KR20170016479A - 아우리스타틴 유도체 및 그의 접합체 - Google Patents
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Abstract
본원에 기재된 바와 같은 화학식 I의 신규 화합물 및 면역접합체 (즉 항체 약물 접합체)를 제조하는데 있어서 이러한 펩티드의 용도가 본원에 개시된다. 또한, 항원 결합 모이어티, 예컨대 항체에 연결된 이러한 신규 화합물을 포함하는 면역접합체 (즉 항체 약물 접합체)가 본원에 기재되며; 여기서 이러한 면역접합체는 세포 증식성 장애를 치료하는데 유용하다. 본 발명은 추가로 이들 면역접합체를 포함하는 제약 조성물, 치료 공동-작용제와 함께 면역접합체를 포함하는 조성물, 및 세포 증식 장애를 치료하기 위해 이들 면역접합체 및 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
<화학식 I>
<화학식 I>
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2014년 6월 13일에 출원된 미국 가출원 번호 62/011961의 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 항유사분열 세포독성 펩티드이며, 세포 증식성 장애를 치료하는데 유용한 화합물을 제공한다. 본 발명은 또한, 항원-결합 모이어티에 연결된 이러한 화합물을 포함하는 접합체, 및 이들 접합체를 함유하는 제약 조성물을 포함한다. 또한, 암을 비롯한, 세포 증식 장애를 치료하기 위해 이들 화합물 및 접합체를 사용하는 방법을 포함한다.
특정 세포에 세포 증식 억제제 및/또는 세포독성제의 표적화된 전달을 위한 항체-약물 접합체 (ADC)의 사용은 중요한 연구의 중심이 되어 왔다. 문헌 [Antibody-Drug Conjugate, Methods in Molecular Biology, Vol. 1045, Editor L. Ducry, Humana Press (2013)]. ADC는 그의 세포증식억제성 또는 세포독성 활성을 위해 선택된 약물에 연결된, 치료적 개입을 위해 표적화된 세포에 결합하는 그의 능력에 대해 선택된 항체를 포함한다. 표적화된 세포에의 항체의 결합은 그에 의해 그의 치료 효과가 필요한 부위에 약물을 전달한다.
암 세포와 같은 표적화된 세포를 인식하고 선택적으로 결합하는 많은 항체가 ADC에서의 사용에 대해 개시되어 있고, 항체에 세포독소와 같은 페이로드 (약물) 화합물을 부착하기 위한 많은 방법이 또한 기재되어 있다. ADC에 대한 광범위한 연구에도 불구하고, 단지 소수의 부류의 세포 증식 억제제가 ADC 페이로드로서 광범위하게 사용되어 왔다. 미국에서 인간에서의 사용을 위해 승인된 최초의 ADC가 2000년에 출시 (나중에 시장에서 철수)되었지만, 10년 후 단지 소수의 화학적 부류의 약물 화합물 (메이탄시노이드, 아우리스타틴, 칼리케아미신 및 두오카르마이신)이 ADC를 위한 페이로드로서 임상 시험에 이른 바 있다. 문헌 [Antibody-Drug Conjugates: the Next Generation of Moving Parts, A. Lash, Start-Up, Dec. 2011, 1-6]. 따라서, 특히 암을 치료하기 위한 치료제로서 ADC의 널리 인정되는 가치를 고려해 볼 때, ADC에서 페이로드로서 사용하기 위한 개선된 특성을 갖는 화합물에 대한 필요가 남아 있다.
본원에 제공된 본 발명은 화합물 및 이러한 화합물을 항체-약물 접합체 (ADC)의 약물 성분으로서 사용하는 방법을 포함한다. 본 발명은 신규 화합물 및 이러한 신규 화합물의 ADC를 위한 페이로드로서의 용도를 포함한다. 본 발명은 추가로 이러한 신규 화합물을 ADC에 혼입하는데 유용한 방법 및 중간체, 및 세포 증식 장애를 치료하기 위해 신규 화합물 및 접합체를 사용하는 방법을 포함한다. 이러한 화합물은 튜블린의 중합을 차단하고 그에 의해 핵 이동 및 핵 및 세포 분열을 차단함으로써 세포 분열을 억제하는 항유사분열제이다.
본 발명의 한 측면은 화학식 I의 구조를 갖는 화합물, 또는 그의 입체이성질체, 및 그의 호변이성질체, 수화물 및 제약상 허용되는 염이다.
<화학식 I>
여기서,
R1은 -N=CR4R5, -N=R19, -N=CR5R20, -N=CR5NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12, -N=CR5NR12(CH2)mN(R12)2, -NHC(=NR6)R4, -NHC(=O)R4, -NHC(=O)R20, -NHR8, -NHLR11, -NHR21, -N=CR5R10, -N=R22, -N=CR5R23 또는 -NHC(=O)R23이고;
R2는 -C1-C6알킬이고;
R3은
이고;
R4는 -N(R6)2 또는 -NR6R7이고;
R5는 N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R7은 -(CH2)mN(R12)2, -(CH2)mN(R12)C(=O)OR12 또는 비치환된 C3-C8시클로알킬이거나;
또는 R7은 C1-C6알킬, 옥소, -C(=O)R18, -(CH2)mOH, -C(=O)(CH2)mOH, -C(=O)((CH2)mO)nR12, -((CH2)mO)nR12, 또는 1 내지 5개의 히드록실로 임의로 치환된 C1-C6알킬로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된 C3-C8시클로알킬이고;
R8은 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이거나;
또는 R8은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, C1-C6알콕시, -OH, -CN, -NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2, -C(=O)NR6(CH2)mN(R6)C(O)OR6 및 -C(=O)NR6(CH2)mN(R6)2로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이고;
R9는 -OH, C1-C6알콕시, -NHS(O)2(CH2)mN3, -NHS(=O)2LR11, -NHLR11, -NHS(O)2(CH2)mNH2, -N(R12)2, -R16, -NR12(CH2)mN(R12)2, -NR12(CH2)mR16, -LR11, -NHS(O)2R18,
이고;
R10은 LR11 또는 
이고;
R11은
이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R13은 -S(CH2)nCHR14NHC(=O)R12,
이고;
R14는 R12 또는 -C(=O)OR12이고;
R15는 테트라졸릴, -CN, -C(=O)OR12,
-LR11 또는 -X4LR11이고;
각각의 L은 독립적으로 -L1L2L3L4L5L6-, -L6L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4L5-, -L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4-, -L4L3L2L1-, -L1L2L3-, -L3L2L1-, -L1L2-, -L2L1- 및 -L1로부터 선택되고, 여기서 -L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 본원에 정의된 바와 같고;
R16은 비치환되거나 또는 -LR11로 치환된, N, O, S, S(=O) 및 S(=O)2로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 함유하는 N-연결된 4-8원 헤테로시클로알킬이고;
R17은 2-피리딜 또는 4-피리딜이고;
각각의 R18은 독립적으로 C1-C6알킬, 아지도로 치환된 C1-C6알킬, 및 1 내지 5개의 히드록실로 치환된 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R19는 N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R19는 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R20은 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R20은 C1-C6알킬, -C(=O)OR12, -C(=O)(CH2)mN3, C1-C6할로알킬, 할로겐, 옥소, -OH 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R21은 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -CN, NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이고;
R22는 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R23은 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
X3은 
이고; X4는 
이고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되고;
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된다.
이러한 상기 언급된 측면의 실시양태에서,
R1은 -N=CR4R5, -N=R19, -N=CR5R20, -N=CR5NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12, -N=CR5NR12(CH2)mN(R12)2, -NHC(=NR6)R4, -NHC(=O)R4, -NHC(=O)R20, -NHR8, -NHLR11, -NHR21, -N=CR5R10, -N=R22, -N=CR5R23 또는 -NHC(=O)R23이고;
R2는 -C1-C6알킬이고;
R3은 
이고;
R4는 -N(R6)2 또는 -NR6R7이고;
R5는 N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R7은 -(CH2)mN(R12)2, -(CH2)mN(R12)C(=O)OR12 또는 비치환된 C3-C8시클로알킬이거나;
또는 R7은 C1-C6알킬, 옥소, -C(=O)R18, -(CH2)mOH, -C(=O)(CH2)mOH, -C(=O)((CH2)mO)nR12, -((CH2)mO)nR12, 또는 1 내지 5개의 히드록실로 임의로 치환된 C1-C6알킬로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된 C3-C8시클로알킬이고;
R8은 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이거나;
또는 R8은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, C1-C6알콕시, -OH, -CN, -NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2, -C(=O)NR6(CH2)mN(R6)C(O)OR6 및 -C(=O)NR6(CH2)mN(R6)2로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이고;
R9는 -OH, C1-C6알콕시, -NHS(O)2(CH2)mN3, -N(R12)2, -R16, -NR12(CH2)mN(R12)2, -NR12(CH2)mR16, -LR11, -NHS(O)2R18, -NHS(=O)2LR11,
이고;
R10은 LR11 또는 
이고;
R11은 
, -NR12C(=O)CH=CH2, -N3, 
, SH, -SSR17, -S(=O)2(CH=CH2), -(CH2)2S(=O)2(CH=CH2), -NR12S(=O)2(CH=CH2), -NR12C(=O)CH2R13, -NR12C(=O)CH2Br, -NR12C(=O)CH2I, -NHC(=O)CH2Br, -NHC(=O)CH2I, -ONH2, -C(O)NHNH2, 
, -CO2H, -NH2, -NCO, -NCS,
이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R13은 -S(CH2)nCHR14NHC(=O)R12 또는
R14는 R12 또는 -C(=O)OR12이고;
R15는 테트라졸릴, -CN, -C(=O)OR12,
-LR11 또는 -X4LR11이고;
R16은 비치환되거나 또는 -LR11로 치환된, N, O, S, S(=O) 및 S(=O)2로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 함유하는 N-연결된 4-8원 헤테로시클로알킬이고;
R17은 2-피리딜 또는 4-피리딜이고;
각각의 R18은 독립적으로 C1-C6알킬, 아지도로 치환된 C1-C6알킬, 및 1 내지 5개의 히드록실로 치환된 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R19는 N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R19는 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R20은 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R20은 C1-C6알킬, -C(=O)OR12, -C(=O)(CH2)mN3, C1-C6할로알킬, 할로겐, 옥소, -OH 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R21은 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -CN, NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이고;
R22는 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R23은 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
X3은 
이고;
X4는 
이고;
각각의 L은 독립적으로 -L1L2L3L4L5L6-, -L6L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4L5-, -L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4-, -L4L3L2L1-, -L1L2L3-, -L3L2L1-, -L1L2-, -L2L1- 및 -L1로부터 선택되고, 여기서 -L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 본원에 정의된 바와 같고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되고,
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된다.
화학식 I의 구조를 갖는 화합물의 이러한 측면의 특정 실시양태에서,
R1은 -N=CR4R5, -N=R19, -N=CR5R20, -N=CR5NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12, -N=CR5NR12(CH2)mN(R12)2, -NHC(=NR6)R4, -NHC(=O)R4, -NHC(=O)R20 또는 -NHR8이고;
R2는 -C1-C6알킬이고;
R3은 
이고;
R4는 -N(R6)2 또는 -NR6R7이고;
R5는 N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R7은 -(CH2)mN(R12)2, -(CH2)mN(R12)C(=O)OR12 또는 비치환된 C3-C8시클로알킬이거나;
또는 R7은 C1-C6알킬, 옥소, -C(=O)R18, -(CH2)mOH, -C(=O)(CH2)mOH, -C(=O)((CH2)mO)nR12, -((CH2)mO)nR12, 또는 1 내지 5개의 히드록실로 임의로 치환된 C1-C6알킬로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된 C3-C8시클로알킬이고;
R8은 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이거나;
또는 R8은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, C1-C6알콕시, -OH, -CN, -NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2, -C(=O)NR6(CH2)mN(R6)C(O)OR6 및 -C(=O)NR6(CH2)mN(R6)2로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이고;
R9는 -OH, C1-C6알콕시, -N(R12)2, -R16, -NR12(CH2)mN(R12)2, -NR12(CH2)mR16, -NHS(O)2R18, 또는 
이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R14는 R12 또는 -C(=O)OR12이고;
R15는 테트라졸릴, -CN, -C(=O)OR12,
이고;
R16은 N, O, S, S(=O) 및 S(=O)2로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 함유하는 N-연결된 4-8원 헤테로시클로알킬이고;
R17은 2-피리딜 또는 4-피리딜이고;
각각의 R18은 독립적으로 C1-C6알킬, 아지도로 치환된 C1-C6알킬, 및 1 내지 5개의 히드록실로 치환된 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R19는 N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R19는 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R20은 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R20은 C1-C6알킬, -C(=O)OR12, -C(=O)(CH2)mN3, C1-C6할로알킬, 할로겐, 옥소, -OH 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되고,
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된다.
화학식 I의 구조를 갖는 화합물의 이러한 측면의 특정 실시양태는 화학식 Ia의 구조를 갖는 화합물이다.
<화학식 Ia>
화학식 I 또는 화학식 Ia의 구조를 갖는 화합물의 측면의 다른 실시양태는 화학식 Ib의 구조를 갖는 화합물이다.
<화학식 Ib>
화학식 I의 구조를 갖는 화합물의 측면의 특정 실시양태는 화학식 Ic의 구조를 갖는 화합물이다.
<화학식 Ic>
화학식 I 또는 화학식 Ic의 구조를 갖는 화합물의 측면의 다른 실시양태는 화학식 Id의 구조를 갖는 화합물이다.
<화학식 Id>
화학식 I의 구조를 갖는 화합물의 측면의 특정 실시양태는 화학식 Ie의 구조를 갖는 화합물이다.
<화학식 Ie>
화학식 I 또는 화학식 Ie의 구조를 갖는 화합물의 측면의 다른 실시양태는 화학식 If의 구조를 갖는 화합물이다.
<화학식 If>
본 발명은 항원 결합 모이어티, 예컨대 항체 또는 항체 단편에 연결된 화학식 I의 화합물을 함유하는, 본원에서 ADC로도 칭하는 면역접합체를 제공한다. 화학식 I의 화합물을 포함하는 이들 접합체는, 특히 화합물이 암 세포를 인식하여 공격을 위해 표적화된 세포에 화합물의 전달을 촉진하는 항체에 연결된 경우에, 세포 증식 장애를 치료하는데 유용하다. 면역접합체는 본원에 추가로 상세화된 바와 같이 특정 암을 치료하는데 특히 유용하다. 본원에 제공된 데이터는 이들 면역접합체가 세포 증식의 효과적인 억제제임을 입증하며; 이론에 얽매이지는 않지만, 그의 활성은 세포에서 튜불린의 중합의 억제로 인한 것으로 여겨진다.
본 발명의 면역접합체의 한 측면은 화학식 II의 면역접합체를 포함한다.
<화학식 II>
여기서,
Ab는 항원 결합 모이어티를 나타내고;
L은 -L1L2L3L4L5L6-, -L6L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4L5-, -L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4-, -L4L3L2L1-, -L1L2L3-, -L3L2L1-, -L1L2-, -L2L1- 및 -L1로부터 선택되고, 여기서 -L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 본원에 정의된 바와 같고;
y는 1 내지 16의 정수이고;
R101은 
, -NHC(=O)NR6*-, -NHR121*-, 
또는 -NHC(=O)R123*-이고, 여기서 *는 L에 대한 부착 지점을 나타내고;
R2는 -C1-C6알킬이고;
R3은
이고;
R5는 N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R9는 -OH, C1-C6알콕시, -N(R12)2, -R16, -NR12(CH2)mN(R12)2, -NR12(CH2)mR16, -NHS(O)2R18 또는 
이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R15는 테트라졸릴,
이고;
R16은 비치환되거나 또는 -LR11로 치환된, N, O, S, S(=O) 및 S(=O)2로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 함유하는 N-연결된 4-8원 헤테로시클로알킬이고;
각각의 R18은 독립적으로 C1-C6알킬, 아지도로 치환된 C1-C6알킬, 및 1 내지 5개의 히드록실로 치환된 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R110은 결합 또는 
이고;
R121은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -CN, NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴렌이고;
R122는 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬렌이고;
R123은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬렌이고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되고,
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된다.
화학식 II의 면역접합체의 한 실시양태에서,
Ab는 항원 결합 모이어티를 나타내고;
L은 -L1L2L3L4L5L6-, -L6L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4L5-, -L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4-, -L4L3L2L1-, -L1L2L3-, -L3L2L1-, -L1L2-, -L2L1- 및 -L1로부터 선택되고, 여기서 -L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 본원에 정의된 바와 같고;
y는 1 내지 16의 정수이고;
R101은 
, -NHC(=O)NR6*-, -NHR121*-, 
또는 -NHC(=O)R123*-이고, 여기서 *는 L에 대한 부착 지점을 나타내고;
R2는 -C1-C6알킬이고;
R3은 
이고;
R5는 N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R9는 -OH, C1-C6알콕시, -N(R12)2, -R16, -NR12(CH2)mN(R12)2, -NR12(CH2)mR16, -NHS(O)2R18 또는 
이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R15는 테트라졸릴,
이고;
R16은 비치환되거나 또는 -LR11로 치환된, N, O, S, S(=O) 및 S(=O)2로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 함유하는 N-연결된 4-8원 헤테로시클로알킬이고;
각각의 R18은 독립적으로 C1-C6알킬, 아지도로 치환된 C1-C6알킬, 및 1 내지 5개의 히드록실로 치환된 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R110은 결합 또는 
이고;
R121은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -CN, NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴렌이고;
R122는 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬렌이고;
R123은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬렌이고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되고,
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된다.
본 발명의 면역접합체의 또 다른 측면은 화학식 III의 구조를 갖는 면역접합체이다.
<화학식 III>
여기서,
Ab는 항원 결합 모이어티를 나타내고;
L은 -L1L2L3L4L5L6-, -L6L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4L5-, -L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4-, -L4L3L2L1-, -L1L2L3-, -L3L2L1-, -L1L2-, -L2L1- 및 -L1로부터 선택되고, 여기서 -L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 본원에 정의된 바와 같고;
y는 1 내지 16의 정수이고;
R1은 -N=CR4R5, -N=R19, -N=CR5R20, -NHC(=NR6)R4, -NHC(=O)R4, -NHC(=O)R20 또는 -NHR8이고;
R2는 -C1-C6알킬이고;
R4는 -N(R6)2 또는 -NR6R7이고;
R5는 N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R7은 비치환된 C3-C8시클로알킬이거나;
또는 R7은 C1-C6알킬, 옥소, -C(=O)R18, -(CH2)mOH, -C(=O)(CH2)mOH, -C(=O)((CH2)mO)nR12, -((CH2)mO)nR12, 또는 1 내지 5개의 히드록실로 임의로 치환된 C1-C6알킬로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된 C3-C8시클로알킬이고;
R8은 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이거나;
또는 R8은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -OH, -N(R6)2, -CN, -NO2, -C(=O)OR6 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R19는 N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R19는 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R20은 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R20은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -C(=O)OR12, 옥소, -OH 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R113은
이고;
R117은 결합, -NH-, -NHS(=O)2-, -NHS(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, -,-NHS(=O)2(CH2)mNHC(=O)-, -NHS(=O)2(CH2)mNHC(=O)O(CH2)m-,
이고;
R118은 결합, 테트라졸릴, 
이고;
R26은
이고,
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되고,
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된다.
화학식 III의 면역접합체의 한 실시양태에서,
Ab는 항원 결합 모이어티를 나타내고;
L은 -L1L2L3L4L5L6-, -L6L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4L5-, -L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4-, -L4L3L2L1-, -L1L2L3-, -L3L2L1-, -L1L2-, -L2L1- 및 -L1로부터 선택되고, 여기서 -L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 본원에 정의된 바와 같고;
y는 1 내지 16의 정수이고;
R1은 -N=CR4R5, -N=R19, -N=CR5R20, -NHC(=NR6)R4, -NHC(=O)R4, -NHC(=O)R20 또는 -NHR8이고;
R2는 -C1-C6알킬이고;
R4는 -N(R6)2 또는 -NR6R7이고;
R5는 N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R7은 비치환된 C3-C8시클로알킬이거나;
또는 R7은 C1-C6알킬, 옥소, -C(=O)R18, -(CH2)mOH, -C(=O)(CH2)mOH, -C(=O)((CH2)mO)nR12, -((CH2)mO)nR12, 또는 1 내지 5개의 히드록실로 임의로 치환된 C1-C6알킬로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된 C3-C8시클로알킬이고;
R8은 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이거나;
또는 R8은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -OH, -N(R6)2, -CN, -NO2, -C(=O)OR6 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R19는 N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R19는 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R20은 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R20은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -C(=O)OR12, 옥소, -OH 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R113은 
이고;
R117은 결합, -NH-, -NHS(=O)2-,
이고;
R118은 결합, 테트라졸릴, 
이고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되고,
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된다.
본 발명은 전달되는 페이로드 (약물)로서 화학식 I의 화합물을 사용하여 이러한 ADC를 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 화합물은 항유사분열 세포독성 펩티드이며, 여기서 N-말단 또는 C-말단은 반응성 관능기, 및 임의로 1개 이상의 링커 성분을 갖도록 변형되어, 화합물이 항체 또는 항원 결합 단편에 직접 또는 간접적으로 연결되는 것을 용이하게 한다 (예를 들어 화학식 I의 화합물의 상기 기재된 제2 및 제3 측면). 또한, 본 발명은 세포 증식 장애를 치료하기 위해 이들 ADC를 사용하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체를, 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합하여, 임의로 2종 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합하여 포함하는 제약 조성물, 및 세포 증식 장애를 치료하기 위해 이들 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 과도하거나 바람직하지 않은 세포 증식을 특징으로 하는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 화학식 II 또는 화학식 III의 면역접합체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 치료 대상체는 포유동물일 수 있고, 바람직하게는 인간이다. 본원에 기재된 면역접합체 및 방법에 의해 치료가능한 상태는 다양한 형태의 암, 예컨대 위, 골수, 결장, 비인두, 식도, 및 전립선 종양, 신경교종, 신경모세포종, 유방암, 폐암, 난소암, 결장직장암, 갑상선암, 백혈병 (예를 들어, 골수 백혈병, 림프구성 백혈병, 급성 골수 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), T-계통 급성 림프모구성 백혈병 또는 T-ALL 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 골수이형성 증후군 (MDS), 모발상 세포 백혈병), 림프종 (호지킨 림프종 (HL), 비호지킨 림프종 (NHL)), 다발성 골수종, 방광암, 신장암, 위암 (예를 들어, 위장 기질 종양 (GIST)), 간암, 흑색종 및 췌장암, 및 육종을 포함한다. 이들 방법 및 조성물로 치료될 수 있는 다른 세포 증식 장애는 당뇨병성 망막병증, 간 및 폐 섬유증, 쇼그렌 증후군, 및 홍반성 루푸스를 포함한다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I-III 및 그의 하위화학식, 및 그의 모든 입체이성질체 (부분입체이성질체 및 거울상이성질체 포함), 호변이성질체, 및 동위원소 농축 버전 (중수소 치환 포함) 뿐만 아니라 이들 화합물의 제약상 허용되는 염의 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한 화학식 I (또는 그의 하위-화학식)의 다형체 및 그의 염, 특히 제약상 허용되는 염을 포함한다.
도 1. 항-Her2 ADC의 시험관내 세포 증식 검정: (a) MDA-MB-231 클론 40 세포, (b) MDA-MB-231 클론 16 세포, (c) HCC1954 세포, 및 (d) JimT-1 세포.
도 2. 항체 20507 ADC의 시험관내 세포 증식 검정: (a) Jurkat 세포, (b) NCI-H526 세포, (c) KU812 세포, 및 (d) CMK11-5 세포.
도 3. 항-hIgG 검정 및 항-MMAF 검정을 사용한 항-Her2 및 항체 20507 ADC 및 항체들의 약동학적 연구: 조작된 Cys 잔기를 통해 접합된 항-Her2 ADC (a 및 b) 및 항체 20507 ADC (c 및 d), 효소적으로 접합된 것 (e), 및 천연 디술피드 결합의 부분적 환원을 통해 접합되고 리신 잔기를 통해 접합된 것 (f). 비-접합체 항-Her2 항체 (항-Her2)를 도 (f)에서 참조로서 포함시켰다.
도 4. NCI-N87 이종이식편 모델에서의 항-Her2 ADC (a 및 b) 및 H526 이종이식편 모델에서의 항체 20507 ADC (c, d 및 e)의 생체내 효능 연구. 단일 용량을 제0일에 투여하였다.
도 2. 항체 20507 ADC의 시험관내 세포 증식 검정: (a) Jurkat 세포, (b) NCI-H526 세포, (c) KU812 세포, 및 (d) CMK11-5 세포.
도 3. 항-hIgG 검정 및 항-MMAF 검정을 사용한 항-Her2 및 항체 20507 ADC 및 항체들의 약동학적 연구: 조작된 Cys 잔기를 통해 접합된 항-Her2 ADC (a 및 b) 및 항체 20507 ADC (c 및 d), 효소적으로 접합된 것 (e), 및 천연 디술피드 결합의 부분적 환원을 통해 접합되고 리신 잔기를 통해 접합된 것 (f). 비-접합체 항-Her2 항체 (항-Her2)를 도 (f)에서 참조로서 포함시켰다.
도 4. NCI-N87 이종이식편 모델에서의 항-Her2 ADC (a 및 b) 및 H526 이종이식편 모델에서의 항체 20507 ADC (c, d 및 e)의 생체내 효능 연구. 단일 용량을 제0일에 투여하였다.
달리 명백하게 제공되지 않는 한 하기 정의를 적용한다.
용어 "아미노산"은 정규, 합성, 및 비천연 아미노산 뿐만 아니라 정규 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 정규 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩되는 단백질생성 아미노산이며, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, 뿐만 아니라 셀레노시스테인, 피롤리신 및 피롤린-카르복시-리신을 포함한다. 아미노산 유사체는 정규 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉, 수소, 카르복실 기, 아미노 기 및 R 기에 결합된 α-탄소를 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기 (예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 갖지만, 정규 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다.
본원에 사용된 용어 "항원 결합 모이어티"는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티를 지칭하고, 항체 및 항원 결합 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 상응하는 항원에, 비-공유, 가역적, 및 특이적 방식으로 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 패밀리의 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 자연 발생 IgG 항체는 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 사량체이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분 (Clq)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
용어 "항체"는 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 낙타류 항체, 키메라 항체, 및 항-이디오타입 (항-Id) 항체 (예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체 포함)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 항체는 임의의 이소형/부류 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 또는 하위부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)일 수 있다.
경쇄 및 중쇄 둘 다는 구조적 및 기능적 상동성 영역으로 분류된다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) 부분 둘 다의 가변 도메인은 항원 인식 및 특이성을 결정하는 것으로 인지될 것이다. 반대로, 경쇄의 불변 도메인 (CL) 및 중쇄의 불변 도메인 (CH1, CH2 또는 CH3)은 중요한 생물학적 특성, 예컨대 분비, 경태반 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등을 부여한다. 통상적으로, 불변 영역 도메인의 넘버링은 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노-말단에서 더욱 멀어질수록 증가한다. N-말단은 가변 영역이고, C-말단에 불변 영역이 있고; CH3 및 CL 도메인은 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카르복시-말단 도메인을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항원 결합 단편"은 항원의 에피토프와 (예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화/불안정화, 공간 분포에 의해) 특이적으로 상호작용하는 능력을 보유하는 항체의 1개 이상의 부분을 지칭한다. 결합 단편의 예는 단일쇄 Fv (scFv), 디술피드-연결 Fv (sdFv), Fab 단편, F(ab') 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989); 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR), 또는 항체의 다른 에피토프-결합 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH가 개별 유전자에 의해 코딩되더라도, 재조합 방법을 사용하여, 이들을 VL 및 VH 영역이 쌍 형성하여 1가 분자를 형성한 단일 단백질 쇄 (단일 쇄 Fv ("scFv")로 공지됨; 예를 들어, 문헌 [Bird et al., Science 242:423-426, 1988; 및 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883, 1988] 참조)로 만들어지게 할 수 있는 합성 링커에 의해 이들이 연결될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 또한 용어 "항원 결합 단편" 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 이들 항원 결합 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 bis-scFv 내로 혼입될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005] 참조). 항원 결합 단편은 제III형 피브로넥틴 (Fn3)과 같은 폴리펩티드에 기초한 스캐폴드 내로 그라프팅될 수 있다 (피브로넥틴 폴리펩티드 모노바디를 기재한 미국 특허 번호 6,703,199 참조).
항원 결합 단편은 한 쌍의 탠덤 Fv 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 단일 쇄 분자 내로 혼입될 수 있고, 이는 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성한다 (Zapata et al., Protein Eng. 8:1057-1062, 1995; 및 미국 특허 번호 5,641,870).
본원에 사용된 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 동일한 유전자 공급원으로부터 유래된, 항체 및 항원 결합 단편을 비롯한 폴리펩티드를 지칭한다. 이 용어는 또한 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 포함한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 기원의 서열로부터 유래된 것인 가변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우에, 불변 영역은 또한 이러한 인간 서열, 예를 들어 인간 배선 서열, 또는 인간 배선 서열의 돌연변이된 버전, 또는 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래된 컨센서스 프레임워크 서열을 함유하는 항체로부터 유래된다 (예를 들어 문헌 [Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000]에 기재된 바와 같음).
본 발명의 인간 항체는 인간 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다 (예를 들어, 시험관내에서의 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서의 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이, 또는 안정성 또는 제작을 촉진하기 위한 치환).
본원에 사용된 용어 "인간화" 항체는 비-인간 항체의 반응성을 보유하면서 인간에서 덜 면역원성인 항체를 지칭한다. 이는, 예를 들어 비-인간 CDR 영역을 보유하고 항체의 나머지 부분을 그의 인간 대응물로 대체함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)]을 참조한다.
용어 "특이적으로 결합하다" 또는 "선택적으로 결합하다"는, 항원 (예를 들어, 단백질 또는 글리칸)과 항체, 항체 단편, 또는 항체-유래 결합제와의 상호작용을 기재하는 맥락에서 사용되는 경우에, 예를 들어 생물학적 샘플, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장 또는 조직 샘플에서, 단백질 및 다른 생물제제의 이종 집단에서의 항원의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 특정 지정된 면역검정 조건 하에, 특정한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 결합제는 특정한 항원에 백그라운드의 적어도 2배로 결합하고, 샘플에 존재하는 다른 항원에 유의한 양으로 실질적으로 결합하지 않는다. 한 실시양태에서, 지정된 면역검정 조건 하에, 특정한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 결합제는 특정한 항원에 백그라운드의 적어도 10배로 결합하고, 샘플에 존재하는 다른 항원에 유의한 양으로 실질적으로 결합하지 않는다. 이러한 조건 하에서 항체 또는 결합제에 대한 특이적 결합은, 특정한 단백질에 대한 그의 특이성에 대해 항체 또는 결합제를 선택하는 것을 필요로 할 수 있다. 필요에 따라 또는 적절한 경우에, 이러한 선택은 다른 종 (예를 들어, 마우스 또는 래트) 또는 다른 하위유형으로부터의 분자와 교차-반응하는 항체를 차감함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 특정 목적 분자와 교차-반응하는 항체 또는 항체 단편이 선택된다.
다양한 면역검정 포맷을 사용하여 특정한 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택할 수 있다. 예를 들어, 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택하기 위해 고체-상 ELISA 면역검정이 통상적으로 사용된다 (특이적 면역반응성을 결정하는데 사용될 수 있는 면역검정 포맷 및 조건의 기재에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)] 참조). 전형적으로 특이적 또는 선택적 결합 반응은 백그라운드 신호에 비해 적어도 2배, 보다 전형적으로 백그라운드에 비해 적어도 10 내지 100배 초과의 신호를 발생시킬 것이다.
본원에 사용된 용어 "친화도"는 단일 항원 부위에서 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 각각의 항원 부위 내에서, 항체 "아암"의 가변 영역은 수많은 부위에서 항원과 약한 비-공유 힘을 통해 상호작용하고; 상호작용이 더 많을수록 친화도가 더 강해진다.
용어 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다. 그러나, 1개의 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원에 대한 교차-반응성을 가질 수 있다. 또한, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 이 용어는 정규 아미노산 중합체 뿐만 아니라 비-정규 아미노산 중합체에도 적용된다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 폴리펩티드 서열은 또한 그의 변형된 변이체를 함축적으로 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "면역접합체" 또는 "항체-약물-접합체"는 항원 결합 모이어티, 예컨대 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 화학식 I의 화합물의 연결을 지칭한다. 연결은 공유 결합, 또는 비-공유 상호작용일 수 있고, 킬레이트화를 포함할 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 다양한 링커가 면역접합체를 형성하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "세포독성 펩티드", "세포독소" 또는 "세포독성제"는 세포의 성장 및 증식에 해롭고, 세포 또는 악성종양을 감소시키거나, 억제하거나 또는 파괴하는 작용을 할 수 있는 임의의 작용제를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "항암제"는 세포독성제, 화학요법제, 방사선요법 및 방사선요법제, 표적화 항암제, 및 면역요법제를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 암과 같은 세포 증식성 장애를 치료하는데 사용될 수 있는 임의의 작용제를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "약물 모이어티" 또는 "페이로드"는 면역접합체를 형성하기 위해 항체 또는 항원 결합 단편에 접합되거나 접합될 수 있는 화학 모이어티를 지칭하고, 항체 또는 항원 결합 단편에 부착되는데 유용한 임의의 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, "약물 모이어티" 또는 "페이로드"는 본원에 기재된 화합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 면역접합체는 본원에 기재된 1종 이상의 화합물을 페이로드로서 포함하나, 또한 1종 이상의 다른 페이로드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 약물 모이어티 또는 페이로드를 포함하는 다른 페이로드는, 항암제, 항염증제, 항진균제, 항박테리아제, 항기생충제, 항바이러스제, 또는 마취제일 수 있다. 특정 실시양태에서 약물 모이어티는 Eg5 억제제, HSP90 억제제, IAP 억제제, mTor 억제제, 미세관 안정화제, 미세관 탈안정화제, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 메이탄시노이드, MetAP (메티오닌 아미노펩티다제), 단백질 CRM1의 핵 유출의 억제제, DPPIV 억제제, 미토콘드리아에서의 포스포릴 전달 반응의 억제제, 단백질 합성 억제제, 키나제 억제제, CDK2 억제제, CDK9 억제제, 프로테아솜 억제제, 키네신 억제제, HDAC 억제제, DNA 손상 작용제, DNA 알킬화제, DNA 삽입제, DNA 작은 홈 결합제 및 DHFR 억제제로부터 선택된다. 적합한 예는 칼리케아미신, 예컨대 감마-칼리케아미신; 및 메이탄시노이드, 예컨대 DM1, DM3 및 DM4를 포함한다. 이들 각각을 본 발명의 항체 및 방법과 상용성인 링커에 부착시키는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Singh et al., (2009) Therapeutic Antibodies: Methods and Protocols, vol. 525, 445-457]을 참조한다.
"종양"은 악성 또는 양성에 관계 없이 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다.
용어 "항종양 활성"은 종양 세포 증식, 생존율, 또는 전이성 활성의 비율에서의 감소를 의미한다. 항-종양 활성을 나타내는 가능한 방식은 요법 동안 발생하는 비정상 세포의 성장 속도에서의 저하 또는 종양 크기 안정성 또는 감소를 나타내는 것이다. 이러한 활성은 이종이식편 모델, 동종이식편 모델, MMTV 모델, 및 항종양 활성을 조사하기 위한 관련 기술분야에 공지된 다른 공지된 모델을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 허용되는 시험관내 또는 생체내 종양 모델을 사용하여 평가될 수 있다.
용어 "악성종양"은 비-양성 종양 또는 암을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "암"은 탈조절되거나 비제어된 세포 성장을 특징으로 하는 악성종양을 포함한다. 예시적인 암은 암종, 육종, 백혈병 및 림프종을 포함한다.
용어 "암"은 원발성 악성 종양 (예를 들어, 세포가 대상체의 본래 종양 부위 이외의 다른 신체 내의 부위로 이동하지 않은 종양) 및 속발성 악성 종양 (예를 들어, 전이, 즉 종양 세포가 본래 종양 부위와 상이한 속발성 부위로 이동함으로써 발생하는 종양)을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지될 것과 같은, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제 (예를 들어, 항박테리아제, 항진균제), 등장화제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 약물 안정화제, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료 등 및 그의 조합을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329] 참조). 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 비상용성인 경우를 제외하고는, 치료 또는 제약 조성물에서의 그의 사용이 고려된다.
본 발명의 화합물의 용어 "치료 유효량"은 대상체의 생물학적 또는 의학적 반응, 예를 들어 효소 또는 단백질 활성의 감소 또는 억제, 또는 증상의 개선, 상태의 완화, 질환 진행의 둔화 또는 지연, 또는 질환의 예방 등을 도출할 본 발명의 화합물의 양을 지칭한다. 한 비제한적 실시양태에서, 용어 "치료 유효량"은, 대상체에게 투여 시, 상태 또는 장애 또는 질환을 적어도 부분적으로 완화, 억제, 예방 및/또는 개선시키는데 효과적인 본 발명의 화합물의 양을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 동물을 지칭한다. 전형적으로 동물은 포유동물이다. 대상체는 또한 예를 들어, 영장류 (예를 들어, 인간, 남성 또는 여성), 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 래트, 마우스, 어류, 조류 등을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 영장류이다. 구체적 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본원에 사용된 용어 "억제하다", "억제" 또는 "억제하는"은 주어진 상태, 증상, 또는 장애, 또는 질환의 감소 또는 억제, 또는 생물학적 활성 또는 과정의 기저 활성의 유의한 감소를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 임의의 질환 또는 장애를 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는, 한 실시양태에서, 질환 또는 장애의 개선 (즉, 질환 또는 그의 임상 증상 중 적어도 하나의 발달의 둔화 또는 정지 또는 감소)을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 환자에 의해 식별가능하지 않을 수 있는 것을 포함하는 적어도 하나의 물리적 파라미터의 완화 또는 개선을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 장애를, 물리적으로 (예를 들어, 식별가능한 증상의 안정화), 생리학적으로 (예를 들어, 물리적 파라미터의 안정화), 또는 이들 둘 다로 조정하는 것을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 장애의 예방 또는 진행의 지연을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 대상체가 치료로부터 생물학적으로, 의학적으로 또는 삶의 질에 있어서 유익할 경우에, 이러한 대상체는 이러한 치료를 "필요로 한다".
본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 문맥에서 (특히, 청구범위의 문맥에서) 사용된 단수 용어 및 유사한 용어들은, 본원에 달리 나타내거나 또는 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형 둘 다를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 변형된 면역접합체는, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8, 또는 12 또는 16의 "약물-대-항체" 비에 따라 기재되며; 이 비는 화학식 II 및 화학식 III에서 "y"에 상응한다. 이 비가 특정 접합체 분자에 대한 정수 값을 갖지만, 면역접합체의 샘플 내에 어느 정도의 불균질성으로 인해, 많은 분자를 함유하는 샘플을 기재하기 위해 평균값이 전형적으로 사용되는 것으로 이해된다. 면역접합체의 샘플에 대한 평균 로딩은 본원에서 "약물 대 항체 비" 또는 DAR로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, DAR은 약 1 내지 약 16이고, 전형적으로 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8이다. 일부 실시양태에서, 중량 기준으로 샘플의 적어도 50%는 평균 DAR 플러스 또는 마이너스 2를 갖는 화합물이며, 바람직하게는 샘플의 적어도 50%는 평균 DAR 플러스 또는 마이너스 1.5를 함유하는 생성물이다. 바람직한 실시양태는 DAR이 약 2 내지 약 8, 예를 들어 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 또는 약 8인 면역접합체를 포함한다. 이들 실시양태에서, "약 q"의 DAR은 DAR에 대해 측정된 값이 q의 ±20% 내에, 또는 바람직하게는 q의 ±10% 내에 있음을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "광학 이성질체" 또는 "입체이성질체"는 주어진 본 발명의 화합물에 대해 존재할 수 있는 다양한 입체 이성질체 배위 중 임의의 것을 지칭하고, 기하 이성질체를 포함한다. 치환기는 탄소 원자의 키랄 중심에 부착될 수 있는 것으로 이해된다. 용어 "키랄"은 그의 거울상 파트너 상에 비-중첩가능한 특성을 갖는 분자를 지칭하는 반면에, 용어 "비키랄"은 그의 거울상 파트너 상에 중첩가능한 분자를 지칭한다. 따라서, 본 발명은 화합물의 거울상이성질체, 부분입체이성질체 또는 라세미체를 포함한다. "거울상이성질체"는 서로 비-중첩가능한 거울상인 한 쌍의 입체이성질체이다. 한 쌍의 거울상이성질체의 1:1 혼합물은 "라세미" 혼합물이다. 상기 용어는 적절한 경우에 라세미 혼합물을 지정하는데 사용된다. "부분입체이성질체"는 적어도 2개의 비대칭 원자를 갖지만 서로 거울상이 아닌 입체이성질체이다. 절대 입체화학은 칸-인골드-프렐로그 R-S 시스템에 따라 명시된다. 화합물이 순수한 거울상이성질체인 경우에 각각의 키랄 탄소에서의 입체화학은 R 또는 S에 의해 명시될 수 있다. 절대 배위가 공지되지 않은 분해된 화합물은, 이들이 나트륨 D 선의 파장에서 평면 편광을 회전시키는 방향 (우선성 또는 좌선성)에 따라 (+) 또는 (-)로 지정될 수 있다. 본원에 기재된 특정 화합물은 1개 이상의 비대칭 중심 또는 축을 함유하며, 따라서 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 및 절대 입체화학의 관점에서 (R)- 또는 (S)-로서 정의될 수 있는 다른 입체이성질체 형태를 발생시킬 수 있다.
출발 물질 및 절차의 선택에 따라, 화합물은 비대칭 탄소 원자의 개수에 따라 가능한 이성질체 중 1종의 형태로 또는 그의 혼합물로서, 예를 들어 순수한 광학 이성질체로서, 또는 이성질체 혼합물, 예컨대 라세미체 및 부분입체이성질체 혼합물로서 존재할 수 있다. 본 발명은, 달리 언급되지 않는 한, 예를 들어 특정 이성질체가 확인되는 경우에, 라세미 혼합물, 부분입체이성질체 혼합물 및 임의로 순수한 형태를 비롯한 모든 이러한 가능한 이성질체를 포함하는 것으로 의도된다. 광학 활성 (R)- 및 (S)- 이성질체는 키랄 합성단위체 또는 키랄 시약을 사용하여 제조될 수 있거나, 또는 통상적인 기술을 사용하여 분해될 수 있다. 화합물이 이중 결합을 함유하는 경우에, 치환기는 E 또는 Z 배위일 수 있다. 화합물이 이치환된 시클로알킬을 함유하는 경우에, 시클로알킬 치환기는 시스- 또는 트랜스-배위를 가질 수 있다. 모든 호변이성질체 형태가 또한 포함되는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "염" 또는 "염들"은 본 발명의 화합물의 산 부가염 또는 염기 부가염을 지칭한다. "염"은 특히 "제약상 허용되는 염"을 포함한다. 용어 "제약상 허용되는 염"은, 본 발명의 화합물의 생물학적 유효성 및 특성을 보유하고 전형적으로 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 염을 지칭한다. 다수의 경우에서, 본 발명의 화합물은 아미노 및/또는 카르복실 기 또는 그와 유사한 기의 존재에 의해 산 및/또는 염기 염을 형성할 수 있다.
제약상 허용되는 산 부가염은 무기 산 및 유기 산에 의해 형성될 수 있고, 예를 들어 아세테이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 베실레이트, 브로마이드/히드로브로마이드, 비카르보네이트/카르보네이트, 비술페이트/술페이트, 캄포르술포네이트, 클로라이드/히드로클로라이드, 클로로테오필리네이트, 시트레이트, 에탄디술포네이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 히푸레이트, 히드로아이오다이드/아이오다이드, 이세티오네이트, 락테이트, 락토비오네이트, 라우릴술페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 만델레이트, 메실레이트, 메틸술페이트, 나프토에이트, 나프실레이트, 니코티네이트, 니트레이트, 옥타데카노에이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/히드로겐 포스페이트/디히드로겐 포스페이트, 폴리갈락투로네이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 술포살리실레이트, 타르트레이트, 토실레이트 및 트리플루오로아세테이트 염이 있다.
염이 유도될 수 있는 무기 산은, 예를 들어 염산, 브로민화수소산, 황산, 질산, 인산 등을 포함한다.
염이 유도될 수 있는 유기 산은, 예를 들어 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 톨루엔술폰산, 술포살리실산 등을 포함한다. 제약상 허용되는 염기 부가염은 무기 및 유기 염기에 의해 형성될 수 있다.
염이 유도될 수 있는 무기 염기는, 예를 들어 암모늄 염 및 주기율표의 칼럼 I 내지 XII로부터의 금속을 포함한다. 특정 실시양태에서, 염은 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 은, 아연 및 구리로부터 유도되며; 특히 적합한 염은 암모늄, 칼륨, 나트륨, 칼슘 및 마그네슘 염을 포함한다.
염이 유도될 수 있는 유기 염기는, 예를 들어 1급, 2급 및 3급 아민, 자연 발생 치환된 아민을 비롯한 치환된 아민, 시클릭 아민, 염기성 이온 교환 수지 등을 포함한다. 특정 유기 아민은 이소프로필아민, 벤자틴, 콜리네이트, 디에탄올아민, 디에틸아민, 리신, 메글루민, 피페라진 및 트로메타민을 포함한다.
본 발명의 제약상 허용되는 염은 통상적인 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 유리 산 형태의 이들 화합물을 화학량론적 양의 적절한 염기 (예컨대, Na, Ca, Mg 또는 K 히드록시드, 카르보네이트, 비카르보네이트 등)와 반응시키거나, 또는 유리 염기 형태의 이들 화합물을 화학량론적 양의 적절한 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 반응은 전형적으로 물 중에서 또는 유기 용매 중에서, 또는 상기 둘의 혼합물 중에서 수행된다. 일반적으로, 실행가능한 경우에, 비-수성 매질 예컨대 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올, 또는 아세토니트릴의 사용이 바람직하다. 추가의 적합한 염의 목록은, 예를 들어 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences", 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985); 및 "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use" by Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002)]에서 찾아볼 수 있다.
본원에 제시된 임의의 화학식은 또한 화합물의 비표지된 형태 뿐만 아니라, 동위원소 표지된 형태를 나타내는 것으로 의도된다. 동위원소 표지된 화합물은 1개 이상의 원자가 선택된 원자 질량 또는 질량수를 갖는 원자에 의해 대체된 것을 제외하고 본원에 주어진 화학식에 의해 도시된 구조를 갖는다. 본 발명의 화합물 내로 혼입될 수 있는 동위원소의 예는 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 플루오린, 및 염소의 동위원소, 예컨대 각각 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 15N, 18F 31P, 32P, 35S, 36Cl, 125I를 포함한다. 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 다양한 동위원소 표지된 화합물, 예를 들어 그 안에 방사성 동위원소, 예컨대 3H 및 14C가 존재하는 화합물, 또는 그 안에 비-방사성 동위원소, 예컨대 2H 및 13C가 존재하는 화합물을 포함한다. 이러한 동위원소 표지된 화합물은 대사 연구 (14C 사용), 반응 동역학 연구 (예를 들어, 2H 또는 3H 사용), 검출 또는 영상화 기술, 예컨대 약물 또는 기질 조직 분포 검정을 비롯한 양전자 방출 단층촬영 (PET) 또는 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT)에, 또는 환자의 방사성 치료에 유용하다. 특히, 18F 또는 표지된 화합물은 PET 또는 SPECT 연구에 특히 바람직할 수 있다. 화학식 I의 동위원소-표지된 화합물은 일반적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술에 의해 또는 첨부된 실시예 및 제조예에 기재된 것과 유사한 방법에 의해 이전에 사용된 비-표지된 시약 대신에 적절한 동위원소-표지된 시약을 사용하여 제조될 수 있다.
추가로, 보다 무거운 동위원소, 특히 중수소 (즉, 2H 또는 D)로의 치환은 보다 큰 대사 안정성, 예를 들어 증가된 생체내 반감기 또는 감소된 투여량 요건 또는 치료 지수에서의 개선으로부터 생성된 특정의 치료 이점을 제공할 수 있다. 이러한 보다 무거운 동위원소, 구체적으로 중수소의 농도는, 동위원소 농축 계수에 의해 정의될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "동위원소 농축 계수"는 특정된 동위원소의 동위원소 존재비와 천연 존재비 사이의 비율을 의미한다. 본 발명의 화합물 내 치환기가 표시된 중수소인 경우에, 이러한 화합물은 각각의 지정된 중수소 원자에 대해 적어도 3500 (각각의 지정된 중수소 원자에서 52.5% 중수소 혼입), 적어도 4000 (60% 중수소 혼입), 적어도 4500 (67.5% 중수소 혼입), 적어도 5000 (75% 중수소 혼입), 적어도 5500 (82.5% 중수소 혼입), 적어도 6000 (90% 중수소 혼입), 적어도 6333.3 (95% 중수소 혼입), 적어도 6466.7 (97% 중수소 혼입), 적어도 6600 (99% 중수소 혼입), 또는 적어도 6633.3 (99.5% 중수소 혼입)의 동위원소 농축 계수를 갖는다.
본 발명에 따른 제약상 허용되는 용매화물은 결정화의 용매가 동위원소 치환될 수 있는 것, 예를 들어 D2O, d6-아세톤, d6-DMSO, 뿐만 아니라 비-농축 용매와의 용매화물을 포함한다.
수소 결합에 대한 공여자 및/또는 수용자로서 작용할 수 있는 기를 함유하는 본 발명의 화합물, 즉 화학식 I의 화합물은 적합한 공-결정 형성제를 사용하여 공-결정을 형성할 수 있다. 이들 공-결정은 공지된 공-결정 형성 절차에 의해 화학식 I의 화합물로부터 제조될 수 있다. 이러한 절차는 결정화 조건 하에 화학식 I의 화합물을 공-결정 형성제와 함께 분쇄, 가열, 공-승화, 공-용융 또는 용액 중 접촉시키고, 그에 의해 형성된 공-결정을 단리하는 것을 포함한다. 적합한 공-결정 형성제는 WO 2004/078163에 기재된 것을 포함한다. 따라서 본 발명은 화학식 I의 화합물을 포함하는 공-결정을 추가로 제공한다.
본 발명의 화합물(들)의 임의의 비대칭 원자 (예를 들어, 탄소 등)는 라세미로 또는 거울상이성질체적으로 풍부하게, 예를 들어 (R)-, (S)- 또는 (R,S)- 배위로 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 각각의 비대칭 원자는 (R)- 또는 (S)- 배위의 적어도 50% 거울상이성질체 과잉률, 적어도 60% 거울상이성질체 과잉률, 적어도 70% 거울상이성질체 과잉률, 적어도 80% 거울상이성질체 과잉률, 적어도 90% 거울상이성질체 과잉률, 적어도 95% 거울상이성질체 과잉률, 또는 적어도 99% 거울상이성질체 과잉률을 갖고; 즉, 광학 활성 화합물의 경우에, 다른 거울상이성질체를 실질적으로 배제한 1종의 거울상이성질체를 사용하는 것이 종종 바람직하다. 불포화 이중 결합을 갖는 원자에서의 치환기는 가능한 경우에 시스- (Z)- 또는 트랜스- (E)- 형태로 존재할 수 있다.
따라서, 본원에 사용된 본 발명의 화합물은 가능한 이성질체, 회전이성질체, 회전장애이성질체, 호변이성질체 중 1종의 형태 또는 그의 혼합물, 예를 들어 실질적으로 순수한 기하 (시스 또는 트랜스) 이성질체, 부분입체이성질체, 광학 이성질체 (대장체), 라세미체 또는 그의 혼합물일 수 있다. 본원에 사용된 "실질적으로 순수한" 또는 "다른 이성질체가 실질적으로 없는"은 생성물이 바람직한 이성질체의 양과 관련하여 다른 이성질체를 5 중량% 미만, 바람직하게는 2 중량% 미만으로 함유한다는 것을 의미한다.
이성질체의 임의의 생성된 혼합물은 구성성분의 물리화학적 차이에 기초하여, 예를 들어 크로마토그래피 및/또는 분별 결정화에 의해 순수한 또는 실질적으로 순수한 기하 또는 광학 이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체로 분리될 수 있다.
최종 생성물 또는 중간체의 임의의 생성된 라세미체는 공지된 방법에 의해, 예를 들어 광학 활성 산 또는 염기를 사용하여 수득된 그의 부분입체이성질체 염을 분리하고, 광학 활성 산성 또는 염기성 화합물을 유리시킴으로써, 광학 대장체로 분해될 수 있다. 특히, 염기성 모이어티는 따라서, 예를 들어 광학 활성 산, 예를 들어 타르타르산, 디벤조일 타르타르산, 디아세틸 타르타르산, 디-O,O'-p-톨루오일 타르타르산, 만델산, 말산 또는 캄포르-10-술폰산을 사용하여 형성된 염의 분별 결정화에 의해, 본 발명의 화합물을 그의 광학 대장체로 분해하기 위해 사용될 수 있다. 라세미 생성물은 또한 키랄 크로마토그래피, 예를 들어 키랄 흡착제를 사용하는 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 분해될 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물 (그의 염 포함)은 또한 그의 수화물 형태로 수득되거나, 또는 그의 결정화에 사용되는 다른 용매를 포함할 수 있다. 본 발명의 화합물은 본질적으로 또는 설계에 의해 제약상 허용되는 용매 (물 포함)와 용매화물을 형성할 수 있고; 따라서, 본 발명은 용매화 및 비용매화 형태 둘 다를 포괄하는 것으로 의도된다. 용어 "용매화물"은 본 발명의 화합물 (그의 제약상 허용되는 염 포함)과 1종 이상의 용매 분자와의 분자 복합체를 지칭한다. 이러한 용매 분자는 수용자에게 무해한 것으로 공지되어 있는, 제약 기술분야에서 통상적으로 사용된 것들, 예를 들어 물, 에탄올 등이다. 용어 "수화물"은 용매 분자가 물인 복합체를 지칭한다.
본 발명의 화학식 I의 화합물 (그의 염, 수화물 및 용매화물 포함)은 본질적으로 또는 설계에 의해 다형체를 형성할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "티올-말레이미드"는 하기 화학식을 갖는, 티올의 말레이미드와의 반응에 의해 형성된 기를 지칭하고,
여기서 Y 및 Z는 티올-말레이미드 연결을 통해 연결되는 기이고, 이는 링커 성분, 항체 또는 페이로드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "절단가능한"은 공유 연결에 의해 2개의 모이어티를 연결하지만, 생리학상 적절한 조건 하에 분해되어 모이어티 사이의 공유 연결을 절단하는 링커 또는 링커 성분을 지칭하며, 전형적으로 절단가능한 링커는 세포 외부의 경우보다 세포내 환경에서 생체내에서 보다 신속하게 절단되어, 페이로드의 방출이 표적화된 세포 내부에서 우선적으로 일어나게 한다. 절단은 효소적 또는 비-효소적일 수 있지만, 일반적으로 항체를 분해하지 않으면서 항체로부터 페이로드를 방출한다. 절단은 페이로드에 부착된 링커 또는 링커 성분의 일부 부분을 남겨 둘 수 있거나, 링커의 임의의 잔여 부분 또는 성분 없이 페이로드를 방출할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "Pcl"은 피롤린 카르복시 리신, 예를 들어
본원에 사용된 바와 같은 "비-절단가능한"은 생리학적 조건 하에 분해에 특별히 감수성이지 않은 링커 또는 링커 성분을 지칭하고, 예를 들어 이는 적어도 면역접합체의 항체 또는 항원 결합 단편 부분만큼 안정하다. 이러한 링커는 때때로 "안정한"으로 지칭되고, 이는 이들이 분해에 충분히 저항성이어서 페이로드가 항원 결합 모이어티 Ab에 Ab 그 자체가 적어도 부분적으로 분해될 때까지 연결을 유지하도록 한다는 것, 즉 Ab의 분해가 생체내에서 링커의 절단보다 선행한다는 것을 의미한다. 안정한 또는 비-절단가능한 링커를 갖는 ADC의 항체 부분의 분해는 링커의 일부 또는 모두, 및 생체내에서 전달되는 페이로드 또는 약물 모이어티에 부착된, 항체로부터 1개 이상의 아미노산 기를 남길 수 있다.
본원에 사용된 용어 "C1-C3알킬", "C2-C3알킬", "C1-C4알킬", "C1-C5알킬", "C1-C6알킬" 및 "C2-C6알킬"은 각각 1-3개의 탄소 원자, 2-3개의 탄소 원자, 1-4개의 탄소 원자, 1-5개의 탄소 원자, 1-6개의 탄소 원자 또는 2-6개의 탄소 원자를 함유하는 완전 포화 분지형 또는 직쇄 탄화수소를 지칭한다. "C1-C3알킬" 기의 비제한적 예는 메틸, 에틸, n-프로필 및 이소프로필을 포함한다. "C2-C3알킬" 기의 비제한적 예는 에틸, n-프로필 및 이소프로필을 포함한다. "C1-C4알킬" 기의 비제한적 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸 및 tert-부틸을 포함한다. "C1-C5알킬" 기의 비제한적 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸 및 이소펜틸을 포함한다. "C1-C6알킬" 기의 비제한적 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸 및 헥실을 포함한다. "C2-C6알킬" 기의 비제한적 예는 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸 및 헥실을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "알킬렌"은 1 내지 10개의 탄소 원자 및 다른 특색에 부착하는 2개의 개방 원자가를 갖는 2가 알킬 기를 지칭한다. 달리 제공되지 않는 한, 알킬렌은 1 내지 10개의 탄소 원자, 1 내지 6개의 탄소 원자, 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 모이어티를 지칭한다. 알킬렌의 대표적인 예는 메틸렌, 에틸렌, n-프로필렌, 이소-프로필렌, n-부틸렌, sec-부틸렌, 이소-부틸렌, tert-부틸렌, n-펜틸렌, 이소펜틸렌, 네오펜틸렌, n-헥실렌, 3-메틸헥실렌, 2,2- 디메틸펜틸렌, 2,3-디메틸펜틸렌, n-헵틸렌, n-옥틸렌, n-노닐렌, n-데실렌 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "C1-C3알콕시", "C2-C3알콕시", "C1-C4알콕시", "C1-C5알콕시", "C1-C6알콕시" 및 "C2-C6알콕시는 각각 기 -O-C1-C3알킬, -O-C2-C3알킬, -O-C1-C4알킬, -O-C1-C5알킬, -O-C1-C6알킬 및 -O-C2-C6알킬을 지칭하며, 여기서 기 "C1-C3알킬", "C2-C3알킬", "C1-C4알킬", "C1-C5알킬", "C1-C6알킬" 및 "C2-C6알킬"은 상기 정의된 바와 같다. "C1-C3알콕시" 기의 비제한적 예는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시 및 이소프로폭시를 포함한다. "C2-C3알콕시" 기의 비제한적 예는 에톡시, n-프로폭시 및 이소프로폭시를 포함한다. "C1-C4알콕시" 기의 비제한적 예는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시 및 tert-부톡시를 포함한다. "C1-C5알콕시" 기의 비제한적 예는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, n-펜틸옥시 및 이소펜틸옥시를 포함한다. "C1-C6알콕시" 기의 비제한적 예는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, n-펜틸옥시, 이소펜틸옥시 및 헥실옥시를 포함한다. "C2-C6알콕시" 기의 비제한적 예는 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, n-펜틸옥시, 이소펜틸옥시 및 헥실옥시를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "할로겐" (또는 할로)은 플루오린, 브로민, 염소 또는 아이오딘, 특히 플루오린 또는 염소를 지칭한다. 할로겐-치환된 기 및 모이어티, 예컨대 할로겐에 의해 치환된 알킬 (할로알킬)은 모노-, 폴리- 또는 퍼-할로겐화될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "헤테로 원자"는, 달리 제공되지 않는 한 질소 (N), 산소 (O) 또는 황 (S) 원자, 특히 질소 또는 산소를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "4-8원 헤테로시클로알킬"은 포화 4-8원 모노시클릭 탄화수소 고리 구조를 지칭하고, 여기서 탄화수소 고리 구조의 고리 탄소 중 1 내지 2개는 1 내지 2개의 NR 기에 의해 대체되고, 여기서 R은 수소, 결합, 본원에 정의된 바와 같은 R5 기 또는 본원에 정의된 바와 같은 R7 기이다. 본원에 사용된 바와 같은 4-8원 헤테로시클로알킬 기의 비제한적 예는, 아제타디닐, 아제타딘-1-일, 아제타딘-2-일, 아제타딘-3-일, 피롤리디닐, 피롤리딘-1-일, 피롤리딘-2-일, 피롤리딘-3-일, 피롤리딘-4-일, 피롤리딘-5-일, 피페리디닐, 피페리딘-1-일, 피페리딘-2-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 피페리딘-5-일, 피페리딘-6-일, 피페라지닐, 피페라진-1-일, 피페라진-2-일, 피페라진-3-일, 피페라진-4-일, 피페라진-5-일, 피페라진-6-일, 아제파닐, 아제판-1-일, 아제판-2-일, 아제판-3-일, 아제판-4-일, 아제판-5-일, 아제판-6-일, 및 아제판-7-일을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "6원 헤테로시클로알킬"은 포화 6원 모노시클릭 탄화수소 고리 구조를 지칭하고, 여기서 탄화수소 고리 구조의 고리 탄소 중 1 내지 2개는 1 내지 2개의 NR 기에 의해 대체되고, 여기서 R은 수소, 결합, 본원에 정의된 바와 같은 R5 기 또는 본원에 정의된 바와 같은 R7 기이다. 본원에 사용된 바와 같은 6원 헤테로시클로알킬 기의 비제한적 예는 피페리디닐, 피페리딘-1-일, 피페리딘-2-일, 피페리딘-3-일, 피페리딘-4-일, 피페리딘-5-일, 피페리딘-6-일, 피페라지닐, 피페라진-1-일, 피페라진-2-일, 피페라진-3-일, 피페라진-4-일, 피페라진-5-일 및 피페라진-6-일을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "4-8원 헤테로시클로알킬렌"은 4-8원 헤테로시클로알킬 기로부터 유래된 2가 라디칼을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "6원 헤테로시클로알킬렌"은 6원 헤테로시클로알킬 기로부터 유래된 2가 라디칼을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "헤테로아릴"은 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로방향족 모노시클릭 고리를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 이러한 헤테로아릴 기의 비제한적 예는 2- 또는 3-푸릴; 1-, 2-, 4-, 또는 5-이미다졸릴; 3-, 4-, 또는 5-이소티아졸릴; 3-, 4-, 또는 5-이속사졸릴; 2-, 4-, 또는 5-옥사졸릴; 4- 또는 5-1,2,3-옥사디아졸릴; 2- 또는 3-피라지닐; 1-, 3-, 4-, 또는 5- 피라졸릴; 3-, 4-, 5- 또는 6-피리다지닐; 2-, 3-, 또는 4-피리딜; 2-, 4-, 5- 또는 6-피리미디닐; 1-, 2- 또는 3-피롤릴; 1- 또는 5-테트라졸릴; 2- 또는 5-1,3,4-티아디아졸릴; 2-, 4-, 또는 5-티아졸릴; 2- 또는 3-티에닐; 2-, 4- 또는 6-1,3,5-트리아지닐; 1-, 3- 또는 5-1,2,4-트리아졸릴; 및 1-, 4- 또는 5-1,2,3-트리아졸릴을 포함한다. 본원에 사용된 헤테로아릴의 바람직한 실시양태는 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로방향족 모노시클릭 고리이다. 특정 실시양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 헤테로아릴 기의 비제한적 예는 2- 또는 3-피라지닐; 3-, 4-, 5- 또는 6-피리다지닐; 2-, 3-, 또는 4-피리딜; 및 2-, 4-, 5- 또는 6-피리미디닐을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "헤테로아릴렌"은 헤테로아릴 기로부터 유래된 2가 라디칼을 지칭한다.
본원에 사용된 면역접합체 명명 규정은 항체-화합물 번호이고, 여기서 화합물 번호는 특정한 항체에의 접합에 사용된 화학식 I의 화합물을 지칭한다. 예로서, 항-Her2-LC-S159C-CL-12는 화합물 CL-12에 접합된 항체 항-Her2-LC-S159C를 기재한다. 예로서, 항-Her2-HC-ins388-A1-CoA-1-CL-22는 CoA 유사체 (CoA-1)에 커플링된 다음 화합물 CL-22에 접합된, A1 펩티드로 태그부착된 항체 항-Her2-HC-ins388을 기재한다.
링커
ADC 페이로드로서 사용하기 위해 본원에 제공된 화합물은 링커 L에, 또는 항원 결합 모이어티에 직접 부착될 수 있다. 이러한 ADC에서 사용하기에 적합한 링커는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본 발명의 접합체에서 사용될 수 있다. 링커 L은 항원 결합 모이어티 상의 임의의 적합한 이용가능한 위치에서 항원 결합 모이어티에 부착될 수 있고: 전형적으로, L은 이용가능한 아미노 질소 원자 (즉 아미드보다는, 1급 또는 2급 아민) 또는 히드록실 산소 원자에, 또는 예컨대 시스테인 상의 이용가능한 술프히드릴에 부착된다. 본원에 제공된 화합물은 항유사분열 세포독성 펩티드이고, 화합물에의 링커 L의 부착은 N-말단 또는 C-말단에서 이루어질 수 있다. ADC에 사용하기 위한 광범위하게 다양한 링커가 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Lash, Antibody-Drug Conjugates: the Next Generation of Moving Parts, Start-Up, Dec. 2011, 1-6] 참조), 본 발명의 범주 내의 접합체에 사용될 수 있다.
화학식 I, 화학식 II 및 화학식 III에서 링커 L은 1개 이상의 링커 성분 L1, L2, L3, L4, L5, L6 등을 포함하는 연결 모이어티이다. 특정 실시양태에서 링커 성분은 함께 플랭킹된 기를 연결하는 결합을 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, L은 -*L1L2L3L4L5L6-이고, 여기서 *는 본 발명의 화합물에 대한 부착 부위를 나타낸다. 특정 실시양태에서 링커 성분은 함께 플랭킹된 기를 연결하는 결합을 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, L은 -*L1L2L3L4L5-이고, 여기서 *는 본 발명의 화합물에 대한 부착 부위를 나타낸다. 특정 실시양태에서 링커 성분은 함께 플랭킹된 기를 연결하는 결합을 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, L은 -*L1L2L3L4-이고, 여기서 *는 본 발명의 화합물에 대한 부착 부위를 나타낸다. 특정 실시양태에서 링커 성분은 함께 플랭킹된 기를 연결하는 결합을 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, L은 -*L1L2L3-이고, 여기서 *는 본 발명의 화합물에 대한 부착 부위를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서 L은 -*L1L2-이고, 여기서 *는 본 발명의 화합물에 대한 부착 부위를 나타낸다. 특정 실시양태에서 L은 -L1-이다. 일부 바람직한 링커 및 링커 성분이 본원에 도시되어 있다.
화학식 I, 화학식 II 및 화학식 III에서 링커 L은 2가일 수 있고, 이는 이것이 항원 결합 모이어티에 링커당 단지 1개의 페이로드를 연결하는데 사용될 수 있음을 의미하거나, 또는 이는 3가일 수 있고 항원 결합 모이어티에 링커당 2개의 페이로드를 연결할 수 있거나, 또는 이는 다가일 수 있다. 3가, 4가, 및 다가 링커를 사용하여 항원 결합 모이어티 (예를 들어 항체) 상에 페이로드 (약물)의 로딩을 증가시킬 수 있고, 그에 의해 다중 링커를 부착하기 위해 항체 상에 추가의 부위를 필요로 하지 않으면서 약물 대 항체 비 (DAR)가 증가된다. 이러한 링커의 예는 문헌 [Bioconjugate Chem., 1999 Mar-Apr;10(2):279-88; US6638499; Clin Cancer Res October 15, 2004 10; 7063]; 및 WO2012/113847A1에 제공되어 있다.
화학식 I의 화합물 및 화학식 II 및 화학식 III의 면역접합체에서 사용하기 위한 링커 L은 절단가능하거나 또는 비-절단가능할 수 있다. 절단가능한 링커, 예컨대 히드라존, 디술피드, 디펩티드 Val-Cit를 함유하는 것들, 및 글루쿠로니다제-절단가능한 p-아미노벤질옥시카르보닐 모이어티를 함유하는 것들이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Ducry, et al., Bioconjugate Chem., vol. 21, 5-13 (2010)]을 참조한다. 절단가능한 링커를 포함하는 면역접합체의 경우에, 면역접합체가 세포에 결합하거나 또는 세포에 진입할 때까지 링커는 생체내에서 실질적으로 안정하고, 이 시점에서 세포내 효소 또는 세포내 화학 조건 (pH, 환원 능력)은 링커를 절단하여 화합물을 유리시킨다.
대안적으로, 비-절단가능한 링커를 화학식 I의 화합물 및 화학식 II 및 화학식 III의 면역접합체에서 사용할 수 있다. 비-절단가능한 링커는 세포에서 분해되도록 설계된 구조적 성분이 결여되어 있고, 따라서 그의 구조는 실질적으로 달라질 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Ducry, et al., Bioconjugate Chem., vol. 21, 5-13 (2010)]을 참조한다. 이들 면역접합체는 표적화된 세포에 진입하고 링커 분해보다는 항체의 단백질분해적 분해를 거치는 것으로 여겨지고; 따라서, 적어도 일부 또는 모두의 링커 및 심지어 일부의 항체 또는 항체 단편이 페이로드에 부착된 상태로 남을 수 있다.
화학식 I의 화합물 및 화학식 II 및 화학식 III의 면역접합체에서 링커 L은 전형적으로 통상적으로 2개 이상의 링커 성분을 함유하고, 이는 편의상 접합체의 어셈블리로 선택될 수 있거나, 또는 접합체의 특성에 영향을 미치기 위해 선택될 수 있다. 링커 L을 형성하는데 적합한 링커 성분은 링커 L을 구축하는 방법과 같이, 관련 기술분야에 공지되어 있다. 링커 성분은 아미노산에 기를 부착시키는데 통상적으로 사용되는 기, 스페이서, 예컨대 알킬렌 기 및 에틸렌 옥시드 올리고머, 아미노산 및 약 4개 이하의 아미노산 길이의 짧은 펩티드; 결합; 및 카르보닐, 카르바메이트, 카르보네이트, 우레아, 에스테르 및 아미드 연결 등을 포함할 수 있다. 링커 성분은 티올-말레이미드 기, 티오에테르, 아미드, 및 에스테르; 표적화된 세포 내, 세포 상 또는 주위에서 발견되는 조건 하에 생체내에서 용이하게 절단되는 기, 예컨대 디술피드, 히드라존, 디펩티드, 예컨대 Val-Cit, 치환된 벤질옥시카르보닐 기 등; 항원 결합 모이어티에 대해 적합한 위치에서 페이로드를 배향하는 스페이서, 예컨대 페닐, 헤테로아릴, 시클로알킬 또는 헤테로시클릴 고리, 및 알킬렌 쇄; 및/또는 예를 들어 용해도를 증진시키거나 분자간 응집을 감소시킬 수 있는, 약동학적 특성-증진 기, 예컨대 1개 이상의 극성 기 (카르복시, 술포네이트, 히드록실, 아민, 아미노산, 사카라이드)로 치환된 알킬렌, 및 메틸렌 기(들) 대신 1개 이상의 -NH- 또는 -O-를 함유하는 알킬렌 쇄, 예컨대 글리콜 에테르 (-CH2CH2O-)p (여기서 p는 1-10임)를 포함할 수 있다.
또한, 링커 성분은 2개의 반응성 기 사이의 반응에 의해 용이하게 형성되는 화학적 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 화학적 모이어티의 비제한적 예는 표 1에 제공된다.
<표 1>
여기서: 표 1에서 R32는 H, C1-4 알킬, 페닐, 피리미딘 또는 피리딘이고; 표 1에서 R35는 H, C1- 6알킬, 페닐 또는 1 내지 3개의 -OH 기로 치환된 C1- 4알킬이고; 표 1에서 각각의 R36은 H, C1- 6알킬, 플루오로, -C(=O)OH로 치환된 벤질옥시, -C(=O)OH로 치환된 벤질, -C(=O)OH로 치환된 C1- 4알콕시 및 -C(=O)OH로 치환된 C1- 4알킬로부터 독립적으로 선택되고; 표 1에서 R37은 H, 페닐 및 피리딘으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 실시양태에서, 화학식 II 및 화학식 III의 면역접합체의 링커 L의 링커 성분은 접합에 통상적으로 사용되는 아미노산 측쇄 중 하나, 예를 들어 시스테인의 티올, 또는 리신의 유리 -NH2, 또는 항체 내로 조작된 Pcl 또는 Pyl 기와 반응성 관능기의 반응시 형성되는 기이다. 예를 들어, 문헌 [Ou, et al., PNAS 108(26), 10437-42 (2011)]을 참조한다. 항원 결합 모이어티의 시스테인 잔기와의 반응에 의해 형성되는 링커 성분은
를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 항원 결합 모이어티의 리신 잔기의 -NH2와의 반응에 의해 형성되는 링커 성분은
를 포함하나 이에 제한되지는 않고, 여기서 각각의 p는 1-10이고, 각각의 R은 독립적으로 H 또는 C1-4 알킬 (바람직하게는 메틸)이다. Pcl 또는 Pyl 기와의 반응에 의해 형성되는 링커 성분은
를 포함하나 이에 제한되지는 않고, 여기서 R20은 H 또는 Me이고, R30은 H, Me 또는 페닐이고, 연결을 위해, 제시된 아실 기가 조작된 항체 내의 Pcl 또는 Pyl의 리신 부분에 부착된다.
일부 실시양태에서, 화학식 II 및 화학식 III의 면역접합체의 링커 L의 링커 성분은 
이고, 이는 
및 히드록실아민을 함유하는 화학식 I의 화합물의 반응 시 형성된다. 일부 실시양태에서, 화학식 II 및 화학식 III의 면역접합체의 링커 L의 링커 성분은 
이고, 이는 
및 히드록실아민을 함유하는 화학식 I의 화합물의 반응 시 형성된다.
일부 실시양태에서, 화학식 II 및 화학식 III의 면역접합체의 링커 L의 링커 성분은, 예를 들어 알킬렌 기 -(CH2)n- (여기서 n은 전형적으로 1-10 또는 1-6임), 에틸렌 글리콜 단위 (-CH2CH2O-)n (여기서 n은 1-20, 전형적으로 1-10 또는 1-6임), -O-, -S-, 카르보닐 (-C(=O)-), 아미드 -C(=O)-NH- 또는 -NH-C(=O)-, 에스테르 -C(=O)-O- 또는 -O-C(=O)-, 2개의 이용가능한 부착 지점을 갖는 고리계, 예컨대 페닐 (1,2- 1,3- 및 1,4-이치환된 페닐 포함), C5-6 헤테로아릴, 1,1-이치환된 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 또는 시클로헥실을 비롯한 C3-8 시클로알킬, 및 1,4-이치환된 시클로헥실, 및 C4-8 헤테로시클릴 고리로부터 선택된 2가 고리, 및 하기 제시된 구체적인 예; 아미노산 -NH-CHR*-C=O- 또는 -C(=O)-CHR*-NH-, 또는 화학식 [N]-CHR*-C(=O)-를 갖는 인접 구조의 N에 (예를 들어, 말레이미드 질소에) 부착하는 아미노산으로부터 유래된 기 (여기서 R*는 공지된 아미노산 (빈번하게는 정규 아미노산 중 하나, 예를 들어 trp, ala, asp, lys, gly 등이지만, 또한 예를 들어 노르발린, 노르류신, 호모세린, 호모시스테인, 페닐글리신, 시트룰린, 및 통상적으로 알파-아미노산으로 명명되는 다른 것을 포함함)의 측쇄임), 공지된 아미노산의 폴리펩티드 (예를 들어, 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 등), 티올-말레이미드 연결 (말레이미드에의 -SH의 부가로부터), -S-CR2- 및 다른 티올 에테르, 예컨대 -S-CR2-C(=O)- 또는 -C(=O)-CR2-S- (여기서 R은 독립적으로 각 경우에 H 또는 C1-4 알킬임), -CH2-C(=O)-, 및 디술피드 (-S-S-), 뿐만 아니라 임의의 이들과 하기 기재된 다른 링커 성분, 예를 들어 결합, 비-효소적으로 절단가능한 링커, 비-절단가능한 링커, 효소적으로 절단가능한 링커, 광-안정한 링커, 광-절단가능한 링커 또는 자기 희생적 스페이서를 포함하는 링커의 조합을 포함한다.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 화합물 및 화학식 II 및 화학식 III의 면역접합체의 링커 L은 -*L1L2L3L4L5L6-이고, 여기서 *는 본 발명의 화합물에 대한 부착 부위를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 화학식 I의 화합물 및 화학식 II 및 화학식 III의 면역접합체의 링커 L은 -*L1L2L3L4L5-이고, 여기서 *는 본 발명의 화합물에 대한 부착 부위를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 화학식 I의 화합물 및 화학식 II 및 화학식 III의 면역접합체의 링커 L은 -*L1L2L3L4-이고, 여기서 *는 본 발명의 화합물에 대한 부착 부위를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 화학식 I의 화합물 및 화학식 II 및 화학식 III의 면역접합체의 링커 L은 -*L1L2L3-이고, 여기서 *는 본 발명의 화합물에 대한 부착 부위를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서 화학식 I의 화합물 및 화학식 II 및 화학식 III의 면역접합체의 링커 L은 -*L1L2-이고, 여기서 *는 본 발명의 화합물에 대한 부착 부위를 나타낸다. 특정 실시양태에서 화학식 I의 화합물의 링커 L은 -L1-이다.
화학식 I의 화합물 및 화학식 II 및 화학식 III의 면역접합체의 링커 성분 L1은 -(CH2)m-, -C(=O)(CH2)m-, -NR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)(CH2)mNR12(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1C(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, 
, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNR12(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mX3-, -X3(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)n-, -((C(R12)2)mOC(=O)NR12(CH2)mO(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(C(R12)2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -(CH2)m(O(CH2)m)nS(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mNR12(CH2)mC(=O)-, -(CH2)mO(CH2)mNR12C(=O)O((C(R12)2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)X1-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, 
, -((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)n-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-, -(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3-, -X3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mS(CH2)m-, -NR12C(=O)(CH2)m-, -NR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12-, -(CH2)mC(=O)NR12-, -(CH2)mNR12(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3-, -X3(CH2)m-, -((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-, -NR12(CH2)m-, -NR12C(R12)2(CH2)m-, -(CH2)mC(R12)2NR12-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)NR12-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -NR12C(R12)2(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -NR12C(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)O(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-, -(CH2)mNR12-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-, -(C(R12)2)m-, -(CH2CH2O)n-, -(OCH2CH2)n-, -(CH2)mO(CH2)m-, -S(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2-, -S(=O)2(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mS(=O)2-, -S(=O)2(CH2)m X3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2-, -(CH2)mX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)X2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNR12C(=O(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)NR12(CH2)m-, -X4X1X2C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1X4-, -X1C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)X1-, -C(=O)CHRaaNR12-, -NR12CHRaaC(=O)-, -C(=O)NR12-, -C(=O)O-, -S-, -SCH2(C=O)NR12-, -NR12C(=O)CH2S-, -S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2CH2CH2-, -NR12C(=S)-, -(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12C(=O)-, -C(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m- 및 -NR12S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2NR12-, NHS(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, -S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m-, -NHS(=O)2(CH2)mNHC(=O)-, -S(=O)2(CH2)mNHC(=O)-, -(CH2)mNHC(=O)-, -NHS(=O)2(CH2)mNHC(=O)O(CH2)m-, -S(=O)2(CH2)mNHC(=O)O(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)O(CH2)m-으로부터 선택되고, L1은 하기 표 2에 제시된 기로부터 선택되며,
<표 2>
여기서
X1은
로부터 선택된 자기 희생적 스페이서이고;
X2는
로부터 선택된 디펩티드이고;
X3은 
이고,
X4는 
이고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되고,
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된다.
화학식 I의 화합물 및 화학식 II 및 화학식 III의 면역접합체의 링커 성분 L2, L3, L4, L5, 및 L6은 각각 독립적으로 결합 및 L1로부터 선택된다.
세포독성 펩티드
본 발명의 화합물은 항유사분열 세포독성 펩티드이고, 이러한 화합물 또는 그의 입체이성질체, 및 그의 호변이성질체, 수화물 및 제약상 허용되는 염은 화학식 I의 구조를 갖는 화합물이다.
<화학식 I>
여기서,
R1은 -N=CR4R5, -N=R19, -N=CR5R20, -N=CR5NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12, -N=CR5NR12(CH2)mN(R12)2, -NHC(=NR6)R4, -NHC(=O)R4, -NHC(=O)R20, -NHR8, -NHLR11, -NHR21, -N=CR5R10, -N=R22, -N=CR5R23 또는 -NHC(=O)R23이고;
R2는 -C1-C6알킬이고;
R3은
이고;
R4는 -N(R6)2 또는 -NR6R7이고;
R5는 N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R7은 -(CH2)mN(R12)2, -(CH2)mN(R12)C(=O)OR12 또는 비치환된 C3-C8시클로알킬이거나;
또는 R7은 C1-C6알킬, 옥소, -C(=O)R18, -(CH2)mOH, -C(=O)(CH2)mOH, -C(=O)((CH2)mO)nR12, -((CH2)mO)nR12, 또는 1 내지 5개의 히드록실로 임의로 치환된 C1-C6알킬로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된 C3-C8시클로알킬이고;
R8은 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이거나;
또는 R8은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, C1-C6알콕시, -OH, -CN, -NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2, -C(=O)NR6(CH2)mN(R6)C(O)OR6 및 -C(=O)NR6(CH2)mN(R6)2로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이고;
R9는 -OH, C1-C6알콕시, -NHS(O)2(CH2)mN3, -NHS(=O)2LR11, -NHLR11, -NHS(O)2(CH2)mNH2, -N(R12)2, -R16, -NR12(CH2)mN(R12)2, -NR12(CH2)mR16, -LR11, -NHS(O)2R18, -NHS(=O)2LR11,
이고;
R10은 LR11 또는 
이고;
R11은 
, -NR12C(=O)CH=CH2, -N3, 
, SH, -SSR17, -S(=O)2(CH=CH2), -(CH2)2S(=O)2(CH=CH2), -NR12S(=O)2(CH=CH2), -NR12C(=O)CH2R13, -NR12C(=O)CH2Br, -NR12C(=O)CH2I, -NHC(=O)CH2Br, -NHC(=O)CH2I, -ONH2, -C(O)NHNH2, 
, -CO2H, -NH2, -NCO, -NCS,
이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R13은 -S(CH2)nCHR14NHC(=O)R12 또는
R14는 R12 또는 -C(=O)OR12이고;
R15는 테트라졸릴, -CN, -C(=O)OR12,
-LR11 또는 -X4LR11이고;
R16은 비치환되거나 또는 -LR11로 치환된, N, O, S, S(=O) 및 S(=O)2로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 함유하는 N-연결된 4-8원 헤테로시클로알킬이고;
R17은 2-피리딜 또는 4-피리딜이고;
각각의 R18은 독립적으로 C1-C6알킬, 아지도로 치환된 C1-C6알킬, 및 1 내지 5개의 히드록실로 치환된 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R19는 N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R19는 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R20은 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R20은 C1-C6알킬, -C(=O)OR12, -C(=O)(CH2)mN3, C1-C6할로알킬, 할로겐, 옥소, -OH 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R21은 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -CN, NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이고;
R22는 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R23은 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
X3은 
이고;
X4는 
이고;
각각의 L은 -L1L2L3L4L5L6-, -L6L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4L5-, -L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4-, -L4L3L2L1-, -L1L2L3-, -L3L2L1-, -L1L2-, -L2L1- 및 -L1로부터 독립적으로 선택된 링커이고, 여기서 -L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 본원에 정의된 바와 같고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되고;
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된다.
본 발명의 한 측면은 화학식 I의 구조를 갖는 화합물, 또는 그의 입체이성질체, 및 그의 제약상 허용되는 염이다.
<화학식 I>
여기서,
R1은 -N=CR4R5, -N=R19, -N=CR5R20, -N=CR5NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12, -N=CR5NR12(CH2)mN(R12)2, -NHC(=NR6)R4, -NHC(=O)R4, -NHC(=O)R20, -NHR8, -NHLR11, -NHR21, -N=CR5R10, -N=R22, -N=CR5R23 또는 -NHC(=O)R23이고;
R2는 -C1-C6알킬이고;
R3은 
이고;
R4는 -N(R6)2 또는 -NR6R7이고;
R5는 N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R7은 -(CH2)mN(R12)2, -(CH2)mN(R12)C(=O)OR12 또는 비치환된 C3-C8시클로알킬이거나;
또는 R7은 C1-C6알킬, 옥소, -C(=O)R18, -(CH2)mOH, -C(=O)(CH2)mOH, -C(=O)((CH2)mO)nR12, -((CH2)mO)nR12, 또는 1 내지 5개의 히드록실로 임의로 치환된 C1-C6알킬로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된 C3-C8시클로알킬이고;
R8은 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이거나;
또는 R8은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, C1-C6알콕시, -OH, -CN, -NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2, -C(=O)NR6(CH2)mN(R6)C(O)OR6 및 -C(=O)NR6(CH2)mN(R6)2로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이고;
R9는 -OH, C1-C6알콕시, -NHS(O)2(CH2)mN3, -NHS(O)2(CH2)mNH2, -N(R12)2, -R16, -NR12(CH2)mN(R12)2, -NR12(CH2)mR16, -LR11, -NHS(O)2R18, -NHS(=O)2LR11,
이고;
R10은 LR11 또는 
이고;
R11은 
, -NR12C(=O)CH=CH2, -N3, 
, SH, -SSR17, -S(=O)2(CH=CH2), -(CH2)2S(=O)2(CH=CH2), -NR12S(=O)2(CH=CH2), -NR12C(=O)CH2R13, -NR12C(=O)CH2Br, -NR12C(=O)CH2I, -NHC(=O)CH2Br, -NHC(=O)CH2I, -ONH2, -C(O)NHNH2, 
, -CO2H, -NH2, -NCO, -NCS,
이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R13은 -S(CH2)nCHR14NHC(=O)R12 또는
R14는 R12 또는 -C(=O)OR12이고;
R15는 테트라졸릴, -CN, -C(=O)OR12,
-LR11 또는 -X4LR11이고;
R16은 비치환되거나 또는 -LR11로 치환된, N, O, S, S(=O) 및 S(=O)2로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 함유하는 N-연결된 4-8원 헤테로시클로알킬이고;
R17은 2-피리딜 또는 4-피리딜이고;
각각의 R18은 독립적으로 C1-C6알킬, 아지도로 치환된 C1-C6알킬, 및 1 내지 5개의 히드록실로 치환된 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R19는 N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R19는 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R20은 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R20은 C1-C6알킬, -C(=O)OR12, -C(=O)(CH2)mN3, C1-C6할로알킬, 할로겐, 옥소, -OH 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R21은 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -CN, NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이고;
R22는 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R23은 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
X3은 
이고;
X4는 
이고;
각각의 L은 -L1L2L3L4L5L6-, -L6L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4L5-, -L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4-, -L4L3L2L1-, -L1L2L3-, -L3L2L1-, -L1L2-, -L2L1- 및 -L1로부터 독립적으로 선택된 링커이고, 여기서 -L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 본원에 정의된 바와 같고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되고;
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된다.
합성 방법
본 발명의 화합물을 합성하는데 이용되는 모든 출발 물질, 빌딩 블록, 시약, 산, 염기, 탈수제, 용매 및 촉매는 상업적으로 입수가능하거나, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 유기 합성 방법에 의해 생성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Houben-Weyl 4th Ed. 1952, Methods of Organic Synthesis, Thieme, Volume 21] 참조). 추가로, 본 발명의 화합물은 하기 실시예의 관점에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 유기 합성 방법에 의해 생성될 수 있다.
화학식 I 및 그의 하위화학식의 화합물에 대한 합성 접근법의 예시적인 예가 하기 반응식 1-25에서 제공된다. 하기 반응식에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20, R21, R22, R23 및 L은 본원에 정의된 바와 같다. 반응식이 다양한 합성 단계에 사용된 구체적 시약을 제시할 수 있지만, 다른 공지된 시약을 사용하여 이러한 합성 단계를 달성할 수 있는 것으로 이해된다.
<반응식 1>
반응식 1에서, R3은 아미드 결합 형성을 통해 짧은 펩티드에 커플링된 후 탈보호 단계를 거치고, 후속해서 이민 결합 형성을 통해 RB가 커플링된다.
반응식 1에서, 예로서 RA는 t-부틸, 플루오레닐 또는 벤질일 수 있다. 반응식 1에서, 예로서 RB는 -R4, -R20, -NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12, -NR12(CH2)mN(R12)2, -R10, -R22, -R19 또는 -R23일 수 있고, 이들 각각은 본원에 정의된 바와 같다.
<반응식 2>
반응식 2에서, R3은 아미드 결합 형성을 통해 짧은 펩티드에 커플링된 후 탈보호 단계를 거치고, 후속해서 이민 결합 형성을 통해 RB가 커플링된다.
반응식 2에서, 예로서 RA는 t-부틸, 플루오레닐 또는 벤질일 수 있고, RC는 H 또는 -R6일 수 있다.
<반응식 3>
반응식 3에서, R3은 아미드 결합 형성을 통해 짧은 펩티드에 커플링된 후 탈보호 단계를 거치고, 후속해서 아미드 결합 형성을 통해 -N(RD)2가 커플링된다.
반응식 3에서, 예로서 RA는 t-부틸, 플루오레닐 또는 벤질일 수 있고, 각각의 RD는 독립적으로 -R6 또는 -R7일 수 있다. 반응식 3에서, 예로서 R20은 
일 수 있고, 여기서 X는 -NC(=O)OR12, NH, O 또는 S이고, p는 1 또는 2이고, R'20은 비치환되거나, 또는 C1-C6알킬, -C(=O)OR12, -C(=O)(CH2)mN3, C1-C6할로알킬, 할로겐, 옥소, -OH 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 치환기로 치환될 수 있다. 반응식 3에서, 예로서 R'23은 
일 수 있고, 여기서 X는 -NC(=O)OR12, NH, O 또는 S이고, p는 1 또는 2이고, R'23은 비치환되거나, 또는 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환될 수 있다.
<반응식 4>
반응식 4에서, R3은 아미드 결합 형성을 통해 짧은 펩티드에 커플링된 후 탈보호 단계를 거치고, 후속해서 아민 결합 형성을 통해 RE가 커플링된다.
반응식 1에서, 예로서 RA는 t-부틸, 플루오레닐 또는 벤질일 수 있고, RE는 -R8, LR11 또는 -R21일 수 있다.
<반응식 5>
반응식 5는 화학식 I의 특정 화합물의 N-말단의 추가의 변형을 예시한다.
<반응식 5>
반응식 6은 화학식 I의 특정 화합물의 N-말단의 추가의 변형을 예시하며, 여기서 RG1 및 RG2는 반응성 기이고, CM은 표 1에 주어진 것과 같은 RG1 및 RG2 사이의 반응으로부터 생성된 화학적 모이어티이고, L'는 1개 이상의 링커 성분이다. 다른 예시적인 예가 반응식 7에 제시된다.
<반응식 7>
<반응식 8>
반응식 8은 화학식 I의 특정 화합물의 N-말단의 추가의 변형을 예시하며, 여기서 RG1 및 RG2는 반응성 기이고, CM은 표 1에 주어진 것과 같은 RG1 및 RG2 사이의 반응으로부터 생성된 화학적 모이어티이고, L'는 1개 이상의 링커 성분이다. 다른 예시적인 예가 반응식 9에 제시된다.
<반응식 9>
<반응식 10>
반응식 10은 화학식 I의 특정 화합물의 N-말단의 추가의 변형을 예시하며, 여기서 RG1 및 RG2는 반응성 기이고, CM은 표 1에 주어진 것과 같은 RG1 및 RG2 사이의 반응으로부터 생성된 화학적 모이어티이고, L'는 1개 이상의 링커 성분이다. 다른 예시적인 예가 반응식 11에 제시된다.
<반응식 11>
<반응식 12>
반응식 12는 화학식 I의 특정 화합물의 N-말단의 추가의 변형을 예시하며, 여기서 RG1 및 RG2는 반응성 기이고, CM은 표 1에 주어진 것과 같은 RG1 및 RG2 사이의 반응으로부터 생성된 화학적 모이어티이고, L'는 1개 이상의 링커 성분이다. 다른 예시적인 예가 반응식 13에 제시된다.
<반응식 13>
반응식 13에서, Y1, Y2 및 Y3은 각각 독립적으로 C*, N 또는 CRF이고, 여기서 *는 -L'NH2 기의 부착 지점을 나타내고, RF는 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -CN, NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2 또는 C1-C6알콕시이다. Y1, Y2 및 Y3 중 단지 1개가 N일 수 있고, Y1, Y2 및 Y3 중 단지 1개가 C*일 수 있다.
화학식 I 및 그의 하위화학식의 화합물에 대한 또 다른 합성 접근법이 하기 반응식 14에 제시된다.
<반응식 14>
화학식 I 및 그의 하위화학식의 화합물에 대한 또 다른 합성 접근법이 하기 반응식 15에 제시된다.
<반응식 15>
반응식 15에서, 예로서 RB는 -R4, -R20, -NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12, -NR12(CH2)mN(R12)2, -R22 또는 -R19일 수 있고, 이들 각각은 본원에 정의된 바와 같다.
화학식 I 및 그의 하위화학식의 화합물에 대한 또 다른 합성 접근법이 하기 반응식 16에 제시된다.
<반응식 16>
화학식 I 및 그의 하위화학식의 화합물에 대한 또 다른 합성 접근법이 하기 반응식 17에 제시된다.
<반응식 17>
반응식 17에서, 예로서 RB는 -R4, -R20, -NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12, -NR12(CH2)mN(R12)2, -R22 또는 -R19일 수 있고, 이들 각각은 본원에 정의된 바와 같다. 반응식 17에서, 예로서 RC는 H 또는 -R6일 수 있고, RE는 -R8일 수 있다.
화학식 I 및 그의 하위화학식의 화합물에 대한 또 다른 합성 접근법이 하기 반응식 18에 제시된다.
<반응식 18>
반응식 18에서, RA는 t-부틸, 플루오레닐 또는 벤질일 수 있고, 각각의 RD는 독립적으로 -R6 또는 -R7일 수 있다. 반응식 21에서, 예로서 X는 -NC(=O)OR12, NH, O 또는 S이고, p는 1 또는 2이고, 
는 비치환되거나, 또는 C1-C6알킬, -C(=O)OR12, -C(=O)(CH2)mN3, C1-C6할로알킬, 할로겐, 옥소, -OH 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 치환기로 치환될 수 있다.
화학식 I 및 그의 하위화학식의 화합물에 대한 또 다른 합성 접근법이 하기 반응식 19에 제시된다.
<반응식 19>
반응식 19에서, 예로서 RB는 -R4, -R20, -NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12, -NR12(CH2)mN(R12)2, -R22 또는 -R19일 수 있고, 이들 각각은 본원에 정의된 바와 같다. 반응식 19에서, 예로서 RC는 H 또는 -R6일 수 있고, RE는 -R8일 수 있다.
화학식 I 및 그의 하위화학식의 화합물에 대한 또 다른 합성 접근법이 하기 반응식 20에 제시된다.
<반응식 20>
반응식 20에서, 예로서 X는 -NC(=O)OR12, NH, O 또는 S이고, p는 1 또는 2이고, 
는 비치환되거나, 또는 C1-C6알킬, -C(=O)OR12, -C(=O)(CH2)mN3, C1-C6할로알킬, 할로겐, 옥소, -OH 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 치환기로 치환될 수 있다.
화학식 I 및 그의 하위화학식의 화합물에 대한 또 다른 합성 접근법이 하기 반응식 21에 제시된다.
<반응식 21>
반응식 21에서, 예로서 RB는 -R4, -R20, -NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12, -NR12(CH2)mN(R12)2, -R22 또는 -R19일 수 있고, 이들 각각은 본원에 정의된 바와 같다. 반응식 21에서, 예로서 RC는 H 또는 -R6일 수 있고, RE는 -R8일 수 있다.
화학식 I 및 그의 하위화학식의 화합물에 대한 또 다른 합성 접근법이 하기 반응식 22에 제시된다.
<반응식 22>
반응식 22에서, 예로서 RB는 -R4, -R20, -NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12, -NR12(CH2)mN(R12)2, -R22 또는 -R19일 수 있고, 이들 각각은 본원에 정의된 바와 같다. 반응식 22에서, 예로서 RC는 H 또는 -R6일 수 있고, RE는 -R8일 수 있다.
화학식 I 및 그의 하위화학식의 화합물에 대한 또 다른 합성 접근법이 하기 반응식 23에 제시된다.
<반응식 23>
반응식 23에서, 예로서 X는 -NC(=O)OR12, NH, O 또는 S이고, p는 1 또는 2이고, 
는 비치환되거나, 또는 C1-C6알킬, -C(=O)OR12, -C(=O)(CH2)mN3, C1-C6할로알킬, 할로겐, 옥소, -OH 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 치환기로 치환될 수 있다.
화학식 I 및 그의 하위화학식의 화합물에 대한 또 다른 합성 접근법이 하기 반응식 24에 제시된다.
<반응식 24>
반응식 24에서, 예로서 X는 -NC(=O)OR12, NH, O 또는 S이고, p는 1 또는 2이고, 
는 비치환되거나, 또는 C1-C6알킬, -C(=O)OR12, -C(=O)(CH2)mN3, C1-C6할로알킬, 할로겐, 옥소, -OH 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 치환기로 치환될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 방법의 임의의 변형을 추가로 포함하며, 여기서 그의 임의의 스테이지에서 수득가능한 중간체 생성물이 출발 물질로서 사용되고 나머지 단계가 수행되거나, 또는 출발 물질이 반응 조건 하에 계내 형성되거나, 또는 반응 성분이 그의 염 또는 광학적으로 순수한 물질의 형태로 사용된다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 의도되며, 그에 대한 제한으로서 해석되어서는 안된다. 온도는 섭씨 온도로 주어진다. 실온 (rt)은 20 내지 21℃이다. 달리 언급되지 않는 한, 모든 증발은 감압, 전형적으로 약 15 mm Hg 내지 100 mm Hg (= 20-133 mbar) 하에 수행된다. 사용된 약어는 관련 기술분야에 통상적인 것들이다. 모든 반응은 임의의 추가 증류 없이 상업용 등급의 무수 용매를 사용하여 질소 하에 수행하였다. 시약은 추가 정제 없이 상업용 등급으로서 사용하였다. 박층 크로마토그래피는 TLC 실리카 겔 플레이트를 사용하여 수행하였다. 칼럼 크로마토그래피는 플래쉬 등급 사전패킹된 레디셉(Redisep)® 칼럼을 사용하여, ISCO 콤비플래시(Combiflash) Rf 시스템을 사용하여 수행하였다.
정제용 HPLC는 하기 조건을 사용하여 워터스(Waters) 자동정제 시스템 상에서 수행하였다: 칼럼 선파이어(Sunfire) C18 30 x 100mm, 5μ, 30 ml/분으로 물 + 0.05%TFA 중 CH3CN-CH3CN에 의한 구배 용리.
크로마토그래피 정제 후 적절한 순도의 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축시켜 목적 생성물을 수득하였다.
분석 방법
달리 나타내지 않는 한, 하기 HPLC 및 HPLC/MS 방법이 중간체의 제조 및 실시예에서 사용되었다.
LC/MS 분석은 애질런트(Agilent) 1200sl/6140 시스템 상에서 수행하였다.
칼럼: 워터스 액퀴티(Acquity) HSS T3 C18, 50x2.0, 1.8um
이동상: A) H2O + 0.05% TFA; B: 아세토니트릴 + 0.035% TFA
펌프 방법:
검출: 190 nm - 400 nm에서 UV 다이오드 어레이
MS 스캔: 200 - 1350amu
ELSD: 60℃
MS 파라미터:
중간체에 대한 합성 절차
리튬 (E)-6-(((1-에톡시에틸리덴)아미노)옥시)헥사노에이트 (I-1)의 합성
500 mL 플라스크에서, 에틸 N-히드록시아세트이미데이트 (6.18 g, 59.9 mmol), 에틸 6-브로모헥사노에이트 (8.9 mL, 50 mmol) 및 N,N-디메틸포름아미드 (DMF, 100 mL)를 합하였다. NaH (미네랄 오일 중 60%, 2.20 g, 55 mmol)를 20℃에서 교반하면서 플라스크에 여러 부분으로 첨가하고, 반응물을 20℃에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 150mL 얼음이 담긴 포화 수성 NH4Cl 200 mL에 붓고, 얼음이 용융될 때까지 교반하였다. 혼합물을 EtOAc (125 mLx3)로 추출하였다. 합한 유기 층을 연속적으로 10% 수성 시트르산, 물, 포화 수성 NaHCO3, 및 포화 수성 NaCl의 각각 100mL로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켜 조 생성물로서 적색빛 오일 12.6 g을 수득하였다. 조 오일을 뷔히 유리 오븐을 사용하여 1mbar 미만에서 증류시켰다. 에틸 6-(((1-에톡시에틸리덴)아미노)옥시)헥사노에이트를 무색 오일로서 수득하였다. MS (ESI+) 계산치 246.2, 실측치 246.1 (M+1).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.121 (q, 2H, J=4.7Hz), 4.004 (q, 2H, J=4.7Hz), 3.881 (t, 2H, J=4.4Hz), 2.303 (t, 2H, J=5.0Hz), 1.920 (s, 3H), 1.686-1.616 (m, 4H), 1.418-1.366 (m, 2H), 1.266 (t, 3H, J=4.8Hz), 1.249 (t, 3H, J=4.8Hz).
에틸 6-(((1-에톡시에틸리덴)아미노)옥시)헥사노에이트 (2.457 g, 10.0 mmol)를 100mL 둥근 바닥 플라스크에 채우고, THF (30mL) 중에 용해시켰다. 수성 LiOH (1.0 M, 10.0 mL)를 반응물에 첨가하고, 반응물을 20℃에서 16시간 동안 교반하였다. 추가의 1M 수성 LiOH 2.5mL를 반응물에 첨가하고, 반응물을 50℃에서 13시간 동안 교반하였다. LCMS 분석은 반응의 완결을 나타내었다. THF를 증발에 의해 제거하고, 나머지 혼합물을 동결건조시켜 리튬 (E)-6-(((1-에톡시에틸리덴)아미노)옥시)헥사노에이트 (I-1)를 백색 고체로서 수득하였다. MS (ESI+) 계산치 218.1, 실측치 218.1 (M+1, H 형태).
1H NMR (400 MHz, MeOH-d4): δ 3.980 (q, 2H, J=7.2Hz), 3.861 (t, 2H, J=6.6Hz), 2.161 (t, 2H, J= 7.6Hz), 1.883 (s, 3H), 1.665-1.588 (m, 4H), 1.431-1.370 (m, 2H), 1.250 (t, 3H, J= 7.0Hz). 13C NMR (100 MHz, MeOH-d4): δ 182.976, 163.331, 74.495, 63.180, 39.324, 29.972, 27.737, 27.394, 14.779, 13.646.
1-(2-(2-아미노에톡시)에틸)-1H-피롤-2,5-디온 (I-2)의 합성
단계 1
t-부틸 (2-(2-아미노에톡시)에틸)카르바메이트 (204 mg, 1 mmol)를 포화 수성 NaHCO3 (10 mL) 중에 용해시켰다. 용액을 0℃로 냉각시켰다. 이어서, 메틸-2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-카르복실레이트 (155 mg, 1.0 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. pH를 2M HCl을 사용하여 1-2로 조정하고, 혼합물을 EtOAc (3 X 20 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 이스코에 의해 DCM 중 MeOH의 0-4% 구배를 사용하여 정제하여 tert-부틸 (2-(2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에톡시)에틸)카르바메이트를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 6.82 (s, 2H), 3.68 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.59 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.46 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.18-3.14 (m, 2H), 1.43 (s, 9H).
MS m/z 185.1(M+1-Boc). 체류 시간 0.918분.
단계 2
t-부틸 (2-(2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에톡시)에틸)카르바메이트 (162 mg, 0.57 mmol)를 메탄올성 HCl (3 M, 2 mL) 중에 용해시켰다. 용매를 증발에 의해 천천히 제거하였다. 잔류 용매를 고진공 하에 추가로 제거하여 1-(2-(2-아미노에톡시)에틸)-1H-피롤-2,5-디온 (I-2)을 수득하였다.
MS m/z 185.1(M+1). 체류 시간 0.307분.
Cbz-Val-Dil-OtBu: ((3R,4S,5S)-tert-부틸 4-((S)-2-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노에이트) (I-3)의 합성
Cbz-Val-OH (바켐(Bachem), 3.682 g, 14.7 mmol) 및 H-Dil-OtBu ((3R,4S,5S)-tert-부틸 3-메톡시-5-메틸-4-(메틸아미노)헵타노에이트) (스몰 몰레큘스 인크.(Small Molecules Inc.), 3.006 g, 9.75 mmol)를 200 mL 플라스크에 넣고, DMF (60 mL) 중에 용해시켰다. DIEA (8.0 mL, 46 mmol)를 첨가하였다. DMF (30 mL) 중 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 5.56 g, 14.6 mmol)의 용액을 20℃에서 교반하면서 3분에 걸쳐 플라스크에 적가하였다. 반응물을 20℃에서 2일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (200 mL)로 희석하고, 5% 수성 시트르산, 물 및 포화 수성 NaCl 각각 100 mL로 연속적으로 세척하였다. 합한 수성 상을 100 mL EtOAc로 추출하고, 제1 유기 상과 합하였다. 합한 유기 상을 건조 및 농축시켰다. 잔류물을 220 g 실리카 겔 칼럼을 사용하여 이스코에 의해 헥산 중 10-20% EtOAc의 구배를 사용하여 정제하여 Cbz-Val-Dil-OtBu (I-3)를 점성 오일로서 수득하였다. MS (ESI+) m/z 493.4 (M+1). 체류 시간 1.494분.
Val-Dil-OtBu: ((3R,4S,5S)-tert-부틸 4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노에이트) (I-4)의 합성
Cbz-Val-Dil-OtBu (I-3) (1.076 g, 2.16 mmol), 활성탄 상 Pd (5% Pd, 98 mg) 및 MeOH (50 mL)를 자기 교반기 막대가 구비된 200 mL 플라스크에서 합하였다. 반응 분위기를 H2로 대체하고, 반응물을 20℃에서 1시간 동안 격렬히 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하여 폐촉매를 제거하였다. 여과물을 농축시켜 H-Val-Dil-OtBu (I-4)를 미황색 점성 오일로서 수득하였다. MS (ESI+) m/z 359.3 (M+1). 체류 시간 0.979분.
(3R,4S,5S)-tert-부틸 4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노에이트 (I-5)의 합성
(3R,4S,5S)-tert-부틸 4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노에이트 (360 mg, 0.994 mmol)를 DMSO (5.0 mL) 중에 용해시키고, HBTU (526 mg, 1.383 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 20℃에서 17시간 동안 교반하였다. DIEA (0.174 mL)를 반응물에 첨가하고, 반응물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 20℃에서 17시간 동안 교반하였다. DIEA (0.174 mL)를 반응물에 첨가하고, 반응물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 50g C18 칼럼을 사용하여 이스코에 의해 물 중 아세토니트릴의 구배를 사용하여 정제하여 (3R,4S,5S)-tert-부틸 4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노에이트 (I-5)를 백색 고체로서 수득하였다. MS (ESI+) 계산치 457.4, 실측치 457.4 (M+1). 체류 시간 1.089분.
(3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵탄산 (I-6)의 합성
(3R,4S,5S)-tert-부틸 4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노에이트 TFA 염 (I-5) (292 mg, 0.511 mmol)을 1,4-디옥산 중 4M HCl (10 mL) 중에 용해시키고, 생성된 용액을 실온에서 20시간 동안 정치시켰다. 용액을 농축시켰다. 잔류물을 아세토니트릴 및 물에 녹이고, 동결건조시켜 매우 점성인 황색 오일을 수득하였다. F-NMR은 이 물질이 TFA를 함유한다는 것을 시사하였다. TFA를 제거하기 위해, 오일을 아세토니트릴 (10 mL) 중에 용해시키고, 6N 염산 (10 mL)으로 처리하였다. 용매를 감압 하에 제거하여 (3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵탄산 (I-6)을 수득하였다. MS m/z 계산치 401.3, 실측치 401.3. 체류 시간 0.760분.
Cbz-Val-Dil-OH: ((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵탄산) (I-7)의 합성
Cbz-Val-Dil-OtBu (I-3) (0.371 g, 0.745 mmol)를 아세토니트릴 (3.0 mL) 중에 용해시키고, 1 N 염산 (2.0 mL)을 첨가하였다. 반응물을 40℃에서 1시간 동안 교반하고, 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 대부분의 아세토니트릴을 감압 하에 증발에 의해 제거하여 과량의 HCl을 제거하였다. 백색 침전물이 형성되었다. 혼합물을 15 mL 아세토니트릴 및 10 mL 물로 희석하였다. 생성된 용액을 결빙시키고, 동결건조시켜 Cbz-Val-Dil-OH (I-7)를 백색 고체로서 수득하였다. MS (ESI+) m/z 437.2 (M+1). 체류 시간 1.145분.
Boc-Dap-OMe: ((S)-tert-부틸 2-((1R,2R)-1,3-디메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-카르복실레이트) (I-8)의 합성
Boc-Dap-OH (스몰 몰레큘스 인크., 3.11 g, 10.8 mmol), K2CO3 (2.99 g, 21.6 mmol), 아이오도메탄 (2.95 g) 및 아세톤 (55 mL)을 합하였다. 반응물을 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 추가의 메틸아이오다이드 (2.28 g)를 반응물에 첨가하고, 반응물을 40℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 200 mL EtOAc와 100 mL H2O 사이에 분배하였다. 유기 층을 분리하고, 50mL 포화 수성 NaCl로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 Boc-Dap-OMe (I-8)를 황색 오일로서 수득하였다. MS (ESI+) m/z 계산치 324.2, 실측치 324.2 (M+23). 체류 시간 1.245분.
Dap-OMe: ((2R,3R)-메틸 3-메톡시-2-메틸-3-((S)-피롤리딘-2-일)프로파노에이트) (I-9)의 합성
Boc-Dap-OMe (3.107 g, 10.3 mmol)를 디에틸 에테르 중 HCl (2 M, 10 mL)과 합하고, 농축시켰다. 이 작업을 반복하였다. 반응은 7번째 처리 후에 완결되었다. Dap-OMe (I-9)의 HCl 염을 농축 후 백색 고체로서 수득하였다. MS (ESI+) m/z 계산치 202.1, 실측치 202.2 (M+1). 체류 시간 0.486분.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.065-4.041 (m, 1H), 3.732 (br.s, 1H), 3.706 (s, 3H), 3.615 (s, 3H), 3.368 (br.s, 1H), 3.314 (br.s, 1H), 2.795 (q, 1H, J=6.8Hz), 2.085-1.900 (m, 4H), 1.287 (d, 3H, J=7.2Hz).
(2R,3R)-메틸 3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노에이트 (I-10)의 합성
Cbz-Val-Dil-OH (I-7) (208 mg, 0.875 mmol), HATU (281 mg, 0.739 mmol) 및 DMF (7.5 mL)를 40mL 유리 바이알 내에서 합하였다. DIEA (0.256 mL)를 첨가하고, 반응물을 21℃에서 50분 동안 진탕시켰다. (2R,3R)-메틸 3-메톡시-2-메틸-3-((S)-피롤리딘-2-일)프로파노에이트 (I-9) (208 mg, 0.875 mmol)를 반응물에 첨가하고, 이어서 추가의 DIEA (0.256 mL)를 첨가하였다. 반응물을 21℃에서 3시간 동안 진탕시켰다. 반응 혼합물을 EtOAc (60 mL)로 희석하고, 5% 수성 시트르산, H2O, 및 포화 수성 NaCl으로 연속적으로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 150g C18 칼럼을 사용하여 이스코에 의해 H2O 중 아세토니트릴의 20-80% 구배를 사용하여 정제하여 (2R,3R)-메틸 3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노에이트 (I-10)를 황색 유리질 물질로서 수득하였다.
MS (ESI+) m/z 계산치 620.4, 실측치 620.5 (M+1). 체류 시간 1.391분.
(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산 (i-11)의 합성
단계 1
MeOH (5ml) 중 (2R,3R)-메틸 3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노에이트 (i-10) (200mg, 0.32mmol)에 Pd/C (10% 습윤, 68.7mg)를 첨가하고, 반응 혼합물을 H2 분위기 하에 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 여과하고 농축시켜 (2R,3R)-메틸 3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노에이트, 
를 수득하였다.
MS m/z 486.4 (M+1). 체류 시간 0.883분.
단계 2
DIEA (0.27ml, 1.54mmol) 및 HATU (141mg, 0.37mmol)를 DMF (4 ml) 중 (2R,3R)-메틸 3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노에이트 (150 mg, 0.31 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 정제용 HPLC (20-70% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 (2R,3R)-메틸 3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노에이트, 
를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 584.4 (M+1). 체류 시간 1.027분.
단계 3
ACN (2.5 ml) 및 물 (1.6 ml) 중 (2R,3R)-메틸 3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노에이트 (133 mg, 228 μmol)를 먼저 1N 수성 NaOH (0.68 ml)로 실온에서 2시간 동안 처리한 다음, 추가의 1N 수성 NaOH 1.02 mL로 동일한 온도에서 3시간 동안 처리하였다. 반응물의 pH를 1N 염산을 사용하여 5~6으로 조정하고, 동결건조시켰다. 잔류물을 역상 이스코 (H2O 중 20-70% ACN)를 사용하여 정제하여 (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산 (i-11)을 수득하였다.
MS m/z 570.4 (M+1). 체류 시간 1.028분.
(R)-2,4-디히드록시-3,3-디메틸-N-(3-옥소-3-((2-옥소프로필)아미노)프로필)부탄아미드 (i-12)의 합성
단계 1
판토테산 (50 mg, 0.23 mmol)을 DMF (5 mL) 중에 용해시키고, 디페닐포스포릴 아지드 (98 μL, 0.46 mmol) 및 2-(2-메틸-1,3-디옥솔란-2-일)에탄아민 (40 mg, 0.34 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 트리에틸아민 (79 μL, 0.57 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반한 다음, 실온에서 24시간 동안 교반하였다. EtOAc (50 mL)를 첨가하고, 0.1N HCl 용액 (20 mL), 0.1N NaOH 용액 (20 mL), 염수 (20 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하였다. 여과물을 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 HPLC에 의해 정제하고 동결건조시켜 (R)-2,4-디히드록시-3,3-디메틸-N-(3-(((2-메틸-1,3-디옥솔란-2-일)메틸)아미노)-3-옥소프로필)부탄아미드를 수득하였다. MS (m+1) = 319.2, 체류 시간: 0.466분
단계 2
(R)-2,4-디히드록시-3,3-디메틸-N-(3-(((2-메틸-1,3-디옥솔란-2-일)메틸)아미노)-3-옥소프로필)부탄아미드 (46 mg, 0.14 mmol)를 THF (5 mL) 및 3N HCl 용액 (3mL) 중에 용해시키고, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 0℃로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 1N NaOH 용액으로 중화시키고, 진공 하에 절반 부피로 농축시켰다. 반응 혼합물을 이스코 RP-C18에 의해 정제하고, 동결건조시켜 (R)-2,4-디히드록시-3,3-디메틸-N-(3-옥소-3-((2-옥소프로필)아미노)프로필)부탄아미드 (i-12)를 수득하였다. MS (m+1) = 275.2, 체류 시간: 0.337분,
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 3.99 (s, 2H), 3.84 (s, 1H), 3.42~4.47 (m, 2H), 3.42 (d, 1H, J = 11.2 Hz), 3.34 (d, 1H, J = 11.2 Hz), 2.45 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 2.10 (s, 3H), 0.87 (s, 6H).
(R)-N-(3-((2-아지도에틸)아미노)-3-옥소프로필)-2,4-디히드록시-3,3-디메틸부탄아미드 (i-13)의 합성
판토테산 (50 mg, 0.23 mmol)을 DMF (5 mL) 및 디페닐포스포릴 아지드 (98 μL, 0.46 mmol) 중에 용해시키고, 2-아지도에탄아민 (30 mg, 0.34 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 트리에틸아민 (79 μL, 0.57 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반한 다음, 실온에서 24시간 동안 교반하였다. EtOAc (50 mL)를 첨가하고, 0.1N HCl 용액 (20 mL), 0.1N NaOH 용액 (20 mL), 염수 (20 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하였다. 여과물을 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 HPLC에 의해 정제하고 동결건조시켜 (R)-N-(3-((2-아지도에틸)아미노)-3-옥소프로필)-2,4-디히드록시-3,3-디메틸부탄아미드 (i-13)를 수득하였다. MS (m+1) = 288.2, 체류 시간: 0.504분,
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 3.84 (s, 1H), 3.41~4.47 (m, 3H), 3.31~3.35 (m, 5H), 2.40 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 0.87 (s, 6H).
(R)-2,4-디히드록시-3,3-디메틸-N-(3-옥소-3-((3-옥소부틸)아미노)프로필) 부탄아미드 (i-14)의 합성
단계 1
판토테산 헤미칼슘 염 (100 mg, 0.390 mmol)을 CH3CN (10 mL) 중에 용해시키고, 황산 수지를 사용하여 판토테산으로 교환하였다. 판토테산 (10 mg, 0.046 mmol)을 DMF (2 mL) 및 디페닐포스포릴 아지드 (20 μL, 0.091 mmol) 중에 용해시키고, 2-(2-메틸-1,3-디옥솔란-2-일)에탄아민 (7 mg, 0.005 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 트리에틸아민 (16 μL, 0.114 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반한 다음, 실온에서 24시간 동안 교반하였다. EtOAc (50 mL)를 첨가하고, 0.1N HCl 용액 (20 mL), 0.1N NaOH 용액 (20 mL), 염수 (20 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하였다. 여과물을 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 HPLC에 의해 정제하고 동결건조시켜 (R)-2,4-디히드록시-3,3-디메틸-N-(3-((2-(2-메틸-1,3-디옥솔란-2-일)에틸)아미노)-3-옥소프로필)부탄아미드를 수득하였다. MS (m+1) = 333.2, 체류 시간: 0.512분
단계 2
(R)-2,4-디히드록시-3,3-디메틸-N-(3-((2-(2-메틸-1,3-디옥솔란-2-일)에틸)아미노)-3-옥소프로필)부탄아미드 (6 mg, 0.02 mmol)를 THF (2 mL) 및 3N HCl 용액 (1mL) 중에 용해시키고, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 0℃로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 1N NaOH 용액으로 중화시키고, 진공 하에 절반 부피로 농축시켰다. 반응 혼합물을 이스코 RP-C18에 의해 정제하고, 동결건조시켜 (R)-2,4-디히드록시-3,3-디메틸-N-(3-옥소-3-((3-옥소부틸)아미노)프로필) 부탄아미드 (i-14)를 수득하였다. MS (m+1) = 289.2, 체류 시간: 0.362분,
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 3.83 (s, 1H), 3.37~4.45 (m, 3H), 3.34 (d, 2H, J = 7.2 Hz), 3.32 (d, 1H, J = 3.2 Hz), 2.65 (t, 2H, J = 6.4Hz), 2.34 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 2.10 (s, 3H), 0.87 (s, 6H).
2,4-디히드록시-3,3-디메틸-N-(3-옥소부틸)부탄아미드 (i-15)의 합성
단계 1
수소화알루미늄리튬 (583 mg, 15 mmol)을 THF (100 mL) 중에 용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. THF (50 mL) 중 (±)-판토락톤 (1g, 8 mmol)의 용액을 0℃에서 첨가하고, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 무수 황산나트륨을 천천히 첨가한 다음 EtOAc (50 mL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 짧은 셀라이트 패드로 여과하고, 여과물을 농축시켰다. 잔류물을 이스코 (CH2Cl2 중 5%에서 20% MeOH)에 의해 정제하여 3,3-디메틸부탄-1,2,4-트리올을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 3.71~3.74 (m, 1H), 3.65 (dd, 1H, J = 4.8 및 7.6 Hz), 3.57 (dd, 1H, J = 2.4 및 4.8 Hz), 3.54 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 3.48 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 0.95 (s, 3H), 0.93 (s, 3H).
단계 2
3,3-디메틸부탄-1,2,4-트리올 (570 mg, 4 mmol) 및 1-(디메톡시메틸)-4-메톡시벤젠 (1.16 g, 6 mmol)을 CH2Cl2 (50 mL) 중에 용해시키고, (7,7-디메틸-2-옥소비시클로[2.2.1]헵탄 -1-일) 메탄술폰산 (99 mg, 0.4 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 트리에틸아민 (0.29 mL, 2 mmol)을 첨가하였다. 농축시킨 후, 잔류물을 이스코 (n-헥산 중 0%에서 30% EtOAc)에 의해 정제하여 2-(4-메톡시페닐)-5,5-디메틸-1,3-디옥산-4-일)메탄올을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.44 (d, 2H, J = 6.0 Hz), 6.91 (d, 2H, J = 6.0 Hz), 5.47 (s, 1H), 3.90 (s, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.59~3.70 (m, 5H), 1.14 (s, 3H), 0.84 (s, 3H).
단계 3
DMSO (0.27 mL, 4 mmol)를 무수 CH2Cl2 (20 mL) 중에 용해시키고, 옥살릴 클로라이드 (0.25 mL, 3 mmol)를 -78℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 -78℃에서 15분 동안 교반하고, 무수 CH2Cl2 (1 mL) 중 2-(4-메톡시페닐)-5,5-디메틸-1,3-디옥산-4-일)메탄올 (485 mg, 2 mmol)의 용액을 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 -78℃에서 30분 동안 교반하고, 트리에틸아민 (1.34 mL, 10 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물 (50 mL)과 CH2Cl2 (100 mL) 사이에 분배하고, 유기 층을 포화 NaHCO3 (50 mL) 및 염수 (50 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 이스코 (n-헥산 중 20%에서 50% EtOAc)에 의해 정제하여 2-(4-메톡시페닐)-5,5-디메틸-1,3-디옥산-4-카르브알데히드를 수득하였다. MS (m+1) = 251.2, 체류 시간: 1.105분.
단계 4
2-(4-메톡시페닐)-5,5-디메틸-1,3-디옥산-4-카르브알데히드 (289 mg, 1 mmol)를 아세톤/CH2Cl2 (3:1, 20 mL) 중에 용해시키고, 새로이 제조된 물 (5 mL) 중 NaH2PO4.H2O (1593 mg, 12 mmol) 및 NaCl2O (528 mg, 6 mmol)의 용액을 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고, 농축시켰다. 잔류물을 이스코 (C18)에 의해 정제하여 2-(4-메톡시페닐)-5,5-디메틸-1,3-디옥산-4-카르복실산을 수득하였다. MS (m+1) = 267.2, 체류 시간: 0.957분.
단계 5
2-(4-메톡시페닐)-5,5-디메틸-1,3-디옥산-4-카르복실산 (40 mg, 0.2 mmol)을 DMF (3 mL) 중에 용해시키고, HATU (39 mg, 0.2 mmol) 및 DIEA (0.05 mL, 0.3 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하고, 2-(2-메틸-1,3-디옥솔란-2-일)에탄아민 (40 mg, 0.3 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 정제용 HPLC에 의해 정제하여 2-(4-메톡시페닐)-5,5-디메틸-N-(2-(2-메틸-1,3-디옥솔란-2-일)에틸)-1,3-디옥산-4-카르복스아미드를 수득하였다. MS (m+1) = 380.2, 체류 시간: 1.102분,
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.44 (d, 2H, J = 5.6 Hz), 7.33 (bs, 1H), 6.90 (d, 2H, J = 5.2 Hz), 5.46 (s, 1H), 4.08 (s, 1H), 3.82~3.88 (m, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.75 (m, 1H), 3.68 (dd, 2H, J = 7.6 및 16.0 Hz),3.38 (m, 2H), 1.86 (m, 4H), 1.31 (s, 3H), 1.11(s, 3H), 1.09 (s, 3H).
단계 5
2-(4-메톡시페닐)-5,5-디메틸-N-(2-(2-메틸-1,3-디옥솔란-2-일)에틸)-1,3-디옥산-4-카르복스아미드 (10 mg, 0.03 mmol)를 MeOH 중 3M HCl (1 mL) 중에 용해시키고, 물 (0.1 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 이스코 (C18)에 의해 정제하여 2,4-디히드록시-3,3-디메틸-N-(3-옥소부틸)부탄아미드 (i-15)를 수득하였다. MS (m+1) = 218.2, 체류 시간: = 0.400분,
1H NMR (MeOD-d4, 400 MHz) δ 3.84 (s, 1H), 3.31~3.44 (m, 4H), 2.70 (t, 2H, J = 4.0 Hz),2.12 (s, 3H), 0.88 (s, 3H).
비-연결된 펩티드에 대한 합성 절차
실시예 1
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-1) 및 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (FP-22)의 합성
단계 1
0℃에서 DMF (20.0 mL) 중 Boc-Val-Dil-Dap-OH (1.00 g, 1.75 mmol)의 용액에 DIEA (0.677 g, 5.25 mmol) 및 HATU (0.731 g, 1.93 mmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을 5분 동안 교반하고, 0℃에서 DMF (5.0 mL) 중 L-페닐알라닌 메틸 에스테르 HCl 염 (0.377 g, 1.75 mmol) 및 DIEA (0.226 g, 1.75 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온하고, 추가로 30분 동안 교반하고, 반응 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 C18 칼럼을 사용하여 이스코에 의해 물 중 아세토니트릴의 20-90% 구배를 사용하여 정제하여 BocVal-Dil-Dap-PheOMe를 수득하였다.
MS m/z 733.4 (M+1). 체류 시간 1.47분.
단계 2
HCl (1,4-디옥산 중 4N, 16 mL)을 메탄올 (20 mL) 중 단계 1에서 수득된 BocVal-Dil-Dap-PheOMe (0.683 g, 0.932 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 7시간 동안 교반하고, 농축시켰다. 잔류물을 디옥산 중에 용해시키고, 동결건조시켜 Val-Dil-Dap-PheOMe HCl 염을 수득하였다.
MS m/z 633.4 (M+1). 체류 시간 0.96분.
단계 3
Val-Dil-Dap-PheOMe (4.2 mg, 0.0067 mmol)의 용액에 DMF (1 mL) 및 DIEA (4.3 mg, 0.033 mmol)를 첨가하고, 이어서 HATU (2.6 mg, 0.0067 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 20-50% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-1)를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 731.4 (M+1). 체류 시간 1.122분.
단계 4
MeOH-H2O (2:1, 3 mL) 중 (S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 TFA 염 (FP-1) (10.2 mg, 0.012 mmol)의 용액에 LiOH (20 mg, 0.84 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 18시간 동안 교반하고, 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 20-45% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (FP-22)을 수득하였다.
MS m/z 717.5 (M+1). 체류 시간 1.008분.
실시예 2
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3,3-디메틸구아니디노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-2)의 합성
25 ml 둥근 바닥 플라스크에 벤조트리아졸 (1.19 g, 9.99 mmol) 및 2-프로판올 중 6 N HCl (3 mL)을 첨가하였다. 균질 용액이 5분 내에 생성되었지만, 이후 백색 고체가 침전되었다. 이어서, 용매를 증발에 의해 제거하여 벤조트리아졸 HCl 염 (1.55 g, 9.96 mmol)을 수득하였다. 이 벤조트리아졸 HCl 염에 N,N-디메틸시안아미드 (0.84 g, 12 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 80℃에서 30분 동안 가열하였다. 반응물이 처음에 투명해졌다가, 고체가 형성되기 시작하였다. 결정을 수집하여 N,N-디메틸-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-카르복스이미드아미드를 수득하였다. 아세토니트릴 (1 mL) 중 (S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (Val-Dil-Dap-PheOMe) (5.0 mg, 0.0067 mmol)의 용액에 DIEA (0.023 mL, 0.13 mmol) 및 N,N-디메틸-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-카르복스이미드아미드 (0.015 g, 0.067 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 30초 동안 초음파처리하고, 밀봉하고, 60℃에서 20시간 동안 가열하였다. LCMS는 전환율이 약 50%임을 나타내었다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 20-70% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3,3-디메틸구아니디노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-2)를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 703.4 (M+1). 체류 시간 1.256분.
실시예 3
(S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-아지도프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (FP-3)의 합성
단계 1
물 (25 ml) 중 아지드화나트륨 (3.5 g, 54 mmol)의 교반 용액에 아세톤 (25 ml) 중 1,3-프로판 술톤 (6.1 g, 50 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하고, 농축시켰다. 생성된 고체를 디에틸 에테르 (100 ml) 중에 현탁시키고, 환류 하에 1시간 동안 교반하였다. 현탁액을 실온으로 냉각시켰다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 아세톤 및 디에틸 에테르로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 3-아지도-1-프로판술폰산을 수득하였다.
MS m/z 188.1 (M+23).
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 3.47 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.87 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.07-2.00 (m, 2H).
단계 2
3-아지도-1-프로판술폰산 (2.07 g, 13 mmol)을 톨루엔 중에 현탁시켰다. PCl5 (2.61 g, 13 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 환류 하에 3시간 동안 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시켰다. 불용성 물질을 여과에 의해 제거하고, DCM으로 세척하였다. 합한 여과물을 농축시켜 3-아지도프로판-1-술포닐 클로라이드를 황갈색 오일로서 수득하였으며, 이를 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 3
NH4OH (28%, 5 mL)를 0℃로 냉각시켰다. 3-아지도프로판-1-술포닐 클로라이드 (1.75 g, 9.53 mmol)를 첨가하였다. 10분 후, 반응물을 실온으로 가온한 다음, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 2개의 상이 균질해졌다. 반응 혼합물을 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기 상을 염수로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 회전 증발기 상에서 농축시키고, 이어서 고진공에 의해 18시간 동안 농축시켜 3-아지도프로판-1-술폰아미드를 수득하였다.
MS m/z 187.1 (M+23).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.83 (s, 2H), 3.51 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.23 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.17-2.10 (m, 2H).
단계 4
(S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-페닐프로판산 (100 mg, 0.38 mmol)을 DMF (4 mL) 중에 용해시켰다. DIEA (0.395 mL, 2.26 mmol) 및 HATU (358 mg, 0.94 mmol)를 첨가하였다. 15분 후에, 3-아지도프로판-1-술폰아미드 (186 mg, 1.13 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 2시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응의 완결을 나타내었다. 반응 혼합물을 정제용 HPLC에 의해 10-90% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-tert-부틸 (1-(3-아지도프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)카르바메이트를 수득하였다.
MS m/z 312.1 (M+1-Boc). 체류 시간 1.15분.
이와 같이 하여 수득한 생성물 (72.4 mg. 0.176 mmol)을 메탄올성 HCl (3 M, 5 mL) 중에 용해시켰다. 용매를 증발에 의해 제거하였다. 잔류물을 아세토니트릴 및 H2O로부터 동결건조시켜 (S)-2-아미노-N-((3-아지도프로필)술포닐)-3-페닐프로판아미드를 분홍색빛 황색빛 고체로서 수득하였다.
MS m/z 312.1 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.42-7.31 (m, 5H), 4.16-4.13 (m, 1H), 3.51-3.47 (m, 4H), 3.32-3.26 (m, 1H), 3.13-3.08 (m, 1H), 2.00-1.94 (m, 2H).
단계 5
DMF (4mL) 중 Boc-Val-Dil-Dap-OH (195 mg, 0.3 4mmol)에 DIEA (132 mg, 1.02 mmol) 및 HATU (108 mg, 0.28 mmol)를 첨가하였다. 이것을 실온에서 15분 동안 교반하였다. (S)-2-아미노-N-((3-아지도프로필)술포닐)-3-페닐프로판아미드 (59.2 mg, 0.17 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 목적 생성물을 수득하였다 (95 mg, 65% 수율, MS m/z 865.4 (M+1), 체류 시간 1.43분). 생성물을 MeOH 중 3M HCl (3 mL) 중에 용해시켰다. 용매를 증발에 의해 제거하였다. 잔류물을 아세토니트릴-물로부터 동결건조시켜 (S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-아지도프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-2-아미노-3-메틸-1-옥소부탄, 
를 HCl 염으로서 수득하였다.
MS m/z 765.4 (M+1), 체류 시간 1.04분.
단계 6
DMF (2 mL) 중 (S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-아지도프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-2-아미노-3-메틸-1-옥소부탄 HCl 염 (20 mg, 0.025 mmol)에 DIEA (0.024 mL, 0.14 mmol) 및 HATU (21.6 mg, 0.057 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응의 완결을 나타내었다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 10-90% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-아지도프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (FP-3)을 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 863.5 (M+1). 체류 시간 1.169분.
실시예 4
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3,3-디메틸우레이도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-4)의 합성
Val-Dil-Dap-PheOMe (4.2 mg, 0.0067 mmol)를 THF-DMF (1:1, 1.6 ml) 중에 용해시키고, 4-니트로페닐 클로로포르메이트 (20 mg, 0.099 mmol)를 첨가하고, 이어서 DIEA (20 mg, 0.17 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 농축시키고, C18 칼럼을 사용하여 이스코에 의해 H2O 중 아세토니트릴의 30%-70% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-(((4-니트로페녹시)카르보닐)아미노)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트를 수득하였다.
MS m/z 798.5 (M+1). 체류 시간 1.481분.
이와 같이 하여 수득한 니트로페닐카르바메이트를 THF-DMF (1:1, 1.6 mL) 중에 용해시키고, 디메틸아민 HCl 염 (0.010 mg, 0.12 mmol)을 첨가하고, 이어서 DIEA (0.027 mL, 0.16 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 72시간 동안 교반한 다음, 농축시켰다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 0-55% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3,3-디메틸우레이도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-4)를 수득하였다. MS m/z 704.4 (M+1). 체류 시간 1.251분.
실시예 5
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3,3-디이소프로필우레이도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-5)의 합성
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3,3-디이소프로필우레이도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-5)를, 디메틸아민 대신 디이소프로필아민 (10 mg, 0.099 mmol)을 사용하는 것을 제외하고, 화합물 FP-4에 대해 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 합성하였다.
MS m/z 760.5 (M+1). 체류 시간 1.481분.
실시예 6
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3-에틸-3-이소프로필우레이도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-6)의 합성
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3-에틸-3-이소프로필우레이도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-6)를, 디메틸아민 대신 에틸이소프로필아민 (10 mg, 0.099 mmol)을 사용하는 것을 제외하고, 화합물 FP-4에 대해 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 합성하였다.
MS m/z 746.5 (M+1). 체류 시간 1.412분.
실시예 7
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3-(1-(히드록시메틸)시클로부틸)우레이도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-7)
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3-(1-(히드록시메틸)시클로부틸)우레이도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-7)를, 디메틸아민 대신 (1-아미노시클로부틸)메탄올 (10 mg, 0.099 mmol)을 사용하는 것을 제외하고, 화합물 FP-4에 대해 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 합성하였다.
MS m/z 760.5 (M+1). 체류 시간 1.224분.
실시예 8
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-((4-메틸피리미딘-2-일)아미노)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-8)의 합성
4 oz. 바이알에 들은 2-프로판올 (2 ml) 중 Val-Dil-Dap-PheOMe TFA 염 (5.0 mg, 0.0067 mmol)의 용액에 2-클로로-4-메틸피리미딘 (2.6 mg, 0.020 mmol) 및 DIEA (4.3 mg, 0.033 mmol)를 첨가하였다. 바이알을 밀봉하고, 100℃에서 4일 동안 가열하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 20-50% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-((4-메틸피리미딘-2-일)아미노)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-8)를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 725.4 (M+1). 체류 시간 1.177분.
실시예 9
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-((4-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일)아미노)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-9)의 합성
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-((4-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일)아미노)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-9)를, 2-클로로-4-메틸피리미딘 대신 2-클로로-4-(트리플루오로메틸)피리미딘 (3.7 mg, 0.020 mmol)을 사용하는 것을 제외하고, 화합물 FP-8에 대해 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 합성하였다. 반응물을 90℃에서 18시간 동안 가열하였다.
MS m/z 779.3 (M+1). 체류 시간 1.481분.
실시예 10
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-10)의 합성
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-10)를, 2-클로로-4-메틸피리미딘 대신 3-클로로-2-플루오로-5-(트리플루오로메틸)피리딘 (1.3 mg, 0.0067 mmol)을 사용하는 것을 제외하고, 화합물 FP-8에 대해 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 합성하였다. 반응물을 90℃에서 18시간 동안 가열하였다.
MS m/z 812.3 (M+1). 체류 시간 1.638분.
실시예 11
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-브로모-3-플루오로피리딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-11)의 합성
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-브로모-3-플루오로피리딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-11)를, 2-클로로-4-메틸피리미딘 대신 5-브로모-2,3-디플루오로피리딘 (1.3 mg, 0.0067 mmol)을 사용하는 것을 제외하고, 화합물 FP-8에 대해 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 합성하였다. 반응물을 100℃에서 96시간 동안 가열하였다.
MS m/z 806.3 (M+1). 체류 시간 1.592분.
실시예 12
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-(피리미딘-2-일아미노)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-12)의 합성
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-(피리미딘-2-일아미노)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-12). 이 화합물을 2-클로로-4-메틸피리미딘 대신 2-클로로피리미딘 (7.7 mg, 0.067 mmol)을 사용하여 화합물 FP-8에 대해 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 합성하였다. 반응물을 120℃에서 48시간 동안 가열하였다.
MS m/z 711.4 (M+1). 체류 시간 1.221분.
실시예 13
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((4-에틸피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-13)의 합성
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((4-에틸피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-13)를, 2-클로로-4-메틸피리미딘 대신 2-클로로-4-에틸피리미딘 (9.6 mg, 0.067 mmol)을 사용하여 화합물 FP-8에 대해 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 합성하였다. 반응물을 120℃에서 48시간 동안 가열하였다.
MS m/z 739.4 (M+1). 체류 시간 1.221분.
실시예 14
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-((6-메틸피리미딘-4-일)아미노)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-14)의 합성
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-((6-메틸피리미딘-4-일)아미노)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-14)를, 2-클로로-4-메틸피리미딘 대신 4-클로로-6-메틸피리미딘 (8.6 mg, 0.067 mmol)을 사용하는 것을 제외하고, 화합물 FP-8에 대해 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 합성하였다. 반응물을 160℃에서 6시간 동안 가열하였다.
MS m/z 725.4 (M+1). 체류 시간 1.068분.
실시예 15
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((4,6-디메틸피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-15)의 합성
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((4,6-디메틸피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-15)를, 2-클로로-4-메틸피리미딘 대신 2-클로로-4,6-디메틸피리미딘 (9.6 mg, 0.067 mmol)을 사용하는 것을 제외하고, 화합물 FP-8에 대해 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 합성하였다. 반응물을 120℃에서 48시간 동안 가열하였다.
MS m/z 739.3 (M+1). 체류 시간 1.164분.
실시예 16
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((6-플루오로피리딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-16)의 합성
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 TFA 염 (5.0 mg, 0.0067 mmol), 2,6-디플루오로피리딘 (7.7 mg, 0.067 mmol), K2CO3 (10 mg, 0.072 mmol), DIEA (8.7 mg, 0.067 mmol) 및 DMSO (1 mL)를 합하고, 밀봉된 바이알에서 160℃에서 24시간 동안 가열하였다. 조 물질을 역상 HPLC에 의해 20-50% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((6-플루오로피리딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-16)를 수득하였다.
MS m/z 728.4 (M+1). 체류 시간 1.457분.
실시예 17
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((4-이소프로필피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-17)의 합성
S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((4-이소프로필피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-17)를, 2-클로로-4-메틸피리미딘 대신 2-클로로-4-이소프로필피리미딘 (10.5 mg, 0.067 mmol)을 사용하는 것을 제외하고, 화합물 FP-8에 대해 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 합성하였다. 반응물을 155℃에서 10시간 동안 가열하였다.
MS m/z 753.4 (M+1). 체류 시간 1.266분.
실시예 18
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-(피라진-2-일아미노)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-18)의 합성
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-(피라진-2-일아미노)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-18)를, 2,6-디플루오로피리딘 대신 2-클로로피라진 (7.7 mg, 0.067 mmol)을 사용하는 것을 제외하고, 화합물 FP-16에 대해 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 합성하였다. 반응물을 130℃에서 10시간 동안 가열하였다.
MS m/z 711.4 (M+1). 체류 시간 1.295분.
실시예 19
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-메톡시-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-3-메톡시-4-((S)-2-((4-메톡시피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-19)의 합성
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-메톡시-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-3-메톡시-4-((S)-2-((4-메톡시피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-19)를, 2-클로로-4-메틸피리미딘 대신 2-클로로-4-메톡시피리미딘 (20 mg, 0.14 mmol)을 사용하는 것을 제외하고, 화합물 FP-8에 대해 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 합성하였다. 반응물을 155℃에서 4시간 동안 가열하였다.
MS m/z 741.5 (M+1). 체류 시간 1.135분.
실시예 20
(S)-tert-부틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-(피리미딘-2-일아미노)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-20)의 합성
단계 1
LiOH (240 mg, 10.0 mmol)를 MeOH-H2O (5:1, 12 ml) 중 Cbz-Val-Dil-Dap-OMe (516 mg, 0.833 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 40℃에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 10 mL 물 중에 용해시키고, 1 N 수성 HCl로 산성화시켰다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (10 mL X3)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 Cbz-Val-Dil-Dap-OH를 수득하였다.
MS m/z 606.3 (M+1). 체류 시간 1.423분.
단계 2
실온에서 DMF (1.0 mL) 중 Cbz-Val-Dil-Dap-OH (30 mg, 0.050 mmol)에 DIEA (19 mg, 0.15 mmol) 및 HATU (18.8 mg, 0.050 mmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을 5분 동안 교반하고, L-페닐알라닌 tert-부틸 에스테르 (11 mg, 0.050 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 HPLC에 의해 30-90% 구배를 사용하여 정제하여 Cbz-Val-Dil-Dap-PheOtBu를 수득하였다.
MS m/z 809.1 (M+1). 체류 시간 1.595분.
단계 3
메탄올 (2 mL) 중 단계 2에서 수득한 BocVal-Dil-Dap-PheOtBu (10.2 mg, 0.013 mmol)에 탄소 상 10% Pd (10 mg)를 첨가하였다. 반응물을 H2 하에 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 촉매를 여과에 의해 제거하고, 여과물을 농축시켜 Val-Dil-Dap-PheOtBu를 수득하였다.
MS m/z 675.1 (M+1). 체류 시간 1.247분.
단계 4
마이크로웨이브 반응 튜브에 Val-Dil-Dap-PheOtBu (4.5 mg, 0.0067 mmol), 2-클로로피리미딘 (8.7 mg, 0.076 mmol), DIEA (0.0088 ml, 0.050 mmol) 및 sec-BuOH (2.0 ml)를 첨가하였다. 튜브를 밀봉하고, 130℃에서 18시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 정제용 HPLC에 의해 30-60%를 사용하여 정제하여 (S)-tert-부틸 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-(피리미딘-2-일아미노)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (FP-20)를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 753.4 (M+1). 체류 시간 1.410분.
실시예 21
(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-시아노-2-페닐에틸)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸-2-(피리미딘-2-일아미노)부탄아미드 (FP-21)의 합성
단계 1
DMF (1.0 mL) 중 Cbz-Val-Dil-Dap-OH (30 mg, 0.050 mmol)에 실온에서 DIEA (6.4 mg, 0.05 mmol) 및 HATU (18.8 mg, 0.050 mmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을 5분 동안 교반하고, (S)-2-아미노-3-페닐프로판니트릴 (13 mg, 0.050 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하고 정제용 HPLC에 의해 30-75% 구배를 사용하여 정제하여 벤질 ((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-시아노-2-페닐에틸)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바메이트를 수득하였다.
MS m/z 734.1 (M+1). 체류 시간 1.469분.
단계 2
메탄올 (2 mL) 중 단계 1에서 수득한 생성물 (28.2 mg, 0.038 mmol)에 탄소 상 10% Pd (10 mg)를 첨가하였다. 반응물을 H2 하에 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 촉매를 여과에 의해 제거하고, 여과물을 농축시켜 (S)-2-아미노-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-시아노-2-페닐에틸)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드를 수득하였다.
MS m/z 600.1 (M+1). 체류 시간 1.119분.
단계 3
마이크로웨이브 반응 튜브에 단계 2에서 수득한 (S)-2-아미노-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-시아노-2-페닐에틸)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드 (4.5 mg, 0.0075mmol), 2-클로로피리미딘 (8.7 mg, 0.076 mmol), DIEA (0.0022 ml, 0.013 mmol) 및 sec-BuOH (2.0 mL)를 첨가하였다. 반응 튜브를 밀봉하고, 130℃에서 18시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 정제용 HPLC에 의해 20-60% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-시아노-2-페닐에틸)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸-2-(피리미딘-2-일아미노)부탄아미드 (FP-21)를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 678.4 (M+1). 체류 시간 1.272분.
실시예 22
(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-16-아미노-7-벤질-4,9,12-트리메틸-5,8,13-트리옥소-2-옥사-6,9,12-트리아자헥사데칸-3-일)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미드 (FP-23)의 합성
단계 1
DMF (4 ml) 중 Cbz-Phe-OH (114 mg, 0.382 mmol)에 DIEA (278 μl, 1.59 mmol) 및 HATU (133 mg, 0.351 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반한 다음, t-부틸 메틸(2-(메틸아미노)에틸)카르바메이트 (60 mg, 0.32 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 정제용 HPLC 정제 (20-70% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 ((S)-tert-부틸 (2-(2-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-N-메틸-3-페닐프로판아미도)에틸)(메틸)카르바메이트), 
를 수득하였다:
MS m/z 470.2 (M+1). 체류 시간 1.313분.
단계 2
MeOH (5 ml) 중 (S)-t-부틸 (2-(2-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-N-메틸-3-페닐프로판아미도)에틸)(메틸)카르바메이트 (104.5 mg, 0.223 mmol)에 Pd/C (47.4 mg, 10% 습윤)를 첨가하였다. 반응 용기를 H2로 충전하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축시켜 ((S)-t-부틸 (2-(2-아미노-N-메틸-3-페닐프로판아미도)에틸)(메틸)카르바메이트), 
를 무색 오일로서 수득하였다.
MS m/z 336.2 (M+1). 체류 시간 0.851분.
단계 3
DIEA (65 μl) 및 HATU (31.2 mg, 0.082 mmol)를 DMF (2 ml) 중 (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산 (i-11) (61.2 mg, 89 μmol)에 첨가하였다. 15분 동안 교반한 후, DMF (1.5 ml) 중 (S)-tert-부틸 (2-(2-아미노-N-메틸-3-페닐프로판아미도)에틸)(메틸)카르바메이트 (25 mg, 75 μmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 정제용 HPLC 정제 (30-50% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 t-부틸 (2-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-N-메틸-3-페닐프로판아미도)에틸)(메틸)카르바메이트, 
를 수득하였다:
MS m/z 887.6 (M+1). 체류 시간 1.167분. DCM (2 ml) 중 생성물 (37.8 mg, 38 μmol)을 TFA (0.4 ml)로 0℃에서 30분 동안 처리한 다음, 실온에서 2시간 동안 처리하였다. 증발에 의해 용매를 제거하여 (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((7S,10R,11R)-7-벤질-5,10-디메틸-6,9-디옥소-12-옥사-2,5,8-트리아자트리데칸-11-일)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미드, 
를 TFA 염으로서 수득하였다. MS m/z 787.6 (M+1). 체류 시간 0.891분.
단계 4
DMF (2 ml) 중 4-((t-부톡시카르보닐)아미노)부탄산 (7.9 mg, 39 μmol)에 DIEA (25.2 mg, 195 μmol)에 이어서 HATU (14.8 mg, 39 μmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, DMF (1 ml) 중 (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((7S,10R,11R)-7-벤질-5,10-디메틸-6,9-디옥소-12-옥사-2,5,8-트리아자트리데칸-11-일)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미드 TFA 염 (39.6 mg, 39 μmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 농축시키고, 정제용 HPLC (20-60% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 tert-부틸 ((3R,4R,7S)-7-벤질-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-4,9,12-트리메틸-5,8,13-트리옥소-2-옥사-6,9,12-트리아자헥사데칸-16-일)카르바메이트, 
를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 972.7 (M+1). 체류 시간 1.106분. DCM (3 ml) 중 이 생성물 (42.4 mg, 39 μmol)을 실온에서 TFA (1 ml)로 4시간 동안 처리한 다음, 농축시켰다. 조 물질을 정제용 HPLC (10-40% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-16-아미노-7-벤질-4,9,12-트리메틸-5,8,13-트리옥소-2-옥사-6,9,12-트리아자헥사데칸-3-일)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미드 (FP-23)를 TFA 염으로서 수득하였다. MS m/z 872.7 (M+1). 체류 시간 0.874분.
실시예 23
N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-히드록시-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-4-메틸피페라진-1-카르복스아미드 (FP-24)의 합성
단계 1
4-니트로페닐 카르보노클로리데이트 (20 mg, 10 μmol) 및 DIEA (25 mg, 190 μmol)를 DMF (1 ml) 및 THF (1 ml) 중 1-메틸피페라진 (10 mg, 10 μmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, Val-Dil-Dap-OH, 
(30 mg, 64 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 16시간 동안 교반한 다음 농축시키고, 정제용 HPLC (10-30% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-(4-메틸피페라진-1-카르복스아미도)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산, 
를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 598.4 (M+1). 체류 시간 0.874분.
단계 2
DIEA (8 mg, 6 μmol) 및 HATU (3.9 mg, 10 μmol)를 DMF (1 ml) 중 단계 1에서 수득한 생성물 (7.4 mg, 10 μmol)에 첨가하고, 실온에서 5분 동안 교반하였다. 이어서, (S)-2-아미노-3-페닐프로판-1-올 (1.6 mg, 10 μmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 정제용 HPLC (10-40% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 화합물 (FP-24)을 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 731.5 (M+1). 체류 시간 0.925분.
실시예 24
N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-히드록시-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)모르폴린-4-카르복스아미드 (FP-25)의 합성
단계 1
4-니트로페닐 카르보노클로리데이트 (8.3 mg, 41 μmol) 및 DIEA (16 mg, 120 μmol)를 DMF (1 ml) 및 THF (1 ml) 중 Val-Dil-Dap-OMe, 
(20 mg, 41 μmol)에 첨가하고, 10분 동안 교반하였다. 이어서, 모르폴린 (3.6 mg, 41 μmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음 농축시키고, 정제용 HPLC (25-60% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 (2R,3R)-메틸 3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-(모르폴린-4-카르복스아미도)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노에이트, 
를 수득하였다.
MS m/z 599.4 (M+1). 체류 시간 1.164분.
단계 2
단계 1에서 수득한 우레아 (24 mg, 41 μmol)를 MeOH-H2O (2:1 3ml) 중에 용해시키고, 실온에서 LiOH (20 mg, 0.84 mmol)로 2일 동안 처리하였다. 이어서, 반응 혼합물을 농축시키고, HOAc (40 μl)를 첨가하였다. 조 물질을 정제용 HPLC (20-45% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-(모르폴린-4-카르복스아미도) 부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일) 피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산, 
를 수득하였다.
MS m/z 585.4 (M+1). 체류 시간 1.036분.
단계 3
DIEA (2.8 mg, 21 μmol) 및 HATU (3.2 mg, 84 μmol)를 단계 2에서 수득한 산 (5.0 mg, 8.4 μmol)에 첨가한 다음, 실온에서 5분 동안 교반하였다. 이어서, S)-2-아미노-3-페닐프로판-1-올 (1.3 mg, 8.4 μmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 조 물질을 정제용 HPLC (10-70% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 화합물 (FP-25)을 수득하였다.
MS m/z 718.5 (M+1). 체류 시간 1.097분.
실시예 25
(S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-히드록시-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-3-메틸모르폴린-4-카르복스아미드 (FP-26)의 합성
화합물 (FP-26) (MS m/z 732.5 (M+1); 체류 시간 1.136분)을, 단계 1에서 모르폴린 대신 (S)-3-메틸모르폴린을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 24에 기재된 방법을 사용하여 제조하였다.
실시예 26
(2S,6R)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-히드록시-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-2,6-디메틸모르폴린-4-카르복스아미드 (FP-27)의 합성
화합물 (FP-27) (MS m/z 746.5 (M+1); 체류 시간 1.193분)을, 단계 1에서 모르폴린 대신 (2R,6S)-2,6-디메틸모르폴린을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 24에 기재된 방법을 사용하여 제조하였다.
실시예 27
(R)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-히드록시-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-2-메틸모르폴린-4-카르복스아미드 (FP-28)의 합성
화합물 (FP-28) (MS m/z 732.5 (M+1); 체류 시간 1.143분)을, 단계 1에서 모르폴린 대신 (R)-2-메틸모르폴린 HCl 염을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 24에 기재된 방법을 사용하여 제조하였다.
실시예 28
(S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-히드록시-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-2-메틸모르폴린-4-카르복스아미드 (FP-29)의 합성
화합물 (FP-29) (MS m/z 732.5 (M+1); 체류 시간 1.144분)을, 단계 1에서 모르폴린 대신 (S)-2-메틸모르폴린 HCl 염을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 24에 기재된 방법을 사용하여 제조하였다.
실시예 29
(R)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-히드록시-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-3-메틸모르폴린-4-카르복스아미드 (FP-30)의 합성
화합물 (FP-30) (MS m/z 732.5 (M+1); 체류 시간 1.145분)을, 단계 1에서 모르폴린 대신 (R)-3-메틸모르폴린 HCl 염을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 24에 기재된 방법을 사용하여 제조하였다.
실시예 30
(2S,6S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-히드록시-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-2,6-디메틸모르폴린-4-카르복스아미드 (FP-31)의 합성
화합물 (FP-31) (MS m/z 746.5 (M+1); 체류 시간 1.179분)을, 단계 1에서 모르폴린 대신 (2S,6S)-2,6-디메틸모르폴린을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 24에 기재된 방법을 사용하여 제조하였다.
실시예 31
N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-히드록시-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-3-옥소피페라진-1-카르복스아미드 (FP-32)의 합성
화합물 (FP-32) (MS m/z 731.5 (M+1); 체류 시간 1.129분)을, 단계 1에서 모르폴린 대신 피페라진-2-온을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 24에 기재된 방법을 사용하여 제조하였다.
실시예 32
N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-히드록시-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-2,2-디메틸-3-옥소피페라진-1-카르복스아미드 (FP-33)의 합성
화합물 (FP-33) (MS m/z 759.5 (M+1); 체류 시간 1.084분)을, 단계 1에서 모르폴린 대신 3,3-디메틸피페라진-2-온을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 24에 기재된 방법을 사용하여 제조하였다.
실시예 33
(S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-히드록시-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-2,4-디메틸피페라진-1-카르복스아미드 (FP-34)의 합성
화합물 (FP-34) (MS m/z 745.6 (M+1); 체류 시간 0.946분)을, 단계 1에서 모르폴린 대신 (S)-1,3-디메틸피페라진을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 24에 기재된 방법을 사용하여 제조하였다.
실시예 34
(2R,6S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-히드록시-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-2,6-디메틸피페라진-1-카르복스아미드 (FP-35)의 합성
화합물 (FP-35) (MS m/z 745.6 (M+1); 체류 시간 0.946분)을, 단계 1에서 모르폴린 대신 (3S,5R)-tert-부틸 3,5-디메틸피페라진-1-카르복실레이트를 사용하는 것을 제외하고, 실시예 24에 기재된 방법을 사용하여 제조하였고, 1:1 아세토니트릴-물 혼합물 중 5% HCl (4 ml)로 처리하는 것에 의해 최종 중간체로부터 boc 보호기를 제거하고, 48시간 동안 교반하여 표제 화합물을 HCl 염으로서 수득하였다.
실시예 35
N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-히드록시-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-2,2-디메틸피페라진-1-카르복스아미드 (FP-36)
화합물 (FP-36) (MS m/z 745.5 (M+1); 체류 시간 0.976분)을, 단계 1에서 (3S,5R)-tert-부틸 3,5-디메틸피페라진-1-카르복실레이트 대신 tert-부틸 3,3-디메틸피페라진-1-카르복실레이트를 사용하는 것을 제외하고, 실시예 34에 기재된 방법을 사용하여 제조하였다.
실시예 36
(2R,6S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-히드록시-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-2,4,6-트리메틸피페라진-1-카르복스아미드 (FP-37)
파라포름알데히드 (1.7 mg, 56 μmol), 아세트산 (5 μl, 90 μmol) 및 NaCNBH3 (3.5 mg, 56 μmol)을 MeOH (2 ml) 중 (2R,6S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-히드록시-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-2,6-디메틸피페라진-1-카르복스아미드 HCl 염 (FP-35) (4.4 mg, 56 μmol)에 첨가한 다음, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 정제용 HPLC 정제 (10-45% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 이어서 HCl 처리하여 표제 화합물 (FP-37)을 HCl 염으로서 수득하였다.
MS m/z 759.6 (M+1). 체류 시간 0.950분.
실시예 37
N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-히드록시-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-2,2,4-트리메틸피페라진-1-카르복스아미드 (FP-38)
화합물 (FP-38) (MS m/z 759.6 (M+1); 체류 시간 0.980분)을, 화합물 (FP-35) 대신 화합물 (FP-37)을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 36에 기재된 방법을 사용하여 제조하였다.
실시예 38
(S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-히드록시-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-2-메틸피페라진-1-카르복스아미드 (FP-39)
화합물 (FP-39) (MS m/z 731.6 (M+1); 체류 시간 0.934분)을, 단계 1에서 모르폴린 대신 (S)-t-부틸 3-메틸피페라진-1-카르복실레이트를 사용하는 것을 제외하고, 실시예 24에 기재된 방법을 사용하여 제조하였고, 1:1 아세토니트릴-물 혼합물 중 5% HCl (4 ml)로 처리하는 것에 의해 최종 중간체로부터 boc 보호기를 제거하고, 2시간 동안 교반하여 표제 화합물을 HCl 염으로서 수득하였다.
실시예 39
(R)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-히드록시-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-2-메틸피페라진-1-카르복스아미드 (FP-40)
화합물 (FP-40) (MS m/z 731.5 (M+1); 체류 시간 0.932분)을, 단계 1에서 모르폴린 대신 (R)-t-부틸 3-메틸피페라진-1-카르복실레이트를 사용하는 것을 제외하고, 실시예 24에 기재된 방법을 사용하여 제조하였고, 1:1 아세토니트릴-물 혼합물 중 5% HCl (4 ml)로 처리하는 것에 의해 최종 중간체로부터 boc 보호기를 제거하고, 2시간 동안 교반하여 표제 화합물을 HCl 염으로서 수득하였다.
실시예 40
(S)-4-아세틸-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-히드록시-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-2-메틸피페라진-1-카르복스아미드 (FP-41)
DMF (0.5 ml) 중 아세트산 (0.9 mg, 20 μmol)에 DIEA (3.9 mg, 30 μmol) 및 HATU (3.2 mg, 8 μmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, DMF (0.5 ml) 중 화합물 (FP-39) HCl 염 (5.8 mg, 7.6 μmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음 농축시키고, 정제용 HPLC (10-60% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 표제 화합물 (FP-41)을 수득하였다.
MS m/z 773.5 (M+1). 체류 시간 1.061분.
실시예 41
(R)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-히드록시-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-2,4-디메틸피페라진-1-카르복스아미드 (FP-42)
화합물 (FP-42) (MS m/z 745.5 (M+1); 체류 시간 0.935분)을, 화합물 (FP-35) 대신 화합물 (FP-40)을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 36에 기재된 방법을 사용하여 제조하였다.
실시예 42
(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-히드록시-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸-2-(피리미딘-2-일아미노)부탄아미드 (FP-43)
단계 1
탄소 상 10% Pd (60 mg)를 MeOH (10 ml) 중 Cbz-Val-Dil-Dap-OMe (350 mg, 565 μmol)에 첨가하고, 반응물을 수소 분위기 하에 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 촉매를 여과에 의해 제거하였다. 여과물을 농축시켜 Val-Dil-Dap-OMe를 수득하였다.
MS m/z 486.3 (M+1). 체류 시간 1.070분.
단계 2
마이크로웨이브 반응 튜브에 Val-Dil-Dap-OMe (274 mg, 565 μmol), 2-클로로피리미딘 (194 mg, 1.69 mmol), DIEA (292 mg, 2.26 mmol) 및 sec-BuOH (5.0 ml)를 채웠다. 이것을 밀봉하고, 130℃에서 48시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 정제용 HPLC (20-70% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 (2R,3R)-메틸 3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-(피리미딘-2-일아미노)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노에이트, 
를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 564.4 (M+1). 체류 시간 1.274분.
단계 3
수산화리튬 (120 mg, 5.0 mmol)을 MeOH-H2O (1:1, 10 ml) 중 단계 2에서 수득한 생성물 (383 mg, 565 μmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 16시간 동안 교반한 다음, 60℃에서 1시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 농축시켰다. 침전물이 형성될 때까지 염산 (1 N)을 잔류물에 첨가하였다 (pH~5). 혼합물을 농축시키고, 정제용 HPLC (20-60% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 물)에 의해 정제하여 (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-(피리미딘-2-일아미노)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산, 
를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 550.3 (M+1). 체류 시간 1.152분.
단계 4
DIEA (3.5 mg, 27 μmol)에 이어서 HATU (6.9 mg, 18 μmol)를 DMF (0.5 ml) 중 단계 3에서 수득한 생성물 (6.0 mg, 9 μmol)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, DMF (0.5 ml) 중 (S)-2-아미노-3-페닐프로판-1-올 (4.1 mg, 27 μmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한 다음, 정제용 HPLC (20-60% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 화합물 (FP-43)을 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 683.4 (M+1). 체류 시간 1.264분.
실시예 43
(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-아미노페닐)-3-히드록시프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸-2-(피리미딘-2-일아미노)부탄아미드 (FP-44)
단계 1
0℃에서 N2 하에 교반되는 THF (10 ml) 중 (S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-(3-니트로페닐)프로판산 (562 mg, 1.81 mmol)의 용액에 THF 중 BH3 (1M, 10 ml)을 첨가하고, 반응물을 50℃로 가온하고, 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 0℃로 냉각시키고, 물로 켄칭하였다. 켄칭한 혼합물을 에틸아세테이트로 희석하고, 10% 수성 K2CO3으로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 물질을 실리카 겔 칼럼에 의해 30-70% 에틸아세테이트-헥산으로 용리시키면서 정제하여 (S)-t-부틸 (1-히드록시-3-(3-니트로페닐)프로판-2-일)카르바메이트를 백색 고체로서 수득하였다.
MS m/z 319.1 (M+Na). 체류 시간 1.183분.
1H NMR (600 MHz, 클로로포름-d) δ 8.13 - 8.04 (m, 2H), 7.57 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.46 (dd, J = 8.9, 7.6 Hz, 1H), 4.76 (s, 1H), 3.87 (dq, J = 8.0, 4.6, 4.1 Hz, 1H), 3.69 (dd, J = 10.9, 3.9 Hz, 1H), 3.58 (dd, J = 10.8, 4.7 Hz, 1H), 2.97 (td, J = 13.1, 12.5, 7.3 Hz, 2H), 1.37 (s, 9H).
단계 2
아세토니트릴 (5 ml) 중 (S)-t-부틸 (1-히드록시-3-(3-니트로페닐)프로판-2-일)카르바메이트 (0.31 g, 1.046 mmol)의 용액에 10% HCl (5 ml)을 첨가하였다. 이것을 실온에서 48시간 동안 교반한 다음, 농축시켜 (S)-2-아미노-3-(3-니트로페닐)프로판-1-올을 HCl 염으로서 수득하였다.
MS m/z 197.2 (M+H). 체류 시간 0.775분.
단계 3
단계 2에서 수득한 (S)-2-아미노-3-(3-니트로페닐)프로판-1-올 HCl 염 (0.243 g, 1.046 mmol)을 MeOH (10 ml) 중에 용해시키고, 탄소 상 10% 팔라듐 (50 mg, 0.047 mmol)을 첨가하였다. 2L 수소 풍선을 부착하였다. 반응물을 H2로 3회 플러싱한 다음, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과한 다음, 농축시켜 (S)-2-아미노-3-(3-아미노페닐)프로판-1-올을 HCl 염으로서 수득하였다.
MS m/z 167.2 (M+H). 체류 시간 0.373분.
단계 4
단계 3에서 수득한 (S)-2-아미노-3-(3-아미노페닐)프로판-1-올 HCl 염 (0.212 g, 1.05 mmol)을 디옥산-물-AcOH (10:9:1, 20ml) 중에 용해시켰다. Boc2O (0.243 mL, 1.05 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 3일 동안 교반하였다. LCMS는 여전히 1/4 출발 물질이 남아있음을 나타내었다. 추가의 Boc2O (150 mg)를 첨가하고, 반응물을 6시간 동안 추가로 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 농축시키고, 정제용 HPLC (0.05% TFA 함유 물 중 10-40% 아세토니트릴)를 사용하여 정제하여 (S)-t-부틸 (3-(2-아미노-3-히드록시프로필)페닐)카르바메이트를 오일로서 수득하였다.
MS m/z 267.2 (M+H). 체류 시간 1.011분.
단계 5
DMF (1ml) 중 (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-(피리미딘-2-일아미노)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산, 
, TFA 염 (30 mg, 0.045 mmol)에 DIEA (0.029 mg, 0.226 mmol) 및 HATU (17.2 mg, 0.045 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반한 다음, DMF (1 ml) 중 (S)-t-부틸 (3-(2-아미노-3-히드록시프로필)페닐)카르바메이트 HCl 염 (17.2 mg, 0.045 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 농축시켰다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 (10-70% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O를 사용하여 용리함) t-부틸 (3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-(피리미딘-2-일아미노)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-히드록시프로필)페닐)카르바메이트를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 798.5(M+H). 체류 시간 1.267분.
단계 6
5% HCl을 함유하는 아세토니트릴-H2O (1:1, 5 ml) 중 단계 5에서 수득한 화합물 (36.1 mg, 0.045 mmol)을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 농축시키고, 정제용 HPLC에 의해 정제하여 (5-35% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O를 사용하여 용리함) 화합물 (FP-44)을 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 698.5(M+H). 체류 시간 0.894분.
실시예 44
(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-히드록시-1-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸-2-(피리미딘-2-일아미노)부탄아미드 (FP-45)
DMF (1 ml) 중 (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-(피리미딘-2-일아미노)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산 (8 mg, 0.015 mmol)에 DIEA (8.6 mg, 0.012 ml) 및 HATU (5.3 mg, 0.014 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 15분 동안 교반한 다음, (1S,2R)-(+)-노르에페드린 (2 mg, 0.013 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC (20-70% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 화합물 (FP-45)을 수득하였다.
MS m/z 683.4 (M+1). 체류 시간 1.241분.
예 N-말단 연결된 화학식 I의 화합물에 대한 합성 절차
실시예 45
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((디메틸아미노)(4-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일)피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-4)의 합성
단계 1
DCM (1 mL) 중 옥살릴 클로라이드 (0.356 g, 2.80 mmol)를 DCM (5 mL) 중 tert-부틸 4-(디메틸카르바모일)피페라진-1-카르복실레이트 (0.361 g, 1.40 mmol)에 실온에서 5분에 걸쳐 적가하였다. 반응물을 교반하면서 환류 하에 3시간 동안 가열하였다. 출발 우레아의 목적 생성물로의 전환은 LCMS 분석에 의한 판단 시 대략 70%였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 디에틸 에테르 (10 mL)로 처리하였다. 그에 의해 형성된 고체를 초음파처리하고, 에테르 층을 버렸다. 고체를 DCM (10 mL) 중에 용해시키고, 포화 수성 KPF6 (3.0 mL 물 중 0.8 g)으로 처리하였다. 혼합물을 5분 동안 진탕시켰다. DCM 층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켜 N-((4-(tert-부톡시카르보닐)피페라진-1-일)클로로메틸렌)-N-메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트, 
를 수득하였다.
MS m/z 276.1 (M+). 체류 시간 0.771분. 생성물을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 2
단계 1에서 수득한 생성물 (0.462 g, 1.09 mmol)을 DCM (10 mL) 중 1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-올 (HOBt)(0.148 g, 1.09 mmol) 및 트리에틸아민 (0.111 g, 1.09 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반하였고, 침전물이 형성되었다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 디에틸 에테르로 세척하여 이소우로늄 1 헥사플루오로포스페이트, 
를 고체로서 수득하였다.
MS m/z 375.2 (M+). 체류 시간 0.826분.
단계 3
DMF (5 mL) 중 (S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (118 mg, 0.186 mmol)에 DIEA (120 mg, 0.928 mmol) 및 단계 2에서 수득한 생성물 (342 mg, 0.557 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 40℃에서 12시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, C18 칼럼을 사용하여 이스코에 의해 0.035% TFA를 함유하는 H2O 중 아세토니트릴의 25-75% 구배를 사용하여 정제하여 tert-부틸 4-((E)-N'-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-3-(((S)-1-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-N,N-디메틸카르밤이미도일)피페라진-1-카르복실레이트 (NL-1)를 TFA 염, 
로서 수득하였다.
MS m/z 872.5 (M+1). 체류 시간 1.159분.
단계 4
DCM (10.0 mL) 중 tert-부틸 4-((E)-N'-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-3-(((S)-1-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-N,N-디메틸카르밤이미도일)피페라진-1-카르복실레이트 (NL-1) (0.157 g, 0.180 mmol)를 TFA (3.0 mL)로 실온에서 1시간 동안 처리하였다. 반응 혼합물을 농축시켜 (S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((디메틸아미노)(피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (NL-2)를 TFA 염, 
로서 수득하였다.
MS m/z 772.5 (M+1). 체류 시간 0.924분.
단계 5
(S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((디메틸아미노)(피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (NL-2) (183 mg, 0.207 mmol)를 MeOH:H2O (2:1, 9.0 ml) 중에 용해시키고, LiOH (35.6 mg, 1.49 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 농축시켰다. 잔류물을 아세트산 (0.060 mL)으로 처리하고, C18 칼럼을 사용하여 이스코에 의해 0.05% TFA를 함유하는 H2O 중 아세토니트릴의 10-70% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((디메틸아미노)(피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-3)을 TFA 염, 
로서 수득하였다.
MS m/z 758.5 (M+1). 체류 시간 0.860분.
단계 6
DMF (2.0 mL) 중 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산산 (EMCA, 17 mg, 0.080 mmol)에 DIEA (0.042 mL, 0.241 mmol) 및 HATU (30.5 mg, 0.080 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하고, DMF (1.0 mL) 중 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((디메틸아미노)(피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-3) (70 mg, 0.080 mmol)에 첨가하였다. 반응은 바로 완결되었다. DMF를 증발에 의해 제거하였다. 잔류물을 C18 칼럼을 사용하여 이스코에 의해 0.05% TFA를 함유하는 물 중 아세토니트릴의 15-70% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((디메틸아미노)(4-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일)피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-4)을 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 951.5 (M+1). 체류 시간 1.049분.
실시예 46
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,7S,E)-4-((S)-sec-부틸)-9-(디메틸아미노)-19-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-7-이소프로필-3-메톡시-5,10,13-트리메틸-6,14-디옥소-5,8,10,13-테트라아자노나데스-8-엔-1-오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-9)의 합성
단계 1
디메틸카르밤산 클로라이드 (129 mg, 1.20 mmol)를 DCM (5 mL) 중 tert-부틸(2-(디메틸아미노)에틸)카르바메이트 (188 mg, 0.999 mmol) 및 트리에틸아민 (0.139 mL, 0.999 mmol)에 0℃에서 교반하면서 적가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 1N 수성 NaOH로 염기성화시키고, 생성된 2개의 상을 분리하였다. 수성 상을 DCM으로 추출하였다. 합한 DCM 상을 물 및 포화 수성 NaCl로 연속적으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 tert-부틸 메틸(2-(1,3,3-트리메틸우레이도)에틸)카르바메이트를 수득하였다.
MS m/z 260.2 (M+1). 체류 시간 1.042분. 생성물을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 2
DCM (1 mL) 중 옥살릴 클로라이드 (253 mg, 2.00 mmol)를 DCM (5 mL) 중 단계 1에서 수득한 우레아 (288 mg, 1.11 mmol)에 실온에서 5분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 교반하면서 환류 하에 가열한 다음, 농축시켰다. 잔류물을 디에틸 에테르 (10 mL)에 녹이고, 초음파처리하였다. 에테르 층을 버린 후, 잔류물을 DCM 중에 용해시키고, 1.5 mL 포화 수성 KPF6 (1.5 mL 물 중 0.38g)으로 처리하였다. 혼합물을 5분 동안 진탕시키고, DCM 층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 N-(((2-((tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노)에틸)(메틸)아미노)클로로메틸렌)-N-메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트를 수득하였다.
MS m/z 278.2 (M+). 체류 시간 0.710분. 생성물을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 3
단계 2에서 수득한 생성물 (179 mg, 0.422 mmol)을 DCM (10 mL) 중 HOBt (56.9 mg, 0.421 mmol) 및 트리에틸아민 (42.6 mg, 0.421 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 어떠한 침전물도 형성되지 않았지만, LCMS는 생성물의 형성을 나타내었다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 디에틸 에테르로 처리하였다. LCMS 분석에 의한 판단 시 불용성 잔류물이 주로 목적 생성물, 2-(1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-일)-1-(2-((tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노)에틸)-1,3,3-트리메틸이소우로늄 헥사플루오로포스페이트, 
였다.
MS m/z 377.2 (M+). 체류 시간 0.746분. 잔류물을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 4
DIEA (15.6 mg, 0.121 mmol)를 DMF (2 mL) 중 단계 3에서 수득한 잔류물 (63.1 mg, 0.121 mmol) 및 (S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 TFA 염 (30 mg, 0.040 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 50℃에서 2시간 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 30-55% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((11S,14S,15R,Z)-14-((S)-sec-부틸)-9-(디메틸아미노)-11-이소프로필-15-메톡시-2,2,5,8,13-펜타메틸-4,12-디옥소-3-옥사-5,8,10,13-테트라아자헵타데스-9-엔-17-오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (NL-5)를 TFA 염, 
로서 수득하였다. MS m/z 874.5 (M+1). 체류 시간 1.179분.
단계 5
DCM (2 mL) 중 (S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((11S,14S,15R,Z)-14-((S)-sec-부틸)-9-(디메틸아미노)-11-이소프로필-15-메톡시-2,2,5,8,13-펜타메틸-4,12-디옥소-3-옥사-5,8,10,13-테트라아자헵타데스-9-엔-17-오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (NL-5) (17 mg, 0.020 mmol)를 TFA (2 mL)로 처리하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고, 농축시켜 (S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((8S,11S,12R,Z)-11-((S)-sec-부틸)-6-(디메틸아미노)-8-이소프로필-12-메톡시-5,10-디메틸-9-옥소-2,5,7,10-테트라아자테트라데스-6-엔-14-오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (NL-6)를 TFA 염, 
로서 수득하였다. MS m/z 774.5 (M+1). 체류 시간 0.899분.
단계 6
LiOH (10 mg, 0.42 mmol)를 MeOH:H2O (2:1, 6 mL) 중 (S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((8S,11S,12R,Z)-11-((S)-sec-부틸)-6-(디메틸아미노)-8-이소프로필-12-메톡시-5,10-디메틸-9-옥소-2,5,7,10-테트라아자테트라데스-6-엔-14-오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (NL-6) (24 mg, 0.027 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 0.5시간 동안 교반하였다. LCMS는 우레아 NL-8이 NL-7과 함께 형성되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 20-55% 구배를 사용하여 정제하였다. NL-7 및 NL-8을 함유하는 분획을 개별적으로 수집하고 농축시켜 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((8S,11S,12R,Z)-11-((S)-sec-부틸)-6-(디메틸아미노)-8-이소프로필-12-메톡시-5,10-디메틸-9-옥소-2,5,7,10-테트라아자테트라데스-6-엔-14-오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-7)을 TFA 염, 
MS m/z 760.5 (M+1), 체류 시간 0.868분으로서; 및 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((8S,11S,12R)-11-((S)-sec-부틸)-8-이소프로필-12-메톡시-5,10-디메틸-6,9-디옥소-2,5,7,10-테트라아자테트라데칸-14-오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-8)을 TFA 염, 
MS m/z 733.4 (M+1), 체류 시간 0.954분으로서 수득하였다.
단계 7
DMF (2 mL) 중 EMCA (2.4 mg, 0.011 mmol)에 DIEA (6.0 mg, 0.046 mmol) 및 HATU (4.0 mg, 0.010 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 5분 동안 교반하고, (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((8S,11S,12R,Z)-11-((S)-sec-부틸)-6-(디메틸아미노)-8-이소프로필-12-메톡시-5,10-디메틸-9-옥소-2,5,7,10-테트라아자테트라데스-6-엔-14-오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-7) TFA 염 (5.5 mg, 0.0056 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 30-50% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,7S,E)-4-((S)-sec-부틸)-9-(디메틸아미노)-19-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-7-이소프로필-3-메톡시-5,10,13-트리메틸-6,14-디옥소-5,8,10,13-테트라아자노나데스-8-엔-1-오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-9)을 수득하였다.
MS m/z 953.5 (M+1). 체류 시간 1.057분.
실시예 47
(S)-2-((E)-((디메틸아미노)(4-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일)피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-1-(2H-테트라졸-5-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드 (NL-12)의 합성
단계 1
2-프로판올-물 혼합물 (1:1, 60 ml) 중 (S)-tert-부틸 (1-시아노-2-페닐에틸)카르바메이트 (0.50 g, 2.03 mmol), 아지드화나트륨 (0.264 g, 4.06 mmol) 및 ZnBr2 (0.229 g, 1.02 mmol)를 환류 하에 16시간 동안 가열하였다. 반응이 완결된 후, 10% 시트르산 및 30 mL EtOAc 5 mL를 첨가하고, 어떠한 고체도 남지 않을 때까지 교반하였다. 수성 층을 EtOAc로 2회 추출하였다. 합한 유기 층을 물로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하였다. 용매를 증발에 의해 제거하고, 잔류물을 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피 (DCM 중 10% MeOH)에 의해 정제하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 농축시키고, EtOAc 중에 재용해시키고, 염수로 세척하고, 건조하고, 농축시켜 (S)-tert-부틸 (2-페닐-1-(2H-테트라졸-5-일)에틸)카르바메이트를 수득하였다.
MS m/z 290.2 (M+1). 체류 시간 0.990분.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.40 - 7.24 (m, 3H), 7.22 - 7.12 (m, 2H), 5.22 - 5.02 (m, 2H), 3.49 - 3.24 (m, 2H), 1.40 (s, 9H).
단계 2
15 mL 둥근 바닥 플라스크에서, (S)-tert-부틸 (2-페닐-1-(2H-테트라졸-5-일)에틸)카르바메이트 (30 mg, 0.104 mmol), TFA (2 mL) 및 DCM (4 mL)을 합하여 투명한 용액을 생성하였다. 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 농축시켜 (S)-2-페닐-1-(2H-테트라졸-5-일)에탄아민을 TFA 염 (M+1 190.2)으로서 수득하였다. 체류 시간 0.422분. 이것을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 3
15 ml 둥근 바닥 플라스크에 Boc-Val-Dil-Dap-OH (59.3 mg, 0.104 mmol), DIEA (0.072 mL, 0.415 mmol) 및 DMF (2 ml)에 이어서 HATU (43.4 mg, 0.114 mmol)를 채웠다. 반응물을 5분 동안 교반하고, 단계 2에서 수득한 (S)-2-페닐-1-(2H-테트라졸-5-일)에탄아민 TFA 염 (0.104 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 72시간 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 10-70% 구배를 사용하여 정제하여 tert-부틸 ((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-1-(1H-테트라졸-5-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바메이트, 
를 수득하였다.
MS m/z 743.5 (M+1). 체류 시간 1.373분.
단계 4
15 mL 둥근 바닥 플라스크에서, tert-부틸 ((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-1-(1H-테트라졸-5-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바메이트 (46 mg, 0.056 mmol), TFA (2 mL) 및 DCM (4 mL)을 합하여 투명한 용액을 생성하였다. 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 농축시켜 (S)-2-아미노-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-1-(1H-테트라졸-5-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드를 TFA 염, 
로서 수득하였다.
MS m/z 643.5 (M+1). 체류 시간 0.929분. 이것을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 5
DIEA (0.028 ml, 0.16 mmol)를 DMF (2 mL) 중 (S)-2-아미노-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-1-(1H-테트라졸-5-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드 TFA 염 (40 mg, 0.053 mmol) 및 이소우로늄 1 (27.6 mg, 0.053 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 30-55% 구배를 사용하여 정제하여 tert-부틸 4-((E)-N'-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-1-(2H-테트라졸-5-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-N,N-디메틸카르밤이미도일)피페라진-1-카르복실레이트 (NL-10)를 TFA 염, 
로서 수득하였다.
MS m/z 882.6 (M+1). 체류 시간 1.174분.
단계 6
DCM (1 mL) 중 tert-부틸 4-((E)-N'-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-1-(2H-테트라졸-5-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-N,N-디메틸카르밤이미도일)피페라진-1-카르복실레이트 (NL-10) (46.6 mg, 0.053 mmol)를 실온에서 TFA (1 mL)로 2시간 동안 처리하고, 농축시켰다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 10-45% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((Z)-((디메틸아미노)(피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-1-(1H-테트라졸-5-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드 (NL-11)를 TFA 염, 
로서 수득하였다.
MS m/z 782.5 (M+1). 체류 시간 0.869분.
단계 7
DMF (1 mL) 중 EMCA (1.9 mg, 0.0092 mmol)에 DIEA (4.9 mg, 0.038 mmol) 및 HATU (3.5 mg, 0.0092 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 5분 동안 교반하고, (S)-2-((Z)-((디메틸아미노)(피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-1-(1H-테트라졸-5-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드 (NL-11) (5.0 mg, 0.0044 mmol)에 첨가하였다. LCMS에 의한 판단 시, 반응은 10분 내에 완결되었다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 30-50% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((E)-((디메틸아미노)(4-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일)피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-1-(2H-테트라졸-5-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드 (NL-12)를 수득하였다.
MS m/z 975.6 (M+1). 체류 시간 1.074분.
실시예 48
(2R)-2-아세트아미도-3-((1-(6-(4-((E)-N'-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-카르복시-2-페닐에틸)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-N,N-디메틸카르밤이미도일)피페라진-1-일)-6-옥소헥실)-2,5-디옥소피롤리딘-3-일)티오)프로판산 (NL-13)의 합성
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((디메틸아미노)(4-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일)피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-4) (3.6 mg, 0.0034 mmol)을 물 중 50% 아세토니트릴 (3 mL) 중에 용해시키고, pH7.5 인산염 완충액 중 L-아세틸 시스테인 (1.1 mg, 0.0067 mmol)을 첨가하였다. LCMS 분석은 생성물이 정량적으로 형성되었음을 나타내었다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 20-70% 구배를 사용하여 정제하여 (2R)-2-아세트아미도-3-((1-(6-(4-((E)-N'-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-카르복시-2-페닐에틸)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-N,N-디메틸카르밤이미도일)피페라진-1-일)-6-옥소헥실)-2,5-디옥소피롤리딘-3-일)티오)프로판산 (NL-13)을 수득하였다.
MS m/z 1114.6 (M+1). 체류 시간 0.973분.
실시예 49
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((디메틸아미노)(4-(4-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)부타노일)피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-15)의 합성
단계 1
DMF (1 mL) 중 4-아지도부탄산 (1.9 mg, 0.015 mmol)에 DIEA (0.0076 ml, 0.044 mmol) 및 HATU (5.5 mg, 0.015 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하고, DMF (1 mL) 중 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((디메틸아미노)(피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 TFA 염 (NL-3)(12.7 mg, 0.015 mmol) 및 DIEA (0.010 ml)의 용액에 첨가하였다. LCMS는 반응이 10분 내에 완결되었음을 나타내었다. 조 물질을 C18 칼럼을 사용하여 이스코에 의해 0.05% TFA를 함유하는 물 중 15-85% 아세토니트릴의 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((4-(4-아지도부타노일)피페라진-1-일)(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-14)을 TFA 염, 
로서 수득하였다.
MS m/z 869.5 (M+1). 체류 시간 1.076분.
단계 2
물 및 t-BuOH의 1:2 혼합물 중 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((4-(4-아지도부타노일)피페라진-1-일)(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-14) TFA 염 (11.6 mg, 0.012 mmol) 및 1-(프로프-2-인-1-일)-1H-피롤-2,5-디온 (2.0 mg, 0.015 mmol)의 용액을 Ar로 탈기하였다. 소듐 L-아스코르베이트 (5.9 mg, 0.030 mmol) 및 CuSO4 (0.5 mg, 0.003 mmol)의 탈기된 수용액을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 용매를 증발에 의해 제거하였다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 20-45% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((디메틸아미노)(4-(4-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)부타노일)피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-15)을 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 1004.5 (M+1). 체류 시간 1.031분.
실시예 50
(2R)-2-아세트아미도-3-((1-((1-(4-(4-((Z)-N'-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-카르복시-2-페닐에틸)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-N,N-디메틸카르밤이미도일)피페라진-1-일)-4-옥소부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸)-2,5-디옥소피롤리딘-3-일)티오)프로판산 (NL-16)의 합성
아세토니트릴 중 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((디메틸아미노)(4-(4-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)부타노일)피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 TFA 염 (NL-15) (2.0 mg, 0.0018 mmol)에 pH 7.5 인산염 완충액 중 아세틸 시스테인 (0.3 mg, 0.002 mmol)을 첨가하였다. 반응이 완결된 후, 목적 생성물을 정제용 HPLC에 의해 20-50% 구배를 사용하여 정제하여 (2R)-2-아세트아미도-3-((1-((1-(4-(4-((Z)-N'-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-카르복시-2-페닐에틸)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-N,N-디메틸카르밤이미도일)피페라진-1-일)-4-옥소부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸)-2,5-디옥소피롤리딘-3-일)티오)프로판산 (NL-16)을 수득하였다.
MS m/z 1167.5 (M+1). 체류 시간 0.986분.
실시예 51
((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((디메틸아미노)(4-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일)피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)포스폰산 (NL-19)의 합성
단계 1
((R)-1-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-2-페닐에틸)포스핀산 (문헌 [J Organometallic Chem 646 (2002) 212 and J Chem Soc Perkin Trans I: Organic and Bio-Organic Chemistry (1984), (12), 2845]에 기재된 반응식에 따라 합성함) (100 mg, 0.313 mmol)을 피리딘 (5 ml) 및 n-BuOH (35 mg, 0.46 mmol) 중에 용해시키고, 이어서 피발로일 클로라이드 (70 mg, 0.58 mmol)를 첨가하였다. LCMS에 의한 판단 시 모든 포스핀산이 소모될 때까지 3회 더 동등 부분의 n-BuOH 및 피발로일 클로라이드를 첨가하였다. 2 mL 피리딘-H2O (10% 물) 중 아이오딘 (160 mg, 0.630 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 20분 동안 교반하였다. LCMS는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 피리딘을 증발에 의해 제거하였다. 수성 티오황산나트륨을 첨가하고, 반응 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. EtOAc 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 C18 칼럼을 사용하여 이스코에 의해 0.5% TFA를 함유하는 물 중 아세토니트릴의 10%-60% 구배를 사용하여 정제하여 벤질 ((1R)-1-(부톡시(히드록시)포스포릴)-2-페닐에틸)카르바메이트를 백색 고체, 
로서 수득하였다.
MS m/z 392.1 (M+1). 체류 시간 1.179분.
1H NMR (400 MHz, CD3CN) d 7.42 - 7.18 (m, 8H), 7.18 - 7.00 (m, 2H), 6.10 (s, 1H), 5.07 - 4.59 (m, 2H), 4.20-4.35 (m, 1H), 4.13 - 3.93 (m, 2H), 3.15-3.30 (m, 1H), 2.85-2.75 (s, 1H), 1.71 - 1.47 (m, 2H), 1.47 - 1.23 (m, 2H), 0.89 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
단계 2
MeOH (5 mL) 중 벤질 ((1R)-1-(부톡시(히드록시)포스포릴)-2-페닐에틸)카르바메이트 (84.7 mg, 0.216 mmol)의 용액에 10% Pd/C (26 mg)를 첨가하였다. 반응물을 H2 분위기 하에 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 촉매를 셀라이트를 통한 여과에 의해 제거하고, 여과물을 농축시켜 부틸 수소 ((R)-1-아미노-2-페닐에틸)포스포네이트, 
를 수득하였다.
MS m/z 258.1 (M+1). 체류 시간 0.789분. 이 물질을 단계 3에 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 3
15 mL 둥근 바닥 플라스크에서, Boc-Val-Dip-Dap-OH (80 mg, 0.140 mmol), DIEA (62.9 mg, 0.487 mmol) 및 DMF (2 mL)에 이어서 HATU (53 mg, 0.139 mmol)를 합하였다. 반응물을 5분 동안 교반하고, 단계 2에서 수득한 생성물 (41.9 mg, 0.163 mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 40-60% 구배를 사용하여 정제하여 tert-부틸 ((2S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((2S)-2-((1R,2R)-3-((1-(부톡시(히드록시)포스포릴)-2-페닐에틸)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바메이트, 
를 수득하였다.
MS m/z 811.4 (M+1). 체류 시간 1.376분.
단계 4
TFA (1 mL)를 DCM (3 mL) 중 단계 3에서 수득한 생성물 (106 mg, 0.131 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 농축시켜 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)포스폰산 TFA 염, 
를 수득하였다.
MS m/z 655.3 (M+1). 체류 시간 0.957분.
단계 5
DMF (1 ml) 중 단계 4에서 수득한 생성물 (22.6 mg, 0.029 mmol)에 이소우로늄 1 (30.7 mg, 0.059 mmol) 및 DIEA (19.0 mg, 0.15 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 40℃에서 2시간 동안 가열하고, 반응 혼합물을 정제용 HPLC에 의해 25-42% 구배를 사용하여 정제하여 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((4-(tert-부톡시카르보닐)피페라진-1-일)(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)포스폰산 (NL-17)을 TFA 염, 
로서 수득하였다.
MS m/z 894.5 (M+1). 체류 시간 1.067분.
단계 6
((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((4-(tert-부톡시카르보닐)피페라진-1-일)(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)포스폰산 (NL-17) TFA 염 (9 mg, 0.01 mmol)을 DCM (2 ml) 중에 용해시키고, TFA (1 ml)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 농축시켜 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((디메틸아미노)(피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)포스폰산 (NL-18)을 TFA 염, 
로서 수득하였다.
MS m/z 794.5 (M+1). 체류 시간 0.842분.
단계 7
DMF (1 mL) 중 EMCA (0.7 mg, 0.003 mmol)에 DIEA (0.0017 mL, 0.0099 mmol) 및 HATU (1.4 mg, 0.0036 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 5분 동안 교반하고, DMF (0.5 mL) 중 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((디메틸아미노)(피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)포스폰산 (NL-18) (3 mg, 0.003 mmol)에 첨가하였다. LCMS에 의해 나타내어진 바와 같이, 반응은 5분 내에 완결되었다. 반응 혼합물을 정제용 HPLC에 의해 25-34% 구배를 사용하여 정제하여 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((디메틸아미노)(4-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일)피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)포스폰산 (NL-19)을 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 987.5 (M+1). 체류 시간 1.042분.
실시예 52
((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((디메틸아미노)(4-(4-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)부타노일)피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)포스폰산 (NL-21)의 합성
단계 1
DMF (1 mL) 중 4-아지도부탄산 (0.8 mg, 0.007mmol)에 DIEA (2.6 mg, 0.020 mmol) 및 HATU (2.5 mg, 0.0066mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 5분 동안 교반하고, DMF (0.5 mL) 중 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((디메틸아미노)(피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)포스폰산 (NL-18) TFA 염 (6.0 mg, 0.0066 mmol)에 첨가하였다. LCMS에 의해 나타내어진 바와 같이, 반응은 5분 내에 완결되었다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 25-32% 구배를 사용하여 정제하여 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((4-(4-아지도부타노일)피페라진-1-일)(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)포스폰산 (NL-20)을 TFA 염, 
로서 수득하였다.
MS m/z 905.5 (M+1). 체류 시간 1.048분.
단계 2
물-t-BuOH의 1:2 혼합물 중 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((4-(4-아지도부타노일)피페라진-1-일)(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)포스폰산 (NL-20) TFA 염 (4.0 mg, 0.0039mmol) 및 1-(프로프-2-인-1-일)-1H-피롤-2,5-디온 (1.1 mg, 0.0079mmol)의 용액을 Ar로 탈기하였다. 탈기된 용액에 물 중 황산구리 (0.7 mg, 0.004 mmol) 및 물 중 소듐 L-아스코르베이트 (2.3 mg, 0.012 mmol)의 탈기된 용액을 연속적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하고, 농축시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 20-32% 구배를 사용하여 정제하여 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((디메틸아미노)(4-(4-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)부타노일)피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)포스폰산 (NL-21)을 수득하였다.
MS m/z 1040.5 (M+1). 체류 시간 0.996분.
실시예 53
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,7S)-4-((S)-sec-부틸)-19-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-7-이소프로필-3-메톡시-5,10,13-트리메틸-6,9,14-트리옥소-5,8,10,13-테트라아자노나데칸-1-오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-22)의 합성
DMF (2 mL) 중 EMCA (2.1 mg, 0.0010 mmol)에 DIEA (0.0081 mL, 0.046 mmol) 및 HATU (3.7 mg, 0.0097 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 5분 동안 교반하고, (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((8S,11S,12R)-11-((S)-sec-부틸)-8-이소프로필-12-메톡시-5,10-디메틸-6,9-디옥소-2,5,7,10-테트라아자테트라데칸-14-오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-8) TFA 염 (4.3 mg, 0.0051 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 목적 생성물을 정제용 HPLC에 의해 30-55% 선형 구배를 사용하여 단리하여 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,7S)-4-((S)-sec-부틸)-19-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-7-이소프로필-3-메톡시-5,10,13-트리메틸-6,9,14-트리옥소-5,8,10,13-테트라아자노나데칸-1-오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-22)을 수득하였다.
MS m/z 926.4 (M+1). 체류 시간 1.141분.
실시예 54
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(4-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일)피페라진-1-카르복스아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-26)의 합성
단계 1
DIEA (0.012 ml, 0.067 mmol) 및 4-니트로페닐 카르보노클로리데이트 (4.5 mg, 0.022 mmol)를 DMF:THF의 혼합물 (1:1, 2 mL) 중 (S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 HCl 염 (15 mg, 0.022 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS는 4-니트로페녹시카르바메이트의 형성이 완결되었음을 나타내었다. MS m/z 798.4 (M+1). 체류 시간 1.409분. 반응물에 tert-부틸 피페라진-1-카르복실레이트 (6.3 mg, 0.034 mmol)를 첨가하고, 반응물을 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 HPLC에 의해 30-70% 구배를 사용하여 정제하여 tert-부틸 4-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-3-(((S)-1-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바모일)피페라진-1-카르복실레이트 (NL-23), 
를 수득하였다. MS m/z 845.5 (M+1). 체류 시간 1.367분.
단계 2
TFA (1 ml)를 DCM (2 mL) 중 tert-부틸 4-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-3-(((S)-1-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바모일)피페라진-1-카르복실레이트 (NL-23) (14.9 mg, 0.018 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 농축시켜 (S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-(피페라진-1-카르복스아미도)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (NL-24)를 TFA 염, 
로서 수득하였다.
MS m/z 745.5 (M+1). 체류 시간 1.006분.
단계 3
LiOH (15 mg, 0.63 mmol)를 MeOH:H2O (1:1, 2 mL) 중 (S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-(피페라진-1-카르복스아미도)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (NL-24) TFA 염 (15.5 mg, 0.018 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 혼합물을 정제용 HPLC에 의해 20-45% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-(피페라진-1-카르복스아미도)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-25)을 TFA 염, 
로서 수득하였다.
MS m/z 731.4 (M+1). 체류 시간 0.918분.
단계 4
HATU (6.8 mg, 0.018 mmol)를 DMF (1 mL) 중 EMCA (3.8 mg, 0.018 mmol) 및 DIEA (0.0094 ml, 0.054 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 5분 동안 교반하고, (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-(피페라진-1-카르복스아미도)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-25) TFA 염 (16 mg, 0.019 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 정제용 HPLC에 의해 20-60% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(4-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일)피페라진-1-카르복스아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-26)을 수득하였다.
MS m/z 924.6 (M+1). 체류 시간 1.152분.
실시예 55
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,7S)-4-((S)-sec-부틸)-20-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-7,10-디이소프로필-3-메톡시-5-메틸-6,9,15-트리옥소-5,8,10,14-테트라아자이코산-1-오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-30)의 합성
단계 1
DIEA (23 mg, 0.18 mmol) 및 4-니트로페닐 카르보노클로라이드 (9.0 mg, 0.045 mmol)를 DMF:THF (1:1, 2 mL) 중 (S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 HCl 염 (30 mg, 0.045 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS는 4-니트로페녹시카르바메이트의 형성이 완결되었음을 나타내었다. MS m/z 798.4 (M+1). 체류 시간 1.409분. 반응물에 tert-부틸 (3-(이소프로필아미노)프로필)카르바메이트 (9.7 mg, 0.045 mmol)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 70시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 HPLC에 의해 20-80% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((12S,15S,16R)-15-((S)-sec-부틸)-9,12-디이소프로필-16-메톡시-2,2,14-트리메틸-4,10,13-트리옥소-3-옥사-5,9,11,14-테트라아자옥타데칸-18-오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (NL-27), 
를 수득하였다. MS m/z 875.6 (M+1). 체류 시간 1.371분.
단계 2
TFA (1 mL)를 DCM (2 mL) 중 (S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((12S,15S,16R)-15-((S)-sec-부틸)-9,12-디이소프로필-16-메톡시-2,2,14-트리메틸-4,10,13-트리옥소-3-옥사-5,9,11,14-테트라아자옥타데칸-18-오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (NL-27) (19.1 mg, 0.022 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 농축시켜 (S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3-(3-아미노프로필)-3-이소프로필우레이도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (NL-28)를 TFA 염, 
로서 수득하였다.
MS m/z 775.6 (M+1). 체류 시간 1.064분.
단계 3
LiOH (20 mg, 0.84 mmol)를 MeOH:H2O (3:2, 2 mL) 중 (S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3-(3-아미노프로필)-3-이소프로필우레이도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (NL-28)TFA 염 (19.0 mg, 0.022 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 정제용 HPLC에 의해 20-80% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3-(3-아미노프로필)-3-이소프로필우레이도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-29)을 TFA 염, 
로서 수득하였다.
MS m/z 761.5 (M+1). 체류 시간 0.993분.
단계 4
DMF (1 mL) 중 EMCA (3.1 mg, 0.015 mmol)에 DIEA (0.0070 ml, 0.040 mmol) 및 HATU (5.6 mg, 0.015 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하고, (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3-(3-아미노프로필)-3-이소프로필우레이도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-29) (12 mg, 0.013 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 정제용 HPLC에 의해 20-45% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,7S)-4-((S)-sec-부틸)-20-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-7,10-디이소프로필-3-메톡시-5-메틸-6,9,15-트리옥소-5,8,10,14-테트라아자이코산-1-오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-30)을 수득하였다.
MS m/z 954.5 (M+1). 체류 시간 1.144분.
실시예 56
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)에틸)카르바모일)-4-메틸피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-34)의 합성
단계 1
옥살릴 클로라이드 (0.055 ml, 0.624 mmol) 및 DMF (0.0024 mL, 0.031 mmol)를 DCM (6.0 mL) 중 2-클로로-4-메틸피리미딘-5-카르복실산 (59.2 mg, 0.343 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 DCM (6.0 ml) 중에 용해시켰다. DCM (3 mL) 중 tert-부틸 (2-아미노에틸)카르바메이트 (50 mg, 0.312 mmol)를 첨가하고, 이어서 트리에틸아민 (0.13 mL, 0.936 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응의 완결을 나타내었다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 20-70% 구배를 사용하여 정제하여 tert-부틸 (2-(2-클로로-4-메틸피리미딘-5-카르복스아미도)에틸)카르바메이트를 수득하였다.
MS m/z 315.1 (M+1). 체류 시간 0.951분.
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.65 (s, 1H), 3.46-3.43 (m, 2H), 3.31-3.26 (m, 2H), 2.61 (s, 3H), 1.43 (s, 9H).
단계 2
2-프로판올 (2 mL) 중 Val-Dil-Dap-Phe-OMe (실시예 1의 단계 2) (24 mg, 0.038 mmol), tert-부틸 (2-(2-클로로-4-메틸피리미딘-5-카르복스아미도)에틸)카르바메이트 (23.9 mg, 0.076 mmol) 및 DIEA (0.066 ml, 0.38 mmol)를 밀봉된 바이알에서 120℃에서 4시간 동안 가열하였다. LCMS는 반응의 완결을 나타내었다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 20-70% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)에틸)카르바모일)-4-메틸피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (NL-31), 
를 수득하였다.
MS m/z 911.6 (M+1). 체류 시간 1.295분.
단계 3
(S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)에틸)카르바모일)-4-메틸피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (NL-31) (11.8 mg, 0.013 mmol)를 메탄올성 HCl (3 M, 2 mL) 중에 용해시켰다. 용매를 천천히 증발시켰다. LCMS 분석은 Boc 기의 완전한 제거를 나타내었다. 잔류물을 아세토니트릴 및 물에 녹이고, 동결건조시켜 (S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-아미노에틸)카르바모일)-4-메틸피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (NL-32), 
를 수득하였다.
MS m/z 811.5 (M+1). 체류 시간 1.009분.
단계 4
(S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-아미노에틸)카르바모일)-4-메틸피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (NL-32) (11mg, 0.013mmol)를 THF (0.8 mL), MeOH (0.1 mL) 및 H2O (0.1 mL)의 혼합물에 용해시켰다. LiOH (5.5mg, 0.13mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. LCMS 분석은 반응의 완결을 나타내었다. 염산 (0.1N)을 사용하여 반응 혼합물의 pH를 7로 조정하고, 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 아세토니트릴 및 물로부터 동결건조시켜 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-아미노에틸)카르바모일)-4-메틸피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-33), 
을 수득하였다.
MS m/z 797.6 (M+1). 체류 시간 0.942분.
단계 5
DIEA (10 mg, 0.078 mmol) 및 HATU (12.3 mg, 0.032 mmol)를 DMF (2 mL) 중 EMCA (8.2 mg, 0.039 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 10분 동안 교반한 후, (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-아미노에틸)카르바모일)-4-메틸피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-33) (10.3 mg, 0.013 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응의 완결을 나타내었다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 20-70% ACN-H2O 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)에틸)카르바모일)-4-메틸피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-34)을 수득하였다.
MS m/z 990.5 (M+1). 체류 시간 1.115분.
실시예 57
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((4-((2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)에틸)카르바모일)-6-메틸피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-38)의 합성
단계 1
(S)-메틸-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((4-((2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)에틸)카르바모일)-6-메틸피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (NL-35), 
를 (S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)에틸)카르바모일)-4-메틸피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (NL-31)에 대해 기재된 방법을 사용하여 제조하였다.
MS m/z 911.5 (M+1). 체류 시간 1.405분.
단계 2
(S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((4-((2-아미노에틸)카르바모일)-6-메틸피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (NL-36), 
를 (S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-아미노에틸)카르바모일)-4-메틸피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트 (NL-32)에 대해 기재된 방법을 사용하여 제조하였다.
MS m/z 811.5 (M+1). 체류 시간 1.131분.
단계 3
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((4-((2-아미노에틸)카르바모일)-6-메틸피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-37), 
를 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-아미노에틸)카르바모일)-4-메틸피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-33)에 대해 기재된 방법을 사용하여 제조하였다.
MS m/z 797.5 (M+1). 체류 시간 1.038분.
단계 4
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((4-((2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)에틸)카르바모일)-6-메틸피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-38)을 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)에틸)카르바모일)-4-메틸피리미딘-2-일)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (NL-34)에 대해 기재된 방법을 사용하여 제조하였다.
MS m/z 990.5 (M+1). 체류 시간 1.183분.
실시예 58
2-(((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((디메틸아미노)(4-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일)피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(히드록시)포스포릴)아세트산 (NL-42)의 합성
단계 1
DMF (2 mL) 중 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(2-메톡시-2-옥소에틸)포스핀산 TFA 염, 
(17 mg, 0.021 mmol)에 이소우로늄 1 (50 mg, 0.096 mmol) 및 DIEA (0.021 mL, 0.120 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 45℃에서 18시간 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 20-50% 구배를 사용하여 정제하여 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((4-(tert-부톡시카르보닐)피페라진-1-일)(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(2-메톡시-2-옥소에틸)포스핀산 (NL-39)을 TFA 염, 
로서 수득하였다.
MS m/z 950.4 (M+1). 체류 시간 1.252분.
단계 2
DCM (2.0 mL) 중 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((4-(tert-부톡시카르보닐)피페라진-1-일)(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(2-메톡시-2-옥소에틸)포스핀산 (NL-39) TFA 염 (7.6 mg, 0.0071 mmol)을 TFA (1.0 mL)로 처리하였다. 반응물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시켜 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((디메틸아미노)(피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(2-메톡시-2-옥소에틸)포스핀산 (NL-40)을 TFA 염, 
로서 수득하였다.
MS m/z 850.5 (M+1). 체류 시간 0.941분.
단계 3
MeOH:H2O (2:1, 3 mL) 중 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((디메틸아미노)(피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(2-메톡시-2-옥소에틸)포스핀산 (NL-40) TFA 염 (6.9 mg, 0.0071 mmol)에 LiOH (3.4 mg, 0.14 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 18시간 동안 교반하여 에스테르의 완전한 가수분해를 발생시켰다. 농축시킨 후, 잔류물을 0.01 ml HOAc로 처리하고, 정제용 HPLC에 의해 20-45% 구배를 사용하여 정제하여 2-(((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((디메틸아미노)(피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(히드록시)포스포릴)아세트산 (NL-41)을 TFA 염, 
로서 수득하였다.
MS m/z 836.4 (M+1). 체류 시간 0.983분.
단계 4
DMF (1 mL) 중 EMCA (1.07 mg, 0.005 mmol)에 DIEA (0.0037ml, 0.021 mmol) 및 HATU (1.9 mg, 0.005 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 5분 동안 교반하고, DIEA (0.001 mL)를 함유하는 DMF (0.5 mL) 중 2-(((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((디메틸아미노)(피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(히드록시)포스포릴)아세트산 TFA 염 (4 mg, 0.004 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 20-50% 구배를 사용하여 정제하여 2-(((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((디메틸아미노)(4-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일)피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(히드록시)포스포릴)아세트산 (NL-42)을 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 1029.5 (M+1). 체류 시간 1.089분.
예 C-말단 연결된 화학식 I의 화합물에 대한 합성 절차
실시예 59
N-(4-((R)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 (CL-1)의 합성
단계 1
DIEA (388 mg, 3.0 mmol) 및 HATU (571 mg, 1.5 mmol)를 DMF (5 mL) 중 tert-부틸 (4-(아미노메틸)페닐)카르바메이트 (111 mg, 0.50 mmol) 및 EMCA (127 mg, 0.60 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (30 mL)로 희석하고, 포화 수성 NaHCO3으로 세척하였다. 수성 층을 EtOAc (2 x 30 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 H2O (5 x 10 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 이스코 (EtOAc/헥산 0-75%)에 의해 정제하였다. 목적 생성물, tert-부틸 (4-((6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)메틸)페닐)카르바메이트 (MS m/z 416.3 (M+1))를 황색 오일로서 수득하였다. 오일을 DCM (2 mL) 중에 용해시키고, TFA (2 mL)로 처리하였다. 실온에서 1시간 후, 반응 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 아세토니트릴 및 H2O 중에 용해시키고, 동결건조시켜 N-(4-아미노벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 TFA 염을 황색 고체로서 수득하였다 (MS m/z 316.2 (M+1)).
단계 2
DIEA (226 mg, 1.75 mmol) 및 HATU(265 mg, 0.698 mmol)를 DMF (2 mL) 중 N-(4-아미노벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 TFA 염 (110 mg, 0.349 mmol) 및 (S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-페닐프로판산 (111 mg, 0.419 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (20 mL)로 희석하고, 포화 수성 NaHCO3으로 세척하였다. 수성 층을 EtOAc (2 x 20 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 H2O (5 x 10 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 이스코 (EtOAc/헥산, 0-75%)에 의해 정제하여 (S)-tert-부틸 (1-((4-((6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)메틸)페닐)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)카르바메이트 (MS m/z 563.3 (M+1))를 수득하였다. 이 생성물을 MeOH 중 3M HCl (3 mL) 중에 용해시키고, 농축시켰다. 잔류물을 아세토니트릴 및 H2O에 녹이고, 동결건조시켜 (S)-N-(4-(2-아미노-3-페닐프로판아미도)벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드를 HCl 염, 
로서 수득하였다.
MS m/z 463.3 (M+1).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.76 (bs, 1H), 7.36-7.20 (m, 9H), 6.70 (s, 2H), 5.84 (s, 1H), 4.47 (bs, 1H), 4.41 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 3.52 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.17 (d, J= 7.2 Hz, 2H), 2.23(t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.64-1.26 (m, 6H), 1.45 (s, 9H).
단계 3
DIEA (60.1 mg, 0.465 mmol) 및 HATU (70.7 mg, 0.186 mmol)를 DMF (2 mL) 중 (S)-N-(4-(2-아미노-3-페닐프로판아미도)벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 HCl 염 (46.3 mg, 0.093 mmol) 및 BocVal-Dil-Dap-OH (53 mg, 0.093 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 tert-부틸 ((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)메틸)페닐)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바메이트를 수득하였다.
MS m/z 1016.6 (M+1). 생성물을 MeOH 중 3M HCl (2 mL) 중에 용해시키고, 농축시켰다. 잔류물을 아세토니트릴 및 H2O에 녹이고, 동결건조시켜 N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드를 HCl 염, 
로서 수득하였다. MS m/z 916.5 (M+1). 체류 시간 1.060분.
단계 4
DIEA (1.7 mg, 0.013 mmol) 및 HATU (3.4 mg, 0.0089 mmol)를 DMF 중 N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 HCl 염 (4.6 mg, 0.0045 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 20-50% 구배를 사용하여 정제하여 N-(4-((R)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 (CL-1)를 수득하였다.
MS m/z 1014.5 (M+1). 체류 시간 1.108분.
실시예 60
N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1,3-디메틸이미다졸리딘-2-일리덴)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 (CL-2)의 합성
DMF (1 mL) 중 N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 HCl 염 (4.5 mg, 0.0044 mmol)에 DIEA (20 mg, 0.16 mmol) 및 2-클로로-1,3-디메틸이미다졸리늄 헥사플루오로포스페이트 (4.6 mg, 0.017 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 조 물질을 역상 HPLC에 의해 33-38% 구배를 사용하여 정제하여 N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1,3-디메틸이미다졸리딘-2-일리덴)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 (CL-2)를 수득하였다.
MS m/z 1012.6 (M+1). 체류 시간 1.122분.
실시예 61
N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((디메틸아미노)(모르폴리노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 (CL-3)의 합성
단계 1
N,N-디메틸카르바모일 클로라이드 (129 mg, 1.20 mmol)를 DCM (5 mL) 중 모르폴린 (87 mg, 0.999 mmol) 및 트리에틸아민 (0.139 ml, 0.999 mmol)의 교반 중인 혼합물에 0℃에서 적가하였다. 첨가가 완결되면, 온도를 실온으로 올리고, 반응물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 10% 수성 NaOH로 염기성화시켰다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM으로 추출하였다. 합한 DCM 층을 물 및 포화 수성 NaCl로 연속적으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 N,N-디메틸모르폴린-4-카르복스아미드를 수득하였다.
MS m/z 159.2 (M+1). 체류 시간 0.474분. 생성물을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 2
DCM (1 mL) 중 옥살릴 클로라이드 (0.079 ml, 0.90 mmol)를 DCM (2 mL) 중 N,N-디메틸모르폴린-4-카르복스아미드 (158 mg, 0.999 mmol)에 실온에서 5분에 걸쳐 적가하였다. 반응물을 환류 하에 3시간 동안 가열하였다. 목적 생성물 N-(클로로(모르폴리노)메틸렌)-N-메틸메탄아미늄 클로라이드가 깨끗하게 형성되었다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 에테르로 세척하였다. 이에 의해 수득된 백색 고체를 DCM 중에 용해시키고, 포화 수성 KPF6을 실온에서 격렬히 교반하면서 첨가하였다. 수용액을 DCM으로 3회 추출하였다. 유기 층을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 생성물 N-(클로로(모르폴리노)메틸렌)-N-메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트를 수득하였다.
MS m/z 177.1 (M+1). 체류 시간 0.244분.
단계 3
N-(클로로(모르폴리노)메틸렌)-N-메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트 (140 mg, 0.433 mmol)를 DCM (20 mL) 중 1-히드록시-벤조트리아졸 (58.5 mg, 0.433 mmol) 및 트리에틸아민 (0.060 mL, 0.43 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 14시간 동안 교반하였다. HOBt의 첨가 시 침전물이 즉시 형성되었다. 백색 고체를 여과에 의해 수집하여 이소우로늄 2, 
를 수득하였다.
MS m/z 276 (M+). 체류 시간 0.375분. 생성물을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 4
DMF (1 mL) 중 N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 HCl 염 (5.0 mg, 0.0049 mmol)에 DIEA (1.9 mg, 0.015 mmol) 및 이소우로늄 2 (4.1 mg, 0.0097 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 33-40% 구배를 사용하여 정제하여 N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((디메틸아미노)(모르폴리노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 (CL-3)를 수득하였다.
MS m/z 1056.6 (M+1). 체류 시간 1.125분.
실시예 62
tert-부틸 4-((E)-N'-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)메틸)페닐)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-N,N-디메틸카르밤이미도일)피페라진-1-카르복실레이트 (CL-4)의 합성
DMF (1 mL) 중 N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 HCl 염 (10 mg, 0.0097 mmol)에 DIEA (10 mg, 0.077 mmol) 및 이소우로늄 1 (20 mg, 0.038 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 60℃에서 30분 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 35-46% 구배를 사용하여 정제하여 tert-부틸 4-((E)-N'-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)메틸)페닐)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-N,N-디메틸카르밤이미도일)피페라진-1-카르복실레이트 (CL-4)를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 1155.6 (M+1). 체류 시간 1.226분.
실시예 63
N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((디메틸아미노)(피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 (CL-5)의 합성
TFA (1 mL)를 DCM (2 mL) 중 tert-부틸 4-((Z)-N'-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)메틸)페닐)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-N,N-디메틸카르밤이미도일)피페라진-1-카르복실레이트 TFA 염 (5.1 mg, 0.004 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 농축시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 25-35% 구배를 사용하여 정제하여 N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((디메틸아미노)(피페라진-1-일)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 (CL-5)를 수득하였다.
MS m/z 1055.6 (M+1). 체류 시간 0.973분.
실시예 64
N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-N-메틸-3-페닐프로판아미도)벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 (CL-6)의 합성
단계 1
DMF (10 mL) 중 EMCA (349 mg, 1.65 mmol)에 DIEA (820 mg, 6.35 mmol) 및 HATU (579 mg, 1.52 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 10분 후, tert-부틸 (4-(아미노메틸)페닐)(메틸)카르바메이트 (300 mg, 1.27 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 추가의 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (30 mL)로 희석하고, 포화 수성 NaHCO3으로 세척하였다. 수성 층을 EtOAc (2 x 30 ml)로 추출하였다. 합한 유기 상을 H2O (5 x 10 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 이스코 (EtOAc/헥산 0-80%)에 의해 정제하여 목적 생성물을 황색 오일로서 수득하였다.
MS m/z 374.2 (M-56.1 (이소부틸렌)+1). 체류 시간 1.156분. 이 생성물을 DCM (3 mL) 중에 용해시키고, TFA (1 mL)로 처리하였다. 실온에서 1시간 후, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 아세토니트릴 및 H2O에 녹이고, 동결건조시켜 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-(4-(메틸아미노)벤질)헥산아미드 TFA 염을 황색 고체로서 수득하였다.
MS m/z 330.2 (M+1). 체류 시간 0.61분.
단계 2
DIEA (356 mg, 2.76 mmol) 및 HATU (288 mg, 0.758 mmol)를 DMF (5 mL) 중 Boc-페닐알라닌 (219 mg, 0.827 mmol)에 첨가하였다. 실온에서 10분 후, 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-(4-(메틸아미노)벤질)헥산아미드 TFA 염 (227 mg, 0.512 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (20 mL)로 희석하고, 포화 수성 NaHCO3으로 세척하였다. 수성 층을 EtOAc (2 x 20 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 H2O (5 x 10 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 이스코 (EtOAc/헥산, 0-75%)에 의해 정제하여 (S)-tert-부틸 (1-((4-((6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)메틸)페닐)(메틸)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)카르바메이트를 수득하였다.
MS m/z 577.3 (M+1). 체류 시간 1.19분.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.00 (s, 1H), 8.24 (t, J = 6.0 Hz, 1h), 7.52 (d, j = 8.4 Hz, 2H), 7.32-7.09 (m, 7H), 7.01 (s, 2H), 4.31 (m, 1H), 4.19 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.38 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.17 (d, J= 7.2 Hz, 2H), 3.00 (m, 1H), 2.85 (m, 1H), 2.10 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.54-1.44 (m, 4H), 1.31 (s, 9H), 1.22-1.15 (m, 4H). 이 생성물을 메탄올성 HCl (3M, 5 mL) 중에 용해시키고, 천천히 농축시켰다. 잔류물을 아세토니트릴 및 H2O에 녹이고, 동결건조시켜 (S)-N-(4-(2-아미노-N-메틸-3-페닐프로판아미도)벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드를 HCl 염으로서 수득하였다.
MS m/z 477.2 (M+1). 체류 시간 0.83분.
단계 3
DMF (4 mL) 중 Boc-Val-Dil-Dap-OH (347mg, 0.607mmol)에 DIEA (261 mg, 2.02 mmol) 및 HATU(282 mg, 0.49 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 15분 동안 교반한 후, (S)-N-(4-(2-아미노-N-메틸-3-페닐프로판아미도)벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 HCl 염 (193 mg, 0.376 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 추가로 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 tert-부틸 ((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)메틸)페닐)(메틸)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바메이트를 수득하였다.
MS m/z 1030.5 (M+1). 체류 시간 1.430분. 이 생성물을 메탄올성 HCl (3M, 3 mL) 중에 용해시키고, 농축시켰다. 잔류물을 아세토니트릴 및 H2O에 녹이고, 동결건조시켜 N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-N-메틸-3-페닐프로판아미도)벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드, 
를 HCl 염으로서 수득하였다 (MS m/z 930.5 (M+1), 체류 시간 1.07분).
단계 4
DIEA (0.019 mL, 0.11 mmol) 및 HATU (12.3 mg, 0.032 mmol)를 DMF (2 mL) 중 N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-N-메틸-3-페닐프로판아미도)벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 HCl 염 (20 mg, 0.021 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 10-90% 구배를 사용하여 정제하여 N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-N-메틸-3-페닐프로판아미도)벤질)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드를 TFA 염 (CL-6)으로서 수득하였다.
MS m/z 1028.6 (M+1). 체류 시간 1.129분.
실시예 65
6-(아미노옥시)-N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질)헥산아미드 (CL-7)의 합성
단계 1
DMF (10 mL) 중 Boc-페닐알라닌 (964 mg, 3.63 mmol)에 실온에서 DIEA (1.27 g, 9.84 mmol) 및 HATU (1.13 g, 3.03 mmol)를 첨가하였다. 10분 후, 벤질 4-아미노벤질카르바메이트 (388 mg, 1.51 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (60 mL)로 희석하고, 포화 수성 NaHCO3으로 세척하였다. 수성 층을 EtOAc (2 x 30 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 H2O (5 x 10mL)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 DCM (5.0 mL) 중에 용해시키고, 실온에서 TFA (5.0 mL)로 1시간 동안 처리하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 이스코에 의해 DCM 중 2M 암모니아를 함유하는 0-8% MeOH를 사용하여 정제하여 (S)-벤질 4-(2-아미노-3-페닐프로판아미도)벤질카르바메이트를 백색 고체로서 수득하였다.
MS m/z 404.2(M+1).
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.44-7.23 (m, 14H), 5.10 (s, 2H), 4.26 (s, 2H), 4.12 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 3.28-3.22 (m, 1H), 3.15-3.10 (m, 1H).
단계 2
DIEA (323 mg, 2.50 mmol) 및 HATU (342 mg, 0.90 mmol)를 DMF (6 mL) 중 (S)-벤질 4-(2-아미노-3-페닐프로판아미도)벤질카르바메이트 (202 mg, 0.50 mmol) 및 (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산 (429 mg, 0.75 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 정제용 HPLC에 의해 정제하여 tert-부틸 ((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((((벤질옥시)카르보닐)아미노)메틸)페닐)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바메이트를 수득하였다.
MS m/z 957.5 (M+1). 체류 시간 1.54분. 이 생성물 (393 mg, 0.41 mmol)을 메탄올성 HCl (3 M, 15 mL) 중에 용해시켰다. 용매를 천천히 증발시켰다. LCMS 분석은 Boc 기의 완전한 제거를 나타내었다. 잔류물을 아세토니트릴 및 물 중에 용해시키고, 동결건조시켜 벤질 4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질카르바메이트, 
를 HCl 염으로서 수득하였다. MS m/z 857.5 (M+1). 체류 시간 1.16분.
단계 3
DIEA (0.031 mL, 0.18 mmol) 및 HATU (20.0 mg, 0.053 mmol)를 DMF (2 mL) 중 벤질 4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질카르바메이트 HCl 염 (30 mg, 0.034 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응의 완결을 나타내었다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 10-90% 구배를 사용하여 정제하여 벤질 4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질카르바메이트, 
를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 955.6 (M+1). 체류 시간 1.232분.
단계 4
벤질 4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질카르바메이트 TFA 염 (16 mg, 0.015 mmol)을 MeOH (1ml) 중에 용해시켰다. Pd/C (10%, 습윤, 7.1mg)를 첨가하였다. 반응물을 H2 하에 1시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응의 완결을 나타내었다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축시켜 (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-(아미노메틸)페닐)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미드, 
를 수득하였다.
MS m/z 821.5 (M+1). 체류 시간 0.907분.
단계 5
리튬 6-(((1-에톡시에틸리덴)아미노)옥시)헥사노에이트 (13.2 mg, 0.059 mmol)를 DMF (2 mL) 중에 현탁시키고, HATU (18.75, 0.049mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. DIEA (0.021 mL, 0.12mmol)를 첨가하고, 이어서 (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-(아미노메틸)페닐)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미드 (16.2 mg, 0.020 mmol)를 첨가하였다. LCMS가 반응의 완결을 나타낼 때까지 반응물을 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 10-90% 구배를 사용하여 정제하여 에틸 N-(6-((4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질)아미노)-6-옥소헥실)옥시아세트이미데이트, 
를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 1020.6 (M+1). 체류 시간 1.243분.
단계 6
MeOH (1.5 mL) 중 에틸 N-(6-((4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질)아미노)-6-옥소헥실)옥시아세트이미데이트 (11.4 mg, 0.0101 mmol)를 염산 (1 M, 0.061 ml)으로 30분 동안 실온에서 처리하였다. LCMS는 반응의 완결을 나타내었다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 33-45% 구배를 사용하여 정제하여 6-(아미노옥시)-N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질)헥산아미드 (CL-7)를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 950.6 (M+1). 체류 시간 0.967분.
실시예 66
(S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((3-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥실)우레이도)메틸)페닐)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드 (CL-8)의 합성
단계 1
(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-(아미노메틸)페닐)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미드 (6.4 mg)를 DMF(0.5 mL) 및 THF(0.5 mL) 중에 용해시켰다. DIEA (0.0068 mL 0.039 mmol) 및 4-니트로페닐 카르보노클로리데이트 (3.14 mg, 0.016 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응의 완결을 나타내었다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 10-90% 구배를 사용하여 정제하여 4-니트로페닐 4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질카르바메이트, 
를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 986.5 (M+1). 체류 시간 1.206분.
단계 2
DMF(0.5 mL) 및 THF(0.5 mL) 중 4-니트로페닐 4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)벤질카르바메이트 TFA 염 (2.4 mg, 0.0024 mmol)에 DIEA (0.0085 mL, 0.049 mmol) 및 1-(6-아미노헥실)-1H-피롤-2,5-디온 (2.9 mg, 0.015 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응의 완결을 나타내었다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 10-90% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((3-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥실)우레이도)메틸)페닐)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드 (CL-8)를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 1043.6 (M+1). 체류 시간 1.161분.
실시예 67
(S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-9)의 합성
(S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-아지도프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (FP-3) TFA 염 (87.4 mg, 0.089 mmol) 및 1-(프로프-2-인-1-일)-1H-피롤-2,5-디온 (24.2 mg, 0.0179 mmol)을 각각 3.0 mL의 t-BuOH 및 물 중에 현탁시켰다. 반응 용기를 N2에 의한 5회의 진공-충전 주기에 의해 N2로 충전시켰다. H2O (2.4 ml) 중 소듐 L-아스코르베이트 (17.7mg, 0.089mmol) 및 H2O (0.6 ml) 중 CuSO4 (2.86 mg, 0.018 mmol)의 탈기된 용액을 연속적으로 첨가하고, 반응물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응의 완결을 나타내었다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 20-45% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-9)을 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 998.5 (M+1). 체류 시간 1.014분.
실시예 68
(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-7-벤질-21-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4-메틸-5,8,19-트리옥소-2,12,15-트리옥사-6,9,18-트리아자헤니코산-3-일)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미드 (CL-10)의 합성
단계 1
DMF (10 mL) 중 (S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-페닐프로판산 (482 mg, 1.82 mmol)에 DIEA (705 mg, 5.46 mmol) 및 HATU (622 mg, 1.64 mmol)를 첨가하였다. 10분 후, (9H-플루오렌-9-일)메틸 (2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)카르바메이트 (370 mg, 0.91 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 10-90% 구배를 사용하여 정제하여 tert-부틸 (S)-(1-(9H-플루오렌-9-일)-3,14-디옥소-16-페닐-2,7,10-트리옥사-4,13-디아자헥사데칸-15-일)카르바메이트를 수득하였다.
MS m/z 618.3 (M+1). 체류 시간 1.395분. 이 생성물을 메탄올성 HCl (3 M, 5 ml) 중에 용해시키고 천천히 농축시켰다. LCMS 분석은 Boc 기의 완전한 제거를 나타내었다. 잔류물을 아세토니트릴 및 H2O에 녹이고, 동결건조시켜 (S)-(9H-플루오렌-9-일)메틸 (2-(2-(2-(2-아미노-3-페닐프로판아미도)에톡시)에톡시)에틸)카르바메이트를 HCl 염으로서 수득하였다.
MS m/z 518.2 (M+1). 체류 시간 1.041분.
단계 2
DMF (6 mL) 중 Boc-Val-Dil-Dap-OH (189 mg, 0.33 mmol)에 DIEA (0.144 mL, 0.83 mmol) 및 HATU (113 mg, 0.297 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 15분 후, (S)-(9H-플루오렌-9-일)메틸 (2-(2-(2-(2-아미노-3-페닐프로판아미도)에톡시)에톡시)에틸)카르바메이트 HCl 염 (91.5 mg, 0.165 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 추가로 2시간 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 10-90% 구배를 사용하여 정제하여 tert-부틸 ((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((15S,18R,19R)-15-벤질-1-(9H-플루오렌-9-일)-18-메틸-3,14,17-트리옥소-2,7,10,20-테트라옥사-4,13,16-트리아자헤니코산-19-일)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바메이트를 수득하였다.
MS m/z 1071.6 (M+1). 체류 시간 1.577분. 이 생성물 (93 mg, 0.087 mmol)을 메탄올성 HCl (3 M, 3 ml) 중에 용해시키고, 천천히 농축시켰다. LCMS 분석은 Boc 기의 완전한 제거를 나타내었다. 잔류물을 아세토니트릴 및 물에 녹이고, 동결건조시켜 (9H-플루오렌-9-일)메틸 ((3R,4R,7S)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-7-벤질-4-메틸-5,8-디옥소-2,12,15-트리옥사-6,9-디아자헵타데칸-17-일)카르바메이트, 
를 HCl 염으로서 수득하였다.
MS m/z 971.6 (M+1). 체류 시간 1.195분.
단계 3
DMF (2 mL) 중 (9H-플루오렌-9-일)메틸 ((3R,4R,7S)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-7-벤질-4-메틸-5,8-디옥소-2,12,15-트리옥사-6,9-디아자헵타데칸-17-일)카르바메이트 HCl 염 (30 mg, 0.030 mmol)에 DIEA (0.027 mL0.15 mmol) 및 HATU (23.5 mg, 0.062 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 10-90% 구배를 사용하여 정제하여 (9H-플루오렌-9-일)메틸 ((3R,4R,7S)-7-벤질-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-4-메틸-5,8-디옥소-2,12,15-트리옥사-6,9-디아자헵타데칸-17-일)카르바메이트를 수득하였다.
MS m/z 1069.6 (M+1). 체류 시간 1.255분. DMF (2 mL) 중 피페리딘 (0.2 mL)에 의해 실온에서 30분 동안 처리하여 생성물 (13.6 mg, 0.011 mmol)로부터 Fmoc 기를 제거하였다. 휘발성 물질을 증발에 의해 제거하여 (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-17-아미노-7-벤질-4-메틸-5,8-디옥소-2,12,15-트리옥사-6,9-디아자헵타데칸-3-일)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미드, 
를 수득하였다.
MS m/z 847.6 (M+1). 체류 시간 0.924분. 이 물질을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 4
DMF (2 mL) 중 3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로판산 (5.83 mg, 0.034 mmol)에 DIEA (0.012 mL, 0.069 mmol) 및 HATU (10.9 mg, 0.029 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 15분 후, 단계 3에서 수득한 조 생성물 (9.74 mg)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 10-90% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-7-벤질-21-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4-메틸-5,8,19-트리옥소-2,12,15-트리옥사-6,9,18-트리아자헤니코산-3-일)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미드 (CL-10)를 수득하였다.
MS m/z 998.6 (M+1). 체류 시간 1.007분.
실시예 69
(S)-2-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)프로필 (2-(2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에톡시)에틸)카르바메이트 (CL-11)의 합성
단계 1-2: (S)-2-아미노-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(((S)-1-히드록시프로판-2-일)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드, 
, HCl 염을, (9H-플루오렌-9-일)메틸 (2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)카르바메이트 대신 (S)-2-아미노프로판-1-올을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 68의 단계 1 및 2에 따라 수득하였다.
MS m/z 676.5 (M+1). 체류 시간 0.899분.
단계 3
DIEA (0.026 mL, 0.15 mmol) 및 HBTU (14.6 mg, 0.038 mmol)를 DMF (2 mL) 중 (S)-2-아미노-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(((S)-1-히드록시프로판-2-일)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드 HCl 염 (20 mg, 0.028 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응의 완결을 나타내었다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 10-90% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(((S)-1-히드록시프로판-2-일)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드, 
를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 774.6 (M+1). 체류 시간 0.984분.
단계 4
DCM (2.0 mL) 중 1-(2-(2-아미노에톡시)에틸)-1H-피롤-2,5-디온 (I-2) (12.5 mg, 0.057 mmol) 및 무수 피리딘 (0.0092 mL, 0.11 mmol)의 교반 용액에 포스겐 (톨루엔 중 15% 용액, 0.276 mL, 0.364 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하고, 환류 하에 40분 동안 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, DCM (1.0 mL) 중 (S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(((S)-1-히드록시프로판-2-일)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드 TFA 염 (8.8 mg, 0.0099 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 환류 하에 1시간 동안 가열하였다. 조 생성물을 정제용 HPLC에 의해 10-90% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)프로필 (2-(2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에톡시)에틸)카르바메이트 (CL-11)를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 984.6 (M+1). 체류 시간 1.065분.
실시예 70
(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-7-벤질-14-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4-메틸-5,8-디옥소-2,12-디옥사-6,9-디아자테트라데칸-3-일)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미드 (CL-12)의 합성
단계 1-2: (S)-2-아미노-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-7-벤질-14-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4-메틸-5,8-디옥소-2,12-디옥사-6,9-디아자테트라데칸-3-일)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드, 
, HCl 염을, (9H-플루오렌-9-일)메틸 (2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)카르바메이트 대신 1-(2-(2-아미노에톡시)에틸)-1H-피롤-2,5-디온 (I-2)을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 68의 단계 1 및 2에 따라 수득하였다.
MS m/z 785.4 (M+1). 체류 시간 0.975분.
단계 3
DIEA (0.019 ml, 0.11 mmol) 및 HATU (17.4 mg, 0.046 mmol)를 DMF (2 mL) 중 (S)-2-아미노-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-7-벤질-14-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4-메틸-5,8-디옥소-2,12-디옥사-6,9-디아자테트라데칸-3-일)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드 HCl 염 (15 mg, 0.018 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응의 완결을 나타내었다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 10-90% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-7-벤질-14-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4-메틸-5,8-디옥소-2,12-디옥사-6,9-디아자테트라데칸-3-일)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미드 (CL-12)를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 883.5 (M+1). 체류 시간 1.061분.
실시예 71
(S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄의 (R)-Ac-Cys-OH 부가물 (CL-13)의 합성
(S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-9) TFA 염 (5 mg, 0.005 mmol)을 (R)-Ac-Cys-OH 1.3mg을 함유하는 인산염 완충액 (pH 7.5, 1 mL) 중에 용해시켰다. 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 10-90% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄의 (R)-Ac-Cys-OH 부가물 (CL-13)을 TFA 염으로서 수득였다.
MS m/z 1161.5 (M+1). 체류 시간 0.976분.
실시예 72
((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(2-((3-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)프로필)아미노)-2-옥소에틸)포스핀산 (CL-15)의 합성
단계 1
((R)-1-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-2-페닐에틸)포스핀산 (문헌 [J Organometallic Chem 646 (2002) 212 and J Chem Soc Perkin Trans I: Organic and Bio-Organic Chemistry (1984), (12), 2845]에 기재된 반응식에 따라 합성함) (300 mg, 0.940 mmol) 및 헥사메틸디실라잔 (1.516 g, 9.40 mmol)을 밀봉된 바이알에서 합하고, 115℃에서 2시간 동안 가열하였다. 온도를 95℃로 낮추고, 메틸 브로모아세테이트 (719 mg, 4.70 mmol)를 적가하여 현탁액을 수득하였다. 반응 혼합물을 95℃에서 1시간 동안 교반하고, 농축시켰다. 잔류물을 C18 칼럼을 사용하여 이스코에 의해 정제하고 (15.5g), 목적 생성물을 10-45% 아세토니트릴-0.05%TFA를 함유하는 H2O로 용리시켜 (2-메톡시-2-옥소에틸)((R)-2-페닐-1-(2-페닐아세트아미도)에틸)포스핀산을 수득하였다.
MS m/z 392.1 (M+1). 체류 시간 1.010분.
단계 2
MeOH (10 mL) 중 (2-메톡시-2-옥소에틸)((R)-2-페닐-1-(2-페닐아세트아미도)에틸)포스핀산 (0.178 g, 0.454 mmol)에 10% Pd/C (0.048 g, 0.045 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 H2 분위기 하에 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 촉매를 셀라이트를 통한 여과에 의해 제거하고, 여과물을 증발시켜 ((R)-1-아미노-2-페닐에틸)(2-메톡시-2-옥소에틸)포스핀산을 수득하였다.
MS m/z 258.1 (M+1). 체류 시간 0.565분. 이 물질을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 3
DMF (5 mL) 중 Boc-Dap-OH (스몰 몰레큘스 인크.) (118 mg, 0.412 mmol)에 DIEA (160 mg, 1.236 mmol) 및 HATU (157 mg, 0.412 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하고, DMF 중 ((R)-1-아미노-2-페닐에틸)(2-메톡시-2-옥소에틸)포스핀산 (106 mg, 0.412 mmol)에 첨가하였다. 반응이 완결된 후, 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 20-34% 구배를 사용하여 정제하여 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-(tert-부톡시카르보닐)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(2-메톡시-2-옥소에틸)포스핀산을 수득하였다.
MS m/z 527.2 (M+1). 체류 시간 1.144분. 농축 동안 Boc 기가 생성물로부터 부분적으로 손실되었다.
단계 4
TFA (0.676 mL, 8.77 mmol)를 DCM (10 mL) 중 단계 3에서 수득한 생성물 (155 mg, 0.294 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하고, 농축시켜 ((R)-1-((2R,3R)-3-메톡시-2-메틸-3-((S)-피롤리딘-2-일)프로판아미도)-2-페닐에틸)(2-메톡시-2-옥소에틸)포스핀산, 
를 수득하였다.
MS m/z 427.2 (M+1). 체류 시간 0.774분.
단계 5
DMF (5 mL) 중 Cbz-Val-Dil-OH (I-7) (108 mg, 0.247 mmol)에 DIEA (0.131 mL, 0.752 mmol) 및 HATU (94 mg, 0.25 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 5분 동안 교반하고, DMF (2 mL) 중 단계 4에서 수득한 아민 (133.5 mg, 0.247 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 35-44% 구배를 사용하여 정제하여 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(2-메톡시-2-옥소에틸)포스핀산, 
를 수득하였다.
MS m/z 845.4 (M+1). 체류 시간 1.322분.
단계 6
Pd/C (10%, 17.9 mg)를 MeOH (5 mL) 중 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(2-메톡시-2-옥소에틸)포스핀산 (143 mg, 0.169 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 H2 하에 1시간 동안 교반하였다. LCMS는 Cbz 기의 완전한 제거를 나타내었다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하여 Pd/C를 제거하고, 농축시켰다. 잔류물을 C18 칼럼 (15.5g)을 사용하여 이스코에 의해 정제하고, 목적 생성물을 0.05% TFA를 함유하는 물 중 10-50% 아세토니트릴로 용리시켜 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(2-메톡시-2-옥소에틸)포스핀산, 
를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 711.4 (M+1). 체류 시간 1.009분.
단계 7
DMF (1 mL) 중 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-아미노-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(2-메톡시-2-옥소에틸)포스핀산 TFA 염 (35 mg, 0.042 mmol)에 DIEA (16 mg, 0.12 mmol) 및 HATU (16 mg, 0.042 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 4시간 동안 교반하고, 목적 생성물을 정제용 HPLC에 의해 20-45% 구배를 사용하여 단리시켜 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(2-메톡시-2-옥소에틸)포스핀산, 
를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 809.5 (M+1). 체류 시간 1.044분.
단계 8
LiOH (20 mg, 0.84 mmol)를 MeOH-H2O (2:1, 3 mL) 중 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(2-메톡시-2-옥소에틸)포스핀산 TFA 염 (27 mg, 0.029 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하고, 농축시켰다. 잔류물을 아세토니트릴-H2O 중에 용해시키고, AcOH (0.060 mL)로 처리하였다. 생성된 용액을 이스코 상의 C18 칼럼에 적용하고, 목적 생성물을 5-50% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O로 용리시켜 2-(((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(히드록시)포스포릴)아세트산, 
를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 795.4 (M+1). 체류 시간 1.010분.
단계 9
DIEA (2.1 mg, 0.017 mmol) 및 HATU (2.1 mg, 0.0055mmol)를 DMF (1 mL) 중 2-(((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(히드록시)포스포릴)아세트산 TFA 염 (5.0 mg, 0.0055 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하고, DMF (0.2 mL) 중 tert-부틸 (3-아미노프로필)카르바메이트 (1.0 mg, 0.0055mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 유지시키고, 정제용 HPLC에 의해 20-55% 구배를 사용하여 정제하여 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(2-((3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)아미노)-2-옥소에틸)포스핀산, 
를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 951.0 (M+1). 체류 시간 1.074분.
단계 10
TFA (1 mL)를 DCM (1 mL) 중 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(2-((3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)아미노)-2-옥소에틸)포스핀산 TFA 염 (3.5 mg, 0.0033 mmol)에 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 농축시켜 (2-((3-아미노프로필)아미노)-2-옥소에틸)((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)포스핀산 (CL-14), 
를 TFA 염으로서 수득하였다. MS m/z 851.1 (M+1). 체류 시간 0.971분.
단계 11
DMF (1 mL) 중 EMCA (1.0 mg, 0.0049 mmol)에 DIEA (0.0029 mL, 0.016 mmol) 및 HATU (1.9 mg, 0.0049 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 정치시키고, (2-((3-아미노프로필)아미노)-2-옥소에틸)((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)포스핀산 (CL-14) TFA 염 (4.2 mg, 0.0039 mmol)에 첨가하였다. 반응이 완결된 후, 조 생성물을 정제용 HPLC에 의해 20-50% 구배를 사용하여 정제하여 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(2-((3-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)프로필)아미노)-2-옥소에틸)포스핀산 (CL-15)을 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 1044.0 (M+1). 체류 시간 1.094분.
실시예 73
((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(2-((3-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필)아미노)-2-옥소에틸)포스핀산 (CL-17)의 합성
단계 1
DIEA (2.1 mg, 0.017 mmol) 및 HATU (2.1 mg, 0.0055 mmol)를 DMF (1 mL) 중 2-(((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(히드록시)포스포릴)아세트산 TFA 염 (5.0 mg, 0.0055 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하고, DMF (0.2 mL) 중 3-아지도프로판-1-아민 (0.6 mg, 0.006 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 유지시키고, 정제용 HPLC에 의해 20-55% 구배를 사용하여 정제하여 (2-((3-아지도프로필)아미노)-2-옥소에틸)((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)포스핀산 (CL-16), 
를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 877.0 (M+1). 체류 시간 1.141분.
단계 2
물-t-BuOH의 1:2 혼합물 중 (2-((3-아지도프로필)아미노)-2-옥소에틸)((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)포스핀산 (CL-16) TFA 염 (2.8 mg, 0.0028 mmol) 및 1-(프로프-2-인-1-일)-1H-피롤-2,5-디온 (0.8 mg, 0.006 mmol)의 용액을 Ar로 탈기하였다. 탈기된 용액에 소듐 L-아스코르베이트 (1.7 mg, 0.0085 mmol) 및 황산구리 (0.7 mg, 0.005 mmol)의 탈기된 수용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 농축시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 20-45% 구배를 사용하여 정제하여 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(2-((3-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필)아미노)-2-옥소에틸)포스핀산 (CL-17)을 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 1012.0 (M+1). 체류 시간 1.059분.
실시예 74
((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(2-((2-(2-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에틸)아미노)-2-옥소에틸)포스핀산 (CL-19)의 합성
단계 1
DIEA (2.1 mg, 0.017 mmol)에 이어서 HATU (2.1 mg, 0.0055mmol)를 DMF (1 mL) 중 2-(((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(히드록시)포스포릴)아세트산 TFA 염 (5.0 mg, 0.0055 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하고, DMF (0.2 mL) 중 2-(2-아지도에톡시)에탄아민 (0.7 mg, 0.006 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 유지시키고, 정제용 HPLC에 의해 20-55% 구배를 사용하여 정제하여 (2-((2-(2-아지도에톡시)에틸)아미노)-2-옥소에틸)((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)포스핀산 (CL-18), 
를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 907.0 (M+1). 체류 시간 1.121분.
단계 2
물-t-BuOH의 1:2 혼합물 중 2-((2-(2-아지도에톡시)에틸)아미노)-2-옥소에틸)((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)포스핀산 (CL-18) TFA 염 (4.6 mg, 0.0045 mmol) 및 1-(프로프-2-인-1-일)-1H-피롤-2,5-디온 (1.2 mg, 0.0090 mmol)의 용액을 Ar로 탈기하였다. 탈기된 용액에 소듐 L-아스코르베이트 (2.7 mg, 0.014 mmol) 및 황산구리 (0.7 mg, 0.005 mmol)의 탈기된 수용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 농축시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 20-45% 구배를 사용하여 정제하여 ((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-2-페닐에틸)(2-((2-(2-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에틸)아미노)-2-옥소에틸)포스핀산 (CL-19)을 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 1042.0 (M+1). 체류 시간 1.057분.
실시예 75
(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-7-벤질-20-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-4-메틸-5,8-디옥소-2,12,15,18-테트라옥사-6,9-디아자이코산-3-일)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미드 (CL-21)의 합성
단계 1-3: (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-20-아지도-7-벤질-4-메틸-5,8-디옥소-2,12,15,18-테트라옥사-6,9-디아자이코산-3-일)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미드 (CL-20), 
를, 1-(2-(2-아미노에톡시)에틸)-1H-피롤-2,5-디온 (I-2) 대신 2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에탄아민을 사용하는 것을 제외하고, (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-7-벤질-14-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4-메틸-5,8-디옥소-2,12-디옥사-6,9-디아자테트라데칸-3-일)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미드 (CL-12)에 대해 실시예 70에 기재된 방법에 의해 제조하였다.
MS m/z 917.7 (M+1). 체류 시간 1.099분.
단계 4
(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-20-아지도-7-벤질-4-메틸-5,8-디옥소-2,12,15,18-테트라옥사-6,9-디아자이코산-3-일)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미드 (CL-20) (8.9 mg, 0.0097 mmol) 및 1-(프로프-2-인-1-일)-1H-피롤-2,5-디온 (2.6 mg, 0.019 mmol)을 t-BuOH (1.0 ml) 및 물 (1.0 ml) 중에 현탁시켰다. 혼합물을 N2에 의한 5회의 진공-충전 주기에 의해 탈기하였다. H2O (0.4 mL) 중 소듐 L-아스코르베이트 (1.9 mg, 0.0097 mmol) 및 H2O (0.4 mL) 중 CuSO4 (0.31 mg, 0.0019 mmol)의 탈기된 용액을 첨가하고, 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 20-70% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-7-벤질-20-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-4-메틸-5,8-디옥소-2,12,15,18-테트라옥사-6,9-디아자이코산-3-일)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미드 (CL-21)를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 1052.3 (M+1). 체류 시간 0.998분.
실시예 76
(S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-(아미노옥시메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-22)의 합성
단계 1
DMF (8.3 mL) 중 에틸 N-히드록시아세트이미데이트 (520 mg, 5.04 mmol)에 3-브로모프로프-1-인 (500 mg, 4.2 mmol)에 이어서 NaOH (185 mg, 4.62 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응의 완결을 나타내었다. 반응 혼합물을 얼음을 함유하는 포화 수성 NH4Cl (30ml)에 부었다. 얼음이 용융될 때까지 혼합물을 교반하였다. 혼합물을 EtOAc (3X)로 추출하였다. 합한 유기 상을 물 및 염수로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 에틸 N-프로프-2-인-1-일옥시아세트이미데이트를 황색 오일로서 수득하였다.
MS m/z 142.1 (M+1). 체류 시간 1.177분.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.52 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 4.06 (m, 2H), 2.42 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 1.96 (s, 3H), 1.30-1.24 (m, 3H). 이 물질을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 2
(S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (FP-3) (24 mg, 0.025 mmol) 및 에틸 N-프로프-2-인-1-일옥시아세트이미데이트 (6.9 mg, 0.049 mmol)를 t-BuOH (0.5 mL) 및 물 (1.0 mL) 중에 현탁시켰다. 반응 혼합물을 N2에 의한 5회의 진공-충전 주기에 의해 탈기하였다. H2O (0.25ml) 중 소듐 L-아스코르베이트 (4.9mg, 0.025mmol) 및 H2O (0,25ml) 중 CuSO4 (0.8 mg, 0.005mmol)의 탈기된 용액을 첨가하고, 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응의 완결을 나타내었다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 20-70% 구배를 사용하여 정제하여 목적 옥심 생성물, 
를 수득하였다.
MS m/z 1004.0 (M+1). 체류 시간 1.226분.
단계 3
MeOH (3.0 mL) 중 단계 2로부터의 생성물 (17.5 mg, 0.017 mmol)에 염산 (1M, 0.095 mL)을 첨가하였다. 실온에서 30분 후, LCMS는 반응의 완결을 나타내었다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 20-70% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-(아미노옥시메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-22)을 수득하였다.
MS m/z 934.3 (M+1). 체류 시간 0.882분.
실시예 77
(S)-2-((4-메틸피리미딘-2-일)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-24)의 합성
단계 1
2-프로판올 (2 mL) 중 (S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-아지도프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-2-아미노-3-메틸-1-옥소부탄 (7 mg, 0.009 mmol), 2-클로로-4-메틸피리미딘 (5.6 mg, 0.044 mmol) 및 DIEA (0.031 mL, 0.18 mmol)를 밀봉된 바이알에서 150℃에서 밤새 가열하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 20-70% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((4-메틸피리미딘-2-일)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-아지도프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-23), 
를 수득하였다.
MS m/z 857.4 (M+1). 체류 시간 1.241분.
단계 2
(S)-2-((4-메틸피리미딘-2-일)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-아지도프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-23) (2.8 mg, 0.0029 mmol) 및 1-(프로프-2-인-1-일)-1H-피롤-2,5-디온 (1.2 mg, 0.0087 mmol)을 각각 0.5 mL의 t-BuOH 및 물 중에 현탁시켰다. 혼합물을 N2에 의한 5회의 진공-충전 주기에 의해 탈기하였다. 물 (0.4 mL) 중 소듐 L-아스코르베이트 (0.7 mg, 0.004 mmol) 및 물 (0.1 mL) 중 CuSO4 (0.1mg, 0.0007mmol)의 탈기된 용액을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응의 완결을 나타내었다. 조 물질을 역상 HPLC에 의해 20-70% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((4-메틸피리미딘-2-일)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-24)을 수득하였다.
MS m/z 992.5 (M+1). 체류 시간 1.077분.
실시예 78
(S)-2-(3,3-디이소프로필우레이도)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-26)의 합성
단계 1
THF:DMF (1:1, 1 mL) 중 (S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-아지도프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-2-아미노-3-메틸-1-옥소부탄 HCl 염 (7.5 mg, 0.0095 mmol)에 4-니트로페닐클로로포르메이트 (3.2 mg, 0.016 mmol) 및 DIEA (6.0 mg, 0.047 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 10분 후, LCMS는 목적 카르바메이트, 
의 형성을 나타내었다. THF를 증발에 의해 제거하였다. 디이소프로필아민 (5.7 mg, 0.056 mmol)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 40-80% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-아지도프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-(3,3-디이소프로필우레이도)-N,3-디메틸부탄아미드 (CL-25), 
를 수득하였다.
MS m/z 892.5 (M+1). 체류 시간 1.493분.
단계 2
물-tBuOH의 1:2 혼합물 (3 mL) 중 (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-아지도프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-(3,3-디이소프로필우레이도)-N,3-디메틸부탄아미드 (CL-25) (6.2 mg, 0.007 mmol) 및 1-(프로프-2-인-1-일)-1H-피롤-2,5-디온 (1.7 mg, 0.013 mmol)의 용액을 Ar로 탈기하였다. 탈기된 용액에 황산구리 (2.0 mg, 0.013 mmol) 및 아스코르브산나트륨 (4.1 mg, 0.021 mmol)의 탈기된 수용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 농축시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 40-73% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-(3,3-디이소프로필우레이도)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-26)을 수득하였다.
MS m/z 1027.5 (M+1). 체류 시간 1.336분.
실시예 79
N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)모르폴린-4-카르복스아미드 (CL-28)의 합성
단계 1
THF:DMF (1:1, 1 mL) 중 (S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-아지도프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-2-아미노-3-메틸-1-옥소부탄 HCl 염 (7.5 mg, 0.0095 mmol)에 4-니트로페닐클로로포르메이트 (3.2 mg, 0.016 mmol) 및 DIEA (6.0 mg, 0.047 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 10분 후, LCMS는 목적 카르바메이트가 형성되었음을 나타내었다. THF를 증발시켰다. 모르폴린 (4.9 mg, 0.056 mmol)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 30-70% 구배를 사용하여 정제하여 N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-아지도프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)모르폴린-4-카르복스아미드 (CL-27), 
를 수득하였다.
MS m/z 878.4 (M+1). 체류 시간 1.310분.
단계 2
물-tBuOH의 1:2 혼합물 (3 mL) 중 N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-아지도프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)모르폴린-4-카르복스아미드 (CL-27) (6.3 mg, 0.007 mmol) 및 1-(프로프-2-인-1-일)-1H-피롤-2,5-디온 (1.7 mg, 0.013 mmol)의 용액을 Ar로 탈기하였다. 탈기된 용액에 황산구리 (1.9 mg, 0.013 mmol) 및 아스코르브산나트륨 (1.9 mg, 0.0095 mmol)의 탈기된 수용액을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 정제용 HPLC에 의해 30-60% 구배를 사용하여 정제하여 N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)모르폴린-4-카르복스아미드 (CL-28)를 수득하였다.
MS m/z 1013.4(M+1). 체류 시간 1.122분.
실시예 80
(S)-2-((1,3-디메틸이미다졸리딘-2-일리덴)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-30)의 합성
단계 1
DCM (2 mL) 중 HOBt (27.8 mg, 0.206 mmol)를 DCM (2 mL) 중 2-클로로-1,3-디메틸-4,5-디히드로-1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트 (57.4 mg, 0.206 mmol) 및 트리에틸아민 (0.029 mL, 0.21 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하여 2-((1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-일)옥시)-1,3-디메틸-4,5-디히드로-1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트, 
를 백색 고체로서 수집하였다.
MS m/z 232.1(M+). 체류 시간 0.324분. 이 물질을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 2
DMF (2 mL) 중 (S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-아지도프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-2-아미노-3-메틸-1-옥소부탄 히드로클로라이드 (30.6 mg, 0.038 mmol)에 DIEA (0.033 mL, 0.191 mmol) 및 2-((1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-일)옥시)-1,3-디메틸-4,5-디히드로-1H-이미다졸-3-윰 헥사플루오로포스페이트 (28.8 mg, 0.076 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응의 완결을 나타내었다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 20-70% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((1,3-디메틸이미다졸리딘-2-일리덴)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-아지도프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-29), 
를 수득하였다.
MS m/z 861.3 (M+1). 체류 시간 1.090분.
단계 3
(S)-2-((1,3-디메틸이미다졸리딘-2-일리덴)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-30)을, (S)-2-((1,3-디메틸이미다졸리딘-2-일리덴)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-아지도프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-29)을 사용하는 것을 제외하고, (S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-9)에 대해 기재된 방법에 의해 제조하였다.
MS m/z 996.4 (M+1). 체류 시간 1.118분.
실시예 81
(S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-카르복시부토일)아미노프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄의 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르 (CL-32)의 합성
단계 1
Pd/C (10%, 습윤, 6.5mg)를 물/에탄올 (2 mL/2 mL) 중 (S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-아지도프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (FP-3) TFA 염 (30 mg, 0.031 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 H2 하에 3시간 동안 교반하였다. 촉매를 여과에 의해 제거하였다. 여과물을 농축시켜 (S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-아미노프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-31), 
를 수득하였다.
MS m/z 837.5 (M+1). 체류 시간 0.993분.
단계 2
(S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-아미노프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-31) (12 mg, 0.014 mmol) 및 DIEA (0.0125 mL, 0.0715 mmol)를 DMF (1 mL) 중에 용해시켰다. 생성된 용액을 DMF (1 mL) 중 비스(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 글루타레이트 (7.0 mg, 0.022 mmol) 및 DIEA (0.0125 mL, 0.0715 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응의 완결을 나타내었다. 조 물질을 정제용 HPLC에 의해 20-70% 구배를 사용하여 정제하여 (S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(5-((2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시)-5-옥소펜탄아미도)프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-32)을 수득하였다.
MS m/z 1048.5 (M+1). 체류 시간 1.285분.
실시예 82
(S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-((1R,8S,9s)-비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메틸옥시카르보닐)아미노프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-33)의 합성
DMF (1 mL) 중 (S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-아미노프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-32) (15 mg, 14 μmol) 및 DIEA (12 μl)의 용액을 DMF (1 ml) 중 (1R,8S,9s)-비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메틸 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 카르보네이트 (4.1 mg, 14 μmol) 및 DIEA (12 μl)에 첨가하였다. 반응물을 알루미늄 호일로 덮고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 정제용 HPLC (20-70% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 화합물 (CL-33)을 수득하였다.
MS m/z 1013.5(M+1). 체류 시간 1.203분.
실시예 83
(1R,8S,9s)-비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메틸 (3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)프로필)카르바메이트 (CL-34)의 합성
단계 1
DMF (2 ml) 중 Boc-L-Phe-OH (65 mg, 0.25 mmol)에 DIEA (142 μl, 1.02 mmol) 및 HATU (85 mg, 0.225 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 15분 동안 교반한 다음, DMF (1 ml) 중 벤질 (3-아미노프로필)카르바메이트 (50 mg, 0.20 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 정제용 HPLC (20-70% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 (S)-벤질 (3-(2-(tert-부톡시카르보닐)아미노-3-페닐프로판아미도)프로필)카르바메이트를 수득하였다.
MS m/z 456.3(M+1). 체류 시간 1.225분. 이와 같이 수득한 생성물 (81.2mg, 0.18 mmol)을 메탄올성 HCl (3M, 4 ml) 중에 용해시켰다. 용매를 N2 스트림 하에 천천히 제거하여 Boc 기를 제거하였다. 아세토니트릴 물 혼합물로부터 동결건조시켜 (S)-벤질 (3-(2-아미노-3-페닐프로판아미도)프로필) HCl 염을 수득하였다. MS m/z 356.2(M+1). 체류 시간 0.857분.
단계 2
DMF (2 ml) 중 (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산 (i-11) (14 mg)에 DIEA (12.4 mg, 122 μmol) 및 HATU (7.8 mg, 20 μmol)를 첨가하였다. 반응물을 15분 동안 교반한 다음, (S)-벤질 (3-(2-아미노-3-페닐프로판아미도)프로필)카르바메이트 (8 mg, 20 μmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 정제용 HPLC (20-70% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 벤질 (3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판아미도)프로필)카르바메이트, 
를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 907.6 (M+1). 체류 시간 1.149분.
단계 3
MeOH (2 ml) 중 단계 2에서 수득한 생성물 (16.2 mg, 16 μmol)에 Pd/C (3.4 mg, 10% 습윤)를 첨가하였다. 반응 분위기를 H2로 대체하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 여과하고 농축시켜 (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((3-아미노프로필)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미드, 
를 수득하였다.
MS m/z 773.6(M+1). 체류 시간 0.872분.
단계 4
단계 3에서 수득한 생성물 (13.3 mg, 15 μmol)을 DMF (1 ml) 중에 용해시키고, DIEA (13 μl)를 첨가하였다. (1R,8S,9s)-비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메틸 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 카르보네이트, 
(4.4 mg, 15 μmol)를 DMF (1 ml) 중에 용해시키고, DIEA (13 μl)를 첨가하였다. 두 용액을 합하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 정제용 HPLC (20-70% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 화합물 (CL-34)을 수득하였다.
MS m/z 949.6(M+1). 체류 시간 1.190분.
실시예 84
(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((2-(아미노옥시)에틸)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미드 (CL-35)의 합성
단계 1
디이소프로필 아조디카르복실레이트 (1.26 ml, 6.51 mmol)를 테트라히드로푸란 (10 ml) 중 N-(tert-부톡시카르보닐)에탄올아민 (1.0 g, 6.2 mmol), N-히드록시프탈이미드 (1.01 g, 6.2 mmol) 및 트리페닐포스핀 (1.71 g, 6.51 mmol)의 현탁액에 0℃에서 적가하였다. 반응물을 교반하고, 16시간에 걸쳐 실온으로 가온되도록 하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 플래쉬 크로마토그래피 (SiO2, 에틸 아세테이트/헥산, 0%에서 50%)에 의해 정제하여 [2-(1,3-디옥소-1,3-디히드로-이소인돌-2-일옥시)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르를 백색 고체로서 수득하였다.
MS m/z 207.1(M+1-Boc). 체류 시간 1.138분. TFA (2 ml)를 0℃에서 DCM (10 ml) 중 [2-(1,3-디옥소-1,3-디히드로-이소인돌-2-일옥시)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (1g, 대략 60% 순도, 2 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온으로 천천히 가온하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시켜 2-(2-아미노에톡시)이소인돌린-1,3-디온을 TFA 염으로서 수득하였다. MS m/z 207.1(M+1). 체류 시간 0.780분.
단계 2
DMF (5 ml) 중 Boc-L-Phe-OH (519 mg, 1.96 mmol)에 DIEA (1.37 ml, 9.79 mmol) 및 HATU (745 mg, 1.96 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 15분 동안 교반한 다음, DMF (3 ml) 중 2-(2-아미노에톡시)이소인돌린-1,3-디온 (627 mg, 1.96 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 정제용 HPLC (20-70% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 (S)-tert-부틸 (1-((2-((1,3-디옥소이소인돌린-2-일)옥시)에틸)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)카르바메이트를 수득하였다.
MS m/z 454.2(M+1). 체류 시간 1.215분. 이와 같이 수득한 생성물 (0.66 g, 1.5 mmol)을 DCM (6 ml) 중에 용해시키고, TFA (1.5 ml)를 0℃에서 첨가하였다. 반응물을 천천히 실온으로 가온하고, 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시켜 (S)-2-아미노-N-(2-((1,3-디옥소이소인돌린-2-일)옥시)에틸)-3-페닐프로판아미드를 TFA 염으로서 수득하였다. MS m/z 354.2(M+1). 체류 시간 0.698분.
단계 3
DIEA (36 μl, 0.20 mmol) 및 HATU (6.5mg, 0.017 mmol)를 DMF (1 ml) 중 (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산 (i-11) (11.6 mg, 17 μmol)에 첨가하였다. 반응물을 15분 동안 교반한 다음, DMF (1 ml) 중 (S)-2-아미노-N-(2-((1,3-디옥소이소인돌린-2-일)옥시)에틸)-3-페닐프로판아미드 (11.7 mg, 017 μmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 정제용 HPLC (20-70% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 (S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((2-((1,3-디옥소이소인돌린-2-일)옥시)에틸)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드, 
를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 905.5(M+1). 체류 시간 1.110분.
단계 4
HCl (6 M, 6 ml) 중 단계 3에서 수득한 생성물 (86 mg, 84 μmol)을 실온에서 2일 동안 교반하여 반응을 완결시켰다. 정제용 HPLC (20-45% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 화합물 (CL-35)을 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 775.5(M+1). 체류 시간 0.859분.
실시예 85
(S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(아민옥시아세틸)아미노프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-36)의 합성
단계 1
DMF (1.5 ml) 중 (S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-아미노프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-31) (25 mg, 30 μmol) 및 DIEA (26 μl)의 용액을 DMF (1.5 ml) 중 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2-(((tert-부톡시카르보닐)아미노)옥시)아세테이트 (8.6 mg, 30 μmol) 및 DIEA (26 μl)의 용액과 합하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 정제용 HPLC (20-70% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 
, (S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(N-(t-부톡시카르보닐)아민옥시아세틸)아미노프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄을 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 1011.5(M+1). 체류 시간 1.079분.
단계 2
TFA (0.4 ml)를 0℃에서 DCM (2 ml) 중 단계 1에서 수득한 생성물 (15.3 mg, 14 μmol)에 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 30분 동안 교반한 다음, 실온으로 가온하고, 1시간 동안 교반하였다. 정제용 HPLC (20-70% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 화합물 (CL-36)을 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 910.5(M+1). 체류 시간 0.919분.
실시예 86
(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-14-(아미노옥시)-7-벤질-4-메틸-5,8-디옥소-2,12-디옥사-6,9-디아자테트라데칸-3-일)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미드 (CL-37)의 합성
단계 1
EtOAc (25 ml) 중 t-부틸 2-(2-벤질옥시 카르보닐아미노에톡시)에톡시카르바메이트 (1.5 g, 4.2 mmol) 및 10% Pd-C (0.45 g, 0.42 mmol)를 수소 분위기 하에 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 폐촉매를 여과에 의해 제거한 후, 용매를 농축에 의해 제거하여 t-부틸 2-(2-아미노에톡시)에톡시카르바메이트를 수득하였다.
MS m/z 221.2(M+1). 체류 시간 0.451분.
단계 2
DMF (2 ml) 중 Cbz-Phe (299 mg, 1.0 mmol)에 DIEA (0.793 ml, 4.54 mmol) 및 HATU (363 mg, 953 μmol)를 첨가하였다. 실온에서 15분 동안 교반한 후, DMF (2 ml) 중 t-부틸 2-(2-아미노에톡시)에톡시카르바메이트 (200 mg, 0.908 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 정제용 HPLC (20-70% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 (S)-t-부틸 2-(2-(2-벤질옥시 카르보닐아미노-3-페닐프로판아미도)에톡시)에톡시카르바메이트를 수득하였다.
MS m/z 502.3(M+1). 체류 시간 1.206분.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.58 (s, 1H), 7.35-7.18 (m, 10H), 6.74 (s, 1H), 5.58 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.07 (s, 2H), 4.46-4.44 (m, 1H), 3.94-3.92 (m, 2H), 3.59-3.57 (m, 2H), 3.46-3.34 (m, 4H), 3.10-3.08 (m, 2H), 1.46 (s, 9H).
단계 3
Cbz 기를 단계 1에 기재된 방법에 의해 제거하여 (S)-tert-부틸 2-(2-(2-아미노-3-페닐프로판아미도)에톡시)에톡시카르바메이트를 수득하였다.
MS m/z 368.5(M+1). 체류 시간 0.807분.
단계 4
DIEA (19 μl) 및 HATU (8.3 mg, 22 μmol)를 DMF (1 ml) 중 (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판산 (i-11) (15 mg, 22 μmol)에 첨가하였다. 반응물을 15분 동안 교반한 다음, DMF (1ml) 중 (S)-tert-부틸 2-(2-(2-아미노-3-페닐프로판아미도)에톡시)에톡시카르바메이트 (8.1 mg, 22 μmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 정제용 HPLC (20-70% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 tert-부틸 ((3R,4R,7S)-7-벤질-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-4-메틸-5,8-디옥소-2,12-디옥사-6,9-디아자테트라데칸-14-일)옥시카르바메이트, 
를 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 919.6(M+1). 체류 시간 1.139분.
단계 5
TFA (0.4 ml)를 0℃에서 DCM (2 ml) 중 단계 4에서 수득한 생성물 (13.8 mg, 13 μmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반한 다음, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 정제용 HPLC (20-70% 아세토니트릴-0.05% TFA를 함유하는 H2O)에 의해 정제하여 화합물 (CL-37)을 TFA 염으로서 수득하였다.
MS m/z 819.6(M+1). 체류 시간 0.868분.
실시예 87
(3R,4R,7S)-2,5-디옥소피롤리딘-1-일 7-벤질-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-4,9,12-트리메틸-5,8,13-트리옥소-2-옥사-6,9,12-트리아자헵타데칸-17-오에이트 (CL-38)의 합성
화합물 (CL-38) (MS m/z 998.5 (M+1); 체류 시간 1.022분)을, 화합물 (CL-31) 대신 (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((7S,10R,11R)-7-벤질-5,10-디메틸-6,9-디옥소-12-옥사-2,5,8-트리아자트리데칸-11-일)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-N,3-디메틸부탄아미드, 
를 사용하는 것을 제외하고, 실시예 81의 단계 2에 대해 기재된 방법에 의해 제조하였다.
실시예 88
(S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-카르복시부토일)아미노프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄의 2,3,5,6-테트라플루오로페닐 에스테르 (CL-39)의 합성
화합물 (CL-39) (MS m/z 1099.5 (M+1); 체류 시간 1.197분)을, 비스(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 글루타레이트 대신 비스(2,3,5,6-테트라플루오로페닐) 글루타레이트를 사용하는 것을 제외하고, 실시예 81의 단계 2에 기재된 방법에 의해 제조하였다.
실시예 89
(S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(3-(2-카르복시에톡시)프로파노일)아미노프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄의 퍼플루오로페닐 에스테르 (CL-40)의 합성
화합물 (CL-40) (MS m/z 1147.4 (M+1); 체류 시간 1.223분)을, 비스(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 글루타레이트 대신 비스(퍼플루오로페닐) 3,3'-옥시디프로파노에이트를 사용하는 것을 제외하고, 실시예 81의 단계 2에 대해 기재된 방법에 의해 제조하였다.
실시예 90
(S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-카르복시부토일)아미노프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄의 퍼플루오로페닐 에스테르 (CL-41)의 합성
화합물 (CL-41) (MS m/z 1117.5 (M+1); 체류 시간 1.220분)을, 비스(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 글루타레이트 대신 비스(퍼플루오로페닐) 글루타레이트를 사용하는 것을 제외하고, 실시예 81의 단계 2에 대해 기재된 방법에 의해 제조하였다.
조효소 A 유사체에 대한 합성 절차
실시예 91
조효소 A의 3-부텐-2-온 부가물 (CoA-1)
조효소 A 트리리튬 염 (259 mg, 시그마(Sigma), 검정 >93%)을 EDTA를 함유하는 인산염 완충액 (100 mM 포스페이트, 5 mM EDTA, pH7.5) 2.0 mL 중에 용해시켰다. 반응 혼합물에 3-부텐-2-온 (29.0 μL, 알드리치(Aldrich), 99%)을 첨가하고, 반응 혼합물을 20℃에서 75분 동안 정치시켰다. 전체 반응 혼합물을 100% H2O로 사전-평형화된 이스코 C18 Aq 금 15.5 g 칼럼 상에 로딩하였다. 목적 생성물을 100% H2O로 용리시켰다. 순수한 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결건조시켜 화합물 CoA-1을 결정질 고체로서 수득하였다. MS (ESI+) m/z 838.2 (M+1). H-NMR (400MHz, D2O) δ 8.525 (s, 1H), 8.235 (s, 1H), 6.140 (d, 1H, J=7.2Hz), 4.746 (m, 1H), 4.546 (bs, 1H), 4.195 (bs, 1H), 3.979 (s, 1H), 3.786 (dd, 1H, J= 4.8, 9.6Hz), 3.510 (dd, 1H, J=4.8, 9.6Hz), 3.429 (t, 2H, J= 6.6Hz), 3.294S (t, 2H, J=6.6Hz), 2.812 (t, 2H, J=6.8Hz), 2.676 (t, 2H, J=6.8Hz), 2.604 (t, 2H, J=6.8Hz), 2.420 (t, 2H, J=6.6Hz), 2.168 (s, 3H), 0.842 (s, 3H), 0.711 (s, 3H) (주: D2O와 중첩되는 일부 피크는 보고되지 않음).
실시예 92
조효소 A의 (S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 부가물 (CoA-2)
DMSO 100 μL 중 화합물 CL-9 (2.0 mg, 2.0 μmol)의 용액을 물 120 μL 중에 용해시킨 조효소 A 트리리튬 염 (2.4 mg, 3.0 μmol)으로 보충하였다. 반응 혼합물을 75 mM 인산나트륨 완충제 (pH 7.0) 750 μL의 첨가에 의해 완충시켰다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 진탕시킨 후, 생성물을 정제용 역상 C18 HPLC 칼럼 상에서 0.05% TFA를 함유하는 물 중 10-90% 아세토니트릴의 선형 구배를 사용하여 정제하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결건조시켜 화합물 CoA-2를 결정질 고체로서 수득하였다. MS (ESI+) m/z 883.5 ((M+2)/2). 체류 시간 0.89분.
실시예 93
케톤-조효소 A 유사체 CoA-(i-12)
화합물 (i-12) 5 mM을 20 mM MgCl2를 함유하는 50 mM HEPES 완충제 (pH 8.0) 중에서 10 μM 스타필로코쿠스 아우레우스 CoAA, 25 μM 에스케리키아 콜라이 CoAD, 및 20 μM 에스케리키아 콜라이 CoAE의 존재 하에 ATP 25 mM과 37℃에서 약 16시간 동안 반응시켜 화합물 (i-12)을 케톤-관능화 CoA 유사체 CoA-(i-12)로 전환시켰다. 침전물을 원심분리 (20,817 x g, 2분 동안)에 의해 제거하였다. 효소를 반응 혼합물로부터 아미콘 울트라 원심분리 필터를 통해 10 kDa 컷오프로 한외여과하여 분리하였다. CoA-(i-12)를 함유하는 여과물을 추가 정제 없이 사용하였다. 화합물 (i-12)의 CoA 유사체 CoA-(i-12)로의 효소적 전환을 항-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-(i-12)-CL-35 ADC의 형성에 의해 확인하였다 (표 11, 표 12 및 실시예 102 참조).
실시예 94
아지드-조효소 A 유사체 CoA-(i-13)
화합물 (i-13)을, 화합물 (i-12) 대신 화합물 (i-13)을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 93에 기재된 절차를 사용하여 케톤-관능화 CoA 유사체 CoA-(i-13)로 전환시켰다. 화합물 CL-33을 사용한 구리-무함유 클릭 화학을 50% (v/v) DMSO/H2O 중에서 23℃에서 3시간 동안 수행하고, 반응 혼합물을 역상 액퀴티 UPLC HSS T3 칼럼 (100 Å, 2.1 mm x 50 mm, 워터스) 상에서 0.05% TFA를 함유하는 물 중 10에서 100%의 아세토니트릴의 구배 용리를 사용하여 0.9 mL/분의 유량으로 분리하였다. 질량 스펙트럼 분석으로 CoA 유사체 CoA-(i-13)의 구조를 확인하였다.
MS m/z 895.5 ((M+2)/2). 체류 시간 0.88분.
실시예 95
케톤-조효소 A 유사체 CoA-(i-14)
화합물 (i-14)을, 화합물 (i-12) 대신 화합물 (i-14)을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 93에 기재된 절차를 사용하여 케톤-관능화 CoA 유사체 CoA-(i-14)로 전환시켰다. 화합물 (i-14)의 CoA 유사체 CoA-(i-14)로의 효소적 전환은 항-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-(i-14)-CL-35 ADC의 형성에 의해 확인하였다 (표 11, 표 12 및 실시예 102 참조).
실시예 96
케톤-조효소 A 유사체 CoA-(i-15)
화합물 (i-15)을, 화합물 (i-12) 대신 화합물 (i-15)을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 93에 기재된 절차를 사용하여 케톤-관능화 CoA 유사체 CoA-(i-15)로 전환시켰다. 화합물 (i-15)의 CoA 유사체 CoA-(i-15)의 효소적 전환을 항-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-(i-15)-CL-35 ADC의 형성에 의해 확인하였다 (표 11, 표 12 및 실시예 102 참조).
비교용 펩티드에 대한 합성 절차
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-메틸헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (MC-MMAF)의 합성
MMAF-OMe (135 mg, 콘코르티스 바이오시스템즈(Concortis Biosystems))를 CH3CN (10 mL) 중에 용해시켰다. 생성된 투명한 용액에 5 mL 물에 이어서 0.375 mL 1N 수성 NaOH (공인됨, 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))를 첨가하였다. 반응 혼합물을 21℃에서 18시간 동안 자기 교반하였고, 이때 LCMS 분석은 반응이 완결되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 동결건조시켜 MMAF 나트륨 염을 수득하였다. LCMS 체류 시간 0.911분. MS (ESI+) m/z 732.5 (M+1). 이전 반응에서 이와 같이 수득한 전체 MMAF 나트륨 염을 10 mL DMSO 중에 용해시켰다. 개별 반응 용기에서, EMCA (95 mg)를 3.0 mL DMSO 중 HATU (165 mg) 및 DIEA (0.126 mL)로 21℃에서 25분 동안 처리하였다. 활성화된 에스테르의 전체 반응 혼합물을 MMAF 나트륨 염의 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 21℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc 40 mL와 5% 수성 시트르산 20 mL 사이에 분배하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc 20 mL로 추출하였다. 합한 유기 층을 10 mL 포화 수성 NaCl로 세척하고, 무수 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 이스코 콤비플래쉬 기기 상에서 이스코 C18금 15.5g 칼럼을 사용하여 정제하였다. 목적 물질을 H2O 중 50% CH3CN으로 용리시켜 목적 화합물을 백색 고체로서 수득하였다.
LCMS 체류 시간 1.392분. MS (ESI+) m/z 925.6 (M+1).
항원-결합 모이어티
화학식 II 또는 III에서 항원-결합 모이어티 (Ab)는 표적화된 세포 유형에 선택적으로 결합하는 임의의 모이어티일 수 있다. 일부 측면에서, Ab는 암 세포의 표면 상에서 주로 또는 우선적으로 발견되는 항원, 예를 들어 종양-연관 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편 (예를 들어 항체의 항원 결합 단편)이다. 일부 측면에서, Ab는 세포 표면 수용체 단백질 또는 다른 세포 표면 분자, 세포 생존 조절 인자, 세포 증식 조절 인자, 조직 발달 또는 분화와 연관된 (예를 들어, 조직 발달 또는 분화에 기능적으로 기여하는 것으로 공지되거나 의심되는) 분자, 림포카인, 시토카인, 세포 주기 조절에 관여하는 분자, 혈관생성에 관여하는 분자 또는 혈관신생과 연관된 (예를 들어 혈관신생에 기능적으로 기여하는 것으로 공지되거나 의심되는) 분자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, 항원 결합 단편)이다. 종양-연관 항원은 클러스터 분화 인자 (즉, CD 단백질)일 수 있다. 본 발명의 일부 측면에서, 본 발명의 항원 결합 모이어티는 1종의 항원에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 일부 측면에서, 본 발명의 항원 결합 모이어티는 본원에 기재된 2종 이상의 항원에 특이적으로 결합하며, 예를 들어 본 발명의 항원 결합 모이어티는 이중특이적 또는 다중특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.
예시적인 항체 또는 항원 결합 단편은 항-에스트로겐 수용체 항체, 항-프로게스테론 수용체 항체, 항-p53 항체, 항-HER-2 항체, 항-EGFR 항체, 항-카텝신 D 항체, 항-Bcl-2 항체, 항-E-카드헤린 항체, 항-CA125 항체, 항-CA15-3 항체, 항-CA19-9 항체, 항-c-erbB-2 항체, 항-P-당단백질 항체, 항-CEA 항체, 항-망막모세포종 단백질 항체, 항-ras 종양단백질 항체, 항-루이스 X 항체, 항-Ki-67 항체, 항-PCNA 항체, 항-CD3 항체, 항-CD4 항체, 항-CD5 항체, 항-CD7 항체, 항-CD8 항체, 항-CD9/p24 항체, 항-CD1-항체, 항-CD11c 항체, 항-CD13 항체, 항-CD14 항체, 항-CD15 항체, 항-CD19 항체, 항-CD20 항체, 항-CD22 항체, 항-CD23 항체, 항-CD30 항체, 항-CD31 항체, 항-CD33 항체, 항-CD34 항체, 항-CD35 항체, 항-CD38 항체, 항-CD39 항체, 항-CD41 항체, 항-LCA/CD45 항체, 항-CD45RO 항체, 항-CD45RA 항체, 항-CD71 항체, 항-CD95/Fas 항체, 항-CD99 항체, 항-CD100 항체, 항-S-100 항체, 항-CD106 항체, 항-유비퀴틴 항체, 항-c-myc 항체, 항-시토케라틴 항체, 항-람다 경쇄 항체, 항-멜라노솜 항체, 항-전립선 특이적 항원 항체, 항-타우 항원 항체, 항-피브린 항체, 항-케라틴 항체, 및 항-Tn-항원 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 화학식 II 또는 III의 항체-약물 접합체 (ADC)의 항원 결합 모이어티는 ErbB 유전자에 의해 코딩되는 수용체에 특이적으로 결합한다. 항원 결합 모이어티는 EGFR, HER2, HER3 및 HER4로부터 선택된 ErbB 수용체에 특이적으로 결합할 수 있다. 항원 결합 모이어티는 HER2 수용체의 세포외 도메인 (ECD)에 특이적으로 결합하고 HER2 수용체를 과다발현하는 종양 세포의 성장을 억제할 항체일 수 있다. 항체는 모노클로날 항체, 예를 들어 뮤린 모노클로날 항체, 키메라 항체, 또는 인간화 항체일 수 있다. 인간화 항체는 huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 또는 huMAb4D5-8 (트라스투주맙)일 수 있다. 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fab 단편일 수 있다.
화학식 II 또는 III에서의 항원-결합 모이어티는 세포 표면 수용체 및 종양-연관 항원에 대한 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, 항원 결합 단편)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 종양-연관 항원은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 관련 기술분야에 널리 공지된 방법 및 정보를 사용하여 항체를 생성하는데 사용되도록 제조될 수 있다. 암 진단 및 요법에 효과적인 세포 표적을 발견하기 위한 시도에서, 연구원들은 1종 이상의 정상 비-암성 세포(들)와 비교하여 1종 이상의 특정한 유형(들)의 암 세포의 표면에서 특이적으로 발현되는 막횡단 또는 달리 종양-연관 폴리펩티드를 확인하기 위해 모색해 왔다. 종종, 이러한 종양-연관 폴리펩티드는 비-암성 세포의 표면에서와 비교하여 암 세포의 표면에서 더 풍부하게 발현된다. 이러한 종양-연관 세포 표면 항원 폴리펩티드의 확인은, 항체-기반 요법을 통한 파괴를 위해 암 세포를 특이적으로 표적화하는 능력을 발생시킨다.
본 발명의 면역접합체에 유용한 항체 및 항체 단편 (예를 들어, 항원 결합 단편)은 변형된 또는 조작된 항체, 예컨대 천연 서열의 적어도 1개의 아미노산 대신 시스테인 잔기 (Junutula JR, Raab H, Clark S, Bhakta S, Leipold DD, Weir S, Chen Y, Simpson M, Tsai SP, Dennis MS, Lu Y et al.: Nat Biotechnol 2008, 26:925-932), 또는 Pcl, 피롤리신, 및 비-천연 아미노산을 비롯한 다른 반응성 아미노산을 도입하기 위해 변형된 항체를 포함하며, 이는 항체 또는 항원 결합 단편 상에 화학식 I 또는 그의 하위화학식의 화합물에의 접합을 위한 반응성 부위를 제공한다. 예를 들어, 항체 또는 항체 단편은 약물에의 접합을 위한 부위로서 Pcl 또는 피롤리신 (W. Ou et al. (2011) PNAS 108 (26), 10437-10442) 또는 비천연 아미노산 (J.Y. Axup, K.M. Bajjuri, M. Ritland, B.M. Hutchins, C.H. Kim, S.A. Kazane, R. Halder, J.S. Forsyth, A.F. Santidrian, K. Stafin, Y. Lu et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 109 (2012), pp. 16101-16106; 검토를 위해, 문헌 [C.C. Liu and P.G. Schultz (2010) Annu Rev Biochem 79, 413-444; C.H. Kim, J.Y. Axup, P.G. Schultz (2013) Curr Opin Chem Biol. 17, 412-419] 참조)를 혼입시키기 위해 변형될 수 있다. 유사하게, 효소적 접합 방법을 위한 펩티드 태그가 항체 내로 도입될 수 있다 (Strop P. et al. Chem Biol. 2013, 20(2):161-7; Rabuka D., Curr Opin Chem Biol. 2010 Dec;14(6):790-6; Rabuka D,et al., Nat Protoc. 2012, 7(6):1052-67). 하나의 다른 예는 펩티드 태그, 예컨대 S6, A1 및 ybbR 태그에의 조효소 A 유사체의 접합을 위한 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)의 사용이다 (Grunewald J. et al., SITE-SPECIFIC LABELING METHODS AND MOLECULES PRODUCED THEREBY, PCT/US2013/043684). 이러한 변형된 또는 조작된 항체를 페이로드 또는 링커-페이로드 조합물과 접합시키는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이. 콜라이(E. coli)로부터의 돌연변이된 AcpS PPTase, AcpS R26L-C119S의 단백질 서열이 표 3에 열거되어 있다 (서열식별번호: 25). 재조합 효소는 C-말단 His6 태그를 함유한다.
본 발명에서 유용한 항원-결합 모이어티 (예를 들어, 항체 및 항원 결합 단편)는 또한 다른 변형을 가질 수 있거나, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 태그, 알부민, 및 다른 융합 폴리펩티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 모이어티에 접합될 수 있다.
본원의 실시예에서 사용된 항체는 표 3에 열거된 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는다. 이들 항체 중 일부를 조작하여 본 발명의 화합물과 부위-특이적 접합을 위한 시스테인 잔기 또는 PPTase 효소 태그를 함유하도록 하였다. 본원의 실시예는 이들 조작된 항체가 화학식 II 또는 III의 면역접합체에서 사용하기에 적합한 항체임을 예시한다. 또한, 비-조작된 항체가 전통적인 방법 (Carter PJ, Senter PD, Antibody-drug conjugates for cancer therapy, Cancer J. 2008, 14(3):154-69; J.E. Stefano, M. Busch, L. Hou, A. Park, and D.A. Gianolio, p. 145-171, 및 M.-P. Brun and L. Gauzy-Lazo, p. 173-187 in Antibody-Drug Conjugate, Methods in Molecular Biology, Vol. 1045, Editor L. Ducry, Humana Press, 2013)을 통해 화학식 II 또는 III의 면역접합체의 제조를 위해 또한 사용될 수 있다.
<표 3> 예시적인 항체 및 효소의 아미노산 서열
서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2는 각각 야생형 항-Her2 항체 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)의 전장 아미노산 서열이다. 서열식별번호: 3 및 서열식별번호: 4는 항체 20507 및 항-Her2 항체의 각각 HC 및 LC에 대한 불변 영역의 아미노산 서열이다. 서열식별번호: 5는 항-Her2 LC-S159C 및 항체 20507-LC-S159C 돌연변이체 항체의 LC 불변 영역의 아미노산 서열이다. 서열식별번호: 6 및 서열식별번호: 7은 각각 둘 다의 항체의 중쇄 HC-E152C 돌연변이체 항체 20507 및 항-Her2 항체 및 중쇄 HC-S375C 돌연변이체에 대한 불변 영역의 아미노산 서열이다. 서열식별번호: 8은 각각 항체 20507 및 항-Her2 항체의 경쇄 LC-K107C 돌연변이체의 아미노산 서열이다. 서열식별번호: 9는 각각 항체 20507 및 항-Her2 항체의 중쇄 HC-K360C 돌연변이체의 아미노산 서열이다. 서열식별번호: 10은 항체 20507 및 항-Her2의 중쇄 이중 시스테인 돌연변이체 HC-E152C 및 HC-S375C에 대한 불변 영역의 아미노산 서열이다. 서열식별번호: 11은 항-Her2 및 항체 20507 HC-ins388-A1 항체 둘 다에 대한 돌연변이체 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열이며, 여기서 A1 태그는 HC 잔기 Glu388 다음에 삽입된다. 서열식별번호: 14는 항-Her2 항체에 대한 돌연변이체 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열이며, 여기서 ybbR 태그는 HC 잔기 Glu388 다음에 삽입된다. 서열식별번호: 15는 항-Her2 항체에 대한 돌연변이체 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열이며, 여기서 ybbR-S2C 태그 (서열식별번호: 21)는 HC 잔기 Glu388 다음에 삽입된다. 서열식별번호: 16은 항-Her2 항체에 대한 돌연변이체 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열이며, 여기서 A1-3aa 태그 (서열식별번호: 22)는 잔기 S119, T120, K121, G122, 및 P123을 대체한다. 서열식별번호: 17은 항-Her2 항체에 대한 돌연변이체 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열이며, 여기서 S6-5aa 태그 (서열식별번호: 23)는 하기 돌연변이: P189G, S190D, S192L, L193S, G194W, 및 T195L을 통해 도입된다. 서열식별번호: 18은 항-Her2 항체에 대한 돌연변이체 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열이며, 여기서 S6-6aa 태그 (서열식별번호: 24)는 하기 돌연변이: S190D, S192L, L193S, G194W, 및 T195L을 통해 도입된다. 서열식별번호: 19는 항-Her2 항체에 대한 돌연변이체 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열이며, 여기서 단일 시스테인 잔기는 HC 잔기 Glu388 다음에 삽입된다. 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 및 서열식별번호: 24는 각각 A1 태그, ybbR 태그, ybbR-S2C 태그, A1-3aa 태그, S6-5aa 태그, 및 S6-6aa 태그의 아미노산 서열이다. 서열식별번호: 13은 사용된 신호 펩티드이다. 돌연변이체 또는 삽입된 Cys 잔기 및 A1, ybbR, ybbR-S2C, A1-3aa, S6-5aa, 및 S6-6aa의 서열 태그는 볼드체로 제시되고, 상응하는 돌연변이체 쇄의 서열에서 밑줄로 표시된다. CDR 서열은 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2에서 밑줄로 표시된다.
항체 생산
본 발명의 항체 및 항체 단편 (예를 들어, 항원 결합 단편)은, 항체 사량체의 재조합 발현, 화학적 합성, 및 효소적 소화를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 생산될 수 있으며, 전장 모노클로날 항체는, 예를 들어 하이브리도마 또는 재조합 생산에 의해 수득될 수 있다. 재조합 발현은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적절한 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 숙주 세포, 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포 등으로부터 일어날 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 절편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다.
폴리뉴클레오티드 서열은 신생 고체-상 DNA 합성에 의해 또는 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 기존 서열 (예를 들어, 이하에 실시예에서 기재된 바와 같은 서열)의 PCR 돌연변이유발에 의해 생산될 수 있다. 핵산의 직접적인 화학적 합성은 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 문헌 [Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90, 1979]의 포스포트리에스테르 방법; [Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979]의 포스포디에스테르 방법; [Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981]의 디에틸포스포르아미다이트 방법; 및 미국 특허 번호 4,458,066의 고체 지지체 방법에 의해 달성될 수 있다. PCR에 의해 폴리뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입하는 것은, 예를 들어 문헌 [PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; 및 Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
또한 상기 기재된 항체 또는 항체 단편을 생산하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포가 본 발명에서 제공된다. 다양한 발현 벡터를 사용하여 본 발명의 항체 쇄 또는 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있다. 포유동물 숙주 세포에서 항체를 생산하기 위해 바이러스-기반 및 비바이러스 발현 벡터 둘 다가 사용될 수 있다. 비바이러스 벡터 및 시스템은 플라스미드, 에피솜 벡터 (전형적으로, 단백질 또는 RNA 발현을 위한 발현 카세트를 가짐), 및 인간 인공 염색체 (예를 들어, 문헌 [Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997] 참조)를 포함한다. 예를 들어, 포유동물 (예를 들어, 인간) 세포에서의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 발현에 유용한 비바이러스 벡터는 pThioHis A, B & C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C (라이프 테크.(Life Tech.), 캘리포니아주 샌디에고), MPSV 벡터, 및 다른 단백질을 발현시키기 위한 관련 기술분야에 공지된 다수의 다른 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노연관 바이러스, 포진 바이러스를 기반으로 하는 벡터, SV40, 유두종 바이러스, HBP 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스를 기반으로 하는 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스 (SFV)를 포함한다. 문헌 [Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; 및 Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992]을 참조한다.
발현 벡터의 선택은 벡터를 발현시키고자 의도되는 숙주 세포에 의존한다. 전형적으로, 발현 벡터는 프로모터, 및 본 발명의 항체 쇄 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 다른 조절 서열 (예를 들어, 인핸서)을 함유한다. 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 유도 조건 하인 경우를 제외하고 삽입된 서열의 발현을 방지하기 위해 사용된다. 유도성 프로모터는 예를 들어 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터 또는 열 쇼크 프로모터를 포함한다. 형질전환된 유기체의 배양물은, 발현 생성물이 숙주 세포에 의해 보다 우수하게 허용되는 서열을 코딩하는 집단으로 편향되지 않으면서 비유도 조건 하에 확장될 수 있다. 프로모터에 더하여, 다른 조절 요소가 또한 본 발명의 항체 쇄 또는 단편의 효율적인 발현을 위해 필요하거나 요구될 수 있다. 이들 요소는 전형적으로 ATG 개시 코돈 및 인접한 리보솜 결합 부위 또는 다른 서열을 포함한다. 또한, 발현 효율은 사용되는 세포계에 적절한 인핸서를 포함시키는 것에 의해 증진될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; 및 Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987] 참조). 예를 들어, SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서가 포유동물 숙주 세포에서의 발현을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
발현 벡터는 또한 분비 신호 서열 위치를 제공하여 삽입된 항체 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드를 갖는 융합 단백질을 형성할 수 있다. 보다 종종, 삽입된 항체 서열은 벡터에 포함되기 전에 신호 서열에 연결된다. 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 서열을 수용하는데 사용되는 벡터는 때때로 또한 그의 불변 영역 또는 부분을 코딩한다. 이러한 벡터는 불변 영역과의 융합 단백질로서 가변 영역의 발현을 허용함으로써 무손상 항체 또는 그의 단편이 생산되게 한다. 전형적으로, 이러한 불변 영역은 인간의 것이다.
본 발명의 항체 쇄를 보유하고 발현하는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵일 수 있다. 이. 콜라이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 발현시키는데 유용한 1종의 원핵 숙주이다. 사용하기에 적합한 다른 미생물 숙주는 바실루스, 예컨대 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 다른 엔테로박테리아세아에, 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 이들 원핵 숙주에서, 전형적으로 숙주 세포와 상용성인 발현 제어 서열 (예를 들어, 복제 기점)을 함유하는 발현 벡터를 또한 제조할 수 있다. 또한, 임의의 수의 다양한 널리 공지된 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 수 있다. 프로모터는 임의로 오퍼레이터 서열과 함께 전형적으로 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 개시 및 완료하기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 갖는다. 다른 미생물, 예컨대 효모를 또한 사용하여 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 발현시킬 수 있다. 바큘로바이러스 벡터와 조합되어 곤충 세포가 또한 사용될 수 있다.
한 측면에서, 포유동물 숙주 세포를 사용하여 본 발명의 항체 및 항체 단편을 발현시키고 생산한다. 예를 들어, 이들은 내인성 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주 또는 외인성 발현 벡터를 보유하는 포유동물 세포주일 수 있다. 이들은 임의의 정상적인 사멸, 또는 정상적이거나 비정상적인 불멸 동물 또는 인간 세포를 포함한다. 예를 들어, CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포 및 하이브리도마를 비롯한, 무손상 이뮤노글로불린을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 개발되어 있다. 폴리펩티드를 발현시키기 위한 포유동물 조직 세포 배양의 사용은 예를 들어 문헌 [Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987]에서 일반적으로 논의된다. 포유동물 숙주 세포를 위한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기점, 프로모터, 및 인핸서 (예를 들어, 문헌 [Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986] 참조), 및 필수적인 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. 이들 발현 벡터는 통상적으로 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터를 함유한다. 적합한 프로모터는 구성적, 세포 유형-특이적, 단계-특이적 및/또는 조정가능하거나 조절가능한 것일 수 있다. 유용한 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 구성적 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 구성적 MPSV 프로모터, 테트라시클린-유도성 CMV 프로모터 (예컨대, 인간 극초기 CMV 프로모터), 구성적 CMV 프로모터, 및 관련 기술분야에 공지된 프로모터-인핸서 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
관심 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 도입하는 방법은 세포 숙주의 유형에 따라 달라진다. 예를 들어, 염화칼슘 형질감염은 통상적으로 원핵 세포에 이용되며, 인산칼슘 처리 또는 전기천공은 다른 세포 숙주에 사용될 수 있다 (일반적으로 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌] 참조). 다른 방법, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 처리, 리포솜-매개 형질전환, 주사 및 미세주사, 탄도적 방법, 비로솜, 이뮤노리포솜, 다가양이온:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 포진 바이러스 구조 단백질 VP22에 대한 융합 (Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997), DNA의 작용제-증진된 흡수 및 생체외 형질도입을 포함한다. 재조합 단백질의 장기간, 고수율 생산을 위해, 안정한 발현이 종종 요구될 것이다. 예를 들어, 항체 쇄 또는 결합 단편을 안정적으로 발현하는 세포주는 바이러스 복제 기점 또는 내인성 발현 요소 및 선택 마커 유전자를 함유하는 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 제조될 수 있다. 벡터의 도입 후에, 세포는 풍부 배지에서 1-2일 동안 성장되도록 할 수 있고, 이는 그 후 선택 배지로 스위칭된다. 선택 마커의 목적은 선택에 대한 저항성을 부여하는 것이고, 그의 존재는 선택 배지에서 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장을 가능하게 한다. 저항성의, 안정하게 형질감염된 세포는 세포 유형에 적절한 조직 배양 기술을 사용하여 증식될 수 있다.
실시예 97: 접합 연구를 위한 항-Her2 및 항체 20507 Cys 및 A1/ybbR- 태그부착된 돌연변이체 항체의 클로닝
항-Her2 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA 올리고뉴클레오티드 (Carter P, Presta L, Gorman CM, Ridgway JB, Henner D, Wong WL, Rowland AM, Kotts C, Carver ME, Shepard HM. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, Humanization of an anti-p185her2 antibody for human Cancer therapy)를 화학적으로 합성하고, 인간 IgG1 및 인간 카파 경쇄의 불변 영역을 함유하는 2개의 포유동물 발현 벡터, pOG-HC 및 pOG-LC 내로 클로닝하여 2개의 야생형 구축물, pOG-항-Her2 항체 HC 및 pOG-항-Her2 항체 LC를 각각 생성하였다. 이들 벡터에서, 포유동물 세포에서의 항체 중쇄 및 경쇄의 발현은 CMV 프로모터에 의해 구동된다. 벡터는 중쇄 및 경쇄의 N-말단에서 합성 24개의 아미노산 신호 서열, MKTFILLLWVLLLWVIFLLPGATA (서열식별번호: 13)를 코딩하여, 포유동물 세포로부터 그의 분비를 가이드한다. 신호 서열은 293 프리스타일(Freestyle)™ 세포에서 수백개의 포유동물 단백질에서 단백질 분비를 지시하는데 효율적인 것으로 입증된 바 있다 (Gonzalez R, Jennings LL, Knuth M, Orth AP, Klock HE, Ou W, Feuerhelm J, Hull MV, Koesema E, Wang Y, Zhang J, Wu C, Cho CY, Su AI, Batalov S, Chen H, Johnson K, Laffitte B, Nguyen DG, Snyder EY, Schultz PG, Harris JL, Lesley SA. (2010) Proc Natl Acad Sci U S A. 107:3552-7). 올리고뉴클레오티드 지시된 돌연변이유발을 사용하여 항-Her2 항체의 LC-S159C 돌연변이체를 제조하였다. 인간 카파 경쇄의 불변 영역에서 LC-S159C에 상응하는 센스 및 안티-센스 프라이머 (표 4)를 화학적으로 합성하였다. PCR 반응을 주형으로서 pOG-항-Her2 항체 HC 및 pOG-항-Her2 항체 LC를 사용하여 PfuUltra II 퓨전 HS DNA 폴리머라제 (스트라타진(Stratagene))를 사용하여 수행하였다. PCR 생성물을 아가로스 겔 상에서 확인하였고, DPN I로 처리한 후에 DH5a 세포에서 형질전환시켰다 (Klock et al., (2009) Methods Mol Biol. 498:91-103).
야생형 및 Cys 돌연변이체 구축물의 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 야생형 항-Her2 항체 중쇄의 전장 아미노산 서열은 서열식별번호: 1로서 제시되고, 경쇄의 전장 아미노산 서열은 서열식별번호: 2로서 제시된다 (표 3). LC-S159C 돌연변이체 항체의 아미노산 서열은 표 3에 제시되고, C159는 볼드체 및 밑줄로 표시된다 (서열식별번호: 5). 인간 IgG1 중쇄 및 인간 카파 경쇄에서 아미노산 잔기는 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다 (Edelman et al., (1969) Proc Natl Acad Sci U S A, 63:78-85). 항-Her2 LC-S159C 항체를 추가로, 상응하는 항생제를 함유하는 배지에서 안정적으로 형질감염된 세포 클론을 선택하기 위해, 항생제 선택 마커를 함유하는 벡터 내로 클로닝하였다. 추가의 단일 Cys 돌연변이체 (HC-E152C, HC-S375C, LC-K107C) 및 2개의 이중 Cys 돌연변이체 (HC-E152/HC-S375C, HC-K360C/LC-K107C)를 표 4에 열거된 DNA 프라이머 및 상기 절차를 사용하여 클로닝하였다. 추가로, 표준 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여 단일 시스테인 잔기를 CH3 도메인의 루프 영역 내로 삽입하였다. 각각의 올리고뉴클레오티드의 서열이 표 4에 열거되어 있다.
유사하게, 제2 항체, 항체 20507의 4개의 단일 Cys 돌연변이체 (HC-E152C, HC-S375C, LC-K107C, LC-S159C) 및 2개의 이중 Cys 돌연변이체 (HC-E152/HC-S375C, HC-K360C/LC-K107C)를 클로닝하였다. 항체 20507은 인간 IgG1 중쇄 및 인간 카파 경쇄를 함유한다. 항체 20507의 중쇄 및 경쇄의 불변 부분은 항-Her2 항체에서의 그것과 아미노산 서열에서 동일하다. 모든 Cys 돌연변이체의 불변 영역의 아미노산 서열은 표 3에 제시되고, 돌연변이된 Cys는 볼드체 및 밑줄로 표시된다.
PPTase-매개 접합을 위한 A1 태그 (GDSLDMLEWSLM, 서열식별번호: 12) 및 ybbR 태그 (DSLEFIASKLA, 서열식별번호: 20)를 코딩하는 DNA 서열을 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 인간 IgG1 중쇄 내로 혼입하고, DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 표 4는 HC-ins388-A1 항체 및 HC-ins388-ybbR 항체의 중쇄의 발현 벡터를 생성하는, 플라스미드 pOG-항-Her2 항체 HC의 PCR 증폭에 사용된 올리고뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 38, 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41)을 열거한다. 표 3은 HC-ins388-A1 (서열식별번호: 11) 및 HC-ins388-ybbR (서열식별번호: 14)의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 제시한다. A1 및 ybbR 펩티드 태그 (볼드체 및 밑줄로 강조됨)는 Eu 넘버링 시스템에 따라 잔기 Glu388 다음에 삽입된다 (Edelman et al., (1969) Proc Natl Acad Sci U S A, 63:78-85). ybbR 태그의 위치 2에서의 세린 잔기를 추가로, 표 4에 열거된 올리고뉴클레오티드 (서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49)를 사용하여 시스테인 (DCLEFIASKLA, 서열식별번호: 21)으로 돌연변이시켰다. 생성된 HC-ins388-ybbR-S390C 항체의 단백질 서열 (서열식별번호: 15)을 표 3에 제시한다. 유사하게, A1 (서열식별번호: 22) 및 S6 (서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24) 태그의 말단절단된 버전을 표 4에 열거된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 항-Her2 항체의 CH1 도메인 내로 클로닝하였다. 돌연변이된 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18)을 표 3에 제시하고, 말단절단된 펩티드 태그는 볼드체 및 밑줄로 표시한다.
A1-태그부착된 항체 20507을 코딩하는 벡터 (서열식별번호: 11)를, 항-Her2 가변 영역을 항체 20507의 가변 영역으로 치환하여 구축하였다. 불변 영역의 각각의 단백질 서열이 표 3에 열거되어 있다. 항-Her2 HC-ins388-A1 및 항-Her2 HC-ins388-ybbR 항체를 코딩하는 DNA 서열을, 이들 펩티드-태그부착된 항체 구축물을 안정적으로 발현하는 세포주의 선택에 적합한 벡터 내로 추가로 클로닝하였다.
<표 4> Cys 및 펩티드-태그부착된 돌연변이체 항체를 클로닝하는데 사용된 돌연변이 프라이머의 DNA 서열.
실시예 98: 항-Her2 및 항체 20507 Cys 및 A1 태그부착된 돌연변이체 항체의 제조
항-Her2-LC-S159C, 항-Her2 HC-ins388-C, 항-Her2 HC-S119G-T120D-K121S-G122L-P123D-ins123-MLEW, 항-Her2 HC-P189G-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L, 항-Her2 HC-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L, 항-Her2 HC-ins388-ybbR-S390C, 모든 항체 20507 Cys 돌연변이체, 및 항체 20507 HC-ins388-A1을, 이전에 기재된 바와 같은 (Meissner, et al., Biotechnol Bioeng. 75:197-203 (2001)) 일시적 형질감염 방법을 사용하여 중쇄 및 경쇄 플라스미드를 공동-형질감염시킴으로써 293 프리스타일™ 세포에서 발현시켰다. 공동-형질감염에 사용된 DNA 플라스미드는 제조업체의 프로토콜에 따라 퀴아젠(Qiagen) 플라스미드 제조 키트를 사용하여 제조하였다. 293 프리스타일™ 세포를 프리스타일™ 발현 배지 (인비트로젠(Invitrogen)) 중 현탁액 중에서 5% CO2 하에 37℃에서 배양하였다. 형질감염 전날에, 세포를 0.7 x 106개 세포/mL로 새로운 배지로 분할하였다. 형질감염 당일에, 세포 밀도는 전형적으로 1.5 x 106개 세포/mL에 도달하였다. 세포를 PEI 방법을 사용하여 중쇄 및 경쇄 플라스미드의 혼합물로 1:1의 비로 형질감염시켰다 (Meissner et al., 2001 상기 문헌). 형질감염된 세포를 5일 동안 추가로 배양하였다. 배양물을 20분 동안 2000x g에서 원심분리하여 배양물로부터 배지를 수거하고, 0.2 마이크로미터 필터를 통해 여과하였다. 발현된 항체를 단백질 A-세파로스™ (지이 헬스케어 라이프 사이언시스(GE Healthcare Life Sciences))를 사용하여 여과된 배지로부터 정제하였다. IgG 항체를 단백질 A-세파로스™ 칼럼으로부터 pH 3.0 용리 완충제를 사용하여 용리시켰다. 용리된 IgG 용액을 1 M 트리스-HCl (pH 8.0)로 즉시 중화시킨 후 PBS로 완충제 교환하였다.
항-Her2 LC-S159C, 항-Her2 HC-ins388-A1, 및 항-Her2 HC-ins388-ybbR에 대한 발현 구축물을 CHO 세포 내로 형질감염시켰다. 이어서 표준 프로토콜에 따라, 이들 항체를 안정적으로 발현하는 세포를 항생제를 사용하여 선택하였다. 선택된 CHO 세포 클론에서 발현된 모든 항-Her2 항체 구축물을 상기 기재된 바와 같이 단백질 A-세파로스 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
면역접합체
페이로드 (약물)로서 이러한 화학식 I 및 그의 하위화학식의 화합물을 포함하는 본 발명의 면역접합체는 화학식 II의 접합체를 포함한다.
<화학식 II>
여기서,
Ab는 항원 결합 모이어티를 나타내고;
L은 -L1L2L3L4L5L6-, -L6L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4L5-, -L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4-, -L4L3L2L1-, -L1L2L3-, -L3L2L1-, -L1L2-, -L2L1- 및 -L1로부터 선택된 링커이고, 여기서 -L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 본원에 정의된 바와 같고;
y는 1 내지 16의 정수이고;
R101은 
, -NHC(=O)NR6*-, -NHR121*-, 
또는 -NHC(=O)R123*-이고, 여기서 *는 L에 대한 부착 지점을 나타내고;
R2는 -C1-C6알킬이고;
R3은 
이고;
R5는 N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R9는 -OH, C1-C6알콕시, -N(R12)2, -R16, -NR12(CH2)mN(R12)2, -NR12(CH2)mR16, -NHS(O)2R18 또는 
이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R15는 테트라졸릴,
이고;
R16은 비치환되거나 또는 -LR11로 치환된, N, O, S, S(=O) 및 S(=O)2로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 함유하는 N-연결된 4-8원 헤테로시클로알킬이고;
각각의 R18은 독립적으로 C1-C6알킬, 아지도로 치환된 C1-C6알킬, 및 1 내지 5개의 히드록실로 치환된 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R110은 결합 또는 
이고;
R121은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -CN, NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴렌이고;
R122는 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬렌이고;
R123은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬렌이고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되고,
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된다.
페이로드 (약물)로서 이러한 화학식 I 및 그의 하위화학식의 화합물을 포함하는 본 발명의 다른 면역접합체는 화학식 III의 접합체를 포함한다.
<화학식 III>
여기서,
Ab는 항원 결합 모이어티를 나타내고;
L은 -L1L2L3L4L5L6-, -L6L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4L5-, -L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4-, -L4L3L2L1-, -L1L2L3-, -L3L2L1-, -L1L2-, -L2L1- 및 -L1로부터 선택되고, 여기서 -L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 본원에 정의된 바와 같고;
y는 1 내지 16의 정수이고;
R1은 -N=CR4R5, -N=R19, -N=CR5R20, -NHC(=NR6)R4, -NHC(=O)R4, -NHC(=O)R20 또는 -NHR8이고;
R2는 -C1-C6알킬이고;
R4는 -N(R6)2 또는 -NR6R7이고;
R5는 N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R7은 비치환된 C3-C8시클로알킬이거나;
또는 R7은 C1-C6알킬, 옥소, -C(=O)R18, -(CH2)mOH, -C(=O)(CH2)mOH, -C(=O)((CH2)mO)nR12, -((CH2)mO)nR12, 또는 1 내지 5개의 히드록실로 임의로 치환된 C1-C6알킬로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된 C3-C8시클로알킬이고;
R8은 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이거나;
또는 R8은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -OH, -N(R6)2, -CN, -NO2, -C(=O)OR6 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R19는 N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R19는 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R20은 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R20은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -C(=O)OR12, 옥소, -OH 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R113은
이고;
R117은 결합, -NH-, -NHS(=O)2-,
이고;
R118은 결합, 테트라졸릴,
이고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되고,
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된다.
본 발명은 항원-결합 모이어티, 예컨대 항체 또는 항체 단편에 연결된 1개 이상의 항유사분열 세포독성 펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공한다. 본 발명의 바람직한 면역접합체는 본원에 기재된 바와 같은 화학식 II 또는 III의 면역접합체이다. 이러한 면역접합체를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 바람직한 면역접합체는 표 6-14 및 실시예 100 내지 109에 개시된 것, 및 항-Her2 항체 대신 또 다른 항원 결합 모이어티를 갖는 그의 변형, 특히 항-Her2 항체가 하기 목록으로부터 선택된 항체에 의해 대체된 접합체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 항-에스트로겐 수용체 항체, 항-프로게스테론 수용체 항체, 항-p53 항체, 항-EGFR 항체, 항-카텝신 D 항체, 항-Bcl-2 항체, 항-E-카드헤린 항체, 항-CA125 항체, 항-CA15-3 항체, 항-CA19-9 항체, 항-c-erbB-2 항체, 항-P-당단백질 항체, 항-CEA 항체, 항-망막모세포종 단백질 항체, 항-ras 종양단백질 항체, 항-루이스 X 항체, 항-Ki-67 항체, 항-PCNA 항체, 항-CD3 항체, 항-CD4 항체, 항-CD5 항체, 항-CD7 항체, 항-CD8 항체, 항-CD9/p24 항체, 항-CD1-항체, 항-CD11c 항체, 항-CD13 항체, 항-CD14 항체, 항-CD15 항체, 항-CD19 항체, 항-CD20 항체, 항-CD22 항체, 항-CD23 항체, 항-CD30 항체, 항-CD31 항체, 항-CD33 항체, 항-CD34 항체, 항-CD35 항체, 항-CD38 항체, 항-CD39 항체, 항-CD41 항체, 항-LCA/CD45 항체, 항-CD45RO 항체, 항-CD45RA 항체, 항-CD71 항체, 항-CD95/Fas 항체, 항-CD99 항체, 항-CD100 항체, 항-S-100 항체, 항-CD106 항체, 항-유비퀴틴 항체, 항-c-myc 항체, 항-시토케라틴 항체, 항-람다 경쇄 항체, 항-멜라노솜 항체, 항-전립선 특이적 항원 항체, 항-타우 항원 항체, 항-피브린 항체, 항-케라틴 항체, 및 항-Tn-항원 항체.
일부 실시양태에서, 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체는 항원-결합 활성을 갖는 항체 또는 항체 단편 Ab를 포함하며, 여기서 링커 L은 Ab의 시스테인 황 원자에서 Ab에 부착된다. 시스테인 황 기와의 반응에 사용되는 전형적인 반응성 기 및 형성되는 생성된 기를 표 1에 제공한다. 항원 결합 모이어티의 시스테인 잔기와의 반응에 의해 형성되는 링커 성분의 비제한적 예는 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체는 항원-결합 활성을 갖는 항체 또는 항체 단편 Ab를 포함하며, 여기서 링커는 
과 히드록실아민을 함유하는 화학식 I의 화합물의 반응 시 형성되는 
의 가교된 디술피드를 통해 Ab에 부착된다. 일부 실시양태에서, 화학식 II 및 화학식 III의 면역접합체의 링커 L의 링커 성분은 
이고, 이는 
과 히드록실아민을 함유하는 화학식 I의 화합물의 반응 시 형성된다.
일부 실시양태에서, 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체는 항원-결합 활성을 갖는 항체 또는 항체 단편 Ab를 포함하며, 여기서 링커 L은 리신의 유리 -NH2에서 Ab에 부착된다. 항원 결합 모이어티의 리신 잔기의 -NH2와의 반응에 의해 형성된 링커 성분 (여기서 각각의 p는 1-10이고, 각각의 R은 독립적으로 H 또는 C1-4 알킬 (바람직하게는 메틸)임)은 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체는 항원-결합 활성을 갖는 항체 또는 항체 단편 Ab를 포함하며, 여기서 링커 L은 항체 내로 조작된 Pcl 또는 Pyl 기에서 Ab에 부착된다. 예를 들어, 문헌 [Ou, et al., PNAS 108(26), 10437-42 (2011)]을 참조한다. Pcl 또는 Pyl 기와의 반응에 의해 형성된 링커 성분은
를 포함하나 이에 제한되지는 않고, 여기서 R20은 H 또는 Me이고, R30은 H, Me 또는 페닐이며, 연결을 위해 여기서 제시된 아실 기는 조작된 항체 내의 Pcl 또는 Pyl의 리신 부분에 부착된다.
일부 실시양태에서, 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체는 항원-결합 활성을 갖는 항체 또는 항체 단편 Ab를 포함하며, 여기서 링커 L은 항체 내로 조작된 S6, ybbR 또는 A1 펩티드 내의 세린 잔기에서 Ab에 부착된다. 이러한 세린 잔기와의 반응에 의해 형성된 링커 성분은 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
예로서, 화학식 II의 면역접합체의 형성을 위한 하나의 일반적인 반응식이 하기 반응식 32에 제시된다:
<반응식 32>
여기서 RG1은 표 1로부터의 반응성 기 1이고, RG2는 표 1로부터의 반응성 기 2이고, 각각의 기의 반응 생성물 (표 1에서 관찰되는 바와 같음)은 링커 L의 링커 성분이다. R101, R2, R3, L 및 Ab는 본원에 정의된 바와 같다.
화학식 II의 면역접합체의 형성을 위한 또 다른 일반적인 반응식이 하기 반응식 33에 제시된다:
<반응식 33>
여기서 RG1은 표 1로부터의 반응성 기 1이고, RG2는 표 1로부터의 반응성 기 2이고, 각각의 기의 반응 생성물 (표 1에서 관찰되는 바와 같음)은 링커 L의 링커 성분이다. R101, R2, R3, L 및 Ab는 본원에 정의된 바와 같다.
예로서, 화학식 III의 면역접합체의 형성을 위한 하나의 일반적인 반응식이 하기 반응식 34에 제시된다:
<반응식 34>
여기서 RG1은 표 1로부터의 반응성 기 1이고, RG2는 표 1로부터의 반응성 기 1이고, 각각의 기의 반응 생성물 (표 1에서 관찰되는 바와 같음)은 링커 L의 링커 성분이다. R1, R2, R113, L 및 Ab는 본원에 정의된 바와 같다.
화학식 II의 면역접합체의 형성을 위한 또 다른 일반적인 반응식이 하기 반응식 35에 제시된다:
<반응식 35>
여기서 RG1은 표 1로부터의 반응성 기 1이고, RG2는 표 1로부터의 반응성 기 2이고, 각각의 기의 반응 생성물 (표 1에서 관찰되는 바와 같음)은 링커 L의 링커 성분이다. R1, R2, R113, L 및 Ab는 본원에 정의된 바와 같다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체, 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 제약 조성물은 정맥내 투여, 비경구 투여 등과 같은 특정한 투여 경로를 위해 제제화될 수 있다.
본 발명의 면역접합체는 전형적으로 수성 완충제 및/또는 등장성 수용액 중 용액 또는 현탁액으로서 제제화된다. 이들은 전형적으로 주사에 의해 또는 주입에 의해 비경구로 투여된다. 그의 제제화 및 투여 방법은 다른 생물학적-기반 약제, 예컨대 항체 치료제의 제제화 및 투여 방법과 유사하고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
특정의 주사가능한 조성물은 수성 등장성 용액 또는 현탁액이고, 좌제는 지방 에멀젼 또는 현탁액으로부터 제조된다. 상기 조성물은 멸균될 수 있고/거나, 아주반트, 예컨대 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용해 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제를 함유할 수 있다. 또한, 이들은 다른 치료상 가치있는 물질을 또한 함유할 수 있다. 상기 조성물은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 각각 제조되고, 약 0.1-75% 또는 약 1-50%의 활성 성분을 함유한다.
화학식 I의 특정 화합물에 대해 수득된 표 3에 제공된 시험관내 세포 사멸 효력은 이러한 화학식 I의 화합물이 가치있는 약리학적 활성을 나타내고, 따라서 이들 화합물은 ADC의 페이로드로서 사용될 수 있음을 제시한다. 본원에서 입증된 바와 같이, 화학식 I의 화합물을 포함하는 면역접합체는, 상이한 인간 암을 나타내는 이종이식 종양의 강력한 성장 억제에 의해 입증된 바와 같은, 시험관내 표적화된 세포에 대해 및 생체내 종양에 대해 실질적인 활성을 나타낸다. 따라서 항체와 같은 항원 결합 모이어티에 연결된, 화학식 I 및 그의 하위화학식의 페이로드를 포함하는 본 발명의 화학식 II 또는 III의 면역접합체는, 또한 암, 예컨대 위, 골수, 결장, 비인두, 식도, 및 전립선 종양, 신경교종, 신경모세포종, 유방암, 폐암, 난소암, 결장직장암, 갑상선암, 백혈병 (예를 들어, 골수 백혈병, 림프구성 백혈병, 급성 골수 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), T-계통 급성 림프모구성 백혈병 또는 T-ALL 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 골수이형성 증후군 (MDS), 모발상 세포 백혈병), 림프종 (호지킨 림프종 (HL), 비호지킨 림프종 (NHL)), 다발성 골수종, 방광암, 신장암, 위암 (예를 들어, 위장 기질 종양 (GIST)), 간암, 흑색종 및 췌장암, 및 육종을 치료하는데 유용하다.
본 발명의 한 실시양태는 화학식 I 및 그의 하위화학식의 화합물의 항원 결합 모이어티에의 접합, 및 그에 의해 본원에 기재된 바와 같은 화학식 II 또는 화학식 III의 면역접합체를 형성하는 것을 제공한다.
화학식 I 또는 그의 하위화학식의 화합물을 포함하는 본 발명의 면역접합체는 항유사분열 독소에 의해 억제되는 관련 기술분야에 공지된 암, 및 본 발명의 화합물 및 접합체에 의한 억제에 감수성인 것으로 본원에서 입증된 그러한 종양 유형을 치료하는데 특히 유용하다. 치료를 위한 적합한 적응증은 위, 골수, 결장, 비인두, 식도, 및 전립선 종양, 신경교종, 신경모세포종, 유방암, 폐암, 난소암, 결장직장암, 갑상선암, 백혈병 (예를 들어, 골수 백혈병, 림프구성 백혈병, 급성 골수 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), T-계통 급성 림프모구성 백혈병 또는 T-ALL 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 골수이형성 증후군 (MDS), 모발상 세포 백혈병), 림프종 (호지킨 림프종 (HL), 비호지킨 림프종 (NHL)), 다발성 골수종, 방광암, 신장암, 위암 (예를 들어, 위장 기질 종양 (GIST)), 간암, 흑색종 및 췌장암, 및 육종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 화학식 I 또는 그의 하위화학식의 화합물을 포함하는 본 발명의 면역접합체는 요법에서 특히 유용하다. 추가 실시양태에서, 요법은 항유사분열 독소에 의해 치료될 수 있는 질환을 위한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 위, 골수, 결장, 비인두, 식도, 및 전립선 종양, 신경교종, 신경모세포종, 유방암, 폐암, 난소암, 결장직장암, 갑상선암, 백혈병 (예를 들어, 골수 백혈병, 림프구성 백혈병, 급성 골수 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), T-계통 급성 림프모구성 백혈병 또는 T-ALL 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 골수이형성 증후군 (MDS), 모발상 세포 백혈병), 림프종 (호지킨 림프종 (HL), 비호지킨 림프종 (NHL)), 다발성 골수종, 방광암, 신장암, 위암 (예를 들어, 위장 기질 종양 (GIST)), 간암, 흑색종 및 췌장암, 및 육종을 포함하나 이에 제한되지 않는 암을 치료하는데 유용하다.
방법은 전형적으로 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 면역접합체 또는 이러한 면역접합체를 포함하는 제약 조성물을 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 면역접합체는 본원에 기재된 것들과 같은 임의의 적합한 방법에 의해 투여될 수 있고, 투여는 치료 의사에 의해 선택된 간격으로 반복될 수 있다.
따라서, 추가 실시양태로서, 본 발명은 의약의 제조를 위한, 화학식 II 또는 III의 면역접합체, 또는 본원에 기재된 이러한 화합물의 실시양태 중 임의의 것의 용도를 제공한다. 추가 실시양태에서, 의약은 항유사분열 독소에 의해 치료될 수 질환의 치료를 위한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 질환은 위, 골수, 결장, 비인두, 식도, 및 전립선 종양, 신경교종, 신경모세포종, 유방암, 폐암, 난소암, 결장직장암, 갑상선암, 백혈병 (예를 들어, 골수 백혈병, 림프구성 백혈병, 급성 골수 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), T-계통 급성 림프모구성 백혈병 또는 T-ALL 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 골수이형성 증후군 (MDS), 모발상 세포 백혈병), 림프종 (호지킨 림프종 (HL), 비호지킨 림프종 (NHL)), 다발성 골수종, 방광암, 신장암, 위암 (예를 들어, 위장 기질 종양 (GIST)), 간암, 흑색종 및 췌장암, 및 육종으로부터 선택된다.
본 발명의 제약 조성물 또는 조합물은 약 50-100 kg의 대상체를 위한 약 1-1000 mg의 활성 성분(들), 또는 약 1-500 mg 또는 약 1-250 mg 또는 약 1-150 mg 또는 약 0.5-100 mg, 또는 약 1-50 mg의 활성 성분의 단위 투여량일 수 있다. 화합물, 그의 제약 조성물, 또는 조합물의 치료 유효 투여량은, 대상체의 종, 체중, 연령 및 개별 상태, 치료할 장애 또는 질환 또는 그의 중증도에 따라 좌우된다. 통상의 기술을 갖는 의사, 임상의 또는 수의사는 장애 또는 질환의 진행을 예방, 치료 또는 억제하는데 필요한 활성 성분 각각의 유효량을 용이하게 결정할 수 있다.
상기 언급된 투여량 특성은 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트, 개, 원숭이 또는 그의 단리된 기관, 조직 및 표본을 사용하여 시험관내 및 생체내 시험에서 입증가능하다. 본 발명의 화합물은 용액, 예를 들어 수용액의 형태로 시험관내 적용될 수 있고, 경장으로, 비경구로, 정맥내로, 예를 들어 현탁액으로서 또는 수용액으로 생체내 적용될 수 있다. 시험관내 투여량은 약 10-3 몰 내지 10-12 몰 농도의 범위일 수 있다. 생체내 치료 유효량은 투여 경로에 따라 약 0.1-500 mg/kg, 또는 약 1-100 mg/kg의 범위일 수 있다.
본 발명의 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체는 1종 이상의 치료 공동-작용제(들)와 동시에, 또는 그 전에 또는 그 후에 투여될 수 있다. 본 발명의 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체는 개별적으로, 동일하거나 상이한 투여 경로에 의해, 또는 공동-작용제(들)와 동일한 제약 조성물로 함께 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 화학식 I 또는 그의 하위화학식의 화합물, 및 적어도 1종의 다른 치료 공동-작용제를 요법에서 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제로서 포함하는 생성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 요법은 암과 같은 질환 또는 상태를 항유사분열 독소로 치료하는 것이다. 조합 제제로서 제공되는 생성물은 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체 및 다른 치료 공동-작용제(들)를 동일한 제약 조성물에서 함께, 또는 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체 및 다른 치료 공동-작용제(들)를 별개의 형태로, 예를 들어 키트의 형태로 포함하는 조성물을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체, 및 또 다른 치료 공동-작용제(들)를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 임의로, 제약 조성물은 상기 기재된 바와 같은 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물 및 접합체와 함께 사용하기에 적합한 공동-작용제는 다른 항암제, 항알레르기제, 항오심제 (또는 항구토제), 통증 완화제, 항염증제, 세포보호제, 및 그의 조합을 포함한다.
본원에 개시된 접합체와 조합하여 사용하기 위해 고려되는 구체적인 공동-작용제는 아나스트로졸 (아리미덱스(Arimidex)®), 비칼루타미드 (카소덱스(Casodex)®), 블레오마이신 술페이트 (블레녹산(Blenoxane)®), 부술판 (밀레란(Myleran)®), 부술판 주사 (부술펙스(Busulfex)®), 카페시타빈 (젤로다(Xeloda)®), N4-펜톡시카르보닐-5-데옥시-5-플루오로시티딘, 카르보플라틴 (파라플라틴(Paraplatin)®), 카르무스틴 (BiCNU®), 클로람부실 (류케란(Leukeran)®), 시스플라틴 (플라티놀(Platinol)®), 클라드리빈 (류스타틴(Leustatin)®), 시클로포스파미드 (시톡산(Cytoxan)® 또는 네오사르(Neosar)®), 시타라빈, 시토신 아라비노시드 (시토사르-U(Cytosar-U)®), 시타라빈 리포솜 주사 (데포사이트(DepoCyt)®), 다카르바진 (DTIC-돔(DTIC-Dome)®), 닥티노마이신 (악티노마이신 D(Actinomycin D), 코스메간(Cosmegan)), 다우노루비신 히드로클로라이드 (세루비딘(Cerubidine)®), 다우노루비신 시트레이트 리포솜 주사 (다우녹솜(DaunoXome)®), 덱사메타손, 도세탁셀 (탁소테레(Taxotere)®), 독소루비신 히드로클로라이드 (아드리아마이신(Adriamycin)®, 루벡스(Rubex)®), 에토포시드 (베페시드(Vepesid)®), 플루다라빈 포스페이트 (플루다라(Fludara)®), 5-플루오로우라실 (아드루실(Adrucil)®, 에푸덱스(Efudex)®), 플루타미드 (유렉신(Eulexin)®), 테자시티빈, 겜시타빈 (디플루오로데옥시시티딘), 히드록시우레아 (히드레아(Hydrea)®), 이다루비신 (이다마이신(Idamycin)®), 이포스파미드 (이펙스(IFEX)®), 이리노테칸 (캄프토사르(Camptosar)®), L-아스파라기나제 (엘스파르(ELSPAR)®), 류코보린 칼슘, 멜팔란 (알케란(Alkeran)®), 6-메르캅토퓨린 (퓨린톨(Purinethol)®), 메토트렉세이트 (폴렉스(Folex)®), 미톡산트론 (노반트론(Novantrone)®), 밀로타르그, 파클리탁셀 (탁솔(Taxol)®), 포에닉스 (이트륨90/MX-DTPA), 펜토스타틴, 폴리페프로산 20과 카르무스틴 이식물 (글리아델(Gliadel)®), 타목시펜 시트레이트 (놀바덱스(Nolvadex)®), 테니포시드 (부몬(Vumon)®), 6-티오구아닌, 티오테파, 티라파자민 (티라존(Tirazone)®), 주사용 토포테칸 히드로클로라이드 (하이캄틴(Hycamptin)®), 빈블라스틴 (벨반(Velban)®), 빈크리스틴 (온코빈(Oncovin)®) 및 비노렐빈 (나벨빈(Navelbine)®)을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 2종 이상의 개별 제약 조성물을 포함하는 키트를 제공하며, 이 중 적어도 1종은 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식을 함유한다. 한 실시양태에서, 키트는 상기 조성물을 개별적으로 보유하기 위한 수단, 예컨대 용기, 분할된 병 또는 분할된 호일 패킷을 포함한다.
본 발명의 조합 요법에서, 본 발명의 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체 및 다른 치료 공동-작용제는 동일하거나 상이한 제조업자에 의해 제조 및/또는 제제화될 수 있다. 또한, 본 발명의 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체 및 다른 치료제는 (i) 의사에게 조합 제품으로 배포되기 전에 (예를 들어, 본 발명의 화합물 및 다른 치료제를 포함하는 키트의 경우); (ii) 투여 직전에 의사 자신에 의해 (또는 의사 안내 하에); (iii) 예를 들어 본 발명의 화합물 및 다른 치료제의 순차적 투여 동안에 환자 자신에서, 조합 요법으로 합해질 수 있다.
본 발명은 또한 세포독성 펩티드로 질환 또는 상태를 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체를 제공한다. 본 발명은 또한 세포독성 펩티드로 질환 또는 상태를 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체를 제공하며, 여기서 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체는 또 다른 치료제와 함께 투여하기 위해 제조된다. 본 발명은 또한 세포독성 펩티드로 질환 또는 상태를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 또 다른 치료 공동-작용제를 제공하며, 여기서 다른 치료 공동-작용제는 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체와 함께 투여하기 위해 제조된다. 본 발명은 또한 항유사분열 독소로 질환 또는 상태를 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체를 제공하며, 여기서 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체는 또 다른 치료 공동-작용제와 함께 투여된다. 본 발명은 또한 항유사분열 독소로 질환 또는 상태를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 또 다른 치료 공동-작용제를 제공하며, 여기서 다른 치료 공동-작용제는 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체와 함께 투여된다.
본 발명은 또한 세포독성 펩티드로 질환 또는 상태를 치료하기 위한, 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체의 용도를 제공하며, 여기서 환자는 이전에 (예를 들어 24시간 내에) 또 다른 치료제로 치료된 바 있다. 본 발명은 또한 항유사분열 독소로 질환 또는 상태를 치료하기 위한, 또 다른 치료제의 용도를 제공하며, 여기서 환자는 이전에 (예를 들어 24시간 내에) 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체로 치료된 바 있다.
본 발명은 또한 항유사분열 독소로 질환 또는 상태를 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체를 제공한다. 본 발명은 또한 항유사분열 독소로 질환 또는 상태를 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체를 제공하며, 여기서 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체는 또 다른 치료제와 함께 투여하기 위해 제조된다. 본 발명은 또한 항유사분열 독소로 질환 또는 상태를 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 또 다른 치료 공동-작용제를 제공하며, 여기서 다른 치료 공동-작용제는 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체와 함께 투여하기 위해 제조된다. 본 발명은 또한 항유사분열 독소로 질환 또는 상태를 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체를 제공하며, 여기서 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체는 또 다른 치료 공동-작용제와 함께 투여된다. 본 발명은 또한 항유사분열 독소로 질환 또는 상태를 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 또 다른 치료 공동-작용제를 제공하며, 여기서 다른 치료 공동-작용제는 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체와 함께 투여된다.
본 발명은 또한 항유사분열 독소로 질환 또는 상태를 치료하기 위한, 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체의 용도를 제공하며, 여기서 환자는 이전에 (예를 들어 24시간 내에) 또 다른 치료제로 치료된 바 있다. 본 발명은 또한 항유사분열 독소로 질환 또는 상태를 치료하기 위한, 또 다른 치료제의 용도를 제공하며, 여기서 환자는 이전에 (예를 들어 24시간 내에) 화학식 II 또는 화학식 III 또는 그의 하위화학식의 면역접합체로 치료된 바 있다.
링커-페이로드 (L-P)와 항원 결합 모이어티의 접합
실시예 99: 조작된 Cys 돌연변이체 항체를 사용한 항체 약물 접합체의 제조
링커-페이로드를 항원 결합 모이어티에 접합시키기 위한 수많은 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Antibody-Drug Conjugate, Methods in Molecular Biology, Vol. 1045, Editor L. Ducry, Humana Press (2013)]에서 검토됨). 본 실시예에서, 링커를 포함하는 본 발명에 기재된 화합물을 문헌 [Junutula JR, Raab H, Clark S, Bhakta S, Leipold DD, Weir S, Chen Y, Simpson M, Tsai SP, Dennis MS, Lu Y, Meng YG, Ng C, Yang J, Lee CC, Duenas E, Gorrell J, Katta V, Kim A, McDorman K, Flagella K, Venook R, Ross S, Spencer SD, Lee Wong W, Lowman HB, Vandlen R, Sliwkowski MX, Scheller RH, Polakis P, Mallet W. (2008) Nature Biotechnology 26:925-932]에 기재된 바와 같이 항체 내로 조작된 시스테인 잔기에 접합시켰다. 예로서, 본 발명의 화합물의 접합은 단지 작은 세트의 Cys 항체 돌연변이체에 대해서만 예시되지만, 화합물은 모든 가능한 Cys 항체 돌연변이체는 아닐지라도 대부분에 접합될 수 있는 것으로 예상된다.
포유동물 세포에서 발현된 항체에서 조작된 Cys는 그의 생합성 동안 부가물 (디술피드), 예컨대 글루타티온 (GSH) 및/또는 시스테인에 의해 변형되기 때문에 (Chen et al. 2009), 초기에 발현된 바와 같은 생성물 내의 변형된 Cys는 티올 반응성 시약, 예컨대 말레이미도 또는 브로모- 또는 아이오도-아세트아미드 기에 대해 비반응성이다. 발현 후에 조작된 시스테인을 접합시키기 위해, 글루타티온 또는 시스테인 부가물은 이들 디술피드를 환원시킴으로써 제거될 필요가 있고, 이는 일반적으로 발현된 항체 내의 천연 디술피드를 또한 환원시키는 것을 수반한다. 이는 먼저 항체를 환원제, 예컨대 디티오트레이톨 (DTT)에 노출시킨 후, 항체의 모든 천연 디술피드 결합의 재-산화를 가능하게 하여, 기능적 항체 구조를 복구 및/또는 안정화시키는 절차에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 모든 천연 디술피드 결합 및 조작된 시스테인 잔기의 시스테인 또는 GSH 부가물 사이에 결합된 디술피드를 환원시키기 위해, 새로이 제조된 DTT를 정제된 항-Her2 또는 항체 20507 Cys 돌연변이체 구축물에 10 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 1시간 동안 37℃에서 DTT와 함께 인큐베이션한 후에, 혼합물을 매일 완충제 교환하면서 3일 동안 PBS에 대해 4℃에서 투석하여 DTT를 제거하고 천연 디술피드 결합을 재-산화시켰다. 대안적 방법은 탈염 칼럼, 예컨대 세파덱스 G-25를 통해 환원 시약을 제거하는 것이다. 단백질이 환원된 후, 1 mM 산화 아스코르베이트 (데히드로-아스코르브산)을 탈염 샘플에 첨가하고, 재-산화 인큐베이션을 20시간 동안 수행하였다. 모든 방법은 유사한 결과를 생성하였다. 그러나, CuSO4를 사용하여 문헌에 이전에 기재된 재-산화 프로토콜을 따르도록 한 시도는 단백질 침전을 발생시켰다 (Junutula JR, Raab H, Clark S, Bhakta S, Leipold DD, Weir S, Chen Y, Simpson M, Tsai SP, Dennis MS, Lu Y, Meng YG, Ng C, Yang J, Lee CC, Duenas E, Gorrell J, Katta V, Kim A, McDorman K, Flagella K, Venook R, Ross S, Spencer SD, Lee Wong W, Lowman HB, Vandlen R, Sliwkowski MX, Scheller RH, Polakis P, Mallet W. (2008) Nature Biotechnology 26:925). 재산화는 쇄내 디술피드를 복구하며, 투석은 항체의 조작된 시스테인(들)에 초기에 연결된 시스테인 및 글루타티온을 제거한다.
재-산화 후에, 항체를 링커 및 반응성 모이어티를 포함하는 화학식 I의 화합물과 접합시켰다. 예로서, 연결된 말레이미드 모이어티를 갖는 화합물 (항체에 대해 10몰 당량)을 PBS 완충제 (pH 7.2) 중 재-산화된 항-Her2 또는 항체 20507 Cys 돌연변이체 항체에 첨가하였다. 인큐베이션을 1시간 동안 수행하였다. 접합 과정을 역상 HPLC에 의해 모니터링하였고, 이는 접합된 항체를 비접합된 것과 분리할 수 있었다. 접합 반응 혼합물을 80℃로 가열된 PLRP-S 칼럼 (4000 Å, 50 mm x 2.1 mm, 애질런트) 상에서 분석하고, 칼럼으로부터 용리는 0.1% TFA를 함유하는 물 중 30-60% 아세토니트릴의 선형 구배에 의해 1.5 mL/분의 유량으로 수행하였다. 칼럼으로부터의 항체 용리를 280 nm, 254 nm 및 215 nm에서 모니터링하였다.
항-Her2 또는 항체 20507 Cys 돌연변이체 항체에 대해 연결된 말레이미드를 갖는 다양한 화합물의 접합 효율은 사용된 화합물의 용해도에 따라 달라졌지만, 대부분의 반응은 80% 초과의 접합체를 생성하였다 (표 5 및 6). 응집 상태를 평가하기 위해, 생성된 ADC를 크기 배제 크로마토그래피 (애질런트 바이오 SEC3, 300Å, 7.8x150mm)에 의해 PBS 중 1 mL/분의 유량으로 분석하였다. 모든 ADC는 주로 단량체였다. 대부분의 ADC는 3% 미만의 이량체 및 올리고머 물질을 함유하였고 (표 5 및 6), 이는 항-Her2 또는 항체 20507 Cys 돌연변이체 항체에의 화합물의 접합은 유의한 응집을 유발하지 않았다는 것을 나타낸다.
접합체를 또한, 일반적으로 약물 대 항체 비 (DAR)로서 지칭되는 항체 결합 모이어티에의 화합물의 평균 로딩의 면에서 특징화하였다. DAR 값을 역상 HPLC 측정으로부터 또는 LC-MS 분석으로부터 외삽하였다. 대부분의 링커-페이로드 분자의 경우에, 상이한 수의 약물 분자가 부착된 ADC는 HPLC에 의해 용이하게 분해될 수 있다. LC/MS는 또한 ADC에서 항체에 부착된 페이로드 (약물)의 분자의 평균 수의 정량화를 가능하게 한다. LC-MS 분석의 경우에, ADC는 전형적으로 환원되고 탈글리코실화된다. LC는 쇄당 링커-페이로드 기의 수에 따라 환원된 항체의 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 분리한다. 질량 스펙트럼 데이터는 혼합물 중 성분 종, 예를 들어 LC, LC+1, LC+2, HC, HC+1, HC+2 등의 확인을 가능하게 한다. LC 및 HC 쇄 상의 평균 로딩으로부터, 평균 DAR을 ADC에 대해 계산할 수 있다. 주어진 접합체에 대한 DAR은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 함유하는 전형적인 항체에 부착된 약물 (페이로드) 분자의 평균 수를 나타낸다. LC/MS 및/또는 HPLC 측정을 수행하였다. 생성된 DAR 값은 둘 다의 방법의 경우에 일치한다. 표 5 및 6은 항-Her2 또는 항체 20507 Cys 돌연변이체 항체 및 연결된 말레이미드를 갖는 화학식 I의 특정 화합물의 ADC에 대해 HPLC 또는 ESI-MS에 의해 수득된 DAR 값을 열거한다.
비교자로서, 상기 프로토콜에 따라, 항-Her2-LC-S159C 및 항체 20507-HC-E152C 돌연변이체 항체를 또한 말레이미도카프로일 모노-메틸 아우리스타틴 F와 접합시켰다 (MC-MMAF; Doronina SO, Mendelsohn BA, Bovee TD, Cerveny CG, Alley SC, Meyer DL, Oflazoglu E, Toki BE, Sanderson RJ, Zabinski RF, Wahl AF, Senter PD. Bioconjug. Chem. 2006 Jan-Feb;17(1):114-24.). 2종의 비교자 ADC의 선택된 특성을 또한 표 5 및 6에 열거한다.
본 발명자들의 항체에서 중쇄 또는 경쇄에서 조작된 단일 Cys 돌연변이 부위에 의하면, 최대 2개의 페이로드 분자를 각각의 항체 분자에 접합시켜 DAR 2 ADC를 생성할 수 있다. 항체당 페이로드의 수를 증가시키기 위해, 본 발명자들은 또한 중쇄 및 경쇄 둘 다에서 Cys 돌연변이 부위를 도입하거나, 또는 중쇄에서 2개의 Cys 돌연변이 부위를 도입함으로써 항체 분자당 4개의 Cys 돌연변이를 함유하는 항체 구축물을 생성하였다. 예로서, 항-Her2-HC-E152C-S375C, 항체 20507-HC-K360C-LC-K107C 및 항체 20507-HC-E152C-S375C Cys 돌연변이체 항체를 화합물 CL-9에 접합시켰다. 3종의 ADC의 선택된 특성을 표 5 및 6에 제시한다. 화합물 CL-9는 이중 Cys 항체 돌연변이체에 효율적으로 접합되어 3.9 내지 4의 DAR을 갖는 ADC를 생성하였다. DAR 4 ADC의 접합은 DAR 2 ADC만큼 효율적이었고, 생성된 ADC는 DAR 2 ADC만큼 단량체였다 (표 5 및 6).
<표 5> 다양한 항-Her2 Cys 돌연변이체 ADC의 특성
a 명칭은 화학적 접합 단계에 사용된 돌연변이된 항체의 설명 및 화합물의 설명으로 이루어진다.
b 접합 효율은 역상 HPLC에 의해 측정되었고, ADC로 전환된 항체의 백분율을 기재한다.
c 역상 HPLC에 따른 약물-대-항체 비.
d 응집은 분석용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정되었다. 퍼센트 올리고머는 이량체 및 올리고머 종을 포함한다.
<표 6> 다양한 항체 20507 Cys 돌연변이체 ADC의 특성
a 명칭은 화학적 접합 단계에 사용된 돌연변이된 항체의 설명 및 화합물의 설명으로 이루어진다.
b 접합 효율은 역상 HPLC에 의해 측정되었고, ADC로 전환된 항체의 백분율을 기재한다.
c 역상 HPLC에 따른 약물-대-항체 비.
d 응집은 분석용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정되었다. 퍼센트 올리고머는 이량체 및 올리고머 종을 포함한다. B.L.Q, 정량화 한계 미만.
실시예 100: 화합물 CoA-2와 펩티드-태그부착된 항체의 효소적 접합-ybbR-태그부착된 항-Her2 돌연변이체 항체의 접합을 통한 항체 약물 접합체의 1-단계 제조
자연적으로 단백질의 번역후 변형을 발생시키는 일부 효소적 과정을 구조적으로 다양한 소분자를 단백질에 효율적으로 접합시키기 위해 용도변경시킬 수 있다 (Rabuka D, Rush JS, deHart GW, Wu P, Bertozzi CR. Nat Protoc. (2012) 7:1052-1067) (Strop P, Liu SH, Dorywalska M, Delaria K, Dushin RG, Tran TT, Ho WH, Farias S, Casas MG, Abdiche Y, Zhou D, Chandrasekaran R, Samain C, Loo C, Rossi A, Rickert M, Krimm S, Wong T, Chin SM, Yu J, Dilley J, Chaparro-Riggers J, Filzen GF, O'Donnell CJ, Wang F, Myers JS, Pons J, Shelton DL, Rajpal A. Chem Biol. (2013) 20:161-167) (Tsukiji S, Nagamune T. Chembiochem (2009) 10:787-798) (Yin J, Straight PD, McLoughlin SM, Zhou Z, Lin AJ, Golan DE, Kelleher NL, Kolter R, Walsh CT (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102:15815-15820), (Zhou Z, Cironi P, Lin AJ, Xu Y, Hrvatin S, Golan DE, Silver PA, Walsh CT, Yin J. ACS Chem Biol. (2007) 2:337-346). 예를 들어, 본 발명자들은 이전에, 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTases)에 의해 촉매되는 번역후 변형이 화학적으로 규정된, 균질한 ADC의 생산에 이용될 수 있음을 입증한 바 있다 (Gruenewald et al., WO2013184514). 세포독성 화합물의 부위-특이적 접합은 11-12-mer A1, S6, 또는 ybbR 펩티드를 IgG1 항체의 불변 영역의 표면-노출된 루프 내에 삽입함으로써 달성되었다. 이들 펩티드 태그는 Sfp 및 AcpS PPTases에 대한 인식 요소로서 작용하였고, 이는 조효소 A (CoA) 연결된 세포독성 약물을 포스포디에스테르 결합 형성을 통해 불변 세린 잔기에 공유 부착시키는 것을 촉매하였다. PPTase 촉매작용의 생물직교성은 추가로 세포 배양 배지에서 CoA 유사체에 의한 펩티드-태그부착된 항체의 직접 표지화를 가능하게 하였다. 하기 실시예는 오직 1개의 부위에 대한 PPTase-매개 ADC 형성을 기재하지만, 접근법은 항체 스캐폴드 내의 많은 삽입 부위에 적용가능할 것으로 예상되고, 다른 항체에 적용가능할 것으로 예상된다.
기질로서 다양한 CoA-리포터 유사체를 수용하는 다기능 효소로서 PPTase (La Clair JJ, Foley TL, Schegg TR, Regan CM, Burkart MD (2004) Chem. Biol. 11:195-201). 세포독성 CoA-펩티드 유사체 (CoA-2, CoA에 공유 연결된 CL-9, 실시예 92 참조)를 항-Her2 항체의 삽입된 ybbR 서열에 효소적으로 접합시켰다. 구체적으로, 2.5 μM의 항-Her2-HC-ins388-ybbR 항체를 2 μM의 바실루스 서브틸리스로부터의 Sfp PPTase의 존재 하에 50 μM의 CoA-2 (항체에 대해 20 몰 당량)와 접합시켰다. 반응을 20 mM NaCl 및 12.5 mM MgCl2로 보충된 75 mM 트리스-HCl 완충제 (pH 8.0) 중에서 실온에서 대략 16시간 동안 수행하였다. 접합 후에, Sfp PPTase 및 과량의 시약을 rmp 단백질 A 세파로스 패스트 플로우 수지 (지이 헬스케어 라이프 사이언시스)를 사용하여 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 친화성 수지로부터의 용리는 대략 6 베드 부피의 0.1 M 아세트산나트륨 완충제 (pH 2.8)를 사용하여 수행한 다음, 25% (v/v)의 1 M 트리스-HCl 완충제 (pH 8.0)를 사용하여 즉시 중화시켰다. ADC를 최종적으로, PD-10 탈염 칼럼 (지이 헬스케어)을 사용하여 PBS로 완충제-교환하였다.
페이로드 접합의 정도는 80℃로 가열된 PLRP-S 칼럼 (4000 Å, 50 mm x 2.1 mm, 애질런트 테크놀로지스) 상에서의 역상 분석용 HPLC에 의해 0.1% TFA를 함유하는 물 중 30 - 60% 아세토니트릴의 선형 구배를 1.5 mL/분의 유량으로 사용하여 결정하였다. 접합 및 비접합된 항체의 역상 분리를 280 nm, 254 nm, 및 215 nm에서 모니터링하였다. 효소적으로 표지된 ADC의 정체는 추가로, 환원 및 탈글리코실화된 샘플의 디컬볼루션된 ESI-MS 스펙트럼을 수득함으로써 확인하였다. 표 8에 제시된 바와 같이, 관찰된 질량은 항-Her2-HC-ins388-ybbR 항체의 약물-표지된 중쇄의 계산된 분자량과 일치하였다. 마지막으로, 효소적으로 표지된 ADC를 바이오 SEC-3 칼럼 (애질런트 테크놀로지스) 상에서 분석용 크기-배제 크로마토그래피 (AnSEC)에 의해 검사하였다. 이러한 ADC에 대한 접합 효율, DAR 및 % 응집을 표 7에 제시한다.
<표 7> ybbR-태그부착된 항-Her2 ADC의 특성
a HC-ins388은 중쇄에서 잔기 Glu388 다음의 ybbR 펩티드 태그의 삽입을 지칭한다. 마지막 숫자는 효소적 접합 단계에 사용된 화합물에 상응한다.
b 접합 효율은 역상 HPLC에 의해 측정되었고, ADC로 전환된 항체의 백분율을 기재한다.
c 역상 HPLC에 따른 약물-대-항체 비.
d 응집은 AnSEC에 의해 측정되었고, 이량체 및 올리고머 종을 포함한다.
<표 8> ybbR-태그부착된 항-Her2 ADC의 질량 분광측정 분석
a HC-ins388은 중쇄에서 잔기 Glu388 다음의 ybbR 펩티드 태그의 삽입을 지칭한다. 마지막 숫자는 효소적 접합 단계에 사용된 화합물에 상응한다.
b 애질런트 6520 Q-TOF 기기 (애질런트 테크놀로지스) 상에서 검출된 바와 같은 달톤 단위의 질량.
c 접합된 중쇄에 대해 예측되는 바와 같은 달톤 단위의 질량.
d 비커플링된 중쇄에 대해 예측되는 바와 같은 달톤 단위의 질량.
실시예 101: 화학식 I의 화합물과 펩티드-태그부착된 항체의 효소적 접합-펩티드-태그부착된 항-Her2 및 항체 20507 돌연변이체 항체의 접합을 통한 항체-약물 접합체의 2-단계 제조
ADC 제조는 CoA 모이어티를 특색으로 하는 세포독성 화합물을 직접 및 효소적으로 접합시키는 1-단계 접근법을 사용하여 수행될 수 있거나 (실시예 100 참조), 또는 ADC 제조는 제1로 항체를 CoA 또는 CoA 유사체와 효소적으로 접합시키고, 이어서 제2 단계에서 세포독성 화합물을 사용하여 화학적으로 변형시키는 2-단계 접근법을 사용하여 수행될 수 있다.
2-단계 방법의 1가지 접근법은 A1, S6, 또는 ybbR 펩티드, 또는 말단절단된 태그 (표 3 참조)로 태그부착된 항체, 및 PPTase 둘 다를 배양 배지로 공동-분비시키기 위해 안정한 세포주를 사용한다. 이러한 2-단계 접근법의 제1 단계에서, 배양 배지는 표 1에 열거된 반응성 기 중 어느 하나를 함유하는 CoA 유사체로 보충된다. 후속 PPTase 촉매작용은 표 1로부터의 반응성 기로 관능화된 상응하는 항체를 제공한다. 제2 단계에서, 정제된, 관능화된 항체는 상보적인 반응성 기로 활성화된 세포독성 약물과 반응한다. 이러한 2-단계 접근법의 이점은 PPTase 효소를 개별적으로 발현시키고 정제할 필요가 없고, 비-독성 생물직교 CoA 유사체를 사용함으로써 세포독성 페이로드의 커플링 전에 비-독성, 관능화된 항체의 정제를 가능하게 할 수 있다는 것이다. 이는 PPTase-표지된 ADC의 생산 수준으로의 스케일 업을 용이하게 할 수 있다.
대안적으로, 2-단계 방법은 A1, S6, 또는 ybbR 펩티드, 또는 말단절단된 태그 (표 3 참조)로 태그부착된 항체의 생산을 수반할 수 있고, 이는 CoA 유사체 및 PPTase의 혼합물에의 노출 전에 정제된다. 혼합물은 표 1에 열거된 반응성 기 중 어느 하나를 함유하는 생물직교 CoA 유사체에 공유 부착된 PPTase를 함유하고, 그에 의해 표 1로부터의 반응성 기로 관능화된 상응하는 항체가 생산된다. 이어서 이러한 관능화된 항체를 정제한다. 제2 단계에서, 세포독성 화합물의 공유 접합/연결은 정제된 관능화된 항체를 단계 1로부터의 관능화된 항체의 반응성 기와 반응하는 반응성 기로 관능화된 세포독성 화합물 (페이로드)과 반응시키는 것에 의해 달성된다. 이어서 생성된 ADC를 정제한다.
2-단계 접근법을 입증하기 위해, 케톤-CoA 유사체 (실시예 91: 화합물 CoA-1)를 A1 태그부착된 항체에 효소적으로 접합시켜 케톤 관능화된 항체를 형성한 다음 이를 정제하고 알콕실아민 모이어티를 갖는 화학식 I의 화합물 (화합물 CL-22)과 반응시키는 것에 의해 제조된 ADC를 후자의 방법을 사용하여 부위-특이적으로 표지하였다.
구체적으로, 중쇄의 잔기 Glu388 (Eu 넘버링 시스템에 따름) 다음에 삽입된 A1 펩티드를 갖는 2개의 IgG1 항체 (항-Her2-HC-ins388-A1 및 항체 20507-HC-ins388-A1)를 제조하였다 (실시예 98). 이어서 30 μM의 케톤-관능화된 CoA (화합물 CoA-1) (항체에 대해 12 몰 당량)를 2 μM 비. 서브틸리스 Sfp의 존재 하에 2.5 μM 항체 20507-HC-ins388-A1과 반응시켰다. 동일한 기질 및 효소 농도를 항-Her2-HC-ins388-A1 항체와의 상응하는 접합 반응에 사용하였다. 둘 다의 효소적 반응을 12.5 mM MgCl2 및 20 mM NaCl을 함유하는 75 mM 트리스 완충제 (pH 8.0) 중에서 23℃에서 대략 16시간 동안 수행하였다. 접합 후에, 둘 다의 항체 구축물을 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (단백질 A-세파로스™, 지이 헬스케어 라이프 사이언시스)에 의해 정제하여 과량의 시약 및 효소를 제거하였다. 항체 용리는 75 mM 아세트산나트륨 완충제 (pH 3.0)를 사용하여 수행하였다. 산성 용액을 1 M 트리스 완충제 (pH 8.0)로 즉시 중화시킨 다음, PD-10 탈염 칼럼 (지이 헬스케어)을 사용하여 PBS로 완충제 교환하였다. ESI-MS 분석을 위해, 완충제 교환된 항체 구축물을 탈글리코실화하고 환원시켰다. ESI-MS 분석은 케톤-관능화된 항체, 항-Her2-HC-ins388-A1-CoA-1 및 항체 20507-HC-ins388-A1-CoA-1 (표 9)의 형성을 확인시켜주었다.
2.5% (v/v) DMSO를 함유하는 100 mM 아세트산나트륨 완충제 (pH 5.0) 중 케톤-관능화된 항체 (25 μM 항-Her2-HC-ins388-A1-CoA-1 또는 항체 20507-HC-ins388-A1-CoA-1)의 용액에 500 μM의 아미노옥시-관능화된 화합물 (화합물 CL-22) (항체보다 20-배 몰 과량)을 첨가하고, 23℃에서 2일 동안 인큐베이션하였다. 과량의 시약을 크기-배제 크로마토그래피 정제에 의해 제거하였다. 탈글리코실화 및 환원된 샘플의 ESI-MS 분석은 옥심-연결된 ADC, 항-Her2-HC-ins388-A1-CoA-1-CL-22 및 항체 20507-HC-ins388-A1-CoA-1-CL-22의 형성을 확인시켜주었다 (표 9). Cys 돌연변이체 항체에의 화학적 접합과 유사하게 (실시예 99), 삽입된 A1 펩티드를 통한 효소적 접합도 또한 약 95%의 높은 효율로 진행되었고 (표 11), 1% 미만의 검출가능한 응집체와 함께 단량체인 접합체를 생성하였다 (표 10).
또한 이러한 2-단계 접근법을 사용하여 화학식 I의 화합물을 ybbR 및 S6-5aa 태그를 함유하는 항-Her2 항체에 CH1 도메인 및 CH3 도메인 내의 부위에서 부착시켰다. PPTase 촉매작용을 사용하여 생물직교 케톤 기 (CoA-1)를 항-Her2 항체의 매립된 ybbR 및 S6-5aa 태그에 부위-특이적으로, 효소적으로 접합시켰다. 항-Her2-HC-ins388-ybbR 항체를, 감소된 농도의 1.5 μM Sfp PPTase를 사용하는 것을 제외하고, A1 태그에의 효소적 접합에 대해 상기 기재된 것과 완전히 동일한 조건 하에 CoA-1과 접합시켰다. 또한, 상승된 농도의 CoA-1 (100 μM) 및 Sfp PPTase (3 μM)를 사용하는 것을 제외하고, A1 태그에의 효소적 접합에 대해 상기 기재된 것과 동일한 조건을 항-Her2 HC-P189G-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L (S6-5aa 태그 함유)의 접합에 사용하였다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (맙셀렉트 슈어(MabSelect SuRe)™ 수지, 지이 헬스케어 라이프 사이언시스)에 의해 Sfp PPTase 및 과량의 케톤-CoA 유사체 (CoA-1)를 제거한 후, 케톤-활성화된 항체 항-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-1 및 항-Her2 HC-P189G-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L-CoA-1을 IgG 용리 완충제 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))로 용리시켰다. 중화된 항체 용액을 PD-10 탈염 칼럼 (지이 헬스케어)을 사용하여 PBS로 완충제-교환하였다.
이어서 2-단계 방법의 제2 단계는 후속 옥심 라이게이션을 통한 세포독성 페이로드의 케톤-활성화된 항체; 항-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-1, 및 항-Her2-HC-P189G-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L-CoA-1에의 부위-특이적 부착을 수반하였다. 구체적으로, 67 μM의 항-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-1을 6.7% (v/v) DMSO를 함유하는 100 mM 아세트산나트륨 완충제 (pH 4.0) 중 20-배 과량의 화합물 CL-22 또는 화합물 CL-35 (1.33 mM)와 37℃에서 대략 16 - 24시간 동안 접합시켰다. 더 낮은 DMSO 농도 (5.0% (v/v))를 제외하고 동일한 접합 조건을 사용하여 1.0 mM의 화합물 CL-35를 67 μM의 케톤-관능화된 항체 항-Her2 HC-P189G-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L-CoA-1에 접합시켰다. 접합 후에, 과량의 아미노옥시 시약을 하이로드(HiLoad) 26/600 슈퍼덱스 200 정제용 등급 칼럼 (지이 헬스케어) 또는 하이로드 16/600 슈퍼덱스 200 정제용 등급 칼럼 (지이 헬스케어) 상에서 정제용 크기-배제 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 약물-대-항체 비를 PLRP-S 칼럼 상에서의 분석용 역상 HPLC (4000 Å, 5 μm, 50 x 4.6 mm, 애질런트 테크놀로지스, 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 물 중 30 - 60% 아세토니트릴의 5-분 선형 구배, 유량 1.5 mL/분 및 칼럼 온도 80℃)에 의해 결정하였다. HPLC 트레이스를 280 nm의 파장에서 모니터링한 후, 접합 및 비-접합된 항체의 피크를 적분하였다. 이러한 2-단계 접근법을 사용하여 수득된 ADC에 대해, 표 9는 예상 질량을 관찰 질량과 비교하고, 표 10은 접합 효율, DAR 및 응집을 제시한다.
<표 9> 효소적으로 접합된 ADC의 특징화
a HC-ins388-A1 및 HC-ins388-ybbR은 Eu 넘버링 시스템에 따라 중쇄의 Glu388 다음에의 A1 펩티드 또는 ybbR 펩티드 각각의 삽입을 지칭한다. 나머지 숫자는 접합 단계에 사용된 CoA 유사체 및 화합물을 기재한다. 항-Her2-HC-ins388-A1, 항-Her2-HC-ins388-ybbR, 항-Her2 HC-P189G-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L 및 항체 20507-HC-ins388-A1을 먼저 화합물 CoA-1과 효소적으로 접합시킨 다음, 화합물 CL-22 또는 CL-35와 옥심 라이게이션시켰다.
b 애질런트 6520 Q-TOF 기기 (애질런트 테크놀로지스) 상에서 검출된 바와 같은 달톤 단위의 질량.
c 접합된 중쇄에 대해 예측된 달톤 단위의 질량.
d 비커플링된 중쇄에 대해 예측된 달톤 단위의 질량.
e 예측 질량은 N-말단 글루타민 잔기의 피로글루타메이트 형성을 기초로 한다.
<표 10> 효소적으로 접합된 ADC의 특성
a HC-ins388-A1 및 HC-ins388-ybbR은 Eu 넘버링 시스템에 따라 중쇄의 Glu388 다음에의 A1 펩티드 또는 ybbR 펩티드 각각의 삽입을 지칭한다. 나머지 숫자는 접합 단계에 사용된 CoA 유사체 및 화학식 I의 화합물을 기재한다. 항-Her2-HC-ins388-A1, 항-Her2-HC-ins388-ybbR, 항-Her2 HC-P189G-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L 및 항체 20507-HC-ins388-A1을 먼저 화합물 CoA-1과 효소적으로 접합시킨 다음, 화합물 CL-22 또는 CL-35와 옥심 라이게이션시켰다.
b 접합 효율은 역상 HPLC에 의해 측정되었고, ADC로 전환된 항체의 백분율을 기재한다.
c 분석용 역상 HPLC에 따른 약물-대-항체 비.
d 응집은 분석용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정되었고, 이량체 및 올리고머 종을 포함한다.
e DAR 및 접합 효율은 HPLC 피크 높이에 기초하여 추정되었다.
* ND: 결정되지 않음 및 NA: 적용가능하지 않음
실시예 102: 화학효소적으로 합성된 CoA 유사체를 사용한 항체-약물 접합체의 2-단계 제조
2-단계 표지화 접근법의 또 다른 측면에서, 변형된 CoA 유사체를 CoA 생합성 효소 CoAA, CoAD, 및 CoAE를 사용하여 화학효소적으로 제조하였다 (Worthington AS, Burkart MD (2006) Org. Biomol. Chem. 4:44-46) (Kosa NM, Haushalter RW, Smith AR, Burkart MD (2012) Nat Methods 9:981-984). 이러한 접근법을 채택하여, 케톤-관능화된 CoA 유사체 CoA-(i-12), CoA-(i-14), 및 CoA-(i-15)를 각각 상응하는 판토테네이트 전구체 분자 i-12, i-14, 및 i-15 (실시예 93, 95 및 96)로부터 제조하였다. 마찬가지로, 아지드-관능화된 CoA 유사체 CoA-(i-13)를 각각의 판토테네이트 유도체 i-13 (실시예 94)으로부터 화학효소적으로 합성하였다.
CoA 유사체 CoA-(i-12), CoA-(i-13), 및 CoA-(i-14)의 조 제제 (실시예 93-95 참조)를 대략 30 μM의 최종 농도에서 항-Her2-HC-ins388-ybbR 항체 (2.5 μM)에의 접합을 위해 사용하였다. 표지화를 12.5 mM MgCl2 및 20 mM NaCl로 보충된 75 mM 트리스-HCl 완충제 (pH 8.0) 중 1.5 μM 비. 서브틸리스 Sfp PPTase의 존재 하에 23℃에서 약 16시간 동안 수행하였다. 유사하게, 대략 25 μM의 CoA-(i-15) (실시예 96에서 제조됨)를 2 μM Sfp 효소의 존재 하에 그 외에는 동일한 조건 하에서 2.5 μM의 항-Her2-HC-ins388-ybbR 항체에 접합시켰다. 화학효소적으로 합성된 CoA 유사체의 접합이 추가로 상이한 표지화 부위에 대해 입증되었다. 상기 기재된 접합 반응과 유사하게, 2.5 μM의 항-Her2 HC-P189G-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L 항체를 12.5 mM MgCl2 및 20 mM NaCl로 보충된 75 mM 트리스-HCl 완충제 (pH 8.0) 중 3 μM Sfp 효소의 존재 하에 대략 100 μM의 CoA-(i-12)와 커플링시켰다. 반응 혼합물을 23℃에서 약 16시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 언급된 표지화 반응과 대조적으로, 이. 콜라이로부터의 돌연변이된 AcpS PPTase, AcpS R26L-C119S를 사용하여 CoA-(i-12) 또는 CoA-(i-14) (각각 400 μM)를 항-Her2 HC-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L 항체 (10 μM)에 접합시켰다. 이러한 돌연변이체 효소의 40 μM의 최종 농도를 사용하여, 커플링 반응을 10 mM의 MgCl2를 함유하는 76 mM HEPES 완충제 (pH 7)의 존재 하에 37℃에서 16시간 동안 수행하였다. 또한 동일한 반응 조건을 사용하여 40 μM의 AcpS R26L-C119S 돌연변이체의 존재 하에 항-Her2 HC-S119G-T120D-K121S-G122L-P123D-ins123-MLEW 항체 (10 μM)를 CoA-(I-13) (333 μM)와 접합시켰다. 모든 생물직교 표지된 항체를 맙셀렉트 슈어™ 수지 (지이 헬스케어 라이프 사이언시스) 또는 r단백질 A 세파로스 패스트 플로우 수지 (지이 헬스케어 라이프 사이언시스)를 사용하여 친화도-정제하였다. 정제 후, 중화된 항체 용액을 PBS로 완충제-교환하였다. 조작된 항체에의 케톤 및 아지드 모이어티의 공유 부착은 PNGase F 및 TCEP를 사용한 샘플 처리 후에 질량 분광측정 분석에 의해 확인하였다 (표 11).
케톤 및 아지드 모이어티에 의한 부위-특이적 항체 표지화는 2-단계 방법의 제2 단계로서 각각 옥심 라이게이션 및 구리-무함유 클릭 화학을 통해 후속 페이로드 접합을 가능하게 하였다. 케톤-활성화된 항체 항-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-(i-12) 및 항-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-(i-14) (각각 67 μM)를 7 - 13% (v/v) DMSO를 함유하는 100 mM 아세트산나트륨 완충제 (pH 4) 중에서 20-배 과량의 아미노옥시-관능화된 페이로드 CL-22 및 CL-35 (각각 1.33 mM)와 37℃에서 대략 16시간 동안 반응시켰다. 항-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-(i-14)와 화합물 CL-36 및 CL-37의 옥심 라이게이션을 보다 높은 pH 값 5를 제외하고 동일한 조건 하에 수행하였다. 유사하게, 67 μM의 항-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-(i-15)를 5% (v/v) DMSO를 함유하는 100 mM 아세트산나트륨 완충제 (pH 4) 중에서 15-배 과량의 CL-22 및 CL-36 (각각 1.0 mM)과 37℃에서 약 16시간 동안 반응시켰다. CL-37 (1.0 mM) 및 CL-35 (0.5 mM)를 갖는 동일한 항체 구축물의 표지화를 위해 인큐베이션 시간을 2일로 연장하였다. 접합 전략을 상이한 표지화 부위로 확장하기 위해, 항-Her2 HC-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L-CoA-(i-14) 및 항-Her2 HC-S119G-T120D-K121S-G122L-P123D-ins123-MLEW-CoA-(i-14) (각각 60 μM)를 5% (v/v) DMSO를 함유하는 190 mM 아세트산나트륨 완충제 (pH 5) 중에서 15-배 과량의 CL-22 페이로드 (0.9 mM)와 접합시켰다. 둘 다의 옥심 라이게이션을 23℃에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 항-Her2 HC-S119G-T120D-K121S-G122L-P123D-ins123-MLEW-CoA-(i-14) (30 μM)를 또한 CL-35 (0.89 mM)와 37℃ 및 pH 5에서 약 24시간 동안 접합시켰다. 또한, 항-Her2 HC-S119G-T120D-K121S-G122L-P123D-ins123-MLEW-CoA-(i-15) (33 μM)를 2.5% (v/v) DMSO를 함유하는 200 mM 아세트산나트륨 완충제 (pH 4.0) 중에서 23℃에서 2일 동안 CL-22 페이로드 (500 μM)에 접합시켰다. 마지막으로, 항-Her2 HC-P189G-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L-CoA-(i-12) 및 항-Her2 HC-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L-CoA-(i-12) (각각 67 μM)를 37℃에서 약 16 - 24시간 동안 5% (v/v) DMSO를 함유하는 100 mM 아세트산나트륨 완충제 (pH 4) 중 15 당량의 CL-35 (1 mM)와 접합시켰다.
항체 표지화 후에, 과량의 시약을 하이로드 26/600 슈퍼덱스 200 정제용 등급 칼럼 (지이 헬스케어) 또는 하이로드 16/600 슈퍼덱스 200 정제용 등급 칼럼 (지이 헬스케어) 상에서 정제용 크기-배제 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 약물-대-항체 비 (DAR)를 PLRP-S 칼럼 상에서의 분석용 역상 HPLC (4000 Å, 5 μm, 50 x 4.6 mm, 애질런트 테크놀로지스, 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 물 중 30 - 60% 아세토니트릴의 5-분 선형 구배, 유량 1.5 mL/분 및 칼럼 온도 80℃)에 의해 결정하였다. HPLC 트레이스를 280 nm의 파장에서 모니터링한 후, 접합 및 비-접합된 항체의 피크를 적분하였다. 표 11은 아미노옥시-펩티드 유사체 CL-22, CL-35, CL-36 및 CL-37로 표지된 케톤-활성화된 항-Her2 항체에 대해 수득된 질량을 제시하고, 표 12는 이들 표지된 항체에 대해 관찰된 접합 효율, DAR 및 응집을 제시한다.
조작된 항체에의 아지드 모이어티의 부위-특이적 부착은 구리-무함유 클릭 화학을 통해 후속 페이로드 접합을 가능하게 하였다. 이는 비시클로[6.1.0]노닌 (BCN)-관능화된 페이로드 CL-33의 존재 하에 아지드-활성화된 항-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-(i-13) 항체와 함께 수행된 균주-촉진 알킨-아지드 고리화첨가를 사용하여 입증되었고, 여기서 127 μM 항-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-(i-13)를 1 M NaCl 및 6% (v/v) DMSO로 보충된 100 mM 인산나트륨 완충제 (pH 7.5) 중 10-배 몰 과량의 BCN-관능화된 페이로드 CL-33 (1.27 mM)에 첨가하였다. 23℃에서의 대략 16시간의 인큐베이션 후에, 과량의 BCN 시약을 맙셀렉트 슈어™ 수지 (지이 헬스케어 라이프 사이언시스)를 사용하여 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 제거하였다. IgG 용리 완충제 (써모 사이언티픽)를 사용하여 용리를 수행한 다음, 1 M 트리스-HCl 완충제 (pH 8)로 중화시키고, PBS로 완충제 교환하였다. BCN-관능화된 페이로드 CL-33으로 표지된 이러한 아지드-활성화된 항-Her2 항체에 대해 수득된 질량을 표 11에 제시하고, 표 12는 이러한 ADC에 대해 관찰된 접합 효율, DAR 및 응집을 제시한다. DAR 값은 10 μL의 50% 슬러리의 IgG 세파로스 6 패스트 플로우 (지이 헬스케어) 중 BCN-관능화된 페이로드 CL-33으로 표지된 10 μg의 이러한 아지드-활성화된 항-Her2 항체를 사용하여 수득하였다. 수지 결합을 23℃에서 1시간 동안 경도 교반 하에 수행하였다. 수지를 PBS로 세척한 후, 친화도-결합된 ADC를 5 μg의 PNGase F의 첨가 후 37℃에서의 3시간 동안의 인큐베이션에 의해 탈글리코실화하였다. PBS로 친화도 수지를 세척하여 PNGase F 효소를 제거하였다. 다음으로, 탈글리코실화된 샘플을 1% 포름산을 사용하여 용리시키고, 이어서 10 M 아세트산암모늄 (pH 5)을 사용하여 즉시 중화시켰다. 항체 구축물을 중쇄 및 경쇄로 효과적으로 환원시키기 위해, 20 μL의 용리액을 10 M 아세트산암모늄 (pH 5) 중 6 M 구아니딘 히드로클로라이드를 함유하는 100 mM 포름산나트륨 완충제 (pH 4.0) 10 μL 및 0.66 M TCEP 5 μL로 보충하였다. 23℃에서 적어도 30분 동안 인큐베이션한 후에, 환원 및 탈글리코실화된 샘플을 6550 아이퓨넬(iFunnel) Q-TOF LC/MS 시스템 (애질런트 테크놀로지스) 상에 주입하였다. 매스헌터(MassHunter) 정성 분석 소프트웨어 (애질런트 테크놀로지스)를 스펙트럼 기록 및 스펙트럼 디컨볼루션의 프로세싱에 사용하였다.
<표 11> 항체 및 생물직교 CoA 유사체를 함유하는 ADC의 질량 분광측정 분석
a HC-ins388-ybbR은 Eu 넘버링 시스템에 따라 중쇄의 Glu388 다음에의 ybbR 펩티드의 삽입을 지칭한다. 나머지 숫자는 접합 단계에 사용된 CoA 유사체 및 화합물을 기재한다. 예를 들어, 항-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-(i-12)-CL-22를 먼저 화합물 CoA-(i-12)와 효소적으로 접합시킨 다음, 화합물 CL-22와 옥심 라이게이션시켰다.
b 애질런트 6520 Q-TOF 기기 (애질런트 테크놀로지스) 상에서 검출된 바와 같은 달톤 단위의 질량.
c 접합된 중쇄에 대해 예측된 바와 같은 달톤 단위의 질량.
d 비커플링된 중쇄에 대해 예측된 바와 같은 달톤 단위의 질량.
e 관찰 질량은 50655.1 Da의 예측 질량을 갖는 CoA 유사체의 1급 아민에 가장 유력하게 상응한다 (아지드 모이어티의 환원으로부터 유래됨).
<표 12> 항체 및 생물직교 CoA 유사체를 함유하는 ADC의 특성
a HC-ins388-ybbR은 Eu 넘버링 시스템에 따라 중쇄의 Glu388 다음에의 ybbR 펩티드의 삽입을 지칭한다. 나머지 숫자는 접합 단계에 사용된 CoA 유사체 및 화합물을 기재한다. 예를 들어, 항-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-(i-12)-CL-22를 먼저 화합물 CoA-(i-12)와 효소적으로 접합시킨 다음, 화합물 CL-22와 옥심 라이게이션시켰다.
b 접합 효율은 분석용 역상 HPLC에 의해 측정되었고, ADC로 전환된 항체의 백분율을 기재한다.
c 분석용 역상 HPLC에 따른 약물-대-항체 비 (DAR).
d 응집은 분석용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정되었고, 이량체 및 올리고머 종을 포함한다.
e 접합 효율은 ESI-MS에 의해 측정되었고, ADC로 전환된 항체의 백분율을 기재한다.
f ESI-MS에 따른 약물-대-항체 비.
g DAR 및 접합 효율은 HPLC 피크 높이에 기초하여 추정되었다.
* ND: 결정되지 않음; NA: 적용가능하지 않음
실시예 103: 비-조작된 항체의 천연 디술피드 결합의 부분 환원을 통한 항체 약물 접합체의 제조
본 발명의 세포독성 약물을 또한 항체의 부분 환원을 수반하는 절차를 사용하여 비-조작된 항체의 천연 시스테인 잔기에 접합시킬 수 있다 (Doronina, S. O., Toki, B. E., Torgov, M. Y., Mendelsohn, B. A., Cerveny, C. G., Chace, D. F., DeBlanc, R. L., Gearing,R. P., Bovee, T. D., Siegall, C. B., Francisco, J. A., Wahl, A. F., Meyer, D. L., 및 Senter, P. D. (2003) Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy. Nat. Biotechnol. 21, 778-84). 본 실시예에서, 5 내지 10 mg/ml의 농도의 항-Her2 및 항체 20507 항체의 쇄간 및 쇄내 디술피드 결합을 먼저 2 mM EDTA를 함유하는 PBS에서, 고체 메르캅토에틸아민을 50 mM의 최종 농도로 첨가하고 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 부분 환원시켰다. 탈염 및 1% w/v PS-20 세제의 첨가 후에, 부분 환원된 항체 (1-2 mg/ml)를 10 mg 항체당 0.5 내지 1 mg CL-9와 4℃에서 밤새 반응시켰다. 생성된 ADC를 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. PBS로 기준선 세척한 후에, 접합체를 50 mM 시트레이트, pH 2.7, 140 mM NaCl로 용리시키고, 중화시키고, 멸균 여과하였다. 생성된 ADC, 항-Her2-CL-9 및 항체 20507-CL-9의 평균 DAR은 각각 4.1 및 3.9인 것으로 결정되었다. 항-Her2-CL-9 및 항체 20507-CL9 ADC의 선택된 특성을 표 13에 요약한다.
실시예 104: 비-조작된 항체의 천연 디술피드 결합을 재연결시키기 위한, 1,3-디클로로프로판-2-온을 사용한 항체 약물 접합체의 제조
실시예 103에서의 절차를 사용한 비-조작된 항체의 천연 시스테인 잔기에의 접합은 자연적으로 항체를 안정화시키는 일부 천연 디술피드 결합을 파괴하여 약물 접합 후에 그 상태로 남는다는 단점을 갖는다. 이러한 단점을 극복하는 대안적 방법에서, 항체의 쇄간 및 쇄내 디술피드 결합을 먼저 환원시킨 다음 1,3-디클로로프로판-2-온과의 반응을 통해 화학적으로 재연결시킨다. 상기 방법에서, 항체 내의 4개의 천연 쇄간 디술피드 결합은 3개의 탄소 "케톤 가교"에 의해 대체된다 (반응식 36). 이어서 케톤 기를 제2 단계에서 세포독성 약물과 특이적으로 접합시킬 수 있다. 생성된 ADC는 항체의 4개의 천연 쇄간 디술피드 결합의 위치에서 특이적으로 부착된 최대 4개의 약물을 갖는다. 부분 환원된 천연 디술피드에의 전통적인 접합 (실시예 103)과 대조적으로, 본 실시예에서 제조된 ADC가 더 안정하다.
한 예에서, 비-조작된, 재조합 항체 20507을 표준 방법에 의해 및 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 정제 후에, 항체 20507을 반응식 36에 따라 2 단계로 세포독성 약물에 접합시켰다.
<반응식 36>
단계 1 - 천연 디술피드 가교의 환원 및 1,3-디클로로프로판-2-온을 사용한 재-가교: TCEP·HCl (41.4 μg, 0.144 μmol)을 4℃에서 항체 20507 (1770 μg, 0.012 μmol, 0.25 M 트리스 pH 7.4 중 147 μL) 및 1,3-디클로로프로판-2-온 (193 μg, 1.443 μmol)의 용액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 4℃에서 4시간 동안 유지시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 제바 스핀 칼럼 7K MWCO (0.5 mL)를 사용하여 용리 완충제로서 PBS (pH 7.4)에 의해 4회 탈염시켜 변형된 항체 20507: 144483 Da (PNGase F (뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))에 의한 탈글리코실화 후)을 수득하였다. ESI (용리액 A: 물 + 0.1% 포름산, 용리액 B: 아세토니트릴 + 0.04% 포름산. 구배: 2분 내 3에서 80% B - 유량 1.0 mL/분. 칼럼: 프로스위프트 모노리스(Proswift Monolith) 4.6*50 mm 40℃).
단계 2 - 세포독성 약물의 접합: (S)-2-((비스(디메틸아미노)메틸렌)아미노)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-(아미노옥시메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필술폰아미도)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄 (CL-22) (304 μg, 0.326 μmol, 3.04 μL, DMSO 중) 및 3,5-디아미노벤조산 (681 μg, 4.48 μmol, 2.27 μL, DMSO 중)의 용액을 단계 1로부터의 변형된 항체의 용액 (1200 μg, 0.0081 μmol, PBS pH 7.4 중 118 μL)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 23℃에서 15시간 동안 유지시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 제바 스핀 칼럼 7K MWCO (2 mL)를 사용하여 용리 완충제로서 PBS (pH 7.4)에 의해 탈염시켰다 (3x). 생성된 ADC, 항체 20507-CL-22는 MS에 의해 결정된 바와 같이, 평균 DAR 3.8을 가졌다. ADC의 일부 특성을 표 13에 제시한다.
실시예 105: 화학식 I의 리신 반응성 화합물을 사용한 항체 약물 접합체의 제조
본 발명의 세포독성 약물을 또한 비-조작된 항체의 천연 리신 잔기에 접합시킬 수 있다. 이는, 예를 들어 NHS 에스테르 또는 펜타플루오로페닐 (PFP) 에스테르 기에 연결된 세포독성 약물을 유리 아민이 결여된 PBS 완충제 중 중성 pH 하에 비-조작된 항체와 반응시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 약물 내의 NHS 또는 PFP 에스테르 기는 항체 내의 리신 잔기와 용이하게 반응한다 (Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, 1996; Basle E, Joubert N, Pucheault M. Chem Biol. 2010, 17:213-227. Protein chemical modification on endogenous amino acids). 한 예에서, 비-조작된 항-Her2 및 항체 20507 항체를 화합물 CL-32 또는 CL-41과 각각 10:1 및 4:1의 몰 화합물 대 항체 비로 반응시켰다. 생성된 ADC, 항-Her2-CL-32, 항-Her2-CL-41 및 항체 20507-CL-32는 각각 평균 DAR 4.7, DAR1.3 및 DAR 2.7을 가졌다 (표 13). 항-Her2-CL-32 및 항체20507-CL-32의 일부 특성이 표 13에 열거되어 있다.
<표 13> 비-조작된 항체를 사용하여 제조된 다양한 ADC의 특성
표 5 및 6에 개시된 화학식 II 및 화학식 III의 면역접합체는 항-Her2 및 항체 20507 Cys 돌연변이체 항체를 연결된 말레이미드 모이어티를 갖는 화학식 I의 특정 화합물과 접합시켜 수득하였고, 본 발명의 다른 링커-페이로드 조합을 또한 표 8-13에 개시된 면역접합체에 의해 예시되는 바와 같이 사용하였다. 또한 관련 기술분야에 공지되고 실시예 103, 실시예 104 및 실시예 105에 제시된 바와 같은 방법을 사용하여 비-조작된 항체에의, 특히 시스테인 또는 리신 잔기에서의 접합이 또한 가능하고, 이는 표 13에서 면역접합체에 의해 예시된다.
모든 예시적인 ADC를 실시예 107에 기재된 바와 같이 시험관내 세포 사멸 효력에 대해 시험하였다. 약동학적 연구 (실시예 108) 및 생체내 효능 연구 (실시예 109)를 본 발명의 선택된 면역접합체에 대해 수행하였다.
실시예 106: 화학식 I의 화합물의 시험관내 세포 사멸 검정
화학식 I의 화합물의 시험관내에서의 세포 사멸 효력의 평가를 위해, 세포 증식 검정을 8종의 세포주를 사용하여 병행하여 수행하였다: MDA-MB231 클론 16, 클론 40, JimT1, HCC1954, NCI-H526, KU812, CMK11-5 세포 및 Jurkat 세포. 세포주는 실시예 107에서 보다 상세하게 기재되어 있고, 또한 본 발명의 면역접합체의 시험관내 효능을 평가하기 위해 사용하였다. 세포를 다양한 농도의 화합물과 인큐베이션하고 5일 후에 셀-타이터-글로(Cell-Titer-Glo)™ (프로메가(Promega))를 사용하여 세포 증식 검정을 수행하였다 (Riss et al., (2004) Assay Drug Dev Technol. 2:51-62). 일부 연구에서, 세포 기반 검정은 고처리량이고, 자동화된 시스템 상에서 수행된다 (Melnick et al., (2006) Proc Natl Acad Sci U S A. 103:3153-3158). 화학식 I의 화합물의 특정 예에 대해 수득된 시험관내 세포 사멸 효력을 표 14에 제공한다.
<표 14> 화학식 I의 특정 화합물의 시험관내 세포 사멸 (IC50 [nM])
실시예 107: ADC의 시험관내 세포 사멸 효력을 측정하기 위한 세포 증식 검정
표적 항원을 자연 발현하는 세포 또는 표적 항원을 발현하도록 조작된 세포주는 ADC의 활성 및 효력을 검정하는데 빈번하게 사용된다. 시험관내에서 항-Her2 항체 ADC의 세포 사멸 효력을 평가하기 위해, 2종의 조작된 세포주, MDA-MB-231 클론 16 및 클론 40, 및 2종의 내인성 세포주 JimT-1 및 HCC1954 세포를 사용하였다 (Clinchy B, Gazdar A, Rabinovsky R, Yefenof E, Gordon B, Vitetta ES. Breast Cancer Res Treat. (2000) 61:217-228). MDA-MB-231 클론 16 세포는 세포 표면 상에서 높은 카피수 (~5x105 카피/세포)의 재조합 인간 Her2를 안정하게 발현하고, 클론 40은 인간 Her2를 낮은 수준 (~5x103 카피/세포)으로 발현한다. HCC1954 세포는 표면에서 높은 수준 (~5x105 카피/세포)의 재조합 인간 Her2를 내생적으로 발현하고, JimT-1 세포는 인간 Her2를 중간 수준 (~8x104 카피/세포)으로 발현한다. NCI-N87 세포는 높은 수준의 Her2를 발현하고, A375 세포는 낮은 수준의 Her2를 발현한다. ADC는 세포를 항원-의존성 방식으로 사멸시켜야 하고, 이는 항원이 결여된 세포가 아닌 세포 표면에서 충분한 항원을 발현하는 세포 만을 사멸시킬 것을 의미한다. 따라서, 세포 사멸은 MDA-MB-231 클론 40 세포에서 관찰되어서는 안된다.
항원-의존성 세포 사멸을 측정하기 위해, 상이한 세포 유형을 다양한 농도의 ADC와 인큐베이션하고 5일 후에 셀-타이터-글로™ (프로메가)를 사용하여 세포 증식 검정을 수행하였다 (Riss et al., (2004) Assay Drug Dev Technol. 2:51-62). 일부 연구에서, 세포 기반 검정은 고처리량이고, 자동화된 시스템 상에서 수행된다 (Melnick et al., (2006) Proc Natl Acad Sci U S A. 103:3153-3158).
본 발명의 화합물을 사용하여 제조되고 항-Her2 Cys 돌연변이체 항체에 부위-특이적으로 접합된 항-Her2 ADC (표 5 참조)를 상기 언급된 4종의 세포주에서 검정하여 그의 세포독성을 평가하였다. 2종 (항-Her2-LC-S159C-NL-34 및 -CL-6)을 제외한 모든 ADC는 높은 수준의 Her2 발현을 갖는 2종의 세포주; MDA-MB231 클론 16 및 HCC1954를 특이적으로 사멸시켰지만, 낮은 수준의 Her2를 발현하는 MDA-MB-231 클론 40 세포는 사멸시키지 않았다 (도 1, 표 15). MDA-MB-231 클론 16 및 HCC1954 세포 검정에서 항-Her2 ADC의 IC50 값은 20 pM 내지 300 pM의 범위였다 (표 15). 2종의 페이로드를 사용하여 제조된 ADC (항-Her2-LC-S159C-NL-34 및 -CL-6)는 검정에서 어떠한 세포주에 대해서도 세포독성을 제시하지 않았다. 중간 수준의 Her2 발현을 갖는 세포주인 JimT-1 세포에서, ADC에 의한 세포 사멸 활성은 광범위하게 달랐다. 일부 페이로드 (화합물: CL-5, NL-38, NL-30, NL-19, NL-21, CL-24)를 갖는 ADC는 HCC1954 및 MDAMB231-16 세포에서 활성이었지만, JimT-1 세포에서는 그렇지 않았다. 많은 ADC가 JimT-1 세포를 HCC1954 및 MDAMB231-16 세포만큼 효과적으로 사멸시켰다 (도 1, 표 15). JimT-1 세포 증식 검정에서 (표 15), 본 발명의 많은 페이로드를 갖는 항-Her2 ADC는 널리 특징화된 참조 페이로드를 함유하는 ADC인 항-Her2-MMAF보다 더 높은 세포독성을 나타내었다 (Svetlana O. Doronina, Brian A. Mendelsohn, Tim D. Bovee, Charles G. Cerveny, Stephen C. Alley, Damon L. Meyer, Ezogelin Oflazoglu, Brian E. Toki, Russell J. Sanderson, Roger F. Zabinski, Alan F. Wahl, 및 Peter D. Senter, Bioconjugate Chem. 2006, 17, 114-124). 항-Her2-LC-S159C ADC 사이에서, JimT-1 세포에서 관찰된 세포독성 효력의 유의차는 페이로드의 효력의 등급화를 가능하게 한다. 결과는 본 발명의 다양한 화합물을 갖는 항-Her2 ADC가 Her2+ 세포를 Her2 의존성 방식으로 사멸시키고, ADC는 다중 세포 유형에 대해 고도로 활성임을 나타낸다. 이는 본 발명의 유리, 비접합된 화합물에 의한 높은 및 낮은 둘 다의 Her2 발현 세포주의 시험관내 세포 사멸과 대조적이다 (실시예 106, 표 14 참조).
화학식 I의 화합물이 또한 다른 항체에 접합된 경우에도 활성인지 여부를 확인하기 위해, 여러 화합물 (CL-1, CL-6, CL-9, NL-4)을 항체 20507 Cys 돌연변이체 항체에 접합시켰고 (표 6), 그의 표적 항원은 H526, KU812 및 CMK11-5 세포에서는 발현되지만 Jurkat 세포에서는 그렇지 않아서, 세포 사멸은 Jurkat 세포주에 대해 관찰되어서는 안된다. 도 2 및 표 16에 제시된 바와 같이, Her2+ 세포에서 세포 사멸 활성을 제시한 페이로드 링커 조합 (CL-1, CL9, NL-4)은 또한 항체 20507에 접합된 경우에도 활성이어서, 표적 항원을 발현하는 세포를 사멸시킨다. 항-Her2-CL-6 ADC가 Her2+ 세포에서 어떠한 세포독성도 갖지 않는다는 관찰과 일치하게, 항체 20507-CL-6 ADC는 또한 항원 발현 세포를 사용한 세포 사멸 검정에서 활성이지 않았다 (표 16). 결과는 본원에 기재된 화합물이 광범위한 세포 유형에 대해 세포독성을 제시한다는 것을 나타낸다.
ADC 내의 세포독성 약물 페이로드가 세포 독성의 주요 원인이기 때문에, 약물 대 항체 비 (DAR)를 증가시키는 것은 ADC의 세포독성 효력을 증진시켜야 한다. 본 발명자들은 2종의 DAR 4 ADC, 항체 20507-HC-K360C-LC-K107C-CL-9 및 항체 20507-HC-E152C-S375C-CL-9의 세포독성 활성을 세포 증식 검정에서 시험하였다. 표 16에 제시된 바와 같이, 2종의 DAR 4 ADC는 상응하는 DAR 2 ADC보다 낮은 IC50 값으로 항원-의존성 방식으로 세포 증식을 억제하였고, 이는 각각의 항체에의 4종의 CL-9 페이로드 분자의 접합이, 예상되는 바와 같이, 항체의 특이성을 희생시키지 않으면서 ADC의 세포독성 효력을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
본 발명의 화합물은 광범위한 접합 방법에 의해 접합에서 ADC 페이로드로서 효과적으로 이용될 수 있다. Cys 조작된 항체를 사용하여 제조된 고도로 강력한 ADC에 더하여 (상기 논의; 실시예 99), 본 발명의 면역접합체를 4종의 다른 접합 방법을 사용하여 제조하였다: 태그부착된 항체를 사용한 효소적 방법을 사용한 접합 (실시예 101-103), 및 천연 디술피드 결합의 부분 환원을 통한 (실시예 103), 환원된 천연 디술피드 결합의 "케톤-가교"를 통한 (실시예 104), 및 천연 리신 잔기를 통한 (실시예 105) 비-조작된 항체의 접합.
Cys 조작된 ADC에 더하여, 후자의 4종의 방법을 사용하여 제조된 ADC는 또한 고도로 세포독성이고 세포를 항원-의존성 방식으로 사멸시키는 것으로 입증되었다. 특히, 페이로드 CL-22는 CL-9와 유사한 코어 구조를 갖고, 히드록실 아민 모이어티를 함유하여 말레이미드 모이어티를 대체한다. CL-22를 실시예 101-103에 기재된 바와 같은 효소-매개된 접합 방법 및 실시예 104에 기재된 바와 같은 케톤 가교-기반 방법을 통해 항체 20507에 접합시켰다. 생성된 2종의 ADC는 항체 20507-HC-ins388-A1-CoA-1-CL-22 및 항체 20507-CL-22였다. 2종의 ADC를 상기 기재된 바와 같이 세포 증식 검정에서 시험하였다. 동일한 접합 비를 갖지만 (DAR 2), 효소적으로 접합된 ADC, 항체 20507-HC-ins388-A1-CoA-1-CL-22는 상응하는 CL-9-접합된 DAR 2 Cys ADC와 비교하여 2 - 3배 더 높은 IC50 값을 나타내었다 (표 16). 한편, DAR 4를 갖는 케톤 가교된 ADC, 항체 20507-CL-22는 IC50의 면에서 DAR 2 CL-9 Cys ADC와 유사한 효력을 제시하였고, DAR 4 CL-9 Cys ADC보다 덜 강력하였다 (표 16). CL-9는 그것이 항-Her2 및 항체 20507에 부위-특이적으로 접합된 경우에 강력한 페이로드이다. CL-9를 또한 항-Her2 및 항체 20507의 천연 Cys 잔기에 실시예 103에 기재된 바와 같은 부분 환원 방법을 통해 접합시켰다. 2종의 생성된 ADC: 항-Her2-CL-9 및 항체 20507-CL-9에 대한 평균 DAR 비는 각각 DAR 4.1 및 DAR 3.9였다 (표 13). 둘 다의 ADC는 시험관내 세포 기반 검정에서 강력하였고, IC50은 부위-특이적, Cys 조작된 CL-9 ADC의 그것과 유사하였다 (표 15 및 16). 항체 내의 리신 잔기를 NHS 에스테르 및 PFP 에스테르 함유 약물 페이로드와 접합시키는 것은 ADC 제조에서 통상적인 방법이다. CL-32 또는 CL-41을 항-Her2 및 항체 20507에 접합시켜 ADC를 제조하였다. 생성된 ADC, 항-Her2-CL-32, 항-Her2-CL-41 및 항체 20507-CL-32 (표 13)는 세포 기반 검정에서 높은, 항원-의존성 세포독성을 제시하였다 (표 15 및 표 16).
본 발명자들의 결과는 본 발명에 기재된 페이로드 부류가 상기 언급된 바와 같은 다양한 접합 방법을 사용하여 활성 ADC를 제조하는데 적합하다는 것을 입증한다. 강력한 ADC는 페이로드를 조작된 시스테인 잔기, 천연 시스테인 잔기, 리신 잔기, 및 특정 세린 잔기를 포함하는 항체 내의 다수의 다양한 접합 부위에 접합시키는 것으로부터 제조될 수 있다.
<표 15> 시험관내 세포 사멸 검정에서의 ADC 효력: MDA-MB231 클론 40, MDA-MB231 클론 16, HCC1954, JimT-1 NCI-N87, 및 A375 세포 증식 검정에서의 항-Her2 ADC의 IC50.
검정에 사용된 최고 농도는 모든 Cys ADC의 경우에 67 nM이었고, 항-Her2-HC-ins388-A1-CoA-1-CL-22의 경우에 61 nM이었다. IC50 값 67 nM은 검정에서의 ADC의 불활성을 나타낸다. ND: 결정되지 않음
<표 16> 시험관내 세포 사멸 검정에서의 ADC 효력: Jurkat, H526, KU812 및 CMK11-5 세포 증식 검정에서의 항체 20507 ADC의 IC50.
검정에 사용된 최고 농도는 67 nM이었다. IC50 값 67 nM은 따라서 검정에서의 ADC의 불활성을 나타낸다.
실시예 108: ADC 약동학적 연구
긴 혈청 반감기는 ADC의 높은 생체내 효능에 중요하다는 것이 입증된 바 있다 (Hamblett, et al., "Effects of drug loading on the antitumor activity of a monoclonal antibody drug conjugate," Clin Cancer Res., 10:7063-7070 (2004); Alley et al., Bioconjug Chem. 19:759-765 (2008)). 항체에 소수성 약물 페이로드를 부착하는 것은 항체의 특성에 영향을 미칠 수 있고, 이는 ADC의 생체내 신속한 클리어런스 (Hamblett et al., 2004) 및 불량한 생체내 효능으로 이어질 수 있다. 생체내 ADC의 클리어런스에 대한 다양한 화학식 I의 화합물의 접합의 효과를 평가하기 위해, 비-종양 보유 마우스에서 약동학적 연구를 수행하였다. 뮤린 혈장에서 면역접합체를 검출하기 위해, 본 발명에 기재된 다양한 화합물을 인식하는 항-MMAF 항체를 생성하였다. 면역접합체의 검출을 위한 ELISA 검정을, 혈장으로부터 인간 IgG 분자를 포획하기 위한 항-hIgG 항체, 및 2개의 개별 검정에서 신호 검출을 위한 제2 항-인간 IgG 항체 및 항-MMAF 항체를 사용하여 기로스(Gyros)™ 플랫폼 상에서 전개시켰다. 항-MMAF 항체는 본 발명의 화합물을 인식하고, 따라서 화합물이 부착된 ADC ("무손상" ADC)를 검출하는데 사용될 수 있다. 따라서, 2종의 ELISA 검정은 인간 항체 및 "무손상" ADC 각각의 혈청 농도를 측정한다.
PK 연구의 예를 도 3에 제시한다. 군당 3마리의 마우스에 표시된 ADC의 단일 용량을 투여하였다. 8종의 항-Her2 DAR 2 ADC, 항-Her2-LC-S159C-CL-9, 항-Her2-LC-S159C-NL-4, 항-Her2-LC-S159C-CL-1, 항-Her2-LC-S159C-CL-6, 항-Her2-LC-S159C-CL-10, 항-Her2-LC-S159C-CL-11, 항-Her2-LC-S159C-CL-12, 및 항-Her2-LC-S159C-NL-38 (도 3a, b), 2종의 항체 20507 DAR 2 ADC, 항체 20507-HC-E152C-CL-9, 및 항체 20507-HC-E152C-NL-4 (도 3c), 2종의 항체 20507 DAR 4 ADC, 항체 20507-HC-E152C-S375C-CL-9 및 항체 20507-HC-K360C-LC-K107C-CL-9 (도 3d), 2종의 효소적으로 접합된 ADC, 항-Her2-HC-ins388-A1-CoA-1-CL-22 및 항체 20507-HC-ins388-A1-CoA-1-CL-22 (도 3e), 천연 디술피드 결합의 부분 환원에 의해 제조된 항-Her2-CL-9 ADC (도 3f), 천연 리신 잔기를 통해 접합된 항-Her2-CL-32 ADC (도 3f) 뿐만 아니라 비접합된, 야생형 항-Her2 항체를 마우스에 1 mg/kg으로 투여하였다. 3주의 과정을 경과하여 혈장 샘플을 수집하고, ADC를 포함하는 IgG 분자 및 네이키드 항-Her2 항체 및 항체 20507을 포획하기 위한 항-hIgG 항체를 사용하여 ELISA 검정에 의해 검정하였다. 이어서 항-MMAF 및 항-hIgG 항체를 2개의 개별 검정에서의 검출을 위해 사용하였다. 항-MMAF 항체 검정은 접합체의 농도 만을 측정하고, 항-hIgG는 접합체 및 페이로드가 결여된 항체 둘 다를 정량화한다. 마우스에 주사된 것과 동일한 물질을 사용하여 각각의 ADC에 대해 개별적으로 표준 곡선을 생성하였다. 따라서 항-MMAF 및 항-hIgG를 사용한 검정은 마우스에의 주사 후 ADC의 약물 로딩에 대해 어떠한 변화도 발생하지 않은 경우에 동일한 농도 판독치를 생성해야 한다. 일부 페이로드를 상실한 ADC의 경우에, 항-MMAF 항체를 사용한 검정은 항-hIgG 검정보다 낮은 농도를 측정할 것이다. 따라서 2개의 농도 판독치의 비교는 마우스에서의 생체내 인큐베이션 동안 ADC로부터의 약물-방출의 측정을 가능하게 한다. 비교를 위해, 비접합된, 야생형 항-Her2를 사용한 PK 연구를 또한 수행하였다 (도 3f).
본 발명의 대부분의 항-Her2 ADC는 야생형, 비접합된 항체의 그것과 유사한 약동학을 나타내었다 (도 3f 참조). 도 3a 및 b에 제시된 바와 같이, 6종의 ADC (항-Her2-LC-S159C-CL-9, 항-Her2-LC-S159C-NL-4, 항-Her2-LC-S159C-CL-10, 항-Her2-LC-S159C-CL-11, 항-Her2-LC-S159C-CL-12, 및 항-Her2-LC-S159C-NL-38)의 경우에, 항-hIgG 검정 및 항-MMAF 검정 둘 다에 의해 수득된 혈장 농도는 근사하게 매칭되었고, 이는 시험 기간 동안 6종의 ADC에서 최소한의 약물 손실이 존재함을 나타내고, 그러한 6종의 페이로드 (CL-9, CL10, CL-11, CL-12 및 NL-4, NL-38) 및 그러한 페이로드의 링커가 마우스에서의 순환 동안 안정하다는 것을 나타낸다. 그러나, 1종의 ADC (항-Her2-LC-S159C-CL-1)의 경우에, 항-MMAF 검정 및 항-hIgG 검정의 결과는 서로 유의하게 상이하고, 이는 CL-1 페이로드가 항체로부터 상실되었음을 시사한다 (도 3b). ADC 투여 3주 후 마우스 혈장으로부터 단리된 항-Her2-LC-S159C-CL-1 ADC의 MS 분석은 CL-1 링커 내의 아미드 결합이 절단되었음을 나타내었고, 항-MMAF 검정으로부터의 결과를 확인시켜주었다.
항-MMAF 및 항-hIgG 검정 데이터 (도 3b)는 항-Her2-LC-S159C-CL-6이 비접합된 항-Her2 항체 (사각형, 도 3f)보다 마우스에서 순환으로부터 더 신속하게 소거된다는 것을 제시하였다. PK 연구는 6종의 페이로드 (CL-9, CL10, CL-11, CL-12 및 NL-4, NL-38)의 경우의 안정한 페이로드-링커 조합을 명확하게 확인하였다. 이들 페이로드 중 2종 (CL-9 및 NL-4)을 제2 항체, 항체 20507에 DAR 2 및 DAR 4 포맷으로 접합시켰다. 4종의 항체 20507 ADC (항체 20507-HC-E152C-CL-9, 항체 20507-HC-E152C-NL-4, 항체 20507-HC-E152C-S375C-CL-9 및 항체 20507-HC-K360C-LC-K107C-CL-9)에 대한 PK 연구는 제2 항체와 관련하여 4종의 링커-페이로드 조합에 대해 탁월한 링커 안정성을 확인시켜주었다 (도 3c, d). DAR 2 항체 20507 ADC (도 3c)와 비교하여, DAR 4 항체 20507 ADC (도 3d), 항체 20507-HC-K360C-LC-K107C-CL-9는 특히 마우스에서의 순환으로부터 약간 더 신속하게 소거되는 것으로 보인다. 그러나, 결과는 각각의 항체 분자에 대해 기재된 부위에서의 2 또는 4개의 CL-9 또는 NL-4 페이로드의 접합이 생화학적 특성을 변경시키지 않을 뿐만 아니라 항체의 약동학을 유의하게 변화시키지 않는다는 것을 나타낸다.
또 다른 예에서, 페이로드 화합물 CL-22를 실시예 101-103에 기재된 바와 같은 효소 매개된 접합 방법을 통해 항-Her2 및 항체 20507 항체에 접합시켰다. 2종의 ADC (항-Her2-HC-ins388-A1-CoA-1-CL-22 및 항체 20507-ins388-A1-CoA-1-CL-22)를 마우스 PK 연구에 적용하였다. 도 3e에 제시된 바와 같이, 항-hIgG 검정 데이터는 3주의 기간에 걸쳐 비접합된, 야생형 항-Her2 항체 (도 3f)의 그것과 유사한 PK 프로파일을 제시하였고, 항-MMAF 검정은 마우스 혈장에서 둘 다의 ADC의 수준이 24시간 내에 검출 수준 미만으로 강하된다는 것을 제시하였으며, 이는 CL-22 페이로드가 2종의 항체로부터 방출되었다는 것을 나타낸다. MS 분석은 CL-22 내의 링커가 술폰아미드 및 옥심 링커 기에서 절단되었음을 나타낸다. 이러한 발견은 밀접하게 관련된 화합물 CL-9가 조작된 Cys 잔기 (도 3a, c 및 d) 또는 천연 Cys 잔기 (도 3f)에 접합된 경우에 전혀 절단을 겪지 않기 때문에 예상외의 것이다. 후자의 예에서, 페이로드 화합물 CL-9를 부분적으로 환원된 항-Her2 항체의 천연 시스테인 잔기에 접합시켰다 (실시예 103). 생성된 ADC, 항-Her2-CL-9를 사용한 PK 연구는 항-IgG 및 항-MMAF 검정 둘 다의 프로파일이 비접합된, 야생형 항-Her2 (도 3f)의 그것과 유사하다는 것을 제시하였고, 이는 ADC가 부분적으로 환원된 천연 디술피드 결합에도 불구하고 양호한 PK 특성을 갖는다는 것을 나타낸다.
CL-9 ADC와 비교하여, 2종의 CL-22 ADC (항-Her2-HC-ins388-A1-CoA-1-CL-22 및 항체 20507-ins388-A1-CoA-1-CL-22)는 화합물과 항체 상의 접합 부위 사이에 더 긴 링커를 함유한다 (실시예 91, 반응식 49). 효소적 방법 (실시예 101-103)에 의해 제조된 2종의 CL-22 ADC에서의 길고 가요성인 링커는 잠재적으로 링커가 링커 절단을 용이하게 할 수 있는 효소에 보다 더 접근가능하게 할 수 있다. 한편, 실시예 104에 기재된 접합 방법에 의해 제조된 CL-22 ADC인 항-Her2-CL-22는 효소적으로 제조된 CL-22 ADC와 비교하여 화합물과 항체 상의 접합 부위 사이에 더 짧은 링커를 함유한다. 항-Her2-CL-22를 PK 연구에 적용한 경우에, WT 항-Her2의 그것과 유사한 양호한 PK 프로파일이 항-hIgG 검정 및 항-MMAF 검정 둘 다에서 입증되었고 (도 3f), 이는 항-Her2-CL-22에서의 CL-22 페이로드가 PK 연구 동안 ADC로부터 방출되지 않는다는 것을 나타낸다. 따라서, 링커의 길이 및 화학적 조성은 ADC의 안정성을 위한 중요한 인자일 수 있다.
본 발명자들은 또한 항-Her2 항체의 리신 잔기에 접합된 페이로드 CL-32를 갖는 ADC인 항-Her2-CL-32를 사용하여 PK 연구를 수행하였다 (실시예 105). 항-IgG 및 항-MMAF 검정 둘 다의 프로파일 (도 3f)은 서로 중첩되었고, 이는 페이로드 CL-32가 항체에 안정하게 접합된다는 것을 나타내고, 마우스 순환에서의 ADC에 대한 탁월한 PK 특성을 입증한다.
종합하면, 본 발명자들의 PK 연구에서의 발견은 본 발명에 기재된 페이로드 사이에 마우스 순환에서의 ADC의 안정성의 측면에서 유의차가 존재한다는 것을 명백하게 입증한다. 페이로드 CL-1 및 CL-22에서의 링커는 마우스에서 순환 중 절단되는 것으로 발견되었다. 페이로드 CL-6은 ADC를 비접합된 항체보다 순환으로부터 더 신속하게 소거되게 하였다. 그러나, 상이한 접합 방법을 사용하여 페이로드 CL-9, CL10, CL-11, CL-12, CL-32, NL-4, 및 NL-38로 제조한 ADC는 마우스에서의 순환에서 안정하였고, 탁월한 PK 특성을 나타내었다. 페이로드 CL-9, CL10, CL-11, CL-12, NL-4, 및 NL-38로 제조된 ADC는 마우스에서 안정하였다.
실시예 109: 생체내 효능 연구
생체내 이종이식 종양 모델은, 관련되고 잘 특징화된 인간 원발성 종양 또는 종양 세포주를 면역-결핍 누드 마우스 내로 그라프팅함으로써 인간에서 관찰되는 생물학적 활성을 시뮬레이션한다. 항암 시약으로 종양 이종이식편 마우스를 처리하는 것에 대한 연구는 시험된 시약의 생체내 효능과 관련하여 가치있는 정보를 제공해왔다 (Sausville and Burger, Cancer Res. 2006, 66:3351-3354). NCI-N87 세포는 세포 표면 상에 Her2 항원을 과다발현하고, 항-Her2 항체에 대한 시험관내 및 생체내 효능 둘 다에 대한 모델로서 이용되어 왔다 (Kasprzyk, P., Song, S. V., DiFiore, P. P. & King, C. R., Cancer Res. 1992, 52: 2771-2776). NCI-N87 세포주를 항-Her2 항체를 사용하여 제조된 ADC를 생체내 시험하기 위한 모델로서 사용하였다. H526 세포는 그의 표면 상에 항체 20507의 항원을 발현하고, 항체 20507 ADC에 의해 선택적으로 사멸된다 (도 2, 표 16). 상기 세포주를 항체 20507을 사용하여 제조된 ADC의 생체내 활성을 평가하기 위한 제2 이종이식편 모델로서 사용하였다. 모든 동물 연구는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침 (NIH 출판물; National Academy Press, 8th edition, 2001)에 따라 수행하였다. NCI-N87 또는 H526 세포를 nu/nu 마우스에 피하로 이식하였다 (Morton and Houghton, Nat. Protoc. 2007; 2:247-250). 종양 크기가 ~200 mm3에 이른 후에, ADC를 마우스에게 IV 주사에 의해 각각의 연구에서 제시된 바와 같은 투여량으로 단일 용량으로 투여하였다. 이어서 ADC 투여 후 종양 성장을 주기적으로 측정하였다. NCI-N87 이종이식편 모델에서 항-Her2 ADC를 사용한 생체내 효능 연구의 예를 도 4a 및 4b에 제시하고, H526 이종이식편 모델에서 항체 20507 ADC를 사용한 생체내 효능 연구의 예는 도 4c, 4d 및 4e에 제시한다.
NCI-N87 이종이식편 연구는 항-Her2-LC-S159C-CL-9 및 항-Her2-LC-S159C-NL-4를 사용한 마우스의 처리가 NCI-N87 종양에서 용량-의존성 종양 억제 및 퇴행을 유발한다는 것을 제시하였다 (도 4a 및 4b). NCI-N87 종양의 억제는 2.5 mg/kg 항-Her2-LC-S159C-CL-9의 투여에 의해 관찰되었고, 동일한 ADC에 의한 5 mg/kg으로의 처리는 종양의 정체를 유도하였다 (도 4a). 지속적인 종양 퇴행이 10 mg/kg 항-Her2-LC-S159C-CL-9에서 50일 동안 관찰되었다. 비교로서, 마우스를 문헌 참조 화합물 MMAF를 함유하는 항-Her2-LC-S159C-MMAF 10 mg/kg로 처리한 경우에, NCI-N87 종양은 초기에는 퇴행되었지만 30일 후에 다시 성장하였다 (도 4a). 따라서, 항-Her2-LC-S159C-CL-9에 의해 유발된 종양 퇴행은 항-Her2-LC-S159C-MMAF ADC를 동일한 투여량으로 투여한 경우보다 유의하게 더 길게 지속되었다. 마우스를 또 다른 페이로드, NL-4를 함유하는 ADC로 처리하는 것은, 또한 NCI-N87 종양의 용량-의존성 억제를 유발하였다 (항-Her2-LC-S159C-NL-4, 도 4b). NCI-N87 종양 성장의 약한 억제가 2.5 mg/kg의 단일 용량 후에 관찰되었고, 종양 정체가 5 mg/kg 및 10 mg/kg 항-Her2-LC-S159C-NL-4의 용량에서 관찰되었다. 항-Her2-LC-S159C-NL-4에 의해 유발된 종양 억제의 정도는 항-Her2-LC-S159C-MMAF에 의해 유발된 것과 유사하였다 (도 4b).
상기 2종의 페이로드를 함유하는 ADC가 또 다른 종양 모델에서 생체내 효과적인지 여부를 조사하기 위해, 페이로드 CL-9 및 NL-4를 항체 20507에 접합시켜 ADC를 제조하였고, 상기 항체의 항원은 H526 세포 상에서 고도로 발현된다 (실시예 107). 2종의 상이한 항체-대-약물 비, 즉 DAR 2 및 DAR 4를 갖는 ADC를 제조하여 H526 종양 모델에서 시험하였다. 도 4c에 제시된 바와 같이, NCI-N87 모델에서 항-Her2 ADC를 사용한 상기 연구의 결과와 유사하게, 항체 20507-LC-S159C-NL-4 ADC (DAR 2)는 용량 의존성 방식으로 H526 종양 성장을 억제하였다. 항체 20507-LC-S159C-NL-4는 3 mg/kg의 단일 용량 후에 H526 종양 성장을 억제하였고, 10 mg/kg에서 종양 퇴행을 유발하였다. 3 mg/kg 항체 20507-LC-S159C-NL-4 ADC에 의해 유발된 H526 종양의 억제는 참조 ADC, 항체 20507-LC-S159C-MMAF에 의해 동일한 투여량에서 유발된 것과 유사하였다.
DAR 4ADC는 DAR 2 ADC보다 2배만큼 더 큰 항체에 부착된 세포독성 약물을 갖고, 따라서 항체당 2배의 약물 용량을 전달해야 한다. 이러한 특색을 예시하기 위해, DAR 2 및 DAR 4 ADC의 효능을 H526 이종이식편 모델에서 생체내 비교하였다 (도 4d). 연구에서, DAR 4 ADC, 항체 20507-HC-E152C-S375C-CL-9 5 mg/kg에 의한 마우스의 처리는 DAR 2 ADC, 항체 20507-HC-S375C-CL-9 10 mg/kg과 대등한 종양 퇴행을 유발하였다. 결과는 DAR 2 또는 DAR 4 ADC로서 제조된 페이로드, CL-9가 생체내 효과적이라는 것을 나타낸다. CL-9 ADC에 의해 유발된 종양 억제 및 퇴행은 실험 동물에서 ADC에 의해 전달되는 CL-9의 양에 의존적이다.
실시예 107에서, 본 발명자들은 다양한 접합 방법에 의해 본 발명의 페이로드를 사용하여 제조된 ADC가 시험관내 세포 기반 검정에서 강력하다는 것을 제시한 바 있다. 또 다른 예에서, 2가지 상이한 접합 방법에 의해 제조된 항체 20507 내에 페이로드 CL-9를 갖는 ADC를 종양 성장의 억제에서의 그의 생체내 효능에 대해 H526 종양 모델에서 평가하였다 (도 4e): 항체 20507-HC-E152C-S375C-CL-9는 실시예 99에 기재된 바와 같이 CL-9를 항체 20507 내의 4개의 조작된 Cys 잔기에 접합시켜 제조하고, 항체 20507-CL-9 ADC는 실시예 103에 기재된 바와 같이 CL-9를 부분 환원 방법에 의해 천연 Cys 잔기에 접합시켜 제조하였다. H526 종양 세포는 표면에서 Her2 항원을 발현하지 않기 때문에, 항-Her2-HC-E152C-S375C-CL-9를 항체 20507-HC-E152C-S375C-CL-9와 동일한 방식으로 제조하고, 연구에서 음성 대조군 ADC로서 사용하였다. 3종의 ADC는 동일한 CL-9 약물 대 항체 비를 함유하였다 (DAR 3.9). H526 종양 보유 마우스에 투여한 경우에, 예상된 바와 같이, 항-Her2-HC-E152C-S375C-CL-9는 5 mg/kg으로 투여한 경우에 종양 성장에 영향을 미치지 않았고, 항체 20507-HC-E152C-S375C-CL-9 및 항체 20507-CL-9 ADC는 용량-의존성 방식으로 종양 퇴행을 유발하였다 (도 4e). 2.5 mg/kg 투여량에서, 항체 20507 ADC 둘 다는 H526 종양 성장에 대해 억제를 나타내었다. 완전 종양 퇴행은 둘 다의 항체 20507 ADC의 경우에 5 mg/kg에서 관찰되었다.
2종의 상이한 항체를 사용하여 제조된 ADC에 의한 NCI-N87 및 H526 종양의 생체내 이종이식편 모델의 결과로부터, CL-9로 제조된 ADC가 참조 MMAF ADC와 비교하여 종양 억제 및 퇴행에서 더 높은 효능을 제시한다는 것은 분명하다. CL-9 ADC는 MMAF ADC보다 더 지속가능한 종양 퇴행을 유발할 수 있다. 페이로드 NL-4로 제조된 ADC는 참조 MMAF ADC의 그것과 유사한 생체내 효능을 나타내었다. 본 발명자들은 또한 2가지 상이한 방법을 사용하여 페이로드 CL-9로 제조된 ADC가 생체내 종양 퇴행을 유발할 수 있다는 것을 제시한 바 있고, 이는 시험관내 연구로부터의 관찰을 확인시켜주었다 (실시예 107). 실시예 107 및 실시예 109에서의 결과는 본 발명에 개시된 화합물 페이로드로 제조된 ADC가 시험관내 및 생체내 둘 다에서 상이한 항체 및 다중 종양 세포주에 대해 강력하다는 것을 시사한다. 본 발명의 화합물은 많은 상이한 종양 세팅 및 적응증에 광범위하게 적용될 수 있을 것으로 기대된다. 화합물은 부위-특이적 조작된 Cys 방법 (실시예 99), 부분 환원 방법 (실시예 103), 효소-매개 접합 방법 (실시예 101-103), 시스테인 케톤 가교 방법 (실시예 104) 및 NHS-리신 접합 방법 (실시예 105)을 비롯한 많은 확립된 접합 방법을 사용하여 강력한 ADC를 제조하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 많은 상이한 항체 또는 항원 표적화 모이어티와 조합될 수 있는 것으로 기대된다.
본 발명의 특정 측면 및 예는 열거된 실시양태의 하기 목록에 제공된다. 각 실시양태에 명시된 특색은 다른 명시된 특색과 조합되어 본 발명의 추가 실시양태를 제공할 수 있는 것으로 인지될 것이다.
1. 화학식 I의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 입체이성질체 및 호변이성질체.
<화학식 I>
여기서,
R1은 -N=CR4R5, -N=R19, -N=CR5R20, -N=CR5NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12, -N=CR5NR12(CH2)mN(R12)2, -NHC(=NR6)R4, -NHC(=O)R4, -NHC(=O)R20 또는 -NHR8이고;
R2는 -C1-C6알킬이고;
R3은 
이고;
R4는 -N(R6)2 또는 -NR6R7이고;
R5는 N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R7은 -(CH2)mN(R12)2, -(CH2)mN(R12)C(=O)OR12 또는 비치환된 C3-C8시클로알킬이거나;
또는 R7은 C1-C6알킬, 옥소, -C(=O)R18, -(CH2)mOH, -C(=O)(CH2)mOH, -C(=O)((CH2)mO)nR12, -((CH2)mO)nR12, 또는 1 내지 5개의 히드록실로 임의로 치환된 C1-C6알킬로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된 C3-C8시클로알킬이고;
R8은 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이거나;
또는 R8은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, C1-C6알콕시, -OH, -CN, -NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2, -C(=O)NR6(CH2)mN(R6)C(O)OR6 및 -C(=O)NR6(CH2)mN(R6)2로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이고;
R9는 -OH, C1-C6알콕시, -NHS(O)2(CH2)mN3, -NHS(O)2(CH2)mNH2, -N(R12)2, -R16, -NR12(CH2)mN(R12)2, -NR12(CH2)mR16, -NHS(O)2R18 또는 
이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R13은 -S(CH2)nCHR14NHC(=O)R12 또는
R14는 R12 또는 -C(=O)OR12이고;
R15는 테트라졸릴, -CN, -C(=O)OR12,
이고;
R16은 N, O, S, S(=O) 및 S(=O)2로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 함유하는 N-연결된 4-8원 헤테로시클로알킬이고;
R17은 2-피리딜 또는 4-피리딜이고;
각각의 R18은 독립적으로 C1-C6알킬, 아지도로 치환된 C1-C6알킬, 및 1 내지 5개의 히드록실로 치환된 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R19는 N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R19는 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R20은 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R20은 C1-C6알킬, -C(=O)OR12, -C(=O)(CH2)mN3, C1-C6할로알킬, 할로겐, 옥소, -OH 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되고;
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된다.
2. 실시양태 1에 있어서, R1이 -N=CR4R5, -N=R19, -N=CR5NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12, -N=CR5NR12(CH2)mN(R12)2 또는 -N=CR5R20인 화합물.
3. 실시양태 1에 있어서, R1이 -NHC(=NR6)R4, -NHC(=O)R4 또는 -NHC(=O)R20인 화합물.
4. 실시양태 1에 있어서,
R1이 -N=CR4R5이고;
R4가 -N(R6)2이고;
R5가 N(R6)2이고;
각각의 R6이 독립적으로 -C1-C6알킬로부터 선택된 것인
화합물.
5. 실시양태 1에 있어서, R1이 
인 화합물.
6. 실시양태 1에 있어서, R1이 -NHR8인 화합물.
7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 한 실시양태에 있어서, R3이 
인 화합물.
8. 실시양태 1 내지 3 중 어느 한 실시양태에 있어서, R7이 -(CH2)mN(R12)2, -(CH2)mN(R12)C(=O)OR12인 화합물.
9. 실시양태 1 내지 3 중 어느 한 실시양태에 있어서, R7이 -(CH2)mOH로 치환된 C3-C8시클로알킬인 화합물.
10. 실시양태 1, 3 및 6 중 어느 한 실시양태에 있어서, R8이 비치환된 C-연결된 피리디닐, 비치환된 C-연결된 피리미디닐 또는 비치환된 C-연결된 피라지닐인 화합물.
11. 실시양태 1, 3 및 6 중 어느 한 실시양태에 있어서, R8이 C-연결된 피리디닐, C-연결된 피리미디닐 또는 C-연결된 피라지닐이고, 이들 각각이 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, C1-C6알콕시, -C(=O)NR6(CH2)mN(R6)C(O)OR6 및 -C(=O)NR6(CH2)mN(R6)2로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된 것인 화합물.
12. 실시양태 1, 2 및 7 중 어느 한 실시양태에 있어서, R19가 C-연결된 이미다졸리디닐 또는 C-연결된 피페라지닐이고, 이들 각각이 C1-C6알킬로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된 것인 화합물.
13. 실시양태 1, 2, 3 및 7 중 어느 한 실시양태에 있어서, R20이 비치환된 피페라지닐인 화합물.
14. 실시양태 1, 2, 3 및 7 중 어느 한 실시양태에 있어서, R20이 -C(=O)OR12 및 -C(=O)(CH2)mN3으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 치환기로 치환된 N-연결된 피페라지닐인 화합물.
15. 실시양태 1 내지 14 중 어느 한 실시양태에 있어서, R9가 -OH, C1-C6알콕시, -NHS(O)2(CH2)mN3 또는 -NHS(O)2(CH2)mNH2인 화합물.
16. 실시양태 1 내지 14 중 어느 한 실시양태에 있어서, R15가 테트라졸릴 또는 
인 화합물.
17. 화학식 I의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 입체이성질체, 또는 그의 호변이성질체, 수화물, 또는 제약상 허용되는 염.
<화학식 I>
여기서,
R1은 -N=CR4R5, -N=R19, -N=CR5R20, -N=CR5NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12, -N=CR5NR12(CH2)mN(R12)2, -NHC(=NR6)R4, -NHC(=O)R4, -NHC(=O)R20, -NHR8, -NHLR11, -NHR21, -N=CR5R10, -N=R22, -N=CR5R23 또는 -NHC(=O)R23이고;
R2는 -C1-C6알킬이고;
R3은
이고;
R4는 -N(R6)2 또는 -NR6R7이고;
R5는 N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R7은 -(CH2)mN(R12)2, -(CH2)mN(R12)C(=O)OR12 또는 비치환된 C3-C8시클로알킬이거나;
또는 R7은 C1-C6알킬, 옥소, -C(=O)R18, -(CH2)mOH, -C(=O)(CH2)mOH, -C(=O)((CH2)mO)nR12, -((CH2)mO)nR12, 또는 1 내지 5개의 히드록실로 임의로 치환된 C1-C6알킬로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된 C3-C8시클로알킬이고;
R8은 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이거나;
또는 R8은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, C1-C6알콕시, -OH, -CN, -NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2, -C(=O)NR6(CH2)mN(R6)C(O)OR6 및 -C(=O)NR6(CH2)mN(R6)2로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이고;
R9는 -OH, C1-C6알콕시, -NHS(O)2(CH2)mN3, -NHS(=O)2LR11, -NHLR11, -NHS(O)2(CH2)mNH2, -N(R12)2, -R16, -NR12(CH2)mN(R12)2, -NR12(CH2)mR16, -LR11, -NHS(O)2R18,
이고;
R10은 LR11 또는 
이고;
R11은 
, -NR12C(=O)CH=CH2, -N3, 
, SH, -SSR17, -S(=O)2(CH=CH2), -(CH2)2S(=O)2(CH=CH2), -NR12S(=O)2(CH=CH2), -NR12C(=O)CH2R13, -NR12C(=O)CH2Br, -NR12C(=O)CH2I, -NHC(=O)CH2Br, -NHC(=O)CH2I, -ONH2, -C(O)NHNH2, 
, -CO2H, -NH2, -NCO, -NCS,
이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R13은 -S(CH2)nCHR14NHC(=O)R12,
이고;
R14는 R12 또는 -C(=O)OR12이고;
R15는 테트라졸릴, -CN, -C(=O)OR12,
-LR11 또는 -X4LR11이고;
각각의 L은 독립적으로 -L1L2L3L4L5L6-, -L6L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4L5-, -L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4-, -L4L3L2L1-, -L1L2L3-, -L3L2L1-, -L1L2-, -L2L1- 및 -L1로부터 선택되고, 여기서 -L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 본원에 정의된 바와 같고;
R16은 비치환되거나 또는 -LR11로 치환된, N, O, S, S(=O) 및 S(=O)2로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 함유하는 N-연결된 4-8원 헤테로시클로알킬이고;
R17은 2-피리딜 또는 4-피리딜이고;
각각의 R18은 독립적으로 C1-C6알킬, 아지도로 치환된 C1-C6알킬, 및 1 내지 5개의 히드록실로 치환된 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R19는 N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R19는 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R20은 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R20은 C1-C6알킬, -C(=O)OR12, -C(=O)(CH2)mN3, C1-C6할로알킬, 할로겐, 옥소, -OH 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R21은 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -CN, NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이고;
R22는 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R23은 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
X3은 
이고; X4는 
이고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되고;
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된다.
18. 화학식 I의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 입체이성질체, 또는 그의 호변이성질체, 수화물, 용매화물 또는 제약상 허용되는 염.
<화학식 I>
여기서,
R1은 -N=CR4R5, -N=R19, -N=CR5R20, -N=CR5NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12, -N=CR5NR12(CH2)mN(R12)2, -NHC(=NR6)R4, -NHC(=O)R4, -NHC(=O)R20, -NHR8, -NHLR11, -NHR21, -N=CR5R10, -N=R22, -N=CR5R23 또는 -NHC(=O)R23이고;
R2는 -C1-C6알킬이고;
R3은 
이고;
R4는 -N(R6)2 또는 -NR6R7이고;
R5는 N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R7은 -(CH2)mN(R12)2, -(CH2)mN(R12)C(=O)OR12 또는 비치환된 C3-C8시클로알킬이거나;
또는 R7은 C1-C6알킬, 옥소, -C(=O)R18, -(CH2)mOH, -C(=O)(CH2)mOH, -C(=O)((CH2)mO)nR12, -((CH2)mO)nR12, 또는 1 내지 5개의 히드록실로 임의로 치환된 C1-C6알킬로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된 C3-C8시클로알킬이고;
R8은 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이거나;
또는 R8은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, C1-C6알콕시, -OH, -CN, -NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2, -C(=O)NR6(CH2)mN(R6)C(O)OR6 및 -C(=O)NR6(CH2)mN(R6)2로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이고;
R9는 -OH, C1-C6알콕시, -NHS(O)2(CH2)mN3, -NHS(O)2(CH2)mNH2, -N(R12)2, -R16, -NR12(CH2)mN(R12)2, -NR12(CH2)mR16, -LR11, -NHS(O)2R18, -NHS(=O)2LR11,
이고;
R10은 LR11 또는 
이고;
R11은 
, -NR12C(=O)CH=CH2, -N3, 
, SH, -SSR17, -S(=O)2(CH=CH2), -(CH2)2S(=O)2(CH=CH2), -NR12S(=O)2(CH=CH2), -NR12C(=O)CH2R13, -NR12C(=O)CH2Br, -NR12C(=O)CH2I, -NHC(=O)CH2Br, -NHC(=O)CH2I, -ONH2, -C(O)NHNH2, 
, -CO2H, -NH2, -NCO, -NCS,
이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R13은 -S(CH2)nCHR14NHC(=O)R12 또는
R14는 R12 또는 -C(=O)OR12이고;
R15는 테트라졸릴, -CN, -C(=O)OR12,
-LR11 또는 -X4LR11이고;
R16은 비치환되거나 또는 -LR11로 치환된, N, O, S, S(=O) 및 S(=O)2로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 함유하는 N-연결된 4-8원 헤테로시클로알킬이고;
R17은 2-피리딜 또는 4-피리딜이고;
각각의 R18은 독립적으로 C1-C6알킬, 아지도로 치환된 C1-C6알킬, 및 1 내지 5개의 히드록실로 치환된 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R19는 N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R19는 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R20은 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R20은 C1-C6알킬, -C(=O)OR12, -C(=O)(CH2)mN3, C1-C6할로알킬, 할로겐, 옥소, -OH 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R21은 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -CN, NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이고;
R22는 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R23은 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
각각의 L은 독립적으로 -L1L2L3L4L5L6-, -L6L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4L5-, -L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4-, -L4L3L2L1-, -L1L2L3-, -L3L2L1-, -L1L2-, -L2L1- 및 -L1로부터 선택되고, 여기서 -L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 본원에 정의된 바와 같고;
X3은 
이고,
X4는 
이고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되고;
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된다.
19. 실시양태 1 내지 17 중 어느 한 실시양태에 있어서, 화학식 Ia의 구조를 갖는 화합물인 화합물.
<화학식 Ia>
20. 실시양태 1 내지 18 중 어느 한 실시양태에 있어서, 화학식 Ib의 구조를 갖는 화합물인 화합물.
<화학식 Ib>
21. 실시양태 1 내지 6 중 어느 한 실시양태에 있어서, 화학식 Ic의 구조를 갖는 화합물인 화합물.
<화학식 Ic>
22. 실시양태 1 내지 6 및 20 중 어느 한 실시양태에 있어서, 화학식 Id의 구조를 갖는 화합물인 화합물.
<화학식 Id>
23. 실시양태 1 내지 17 중 어느 한 실시양태에 있어서, 화학식 Ie의 구조를 갖는 화합물인 화합물.
<화학식 Ie>
24. 실시양태 1 내지 17 및 22 중 어느 한 실시양태에 있어서, 화학식 If의 구조를 갖는 화합물인 화합물.
<화학식 If>
25. 실시양태 17 내지 23 중 어느 한 실시양태에 있어서, 각각의 L이 독립적으로 -L1L2L3L4L5L6- 및 -L6L5L4L3L2L1-로부터 선택되고, 여기서 -L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 본원에 정의된 바와 같은 것인 화합물.
26. 실시양태 17 내지 23 중 어느 한 실시양태에 있어서, 각각의 L이 독립적으로 -L1L2L3L4L5-, -L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4-, -L4L3L2L1-, -L1L2L3- 및 -L3L2L1-로부터 선택되고, 여기서 -L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 본원에 정의된 바와 같은 것인 화합물.
27. 실시양태 17 내지 23 중 어느 한 실시양태에 있어서, 각각의 L이 독립적으로 -L1L2- 및 -L2L1-로부터 선택되고, 여기서 -L1 및 L2는 본원에 정의된 바와 같은 것인 화합물.
28. 실시양태 17 내지 23 중 어느 한 실시양태에 있어서, L이 -L1-이고, 여기서 -L1은 본원에 정의된 바와 같은 것인 화합물.
29. 실시양태 17 내지 27 중 어느 한 실시양태에 있어서, R1이 -N=CR4R5, -N=R19, -N=CR5R20, -N=CR5R10, -N=R22 또는 -N=CR5R23인 화합물.
30. 실시양태 17 내지 27 중 어느 한 실시양태에 있어서, R1이 -N=CR5R10, -N=R22 또는 -N=CR5R23인 화합물.
31. 실시양태 17 내지 27 중 어느 한 실시양태에 있어서, R1이 -N=CR5R10, -N=R22, -NHLR11, -NHR21, -N=CR5R23 또는 -NHC(=O)R23인 화합물.
32. 실시양태 17 내지 27 중 어느 한 실시양태에 있어서, R1이 -NHC(=NR6)R4, -NHC(=O)R4, -NHC(=O)R20 또는 -NHC(=O)R23인 화합물.
33. 실시양태 17 내지 27 중 어느 한 실시양태에 있어서, R1이 -NHC(=O)R23인 화합물.
34. 실시양태 17 내지 27 중 어느 한 실시양태에 있어서, R1이 -NHR8, -NHLR11 또는 -NHR21인 화합물.
35. 실시양태 17 내지 27 중 어느 한 실시양태에 있어서, R1이 -NHR8인 화합물.
36. 실시양태 17 내지 27 중 어느 한 실시양태에 있어서, R1이 -NHLR11 또는 -NHR21인 화합물.
37. 실시양태 17 내지 27 중 어느 한 실시양태에 있어서, R1이 -N=CR4R5이고; R4가 -N(R6)2이고; R5가 N(R6)2이고; 각각의 R6이 독립적으로 -C1-C6알킬로부터 선택된 것인 화합물.
38. 실시양태 17 내지 27 중 어느 한 실시양태에 있어서, R1이 
인 화합물.
39. 실시양태 17 내지 27 중 어느 한 실시양태에 있어서, R7이 -(CH2)mN(R12)2, -(CH2)mN(R12)C(=O)OR12인 화합물.
40. 실시양태 17 내지 27 중 어느 한 실시양태에 있어서, R7이 -(CH2)mOH로 치환된 C3-C8시클로알킬인 화합물.
41. 실시양태 17 내지 27, 33 및 34 중 어느 한 실시양태에 있어서, R8이 비치환된 C-연결된 피리디닐, 비치환된 C-연결된 피리미디닐 또는 비치환된 C-연결된 피라지닐인 화합물.
42. 실시양태 17 내지 27, 33 및 34 중 어느 한 실시양태에 있어서, R8이 C-연결된 피리디닐, C-연결된 피리미디닐 또는 C-연결된 피라지닐이고, 이들 각각이 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, C1-C6알콕시, -OH, -CN, -NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2, -C(=O)NR6(CH2)mN(R6)C(O)OR6 및 -C(=O)NR6(CH2)mN(R6)2로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된 것인 화합물.
43. 실시양태 17 내지 28 중 어느 한 실시양태에 있어서, R19가 C-연결된 이미다졸리디닐 또는 C-연결된 피페라지닐이고, 이들 각각이 C1-C6알킬로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된 것인 화합물.
44. 실시양태 17 내지 28 및 31중 어느 한 실시양태에 있어서, R20이 비치환된 피페라지닐인 화합물.
45. 실시양태 17 내지 28 및 31 중 어느 한 실시양태에 있어서, R20이 -C(=O)OR12 및 -C(=O)(CH2)mN3으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 치환기로 치환된 N-연결된 피페라지닐인 화합물.
46. 실시양태 17 내지 27, 30 및 33 중 어느 한 실시양태에 있어서, R21이 C-연결된 피리디닐, C-연결된 피리미디닐 또는 C-연결된 피라지닐이고, 이들 각각이 -LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, C1-C6알콕시, -OH, -CN, -NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된 것인 화합물.
47. 실시양태 17 내지 30 중 어느 한 실시양태에 있어서, R22이 C-연결된 이미다졸리디닐 또는 C-연결된 피페라지닐이고, 이들 각각이 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된 것인 화합물.
48. 실시양태 17 내지 32 중 어느 한 실시양태에 있어서, R23이 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된 N-연결된 피페라지닐인 화합물.
49. 실시양태 17 내지 30 중 어느 한 실시양태에 있어서, R10이 LR11인 화합물.
50. 실시양태 17 내지 49 중 어느 한 실시양태에 있어서, R3이
인 화합물.
51. 실시양태 17 내지 50 중 어느 한 실시양태에 있어서, R9가 -OH, C1-C6알콕시, -NHS(O)2(CH2)mN3 또는 -NHS(O)2(CH2)mNH2인 화합물.
52. 실시양태 17 내지 50 중 어느 한 실시양태에 있어서, R9가 -LR11, -NHS(=O)2LR11,
인 화합물.
53. 실시양태 17 내지 50 중 어느 한 실시양태에 있어서, R15가 테트라졸릴 또는 
인 화합물.
54. 실시양태 17 내지 50 중 어느 한 실시양태에 있어서, R15가
-LR11 또는 -X4LR11인 화합물.
55. 실시양태 17 내지 50 중 어느 한 실시양태에 있어서, R15가 테트라졸릴, -CN, -C(=O)OR12,
인 화합물.
56. 실시양태 17 내지 55 중 어느 한 실시양태에 있어서, R11이
57. 화학식 II의 면역접합체.
<화학식 II>
여기서,
Ab는 항원 결합 모이어티를 나타내고;
L은 -L1L2L3L4L5L6-, -L6L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4L5-, -L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4-, -L4L3L2L1-, -L1L2L3-, -L3L2L1-, -L1L2-, -L2L1- 및 -L1로부터 선택되고, 여기서 -L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 본원에 정의된 바와 같고;
R101은
또는 -NHC(=O)R123*-이고, 여기서 *는 L에 대한 부착 지점을 나타내고;
R2는 -C1-C6알킬이고;
R3은 
이고;
R5는 N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R9는 -OH, C1-C6알콕시, -N(R12)2, -R16, -NR12(CH2)mN(R12)2, -NR12(CH2)mR16, -NHS(O)2R18 또는 
이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R15는 테트라졸릴,
이고;
R16은 비치환되거나 또는 -LR11로 치환된, N, O, S, S(=O) 및 S(=O)2로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 함유하는 N-연결된 4-8원 헤테로시클로알킬이고;
각각의 R18은 독립적으로 C1-C6알킬, 아지도로 치환된 C1-C6알킬, 및 1 내지 5개의 히드록실로 치환된 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R110은 결합 또는 
이고;
R121은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -CN, NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴렌이고;
R122는 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬렌이고;
R123은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬렌이고;
y는 1 내지 16의 정수이고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되고,
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된다.
58. 실시양태 57에 있어서, L이 -L1L2L3L4L5L6- 또는 -L6L5L4L3L2L1-이고, 여기서 -L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 본원에 정의된 바와 같은 것인 면역접합체.
59. 실시양태 57에 있어서, L이 -L1L2L3L4L5-, -L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4-, -L4L3L2L1-, -L1L2L3- 및 -L3L2L1-로부터 선택되고, 여기서 -L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 본원에 정의된 바와 같은 것인 면역접합체.
60. 실시양태 57 내지 59 중 어느 한 실시양태에 있어서, 화학식 II의 면역접합체가 화학식 IIa의 면역접합체인 면역접합체.
<화학식 IIa>
61. 실시양태 57 내지 60 중 어느 한 실시양태에 있어서, L이 -L1L2- 또는 -L2L1-이고, 여기서 -L1 및 L2는 본원에 정의된 바와 같은 것인 면역접합체.
62. 실시양태 57 내지 61 중 어느 한 실시양태에 있어서, 화학식 II의 면역접합체가 화학식 IIb의 면역접합체인 면역접합체.
<화학식 IIb>
63. 실시양태 57 내지 62 중 어느 한 실시양태에 있어서, 화학식 II, 화학식 IIa 또는 화학식 IIb의 면역접합체가 화학식 IIc의 구조를 갖는 면역접합체인 면역접합체.
<화학식 IIc>
64. 실시양태 57 내지 63 중 어느 한 실시양태에 있어서, R101이 
이고, R110이 결합인 면역접합체.
65. 실시양태 57 내지 63 중 어느 한 실시양태에 있어서, R101이 
이고, R110이 
인 면역접합체.
66. 실시양태 57 내지 63 중 어느 한 실시양태에 있어서, R101이 -NHR121*-이고, R121이 C-연결된 피리미디닐렌, C-연결된 피라지닐렌 또는 C-연결된 피리디닐렌이고, 이들 각각은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -CN, NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된 것인 면역접합체.
67. 실시양태 57 내지 63 중 어느 한 실시양태에 있어서, R101이 -NHC(=O)R123*-이고, R123이 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된 N-연결된 피페라지닐렌인 면역접합체.
68. 실시양태 57 내지 63 중 어느 한 실시양태에 있어서, R101이 -NHC(=O)NR6*-인 면역접합체.
69. 실시양태 57 내지 68 중 어느 한 실시양태에 있어서,
R9가 -OH, C1-C6알콕시, -N(R14)2, -R16, -NR12(CH2)mN(R12)2, -NHS(O)2R18, 또는 -NR12(CH2)mR16이고;
R15가 테트라졸릴,
인 면역접합체.
70. 실시양태 57 내지 69 중 어느 한 실시양태에 있어서, R3이
인 면역접합체.
71. 실시양태 57 내지 70 중 어느 한 실시양태에 있어서, R9가 -OH, C1-C6알콕시, -N(R14)2, -R16, -NR12(CH2)mN(R14)2, 또는 -NR12(CH2)mR16인 면역접합체.
72. 실시양태 57 내지 71 중 어느 한 실시양태에 있어서, R9가 -OH 또는 -OCH3인 면역접합체.
73. 실시양태 57 내지 70 중 어느 한 실시양태에 있어서, R15가
인 면역접합체.
74. 화학식 III의 면역접합체.
<화학식 III>
여기서,
Ab는 항원 결합 모이어티를 나타내고;
L은 -L1L2L3L4L5L6-, -L6L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4L5-, -L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4-, -L4L3L2L1-, -L1L2L3-, -L3L2L1-, -L1L2-, -L2L1- 및 -L1로부터 선택되고, 여기서 -L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 본원에 정의된 바와 같고;
y는 1 내지 16의 정수이고;
R1은 -N=CR4R5, -N=R19, -N=CR5R20, -NHC(=NR6)R4, -NHC(=O)R4, -NHC(=O)R20 또는 -NHR8이고;
R2는 -C1-C6알킬이고;
R4는 -N(R6)2 또는 -NR6R7이고;
R5는 N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R7은 비치환된 C3-C8시클로알킬이거나;
또는 R7은 C1-C6알킬, 옥소, -C(=O)R18, -(CH2)mOH, -C(=O)(CH2)mOH, -C(=O)((CH2)mO)nR12, -((CH2)mO)nR12, 또는 1 내지 5개의 히드록실로 임의로 치환된 C1-C6알킬로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된 C3-C8시클로알킬이고;
R8은 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이거나;
또는 R8은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -OH, -N(R6)2, -CN, -NO2, -C(=O)OR6 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R19는 N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R19는 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R20은 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R20은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -C(=O)OR12, 옥소, -OH 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R113은
R117은 결합, -NH-, -NHS(=O)2-, -NHS(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, -,-NHS(=O)2(CH2)mNHC(=O)-, -NHS(=O)2(CH2)mNHC(=O)O(CH2)m-,
이고;
R118은 결합, 테트라졸릴, 
이고;
R26은
이고,
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되고,
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된다.
75. 화학식 III의 면역접합체.
<화학식 III>
여기서,
Ab는 항원 결합 모이어티를 나타내고;
R1은 -N=CR4R5, -N=R19, -N=CR5R20, -NHC(=NR6)R4, -NHC(=O)R4, -NHC(=O)R20 또는 -NHR8이고;
R2는 -C1-C6알킬이고;
R4는 -N(R6)2 또는 -NR6R7이고;
R5는 N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R7은 비치환된 C3-C8시클로알킬이거나;
또는 R7은 C1-C6알킬, 옥소, -C(=O)R18, -(CH2)mOH, -C(=O)(CH2)mOH, -C(=O)((CH2)mO)nR12, -((CH2)mO)nR12, 또는 1 내지 5개의 히드록실로 임의로 치환된 C1-C6알킬로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된 C3-C8시클로알킬이고;
R8은 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이거나;
또는 R8은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -OH, -N(R6)2, -CN, -NO2, -C(=O)OR6 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R19는 N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R19는 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R20은 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R20은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -C(=O)OR12, 옥소, -OH 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R113은
R117은 결합, -NH-, -NHS(=O)2-,
R118은 결합, 테트라졸릴, 
이고;
L은 -L1L2L3L4L5L6-, -L6L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4L5-, -L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4-, -L4L3L2L1-, -L1L2L3-, -L3L2L1-, -L1L2-, -L2L1- 및 -L1로부터 선택되고, 여기서 -L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 본원에 정의된 바와 같고;
y는 1 내지 16의 정수이고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되고,
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된다.
76. 실시양태 74에 있어서, L이 -L1L2L3L4L5L6- 또는 -L6L5L4L3L2L1-이고, 여기서 -L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 본원에 정의된 바와 같은 것인 면역접합체.
77. 실시양태 74 또는 75에 있어서, L이 -L1L2L3L4L5-, -L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4-, -L4L3L2L1-, -L1L2L3- 및 -L3L2L1-로부터 선택되고, 여기서 -L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 본원에 정의된 바와 같은 것인 면역접합체.
78. 실시양태 74 내지 76 중 어느 한 실시양태에 있어서, 화학식 III의 면역접합체가 화학식 IIIa의 면역접합체인 면역접합체.
<화학식 IIIa>
79. 실시양태 74 내지 76 중 어느 한 실시양태에 있어서, L이 -L1L2- 또는 -L2L1-이고, 여기서 -L1 및 L2는 본원에 정의된 바와 같은 것인 면역접합체.
80. 실시양태 74 내지 76 및 78 중 어느 한 실시양태에 있어서, 화학식 III 또는 화학식 IIIa의 면역접합체가 화학식 IIIb의 면역접합체인 면역접합체.
<화학식 IIIb>
81. 실시양태 74 내지 79 중 어느 한 실시양태에 있어서, 화학식 III, 화학식 IIIa 또는 화학식 IIIb의 면역접합체가 화학식 IIIc의 면역접합체인 면역접합체.
<화학식 IIIc>
82. 실시양태 74 내지 80 중 어느 한 실시양태에 있어서, R1이 -N=CR4R5, -N=R19 또는 -N=CR5R20인 면역접합체.
83. 실시양태 74 내지 80 중 어느 한 실시양태에 있어서, R1이 -NHC(=NR6)R4, -NHC(=O)R4 또는 -NHC(=O)R20인 면역접합체.
84. 실시양태 74 내지 80 중 어느 한 실시양태에 있어서, R1이 -NHR8인 면역접합체.
85. 실시양태 74 내지 80 중 어느 한 실시양태에 있어서, R1이 -N=CR4R5이고; R4가 -N(R6)2이고; R5가 N(R6)2이고; 각각의 R6이 독립적으로 -C1-C6알킬로부터 선택된 것인 면역접합체.
86. 실시양태 74 내지 80 중 어느 한 실시양태에 있어서, R1이 
인 면역접합체.
87. 실시양태 74 내지 85 중 어느 한 실시양태에 있어서, R113이 
이고, R117이 -NH-, -NHS(=O)2- 또는 
인 면역접합체.
88. 실시양태 74 내지 85 중 어느 한 실시양태에 있어서, R113이 
이고, R118이 
인 면역접합체.
89. 실시양태 17 내지 56 및 실시양태 57 내지 87 중 어느 한 실시양태에 있어서,
L1이 -(CH2)m-, -C(=O)(CH2)m-, -NR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)(CH2)mNR12(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1C(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, 
, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNR12(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mX3-, -X3(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)n-, -((C(R12)2)mOC(=O)NR12(CH2)mO(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(C(R12)2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -(CH2)m(O(CH2)m)nS(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mNR12(CH2)mC(=O)-, -(CH2)mO(CH2)mNR12C(=O)O((C(R12)2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)X1-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, 
, -((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)n-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-, -(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3-, -X3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mS(CH2)m-, -NR12C(=O)(CH2)m-, -NR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12-, -(CH2)mC(=O)NR12-, -(CH2)mNR12(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3-, -X3(CH2)m-, -((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-, -NR12(CH2)m-, -NR12C(R12)2(CH2)m-, -(CH2)mC(R12)2NR12-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)NR12-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -NR12C(R12)2(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -NR12C(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-, -(CH2)mNR12-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-, -(C(R12)2)m-, -(CH2CH2O)n-, -(OCH2CH2)n-, -(CH2)mO(CH2)m-, -S(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2-, -S(=O)2(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mS(=O)2-, -S(=O)2(CH2)m X3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2-, -(CH2)mX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)X2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNR12C(=O(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)NR12(CH2)m-, -X4X1X2C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1X4-, -X1C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)X1-, -C(=O)CHRaaNR12-, -NR12CHRaaC(=O)-, -C(=O)NR12-, -C(=O)O-, -S-, -SCH2(C=O)NR12-, -NR12C(=O)CH2S-, -S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2CH2CH2-, -NR12C(=S)-, -(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12C(=O)-, -C(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -NR12S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, 및 -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2NR12-로부터 선택되고, L1이 표 2에 제시된 기로부터 선택되고,
여기서
X1은
로부터 선택된 자기 희생적 스페이서이고;
X2는
로부터 선택된 디펩티드이고;
X3은 
이고,
X4는 
이고;
L2, L3, L4, L5, 및 L6은 각각 독립적으로 결합 및 L1로부터 선택되는 것인 화합물 또는 면역접합체.
90. 실시양태 17 내지 56 및 실시양태 57 내지 87 중 어느 한 실시양태에 있어서,
L1이 표 2에 제시된 기, -(CH2)m-, -C(=O)(CH2)m-, -NHC(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2(CH2)mNH((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNH((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)(CH2)mNH(CH2)m-, -C(=O)NH(CH2)m-, -C(=O)NH(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)NH(CH2)mNHC(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1C(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1C(=O)NH(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -C(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, 
, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNH(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3-, -X3(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m(O(CH2)m)n-, -(CH2)mOC(=O)NH(CH2)mO(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(=O)O(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -(CH2)m(O(CH2)m)nS(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mNH(CH2)mC(=O)-, -(CH2)mO(CH2)mNHC(=O)O((CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)NH(CH2)mNHC(=O)-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)X1-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)-, 
, -((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)n-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-, -(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-, -X3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -C(=O)NH(CH2)mNHC(=O)-, -(CH2)mS(CH2)m-, -NHC(=O)(CH2)m-, -NHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH-, -(CH2)mC(=O)NH-, -(CH2)mNH(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3-, -X3(CH2)m-, -((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-, -NH(CH2)m-, -NHCH2(CH2)m-, -(CH2)mCH2NH-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNH-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)NH-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -NHCH2(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mCH2NH-, -NH(CH2)mX3(CH2)m-, -NHCH2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mCH2NH-, -NHCH2(CH2)mOC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)O(CH2)mCH2NH-, -NHCH2(CH2)mOC(=O)NH(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNHC(=O)O(CH2)mCH2NH-, -NHCH2(CH2)mOC(=O)NH((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(=O)O(CH2)mCH2NH-, -NHCH2(CH2)mOC(=O)NH((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(=O)O(CH2)mCH2NH-, -(CH2)mX3(CH2)mNH-, -NH((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNH-, -(CH2)mNH-, -NH((CH2)mO)n(CH2)m-, -NH((CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nNH-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNH-, -(CH2)m-, -(CH2CH2O)n-, -(OCH2CH2)n-, -(CH2)mO(CH2)m-, -S(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2-, -S(=O)2(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mS(=O)2-, -S(=O)2(CH2)m X3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2-, -(CH2)mX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)X2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNHC(=O(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)NH(CH2)m-, -X4X1X2C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1X4-, -X1C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mC(=O)X1-, -C(=O)CHRaaNH-, -NHCHRaaC(=O)-, -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -S-, -SCH2(C=O)NH-, -NHC(=O)CH2S-, -S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2CH2CH2-, -NHC(=S)-, -(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNHC(=O)-, -C(=O)NH(CH2)mX3(CH2)m-, -NHS(=O)2(CH2)mX3(CH2)m- 및 -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2NH-로부터 선택되고; 여기서
X1은
로부터 선택된 자기 희생적 스페이서이고;
X2는
로부터 선택된 디펩티드이고;
X3은 
이고,
X4는 
이고;
L2, L3, L4, L5, 및 L6은 각각 독립적으로 결합 및 L1로부터 선택된 것인
화합물 또는 면역접합체.
91. 실시양태 17 내지 56 및 실시양태 57 내지 87 중 어느 한 실시양태에 있어서,
L1이 -(CH2)m-, -C(=O)(CH2)m-, -NR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)(CH2)mNR12(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1C(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, 
, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNR12(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mX3-, -X3(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)n-, -((C(R12)2)mOC(=O)NR12(CH2)mO(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(C(R12)2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -(CH2)m(O(CH2)m)nS(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mNR12(CH2)mC(=O)-, -(CH2)mO(CH2)mNR12C(=O)O((C(R12)2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)X1-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, 
, -((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)n-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-, -(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3-, -X3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mS(CH2)m-, -NR12C(=O)(CH2)m-, -NR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12-, -(CH2)mC(=O)NR12-, -(CH2)mNR12(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3-, -X3(CH2)m-, -((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-, -NR12(CH2)m-, -NR12C(R12)2(CH2)m-, -(CH2)mC(R12)2NR12-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)NR12-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -NR12C(R12)2(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -NR12C(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-, -(CH2)mNR12-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-, -(C(R12)2)m-, -(CH2CH2O)n-, -(OCH2CH2)n-, -(CH2)mO(CH2)m-, -S(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2-, -S(=O)2(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mS(=O)2-, -S(=O)2(CH2)m X3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2-, -(CH2)mX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)X2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNR12C(=O(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)NR12(CH2)m-, -X4X1X2C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1X4-, -X1C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)X1-, -C(=O)CHRaaNR12-, -NR12CHRaaC(=O)-, -C(=O)NR12-, -C(=O)O-, -S-, -SCH2(C=O)NR12-, -NR12C(=O)CH2S-, -S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2CH2CH2-, -NR12C(=S)-, -(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12C(=O)-, -C(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -NR12S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, 및 -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2NR12-로부터 선택되고; 여기서
X1은
로부터 선택된 자기 희생적 스페이서이고;
X2는
로부터 선택된 디펩티드이고;
X3은 
이고;
X4는 
이고;
L2, L3, L4, L5, 및 L6은 각각 독립적으로 결합 및 표 2에 제시된 기로부터 선택된 것인
화합물 또는 면역접합체.
92. 실시양태 17 내지 56 및 실시양태 57 내지 87 중 어느 한 실시양태에 있어서,
L1이 -(CH2)m-, -C(=O)(CH2)m-, -NHC(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2(CH2)mNH((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNH((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)(CH2)mNH(CH2)m-, -C(=O)NH(CH2)m-, -C(=O)NH(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)NH(CH2)mNHC(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1C(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1C(=O)NH(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -C(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, 
, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNH(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3-, -X3(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m(O(CH2)m)n-, -(CH2)mOC(=O)NH(CH2)mO(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(=O)O(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -(CH2)m(O(CH2)m)nS(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mNH(CH2)mC(=O)-, -(CH2)mO(CH2)mNHC(=O)O((CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)NH(CH2)mNHC(=O)-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)X1-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)-, 
, -((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)n-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-, -(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-, -X3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -C(=O)NH(CH2)mNHC(=O)-, -(CH2)mS(CH2)m-, -NHC(=O)(CH2)m-, -NHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH-, -(CH2)mC(=O)NH-, -(CH2)mNH(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3-, -X3(CH2)m-, -((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-, -NH(CH2)m-, -NHCH2(CH2)m-, -(CH2)mCH2NH-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNH-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)NH-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -NHCH2(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mCH2NH-, -NH(CH2)mX3(CH2)m-, -NHCH2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mCH2NH-, -NHCH2(CH2)mOC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)O(CH2)mCH2NH-, -NHCH2(CH2)mOC(=O)NH(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNHC(=O)O(CH2)mCH2NH-, -NHCH2(CH2)mOC(=O)NH((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(=O)O(CH2)mCH2NH-, -NHCH2(CH2)mOC(=O)NH((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(=O)O(CH2)mCH2NH-, -(CH2)mX3(CH2)mNH-, -NH((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNH-, -(CH2)mNH-, -NH((CH2)mO)n(CH2)m-, -NH((CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nNH-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNH-, -(CH2)m-, -(CH2CH2O)n-, -(OCH2CH2)n-, -(CH2)mO(CH2)m-, -S(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2-, -S(=O)2(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mS(=O)2-, -S(=O)2(CH2)m X3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2-, -(CH2)mX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)X2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNHC(=O(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)NH(CH2)m-, -X4X1X2C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1X4-, -X1C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mC(=O)X1-, -C(=O)CHRaaNH-, -NHCHRaaC(=O)-, -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -S-, -SCH2(C=O)NH-, -NHC(=O)CH2S-, -S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2CH2CH2-, -NHC(=S)-, -(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNHC(=O)-, -C(=O)NH(CH2)mX3(CH2)m-, -NHS(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, 및 -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2NH-로부터 선택되고;
X1이
로부터 선택된 자기 희생적 스페이서이고;
X2가 
로부터 선택된 디펩티드이고;
X3이 
이고;
X4가 
이고;
L2, L3, L4, L5, 및 L6이 각각 독립적으로 결합 및 표 2에 제시된 기로부터 선택된 것인
화합물 또는 면역접합체.
93. 실시양태 17 내지 56 중 어느 한 실시양태에 있어서, L이 -L1-이고, -L1-이 -(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)m-, -(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-,
-(CH2)m(O(CH2)m)nS(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mNH(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNH(CH2)m-, -(CH2)mNR12(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNR12(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2-, -S(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2-, -S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)X2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nS(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2((CH2)mO)n(CH2)m-, -((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)n-, -(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)-, -C(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)-, -((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-, -C(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNHC(=O)-, -C(=O)NH(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)-, -C(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNHC(=O(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -NR12S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2NR12-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)m- 및 -(CH2)mNHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m-으로부터 선택된 것인 화합물.
94. 실시양태 17 내지 56 중 어느 한 실시양태에 있어서, L이 -L1-이고, -L1-이 -(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)m-, -(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-,
-(CH2)m(O(CH2)m)nS(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mNH(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNH(CH2)m-, -(CH2)mNR12(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNR12(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m-, -((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2-, -S(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2- 및 -S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m -으로부터 선택된 것인 화합물.
95. 실시양태 17 내지 56 중 어느 한 실시양태에 있어서, L이 -L1-이고, -L1-이 -(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m-, -((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, 및 -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-로부터 선택된 것인 화합물.
96. 실시양태 17 내지 56 및 실시양태 57 내지 73 중 어느 한 실시양태에 있어서,
L1이 -(CH2)mNHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m*-, -(CH2)mC(=O)*-, -(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)*-, -(CH2)mX2X1C(=O)*-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)*-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)X2X1C(=O)*-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)*-, -(CH2)m(O(CH2)m)nS(=O)2(CH2)m*-, -(CH2)mNR12(CH2)mC(=O)*-, -X3(CH2)m*-, -(CH2)mC(=O)NH*-, -(CH2)mNH(CH2)mC(=O)*-, -((CH2)mO)n(CH2)m*-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)*-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12*-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)NH*-, -(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)*-, -(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(=O)*-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)*-, -(CH2)mNHC(=O)*-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)*-, -(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m*-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)m*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)*-, -(CH2)mX3(CH2)mNHC(=O)*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mC(=O)*-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)*-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)mC(=O)*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)*-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m*-, -(CH2)mX3(CH2)mNHC(=O)(CH2)m*-, -X3(CH2)mNHC(=O)(CH2)m*-, -(CH2)m(O(CH2)m)n*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m(O(CH2)m)n*-, -X3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(=O)(CH2)m*-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(=O)(CH2)m*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mC(=O)NH(CH2)m*-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)m*-, -(CH2)mO(CH2)mNHC(=O)O((C(R12)2)m*-, -(CH2)mS(=O)2*- 또는 -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2*-이고, 여기서 면역접합체 실시양태에서 *는 R101에 대한 부착 지점을 나타내고;
L2가
-S-, -SCH2(C=O)NH-, -NHC(=O)CH2S-, -NH(=O)CH2CH2S-, -SCH2CH2C(=O)NH-, -S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2S- 또는 -SCH2CH2S(=O)2CH2CH2-이고, 여기서 L2의 *는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고;
L3, L4, L5 및 L6이 결합인
화합물 또는 면역접합체.
97. 실시양태 17 내지 56 및 실시양태 57 내지 73 중 어느 한 실시양태에 있어서,
L1이 -(CH2)mC(=O)*-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)*-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12*-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)NH*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)*-, -(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)*-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)*-, -(CH2)m(O(CH2)m)nS(=O)2(CH2)m*-, -(CH2)mNR12(CH2)mC(=O)*-, -X3(CH2)m*-, -(CH2)mC(=O)NH*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m*-, -(CH2)mX3(CH2)mNHC(=O)(CH2)m*-, -X3(CH2)mNHC(=O)(CH2)m*-, -(CH2)m(O(CH2)m)n*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m(O(CH2)m)n*-, -(CH2)mO(CH2)mNHC(=O)O((C(R12)2)m*-, -X3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(=O)(CH2)m*- 및 -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(=O)(CH2)m*-로부터 선택되고, 여기서 면역접합체 실시양태에서 *는 R101에 대한 부착 지점을 나타내고;
L2가
-S-, -SCH2(C=O)NH-, -NHC(=O)CH2S-, -NH(=O)CH2CH2S-, -SCH2CH2C(=O)NH-, -S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2S- or -SCH2CH2S(=O)2CH2CH2-이고, 여기서 L2의 *는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고,
L3, L4, L5 및 L6이 결합인
화합물 또는 면역접합체.
98. 실시양태 17 내지 56 및 실시양태 57 내지 73 중 어느 한 실시양태에 있어서,
L1이 -(CH2)mC(=O)*-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)*-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12*-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)NH*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)*-, -(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)*-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)*-, -(CH2)m(O(CH2)m)nS(=O)2(CH2)m*-, -(CH2)mNR12(CH2)mC(=O)*-, -X3(CH2)m*-, -(CH2)mC(=O)NH*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m*-, -(CH2)mX3(CH2)mNHC(=O)(CH2)m*-, -X3(CH2)mNHC(=O)(CH2)m*-, -(CH2)m(O(CH2)m)n*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m(O(CH2)m)n*-, -(CH2)mO(CH2)mNHC(=O)O((C(R12)2)m*-, -X3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(=O)(CH2)m*- 및 -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(=O)(CH2)m*-로부터 선택되고, 여기서 면역접합체 실시양태에서 *는 R101에 대한 부착 지점을 나타내고;
L2가
L3, L4, L5 및 L6이 결합인
화합물 또는 면역접합체.
99. 실시양태 17 내지 56 및 실시양태 57 내지 73 중 어느 한 실시양태에 있어서,
L1이 -(CH2)mC(=O)*-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)*-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12*-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)NH*-, 및 -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)*-로부터 선택되고, 여기서 면역접합체 실시양태에서 *는 R101에 대한 부착 지점을 나타내고;
L2가
이고, 여기서 L2의 *는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고;
L3, L4, L5 및 L6이 결합인
화합물 또는 면역접합체.
100. 실시양태 17 내지 56 및 실시양태 74 내지 87 중 어느 한 실시양태에 있어서,
L1이 -*(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mX3-, -*C(=O)(CH2)m-, -*NHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3-, -*(CH2)mO)n(CH2)m-, -*(CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*((C(R12)2)mOC(=O)NH(CH2)mO(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mNHC(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -*X4X1X2C(=O)(CH2)m-, -*X1C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, 
, -*C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m)-, -*C(=O)NH(CH2)m)-, -*C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -*C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -*(CH2)mS(=O)2((CH2)mO)n(CH2)m-, -*C(=O)(CH2)mNR12(CH2)m-, -*C(=O)(CH2)mNH(CH2)m-, -*(CH2)m(O(CH2)m)n-, -*C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, - *C(=O)NH(CH2)m-, -*C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*C(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*NH2S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mNHC(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m- 및 -C(=O)NH(CH2)mNHC(=O)-로부터 선택되고, 여기서 면역접합체 실시양태에서 *는 R3에 대한 부착 지점을 나타내고;
L2가 결합,
-S-, -SCH2(C=O)NH-, -NHC(=O)CH2S-,
-S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2S- 또는 -SCH2CH2S(=O)2CH2CH2-이고, 여기서 L2의 *는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고;
L3, L4, L5 및 L6이 결합인
화합물 또는 면역접합체.
101. 실시양태 17 내지 56 및 실시양태 74 내지 87 중 어느 한 실시양태에 있어서,
L1이 -*(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mX3-, -*C(=O)(CH2)m-, -*NHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3-, -*(CH2)mO)n(CH2)m-, -*(CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*((C(R12)2)mOC(=O)NH(CH2)mO(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mNHC(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -*X4 X1X2C(=O)(CH2)m-, -*X1C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, 
, -*NH2S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, -*C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m)- 및 -*C(=O)NH(CH2)m)-로부터 선택되고, 여기서 면역접합체 실시양태에서 *는 R3에 대한 부착 지점을 나타내고;
L2가
-S-, -SCH2(C=O)NH-, -NHC(=O)CH2S-,
-S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2S- 또는 -SCH2CH2S(=O)2CH2CH2-이고, 여기서 L2의 *는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고,
L3, L4, L5 및 L6이 결합인
화합물 또는 면역접합체.
102. 실시양태 17 내지 56 및 실시양태 74 내지 87 중 어느 한 실시양태에 있어서,
L1이 -*(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mX3-, -*C(=O)(CH2)m-, -*NHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3-, -*(CH2)mO)n(CH2)m-, -*(CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*((C(R12)2)mOC(=O)NH(CH2)mO(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mNHC(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -*X4 X1X2C(=O)(CH2)m-, -*X1C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, 
, -*NH2S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, -*C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m)- 및 -*C(=O)NH(CH2)m)-로부터 선택되고, 여기서 면역접합체 실시양태에서 *는 R3에 대한 부착 지점을 나타내고,
L2가
이고, 여기서 L2의 *는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고,
L3, L4, L5 및 L6이 결합인
화합물 또는 면역접합체.
103. 실시양태 17 내지 56 및 실시양태 74 내지 87 중 어느 한 실시양태에 있어서,
L1이 -*(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mX3-, -*C(=O)(CH2)m-, -*NHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3-, -*(CH2)mO)n(CH2)m-, -*(CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*((C(R12)2)mOC(=O)NH(CH2)mO(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mNHC(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -*X4 X1X2C(=O)(CH2)m-, -*X1C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, 
, -*NH2S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, -*C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m)- 및 -*C(=O)NH(CH2)m)-로부터 선택되고, 여기서 면역접합체 실시양태에서 *는 R3에 대한 부착 지점을 나타내고,
L2가
이고, 여기서 L2의 *는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고,
L3, L4, L5 및 L6이 결합인
화합물 또는 면역접합체.
104. 실시양태 17 내지 56 및 실시양태 74 내지 87 중 어느 한 실시양태에 있어서,
L1이 -*(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mX3-, -*C(=O)(CH2)m-, -*NHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3-, -*(CH2)mO)n(CH2)m-, -*(CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*((C(R12)2)mOC(=O)NH(CH2)mO(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-, 및 -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-으로부터 선택되고, 여기서 면역접합체 실시양태에서 *는 R3에 대한 부착 지점을 나타내고;
L2가
이고, 여기서 L2의 *는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고,
L3, L4, L5 및 L6이 결합인
화합물 또는 면역접합체.
105. 실시양태 1 내지 56 및 88 내지 106 및 실시양태 57 내지 87 및 88 내지 106 중 어느 한 실시양태에 있어서, R6이 H, 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 sec-부틸인 화합물 또는 면역접합체.
106. 실시양태 1 내지 56 및 88 내지 107 및 88 및 실시양태 57 내지 88 및 88 내지 107 중 어느 한 실시양태에 있어서, R12가 H, 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 sec-부틸인 화합물 또는 면역접합체.
107. 실시양태 1 내지 56 및 88 내지 108, 88 및 89 및 실시양태 57 내지 89 및 88 내지 108 중 어느 한 실시양태에 있어서, R2가 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 sec-부틸인 화합물 또는 면역접합체.
108. 실시양태 1 내지 56 및 88 내지 109 중 어느 한 실시양태에 있어서,
로부터 선택된 것인 화합물.
109. 실시양태 57 내지 87 중 어느 한 실시양태의 면역접합체 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
110. 치료 유효량의 실시양태 57 내지 87 중 어느 한 실시양태의 면역접합체 및 1종 이상의 치료 활성 공동-작용제를 포함하는 조합물.
111. 세포 증식 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 실시양태 57 내지 87 중 어느 한 실시양태의 면역접합체를 투여하는 것을 포함하는, 세포 증식 장애의 치료 방법.
112. 실시양태 57 내지 87 중 어느 한 실시양태에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 면역접합체.
113. 실시양태 114에 있어서, 의약이 암의 치료에서 사용하기 위한 것인 면역접합체.
114. 암을 치료하기 위한 사용을 위한 실시양태 57 내지 87 중 어느 한 실시양태의 면역접합체.
115. 실시양태 57 내지 87 중 어느 한 실시양태에 있어서,
로부터 선택된 화학식을 갖는 면역접합체.
116. 실시양태 117에 있어서, X가 
이고, 여기서 R101, R2 및 R3은 실시양태 57 내지 73에 정의된 바와 같다.
117. 실시양태 117에 있어서, X가 
이고, 여기서 R1, R2 및 R3은 실시양태 74 내지 87에 정의된 바와 같다.
118. 화학식 I의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 입체이성질체.
<화학식 I>
여기서
R1은 -N=CR4R5이고; R2는 -C1-C6알킬이고; R3은 
이고; R4는 -N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R9는 -NHS(=O)2LR11이고; R11은 
이고; L은 -(CH2)mX3(CH2)m-이고; X3은 
이고,
각각의 m은 독립적으로 1, 2 및 3으로부터 선택된다.
119. 화학식 III의 면역접합체.
<화학식 III>
여기서
Ab는 항원 결합 모이어티를 나타내고;
L은 
이고; y는 1 내지 16의 정수이고; R1은 -N=CR4R5이고; R2는 -C1-C6알킬이고;
R113은 
이고; R4는 -N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R117은 -NHS(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-이고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2 및 3으로부터 선택된다.
120. 화학식 III의 면역접합체.
<화학식 III>
여기서,
Ab는 항원 결합 모이어티를 나타내고;
L은 -L1L2-이고; L1은 -NHS(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-이고; L2는 
이고; y는 1 내지 16의 정수이고;
R1은 -N=CR4R5이고; R2는 -C1-C6알킬이고;
R113은 
이고; R4는 -N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R117은 결합이고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2 및 3으로부터 선택된다.
121. 실시양태 57 내지 87 및 117 내지 119 중 어느 한 실시양태에 있어서, 달리 기재되지 않는 한, Ab는 임의의 항원 결합 모이어티일 수 있고, 바람직하게는 세포 표면 마커, 예컨대 표적화된 세포, 예컨대 암 세포의 특징인 본원에 기재된 것을 인식하는 항원 또는 항원 단편이다.
122. 실시양태 57 내지 87 및 117 내지 119 중 어느 한 실시양태에 있어서, 달리 기재되지 않는 한, Ab는 임의의 항원 결합 모이어티, 전형적으로 제약 개입을 위해 표적화되는 세포, 예컨대 암 세포의 항원 특징을 인식하는 것일 수 있다. 많은 적합한 항원은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고; 특별한 관심대상의 구체적인 것이 본원에 기재되어 있다. 전형적으로, Ab는 단리 또는 구축될 수 있고 천연 또는 변형 (조작)될 수 있는 항체, 또는 항체와 유사한 항원 결합 활성을 보유하는 항체 단편이다.
123. 상기 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, 각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4 및 5로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3 및 4로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 m은 독립적으로 1, 2 및 3으로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 m은 독립적으로 1 및 2로부터 선택된다.
124. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4 및 5로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3 및 4로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 n은 독립적으로 1, 2 및 3으로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 n은 독립적으로 1 및 2로부터 선택된다.
125. 실시양태 38 내지 95 중 어느 한 실시양태에 있어서, 각각의 y는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 y는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 y는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 y는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 y는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 y는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 y는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 y는 독립적으로 1, 2, 3, 4 및 5로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 y는 독립적으로 1, 2, 3 및 4로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 y는 독립적으로 1, 2 및 3으로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에서, 각각의 y는 독립적으로 1 및 2로부터 선택된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Novartis AG
Geierstanger, Bernhard
Grunewald, Jan
Ou, Weijia
Pan, Shifeng
Uno, Tetsuo
Wan, Yongqin
Wang, Xing
<120> CYTOTOXIC PEPTIDES AND CONJUGATES THEREOF
<130> PAT055898-WO-PCT
<160> 49
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-Her2 heavy chain wild-type
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-Her2 light chain wild-type
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 3
<211> 331
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> constant region of the heavy chain wild-type of antibody 20507
and anti-Her2)
<400> 3
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
1 5 10 15
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
35 40 45
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
50 55 60
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
65 70 75 80
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
85 90 95
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
100 105 110
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
115 120 125
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
130 135 140
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
145 150 155 160
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
165 170 175
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
180 185 190
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
195 200 205
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
210 215 220
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
225 230 235 240
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
245 250 255
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
260 265 270
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
275 280 285
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
290 295 300
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
305 310 315 320
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> constant region of the light chain wild-type of antibody 20507
and of anti-Her2
<400> 4
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
1 5 10 15
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
20 25 30
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
35 40 45
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
50 55 60
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
65 70 75 80
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
85 90 95
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 5
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> constant region of the mutant light chain of anti-Her2 LC-S159C
and antibody 20507 LC-S159C
<400> 5
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
1 5 10 15
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
20 25 30
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
35 40 45
Gln Ser Gly Asn Cys Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
50 55 60
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
65 70 75 80
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
85 90 95
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 6
<211> 331
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> constant region of the mutant heavy chain of antibody 20507
HC-E152C
<400> 6
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
1 5 10 15
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Pro Cys Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
35 40 45
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
50 55 60
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
65 70 75 80
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
85 90 95
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
100 105 110
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
115 120 125
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
130 135 140
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
145 150 155 160
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
165 170 175
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
180 185 190
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
195 200 205
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
210 215 220
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
225 230 235 240
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
245 250 255
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
260 265 270
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
275 280 285
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
290 295 300
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
305 310 315 320
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 7
<211> 331
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> constant region of the mutant heavy chain of antibody 20507
HC-S375C
<400> 7
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
1 5 10 15
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
35 40 45
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
50 55 60
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
65 70 75 80
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
85 90 95
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
100 105 110
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
115 120 125
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
130 135 140
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
145 150 155 160
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
165 170 175
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
180 185 190
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
195 200 205
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
210 215 220
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
225 230 235 240
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
245 250 255
Tyr Pro Cys Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
260 265 270
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
275 280 285
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
290 295 300
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
305 310 315 320
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> constant region of the mutant light chain of antibody 20507
LC-K107C
<400> 8
Cys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
1 5 10 15
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
20 25 30
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
35 40 45
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
50 55 60
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
65 70 75 80
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
85 90 95
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 9
<211> 331
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> constant region of the mutant heavy chain of antibody 20507
HC-K360C
<400> 9
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1 5 10 15
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Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
35 40 45
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
50 55 60
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
65 70 75 80
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
85 90 95
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130 135 140
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HC-E152C-S375C and of anti-Her2 HC-E152C-S375C
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50 55 60
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260 265 270
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275 280 285
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<213> Artificial Sequence
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<223> constant region of the mutant heavy chain of HC-ins388-A1 in
anti-Her2 and antibody 20507
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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HC-ins388-ybbR
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> constant region of the mutant heavy chain of anti-Her2
HC-ins388-ybbR-S390C
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<213> Artificial Sequence
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<223> constant region of the mutant heavy chain of anti-Her2
HC-S119G-T120D-K121S-G122L-P123D-ins123-MLEW
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Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
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Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> constant region of the mutant heavy chain of anti-Her2
HC-P189G-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L
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Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
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Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
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Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
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Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
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Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
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Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
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Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
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Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
305 310 315 320
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> constant region of the mutant heavy chain of anti-Her2
HC-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L
<400> 18
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
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Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> constant region of the mutant heavy chain of anti-Her2
HC-ins388-C
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Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
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Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
225 230 235 240
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
245 250 255
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<213> Artificial Sequence
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1 5
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S6-6aa
<400> 24
Asp Ser Leu Ser Trp Leu
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 25
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Lys Leu Ala Glu Lys Leu Gly Val Ala Asn Met His Val Thr Leu Ala
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130
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LC-S159C: Sense
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<210> 27
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LC-S159C: Anti-sense
<400> 27
ctctcctgac agttgccgct ctgcagggcg ttgtccacct 40
<210> 28
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HC-E152C : Sense
<400> 28
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<213> Artificial Sequence
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<223> HC-E152C : Anti-sense
<400> 29
ggtcacggga caggggaagt agtccttcac caggcagc 38
<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HC-S375C: Sense
<400> 30
ttctacccct gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaacg 40
<210> 31
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HC-S375C: Anti-sense
<400> 31
ggcgatgtcg caggggtaga agcccttcac cagacaggtc a 41
<210> 32
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HC-K360C: Sense
<400> 32
agctgacctg caaccaggtg tccctgacct gtctggtga 39
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HC-K360C: Anti-sense
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cacctggttg caggtcagct cgtcccggga tggaggcagg 40
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> LC-K107C: Sense
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gtggagatct gtcgaacggt ggccgctccc agcgtgttca 40
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<220>
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accgttcgac agatctccac cttggtaccc tgtccgaac 39
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cccgagtgta acaactacaa gaccacacct ccagtgctg 39
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gttgttacac tcgggctggc cgttgctctc ccactccac 39
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<212> DNA
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<220>
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ctggacatgc tggagtggag cctgatgaac aactacaaga ccacacctcc ag 52
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HC-ins388-A1: Anti-sense
<400> 39
ccactccagc atgtccaggc tgtcgccctc gggctggccg ttgctc 46
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<211> 52
<212> DNA
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<220>
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<400> 40
ctggagttca tcgccagcaa gctggccaac aactacaaga ccacacctcc ag 52
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cttgctggcg atgaactcca ggctgtcctc gggctggccg ttgctc 46
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<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-Her2 HC-S119G-T120D-K121S-G122L-P123D-ins123-MLEW: Sense
<400> 42
tggacatgct ggagtggagc gtgttccccc tggcccccag cagc 44
<210> 43
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-Her2 HC-S119G-T120D-K121S-G122L-P123D-ins123-MLEW:
Anti-sense
<400> 43
ctccagcatg tccaggctgt cgccagccga ggagacggtg accagggttc 50
<210> 44
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-Her2 HC-P189G-S190D- S192L-L193S-G194W-T195L: Sense
<400> 44
gcgacagcct gagctggctg cagacctaca tctgcaacgt gaac 44
<210> 45
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-Her2 HC-P189G-S190D- S192L-L193S-G194W-T195L: Anti-sense
<400> 45
cagccagctc aggctgtcgc ccactgtcac cacgctggac ag 42
<210> 46
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-Her2 HC-S190D- S192L-L193S-G194W-T195L: Sense
<400> 46
gacagtgccc gacagcctga gctggctgca gacctacatc 40
<210> 47
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-Her2 HC-S190D- S192L-L193S-G194W-T195L
<400> 47
gctgtcgggc actgtcacca cgctggacag gctgtacag 39
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HC-ins388-ybbR-S390C: Sense
<400> 48
cagcccgagg actgcctgga gttcat 26
<210> 49
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HC-ins388-ybbR-S390C: Anti-sense
<400> 49
atgaactcca ggcagtcctc gggctgg 27
Claims (64)
- 화학식 I의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 입체이성질체, 또는 그의 호변이성질체, 수화물, 또는 제약상 허용되는 염.
<화학식 I>
여기서,
R1은 -N=CR4R5, -N=R19, -N=CR5R20, -N=CR5NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12, -N=CR5NR12(CH2)mN(R12)2, -NHC(=NR6)R4, -NHC(=O)R4, -NHC(=O)R20, -NHR8, -NHLR11, -NHR21, -N=CR5R10, -N=R22, -N=CR5R23 또는 -NHC(=O)R23이고;
R2는 -C1-C6알킬이고;
R3은이고;
R4는 -N(R6)2 또는 -NR6R7이고;
R5는 N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R7은 -(CH2)mN(R12)2, -(CH2)mN(R12)C(=O)OR12 또는 비치환된 C3-C8시클로알킬이거나;
또는 R7은 C1-C6알킬, 옥소, -C(=O)R18, -(CH2)mOH, -C(=O)(CH2)mOH, -C(=O)((CH2)mO)nR12, -((CH2)mO)nR12, 또는 1 내지 5개의 히드록실로 임의로 치환된 C1-C6알킬로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된 C3-C8시클로알킬이고;
R8은 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이거나;
또는 R8은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, C1-C6알콕시, -OH, -CN, -NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2, -C(=O)NR6(CH2)mN(R6)C(O)OR6 및 -C(=O)NR6(CH2)mN(R6)2로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이고;
R9는 -OH, C1-C6알콕시, -NHS(O)2(CH2)mN3, -NHS(O)2(CH2)mNH2, -N(R12)2, -R16, -NR12(CH2)mN(R12)2, -NR12(CH2)mR16, -LR11, -NHS(O)2R18, -NHS(=O)2LR11,
이고;
R10은 LR11 또는이고;
R11은
, -NR12C(=O)CH=CH2, -N3,
, SH, -SSR17, -S(=O)2(CH=CH2), -(CH2)2S(=O)2(CH=CH2), -NR12S(=O)2(CH=CH2), -NR12C(=O)CH2R13, -NR12C(=O)CH2Br, -NR12C(=O)CH2I, -NHC(=O)CH2Br, -NHC(=O)CH2I, -ONH2, -C(O)NHNH2,
, -CO2H, -NH2, -NCO, -NCS,
이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R13은 -S(CH2)nCHR14NHC(=O)R12 또는
이고;
R14는 R12 또는 -C(=O)OR12이고;
R15는 테트라졸릴, -CN, -C(=O)OR12,
,
-LR11 또는 -X4LR11이고;
R16은 비치환되거나 또는 -LR11로 치환된, N, O, S, S(=O) 및 S(=O)2로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 함유하는 N-연결된 4-8원 헤테로시클로알킬이고;
R17은 2-피리딜 또는 4-피리딜이고;
각각의 R18은 독립적으로 C1-C6알킬, 아지도로 치환된 C1-C6알킬, 및 1 내지 5개의 히드록실로 치환된 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R19는 N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R19는 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R20은 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R20은 C1-C6알킬, -C(=O)OR12, -C(=O)(CH2)mN3, C1-C6할로알킬, 할로겐, 옥소, -OH 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R21은 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -CN, NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이고;
R22는 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R23은 LR11 및 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
각각의 L은 독립적으로 -L1L2L3L4L5L6-, -L6L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4L5-, -L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4-, -L4L3L2L1-, -L1L2L3-, -L3L2L1-, -L1L2-, -L2L1- 및 -L1로부터 선택되고,
여기서 L1은
-(CH2)m-, -C(=O)(CH2)m-, -NR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)(CH2)mNR12(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1C(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-,, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNR12(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mX3-, -X3(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)n-, -((C(R12)2)mOC(=O)NR12(CH2)mO(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(C(R12)2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -(CH2)m(O(CH2)m)nS(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mNR12(CH2)mC(=O)-, -(CH2)mO(CH2)mNR12C(=O)O((C(R12)2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)X1-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-,
, -((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)n-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-, -(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3-, -X3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mS(CH2)m-, -NR12C(=O)(CH2)m-, -NR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12-, -(CH2)mC(=O)NR12-, -(CH2)mNR12(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3-, -X3(CH2)m-, -((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-, -NR12(CH2)m-, -NR12C(R12)2(CH2)m-, -(CH2)mC(R12)2NR12-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)NR12-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -NR12C(R12)2(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -NR12C(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-, -(CH2)mNR12-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-, -(C(R12)2)m-, -(CH2CH2O)n-, -(OCH2CH2)n-, -(CH2)mO(CH2)m-, -S(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2-, -S(=O)2(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mS(=O)2-, -S(=O)2(CH2)m X3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2-, -(CH2)mX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)X2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNR12C(=O(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)NR12(CH2)m-, -X4X1X2C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1X4-, -X1C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)X1-, -C(=O)CHRaaNR12-, -NR12CHRaaC(=O)-, -C(=O)NR12-, -C(=O)O-, -S-, -SCH2(C=O)NR12-, -NR12C(=O)CH2S-, -S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2CH2CH2-, -NR12C(=S)-, -(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12C(=O)-, -C(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -NR12S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2NR12-,
로부터 선택되고;
R24는 H 또는 Me이고;
각각의 R25는 독립적으로 H 또는 C1-4 알킬로부터 선택되고;
R26은이고;
Raa는 H, 또는 알라닌, 트립토판, 티로신, 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 아스파르트산, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 시스테인, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시트룰린, 오르니틴, 페닐글리신 및 t-부틸글리신으로부터 선택된 아미노산의 측쇄이고;
R30은 H, -CH3 또는 페닐이고;
R32는 독립적으로 H, C1-4 알킬, 페닐, 피리미딘 및 피리딘으로부터 선택되고;
R33은 독립적으로
로부터 선택되고;
R34는 독립적으로 H, C1-4 알킬, 및 C1-6 할로알킬로부터 선택되고;
X1은
로부터 선택된 자기 희생적 스페이서이고;
X2는
로부터 선택된 디펩티드이고;
X3은이고,
X4는이고;
L2, L3, L4, L5, 및 L6은 각각 독립적으로 결합 및 L1로부터 선택되고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되고;
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된다. - 제1항에 있어서, 화학식 Ia의 구조를 갖는 화합물인 화합물.
<화학식 Ia>
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 화학식 Ib의 구조를 갖는 화합물인 화합물.
<화학식 Ib>
- 제1항에 있어서, 화학식 Ic의 구조를 갖는 화합물인 화합물.
<화학식 Ic>
- 제1항 또는 제4항에 있어서, 화학식 Id의 구조를 갖는 화합물인 화합물.
<화학식 Id>
- 제1항에 있어서, 화학식 Ie의 구조를 갖는 화합물인 화합물.
<화학식 Ie>
- 제1항 또는 제6항에 있어서, 화학식 If의 구조를 갖는 화합물인 화합물.
<화학식 If>
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 L이 독립적으로 L1L2- 및 -L2L1-로부터 선택되거나, 또는 L이 -L1-인 화합물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 -N=CR4R5, -N=R19, -N=CR5R20, -N=CR5R10, -N=R22 또는 -N=CR5R23인 화합물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 -N=CR5R10, -N=R22, -NHLR11, -NHR21, -N=CR5R23 또는 -NHC(=O)R23인 화합물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 -NHC(=NR6)R4, -NHC(=O)R4, -NHC(=O)R20 또는 -NHC(=O)R23인 화합물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 -NHR8, -NHLR11 또는 -NHR21인 화합물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 -N=CR5R10, -N=R22, -NHLR11, -NHR21, -N=CR5R23 또는 -NHC(=O)R23인 화합물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
R1이 -N=CR4R5이고;
R4가 -N(R6)2이고;
R5가 N(R6)2이고;
각각의 R6이 독립적으로 -C1-C6알킬로부터 선택된 것인
화합물. - 제1항 내지 제10항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, R1이인 화합물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, R9가 -OH, C1-C6알콕시, -NHS(O)2(CH2)mN3, -NHS(O)2(CH2)mNH2, -NHS(=O)2LR11 또는인 화합물.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, -R15가인 화합물.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, R11이
,
-S(=O)2(CH=CH2), -NHC(=O)CH2Br, -NHC(=O)CH2I, -ONH2, N3,
인 화합물.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, -R11이
또는 -ONH2인 화합물.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, L이 -L1-이고, -L1-이 -(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)m-, -(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-,
,
-(CH2)m(O(CH2)m)nS(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mNH(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNH(CH2)m-, -(CH2)mNR12(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNR12(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2-, -S(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2-, -S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)X2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nS(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2((CH2)mO)n(CH2)m-, -((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)n-, -(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)-, -C(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)-, -((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-, -C(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNHC(=O)-, -C(=O)NH(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)-, -C(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNHC(=O(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -NR12S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2NR12-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)m- 및 -(CH2)mNHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m-으로부터 선택된 것인 화합물. - 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, L이 -L1-이고, -L1-이 -(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)m-, -(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-,
,
-(CH2)m(O(CH2)m)nS(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mNH(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNH(CH2)m-, -(CH2)mNR12(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNR12(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m-, -((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2-, -S(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2- 및 -S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m -으로부터 선택된 것인 화합물. - 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, L이 -L1-이고, -L1-이 -(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m-, -((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, 및 -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-로부터 선택된 것인 화합물.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, R12이 H, -CH3 또는 -CH2CH3인 화합물.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 sec-부틸인 화합물.
- 제1항에 있어서,
로부터 선택된 화합물. - 화학식 II의 면역접합체.
<화학식 II>
여기서,
Ab는 항원 결합 모이어티를 나타내고;
R101은, -NHC(=O)NR6*-, -NHR121*-,
또는 -NHC(=O)R123*-이고, 여기서 *는 L에 대한 부착 지점을 나타내고;
R2는 -C1-C6알킬이고;
R3은이고;
R5는 N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R9는 -OH, C1-C6알콕시, -N(R12)2, -R16, -NR12(CH2)mN(R12)2, -NR12(CH2)mR16, -NHS(O)2R18 또는이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R15는 테트라졸릴,
이고;
R16은 비치환되거나 또는 -LR11로 치환된, N, O, S, S(=O) 및 S(=O)2로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 함유하는 N-연결된 4-8원 헤테로시클로알킬이고;
각각의 R18은 독립적으로 C1-C6알킬, 아지도로 치환된 C1-C6알킬, 및 1 내지 5개의 히드록실로 치환된 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R110은 결합 또는이고;
R121은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -CN, NO2, -C(=O)OR6, -C(=O)N(R6)2 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴렌이고;
R122는 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬렌이고;
R123은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬렌이고;
L은 -L1L2L3L4L5L6-, -L6L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4L5-, -L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4-, -L4L3L2L1-, -L1L2L3-, -L3L2L1-, -L1L2-, -L2L1- 및 -L1로부터 선택되고,
여기서
L1은
-(CH2)m-, -C(=O)(CH2)m-, -NR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)(CH2)mNR12(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1C(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-,, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNR12(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mX3-, -X3(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)n-, -((C(R12)2)mOC(=O)NR12(CH2)mO(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(C(R12)2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -(CH2)m(O(CH2)m)nS(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mNR12(CH2)mC(=O)-, -(CH2)mO(CH2)mNR12C(=O)O((C(R12)2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)X1-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-,
, -((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)n-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-, -(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3-, -X3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mS(CH2)m-, -NR12C(=O)(CH2)m-, -NR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12-, -(CH2)mC(=O)NR12-, -(CH2)mNR12(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3-, -X3(CH2)m-, -((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-, -NR12(CH2)m-, -NR12C(R12)2(CH2)m-, -(CH2)mC(R12)2NR12-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)NR12-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -NR12C(R12)2(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -NR12C(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-, -(CH2)mNR12-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-, -(C(R12)2)m-, -(CH2CH2O)n-, -(OCH2CH2)n-, -(CH2)mO(CH2)m-, -S(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2-, -S(=O)2(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mS(=O)2-, -S(=O)2(CH2)m X3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2-, -(CH2)mX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)X2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNR12C(=O(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)NR12(CH2)m-, -X4X1X2C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1X4-, -X1C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)X1-, -C(=O)CHRaaNR12-, -NR12CHRaaC(=O)-, -C(=O)NR12-, -C(=O)O-, -S-, -SCH2(C=O)NR12-, -NR12C(=O)CH2S-, -S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2CH2CH2-, -NR12C(=S)-, -(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12C(=O)-, -C(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -NR12S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2NR12-,
로부터 선택되고;
R24는 H 또는 Me이고;
각각의 R25는 독립적으로 H 또는 C1-4 알킬로부터 선택되고;
R26은이고;
Raa는 H, 또는 알라닌, 트립토판, 티로신, 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 아스파르트산, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 시스테인, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시트룰린, 오르니틴, 페닐글리신 및 t-부틸글리신으로부터 선택된 아미노산의 측쇄이고;
R30은 H, -CH3 또는 페닐이고;
R32는 독립적으로 H, C1-4 알킬, 페닐, 피리미딘 및 피리딘으로부터 선택되고;
R33은 독립적으로
로부터 선택되고;
R34는 독립적으로 H, C1-4 알킬, 및 C1-6 할로알킬로부터 선택되고;
X1은
로부터 선택된 자기 희생적 스페이서이고;
X2는
로부터 선택된 디펩티드이고;
X3은이고,
X4는이고;
y는 1 내지 16의 정수이고;
L2, L3, L4, L5, 및 L6은 각각 독립적으로 결합 및 L1로부터 선택되고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되고,
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된다. - 제26항에 있어서, 화학식 II의 면역접합체가 화학식 IIa의 면역접합체인 면역접합체.
<화학식 IIa>
- 제26항 또는 제27항에 있어서, L이 -L1L2- 또는 -L2L1-인 면역접합체.
- 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 II의 면역접합체가 화학식 IIb의 면역접합체인 면역접합체.
<화학식 IIb>
- 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 II, 화학식 IIa 또는 화학식 IIb의 면역접합체가 화학식 IIc의 구조를 갖는 면역접합체인 면역접합체.
<화학식 IIc>
- 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, R101이이고, R110이 결합인 면역접합체.
- 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, R101이이고, R110이
인 면역접합체.
- 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
R9가 -OH, C1-C6알콕시, -N(R14)2, -R16, -NR12(CH2)mN(R12)2, -NHS(O)2R18, 또는 -NR12(CH2)mR16이고;
R15가 테트라졸릴,
인 면역접합체. - 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, R9가 -OH, C1-C6알콕시, -N(R14)2, -R16, -NR12(CH2)mN(R14)2, 또는 -NR12(CH2)mR16인 면역접합체.
- 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, R15가
인 면역접합체. - 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, R9가 -OH 또는 -OCH3인 면역접합체.
- 제26항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, R12가 H, -CH3 또는 -CH2CH3인 면역접합체.
- 제26항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 sec-부틸인 면역접합체.
- 제26항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
L1이 -(CH2)mNHC(=O)(CH2)mX3(CH2)m*-, -(CH2)mC(=O)*-, -(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)*-, -(CH2)mX2X1C(=O)*-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)*-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)X2X1C(=O)*-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)*-, -(CH2)m(O(CH2)m)nS(=O)2(CH2)m*-, -(CH2)mNR12(CH2)mC(=O)*-, -X3(CH2)m*-, -(CH2)mC(=O)NH*-, -(CH2)mNH(CH2)mC(=O)*-, -((CH2)mO)n(CH2)m*-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)*-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12*-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)NH*-, -(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)*-, -(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(=O)*-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)*-, -(CH2)mNHC(=O)*-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)*-, -(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m*-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)m*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)*-, -(CH2)mX3(CH2)mNHC(=O)*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mC(=O)*-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)*-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)mC(=O)*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)*-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m*-, -(CH2)mX3(CH2)mNHC(=O)(CH2)m*-, -X3(CH2)mNHC(=O)(CH2)m*-, -(CH2)m(O(CH2)m)n*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m(O(CH2)m)n*-, -X3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(=O)(CH2)m*-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(=O)(CH2)m*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mC(=O)NH(CH2)m*-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NH(CH2)m*-, -(CH2)mO(CH2)mNHC(=O)O((C(R12)2)m*-, -(CH2)mS(=O)2*- 및 -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2*-이고, 여기서 L1의 *는 R101에 대한 부착 지점을 나타내고;
L2가
,
-S-, -SCH2(C=O)NH-, -NHC(=O)CH2S-, -NH(=O)CH2CH2S-, -SCH2CH2C(=O)NH-, -S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2S- 또는 -SCH2CH2S(=O)2CH2CH2-이고, 여기서 L2의 *는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고;
L3, L4, L5 및 L6이 결합인
면역접합체. - 제26항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
L1이 -(CH2)mC(=O)*-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)*-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12*-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)NH*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)*-, -(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)*-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)*-, -(CH2)m(O(CH2)m)nS(=O)2(CH2)m*-, -(CH2)mNR12(CH2)mC(=O)*-, -X3(CH2)m*-, -(CH2)mC(=O)NH*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m*-, -(CH2)mX3(CH2)mNHC(=O)(CH2)m*-, -X3(CH2)mNHC(=O)(CH2)m*-, -(CH2)m(O(CH2)m)n*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m(O(CH2)m)n*-, -(CH2)mO(CH2)mNHC(=O)O((C(R12)2)m*-, -X3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(=O)(CH2)m*- 및 -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(=O)(CH2)m*-로부터 선택되고, 여기서 L1의 *는 R101에 대한 부착 지점을 나타내고;
L2가
,
-S-, -SCH2(C=O)NH-, -NHC(=O)CH2S-, -NH(=O)CH2CH2S-, -SCH2CH2C(=O)NH-, -S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2S- 또는 -SCH2CH2S(=O)2CH2CH2-이고, 여기서 L2의 *는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고,
L3, L4, L5 및 L6이 결합인
면역접합체. - 제26항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
L1이 -(CH2)mC(=O)*-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)*-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12*-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)NH*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)*-, -(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)*-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)*-, -(CH2)m(O(CH2)m)nS(=O)2(CH2)m*-, -(CH2)mNR12(CH2)mC(=O)*-, -X3(CH2)m*-, -(CH2)mC(=O)NH*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m*-, -(CH2)mX3(CH2)mNHC(=O)(CH2)m*-, -X3(CH2)mNHC(=O)(CH2)m*-, -(CH2)m(O(CH2)m)n*-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)m(O(CH2)m)n*-, -(CH2)mO(CH2)mNHC(=O)O((C(R12)2)m*-, -X3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(=O)(CH2)m*- 및 -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(=O)(CH2)m*-로부터 선택되고, 여기서 L1의 *는 R101에 대한 부착 지점을 나타내고;
L2가
이고,
여기서 L2의 *는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고,
L3, L4, L5 및 L6이 결합인
면역접합체. - 제26항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
L1이 -(CH2)mC(=O)*-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)*-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12*-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)NH*-, 및 -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)*-로부터 선택되고, 여기서 L1의 *는 R101에 대한 부착 지점을 나타내고;
L2가
이고,
여기서 L2의 *는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고,
L3, L4, L5 및 L6이 결합인
면역접합체. - 화학식 III의 면역접합체.
<화학식 III>
여기서,
Ab는 항원 결합 모이어티를 나타내고;
R1은 -N=CR4R5, -N=R19, -N=CR5R20, -NHC(=NR6)R4, -NHC(=O)R4, -NHC(=O)R20 또는 -NHR8이고;
R2는 -C1-C6알킬이고;
R4는 -N(R6)2 또는 -NR6R7이고;
R5는 N(R6)2이고;
각각의 R6은 독립적으로 H 및 -C1-C6알킬로부터 선택되고;
R7은 비치환된 C3-C8시클로알킬이거나;
또는 R7은 C1-C6알킬, 옥소, -C(=O)R18, -(CH2)mOH, -C(=O)(CH2)mOH, -C(=O)((CH2)mO)nR12, -((CH2)mO)nR12, 또는 1 내지 5개의 히드록실로 임의로 치환된 C1-C6알킬로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된 C3-C8시클로알킬이고;
R8은 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이거나;
또는 R8은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -OH, -N(R6)2, -CN, -NO2, -C(=O)OR6 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, 1-2개의 N 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로아릴이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R19는 N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R19는 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 치환된, N 및 O로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 C-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R20은 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 비치환된 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이거나;
또는 R20은 C1-C6알킬, C1-C6할로알킬, 할로겐, -C(=O)OR12, 옥소, -OH 및 C1-C6알콕시로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 치환기로 치환된, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 N-연결된 5-6원 헤테로시클로알킬이고;
R113은이고;
R117은 결합, -NH-, -NHS(=O)2-,
이고;
R118은 결합, 테트라졸릴,이고;
L은 -L1L2L3L4L5L6-, -L6L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4L5-, -L5L4L3L2L1-, -L1L2L3L4-, -L4L3L2L1-, -L1L2L3-, -L3L2L1-, -L1L2-, -L2L1- 및 -L1로부터 선택되고,
여기서 L1은 -(CH2)m-, -C(=O)(CH2)m-, -NR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)X1X2(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)X1X2C(=O)(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2((CH2)mO)n(CH2)m-, -C(=O)(CH2)mNR12(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)X1C(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-,, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNR12(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mX3-, -X3(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)n-, -((C(R12)2)mOC(=O)NR12(CH2)mO(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(C(R12)2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -(CH2)m(O(CH2)m)nS(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mNR12(CH2)mC(=O)-, -(CH2)mO(CH2)mNR12C(=O)O((C(R12)2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)X1-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-,
, -((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)n-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-, -(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3-, -X3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -C(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mS(CH2)m-, -NR12C(=O)(CH2)m-, -NR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12-, -(CH2)mC(=O)NR12-, -(CH2)mNR12(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3-, -X3(CH2)m-, -((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-, -NR12(CH2)m-, -NR12C(R12)2(CH2)m-, -(CH2)mC(R12)2NR12-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)NR12-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -NR12(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -NR12C(R12)2(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -NR12C(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -NR12C(R12)2(CH2)mOC(=O)NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(=O)O(CH2)mC(R12)2NR12-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-, -(CH2)mNR12-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)m-, -NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-, -(C(R12)2)m-, -(CH2CH2O)n-, -(OCH2CH2)n-, -(CH2)mO(CH2)m-, -S(=O)2(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2-, -S(=O)2(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mS(=O)2-, -S(=O)2(CH2)m X3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2-, -(CH2)mX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)X2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(=O)-, -C(=O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mNR12C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)-, -C(=O)(CH2)mNR12C(=O(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)NR12(CH2)m-, -X4X1X2C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)X2X1X4-, -X1C(=O)(CH2)mNR12C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR12(CH2)mC(=O)X1-, -C(=O)CHRaaNR12-, -NR12CHRaaC(=O)-, -C(=O)NR12-, -C(=O)O-, -S-, -SCH2(C=O)NR12-, -NR12C(=O)CH2S-, -S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2CH2CH2-, -NR12C(=S)-, -(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(=O)-, -C(=O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mNR12C(=O)NR12(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNR12C(=O)-, -C(=O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-, -NR12S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2NR12-,
로부터 선택되고;
R24는 H 또는 Me이고;
각각의 R25는 독립적으로 H 또는 C1-4 알킬로부터 선택되고;
R26은이고;
Raa는 H, 또는 알라닌, 트립토판, 티로신, 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 아스파르트산, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 시스테인, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시트룰린, 오르니틴, 페닐글리신 및 t-부틸글리신으로부터 선택된 아미노산의 측쇄이고;
R30은 H, -CH3 또는 페닐이고;
R32는 독립적으로 H, C1-4 알킬, 페닐, 피리미딘 및 피리딘으로부터 선택되고;
R33은 독립적으로
로부터 선택되고;
R34는 독립적으로 H, C1-4 알킬, 및 C1-6 할로알킬로부터 선택되고;
X1은
로부터 선택된 자기 희생적 스페이서이고;
X2는
로부터 선택된 디펩티드이고;
X3은이고,
X4는이고;
y는 1 내지 16의 정수이고;
L2, L3, L4, L5, 및 L6은 각각 독립적으로 결합 및 L1로부터 선택되고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되고,
각각의 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된다. - 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 III의 면역접합체가 화학식 IIIa의 면역접합체인 면역접합체.
<화학식 IIIa>
- 제43항 또는 제44항에 있어서, L이 -L1L2- 또는 -L2L1-인 면역접합체.
- 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 III의 면역접합체가 화학식 IIIb의 면역접합체인 면역접합체.
<화학식 IIIb>
- 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 III, 화학식 IIIa 또는 화학식 IIIb의 면역접합체가 화학식 IIIc의 면역접합체인 면역접합체.
<화학식 IIIc>
- 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 -N=CR4R5, -N=R19 또는 -N=CR5R20인 면역접합체.
- 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 -NHC(=NR6)R4, -NHC(=O)R4 또는 -NHC(=O)R20인 면역접합체.
- 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 -NHR8인 면역접합체.
- 제43항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
R1이 -N=CR4R5이고;
R4가 -N(R6)2이고;
R5가 N(R6)2이고;
각각의 R6이 독립적으로 -C1-C6알킬로부터 선택된 것인
면역접합체. - 제43항 내지 제48항 및 제51항 중 어느 한 항에 있어서, R1이인 면역접합체.
- 제43항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, R12가 H, -CH3 또는 -CH2CH3인 면역접합체.
- 제43항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 sec-부틸인 면역접합체.
- 제43항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
L1이 -*(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mX3-, -*C(=O)(CH2)m-, -*NHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3-, -*(CH2)mO)n(CH2)m-, -*(CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*((C(R12)2)mOC(=O)NH(CH2)mO(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mNHC(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -*X4X1X2C(=O)(CH2)m-, -*X1C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-,, -*C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m)-, -*C(=O)NH(CH2)m)-, -*C(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -*C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -*(CH2)mS(=O)2((CH2)mO)n(CH2)m-, -*C(=O)(CH2)mNR12(CH2)m-, -*C(=O)(CH2)mNH(CH2)m-, -*(CH2)m(O(CH2)m)n-, -*C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, - *C(=O)NH(CH2)m-, -*C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*C(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*C(=O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*NH2S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mNHC(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m- 및 -C(=O)NH(CH2)mNHC(=O)-로부터 선택되고, 여기서 L1의 *는 R3에 대한 부착 지점을 나타내고;
L2가 결합,
,
-S-, -SCH2(C=O)NH-, -NHC(=O)CH2S-,
,
-S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2S- 또는 -SCH2CH2S(=O)2CH2CH2-이고, 여기서 L2의 *는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고,
L3, L4, L5 및 L6이 결합인
면역접합체. - 제43항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
L1이 -*(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mX3-, -*C(=O)(CH2)m-, -*NHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3-, -*(CH2)mO)n(CH2)m-, -*(CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*((C(R12)2)mOC(=O)NH(CH2)mO(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mNHC(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -*X4 X1X2C(=O)(CH2)m-, -*X1C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-,, -*NH2S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, -*C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m)- 및 -*C(=O)NH(CH2)m)-로부터 선택되고, 여기서 L1의 *는 R3에 대한 부착 지점을 나타내고;
L2가
,
-S-, -SCH2(C=O)NH-, -NHC(=O)CH2S-,
,
-S(=O)2CH2CH2S-, -SCH2CH2S(=O)2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2S- 또는 -SCH2CH2S(=O)2CH2CH2-이고, 여기서 L2의 *는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고,
L3, L4, L5 및 L6이 결합인
면역접합체. - 제43항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
L1이 -*(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mX3-, -*C(=O)(CH2)m-, -*NHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3-, -*(CH2)mO)n(CH2)m-, -*(CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*((C(R12)2)mOC(=O)NH(CH2)mO(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mNHC(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -*X4 X1X2C(=O)(CH2)m-, -*X1C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-,, -*NH2S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, -*C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m)- 및 -*C(=O)NH(CH2)m)-로부터 선택되고, 여기서 L1의 *는 R3에 대한 부착 지점을 나타내고;
L2가
이고,
여기서 L2의 *는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고,
L3, L4, L5 및 L6이 결합인
면역접합체. - 제43항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
L1이 -*(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mX3-, -*C(=O)(CH2)m-, -*NHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3-, -*(CH2)mO)n(CH2)m-, -*(CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*((C(R12)2)mOC(=O)NH(CH2)mO(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mNHC(=O)X1X2C(=O)(CH2)m-, -*X4 X1X2C(=O)(CH2)m-, -*X1C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-,, -*NH2S(=O)2(CH2)mX3(CH2)m-, -*C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m)- 및 -*C(=O)NH(CH2)m)-로부터 선택되고, 여기서 L1의 *는 R3에 대한 부착 지점을 나타내고;
L2가
이고,
여기서 L2의 *는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고,
L3, L4, L5 및 L6이 결합인
면역접합체. - 제43항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
L1이 -*(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mX3-, -*C(=O)(CH2)m-, -*NHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mX3-, -*(CH2)mO)n(CH2)m-, -*(CH2)mO)n(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -*((C(R12)2)mOC(=O)NH(CH2)mO(CH2)m-, -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-, 및 -*(CH2)mC(=O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-으로부터 선택되고, 여기서 L1의 *는 R3에 대한 부착 지점을 나타내고;
L2가
이고,
여기서 L2의 *는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고,
L3, L4, L5 및 L6이 결합인
면역접합체. - 제26항 내지 제59항 중 어느 한 항의 면역접합체 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
- 치료 유효량의 제26항 내지 제59항 중 어느 한 항의 면역접합체 및 1종 이상의 치료 활성 공동-작용제를 포함하는 조합물.
- 세포 증식 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 제26항 내지 제59항 중 어느 한 항의 면역접합체를 투여하는 것을 포함하는, 세포 증식 장애의 치료 방법.
- 제26항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 면역접합체.
- 제26항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 암을 치료하기 위해 사용하기 위한 면역접합체.
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