CN116096413A - 抗人vista抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了抗VISTA抗体药物缀合物，其可用于将抗炎剂诸如类固醇靶向递送至免疫细胞例如骨髓细胞。本发明还提供了使用抗VISTA抗体药物缀合物治疗炎症性和/或自身免疫性病状以及/或者用于减轻抗炎剂诸如类固醇的毒性的方法。

Description

抗人VISTA抗体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年4月22日提交的美国临时申请62/013,878、2021年4月22日提交的美国临时申请号63/013,887、2021年1月7日提交的美国临时申请号63/134,811和2021年1月19日提交的美国临时申请号63/138,958的优先权，所有这些申请都以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及抗体药物缀合物(ADC)，其包含具有短血清半衰期(在人VISTA敲入啮齿动物中约24-27小时或更短)的抗人VISTA(含V区免疫球蛋白的T细胞激活抑制剂(1))抗体或抗VISTA抗原结合抗体片段和抗炎剂，例如类固醇诸如地塞米松、布地奈德或本领域已知的其他类固醇或本文公开的新型类固醇化合物之一。本发明还涉及此类ADC和新型类固醇用于治疗自身免疫性和炎症性病状的用途。本发明还涉及用于通过使用此类ADC选择性地将抗炎剂递送至靶免疫细胞来减少这些抗炎剂的不良副作用和/或增强其功效从而减少对非靶细胞的潜在毒性的方法，所述抗炎剂例如小分子抗炎剂，诸如类固醇并且特别是糖皮质激素受体激动剂，诸如地塞米松、地塞米松、布地奈德或本领域已知的其他类固醇或本文公开的新型类固醇化合物之一，所述靶免疫细胞诸如单核细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、Treg等，并且特别是骨髓细胞。
背景技术
VISTA是一种NCR配体，其最接近的系统发育亲属是PD-L1。VISTA与PD-L1具有同源性，但表现出仅限于造血隔室的独特表达模式。具体地，VISTA在CD11b高骨髓细胞上组成性和高度表达，并且在CD4+和CD8+T细胞上以较低水平表达。像PD-L1一样，VISTA是一种显著抑制免疫的配体，并且像PD-L1一样，阻断VISTA允许在临床前肿瘤学模型中发展对癌症的治疗性免疫。阻断VISTA增强免疫，尤其是CD8+和CD4+介导的T细胞免疫，而用VISTA细胞外结构域的可溶性Ig融合蛋白(VISTA-Ig)治疗抑制免疫，并且已被证明可阻止多种自身免疫性疾病小鼠模型的进展。基于上述，已经报道了拮抗剂抗VISTA抗体促进T细胞免疫和治疗其中这样做是有益的的病状诸如癌症和感染的用途。相反，已经报道了激动剂抗VISTA抗体抑制T细胞免疫和治疗其中这样做是治疗有益的的病状诸如自身免疫性、过敏性和炎症性病状的用途。不幸的是，一些抗VISTA抗体(包括用于人临床试验的一些抗体)具有非常短的血清半衰期，这在治疗癌症或自身免疫等慢性病状的情况下通常是不理想的，因为这需要非常频繁的给药，而这对于患者来说不方便也很昂贵。此外，已经提出了抗VISTA抗体和VISTA融合蛋白将有效载荷诸如化学治疗剂递送至癌细胞或肿瘤部位的潜在用途。
合成糖皮质激素受体激动剂(例如，地塞米松、泼尼松龙(prednisolone)、布地奈德、倍氯米松、倍他米松、皮质醇、醋酸可的松、16-α羟基泼尼松龙、地塞米松、二氟拉松(difluorasone)、氟米松、氟尼缩松(flunisolide)、醋酸氟轻松、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、环索奈德(ciclesonide)、甲基泼尼松龙、强的松(prednisone)、泼尼松龙、莫米松(mometasone)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)等)是一类用于治疗炎症和与其相关病症的有效的小分子。虽然这些化合物在抑制与不同病状诸如自身免疫性和炎症性病症、癌症和感染性疾病相关的炎症方面非常有效，但由于严重的副作用，它们在疾病的慢性治疗中的效用受到限制。
基于上述，已经探索了几种方法来保留合成糖皮质激素的抗炎功效同时避免不需要的毒性，已经进行了描述(Rosen,J和Miner,J NEndocrine Reviews 26:452-64(2005))。具体而言，已经开发了抗体药物缀合物(ADC)，其中此类化合物与靶向由免疫细胞表达的抗原(包括CD40、CD163、CD74、PRLR和TNF)的抗体缀合。尽管如此，在自身免疫性和炎症性疾病领域仍然需要改进的抗炎疗法和开发改进的抗炎治疗剂，例如与治疗此类病状的现有治疗剂相比具有增强的功效、延长的功效和/或减少的副作用。
发明内容
本发明的目的是通过提供新型类固醇和ADC，尤其是包含抗人VISTA抗体或抗人VISTA抗体片段的那些来提供用于治疗或预防炎症和与所述炎症相关的病症的治疗剂。
本发明的目的是提供包含抗VISTA抗体或抗体片段的新型抗体药物缀合物(ADC)，所述抗VISTA抗体或抗体片段在生理条件(约pH 7.5)下具有非常短的血清半衰期，本文定义为在人VISTA敲入啮齿动物中1至72小时、1至32小时、1至16小时、1至8小时、1至4小时或1-2小时或在食蟹猕猴中约3-4天或更短，所述抗VISTA抗体或抗体片段与抗炎药缀合，所述抗炎药必须内化到细胞中以获得功效，所述抗炎药例如小分子抗炎药，例如糖皮质激素受体激动剂或其他类固醇，诸如地塞米松、泼尼松龙、布地奈德、倍氯米松、倍他米松、皮质醇、醋酸可的松、16-α羟基泼尼松龙、地塞米松、二氟拉松、氟米松、氟尼缩松、醋酸氟轻松、丙酸氟替卡松、环索奈德、甲基泼尼松龙、强的松、泼尼松龙、莫米松、曲安奈德或本文公开的新型类固醇。
如下文所示，主题ADC具有与用于使抗炎剂、特别是类固醇靶向免疫细胞并且引导其内化到免疫细胞中的先前ADC(例如靶向CD74、CD163、TNF和PRLR的ADC)相比的独特的优势组合；这是由于VISTA作为ADC靶标和包含在主题ADC中的抗VISTA抗体的特定性质(在生理pH下与表达VISTA的免疫细胞结合并具有非常短的pK)的组合益处。具体地，主题ADC与以非常高的密度表达VISTA的免疫细胞结合，并且尽管其PK非常短，但在延长的持续时间内是有效的(引发抗炎活性)，因此非常适合治疗慢性炎症性或自身免疫性疾病，其中长期和重复施用在治疗上是必要的；主题ADC靶向广泛范围的免疫细胞，包括嗜中性粒细胞、骨髓细胞、T细胞和内皮细胞，因此主题ADC可用于治疗涉及任何或所有这些类型的免疫细胞的炎症性或自身免疫性疾病；主题ADC起效快速，因此可用于治疗急性治疗；主题ADC不结合B细胞，因此不像游离类固醇那样具有免疫抑制作用；主题ADC作用于Treg，Treg是负责类固醇功效的重要免疫细胞；主题ADC同时作用于静息和激活的免疫细胞，因此在炎症性和自身免疫性病状的活动期和缓解期都具有活性(引发抗炎活性)；主题ADC作用于嗜中性粒细胞，所述免疫细胞对急性炎症至关重要；因为VISTA细胞表面周转率高，主题ADC非常迅速且组成性地内化到免疫细胞中；主题ADC具有非常短的半衰期(PK)并且仅结合免疫细胞，因此主题ADC不会容易出现靶向相关毒性和发生不希望的外周类固醇暴露(低非特异性损失效应)；主题ADC的生物活性(抗炎作用)完全归因于抗炎有效载荷(类固醇)，因为其中具有沉默IgG的抗VISTA抗体不表现出免疫学功能(不阻断任何VISTA生物机理)。
本发明的更具体的目的是提供新型抗体药物缀合物(ADC)，其包含在生理条件(约pH 7.5)下在人VISTA敲入啮齿动物中血清半衰期为1至72小时、1至32小时、1至16小时、1至8小时、1至4小时或1-2小时±0.5小时，或者在灵长类动物(食蟹猕猴)中血清半衰期为约3.5、3、2.5或2.3天±0.5天的抗VISTA抗体或抗体片段以及抗炎药，例如合成糖皮质激素受体激动剂，诸如地塞米松、泼尼松龙或布地奈德等，或本文公开的新型类固醇，因此此类ADC在施用时导致抗炎药释放并内化到靶免疫细胞中，所述抗炎药例如合成糖皮质激素受体激动剂，诸如地塞米松、泼尼松龙或布地奈德或者衍生物。
本发明的更具体的目的是提供抗体药物缀合物(ADC)，其包含：抗体或抗原结合片段(“A”)，所述抗体或抗原结合片段包含特异性结合至人T细胞激活V结构域Ig抑制因子(人VISTA)的抗原结合区；可切割或不可切割接头(“L”)；以及至少一种小分子抗炎剂(“AI”)；任选“异双官能基团”或“异三官能基团”“Q”，所述Q是任选用于将接头连接至抗VISTA抗体或抗体片段的化学部分；以及至少一种小分子抗炎剂(“AI”)，所述ADC由下式表示：
“A-(Q-L-AI)n”或“(AI-L-Q)n-A”
其中“n”至少为1，并且当向有需要的受试者施用时，抗体或ADC或含有其的组合物优先递送至表达VISTA的免疫细胞(任选单核细胞或骨髓细胞)并且导致小分子抗炎剂在生理条件(约pH 7.5)下功能内化至所述免疫细胞中，优选其中抗VISTA抗体或抗原结合片段在体内使用时在生理pH(约pH 7.5)下在血清中具有短体内血清半衰期，任选在生理pH(约pH 7.5)下在血清中的体内血清半衰期在人VISTA敲入啮齿动物中为不超过72小时、1至32小时、1至16小时、1至8小时、1至4小时或1-2小时±0.5小时或者在灵长类动物(食蟹猕猴)中为约3.5、3、2.5或2.3天±0.5天。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含其中当向有需要的受试者施用时，ADC优先递送至表达VISTA的免疫细胞，任选单核细胞、骨髓细胞、T细胞、Treg、NK细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞和内皮细胞中的一种或多种，并且导致小分子抗炎剂功能内化至一种或多种所述免疫细胞中中；其中抗人VISTA抗体或抗体片段在人VISTA敲入啮齿动物中具有至多40小时的pK。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中AI包括糖皮质激素。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中糖皮质激素包括以下中的一种：
Figure BDA0004033983910000061
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述糖皮质激素包括16-α羟基泼尼松龙、地塞米松、二氟拉松、氟米松、氟尼缩松、醋酸氟轻松、丙酸氟替卡松、环索奈德、甲基泼尼松龙、强的松、泼尼松龙、莫米松、曲安奈德或它们的衍生物。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其在生理pH下在食蟹猕猴或人中具有至多3.5至4天的pK。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其在生理pH下在食蟹猕猴或人中具有至多约2.8天或约2.5天±0.5天的pK。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其在生理pH下在人VISTA啮齿动物中具有至多6-12小时的pK。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含接头，所述接头在所述ADC内化至表达VISTA的免疫细胞(任选T细胞、Treg、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、骨髓细胞、树突细胞、巨噬细胞和内皮细胞中的一种或多种)中时被切割，导致在所述免疫细胞中释放治疗有效量的所述抗炎剂，其中所述抗炎剂引发抗炎活性。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述抗VISTA抗体或抗原结合片段在灵长类动物，任选食蟹猕猴中在生理pH(约pH 7.5)下具有约2天或更短的体内血清半衰期。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述抗VISTA抗体或抗原结合片段在人VISTA敲入啮齿动物中在生理pH(约pH 7.5)下在血清中具有以下体内血清半衰期：不超过70小时、不超过60小时、不超过50小时、不超过40小时、不超过30小时、不超过24小时、不超过22-24小时、不超过20-22小时、不超过18-20小时、不超过16-18小时、不超过14-16小时、不超过12-14小时、不超过10-12小时、不超过8-10小时、不超过6-8小时、不超过4-6小时、不超过2-4小时、不超过1-2小时、不超过0.5-1.0小时或不超过0.1-0.5小时。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中在体内使用时，所述ADC在人VISTA敲入啮齿动物或者人或非人灵长类动物，任选食蟹猕猴中的pK/pD比率为至少2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或更大。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述ADC在人VISTA敲入啮齿动物或者人或非人灵长类动物，任选食蟹猕猴中的PD为至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天、2-3周、3-4周、4-5周、5-6周或更长。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中抗人VISTA抗体包含具有受损的FcR结合的Fc区。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述抗人VISTA抗体包含具有受损的FcR结合的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中抗人VISTA抗体包含具有受损的FcR结合的人IgG1 Fc区。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含被修饰以削弱或消除与至少2种天然人Fcγ受体的结合的人或非人灵长类动物恒定区或Fc区。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含被修饰以削弱或消除与以下FcR中的任一个、两个、三个、四个或全部五个的结合的人或非人灵长类动物恒定区或Fc区：hFcγRI(CD64)、FcyRIIA或hFcyRIIB、(CD32或CD32A)以及FcγRlllA(CD16A)或FcγRlllB(CD16B)。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含在Fc区中具有V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S沉默突变的人IgG2κ主链。
19.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含在Fc区中具有L234A/L235A沉默突变以及任选的削弱补体(C1Q)结合的突变的人IgG1/κ主链。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含在Fc区中具有L234A/L235A沉默突变以及E269R和E233A突变的人IgG1/κ主链。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述抗VISTA抗体或抗原结合片段与表达VISTA的免疫细胞的结合不直接激动或拮抗VISTA介导的对免疫的作用。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含人IgG2Fc区，其中内源性FcR结合未受损。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含天然(未修饰的)人IgG2 Fc区。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述抗VISTA抗体或抗原结合片段包含通过表面等离子共振(SPR)在24℃或37℃下测定的在0.0001nM至10.0nM、0.001至1.0nM、0.01至0.7或更小范围内的KD。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述抗VISTA抗体或抗原结合片段包含通过表面等离子共振(SPR)在24℃或37℃下测定的0.13至0.64nM的KD。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中接头是可切割肽。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中接头选自本文一般和具体描述的任何接头。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述抗炎剂包括类固醇，任选糖皮质激素受体激动剂，进一步任选地塞米松、泼尼松龙或布地奈德或者前述中的任一者的功能衍生物，即所述衍生物在内化至表达VISTA的免疫细胞中后引发抗炎活性。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中药物抗体比在1:1-10:1范围内。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中药物抗体比在2-8:1、4-8:1或6-8:1范围内。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中药物抗体比为8:1(n＝8)。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其内化至单核细胞、骨髓细胞、T细胞、Treg、巨噬细胞和嗜中性粒细胞中的一种或多种中。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其不会明显内化至B细胞中。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，与以裸(非缀合)形式施用的相同剂量的抗炎剂相比，所述ADC当施用于有需要的受试者时促进与所述抗炎剂(例如，类固醇，任选糖皮质激素受体激动剂，进一步任选地塞米松、泼尼松龙或布地奈德)相关的功效和/或减少与其相关的不良副作用。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述抗炎剂，任选类固醇或糖皮质激素受体激动剂，进一步任选地塞米松、泼尼松龙或布地奈德或者前述中的任一者的功能衍生物，经由链间二硫键与所述抗体或抗原结合片段缀合。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含酯酶敏感性接头和作为抗炎剂的地塞米松或布地奈德或另一种皮质类固醇或功能衍生物。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含对酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键切割中的一种或多种敏感的可切割接头。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中接头是酯酶可切割接头。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含对酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键切割中的一种或多种基本上具有抗性的不可切割接头。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中包含在ADC中的抗VISTA抗原结合片段包含Fab、F(ab')2或scFv抗体片段。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中包含在所述ADC中的抗VISTA抗体或抗体片段是这样的一种：
(i)包含SEQ ID NO:100、101和102的VH CDR以及SEQ ID NO:103、104和105的VLCDR；
(ii)包含SEQ ID NO:110、111和112的VH CDR以及SEQ ID NO:113、114和115的VLCDR；
(iii)包含SEQ ID NO:120、121和122的VH CDR以及SEQ ID NO:123、124和125的VLCDR；
(iv)包含SEQ ID NO:130、131和132的VH CDR以及SEQ ID NO:133、134和135的VLCDR；
(v)包含SEQ ID NO:140、141和142的VH CDR以及SEQ ID NO:143、144和145的VLCDR；
(vi)包含SEQ ID NO:150、151和152的VH CDR以及SEQ ID NO:153、154和155的VLCDR；
(vii)包含SEQ ID NO:160、161和162的VH CDR以及SEQ ID NO:163、164和165的VLCDR；
(viii)包含SEQ ID NO:170、171和172的VH CDR以及SEQ IDNO:173、174和175的VLCDR；
(ix)包含SEQ ID NO:180、181和182的VH CDR以及SEQ ID NO:183、184和185的VLCDR；
(x)包含SEQ ID NO:190、191和192的VH CDR以及SEQ ID NO:193、194和195的VLCDR；
(xi)包含SEQ ID NO:200、201和202的VH CDR以及SEQ ID NO:203、204和205的VLCDR；
(xii)包含SEQ ID NO:210、211和212的VH CDR以及SEQ ID NO:213、214和215的VLCDR；
(xiii)包含SEQ ID NO:220、221和222的VH CDR以及SEQ ID NO:223、224和225的VLCDR；
(xiv)包含SEQ ID NO:230、231和232的VH CDR以及SEQ ID NO:233、234和235的VLCDR；
(xv)包含SEQ ID NO:240、241和242的VH CDR以及SEQ ID NO:243、244和245的VLCDR；
(xvi)包含SEQ ID NO:250、251和252的VH CDR以及SEQ ID NO:253、254和255的VLCDR；
(xvii)包含SEQ ID NO:260、261和262的VH CDR以及SEQ ID NO:263、264和265的VL CDR；
(xviii)包含SEQ ID NO:270、271和272的VH CDR以及SEQ ID NO:273、274和275的VL CDR；
(xix)包含SEQ ID NO:280、281和282的VH CDR以及SEQ ID NO:283、284和285的VLCDR；
(xx)包含SEQ ID NO:290、291和292的VH CDR以及SEQ ID NO:293、294和295的VLCDR；
(xxi)包含SEQ ID NO:300、301和302的VH CDR以及SEQ ID NO:303、304和305的VLCDR；
(xxii)包含SEQ ID NO:310、311和312的VH CDR以及SEQ ID NO:313、314和315的VLCDR；
(xxiii)包含SEQ ID NO:320、321和322的VH CDR以及SEQ ID NO:323、324和325的VL CDR；
(xxiv)包含SEQ ID NO:330、331和332的VH CDR以及SEQ ID NO:333、334和335的VLCDR；
(xxv)包含SEQ ID NO:340、341和342的VH CDR以及SEQ ID NO:343、344和345的VLCDR；
(xxvi)包含SEQ ID NO:350、351和352的VH CDR以及SEQ ID NO:353、354和355的VLCDR；
(xxvii)包含SEQ ID NO:360、361和362的VH CDR以及SEQ ID NO:363、364和365的VL CDR；
(xxviii)包含SEQ ID NO:370、371和372的VH CDR以及SEQ ID NO:373、374和375的VL CDR；
(xxix)包含SEQ ID NO:380、381和382的VH CDR以及SEQ ID NO:383、384和385的VLCDR；
(xxx)包含SEQ ID NO:390、391和392的VH CDR以及SEQ ID NO:393、394和395的VLCDR；
(xxxi)包含SEQ ID NO:400、401和402的VH CDR以及SEQ ID NO:403、404和405的VLCDR；
(xxxii)包含SEQ ID NO:410、411和412的VH CDR以及SEQ ID NO:413、414和415的VL CDR；
(xxxiii)包含SEQ ID NO:420、421和422的VH CDR以及SEQ ID NO:423、424和425的VL CDR；
(xxxiv)包含SEQ ID NO:430、431和432的VH CDR以及SEQ ID NO:433、434和435的VL CDR；
(xxxv)包含SEQ ID NO:440、441和442的VH CDR以及SEQ ID NO:443、444和445的VLCDR；
(xxxvi)包含SEQ ID NO:450、451和452的VH CDR以及SEQ ID NO:453、454和455的VL CDR；
(xxxvii)包含SEQ ID NO:460、461和462的VH CDR以及SEQ ID NO:463、464和465的VL CDR；
(xxxviii)包含SEQ ID NO:470、471和472的VH CDR以及SEQ ID NO:473、474和475的VL CDR；
(xxxix)包含SEQ ID NO:480、481和482的VH CDR以及SEQ ID NO:483、484和485的VL CDR；
(xl)包含SEQ ID NO:490、491和492的VH CDR以及SEQ ID NO:493、494和495的VLCDR多肽；
(xli)包含SEQ ID NO:500、501和502的VH CDR以及SEQ ID NO:503、504和505的VLCDR多肽；
(xlii)包含SEQ ID NO:510、511和512的VH CDR以及SEQ ID NO:513、514和515的VL CDR多肽；
(xliii)包含SEQ ID NO:520、521和522的VH CDR以及SEQ ID NO:523、524和525的VL CDR多肽；
(xliv)包含SEQ ID NO:530、531和532的VH CDR以及SEQ ID NO:533、534和535的VL CDR多肽；
(xlv)包含SEQ ID NO:540、541和542的VH CDR以及SEQ ID NO:543、544和545的VLCDR多肽；
(xlvi)包含SEQ ID NO:550、551和552的VH CDR以及SEQ ID NO:553、554和555的VL CDR多肽；
(xlvii)包含SEQ ID NO:560、561和562的VH CDR以及SEQ ID NO:563、564和565的VL CDR；
(xlviii)包含SEQ ID NO:570、571和572的VH CDR以及SEQ ID NO:573、574和575的VL CDR；
(xlix)包含SEQ ID NO:580、581和582的VH CDR以及SEQ ID NO:583、584和585的VLCDR；
(l)包含SEQ ID NO:590、591和592的VH CDR以及SEQ ID NO:593、594和595的VLCDR；
(li)包含SEQ ID NO:600、601和602的VH CDR以及SEQ ID NO:603、604和605的VLCDR；
(lii)包含SEQ ID NO:610、611和612的VH CDR以及SEQ ID NO:613、614和615的VLCDR；
(liii)包含SEQ ID NO:620、621和622的VH CDR以及SEQ ID NO:623、624和625的VLCDR；
(liv)包含SEQ ID NO:630、631和632的VH CDR以及SEQ ID NO:633、634和635的VLCDR；
(lv)包含SEQ ID NO:640、641和642的VH CDR以及SEQ ID NO:643、644和645的VLCDR；
(lvi)包含SEQ ID NO:650、651和652的VH CDR以及SEQ ID NO:653、654和655的VLCDR；
(lvii)包含SEQ ID NO:660、661和662的VH CDR以及SEQ ID NO:663、664和665的VLCDR；
(lviii)包含SEQ ID NO:670、671和672的VH CDR以及SEQ ID NO:673、674和675的VL CDR；
(lix)包含SEQ ID NO:680、681和682的VH CDR以及SEQ ID NO:683、684和685的VLCDR；
(lx)包含SEQ ID NO:690、691和692的VH CDR以及SEQ ID NO:693、694和695的VLCDR；
(lxi)包含SEQ ID NO:700、701和702的VH CDR以及SEQ ID NO:703、704和705的VLCDR；
(lxii)包含SEQ ID NO:710、711和712的VH CDR以及SEQ ID NO:713、714和715的VLCDR；
(lxiii)包含SEQ ID NO:720、721和722的VH CDR以及SEQ ID NO:723、724和725的VL CDR；
(lxiv)包含SEQ ID NO:730、731和732的VH CDR以及SEQ ID NO:733、734和735的VLCDR；
(lxv)包含SEQ ID NO:740、741和742的VH CDR以及SEQ ID NO:743、744和745的VLCDR；
(lxvi)包含SEQ ID NO:750、751和752的VH CDR以及SEQ ID NO:753、754和755的VLCDR；
(lxvii)包含SEQ ID NO:760、761和762的VH CDR以及SEQ ID NO:763、764和765的VL CDR；
(lxviii)包含SEQ ID NO:770、771和772的VH CDR以及SEQ ID NO:773、774和775的VL CDR；
(lxix)包含SEQ ID NO:780、781和782的VH CDR以及SEQ ID NO:783、784和785的VLCDR；
(lxx)包含SEQ ID NO:790、791和792的VH CDR以及SEQ ID NO:793、794和795的VLCDR；
(lxxi)包含SEQ ID NO:800、801和802的VH CDR以及SEQ ID NO:803、804和805的VLCDR；
(lxxii)包含SEQ ID NO:810、811和812的VH CDR以及SEQ ID NO:813、814和815的VL CDR。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的ADC，其中包含在ADC中的抗VISTA抗体或抗体片段包含与VSTB92、VSTB56、VSTB95、VSTB103和VSTB66中的任一者相同的CDR。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中包含在所述ADC中的所述抗VISTA抗体或抗体片段是包含VH多肽和VL多肽的抗VISTA抗体或抗体片段，所述两种多肽分别与包含以下VH多肽和VL多肽的抗体的两种多肽具有至少90％、95％或100％的序列同一性，并且此外，所述CDR未被修饰：
(i)包含SEQ ID NO:106同一性的VH多肽和SEQ ID NO:108的VL多肽的抗体；
(ii)包含SEQ ID NO:116的VH多肽和SEQ ID NO:118的VL多肽的抗体；
(iii)包含SEQ ID NO:126的VH多肽和SEQ ID NO:128的VL多肽的抗体；
(iv)包含SEQ ID NO:136的VH多肽和SEQ ID NO:138的VL多肽的抗体；
(v)包含SEQ ID NO:146的VH多肽和SEQ ID NO:148的VL多肽的抗体；
(vi)包含SEQ ID NO:156的VH多肽和SEQ ID NO:158的VL多肽的抗体；
(vii)包含SEQ ID NO:166的VH多肽和SEQ ID NO:168的VL多肽的抗体；
(viii)包含SEQ ID NO:176的VH多肽和SEQ ID NO:178的VL多肽的抗体；
(ix)包含SEQ ID NO:186的VH多肽和SEQ ID NO:188的VL多肽的抗体；
(x)包含SEQ ID NO:196的VH多肽和SEQ ID NO:198的VL多肽的抗体；
(xi)包含SEQ ID NO:206的VH多肽和SEQ ID NO:208的VL多肽的抗体；
(xii)包含SEQ ID NO:216的VH多肽和SEQ ID NO:218的VL多肽的抗体；
(xiii)包含SEQ ID NO:226的VH多肽和SEQ ID NO:228的VL多肽的抗体；
(xiv)包含SEQ ID NO:236的VH多肽和SEQ ID NO:238的VL多肽的抗体；
(xv)包含SEQ ID NO:246的VH多肽和SEQ ID NO:248的VL多肽的抗体；
(xvi)包含SEQ ID NO:256的VH多肽和SEQ ID NO:258的VL多肽的抗体；
(xvii)包含SEQ ID NO:266的VH多肽和SEQ ID NO:268的VL多肽的抗体；
(xviii)包含SEQ ID NO:276的VH多肽和SEQ ID NO:278的VL多肽的抗体；
(xix)包含SEQ ID NO:286的VH多肽和SEQ ID NO:288的VL多肽的抗体；
(xx)包含SEQ ID NO:296的VH多肽和SEQ ID NO:298的VL多肽的抗体；
(xxi)包含SEQ ID NO:306的VH多肽和SEQ ID NO:308的VL多肽的抗体；
(xxii)包含SEQ ID NO:316的VH多肽和SEQ ID NO:318的VL多肽的抗体；
(xxiii)包含SEQ ID NO:326的VH多肽和SEQ ID NO:328的VL多肽的抗体；
(xxiv)包含SEQ ID NO:336的VH多肽和SEQ ID NO:338的VL多肽的抗体；
(xxv)包含SEQ ID NO:346的VH多肽和SEQ ID NO:348的VL多肽的抗体；
(xxvi)包含SEQ ID NO:356的VH多肽和SEQ ID NO:358的VL多肽的抗体；
(xxvii)包含SEQ ID NO:366的VH多肽和SEQ ID NO:368的VL多肽的抗体；
(xxviii)包含SEQ ID NO:376的VH多肽和SEQ ID NO:378的VL多肽的抗体；
(xxix)包含SEQ ID NO:386的VH多肽和SEQ ID NO:388的VL多肽的抗体；
(xxx)包含SEQ ID NO:396的VH多肽和SEQ ID NO:398的VL多肽的抗体；
(xxxi)包含SEQ ID NO:406的VH多肽和SEQ ID NO:408的VL多肽的抗体；
(xxxii)包含SEQ ID NO:416的VH多肽和SEQ ID NO:418的VL多肽的抗体；
(xxxiii)包含SEQ ID NO:426的VH多肽和SEQ ID NO:428的VL多肽的抗体；
(xxxiv)包含SEQ ID NO:436的VH多肽和SEQ ID NO:438的VL多肽的抗体；
(xxxv)包含SEQ ID NO:446的VH多肽和SEQ ID NO:448的VL多肽的抗体；
(xxxvi)包含SEQ ID NO:456的VH多肽和SEQ ID NO:458的VL多肽的抗体；
(xxxvii)包含SEQ ID NO:466的VH多肽和SEQ ID NO:468的VL多肽的抗体；
(xxxviii)包含SEQ ID NO:476的VH多肽和SEQ ID NO:478的VL多肽的抗体；
(xxxix)包含SEQ ID NO:486的VH多肽和SEQ ID NO:488的VL多肽的抗体；
(xl)包含SEQ ID NO:496的VH多肽和SEQ ID NO:498的VL多肽的抗体；
(xli)包含SEQ ID NO:506的VH多肽和SEQ ID NO:508的VL多肽的抗体；
(xlii)包含SEQ ID NO:516的VH多肽和SEQ ID NO:518的VL多肽的抗体；
(xliii)包含SEQ ID NO:526的VH多肽和SEQ ID NO:528的VL多肽的抗体；
(xliv)包含SEQ ID NO:536的VH多肽和SEQ ID NO:533、534和535的VL多肽的抗体；
(xlv)包含SEQ ID NO:546的VH多肽和SEQ ID NO:548的VL多肽的抗体；
(xlvi)包含SEQ ID NO:556的VH多肽和SEQ ID NO:558的VL多肽的抗体；
(xlvii)包含SEQ ID NO:566的VH多肽和SEQ ID NO:568的VL多肽的抗体；
(xlviii)包含SEQ ID NO:576的VH多肽和SEQ ID NO:578的VL多肽的抗体；
(xlix)包含SEQ ID NO:586的VH多肽和SEQ ID NO:588的VL多肽的抗体；
(l)包含SEQ ID NO:596的VH多肽和SEQ ID NO:598的VL多肽的抗体；
(li)包含SEQ ID NO:606的VH多肽和SEQ ID NO:608的VL多肽的抗体；
(lii)包含SEQ ID NO:616的VH多肽和SEQ ID NO:618的VL多肽的抗体；
(liii)包含SEQ ID NO:626的VH多肽和SEQ ID NO:628的VL多肽的抗体；
(liv)包含SEQ ID NO:636的VH多肽和SEQ ID NO:638的VL多肽的抗体；
(lv)包含SEQ ID NO:646的VH多肽和SEQ ID NO:648的VL多肽的抗体；
(lvi)包含SEQ ID NO:656的VH多肽和SEQ ID NO:658的VL多肽的抗体；
(lvii)包含SEQ ID NO:666的VH多肽和SEQ ID NO:668的VL多肽的抗体；
(lviii)包含SEQ ID NO:676的VH多肽和SEQ ID NO:678的VL多肽的抗体；
(lix)包含SEQ ID NO:686的VH多肽和SEQ ID NO:688的VL多肽的抗体；
(lx)包含SEQ ID NO:696的VH多肽和SEQ ID NO:698的VL多肽的抗体；
(lxi)包含SEQ ID NO:706的VH多肽和SEQ ID NO:708的VL多肽的抗体；
(lxii)包含SEQ ID NO:716的VH多肽和SEQ ID NO:718的VL多肽的抗体；
(lxiii)包含SEQ ID NO:726的VH多肽和SEQ ID NO:728的VL多肽的抗体；
(lxiv)包含SEQ ID NO:736的VH多肽和SEQ ID NO:738的VL多肽的抗体；
(lxv)包含SEQ ID NO:746的VH多肽和SEQ ID NO:748的VL多肽的抗体；
(lxvi)包含SEQ ID NO:756的VH多肽和SEQ ID NO:758的VL多肽的抗体；
(lxvii)包含SEQ ID NO:766的VH多肽和SEQ ID NO:768的VL多肽的抗体；
(lxviii)包含SEQ ID NO:776的VH多肽和SEQ ID NO:778的VL多肽的抗体；
(lxix)包含SEQ ID NO:786的VH多肽和SEQ ID NO:788的VL多肽的抗体；
(lxx)包含SEQ ID NO:796的VH多肽和SEQ ID NO:798的VL多肽的抗体；
(lxxi)包含SEQ ID NO:806的VH多肽和SEQ ID NO:808的VL多肽的抗体；以及
(lxxii)包含SEQ ID NO:816的VH多肽和SEQ ID NO:818的VL多肽的抗体。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述抗VISTA抗体或抗体片段包含与VSTB92、VSTB56、VSTB95、VSTB103和VSTB66中的一者相同的可变区。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述抗VISTA抗体或抗体片段包含在Fc区中具有V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S沉默突变的人IgG2κ主链。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述抗VISTA抗体或抗体片段包含在Fc区中具有L234A/L235A沉默突变的人IgG1/κ主链。
本发明的更具体的目的是提供如上所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述AI或所述L或Q经由链间二硫键与所述抗VISTA抗体或抗原结合片段缀合。
一种药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种如前述中任一者所述的抗体药物缀合物(ADC)和药学上可接受的载剂。
如上所阐述的组合物，其可经由注射途径，任选静脉内、肌肉内、鞘内或皮下来施用。
如上所阐述的组合物，其可皮下施用。
一种包括如上所阐述的组合物的装置，其提供选自由以下组成的组的皮下施用：注射筒、注射装置、输液泵、注射笔、无针装置、自助注射器和皮下贴片递送系统。
如上所阐述的装置，其向患者递送固定剂量的所述抗炎剂，例如类固醇，例如糖皮质激素受体激动剂，任选地塞米松、泼尼松龙或布地奈德或者它们的功能衍生物。
一种包括如上所阐述的装置的药盒，其还包括告知所述患者如何施用其中包含的所述ADC组合物和给药方案的说明书。
一种治疗和/或预防的方法，其包括向有需要的患者施用至少一种根据前述中任一者所述的抗体药物缀合物(ADC)或组合物，其中所述组合物可以在根据前述中任一者所述的装置中。
上文阐述的治疗和/或预防的方法，其用于人受试者的过敏、自身免疫、移植、基因治疗、炎症、GVHD或脓毒症的治疗，或者用于治疗或预防所述人受试者的与任何前述病状相关的炎症性、自身免疫性或过敏性副作用。
上文阐述的治疗和/或预防的方法，其中所述治疗的患者包括选自以下的病状：类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、成人克罗恩(Crohn's)病、小儿克罗恩病、溃疡性结肠炎、斑块型银屑病、化脓性汗腺炎、葡萄膜炎、贝赛特氏症(Bechet’s disease)、脊椎关节病或银屑病。
上文阐述的治疗和/或预防的方法，其中患者包括以下中的一者或多者：
(i)主要仅可用高剂量类固醇有效治疗的病状，任选风湿性多肌痛和/或巨细胞动脉炎，所述患者任选已经接受或正在接受高类固醇剂量治疗；
(ii)具有限制类固醇使用的共患症的病状，任选糖尿症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、病态肥胖、无血管性坏死/骨坏死(AVN)、青光眼、类固醇引起的高血压、严重皮肤脆弱(severe skin fragility)和/或骨关节炎；
(iii)其中可获得安全长期治疗剂但其中需要用高剂量类固醇诱导数月的病状，任选AAV、多发性肌炎、皮肌炎、狼疮、炎症性肺病、自身免疫性肝炎、炎症性肠病、免疫性血小板减少症、自身免疫性溶血性贫血、痛风患者，其中用高剂量类固醇诱导数月在治疗上是必要的；
(iv)需要短期/长期治疗、任选具有不确定的治疗或持续时间和/或没有类固醇施用的有效替代的皮肤病病状，任选史蒂芬斯强森综合征(Stevens Johnson)、其他严重药疹病状、涉及广泛接触性皮炎(extensive contact dermatitis)的病状、其他严重免疫相关皮肤病病状诸如PG、LCV、红皮病等；
(v)用高剂量皮质类固醇治疗的突发/复发(flares/reoccurrences)病状，任选COPD、哮喘、狼疮、痛风、假痛风；
(vi)免疫相关神经系统疾病，诸如小纤维神经病、MS(亚组)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、重症肌无力等；
(vii)血液学/肿瘤学适应症，任选其中高剂量类固醇可能将在治疗上是必要的或有益的；
(viii)眼科病状，任选葡萄膜炎、虹膜炎、巩膜炎等；
(ix)与永久性或非常长时间的肾上腺功能不全或继发性肾上腺功能不全相关的病状，任选医源性爱迪生危象(latrogenic Addisonian crisis)；
(x)通常用长期、低剂量类固醇治疗的病状，任选狼疮、RA、psA、血管炎等；以及
(xi)特殊类别的患者，诸如怀孕/授乳女性、儿科患者(任选患有生长障碍或白内障的那些)。
上文阐述的治疗和/或预防的方法，其中所述患者还正在用另一种活性剂治疗。
上文阐述的治疗和/或预防的方法，其中所述患者还正在用免疫调节抗体或融合蛋白治疗，其选自靶向以下中的一种或多种的免疫抑制抗体或融合蛋白：CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA，和/或靶向以下中的一种或多种的激动性抗体或融合蛋白：CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS。
本发明的另一个目的是提供根据前述中任一者所述的新型抗体药物缀合物(ADC)，其中药物抗体比在1:1-10:1范围内。
本发明的另一个目的是提供根据前述中任一者所述的新型抗体药物缀合物(ADC)，其中药物抗体比在2-8:1、4-8:1或6-8:1范围内。
本发明的另一个目的是提供根据前述中任一者所述的新型抗体药物缀合物(ADC)，其中药物抗体比为8:1(n＝8)。
本发明的另一个目的是提供根据前述中任一者所述的新型抗体药物缀合物(ADC)，与以裸(非缀合)形式施用的相同剂量的抗炎剂相比，所述ADC当施用于有需要的受试者时促进与所述抗炎剂(例如，类固醇，任选糖皮质激素受体激动剂，进一步任选地塞米松、泼尼松龙或布地奈德)相关的功效和/或减少与其相关的不良副作用。
本发明的另一个目的是提供根据前述中任一者所述的新型抗体药物缀合物(ADC)，其中ADC中的抗体或抗原结合片段与VISTA表位竞争或结合，所述VISTA表位包括由具有图10序列的任何抗人VISTA抗体结合的表位或与其重叠。
本发明的另一个具体目的是提供使免疫细胞例如人免疫细胞与根据本发明的ADC体外或体内接触的方法，例如，其中接触的细胞在与此类ADC接触之后被输注到人受试者中，所述人受试者诸如患有自身免疫性或炎症性病状或其他病状(诸如上文确定的那些病状)的受试者，其中AI或类固醇施用在治疗上将是合意的，但可能与毒性相关联和/或由于其他安全性或临床问题而禁用。
附图说明
图1A-图1B：此图示出了通过胰蛋白酶消化获得的对照VISTA抗体767-IgG1.3的肽图。767-IgG1.3的确定的序列，鉴定的胰蛋白酶肽加下划线：(A)轻链(85.6％覆盖率)(B)重链(76.1％覆盖率)。
图2A-图2B：此图示出了使用Lys-C消化获得的767-IgG1.3的确定的序列。在图中，Lys-C肽加下划线：(A)轻链(63.3％覆盖率)(B)重链(76.3％覆盖率)。
图3：此图包含结合实验的结果，其证实合成的对照抗体767-IgG1.3和INX200表现出相反的pH依赖性结合特性。
图4A-图4C：此图包含结合研究的结果，其揭示DAR 8与接头A的缀合不会影响VISTA与(A)INX200(B)INX201或(C)767-IgG1.3的结合。
图5：此图包含ConA实验的结果，其中向雌性hVISTA敲入动物施用不同的裸和Dex缀合的抗VISTA抗体，所述ConA实验在外周血中在ConA后6h检测到G-CSF变化。使用小鼠7-plex测量的血浆浓度(SEM；n＝5/组)(给药：Dex-0.2＝0.2mg/Kg，Dex-2＝2mg/Kg，INX210和INX210A为10mg/Kg，[INX210A提供0.2mg/kg dex有效载荷])。
图6：此图包含ConA研究的结果，其中向雄性hVISTA敲入动物施用不同的裸和Dex缀合的抗VISTA抗体。在图中的实验中，外周血中ConA后6h的细胞因子变化。使用小鼠7-plex测量的血浆浓度(SEM；n＝10/组，与仅ConA组相比的普通单因素方差分析)(给药：Dex为0.2或5mg/Kg，INX210和INX210A为10mg/Kg)。
图7：此图包含ConA实验的结果，其中向动物施用不同的裸和Dex缀合的抗VISTA抗体，并且在外周血中，在ConA后6h检测到细胞因子变化。使用ELISA测定测量了血浆浓度(SD；n＝6/组，与仅ConA组相比的单因素方差分析)(给药：Dex为0.02、0.2或2mg/Kg，INX200A为10、5和1mg/Kg)。
图8包含INX200、INX201和INX210的可变重区和可变轻区以及恒定区的序列和序列图例。
图9绘示了示例性布地奈德衍生物，其可以例如经由如本文所述的接头与抗VISTA抗体和抗VISTA抗体片段缀合。
图10A-图10JJ包含序列表格，其包含示例性抗人VISTA抗体VSTB49-VSTB116(其在啮齿动物和灵长类动物中在生理条件(pH约7.5)下具有短血清半衰期)的CDR、可变重链序列和可变轻链序列、框架序列和恒定结构域，和表位信息。
图11A-图11C包含来自实施例3中公开的那些的示例性类固醇结构。
图12A-图12C包含实施例中公开的示例性抗VISTA抗体和对照抗体的序列。
图13包含INX200和767-IgG1.3相比于人IgG1si的结合研究。与所测试抗体的连续稀释液(0-333nM)一起孵育的单核细胞的测量的中值荧光强度；黑色虚线对应于未染色细胞的自发荧光；n＝1。
图14绘示了多少比例的抗VISTA抗体(INX200)被免疫细胞内化。在60min的时程中绘制了细胞结合抗体的细胞内池；对于每个数据点，将荧光标准化为0min时INX200的荧光；平均值±SD n＝2供体。
图15包含实验的结果，评估了INX200抗体的内化速率。在60min的时程中在单核细胞中评估了INX200抗体的内化速率；抗CD45抗体在任何时间点均未内化；显示为平均值±SD，n＝2供体。
图16：包含INX200、INX200A相比于人IgG1的PK研究。hVISTAKI小鼠注释时间点的抗体血浆浓度(SD；n＝5/组)。
图17：包含767-IgG1.3、767-IgG1.3A相比于人IgG1的PK研究。hVISTA KI小鼠注释时间点的抗体血浆浓度(SD；n＝5/组)。
图18包含实验的结果，评估了根据本发明的ADC缀合物的效力。在实验中，评估了腹膜定居巨噬细胞和脾单核细胞中Dex(左)和ADCINX201J(右)治疗后的FKBP5转录激活。Dex(左)效果在2mg/Kg的单一1次i.p.注射后4和24h进行评价。ADC(右)效果在10mg/Kg(递送0.2mg/Kg的GC有效载荷)的单一1次i.p.注射后24、48、72和96h进行分析。通过实时PCR测量了FKBP5转录水平，并且表示为与PBS对照组相比的Log2倍数变化。每组四只小鼠汇集在一起，以产生足够的材料用于RNA制备。
图19包含体内实验的结果，表明Dex治疗可防止PRM中促炎细胞因子的离体诱导。Dex效果在2mg/Kg的单一1次i.p.注射后2h进行评价；使用小鼠32-plex根据细胞上清液(在1h时收集)评价IL-6和TNFα(n＝4小鼠/组；未配对T检验)。
图20包含实验的结果，评估了INX201J或Dex治疗对PRM中TNFα的体内效果。结果表明INX201J或Dex治疗可防止PRM中TNFα的离体诱导。在这些实验中，Dex效果在2和0.2mg/Kg的单一1次i.p.注射后2h进行评价；INX201J效果在以10mg/Kg(相当于0.2mg/Kg有效载荷)注射后1天(d-1)、2天(d-2)和4天(d-4)进行评价。在2h时收集细胞上清液。使用ELISA测量TNFα(n＝4小鼠/组；与仅PBS组相比的普通单因素方差分析)。
图21包含实验的结果，评估了根据本发明的示例性ADC的长期效果。结果表明，所有测试的ADC都对PRM中TNFα和IL-6的离体诱导引发了长期影响。Dex效果在2mg/Kg的单一1次i.p.注射后2h进行评价；INX201J、INX231J、INX234J和INX240 J效果在10mg/Kg的单一1次i.p.注射后4天(-4)和7天(-7)进行评价。在2h时收集细胞上清液。使用ELISA测量了TNFα和IL-6(n＝4小鼠/组；与仅PBS组相比的普通单因素方差分析)。
图22包含实验的结果，评估了根据本发明的示例性ADC缀合物，即INX231J、INX234J和INX240 J的效力。结果表明，INX231J、INX234J和INX240 J ADC在防止PRM中TNFα和IL-6的离体诱导方面具有相当的效力。Dex效果在2mg/Kg的单一1次i.p.注射后2h进行评价；INX231J、INX234J和INX240 J效果在10、3或1mg/Kg(0.2、0.06和0.02mg/Kg的GC有效载荷)的单一1次i.p.注射后7天进行评价。在2h时收集细胞上清液。使用ELISA测量了TNFα和IL-6(参见方法部分)(n＝4小鼠/组，出于技术原因PBS组除外(n＝1)；与仅PBS组相比的普通单因素方差分析)。
图23包含实验的结果，比较了INX201J、INX201P、INX231J、INX234J和INX240 JADC的效力，它们在防止PRM中TNFα和IL-6的离体诱导方面具有相当的效力。INX201J、INX201P、INX231J、INX234J、INX240 J和Dex效果在单一1次i.p.注射后7天进行评价；ADC以10mg/Kg(0.2mg/Kg的GC有效载荷)进行给药，而Dex以2mg/Kg进行给药。在2h时收集细胞上清液。使用ELISA测量了TNFα和IL-6(n＝4小鼠/组，出于技术原因PBS组和Dex组除外(n＝3)；与仅PBS组相比的普通单因素方差分析)。
图24：INX201J、INX231P、INX234P和INX240 P ADC在防止PRM中TNFα的离体诱导方面具有相当的效力。在实验中，ADC效果在单一1次i.p.注射后7天进行评价；ADC以10mg/Kg(0.2mg/Kg的GC有效载荷)进行给药。在2h时收集细胞上清液。使用ELISA测量了TNFα和IL-6(参见方法部分)(n＝4小鼠/组；与仅PBS组相比的普通单因素方差分析，SEM)。
图25：INX231P、INX231R、INX233P和INX234P在防止PRM中TNFα和IL-6的离体诱导方面具有相当的效力。在实验中，ADC效果在单一1次i.p.注射后7天进行评价；ADC以10mg/Kg(0.2mg/Kg的GC有效载荷)进行给药。在24h时收集细胞上清液。使用ELISA测量了TNFα和IL-6(参见方法部分)(n＝4小鼠/组；与仅PBS组相比的普通单因素方差分析，SEM)。
图26：与INX231或INX201缀合的GC接头有效载荷INX R、INX O、INX S、INX V和INXW相比于INX P在防止PRM中TNFα和IL-6的离体诱导方面的效力评价。在实验中，ADC效果在单一1次i.p.注射后7天进行评价；ADC以0.2mg/Kg的GC有效载荷进行给药。在24h时收集细胞上清液。使用ELISA测量了TNFα和IL-6(参见方法部分)(n＝4小鼠/组；与仅PBS组相比的普通单因素方差分析，SEM)。
图27：外周血中LPS后2h(左)和4h(右)的IL-12p40变化。使用小鼠多路复用测量了血浆浓度；给药：Dex(方形)在LPS刺激之前2h以0.02、0.2、2和5mg/Kg给药，INX201J(圆形)在LPS注射之前2或17h以10mg/Kg(提供0.2mg/Kg的GC)给药。仅PBS组(灰色实心三角形)表示不存在刺激情况下的基线细胞因子水平；PBS+LPS(黑色实心三角形)(SEM；n＝5/组，除非因技术失败被排除在分析之外；与PBS+LPS组相比的普通单因素方差分析)。
图28：外周血中LPS后2h的细胞因子变化。使用小鼠5-plex测量的血浆浓度；给药：Dex在LPS刺激之前2h以0.002、0.02、0.2、2mg/Kg(方形)或在LPS前17h以2mg/Kg(黑色实心方形)进行给药，INX201J(圆形)在LPS注射之前17h以0.02、0.06、0.2mg/Kg的GC有效载荷进行给药。仅PBS组(实心灰色三角形)表示不存在刺激情况下的基线细胞因子水平；PBS+LPS(实心黑色三角形)(SEM；n＝5/组，除非因技术失败被排除在分析之外；与PBS+LPS组相比的普通单因素方差分析)。
图29：外周血中LPS后2h的TNFα变化。使用ELISA测量的TNFα血浆浓度；给药：Dex在LPS刺激之前2h以0.2和2mg/Kg进行给药(方形)，INX201J(圆形)在LPS注射之前17h以0.06和0.2mg/Kg的GC有效载荷进行给药。PBS组(实心黑色三角形)在LPS前2h接受PBS。IgG1siJ(G1siJ)组(三角形)在LPS前17h以0.2mg/Kg的有效载荷接受与GC缀合的人IgG1沉默。(SEM；n＝5/组，除非因技术失败被排除在分析之外；与PBS组相比的普通单因素方差分析)。
图30示出了外周血中LPS后2h的TNFα变化。通过ELISA测量了TNFα血浆浓度；给药：Dex在LPS刺激之前2h以0.2和2mg/Kg进行给药(方形)，INX201J(圆形)和INX201N(倒三角形)在LPS注射之前17h以0.2mg/Kg的GC有效载荷进行给药。PBS组在LPS前2h接受PBS(实心黑色三角形)。(SEM；n＝5/组，除非因技术失败被排除在分析之外；与PBS组相比的普通单因素方差分析)。
图31示出了外周血中LPS后2h的TNFα(左)和IL-12p40(右)变化。通过ELISA测量了细胞因子血浆浓度；给药：PBS(实心圆形)、INX201J(方形)、INX231J(三角形)、INX234J(菱形)和INX201P(倒三角形)在LPS注射之前17h以0.2mg/Kg的GC有效载荷进行给药(SEM；n＝5/组；与PBS组相比的普通单因素方差分析)。
图32示出了外周血中LPS后2h的TNFα(左)和IL-12p40(右)变化。通过ELISA测量了细胞因子血浆浓度；给药：PBS(实心三角形)、INX201J(圆形)、INX201O(方形)和INX201P(菱形)在LPS注射之前17h以0.2mg/Kg的GC有效载荷进行给药(SEM；n＝5/组，除非因技术失败被排除在分析之外；与PBS组相比的普通单因素方差分析)。
图33示出了外周血中LPS后2h的TNFα(右)和IL-12p40(左)变化。通过ELISA测量了细胞因子血浆浓度；给药：PBS、INX201J(圆形)、INX201O(方形)和INX201P(菱形)在LPS注射之前17h以0.2mg/Kg的GC有效载荷进行给药(SEM；n＝5/组，除非因技术失败被排除在分析之外；与PBS组相比的普通单因素方差分析(实心黑色三角形))。
图34示出了外周血中LPS后2h的TNFα(右)和IL-12p40(左)变化。通过ELISA测量了细胞因子血浆浓度；所有ADC和PBS在LPS注射之前20h以0.2mg/Kg的GC有效载荷进行给药(INX231P(方形)、INX231R(三角形)、INX233P(菱形))(SEM；n＝5/组，除非因技术失败被排除在分析之外；与PBS组相比的普通单因素方差分析(实心圆形))。
图35示出了外周血中LPS后2h的TNFα(右)和IL-12p40(左)变化。通过ELISA测量了细胞因子血浆浓度；所有ADC和PBS在LPS注射之前20h以0.2mg/Kg的GC有效载荷进行给药(INX231P(实心方形)、INX231R(实心三角形)、INX201O(实心菱形)、INX231S(圆形)、INX231V(方形)、INX231W(三角形))(SEM；n＝4/组，除了INX231S因2个技术失败被排除在分析之外；与PBS组(实心圆形)相比的普通单因素方差分析未示出显著性数据)。
图36示出了ADC治疗后4天腹膜定居中ADC治疗之后的FKBP5转录激活。ADC在第0天i.p.注射，各自递送0.2mg/Kg的GC有效载荷；PRM在第3天被分离。FKBP5转录水平通过实时PCR来测量，并且表示为与PBS对照组相比的Log2倍数变化(SEM，与PBS组相比的普通单因素方差分析，n＝4)。
图37包含实验的结果，所述实验检测了不同细胞上的VISTA表达。如其中所示，VISTA在肝内皮细胞中高度表达。将CD45-CD31+非免疫内皮细胞从hVISTA敲入小鼠肝脏中分离出来，并且用抗人VISTA染色(红线，右移)或未染色(实心灰色)。
图38包含实验的结果，所述实验检测了INX201J注射后肾上腺、脑、肝脏和脾脏中的FKBP5转录激活。如其中所示，INX201J效果在0.3、3、10mg/Kg(分别递送0.006、0.06和0.2mg/Kg的有效载荷)的单一1次i.p.注射后20h测量。Dex在0.2或2mg/Kg的单次i.p.注射后2h测量。FKBP5转录水平通过实时PCR来测量并且表示为与PBS对照组的平均值相比的Log2倍数变化。(n＝4小鼠/组；与仅PBS组相比的普通单因素方差分析)
图39：INX-SM-3、INX-SM-4和INX-SM-1抑制IL-1β(左)和IL-6(右)产生。在24小时时测量了与1ng/mL LPS和类固醇有效载荷的连续稀释液(1000-1nM)一起孵育的人PBMCS的细胞因子水平，其中在对数刻度x轴上<1nM处绘制了未处理对照；n＝1供体，根据技术重复份绘制标准偏差。
图40：INX-SM-1、INX-SM-3、INX-SM-4和INX-SM-6抑制IL-1β产生。在24小时时测量了与1ng/mL LPS和类固醇有效载荷的连续稀释液(1000-1nM)一起孵育的人PBMCS的细胞因子水平，其中在对数刻度x轴上<1nM处绘制了未处理对照；n＝1供体，根据技术重复份绘制标准偏差。
图41：INX-SM-9、INX-SM-31和INX-SM-35抑制IL-1β(上)和IL-6(下)产生。在24小时时测量了与1ng/mL LPS和类固醇有效载荷的连续稀释液(1000-0.2nM)一起孵育的人PBMCS的细胞因子水平，其中在对数刻度x轴上<0.2nM处绘制了未处理对照；n＝2供体——示出了代表性供体。根据技术重复份绘制标准偏差。
图42：INX-SM-32抑制IL-1β(上)和IL-6(下)产生。在24小时时测量了与1ng/mLLPS和类固醇有效载荷的连续稀释液(500-1nM)一起孵育的人PBMCS的细胞因子水平，其中在对数刻度x轴上<1nM处绘制了未处理对照；n＝2。示出了代表性供体。根据技术重复份绘制标准偏差。
图43：INX-SM-10表现出对IL-1β(上)和IL-6(下)产生的稳健抑制。INX-SM-33表现出对细胞因子产生的适度抑制。在24小时时测量了与1ng/mL LPS和类固醇有效载荷的连续稀释液(1000-0.5nM)一起孵育的人PBMCS的细胞因子水平，其中在对数刻度x轴上<0.5nM处绘制了未处理对照；n＝1供体，根据技术重复份绘制标准偏差。
图44：INX-SM-2和INX-SM-7表现出对IL-1β的抑制。在24小时时测量了与1ng/mLLPS和类固醇有效载荷的连续稀释液(1000-0.16nM)一起孵育的人PBMCS的平均细胞因子水平，其中在对数刻度x轴上<0.16nM处绘制了未处理对照；n＝1，根据技术重复份绘制标准偏差。
图45示出了C6和C9两者卤化，但不是单独的C9提供了增加的效力。在24小时时测量了与1ng/mL LPS和类固醇有效载荷的连续稀释液(1000-0.16nM)一起孵育的人PBMCS的平均细胞因子水平，其中在对数刻度x轴上<0.16nM处绘制了未处理对照；n＝1，根据技术重复份绘制标准偏差。
图46包含实验的结果，比较了示例性本发明抗体INX200与人IgG1相比的PK性质。如其中所示，hVISTA KI小鼠中注释时间点的抗体血浆浓度(SD；n＝5/组)。
图47包含实验的结果，比较了767-IgG1.3与人IgG1相比的PK性质。如其中所示，hVISTA KI小鼠中注释时间点的抗体血浆浓度(SD；n＝5/组)。
图48包含实验的结果，比较了根据本发明的其他示例性抗VISTA抗体，即INX231、INX234、INX237和INX240的PK值。如其中所示，hVISTA KI小鼠中注释时间点的抗体血浆浓度(SD；n＝5/组)。左图以Log10显示y轴和x轴，而对于右图，只有y轴以Log10显示。
图49包含实验的结果，比较了根据本发明的示例性抗VISTA抗体，即INX901、INX904、INX907和INX908的PK值。hVISTA KI小鼠注释时间点的抗体血浆浓度(SD；n＝5/组)。
图50包含实验的结果，比较了根据本发明的不同ADC，即INX201J、INX231J、INX234J和INX240 J的PK值。hVISTA KI小鼠注释时间点的抗体血浆浓度(SD；n＝4/组)。
图51包含实验的结果，测定了用示例性VISTA Ab ADC缀合物INX201J和地塞米松长期治疗对皮质酮水平的影响。图示出了血浆皮质酮水平的变化。(SEM，单因素方差分析，n＝8，除了右图中的PBS对照组n＝6)。
图52示出了实施例12中实验1中免疫后第6天来自外周血的Ag特异性CD8 T细胞数。(SEM，单因素方差分析，n＝5)。
图53示出了实施例12中实验2中免疫后第6天来自外周血的Ag特异性CD8 T细胞数。左边的图示出了包括所有样品的PBS对照组，右边的图示出了去除一个异常值的PBS对照组(SEM，单因素方差分析，除了初始外n＝5；一个样品被排除在Dex 0.2mg/Kg的组外作为免疫失败)。
图54示出了实施例12中实验3中免疫后第6天来自外周血的Ag特异性CD8 T细胞数。在此实验中，由于处理期间的技术问题，不得不排除多个样品：PBS组n＝3、2mg/Kg的Dexn＝2、0.2mg/Kg的Dex n＝3、INX201J D-1n＝5、INX201J D-7n＝2、INX231J D-7n＝3、INX234J D-7n＝5、INX240 J D-7n＝4(SEM，单因素方差分析，D＝天)。
图55示出了实施例12中实验3中免疫后第6天来自外周血的Ag特异性CD8 T细胞数。由于技术原因，在PBS、INX231P和INX234P组中，2个样品被排除；对于所有其他组，n＝5(SEM，单因素方差分析)。
图56示出了2个实验方案中外周血中绝对细胞数的变化。第14至18天和第21至25天的OVA攻击(SEM，单因素方差分析，n＝10，除了初始组n＝5)。
图57示出了2个实验方案中外周血中免疫球蛋白产生的变化。第14至18天(第1部分)和第21至25天(第2部分)的OVA攻击(SEM，单因素方差分析，n＝10，除了初始组n＝5)。
图58A-图58B示出了2个实验方案中BAL中免疫浸润的变化。第14至18天(第1部分)和第21至25天(第2部分)的OVA攻击；A)骨髓浸润的变化；B)淋巴细胞浸润的变化(SEM，单因素方差分析，n＝10，对照组删失2个样品，Dex组和INX201J组均删失3个样品；对于初始组，n＝5)。
图59示出了2个实验方案中BAL中细胞因子水平的变化。第14至18天(第1部分)和第21至25天(第2部分)的OVA攻击(SEM，单因素方差分析，n＝10，对照组删失2个样品，Dex组和INX201J组均删失3个样品；对于初始组n＝5)。
图60示出了研究的第1部分的肺疾病评分。(SEM，单因素方差分析，n＝10，除了初始组n＝5)。
图61示出了在脾脏(左)细胞和血液(右)细胞中INX231J注射后的FKBP5转录激活。INX231J效果和hIgG1siJ(灰色)在5mg/Kg(递送0.1mg/Kg的有效载荷)的单一1次i.v.注射后20h时测量。Dex效果在2mg/Kg的单次i.p.注射后2h测量。FKBP5转录水平通过实时PCR来测量，并且表示为与PBS对照组的平均值相比的Log2倍数变化。(n＝4小鼠/组；与仅PBS组相比的普通单因素方差分析。
图62示出了C57Bl/6小鼠中INX231P注射后的FKBP5转录激活。INX231P效果在10mg/Kg(递送0.2mg/Kg的有效载荷)的单一1次i.v.注射后20h测量。Dex效果在2mg/Kg的单次i.p.注射后2h测量。FKBP5转录水平通过实时PCR来测量，并且表示为与PBS对照组的平均值相比的Log2倍数变化。(n＝4小鼠/组；与仅PBS组相比的普通单因素方差分析)。
图63包含实验的结果，示出了C57Bl/6或hVISTA KI小鼠中INX231P注射后的FKBP5转录激活。INX231P效果在10mg/Kg的单一1次i.v.注射后20h测量(递送0.2mg/Kg的有效载荷)。Dex效果在2mg/Kg的单次i.p.注射后2h测量。FKBP5转录水平通过实时PCR来测量，并且表示为与PBS对照组的平均值相比的Log2倍数变化。(n＝4小鼠/组；与仅PBS组相比的普通单因素方差分析)。
图64包含实验结果，表明体内Dex治疗导致离体单核细胞对LPS的炎症反应降低。对小鼠进行PBS或者2mg/Kg或0.2mg/Kg Dex的i.p.注射。在2h之后，将脾单核细胞分离，培养并且经受0、10和100ng/ml的LPS刺激。在Luminex 32-plex上分析24h上清液(n＝5小鼠/组，但样品1、2、3和4、5合并为2个样品)。
图65包含实验的结果，表明用INX231P体内治疗影响离体单核细胞对LPS的炎症反应。在细胞分离之前2h、2天或6天对小鼠进行PBS或2mg/Kg Dex的i.p.注射；在细胞分离之前1、3和7天进行10mg/Kg INX231P和INX901的i.v.注射。在分离之后，将脾单核细胞培养并且经受0或10ng/ml的LPS刺激(仅示出10ng/ml)。通过ELISA分析24h上清液(n＝4小鼠/组；仅对第1天(D1)样品进行与PBS处理组相比的单因素方差分析)。
图66包含实验的结果，表明用INX231P体内治疗影响离体单核细胞对LPS的炎症反应。在细胞分离之前2h对小鼠进行PBS或2mg/Kg Dex的i.p.注射；在细胞分离之前24h进行10mg/Kg INX231P和INX901的i.v.注射。将脾单核细胞培养并且经受10和100ng/ml的LPS刺激。通过ELISA分析24h上清液(n＝4小鼠/组；针对每个LPS剂量，进行单独的与PBS处理组相比的普通单因素方差分析)。
图67示出了B细胞或单核细胞中的FKBP5转录激活。将细胞用20nM的游离J有效载荷，或者等摩尔量的与INX201缀合的有效载荷(INX201J)或同种型对照(huIgG1si J)处理。根据技术重复份分析转录物水平。
图68示出了单核细胞中的FKBP5转录激活。将细胞用增加量的INX201J[0-100nM有效载荷])处理。0有效载荷表示单独用未缀合的INX201抗体处理，所述抗体的量与100nM有效载荷INX201J剂量中的抗体的量相同。根据技术重复份分析转录物水平。
图69示出了用20nM INX-SM-3(游离有效载荷)或摩尔有效载荷当量的INX231P(缀合的有效载荷)处理的来自2个供体的Treg中的FKBP诱导。生成样品并且根据单份进行分析。如通过流式细胞术所评估，分离的Treg纯度≥75％。
图70示出了相对于20nM有效载荷当量huIgG1si J，用20nM有效载荷当量的INX201J处理的来自1个供体的Treg中的FKBP5诱导。根据技术重复份分析样品。如通过流式细胞术所评估，分离的Treg纯度≥75％。
图71总结了基于报告的“每百万的转录物”(TPM)，不同免疫细胞对VISTA和其他ADC靶标(CD40，TNFα，CD74，CD163(PRLR)的共识RNA表达水平，其中TPM<10表示(最小/无表达“-”)；TPM10-100表示(低/中等表达“+”)；并且TPM>100表示(高表达“++”)。
图72A-图72E总结了鉴定的细胞群上VISTA、CD74、CD163和mTNFα抗原密度的量化：A)单核细胞表达VISTA、CD74和CD163；B)B细胞表达CD74；C)CD4+T细胞；D)CD4+Treg；以及E)CD8+T细胞表达VISTA(平均值±SD，n＝5供体)。
图73A-图73F示出了人血液中鉴定的细胞群上VISTA、CD74、CD163和mTNFα抗原密度的量化：A)单核细胞表达VISTA、CD74和CD163；B)B细胞表达CD74；C)嗜中性粒细胞表达VISTA；D)CD4+T细胞；E)CD4+Treg；以及F)CD8+T细胞表达VISTA(平均值±SD，n＝3)。
具体实施方式
本文提供了包含以下的ADC：抗VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段在生理条件(pH约7.5)下具有非常短的血清半衰期，通常血清半衰期在生理条件(约pH 7.5)下在人VISTA敲入啮齿动物中为1至72小时、1至32小时、1至16小时、1至8小时、1至4小时或1-2小时±0.5小时或在灵长类动物(食蟹猕猴)中为约3.5、3、2.5或2.3天±0.5天；以及需要细胞内化以获得功效的小分子抗炎药，例如糖皮质激素受体激动剂，诸如糖皮质激素，所述糖皮质激素任选经由接头(例如肽或非肽接头，其任选可在特定条件下是可切割的，例如酯酶可切割二肽接头，并且所述接头任选经由异双官能基团或异三官能基团直接或间接与抗体附接)附接，其中此类ADC在施用于有需要的受试者时将这种抗炎剂递送至靶免疫细胞(例如单核细胞、T细胞、嗜中性粒细胞、Treg、CD8 T细胞、CD4T细胞或骨髓细胞)并且导致所述抗炎剂功能内化至所述细胞中，在所述细胞中糖皮质激素或其他抗炎剂引发对炎症的期望抑制效果，而不会引发不良副作用(诸如对非靶细胞的毒性)或实质上引发降低的不良副作用。还提供了制备此类ADC的方法和使用所述ADC，特别是用于治疗自身免疫性和炎症性病状诸如先前确定的那些病状的方法。
更具体地提供了新型抗体药物缀合物(ADC)，其包含在生理条件(约pH 7.5)下具有非常短的血清半衰期的抗VISTA抗体或抗体片段以及抗炎药，例如小分子抗炎药，例如糖皮质激素受体激动剂诸如地塞米松、泼尼松龙或布地奈德等或者本文公开的其他类固醇之一。
还更具体地提供了新型抗体药物缀合物(ADC)，其包含在生理条件(约pH 7.5)下在人VISTA敲入啮齿动物中血清半衰期为1至72小时、1至32小时、1至16小时、1至8小时、1至4小时或1-2小时±0.5小时，或者在灵长类动物(食蟹猕猴)中血清半衰期为约3.5、3、2.5或2.3天±0.5天的抗VISTA抗体或抗体片段以及抗炎药，例如合成糖皮质激素受体激动剂，诸如地塞米松、泼尼松龙或布地奈德等，因此此类ADC在施用时导致抗炎药释放并内化到靶免疫细胞中，所述抗炎药例如合成糖皮质激素受体激动剂，诸如地塞米松、泼尼松龙或布地奈德或者其他糖皮质激素或衍生物。
还更具体地提供了抗体药物缀合物(ADC)，其包含：抗体或抗原结合片段(“A”)，所述抗体或抗原结合片段包含特异性结合至人T细胞激活V结构域Ig抑制因子(人VISTA)的抗原结合区；可切割或不可切割接头(“L”)；以及至少一种小分子抗炎剂(“AI”)；任选“异双官能基团”或“异三官能基团”“Q”，所述Q是任选用于将接头连接至抗VISTA抗体或抗体片段的化学部分；以及至少一种小分子抗炎剂(“AI”)，所述ADC由下式表示：
“A-(Q-L-AI)n”或“(AI-L-Q)n-A”
其中“n”至少为1，并且当向有需要的受试者施用时，抗体或ADC或含有其的组合物优先递送至表达VISTA的免疫细胞(任选单核细胞或骨髓细胞)并且导致小分子抗炎剂在生理条件(约pH 7.5)下功能内化至所述免疫细胞中，优选其中抗VISTA抗体或抗原结合片段在体内使用时在生理pH(约pH 7.5)下在血清中具有短体内血清半衰期，在生理条件(约pH7.5)下在人VISTA敲入啮齿动物中为1至72小时、1至32小时、1至16小时、1至8小时、1至4小时或1-2小时±0.5小时或者在灵长类动物(食蟹猕猴)中为约3.5、3、2.5或2.3天±0.5天。
此外，本发明提供了新型类固醇，其中所述类固醇(糖皮质激素激动剂)通常包含以下通用结构：
式1
Figure BDA0004033983910000431
其中X或Z可以是苯基、3-6元杂环、环烷基、螺烷基、螺杂环烷基、[1.1.1]双环戊烷、双环[2.2.2]辛烷或立方烷，其各自可以被1-4个独立地选自N、S和O的杂原子取代并且任选进一步被1-4个C1-3烷基取代；
X至Z的键联可以占据X和Z上的任何可用位置；
Y可以是CHR1、O、S或NR1；
E可以是CH2或O；
G可以是CH2或NR1；
R1可以是H、1-8个碳的低级或支链烷基、芳基或杂芳基。在芳基或杂芳基环被取代的情况下，所述取代基可以是烷基、卤代烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫代烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基-C(O)-；
当R1＝H时，R2可以是H、1-8个碳的低级或支链烷基、芳基或杂芳基。在芳基或杂芳基环被取代的情况下，所述取代基可以是烷基、卤代烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫代烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基-C(O)-；
当R1是H、1-8个碳的低级或支链烷基、杂芳基时，R2可以是选自以下的官能团：[(C＝O)CH2(W)NHC＝O]m-V-J并且W可以是H或[(CH2)n R3]n，其中n＝1-4并且m＝1-6。W也可以是以R3为末端的支链烷基链或1-13个单元的聚乙二醇基团OCH2CH2O；
R3可以是H或选自以下：OH、O-烷基、NH2、NH-烷基、N-二烷基、SH、S-烷基、胍、脲、羧酸、羧酰胺、羧酸酯、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基，所述取代基可以是烷基、卤代烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫代烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基-C(O)-；
取代基NR1R2可以占据Z上的任何可用位置；
R2也可以是C(＝O)OCH2-对-氨基苯基[(C＝O)CH(W)NHC＝O]m-V-J并且W可以是H或[(CH2)n R3]n，其中n＝1-4并且m＝1-6。W也可以是以R3为末端的支链烷基链、1-13个单元的聚乙二醇基团OCH2CH2O或C(＝O)OCH2-对-氨基苯基-V-J；
V可以是1-8个碳的烷基链、1-13个单元的聚乙二醇基团OCH2CH2O或选自1-8个碳的低级或支链烷基、芳基或杂芳基。当芳基或杂芳基环被取代时，所述取代基可以是烷基、卤代烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫代烷基、胍、尿素、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-、二烷基氨基-C(O)-和1-3个选自Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、βAla、Phe、Val或Cit的氨基酸序列；
J是选自-NH2、N3、硫代、环辛炔、-OH、-CO2H、反式-环辛炔的反应性基团，
Figure BDA0004033983910000451
其中R32是Cl、Br、F、甲磺酸酯或甲苯磺酸酯并且R33是Cl、Br、I、F、OH、-O-N-琥珀酰亚胺基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基，R34是H、Me或四嗪-H或Me；
Q可以是H、P(O)OR4(其中R4可以是H或低级1-10烷基)、C(O)R6(其中R6是1-8个碳的低级或支链烷基)或[(C＝O)NR4CHnNR4(C＝O)OCHm]m-V-V-J(其中n＝1-8，m＝1-6并且R4＝H、烷基或支链烷基)；
A1和A2可以是H或卤素，并且除非另有说明，否则包括所有可能的立体异构体；并且此外，其中接头“L”可以包括一个或多个不可切割或可切割接头，包括本领域已知的和本文例示的那些中的任一者(参见接头定义、在本申请的示例性实施方案部分中确定的接头和下文实施例3中体现的类固醇-接头有效载荷和ADC的合成中使用的那些。
此外，本发明提供了包含上文式1新型类固醇的ADC和类固醇-接头有效载荷、包含其的组合物以及它们用于以下方面的用途：治疗/预防炎症和治疗有需要的受试者的与炎症急性、慢性或发作性相关的任何病状或病症，例如像炎症性疾病、自身免疫性疾病、感染、癌症以及下文公开的其他病状。
根据一般理解，除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与为本发明所属领域的普通技术人员通常理解的那些含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料可以用于本发明或本发明的测试，但本文描述了合适的方法和材料。所述材料、方法和实施例仅为例示性的，并且不旨在是限制性的。结合本文描述的分析化学、合成有机化学以及医药化学所使用的命名法以和它们的实验室流程和技术是本领域众所周知且常用的那些。标准技术可以用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂以及递送和患者治疗。
I.定义
为促进对本公开的理解，以下定义了多个术语和短语。
如在本文描述以及随后的整个权利要求书中所用，“一个/种(a/an)”和“所述(the)”的含义包括复数个指示物，除非上下文另外清楚地指出。
在本公开中，术语“糖皮质激素”或“类固醇”是指与糖皮质激素受体相互作用的天然存在或合成的类固醇激素。非限制性示例性糖皮质激素包括WO 2009/069032、US20180126000、WO05/028495等中描述的那些。非限制性示例性糖皮质激素包括：
Figure BDA0004033983910000461
其他糖皮质激素描述在WO 2009/069032中。糖皮质激素的具体实例包括16-α羟基泼尼松龙、地塞米松、二氟拉松、氟米松、氟尼缩松、醋酸氟轻松、丙酸氟替卡松、环索奈德、甲基泼尼松龙、强的松、泼尼松龙、莫米松、曲安奈德和本文公开的式1新型类固醇。
“糖皮质激素衍生物”是通过添加或去除一个或多个原子或官能团以便促进“糖皮质激素衍生物”附接至另一部分例如接头和/或抗体或抗体片段而衍生的化合物。通常，这种添加或去除不会妨碍“糖皮质激素衍生物”的活性，即其在被免疫细胞内化后引发抗炎活性的能力。“糖皮质激素衍生物”具体包括“糖皮质激素的自由基”或“糖皮质激素自由基”。
“糖皮质激素的自由基”或“糖皮质激素自由基”通过从母体糖皮质激素去除一个或多个原子(即，氢原子)以便促进母体糖皮质激素附接至另一部分(通常是接头)而产生。例如，可以从母体糖皮质激素的任何合适的-NH2基团中去除氢原子；可以从母体糖皮质激素的任何合适的-OH基团中去除氢原子；可以从任何合适的-SH基团中去除氢原子；可以从任何合适的-N(H)-基团中去除氢原子；从母体糖皮质激素的任何合适的-CH3、-CH2-或-CH＝基团中去除氢原子。
在本公开中，术语“异双官能基团”或术语“异三官能基团”是指任选可以用于连接接头和抗VISTA抗体或抗体片段的化学部分(本文公开的ADC通式中的(“Q”))。异双官能基团和异三官能基团的特征在于在化学部分的任一端具有不同的反应性基团。非限制性示例性异双官能基团在美国公开号：20180126000中公开，其以引用的方式并入本文并且非限制性示例性异双官能基团在示例性实施方案部分和本申请的实施例3中公开的ADC缀合物进一步例示。
异双官能基团和异三官能基团在本领域中公知用于特异性地产生蛋白质缀合物和抗体药物缀合物(ADC)。这些部分的特征在于在化学部分的任一端具有不同的反应性基团。非限制性示例性异双官能基团包括：
Figure BDA0004033983910000481
示例性异三官能基团为：
Figure BDA0004033983910000482
如本文所用，术语“抗体(antibody/antibodies)”是本领域术语并且可以在本文中互换使用并且是指具有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。
术语“抗体”意指通过免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并且特异性结合靶标(诸如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述的组合)的免疫球蛋白分子。如本文所用，术语“抗体”涵盖完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的融合蛋白和任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要抗体表现出所需的生物活性。抗体可以是免疫球蛋白的五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM或者其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)中的任一种，这基于它们的重链恒定结构域(分别称为α、δ、ε、γ和μ)的身份。不同类别的免疫球蛋白具有不同且众所周知的亚基结构和三维构型。抗体可以是裸的或与其他分子诸如毒素、放射性同位素等缀合。如本文所用，术语“抗体”涵盖双特异性和多特异性抗体。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分。“抗原结合片段”是指与抗原结合的完整抗体的一部分。抗原结合片段可以含有完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体和单链抗体。“抗原结合片段”可以是双特异性或多特异性抗原结合片段。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其结合的抗原诸如VISTA的生物活性的抗体。在一些实施方案中，阻断抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。生物活性可以降低10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。
“促进”抗体或“增强”抗体或“激动剂”抗体是增强或增加其结合的抗原诸如VISTA的生物活性的抗体。在一些实施方案中，阻断抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。生物活性可以降低10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。
术语“抗VISTA抗体”或“结合VISTA的抗体”是指特异性结合VISTA(通常是具有足够的亲和力，使得所述抗体可用于靶向表达VISTA的免疫细胞人VISTA)的抗体。抗VISTA抗体与不相关、非VISTA蛋白的结合程度可以小于抗体与VISTA的结合的约10％，例如像通过放射免疫测定(RIA)所测量。在某些实施方案中，结合VISTA的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。包含在主题ADC中的示例性抗VISTA抗体和片段将包含与VSTB94或VSTB49-116中相同的CDR和/或相同的可变重链和可变轻链多肽，即分别具有图8、图10和图12中所示的序列。
“单克隆”抗体或其抗原结合片段是指参与单个抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合的同源抗体或抗原结合片段群。这与通常包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体形成对比。术语“单克隆”抗体或其抗原结合片段涵盖完整且全长单克隆抗体以及抗体片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白，以及包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆”抗体或其抗原结合片段是指以包括但不限于杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物的任意多种方式制备的此类抗体及其抗原结合片段。
术语“人源化”抗体或其抗原结合片段是指非人(例如鼠类)抗体或抗原结合片段的形式，它们是特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其片段，它们含有最少的非人(例如鼠类)序列。通常，人源化抗体或其抗原结合片段是人免疫球蛋白，其中来自互补决定区(CDR)的残基被来自具有所需的特异性、亲和力和能力的非人物种(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠)的CDR替换(“CDR移植”)(Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science 239:1534-1536(1988))。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被替换为来自非人物种的抗体或片段中的对应的、具有所需特异性、亲和力和能力的残基。人源化抗体或其抗原结合片段可以通过取代Fv框架区中和/或替换的非人残基内的额外残基来进一步修饰以改善和优化抗体或其抗原结合片段的特异性、亲和力和/或能力。一般而言，人源化抗体或其抗原结合片段将包含基本上所有或至少一个、并且通常是两个或三个可变结构域，所述可变结构域含有对应于非人免疫球蛋白的所有或基本上所有CDR区，而所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体或其抗原结合片段还可以包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。用于产生人源化抗体的方法的实例描述在美国专利号5,225,539；Roguska等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91(3):969-973(1994)和Roguska等人,Protein Eng.9(10):895-904(1996)中。在一些实施方案中，“人源化抗体”是表面重修的抗体(resurfaced antibody)。
抗体的“可变区”是指单独或组合的抗体轻链可变区或抗体重链可变区。重链和轻链的可变区各自均由四个框架区(FR)组成，这些框架区(FR)通过三个也称为高变区的互补决定区(CDR)连接。每条链中的CDR通过FR紧密地结合在一起，并且与来自另一条链的CDR紧密地结合在一起，这有助于抗体的抗原结合位点的形成。至少有两种用于确定CDR的技术：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即，Kabat等人Sequences of Proteins ofImmunological Interest,(第5版,1991,National Institutes of Health,BethesdaMd.))；以及(2)基于抗原-抗体复合物晶体学研究的方法(Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273:927-948))。此外，在本领域中有时将这两种方法的组合用于确定CDR。
Kabat编号系统通常在指代可变结构域中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时使用(例如，Kabat等人,Sequences of Immunological Interest.第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。除非另有明确说明，否则本文使用的编号系统是Kabat编号系统。
如Kabat中的氨基酸位置编号是指用于Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)中抗体汇编的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这种编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有更少或额外的氨基酸，对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变结构域可以包含在H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后的插入的残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。通过在抗体序列的同源区域与“标准”Kabat编号的序列进行比对，可以确定给定抗体的残基的Kabat编号。而Chothia是指结构环的位置(Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。当使用Kabat编号约定进行编号时，Chothia CDR-H1环的末端取决于环的长度在H32与H34之间变化(这是因为Kabat编号方案将插入置于H35A和H35B处；如果35A和35B都不存在，则环在32处结束；如果仅存在35A，则环在33处结束；如果35A和35B都存在，则环在34处结束)。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，并且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。
在某些方面，抗体或其抗原结合片段的CDR可以根据Chothia编号方案来确定，所述Chothia编号方案是指免疫球蛋白结构环的位置(参见，例如，Chothia C和Lesk A M,(1987),J Mol Biol 196:901-917；Al-Lazikani B等人,(1997)J Mol Biol 273:927-948；Chothia C等人,(1992)J Mol Biol 227:799-817；Tramontano A等人,(1990)J Mol Biol215(1):175-82；和美国专利号7,709,226)。通常，当使用Kabat编号约定时，Chothia CDR-H1环存在于重链氨基酸26至32、33或34处，Chothia CDR-H2环存在于重链氨基酸52至56处，并且Chothia CDR-H3环存在于重链氨基酸95至102处，而Chothia CDR-L1环存在于轻链氨基酸24至34处，Chothia CDR-L2环存在于轻链氨基酸50至56处，并且Chothia CDR-L3环存在于轻链氨基酸89至97处。当使用Kabat编号约定进行编号时，Chothia CDR-H1环的末端取决于环的长度在H32与H34之间变化(这是因为Kabat编号方案将插入置于H35A和H35B处；如果35A和35B都不存在，则环在32处结束；如果仅存在35A，则环在33处结束；如果35A和35B都存在，则环在34处结束)。
在某些方面，可以根据如Lefranc M-P,(1999)The Immunologist 7:132-136和Lefranc M-P等人,(1999)Nucleic Acids Res 27:209-212中描述的IMGT编号系统确定抗体或其抗原结合片段的CDR。根据IMGT编号方案，VH-CDR1在位置26至35处，VH-CDR2在位置51至57处，VH-CDR3在位置93至102处，VL-CDR1在位置27至32处，VL-CDR2在位置50至52处，并且VL-CDR3在位置89至97处。
在某些方面，可以根据MacCallum R M等人,(1996)J Mol Biol 262:732-745确定抗体或其抗原结合片段的CDR。也参见，例如，Martin A."Protein Sequence andStructure Analysis of Antibody Variable Domains,"in Antibody Engineering,Kontermann和Dubel,编,第31章,第422-439页,Springer-Verlag,Berlin(2001)。
在某些方面，抗体或其抗原结合片段的CDR可以根据AbM编号方案确定，所述AbM编号方案是指代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷并且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件(Oxford Molecular Group,Inc.)使用的AbM高变区。
抗体的“恒定区”是指单独或组合的抗体轻链恒定区或抗体重链恒定区。
术语“人”抗体意指由人产生的抗体或者使用本领域已知的任何技术制成的具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义包括完整或全长抗体、其片段、和/或包含至少一种人重链和/或轻链多肽的抗体，例如像包含鼠类轻链和人重链多肽的抗体。
术语“嵌合”抗体是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两个或更多个物种的抗体。通常，轻链和重链两者的可变区对应于来源于一种哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔等)的抗体的、具有所需的特异性、亲和力和能力的可变区，而恒定区与来源于另一种哺乳动物(通常是人)的抗体中的序列同源，以避免在所述物种中引发免疫反应。
术语“表位”或“抗原决定簇”在本文中可互换使用，并且是指能够被特定抗体识别且特异性结合的抗原的那一部分。当抗原是多肽时，表位可以由连续氨基酸和通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸两者形成。由连续氨基酸形成的表位通常在蛋白质变性时保留，而由三级折叠形成的表位通常在蛋白质变性时丢失。表位通常包含至少3个，并且更通常至少5个或8-10个呈独特的空间构象形式的氨基酸。图10中确定了示例性抗VISTA抗体可以结合的VISTA上的优选表位。
“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合伴侣(例如，抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另外说明，否则如本文所用的“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常用方法(包括本文所述的那些方法)来测量。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且往往易于解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且往往更长久的保持结合。测量结合亲和力的多种方法在本领域中是已知的，所述方法中的任一种都可以用于本公开的目的。此类方法包括表面等离子共振(BIAcore)、ELISA、Kinexa生物传感器、闪烁邻近分析、ORIGEN免疫分析(IGEN)、荧光淬灭、荧光转移和/或酵母展示。也可以使用合适的生物测定法筛选结合亲和力。在本申请中，示例性ADC中包含的示例性抗VISTA抗体的Kd通过表面等离子共振(SPR)方法在ProteOn仪器上进行测定。
当在本文中用于指代结合亲和力时，“或更好”是指分子与其结合伴侣之间的更强的结合。在本文中使用时，“或更好”是指更强的结合，由更小的Kd数值表示。例如，若抗体对抗原的亲和力为“0.6nM或更好”，则抗体对抗原的亲和力为<0.6nM，即0.59nM、0.58nM、0.57nM等或小于0.6nM的任何值。
“特异性结合”通常意指抗体经由其抗原结合结构域与表位结合，并且所述结合需要抗原结合结构域与表位之间的某种互补性。根据此定义，当抗体经由其抗原结合结构域与某一表位的结合比与随机、不相关的表位的结合更容易时，所述抗体被称为与所述表位“特异性结合”。术语“特异性”在本文中用于限定某一抗体与某一表位结合的相对亲和力。例如，可以认为抗体“A”针对给定表位的特异性比抗体“B”更高，或者可以说抗体“A”以比其针对相关的表位“D”的特异性更高的特异性结合表位“C”。
“优先结合”意指抗体与表位的特异性结合比其与相关的、相似的、同源的或类似的表位的结合更容易。因此，“优先结合”给定表位的抗体将更有可能结合所述表位而不是相关的表位，即使这样的抗体可能与相关的表位发生交叉反应。
如果抗体优先与给定表位或重叠表位结合至其在某种程度上阻断参考抗体与所述表位的结合，则称所述抗体“竞争性抑制”参考抗体与所述表位的结合。竞争性抑制可以通过本领域已知的任何方法来确定，例如竞争性ELISA测定。可以说抗体竞争性抑制参考抗体与给定表位的结合至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。
“同种型”在本文中是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM、IgG1、IgG3、IgG3或IgG4)。
如本文所用，“K-assoc”或“Ka”泛指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而如本文所用，术语“Kdiss”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。
如本文所用，术语“KD”旨在指代解离常数，其从Kd与Ka的比率(即，Kd/Ka)获得，并且表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以使用本领域已确立的方法确定，诸如等离子共振
Figure BDA0004033983910000551
ELISA和KINEXA。确定抗体KD的优选方法是通过使用表面等离子共振，优选使用生物传感器系统诸如
Figure BDA0004033983910000552
系统或通过ELISA。通常，这些方法在25℃或37℃下进行。用于治疗用途的抗体在通过表面等离子共振测定时将在25℃或37℃下拥有通常50nM或更小或者更通常1nM或更小的KD。
本文中的短语“Kd”是指抗体与其抗原之间的平衡解离常数，即计算的Koff/Kon比率。缔合常数(Kon)用于表征抗体与其靶标结合的速度。在本文中抗体Kd通过表面等离子共振(SPR)使用Proteon仪器来测定。
本文中的短语“PK”是指一半量的抗体或抗体片段或抗体药物缀合物(ADC)，优选根据本发明的抗VISTA或抗体片段(即，包含在生理pH下与表达VISTA的细胞结合的抗VISTA抗体或抗体片段以及抗炎剂(AI)的抗体药物缀合物(ADC)，所述AI是需要细胞内化以获得功效(抗炎活性)的小分子，并且通常是类固醇)保留在血清中的外周循环中的体内半衰期或持续期(时间)。PK可以在被施用抗体或抗体片段或ADC的受试者例如人VISTA敲入啮齿动物或灵长类动物(例如，人或食蟹猕猴)中体内测定。如下文所述，包含在主题ADC中的抗VISTA抗体通常将包含短PK，即，在食蟹猕猴中通常大约2.3±0.7天，并且在人VISTA敲入啮齿动物中通常至多约2.5天且更通常仅几小时或更短。
本文中的短语“PD”是指一定剂量的抗体药物缀合物(ADC)，优选根据本发明的抗体药物缀合物(ADC)(即，包含在生理pH下与表达VISTA的细胞结合的抗VISTA抗体或抗体片段以及抗炎剂(AI)的抗体药物缀合物(ADC)，所述AI是需要细胞内化以获得功效(抗炎活性)的小分子，并且通常包含类固醇))引发功效(抗炎活性)的持续期(时间)。类固醇的PD可以通过不同的测定来确定。例如，根据本发明的VISTA ADC的PD可以使用与ADC接触的表达VISTA的免疫细胞体外测定，或者可以在被施用ADC剂量的受试者例如啮齿动物或灵长类动物(例如，人或食蟹猕猴)中体内测定。因为主题ADC与不同的免疫细胞(例如，T细胞、Treg、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞)结合，并且还因为这些ADC基于相对VISTA表达不同地内化抗VISTA抗体ADC，并且还因为此类表达VISTA的免疫细胞的周转速率有所不同，所以如果使用不同类型的表达VISTA的免疫细胞进行体外测定，则PD值将有所不同。通常在本文中，PD基于由巨噬细胞引发的抗炎活性的持续时间来表示，因为这些细胞存在于循环中并且(令人惊讶地)在ADC施用之后数周引发抗炎活性。
在本文中短语PK/PD比率是指在特定物种的免疫细胞中或在动物模型中，例如人VISTA敲入啮齿动物或灵长类动物(例如，人或食蟹猕猴)中，体外或体内测定的根据本发明的ADC的PK值/PD值的比率。[如下文所示，根据本发明的ADC的PK/PD比率已被证明在VISTA敲入啮齿动物中惊人地高，即至少14:1。此外，类似或更高的PK/PD比率预计在人和非人灵长类动物中获得，因为在啮齿动物以及人和灵长类动物中不同免疫细胞的VISTA表达非常相似，并且还因为药物代谢在啮齿动物中通常比在人和非人灵长类动物中发生得快得多。虽然申请人不希望受此理论的约束；据信，由于这些免疫细胞上的表面VISTA表达的高密度(这显然会产生“储库效应(depot effect)”，即内化ADC的储库非常缓慢地代谢，从而提供治疗有效(抗炎)量的抗炎剂(例如，类固醇)的令人惊讶的延长释放)，所述主题ADC以非常高的量内化特定类型的表达VISTA的细胞。
“功效开始”是指治疗剂例如类固醇或ADC缀合物的功效在体内开始产生的时间。在本发明中，这可以使用检测类固醇的抗炎功效的已知体内测定法在被施用根据本发明的类固醇或ADC缀合物的受试者中检测。如下文公开的，根据本发明的ADC在人VISTA敲入啮齿动物中已显示出具有快速功效开始，即约2小时。
如本文所用，短语“基本相似”或“基本相同”表示两个数值之间足够高的相似度(通常一个与本公开的抗体相关，而另一个与参考或比较物抗体相关)，使得本领域技术人员会认为所述两个值之间的差异在由所述值(例如，Kd值)测量的生物学特性的上下文内几乎不具有或不具有生物学和/或统计学显著性。所述两个值之间的差异可以小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％或小于约10％，随参考/比较物抗体的值而变化。
“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是自然界中未发现的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已被纯化到不再呈其在自然界中存在的形式的程度的那些。在一些实施方案中，分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。
如本文所用，“基本上纯的”是指至少50％纯(即，不含污染物)、至少90％纯、至少95％纯、至少98％纯或至少99％纯的材料。
如本文所用，术语“免疫缀合物”、“缀合物”、“抗体药物缀合物”或“ADC”是指与抗VISTA抗体或其片段连接的化合物或其衍生物和抗炎剂诸如糖皮质激素激动剂以及通常居间的接头，其可以由通式表示：(AI-L-Q)n-A，其中AI＝抗炎剂，通常是小分子糖皮质激素受体激动剂，例如糖皮质激素，其可包括根据式1的类固醇；L＝接头；Q＝异双官能基团、异三官能基团或不存在；以及A＝抗VISTA抗体或其VISTA结合片段，其在生理pH下优先结合人VISTA并且其通常具有如上所述的较短的pK，并且n是大于1的整数，任选1-10。免疫缀合物也可以通过相反的顺序的通式来定义：A-(Q-L-AI)n。
在本公开中，术语“接头”是指能够连接抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗炎剂药物的功能等效物(通常是糖皮质激素受体激动剂，例如，糖皮质激素)的任何化学部分。接头可能对切割敏感(“可切割接头”)，从而促进抗炎剂诸如糖皮质激素的释放。例如，在糖皮质激素和/或抗体在内化到免疫细胞诸如单核细胞或骨髓细胞之前或之后保持活性的条件下，此类可切割接头可能对酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键切割敏感。或者，接头可以基本上对切割具有抗性(“不可切割接头”)。
不可切割接头包括能够以稳定的共价方式将抗炎剂诸如糖皮质激素激动剂糖皮质激素与抗体连接并且不落入以上列出类别的可切割接头的任何化学部分。因此，不可切割接头基本上对酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键切割具有抗性。此外，不可切割是指在糖皮质激素和/或抗体在内化到免疫细胞诸如单核细胞或骨髓细胞之前或之后不会失去其活性的条件下，接头中或与接头相邻的化学键经受由酸、光不稳定切割剂、肽酶、酯酶或切割二硫键的化学或生理化合物诱导的切割的能力。
一些可切割接头被肽酶切割(“肽酶可切割接头”)。只有某些肽在细胞内或细胞外容易被切割，参见例如Trout等人,79Proc.Natl.Acad.Sci.USA,626-629(1982)和Umemoto等人43Int.J.Cancer,677-684(1989)。此外，肽由α-氨基酸单元和肽键构成，所述肽键在化学上是一个氨基酸的羧酸基与第二个氨基酸的氨基之间的酰胺键。其他酰胺键诸如赖氨酸的羧酸基与α氨基酸基团之间的键被理解为不是肽键并且被认为是不可切割的。
一些接头被酯酶切割(“酯酶可切割接头”)。只有某些酯可以被细胞内或细胞外存在的酯酶切割。酯是由羧酸和醇缩合形成的。简单酯是用简单的醇诸如脂族醇以及小环醇和小芳族醇产生的酯。
在一些实施方案中，可切割接头组分可以包含有包含一至十个氨基酸残基的肽。在这些实施方案中，肽允许通过蛋白酶切割接头，从而在暴露于细胞内蛋白酶诸如溶酶体酶时促进抗炎剂例如糖皮质激素的释放(Doronina等人(2003)Nat.Biotechnol.21:778-784)。示例性肽包括但不限于二肽、三肽、四肽和五肽。示例性二肽包括但不限于丙氨酸-丙氨酸(ala-ala)、缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)；苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)；苯丙氨酸-高赖氨酸(phe-homolys)；和N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。示例性三肽包括但不限于甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)以及“示例性实施方案”部分中确定和本申请的实施例3中体现的特定接头。
肽可以包含天然存在的和/或非天然氨基酸残基。术语“天然存在的氨基酸”是指Ala、Asp、Cys、Glu、Phe、Gly、His、He、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr。“非天然氨基酸”(即，氨基酸不是天然存在的)包括(作为非限制性实例)高丝氨酸、高精氨酸、瓜氨酸、苯基甘氨酸、牛磺酸、碘代酪氨酸、硒代半胱氨酸、正亮氨酸(“Nle”)、正缬氨酸(“Nva”)、β-丙氨酸、L-或D-萘基丙氨酸(L-or D-naphthalanine)、鸟氨酸(“Orn”)等。肽可以被设计和优化以供特定酶进行酶促切割，所述特定酶例如，肿瘤相关的蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D或者纤溶酶蛋白酶。
氨基酸还包括天然和非天然氨基酸的D型。“D-”表示具有“D”(右旋)构型(与天然存在的(“L-”)氨基酸中的构型相反)的氨基酸。天然和非天然氨基酸可以商业购买(SigmaChemical Co.,Advanced Chemtech)或使用本领域已知的方法合成。
术语“药物抗体比”或“DAR”是指与A(抗VISTA抗体或其抗原结合片段)连接的抗炎剂或功能衍生物(即衍生自小分子糖皮质激素受体激动剂例如糖皮质激素诸如地塞米松或布地奈德的自由基)的数量。因此，在具有通式(AI-L-Q)n-A或相反通式的免疫缀合物中，DAR由变量“n”定义。
当提及具有式(AI-L-Q)n-A的化合物代表单个免疫缀合物时，DAR是指与A连接(例如，n是1至10的整数或分数)/与特定的A连接(例如，n是1至10的整数)的炎症性剂或功能衍生物(例如，衍生自小分子糖皮质激素受体激动剂例如糖皮质激素诸如地塞米松或布地奈德或新型式1类固醇的自由基)的数量。
当提及具有式(AI-L-Q)n-A的化合物代表多个免疫缀合物时，DAR是指与A连接(例如，n是1至10的整数或分数)的抗炎剂或功能衍生物(例如，衍生自小分子糖皮质激素受体激动剂例如糖皮质激素诸如地塞米松或布地奈德或新型式1类固醇的自由基)的平均数量。因此，举例来说，包含具有3AI/A的第一免疫缀合物和具有4AI/A的第二免疫缀合物的具有式(AI-L-Q)n-A的化合物将具有3.5的DAR(即，“n”)。
术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物等，它们将成为特定治疗的接受者。通常，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，指的是人受试者。
术语“药物制剂”是指呈允许活性成分的生物活性有效的形式的制备剂，并且其不含对将施用制剂的受试者具有不可接受的毒性的其它组分。制剂可以是无菌的。
如本文所公开的ADC或糖皮质激素受体激动剂的“有效量”是足以实现特定所述目的的量。可以根据所述目的确定“有效量”。
术语“治疗有效量”是指有效“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或病症的免疫缀合物或糖皮质激素受体激动剂的量。“预防有效量”是指有效达到所需预防结果的量。
术语诸如“治疗(treating/treatment/to treat)”或“缓解(alleviating/toalleviate)”是指治愈、减缓、减轻所诊断的病理病状或病症的症状的和/或停止其进展的治疗措施。因此，需要治疗的那些包括已经被诊断患有或怀疑患有病症的那些。预防或防止措施是指防止和/或减缓目标病理病状或病症的发展的措施。因此，需要预防或防止措施的那些包括容易患病症的那些和要防止病症的那些。
如本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或者可以通过DNA或RNA聚合酶掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可以间杂非核苷酸组分。多核苷酸可以在聚合之后进一步进行修饰，诸如通过与标记组分缀合。其他类型的修饰包括例如“帽”；用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，例如像具有不带电荷的键联(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和具有带电荷的键联(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰；含有侧基部分例如像蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、ply-L-赖氨酸等)的修饰；具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的修饰；含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的修饰；含有烷基化剂的修饰；具有修饰的键联(例如，α异头(anomeric)核酸等)的修饰；以及未修饰形式的多核苷酸。此外，通常存在于糖中的任何羟基可以例如被膦酸酯基团、磷酸酯基团取代，被标准保护基团保护，或被激活以制备与额外核苷酸的额外键联，或者可以与固体支持物缀合。5'和3'端OH可以被磷酸化或被胺或1至20个碳原子的有机封端基团部分取代。其他羟基也可以衍生为标准保护基团。多核苷酸还可以含有本领域通常已知的类似形式的核糖或脱氧核糖，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖(诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。一个或多个磷酸二酯键联可以被替代的连接基团替换。这些替代的连接基团包括但不限于其中磷酸酯基被P(O)S(“硫代磷酸酯基(thioate)”)、P(S)S(“二硫代磷酸酯基(dithioate)”)、“(O)NR2(“酰胺酸酯基(amidate)”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲缩醛基(formacetal)”)替换的实施方案，其中每个R或R'独立地为H或任选含有醚(-O-)键联、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)的取代或未取代的烷基(1-20C)。并非多核苷酸中的所有键联都需要相同。前述描述适用于本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
术语“载体”意指能够在宿主细胞中递送和任选表达一种或多种感兴趣的基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体、封装在脂质体中的DNA或RNA表达载体，以及某些真核细胞，诸如生产细胞。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可在本文中互换用于指代任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链或支链的，其可以包含修饰的氨基酸，并且其可以间杂非氨基酸。所述术语还涵盖已被天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵或修饰(诸如与标记组分缀合)。定义内还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽，以及本领域已知的其他修饰。应当理解，因为本公开的多肽基于抗体，所以在某些实施方案中，多肽可以作为单链或缔合链出现。
在两个或更多个核酸或多肽的上下文中，术语“相同”或百分比“同一性”是指两个或更多个序列或亚序列相同或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，当比较和比对(如有必要，引入空位)以获得最大对应时，不考虑将任何保守氨基酸取代作为序列同一性的一部分。百分比同一性可以使用序列比较软件或算法或通过目测来测量。可用于获得氨基酸或核苷酸序列比对的各种算法和软件是本领域已知的。序列比对算法的一个这样的非限制性实例是在Karlin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:2264-2268(1990)中所述，如在Karlin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,90:5873-5877(1993)中修改，并且纳入NBLAST和XBLAST程序(Altschul等人,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402(1991))中的算法。在某些实施方案中，Gapped BLAST可以如Altschul等人,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997)中所述使用。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等人,Methods in Enzymology,266:460-480(1996))、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,Calif.)或Megalign(DNASTAR)是可用于比对序列的其他公开可用的软件程序。在某些实施方案中，使用GCG软件中的GAP程序(例如，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70或90的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重)测定两个核苷酸序列之间的百分比同一性。在某些替代实施方案中，GCG软件包中的GAP程序结合了Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))，可用于测定两个氨基酸序列之间的百分比同一性(例如，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5的长度权重)。或者，在某些实施方案中，核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性使用Myers和Miller算法(CABIOS,4:11-17(1989))来测定。例如，百分比同一性可以使用ALIGN程序(版本2.0)以及使用具有残基表的PAM120、12的空位长度罚分和4的空位罚分来测定。特定比对软件的最大比对的适当参数可以由本领域技术人员来确定。在某些实施方案中，使用比对软件的默认参数。在某些实施方案中，第一氨基酸序列与第二序列氨基酸的百分比同一性“X”被计算成100乘以(Y/Z)，其中Y为在第一和第二序列比对(如通过目测或特定序列比对程序来比对)中被评分为相同匹配的氨基酸残基数并且Z为第二序列中的残基总数。如果第一序列的长度长于第二序列，则第一序列与第二序列的百分比同一性将高于第二序列与第一序列的百分比同一性。
作为非限制性实例，任何特定多核苷酸是否与参考序列具有一定百分比的序列同一性(例如，至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同，并且在一些实施方案中，至少95％、96％、97％、98％或99％相同)在某些实施方案中可以使用Bestfit程序(WisconsinSequence Analysis Package,Version 8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575Science Drive,Madison,Wis.53711)来测定。Bestfit使用Smith和Waterman局部同源算法(Advances in Applied Mathematics 2:482 489(1981))来寻找两个序列之间的最佳同源区段。当使用Bestfit或其它序列比对程序来确定特定序列是否与根据本公开的参考序列例如95％相同时，设置参数，使得同一性百分比在参考核苷酸序列全长内计算，并且允许高达参考序列中核苷酸总数5％的同源空位。
在一些实施方案中，本公开的两个核酸或多肽基本上相同，意味着当比较和比对最大对应时，它们具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，并且在一些实施方案中至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸残基同一性，如使用序列比较算法或通过目测所测量。同一性可以存在于长度至少约10、约20、约40-60个残基或它们之间的任何整数值的序列区域上，并且可以存在于比60-80个残基更长(例如至少约90-100个残基)的区域上，并且在一些实施方案中，序列在被比较的序列的全长上基本相同，例如像核苷酸序列的编码区。
“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被具有相似侧链的另一个氨基酸残基替换的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色胺酸、组氨酸)。例如，苯丙氨酸取代酪氨酸是保守取代。在一些实施方案中，本公开的多肽和抗体的序列中的保守取代不会消除含有氨基酸序列的抗体与抗原(例如抗体结合的VISTA)的结合。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域众所周知的(参见，例如，Brummell等人,Biochem.32:1180-1 187(1993)；Kobayashi等人,Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997))。
如本文所用，“基本上纯的”是指至少50％纯(即，不含污染物)、更优选至少90％纯、更优选至少95％纯、更优选至少98％纯、更优选至少99％纯的材料。
“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是用于掺入多核苷酸插入物的载体的接受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于自然、偶然或有意突变，后代可能不一定与最初亲代细胞完全相同(在形态方面或在基因组DNA补体方面)。宿主细胞包括用本发明的多核苷酸体内转染的细胞。
术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域。“Fc区”可以是天然序列Fc区或变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能会有所不同，但人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或Pro230位置的氨基酸残基延伸到其羧基端。Fc区的残基的编号与如Kabat中的EU索引相同。Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构域CH2和CH3。
如本文所用，“Fc受体”和“FcR”描述了与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRII亚类受体(包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式)的FcR。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要在其细胞质结构域方面不同。在Ravetch和Kinet,1991,Ann.Rev.Immunol.,9:457-92；Capel等人,1994,ImmunoMethods,4:25-34；和de Haas等人,1995,J.Lab.Clin.Med.,126:330-41中对FcR进行了综述。“FcR”还包括新生儿受体FcRn，它负责将母亲的IgG转移至胎儿(Guyer等人,1976,J.Immunol.,117:587；和Kim等人,1994,J.Immunol.,24:249)。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在的情况下靶标的裂解。补体激活途径由补体系统的第一组分(C1q)结合至与同源抗原络合的分子(例如抗体)而启动。为了评估补体激活，可以进行CDC测定，例如像Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods,202:163(1996)中所述。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的至少一个效应子功能。示例性“效应子功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体BCR)的下调；等等。此类效应子功能通常需要将Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，并且可以使用本领域已知的各种测定法进行评估以评价此类抗体效应子功能。
“天然序列Fc区”或“内源性FcR”包含与自然中存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。“变体Fc区”包含通过至少一个氨基酸修饰而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列的氨基酸序列，但仍保留天然序列Fc区的至少一种效应子功能。优选地，变体Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸取代，例如约一至约十个氨基酸取代，并且优选约一至约五个氨基酸取代。本文中的变体Fc区将优选与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％序列同一性，并且最优选与其具有至少约90％序列同一性、更优选与其具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％序列同一性。
如本文所用，“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别在靶细胞上的结合抗体并且随后导致靶细胞裂解。可以使用体外ADCC测定来评估感兴趣的分子的ADCC活性，所述测定诸如在美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的那些。对于此类测定有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMCS)和NK细胞。或者或另外，可以在体内例如在动物模型中评估感兴趣的分子的ADCC活性，所述动物模型诸如Clynes等人,1998,PNAS(USA),95:652-656中公开的那些。
在本公开中，如独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“卤基”是指-Cl、-F、-Br或-I。例如，卤基是-Cl或-F。
在本公开中，如独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“羟基”是指-OH。
在本公开中，如独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“硫醇”或术语“巯基”是指-SH。
在本公开中，如独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“烷基”是指含有一至十二个碳原子的未取代的直链或支链脂族烃，即C1-12烷基，或含有指定数量的碳原子的未取代的直链或支链脂族烃，例如C1烷基诸如甲基、C2烷基诸如乙基、C3烷基诸如丙基或异丙基、C1-3烷基诸如甲基、乙基、丙基或异丙基等等。例如，烷基是C1-10烷基。在另一个实例中，烷基是C1-6烷基。在另一个实例中，烷基是C1-4烷基。在另一个实例中，烷基是直链C1-10烷基。在另一个实例中，烷基是支链C3-10烷基。在另一个实例中，烷基是直链C1-6烷基。在另一个实例中，烷基是支链C3-6烷基。在另一个实例中，烷基是直链C1-4烷基。在另一个实例中，烷基是支链C3-4烷基。在另一个实例中，烷基是直链或支链C3-4烷基。非限制性示例性C1-10烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基、3-戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基。非限制性示例性C1-4烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基和异丁基。
在本公开中，如独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“任选取代的烷基”是指未被取代或被一个、两个或三个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的烷基：硝基、羟基、氰基、卤代烷氧基、芳氧基、烷硫基、磺酰胺基、烷基羰基、芳基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、羧基、羧酰胺基、烷氧基羰基、硫醇、-N(H)C(＝O)NH2和-N(H)C＝NH)NH2、任选取代的芳基以及任选取代的杂芳基。例如，任选取代的烷基被两个取代基取代。在另一个实例中，任选取代的烷基被一个取代基取代。在另一个实例中，任选取代的烷基未被取代。非限制性示例性取代的烷基包括-CH2OH、-CH2SH、-CH2Ph、-CH2(4-OH)Ph、-CH2(咪唑基)、-CH2CH2CO2H、-CH2CH2SO2CH3、-CH2CH2COPh和-CH2OC(＝O)CH3。
在本公开中，如独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“环烷基”是指含有一个至三个具有三至十二个碳原子的未取代的饱和或部分不饱和的(例如含有一个或两个双键)环脂族烃(即C3-12环烷基)，或者含有一个至三个具有指定数量的碳的未取代的饱和或部分不饱和的(例如含有一个或两个双键)环脂族烃。在一个实例中，环烷基具有两个环。在另一个实例中，环烷基具有一个环。在另一个实例中，环烷基是饱和的。在另一个实例中，环烷基是不饱和的。在另一个实例中，环烷基是C3-8环烷基。在另一个实例中，环烷基是C3-6环烷基。术语“环烷基”意在包括其中环-CH2-被-C(＝O)-替换的基团。非限制性示例性环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、降冰片基、十氢萘、金刚烷基、环己烯基、环戊烯基和环戊酮。
在本公开中，如独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“任选取代的环烷基”是指未取代或被一个、两个或三个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的环烷基：卤基、硝基、氰基、羟基、烷基羰基氧基、环烷基羰基氧基、氨基、卤代烷基、羟烷基、烷氧基、卤代烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰胺基、磺酰胺基、烷基羰基、芳基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、羧基、羧基烷基、任选取代的烷基、任选取代的环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基、烷氧基烷基、(氨基)烷基、(羧酰胺基)烷基、(杂环基)烷基和-OC(＝O)-氨基。术语任选取代的环烷基包括具有稠合的任选取代的芳基例如苯基或稠合的任选取代的杂芳基例如吡啶基的环烷基。具有稠合的任选取代的芳基或稠合的任选取代的杂芳基的任选取代的环烷基可以在环烷基环上的任何可用碳原子处附接至分子的其余部分。在一个实例中，任选取代的环烷基被两个取代基取代。在另一个实例中，任选取代的环烷基被一个取代基取代。在另一个实例中，任选取代的环烷基未被取代。
在本公开中，如独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“芳基”是指具有六至十四个碳原子的未取代的单环或双环芳族环系统，即C6-14芳基。非限制性示例性芳基包括苯基(缩写为“Ph”)、萘基、菲基、蒽基、茚基、薁基、联苯、联苯烯基(biphenylenyl)和芴基。在一个实例中，芳基是苯基或萘基。
在本公开中，如本文独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“任选取代的芳基”是指未被取代或被一至五个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的芳基：卤基、硝基、氰基、羟基、硫醇、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、任选取代的烷基、卤代烷基、羟烷基、烷氧基、卤代烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、甲酰氨基、磺酰氨基、烷基羰基、芳基羰基、烷基磺酰基、卤代烷基磺酰基、环烷基磺酰基、(环烷基)烷基磺酰基、芳基磺酰基、杂芳基磺酰基、杂环基磺酰基、羧基、羧基烷基、任选取代的环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基、烷氧基羰基、烷氧基烷基、(氨基)烷基、(羧酰胺基)烷基和(杂环基)烷基。
在一个实例中，任选取代的芳基是任选取代的苯基。在另一个实例中，任选取代的苯基具有四个取代基。在另一个实例中，任选取代的苯基具有三个取代基。在另一个实例中，任选取代的苯基具有两个取代基。在另一个实例中，任选取代的苯基具有一个取代基。在另一个实例中，任选取代的苯基未被取代。非限制性示例性取代的芳基包括2-甲基苯基、2-甲氧基苯基、2-氟苯基、2-氯苯基、2-溴苯基、3-甲基苯基、3-甲氧基苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、4-甲基苯基、4-乙基苯基、4-甲氧基苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、2,6-二氟苯基、2,6-二氯苯基、2-甲基-3-甲氧基苯基、2-乙基-3-甲氧基苯基、3,4-二甲氧基苯基、3,5-二氟苯基、3,5-二甲基苯基、3,5-二甲氧基-4-甲基苯基、2-氟-3-氯苯基、3-氯-4-氟苯基、4-(吡啶-4-基磺酰基)苯基。术语任选取代的芳基包括具有稠合的任选取代的环烷基或稠合的任选取代的杂环基的苯基。具有稠合的任选取代的环烷基或稠合的任选取代的杂环基的任选取代的苯基可以在苯基环上的任何可用碳原子处附接至分子的其余部分。
在本公开中，如独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“烯基”是指含有一个、两个或三个碳-碳双键的烷基。在一个实例中，烯基具有一个碳-碳双键。在另一个实例中，烯基是C2-6烯基。在另一个实例中，烯基是C2-4烯基。非限制性示例性烯基包括乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、仲丁烯基、戊烯基和己烯基。
在本公开中，如本文独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“任选取代的烯基”是指未被取代或被一个、两个或三个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的烯基：卤基、硝基、氰基、羟基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、卤代烷基、羟烷基、烷氧基、卤代烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、甲酰氨基、磺酰氨基、烷基羰基、芳基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、羧基、羧基烷基、任选取代的烷基、任选取代的环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、杂芳基和任选取代的杂环基。
在本公开中，如独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“炔基”是指含有一个至三个碳-碳三键的烷基。在一个实例中，炔基具有一个碳-碳三键。在另一个实例中，炔基是C2-6炔基。在另一个实例中，炔基是C2-4炔基。非限制性示例性炔基包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、2-丁炔基、戊炔基和己炔基。
在本公开中，如本文独自使用或作为一部分使用的术语“任选取代的炔基”是指未被取代或被一个、两个或三个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的炔基：卤基、硝基、氰基、羟基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、卤代烷基、羟烷基、烷氧基、卤代烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、甲酰氨基、磺酰氨基、烷基羰基、芳基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、羧基、羧基烷基、任选取代的烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基和杂环基。
在本公开中，如独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“卤代烷基”是指被一个或多个氟、氯、溴和/或碘原子取代的烷基。在一个实例中，烷基被一个、两个或三个氟和/或氯原子取代。在另一个实例中，卤代烷基是C1-4卤代烷基。非限制性示例性卤代烷基包括氟甲基、2-氟乙基、二氟甲基、三氟甲基、五氟乙基、1,1-二氟乙基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、3,3,3-三氟丙基、4,4,4-三氟丁基和三氯甲基。
在本公开中，如独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“烷氧基”是指附接至末端氧原子的任选取代的烷基、任选取代的环烷基、任选取代的烯基或任选取代的炔基。在一个实例中，烷氧基是附接至末端氧原子的任选取代的烷基。在一个实例中，烷氧基是附接至末端氧原子的C1-6烷基。在另一个实例中，烷氧基是附接至末端氧原子的C1-4烷基。非限制性示例性烷氧基包括甲氧基、乙氧基和叔丁氧基。
在本公开中，如独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“烷硫基”是指附接至末端硫原子的任选取代的烷基。在一个实例中，烷硫基是C1-4烷硫基。非限制性示例性烷硫基包括-SCH3和-SCH2CH3。
在本公开中，如独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“卤代烷氧基”是指附接至末端氧原子的卤代烷基。非限制性示例性卤代烷氧基包括氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基和2,2,2-三氟乙氧基。
在本公开中，术语“杂芳基”是指具有5至14个环原子的未取代的单环和双环芳族环系统，即5至14元杂芳基，其中环之一的至少一个碳原子被独立地选自由氧、氮和硫组成的组的杂原子替换。在一个实例中，杂芳基含有1、2、3或4个独立地选自由氧、氮和硫组成的组的杂原子。在一个实例中，杂芳基具有三个杂原子。在另一个实例中，杂芳基具有两个杂原子。在另一个实例中，杂芳基具有一个杂原子。在另一个实例中，杂芳基是5至10元杂芳基。在另一个实例中，杂芳基是5或6元杂芳基。在另一个实例中，杂芳基具有5个环原子，例如噻吩基，一种具有四个碳原子和一个硫原子的5元杂芳基。在另一个实例中，杂芳基具有6个环原子，例如吡啶基，一种具有五个碳原子和一个氮原子的6元杂芳基。非限制性示例性杂芳基包括噻吩基、苯并[b]噻吩基、萘并[2,3-b]噻吩基、噻蒽基、呋喃基、苯并呋喃基、吡喃基、异苯并呋喃基、苯并噁唑基、色烯基、呫吨基、2H-吡咯基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、异喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、噌啉基、喹唑啉基、蝶啶基、4aH-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、噻唑基、异噻唑基、吩噻唑基、异噁唑基、呋咕基和吩噁嗪基。在一个实例中，杂芳基选自由以下组成的组：噻吩基(例如，噻吩-2-基和噻吩-3-基)、呋喃基(例如，2-呋喃基和3-呋喃基)、吡咯基(例如，1H-吡咯-2-基和1H-吡咯-3-基)、咪唑基(例如，2H-咪唑-2-基和2H-咪唑-4-基)、吡唑基(例如，1H-吡唑-3-基、1H-吡唑-4-基和1H-吡唑-5-基)、吡啶基(例如，吡啶-2-基、吡啶-3-基和吡啶-4-基)、嘧啶基(例如，嘧啶-2-基、嘧啶-4-基和嘧啶-5-基)、噻唑基(例如，噻唑-2-基、噻唑-4-基和噻唑-5-基)、异噻唑基(例如，异噻唑-3-基、异噻唑-4-基和异噻唑-5-基)、噁唑基(例如，噁唑-2-基、噁唑-4-基和噁唑-5-基)、异噁唑基(例如，异噁唑-3-基、异噁唑-4-基和异噁唑-5-基)和吲唑基(例如，1H-吲唑-3-基)。术语“杂芳基”也意在包括可能的N氧化物。非限制性示例性N氧化物是吡啶基N氧化物。
在一个实例中，杂芳基是5或6元杂芳基。在一个实例中，杂芳基是5元杂芳基，即杂芳基是具有5个环原子的单环芳族环系统，其中环的至少一个碳原子被独立地选自氮、氧和硫的杂原子替换。非限制性示例性5元杂芳基包括噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基和异噁唑基。在另一个实例中，杂芳基是6元杂芳基，例如杂芳基是具有6个环原子的单环芳族环系统，其中环的至少一个碳原子被氮原子替换。非限制性示例性6元杂芳基包括吡啶基、吡嗪基、嘧啶基和哒嗪基。
在本公开中，如独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“任选取代的杂芳基”是指未被取代或被一个、两个、三个或四个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的杂芳基：卤基、硝基、氰基、羟基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、卤代烷基、羟烷基、烷氧基、卤代烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰胺基、磺酰胺基、烷基羰基、芳基羰基、烷基磺酰基、卤代烷基磺酰基、环烷基磺酰基、(环烷基)烷基磺酰基、芳基磺酰基、杂芳基磺酰基、羧基、羧基烷基、任选取代的烷基、任选取代的环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基、烷氧基烷基、(氨基)烷基、(羧酰胺基)烷基和(杂环基)烷基。在一个实例中，任选取代的杂芳基具有一个取代基。在另一个实例中，任选取代的杂芳基未被取代。任何可用的碳或氮原子都可以被取代。术语任选取代的杂芳基包括具有稠合的任选取代的环烷基或稠合的任选取代的杂环基的杂芳基。具有稠合的任选取代的环烷基或稠合的任选取代的杂环基的任选取代的杂芳基可以在杂芳基环上的任何可用碳原子处附接至分子的其余部分。
在本公开中，如独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“杂环基”是指未取代的饱和和部分不饱和的(例如含有一个或两个双键)、含有具有三至十四个环成员的一个、两个或三个环的环状基团，即3至14元杂环基，其中环之一的至少一个碳原子被杂原子替换。每个杂原子独立地选自由氧、硫(包括亚砜和砜)和/或氮(可以被氧化或季铵化)原子组成的组。术语“杂环基”包括其中-CH2-被-C(＝O)-替换的环基团，例如，环脲基诸如2-咪唑烷酮和环酰胺基诸如β-内酰胺、γ-内酰胺、δ-内酰胺、ε-内酰胺和哌嗪-2-酮。术语“杂环基”还包括具有稠合的任选取代的芳基的基团，例如二氢吲哚基或色满-4-基。在一个实施方案中，杂环基是含有一个环和一个或两个氧和/或氮原子的C4-6杂环基，即4、5或6元环状基团。在一个实施方案中，杂环基是含有一个环和一个氮原子的C4-6杂环基。杂环基可以任选通过任何可用的碳或氮原子连接到分子的其余部分。非限制性示例性杂环基包括氮杂环丁烷基、二噁烷基、四氢吡喃基、2-氧代吡咯烷-3-基、哌嗪-2-酮、哌嗪-2,6-二酮、2-咪唑烷酮、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、吡咯烷基和二氢吲哚基。
在本公开中，如本文独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“任选取代的杂环基”是指未被取代或被一个、两个、三个或四个独立地选自由以下组成的组的取代基取代的杂环基：卤基、硝基、氰基、羟基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、卤代烷基、羟烷基、烷氧基、卤代烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰胺基、磺酰胺基、烷基羰基、环烷基羰基、烷氧羰基、CF3C(═O)-、芳基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、羧基、羧基烷基、烷基、任选取代的环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基、烷氧基烷基、(氨基)烷基、(羧酰胺基)烷基或(杂环基)烷基。取代可能发生在任何可用的碳或氮原子上，或两者兼有。
在本公开中，如独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“氨基”是指式-NROaRb自由基，其中Ra和Rb各自独立地选自由氢、任选取代的烷基和芳烷基组成的组，或者Ra和Rb一起形成3至8元任选取代的杂环基。非限制性示例性氨基包括-NH2和-N(H)(CH3)。
在本公开中，如独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“羧酰胺基”是指式-C(＝O)NRaRb自由基，其中Ra和Rb各自独立地选自由氢、任选取代的烷基、羟基烷基和任选取代的芳基、任选取代的杂环基和任选取代的杂芳基组成的组，或者Ra和Rb与它们所附接至的氮一起形成3至8元任选取代的杂环基。在一个实施方案中，Ra和Rb各自独立地是氢或任选取代的烷基。在一个实施方案中，Ra和Rb与它们所附接至的氮一起形成3至8元任选取代的杂环基。非限制性示例性羧酰胺基包括-CONH2、-CON(H)CH3和-CON(CH3)2。
在本公开中，如独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“烷氧基羰基”是指被烷氧基取代的羰基(即-C(＝O)-)。在一个实施方案中，烷氧基是C1-4烷氧基。非限制性示例性烷氧基羰基包括-C(＝O)OMe、-C(＝O)OEt和-C(＝O)OtBu。
在本公开中，如独自使用或作为另一个基团的一部分使用的术语“羧基”是指式-CO2H自由基。
在本公开中，术语“自我牺牲型基团”或“牺牲型基团”或“牺牲型接头”是指可切割接头的整体或一部分并且包含双功能化学部分，所述双功能化学部分能够将两个间隔的化学部分共价连接成通常稳定的三方分子(tripartite molecule)，可以通过酶促切割从三方分子中释放出间隔的化学部分之一；并且在酶促切割之后，可以自发地从分子的其余部分切割以释放另一个间隔的化学部分(例如糖皮质激素)。在一些实施方案中，牺牲型接头包含对氨基苄基单元。在一些此类实施方案中，将对氨基苄基醇经由酰胺键附接至氨基酸单元，并且在苄醇与药物之间制成氨基甲酸酯、氨基甲酸甲酯或碳酸酯(Hamann等人(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15:1087-1103)。在一些实施方案中，牺牲型接头是对氨基苄氧羰基(PAB)。(参见本申请的实施例3和示例性实施方案部分)。
在本公开中，术语“保护基团”或“PG”是指在对分子的其他官能团或部分进行反应的同时阻断(即保护)官能性(例如胺官能性)的基团。本领域技术人员将熟悉胺保护基团的选择、附接和切割，并且将理解本领域已知许多不同的保护基团，一种或另一种保护基团的适用性取决于计划的具体合成方案。可查阅有关该主题的论文，诸如Wuts,P.G.M.；Greene,T.W.,"Greene's Protective Groups in Organic Synthesis",第4版,J.Wiley&Sons,NY,2007。合适的保护基团包括苄氧基羰基(Cbz)、叔丁氧基羰基(BOC)、9-芴基甲氧基羰基(FMOC)和苄基(Bn)基团。在一个实施方案中，保护基团是BOC基团。
如在本公开和权利要求书中使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数形式。
应该理解，每当在本文中用措辞“包含”来描述实施方案时，还提供以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其它类似实施方案。
本文中短语诸如“A和/或B”中使用的术语“和/或”旨在包括：“A和B”两者、“A或B”、“A”和“B”。类似地，在短语诸如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
如本文所用，“自身免疫”或“自身免疫性疾病或病状”广义上是指源于个体自身组织并针对个体自身组织的疾病或病状或其共分离性状(co-segregate)或表现或由其产生的病状，并且包括。本文中的自身免疫性病状包括炎症性或过敏性病状，例如以针对可能与组织破坏相关的自身抗原的宿主免疫反应为特征的慢性疾病，诸如以炎症为特征的类风湿性关节炎，和/或其中类固醇是有效治疗的慢性疾病。
如本文所用，“免疫细胞”泛指具有造血来源并且在免疫反应中发挥作用的细胞。免疫细胞包括但不限于淋巴细胞，诸如B细胞和T细胞；自然杀伤细胞；树突细胞和骨髓细胞，诸如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
如本文所用，“免疫相关疾病(或病症或病状)”应理解为涵盖选自下组的任何疾病、病症或病状，包括但不限于：与移植物移植排斥相关的自身免疫性疾病、炎症性病症和免疫性病症(诸如急性和慢性器官移植排斥、同种异体干细胞移植排斥、自体干细胞移植排斥、骨髓移植排斥)和移植物抗宿主病。
“炎症性病症”、“炎症性病状”和/或“炎症”在本文中可互换使用，泛指慢性或急性炎症性疾病，并且明确包括炎症性自身免疫性疾病和炎症性过敏性病状。这些病状包括例如炎症性异常，其特征在于对有害刺激(诸如病原体、损伤细胞或刺激物)的免疫反应失调。炎症性病症是多种人疾病的基础。病因学上源于炎症性过程的非免疫性疾病包括癌症、动脉粥样硬化和缺血性心脏病。与炎症相关的病症的实例包括：慢性前列腺炎、肾小球肾炎、超敏反应、盆腔炎、再灌注损伤、结节病、血管炎、间质性膀胱炎、正常补体性荨麻疹性血管炎、心包炎、肌炎、抗合成酶综合征、巩膜炎、巨噬细胞活化综合征、贝赛特氏综合征、PAPA综合征、布劳综合征(Blau's Syndrome)、痛风、成人和青少年斯蒂尔(Still's)病、冷冻性吡虫病(cryropyrinopathy)、穆克尔-韦尔斯综合征(Muckle-Wells syndrome)、家族性寒冷型自身炎症综合征(familial cold-induced auto-inflammatory syndrome)、新生儿发作多系统炎症性疾病、家族性地中海热、慢性婴儿神经、皮肤和关节综合征、全身性青少年特发性关节炎、高IgD综合征、施尼茨勒综合征(Schnitzler's syndrome)、TNF受体相关周期性综合征(TRAPSP)、牙龈炎、牙周炎、肝炎、肝硬化、胰腺炎、心肌炎、血管炎、胃炎、痛风、痛风性关节炎和炎症性皮肤病症(选自由以下组成的组：银屑病、特应性皮炎、湿疹、酒渣鼻、荨麻疹和痤疮)。
如本文所用，“哺乳动物”泛指哺乳动物纲(class Mammalia)的任何和所有温血脊椎动物，包括人，其特征在于皮肤上覆盖有毛发，并且在雌性中，产生乳汁的乳腺用于喂养幼仔。哺乳动物的实例包括但不限于羊驼、犰狳、水豚、猫、骆驼、黑猩猩、南美栗鼠、牛、狗、山羊、大猩猩、仓鼠、马、人、狐猴、美洲驼、小鼠、非人灵长类动物、猪、大鼠、绵羊、鼩鼱、松鼠、貘和田鼠。哺乳动物包括但不限于牛科动物、犬科动物、马科动物、猫科动物、鼠科动物、羊科动物、猪科动物、灵长类动物和啮齿动物物种。哺乳动物还包括由华盛顿特区(Washington D.C.)的史密森学会的国家自然历史博物馆(National Museum of NaturalHistory,Smithsonian Institution)维护的世界哺乳动物物种(Mammal Species of theWorld)上列出的任何和所有哺乳动物。
“患者”或“受试者”或“接受者”、“个体”或“治疗的个体”在本文中可互换使用，并且泛指需要治疗以缓解疾病状态或防止疾病状态发生或复发的任何动物。如本文所用，“患者”还泛指具有疾病的风险因素、疾病史、易感性、症状和体征，先前被诊断患有疾病，具有患疾病的风险或者作为疾病患者群体成员的任何动物。患者可以是临床患者(诸如人)，或兽医患者(诸如伴侣动物、家养动物、家畜、外来动物或动物园动物)。
本文治疗或诊断上下文中的“受试者”或“患者”或“个体”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等，即适合根据本发明进行治疗的任何动物，包括但不限于鸟类和哺乳动物受试者，并且优选哺乳动物。需要根据本发明进行治疗的任何哺乳动物受试者都是合适的。可以根据本发明治疗两种性别和处于任何发育阶段的人受试者(即，新生儿、婴儿、少年、青少年和成人)。本发明还可以对动物受试者，特别是哺乳动物受试者(诸如小鼠、大鼠、狗、猫、牛、山羊、绵羊和马)进行，用于兽医目的，并且用于药物筛选和药物开发目的。“受试者”与“个体”和“患者”可互换使用。
如本文所用，“治疗(Therapy/therapeutic/treating/treatment)”泛指治疗疾病、阻止或减少疾病或其临床症状的发展、和/或缓解疾病、引起疾病或其临床症状的消退。治疗(therapy)涵盖预防、治疗(treatment)、补救、减少、减轻和/或缓解疾病、疾病的体征和/或症状。治疗涵盖减轻具有正在进行中的疾病体征和/或症状(例如炎症、疼痛)的患者的体征和/或症状。治疗还涵盖“预防”。出于治疗的目的，术语“减少”泛指体征和/或症状的临床显著减少。治疗(therapy)包括治疗(treating)再发或复发的体征和/或症状(例如炎症、疼痛)。治疗涵盖但不限于随时排除体征和/或症状的出现，以及减少现有体征和/或症状并且消除现有体征和/或症状。治疗(therapy)包括治疗(treating)慢性疾病(“维持”)和急性疾病。例如，治疗(treatment)包括治疗(treating)或防止体征和/或症状(例如炎症、疼痛)的再发或复发。
在定义了本申请中使用的某些术语和短语后，下文进一步描述了本发明所包含的抗VISTA抗体和抗原结合抗体片段及其产生和使用的方法。
本发明涉及包含抗体或抗体片段的ADC，所述抗体或抗体片段包含结合至T细胞激活V结构域Ig抑制因子(VISTA)的抗原结合区，所述抗体或片段在生理pH条件(约pH 7.5)下具有短血清半衰期，例如，其中抗体或片段在生理条件(约pH 7.5)下在啮齿动物(人VISTA敲入)中的血清半衰期通常在人VISTA敲入啮齿动物中为1至72小时、1至32小时、1至16小时、1至8小时、1至4小时或在灵长类动物(食蟹猕猴)中为1-2小时±0.5小时或约3.5、3、2.5或2.3天±0.5天，所述抗人VISTA抗体或抗体片段经由接头直接或间接附接至抗炎剂，例如类固醇或皮质类固醇受体激动剂，诸如上文所述或更具体地是地塞米松、泼尼松龙、布地奈德、倍氯米松、倍他米松、皮质醇、醋酸可的松、16-α羟基泼尼松龙、地塞米松、二氟拉松、氟米松、氟尼缩松、醋酸氟轻松、丙酸氟替卡松、环索奈德、甲基泼尼松龙、强的松、泼尼松龙、莫米松、曲安奈德等，或由它们衍生的自由基或者如本文公开的式1新型类固醇)或它们的功能衍生物或自由基，即，当施用于受试者例如人或其他哺乳动物时，在内化至免疫细胞中后，当从含有其的ADC中释放时，引发所需的抗炎效果的衍生物。
具体地，ADC将在生理pH下特异性结合至表达VISTA的免疫细胞，并且抗炎剂将从ADC释放并内化至靶(免疫)细胞诸如嗜中性粒细胞、单核细胞诸如骨髓细胞、T细胞和存在于外周血中的其他免疫细胞中。抗炎剂的释放，例如，皮质类固醇受体激动剂，诸如地塞米松、泼尼松龙、布地奈德、倍氯米松、倍他米松、皮质醇、醋酸可的松、16-α羟基泼尼松龙、地塞米松、二氟拉松、氟米松、氟尼缩松、醋酸氟轻松、丙酸氟替卡松、环索奈德、甲基泼尼松龙、强的松、泼尼松龙、莫米松、曲安奈德等，或由它们衍生的自由基或者如本文公开的式1新型类固醇或它们的功能衍生物或自由基，即，在内化至免疫细胞中后，当从含有其的ADC中释放时，引发所需的抗炎效果的衍生物。这种释放可能在靶细胞之外或在ADC内化至靶免疫细胞中之后发生。抗炎剂的切割和释放最通常将发生在细胞内。如先前所述，包含在主题ADC中的抗炎剂的功效(抗炎活性)只有在这种类固醇化合物或包含其的ADC被免疫细胞内化之后才能获得。
在优选实施方案中，抗VISTA抗体或片段将包含沉默(即突变以削弱FcR结合)Fc区，例如沉默IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，最典型的是沉默IgG2或沉默IgG1或抗体或片段可能缺少Fc区或包含不与FcR结合的Fc片段。示例性沉默Fc区在下文中公开。因此，包含抗VISTA抗体或片段的ADC当结合表达VISTA的免疫细胞并且内化至其中时通常不会引发对VISTA的调节作用，即它不会激动或拮抗VISTA介导的对免疫的作用。相反，ADC引发的治疗效果将单独或主要归因于与其结合的抗炎剂，例如，如前所述的皮质类固醇受体激动剂或皮质类固醇，例如地塞米松、泼尼松龙、布地奈德、倍氯米松、倍他米松、皮质醇、醋酸可的松、16-α羟基泼尼松龙、地塞米松、二氟拉松、氟米松、氟尼缩松、醋酸氟轻松、丙酸氟替卡松、环索奈德、甲基泼尼松龙、强的松、泼尼松龙、莫米松、曲安奈德等，或如本文公开的式1新型类固醇或先前所述中的任一者的功能衍生物或自由基，即当包含在ADC中时导致在内化至免疫细胞中后释放的引发所需抗炎效果的功能性糖皮质激素的衍生物，所述治疗效果仅或优先在抗炎剂内化在靶免疫细胞中时引发。
因为主题ADC选择性结合免疫细胞(例如，骨髓细胞、T细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞等)，所以主题ADC在许多免疫细胞中将是有效的，但仍将减轻或防止由许多抗炎剂(例如皮质类固醇受体激动剂，诸如地塞米松和其他类固醇)引发的不良副作用，所述不良副作用在所述剂被内化至非靶细胞中时可能发生。此外，因为主题ADC选择性结合初始和激活的表达VISTA的靶免疫细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、T细胞、Treg、CD4 T细胞、CD8 T细胞、嗜中性粒细胞和骨髓细胞，所以ADC可能会促进使用减少剂量的皮质类固醇受体激动剂，诸如地塞米松和其他类固醇，诸如本文先前确定的。此外，主题ADC可用于治疗其中任何或所有这些特定类型的免疫细胞参与疾病病理学的病状。
事实上，主题ADC具有相对于用于使抗炎剂靶向免疫细胞并且引导其内化到免疫细胞中的先前报道的ADC、特别是用于实现类固醇内化到免疫细胞中的那些先前报道的ADC(例如靶向CD74、CD163、TNF和PRLR的ADC)的独特的优势组合；这是由于VISTA作为ADC靶标和包含在主题ADC中的抗VISTA抗体的特定性质(即，在生理pH下与表达VISTA的免疫细胞结合并具有非常短的pK)的组合益处。
具体地，主题ADC与以非常高的密度表达VISTA的免疫细胞结合，并且尽管它们的PK非常短，但在其中长时间有效(引发抗炎活性)，因此非常适合治疗慢性炎症性或自身免疫性疾病，其中长期并且重复施用在治疗上是必要的。
此外，主题ADC靶向广泛范围的免疫细胞，包括嗜中性粒细胞、骨髓细胞、T细胞和内皮细胞，因此主题ADC可用于治疗疾病诸如炎症性或自身免疫性疾病，以及与炎症相关的病状，诸如心脏病、ARDS、癌症和涉及任何或所有这些类型的免疫细胞的感染。例如，主题ADC可用于治疗或预防与细菌或病毒感染诸如COVID-19、流感病毒、肺炎(病毒或细菌)感染等相关的炎症。
此外，主题ADC具有快速起效的功效，例如在施用2小时内引发抗炎活性，因此可用于急性治疗，这在以下情况下可能特别有益：治疗/预防与细菌或病毒感染诸如COVID-19、流感病毒、肺炎(病毒或细菌)感染等相关的炎症，在上述情况下如果不迅速治疗，可能会导致细胞因子风暴、ARDS以及最坏情况下的脓毒症或脓毒性休克。
此外，与一些其他ADC靶抗原不同，VISTA仅由免疫细胞表达。因此，主题ADC将不易内化至非靶细胞中。
此外，由于主题ADC不结合B细胞，所以它们不会像游离类固醇那样具有免疫抑制作用，这对反复和/或长时间接受主题ADC的受试者会是有益的，因为慢性使用类固醇与某些癌症、感染和其他病状相关，这可能是长期使用类固醇引起的长期免疫抑制的意外后果。
此外，主题ADC作用于Treg，Treg是负责类固醇功效的重要免疫细胞，因此它们可能更广泛或具体地有效，特别是在治疗涉及Treg的自身免疫性或炎症性病状或炎症方面。
此外，主题ADC同时作用于静息(初始)和激活的免疫细胞(VISTA在其上组成性表达)，并且因此主题ADC在炎症性和自身免疫性病状的活跃期和缓解期都将保持活跃(引发抗炎活性)。
此外，主题ADC作用于嗜中性粒细胞，其中免疫细胞对急性炎症至关重要，因此主题ADC可用于治疗急性炎症和/或炎症性或自身免疫性病状，其特征在于不常见或散发性炎症性发作。
此外，由于VISTA细胞表面周转率高，所以主题ADC非常迅速和组成性地(在半小时内)内化至免疫细胞中，这进一步表明主题ADC非常适合治疗急性炎症和/或炎症性或自身免疫性病状，其特征在于不常见或散发性炎症性发作。
此外，主题ADC具有非常短的半衰期(PK)并且仅结合免疫细胞；因此，与包含具有常规(较长)PK的抗体(诸如Humira)的其他ADC相比，主题ADC不会更容易发生靶相关毒性和不希望的外周类固醇暴露(低非特异性损失效应)。
再此外，在一些实施方案中，主题ADC的生物活性(抗炎作用)完全归因于其中包含的抗炎有效载荷(类固醇)，即在其中抗VISTA抗体具有沉默IgG诸如沉默IgG1或IgG2 Fc区(不显示免疫功能(不阻断任何VISTA生物机理))的情况。
至少基于前述优势组合，主题ADC会非常适合急性和慢性用途，并且将适合治疗和预防用途，即用于减少或抑制炎症、预防炎症发作、延长疾病的非活跃期，以及用于治疗多种不同类型的炎症性和自身免疫性疾病。
如所提及的，主题ADC包含抗VISTA抗体，其在生理pH条件下结合表达VISTA(通常是人VISTA)的免疫细胞，并且具有如上所述的短半衰期或PK。通常，这些抗体将包含沉默Fc或不含Fc，并且ADC与表达VISTA的细胞的结合不会引发对VISTA信号传导或VISTA介导的对免疫的作用的任何影响。
相反，在一些实施方案中，抗VISTA抗体将包含功能性IgG2并且促进VISTA信号传导或VISTA相关功能，诸如抑制T细胞增殖和T细胞活性以及抑制一些促炎细胞因子。这可能对抑制炎症和/或自身免疫产生累加或协同作用。
示例性抗VISTA抗体和抗体片段的CDR和可变序列(即具有在生理pH条件(约pH7.5)下拥有短血清半衰期的片段，例如，其中抗体或片段的血清半衰期在生理条件(约pH7.5)下在食蟹猕猴或人中通常为2.3天±0.7天或更少，而在啮齿动物(人VISTA敲入)中通常为1至72小时、1至32小时、1至16小时、1至8小时、1至4小时或1-2小时±0.5小时或在灵长类动物(食蟹猕猴)中为约3.5、3、2.5或2.3天±0.5天)可在图8、图10和图12中找到。
可以掺入本发明ADC中的示例性抗炎剂(即，可以经由接头与抗VISTA抗体和抗VISTA抗体片段缀合并且任选进一步由异双官能基团缀合)包括类固醇或皮质类固醇受体激动剂，诸如先前一般描述的皮质类固醇，以及更具体地是布地奈德、倍氯米松、倍他米松、环索奈德、皮质醇、可的松、醋酸可的松、16-α羟基泼尼松龙、地塞米松、二氟拉松、乙米松(ethamethasoneb)、氟米松、氟尼缩松、醋酸氟轻松、氟氢可的松(fludrocortisone)、丙酸氟替卡松(FloventTM、FlonaseTM)、氢化可的松、环索奈德、甲基泼尼松龙、强的松、泼尼松龙、莫米松、普米克(Pulmicort)、去炎松(triamcinolone)、曲安奈德或其他具有抗炎或类固醇活性的类固醇化合物或它们的衍生物，并且尤其包括根据本发明的式1新型类固醇和功能衍生物，例如图9中绘示的布地奈德衍生物和图11中所示的式1类固醇化合物和在先前确定的专利申请中公开的皮质类固醇以及在本申请中公开的皮质类固醇，特别是在标题为“示例性实施方案”的部分和实施例3中。根据本发明的优选示例性ADC在以下实施例中，特别是在实施例3中公开。
考虑主题ADC可用于治疗受试者，例如患有其中通过使用抗炎剂诸如类固醇减轻炎症在治疗上必要的任何病状的人或非人哺乳动物。此类病状可能与例如偶发性或发作性急性或慢性炎症相关。在一些优选实施方案中，受试者将患有需要重复和/或高剂量的抗炎剂诸如皮质类固醇受体激动剂的病状，其中所述抗炎剂在常规条件(即其中所述抗炎剂是裸或未缀合的)下给药时，药物可能引发不希望的副作用，诸如对非靶向细胞的毒性。此类病状包括自身免疫性和炎症性病状。此类病状的非限制性实例包括过敏、自身免疫、移植、基因治疗、炎症、GVHD或脓毒症、感染、癌症或者治疗或预防与人受试者的任何上述病状相关的炎症性、自身免疫性或过敏性副作用。
在一些其他优选实施方案中，受试者将患有急性或慢性炎症性病状或突然发作，其中功效快速起效是治疗上所希望的，所述病状例如以频繁或不频繁的反复急性炎症发作为特征的炎症性病状，任选其中重复和/或高剂量的抗炎剂诸如皮质类固醇受体激动剂在治疗上是必要的，并且任选其中所述抗炎剂在常规条件(即其中所述抗炎剂是裸或未缀合的)下给药时，药物可能引发不希望的副作用，诸如对非靶向细胞的毒性。此类病状包括自身免疫性和炎症性病状、癌症和与炎症相关(例如以急性和/或严重的炎症发作为特征)的感染性病状。
此类病状的非限制性实例包括过敏、自身免疫、移植、基因治疗、炎症、癌症、GVHD或脓毒症、感染(例如，细菌、病毒、真菌、寄生虫)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或者治疗或预防与人受试者的任何上述病状相关的炎症性、自身免疫性或过敏性副作用。
其中使用主题ADC可能有益的其他具体示例性病状包括类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、成人克罗恩病、小儿克罗恩病、溃疡性结肠炎、斑块型银屑病、化脓性汗腺炎、葡萄膜炎、贝赛特氏症、脊椎关节病或银屑病。
其中使用主题ADC在治疗上可能有益的其他示例性病状和实例包括：
(i)主要仅可用高剂量类固醇有效治疗的病状，任选风湿性多肌痛和/或巨细胞动脉炎，所述患者任选已经接受或正在接受高类固醇剂量治疗；
(ii)具有限制类固醇使用的共患症的病状，任选糖尿症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、病态肥胖、无血管性坏死/骨坏死(AVN)、青光眼、类固醇引起的高血压、严重皮肤脆弱和/或骨关节炎；
(iii)其中可获得安全长期治疗剂但其中需要用高剂量类固醇诱导数月的病状，任选AAV、多发性肌炎、皮肌炎、狼疮、炎症性肺病、自身免疫性肝炎、炎症性肠病、免疫性血小板减少症、自身免疫性溶血性贫血、痛风患者，其中用高剂量类固醇诱导数月在治疗上是必要的；
(iv)需要短期/长期治疗、任选具有不确定的治疗或持续时间和/或没有类固醇施用的有效替代的皮肤病病状，任选史蒂芬斯强森综合征、其他严重药疹病状、涉及广泛接触性皮炎的病状、其他严重免疫相关皮肤病病状诸如PG、LCV、红皮病等；
(v)用高剂量皮质类固醇治疗的突发/复发病状，任选COPD、哮喘、狼疮、痛风、假痛风；
(vi)免疫相关神经系统疾病，诸如小纤维神经病、MS(亚组)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、重症肌无力等；
(vii)血液学/肿瘤学适应症，任选其中高剂量类固醇可能将在治疗上是必要的或有益的；
(viii)眼科病状，任选葡萄膜炎、虹膜炎、巩膜炎等；
(ix)与永久性或非常长时间的肾上腺功能不全或继发性肾上腺功能不全相关的病状，任选医源性爱迪生危象；
(x)通常用长期、低剂量类固醇治疗的病状，任选狼疮、RA、psA、血管炎等；以及
(xi)特殊类别的患者，诸如怀孕/授乳女性、儿科患者(任选患有生长障碍或白内障的那些)。
含有根据本发明的ADC或式1新型糖皮质激素的组合物可以单独使用或与其他治疗剂，特别是其他免疫抑制剂分子或用于治疗自身免疫性和炎症性病状的其他治疗剂，诸如用于治疗以下疾病的药物关联使用：例如获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、获得性脾萎缩、急性前葡萄膜炎、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性痛风性关节炎、急性坏死性出血性白脑炎、急性或慢性鼻窦炎、急性化脓性脑膜炎(或其他中枢神经系统炎症性病症)、急性严重炎症、艾迪生病(Addison's disease)、肾上腺炎、成人发病糖尿症(adult onset diabetesmellitus)(II型糖尿病)、成人发病特发性甲状旁腺机能减退症(AOIH)、无丙种球蛋白血症、粒细胞缺乏症、血管炎(vasculitides)(包括血管炎、任选大血管血管炎)、风湿性多肌痛和巨细胞(Takayasu’s(高安氏))关节炎、过敏性病状、过敏性接触性皮炎、过敏性皮炎、过敏性肉芽肿性血管炎(allergic granulomatous angiitis)、过敏性超敏症(allergichypersensitivity disorders)、过敏性神经炎、过敏反应、斑秃、全秃、阿尔波特氏综合征(Alport's syndrome)、肺泡炎(任选过敏性肺泡炎或纤维性肺泡炎)、阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)、淀粉样变性、淀粉样侧索硬化症(ALS；卢伽雷氏病(Lou Gehrig'sdisease))、嗜酸性粒细胞相关病症(任选嗜酸性粒细胞增多症)、过敏症、强直性脊柱炎、血管扩张症、抗体介导的肾炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、抗磷脂抗体综合征、抗磷脂综合征(APS)、口疮、口疮性口炎、再生障碍性贫血、心律失常、动脉硬化、动脉硬化症、关节炎(任选类风湿性关节炎诸如急性关节炎、或慢性类风湿关节炎、慢性进展性关节炎、变形性关节炎)、蛔虫病、曲霉肿、含有嗜酸性粒细胞的肉芽肿、曲霉菌病、不形成精子(aspermiogenese)、哮喘(任选支气管哮喘病(asthmabronchiale)、支气管哮喘(bronchial asthma)或自身免疫性哮喘)、共济失调毛细血管扩张症、共济性硬化症、动脉粥样硬化、自闭症、自身免疫性血管水肿、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫萎缩性胃炎、自身免疫性糖尿病、睾丸和卵巢的自身免疫性疾病(包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎)、与胶原疾病相关的自身免疫性病症、自身免疫性自主失调、自身免疫性耳病(任选自身免疫性内耳疾病(AGED))、自身免疫性内分泌疾病(包括甲状腺炎诸如自身免疫性甲状腺炎、自身免疫肠病综合征、自身免疫性性腺衰竭)、自身免疫性听力丧失、自身免疫性溶血、自身免疫性肝炎、自身免疫性肝病、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多发内分泌病、I型自身免疫性多腺性综合征、自身免疫性视网膜病、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性介导的胃肠道疾病、轴突和神经性神经病(Axonal&neuronalneuropathies)、巴娄病(Balo disease)、贝赛特氏症、良性家族性和缺血再灌注损伤、良性淋巴细胞性血管炎、Berger氏病(IgA肾病)、鸟扇氏肺、失明、伯格氏病(Berger's disease)(IgA肾病)、饲鸟者肺病(bird-fancier's lung)、失明、伯克氏病(Boeck's disease)、闭塞性细支气管炎(非移植)与NSIP、支气管炎、支气管肺炎曲霉菌病、布鲁顿综合征(Bruton'ssyndrome)、大疱性类天疱疮、卡普兰综合征(Caplan's syndrome)、心肌病、心血管缺血、卡斯特曼综合征(Castleman's syndrome)、腹腔疾病、腹腔口炎性腹泻(celiac sprue)(麸质肠病)、小脑变性、脑缺血、以及伴随血管形成的疾病、查加斯病(Chagas disease)、通道病变、任选癫痫、CNS通道病变、脉络膜视网膜炎、脉络膜炎、自身免疫性血液病、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎、慢性接触性皮炎、慢性嗜酸粒细胞性肺炎、慢性疲劳综合征、慢性肝炎、慢性超敏肺炎、慢性炎症性关节炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性顽固性炎症、慢性粘膜皮肤念珠菌病、慢性神经病(任选IgM多发性神经病或IgM介导的神经病)、慢性阻塞性气道疾病、慢性肺部炎症性疾病、慢性复发性多发性骨髓炎(CRMO)、慢性甲状腺炎(桥本氏甲状腺腺炎(Hashimoto's thyroiditis))或亚急性甲状腺病、查格-施特劳斯综合征(Churg-Strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮、冠状病毒介导的感染(诸如SARS-CoV-2(COVID-19)、SARS-CoV、MERS、SARS-CoV-2)和相关副作用、CNS炎症性病症、CNS血管炎、腹腔疾病、科干综合征(Cogan’s syndrome)、冷凝集素病、息肉状结肠炎、结肠炎(诸如溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、溃疡状结膜炎(colitis ulcerosa)、胶原性结肠炎)、涉及T细胞浸润和慢性炎症性反应的病状、先天性心脏传导阻滞、先天性风疹感染、库姆斯阳性贫血(Coombs positive anemia)、冠状动脉疾病、柯萨奇心肌炎(Coxsackie myocarditis)、CREST综合征(钙质沉着症、雷诺现象(Raynaud's phenomenon))、克罗恩病、冷球蛋白血症、库欣综合征(Cushing's syndrome)、睫状体炎(任选慢性睫状体炎、异慢性睫状体炎、虹膜睫状体炎或富氏(Fuch's)睫状体炎)、囊性纤维化、细胞因子诱导的毒性、耳聋、退行性关节炎、脱髓鞘性疾病、任选自身免疫性脱髓鞘性病、脱髓髓性神经病、登革热、疱疹样皮炎和特应性皮炎、皮炎(包括接触性皮炎、皮肌炎)、具有急性炎症性组分的皮肤病、德维克氏病(Devic's disease)(视神经脊髓炎)、糖尿病大动脉病症、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、先天性纯红细胞再生障碍性贫血(Diamond Blackfan anemia)、弥漫性间质肺纤维化、扩张型心肌病、盘状狼疮、涉及白细胞渗出的疾病、德雷斯勒综合征(Dressler's syndrome)、杜普伊特伦挛缩(Dupuytren'scontracture)、艾柯病毒感染、湿疹(包括过敏性或特应性湿疹)、脑炎(诸如拉斯穆森脑炎(Rasmussen's encephalitis)以及边缘性和/或脑干脑炎)、脑脊髓炎(任选过敏性脑脊髓炎(allergic encephalomyelitis)或过敏脑脊髓炎(encephalomyelitis allergica)和实验性过敏性脑髓炎(EAE))、动脉内膜增生、心内膜炎、内分泌眼病、子宫内膜异位症、心内膜心肌纤维化、眼内炎性白内障(endophthalmia phacoanaphylactica)、眼内炎、过敏性肠炎、嗜酸性粒细胞性肌痛综合征、嗜酸性粒细胞性筋膜炎、流行性角膜结膜炎、获得性大疱性表皮松解症(EBA)、巩膜外炎(episclera)、巩膜外层炎(episcleritis)、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒感染、持久隆起性红斑(erythema elevatum et diutinum)、多形性红斑、麻风结节性红斑、结节性红斑、胎儿成红细胞增多病、食管运动障碍、原发性混合冷球蛋白血症、筛窦、埃文氏综合征(Evan's syndrome)、实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)、因子VIII缺乏、农民肺(farmer's lung)、风湿热(febris rheumatica)、费尔蒂综合征(Felty'ssyndrome)、纤维肌痛、纤维性肺泡炎、丝虫病、局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、食物中毒、额叶、胃萎缩、巨细胞性关节炎(颞关节炎)、巨细胞肝炎、巨细胞多肌痛、肾小球性肾炎、伴有或不伴有肾病综合征的肾小球性肾炎(GN)(诸如慢性或急性肾小球性肾炎(例如，原发性GN))、古德帕斯彻氏综合症(Goodpasture's syndrome)、痛风性关节炎、粒细胞输血相关综合征(granulocyte transfusion-associated syndromes)、肉芽肿病(包括淋巴瘤样肉芽肿病、伴有多血管炎的肉芽肿病(GPA)、肉芽肿性葡萄膜炎)、格雷夫斯病(Grave'sdisease)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、滴状银屑病(gutattepsoriasis)、阵发性血红蛋白尿(hemoglobinuria paroxysmatica)、哈曼-里奇病(Hamman-Rich's disease)、桥本氏病、桥本氏脑炎、桥本氏甲状腺炎、血色素沉着症、溶血性贫血或免疫性溶血性贫血症(包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、溶血性贫血)、血友病A、过敏性紫斑症(Henoch-
Figure BDA0004033983910000901
purpura)、妊娠疱疹、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、痛觉过敏、低丙种球蛋白血症、性腺机能减退、甲状旁腺功能减退、特发性尿崩症、特发性面瘫、特发性甲状腺功能减退症、特发性IgA肾病、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、特发肾炎综合征、特发性肺纤维化、特发性脂肪泻、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、IgE介导的疾病、任选过敏性反应和过敏性或特应性鼻炎、IgG4相关硬化性疾病、区域性回肠炎(ileitisregionalis)、免疫复合物性肾炎、与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应相关的免疫反应、免疫介导的GN、免疫调节性脂蛋白、包括成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、包涵体肌炎、感染性关节炎、由于抗精子抗体(antispermatozoan antibodies)引起的不孕、全部或部分葡萄膜炎症、炎症性肠病(IBD)、炎症性过度增殖性皮肤病、炎症性肌病、胰岛素依赖性糖尿病(1型)、胰岛炎、间质性膀胱炎、间质性肺病、间质肺纤维化、虹膜炎、缺血性再灌注障碍、关节炎症、青少年型关节炎、青少年型皮肌炎、青少年型糖尿病、青少年发病性(I型)糖尿症(包括儿童胰岛素依赖性糖尿症(IDDM))、青少年发病性类风湿性关节炎、川崎综合征(Kawasaki syndrome)、干燥性角膜结膜炎、锥虫病(kypanosomiasis)、兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eaton syndrome)、利什曼病(leishmaniasis)、麻风病、白细胞减少症、白细胞粘附缺陷、白细胞破碎性血管炎、白血球减少症、扁平苔藓、硬化苔藓症、木样结膜炎、线性IgA皮肤病、线性IgA病(LAD)、吕弗勒氏综合征(Loffler's syndrome)、狼疮性肝炎、狼疮(包括肾炎、脑炎、儿科、非肾性、肾外、盘状、脱发)、狼疮(SLE)、播散性红斑狼疮、莱姆关节炎(Lyme arthritis)、莱姆病、淋巴样间质性肺炎、疟疾、男性和女性自身免疫性不孕症、上颌、中血管血管炎(包括川崎氏病和结节性多动脉炎)、膜状或膜性增生性GN(MPGN)(包括I型和II型，以及快速进展性GN、膜性GN(膜性肾病))、梅尼埃氏病(Meniere'sdisease)、脑膜炎、显微镜结肠炎、显微镜多血管炎、偏头痛、微小病变性肾病、混合结缔组织病(MCTD)、感染性单核细胞增多症、穆伦溃疡(Mooren's ulcer)、穆查-哈伯曼病(Mucha-Habermann disease)、多发性运动神经病变、多发性内分泌衰竭、多器官损伤综合征(诸如继发于败血症、创伤或出血的那些)、多器官损伤综合征、多发性硬化症(MS)(诸如脊髓-视觉MS)、多发性硬化症、腮腺炎、肌肉病症、重症肌无力(诸如胸腺瘤相关重症肌无力)、重症肌无力、心肌炎、肌炎、嗜睡症、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎以及自身免疫性炎症性肠病、坏死性、皮肤性或超敏性血管炎、新生儿狼疮综合征(NLE)、肾病、肾病综合征、神经系统疾病、视神经脊髓炎(德维克氏)、视神经脊髓炎、神经性肌强直、嗜中性粒细胞减少症、非癌性淋巴细胞增多症、非肉芽肿性葡萄膜炎、非恶性胸腺瘤、眼部和眼眶炎症性病症、眼部瘢痕性类天疱疮、卵巢炎、交感性眼炎(ophthalmia symphatica)、视索肌肌阵挛综合征(OMS，opsoclonus myoclonus syndrome)、视索或视索肌肌阵挛综合症(OMS，opsoclonusor opsoclonus myoclonus syndrome)以及感觉神经病、视神经炎、肉芽肿性睾丸炎(granulomatous orchitis)、骨关节炎、复发性风湿病、胰腺炎、全血细胞减少症、PANDAS(与链球菌相关的儿科自身免疫性神经精神疾病)、副肿瘤性小脑变性、副肿瘤综合征、副肿瘤综合症(包括神经系统副肿瘤综合症，任选兰伯特-伊顿肌无力综合症或伊顿-兰伯特综合症)、寄生虫病(诸如利什曼原虫)、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、帕里-隆伯格综合征(Parry Romberg syndrome)、睫状体扁平部炎(pars planitis)(外周葡萄膜炎)、帕森纳格-特纳综合征(Parsonnage-Turner syndrome)、细小病毒感染、类天疱疮(诸如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮)、天疱疮(包括寻常型天疱疮)、红斑性天疱疮、落叶性天疱疮、天疱疮粘液膜类天疱疮(pemphigus mucus-membrane pemphigoid)、天疱疮、消化性溃疡、周期性瘫痪、周围神经病变、静脉周围脑脊髓炎、恶性贫血(pernicious anemia)(恶性的贫血(anemia perniciosa))、恶性贫血、晶状体抗原性葡萄膜炎、肺变硬、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I型、II型和III型原发性慢性多关节炎、多发性软骨炎(例如，难治性或复发性多发性软骨炎)、多内分泌自身免疫性疾病、多内分泌衰竭、多腺性综合征、任选自身免疫性多腺性综合征(或多腺性内分泌病综合征)、风湿性多肌痛、多发性肌炎、多发性肌炎/皮肌炎、多发性神经病、急性多发性神经根炎、心脏切开术后综合征、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合症、链球菌后肾炎、接种后综合征、老年前期痴呆、原发性胆汁性肝硬化、原发甲状腺功能减退、原发性特发性粘液水肿、原发淋巴细胞增多症(其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多症，任选良性单克隆γ病和未确定意义的单克隆γ病)、MGUS、原发性粘液水肿，原发性进行性MS(PPMS)和复发缓解型MS(RRMS)、原发性硬化性胆管炎、黄体酮皮炎、进行性系统性硬化症、增殖性关节炎、银屑病(诸如斑块型银屑病、银屑病、银屑病性关节炎)、肺泡蛋白沉积症、肺浸润性嗜酸性粒细胞增多症、纯红细胞贫血或再生障碍(PRCA)、纯红细胞再生障碍、化脓性或非化脓性鼻窦炎、脓疱性银屑病和指甲银屑病、肾盂炎、坏疽性脓皮病、奎尔文甲状腺炎(Quervain's thyroiditis)、雷诺现象、反应性关节炎、复发性流产、血压反应降低、反射性交感神经营养不良、难治性口炎性腹泻、莱特尔病或综合征(Reiter's disease or syndrome)、复发性多发性软骨炎、心肌或其他组织的再灌注损伤、再灌注损伤、呼吸窘迫综合征、不安腿综合征、视网膜自身免疫、腹膜后纤维化、雷诺综合征、风湿性疾病、风湿热、风湿病、类风湿性关节炎、类风湿性脊柱炎、风疹病毒感染、桑普特综合征(Sampter's syndrome)、结节病、血吸虫病、施密特综合征(Schmidtsyndrome)、SCID和爱泼斯坦-巴尔病毒相关疾病、巩膜、巩膜炎、指端硬化、硬皮病(任选系统性硬皮病)、硬化性胆管炎、播散性硬化症、硬化症(诸如系统性硬化症)、感觉神经性听力丧失(sensoneural hearing loss)、血清阴性脊椎关节病(seronegativespondyloarthritides)、席汉氏综合征(Sheehan's syndrome)、舒尔曼综合征(Shulman'ssyndrome)、矽肺、舍格伦综合症(
Figure BDA0004033983910000931
syndrome)、精子和睾丸自身免疫、蝶窦炎、史蒂文斯—约翰逊综合征(Stevens-Johnson syndrome)、僵人(stiff-man)(或僵硬人(stiff-person))综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、亚急性皮肤型红斑狼疮、突发性听力丧失、苏萨克综合征(Susac's syndrome)、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham's chorea)、交感性眼炎、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)(SLE)或系统红肿狼疮(systemiclupus erythematodes)、皮肤型SLE、系统性坏死性血管炎、ANCA相关血管炎(任选丘-施二氏(Churg-Strauss)血管炎或丘-施二氏综合征(CSS))、脊髓痨、高安氏动脉炎、毛细血管扩张、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血栓闭塞性脉管炎(thromboangiitis ubiterans)、血小板减少症(包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和自身免疫性或免疫介导的血小板减少症，诸如特发性血小板减少性紫癜)、甲状腺功能亢进、组织损伤、托-享综合症(Tolosa-Huntsyndrome)、中毒性表皮坏死松解症、中毒性休克综合症、输血反应、婴儿暂时性低丙球蛋白血症、横贯性脊髓炎(transverse myelitis)、横贯脊髓炎(traverse myelitis)、热带肺嗜酸性粒细胞增多症、结核病、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(UCTD)、荨麻疹(任选慢性过敏性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫性荨麻疹)、葡萄膜炎、前葡萄膜炎、葡萄膜视网膜炎(uveoretinitis)、瓣膜炎、血管功能障碍、血管炎、脊椎关节炎、水疱性皮肤病、白癜风、韦格纳肉芽肿(Wegener's granulomatosis)(肉芽肿伴多血管炎(GPA))、威斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)或x连锁高IgM综合征。
主题ADC和式1新型皮质类固醇可用于预防性和/或治疗性治疗炎症和与炎症相关的疾病，包括例如自身免疫性病症、炎症性病症、感染性疾病和癌症。主题ADC的优选应用是用于治疗与炎症相关的慢性疾病。如实施例中所示，十分出乎意料地是，尽管包含在主题ADC中的抗VISTA抗体的pK较短(其在生理条件下与表达VISTA的细胞结合并且未经过工程改造以改变或优化pH结合或增强半衰期，即在食蟹猕猴中通常为约2.3天或更短，而在人VISTA工程化小鼠中通常为仅几小时)，但已发现受试者ADC相对于抗体的半衰期(PK)在长时间(PD)内保持效力。
如本文所示，根据本发明的ADC缀合物在进行体外和体内模型评价时已被证明提供至少14:1的PK/PD比率(事实上，PK/PD比率可能实质上要高得多，因为在确定PD时对啮齿动物实施了安乐死，因此不允许对效力进行更长时间的评估)。
尽管申请人不想受其信念的束缚，但理论上主题ADC在表达VISTA的靶细胞诸如巨噬细胞、T细胞和Treg以及其他表达VISTA的免疫细胞(包括具有长细胞周转率(数周、数月或更长时间)的免疫细胞)中以非常高的量递送。本质上，似乎在特定类型的免疫细胞中产生了储库效应，即大量或“储库”的主题ADC被内化至此类表达VISTA的免疫细胞例如巨噬细胞和骨髓细胞中，因为这些细胞具有非常高的VISTA表面表达。这又明显地导致包含内化的ADC的这种储库在免疫细胞内例如由细胞酶缓慢代谢或切割。本文公开的体内研究表明，内化的ADC的代谢或切割显然可以在啮齿动物中发生超过1周、2周或更长时间，从而在宿主免疫细胞内提供治疗有效量的类固醇有效载荷的逐渐和延长的释放。尽管事实上到那时(由于ADC和其中的抗体的PK较短)血清中不会保留可观量的ADC(即，基于PK，没有足够的ADC存在具有治疗意义)。
此外，虽然这些观察结果非常令人惊讶；这是可以预料的，因为啮齿动物的药物代谢通常比灵长类动物快得多(人比啮齿动物慢得多)；并且还因为VISTA表达水平和表达VISTA的免疫细胞在啮齿动物以及人和非人灵长类动物中相似，在人和其他灵长类动物中，主题ADC将具有相似或更高的PK/PD比率。因此，主题ADC会非常适用于其中需要或必须延长药物功效的治疗应用。
如所提到的，主题ADC以及式1新型皮质类固醇的另一个优选用途是用于急性用途，即用于治疗急性炎症。如实施例中所示，主题ADC具有快速起效的功效，例如，它们在施用之后2小时内即可迅速引发抗炎效果。此外，主题ADC的急性用途是进一步有利的，因为主题ADC已被证明有效靶向嗜中性粒细胞并且内化至其中，主题ADC在嗜中性粒细胞中引发抗炎效果。这在急性用途中特别有益，因为嗜中性粒细胞参与炎症反应的早期阶段，因此主题ADC也非常适合于治疗急性炎症性适应症。
主题ADC和式1新型皮质类固醇的另一个优选用途是用于维持治疗。本质上，因为VISTA在激活和非激活(初始)免疫细胞上均表达(VISTA由其组成性地表达)，所以主题ADC可以在延长的时间段内定期施用，并且这种施用将在被治疗的受试者处于炎症反应的活跃期时以及在受试者处于疾病缓解时引发抗炎活性。这在治疗上是有益的，因为已知许多慢性自身免疫性和炎症性病症的特征在于活跃期或发作，其中患者经历炎症和其他与疾病相关的症状或病理反应以及缓解期，其中包括炎症和其他与疾病相关的症状或病理反应的疾病症状不存在或不太严重(即，缓解/复发或发作)。预计由于主题ADC与激活和未激活的免疫细胞结合，因此用主题ADC治疗的患者可以更有效地维持疾病缓解，即缓解期会更长和/或疾病的活跃期可能以不太严重的形式表现出来，因为在疾病活跃和缓解期间，主题ADC对靶免疫细胞的抗炎功效保持不变。
此外，主题ADC会非常适合长期或慢性使用，因为它们对非靶细胞即非免疫细胞没有任何影响。如以下实施例中所示，主题ADC实际上只作用于免疫细胞而不作用于非免疫细胞(在肝脏中检测到一些抗炎活性，然而，这可能是由于肝脏包含免疫细胞)。
此外，由于主题ADC的短PK(但令人惊讶的长PD)，主题ADC不会长时间保持在血清中，即它们迅速结合免疫细胞并且被免疫细胞内化，在免疫细胞中它们递送其抗炎有效载荷并且长时间有效，这显然是因为ADC被免疫细胞有效且迅速地大量吸收，并在这些免疫细胞内缓慢代谢。因此，由于主题ADC仅短时间存在于外周循环中，因此与具有长PK的ADC(因为其中包含的抗体具有长PK(这对治疗性抗体而言是常规的))相比，主题ADC与非靶细胞相互作用的机会有限。
又此外，主题ADC会非常适合长期或慢性使用，因为根据本发明的ADC(特别是根据本发明的包含被工程改造以削弱FcR和补体结合的Fc区的抗VISTA ADC)的功效完全归因于抗炎有效载荷，例如类固醇。本质上，这种情况下的抗VISTA抗体仅提供靶向功能，即它促进ADC被靶免疫细胞结合且内化。然而，这种ADC与表达VISTA的免疫细胞的结合不调节VISTA的活性，即，包含被工程改造以排除Fc交联的Fc的抗VISTA抗体不拮抗或激动VISTA活性。[这将与现有的用于递送类固醇的ADC形成对比，所述ADC包含在与靶抗原结合后引发生物学效应的抗体(诸如Humira ADC)。从剂量的角度来看，这会是有益的，因为ADC效力仅取决于抗炎有效载荷。此外，这在治疗上也是有益的，因为VISTA激动剂和拮抗剂抗体可能引发促炎细胞因子反应，这在以减轻炎症为目的的药物的情况下可能是不期望的。
其中可以使用主题ADC的急性和慢性自身免疫性和炎症性适应症已在前面提及，并且包括获得性再生障碍性贫血+、获得性血友病+、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)+、急性出血性白质脑炎(AHLE)/赫斯特病(Hurst’s disease)+、原发性无丙种球蛋白血症+、斑秃+、强直性脊柱炎(AS)、抗NMDA受体脑炎+、抗磷脂综合征(APS)+、动脉硬化、自闭症谱系障碍(ASD)、自身免疫性艾迪生病(AAD)+、自身免疫性自主神经功能障碍/自身免疫性自主神经节病(AAG)、自身免疫性脑炎+、自身免疫性胃炎、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)+、自身免疫性肝炎(AIH)+、自身免疫性高脂血症、自身免疫性垂体炎/淋巴细胞性垂体炎+、自身免疫性内耳病(AIED)+、自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)+、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎+、自身免疫性睾丸炎+、自身免疫性胰腺炎(AIP)/免疫球蛋白G4相关疾病(IgG4-RD)+、I型、II型和III型自身免疫性多腺综合征+、自身免疫性黄体酮皮炎+、自身免疫性突发性感觉神经性听力损失(SNHL)、贲门失弛缓症、艾迪生病、成人斯蒂尔病、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性自主神经功能障碍、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性荨麻疹、轴突和神经元神经病(AMAN)、巴娄病、贝赛特氏症、良性黏膜类天疱疮、大疱性类天疱疮、淋巴结增生症(Castleman disease)(CD)、腹腔疾病、南美锥虫病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、查格-施特劳斯综合征(CSS)或嗜酸性肉芽肿病(EGPA)、瘢痕性类天疱疮、科干综合征、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎、CREST综合征、1型糖尿病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克氏病(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德雷斯勒综合征、子宫内膜异位症、嗜酸性食管炎(EoE)、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、原发性混合冷球蛋白血症、埃文斯综合征(Evanssyndrome)、纤维肌痛、纤维化肺泡炎、纤维化肺泡炎、巨细胞性心肌炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征(Goodpasture’s syndrome)、肉芽肿性多血管炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)(HSP)、妊娠疱疹或妊娠类天疱疮(PG)、化脓性汗腺炎(HS)(反常性痤疮)、低丙种球蛋白血症、IgA肾病、IgG4相关硬化性疾病、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、包涵体肌炎(IBM)、间质性膀胱炎(IC)、青少年关节炎、青少年糖尿病(1型糖尿病)、青少年肌炎(JM)、川崎氏病、兰伯特-伊顿综合征、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化苔藓症、木质结膜炎、线性IgA病(LAD)、狼疮(包括肾炎和皮肤)、慢性莱姆病、梅尼埃氏病、显微镜多血管炎(MPA)、混合性结缔组织病(MCTD)、穆伦溃疡、穆查-哈伯曼病、多灶性运动神经病(MMN)或MMNCB、多发性硬化症、重症肌无力、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体障碍、肌炎、嗜睡症、新生儿狼疮、视神经脊髓炎、中性粒细胞减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS)、复发性风湿病(PR)、PANDAS、副肿瘤性小脑变性(PCD)、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、帕里-隆伯格综合征、睫状体扁平部炎(外周葡萄膜炎)、牧师特纳综合症(Parsonage-Turner syndrome)、天疱疮、周围神经病变、外周脑脊髓炎、恶性贫血(PA)、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I、II、III型多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、孕酮性皮炎、银屑病、银屑病关节炎、纯红细胞再生障碍(PRCA)、坏疽性脓皮病、雷诺现象、反应性关节炎、反射性交感神经营养不良、复发性多软骨炎、不安腿综合征(RLS)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、施密特综合征、巩膜炎、硬皮病、舍格伦综合症、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征(SPS)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克综合征、交感性眼炎(SO)、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、甲状腺眼病(TED)、托-享综合症(THS)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、Vogt-小柳-原田病(Vogt-Koyanagi-Harada Disease)等。
其中ADC会是治疗有效的的优选适应症包括严重哮喘、巨细胞动脉炎、ANKA血管炎和IBD(结肠炎(例如，溃疡性)和克罗恩病)。当然，应该理解，本文所确定的疾病病状旨在是示例性的而不是详尽的。
主题ADC可以与其他治疗剂组合，它们可以在相同或不同组合物中、在相同或不同时间施用。例如，主题ADC可以在治疗方案中施用，包括施用PD-1或PD-L1激动剂、CTLA4-Ig、细胞因子、细胞因子激动剂或拮抗剂，或者另一种免疫抑制受体激动剂或拮抗剂。
可以与根据本发明的ADC组合的特定免疫抑制分子的其他实例包括阻断共刺激信号(例如，针对CD28或ICOS)的抗体、经由CTLA4激活抑制信号的抗体和/或针对其他免疫细胞标志物(例如，针对CD40、CD40配体或细胞因子)、融合蛋白(例如，CTLA4-Fc或PD-1-Fc)和免疫抑制药物(例如，雷帕霉素(rapamycin)、环孢素A(cyclosporine A)或FK506)的抗体。
根据本发明的ADC中修饰的Fc区
如所提到的，在本发明的一些优选实施方案中，ADC包含Fc，所述Fc可以被工程改造以包括Fc区内的修饰，通常以改变抗体的一种或多种功能性质，诸如补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，在本发明的一些实施方案中，ADC可以被化学修饰(例如，一种或多种化学部分可以附接至抗体)或被修饰以改变其糖基化，继而改变抗体的一种或多种功能性质。此类实施方案将在下面进一步描述。Fc区的残基的编号与Kabat的EU索引相同。
在一个实施方案中，CH1的铰链区被修饰，使得铰链区中半胱氨酸残基的数量被改变，例如增加或减少。这种方法在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中进一步描述。改变CHI铰链区中半胱氨酸残基的数量以例如促进轻链和重链的组装或者增加或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，抗体的Fc铰链区发生突变以进一步降低抗体的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区，使得抗体相对于天然Fc铰链结构域SpA结合具有削弱的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。这种方法在Ward等人的美国专利号6,165,745中更详细地描述。
在再其他实施方案中，通过用不同的氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区以改变抗体的效应子功能。例如，一个或多个选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的氨基酸可以被不同的氨基酸残基替换，使得抗体对效应配体(effectorligand)具有改变的亲和力，但保留了亲本抗体的抗原结合能力。亲和力改变的效应配体可以是例如Fc受体或补体的Cl组分。这种方法在Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中更详细地描述。
在另一个实例中，一个或多个选自氨基酸残基329、331和322的氨基酸可以被不同的氨基酸残基替换，使得抗体具有改变的C1q结合和/或减少或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这种方法在Idusogie等人的美国专利号6,194,551中更详细地描述。
在另一个实例中，氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基被改变，从而改变抗体固定补体的能力。这种方法在Bodmer等人的PCT出版物WO 94/29351中进一步描述。
在再另一个实例中，ADC中的Fc区被修饰以通过修饰一个或多个以下位置的氨基酸来增加抗体对Fγ受体的亲和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。这种方法在Presta的PCT出版物WO 00/42072中进一步描述。此外，人IgG1上针对FcyRI、FcyRII、FcyRIII和FcRn的结合位点已经被绘制出来，并且已经描述了具有改善的结合的变体(参见Shields,R.L.等人(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。在位置256、290、298、333、334和339处的特定突变表明可改善与FcyRIII的结合。此外，以下组合突变体表明可改善FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。此外，突变诸如M252Y/S254T/T256E或M428L/N434S可改善与FcRn的结合并且增加抗体循环半衰期(参见Chan CA和Carter PJ(2010)Nature Rev Immunol 10:301-316)。
在又另一个实施方案中，ADC中的抗体可以被修饰以消除体内Fab臂交换。具体地，此过程涉及在其他IgG4抗体之间交换IgG4半分子(一条重链加一条轻链)，这有效地产生功能单价的双特异性抗体。重链铰链区和恒定结构域的突变可以消除这种交换(参见Aalberse,RC,Schuurman J.,2002,Immunology 105:9-19)。
在又另一个实施方案中，ADC中抗体的糖基化被修饰。例如，可以制备非糖基化抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除所述位点的糖基化。这种去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。这种方法在Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中更详细地描述。
另外或或者，可以制备ADC中的具有改变类型的糖基化的抗体，诸如具有减少量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已证明这种改变的糖基化模式可增加抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来完成。本领域已经描述了具有改变的糖基化机制的细胞并且所述细胞可以用作宿主细胞，在其中表达根据本发明的至少一些实施方案的重组抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8((1,6)岩藻糖基转移酶)，因此在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其碳水化合物上缺乏岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709 FUT8细胞系通过使用两种替换载体靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因来产生(参见Yamane等人的美国专利公开号20040110704和Yamane-Ohnuki等人(2004)Biotechnol Bioeng87:614-22)。作为另一个实例，Hanai等人的EP 1,176,195描述了具有功能破坏的FUT8基因的细胞系，所述FUT8基因编码岩藻糖基转移酶，使得在这种细胞系中表达的抗体通过减少或消除1,6键相关的酶而表现出低岩藻糖基化。Hanai等人还描述了具有低酶活性的细胞系(用于将岩藻糖添加到与抗体的Fc区结合的N-乙酰氨基葡糖)或者不具有酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL1662)。Presta的PCT出版物WO 03/035835描述了变异CHO细胞系Lecl3细胞，其具有降低的岩藻糖附接至Asn(297)连接的碳水化合物的能力，也导致所述宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(也参见Shields,R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT出版物WO 99/54342描述了被工程改造以表达糖蛋白修饰糖基转移酶(例如，P(1,4)-N-乙酰氨基葡糖基转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在工程化的细胞系中表达的抗体表现出增加的二等分GlcNac结构，这导致增加的抗体的ADCC活性(也参见Umana等人(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。或者，可以使用岩藻糖苷酶将抗体的岩藻糖残基切割掉。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体中去除岩藻糖基残基(Tarentino,A.L.等人(1975)Biochem.14:5516-23)。
如示例性实施方案中提到的，抗体的Fc区发生突变以削弱FcR结合并且任选削弱补体结合。这些突变包括包含在它们的示例性抗体中的那些突变。这些突变包括任何或所有L234A/L235A和L234A/L235A/E269R/K322A(IgG1 Fc)；以及V234A/G237A/P238s.V309L/A330S/P331S(IgG2 Fc)。
编码根据本发明的ADC的核酸分子
本发明还提供了编码根据本发明的ADC(其中ADC中的抗炎剂是肽)的核酸。核酸可以存在于全细胞中、细胞裂解物中或以部分纯化的或基本上纯的形式存在。当通过标准技术(包括碱性/SDS处理、CsCl显带、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其他技术)从其他细胞组分或其他污染物(例如，其他细胞核酸或蛋白质)中纯化时，核酸被“分离”或“致使基本上纯的”。参见，F.Ausubel,等人,编(1987)Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。根据本发明的至少一些实施方案的核酸可以是例如DNA或RNA并且可或可不含有内含子序列。在一个优选实施方案中，核酸是cDNA分子。
根据本发明的ADC的离体使用
根据至少一些实施方案，可以使免疫细胞例如单核细胞或骨髓细胞、T细胞和其他造血细胞离体与主题ADC接触以引发抗炎反应，然后将接触的细胞输注到患者(例如，患有过敏性、自身免疫性或炎症性病状的患者)体内，其中炎症的减轻是治疗上需要的。调节免疫反应。
主题ADC和含有所述主题ADC的药物组合物用于治疗自身免疫性疾病的示例性用 途
本文所述的ADC和式1新型类固醇可用于治疗免疫系统相关的疾病。任选地，免疫系统相关的病状包括自身免疫性或炎症性疾病，诸如先前确定的那些，例如移植排斥、严重哮喘、结肠炎或IBD、移植物抗宿主病。任选地，所述治疗与用于治疗免疫相关的病状的另一种部分组合。
因此，使用主题ADC治疗多发性硬化症可以与例如任何已知的用于治疗多发性硬化症的治疗剂或方法(任选如本文所述)组合。
因此，使用主题ADC治疗类风湿性关节炎或其他关节炎病状可以与例如任何已知的用于治疗类风湿性关节炎的治疗剂或方法(任选如本文所述)组合。
因此，使用主题ADC治疗IBD可以与例如任何已知的用于治疗IBD的治疗剂或方法(任选如本文所述)组合。
因此，使用主题ADC治疗银屑病可以与例如任何已知的用于治疗银屑病的治疗剂或方法(任选如本文所述)组合。
因此，使用主题ADC治疗1型糖尿病可以与例如任何已知的用于治疗1型糖尿病的治疗剂或方法(任选如本文所述)组合。
因此，使用主题ADC治疗葡萄膜炎可以与例如任何已知的用于治疗葡萄膜炎的治疗剂或方法(任选如本文所述)组合。
因此，使用主题ADC治疗银屑病可以与例如任何已知的用于治疗银屑病的治疗剂或方法(任选如本文所述)组合。
因此，使用主题ADC治疗舍格伦综合症可以与例如任何已知的用于治疗舍格伦综合症的治疗剂或方法(任选如本文所述)组合。
因此，使用主题ADC治疗系统性红斑狼疮可以与例如任何已知的用于治疗系统性红斑狼疮的治疗剂或方法(任选如本文所述)组合。
因此，使用主题ADC治疗GVHD可以与例如任何已知的用于治疗GVHD的治疗剂或方法(任选如本文所述)组合。
因此，使用主题ADC治疗慢性或急性感染和/或与所述慢性或急性感染相关的肝毒性例如肝炎可以与例如任何已知的用于治疗慢性或急性感染和/或与所述慢性或急性感染相关的肝毒性的治疗剂或方法(任选如本文所述)组合。
因此，使用主题ADC治疗慢性或急性严重哮喘可以与例如任何已知的用于治疗严重哮喘的治疗剂或方法(任选如本文所述)组合。
因此，使用主题ADC治疗慢性或急性巨细胞动脉炎可以与例如任何已知的用于治疗巨细胞动脉炎的治疗剂或方法(任选如本文所述)组合。
因此，使用主题ADC治疗慢性或急性ANKA血管炎可以与例如任何已知的用于治疗ANKA血管炎的治疗剂或方法(任选如本文所述)组合。
因此，使用主题ADC治疗慢性或急性IBD(结肠炎和克罗恩病)可以与例如任何已知的用于治疗ANKA血管炎的治疗剂或方法(任选如本文所述)组合。
同样，应理解本文确定的疾病病状和提出的治疗旨在是示例性的而不是详尽的。
在上述疗法中，优选地，将向患有上述或其他自身免疫性或炎症性病状之一的受试者施用根据本发明的ADC，从而预防或改善疾病症状。
药物组合物
在另一方面，本发明提供了一种组合物，例如药物组合物，其含有根据本发明的ADC或式1新型类固醇中的一者或其组合，以及任选另一种免疫抑制剂或其他活性剂。因此，本发明以包含治疗有效量的根据本发明的ADC或式1新型类固醇的药物组合物为特点。具体而言，本发明以包含治疗有效[抗炎]量的根据本发明的ADC或式1新型类固醇中的至少一种的药物组合物为特点。
术语“治疗有效量”是指有效治疗哺乳动物的疾病或病症的本发明的剂的量。本发明的治疗剂可以单独或作为药物组合物的一部分提供给受试者，其中它们与药学上可接受的载剂混合。在许多情况下，根据本发明的ADC将与用于治疗特定病状的其他免疫治疗剂或其他治疗剂组合使用。
如果一种组合物的施用可以被接受的患者耐受，则称所述组合物是“药学上可接受的”。如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括任何和所有生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载剂适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。
这样的组合物包括无菌水、缓冲盐水(例如，Tris-HCl、醋酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度以及任选添加剂诸如去污剂和增溶剂(例如，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如，硫柳汞、苯甲醇)和填充物质(例如，乳糖、甘露醇)。如下文详述的，也可以使用非水性溶剂或媒介物。
可以在根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物中采用的合适的水性和非水性载剂的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和它们的合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)以及可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。例如，可以通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)、通过维持所需的粒度(在分散体的情况下)以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。根据施用途径，活性化合物(即单克隆或多克隆抗体和抗原结合片段和含有它们的缀合物，和/或可特异性结合VISTA蛋白中的任一种的替代支架，或双特异性分子)可包封在材料中以保护化合物免受酸和可能使化合物失活的其他自然条件的作用。根据本发明的至少一些实施方案的药物化合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性并且不赋予任何不希望的毒理效应的盐(参见例如，Berge,S.M.,等人(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等，以及衍生自无毒有机酸诸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等的那些。碱加成盐包括衍生自碱土金属诸如钠、钾、镁、钙等，以及衍生自无毒有机胺诸如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的那些。
根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物还可以包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
这些组合物也可以含有佐剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述灭菌程序以及通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂例如尼泊金(paraben)、氯丁醇、苯酚山梨酸等来确保防止微生物的存在。还可能需要在组合物中包含等渗剂，诸如糖、氯化钠等。此外，可注射药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸收的剂诸如单硬脂酸铝和明胶来达成。
药学上可接受的载剂包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。用于药学活性物质的此类介质和剂的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或剂与活性化合物不相容，否则考虑将其用于根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物中。补充性活性化合物也可以掺入组合物中。
治疗组合物在制造和储存的条件下通常必须是无菌和稳定的。组合物可以被配制为适合于高药物浓度的溶液、微乳液、脂质体或其他有序结构。载剂可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和它们的合适的混合物。例如，可以通过使用包衣(诸如卵磷脂)、通过维持所需的粒度(在分散体的情况下)以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在很多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖类、诸如甘露糖醇、山梨糖醇的多元醇或氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的剂例如单硬脂酸盐和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。可以通过将所需量的活性化合物与一种上文列举的成分或其组合掺入适当的溶剂中，按照需要，接着进行微滤灭菌来制备无菌注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有碱性分散介质和来自上文列举的那些的所需的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，所述方法从其先前无菌过滤的溶液中得到活性成分加上任何附加的所需的成分的粉末。
可以通过将所需量的活性化合物与一种上文列举的成分或其组合掺入适当的溶剂中，按照需要，接着进行微滤灭菌来制备无菌注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有碱性分散介质和来自上文列举的那些的所需的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，所述方法从其先前无菌过滤的溶液中得到活性成分加上任何附加的所需的成分的粉末。
本发明的组合物可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种经由一种或多种施用途径来施用。如技术人员将理解，所述施用途径和/或方式将根据所需的结果而有所不同。根据本发明的至少一些实施方案的治疗剂的优选施用途径包括血管内递送(例如注射或输注)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓、口服、肠内、直肠、肺(例如吸入)、鼻腔、局部(包括经皮、口腔和舌下)、膀胱内、玻璃体内、腹膜内、阴道、脑递送(例如脑室内、脑内和对流增强扩散)、CNS递送(例如鞘内、脊髓周围和脊髓内)或肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内和皮内)、经粘膜(例如舌下施用)、施用或经由植入物施用，或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注，或者本领域已知的其他递送途径和/或施用形式。如本文所用，短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用之外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊髓内、硬膜外和胸骨内注射和输注。在一个具体实施方案中，根据本发明的至少一些实施方案的蛋白质、治疗剂或药物组合物可以腹膜内或静脉内施用。
或者，根据本发明的ADC可以经由非肠胃外途径施用，诸如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部。
包含根据本发明的ADC的治疗组合物可以用本领域已知的医疗装置施用。例如，在一个优选实施方案中，根据本发明的至少一些实施方案的治疗组合物可以用针头皮下注射装置施用，诸如美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置。可用于本发明的众所周知的植入物和模件的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开了一种用于以受控的速率分配药物的可植入微型输液泵；美国专利号4,486,194，其公开了一种用于通过皮肤施用药剂的治疗装置；美国专利号4,447,233，其公开了一种用于以精确的输注速率递送药物的输液泵；美国专利号4,447,224，其公开了一种用于进行连续药物递送的可变流量植入式输液设备；美国专利号4,439,196，其公开了一种具有多室隔室的渗透药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其公开了一种渗透药物递送系统。这些专利以引用的方式并入本文。许多其它此类植入物、递送系统和模件是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，可以配制ADC以确保体内适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排除了许多高度亲水的化合物。为了确保根据本发明的至少一些实施方案的治疗化合物穿过BBB(如果需要)，可以将它们配制在例如脂质体中。关于制造脂质体的方法，参见，例如，美国专利号4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可以包含一种或多种选择性转运到特定细胞或器官中，从而增强靶向药物递送的部分(参见，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(参见，例如，Low等人的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等人(1995)FEBS Lett.357:140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人(1995)Am.JPhysiol.1233:134)；pl20(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion；和I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括任何和所有生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载剂适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，活性化合物(即含有VISTA抗原胞外域的可溶性多肽缀合物、抗体、免疫缀合物、替代支架和/或双特异性分子)可以包封在材料中以保护化合物免受酸和可能使化合物失活的其他自然条件的作用。根据本发明的至少一些实施方案的药物化合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性并且不赋予任何不希望的毒理效应的盐(参见例如，Berge,S.M.,等人(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等，以及衍生自无毒有机酸诸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等的那些。碱加成盐包括衍生自碱土金属诸如钠、钾、镁、钙等，以及衍生自无毒有机胺诸如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的那些。
根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物还可以包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。可以在根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物中采用的合适的水性和非水性载剂的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和它们的合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)以及可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。例如，可以通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)、通过维持所需的粒度(在分散体的情况下)以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
这些组合物也可以含有佐剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述灭菌程序以及通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂例如尼泊金、氯丁醇、苯酚山梨酸等来确保防止微生物的存在。还可能需要在组合物中包含等渗剂，诸如糖、氯化钠等。此外，可注射药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸收的剂诸如单硬脂酸铝和明胶来达成。
药学上可接受的载剂包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。用于药学活性物质的此类介质和剂的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或剂与活性化合物不相容，否则考虑将其用于根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物中。补充性活性化合物也可以掺入组合物中。
治疗组合物在制造和储存的条件下通常必须是无菌和稳定的。组合物可以被配制为适合于高药物浓度的溶液、微乳液、脂质体或其他有序结构。载剂可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和它们的合适的混合物。例如，可以通过使用包衣(诸如卵磷脂)、通过维持所需的粒度(在分散体的情况下)以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在很多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖类、诸如甘露糖醇、山梨糖醇的多元醇或氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的剂例如单硬脂酸盐和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。可以通过将所需量的活性化合物与一种上文列举的成分或其组合掺入适当的溶剂中，按照需要，接着进行微滤灭菌来制备无菌注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有碱性分散介质和来自上文列举的那些的所需的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，所述方法从其先前无菌过滤的溶液中得到活性成分加上任何附加的所需的成分的粉末。
可以通过将所需量的活性化合物与一种上文列举的成分或其组合掺入适当的溶剂中，按照需要，接着进行微滤灭菌来制备无菌注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有碱性分散介质和来自上文列举的那些的所需的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，所述方法从其先前无菌过滤的溶液中得到活性成分加上任何附加的所需的成分的粉末。
可以与载剂材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据被治疗受试者和特定施用方式而有所不同。可以与载剂材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常将是产生治疗效果的组合物的量。通常，在百分之百中，此量将是与药学上可接受的载剂组合的约0.01百分比至约99百分比范围内的活性成分、优选约0.1百分比至约70百分比、最优选约1百分比至约30百分比范围内的活性成分。。
调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用几个分开的剂量或者剂量可以按比例减少或增加，如治疗情况的紧急程度所指示。为了施用方便和剂量均匀而配制剂量单位形式的肠胃外组合物是特别有利的。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗的受试者的单个剂量(unitarydosages)的物理离散单位；每个单位含有与需要的药物载剂结合的经计算产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。根据本发明的至少一些实施方案的剂量单位形式的规格由以下各项规定并且直接取决于以下各项：(a)活性化合物的独特特性和待实现的特定治疗效果，和(b)合成这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的领域中固有的限制。
对于本文公开的ADC的施用，在一些实施方案中，剂量范围通常将包括施用一定量的ADC，与如果特定抗炎剂(例如类固醇诸如地塞米松)经由常规途径施用(即，其中类固醇以裸或未缀合的形式施用以治疗特定病状)相比，所述ADC递送相同或更少量的抗炎剂(例如类固醇诸如地塞米松)来获得治疗功效。在示例性实施方案中，剂量范围通常将包括施用一定量的ADC，与如果AI经由常规途径施用(即，其中类固醇以裸或未缀合的形式施用以治疗特定病状)相比，所述ADC递送减少量的抗炎剂(例如其(例如地塞米松的)10-90％)以获得治疗功效，正如基于迄今为止获得的结果所预期的那样：除了减少或消除AI诸如类固醇的不良副作用之外，本发明的ADC将更有效地递送至所需的靶免疫细胞并且将不易到达非靶细胞，从而减少需要的类固醇剂量有效量和/或减少对非靶细胞的影响。
本文公开的ADC可以多次施用。单次剂量之间的间隔可以是例如每3-5天、每周、每两周等。在一些方法中，调整剂量以实现所需水平的血浆类固醇浓度。与其他ADC(其中在ADC中的抗体引发生物或治疗效应)相比，确定使用主题ADC进行治疗或预防的有效给药方案会相对容易，因为主题ADC的治疗活性完全由抗炎有效载荷控制。(本质上，抗体仅靶向特定免疫细胞并引导主题ADC内化至特定免疫细胞中)。
或者，ADC可以作为缓释制剂施用，在这种情况下需要较少的施用频率。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而有所不同。在预防性应用中，可以在较长时间段内以相对不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者可能会在其余生中继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对较短的间隔使用相对较高的剂量，直到疾病进展减少或终止，并且优选直到患者表现出疾病症状的部分或完全改善。此后，可以向患者施用预防性方案。如所述，主题ADC优选用于此类用途，因为它们在外周循环中停留的持续时间非常短，不与非免疫细胞结合并且不会明显引发对非靶细胞的毒性。
可以改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平以便获得有效实现针对特定患者的所需治疗反应的活性成分、组合物的量以及施用方式(不对患者产生毒性)。所选剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所用的本发明的特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所用特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、被治疗患者的年龄、性别、重量、病情、一般健康状况和既往病史，以及医学领域中众所周知的类似因素。
示例性实施方案
本发明提供了抗体药物缀合物(ADC)，其包含：抗体或抗原结合片段(“A”)，所述抗体或抗原结合片段包含特异性结合至人T细胞激活V结构域Ig抑制因子(人VISTA)的抗原结合区；可切割和/或不可切割接头(“L”)；任选“异双官能基团”或“异三官能基团”“Q”，所述Q是任选用于将接头连接至抗VISTA抗体或抗体片段的化学部分；以及至少一种小分子抗炎剂(“AI”)(通常是类固醇)，所述ADC由下式表示：
“A-(Q-L-AI)n”或“(AI-L-Q)n-A”
其中“n”至少为1，并且当向有需要的受试者施用时，抗体或ADC或含有其的组合物优先递送至表达VISTA的免疫细胞(任选单核细胞或骨髓细胞)并且导致小分子抗炎剂在生理条件(约pH 7.5)下功能内化至所述免疫细胞中，优选其中抗VISTA抗体或抗原结合片段在体内使用时在生理pH(约pH 7.5)下在血清中具有短体内血清半衰期，任选在生理pH(约pH 7.5)下在血清中在啮齿动物(人VISTA敲入小鼠或大鼠)中具有以下体内血清半衰期：不超过70小时、不超过60小时、不超过50小时、不超过40小时、不超过30小时、不超过24小时、不超过22-24小时、不超过20-22小时、不超过18-20小时、不超过16-18小时、不超过14-16小时、不超过12-14小时、不超过10-12小时、不超过8-10小时、不超过6-8小时、不超过4-6小时、不超过2-4小时、不超过1-2小时、不超过0.5-1.0小时或不超过0.1-0.5小时；和/或在灵长类动物(例如，人或食蟹猕猴)中具有不超过约3、2.5或2.3±0.7天的血清半衰期。
可并入主题ADC中的示例性可切割和不可切割接头先前已在本文中确定并且在本领域中是众所周知的。可用于根据本发明的ADC中的此类接头的具体类型和实例在下文进一步确定。
如所提到的，本发明考虑包含在根据本发明的抗VISTA ADC中的抗炎剂(AI)包括任何需要细胞内化以获得功效(抗炎活性)的小分子抗炎剂。具体地，本发明包括合成糖皮质激素受体激动剂(例如，地塞米松、泼尼松龙、布地奈德、倍氯米松、倍他米松、皮质醇、醋酸可的松、16-α羟基泼尼松龙、地塞米松、二氟拉松、氟米松、氟尼缩松、醋酸氟轻松、丙酸氟替卡松、环索奈德、甲基泼尼松龙、强的松、泼尼松龙、莫米松、曲安奈德等)作为AI。如所提到的，虽然这些类固醇化合物在抑制与不同病状(诸如自身免疫性和炎症性病症、癌症和感染性疾病)相关的炎症方面非常有效，但由于严重的副作用，它们在疾病的慢性治疗中的效用受到限制，当所述类固醇化合物并入到根据本发明的抗VISTA ADC中时，所述严重的副作用将会减轻。
具体地，本发明包括根据本发明的抗VISTA ADC，其中AI包括类固醇(糖皮质激素激动剂)，其包含以下通用结构：
Figure BDA0004033983910001151
其中X或Z可以是苯基、3-6元杂环、环烷基、螺烷基、螺杂环烷基、[1.1.1]双环戊烷、双环[2.2.2]辛烷或立方烷，其各自可以被1-4个独立地选自N、S和O的杂原子取代并且任选进一步被1-4个C1-3烷基取代；
X至Z的键联可以占据X和Z上的任何可用位置；
Y可以是CHR1、O、S或NR1；
E可以是CH2或O；
G可以是CH2或NR1；
R1可以是H、1-8个碳的低级或支链烷基、芳基或杂芳基。在芳基或杂芳基环被取代的情况下，所述取代基可以是烷基、卤代烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫代烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基-C(O)-；
当R1＝H时，R2可以是H、1-8个碳的低级或支链烷基、芳基或杂芳基。在芳基或杂芳基环被取代的情况下，所述取代基可以是烷基、卤代烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫代烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基-C(O)-；
当R1是H、1-8个碳的低级或支链烷基、杂芳基时，R2可以是选自以下的官能团：[(C＝O)CH2(W)NHC＝O]m-V-J并且W可以是H或[(CH2)n R3]n，其中n＝1-4并且m＝1-6。W也可以是以R3为末端的支链烷基链或1-13个单元的聚乙二醇基团OCH2CH2O；
R3可以是H或选自以下：OH、O-烷基、NH2、NH-烷基、N-二烷基、SH、S-烷基、胍、脲、羧酸、羧酰胺、羧酸酯、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基，所述取代基可以是烷基、卤代烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫代烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基-C(O)-；
取代基NR1R2可以占据Z上的任何可用位置；
R2也可以是C(＝O)OCH2-对-氨基苯基[(C＝O)CH(W)NHC＝O]m-V-J并且W可以是H或[(CH2)n R3]n，其中n＝1-4并且m＝1-6。W也可以是以R3为末端的支链烷基链、1-13个单元的聚乙二醇基团OCH2CH2O或C(＝O)OCH2-对-氨基苯基-V-J；
V可以是1-8个碳的烷基链、1-13个单元的聚乙二醇基团OCH2CH2O或选自1-8个碳的低级或支链烷基、芳基或杂芳基。当芳基或杂芳基环被取代时，所述取代基可以是烷基、卤代烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫代烷基、胍、尿素、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-、二烷基氨基-C(O)-和1-3个选自Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、βAla、Phe、Val或Cit的氨基酸序列；
J是选自-NH2、N3、硫代、环辛炔、-OH、-CO2H、反式-环辛炔的反应性基团，
Figure BDA0004033983910001171
其中R32是Cl、Br、F、甲磺酸酯或甲苯磺酸酯并且R33是Cl、Br、I、F、OH、-O-N-琥珀酰亚胺基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基，R34是H、Me或四嗪-H或Me；
Q可以是H、P(O)OR4(其中R4可以是H或低级1-10烷基)、C(O)R6(其中R6是1-8个碳的低级或支链烷基)或[(C＝O)NR4CHnNR4(C＝O)OCHm]m-V-V-J(其中n＝1-8，m＝1-6并且R4＝H、烷基或支链烷基)；
A1和A2可以是H或卤素，并且除非另有说明，否则包括所有可能的立体异构体。
I.示例性接头
如前所述，可以将不同的接头并入到根据本发明的ADC中。此类接头先前已在定义部分中确定，其中定义了“接头”。此外，下面提供了可以并入到根据本发明的ADC中的示例性接头：
A.牺牲型接头ADC
(I)
Figure BDA0004033983910001181
其中，
Ab＝抗体
L＝接头
AA＝单、双或三氨基酸序列
Figure BDA0004033983910001182
REG独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、联苯、-CF3、-NO2、-CN、氟、溴、氯、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-。
(II)
Figure BDA0004033983910001191
其中，
Ab＝抗体
L＝接头
AA＝单、双或三氨基酸序列
Figure BDA0004033983910001192
REG独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、联苯、-CF3、-NO2、-CN、氟、溴、氯、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-。
(III)
Figure BDA0004033983910001193
其中，
Ab＝抗体
L＝接头
AA＝单、双或三氨基酸序列或不存在
Figure BDA0004033983910001201
REG独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、联苯、-CF3、-NO2、-CN、氟、溴、氯、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-。
RT＝AA或
Figure BDA0004033983910001202
(IV)
Figure BDA0004033983910001203
其中，
Ab＝抗体
L＝接头
AA＝单、双或三氨基酸序列
Figure BDA0004033983910001211
(V)
Figure BDA0004033983910001212
其中，
Ab＝抗体
L＝接头
AA＝单、双或三氨基酸序列或不存在
Figure BDA0004033983910001213
Figure BDA0004033983910001221
RT＝AA或
Figure BDA0004033983910001222
B.氨基酸(AA)接头
(I)由组织蛋白酶切割的序列
a.单氨基酸接头
Figure BDA0004033983910001223
Figure BDA0004033983910001231
b.二肽接头
Figure BDA0004033983910001232
Figure BDA0004033983910001241
Figure BDA0004033983910001251
c.三肽接头
Figure BDA0004033983910001252
Figure BDA0004033983910001261
Figure BDA0004033983910001271
(I)豆荚蛋白可切割接头
Figure BDA0004033983910001281
其中，
L＝接头
Ab＝抗体
Figure BDA0004033983910001282
表示有效载荷或牺牲型接头的附接点。
II.示例性抗体缀合策略
可以使用不同的缀合策略将抗VISTA抗体缀合至接头和有效载荷(类固醇或其他抗炎化合物)。实施例中提供了用于产生示例性ADC和接头有效载荷的详细合成方法。此外，下面提供了示例性缀合策略：
(I)有效载荷-接头-J
其中有效载荷为：
Figure BDA0004033983910001283
接头＝Q、R1或R2
J是适合与Ab上的互补官能团反应以形成抗体药物缀合物的官能团。
J选自：
Figure BDA0004033983910001291
Figure BDA0004033983910001292
表示J与选自Q、R1或R2的接头的附接点。
其中R32是Cl、Br、F、甲磺酸酯或甲苯磺酸酯，R33是Cl、Br、I、F、OH、-O-N-琥珀酰亚胺基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基，并且R34是H、Me或吡啶基；
-OH基团可以与抗体上(例如，天冬氨酸或谷氨酸侧链上)的羧基酯化；
-CO2H基团可以与抗体上(例如赖氨酸侧链上)的-OH基团酯化或与氨基酰胺化；
N-羟基琥珀酰亚胺基团在功能上是活化的羧基，并且可以方便地通过与氨基(例如，来自赖氨酸)反应酰胺化；
在迈克尔加成反应(Michael addition reaction)中，马来酰亚胺基团可以与抗体上的-SH基团缀合(例如，来自抗体的半胱氨酸或来自抗体的化学修饰以引入巯基官能性)；
在抗体没有可用于缀合的半胱氨酸-SH的情况下，赖氨酸残基侧链中的ε-氨基可以与2-亚氨基硫杂环戊烷或N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(“SPDP”)反应以引入游离硫醇(-SH)基团——产生半胱氨酸替代物。硫醇基团可以与马来酰亚胺或其他亲核受体基团反应以实现缀合。
抗体Ab可以用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(“SMCC”)或其磺化变体磺基-SMCC(两者都可自Sigma-Aldrich获得)进行修饰，以向其引入马来酰亚胺基团。然后，可以用在接头上具有-SH基团的药物接头化合物实现缀合。
无铜“点击化学”，其中将叠氮基(-N3)加到应变环辛炔上以形成1,2,3-三唑环。叠氮化物可以位于抗体上，而环辛炔可以位于药物接头部分上，反之亦然。优选的环辛炔基团是二苯并环辛炔(DBCO)。
将非天然氨基酸引入抗体，其中所述非天然氨基酸提供与药物部分中的反应性官能团缀合的官能性。例如，可以将非天然氨基酸对乙酰基苯丙氨酸并入抗体或其他多肽中。对乙酰基苯丙氨酸中的酮基可以经由在接头药物部分上与羟氨基形成肟而成为缀合位点。或者，可以将非天然氨基酸对叠氮基苯丙氨酸(或对叠氮基甲基-l-苯丙氨酸)并入抗体中以提供叠氮化物官能团，以经由点击化学与DBCO缀合而形成1,2,3-三唑环。
另一个实例是并入含有应变烯烃降冰片烯、反式环辛烯或环丙烯的非天然氨基酸，其可以与四嗪发生逆电子消去迪尔斯阿尔德“点击化学”反应(inverse electrondemad Diels Alder“click chemistry”reaction)以形成双环二嗪产物。
另一种缀合技术使用转谷氨酰胺酶(优选来自茂原链霉菌(Streptomycesmobaraensis)或BTG的细菌转谷氨酰胺酶)。BTG在谷氨酰胺的侧链羧酰胺(胺受体)与亚烷基氨基(胺供体)之间形成酰胺键，所述亚烷基氨基(胺供体)可以是例如赖氨酸的ε-氨基或5-氨基-n-戊基。在典型的缀合反应中，谷氨酰胺残基位于抗体上，而亚烷基氨基位于接头药物部分上。
III.示例性抗体缀合物
根据本发明的ADC缀合物任选包含抗VISTA抗体(其在生理pH下与人VISTA结合并且具有如前所定义的短PK)、一种或多种可切割和/或不可切割接头以及一种或多种任选附接至牺牲型接头的有效载荷(类固醇或其他抗炎化合物)，所述ADC缀合物可以使用上述和如实施例中公开的详细合成方法来产生。下面提供了一些示例性ADC结构和缀合方法：
(I)优选实例
Figure BDA0004033983910001321
Figure BDA0004033983910001331
Figure BDA0004033983910001341
Figure BDA0004033983910001342
表示抗体或其抗原结合片段的附接点
Figure BDA0004033983910001343
表示抗体或其抗原结合片段经由半胱氨酸残基的硫原子的附接点；或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体，和/或立体异构体的混合物。
Figure BDA0004033983910001344
表示接头或AA的附接点
IV.示例性有效载荷接头结构
可以使用上述和如实施例中公开的详细合成方法来产生附接至接头的不同有效载荷(类固醇或其他抗炎化合物)。下面提供了一些示例性有效载荷接头结构：
(I)有效载荷-接头-J
其中，
接头＝蛋白酶可切割序列(AA)
J＝烷氧基胺
Figure BDA0004033983910001351
Figure BDA0004033983910001361
Figure BDA0004033983910001371
其中，
接头＝蛋白酶可切割序列(AA)
J＝溴乙酰溴
Figure BDA0004033983910001381
Figure BDA0004033983910001391
其中，
接头＝蛋白酶可切割序列(AA)
J＝二苄基环辛炔
Figure BDA0004033983910001401
Figure BDA0004033983910001411
Figure BDA0004033983910001421
Figure BDA0004033983910001431
其中，
接头＝蛋白酶可切割序列(AA)
J＝羟基琥珀酰亚胺
Figure BDA0004033983910001432
Figure BDA0004033983910001441
Figure BDA0004033983910001451
Figure BDA0004033983910001461
其中，
接头＝蛋白酶可切割序列(AA)
J＝马来酰亚胺
Figure BDA0004033983910001471
Figure BDA0004033983910001481
Figure BDA0004033983910001491
Figure BDA0004033983910001501
其中，
接头＝蛋白酶可切割序列(AA)
J＝四嗪
Figure BDA0004033983910001502
Figure BDA0004033983910001511
Figure BDA0004033983910001521
Figure BDA0004033983910001531
Figure BDA0004033983910001541
其中，
接头＝蛋白酶可切割序列(AA)
J＝TG缀合
Figure BDA0004033983910001551
Figure BDA0004033983910001561
Figure BDA0004033983910001571
(II)有效载荷-接头-J
其中，
接头＝蛋白酶可切割序列(AA)+牺牲型接头对氨基苄基(PAB)
J＝烷氧基胺
Figure BDA0004033983910001581
Figure BDA0004033983910001591
Figure BDA0004033983910001601
Figure BDA0004033983910001611
其中，
接头＝蛋白酶可切割序列(AA)+牺牲型接头对氨基苄基(PAB)
J＝溴乙酰溴
Figure BDA0004033983910001612
Figure BDA0004033983910001621
Figure BDA0004033983910001631
Figure BDA0004033983910001641
其中，
接头＝蛋白酶可切割序列(AA)+牺牲型接头对氨基苄基(PAB)
J＝二苯并环辛炔
Figure BDA0004033983910001651
Figure BDA0004033983910001661
Figure BDA0004033983910001671
Figure BDA0004033983910001681
其中，
接头＝蛋白酶可切割序列(AA)+牺牲型接头对氨基苄基(PAB)
J＝羟基琥珀酰亚胺
Figure BDA0004033983910001691
Figure BDA0004033983910001701
Figure BDA0004033983910001711
Figure BDA0004033983910001721
其中，
接头＝蛋白酶可切割序列(AA)+牺牲型接头对氨基苄基(PAB)
J＝马来酰亚胺
Figure BDA0004033983910001722
Figure BDA0004033983910001731
Figure BDA0004033983910001741
Figure BDA0004033983910001751
其中，
接头＝蛋白酶可切割序列(AA)+牺牲型接头对氨基苄基(PAB)
J＝四嗪
Figure BDA0004033983910001761
Figure BDA0004033983910001771
Figure BDA0004033983910001781
Figure BDA0004033983910001791
其中，
接头＝蛋白酶可切割序列(AA)+牺牲型接头对氨基苄基(PAB)
J＝胺
Figure BDA0004033983910001801
Figure BDA0004033983910001811
Figure BDA0004033983910001821
Figure BDA0004033983910001831
(II)有效载荷-接头-J
其中，
接头＝葡糖醛酸酶可切割糖(GlcA)+牺牲型接头对氨基苄基(PAB)
J＝烷氧基胺
Figure BDA0004033983910001832
Figure BDA0004033983910001841
Figure BDA0004033983910001851
Figure BDA0004033983910001861
Figure BDA0004033983910001871
其中，
接头＝葡糖醛酸酶可切割糖(GlcA)+牺牲型接头对氨基苄基(PAB)
J＝溴乙酰溴
Figure BDA0004033983910001881
Figure BDA0004033983910001891
Figure BDA0004033983910001901
Figure BDA0004033983910001911
其中，
接头＝葡糖醛酸酶可切割糖(GlcA)+牺牲型接头对氨基苄基(PAB)
J＝二苯并环辛炔
Figure BDA0004033983910001921
Figure BDA0004033983910001931
Figure BDA0004033983910001941
Figure BDA0004033983910001951
Figure BDA0004033983910001961
其中，
接头＝葡糖醛酸酶可切割糖(GlcA)+牺牲型接头对氨基苄基(PAB)
J＝羟基琥珀酰亚胺
Figure BDA0004033983910001971
Figure BDA0004033983910001981
Figure BDA0004033983910001991
Figure BDA0004033983910002001
Figure BDA0004033983910002011
其中，
接头＝葡糖醛酸酶可切割糖(GlcA)+牺牲型接头对氨基苄基(PAB)
J＝马来酰亚胺
Figure BDA0004033983910002012
Figure BDA0004033983910002021
Figure BDA0004033983910002031
Figure BDA0004033983910002041
Figure BDA0004033983910002051
Figure BDA0004033983910002061
其中，
接头＝葡糖醛酸酶可切割糖(GlcA)+牺牲型接头对氨基苄基(PAB)
J＝四嗪
Figure BDA0004033983910002071
Figure BDA0004033983910002081
Figure BDA0004033983910002091
Figure BDA0004033983910002101
Figure BDA0004033983910002111
其中，
接头＝葡糖醛酸酶可切割糖(GlcA)+牺牲型接头对氨基苄基(PAB)
J＝胺
Figure BDA0004033983910002112
Figure BDA0004033983910002121
Figure BDA0004033983910002131
Figure BDA0004033983910002141
Figure BDA0004033983910002151
(IV)有效载荷-接头-J
替代的有效载荷的接头-J附接位点(C11-OH)。
INX-SM-3被用作有效载荷实例
烷氧基胺
Figure BDA0004033983910002161
溴乙酰溴
Figure BDA0004033983910002162
马来酰亚胺
Figure BDA0004033983910002171
二苯并环辛炔
Figure BDA0004033983910002181
四嗪
Figure BDA0004033983910002191
胺
Figure BDA0004033983910002192
Figure BDA0004033983910002201
(IV)有效载荷-接头-J
替代的有效载荷的接头-J附接位点(C17)。
INX-SM-3被用作有效载荷实例烷氧基胺
Figure BDA0004033983910002202
溴乙酰溴
Figure BDA0004033983910002211
马来酰亚胺
Figure BDA0004033983910002212
Figure BDA0004033983910002221
二苯并环辛炔
Figure BDA0004033983910002222
四嗪
Figure BDA0004033983910002231
胺
Figure BDA0004033983910002241
V.示例性有效载荷-接头-Ab缀合物(其中INX-SM-3是示例性有效载荷)
不同的ADC缀合物包含与由免疫细胞表达的抗原结合的抗体或抗体片段(任选具有本文所述的pH结合/PK性质的抗VISTA抗体或片段)、一种或多种接头和一种或多种有效载荷(类固醇或其他抗炎化合物)，所述ADC缀合物可以使用上述和如实施例中公开的详细合成方法来产生。下面提供了一些包含示例性类固醇有效载荷(INX-SM-3)的示例性ADC：
烷氧基胺+酮缀合(C11-OH连接的)
Figure BDA0004033983910002251
叠氮化物+二苯并环辛炔缀合(C11-OH连接的)
Figure BDA0004033983910002252
Figure BDA0004033983910002261
卤乙酰(Haloacetyl)+半胱氨酸缀合(C11-OH连接的)
Figure BDA0004033983910002262
马来酰亚胺+半胱氨酸缀合(C11-OH连接的)
Figure BDA0004033983910002271
四嗪+反式环辛烯缀合(C11-OH连接的)
Figure BDA0004033983910002272
Figure BDA0004033983910002281
氨+谷氨酰胺缀合(使用反式谷氨酰胺酶)(C11-OH连接的)
Figure BDA0004033983910002282
烷氧基胺+酮缀合(C17)
Figure BDA0004033983910002291
叠氮化物+二苯并环辛炔缀合(C17)
Figure BDA0004033983910002301
卤乙酰与半胱氨酸缀合(C17)
Figure BDA0004033983910002311
马来酰亚胺与半胱氨酸缀合(C17)
Figure BDA0004033983910002312
Figure BDA0004033983910002321
四嗪+反式环辛烯(C17)
Figure BDA0004033983910002322
Figure BDA0004033983910002331
氨+谷氨酰胺缀合(使用反式谷氨酰胺酶)(C17)
Figure BDA0004033983910002332
N-连接的有效载荷-接头-Ab ADC
Figure BDA0004033983910002341
Figure BDA0004033983910002351
Figure BDA0004033983910002361
Figure BDA0004033983910002371
Figure BDA0004033983910002381
式1类固醇有效载荷和含有其的ADC的治疗应用
可以如上所述产生包含诸如以下的合成糖皮质激素激动剂的ADC：地塞米松、泼尼松龙、布地奈德、倍氯米松、倍他米松、皮质醇、醋酸可的松、16-α羟基泼尼松龙、地塞米松、二氟拉松、氟米松、氟尼缩松、醋酸氟轻松、丙酸氟替卡松、环索奈德、甲基泼尼松龙、强的松、泼尼松龙、莫米松、曲安奈德或式1类固醇。在示例性实施方案中，ADC中包含的抗体将包括抗人VISTA抗体或片段，其在生理pH下与免疫细胞结合并且还具有短PK。然而，在类固醇是式1之一的ADC中，ADC中的抗体或抗体片段可以结合至免疫细胞上表达的另一种抗原，优选仅在免疫细胞上表达的抗原。
这些ADC可用于预防性和/或治疗性治疗炎症和与炎症相关的疾病，包括例如像先前公开的自身免疫性病症、炎症性病症和癌症。同样，主题ADC(包括那些包含式1类固醇的ADC)的优选应用是用于治疗与炎症相关的慢性疾病。
如本文所示，尽管包含在主题ADC中的抗VISTA抗体的短pK(所述抗VISTA抗体在生理条件下与表达VISTA的细胞结合，并且其未被工程改造以改变或优化pH结合)，即，通常在食蟹猕猴中约2.3天或更短，以及在人VISTA工程化小鼠中不超过70小时、不超过60小时、不超过50小时、不超过40小时、不超过30小时、不超过24小时、不超过22-24小时、不超过20-22小时、不超过18-20小时、不超过16-18小时、不超过14-16小时、不超过12-14小时、不超过10-12小时、不超过8-10小时、不超过6-8小时、不超过4-6小时、不超过2-4小时、不超过1-2小时、不超过0.5至1.0小时或不超过0.1-0.5小时，已发现主题ADC相对于抗体的半衰期(PK)长时间(PD)保持效力。
如本文所示，根据本发明的ADC缀合物在体内模型中评价时已被证明提供至少14:1的PK/PD比率。同样，虽然申请人不想受其信念的束缚，但理论上主题ADC在表达VISTA的靶细胞中以非常高的量递送，所述表达VISTA的靶细胞诸如巨噬细胞、T细胞和Treg以及其他具有长细胞周转率(数周、数月或更长时间)的表达VISTA的免疫细胞。本质上，似乎产生了储库效应，即，大量主题ADC被内化至表达VISTA的免疫细胞中，即由于VISTA的非常高的表达，然后ADC例如通过细胞酶被缓慢代谢或切割，导致细胞内治疗有效量的类固醇有效载荷逐渐和延长的释放。
本发明还包括以下实施例。
实施方案
(1.)一种糖皮质激素激动剂化合物，其具有以下式(1)结构:
Figure BDA0004033983910002401
其中X或Z可以是苯基、3-6元杂环、环烷基、螺烷基、螺杂环烷基、[1.1.1]双环戊烷、双环[2.2.2]辛烷或立方烷，其各自可以被1-4个独立地选自N、S和O的杂原子取代并且任选进一步被1-4个C1-3烷基取代；
X至Z的键联可以占据X和Z上的任何可用位置；
Y可以是CHR1、O、S或NR1；
E可以是CH2或O；
G可以是CH2或NR1；
R1可以是H、1-8个碳的低级或支链烷基、芳基或杂芳基。在芳基或杂芳基环被取代的情况下，所述取代基可以是烷基、卤代烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫代烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-；
当R1＝H时，R2可以是H、1-8个碳的低级或支链烷基、芳基或杂芳基。在芳基或杂芳基环被取代的情况下，所述取代基可以是烷基、卤代烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫代烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-；
当R1是H、1-8个碳的低级或支链烷基、杂芳基时，R2可以是选自以下的官能团：[(C＝O)CH2(W)NHC＝O]m-V-J并且W可以是H或[(CH2)n R3]n，其中n＝1-4并且m＝1-6。W也可以是以R3为末端的支链烷基链或1-13个单元的聚乙二醇基团OCH2CH2O；
R3可以是H或选自以下：OH、O-烷基、NH2、NH-烷基、N-二烷基、SH、S-烷基、胍、脲、羧酸、羧酰胺、羧酸酯、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基，所述取代基可以是烷基、卤代烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫代烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-；
取代基NR1R2可以占据Z上的任何可用位置；
R2也可以是C(＝O)OCH2-对-氨基苯基[(C＝O)CH(W)NHC＝O]m-V-J并且W可以是H或[(CH2)n R3]n，其中n＝1-4并且m＝1-6。W也可以是以R3为末端的支链烷基链、1-13个单元的聚乙二醇基团OCH2CH2O或C(＝O)OCH2-对-氨基苯基-V-J；
V可以是1-8个碳的烷基链、1-13个单元的聚乙二醇基团OCH2CH2O或选自1-8个碳的低级或支链烷基、芳基或杂芳基。当芳基或杂芳基环被取代时，所述取代基可以是烷基、卤代烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫代烷基、胍、尿素、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-、二烷基氨基C(O)-和1-3个选自Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、βAla、Phe、Val或Cit的氨基酸序列；
J是选自-NH2、N3、硫代、环辛炔、-OH、-CO2H、反式-环辛炔的反应性基团，
Figure BDA0004033983910002421
其中R32是Cl、Br、F、甲磺酸酯或甲苯磺酸酯并且R33是Cl、Br、I、F、OH、-O-N-琥珀酰亚胺基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基，R34是H、Me或四嗪-H或Me；
Q可以是H、P(O)OR4(其中R4可以是H或低级1-10烷基)、C(O)R6(其中R6是1-8个碳的低级或支链烷基)或[(C＝O)NR4CHnNR4(C＝O)OCHm]m-V-V-J(其中n＝1-8，m＝1-6并且R4＝H、烷基或支链烷基)；
A1和A2可以是H或卤素并且
除非另有说明，否则要求保护所有可能的立体异构体。
(2.)根据实施方案1所述的糖皮质激素激动剂化合物，其选自实施例3中公开的糖皮质激素激动剂化合物中的任一者。
(3.)一种选自图11中示出的那些糖皮质激素激动剂化合物的糖皮质激素激动剂化合物。
(4.)一种选自本文公开的INX-SM化合物的糖皮质激素激动剂化合物。
(5.)一种选自以下的糖皮质激素激动剂化合物：
Figure BDA0004033983910002431
Figure BDA0004033983910002441
其中X或Z可以是环状sp3苯基等排体[1.1.1]双环戊烷或双环[2.2.2]辛烷，并且Y可以是CH2或O；
并且W1是CH2CH2CO2H并且W2是H。
(6.)根据前述实施方案中任一项所述的糖皮质激素激动剂化合物，其直接或间接附接至至少一个可切割或不可切割肽和/或非肽接头(类固醇-接头有效载荷)。
(7)一种化合物(类固醇-接头有效载荷)，其包含：至少一个可切割或不可切割接头(“L”)；任选“异双官能基团”或“异三官能基团”“Q”，其是任选用于将所述化合物中的所述接头连接至抗体或抗体片段的化学部分；以及至少一种抗炎剂(“AI”)，其中AI是根据实施方案(1)-(5)中任一项所述的糖皮质激素激动剂化合物，所述化合物可以由以下结构表示：
Q-L-AI或AI-L-Q。
(8.)根据(6)或(7)所述的类固醇-接头有效载荷，其中所述接头选自本文公开的那些。
(9)根据(6)或(7)或(8)所述的类固醇-接头有效载荷，其包含至少一个选自以下的可切割或不可切割接头：PAB和/或氨基酸或肽，任选1-12个氨基酸，进一步任选二肽、三肽、四肽、五肽以及进一步任选Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、Phe、Cit、Val、Val-Cit、Val-Ala、Val-Gly、Val-Gln、Ala-Val、Cit-Cit、Lys-Val-Cit、Asp-Val-Ala、Ala-Ala-Asn、Asp-Val-Ala、Ala-Val-Cit、Ala-Asn-Val、βAla-Leu-Ala-Leu、Lys-Val-Ala、Val-Leu-Lys、Asp-Val-Cit、Val-Ala-Val和Ala-Ala-Asn；或者任选GlcA、PAB和Glu-Gly中的至少一者。
(10.)根据前述实施方案中任一项所述的类固醇-接头有效载荷，其包含至少一个可切割接头，和/或一个牺牲型接头，所述接头直接或间接附接至糖皮质激素激动剂类固醇化合物。
(11.)根据前述实施方案中任一项所述的糖皮质激素激动剂类固醇化合物或类固醇-接头有效载荷，其选自实施例3中公开的糖皮质激素激动剂化合物或类固醇-接头有效载荷化合物中的任一者。
(12.)一种糖皮质激素激动剂(有效载荷)-接头缀合物，其选自：
(i)INX-SM-3-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-4-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-53-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-54-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-56-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-98-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-6-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-2-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-57-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-31-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-32-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-10-GluGly-烷氧基胺、IINX-SM-40-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-34-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-28-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-27-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-35-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-8-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-7-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-33-GluGly-烷氧基胺或糖皮质激素激动剂(有效载荷)-接头缀合物，其中所述Glu-Gly被不同的可切割肽接头取代和/或其中另一种INX-SM有效载荷取代其中包含的所述INX-SM有效载荷；或者
(ii)INX-SM-53-GluGly-溴乙酰、INX-SM-3-GluGly-溴乙酰、INX-SM-54-GluGly-溴乙酰、INX-SM-1-GluGly-溴乙酰、INX-SM-4-GluGly-溴乙酰、INX-SM-2-GluGly-溴乙酰、INX-SM-47-GluGly-溴乙酰、INX-SM-7-GluGly-溴乙酰、INX-SM-8-GluGly-溴乙酰、INX-SM-56-GluGly-溴乙酰、INX-SM-32-GluGly-溴乙酰、INX-SM-6-GluGly-溴乙酰、INX-SM-10-GluGly-溴乙酰、INX-SM-33-GluGly-溴乙酰、INX-SM-31-GluGly-溴乙酰、INX-SM-35-GluGly-溴乙酰、INX-SM-9-GluGly-溴乙酰、INX-SM-28-GluGly-溴乙酰、INX-SM-27-GluGly-溴乙酰、INX-SM-34-GluGly-溴乙酰、INX-SM-35-GluGly-溴乙酰、IINX-SM-40-GluGly-溴乙酰或糖皮质激素激动剂(有效载荷)-接头缀合物，其中所述Glu-Gly被不同的可切割肽接头取代和/或其中另一种INX-SM有效载荷取代其中包含的所述INX-SM有效载荷；
(iii)INX-SM-53-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-1-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-4-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-54-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-7-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-8-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-2-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-57-GluGly-二苯并环辛炔、IINX-SM-40-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-34-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-28-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-27-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-35-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-9-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-10-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-31-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-32-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-33-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-56-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-6-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-3-GluGly-二苯并环辛炔或糖皮质激素激动剂(有效载荷)-接头缀合物，其中所述GluGly被不同的可切割肽接头取代和/或其中另一种INX-SM有效载荷取代其中包含的所述INX-SM有效载荷；或者
(iv)INX-SM-1-GluGly-NHS酯；INX-SM-31-GluGly-NHS酯；INX-SM-32-GluGly-NHS酯；INX-SM-33-GluGly-NHS酯；INX-SM-53-GluGly-NHS酯；INX-SM-7-GluGly-NHS酯；INX-SM-8-GluGly-NHS酯；INX-SM-2-GluGly-NHS酯；INX-SM-56-GluGly-NHS酯；INX-SM-6-GluGly-NHS酯；INX-SM-54-GluGly-NHS酯；INX-SM-4-GluGly-NHS酯；INX-SM-53-GluGly-NHS酯；INX-SM-3-GluGly-NHS酯；INX-SM-9-GluGly-NHS酯；IINX-SM-40-GluGly-NHS酯；INX-SM-34-GluGly-NHS酯；INX-SM-28-GluGly-NHS酯；INX-SM-34-GluGly-NHS酯；INX-SM-28-GluGly-NHS酯；INX-SM-27-GluGly-NHS酯；INX-SM-35-GluGly-NHS酯；INX-SM-10-GluGly-NHS酯或糖皮质激素激动剂(有效载荷)-接头缀合物，其中所述GluGly被不同的可切割肽接头取代和/或其中另一种INX-SM有效载荷取代其中包含的所述INX-SM有效载荷；
(v)INX-SM-1-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-3-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-4-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-8-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-2-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-7-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-56-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-6-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-54-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-53-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-33-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-35-GluGly-马来酰亚胺、IINX-SM-40-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-34-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-28-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-27-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-35-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-9-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-10-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-31-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-32-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-57-GluGly-马来酰亚胺或糖皮质激素激动剂(有效载荷)-接头缀合物，其中所述GluGly被不同的可切割肽接头取代和/或其中另一种INX-SM有效载荷取代其中包含的所述INX-SM有效载荷；或者
(vi)INX-SM-3-GluGly-四嗪、INX-SM-53-GluGly-四嗪、INX-SM-1-GluGly-四嗪、INX-SM-54-GluGly-四嗪、INX-SM-6-GluGly-四嗪、INX-SM-56-GluGly-四嗪、INX-SM-4-GluGly-四嗪、INX-SM-10-GluGly-四嗪、INX-SM-31-GluGly-四嗪、INX-SM-32-GluGly-四嗪、INX-SM-33-GluGly-四嗪、INX-SM-7-GluGly-四嗪、INX-SM-8-GluGly-四嗪、INX-SM-9-GluGly-四嗪、INX-SM-27-GluGly-四嗪、INX-SM-35-GluGly-四嗪、INX-SM-2-GluGly-四嗪、IINX-SM-40-GluGly-四嗪、INX-SM-34-GluGly-四嗪、INX-SM-28-GluGly-四嗪、INX-SM-27-GluGly-四嗪或糖皮质激素激动剂(有效载荷)-接头缀合物，其中所述GluGly被不同的可切割肽接头取代和/或其中另一种INX-SM有效载荷取代其中包含的所述INX-SM有效载荷；或者
(vii)INX-SM-6-GluGly-胺、INX-SM-54-GluGly-胺、INX-SM-4-GluGly-胺、INX-SM-53-GluGly-胺、INX-SM-2-GluGly-胺、INX-SM-56-GluGly-胺、INX-SM-57-GluGly-胺、INX-SM-35-GluGly-胺、INX-SM-27-GluGly-胺、IINX-SM-40-GluGly-胺、INX-SM-34-GluGly-胺、INX-SM-28-GluGly-胺、INX-SM-35-GluGly-胺、INX-SM-9-GluGly-胺、INX-SM-10-GluGly-胺、INX-SM-31-GluGly-胺、INX-SM-32-GluGly-胺、INX-SM-33-GluGly-胺、INX-SM-7-GluGly-胺、INX-SM-8-GluGly-胺、INX-SM-1-GluGly-胺、INX-SM-3-GluGly-胺或糖皮质激素激动剂(有效载荷)-接头缀合物，其中所述GluGly被不同的可切割肽接头取代和/或其中另一个INX-SM有效载荷取代其中包含的所述INX-SM有效载荷；或者
(viii)INX-SM-53-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-1-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-3-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-2-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-56-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-35-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-25-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-27-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-35-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-9-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-10-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-31-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-32-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-33-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-57-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-7-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-8-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-6-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-54-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-4-PAB-GluGly-烷氧基胺、IINX-SM-40-PAB-GluGly-烷氧基胺、INX-SM-34-PAB-GluGly-烷氧基胺或另一种糖皮质激素激动剂(有效载荷)-接头缀合物，其中所述GluGly和/或所述PAB被不同的可切割肽或非肽接头取代和/或其中另一种INX-SM有效载荷取代其中包含的所述INX-SM有效载荷；或者
(ix)INX-SM-1-PAB-GluGly-溴乙酰、INX-SM-3-PAB-GluGly-溴乙酰、INX-SM-2-PAB-GluGly-溴乙酰、INX-SM-7-PAB-GluGly-溴乙酰、INX-SM-8-PAB-GluGly-溴乙酰、IINX-SM-40-PAB-GluGly-溴乙酰、INX-SM-56-PAB-GluGly-溴乙酰、INX-SM-6-PAB-GluGly-溴乙酰、INX-SM-154PAB-GluGly-溴乙酰、INX-SM-4-PAB-GluGly-溴乙酰、INX-SM-33-PAB-GluGly-溴乙酰、INX-PAB-GluGly-溴乙酰、INX-SM-32-PAB-GluGly-溴乙酰、INX-SM-10-PAB-GluGly-溴乙酰、INX-SM-34-PAB-GluGly-溴乙酰、INX-SM-31-PAB-GluGly-溴乙酰、INX-SM-9-PAB-GluGly-溴乙酰、INX-SM-28-PAB-GluGly-溴乙酰、INX-SM-27-PAB-GluGly-溴乙酰、INX-SM-35-PAB-GluGly-溴乙酰、INX-SM-53-PAB-GluGly-溴乙酰或另一种糖皮质激素激动剂(有效载荷)-接头缀合物，其中所述GluGly和/或所述PAB被不同的可切割肽或非肽接头取代和/或其中另一种INX-SM有效载荷取代其中包含的所述INX-SM有效载荷；
(x)INX-SM-6-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-54-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、
INX-SM-4-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-53-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-1-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-7-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-8-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-2-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-56-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-57-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-33-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-32-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-31-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-3-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-9-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-27-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-35-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-34-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-28-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、IINX-SM-40-PAB-GluGly-二苯并环辛炔、INX-SM-10-PAB-GluGly-二苯并环辛炔或另一种糖皮质激素激动剂(有效载荷)-接头缀合物，其中所述GluGly和/或所述PAB被不同的可切割肽或非肽接头取代和/或其中另一种INX-SM有效载荷取代其中包含的所述INX-SM有效载荷；或者
(xi)INX-SM-56-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-54-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-4-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-53-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-1-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-3-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-33-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-57-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-7-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-8-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-27-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-35-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-9-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-10-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-31-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-32-PAB-GluGly-NHS酯、IINX-SM-40-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-34-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-28-PAB-GluGly-NHS酯、INX-SM-2-PAB-GluGly-NHS酯或另一种糖皮质激素激动剂(有效载荷)-接头缀合物，其中所述GluGly和/或所述PAB被不同的可切割肽或非肽接头取代和/或其中另一种INX-SM有效载荷取代其中包含的所述INX-SM有效载荷；或者
(viii)INX-SM-1-PAB-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-53-PAB-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-5-PAB-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-2-PAB-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-8-PAB-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-56-PAB-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-54-PAB-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-4-PAB-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-57-PAB-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-7-PAB-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-32-PAB-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-31-PAB-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-53-PAB-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-3-PAB-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-34-PAB-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-28-PAB-GluGly-马来酰亚胺、IINX-SM-40-PAB-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-27-PAB-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-35-PAB-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-9-PAB-GluGly-马来酰亚胺、INX-SM-10-PAB-GluGly-马来酰亚胺或另一种糖皮质激素激动剂(有效载荷)-接头缀合物，其中所述GluGly和/或所述PAB被不同的可切割肽或非肽接头取代和/或其中另一种INX-SM有效载荷取代其中包含的所述INX-SM有效载荷；或者
(viii)INX-SM-6-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-54-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-4-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-53-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-1-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-3-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-57-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-7-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-8-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-2-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-31-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-32-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-33-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-56-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-35-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-9-PAB-GluGly-四嗪、IINX-SM-40-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-34-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-28-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-27-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-35-PAB-GluGly-四嗪、INX-SM-10-PAB-GluGly-四嗪或另一种糖皮质激素激动剂(有效载荷)-接头缀合物，其中所述GluGly和/或所述PAB被不同的可切割肽或非肽接头取代和/或其中另一种INX-SM有效载荷取代其中包含的所述INX-SM有效载荷；或者
(viii)INX-SM-1-PAB-GluGly-胺、INX-SM-3-PAB-GluGly-胺、INX-SM-8-PAB-GluGly-胺、INX-SM-2-PAB-GluGly-胺、INX-SM-56-PAB-GluGly-胺、INX-SM-6-PAB-GluGly-胺、INX-SM-54-PAB-GluGly-胺、INX-SM-4-PAB-GluGly-胺、INX-SM-53-PAB-GluGly-胺、INX-SM-33-PAB-GluGly-胺、INX-SM-53-PAB-GluGly-胺、INX-SM-7-PAB-GluGly-胺、INX-SM-9-PAB-GluGly-胺、INX-SM-35-PAB-GluGly-胺、IINX-SM-40-PAB-GluGly-胺、INX-SM-34-PAB-GluGly-胺、INX-SM-28-PAB-GluGly-胺、INX-SM-27-PAB-GluGly-胺、INX-SM-35-PAB-GluGly-胺、INX-SM-10-PAB-GluGly-胺、INX-SM-31-PAB-GluGly-胺、INX-SM-32-PAB-GluGly-胺或另一种糖皮质激素激动剂(有效载荷)-接头缀合物，其中所述GluGly和/或所述PAB被不同的可切割肽或非肽接头取代和/或其中另一种INX-SM有效载荷取代其中包含的所述INX-SM有效载荷；或者
(xv)INX-SM-1-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-35-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-9-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-10-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-54-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-31-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-32-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-33-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-57-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-7-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-8-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-2-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-56-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-6-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-4-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-53-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-27-PAB-GlcA-烷氧基胺、IINX-SM-40-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-34-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-28-PAB-GlcA-烷氧基胺、INX-SM-3-PAB-GlcA-烷氧基胺或另一种糖皮质激素激动剂(有效载荷)-接头缀合物，其中所述GlcA和/或所述PAB被不同的可切割肽或非肽接头取代和/或其中另一种INX-SM有效载荷取代其中包含的所述INX-SM有效载荷；或者
(xvi)INX-SM-3-PAB-GlcA-溴乙酰、INX-SM-4-PAB-GlcA-溴乙酰、INX-SM-56-PAB-GlcA-溴乙酰、INX-SM-54-PAB-GlcA-溴乙酰、INX-SM-4-PAB-GlcA-溴乙酰、INX-SM-53-PAB-GlcA-溴乙酰、INX-SM-7-PAB-GlcA-溴乙酰、INX-SM-8-PAB-GlcA-溴乙酰、INX-SM-2-PAB-GlcA-溴乙酰、IINX-SM-40-PAB-GlcA-溴乙酰、INX-SM-57-PAB-GlcA-溴乙酰、INX-SM-33-PAB-GlcA-溴乙酰、INX-SM-10-PAB-GlcA-溴乙酰、INX-SM-34-PAB-GlcA-溴乙酰、INX-SM-31-PAB-GlcA-溴乙酰、INX-SM-32-PAB-GlcA-溴乙酰、INX-SM-35-PAB-GlcA-溴乙酰、INX-SM-9-PAB-GlcA-溴乙酰、INX-SM-28-PAB-GlcA-溴乙酰、INX-SM-27-PAB-GlcA-溴乙酰、INX-SM-1-PAB-GlcA-溴乙酰或另一种糖皮质激素激动剂(有效载荷)-接头缀合物，其中所述GluGly和/或所述PAB被不同的可切割肽或非肽接头取代和/或其中另一种INX-SM有效载荷取代其中包含的所述INX-SM有效载荷；或者
(xvii)INX-SM-4-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-54-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-1-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-54-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-33-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-57-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-7-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-8-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-2-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-5-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-6-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-35-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-9-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-10-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-31-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-32-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-27-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-35-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-28-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-34-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、IINX-SM-40-PAB-GlcA-二苯并环辛炔、INX-SM-3-PAB-GlcA-二苯并环辛炔或另一种糖皮质激素激动剂(有效载荷)-接头缀合物，其中所述GlcA和/或所述PAB被不同的可切割肽或非肽接头取代和/或其中另一种INX-SM有效载荷取代其中包含的所述INX-SM有效载荷；或者
(xviii)INX-SM-3-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-53-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-4-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-56-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-54-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-8-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-2-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-7-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-57-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-32-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-33-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-31-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-9-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-10-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-35-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-27-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-28-PAB-GlcA-NHS酯、IINX-SM-40-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-34-PAB-GlcA-NHS酯、INX-SM-1-PAB-GlcA-NHS酯或另一种糖皮质激素激动剂(有效载荷)-接头缀合物，其中所述GlcA和/或所述PAB被不同的可切割肽或非肽接头取代和/或其中另一种INX-SM有效载荷取代其中包含的所述INX-SM有效载荷；或者
(xix)INX-SM-3-PAB-GlcA-马来酰亚胺、INX-SM-4-PAB-GlcA-马来酰亚胺、INX-SM-53-PAB-GlcA-马来酰亚胺、INX-SM-31-PAB-GlcA-马来酰亚胺、INX-SM-32-PAB-GlcA-马来酰亚胺、INX-SM-33-PAB-GlcA-马来酰亚胺、INX-SM-53-PAB-GlcA-马来酰亚胺、INX-SM-7-PAB-GlcA-马来酰亚胺、INX-SM-8-PAB-GlcA-马来酰亚胺、INX-SM-2-PAB-GlcA-马来酰亚胺、INX-SM-56-PAB-GlcA-马来酰亚胺、INX-SM-6-PAB-GlcA-马来酰亚胺、INX-SM-54-PAB-GlcA-马来酰亚胺、INX-SM-1-PAB-GlcA-马来酰亚胺、INX-SM-9-PAB-GlcA-马来酰亚胺、INX-SM-35-PAB-GlcA-马来酰亚胺、INX-SM-27-PAB-GlcA-马来酰亚胺、INX-SM-28-PAB-GlcA-马来酰亚胺、INX-SM-34-PAB-GlcA-马来酰亚胺、IINX-SM-40-PAB-GlcA-马来酰亚胺、INX-SM-10-PAB-GlcA-马来酰亚胺或另一种糖皮质激素激动剂(有效载荷)-接头缀合物，其中所述GlcA和/或所述PAB被不同的可切割肽或非肽接头取代和/或其中另一种INX-SM有效载荷取代其中包含的所述INX-SM有效载荷；或者
(xx)INX-SM-33-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-57-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-7-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-8-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-2-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-56-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-6-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-54-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-4-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-9-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-35-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-27-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-28-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-34-PAB-GlcA-四嗪、IINX-SM-40-PAB-GlcA-四嗪、INX-SM-10-PAB-GlcA-四嗪或另一种糖皮质激素激动剂(有效载荷)-接头缀合物，其中所述GlcAy和/或所述PAB被不同的可切割肽或非肽接头取代和/或其中另一种INX-SM有效载荷取代其中包含的所述INX-SM有效载荷；或者
(xxi)INX-SM-1-PAB-GlcA-胺、INX-SM-3-PAB-GlcA-胺、INX-SM-53-PAB-GlcA-胺、INX-SM-6-PAB-GlcA-胺、INX-SM-54-PAB-GlcA-胺、INX-SM-8-PAB-GlcA-胺、INX-SM-2-PAB-GlcA-胺、INX-SM-56-PAB-GlcA-胺、INX-SM-4-PAB-GlcA-胺、INX-SM-35-PAB-GlcA-胺、INX-SM-8-PAB-GlcA-胺、INX-SM-10-PAB-GlcA-胺、INX-SM-31-PAB-GlcA-胺、INX-SM-32-PAB-GlcA-胺、INX-SM-33-PAB-GlcA-胺、INX-SM-57-PAB-GlcA-胺、INX-SM-27-PAB-GlcA-胺、INX-SM-35-PAB-GlcA-胺、INX-SM-34-PAB-GlcA-胺、INX-SM-28-PAB-GlcA-胺、IINX-SM-40-PAB-GlcA-胺、INX-SM-7-PAB-GlcA-胺或另一种糖皮质激素激动剂(有效载荷)-接头缀合物，其中所述GlcA和/或所述PAB被不同的可切割肽或非肽接头取代和/或其中另一种INX-SM有效载荷取代其中包含的所述INX-SM有效载荷；或者
(xxii)烷氧基胺-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或烷氧基胺-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或其他包含相同或不同肽或非肽接头的接头有效载荷，其中所述接头经由C11-OH附接至相同或不同的INX类固醇；
(xxiii)溴乙酰-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或溴乙酰-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或其他包含相同或不同肽或非肽接头的接头有效载荷，其中所述接头经由C11-OH附接至相同或不同的INX类固醇；
(xxiv)二苯并环辛炔-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或二苯并环辛炔-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或其他包含相同或不同肽或非肽接头的接头有效载荷，其中所述接头经由C11-OH附接至相同或不同的INX类固醇；
(xxv)四嗪-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或四嗪-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或其他包含相同或不同肽或非肽接头的接头有效载荷，其中所述接头经由C11-OH附接至相同或不同的INX类固醇；
(xxvi)烷氧基胺-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或烷氧基胺-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或其他包含相同或不同接头的接头有效载荷，其中接头经由C17附接至相同或不同的INX类固醇有效载荷；
(xxvii)溴乙酰-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或溴乙酰-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或其他包含相同或不同接头的接头有效载荷，其中接头经由C17附接至相同或不同的INX类固醇有效载荷；
(xxviii)马来酰亚胺-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或马来酰亚胺-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或其他包含相同或不同接头的接头有效载荷，其中所述接头经由C17附接至相同或不同的INX类固醇有效载荷；
(xxix)二苯并环辛炔-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或二苯并环辛炔-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或其他包含相同或不同接头的接头有效载荷，其中所述接头经由C17附接至相同或不同的INX类固醇有效载荷；
(xxx)四嗪-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或四嗪-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或其他包含相同或不同接头的接头有效载荷，其中所述接头经由C17附接至相同或不同的INX类固醇有效载荷；以及
(xxxi)胺-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3或胺-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3，或其他包含相同或不同接头的接头有效载荷，其中所述接头经由C17附接至相同或不同的INX类固醇有效载荷。
(13)一种选自以下的抗体药物缀合物(ADC)：
(i)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(烷氧基胺+酮缀合(C11-OH连接的)，或另一种包含不同的INX-SM有效载荷的ADC，其中所述INX-SM有效载荷经由烷氧基胺+酮缀合与所述抗体缀合并且是C11-OH连接的；
(ii)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(叠氮化物+二苯并环辛炔缀合(C11-OH连接的)，或另一种包含不同的INX-SM有效载荷的ADC，其中所述INX-SM有效载荷经由叠氮化物+二苯并环辛炔缀合与所述抗体缀合并且是C11-OH连接的；
(iii)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(卤乙酰+半胱氨酸缀合(C11-OH连接的)，或另一种包含不同的INX-SM有效载荷的ADC，其中所述INX-SM有效载荷经由叠氮化物+二苯并环辛炔缀合与所述抗体缀合并且是C11-OH连接的；
(iv)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(马来酰亚胺+半胱氨酸缀合(C11-OH连接的)，或另一种包含不同的INX-SM有效载荷的ADC，其中所述INX-SM有效载荷经由叠氮化物+二苯并环辛炔缀合与所述抗体缀合并且是C11-OH连接的；
(v)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(四嗪+反式环辛烯缀合(C11-OH连接的)，或另一种包含不同的INX-SM有效载荷的ADC，其中所述INX-SM有效载荷经由四嗪+反式环辛烯缀合与所述抗体缀合并且是C11-OH连接的；
(vi)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(烷氧基胺+酮缀合(C11-OH连接的))，或另一种包含不同的INX-SM有效载荷的ADC，其中所述INX-SM有效载荷经由烷氧基胺+酮缀合与所述抗体缀合并且是C11-OH连接的；
(vii)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(叠氮化物+二苯并环辛炔缀合(C17连接的))，或另一种包含不同的INX-SM有效载荷的ADC，其中所述INX-SM有效载荷经由叠氮化物+二苯并环辛炔酮缀合与所述抗体缀合并且是C17连接的；
(viii)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(卤乙酰+半胱氨酸缀合(C17连接的))，或另一种包含不同的INX-SM有效载荷的ADC，其中所述INX-SM有效载荷经由叠氮化物+二苯并环辛炔酮缀合与所述抗体缀合并且是C17连接的；
(ix)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(四嗪+反式环辛烯缀合(C17连接的))，或另一种包含不同的INX-SM有效载荷的ADC，其中所述INX-SM接头有效载荷经由四嗪+反式环辛烯缀合与所述抗体缀合并且是C17连接的；
(x)Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3或Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(胺+谷氨酰胺缀合(使用反式谷氨酰胺酶)(C17连接的))，或另一种包含不同的INX-SM有效载荷的ADC，其中所述INX-SM接头有效载荷经由胺+谷氨酰胺缀合与所述抗体缀合并且是C17连接的；
(xi)INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(烷氧基胺和酮缀合)(N连接的有效载荷)，或另一种包含不同的INX-SM有效载荷的ADC，其中所述INX-SM接头有效载荷经由烷氧基胺和酮缀合与所述抗体缀合并且是N连接的；
(xii)INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(卤乙酰缀合)(N连接的有效载荷)，或另一种包含不同的INX-SM有效载荷的ADC，其中所述INX-SM接头有效载荷经由卤乙酰缀合与所述抗体缀合并且是N连接的；
(xiii)INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(叠氮化物+二苯并环辛炔缀合)(N连接的有效载荷)，或另一种包含不同的INX-SM有效载荷的ADC，其中所述INX-SM接头有效载荷经由叠氮化物+二苯并环辛炔缀合与所述抗体缀合并且是N连接的；
(xiv)INX-SM-3-GlcA-Ab或INX-SM-3-Glu-Gly-Ab(N羟基琥珀酰亚胺缀合)(N连接的有效载荷)，或另一种包含不同的INX-SM有效载荷的ADC，其中所述INX-SM接头有效载荷经由N羟基琥珀酰亚胺缀合与所述抗体缀合并且是N连接的；
(xv)INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(叠氮化物+二苯并环辛炔缀合)(N连接的有效载荷)，或另一种包含不同的INX-SM有效载荷的ADC，其中所述INX-SM接头有效载荷经由叠氮化物+二苯并环辛炔缀合与所述抗体缀合并且是N连接的；
(xvi)INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(N羟基琥珀酰亚胺缀合)(N连接的有效载荷)，或另一种包含不同的INX-SM有效载荷的ADC，其中所述INX-SM接头有效载荷经由N羟基琥珀酰亚胺缀合与所述抗体缀合并且是N连接的；
(xvii)INX-SM-3-Glu-Gly-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(马来酰亚胺缀合)(N连接的有效载荷)，或另一种包含不同的INX-SM有效载荷的ADC，其中所述INX-SM接头有效载荷经由马来酰亚胺缀合与所述抗体缀合并且是N连接的；
(xviii)INX-SM-3-Glu-Gly-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab或INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab(反式环辛烯+四嗪缀合)(N连接的有效载荷)，或另一种包含不同的INX-SM有效载荷的ADC，其中所述INX-SM接头有效载荷经由反式环辛烯+四嗪缀合与所述抗体缀合并且是N连接的；
(xix)INX-SM-3-Glu-Gly-Ab或INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab或INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab(胺缀合)(N连接的有效载荷)，或另一种包含不同的INX-SM有效载荷的ADC，其中所述INX-SM接头有效载荷经由反式环辛烯+四嗪缀合与所述抗体缀合并且是N连接的。
(14)一种选自以下的抗体药物缀合物(ADC)：
(I)
Figure BDA0004033983910002601
其中，
Ab＝抗体，优选在生理pH下与VISTA免疫细胞结合的抗VISTA抗体
L＝接头
AA＝单、双或三氨基酸序列
Figure BDA0004033983910002602
REG独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、联苯、-CF3、-NO2、-CN、氟、溴、氯、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(
O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-。
(II)
Figure BDA0004033983910002603
Ab＝抗体
L＝接头
AA＝单、双或三氨基酸序列
Figure BDA0004033983910002611
REG独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、联苯、-CF3、-NO2、-CN、氟、溴、氯、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(
O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-。
(III)
Figure BDA0004033983910002612
Ab＝抗体
L＝接头
AA＝单、双或三氨基酸序列或不存在
Figure BDA0004033983910002613
REG独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、联苯、-CF3、-NO2、-CN、氟、溴、氯、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基-C(
O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-。
RT＝AA或
Figure BDA0004033983910002621
(IV)
Figure BDA0004033983910002622
Ab＝抗体
L＝接头
AA＝单、双或三氨基酸序列
Figure BDA0004033983910002623
(V)
Figure BDA0004033983910002631
Ab＝抗体
L＝接头
AA＝单、双或三氨基酸序列或不存在
Figure BDA0004033983910002632
RT＝AA或
Figure BDA0004033983910002633
(15)根据实施方案(14)所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述接头包括可切割或不可切割肽或牺牲型接头。
(16)根据前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含选自以下的接头：PAB和/或氨基酸或肽，任选1-12个氨基酸，进一步任选二肽、三肽、四肽、五肽以及进一步任选Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、Phe、Cit、Val、Val-Cit、Val-Ala、Val-Gly、Val-Gln、Ala-Val、Cit-Cit、Lys-Val-Cit、Asp-Val-Ala、Ala-Ala-Asn、Asp-Val-Ala、Ala-Val-Cit、Ala-Asn-Val、βAla-LeuAla-Leu、Lys-Val-Ala、Val-Leu-Lys、Asp-Val-Cit、Val-Ala-Val和Ala-Ala-Asn。
(17)一种具有以下结构的类固醇抗体缀合物化合物：
Figure BDA0004033983910002641
其中n＝2-8并且A任选是抗人VISTA抗体。
(18).一种组合物，其包含至少一种根据前述实施方案中任一项所述的糖皮质激素激动剂化合物或类固醇-接头缀合物或ADC以及药学上可接受的载剂。
(19).如前述实施方案所述的组合物，其适合于体内施用于有需要的受试者。
(20).如前述实施方案所述的组合物，其适用于肠胃外施用，任选通过注射。
(21).如前述实施方案所述的组合物，其适合于注射给有需要的受试者，任选经由静脉内、皮下、肌肉内、瘤内或鞘内。
(22).如前述实施方案所述的组合物，其可皮下施用。
(23)如前述实施方案所述的组合物，其包括在装置中，所述装置提供选自由以下组成的组的皮下施用：注射筒、注射装置、输液泵、注射笔、无针装置、自助注射器和皮下贴片递送系统。
(24)如前述实施方案所述的装置，其向患者递送固定剂量的所述抗炎剂，例如类固醇，例如糖皮质激素受体激动剂或糖皮质激素，任选地塞米松、泼尼松龙或布地奈德或者它们的功能衍生物。
(25).根据前述实施方案中任一项所述的糖皮质激素激动剂化合物或类固醇-接头缀合物或ADC或含有它们的组合物用于治疗、预防或抑制有需要的受试者的炎症或自身免疫的用途。
(26)根据前述实施方案中任一项所述的糖皮质激素激动剂化合物或类固醇-接头缀合物或ADC或含有它们的组合物，其用于制备用于治疗、预防或抑制有需要的受试者的炎症或自身免疫的药剂。
(27)一种治疗和/或预防方法，其包括向有需要的患者施用至少一种根据前述实施方案中任一项所述的糖皮质激素激动剂化合物或类固醇-接头缀合物或ADC或根据前述实施方案中任一项所述的含有它们的组合物。
(28)如前述实施方案所述的用途或方法，其用于过敏、自身免疫、移植、基因治疗、炎症、GVHD或脓毒症的治疗，或者治疗或预防与人受试者的任何前述病状相关的炎症性、自身免疫性或过敏性副作用。
(29)如前述实施方案中任一项所述的用途或方法，其用于急性用途。
(30)如前述实施方案中任一项所述的用途或方法，其用于慢性用途。
(31)如前述实施方案中任一项所述的用途或方法，其用于维持疗法。
(32)如先前实施方案中任一项所述的用途或方法，其用于治疗或预防急性或慢性炎症以及与所述急性或慢性炎症相关的自身免疫性和炎症性适应症，其中所述病状任选包括获得性再生障碍性贫血+、获得性血友病+、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)+、急性出血性白质脑炎(AHLE)/赫斯特病+、原发性无丙种球蛋白血症+、斑秃+、强直性脊柱炎(AS)、抗NMDA受体脑炎+、抗磷脂综合征(APS)+、动脉硬化、自闭症谱系障碍(ASD)、自身免疫性艾迪生病(AAD)+、自身免疫性自主神经功能障碍/自身免疫性自主神经节病(AAG)、自身免疫性脑炎+、自身免疫性胃炎、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)+、自身免疫性肝炎(AIH)+、自身免疫性高脂血症、自身免疫性垂体炎/淋巴细胞性垂体炎+、自身免疫性内耳病(AIED)+、自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)+、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎+、自身免疫性睾丸炎+、自身免疫性胰腺炎(AIP)/免疫球蛋白G4相关疾病(IgG4-RD)+、I型、II型和III型自身免疫性多腺综合征+、自身免疫性黄体酮皮炎+、自身免疫性突发性感觉神经性听力损失(SNHL)、贲门失弛缓症、艾迪生病、成人斯蒂尔病、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性自主神经功能障碍、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性荨麻疹、轴突和神经元神经病(AMAN)、巴娄病、贝赛特氏症、良性黏膜类天疱疮、大疱性类天疱疮、淋巴结增生症(CD)、腹腔疾病、南美锥虫病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、查格-施特劳斯综合征(CSS)或嗜酸性肉芽肿病(EGPA)、瘢痕性类天疱疮、科干综合征、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎、CREST综合征、1型糖尿病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克氏病(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德雷斯勒综合征、子宫内膜异位症、嗜酸性食管炎(EoE)、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、原发性混合冷球蛋白血症、埃文斯综合征、纤维肌痛、纤维化肺泡炎、纤维化肺泡炎、巨细胞性心肌炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征、肉芽肿性多血管炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、亨-舍二氏紫癜(HSP)、妊娠疱疹或妊娠类天疱疮(PG)、化脓性汗腺炎(HS)(反常性痤疮)、低丙种球蛋白血症、IgA肾病、IgG4相关硬化性疾病、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、包涵体肌炎(IBM)、间质性膀胱炎(IC)、青少年关节炎、青少年糖尿病(1型糖尿病)、青少年肌炎(JM)、川崎氏病、兰伯特-伊顿综合征、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化苔藓症、木质结膜炎、线性IgA病(LAD)、狼疮(包括肾炎和皮肤)、慢性莱姆病、梅尼埃氏病、显微镜多血管炎(MPA)、混合性结缔组织病(MCTD)、穆伦溃疡、穆查-哈伯曼病、多灶性运动神经病(MMN)或MMNCB、多发性硬化症、重症肌无力、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体障碍、肌炎、嗜睡症、新生儿狼疮、视神经脊髓炎、中性粒细胞减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS)、复发性风湿病(PR)、PANDAS、副肿瘤性小脑变性(PCD)、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、帕里-隆伯格综合征、睫状体扁平部炎(外周葡萄膜炎)、牧师特纳综合症、天疱疮、周围神经病变、外周脑脊髓炎、恶性贫血(PA)、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I、II、III型多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、孕酮性皮炎、银屑病、银屑病关节炎、纯红细胞再生障碍(PRCA)、坏疽性脓皮病、雷诺现象、反应性关节炎、反射性交感神经营养不良、复发性多软骨炎、不安腿综合征(RLS)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、施密特综合征、巩膜炎、硬皮病、舍格伦综合症、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征(SPS)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克综合征、交感性眼炎(SO)、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、甲状腺眼病(TED)、托-享综合症(THS)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、Vogt-小柳-原田病等。
(33)如前述实施方案中任一项所述的用途或方法，其用于治疗或预防急性或慢性炎症以及与所述急性或慢性炎症相关的自身免疫性和炎症性适应症，其中所述病状任选包括严重哮喘、巨细胞动脉炎、ANKA血管炎和IBD(结肠炎和克罗恩病)。
(34)如前述实施方案中任一项所述的用途或方法，其用于治疗或预防选自以下的病状：类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、成人克罗恩病、小儿克罗恩病、溃疡性结肠炎、斑块型银屑病、化脓性汗腺炎、葡萄膜炎、贝赛特氏症、脊椎关节病或银屑病。
(35)如前述实施方案中任一项所述的用途或方法，其用于在包括以下中的一者或多者的患者中进行治疗或预防：
(i)主要仅可用高剂量类固醇有效治疗的病状，任选风湿性多肌痛和/或巨细胞动脉炎，所述患者任选已经接受或正在接受高类固醇剂量治疗；
(ii)具有限制类固醇使用的共患症的病状，任选糖尿症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、病态肥胖、无血管性坏死/骨坏死(AVN)、青光眼、类固醇引起的高血压、严重皮肤脆弱和/或骨关节炎；
(iii)其中可获得安全长期治疗剂但其中需要用高剂量类固醇诱导数月的病状，任选AAV、多发性肌炎、皮肌炎、狼疮、炎症性肺病、自身免疫性肝炎、炎症性肠病、免疫性血小板减少症、自身免疫性溶血性贫血、痛风患者，其中用高剂量类固醇诱导数月在治疗上是必要的；
(iv)需要短期/长期治疗、任选具有不确定的治疗或持续时间和/或没有类固醇施用的有效替代的皮肤病病状，任选史蒂芬斯强森综合征、其他严重药疹病状、涉及广泛接触性皮炎的病状、其他严重免疫相关皮肤病病状诸如PG、LCV、红皮病等；
(v)用高剂量皮质类固醇治疗的突发/复发病状，任选COPD、哮喘、狼疮、痛风、假痛风；
(vi)免疫相关神经系统疾病，诸如小纤维神经病、MS(亚组)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、重症肌无力等；
(vii)血液学/肿瘤学适应症，任选其中高剂量类固醇可能将在治疗上是必要的或有益的；
(viii)眼科病状，任选葡萄膜炎、虹膜炎、巩膜炎等；
(ix)与永久性或非常长时间的肾上腺功能不全或继发性肾上腺功能不全相关的病状，任选医源性爱迪生危象；
(x)通常用长期、低剂量类固醇治疗的病状，任选狼疮、RA、psA、血管炎等。
(36)如前述实施方案中任一项所述的用途或方法，其用于在处于特殊类别患者中的患者(所述特殊类别患者在类固醇治疗中有毒性风险)诸如怀孕/授乳女性、儿科患者(任选患有生长障碍或白内障的那些)中进行治疗或预防，其中所述患者还正在用另一种活性剂治疗。
(37)如前述实施方案中任一项所述的用途或方法，其中所述患者还正在用免疫调节抗体或融合蛋白治疗，其选自靶向以下中的一种或多种的免疫抑制抗体或融合蛋白：CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA，和/或靶向以下中的一种或多种的激动性抗体或融合蛋白：CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS。
(38).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含：抗体或抗原结合片段(“A”)，其包含特异性结合至人T细胞激活V结构域Ig抑制因子(人VISTA)的抗原结合区；至少一个可裂解或不可裂解接头(“L”)；任选“异双官能基团”或“异三官能基团”“Q”，其是任选用于连接所述接头和所述抗VISTA抗体或抗体片段的化学部分；并且其中所述至少一种抗炎剂是包含式1的糖皮质激素化合物，所述ADC由下式表示：
“A-(Q-L-AI)n”或“(AI-L-Q)n-A”
其中“n”至少为1并且此外，其中所述ADC当施用于有需要的受试者时优先递送至表达VISTA的免疫细胞，任选单核细胞、骨髓细胞、T细胞、Treg、NK细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞和内皮细胞中的一种或多种，并且导致所述小分子抗炎剂功能内化至一种或多种所述免疫细胞中。
(39).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含在生理pH(约7.5)下优先结合至表达VISTA的细胞的抗人VISTA抗体或抗体片段；其任选在人VISTA敲入啮齿动物中具有至多70小时的pK。
(40).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其在生理pH下在食蟹猕猴中或在人中的pK为至多3.5±0.5天。
(41).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其在生理pH下在食蟹猕猴中或在人中的pK为至多2.8或2.3±0.5天。
(42).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其在生理pH下在人VISTA啮食动物中的pK为至多6-12小时。
(43).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，所述ADC包含接头，所述接头在所述ADC内化至表达VISTA的免疫细胞(任选T细胞、Treg、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、骨髓细胞、树突细胞、巨噬细胞和内皮细胞中的一种或多种)中时被切割，导致在所述免疫细胞中释放治疗有效量的所述抗炎剂，其中所述抗炎剂引发抗炎活性。
(44).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗VISTA抗体或抗原结合片段的体内血清半衰期在生理pH(约pH7.5)下在灵长类动物任选食蟹猕猴中为约2.3天。
(45).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述抗VISTA抗体或抗原结合片段在人VISTA敲入啮齿动物中在生理pH(约pH 7.5)下在血清中具有以下体内血清半衰期：不超过70小时、不超过60小时、不超过50小时、不超过40小时、不超过30小时、不超过24小时、不超过22-24小时、不超过20-22小时、不超过18-20小时、不超过16-18小时、不超过14-16小时、不超过12-14小时、不超过10-12小时、不超过8-10小时、不超过6-8小时、不超过4-6小时、不超过2-4小时、不超过1-2小时、不超过0.5-1.0小时或不超过0.1-0.5小时。
(46).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中在体内使用时，所述ADC在人VISTA敲入啮齿动物和/或人或非人灵长类动物，任选食蟹猕猴中的pK/pD比率为至少2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或更大。
(47).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述ADC在啮齿动物或人或非人灵长类动物，任选食蟹猕猴中的PD为至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天、2-3周或更长。
(48).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述抗人VISTA抗体包含具有受损的FcR结合的Fc区。
(49).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述抗人VISTA抗体包含具有受损的FcR结合的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区。
(50).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述抗人VISTA抗体包含具有受损的FcR结合的人IgG1 Fc区。
(51).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗人VISTA抗体或抗体片段包含人或非人灵长类动物恒定区或Fc区，其被修饰以削弱或消除与至少2个天然人Fcγ受体的结合。
(52).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗人VISTA抗体或抗体片段包含被修饰以削弱或消除与以下FcR中的任何一种、两种、三种、四种或所有五种的结合的人或非人灵长类动物恒定区或Fc区：hFcγRI(CD64)、FcyRIIA或hFcyRIIB、(CD32或CD32A)和FcγRlllA(CD16A)或FcγRlllB(CD16B)。
(53).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗人VISTA抗体或抗体片段包含在Fc区中具有V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S沉默突变的人IgG2κ主链。
(54).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗人VISTA抗体或抗体片段包含在Fc区中具有L234A/L235A沉默突变和任选削弱补体(C1Q)结合的突变的人IgG1/κ主链。
(55).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗人VISTA抗体或抗体片段包含在Fc区中具有L234A/L235A沉默突变以及E269R和E233A突变的人IgG1/κ主链。
(56).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述抗VISTA抗体或抗原结合片段与表达VISTA的免疫细胞的结合不直接激动或拮抗VISTA介导的对免疫的作用。
(57).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗人VISTA抗体或抗体片段包含人IgG2 Fc区，其中内源性FcR结合未受损。
(58).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗人VISTA抗体或抗体片段包含天然(未修饰的)人IgG2 Fc区。
(59).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述抗VISTA抗体或抗原结合片段包含通过表面等离子共振(SPR)在24℃或37℃下测定的在0.0001nM至10.0nM、0.001至1.0nM、0.01至0.7或更小范围内的KD。
(60).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述抗VISTA抗体或抗原结合片段包含通过表面等离子共振(SPR)在24℃或37℃下测定的0.13至0.64nM的KD。
(61).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述药物抗体比在1:1-10:1范围内。
(62).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述药物抗体比在2-8:1、4-8:1或6-8:1范围内。
(63).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC任选包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述药物抗体比为8:1(n＝8)。
(64).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，所述ADC内化至单核细胞、骨髓细胞、T细胞、Treg、巨噬细胞和嗜中性粒细胞中的一种或多种中。
(65).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，所述ADC不会明显内化至B细胞中。
(66).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，与以裸(非缀合)形式施用的相同剂量的抗炎剂相比，所述ADC当施用于有需要的受试者时促进与所述抗炎剂相关的功效和/或减少与其相关的不良副作用诸如毒性。
(67).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC任选包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述糖皮质激素任选经由链间二硫键与所述抗体或抗原结合片段缀合。
(68).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，所述ADC包含酯酶敏感性接头。
(69).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述可切割接头对酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键切割中的一种或多种敏感。
(70).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述ADC中包含的所述抗VISTA抗原结合片段包含Fab、F(ab')2或scFv抗体片段。
(71).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中包含在所述ADC中的所述抗VISTA抗体或抗体片段是包含与具有图8、图10或图12中的序列的抗体相同的CDR的抗VISTA抗体或抗体片段，任选选自以下之一：
(i)包含SEQ ID NO:100、101和102的VH CDR以及SEQ ID NO:103、104和105的VLCDR；
(ii)包含SEQ ID NO:110、111和112的VH CDR以及SEQ ID NO:113、114和115的VLCDR；
(iii)包含SEQ ID NO:120、121和122的VH CDR以及SEQ ID NO:123、124和125的VLCDR；
(iv)包含SEQ ID NO:130、131和132的VH CDR以及SEQ ID NO:133、134和135的VLCDR；
(v)包含SEQ ID NO:140、141和142的VH CDR以及SEQ ID NO:143、144和145的VLCDR；
(vi)包含SEQ ID NO:150、151和152的VH CDR以及SEQ ID NO:153、154和155的VLCDR；
(vii)包含SEQ ID NO:160、161和162的VH CDR以及SEQ ID NO:163、164和165的VLCDR；
(viii)包含SEQ ID NO:170、171和172的VH CDR以及SEQ ID NO:173、174和175的VLCDR；
(ix)包含SEQ ID NO:180、181和182的VH CDR以及SEQ ID NO:183、184和185的VLCDR；
(x)包含SEQ ID NO:190、191和192的VH CDR以及SEQ ID NO:193、194和195的VLCDR；
(xi)包含SEQ ID NO:200、201和202的VH CDR以及SEQ ID NO:203、204和205的VLCDR；
(xii)包含SEQ ID NO:210、211和212的VH CDR以及SEQ ID NO:213、214和215的VLCDR；
(xiii)包含SEQ ID NO:220、221和222的VH CDR以及SEQ ID NO:223、224和225的VLCDR；
(xiv)包含SEQ ID NO:230、231和232的VH CDR以及SEQ ID NO:233、234和235的VLCDR；
(xv)包含SEQ ID NO:240、241和242的VH CDR以及SEQ ID NO:243、244和245的VLCDR；
(xvi)包含SEQ ID NO:250、251和252的VH CDR以及SEQ ID NO:253、254和255的VLCDR；
(xvii)包含SEQ ID NO:260、261和262的VH CDR以及SEQ ID NO:263、264和265的VL CDR；
(xviii)包含SEQ ID NO:270、271和272的VH CDR以及SEQ ID NO:273、274和275的VL CDR；
(xix)包含SEQ ID NO:280、281和282的VH CDR以及SEQ ID NO:283、284和285的VLCDR；
(xx)包含SEQ ID NO:290、291和292的VH CDR以及SEQ ID NO:293、294和295的VLCDR；
(xxi)包含SEQ ID NO:300、301和302的VH CDR以及SEQ ID NO:303、304和305的VLCDR；
(xxii)包含SEQ ID NO:310、311和312的VH CDR以及SEQ ID NO:313、314和315的VLCDR；
(xxiii)包含SEQ ID NO:320、321和322的VH CDR以及SEQ ID NO:323、324和325的VL CDR；
(xxiv)包含SEQ ID NO:330、331和332的VH CDR以及SEQ ID NO:333、334和335的VLCDR；
(xxv)包含SEQ ID NO:340、341和342的VH CDR以及SEQ ID NO:343、344和345的VLCDR；
(xxvi)包含SEQ ID NO:350、351和352的VH CDR以及SEQ ID NO:353、354和355的VLCDR；
(xxvii)包含SEQ ID NO:360、361和362的VH CDR以及SEQ ID NO:363、364和365的VL CDR；
(xxviii)包含SEQ ID NO:370、371和372的VH CDR以及SEQ ID NO:373、374和375的VL CDR；
(xxix)包含SEQ ID NO:380、381和382的VH CDR以及SEQ ID NO:383、384和385的VLCDR；
(xxx)包含SEQ ID NO:390、391和392的VH CDR以及SEQ ID NO:393、394和395的VLCDR；
(xxxi)包含SEQ ID NO:400、401和402的VH CDR以及SEQ ID NO:403、404和405的VLCDR；
(xxxii)包含SEQ ID NO:410、411和412的VH CDR以及SEQ ID NO:413、414和415的VL CDR；
(xxxiii)包含SEQ ID NO:420、421和422的VH CDR以及SEQ ID NO:423、424和425的VL CDR；
(xxxiv)包含SEQ ID NO:430、431和432的VH CDR以及SEQ ID NO:433、434和435的VL CDR；
(xxxv)包含SEQ ID NO:440、441和442的VH CDR以及SEQ ID NO:443、444和445的VLCDR；
(xxxvi)包含SEQ ID NO:450、451和452的VH CDR以及SEQ ID NO:453、454和455的VL CDR；
(xxxvii)包含SEQ ID NO:460、461和462的VH CDR以及SEQ ID NO:463、464和465的VL CDR；
(xxxviii)包含SEQ ID NO:470、471和472的VH CDR以及SEQ ID NO:473、474和475的VL CDR；
(xxxix)包含SEQ ID NO:480、481和482的VH CDR以及SEQ ID NO:483、484和485的VL CDR；
(xl)包含SEQ ID NO:490、491和492的VH CDR以及SEQ ID NO:493、494和495的VLCDR多肽；
(xli)包含SEQ ID NO:500、501和502的VH CDR以及SEQ ID NO:503、504和505的VLCDR多肽；
(xlii)包含SEQ ID NO:510、511和512的VH CDR以及SEQ ID NO:513、514和515的VL CDR多肽；
(xliii)包含SEQ ID NO:520、521和522的VH CDR以及SEQ ID NO:523、524和525的VL CDR多肽；
(xliv)包含SEQ ID NO:530、531和532的VH CDR以及SEQ ID NO:533、534和535的VL CDR多肽；
(xlv)包含SEQ ID NO:540、541和542的VH CDR以及SEQ ID NO:543、544和545的VLCDR多肽；
(xlvi)包含SEQ ID NO:550、551和552的VH CDR以及SEQ ID NO:553、554和555的VL CDR多肽；
(xlvii)包含SEQ ID NO:560、561和562的VH CDR以及SEQ ID NO:563、564和565的VL CDR；
(xlviii)包含SEQ ID NO:570、571和572的VH CDR以及SEQ ID NO:573、574和575的VL CDR；
(xlix)包含SEQ ID NO:580、581和582的VH CDR以及SEQ ID NO:583、584和585的VLCDR；
(l)包含SEQ ID NO:590、591和592的VH CDR以及SEQ ID NO:593、594和595的VLCDR；
(li)包含SEQ ID NO:600、601和602的VH CDR以及SEQ ID NO:603、604和605的VLCDR；
(lii)包含SEQ ID NO:610、611和612的VH CDR以及SEQ ID NO:613、614和615的VLCDR；
(liii)包含SEQ ID NO:620、621和622的VH CDR以及SEQ ID NO:623、624和625的VLCDR；
(liv)包含SEQ ID NO:630、631和632的VH CDR以及SEQ ID NO:633、634和635的VLCDR；
(lv)包含SEQ ID NO:640、641和642的VH CDR以及SEQ ID NO:643、644和645的VLCDR；
(lvi)包含SEQ ID NO:650、651和652的VH CDR以及SEQ ID NO:653、654和655的VLCDR；
(lvii)包含SEQ ID NO:660、661和662的VH CDR以及SEQ ID NO:663、664和665的VLCDR；
(lviii)包含SEQ ID NO:670、671和672的VH CDR以及SEQ ID NO:673、674和675的VL CDR；
(lix)包含SEQ ID NO:680、681和682的VH CDR以及SEQ ID NO:683、684和685的VLCDR；
(lx)包含SEQ ID NO:690、691和692的VH CDR以及SEQ ID NO:693、694和695的VLCDR；
(lxi)包含SEQ ID NO:700、701和702的VH CDR以及SEQ ID NO:703、704和705的VLCDR；
(lxii)包含SEQ ID NO:710、711和712的VH CDR以及SEQ ID NO:713、714和715的VLCDR；
(lxiii)包含SEQ ID NO:720、721和722的VH CDR以及SEQ ID NO:723、724和725的VL CDR；
(lxiv)包含SEQ ID NO:730、731和732的VH CDR以及SEQ ID NO:733、734和735的VLCDR；
(lxv)包含SEQ ID NO:740、741和742的VH CDR以及SEQ ID NO:743、744和745的VLCDR；
(lxvi)包含SEQ ID NO:750、751和752的VH CDR以及SEQ ID NO:753、754和755的VLCDR；
(lxvii)包含SEQ ID NO:760、761和762的VH CDR以及SEQ ID NO:763、764和765的VL CDR；
(lxviii)包含SEQ ID NO:770、771和772的VH CDR以及SEQ ID NO:773、774和775的VL CDR；
(lxix)包含SEQ ID NO:780、781和782的VH CDR以及SEQ ID NO:783、784和785的VLCDR；
(lxx)包含SEQ ID NO:790、791和792的VH CDR以及SEQ ID NO:793、794和795的VLCDR；
(lxxi)包含SEQ ID NO:800、801和802的VH CDR以及SEQ ID NO:803、804和805的VLCDR；
(lxxii)包含SEQ ID NO:810、811和812的VH CDR以及SEQ ID NO:813、814和815的VL CDR。
(72).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述ADC包含抗VISTA抗体或抗体片段，所述抗VISTA抗体或抗体片段包含与VSTB92、VSTB56、VSTB95、VSTB103和VSTB66中的任一者相同的CDR。
(73).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述ADC包含抗VISTA抗体或抗体片段，所述抗VISTA抗体或抗体片段包含VH多肽和VL多肽，所述两种多肽分别与包含以下VH多肽和VL多肽的抗体的两种多肽具有至少90％、95％或100％的序列同一性，并且此外，所述CDR未被修饰：
(i)包含SEQ ID NO:106同一性的VH多肽和SEQ ID NO:108的VL多肽的抗体；
(ii)包含SEQ ID NO:116的VH多肽和SEQ ID NO:118的VL多肽的抗体；
(iii)包含SEQ ID NO:126的VH多肽和SEQ ID NO:128的VL多肽的抗体；
(iv)包含SEQ ID NO:136的VH多肽和SEQ ID NO:138的VL多肽的抗体；
(v)包含SEQ ID NO:146的VH多肽和SEQ ID NO:148的VL多肽的抗体；
(vi)包含SEQ ID NO:156的VH多肽和SEQ ID NO:158的VL多肽的抗体；
(vii)包含SEQ ID NO:166的VH多肽和SEQ ID NO:168的VL多肽的抗体；
(viii)包含SEQ ID NO:176的VH多肽和SEQ ID NO:178的VL多肽的抗体；
(ix)包含SEQ ID NO:186的VH多肽和SEQ ID NO:188的VL多肽的抗体；
(x)包含SEQ ID NO:196的VH多肽和SEQ ID NO:198的VL多肽的抗体；
(xi)包含SEQ ID NO:206的VH多肽和SEQ ID NO:208的VL多肽的抗体；
(xii)包含SEQ ID NO:216的VH多肽和SEQ ID NO:218的VL多肽的抗体；
(xiii)包含SEQ ID NO:226的VH多肽和SEQ ID NO:228的VL多肽的抗体；
(xiv)包含SEQ ID NO:236的VH多肽和SEQ ID NO:238的VL多肽的抗体；
(xv)包含SEQ ID NO:246的VH多肽和SEQ ID NO:248的VL多肽的抗体；
(xvi)包含SEQ ID NO:256的VH多肽和SEQ ID NO:258的VL多肽的抗体；
(xvii)包含SEQ ID NO:266的VH多肽和SEQ ID NO:268的VL多肽的抗体；
(xviii)包含SEQ ID NO:276的VH多肽和SEQ ID NO:278的VL多肽的抗体；
(xix)包含SEQ ID NO:286的VH多肽和SEQ ID NO:288的VL多肽的抗体；
(xx)包含SEQ ID NO:296的VH多肽和SEQ ID NO:298的VL多肽的抗体；
(xxi)包含SEQ ID NO:306的VH多肽和SEQ ID NO:308的VL多肽的抗体；
(xxii)包含SEQ ID NO:316的VH多肽和SEQ ID NO:318的VL多肽的抗体；
(xxiii)包含SEQ ID NO:326的VH多肽和SEQ ID NO:328的VL多肽的抗体；
(xxiv)包含SEQ ID NO:336的VH多肽和SEQ ID NO:338的VL多肽的抗体；
(xxv)包含SEQ ID NO:346的VH多肽和SEQ ID NO:348的VL多肽的抗体；
(xxvi)包含SEQ ID NO:356的VH多肽和SEQ ID NO:358的VL多肽的抗体；
(xxvii)包含SEQ ID NO:366的VH多肽和SEQ ID NO:368的VL多肽的抗体；
(xxviii)包含SEQ ID NO:376的VH多肽和SEQ ID NO:378的VL多肽的抗体；
(xxix)包含SEQ ID NO:386的VH多肽和SEQ ID NO:388的VL多肽的抗体；
(xxx)包含SEQ ID NO:396的VH多肽和SEQ ID NO:398的VL多肽的抗体；
(xxxi)包含SEQ ID NO:406的VH多肽和SEQ ID NO:408的VL多肽的抗体；
(xxxii)包含SEQ ID NO:416的VH多肽和SEQ ID NO:418的VL多肽的抗体；
(xxxiii)包含SEQ ID NO:426的VH多肽和SEQ ID NO:428的VL多肽的抗体；
(xxxiv)包含SEQ ID NO:436的VH多肽和SEQ ID NO:438的VL多肽的抗体；
(xxxv)包含SEQ ID NO:446的VH多肽和SEQ ID NO:448的VL多肽的抗体；
(xxxvi)包含SEQ ID NO:456的VH多肽和SEQ ID NO:458的VL多肽的抗体；
(xxxvii)包含SEQ ID NO:466的VH多肽和SEQ ID NO:468的VL多肽的抗体；
(xxxviii)包含SEQ ID NO:476的VH多肽和SEQ ID NO:478的VL多肽的抗体；
(xxxix)包含SEQ ID NO:486的VH多肽和SEQ ID NO:488的VL多肽的抗体；
(xl)包含SEQ ID NO:496的VH多肽和SEQ ID NO:498的VL多肽的抗体；
(xli)包含SEQ ID NO:506的VH多肽和SEQ ID NO:508的VL多肽的抗体；
(xlii)包含SEQ ID NO:516的VH多肽和SEQ ID NO:518的VL多肽的抗体；
(xliii)包含SEQ ID NO:526的VH多肽和SEQ ID NO:528的VL多肽的抗体；
(xliv)包含SEQ ID NO:536的VH多肽和SEQ ID NO:533、534和535的VL多肽的抗体；
(xlv)包含SEQ ID NO:546的VH多肽和SEQ ID NO:548的VL多肽的抗体；
(xlvi)包含SEQ ID NO:556的VH多肽和SEQ ID NO:558的VL多肽的抗体；
(xlvii)包含SEQ ID NO:566的VH多肽和SEQ ID NO:568的VL多肽的抗体；
(xlviii)包含SEQ ID NO:576的VH多肽和SEQ ID NO:578的VL多肽的抗体；
(xlix)包含SEQ ID NO:586的VH多肽和SEQ ID NO:588的VL多肽的抗体；
(l)包含SEQ ID NO:596的VH多肽和SEQ ID NO:598的VL多肽的抗体；
(li)包含SEQ ID NO:606的VH多肽和SEQ ID NO:608的VL多肽的抗体；
(lii)包含SEQ ID NO:616的VH多肽和SEQ ID NO:618的VL多肽的抗体；
(liii)包含SEQ ID NO:626的VH多肽和SEQ ID NO:628的VL多肽的抗体；
(liv)包含SEQ ID NO:636的VH多肽和SEQ ID NO:638的VL多肽的抗体；
(lv)包含SEQ ID NO:646的VH多肽和SEQ ID NO:648的VL多肽的抗体；
(lvi)包含SEQ ID NO:656的VH多肽和SEQ ID NO:658的VL多肽的抗体；
(lvii)包含SEQ ID NO:666的VH多肽和SEQ ID NO:668的VL多肽的抗体；
(lviii)包含SEQ ID NO:676的VH多肽和SEQ ID NO:678的VL多肽的抗体；
(lix)包含SEQ ID NO:686的VH多肽和SEQ ID NO:688的VL多肽的抗体；
(lx)包含SEQ ID NO:696的VH多肽和SEQ ID NO:698的VL多肽的抗体；
(lxi)包含SEQ ID NO:706的VH多肽和SEQ ID NO:708的VL多肽的抗体；
(lxii)包含SEQ ID NO:716的VH多肽和SEQ ID NO:718的VL多肽的抗体；
(lxiii)包含SEQ ID NO:726的VH多肽和SEQ ID NO:728的VL多肽的抗体；
(lxiv)包含SEQ ID NO:736的VH多肽和SEQ ID NO:738的VL多肽的抗体；
(lxv)包含SEQ ID NO:746的VH多肽和SEQ ID NO:748的VL多肽的抗体；
(lxvi)包含SEQ ID NO:756的VH多肽和SEQ ID NO:758的VL多肽的抗体；
(lxvii)包含SEQ ID NO:766的VH多肽和SEQ ID NO:768的VL多肽的抗体；
(lxviii)包含SEQ ID NO:776的VH多肽和SEQ ID NO:778的VL多肽的抗体；
(lxix)包含SEQ ID NO:786的VH多肽和SEQ ID NO:788的VL多肽的抗体；
(lxx)包含SEQ ID NO:796的VH多肽和SEQ ID NO:798的VL多肽的抗体；
(lxxi)包含SEQ ID NO:806的VH多肽和SEQ ID NO:808的VL多肽的抗体；以及
(lxxii)包含SEQ ID NO:816的VH多肽和SEQ ID NO:818的VL多肽的抗体。
(74).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述抗VISTA抗体或抗体片段包含与VSTB92、VSTB56、VSTB95、VSTB103和VSTB66之一相同的可变区。
(75).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述抗VISTA抗体或抗体片段包含在Fc区中具有V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S沉默突变的人IgG2κ主链。
(76).如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)、用途或方法，其中所述ADC包含抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述抗VISTA抗体或抗体片段包含在Fc区中具有L234A/L235A沉默突变的人IgG1/κ主链。
(77)如前述实施方案中任一项所述的ADC，其中所述糖皮质激素(AI)或所述L或Q经由链间二硫键与包含在所述ADC中的抗VISTA抗体或抗原结合片段缀合。
(78)一种药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种如前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)或类固醇和药学上可接受的载剂。
(79)如实施方案(78)所述的组合物，其可经由注射途径，任选静脉内、肌肉内、鞘内或皮下来施用。
(80).如实施方案(78)或(79)所述的组合物，其可皮下施用。
(81).一种包括如先前实施方案中任一项所述的组合物的装置，其提供选自由以下组成的组的皮下施用：注射筒、注射装置、输液泵、注射笔、无针装置、自助注射器和皮下贴片递送系统。
(82).如实施方案(81)所述的装置，其向患者递送固定剂量的糖皮质激素受体激动剂或其功能衍生物。
(83)一种包括如实施方案(81)或实施方案(82)所述的装置的药盒，其还包括告知所述患者如何施用其中包含的所述ADC组合物和给药方案的说明书。
(84)一种治疗和/或预防的方法，其包括向有需要的患者施用至少一种根据前述实施方案中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)或类固醇或组合物，其中所述组合物可以在根据前述实施方案中任一项所述的装置中。
(85)如实施方案(84)所述的方法，其用于人受试者的过敏、自身免疫、移植、基因治疗、炎症、GVHD或脓毒症的治疗，或者用于治疗或预防所述人受试者的与任何前述病状相关的炎症性、自身免疫性或过敏性副作用。
(86)如实施方案(84)或(85)所述的方法，其中所述炎症与癌症或感染，任选病毒或细菌感染相关。
(87)如实施方案(84)或(85)所述的方法，其中所述患者包括选自以下的病状：类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、成人克罗恩病、小儿克罗恩病、溃疡性结肠炎、斑块型银屑病、化脓性汗腺炎、葡萄膜炎、贝赛特氏症、脊椎关节病或银屑病。
(88)如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述患者包括以下中的一者或多者：
(i)主要仅可用高剂量类固醇有效治疗的病状，任选风湿性多肌痛和/或巨细胞动脉炎，所述患者任选已经接受或正在接受高类固醇剂量治疗；
(ii)具有限制类固醇使用的共患症的病状，任选糖尿症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、病态肥胖、无血管性坏死/骨坏死(AVN)、青光眼、类固醇引起的高血压、严重皮肤脆弱和/或骨关节炎；
(iii)其中可获得安全长期治疗剂但其中需要用高剂量类固醇诱导数月的病状，任选AAV、多发性肌炎、皮肌炎、狼疮、炎症性肺病、自身免疫性肝炎、炎症性肠病、免疫性血小板减少症、自身免疫性溶血性贫血、痛风患者，其中用高剂量类固醇诱导数月在治疗上是必要的；
(iv)需要短期/长期治疗、任选具有不确定的治疗或持续时间和/或没有类固醇施用的有效替代的皮肤病病状，任选史蒂芬斯强森综合征、其他严重药疹病状、涉及广泛接触性皮炎的病状、其他严重免疫相关皮肤病病状诸如PG、LCV、红皮病等；
(v)用高剂量皮质类固醇治疗的突发/复发病状，任选COPD、哮喘、狼疮、痛风、假痛风；
(vi)免疫相关神经系统疾病，诸如小纤维神经病、MS(亚组)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、重症肌无力等；
(vii)血液学/肿瘤学适应症，任选其中高剂量类固醇可能将在治疗上是必要的或有益的；
(viii)眼科病状，任选葡萄膜炎、虹膜炎、巩膜炎等；
(ix)与永久性或非常长时间的肾上腺功能不全或继发性肾上腺功能不全相关的病状，任选医源性爱迪生危象；
(x)通常用长期、低剂量类固醇治疗的病状，任选狼疮、RA、psA、血管炎等；以及
(xi)特殊类别的患者，诸如怀孕/授乳女性、儿科患者(任选患有生长障碍或白内障的那些)。
(89)如前述实施方案中任一项所述的方法或用途，其中所述患者还正在用另一种活性剂治疗。
(90)如前述实施方案中任一项所述的方法或用途，其中所述患者还正在用免疫调节抗体或融合蛋白治疗，其选自靶向以下中的一种或多种的免疫抑制抗体或融合蛋白：CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA，和/或靶向以下中的一种或多种的激动性抗体或融合蛋白：CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS。
(91)根据前述实施方案中任一项所述的ADC或类固醇的离体用途，其中使来自患者或供体的免疫细胞与根据前述实施方案中任一项所述的ADC或类固醇接触，并且输注到有需要的患者体内，例如患有前述实施方案中确定的病状中的一者或多者的患者。
已经描述了本发明，提供以下实施例以进一步说明本发明及其固有优点。
实施例
以下实施例描述了本发明的示例性实施方案。
实施例中使用的缩写
Ab          抗体
AF488       Alexa Fluor 488
ADC         抗体药物缀合物
BSA         牛血清白蛋白，组分V
CD14        单核细胞分化抗原CD14
CD20        分化抗原CD20
CD4         T细胞表面糖蛋白CD4
CD8         T细胞表面糖蛋白CD8
CD66b       粒细胞GPI连接糖蛋白
SSC         侧向散射光
CD25        IL-2Rα链
CD127       IL-7受体α链
ConA        伴刀豆球蛋白A
CPT         含0.05％吐温20的柠檬酸/磷酸盐
CPTB:       含0.05％吐温20和1％BSA的柠檬酸/磷酸盐
DAR         药物抗体比
Dex         地塞米松
ECD         细胞外结构域
FA          甲醛
FACS        荧光激活细胞分选
FBS         胎牛血清
Fc          抗体重链恒定区(铰链/CH2/CH3)
GC          糖皮质激素
h           小时
HIC         疏水相互作用色谱
HMW         高分子量
i.p.        腹膜内
i.v.        静脉内
KI          敲入
LAL         鲎变形细胞裂解物
LOD         检测限
LOQ         定量限
LPS         脂多糖
M           摩尔浓度
mAb         单克隆抗体
MFI         平均荧光强度
min         分钟
MS          质谱
mTNFα       膜肿瘤坏死因子α
pAb         多克隆抗体
PBS         磷酸盐缓冲盐水
PBMCS       外周血单核细胞
PBS         磷酸盐缓冲盐水
PD          药效学
PK          药代动力学
PRM         腹膜定居巨噬细胞
PT          含0.05％吐温20的PBS
PTB         含0.05％吐温20和1％BSA的PBS
PTS         便携式测试系统
QC          质量控制
RP-HPLC     反相-高压液相色谱
RPMI        RPMI 1640，基础培养基
RSV         呼吸道合胞病毒
RT          室温
SEC         尺寸排阻色谱
SPR         表面等离子共振
SSC         侧向散射光
TMDD        靶标介导的药物处置
WB          全血
实施例1：示例性类固醇-抗VISTA抗体缀合物的合成和表征
A.合成
Figure BDA0004033983910002941
接头A的合成方案
Figure BDA0004033983910002942
程序
制备化合物2的一般程序
Figure BDA0004033983910002951
向化合物1(3.0g,7.64mmol,1.0eq)在二氯甲烷/乙腈(500mL/100mL)中的溶液中添加环酐(3.0g,30.58mmol,4.0eq)和DMAP(1.8g,15.29mmol,2.0eq)。将反应混合物在室温下搅拌2h并且将混合物在减压下浓缩。将残余物通过柱色谱在硅胶上纯化，用DCM/MeOH(10％至15％)+0.1％ AcOH洗脱，提供呈白色固体状的化合物2(3.2g,85％)。
TLC:DCM/MeOH＝10:1,UV
Rf(化合物1)＝0.45
Rf(化合物2)＝0.30
LC-MS:394.40(M+1)
Figure BDA0004033983910002952
向2(220mg,0.45mmol)和3(230mg,0.67mmol)在NMP(4mL)中的溶液中添加HATU(342mg,0.90mmol)和DIPEA(232mg,1.8mmol)。将混合物在室温下搅拌5h。将混合物通过制备型HPLC(ACN/H2O,0.1％ HCOOH)纯化，得到接头A(122mg,39％)。
LCMS:703[M+H]，
1H NMR(CDCl3,300MHz)(δ,ppm)7.20(d,J＝9.0Hz,1H),6.73(s,2H),6.52(br,1H),6.33(d,J＝9.0Hz,1H),6.11(s,1H),4.91(q,J＝17.3Hz,2H),4.35(d＝9.3Hz,1H),3.76-3.42(m,10H),3.03(m,1H),2.79(m,2H),2.65-2.56(m,3H),2.42-2.06(m,7H),1.84-1.63(m,3H),1.22(m,1H),1.02(s,3H),0.90(d,J＝7.2Hz,3H)。
19F NMR(CDCl3)(δ,ppm)-166.09(q)。
制备具有接头A的缀合物的一般方案
为了每个抗体缀合八个接头A，将抗体的缓冲液交换成PBS缓冲液(pH 7.4)，浓度10mg/mL，之后添加7当量的TCEP并且在37℃下孵育2小时。然后将还原的抗体通过PD-10柱(GE Healthcare)用含有2mM EDTA的50mM硼酸盐缓冲液(pH 8.0)进行缓冲液交换，之后添加12当量的接头A(新鲜制备为DMSO中的10mM储备溶液)，将反应在环境温度下在管式旋转器中以10rpm放置1小时。将每个抗体含有八个接头A的缀合物使用PD-10脱盐柱用pH 7.4的PBS缓冲液进行纯化。洗脱后，将缀合物进一步进行缓冲液交换并且使用30kDa截留分子量(MWCO)的Amicon Ultra 15mL离心过滤器浓缩至所需浓度。使用质谱法以测定药物抗体比(DAR)，将缀合物在37℃下与25mM的DTT一起孵育30分钟。将还原的缀合物在水中稀释50倍，并且在与Xevo G2-S QToF质谱仪连接的Waters ACQUITY UPLC上进行分析。使用WatersMassLynx 4.2软件获得解卷积质量。药物抗体比(DAR)使用以下公式、使用与每种药物负载种类对应的峰强度的加权平均值进行计算：
DAR＝∑(药物负载n的每种Ab的药物负载分布(％))(n)/100
SEC方法
缀合物的纯度通过尺寸排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)、使用20分钟等度法来测定，流动相为0.2M磷酸钠、0.2M氯化钾、15重量/体积异丙醇，pH 6.8。以0.35mL/min的恒定流速将10μL的进样体积装载到TSKgel SuperSW3000柱。基于洗脱时间对色谱图进行积分以计算单体缀合物种类的纯度。
如上所述合成抗体药物缀合物(ADC)之后，使裸抗体和ADC经历质量控制过程以评估和确认缀合、结合VISTA的能力和内毒素水平。此外，合成了在生理条件下具有相对较长的体内半衰期的对照pH依赖性结合抗VISTA抗体(767-IgG1.3抗体)，并且使用肽图谱进行分析以确认其序列同一性和其pH依赖性结合。
B.通过SEC确认药物抗体比和纯度
在与接头A缀合后评估缀合物的缀合水平、高分子量(HMW)聚集体的存在和内毒素水平(由Abzena进行的测定)。简而言之，缀合水平经由反相HPLC、质谱或两者进行评估。经由尺寸排阻柱评估HMW聚集体水平。使用LAL测试盒经由Charles River endosafe-PTS系统评估内毒素水平。
将200μg的对照抗人VISTA抗体(767-IgG1.3)在23℃下用胰蛋白酶(1/20胰蛋白酶/蛋白质)消化14h或在37℃下用Lys-C(1/50Lys-C/蛋白质)消化14h。在Agilent QTOF6530B上通过质谱分析80μg样品。使用BioConfirm 9.0进行序列搜索。
C.ELISA结果
1.用于测定pH特异性结合的ELISA
将96孔平底板(Thermo Scientific Nunc Immuno Maxisorp，目录号442404)在室温(RT)下用在PBS中稀释至1μg/mL的767-IgG1.3或INX200包被一小时。将孔用PT(含0.05％吐温20的PBS)洗涤三次，然后在室温下用PTB(含0.05％吐温20和1％ BSA的PBS)阻断1.5小时。
将生物素化hIX50(人VISTA ECD，在Aragen Bioscience生产，在ImmuNext生物素化)在pH 6.1、6.7或7.5的含0.05％吐温20和1％BSA的柠檬酸/磷酸盐(CPTB)中稀释至1000至0.001ng/mL的范围。将孔用pH 6.1、6.7或7.5的含0.05％吐温20的柠檬酸/磷酸盐(CPT)洗涤三次，然后将生物素化hIX50添加到孔中并且在室温下孵育一小时。
在用pH 6.1、6.7或7.5的CPT洗涤三次之后，将在pH 6.1、6.7或7.5的CPTB中1/2000稀释的与HRP偶联的链霉亲和素(Southern Biotech，目录号7100-05)用作检测试剂，并且在室温下孵育一小时。在用pH 6.1、6.7或7.5的CPT洗涤三次后，使用TMB(ThermoScientific，目录号34028)作为比色底物揭示ELISA反应。在室温下五分钟之后，将反应用1M H2SO4终止。
2.用于裸和药物缀合的抗体的VISTA结合验证的ELISA
将96孔平底板(与上述相同)在室温下用在PBS中的1μg/ml的hIX50(人VISTA ECD，在Aragen Bioscience为ImmuNext生产)包被一小时。洗涤三次之后，将孔在室温下用PTB阻断一小时。
将INX200、INX200A、INX201、INX201A、767-IgG1.3或767-IgG1.3A在PTB中稀释至500至0.03、100至0.02或400或0.1ng/mL范围。将孔用PT洗涤三次，然后将稀释的抗体添加到孔中并且在室温下孵育一小时。
在用PT洗涤三次之后，将在PTB中1/2000稀释的小鼠抗人κ-HRP(SouthernBiotech，目录号9230-05)用作检测试剂，在室温下孵育1小时。洗涤三次后，使用TMB底物揭示ELISA反应。在室温下5min之后，将反应用1M H2S04终止。
D.所评估抗体的缀合水平和SEC纯度水平
接头A的缀合涉及链间二硫键的完全还原，然后是用接头A完全修饰(如质谱[MS]缀合评估所证实)。检测了最小HMW聚集体，如通过尺寸排阻色谱(SEC)所评估并且报告为％纯度(参见下表1)。
表1：抗体缀合水平和SEC纯度水平(*基于MS的缀合水平[表中橙色列]用于地塞米松等值的所有计算)
Figure BDA0004033983910002991
E.767-IgG1.3的肽图谱
如图1所示，胰蛋白酶消化导致85.6％的轻链序列覆盖率和76.1％的重链序列覆盖率。所述图示出了767-IgG1.3的序列，鉴定的胰蛋白酶肽加下划线：(A)轻链(85.6％覆盖率)(B)重链(76.1％覆盖率)。
如图2所示，Lys-C消化导致63.3％的轻链序列覆盖率和76.3％的重链序列覆盖率。所述图示出了767-IgG1.3的序列，鉴定的Lys-C肽加下划线：(A)轻链(63.3％覆盖率)(B)重链(76.3％覆盖率)。
胰蛋白酶与Lys-C消化策略之间的总组合序列覆盖率为91.7％的轻链序列覆盖率和80.8％的重链序列覆盖率。轻链和重链都匹配预期的序列，如专利WO 2018/169993 A1中所述。基于此，我们确认克隆和表达的序列是767-IgG1.3的序列。
F.不同pH条件下抗VISTA抗体的VISTA结合的比较
如图3所示，板结合的767-IgG1.3和INX200被证实具有相反的抗VISTA pH依赖性结合特性。具体地，图3显示，在pH 7.5(生理pH)下，767-IgG1.3与可溶性VISTA的结合最小，在pH 6.7下与VISTA的结合明显更高，而最高程度的结合为在pH 6.1(所测试的最低pH)下。相比之下，INX200在生理pH下与可溶性VISTA的结合程度最高，并且当pH降低时，INX200与可溶性VISTA的结合程度要低得多(再次比较了在pH 6.7和pH 6.1下的相对结合)。因此，767-IgG1.3和INX200表现出相反的pH依赖性结合特性。
G.药物缀合对VISTA结合的影响
在体外和体内ADC研究中证实了上述鉴定的抗VISTA抗体药物缀合物经历了链间二硫键的完全还原，大约DAR 8缀合至基于地塞米松的接头A。此外，如图4A-图4C所示，与裸抗体相比，与接头A的DAR 8缀合显示对INX200A、INX201A或767-IgG1.3A与VISTA的结合具有可忽略的影响(图4A-图4C)。
H.结论
上述实验和数据证实对照767-IgG1.3抗体包含与前述767-IgG1.3抗体相同的序列和功能特性(pH依赖性结合)。这些数据进一步证实，所制备的所有抗VISTA抗体药物缀合物都经历了完全的半胱氨酸还原，并且使用基于地塞米松的接头A的DAR 8缀合导致最小HMW聚集体形成(如由SEC纯度所评估)，并且进一步表明这种缀合对抗体药物缀合物与人VISTA的结合的影响可以忽略不计。
实施例2：示例性抗VISTA药物缀合物的体内表征
A.ConA模型
同样，因为VISTA在大多数造血细胞上，特别是在骨髓细胞上高度表达，所以我们选择它作为抗炎抗体药物缀合物(ADC)的潜在靶标。为了评估其在开发潜在用于治疗自身免疫性和炎症性疾病的ADC中的潜在功效，在伴刀豆球蛋白A诱导的肝脏炎症(ConA诱导的肝炎)的短期模型中评价了Dex-抗体药物缀合物的功效。
此模型涉及在小鼠中静脉内(i.v.)注射植物凝集素伴刀豆球蛋白A(ConA)，并且包括广泛使用的小鼠急性免疫介导肝炎模型。与其他几种急性肝损伤模型相比，ConA诱导的损伤主要是由T细胞的激活和T细胞向肝脏的募集驱动的。因此，ConA模型在其发病机制方面具有独特的特征，并且与人免疫介导的肝炎(诸如自身免疫性肝炎、急性病毒性肝炎或导致免疫激活的不同药物毒性实体)具有重要相似性。ConA模型的特点是可以在注射后最早6h监测到大量促炎细胞因子。到24小时，仍可检测到高水平的促炎细胞因子，并且肝损伤/坏死可以通过组织病理学进行观察。我们通过主要监测ConA注射后6h的细胞因子反应来利用此模型。如下所述和图中所示，这些研究表明，Dex治疗对G-CSF、IFNγ、IL-2、IL-6、IL-12p40、IL-12p70和KC具有剂量依赖性影响，因此我们的研究集中在测量一些这些细胞因子。
B.研究设计
在这些实验中，小鼠在疾病开始之前约15h接受抗体或Dex治疗。调整伴刀豆球蛋白A给药以在6小时时产生急性但非致命性炎症(在初步实验中确立)。在ConA i.v.注射后6h收集血液，并且分离血浆用于细胞因子分析。
体内研究的目的是在ConA诱导的肝炎中评价这些经由酯酶敏感性接头与地塞米松缀合的INX人VISTA抗体与游离Dex相比的相对功效。具体地，进行了体内研究以评价抗人VISTA抗体(INX210[沉默IgG2 Fc]、INX200[沉默IgG1 Fc]和767.3-IgG1.3[对照pH敏感性抗体])裸或与地塞米松缀合在伴刀豆球蛋白A诱导的肝炎模型中的功效(分别为实验1、2和3)。
这些实验是在人VISTA敲入(hVISTA KI)小鼠中进行的。hVISTA KI小鼠敲入了人VISTA cDNA代替小鼠VISTA基因，并且在RNA和蛋白质水平上表达人VISTA。此外，为了排除基于性别的功效差异，这些实验是在雌性和雄性小鼠中进行的。所有动物都在伴刀豆球蛋白A(ConA)注射之前15h接受治疗(抗体或地塞米松)。然后在ConA注射后6h对小鼠进行采血，并且将细胞因子反应作为疾病进展的标志物进行评价。
C.方法和材料
抗VISTA抗体和缀合物
INX200：在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235A沉默突变的人源化抗人VISTA抗体，其在生理pH下具有非常短的血清半衰期(参见下文表6)并且包含可变重链和轻链序列以及IgG1 Fc区(包含在图8中)。
INX200A：INX200经由链间二硫键与地塞米松药物缀合，药物/抗体比(DAR)为约8。接头/有效载荷(A)由酯酶敏感性接头与地塞米松有效载荷组成(如Graverson等人,2012中所述)。
INX201：在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235A/E269R/K322A沉默突变的人源化抗人VISTA抗体，其在生理pH下具有非常短的血清半衰期(参见下文表6)，具有可变重链和轻链序列以及IgG1 Fc区(包含在图8中)。
INX201A：INX201抗体经由链间二硫键与地塞米松药物缀合，药物/抗体比(DAR)为8。接头/有效载荷(A)同样由酯酶敏感性接头与地塞米松有效载荷组成(如Graverson等人,2012中所述)。
INX210：在人IgG2/κ主链上具有Fc区中的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S沉默突变的人源化抗人VISTA抗体，具有可变重链和轻链序列以及IgG1 Fc区(包含在图8中)，其具有非常短的血清半衰期(参见下文表6)(Vafa等人,2014)。
INX210A：INX210抗体经由链间二硫键与药物缀合，药物/抗体比(DAR)为约8。接头/有效载荷(A)同样由酯酶敏感性接头与地塞米松有效载荷组成(如Graverson等人,2012中所述)。
767-IgG1：由Five Prime Therapeutics and Bristol-Myers Squibb Company开发的在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235E/G237A沉默突变的对照人源化抗人VISTA抗体，具有可变重链和轻链序列以及IgG1 Fc区(包含在图8中)，其在生理pH下具有长得多的血清半衰期(在啮齿动物和灵长类动物中超过24小时)。此抗体被设计以在低pH(例如pH 6)下结合VISTA，但在生理pH(pH 7.4)下具有最小结合(WO 2018/169993 A1)。
767-IgG1A：767-IgG1抗体经由链间二硫键与药物缀合，药物/抗体比(DAR)为约8。接头/有效载荷(A)同样由酯酶敏感性接头与地塞米松有效载荷组成(如Graverson等人,2012中所述)。
抗体给药：
将所有抗体在PBS中稀释并且以0.2ml的体积腹膜内(i.p.)注射以递送10mg/Kg的剂量。
地塞米松
将地塞米松(来自Phoenix的无菌注射剂，NDC 57319-519-05)在PBS中稀释并且经由i.p.注射以5、2、0.2和0.02mg/Kg给药。
伴刀豆球蛋白A
伴刀豆球蛋白A获自Sigma Aldrich(C2010)。根据其批次，ConA可能或多或少是有毒力的，因此始终进行初步实验以确定最佳的ConA给药，以在6小时时产生急性但非致命性炎症：针对实验1和2，15mg/Kg(批号SLBX7517)以及针对实验3和4，7.5mg/Kg(批号SLCC2664)。
小鼠
hVISTA小鼠在Sage Labs(Boyertown,PA)繁育。8-12周龄的小鼠先在我们的隔离设施中过渡3周，然后转移到常规设施。在实验开始之前使小鼠适应1至2周。
抽血和准备
使用首先用肝素冲洗以防止凝血的玻璃巴斯德移液器从眼眶后腔收获外周血。然后将血液以400rcf离心5min，并且收集血浆并储存在-80℃下，然后进行细胞因子分析。
血浆细胞因子分析
使用Millipore小鼠7-plex平台对25μl血浆进行细胞因子分析。
实验1和2：用于体内研究ADC-INVIVO-5和ADC-INVIVO-7的分析中包括的细胞因子是G-CSF、IL-2IFNγ、IL-6、IL-12p40、IL-12p70和KC。
实验3：对于体内实验3，仅使用G-CSF(DY414-05；G-CSF的预期值<100,000pg/mL并且可能<50,000pg/mL-试剂盒检测水平：2000pg/mL-31.3pg/mL)和KC(DY453-05；预期值<120,000pg/mL并且可能<50,000pg/mL-试剂盒检测水平：1000pg/mL-15.6pg/mL)的R&D Duo套件经由ELISA分析了G-CSF和KC。
D.结果
实验1：INX210A在雌性hVISTA KI小鼠的ConA诱导的肝炎中的功效
图5示出了ConA后6h雌性hVISTA KI小鼠外周血中的G-CSF变化。使用小鼠7-plex测量的血浆浓度(SEM；n＝5/组)(给药：Dex-0.2＝0.2mg/Kg，Dex-2＝2mg/Kg，INX210和INX210A为10mg/Kg，[INX210A提供0.2mg/kg dex有效载荷])。
如图所示，INX210A治疗在控制ConA诱导的G-CSF上调方面显示出一些功效(尽管不显著)，与5mg/Kg的Dex治疗相当。相比之下，非Dex缀合的抗体INX210或Dex施用0.2mg/Kg(这是INX210A递送的Dex的摩尔当量)没有抗炎作用。
因为我们在ConA反应中观察到高水平的组内变异性，所以不包括来自其他6种细胞因子的数据，因为它变化太大而无法解释。这并不意外，因为在雌性小鼠中进行实验时，ConA的作用高度依赖于动物的激素状态。虽然雌性小鼠可能对ConA表现出更高的易感性，但它们的疾病结果也表现出更大的变化。所有后续的ConA实验都是在雄性小鼠中进行的。
实验2：INX210A在雄性hVISTA KI小鼠的ConA诱导的肝炎中的功效
图6示出了在ConA后6h雄性hVISTA KI小鼠外周血中的细胞因子变化。使用小鼠7-plex测量的血浆浓度(SEM；n＝10/组，与仅ConA组相比的普通单因素方差分析)(给药：Dex为0.2或5mg/Kg，INX210和INX210A为10mg/Kg)。
正如文献中先前报道的，雄性小鼠对ConA表现出更一致的细胞因子反应。当在INX210A治疗后6h与未治疗的ConA组相比时，所分析的7种细胞因子中有六种显示出显著降低(1至3倍)(图6)。降低介于Dex 0.2mg/kg(INX210A dex有效载荷的摩尔当量)与Dex 5mg/kg之间。相比之下，在INX210治疗组中没有发现功效。
实验3：INX200A对DDE1雄性小鼠的伴刀豆球蛋白A诱导的肝炎的剂量反应
图7示出了在ConA后6h DDE1雄性小鼠外周血中的细胞因子变化。在实验中，使用ELISA测定来测量细胞因子血浆浓度(SD；n＝6/组；与仅ConA组相比的单因素方差分析)(给药：0.02、0.2或2mg/Kg的Dex；10、5和1mg/Kg的INX200A)。
为了评价ADC INX200A是否能增强功效，对各种来自ADC的等效Dex有效载荷的Dex剂量(0.2mg/Kg的游离Dex＝10mg/Kg的INX200A；0.02mg/Kg的游离Dex＝1mg/Kg的INX200A)的反应进行了比较。从图7中的数据可以看出，虽然0.02mg/Kg的游离Dex在控制细胞因子反应方面已失去功效，但是1mg/Kg的INX200A仍然有效。更一般地，数据显示以下内容：
实验1
·在雌性hVISTA KI小鼠中，INX210在与Dex缀合(INX210A)时显示出控制ConA诱导的G-CSF反应的功效。
实验2
·雄性hVISTA KI小鼠对ConA损伤表现出更一致的反应。
·INX210在与Dex(INX210A)缀合时显示出控制ConA诱导的细胞因子反应的功效。裸抗体没有功效。
·以10mg/Kg给药的INX210A递送约0.2mg/Kg的Dex；观察到的INX210A的功效与0.2mg/Kg的游离Dex的功效相当。
实验3
·剂量反应实验表明，当Dex有效载荷经由ADC INX200A递送时具有改善/增强的功效：虽然0.02mg/Kg的游离Dex没有功效，但是经由ADC递送的摩尔当量显示出高效力。
结论
我们证明，当与Dex(INX210A)缀合时，抗VISTA抗体(INX210)可以在等效摩尔剂量的Dex下与游离Dex一样有效或比其更好地预防ConA诱导的炎症。未缀合的INX210没有作用。我们还证明，将Dex与抗VISTA抗体INX200缀合改善了Dex递送，因为我们证明，0.02mg/Kg的游离Dex没有功效，而经由ADC递送的摩尔当量具有高效力。
实施例3：其他示例性类固醇有效载荷和抗体药物缀合物的合成
合成类固醇有效载荷和缀合物的程序
在此实施例中，我们描述了以下的合成：根据本发明的新型类固醇；缀合物，其中所述类固醇与接头和/或双官能基团或三官能基团偶联，所述双官能基团或三官能基团允许类固醇接头缀合物附接至抗体；以及抗体药物缀合物(ADC)，其包含与接头和/或双官能基团或三官能基团偶联的所述类固醇，所述双官能基团或三官能基团与抗体偶联，所述抗体即在生理pH下与人VISTA结合并且包含短pK的抗VISTA抗体。
如前所述，这些类固醇具有以下式1结构：
Figure BDA0004033983910003071
其中X或Z可以是苯基、3-6元杂环、环烷基、螺烷基、螺杂环烷基、[1.1.1]双环戊烷、双环[2.2.2]辛烷或立方烷，其各自可以被1-4个独立地选自N、S和O的杂原子取代并且任选进一步被1-4个C1-3烷基取代；
X至Z的键联可以占据X和Z上的任何可用位置；
Y可以是CHR1、O、S或NR1；
E可以是CH2或O；
G可以是CH2或NR1；
R1可以是H、1-8个碳的低级或支链烷基、芳基或杂芳基。在芳基或杂芳基环被取代的情况下，所述取代基可以是烷基、卤代烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫代烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-；
当R1＝H时，R2可以是H、1-8个碳的低级或支链烷基、芳基或杂芳基。在芳基或杂芳基环被取代的情况下，所述取代基可以是烷基、卤代烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫代烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-；
当R1是H、1-8个碳的低级或支链烷基、杂芳基时，R2可以是选自以下的官能团：[(C＝O)CH2(W)NHC＝O]m-V-J并且W可以是H或[(CH2)n R3]n，其中n＝1-4并且m＝1-6。W也可以是以R3为末端的支链烷基链或1-13个单元的聚乙二醇基团OCH2CH2O；
R3可以是H或选自以下：OH、O-烷基、NH2、NH-烷基、N-二烷基、SH、S-烷基、胍、脲、羧酸、羧酰胺、羧酸酯、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基，所述取代基可以是烷基、卤代烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫代烷基、胍、脲、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基C(O)-；
取代基NR1R2可以占据Z上的任何可用位置；
R2也可以是C(＝O)OCH2-对-氨基苯基[(C＝O)CH(W)NHC＝O]m-V-J并且W可以是H或[(CH2)n R3]n，其中n＝1-4并且m＝1-6。W也可以是以R3为末端的支链烷基链、1-13个单元的聚乙二醇基团OCH2CH2O或C(＝O)OCH2-对-氨基苯基-V-J；
V可以是1-8个碳的烷基链、1-13个单元的聚乙二醇基团OCH2CH2O或选自1-8个碳的低级或支链烷基、芳基或杂芳基。当芳基或杂芳基环被取代时，所述取代基可以是烷基、卤代烷基、卤素、联苯、硝基、腈、-OH、-O-烷基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、硫醇、硫代烷基、胍、尿素、羧酸、烷氧基、羧酰胺、羧酸酯、烷基-C(O)O-、烷基氨基-C(O)-、二烷基氨基C(O)-和1-3个选自Gly、Asn、Asp、Gln、Leu、Lys、Ala、βAla、Phe、Val或Cit的氨基酸序列；
J是选自-NH2、N3、硫代、环辛炔、-OH、-CO2H、反式-环辛炔的反应性基团，
Figure BDA0004033983910003091
其中R32是Cl、Br、F、甲磺酸酯或甲苯磺酸酯并且R33是Cl、Br、I、F、OH、-O-N-琥珀酰亚胺基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基，R34是H、Me或四嗪-H或Me；
Q可以是H、P(O)OR4(其中R4可以是H或低级1-10烷基)、C(O)R6(其中R6是1-8个碳的低级或支链烷基)或[(C＝O)NR4CHnNR4(C＝O)OCHm]m-V-V-J(其中n＝1-8，m＝1-6并且R4＝H、烷基或支链烷基)；
A1和A2可以是H或卤素并且
除非另有说明，否则要求保护所有可能的立体异构体。
式1的示例性化合物绘示于图11中。此外，本文描述了示例性化合物的合成。
一般程序
以下一般程序用于液相色谱(制备型或分析型)和核磁共振。
液相色谱
除非另有说明，否则以下条件用于高压液相色谱(HPLC)纯化或用于液相色谱-质谱(LC-MS)：
LCMS方法A
根据此方法在具有OnyxTMMonolithic C18 LC柱(50x2mm)的Agilent 1260LCMS-4-QUAD系统上进行样品分析。在6分钟内使用含5-95％ A的B的梯度运行样品，其中A＝含0.05％ AcOH的水/ACN(95:5体积/体积)并且B＝含0.05％ AcOH的ACN。
LCMS方法B
根据此方法在具有
Figure BDA0004033983910003101
1.7μm C18
Figure BDA0004033983910003102
LC柱(50x2.1mm)的WatersAcquity LCMS-5-SQD系统上进行样品分析。在2.5分钟内使用含10-95％ A的B的梯度运行样品，其中A＝含0.02％甲酸的水并且B＝含0.05％甲酸的ACN。
以下是用于分析最终目标的LCMS方法：
LCMS方法-1：
柱详细信息：X-BRIDGE BEH 2.1*50mm 2.5μm
机器详细信息：-Water Acquity UPLC-H Class，配备有PDA和Acquity SQ检测器；柱温：35℃；自动进样器温度：5℃；流动相A：含0.1％甲酸的Milli Q水(pH＝2.70)；流动相B：含0.1％甲酸的Milli Q水:乙腈(10:90)。
流动相梯度详细信息：T＝0min(97％ A,3％ B)流速：0.8mL/min；T＝0.75min(97％ A,3％ B)流速：0.8mL/min；梯度至T＝2.7min(2％A,98％ B)流速：0.8mL/min；梯度至T＝3min(0％ A,100％ B)流速：1mL/min；T＝3.5min(0％ A,100％ B)流速：1mL/min；梯度至T＝3.51min(97％ A,3％ B)流速：0.8mL/min；运行结束在T＝4min(97％ A,3％B)，流速：0.8mL/min，流速：0.8mL/min，运行时间：4min，UV检测方法：PDA。
质量参数：
探针：ESI，电离方式：正负，锥体电压：30V和10V，毛细管电压：3.0KV，提取器电压：1V，Rf透镜：0.1V，源温度：120℃，去溶剂化温度：400℃。锥形气体流速：100L/小时，去溶剂化气体流速：800L/小时。
LCMS方法-2：
柱详细信息：Xtimate C18 4.6*150mm 5μm
机器详细信息：Waters 996光电二极管阵列探测器，配备有Waters微量ZQ检测器；柱温：35℃；自动进样器温度：15℃；流动相A：含5mM醋酸铵和0.1％甲酸(pH＝3.50)的MilliQ水；流动相B：甲醇
流动相梯度详细信息：T＝0min(90％ A,10％ B)；T＝7.0min(10％ A,90％ B)；梯度至T＝9.0min(0％ A,100％ B)；梯度至T＝14.00min(0％ A,100％ B)；T＝14.01min(90％ A,10％ B)；运行结束在T＝17min(90％ A,10％ B)，流速：1.0mL/min，运行时间：17min，UV检测方法：PDA。
质量参数：
探针：ESI，电离方式：正负，锥体电压：30和10V，毛细管电压：3.0KV，提取器电压：2V，Rf透镜：0.1V，源温度：120℃，探针温度：400℃，锥形气体流速：100L/小时，去溶剂化气体流速：800L/小时。
LCMS方法-3：
柱详细信息：Sunfire C18 150x4.6 mm,3.5μm
机器详细信息：Agilent 1260Infinity-II和G6125C(LC/MSD)质量检测器；柱温：35℃；自动进样器温度：15℃；流动相A：含5mM醋酸铵和0.1％甲酸(pH＝3.50)的Milli Q水；流动相B：甲醇
流动相梯度详细信息：T＝0min(90％ A,10％ B)；T＝7.0min(10％ A,90％ B)；梯度至T＝9.0min(0％ A,100％ B)；梯度至T＝14.00min(0％ A,100％ B)；T＝14.01min(90％ A,10％ B)；运行结束在T＝17min(90％ A,10％ B)，流速：1.0mL/min，运行时间：17min，UV检测方法：PDA。
质量参数：
探针：MMI，电离方式：(ESI)正负，碎片电压：30V和70V，毛细管电压：3000V，源气体温度：325℃，蒸发器温度：225℃，气体流速：12L/min，雾化器：50。
HPLC方法-1：
柱详细信息：Sunfire C18(150mm x 4.6mm),3.5μm
机器详细信息：Agilent Technologies.1260Series,Infinity-II，具有PDA检测器；柱温：35℃；自动进样器温度：15℃；流动相A：含0.05％三氟乙酸的Milli Q水(pH＝2.2)；流动相B：乙腈。
流动相梯度详细信息：T＝0min(90％ A,10％ B)流速：1.0mL/min；T＝7.0min(10％ A,90％ B)流速：1.0mL/min；梯度至T＝9.0min(00％ A,100％ B)流速：1.0mL/min；梯度至T＝14min(00％ A,100％ B)流速：1.0mL/min；T＝14.01min(90％ A,10％ B)流速：1mL/min；运行结束在T＝17min(90％ A,10％ B)流速：1.0mL/min，流速：1.0mL/min，运行时间：17min，UV检测方法：PDA。
HPLC方法-2
柱详细信息：Atlantis C18(150mm x 4.6mm),5.0μm或Welch C18(150mm x4.6mm),5.0μm
机器详细信息：-Waters Alliance e2695，具有2998PDA检测器；柱温：35℃；自动进样器温度：15℃；流动相A：含0.1％氨的Milli Q水(pH＝10.5)；流动相B：乙腈。
流动相梯度详细信息：T＝0min(90％ A,10％ B)流速：1.0mL/min；T＝7.0min(10％ A,90％ B)流速：1.0mL/min；梯度至T＝9.0min(00％ A,100％ B)流速：1.0mL/min；梯度至T＝14min(00％ A,100％ B)流速：1.0mL/min；T＝14.01min(90％ A,10％ B)流速：1mL/min；运行结束在T＝17min(90％ A,10％ B)流速：1.0mL/min，流速：1.0mL/min，运行时间：17min，UV检测方法：PDA。
HPLC详细信息：Waters Alliance e2695，具有2998PDA检测器；柱详细信息：Atlantis C18(150mm x 4.6mm),5.0μm或Welch C18(150mm x 4.6mm),5.0μm；流动相A：含0.1％氨的Milli Q水(pH＝10.5)；流动相B：乙腈；流速：1.0mL/min；运行时间：17min
NMR
以下条件用于获得质子核磁共振(NMR)光谱：NMR光谱在1H NMR(400MHz)BrukerAdvancer-III HD FT-NMR分光光度计(Bruker,USA)上进行记录。使用Topspin 3.6.3软件分析原始NMR数据。
从氘代NMR溶剂推断的TMS位置向低场以百万分之几(ppm)为单位报告化学位移。表观多重性报告为：单峰-s、二重峰-d、三重峰-t、四重峰-q或多重峰-m。表现出变宽的峰进一步表示为br。积分是近似的。应该提到的是积分强度、峰形、化学位移和耦合常数可能取决于溶剂、浓度、温度、pH和其他因素。
实验细节
除非另有说明，否则所有反应均在干燥的氮气气氛下进行。所有关键化学品均按原样使用。所有其他可商购获得的材料诸如溶剂、试剂和催化剂无需进一步纯化即可使用。使用预包被的Merck硅胶60F254铝片(Merck,Germany)通过薄层色谱(TLC)监测反应。TLC板的可视化是使用UV光、茚三酮喷雾和碘蒸气完成的。使用适当的流动相，使用230-400目、100-200目和60-120目硅胶或C18硅胶作为固定相进行柱色谱分离。
INX J的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910003141
(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX J.a)的合成：
Figure BDA0004033983910003151
程序：
向圆底烧瓶中装入Fmoc-Gly-OSu(1.0g,2.535mmol,1.0eq)、H-Glu(OtBu)-OH(0.6183g,3.043mmol,1.2eq)和碳酸氢钠(0.4260g,5.07mmol,2.0eq)。添加水和1,4-二噁烷的溶液(1:1,26mL)，并且将混合物在室温下搅拌过夜。通过LCMS确认起始材料消耗并且减少溶剂，去除二噁烷但留下水。然后将混合物酸化至pH 2-3，添加到分液漏斗中，并且用5:1醋酸异丙酯/异丙醇(3x 100mL)萃取。将合并的有机物经Na2SO4干燥，过滤，减少，装载到Isco C18 Aq 100g反相柱上，并且用含0-100％乙腈(0.05％ AcOH添加剂)的H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并、冷冻并且冻干，提供0.9982g呈白色固体状的INX J.a，82％产率。LCMS方法B(ESI+)：C26H31N2O7[M+H]+需要483.21，在1.14分钟实测为483.25。
(3-(4-甲酰基苄基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(INX J-1)的合成：
Figure BDA0004033983910003152
程序：
用氩气回填圆底烧瓶并且装入(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(4.2765g,13.40mmol,1.0eq)、4-溴甲基苯甲醛(4.0g,20.1mmol,1.5eq)、碳酸钾(9.2594g,67.0mmol,5.0eq)和[1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(0.3841g,0.469mmol,0.035eq)。将无水THF(84mL)添加到烧瓶中，然后将其配备回流冷凝器并且加热至80℃持续16h。通过LCMS确认起始材料消耗，然后将混合物冷却，用水(200mL)稀释，添加到分液漏斗中，并且用EtOAc(3x 100mL)萃取。合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，减少，并且装载到Isco Rf Gold 80g SiO2柱上，并且用含0-100％ EtOAc的己烷的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并并且减少，提供3.529g呈透明油状物的化合物INX J-1，85％产率，其在减压去除之后结晶过夜。LCMS方法A(ESI-)：C19H20NO3[M-H]-需要310.15，在3.080分钟实测为310.1。
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-氨基苄基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX J-2)的合成：
Figure BDA0004033983910003161
程序：
向圆底烧瓶中装入16-α-羟基泼尼松龙(3.30g,8.765mmol,1.0eq)、醛INX J-1(3.0023g,9.641mmol,1.1eq)和MgSO4(3.1659g,26.29mmol,3.0eq)。将固体悬浮在乙腈(88mL)中并且将混合物冷却至0℃，然后逐滴添加三氟甲磺酸(3.9mL,43.83mmol,5.0eq)。在10-20分钟之后反应变成粉红色，并且在1h之后起始材料完全消耗。减少溶剂并且将粗品分两批纯化，每批装载到Isco C18 Aq 275g反相柱上，并且用含5-100％乙腈(0.05％ AcOH添加剂)的H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相洗脱。将两批含有纯产物的级分合并、冷冻并且冻干，提供2.50g呈白色固体状的INX J-2，50％产率。LCMS方法A(ESI+)：C35H40NO6[M+H]+需要570.28，在2.572分钟实测为570.3。
(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX J-3)的合成：
Figure BDA0004033983910003171
程序：
将DMF(2.3mL)添加到装有双氨基酸INX J.a(0.3074g,0.6372mmol,1.1eq)的圆底烧瓶中。然后添加苯胺INX J-2(0.330g,0.579mmol,1.0eq)，随后添加三乙胺(0.24mL,1.73mmol,3.0eq)。将溶液冷却至0℃，然后添加50％丙烷膦酸酐在DMF中的溶液(0.70mL,1.1586mmol,2.0eq)。将混合物搅拌16h，同时升温至室温。一旦通过LCMS确认反应完成，就将粗混合物直接装载到Isco C18 Aq 50g反相柱上，并且用含0-100％乙腈(0.05％ AcOH添加剂)的H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并、冷冻并且冻干，提供0.200g呈白色固体状的INX J-3，33％产率。LCMS方法A(ESI+)：C61H68N3O12[M+H]+需要1034.47，在3.073分钟实测为1034.4。
(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯AcOH盐(INXJ-4)的合成：
Figure BDA0004033983910003181
程序：
向小瓶中装入化合物INX J-3(0.080g,0.0774mmol,1.0eq)，然后将其溶解在乙腈(0.50mL)和哌啶(62μL)中。搅拌混合物直到所有起始材料都脱保护，30min。减少溶剂，将粗品在DMSO中稀释，并且装载到Isco C18 Aq 15.5g反相柱上，并且用含0-100％乙腈(0.05％AcOH添加剂)的H2O(0.05％ AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并、冷冻并且冻干，提供0.0423g呈透明油状物的INX J-4·AcOH，63％产率。LCMS方法A(ESI+)：C46H58N3O10[M+H]+需要812.40，在2.638分钟实测为812.4。
(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX J-5)的合成：
Figure BDA0004033983910003182
程序：
向小瓶中装入2-溴乙酸(0.0092g,0.0665mmol,2.1eq)和DMF(0.33mL)。添加N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(0.0156g,0.0632mmol,2.0eq)，并且将混合物搅拌约90分钟。然后将胺INX J-4·AcOH(0.0270g,0.0309mmol,1.0eq)与碳酸氢钠(0.0140g,0.1665mmol,5.4eq)一起添加到溶液中，并且将混合物搅拌2h(直到所有INX J-4被消耗)。一旦通过LCMS确认反应完成，就将粗混合物直接装载到Isco C18 Aq 5.5g反相柱上，并且用含0-100％乙腈(0.05％AcOH添加剂)的H2O(0.05％ AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并、冷冻并且冻干，提供0.0100g呈白色固体状的INX J-5，35％产率。LCMS方法A(ESI+)：C48H59BrN3O11[M+H]+需要932.33，在2.926分钟实测为932.2。
(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸(INX J)的合成：
Figure BDA0004033983910003191
程序：
向小瓶中装入叔丁酯INX J-5(0.010g,0.01072mmol,1.0eq)，将其溶解在含50％TFA的DCM溶液(0.200mL)中并且搅拌1h。一旦通过LCMS确认反应完成，就去除溶剂，将残余物溶解在DMSO中，并且装载到Isco C18 Aq 5.5g反相柱上，并且用含0-100％乙腈(0.05％AcOH添加剂)的H2O(0.05％ AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并、冷冻并且冻干，提供0.0033g呈白色固体状的INX J，35％产率。LCMS方法A(ESI+)：C44H51BrN3O11[M+H]+需要876.26，在2.524分钟实测为877.2。
INX L的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910003201
(S)-5-(叔丁氧基)-2-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙酰氨基)-5-氧代戊酸(Boc-Gly-Glu(OtBu)-OH)的合成：
Figure BDA0004033983910003202
程序：
向圆底烧瓶中装入Boc-Gly-OSu(12.0g,44.07mmol,1.0eq)、H-Glu(OtBu)-OH(9.8524g,48.47mmol,1.1eq)和碳酸氢钠(7.4040g,88.14mmol,2.0eq)。添加水和1,4-二噁烷的溶液(1:1,220mL)，并且将混合物在室温下搅拌过夜。通过LCMS确认起始材料消耗并且减少溶剂，去除二噁烷但留下水。然后将混合物酸化至pH 2-3，形成沉淀物，然后将沉淀物过滤并且在冻干机上干燥，提供14.0152g呈白色固体状的Boc-Gly-Glu(OtBu)-OH，88％产率。LCMS方法A(ESI+)：C16H29N2O7[M+H]+需要361.19，在2.122分钟实测为361.2。
(S)-4-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX L-1)的合成：
Figure BDA0004033983910003211
程序：
在惰性气氛下向烘干的小瓶中装入胺INX J-2(0.8200g,2.63mmol,1.0eq)、Boc-Gly-Glu(OtBu)-OH(2.5916g,7.197mmol,2.73eq)、((7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐)(2.2515g,4.318mmol,1.64eq)和DMF(15mL)。接着，添加N,N-二异丙基乙胺(1.5mL,8.636mmol,3.3eq)，并且将混合物搅拌直到所有胺消耗，1h。然后将粗溶液直接添加到Isco C18 Aq 100g反相柱中，并且用含0-100％乙腈(0.05％ TFA添加剂)的H2O(0.05％ TFA添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并、冷冻并且冻干，提供0.4404g呈白色固体状的INX L-1，34％产率。LCMS方法A(ESI+)：C51H66N3O12[M+H]+需要912.46，在2.524分钟实测为912.4。
(S)-4-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX L-2)的合成：
Figure BDA0004033983910003221
程序：
在惰性气氛下向烘干的小瓶中装入叔丁酯INX L-1(0.200g,0.220mmol,1.0eq)和DMF(0.50mL)。接着，添加1-H四唑(0.1540g,2.20mmol,10eq)和N,N-二乙基亚磷酰胺二叔丁酯(1.311g,5.265mmol,24.0eq)，并且将混合物搅拌72h至实现90％转化。添加过氧化氢(2mL)，并且将混合物搅拌1h，之后装载到Isco C18 Aq 50g反相柱上，并且用含0-100％乙腈(0.05％ AcOH添加剂)的H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并、冷冻并且冻干，提供0.120g呈白色固体状的INX L-2，49％产率。LCMS方法A(ESI+)：C59H83N3O15P[M+H]+需要1104.55，在3.894分钟实测为1104.5。
(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(磷酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸TFA盐(INX L-3)的合成：
Figure BDA0004033983910003222
程序：
向圆底烧瓶中装入叔丁酯INX L-2(0.772g,0.7mmol,1.0eq)、DCM(10mL)、三氟乙酸(5mL)和三异丙基硅烷(1.2mL)。将混合物在室温下搅拌8h。通过LCMS确认起始材料消耗并且减少溶剂。将所得残余物溶解在DMF(4mL)中，装载到Isco C18 Aq 100g反相柱上，并且用含0-100％乙腈(0.05％ TFA添加剂)的H2O(0.05％ TFA添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并、冷冻并且冻干，提供0.3976g呈白色固体状的INX L-3·TFA，54％产率。LCMS方法A(ESI+)：C42H51N3O13P[M+H]+需要836.3，在2.053分钟实测为836.3。
(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(磷酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸(INX L)的合成：
Figure BDA0004033983910003231
程序：
向圆底烧瓶中装入2-溴乙酸(0.0250g,0.180mmol,3.5eq)、DMF(0.50mL)、(7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(0.0470g,0.090mmol,1.7eq)和N,N-二异丙基乙胺(0.0155g,0.120mmol,2.3eq)。在单独的小瓶中，将胺INX L-3·TFA(0.050g,0.052mmol,1.0eq)溶解在DMF(2.0mL)中并且添加到含有溴乙酸和偶联剂的容器中。将混合物搅拌30分钟并且通过LCMS确认起始材料消耗。将粗混合物通过制备型HPLC纯化，流动相为含0-100％乙腈(0.05％ AcOH添加剂)的H2O(0.05％ AcOH添加剂)。将含有纯产物的级分合并、冷冻并且冻干，提供0.030g呈白色固体状的INX L，60％产率。LCMS方法A(ESI+)：C44H52BrN3O14P[M+H]+需要956.78，在2.323分钟实测为956.2。
INX-SM-1和INX N的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910003241
(S)-(1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸烯丙酯(INX-SM-1-1)的合成：
Figure BDA0004033983910003242
程序：
在惰性气氛下向圆底烧瓶中装入4-(溴甲基)苯甲醛(1.465g，7.40mmol，1.2eq)、(5-(三丁基甲锡烷基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(3.00g,6.10mmol,1.0eq)、磷酸三钾(3.902g,18.40mmol,3.0eq)和甲磺酸(2-二环己基膦基-2',6'-二甲氧基联苯)[2-(2′-氨基-1,1′-联苯)]钯(II)(1.148g,1.50mmol,20mol％)。将水(10mL)和THF(100mL)脱气，然后添加并且将混合物回流过夜。完成后(经由LCMS测定)，将混合物冷却至室温，减少并且装载到Isco C18 Aq 450g反相柱上，并且用含0-100％乙腈(10mM NH4OAc添加剂)的H2O(10mMNH4OAc添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并、冷冻并且冻干，提供1.064g呈灰白色固体状的INX-SM-1-1，55％产率。LCMS方法B(ESI+)：C11H11N2OS[M-Boc+H]+需要219.10，在1.66分钟实测为219.04。
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((2-氨基噻唑-5-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮AcOH盐(INX-SM-1)的合成：
Figure BDA0004033983910003251
程序：
向圆底烧瓶中装入16-α-羟基泼尼松龙(1.1833g,3.143mmol,1.0eq)、醛INX-SM-1-1(1.10g,3.458mmol 1.1eq)和MgSO4(1.1355g,9.431mmol,3.0eq)。将固体悬浮在乙腈(31mL)中并且将混合物冷却至0℃，然后逐滴添加三氟甲磺酸(1.4mL,15.718mmol,5.0eq)。在10-20分钟之后，反应变成粉红色，并且在1h之后起始材料消耗。减少溶剂，将粗品装载到Isco C18 Aq 275g反相柱上，并且用含0-100％乙腈(0.05％ AcOH添加剂)的H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并、冷冻并且冻干，提供1.059g呈白色固体状的INX-SM-1·AcOH，53％产率。LCMS方法B(ESI+)：C32H37N2O6S[M+H]+需要577.23，在1.10分钟实测为577.93。
(S)-4-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)噻唑-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX N-1)的合成：
Figure BDA0004033983910003261
程序：
向圆底烧瓶中装入INX-SM-1·AcOH(1.000g,1.57mmol,1.0eq)、Boc-Gly-Glu(OtBu)-OH(3.1212g,8.607mmol,5.5eq)和PyAOP(4.5210g,8.678mmol,5.5eq)。添加1:1DCM/DMF的混合物(22mL总体积)，随后添加DIPEA(3.0mL,17.356mmol,11.0eq)并且将混合物搅拌5小时。一旦大部分INX-SM-1被消耗，就将溶剂减少(至仅DMF)并且将粗混合物装载到Isco C18 Aq 275g反相柱上，并且用含5-100％乙腈(0.05％ AcOH添加剂)的H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并、冷冻并且冻干，提供0.4050g呈白色固体状的INX N-1，28％产率。LCMS方法A(ESI+)：C48H63N4O12S[M+H]+需要919.41，在3.089分钟实测为919.4。
(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)噻唑-2-基)氨基)-5-氧代戊酸TFA盐(INX N-2)的合成：
Figure BDA0004033983910003262
程序：
向圆底烧瓶中装入叔丁酯INX N-1(0.200g,0.2177mmol,1.0eq)、MeCN(2.0mL)、三氟乙酸(2.0mL)和三异丙基硅烷(0.70mL,3.266mmol,15.0eq)。将混合物在室温下搅拌3h。通过LCMS确认起始材料消耗并且减少溶剂。将所得残余物装载到Isco C18 Aq 30g反相柱上，并且用含0-100％乙腈(0.10％ TFA添加剂)的H2O(0.10％TFA添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并、冷冻并且冻干，提供0.0954g呈白色固体状的INX N-2·TFA，50％产率。LCMS方法A(ESI+)：C39H47N4O10S[M+H]+需要763.29，在1.732分钟实测为763.3。
(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)噻唑-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX N)的合成：
Figure BDA0004033983910003271
程序：
向小瓶中装入2-溴乙酸(0.0127g,0.0913mmol,2.0eq)，将其溶解在DMF(0.500mL)中。添加N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(0.0215g,0.0867mmol,1.9eq)，并且将混合物搅拌90分钟。然后将胺INX N-2·TFA(0.040g,0.0457mmol,1.0eq)与碳酸氢钠(0.0230g,0.2739mmol,6.0eq)一起添加到溶液中，并且将混合物搅拌2h(直到所有INX N-2被消耗)。一旦通过LCMS确认反应完成，就将粗混合物直接装载到Isco C18 Aq 15.5g反相柱上，并且用含0-100％乙腈(0.05％ AcOH添加剂)的H2O(0.05％ AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并、冷冻并且冻干，提供0.0091g呈蓬松黄色固体状的INX N，22％产率。LCMS方法A(ESI+)：C41H48BrN4O11S[M+H]+需要883.21，在2.247分钟实测为883.2。
INX-SM-2和INX Q的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910003281
(4-(4-甲酰基苄基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-2-1)的合成：
Figure BDA0004033983910003282
程序：
用氩气回填圆底烧瓶并且装入(4-(溴甲基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(0.150g,0.5115mmol,1.5eq)、(4-甲酰基苯基)硼酸(0.0511g,0.3411mmol,1.0eq)、碳酸钾(0.2357g,1.706mmol,5.0eq)和[1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(0.0279g,0.0341mmol,0.10eq)。将无水THF(2.5mL)添加到烧瓶中，然后将其配备回流冷凝器并且加热至80℃持续16h。通过LCMS确认起始材料消耗，然后将混合物冷却，用水(10mL)稀释，添加到分液漏斗中，并且用EtOAc(3x 20mL)萃取。合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，减少，并且装载到Isco Rf Gold 24g SiO2柱上，并且用含0-100％EtOAc的己烷的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并并且减少，提供0.0082g呈透明油状物的化合物IN-SM-2-1，8％产率，其在减压去除之后结晶过夜。LCMS方法A(ESI+)：C16H19N2O3S[M+H]+需要319.10，在2.1716分钟实测为319.1。
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((2-氨基噻唑-4-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮AcOH盐(INX-SM-2)的合成：
Figure BDA0004033983910003291
程序：
向圆底烧瓶中装入16-α-羟基泼尼松龙(0.1936g,0.5143mmol,1.0eq)、醛INX-SM-2-1(0.1800g,0.5659mmol 1.1eq)和MgSO4(0.1857g,1.5428mmol,3.0eq)。将固体悬浮在乙腈(5.1mL)中并且将混合物冷却至0℃，然后逐滴添加三氟甲磺酸(0.23mL,2.571mmol,5.0eq)。在10-20分钟之后，反应变成浅粉色，并且在约1h之后起始材料消耗。减少溶剂，将粗品装载到Isco C18 Aq 30g反相柱上，并且用含0-100％乙腈(0.05％ AcOH添加剂)的H2O(0.05％ AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并、冷冻并且冻干，提供0.1680g呈白色固体状的INX-SM-2·AcOH，52％产率。LCMS方法A(ESI+)：C32H37N2O6S[M+H]+需要577.23，在1.974分钟实测为577.3。
(S)-4-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)噻唑-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX Q-1)的合成：
Figure BDA0004033983910003301
程序：
向圆底烧瓶中装入INX-SM-2·AcOH(0.1125g,0.176mmol,1.0eq)、Boc-Gly-Glu(OtBu)-OH(0.0700g,0.1760mmol,1eq)和PyAOP(0.1220g,0.2340mmol,1.3eq)。添加DMF(1.6mL)，然后添加DIPEA(0.081mL,0.4686mmol,2.6eq)并且将混合物在室温下搅拌2小时。一旦大部分INX-SM-2消耗，就将粗混合物装载到Isco C18 Aq 15.5g反相柱上，并且用含0-100％乙腈(0.05％ AcOH添加剂)的H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并、冷冻并且冻干，提供0.060g呈白色固体状的INX Q-1，37％产率。LCMS方法A(ESI+)：C48H63N4O12S[M+H]+需要919.41，在2.931分钟实测为919.4。
(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)噻唑-2-基)氨基)-5-氧代戊酸TFA盐(INX Q-2)的合成：
Figure BDA0004033983910003311
程序：
向圆底烧瓶中装入叔丁酯INX Q-1(0.0800g,0.0871mmol,1.0eq)、MeCN(1.0mL)、三氟乙酸(1.0mL)和三异丙基硅烷(0.178mL,0.871mmol,10.0eq)。将混合物在室温下搅拌3h。通过LCMS确认起始材料消耗并且减少溶剂。将所得残余物装载到Isco C18 Aq 15.5g反相柱上，并且用含0-100％乙腈(0.10％ TFA添加剂)的H2O(0.10％TFA添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并、冷冻并且冻干，提供0.0100g呈白色固体状的INX Q-2·TFA，13％产率。LCMS方法A(ESI+)：C39H47N4O10S[M+H]+需要763.29，在1.945分钟实测为763.2。
(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)噻唑-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX Q)的合成：
Figure BDA0004033983910003321
程序：
向小瓶中装入2-溴乙酸(0.0036g,0.0262mmol,2.3eq)，将其溶解在DMF(0.500mL)中。添加N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(0.0062g,0.0250mmol,2.2eq)，并且将混合物搅拌90分钟。然后将胺INX Q-2·TFA(0.010g,0.0114mmol,1.0eq)与碳酸氢钠(0.0066g,0.0786mmol,6.9eq)一起添加到溶液中，并且将混合物搅拌2h(直到所有INX Q-2被消耗)。一旦通过LCMS确认反应完成，就将粗混合物直接装载到Isco C18 Aq 5.5g反相柱上，并且用含0-100％乙腈(0.05％ AcOH添加剂)的H2O(0.05％ AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并、冷冻并且冻干，提供0.0036g呈蓬松黄色固体状的INX Q，36％产率。LCMS方法B(ESI+)：C41H48BrN4O11S[M+H]+需要883.21，在1.20分钟实测为883.53。
INX-SM-3和INX-SM-53的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910003331
3-((叔丁氧基羰基)氨基)双环[1.1.1]戊烷-1-甲酸甲酯(INX-SM-3-1)的合成
Figure BDA0004033983910003332
程序：
在室温下向3-(甲氧基羰基)双环[1.1.1]戊烷-1-甲酸(10g,58.76mmol)在叔丁醇(20mL)中的溶液中添加叠氮磷酸二苯酯(DPPA)(20.2mL,88.15mmol)和三乙胺(33.04mL,235.0mmol)。将反应混合物在80℃下加热1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到粗产物。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷：12:88)纯化，得到呈白色固体状的标题化合物(10g,70.55％)。1H NMR(CDCl3)δ:7.43(bs,1H),3.69(s,3H),2.30(s,6H),1.46(s,9H)。
(3-(羟甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-3-2)的合成
Figure BDA0004033983910003341
程序：
在室温下向3-((叔丁氧基羰基)氨基)双环[1.1.1]戊-1-甲酸甲酯(INX-SM-3-1)(5g,20.70mmol)在THF:MeOH(3:1)(20mL)中的搅拌溶液中添加硼氢化钠(3.9g,103.5mmol)并且再搅拌16h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用稀HCl水溶液淬灭并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到粗产物(4.3g,97.38％)。LCMS:214.0[M+H]+；1H NMR(CDCl3)δ:4.99(bs,1H),3.72(s,2H),1.95(s,6H),1.42(s,6H)。
(3-甲酰基双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-3-3)的合成
Figure BDA0004033983910003342
程序：
在室温下向(3-(羟甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-3-2)(0.1g,0.46mmol)在DCM(2mL)中的搅拌溶液中添加戴斯-马丁高碘烷(Dess-Martinperiodinane,DMP)(0.40g,40.93mmol)并且搅拌30min。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用饱和NaHCO3溶液淬灭并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到粗产物。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷：40:60)纯化，得到呈白色固体状的标题化合物(0.050g,52％)。1H NMR(DMSO-d6)δ:9.59(s,1H),7.68(bs,1H),2.12(s,6H),1.37(s,9H)。
(3-((2-甲苯磺酰基亚肼基)甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-3-4)的合成
Figure BDA0004033983910003351
程序：
向(3-甲酰基双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-3-3)(0.40g,1.89mmol)在二噁烷(5mL)中的搅拌溶液中添加对甲苯磺酰肼(8.8g,47.20mmol)并且在50℃下搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到粗产物。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷：30:70)纯化，得到呈白色固体状的标题化合物(0.28g,38.96％)。LCMS:324.5(M-56)；1H NMR(DMSO-d6)δ:11.07(s,1H),7.66(d,J＝8Hz,2H),7.40(d,J＝8Hz,2H),7.23(s,1H),2.38(s,3H),1.90(s,6H),1.36(s,9H)。
(3-(4-甲酰基苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯
(INX-SM-3-5)的合成
Figure BDA0004033983910003352
程序：
在室温下向)-(3-((2-甲苯磺酰基亚肼基)甲基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-3-4)(3.20g,8.43mmol)在二噁烷(30mL)中的搅拌溶液中添加(4-甲酰基苯基)硼酸(1.64g,8.43mmol)和K2CO3(1.74g,12.64mmol)并且在110℃下再搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到粗产物。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷：15:85)纯化，得到呈白色固体状的标题化合物(0.81g,31.87％)。LCMS:302.5(M+H)+；1H NMR(DMSO-d6)δ:9.97(s,1H),7.84(d,J＝7.6Hz,2H),7.33(d,J＝7.6Hz,2H),2.89(s,2H),1.68(s,6H),1.33(s,9H)。
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-3)
和
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-53)的合成
Figure BDA0004033983910003361
程序：
向(3-(4-甲酰基苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-3-5)(1.0g,3.31mmol)和(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(1.24g,3.31mmol)在DCM(10mL)中的溶液中添加PTSA(0.95g,4.97mmol)并且在室温下再搅拌16h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到呈异构体混合物形式的粗产物。将粗品通过制备型HPLC纯化，然后将异构体通过手性制备型HPLC分离(柱：IG250*21μm，5微米，流动相：A＝含0.1％氨的庚烷，B＝IPA:ACN(70:30)，A:B＝60:40)，得到异构体-1和异构体-2。将这些异构体洗脱，保留时间为6.72min(异构体-1)和11.87min(异构体-2)。
INX-SM-3(异构体-1)：LCMS:561.0(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:5.45(s,1H,乙缩醛-H),5.07(d,J＝5.2Hz,1H,C16H)
INX-SM-53(异构体-2)：LCMS 561.1(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD,关键质子分配):δ:6.13(s,1H,缩醛-H),5.41(d,J＝5.6Hz,1H,C16H)
INX-P的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910003381
5-(叔丁基)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-谷氨酸1-苄酯
(INX-P-1)的合成
Figure BDA0004033983910003382
程序：
向500mL三颈圆底烧瓶中装入含(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(25g,58.82mmol)和碳酸氢钠(9.8g,116.66mmol)的DMF(200mL)。在室温下向此悬浮液中添加苄基溴(10.9g,63.74mmol)并且在室温下搅拌16h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用水洗涤，经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品与乙醚和戊烷一起研磨，得到呈白色固体状的标题化合物(26g,85.83％)。LCMS:516.4(M+H)+。
5-(叔丁基)L-谷氨酸1-苄酯(INX-P-2)的合成
Figure BDA0004033983910003391
程序：
向500mL单颈圆底烧瓶中装入5-(叔丁基)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-谷氨酸1-苄酯(INX-P-1)(26g,50.42mmol)和THF(200mL)。向此溶液中添加二乙胺(36.8g,504.11mmol)并且在室温下搅拌3h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，真空蒸发并且与戊烷一起研磨，得到浅黄色粘性标题化合物(28g)。粗产物直接用于下一步骤，没有任何分析数据。
5-(叔丁基)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基-L-谷氨酸1-苄酯(INX-P-3)的合成
Figure BDA0004033983910003392
程序：
向500mL单颈圆底烧瓶中装入(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酸(28.0g,94.27mmol)和DMF(200mL)。在室温下向此溶液中添加EDC.HCl(19.7g,102.76mmol)、HOBT(13.9g,102.76mmol)、DIPEA(24.2g,187.24mmol)和5-(叔丁基)L-谷氨酸1-苄酯(INX-P-2)(30.38g,103.25mmol)并且搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用水淬灭并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到粗产物。将粗品通过柱色谱(乙酸乙酯/己烷，50:50)纯化，得到浅黄色的标题化合物(12.0g,23.64％)。LCMS:574.4(M+H)+。
(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)的合成
Figure BDA0004033983910003401
程序：
向500mL单颈圆底烧瓶中装入含5-(叔丁基)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基-L-谷氨酸1-苄酯(INX-P-3)(12.0g,20.95mmol)的MeOH(120mL)。在室温下向此溶液中添加10％Pd/C(2.4g,)并且用氢气吹扫3-4h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物通过硅藻土床过滤，并且将滤液真空蒸发。将粗品通过反相柱色谱(乙腈/水)纯化，得到呈灰白色固体状的标题化合物(5g,49.45％)。LCMS:483.2(M+H)+。
(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-P-5)的合成
Figure BDA0004033983910003411
程序：
在室温下向50mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.47g,0.97mmol)、HATU(0.55g,1.45mmol)、DIPEA(0.25g,1.94mmol)和DMF(4mL)。在室温下向此溶液中添加(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-3)(0.59g,1.06mmol)并且在室温下搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过反相柱色谱(乙腈/水，50:50)纯化，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(0.42g,57.38％)。LCMS:1025.0(M+H)+。
(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-P-6)的合成
Figure BDA0004033983910003421
程序：
向50mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-P-5)(0.40g,0.41mmol)和THF(4mL)。向此溶液中添加二乙胺(0.40g,4.10mmol)并且在室温下搅拌3h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物真空蒸发，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.23g,73.43％)。LCMS:802.1(M+H)+。
(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-P-7)的合成
Figure BDA0004033983910003431
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-P-6)(0.23g,0.28mmol)和DCM(2mL)。在室温下向此溶液中添加Na2CO3(0.12g,0.57mmol)的水溶液(1mL)，随后添加溴乙酰溴(0.029g,0.28mmol)并且搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用水淬灭并且用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过反相柱色谱(乙腈/水，50:50)纯化，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.090g,34.00％)。LCMS:922.9&924.8(M&M+2)。
(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-P)的合成
Figure BDA0004033983910003441
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-P-7)(0.090g,0.097mmol)和DCM(2mL)。向此溶液中添加TFA(0.055g,0.48mmol)并且在室温下搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物真空蒸发。将粗品通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE Prep C18 OBD，19x 250mm，5μm，流动相：A＝含0.1％ FA的水，B＝乙腈；A:B，55:45)纯化，保留时间为15.51min，得到呈灰白色固体状的R-异构体(0.010g,11.83％)。LCMS:866.80&868.8(M&M+2)；1H NMR(400MHz,DMOS-d6，关键质子分配):δ:5.40(s,1H，缩醛-H),4.92(d,J＝4.8Hz,1H,C16H)。
INX-SM-4和INX-SM-54的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910003451
3-(羟甲基)双环[1.1.1]戊-1-甲酸甲酯(INX-SM-4-1)的合成
Figure BDA0004033983910003452
程序：
在0℃下向3-(甲氧基羰基)双环[1.1.1]戊-1-甲酸(10g,58.75mmol)在THF(15mL)中的溶液中逐滴添加硼烷二甲硫醚(BH3.DMS)(13.49mL,176.2mmol)。将反应混合物在0℃下再搅拌30min。如通过TLC表明反应完成之后，通过缓慢添加稀HCl溶液淬灭反应混合物。将产物用乙酸乙酯萃取，并且合并的有机层经Na2SO4干燥，并且真空蒸发，得到呈黏性固体状的标题化合物(8.2g,89.30％)。将粗品用于下一步骤。1H NMR(CDCl3)δ:3.68(s,3H),3.63(s,2H),3.07(bs,1H),2.05(s,6H)。
3-甲酰基双环[1.1.1]戊-1-甲酸甲酯(INX-SM-4-2)的合成
Figure BDA0004033983910003461
程序：
在0℃下向3-(羟甲基)双环[1.1.1]戊-1-甲酸甲酯(INX-SM-4-1)(8.0g,56.27mmol)在DCM(240mL)中的溶液中添加戴斯-马丁高碘烷(DMP)(23.87g,56.27mmol)并且在室温下再搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用饱和NaHCO3溶液淬灭。将反应混合物用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到呈黏性白色固体状的标题化合物(12g，粗品)。粗产物不经纯化即用于进行下一步骤。
3-((2-甲苯磺酰基亚肼基)甲基)双环[1.1.1]戊-1-甲酸甲酯(INX-SM-4-3)的合成
Figure BDA0004033983910003462
程序：
将3-甲酰基双环[1.1.1]戊-1-甲酸甲酯(INX-SM-4-2)(8g,51.88mmol)和对甲苯磺酰肼(9.66g,51.88mmol)在二噁烷(120mL)中的混合物在50℃下加热2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷：60:40)纯化，得到呈白色固体状的标题化合物(10g,60.34％)。LCMS:323.2(M+H)+；1H NMR(DMSO-d6)δ:11.19(s,1H),7.66(d,J＝8Hz,2H),7.40(d,J＝8Hz,2H),7.20(s,1H),3.60(s,3H),2.38(s,3H),2.09(s,6H)。
3-(3-硝基苄基)双环[1.1.1]戊-1-甲酸甲酯(INX-SM-4-4)的合成
Figure BDA0004033983910003471
程序：
在室温下向3-((2-甲苯磺酰基亚肼基)甲基)双环[1.1.1]戊-1-甲酸甲酯(INX-SM-4-3)(4g,12.42mmol)在二噁烷(30mL)中的搅拌溶液中添加(4-硝基苯基)硼酸(2.07g,12.42mmol)和K2CO3(2.57g,18.63mmol)并且在110℃下搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷：06:94)纯化，得到呈白色固体状的标题化合物(0.520g,16.04％)。1H NMR(DMSO-d6)δ:8.10(d,J＝6.4Hz,1H),8.01(s,1H),7.64-7.59(m,2H),3.55(s,3H),2.95(s,2H),1.82(s,6H)。
3-(3-硝基苄基)双环[1.1.1]戊-1-甲醛(INX-SM-4-5)的合成
Figure BDA0004033983910003472
程序：
在-78℃下向3-(3-硝基苄基)双环[1.1.1]戊-1-甲酸甲酯(INX-SM-4-4)(0.490g,1.87mmol)在DCM(25mL)中的搅拌溶液中添加二异丁基氢化铝(1M在甲苯中，3.2mL，3.75mmol)并且再搅拌30min。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用稀HCl溶液淬灭并且使其达到室温，然后用DCM萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷：18:82)纯化，得到呈白色固体状的标题化合物(0.27g,62.26％)。1H NMR(DMSO-d6)δ:9.55(s,1H),8.12(d,J＝8Hz,1H),7.99(s,1H),7.51(t,J＝7.6Hz,1H),7.44(d,J＝7.6Hz,1H),2.95(s,2H),1.93(s,6H)。
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-10-(3-(3-硝基苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮
(INX-SM-4-6)的合成
Figure BDA0004033983910003481
程序：
向3-(3-硝基苄基)双环[1.1.1]戊-1-甲醛(INX-SM-4-5)(0.27g,1.16mmol)在DCM(30mL)中的搅拌溶液中添加(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.351g,0.93mmol)和对甲苯磺酸(0.30g,1.76mmol)。将反应混合物在室温下再搅拌16h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到呈异构体混合物形式的标题化合物(0.470g，粗品)。LCMS:590.93(M+H)+。
此外，将异构体通过手性制备型HPLC(柱：IG 250*21m，5微米，流动相：A＝含0.1％氨的庚烷，B＝IPA:ACN(70:30)，A:B＝75:25)分离，得到异构体-1和异构体-2。将这些异构体洗脱，保留时间为12.85min(异构体-1)和19.40min(异构体-2)。
异构体-1：1H NMR(400MHz,CDCl3)Fr-1:δ4.94(d,1H,C16H),4.57(s,1H，缩醛-H)
异构体-2：1H NMR(400MHz,CDCl3)Fr-1:δ5.19(d,1H,C16H),5.08(s,1H，缩醛-H)
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(3-(3-氨基苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-4)和
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(3-(3-氨基苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-54)的合成
Figure BDA0004033983910003491
程序：
向(INX-SM-4-6，异构体的混合物)(0.30g,0.50mmol)在乙醇(10mL)中的搅拌溶液中添加NH4Cl(0.22g,4.0mmol)和Zn粉(0.26g,4.0mmol)。将反应混合物在80℃下搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物过滤，并且将滤液真空蒸发，得到呈异构体混合物形式的标题化合物(0.360g，粗品)。
此外，将异构体通过手性制备型HPLC(柱：IG 250*21μm，5微米，流动相：A＝含0.1％氨的庚烷，B＝IPA:ACN(70:30)，A:B＝82:18)分离，得到异构体-1和异构体-2。将这些异构体洗脱，保留时间为27.96min(异构体-1)和43.90min(异构体-2)。
INX-SM-4(异构体-1)：LCMS:560.90(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD，关键质子分配)δ:5.00-4.90(m,2H，缩醛&C16-H)
INX-SM-54(异构体-2：LCMS:561.00(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD，关键质子分配)δ:5.16(d,J＝7.2Hz,1H,C16-H),5.09(s,1H，缩醛-H)
INX O的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910003501
(S)-4-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-((3-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX O-1)的合成：
Figure BDA0004033983910003511
程序：
向圆底烧瓶中装入INX-SM-4(0.050g,0.0894mmol,1.0eq)、Boc-Gly-Glu(OtBu)-OH(0.0805g,0.2235mmol,2.5eq)和PyAOP(0.1165g,0.2235mmol,2.5eq)。添加DMF(0.10mL)，然后添加DIPEA(0.078mL,0.4470mmol,5.0eq)并且将混合物搅拌45分钟。此时所有INX-SM-4都被消耗，并且所需产物与双Gly-Glu偶联化合物的比率为2:1。将粗混合物装载到Isco C18 Aq 30g反相柱上，并且用含5-100％乙腈(0.05％ AcOH添加剂)的H2O(0.05％ AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并、冷冻并且冻干，提供0.0220g呈白色固体状的INX O-1，28％产率。LCMS方法B(ESI+)：C50H68N3O12[M+H]+需要902.47，在1.76分钟实测为902.88。
(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-((3-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸TFA盐(INX O-2)的合成：
Figure BDA0004033983910003521
程序：
向圆底烧瓶中装入叔丁酯INX O-1(0.020g,0.022mmol,1.0eq)、MeCN(0.50mL)、三氟乙酸(1.0mL)和三异丙基硅烷(0.075mL,0.3662mmol,16.6eq)。将混合物在室温下搅拌1h。通过LCMS确认起始材料消耗并且减少溶剂。将所得残余物装载到Isco C18 Aq 30g反相柱上，并且用含0-100％乙腈(0.10％ TFA添加剂)的H2O(0.10％ TFA添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并、冷冻并且冻干，提供0.0144g呈白色固体状的INX O-2·TFA，76％产率。LCMS方法A(ESI+)：C41H52N3O10[M+H]+需要746.36，在2.088分钟实测为746.3。
(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-((3-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸(INX O)的合成：
Figure BDA0004033983910003522
程序：
向小瓶中装入2-溴乙酸(0.0205g,0.1476mmol,2eq)，将其溶解在DMF(0.40mL)中。添加N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(0.0347g,0.1402mmol,2eq)，并且将混合物搅拌90分钟。然后将胺INX O-2·TFA(0.0622g,0.072mmol,1.0eq)与碳酸氢钠(0.0371g,0.4428mmol,6.15eq)一起添加到溶液中，并且将混合物搅拌2h(直到所有INX O-2被消耗)。一旦通过LCMS确认反应完成，就将粗混合物直接装载到Isco C18 Aq 5.5g反相柱上，并且用含0-100％乙腈(0.05％ AcOH添加剂)的H2O(0.05％ AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并、冷冻并且冻干，提供0.0124g呈蓬松白色固体状的INX O，20％产率。LCMS方法A(ESI+)：C43H53BrN3O11[M+H]+需要866.28，在2.174分钟实测为866.3。
INX-SM-6和INX-SM-56的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910003531
2-(3-硝基苯基)乙酰胺(INX-SM-6-1)的合成
Figure BDA0004033983910003541
程序：
在0℃下向2-(3-硝基苯基)乙酸(0.5g,2.76mmol)在DCM(15mL)中的溶液中逐滴添加草酰氯(0.71mL,8.28mmol)。将反应混合物在室温下再搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物真空浓缩，得到黏性液体，将其溶解在DCM中并且在0℃下用氨气吹扫。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用碳酸氢钠溶液淬灭，并且将产物用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.3g,60.33％)。将粗品用于下一步骤。LCMS:181.1(M+H)+。
2-(3-硝基苯基)硫代乙酰胺(INX-SM-6-2)的合成
Figure BDA0004033983910003542
程序：
在室温下向2-(3-硝基苯基)乙酰胺(INX-SM-6-1)(3.0g,16.6mmol)在THF(50mL)中的搅拌溶液中添加劳森试剂(Lawesson’s reagent)(13.4g,33.33mmol)并且将反应混合物在回流温度下搅拌14h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用水淬灭并且用乙酸乙酯萃取产物。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷：28:72)纯化，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(3.0g,91.76％)。LCMS:197.1(M+H)+；1H NMR(DMSO):9.62,9.54(2brs,2H),8.28(s,1H),8.13(d,J＝8.0Hz,1H),7.80(d,J＝7.6Hz,1H),7.63(t,J＝8.0Hz,1H),3.96(s,2H)。
2-氯-3-乙氧基-3-氧代丙-1-烯-1-酸钾(INX-SM-6 -3)的合成
Figure BDA0004033983910003551
程序：
在0℃下向甲酸甲基乙酯(methyl ethyl formate)(0.5g,6.75mmol)和2-氯乙酸乙酯(0.824g,6.75mmol)在二异丙醚(25mL)中的溶液中添加叔丁醇钾(0.75g,6.75mmol)并且在室温下搅拌3h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物真空蒸发。将粗品通过与乙醚一起研磨纯化并且真空干燥，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.55g,71.40％)。1HNMR(DMSO-d6)δ:8.94(s,1H),3.94(q,2H),1.11(t,3H)。
2-(3-硝基苄基)噻唑-5-甲酸乙酯(INX-SM-6-4)的合成
Figure BDA0004033983910003552
程序：
将2-氯-3-乙氧基-3-氧代丙-1-烯-1-酸钾(INX-SM-6-3)(5.5g)用稀HCl处理，并且通过乙酸乙酯萃取，并且经Na2SO4干燥，并且浓缩，得到黄色半固体状的2-氯-3-氧代丙酸乙酯(3.0g)。向2-(3-硝基苯基)硫代乙酰胺(INX-SM-6-2)(3g,15.30mmol)在乙醇(50mL)中的搅拌溶液中添加2-氯-3-氧代丙酸乙酯(2.75g,18.36mmol)和Na2SO4(8.03g,76.53mmol)并且在80℃下搅拌12h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷：30:70)纯化，得到呈微黄色液体状的标题化合物(1.6g,35.80％)。LCMS:293.40(M+H)+；1H NMR(CDCl3)δ:8.34(s,1H),8.22-8.19(m,2H),7.70(d,J＝7.6Hz,1H),7.57(t,J＝8Hz,1H),4.49(s,2H),4.32(q,2H),1.31(t,3H)。
2-(3-硝基苄基)噻唑-5-甲醛(INX-SM-6-5)的合成
Figure BDA0004033983910003561
程序：
在-78℃下向2-(3-硝基苄基)噻唑-5-甲酸乙酯(INX-SM-6-4)(1.6g,5.4mmol)在DCM(100mL)中的搅拌溶液中添加二异丁基氢化铝(DIBAL)(1M在甲苯中，12.05ml，12.05mmol)并且在-78℃下再搅拌20min。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用稀HCl溶液淬灭并且使其达到室温。将产物用DCM萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷：10:90)纯化，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.400g,29.44％)。LCMS:249.29(M+H)+；1H NMR(DMSO-d6)δ:10.00(s,1H),8.62(s,1H),8.30(s,1H),8.17(d,J＝8.0Hz,1H),7.85(d,J＝7.6Hz,1H),7.67(t,J＝8Hz,1H),4.65(s,2H)。
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-10-(2-(3-硝基苄基)噻唑-5-基)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-6-7)和
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-10-(2-(3-硝基苄基)噻唑-5-基)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-56-1)的合成
Figure BDA0004033983910003571
程序：
向2-(3-硝基苄基)噻唑-5-甲醛((INX-SM-6.5)(0.4g,1.06mmol)在DCM(20mL)中的搅拌溶液中添加(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.211g,0.84mmol)和对甲苯磺酸(1.0g,5.30mmol)并且在室温下搅拌8h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用碳酸氢盐溶液淬灭并且用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过快速色谱(甲醇/DCM：6:94)纯化，得到呈非对映异构体混合物形式的化合物(INX-SM-6.6)。
此外，将非对映异构体通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart Prep C18-S，250X20mm S-10μm，12mm，流动相：A＝含0.05％氨的水，B＝含20％ A-Line的ACN，A:B＝45:55)分离。将这些异构体洗脱，保留时间为13.5min(INX-SM-6-7，异构体-1)(0.030g,8.8％)和18.50min(INX-SM-56-1，异构体-2)(0.040g,11.8％)。
((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(2-(3-氨基苄基)噻唑-5-基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-6)的合成
Figure BDA0004033983910003581
程序：
向(INX-SM-6-7，异构体-1)(0.030g,0.049mmol)在乙醇(2mL)中的搅拌溶液中添加NH4Cl(0.020g,0.39mmol)和Zn金属(0.025g,0.39mmol)。将反应混合物在80℃下加热2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物过滤，并且将滤液真空蒸发。将粗品通过反相制备型HPLC(0.05％氨-乙腈)纯化，得到呈白色固体状的标题化合物(0.005g,17.8％)。
INX-SM-6(R-异构体)：LCMS:577.2(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD，关键质子分配):δ:5.86(s,1H，缩醛-H),5.02(d,C-16H)。
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(2-(3-氨基苄基)噻唑-5-基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-56)的合成
Figure BDA0004033983910003582
程序：
向(INX-SM-56-1，异构体-2)(0.040g,0.065mmol)在乙醇(2mL)中的搅拌溶液中添加NH4Cl(0.027g,0.52mmol)和Zn金属(0.034g,0.52mmol)。将反应混合物在80℃下加热2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物过滤，并且将滤液真空蒸发。将粗品通过反相制备型HPLC(0.05％氨-乙腈)进一步纯化，得到呈白色固体状的标题化合物(0.015g,39％)；LCMS:577.1(M+H)+。
INX-SM-56(S-异构体)：LCMS:577.2(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD，关键质子分配):δ:6.40(s,1H，缩醛-H),5.33(d,J＝6.0Hz,C-16H)
INX-SM-7和INX-SM-57的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910003591
(2-溴噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-7-1)的合成
Figure BDA0004033983910003592
程序：
向2-溴噻唑-5-甲酸(5.0g,24.0mmol)在t-BuOH(50mL)中的溶液中添加叠氮磷酸二苯酯(DPPA)(7.74mL,36.0mmol)和三乙胺(13.48ml,96.1mmol)并且在80℃下搅拌12h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物真空蒸发。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷：10:90)纯化，得到呈棕色固体状的标题化合物(2.3g,34.28％)。LCMS:278(M+H)+；1H NMR(DMSO-d6):10.98(s,1H),7.09(s,1H)1.46(s,9H)。
(2-乙烯基噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-7-2)的合成
Figure BDA0004033983910003601
程序：
在室温下向(2-溴噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-7-1)(1.5g,5.37mmol)在二噁烷(50mL)中的搅拌溶液中添加三丁基(乙烯基)锡(1.70g,5.37)并且用N2(g)脱气15min。将四三苯基膦钯(0)(0.310g,0.26mmol)添加到反应混合物中并且在100℃下搅拌反应混合物12h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物通过硅藻土过滤，并且将滤液真空蒸发。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷：20:80)纯化，得到标题化合物(0.9g,74.2％)。LCMS:227.0(M+H)+；1H NMR(DMSO-d6):10.72(s,1H),7.26(s,1H),6.76(dd,J＝11.2&17.6Hz,1H),5.82(d,J＝17.6Hz,1H),5.42(d,J＝11.2Hz,1H),1.46(s,9H)。
(2-甲酰基噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-7-3)的合成
Figure BDA0004033983910003602
程序：
向(2-乙烯基噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-7-2)(3.8g,16.8mmol)在二噁烷(50mL)中的溶液中添加K2OsO4.2H2O(0.179g,0.48mmol)在水(2ml)中的溶液。将NaIO4(18.15g,85.2mmol)溶解在水(10ml)中并且添加到反应混合物中，在室温下搅拌3h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤，并且将滤液真空蒸发。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯:己烷：15:85)纯化，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(2.5g,65.22％)。LCMS:229.0(M+H)+。
(2-((2-甲苯磺酰基亚肼基)甲基)噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-7-4)的合成
Figure BDA0004033983910003611
程序：
向(2-甲酰基噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-7-3)(2.5g,10.9mmol)在二噁烷(50mL)中的溶液中添加对甲苯磺酰肼(2.23g,12.0mmol)并且在90℃下搅拌反应混合物5h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物真空蒸发。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯:己烷：25:75)纯化，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(2.8g,64.48％)。LCMS:397.0(M+H)+。
(2-(4-甲酰基苄基)噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-7-5)的合成
Figure BDA0004033983910003612
程序：
向(2-((2-甲苯磺酰基亚肼基)甲基)噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-7-4)(2.8g,7.06mmol)在二噁烷(50mL)中的搅拌溶液中添加(4-甲酰基苯基)硼酸(1.16g,7.76mmol)和K2CO3(1.94g,14.12mmol)并且在110℃下搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷：20:80)纯化，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.4g,17.79％)。LCMS:319.0(M+H)+。
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((5-氨基噻唑-2-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮
和
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((5-氨基噻唑-2-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮
(INX-SM-7和INX-SM-57)的合成
Figure BDA0004033983910003621
程序：
向(2-(4-甲酰基苄基)噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-7-5)(0.1g,0.31mmol)和(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.118g,0.31mmol)在DCM(50mL)中的搅拌溶液中添加三氟甲磺酸(0.15g,1.03mmol)在乙腈(6.2ml)中的溶液并且在室温下搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入饱和NaOH溶液中并且用MDC萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到呈异构体混合物形式的标题化合物(0.060g，粗品)。
此外，将非对映异构体通过制备型HPLC(柱：Xbridge prep，C18，OBD19*250mm，5微米，流动相：A＝含0.05％氨的水，B＝ACN(67:33)，A:B＝67:33)分离，得到异构体-1和异构体-2。将这些异构体洗脱，保留时间为17.70min(异构体-1)和20.87min(异构体-2)。
INX-SM-7(异构体-1，R-异构体)：(产率：0.010g，3％)。LCMS:577.4(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD，关键质子分配):δ:5.47(s,1H，缩醛-H),5.06(d,J＝5.2Hz,1H,C16H)
INX-SM-57(异构体-2，S异构体)：(产率：0.003g，0.6％)。LCMS577.4(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD，关键质子分配):δ:6.03(s,1H，缩醛-H),5.41(d,J＝5.2Hz,1H,C16H)
INX-SM-13和INX-SM-6 3的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910003631
(6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮
(INX-SM-13)
和
(6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-6 3)的合成
程序：
向(3-(4-甲酰基苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-3-5)(0.180g,0.597mmol)和(8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-9-氟-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊并[a]菲-3-酮(去炎松)(0.259g,0.656mmol)在DCM(2mL)中的溶液中添加对甲苯磺酸(0.908g,4.77mmol)并且在室温下再搅拌16h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入饱和NaHCO3溶液中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到呈异构体混合物形式的粗产物化合物。
此外，将粗产物纯化并且将异构体通过反相制备型HPLC(柱：YMC-Actus TriartPrep C18-S，250X 20mm S-10μm，12nm，流动相：A＝含0.05％氨的水，B＝ACN:MeOH(50:50)分离。将这些异构体洗脱，保留时间为14min(异构体-1)和19.5min(异构体-2)。
INX-SM-13(异构体-1)：(产率：0.038g，11.08％)。LCMS:578.20(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD，关键质子分配):δ:5.47(s,1H，缩醛-H),5.05(d,J＝5.2Hz,1H,C16H)
INX-SM-6 3(异构体-2)：(产率：0.005g，1.45％)。LCMS578.30(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD，关键质子分配):δ:6.13(s,1H，缩醛-H),5.42(d,J＝6.8Hz,1H,C16H)
实验程序INX-SM-24和INX-SM-74
反应方案
Figure BDA0004033983910003651
(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-24)
和
(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-74)的合成
程序：
向(3-(4-甲酰基苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-3-5)(0.500g,1.66mmol)和(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a,10,10-四甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(醋酸氟轻松)(0.716g,1.65mmol)在DCM(10mL)中的溶液中添加对甲苯磺酸(2.5g,13.26mmol)并且在室温下再搅拌16h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入饱和NaHCO3溶液中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到呈异构体混合物形式的粗产物。
此外，将粗产物纯化并且将异构体通过反相制备型HPLC(柱：Unisil 10-120C18Ultra，250x 21.2mm x 10μm，流动相：A＝含0.05％氨的水，B＝乙腈)分离，得到异构体-1和异构体-2。将这些异构体洗脱，保留时间为13.5min。
(异构体-1)和19.5min(异构体-2)。
INX-SM-24(R-异构体)：(产率0.100g，10.11％)。LCMS:596.20(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD，关键质子分配):δ:5.48(s,1H，缩醛-H),5.06(d,J＝4.4Hz,1H,C16H)
INX-SM-74(S-异构体)：(产率0.020g，2.02％)。LCMS:596.20(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD，关键质子分配):δ:6.17(s,1H，缩醛-H),5.43(d,J＝7.2Hz,1H,C16H)
INX-SM-9的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910003661
4-((叔丁氧基羰基)氨基)立方烷-1-甲酸甲酯(INX-SM-9-1)的合成
Figure BDA0004033983910003671
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入4-甲氧基羰基立方烷甲酸(2g,9.69mmol)和叔丁醇(60mL)。在室温下向此溶液中添加叠氮磷酸二苯酯(DPPA)(3.1mL,14.54mmol)和三乙胺(10.8mL,77.59mmol)并且在室温下搅拌30min。将反应混合物在80℃下加热1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷：15:85)纯化，得到呈白色固体状的标题化合物(0.90g,33.46％)。1H NMR(CDCl3)δ:4.1(bs,6H),3.71(s,3H),1.46(s,9H)。
(4-(羟甲基)立方烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-9-2)的合成
Figure BDA0004033983910003672
程序：
在氮气下向100mL三颈圆底烧瓶中装入4-((叔丁氧基羰基)氨基)立方烷-1-甲酸甲酯(INX-SM-9-1)(0.9g,3.24mmol)和THF(40mL)。在-78℃下向此溶液中添加含1M氢化铝锂的THF(3.2mL,3.24mmol)并且再搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用1NNaOH溶液淬灭并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到粗产物(0.8g,98.88％)。1H NMR(DMSO-d6)δ:7.58(bs,1H),4.42(t,1H),3.80(bs,3H),3.57(bs,3H)3.48(d,2H,J＝5.2),1.37(s,9H)。
(4-甲酰基立方烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-9-3)的合成
Figure BDA0004033983910003681
程序：
在氮气下向100mL三颈圆底烧瓶中装入(4-(羟甲基)立方烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-9-2)(0.9g,3.60mmol)和DCM(25mL)。在0℃下向此溶液中添加戴斯-马丁高碘烷(DMP)(3.06g,7.21mmol)并且搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物通过硅藻土过滤并且用乙醚洗涤。将合并的滤液真空蒸发，得到呈白色固体状的标题化合物(1.0g，粗品，定量)。将粗品立即用于下一步骤。
(4-((2-甲苯磺酰基亚肼基)甲基)立方烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-9-4)的合成
Figure BDA0004033983910003682
程序：
在氮气下向50mL单颈圆底烧瓶中装入(4-甲酰基立方烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-9-3)(1.0g,4.04mmol)和EtOH(30mL)。向此溶液中添加对甲苯磺酰肼(1.1g,6.06mmol)与催化量的AcOH，并且在室温下搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中。过滤固体并且将产物真空干燥。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯:己烷，1:4)纯化，得到呈白色固体状的标题化合物(0.8g,47.61％)。LCMS:416.3(M+H)+；1H NMR(DMSO-d6)δ:11.07(s,1H),7.67(d,J＝8.4Hz,2H),7.40-7.38(m,3H),3.85-3.81(m,6H),2.38(s,3H),1.36(s,9H)。
(4-(4-甲酰基苄基)立方烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-9-5)的合成
Figure BDA0004033983910003691
程序：
在氮气下向35mL小瓶中装入(4-((2-甲苯磺酰基亚肼基)甲基)立方烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-9-4)(0.50g,1.20mmol)和二噁烷(10mL)。将反应混合物用N2吹扫10min。在室温下向此溶液中添加(4-甲酰基苯基)硼酸(0.36g,2.40mmol)和K2CO3(0.33g,2.41mmol)并且在110℃下搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷，15:85)纯化，得到呈白色固体状的标题化合物(0.040g,9.85％)。1H NMR(DMSO-d6)δ:9.96(s,1H),7.83(d,J＝8Hz,2H),7.59(bs,1H),7.40(d,J＝7.6Hz,2H),3.76(bs,3H),3.58(bs,3H),2.96(s,2H),1.35(s,9H)。
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-氨基立方烷-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-9)的合成
Figure BDA0004033983910003701
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入((2r,3R,4s,5S)-4-(4-甲酰基苄基)立方烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-9-5)(0.035g,0.10mmol)以及(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.038g,0.10mmol)、MgSO4(0.062g,0.51mmol)和DCM(10mL)。向此溶液中添加HClO4(0.157g,1.55mmol)并且在室温下搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用饱和NaHCO3溶液淬灭并且真空浓缩。将粗品与冷水一起研磨，并且将沉淀过滤并真空干燥。将粗品通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE Prep C18 OBD，19x 250mm，5μm，流动相：A＝含0.1％ FA的水，B＝ACN:MeOH:IPA(65:25:10)，A:B，67:33)纯化；保留时间为15.14min，得到呈白色固体状的R-异构体(0.010g,16.18％)；LCMS:597.4(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD，关键质子分配):δ:5.47(s,1H，缩醛-H),5.06(d,J＝4.8Hz,1H,C16H)。
INX-SM-32的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910003711
(6-(羟甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-32-1)的合成
Figure BDA0004033983910003712
程序：
在氮气下向50mL单颈圆底烧瓶中装入6-((叔丁氧基羰基)氨基)螺[3.3]庚-2-甲酸甲酯(2.0g,7.43mmol)和THF:MeOH(15:5mL)。在0℃下向此溶液中分批添加NaBH4(1.4g,37.17mmol)并且在室温下再搅拌4h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用水稀释并且用1N HCl调整至中性pH。将产物用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到粗产物(2.0g，定量)。LCMS:186.2(M+H-56),1H NMR(CDCl3)δ:4.63(bs,1H),3.97(bs,1H),3.54(d,J＝6.8Hz,2H),2.50-2.25(m,3H),2.20-1.95(m,2H),1.90-1.40(m,5H),1.46(s,9H)。
(6-甲酰基螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-32-2)的合成
Figure BDA0004033983910003721
程序：
在氮气下向50mL单颈圆底烧瓶中装入(6-(羟甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-32-1)(2.0g,8.30mmol)和DCM(20mL)。在0℃下向此溶液中添加戴斯-马丁高碘烷(DMP)(3.51g,8.30mmol)并且搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物通过硅藻土过滤并且用乙醚洗涤。将合并的有机层真空蒸发。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷，40:60)纯化，得到呈黄色固体状的标题化合物(1.7g,85.72％)。LCMS:184.2(M+H-56)。
(6-((2-甲苯磺酰基亚肼基)甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯
(INX-SM-32-3)的合成
Figure BDA0004033983910003722
程序：
在氮气下向50mL单颈圆底烧瓶中装入(6-甲酰基螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-32-2)(1.5g,6.27mmol)和EtOH(15mL)。向此溶液中添加对甲苯磺酰肼(1.16g,6.27mmol)和催化量的AcOH(0.2mL)并且在室温下搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中。将固体过滤并且真空干燥，得到呈白色固体状的标题化合物(2.2g,86.13％)。LCMS:425.5(M+18)。
(6-(4-甲酰基苄基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-32-4)的合成
Figure BDA0004033983910003731
程序：
在氮气下向35mL小瓶中装入(6-((2-甲苯磺酰基亚肼基)甲基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-32-3)(1.0g,2.45mmol)和二噁烷(10mL)。在室温下向此溶液中添加(4-甲酰基苯基)硼酸(0.36g,2.45mmol)和K2CO3(0.51g,3.68mmol)并且在100℃下再搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷，30:70)纯化，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.16g,19.79％)。LCMS:274.3(M+H-56)。
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-32)
Figure BDA0004033983910003732
程序：
向35mL小瓶中装入(6-(4-甲酰基苄基)螺[3.3]庚-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-32-4)(0.16g,0.48mmol)、(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.13g,0.34mmol)、MgSO4(0.29g,2.43mmol)和DCM(4mL)。向此溶液中添加HClO4(0.40g,2.43mmol)并且在室温下再搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用饱和NaHCO3溶液淬灭并且真空浓缩。将粗品与冷水一起研磨，并且将沉淀的固体过滤并真空干燥。
将粗品通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE Prep C18 OBD，19x 250mm，5μm，流动相：A＝含0.1％ FA的水，B＝乙腈，A:B，80:20)纯化，保留时间为18.54min，得到呈白色固体状的R-异构体(0.045g,15.76％)；LCMS:588.4(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD，关键质子分配):δ:5.45(s,1H，缩醛-H),5.05(d,J＝4.8Hz,1H,C16H)。
INX-SM-31的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910003741
7-甲酰基-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛-2-甲酸叔丁酯(INX-SM-31-1)的合成
Figure BDA0004033983910003751
程序：
在氮气下向100mL三颈圆底烧瓶中装入7-(羟甲基)-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛-2-甲酸叔丁酯(1.0g,4.11mmol)和DCM(20mL)。在室温下向此溶液中添加戴斯-马丁高碘烷(DMP)(3.40,8.22mmol)并且搅拌30min。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用饱和NaHCO3溶液淬灭并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到呈黏性固体状的标题化合物(0.8g,78.71％)。1H NMR(DMSO-d6)δ:9.59(s,1H),4.08-4.04(m,1H),3.88-3.70(m,5H),3.21-3.19(m,1H),2.37-2.21(m,2H),1.36(s,9H)。
7-((2-甲苯磺酰基亚肼基)甲基)-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛-2-甲酸叔丁酯(INX-SM-31-2)的合成
Figure BDA0004033983910003752
程序：
在氮气下向50mL单颈圆底烧瓶中装入7-甲酰基-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛-2-甲酸叔丁酯(INX-SM-31-1)(0.8g,4.04mmol)和EtOH(30mL)。向此溶液中添加对甲苯磺酰肼(0.92g,4.97mmol)和催化量的AcOH并且在室温下搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且将固体过滤并真空干燥。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷，20:80)纯化，得到呈白色固体状的标题化合物(0.7g,51.56％)。LCMS:410.8(M+H)+。
7-(4-甲酰基苄基)-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛-2-甲酸叔丁酯(INX-SM-31-3)的合成
Figure BDA0004033983910003761
程序：
在氮气下向35mL小瓶中装入7-((2-甲苯磺酰基亚肼基)甲基)-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛-2-甲酸叔丁酯((INX-SM-31-2)(0.72g,1.76mmol)和二噁烷(10mL)。在室温下向此溶液中添加(4-甲酰基苯基)硼酸(0.26g,1.76mmol)和K2CO3(0.48g,3.52mmol)并且在110℃下再搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷，15:85)纯化，得到呈白色固体状的标题化合物(0.30g,52.96％)。LCMS:332.8(M+H)+。
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛-7-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-31)的合成
Figure BDA0004033983910003762
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入7-(4-甲酰基苄基)-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛-2-甲酸叔丁酯(INX-SM-31-3)(0.30g,0.90mmol)、(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.34g,0.90mmol)、MgSO4(0.54g,4.52mmol)和DCM(5mL)。向此溶液中添加HClO4(0.45g,4.52mmol)并且在室温下再搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。
合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过制备型HPLC(柱：SUNFIREPrep C18 OBD，19x 250mm，5μm，流动相：A＝含0.1％ FA的水，B＝ACN:MEOH:IPA(65:25:10)纯化；保留时间：16.40min，得到呈白色固体状的R-异构体(0.022g,4.50％)；LCMS:591.3(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD，关键质子分配):δ:5.44(s,1H，缩醛-H),5.06(d,J＝4.8Hz,1H,C16H)。
INX-SM-33的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910003771
(3-甲酰基氧杂环丁烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-33-1)的合成
Figure BDA0004033983910003781
程序：
在氮气下向100mL三颈圆底烧瓶中装入(3-(羟甲基)氧杂环丁烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(2.0g,9.84mmol)和DCM(20mL)。在0℃下向此溶液中添加戴斯-马丁高碘烷(DMP)(4.17g,9.84mmol)并且搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物通过硅藻土过滤并且用乙醚洗涤。将合并的有机层真空蒸发，得到粗产物。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷：45:55)纯化，得到呈黄色固体状的标题化合物(2.0g，定量)。1H NMR(CDCl3)δ:9.85(s,1H),5.50-5.42(m,1H),5.10-4.940(m,1H),4.86-4.84(d,2H),1.47(s,9H)。
(3-((2-甲苯磺酰基亚肼基)甲基)氧杂环丁烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-33-2)的合成
Figure BDA0004033983910003782
程序：
在氮气下向50mL单颈圆底烧瓶中装入(3-甲酰基氧杂环丁烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-33-1)(1.7g,8.44mmol)和EtOH(17mL)。向此溶液中添加对甲苯磺酰肼(1.57g,8.44mmol)和催化剂AcOH并且在室温下搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到粗产物。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷，50:50)纯化，得到呈白色固体状的标题化合物(2.5g,80.10％)。LCMS:387.4(M+18)。
(3-(4-甲酰基苄基)氧杂环丁烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-33-3)的合成
Figure BDA0004033983910003791
程序：
在氮气下向50mL小瓶中装入(3-((2-甲苯磺酰基亚肼基)甲基)氧杂环丁烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-33-2)(2.5g,6.77mmol)和二噁烷(25mL)。在室温下向此溶液中添加(4-甲酰基苯基)硼酸(1.0g,6.77mmol)和K2CO3(1.4g,10.16mmol)并且在100℃下再搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到粗产物。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷，30:70)纯化，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.25g,12％)。LCMS:292.2(M+H)+。
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基氧杂环丁烷-3-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-33)
Figure BDA0004033983910003801
程序：
向35mL小瓶中装入(3-(4-甲酰基苄基)氧杂环丁烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-33-1)(0.080g,0.27mmol)、(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.073g,0.19mmol)、MgSO4(0.16g,1.37mmol)和DCM(2mL)。向此溶液中添加HClO4(0.23g,1.37mmol)并且在室温下再搅拌4h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用饱和NaHCO3溶液淬灭并且真空浓缩。将粗品与冷水一起研磨，并且将沉淀的固体过滤并真空干燥。将粗品通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE Prep C18 OBD，19x 250mm，5μm，流动相：A＝含0.1％ FA的水，B＝乙腈；A:B，80:20)纯化；保留时间：8.70min，得到呈白色固体状的R-异构体(0.004g,2.65％)LCMS:551.3(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD，关键质子分配):δ:5.48(s,1H，缩醛-H),5.07(d,J＝5.4Hz,1H,C16H)。
INX-SM-10的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910003811
4-异氰酸基双环[2.2.2]辛-1-甲酸甲酯(INX-SM-10-1)的合成
Figure BDA0004033983910003812
程序：
向50mL单颈圆底烧瓶中装入4-(甲氧基羰基)双环[2.2.2]辛-1-甲酸(1g,4.47mmol)和甲苯(20mL)。向此溶液中添加叠氮磷酸二苯酯(DPPA)(1.29g,4.47mmol)和三乙胺(0.47g,4.47mmol)。将反应混合物在110℃下加热2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物在室温下冷却，用乙酸乙酯稀释并且用10％柠檬酸溶液洗涤，然后用饱和碳酸氢盐溶液洗涤。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷，10:90)纯化，得到呈无色液体状的标题化合物(0.45g,45.46％)。1H NMR(CDCl3)δ:3.62(s,3H),1.90-1.87(m,12H)。
4-氨基双环[2.2.2]辛-1-甲酸(INX-SM-10-2)的合成
Figure BDA0004033983910003813
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入4-异氰酸基双环[2.2.2]辛-1-甲酸甲酯(INX-SM-10-1)(0.45g,2.15mmol)和6N HCl(10mL)。将反应混合物在室温下再搅拌12h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物真空蒸发，得到粗产物。将粗品与正戊烯和乙醚一起研磨，得到白色固体(0.45g，定量)。1H NMR(DMSO-d6)δ:12.21(bs,1H),8.20(s,3H),1.83-1.69(m,12H)。
4-氨基双环[2.2.2]辛-1-甲酸乙酯(INX-SM-10-3)的合成
Figure BDA0004033983910003821
程序：
在氮气下向25mL三颈圆底烧瓶中装入乙醇(5mL)。在0℃下向此溶液中添加亚硫酰氯(0.62g,5.32mmol)并且添加4-氨基双环[2.2.2]辛-1-甲酸(INX-SM-10-2)(0.45g,2.65mmol)并回流3h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物真空蒸发，得到粗产物。将粗品通过与正戊烯和乙醚一起研磨纯化，得到白色固体(0.55g，定量)。LCMS:198.20；1HNMR(DMSO-d6)δ:8.13(s,1H),7.68(s,2H),4.04-4.99(q,J＝6.8Hz,2H),1.82-1.71(m,12H)1.16-1.12(t,3H,J＝8Hz)。
(4-氨基双环[2.2.2]辛-1-基)甲醇(INX-SM-10-4)的合成
Figure BDA0004033983910003822
程序：
在氮气下向25mL三颈圆底烧瓶中装入4-氨基双环[2.2.2]辛-1-甲酸乙酯(INX-SM-10-3)(0.55g,2.27mmol)和THF(5.5mL)。在-20℃下向此溶液中添加LiAlH4(1M在THF中)(6.9mL,6.9mmol)并且在室温下搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用10％NaOH溶液淬灭并且通过硅藻土床过滤。滤液经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品与正戊烯和乙醚一起研磨，得到呈白色固体状的标题化合物(0.30g,69.32％)。LCMS:156.1(M+H)+；1HNMR(DMSO-d6)δ:3.05(s,2H),1.48-1.37(m,12H)。
(4-(羟甲基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-10-5)的合成
Figure BDA0004033983910003831
程序：
在氮气下向25mL单颈圆底烧瓶中装入(4-氨基双环[2.2.2]辛-1-基)甲醇(INX-SM-10-4)(0.30g,1.93mmol)和DCM(15mL)。在室温下向此溶液中添加Boc-酸酐(0.63g,2.90mmol)并且再搅拌16h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用饱和碳酸氢盐溶液洗涤，经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品与二异丙醚一起研磨，得到白色固体(0.45g,91.19％)。LCMS:200.2(M+H-56)；1H NMR(CDCl3)δ:4.34(bs,1H),3.27(s,2H),1.86＝1.82(m,6H),1.59-1.53(m,6H),1.43(s,9H)。
(4-甲酰基双环[2.2.2]辛-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-10-6)的合成
Figure BDA0004033983910003841
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入(4-(羟甲基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-10-5)(0.45g,1.76mmol)和THF(10mL)。在室温下添加戴斯-马丁高碘烷(DMP)(1.12g,2.64mmol)并且在室温下搅拌1.5h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用NaHCO3水溶液淬灭并且用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到呈白色固体状的标题化合物(0.45g，粗品)。LCMS:198.3(M+H-56)。
(4-((2-甲苯磺酰基亚肼基)甲基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基甲酸叔丁酯的合成
(INX-SM-10-7)
Figure BDA0004033983910003842
程序：
向10mL玻璃小瓶中装入(4-甲酰基双环[2.2.2]辛-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-10-6)(0.45g,1.77mmol)和乙醇(5mL)。在室温下向此溶液中添加对甲苯磺酰肼(0.39g,2.13mmol)和乙酸(0.05g,0.88mmol)并且在室温下搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中。将白色固体过滤并且真空干燥，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.38g 51.42％)。LCMS:422.3(M+H)+；1H NMR(DMSO-d6)δ:10.72(s,1H),7.65(d,J＝8.4Hz,2H),7.39(d,J＝8.0Hz,2H)7.02(s,1H),6.37(bs,1H),2.37(s,3H),1.71-1.69(m,6H),1.46-1.42(m,6H),1.34(s,9H)。
(4-(4-甲酰基苄基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-10-8)的合成
Figure BDA0004033983910003851
程序：
向50mL单颈圆底烧瓶中装入(4-((2-甲苯磺酰基亚肼基)甲基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-10-7)(1.0g,2.37mmol)和二噁烷(20mL)。在室温下添加(4-甲酰基苯基)硼酸(0.53g,3.55mmol)和K2CO3(0.49g,3.55mmol)并且在110℃下再搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷：50:50)纯化，得到呈无色液体状的标题化合物(0.06g,7.36％)。LCMS:288.8(M+H-56)。
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-氨基双环[2.2.2]辛-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-10)的合成
Figure BDA0004033983910003852
Figure BDA0004033983910003861
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入(4-(4-甲酰基苄基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-10-8)(0.05g,0.145mmol)以及(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.054g,0.14mmol)、MgSO4(0.080g,0.73mmol)和DCM(5mL)。向此溶液中添加HClO4(0.072g,0.73mmol)并且在室温下再搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用饱和碳酸氢盐溶液淬灭并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE PrepC18 OBD，19x 250mm，5μm，流动相：A＝含0.1％ FA的水，B＝ACN:MEOH:IPA(65:25:10)；A:B，80:20)纯化；保留时间为18.76min，得到呈白色固体状的R-异构体(0.015g,14.27％)；LCMS603.52(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD关键质子分配)δ:5.46(s,1H，缩醛-H),5.06(d,J＝4.80Hz,1H,C16H)。
INX-SM-35的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910003862
(E)-(3,3-二氟-1-((2-甲苯磺酰基亚肼基)甲基)环丁基)氨基甲酸叔丁酯的合成
(INX-SM-35-1)
Figure BDA0004033983910003871
程序：
在氮气下向30mL玻璃小瓶中装入(3,3-二氟-1-甲酰基环丁基)氨基甲酸叔丁酯(0.50g,2.12mmol)和二噁烷(5mL)。向此溶液中添加对甲苯磺酰肼(0.4g,2.12mmol)并且在90℃下搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到粗产物。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷，30:70)纯化，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(0.55g,64.23％)。LCMS:348.1(M+H-56)。
(3,3-二氟-1-(4-甲酰基苄基)环丁基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-35-2)的合成
Figure BDA0004033983910003872
程序：
在氮气下向30mL小瓶中装入(3,3-二氟-1-((2-甲苯磺酰基亚肼基)甲基)环丁基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-35-1)(0.50g,1.72mmol)和二噁烷(5mL)。在室温下向此溶液中添加(4-甲酰基苯基)硼酸(0.18g,1.72mmol)和K2CO3(0.25g,1.85mmol)并且在110℃下再搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷，10:90)纯化，得到呈白色固体状的标题化合物(0.11g,24.80％)。LCMS:326.1(M+H)+。
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((1-氨基-3,3-二氟环丁基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-35)的合成
Figure BDA0004033983910003881
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入(3,3-二氟-1-(4-甲酰基苄基)环丁基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-35-3)(0.11g,0.33mmol)、(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊并[a]菲-3-酮(16-α-羟基泼尼松龙)(0.1g,0.27mmol)、MgSO4(0.2g,1.69mmol)和DCM(3mL)。向此溶液中添加HClO4(0.16g,1.69mmol)并且在室温下再搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart Prep C18-S，250X 20mm S-5μm，12nm，流动相：A＝含0.05％氨的水，B＝乙腈；A:B，58:42)纯化，保留时间为18.36min，得到呈白色固体状的R-异构体(Fr-1)(0.030g,15.58％)；LCMS:585.4(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD，关键质子分配):δ:5.48(s,1H，缩醛-H),5.07(d,J＝5.2Hz,1H,C16H)。
INX-A1的合成
Figure BDA0004033983910003891
(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3,3-二氟-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)环丁基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A1-1)的合成
Figure BDA0004033983910003892
程序：
在室温下向10mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.20g,0.41mmol)、HATU(0.24g,0.64mmol)、DMF(2mL)和DIPEA(0.11g,0.82mmol)。向此溶液中添加(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3,3-二氟-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)环丁基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-SM-35)(0.25g,0.41mmol)并且在室温下搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到粗产物。将粗品通过反相柱色谱(乙腈/水：50:50)纯化，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.24g,52.03％)。
(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3,3-二氟-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)环丁基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A1-2)的合成
Figure BDA0004033983910003901
程序：A
向10mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3,3-二氟-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)环丁基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A1-1)(0.2g,0.12mmol)和THF(3mL)。在室温下向此溶液中添加二乙胺(0.3g,0.24mmol)并且搅拌3h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物真空蒸发并且与乙醚和戊烷一起研磨，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.13g,68.74％)LCMS:827.6(M+1)。
(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3,3-二氟-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)环丁基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A1-3)的合成
Figure BDA0004033983910003911
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3,3-二氟-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)环丁基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A1-2)(0.1g,0.12mmol)和DCM(4mL)。在室温下向此溶液中逐滴添加Na2CO3(0.048g,0.24mmol)的水溶液(1mL)和溴乙酰溴(0.005g,0.48mmol)并且搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用水淬灭并且用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过反相柱色谱(乙腈/水：50:50)纯化，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.10g,67.10％)。LCMS:946.8,848.9(M&M+2)。
(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3,3-二氟-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)环丁基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A1-1)的合成
Figure BDA0004033983910003921
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入含(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3,3-二氟-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)环丁基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-A1-3)(0.10g,0.01mmol)的DCM(2mL)。在室温下向此溶液中添加TFA(0.24g,2.10mmol)并且在室温下搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物真空蒸发，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.090g,95.67％)。LCMS:890.90,893.0(M&M+2)。
INX-V的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910003931
(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯
(INX-V-1)的合成
Figure BDA0004033983910003932
程序：
在室温下向10mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.25g,0.41mmol)以及HATU(0.20g,0.41mmol)、DMF(2mL)和DIPEA(0.10g,0.82mmol)。向此溶液中添加(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-32)(0.25g,0.41mmol)并且在室温下搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过反相柱色谱(乙腈/水：50:50)纯化，得到呈淡黄色固体状的标题化合物。将其立即用于下一步骤。
(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-V-2)的合成
Figure BDA0004033983910003941
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-V-1)(0.2g,0.19mmol)和THF(2mL)。在室温下向此溶液中添加二乙胺(0.14g,1.9mmol)并且在室温下搅拌3h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物真空蒸发并且与乙醚一起研磨，得到黄色固体(0.15g,90.12％)。LCMS:831.9(M+H)+。
(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-V-3)的合成
Figure BDA0004033983910003951
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入含(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-V-2)(0.15g,0.28mmol)的DCM(3mL)。在室温下向此溶液中添加Na2CO3(0.11g,0.57mmol)的水溶液(1mL)，随后添加溴乙酰溴(0.037g,0.18mmol)并且搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用水淬灭并且用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过反相柱色谱(乙腈/水：50:50)纯化，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.070g,40％)。LCMS:950.9,952.9(M&M+2)。
(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-V)的合成
Figure BDA0004033983910003961
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)螺[3.3]庚-2-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-V-3)(0.070g,0.07mmol)和DCM(2mL)。向此溶液中添加TFA(0.055g,0.71mmol)并且在室温下搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物真空蒸发，得到呈浅黄色固体状的粗产物。将粗品通过制备型HPLC(柱：Xbridge Prep，C18，OBD 19x 250mm，5μm；流动相：A＝含0.1％ FA的水，B＝乙腈；A:B，58:42)纯化，得到R-异构体，将其以保留时间16.92min洗脱，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.004g,11.83％)。LCMS:895.1&897.1(M&M+2)；1H NMR(400MHz,MeOD，关键质子分配):δ:5.44(s,1H，缩醛-H),5.05(d,J＝4.8Hz,1H,C16H)。
INX-W的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910003971
N2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基)-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸苄酯(INX-W-1)的合成
Figure BDA0004033983910003972
程序：
在室温下向250mL单颈圆底烧瓶中装入(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酸(8.8g,29.62mmol)、HATU(16.9g,44.67mmol)、DMF(100mL)和DIPEA(16g,89.28mmol)。向此溶液中添加N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸苄酯(10g,29.76mmol)并且在室温下搅拌4h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过柱色谱(乙酸乙酯:己烷，30:70)纯化，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(15g,81.96％)。LCMS:616.6(M+H)+。
N2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基)-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸(INX-W-2)的合成
Figure BDA0004033983910003981
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入N2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基)-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸苄酯(INX-W-1)(5g,8.12mmol)和MeOH(50mL)。在室温下向此溶液中添加10％ Pd/C(2.5g)并且氢气吹扫2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物通过硅藻土过滤，并且将滤液真空蒸发。将粗品通过反相柱色谱(乙腈:水，50:50)纯化，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.5g,23.43％)。LCMS:426.2(M+1-Boc)。
(2-(((S)-6-((叔丁氧基羰基)氨基)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(INX-W-3)的合成
Figure BDA0004033983910003982
程序：
在室温下向50mL单颈圆底烧瓶中装入N2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基)-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸(INX-W-2)(0.5g,0.95mmol)、HATU(0.54g,1.42mmol)、DMF(25mL)和DIPEA(0.5mL,2.85mmol)。向此溶液中添加(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-3)(0.53g,0.95mmol)并且在室温下搅拌4h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到粗产物。将粗品通过反相柱色谱(乙腈:水，70:30)纯化，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.45g,44.32％)。LCMS:1067.7(M+H)+。
((S)-5-(2-氨基乙酰胺基)-6-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-W-4)的合成
Figure BDA0004033983910003991
程序：
向50mL单颈圆底烧瓶中装入(2-(((S)-6-((叔丁氧基羰基)氨基)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(INX-W-3)(0.45g,0.42mmol)和THF(20mL)。向此溶液中添加二乙胺(0.30g,4.21mmol)并且在室温下搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物真空浓缩。将粗品通过与乙醚-己烷一起研磨纯化并且真空干燥，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.35g,98.23％)。LCMS:845.6(M+H)+。
((S)-5-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-6-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-W-5)的合成
Figure BDA0004033983910004001
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入((S)-5-(2-氨基乙酰胺基)-6-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-W-4)(0.35g,0.41mmol)和DCM(5mL)。在室温下向此溶液中添加含Na2CO3(0.070g,0.82mmol)的水(1mL)，随后添加溴乙酰溴(0.1g,0.49mmol)并且搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用水淬灭并且用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过反相柱色谱(乙腈/水，50:50)纯化，得到呈灰白色固体状的标题化合物(0.330g,82.48％)。LCMS:967.5(M+H)+。
(S)-6-氨基-2-(2-(2-溴乙酰氨基)乙酰氨基)-N-(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)己酰胺(INX-W)
Figure BDA0004033983910004011
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入((S)-5-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-6-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯(INX-W-5)(0.10g,0103mmol)和DCM(5mL)。向此溶液中添加TFA(0.059g,0.52mmol)并且在室温下搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物真空蒸发。将粗品通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE Prep C18 OBD，19x 250mm，5μm，流动相：A＝含0.1％ FA的水，B＝ACN:MeOH:IPA(65:25:10)；A:B，62:38)纯化；保留时间为19.06min，得到呈白色固体状的R-异构体(0.008g,8.93％)；1H NMR(400MHz,MeOD，关键质子分配):δ:5.47(s,1H，缩醛-H),5.07(d,J＝4.8Hz,1H,C16H)。
INX-R的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910004021
(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酸甲酯(INX-R-1)的合成
Figure BDA0004033983910004022
程序：
在氮气下向30mL玻璃小瓶中装入(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸(5.0g,26.45mmol)、DIPEA(1.36mL,79.36mmol)和DMF(50mL)。在0℃下向此溶液中添加HATU(15.07g,39.67mmol)，然后添加L-丙氨酸甲酯盐酸盐(3.69g,26.45mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30min。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用冰冷水淬灭并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品与己烷和DCM一起研磨，得到呈白色固体状的标题化合物(5.5g,56.20％)。LCMS 275.3(M+H)+。
(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酸(INX-R2)的合成
Figure BDA0004033983910004031
程序：
向100mL玻璃密封小瓶中装入(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酸酯(INX-R-1)(4.5g,16.42mmol)和THF-水(9:1)(55mL)。向此溶液中添加LiOH.H2O(20.69g,49.26mmol)并且在60℃下搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品与己烷和DCM一起研磨，得到呈白色固体状的标题化合物(4.0g,93.70％)。LCMS:261.20(M+H)+。
((S)-1-(((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-R-3)的合成
Figure BDA0004033983910004041
程序：
在氮气下向30mL玻璃小瓶中装入含(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酸(INX-R-2)(0.33g,1.26mmol)的DMF(5mL)和DIPEA(0.65mL,3.78mmol)。在0℃下向此溶液中添加HATU(0.96g,2.52mmol)，然后添加(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-3)(0.70g,1.26mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用冰冷水淬灭。将固体过滤并且真空干燥。将粗品通过硅胶柱色谱(甲醇/DCM：6:94)纯化，得到呈白色固体状的标题化合物(0.35g,34.42％)。LCMS:802.6(M+H)+。
(S)-2-氨基-N-((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)丙酰胺(INX-R-4)的合成
Figure BDA0004033983910004042
Figure BDA0004033983910004051
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入((S)-1-(((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-R-3)(0.35g,0.44mmol)和DCM(3mL)。向此溶液中添加含2M HCl的乙醚(3ml)并且在室温下再搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物真空蒸发并且与乙醚和正戊烷一起研磨，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.3g,97.92％)。LCMS:702.5(M+H)+。
(S)-2-(2-溴乙酰氨基)-N-((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)丙酰胺(INX-R)的合成
Figure BDA0004033983910004052
程序：
在氮气下向10mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-2-氨基-N-((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)丙酰胺(INX-R-4)(0.30g,0.43mmol)和DCM:水(8:2)(3.6mL)。向此溶液中添加Na2CO3(0.91g,0.855mmol)，然后添加溴乙酰溴(0.87g,0.43mmol)并且在室温下搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过制备型HPLC(柱：Xbridge Prep，C18，OBD 19x 250mm，5μm，流动相：A＝含0.05％ NH3的水，B＝乙腈；A:B，65:35)纯化，保留时间为24.10min，得到呈白色固体状的R-异构体(0.030g,8.53％)；LCMS:822.5,824.4(M&M+2)；1HNMR(400MHz,MeOD，关键质子分配):δ:5.46(s,1H，缩醛-H),5.05(d,J＝5.2Hz,1H,C16H)。
INX-X的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910004061
(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基-L-天冬氨酸甲基叔丁酯(INX-X-1)的合成
Figure BDA0004033983910004071
程序：
在氮气下向100mL螺旋盖玻璃小瓶中装入(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酸(5.0g,16.83mmol)、DIPEA(8.68mL,50.50mmol)和DMF(50mL)。在0℃下向此溶液中添加HATU(7.67g,20.19mmol)，然后添加L-天冬氨酸叔丁酯(3.79g,20.19mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用冰冷水淬灭并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品与己烷和DCM一起研磨，得到呈白色固体状的标题化合物(7.5g,95.41％)。LCMS 412.83(M-56)。
(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基-L-天冬酰胺(INX-X2)的合成
Figure BDA0004033983910004072
程序：
向250mL单颈圆底烧瓶中装入(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基-L-天冬氨酸甲基叔丁酯(INX-X-1)(2.0g,4.28mmol)和DCM(50mL)。向此溶液中添加TFA(40ml)并且在室温下搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物真空蒸发并且与乙醚和DCM一起研磨，得到呈白色固体状的标题化合物(1.5g,85.22％)。LCMS:412.8(M+H)+。
(2-(((S)-4-氨基-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-1,4-二氧代丁-2-基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(INX-X-3)的合成
Figure BDA0004033983910004081
程序：
在氮气下向30mL玻璃小瓶中装入(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基-L-天冬酰胺(INX-X-2)(0.4g,0.973mmol)、DMF(5mL)、HATU(0.96g,2.52mmol)和(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-3)(0.70g,1.26mmol)。向此溶液中添加DIPEA(0.50mL,2.91mmol)并且在室温下搅拌30min。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用冰冷水淬灭。将固体过滤并且真空干燥。将粗品与乙醚和正戊烷一起研磨，得到呈白色固体状的标题化合物(0.6g,64.72％)。LCMS:954.24(M+H)+。
(S)-2-(2-氨基乙酰胺基)-N1-(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)琥珀酰胺(INX-X-4)的合成
Figure BDA0004033983910004091
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入(2-(((S)-4-氨基-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-1,4-二氧代丁-2-基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(INX-X-3)(0.30g,0.314mmol)和THF(5mL)。向此溶液中添加DEA(0.48mL,4.72mmol)并且在室温下再搅拌4h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物真空蒸发并且与己烷一起研磨，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.20g,96.06％)。LCMS:731.0(M+H)+。
(S)-2-(2-(2-溴乙酰氨基)乙酰氨基)-N1-(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)琥珀酰胺(INX-X)的合成
Figure BDA0004033983910004092
程序：
在氮气下向25mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-2-(2-氨基乙酰胺基)-N1-(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)琥珀酰胺(INX-X-4)(0.20g,0.273mmol)和THF-水(8:2)(3.6mL)。向此反应混合物中添加Na2CO3(0.58g,0.55mmol)，然后添加溴乙酰溴(0.066g,0.33mmol)并且在室温下搅拌4h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart Prep C18-S，250X 20mm S-5μm，12nm，流动相：A＝含0.05％ NH3的水，B＝乙腈；A:B 62:38)纯化，保留时间为17.79min，得到呈白色固体状的R-异构体(0.030g,8.53％)；LCMS:852.7(M+H)+；1H NMR(400MHz,MeOD，关键质子分配):δ:5.46(s,1H，缩醛-H),5.06(d,J＝5.2Hz,1H,C16H)。
INX-Y的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910004101
(6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-Y-1)的合成
Figure BDA0004033983910004111
程序：
向100mL单颈圆底烧瓶中装入(8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-9-氟-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊并[a]菲-3-酮(去炎松)(1.0g,2.53mmol)和(3-(4-甲酰基苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-3-5)(0.76g,2.53mmol)和DCM(10mL)。向此溶液中添加MgSO4(1.51g,12.65mmol)并且在室温下搅拌5min。向反应混合物中添加HClO4(1.2g,12.65mmol)并且在室温下再搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过反相柱色谱(乙腈/水；60:40)纯化，得到呈浅黄色的标题化合物(0.5g,34.14％)。LCMS:579.4(M+H)+
(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-Y-2)的合成
Figure BDA0004033983910004121
程序：
在室温下向50mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.42g,0.87mmol)、HATU(0.49g,1.30mmol)、DMF(4mL)和DIPEA(0.22g,1.74mmol)。在室温下向此溶液中添加(6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-Y-1)(0.50g,0.97mmol)并且在室温下搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过反相柱色谱(乙腈/水，50:50)纯化，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(0.65g,71.42％)。
(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-Y-3)的合成
Figure BDA0004033983910004131
程序：
向50mL单颈圆底烧瓶中装入含(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-Y-2)(0.65g,0.62mmol)的THF(4mL)。在室温下向此溶液中添加二乙胺(0.40g,64.24mmol)并且在室温下搅拌3h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物真空蒸发并且与乙醚一起研磨，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.42g,84.82％)。LCMS:821.4(M+H)+。
(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-Y-4)的合成
Figure BDA0004033983910004132
Figure BDA0004033983910004141
程序：
向50mL单颈圆底烧瓶中装入含(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-Y-3)(0.42g,0.51mmol)的DCM(10mL)。在室温下向此溶液中添加溶解在水(1ml)中的Na2CO3(0.11g,1.02mmol)，然后添加溴乙酰溴(0.10g,0.51mmol)并且搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用水淬灭并且用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过反相柱色谱(乙腈:水，60:40)纯化，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.20g,41.45％)。LCMS:942.0(M+H)+。
(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-Y)的合成
Figure BDA0004033983910004142
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-Y-4)(0.20g,0.20mmol)和DCM(2mL)。向此溶液中添加TFA(0.11g,1.01mmol)并且在室温下搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物真空蒸发。将粗品通过制备型HPLC(柱：Xbridge Prep，C18，30x 250mm，5μm，流动相：A＝含0.1％甲酸的水，B＝ACN:MeOH，50:50；A:B，47:53)纯化；保留时间为18.83min，得到呈白色固体状的R-异构体(Fr-1)(0.040g,22.37％)。LCMS:885.8(M+H)+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6，关键质子分配):δ:5.48(s,1H，缩醛-H),5.06(d,J＝4.8Hz,1H,C16H)。
INX-S的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910004161
(6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-二氟-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊并[a]菲-3-酮(INX-S-1)的合成
Figure BDA0004033983910004162
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a,10,10-四甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(醋酸氟轻松)(1.0g)并且添加50％ HBF4水溶液(20ml)，然后在室温下再搅拌16h。如通过TLC表明反应完成之后，将固体过滤，用水洗涤并且真空干燥(1.0g，定量)。LCMS:413.3(M+H)+。
((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-S-2)的合成
Figure BDA0004033983910004171
程序：
向25mL单颈圆底烧瓶中装入6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-二氟-11,16,17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊并[a]菲-3-酮(INX-S-1)(1.0g,2.42mmol)和(3-(4-甲酰基苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(0.80g,2.66mmol)和DCM(10mL)。向此溶液中添加MgSO4(1.42g,12.14mmol)并且在室温下再搅拌5min。添加HClO4(1.2g,12.14mmol)并且在室温下再搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过反相柱色谱(乙腈/水，60:40)纯化，得到呈浅黄色的化合物(0.61g,42.28％)。LCMS:596.4(M+H)+。
(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-S-3)的合成
Figure BDA0004033983910004181
程序：
在室温下向50mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(INX-P-4)(0.45g,0.93mmol)、HATU(0.53g,1.40mmol)、DMF(4mL)和DIPEA(0.23g,1.86mmol)。在室温下向此溶液中添加((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-S2)(0.61g,1.02mmol)并且在室温下搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物倒入水中并且用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过反相柱色谱(乙腈/水，50:50)纯化，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(0.40g,56.19％)。LCMS:1061.5(M+H)+。
(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-S-4)的合成
Figure BDA0004033983910004191
程序：
向50mL单颈圆底烧瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-S3)(0.41g,0.39mmol)和THF(4mL)。在室温下向此溶液中添加二乙胺(0.28g,3.91mmol)并且搅拌3h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物真空蒸发，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.26g,82.24％)。LCMS:838.5(M+H)+。
(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯
(INX-S-5)的合成
Figure BDA0004033983910004201
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入含(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-S4)(0.22g,0.26mmol)的DCM(2mL)。在室温下向此溶液中添加含Na2CO3(0.10g,0.53mmol)的水(1mL)，随后添加溴乙酰溴(0.030g,0.28mmol)并且搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用水淬灭并且用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发。将粗品通过反相柱色谱(乙腈/水：60:40)纯化，得到呈浅黄色的标题化合物(0.1g,39.72％)。LCMS:960.4(M+H)+。
(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-S)的合成
Figure BDA0004033983910004211
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入含(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-S-5)(0.10g,0.10mmol)的DCM(2mL)。在室温下向此溶液中添加TFA(0.059g,0.52mmol)并且在室温下搅拌2h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物直接真空蒸发。将粗品通过制备型HPLC(柱：SUNFIRE Prep C18 OBD，19x 250mm，5μm，流动相：A＝含0.1％甲酸的水，B＝乙腈；A:B，65:35)纯化；保留时间为17.7min，得到呈白色固体状的R-异构体(0.011g,11.68％)。LCMS:902.3,904.3(M&M+2).1H NMR(400MHz,DMSO-d6，关键质子分配):δ:5.45(s,1H，缩醛-H),4.95(d,J＝4.8Hz,1H,C16H)。
INX-T的合成
Figure BDA0004033983910004221
(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-T-1)的合成
Figure BDA0004033983910004222
程序：
向10mL小瓶中装入(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-P-5)(0.20g,0.19mmol)和DMF(1mL)。在室温下向此溶液中添加1H-四唑(0.137g,1.950mmol)和(tBuO)2PNEt2(1.3g,4.68mmol)并且在室温下搅拌79h。如通过TLC表明反应完成之后，将过氧化氢(1.3g,4.68mmol)添加到溶液中。将粗品通过反相柱色谱(乙腈:水，80:20)纯化，得到呈浅黄色固体状的标题化合物(0.070g,29.47％)。将其立即用于下一步骤。
(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-T-2)的合成
Figure BDA0004033983910004231
程序：
向10mL玻璃小瓶中装入含(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-T-1)(0.070g,0.057mmol)的THF(1mL)。在室温下向此溶液中添加二乙胺(0.042g,0.57mmol)并且在室温下搅拌16h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物浓缩。将粗品通过与乙醚和己烷一起研磨纯化，得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.30g,52.44％)。将其立即用于下一步骤。
(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯
(INX-T-3)的合成
Figure BDA0004033983910004241
程序：
向10mL玻璃小瓶中装入含(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-T-2)(0.030g,0.030mmol)的DCM(1mL)。向此溶液中添加Na2CO3(0.006g,0.060mmol)的水溶液(0.1mL)和溴乙酰溴(0.006g,0.030mmol)，在室温下搅拌1h。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物用水淬灭并且用DCM萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并且真空蒸发，得到呈灰白色固体状的粗产物(0.040g，粗品)。
(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(磷酰氧基)乙酰基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-T)的合成
Figure BDA0004033983910004251
程序：
向10mL单颈圆底烧瓶中装入含(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX-T-3)(0.001g,0.0089mmol)的DCM(1mL)。在室温下向此溶液中添加TFA(0.005g,0.043mmol)和催化剂三异丙基硅烷并且搅拌20min。如通过TLC表明反应完成之后，将反应混合物真空蒸发，得到呈黄色固体状的标题化合物(0.006g,71％)。LCMS:946.2,948.2(M&M+2)。
INX-A的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910004252
INX-A-2的合成
Figure BDA0004033983910004261
程序：
向化合物INX-A-1(3.0g,7.64mmol,1.0eq)在二氯甲烷/乙腈(500mL/100mL)中的溶液中添加环酐(3.0g,30.58mmol,4.0eq)和DMAP(1.8g,15.29mmol,2.0eq)。将反应混合物在室温下搅拌2h并且将混合物在减压下浓缩。将残余物通过柱色谱在硅胶上纯化，用DCM/MeOH(10％至15％)+0.1％ AcOH洗脱，提供呈白色固体状的化合物INX-A-2(3.2g,85％)。薄层色谱：DCM/MeOH＝10:1。Rf(化合物1)＝0.45。Rf(化合物2)＝0.30。LC-MS:(M+H)+＝394.40
INX-A的合成
Figure BDA0004033983910004262
程序：
向INX-A-2(220mg,0.45mmol)和INX-A-3(230mg,0.67mmol)在NMP(4mL)中的溶液中添加HATU(342mg,0.90mmol)和DIPEA(232mg,1.8mmol)。将混合物在室温下搅拌5h。将混合物通过制备型HPLC(ACN/H2O,0.1％ HCOOH)纯化，得到INX-A(122mg,39％)。LCMS:[M+H]+＝703；1H NMR(CDCl3,300MHz)(δ,ppm)7.20(d,J＝9.0Hz,1H),6.73(s,2H),6.52(br,1H),6.33(d,J＝9.0Hz,1H),6.11(s,1H),4.91(q,J＝17.3Hz,2H),4.35(d＝9.3Hz,1H),3.76-3.42(m,10H),3.03(m,1H),2.79(m,2H),2.65-2.56(m,3H),2.42-2.06(m,7H),1.84-1.63(m,3H),1.22(m,1H),1.02(s,3H),0.90(d,J＝7.2Hz,3H).19F NMR(CDCl3)(δ,ppm)-166.09(q)。
INX AA的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910004271
代表性程序
缩醛形成：
向圆底烧瓶中装入16-α-羟基泼尼松龙(1.0eq)、醛(1.1eq)和MgSO4(3.0eq)。将固体悬浮在乙腈(0.10M)中并且将混合物冷却至0℃，然后逐滴添加三氟甲磺酸(5.0eq)。在10-20分钟之后反应变成粉红色，并且在约1h之后起始材料完全消耗。减少溶剂，并且将粗品装载到Isco C18 Aq反相柱上，并且用含5-100％乙腈(0.05％ AcOH添加剂)的H2O(0.05％ AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并且冻干，得到标题化合物。
Gly-Glu偶联：
向圆底烧瓶中装入缩醛(1.0eq)、Boc-Gly-Glu(OtBu)-OH(5.0eq)和PyAOP(5.0eq)。添加1:2DCM/DMF的混合物(22mL总体积)，随后添加DIPEA(3.0mL,17.356mmol,10.0eq)并且将混合物搅拌1小时。在1小时之后，大多数游离胺消耗，减少溶剂(至仅DMF)，并且将粗混合物装载到Isco C18 Aq反相柱上，并且用含5-100％乙腈(0.05％ AcOH添加剂)的H2O(0.05％ AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并且冻干，得到标题化合物。
Boc基团和叔丁基基团的脱保护：
向圆底烧瓶中装入叔丁基/Boc保护的化合物(1.0eq)、MeCN(0.10M)、三氟乙酸(0.10M)和三异丙基硅烷(15.0eq)。将混合物在室温下搅拌2-3h。通过LCMS确认起始材料消耗并且减少溶剂。将所得残余物装载到Isco C18 Aq反相柱上，并且用含0-100％乙腈(0.10％ TFA添加剂)的H2O(0.10％ TFA添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并且冻干，得到标题化合物。
溴乙酸偶联：
向小瓶中装入2-溴乙酸(2.0eq)和DMF(0.20M)。添加N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(1.9eq)，并且将混合物搅拌约90分钟。然后将胺(1.0eq)与碳酸氢钠(5.0eq)一起添加到溶液中，并且将混合物搅拌2h。一旦通过LCMS确认反应完成，就将粗混合物直接装载到Isco C18 Aq g反相柱上，并且用含0-100％乙腈(0.05％ AcOH添加剂)的H2O(0.05％AcOH添加剂)的流动相洗脱。将含有纯产物的级分合并，冷冻并且冻干，得到标题化合物。
(S)-4-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX AA-1)的合成：
Figure BDA0004033983910004291
程序：
使用Gly-Glu偶联的代表性程序合成化合物INX AA-1。
(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX AA-2)的合成：
Figure BDA0004033983910004292
程序：
使用Boc/叔丁基脱保护的代表性程序合成化合物INX AA-2。
(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)双环[2.2.2]辛-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX AA)的合成：
Figure BDA0004033983910004301
程序：
使用溴乙酸偶联的代表性程序合成化合物INX AA。
INX AB的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910004302
(4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)双环[2.2.2]辛-1-基)甲醇(INX-SM-102-1)的合成：
Figure BDA0004033983910004311
程序：
在氩气下在-78℃下向双环[2.2.2]辛-1,4-二基二甲醇(255mg,1mmol)在THF(0.6M)中的溶液中添加n-BuLi(1eq，2.5M在己烷中，0.4mL)，并且将所得溶液在-78℃下搅拌30min。快速添加TBS-Cl(1eq,1mmol)在THF(1mL)中的溶液，并且在-78℃下将所得混合物搅拌10min，然后升温至室温并且搅拌3h。将反应物用水(10mL)稀释并且用乙醚(10mL)萃取。将水相用乙醚(10mL)萃取，并且将合并的有机层用盐水洗涤并经MgSO4干燥。经由旋转蒸发去除溶剂，产生标题化合物INX-SM-102-1，其无需进一步纯化即可使用。
((4-(溴甲基)双环[2.2.2]辛-1-基)甲氧基)(叔丁基)二甲基硅烷(INX-SM-102-2)的合成：
Figure BDA0004033983910004312
程序：
在氩气下在搅拌下向醇INX-SM-102-1(28.4mg,0.1mmol)在MeCN(1mL)中的溶液中添加咪唑(2.2eq,0.22mmol)、PPh3(2.5eq,0.25mmol)和CBr4(2.2eq,0.22mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h，用饱和NaHCO3水溶液淬灭，并且用EtOAc(3x)萃取。合并的有机层经无水MgSO4干燥并且过滤。将滤液在减压下浓缩。将残余物通过快速柱色谱(用己烷/EtOAc的混合物洗脱)在硅胶上纯化，得到标题化合物INX-SM-102-2。
(4-((4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)双环[2.2.2]辛-1-基)甲基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-102-3)的合成：
Figure BDA0004033983910004321
程序：
将INX-SM-102-2(347mg,1mmol)和镁屑(2.5eq,2.5mmol)在乙醚中的混合物与催化量的二溴乙烷一起回流4小时。向所述溶液中添加4-溴苯乙烯(0.6eq,0.6mmol)和Ni(dppf)Cl2(10mol％)。将所得反应混合物在回流下加热8h。将反应物用饱和NH4Cl水溶液淬灭，并且用MTBE(2x 15mL)萃取。将合并的有机萃取物用水洗涤，经MgSO4干燥，并且浓缩。将残余物通过快速柱色谱(用己烷/EtOAc的混合物洗脱)在硅胶上纯化，得到标题化合物INX-SM-102-3。
(4-((4-(羟甲基)双环[2.2.2]辛-1-基)甲基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-102-4)的合成：
Figure BDA0004033983910004322
程序：
在0℃下，将TBAF在THF(1.00M,3mL,3eq)中的溶液添加到INX-SM-102-3(345mg,1mmol)在THF(10mL)中的溶液中。在5min之后，将反应物升温至室温并且再搅拌3.5h，此时依次添加饱和NH4Cl水溶液(10mL)、水(5mL)、乙醚(10mL)和EtOAc(10mL)。将各层分离并且用EtOAc(3x 50mL)萃取水层。将有机层合并，用盐水(10mL)洗涤，然后经无水MgSO4干燥并且在减压下浓缩。将残余物通过快速柱色谱(用己烷/EtOAc的混合物洗脱)在硅胶上纯化，得到标题化合物INX-SM-102-4。
(4-((4-甲酰基双环[2.2.2]辛-1-基)甲基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-102-5)的合成：
Figure BDA0004033983910004331
程序：
将INX-SM-102-4(69mg,0.20mmol)在CH2Cl2(2.5mL)中的溶液冷却至0℃并且添加戴斯-马丁高碘烷(129mg,0.30mmol,1.5eq)并且搅拌1h。然后将反应物用饱和溶液(15mL,NaHCO3/Na2S2O3＝1:1)的混合物淬灭。将混合物用EtOAc(15mL×3)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩。将残余物通过快速柱色谱(用己烷/EtOAc的混合物洗脱)在硅胶上纯化，得到标题化合物INX-SM-102-5。
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(4-氨基苄基)双环[2.2.2]辛-1-基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-102)的合成：
Figure BDA0004033983910004332
程序：
使用缩醛形成的代表性程序合成化合物INX-SM-102。
(S)-4-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((4-((4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)双环[2.2.2]辛-1-基)甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX AB-1)的合成：
Figure BDA0004033983910004341
程序：
使用Gly-Glu偶联的代表性程序合成化合物INX AB-1。
(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((4-((4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)双环[2.2.2]辛-1-基)甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸(INX AB-2)的合成：
Figure BDA0004033983910004342
程序：
使用Boc/叔丁基脱保护的代表性程序合成化合物INX AB-2。
(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((4-((4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)双环[2.2.2]辛-1-基)甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸(INX AB)的合成：
Figure BDA0004033983910004351
程序：
使用溴乙酸偶联的代表性程序合成化合物INX AB。
INX AC的合成
反应方案
Figure BDA0004033983910004352
(3-(4-甲酰基苯氧基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(INX-SM-8-1)的合成：
Figure BDA0004033983910004361
程序：
将(3-羟基双环[1.1.1]戊-1-基)氨基甲酸叔丁酯(1.1eq,1.1mmol)、4-氟-苯甲醛(124mg,1mmol)和K2CO3(1.5eq,1.5mmol)在DMF(1mL)中的混合物在80℃下加热16h，冷却至室温，用水(10mL)稀释并且用EtOAc(10mL x 3)萃取。将合并的有机层用盐水(5mL)洗涤，经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。将残余物通过快速柱色谱(用己烷/EtOAc的混合物洗脱)在硅胶上纯化，得到标题化合物INX-SM-8-1。
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)氧基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-8)的合成：
Figure BDA0004033983910004362
程序：
使用缩醛形成的代表性程序合成化合物INX-SM-8。
(S)-4-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(INX AC-1)的合成：
Figure BDA0004033983910004371
程序：
使用Gly-Glu偶联的代表性程序合成化合物INX AC-1。
(S)-4-(2-氨基乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INXAC-2)的合成：
Figure BDA0004033983910004372
程序：
使用Boc/叔丁基脱保护的代表性程序合成化合物INX AC-2。
(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苯氧基)双环[1.1.1]戊-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX AC)的合成：
Figure BDA0004033983910004381
程序：
使用溴乙酸偶联的代表性程序合成化合物INX AC。
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-氨基-2-氧杂双环[2.2.2]辛-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-36)的合成
Figure BDA0004033983910004382
(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-4(2H)-酮(INX-SM-37)的合成
Figure BDA0004033983910004391
(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-氨基苄基)苯基)-2,6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-4(2H)-酮(INX-SM-28)的合成
Figure BDA0004033983910004401
醋酸2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-氨基双环[1.1.1]戊-1-基)甲基)苯基)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-氧代-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-8b(2H)-基)-2-氧代乙酯(INX-SM-34)的合成
Figure BDA0004033983910004402
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-氨基苄基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-十四氢萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-c]吡咯-4(2H)-酮(INX-SM-4 0)的合成
Figure BDA0004033983910004411
(6aR,6bS,7S,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)氧基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a-甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-4 3)的合成
Figure BDA0004033983910004412
(6aR,6bS,7S,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-氨基螺[3.3]庚-2-基)氧基)-2-氟苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a-甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-酮(INX-SM-44)的合成
Figure BDA0004033983910004421
(S)-4-(2-(2-溴乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a,8a-二甲基-4-氧代-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氢-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)立方烷-1-基)氨基)-5-氧代戊酸(INX-A2)的合成
Figure BDA0004033983910004422
实施例4：抗VISTA抗体在生理pH下的结合和内化的比较
最初是为了评估VISTA抗体是否可能有效地将类固醇或其他有效载荷递送至靶免疫细胞中，进行了研究以评价不同抗VISTA抗体到人单核细胞中的内化。具体地，比较了裸抗人VISTA抗体(分别为INX200、767IgG1,3(图12中的抗体序列))在人单核细胞中的结合和内化。VISTA在大多数造血细胞上高度表达，特别是在骨髓细胞上。基于此，我们推测快速内化与相关细胞类型的高密度和选择性相结合可能使VISTA成为抗炎抗体药物缀合物(ADC)的理想靶标。
因为与EGFR结合的抗体迅速内化到靶细胞中，抗EGFR抗体的药物缀合物已被广泛研究。文献详细介绍了确定内化速率的稳健方法。例如，在表达EGFR的细胞系中，针对EGFR的LA22 mAb在37℃下在10min内达到了65.8％的最大内化水平(Liu,Z.,等人,(2009),“In-vitro internalization and in-vivo tumor uptake of anti-EGFR monoclonalantibody LA22 in A549 lung cancer cells and animal model”,Cancer BiotherRadiopharm,15-20)，而Ab033在15min内显示出54％的内化(Durbin,K.R.等人,2018,“Mechanistic Modeling of Antibody-Drug Conjugate Internalization at theCellproton assignmentular Level Reveals Inefficient Processing Steps”,MolCancer Ther,1535-7163)。
本研究的目的是评价抗VISTA单克隆抗体INX200在人单核细胞中的内化速率，并且进一步评估767-IgG1,3作为比较的内化性质，后者是由Five Prime Therapeutics andBristol-Myers Squibb Company开发的具有增强血清PK半衰期的pH敏感性抗人VISTA(Johnston,R.J.等人,(2019),“VISTA is an acidic pH-selective ligand for PSGL-1”,Nature,574(7779),565-570)。
材料和方法
在此实验中，首先确定了抗VISTA抗体INX200和767-IgG1,3与人单核细胞(来自新鲜分离的人外周血单核细胞或PBMCS)的结合曲线。其次，使用非内化抗体抗CD45作为阴性对照确定这些不同抗体对人单核细胞的内化速率。简而言之，为了仅检测内化的抗体，首先将细胞在4℃下与荧光标记的抗体一起孵育30min，在此温度下几乎不会发生内化。将细胞洗涤并且在25℃下孵育以允许内化。然后使用等效量的抗AF488抗体在不同时间点淬灭细胞表面信号。随后，将PBMCS用抗CD14抗体染色以鉴定单核细胞并且通过流式细胞术进行分析。
测试剂和剂量
·INX200(Aragen，批号BP-2875-019-6.1)是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235A沉默突变的人源化抗人VISTA抗体。
·人IgG1si(BioXcell ref，批号659518N1)是具有带有Fc区中的L234A/L235A沉默突变的人IgG1/κ主链的抗RSV(呼吸道合胞病毒)抗体。
·767-IgG1,3(Aragen，批号BP-2985-019-6)是由Five Prime Therapeutics andBristol-Myers Squibb Company开发的在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235E/G237A沉默突变的抗人VISTA抗体。此抗体被设计为在低pH(例如，pH 6)下结合，但在生理pH(pH 7.4)下具有最小结合，并且因此由于不像其他抗VISTA抗体那样经受TMDD而具有增强的血清PK半衰期。此抗体如文件WO2018169993A1中所述制备。抗体的pH敏感性行为经由ELISA格式确认。简而言之，将767-IgG1,3或INX200板结合并且将在含有BSA的柠檬酸/吐温缓冲液中稀释的hIX50-生物素(VISTA ECD)在pH6.1、6.7或7.5下进行滴定，并且使用链霉亲和素-HRP缀合物/TMB读出进行检测。虽然在pH 7.5下观察到最大的INX200结合，但在pH7.5下观察到767-IgG1,3的最小结合，其中在pH 6.7下结合水平增加，并且在pH 6.1下甚至更高。
·CD45(克隆HI30)是抗人CD45单克隆抗体。
·抗Alexa Fluor 488(AF488)多克隆抗体(Life Technologies,#A-11094)是抗Alexa Fluor 488抗体，用于淬灭AF488荧光信号。
除抗AF488之外，所有抗体均按照制造商的标记和纯化说明与AF488缀合(Invitrogen目录号A10235)。除非另有说明，否则抗体在含有1％ BSA的RPMI培养基中稀释。
PBMCS制备
将人PBMC在无菌条件下从获得自献血者项目(Dartmouth Hitchcock MedicalCenter，来自健康非相关人供体)的单采锥体细胞中分离出来。将血液转移到50ml Falcon管中并且用PBS稀释至30ml。使13ml的Histopaque 1077(Sigma Aldrich)在血液下缓慢分层，并且将管在室温下以850x g离心20min，温和加速且无制动。从血浆/Ficoll分界面收集单核细胞，重悬于50ml的PBS中并且以300x g离心5min。将细胞重悬于PBS中，然后进行计数。
抗体的荧光标记
抗人VISTA抗体和huIgG1si按照制造商的标记和纯化说明与Alexa Fluor 488染料缀合(Invitrogen目录号A10235)。经由Nanodrop评估浓度和标记度。INX200的标记度为5.9，而767IgG1,3的标记度为7.1。与AF488缀合的抗人CD45(克隆H130)(Biolegend,#304017)和与APC缀合的抗CD14(克隆M5E2，Biolegend，#301808)按原样使用。
抗体结合分析
将PBMC以5x106个细胞/ml重悬在含人Fc阻断试剂(eBioscience,14-9161-73)的RPMI/1％ BSA缓冲液中，然后将50μl/孔的细胞分布到96孔板中。抗人VISTA抗体在RPMI/1％ BSA缓冲液中以2倍稀释系列(10个浓度)制备，从333nM(50μg/ml)开始。将PBMCS在冰上染色30min以限制内化，用PBS洗涤两次，并且在4℃下用含2％FA的PBS固定10min。将单核细胞在室温下在PBS/0.2％ BSA中用抗CD14 mAb以1:400(体积/体积)标记20min。将细胞洗涤并且通过FACS分析细胞，使用Macsquant(Miltenyi)流式细胞仪和FlowJo以进行分析。所有图表均使用GraphPad(Prism)制作。
抗体内化分析
将5x106个PBMC重悬在1ml的含人Fc阻断试剂(eBioscience,14-9161-73)的RPMI/1％ BSA缓冲液中，并且在冰上与133nM(20μg/ml)的抗人VISTA mAb一起孵育30min。将细胞用3ml冰冷PBS洗涤并且以515x g离心2min。将PBMCS重悬在1.25ml的新鲜RPMI/1％ BSA中并且保持在室温下。减慢内化允许产生稳健的曲线。在每个时间点，将50μl的细胞转移到含有50μl RPMI/1％ BSA和抗CD14 APC的96孔板中以测量总抗体结合。将细胞保持在冰上以阻断随后的内化。
然后将50μl的细胞转移到96孔板中，所述板含有50μl RPMI/1％BSA、266nM(40μg/ml)的抗AF488抗体(淬灭表面结合抗体的荧光)和抗CD14 APC(标记单核细胞)。将细胞保持在冰上以阻断随后的内化。在技术重复份中收集样品，并且跟踪抗体内化长达60min。在时程结束时，将所有样品用PBS洗涤并且在4℃下用含2％ FA的PBS固定10min。在PBS中最后一次洗涤之后，通过FACS分析细胞，使用Macsquant(Miltenyi)流式细胞仪和FlowJo以进行分析。测量抗VISTA或CD45 mAb的中值荧光强度(MFI)并且绘制数据。
通过减去未处理细胞的背景荧光并且将MFI值标准化为时间＝0的MFI来计算细胞内分数。内化速率计算为每个时间点的细胞内信号与总细胞相关荧光的分数(参见下面的等式)并且标准化为100％(Liao-Chan,S.等人,(2015),“Quantitative assessment ofantibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexafluorophores”,PLoS One,10(4):e012470)。
Figure BDA0004033983910004461
N1–各时间点(t1)的未淬灭MFI
O1–各时间点(t1)的淬灭MFI
N0–0min(t0)的未淬灭MFI
Q0–0min(t0)的样品淬灭MFI
裸抗VISTA抗体(INX200、767-IgG1,3)的结合
在图13中的实验中，测量了与测试的抗体的连续稀释液(0-333nM)一起孵育的单核细胞的中值荧光强度；其中黑色虚线对应于未染色细胞的自发荧光；n＝1。在每个浓度下进行一次测量。如其中所示，在7.3的生理pH下，INX200在CD14+PBMCS上在测试的范围(0-333nM)内显示出浓度依赖性荧光增加(参见图13)。相反，当细胞与767-IgG1,3抗体一起孵育时，没有检测到信号。这是预期的，因为它在较低pH下具有结合选择性，这先前在ELISA格式中得到了证实。用于评估非特异性结合水平的人IgG1si抗体即使在高抗体浓度下也几乎不显示结合。
抗人VISTA抗体的内化
图14示出了抗VISTA抗体的内化分数。在这些实验中，在60min的时程中绘制了细胞结合抗体的细胞内池；对于每个数据点，将荧光标准化为0min时INX200的荧光；平均值±SD n＝2供体。为了比较抗体的内化分数，通过减去未处理的单核细胞的MFI来针对背景荧光校正每个时间点的的MFI值，并且标准化为t＝0时间点的INX200的总MFI(图14)。与图13所示的数据一致，在t＝0时，767-IgG1,3相对于INX200表现出弱结合，为3.2％±4.5％(图14)。
如其中所示，由人IgG1si染色表示的非特异性信号在0min时被评估为5.9％。当细胞与INX200一起孵育时，随着时间的推移观察到细胞内信号明显增加，并且到60min时，细胞内分数为70.4％±9.2％。MFI值在时程的40min时达到平台期。相比之下，在60min时，仅5.3％±7.5％的767-IgG1,3被检测为内部分数。在时程期间，人IgG1si的细胞内信号在5-6％内。
此外，在图15中，进行了另一个实验，其中在60min时程中评估了单核细胞中INX200抗体的内化速率，并且与抗CD45抗体HI30进行比较。如其中所示，抗CD45抗体在任何时间点均未内化；显示为平均值±SD，n＝2供体。相比之下，INX200有效内化，在20min时检测到一半的表面抗体在细胞内(图15)。此外，在40min内，64.5％±11.2％的INX200在单核细胞中内化。相比之下，在任何测试的时间点都没有观察到抗CD45 mAb的内化。
数据显示抗人VISTA INX200以高亲和力结合，并且在40分钟时以64％的最大内化水平内化。这有力地表明，VISTA是向免疫细胞递送抗炎有效载荷的独特合适靶标，因为这些结果表明大部分有效载荷会在相对较短的时间段内递送，鉴于缺乏CD45内化，这不简单且不平凡。相比之下，pH敏感性抗体抗人VISTA 767.3-IgG1.3在生理pH下与单核细胞的结合有限。此外，与INX200相比，767-IgG1,3在生理pH下表现出可忽略到有限的内化水平。
实施例5：抗VISTA抗体作为裸抗体或地塞米松缀合物的PK的比较示例性抗VISTA抗体在生理pH下的结合和内化
进行了两个实验以在人VISTA敲入(hVISTA KI)小鼠中比较抗人VISTA抗体INX200裸或与地塞米松缀合(INX200A)(在第一个实验(ADC-INVIVO-11或实验1)中)以及767-IgG1.3裸或与地塞米松缀合(767-IgG1.3A)(Johnston等人,“VISTA is an acidic pH-selectiveligand for PSGL-1.”Nature.2019Oct；574(7779):565-5702019)(在第二个实验(实验2或ADC-INVIVO-14)中)的药代动力学(PK)。这些小鼠敲入了人VISTA cDNA代替小鼠VISTA基因，并且在RNA和蛋白质水平上表达人VISTA。实验在雄性hVISTA KI小鼠中进行，并且在两项研究中，动物以10mg/Kg接受1剂抗体。在20min、4、24、48小时，然后在实验1的第5、8、14、21和28天以及实验2的第4、7、14、21和28天量化外周血中的抗体量。
这2个实验的目的是评价是否添加8接头-有效载荷分子/抗体将改变PK并且确认由BMS/Five Prime Therapeutics描述的“pH敏感性”抗体和糖皮质激素连接形式与在生理下与表达人VISTA的细胞结合的抗VISTA抗体和它们各自的糖皮质激素连接形式(相对于hIgG1较短)相比具有显著不同的PK(与hIgG1相当)。
材料和方法
实验1：INX200、INX200A(地塞米松缀合物)在人VISTA KI小鼠中的PK研究
将hVISTA KI小鼠分为3组，每组10只小鼠，在第0天分别用人IgG1、INX200和INX200A以10mg/Kg进行处理。
实验2：767-IgG1.3、767-IgG1.3A(地塞米松缀合物)在人VISTA KI小鼠中的PK研究
将hVISTA KI小鼠分为3组，每组10只小鼠，在第0天分别用人IgG1、767-IgG1.3和767-IgG1A以10mg/Kg进行处理。在两个实验中，小鼠均在20min、4、24、48小时，然后在实验1的第5天和第8天以及实验2的第4天和第7天进行眼眶后采血；通过ELISA量化循环抗体。
测试剂和剂量
·INX200(Aragen，批号BP-2875-019-6.1)是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235A沉默突变的人源化抗人VISTA抗体。
·INX200A(Abzena，批号JZ-0556-005)是经由链间二硫键以8的药物/抗体比缀合的INX200抗体。接头/有效载荷(A)由酯酶敏感性接头与地塞米松有效载荷组成。
·人IgG1(BioXcell ref，批号659518N1)
·767-IgG1,3(Aragen，批号BP-2985-019-6)是由Five Prime Therapeutics andBristol-Myers Squibb Company开发的在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235E/G237A沉默突变的抗人VISTA抗体。此抗体被设计以在低pH(例如pH 6)下结合，但在生理pH(pH 7.4)下具有最小结合(1)。
·767-IgG1.3A(Abzena，批号JCC0624003)是经由链间二硫键缀合的767-IgG1.3抗体，药物/抗体比为8。接头/有效载荷(A)由酯酶敏感性接头与地塞米松有效载荷组成。
所有抗体均在PBS中稀释，并且以0.2ml的体积在小鼠尾静脉静脉内注射，以递送10mg/Kg的剂量。
小鼠
hVISTA小鼠在Sage Labs(Boyertown,PA)繁育。8-12周龄的小鼠先在我们的隔离设施中过渡3周，然后转移到常规设施。在实验开始之前使小鼠适应1至2周。
抽血和准备
对动物采血每24小时不超过一次。每个小鼠组分为2个亚组，每个亚组5只小鼠，在第0天交替采血。在注射后第0天20min、4、24、48小时，然后在实验1的第5天和第8天以及实验2的第4天和第7天采集血液。在最初24小时时间段内，基于静脉内注射的注册质量排除了一些数据。对于随后的时间点，只有成功进行静脉内注射的动物才进行采血。
使用首先用肝素冲洗以防止凝血的玻璃巴斯德移液器从眼眶后腔收获外周血。然后将血液以400rcf离心5min，并且收集血浆并储存在-80℃下用于分析(参见上文)。
抗体血液浓度分析
用于检测人IgG1的ELISA
首先，在室温(RT)下将96孔平底板(Thermo Scientific Nunc Immuno Maxisorp，目录号442404)用1μg/ml的在PBS中的小鼠抗huIgG Fcγ(Jackson ImmunoResearch，目录号209-005-098)包被一小时。
将孔用PT(含0.05％吐温20的PBS)洗涤3次，然后在室温下用PTB(含0.05％吐温20和1％ BSA的PBS)阻断1小时。将人IgG(Southern Biotech，目录号0150-01)用作阳性对照，并且将人IgG1(BioXcell，目录号BE0297)用于构建标准曲线。将孔用PT洗涤3次，然后将血浆样品在室温下以PTB中多达4种不同的稀释液(以拟合标准曲线)孵育1小时。
在用PT洗涤3次之后，将1/2000稀释的与HRP偶联的小鼠抗人IgG Fcγ(JacksonImmunoResearch，目录号209-035-098)用作检测试剂，并且在室温下孵育1小时。洗涤3次后，使用TMB(Thermo Scientific，目录号34028)作为比色底物揭示ELISA反应。在室温下5-10min之后，将反应用1M H2S04终止。
用于检测INX200或INX200A的ELISA
首先，在室温下将96孔平底板(与4.4.1相同)用1μg/ml的在PBS中的hIX50(人VISTA ECD，在Aragen Bioscience为ImmuNext生产)包被一小时。在洗涤3次之后，将孔在室温下用PTB阻断一小时。将INX908(在Aragen Bioscience为ImmuNext生产)用作阳性对照，并且将INX200或INX200A用于构建标准曲线。将孔用PT洗涤3次，然后将血浆样品在室温下以PTB中多达4种不同的稀释液(以拟合标准曲线)孵育1小时。
在用PT洗涤3次之后，将1/2000的小鼠抗人κ-HRP(Southern Biotech，目录号9230-05)用作检测试剂，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，使用TMB底物揭示ELISA反应。在室温下5min之后，将反应用1M H2S04终止。
用于检测767-IgG1.3或767-IgG1.3A的ELISA
首先，在室温下将96孔平底板(和上文一样)用1μg/ml的在PBS中的小鼠抗huIgGFcγ(Jackson ImmunoResearch，目录号209-005-098)包被一小时。
在洗涤3次之后，将孔在室温下用PTB阻断一小时。将人IgG(Southern Biotech，目录号0150-01)用作阳性对照，并且将767-IgG1.3或767-IgG1.3A用于构建标准曲线。将孔用PT洗涤3次，然后将血浆样品在室温下以PTB中多达4种不同的稀释液(以拟合标准曲线)孵育1小时。
在PTB中洗涤3次之后，将1/2000的小鼠抗人IgG Fcγ-HRP(JacksonImmunoResearch，目录号209-035-098)用作检测试剂，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，按照制造商说明书使用TMB底物揭示ELISA反应。在室温下5min之后，将反应用1M H2S04终止。在静脉内推注之后使用PKsolver程序进行非隔室分析(NCA)来测定抗体半衰期。
结果
实验1：INX200裸或缀合抗体的血浆PK
从用INX200、INX200A或hIgG1治疗的组采集血浆样品以测定抗体浓度和随后它们的半衰期。INX200表现出0.1天的半衰期，虽然较低但与先前的PK数据一致(T1/2＝约0.3天)，并且抗体在24小时时低于量化水平。INX200A表现出相同的PK。相比之下，人IgG1具有7.2天的半衰期，虽然低但对于免疫球蛋白来说不是非典型的(图16)。图中示出了hVISTAKI小鼠中注释时间点的抗体血浆浓度(SD；n＝5/组)。
实验2：767-IgG1.3裸或缀合抗体的血浆PK
从用767-IgG1.3、767-IgG1.3A或hIgG1治疗的组采集血浆样品以测定抗体浓度和随后它们的半衰期。结果表明，767-IgG1.3和767-IgG1.3A表现出相似的半衰期，分别为3.5天和4天，并且两者在第7天仍可检测到。hIgG1的半衰期为8.7天，与在实验1中观察到的相似(参见图17，其包含767-IgG1.3、767-IgG1.3A相比于人IgG1的PK研究，以及其中hVISTAKI小鼠中注释时间点的抗体血浆浓度(SD；n＝5/组))。
结论
这2个实验的结果表明：
实验1
图16中的数据表明，由于靶标介导的药物处置(TMDD)，抗人VISTA抗体INX200(在生理pH下与人VISTA细胞结合)在给药后24小时时无法在血浆中量化，而人IgG1对照显示IgG更典型的延长半衰期。结果进一步表明，地塞米松与INX200以DAR＝8的缀合(不影响其PK。
实验2
图17中的数据表明，pH敏感性抗人VISTA 767-IgG1.3表现出与人IgG1对照抗体相似的PK，认为它与其VISTA靶标的结合有限并且不经受TMDD。此外，地塞米松与767-IgG1.3以DAR＝8的缀合不影响其PK。
实施例6：抗体药物缀合物对离体巨噬细胞激活的长期影响
在此实施例中，进行了9个实验以评估示例性本发明抗体药物缀合物(ADC)分子的长期功效，所述分子包含靶向VISTA的抗体和糖皮质激素(GC)药物，所述VISTA是在大多数造血细胞(包括骨髓细胞和T细胞)上高度表达的细胞表面分子。我们先前已经证明(内部未发表的研究)，此类ADC在短期炎症模型中发挥稳健的抗炎活性。这些研究的目的是(i)评价骨髓细胞中各种抗体药物缀合物(ADC)和与糖皮质激素(GC)有效载荷连接的抗人VISTA单克隆抗体的药效学范围；和(ii)评价示例性INX GC接头有效载荷ADC的效力。
首先，我们评价了与地塞米松(Dex)对腹膜定居巨噬细胞(PRM)和脾单核细胞相比，ADC对早期GC反应基因FKBP5的长期体内影响(Vermeer等人(2003)“Glucocorticoid-induced increase in lymphocytic FKBP51 messenger ribonucleic acid expression:a potential marker for glucocorticoid sensitivity,potency,andbioavailability”,J Clin Endocrinol Metab.88(1):277-84)。
基于此，我们开发了模型以使我们能够评价ADC对特定目标群体(诸如PRM)的长期抗炎影响。简而言之，经由腹膜内(i.p.)注射体内递送ADC，并且在1至7天之后分离PRM且进行培养。在没有GC治疗的情况下，在2h之后PRM变得高度激活，如由细胞因子产生的增加所示。在PRM分离之前2h的体内Dex治疗可稳健减少细胞因子产生。这些研究的目的是评价与游离Dex相比，与糖皮质激素有效载荷缀合的INX人VISTA抗体的功效和药效学范围。
材料和方法
评估ADC或Dex对PRM和脾单核细胞中FKBP5转录的影响的方法
在小鼠安乐死和细胞分离之前2至24h i.p.注射Dex。然后在小鼠安乐死和细胞分离之前17h至7天注射ADC。
测试剂和剂量
抗体
·INX201(Aragen，批号BP-3200-019-6)是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235A/E269R/K322A沉默突变的人源化抗人VISTA抗体。
·INX201J(Abzena，批号JZ-0556-025-1、批号JZ-0556-027、批号JZ-0556-013)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的药物/抗体比(DAR)与接头/有效载荷缀合的INX201。接头/有效载荷(INX J)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX J-2)。
1.INX231J(Abzena，批号JZ-0556-013-1)是以8.0的DAR缀合的INX231。接头/有效载荷(INX J)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX J-2)。
·INX234J(Abzena，批号JZ-0556-013-2)是以8.0的DAR缀合的INX234。接头/有效载荷(INX J)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX J-2)。
·INX240J(Abzena，批号JZ-0556-013-3)是以8.0的DAR缀合的INX240。接头/有效载荷(INX J)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX J-2)。
·INX201O(Abzena，批号JZ-0556-016-2)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的DAR缀合的INX201。接头/有效载荷(INX O)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX-SM-4)。
·INX201P(Abzena，批号JZ-0556-016-1)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的DAR缀合的INX201。接头/有效载荷(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX-SM-3)。
·INX233(ATUM批号82276.1.a)是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235A/E269R/K322A沉默突变的人源化抗人VISTA抗体。
·INX233P(Abzena，批号PP-0924-001-3)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的DAR缀合的INX233。接头/有效载荷(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX-SM-3)。
·INX231(ATUM批号72928.1.a)是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235A/E269R/K322A沉默突变的人源化抗人VISTA抗体。
·INX231P(Abzena，批号JZ-0556-017-1)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的DAR缀合的INX231。接头/有效载荷(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX-SM-3)。
·INX234(ATUM批号72931.2.a)是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235A/E269R/K322A沉默突变的人源化抗人VISTA抗体。
·INX234P(Abzena，批号JZ-0556-017-2)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的DAR缀合的INX234。接头/有效载荷(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX-SM-3)。
·INX240(ATUM批号73419.2.a)是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235A/E269R/K322A沉默突变的人源化抗人VISTA抗体。
·INX240 P(Abzena，批号JZ-0556-017-3)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的DAR缀合的INX240。接头/有效载荷(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX-SM-3)。
·INX231R(Abzena，批号PP-0924-001-2)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的DAR缀合的INX231。接头/有效载荷(INX R)由中性蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX-SM-3)。
·INX231S(Abzena，批号PP-0920-014-1)是经由链间二硫键的修饰以6.9的DAR缀合的INX231。接头/有效载荷(INX S)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与醋酸氟轻松类似物有效载荷组成(INX-SM-24)。
·INX231V(Abzena，批号PP-0920-014-2)是经由链间二硫键的修饰以7.8的DAR缀合的INX231。接头/有效载荷(INX V)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX-SM-32)。
·INX231W(Abzena，批号PP-0920-014-3)是经由链间二硫键的修饰以7.5的DAR缀合的INX231。接头/有效载荷(INX W)由带正电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX-SM-3)。
将抗体稀释在PBS中并且以0.2ml的体积腹膜内(i.p.)注射以递送指定剂量。
地塞米松
将来自Phoenix的地塞米松无菌注射剂NDC 57319-519-05在PBS中稀释并且经由i.p.注射如所述进行给药。
小鼠
hVISTA小鼠是现场繁育的(在Dartmouth的比较医学和研究中心)。所有实验均在以9至15周龄之间入组的雌性小鼠中进行。
细胞分离
在安乐死之后，在小鼠腹腔内注射7ml的PBS/0.5％ BSA/2mM EDTA。对腹膜进行短暂按摩之后，切开一个小切口，并且收集腹腔灌洗液。使用阴性选择(Miltenyi试剂盒，ref130-110-434)分离PRM。将脾脏解剖并且机械解离；使用阴性选择(干细胞，EasySepTM小鼠CD11b阳性选择试剂盒II)分离单核细胞。
RNA制备和实时PCR
将来自不同组织的细胞沉淀物重悬于来自RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen,PN:74136)的0.4ml RNeasy裂解缓冲液中，并且用20G针头均化5次。按照制造商的说明书分离RNA，并且在30或40ml H2O(不含核糖核酸酶/脱氧核糖核酸酶)中洗脱RNA。在Nanodrop上评估RNA浓度。
使用Taqman逆转录试剂(#N8080234)并且按照制造商的说明书进行逆转录。使用Taqman master mix 2X试剂盒(#4369016)和小鼠FKBP5的Taqman引物(Mm00487401_m1)，并且使用小鼠HPRT作为管家基因(Mm446968_m1)进行定量实时PCR并且在来自AppliedBiosystem的QuantStudio3上运行。
将Ct数据转换为DCt(FKBP5标准化为样品内的HPRT)，然后转换为ΔΔCt(处理过的样品相比于PBS对照的FKBP5相对水平)以获得相对于PBS的Log2倍数变化。
腹膜定居巨噬细胞培养和细胞因子分析
培养条件
将PRM重悬在含10％ FBS、10mM Hepes、青霉素/链霉素和谷氨酰胺的RPMI 1640中，并且以100,000个细胞每孔铺种在96孔组织培养板中。在铺种后2和24h收集上清液并且储存在-80℃下。
使用Millipore平台的细胞因子分析
使用Millipore小鼠32-plex平台对25ml的血浆进行细胞因子分析。免疫监测实验室(IML，Dartmouth-Hitchcock Norris Cotton Cancer Center的共享资源)进行了分析。
经由ELISA的细胞因子分析
·BioLegend(目录号430904)ELISA MAX Deluxe Set Mouse TNF-α
·BioLegend(目录号431304)ELISA MAX Deluxe Set Mouse IL-6
按照制造商提供的方案进行ELISA。
结果
实验1：腹膜定居巨噬细胞和脾单核细胞中Dex处理后的FKBP5转录激活
图18中的实验比较了腹膜居住巨噬细胞和脾单核细胞中Dex(左)和ADC INX201J(右)处理后对FKBP5转录激活的影响。如其中所示，评价了以2mg/Kg单一1次i.p.注射后4和24h的Dex(左)影响；分析了以10mg/Kg(递送0.2mg/Kg的GC有效载荷)单一1次i.p.注射后24、48、72和96h的ADC(右)影响。通过实时PCR测量了FKBP5转录水平，并且表示为与PBS对照组相比的Log2倍数变化。每组四只小鼠汇集在一起，以产生足够的材料用于RNA制备。图18中的数据表明，到处理后4h，Dex处理导致PRM和脾单核细胞中FKBP5信使RNA的显著增加，但转录影响在24h消失(图18，左)。相比之下，INX201J对FKBP5的影响是持久的，即，在PRM中最晚96h检测到FKBP5信使RNA的增加，并且在脾单核细胞中在72h检测到FKBP5信使RNA的增加(图18，右)。
在没有任何额外刺激的情况下，当PRM转移到组织培养板上时，它们会非常迅速地被激活并且极大增加大量促炎细胞因子的产生，这些细胞因子可以在铺种后最早1h从细胞上清液中测量。
实验2：Dex处理防止PRM中促炎细胞因子的离体诱导
图19中的实验表明，Dex处理防止了PRM中促炎细胞因子的离体诱导。在实验中，Dex效果在2mg/Kg的单一1次i.p.注射后2h进行评价；使用小鼠32-plex根据细胞上清液(在1h时收集)评价IL-6和TNFα(参见方法部分)(n＝4小鼠/组；未配对T检验)。
这些结果表明，在细胞分离之前2h的体内Dex治疗可以稳健关闭离体PRM激活(此处以IL-6和TNFa分泌为例)，这早及细胞铺种后1h。在培养24h之后仍能清楚地检测到这种影响(未示出)。
实验3：ADC INX201J的药效学
在图20中包含的实验中，ADC INX201J的药效学范围是在分离PRM和离体刺激之前的第-4、-2和-1天注射ADC的情况下评价的。在PRM分离之前2h注射Dex对照组。在实验中，Dex效果在2和0.2mg/Kg的单一1次i.p.注射后2h进行评价；INX201J效果在以10mg/Kg(相当于0.2mg/Kg有效载荷)注射后1天(d-1)、2天(d-2)和4天(d-4)进行评价。在2h时收集细胞上清液。使用ELISA测量TNFa(参见方法部分)(n＝4小鼠/组；与仅PBS组相比的普通单因素方差分析)。INX201J以10mg/Kg或等效的0.2mg/Kg的有效载荷进行给药。
如图20所示，INX201J治疗当在第-1天给药时对减少TNFa产生具有非常显著的影响。此外，在第-2天或第-4天给药ADC仍然会影响分泌的细胞因子水平，类似于Dex对照组。数据表明，INX201J引发了对PRM的长期(>4天)抗炎影响。值得注意的是，此实验中上清液中检测到的TNFα的量远低于先前的实验，这可能是由于量化是通过ELISA(而不是Luminex)进行的。当在其他实验中通过ELISA进行量化时，我们也观察到较低的IL-6水平。
实验3：与J有效载荷缀合的不同抗VISTA抗体的长期效力
在图21中的实验中，发明人评价了与J有效载荷缀合的不同抗VISTA抗体的长期效力。INX201J、INX234J和INX240J以10mg/Kg(0.2mg/Kg的有效载荷)在第-4天和第-7天注射，而Dex以2mg/Kg在细胞分离之前2h进行给药。出于实际实验原因，INX231J仅在第-4天给药。
图21中的结果揭示，测试的ADC对PRM中TNFa和IL-6的离体诱导具有长期影响。在实验中，Dex效果在2mg/Kg的单一1次i.p.注射后2h进行评价；INX201J、INX231J、INX234J和INX240J效果在10mg/Kg的单一1次i.p.注射后4天(-4)和7天(-7)进行评价。在2h时收集细胞上清液。使用ELISA测量了TNFa和IL-6(参见方法部分)(n＝4小鼠/组；与仅PBS组相比的普通单因素方差分析)。如图21所示，对于TNFa和IL-6，当在第-4天或第-7天给药时，所有4种ADC都表现出有效的抗炎活性。
实验5：INX231J、INX234J和INX240 J对离体PRM激活的剂量依赖性影响
在图22中的实验中，发明人评价了INX231J、INX234J和INX240J对离体PRM激活的剂量依赖性影响。在实验中，Dex效果在2mg/Kg的单一1次i.p.注射后2h进行评价；INX231J、INX234J和INX240J效果在10、3或1mg/Kg(0.2、0.06和0.02mg/Kg的GC有效载荷)的单一1次i.p.注射后7天进行评价。在2h时收集细胞上清液。使用ELISA测量了TNFa和IL-6(参见方法部分)(n＝4小鼠/组，出于技术原因PBS组除外(n＝1)；与仅PBS组相比的普通单因素方差分析)。
如所述，所有ADC在第-7天以不同剂量进行i.p.注射：10、3和1mg/Kg分别递送0.2、0.06和0.02mg/Kg的GC有效载荷。Dex在细胞分离之前2h以2mg/Kg进行给药。结果表明，在不同的ADC之间没有观察到显著差异，表明它们具有相似的效力(图22)。
实验6：与治疗后第7天的Dex相比的示例性本发明ADC和与接头/有效载荷P缀合的INX201的效力
在图23中的实验中，我们评价了1)与治疗后第7天Dex相比的J连接的ADC，以及2)与接头/有效载荷P缀合的INX201的效力。图23中的结果表明，INX201J、INX201P、INX231J、INX234J和INX240J ADC在防止PRM中TNFα和IL-6的离体诱导方面具有相当的效力。在实验中，INX201J、INX201P、INX231J、INX234J、INX240J和Dex效果在单一1次i.p.注射后7天进行评价；ADC以10mg/Kg(0.2mg/Kg的GC有效载荷)进行给药，而Dex以2mg/Kg进行给药。在2h时收集细胞上清液。使用如上文所述测量了TNFa和IL-6(n＝4小鼠/组，出于技术原因PBS组和Dex组除外(n＝3)；与仅PBS组相比的普通单因素方差分析)。
如所述，所有治疗均在第-7天进行i.p.注射，其中Dex为2mg/Kg的有效载荷而ADC为0.2mg/Kg的有效载荷。图23中的数据表明，虽然Dex在控制细胞因子反应方面失去了所有功效，但所有携带J或P有效载荷的ADC都具有相当的效力。
实验7：当在第-7天注射时，INX201J相比于INX231P、INX234P和INX240P对离体巨噬细胞激活的影响
在此实验中，我们通过评估与INX201J相比的与不同抗VISTA缀合的INX P有效载荷，评价了改变抗VISTA CDR对延长效力的影响。所有ADC均在第-7天i.p.注射，以0.2mg/Kg的有效载荷进行给药。
数据表明，所有携带INX J或INX P接头有效载荷的抗VISTA ADC在延长的时间段后具有相当的效力(图24)。更具体地，图24中的数据表明，INX201J、INX231P、INX234P和INX240P ADC在防止PRM中TNFα的离体诱导方面具有相当的效力。ADC效果在单一1次i.p.注射后7天进行评价；ADC以10mg/Kg(0.2mg/Kg的GC有效载荷)进行给药。在2h时收集细胞上清液。使用ELISA测量了TNFα和IL-6(参见方法部分)(n＝4小鼠/组；与仅PBS组相比的普通单因素方差分析，SEM)。
实验8：当在第-7天注射时INX231P、INX233P、INX234P和INX231R对离体巨噬细胞激活的影响
在此实验中，我们评价了与INX231缀合的INX R接头有效载荷的长期效力。这种缀合类似于INX231P；然而，它含有中性二肽接头，其中INX231P具有带负电荷的二肽接头。我们还评价了额外的抗VISTA抗体INX233。作为比较物，我们使用了INX231P和INX234P。所有ADC均在第-7天i.p.注射，以0.2mg/Kg的有效载荷进行给药。我们分析了在24h收集的细胞上清液，因为先前的实验表明在2h或24h收集的上清液之间没有显著差异。
数据表明，除了INX231P表现出低于通常效力的效力(参见实验7)，INX231R和INX233P具有与INX234P相当的效力(图25)。更具体地，图25中的数据表明，INX231P、INX231R、INX233P和INX234P在防止PRM中TNFα和IL-6的离体诱导方面具有相当的效力。ADC效果在单一1次i.p.注射后7天进行评价；ADC以10mg/Kg(0.2mg/Kg的GC有效载荷)进行给药。在24h时收集细胞上清液。使用ELISA测量了TNFα和IL-6(参见方法部分)(n＝4小鼠/组；与仅PBS组相比的普通单因素方差分析，SEM)。
实验9：当在第天注射时INX231P、INX231R、INX231S、INX231V、INX231W和INX201O对离体巨噬细胞激活的影响
在此实验中，我们评价了与INX231缀合的数种新INX接头有效载荷的长期效力。在此实验中，二肽接头的电荷(INX R、INX W相比于INX P)、类固醇环的卤化(INX S相比于INXP)和有效载荷(INX V相比于INX P)独立地变化。具有来自INX P的不同有效载荷的接头有效载荷INX O也作为INX201缀合物进行评价。所有ADC均在第-7天i.p.注射，以0.2mg/Kg的有效载荷进行给药。我们分析了在24h收集的细胞上清液。
如图26所示，与INX231缀合的接头有效载荷INX S、V和W在控制细胞因子反应方面显示出显著的长期效力，而INX231P和INX231R表现出更有限但显著的长期功效；与INX231缀合的INX O接头有效载荷对PRM细胞因子反应的影响很小且不显著。更具体地，图26示出了与INX231或INX201缀合的GC接头有效载荷INX R、INX O、INX S、INX V和INX W相比于INXP在防止PRM中TNFα和IL-6的离体诱导方面的效力评价。ADC效果在单一1次i.p.注射后7天进行评价；ADC以0.2mg/Kg的GC有效载荷进行给药。在24h时收集细胞上清液。使用ELISA测量了TNFα和IL-6(参见方法部分)(n＝4小鼠/组；与仅PBS组相比的普通单因素方差分析，SEM)。
结论
数据表明：
·单次注射INX201J可在PRM靶细胞群中诱导GC报告基因转录物FKBP5的长期转录诱导，表明ADC的药效学范围>4天，而Dex的FKBP5转录诱导在24h时检测不到，这与技术报告ADCINVIVO-05中的数据一致，这表明我们的ADC可以在至多第14天上调FKBP5。
·在我们基于促炎IL-6和TNFα产生/分泌的PRM炎症状态的体内治疗/离体评价模型中：
-测试的ADC(INX201J/INX231J/INX234J/INX240J)在7天之后表现出效力(与抗VISTA CDR无关)，即使是当以0.02mg/Kg的有效载荷进行给药，这比以2mg/Kg给药的Dex对照低100倍。
-基于TNFα和IL-6减少，所有测试的抗VISTA ADC(INX201J/INX201P/INX231J/INX234J/INX240J)在PRM中具有>7天的药理学范围，而Dex失去了所有效力。
-抗VISTA类固醇缀合物在给药后7天有效，与二肽接头电荷(正、负或中性)无关。
○负(INX P)和中性(INX R)接头/有效载荷在给药后至多7天显示出相似的效力。带正电荷的接头/有效载荷INX W在同一时间点显示出相对于INX P和INX R增加的效力。
-抗VISTA类固醇缀合物在给药后7天有效，与类固醇环卤化无关。INX S(C6、C9氟化)和INX P(非卤化)在给药后7天都有效，其中INX S表现出相对于INX P增加的效力。
-具有各种有效载荷置换的抗VISTA类固醇缀合物在给药后7天有效。
○含有INX V、INX P和INX J的抗VISTA缀合物在给药后7天都有效。
○当与INX201缀合时，接头有效载荷INX O表现出非常有限的效力。
实施例7：抗体药物缀合物对LPS诱导的炎症的影响
进行了十项体内研究(其结果在此实施例中公开并且示出在图27-图36中)以评估根据本发明的示例性抗体药物缀合物对LPS诱导的炎症的影响。
为了评价ADC在自身免疫性疾病中的潜在功效，我们使用了LPS诱导的全身炎症的短期模型。腹膜内(i.p.)注射脂多糖(LPS)被广泛用作小鼠急性免疫反应(局部和全身)模型。LPS模型的特点是血液循环中大量促炎细胞因子，这可以在注射后最早2h监测到。到24h，大多数细胞因子回到正常水平。我们通过主要监测LPS注射后2或4h的细胞因子反应来利用此模型。初步研究表明，地塞米松(Dex)治疗对IL-12p40、TNFα、MIG、MIP-1α和IL-1β具有剂量依赖性影响，最早可在2h检测到，因此我们的研究集中在测量这5种细胞因子中的一种或多种。(参见Vermeer等人(2003)Glucocorticoid-induced increase in lymphocyticFKBP51 messenger ribonucleic acid expression:a potential marker forglucocorticoid sensitivity,potency,and bioavailability.J Clin EndocrinolMetab.Jan；88(1):277-84)
研究的目的是评价与游离Dex相比，与各种糖皮质激素有效载荷缀合的人抗VISTA抗体的功效。
材料和方法
方法
在这些实验中，小鼠分别在LPS注射之前约20h或2-4h接受抗体或Dex治疗。Dex寿命短且作用迅速，而ADC需要额外的处理时间。选择这些时间点是为了公平地比较ADC和Dex的峰值活性。
在LPS i.p.注射后2或4h采集血液，并且分离血浆用于细胞因子分析。
测试剂和剂量
抗体
·INX201(Aragen，批号BP-3200-019-6)是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235A/E269R/K322A沉默突变的人源化抗人VISTA抗体。
·huIgG1si(Aragen，批号BP-2211-018-6)是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的E269R/K322A沉默突变的抗RSV mAb。
·INX201J(Abzena，批号JZ-0556-025-1、批号JZ-0556-027、批号JZ-0556-013)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的药物/抗体比(DAR)缀合的INX201抗体。接头/有效载荷(J)基于先前报道的接头/有效载荷(US 15/611,037)(2)。它由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX J-2)。
·huIgG1si J(Abzena，批号JZ-0556-025-2)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的DAR与INX J接头/有效载荷缀合的huIgG1si抗体。
·INX201N(Abzena，批号JZ-0556-028)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的DAR缀合的INX201。接头/有效载荷(INX N)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX-SM-1)。
·INX201O(Abzena，批号JZ-0556-016-2)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的DAR缀合的INX201。接头/有效载荷(INX O)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX-SM-4)。
·INX201P(Abzena，批号JZ-0556-016-1)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的DAR缀合的INX201。接头/有效载荷(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX-SM-3)。
·INX233(ATUM批号82276.1.a)是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235A/E269R/K322A沉默突变的人源化抗人VISTA抗体。
·INX233P(Abzena，批号PP-0924-001-3)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的DAR缀合的INX233。接头/有效载荷(INX P)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX-SM-3)。
·INX231(ATUM批号72928.1.a)是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235A/E269R/K322A沉默突变的人源化抗人VISTA抗体。
·INX231R(Abzena，批号PP-0924-001-2)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的DAR缀合的INX231。接头/有效载荷(INX R)由中性蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX-SM-3)。
·INX231S(Abzena，批号PP-0920-014-1)是经由链间二硫键的修饰以6.9的DAR缀合的INX231。接头/有效载荷(INX S)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与醋酸氟轻松类似物有效载荷组成(INX-SM-24)。
·INX231V(Abzena，批号PP-0920-014-2)是经由链间二硫键的修饰以7.8的DAR缀合的INX231。接头/有效载荷(INX V)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX-SM-32)。
·INX231W(Abzena，批号PP-0920-014-3)是经由链间二硫键的修饰以7.5的DAR缀合的INX231。接头/有效载荷(INX W)由带正电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX-SM-3)。
·INX231J(Abzena，批号JZ-0556-013-1)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的药物/抗体比(DAR)缀合的INX231抗体。接头/有效载荷(J)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX J-2)。
·INX234J(Abzena，批号JZ-0556-013-3)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的药物/抗体比(DAR)缀合的INX234抗体。接头/有效载荷(J)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX J-2)。
·INX240 J(Abzena，批号JZ-0556-013-3)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的药物/抗体比(DAR)缀合的INX240抗体。接头/有效载荷(J)由带负电荷的蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成(INX J-2)。
将抗体稀释在PBS中并且以0.2ml的体积腹膜内(i.p.)注射以递送指定剂量。
地塞米松
将来自Phoenix的地塞米松无菌注射剂NDC 57319-519-05在PBS中稀释并且经由i.p.注射如所述进行给药。
LPS
LPS获自AMSBIO(#9028)。小鼠以0.5mg/Kg进行给药。
小鼠
hVISTA小鼠是现场繁育的(在Dartmouth的比较医学和研究中心)。所有实验均在以9至15周龄之间入组的雌性小鼠中进行。
抽血和准备
使用首先用肝素冲洗以防止凝血的玻璃巴斯德移液器从眼眶后腔收获外周血。然后将血液以550rcf离心5min，并且收集血浆并储存在-80℃下，然后进行细胞因子分析。
血浆细胞因子分析
使用Millipore平台的细胞因子分析
使用Millipore小鼠5或7-plex平台对25μl血浆进行细胞因子分析。对于ADC-INVIVO-30和35，免疫监测实验室(IML，Dartmouth-Hitchcock Norris Cotton CancerCenter的共享资源)进行了分析。
分析中包括的细胞因子是MIP-1α、TNFα、IL-1β、IL-12p40和MIG，并且如下经由ELISA进行检测：
·BioLegend(目录号430904)ELISA MAX Deluxe Set Mouse TNF-α
·BioLegend(目录号431604)ELISA MAX Deluxe Set Mouse IL-12/IL-23(p40)
按照制造商提供的方案进行ELISA。
当对于IL-12p40低于20pg/ml阈值和/或对于TNF-α低于10pg/ml阈值时，将细胞因子数据删失，因为它表明LPS注射失败。
细胞分离
在安乐死之后，在小鼠腹腔内注射7ml的PBS/0.5％ BSA/2mM EDTA。对腹膜进行短暂按摩之后，切开一个小切口，并且收集腹腔灌洗液。使用阴性选择(Miltenyi试剂盒，ref130-110-434)分离PRM。将脾脏解剖并且机械解离；使用阴性选择(干细胞，EasySepTM小鼠CD11b阳性选择试剂盒II)分离单核细胞。
RNA制备和实时PCR
将来自不同组织的细胞沉淀物重悬于来自RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen,PN:74136)的0.4ml RNeasy裂解缓冲液中，并且用20G针头均化5次。按照制造商的说明书分离RNA，并且在30或40μl H2O(不含核糖核酸酶/脱氧核糖核酸酶)中进行洗脱。使用Nanodrop通过UV光谱评估RNA浓度。
使用Taqman逆转录试剂(#N8080234)并且按照制造商的说明书进行逆转录。
使用Taqman master mix 2X试剂盒(#4369016)和小鼠FKBP5的Taqman引物(Mm00487401_m1)，并且使用小鼠HPRT作为管家基因(Mm446968_m1)进行定量实时PCR并且在来自Applied Biosystem的QuantStudio3上运行。
将Ct数据转换为ΔCt(FKBP5标准化为样品内的HPRT)，然后转换为ΔΔCt(处理过的样品相比于PBS对照的FKBP5相对水平)以获得相对于PBS的Log2倍数变化。
结果
实验1：INX201J在LPS诱导的细胞因子释放中的体内功效评价
如图27所示，用10mg/Kg的INX201J治疗在控制LPS诱导的IL-12p40释放中表现出与2mg/Kg的Dex相似的功效。需要注意的是，10mg/kg的INX201J递送0.2mg/Kg摩尔当量的GC有效载荷，在所述剂量下Dex仅具有部分功效。
在此实验中，我们还评价了我们的ADC是否需要比游离Dex更多的时间来处理。我们证明，当与LPS前2h相比时，当ADC在LPS注射之前17h给药时，功效得到改善。在LPS后2与4h之间未注意到细胞因子反应的差异，并且对于我们接下来的所有研究，我们仅在2h时间点采集血浆。图27示出了外周血中LPS后2(左)和4h(右)的IL-12p40变化。使用小鼠多路复用测量了血浆浓度；给药：Dex(方形)在LPS刺激之前2h以0.02、0.2、2和5mg/Kg给药，INX201J(圆形)在LPS注射之前2或17h以10mg/Kg(提供0.2mg/Kg的GC)给药。仅PBS组(灰色实心三角形)表示不存在刺激情况下的基线细胞因子水平；PBS+LPS(黑色实心三角形)(SEM；n＝5/组，除非因技术失败被排除在分析之外；与PBS+LPS组相比的普通单因素方差分析)。
实验2：LPS诱导的细胞因子释放中的INX201J剂量反应
在此实验中，我们评价了在更高稀释度下的INX201J抗炎性质。如图28所示，对于除MIG之外的所有分析的细胞因子，10mg/Kg(0.2mg/Kg的有效载荷)的INX201J与2mg/Kg的Dex具有相同的功效，而0.2mg/Kg的Dex与INX201J相比具有降低的功效。INX201J当稀释在0.06和0.02mg/Kg的有效载荷时仍然表现出一些功效。
我们还测试了当在LPS前17h注射时Dex的功效，正如对INX201J所做的那样。如所预期，由于Dex的半衰期短，当与LPS前2h给药的组相比时，所述组的效力有所损失，这表明INX201J可能对细胞因子产生具有增加的药效学影响。图28示出了外周血中LPS后2h的细胞因子变化。使用小鼠5-plex测量的血浆浓度；给药：Dex在LPS刺激之前2h以0.002、0.02、0.2、2mg/Kg(方形)或在LPS前17h以2mg/Kg(黑色实心方形)进行给药，INX201J(圆形)在LPS注射之前17h以0.02、0.06、0.2mg/Kg的GC有效载荷进行给药。仅PBS组(实心灰色三角形)表示不存在刺激情况下的基线细胞因子水平；PBS+LPS(实心黑色三角形)(SEM；n＝5/组，除非因技术失败被排除在分析之外；与PBS+LPS组相比的普通单因素方差分析)。
实验3：LPS诱导的细胞因子释放中的INX201J剂量反应
在此实验中，我们比较了0.2和0.06mg/Kg的GC有效载荷的INX201J与2和0.2mg/Kg的游离Dex的功效。如图29所示，0.2mg/Kg的GC有效载荷的INX201J与2mg/Kg的Dex在控制对LPS的TNFα反应方面表现出相当的功效。0.06mg/Kg的GC有效载荷的INX201J仍然比0.2mg/Kg的Dex表现出更高的功效。注射与相同有效载荷缀合的对照人IgG1沉默的对照组在防止TNFα上调方面表现出一定水平的功效。
图29示出了外周血中LPS后2h的TNFα变化。使用ELISA测量的TNFα血浆浓度；给药：Dex在LPS刺激之前2h以0.2和2mg/Kg进行给药(方形)，INX201J(圆形)在LPS注射之前17h以0.06和0.2mg/Kg的GC有效载荷进行给药。PBS组(实心黑色三角形)在LPS前2h接受PBS。IgG1siJ(G1siJ)组(三角形)在LPS前17h以0.2mg/Kg的有效载荷接受与GC缀合的人IgG1沉默。(SEM；n＝5/组，除非因技术失败被排除在分析之外；与PBS组相比的普通单因素方差分析)。
实验4：INX201J相比于地塞米松在LPS诱导的细胞因子释放中的体内功效评价
如图30所示和上述实验中观察到的，0.2mg/Kg的GC有效载荷的INX201J在控制LPS诱导的细胞因子反应方面与2mg/Kg的Dex具有相似的功效。此外，INX201N在控制TNFα反应方面没有功效，可能是由于在体内此接头/有效载荷的释放产物的切割效率低或形成微聚集体。具体地，图30示出了外周血中LPS后2h的TNFα变化。通过ELISA测量了TNFα血浆浓度；给药：Dex在LPS刺激之前2h以0.2和2mg/Kg进行给药(方形)，INX201J(圆形)和INX201N(倒三角形)在LPS注射之前17h以0.2mg/Kg的GC有效载荷进行给药。PBS组在LPS前2h接受PBS(实心黑色三角形)。(SEM；n＝5/组，除非因技术失败被排除在分析之外；与PBS组相比的普通单因素方差分析)。
实验5：INX231J、INX234J和INX240 J相比于INX201J在LPS诱导的细胞因子释放中的体内功效评价
我们接下来评价了与相同INX J有效载荷缀合的3种不同的抗VISTA抗体。如图31所示，INX231J、INX234J和INX240 J在控制LPS诱导的细胞因子反应方面表现出与INX201J相似的效力。具体地，图31示出了外周血中LPS后2h的TNFα(左)和IL-12p40(右)变化。通过ELISA测量了细胞因子血浆浓度；给药：PBS(实心圆形)、INX201J(方形)、INX231J(三角形)、INX234J(菱形)和INX201P(倒三角形)在LPS注射之前17h以0.2mg/Kg的GC有效载荷进行给药(SEM；n＝5/组；与PBS组相比的普通单因素方差分析)。
实验6：INX201O和INX201P相比于INX201J在LPS诱导的细胞因子释放中的体内功效评价
如图32所示，INX201P在控制LPS诱导的细胞因子反应方面表现出与INX201J相似的功效，而INX201O具有降低的功效)。所有ADC均以10mg/Kg给药，递送0.2mg/Kg的有效载荷。具体地，图32示出了外周血中LPS后2h的TNFα(左)和IL-12p40(右)变化。通过ELISA测量了细胞因子血浆浓度；给药：PBS(实心三角形)、INX201J(圆形)、INX201O(方形)和INX201P(菱形)在LPS注射之前17h以0.2mg/Kg的GC有效载荷进行给药(SEM；n＝5/组，除非因技术失败被排除在分析之外；与PBS组相比的普通单因素方差分析)。
实验7：INX201O和INX201P相比于INX201J在LPS诱导的细胞因子释放中的体内功效评价-剂量反应研究
如实验6中所观察到的，与INX201J相比，INX201O表现出降低的功效。相比之下，INX201P和INX201J在控制IL-12p40和TNFα对LPS的反应方面表现出相似的效力。需要注意的是，在0.06mg/Kg的有效载荷的情况下，仍然存在细胞因子反应的有效控制(图33)。具体地，图33示出了外周血中LPS后2h的TNFα(右)和IL-12p40(左)变化。
通过ELISA测量了细胞因子血浆浓度；给药：PBS、INX201J(圆形)、INX201O(方形)和INX201P(菱形)在LPS注射之前17h以0.2mg/Kg的GC有效载荷进行给药(SEM；n＝5/组，除非因技术失败被排除在分析之外；与PBS组相比的普通单因素方差分析(实心黑色三角形))。
实验8：INX231R、INX233P相比于INX231P在LPS诱导的细胞因子释放中的体内功效评价
如图34所示，INX231R(中性二肽接头)对IL-12p40诱导几乎没有影响，但在LPS注射后TNFa显著降低。相比之下，INX233P与INX231P具有相似的功效(均具有带负电荷的二肽接头)。所有ADC均以10mg/Kg给药，递送0.2mg/Kg的有效载荷。具体地，图34示出了外周血中LPS后2h的TNFα(右)和IL-12p40(左)变化。通过ELISA测量了细胞因子血浆浓度；所有ADC和PBS在LPS注射之前20h以0.2mg/Kg的GC有效载荷进行给药(INX231P(方形)、INX231R(三角形)、INX233P(菱形))(SEM；n＝5/组，除非因技术失败被排除在分析之外；与PBS组相比的普通单因素方差分析(实心圆形))。
实验9：INX231R、INX201O、INX231S、INX231V和INX231W相比于INX231P在LPS诱导的细胞因子释放中的体内功效评价
如实验8中所观察到的，INX231R的功效低于INX231P，并且与INX231W的表现相似，主要对TNFa产生影响。INX231S和INX231V表现出与INX231P相似的功效。最后，如先前的两个实验(第5.6节和第5.7节)中所观察到的，与其他ADC相比，INX201O表现出降低的功效(图35)。在此实验中，一些ADC的DAR低于8，因此调整ADC给药以递送0.2mg/Kg的有效载荷。
具体地，图35示出了外周血中LPS后2h的TNFα(右)和IL-12p40(左)变化。通过ELISA测量了细胞因子血浆浓度；所有ADC和PBS在LPS注射之前20h以0.2mg/Kg的GC有效载荷进行给药(INX231P(实心方形)、INX231R(实心三角形)、INX201O(实心菱形)、INX231S(圆形)、INX231V(方形)、INX231W(三角形))(SEM；n＝4/组，除了INX231S因2个技术失败被排除在分析之外；与PBS组(实心圆形)相比的普通单因素方差分析未示出显著性数据)。
实验10：INX231R、INX201O、INX231S、INX231V和INX231W相比于INX231P对FKBP5转录影响的比较
如本文所示，腹膜定居巨噬细胞(PRM)对ADC非常敏感，并且可以通过实时定量PCR(RT-qPCR)测量GC对GC靶标FKBP5的影响。
在LPS治疗后第3天(ADC给药后4天)分离PRM，提取RNA并且对FKBP5进行RT-qPCR。如图36所示，除INX201O之外，所有ADC均诱导有效FKBP5转录，证明GC有效载荷的正确递送以及至少4天的药效学范围)。具体地，图36示出了ADC治疗后4天腹膜定居中ADC治疗之后的FKBP5转录激活。ADC在第0天i.p.注射，各自递送0.2mg/Kg的GC有效载荷；PRM在第3天被分离。FKBP5转录水平通过实时PCR来测量，并且表示为与PBS对照组相比的Log2倍数变化(SEM，与PBS组相比的普通单因素方差分析，n＝4)。
结论
如本文所公开的，已经合成了包含不同抗VISTA抗体的不同ADC，这些抗体在生理pH下结合VISTA，并且所述抗体还都具有短PK和不同的互补决定区(CDR)和不同的GC有效载荷。
数据表明使用INX201、INX231、INX234、INX240或INX233中的每一者的免疫细胞靶向的GC递送：
·有效降低LPS诱导的细胞因子反应；
·允许与递送约10分之一更低剂量的GC(基于mg/Kg有效载荷)相似的效力；
·可能导致GC的药效学持续时间增加。
此外，我们评价了类似于INX P接头有效载荷的缀合物，其中二肽接头的电荷发生变化。这些包括正电荷(INX W)、中性电荷(INX R)和负电荷(INX P)。这些结果表明：
·带正电荷的INX W和中性INX R在这个模型中都有效，但带负电荷的INX P更有效。
·所有二肽接头变体(正、负和中性)均表现出至少4天的药效学范围，如GC报告基因FKBP5的高水平表达所证明。
我们进一步评价了具有4种布地奈德类似物接头/有效载荷INX N、INX O、INX P和INX V的缀合物(除了最初的INX J接头/有效载荷)，这些缀合物改变了有效载荷的结构。这些结果表明：
·缀合的INX N接头/有效载荷在短期LPS激活模型中没有效力，可能反映了INX N释放产物缺乏有效切割或形成微聚集体。
·缀合的INX O接头/有效载荷在此模型中具有影响，但与缀合的INX J、INX P或INX V接头/有效载荷相比表现出降低的效力。
·缀合的INX P表现出与缀合的INX J和INX V接头/有效载荷相似的功效。
·缀合的INX P、INX V和INX J接头有效载荷(参见技术报告ADCINVIVO.04)表现出至少4天的药效学范围，如GC报告基因FKBP5的高水平表达所证明。
·在不破坏效力的情况下，可以容忍某些有效载荷改变。
我们评价了具有氟轻松丙酮类似物(INX S)的缀合物与其布地奈德类似物对应物(INX P)的比较。这些结果表明：
·INX231P和INX231S具有相似的功效。
·INX231P和INX231S都表现出至少4天的药效学范围，如GC报告基因FKBP5的高水平表达所证明。
实施例8：抗VISTA抗体药物缀合物对非VISTA表达细胞的影响有限
在此实施例中描述的实验中评估了示例性ADC对非靶标(非VISTA)表达细胞的影响，并且示出在图37中。这些研究的目的是验证与游离地塞米松(Dex)相比本发明ADC对表达VISTA的细胞/组织的靶向特异性。为了监测/证实GC递送和活性，我们通过定量实时PCR(qRT-PCR)测量了FKBP5(敏感的早期GC反应基因)的转录激活(Vermeer等人,(2003)Glucocorticoid-induced increase in lymphocytic FKBP51 messenger ribonucleicacid expression:a potential marker for glucocorticoid sensitivity,potency,andbioavailability.J Clin Endocrinol Metab.Jan；88(1):277-84)。在下文详细公开的这些实验中，INX201J或游离Dex经由腹膜内(i.p.)注射体内递送，然后从肝脏、脑和肾上腺分离表达VISTA的脾细胞和非VISTA表达细胞。然后提取RNA并且评价FKBP5转录水平。
材料和方法
方法
在小鼠安乐死和细胞分离之前2h i.p.注射Dex，这对应于峰值FKBP5诱导。在小鼠安乐死和细胞分离之前20h注射INX201J，从而为ADC处理和峰值FKBP5诱导提供足够的时间。包括仅注射PBS的对照组以确定FKBP5转录物基线。
测试剂和剂量
抗体
·INX201(Aragen，批号BP-3200-019-6)是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235A/E269R/K322A沉默突变的人源化抗人VISTA抗体。
·INX201J(Abzena，批号JZ-0556-025-1、批号JZ-0556-027、批号JZ-0556-013)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的药物/抗体比缀合的INX201抗体。接头/有效载荷(J)由蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成。
将这些抗体稀释在PBS中并且以0.2ml的体积腹膜内(i.p.)注射以递送指定剂量。
地塞米松
将来自Phoenix的地塞米松无菌注射剂NDC 57319-519-05在PBS中稀释并且经由i.p.注射如所述进行给药。
小鼠
hVISTA KI小鼠是现场繁育的(在Dartmouth的比较医学和研究中心)。所有实验均在以9至15周龄之间入组的雌性小鼠中进行。
细胞分离
在安乐死之后，将脾脏、肝脏、肾上腺和脑解剖并且机械解离。在40μm过滤器上通过之后，将细胞沉淀物重悬在RNA裂解缓冲液中(参见下文)。
RNA制备和实时PCR
将来自不同组织的细胞沉淀物重悬于来自RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen,PN:74136)的0.4ml RNeasy裂解缓冲液中，并且用20G针头均化5次。按照制造商的说明书分离RNA，并且在30或40μl H2O(不含核糖核酸酶/脱氧核糖核酸酶)中进行洗脱。在Nanodrop上评估RNA浓度。
使用Taqman逆转录试剂(#N8080234)并且按照制造商的说明书进行逆转录。使用Taqman master mix 2X试剂盒(#4369016)和小鼠FKBP5的Taqman引物(Mm00487401_m1)，并且使用小鼠HPRT作为管家基因(Mm446968_m1)进行定量实时PCR并且在来自AppliedBiosystem的QuantStudio3上运行。
将Ct数据转换为ΔCt和ΔΔCt或对PBS的Log2倍数变化。
结果
简而言之，使用来自Miltenyi的肝解离试剂盒和肝内皮细胞分离试剂盒(分别为130-105-807和130-092-007)以从hVISTA KI小鼠中分离肝内皮细胞。如图37所示，CD45阴性(非免疫)CD31阳性(内皮)细胞表现出高水平的VISTA表达(红线VISTA；实心灰色无抗体)。具体地，图37表明，VISTA在肝内皮细胞，特别是从hVISTA敲入小鼠肝脏中分离并且用抗人VISTA染色(红线，右移)或未染色(实心灰色)的CD45-CD31+非免疫内皮细胞中高度表达。
在图38所示的实验中，我们评价了INX201J相比于Dex对雌性hVISTA KI小鼠的非VISTA表达组织(肾上腺、脑和肝脏)和表达VISTA的脾脏的影响。具体地，如图38所示，INX201J注射后肾上腺、脑、肝脏和脾脏中的FKBP5转录激活。INX201J效果在0.3、3、10mg/Kg(分别递送0.006、0.06和0.2mg/Kg的有效载荷)的单一1次i.p.注射后20h测量。Dex在0.2或2mg/Kg的单次i.p.注射后2h测量。FKBP5转录水平通过实时PCR来测量，并且表示为与PBS对照组的平均值相比的Log2倍数变化。(n＝4小鼠/组；与仅PBS组相比的普通单因素方差分析)。
从图38中的结果可以看出，在INX201J注射后在肾上腺和脑中没有检测到高于基线的信号，而2mg/Kg的Dex导致肾上腺FKBP5转录物的轻微增加和脑FKBP5转录物的稳健增加。在肝脏中，0.2mg/Kg有效载荷的INX201J或Dex检测到了相似水平的FKBP5，而在2mg/Kg的Dex检测到了提高水平的FKBP5。
此外，在脾脏中观察到INX201J的明显剂量依赖性诱导，当与0.2mg/Kg有效载荷的Dex相比时，0.2mg/Kg有效载荷的INX201J的FKBP5信号增加了10倍。相比之下，Dex的相当的反应只有在2mg/Kg时才达到。
结论
数据表明，3和10mg/Kg(0.06和0.2mg/Kg的有效载荷)的INX201J在表达VISTA的脾细胞，而不是肾上腺或脑中诱导FKBP5表达(图38)。在肝脏中，当以3和10mg/Kg(0.06和0.2mg/Kg的有效载荷)给药时，INX201J适度诱导FKBP5，可能是由于此组织的免疫细胞丰度和肝内皮细胞中的稳健VISTA表达(图38)。相比之下，2mg/Kg治疗剂量的Dex诱导脾细胞中的FKBP5诱导，并且此相同剂量在脑和肝脏中诱导稳健水平的FKBP5，并且在肾上腺中诱导适度水平的FKPB5。
实施例9：INX S类固醇有效载荷在人外周血单核细胞中的体外效力研究
在此实施例中，我们评估了不同类固醇有效载荷在人外周血单核细胞中的体外效力。LPS的存在导致PBMCS增殖和细胞因子释放(Jansky,L.,Reymanova,P.,和Kopecky,J.(2003),“Dynamics of cytokine production in human peripheral blood mononuclearcells stimulated by LPS,or infected by Borrelia”,Physiological Research,52(5),593-5981)。因此，本研究的目的是评价新型类固醇在体外炎症模型中的效力。
材料和方法
方法
在LPS刺激的人外周血单核细胞(PBMCS)模型中评估了新型类固醇的效力。在此测定中刺激的PBMC会产生多种促炎细胞因子1。在这些研究中，类固醇效力是通过相对于不治疗，24小时以剂量依赖性方式减少刺激相关细胞因子表达的能力来判断的。
本研究的目的是评价在ImmuNext产生的新型糖皮质激素(鉴定为INX-SM-GC)在良好表征的体外炎症模型中的效力。当用LPS刺激时，人PBMCS会产生几种促炎细胞因子，而糖皮质激素(GC)可以显著抑制这种细胞因子反应。在我们的研究中，我们使用布地奈德(非常有效且临床上相关的GC)作为比较物。
材料和方法
实验设计
在以下所有实验中，将每个实验从1-2名健康供体中分离出的人PBMC用LPS刺激以诱导细胞因子产生。将细胞用连续稀释的糖皮质激素(1000–0.2nM)共处理，以确定单个药物的剂量依赖性效力，布地奈德作为阳性对照。
在初步实验中，我们将IL-6和IL-1b确定为高GC反应性细胞因子。因此，在将PBMCS与GC一起孵育24h之后，收集细胞上清液并且经由ELISA评估IL-6和IL-1β细胞因子水平。
试剂
测试有效载荷
·布地奈德：10mM在DMSO中
·INX-SM-1(Abzena)：5mM在DMSO中
·INX-SM-2(Abzena)：2mM在DMSO中
·INX-SM-3(O2H)：10mM在DMSO中
·INX-SM-53(O2H)：10mM在DMSO中(INX-SM-3的S立体异构体)
·INX-SM-4(O2H)：20mM在DMSO中
·INX-SM-54(O2H)：10mM在DMSO中(INX-SM-4的S立体异构体)
·INX-SM-6(O2H)：10mM在DMSO中
·INX-SM-56(O2H)：10mM在DMSO中(INX-SM-6的S立体异构体)
·INX-SM-7(O2H)：2mM在DMSO中
·INX-SM-9(O2H)：2mM在DMSO中
·INX-SM-10(O2H)：2mM在DMSO中
·INX-SM-13(O2H)：2mM在DMSO中
·INX-SM-24(O2H)：2mM在DMSO中
·INX-SM-31(O2H)：2mM在DMSO中
·INX-SM-32(O2H)：2mM在DMSO中
·INX-SM-33(O2H)：2mM在DMSO中
·INX-SM-35(O2H)：2mM在DMSO中
·INX-SM-74(O2H)：2mM在DMSO中(INX-SM-24的S立体异构体)
细胞培养基
·不含L-谷氨酰胺的RPMI 1640(VWR目录号16750-084)
·青霉素/链霉素/谷氨酰胺(ThermoFisher目录号10378016)
·1M Hepes(Gibco目录号15630-080)
·人AB血清(Valley Biomedical目录号HP1022HI)
其他试剂
·来自大肠杆菌(Escherichia coli)O111:B4的脂多糖(Sigma目录号L2630)
·Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare目录号17-1440-03)
ELISA试剂盒
·人IL-6ELISA MAX Deluxe(Biolegend目录号430504)
·人IL-1βELISA MAX Deluxe(Biolegend目录号437004)
PBMCS制备
将人PBMC在无菌条件下从获得自献血者项目(Dartmouth Hitchcock MedicalCenter，来自去识别健康人供体)的单采锥体细胞中分离出来。
将血液转移到50ml Falcon管中并且用PBS稀释至30ml。使13ml的Histopaque1077(Sigma Aldrich)在血液下缓慢分层，并且将管在室温下以850x g离心20min，温和加速且无制动。
从血浆/Ficoll分界面收集单核细胞，重悬于50ml的PBS中并且以300x g离心5min。将细胞重悬于PBS中，并且进行计数。
测定方案
将分离的PBMC重悬在含有10％人A/B血清、10mM Hepes、1x青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺的RPMI 1640(测定介质)中。
将细胞以150,000个细胞/孔的终浓度铺种在平底96孔板中，每种条件下都具有技术重复份。
将测试剂在测定介质中连续稀释并且添加至1,000nM-1nM或0.2nM的终浓度(取决于测定)或作为无处理对照。
将LPS刺激添加至1ng/ml的终浓度。
将细胞置于37℃的5％ CO2培养箱中24h，然后收获上清液。
根据供应商方案，将人IL-1β和IL-6ELISA试剂盒用于上清液。
所有图表均使用GraphPad(Prism)制作。
结果
实验1：类固醇有效载荷INX-SM-3、INX-SM-53、INX-SM-4、INX-SM-54和INX-SM-1对LPS刺激的人PBMC细胞因子产生的抑制效果的评估
在图39所示的此实验中，我们评价了新型INX-GC有效载荷INX-SM-3、INX-SM-4、INX-SM-1、INX-SM-53和INX-SM-54的抗炎效力。测试了来自一个供体的PBMCS。如图35所示，INX-SM-3、INX-SM-4和INX-SM-1抑制IL-1β和IL-6两者产生，INX-SM-3是这三者中最有效的化合物。相比之下，缩醛位置的S立体异构体——INX-SM-53和INX-SM-54——没有表现出抑制。
从图39中的数据可以看出，INX-SM-3、INX-SM-4和INX-SM-1抑制IL-1β(左)和IL-6(右)产生。在24小时时测量了与1ng/mL LPS和类固醇有效载荷的连续稀释液(1000-1nM)一起孵育的人PBMCS的细胞因子水平，其中在对数刻度x轴上<1nM处绘制了未处理对照；n＝1供体，根据技术重复份绘制标准偏差。
实验2：评估类固醇有效载荷INX-SM-6和INX-SM-56的抑制效果，并且确认INX-SM-1、INX-SM-3和INX-SM-4对LPS刺激的人PBMC细胞因子产生的影响
在图40中的此实验中，我们确认了新型糖皮质激素有效载荷INX-SM-3、INX-SM-4、INX-SM-1的抗炎效力，并且评估了其他化合物INX-SM-6和INX-SM-56的效力。测试了来自一个供体的PBMCS。
如图40所示，INX-SM-1、INX-SM-3、INX-SM-4和INX-SM-6表现出对IL-1β产生的抑制。INX-SM-3似乎又是这些测试的化合物之中最有效的化合物。相比之下，缩醛位置的S立体异构体——INX-SM-56——没有表现出抑制。
具体地，在图40中，在24h时测量了与1ng/mL LPS和类固醇有效载荷的连续稀释液(1000-1nM)一起孵育的人PBMCS的细胞因子水平，其中在对数刻度x轴上<1nM处绘制了未处理对照；n＝1供体，根据技术重复份绘制标准偏差。
实验3：类固醇有效载荷INX-SM-9、INX-SM-31和INX-SM-35对LPS刺激的人PBMC细胞因子产生的抑制效果的评估
在此实验中，我们评价了新型糖皮质激素有效载荷INX-SM-9、INX-SM-31和INX-SM-35的抗炎效力。测试了来自两个供体的PBMCS。如图38的结果所示，INX-SM-9、INX-SM-35和INX-SM-31表现出对IL-1β产生的剂量依赖性抑制。INX-SM-31似乎是这些测试的化合物之中效力最低的化合物。具体地，图41表明，INX-SM-9、INX-SM-31和INX-SM-35抑制IL-1β(上)和IL-6(下)产生。在24小时时测量了与1ng/mL LPS和类固醇有效载荷的连续稀释液(1000-0.2nM)一起孵育的人PBMCS的细胞因子水平，其中在对数刻度x轴上<0.2nM处绘制了未处理对照；n＝2供体——示出了代表性供体。根据技术重复份绘制标准偏差。
实验4：类固醇有效载荷INX-SM-32对LPS刺激的人PBMC细胞因子产生的抑制效果的评估
在此实验中，我们评价了新型糖皮质激素有效载荷INX-SM-32的抗炎效力。使用来自第二个供体的PBMCS重复所述实验。如图42所示，INX-SM-32在IL-1β和IL-6产生中表现出剂量依赖性抑制。具体地，图42中的数据表明，INX-SM-32抑制IL-1β(上)和IL-6(下)产生。在24小时时测量了与1ng/mL LPS和类固醇有效载荷的连续稀释液(500-1nM)一起孵育的人PBMCS的细胞因子水平，其中在对数刻度x轴上<1nM处绘制了未处理对照；n＝2。示出了代表性供体。根据技术重复份绘制标准偏差。
实验5：类固醇有效载荷INX-SM-10和INX-SM-33对LPS刺激的人PBMC细胞因子产生的抑制效果的评估
在此实验中，我们评价了新型糖皮质激素有效载荷INX-SM-10和INX-SM-33的抗炎效力。测试了来自一个供体的PBMCS。如图43所示，INX-SM-10和INX-SM-33在IL-1β产生中表现出剂量依赖性抑制。INX-SM-33似乎是这些测试的化合物之中效力最低的化合物。
图43中的数据表明，INX-SM-10在IL-1β(上)和IL-6(下)产生中引发稳健抑制。INX-SM-33证明了对细胞因子产生的适度抑制。在24小时时测量了与1ng/mL LPS和类固醇有效载荷的连续稀释液(1000-0.5nM)一起孵育的人PBMCS的细胞因子水平，其中在对数刻度x轴上<0.5nM处绘制了未处理对照；n＝1供体，根据技术重复份绘制标准偏差。
实验6：类固醇有效载荷INX-SM-2、INX-SM-7、INX-SM-13、INX-SM-24和INX-SM-74对LPS刺激的人PBMC细胞因子产生的抑制效果的评估
在图44中的此实验中，我们评价了新型糖皮质激素有效载荷INX-SM-2和INX-SM-7的抗炎效力。此外，对INX-SM-13(C9卤化)、INX-SM-24(C6和C9卤化)和INX-SM-74(INX-SM-24的S立体异构体)相比于INX-SM-3(无卤化)进行评价以确定类固醇环卤化对这些化合物的影响。此实验使用来自单个供体的PBMCS。
具体地，图44中的数据示出了INX-SM-2和INX-SM-7对IL-1β产生的剂量依赖性抑制。具体地，图中表明，在24小时时测量了与1ng/mL LPS和类固醇有效载荷的连续稀释液(1000-0.16nM)一起孵育的人PBMCS的平均细胞因子水平，其中在对数刻度x轴上<0.16nM处绘制了未处理对照；n＝1，根据技术重复份绘制标准偏差。
此外，如图45所示，卤化对INX-SM-3效力的影响的评估表明，在INX-SM-24的C6和C9位置处氟化导致效力增加，超过非氟化的INX-SM-3。然而，仅在C9位置处进行氟化(INX-SM-13)不会导致效力增加超过非氟化的有效载荷(INX-SM-3)。值得注意的是，INX-SM-24的S立体异构体也表现出剂量依赖性效力。这与我们测试的几种非氟化的S立体异构体不同，所述几种非氟化的S立体异构体在类似的体外研究中没有表现出效力(INX-SM-53；INX-SM-54和INX-SM-56)。
图45中的数据表明，C6和C9两者卤化，而不是单独的C9卤化提供了增加的效力。在24小时时测量了与1ng/mL LPS和类固醇有效载荷的连续稀释液(1000-0.16nM)一起孵育的人PBMC的平均细胞因子水平，其中在对数刻度x轴上<0.16nM处绘制了未处理对照；n＝1，根据技术重复份绘制标准偏差。
结论
上面讨论的实验中的数据和图39-图45中包含的结果表明，我们产生的特定糖皮质激素在使用LPS激活的人PBMCS的体外测定中作为游离有效载荷表现出不同程度的剂量依赖性类固醇效力：
INX-SM-1、INX-SM-2、INX-SM-3、INX-SM-4、INX-SM-6、INX-SM-7、INX-SM-9、INX-SM-10、INX-SM-13、INX-SM-24、INX-SM-31、INX-SM-32、INX-SM-33、INX-SM-35、INX-SM-74
图45中的数据表明，C6和C9两者卤化，而不是单独的C9卤化提供了增加的效力。在24小时时测量了与1ng/mL LPS和类固醇有效载荷的连续稀释液(1000-0.16nM)一起孵育的人PBMCS的平均细胞因子水平，其中在对数刻度x轴上<0.16nM处绘制了未处理对照；n＝1，根据技术重复份绘制标准偏差。
观察到该系列的R立体异构体中INX-SM-31和INX-SM-33具有最低效力。卤化对INX-SM-3效力的影响的评估表明，在INX-SM-24的C6和C9位置处双卤化导致效力增加。然而，仅在C9位置处进行氟化(INX-SM-13)不会导致效力增加超过非氟化的有效载荷(INX-SM-3)。
在缩醛位置处含有S立体异构体的有效载荷——INX-SM-53、INX-SM-54和INX-SM-56——没有表现出效力。对此的例外是INX-SM-74，它在C9和C6位置处均被卤化，表现出中等效力，尽管比具有相同卤化的R立体异构体弱得多。
数据表明：
·类固醇结构能够适应C17/C16缩醛的多种替代的几何形状、环大小和结构同时保持效力。
·然而，只有在非卤化的类固醇的缩醛碳上的R异构体是可以接受的。值得注意的是，类固醇环上C6和C9位置的氟化的存在确实允许S异构体的效力，尽管比对应的R异构体弱得多。
a.R异构体：INX-SM-1、INX-SM-2、INX-SM-3、INX-SM-4、INX-SM-6、INX-SM-7、INX-SM-09、INX-SM-10、INX-SM-13、INX-SM-24、INX-SM-31、INX-SM-32、INX-SM-33、INX-SM-35，
b.S异构体：INX-SM-53、INX-SM-54、INX-SM-56、INX-SM-74(在C6/C9氟化)
实施例10：不同抗VISTA抗体的药代动力学评价
在此实施例中，进行了研究以确定根据本发明的各种抗人VISTA抗体的药代动力学(PK)，并且将其与来自BMS的pH敏感性抗人VISTA进行比较(767-IgG1.3,Johnston等人,2019)。
本实验的目的是1)确认由BMS/Five Prime Therapeutics描述的“pH敏感性”抗体与ImmuNext(INX)抗VISTA抗体相比具有显著不同的PK(与hIgG1相当)；2)评价更多INX抗VISTA抗体的PK。(参见图8、图10和图12中的INX200和其他INX抗体序列)；以及进一步评价更多其他抗VISTA抗体的PK(参见图8、图10和图12中的其他INX抗体序列)。
这些实验是在人VISTA敲入(hVISTA KI)小鼠中进行的，所述小鼠在小鼠VISTA基因的位置敲入了人VISTA cDNA，并且在RNA和蛋白质水平表达人VISTA。实验在雌性或雄性hVISTA KI小鼠中进行，并且在所有研究中，动物以10mg/Kg接受一剂抗体。通过ELISA量化外周血中的抗体量。
材料和方法
实验设计
实验1：将hVISTA KI小鼠分为2组，每组10只小鼠，分别在第0天用一剂10mg/Kg的人IgG1和INX200治疗。
实验2：将hVISTA KI小鼠分为2组，每组10只小鼠，分别在第0天用一剂10mg/Kg的人IgG1和767-IgG1.3治疗。
在两个实验中，在20min、4、24、48小时，然后在实验1的第5天和第8天以及实验2的第4天和第7天对五只小鼠进行眼眶后采血；通过ELISA量化循环抗体。这些结果分别在图46和图47中。
实验3：将hVISTA KI小鼠分为4组，每组15只小鼠，分别在第0天用一剂10mg/Kg的INX231、INX234、INX237和INX240治疗。每组五只小鼠在20min、4h、24h，然后在第2、3、4、5、8、11、14和21天进行眼眶后采血。这些结果在图48中。
实验4：将hVISTA KI小鼠分为4组，每组10只小鼠，分别在第0天用一剂10mg/Kg的INX901、INX904、INX907和INX908治疗。每组五只小鼠在30min、4h、24h，然后在第2、3、4、7和14天进行眼眶后采血。这些结果在图49中。
实验5：将hVISTA KI小鼠分为5组，每组4只小鼠，分别在第0天用一剂10mg/Kg的INX201J、INX231J、INX234J和INX240 J治疗。在第3天和第6天对小鼠进行眼眶后采血。这些结果在图50中。
测试剂和剂量
INX200(Aragen，批号BP-2875-019-6.1)是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235A沉默突变的人源化抗人VISTA抗体。
INX201(Aragen，批号BP-3200-019-6)是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235A/E269R/K322A沉默突变的人源化抗人VISTA抗体(可变结构域与INX200一样)。
人IgG1(BioXcell ref，批号659518N1)
767-IgG1,3(Aragen，批号BP-2985-019-6)是由Five Prime Therapeutics andBristol-Myers Squibb Company开发的在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235E/G237A沉默突变的抗人VISTA抗体。此抗体被设计以在低pH(例如pH 6)下结合，但在生理pH(pH 7.4)下具有最小结合。
INX231、INX234、INX237和INX240(分别为批号72928.1.a、批号72931.1.a、批号72934.1.a和批号73419.1.a)是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235A/E269R/K322A沉默突变的人源化抗人VISTA抗体。
INX201J、INX231J、INX234J和INX240 J(批号JZ-0556-027、批号JZ-0556-013-1、批号JZ-0556-013-2、批号JZ-0556-013-3)分别是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的药物抗体比(DAR)缀合的INX201、INX231、INX234、INX237和INX240。所述接头/有效载荷(J)基于由蛋白酶敏感性接头和布地奈德类似物有效载荷组成的专利报道的接头/有效载荷。
INX901、INX904、INX907和INX908是在天然人IgG2/κ主链上可变结构域分别匹配INX231、INX234、INX237和INX200/INX201的人源化抗人VISTA抗体。
所有抗体均在PBS中稀释，并且以0.2ml的体积在小鼠尾静脉静脉内注射，以递送10mg/Kg的剂量。
小鼠
hVISTA小鼠在Sage Labs(Boyertown,PA)繁育。8-12周龄的小鼠先在我们的隔离设施中过渡3周，然后转移到常规设施。在实验开始之前使小鼠适应1至2周。
抽血和准备
对动物采血每24小时不超过一次。每个小鼠组分为2或3个亚组，每个亚组5只小鼠，在第0天交替采血。在注射后第0天20min、4、24、48小时，然后在实验1的第5天和第8天以及实验2的第4天和第7天采集血液。在最初的24小时时间段内，基于静脉内注射的注册质量排除了一些数据。对于随后的时间点，只有成功进行静脉内注射的动物才进行采血。
对于实验3，在20min、4h、24h，然后在第2、3、4、5、8、11、14和21天对小鼠进行采血。
对于实验4，在30min、4h、24h，然后在第2、3、4、7、14天对小鼠进行采血。
使用首先用肝素冲洗以防止凝血的玻璃巴斯德移液器从眼眶后腔收获外周血。然后将血液以400rcf离心5min，并且收集血浆并储存在-80℃下用于分析(参见下文)。
抗体血液浓度分析
用于检测人IgG1的ELISA
首先，在室温(RT)下将96孔平底板(Thermo Scientific Nunc Immuno Maxisorp，目录号442404)用1μg/ml的在PBS中的小鼠抗huIgG Fcγ(Jackson ImmunoResearch，目录号209-005-098)包被一小时。
将孔用PT(含0.05％吐温20的PBS)洗涤3次，然后在室温下用PTB(含0.05％吐温20和1％ BSA的PBS)阻断1小时。将人IgG(Southern Biotech，目录号0150-01)用作阳性对照，并且将人IgG1(BioXcell，目录号BE0297)用于构建标准曲线。将孔用PT洗涤3次，然后将血浆样品在室温下以PTB中多达4种不同的稀释液(以拟合标准曲线)孵育1小时。
在用PT洗涤3次之后，将1/2000稀释的与HRP偶联的小鼠抗人IgG Fcγ(JacksonImmunoResearch，目录号209-035-098)用作检测试剂，并且在室温下孵育1小时。洗涤3次后，使用TMB(Thermo Scientific，目录号34028)作为比色底物揭示ELISA反应。在室温下5-10min之后，将反应用1M H2S04终止。
INX200的ELISA检测(实验1)
首先，在室温下将96孔平底板(与4.5.1相同)用1μg/ml的在PBS中的hIX50(人VISTA ECD，在Aragen Bioscience为ImmuNext生产)包被一小时。
在洗涤3次之后，将孔在室温下用PTB阻断一小时。将INX908(在AragenBioscience为ImmuNext生产)用作阳性对照，并且将INX200用于构建标准曲线。将孔用PT洗涤3次，然后将血浆样品在室温下以PTB中多达4种不同的稀释液(以拟合标准曲线)孵育1小时。
在用PT洗涤3次之后，将1/2000的小鼠抗人κ-HRP(Southern Biotech，目录号9230-05)用作检测试剂，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，使用TMB底物揭示ELISA反应。在室温下5min之后，将反应用1M H2S04终止。
767-IgG1.3的ELISA检测(实验2)
首先，在室温下将96孔平底板(和上文一样)用1μg/ml的在PBS中的小鼠抗huIgGFcγ(Jackson ImmunoResearch，目录号209-005-098)包被一小时。
在洗涤3次之后，将孔在室温下用PTB阻断一小时。将人IgG(Southern Biotech，目录号0150-01)用作阳性对照，并且将767-IgG1.3用于构建标准曲线。将孔用PT洗涤3次，然后将血浆样品在室温下以PTB中多达4种不同的稀释液(以拟合标准曲线)孵育1小时。
在PTB中洗涤3次之后，将1/2000的小鼠抗人IgG Fcγ-HRP(JacksonImmunoResearch，目录号209-035-098)用作检测试剂，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，按照制造商说明书使用TMB底物揭示ELISA反应。在室温下5min之后，将反应用1M H2S04终止。
用于实验3的ELISA
首先，将96孔平底板(与上述相同)在室温下用在PBS中的1mg/ml的hIX50(人VISTAECD，在Aragen Bioscience为ImmuNext生产)包被一小时。
在洗涤3次之后，将孔在室温下用PTB阻断一小时。将INX908(在AragenBioscience为ImmuNext生产)用作阳性对照，并且将INX231、INX234、INX237或INX240用于构建标准曲线。将孔用PT洗涤3次，然后将血浆样品在室温下以PTB中多达4种不同的稀释液(以拟合标准曲线)孵育1小时。
在PTB中洗涤3次之后，将1/2000的小鼠抗人IgG Fcγ-HRP(JacksonImmunoResearch，目录号209-035-098)用作检测试剂，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，按照制造商说明书使用TMB底物揭示ELISA反应。在室温下5min之后，将反应用1M H2S04终止。
用于实验4的ELISA
首先，将96孔平底板(与之前实验相同)在室温下用在PBS中的1mg/ml的hINX50(人VISTA ECD，在Aragen Bioscience为ImmuNext生产)包被一小时。
在洗涤3次之后，将孔在室温下用PTB阻断一小时。将INX201用作阳性对照，并且将INX231、INX234或INX240用于构建标准曲线。将孔用PT洗涤3次，然后将血浆样品在室温下以PTB中多达4种不同的稀释液(以拟合标准曲线)孵育1小时。
在PTB中洗涤3次之后，将1/2000的小鼠抗人IgG Fcγ-HRP(JacksonImmunoResearch，目录号209-035-098)用作检测试剂，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，按照制造商说明书使用TMB底物揭示ELISA反应。在室温下5min之后，将反应用1M H2S04终止。
用于实验5的ELISA
首先，将96孔平底板(与上述相同)在室温下用在PBS中的1mg/ml的hIX7(人VISTAECD在小鼠IgG2s主链上)包被一小时。
在洗涤3次之后，将孔在室温下用PTB阻断一小时。将INX901、INX904、INX907或INX908用作阳性对照并且用于构建标准曲线。将孔用PT洗涤3次，然后将血浆样品在室温下以PTB中多达4种不同的稀释液(以拟合标准曲线)孵育1小时。
在PTB中洗涤3次之后，将1/2000的小鼠抗人IgG Fcγ-HRP(JacksonImmunoResearch，目录号209-035-098)用作检测试剂，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，按照制造商说明书使用TMB底物揭示ELISA反应。在室温下5min之后，将反应用1M H2S04终止。
ELISA测定计算
LOQ的计算方法是将标准曲线的最低点乘以用于稀释样品的最低稀释因子。例如，如果最低标准点是0.3ng/mL并且最低标准稀释为1/400，则LOQ是0.1ug/mL，因为它以与报告样品相同的单位报告。
LOD是在样品OD无法与背景OD区分时确定的，大约0.01的OD。没有计算LOD的浓度，但0或0.001ug/mL的浓度分配用于绘图和PK计算目的。
在静脉内推注之后使用PKsolver程序进行非隔室分析(NCA)来测定抗体半衰期。
实验1-实验5的结果分别在图46-图50中。
图46包含比较INX200与人IgG1的PK的实验1的结果。示出了hVISTA KI小鼠注释时间点的抗体血浆浓度(SD；n＝5/组)。
图47包含比较767-IgG1,3与人IgG1的PK的实验2的结果。示出了hVISTA KI小鼠注释时间点的抗体血浆浓度(SD；n＝5/组)。
图48包含比较INX231、INX234、INX237和INX240的PK的实验3的结果。示出了hVISTA KI小鼠注释时间点的抗体血浆浓度(SD；n＝5/组)。左图以Log10显示y轴和x轴，而对于右图，只有y轴以Log10显示。
图49包含比较INX901、INX904、INX907和INX908的PK的实验4的结果。示出了hVISTA KI小鼠注释时间点的抗体血浆浓度(SD；n＝5/组)。
图50包含比较INX201J、INX231J、INX234J和INX240 J的PK的实验5的结果。示出了hVISTA KI小鼠注释时间点的抗体血浆浓度(SD；n＝4/组)。
这些实验中的数据显示如下：
实验1(图46)表明，由于靶标介导的药物处置(TMDD)，抗人VISTA抗体INX200在给药后24小时时无法在血浆中量化，而人IgG1对照显示IgG更典型的延长半衰期。
实验2(图47)表明，pH敏感性抗人VISTA 767-IgG1,3表现出与人IgG1对照抗体相似的PK，认为它与其VISTA靶标的结合有限并且不经受TMDD。
实验3(图48)结果表明，INX231、INX234、INX237和INX240在24小时之后仍然可检测到，并且INX237具有明显增加的半衰期。
实验4(图49)结果表明，将不同的IgG主链并到本发明INX抗体上没有明显改变抗体半衰期。
实验5(图50)结果表明，在所分析的2个时间点，进一步添加GC有效载荷似乎不会影响INX抗VISTA抗体的清除。
这些结果表明，本发明抗VISTA抗体和含有其的ADC具有的PK值和清除性质使其非常适合将所需的有效载荷，特别是类固醇有效载荷靶向递送至靶免疫细胞中。
实施例11：用INX201J相比于地塞米松长期治疗对皮质酮水平的影响
糖皮质激素会迅速合成并且从肾上腺分泌，以对应激作出反应。此外，在基础条件下，糖皮质激素以昼夜节律(circadian)和超昼夜节律(ultradian)(搏动)模式有节奏地释放。这些节律不仅对糖皮质激素靶器官的正常功能很重要，而且对HPA轴对应激的反应也很重要。大量研究表明，长期GC治疗对糖皮质激素节律的破坏与人和啮齿动物的疾病有关。在人中，最丰富的GC是皮质醇，在小鼠中，最丰富的GC是皮质酮。
基于上述，我们评估了使用示例性抗体药物缀合物(ADC)INX201J和与糖皮质激素(GC)有效载荷连接的抗人VISTA单克隆抗体长期治疗对HPA轴，特别是皮质酮基础水平的影响。如下所讨论，实验是在人VISTA敲入(hVISTA KI)中进行的，所述小鼠敲入了人VISTAcDNA代替小鼠VISTA基因，并且在RNA和蛋白质水平上表达人VISTA，表达模式与小鼠VISTA相同。实验是在雌性小鼠中进行的，这些小鼠首先适应特定的处理程序一周，所述处理程序随后将进行所有注射和采血，以限制应激诱导的GC基础水平的变化。
然后使小鼠经受注射，10或3mg/Kg(分别地，0.2或0.06mg/Kg的有效载荷)的INX201J或者2或0.2mg/Kg的地塞米松(Dex)。Dex每天给药持续4天，而INX201J在第1、3和4天给药。在第5天，对小鼠进行采血并且通过ELISA评估其皮质酮水平。
材料和方法
实验设计
实验在雌性hVISTA KI小鼠中进行。然后使小鼠经受注射：10或3mg/Kg(分别地，0.2或0.06mg/Kg的有效载荷)的INX201J，在第1、3和4天；或者2或0.2mg/Kg的地塞米松(Dex)，每天注射连续4天。包括每天接受PBS注射的对照组。在第5天，对小鼠进行采血并且通过ELISA评估其血浆皮质酮水平。
给药方案的基本原理基于其他研究(参见先前实施例)，这些研究表明，本发明ADC具有比Dex(<24h)更长的药效学范围(>96h)。
实验：(每组8只小鼠)
第1组：PBS
第2组：Dex 2mg/Kg
第3组：Dex 0.2mg/Kg
第4组：INX201J 10mg/Kg(0.2mg/Kg的有效载荷)
第5组：INX201J 3mg/Kg(0.06mg/Kg的有效载荷)
测试剂和剂量
抗体
INX201J(Abzena，批号JZ-0556-025-1、批号JZ-0556-027、批号JZ-0556-013)基于INX201，它是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235A/E269R/K322A沉默突变的人源化抗人VISTA抗体。INX201J是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的药物/抗体比缀合的缀合抗体。接头/有效载荷(J)由蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成。
将抗体稀释在PBS中并且以0.2ml的体积腹膜内(i.p.)注射以递送指定剂量。
地塞米松
将来自Phoenix的地塞米松无菌注射剂NDC 57319-519-05在PBS中稀释并且经由i.p.注射如所述进行给药。
小鼠
hVISTA小鼠是现场繁育的(在Dartmouth的比较医学和研究中心)。所有实验均在以9至15周龄之间入组的雌性小鼠中进行。
抽血和准备
使用首先用肝素冲洗以防止凝血的玻璃巴斯德移液器从眼眶后腔收获外周血。然后将血液以550rcf离心5min，并且收集血浆并储存在-80℃下，然后进行皮质酮分析。
皮质酮ELISA
使用阿伯测定(Arbor Assays)(目录号K014-H5)皮质酮5包ELISA试剂盒按照制造商随附方案进行ELISA。
结果
INX201J对皮质酮水平的影响有限
如图51所示，小鼠适应导致对照组的皮质酮水平相对一致，除了2只动物，一只表现出非常高的皮质酮水平，而另一只表现出非常低的皮质酮水平。图51在左侧示出了未删失的数据，在右侧示出了删失的(对照组中没有2个异常值)数据，并且示出了血浆皮质酮水平的变化。(SEM，单因素方差分析，n＝8，除了右图中的PBS对照组n＝6)。如所示，2mg/Kg的Dex显著降低了基础皮质酮水平，但在0.2mg/Kg时仅产生有限(尽管显著)的影响。相比之下，0.06mg/Kg有效载荷的剂量的INX201J没有影响，但在0.2mg/Kg的有效载荷下观察到有限的下降。
结论
数据表明，2mg/Kg的Dex显著降低皮质酮的基础水平，而在0.2mg/Kg时下降更有限，尽管仍然非常显著(P<0.001)。相比之下，0.2mg/Kg有效载荷(在治疗上相当于2mg/KgDex)的INX201J的影响更有限(ns或P<0.5)。在0.06mg/Kg时对皮质酮水平没有影响。(选择这些剂量是因为如先前实施例中所示，0.2mg/Kg有效载荷的INX201J与2mg/Kg的Dex具有相似的功效)。
实施例12：ADC对抗原特异性反应的影响
已知糖皮质激素(GC)对原发性免疫反应具有深远影响，并且可以显著影响IgG对疫苗的反应。因此，我们使用疫苗模型来评价主题抗体药物缀合物(ADC)在破坏抗原特异性反应中的功能性。如下文详细讨论，我们使用了标准免疫方案，组合了小鼠CD40激动剂抗体(FGK4.5)、作为模型抗原(Ag)的OVA肽SIINFEKL和TLR激动剂Poly(I:C)，它驱动有效的CD8T细胞驱动的Ag反应，可以使用四聚体技术进行测量。另一个好处是，此模型还允许我们通过在疫苗接种前治疗长达1周来评价我们的ADC的药效学范围。
如下文详细讨论，三项研究是在这种人VISTA敲入小鼠(hVISTA KI)中进行的，所述小鼠敲入了人VISTA cDNA代替小鼠VISTA基因，并且在RNA和蛋白质水平上表达人VISTA，表达模式与小鼠VISTA相同。简而言之，这些小鼠在免疫前长达7天被注射ADC。地塞米松(Dex)用作阳性GC对照。在免疫后第6天在抗Ag反应峰值时测量外周血中的免疫反应。
材料和方法
实验设计
所有4个实验均在雌性小鼠中进行，每组5只小鼠。
实验1：当免疫前2h施用时Dex对Ag特异性反应的影响
进行此实验(结果在图52中)以确认当免疫前2h施用时Dex对Ag特异性反应的影响，并且此实验在C57Bl/6小鼠中进行。
第1组：PBS
第2组：2mg/Kg的Dex
第3组：0.2mg/Kg的Dex
小鼠以2或0.2mg/Kg的Dex或PBS i.p.给药。两小时后，它们接受疫苗混合物i.p.注射。然后在6天之后对这些小鼠进行采血，并且量化Ag特异性CD8 T细胞数。
实验2：当在免疫前不同时间点施用时ADC INX201J对Ag特异性反应的影响
进行此实验(结果在图53中)以评价当在免疫前不同时间点施用时ADC INX201J对Ag特异性反应的影响，并且此实验在hVISTA KI小鼠中进行。
第1组：PBS
第2组：2mg/Kg的Dex
第3组：0.2mg/Kg的Dex
第4组：10mg/Kg的INX201J–d-1
第5组：10mg/Kg的INX201J–d-2
第6组：10mg/Kg的INX201J–d-4
在免疫之前2h对第1至3组的小鼠进行i.p.给药。在免疫前1、2或4天按指示对第4至6组的小鼠进行给药。所有小鼠在第0天进行免疫。然后在6天之后对所有这些动物进行采血，并且量化Ag特异性CD8 T细胞数。
实验3
进行此实验(结果在图54中)以评价当在免疫前不同时间点施用时多种ADC对Ag特异性反应的影响，并且此实验在hVISTA KI小鼠中进行。
第1组：PBS-疫苗前2h
第2组：2mg/Kg的Dex-疫苗前2h
第3组：0.2mg/Kg的Dex-疫苗前2h
第4组：2mg/Kg的Dex–d-7
第5组：10mg/Kg的INX201J–d-1
第6组：10mg/Kg的INX201J–d-7
第7组：10mg/Kg的INX231J–d-7
第8组：10mg/Kg的INX234J–d-7
第9组：10mg/Kg的INX240 J–d-7
在免疫之前2h对第1至3组的小鼠进行i.p.给药。在免疫前1或7天按指示对第4至9组的小鼠进行给药。所有小鼠在第0天进行免疫。然后在6天之后对所有这些动物进行采血，并且量化Ag特异性CD8 T细胞数。
实验4：多种与GC有效载荷(P)缀合的ADC对Ag特异性反应的影响
进行此实验(结果在图55中)以评价当在免疫前不同时间点施用时多种与GC有效载荷(P)缀合的ADC对Ag特异性反应的影响，并且此实验在hVISTA KI小鼠中进行。
第1组：PBS-疫苗前2h
第2组：2mg/Kg的Dex-疫苗前2h
第3组：10mg/Kg的INX201J–d-1
第4组：10mg/Kg的INX201J–d-7
第5组：10mg/Kg的INX231P–d-7
第6组：10mg/Kg的INX234P–d-7
第7组：10mg/Kg的INX240 P–d-7
在免疫之前2h对第1至2组的小鼠进行i.p.给药。在免疫前1或7天按指示对第3至7组的小鼠进行给药。所有小鼠在第0天进行免疫。然后在6天之后对所有这些动物进行采血，并且量化Ag特异性CD8 T细胞数。
测试剂和剂量
抗体
将INX201、INX231、INX234和INX240(分别为批号72928.1.a、批号72931.1.a和批号73419.1.a)用于这些实验中，所述实验全部包含在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235A/E269R/K322A沉默突变的人源化抗人VISTA抗体。
INX201J、INX231J、INX234J和INX240 J(批号JZ-0556-027、批号JZ-0556-013-1、批号JZ-0556-013-2、批号JZ-0556-013-3)分别包含经由链间二硫键的完全修饰以8.0的药物抗体比(DAR)缀合的INX201、INX231、INX234和INX240。接头/有效载荷(J)由蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成。
INX201P、INX231P、INX234P和INX240 P(批号JZ-0556-0271、批号JZ-0556-017-1、批号JZ-0556-017-2、批号JZ-0556-017-3)分别是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的药物抗体比(DAR)缀合的INX201、INX231、INX234和INX240。接头/有效载荷(P)由蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成。
将这些抗体中的每一者稀释在PBS中并且以0.2ml的体积腹膜内(i.p.)注射以递送指定剂量。
地塞米松
将来自Phoenix的地塞米松无菌注射剂NDC 57319-519-05在PBS中稀释并且经由i.p.注射如所述进行给药。
疫苗混合物
每只小鼠使用含50μg小鼠CD40激动剂抗体(克隆FGK4.5)+50μg SIINFEKL肽+50μgpoly(I:C)的抗体/肽/poly(I:C)标准免疫方案。将疫苗在PBS中稀释并且以200μl的终体积进行i.p.注射。
小鼠
hVISTA小鼠是现场繁育的(在Dartmouth的比较医学和研究中心)。所有实验均在以9至15周龄之间入组的雌性小鼠中进行。C57Bl/6小鼠购自Jackson Laboratories。
抽血和免疫染色
使用首先用肝素冲洗以防止凝血的玻璃巴斯德移液器从眼眶后腔收获外周血。使用允许绝对血细胞计数的1次洗涤方案。
将10μl抗体混合物(参见下文)直接添加到50或100μl血液中。在室温(RT)下孵育30min之后，将600μl BD FACS裂解缓冲液添加到样品中。在室温下孵育30min之后，将样品在550rcf下旋转5min，在PBS中洗涤一次，重悬在固定体积的PBS中。将整个样品在MacsQuant流式细胞仪上运行以获得绝对细胞数。
抗体组(Antibody panel)：
将以下抗体在PBS中稀释。
-CD11a–FITC(BioLegend；克隆2D7；0.5mg/ml)1:200
-H-2kb-OVA-PE四聚体(MBL iTag MHC四聚体目录号T03000；批号T1603004)；(10μl/样品)
-CD8-Alexa647(克隆KT15；MBL#D271-A64；1mg/ml)(1:800)。
-小鼠Fc阻断(1:200)
门控策略：
FSC与SSC–对淋巴细胞群门控。
FSC-H与FSC-A-单细胞群
对CD8+T细胞的门控
CD8+→CD11a+相比于Ova-tet+
结果
实验1
如上所述，进行图52中的实验以确认当免疫前2h施用时Dex对Ag特异性反应的影响，并且实验在C57Bl/6小鼠中进行。2mg/Kg的Dex显著降低了Ag特异性CD8 T细胞(OVAtet)的数量，并且在0.2mg/Kg时也观察到明显减少(参见图52)。具体地，图52示出了免疫后第6天来自外周血的Ag特异性CD8 T细胞数。(SEM，单因素方差分析，n＝5)。
实验2
如图53所示，当以0.2mg/Kg的GC有效载荷在免疫前24h、48h或96h给药时，INX201J在减少Ag特异性(Ova Tet+CD8 T细胞)反应方面表现出与以2mg/Kg在免疫前2h给药的Dex相似的功效。在此实验中，最后添加了来自2只初始小鼠的血液以提供基线对照。更具体地，图53示出了免疫后第6天来自外周血的Ag特异性CD8 T细胞数。在图53中，左边的图示出了包括所有样品的PBS对照组，右边的图示出了去除一个异常值的PBS对照组(SEM，单因素方差分析，除了初始外n＝5；一个样品被排除在Dex 0.2mg/Kg的组外作为免疫失败)。
实验3
在图54的实验中评价了四种不同的ADC。如其中所示，所有测试的ADC当免疫前1或7天以0.2mg/Kg的GC有效载荷给药时在减少Ag特异性(Ova Tet+CD8 T细胞)反应方面均表现出显著的功效。从中进一步可以看出，Dex当以2mg/Kg给药时表现出功效，但是在0.2mg/Kg时或者当在免疫前7天以2mg/Kg给药时失去功效。更具体地，图54示出了免疫后第6天来自外周血的Ag特异性CD8 T细胞数。在此实验中，由于处理期间的技术问题，必须排除多个样品：PBS组n＝3、2mg/Kg的Dex n＝2、0.2mg/Kg的Dex n＝3、INX201J D-1n＝5、INX201J D-7n＝2、INX231J D-7n＝3、INX234J D-7n＝5、INX240J D-7n＝4(SEM，单因素方差分析，D＝天)。
实验4
在图55中包含的此实验中，评价了各自与不同的GC有效载荷(P)缀合的4种ADC。如其中所示，当INX201P、INX231P和INX234P在免疫前1天或7天给药时，观察到Ag特异性(OvaTet+CD8 T细胞)反应的显著减少，这与在第0天以2mg/Kg给药的Dex的效果相当。只有INX240 P几乎没有功效。更具体地，图55示出了免疫后第6天来自外周血的Ag特异性CD8 T细胞数，并且此外，其中出于技术原因，排除了PBS组、INX231P组和INX234P组中的2个样品；对于所有其他组，n＝5(SEM，单因素方差分析)。
结论
如上所述，实验1-实验4中的数据显示以下内容：
(i)实验1表明，免疫前2h以2和0.2mg/Kg给药的Dex有效降低了Ag特异性反应；
(ii)实验2表明，当以0.2mg/Kg的GC有效载荷在免疫前24h、48h或96h给药时，示例性ADC缀合物INX201J在减少Ag特异性反应方面表现出与以2mg/Kg在免疫前2h给药的Dex相似的功效；
(iii)实验3表明，4种示例性ADC当免疫前1或7天以0.2mg/Kg的GC有效载荷给药时在减少Ag特异性反应方面表现出显著的功效。相比之下，Dex当以2mg/Kg给药时表现出功效，但是在0.2mg/Kg时或者当在免疫前7天以2mg/Kg给药时失去功效；以及
(iv)实验4示出了分别与不同的GC有效载荷缀合的4种示例性ADC。同样，当在免疫前1或7天给药时，除INX240 P之外，所有测试的ADC均观察到Ag特异性反应的显著降低。
总之，这些数据表明：
(i)以0.2mg/Kg的GC有效载荷给药的根据本发明的示例性VISTA Ab ADC在降低Ag特异性反应方面与以2mg/Kg给药的Dex具有相当的功效；
(ii)J和P GC有效载荷两者具有相当的效力；
(iii)虽然如果在免疫前7天注射，Dex会失去效力，但不同的ADC在控制Ag特异性反应的发展方面仍然具有显著的效力。
实施例13：抗VISTA抗体药物缀合物在OVA-哮喘小鼠模型中的功效
哮喘是一种复杂的炎症性疾病，临床上以气道高反应性、支气管肺泡灌洗液(BALF)和支气管壁中的炎症细胞浸润以及气道结构改变为特征。吸入性糖皮质激素(GC)被认为是大多数哮喘类型的标准治疗。基于此，进行研究以评价示例性抗体药物缀合物(ADC)INX201J在过敏性哮喘小鼠模型中的治疗功效。
简而言之，如下文详细讨论和在此实施例中提及的图中所示，小鼠每隔一周用氢氧化铝中乳化的卵清蛋白(OVA)注射2次来致敏。在1或2周之后(实验的第1部分和第2部分)，小鼠每天经由吸入暴露于OVA连续5天被攻击。治疗包括在OVA暴露期间的每天3剂10mg/Kg(或0.2mg/Kg的有效载荷)的INX201J或2mg/Kg的地塞米松(Dex)。在最后一次攻击后24h进行分析。
这些实验同样是在人VISTA敲入(hVISTA KI)小鼠(所述小鼠敲入了人VISTA cDNA代替小鼠VISTA基因，并且在RNA和蛋白质水平上表达人VISTA，表达模式与小鼠VISTA相同)或者C57Bl/6小鼠中进行的。这些研究的目的是评价我们的ADC INX201J与游离地塞米松(Dex)相比在OVA哮喘小鼠模型中的治疗功效。
为了评价我们的ADC的功效水平，我们通过流式细胞术测量了募集到肺的炎症细胞的数量以及BAL中的细胞因子产生。通过ELISA评价了全身反应以量化OVA特异性IgG和IgE的产生。最后，我们对H&E染色的肺切片进行了盲法分析以对疾病进行评分。
如下文详细讨论的，这些实验是使用OVA攻击的2个不同时间点进行的，因为我们并行评价了文献中描述的2种不同方案，这可以被视为内部重复。
材料和方法
实验设计
实验包括以下各组，每组10只雌性小鼠。第1-3组和第5组、第6组是C57Bl/6，第4组和第7组的小鼠是人VISTA KI小鼠。第2至7组的所有小鼠均对OVA敏感并且用OVA攻击。
第1组：初始
第2组：OVA alum–吸入D14-18
第3组：OVA alum–吸入D14-18-2mg/Kg的Dex
第4组：OVA alum–吸入D14-18–10mg/Kg的INX201J
第5组：OVA alum–吸入D21-25
第6组：OVA alum–吸入D21-25-2mg/Kg的Dex
第7组：OVA alum–吸入D21-25–10mg/Kg的INX201J
第2至7组的小鼠均用氢氧化铝中乳化的10μg/小鼠的卵清蛋白致敏。
-实验的第1部分：
第1组(初始)的五只小鼠和第2-4组的所有动物从第14天至第18天连续5天经受OVA吸入(含3％ OVA的PBS)30min。从第14天至第18天每天i.p.注射2mg/Kg的Dex。在第13、15和17天i.p.给药10mg/Kg的INX201J。在第19天处死治疗的动物。
-实验的第2部分：
第1组的五只小鼠和第5-7组的所有动物从第21天至第25天连续5天经受OVA吸入(含1％ OVA的PBS)30min。从第21天至第25天每天i.p.注射2mg/Kg的Dex。在第20、22和24天i.p.给药10mg/Kg的INX201J。在第25天处死治疗的动物。
实验设计和分析基于文献(Gueders等人,“Mouse models of asthma:acomparison between C57BL/6and BALB/c strains regarding bronchialresponsiveness,inflammation,and cytokine production”,Inflamm.Res.(2009)58:845–854；Yu等人,“Establishment of different experimental asthma models inmice”,Experimental and Therapeutic Medicine 15:2492-2498,2018)。
测试剂和剂量
抗体
INX201J(Abzena，批号JZ-0556-025-1、批号JZ-0556-027、批号JZ-0556-013)。INX201是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235A/E269R/K322A沉默突变的人源化抗人VISTA抗体。INX201J是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的药物/抗体比缀合的缀合抗体。接头/有效载荷(J)由蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成。将INX201J在PBS中稀释并且以0.2ml的体积腹膜内(i.p.)注射以递送指定剂量。
地塞米松
将来自Phoenix的地塞米松无菌注射剂NDC 57319-519-05在PBS中稀释并且经由i.p.注射如所述进行给药。
卵清蛋白
卵清蛋白(或来自鸡蛋清的白蛋白)购自Sigma(A5503)并且重悬在PBS中。卵清蛋白i.p.给药或经由雾化器给药。
小鼠
hVISTA KI小鼠是现场繁育的(在Dartmouth的比较医学和研究中心)。所有实验均在以15周龄入组的雌性小鼠中进行。C57Bl/6小鼠购自Jackson Laboratories。
OVA吸入
使用来自Kent Scientific(AG-ALSM-0530LG)的雾化器递送系统经由雾化器递送OVA。
采血
使用首先用肝素冲洗以防止凝血的玻璃巴斯德移液器从眼眶后腔收获外周血。然后将血液以550rcf离心5min，并且收集75μl血浆并储存在-80℃下，然后进行细胞因子分析。将血细胞用75μl的PBS重悬并且进行处理以用于免疫染色。
支气管肺泡灌洗
通过CO2吸入处死小鼠，并且立即使用5x 1ml PBS-EDTA(0.5mM)进行支气管肺泡灌洗。通过温和的手动抽吸回收细胞。记录了体积。回收体积低于4ml的样品被排除在外。在550rcf离心5min之后，收集上清液并且在-80℃下冷冻以用于蛋白质评估。将细胞重悬在PBS中并且进行处理以用于免疫染色。
BAL免疫染色
将BAL细胞样品分成2份，并且用2种不同的针对淋巴细胞和骨髓细胞的抗体组进行染色(参见表1和表2)。在4℃下30min之后，将样品洗涤一次并且重悬在固定体积中。在MacsQuant流式细胞仪上分析固定体积以获得可比细胞数。
Figure BDA0004033983910005131
全血免疫染色
我们使用了允许绝对血细胞计数的1次洗涤方案。将10μl抗体混合物(参见下文)直接添加到100μl血液中。在室温(RT)下孵育30min之后，将600μl BD FACS裂解缓冲液添加到样品中。在室温下孵育30min之后，将样品在550rcf下旋转5min，在PBS中洗涤一次，重悬在固定体积的PBS中。将整个样品在MacsQuant流式细胞仪上运行以获得绝对细胞数。
如表3和表4所示，不同的抗体组用于淋巴细胞和骨髓细胞。
Figure BDA0004033983910005132
Figure BDA0004033983910005141
ELISA
IgG、OVA特异性IgG、IgE、OVA特异性IgE的ELISA
小鼠IgG1的ELISA
首先，在室温下将96孔平底板(Thermo Scientific Nunc Immuno Maxisorp，目录号442404)用1μg/ml的在PBS中的山羊抗小鼠IgG1(Southern Biotech，目录号1070-01)包被一小时。将孔用PT(含0.05％吐温20的PBS)洗涤3次，然后在室温下用PTB(含0.05％吐温20和1％BSA的PBS)阻断一小时。将小鼠IgG1抗卵清蛋白(Biolegend，目录号520502)用于构建标准曲线。将孔用PT洗涤3次，然后将血浆样品在室温下以PTB中多达4种不同的稀释液(以拟合标准曲线)孵育1小时。
在用PT洗涤3次之后，将1/20,000的山羊抗小鼠IgG1-HRP(Southern Biotech，目录号1070-05)用作检测试剂，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，按照制造商说明书使用TMB底物揭示ELISA反应。在室温下5-10min之后，将反应用1M H2S04终止。
小鼠IgG1抗卵清蛋白的ELISA
首先，在室温下将96孔平底板(Thermo Scientific Nunc Immuno Maxisorp，目录号442404)用95μg/ml的在PBS中的卵清蛋白(Southern Biotech，目录号1070-01)包被一小时。将孔用PT洗涤3次，然后在室温下用PTB阻断一小时。将小鼠IgG1抗卵清蛋白(Biolegend，目录号520502)用于构建标准曲线。将孔用PT洗涤3次，然后将血浆样品在室温下以PTB中多达4种不同的稀释液(以拟合标准曲线)孵育1小时。
在用PT洗涤3次之后，将1/20,000的山羊抗小鼠IgG1-HRP(Southern Biotech，目录号1070-05)用作检测试剂，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，按照制造商说明书使用TMB底物揭示ELISA反应。在室温下5-10min之后，将反应再次用1M H2S04终止。
小鼠IgE的ELISA
首先，在室温下将96孔平底板(Thermo Scientific Nunc Immuno Maxisorp，目录号442404)用1μg/ml的在PBS中的山羊抗小鼠IgE(Southern Biotech，目录号1110-01)包被一小时。将孔用PT洗涤3次，然后在室温下用PTB阻断一小时。将小鼠IgE抗卵清蛋白(BioRad，目录号MCA2259)用于构建标准曲线。将孔用PT洗涤3次，然后将血浆样品在室温下以PTB中多达4种不同的稀释液(以拟合标准曲线)孵育1小时。
在用PT洗涤3次之后，将1/2000的山羊抗小鼠IgE-HRP(Southern Biotech，目录号1110-05)用作检测试剂，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，按照制造商说明书使用TMB底物揭示ELISA反应。在室温下5-10min之后，将反应用1M H2S04终止。
小鼠IgE抗卵清蛋白的ELISA
首先，在室温下将96孔平底板(Thermo Scientific Nunc Immuno Maxisorp，目录号442404)用95μg/ml的在PBS中的卵清蛋白(Southern Biotech，目录号1070-01)包被一小时。将孔用PT洗涤3次，然后在室温下用PTB阻断一小时。将小鼠IgG1抗卵清蛋白(BioRad，目录号MCA2259)用于构建标准曲线。将孔用PT洗涤3次，然后将血浆样品在室温下以PTB中多达4种不同的稀释液(以拟合标准曲线)孵育1小时。
在用PT洗涤3次之后，将1/2000的山羊抗小鼠IgE-HRP(Southern Biotech，目录号1110-05)用作检测试剂，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，按照制造商说明书使用TMB底物揭示ELISA反应。在室温下5-10min之后，将反应用1M H2S04终止。
细胞因子的ELISA
·R&D(目录号DY420-05)Duoset小鼠CCL11/Eotaxin
·R&D(目录号DY478-05)Duoset小鼠CCL5/RANTES
·R&D(目录号DY405-05)Duoset小鼠IL-5
·R&D(目录号DY413-05)Duoset小鼠IL-13
按照制造商提供的方案进行所有ELISA。
组织病理学肺评分
将肺解剖，福尔马林固定并且进行处理以用于石蜡包埋。疾病评分在H&E染色切片上以盲法方式进行，并且评分分配如下：
4：大量浸润并且遍布-肺结构丧失
3：大量浸润并且遍布-对肺结构的损伤有限
2：浸润可见为大病灶
1：浸润可见为小病灶
0：正常
结果
血液反应
细胞反应
如图56所示，在2个实验方案的外周循环中未观察到疾病驱动的淋巴细胞或骨髓细胞变化，并且当游离(Dex)或缀合(INX201J)施用时，GC治疗导致B细胞和T细胞的相似减少。具体地，图56示出了2个实验方案中外周血中绝对细胞数的变化。第14至18天(第1部分)和第21至25天(第2部分)的OVA攻击(SEM，单因素方差分析，n＝10，除了初始组n＝5)。
免疫球蛋白反应
如图57所示，与初始动物相比，未治疗的OVA攻击的动物表现出IgG1和IgE以及OVA特异性Ig的显著增加。Dex和INX201J治疗组均在IgG1、IgG1 OVA特异性产生方面表现出相似的显著下降。观察到IgE和OVA特异性IgE的有限减少至未减少。具体地，图57示出了2个实验方案中外周血中免疫球蛋白产生的变化。第14至18天(第1部分)和第21至25天(第2部分)的OVA攻击(SEM，单因素方差分析，n＝10，除了初始组n＝5)。
支气管肺泡灌洗液的反应
细胞反应
如图58所示，OVA攻击导致大量炎症性浸润在由淋巴细胞和骨髓细胞构成的支气管肺泡空间中募集。除了CD8 T细胞外，在两个实验方案中，与Dex相比，INX201J治疗导致免疫浸润的相似减少。值得注意的是，INX201J在减少嗜酸性粒细胞数量方面表现出与Dex相同的效力(定义为CD11b+、Ly6G-、SiglecF+CD193+)。具体地，图58示出了2个实验方案中BAL中免疫浸润的变化。第14至18天(第1部分)和第21至25天(第2部分)的OVA攻击；A)骨髓浸润的变化；B)淋巴细胞浸润的变化(SEM，单因素方差分析，n＝10，对照组删失2个样品，Dex组和INX201J组均删失3个样品；对于初始组，n＝5)。
细胞因子变化
图59中的实验表明，除了在疾病诱导后表现出有限增加的CCL11外，所有其他评价的细胞因子均未表现出变化。INX201J和Dex治疗均对BAL中的细胞因子水平没有任何影响。具体地，图59示出了2个实验方案中BAL中细胞因子水平的变化。第14至18天(实验第1部分)和第21至25天(实验第2部分)的OVA攻击(SEM，单因素方差分析，n＝10，对照组删失2个样品，Dex组和INX201J组均删失3个样品；对于初始组，n＝5)。
肺疾病评分
如图60所示(实验第1部分，SEM，单因素方差分析，n＝10，除了初始组n＝5)；在未治疗的肺中观察到显著损伤，包括支气管肺泡形态的丧失和炎症细胞的大量募集。从这些结果可以看出，INX201J和Dex治疗相似且显著地减少了肺损伤，存在有限的结构损伤和炎症性浸润。
结论
此实施例中提及的图56-图60中的实验提供了证据，证明INX201J治疗在以下方面具有与游离Dex(剂量>高于10倍)相当的影响：
-减少支气管肺泡灌洗液(BAL)中炎症性浸润的募集
-减少肺组织病理学水平的损伤
-减少血液循环中IgG1并且更具体地是抗OVA IgG1的产生
-两种治疗方法在血液循环中均未观察到引发IgE或抗OVA IgE变化
-两种治疗方法在支气管肺泡灌洗液中均未观察到引发细胞因子产生变化
重要的是，在这些实验的2个部分/2种不同方案中观察到相似结果。
实施例14：示例性抗VISTA抗体药物缀合物对表达VISTA的免疫细胞的影响
在这些实验中，我们评价了抗体药物缀合物(ADC)INX231J(与糖皮质激素(GC)有效载荷连接的抗人VISTA单克隆抗体)的靶向特异性。为了监测/确认GC递送和活性，我们通过定量实时PCR(qRT-PCR)测量了FKBP5的转录激活(1)。这些实验同样是在人VISTA敲入(hVISTA KI)小鼠中进行的，所述小鼠敲入了人VISTA cDNA代替小鼠VISTA基因，并且在RNA和蛋白质水平上表达人VISTA，表达模式与小鼠VISTA相同。
具体地，我们通过两种不同的方法评价了非特异性ADC内化的影响。首先，我们添加了与相同有效载荷缀合的人IgG1沉默；其次，我们在不表达人VISTA靶标的C57Bl/6小鼠(仅小鼠VISTA)中进行了相同实验。简而言之，INX231J或INX231P、人IgG1siJ或游离地塞米松(Dex)经由腹膜内(i.p.)注射体内递送。在INX231J/hIgG1siJ/INX231P 20h之后以及在Dex 2h之后，分离血细胞和脾细胞，提取RNA并且评价FKBP5转录水平。
这些实验的目的是验证与游离地塞米松(Dex)相比我们的ADC对表达人VISTA的细胞/组织的靶向特异性。为了监测/确认GC递送和活性，我们通过定量实时PCR(qRT-PCR)测量了FKBP5(敏感性、早期GC反应基因)的转录激活。我们先前在本申请中表明，在治疗后2-4h，Dex治疗导致表达VISTA的细胞中FKBP5信使RNA的显著增加，但转录影响在24h时消失。相比之下，ADC对FKBP5转录的影响是持久的，在治疗后20h达到峰值诱导，但在单核细胞中3天和在巨噬细胞中14天仍可检测到信号。
在这些实验中，我们使用了分别经由静脉内(i.v.)或腹膜内(i.p.)注射体内递送的具有2种不同的有效载荷(J和P，均在本文先前描述)的抗VISTA抗体INX231或游离Dex。分离脾细胞和血细胞，提取RNA并且评价FKBP5转录水平。下面详细描述了这些实验和它们的结果。
材料和方法
实验设计
对于所有3项研究：
在小鼠安乐死和细胞分离之前2h i.p.注射Dex，这对应于峰值FKBP5诱导。
在小鼠安乐死和细胞分离之前20h i.v.注射ADC(INX231J或INX231P或hIgG1siJ)以为ADC处理和峰值FKBP5诱导提供足够的时间。需要注意的是，ADC i.v.注射以确保更一致的大分子递送。
包括仅注射PBS的对照组以确定FKBP5转录物基线。
测试剂和剂量
抗体
·INX231(批号72928.1.a)是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235A/E269R/K322A沉默突变的人源化抗人VISTA抗体。
·INX231J(批号JZ-0556-013-1)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的药物/抗体比(DAR)缀合的INX231。接头/有效载荷(J)基于专利报道的接头/有效载荷(2)US 15/611,037)。它由蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成。
·INX231P(批号JZ-0556-017-1)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的药物/抗体比(DAR)缀合的INX231。接头/有效载荷(P)由蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成。
·人IgG1siJ(批号JZ-0556-025-2)是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的E269R/K322A沉默突变的抗RSV mAb。药物/抗体比为8.0，与J接头/有效载荷经由链间二硫键的完全修饰缀合。
第1组的五只小鼠和第5-7组的所有动物从第21天至第25天连续5天经受OVA吸入(含1％ OVA的PBS)30min。从第21天至第25天每天i.p.注射2mg/Kg的Dex。在第20、22和24天i.p.给药10mg/Kg的INX201J。在第25天处死治疗的动物。将所有ADC稀释在PBS中并且以0.2ml的终体积i.v.注射以递送指定剂量。
地塞米松
将来自Phoenix的地塞米松无菌注射溶液NDC 57319-519-05在PBS中稀释并且经由i.p.注射如所述进行给药。
4.3小鼠
hVISTA KI小鼠是现场繁育的(在Dartmouth的比较医学和研究中心)；C57Bl/6小鼠接收自Jackson Laboratories(ref#000665)。
雄性或雌性小鼠在9至15周龄之间入组。
4.4细胞分离
在安乐死之后，采集心脏血液(体积介于0.3与0.5ml之间)和脾脏。
血液制备：将6ml ACK缓冲液添加到血液中用于红细胞裂解。在室温下5min之后，将细胞以1500rpm离心5min；在10ml的PBS中洗涤一次后，将细胞沉淀并且直接重悬在RNA裂解缓冲液中。
将脾脏机械解离。在40μm过滤器上通过之后，将细胞沉淀物重悬在RNA裂解缓冲液中(参见下文)。
RNA制备和实时PCR
将来自血液和脾脏的细胞沉淀物重悬在来自
Figure BDA0004033983910005221
RNAPlus试剂盒(Macherey-Nagel#740984)的0.4ml的RNA裂解缓冲液中。按照制造商的说明书分离RNA，并且在30或40ml H2O(不含核糖核酸酶/脱氧核糖核酸酶)中洗脱RNA。在Nanodrop上评估RNA浓度。
使用Taqman逆转录试剂(#N8080234)并且按照制造商的说明书进行逆转录。
使用Taqman master mix 2X试剂盒(#4369016)和小鼠FKBP5的Taqman引物(Mm00487401_m1)，并且使用小鼠HPRT作为管家基因(Mm446968_m1)进行定量实时PCR并且在来自Applied Biosystem的QuantStudio3上运行。
将Ct数据转换为ΔCt和ΔΔCt或对PBS的Log2倍数变化。
实验1
在此实验中，我们评价了与J有效载荷缀合的人IgG1沉默对照(IgG1siJ)相比于INX231J和Dex在hVISTA KI雄性小鼠中对表达VISTA的组织(血液和脾脏)的影响。将IgG1siJ和INX231J以5 mg/Kg(递送0.1 mg/Kg的有效载荷)给药并且在20h后测量FKBP5诱导，为ADC处理和稳健的FKBP5诱导提供足够的时间。将Dex以2 mg/Kg进行注射并且在2h后测量FKBP5诱导。
如图61所示，虽然INX231J和Dex治疗观察到稳健的FKBP5诱导，但缀合的Ig对照仅引起FKBP5信号的小、非显著变化。更具体地，所述图示出了INX231J注射后在脾(左)细胞和血液(右)细胞中的FKBP5转录激活。INX231J效果和hIgG1siJ在5mg/Kg(递送0.1mg/Kg的有效载荷)的单一1次i.v.注射后20h测量。Dex效果在2mg/Kg的单次i.p.注射后2h测量。FKBP5转录水平通过实时PCR来测量，并且表示为与PBS对照组的平均值相比的Log2倍数变化。(n＝4小鼠/组；与仅PBS组相比的普通单因素方差分析)。
实验2
在此实验中，我们评价了INX231P相比于Dex在不表达人VISTA的C57Bl/6雄性小鼠中对血细胞和脾细胞的影响。将INX231P以10mg/Kg(递送0.2mg/Kg的有效载荷)给药并且在20h后测量FKBP5诱导，为ADC处理和稳健的FKBP5诱导提供足够的时间。将Dex以2mg/Kg进行注射并且在2h后测量FKBP5诱导。
如图62所示，虽然Dex治疗观察到稳健且显著的FKBP5诱导，但INX231P对野生型小鼠的血细胞和脾细胞没有影响，证明ADC影响是靶标驱动的。更具体地，图62示出了C57Bl/6小鼠中INX231P注射后的FKBP5转录激活。INX231P效果在10mg/Kg(递送0.2mg/Kg的有效载荷)的单一1次i.v.注射后20h测量。Dex效果在2mg/Kg的单次i.p.注射后2h测量。FKBP5转录水平通过实时PCR来测量，并且表示为与PBS对照组的平均值相比的Log2倍数变化。(n＝4小鼠/组；与仅PBS组相比的普通单因素方差分析)。
实验3
在此实验中，我们评价了INX231P相比于Dex在不表达人VISTA的C57Bl/6雌性小鼠中对血细胞和脾细胞的影响。我们添加了hVISTA KI组作为ADC活性的对照。将INX231P以10mg/Kg(递送0.2mg/Kg的有效载荷)给药并且在20h后测量FKBP5诱导，为ADC处理和稳健的FKBP5诱导提供足够的时间。将Dex以2mg/Kg进行注射并且在2h后测量FKBP5诱导。
如图63所示，虽然Dex治疗观察到稳健且显著的FKBP5诱导，但INX231P对野生型小鼠的血细胞和脾细胞具有非显著影响，证明ADC影响是靶标驱动的。相比之下，hVISTA KI动物中相同剂量的INX231P治疗导致FKBP5转录物的强烈且显著的诱导，证明ADC对其靶标群体的效力。更具体地，图63示出了C57Bl/6或hVISTA KI小鼠中INX231P注射后的FKBP5转录激活。INX231P效果在10mg/Kg(递送0.2mg/Kg的有效载荷)的单一1次i.v.注射后20h测量。Dex效果在2mg/Kg的单次i.p.注射后2h测量。FKBP5转录水平通过实时PCR来测量，并且表示为与PBS对照组的平均值相比的Log2倍数变化。(n＝4小鼠/组；与仅PBS组相比的普通单因素方差分析)。
结论
实验1的结果表明，在hVISTA KI中，虽然INX231J和Dex在脾细胞和血细胞中诱导了稳健水平的FKBP5，但人IgG1沉默类固醇缀合对照对两种组织中的FKBP5转录水平几乎没有影响。
实验2的结果表明，在雄性C57Bl/6小鼠中，在人VISTA靶标不存在的情况下，INX231P在表达VISTA的血细胞或脾细胞中对FKBP5转录水平没有影响，而游离类固醇在两种组织中诱导了稳健水平的FKBP5。
实验3，是实验2在雌性C57Bl/6小鼠中的重复，但添加有hVISTA KI小鼠阳性对照，该实验的结果表明，在人VISTA靶标不存在的情况下，INX231P在表达VISTA的血细胞或脾细胞中对FKBP5转录水平几乎没有影响。相比之下，hVISTA KI小鼠中相同给药的INX231P或Dex在两种组织中均诱导了稳健水平的FKBP5。
总之，数据表明人VISTA靶标的存在对于ADC有效细胞递送GC是必要的，与GC有效载荷无关。
实施例15：示例性抗VISTA抗体药物缀合物对离体单核细胞激活(急性(一天))评估的影响
进行此实施例中的实验以评价抗体药物缀合物(ADC)INX231P(与糖皮质激素(GC)有效载荷连接的抗人VISTA单克隆抗体)在单核细胞中的功效和药效学范围。我们在较早的实施例中表明，GC靶基因FKBP5的转录在单核细胞中上调长达治疗后3天，而游离地塞米松(Dex)对FKBP5的影响在24h时就无法检测。
我们还开发了模型使我们能够评价ADC对单核细胞的潜在长期抗炎影响。简而言之，将ADC经由静脉内(i.v.)注射体内递送，并且在1至7天之后分离脾单核细胞并且进行培养。然后将细胞用不同浓度的脂多糖(LPS)激活，导致在24h时细胞因子产生显著增加。在单核细胞分离之前2h的Dex治疗可稳健减少细胞因子产生。
这些实验(下文讨论的实验1、2和3)是在人VISTA敲入(hVISTA KI)小鼠中进行的，所述小鼠敲入了人VISTA cDNA代替小鼠VISTA基因，并且在RNA和蛋白质水平上表达人VISTA，表达模式与小鼠VISTA相同。这些研究的目的是评价INX231P体内治疗对表达高水平VISTA的单核细胞的特异性影响。第二个目标是将其抗炎能力与其激动剂对应物INX901进行比较。简而言之，将ADC经由静脉内(i.v.)注射体内递送，并且在1至7天之后分离脾单核细胞并且进行培养。然后将细胞用不同浓度的LPS激活，并且在24h时收集上清液以评价细胞因子反应(通过Luminex小鼠32-plex(实验1)或选择细胞因子的ELISA(实验3和实验3))。
材料和方法
对于所有3个实验，Dex在小鼠安乐死和细胞分离之前2h(最佳反应)i.p.注射。在实验2和实验3中，ADC INX231P和激动剂对应物INX901均在小鼠安乐死和细胞分离之前24hi.v.注射，以为ADC处理提供足够的时间。此外，还包括注射有PBS的对照组以确定最大细胞因子反应。
测试剂和剂量
抗体
·INX231(批号72928.1.a)是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235A/E269R/K322A沉默突变的人源化抗人VISTA抗体。
·INX231P(批号JZ-0556-017-1)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的药物/抗体比(DAR)缀合的INX231。接头/有效载荷(P)由蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成。
·INX901(批号BP-021-016-23)是在人IgG2/κ主链上的人源化抗人VISTA抗体。
将所有抗体和ADC稀释在PBS中并且以0.2ml的体积静脉内(i.v.)注射以递送指定剂量。
地塞米松
将来自Phoenix的地塞米松无菌注射溶液NDC 57319-519-05在0.2ml体积的PBS中稀释并且经由腹膜内(i.p.)注射如所述进行给药。
小鼠
hVISTA KI小鼠是现场繁育的(在Dartmouth的比较医学和研究中心)；C57Bl/6小鼠接收自Jackson Laboratories(ref#000665)。雄性或雌性小鼠在9至15周龄之间入组。
脾单核细胞分离
在实验1和实验2中，将细胞使用来自StemCell的EasySepTM小鼠单核细胞分离试剂盒(目录号19861)按照制造商的说明书分离；在ADC-INVIVO-109中，使用了来自Miltenyi的单核细胞分离试剂盒(目录号130-100-629)。在实验中获得了相似的细胞数和纯度。
离体LPS刺激测定
在计数之后，将细胞以约100,000个细胞/孔铺种，取决于分离的细胞数(注意，所有报告的数据都标准化为铺种的细胞数)，并且作为单份进行。将LPS以0、10或100ng/ml添加到组织培养基中，如所述。在24h时收集细胞上清液用于细胞因子分析。
细胞因子分析
实验1：
使用Millipore小鼠32-plex平台对25μl上清液进行细胞因子分析；免疫监测实验室(IML，Dartmouth-Hitchcock Norris Cotton Canc er Center的共享资源)进行了分析。有关所有方案和分析说明，参见以下网站：http://www.dartmouth.edu/～dartlab/？page＝multiplexed-cytok ines。
实验2和实验3：
使用以下试剂盒经由ELISA对TNFa、MIP-1a和MIP-1b进行细胞因子分析：
○小鼠CCL3/MIP-1αDuoSet ELISA(R&D#DY450-05)
○小鼠CCL3/MIP-1βDuoSet ELISA(R&D#DY451-05)
○小鼠TNFαELISA(Biolegend目录号430904)
所有ELISA均按照制造商的说明书进行。
结果
实验1：地塞米松对从脾脏分离的单核细胞的离体LPS刺激的影响
在实验1中，我们评价了2种不同剂量的Dex的体内治疗对离体脾单核细胞的影响。简而言之，雌性C57Bl/6小鼠用2或0.2mg/Kg Dex的i.p.注射治疗。对照组接受PBS。在2h之后，处死动物并且收集脾脏。分离单核细胞并且进行培养。由于分离后单核细胞数量少，所以每组5个样品被合并为2个样品以用于铺种(合并2个或3个最初样品)。然后将细胞因子数据标准化为之后的细胞数。
在铺种之后，将细胞用10或100ng/ml的LPS处理或不处理细胞。在30min和24h时收集细胞上清液。在小鼠32-plex上分析细胞因子产生。在30min时没有观察到细胞因子水平的变化(未示出)。在24h时，在脾脏样品中8种细胞因子G-CSF、IL-6、IL-10、IP-10、MIP-1a、MIP-1b、TNFa和RANTES由LPS处理而上调。如图64所示，Dex体内治疗导致两种LPS浓度下的细胞因子反应降低。更具体地，图64表明，体内Dex治疗引发离体单核细胞对LPS的炎症反应的显著降低。在实验中，对小鼠进行PBS或者2mg/Kg或0.2mg/Kg Dex的i.p.注射。在2h之后，将脾单核细胞分离，培养并且经受0、10和100ng/ml的LPS刺激。在Luminex 32-plex上分析24h上清液(n＝5小鼠/组，但样品1、2、3和4、5合并为2个样品)。
实验2：地塞米松相比于INX231P相比于INX901对从脾脏分离的单核细胞的离体LPS刺激的影响
在实验2中，我们评价了INX231P相比于INX901(与INX231相同的CDR，但在人IgG2主链上)相比于Dex体内治疗对来自hVISTA KI雌性小鼠的由LPS离体刺激的脾单核细胞的影响。为了评价这些分子的药效学范围，对于INX231P和INX901治疗组，在治疗后24h、3天和7天分离脾单核细胞，而对于Dex治疗组，在治疗后2h、2天和6天分离脾单核细胞。INX231P和INX901以10mg/Kg进行给药，而Dex以2mg/Kg进行注射。在铺种之后，将样品用10ng/ml的LPS处理或不处理样品。在24h时收集细胞上清液。经由ELISA对TNFa、MIP-1b和MIP-1a进行细胞因子分析。将细胞因子数据标准化为铺种的细胞数。
如图65所示，在第1天，INX231P对TNFa和MIP-1b产生具有稳健的影响，与2h的Dex相当。在后来的时间点没有观察到效果。相比之下，INX901对分析的细胞因子没有影响(MIP-1a和b)或具有增加的影响(TNFa)。更具体地，图65示出了INX231P的体内治疗对离体单核细胞对LPS的炎症反应的影响。在细胞分离之前2h、2天或6天对小鼠进行PBS或2mg/KgDex的i.p.注射；在细胞分离之前1、3和7天进行10mg/Kg INX231P和INX901的i.v.注射。在分离之后，将脾单核细胞培养并且经受0或10ng/ml的LPS刺激(仅示出10ng/ml)。通过ELISA分析24h上清液(n＝4小鼠/组；仅对第1天(D1)样品进行与PBS处理组相比的单因素方差分析)。
实验3：地塞米松相比于INX231P相比于INX901对从脾脏分离的单核细胞的离体LPS刺激的影响
在实验3中，我们仅评价了在2h之后Dex(在2mg/Kg)或在24h之后抗体治疗(10mg/Kg)的细胞因子反应。将脾单核细胞分离，置于培养基中并且用10或100ng/ml的LPS处理。在24h时收集细胞上清液。经由ELISA对TNFa、MIP-1b和MIP-1a进行细胞因子分析，并且将数据标准化为铺种的细胞数。
图66表明，对于分析的所有3种细胞因子，INX231P在两种LPS浓度下都有效地防止了单核细胞的离体激活。注意：当将细胞用100ng/ml的LPS刺激时，Dex治疗似乎失去了效力，这表明INX231P当递送10分之一的有效载荷时更有效。最后，如实验3中观察到的，INX901治疗对LPS诱导的细胞因子反应没有影响。更具体地，图示出了INX231P的体内治疗对离体单核细胞对LPS的炎症反应的影响。在细胞分离之前2h对小鼠进行PBS或2mg/Kg Dex的i.p.注射；在细胞分离之前24h进行10mg/Kg INX231P和INX901的i.v.注射。将脾单核细胞置于培养基中并且经受10或100ng/ml的LPS刺激。通过ELISA分析24h上清液(n＝4小鼠/组；针对每个LPS剂量，进行单独的与PBS处理组相比的普通单因素方差分析)。
结论
实验1表明，2mg/Kg的体内Dex治疗有效防止LPS引起的离体单核细胞激活，如细胞因子产生的显著减少所示。实验2表明，体内INX231P治疗可以减少单核细胞的离体激活，如24h一些细胞因子产生的减少所示，但这些效果在治疗后3或7天未观察到，这与已知的2-3天范围内的单核细胞半衰期一致。此外，ADC对细胞因子产生的影响是由于GC递送至表达VISTA的细胞，因为用未缀合的激动剂对应物抗体(相同的CDR)治疗不具有抗炎活性。实验3，是实验2的重复，除了仅观察Dex治疗后2h或者ADC和未缀合的激动剂治疗后24h外，该实验表明INX231P有效降低单核细胞的离体激活，而激动剂抗体没有影响。
因此，实验结果表明，
·LPS诱导的在分离的脾单核细胞上的细胞因子反应被地塞米松有效控制。
·当体内提前24h给药时，INX231P而不是INX901治疗有效控制LPS诱导的在分离的脾单核细胞上的细胞因子反应。到第3天，没有观察到效果，这与已知的2-3天范围内的小鼠单核细胞半衰期一致。
·INX231P而不是INX901治疗有效防止LPS诱导的脾单核细胞的离体激活。在此实验中，我们注意到INX231P虽然递送是游离Dex的10分之一的GC有效载荷，但在高刺激水平(LPS为100ng/ml)下表现出高效力，而Dex似乎失去了功效。最后，如实验3中观察到的，INX901治疗对LPS诱导的细胞因子反应没有影响。
总之，实验结果表明，INX231P体内治疗可以防止单核细胞离体激活，其效力优于游离类固醇至少10倍。相比之下，激动剂抗VISTA抗体INX901在此模型中没有表现出效力。因此，此实验中观察到的结果完全是由类固醇有效载荷，而不是由VISTA调节引起的。
实施例16：抗VISTA药物缀合物对单核细胞、Treg和B细胞中转录的影响取决于靶标表达
我们在本文中描述了与各种糖皮质激素(GC)有效载荷连接的不同抗人VISTA单克隆抗体和它们的体外和体内效果。在此实施例中，我们通过评价根据本发明的示例性ADC对GC报告基因FKBP5的转录的影响，通过评价1)INX201J对单核细胞和B细胞相比于同种型对照(huIgG1si J)和游离J有效载荷以及2)INX231P(对Treg)相比于游离有效载荷(INX-SM-3)的效果来评估VISTA靶标依赖性。
如本文所示，用抗VISTA类固醇ADC治疗导致单核细胞、具有高VISTA表达水平的细胞上的FKBP5的稳健和剂量依赖性上调。对于VISTA表达低于单核细胞的Treg，观察到显著但更温和的影响。对不表达VISTA的B细胞的影响可以忽略不计。当用类固醇缀合的同种型对照处理时，没有观察到单核细胞或B细胞的FKBP5表达变化。
抗体药物缀合物(ADC)允许高效药物的特异性细胞靶向，从而在限制毒性的同时发挥功效。INX201和INX231是抗人VISTA抗体。INX201J和INX231P以其类固醇缀合形式将类固醇递送至表达VISTA的细胞，包括骨髓细胞和T细胞，并且我们希望对VISTA阴性细胞诸如B细胞几乎没有影响(Cancer Res.74:1924-1932,2014)。
为了监测/确认GC递送和活性，我们通过定量实时PCR(qRT-PCR)测量了FKBP5的转录激活，所述FKBP5是糖皮质激素活性的直接和稳健的生物标志物(JCEM 101:4305-4312,2016)。我们在体外ADC治疗后对分离的人单核细胞、调节性T细胞(Treg)和B细胞进行了评估。
材料和方法
将单核细胞或B细胞从健康供体血液样品中分离，并且用游离类固醇、抗VISTA缀合的类固醇或缀合的同种型对照进行处理。分离RNA，并且通过qPCR评估FKBP5转录物水平的变化。
对于单核细胞相比于B细胞分析，一个血液供体采集用于单一药物浓度实验；来自单独的单一供体采集的血液用于评估药物剂量反应。对于调节性T细胞(Treg)分析，使用了来自两个不同供体的血液。
测试剂
·游离J有效载荷，INX J-2(Abzena)。INX J-2或简称为游离J有效载荷，是专利报告的布地奈德类似物，用于完整接头/有效载荷INX J。
·INX201(Aragen，批号BP-3200-019-6)是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S沉默突变的人源化抗人VISTA抗体。
·INX201J(Abzena，批号JZ-0556-025-1)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的药物/抗体比(DAR)缀合的INX201抗体。接头/有效载荷(J)基于先前报道的接头/有效载荷。它由蛋白酶敏感性接头与布地奈德类似物有效载荷组成。
·INX-SM-3(O2H)是在布地奈德类似物有效载荷，用于接头/有效载荷INX P。
·INX231(ATUM，批号72928.1.a)是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的L234A/L235A/E269R/K322A沉默突变的人源化抗人VISTA抗体。
·INX231P(Abzena，批号JZ-0556-017-1)是经由链间二硫键的完全修饰以8.0的DAR与接头/有效载荷INX P缀合的INX231，所述接头/有效载荷INX P由蛋白酶敏感性接头与INX-SM-3组成。
·人IgG1siJ(Abzena，批号JZ-0556-025-2)是在人IgG1/κ主链上具有Fc区中的E269R/K322A沉默突变的同种型对照。DAR比率为8.0，与INX J接头/有效载荷经由链间二硫键的完全修饰缀合。
其他试剂
·Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare目录号17-1440-03)
·不含L-谷氨酰胺的RPMI 1640(VWR目录号16750-084)
·青霉素/链霉素/谷氨酰胺(ThermoFisher目录号10378016)
·1M Hepes(Gibco目录号15630-080)
·人AB血清(Valley Biomedical目录号HP1022HI)
PBMC制备
将人PBMC在无菌条件下从获得自献血者项目(Dartmouth Hitchcock MedicalCenter，来自去识别健康人供体)的单采锥体细胞中分离出来。
将血液转移到50ml Falcon管中并且用PBS稀释至30ml。使13ml的Histopaque1077(Sigma Aldrich)在血液下缓慢分层，并且将管在室温下以850x g离心20min，温和加速且无制动。
从血浆/Ficoll分界面收集单核细胞，重悬于50ml的PBS中并且以300x g离心5min。将细胞重悬于PBS中，并且进行计数。
测定方案
将各种免疫群体使用不同的细胞分离试剂盒并且按照制造商说明书分离：
·无CD16消耗的EasySep人单核细胞富集试剂盒(StemCell目录号19058)
·Pan B细胞分离试剂盒，人(Miltenyi Biotec,130-101-638)
·EasySepTM人CD4+CD127低CD49d-调节性T细胞富集试剂盒(StemCell目录号19232)
将单核细胞、B细胞或Treg(来自单一供体)以2x10^6个细胞每孔铺种在12孔板中的RPMI(10％人AB血清，10mM Hepes，1x青霉素/链霉素/谷氨酰胺)中。
对于单剂量实验，将细胞用20nM游离J有效载荷或INX-SM-3有效载荷或摩尔有效载荷当量的huIgG1si J、INX201J或INX231P(INX-SM-3的连接形式)处理。
对于剂量反应，连续稀释产生100、20、5、0.5、0nM的游离J有效载荷或摩尔有效载荷当量的INX201J。对于0nM点，使用了与用于100nM摩尔有效载荷当量的INX201J的抗体量相当的未缀合INX201(例如，12.5nM未缀合抗体)。未处理孔用作对照。
将板在37℃下孵育1天。
然后收获细胞，并且在收获后汇集每种条件的孔，以允许足够的RNA用于随后的qRT-PCR分析。
RNA制备和实时PCR
在用PBS洗涤一次之后，使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen,PN:74136)或NucleoSpin RNA Plus(Macherey-Nagel#740984.250)从细胞沉淀物中分离RNA。按照制造商的说明书分离RNA，并且在30或40μl H2O(不含核糖核酸酶/脱氧核糖核酸酶)中进行洗脱。使用Nanodrop 2000通过UV光谱评估RNA浓度。
使用Taqman逆转录试剂(#N8080234)并且按照制造商的说明书进行逆转录。
使用Taqman master mix 2X试剂盒(#4369016)进行定量实时PCR并且在来自Applied Biosystem的QuantStudio3上运行。使用的引物：
·实验1和实验2
i.Life Technologies目录号433111182Hs01561006_m1(FKBP5)
ii.Life Technologies目录号HS99999905_m1(GapDH)
·实验3和实验4
i.TaqMan基因表达测定(FAM-MGB)；测定ID:Hs01561006_m1(FKBP5)
ii.TaqMan基因表达测定(FAM-MGB)；测定ID:Hs01922876_u1(GapDH)
将Ct数据转换为ΔCt和ΔΔCt或与未处理对照相比的Log2倍数变化。
结果
实验1
在此实验中，我们评价了通过ADC进行类固醇递送的靶标表达的必要性，如通过在作为VISTA阳性细胞群的单核细胞和作为VISTA阴性细胞群的B细胞中诱导FKBP5转录所评估。添加游离类固醇作为类固醇对特定细胞类型的FKBP5水平影响的阳性对照。给予游离类固醇(游离J有效载荷)、J接头-有效载荷缀合的抗VISTA(INX201J)或同种型对照(huIgG1siJ)以提供相同摩尔当量的有效载荷(20nM)。
如图67所示，相对于未处理对照，游离J有效载荷观察到在单核细胞和B细胞中的FKBP5转录的稳健增加。然而，当用抗VISTA缀合的有效载荷(INX201J)处理时，在单核细胞而非B细胞中观察到了稳健的FKBP5转录。当用有效载荷缀合的同种型对照(HuIgG1si)处理时，在两种细胞类型中均未检测到FKBP5转录。具体地，图67示出了用20nM游离J有效载荷或等摩尔量的与INX201缀合的有效载荷(INX201J)或同种型对照(huIgG1si J)处理的B细胞或单核细胞中的FKBP5转录激活。根据技术重复份分析转录物水平。
实验2
在图68中的此实验中，我们通过评估用类固醇连接的抗VISTA(INX201J)处理对单核细胞(高VISTA表达)的剂量依赖性效果扩展了实验1。将细胞用连续稀释的INX201J(100nM至0nM有效载荷)处理。仅对于0nM浓度，将INX201未缀合抗体用与100nM有效载荷样品中存在的等量的抗体进行处理。具体地，由于12.5nM ADC递送100nM有效载荷，对于0nM样品，未缀合INX201添加到12.5nM。如图68所示，用INX201J处理单核细胞会导致稳健的剂量依赖性效果。在图中，用增加量的INX201J[0-100nM有效载荷])处理的细胞中表现出单核细胞中的FKBP5转录激活。0有效载荷表示单独用未缀合的INX201抗体处理，所述抗体的量与100nM有效载荷INX201J剂量中的抗体的量相同。根据技术重复份分析转录物水平。
实验3
在图69中的此实验中，我们评估了第二种抗VISTA类固醇缀合物(INX231P)对表达VISTA的Treg中FKBP5转录诱导的影响。如图69所示，用20nM的游离有效载荷(INX-SM-3)或摩尔有效载荷当量的抗VISTA缀合的有效载荷(INX231P)处理Treg导致FKBP5转录增加。此实验使用2个不同的供体进行，并且分离的Treg纯度≥75％。
实验4
在图70中的此实验中，我们评估了抗VISTA类固醇缀合物(INX201J)相比于缀合有相同接头/有效载荷的同种型对照(huIgG1si J)对Treg中FKBP5转录诱导的影响。如INX201J处理所示，增加-1/δCt代表相对于管家(GapDH)增加的转录物丰度。用递送20nM类固醇有效载荷的INX201J处理Treg导致FKBP5转录相比于缀合的同种型对照相比增加2.1倍(倍数变化＝2^(ΔCt INX201J-ΔCt huIgG1si J))。此实验使用1个供体进行，并且分离的Treg纯度≥75％。具体地，图中的数据示出了与20nM有效载荷当量的huIgG1si J相比，用20nM有效载荷当量的INX201J处理的来自1个供体的Treg中的FKBP5诱导。根据技术重复份分析样品。如通过流式细胞术所评估，分离的Treg纯度≥75％。
结论
数据表明，与类固醇缀合的抗VISTA抗体特异性诱导单核细胞和Treg中的FKBP5转录，但在B细胞中不诱导，这表明有效载荷递送是特异性的和靶标依赖性的。
当用20nM的抗VISTA类固醇缀合物处理时，虽然分析的所有细胞类型都表现出对游离有效载荷的稳健反应，但只有表达VISTA的细胞类型(巨噬细胞/Treg)表现出中等到强烈的反应。此外，当与未处理对照相比时，同种型对照ADC几乎不表现出对FKBP5的诱导。
GC效果的靶标要求得到了以下支持：抗VISTA ADC对表达VISTA的细胞的稳健剂量依赖性影响；抗VISTA ADC对非VISTA表达细胞的有限影响或对其不存在影响。
结论
数据表明，与类固醇缀合的抗VISTA抗体在单核细胞和Treg中诱导FKBP5转录，但在B细胞中不诱导，表明有效载荷递送取决于靶细胞上是否存在表达。当用20nM的抗VISTA类固醇缀合物处理时，虽然分析的所有细胞类型都表现出对游离有效载荷的稳健反应，但只有表达VISTA的细胞类型(巨噬细胞/Treg)表现出中等到强烈的反应。此外，同种型对照ADC对单核细胞或B细胞均无影响。GC效果的靶标要求得到了以下支持：抗VISTA ADC对表达VISTA的细胞的稳健剂量依赖性影响；抗VISTA ADC对非VISTA表达细胞的非常有限的影响或对其不存在影响。
实施例17：由示例性抗炎药物缀合物靶向的抗原引起的各种免疫细胞的RNA表达
如上所述，主题抗炎药物缀合物被认为具有相对于先前抗炎药物缀合物的优越属性，部分原因是与被先前抗炎药物缀合物靶向的抗原相比，VISTA在特异性免疫和非免疫细胞上表达或不表达。
它们被报告的RNA表达谱表明了这一点。具体而言，发明人最初基于对以下文献的全面综述比较了免疫细胞和非免疫细胞上VISTA和其他免疫细胞靶标的RNA表达：“HumanProtein Atlas Version 20.1和Berglund L等人,“A genecentric Human Protein Atlasfor expression profiles based on antibodies”,Mol Cell Proteomics,Vol.7(10):2019-2027(October 1,2008)(https://www.proteinatlas.org)。
基于此分析，发明人根据来自Human Protein Atlas Version 20.1和Berglund等人(Id)的报告的人组织/细胞RNAseq数据准备了共识数据集。此比较的结果示于图71中。具体地，图71总结了基于报告的“每百万的转录物”(TPM)，不同细胞对VISTA和其他ADC靶标(CD40，TNF，PRLR，CD174)的共识RNA表达水平，其中TPM<10表示(最小/无表达“-”)；TPM 10-100表示(低/中等表达“+”)；并且TPM>100(高表达“++”)。如本领域已知，TPM是众所周知的RNA-seq标准化方法，并且应理解为“对于RNA-seq样品中的每1,000,000个RNA分子，x来自此基因/转录物”。
如图71所示，VISTA是RNA在骨髓细胞(单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞)和T细胞上广泛表达的仅有靶标；相比之下，大多数细胞类型的TNF表达相对较低，而且仅在激活的细胞上表达；骨髓细胞表达CD163，但淋巴细胞不表达；T细胞不表达CD40；PRLR未在免疫细胞上广泛表达并且不受免疫限制；而嗜中性粒细胞不表达CD74。(这一点很重要，因为嗜中性粒细胞在炎症的开始(急性)阶段期间，特别是在细菌感染、环境暴露和一些癌症期间很重要，并且嗜中性粒细胞确实是炎症细胞经由趋化性迁移到炎症部位的第一反应者之一。(Yoo SK等人,(November 2011)."Lyn is a redox sensor that mediates leukocytewound attraction in vivo",Nature,480(7375):109–12)。
关于上述内容，虽然这些报告的不同免疫细胞的RNA表达水平令人感兴趣，但它们未提供有关这些抗原作为ADC靶标的比较推定功效的实际证据。相反，这只能通过这些靶标在不同免疫细胞上的实际表面蛋白表达水平以及VISTA ADC有效靶向不同免疫细胞并且在不同免疫细胞中有效的实验证据(即，提供：治疗有效量的活性炎症药物(诸如类固醇)内化和释放到这些不同类型的免疫细胞中的一种或多种中)来合理评估。
实施例18：比较与示例性抗炎药物缀合物靶向的抗原相比，各种免疫细胞的VISTA表面表达以及抗VISTA、抗CD74、抗CD163和抗mTNFα抗体对人外周血单核细胞和全血的抗体结合能力
初始人外周血单核细胞(PBMCS)上和全血中的VISTA、CD74、CD163和膜TNFα(mTNFα)的表面抗原密度通过流式细胞术来评估。如下所示，数据表明，当与CD74、CD163和mTNFα相比时：
·只有VISTA在人CD8+和CD4+T细胞上以稳定状态表达
·VISTA在CD14+单核细胞上表现出最高的抗原密度
·在任何测试的细胞类型上均未检测到表面mTNFα
VISTA在大多数造血细胞上高度表达，特别是在骨髓细胞和T细胞上。本研究的目的是评价在人PBMC和来自全血的白细胞上的VISTA、CD74、CD163和mTNFα抗原密度。
材料和方法
实验设计
通过流式细胞术测定直接标记的抗体与来自多个供体的人细胞(PBMC)或全血白细胞的结合，并且使用校准珠子计算抗原密度。
试剂
抗体：
抗VISTA GG8(Aragen批号AB131122-3)是在野生型人IgG1/κ主链上的嵌合抗人VISTA抗体并且在ImmuNext产生。GG8克隆按照制造商的标记和纯化说明与Alexa Fluor647染料缀合(Invitrogen，目录号A20186)。除非另有说明，否则所有剩余的抗体均购自BioLegend，并且按原样使用，包括：
CD127 Brilliant Violet 421克隆A019D5、
CD14 PE-Cy7克隆M5E2、
CD20 Brilliant Violet 510克隆2H7、
CD4 APC-Cy7克隆OKT4、
CD163 Alexa Fluor 647克隆GHI/61、
CD25 FITC克隆BC96、
CD74 Alexa Fluor 647克隆332516(R&D Systems)、
CD8 PE克隆BW135/80(Miltenyi)、mTNFαAlexa Fluor 647克隆mAb11。
其他试剂：
校准珠子(Quantum Simply Cellular Mouse IgG)购自Bangs Laboratories，并且按照制造商的方案使用。
PBMC制备
将人PBMC在无菌条件下从获得自献血者项目(Dartmouth Hitchcock MedicalCenter，来自健康非相关人供体)的单采锥体细胞中分离出来。首先，将血液转移到50mlFalcon管中并且用PBS稀释至30ml。使13ml的Histopaque 1077(Sigma Aldrich)在血液下缓慢分层，并且将管在室温下以850x g离心20min，温和加速且无制动。
从血浆/Ficoll分界面收集单核细胞，重悬于50ml的PBS中并且以300x g离心5min。将细胞重悬于PBS中，并且进行计数。
全血制备
在Dartmouth Hitchcock Medical Center从健康非相关人供体抽取新鲜血液，并且对全血进行染色。
抗体结合和分析
PBMC染色
将PBMC重悬在含人Fc阻断试剂(eBioscience,14-9161-73)的PBS/0.2％ BSA缓冲液中，然后将106个细胞/孔分布到96孔板中。制备抗体混合物并且将PBMCS在冰上染色30min以限制内化，用PBS洗涤两次。
全血染色
将100μl血液在深孔96孔板中染色，并且直接添加抗体混合物。在孵育30min之后，将红细胞用1ml的ACK缓冲液(Gibco)裂解10min。将血液离心并且将血液白细胞转移到96孔板中，用PBS洗涤并且分析。
结合量化
按照制造商的方案将量化珠子用抗VISTA、抗CD74、抗CD163和抗mTNFα染色。通过荧光相关细胞分选(FACS)分析细胞和珠子，使用Macsquant(Miltenyi)流式细胞仪和FlowJo进行分析。使用提供有Quantum珠子的QuickCal分析模板计算抗体结合能力。
所有图表均使用GraphPad(Prism)制作。
结果
PBMCS上测试抗体结合的评价
为了评价细胞群上的抗原密度，将来自5个不同供体的人PBMC与mAb一起孵育并且通过流式细胞术进行分析。将中值荧光通过减去背景信号进行标准化，并且根据具有已知抗体结合能力的量化珠子进行校准。细胞群被鉴定为CD20+B细胞、CD14+SSC高单核细胞、CD8+和CD4+T细胞，以及CD4+CD25+CD127低T调节性细胞(Treg)。所有值均报告为平均值±SD。
如图72A所示，CD14+单核细胞高水平表达3个靶标，其中VISTA最丰富，抗体结合能力或ABC＝111587±30502，其次是CD74(ABC＝52001±4765)和CD163(ABC＝36671±12339)(图72A)。值得注意的是，对于CD163，平均值升高是因为一个异常供体的表达是其余4个的5倍。
如图72B所示，在B细胞上仅检测到CD74，并且量化了69574±14997个分子。可见VISTA是唯一在非激活T细胞上表达的蛋白质，CD4+上平均密度为5938±3113个分子(图72C)，Treg上为6641±4059(图72D)，并且CD8+上为9958±2741个分子(图72E)。
在初始PBMC中，未检测到高于背景水平的mTNFα。通过用第二种mTNFa抗体(R&DSystems，Adalimumab biosimilar，克隆Hu7)阴性染色来确认mTNFa不存在。在用LPS激活的细胞上也未检测到mTNFa(数据未示出)。商购获得的抗TNFa抗体的特异性由制造商确定并且经由ELISA内部确认(数据未示出)。
图72A-图72E总结了鉴定的细胞群上VISTA、CD74、CD163和mTNFα抗原密度的量化：A)单核细胞表达VISTA、CD74和CD163；B)B细胞表达CD74；C)CD4+T细胞；D)CD4+Treg；以及E)CD8+T细胞表达VISTA(平均值±SD，n＝5供体)。
全血白细胞上抗体结合的分析
PBMCS制剂中缺少的嗜中性粒细胞是免疫系统的必要部分。因此，还检查了来自3个健康供体的全血白细胞，并且评价了细胞群上的抗原表达。与PBMCS类似，将全血用单克隆抗体混合物染色并且通过FACS进行分析。将中值荧光通过减去背景信号进行标准化，并且根据具有已知抗体结合能力的量化珠子进行校准。
细胞群被鉴定为CD20+B细胞、CD14+SSC高单核细胞、CD66b+SSC高嗜中性粒细胞、CD8+和CD4+T细胞、CD4+CD25+CD127低T调节性细胞(Treg)。所有值均报告为平均值±SD。
如在PBMC上所观察，VISTA在CD14+单核细胞上最丰富(ABC＝223674±16503)，CD163表达维持在13126±790个分子，但CD74的表达比在PBMC中低得多(ABC＝562±338)(图73A)。CD74在CD20+B细胞上的表达在供体之间差异很大(5800±3121)。对于VISTA，类似地观察到最小信号(ABC＝1280±291)(图73B)。嗜中性粒细胞表现出高水平的VISTA表达(ABC＝68571±14731)(图73C)，同时未检测到其他感兴趣的靶标。最后，在全血中也确认了T细胞上的VISTA表达，检测到8717±886个分子。在全血中也确认了T细胞上的VISTA表达，在CD4+上检测到8717±886个分子(图73D)，在Treg上为7486±1767(图73E)，并且在CD8+上为5012±2438(图73F)。图73A-图73F总结了人血液中鉴定的细胞群上VISTA、CD74、CD163和mTNFα抗原密度的量化：A)单核细胞表达VISTA、CD74和CD163；B)B细胞表达CD74；C)嗜中性粒细胞表达VISTA；D)CD4+T细胞；E)CD4+Treg；以及F)CD8+T细胞表达VISTA(平均值±SD，n＝3)。
结论
图72和图73以及下表5中总结的数据表明：
·人VISTA是最稳健的ADC靶蛋白，在单核细胞、嗜中性粒细胞和T细胞上具有高表达水平。值得注意的是，尽管一些RNA数据库描述了T细胞中高水平的CD74转录物(BerglundL等人,“Agenecentric Human Protein Atlas for expression profiles based onantibodies”,Mol Cell Proteomics.(2008)DOI:10.1074/mcp.R800013-MCP200)，但我们没有观察到CD74在T细胞上的表面表达。
·CD74在PBMC和全血中的B细胞上始终检测到，但仅在来自PBMC的单核细胞上检测到。
·CD163仅在来自PBMC的单核细胞上表达。
·在所分析的任何细胞群上均未检测到mTNFα。
·VISTA是唯一在非激活(初始)T细胞上表达的蛋白质，在CD4+细胞上的平均密度为5938±3113个分子，在Treg上为6641±4059，并且在CD8+细胞上为9958±2741个分子。
Figure BDA0004033983910005451
表5.人细胞群上表面表达的总结。
所分析的表面靶标的表达被分类为存在于细胞表面(浅灰色)或不存在于细胞表面(深灰色)；基于量化珠子的标准化，+对应于1000-10000个分子，++对应于10000–100000，+++对应于100000以上；WB–全血，PBMCS–外周血单核细胞；na–不适用。
如上所述，主题抗炎药物缀合物被认为具有相对于先前抗炎药物缀合物的优越属性，部分原因是与被先前抗炎药物缀合物靶向的抗原相比，VISTA在特异性免疫和非免疫细胞上表达或不表达。
基于这些结果，由于VISTA仅由免疫细胞表达，与其他一些不受免疫限制的靶标(诸如PRLR)不同，VISTA ADC会不太容易引发对非靶细胞的毒性。此外，因为VISTA特别地由初始免疫细胞和T细胞组成性表达，与其他一些ADC靶标(诸如TNF)不同，VISTA ADC可能更适合用于治疗慢性自身免疫性和炎症性疾病，因为VISTA ADC会保持恒定水平功效(即，将在激活和非激活期间有效)，从而潜在地降低炎症复发的可能性，和/或可在炎症或自身免疫复发期间降低炎症水平。这在治疗上具有重要意义，因为许多自身免疫性/炎症性疾病都会缓解/复发，因此用于治疗此类病状的药物和生物制剂的重要临床目标是提供在缓解和复发期间有效地控制疾病，使得患者不受组织损伤的治疗方案。
此外，在这些ADC靶标中，只有VISTA在嗜中性粒细胞上表达。这一点很重要，因为嗜中性粒细胞在炎症的开始(急性)阶段期间，特别是在细菌感染、环境暴露和一些癌症期间很重要，并且嗜中性粒细胞确实是炎症细胞经由趋化性迁移到炎症部位的第一反应者之一。(Yoo SK等人,(November 2011)."Lyn is a redox sensor that mediates leukocytewound attraction in vivo".Nature.480(7375):109–12)。此外，由于这些细胞在炎症反应的早期阶段表达，因此预计VISTA ADC会快速起效(这实际上在本文中被证明)。
还有额外的治疗意义，因为VISTA也不在B细胞上表达(与其他一些ADC靶标诸如CD40和CD74不同)，VISTA ADC在治疗期间不会影响B淋巴细胞。因此，VISTA ADC可以在治疗期间保持体液免疫，这可以降低受试者在治疗期间发生感染或甚至癌症的可能性。(因为类固醇是有效的免疫抑制剂，与之相关的风险(特别是在慢性使用期间)是治疗对象可能在治疗期间发生致命感染或恶性肿瘤的风险)。
此外，在这些ADC靶标中，只有VISTA似乎由初始Treg、CD4+T细胞和CD8+T细胞组成性表达。这一点特别重要，因为这些细胞参与炎症反应，并且还因为最近据报道Treg对类固醇的功效非常重要。(参见Buttgereit,Frank和Timo Gaber,Timo；Cellular andMolecular Immunology,“New insights into the fascinating world ofglucocorticoids:the dexamethasone-miR-342-Rictor axis in regulatory T cells”,第18卷,520–522(2021)；和Immunity,“Anti-inflammatory Roles of GlucocorticoidsAre Mediated by Foxp3+Regulatory T Cells via amiR-342-Dependent Mechanism:,Vol.53(2):581-596(September2020)；Braitch M.等人,Acta Neurol Scand.,“Glucocorticoids increase CD4+CD25high cell percentage and Foxp3 expressionin patients with multiple sclerosis”,2009April；119(4):239–245)。
事实上，本文包含的实验证据表明，VISTA ADC有效地靶向这些不同类型的免疫细胞并且在其中有效(即，提供：治疗(抗炎)量的类固醇内化至不同类型的免疫细胞中)。
实施例19：PK与PD总结
如上所述，考虑到包含在缀合物中的抗VISTA抗体的短PK，主题抗炎药物缀合物提供比预期长得多的PD持续时间。根据本发明的示例性抗VISTA抗体和含有其的ADC的PK、PD和Kd值总结在表6中。
表6中鉴定的抗体的CDR和可变序列见于图8、图10和图12。表中涉及FKBP5的PD或效力定义为在给药后14天，FKBP5在巨噬细胞中相比于PBS的2倍诱导。表中涉及“细胞因子减少”的PD或效力定义为在离体巨噬细胞激活测定中给药后7天TNFα减少20％。这些测定在实施例6中举例说明。
表6
小时
Figure BDA0004033983910005471
数据表明示例性抗体(它们都在生理pH下与表达人VISTA的免疫细胞结合，并且具有短pK)仍然提供了长PD，即，如对具有治疗性抗体的更长(并且更典型)PK的抗体所预期的那样。此数据证实了此主题ADC会适用于需要长期功效的用途。
实施例20：IBD或结肠炎研究
葡聚糖硫酸钠结肠炎鼠类模型(DSS)模型通常用于评估潜在的IBD或结肠炎治疗剂。(参见,Eichele等人,“Dextran sodium sulfate colitis murine model:Anindispensable tool for advancing our understanding of inflammatory boweldiseases pathogenesis”,World JGasteroenterology,2017年9月7日；23(33):6016–6029”)。因此，此动物模型用于初步评估根据本发明的ADC治疗结肠炎或IBD的功效。
同样众所周知地，IBD和结肠炎是难以有效治疗和管理的慢性病状，并且如果无效治疗可能导致脓毒症和死亡。目前，IBD或结肠炎疾病管理的主要手段涉及慢性类固醇施用。然而，不幸的是，这可能会导致毒性，例如因为类固醇对非靶标(例如，上皮细胞)的影响，和/或长期免疫抑制。
在此初步实验中，一个动物组每隔一天以0.2mpk的类固醇剂量施用根据本发明的Dex ADC(INX243)，第二个阳性对照动物组每天以2mpk的类固醇剂量施用游离Dex类固醇，并且第三个阴性对照动物组不进行治疗。每组有10只动物。当动物开始表现出体重减轻时(第7天)开始ADC或Dex治疗(DSS在第0天开始)。实验在第13天当一组(dex治疗)达到最大允许体重减轻时终止。
结果(初步，未示出)表明，与未治疗的对照相比，ADC表现出功效。此外，结果表明ADC没有引发在游离类固醇治疗的动物中观察到的相同毒性。关于这一点，据报道地塞米松在此IBD模型中引起毒性；参见van Meeteren ME,Meijssen MAC,Zijlstra FJ.“Theeffect of dexamethasone treatment on murine colitis”,Scand JGastroenterol2000；35:517–521；和Ocon等人,“The glucocorticoid budesonide hasprotective and deleterious effects in experimental colitis in mice”,Biochemical Pharmacology 116(2016)73–88)。
虽然这些结果是初步的，但它们表明主题ADC可用于治疗结肠炎或IBD适应症。此外，它们表明主题ADC在治疗这些慢性疾病方面可能优于现有的游离类固醇疗法，因为它们可以减轻长期游离类固醇疗法期间可能发生的毒性。
结论
本申请中公开的实验结果表明，主题ADC具有与用于使抗炎剂、特别是类固醇靶向免疫细胞并且引导其内化到免疫细胞中的先前ADC(例如靶向CD74、CD163、TNF和PRLR的ADC)相比的独特的优势组合；这是由于VISTA作为ADC靶标和包含在主题ADC中的抗VISTA抗体的特定性质(在生理pH下与表达VISTA的免疫细胞结合并且具有非常短的pK)的组合益处。
这些优势包括以下内容：
主题ADC与以非常高的密度表达VISTA的免疫细胞结合，并且尽管它们的PK非常短，但长时间有效(引发抗炎活性)，因此非常适合治疗慢性或发作性炎症性或自身免疫性疾病，其中长期并且重复施用在治疗上是必要的。
主题ADC靶向广泛的免疫细胞，包括嗜中性粒细胞、骨髓细胞、T细胞和内皮细胞，因此主题ADC可用于治疗涉及任何或所有这些类型的免疫细胞的炎症性疾病或自身免疫性疾病。
主题ADC快速起效(短至2小时内)，因此可用于急性治疗。
主题ADC不结合B细胞，因此不会像游离类固醇那样具有免疫抑制作用(即，将保留体液免疫)。这可能会减少慢性或长期使用主题ADC期间的毒性或不良副作用，所述毒性或不良副作用与长期使用游离类固醇相关(例如，长期使用类固醇与一些癌症、感染性病状和其他疾病相关，显然是因为长期免疫抑制的副作用)。
主题ADC作用于Treg，Treg是负责类固醇功效的重要免疫细胞。
主题ADC同时作用于静息和激活的免疫细胞(在其上组成性表达)；因此主题ADC在炎症性和自身免疫性病状的活跃期和缓解期都将保持活跃(引发抗炎活性)。
主题ADC作用于嗜中性粒细胞，所述免疫细胞对急性炎症至关重要，这进一步证明ADC非常适合治疗急性炎症和控制炎症发病(最好在病理症状出现之前)，所述炎症例如与慢性或发作性自身免疫性或炎症性病状的活跃期，发病早期相关。这可能会减少可能甚至在受试者经历与炎症相关的疼痛或其他症状之前发生的组织损伤。
由于VISTA细胞表面周转率高，主题ADC非常迅速且组成性地内化至免疫细胞中。
主题ADC具有非常短的半衰期(PK)并且仅结合免疫细胞，因此主题ADC不会容易出现发生靶标相关毒性和不希望的外周类固醇暴露(低非特异性损失效应)。
在一些实施方案中，主题ADC的生物活性(抗炎作用)完全归因于抗炎有效载荷(类固醇)，因为其中具有沉默IgG的抗VISTA抗体不表现出免疫功能(不阻断任何VISTA生物学)，从而潜在地简化给药和/或潜在地避免不良副作用，例如在治疗上可能不需要VISTA激动的个体中。
在一些实施方案中，主题ADC的生物活性(抗炎或免疫抑制作用)归因于抗炎有效载荷(类固醇)和抗VISTA抗体的Fc部分，特别是在其中抗VISTA抗体包含功能性IgG2 Fc区的实施方案中，因为具有功能性IgG2的抗VISTA抗体与表达VISTA的免疫细胞的结合会激动VISTA的免疫抑制作用，特别是VISTA对T细胞增殖和T细胞活性的抑制作用，从而提供具有由2种不同的机制引发的免疫抑制活性的ADC。
实施例中引用的参考文献
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(6)Liu，Z.，Yu，Z.，He，W.Liu，Z.，Yu，Z.，He，W.，Ma，S.，Sun,L.,&Wang,L.(2009).“In-vitro internalization and in-vivo tumor uptake of anti～EGFRmonoclonalantibody LA22 in A549 lung cancer cells and animal model”.CancerBiother Radiopharm，15-23.
非正式序列表
SEQ ID NO：1：智人VISTA(替代名称：B7-H5；B7H5；DD1α；GI24；PP2135；SISP1)氨基酸序列
Figure BDA0004033983910005511
SEQ ID NO：2：小家鼠VISTA氨基酸序列
Figure BDA0004033983910005512
SEQ ID NO:3：小家鼠VISTA氨基酸序列
Figure BDA0004033983910005521
SEQ ID NO:4：智人VISTA(替代名称：B7-H5；B7H5；DD1α；GI24；PP2135；SISP1)核酸序列
Figure BDA0004033983910005522
Figure BDA0004033983910005531
Figure BDA0004033983910005541
SEQ ID NO:5：智人VISTA(替代名称：B7-H5；B7H5；DD1α；GI24；PP2135；SISP1)编码核酸序列
Figure BDA0004033983910005542
SEQ ID NO:6：小家鼠VISTA编码核酸序列
Figure BDA0004033983910005551
Figure BDA0004033983910005561
人_κ_恒定
Figure BDA0004033983910005562

Claims (65)

1.一种抗体药物缀合物(ADC)，其包含：抗体或抗原结合片段(“A”)，其包含特异性结合至人T细胞激活V结构域Ig抑制因子(人VISTA)的抗原结合区；至少一个可切割或不可切割接头(“L”)；任选“异双官能基团”或“异三官能基团”“Q”，其是任选用于连接所述接头和所述抗VISTA抗体或抗体片段的化学部分；以及至少一种抗炎剂，优选小分子(“AI”)，其中AI需要细胞内化以获得功效(抗炎活性)，所述ADC由下式表示：
“A-(Q-L-AI)n”或“(AI-L-Q)n-A”
其中“n”至少为1并且另外，其中所述ADC当施用于有需要的受试者时优先递送至表达VISTA的免疫细胞，任选单核细胞、骨髓细胞、T细胞、Treg、NK细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞和内皮细胞中的一种或多种，并且导致所述小分子抗炎剂功能内化至一种或多种所述免疫细胞中；其中：
(i)所述抗人VISTA抗体或抗体片段在生理pH(约7.5)下优先结合至表达VISTA的细胞；
(ii)所述抗人VISTA抗体或抗体片段在人VISTA敲入啮齿动物中具有至多70小时的pK。
2.如权利要求1所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述AI包括糖皮质激素。
3.如权利要求1所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述糖皮质激素包括以下中的一者：
Figure FDA0004033983900000021
4.如权利要求1所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述糖皮质激素包括16-α羟基泼尼松龙、地塞米松、二氟拉松、氟米松、氟尼缩松、醋酸氟轻松、丙酸氟替卡松、环索奈德、甲基泼尼松龙、强的松、泼尼松龙、莫米松、曲安奈德或它们的衍生物。
5.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其在食蟹猕猴或人中在生理pH下具有至多3.5至4天的pK，或如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其在食蟹猕猴或人中在生理pH下具有至多2.8天±0.5天的pK。
6.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其在人VISTA啮齿动物中在生理pH下具有至多6-12小时的pK。
7.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述抗体的PK如在实施例10中所述通过ELISA，任选在静脉推注之后使用PKsolver程序并且通过进行非隔室分析(NCA)来测定。
8.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含接头，所述接头在所述ADC内化至表达VISTA的免疫细胞(任选T细胞、Treg、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、骨髓细胞、树突细胞、巨噬细胞和内皮细胞中的一种或多种)中时被切割，导致在所述免疫细胞中释放治疗有效量的所述抗炎剂，其中所述抗炎剂引发抗炎活性。
9.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述抗VISTA抗体或抗原结合片段在灵长类动物，任选食蟹猕猴中在生理pH(约pH7.5)下具有约2.3天±0.7天或更短的体内血清半衰期。
10.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述抗VISTA抗体或抗原结合片段在人VISTA敲入啮齿动物中在生理pH(约pH7.5)下在血清中具有以下体内血清半衰期：不超过70小时、不超过60小时、不超过50小时、不超过40小时、不超过30小时、不超过24小时、不超过22-24小时、不超过20-22小时、不超过18-20小时、不超过16-18小时、不超过14-16小时、不超过12-14小时、不超过10-12小时、不超过8-10小时、不超过6-8小时、不超过4-6小时、不超过2-4小时、不超过1-2小时、不超过0.5-1.0小时或不超过0.1-0.5小时。
11.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中在体内使用时，所述ADC在人VISTA敲入啮齿动物和/或人或非人灵长类动物，任选食蟹猕猴中的pK/pD比率为至少2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或更大。
12.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述ADC在人VISTA敲入啮齿动物和/或人或非人灵长类动物，任选食蟹猕猴中的PD为至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天、2-3周或更长。
13.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述抗人VISTA抗体包含具有受损的FcR结合的Fc区。
14.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述抗人VISTA抗体包含具有受损的FcR结合的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区。
15.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述抗人VISTA抗体包含具有受损的FcR结合的人IgG1 Fc区。
16.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含被修饰以削弱或消除与至少2种天然人Fcγ受体的结合的人或非人灵长类动物恒定区或Fc区。
17.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含被修饰以削弱或消除与以下FcR中的任一个、两个、三个、四个或全部五个的结合的人或非人灵长类动物恒定区或Fc区：hFcγRI(CD64)、FcyRIIA或hFcyRIIB、(CD32或CD32A)以及FcγRlllA(CD16A)或FcγRlllB(CD16B)。
18.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含在Fc区中具有V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S沉默突变的人IgG2κ主链。
19.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含在Fc区中具有L234A/L235A沉默突变以及任选的削弱补体(C1Q)结合的突变的人IgG1/κ主链。
20.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含在Fc区中具有L234A/L235A沉默突变以及E269R和E233A突变的人IgG1/κ主链。
21.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述抗VISTA抗体或抗原结合片段与表达VISTA的免疫细胞的结合不直接激动或拮抗VISTA介导的对免疫的作用。
22.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含其中内源性FcR结合未受损的人IgG2 Fc区。
23.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含天然(未修饰的)人IgG2 Fc区。
24.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述抗VISTA抗体或抗原结合片段包含通过表面等离子共振(SPR)在24℃或37℃下测定的在0.0001nM至10.0nM、0.001至1.0nM、0.01至0.7或更小范围内的KD。
25.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述抗VISTA抗体或抗原结合片段包含通过表面等离子共振(SPR)在24℃或37℃下测定的0.02至0.64nM的KD。
26.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述接头包括本申请中公开的任何接头。
27.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述接头是带正电荷、负电荷或中性电荷的可切割肽，任选可被酯酶切割。
28.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述抗炎剂包括类固醇，任选糖皮质激素受体激动剂，进一步任选地塞米松、泼尼松龙或布地奈德或者前述中的任一者的功能衍生物，即所述衍生物在内化至表达VISTA的免疫细胞中后引发抗炎活性。
29.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述药物抗体比的范围为1:1-10:1。
30.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述药物抗体比的范围为2-8:1、4-8:1或6-8:1。
31.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述药物抗体比为8:1(n＝8)。
32.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其内化至单核细胞、骨髓细胞、T细胞、Treg、巨噬细胞和嗜中性粒细胞中的一种或多种中。
33.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其不会明显内化至B细胞中。
34.如前述权利要求中任一项所述的ADC，与以裸(非缀合)形式施用的相同剂量的抗炎剂相比，所述ADC当施用于有需要的受试者时促进与所述抗炎剂(例如，类固醇，任选糖皮质激素受体激动剂，进一步任选地塞米松、泼尼松龙或布地奈德)相关的功效和/或减少与其相关的不良副作用。
35.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述抗炎剂，任选类固醇或糖皮质激素受体激动剂，进一步任选地塞米松、泼尼松龙或布地奈德或者前述中的任一者的功能衍生物，经由链间二硫键与所述抗体或抗原结合片段缀合。
36.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含酯酶敏感性接头和作为所述抗炎剂的地塞米松或功能衍生物。
37.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述可切割接头对酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键切割中的一种或多种敏感。
38.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中所述可切割接头是酯酶可切割接头。
39.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其包含基本上抵抗酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键切割中的一种或多种的不可切割接头。
40.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中包含在所述ADC中的所述抗VISTA抗原结合片段包含Fab、F(ab')2或scFv抗体片段。
41.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中包含在所述ADC中的所述抗VISTA抗体或抗体片段是这样的一种：
(i)包含SEQ ID NO:100、101和102的VH CDR以及SEQ ID NO:103、104和105的VL CDR；
(ii)包含SEQ ID NO:110、111和112的VH CDR以及SEQ ID NO:113、114和115的VL CDR；
(iii)包含SEQ ID NO:120、121和122的VH CDR以及SEQ ID NO:123、124和125的VL CDR；
(iv)包含SEQ ID NO:130、131和132的VH CDR以及SEQ ID NO:133、134和135的VL CDR；
(v)包含SEQ ID NO:140、141和142的VH CDR以及SEQ ID NO:143、144和145的VL CDR；
(vi)包含SEQ ID NO:150、151和152的VH CDR以及SEQ ID NO:153、154和155的VL CDR；
(vii)包含SEQ ID NO:160、161和162的VH CDR以及SEQ ID NO:163、164和165的VL CDR；
(viii)包含SEQ ID NO:170、171和172的VH CDR以及SEQ ID NO:173、174和175的VLCDR；
(ix)包含SEQ ID NO:180、181和182的VH CDR以及SEQ ID NO:183、184和185的VL CDR；
(x)包含SEQ ID NO:190、191和192的VH CDR以及SEQ ID NO:193、194和195的VL CDR；
(xi)包含SEQ ID NO:200、201和202的VH CDR以及SEQ ID NO:203、204和205的VL CDR；
(xii)包含SEQ ID NO:210、211和212的VH CDR以及SEQ ID NO:213、214和215的VL CDR；
(xiii)包含SEQ ID NO:220、221和222的VH CDR以及SEQ ID NO:223、224和225的VLCDR；
(xiv)包含SEQ ID NO:230、231和232的VH CDR以及SEQ ID NO:233、234和235的VL CDR；
(xv)包含SEQ ID NO:240、241和242的VH CDR以及SEQ ID NO:243、244和245的VL CDR；
(xvi)包含SEQ ID NO:250、251和252的VH CDR以及SEQ ID NO:253、254和255的VL CDR；
(xvii)包含SEQ ID NO:260、261和262的VH CDR以及SEQ ID NO:263、264和265的VLCDR；
(xviii)包含SEQ ID NO:270、271和272的VH CDR以及SEQ ID NO:273、274和275的VLCDR；
(xix)包含SEQ ID NO:280、281和282的VH CDR以及SEQ ID NO:283、284和285的VL CDR；
(xx)包含SEQ ID NO:290、291和292的VH CDR以及SEQ ID NO:293、294和295的VL CDR；
(xxi)包含SEQ ID NO:300、301和302的VH CDR以及SEQ ID NO:303、304和305的VL CDR；
(xxii)包含SEQ ID NO:310、311和312的VH CDR以及SEQ ID NO:313、314和315的VLCDR；
(xxiii)包含SEQ ID NO:320、321和322的VH CDR以及SEQ ID NO:323、324和325的VLCDR；
(xxiv)包含SEQ ID NO:330、331和332的VH CDR以及SEQ ID NO:333、334和335的VLCDR；
(xxv)包含SEQ ID NO:340、341和342的VH CDR以及SEQ ID NO:343、344和345的VL CDR；
(xxvi)包含SEQ ID NO:350、351和352的VH CDR以及SEQ ID NO:353、354和355的VLCDR；
(xxvii)包含SEQ ID NO:360、361和362的VH CDR以及SEQ ID NO:363、364和365的VLCDR；
(xxviii)包含SEQ ID NO:370、371和372的VH CDR以及SEQ ID NO:373、374和375的VLCDR；
(xxix)包含SEQ ID NO:380、381和382的VH CDR以及SEQ ID NO:383、384和385的VLCDR；
(xxx)包含SEQ ID NO:390、391和392的VH CDR以及SEQ ID NO:393、394和395的VL CDR；
(xxxi)包含SEQ ID NO:400、401和402的VH CDR以及SEQ ID NO:403、404和405的VLCDR；
(xxxii)包含SEQ ID NO:410、411和412的VH CDR以及SEQ ID NO:413、414和415的VLCDR；
(xxxiii)包含SEQ ID NO:420、421和422的VH CDR以及SEQ ID NO:423、424和425的VLCDR；
(xxxiv)包含SEQ ID NO:430、431和432的VH CDR以及SEQ ID NO:433、434和435的VLCDR；
(xxxv)包含SEQ ID NO:440、441和442的VH CDR以及SEQ ID NO:443、444和445的VLCDR；
(xxxvi)包含SEQ ID NO:450、451和452的VH CDR以及SEQ ID NO:453、454和455的VLCDR；
(xxxvii)包含SEQ ID NO:460、461和462的VH CDR以及SEQ ID NO:463、464和465的VLCDR；
(xxxviii)包含SEQ ID NO:470、471和472的VH CDR以及SEQ ID NO:473、474和475的VLCDR；
(xxxix)包含SEQ ID NO:480、481和482的VH CDR以及SEQ ID NO:483、484和485的VLCDR；
(xl)包含SEQ ID NO:490、491和492的VH CDR以及SEQ ID NO:493、494和495的VL CDR多肽；
(xli)包含SEQ ID NO:500、501和502的VH CDR以及SEQ ID NO:503、504和505的VL CDR多肽；
(xlii)包含SEQ ID NO:510、511和512的VH CDR以及SEQ ID NO:513、514和515的VL CDR多肽；
(xliii)包含SEQ ID NO:520、521和522的VH CDR以及SEQ ID NO:523、524和525的VLCDR多肽；
(xliv)包含SEQ ID NO:530、531和532的VH CDR以及SEQ ID NO:533、534和535的VL CDR多肽；
(xlv)包含SEQ ID NO:540、541和542的VH CDR以及SEQ ID NO:543、544和545的VL CDR多肽；
(xlvi)包含SEQ ID NO:550、551和552的VH CDR以及SEQ ID NO:553、554和555的VL CDR多肽；
(xlvii)包含SEQ ID NO:560、561和562的VH CDR以及SEQ ID NO:563、564和565的VLCDR；
(xlviii)包含SEQ ID NO:570、571和572的VH CDR以及SEQ ID NO:573、574和575的VLCDR；
(xlix)包含SEQ ID NO:580、581和582的VH CDR以及SEQ ID NO:583、584和585的VLCDR；
(l)包含SEQ ID NO:590、591和592的VH CDR以及SEQ ID NO:593、594和595的VL CDR；
(li)包含SEQ ID NO:600、601和602的VH CDR以及SEQ ID NO:603、604和605的VL CDR；
(lii)包含SEQ ID NO:610、611和612的VH CDR以及SEQ ID NO:613、614和615的VL CDR；
(liii)包含SEQ ID NO:620、621和622的VH CDR以及SEQ ID NO:623、624和625的VLCDR；
(liv)包含SEQ ID NO:630、631和632的VH CDR以及SEQ ID NO:633、634和635的VL CDR；
(lv)包含SEQ ID NO:640、641和642的VH CDR以及SEQ ID NO:643、644和645的VL CDR；
(lvi)包含SEQ ID NO:650、651和652的VH CDR以及SEQ ID NO:653、654和655的VL CDR；
(lvii)包含SEQ ID NO:660、661和662的VH CDR以及SEQ ID NO:663、664和665的VLCDR；
(lviii)包含SEQ ID NO:670、671和672的VH CDR以及SEQ ID NO:673、674和675的VLCDR；
(lix)包含SEQ ID NO:680、681和682的VH CDR以及SEQ ID NO:683、684和685的VL CDR；
(lx)包含SEQ ID NO:690、691和692的VH CDR以及SEQ ID NO:693、694和695的VL CDR；
(lxi)包含SEQ ID NO:700、701和702的VH CDR以及SEQ ID NO:703、704和705的VL CDR；
(lxii)包含SEQ ID NO:710、711和712的VH CDR以及SEQ ID NO:713、714和715的VLCDR；
(lxiii)包含SEQ ID NO:720、721和722的VH CDR以及SEQ ID NO:723、724和725的VLCDR；
(lxiv)包含SEQ ID NO:730、731和732的VH CDR以及SEQ ID NO:733、734和735的VLCDR；
(lxv)包含SEQ ID NO:740、741和742的VH CDR以及SEQ ID NO:743、744和745的VL CDR；
(lxvi)包含SEQ ID NO:750、751和752的VH CDR以及SEQ ID NO:753、754和755的VLCDR；
(lxvii)包含SEQ ID NO:760、761和762的VH CDR以及SEQ ID NO:763、764和765的VLCDR；
(lxviii)包含SEQ ID NO:770、771和772的VH CDR以及SEQ ID NO:773、774和775的VLCDR；
(lxix)包含SEQ ID NO:780、781和782的VH CDR以及SEQ ID NO:783、784和785的VLCDR；
(lxx)包含SEQ ID NO:790、791和792的VH CDR以及SEQ ID NO:793、794和795的VL CDR；
(lxxi)包含SEQ ID NO:800、801和802的VH CDR以及SEQ ID NO:803、804和805的VLCDR；
(lxxii)包含SEQ ID NO:810、811和812的VH CDR以及SEQ ID NO:813、814和815的VLCDR。
42.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中包含在所述ADC中的所述抗VISTA抗体或抗体片段包含与VSTB92、VSTB56、VSTB95、VSTB103和VSTB66中的任一者相同的CDR。
43.如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)，其中包含在所述ADC中的所述抗VISTA抗体或抗体片段是包含VH多肽和VL多肽的抗VISTA抗体或抗体片段，所述两种多肽分别与包含以下VH多肽和VL多肽的抗体的两种多肽具有至少90％、95％或100％的序列同一性，并且此外，所述CDR未被修饰：
(i)包含SEQ ID NO:106同一性的VH多肽和SEQ ID NO:108的VL多肽的抗体；
(ii)包含SEQ ID NO:116的VH多肽和SEQ ID NO:118的VL多肽的抗体；
(iii)包含SEQ ID NO:126的VH多肽和SEQ ID NO:128的VL多肽的抗体；
(iv)包含SEQ ID NO:136的VH多肽和SEQ ID NO:138的VL多肽的抗体；
(v)包含SEQ ID NO:146的VH多肽和SEQ ID NO:148的VL多肽的抗体；
(vi)包含SEQ ID NO:156的VH多肽和SEQ ID NO:158的VL多肽的抗体；
(vii)包含SEQ ID NO:166的VH多肽和SEQ ID NO:168的VL多肽的抗体；
(viii)包含SEQ ID NO:176的VH多肽和SEQ ID NO:178的VL多肽的抗体；
(ix)包含SEQ ID NO:186的VH多肽和SEQ ID NO:188的VL多肽的抗体；
(x)包含SEQ ID NO:196的VH多肽和SEQ ID NO:198的VL多肽的抗体；
(xi)包含SEQ ID NO:206的VH多肽和SEQ ID NO:208的VL多肽的抗体；
(xii)包含SEQ ID NO:216的VH多肽和SEQ ID NO:218的VL多肽的抗体；
(xiii)包含SEQ ID NO:226的VH多肽和SEQ ID NO:228的VL多肽的抗体；
(xiv)包含SEQ ID NO:236的VH多肽和SEQ ID NO:238的VL多肽的抗体；
(xv)包含SEQ ID NO:246的VH多肽和SEQ ID NO:248的VL多肽的抗体；
(xvi)包含SEQ ID NO:256的VH多肽和SEQ ID NO:258的VL多肽的抗体；
(xvii)包含SEQ ID NO:266的VH多肽和SEQ ID NO:268的VL多肽的抗体；
(xviii)包含SEQ ID NO:276的VH多肽和SEQ ID NO:278的VL多肽的抗体；
(xix)包含SEQ ID NO:286的VH多肽和SEQ ID NO:288的VL多肽的抗体；
(xx)包含SEQ ID NO:296的VH多肽和SEQ ID NO:298的VL多肽的抗体；
(xxi)包含SEQ ID NO:306的VH多肽和SEQ ID NO:308的VL多肽的抗体；
(xxii)包含SEQ ID NO:316的VH多肽和SEQ ID NO:318的VL多肽的抗体；
(xxiii)包含SEQ ID NO:326的VH多肽和SEQ ID NO:328的VL多肽的抗体；
(xxiv)包含SEQ ID NO:336的VH多肽和SEQ ID NO:338的VL多肽的抗体；
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(xxvi)包含SEQ ID NO:356的VH多肽和SEQ ID NO:358的VL多肽的抗体；
(xxvii)包含SEQ ID NO:366的VH多肽和SEQ ID NO:368的VL多肽的抗体；
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(xxxix)包含SEQ ID NO:486的VH多肽和SEQ ID NO:488的VL多肽的抗体；
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(xlvi)包含SEQ ID NO:556的VH多肽和SEQ ID NO:558的VL多肽的抗体；
(xlvii)包含SEQ ID NO:566的VH多肽和SEQ ID NO:568的VL多肽的抗体；
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(xlix)包含SEQ ID NO:586的VH多肽和SEQ ID NO:588的VL多肽的抗体；
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(li)包含SEQ ID NO:606的VH多肽和SEQ ID NO:608的VL多肽的抗体；
(lii)包含SEQ ID NO:616的VH多肽和SEQ ID NO:618的VL多肽的抗体；
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(liv)包含SEQ ID NO:636的VH多肽和SEQ ID NO:638的VL多肽的抗体；
(lv)包含SEQ ID NO:646的VH多肽和SEQ ID NO:648的VL多肽的抗体；
(lvi)包含SEQ ID NO:656的VH多肽和SEQ ID NO:658的VL多肽的抗体；
(lvii)包含SEQ ID NO:666的VH多肽和SEQ ID NO:668的VL多肽的抗体；
(lviii)包含SEQ ID NO:676的VH多肽和SEQ ID NO:678的VL多肽的抗体；
(lix)包含SEQ ID NO:686的VH多肽和SEQ ID NO:688的VL多肽的抗体；
(lx)包含SEQ ID NO:696的VH多肽和SEQ ID NO:698的VL多肽的抗体；
(lxi)包含SEQ ID NO:706的VH多肽和SEQ ID NO:708的VL多肽的抗体；
(lxii)包含SEQ ID NO:716的VH多肽和SEQ ID NO:718的VL多肽的抗体；
(lxiii)包含SEQ ID NO:726的VH多肽和SEQ ID NO:728的VL多肽的抗体；
(lxiv)包含SEQ ID NO:736的VH多肽和SEQ ID NO:738的VL多肽的抗体；
(lxv)包含SEQ ID NO:746的VH多肽和SEQ ID NO:748的VL多肽的抗体；
(lxvi)包含SEQ ID NO:756的VH多肽和SEQ ID NO:758的VL多肽的抗体；
(lxvii)包含SEQ ID NO:766的VH多肽和SEQ ID NO:768的VL多肽的抗体；
(lxviii)包含SEQ ID NO:776的VH多肽和SEQ ID NO:778的VL多肽的抗体；
(lxix)包含SEQ ID NO:786的VH多肽和SEQ ID NO:788的VL多肽的抗体；
(lxx)包含SEQ ID NO:796的VH多肽和SEQ ID NO:798的VL多肽的抗体；
(lxxi)包含SEQ ID NO:806的VH多肽和SEQ ID NO:808的VL多肽的抗体；以及
(lxxii)包含SEQ ID NO:816的VH多肽和SEQ ID NO:818的VL多肽的抗体。
44.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述抗VISTA抗体或抗体片段包含与VSTB92、VSTB56、VSTB95、VSTB103和VSTB66中的一者相同的可变区。
45.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述抗VISTA抗体或抗体片段包含在Fc区中具有V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S沉默突变的人IgG2κ主链。
46.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述抗VISTA抗体或抗体片段包含在Fc区中具有L234A/L235A沉默突变的人IgG1/κ主链。
47.如前述权利要求中任一项所述的ADC，其中所述AI或所述L或Q经由链间二硫键与所述抗VISTA抗体或抗原结合片段缀合。
48.一种药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种如前述权利要求中任一项所述的抗体药物缀合物(ADC)和药学上可接受的载剂。
49.如权利要求45所述的组合物，其可经由注射途径，任选静脉内、肌肉内、鞘内或皮下来施用。
50.如权利要求45或46所述的组合物，其可皮下施用。
51.一种包括如权利要求45、46或47所述的组合物的装置，其提供选自由以下组成的组的皮下施用：注射筒、注射装置、输液泵、注射笔、无针装置、自助注射器和皮下贴片递送系统。
52.如权利要求48所述的装置，其向患者递送固定剂量的所述抗炎剂，例如类固醇，例如糖皮质激素受体激动剂，任选地塞米松、泼尼松龙或布地奈德或者它们的功能衍生物。
53.一种包括如权利要求48或49所述的装置的药盒，其还包括告知所述患者如何施用其中包含的所述ADC组合物和给药方案的说明书。
54.一种治疗和/或预防的方法，其包括向有需要的患者施用至少一种抗体药物缀合物(ADC)或组合物，其中所述组合物可以在根据前述权利要求中任一项的装置中。
55.如权利要求51所述的方法，其用于人受试者的过敏、自身免疫、移植、基因治疗、炎症、GVHD或脓毒症的治疗，或者用于治疗或预防人受试者的与任何前述病状相关的炎症性、自身免疫性或过敏性副作用。
56.如权利要求51或52所述的方法，其中所述患者包括选自以下的病状：类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、成人克罗恩病、小儿克罗恩病、溃疡性结肠炎、斑块型银屑病、化脓性汗腺炎、葡萄膜炎、贝赛特氏症、脊椎关节病或银屑病。
57.如权利要求51-53中任一项所述的方法，其中所述患者包括以下中的一者或多者：
(i)主要仅可用高剂量类固醇有效治疗的病状，任选风湿性多肌痛和/或巨细胞动脉炎，所述患者任选已经接受或正在接受高类固醇剂量治疗；
(ii)具有限制类固醇使用的共患症的病状，任选糖尿症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、病态肥胖、无血管性坏死/骨坏死(AVN)、青光眼、类固醇引起的高血压、严重皮肤脆弱和/或骨关节炎；
(iii)其中可获得安全长期治疗剂但其中需要用高剂量类固醇诱导数月的病状，任选AAV、多发性肌炎、皮肌炎、狼疮、炎症性肺病、自身免疫性肝炎、炎症性肠病、免疫性血小板减少症、自身免疫性溶血性贫血、痛风患者，其中用高剂量类固醇诱导数月在治疗上是必要的；
(iv)需要短期/长期治疗、任选具有不确定的治疗或持续时间和/或没有类固醇施用的有效替代的皮肤病病状，任选史蒂芬斯强森综合征、其他严重药疹病状、涉及广泛接触性皮炎的病状、其他严重免疫相关皮肤病病状诸如PG、LCV、红皮病等；
(v)用高剂量皮质类固醇治疗的突发/复发病状，任选COPD、哮喘、狼疮、痛风、假痛风；
(vi)免疫相关神经系统疾病，诸如小纤维神经病、MS(亚组)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、重症肌无力等；
(vii)血液学/肿瘤学适应症，任选其中高剂量类固醇可能将在治疗上是必要的或有益的；
(viii)眼科病状，任选葡萄膜炎、虹膜炎、巩膜炎等；
(ix)与永久性或非常长时间的肾上腺功能不全或继发性肾上腺功能不全相关的病状，任选医源性爱迪生危象；
(x)通常用长期、低剂量类固醇治疗的病状，任选狼疮、RA、psA、血管炎等；以及
(xi)特殊类别的患者，诸如怀孕/授乳女性、儿科患者(任选患有生长障碍或白内障的那些)。
58.如权利要求50-54中任一项所述的方法，其中所述患者还正在用另一种活性剂治疗。
59.如权利要求50-55中任一项所述的方法，其中所述患者还正在用免疫调节抗体或融合蛋白治疗，其选自靶向以下中的一种或多种的免疫抑制抗体或融合蛋白：CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA，和/或靶向以下中的一种或多种的激动性抗体或融合蛋白：CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS。
60.如权利要求50-56中任一项所述的方法，其用于治疗或预防急性或慢性炎症以及与所述急性或慢性炎症相关的自身免疫性和炎症性适应症，其中所述病状任选包括获得性再生障碍性贫血+、获得性血友病+、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)+、急性出血性白质脑炎(AHLE)/赫斯特病+、原发性无丙种球蛋白血症+、斑秃+、强直性脊柱炎(AS)、抗NMDA受体脑炎+、抗磷脂综合征(APS)+、动脉硬化、自闭症谱系障碍(ASD)、自身免疫性艾迪生病(AAD)+、自身免疫性自主神经功能障碍/自身免疫性自主神经节病(AAG)、自身免疫性脑炎+、自身免疫性胃炎、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)+、自身免疫性肝炎(AIH)+、自身免疫性高脂血症、自身免疫性垂体炎/淋巴细胞性垂体炎+、自身免疫性内耳病(AIED)+、自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)+、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎+、自身免疫性睾丸炎+、自身免疫性胰腺炎(AIP)/免疫球蛋白G4相关疾病(IgG4-RD)+、I型、II型和III型自身免疫性多腺综合征+、自身免疫性黄体酮皮炎+、自身免疫性突发性感觉神经性听力损失(SNHL)、贲门失弛缓症、艾迪生病、成人斯蒂尔病、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性自主神经功能障碍、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性荨麻疹、轴突和神经元神经病(AMAN)、巴娄病、贝赛特氏症、良性黏膜类天疱疮、大疱性类天疱疮、淋巴结增生症(CD)、腹腔疾病、南美锥虫病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、查格-施特劳斯综合征(CSS)或嗜酸性肉芽肿病(EGPA)、瘢痕性类天疱疮、科干综合征、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎、CREST综合征、1型糖尿病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克氏病(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德雷斯勒综合征、子宫内膜异位症、嗜酸性食管炎(EoE)、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、原发性混合冷球蛋白血症、埃文斯综合征、纤维肌痛、纤维化肺泡炎、纤维化肺泡炎、巨细胞性心肌炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征、肉芽肿性多血管炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、亨-舍二氏紫癜(HSP)、妊娠疱疹或妊娠类天疱疮(PG)、化脓性汗腺炎(HS)(反常性痤疮)、低丙种球蛋白血症、IgA肾病、IgG4相关硬化性疾病、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、包涵体肌炎(IBM)、间质性膀胱炎(IC)、青少年关节炎、青少年糖尿病(1型糖尿病)、青少年肌炎(JM)、川崎氏病、兰伯特-伊顿综合征、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化苔藓症、木质结膜炎、线性IgA病(LAD)、狼疮(包括肾炎和皮肤)、慢性莱姆病、梅尼埃氏病、显微镜多血管炎(MPA)、混合性结缔组织病(MCTD)、穆伦溃疡、穆查-哈伯曼病、多灶性运动神经病(MMN)或MMNCB、多发性硬化症、重症肌无力、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体障碍、肌炎、嗜睡症、新生儿狼疮、视神经脊髓炎、中性粒细胞减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS)、复发性风湿病(PR)、PANDAS、副肿瘤性小脑变性(PCD)、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、帕里-隆伯格综合征、睫状体扁平部炎(外周葡萄膜炎)、牧师特纳综合症、天疱疮、周围神经病变、外周脑脊髓炎、恶性贫血(PA)、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I、II、III型多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、孕酮性皮炎、银屑病、银屑病关节炎、纯红细胞再生障碍(PRCA)、坏疽性脓皮病、雷诺现象、反应性关节炎、反射性交感神经营养不良、复发性多软骨炎、不安腿综合征(RLS)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、施密特综合征、巩膜炎、硬皮病、舍格伦综合症、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征(SPS)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克综合征、交感性眼炎(SO)、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、甲状腺眼病(TED)、托-享综合症(THS)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、Vogt-小柳-原田病等。
61.如权利要求50-57中任一项所述的方法，其用于治疗或预防急性或慢性炎症以及与所述急性或慢性炎症相关的自身免疫性和炎症性适应症，其中所述病状任选包括严重哮喘、巨细胞动脉炎、ANKA血管炎和IBD(结肠炎和克罗恩病)。
62.如权利要求50-56中任一项所述的方法，其用于治疗或预防选自以下的病状：类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、成人克罗恩病、小儿克罗恩病、溃疡性结肠炎、斑块型银屑病、化脓性汗腺炎、葡萄膜炎、贝赛特氏症、脊椎关节病或银屑病。
63.一种用于实现类固醇内化到T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、Treg、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、骨髓细胞、树突细胞和巨噬细胞中的一种或多种中的方法，其包括向受试者施用根据前述权利要求中任一项所述的ADC或使所述细胞与根据前述权利要求中任一项所述的ADC离体接触。
64.如权利要求60所述的方法，其是离体实现的，并且使纯化或富集的包含免疫细胞或包含特定一种类型或多种类型的选自以下的免疫细胞的组合物与根据前述权利要求中任一项所述的ADC离体接触并且之后引入有需要的受试者中：细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、Treg、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、骨髓细胞、树突细胞和巨噬细胞。
65.一种用于治疗涉及T细胞、Treg、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、骨髓细胞、树突细胞和巨噬细胞中的任何一种或多种的炎症性或自身免疫性病状的方法，其包括向有需要的受试者施用根据前述权利要求中任一项所述的ADC。
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