3：类固醇有效负载INX-SM-9、INX-SM-31和INX-SM-35对LPS刺激的人类PBMC的细胞因子产生的抑制作用评估
在本实验中，我们评价了新颖糖皮质激素有效负载INX-SM-9、INX-SM-31和INX-SM-35的抗炎效力。测试了来自两名供体的PBMC。具体而言，图53显示INX-SM-9、INX-SM-31和INX-SM-35抑制IL-1β(上)和IL-6(下)产生。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.2nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.2nM绘制无处理对照；n＝2名供体，示出代表性供体。根据技术重复绘制标准偏差。
如图53中的结果所示，INX-SM-9、INX-SM-35和INX-SM-31显示出IL-1β产生的剂量依赖性抑制。INX-SM-31似乎为这些测试化合物中效力最低的化合物。
实验4：示例性类固醇有效负载INX-SM-32对LPS刺激的人类PBMC的细胞因子产生的抑制作用评估
在本实验中，我们评价了新颖糖皮质激素有效负载INX-SM-32的抗炎效力。使用来自第二名供体的PBMC重复所述实验。具体而言，图54中的数据显示INX-SM-32抑制IL-1β(上)和IL-6(下)产生。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(500-1nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以<1nM绘制无处理对照；n＝2。示出代表性供体。根据技术重复绘制标准偏差。
如图54中的数据所示，INX-SM-32对IL-1β和IL-6产生显示出剂量依赖性抑制。
实验5：示例性类固醇有效负载INX-SM-10和INX-SM-33对LPS刺激的人类PBMC的细胞因子产生的抑制作用评估
在本实验中，我们评价了新颖糖皮质激素有效负载INX-SM-10和INX-SM-33的抗炎效力。测试了来自一名供体的PBMC。图55显示INX-SM-10对IL-1β(上)和IL-6(下)产生引发强有力抑制。INX-SM-33展示出细胞因子产生的适度抑制。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.5nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.5nM绘制无处理对照；n＝1名供体，根据技术重复绘制标准偏差。
更具体而言，图55中的数据显示INX-SM-10和INX-SM-33对IL-1β产生引发剂量依赖性抑制，其中INX-SM-33似乎为这些测试化合物中效力最低的化合物。
实验6：示例性类固醇有效负载INX-SM-2、INX-SM-7、INX-SM-13、INX-SM-24和INX-SM-74对LPS刺激的人类PBMC的细胞因子产生的抑制作用评估
在图56中的本实验中，我们评价了新颖糖皮质激素有效负载INX-SM-2和INX-SM-7的抗炎效力。另外，评估INX-SM-13(在C9处卤化)、INX-SM-24(在C6和C9处卤化)和INX-SM-74(INX-SM-24的S立体异构体)对比INX-SM-3(无卤化)以确立类固醇环卤化对这些化合物的影响。本实验使用来自单个供体的PBMC。
具体而言，图56中的数据显示INX-SM-2和INX-SM-7对IL-1β产生的剂量依赖性抑制。具体而言，在该图中显示在24小时测量的与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.16nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的平均细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.16nM绘制无处理对照；n＝1，根据技术重复绘制标准偏差。
此外，如图57中所示，卤化对INX-SM-3效力的影响的评估证明，在INX-SM-24的C6和C9位置处的氟化引起效力增加超过非氟化INX-SM-3。然而，单独在C9位置处的氟化(INX-SM-13)不会引起效力增加超过非氟化有效负载(INX-SM-3)。值得注意的是，INX-SM-24的S立体异构体也显示出剂量依赖性效力。这不同于我们测试的若干非氟化S立体异构体，后者在类似体外研究中不显示出效力(INX-SM-53、INX-SM-54和INX-SM-56)。
图57中的数据显示C6和C9两者的卤化而非单独C9的卤化提供增加的效力。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.16nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的平均细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.16nM绘制无处理对照；n＝1，根据技术重复绘制标准偏差。
实验7：不同ADC，包括偶联至对其他免疫细胞靶标具有特异性的抗体的那些ADC的抗炎作用评估，所述ADC包含示例性本发明接头有效负载(INX P接头有效负载)
在本实验中，我们评估了包含对其他免疫细胞靶标(除VISTA以外的2种不同免疫细胞抗原)具有特异性的抗体的ADC的抗炎作用，所述ADC包含示例性本发明接头有效负载(INX P接头有效负载)。特别地，抗体针对靶标B(INX1400P)和靶标A(INX1302P)，并且检测其对LPS刺激的人类PBMC的作用。如上文所指出，靶标A和靶标B是彼此不同并且与VISTA不同的抗原，并且都由特定免疫细胞类型高度表达。
在本研究中，我们评价了与INX P接头有效负载偶联，但针对其他细胞表面靶标的抗体的抗炎作用，所述抗体为抗靶标B(INX1400P)和抗靶标A(INX1302P)。添加未偶联的抗靶标A抗体(INX1302)作为潜在抗体作用的对照。测试了来自一名供体的PBMC。
如图58中所示，所有三种INXP偶联物能够递送活性游离有效负载并且保留用抗VISTA INX P偶联物所观测的效力。图58显示针对靶标B和靶标A(除VISTA以外的2种不同免疫细胞特异性抗原)的INX P偶联抗体也引发强效抗炎作用。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(8,000-0.26nM偶联有效负载)的糖皮质激素偶联物一起温育的人类PBMC的平均细胞因子水平；n＝1，技术重复的平均值。
另外，评估了两种游离有效负载INX-SM-43和INX-SM-44的抗炎作用。如图59(INX-SM-43)和图60(INX-SM-44)中所示，两种有效负载能够具有一定程度的抗炎作用
具体而言，图59中的实验显示INX-SM-43引发huIL1-β的中度抑制。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(100-0.032nM)的糖皮质激素有效负载一起温育的人类PBMC的平均细胞因子水平；n＝1，技术重复的平均值。图60中的实验也显示INX-SM-44引发huIL1-β的中度抑制。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.32nM)的糖皮质激素有效负载一起温育的人类PBMC的平均细胞因子水平；n＝1，技术重复的平均值。
实验8：示例性糖皮质激素有效负载INX-SM-25、INX-SM-45和INX-SM-46对比INX-SM-3的抗炎效力评估
在本研究中，我们评价了新颖糖皮质激素有效负载INX-SM-25、INX-SM-45和INX-SM-46对比INX-SM-3的抗炎效力。测试了来自一名供体的PBMC。具体而言，图61显示INX-SM-25和INX-SM-3对IL-1β产生显示出强有力抑制。INX-SM-45和INX-SM-46展示出细胞因子产生的更适度抑制。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.5nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.5nM绘制无处理对照；n＝1名供体，绘制技术重复的平均值。
如图61中的实验所示，测试的所有游离有效负载对IL-1β产生显示出剂量依赖性抑制，并且INX-SM-45和INX-SM-46相对于INX-SM-25和INX-SM-3明显具有降低的效力。
实验9：完全偶联形式的新颖糖皮质激素有效负载(INX231J、INX231P、INX231V)的抗炎效力评估
在数据在图62中的本研究中，我们评价了完全偶联形式的新颖糖皮质激素有效负载的抗炎效力。将先前报道的接头/有效负载INX J(INX-J2)与含有INX-SM-3有效负载的新颖接头有效负载INX P和含有INX-SM-32有效负载的INX V相比较。所有接头有效负载以约8的DAR偶联至INX231(一种抗VISTA抗体)，如同INX231J、INX231P和INX231V一样。值得注意的是，所有有效负载(INX-SM-3)、(INX-SM-32)和(INX-SM-3与INX-J2)在体外刺激的PBMC测定中相对于布地奈德具有类似的效力。
作为有效负载浓度的剂量反应，将偶联物添加至单个供体的PBMC中，并且允许温育4小时。这种延迟允许用于有效负载处理的时间。4小时后，添加LPS并且将样品温育24小时，随后评估IL-1b和IL-6。如图62中所示，INX231V的效力显著增强超过INX231P和INX231J。INX231P的效力有一定增强，超过INX231J(文献比较物)。这种发现是出乎意料的，因为使用相同接头(gly/glu)并且所有游离有效负载相对于布地奈德具有类似的效力。
这种发现是出乎意料的，因为使用相同接头(gly/glu)并且所有游离有效负载相对于布地奈德具有类似的效力。特别地，图62显示INX231V的效力显著增加超过INX231P和INX231J。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.16nM)的偶联类固醇接头有效负载一起温育的人类PBMC的A.huIL-1βB.huIL-6的平均细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.16nM绘制无处理对照；n＝1，根据技术重复绘制标准偏差。高于ULOQ(对于IL-1b为12,500pg/mL并且对于IL-6为150,000pg/mL)的值绘制为外推值。
实验10：完全偶联形式的新颖糖皮质激素有效负载(INX231J、INX231P、INX234P、INX231V、INX234A4、INX231S、INX234T、INX234A3、INX201J、INX201L、INX234A11、INX234V、INX234A5)的抗炎效力评估
在数据在图63中的本研究中，我们评价了完全偶联形式的新颖糖皮质激素有效负载的抗炎效力。具体而言，将与先前报道的接头/有效负载INX J(INX-J2)偶联的INX231与INX231P、INX234P、INX231V、INX234A4、INX231S、INX234T、INX234A3、INX201J、INX201L、INX234A11、INX234V、INX234A5相比较。测试了来自一名供体的PBMC。
如图63中的实验所示，V当偶联至相同抗靶标抗体时，偶联的INX V具有实质性效力增强，超过偶联的INX P和INX J。偶联的INX P具有适度增强，超过偶联的INX J。这与本文所公开的人类PBMC中的累积数据一致，其显示INX231V相对于INX231P释放235x有效负载，并且INX231J超过INX231P释放>3x有效负载。值得注意的是，INX234P和INX231P具有类似的效力，反映这些抗体具有类似特性。
图64中的实验进一步显示INX231V具有实质性效力，并且INX231P具有超过INX231J的适度效力。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.16nM)的偶联类固醇接头有效负载一起温育的人类PBMC的IL-1β的平均细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.16nM绘制无处理对照；n＝1，绘制技术重复的平均值。具体而言，如图64中的实验所示，INX231S具有超过其他偶联物的实质性效力，这可能归因于其释放的C6/C9氟化有效负载(INX-SM-24)的效力增强。INX234T(INX P的磷酸化型式)和INX234A3(INX V的带正电荷的接头变体)也具有高于INX231J的效力。具体而言，图64中的实验显示INX231S、INX234T和INX234A3超过INX231J的增强效力。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.16nM)的偶联类固醇接头有效负载一起温育的人类PBMC的IL-1β的平均细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.16nM绘制无处理对照；n＝1，绘制技术重复的平均值。
尽管我们已观测到INX231和INX234偶联物表现类似，但偶联至INX201的接头有效负载可具有增强的体外效力，这归因于INX201抗体的更快速内化。实际上，如图65中的实验所示，INX201J和IN201L相对于INX231J偶联物具有增强的效力。值得注意的是，INX234A4(可能与INX231A4偶联形式相当)具有超过INX231J的增强效力。特别地，图65显示INX201可能引起偶联物对比INX231的早期效力增强。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.16nM)的偶联类固醇接头有效负载一起温育的人类PBMC的IL-1β的平均细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.16nM绘制无处理对照；n＝1，绘制技术重复的平均值。
此外，如图66中的实验所示，V的带负电荷的接头变体INX A11，其与INX V的Glu/gly接头成对比利用Asn/gly接头，具有超过INX J的类似效力增强。值得注意的是，INX234A5也有螺[2.2]庚烷，并且显示出超过INX231J的增强效力，表明其在释放和后续效力中的重要性。具体而言，图66中的实验显示INX V的不同类似物相对于INX231J是强效的。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.16nM)的偶联类固醇接头有效负载一起温育的人类PBMC的IL-1β的平均细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.16nM绘制无处理对照；n＝1，绘制技术重复的平均值。
我们进一步比较了INX-SM-3、INX-J2、布地奈德、地塞米松、INX-SM-32、INX-SM-36的功效。如图67中的实验所示：INX-SM-36、INX-SM-32(上)和INX-SM-3、INX-SM-J2(下)抑制IL-1β。INX-SM-32和INX-SM-36以与地塞米松类似的效力抑制IL-1β。INX-SM-3和INX-J2具有与布地奈德类似的效力。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.5nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.5nM绘制无处理对照；n＝1名供体，绘制技术重复的平均值。
实验11：新颖糖皮质激素有效负载(INX-SM-3、INX-SM-37和INX-SM-32)相对于所报道的糖皮质激素有效负载(INX-J2)的抗炎效力评估
在本研究中，我们评价了游离糖皮质激素INX-J2(已知游离糖皮质激素)相对于我们的新颖糖皮质激素INX-SM-3、INX-SM-37和INX-SM-32的抗炎效力。如图68中的实验所示，在INX J、INX P和INX V接头有效负载(分别为INX-J2、INX-SM-3和INX-SM-32)的游离有效负载的直接比较中，全部显示出类似的效力。此外，结果表明INX-J2可能显示出超过INX-SM-32和INX-SM-3的适度效力增强。效力的这种类似性汇总性地证明，如图68中所示和在图64的实验中，用INX V和INX P偶联物(和相关类似物)所观测的超过INX J偶联物的效力增强并不归因于所释放的有效负载的效力增强，但可能归因于积累增加。相比之下，INX-SM-37相对于其他游离有效负载具有弱效力。
图68中的数据显示INX-SM-32、INX-J2和INX-SM-3对IL-1β具有类似抑制，其中INX-SM-37弱抑制IL-1β，并且INX-SM-32、INX-J2和INX-SM-3以类似效力抑制IL-1β。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.15nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.5nM绘制无处理对照；n＝1名供体，绘制技术重复的平均值。
图69中的实验进一步显示INX231V比其他INX231/INX234偶联物基本上更强效。在本实验中，在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.16nM)的偶联类固醇接头有效负载一起温育的人类PBMC的IL-1β的平均细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.16nM绘制无处理对照；n＝1，绘制技术重复的平均值。
如图70中所示，INX V的磷酸化(INX231A7、INX231A12)和卤化形式(INX231A23和INX231A12)也展示出超过INX 231J的增强效力。特别地，图70中的实验显示INX V的磷酸化和卤化类似物相对于INX J是强效的。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.16nM)的偶联类固醇接头有效负载一起温育的人类PBMC的IL-1β的平均细胞因子水平，在对数标度x轴上以<0.16nM绘制无处理对照；n＝1，绘制技术重复的平均值。
实验12：新颖糖皮质激素有效负载(INX-SM-14、INX-SM-15、INX-SM-17、INX-SM-40、INX-SM-34、INX-SM-47、INX-SM-49和INX-J2)的抗炎效力评估
在本研究中，我们评价了新颖糖皮质激素有效负载的抗炎效力。将先前报道的有效负载INX-J2与有效负载INX-SM-14、INX-SM-15、INX-SM-17、INX-SM-40、INX-SM-34、INX-SM-47和INX-SM-49相比较。测试了来自一名供体的PBMC。
如图71中所示，INX-SM-14和INX-SM-15具有与INX-J2类似的抑制IL-1β和IL-6的能力。如图71、图72和图73中所示，其他GC有效负载INX-SM-17、INX-SM-34、INX-SM-40、INX-SM-47和INX-SM-49相对于INX-J2弱抑制IL-1β和IL-6或者仅弱抑制IL-1β(INX-SM-17)。
特别地，图71中的数据显示INX-SM-14、INX-SM-15和INX-J2对IL-1β(上)和IL-6(下)具有类似抑制。INX-SM-17弱抑制IL-1β，但不抑制IL-6。INX-SM-14、INX-SM-15和INX-J2以类似的效力抑制IL-1β和IL-6。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.15nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以0.01nM绘制无处理对照；n＝1名供体，绘制技术重复的平均值。
此外，图72中的数据显示INX-SM-40和INX-SM-34相对于INX-J2弱抑制IL-1β(上)和IL-6(下)。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.15nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以0.01nM绘制无处理对照；n＝1名供体，绘制技术重复的平均值。
此外，图73中的数据显示INX-SM-49和INX-SM-47相对于INX-J2弱抑制IL-1β(上)和IL-6(下)。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释(1000-0.15nM)的类固醇有效负载一起温育的人类PBMC的细胞因子水平(IL1-β和IL-6)，在对数标度x轴上以0.01nM绘制无处理对照；n＝1名供体，绘制技术重复的平均值。
实验13：完全偶联形式的新颖糖皮质激素有效负载(INX234J、INX201J、INX234A9、INX201V)的抗炎效力评估
在本研究中，我们评价了完全偶联形式的新颖糖皮质激素接头有效负载的抗炎效力。将先前报道的接头有效负载INX-J2偶联至INX234和INX201，并且与偶联至INX231的INXA9和偶联至INX201的INX V相比较。测试了来自一名供体的PBMC。如图74中所示，INX A9和INX V显示出超过偶联至相同抗体主链的INX J的增强效力。值得注意的是，INX A9包括螺环系统，所述系统与INX V在有效负载的适配子区域中不同，并且显示出与INX V类似的偶联形式的增强效力，超过游离有效负载(图118A-O中所示的INX-SM-46)已预测的效力。这可能归因于用INX V所观测的增强积累。
特别地，图74中的数据显示INX231A9和INX201V对降低IL-1β产生显示出超过INX234J和INX201J的增强效力。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释的抗VISTA偶联物(关于偶联的有效负载浓度，1000-0.15nM)一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以0.1nM绘制无处理对照；n＝1名供体，绘制技术重复的平均值。
实验14：完全偶联形式的新颖糖皮质激素有效负载(INX231V、INX231J、INX201A23、INX201V、INX201J、INX201P)的抗炎效力评估(DAR 4对比DAR 8)
在本研究中，我们评价了完全偶联形式的新颖糖皮质激素有效负载的抗炎效力，特别评估降低的DAR(约4对比约8)的影响。相对于先前报道的接头/有效负载，均在DAR 8.0下偶联至INX201和INX231的INX J(INX-J2)来评估偶联物INX231V(DAR 3.66)、INX201A23(DAR 4.34和7.71)、INX201V(DAR 3.95和7.86)和INX201P(DAR 4.52)。测试了来自一名供体的PBMC。
如图75中所示，在降低的DAR(3.66)下INX V偶联物对降低IL-1β具有比在DAR 8.0下具有相同抗体主链的INX J偶联物显著更强的效力。类似地，包括与INX V类似的有效负载，但具有C6、C9氟化的INX201A23在DAR 7.71和DAR 4.43下都具有超过INX231V DAR 3.66和INX231J DAR 8.0的增加效力。特别地，图75中的数据显示INX V和INX A23在同等或降低的DAR下对降低IL-1β产生显示出超过INX J的增强效力。在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释的抗VISTA偶联物(关于总ADC浓度，20-0.003μg/mL)一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以0.001μg/mL绘制无处理对照；n＝1名供体，绘制技术重复的平均值。
图76中的实验进一步显示INX201V在DAR 7.86或3.95的降低DAR下展示出超过INX201J DAR 8.0的效力。值得注意的是，INX201P(DAR 4.52)具有与INX201J(DAR 8.0)类似的效力，但其DAR比相当的INX J偶联物低43％。对于INX201V偶联物和INX201A23偶联物，DAR约8的偶联物的效力约为DAR约4的偶联物的2倍。鉴于此处所述的这些和其他新颖接头有效负载的效力概况，DAR 4可能足以用于治疗用途，并且可能具有良好的可开发特性。
更特别地，图76中的数据显示INX V偶联物即使在降低的DAR下对IL-1β的影响仍具有超过INX J偶联物的增强效力。在实验中，在24小时测量与1ng/mL LPS和连续稀释的抗VISTA偶联物(关于总ADC浓度，20-0.003μg/mL)一起温育的人类PBMC的细胞因子水平，在对数标度x轴上以0.001μg/mL绘制无处理对照；n＝1名供体，绘制技术重复的平均值。
结论
与新颖糖皮质激素有关的结论
我们已显示在使用LPS活化的人类PBMC的体外测定中，以下新颖GC显示出与游离有效负载不同程度的剂量依赖性类固醇效力：
INX-SM-1、INX-SM-2、INX-SM-3、INX-SM-4、INX-SM-6、INX-SM-7、INX-SM-9、INX-SM-10、INX-SM-13、INX-SM-24、INX-SM-31、INX-SM-32、INX-SM-33、INX-SM-35、INX-SM-36、INX-SM-37、INX-SM-43、INX-SM-44、INX-SM-45、INX-SM-46、INX-SM-74、INX-SM-14、INX-SM-15、INX-SM-17、INX-SM-34、INX-SM-40、INX-SM-47、INX-SM-49
用INX-SM-31、INX-SM-33和INX-SM-37观测到所述系列的R立体异构体中效力最低。
氟化对INX-SM-3效力的影响的评估证明INX-SM-24的C6和C9位置处的双卤化引起效力增加。然而，单独在C9位置处的氟化(INX-SM-13)不会引起效力增加超过非氟化有效负载(INX-SM-3)
含有缩醛位置处的S立体异构体的有效负载(INX-SM-53、INX-SM-54和INX-SM-56)不显示出效力。对此例外为在C9和C6位置处都卤化的INX-SM-74，其显示出中度效力，但比具有相同卤化的R立体异构体弱得多。
将缩醛变为吡咯烷(例如，将INX-SM-32转化为INX-SM-37)也显著降低游离有效负载的效力。
与偶联的接头有效负载有关的结论
数据显示：
·大多数接头有效负载以其偶联形式保留游离有效负载的效力。
·带有螺[3.3]庚烷的接头有效负载(INX V系列)具有超过文献先例接头有效负载(INX J)的效力增强，达到游离有效负载的效力无法预测的水平。这种效力增强可能归因于增强的释放，使得先前实施例中所见的积累水平更高。
·这些具有增强效力的接头有效负载包括：INX V、INX A11、INX A3、INX A4、INXA5、INX A12、INX A7、INX A23和INX A9。
·如根据每个抗体的有效负载减少约50％合理预期，在DAR约4下保留偶联物的效力增强，但总效力约为相应DAR约8偶联物的一半。即使效力降低，DAR 4仍可能足以用于治疗用途，并且可能具有比DAR 8分子更理想的可开发特性。
·带有螺[2.5]辛烷的单独接头有效负载也显示出超过INX J的效力增强，达到游离有效负载INX-SM-46的效力无法预测的水平。
·INX P偶联物具有超过具有相同抗体主链的INX J偶联物的适度效力增加，这也可能归因于增强的释放，使得积累的水平更高。这种效力增加使得DAR低43％的INX P偶联物的效力等同于具有相同抗体主链的INX J偶联物。
·具有相同接头有效负载的INX201偶联物具有超过INX231偶联物的增加效力。具有相同接头有效负载的INX234和INX231偶联物具有类似的效力。
·针对其他细胞表面靶标(例如抗靶标A-P、抗靶标B-P)的INX P偶联物在此测定中也具有效力，确认接头有效负载不需要特异性地偶联至抗VISTA靶标抗体以具有效力。
数据进一步显示：
·类固醇结构能够适应多种脱离C17/C16缩醛的替代性几何形状、环尺寸和结构，同时维持效力。
·然而，仅容许在非卤化类固醇的缩醛碳处的R异构体。值得注意的是，类固醇环上的C6和C9位置处氟化的存在确实允许有S异构体的效力，但比相应R异构体弱得多。
·R异构体：INX-SM-1、INX-SM-2、INX-SM-3、INX-SM-4、INX-SM-6、INX-SM-7、INX-SM-09、INX-SM-10、INX-SM-13、INX-SM-24、INX-SM-31、INX-SM-32、INX-SM-33、INX-SM-35、INX-SM-43、INX-SM-44、INX-SM-45、INX-SM-46、INX-SM-36
·S异构体：INX-SM-53、INX-SM-54、INX-SM-56、INX-SM-74(C6/C9氟化)
·代替缩醛的吡咯烷类似物(INX-SM-37)效力较低，但仍维持一定效力
·一些有效负载的偶联形式，特别是INX V与INX-SM-32有效负载及其类似物，可能归因于相应游离有效负载的释放和暴露增强而允许功效实质性增强。
·当抗体保持恒定时，INX P的偶联形式具有超过INX J偶联物的适度效力增强，即使INX J(INX-SM-J2)的游离有效负载形式可能比INX P(INX-SM-3)的效力适度更强。
实施例10：示例性抗VISTA抗体的药物动力学评估
在本实施例中，进行研究以定义根据本发明的各种抗人VISTA抗体的药物动力学(PK)并且将其与来自BMS的pH敏感性抗人VISTA相比较(767-IgG1.3，Johnston等人,2019)。
本实验的目的是1)确认由BMS/Five Prime Therapeutics所述的“pH敏感性”抗体与ImmuNext(INX)抗VISTA抗体相比具有显著不同的PK(与hIgG1相当)；2)评价许多INX抗VISTA抗体的PK。(参见图8、图10和图12中的INX200和其他INX抗体序列)；并且进一步评价更多其他抗VISTA抗体的PK(参见图8、图10和图12中的其他INX抗体序列)。
这些研究在人类VISTA敲入(hVISTA KI)小鼠中进行，所述小鼠具有代替小鼠VISTA基因敲入的人类VISTA cDNA，并且在RNA和蛋白质水平上均表达人类VISTA。在雌性或雄性hVISTA KI小鼠中进行实验，并且在所有研究中，动物接受10mg/Kg抗体的一次剂量。通过ELISA定量外周血中的抗体量。
材料和方法
实验设计
实验1：
将hVISTA KI小鼠分为2个组，每组10只小鼠，在第0天分别用10mg/Kg的人类IgG1和INX200的一次剂量处理。
实验2：
将hVISTA KI小鼠分为2个组，每组10只小鼠，在第0天分别用10mg/Kg的人类IgG1和767-IgG1.3的一次剂量处理。
在实验1和实验2中，在20分钟、4、24、48小时，接着在第5天和第8天(实验1)以及第4天和第7天(实验2)对五只小鼠进行眼眶后放血；通过ELISA定量循环抗体。这些结果分别在图77和图78中。
实验3：
将hVISTA KI小鼠分为4组，每组15只小鼠，在第0天分别用10mg/Kg的INX231、INX234、INX237和INX240的一次剂量处理。在20分钟、4小时、24小时，接着在第2、3、4、5、8、11、14和21天对每组五只小鼠进行眼眶后放血。这些结果在图79中。
实验4：
将hVISTA KI小鼠分为4组，每组10只小鼠，在第0天分别用10mg/Kg的INX901、INX904、INX907和INX908的一次剂量处理。在30分钟、4小时、24小时，接着在第2、3、4、7和14天对每组五只小鼠进行眼眶后放血。这些结果在图80中。
实验5：
将hVISTA KI小鼠分为5组，每组4只小鼠，在第0天分别用10mg/Kg的INX201J、INX231J、INX234J和INX240 J的一次剂量处理。在第3天和第6天对小鼠进行眼眶后放血。这些结果在图81中。
测试剂和剂量
INX200(Aragen，批号BP-2875-019-6.1)为在Fc区中具有L234A/L235A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。
INX201(Aragen，批号BP-3200-019-6)为在Fc区中具有L234A/L235A/E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体(与INX200相同的可变结构域)。
人类IgG1(BioXcell参考，批号659518N1)
767-IgG1,3(Aragen，批号BP-2985-019-6)为由Five Prime Therapeutics与Bristol-Myers Squibb Company开发的在Fc区中具有L234A/L235E/G237A静默突变的人类IgG1/κ主链上的抗人VISTA抗体。此抗体经设计以在低pH(例如pH 6)下结合，但在生理pH(pH 7.4)下具有最小结合。
INX231、INX234、INX237和INX240(批号分别为72928.1.a、72931.1.a、72934.1.a和73419.1.a)为在Fc区中具有L234A/L235A/E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。
INX201J、INX231J、INX234J和INX240J(批号JZ-0556-027、JZ-0556-013-1、JZ-0556-013-2、JZ-0556-013-3)分别为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX201、INX231、INX234、INX237和INX240。接头/有效负载(J)是基于由蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载组成的专利报道的接头/有效负载。
INX901、INX904、INX907和INX908为原生人类IgG2/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体，其中可变结构域分别匹配INX231、INX234、INX237和INX200/INX201。
在PBS中稀释所有抗体，并且以0.2ml体积在小鼠尾静脉中静脉内注射，以递送10mg/Kg的剂量。
小鼠
在Sage Labs(Boyertown,PA)饲养hVISTA小鼠。将8-12周龄的小鼠首先在我们的隔离设施中过渡3周，接着转移至常规设施。在实验起始前使所述小鼠适应1至2周。
抽血和制备
每24小时对动物进行不超过一次放血。将每个小鼠组分为2或3个子组，每组5只小鼠，在第0天交替放血。在注射后第0天在20分钟、4、24、48小时，接着在第5天和第8天(实验1)以及第4天和第7天(实验2)收集血液。在前24小时期间，基于静脉内注射的注册质量排除一些数据。对于后续时间点，仅对成功静脉内注射的动物进行放血。
对于实验3，在20分钟、4小时、24小时，接着在第2、3、4、5、8、11、14和21天对小鼠进行放血。
对于实验4和5，在30分钟、4小时、24小时，接着在第2、3、4、7、14天对小鼠进行放血。
使用玻璃巴斯德移液管从眼眶后腔采集外周血，所述移液管首先用肝素冲洗以防止凝血。接着将血液以400rcf离心5分钟，并且收集血浆并储存于-80℃下以供分析(参见下文)。
抗体血液浓度分析
用于检测人类IgG1的ELISA
首先，在室温(RT)下将96孔平底板(Thermo Scientific Nunc ImmunolMaxisorp，目录号442404)用含1μg/ml小鼠抗huIgG Fcγ(Jackson ImmunoResearch，目录号209-005-098)的PBS包被一小时。
用PT(含0.05％Tween 20的PBS)将孔洗涤3次，接着在室温下用PTB(含0.05％Tween20和1％BSA的PBS)封闭1小时。人类IgG(Southern Biotech，目录号0150-01)用作阳性对照，并且人类IgG1(BioXcell，目录号BE0297)用于构建标准曲线。用PT将孔洗涤3次，接着在室温下将血浆样品在PTB中以至多4种不同稀释度(以在标准曲线上拟合)温育1小时。
用PT洗涤3次后，以1/2000的稀释度使用偶接至HRP的小鼠抗人IgG Fcγ(JacksonImmunoResearch，目录号209-035-098)作为检测试剂，并在室温下温育1小时。洗涤3次后，使用TMB(Thermo Scientific，目录号34028)作为比色底物来显现ELISA反应。在室温下5-10分钟后，用1M H2S04终止反应。
INX200的ELISA检测(实验1)
首先，在室温下将96孔平底板(与4.5.1相同)用含1μg/ml hIX50(人类VISTA ECD，在ImmuNext的Aragen Bioscience生产)的PBS包被一小时。
洗涤3次后，在室温下用PTB将孔封闭一小时。INX908(在ImmuNext的AragenBioscience生产)用作阳性对照，并且INX200用于构建标准曲线。用PT将孔洗涤3次，接着在室温下将血浆样品在PTB中以至多4种不同稀释度(以在标准曲线上拟合)温育1小时。
用PT洗涤3次后，以1/2000使用小鼠抗人κ-HRP(Southern Biotech，目录号9230-05)作为检测试剂，在室温下温育1小时。洗涤3次后，使用TMB底物显现ELISA反应。在室温下5分钟后，用1M H2S04终止反应。
767-IgG1.3的ELISA检测(实验2)
首先，在室温下将96孔平底板(与上述相同)用含1μg/ml小鼠抗huIgG Fcγ(Jackson ImmunoResearch，目录号209-005-098)的PBS包被一小时。
洗涤3次后，在室温下用PTB将孔封闭一小时。人类IgG(Southern Biotech，目录号0150-01)用作阳性对照，并且767-IgG1.3用于构建标准曲线。用PT将孔洗涤3次，接着在室温下将血浆样品在PTB中以至多4种不同稀释度(以在标准曲线上拟合)温育1小时。
在PTB中洗涤3次后，以1/2000使用小鼠抗人IgG Fcγ-HRP(JacksonImmunoResearch，目录号209-035-098)作为检测试剂，在室温下温育1小时。洗涤3次后，遵循制造商的说明书使用TMB底物显现ELISA反应。在室温下5分钟后，用1M H2S04终止反应。
用于实验3的ELISA
首先，在室温下将96孔平底板(与上述相同)用含1mg/ml hIX50(人类VISTA ECD，在ImmuNext的Aragen Bioscience生产)的PBS包被一小时。
洗涤3次后，在室温下用PTB将孔封闭一小时。INX908(在ImmuNext的AragenBioscience生产)用作阳性对照，并且INX231、INX234、INX237或INX240用于构建标准曲线。用PT将孔洗涤3次，接着在室温下将血浆样品在PTB中以至多4种不同稀释度(以在标准曲线上拟合)温育1小时。
在PTB中洗涤3次后，以1/2000使用小鼠抗人IgG Fcγ-HRP(JacksonImmunoResearch，目录号209-035-098)作为检测试剂，在室温下温育1小时。洗涤3次后，遵循制造商的说明书使用TMB底物显现ELISA反应。在室温下5分钟后，用1M H2S04终止反应。
用于实验4的ELISA
首先，在室温下将96孔平底板(与先前实验相同)用含1mg/ml hINX50(人类VISTAECD，在ImmuNext的Aragen Bioscience生产)的PBS包被一小时。
洗涤3次后，在室温下用PTB将孔封闭一小时。INX201用作阳性对照，并且INX231、INX234或INX240用于构建标准曲线。用PT将孔洗涤3次，接着在室温下将血浆样品在PTB中以至多4种不同稀释度(以在标准曲线上拟合)温育1小时。
在PTB中洗涤3次后，以1/2000使用小鼠抗人IgG Fcγ-HRP(JacksonImmunoResearch，目录号209-035-098)作为检测试剂，在室温下温育1小时。洗涤3次后，遵循制造商的说明书使用TMB底物显现ELISA反应。在室温下5分钟后，用1M H2S04终止反应。
用于实验5的ELISA
首先，在室温下将96孔平底板(与上述相同)用含1mg/ml hIX7(小鼠IgG2s主链上的人类VISTA ECD)的PBS包被一小时。
洗涤3次后，在室温下用PTB将孔封闭一小时。INX901、INX904、INX907或INX908用作阳性对照并且构建标准曲线。用PT将孔洗涤3次，接着在室温下将血浆样品在PTB中以至多4种不同稀释度(以在标准曲线上拟合)温育1小时。
在PTB中洗涤3次后，以1/2000使用小鼠抗人IgG Fcγ-HRP(JacksonImmunoResearch，目录号209-035-098)作为检测试剂，在室温下温育1小时。洗涤3次后，遵循制造商的说明书使用TMB底物显现ELISA反应。在室温下5分钟后，用1M H2S04终止反应。
ELISA测定计算
通过将标准曲线的最低点乘以用于稀释样品的最低稀释因子来计算LOQ。例如，如果最低标准点为0.3ng/mL并且最低标准稀释度为1/400，则LOQ为0.1ug/mL，因为其以与报告样品相同的单位报告。
当样品OD无法与背景OD(约0.01的OD)相区分时，确定LOD。不计算LOD的浓度，但0或0.001ug/mL的浓度指定用于绘图和PK计算目的。
使用PKsolver程序在静脉内推注后进行非隔室分析(NCA)来确定抗体半衰期。
实验1-5的结果分别在图77-81中。
图77含有比较INX200与人类IgG1的PK的实验1的结果。显示在标注的时间点在hVISTA KI小鼠(SD；n＝5/组)中抗体的血浆浓度。
图78含有比较767-IgG1.3与人类IgG1的PK的实验2的结果。显示在标注的时间点在hVISTA KI小鼠(SD；n＝5/组)中抗体的血浆浓度。
图79含有比较INX231、INX234、INX237和INX240的PK的实验3的结果。显示在标注的时间点在hVISTA KI小鼠(SD；n＝5/组)中抗体的血浆浓度。左图在Log10中显示y轴和x轴，而对于右图，仅y轴在Log10中。
图80含有比较INX901、INX904、INX907和INX908的PK的实验4的结果。显示在标注的时间点在hVISTA KI小鼠(SD；n＝5/组)中抗体的血浆浓度。
图81含有比较INX201J、INX231J、INX234J和INX240J的PK的实验5的结果。显示在标注的时间点在hVISTA KI小鼠(SD；n＝4/组)中抗体的血浆浓度。
这些实验中的数据显示如下：
实验1(图77)显示，归因于靶标介导的药物处置(TMDD)，在给药后24小时抗人VISTA抗体INX200的PK在血浆中不可定量，而人类IgG1对照显示出对于IgG更典型的延长半衰期。
实验2(图78)显示，pH敏感性抗人VISTA 767-IgG1,3表现出类似于人类IgG1对照抗体的PK，表明所述对照抗体与其VISTA靶标的结合有限并且不受TMDD影响。
实验3(图79)结果显示，INX231、INX234、INX237和INX240在24小时后仍全部可检测到，并且INX237具有明显增加的半衰期。
实验4(图80)结果显示，将不同IgG主链并入本发明INX抗体上并不明显改变抗体的半衰期。
实验5(图81)结果显示，在所分析的2个时间点，GC有效负载的添加似乎不会进一步影响INX抗VISTA抗体的清除。
这些结果指示，本发明抗VISTA抗体和含有其的ADC具有使其极其适于将所需有效负载，特别是类固醇有效负载靶向递送至靶免疫细胞中的PK值和清除特性。
实施例11：INX201J对比地塞米松的长期处理对皮质酮水平的影响
糖皮质激素快速合成并且对应激作出反应而从肾上腺中分泌。另外，在基础条件下，糖皮质激素以昼夜节律和超昼夜节律(搏动)模式有节奏地释放。这些节律不仅对糖皮质激素靶器官的正常功能是重要的，而且对HPA轴对应激的反应也是重要的。大量研究已显示，长期GC处理对糖皮质激素节律的破坏与人类和啮齿动物的疾病相关。在人类中，最丰富的GC为皮质醇，在小鼠中，其为皮质酮。
基于前述内容，我们评估了示例性抗体药物偶联物(ADC)INX201J和连接到糖皮质激素(GC)有效负载的抗人VISTA单克隆抗体的长期处理对HPA轴、特别是皮质酮基础水平的影响。如下文所论述，在人类VISTA敲入(hVISTA KI)中进行实验，其具有代替小鼠VISTA基因敲入的人类VISTA cDNA，并且在RNA和蛋白质水平上以与小鼠VISTA相同的表达模式表达人类VISTA。在雌性小鼠中进行实验，首先使所述小鼠适应特定处理程序一周，所述处理程序随后将进行所有注射和放血，以限制应激诱导的GC基础水平的变化。
接着向小鼠注射10或3mg/Kg(分别为0.2或0.06mg/Kg有效负载)INX201J或者2或0.2mg/Kg地塞米松(Dex)。每天给与Dex持续4天，而在第1、3和4天给与INX201J。第5天，对小鼠进行放血并且通过ELISA评估其皮质酮水平。
材料和方法
实验设计
在雌性hVISTA KI小鼠中进行实验。接着在第1、3和4天向小鼠注射10或3mg/Kg(分别为0.2或0.06mg/Kg有效负载)INX201J；或者每天注射2或0.2mg/Kg地塞米松(Dex)连续4天。包括每天接受PBS注射剂的对照组。第5天，对小鼠进行放血并通过ELISA评估其血浆皮质酮水平。
给药方案的基本原理是基于其他研究(参见先前实施例)，所述研究显示本发明ADC具有比Dex(<24小时)长得多的药效范围(>96小时)。
实验：(每组8只小鼠)
第1组：PBS
第2组：Dex2mg/Kg
第3组：Dex0.2mg/Kg
第4组：INX201J 10mg/Kg(0.2mg/Kg有效负载)
第5组：INX201J 3mg/Kg(0.06mg/Kg有效负载)
测试剂和剂量
抗体
INX201J(Abzena，批号：JZ-0556-025-1、JZ-0556-027、JZ-0556-013)是基于INX201，其为在Fc区中具有L234A/L235A/E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。INX201J为具有8.0的药物/抗体比率并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的偶联抗体。接头/有效负载(J)由蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载组成。
将抗体在PBS中稀释并以0.2ml的体积腹膜内(i.p.)注射以递送指定剂量。
地塞米松
将来自Phoenix的地塞米松无菌注射剂NDC 57319-519-05在PBS中稀释并且如所述经由腹膜内注射而给药。
小鼠
在现场(达特茅斯比较医学与研究中心)饲养hVISTA小鼠。在9与15周龄之间录入的雌性小鼠中进行所有实验。
抽血和制备
使用玻璃巴斯德移液管从眼眶后腔采集外周血，所述移液管首先用肝素冲洗以防止凝血。接着将血液以550rcf离心5分钟，并且收集血浆并在皮质酮分析之前储存于-80℃下。
皮质酮ELISA
遵循制造商所包括的方案使用Arbor Assays(目录号K014-H5)皮质酮5包装ELISA试剂盒进行ELISA。
结果
INX201J对皮质酮水平具有有限影响
如图82中的实验所示，小鼠适应使得对照组中的皮质酮水平相对一致，2只动物除外，一只显示出极高皮质酮水平并且另一只显示出极低皮质酮水平。图82显示未审查的数据(左)和审查(对照组中无2个异常值)的数据(右)，并且显示血浆皮质酮水平的变化。(SEM，单因素ANOVA，n＝8，右图中的PBS对照组(n＝6)除外)。如所示，2mg/Kg Dex显著降低基础皮质酮水平，但仅在0.2mg/Kg下产生有限但显著的影响。相比之下，INX201J在0.06mg/Kg有效负载的剂量下无影响，但在0.2mg/Kg有效负载下观测到有限降低。
结论
数据显示，2mg/Kg Dex显著降低皮质酮的基础水平，而在0.2mg/Kg下降幅更有限，但仍为高度显著的(P<0.001)。相比之下，治疗上等效于2mg/Kg Dex的0.2mg/Kg有效负载的INX201J具有更有限的影响(ns或P<0.5)。在0.06mg/Kg下，对皮质酮水平无影响。(选择这些剂量，因为如先前实施例中所示，0.2mg/Kg有效负载的INX201J具有与2mg/Kg Dex类似的功效)。
实施例12：ADC对抗原特异性反应的影响
已知糖皮质激素(GC)对初级免疫反应具有深远影响，并且可显著影响IgG对疫苗的反应。因此，我们使用了疫苗模型来评价主题抗体药物偶联物(ADC)在破坏抗原特异性反应中的功能。如下文详细论述，我们使用标准免疫方案，所述方案组合小鼠CD40激动剂抗体(FGK4.5)、OVA肽SIINFEKL作为模型抗原(Ag)和TLR激动剂Poly(I:C)，其驱动强效CD8T细胞驱动的Ag反应，所述反应可使用四聚体技术来测量。另一个益处为此模型允许我们通过在疫苗接种前处理长达1周来评价我们ADC的药效范围。
如下文详细论述，在此种人类VISTA敲入小鼠(hVISTA KI)中进行三项研究，其具有代替小鼠VISTA基因敲入的人类VISTA cDNA，并且在RNA和蛋白质水平上以与小鼠VISTA相同的表达模式表达人类VISTA。简言之，在免疫前向这些小鼠注射ADC长达7天。地塞米松(Dex)用作阳性GC对照。在免疫后第6天在抗Ag反应的峰值处测量外周血中的免疫反应。
材料和方法
实验设计
在雌性小鼠中进行所有4个实验，每组5只小鼠。
实验1：在免疫前2小时施用时Dex对Ag特异性反应的影响
进行图83中所示的实验以确认在免疫前2小时施用时Dex对Ag特异性反应的影响并且在C57Bl/6小鼠中进行。
第1组：PBS
第2组：2mg/Kg Dex
第3组：0.2mg/Kg Dex
向小鼠腹膜内给与2或0.2mg/Kg Dex或者PBS。两小时后，其接受腹膜内注射的疫苗混合剂。接着在6天后对这些小鼠进行放血，并且定量Ag特异性CD8 T细胞数。
实验2：在免疫前不同时间点施用时ADC INX201J对Ag特异性反应的影响
进行图84中的本实验以评价在免疫前不同时间点施用时ADC INX201J对Ag特异性反应的影响并且在hVISTA KI小鼠中进行。
第1组：PBS
第2组：2mg/Kg Dex
第3组：0.2mg/Kg Dex
第4组：10mg/Kg INX201J-第-1天
第5组：10mg/Kg INX201J-第-2天
第6组：10mg/Kg INX201J-第-4天
在免疫前2小时向第1组至第3组的小鼠腹膜内给药。在免疫前1、2或4天按指示向第4组至第6组的小鼠给药。第0天对所有小鼠进行免疫。接着在6天后对所有这些动物进行放血，并且定量Ag特异性CD8 T细胞数。
实验3
进行图85中的本实验以评价在免疫前不同时间点施用时多种ADC对Ag特异性反应的影响并且在hVISTA KI小鼠中进行。
第1组：PBS-疫苗前2小时
第2组：2mg/Kg Dex-疫苗前2小时
第3组：0.2mg/Kg Dex-疫苗前2小时
第4组：2mg/Kg Dex-第-7天
第5组：10mg/Kg INX201J-第-1天
第6组：10mg/Kg INX201J-第-7天
第7组：10mg/Kg INX231J-第-7天
第8组：10mg/Kg INX234J-第-7天
第9组：10mg/Kg INX240J-第-7天
在免疫前2小时向第1组至第3组的小鼠腹膜内给药。在免疫前1或7天按指示向第4组至第9组的小鼠给药。第0天对所有小鼠进行免疫。接着在6天后对所有这些动物进行放血，并且定量Ag特异性CD8 T细胞数。
实验4：偶联至GC有效负载(P)的多种ADC对Ag特异性反应的影响
进行图86中的本实验以评价在免疫前不同时间点施用时偶联至GC有效负载(P)的多种ADC对Ag特异性反应的影响并且在hVISTA KI小鼠中进行。
第1组：PBS-疫苗前2小时
第2组：2mg/Kg Dex-疫苗前2小时
第3组：10mg/Kg INX201J-第-1天
第4组：10mg/Kg INX201J-第-7天
第5组：10mg/Kg INX231P-第-7天
第6组：10mg/Kg INX234P-第-7天
第7组：10mg/Kg INX240P-第-7天
在免疫前2小时向第1组至第2组的小鼠腹膜内给药。在免疫前1或7天按指示向第3组至第7组的小鼠给药。第0天对所有小鼠进行免疫。接着在6天后对所有这些动物进行放血，并且定量Ag特异性CD8 T细胞数。
测试剂和剂量
抗体
在这些实验中使用INX201、INX231、INX234和INX240(分别为批号72928.1.a、72931.1.a和73419.1.a)，其全部包含在Fc区中具有L234A/L235A/E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。
INX201J、INX231J、INX234J和INX240J(批号JZ-0556-027、JZ-0556-013-1、JZ-0556-013-2、JZ-0556-013-3)分别包含具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX201、INX231、INX234和INX240。接头/有效负载(J)由蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载组成。
INX201P、INX231P、INX234P和INX240 P(批号JZ-0556-0271、JZ-0556-017-1、JZ-0556-017-2、JZ-0556-017-3)分别为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX201、INX231、INX234和INX240。接头/有效负载(P)由蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载组成。
将这些抗体中的每一者在PBS中稀释并且以0.2ml的体积腹膜内(i.p.)注射以递送指定剂量。
地塞米松
将来自Phoenix的地塞米松无菌注射剂NDC 57319-519-05在PBS中稀释并且如所述经由腹膜内注射而给药。
疫苗混合剂
每只小鼠使用50μg小鼠CD40激动剂抗体(克隆FGK4.5)+50μg SIINFEKL肽+50μg聚(I:C)的抗体/肽/聚(I:C)标准免疫方案。将疫苗在PBS中稀释并且以200μl最终体积进行腹膜内注射。
小鼠
在现场(达特茅斯比较医学与研究中心)饲养hVISTA小鼠。在9与15周龄之间录入的雌性小鼠中进行所有实验。C57Bl/6小鼠购自杰克逊实验室(Jackson Laboratories)。
抽血和免疫染色
使用玻璃巴斯德移液管从眼眶后腔采集外周血，所述移液管首先用肝素冲洗以防止凝血。使用允许绝对血细胞计数的1次洗涤方案。
将10μl抗体混合剂(参见下文)直接添加至50或100μl血液中。在室温(RT)下温育30分钟后，将600μl BD FACS溶解缓冲液添加至样品中。在室温下温育30分钟后，将样品以550rcf旋转5分钟，在PBS中洗涤一次，重悬于固定体积的PBS中。在MacsQuant流式细胞仪上操作整个样品以获得绝对细胞数。
抗体组：
将以下抗体在PBS中稀释。
-CD11a-FITC(BioLegend；克隆2D7；0.5mg/ml)1:200
-H-2kb-OVA-PE四聚体(MBL iTag MHC四聚体目录号T03000；批号T1603004)；(10μl/样品)
-CD8-Alexa647(克隆KT15；MBL编号D271-A64；1mg/ml)(1:800)。
-小鼠Fc阻断剂(1:200)
闸控策略：
FSC对比SSC-对淋巴细胞群体进行闸控。
FSC-H对比FSC-A-单态群体
对CD8+T细胞进行闸控
CD8+→CD11a+对比Ova-tet+
结果
实验1
如上文所指出，进行图83中的实验以确认在免疫前2小时施用时Dex对Ag特异性反应的影响并且在C57Bl/6小鼠中进行。2mg/Kg Dex显著减少Ag特异性CD8 T细胞(OVA tet)的数目，并且在0.2mg/Kg下还观测到明显减少。具体而言，图83显示在免疫后第6天来自外周血的Ag特异性CD8 T细胞数。(SEM，单因素ANOVA，n＝5)。
实验2
如图84中所示，在免疫前24小时、48小时或96小时以0.2mg/Kg GC有效负载给药时INX201J对降低Ag特异性(Ova Tet+CD8 T细胞)反应显示出与免疫前2小时以2mg/Kg给与的Dex类似的功效。在本实验中，最后添加来自2只初始小鼠的血液以提供基线对照。更具体而言，图84显示在免疫后第6天来自外周血的Ag特异性CD8 T细胞数。在图84中，左图显示包括所有样品的PBS对照组，右图显示去除一个异常值的PBS对照组(SEM，单因素ANOVA，n＝5，初始除外；一个样品由于免疫失败而排除在0.2mg/Kg Dex的组之外)。
实验3
在图85中的实验中评价四种不同ADC。如其中所示，在免疫前1或7天以0.2mg/KgGC有效负载给药时所有测试的ADC对降低Ag特异性(Ova Tet+CD8 T细胞)反应显示出显著功效。自此进一步可见，当以2mg/Kg给药时Dex显示出功效，但在0.2mg/Kg下或在免疫前7天以2mg/Kg给药时损失功效。更具体而言，图85中的实验显示在免疫后第6天来自外周血的Ag特异性CD8 T细胞数。在所述实验中，由于处理期间的技术问题必须排除多个样品：PBS组n＝3，2mg/Kg Dex n＝2，0.2mg/Kg Dex n＝3，INX201J D-1n＝5，INX201J D-7n＝2，INX231JD-7n＝3，INX234J D-7n＝5，INX240J D-7n＝4(SEM，单因素ANOVA，D＝天)。
实验4
在图86中所含的本实验中，评价各自与不同GC有效负载(P)偶联的4种ADC。如其中所示，在免疫前1天或7天给药时INX201P、INX231P和INX234P观测到Ag特异性(Ova Tet+CD8T细胞)反应显著降低，这与第0天以2mg/Kg给与的Dex的作用相当。如其中所示，仅INX240P显示出极小功效。更具体而言，图86中的数据显示在免疫后第6天来自外周血的Ag特异性CD8 T细胞数，其中出于技术原因，在PBS、INX231P和INX234P组中排除2个样品；对于所有其他组，n＝5(SEM，单因素ANOVA)。
结论
如上文所指出，实验1-4中的数据显示如下：
(i)实验1显示在免疫前2小时以2和0.2mg/Kg给与的Dex有效降低Ag特异性反应；
(ii)实验2显示在免疫前24小时、48小时或96小时以0.2mg/Kg GC有效负载给药时根据本发明的示例性ADC偶联物INX201J对降低Ag特异性反应显示出与免疫前2小时以2mg/Kg给与的Dex类似的功效；
(iii)实验3显示在免疫前1或7天以0.2mg/Kg GC有效负载给药时4种示例性ADC对降低Ag特异性反应显示出显著功效。相比之下，当以2mg/Kg给药时Dex显示出功效，但在0.2mg/Kg下或在免疫前7天以2mg/Kg给药时损失功效；并且
(iv)实验4显示分别与不同GC有效负载偶联的4种示例性ADC。此外，在免疫前1或7天给药时所有测试的ADC观测到Ag特异性反应显著降低，INX240P除外。
总而言之，这些数据显示：
(i)以0.2mg/Kg GC有效负载给与的根据本发明的示例性ADC对降低Ag特异性反应具有与以2mg/Kg给与的Dex相当的功效；
(ii)J和P GC有效负载具有相当的效力；
(iii)尽管在免疫前7天注射时Dex损失效力，但不同ADC对控制Ag特异性反应的发展仍具有显著效力。
实施例13：抗VISTA抗体药物偶联物在OVA-哮喘小鼠模型中的功效
哮喘是一种复杂炎症性疾病，其临床特征为气道高反应性、支气管肺泡灌洗液(BALF)和支气管壁中的炎症性细胞浸润以及气道结构变化。吸入性糖皮质激素(GC)被视为大多数哮喘类型的护理标准。基于此，进行研究以评价示例性抗体药物偶联物(ADC)INX201J在小鼠过敏性哮喘模型中的治疗功效。
简言之，如下文详细论述和本实施例中提及的附图中所示，以一周的时间间隔用氢氧化铝中乳化的卵白蛋白(OVA)注射2次将小鼠致敏。1或2周后(实验的第1部分和第2部分)，每天经由吸入暴露于OVA连续5天对小鼠进行攻击。处理由在OVA暴露期间每天10mg/Kg(或0.2mg/Kg有效负载)INX201J或2mg/Kg地塞米松(Dex)的3次剂量组成。在最后一次攻击后24小时进行分析。
在人类VISTA敲入(hVISTA KI)小鼠中再次进行这些实验，其具有代替小鼠VISTA基因敲入的人类VISTA cDNA，并且在RNA和蛋白质水平上以与小鼠VISTA或C57Bl/6小鼠相同的表达模式表达人类VISTA。这些研究的目的是评价我们的ADC INX201J与游离地塞米松(Dex)相比在OVA哮喘鼠类模型中的治疗功效。
为评价我们的ADC的功效水平，我们通过流式细胞术测量募集至肺部的炎症细胞数以及BAL中的细胞因子产生。通过ELISA评价全身反应以定量OVA特异性IgG和IgE的产生。最后，我们对H&E染色肺切片进行盲法分析以对疾病进行评分。
如下文详细论述，使用OVA攻击的2个不同时间点进行这些实验，因为我们并行评价文献中所述的2种不同方案，这可视为内部重复。
材料和方法
实验设计
实验包括以下组，每组10只雌性小鼠。第1-3组和第5、6组为C57Bl/6，第4组和第7组的小鼠为人类VISTA KI小鼠。使第2组至第7组的所有小鼠对OVA敏感并用OVA攻击。
第1组：初始
第2组：OVA氢氧化铝-第14-18天吸入
第3组：OVA氢氧化铝-第14-18天吸入-2mg/Kg Dex
第4组：OVA氢氧化铝-第14-18天吸入-10mg/Kg INX201J
第5组：OVA氢氧化铝-第21-25天吸入
第6组：OVA氢氧化铝-第21-25天吸入-2mg/Kg Dex
第7组：OVA氢氧化铝-第21-25天吸入-10mg/Kg INX201J
将第2组至第7组的小鼠全部用氢氧化铝中乳化的卵白蛋白以10μg/小鼠致敏。
-实验的第1部分：
使第1组(初始)的五只小鼠和第2-4组的所有动物从第14天至第18天吸入30分钟OVA(含3％OVA的PBS)连续5天。从第14天至第18天每天腹膜内注射2mg/Kg Dex。第13、15和17天腹膜内给与10mg/Kg INX201J。第19天处死经处理的动物。
-实验的第2部分：
使第1组的五只小鼠和第5-7组的所有动物从第21天至第25天吸入30分钟OVA(含1％OVA的PBS)连续5天。从第21天至第25天每天腹膜内注射2mg/Kg Dex。第20、22和24天腹膜内给与10mg/Kg INX201J。第25天处死经处理的动物。
实验设计和分析是基于文献(Gueders等人,“Mouse models of asthma:acomparison between C57BL/6and BALB/c strains regarding bronchialresponsiveness,inflammation,and cytokine production”,Inflamm.Res.(2009)58:845-854；Yu等人,“Establishment of different experimental asthma models inmice”,Experimental and Therapeutic Medicine 15:2492-2498,2018)。
测试剂和剂量
抗体
INX201J(Abzena，批号：JZ-0556-025-1、JZ-0556-027、JZ-0556-013)。INX201为在Fc区中具有L234A/L235A/E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。INX201J为具有8.0的药物/抗体比率并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的偶联抗体。接头/有效负载(J)由蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载组成。将INX201J在PBS中稀释并且以0.2ml的体积腹膜内(i.p.)注射以递送指定剂量。
地塞米松
将来自Phoenix的地塞米松无菌注射剂NDC 57319-519-05在PBS中稀释并且如所述经由腹膜内注射而给药。
卵白蛋白
卵白蛋白(或来自鸡卵白的白蛋白)购自Sigma(A5503)并重悬于PBS中。将其腹膜内或经由雾化器给药。
小鼠
在现场(达特茅斯比较医学与研究中心)饲养hVISTA KI小鼠。在15周龄录入的雌性小鼠中进行所有实验。C57Bl/6小鼠购自杰克逊实验室。
OVA吸入
使用来自Kent Scientific(AG-ALSM-0530LG)的雾化器递送系统经由雾化器递送OVA。
放血
使用玻璃巴斯德移液管从眼眶后腔采集外周血，所述移液管首先用肝素冲洗以防止凝血。接着将血液以550rcf离心5分钟，并且收集75μl血浆并在细胞因子分析之前储存于-80℃下。将血细胞重悬于75μl PBS中并进行处理以供免疫染色。
支气管肺泡灌洗
通过吸入CO2处死小鼠，并且立即使用5x 1ml PBS-EDTA(0.5mM)进行支气管肺泡灌洗。通过温和手动抽吸回收细胞。记录体积。排除回收体积低于4ml的样品。以550rcf离心5分钟后，收集上清液并在-80℃下冷冻以进行蛋白质评估。将细胞重悬于PBS中并进行处理以供免疫染色。
BAL免疫染色
将BAL细胞样品分为2份，并用淋巴细胞和骨髓细胞的2种不同抗体组染色(参见表2和表3)。在4℃下30分钟后，将样品洗涤一次并重悬于固定体积中。在MacsQuant流式细胞仪上分析固定体积以获得相当的细胞数。
全血免疫染色
我们使用允许绝对血细胞计数的1次洗涤方案。将10μl抗体混合剂(参见下文)直接添加至100μl血液中。在室温(RT)下温育30分钟后，将600μl BD FACS溶解缓冲液添加至样品中。在室温下温育30分钟后，将样品以550rcf旋转5分钟，在PBS中洗涤一次，重悬于固定体积的PBS中。在MacsQuant流式细胞仪上操作整个样品以获得绝对细胞数。
如表4和表5中所示，不同抗体组用于淋巴细胞和骨髓细胞。
ELISA
IgG、OVA特异性IgG、IgE、OVA特异性IgE的ELISA
用于小鼠IgG1的ELISA
首先，在室温下将96孔平底板(Thermo Scientific Nunc Immunol Maxisorp，目录号442404)用含1μg/ml山羊抗小鼠IgG1(Southern Biotech，目录号1070-01)的PBS包被一小时。用PT(含0.05％Tween 20的PBS)将孔洗涤3次，接着在室温下用PTB(含0.05％Tween20和1％BSA的PBS)封闭一小时。小鼠IgG1抗卵白蛋白(Biolegend，目录号520502)用于构建标准曲线。用PT将孔洗涤3次，接着在室温下将血浆样品在PTB中以至多4种不同稀释度(以在标准曲线上拟合)温育1小时。
用PT洗涤3次后，以1/20,000使用山羊抗小鼠IgG1-HRP(Southern Biotech，目录号1070-05)作为检测试剂，在室温下温育1小时。洗涤3次后，遵循制造商的说明书使用TMB底物显现ELISA反应。在室温下5-10分钟后，用1M H2S04终止反应。
用于小鼠IgG1抗卵白蛋白的ELISA
首先，在室温下将96孔平底板(Thermo Scientific Nunc Immunol Maxisorp，目录号442404)用含95μg/ml卵白蛋白(Sigma，目录号1070-01)的PBS包被一小时。用PT将孔洗涤3次，接着在室温下用PTB封闭一小时。小鼠IgG1抗卵白蛋白(Biolegend，目录号520502)用于构建标准曲线。用PT将孔洗涤3次，接着在室温下将血浆样品在PTB中以至多4种不同稀释度(以在标准曲线上拟合)温育1小时。
用PT洗涤3次后，以1/20,000使用山羊抗小鼠IgG1-HRP(Southern Biotech，目录号1070-05)作为检测试剂，在室温下温育1小时。洗涤3次后，遵循制造商的说明书使用TMB底物显现ELISA反应。在室温下5-10分钟后，用1M H2S04再次终止反应。
用于小鼠IgE的ELISA
首先，在室温下将96孔平底板(Thermo Scientific Nunc Immunol Maxisorp，目录号442404)用含1μg/ml山羊抗小鼠IgE(Southern Biotech，目录号1110-01)的PBS包被一小时。用PT将孔洗涤3次，接着在室温下用PTB封闭一小时。小鼠IgE抗卵白蛋白(BioRad，目录号MCA2259)用于构建标准曲线。用PT将孔洗涤3次，接着在室温下将血浆样品在PTB中以至多4种不同稀释度(以在标准曲线上拟合)温育1小时。
用PT洗涤3次后，以1/2000使用山羊抗小鼠IgE-HRP(Southern Biotech，目录号1110-05)作为检测试剂，在室温下温育1小时。洗涤3次后，遵循制造商的说明书使用TMB底物显现ELISA反应。在室温下5-10分钟后，用1M H2S04终止反应。
用于小鼠IgE抗卵白蛋白的ELISA
首先，在室温下将96孔平底板(Thermo Scientific Nunc Immunol Maxisorp，目录号442404)用含95μg/ml卵白蛋白(Sigma，目录号1070-01)的PBS包被一小时。用PT将孔洗涤3次，接着在室温下用PTB封闭一小时。小鼠IgG1抗卵白蛋白(BioRad，目录号MCA2259)用于构建标准曲线。用PT将孔洗涤3次，接着在室温下将血浆样品在PTB中以至多4种不同稀释度(以在标准曲线上拟合)温育1小时。
用PT洗涤3次后，以1/2000使用山羊抗小鼠IgE-HRP(Southern Biotech，目录号1110-05)作为检测试剂，在室温下温育1小时。洗涤3次后，遵循制造商的说明书使用TMB底物显现ELISA反应。在室温下5-10分钟后，用1M H2S04终止反应。
用于细胞因子的ELISA
·R&D(目录号DY420-05)Duoset小鼠CCL11/伊红趋素
·R&D(目录号DY478-05)Duoset小鼠CCL5/RANTES
·R&D(目录号DY405-05)Duoset小鼠IL-5
·R&D(目录号DY413-05)Duoset小鼠IL-13
遵循制造商所包括的方案进行所有ELISA。
组织病理学肺评分
将肺解剖，用福尔马林(formalin)固定并进行处理用于石蜡包埋。以盲法方式对H&E染色切片进行疾病评分，并且评分指定如下：
4：浸润液丰富并遍布全身-肺结构损失
3：浸润液丰富并遍布全身-对肺结构的损害有限
2：浸润液可见为大病灶
1：浸润液可见为小病灶
0：正常
结果
血液反应
细胞反应
如图87中的实验所示，在2种实验方案下在外周循环中未观测到疾病驱动的淋巴细胞或骨髓细胞变化，并且当施用游离(Dex)或偶联(INX201J)时GC处理引起B和T细胞的类似减少。具体而言，图87显示2种实验方案中外周血中的绝对细胞数的变化。第14天至第18天(第1部分)和第21天至第25天(第2部分)的OVA攻击(SEM，单因素ANOVA，n＝10，初始组(n＝5)除外)。
免疫球蛋白反应
如图88中的实验所示，与初始动物相比，未处理OVA攻击的动物显示出IgG1和IgE以及OVA特异性Ig的显著增加。Dex和INX201J处理组显示出IgG1、IgG1 OVA特异性产生的类似显著减少。用IgE和OVA特异性IgE观测到有限乃至无减少。特别地，图88显示2种实验方案中外周血中的免疫球蛋白产生的变化。第14天至第18天(第1部分)和第21天至第25天(第2部分)的OVA攻击(SEM，单因素ANOVA，n＝10，初始组(n＝5)除外)。
支气管肺泡灌洗液的反应
细胞反应
如图89中的实验所示，OVA攻击引起大量炎症性浸润液在由淋巴细胞和骨髓细胞组成的支气管肺泡空间中募集。除CD8 T细胞外，在两种实验方案中与Dex相比，INX201J处理引起免疫浸润液的类似减少。值得注意的是，INX201J对减少嗜酸性粒细胞数目(定义为CD11b+、Ly6G-、SiglecF+CD193+)显示出与Dex相同的效力。特别地，图89显示2种实验方案中BAL中的免疫浸润液的变化。第14天至第18天(第1部分)和第21天至第25天(第2部分)的OVA攻击；A)骨髓浸润液的变化；B)淋巴细胞浸润液的变化(SEM，单因素ANOVA，n＝10，在对照组中审查2个样品，在Dex组和INX201J组中都审查3个样品；对于初始组n＝5)。
细胞因子变化
图90中的实验指示，除在疾病诱导后显示有限增加的CCL11外，评价的所有其他细胞因子都未显示出变化。INX201J和Dex处理都对BAL中的细胞因子水平无任何影响。具体而言，图90显示2种实验方案中BAL中的细胞因子水平的变化。第14天至第18天(实验第1部分)和第21天至第25天(实验第2部分)的OVA攻击(SEM，单因素ANOVA，n＝10，在对照组中审查2个样品，在Dex组和INX201J组中都审查3个样品；对于初始组n＝5)。
肺部疾病评分
如图91中的实验所示(实验第1部分，SEM，单因素ANOVA，n＝10，初始组(n＝5)除外)；在未处理的肺中观测到显著损伤，包括支气管肺泡形态的损失和炎症性细胞的大量募集。从这些结果可见，INX201J和Dex处理类似并且显著地减少肺损伤，其中结构损伤和炎症性浸润液有限。
结论
图87-91中的实验提供INX201J处理在以下方面具有与游离Dex(以>10倍以上给药)同等的影响的具体证据：
-减少支气管肺泡灌洗液(BAL)中的炎症性浸润液的募集
-减少组织病理学水平下的肺损伤
-减少血液循环中IgG1并且更具体为抗OVA IgG1的产生
-两种治疗方法在血液循环中均未观测到引发IgE或抗OVA IgE的变化
-两种治疗方法在支气管肺泡灌洗液中均未观测到引发细胞因子产生的变化
重要地，在这些实验的2个部分/2种不同方案中观测到类似结果。
实施例14：示例性抗VISTA抗体药物偶联物对表达VISTA的免疫细胞的影响
在这些实验中，我们评价了抗体药物偶联物(ADC)INX231J，即，连接到糖皮质激素(GC)有效负载的抗人VISTA单克隆抗体的靶向特异性。为监测/确认GC递送和活性，我们通过定量实时PCR(qRT-PCR)(1)测量FKBP5的转录活化。在人类VISTA敲入(hVISTA KI)小鼠中再次进行这些实验，其具有代替小鼠VISTA基因敲入的人类VISTA cDNA，并且在RNA和蛋白质水平上以与小鼠VISTA相同的表达模式表达人类VISTA。
特别地，我们通过两种不同方法评价非特异性ADC内化的影响。首先，我们添加偶联至相同有效负载的人类IgG1静默体；其次，我们在不表达人类VISTA靶标(仅小鼠VISTA)的C57Bl/6小鼠中操作相同实验。简言之，经由腹膜内(i.p.)注射体内递送INX231J或INX231P、人类IgG1siJ或游离地塞米松(Dex)。对于INX231J/hIgG1siJ/INX231P在20小时和对于Dex在2小时后，分离血细胞和脾细胞，提取RNA并评价FKBP5转录水平。
这些实验的目的是验证与游离地塞米松(Dex)相比，我们的ADC对人类VISTA表达细胞/组织的靶向特异性。为监测/确认GC递送和活性，我们通过定量实时PCR(qRT-PCR)测量FKBP5(一种敏感性和早期GC反应基因)的转录活化。我们先前在本申请中已显示，在处理后2-4小时，Dex处理引起VISTA表达细胞中FKBP5信使RNA的显著增加，但截至24小时转录影响消失。相比之下，ADC对FKBP5转录的影响是持久的，在处理后20小时达到峰值诱导，但在单核细胞中持续3天和在巨噬细胞中持续14天仍可检测到信号。
在这些实验中，我们使用具有2种不同有效负载(J和P)的抗VISTA抗体INX231或游离Dex，分别经由静脉内(i.v.)或腹膜内(i.p.)注射体内递送。分离脾细胞和血细胞，提取RNA并且评价FKBP5转录水平。下文详细描述这些实验和其结果。
材料和方法
实验设计
对于所有3项研究：
在小鼠安乐死和细胞分离前2小时腹膜内注射Dex，这对应于峰值FKBP5诱导。
在小鼠安乐死和细胞分离前20小时静脉内注射ADC(INX231J或INX231P或hIgG1siJ)，以提供足够的时间用于ADC处理和峰值FKBP5诱导。值得注意的是，静脉内注射ADC，以确保大分子的更一致递送。
包括仅注射PBS的对照组以定义FKBP5转录物基线。
测试剂和剂量
抗体
·INX231(批号72928.1.a)为在Fc区中具有L234A/L235A/E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。
·INX231J(批号JZ-0556-013-1)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX231。接头/有效负载(J)由蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载组成。
·INX231P(批号JZ-0556-017-1)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX231。接头/有效负载(P)由蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载组成。
·人类IgG1siJ(批号JZ-0556-025-2)为在Fc区中具有E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的抗RSV mAb。药物/抗体比率为8.0，经由链间二硫键的完全修饰与J接头/有效负载偶联。
使第1组的五只小鼠和第5-7组的所有动物从第21天至第25天吸入30分钟OVA(含1％OVA的PBS)连续5天。从第21天至第25天每天腹膜内注射2mg/Kg Dex。第20、22和24天腹膜内给与10mg/Kg INX201J。第25天处死经处理的动物。将所有ADC在PBS中稀释并且以0.2ml的最终体积静脉内注射以递送指定剂量。
地塞米松
将来自Phoenix的地塞米松无菌注射溶液NDC 57319-519-05在PBS中稀释并且如所述经由腹膜内注射而给药。
小鼠
在现场(达特茅斯比较医学与研究中心)饲养hVISTA KI小鼠；从杰克逊实验室(参考编号000665)接收C57Bl/6小鼠。
在9与15周龄之间录入雄性或雌性小鼠。
细胞分离
安乐死后，收集心脏血液(体积范围介于0.3与0.5ml之间)和脾。
血液制备：将6ml ACK缓冲液添加至血液中用于红细胞溶解。在室温下5分钟后，将细胞以1500rpm短暂离心5分钟；在10ml PBS中洗涤一次后，使细胞成团并直接重悬于RNA溶解缓冲液中。
将脾机械分离。通过40μm过滤器后，将细胞团块重悬于RNA溶解缓冲液中(参见下文)。
RNA制备和实时PCR
将来自血液和脾的细胞团块重悬于来自RNA Plus试剂盒(Macherey-Nagel编号740984)的0.4ml RNA溶解缓冲液中。遵循制造商的说明书分离RNA，并且在30或40ml H2O(不含RNase/DNase)中洗脱。在Nanodrop上评估RNA浓度。
使用Taqman反转录试剂(编号N8080234)并且遵循制造商的说明书进行反转录。
使用Taqman主混合液2X试剂盒(编号4369016)和Taqman引物用于小鼠FKBP5(Mm00487401_m1)以及小鼠HPRT作为管家基因(Mm446968_m1)进行定量实时PCR，并且在来自Applied Biosystem的QuantStudio3上运作。
将Ct数据转换为ΔCt和ΔΔCt或相对于PBS的Log2倍数变化。
实验1
在本实验中，我们在hVISTA KI雄性小鼠中评价偶联至J有效负载的人类IgG1静默对照(IgG1siJ)对比INX231J和Dex对表达VISTA的组织(血液和脾)的影响。以5mg/Kg(递送0.1mg/Kg有效负载)给与IgG1siJ和INX231J，并且在20小时后测量FKBP5诱导，以提供足够的时间用于ADC处理和强有力的FKBP5诱导。以2mg/Kg注射Dex并且在2小时后测量FKBP5诱导。
如图92中的实验所示，尽管用INX231J和Dex处理观测到强有力的FKBP5诱导，但偶联的Ig对照仅引起FKBP5信号的小的非显著变化。更具体而言，图92显示在注射INX231J后脾(左)和血(右)细胞中的FKBP5转录活化。在以5mg/Kg(递送0.1mg/Kg有效负载)进行1次单次静脉内注射后20小时测量INX231J作用和hIgG1siJ。在以2mg/Kg进行单次腹膜内注射后2小时测量Dex作用。通过实时PCR测量FKBP5转录水平并呈现为Log2倍数变化对比PBS对照组的平均值。(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比)。
实验2
在本实验中，我们评价了INX231P对比Dex在不表达人类VISTA的C57Bl/6雄性小鼠中对血细胞和脾细胞的影响。以10mg/Kg(递送0.2mg/Kg有效负载)给与INX231P，并且在20小时后测量FKBP5诱导，以提供足够的时间用于ADC处理和强有力的FKBP5诱导。以2mg/Kg注射Dex并且在2小时后测量FKBP5诱导。
如图93中的实验所示，尽管用Dex处理观测到强有力且显著的FKBP5诱导，但INX231P对野生型小鼠的血细胞和脾细胞无作用，证明ADC影响是靶标驱动的。更具体而言，图93显示INX231P注射后C57Bl/6小鼠中的FKBP5转录活化。在以10mg/Kg(递送0.2mg/Kg有效负载)进行1次单次静脉内注射后20小时测量INX231P作用。在以2mg/Kg进行单次腹膜内注射后2小时测量Dex作用。通过实时PCR测量FKBP5转录水平并呈现为Log2倍数变化对比PBS对照组的平均值。(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比)。
实验3
在本实验中，我们评价了INX231P对比Dex在不表达人类VISTA的C57Bl/6雌性小鼠中对血细胞和脾细胞的影响。我们添加hVISTA KI组作为ADC活性的对照。以10mg/Kg(递送0.2mg/Kg有效负载)给与INX231P，并且在20小时后测量FKBP5诱导，以提供足够的时间用于ADC处理和强有力的FKBP5诱导。以2mg/Kg注射Dex并且在2小时后测量FKBP5诱导。
如图94中的实验所示，尽管用Dex处理观测到强有力且显著的FKBP5诱导，但INX231P对野生型小鼠的血细胞和脾细胞具有非显著作用，证明ADC影响是靶标驱动的。相比之下，在hVISTA KI动物中相同剂量的INX231P处理引起FKBP5转录物的强烈而显著的诱导，证明ADC对其靶标群体的效力。更具体而言，图84显示INX231P注射后C57Bl/6或hVISTAKI小鼠中的FKBP5转录活化。在以10mg/Kg(递送0.2mg/Kg有效负载)进行1次单次静脉内注射后20小时测量INX231P作用。在以2mg/Kg进行单次腹膜内注射后2小时测量Dex作用。通过实时PCR测量FKBP5转录水平并呈现为Log2倍数变化对比PBS对照组的平均值。(n＝4只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比)。
结论
实验1的结果显示，在hVISTA KI中，尽管INX231J和Dex在脾细胞和血细胞中诱导强水平的FKBP5，但人类IgG1静默类固醇偶联的对照对两种组织中的FKBP5转录水平具有极小乃至无影响。
实验2的结果显示，在雄性C57Bl/6小鼠中，在无人类VISTA靶标的情况下，INX231P对表达VISTA的血细胞或脾细胞中的FKBP5转录水平无影响，而游离类固醇在两种组织中诱导强水平的FKBP5。
在添加hVISTA KI小鼠的阳性对照下，作为雌性C57Bl/6小鼠中的实验2的重复的实验3的结果显示，在无人类VISTA靶标的情况下，INX231P对表达VISTA的血细胞或脾细胞中的FKBP5转录水平具有极小乃至无影响。相比之下，在hVISTA KI小鼠中相同剂量的INX231P或Dex诱导两种组织中强水平的FKBP5。
总而言之，数据证明人类VISTA靶标的存在对于ADC对GC的有效细胞递送是必要的，无论GC有效负载如何。
实施例15：示例性抗VISTA抗体药物偶联物对离体单核细胞活化(急性(一天))评估的影响
进行本实施例中的实验以评价抗体药物偶联物(ADC)INX231P，即，连接到糖皮质激素(GC)有效负载的抗人VISTA单克隆抗体在单核细胞中的功效和药效范围。我们在早先的实施例中显示，GC靶基因FKBP5的转录在单核细胞中上调至处理后3天，而在24小时时无法检测到游离地塞米松(Dex)对FKBP5的影响。
我们进一步开发了一种模型，以允许我们评价ADC对单核细胞的潜在长期抗炎影响。简言之，经由静脉内(i.v.)注射体内递送ADC，并且在1至7天后分离脾单核细胞并置于培养中。接着用不同浓度的脂多糖(LPS)活化细胞，引起24小时细胞因子产生的急剧增加。在单核细胞分离前2小时进行Dex处理强有力地减少细胞因子产生。
在人类VISTA敲入(hVISTA KI)小鼠中进行三个实验(下文所论述的实验1、2和3)，其具有代替小鼠VISTA基因敲入的人类VISTA cDNA，并且在RNA和蛋白质水平上以与小鼠VISTA相同的表达模式表达人类VISTA。这些研究的目的是评价INX231P体内处理对表达高水平的VISTA的单核细胞的影响。第二个目的是将其抗炎能力与其激动剂对应物INX901相比较。简言之，经由静脉内(i.v.)注射体内递送ADC，并且在1至7天后分离脾单核细胞并置于培养中。接着用不同浓度的LPS活化细胞，并且在24小时收集上清液以评价细胞因子反应(通过Luminex小鼠32-plex(实验1)或用于所选细胞因子的ELISA(实验2和实验3))。
材料和方法
对于所有3个实验，在小鼠安乐死和细胞分离前2小时，在最优选反应下腹膜内注射Dex。在实验2和实验3中，在小鼠安乐死和细胞分离前24小时静脉内注射ADC INX231P和激动剂对应物INX901，以提供足够的时间用于ADC处理。此外，还包括注射PBS的对照组，以定义最大细胞因子反应。
测试剂和剂量
抗体
·INX231(批号72928.1.a)为在Fc区中具有L234A/L235A/E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。
·INX231P(批号JZ-0556-017-1)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX231。接头/有效负载(P)由蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载组成。
·INX901(批号BP-021-016-23)为人类IgG2/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。
将所有抗体和ADC在PBS中稀释并且以0.2ml的体积静脉内(i.v.)注射以递送指定剂量。
地塞米松
将来自Phoenix的地塞米松无菌注射溶液NDC 57319-519-05以0.2ml的体积在PBS中稀释并且如所述经由腹膜内(i.p.)注射而给药。
小鼠
在现场(达特茅斯比较医学与研究中心)饲养hVISTA KI小鼠；从杰克逊实验室(参考编号000665)接收C57Bl/6小鼠。在9与15周龄之间录入雄性或雌性小鼠。
脾单核细胞分离
在实验1和实验2中，遵循制造商的说明书使用来自StemCell的EasySepTM小鼠单核细胞分离试剂盒(目录号19861)分离细胞；在ADC-INVIVO-109中，使用来自Miltenyi的单核细胞分离试剂盒(目录号130-100-629)。跨实验获得类似的细胞数和纯度。
离体LPS刺激测定
计数后，取决于分离的细胞数(应注意，所有报告的数据均针对铺板的细胞数归一化)并且作为单份，将细胞以约100,000个细胞/孔铺板。如所述以0、10或100ng/ml将LPS添加至组织培养基中。在24小时收集细胞上清液用于细胞因子分析。
细胞因子分析
实验1：
使用Millipore小鼠32-plex平台对25μl上清液进行细胞因子分析；免疫监测实验室(IML，达特茅斯-希区柯克诺里斯柯顿癌症中心的共享资源)进行分析。关于所有方案和分析描述，参见以下网站http://www.dartmouth.edu/～dartlab/？page＝multiplexed-cytokines。
实验2和3：
使用以下试剂盒经由ELISA对TNFα、MIP-1a和MIP-1b进行细胞因子分析：
ο小鼠CCL3/MIP-1αDuoSet ELISA(R&D编号DY450-05)
ο小鼠CCL3/MIP-1βDuoSet ELISA(R&D编号DY451-05)
ο小鼠TNFαELISA(Biolegend目录号430904)
遵循制造商的说明书进行所有ELISA。
结果
实验1：地塞米松对从脾中分离的单核细胞的离体LPS刺激的影响
在实验1中，我们评价了2种不同剂量的Dex体内处理对离体脾单核细胞的影响。简言之，用腹膜内注射的2或0.2mg/Kg Dex处理雌性C57Bl/6小鼠。对照组接受PBS。2小时后，处死动物并且收集脾。分离单核细胞并置于培养中。由于分离后的低单核细胞数，将每组5个样品汇集为2个用于铺板的样品(2个或3个初始样品的库)。接着将细胞因子数据针对此后的细胞数归一化。
铺板后，用10或100ng/ml LPS处理细胞或不加处理。在30分钟和24小时收集细胞上清液。在小鼠32-plex上分析细胞因子产生。在30分钟未观测到细胞因子水平的变化(未显示)。在24小时，在脾样品中通过LPS处理上调8种细胞因子G-CSF、IL-6、IL-10、IP-10、MIP-1a、MIP-1b、TNFα和RANTES。如图95中所示，Dex体内处理在两种LPS浓度下引起细胞因子反应降低。更具体而言，图95显示体内Dex处理引发离体单核细胞对LPS的炎症反应实质性降低。在实验中，向小鼠腹膜内注射PBS或者2mg/Kg或0.2mg/Kg Dex。2小时后，分离脾单核细胞，置于培养中并经受0、10和100ng/ml的LPS刺激。在Luminex32-plex上分析24小时上清液(n＝5只小鼠/组，但样品1、2、3和4、5汇集为2个样品)。
实验2：地塞米松对比INX231P对比INX901对从脾中分离的单核细胞的离体LPS刺激的影响
在实验2中，我们评价了INX231P对比INX901(CDR与INX231相同，但在人类IgG2主链上)对比Dex体内处理对来自由LPS离体刺激的hVISTA KI雌性小鼠的脾单核细胞的影响。为评价这些分子的药效范围，对于INX231P和INX901处理组在24小时、3天和7天后并且对于Dex处理组在处理后2小时、2天和6天分离脾单核细胞。以10mg/Kg给与INX231P和INX901，以2mg/Kg注射Dex。铺板后，用10ng/ml LPS处理样品或不加处理。在24小时收集细胞上清液。经由ELISA对NFα、MIP-1b和MIP-1a进行细胞因子分析。将细胞因子数据针对铺板的细胞数归一化。
如图96中的实验所示，在第1天，INX231P对TNFα和MIP-1b产生具有强有力的影响，与2小时的Dex相当。在稍后的时间点未观测到作用。相比之下，INX901对分析的细胞因子无影响(MIP-1a和b)或增加细胞因子(TNFα)。更特别地，图96显示INX231P体内处理对离体单核细胞对LPS的炎症反应的影响的作用。在细胞分离前2小时、2天或6天向小鼠腹膜内注射2mg/Kg的PBS或Dex；在细胞分离前1天、3天和7天静脉内注射10mg/Kg的INX231P和INX901。分离后，将脾单核细胞置于培养中并经受0或10ng/ml的LPS刺激(仅示出10ng/ml)。通过ELISA分析24小时上清液(n＝4只小鼠/组；仅对第1天(D1)样品进行与PBS处理组相比的单因素ANOVA)。
实验3：地塞米松对比INX231P对比INX901对从脾中分离的单核细胞的离体LPS刺激的影响
在实验3中，我们对于Dex(2mg/Kg)仅在2小时后或对于抗体处理(10mg/Kg)在24小时后评价细胞因子反应。分离脾单核细胞，置于培养中并用10或100ng/ml LPS处理。在24小时收集细胞上清液。经由ELISA对TNFα、MIP-1b和MIP-1a进行细胞因子分析，并且将数据针对铺板的细胞数归一化。
图97中的实验显示INX231P对于在两种LPS浓度下分析的所有3种细胞因子都强效地防止单核细胞的离体活化。值得注意的是，当用100ng/ml LPS刺激细胞时，Dex处理似乎损失效力，表明INX231P尽管递送少10倍的有效负载，但更强效。最后，如实验3中所观测，INX901处理对LPS诱导的细胞因子反应无作用。更特别地，图97显示INX231P体内处理对离体单核细胞对LPS的炎症反应的影响。在细胞分离前2小时向小鼠腹膜内注射2mg/Kg的PBS或Dex；在细胞分离前24小时静脉内注射10mg/Kg的INX231P和INX901。将脾单核细胞置于培养中并经受10和100ng/ml的LPS刺激。通过ELISA分析24小时上清液(n＝4只小鼠/组；独立常规单因素ANOVA，对于各LPS剂量与PBS处理组相比)。
结论
实验1显示2mg/Kg体内Dex处理有效地防止LPS引起的离体单核细胞活化，如细胞因子产生的显著减少所示。实验2显示，体内INX231P处理可减少单核细胞的离体活化，如在24小时一些细胞因子产生的减少所示，但在处理后3或7天未观测到这些作用，这与在2-3天范围内的单核细胞的已知半衰期一致。另外，ADC对细胞因子产生的影响是归因于GC递送至VISTA表达细胞，因为用未偶联的激动剂对应抗体(相同CDR)处理无抗炎活性。实验3是实验2的重复，例外之处为观察到仅在Dex后2小时或在ADC后24小时和未偶联的激动剂处理显示INX231P强效地降低单核细胞的离体活化，而激动剂抗体无影响。
因此，实验结果显示
·在分离的脾单核细胞上LPS诱导的细胞因子反应由地塞米松有效控制。
·INX231P而非INX901处理在体内24小时前给药时，有效控制分离的脾单核细胞上LPS诱导的细胞因子反应。截至第3天，未观测到作用，这与在2-3天范围内的小鼠单核细胞的已知半衰期一致。
·INX231P而非INX901处理强效地防止LPS诱导的脾单核细胞离体活化。在本实验中，我们注意到INX231P尽管递送比游离Dex少10倍的GC有效负载，但在高刺激水平(100ng/ml LPS)下显示高效力，但Dex似乎损失功效。最后，如实验3中所观测，INX901处理对LPS诱导的细胞因子反应无作用。
总而言之，实验结果指示INX231P体内处理可防止单核细胞离体活化，其效力比游离类固醇至少强10倍。相比之下，激动剂抗VISTA抗体INX901在此模型中不显示出效力。因此，本实验中所观测的结果完全由类固醇有效负载引发，而不由VISTA调节引发。
实施例16：抗VISTA药物偶联物对单核细胞、T reg和B细胞转录的作用的影响取决于靶标表达
我们在本文中描述了连接到各种糖皮质激素(GC)有效负载的不同抗人VISTA单克隆抗体及其体外和体内作用。在本实施例中，我们通过评价对根据本发明的示例性ADC的GC报告基因FKBP5的转录的影响来评估VISTA靶标依赖性，这是通过评价以下作用来实现：1)INX201J对比同型对照(huIgG1si J)和游离J有效负载对单核细胞和B细胞的作用，和2)INX231P(在Treg上)对比游离有效负载(INX-SM-3)的作用。
如本文所示，用抗VISTA类固醇ADC处理引起单核细胞上FKBP5的强有力的和剂量依赖性上调，所述单核细胞为具有高表达水平的VISTA的细胞。对于VISTA表达低于单核细胞的Treg观测到显著但更适中的影响。对不表达VISTA的B细胞观察到可忽略的影响。当用类固醇偶联的同型对照处理时，未观测到单核细胞或B细胞的FKBP5表达变化。
抗体药物偶联物(ADC)允许高效药物的特异性细胞靶向，以允许在限制毒性同时发挥功效。INX201和INX231是抗人VISTA抗体。INX201J和INX231P以其类固醇偶联形式将类固醇递送至VISTA表达细胞，包括骨髓细胞和T细胞，并且我们希望对VISTA阴性细胞(例如B细胞)具有极小乃至无影响(Cancer Res.74:1924-1932,2014)。
为监测/确认GC递送和活性，我们通过定量实时PCR(qRT-PCR)测量FKBP5的转录活化，FKBP5为糖皮质激素活性的直接和强有力的生物标志物(JCEM 101:4305-4312,2016)。我们在体外用ADC处理后对分离的人类单核细胞、调控性T细胞(T reg)和B细胞进行这种评估。
材料和方法
从健康供体血液样品中分离单核细胞或B细胞，并用游离类固醇、抗VISTA偶联类固醇或偶联同型对照进行处理。分离RNA，并且通过qPCR评估FKBP5转录物水平的变化。
对于单核细胞对比B细胞分析，一个献血者采集用于单个药物浓度实验；来自单独单个供体采集的血液用于评估药物剂量反应。对于调控性T细胞(Treg)分析，使用来自两个单独供体的血液。
测试剂
·游离J有效负载，INX J-2(Abzena)。INX J-2或简言之游离J有效负载，为专利报告的用于完整接头/有效负载INX J的布地奈德类似物。
·INX201(Aragen，批号BP-3200-019-6)为在Fc区中具有V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。
·INX201J(Abzena，批号JZ-0556-025-1)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX201。接头/有效负载(J)是基于先前报道的接头/有效负载。其由蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载组成。
·INX-SM-3(O2H)为用于接头/有效负载INX P中的布地奈德类似物有效负载。
·INX231(ATUM，批号72928.1.a)为在Fc区中具有L234A/L235A/E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。
·INX231P(Abzena，批号JZ-0556-017-1)为经由链间二硫键的完全修饰以8.0的DAR偶联至由蛋白酶敏感性接头与INX-SM-3组成的接头/有效负载INX P的INX231。
·人类IgG1siJ(Abzena，批号JZ-0556-025-2)为在Fc区中具有E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的同型对照。DAR比率为8.0，经由链间二硫键的完全修饰与INX J接头/有效负载偶联。
额外试剂
·Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare目录号17-1440-03)
·不含L-谷氨酰胺的RPMI 1640(VWR目录号16750-084)
·青霉素/链霉素/谷氨酰胺(ThermoFisher目录号10378016)
·1M Hepes(Gibco目录号15630-080)
·人类AB血清(Valley Biomedical目录号HP1022HI)
PBMC制备
在无菌条件下在达特茅斯希区柯克医疗中心的供血者项目中从去识别化健康人类供体获得的单采锥分离出人类PBMC。
将血液转移至50ml Falcon管中并用PBS稀释至30ml。将13ml Histopaque 1077(Sigma Aldrich)在血液下缓慢分层，并在室温下以850x g将管离心20分钟，同时缓缓加速并且无制动。
从血浆/Ficoll界面收集单核细胞，重悬于50ml PBS中并且以300x g离心5分钟。将细胞重悬于PBS中并进行计数。
测定方案
使用不同细胞分离试剂盒并且遵循制造商的说明书分离各种免疫群体：
·无CD16消耗的EasySep人类单核细胞富集试剂盒(StemCell目录号19058)
·人类Pan B细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，130-101-638)
·EasySepTM人类CD4+CD127低CD49d-调控性T细胞富集试剂盒(StemCell目录号19232)
将单核细胞、B细胞或Treg(来自单个供体)在RPMI、10％人类AB血清、10mM Hepes、1x青霉素/链霉素/谷氨酰胺中以每孔2x10^6个细胞铺于12孔板中。
对于单剂量实验，用20nM游离J有效负载或INX-SM-3有效负载或摩尔有效负载当量的huIgG1si J、INX201J或INX231P(INX-SM-3的连接形式)处理细胞。
对于剂量反应，连续稀释产生100、20、5、0.5、0nM游离J有效负载或摩尔有效负载当量的INX201J。对于0nM点，使用等效于用于100nM摩尔有效负载当量的INX201J的抗体量的未偶联INX201(例如12.5nM未偶联抗体)。无处理孔用作对照。
在37℃下将板温育1天。
接着收集细胞并且在收集后汇集每种条件的孔，以允许足够的RNA用于后续qRT-PCR分析。
RNA制备和实时PCR
用PBS洗涤一次后，使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen，PN：74136)或NucleoSpin RNA Plus(Macherey-Nagel编号740984.250)从细胞团块中分离RNA。遵循制造商的说明书分离RNA，并且在30或40μl H2O(不含RNase/DNase)中洗脱。通过UV光谱法使用Nanodrop2000评估RNA浓度。
使用Taqman反转录试剂(编号N8080234)并且遵循制造商的说明书进行反转录。
使用Taqman主混合液2X试剂盒(编号4369016)进行定量实时PCR并且在来自Applied Biosystem的QuantStudio3上运作。所使用的引物：
·实验1和实验2
i.Life Technologies目录号433111182Hs01561006_m1(FKBP5)
ii.Life Technologies目录号HS99999905_m1(GapDH)
·实验3和实验4
i.TaqMan基因表达测定(FAM-MGB)；测定ID：Hs01561006_m1(FKBP5)
ii.TaqMan基因表达测定(FAM-MGB)；测定ID：Hs01922876_u1(GapDH)
将Ct数据转换为ΔCt和ΔΔCt或相较于未处理对照的Log2倍数变化。
结果
实验1
在本实验中，我们评价了ADC对类固醇递送的靶标表达的必要性，如通过在作为VISTA阳性细胞群体的单核细胞和作为VISTA阴性群体的B细胞中诱导FKBP5转录来评估。添加游离类固醇作为类固醇对特定细胞类型的FKBP5水平的影响的阳性对照。给与游离类固醇(游离J有效负载)、J接头-有效负载偶联的抗VISTA(INX201J)或同型对照(huIgG1si J)以提供相同摩尔当量的有效负载(20nM)。
如图98中所示，相对于无处理对照，在单核细胞和B细胞中用游离J有效负载观测到FKBP5转录的强有力增加。然而，当用抗VISTA偶联有效负载(INX201J)处理时，在单核细胞而非B细胞中观测到强有力的FKBP5转录。当用有效负载偶联的同型对照(HuIgG1si)处理时，在两种细胞类型中均未检测到FKBP5转录。特别地，图98显示用20nM游离J有效负载或等摩尔量的偶联至INX201(INX201J)或同型对照(huIgG1siJ)的有效负载处理的B细胞或单核细胞中的FKBP5转录活化。以技术重复分析转录物水平。
实验2
在图99中的实验中，我们通过评估用类固醇连接的抗VISTA(INX201J)处理对单核细胞(高VISTA表达)的剂量依赖性作用来扩展实验1。用连续稀释的INX201J(100nM至0nM有效负载)处理细胞。仅对于0nM浓度，用与100nM有效负载样品所存在的等量的抗体处理INX201未偶联抗体。具体而言，由于12.5nM ADC递送100nM有效负载，因此对于0nM样品，添加未偶联的INX201以达到12.5nM。如图99中所示，用INX201J处理单核细胞产生强有力的剂量依赖性作用。在图99中，在用渐增量的INX201J([0-100nM有效负载])处理的细胞中显示单核细胞中的FKBP5转录活化。0有效负载表示单独用与100nM有效负载INX201J剂量中的抗体量相同的未偶联INX201抗体处理。以技术重复分析转录物水平。
实验3
在图100中的实验中，我们评估了第二种抗VISTA类固醇偶联物(INX231P)对表达VISTA的Treg中的FKBP5转录诱导的影响。如图100中所示，用20nM游离有效负载(INX-SM-3)或摩尔有效负载当量的抗VISTA偶联有效负载(INX231P)处理Treg引起FKBP5转录增加。用2名不同供体进行本实验，并且分离的Treg纯度≥75％。
实验4
在图101中的实验中，我们评估了抗VISTA类固醇偶联物(INX201J)对比与相同接头/有效负载(huIgG1si J)偶联的同型对照对Treg中的FKBP5转录诱导的影响。如INX201J处理所示，增加-1/ΔCt代表相对于管家(GapDH)增加的转录物丰度。用递送20nM类固醇有效负载的INX201J处理Treg引起FKBP5转录对比偶联的同型对照增加2.1倍(倍数变化＝2^(ΔCt INX201J-ΔCt huIgG1si J))。用1名供体进行本实验，并且分离的Treg纯度≥75％。具体而言，图101中的数据显示相对于20nM有效负载当量的huIgG1si J，来自用20nM有效负载当量的INX201J处理的1名供体的T reg中的FKBP5诱导。以技术重复分析样品。如通过流式细胞术评估，分离的Treg纯度≥75％。
结论
数据证明，偶联至类固醇的抗VISTA抗体特异性地诱导单核细胞和Treg中而非B细胞中的FKBP5转录，指示有效负载递送为特异性的和靶标依赖性的。
尽管分析的所有细胞类型显示出对游离有效负载的强有力反应，但仅表达VISTA的细胞类型(单核细胞/Treg)当用20nM抗VISTA类固醇偶联物处理时显示出中度至强烈反应。另外，与无处理对照相比，同型对照ADC显示出极少乃至无FKBP5诱导。
GC作用的靶标要求由对VISTA表达细胞的强有力的剂量依赖性影响和抗VISTAADC对非VISTA表达细胞的有限乃至无影响所支持。
实施例17：由示例性抗炎药物偶联物靶向的抗原对各种免疫细胞的RNA表达
如前文所提及，据认为主题抗炎药物偶联物具有相对于先前抗炎药物偶联物的优越属性，这一部分是由于与已由先前抗炎药物偶联物靶向的抗原相比，在特异性免疫和非免疫细胞上表达或不表达VISTA。
其报道的RNA表达概况表明这一点。特别地，本发明人最初基于“Human ProteinAtlas20.1版”和Berglund L等人,“A genecentric Human Protein Atlas forexpression profiles based on antibodies”,Mol Cell Proteomics,第7卷(10):2019-2027(2008年10月1日)(https://www.proteinatlas.org)的综合评述来比较免疫和非免疫细胞上VISTA和其他免疫细胞靶标的RNA表达。
基于此分析，本发明人从Human Protein Atlas 20.1版和Berglund等人(同上)报告的人类组织/细胞RNAseq数据制定共有数据集。此比较的结果示于图102中。特别地，图102汇总不同细胞针对VISTA和其他ADC靶标(CD40、TNF、PRLR、CD174)的共有RNA表达水平，基于报告的“每百万转录物”(TPM)，其中TPM<10表示(最小/无表达“-”)；TPM 10-100表示(低/中等表达“+”)；和TPM>100(高表达“++”)。如本领域中已知，TPM为用于RNA-seq的熟知归一化方法，并且应解读为“对于RNA-seq样品中的每1,000,000个RNA分子，x来自此基因/转录物”。
如图102中所示，VISTA为RNA在活化和非活化的骨髓细胞(单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞)、T细胞、树突状细胞、NK细胞和嗜酸性粒细胞上广泛表达的唯一靶标(数据未示出，参见例如“The immune checkpoint molecule VISTA regulates allergen-specific Th2-mediated immune responses”,Tatsukuni Ohno等人,InternationalImmunology,第30卷,第1期,2018年1月,第3-11页)；相比之下，大多数细胞类型的TNF表达相对较低，而且仅在活化的免疫细胞上表达；CD163由骨髓细胞而非淋巴细胞表达；CD40避开T细胞；PRLR不在免疫细胞上广泛表达并且不受免疫限制；并且CD74避开嗜中性粒细胞。这为显著的，因为嗜中性粒细胞在炎症开始(急性)阶段，特别在细菌感染、环境暴露和一些癌症期间是重要的，并且确实为炎性细胞经由趋化性向炎症部位迁移的第一反应者之一。(Yoo SK等人,(2011年11月).“Lyn is a redox sensor that mediates leukocyte woundattraction in vivo”,Nature,480(7375):109-12)。
关于前述内容，尽管这些报告的不同免疫细胞的RNA表达水平令人感兴趣，但其并未提供有关这些抗原作为ADC靶标的比较性推定功效的实际证据。相反，这仅可通过这些靶标在不同免疫细胞上的实际表面蛋白质表达水平和VISTA ADC有效靶向并在不同免疫细胞中有效的实验证据来合理评估(即，提供治疗有效量的活性炎症药物(例如类固醇)内化和释放至这些不同类型的免疫细胞中的一者或多者中)。
实施例18：各种免疫细胞的VISTA表面表达与示例性抗炎药物偶联物靶向的抗原的比较和抗VISTA、抗CD74、抗CD163和抗mTNFα抗体对人类外周血单核细胞和全血的抗体结合能力
通过流式细胞术对初始人类外周血单核细胞(PBMC)和全血评估VISTA、CD74、CD163和膜TNFα(mTNFα)的表面抗原密度。如下文所指示，数据显示与CD74、CD163和mTNFα相比：
·仅VISTA在人类CD8+和CD4+T细胞上稳态表达
·VISTA在CD14+单核细胞上显示出最高抗原密度
·在测试的任何细胞类型上均未检测到表面mTNFα
VISTA在大多数造血细胞上，特别在骨髓细胞和T细胞上高度表达。本研究的目的是评价VISTA、CD74、CD163和mTNFα在人类PBMC和全血白细胞上的抗原密度。
材料和方法
实验设计
通过流式细胞术确定直接标记的抗体与来自多名供体的人类细胞(PBMC)或全血白细胞的结合，并且使用校准珠粒计算抗原密度。
试剂
抗体：
抗VISTA GG8(Aragen批号AB131122-3)为野生型人类IgG1/κ主链上的嵌合抗人VISTA抗体并且在ImmuNext产生。遵循制造商关于标记和纯化的说明书(Invitrogen，目录号A20186)将GG8克隆与Alexa Fluor 647染料偶联。除非另有规定，否则所有其余抗体均购自BioLegend，并且按原样使用，包括：
CD127 Brilliant Violet 421克隆A019D5，
CD14 PE-Cy7克隆M5E2，
CD20 Brilliant Violet 510克隆2H7，
CD4 APC-Cy7克隆OKT4，
CD163 Alexa Fluor 647克隆GHI/61，
CD25 FITC克隆BC96，
CD74 Alexa Fluor 647克隆332516(R&D Systems)，
CD8 PE克隆BW135/80(Miltenyi)，mTNFαAlexa Fluor 647克隆mAb11。
其他试剂：
校准珠粒(Quantum Simply Cellular Mouse IgG)购自Bangs Laboratories并且遵循制造商的方案使用。
PBMC制备
在无菌条件下在达特茅斯希区柯克医疗中心(Dartmouth Hitchcock MedicalCenter)的供血者项目中从健康无关人类供体获得的单采锥分离出人类PBMC。首先，将血液转移至50ml Falcon管中并用PBS稀释至30ml。将13ml Histopaque 1077(Sigma Aldrich)在血液下缓慢分层，并在室温下以850x g将管离心20分钟，同时缓缓加速并且无制动。
从血浆/Ficoll界面收集单核细胞，重悬于50ml PBS中并以300x g离心5分钟。将细胞重悬于PBS中并进行计数。
全血制备
在达特茅斯希区柯克医疗中心从健康无关人类供体抽取新鲜血液，并且对全血进行染色。
抗体结合和分析
PBMC染色
将PBMC重悬于含有人类Fc封闭试剂(eBioscience，14-9161-73)的PBS/0.2％BSA缓冲液中，接着以106个细胞/孔分配至96孔板中。制备抗体混合剂并且将PBMC在冰上染色30分钟以限制内化，用PBS洗涤两次。
全血染色
将100μl血液在深孔96孔板中染色并且直接添加抗体混合剂。温育30分钟后，用1ml ACK缓冲液(Gibco)将红细胞溶解10分钟。将血液离心并且将血液白细胞转移至96孔板中，用PBS洗涤并分析。
结合定量
遵循制造商的方案用抗VISTA、抗CD74、抗CD163和抗mTNFα将定量珠粒染色。通过荧光相关细胞分选(FACS)，使用Macsquant(Miltenyi)流式细胞仪和用于分析的FlowJo来分析细胞和珠粒。使用与Quantum珠粒一起提供的QuickCal分析模板来计算抗体结合能力。
用GraphPad(Prism)制作所有图。
结果
PBMC上的测试抗体结合的评价
为评价细胞群体上的抗原密度，将来自5名不同供体的人类PBMC与mAb一起温育并通过流式细胞术进行分析。通过减去背景信号将中位荧光归一化，并且针对具有已知抗体结合能力的定量珠粒进行校准。将细胞群体鉴定为CD20+B细胞、CD14+SSC高单核细胞、CD8+和CD4+T细胞以及CD4+CD25+CD127低T调控细胞(T reg)。所有值报告为平均值±SD。
如图103A中所示，CD14+单核细胞以高水平表达3个靶标，其中VISTA最丰富，其抗体结合能力或ABC＝111587±30502，其次为CD74(ABC＝52001±4765)和CD163(ABC＝36671±12339)(图103A)。值得注意的是，对于CD163，平均值升高，因为一个异常供体显示出比其余4者高5倍的表达。
如图103B中所示，在B细胞上仅检测到CD74，并且定量69574±14997个分子。可见VISTA是在非活化T细胞上表达的唯一蛋白质，其平均密度在CD4+上为5938±3113个分子(图103C)，在T reg上为6641±4059(图103D)，和在CD8+上为9958±2741个分子(图103E)。
在初始PBMC中，未检测到高于背景水平的mTNFα。通过用第二种mTNFα抗体(R&DSystems，Adalimumab biosimilar，克隆Hu7)进行阴性染色来确认mTNFa不存在。在用LPS活化的细胞上也未检测到mTNFa(数据未示出)。由制造商确定商业获得的抗TNFa抗体的特异性并通过ELISA内部确认(数据未示出)。
图103A-E汇总VISTA、CD74、CD163和mTNFα在鉴定的细胞群体上的抗原密度的定量A)单核细胞表达VISTA、CD74和CD163；B)B细胞表达CD74；C)CD4+T细胞；D)CD4+T reg；和E)CD8+T细胞表达VISTA(平均值±SD，n＝5名供体)。
全血白细胞上的抗体结合的分析
嗜中性粒细胞为PBMC制剂中缺少的免疫系统的重要部分。因此，也检查了来自3名健康供体的全血白细胞，并且评价细胞群上的抗原表达。类似于PBMC，将全血用单克隆抗体混合剂染色并通过FACS进行分析。通过减去背景信号将中位荧光归一化，并且针对具有已知抗体结合能力的定量珠粒进行校准。
将细胞群体鉴定为CD20+B细胞、CD14+SSC高单核细胞、CD66b+SSC高嗜中性粒细胞、CD8+和CD4+T细胞、CD4+CD25+CD127低T调控细胞(T reg)。所有值报告为平均值±SD。
如PBMC上所观测，VISTA在CD14+单核细胞上最丰富(ABC＝223674±16503)，CD163表达维持于13126±790个分子，但CD74的表达远低于PBMC中(ABC＝562±338)(图104A)。CD74在CD20+B细胞上的表达在供体之间差异极大(5800±3121)。对于VISTA(ABC＝1280±291)，类似地观测到最小信号(图104B)。嗜中性粒细胞显示出高水平的VISTA表达(ABC＝68571±14731)(图104C)，而未检测到所关注的其他靶标。最后，在全血中还确认T细胞上的VISTA表达，其中检测到8717±886个分子。在全血中还确认T细胞上的VISTA表达，其中在CD4+上检测到8717±886个分子(图104D)，在T reg上检测到7486±1767(图104E)，以及在CD8+上检测到5012±2438(图104F)。图104A-F汇总VISTA、CD74、CD163和mTNFα在人类血液中鉴定的细胞群体上的抗原密度的定量A)单核细胞表达VISTA、CD74和CD163；B)B细胞表达CD74；C)嗜中性粒细胞表达VISTA；D)CD4+T细胞；E)CD4+T reg；和F)CD8+T细胞表达VISTA(平均值±SD，n＝3)。
与其他靶标相比VISTA在活化免疫(单核细胞)上的表达
另外，进行了比较VISTA与其他抗原在活化的免疫细胞(单核细胞)上的表达的实验。如图110中所示，将VISTA在活化的免疫细胞(特别是单核细胞)上的表达与其他蛋白质(特别是已用其他类固醇ADC靶向的蛋白质)在活化的免疫细胞(单核细胞)上的表达水平相比较。
在实验中，用LPS(在U底96孔板中每孔100μL；1μg/mL LPS；在37℃下2小时)活化来自健康供体的人类全血。通过流式细胞术评估活化的免疫细胞上的细胞表面蛋白质表达水平。用于染色的直接偶联抗体再次包括抗VISTA克隆GG8、CD163克隆GHI/61、CD74克隆332516和mTNFα克隆mAb11。[抗VISTA克隆GG8(Aragen批号AB131122-3)为野生型人类IgG1/κ主链上的嵌合抗人VISTA抗体并且在ImmuNext产生；遵循制造商关于标记和纯化的说明书(Invitrogen，目录号A20186)将GG8克隆与Alexa Fluor 647染料偶联。所有其余抗体均购得并且按原样使用：CD163 Alexa Fluor 647克隆GHI/61(Biolegend)、CD74 Alexa Fluor647克隆332516(R&D Systems)、mTNFαAlexa Fluor 647克隆mAb11(Biolegend)]。
如图103中所示，活化的单核细胞上的VISTA表达模式类似于非活化的单核细胞上所观测的表达水平，而活化的单核细胞上所检测的其他检测蛋白质的表达水平较低。此外，mTNFαMFI仅略高于荧光减一(FMO)对照。这些结果进一步指示，主题VISTA ADC可用于靶向活化和非活化的免疫细胞，例如以高水平表达VISTA的单核细胞和其他骨髓细胞(以及组成性地表达VISTA的其他免疫细胞，例如先前鉴定的那些，例如嗜酸性粒细胞、树突状细胞、巨噬细胞、骨髓细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、Treg、NK细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞等)。
结论
图103、图104、图110和下表6中汇总的数据显示：
·人类VISTA为在单核细胞、嗜中性粒细胞和T细胞上具有高表达水平的最强ADC靶蛋白。值得注意的是，尽管一些RNA数据库描述T细胞中高水平的CD74转录物(Berglund L等人,“A genecentric Human Protein Atlas for expression profiles based onantibodies”,Mol Cell Proteomics.(2008)DOI:10.1074/mcp.R800013-MCP200)，但我们未观测到CD74在T细胞上的表面表达。
·VISTA在活化的免疫细胞(单核细胞)上以比所分析的其他靶标高得多的水平表达，并且VISTA在活化和非活化的免疫细胞(例如单核细胞)上的表达是类似的，进一步指示主题VISTA ADC可用于靶向活化和未活化的免疫细胞，例如单核细胞(以及先前鉴定的其他免疫细胞，例如嗜酸性粒细胞、NK细胞、细胞、巨噬细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、Treg、NK细胞、嗜中性粒细胞等)。
·在PBMC和全血中的B细胞上始终检测到CD74，但仅在来自PBMC的单核细胞上检测到。
·CD163仅在来自PBMC的单核细胞上表达。
·在所分析的任何细胞群体上未检测到mTNFα。
·VISTA为在非活化(初始)T细胞上表达的唯一蛋白质，其平均密度在CD4+细胞上为5938±3113个分子，在T reg上为6641±4059个分子，并且在CD8+细胞上为9958±2741个分子。
表6含有不同抗原(包括VISTA)在人类免疫细胞群体上的表面表达的汇总。将所分析的表面靶标的表达归类为存在(浅灰色)或不存在于细胞表面(深灰色)；基于针对定量珠粒的归一化，+对应于1000-10000个分子，++对应于10000-100000，+++对应于100000以上；WB-全血，PBMC-外周血单核细胞；na-不适用。
如前文所提及，据认为主题抗炎药物偶联物具有相对于先前抗炎药物偶联物的优越属性，这一部分是由于与已由先前抗炎药物偶联物靶向的抗原相比，在特异性免疫和非免疫细胞上表达或不表达VISTA。
基于这些结果，由于VISTA仅由免疫细胞表达，因此不同于不受免疫限制的一些其他靶标(例如PRLR)，VISTA ADC应不易引发对非靶细胞的毒性。此外，由于VISTA由初始免疫细胞和特别是T细胞组成性地表达，因此不同于一些其他ADC靶标(例如TNF)，VISTA ADC可能优选用于治疗慢性自身免疫和炎症性疾病，这是因为VISTA ADC应维持恒定水平的功效(即，将在活化和非活化期间有效)，从而潜在地降低炎症复发的可能性，和/或可在炎症或自身免疫复发期间降低炎症水平。这是治疗上显著的，因为许多自身免疫性/炎症性疾病为缓解/复发的，并且因此用于治疗此类疾患的药物和生物剂的显著临床目的是提供治疗方案，由此在缓解和复发期间有效地控制疾病，使得患者不会经受组织损伤。
此外，在这些ADC靶标中，仅VISTA在嗜中性粒细胞上表达。这是显著的，因为嗜中性粒细胞在炎症开始(急性)阶段，特别在细菌感染、环境暴露和一些癌症期间是重要的，并且确实为炎性细胞经由趋化性向炎症部位迁移的第一反应者之一。(Yoo SK等人,(2011年11月).“Lyn is a redox sensor that mediates leukocyte wound attraction invivo”.Nature.480(7375):109-12)。此外，由于这些细胞在炎症反应早期表达，因此预期VISTA ADC快速起效(实际上在本文中显示)。
也有额外治疗意义，因为VISTA也不在B细胞上表达(不同于一些其他ADC靶标，例如CD40和CD74)，所以VISTA ADC在治疗期间不应影响B淋巴细胞。因此，VISTA ADC可在治疗期间保持体液免疫，这可降低受试者在治疗期间发生感染或甚至癌症的可能性。(因为类固醇为强效免疫抑制剂，所以特别在长期使用期间与其相关的风险为所治疗受试者可能在治疗期间发生致命感染或恶性病的风险)。
此外，在这些ADC靶标中，仅VISTA似乎由初始Treg、CD4+T和CD8+T细胞组成性地表达。这是特别显著的，因为这些细胞参与炎症反应，并且进一步因为最近已报道Treg对类固醇的功效极为重要。(参见Buttgereit,Frank和Timo Gaber,Timo；Cellular andMolecular Immunology,“New insights into the fascinating world ofglucocorticoids:the dexamethasone-miR-342-Rictor axis in regulatory T cells”,第18卷,520-522(2021)；和Immunity,“Anti-inflammatory Roles of GlucocorticoidsAre Mediated by Foxp3+Regulatory T Cells via a miR-342-Dependent Mechanism”,第53卷(2):581-596(2020年9月)；Braitch M.等人,Acta Neurol Scand.,“Glucocorticoids increase CD4+CD25high cell percentage and Foxp3expression inpatients with multiple sclerosis”,2009年4月；119(4):239-245)。
实际上，本文所含的实验证据证明，VISTA ADC有效地靶向这些不同类型的免疫细胞并在其中有效(即，提供治疗(抗炎)量的类固醇内化至不同类型的免疫细胞中)。
实施例19：PK对比PD汇总
如前文所提及，鉴于偶联物中所包含的抗VISTA抗体的短PK，主题抗炎药物偶联物提供比预期长得多的PD持续时间。表7中汇总根据本发明的示例性抗VISTA抗体和含有其的ADC的PK、PD和Kd值。
表7中鉴定的抗体的CDR和可变序列见于图8、图10和图12中。表中涉及FKBP5的PD或效力定义为给药后14天在巨噬细胞中FKBP5超过PBS的2倍诱导。表中涉及“细胞因子减少”的PD或效力定义为在离体巨噬细胞活化测定中给药后7天TNFα减少20％。实施例6中示例这些测定。
表7中的数据显示示例性抗体(其在生理pH下全部结合至表达人类VISTA的免疫细胞并且具有短pK，尽管如此仍提供长PD，即，如对于具有用于治疗性抗体的更长(和更典型)PK的抗体所预期。此数据证实主题ADC应适用于需要延长功效的用途。
实施例20：抗VISTA抗体药物偶联物在血液中具有靶标依赖性作用，但在具有极少乃至无靶标表达细胞的组织中无作用
进行这些研究以评价抗体药物偶联物(ADC)INX231P和INX234P对VISTA表达组织的靶向特异性。为监测/确认GC递送和活性，全基因组转录影响是根据以下文献经由RNA测序(RNAseq)来测量：Vermeer等人,(2003)Glucocorticoid-induced increase inlymphocytic FKBP51 messenger ribonucleic acid expression:a potential markerfor glucocorticoid sensitivity,potency,and bioavailability.J Clin EndocrinolMetab.1月；88(1):277-84。如早前的实施例中所示，INX201J在VISTA表达组织(例如脾)中引起FKBP5的快速和长期诱导。相比之下，非VISTA表达组织显示出极少乃至无FKBP5诱导。在食蟹猴中进行分析，将VISTA表达组织(血液)与非表达组织(脑、白色脂肪和骨骼)相比较(实验1)，和在小鼠骨骼中进行分析(实验2)。
如本文的先前实施例中所公开，我们已证明根据本发明的ADC对于延长的持续时间是强效的。特别地，我们显示用示例性ADC，即INX231P和INX234P处理引起FKBP5的快速和长期(>4天)诱导，FKBP5为VISTA表达组织(例如脾)中GC的直接转录靶标。相比之下，非VISTA表达组织显示出极少乃至无FKBP5诱导。
在本实施例中，我们使用RNAseq评估全局转录变化而显示本发明ADC处理的靶标特异性影响。在非人类灵长类动物(NHP、食蟹猴)中进行分析，并且比较VISTA表达组织(血液)与非表达组织(脑、白色脂肪和骨骼)中的转录，和在小鼠骨骼中进行分析。此外，我们经由质谱法评估多个VISTA表达组织和非表达组织中释放的有效负载(INX-SM-3)、半胱氨酸修饰的接头有效负载(INXP-cys)和游离地塞米松的细胞内积累。具体而言，在C57Bl/6中或人类VISTA敲入(hVISTA KI)小鼠中进行实验，其具有替代小鼠VISTA基因敲入的人类VISTAcDNA，并且在RNA和蛋白质水平上以与小鼠VISTA相同的表达模式表达人类VISTA。简言之，对于小鼠，经由腹膜内(i.p.)注射递送INX231P、PBS或游离地塞米松(Dex)。对于INX231P处理在20小时后和对于Dex处理在2小时后，分离骨骼，冲洗骨髓并提取RNA。
对于NHP(食蟹猴)研究，静脉内(i.v.)递送INX234P、媒介物或游离Dex。每组一半动物在24小时处死(载剂组除外)并且另一半在7天后处死。在两个时间点，对动物进行放血，接着经受尸检。收集组织并提取RNA或蛋白质/肽。
对于两项研究，通过RNAseq(Admera Health)评价全基因组转录水平，并且通过质谱法(Quintara Biosciences)评价细胞内有效负载水平。
这些研究的目的是评价我们的抗VISTA类固醇ADC对小鼠和NHP中的带靶标组织与不带靶标组织中的基因表达的影响。另外，我们经由质谱法(Quintara Biosciences)评估NHP中的带靶标组织与不带靶标组织中释放的有效负载的积累。
经由RNAseq(Admera Health)评估转录物表达的全基因组变化。监测到文献中明确鉴定的转录物受糖皮质激素作用所影响。这些转录物之一为FKBP5，一种敏感性和早期GC反应基因(Vermeer等人,(2003)Glucocorticoid-induced increase in lymphocyticFKBP51messenger ribonucleic acid expression:a potential marker forglucocorticoid sensitivity,potency,and bioavailability.J Clin EndocrinolMetab.1月；88(1):277-84))。我们已显示(ADCINVIVO.04)，在处理后2-4小时，Dex处理引起VISTA表达细胞中FKBP5信使RNA的显著增加，但截至24小时转录影响消失。相比之下，ADC对FKBP5转录的影响是持久的，在处理后20小时达到峰值诱导，但在单核细胞中持续3天和在巨噬细胞中持续14天仍可检测到信号。
在这些实验中，使用分别具有如本文所述的INX P接头有效负载或体内递送的游离Dex的抗VISTA抗体INX231和INX234。收集各种组织，并且分离RNA，并且对于小鼠和食蟹猴组织评估处理的转录影响。经由质谱法(Quintara Biosciences)在多种食蟹猴组织中评估Dex处理组和INX234P处理组的细胞内释放的有效负载和接头有效负载积累。所使用的材料和方法在下文具体详细描述。
材料和方法
方法
实验1
在小鼠安乐死和骨骼分离前2小时腹膜内注射Dex，其对应于峰值FKBP5诱导。在C57Bl/6雌性老鼠中进行实验。
在小鼠安乐死前20小时腹膜内注射ADC(INX231P)，以提供足够的时间用于ADC处理和峰值潜在基因诱导。在hVISTA KI雌性小鼠中进行实验。
包括仅注射PBS的对照组以定义转录物基线。安乐死后，分离骨骼，冲洗骨髓，并且在RNA分离和RNAseq分析(Admera Health)之前将骨骼在液氮中快速冷冻。
在放血前24小时将媒介物、INX234P或Dex静脉内递送至食蟹猴。将血液运送至ImmuNext，在此进行红细胞溶解，用PBS洗涤一次，接着在RNA分离之前将细胞团块在液氮中快速冷冻。接着在组织收集之前对猴实施安乐死并且灌注组织。在RNA分离和RNAseq分析(Admera Health)或经由MS(Quintara Biosciences)定量之前，再次将组织在液氮中快速冷冻。
材料
测试剂和剂量
抗体
INX231P(批号JZ-0556-017-1)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX231。接头/有效负载(P)由蛋白酶敏感性接头与布地奈德衍生物有效负载组成。
INX234P(批号JZ-0556-029、JZ-0556-017)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234。接头/有效负载(P)由蛋白酶敏感性接头与布地奈德衍生物有效负载组成。
地塞米松
对于实验1，将Dex(无菌注射溶液，Phoenix，NDC 57319-519-05)在PBS中稀释并且如所述经由腹膜内注射而给药。对于实验2，静脉内施用Dex并由Bimeda MTC提供。
小鼠
在现场(达特茅斯比较医学与研究中心)饲养hVISTA KI小鼠；从杰克逊实验室(参考编号000665)接收C57Bl/6小鼠。
在9与15周龄之间录入雌性小鼠。
食蟹猴
在查尔斯河实验室(Charles River Laboratory)进行研究。录入十二只雌性食蟹猴，其为专门饲养的、非初始的，年龄范围在2岁与4岁之间。
组由媒介物对照处理组中的2只动物、Dex处理组中的4只动物和INX234P处理组中的6只动物组成。第1天向动物注射。
在24小时对所有动物进行放血并且第8天对剩余动物再次进行放血。对于在24小时(Dex和INX234P)和第8天(仅INX234P)处死的组进行组织分析；将2只用Dex处理的动物和3只用INX234P处理的动物在24小时实施安乐死，并且将2只注射媒介物对照的动物、2只用Dex处理的动物和3只用INX234P处理的动物在注射后第8天实施安乐死。
RNA制备和RNAseq
将来自血液和脑的细胞团块重悬于来自RNA Plus试剂盒(Macherey-Nagel编号740984)的0.4ml RNA溶解缓冲液中。遵循制造商的说明书分离RNA，并且在30或40μl H2O(不含RNase/DNase)中洗脱。在Nanodrop上评估RNA浓度。
Admera Health从骨骼和白色脂肪组织中分离RNA。Admera Health进行所有样品的质量控制评估和RNAseq。
用于质谱法的组织制备
用2倍体积的25％甲醇匀化来自不同组织的细胞团块。用相应血浆空白稀释所有样品，并用含有内标物(维拉帕米(Verapamil))的乙腈萃取每个样品。使混合物在振荡器上涡旋，随后离心。转移上清液的等分试样用于注射至LC/MS/MS。通过将测试化合物外加至空白食蟹猴血浆中来制备校准标准和质量控制样品，接着与未知样品一起处理。
结果
实验1
在本研究中，我们评价了INX231P和Dex对hVISTA KI(INX231P)对比C57Bl/6小鼠(Dex/PBS)中的骨转录物水平的影响。以10mg/Kg(递送0.2mg/Kg有效负载)给与INX231P。分离骨骼，冲洗骨髓并且在20小时后测量转录物表达水平，从而提供足够的时间用于ADC处理和潜在峰值转录物表达影响。以2mg/Kg注射Dex并且在2小时后测量转录表达水平。在以10mg/Kg(递送0.2mg/Kg有效负载)进行1次单次腹膜内注射后20小时测量INX231P作用。在以2mg/Kg进行单次腹膜内注射后2小时测量Dex作用。通过RNAseq测量基因转录水平并且呈现为归一化计数。(n＝5只小鼠/组；常规单因素ANOVA，与仅PBS组相比)。
如图105中的实验所示，尽管用Dex处理观测到强有力的FKBP5诱导，但INX231P引起FKBP5信号的较小变化，这可能由表达VISTA的免疫细胞驱动。同样地，Dex处理对许多其他骨毒性相关转录物造成显著影响，所述转录物例如Rankl、Ddit4、Fam107a和其他(例如Stc2、Runx2、Errfl1-数据未示出)。结果指示本发明ADC INX231P对相同转录物具有非显著影响。如图105中所示，骨骼中的类固醇反应基因受Dex显著影响。INX231P具有有限影响。Fkpb5(左)RANKL(左中)ddit4(右中)Fam107a(右)。在以10mg/Kg(递送0.2mg/Kg有效负载)进行1次单次腹膜内注射后20小时测量INX231P作用。
实验2
RNAseq分析
在图106中的本实验中，我们在给药(10mg/kg-0.2mg/kg有效负载)后24小时在雌性食蟹猴(外周血白细胞、脑、骨、白色脂肪)中评价INX234P对比Dex对转录物水平的影响。在10mg/Kg(递送0.2mg/Kg有效负载)的1次单次静脉内剂量后24小时测量INX234P作用。通过RNAseq测量基因转录水平并呈现为归一化计数。(n＝2媒介物，n＝6ADC/组；未配对t检验对比媒介物)。结果显示在血液中用根据本发明的示例性ADC INX234P处理促成使用INX234P的清晰类固醇特征(图106)。如其中所示，ADC相对于媒介物对照诱导食蟹猴外周血细胞中的类固醇反应基因表达。
如图107中的实验进一步所示，在10mg/Kg(递送0.2mg/Kg有效负载)或D8(媒介物)的1次单次静脉内剂量后24小时测量INX234P在脑、白色脂肪和骨骼中对类固醇相关转录物的作用。通过RNAseq再次测量基因转录水平并呈现为归一化计数。(n＝2媒介物，n＝3ADC/组(对于组织)；未配对t检验对比媒介物-INX234P不显著)。图107中的结果显示在脑、白色脂肪和骨骼中，类固醇相关转录物在24小时显示出有限变化或类似于对照。此外，尽管这些结果在组内存在一些变异性，但这可能归因于动物数目少和猴之间的异质性。
在图108中的实验中，类固醇反应基因似乎在24小时在白色脂肪组织中显示出残留Dex作用。如所示，ADC基因表达类似于媒介物对照。在本实验中，在1次单次静脉内剂量后24小时或在第8天(媒介物)测量游离Dex(2mg/Kg)和INX234P(10mg/Kg-递送0.2mg/Kg有效负载)作用。通过RNAseq测量基因转录水平并呈现为归一化计数。(n＝2媒介物，n＝2地塞米松，n＝3ADC/组(对于组织)；未配对t检验对比媒介物)。
图108中的结果显示在24小时，Dex对与快速清除相关的直接类固醇反应基因(例如FKBP5)具有极小乃至无残余影响。值得注意的是，在白色脂肪中，PDE3B为已知由GC下调的糖皮质激素作用的间接标志物。观测到PDE3B由Dex下调，而在ADC处理的猴中，转录物水平类似于对照(图101)(Lee R.等人,(2018)Glucocorticoid receptor and adipocytebiology.Nucl Receptor Res.5:101373)。已知使用处理上调的类固醇作用的其他直接靶标(ANGPTL4、Mgll)似乎也在Dex组中在24小时下调(图108)(Lee R.等人,(2018)Glucocorticoid receptor and adipocyte biology.Nucl Receptor Res.5:101373)。
我们假设这可能是初始上调后负反馈环的结果，并且提供糖皮质激素处理会发生转录物表达变化的一些确认。
MS分析
在图109A-D中的实验中，经由MS在各种VISTA表达组织和非VISTA表达组织中评估释放的有效负载(INX-SM-3)和半胱氨酸修饰的接头有效负载(INXP-cys)的浓度。本实验显示，在INX234P处理的猴中在24小时活性有效负载(INX-SM-3)的高积累与VISTA表达组织相关。在INX234P(10mg/kg-递送0.2mg/Kg有效负载)或游离地塞米松(2mg/kg)的1次单次静脉内剂量后24小时测量(A)释放的有效负载(INX-SM-3)，或(B)半胱氨酸修饰的接头/有效负载(INXP-cys)，或(C)地塞米松。通过LC-MS/MS测量累积的化合物水平并且呈现为ng化合物/g组织(n＝3ADC/组(对于组织)，n＝2地塞米松)。
特别地，在24小时，释放的有效负载在表达VISTA的免疫组织中存在强积累，并且在非VISTA表达组织如结肠和十二指肠、脂肪或脑中存在有限乃至无积累(图109A)；在负责过滤和排泄的器官肝和肾中也检测到有效负载(图109A)。半胱氨酸修饰的接头有效负载也存在一些积累，这将为在有效负载释放之前分解代谢的ADC的预期产物(图109B)。如我们所预期，Dex处理的猴在24小时在任何组织中具有极少积累的游离地塞米松(图109C)。残留地塞米松与VISTA表达无关，而集中于肝、肾和白色脂肪中。与仅在24小时以低水平存在的Dex成直接对比，在VISTA表达组织中强水平的释放的有效负载(INX-SM-3)在第8天(研究终止)持续存在，在非VISTA表达组织中仅有低水平或不可检测的水平(图109D)。
结论
实验1的结果显示，在小鼠骨骼样品中，以2mg/Kg给与的Dex诱导强水平的Fkbp5、Rankl、Ddit4和其他类固醇和骨特异性毒素相关转录物。相比之下，以10mg/Kg(0.2mg/kg有效负载)给与的INX231P显示出与未处理组相比相同转录物的表达的有限变化。与长期GC处理相关的一种主要毒性为糖皮质激素诱导的骨质疏松性骨损伤。这些数据表明类固醇-抗VISTA偶联物将具有有限的骨相关毒性。
实验2的结果显示，在雌性食蟹猴中，以10mg/Kg(或0.2mg/Kg有效负载)给与的INX234P相对于媒介物对照对血液中的FKBP5和其他类固醇途径相关转录物具有强有力的影响。在具有极少乃至无VISTA表达的组织中，转录水平似乎更类似于对照-尽管结果受动物之间的内在变异性和小样品数目所影响。
鉴于在24小时应清除小分子，2mg/Kg Dex在大多数组织中仅具有有限影响。这些发现与来自INX234P处理组的释放的有效负载在24小时在VISTA表达组织中的强细胞内积累以及在非VISTA表达组织中的有限积累相关联。7天后(研究第8天)，在VISTA表达组织，例如淋巴结(髂和颌)和骨髓中持续存在强水平的释放的有效负载。这与游离地塞米松成鲜明对比，如截至24小时所预期，游离地塞米松在非免疫组织中以极低水平检测到。
有趣的是，尽管鉴于在24小时应清除小分子，2mg/Kg Dex在大多数组织中仅具有有限影响，但一些转录物潜在地由于负反馈环而下调。这提供在存在时应显示类固醇影响的转录物的指示，并且其中我们特别认为我们的抗VISTA类固醇ADC具有有限乃至无影响。
此外，结果显示转录数据得到有效负载积累数据强烈支持。INX234P处理的猴在VISTA表达组织中显示出强水平的释放的活性有效负载INX234P、INX-SM-3和较低水平的完整接头有效负载(INXP-cys)。低水平的残留地塞米松与VISTA表达组织无关。
具体而言，实验1的数据显示，在小鼠骨骼样品中，以2mg/Kg给与的Dex诱导强水平的Fkbp5，以及额外骨毒性相关转录物，尤其例如Rankl、ddit4和Fam107a。相比之下，以10mg/Kg(0.2mg/kg有效负载)给与的INX231P显示出与未处理组相比相同转录物的表达的极有限乃至无变化。
在雌性食蟹猴中，以10mg/Kg(或0.2mg/Kg有效负载)给与的INX234P相对于媒介物对照对血液中的FKBP5和其他类固醇途径相关转录物具有强有力的影响。在具有极少乃至无VISTA表达的组织中，转录物水平似乎更类似于对照，尽管结果受动物之间的内在变异性和小样品数目所影响。
此外，尽管鉴于在24小时应清除小分子，2mg/Kg Dex在大多数组织中仅具有有限影响，但一些转录物潜在地由于负反馈环而下调。这提供在存在时应显示类固醇影响的转录物的指示，并且其中我们特别认为我们的抗VISTA类固醇ADC具有有限乃至无影响。
转录数据得到有效负载积累数据强烈支持。INX234P处理的猴在VISTA表达组织中显示出强水平的释放的活性有效负载INX-SM-3和较低水平的完整接头有效负载(INXP-cys)。第8天(研究终止)，在VISTA表达组织(淋巴结和骨髓)中持续存在强水平的释放的有效负载。在24小时低水平的残留地塞米松与VISTA表达组织无关。
实施例21：食蟹猴中静脉内注射的INX234P的非GLP药物动力学研究
在查尔斯河实验室(CRL)进行研究，以确定在食蟹猴中以15mg/Kg单次注射后，根据本发明的示例性ADC INX234P，即，连接到糖皮质激素(GC)有效负载的抗人VISTA单克隆抗体的药物动力学特征。还测量了免疫群体、皮质醇水平和GC有效负载的细胞内/血清水平的变化。
在这些实验中，在实验过程中监测白细胞(WBC)数目和皮质醇水平的变化。此外，通过质谱法(MS)在血清和血细胞团块中定量释放的有效负载积累。
材料和方法
实验设计
四只雄性食蟹猴静脉内(i.v.)接受15mg/Kg INX234P的一次剂量。接着在下文列出的时间点对动物进行放血。在所有时间点收集并储存血清和血细胞团块。
测试剂和剂量
INX234P(Abzena，HA-0853-02)
以15mg/Kg给药并且静脉内注射
食蟹猴
在CRL对来自RMS Houston,Houston,TX,USA和Orient BioResource Center,Alice,TX,USA的专门饲养、非初始的非人类灵长类动物进行研究。
将年龄介于2岁与4岁之间的四只雄性录入研究中。
样品收集详情在表8中。
X＝待收集样品；-＝不适用；hr＝小时。PK＝药物动力学(用于生物分析)
a如果不超过允许的采样频率和体积，则可获得额外样品(例如，归因于非血清样品的凝结)。
血液学
血液学详情在表9中。
从每个血液学样品制备血涂片。
生物分析样品处理
将PK血液样品离心，分离所得血清，并且立即在干冰上或在设置为维持-70℃或更冷的冷冻机中冷冻。
生物分析样品分析
在2-8℃下将96孔聚苯乙烯微板用0.5μg/mL包被溶液(绵羊抗人IgG，结合位点，目录号AU003.M)包被12-24小时。洗涤后，添加封闭缓冲液(Pierce/Thermo Scientific，目录号37528)，并在室温下在板振荡器上以350rpm温育90分钟±10分钟。洗涤板并且添加测试样品，并在室温下在板振荡器上以350rpm温育2小时±20分钟。洗涤板，并且将250ng/mL检测抗体溶液(山羊抗人IgG，HRP(H&L)，Bethyl，目录号A80-319P)添加至板的每个孔中，在室温下在板振荡器上以350rpm温育60±5分钟。洗涤板，并且将100μL TMB底物溶液添加至板的每个孔中并在室温下温育15±2分钟。将100μL终止溶液添加至板的每个孔中以终止TMB反应。
在反应停止15分钟内，使用微板读取器(Molecular Devices SPECTRAmax)在450nm下读取板。测试物品用于校准曲线。
药物动力学评价
使用PKsolver程序在静脉内推注后进行非隔室分析(NCA)来确定抗体半衰期。
皮质醇ELISA
皮质醇酶免疫测定试剂盒(Arbor Assays目录号K003-H5)。
根据供应商的方案，使用皮质醇ELISA试剂盒测定血清样品。
质谱分析
由Quintara Discovery对细胞团块和血清进行MS定量。
在细胞团块上：
简言之，将细胞团块悬浮于100μL 20％甲醇中。用相应血浆空白稀释所有样品，并用含有内标物(维拉帕米)的乙腈:甲醇萃取每个样品。使混合物在振荡器上涡旋，随后离心。转移上清液的等分试样用于注射至LC/MS/MS(ExionLC AD泵；Sciex Qtrap 6500+)。通过将测试化合物外加至空白食蟹猴血浆中来制备校准标准和质量控制样品，接着与未知样品一起处理。
通过首先基于PBL或WBC血液学计数计算细胞数和经处理用于MS的每个样品的固定体积，将数据针对细胞体积(ng/ml)进行归一化。接着，我们通过使用最常用的每个细胞400飞升的任意平均红细胞体积(MCV)转换为体积(3)。
关于血清：
用含有内标物(维拉帕米)的乙腈:甲醇萃取每个血浆样品。使混合物在振荡器上涡旋，随后离心。转移上清液的等分试样用于注射至LC/MS/MS(ExionLC AD泵；Sciex Qtrap6500+)。通过将测试化合物外加至空白食蟹猴血浆中来制备校准标准和质量控制样品，接着与未知样品一起处理。
用GraphPad(Prism)制作所有图。
结果
药物动力学数据
动物以15mg/Kg的剂量静脉内接受INX234P的一次剂量，并且使用PK Solver分析PK数据，得出PK或T1/2＝14小时。
图111中的实验显示INX234P PK分析。在实验中，以15mg/Kg静脉内给与INX234P，并且在指定时间点对动物进行放血，分离血清并且测量抗体水平(n＝4只食蟹猴，SEM)。
另外，以下表10和表11中含有原始PK数据。
表10：PK数据分析：
表1.1：在单次静脉内推注15mg/kg INX234P之后个别和汇总雄性食蟹猴血清INX234P浓度
DQL＝低于定量限
NA不适用.
表11：PK数据分析
表2.1：在单次静脉内推注15mg/kg INX234P之后雄性食蟹猴血清中的个别INX234P药物动力学参数
血液学变化
如图112中的实验结果所示，所有动物显示出白细胞(WBC)的总体增加，截至注射后48小时数目恢复正常。淋巴细胞(LYMPH)在注射后3小时展示出快速减少。截至96小时，数目恢复正常。截至给药后24小时，单核细胞(MONO)显示出减少，但截至96小时也恢复正常。这些变化与已知会导致短暂性白细胞减少症的GC的正常影响一致。
更特别地，图112中的结果显示由INX234P的一次剂量引起的血液学变化。以15mg/Kg静脉内给与INX234P。在指定时间点对动物进行放血，完成血涂片并且对不同细胞群体进行计数(n＝4只食蟹猴，SEM)(WBC＝白细胞，NEUT＝嗜中性粒细胞，LYMPH＝淋巴细胞，MONO＝单核细胞，EOS＝嗜酸性粒细胞，BASO＝嗜碱性粒细胞，RBC＝红细胞，Retic＝网织红细胞)。
皮质醇变化
基础皮质醇水平在动物之间有极大差异(从193.7ng/ml至298.8ng/ml)。在静脉内注射后20分钟，所有动物显示出由于应激所致的皮质醇增加。截至注射后12小时，所有动物具有较低至正常水平的皮质醇，动物之间再次具有极大差异，但截至24小时恢复正常(图113中的实验)。考虑到时间0＝8AM，约12小时＝10PM的皮质醇下降与食蟹猴中的正常昼夜节律一致(Tochitani等人，2019，“Physiological and dmg-induced changes in bloodlevels of adrenal steroidsand their precursors incynomolgus monkeys：Anapplication of steroid profiling by LC-MS/MS for evaluation of the adrenaltoxicity”，Toxicol.Sci.第44卷，第9期，575-584)。
更特别地，图113中的结果显示在个别动物中由INX234P的一次剂量诱导的皮质醇变化。以15mg/Kg静脉内给与INX234P。在指定时间点对动物进行放血，分离血清并通过ELISA测量皮质醇水平(n＝4只食蟹猴)。
血清和外周血白细胞中的有效负载积累
我们在先前的实验中已显示INX234P的主要代谢物或释放的有效负载为INX-SM-3。将血清和外周血白细胞(PBL)运送至Quintara Discovery以进行MS分析，用于定量接头-有效负载(P-cys)和随时间释放的有效负载(SM3)。
图114中的实验显示，截至早期时间点，偶联物已内化，并且抗体已开始分解代谢，从而释放完整接头有效负载(INX P-cys)的一部分。这在细胞中积累，接着裂解，产生活性释放有效负载(INX-SM-3)的细胞内浓度。
更具体而言，图114中的实验显示当以15mg/Kg静脉内给与INX234P时，PBL中接头有效负载(P-cys)和释放的有效负载(SM3)的PK。在指定时间点对动物进行放血，分离PBL并通过MS进行分析(n＝4只食蟹猴，SEM)。由于偶联物在7天为血浆稳定的(数据未示出)，因此血浆中释放的有效负载和接头有效负载代表来自细胞的有效负载流出。
图115中的实验显示，在血清中，P-cys在约12小时达到峰值，而对于释放的有效负载SM3在约24小时达到最大浓度。值得注意的是，与允许有功效但限制非靶向组织的血清暴露的血清相比，接头有效负载的细胞内水平高100倍并且释放的有效负载高20倍。
截至注射后第8天(192小时)，释放的有效负载和接头有效负载均低于检测限，即使在淋巴结和骨髓中释放的有效负载的组织内水平相当高。更具体而言，图115中的实验显示当以15mg/Kg静脉内给与INX234P，并且在指定时间点对动物进行放血，分离血清并通过MS分析(n＝4只食蟹猴，SEM)时，血清中接头有效负载(P-cys)和释放的有效负载(SM3)的PK。
INX234P诱导外周血白细胞中随时间的转录变化
图116中所示的实验显示在PK研究过程中评价的PBL中的转录变化，使用INX234P给药前(或放血前)收集的血液作为基线水平(以计算倍数变化)。
如图116中所示，尽管动物之间存在可变性，但例如FKBP5、DUSP1、ZBTB16、TSC22D3和NFKBIA的类固醇转录靶标早在给药后3小时显示出转录快速增加，其中FKBP5、DUSP1和ZBTB16在约12小时达到峰值。在24小时，大多数转录靶标仍上调。
如其中所示，在96小时，FKBP5、ZBTB16和NKBIA的转录水平仍高于基线2倍，而DUSP1、SGK1和TSC22D3恢复至基线。
更具体而言，图116中的实验显示，当以15mg/Kg静脉内给与INX234P时，PBL中的类固醇反应基因由INX234P上调。在指定时间点对动物进行放血，分离PBL并经受RNA分离，通过RNAseq测量基因转录水平并呈现为对比放血前的倍数变化(n＝4只食蟹猴)。
结论
本实施例中的数据显示：
-INX234P具有14小时的半衰期(T1/2)。
-如GC所预期，INX234P在外周血中诱导有限和短暂的细胞变化。抗体组分似乎不会增加毒性。
-除由于昼夜节律而预期的那些之外，INX234P给药后未观测到皮质醇水平的一致变化。
-释放的接头有效负载和随后释放的有效负载在血细胞中的积累在数小时内发生，并且使得血细胞中的细胞内浓度比血清中的水平高20至100倍。
-第8天，PBL中不可检测到水平，而释放的有效负载仍持续存在于骨髓和淋巴结组织中，这可能归因于细胞周转。
-INX234P早在给药后3小时诱导PBL中的转录变化，并且对于一些靶标在96小时仍可检测到变化，这证明所递送的有效负载具有功能活性并且药效范围更广。
1-Vermeer等人,(2003)Glucocorticoid-induced increase in lymphocyticFKBP51messenger ribonucleic acid expression:a potential marker forglucocorticoid sensitivity,potency,and bioavailability.J Clin EndocrinolMetab.1月；88(1):277-84
2-McPherson MJ等人,(2017)Glucocorticoid receptor agonist andimmunoconjugates thereof,US15/611,037
3-Khoo等人,(2002)Intracellular Accumulation of Human ImmunodeficiencyVirus Protease Inhibitors,Antimicrob.Agents Chemother.2002年10月；46(10):3228-3235。
4-Tochitani等人,2019,J.Physiological and drug-induced changes inblood levels of adrenal steroids and their precursors in cynomolgus monkeys:An application of steroid profiling by LC-MS/MS for evaluation of the adrenaltoxicity,Toxicol.Sci.第44卷,第9期,575-584
实施例22：人类外周血单核细胞中INX抗体糖皮质激素偶联物的释放的有效负载的鉴定和定量
在本实施例中进行实验，显示根据本发明的示例性抗VISTA糖皮质激素偶联物快速内化至VISTA表达细胞中。抗体分解代谢，释放半胱氨酸修饰的完整接头有效负载。接头有效负载也裂解以释放活性有效负载。鉴于细胞中蛋白酶的多样性，必须凭经验确认释放的有效负载。在本研究中，鉴定人类外周血单核细胞(PBMC)中内化的新颖抗体糖皮质激素偶联物释放的有效负载，并且经由质谱法(MS)对三种不同糖皮质激素接头有效负载进行丰度定量。
本研究的目的是鉴定和定量根据本发明的新颖糖皮质激素偶联物在人类PBMC中释放的有效负载。
材料和方法
实验设计
在所有以下实验中，用根据本发明的示例性抗VISTA糖皮质激素偶联物处理每次研究从1名健康供体分离的人类PBMC，以允许对释放的有效负载进行鉴定和定量。
在初步实验中，我们显示与抗VISTA糖皮质激素偶联物一起温育4小时(h)引起人类PBMC中FKBP5的强有力增加。这是糖皮质激素活性的直接影响。
在本实验中，将PBMC与糖皮质激素(GC)抗体药物偶联物(ADC)一起温育4小时后，收集细胞，并且经由定量实时PCR(qPCR)评估FKBP5转录诱导以及经由质谱法(MS)评估释放的有效负载鉴定和定量。
试剂
测试ADC
·INX201J(Abzena，批号JZ-0556-025-1)为经由链间二硫键的完全修饰而偶联至接头/有效负载并且具有8.0的药物/抗体比率(DAR)的INX201。接头/有效负载(J)是基于专利报道的接头/有效负载(US15/611,037)。其由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX J-2)组成。
·INX231J(Abzena，批号JZ-0556-013-1)为以8.0的DAR偶联的INX231。接头/有效负载(J)是基于专利报道的接头/有效负载(US15/611,037)。其由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX J-2)组成。
·INX231P(Abzena，批号JZ-0556-017-1)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX231。接头/有效负载(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX231V(Abzena，批号PP-0920-014-2)为具有7.8的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX231。接头/有效负载(INX V)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX234A11(Abzena，批号RJS-1054-001)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A11)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头(Asn/gly)与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX234A3(Abzena，批号PP-0924-023-1)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A3)由带正电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX234V(Abzena，批号RJS-1054-003)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX V)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX231V(Abzena，批号PP-0920-014-2)为具有7.8的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX231。接头/有效负载(INX V)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX231A7(Abzena，批号RJS-1054-007-001)为具有7.8的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX231抗体。接头/有效负载(INX A7)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与磷酸化的布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·INX231A12(Abzena，批号RJS-1054-007-002)为具有6.99的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX231抗体。接头/有效负载(INX A12)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与磷酸化的醋酸氟轻松类似物有效负载(INX-SM-25)组成。
·INX231A23(Abzena，批号RJS-1054-006-001)为具有7.34的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX231抗体。接头/有效负载(INX A23)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与醋酸氟轻松类似物有效负载(INX-SM-25)组成。
·INX234A5(Abzena，批号RJS-1054-002)为具有7.9的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A5)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-44)组成。
·INX234A4(Abzena，批号PP-0924-023-2)为具有7.9的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX A4)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-43)组成。
·INX231J(Abzena，批号JZ-0556-013-1)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX231抗体。接头/有效负载(INX J)是基于专利报道的接头/有效负载(US15/611,037)。其由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX J-2)组成。
·INX231P(Abzena，批号JZ-0556-017-1)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX231。接头/有效负载(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX234P(Abzena，批号HA-0853-02)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234。接头/有效负载(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX234J(Abzena，批号JZ-0556-013-2)为具有8.0的DAR并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX J)是基于专利报道的接头/有效负载(US 15/611,037)。其由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INXJ2)组成。
·INX231S(Abzena，批号PP-0924-014-1)为具有6.9的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX231抗体。接头/有效负载(INX S)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与醋酸氟轻松类似物有效负载(INX-SM-24)组成。
细胞培养基
·不含L-谷氨酰胺的RPMI 1640(VWR目录号16750-084)
·青霉素/链霉素/谷氨酰胺(ThermoFisher目录号10378016)
·1M Hepes(Gibco目录号15630-080)
·人类AB血清(Valley Biomedical目录号HP1022HI)
其他试剂
·Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare目录号17-1440-03)
·Histopaque 1077(Sigma Aldrich)
PBMC制备
在无菌条件下在达特茅斯希区柯克医疗中心的供血者项目中从去识别化健康人类供体获得的单采锥分离出人类PBMC。
将血液转移至50ml Falcon管中并用PBS稀释至30ml。将13ml Histopaque 1077在血液下缓慢分层，并在室温下以850x g将管离心20分钟，同时缓缓加速并且无制动。
从血浆/Ficoll界面收集单核细胞，重悬于50ml PBS中并以300x g离心5分钟。将细胞重悬于PBS中并进行计数。
用于代谢物鉴定和定量的测定方案
将分离的PBMC重悬于含有10％人类AB血清、10mM Hepes、1x青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺的RPMI 1640(测定培养基)中。
将来自1名供体的PBMC在PBS中洗涤2次，接着以1x10^7/mL重悬于培养基中。将1mL转移至所用6孔板的每个孔中。
将ADC或培养基单独添加至所用6孔板的每个孔中，最终浓度为1mM有效负载并且添加药物后每孔总体积为2mL。将板置于37℃下4小时。
4小时后，从给定处理的所有孔中收集并合并含细胞的培养基。
使1mL细胞悬浮液成团，去除培养基，并且将团块重悬于RNA溶解缓冲液中以进行FKBP5分析。
将每次处理的剩余细胞分为代表每个等分试样5000万个细胞的等分试样(对于代谢物定量，每种条件仅产生一个等分试样)。
使细胞以450rcf成团4分钟。
自每个细胞团块取出培养基，接着将培养基静置于-80℃下，直至可评估流出的有效负载的浓度。从管中去除任何额外的残留培养基，留下干细胞团块，将其储存于-80℃下用于MS分析。
作为额外对照，将储备药物(2mM)稀释至最终浓度(1mM)，并且静置培养基和等分试样以确认在0时间点培养基中缺乏游离有效负载。
MS分析
通过Quintara Discovery进行MS分析。
对于代谢物鉴定
简言之，将预冷的70％ACN(萃取缓冲液)添加至PBMC团块中以进行萃取。将团块悬浮于萃取缓冲液中并在冰浴中温育。接着将样品离心，并且从每个样品中收集上清液。用Speed Vac干燥上清液并用50％MeOH复原。将15mL注射至LCMS(Luna C18(2)柱，ThermoScientific Q Exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap)上并且评估所得质量。
对于定量
将细胞样品悬浮于100μL 20％甲醇中。用含有内标物(维拉帕米)的乙腈:甲醇(95:5，v/v)萃取每个样品。使混合物在振荡器上涡旋，随后离心。转移上清液的等分试样用于注射至LC/MS/MS(Sciex Qtrap 6500+)。通过将测试化合物外加至未处理的人类PBMC中来制备校准标准和质量控制样品，接着与未知样品一起处理。
RNA制备和实时PCR
将细胞团块重悬于来自RNA Plus试剂盒(Macherey-Nagel编号740984)的0.4ml RNA溶解缓冲液中。遵循制造商的说明书分离RNA，并且在30或40ml H2O(不含RNase/DNase)中洗脱。在Nanodrop上评估RNA浓度。
使用Taqman反转录试剂(编号N8080234)并且遵循制造商的说明书进行反转录。
使用Taqman主混合液2X试剂盒(编号4369016)进行定量实时PCR并且在来自Applied Biosystem的QuantStudio3上运作。所使用的引物：
i.TaqMan基因表达测定(FAM-MGB)；测定ID：Hs01561006_m1(FKBP5)
ii.TaqMan基因表达测定(FAM-MGB)；测定ID：Hs01922876_u1(GapDH)
将Ct数据转换为ΔCt和ΔΔCt或相较于未处理对照的Log2倍数变化。
结果
实验1
INX-SM-J2、INX-SM-3和INX-SM-32分别为INX201J、INX231P和INX231V的主要代谢物。
在本实验中，我们在与人类PBMC(单个供体)一起体外温育4小时后鉴定INX201J、INX231P和INX231V温育的主要代谢物。
如图117中所示，与所有偶联物一起温育引起FKBP5转录的强有力增加。MS分析确认任何偶联物的主要代谢物是其相应的预测释放的有效负载，对于INX201J，这对应于INX-SM-J2，并且对于INX231P和INX231V，这分别对应于INX-SM-3和INX-SM-32。这些以纯化形式释放的有效负载已各自在本文报道的其他实验结果中显示出活性，并且引发类似效力。对于三种偶联物中的每一者也存在较低水平的未裂解半胱氨酸修饰的接头有效负载，代表分解代谢的抗体。
表12中的数据提供释放的有效负载、未裂解的半胱氨酸修饰的接头有效负载和培养基中代表释放的化合物流出的化合物的近似丰度。值得注意的是，INX231V释放的有效负载的丰富大大超过INX231P和INX201J释放的有效负载。
INX231P与INX201J之间释放的有效负载的差异受以下事实混淆：INX201在体内和体外比INX231内化快得多(数据未示出)，引起INX201额外积累，从而使释放的INX J有效负载超过INX P有效负载。即使与更快内化的抗体偶联物相比，INX V释放的有效负载的水平仍基本上超过相应INX J释放的有效负载的水平。
表12
如表12中所示，INX V有效负载对比INX P或INX J存在实质性释放。在4小时估算与1mM偶联有效负载(约20mg/mL ADC)一起温育的人类PBMC的细胞内有效负载丰度并经由MS分析进行定量。还给出了在4小时存在于培养基中的流出有效负载的量。定量而非估算培养基中的水平，这是因为其与另一个实验的样品平行评估(n＝1名供体(ND-不可检测(估算LLOQ＝0.1ng)；BQL-低于定量限(<0.5ng/mL))。
实验2
INX V释放的有效负载相比INX P或INX J释放的有效负载以更高水平存在。
在本研究中，我们确认INX231J、INX231P和INX231V与人类PBMC一起温育4小时后释放的有效负载的丰度。表13提供释放的有效负载、半胱氨酸修饰的接头有效负载和培养基中代表释放的化合物流出的化合物的丰度。其还包括当用培养基(不存在细胞)稀释ADC储备溶液并且提交用于进行MS分析时所检测的释放的有效负载的水平作为对照。
本研究的结果确认和定量INX V释放的有效负载超过INX P并且甚至超过INX J释放的有效负载显著增强235倍(ng/ng)。基于三种接头有效负载之间的结构差异，未预期此种实质性释放增强，而并非抗体或接头贡献的结果，这是因为相同抗体(INX231)和gly glu接头用于所有三种偶联物。
尽管INX P和INX J偶联物的抗体相同，但在4小时INX P释放的有效负载为INX J释放的有效负载量的约3倍。这些结果进一步证实在先前实施例中所示的LPS刺激的PBMC测定中所观测的效力效益。
表13中的数据显示INX231V释放的有效负载的水平超过INX231J或INX231P的水平。本文中示出在4小时定量与1mM偶联有效负载(约20mg/mL ADC)一起温育的人类PBMC的细胞内有效负载的丰度并且经由MS分析进行定量。还给出在4小时存在于培养基中的流出有效负载的量。在储备溶液中所检测的释放的有效负载水平对于INX231J为0.8ng/mL，或低于定量限-<0.5ng/mL(INX231V/INX231P)。储备溶液中半胱氨酸淬灭的有效负载水平对于INX231P为0.9ng/mL，或低于定量限，<0.5ng/mL(INX231V/INX231P)。
实验3
与人类PBMC一起温育的INX A11、INX A3、INX V、INX A7、INX A12、INX A23、INXA5、INX A4、INX P、INX S和INX J抗VISTA偶联物释放的有效负载的定量
在本研究中，我们确认在与人类PBMC(1名供体)一起温育4小时后一系列新颖糖皮质激素偶联物释放的有效负载的丰度。以下表14提供培养基中释放的有效负载和化合物的丰度，代表释放的化合物的流出。本研究还包括当用培养基(不存在细胞)稀释ADC储备溶液并且提交用于进行MS分析时所检测的释放的有效负载的水平作为阴性对照。所有量以ng/mL给出。在两种情况(INX234P和INX234J)下，由于分析前的技术变化而使一部分材料损失，因此将细胞内材料的量归一化以考虑材料的损失。
本研究确认和定量ImmuNext新颖接头有效负载超过INX J文献比较物的显著增强(ng/ng)。值得注意的是，当抗体主链保持恒定(例如INX231)并且偶联至INX J或ImmuNext接头有效负载时，在细胞内检测到更大量的释放的ImmuNext有效负载。在其更类似(例如INX234P对比INX234J)的一种情况下，INX234P在细胞内检测到更高水平(约1.5x)，而与INXJ成对比，培养基中检测不到流出的有效负载。这是重要的，因为在体内流出的有效负载可引起靶向细胞类型的停留时间缩短和其他细胞的非特异性摄取。
表14中的数据显示，新颖接头有效负载释放的有效负载的水平超过INX J比较物的水平。表格显示在4小时定量与500nM偶联有效负载(约10mg/mL ADC)一起温育的人类PBMC的细胞内有效负载的丰度并且经由MS分析进行定量。还给出了在4小时存在于培养基中的流出有效负载的量。在储备溶液中所检测的释放的有效负载水平均为BQL(低于定量限，<0.5ng/mL)。
结论
·抗VISTA与每个特定接头有效负载(INX J、INX V和INX P)的偶联物各自裂解，释放理论释放的有效负载。其他替代的裂解产物不以可检测水平存在。
·一些残留的全半胱氨酸修饰的接头有效负载仍然存在。
·从INX V偶联物和其他新颖糖皮质激素接头有效负载释放的有效负载比相应的INX J释放的有效负载更丰富。
特别地，在本实施例中的实验中，我们将INX201J、INX231P和INX231V的主要代谢物分别鉴定为理论上释放的有效负载INX-J2、INX-SM-3和INX-SM-32。
令人惊讶地，在温育4小时后，INX231V释放的有效负载相比INX P和INX J的有效负载以基本上更大的量存在。在最初研究中估算相对于INX P和INX J偶联物的有效负载丰度>75x(ng/ng)。在第二项研究中，确认相对于INX P丰度>230x(ng/ng)并且对于INX J释放的有效负载甚至更大。
INX P偶联物也展示出当每个偶联物使用相同抗体时释放的有效负载超过INX J偶联物的积累增强(约3x)。
此种增加的丰度对效力和PD都具有实质性影响。使用先前实施例中公开的延迟脂多糖(LPS)测定的额外研究已证明，INX V偶联物以其偶联形式比INX P基本上更强效，INXP比相同抗体的INX J偶联物更强效，即使三者释放的有效负载以其游离形式具有类似效力。此处在体外所观测的释放的有效负载的大量细胞内贮库也可能直接促成体内所观测的多周持续作用，即使ADC具有仅数小时的短血清半衰期。
我们测试的所有额外新颖糖皮质激素偶联物也显示出超过偶联至相同抗体主链的INX J增强甚至显著增强的细胞内积累，其中有极少释放的有效负载流出至培养基中。鉴于游离有效负载形式的效力和糖皮质激素小分子一般极短的PD，此数据强烈支持本发明ADC相对于预期效力增强的体外效力和长PD。
实施例23：IBD或结肠炎研究
葡聚糖硫酸钠结肠炎鼠类模型(DSS)模型通常用于评估潜在IBD或结肠炎治疗。(参见Eichele等人,“Dextran sodium sulfate colitis murine model:Anindispensable tool for advancing our understanding of inflammatory boweldiseases pathogenesis”,World J Gasteroenterology,2017年9月7日；23(33):6016-6029)。因此，此动物模型用于初步评估根据本发明的ADC用于治疗结肠炎或IBD的功效。
此外，如通常已知，IBD和结肠炎是难以有效治疗和控制并且如果治疗无效则可能导致败血症和死亡的慢性疾患。目前，IBD或结肠炎疾病控制的主要手段涉及慢性类固醇施用。然而，不幸的是，这潜在地可导致毒性，例如因为类固醇对非靶标(例如上皮细胞)的作用和/或延长的免疫抑制。
在此初步实验中，向一个动物组每隔一天以0.2mpk的类固醇剂量施用根据本发明的Dex ADC(INX234P)，向第二个阳性对照动物组每天以2mpk的类固醇剂量施用游离Dex类固醇，并且第三个阴性对照动物组不进行处理。每组有10只动物。当动物开始显示出体重减轻(第7天)(DSS第0天开始)时，起始ADC或Dex处理。实验在第13天终止，此时一个组(dex处理)达到最大允许体重减轻。
结果(初步，未显示)表明与未处理的对照相比ADC显示出功效。此外，结果表明ADC不引发游离类固醇处理的动物中所观测的相同毒性。关于此，已报道地塞米松在此IBD模型中导致毒性；参见van Meeteren ME,Meijssen MAC,Zijlstra FJ.“The effect ofdexamethasone treatment on murine colitis”,Scand J Gastroenterol 2000；35:517-521；和Ocon等人,“The glucocorticoid budesonide has protective and deleteriouseffects in experimental colitis in mice”,Biochemical Pharmacology 116(2016)73-88)。
尽管这些结果是初步的，但其表明主题ADC可适用于治疗结肠炎或IBD适应症。此外，其表明主题ADC对于治疗这些慢性疾病可能优于现有游离类固醇疗法，因为其可减轻长期游离类固醇疗法期间可能发生的毒性。这在实施例25中得到进一步证实。
实施例24：抗体药物偶联物INX234P和INX234V对异种GvHD模型中的T细胞扩增和存活的影响-2项研究
异种移植物抗宿主病(异种GvHD)的人源化小鼠模型允许在体内研究对人类药物靶标具有特异性的免疫调节化合物。这些是基于注射人类外周血单核细胞(PBMC)的免疫缺陷小鼠品系。NOD-scid IL-2Rγ空(NSG)品系缺乏成熟T细胞、B细胞和自然杀伤细胞，并且可进行异种GvHD研究。
在异种GvHD的NSG模型中，静脉内(i.v.)转移供体人类T细胞，并且随时间推移在接受体小鼠中强有力地扩增并且影响抗宿主细胞反应性，引起皮肤组织浸润。小鼠体重减轻，并且如果不进行处理则将死于GvHD。疾病进展的时间范围可在3至6周的范围内。在转移人类PBMC之前通过用2.5-3Gy照射小鼠可加速疾病发生和进展的时间。在此种情况下，疾病在约1-2周后开始并且小鼠截至2-3周将死亡。
简言之，首先向小鼠注射2.5x106个人类PBMC，以及对照人类IgG1、INX234或INX234P(实验1)或INX234V(实验2)的剂量。通过定期称重小鼠以及通过外周血上的绝对白细胞计数(ALC)测量人类T细胞扩增来监测疾病进展。研究的目的是评价偶联至2种不同GC有效负载的人类VISTA抗体INX234影响异种GvHD进展的能力。
材料和方法
研究设计
在这些实验中，在用供体细胞静脉内注射第一剂抗体或ADC之后，经由腹膜内注射(i.p.)进行处理，每周一次，10mg/Kg直至第34周。
对于实验1，仅在第21天收集一次血液。对于实验2，从第15天开始每周收集血液一次。
测试剂和剂量
·INX234(ATUM，批号72931.2.a)为在Fc区中具有L234A/L235A/E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。
·INX234P(Abzena，批号JZ-0556-017-2)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234。接头/有效负载(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX234V(Abzena，批号RJS-1054-003)为具有7.9的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX V)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
·huIgG1si(Aragen，批号BP-2211-018-6)为在Fc区中具有E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的抗RSV单克隆Ab。
将所有抗体在PBS中稀释并以0.2ml的体积腹膜内注射以递送10mg/Kg的剂量。
在实验2中，用INX234V处理动物直至第27天，接着在实验的其余时间用INX234P处理。
小鼠
8周龄的NSG小鼠购自杰克逊实验室(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl J库存编号：005557)，并且圈养于达特茅斯-希区柯克医疗中心(DHMC)的特定无病原体条件下。在实验开始之前给小鼠纹身。
| 抗体 |
| 人类CD25 FITC |
| 人类CD19PE |
| 小鼠CD45PerCP cy5.5 |
| 人类CD45RO PECy7 |
| 人类CD4 APC-cy7 |
| 人类CD3 BV421 |
| 人类CD45BV510 |
| 小鼠Fc阻断剂 |
对于实验1，在PBMC静脉内转移前7天，以2.5Gy照射小鼠。
对于实验2，未照射小鼠。
抽血和免疫染色
使用玻璃巴斯德移液管从眼眶后腔采集外周血，所述移液管首先用肝素冲洗以防止凝血。
下文所述的1次洗涤方案允许绝对血细胞计数。
将10ml抗体混合剂(参见右图)直接添加至100ml血液中。在室温(RT)下温育30分钟后，将600ml BD FACS溶解缓冲液添加至样品中。在室温下温育30分钟后，将样品以550rcf旋转5分钟，在PBS中洗涤一次，接着重悬于固定体积的PBS中。在MacsQuant流式细胞仪上操作整个样品以获得绝对细胞数。
外周血单核细胞分离
在无菌条件下在DHMC的供血者项目中从去识别化健康人类供体获得的单采锥分离出人类PBMC。将血液转移至50ml Falcon管中并用PBS稀释至30ml。将13ml Histopaque1077(Sigma Aldrich)在血液下缓慢分层，并在室温下以850rcf将管离心20分钟，同时缓缓加速并且无制动。
接着从血浆/Ficoll界面收集单核细胞，重悬于50ml PBS中并以300x g离心5分钟。将细胞重悬于PBS中并进行计数。
疾病监测
如我们的IACUC组织所允许，每周对小鼠称重3次，并且在体重降至初始体重的75％以下时实施安乐死。
结果
实验1
INX234P处理防止人类PBMC扩增
为监测异种GvHD进展，我们测量了人类T细胞扩增和体重减轻。如图119中所示，在细胞转移后第21天，INX234P处理组中人类PBMC数目显著减少。在这些实验中，第21天收集外周血并通过流式细胞术定量人类CD45阳性细胞。从第0天至第34天每周一次向小鼠给药(SEM；n＝8/组)(以10mg/Kg给药，INX234P提供0.2mg/kg INX P接头有效负载)。
INX234P处理改善小鼠存活
还显示与hIgG1和裸Ab对照组相比INX234P处理防止体重减轻，其转换为存活改善。一旦处理终止，INX234P处理的小鼠开始减轻体重。INX234P处理使得存活改善，如人类IgG1和INX234处理组的中位存活期分别为52天对比38.5天和42天所示。
如图120中的实验结果所示，INX234P处理改善小鼠存活。在这些实验中，从第0天至第34天每周一次向小鼠腹膜内给与10mg/Kg(或0.2mg/Kg INX P接头有效负载)。左上图显示以初始体重百分比表示的平均重量变化；3幅下图显示个别小鼠的体重减轻％；右上图为卡普兰-迈耶存活曲线；上方(下图)或下方(上图)的灰色条指示处理时段(SEM；n＝8/组)。
实验2
INX234V/P处理防止人类PBMC扩增
在本实验中，每周一次用INX234V处理动物直至第27天，接着在实验的剩余时间用INX234P处理，此后我们随时间推移跟踪人类T细胞扩增，主要为此模型中扩增的(>98％)T细胞。如图121中所示，早在第15天即可观测到细胞数的显著差异。尽管两个对照组均显示出在第28天达到稳定的细胞扩增，但INX234V/P处理组显示出持续低的T细胞数。
特别在图121中的实验中，转移后第15天开始每周收集外周血并且通过流式细胞术定量人类CD45+CD3+阳性细胞。从第0天每周一次向小鼠给药(SEM；n＝8/组)(以10mg/Kg给药，INX234V和INX234P分别提供0.2mg/kg INX V或INX P接头有效负载)。
INX234V/P处理改善小鼠存活
INX234V/P处理与hIgG1和未偶联的Ab对照组相比进一步完全防止体重减轻，其转换为存活显著改善(图122)，其中人类IgG1和未偶联的INX234的中位存活期分别为42天和44.5天。INX234V/P处理组中的所有动物在撰写本报告时为活的。
如图122中的结果所示，INX234V/P处理改善小鼠存活。在这些实验中，第0天开始每周一次向小鼠腹膜内给与10mg/Kg(或0.2mg/Kg INX V或INX P接头有效负载)。左上图显示以初始体重百分比表示的平均重量变化；3幅下图显示个别小鼠的体重减轻％；右上图为卡普兰-迈耶存活曲线。
结论
数据显示，INX234P和INX234V都可控制异种GvHD进展并且通过限制/防止免疫缺陷小鼠的人类T细胞扩增和疾病发展而增加存活期。数据进一步显示，在实验2中从接头有效负载INX V变为INX P维持处理的功效。这种功效由GC有效负载介导，如裸抗体INX234不引出功效的事实所证明。
参考文献
1-Johnston RJ,Su LJ,Pinckney J,Critton D,Boyer E,Krishnakumar A,Corbett M,Rankin AL,Dibella R,Campbell L,Martin GH,Lemar H,Cayton T,Huang RY,Deng X,Nayeem A,Chen H,Ergel B,Rizzo JM,Yamniuk AP,Dutta S,Ngo J,Shorts AO,Ramakrishnan R,Kozhich A,Holloway J,Fang H,Wang YK,Yang Z,Thiam K,RakestrawG,Rajpal A,Sheppard P,Quigley M,Bahjat KS,Korman AJ.“VISTA is an acidic pH-selective ligand for PSGL-1.”Nature.2019年10月；574(7779):565-570。
2-McPherson MJ等人,(2017)Glucocorticoid receptor agonist andimmunoconjugates thereof,US15/611,037
实施例25：抗VISTA抗体药物偶联物在小鼠T细胞转移结肠炎模型中具有功效
炎症性肠病(IBD)(克罗恩病；溃疡性结肠炎)为肠道和/或结肠的慢性炎症性病症。尽管糖皮质激素(GC)对治疗IBD高度有效，但由于与长期治疗相关的毒性，这些强效抗炎剂通常限于治疗急性发作。
慢性结肠炎的初始T细胞转移小鼠模型有助于描述负责诱导以及调控肠道炎症的免疫机制。它也是对GC具有高度反应性的唯一鼠类结肠炎模型。
在结肠炎的T细胞转移鼠类模型中评价2种抗体药物偶联物(ADC)INX234P和INX234V的功效，这两种抗人VISTA单克隆抗体都连接到2种不同糖皮质激素(GC)有效负载。
简言之，将来自人类VISTA表达小鼠(hVISTA KI)的初始CD4 T细胞转移至不产生成熟T、B和NK细胞的免疫缺陷性Rag1-/-小鼠中。>21天后，动物开始慢慢减轻体重，并且观测到循环初始T细胞减少。在此模型中，ADC仅靶向转移的细胞，而游离GC可作用于转移的细胞和宿主细胞。
在实验1中，第0天开始用10mg/Kg INX234P处理小鼠，接着每周一次。在实验2中，一旦注意到疾病的第一个迹象，就在第21天开始用INX234V处理，随后每周处理一次。在两个实验中添加四个对照组：PBS、2和0.2mg/Kg地塞米松(Dex)、和未偶联的INX234抗体，全部每周给药一次。在实验1中，第0天(预防性)开始并且第61天终止处理，而在实验2中，第21天(或治疗性)开始处理并且在提交本文档时仍在进行。
在两个实验中获得的数据显示，与任一剂量的Dex相比，INX234P和INX234V对以下具有更优的影响：
1)维持移植的初始CD4 T细胞群体
2)如显著增加的存活期所证明对抗疾病
此外，数据还证明仅靶向疾病效应细胞足以预防疾病发展。
材料和方法
研究设计
在两个实验中，每周一次施用所有处理。
对于实验1，在初始CD4 T细胞转移后第0天(或预防性)开始INX234P处理，并且第61天终止。对于实验2，在初始CD4 T细胞转移后第21天(或治疗性)开始INX234V处理。在本实验中，第42、49和56天，动物接受INX234P，随后在处理时段的其余时间切换回INX234V。
测试剂和剂量
抗体
·INX234(ATUM，批号72931.2.a)为在Fc区中具有L234A/L235A/E269R/K322A静默突变的人类IgG1/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。
·INX234P(Abzena，批号JZ-0556-017-2)为具有8.0的药物/抗体比率(DAR)并且经由链间二硫键的完全修饰而偶联的INX234。接头/有效负载(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-3)组成。
·INX234V(Abzena，批号RJS-1054-003)为具有7.9的DAR并且经由链间二硫键的修饰而偶联的INX234抗体。接头/有效负载(INX V)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效负载(INX-SM-32)组成。
将所有抗体在PBS中稀释并以0.2ml的体积腹膜内(i.p.)注射以递送10mg/Kg的剂量。
地塞米松
将来自Phoenix的地塞米松无菌注射剂NDC 57319-519-05在PBS中稀释至0.2ml的最终体积并且如所述经由腹膜内注射而给药。
小鼠
·8周龄雌性Rag1-/-小鼠或B6.129S7-Rag1tm1Mom/J从杰克逊实验室(库存号：002216)订购。
·人类VISTA敲入(hVISTA KI)小鼠具有代替小鼠VISTA基因敲入的人类VISTAcDNA，并且在RNA和蛋白质水平上以与小鼠VISTA或C57Bl/6小鼠相同的表达模式表达人类VISTA。在现场(达特茅斯比较医学与研究中心)饲养hVISTA KI小鼠。8-10周龄雌性小鼠用于细胞转移。
疾病模型建立
初始CD4 T细胞分离
遵循制造商的说明书使用来自StemCell的EasySepTM小鼠初始CD4+T细胞分离试剂盒(目录号19765)从hVISTA KI脾中分离初始CD4 T细胞。
结肠炎起始
遵循Ostanin等人(2008)的方案，第0天腹膜内注射0.5x106个初始CD45RB+CD4+T细胞。
全血免疫染色
使用玻璃巴斯德移液管从眼眶后腔采集外周血，所述移液管首先用肝素冲洗以防止凝血。
下文所述的1次洗涤方案允许绝对血细胞计数。
将10ml抗体混合剂(参见右表)直接添加至100ml血液中。在室温(RT)下温育30分钟后，将600ml BD FACS溶解缓冲液添加至样品中。在室温下温育30分钟后，将样品以550rcf旋转5分钟，在PBS中洗涤一次，接着重悬于固定体积的PBS中。在MacsQuant流式细胞仪上操作整个样品以获得绝对细胞数。
疾病监测
如我们的IACUC组织所允许，每周对小鼠称重3次，并且在体重降至初始体重的75％以下时实施安乐死。
结果
实验1
INX234P处理改善存活
如图123和图124中所示，对照组、PBS和未偶联(实验1)和低Dex(0.2mg/Kg)组的中位存活期分别为43、74.5和72.5天。相比之下，截至第91天实验终止，INX234P和高Dex(2mg/Kg)组均未达到中位存活期。此外，尽管在高Dex组中必须处死20％(10只中的2只)小鼠，但在INX234P处理组中所有小鼠均存活(由于早期无关事件而审查的1只动物除外)。截至第61天处理结束后第10天，INX234P处理的动物开始减轻体重(图123和图124)。
更具体而言，在图123的实验中，从第0天至第61天每周一次向小鼠腹膜内给与10mg/Kg(和0.2mg/Kg INX P接头有效负载(适当时))与INX234P和INX234。左上图显示以初始体重百分比表示的平均重量变化；3幅下图显示个别小鼠的体重减轻％；右上图为卡普兰-迈耶存活曲线；上方(下图)或下方(上图)的灰色条指示处理时段(SEM；n＝10/组，INX234P组(n＝9)除外)。
图124中的数据显示高剂量地塞米松处理改善小鼠存活。在实验中，从第0天至第61天每周一次向小鼠腹膜内给与2(高)或0.2(低)mg/Kg。左上图显示以初始体重百分比表示的平均重量变化；3幅下图显示个别小鼠的体重减轻％；右上图为卡普兰-迈耶存活曲线；上方(下图)或下方(上图)的灰色条指示处理时段(SEM；n＝10/组)。
实验2
在本实验中，我们通过在初始T细胞转移后第21天开始处理来评价偶联至接头有效负载INX V的抗VISTA提供治疗功效的能力。第42、49和56天，动物接受INX234P，随后在处理时段的其余时间切换回INX234V。
INX234V处理改善存活
如图125和图126中的数据所示，用INX234V处理的动物的体重在实验过程中稳步增加(这是正常的)，而所有其他组显示在前30天增加一些体重后随时间而下降。
尽管在报告发表时，大多数组未达到中位存活期，但ADC处理组中无体重减轻的事实可能会转化为显著改善的存活期。此外，令人惊讶地，与包括PBS组的所有其他组相比，用高剂量Dex处理的组显示出存活期降低(图126)
图125中的数据显示INX234V处理改善小鼠存活。在这些实验中，从第21天至第80天每周一次向小鼠腹膜内给与10mg/Kg(和0.2mg/Kg INX V接头有效负载(适当时))的INX234V和INX234。左上图显示以初始体重百分比表示的平均重量变化；3幅下图显示个别小鼠的体重减轻％；右上图为卡普兰-迈耶存活曲线；上方(下图)或下方(上图)的灰色条指示处理时段(SEM；n＝10/组，INX234处理组(n＝5)除外)。
图126中的数据显示低剂量地塞米松处理改善小鼠存活。在这些实验中，从第21天至第80天每周一次向小鼠腹膜内给与2(高)或0.2(低)mg/Kg。左上图显示以初始体重百分比表示的平均重量变化；3幅下图显示个别小鼠的体重减轻％；右上图为卡普兰-迈耶存活曲线；上方(下图)或下方(上图)的灰色条指示处理时段(SEM；n＝10/组)。
INX234V处理不影响转移的T细胞的存活，但限制其活化。
结肠炎发展由转移的初始CD4 T细胞的扩增和活化引起。为监测疾病发展，我们每周测量外周血中的T细胞数和活化状态。将T细胞活化测量为CD45RB表达的损失，这是初始细胞标志物。一旦我们观测到与第7天相比CD45RB+CD4 T细胞的频率急剧下降，就在第21天开始处理，其中约50％的T细胞仍为CD45RB+(图127，下图)。动物在录入时随机化以进行处理。
如图127中所示，尽管PBS对照组与Dex处理组之间的T细胞数不存在差异(右上图)，但INX234V处理的小鼠显示出极其一致的T细胞有限扩增(左上图)。用未偶联抗体处理的组仅在处理前2周显示出较低的T细胞数(左上图)。另外，在处理开始前，所有组中CD45 RB +T细胞或初始T细胞的频率在第15天与第21天之间急剧下降；INX234V处理允许维持初始T细胞群体>20％移植的总T细胞(左下图)，而所有其他组显示出<10％的初始细胞频率(左下图和右下图)。
图127中的数据显示INX234V处理防止T细胞扩增和活化。在这些实验中，从第21天至第80天每周一次向小鼠腹膜内给与10mg/Kg(和0.2mg/Kg V有效负载(适当时))与INX234V或INX234和2(高)或0.2(低)mg/Kg的Dex。左上图显示INX234V和INX234对比PBS(左)以及高剂量和低剂量的Dex对比PBS(右)的血液中的初始T细胞数；左下图和右下图指示同一组的CD45RB+CD4 T细胞的频率；上方的灰色条指示处理时段(SEM；n＝10/组，INX234处理组(其中n＝5)除外)。
结论
数据显示INX234P和INX234V与Dex相比预防性地和治疗性地在以下方面具有更优的功效：
1)维持移植的初始CD4 T细胞群体
2)如显著增加的存活期所证明对抗疾病
此外，数据还证明仅靶向疾病效应细胞足以预防疾病发展。
参考文献
-McPherson MJ等人,(2017)Glucocorticoid receptor agonist andimmunoconjugates thereof,US15/611,037
-Dmitry V.Ostanin等人,(2009)T cell transfer model of chronic colitis:concepts,considerations,and tricks of the trade,Am J Physiol GastrointestLiver Physiol.；296(2):G135-G146。
主题ADC的示例性优点汇总
本申请中公开的实验结果显示，本发明ADC与用于靶向和引导抗炎剂(特别是类固醇)内化至免疫细胞中的先前ADC，例如靶向CD74、CD163、TNF和PRLR的ADC相比具有独特的优点组合；这是由于VISTA作为ADC靶标的组合效益和主题ADC中包含的抗VISTA抗体的特定特性(在生理pH下结合至表达VISTA的免疫细胞结合并且具有极短pK)。
这些优点包括以下：
1)主题ADC结合至在极高密度下表达VISTA的免疫细胞，并且尽管其PK极短，但长期(具有长PD)有效(引发抗炎活性)，并且因此极其适于治疗慢性或发作性炎症性或自身免疫性或过敏性疾病，其中长期和重复施用是治疗上需要的。
2)主题ADC靶向广泛的免疫细胞，包括嗜中性粒细胞、骨髓细胞、T细胞和内皮细胞，因此主题ADC可用于治疗涉及任何或所有这些类型的免疫细胞的炎症性或自身免疫性或过敏性疾病。
3)主题ADC快速起效(短至2小时内)并且因此可用于急性治疗。
4)主题ADC不结合B细胞，并且因此不应如游离类固醇一样具有免疫抑制性(即，将保留体液免疫)。这潜在地将减少慢性或长期使用与长期使用游离类固醇相关的主题ADC期间的毒性或不良副作用(例如长期使用类固醇与一些癌症、感染性疾患和其他疾病相关，这明显因为长期免疫抑制的不良作用)。
5)主题ADC作用于Treg，Treg是负责类固醇功效的重要免疫细胞。
6)主题ADC作用于静止和活化的免疫细胞，例如骨髓细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、Treg、CD8 T细胞、CD4 T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞(在其上组成性地表达)；因此，主题ADC在炎症性和自身免疫性疾患的活动期和缓解期将为活性的(引发抗炎活性)。
7)主题ADC作用于嗜中性粒细胞，所述免疫细胞对急性炎症至关重要，进一步证明ADC极其适于治疗急性炎症和控制炎症发作，例如与慢性或发作性自身免疫或炎症性疾患的活动期、发病早期、理想地在病理症状出现之前相关。这潜在地将减少甚至在受试者经历与炎症相关的疼痛或其他症状之前可能发生的组织损伤。
8)由于VISTA细胞表面周转率高，因此主题ADC极快速且组成性地内化免疫细胞。
9)主题ADC具有极短半衰期(PK)并且仅结合免疫细胞，因此主题ADC不应易于靶向相关毒性和非所需的外周类固醇暴露(低非特异性损失作用)。
10)在一些实施方案中，主题ADC的生物活性(抗炎作用)完全归因于抗炎有效负载(类固醇)，这是因为其中具有静默IgG的抗VISTA抗体不显示免疫功能(不阻断任何VISTA生物学)，从而潜在地简化给药和/或潜在地避免不良副作用，例如在治疗上可能不需要VISTA激动性的个体中。
11)在一些实施方案中，主题ADC的生物活性(抗炎或免疫抑制作用)归因于抗炎有效负载(类固醇)和抗VISTA抗体的Fc部分，特别在其中抗VISTA抗体包含功能性IgG2 Fc区的实施方案中，这是因为具有功能性IgG2的抗VISTA抗体与表达VISTA的免疫细胞的结合会拮抗VISTA的免疫抑制作用，特别是其对T细胞增殖和T细胞活性的抑制作用，从而提供具有由2种不同机制引发的免疫抑制活性的ADC。
-抗VISTA ADC的优点
1)VISTA在所选免疫细胞上高度表达
ο将药物靶向嗜中性粒细胞、骨髓细胞、T细胞和内皮细胞
ο不结合B细胞并且因此可能不如游离糖皮质激素一般具有免疫抑制性
ο在Treg(淋巴细胞中糖皮质激素的主要细胞类型靶标)上表达
ο仅在嗜中性粒细胞上表达的靶标之一(对急性炎症至关重要)
ο快速且组成性地内化。
οVISTA细胞表面周转率同样高。
2)抗VISTA显示出短半衰期，因此降低任何靶标相关毒性并且减少外周GC暴露(非特异性损失作用低)
3)静默IgG不显示出免疫功能(不阻断任何VISTA生物学)
ο其他结合抗体ADC候选物对以下靶标具有独立功能：CD74、CD163、TNF、PRLR糖皮质激素接头有效负载的优点
INX P系列(INX P、INX S)
1)释放的有效负载超过文献比较物的细胞内水平增强
2)尽管比较物游离有效负载具有类似的效力，但偶联的接头有效负载超过偶联的比较物接头有效负载的效力增强。
3)允许稳定的药物抗体比率为8，在150mg/mL下极少乃至无聚集。
ο稳定的高浓度制剂允许潜在用于皮下给药
INX V系列(INX V、INX A3、INX A11、INX A7、INX A23、INX A12)
1)释放的有效负载超过文献比较物的细胞内水平大大增强
2)偶联的接头有效负载具有超过其他具有类似效力有效负载的偶联的接头有效负载的增强效力
糖皮质激素抗VISTA ADC的优点
1)归因于高度内化至免疫细胞中，提供糖皮质激素的长时间细胞内暴露
2)归因于ADC<24小时血清半衰期，GC对非免疫细胞的暴露有限
3)归因于由药物的细胞内代谢有限引起的糖皮质激素途径的效力更高，可改善给药
4)稳定的药物抗体比率为8，在150mg/mL下极少乃至无聚集。
ο稳定的高浓度制剂允许潜在用于皮下给药
实施例中引用的参考文献
本申请中引用的以下参考文献和所有其他参考文献通过引用整体并入。
(1)Johnston,R.J.等人,W.O.公开第2018/169993A1号。
(2)Graversen,J.H.等人,Mol Ther.2012年8月；20(8):1550-1558
(3)Vafa,O.等人,Methods.2014年1月；65(1):114-26。
(4)Durbin,K.R.,Phipps,C.和Liao,X.(2018).Mechanistic Modeling ofAntibody-Drug Conjugate Internalization at the Cellular Level RevealsInefficient Processing Steps.Mol Cancer Ther,1535-7163。
(5)Liao-Chan,S.,Daine-Matsuoka,B.,Heald,N.,Wong,T.,Lin,T.,Cai,A.G.,...Theunissen,J.W.(2015).Quantitative assessment of antibodyinternalization with novel monoclonal antibodies against Alexafluorophores.PLoS One,10(4):e012470。
(6)Liu,Z.,Yu,Z.,He,W.Liu,Z.,Yu,Z.,He,W.,Ma,S.,Sun,L.和Wang,L.(2009).“In-vitro internalization and in-vivo tumor uptake of anti-EGFR monoclonalantibody LA22 in A549 lung cancer cells and animal model”.Cancer BiotherRadiopharm,15-23。
非正式序列表
SEQ ID NO:1：智人VISTA(替代名称：B7-H5；B7H5；DD1α；GI24；PP2135；SISP1)氨基酸序列
SEQ ID NO:2：小家鼠VISTA氨基酸序列
SEQ ID NO:3：小家鼠VISTA氨基酸序列
SEQ ID NO:4：智人VISTA(替代名称：B7-H5；B7H5；DD1α；GI24；PP2135；SISP1)核酸序列
/>
/>
SEQ ID NO:5：智人VISTA(替代名称：B7-H5；B7H5；DD1α；GI24；PP2135；SISP1)编码核酸序列
SEQ ID NO:6：小家鼠VISTA编码核酸序列
/>
SEQ ID NO:10
SEQ ID NO:11
SEQ ID NO:12
SEQ ID NO:13
SEQ ID NO:14
IgG2_σ
SEQ ID NO:15
人类_κ_恒定
/>
Claims (132)
1.一种糖皮质激素激动剂化合物，所述糖皮质激素激动剂化合物具有以下式(I)结构：
其中
X选自苯基、螺[3.3]庚烷、3-6元杂环、环烷基、螺烷基、螺杂环烷基、双环烷基、杂双环烷基、[1.1.1]双环戊烷、双环[2.2.2]辛烷、金刚烷和立方烷，其各自可被1-4个独立地选自F、Cl、Br、I、N、S和O的杂原子取代，其中每个环结构可含有至少一个选自N、S和O的骨架杂原子，并且任选地进一步被1-4个C1-3烷基或C1-3全氟烷基取代；
Z选自苯基、螺[3.3]庚烷、3-6元杂环、环烷基、螺烷基、螺杂环烷基、双环烷基、杂双环烷基、[1.1.1]双环戊烷、双环[2.2.2]辛烷、金刚烷和立方烷，其各自可被1-4个独立地选自F、Cl、Br、I、N、S和O的杂原子取代，其中每个环结构可含有至少一个选自N、S和O的骨架杂原子，并且任选地进一步被1-4个C1-3烷基或C1-3全氟烷基取代；
Y选自CHR1、O、S和NR1；
E选自CH2和O；
G选自CH和N；
进一步其中当G为CH并且X为苯基时，Z不为苯基；
G与X的键联可任选地选自C1-3烷基和环氧乙烷，其各自可被1-4个独立地选自N、S和O的杂原子取代并且任选地进一步被1-4个C1-3烷基取代；
X与Z的键联可占据X和Z上的任何可用位置；
取代基NR1R2可占据Z上的任何可用位置；
R1选自H、1-8个碳的直链或支链烷基、芳基和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
当R1为H时，R2可选自H、1-8个碳的直链或支链烷基、芳基和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
当R1为H、1-8个碳的直链或支链烷基、或杂芳基时，R2可为选自以下的官能团：
[(C＝O)CH(W)NH]m-[C＝O]-[V]k-J，
(C＝O)OCH2-对氨基苯基-N-V-J，
(C＝O)OCH2-对氨基苯基-N-[(C＝O)CH(W)NH]m-[C＝O]-[V]k-J，和
[V]k-(C＝O)OCH2-对氨基苯基-N-[(C＝O)CH(W)NH]m-[C＝O]-J，
其中m＝1-6，k＝0-1，并且W的每个置换可独立地选自H、[(CH2)nR3](其中n＝1-4)、以R3为末端的支链烷基链，和包含1-13个单元的直链或支链聚环氧乙烷基团；
R3选自H、甲基、乙基、异丙基、OH、O-烷基、NH2、NH-烷基、N-二烷基、SH、S-烷基、胍、脲、羧酸、羧酰胺、羧酸酯、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基，其中所述芳基和杂芳基取代基可选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-；
V可选自1-8个碳的烷基链；包含1-13个单元的直链或支链聚环氧乙烷基团；包含1-8个碳的直链或支链烷基；-O-烷基；羧酸；羧酰胺；羧酸酯；烷基-C(O)O-；烷基氨基-C(O)-；二烷基氨基C(O)-；1-3个氨基酸的序列，其中每个氨基酸独立地选自Glu、Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、βAla、Phe、Val和Cit；芳基；和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-、二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
J为选自以下的反应基团：-NH2、N3、硫基、环辛炔、-OH、-CO2H、反式环辛烯、炔基、炔丙基、
其中R32选自Cl、Br、F、甲磺酸酯和甲苯磺酸酯，并且R33选自Cl、Br、I、F、OH、-O-N-丁二酰亚胺基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基，R34为H、Me、四嗪-H和四嗪-Me；
R5选自由-CH2OH、-CH2SH、-CH2Cl、-SCH2Cl、-SCH2F、-SCH2CF3、羟基、-OCH2CN、-OCH2Cl、-OCH2F、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH2CN和组成的组；
R6和R7独立地选自氢和C1-10烷基；
Q可为H、C(O)R8(其中R8为1-8个碳的直链或支链烷基)，或(C＝O)NR4CHnNR4(C＝O)OCH2-(V)n-J(其中n＝1-4并且R4＝H、烷基或支链烷基)，或P(O)OR4；
A1和A2独立地选自H和F；并且
除非另有规定，否则要求保护所有可能的立体异构体。
2.根据权利要求1所述的糖皮质激素激动剂化合物，其中X和Z独立地选自苯基、螺[3.3]庚烷、[1.1.1]双环戊烷和双环[2.2.2]辛烷；Y选自CH2和O；W的置换独立地选自CH2CH2CO2H和H，并且进一步其中当G为CH并且X为苯基时，Z不为苯基。
3.根据权利要求1或2所述的糖皮质激素激动剂化合物或选自实施例3中公开的糖皮质激素激动剂化合物中的任一者或选自图11或图118A-O中所示的那些者，不包括INX J和INXL。
4.一种糖皮质激素激动剂化合物，所述糖皮质激素激动剂化合物选自本文所公开的INX-类固醇有效负载、INX-类固醇接头和INX-抗体药物偶联物(ADC)化合物，不包括INX J和INX L。
5.一种糖皮质激素激动剂化合物，所述糖皮质激素激动剂化合物选自以下：
6.根据前述权利要求中任一项所述的糖皮质激素激动剂化合物，所述糖皮质激素激动剂化合物直接或间接连接到至少一个可裂解或不可裂解肽和/或非肽接头(即，“类固醇-接头有效负载”或“糖皮质激素-接头有效负载”)。
7.一种化合物(类固醇-接头有效负载)，所述化合物包含：至少一个可裂解或不可裂解接头(“L”)；任选地“Q”，其为“异双官能团”或“异三官能团”，其为任选地用于将所述化合物中的所述接头连接到抗体或抗体片段的化学部分；和至少一种抗炎剂(“AI”)，其中AI为根据权利要求1-6中任一项所述的糖皮质激素激动剂化合物，所述化合物可由以下结构表示：
Q-L-AI或AI-L-Q。
8.根据权利要求6或7所述的类固醇-接头有效负载，其中所述接头选自本文所公开或图118A-E中的类固醇-接头化合物中所示的那些中的任一者。
9.根据权利要求6、7或8所述的类固醇-接头有效负载，所述类固醇-接头有效负载包含至少一个选自PAB和/或氨基酸或肽的可裂解或不可裂解接头，任选地为1-12个氨基酸，进一步任选地为二肽、三肽、四肽、五肽并且进一步任选地为Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、Phe、Cit、Val、Val-Cit、Val-Ala、Val-Gly、Val-Gln、Ala-Val、Cit-Cit、Lys-Val-Cit、Asp-Val-Ala、Ala-Ala-Asn、Asp-Val-Ala、Ala-Val-Cit、Ala-Asn-Val、βAla-Leu-Ala-Leu、Lys-Val-Ala、Val-Leu-Lys、Asp-Val-Cit、Val-Ala-Val和Ala-Ala-Asn；或任选地为GlcA、PAB和Glu-Gly中的至少一者。
10.一种包含至少一种根据前述权利要求中任一项所述的糖皮质激素激动剂化合物的类固醇-接头有效负载，所述类固醇-接头有效负载包含至少一个可裂解接头和/或牺牲型接头，所述接头直接或间接连接到所述糖皮质激素激动剂类固醇化合物。
11.根据前述权利要求中任一项所述的糖皮质激素激动剂化合物或类固醇-接头有效负载，其选自实施例3或图118A-O中公开的糖皮质激素激动剂化合物或类固醇-接头有效负载化合物中的任一者，不包括INX J和INX L。
12.一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，所述糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物选自：
(i)INX-SM-3-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-4-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-53-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-54-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-56-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-98-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-6-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-2-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-57-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-31-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-32-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-10-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-40-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-34-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-28-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-27-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-35-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-8-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-7-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-33-GluGly-烷氧基胺或糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中Glu-Gly被不同可裂解肽接头取代，和/或其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些或根据式I、II或III中的一者的INX-SM有效负载；或
(ii)INX-SM-53-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-3-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-54-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-1-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-4-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-2-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-47-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-7-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-8-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-56-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-32-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-6-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-10-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-33-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-31-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-35-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-9-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-28-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-27-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-34-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-35-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-40-GluGly-溴乙酰基或糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中Glu-Gly被不同可裂解肽接头取代，和/或其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些或根据式I、II或III中的一者的INX-SM有效负载；
(iii)INX-SM-53-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-1-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-4-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-54-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-7-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-8-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-2-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-57-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-40-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-34-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-28-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-27-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-35-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-9-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-10-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-31-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-32-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-33-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-56-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-6-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-3-GluGly-二苯并环辛炔或糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly被不同可裂解肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些或根据式I、II或III中的一者的INX-SM有效负载；或
(iv)INX-SM-1-GluGly-NHS酯；INX-SM-31-GluGly-NHS酯；INX-SM-32-GluGly-NHS酯；INX-SM-33-GluGly-NHS酯；INX-SM-53-GluGly-NHS酯；INX-SM-7-GluGly-NHS酯；INX-SM-8-GluGly-NHS酯；INX-SM-2-GluGly-NHS酯；INX-SM-56-GluGly-NHS酯；INX-SM-6-GluGly-NHS酯；INX-SM-54-GluGly-NHS酯；INX-SM-4-GluGly-NHS酯；INX-SM-53-GluGly-NHS酯；INX-SM-3-GluGly-NHS酯；INX-SM-9-GluGly-NHS酯；INX-SM-40-GluGly-NHS酯；INX-SM-34-GluGly-NHS酯；INX-SM-28-GluGly-NHS酯；INX-SM-34-GluGly-NHS酯；INX-SM-28-GluGly-NHS酯；INX-SM-27-GluGly-NHS酯；INX-SM-35-GluGly-NHS酯；INX-SM-10-GluGly-NHS酯或糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly被不同可裂解肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些或根据式I、II或III中的一者的INX-SM有效负载；
(v)INX-SM-1-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-3-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-4-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-8-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-2-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-7-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-56-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-6-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-54-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-53-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-33-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-35-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-40-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-34-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-28-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-27-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-35-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-9-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-10-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-31-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-32-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-57-GluGly-顺丁烯二酰亚胺或糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly被不同可裂解肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些或根据式I、II或III中的一者的INX-SM有效负载；或
(vi)INX-SM-3-GluGly-四嗪、INX-SM-53-GluGly-四嗪、INX-SM-1-GluGly-四嗪、INX-SM-54-GluGly-四嗪、INX-SM-6-GluGly-四嗪、INX-SM-56-GluGly-四嗪、INX-SM-4-GluGly-四嗪、INX-SM-10-GluGly-四嗪、INX-SM-31-GluGly-四嗪、INX-SM-32-GluGly-四嗪、INX-SM-33-GluGly-四嗪、INX-SM-7-GluGly-四嗪、INX-SM-8-GluGly-四嗪、INX-SM-9-GluGly-四嗪、INX-SM-27-GluGly-四嗪、INX-SM-35-GluGly-四嗪、INX-SM-2-GluGly-四嗪、INX-SM-40-GluGly-四嗪、INX-SM-34-GluGly-四嗪、INX-SM-28-GluGly-四嗪、INX-SM-27-GluGly-四嗪或糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly被不同可裂解肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些或根据式I、II或III中的一者的INX-SM有效负载；或
(vii)INX-SM-6-GluGly-胺、INX-SM-54-GluGly-胺、INX-SM-4-GluGly-胺、INX-SM-53-GluGly-胺、INX-SM-2-GluGly-胺、INX-SM-56-GluGly-胺、INX-SM-57-GluGly-胺、INX-SM-35-GluGly-胺、INX-SM-27-GluGly-胺、INX-SM-40-GluGly-胺、INX-SM-34-GluGly-胺、INX-SM-28-GluGly-胺、INX-SM-35-GluGly-胺、INX-SM-9-GluGly-胺、INX-SM-10-GluGly-胺、INX-SM-31-GluGly-胺、INX-SM-32-GluGly-胺、INX-SM-33-GluGly-胺、INX-SM-7-GluGly-胺、INX-SM-8-GluGly-胺、INX-SM-1-GluGly-胺、INX-SM-3-GluGly-胺或糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly被不同可裂解肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些或根据式I、II或III中的一者的INX-SM有效负载；或
(viii)INX-SM-53-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-1-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-3-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-2-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-56-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-35-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-25-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-27-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-35-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-9-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-10-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-31-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-32-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-33-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-57-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-7-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-8-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-6-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-54-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-4-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-40-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-34-PAB-GluGly-烷氧基胺或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly和/或PAB被不同可裂解肽或非肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些或根据式I、II或III中的一者的INX-SM有效负载；或
(ix)INX-SM-1-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-3-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-2-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-7-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-8-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-40-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-56-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-6-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-154PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-4-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-33-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-32-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-10-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-34-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-31-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-9-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-28-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-27-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-35-PAB-GluGly-溴乙酰基、INX-SM-53-PAB-GluGly-溴乙酰基或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly和/或PAB被不同可裂解肽或非肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些或根据式I、II或III中的一者的INX-SM有效负载；
(x)INX-SM-6-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-54-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-4-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-53-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-1-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-7-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-8-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-2-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-56-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-57-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-33-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-32-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-31-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-3-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-9-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-27-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-35-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-34-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-28-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-40-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-10-PAB-GluGly-二苯并环辛炔或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly和/或PAB被不同可裂解肽或非肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些或根据式I、II或III中的一者的INX-SM有效负载；或
(xi)INX-SM-56-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-54-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-4-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-53-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-1-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-3-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-33-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-57-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-7-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-8-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-27-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-35-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-9-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-10-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-31-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-32-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-40-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-34-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-28-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-2-PAB-GluGly-NHS酯或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly和/或PAB被不同可裂解肽或非肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些或根据式I、II或III中的一者的INX-SM有效负载；或
(xii)INX-SM-1-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-53-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-5-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-2-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-8-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-56-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-54-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-4-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-57-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-7-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-32-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-31-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-53-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-3-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-34-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-28-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-40-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-27-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-35-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-9-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-10-PAB-GluGly-顺丁烯二酰亚胺或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly和/或PAB被不同可裂解肽或非肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些或根据式I、II或III中的一者的INX-SM有效负载；或
(xiii)INX-SM-6-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-54-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-4-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-53-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-1-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-3-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-57-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-7-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-8-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-2-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-31-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-32-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-33-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-56-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-35-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-9-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-40-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-34-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-28-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-27-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-35-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-10-PAB-GluGly-四嗪或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly和/或PAB被不同可裂解肽或非肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些或根据式I、II或III中的一者的INX-SM有效负载；或
(xiv)INX-SM-1-PAB-GluGly-胺、INX-SM-3-PAB-GluGly-胺、INX-SM-8-PAB-GluGly-胺、INX-SM-2-PAB-GluGly-胺、INX-SM-56-PAB-GluGly-胺、INX-SM-6-PAB-GluGly-胺、INX-SM-54-PAB-GluGly-胺、INX-SM-4-PAB-GluGly-胺、INX-SM-53-PAB-GluGly-胺、INX-SM-33-PAB-GluGly-胺、INX-SM-53-PAB-GluGly-胺、INX-SM-7-PAB-GluGly-胺、INX-SM-9-PAB-GluGly-胺、INX-SM-35-PAB-GluGly-胺、INX-SM-40-PAB-GluGly-胺、INX-SM-34-PAB-GluGly-胺、INX-SM-28-PAB-GluGly-胺、INX-SM-27-PAB-GluGly-胺、INX-SM-35-PAB-GluGly-胺、INX-SM-10-PAB-GluGly-胺、INX-SM-31-PAB-GluGly-胺、INX-SM-32-PAB-GluGly-胺或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly和/或PAB被不同可裂解肽或非肽接头取代，其中另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些或根据式I、II或III中的一者的INX-SM有效负载；或
(xv)INX-SM-1-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-35-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-9-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-10-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-54-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-31-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-32-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-33-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-57-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-7-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-8-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-2-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-56-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-6-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-4-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-53-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-27-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-40-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-34-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-28-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-3-PAB-GlcA-烷氧基胺或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GlcA和/或PAB被不同可裂解肽或非肽接头取代，和/或另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些或根据式I、II或III中的一者的INX-SM有效负载；或
(xvi)INX-SM-3-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-4-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-56-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-54-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-4-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-53-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-7-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-8-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-2-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-40-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-57-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-33-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-10-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-34-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-31-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-32-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-35-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-9-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-28-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-27-PAB-GlcA-溴乙酰基、INX-SM-1-PAB-GlcA-溴乙酰基或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GluGly和/或PAB被不同可裂解肽或非肽接头取代，和/或另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些或根据式I、II或III中的一者的INX-SM有效负载；或
(xvii)INX-SM-4-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-54-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-1-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-54-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-33-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-57-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-7-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-8-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-2-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-5-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-6-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-35-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-9-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-10-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-31-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-32-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-27-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-35-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-28-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-34-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-40-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-3-PAB-GlcA-二苯并环辛炔或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GlcA和/或PAB接头被不同可裂解肽或非肽接头取代，和/或另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些或根据式I、II或III中的一者的INX-SM有效负载；或
(xviii)INX-SM-3-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-53-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-4-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-56-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-54-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-8-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-2-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-7-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-57-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-32-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-33-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-31-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-9-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-10-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-35-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-27-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-28-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-40-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-34-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-1-PAB-GlcA-NHS酯或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GlcA和/或PAB被不同可裂解肽或非肽接头取代，和/或另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些或根据式I、II或III中的一者的INX-SM有效负载；或
(xix)INX-SM-3-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-4-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-53-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-31-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-32-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-33-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-53-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-7-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-8-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-2-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-56-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-6-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-54-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-1-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-9-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-35-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-27-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-28-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-34-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-40-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺、INX-SM-10-PAB-GlcA-顺丁烯二酰亚胺或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GlcA和/或PAB被不同可裂解肽或非肽接头取代，和/或另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些或根据式I、II或III中的一者的INX-SM有效负载；或
(xx)INX-SM-33-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-57-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-7-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-8-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-2-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-56-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-6-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-54-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-4-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-9-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-35-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-27-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-28-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-34-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-40-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-10-PAB-GlcA-四嗪或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GlcAy和/或PAB接头被不同可裂解肽或非肽接头取代，和/或另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些或根据式I、II或III中的一者的INX-SM有效负载；或
(xxi)INX-SM-1-PAB-GlcA-胺、INX-SM-3-PAB-GlcA-胺、INX-SM-53-PAB-GlcA-胺、INX-SM-6-PAB-GlcA-胺、INX-SM-54-PAB-GlcA-胺、INX-SM-8-PAB-GlcA-胺、INX-SM-2-PAB-GlcA-胺、INX-SM-56-PAB-GlcA-胺、INX-SM-4-PAB-GlcA-胺、INX-SM-35-PAB-GlcA-胺、INX-SM-8-PAB-GlcA-胺、INX-SM-10-PAB-GlcA-胺、INX-SM-31-PAB-GlcA-胺、INX-SM-32-PAB-GlcA-胺、INX-SM-33-PAB-GlcA-胺、INX-SM-57-PAB-GlcA-胺、INX-SM-27-PAB-GlcA-胺、INX-SM-35-PAB-GlcA-胺、INX-SM-34-PAB-GlcA-胺、INX-SM-28-PAB-GlcA-胺、INX-SM-40-PAB-GlcA-胺、INX-SM-7-PAB-GlcA-胺或另一种糖皮质激素激动剂(有效负载)-接头偶联物，其中GlcA和/或PAB接头被不同可裂解肽或非肽接头取代，和/或另一个INX或INX-SM有效负载取代其中包含的任选地选自图118A-O中的那些或根据式I、II或III中的一者的INX-SM有效负载；或
(xxii)烷氧基胺-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或烷氧基胺-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或其他INX接头有效负载，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物的有效负载，并且包含相同或不同肽或非肽接头并且所述接头经由C11-OH连接到相同或不同INX类固醇；
(xxiii)溴乙酰基-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或溴乙酰基--GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或其他INX接头有效负载，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物的有效负载，和/或包含相同或不同肽或非肽接头，其中所述接头经由C11-OH连接到相同或不同INX类固醇；
(xxiv)二苯并环辛炔-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或二苯并环辛炔-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或其他INX接头有效负载，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物的有效负载，和/或包含相同或不同肽或非肽接头，其中所述接头经由C11-OH连接到相同或不同INX类固醇；
(xxv)四嗪-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或四嗪-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或其他INX接头有效负载，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物的有效负载，和/或包含相同或不同肽或非肽接头，其中所述接头经由C11-OH连接到相同或不同INX类固醇；
(xxvi)烷氧基胺-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或烷氧基胺-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或其他INX接头有效负载，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物的有效负载，和/或包含相同或不同接头，其中接头经由C17连接到相同或不同INX类固醇有效负载；
(xxvii)溴乙酰基-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或溴乙酰基-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或其他INX接头有效负载，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物的有效负载，和/或包含经由C17的相同或不同INX类固醇有效负载；
(xxviii)顺丁烯二酰亚胺-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或顺丁烯二酰亚胺-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或其他INX接头有效负载，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物的有效负载，和/或包含相同或不同接头，其中所述接头经由C17连接到相同或不同INX类固醇有效负载；
(xxix)二苯并环辛炔-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或二苯并环辛炔-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或其他INX接头有效负载，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物的有效负载，和/或包含相同或不同接头，其中所述接头经由C17连接到相同或不同INX类固醇有效负载；
(xxx)四嗪-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或四嗪-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或其他INX接头有效负载，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物的有效负载，和/或包含经由C17的相同或不同INX类固醇有效负载；和
(xxxi)胺-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或胺-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或其他INX接头有效负载，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物的有效负载，并且包含经由C17的相同或不同INX类固醇有效负载。
13.一种抗体药物偶联物(ADC)，所述抗体药物偶联物(ADC)选自以下：
(i)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(烷氧基胺+酮偶联(C11-OH连接)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物的有效负载，其中所述另一种INX-SM有效负载经由烷氧基胺+酮偶联而偶联至所述抗体并且经C11-OH连接；
(ii)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(叠氮化物+二苯并环辛炔偶联(C11-OH连接)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物的有效负载，其中所述INX-SM有效负载经由叠氮化物+二苯并环辛炔偶联而偶联至所述抗体并且经C11-OH连接；
(iii)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(卤乙酰基+半胱氨酸偶联(C11-OH连接)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物的有效负载并且经由叠氮化物+二苯并环辛炔偶联而偶联至所述抗体并且经C11-OH连接；
(iv)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(顺丁烯二酰亚胺+半胱氨酸偶联(C11-OH连接)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物的有效负载并且经由叠氮化物+二苯并环辛炔偶联而偶联至所述抗体并且经C11-OH连接；
(v)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(四嗪+反式环辛烯偶联(C11-OH连接)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物的有效负载并且经由四嗪+反式环辛烯偶联而偶联至所述抗体并且经C11-OH连接；
(vi)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(烷氧基胺+酮偶联(C11-OH连接))，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物的有效负载并且经由烷氧基胺+酮偶联而偶联至所述抗体并且经C11-OH连接；
(vii)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(叠氮化物+二苯并环辛炔偶联(C17连接))，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物的有效负载并且经由叠氮化物+二苯并环辛炔酮偶联而偶联至所述抗体并且经C17连接；
(viii)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(卤乙酰基+半胱氨酸偶联(C17连接))，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物的有效负载并且经由叠氮化物+二苯并环辛炔酮偶联而偶联至所述抗体并且经C17连接；
(ix)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(四嗪+反式环辛烯偶联(C17连接))，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中所述INX-SM接头有效负载经由四嗪+反式环辛烯偶联而偶联至所述抗体并且经C17连接；
(x)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(使用转谷氨酰胺酶的胺+谷氨酰胺偶联(C17连接))，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中所述INX-SM接头有效负载经由使用转谷氨酰胺酶的胺+谷氨酰胺偶联而偶联至所述抗体并且经C17连接；
(xi)INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(烷氧基胺和酮偶联)(N-连接的有效负载)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物有效负载的有效负载并且经由烷氧基胺和酮偶联而偶联至所述抗体并且经N连接；
(xii)INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(卤乙酰基偶联)(N-连接的有效负载)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物有效负载的有效负载并且经由卤乙酰基偶联而偶联至所述抗体并且经N连接；
(xiii)INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(叠氮化物+二苯并环辛炔偶联)(N-连接的有效负载)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物有效负载的有效负载并且经由叠氮化物+二苯并环辛炔偶联而偶联至所述抗体并且经N连接；
(xiv)INX-SM-3-GlcA-Ab或INX-SM-3-Glu-Gly-Ab(N-羟基丁二酰亚胺偶联)(N-连接的有效负载)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物有效负载的有效负载并且经由N-羟基丁二酰亚胺偶联而偶联至所述抗体并且经N连接；
(xv)INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(叠氮化物+二苯并环辛炔偶联)(N-连接的有效负载)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物有效负载的有效负载并且经由叠氮化物+二苯并环辛炔偶联而偶联至所述抗体并且经N连接；
(xvi)INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(N-羟基丁二酰亚胺偶联)(N-连接的有效负载)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物有效负载的有效负载并且经由N-羟基丁二酰亚胺偶联而偶联至所述抗体并且经N连接；
(xvii)INX-SM-3-Glu-Gly-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(顺丁烯二酰亚胺偶联)(N-连接的有效负载)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物有效负载的有效负载并且经由顺丁烯二酰亚胺偶联而偶联至所述抗体并且经N连接；
(xviii)INX-SM-3-Glu-Gly-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab或INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab(反式环辛烯+四嗪偶联)(N-连接的有效负载)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物有效负载的有效负载并且经由反式环辛烯+四嗪偶联而偶联至所述抗体并且经N连接；
(xix)INX-SM-3-Glu-Gly-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab或INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab(胺偶联)(N-连接的有效负载)，或另一种包含不同INX-SM有效负载的ADC，其中INX-SM3取代选自图118A-O中的那些或式I、II或III的另一化合物有效负载的有效负载并且经由反式环辛烯+四嗪偶联而偶联至所述抗体并且经N连接。
14.一种抗体药物偶联物(ADC)，所述抗体药物偶联物(ADC)选自以下：
其中，
Ab＝抗体，优选地为结合至人类免疫细胞的抗体，优选地为在生理pH下结合至人类VISTA免疫细胞的抗VISTA抗体；
L＝接头；
AA＝单、双或三氨基酸序列；
REG独立地选自由氢、烷基、联苯、-CF3、-NO2、-CN、氟、溴、氯、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-组成的组；
/>
Ab＝抗体；
L＝接头；
AA＝单、双或三氨基酸序列；
REG独立地选自由氢、烷基、联苯、-CF3、-NO2、-CN、氟、溴、氯、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-组成的组；
Ab＝抗体；
L＝接头；
AA＝单、双或三氨基酸序列或不存在；
REG独立地选自由氢、烷基、联苯、-CF3、-NO2、-CN、氟、溴、氯、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-组成的组；
RT＝AA或/>
Ab＝抗体，任选地为抗人VISTA抗体；
L＝接头；
AA＝单、双或三氨基酸序列；
Ab＝抗体；
L＝接头；
AA＝单、双或三氨基酸序列或不存在；
RT＝AA或
15.根据权利要求14所述的抗体药物偶联物(ADC)，其中所述接头包括可裂解或不可裂解肽或牺牲型接头。
16.根据前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)，所述ADC包含选自PAB和/或氨基酸或肽的接头，任选地为1-12个氨基酸，进一步任选地为二肽、三肽、四肽、五肽并且进一步任选地为Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、Phe、Cit、Val、Val-Cit、Val-Ala、Val-Gly、Val-Gln、Ala-Val、Cit-Cit、Lys-Val-Cit、Asp-Val-Ala、Ala-Ala-Asn、Asp-Val-Ala、Ala-Val-Cit、Ala-Asn-Val、βAla-LeuAla-Leu、Lys-Val-Ala、Val-Leu-Lys、Asp-Val-Cit、Val-Ala-Val和Ala-Ala-Asn。
17.一种类固醇抗体偶联化合物，所述类固醇抗体偶联化合物选自以下结构：
其中n＝2-12、2-10、2-8、2-6或2-4并且A为抗体或其抗原结合片段，优选为结合至免疫细胞、优选人类免疫细胞上表达的抗原的抗体或抗体片段，更优选为抗人VISTA抗体。
18.一种式(I)的糖皮质激素激动剂化合物：
其中
X选自苯基、螺[3.3]庚烷、3-6元杂环、环烷基、螺烷基、螺杂环烷基、双环烷基、杂双环烷基、[1.1.1]双环戊烷、双环[2.2.2]辛烷、金刚烷和立方烷，其各自可被1-4个独立地选自F、Cl、Br、I、N、S和O的杂原子取代，其中每个环结构可含有至少一个选自N、S和O的骨架杂原子，并且任选地进一步被1-4个C1-3烷基或C1-3全氟烷基取代；
Z选自苯基、螺[3.3]庚烷、3-6元杂环、环烷基、螺烷基、螺杂环烷基、双环烷基、杂双环烷基、[1.1.1]双环戊烷、双环[2.2.2]辛烷、金刚烷和立方烷，其各自可被1-4个独立地选自F、Cl、Br、I、N、S和O的杂原子取代，其中每个环结构可含有至少一个选自N、S和O的骨架杂原子，并且任选地进一步被1-4个C1-3烷基或C1-3全氟烷基取代；
Y选自CHR1、O、S和NR1；
E选自CH2和O；
G选自CH和N；
进一步其中当G为CH并且X为苯基时，Z不为苯基；
G与X的键联可任选地选自C1-3烷基和环氧乙烷，其各自可被1-4个独立地选自N、S和O的杂原子取代并且任选地进一步被1-4个C1-3烷基取代；
X与Z的键联可占据X和Z上的任何可用位置；
取代基NR1R2可占据Z上的任何可用位置；
R1选自H、1-8个碳的直链或支链烷基、芳基和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
当R1为H时，R2可选自H、1-8个碳的直链或支链烷基、芳基和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
当R1为H、1-8个碳的直链或支链烷基、或杂芳基时，R2可为选自以下的官能团：
[(C＝O)CH(W)NH]m-[C＝O]-[V]k-J，
(C＝O)OCH2-对氨基苯基-N-V-J，
(C＝O)OCH2-对氨基苯基-N-[(C＝O)CH(W)NH]m-[C＝O]-[V]k-J，和
[V]k-(C＝O)OCH2-对氨基苯基-N-[(C＝O)CH(W)NH]m-[C＝O]-J，
其中m＝1-6，k＝0-1，并且W的每个置换可独立地选自H、[(CH2)nR3](其中n＝1-4)、以R3为末端的支链烷基链，和包含1-13个单元的直链或支链聚环氧乙烷基团；
R3选自H、甲基、乙基、异丙基、OH、O-烷基、NH2、NH-烷基、N-二烷基、SH、S-烷基、胍、脲、羧酸、羧酰胺、羧酸酯、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基，其中所述芳基和杂芳基取代基可选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-；
V可选自1-8个碳的烷基链；包含1-13个单元的直链或支链聚环氧乙烷基团；包含1-8个碳的直链或支链烷基；-O-烷基；羧酸；羧酰胺；羧酸酯；烷基-C(O)O-；烷基氨基-C(O)-；二烷基氨基C(O)-；1-3个氨基酸的序列，其中每个氨基酸独立地选自Glu、Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、βAla、Phe、Val和Cit；芳基；和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-、二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
J为选自以下的反应基团：-NH2、N3、硫基、环辛炔、-OH、-CO2H、反式环辛烯、炔基、炔丙基、
其中R32选自Cl、Br、F、甲磺酸酯和甲苯磺酸酯，并且R33选自Cl、Br、I、F、OH、-O-N-丁二酰亚胺基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基，R34为H、Me、四嗪-H和四嗪-Me；
R5选自由-CH2OH、-CH2SH、-CH2Cl、-SCH2Cl、-SCH2F、-SCH2CF3、羟基、-OCH2CN、-OCH2Cl、-OCH2F、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH2CN和组成的组；
R6和R7独立地选自氢和C1-10烷基；
Q可为H、C(O)R8(其中R8为1-8个碳的直链或支链烷基)，或(C＝O)NR4CHnNR4(C＝O)OCH2-(V)n-J(其中n＝1-4并且R4＝H、烷基或支链烷基)，或P(O)OR4；
A1和A2独立地选自H和F；并且
除非另有规定，否则要求保护所有可能的立体异构体。
19.如权利要求18所述的化合物，其中Z选自
其各自可被1-4个独立地选自F、Cl、Br、I、N、S和O的杂原子取代，并且任选地进一步被1-4个C1-3烷基或C1-3全氟烷基取代；
其中每个环结构可含有至少一个选自N、S和O的额外骨架杂原子；并且
其中每个指示与所述式的其余部分的连接点，并且所述连接点中的每一者可经由选自N、S和O的额外杂原子共价键结至所述式的其余部分。
20.如前述权利要求中任一项或权利要求18或19中任一项所述的化合物，其中Z-NR1选自
其各自可被1-4个独立地选自F、Cl、Br、I、N、S和O的杂原子取代，并且任选地进一步被1-4个C1-3烷基或C1-3全氟烷基取代；
其中每个环结构可含有至少一个选自N、S和O的额外骨架杂原子；并且
其中每个指示与所述式的其余部分的连接点，并且所述连接点中的每一者可经由选自N、S和O的额外杂原子共价键结至所述式的其余部分。
21.如权利要求18所述的糖皮质激素激动剂化合物，所述糖皮质激素激动剂化合物具有式(II)结构：
其中
Y选自CH2和O；
E选自CH2和O；
G选自CH和N；
L选自H和F；
R5选自-CH2OH、-SCH2F和
A1和A2独立地选自H和F；
V可选自1-8个碳的烷基链；包含1-13个单元的直链或支链聚环氧乙烷基团；包含1-8个碳的直链或支链烷基；-O-烷基；羧酸；羧酰胺；羧酸酯；烷基-C(O)O-；烷基氨基-C(O)-；二烷基氨基C(O)-；1-3个氨基酸的序列，其中每个氨基酸独立地选自Glu、Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、βAla、Phe、Val和Cit；芳基；和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-、二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
J为选自以下的反应基团：-NH2、N3、硫基、环辛炔、-OH、-CO2H、反式环辛烯、炔基、炔丙基、
其中R32选自Cl、Br、F、甲磺酸酯和甲苯磺酸酯，并且R33选自Cl、Br、I、F、OH、-O-N-丁二酰亚胺基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基，R34为H、Me、四嗪-H和四嗪-Me。
22.如权利要求18所述的糖皮质激素激动剂化合物，所述糖皮质激素激动剂化合物具有式(III)结构：
其中
Y选自CH2和O；
E选自CH2和O；
G选自CH和N；
L选自H和F；
R5选自-CH2OH、-SCH2F和
A1和A2独立地选自H和F；
V可选自1-8个碳的烷基链；包含1-13个单元的直链或支链聚环氧乙烷基团；包含1-8个碳的直链或支链烷基；-O-烷基；羧酸；羧酰胺；羧酸酯；烷基-C(O)O-；烷基氨基-C(O)-；二烷基氨基C(O)-；1-3个氨基酸的序列，其中每个氨基酸独立地选自Glu、Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、βAla、Phe、Val和Cit；芳基；和杂芳基，其中所述芳基和杂芳基可被选自烷基、卤烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-、二烷基氨基C(O)-的官能团取代；
J为选自以下的反应基团：-NH2、N3、硫基、环辛炔、-OH、-CO2H、反式环辛烯、炔基、炔丙基、
其中R32选自Cl、Br、F、甲磺酸酯和甲苯磺酸酯，并且R33选自Cl、Br、I、F、OH、-O-N-丁二酰亚胺基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基，R34为H、Me、四嗪-H和四嗪-Me。
23.如权利要求18、21或22所述的化合物，所述化合物选自：
/>
/>
24.如权利要求18、21或22所述的化合物，其中X或Z可为螺[3.3]庚烷或[1.1.1]双环戊烷并且Y可为CH2或O。
25.一种抗体药物偶联物(ADC)，所述抗体药物偶联物(ADC)包含抗体或其抗原结合片段，优选为结合至由免疫细胞、优选人类免疫细胞表达的抗原的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段连接到至少一种根据前述权利要求中任一项所述或图118A-O所示者的糖皮质激素激动剂化合物或类固醇-接头。
26.如权利要求25所述的ADC，所述ADC选自：
/>
/>
/>
优选地其中n＝2-12、2-10、2-8、2-6或2-4，并且A为结合至由免疫细胞、优选人类免疫细胞表达的抗原的抗体并且更优选为抗人VISTA抗体。
27.一种类固醇-接头有效负载，所述类固醇-接头有效负载包含根据前述权利要求中任一项所述的糖皮质激素激动剂，其中所述接头选自本文中所公开或实施例中所示例的那些或图118A-O和图11中所示的化合物中的任一者。
28.一种类固醇-接头有效负载，所述类固醇-接头有效负载包含根据前述权利要求中任一项所述的糖皮质激素激动剂，所述类固醇-接头有效负载包含至少一个选自PAB和/或氨基酸或肽的可裂解或不可裂解接头，任选地为1-12个氨基酸，进一步任选地为二肽、三肽、四肽、五肽并且进一步任选地为Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、Phe、Cit、Val、Val-Cit、Val-Ala、Val-Gly、Val-Gln、Ala-Val、Cit-Cit、Lys-Val-Cit、Asp-Val-Ala、Ala-Ala-Asn、Asp-Val-Ala、Ala-Val-Cit、Ala-Asn-Val、βAla-Leu-Ala-Leu、Lys-Val-Ala、Val-Leu-Lys、Asp-Val-Cit、Val-Ala-Val和Ala-Ala-Asn；或任选地为GlcA、PAB和Glu-Gly中的至少一者。
29.一种类固醇-接头有效负载，所述类固醇-接头有效负载包含根据前述权利要求中任一项所述的糖皮质激素激动剂化合物，所述类固醇-接头有效负载包含至少一个可裂解接头和/或牺牲型接头，所述接头直接或间接连接到所述糖皮质激素激动剂类固醇化合物。
30.一种抗体药物偶联物(ADC)，所述抗体药物偶联物(ADC)包含抗体或其抗原结合片段，优选为结合至由免疫细胞、优选人类免疫细胞上表达的抗原的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段连接到至少一种根据前述权利要求中任一项所述的糖皮质激素激动剂或类固醇-接头化合物。
31.如权利要求30所述的ADC，所述ADC选自：
/>
/>
/>
/>
优选地其中n＝2-12、2-10、2-8、2-6或2-4，并且A为结合至由免疫细胞、优选人类免疫细胞表达的抗原的抗体并且更优选为抗人VISTA抗体。
32.一种组合物，所述组合物包含至少一种根据前述权利要求中任一项所述的糖皮质激素激动剂化合物或类固醇-接头偶联物或ADC和药学上可接受的载剂。
33.如权利要求32所述的组合物，所述组合物适合于向有需要的受试者体内施用。
34.如权利要求32或权利要求33所述的组合物，所述组合物包含至少一种赋形剂。
35.如权利要求32、33或34所述的组合物，所述组合物包含至少一种稳定剂或缓冲剂。
36.如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物适合于肠胃外施用，任选地通过注射。
37.如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物适合于注射至有需要的受试者，任选地经由静脉内、皮下、肌内、瘤内、结内、鼻内或鞘内。
38.如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物可皮下施用。
39.如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物包含于提供皮下施用的装置中，所述装置选自由注射器、注射装置、输注泵、注射笔、无针装置、自动注射器和皮下贴剂递送系统组成的组。
40.如权利要求39所述的装置，所述装置向患者递送固定剂量的所述糖皮质激素受体激动剂。
41.根据前述权利要求中任一项所述的糖皮质激素激动剂化合物或类固醇-接头偶联物或ADC或含有其的组合物用于治疗、预防或抑制有需要的受试者的炎症或自身免疫的用途。
42.根据前述权利要求中任一项所述的糖皮质激素激动剂化合物或类固醇-接头偶联物或ADC或含有其的组合物，其用于制备用以治疗、预防或抑制有需要的受试者的炎症或自身免疫或过敏反应的药剂。
43.一种治疗和/或预防方法，所述方法包括向有需要的患者施用至少一种根据前述权利要求中任一项所述的糖皮质激素激动剂化合物或类固醇-接头偶联物或ADC或根据前述权利要求中任一项所述的含有其的组合物。
44.如前述权利要求中任一项所述的用途、药剂、组合物或方法，其用于治疗过敏、自身免疫、移植、基因疗法、炎症、GVHD或败血症，或用以治疗或预防人类受试者中与前述疾患中的任一者相关的炎症性、自身免疫性或过敏性副作用。
45.如前述权利要求中任一项所述的用途、药剂、组合物或方法，其用于急性使用。
46.如前述权利要求中任一项所述的用途、药剂、组合物或方法，其用于慢性使用。
47.如前述权利要求中任一项所述的用途、药剂、组合物或方法，其用于维持疗法。
48.如前述权利要求中任一项所述的用途、药剂、组合物或方法，其用于治疗或预防急性或慢性炎症和与其相关的自身免疫性和炎症性适应症，其中所述疾患任选地包括获得性再生障碍性贫血+、获得性血友病+、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)+、急性出血性白质脑炎(AHLE)/赫斯特氏病+、原发性无丙种球蛋白血症+、斑秃+、强直性脊柱炎(AS)、抗NMDA受体脑炎+、抗磷脂综合征(APS)+、动脉硬化、自闭症谱系障碍(ASD)、自身免疫性艾迪森氏病(AAD)+、自身免疫性自主神经功能障碍/自身免疫性自主神经节病(AAG)、自身免疫性脑炎+、自身免疫性胃炎、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)+、自身免疫性肝炎(AIH)+、自身免疫性高脂血症、自身免疫性垂体炎/淋巴细胞性垂体炎+、自身免疫性内耳病(AIED)+、自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)+、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎+、自身免疫性睾丸炎+、自身免疫性胰腺炎(AIP)/免疫球蛋白G4相关疾病(IgG4-RD)+、I型、II型和III型自身免疫性多腺体综合征+、自身免疫性黄体酮皮炎+、自身免疫性突发性感觉神经性听力损失(SNHL)弛缓不能、艾迪森氏病、成人斯蒂尔病、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性自主神经功能障碍、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性荨麻疹、轴突与神经元神经病(AMAN)、巴洛病、白塞病、良性粘膜类天疱疮、大疱性类天疱疮、卡斯特莱曼病(CD)、乳糜泻、恰加斯病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、查格-史特劳斯综合征(CSS)或嗜酸性肉芽肿病(EGPA)、瘢痕性类天疱疮、科根氏综合征、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎、CREST综合征、1型糖尿病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克病(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德莱斯勒氏综合征、子宫内膜异位症、嗜酸性食管炎(EoE)、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、原发性混合冷球蛋白血症、伊文氏综合征、纤维肌痛、纤维化肺泡炎、纤维化肺泡炎、巨细胞心肌炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征、肉芽肿性多血管炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、亨诺-许兰紫癜(HSP)、妊娠疱疹或妊娠期类天疱疮(PG)、化脓性汗腺炎(HS)(反常性痤疮)、低丙种球蛋白血症、IgA肾病、IgG4相关硬化性疾病、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、包涵体肌炎(IBM)、间质性膀胱炎(IC)、青少年关节炎、青少年糖尿病(1型糖尿病)、青少年肌炎(JM)、川崎病、兰伯特-伊顿综合征、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、木样结膜炎、线状IgA疾病(LAD)、狼疮(包括肾炎和皮肤型)、慢性莱姆病、梅尼埃病、显微镜下多血管炎(MPA)、混合性结缔组织疾病(MCTD)、莫伦氏溃疡、穆哈-哈伯曼病、多灶性运动神经病(MMN)或MMNCB、多发性硬化、重症肌无力、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体紊乱、肌炎、嗜睡症、新生儿狼疮、视神经脊髓炎、嗜中性白细胞减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、视阵挛-肌阵挛综合征(OMS)、回纹型风湿病(PR)、PANDAS、副肿瘤性小脑变性(PCD)、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、帕罗综合征、睫状体扁平部炎(外周葡萄膜炎)、帕桑-特纳综合征、天疱疮、外周神经病、静脉周脑脊髓炎、恶性贫血(PA)、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I型、II型、III型多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、黄体酮皮炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、纯红细胞再生障碍性贫血(PRCA)、坏疽性脓皮病、雷诺氏现象、反应性关节炎、反射性交感神经营养不良、复发性多软骨炎、不宁腿综合征(RLS)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、类肉瘤病、施密特综合征、巩膜炎、硬皮病、休格伦氏综合征、精子与睾丸自身免疫、僵人综合征(SPS)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克氏综合征、交感性眼炎(SO)、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、甲状腺眼病(TED)、托洛萨-亨特综合征(THS)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、未分化结缔组织疾病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、伏格特-小柳-原田病和其他。
49.如前述权利要求中任一项所述的用途、药剂、组合物或方法，其用于治疗或预防急性或慢性炎症和与其相关的自身免疫性和炎症性和过敏性适应症或副作用，其中所述疾患任选地包括严重哮喘、巨细胞动脉炎、ANKA血管炎和IBD(结肠炎和克罗恩病)。
50.如前述权利要求中任一项所述的用途、药剂、组合物或方法，其用于治疗或预防选自以下的疾患：类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、成人克罗恩病、小儿克罗恩病、溃疡性结肠炎、斑块状牛皮癣、化脓性汗腺炎、葡萄膜炎、白塞病、脊柱关节病或牛皮癣。
51.如前述权利要求中任一项所述的用途、药剂、组合物或方法，其用于治疗或预防包括以下一者或多者的患者：
(i)慢性、急性、阵发性过敏性、炎症性或炎症性疾患，例如慢性、急性、阵发性、缓解/复发性；
(ii)主要仅用高剂量的类固醇可有效治疗的疾患，任选地为风湿性多肌痛和/或巨细胞动脉炎，所述患者任选地已接受治疗或正经历高类固醇剂量的治疗；
(iii)伴有限制类固醇使用的合并症的疾患，任选地为糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、病态肥胖、无血管性坏死/骨坏死(AVN)、青光眼、类固醇诱发的高血压、严重皮肤脆弱和/或骨关节炎；
(iv)其中安全的长期治疗剂可用，但其中需要用高剂量的类固醇诱导数月的疾患，任选地为AAV、多肌炎、皮肌炎、狼疮、炎症性肺病、自身免疫性肝炎、炎症性肠病、免疫性血小板减少症、自身免疫性溶血性贫血、痛风患者，其中在治疗上需要用高剂量的类固醇诱导数月；
(v)需要短期/长期治疗，任选地需要不确定的治疗或持续时间和/或不存在类固醇施用的有效替代方案的皮肤疾患，任选地为史蒂文斯-约翰逊病、其他严重药疹疾患、涉及广泛接触性皮炎的疾患、其他严重免疫相关皮肤病疾患如PG、LCV、红皮病等；
(vi)用高剂量的皮质类固醇治疗突发/复发的疾患，任选地为COPD、哮喘、狼疮、痛风、假痛风；
(vii)免疫相关的神经疾病，例如小纤维神经病、MS(亚组)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、重症肌无力等；
(viii)血液/肿瘤适应症，任选地其中高剂量的类固醇将潜在地在治疗上有需要或有益；
(ix)眼科疾患，任选地为葡萄膜炎、虹膜炎、巩膜炎等；
(x)与永久或极长期肾上腺机能不足或继发性肾上腺机能不足相关的疾患，任选地为医源性艾迪森危象；
(xi)常用长期、低剂量类固醇治疗的疾患，任选地为狼疮、RA、psA、血管炎等。
52.如前述权利要求中任一项所述的用途、药剂、组合物或方法，其用于治疗或预防在类固醇治疗中有毒性风险的特殊类别的患者中的患者，例如怀孕/哺乳妇女、儿科患者，任选地为患有生长障碍或白内障的那些患者，其中所述患者正用另一种活性剂进一步治疗。
53.如前述权利要求中任一项所述的用途或方法，其中所述患者正用免疫调节性抗体或融合蛋白进一步治疗，所述免疫调节性抗体或融合蛋白选自靶向CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA中的一者或多者的免疫抑制性抗体或融合蛋白和/或靶向CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS中的一者或多者的激动性抗体或融合蛋白。
54.根据前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含特异性结合至人类T细胞活化V-结构域Ig抑制因子(人类VISTA)(“A”)的抗原结合区，其中当向有需要的受试者施用时，所述ADC优先递送至表达VISTA的免疫细胞，任选地为单核细胞、骨髓细胞、T细胞、Treg、NK细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和内皮细胞中的一者或多者，并且引起抗炎剂功能性内化至所述免疫细胞中的一者或多者中。
55.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含在生理pH(约7.5)下优先结合至VISTA表达细胞的抗人VISTA抗体或抗体片段；所述ADC在人类VISTA敲入啮齿动物中任选地具有至多70小时的pK。
56.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，所述ADC在生理pH下结合至VISTA表达细胞，并且在食蟹猴或人类中在生理pH下具有至多3.5±0.5天、更典型地至多48小时、至多24小时、至多18小时或至多12小时的pK。
57.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或使用方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，所述ADC在食蟹猴或人类中在生理pH下具有至多2.8或2.3或1.5天或1天或12小时或8小时±0.5天的pK。
58.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或使用方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，所述ADC在人类VISTA啮齿动物中在生理pH下具有至多6-12小时的pK。
59.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，所述ADC包含接头，在所述ADC内化至表达VISTA的免疫细胞，任选地T细胞、Treg、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、骨髓细胞、树突状细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和内皮细胞中的一者或多者中之后，所述接头裂解，从而在所述免疫细胞中释放治疗有效量的抗炎剂，其中所述抗炎剂引发抗炎活性。
60.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗VISTA抗体或抗原结合片段在灵长类动物、任选地食蟹猴中在生理pH(约pH 7.5)下具有约2.3天的体内血清半衰期。
61.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述抗VISTA抗体或抗原结合片段在人类VISTA敲入啮齿动物中在生理pH(约pH 7.5)下在血清中具有不超过70小时、不超过60小时、不超过50小时、不超过40小时、不超过30小时、不超过24小时、不超过22-24小时、不超过20-22小时、不超过18-20小时、不超过16-18小时、不超过14-16小时、不超过12-14小时、不超过10-12小时、不超过8-10小时、不超过6-8小时、不超过4-6小时、不超过2-4小时、不超过1-2小时、不超过0.5至1.0小时或不超过0.1-0.5小时的体内血清半衰期。
62.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中在人类VISTA敲入啮齿动物或人类或非人类灵长类动物、任选地食蟹猴中当在体内使用时所述ADC的PD/PK比率为至少2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、28:1或更高。
63.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中在啮齿动物中的任一者中或在人类或非人类灵长类动物、任选地食蟹猴中所述ADC的PD为至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或28天、2-3周、1个月、2个月或更长时间。
64.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述抗人VISTA抗体包含具有受损FcR结合或完整FcR结合的Fc区。
65.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗体或抗体片段，任选地抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含具有受损FcR结合或完整FcR结合的人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区。
66.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗体或抗体片段，任选地抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含具有受损FcR结合的人类IgG1 Fc区。
67.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗体或抗体片段，任选地抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含人类或非人类灵长类动物恒定区或Fc区，所述区经修饰以削弱或消除与至少2个原生人类Fcγ受体的结合。
68.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗体或抗体片段，任选地抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含人类或非人类灵长类动物恒定区或Fc区，所述区经修饰以削弱或消除与以下FcR中的任一者、两者、三者、四者或全部五者的结合：hFcγRI(CD64)、FcyRIIA或hFcyRIIB(CD32或CD32A)和FcγRlllA(CD16A)或FcγRlllB(CD16B)。
69.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗体或抗体片段，任选地抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含人类IgG2κ主链，任选地在Fc区中具有V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S静默突变。
70.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗体或抗体片段，任选地抗人VISTA抗体或抗体片段，任选地人类IgG1/κ主链在Fc区中具有L234A/L235A静默突变并且任选地具有削弱补体(C1Q)结合的突变。
71.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗体或抗体片段，任选地抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含人类IgG1/κ主链，任选地在Fc区中具有L234A/L235A静默突变和E269R和E233A突变。
72.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述抗VISTA抗体或抗原结合片段与表达VISTA的免疫细胞的结合不会直接激动或拮抗VISTA介导的对免疫的作用。
73.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗体或抗体片段，任选地抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含其中内源FcR结合未受损的人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区。
74.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗体或抗体片段，任选地抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含原生(未经修饰)的人类IgG2 Fc区。
75.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗体或抗体片段，任选地抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含在24℃或37℃下通过表面等离子体共振(SPR)确定的在0.0001nM至10.0nM、0.001至1.0nM或0.01至0.7或更小的范围内的KD。
76.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗体或抗体片段，任选地抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含在24℃或37℃下通过表面等离子体共振(SPR)确定的0.13至0.64nM的KD。
77.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC任选地包含抗体或抗体片段，任选地抗人VISTA抗体或抗体片段，其中药物抗体比率在1:1-12:1的范围内。
78.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC任选地包含抗体或抗体片段，任选地抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述药物抗体比率在2-12:1、2-8:1、4-8:1或6-8:1的范围内。
79.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC任选地包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述药物抗体比率为约8:1(n＝8)或约4:1(n＝4)。
80.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗体或抗体片段，任选地抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段将内化单核细胞、骨髓细胞、T细胞、Treg、CD4 T细胞、CD8 T细胞、巨噬细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、B细胞和嗜中性粒细胞中的一者或多者。
81.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗体或抗体片段，任选地抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段不会明显内化B细胞。
82.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗体或抗体片段，任选地抗人VISTA抗体或抗体片段，当向有需要的受试者施用时，所述ADC与以裸(非偶联)形式施用的相同剂量的抗炎剂相比促进抗炎剂的功效和/或减少与抗炎剂相关的不良副作用如毒性。
83.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗体或抗体片段，任选地抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述糖皮质激素任选地经由链间二硫键偶联至所述抗体或抗原结合片段。
84.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗体或抗体片段，任选地抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含酯酶敏感性接头。
85.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗体或抗体片段，任选地抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述可裂解接头易发生酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解中的一者或多者。
86.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗体或抗体片段，任选地抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述ADC中包含的所述抗原结合片段包含Fab、F(ab')2或scFv抗体片段。
87.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所含的所述抗VISTA抗体或抗体片段为包含与具有图8、图10或图12中的序列的抗体相同的CDR的抗体或任选地选自以下的抗体：
(i)包含SEQ ID NO:100、101和102的VH CDR和SEQ ID NO:103、104和105的VLCDR；
(ii)包含SEQ ID NO:110、111和112的VH CDR和SEQ ID NO:113、114和115的VLCDR；
(iii)包含SEQ ID NO:120、121和122的VH CDR和SEQ ID NO:123、124和125的VLCDR；
(iv)包含SEQ ID NO:130、131和132的VH CDR和SEQ ID NO:133、134和135的VLCDR；
(v)包含SEQ ID NO:140、141和142的VH CDR和SEQ ID NO:143、144和145的VLCDR；
(vi)包含SEQ ID NO:150、151和152的VH CDR和SEQ ID NO:153、154和155的VLCDR；
(vii)包含SEQ ID NO:160、161和162的VH CDR和SEQ ID NO:163、164和165的VLCDR；
(viii)包含SEQ ID NO:170、171和172的VH CDR和SEQ ID NO:173、174和175的VL CDR；
(ix)包含SEQ ID NO:180、181和182的VH CDR和SEQ ID NO:183、184和185的VLCDR；
(x)包含SEQ ID NO:190、191和192的VH CDR和SEQ ID NO:193、194和195的VLCDR；
(xi)包含SEQ ID NO:200、201和202的VH CDR和SEQ ID NO:203、204和205的VLCDR；
(xii)包含SEQ ID NO:210、211和212的VH CDR和SEQ ID NO:213、214和215的VLCDR；
(xiii)包含SEQ ID NO:220、221和222的VH CDR和SEQ ID NO:223、224和225的VL CDR；
(xiv)包含SEQ ID NO:230、231和232的VH CDR和SEQ ID NO:233、234和235的VL CDR；
(xv)包含SEQ ID NO:240、241和242的VH CDR和SEQ ID NO:243、244和245的VLCDR；
(xvi)包含SEQ ID NO:250、251和252的VH CDR和SEQ ID NO:253、254和255的VL CDR；
(xvii)包含SEQ ID NO:260、261和262的VH CDR和SEQ ID NO:263、264和265的VL CDR；
(xviii)包含SEQ ID NO:270、271和272的VH CDR和SEQ ID NO:273、274和275的VL CDR；
(xix)包含SEQ ID NO:280、281和282的VH CDR和SEQ ID NO:283、284和285的VL CDR；
(xx)包含SEQ ID NO:290、291和292的VH CDR和SEQ ID NO:293、294和295的VLCDR；
(xxi)包含SEQ ID NO:300、301和302的VH CDR和SEQ ID NO:303、304和305的VL CDR；
(xxii)包含SEQ ID NO:310、311和312的VH CDR和SEQ ID NO:313、314和315的VL CDR；
(xxiii)包含SEQ ID NO:320、321和322的VH CDR和SEQ ID NO:323、324和325的VL CDR；
(xxiv)包含SEQ ID NO:330、331和332的VH CDR和SEQ ID NO:333、334和335的VL CDR；
(xxv)包含SEQ ID NO:340、341和342的VH CDR和SEQ ID NO:343、344和345的VL CDR；
(xxvi)包含SEQ ID NO:350、351和352的VH CDR和SEQ ID NO:353、354和355的VL CDR；
(xxvii)包含SEQ ID NO:360、361和362的VH CDR和SEQ ID NO:363、364和365的VL CDR；
(xxviii)包含SEQ ID NO:370、371和372的VH CDR和SEQ ID NO:373、374和375的VLCDR；
(xxix)包含SEQ ID NO:380、381和382的VH CDR和SEQ ID NO:383、384和385的VL CDR；
(xxx)包含SEQ ID NO:390、391和392的VH CDR和SEQ ID NO:393、394和395的VL CDR；
(xxxi)包含SEQ ID NO:400、401和402的VH CDR和SEQ ID NO:403、404和405的VL CDR；
(xxxii)包含SEQ ID NO:410、411和412的VH CDR和SEQ ID NO:413、414和415的VL CDR；
(xxxiii)包含SEQ ID NO:420、421和422的VH CDR和SEQ ID NO:423、424和425的VLCDR；
(xxxiv)包含SEQ ID NO:430、431和432的VH CDR和SEQ ID NO:433、434和435的VL CDR；
(xxxv)包含SEQ ID NO:440、441和442的VH CDR和SEQ ID NO:443、444和445的VL CDR；
(xxxvi)包含SEQ ID NO:450、451和452的VH CDR和SEQ ID NO:453、454和455的VL CDR；
(xxxvii)包含SEQ ID NO:460、461和462的VH CDR和SEQ ID NO:463、464和465的VLCDR；
(xxxviii)包含SEQ ID NO:470、471和472的VH CDR和SEQ ID NO:473、474和475的VLCDR；
(xxxix)包含SEQ ID NO:480、481和482的VH CDR和SEQ ID NO:483、484和485的VL CDR；
(xl)包含SEQ ID NO:490、491和492的VH CDR和SEQ ID NO:493、494和495的VL CDR多肽；
(xli)包含SEQ ID NO:500、501和502的VH CDR和SEQ ID NO:503、504和505的VL CDR多肽；
(xlii)包含SEQ ID NO:510、511和512的VH CDR和SEQ ID NO:513、514和515的VL CDR多肽；
(xliii)包含SEQ ID NO:520、521和522的VH CDR和SEQ ID NO:523、524和525的VL CDR多肽；
(xliv)包含SEQ ID NO:530、531和532的VH CDR和SEQ ID NO:533、534和535的VL CDR多肽；
(xlv)包含SEQ ID NO:540、541和542的VH CDR和SEQ ID NO:543、544和545的VL CDR多肽；
(xlvi)包含SEQ ID NO:550、551和552的VH CDR和SEQ ID NO:553、554和555的VL CDR多肽；
(xlvii)包含SEQ ID NO:560、561和562的VH CDR和SEQ ID NO:563、564和565的VL CDR；
(xlviii)包含SEQ ID NO:570、571和572的VH CDR和SEQ ID NO:573、574和575的VLCDR；
(xlix)包含SEQ ID NO:580、581和582的VH CDR和SEQ ID NO:583、584和585的VL CDR；
(l)包含SEQ ID NO:590、591和592的VH CDR和SEQ ID NO:593、594和595的VLCDR；
(li)包含SEQ ID NO:600、601和602的VH CDR和SEQ ID NO:603、604和605的VLCDR；
(lii)包含SEQ ID NO:610、611和612的VH CDR和SEQ ID NO:613、614和615的VLCDR；
(liii)包含SEQ ID NO:620、621和622的VH CDR和SEQ ID NO:623、624和625的VL CDR；
(liv)包含SEQ ID NO:630、631和632的VH CDR和SEQ ID NO:633、634和635的VLCDR；
(lv)包含SEQ ID NO:640、641和642的VH CDR和SEQ ID NO:643、644和645的VLCDR；
(lvi)包含SEQ ID NO:650、651和652的VH CDR和SEQ ID NO:653、654和655的VLCDR；
(lvii)包含SEQ ID NO:660、661和662的VH CDR和SEQ ID NO:663、664和665的VL CDR；
(lviii)包含SEQ ID NO:670、671和672的VH CDR和SEQ ID NO:673、674和675的VL CDR；
(lix)包含SEQ ID NO:680、681和682的VH CDR和SEQ ID NO:683、684和685的VLCDR；
(lx)包含SEQ ID NO:690、691和692的VH CDR和SEQ ID NO:693、694和695的VLCDR；
(lxi)包含SEQ ID NO:700、701和702的VH CDR和SEQ ID NO:703、704和705的VLCDR；
(lxii)包含SEQ ID NO:710、711和712的VH CDR和SEQ ID NO:713、714和715的VL CDR；
(lxiii)包含SEQ ID NO:720、721和722的VH CDR和SEQ ID NO:723、724和725的VL CDR；
(lxiv)包含SEQ ID NO:730、731和732的VH CDR和SEQ ID NO:733、734和735的VL CDR；
(lxv)包含SEQ ID NO:740、741和742的VH CDR和SEQ ID NO:743、744和745的VL CDR；
(lxvi)包含SEQ ID NO:750、751和752的VH CDR和SEQ ID NO:753、754和755的VL CDR；
(lxvii)包含SEQ ID NO:760、761和762的VH CDR和SEQ ID NO:763、764和765的VL CDR；
(lxviii)包含SEQ ID NO:770、771和772的VH CDR和SEQ ID NO:773、774和775的VLCDR；
(lxix)包含SEQ ID NO:780、781和782的VH CDR和SEQ ID NO:783、784和785的VL CDR；
(lxx)包含SEQ ID NO:790、791和792的VH CDR和SEQ ID NO:793、794和795的VL CDR；
(lxxi)包含SEQ ID NO:800、801和802的VH CDR和SEQ ID NO:803、804和805的VL CDR；
(lxxii)包含SEQ ID NO:810、811和812的VH CDR和SEQ ID NO:813、814和815的VL CDR。
88.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)，其中所述ADC包含抗VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含与VSTB92、VSTB56、VSTB95、VSTB103和VSTB66中的任一者相同的CDR。
89.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)，其中所述ADC包含抗VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含分别与包含以下VH多肽和VL多肽的抗体的那些具有至少90％、95％或100％序列同一性的VH多肽和VL多肽并且进一步所述CDR未经修饰：
(i)包含SEQ ID NO:106同一性的VH多肽和SEQ ID NO:108的VL多肽的抗体；
(ii)包含SEQ ID NO:116的VH多肽和SEQ ID NO:118的VL多肽的抗体；
(iii)包含SEQ ID NO:126的VH多肽和SEQ ID NO:128的VL多肽的抗体；
(iv)包含SEQ ID NO:136的VH多肽和SEQ ID NO:138的VL多肽的抗体；
(v)包含SEQ ID NO:146的VH多肽和SEQ ID NO:148的VL多肽的抗体；
(vi)包含SEQ ID NO:156的VH多肽和SEQ ID NO:158的VL多肽的抗体；
(vii)包含SEQ ID NO:166的VH多肽和SEQ ID NO:168的VL多肽的抗体；
(viii)包含SEQ ID NO:176的VH多肽和SEQ ID NO:178的VL多肽的抗体；
(ix)包含SEQ ID NO:186的VH多肽和SEQ ID NO:188的VL多肽的抗体；
(x)包含SEQ ID NO:196的VH多肽和SEQ ID NO:198的VL多肽的抗体；
(xi)包含SEQ ID NO:206的VH多肽和SEQ ID NO:208的VL多肽的抗体；
(xii)包含SEQ ID NO:216的VH多肽和SEQ ID NO:218的VL多肽的抗体；
(xiii)包含SEQ ID NO:226的VH多肽和SEQ ID NO:228的VL多肽的抗体；
(xiv)包含SEQ ID NO:236的VH多肽和SEQ ID NO:238的VL多肽的抗体；
(xv)包含SEQ ID NO:246的VH多肽和SEQ ID NO:248的VL多肽的抗体；
(xvi)包含SEQ ID NO:256的VH多肽和SEQ ID NO:258的VL多肽的抗体；
(xvii)包含SEQ ID NO:266的VH多肽和SEQ ID NO:268的VL多肽的抗体；(xviii)包含SEQ ID NO:276的VH多肽和SEQ ID NO:278的VL多肽的抗体；
(xix)包含SEQ ID NO:286的VH多肽和SEQ ID NO:288的VL多肽的抗体；
(xx)包含SEQ ID NO:296的VH多肽和SEQ ID NO:298的VL多肽的抗体；
(xxi)包含SEQ ID NO:306的VH多肽和SEQ ID NO:308的VL多肽的抗体；
(xxii)包含SEQ ID NO:316的VH多肽和SEQ ID NO:318的VL多肽的抗体；
(xxiii)包含SEQ ID NO:326的VH多肽和SEQ ID NO:328的VL多肽的抗体；
(xxiv)包含SEQ ID NO:336的VH多肽和SEQ ID NO:338的VL多肽的抗体；
(xxv)包含SEQ ID NO:346的VH多肽和SEQ ID NO:348的VL多肽的抗体；
(xxvi)包含SEQ ID NO:356的VH多肽和SEQ ID NO:358的VL多肽的抗体；
(xxvii)包含SEQ ID NO:366的VH多肽和SEQ ID NO:368的VL多肽的抗体；
(xxviii)包含SEQ ID NO:376的VH多肽和SEQ ID NO:378的VL多肽的抗体；
(xxix)包含SEQ ID NO:386的VH多肽和SEQ ID NO:388的VL多肽的抗体；
(xxx)包含SEQ ID NO:396的VH多肽和SEQ ID NO:398的VL多肽的抗体；
(xxxi)包含SEQ ID NO:406的VH多肽和SEQ ID NO:408的VL多肽的抗体；
(xxxii)包含SEQ ID NO:416的VH多肽和SEQ ID NO:418的VL多肽的抗体；
(xxxiii)包含SEQ ID NO:426的VH多肽和SEQ ID NO:428的VL多肽的抗体；
(xxxiv)包含SEQ ID NO:436的VH多肽和SEQ ID NO:438的VL多肽的抗体；
(xxxv)包含SEQ ID NO:446的VH多肽和SEQ ID NO:448的VL多肽的抗体；
(xxxvi)包含SEQ ID NO:456的VH多肽和SEQ ID NO:458的VL多肽的抗体；
(xxxvii)包含SEQ ID NO:466的VH多肽和SEQ ID NO:468的VL多肽的抗体；
(xxxviii)包含SEQ ID NO:476的VH多肽和SEQ ID NO:478的VL多肽的抗体；
(xxxix)包含SEQ ID NO:486的VH多肽和SEQ ID NO:488的VL多肽的抗体；
(xl)包含SEQ ID NO:496的VH多肽和SEQ ID NO:498的VL多肽的抗体；
(xli)包含SEQ ID NO:506的VH多肽和SEQ ID NO:508的VL多肽的抗体；
(xlii)包含SEQ ID NO:516的VH多肽和SEQ ID NO:518的VL多肽的抗体；
(xliii)包含SEQ ID NO:526的VH多肽和SEQ ID NO:528的VL多肽的抗体；
(xliv)包含SEQ ID NO:536的VH多肽和SEQ ID NO:533、534和535的VL多肽的抗体；(xlv)包含SEQ ID NO:546的VH多肽和SEQ ID NO:548的VL多肽的抗体；
(xlvi)包含SEQ ID NO:556的VH多肽和SEQ ID NO:558的VL多肽的抗体；
(xlvii)包含SEQ ID NO:566的VH多肽和SEQ ID NO:568的VL多肽的抗体；
(xlviii)包含SEQ ID NO:576的VH多肽和SEQ ID NO:578的VL多肽的抗体；
(xlix)包含SEQ ID NO:586的VH多肽和SEQ ID NO:588的VL多肽的抗体；
(l)包含SEQ ID NO:596的VH多肽和SEQ ID NO:598的VL多肽的抗体；
(li)包含SEQ ID NO:606的VH多肽和SEQ ID NO:608的VL多肽的抗体；
(lii)包含SEQ ID NO:616的VH多肽和SEQ ID NO:618的VL多肽的抗体；
(liii)包含SEQ ID NO:626的VH多肽和SEQ ID NO:628的VL多肽的抗体；
(liv)包含SEQ ID NO:636的VH多肽和SEQ ID NO:638的VL多肽的抗体；
(lv)包含SEQ ID NO:646的VH多肽和SEQ ID NO:648的VL多肽的抗体；
(lvi)包含SEQ ID NO:656的VH多肽和SEQ ID NO:658的VL多肽的抗体；
(lvii)包含SEQ ID NO:666的VH多肽和SEQ ID NO:668的VL多肽的抗体；
(lviii)包含SEQ ID NO:676的VH多肽和SEQ ID NO:678的VL多肽的抗体；
(lix)包含SEQ ID NO:686的VH多肽和SEQ ID NO:688的VL多肽的抗体；
(lx)包含SEQ ID NO:696的VH多肽和SEQ ID NO:698的VL多肽的抗体；
(lxi)包含SEQ ID NO:706的VH多肽和SEQ ID NO:708的VL多肽的抗体；
(lxii)包含SEQ ID NO:716的VH多肽和SEQ ID NO:718的VL多肽的抗体；
(lxiii)包含SEQ ID NO:726的VH多肽和SEQ ID NO:728的VL多肽的抗体；
(lxiv)包含SEQ ID NO:736的VH多肽和SEQ ID NO:738的VL多肽的抗体；
(lxv)包含SEQ ID NO:746的VH多肽和SEQ ID NO:748的VL多肽的抗体；
(lxvi)包含SEQ ID NO:756的VH多肽和SEQ ID NO:758的VL多肽的抗体；
(lxvii)包含SEQ ID NO:766的VH多肽和SEQ ID NO:768的VL多肽的抗体；
(lxviii)包含SEQ ID NO:776的VH多肽和SEQ ID NO:778的VL多肽的抗体；
(lxix)包含SEQ ID NO:786的VH多肽和SEQ ID NO:788的VL多肽的抗体；
(lxx)包含SEQ ID NO:796的VH多肽和SEQ ID NO:798的VL多肽的抗体；
(lxxi)包含SEQ ID NO:806的VH多肽和SEQ ID NO:808的VL多肽的抗体；和
(lxxii)包含SEQ ID NO:816的VH多肽和SEQ ID NO:818的VL多肽的抗体。
90.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物、方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述抗VISTA抗体或抗体片段包含与VSTB92、VSTB56、VSTB95、VSTB103和VSTB66中的一者相同的可变区。
91.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途、药剂、组合物或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，任选地具有图8、图10或图12中的一者的CDR或可变序列，其中所述抗VISTA抗体或抗体片段包含在Fc区中具有V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S静默突变的人类IgG2κ主链。
92.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，任选地具有图8、图10或图12中的一者的CDR或可变序列，其中所述抗VISTA抗体或抗体片段包含在Fc区中具有L234A/L235A静默突变的人类IgG1/κ主链。
93.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述糖皮质激素激动剂或接头偶联物经由其链间二硫键偶联至抗体或抗体片段，任选地抗人VISTA抗体或抗体片段。
94.一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的至少一种如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)或类固醇激动剂或类固醇-接头和药学上可接受的载剂。
95.如权利要求94所述的组合物，所述组合物可经由注射途径，任选地静脉内、肌内、鞘内或皮下施用。
96.如权利要求94或95所述的组合物，所述组合物可皮下施用。
97.一种装置，所述装置包含如前述权利要求中任一项所述的糖皮质激素激动剂、接头偶联物、ADC、组合物或药剂并且提供皮下施用，其选自由注射器、注射装置、输注泵、注射笔、无针装置、自动注射器和皮下贴剂递送系统组成的组。
98.如权利要求97所述的装置，所述装置向患者递送固定剂量的所述糖皮质激素受体激动剂或其功能衍生物。
99.一种包括如权利要求97或98所述的装置的试剂盒，所述试剂盒还包括告知患者如何施用其中包含的ADC组合物和给药方案的说明书。
100.一种治疗和/或预防方法，所述方法包括向有需要的患者施用至少一种根据前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)或类固醇或组合物，其中所述组合物可在根据前述权利要求中任一项所述的装置中。
101.如权利要求100所述的方法，所述方法用于治疗过敏、自身免疫、移植、基因疗法、炎症、GVHD或败血症，或用以治疗或预防人类受试者中与前述疾患中的任一者相关的炎症性、自身免疫性或过敏性副作用。
102.如权利要求100或101所述的方法，其中所述炎症与癌症或感染、任选地病毒或细菌感染相关。
103.如权利要求100或101所述的方法，其中所述患者包含选自以下的疾患：类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、成人克罗恩病、小儿克罗恩病、溃疡性结肠炎、斑块状牛皮癣、化脓性汗腺炎、葡萄膜炎、白塞病、脊柱关节病或牛皮癣。
104.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者包括以下一者或多者：
(i)慢性、急性、阵发性过敏性、炎症性或炎症性疾患，例如慢性、急性、阵发性、缓解/复发性；
(ii)主要仅用高剂量的类固醇可有效治疗的疾患，任选地为风湿性多肌痛和/或巨细胞动脉炎，所述患者任选地已接受治疗或正经历高类固醇剂量的治疗；
(iii)伴有限制类固醇使用的合并症的疾患，任选地为糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、病态肥胖、无血管性坏死/骨坏死(AVN)、青光眼、类固醇诱发的高血压、严重皮肤脆弱和/或骨关节炎；
(iv)其中安全的长期治疗剂可用，但其中需要用高剂量的类固醇诱导数月的疾患，任选地为AAV、多肌炎、皮肌炎、狼疮、炎症性肺病、自身免疫性肝炎、炎症性肠病、免疫性血小板减少症、自身免疫性溶血性贫血、痛风患者，其中在治疗上需要用高剂量的类固醇诱导数月；
(v)需要短期/长期治疗，任选地需要不确定的治疗或持续时间和/或不存在类固醇施用的有效替代方案的皮肤疾患，任选地为史蒂文斯-约翰逊病、其他严重药疹疾患、涉及广泛接触性皮炎的疾患、其他严重免疫相关皮肤病疾患如PG、LCV、红皮病等；
(vi)用高剂量的皮质类固醇治疗突发/复发的疾患，任选地为COPD、哮喘、狼疮、痛风、假痛风；
(vii)免疫相关的神经疾病，例如小纤维神经病、MS(亚组)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、重症肌无力等；
(viii)血液/肿瘤适应症，任选地其中高剂量的类固醇将潜在地在治疗上有需要或有益；
(ix)眼科疾患，任选地为葡萄膜炎、虹膜炎、巩膜炎等；
(x)与永久或极长期肾上腺机能不足或继发性肾上腺机能不足相关的疾患，任选地为医源性艾迪森危象；
(xi)常用长期、低剂量类固醇治疗的疾患，任选地为狼疮、RA、psA、血管炎等；和
(xii)特殊类别的患者，例如怀孕/哺乳妇女、儿科患者，任选地为患有生长障碍或白内障的那些患者。
105.如前述权利要求中任一项所述的方法、药剂或用途，其中所述患者正用另一种活性剂进一步治疗。
106.如前述权利要求中任一项所述的方法、药剂或用途，其中所述患者正用免疫调节性抗体或融合蛋白进一步治疗，所述免疫调节性抗体或融合蛋白选自靶向CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA中的一者或多者的免疫抑制性抗体或融合蛋白和/或靶向CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS中的一者或多者的激动性抗体或融合蛋白。
107.一种根据前述权利要求中任一项所述的ADC或类固醇的离体用途，其中使来自患者或供体的免疫细胞与根据前述权利要求中任一项所述的ADC或类固醇接触，接着输注至有需要的患者，例如患有前述权利要求中鉴定的疾患中的一者或多者的患者。
108.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述接头为带正电荷、负电荷或中性电荷的可裂解肽，任选地为酯酶可裂解的。
109.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述药物抗体比率在1-12:1或1-10:1的范围内。
110.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述药物抗体比率在2-8:1、4-8:1或6-8:1的范围内。
111.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述药物抗体比率为4:1(n＝4)、6:1(n＝6)、8:1(n＝8)、10:1(n＝10)、12:1(n＝12)，或n为12或更大并且在12-50的范围内。
112.如前述权利要求中任一项所述的ADC，所述ADC内化活化或非活化的单核细胞、骨髓细胞、B细胞、NK细胞、T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、Treg、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞中的一者或多者。
113.如前述权利要求中任一项所述的ADC，所述ADC不会明显内化活化或非活化的B细胞。
114.如前述权利要求中任一项所述的ADC，当向有需要的受试者施用时，所述ADC与以裸(非偶联)形式施用的相同剂量的抗炎剂相比促进所述糖皮质激素受体激动剂的功效和/或减少与所述糖皮质激素受体激动剂相关的不良副作用。
115.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)，其中所述糖皮质激素受体激动剂经由链间二硫键偶联至所述抗体或抗原结合片段。
116.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)，所述抗体药物偶联物(ADC)包含酯酶敏感性接头。
117.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)，其中所述可裂解接头易发生酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解中的一者或多者。
118.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)，所述ADC包含不可裂解接头，所述不可裂解接头基本上对酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解中的一者或多者具有抗性。
119.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物偶联物(ADC)，其中所述ADC中包含的所述抗VISTA抗原结合片段包含Fab、F(ab')2或scFv抗体片段。
120.一种治疗和/或预防方法，所述方法包括向有需要的患者施用至少一种抗体药物偶联物(ADC)或组合物，其中所述组合物可在根据前述权利要求中任一项所述的装置中。
121.如权利要求120所述的方法，所述方法用于治疗过敏、自身免疫、移植、基因疗法、炎症、GVHD或败血症，或用以治疗或预防人类受试者中与前述疾患中的任一者相关的炎症性、自身免疫性或过敏性副作用。
122.如权利要求120或121所述的方法，其中所述患者包含选自以下的疾患：类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、成人克罗恩病、小儿克罗恩病、溃疡性结肠炎、斑块状牛皮癣、化脓性汗腺炎、葡萄膜炎、白塞病、脊柱关节病或牛皮癣。
123.如权利要求120-122中任一项所述的方法，其中所述患者包括以下一者或多者：
(i)主要仅用高剂量的类固醇可有效治疗的疾患，任选地为风湿性多肌痛和/或巨细胞动脉炎，所述患者任选地已接受治疗或正经历高类固醇剂量的治疗；
(ii)伴有限制类固醇使用的合并症的疾患，任选地为糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、病态肥胖、无血管性坏死/骨坏死(AVN)、青光眼、类固醇诱发的高血压、严重皮肤脆弱和/或骨关节炎；
(iii)其中安全的长期治疗剂可用，但其中需要用高剂量的类固醇诱导数月的疾患，任选地为AAV、多肌炎、皮肌炎、狼疮、炎症性肺病、自身免疫性肝炎、炎症性肠病、免疫性血小板减少症、自身免疫性溶血性贫血、痛风患者，其中在治疗上需要用高剂量的类固醇诱导数月；
(iv)需要短期/长期治疗，任选地需要不确定的治疗或持续时间和/或不存在类固醇施用的有效替代方案的皮肤疾患，任选地为史蒂文斯-约翰逊病、其他严重药疹疾患、涉及广泛接触性皮炎的疾患、其他严重免疫相关皮肤病疾患如PG、LCV、红皮病等；
(v)用高剂量的皮质类固醇治疗突发/复发的疾患，任选地为COPD、哮喘、狼疮、痛风、假痛风；
(vi)免疫相关的神经疾病，例如小纤维神经病、MS(亚组)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、重症肌无力等；
(vii)血液/肿瘤适应症，任选地其中高剂量的类固醇将潜在地在治疗上有需要或有益；
(viii)眼科疾患，任选地为葡萄膜炎、虹膜炎、巩膜炎等；
(ix)与永久或极长期肾上腺机能不足或继发性肾上腺机能不足相关的疾患，任选地为医源性艾迪森危象；
(x)常用长期、低剂量类固醇治疗的疾患，任选地为狼疮、RA、psA、血管炎等；和
(xi)特殊类别的患者，例如怀孕/哺乳妇女、儿科患者，任选地为患有生长障碍或白内障的那些患者。
124.如权利要求120-123中任一项所述的方法，其中所述患者正用另一种活性剂进一步治疗。
125.如权利要求120-124中任一项所述的方法，其中所述患者正用免疫调节性抗体或融合蛋白进一步治疗，所述免疫调节性抗体或融合蛋白选自靶向CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA中的一者或多者的免疫抑制性抗体或融合蛋白和/或靶向CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS中的一者或多者的激动性抗体或融合蛋白。
126.如权利要求120-125中任一项所述的方法，所述方法用于治疗或预防急性或慢性炎症和与其相关的自身免疫性和炎症性适应症，其中所述疾患任选地包括严重哮喘、巨细胞动脉炎、ANKA血管炎和IBD(结肠炎和克罗恩病)。
127.如权利要求115-126中任一项所述的方法，所述方法用于治疗或预防选自以下的疾患：类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、成人克罗恩病、小儿克罗恩病、溃疡性结肠炎、斑块状牛皮癣、化脓性汗腺炎、葡萄膜炎、白塞病、脊柱关节病或牛皮癣。
128.一种用于实现糖皮质激素内化至T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、Treg、NK细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、骨髓细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞中的一者或多者中的方法，所述方法包括向受试者施用根据前述权利要求中任一项所述的ADC或使获自受试者的细胞离体接触根据前述权利要求中任一项所述的ADC。
129.如权利要求128所述的方法，所述方法是离体实现的，并且使包含免疫细胞或包含一种或多种特定类型的免疫细胞的经纯化或富集的组合物与根据前述权利要求中任一项所述的ADC离体接触并且此后引入有需要的患者体内，所述免疫细胞选自B细胞、T细胞、CD4T细胞、CD8 T细胞、Treg、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、骨髓细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞。
130.一种用于治疗炎症性或自身免疫性或过敏性疾患的方法，所述炎症性或自身免疫性或过敏性疾患涉及B细胞、T细胞、Treg、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、骨髓细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞中的任一者或多者，所述方法包括向有需要的受试者施用根据前述权利要求中任一项所述的ADC。
131.根据前述权利要求中任一项所述的糖皮质激素激动剂、含有其的组合物或使用方法，其不包括：
132.根据前述权利要求中任一项所述的糖皮质激素激动剂、含有其的组合物或使用方法，其中所述糖皮质激素激动剂化合物不包括图9中描绘的化合物和/或具有以下结构：
其中：
R＝H，或
/>
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