UA124622C2 - Кон'юговані імуноглобуліни з c-кінцевим лізином - Google Patents

Кон'юговані імуноглобуліни з c-кінцевим лізином Download PDF

Info

Publication number
UA124622C2
UA124622C2 UAA201807950A UAA201807950A UA124622C2 UA 124622 C2 UA124622 C2 UA 124622C2 UA A201807950 A UAA201807950 A UA A201807950A UA A201807950 A UAA201807950 A UA A201807950A UA 124622 C2 UA124622 C2 UA 124622C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
amino acid
terminal lysine
acid residue
immunoglobulin
residue
Prior art date
Application number
UAA201807950A
Other languages
English (en)
Inventor
Джаред Спайдел
Ерл Елбон
Эрл ЭЛБОН
Original Assignee
ЕЙСАЙ Ар ЕНД Ді МЕНЕДЖМЕНТ КО., ЛТД.
Эйсай Ар Энд Ди Менеджмент Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ЕЙСАЙ Ар ЕНД Ді МЕНЕДЖМЕНТ КО., ЛТД., Эйсай Ар Энд Ди Менеджмент Ко., Лтд. filed Critical ЕЙСАЙ Ар ЕНД Ді МЕНЕДЖМЕНТ КО., ЛТД.
Publication of UA124622C2 publication Critical patent/UA124622C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6883—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6887—Antibody-chelate conjugates using chelates for therapeutic purposes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0058—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • A61K49/16—Antibodies; Immunoglobulins; Fragments thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1084—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K51/1087—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody the antibody being a hybrid immunoglobulin the immunoglobulin comprises domains from different animal species, e.g. chimeric immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1084—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K51/109—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody the antibody being a hybrid immunoglobulin immunoglobulins having two or more different antigen-binding sites or multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1093—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1093—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
    • A61K51/1096—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies radioimmunotoxins, i.e. conjugates being structurally as defined in A61K51/1093, and including a radioactive nucleus for use in radiotherapeutic applications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12N9/1044—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/02—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12Y203/02013—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/528—CH4 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Споріднені заявки
ІО00О1) Дана заявка запитує пріоритет за попередньою заявкою США 62/269138, поданою 18 грудня 2015 року, повний вміст якої прямо включений за допомогою посилання.
Галузь техніки, до якої належить винахід 00021 У даному винаході забезпечуються кон'юговані імуноглобуліни з С-кінцевим лізином і способи їх одержання.
Рівень техніки
ІЇ000О3| Застосовність моноклональних антитіл простягається від фундаментальних досліджень до терапевтичних і діагностичних застосувань. Можливість кон'югувати антитіла з функціональними агентами ще більше розширює їх функціональність. Одержання кон'югованих антитіл зазвичай включає кон'югацію лінкера, лікарського засобу або іншого функціонального агента з реакційноздатними залишками лізину і цистеїну у важких (НС) і легких (ІС) ланцюгах моноклонального антитіла (птАбБ). Див. ЮОеопагаїп, еї аїЇ., "Етегдіпд Топтаї5 їог пехі-депегайоп апіроду агид сопішдаїевз", Ехрегі Оріпіоп іп Огид Оізсомегу (2015), 10(5): 463-481. Кон'югація лізину зазвичай опосередковує реакціями на основі сукциніміду (МН) або на основі ізотіоціанату. Для кон'югації на основі цистеїну потрібне часткове відновлення антитіла для руйнування деяких міжланцюгових дисульфідних зв'язків, тим самим забезпечуючи вільні тіолові групи бічних ланцюгів. Тіол-реактивні функціональні агенти можуть потім реагувати з вільними тіоловими групами в антитілі з утворенням кон'югатів антитіло-лікарський засіб (АОС).
Обидва ці методи призводять до модифікації численних лізинів або цистеїнів, забезпечуючи одержання гетерогенних сумішей АОС з розподілом співвідношень лікарський засіб до антитіла (САКЕ) і модифікаціями лікарського засобу у випадкових положеннях.
І0004| Нещодавній поштовх до застосування технологій сайт-специфічної кон'югації як способу одержання однорідного продукту АОС з певним ВАК дав декілька способів, включаючи конструювання непарних цистеїнів, включення неприродних амінокислот і сайт-специфічну ферментативну модифікацію. Незважаючи на те, що ці способи дають однорідні продукти, кожний з них має свої недоліки. Для кон'югації на основі цистеїну потрібна додаткова стадія для видалення кепованого цистеїну, глутатіону або навіть легкого ланцюга з непарного цистеїну.
Див., наприклад, Уипшїшіа, еї аі!., "Зйе-зресійс Сопійдайноп ої а Сушюіохіс Огид то ап Апіїбоду
Ітргоме5 Тпегарешійс Іпаех", Маїиге Віотесппоїоду, (2008) 26:925-932; Спеп, вї а!., "Спагае-базєй
Апаїузіз ої Апіїбодіе5 м/йКп Епдіпеегей Сувхівїпе5", МАБ5 (2009) 1(6): 563-571; соте, єї а!., "ЕНесі ог тетрегаїйсге, рн, діззоїмей охудеп, апа пуагоїузаце оп Пе Тогтайоп ої ігіріє Іду спаїіп апііроадіе5 іп сеї сийиге" ВіоїесппоЇ! Ргодгеб55 (2010), 26: 1438-1445. Крім того, було показано, що нестабільність у сироватці крові реакції на основі малеїміду, використовувана в цей час для кон'югатів на основі цистеїну, показала наявність проблем, пов'язаних із втратою ефективності або проявом токсичності поза мішенню. АЇеу, еї аї., "Сопігірбшіоп ої ГіпКег Фаріїйу юю Ше Асіїмйіе5 ої Апіісапсег Іттипосопішдаїев", Віосопіпдаєтє СПпетівігу (2008) 19(3): 759-765; ЗПпеп, еї аї., "Сопідайоп 5йе тоамшіагез Пе іп мімо «їарійу апа (пегарешііс асіїміу ої апібоду-агид сопіидаїев",
Майшге Віоїесппоіоду (2012) 30: 184-189. Крім того, для включення неприродних амінокислот потрібна експресія в генетично модифікованій клітинній системі або безклітинній системі.
Наїіат, еї аї., "Оппашта! Атіпо Асіа5 іп Моме! Апіроду Сопішдаїгев5", Ешиге Мей. Спет. (2014) 6(11): 1309-1324. Крім того, наявність неприродної амінокислоти може індукувати імуногенну відповідь у пацієнтів. Однак для сайт-специфічних ферментативних модифікацій можна потенційно використовувати природну амінокислоту дикого типу в послідовності антитіла, тим самим мінімізуючи ймовірність прояву імуногенності. Крім того, посттрансляційні зв'язки, зазвичай утворені ферментами, що модифікують білок, є дуже стабільними.
ІЇ0005| Сайт-специфічна ферментативна модифікація білків була досліджена з використанням родини білків, називаних трансглутаміназами, які каталізують утворення стабільного ізопептидного зв'язку між у-карбоксіамідною групою (ацил-донор) глутаміну і 6- аміногрупи (ацил-акцептор) лізину (див. фіг. 1) (див., наприклад, УоКоуата, еї аї., "Ргорегііеє5 апа
Арріїсайоп5 ої Місгобіа! Тгапздішатіпавхе", Аррі. Місгоріо!. Віоїесп. (2004) 64: 47-454; ЗпМор, "Мегзайцйу ої Місгобіа! Тгапздішатіпавзе", Віосопіддаєе Спетівігу, (2014) 25(5): 855-862; Кіеєїїз7екК еї аї., "Місгобріа! Тгапздішатіпазе апа йб5 Арріїсайоп іп (Ше Роса Іпаивігу", Еоїїа Місгобіо! (2014) 59:241-250). Нещодавно декілька груп досліджували застосування трансглутамінази як засобу для одержання АОС (див., наприклад, Чо5іеп еї аї., "Обе ої Місгоріа! Тгапздішатіпазе їТог Те
Еплутаїйіс Віоїпуїайоп ої Апііроадіе5", у). Іттипої Меїпод5, (2000) 240:47-54; Міпаїг еї аї., "Моайісаноп ої Оійегепі ДС Апііродієє5 міа Сішатіпе апа Гузіпе О5зіпд Васієгіаї апа Нитап
Тіззце Тгапздішатіпазе", Віосопіддаїе Спетівігу (2008) 19(1): 271-278); Удедег, еї аї., "Зйе- зресійс апа 5іоіспіотеїгіс тоайісайноп ої апіїбодіеє5 Бу Басіегіа! ігапхдішатіпазе" Апдем/. Спет. бо Іпї. Еа. Епої. (2010) 49: 9995-9997; Бігор еї аіІ., "Госацйоп Майцеге: 5йе ої Сопіидайноп Моашаїез езіарійу апа РПпаптасокКіпеїійс5 ої Апібоду Огид Сопідаїевз", Спет Віо! (2013) 29(2):161-167;
Оеппіег еї аї., "Тгапздішатіпахєе-Вазей Спето-Еплутаїйіс Сопідайоп Арргоасп МУієїав5
Нотодепеоиз Апіїбоду-Огид Сопіидатевз", Віосопішдаїе СПпетізігу (2014) 25(3): 569-578; зіедтипа, еї аї., " оскейа Бу Оезідп: А Сопіогтаїйопайу Сопвхігаіпейа Тгапздішатіпазе Тад Епабіе5
Епісієпі Зпйе-5ресійс Сопіидайоп", Апдем/. Спет. Іпі Еа. ЕпадіІ. (2015) 54(45):13420-13424).
Трансглутамінази виявлені в організмах, починаючи від бактерій до людини, які в структурному і функціональному відношенні близькі, але кожна бере участь у конкретних клітинних процесах.
Мікробна трансглутаміназа (мікробна трансглутаміназа), виділена з бактерії бігеріотусе5 тобБрагаєпзіх5, широко використовувалася в харчовій промисловості для зшивання білків, призначених для різних застосувань. Крім низьких витрат на виробництво, це привабливий метод кон'югації за рахунок його здатності функціонувати в широкому діапазоні значень рн, концентрації солі і температури.
ЇО006| Незважаючи на більш ніж дводесятилітній період досліджень, субстратна специфічність мікробної трансглутамінази не була чітко визначена. Загалом, глутаміни або лізини в петлях з гідрофобними або позитивно зарядженими суміжними залишками мають тенденцію бути переважними. Див. Тадиді еї аї., Тадиснпі еї аї., "Зибвігаге 5ресійсйу апайувів ої тісгобіа! (гапздішатіпазе изіпуд ргоїеіпасеои5 ргоївазе іппірпйог5 аз паїига! тоаеї! з!ирзігаїев", 4.
Віоспет. (2000) 128:415-425; Зидітига еї аї., "ІЧепійсайоп ої ргетегтеай з,ирзігагєе зедиепсев5 ої тісгобіа! Ігапздішатіпавзе їїтот Зігеріотусе5 тобрагаєпбвів изіпд а рпаде-аіз5ріауєй рерійае Іїргагу",
Агоп. Віоспет. Віорпуз. (2008) 477:379-383; Тадаті еї аї., "З!ирзігаїє 5ресійсйу ої тісгоріа! ігапхздішатіпазе аз гемеаїеєй Бу (Пгее-дітепвіопа! досКіпуд 5ітшіацоп апа тшиадепебвів", Ргоїеїп
Епа. Оев. Зе!. (2009) 22:747-752. У контексті ацил-донорного глутаміну було встановлено, що він є більш важливим, ніж ацил-акцепторний лізин. Див., наприклад, ОПізиКа еї аї., "Бирзігасге зресійсйіе5 ої тісгобіа! Ігапхдішатіпавзе ог ргітагу атіпев", У). Адгіс. Роса Спет. (2000) 48: 6230- 6233; Опізика еї аїІ., "Сотрагізоп ої зирзігае 5ресіїйсйціе5 ої ігапздішатіпазе5 изіпуд зупіпеїйіс реріїде5 а5 асу! аопог5", Віозсі. Віоїесппої. Віоспет. (2000) 64: 2608-2613; Сипаегзеп еї аї., "Місгобіа! ігапздішатіпазе аізріаує Бгоай асуїІ-ассеріог зибБзігаге 5ресійсну", Аррі. Місгобіої!.
Віотесппої. (2013) 98:219-230.
І0007| За рахунок більш низької специфічності для ацил-акцепторного аміну дослідження
Зо мікробної трансглутаміни дотепер були зосереджені тільки на трансамідуванні залишків глутаміну антитіл. Див. Уо5ієп еї аї., Міпаї еї аї., Уедег еї аї., ігор еї аї., Оеппіег еї аї. і Бівдтипа еї а!., згадані вище. У середньому людський до містить 80 лізинів, з яких, як вважається, 80- 9095 є гідрофільними (Сашіег еї аї., " узіпе Сопійдаїей Ргорегії6з іп Нитап Ідсв5 5іщшаїєа Бу
Іптедганпуд Нідн-Кезоїшіоп Маїме Мавз5 Зресіготеїйу апа Войот-Ор Ргоїеотісв", Ргоїеотіс5 (2015) 15(16):2756-2765; дані не показані), і С-кінцевий кодон ІдС1, Ідс2, ІдОЗ і 94 являє собою лізин (Еїзоп еї аіІ., ОМА (1981) 1:11-18; Ргос. Маї. Асад. Зсі. ОА, (1982) 79:1984-1988;
Біїїзоп еї аї., Мисівїс Асіа Кез. (1982) 10:4071-4079). Однак у сироваткового Ідс є відсутнім лізин (Улапо еї аї., У. Іттипої. (1980) 125:1048-1054; Едеїтап еї аї., Ргос Май! Асад. 5сі. ОБА (1969) 63:78-85; Егапдіопе еї а!., Віоспетівігу (1980) 19:4304-4308; РіпкК еї а!., Віоспет. 9. (1970) 117:33- 47). Те ж саме спостерігали для ДО (У/пе еї аї., зсіепсе, 1985) 228: 733-737; І іп еї аї., Ргос.
Май. Асай. 5сі. ОБА, (1981) 78: 504-508; ЗПіпода еї аї.., Ргос. Май). Асад. 5сі. ОА (1981) 78: 785- 189). Рекомбінантна експресія Іде1 у клітинах НЕК293 ї СНО також призводить до білка, що не має С-кінцевого І уз447 (Езоп еї аї., Наїтів еї аї., ЕЄиг. У. Віоспет. (1990) 194: 611-620; Наїтів, 5.
Спготаноаг. А (1995) 705: 129-134; ріск еї аї., Віотесппої. Віоепд. (2008) 100: 1132-1143).
І0008| До теперішнього часу фахівці в даній галузі техніки вважають, що використання субстрату на основі донора амінів для трансамідування лізину може призвести до одержання неоднорідного продукту АОС за рахунок великої кількості реакційноздатних лізинів на поверхні
Іс (Чозієп еї аї. і Уедег еї аї.), і, таким чином, використання субстрату на основі донора аміну для трансамідування лізинових залишків на імуноглобулінах призвело до розчарування.
Ї0009| Таким чином, існує потреба в сайт-специфічних ферментативних модифікаціях імуноглобулінів для одержання кон'югатів, які мають прогнозований рівень кон'югації. Це дозволить одержати АОС з відносно однорідним АК.
Суть винаходу
ІО010| Даний винахід несподівано розкрив, що, незважаючи на те, модифікація лізинів імуноглобуліну дикого типу за участю мікробної трансглутамінази не спостерігається, коли С- кінцевий залишок лізину імуноглобуліну захищений від розщеплення карбоксипептидазами з використанням С-кінцевого амінокислотного подовження, мікробна трансглутаміназа була здатна використовувати нативний С-кінцевий лізин як ацил-акцептор. Дивно, але кон'югація С- кінцевого лізину з використанням мікробної трансглутамінази приводить до сайт-специфічного і бо передбачуваного включення кон'югованих функціональних агентів.
0011) В одному аспекті забезпечується спосіб одержання кон'югованого імуноглобуліну, де спосіб включає інкубацію імуноглобуліну з мікробною трансглутаміназою і функціональним агентом, що містить ацил-донорний субстрат, де імуноглобулін містить щонайменше один амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, де ацил-донорний субстрат містить залишок глутаміну, і де функціональним агентом є терапевтичний агент або діагностичний агент, де мікробна трансглутаміназа каталізує кон'югацію С-кінцевого лізину імуноглобуліну із залишком глутаміну ацил-донорного субстрату у функціональному агентові, тим самим забезпечуючи одержання кон'югованого імуноглобуліну. 0012) У ще одному аспекті забезпечується спосіб одержання кон'югованого імуноглобуліну, де спосіб включає і) інкубацію імуноглобуліну з мікробною трансглутаміназою і ацил-донорним субстратом, де імуноглобулін містить щонайменше один амінокислотний залишок після С- кінцевого лізину, і де ацил-донорний субстрат містить залишок глутаміну і реакційноздатну групу, де мікробна трансглутаміназа каталізує кон'югацію С-кінцевого лізину імуноглобуліну із залишком глутаміну ацил-донорного субстрату і ії) кон'югацію функціонального агента з реакційноздатною групою ацил-донорного субстрату, де функціональним агентом є терапевтичний агент або діагностичний агент, тим самим забезпечуючи одержання кон'югованого імуноглобуліну.
ІЇ0013| В одному варіанті здійснення реакційноздатна група ацил-донорного субстрату кон'югована з функціональним агентом за допомогою реакції клік-хімії.
І0014| В одному варіанті здійснення С-кінцевий лізин являє собою лізин 447 (К447) у важкому ланцюзі імуноглобуліну. 0015) В одному варіанті здійснення імуноглобулін містить один амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і один амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину являє собою гліцин, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, метіонін, фенілаланін, тирозин, триптофан, серин, треонін, цистеїн, аспарагін, глутамін або гістидин. У ще одному варіанті здійснення імуноглобулін містить один амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, і де один амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину не включає пролін, аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту, лізин або аргінін.
І0016| В одному варіанті здійснення функціональний агент, що містить ацил-донорний
Зо субстрат, відповідає одній з формул (І) або (ІІ): (2)т-СІп-()а-(У) (І) (Х)-()-Са1п-(2) т (1) 00171 де 7 являє собою карбоксибензилокси (СВ2) групу або амінокислотний залишок; іп являє собою залишок глутамінової кислоти; кожний Ї незалежно являє собою прямий або розгалужений лінкер з 1-20 атомів вуглецю, де один або більше атомів вуглецю можуть бути необов'язково і незалежно замінені атомом азоту, кисню або сірки, і де кожний атом вуглецю та азоту може бути необов'язково заміщений; або кожний І необов'язково і незалежно являє собою амінокислотний залишок; т дорівнює цілому числу від 0 до 5; п дорівнює цілому числу від 0 до 5; і М є функціональним агентом.
І0018| В одному варіанті здійснення функціональний агент, що містить ацил-донорний субстрат, відповідає формулі (І), і де 7 являє собою СВ групу; де Ї являє собою молекулу поліетиленгліколю (ПЕГХ-О((СН?г)2)-), етиламін (-МН((СН?г)2)-) або пропіламін (-МН((СНе?г)з)-); і де п дорівнює 0, 1, 2 або 3. В одному варіанті здійснення | являє собою молекулу поліетиленгліколю (ПЕГ). У ще одному варіанті здійснення | містить одну або більше амінокислот і молекулу поліетиленгліколю (ПЕГ). У ще одному варіанті здійснення функціональний агент, що містить ацил-донорний субстрат, відповідає формулі (І), де 7 являє собою СВА2 групу, і де Ї являє собою амінокислоту. В одному варіанті здійснення І. є Су; т дорівнює 1; і п дорівнює 1. У ще одному варіанті здійснення функціональний агент, що містить ацил-донорний субстрат, відповідає формулі (ІІ), де 7 являє собою СВ2 групу; т дорівнює 1; п дорівнює 2, З або 4; і щонайменше один І! є Су; і щонайменше один І являє собою молекулу
ПЕГ. У додатковому варіанті здійснення функціональний агент, що містить ацил-донорний субстрат, відповідає формулі (ІІ), де 7 являє собою СВА2 групу; т дорівнює 1; п дорівнює 4; один
Ї є Су і інші три групи Ї являють собою молекули ПЕГ. 0019) В одному варіанті здійснення ацил-донорний субстрат відповідає одній з формул (І) або (ІМ): (2)т-СсІп-()-(Х) (І) (Х)-()а-аА-(2) т (ІМ)
де 7 являє собою карбоксибензилокси (СВ2) групу або амінокислотний залишок; Сіп являє собою залишок глутамінової кислоти; кожний і! незалежно являє собою прямий або розгалужений лінкер з 1-20 атомів вуглецю, де один або більше атомів вуглецю можуть бути необов'язково і незалежно замінені атомом азоту, кисню або сірки, і де кожний атом вуглецю і азоту може бути необов'язково заміщений; або кожний І необов'язково і незалежно являє собою амінокислотний залишок; т дорівнює цілому числу від 0 до 5; п дорівнює цілому числу від О до 5; і Х є реакційноздатною групою. 0020) В одному варіанті здійснення І. являє собою молекулу поліетиленгліколю (ПЕГ). У ще одному варіанті здійснення, коли п дорівнює 2-5, то щонайменше один Ї містить одну або більше амінокислот, і інший Її являє собою молекулу поліетиленгліколю (ПЕГ). В одному варіанті здійснення ацил-донорний субстрат відповідає формулі (ІІ), і де 7 являє собою СВІ групу; де Ї являє собою молекулу поліетиленгліколю (ПЕГ)-О(СНг)г)-), етиламін(і-МН(СіНг)»2)-) або пропіламін(-МН((СНег)з)-); і де п дорівнює 0, 1, 2 або 3. У ще одному варіанті здійснення ацил-донорний субстрат відповідає формулі (І), де 7 являє собою СВ групу, і де Ї являє собою амінокислоту. В одному варіанті здійснення Ї є Су; п дорівнює 1; і т дорівнює 1. У ще одному варіанті здійснення ацил-донорний субстрат відповідає формулі (ІМ), де 7 являє собою
СВІ групу; т дорівнює 1; п дорівнює 1, 2 або 3; і щонайменше один Г. є су. 0021) У ще одному варіанті здійснення Х являє собою реакційноздатну групу, вибрану із групи, що складається з:
М о (1Е,85,95)біцикло|6.1.Ф|нон-4-ін-9-ілметанолу(ВСМ), о (0ВСО), транс-циклооктену (ТСО), азидо (М»з), алкіну, тетразину метилциклопропену, норборнену, гідразиду/гідразину і альдегіду. (0022) В одному варіанті здійснення терапевтичний агент являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, хіміотерапевтичний препарат, лікарський препарат, радіоактивний агент, цитотоксичний агент, антибіотик, невелику молекулу, нуклеїнову кислоту або поліпептид.
У ще одному варіанті здійснення діагностичним агентом є флуорофор, флуоресцентний барвник, радіонуклід або фермент. 0023) В одному варіанті здійснення імуноглобулін має два амінокислотні залишки після С-
Зо кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину. В одному варіанті здійснення перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину являє собою будь-який амінокислотний залишок, за винятком аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти або проліну, і де другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину. В ще одному варіанті здійснення перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину являє собою лізин або аргінін. У ще одному варіанті здійснення перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, лізину, цистеїну, триптофану, аргініну, серину і гліцину. (0024) В одному варіанті здійснення імуноглобулін має три амінокислотні залишки після С- кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і третій амінокислотний залишок після
С-кінцевого лізину, де третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину. В одному варіанті здійснення перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину не є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою або проліном. В одному варіанті здійснення перший амінокислотний залишок після С- кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, лізину, цистеїну, триптофану, аргініну, серину і гліцину. В одному варіанті здійснення другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину не є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою або проліном. В одному варіанті здійснення другий амінокислотний залишок після С- кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, лізину, цистеїну, триптофану, аргініну, серину і гліцину. 0025) В одному варіанті здійснення імуноглобулін має чотири амінокислотні залишки після
С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, третій амінокислотний залишок після
С-кінцевого лізину та четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, де четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину. В одному варіанті здійснення перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину не є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою або проліном. В одному варіанті здійснення перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, лізину, цистеїну, триптофану, аргініну, серину і гліцину. В одному варіанті здійснення другий амінокислотний залишок після С- кінцевого лізину не є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою або проліном. В одному варіанті здійснення другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, лізину, цистеїну, триптофану, аргініну, серину і гліцину. В одному варіанті здійснення третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину не є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою або проліном. В одному варіанті здійснення третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, лізину, цистеїну, триптофану, аргініну, серину і гліцину. (0026) В одному варіанті здійснення імуноглобулін має п'ять амінокислотних залишків після
Зо С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, третій амінокислотний залишок після
С-кінцевого лізину, четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і п'ятий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, де п'ятий амінокислотний залишок після С- кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину. В одному варіанті здійснення перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину не є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою або проліном. В одному варіанті здійснення перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, лізину, цистеїну, триптофану, аргініну, серину і гліцину. В одному варіанті здійснення другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину не є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою або проліном. В одному варіанті здійснення другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, лізину, цистеїну, триптофану, аргініну, серину і гліцину. В одному варіанті здійснення третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину не є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою або проліном. В одному варіанті здійснення третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, лізину, цистеїну, триптофану, аргініну, серину і гліцину. В одному варіанті здійснення четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину не є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою або проліном. В одному варіанті здійснення четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, лізину, цистеїну, триптофану, аргініну, серину і гліцину. 0027) В одному варіанті здійснення імуноглобулін має менше 9 амінокислотних залишків після С-кінцевого лізину, і де останній амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну,
серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину. (0028) В одному варіанті здійснення імуноглобулін має менше 13 амінокислотних залишків після С-кінцевого лізину, і де останній амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину.
І0029| В одному варіанті здійснення мікробна трансглутаміназа походить із бактерії зігеріотусе5 тобагепвів.
І0ООЗ0О| В одному варіанті здійснення імуноглобулін являє собою імуноглобулін їдДС1. У ще одному варіанті здійснення імуноглобулін являє собою імуноглобулін Ідс2, доЗ3 або Ідс4. В одному варіанті здійснення імуноглобулін являє собою імуноглобулін ІдА1, ІдА2 або ІдМ, які не містять хвостову ділянку. В одному варіанті здійснення імуноглобулін являє собою імуноглобулін ДО або ЧЕ.
І0031| В одному варіанті здійснення імуноглобулін являє собою людський імуноглобулін або гуманізований імуноглобулін. В одному варіанті здійснення імуноглобулін являє собою химерний імуноглобулін або не є людським імуноглобуліном. 0032) В одному варіанті здійснення імуноглобулін містить два важкі ланцюги і два легкі ланцюги. В одному варіанті здійснення відсутнє внутрішньомолекулярне зшивання між двома важкими ланцюгами імуноглобуліну.
І0033| В одному овваріанті здійснення співвідношення функціонального агента до імуноглобуліну становить від 1:1 до 2:1. 0034 У ще одному аспекті забезпечується кон'югований імуноглобулін, що містить імуноглобулін і функціональний агент, де імуноглобулін містить щонайменше один амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, функціональний агент містить ацил-донорний субстрат, де ацил-донорний субстрат містить залишок глутаміну, і функціональний агент є терапевтичним агентом або діагностичним агентом, де С-кінцевий лізин імуноглобуліну кон'югований із залишком глутаміну ацил-донорного субстрату функціонального агента.
Ї0035| У ще одному аспекті забезпечується кон'югований імуноглобулін, що містить
Зо імуноглобулін і функціональний агент, де імуноглобулін містить щонайменше один амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, де С-кінцевий лізин кон'югований із залишком глутаміну в ацил-донорному субстраті, де ацил-донорний субстрат додатково містить реакційноздатну групу, де реакційноздатна група кон'югована з функціональним агентом, де функціональний агент є терапевтичним агентом або діагностичним агентом.
І0036| В одному варіанті здійснення С-кінцевий лізин являє собою лізин 447 (К447) у важкому ланцюзі імуноглобуліну.
І0037| В одному варіанті здійснення імуноглобулін містить один амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, і де один амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину являє собою гліцин, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, метіонін, фенілаланін, тирозин, триптофан, серин, треонін, цистеїн, аспарагін, глутамін або гістидин. 0038) У ще одному варіанті здійснення імуноглобулін містить один амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і де один амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину не є проліном, аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою, лізином або аргініном.
І0039| В одному варіанті здійснення функціональний агент, що містить ацил-донорний субстрат, відповідає одній з формул (І) або (ІІ): (2)т-СІп-()а-(У) (І) (Х)-()-Са1п-(2) т (1) 00401 де 7 являє собою карбоксибензилокси (СВ2) групу або амінокислотний залишок; іп являє собою залишок глутамінової кислоти; кожний Ї незалежно являє собою прямий або розгалужений лінкер з 1-20 атомів вуглецю, де один або більше атомів вуглецю можуть бути необов'язково і незалежно замінені атомом азоту, кисню або сірки, і де кожний атом вуглецю та азоту може бути необов'язково заміщений; або кожний І необов'язково і незалежно являє собою амінокислотний залишок; т дорівнює цілому числу від 0 до 5; п дорівнює цілому числу від 0 до 5; і М є функціональним агентом.
ІЇ0041| В одному варіанті здійснення функціональний агент, що містить ацил-донорний субстрат, відповідає формулі (І), і де 7 являє собою СВ групу; де Ї являє собою молекулу поліетиленгліколю (ПЕГХ-О((СН?г)2)-), етиламін (-МН((СН?г)2)-) або пропіламін (-МН((СНе?г)з)-); і де п дорівнює 1, 2 або 3. У ще одному варіанті здійснення функціональний агент, що містить ацил-
донорний субстрат, відповідає формулі (І), де 7 являє собою СВ групу, і де Ї являє собою амінокислоту. В одному варіанті здійснення І. є Су; т дорівнює 1; і п дорівнює 1. У ще одному варіанті здійснення функціональний агент, що містить ацил-донорний субстрат, відповідає формулі (ІІ), де 7 являє собою СВ2 групу; т дорівнює 1; п дорівнює 1, 2 або 3; і щонайменше один Г. є Су. В одному варіанті здійснення І являє собою молекулу поліетиленгліколю (ПЕГ). У ще одному варіанті здійснення і. містить одну або більш амінокислот і молекулу поліетиленгліколю (ПЕГ). (0042) В одному варіанті здійснення ацил-донорний субстрат відповідає одній з формул (І) або (ІМ): (2)т-СсІп-()-(Х) (І) (Х)-()а-аА-(2) т (ІМ) 0043) де 7 являє собою карбоксибензилокси (СВ2) групу або амінокислотний залишок; іп являє собою залишок глутамінової кислоти; кожний Ї незалежно являє собою прямий або розгалужений лінкер з 1-20 атомів вуглецю, де один або більш атомів вуглецю можуть бути необов'язково і незалежно замінені атомом азоту, кисню або сірки, і де кожний атом вуглецю і азоту може бути необов'язково заміщений; або кожний | необов'язково і незалежно являє собою амінокислотний залишок; т дорівнює цілому числу від 0 до 5; п дорівнює цілому числу від О до 5; і Х є реакційноздатною групою. (0044) В одному варіанті здійснення ацил-донорний субстрат відповідає формулі (ІП), і де 7 являє собою СВ групу; де | являє собою молекулу поліетиленгліколю (ПЕГ) (-О((СНег)»)-), етиламін (-МН((СН?)2)-) або пропіламін (-МН(Сн»)з)-); і де п дорівнює 0, 1, 2 або 3. У ще одному варіанті здійснення ацил-донорний субстрат відповідає формулі (ІІ), де 7 являє собою СВІ групу, і де Ї. являє собою амінокислоту. В одному варіанті здійснення І є су; т дорівнює 1; і п дорівнює 1. У ще одному варіанті ацил-донорний субстрат відповідає формулі (ІМ), де 7 являє собою СВ групу; т дорівнює 1; п дорівнює 1, 2 або 3; і щонайменше один ГІ. є Су. В одному варіанті здійснення Ї являє собою молекулу поліетиленгліколю (ПЕГ). У ще одному варіанті здійснення, коли п дорівнює 2-5, то тоді щонайменше один Ї містить одну або більше амінокислот, і один або більше ГІ. містить молекулу поліетиленгліколю (ПЕГ). 0045) В одному варіанті здійснення Х являє собою реакційноздатну групу, вибрану із групи,
Зо що складається З (1Е,85,95)біциклої6 .1.Ф|нон-4-ін-9-ілметанолу (ВСМ), син по пет - 7 й
З ще па й М и (ОВСО), транс-циклооктену (ТСО), азидо (Мз), алкіну, тетразину метилциклопропену, норборнену, гідразиду/гідразину і альдегіду. (0046) В одному варіанті здійснення терапевтичний агент являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, хіміотерапевтичний препарат, лікарський препарат, радіоактивний агент, цитотоксичний агент, антибіотик, невелику молекулу, нуклеїнову кислоту або поліпептид.
У ще одному варіанті здійснення діагностичним агентом є флуорофор, флуоресцентний барвник, радіонуклід або фермент. 0047) В одному варіанті здійснення імуноглобулін має два амінокислотні залишки після С- кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину.
І0048| В одному варіанті здійснення перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину являє собою будь-який амінокислотний залишок, за винятком аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти або проліну, і де другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину. В одному варіанті здійснення перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину являє собою лізин або аргінін. 0049) В одному варіанті здійснення імуноглобулін має три амінокислотні залишки після С- кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і третій амінокислотний залишок після
С-кінцевого лізину, де третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину. В одному варіанті здійснення перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину не є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою або проліном. В одному варіанті здійснення перший амінокислотний залишок після С- кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, лізину, цистеїну, триптофану, аргініну, серину і гліцину. В одному варіанті здійснення другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину не є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою або проліном. В одному варіанті здійснення другий амінокислотний залишок після С- кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, лізину, цистеїну, триптофану, аргініну, серину і гліцину. 0050) В одному варіанті здійснення імуноглобулін має чотири амінокислотні залишки після
С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, третій амінокислотний залишок після
С-кінцевого лізину і четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, де четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину. В одному варіанті здійснення перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину не є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою або проліном. В одному варіанті здійснення перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, лізину, цистеїну, триптофану, аргініну, серину і гліцину. В одному варіанті здійснення другий амінокислотний залишок після С- кінцевого лізину не є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою або проліном. В одному варіанті здійснення другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, треоніну,
Зо аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, лізину, цистеїну, триптофану, аргініну, серину і гліцину. В одному варіанті здійснення третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину не є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою або проліном. В одному варіанті здійснення третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, лізину, цистеїну, триптофану, аргініну, серину і гліцину.
І0ОО51) В одному варіанті здійснення імуноглобулін має п'ять амінокислотних залишків після
С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, третій амінокислотний залишок після
С-кінцевого лізину, четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і п'ятий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, де п'ятий амінокислотний залишок після С- кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину. В одному варіанті здійснення перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину не є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою або проліном. В одному варіанті здійснення перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, лізину, цистеїну, триптофану, аргініну, серину і гліцину. В одному варіанті здійснення другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину не є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою або проліном. В одному варіанті здійснення другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, лізину, цистеїну, триптофану, аргініну, серину і гліцину. В одному варіанті здійснення третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину не є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою або проліном. В одному варіанті здійснення третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, лізину, цистеїну, триптофану, аргініну, серину і гліцину. В бо одному варіанті здійснення четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину не є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою або проліном. В одному варіанті здійснення четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, лізину, цистеїну, триптофану, аргініну, серину і гліцину. 0052) В одному варіанті здійснення імуноглобулін має менше 9 амінокислотних залишків після С-кінцевого лізину, і де останній амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину. 0053) В одному варіанті здійснення імуноглобулін має менше 13 амінокислотних залишків після С-кінцевого лізину, і де останній амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину. 0054) В одному варіанті здійснення імуноглобулін являє собою імуноглобулін їдДС1. У ще одному варіанті здійснення імуноглобулін являє собою імуноглобулін Ідс2, доЗ3 або Ідс4. В одному варіанті здійснення імуноглобулін являє собою імуноглобулін ІА, ІдА2 або ІдМм, які не містять хвостову ділянку. В одному варіанті здійснення імуноглобулін являє собою імуноглобулін ДО або ЧЕ. 0055) В одному варіанті здійснення імуноглобулін являє собою людський імуноглобулін або гуманізований імуноглобулін. В одному варіанті здійснення імуноглобулін являє собою химерний імуноглобулін або не є людським імуноглобуліном. 0056) В одному варіанті здійснення імуноглобулін містить два важкі ланцюги і два легкі ланцюги. В одному варіанті здійснення відсутнє внутрішньомолекулярне зшивання між двома важкими ланцюгами імуноглобуліну.
І0057| В одному варіанті здійснення співвідношення функціонального агента до імуноглобуліну становить від 1:1 до 2:1. 0058) В одному варіанті здійснення функціональний агент являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, і де імуноглобулін і функціональний агент зв'язуються 3 тим
Зо самим антигеном або зв'язуються з різними антигенами.
Ї0059| У ще одному аспекті забезпечується нуклеїнова кислота, що кодує кон'югований імуноглобулін. У ще одному аспекті забезпечується плазміда, що містить нуклеїнову кислоту. У ще одному варіанті здійснення забезпечується виділена клітина, що містить плазміду.
ЇОО60| У ще одному аспекті забезпечується фармацевтична композиція, що містить кон'югований імуноглобулін і фармацевтично прийнятний носій.
І0О61)| В одному аспекті забезпечується кон'югований імуноглобулін, отриманий будь-яким зі способів, описаних тут.
ІЇ0062| В одному варіанті здійснення спосіб додатково включає стадію очищення імуноглобуліну, кон'югованого із залишком глутаміну ацил-донорного субстрату, перед кон'югацією функціонального агента з реакційноздатною групою ацил-донорного субстрату. В одному варіанті здійснення стадія очищення включає способи на основі критерію розміру, такі як хроматографія або діафільтрація. У ще одному варіанті здійснення стадія очищення включає розділення на основі критерію заряду, таке як аніонообмінна або катіонообмінна хроматографія.
У ще одному варіанті здійснення стадія очищення включає стадію на основі афінності, таку як хроматографія на протеїні А або протеїні 0.
Короткий опис фігур
Ї0063| Розділ "Суть винаходу", а також наступний докладний опис стануть більш зрозумілими при читанні в комбінації із прикладеними фігурами. Для цілей ілюстрації розкритих способів і кон'югованих імуноглобулінів на фігурах показані ілюстративні приклади варіантів здійснення; однак способи і кон'юговані імуноглобуліни не обмежуються розкритими конкретними варіантами здійснення. На фігурах:
І0064| На фіг.1 показана трансглутаміназна реакція, де трансглутаміназа каталізує утворення ізопептидного зв'язку між ацил-донорним глутаміном і ацил-акцепторним лізином з вивільненням молекули аміаку.
І0065І| На фіг. 2 показані структури ілюстративних ацил-донорних субстратів 2-(3Іп-Спу.
І0О6б6| На фіг. З показані можливі шляхи синтезу деяких ілюстративних ацил-донорних субстратів 2-С1п-Спу.
І0067| На фіг. 4, що включає фіг. 4А, 4В ії 4С, показані гідрофільні лізини в кристалічних структурах Раб і Ес людського ІдС1; (А) Раб МН-СНІ ії Мк-Ск, (В) Раб МН-СНІ і МА-СХ і (С) Ес СН2 ії СНЗ визначали з використанням моделювання Оізсомегу Біцадіо 4.5 з радіусом зонда 1,4 А, і вони виділені жовтим кольором. 0068) На фіг. 5 показані послідовності константних ділянок каппа і лямбда дс1і людини.
Гідрофільні лізини константної ділянки на основі 1ЕС1 (Рсу), 4АЕЗЕ (СНІ ї Ск) їі 4НКО (Ск) виділені червоним кольором; лізини усередині петель підкреслені. Константні ділянки нумеровані згідно із системою нумерації ЄС.
І0069)| На фіг. 6, що включає фіг. бА, 68, 6С, 60, 6Е і 6Е, показаний аналіз Е5І-М5 антитіл, інкубованих з ацил-донором і мікробною трансглутаміназою. Антитіла інкубували з 50-кратним молярним надлишком 2-С1Іп-Ссіу-САЮ-біотину і 1 Од/мл мікробної трансглутамінази протягом ночі при 37 "0. Після розщеплення ІЧез і відновлення визначали маси ІС, Ей і Ес з використанням ЕЗІ-М5. 00701 На фіг. 7 показаний аналіз Е5І-М5 реакцій мікробної трансглутамінази антитіла 01 і К-
Тад. тАБ інкубували з 2-С1іп-сСіу-САЮ-біотином і мікробною трансглутаміназою протягом ночі при 37 "б. Після деглікозилювання і відновлення визначали маси НС і с (А) антитіла 01, (В) антитіла 01-НО-КТаод і (С) антитіла 01-І С-КТад з використанням Е5І-М5. 00711 На фіг. 8, що включає фіг. 8А, 88 і 8С, показаний аналіз Е5І-М5 С-кінцевих подовжень антитіла 01. (А) антитіло 01 МАБ, (В) антитіло 01-Ї. ії (С) антитіло 01-І Ї. інкубували з 2-С1п-С1у-
САО-біотином і мікробною трансглутаміназою протягом ночі при 37 "С, і маси аналізували з використанням Е5І-М5, як показано на фіг. 7.
І0072| На фіг.9, що включає фіг. 9А-98, показана одностадійна кон'югація лікарського препарату з Гуз447. (А) Антитіло 01-Ї і (В) антитіло 01-І інкубували з 72-(3Іп-СІу-ПЕГ2-АЄЦЕ і мікробною трансглутаміназою при 37 "С протягом ночі, розщеплювали за допомогою Ідез і відновлювали за допомогою ОТТ з одержанням фрагментів І С, Ра і Ес. Поглинання при 280 нм (А280) і сумарний іонний струм (ТІС) зразків визначали зворотно- фазовою РХ-МС, як описано в розділі "Методи".
І0073| На фіг. 10 показаний електрофорез 505-РАСЕ димерних тАбБ. Антитіло 01-Ї, трансамідоване з 2-С1Іп-С1у-Мз або 72-(231Іп-Сіу-ПЕГз--ВСМ, змішували і інкубували протягом ночі при 22 76. Зразки відновлювали і аналізували електрофорезом 505-РАСЕ з використанням 4- 1295 поліакриламідного гелю Вівб-Тгі5. Маса димеру НО-НС становить приблизно 110 кДа.
Докладний опис винаходу
І0074| Розкриті способи і кон'юговані імуноглобуліни стануть більш зрозумілими при звертанні до наступного докладного опису, наведеного разом із прикладеними фігурами, які становлять частину даного розкриття. Слід розуміти, що розкриті способи і кон'юговані імуноглобуліни не обмежуються конкретними варіантами здійснення, описаними і/або показаними тут, і що термінологія, використовувана тут, призначена з метою опису конкретних варіантів здійснення тільки як приклад і не призначена для обмеження заявлених способів або кон'югованих імуноглобулінів. 0075) Якщо спеціально не зазначене інше, то будь-який опис щодо можливого механізму або способу дії, або причини поліпшення повинен витлумачуватися тільки як ілюстративний, і розкриті способи і кон'юговані імуноглобуліни не повинні обмежуватися коректністю або некоректністю будь-якого такого пропонованого механізму або способу дії або причини поліпшення.
ІЇ0076| За даним текстом опис належить до кон'югованих імуноглобулінів і способів їх одержання. У тих випадках, коли в розкритті описується або заявляється ознака або варіант здійснення, пов'язані з кон'югованих імуноглобуліном, то така ознака або варіант здійснення однаково застосовні до способів його одержання. Аналогічним чином, коли в розкритті описується або заявляється ознака або варіант здійснення, зв'язаний зі способом одержання кон'югованого імуноглобуліну, то така ознака або варіант здійснення рівною мірою застосовні до кон'югованого імуноглобуліну.
І0077| Посилання на конкретне числове значення включає щонайменше дане конкретне значення, якщо контекст явно не диктує інше. Коли діапазон виражений у такому виді, то інший варіант здійснення включає від одного конкретного значення і/або до іншого конкретного значення. Крім того, посилання на значення, зазначені в діапазонах, включає кожне значення в цьому діапазоні. Усі діапазони є такими, що включають і комбінуються.
ІЇ0078| Коли значення виражені у вигляді наближень, за допомогою антецедента "приблизно", то слід розуміти, що конкретне значення формує інший варіант здійснення.
ІЇ0079| Слід приймати до уваги, що деякі ознаки розкритих способів і кон'югованих імуноглобулінів, які для ясності описані тут у контексті окремих варіантів здійснення, також можуть бути представлені в комбінації в одному варіанті здійснення. Навпаки, різні ознаки розкритих способів і кон'югованих імуноглобулінів, які для стислості, описано в контексті одного варіанта здійснення, також можуть бути представлені окремо або в будь-якій підкомбінації.
І0080) Як використовується тут, єдині форми "а", "ап" і "Те" включають множину.
І00О81) Різні терміни, що належать до аспектів опису, використовуються в тексті опису і формулі винаходу. Такі терміни мають своє звичайне значення, використовуване в даній галузі, якщо не зазначене інше. Інші конкретно певні терміни повинні витлумачуватися відповідно до визначень, представлених тут.
І0082| Термін "приблизно", коли використовується для посилань на числові діапазони, відсікання або конкретні значення, використовується для позначення того, що зазначені значення можуть варіюватися в межах до 1095 від зазначеного значення. Таким чином, термін "приблизно" використовується для охоплення варіацій -1095 або менше, варіацій -595 або менше, варіацій -195 або менше, варіацій 40,595 або менше або варіацій 0,195 або менше від зазначеного значення.
І0083| "Кисла амінокислота" належить до амінокислоти, що має негативний заряд при фізіологічному значенні рН. Генетично кодовані гідрофобні амінокислоти включають аспартат, глутамат, аспарагін і глутамін. (0084) Термін "ацил-донорний субстрат" належить до групи з кінцевою ацильною групою в ній. Переважно "ацил-донорний субстрат" містить залишок глутаміну. Ацил-донорний субстрат може необов'язково містити додаткову реакційноздатну групу. У першому варіанті здійснення ацил-донорний субстрат ковалентно зв'язаний з функціональним агентом. У другому варіанті здійснення ацил-донорний субстрат не пов'язаний з функціональним агентом. В одному варіанті здійснення ацил-донорний субстрат містить залишок глутаміну і реакційноздатну групу. У ще одному варіанті здійснення ацил-донорний субстрат містить один або більше лінкерів, як тут описано далі. У будь-якому з вищевказаних варіантів здійснення необов'язково є лінкер між ацил-донорним субстратом і функціональним агентом або між ацил-донорним субстратом і реакційноздатною групою. (0085) Як тут використовується, термін "антитіло" у широкому сенсі належить до будь-якої молекули імуноглобуліну (Ід), що складається із чотирьох поліпептидних ланцюгів, двох важких (Н) ланцюгів і двох легких (І) ланцюгів, або до її будь-якого функціонального фрагмента,
Зо мутанта, варіанта або похідного, що зберігає основні характеристики зв'язування епітопу молекули Ід. Такі формати мутантів, варіантів або похідних антитіл відомі в даній галузі, і їх необмежуючі варіанти здійснення обговорюються тут. В одному варіанті здійснення антитіло являє собою гуманізоване антитіло. У ще одному варіанті здійснення антитіло являє собою людське антитіло. У ще одному варіанті здійснення антитіло являє собою химерне антитіло. У ще одному варіанті здійснення антитіло являє собою антитіло, відмінне від людського антитіла.
І0086| У повнорозмірному антитілі кожний важкий ланцюг складається з варіабельної ділянки важкого ланцюга (скороченої тут як НСМК або МН) і константної ділянки важкого ланцюга. Константна ділянка важкого ланцюга складається із трьох доменів, СНІ, СН2 ї СНЗ.
Кожний легкий ланцюг складається з варіабельної ділянки легкого ланцюга (скороченої тут як
ЇСМК або МІ) і константної ділянки легкого ланцюга. Константна ділянка легкого ланцюга складається з одного домену, Сі. Ділянки МН і МІ. можна додатково підрозділити на ділянки гіперваріабельності, називані визначальними комплементарність ділянками (СОК), що чергуються з ділянками, які є більш консервативними, називаними каркасними ділянками (ЕК).
Кожна з МН і Мі складається із трьох СОК і чотирьох ЕК, розташованих від амінокінця до карбоксикінця в наступному порядку: ЕК7Т, СОКІ, ЕК2, СОМ2, ЕКЗ, СОКЗ і ЕК4. Молекули імуноглобулінів можуть бути будь-якого типу (наприклад, Ідс, ІДЕ, ІМ, дО, ІдДА і Ідхи), класу (наприклад, Ідс1, Ідс2, Ід, Ідс4, ІдА1 і ІдДАг) або підкласу.
І0087| Термін "антигензв'язуючий фрагмент" антитіла (або просто "антигензв'язуюча ділянка" належить до одного або більше фрагментів антитіла, які зберігають здатність до специфічного зв'язування антигену. Було показано, що антигензв'язуючу функцію антитіла можуть здійснювати фрагменти повнорозмірного антитіла. Такі варіанти здійснення антитіл також можуть представляти біспецифічні формати, формати з подвійною специфічністю або поліспецифічні формати, які специфічно зв'язуються із двома або більше різними антигенами.
Приклади єднальних фрагментів, охоплюваних терміном "антигензв'язуючий фрагмент" антитіла, включають (і) фрагмент Раб, моновалентний фрагмент, що складається з ділянок МІ,
МН, СІ ї СНІ; (її) фрагмент ЕК(аб)», бівалентний фрагмент, що містить два фрагменти Раб, зв'язані дисульфідним містком у шарнірній ділянці; (ії) фрагмент Ба, що складається з ділянок
МН ї СНІ; (ім) фрагмент Ем, що складається з доменів МІ ії МН одного плеча антитіла, (м) фрагмент ЯАБ (мага еї а!. (1989) Майиге, 341:544-546, публікація РСТ УМО 90/05144), що містить бо одну варіабельну ділянку; і (мі) виділену визначальну комплементарність ділянку (СОК). Крім того, незважаючи на те, що дві ділянки фрагмента Ем, Мі і МН, кодуються окремими генами, рекомбінантними способами їх можна зв'язати синтетичним лінкером, що дозволяє одержувати їх у вигляді одного білкового ланцюга, у якому ділянки МІ. і МН спаровуються з формуванням моновалентної молекули (відомої як одноланцюгове Ем (5сЕм); див. наприклад, Віга еї аї. (1988) зЗсіепсе, 242:423-426; і Нивіоп еї аїЇ. (1988) Ргос. Май. Асай. 5сі. ОСОБА, 85:5879-5883). Такі одноланцюгові антитіла також призначені для охоплення терміном "антигензв'язуючий фрагмент" антитіла. Також даним терміном охоплюються інші форми одноланцюгових антитіл, такі як діатіла. Діатіла представляють бівалентні біспецифічні антитіла, у яких ділянки МН і МІ. експресовані в одному поліпептидному ланцюзі, але із застосуванням лінкера, що є занадто коротким, щоб дозволити спарювання двох ділянок на одному ланцюзі, у такий спосіб змушуючи спаровуватися ділянки з комплементарними ділянками іншого ланцюга і формуючи дві антигензв'язуючі ділянки (див. наприклад, Ноїдег еї аі. (1993) Ргос. Май. Асай. Зсі. О5А, 90:6444-6448; РоЦак еї аї. (1994) біписійге, 2:1121-1123). Такі антигензв'язуючі ділянки антитіл відомі в даній галузі (Копіеппапп апа Юибеї едз., Апіїбоду Епдіпеегіпд (2001) 5ргіпдег-Мепад.
Мем хогк., 790 рр. (ІЗВМ 3-540-41354-5)). (0088) "Основна амінокислота" належить до амінокислоти, що має позитивний заряд при фізіологічному значенні рН. Генетично кодовані гідрофобні амінокислоти включають гістидин, лізин і аргінін. 0089) Як тут використовується, термін "біологічний зразок" належить до зразка, отриманого від суб'єкта, включаючи зразок біологічної тканини або рідини, отриманий іп мімо або іп міїго. Такі зразки можуть представляти, не обмежуючись цим, рідину організму (наприклад, кров, плазму крові, сироватку, молоко, спинномозкову рідину, асцитичну рідину або сечу), органи, тканини, фракції і клітини, виділені з організму ссавців, включаючи людей. Біологічні зразки також можуть включати зрізи біологічного зразка, включаючи тканини (наприклад, шматочки органа або тканини). Біологічні зразки можуть також включати екстракти біологічного зразка, наприклад, антиген з біологічної рідини (наприклад, крові або сечі).
І0090| Термін "С-кінцевий лізин" належить до С-кінця важкого ланцюга імуноглобуліну.
Переважно є щонайменше один амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину. В одному варіанті здійснення, де після С-кінцевого лізину (амінокислотне положення ї1) є тільки один амінокислотний залишок, то амінокислотний залишок, безпосередньо суміжний із С-кінцевим лізином, вибраний із групи, що складається із гліцину, аланіну, валіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, фенілаланіну, тирозину, триптофану, серину, треоніну, цистеїну, аспарагіну, глутаміну і гістидину. У випадку, коли до С-кінцевого лізину додається більше одного амінокислотного залишку (амінокислотне положення «1, жї2 і т.д.), то амінокислотний залишок, безпосередньо суміжний із С-кінцевим лізином (амінокислотне положення ж1), може бути вибраний з будь-якої амінокислоти, за винятком аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти або проліну. В одному варіанті здійснення, коли до С-кінцевого лізину додаються два амінокислотні залишки, то амінокислотний залишок, безпосередньо суміжний із С-кінцевим лізином (амінокислотне положення 1), являє собою будь-яку амінокислоту, за винятком аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти або проліну, і другий амінокислотний залишок (амінокислотне положення 2) після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину. В одному варіанті здійснення, де до С-кінцевого лізину додається два амінокислотні залишки, то перший амінокислотний залишок, суміжний із С- кінцевим лізином (амінокислотне положення 1), являє собою лізин або аргінін.
ІЇ0091| В одному варіанті здійснення є один амінокислотний залишок (амінокислотне положення «1) після С-кінцевого лізину. У ще одному варіанті здійснення є два амінокислотні залишки (амінокислотні положення яж--1 і 2) після С-кінцевого лізину. У ще одному варіанті здійснення є три (амінокислотні положення «1, 2 і 43), чотири (амінокислотні положення «1, 2, т-3 і 14), п'ять (амінокислотні положення яж1, 2, 3, 4 і 45), шість (положення амінокислот їЖ1, -2, 3, 4, 5 і ї6), сім (амінокислотні положення їт1, 2,3, 4, 5, 6 і 7), вісім (амінокислотні положення 1, 2, 3, 4, 5, б, 7 і 18), дев'ять (амінокислотні положення я1, 2, 3, 4, 5, --6, 7, 8 і 19), десять (амінокислотні положення Ж--1, 2, 3, 4, 5, 6, /, 8, 9 і -10), одинадцять (амінокислотні положення я-1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, -10 ї 411), дванадцять (амінокислотні положення 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, -10, -1 ї 412), тринадцять (амінокислотні положення ї-1, 2, 3, 4, 5, б, /, 8, 9, -10, 4-11, 12 їі 413), чотирнадцять (амінокислотні положення яж1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, -10, -11, 12, 13 ї 414), п'ятнадцять (амінокислотні положення ї-1, 2, 3, 4, 5, б, 7/, 8, 9, 10, -11, 12, 13, -14 ї 15), 60 шістнадцять (амінокислотні положення ї-1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, -10, -11, -12, 13, -14,
т-15 і 416), сімнадцять (амінокислотні положення «1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 4-10, 4-11, -12, 13, -14, 4-15, 16 і 417), вісімнадцять (амінокислотні положення ї-1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, -9, 10, 4-11, -12, -13, 4-14, 15, 4-16, 417 і 418), дев'ятнадцять (амінокислотні положення «1, 2, 3, 4, 5, б, /, 8, 9, 10, -11, -12, 13, -14, 15, 16, 17, 18 ії 419) або двадцять (амінокислотні положення 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, -10, 11, -12, -13, 14, -15, 16, 17, -18, -19 і 420) амінокислотних залишків після С-кінцевого лізину.
І0092| В одному варіанті здійснення амінокислотні залишки після С-кінцевого лізину не включають СТУРОАУСТ. В одному варіанті здійснення амінокислотні залишки після С-кінцевого лізину не включають СЕСТУРОАМОСТЕ. В одному варіанті здійснення амінокислотні залишки після С-кінцевого лізину не включають СЕМТУЕОАМОМТЕ. 0093) В одному варіанті здійснення С-кінцевий лізин являє собою лізин 447 ІдС1, Ід2, (ДОЗ або ІдсС4. У ще одному варіанті здійснення С-кінцевий лізин являє собою С-кінцевий лізин ДО або ЗЕ. У ще одному варіанті здійснення термін "С-кінцевий лізин" належить до останнього залишку лізину перед хвостовою ділянкою ІдА1, ІдА2 або І9М. В одному варіанті здійснення хвостова ділянка ІдДА1, ІДА2 або ІДМ вилучена. В одному варіанті здійснення хвостова ділянка
ІЗА1, ІДА2 або ІдМ не вилучена. Послідовності хвостових ділянок для антитіл наведені нижче:
ІДА: РТНУМУ5УУМАЕУВИаТСУ
ІДА2 РТНУМУ5УУМАЕУВИаТСУ
ЯМ РТ ММУБІ УМЗОТАС,ТСУ 0094) У ще одному варіанті здійснення один або більше амінокислотних залишків можуть бути вилучені, наприклад, делецировані із С-кінця важкого ланцюга імуноглобуліну, і може бути доданий С-кінцевий залишок лізину з наступним щонайменше одним додатковим амінокислотним залишком до імуноглобуліну. Наприклад, амінокислотні залишки 446 і 447 імуноглобуліну ЇДС1, Іде2, ІдОо3З або ІдсС4 можуть бути делецировані, і може бути доданий С- кінцевий лізин, з наступним щонайменше одним додатковим амінокислотним залишком, де потім мікробна трансглутаміназа може каталізувати кон'югацію С-кінцевого лізину імуноглобуліну із залишком глутаміну ацил-донорного субстрату. Інакше кажучи, С-кінцевий лізин може бути присутнім, наприклад, в амінокислотному положенні 446 імуноглобуліну, якщо імуноглобулін був мутований для видалення амінокислотних положень 446 і 447 дикого типу.
Один або більш додаткових амінокислотних залишків потім можуть бути додані до С-кінцевого лізину, наприклад, в амінокислотних положеннях їт1, 2, 3, 4 і т.д., як тут описано. В одному варіанті здійснення один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять або десять амінокислотних залишків можуть бути вилучені, наприклад, делецировані із С-кінця важкого ланцюга імуноглобуліну, і С-кінцевий залишок лізину з наступним щонайменше одним додатковим амінокислотним залишком можуть бути додані до імуноглобуліну, наприклад, в амінокислотних положеннях 1, 2, 3, 1-4 і т. д., як тут описано. 0095) У ще одному варіанті здійснення домен СНЗ видаляється із С-кінця важкого ланцюга імуноглобуліну і С-кінцевий залишок лізину з наступним щонайменше одним додатковим амінокислотним залишком може бути доданий до імуноглобуліну. У ще одному варіанті здійснення домен СНаІ і домен СНЗ видаляються із С-кінця важкого ланцюга імуноглобуліну і С- кінцевий залишок лізину з наступним щонайменше одним додатковим амінокислотним залишком може бути доданий до імуноглобуліну. У ще одному варіанті здійснення шарнірна ділянка, домен СН2 і домен СНЗ видаляються із С-кінця важкого ланцюга імуноглобуліну, і С- кінцевий залишок лізину з наступним щонайменше одним додатковим амінокислотним залишком можуть бути додані до імуноглобуліну. У ще одному варіанті здійснення домен СНІ, шарнірна ділянка домен СН2 і домен СНЗ видаляються із С-кінця важкого ланцюга імуноглобуліну, і С-кінцевий залишок лізину з наступним щонайменше одним додатковим амінокислотним залишком можуть бути додані до імуноглобуліну. (0096) Термін "клік-хімія" належить до певних реакцій синтезу і/або кон'югації білків, які є високопродуктивними, високоселективними, надійними і чистими. Див., наприклад, Кіпд еї аї., "РемеІортепів іп ЩШте Рівеіа ої Віоогіпадопа! Вопа Рогтіпуд Кеасіп5 - Раві апа Ргезепі Тгепав",
Віосопічд. Спет., (2014) 25(5): 825-839; МесКау еї аї., "Сіск Спетівігу іп Сотріех Міхіигев:
Віоогпадопаї! Віосопіидайоп", Спет. Віо!., (2014) 21(9): 1075-1101. (0097) Термін "химеризоване", "химерне", "химерне антитіло" і подібні терміни належать до імуноглобуліну, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга і варіабельну ділянку легкого ланцюга, тобто антигензв'язуючу ділянку, з одного джерела або виду і щонайменше ділянку константної ділянки важкого ланцюга і константної ділянки легкого ланцюга, отриманої з іншого джерела або виду. Ці ділянки можуть бути з'єднані разом хімічно звичайними способами
(наприклад, синтетичними) або отримані у вигляді суміжного поліпептиду з використанням методів генної інженерії (наприклад, ДНК, що кодує білкові ділянки химерного антитіла, може бути експресована для одержання суміжного поліпептидного ланцюга). Інші форми "химерних імуноглобулінів", охоплювані даним винаходом, представляють ті, у яких клас або підклас був модифікований або змінений у порівнянні з вихідним імуноглобуліном (також називані "муноглобулінами з переключеним класом"). По всьому тексту розкриття химерні імуноглобуліни позначаються як "хі". Тут "химерний імуноглобулін" і подібні терміни належать до послідовності імуноглобуліну, а не до способу, використаного для одержання антитіла. 0098) Як тут використовується, "Гуз447" або "лізин 447" належить до залишку лізину в амінокислотному положенні 447 варіабельної ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну (як нумеровано з використанням системи нумерації ЄС), і який являє собою, наприклад, С-кінцевий кодон в ІДС1, дог, Іде, Ід, дО і ЧЕ.
ІЇ0099| Як тут використовується, "функціональний агент" належить до агента, що має терапевтичну, діагностичну або іншу функціональну властивість(і). В одному варіанті здійснення функціональний агент може представляти терапевтичний агент. У ще одному варіанті здійснення функціональний агент може бути діагностичним агентом. Функціональні агенти можуть представляти великі молекули або невеликі молекули. Високомолекулярні функціональні агенти включають, не обмежуючись цим, антитіло і його антигензв'язуючі фрагменти. Низькомолекулярні функціональні агенти включають, не обмежуючись цим, хіміотерапевтичні препарати, цитотоксичні агенти, антибіотики, інші органічні сполуки, які можуть регулювати біологічний процес (наприклад, лікарські засоби) і поліпептиди. 00100) Термін "гуманізований", "гуманізований імуноглобулін" і подібні терміни належать до імуноглобулінів, у яких каркасна ділянка або "ділянки, що визначають комплементарність" (СОВ), були модифіковані таким чином, щоб містити СОК імуноглобуліну різної специфічності в порівнянні з такими батьківського імуноглобуліну. Здебільшого, гуманізовані антитіла являють собою імуноглобуліни людини (реципієнтний імуноглобулін), у яких залишки гіперваріабельної ділянки реципієнта замінені залишками гіперваріабельної ділянки виду, відмінного від людини (донорний імуноглобулін), такого як миша, щур, кролик або примат, що не є людиною, що має необхідну специфічність, афінність і активність антитіл. У деяких випадках залишки ЕМУК людського імуноглобуліну замінені відповідними залишками, відмінними від людських. Крім того, гуманізовані імуноглобуліни можуть містити залишки, які не виявлені в реципієнтному імуноглобуліні або в донорному імуноглобуліні. Такі модифікації зроблені для додаткового поліпшення функції імуноглобуліну. Загалом, гуманізований імуноглобулін буде включати по суті всі щонайменше з однієї і, як правило, дві варіабельні ділянки, у яких усі або практично всі гіперваріабельні петлі відповідають імуноглобуліну, відмінному від людини, і всі або практично всі ЕМУК представляють послідовності людського імуноглобуліну. Гуманізований імуноглобулін може необов'язково також містити щонайменше ділянку константної ділянки імуноглобуліну (Ес), як правило, імуноглобуліну людини. Див., наприклад, Кіеспітапп, Ї., еї аїЇ., Маїшге, 332 (1988) 323-327; і Меибрегдег, М. 5., еї аїЇ., Маїшге, 314 (1985) 268-270. За текстом розкриття "гуманізовані імуноглобуліни" позначаються "2и". Тут "гуманізований імуноглобулін" і подібні терміни належать до послідовності імуноглобуліну, а не до способу, використовуваного для одержання імуноглобуліну. 001011) Термін "діагностичний агент" належить до сполуки, яка може бути придатною для візуалізуючих досліджень, таких як дослідження КТ, МРТ і рентгенівські іп мімо і/або іп міїго.
Необмежуючі приклади діагностичних агентів включають флуорофор, флуоресцентний барвник, радіонуклід і фермент.
І00102| Термін "донорний імуноглобулін" належить до імуноглобуліну, відмінного від людського, який вносить амінокислотні послідовності його варіабельних ділянок, СОК або інших функціональних фрагментів або їх аналогів, у гуманізований імуноглобулін і, таким чином, забезпечує гуманізований імуноглобулін антигенною специфічністю і нейтралізуючою активністю, характерною для донорного імуноглобуліну. 00103) Термін "реципієнтний імуноглобулін" належить до імуноглобуліну, гетерологічному донорному імуноглобуліну, який забезпечує амінокислотні послідовності його каркасних ділянок важкого і/або легкого ланцюга і/або його константні ділянки важкого і/або легкого ланцюга гуманізованому імуноглобуліну. Реципієнтний імуноглобулін може бути отриманий від будь- якого ссавця. У переважних варіантах здійснення реципієнтний імуноглобулін є неімуногенним у людей. Переважно реципієнтний імуноглобулін являє собою імуноглобулін людини.
І00104| "Гуманізація" належить до способу одержання гуманізованого імуноглобуліну і включає будь-який спосіб одержання гуманізованих імуноглобулінів, що володіють бо вищевказаними характеристиками, включаючи, не обмежуючись цим, іп 5ійсо гуманізацію,
конструювання СОК виду/хазяїна в людські імуноглобуліни, заміняючи залишки каркасної ділянки химерного імуноглобуліну відповідною людською каркасною ділянкою і т.д.. 00105) Як тут використовується, термін "імуноглобулін" належить до білка, що складається з одного або більше поліпептидів, по суті кодованих генами імуноглобуліну, включаючи легкі ланцюги каппа і лямбда, а також важкі ланцюги альфа, гамма, дельта, епсилон і мю. "Легкі ланцюги" повнорозмірного імуноглобуліну (приблизно 25 кД або 214 амінокислот) кодуються геном варіабельної ділянки на МНе»е-кінці (приблизно 110 амінокислот) і геном константної ділянки каппа або лямбда на СООН-кінці. "Важкі ланцюги" повнорозмірного імуноглобуліну (приблизно 50 кД або 446 амінокислот) аналогічно кодуються геном варіабельної ділянки (приблизно 116 амінокислот) і одним з інших вищевказаних генів константної ділянки, наприклад гамма (кодуючий приблизно 330 амінокислот). "Імуноглобуліни" включають: (а) поліпептиди імуноглобуліну, тобто поліпептиди родини імуноглобулінів, які містять антигензв'язуючу ділянку, яка специфічно зв'язується з певним антигеном, включаючи всі ізотипи імуноглобулінів (Іде, ІдА, ІДЕ, ІМ, дО і Іди), класи (наприклад, Ід, Ідс2, Ід, ІдС4,
ІЧА1, ІдДА2), підкласи і різні мономерні і полімерні форми кожного ізотипу, якщо не зазначене інше; і (Б) консервативно заміщені варіанти таких імуноглобулінових поліпептидів, які імуноспецифічно зв'язуються з антигеном. Імуноглобуліни, загалом, описані, наприклад, у монографії Нагпом/ 5 І апе, Апіїбодіеєє: Те Гарогаїгу Мапиа! (Со Зргіпд Нагбог Іарогагу
Ргез5, 1988). 00106) Одна форма імуноглобуліну, розкрита тут, являє собою основну структурну одиницю антитіла. Наприклад, антитіло може включати тетрамер і складається із двох ідентичних пар ланцюгів імуноглобуліну, де кожна пара має один легкий ланцюг і один важкий ланцюг. Як правило, у кожній парі варіабельні ділянки легкого ланцюга і важкого ланцюга разом відповідальні за зв'язування з антигеном, і константні ділянки відповідальні за ефекторні функції антитіла.
І00107| На додаток до антитіл імуноглобуліни можуть існувати в множині інших форм, включаючи, наприклад, антигензв'язуючі фрагменти або частини повнорозмірного імуноглобуліну, такі як фрагменти Ем, Раб, (Раб/)» і Ем; і альтернативні формати антитіл, такі як одноланцюгові імуноглобуліни (5СЕМ і 5сГаБб), діатіла, триатіла, тетратіла, лінійні антитіла і мультиспецифічні антитіла, якщо назвати тільки деякі з них. Див., наприклад, Чхатез О. Магкв,
Апііроду Епдіпеегіпоу, розділ 2, Рге55 Охіога Опімегейу Ргезз (1995) (Саїг! К. Воїтебраеск, Еа.).
І00108| В одному варіанті здійснення імуноглобулін може містити Баб-фрагмент. У ще одному варіанті здійснення імуноглобулін може містити домен СНЗ. У ще одному варіанті здійснення імуноглобулін може містити важкий ланцюг.
Ї00109| Як тут використовується, термін "імуноспецифічно" належить до здатності імуноглобуліну специфічно зв'язуватися з антигеном, проти якого був продукований імуноглобулін, і специфічно не зв'язуватися з іншими пептидами або білками. Імуноглобулін, який імуноспецифічно зв'язується з антигеном, проти якого був продукований імуноглобулін, може не зв'язуватися з іншими поліпептидами або білками або може зв'язуватися з іншими поліпептидами або білками з більш низькою афінністю зв'язування, ніж антиген, проти якого був продукований імуноглобулін, що визначається, наприклад, імуноаналізами, ВіАсоге або іншими аналізами, відомими в даній галузі. Імуноглобулін імуноспецифічно зв'язується з антигеном, проти якого продукований імуноглобулін, коли він зв'язується з антигеном з більш високою афінністю зв'язування, ніж з будь-яким перехресно-реактивним антигеном, що визначається з використанням експериментальних методів, таких як, не обмежуючись цим, радіоіїмуноаналізи (КІА) і (ЕГІЗА) (див., наприклад, Раші, ед., Рипдатепіа! Іттипооду, 2па ед., Камеп Ргез5, Мем/
Уогк, стор. 332-336 (1989), де наводиться обговорення специфічності антитіл). 00110) Як тут використовується, "лінкер" належить до спейсера, який може представляти прямий або розгалужений ланцюг для сполуки імуноглобуліну (через ацил-донорний субстрат) з функціональним агентом або реакційноздатною групою. Так лінкери можуть бути розщеплюваними (наприклад, кислотно-лабільні або розщеплювані протеазами) або нерозщеплюваними. В одному варіанті здійснення лінксером є молекула поліетиленгліколю (ПЕГ). У ще одному варіанті здійснення лінкер містить одну або більше амінокислот і молекулу поліетиленгліколю (ПЕГ). 00111) Термін "моноклональне антитіло" належить до антитіла, яке отримано з одного клітинного клону, включаючи будь-який клон еукаріотичних або прокаріотичних клітин, або фаговий клон, а не до методу, за допомогою якого воно отримане. Моноклональне антитіло проявляє одну специфічність і афінність зв'язування до певного епітопу. Термін "моноклональне антитіло" не обмежується антитілами, отриманими за допомогою гібридомної технології.
00112) "Нативний" належить до послідовності імуноглобуліну дикого типу з виду, у якому імуноглобулін був продукований.
ЇО0113| Як тут використовується, термін "відсоток ідентичності" і подібні терміни використовуються для опису відношень між двома або більше нуклеїновими кислотами, полінуклеотидами, білками або поліпептидами, і розуміється в контексті і у комбінації з термінами, що включають: (а) референсна послідовність, (Б) вікно порівняння, (с) ідентичність послідовності і (4) відсоток ідентичності послідовності. (а) "Референсна послідовність" являє собою певну послідовність, використовувану як основа для порівняння послідовностей. Референсна послідовність може бути підмножиною більшої за величиною певної послідовності; наприклад, сегмент повнорозмірної КДНК або послідовності гена, або повна послідовність КДНК або гена. Для поліпептидів зразкові довжини референсної поліпептидної послідовності включають щонайменше приблизно 16 амінокислот, щонайменше приблизно 20 амінокислот, щонайменше приблизно 25 амінокислот, щонайменше приблизно 35 амінокислот, щонайменше приблизно 50 амінокислот або щонайменше приблизно 100 амінокислот. Для нуклеїнових кислот зразкова довжина референсної нуклеотидної послідовності включає щонайменше приблизно 50 нуклеотидів, щонайменше приблизно 60 нуклеотидів, щонайменше приблизно 75 нуклеотидів, щонайменше приблизно 100 нуклеотидів або щонайменше приблизно 300 нуклеотидів, або будь-яке ціле число приблизно або між ними. (Б) "Вікно порівняння" включає посилання на суміжний і певний сегмент полінуклеотидної або поліпептидної послідовності, де полінуклеотидну або поліпептидну послідовність можна порівняти з референсною послідовністю, і де ділянка полінуклеотидної або поліпептидної послідовності у вікні порівняння може містити додавання, заміни або делеції (тобто гепи) у порівнянні з рефренсною послідовністю (яка не містить додавань, замін або делецій) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Ілюстративні вікна порівняння можуть становити щонайменше 20 суміжних нуклеотидів або амінокислот у довжину і необов'язково можуть становити 30, 40, 50, 100 або більше. Фахівці в даній галузі техніки розуміють, що для того, щоб уникнути помилково високої подібності з референсною послідовністю за рахунок включення гепів у полінуклеотидній або поліпептидній послідовності, зазвичай вводиться штраф за геп і віднімається із числа співпадінь. (с) Способи вирівнювання послідовностей для порівняння добре відомі в даній галузі.
Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння може бути проведене, наприклад, алгоритмом локальної гомології Сміта-Уотермана, Адм. Аррі. Май. 2:482 (1981), алгоритмом вирівнювання гомології Нідлемана-Вунша, 9. Мої. Віої. 48:443 (1970), способом пошуку подоби
Пірсона-Ліпмана, Ргос. Май. Асай. 5сі. ОБА 85:2444 (1988), комп'ютеризованими варіантами здійснення цих алгоритмів, включаючи, не обмежуючись цим: СГ О5ЗТАЇ. у програмі РС/сепе від
ІптеїПдепеїіс5, Мошипіаійп Міему, Саїйї., САР, ВЕЗТРІТ, ВГА5Т, ЕАЗТА Її ТЕАЗТА у програмному пакеті Мізсопвіп Сепеїйс5, Сепеїйс5 Сотршег сгоир (00), 7 Зсіепсе Ог., Мадізоп, М/і5., ОА; програма С ОЗТАЇГ. добре описана Хіггінсом і Шарпом, Сепе, 73: 237-244, 1988; Согреї, єї аї.,
Мисієїс Асіа5 Кезеагспй, 16: 881-90, 1988; Ниапо, еї аІ., Сотршиїег Арріїсайопвз іп Віозсіепсев, 8: 1- 6, 1992; і Реагзоп, єї аї., Меїподз» іп МоїІесшіаг Віоіоду, 24: 7-331, 1994. Родина програм ВІ А5Т, яка може використовуватися для пошуку подібності в базах даних, включає: ВІ А5ТМ для заданих нуклеотидних послідовностей проти нуклеотидних послідовностей у базі даних;
ВГА5ТХ для заданих нуклеотидних послідовностей проти білкових послідовностей у базі даних;
ВГА5ТР для заданих білкових послідовностей проти білкових послідовностей у базі даних;
ТВГАБТМ для заданих білкових послідовностей проти нуклеотидних послідовностей у базі даних; і ТВІА5БТХ для заданих нуклеотидних послідовностей проти нуклеотидних послідовностей у базі даних. Див. Сигтепі Ргоїосоїі5 іп МоїІесшіаг Віоіоду, Спарієг 19, А!,зибеї, еї аІ., Еа5., Сгеепе Рибіїзпіпд апа Уміеу-Іпіегосіепсе, Мем/ МогК, 1995. Нові версії вищевказаних програм або нові програми, безсумнівно, стануть доступними в майбутньому, і можуть використовуватися зі даним розкриттям. (4) "Відсоток ідентичності" означає значення, обумовлене шляхом порівняння двох оптимально вирівняних послідовностей у вікні порівняння, де частина полінуклеотидної або поліпептидної послідовності у вікні порівняння може містити додавання, заміни або делеції (тобто гепи) у порівнянні з референсною послідовністю (яка не містить додавань, замін або делецій) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Відсоток розраховується визначенням кількості положень, у яких ідентична основа нуклеїнової кислоти або амінокислотний залишок має місце в обох послідовностях, з одержанням кількості співпадаючих положень, ділячи кількість співпадаючих положень на загальну кількість положень у вікні 60 порівняння і множачи результат на 100, з одержанням відсотка ідентичності послідовності.
(00114) "Фармацевтично ефективна кількість" належить до кількості імуноглобуліну, яка лікує суб'єкта.
І00115| "Фармацевтично прийнятний носій" належить до компонентів фармацевтичної композиції імуноглобуліну, як тут описано, для введення суб'єктові. Наприклад, фармацевтично прийнятний носій може бути на основі ліпосом, на основі ліпідів і/або на основі наночастинок.
ІЇ00116| Як тут використовується, термін "реакційноздатна група" належить до хімічної функціональної групи, яка може взаємодіяти з іншими сполуками, такими як функціональні агенти, з утворенням щонайменше одного ковалентного зв'язку. В одному варіанті здійснення реакційноздатні групи є реакційноздатними в реакціях комбінації кліки-хімії. Необмежуючі приклади реакційноздатних груп включають (1Е,85,95)біцикло|6.1.0|нон-4-ін-9-ілметанол(ВСМ),
МН»
М
Ге) 9 (ОВСО), транс- циклооктен (ТСО), азидо (М»), алкін, тетразин метилциклопропен, норборнен, гідразид/гідразин і альдегід.
ІЇ00117| Як тут використовується, термін "суб'єкт" належить до організму людини або організму, відмінному від організму людини. Таким чином, способи, імуноглобуліни і кон'юговані імуноглобуліни, описані тут, застосовні як для захворювань і патологічних станів як людини, так і тварин. Суб'єктами можуть бути "пацієнти", тобто живі люди або організми, відмінні від людини, які одержують медичну допомогу для лікування захворювання або патологічного стану, або люди або організми, відмінні від людини, без наявності певного захворювання, які обстежуються на наявність ознак патології або наявність/відсутність певного патологічного стану.
І00118| "Заміщення" належить до заміни одного амінокислотного залишку на іншій. "Заміщення" включає, наприклад, місенс-мутації в одній або більше пар основ ДНК, що кодують амінокислотний залишок, або конструювання білка з обміном однієї амінокислоти на іншу амінокислоту. 00119) Як тут використовується, термін "лікування" і подібні терміни належать до зниження тяжкості і/або частоти симптомів захворювання, елімінації симптомів захворювання і/або лежачої в основі причини зазначених симптомів, зниженню частоти або ймовірності прояву симптомів захворювання і/або лежачої в їх основі причини, і також ослабленню або усуненню наслідків ушкодження, викликаного, прямо або опосередковано, захворюванням.
Зо 00120) Термін "терапевтичний агент" означає велику або невелику молекулу, яку можна вводити суб'єктові, що потребує цього, для лікування патологічного стану. Терапевтичні агенти можна вводити для лікування або попередження початку, уповільнення прогресування або ослаблення одного або більше симптомів патологічного стану в суб'єктів, що страждають від них. Терапевтичні агенти включають, не обмежуючись цим, антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, хіміотерапевтичний препарат, радіоактивний агент, цитотоксичний агент, антибіотик тощо. В одному варіанті терапевтичний агент являє собою невелику молекулу. У ще одному варіанті здійснення терапевтичний агент являє собою поліпептид. 00121) Як тут використовується, термін "на 9095 ідентична" включає щонайменше на 90905 ідентична, на 9195 ідентична, на 9295 ідентична, на 9395 ідентична, на 9495 ідентична, на 9595 ідентична, на 9695 ідентична, на 9795 ідентична, на 9895 ідентична, на 9995 ідентична або на 10095 ідентична референсній молекулі (наприклад, біологічної послідовності).
І00122| За текстом розкриття використовуються наступні скорочені позначення: кон'югати лікарського засобу на основі антитіла (АОС); співвідношення лікарський препарат до антитіла (БАК); каркасна ділянка (ЕМУК); визначальна комплементарність ділянка (СОК); ауристатин Е (АчЕ); варіабельна ділянка важкого ланцюга (МН); варіабельна ділянка легкого ланцюга (МІ); варіабельна ділянка каппа (Ук); константна ділянка гамма (Су); константна ділянка каппа (Ск); моноклональне антитіло (тАбБ); лізин в амінокислотному положенні 447 важкого ланцюга імуноглобуліну, як нумеровано з використанням системи нумерації ЄС (І уз447).
Одержання кон'югованих імуноглобулінів
Ї00123| У даному винаході забезпечуються способи одержання кон'югованого імуноглобуліну, де способи включають: інкубацію імуноглобуліну з мікробною трансглутаміназою і функціональним агентом, що містять ацил-донорний субстрат, а) де імуноглобулін містить щонайменше один амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, Б)
де ацил-донорний субстрат містить залишок глутаміну і с) де функціональний агент є терапевтичним агентом або діагностичним агентом, де мікробна трансглутаміназа каталізує кон'югацію С-кінцевого лізину імуноглобуліну із залишком глутаміну ацил-донорного субстрату у функціональному агентові, тим самим забезпечуючи одержання кон'югованого імуноглобуліну.
І00124| Також тут забезпечуються способи одержання кон'югованого імуноглобуліну, де способи включають: ї) інкубацію імуноглобуліну з мікробною трансглутаміназою і ацил- донорним субстратом, а) де імуноглобулін містить щонайменше один амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, Б) де ацил-донорний субстрат містить залишок глутаміну і реакційноздатну групу, де мікробна трансглутаміназа каталізує кон'югацію С-кінцевого лізину імуноглобуліну із залишком глутаміну ацил-донорного субстрату і її) кон'югацію функціонального агента з реакційноздатною групою ацил-донорного субстрату, де функціональний агент є терапевтичним агентом або діагностичним агентом, тим самим забезпечуючи одержання кон'югованого імуноглобуліну. 00125) Кон'югація може бути здійснена розчиненням функціонального агента, що містить ацил-донорний субстрат, у розчинюючому розчині і інкубуванням розчиненого функціонального агента з імуноглобуліном і мікробною трансглутаміназою у буфері для кон'югації. Кон'югація також може бути виконана розчиненням ацил-донорного субстрату в розчинюючому розчині і інкубацією ацил-донорного субстрату з імуноглобуліном і мікробною трансглутаміназою у буфері для кон'югації.
ІЇ00126| Для нерозчинних у воді функціональних агентів і ацил-донорних субстратів підходящі розчинюючі розчини включають органічні, що змішуються з водою, розчинники такі як диметилсульфоксид (ДМСО). Для водорозчинних функціональних агентів і ацил-донорних субстратів підходящі розчинюючі розчини включають, не обмежуючись цим, водні або забуферені водні розчини, такі як забуферений фосфатом фізіологічний розчин, рН 7,2 (1 х
РВ5) або ОРВ5.
І00127| Підходящі концентрації функціонального агента або ацил-донорного субстрату включають приблизно від 10 мкМ до приблизно 800 мМ, приблизно від 10 мМ до приблизно 100
ММ, приблизно від 25 мМ до приблизно 100 мМ, приблизно від 40 мМ до приблизно 100 мМ, приблизно від 55 мМ до приблизно 100 мМ, приблизно від 70 мМ до приблизно 100 мМ,
Ко) приблизно від 10 мМ до приблизно 90 мМ, приблизно від 10 мМ до приблизно 75 мМ, приблизно від 10 мМ до приблизно 60 мМ, приблизно від 10 мМ до приблизно 50 мМ, приблизно від 10 мМ до приблизно 40 мМ або приблизно від 10 мМ до приблизно 30 мМ.
І00128| У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил- донорного субстрату може становити приблизно 10 мкМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 25 МКМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил- донорного субстрату може становити приблизно 50 мкМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 100 мкМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил- донорного субстрату може становити приблизно 250 мкМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 500 мкМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил- донорного субстрату може становити приблизно 750 мкМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 1 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 10 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 20 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 30 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 40 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 50 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 60 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 70 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або субстрату донора ацилу може становити приблизно 80 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 90 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 100 мМ. У бо деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 150 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 200 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 250 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 300 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 350 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 400 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 450 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 500 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 550 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 600 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 650 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 700 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 750 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація функціонального агента або ацил-донорного субстрату може становити приблизно 800 мм.
І00129| Підходящі концентрації імуноглобуліну включають приблизно від 0,1 мг/мл до приблизно 20 мг/мл, приблизно від 0,5 мг/мл до приблизно 20 мг/мл, приблизно від 1 мг/мл до приблизно 20 мг/мл, приблизно від 5 мг/мл до приблизно 20 мг/мл, приблизно від 10 мг/мл до приблизно 20 мг/мл, приблизно від 0,1 мг/мл до приблизно 15 мг/мл, приблизно від 0,1 мг/мл до приблизно 12 мг/мл, приблизно від 0,1 мг/мл до приблизно 10 мг/мл, приблизно від 0,1 мг/мл до приблизно 5 мг/мл або приблизно від 0,1 мг/мл до приблизно 2 мг/мл. У деяких варіантах здійснення концентрація імуноглобуліну може становити приблизно 0,1 мг/мл. У деяких варіантах здійснення концентрація імуноглобуліну може становити приблизно 0,5 мг/мл. У деяких варіантах здійснення концентрація імуноглобуліну може становити приблизно 1 мг/мл. У
Зо деяких варіантах здійснення концентрація імуноглобуліну може становити приблизно 2 мг/мл. У деяких варіантах здійснення концентрація імуноглобуліну може становити приблизно 5 мг/мл. У деяких варіантах здійснення концентрація імуноглобуліну може становити приблизно 10 мг/мл.
В деяких варіантах здійснення концентрація імуноглобуліну може становити приблизно 15 мг/мл. У деяких варіантах здійснення концентрація імуноглобуліну може становити приблизно 20 мг/мл.
Ї00130| Підходящі співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату:імуноглобуліну становлять приблизно від 1:1 до 100:1. В одному варіанті здійснення співвідношення функціонального агента до ацил-донорного субстрату:імуноглобуліну становить приблизно від 25:11 до приблизно 75:11. У ще одному варіанті здійснення співвідношення функціонального агента до ацил-донорного субстрату:імуноглобуліну становить приблизно від 40:1 до приблизно 60:1. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату: імуноглобуліну може становити 1:11. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату: імуноглобуліну може становити 2:1. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату: імуноглобуліну може становити 3:1. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату: імуноглобуліну може становити 4:1. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату: імуноглобуліну може становити 5:1. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату: імуноглобуліну може становити 6:1. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату: імуноглобуліну може становити 7:1. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату: імуноглобуліну може становити 8:1. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату:імуноглобуліну може становити 9:11. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату: імуноглобуліну може становити 10:1. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату:імуноглобуліну може становити 11:11. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату:імуноглобуліну може становити 12:1. У деяких варіантах здійснення співвідношення бо функціонального агента або ацил-донорного субстрату:імуноглобуліну може становити 13:1. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату:імуноглобуліну може становити 14:1. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату:імуноглобуліну може становити 15:11. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату: імуноглобуліну може становити 16:1. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату:імуноглобуліну може становити 17:11. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату: імуноглобуліну може становити 18:1. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату:імуноглобуліну може становити 19:11. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату: імуноглобуліну може становити 20:1. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату:імуноглобуліну може становити 25:11. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату: імуноглобуліну може становити 30:1. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату:імуноглобуліну може становити 35:1. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату: імуноглобуліну може становити 40:1. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату:імуноглобуліну може становити 45:11. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату: імуноглобуліну може становити 50:1. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату:імуноглобуліну може становити 60:11. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату: імуноглобуліну може становити 70:1. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату:імуноглобуліну може становити 80:11. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату: імуноглобуліну може становити 90:1. У деяких варіантах здійснення співвідношення функціонального агента або ацил-донорного субстрату:їмуноглобуліну може становити 100:1. 00131) Інкубація може бути виконана в ряді підходящих буферів для кон'югації, включаючи, наприклад, ОРВ5, їхРВ5, рН 7,2, фосфат натрію, фосфат калію, борат натрію, трис-буфер і
Зо НЕРЕЗ, якщо назвати тільки деякі з них. Концентрація буфера для кон'югації становить приблизно від 5 мМ до приблизно 2 М, приблизно від 5 мМ до приблизно 1 М, приблизно від 5
ММ до приблизно 500 мМ, приблизно від 5 мМ до приблизно 100 мМ, приблизно від 10 мМ до приблизно 100 мМ, приблизно від 20 мМ до приблизно 100 мМ, приблизно від 30 мМ до приблизно 100 мМ, приблизно від 45 мМ до приблизно 100 мМ, приблизно від 60 мМ до приблизно 100 мМ, приблизно від 75 мМ до приблизно 100 мМ, приблизно від 10 мМ до приблизно 90 мМ, приблизно від 10 мМ до приблизно 75 мМ, приблизно від 10 мМ до приблизно 60 мМ, приблизно від 10 мМ до приблизно 45 мМ або приблизно від 10 мМ до приблизно 30 мМ.
У деяких варіантах здійснення концентрація буфера для кон'югації може становити приблизно 10 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація буфера для кон'югації може становити приблизно 20 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація буфера для кон'югації може становити приблизно 30 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація буфера для кон'югації може становити приблизно 40 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація буфера для кон'югації може становити приблизно 50 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація буфера для кон'югації може становити приблизно 60 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація буфера для кон'югації може становити приблизно 70 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація буфера для кон'югації може становити приблизно 80 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація буфера для кон'югації може становити приблизно 90 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація буфера для кон'югації може становити приблизно 100 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація буфера для кон'югації може становити приблизно 250 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація буфера для кон'югації може становити приблизно 500 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація буфера для кон'югації може становити приблизно 750 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація буфера для кон'югації може становити приблизно 1 М. У деяких варіантах концентрація буфера для кон'югації може становити приблизно 1,25 М. У деяких варіантах концентрація буфера для кон'югації може становити приблизно 1,5 М. У деяких варіанти здійснення винаходу концентрація буфера для кон'югації може становити приблизно 1,75 М. У деяких варіантах здійснення концентрація буфера для кон'югації може становити приблизно 2 М.
І00132| Буфер для кон'югації може додатково включати хлорид натрію. Підходящі концентрації хлориду натрію включають приблизно від 0 мМ до приблизно 2 М, приблизно від 0 60 ММ до приблизно 1 М, приблизно від 1 М до приблизно 2 М, приблизно від 500 мМ до приблизно 1,5 М, приблизно від 25 мМ до приблизно 500 мМ, приблизно від 50 мМ до приблизно 500 мМ, приблизно від 75 мМ до приблизно 500 мМ, приблизно від 100 мМ до приблизно 500 мМ, приблизно від 150 мМ до приблизно 500 мМ, приблизно від 200 мМ до приблизно 500 мМ, приблизно від 250 мМ до приблизно 500 мМ, приблизно від 300 мМ до приблизно 500 мМ, приблизно від 350 мМ до приблизно 500 мМ, приблизно від 400 мМ до приблизно 500 мМ, приблизно від 0 мМ до приблизно 400 мМ, приблизно від 0 мМ до приблизно 350 мМ, приблизно від 0 мМ до приблизно 300 мМ, приблизно від 0 мМ до приблизно 250 мМ, приблизно від 0 мМ до приблизно 200 мМ, приблизно від 0 мМ до приблизно 150 мМ, приблизно від 0 мМ до приблизно 100 мМ, приблизно від 0 мМ до приблизно 50 мМ або приблизно від 0
ММ до приблизно 25 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація хлориду натрію може становити приблизно 25 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація хлориду натрію може становити приблизно 50 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація хлориду натрію може становити приблизно 75 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація хлориду натрію може становити приблизно 100 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація хлориду натрію може становити приблизно 150 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація хлориду натрію може становити приблизно 200 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація хлориду натрію може становити приблизно 250 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація хлориду натрію може становити приблизно 300 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація хлориду натрію може становити приблизно 350 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація хлориду натрію може становити приблизно 400 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація хлориду натрію може становити приблизно 500 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація хлориду натрію може становити приблизно 750 мМ. У деяких варіантах здійснення концентрація хлориду натрію може становити приблизно 1 М. У деяких варіантах концентрація хлориду натрію може становити приблизно 1,25 М. У деяких варіантах концентрація хлориду натрію може становити приблизно 1,5 М. У деяких варіантах здійснення концентрація хлориду натрію може становити приблизно 1,75 М. У деяких варіантах концентрація хлориду натрію може становити приблизно 2 М. 00133) рН буфера для кон'югації може становити приблизно від 4 до приблизно 9. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно від 5 до приблизно 8.
У ще одному варіанті здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно від б до
Зо приблизно 7. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 4. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 4,5. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 5. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 5,5. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 6,0. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 6,5. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 6,6. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 6,7. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 6,85. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 6,9. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 7,0. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 7,1. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 7,2. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 7,3. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 7,4. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 7,5. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 7,6. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 7,7. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 7,85. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 7,9. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 8,0. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 8,1. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 8,2. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 8,3. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 8,4. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 8,5. У деяких варіантах здійснення рН буфера для кон'югації може становити приблизно 9. (00134) Для підвищення розчинності функціонального агента або ацил-донорного субстрату в буфері для кон'югації кінцева концентрація органічного розчинника, що змішується з водою, у 60 буфері для кон'югації може становити приблизно від 095 до приблизно 2095, приблизно від 295 до приблизно 2095, приблизно від 595 до приблизно 2095, приблизно від 895 до приблизно 2095, приблизно від 1195 до приблизно 2095, приблизно від 1695 до приблизно 2095, приблизно від 0905 до приблизно 1895, від приблизно 095 до приблизно 1595, приблизно від 095 до приблизно 1295, приблизно від 095 до приблизно 1095, приблизно від 095 до приблизно 895, приблизно від 095 до приблизно 695 або приблизно від 095 до приблизно 2965.
І00135| Буфер для кон'югації може додатково містити пропіленгліколь для підвищення розчинності тіол-реактивної сполуки в буфері для кон'югації. Підходящі концентрації пропіленгліколю включають приблизно від 1 до приблизно 5095, приблизно від 2095 до приблизно 5095, приблизно від 3095 до приблизно 5095, приблизно від 4095 до приблизно 5095, приблизно від 1095 до приблизно 4095, приблизно від 1095 до приблизно 3095 або приблизно від 1095 до приблизно 2095. У деяких варіантах здійснення концентрація пропіленгліколю може становити приблизно 195 або приблизно 595. У деяких варіантах здійснення концентрація пропіленгліколю може становити приблизно 1095. У деяких варіантах здійснення концентрація пропіленгліколю може становити приблизно 2095. У деяких варіантах здійснення концентрація пропіленгліколю може становити приблизно 3095. У деяких варіантах здійснення концентрація пропіленгліколю може становити приблизно 4095. У деяких варіантах здійснення концентрація пропіленгліколю може становити приблизно 5095.
І00136| Буфер для кон'югації може додатково містити неіоногенну поверхнево-активну речовину для підвищення розчинності кон'югованого імуноглобуліну в буфері для кон'югації.
Приклади неіоногенних поверхнево-активних речовин включають, не обмежуючись цим, полісорбат-20 або полісорбат-80. Підходящі концентрації неіоногенної поверхнево-активної речовини включають приблизно від 095 до приблизно 195, приблизно від 0,195 до приблизно 195, приблизно від 0,395 до приблизно 195, приблизно від 0,595 до приблизно 195, приблизно від 0,790 до приблизно 195, приблизно від 095 до приблизно 0,895, приблизно від 095 до приблизно 0,695, приблизно від 096 до приблизно 0,495 або приблизно від 095 до приблизно 0,295. У деяких варіантах здійснення концентрація неіоногенної поверхнево-активної речовини може становити приблизно 0,195. У деяких варіантах здійснення концентрація неіоногенної поверхнево-активної речовини може становити приблизно 0,295. У деяких варіантах здійснення концентрація неіоногенної поверхнево-активної речовини може становити приблизно 0,395. У деяких
Зо варіантах здійснення концентрація неіоногенної поверхнево-активної речовини може становити приблизно 0,495. У деяких варіантах здійснення концентрація неіоногенної поверхнево-активної речовини може становити приблизно 0,595. У деяких варіантах здійснення концентрація неіоногенної поверхнево-активної речовини може становити приблизно 0,695. У деяких варіантах здійснення концентрація неіоногенної поверхнево-активної речовини може становити приблизно 0,795. У деяких варіантах здійснення концентрація неіоногенної поверхнево-активної речовини може становити приблизно 0,895. У деяких варіантах здійснення концентрація неіоногенної поверхнево-активної речовини може становити приблизно 0,995. У деяких варіантах здійснення концентрація неіоногенної поверхнево-активної речовини може становити приблизно 1,095.
І00137| Інкубацію можна проводити протягом приблизно від 30 хв до приблизно 48 год, протягом приблизно від 1 год до приблизно 48 год, протягом приблизно від 2 год до приблизно 24 год, протягом приблизно від 24 год до приблизно 48 год, протягом приблизно від 30 год до приблизно 48 год, протягом приблизно від 36 год до приблизно 48 год, протягом приблизно від 42 год до приблизно 48 год, протягом приблизно від 2 год до приблизно 42 год, протягом приблизно від 2 год до приблизно 36 год, протягом приблизно від 2 год до приблизно 30 год, протягом приблизно від 2 год до приблизно 24 год, протягом приблизно від 2 год до приблизно 18 год, протягом приблизно від 2 год до приблизно 12 год, протягом приблизно від 30 хв до приблизно 1 год, протягом приблизно від 30 хв до приблизно 2 год або протягом приблизно від 2 год до приблизно 6 год. У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана протягом приблизно 30 хв. У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана протягом приблизно 1 год. У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана протягом приблизно 1,5 год. У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана протягом 2 год.
У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана протягом 6 год. У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана протягом 12 год. У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана протягом 18 год. У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана протягом 24 год. У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана протягом 30 год. У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана протягом 36 год.
У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана протягом 42 год. У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана протягом 48 год.
ІО138| Температура інкубації може становити приблизно від 4 "С до приблизно 50 "с, приблизно від 18 "С до приблизно 37 "С, приблизно від 20 "С до приблизно 37 "С, приблизно від 22 С до приблизно 37 "С, приблизно від 24 "С до приблизно 37 "С, приблизно від 26 С до приблизно 37 "С, приблизно від 28 "С до приблизно 37 "С, приблизно від 30 "С до приблизно 37 "С, приблизно від 32 "С до приблизно 37 "С, приблизно від 34 "С до приблизно 37 С, приблизно від 18 "С до приблизно 34 "С, приблизно від 18 "С до приблизно 32 "С, приблизно від 18 С до приблизно 30 "С, приблизно від 18 "С до приблизно 28 "С, приблизно від 18 С до приблизно 26 "С або приблизно від 18 "С до приблизно 24 "С. У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана при 4 "С. У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана при 18 "С. У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана при 20 "С. У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана при 22 "С. У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана при 24 "С. У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана при 26 "С. У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана при 28"С. У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана при 30 "С. У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана при 32 "С. У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана при 34 "С. У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана при 37 "С. У деяких варіантах здійснення інкубація може бути виконана при 50 "С.
ІЇО139| Функціональний агент, що не включився, або ацил-донорний субстрат можна відділити від кон'югованого імуноглобуліну з використанням хроматографії для знесолення з використанням ряду підходящих смол, включаючи, не обмежуючись цим, смолу 5-25, смолу О- 50, Віоде! Р10 або інші смоли з межами відсікання в діапазоні 5000-10000 Да. Хроматографія може бути виконана у форматі колонки або у форматі спін-колонки залежно від об'єму зразка.
Підходящі буфери для знесолення включають, наприклад, ОРВ5, 1їхРВ5, фосфат натрію, фосфат калію, борат натрію, трис або буфери на основі НЕРЕЗ5, можна замінити на 1х РВ5.
ІЇО140| У першому варіанті здійснення функціональний агент містить ацил-донорний субстрат, який містить залишок глутаміну, кон'югований із С-кінцевим лізином за допомогою ацил-донорного субстрату. У цьому першому варіанті здійснення функціональний агент поєднують із ацил-донорним субстратом до кон'югації з імуноглобуліном взаємодією реакційноздатної групи в ацил-донорному субстраті з функціональним агентом. У другому
Зо варіанті здійснення ацил-донорний субстрат, що містить залишок глутаміну і реакційноздатну групу, спочатку кон'югують з імуноглобуліном, і потім реакційноздатну групу з'єднують із функціональним агентом.
І0141| Ацил-донорні субстрати можуть містити лінкер "І". Лінкери можуть представляти нерозщеплювані лінкери або розщеплювані лінкери. Ілюстративні приклади лінкерів включають, наприклад, дисульфідвмісні лінкери, лінкери на основі ацеталів і лінкери на основі кеталів. У деяких аспектах лінкер може представляти нерозщеплюваний лінкер. Підходящі нерозщеплювані лінкери включають, але не обмежуються цим, одну або більше амінокислот, поліеєтиленгліколь (ПЕГ) або алкіл. У деяких варіантах здійснення лінкер може містити ПЕГ. У деяких аспектах лінкер може представляти розщеплюваний лінкер. Підходящі розщеплювані лінкери включають, наприклад, валін-цитрулін-пара- амінобензил. У деяких аспектах лінкером може бути дисульфідвмісний лінкер. У деяких аспектах лінкер може представляти лінкер на основі ацеталів. У деяких аспектах лінкер може представляти лінкер на основі кеталів. Лінкер також може представляти одну або більше амінокислот, одних або в комбінації з іншим лінкером, таким як одна або більше молекул ПЕГ. (0142) Ацил-донорний субстрат, що містить залишок глутаміну, може бути присутнім у складі функціонального агента або частково бути приєднаним до нього. Підходящі функціональні агенти включають, наприклад, флуорофори, флуоресцентні барвники, поліпептиди, імуноглобуліни, антибіотики, нуклеїнові кислоти, радіонукліди, хімічні лінкери, невеликі молекули, хелатори, ліпіди, нуклеїнові кислоти (такі як ДНК або РНК) і лікарські препарати. У деяких аспектах функціональний агент може включати флуорофор. У деяких аспектах функціональний агент може включати флуоресцентний барвник. У деяких аспектах функціональний агент може включати поліпептид. У деяких аспектах функціональний агент може включати імуноглобулін. У деяких аспектах функціональний агент може включати антибіотик. У деяких аспектах функціональний агент може включати нуклеїнову кислоту (таку як
ДНК або РНК). У деяких аспектах функціональний агент може включати радіонуклід. У деяких аспектах функціональний агент може включати невелику молекулу. У деяких аспектах функціональний агент може включати хелатор (наприклад, ООТА, СНХ-А"-ОТРА, МОТА, серед інших). У деяких аспектах функціональний агент може включати ліпід. У деяких аспектах функціональний агент може включати лікарський препарат. У деяких аспектах функціональний бо агент може включати комбінацію будь-якого з вищевказаних функціональних агентів.
І0143| Ацил-донорний субстрат (тобто перший ацил-донорний субстрат) може бути зв'язаний із другим ацил-донорним субстратом або лінкером, де другий ацил-донорний субстрат або лінкер зв'язані із другим імуноглобуліном, що має другу варіабельну ділянку важкого ланцюга і другу варіабельну ділянку легкого ланцюга, де друга варіабельна ділянка важкого ланцюга має С-кінцевий лізин, де С-кінцевий лізин має щонайменше один амінокислотний залишок після лізину. Наприклад, перший ацил-донорний субстрат другий ацил- донорний субстрат можуть мати перший і другий хімічний лінкер як перший і другий функціональні агенти відповідно. Перший і другий хімічні лінкери можуть бути зв'язані один з одним рядом підходящих способів, включаючи, наприклад, реакції клік-хімії.
І0144| В одному варіанті здійснення функціональний агент, що містить ацил-донорний субстрат, відповідає одній з формул (І) або (ІІ): (2)т-СІп-()а-(У) (І) (Х)-()-Са1п-(2) т (1) де 7 являє собою карбоксибензилокси (СВ2) групу або амінокислотний залишок; іп являє собою залишок глутамінової кислоти; кожний і! незалежно являє собою прямий або розгалужений лінкер з 1-20 атомів вуглецю, де один або більше атомів вуглецю можуть бути необов'язково і незалежно замінені атомом азоту, кисню або сірки, і де кожний атом вуглецю і азоту може бути необов'язково заміщений; або кожний Ї необов'язково та незалежно являє собою амінокислотний залишок; т дорівнює цілому числу від 0 до 5; п дорівнює цілому числу від 0 до 5; і М є функціональним агентом. 0145) В одному варіанті здійснення ацил-донорний субстрат відповідає одній з формул (І) або (ІМ): (2)т-СсІп-()-(Х) (І) (Х)-()а-аА-(2) т (ІМ) де 7 являє собою карбоксибензилокси (СВ) групу або амінокислотний залишок; Сіп являє собою залишок глутамінової кислоти; кожний і! незалежно являє собою прямий або розгалужений лінкер з 1-20 атомів вуглецю, де один або більше атомів вуглецю можуть бути необов'язково і незалежно замінені атомом азоту, кисню або сірки, і де кожний атом вуглецю і азоту може бути необов'язково заміщений; або кожний Ї необов'язково та незалежно являє
Зо собою амінокислотний залишок; т дорівнює цілому числу від 0 до 5; п дорівнює цілому числу від О до 5; і Х є реакційноздатною групою.
ІО146| В одному варіанті здійснення 7 являє собою СВ групу. У ще одному варіанті здійснення 7 являє собою амінокислотний залишок.
І0147| В одному варіанті здійснення Ї являє собою амінокислотний залишок. В одному варіанті здійснення п дорівнює 2-5 і кожний І незалежно являє собою амінокислотний залишок.
У ще одному варіанті здійснення І являє собою прямий або розгалужений лінкер з 1-20 атомів вуглецю, де один або більше атомів вуглецю можуть бути необов'язково і незалежно замінені атомом азоту, кисню або сірки, і де кожний атом вуглецю і азоту може бути необов'язково заміщений. У ще одному варіанті здійснення І являє собою молекулу поліетиленгліколю (ПЕГ).
У ще одному варіанті здійснення п дорівнює 2-5, і один або більше Ї містить одну або більше амінокислот, і одна або більше додаткових ГІ. груп містять молекулу поліетиленгліколю (ПЕГ). (0148) В одному варіанті здійснення т дорівнює 0. У ще одному варіанті здійснення т дорівнює 1. У ще одному варіанті здійснення т дорівнює 2. У ще одному варіанті здійснення т дорівнює 3. У ще одному варіанті здійснення т дорівнює 4. У ще одному варіанті здійснення т дорівнює 5.
І0149| В одному варіанті здійснення п дорівнює 0. У ще одному варіанті здійснення п дорівнює 1. У ще одному варіанті здійснення п дорівнює 2. У ще одному варіанті здійснення п дорівнює 3. У ще одному варіанті здійснення п дорівнює 4. У ще одному варіанті здійснення п дорівнює 5.
0150) У ще одному варіанті здійснення Х являє собою (1К,85,95)біцикло|6.1.Ф|нон-4-ін-9- ілметанол(ВСМ). У ще одному варіанті здійснення Х являє собою - (ОВСО). У ще одному варіанті здійснення Х являє собою транс-циклооктен (ТСО). У ще одному варіанті здійснення Х являє собою азидо (Мз). У ще одному варіанті здійснення Х являє собою алкін. У ще одному варіанті здійснення Х являє собою тетразин метилциклопропен. У ще одному варіанті здійснення Х являє собою норборнен. У ще одному варіанті здійснення Х являє собою гідразид/гідразин. У ще одному варіанті здійснення Х являє собою альдегід.
ІО151) В одному варіанті здійснення для ацил-донорного субстрату формули (І) 7 являє собою СВ групу; Ї являє собою молекулу поліетиленгліколю (ПЕГ) (-О((СН?г)2)-), етиламін (-
МН(СН?)2)-) або пропіламін (-МН((СнН»5)з)-); і п дорівнює 0, 1, 2 або 3. 0152) У ще одному варіанті здійснення ацил-донорний субстрат відповідає формулі (І), де 7 являє собою СВ групу; і Ї являє собою амінокислоту. В одному варіанті здійснення І. є Су. В одному аспекті цього варіанта здійснення т дорівнює 1 і п дорівнює 1. 0153) В одному варіанті здійснення ацил-донорний субстрат відповідає формулі (І), де 7 являє собою СВ групу; т дорівнює 1; п дорівнює 1, 2 або 3; і щонайменше один І. є Су. (0154) В одному варіанті здійснення для ацил-донорного субстрату формули (ІІ) 7 являє собою СВ групу; Ї являє собою молекулу поліетиленгліколю (ПЕГ) (-О((СН?г)2)-), етиламін (-
МН(СНг)»2)-) або пропіламін (-МН((СнН5)з)-); і п дорівнює 0, 1, 2 або 3.
ІО155) У ще одному варіанті здійснення ацил-донорний субстрат відповідає формулі (ІІ), де 27 являє собою СВ групу, і Ї являє собою амінокислоту. У ще одному варіанті здійснення Г. являє собою Су. В одному аспекті цього варіанта здійснення т дорівнює 1 і п дорівнює 1.
ІО156) В одному варіанті здійснення ацил-донорний субстрат відповідає формулі (ІМ), де 27 являє собою СВ групу; т дорівнює 1; п дорівнює 1, 2 або 3; і щонайменше один І. є Су.
ІО157| В одному варіанті здійснення імуноглобулін містить 1-20 амінокислотних залишків, доданих після С-кінцевого лізину (наприклад, Гуз447). В одному варіанті здійснення, де додається 1 амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, то доданий амінокислотний залишок, суміжний із С-кінцевим лізином (амінокислотне положення 1), вибраний із групи, що складається із гліцину, аланіну, валіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, фенілаланіну, тирозину, триптофану, серину, треоніну, цистеїну, аспарагіну, глутаміну і гістидину. В одному варіанті здійснення, де додається 1 амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, доданий амінокислотний залишок, суміжний із С-кінцевим лізином (амінокислотне положення «1), не є проліном, аспарагіновою кислотою або глутаміновою кислотою. В одному варіанті здійснення, де додається 1 амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, доданий амінокислотний залишок, суміжний із С-кінцевим лізином (амінокислотне положення 1), не є лізином або аргініном.
ІЇО158| В одному варіанті здійснення імуноглобулін має 2 амінокислотних залишки (амінокислотні положення їж і 2), додані після С-кінцевого лізину (наприклад, І уз447). В одному варіанті здійснення імуноглобулін має З амінокислотних залишки (амінокислотні положення «1, 2 і 43), додані після С-кінцевого лізину (наприклад, І уз447). В одному варіанті здійснення імуноглобулін має 4 амінокислотних залишки (амінокислотні положення 1, 2, 3 і -), додані після С-кінцевого лізину (наприклад, І уз447). В одному варіанті здійснення імуноглобулін має 5 амінокислотних залишків (амінокислотні положення яж1, 2, 3, 4 і 5), додані після С-кінцевого лізину (наприклад, ГГ уз447). В одному варіанті здійснення імуноглобулін має 6 амінокислотних залишків (амінокислотні положення 1, 2, 3, 4, 5 і 16), додані після С- кінцевого лізину (наприклад, І уз447). В одному варіанті здійснення імуноглобулін має 7 амінокислотних залишків (амінокислотні Положення я-1, 2, 3, 4, 5, 6 і 47), додані після С- кінцевого лізину, наприклад, (Іу5447). В одному варіанті здійснення імуноглобулін має 8 амінокислотних залишків (амінокислотні положення їт1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 і 18), додані після
С-кінцевого лізину (наприклад, І уб447). В одному варіанті здійснення імуноглобулін має 9 амінокислотних залишків (амінокислотні положення я1, 2, 3, 4, 5, 6, 7/, 8 і 9), додані після С-кінцевого лізину (наприклад, І уз447). В одному варіанті здійснення імуноглобулін має 10 амінокислотних залишків (амінокислотні положення я-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 її -10), додані після С-кінцевого лізину (наприклад, І ух447). одному варіанті здійснення імуноглобулін має 11 амінокислотних залишків (амінокислотні положення я1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, -8, 9, -10 і Ж-1) додані після С-кінцевого лізину (наприклад, І уз447). В одному варіанті здійснення імуноглобулін має 12 амінокислотних залишків (амінокислотні положення 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, -10, -11 ін12), додані після С-кінцевого лізину (наприклад, І уз447). В одному варіанті здійснення імуноглобулін має 13 амінокислотних залишків (амінокислотні положення 1, 2, 3, 4,5, б, 7, 8, 9, -10, -11, 12, ін13), додані після С-кінцевого лізину (наприклад, І уз447). В одному варіанті здійснення імуноглобулін має 14 амінокислотних залишків (амінокислотні положення ж1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, -10, -11, -12, 4413 ї 414), додані після С-кінцевого лізину (наприклад, ГГ уз447). В одному варіанті здійснення імуноглобулін має 15 амінокислотних залишків (амінокислотні положення 1, 2, 3, 4, 5, б, /, 8, 9, -10, -11, 12, 13, 14 і я-15), додані після С-кінцевого лізину (наприклад, Гуз447). В одному варіанті здійснення імуноглобулін має 16 амінокислотних залишків (амінокислотні положення 1, --2, -3, --4, -5, 4-6, 7, 8, 9, -10, -11, -12, -13, -14, -15 і 416), додані після С-кінцевого лізину (наприклад,
Гуз447). В одному варіанті здійснення імуноглобулін має 17 амінокислотних залишків (амінокислотні положення йж1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, -10, -11, -12, -13, 14, -15, 16 1 я-17), додані після С-кінцевого лізину (наприклад, Гуз447). В одному варіанті здійснення імуноглобулін має 18 амінокислотних залишків (амінокислотні положення 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, -11, -12, 4-13, --14, я-15, -16, -17 і ї-18), додані після С-кінцевого лізину (наприклад, І уз447). В одному варіанті здійснення імуноглобулін має 19 амінокислотних залишків (амінокислотні положення 1, 2, -3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, -10, -11, -12, 13, -14, -15, --16, --17, 4-18 і 419), додані після С-кінцевого лізину (наприклад, І уз447). В одному варіанті здійснення імуноглобулін має 20 амінокислотних залишків (амінокислотні положення 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, в, 9, 10, 11, -12, 13, 14, -15, 16, 17, 18, 19 ї 420), додані після С- кінцевого лізину (наприклад, Гуз447).
ІО159) В одному варіанті здійснення імуноглобулін має менше 9 амінокислотних залишків, додані після С-кінцевого лізину (наприклад, І ух447). В одному варіанті здійснення імуноглобулін має менше 13 амінокислотних залишків, додані після С-кінцевого лізину (наприклад, Гуз447). В одному варіанті здійснення імуноглобулін не має послідовності: атТМгОАМаИТ,
СЕСТУРОАМОСТЕ або СОЕМТУРОАМОИМТЕ, додані після С-кінцевого лізину, наприклад ГІ уз447).
ІО160) В одному варіанті здійснення, де два або більше амінокислотних залишки додані або
Зо присутні після С-кінцевого лізину, то останній амінокислотний залишок, доданий або присутній після С-кінцевого лізину (тобто доданий амінокислотний залишок, найбільш віддалений від С- кінцевого лізину), вибраний із групи, що включає фенілаланін, лейцин, ізолейцин, метіонін, валін, серин, пролін, треонін, аланін, тирозин, гістидин, глутамін, аспарагін, аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту, цистеїн, триптофан і гліцин. В одному варіанті здійснення, де два або більше амінокислотних залишки додані або присутні після С-кінцевого лізину, то останній амінокислотний залишок, доданий або присутній після С-кінцевого лізину, не є лізином або аргініном.
ІО161) Розкриті способи можна здійснити на гуманізованому імуноглобуліні. Таким чином, у деяких варіантах здійснення імуноглобулін може представляти гуманізований імуноглобулін.
І0162| Розкриті способи можна здійснити на людському імуноглобуліні. Таким чином, у деяких варіантах здійснення імуноглобулін може представляти людський імуноглобулін. У ще одному варіанті здійснення імуноглобулін може представляти імуноглобулін, відмінний від людського імуноглобуліну. 0163) В одному варіанті здійснення розкриті способи можна здійснити на імуноглобуліні
Іа, Ідс2, доз або Ідос4. В одному варіанті здійснення спосіб здійснюється на імуноглобуліні
Ід091. В одному варіанті здійснення спосіб здійснюється на імуноглобуліні 952. В одному варіанті здійснення спосіб здійснюється на імуноглобуліні Іде3. В одному варіанті здійснення спосіб здійснюється на імуноглобуліні Іде. (0164) В одному варіанті здійснення розкриті способи можна здійснити на імуноглобуліні
ІЗА1, ІдА2 або ІдМ. В одному варіанті здійснення спосіб здійснюється на імуноглобуліні ІДА1. В одному варіанті здійснення спосіб здійснюється на імуноглобуліні І4А2. В одному варіанті здійснення спосіб здійснюється на імуноглобуліні ДМ. В одному варіанті здійснення імуноглобулін ІдА або ІДМ має хвостову ділянку. У ще одному варіанті здійснення імуноглобулін в ЇДА або ІДМ хвостова ділянка вилучена. 0165) В одному варіанті здійснення спосіб здійснюється на імуноглобуліні (ЧО або ЧЕ. В одному варіанті здійснення спосіб здійснюється на імуноглобуліні (40. В одному варіанті здійснення спосіб здійснюється на імуноглобуліні ІДЕ.
ІО166) Для способів, описаних тут, в одному варіанті здійснення мікробна трансглутаміназа походить із Асііпотадига 5р. 1-2, Васійшнв5 сіксшапв ВІ 32, Васійив5 5,ибБійв 5рогез, Согуперасієтійт 60 аттопіадепе5, Согуперасієтішт дішатісит, Епіегорасієї 5р. С2361, Ргомідепсіа 5р. С1112,
зігеріомепіснШіит тобрагаєпзе (ака бігеріотусе5 тоБбагепвів), Бігеріотусе5 ріаїепвзів М5218, зЗігеріотусев Пудгозсорісив, БЗігеріотусевз Імідап5, Зперіотусез мідап5 ОТ46/рАЕО53, зЗігеріотусев Іудісих, ЗмМеріотусев ріаїеп5іх5, БЗіеріотусев5 зіоуапвіз, З МперіомепіснцШт дгізеосатецйт, ЗігеріомепісйШіит Іадакапит МАНВІ-3191, Бпмнеріомепісіййшт 5р. 5-8112, ог зігеріососсизв 5(ці5.. В одному варіанті здійснення мікробна трансглутаміназа походить із бактерії зігеріотусе5 тобагепвів.
ІО167| Для способів, описаних тут, в одному варіанті здійснення трансглутаміназа виділена з рослини, вибраної із групи, що складається з Медісадо заїїма, Веїа мцідагі5, НеЇїапіпив Шрегозив, 7еа тауз, СПіусіпе тах, Агарідорзіз ІНаійапа, Місоїйапа іабасит, Сніатудотопах геіпНагайії,
РипаїіеїІа заїїпа, Огуга заїїма і Возтагіпив ойісіпаїв І.
ІЇО168| Для способів, описаних тут, в одному варіанті здійснення трансглутаміназа є трансглутаміназою ссавців, і виділена із трансглутамінази 1-7 і фактора ХІПІ.
І0169) В одному варіанті здійснення трансглутаміназа щонайменше на 7595, 8095, 81905, 8290, 8395, 8495, 8595, 8695, 8795, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895 або 99905 ідентична мікробній трансглутаміназі, описаній тут. В одному варіанті здійснення трансглутаміназа щонайменше на 7595, 8095, 8195, 8295, 8395, 8495, 8595, 8695, 8795, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9390, 9495, 9595, 96905, 9790, 9895 або 9995 ідентична мікробній трансглутаміназі з
Бігеріотусе5 тобрагепвтіз. Ферменти трансглутамінази є комерційно доступними від Аіпотоїо? або 7едіга (номер продукту Т001). У ще одному варіанті здійснення трансглутаміназа є очищеною. У ще одному варіанті здійснення трансглутаміназа рекомбінантно експресована і потім очищена з використанням способів, відомих фахівцеві в даній галузі техніки.
ІО179| В одному варіанті здійснення фермент трансглутаміназа є присутньою у способах, описаних тут, у концентрації від приблизно 0,1 Од/мл до приблизно 250 Од/мл. В одному варіанті здійснення фермент трансглутаміназа є присутньою у способах, описаних тут, у концентрації від приблизно 1 Од/мл до приблизно 25 Од/мл. В одному варіанті здійснення фермент трансглутаміназа є присутньою у способах, описаних тут, у концентрації приблизно від 1 Од/мл до приблизно 25 Од/мл. В одному варіанті здійснення фермент трансглутаміназа є присутньою у способах, описаних тут, у концентрації приблизно 0,1 Од/мл. В одному варіанті здійснення фермент трансглутаміназа є присутньою у способах, описаних тут, у концентрації
Зо приблизно 0,5 Од/мл. В одному варіанті здійснення фермент трансглутаміназа є присутньою у способах, описаних тут, у концентрації приблизно 1 Од/мл. В одному варіанті здійснення фермент трансглутаміназа є присутньою у способах, описаних тут, у концентрації приблизно 5
Од/мл. В одному варіанті здійснення фермент трансглутаміназа є присутньою у способах, описаних тут, у концентрації приблизно 10 Од/мл. В одному варіанті здійснення фермент трансглутаміназа є присутньою у способах, описаних тут, у концентрації приблизно 15 Од/мл. В одному варіанті здійснення фермент трансглутаміназа є присутньою у способах, описаних тут, у концентрації приблизно 20 Од/мл. В одному варіанті здійснення фермент трансглутаміназа є присутньою у способах, описаних тут, у концентрації приблизно 25 Од/мл. В одному варіанті здійснення фермент трансглутаміназа є присутньою у способах, описаних тут, у концентрації приблизно 50 Од/мл. В одному варіанті здійснення фермент трансглутаміназа є присутньою у способах, описаних тут, у концентрації приблизно 75 Од/мл. В одному варіанті здійснення фермент трансглутаміназа є присутньою у способах, описаних тут, у концентрації приблизно 100 Од/мл. В одному варіанті здійснення фермент трансглутаміназа є присутньою у способах, описаних тут, у концентрації приблизно 150 Од/мл, 200 Од/мл або 250 Од/мл.
ІЇО171| Для способів, забезпечених тут, в одному варіанті здійснення співвідношення функціонального агента до імуноглобуліну становить приблизно від 1:1 до приблизно 2:1. В одному варіанті здійснення співвідношення функціонального агента до імуноглобуліну становить приблизно від 1:11 до приблизно 2:1. В одному варіанті здійснення співвідношення функціонального агента до імуноглобуліну становить приблизно 1:11. В одному варіанті здійснення співвідношення функціонального агента до імуноглобуліну становить приблизно 2:1.
В одному варіанті здійснення співвідношення функціонального агента і імуноглобуліну відоме і послідовно відтворюється, дотримуючись описаних тут способів. Як тут використовується, співвідношення функціонального агента до імуноглобуліну розраховується на основі середнього значення співвідношення кон'югації функціонального агента з імуноглобуліном в пулі антитіл у композиції.
ІО172| У варіантах здійснення, забезпечених тут, де щонайменше два додаткові амінокислотні залишки присутні після С-кінцевого лізину, і де один щонайменше із двох додаткових амінокислотних залишків включає лізин, то відношення функціонального агента до імуноглобуліну збільшується, грунтуючись на кількості додаткових амінокислотних залишків, які 60 представляють лізин. Наприклад, у випадку, коли два додаткові амінокислотні залишки присутні після С-кінцевого лізину, і один з додаткових амінокислотних залишків також є лізином, то присутні два залишки лізину, у результаті чого утворюється антитіло із чотирма сайтами трансамідування, і співвідношення функціонального агента до імуноглобуліну становить приблизно від 2:11 до приблизно 4:11. Як ще однин приклад, у якому п'ять додаткових амінокислотних залишків присутні після С-кінцевого лізину, і два додаткові амінокислотні залишки представляють лізини, то присутні три (у цілому) залишки лізину, у результаті чого одержують антитіло із шістьома сайтами трансамідування, і співвідношення функціонального агента до імуноглобуліну становить приблизно від 2:1 до приблизно 6:1.
Кон'юговані імуноглобуліни 001731 Крім того, тут забезпечуються кон'юговані імуноглобуліни, що включають будь-який з імуноглобулінів, розкритих тут, де лізин у С-кінцневому положенні (наприклад, лізин у положенні 447 або "І ух447") має щонайменше один додатковий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, і він кон'югований з функціональним агентом, що містить ацил-донорний субстрат, де ацил-донорний субстрат містить залишок глутаміну. Додаткові варіанти здійснення включають кон'юговані імуноглобуліни, що містять будь-який з імуноглобулінів, розкритих тут, де лізин у С- кінцевого положенні (наприклад, лізин у положенні 447 або "І ух447") має щонайменше один додатковий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, і він кон'югований з ацил- донорним субстратом, де ацил-донорний субстрат містить залишок глутаміну і реакційноздатну групу, де реакційноздатну групу можна піддати взаємодії з функціональним агентом після кон'югації ацил-донорного субстрату з імуноглобуліном.
І00174| В одному варіанті здійснення амінокислотний залишок, суміжний із С-кінцевим лізином (амінокислотне положення ї1), включає гліцин, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, метіонін, фенілаланін, тирозин, триптофан, серин, треонін, цистеїн, аспарагін, глутамін або гістидин. В одному варіанті здійснення амінокислотний залишок, суміжний із С-кінцевим лізином (амінокислотне положення «т1), включає гліцин. В одному варіанті здійснення амінокислотний залишок, суміжний із С-кінцевим лізином (амінокислотне положення ї1), включає аланін. В одному варіанті здійснення амінокислотний залишок, суміжний із С-кінцевим лізином (амінокислотне положення ї1), включає валін. В одному варіанті здійснення амінокислотний залишок, суміжний із С-кінцевим лізином (амінокислотне положення ї1), включає лейцин. В
Зо одному варіанті здійснення амінокислотний залишок, суміжний із С-кінцевим лізином (амінокислотне положення ї-1), включає ізолейцин. В одному варіанті здійснення амінокислотний залишок, суміжний із С-кінцевим лізином (амінокислотне положення 1), включає метіонін. В одному варіанті здійснення амінокислотний залишок, суміжний із С- кінцевим лізином (амінокислотне положення ї1), включає фенілаланін. В одному варіанті здійснення амінокислотний залишок, суміжний із С-кінцевим лізином (амінокислотне положення ї1), включає тирозин. В одному варіанті здійснення амінокислотний залишок, суміжний із С- кінцевим лізином (амінокислотне положення ї1), включає триптофан. В одному варіанті здійснення амінокислотний залишок, суміжний із С-кінцевим лізином (амінокислотне положення я-1), включає серин. В одному варіанті здійснення амінокислотний залишок, суміжний із С- кінцевим лізином (амінокислотне положення 1), включає треонін. В одному варіанті здійснення амінокислотний залишок, суміжний із С-кінцевим лізином (амінокислотне положення 1), включає цистеїн. В одному варіанті здійснення амінокислотний залишок, суміжний із С-кінцевим лізином (амінокислотне положення 1), включає аспарагін. В одному варіанті здійснення амінокислотний залишок, суміжний із С-кінцевим лізином (амінокислотне положення 1), включає глутамін. В одному варіанті здійснення амінокислотний залишок, суміжний із С- кінцевим лізином (амінокислотне положення 1), включає гістидин. В одному варіанті здійснення, де додається 1 амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, то доданий амінокислотний залишок, суміжний із С-кінцевим лізином (амінокислотне положення «1), не є проліном, аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою, лізином або аргініном. 00175) У ще одному варіанті здійснення, якщо додається більш ніж одна амінокислота до С- кінцевого лізину, то остання додаткова амінокислота (тобто амінокислота, розташована на С- кінці доданих амінокислотних залишків) може представляти будь-яку амінокислоту, за винятком лізину або аргініну. Наприклад, коли додається два амінокислотні залишки після С-кінцевого лізину, то послідовність містить перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину (амінокислотне положення «Ж1) і другу амінокислоту після С-кінцевого лізину (амінокислотне положення 2), де перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину (амінокислотне положення ї-1) являє собою будь-який амінокислотний залишок, за винятком аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти або проліну, і де другий амінокислотний залишок після С- кінцевого лізину (амінокислотне положення -2) вибраний із групи, що складається бо фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну,
тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину. В одному варіанті здійснення перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину являє собою лізин або аргінін. У ще одному варіанті здійснення другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину (амінокислотне положення ж2) не є лізином або аргініном. 00176) Як ще один приклад, де п'ять амінокислотних залишків додаються після С-кінцевого лізину (амінокислотні положення я-1, 2, Ж-3, 4 і 5), то послідовність включає перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину (амінокислотне положення «1), другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину (амінокислотне положення 2), третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину (амінокислотне положення «т3), четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину (амінокислотне положення 4) і п'ятий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину (амінокислотне положення 5). Першим амінокислотним залишком після С-кінцевого лізину може бути будь-який амінокислотний залишок, за винятком аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти або проліну. Другий, третій і четвертий амінокислотні залишки після С-кінцевого лізину можуть представляти будь-яку амінокислоту. Однак п'ятий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину (амінокислотне положення ж-5) вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину. У ще одному варіанті здійснення п'ятий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину (амінокислотне положення 5) не є лізином або аргініном. У ще одному варіанті здійснення перший, другий, третій або четвертий амінокислотний залишок(ии) (амінокислотні положення 1, 2, 3 і/або 4) після С-кінцевого лізину можуть представляти лізин або аргінін.
І00177| У деяких варіантах здійснення імуноглобулін може бути гуманізованим. У ще одному варіанті здійснення імуноглобулін є людським імуноглобуліном. У ще одному варіанті здійснення імуноглобулін є химерним. (00178) Ацил-донорний субстрат, що містить залишок глутаміну та реакційноздатну групу, також може містити лінкер "1". Аналогічно, функціональні агенти, які містять ацил-донорний субстрат, що включає залишок глутаміну, можуть мати лінкер між функціональним агентом і
Зо ділянкою молекули ацил-донорного субстрату. Лінкери можуть представляти нерозщеплювані лінкери або розщеплювані лінкери. Ілюстративні приклади лінкерів включають, наприклад, дисульфідвмісні лінкери, лінкери на основі ацеталів і лінкери на основі кеталів. У деяких аспектах лінкер може представляти нерозщеплюваний лінкер. Підходящі нерозщеплювані лінкери включають, але не обмежуючись цим, поліетиленгліколь (ПЕГ) або алкіл. У деяких варіантах здійснення лінкер може включати ПЕГ. У деяких аспектах лінкер може представляти розщеплюваний лінкер. Підходящі розщеплювані лінкери включають, наприклад, валін- цитрулін-пара-амінобензил. У деяких аспектах лінкером може представляти дисульфідвмісний лінкер. У деяких аспектах лінксер може представляти лінкер на основі ацеталів. У деяких аспектах лінкер може представляти лінкер на основі кеталів.
І00179| Кон'юговані імуноглобуліни за винаходом містять функціональний агент. Підходящі функціональні агенти включають, наприклад, терапевтичний агент або діагностичний агент.
Підходящі функціональні агенти включають, наприклад, флуорофори, флуоресцентні барвники, поліпептиди, імуноглобуліни, антибіотики, нуклеїнові кислоти, радіонукліди, хімічні лінкери, малі молекули, хелатори, ліпіди і лікарські препарати. У деяких аспектах функціональний агент може містити флуорофор. У деяких аспектах функціональний агент може містити флуоресцентний барвник. У деяких аспектах функціональний агент може містити поліпептид. У деяких аспектах функціональний агент може містити імуноглобулін. У деяких аспектах функціональний агент може містити антибіотик. У деяких аспектах функціональний агент може містити нуклеїнову кислоту (таку як ДНК або РНК). У деяких аспектах функціональний агент може містити радіонуклід. У деяких аспектах функціональний агент може містити невелику молекулу. У деяких аспектах функціональний агент може містити хелатор (наприклад, ООТА, СНХ-А"-ОТРА,
МОТА, серед інших). У деяких аспектах функціональний агент може містити ліпід. У деяких аспектах функціональний агент може містити лікарський препарат. У деяких аспектах функціональний агент може містити комбінацію будь-якого з вищевказаних функціональних агентів.
ІЇ00180| Отже, розкриті кон'юговані імуноглобуліни включають, не обмежуючись цим, кон'югати імуноглобуліну-флуорофору із С-кінцевим лізином, кон'югати імуноглобуліну- флуоресцентного барвника С-кінцевим лізином, кон'югати імуноглобуліну-поліпептиду із С- кінцевим лізином, кон'югати імуноглобуліну-імуноглобуліну із С-кінцевим лізином, кон'югати бо імуноглобуліну-антибіотика із С-кінцевим лізином, кон'югати імуноглобуліну-нуклеїнової кислоти із С-кінцевим лізином, кон'югати імуноглобуліну-радіонукліду із С-кінцевим лізином, кон'югати імуноглобуліну-хімічного лінкера із С-кінцевим лізином, кон'югати імуноглобуліну-невеликої молекули із С-кінцевим лізином, кон'югати імуноглобуліну-хелатора із С-кінцевим лізином, кон'югати імуноглобуліну-ліпіду їз С-кінцевим лізином і кон'югати імуноглобуліну-лікарського препарату із С-кінцевим лізином. 00181) Будь-який з імуноглобулінів, розкритих тут, може бути кон'югований з будь-яким з функціональних агентів, описаних тут. Наприклад, кон'югований імуноглобулін може включати флуорофор, флуоресцентний барвник, поліпептид, імуноглобулін, антибіотик, нуклеїнову кислоту, радіонуклід, хімічний лінкер, малу молекулу, хелатор, ліпід або лікарський препарат.
ІЇ00182| У деяких варіантах здійснення імуноглобулін може бути кон'югований з низькомолекулярним протипухлинним агентом, таким як ауристатин. У деяких аспектах функціональним агентом може бути ауристатин Е (АшР). Таким чином, розкриті кон'юговані імуноглобуліни включають будь-який з вищевказаних імуноглобулінів, кон'югованих з ауристатином Е (кон'югат АєтЕ ГГ уз447).
Фармацевтичні композиції 00183) Також тут забезпечуються фармацевтичні композиції. У деяких варіантах здійснення фармацевтичні композиції можуть містити будь-який з імуноглобулінів, розкритих тут. У деяких варіантах здійснення фармацевтичні композиції можуть містити будь-який з кон'югованих імуноглобулінів, розкритих тут. В одному варіанті здійснення фармацевтична композиція містить кон'югований імуноглобулін і фармацевтично прийнятний носій.
Молекули нуклеїнової кислоти, що кодують імуноглобуліни, і клітини-хазяї, що містять їх
І00184| Також тут забезпечуються молекули нуклеїнових кислот, що кодують будь-які з імуноглобулінів, розкритих тут. Як приклад, в одному варіанті здійснення молекула нуклеїнової кислоти кодує імуноглобулін, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга і варіабельну ділянку легкого ланцюга, де варіабельна ділянка легкого ланцюга має лізин у С-кінцевому положенні (наприклад, положення 447 або "Іуз447") і одну або більше амінокислот після С- кінцевого лізину, вибраних із гліцину, аланіну, валіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, фенілаланіну, тирозину, триптофану, серину, треоніну, цистеїну, аспарагіну, глутаміну і гістидину.
Зо І00185| Також забезпечуються клітини-хазяї, що містять будь-яку з розкритих молекул нуклеїнової кислоти. Підходящі клітини-хазяї включають, не обмежуючись цим, клітини ссавців, бактеріальні клітини, дріжджові клітини, клітини комах, якщо назвати тільки деякі. 00186) Наступні приклади наведені для подальшого опису деяких з варіантів здійснення, розкритих тут. Приклади призначені для ілюстрації, а не для обмеження розкритих варіантів здійснення.
Приклади
Приклад 1: матеріали і методи
Мутагенез 01211 Мутації відтворювали з використанням набору бігаїадепе ОцікСпапде Хі. згідно із протоколом виробника. Наявність необхідних мутацій підтверджували секвенуванням ДНК.
Трансфекція і одержання стабільної клітинної лінії (0122) З розрахунку на кожний мілілітр клітин, що підлягають трансфекції з використанням реагенту Ехрібесіатіпе, 333,3 нг НС плазміди і 333,3 нг І С плазміди інкубували протягом 5-10 хв в 50 мкл середовища Орії-МЕМ (ТПептоРізпег). Аналогічно, 2,67 мкл реагенту Ехрігесіатіпе інкубували в 50 мкл середовища Орії-МЕМ. Розчин Ехрібесіатіпе додавали до суміші ДНК і інкубували протягом 20-30 хв при кімнатній температурі. Суміш ДНКЕ:Ехрігесіатіпе додавали до клітин при перемішуванні і інкубували при 37 "С, в атмосфері 895 СО», струшуючи зі швидкістю 125 об/хв. На наступну добу до суміші для трансфекції додавали 5 мкл енхансера 1 і 50 мкл енхансера 2 на мл клітин з наступною інкубацією протягом ще 7-10 діб.
І0123| Стабільні клітинні пули, експресуючі антитіло, відбирали додаванням 1 мл трансфектантів до 14 мл середовища ОМЕМ у колбі Т75 з 5 мг/мл бластицидину і 400 мкг/мл зеоцину (Іпмімодеп) через одну-три доби після трансфекції. Після того, як резистентні до препаратів клітини виросли до злиття, середовище заміняли середовищем для експресії
Егеебіуїе 293 на 24-48 год. Клітини фізично знімали, акуратним постукуванням по колбі (трипсинізація приводила до низької життєздатності, дані не показані) і потім висівали з розрахунку бх107 клітин/"мл в 30 мл середовища для експресії Ргеебіуіе 293 у колбі, що струшується, ємністю 125 мл. Культури інкубували при 37 "С, в атмосфері 895 СО» при струшуванні зі швидкістю 125 об/хв.
Продукція тАб
Зо
01241 Стабільно трансфіковані пули клітинних ліній висівали з розрахунку від 0,6 до 1х105 клітин/мл у середовищі для експресії Егеезіуе 293. Клітини інкубували при 37 "С, в атмосфері 895 СО», при струшуванні зі швидкістю 125 об/хв. Через 2 доби після того, як культура досягла густини 1х109 клітин/мл, культури підгодовували додаванням у кінцевих концентраціях 10 г/л зеїІесі 5Боуїюпе (ВО Віозсіеєпсе5), 5 мМ валеріанової кислоти (Зідта Аїагісп) ї 1:100 ліпідного концентрату СО (ТпептоРіхпег). Коли життєздатність клітин становила менше 5095 (7-10 діб), культури центрифугували протягом 1 год при 8000 об/хв у роторі ВесКітап ДІ Ав8.1000. Потім супернатант фільтрували через фільтр із поліефірсульфону (ПЕС) 0,2 мкМ і зберігали при 4 "С або -20 "С до очищення.
Очищення таб
І0125| тАр очищали, використовуючи один із двох методів. Для супернатантів з тАр об'ємом менше 10 мл проводили афінну хроматографію з використанням методу періодичного очищення зі смолою із протеїном А. Супернатанти з МАБ об'ємом, що перевищують 25 мл, очищали з використанням попередньо упакованих колонок із протеїном А.
Періодичне очищення
ІО126|Ї Смолу Ргозер-мА з високою ообмінною ємністю із протеїном А (МійПірогеє) урівноважували ОРВ5З і 100 мкл додавали до зразка об'ємом 3-6 мл. Після інкубації при 4 С протягом періоду від 1 год до ночі смолу тричі промивали 1 мл ОРВ5 і центрифугували при 18000х 9 протягом 30 с. Зразок елюювали зі смоли додаванням 400 мкл буфера на основі 0,1 М гліцину, рН 2,9 з наступним центрифугуванням при 18000х д протягом 30 с. Зразок нейтралізували 40 мкл 1 М Трис-буфера, рН 8,0. Буфер обмінювали, використовуючи 0,5 мл
Атісоп ОКга, фільтри з відсіканням ТОК (Мійїроге) концентруванням зразка приблизно до 100 мкл центрифугуванням при 18000х ду протягом 3-5 хв. Концентрований зразок розбавляли 400 мкл ОРВ5 з наступним центрифугуванням. У цілому процедуру повторювали чотири рази.
Очищення на колонці
І0127| Колонку із протеїном А (СЕ Неаййсаге) урівноважували 10 колонковими об'ємами (СМ) буфера на основі 20 мМ фосфату натрію, 10 мМ ЕДТА, рн 7,2. Потім наносили зразок з наступним вимиванням незв'язаного матеріалу 10 СМ буфера, що врівноважує. Зразок елюювали, використовуючи 5 СМ 0,1 М гліцину, рН 2,9. Фракції, що містять тАб, поєднували і
Зо діалізували в ОРВ5З з використанням діалізного апарата МУУСО 20К 5ііде-А-І угег (Тпептовіз5пег).
Синтез субстрату 2-СіиТп-СП1у (01281) 2-С1п-СіІуУ-ОН одержували від Васпет і 2-С1Іп-Сіу-САО-біотин одержували 7еадіга (фіг. 2).
І0129| Синтез 2-С1Іп-Сіу-пентафторфенілового ефіру (2-Сіп-СІу-РЕР) проводили згідно із протоколом, описаним Развіегпаск еї аї. (Рахіегпаск, 1997 15/д4), у модифікації (фіг. 3). 2-(Іп-Спу-
ОН (328,8 мг, 0,975 ммоль) і пентафторфенол (зідта, 183,3 мг, 0,996 ммоль) розчиняли в 10 мл
М,М'-диметилформаміду (ДМФА). Потім додавали ЕСАС-НСІ (Зідта, 201 мг, 1,04 ммоль) і реакційну суміш інкубували при кімнатній температурі в атмосфері азоту протягом 2 год. До реакційної суміші додавали 100 мл охолодженого діетилового ефіру і осаджували протягом ночі при -80 "С. Сирий продукт збирали центрифугуванням і перекристалізовували з 20 мл метанолу при 60 "б. Кінцевий продукт промивали охолодженим діетиловим ефіром і висушували в струмені М». Кінцевий вихід склав 219,04 мг (44,7905). Е5БІ-М5 (пряма інфузія в 5095 ацетонітрилі в 0,195 мурашиній кислоті) пт/2 504,0 (МАНІ, 8695), 526,0 (Ма-Маї, 10095), 542,0 (М'КІ, 22965). 2-СіІп-Сіу-пропілазид (2-С1п-С1у-Мз) 01301 2-С1п-СІу-РЕР (21,24 мг, 4,22х105 моль) і азидопропіламін (СіїскК Спетіса! Тооів, 42,2 мкл вихідного розчину 0,91 М у ДМФА, 3,84х107 моль) розчиняли в кінцевому об'ємі 0,42 мл
ДМФА. Реакційну суміш перемішували в атмосфері азоту протягом ночі при кімнатній температурі. Продукт очищали за допомогою ВЕРХ із використанням 0,195 мурашиної кислоти в суміші НгО/0,195 мурашиної кислоти в рухомій фазі на основі ацетонітрилу. Продукт висушили у вакуумі. Кінцевий вихід склав 10,7 мг (60,4965). Е5БІ-М5 (градієнтне очищення) Ііп/2 420,2 (МАНІ, 10096), 442,1 (М--Маї, З29). 2-СіІп-Сіу-ПЕГз-ендо-біциклононін (2-С1п-С1у-ПЕГз-ВСМ) 013911 2-С1п-С1у-РЕР (18,4 мг, 3,66х105 моль) і ендо-біцикло!/б,1,0| нон-4-ін-9-іл-ПЕГз-амін (Сопіш-Ргобре, 175 мкл 0,27 М вихідного розчину в ДМФА, 4,75х105 моль) розчиняли в кінцевому об'ємі 0,37 мл ДМФА. Реакційну суміш перемішували в атмосфері азоту протягом ночі при кімнатній температурі. Продукт очищали за допомогою ВЕРХ із використанням 0,195 мурашиної кислоти в суміші НгО/0,195 мурашиної кислоти в рухомій фазі на основі ацетонітрилу. Продукт висушували у вакуумі. Кінцевий вихід склав 0,6 мг (295). Е5БІ-М5 (градієнтне очищення) т/7 (510) 688,2 (М--НІ, 10095), 710,2 ((М--Ма)|, 6995).
2-СіІп-Сіу-ПЕГ»-ауристатин Е (2-Сип-С1у-ПЕГ»-А!шЕ) (01321 2-С1п-СІуУ-РЕР (22,2 мг, 4,537х105 моль) розчиняли в 0,85 мл ДМФА і додавали 1,2- етилендіамін (2,3х109 л, 3,5х107 моль) і перемішували. Реакційну суміш перемішували в атмосфері азоту протягом ночі при кімнатній температурі. Продукт очищали за допомогою
ВЕРХ із використанням 0,195 мурашиної кислоти в суміші Н2гО/0,196 мурашиної кислоти в рухомій фазі на основі ацетонітрилу. Продукт висушували у вакуумі. Кінцевий вихід 2-(31п-С1у-
МН» становив 3,8 мг (2395). Е5БІ-М5 (градієнтне очищення) ітп/72 380,1 (МАНІ, 10095).. 2-(сІп-Спу-
МН» (3,8 мг, 1,01х105 моль) і МНЗ-ПЕГ»-АнєчЕ (10,3 мг, 1,03х105 моль) розчиняли в 0,2 мл ДМФА.
Додавали триетиламін (14 мкл, їх107 моль) і реакційну суміш інкубували в атмосфері азоту протягом ночі при кімнатній температурі. Половину реакційної суміші очищали за допомогою
ВЕРХ із використанням 0,195 мурашиної кислоти в суміші НгО/0,195 мурашиній кислоті в рухомій фазі на основі ацетонітрилу. Продукт висушували у вакуумі. Кінцевий вихід СВ2-(3Іп-С1уУ-ПЕГ»-
АцЕ становив 3,8 мг (6095). ЕБІ-М5 (градієнтне очищення) т/72 634,0 (Мне, 10095), 645,1 (М--Мац|, 4595). 1267,0 (МАНІ, 16965).
Реакція з мікробною трансглутаміназою
ІО133| тАБ у концентраціях від 100 мкг/мл до 2,5 мг/мл інкубували з 785 мкМ 2-С1п-С1у- біотину (7едіга), 2-СІп-С1у-Мз, 2-С1Ши-С:0!уУ-ВСМ або 2-С1Ій-Сіу-ПЕГ»-АцЕ з 1 мкг/мл мікробної трансглутамінази (7едіга) в ОРВ5 протягом щонайменше 16 год при 37 70.
Аналіз кон'югації тАб ультраефективною рідинною хроматографією (ШРІ СУУЕ5І-М5
І0134| Очищені антитіла розбавляли до 1 мг/мл в ОРВ5 (якщо концентрація була нижче 1,0 мг/мл, то зразки залишали у вихідній концентрації). Реакційні суміші, що містять диметилсульфоксид (ДМСО), знесолювали, використовуючи спін-колонку для знесолення 7ебва.
Потім тАбр деглікозилювали з використанням пептид-М- глікозидази Е (РМСавзе РЕ) (МЕВ) або розщеплювали на Рар'- і Ес-фрагменти за допомогою Ідез (Рготеда). Для деглікозилювання до тАр (50 або 100 мкл) додавали буфер 7 (5 або 10 мкл) і пептид-М-глікозидазу Е (РМСаве Р) (1 або 2 мкл). Реакційну суміш інкубували в мікрохвильовому реакторі Оізсомег (СЕМ) протягом 2 циклів: 1) потужність мікрохвиль 10 Вт, 37 "С, 10 хв, і потім витримували протягом 3-5 хв; 2) потужність мікрохвиль 2 Вт, 37 "С, 10 хв. Частина деглікозильованого зразка відновлювали додаванням дитіотреїтолу (ОТТ) до кінцевої концентрації 20 мМ із наступною інкубацією при
Зо 60 "С протягом З хв. Для одержання фрагментів Раб" і Ес-фрагментів 50Од/мкл Ідез додавали до 0,5 мг/мл тАб і інкубували при 37 "С протягом 0,5-1 год. Зразки після обробки Ідеб5 не відновлювали, за винятком антитіла 01-С, яке відновлювали, як описано вище. 0135) Потім зразки аналізували з використанням мас-спектрометра М/РІ С Уасег Асдийу і О-
Тої Ргетіег. Зразки (по 0,5-2 мкг кожний) наносили на мікроколонку для знесолення Маз5Ргер при 65 "С, елюювали з колонки зі зрівноважуванням протягом 5 хв 95906 рухомою фазою А, градієнтом протягом 10 хв (5-9095 В) і повторним зрівноважуванням протягом 10 хв 9595 рухомою фазою А зі швидкість 0,05 мл/хв. Мобільна фаза А представляла 0,195 мурашиної кислоти у воді. Мобільна фаза В представляла 0,195 мурашиної кислоти в ацетонітрилі. Мас- спектрометр О-Тої працював у режимі позитивних іонів, М-режимі з детектуванням у діапазоні 500-4000 т/7. Параметри джерела були наступними: напруга на капілярі 2,25 кВ (інтактне антитіло) і -2,50 кВ (відновлене антитіло); напруга пробовідбірного конуса 65,0 В (інтактне антитіло) або 50,0 В (відновлене антитіло); температура джерела, 100 С; температура десольватації 250 "С; газовий потік десольватації 550 л/год. Розгорнення піка білка проводили з використанням функції Маз5і упх МахЕПпі 1.
Зворотно-фазова рідинна хроматографія (РХ)-МС
ІО136) Антитіло 01-Ї (1 мг/мл) інкубували протягом ночі з 50-кратним молярним надлишком 2-Сіп-Сіу-ПЕГ»-АшЕ у присутності 1 Од/мл ферменту ТСазе при 37 "б. тАбБ розщеплювали з утворенням ЕРар'- і Ес-фрагментів за допомогою Ідез і відновлювали за допомогою ОТТ, як описано вище. Зразок аналізували з використанням ВЕРХ Умаїег5 АйШапсе з детекторами 500 і
РОА. Зразок (0,5-2 мкг) наносили на колонку Ргоїеотіх КР-1000 (4,6х50 мМ, 5Зерах) при 65 70.
Розділення ІС, Ео- ії Ба-фрагментів проводили зі зрівноважуванням протягом 1,5 хв 7590 рухомою фазою А (0,195 ТФК у воді) і градієнтом протягом 13,5 (25-6595 рухомої фази В (0,190
ТФК в ацетонітрилі)) зі швидкістю потоку 1 мл/хв.
І0137| Мас-спектрометр БОЮ працював у режимі позитивних іонів, М-режимі з детектуванням у діапазоні 200-2000 т/2. Параметри джерела були наступними: напруга на капілярі 3,00 кВ; напруга пробовідбірного конуса 40 "С; температура джерела 120 "С; температура десольватації 250 "С; газовий потік десольватації, 800 л/год. Час сканування 1 сек. Розгорнення піка білка проводили з використанням функції Маб5і упх МахЕпі 1. РОСА детектора при довжині хвилі 280 нм. бо Приклад 2: аналіз гідрофільних лізинів в |до антитілах
ІО138) Кристалічні структури Ідс1-каппа Раб (антитіло 01, 4ЕЗЕ), Ідс-лямбда Раб (4НКО) і
Ід61 Ес (16С1) досліджували на потенційні ацил-акцепторні сайти. Оскільки мікробна трансглутаміназа має тенденцію віддавати перевагу субстрату гідрофільних глутамінів і лізинів усередині петель (Зроїаоге, 2012 17/44), то гідрофільні лізини виділяли з використанням різсомегу Бішадіо м4.5 з радіусом зонда 1,4 А (фіг. 4). В антитілі 01 МН є 7 гідрофільних лізинів з
З, що перебувають у петлях. Оскільки кількість лізинів може різнитися між тАб за рахунок використання різних родин варіабельних ділянок і в результаті соматичної гіпермутації, то аналіз гідрофільних лізинів в МН-ділянці п'яти інших антитіл також аналізували на основі аналогічних положень залишків у структурі 4ЕЗЕ. Ці МН- ділянки потенційно містять 1-5 гідрофільних лізинів з 1 або 2, що знаходять у петлі. В антитілі 01 Мк присутні 6 гідрофільних лізинів і 4 перебувають у петлях. Ділянки МК із чотирьох інших антитіл потенційно містять 3-5 гідрофільних лізинів з 2 у петлі. В антитілі 05 перебуває лямбда-ланцюг і в гідрофільні лізини визначали з використанням кристалічної структури 4НКО на основі подібності послідовностей легкого ланцюга. В антитілі 05 потенційно є 2 гідрофільних лізинів в домені МА, усього з 1 у петлі.
ІЇО139| Константні домени СНі і каппа, Бс і лямбда аналізували з використанням кристалічних структур 4ЕЗЕ, 1ЕС1 і 4НКО відповідно. Константні домени ДО1 мають 23 гідрофільних лізини в 13 петлях. Константна ділянка каппа має 8 лізинів, з 5 у петлі. Константна ділянка лямбда має 6 гідрофільних лізини з половиною в петлях. У цілому, аналізовані антитіла мають у діапазоні від 42 до 50 гідрофільних лізинів у петлях тАбБ.
ЇО140| Для визначення того, чи може мікробна трансглутаміназа каталізувати трансамідування нативного залишку лізину в ІдсС-антитілі, антитіла інкубували з 50-кратним молярним надлишком 2-С1п-Сіу-САЮО-біотину і 1 мкг/мл мікробної трансглутамінази при 37 70 протягом ночі. Зразки розщеплювали за допомогою Ідез і відновлювали за допомогою ОТ, і маси С, Ба- ії Ро-фрагментів аналізували з використанням мас-спектрометрії. Зразки не зазнали деглікозилювання і для кожного Ес спостерігали два масові піки, що відповідають глікоформам СОЕ (11445 Так) і С1Е (41608 Так). Антитіло 04 також містить сайт М-зв'язаного глікозилювання в МН, і спостерігали два види гліканів, 32Е5 і 52Е52. Усі зразки не мали С- кінцевого лізину (128 Да), про що свідчить різниця від -130 до -132 Да між спостережуваною і
Зо теоретичною масою для Ес. Хоча, у різних антитілах є 42-50 потенційних ацил-акцепторних лізинів, ні НС, ні Ї С не були модифіковані ацил-донорним субстратом (фіг. 6, таблиця 1).
Таблиця 1
Аналіз ЕБІ-МС антитіл, інкубованих з ацил-донором і мікробною трансглутаміназою 27да-САО-біотин: 4631 Да нн с ПО хх ПООНЯ ПОЛО о ЗПО оче | ува масі він | хувана | ляти |вмаві Мене | план (вана Ге мнасю вана жувана вана жувана вана жувана
Антитіло 25328 | СОЕ 25198 -130
Антитіло 25388 |) СОЕ 25258 -130
Антитіло 25328 | СОЕ 25198 -130
Антитіло 27566 27564 |с2Е5 -2 25296 |СОЕ 25166 | -130 гв53и | 53 27857 | 27855 |СоЕБО 25459 25327
Антитіло 25328 | СОЕ 25198 -130
Антитіло 25328 | СОЕ 25198 -130
Таблиця 1: маси І С, Га і Ес визначали Е5І-М5, як наведено на фіг. 6. Теоретичну масу кожного фрагмента визначали амінокислотною послідовністю, що віднімається зі спостережуваної маси, з визначенням зміни маси (Амаси). Амаси -128 Да має місце за рахунок розщеплення І уз447. Ес глікозилюється одним або двома олігосахаридами, СОЕ або
СТЕ. (0141) Також аналізували два отримані позитивні контролі, що включають пептид із двома відомими сайтами ацил-акцептора лізину (СО5ТКНКІРОС5; (ТаКагама, 2004 23/а), генетично злиті з С-кінцем антитіла 01 НС або С (НОС-КТад або ІС-КТад відповідно). тАб КтТад інкубували з 2-С1Іп-Сіу-САО-біотином і мікробною трансглутаміназою. Зразки деглікозилювали пептид-М-глікозидазою Е (РМсСаве Е) і відновлювали за допомогою ОТТ. Маси важкого і легкого ланцюгів аналізували мас-спектрометрією. МАБ І С-КТад модифікували до двох молекул 72-С1п- сСпіу-САО-біотину, що погоджується з модифікацією двох лізинів в КТад (фіг. 7, таблиця 2).
Таблиця 2
Трансамідування С-кінцевого К-Тад 2-Сіп-Сіу-САО-біотин: 4631 Да
Спостере- . Чо
Антитіло 01 23216 23216 0 (0) 0,0 до
НОо-КТаа 23216 23216 (0) (0) 0,0 до
І С-КТад 24323 24953 630 1,00 19,0 96 24323 25584 1261 2,00 81,0 95 жувана кон'югованого
Антитіло 01 48937 48810 -127 (0) 0,0 до
НОо-КТаа 50044 50671 627 0,99 18,7 95 50044 51306 1262 2,00 42,6 95 50044 51938 1894 3,00 38,6 96
І С-КТазд 48809 48811 2 (9) 0,0 до (0142) Маси НС і С визначали Е5І-М5, як наведено на фіг. 7. Теоретична маса кожного фрагмента визначалася амінокислотною послідовністю, що віднімається зі спостережуваної маси, з визначенням зміни маси (ДАмаси). Дмаси -128 Да обумовлена розщепленням І Ууз447, і маса 1631 Да вказує на додавання одного 72-(3Іп-Сіу-САЮ-біотину. Кількість молекул 2-С1п-С1у-
САЮО-біотину, кон'югованих з НС або ІС, визначали розподілом зміни маси на масу 2-С1п-С1у-
САО-біотину. Відсоток кон'югації визначали розподілом інтенсивності сигналу піка однієї НС або
С на суму інтенсивностей усіх піків НС або І С у зразку. (0143) Додавання КтТад до НС несподівано призводило до додавання в НС не тільки двох, а трьох молекул 2-С1Іп-Сіу-САЮ-біотину. Оскільки є тільки два лізини в КТад, то лізин в тАб є третім ацил-акцепторним сайтом. З урахуванням близькості до КТад, найбільш імовірним акцепторним сайтом тАбБ був І уз447 важкого ланцюга.
Приклад 3: подовження на одну амінокислоту є достатнім для трансамідування ГГ уз447 0144 їуз447 зазвичай розщеплюється за участю карбоксипептидази В під час рекомбінантної експресії ЇЧЦ у клітинах НЕК293 і СНО /Наїтіх, 1990 7/а; Нагті5, 1995 б/а; ріск, 2008 3/4). Однак додавання КТад до С-кінця НС блокує видалення Іуз447, тим самим дозволяючи мікробній трансглутаміназі використовувати І ух447 як ацил-акцепторний сайт. Для визначення того, чи може мікробна трансглутаміназа використовувати І уз447 як ацил-акцептор без КТад, розщеплення І узх447 блокували додаванням одного або двох лейцинів на С-кінці антитіла 01 (антитіло 01-НО-Ї. або антитіло 01-НО-І І. відповідно). Очищені тАб інкубували з 2-
СіІп-Спіу-САО-біотином і мікробною трансглутаміназою, і аналізували масу деглікозильованою
НС. Дійсно, додавання одного або двох лейцинів зберігало І уз447 і НС модифікували одним ацил-донорним субстратом, що погоджується із трансамідуванням ГІ уз447 (фіг. 8, таблиця 3).
Таблиця З
Трансамідування антитіла 01 з С-кінцевим лейцином 2-Сій-Сіу-САО-біотин: 4631 Да . Чо 00000000 |фоонмнець |Розрахована Олостережювана| маси | оодваного
Антитіло 01 -.ЗРОК 48937 48803 -134 0,0 до
Антитіло 01-НО-Ї -..ЗРОК-Ї 49050 49674 624 100,0 95
Антитіло 01-НСО-ІЦ /..ЗРОК- 49164 49788 624 100,0 95
Зо ІО145| Маси НС ії С визначали Е5БІ-М5. Процентне кон'югування 2-С1п-Сіу-САЮО-біотину (Дмаси-631 Да) з тАБ визначали, як показано в таблиці 2.
І0146| С-кінцевий лейцин додавали до двох інших тАбБ. тАбр дикого типу і мутантні інкубували з мікробною трансглутаміназою і 2-С1й-Сіу-САЮО-біотином протягом ночі при 37 70.
Ес-фрагмент кожного зразка аналізували за допомогою мас-спектрометрії, як описано вище. Як і у випадку з антитілом 01, додавання С-кінцевого лейцину призводило до трансамідування мутанта, але не тАБ дикого типу (таблиця 4).
Таблиця 4
Трансамідування моноклональних антитіл з С-кінцевим лейцином . . Чо 0000 фооннець | Глюан Розраюованарпостережувана Амаси | ом юованого,
Антитіло 10 -..ЗРОК 25346 1445 25218 -128 0,0 до 25509 1608 25379 -130
Антитіло 11 | ...5РОК-|. 25441 1445 26071 630 100,0 96 25604 1608 26233 629
Антитіло 12 -..ЗРОК 25491 1608 25360 -131 0,0 до 25653 1770 25523 -130
Антитіло 13 | ...БРОК-Ї. 25441 1445 26071 630 100,0 96 25604 1608 26232 628 тА інкубували з 2-(3Іп-Сіу-САО-біотином і мікробною трансглутаміназою при 37 "С протягом ночі з наступним розщеплення Іде5 з одержанням фрагментів Раб і Ес. Маси отриманих після обробки Ідез Ес-фрагментів аналізували Е5І-М5, як наведено на фіг. 6, і процентну кон'югацію з 2-С1п-сіу-САО-біотином (Амаси-631 Да) визначали, як показано в таблиці 2.
ІО147| Для визначення того, чи можуть інші амінокислоти блокувати розщеплення І уз447 і наскільки вони забезпечують потрібне середовище для мікробної трансглутамінази для модифікації І уз447, інші амінокислоти додавали у вигляді подовження одним залишком на С- кінець. Зразки аналізували на модифікацію мікробною трансглутаміназою з використанням 2-
Сіп-Сіу-САО-біотину. Масу Ес-фрагмента аналізували мас-спектрометрією, як описано вище.
Не дивно, що додатковий С-кінцевий лізин або аргінін не захищав І уз447 від розщеплення, оскільки вони є субстратами для карбоксипептидази В (таблиця 5). З інших амінокислот тільки
С-кінцевий пролін і кислі залишки не забезпечували 100 95 кон'югування із субстратом. На додаток до середнього зрушення 1628 Да, пов'язаному з кон'югацією з 2-С1п-С1у-САО-біотином (1631 Да), також спостерігалося зрушення маси 1400 Да. Імовірно, це пов'язане з невеликим відсотком 2-С1п-Сіу-САБ у результаті синтезу 2-Сіп-Сіу-САЮ-біотину або деградації останнього.
Таблиця 5
Вплив С-кінцевих амінокислот на трансамідування ГГ уз447 кон'юговано ..зЗРОоК со 25328 25197 -131 55,1 95 0,0 до
СТЕ 25491 25360 -131 44,9 96 ..зЗРОК-а со 25385 26013 628 31,4 96 100,0 96 сог 25385 25785 400 20,2 чо
СТЕ 25548 26175 627 26,9 96
СТЕ 25548 25954 406 21,6 96 -..ЗРОК-А со 25399 26027 628 44,3 о 100,0 96 сог 25399 25800 401 15,2 96
СТЕ 25562 26189 627 42,5 чо -.ЗРОК-У со 25427 26055 628 Абе до 100,0 96 со 25427 25827 400 15,6 96
СТЕ 25590 26217 627 38,2 96 -.-ЗРОК-Ї. СсоОЕ 25441 26069 628 64,1 95 100,0 96
Таблиця 5
Вплив С-кінцевих амінокислот на трансамідування ГГ уз447 кон'юговано со 25441 25841 400 10,6 96
СТЕ 25604 26231 627 25,3 Чо ...-ЗРОК-Ї со 25441 26069 628 Аб,А до 100,0 96 со 25441 25841 400 15,4 96
СТЕ 25604 26232 628 38,1 96 ...ЗРОК-М со 25459 26087 628 44,3 о 100,0 96 сог 25459 25858 399 13,9 96
СТЕ 25622 26249 627 А1,8 96 -..ЗРОК-Р со 25425 25422 -3 36,7 чо 37,2 Чо сте 25588 25584 -4 26,1 96 сог 25425 26053 628 20,1 96 сте 25588 26216 628 17,0 96 -..ЗРОК-Е со 25475 26103 628 АВ оо 100,0 96 со 25475 25875 400 15,5 96 сте 25638 26265 627 36,4 о ...ЗРОК-У со 25491 26120 629 50,3 95 100,0 96 сог 25491 25892 401 14,5 965
СТЕ 25654 26281 627 35,1 96 -..ЗРОК-М со 25514 26142 628 49,4 до 100,0 96 сог 25514 25915 401 11,5 95
СТЕ 25677 26304 627 39,2 чо ..зЗРОК-5 со 25415 26044 629 47,6 о 100,0 96 сог 25415 25815 400 14,2 96
СТЕ 25578 26205 627 38,2 96 -..ЗРОК-Т со 25423 26057 628 А7 А чо 100,0 96 со 25429 25829 400 12,8 96
СТЕ 25592 26219 627 39,8 96 ..зЗРОК-С со 25431 25431 (0) 8,4 до 91,6 95 сог 25431 26062 631 75,1 95
СТЕ 25594 26224 630 16,5 96 ...ЗРОК-М со 25442 26070 628 А1,2 до 100,0 96 со 25442 25842 400 16,6 96 сте 25605 26232 627 42,2 90 ..зЗРОК-О сог 25456 26084 628 56,3 95 100,0 96 сог 25456 25856 400 8,7 до
СТЕ 25619 26246 627 35,0 96 ...ЗРОК-О со 25443 25441 -2 42,3 Чо 24,0 до сте 25606 25603 -3 33,7 Чо сог 25443 26072 629 12,1 95 сте 25606 26233 627 11,9 96 -.ЗРОК-Е со 25457 25455 -2 28,0 96 34,7 Чо
СТЕ 25620 25617 -3 37,3 Чо сог 25457 26085 628 20,3 У
СТЕ 25620 26248 628 14,4 95 ...ЗРОК-Н со 25465 26094 629 49,2 чо 100,0 96 сог 25465 25865 400 11,6 95
СТЕ 25628 26256 628 39,1 96 ...ЗРОК-К со 25456 25197 -259 50,6 95 0,0 до
СТЕ 25619 25359 -260 49,4 до ...ЗРОК-Н со 25465 25197 -268 53,6 95 0,0 до
СТЕ 25628 25359 -269 46,4 до тА інкубували з 2-(3Іп-Сіу-САО-біотином і мікробною трансглутаміназою при 37 "С протягом ночі з наступним розщепленням Ідез з одержанням Рар- і Ес-фрагментів. Маси отриманих після обробки Іде5 Ес-фрагментів аналізували Е5І-М5, як наведено на фіг. 6, і процентну кон'югацію з 2-С1п-СПу-біотином і 2-С1Іп-Сіу-САО (Амаси-631 Да і 404 Да відповідно) визначали, як показано в таблиці 2. 0148) За рахунок розщеплення доданої С-кінцевої амінокислоти одного лізину або аргініну ефект будь-якої амінокислоти на трансамідування на ГГ уз447 оцінити було неможливим. Отже, лейцин додавали до С-кінця варіантів з лізином і аргініном. Крім того, ефект додаткового С- кінцевого лейцину також досліджували з варіантами проліну, аспартату і глутамату. Додатковий лейцин позитивно впливав на трансамідування всіх тестованих С-кінцевих варіантів (таблиця 6). Блокуючи розщеплення лізину або аргініну, І уб447 зазнав 100 95 переамідування. Крім того, додатковий лізин у варіанті КІ також трансамідували з одержанням антитіла з 4 сайтами трансамідування. С-кінцевий лейцин також підвищував трансамідування варіанта проліну до 61,3 95 і варіанти кислотного залишку помірно трансамідувалися (таблиця 6).
Таблиця 6
Вплив двох С-кінцевих амінокислот на трансамідування ГГ уз447 ана кон'юговано -..ЗРОК-Ї. сог 25441 26072 631 77,3 9 100,0 95 атЕ 25604 26235 631 22,7 90 -..ЗРОК-КІ. сог 25569 26831 1262 62,0 95 100,0 95 сог 25732 26993 1261 38,0 96 -..ЗРОК-ВІ. атЕ 25597 26229 632 57,5 95 100,0 95 атЕ 25760 26391 631 42,5 чо -..ЗРОК-РІ. сог 25538 25538 (0) 25,0 до 61,3 95 сог 25701 25701 (0) 13,8 96 сте 25538 26169 631 29,1 96 атЕ 25701 26332 631 32,2 чо -..ЗРОК-ОІ. сог 25556 25556 (0) А7,8 о 24,0 до сог 25719 25719 (0) 28,2 96 атЕ 25556 26187 631 11,5 95 атЕ 25719 26349 630 12,5 96 -..ЗРОК-ЕЇ. сог 25570 25570 (0) АО,6б до 28,6 96
Со 25733 25733 (0) 30,7 Чо сет1Е 25570 26203 633 14,0 96
Таблиця 6: тАб інкубували з 2-С1Іп-Сіу-САЮ-биотином і мікробною трансглутаміназою при 37 "С протягом ночі з наступним розщепленням Ідез з одержанням Раб- і Ес-фрагментів.
Маси фрагментів Ес, отриманих Ідев5, аналізували за допомогою Е5БІ-М5, як наведено на фіг. 6 (дані не показані), і процентне кон'югування з 2-С1п-Сіу-САЮО-біотином і 2-С1п-Сіу-САО (АДмаси-631 Да і 404 Да відповідно) визначали, як показано в таблиці 2.
Приклад 4: трансамідування С-кінцевого лізину антитіл різних ізотипів 0149 С-кінцевий залишок СНЗ (або СНА у випадках ІЗЕ і І9М) є лізином для всіх ізотипів людини (таблиця 7). Отже, можливо, що цей лізин може використовуватися як сайт кон'югації на інших ізотипах. Одержували варіанти Ідс2, доз і Ідс4 антитіла 01 з додатковим С-кінцевим лейцином або аспартатом, або без них. тА інкубували з мікробною трансглутаміназою і 2-С1Іп- суіу-САО-біотином протягом ночі при 37"0б, і маси фрагментів Ес аналізували мас- спектрометрією, як описано вище. Як і у випадку Ідс1, С-кінцеві лізини піддалися б видаленню під час експресії в клітинах НЕК293, якщо не було додаткового С-кінцевого залишку (таблиця 8).
Ніякого трансамідування не спостерігали з Ідс2, ІдеЗ або Ідс4 дикого типу або з С-кінцевим аспартатом, але С-кінцевий лейцин полегшував трансамідування тАб.
Таблиця 7
Вирівнювання С-кінцевих кодонів СНЗ або
СНаА різних ізотипів людини пог 0 1.М8УММРОЮЄ
С-кінцеві кодони СНЗ (СНА для Іде і І9М) були вирівняні. Три М- кінцевих кодони хвостової ділянки ІдДА і (ДМ включені.
Таблиця 8
Трансамідування Іде, ІщдазЗ і Ї(Да4 з С-кінцевим лейцином 111111 | Сжінець | Глікан Розрахована |Спостережувана| маси |95 кон'югованого
ІС» -..ЗРОК со 25362 25232 -130 0,0 до
СТЕ 25525 25394 -131
ІдСе-ї. -..ЗРОК-Ї. со 25475 26104 629 100,0 96 сте 25638 26266 628
ІдДс2-0 -..ЗРОК-О со 25477 25475 -2 23,2 90
СТЕ 25640 25637 -3 со 25477 26106 629
СТЕ 25640 26268 628
ІЧСз -..ЗРОК сог 25396 25266 -130 0,0 до сте 25559 25428 -131
Ідаз-Ї. -..ЗРОК-Ї. сог 25509 26138 629 100,0 96
СТЕ 25672 26300 628
ІдСіз-О -..ЗРОК-О со 25511 25509 -2 24,7 Чо
СТЕ 25674 25671 -3 со 25511 26140 629
СТЕ 25674 26302 628
ІДС -..ЗРОК со 25344 25214 -130 0,0 до
СТЕ 25507 25376 -131
Ідаа-ї. -..5І ОКА. со 25457 25455 -2 81,9 95
СТЕ 25620 25616 -4 сог 25457 26086 629
СТЕ 25620 26248 628
ІдДаа-О0 -..ЗРОК-О со 25459 25457 -2 16,8 96
СТЕ 25622 25619 -3 сог 25459 26087 628
СТЕ 25622 26250 628 тА інкубували з 2-(3Іп-Сіу-САО-біотином і мікробною трансглутаміназою при 37 "С протягом ночі з наступним розщепленням Ідез з одержанням Рар- і Ес-фрагментів. Маси отриманих після обробки Іде5 Ес-фрагментів аналізували Е5І-М5, як наведено на фіг. 6 (дані не показані), і процентну кон'югацію з 2-С1п-СІу-біотином (Амаси-631 Да)визначали, як показано в таблиці 2.
Приклад 5: ацил-донорні субстрати
ІО150| Одна застосовність кон'югацій із С-кінцевим лізином полягає в одержанні сайт- специфічних АОС. Кон'югування функціональних агентів із С-кінцевим лізином може бути досягнуто одним із двох способів. По-перше, для двостадійного способу потрібна кон'югація з мікробною трансглутаміназою С-кінцевого лізину з ацил-донором, синтезованим з реакційноздатною групою, такою як ВСМ, ОВСО, ТСО, азидо (М3), алкін, тетразин або малеїмід.
Друга стадія включає кон'югацію функціонального агента з реакційноздатною групою з використанням, наприклад, безмідної клік-реакції або тіол-реактивної хімії. Таким чином, аміно-
ПЕГз--ВСМ або амінопропіл-Мз додавали до гідроксильної групи 2-(3Іп-СІу, як докладно описано в розділі "Методи". Антитіло 01-НО-Ї. інкубували з 2-(3Іп-Спу, 2-С1и-Сіу-САО-біотином, 2-(Іп-С1у-
Мз або 2-Сутіп-сСіу-ПЕГЗ-ВСМ і мікробною трансглутаміназою, як описано вище. Зразки знесолювали, деглікозилювали, відновлювали і аналізували за допомогою Е5І-М5 для визначення додавання субстрату до тАбБ. Усі чотири субстрати ефективно кон'югувались із антитілом 01-НО-Ї. (таблиця 9).
Таблиця 9
Кон'югація різних функціональних груп на І уз447 11111111 | Да |Розрахована ІСпостережуванаї Амаси | Процент 2-Сп-СпПу-Мз -402 49050 49048 -2 9,2 о 49050 49447 397 90,8 95 2-Сіп-Сіу-РЕСз-ВСМ -670 49050 49717 667 100,0 95 2-Сіп-СІу -2го0 49050 49047 -3 1,9 9о 49050 49367 317 98,1 95 2-Сіп-Сіу-САО-біотин -631 49050 49047 -3 22,8 95 49050 49677 627 77,2 У тА інкубували з 2-(3Іп-Сіу-САО-біотином і мікробною трансглутаміназою при 37 "С протягом ночі з наступним розщепленням Ідез з одержанням Рар- і Ес- фрагментів. Маси Ес- фрагментів, отриманих після обробки Ідеб5, аналізували за допомогою Е5І-М5, як наведено на фіг. 6 (дані не показані), і процентне кон'югування з різними субстратами визначали, як показано в таблиці 2.
ІО151| Другий спосіб включає одностадійну кон'югацію, за допомогою якої синтезується функціональний агент із донором ацильних груп. Даний спосіб був тестований синтезом групи 2-Сбіп-СуУ на ПЕГ2-ауристатині ЕЕ (2-Сс1Іп-СІуУ-ПЕГ2-АцЕ). 2-С1Іп-СІ1уУ-РЕС2-АиЕ інкубували з антитілом 01-Ї. і мікробною трансглутаміназою протягом ночі при 37 "С. Після розщеплення за допомогою Ідез і відновлення ОТТ вимірювали поглинання при 280 нм за допомогою зворотно- фазової РХ-МС. Для антитіла 01-І| спостерігали три піки (фіг. 9). Масу кожного піка аналізували за допомогою ЕЗІ-М5 і перший пік був визначений як ІС, другий пік - Ес і третій пік - Ед.
Четвертий пік спостерігали для антитіла 01-І, інкубованого з 2-С1п-СІуУ-ПЕГ2-АцЧЕ ї мікробною трансглутаміназою. Хоча, даний пік неможливо було повністю відокремити від піка Га, площа більшості піків (фіг. 9В, вставка) була визначена на рівні 75,4 95 від загальної площі піків Ес і Ес- 2-Сіп-Сіу-ПЕГ2-АшШЕ (таблиця 10). Таким чином, був досягнутий САКЕ вище 1,58.
Таблиця 10
Одностадійне кон'югування ауристатину Е на Гуз447 тА інкубували з ацил-донорними субстратами і мікробною трансглутаміназою при 37 "С протягом ночі, після чого проводили розщеплення за допомогою Ідез і відновлення за допомогою ОТТ з одержанням фрагментів І С, Ес і Га. Відсоткове кон'югування розраховували діленням площі піка УФ 280 Есвсполука на загальну площу піків Ес і
Ес--сполука на фіг. 9.
Приклад 6: Одержання димерних молекул антитіл
І0152| Іншою застосовністю додавання функціональних груп на С-кінцевому лиізині імуноглобуліну є одержання димерних молекул тАбБ-тАбБ. Наприклад, ВСМ-кон'юговане тА може бути кон'югованим з Мз-кон'югованих тАб з використанням безмідної реакції. Отже, рівні об'єми реакційних сумішей 2-С1п-С1у-МЗ3 або 2-С1Іп-Ссіу-РЕСЗ-ВСМ-антитіла 01-НО-Ї. змішували і залишали для інкубації протягом ночі при 22 "б. Відновлену реакційну суміш аналізували на димеризовану НС («110 кДа) за допомогою електрофорезу 5О5-РАСЕ з використанням 4-12 95 поліакриламідного гелю Вів-Тгіз (фіг. 10). Дійсно, важкі ланцюги, модифіковані ВСМ і М, утворювали димерні молекули важкого ланцюга.
ІО153) Фахівцям у даній галузі техніки буде зрозуміло, що в переважні варіанти здійснення винаходу можуть бути внесені численні зміни і модифікації і що такі зміни і модифікації можуть бути зроблені без відхилення від суті винаходу. Отже, вважається, що прикладена формула винаходу охоплює всі такі еквівалентні варіанти, які відповідають даній суті і об'єму винаходу.
Я м список ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1103 МОКРНОТЕК, ІМС. «1205 Кон'юговаві імуноглобуліни з С-кінцевим лізином «1305 118557-03820 «14025 рРОСТ/О52016/067165. «і14аїв» 2018-19-15 «150» 62/2655,135 «1515 2013-12-18 «151» 45 кі70» Расекїїп тегвіоп 3.5 «210» 1 «її» 9 2159» Бідок «13» Штучна послідовність «До кі» джерено «2235 /примітка « «Одис штучної послідовності: Синтетичний пептид» «3005 1 бі Твк Тух РБе біп Аа Тук бБіу ТЕ 1 5 «-210» 2 к21ї» 15 «12» Білок «2135 пПркучнва посплідоввість «ве» к2т71» джерело «тез» /пВримітка з «Опис втучної послідовності: синтетичний пептид» «4005 2 сіу бів Сув Таж Тук Ра біп діа Тухк бі був ТНх біц 1 2 10 «210х З «211» 13 «212» Білок «2155 Штучна посльловність «ВИХ «ивіЗ джерело «232» /примітка зх «Опис штучвої послідовності: синтетичний пептид» «4905 З 5іу Бій дяй Тпих Тук Рье біп Аїіа Тук біу Аза тах бі 1 5 16 квій» 4
«211» 18 «212» Білок «213» Пото варіепв «4005 4
Рго Тих о Нів Маії Азп о Уа1 Бех Уаї Уа1 Меє Аїа бід Уаї Авзр біу Тк 1 5 10 15 сСуз Тує «2102 5 «2115 18 «25122 Білок «213» Ното зарієпз «4005 5
Рго ТЕ Ге Туг АзпоМаії бек Ппейп Уаії Меї 5екг Авр ТЕ Аїа С1у ТПг 1 5 19 15
Суз ТУуг «2105» є «2115 12 «212» Білок «213» Штучна послідовність квво» «221» джерело «2232» /примітка - «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид» «400» 6 біу біу бЗех Тайг Пув Нів Гув І1е Рго біу біу 5екг 1 5 10 «2105 7 «211» 4 «2122 Білок «2135 Ното Барієепз «4005 7 бек Рко сіу БПуз 1 «2102 8 «25115 5 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2200» «221» джерело «223» /примітка х «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид»
«4005 8 бек Рко біу Був Гей 1 5 «2105 9 «2115 6 «219» Білок «2132 Штучна послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка - «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид» «400» 9 бек Рко сіу Пув Пейп Гей 1 З «2105 10 «211» 5 «2122 Білок «213» Штучна послідовність «220» «2512 джерело «223» /примітка - «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид» «4005 10 бЗек Рко біу Пуз СІ1у 1 ів «2105 11 «2115 5 «212» Білок «213» Штучна послідовність й «8720» «221» джерело «223» /примітка « «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид» «4005 11
Зек Рго бі ГПу5 АТа 1 З «2105 12 «2115 5 «2122 Білок «213» Штучна послідовність «до» «221» джерело «2232» /примітка - «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид» «4005 17 бех Ркго біу Ппуз Уаї
1 5 «2105 13 «2115 З «212» Білок «213 Штучна послідовність «ве0» «вйї» джекналиа «223» /примітха хх «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид» «4005 13
Зех Рго б1іу Пцув Ііє 1 З «2102 18 «21ї5 5 «2125 Бідоє «513» Штучна послідовність «ах «гі» джерело «223з /примітка - «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид» «доз 14 бах Рко 5іу буз5 Меє 1 5 «їй» 15 «211» 5 «217» Бідок «213» Штучна послідовність «гг че21» джевело «323» /примітка - «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид» «4005 15 веж Рхко птТУу Ппуя ВкКо 1 5 «210» 15 «211» 5 «2122 Білок «2135 Штучна послідовність ках «1» джерело «2232 /примітка « «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид» «4005 16 век рРКо пі Пуз вна 1 5
«2105 17 «2115» 5 «212» Білок «ВІЗ» Штучна послідовність «2205 «гії» джерело «223» /примітка «є «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид» «4005 17 зех рхе біу Був Тук 1 5 «А1О0ж18 «115 5 «2122 Білок «213з Штучна послідовність ке? «221» джерело «223» /примітка " «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид» «400» 185
Ззек РЕб Сіу Був Тгр 1 З «3105 158 «2115 5 «212» Вілок «313» Штучна послідовність кг» «шиї» джерело «223» /примітка хз «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид» «41005 19
Беж рко бі Був зехї 1 5 «210» 20 «2115 5 «212» Білок «21353 Штучна послідовність «Ва» «221» джерело «ваЗ» /примітка - «Опис штучної послідовностії синтетичний пептид» «4005 20
Бек рхо б1іУ Був ТНЕ 1 5 «210» 81 -211» 5 «212 Білок
«213» Штучна послідовність «йт1» джерело «223» /примітка - «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид» «00» 21
Бех Рко біу Був Сув 1 5 «210» 22 «2112 5 «2122 Білок «2132 Актіїісіаі Зедцепсе «220» «геї?» джерело «2232 /примітка х «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид» «4005 22 бек Рхо сіу Був Азвп 1 в! «2102 23 «2115 5 «212» Білок «2135 Штучна послідовність «220» «221» джерело «293» /примітка з «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид» «4002 23
Чех Рхго Сіу Пух бій 1 5 «210» 24 «2115 5 «219з Білок «2137 Штучна послідовність «е0» «221» джерело «293» /примітка ж «Опис штучної послідоввості: синтетичний пептид» «4005 24
Бех Рко біу Був Авр 1 а «2105 25 «2112 5 «2125 Білок «213» Штучна послідовність «2205
«221» джерело «223» /примітка - «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид» «400» 25
Зеу Рко с1у Був 'ша1й 1 5 «2105» 26 «2115 5 «-212з Білок «213» Штучна послідовність «га» «2217» джерело «223» /примітка « «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид» «4005 25 бех Вхо сіу Бйуз НіБ5 1 5 «2105 27 «2115 5 «912» Білок «213» Штучна послідовність «220» «221» джерело «823» /примітка - «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид» «4005 27
Бех Рхто сіу Пцув Гуз 1 5 «210» 28 «2115 5 «2172» Білок «13» Штучна послідовність «20» «221» джерело «2232 /примітка - «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид» «4005 28
Бек Рхо 5Біу Пух Ага 1 5 «210» 25 «2115 6 «2122 Білок «213» Штучна послідовність «2202 «221» джерело «223» /примітка з «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид»
«4005 25
Бак Рко піу Бу Був Бей 1 в) «210 30 к2115 6 «2512» Білок «213» Штучна послідовність «вах «221» джерела «223» /примітка «х «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид» «4005 зо
Хех Рхто о сіу Був Ахку Гей 1 З «210 31 «2112 6 «212» Білок «213» Штучна послідовність «ва» «21» джерело «2232 /примітка - «Опис штучної послідовності: синтатичний пептид» «400» 31 ват Рко біу йуз Ро Гец 1 5 «2105 35 «211» 5 9512» Білок «213» Штучна послідовність «205 «221» джерело «223» /примітка т «Опис штучної послідовності: синтетичний пептиди» «апп» 35
Зек Рто 5Біу Був Авр Ге 1 5 «210з 33 «2112 6 «212» Білок «2135 Штучна послідовність «22» 21» джерело «223» /примітка зх «Опис штучної послідовності: синтетичний пептид» «4005 33
Сех Рто б5іУу Був бій Гей 1 5
«2105 34 «21125 7 «2122» Білок «2132 Ното зарієепв «4005 34
Пец Зек їевц Зег Рго б1у Був 1 5 «210» 35 «2115 7 «2122 Білок «213» Ното заріепв «400» 35 рец бек Тецй Зех Ге б1іу ТЦув 1 5 «210» 36 «211» 10 «212» Білок «213» Ното заріепз «400» 36
І1е Азр Акуд Гец Аза б1у Пцув Рго ТБг Нів 1 З 10 «2105 37 «2117 7 «212 Білок «2132 Ножто заріепв «4005 37
Уаї бек уаї Азп о Рго б1у уз 1 5 «210» 38 2112 7 «212» Білок «2132 Ното 5аріепь 4005 38
Тпх Авр о Нів С1у Рко Мебє цу 1 5 «2105 39 «211» 10 «2195» Білок «213» Ното заріепе «400» за уа1 Авр Тув Бек ТПк б1у Був Рко ТБх Пец 1 5 19
«2105 40 «2119 330 «212з Білок «213» Ното зарієпв «400» 40
Аіа бек ТБЕ Пув 01у РЕо бех Уві Рпе Рго ГИ Аза Рко Бек беж Пух 1 5 10 15
Бех Тпк бек біу с1у ТЬх діз Аїд Гвуи біу Сув Гей баї Був Авр Тух за впе Рго піц Рко Уа1 Тих Уві Зег Тер о Авлп о бЗеї 0і1Уу Аза Тен блх Бех біу чУаі Ні ТВх Ре РрРко Аів Уаі Бей біп Бех бек біу бев Тук век
Зо во їжи бек бех Уаі Заї Тс оуаі Рко ех бах Бех Без сіу Тпах бів ТБу е5 7о 75 во
Тук Іїа Сузв Азп Уві ДАвп Віз Буз Рго Зах АвпоТВх був Уві Авр о Буз 85 за 5
Буз Узі біо вхо Був Бех Субз Авр Пув ТПх Ні Тк о Сув Рго Рето Сув 100 195 110 хо АЛіа Рхо бій бе Пец біу біу Рго бек уві Рие Пец БВе Рко Рго 115 120 125
БУЗ Рто Був Азр Тк Пейп Меб Ії бек Аку Тих Рго бій Ууаії Так Сув 136 1535 145
Уві чаі Узі Ар Уаї Зек Мі бій Авр о Бко січ Узі Ббо5 Бпе Ап оТеср 145 150 155 160 тТух Уві Авр о біу Уаї Сі) Уді Ні Авп о Аід Гув ТВроБув Рко Агч СТ 165 170 175 сій біп Тух Аква обет ТБу Тук Ага Уаї Узі Зежх Маї Беш тТржх Уа1ї цей 189 185 155 нів біб Авр о ТгроГей Авв о с1іу Був 01) Тух був Сув уз Уаії бек Аз 135 299 205 пуз Аза їец Рко Біда Рго їТ1е біо пуб ТБ ч11їе бек пув Аіа Був бІ1Уу 219 215 27х2о бів Ркго Аха бій ро сій Узі Тук ТВх пе Рхо Рхо бек Ага Авр о біц 239 235 240
Пец Тпх Був Азпобівп Уа)і Зек опцей Тк Сув Пес Уаі Пу5 б1у Рпе Тук 245 о 235
РтІос Бех Авр ї1е Аза уді бін Ттр обі бек Ап о біу 610 Рго 516 Авп гео 255 217О
АвпотТук Пув ТАЖ ТІ Рко Рко Уві Пец Азр обех Авробіу бек Ре РБе 275 ево 285
Ббец Тук Бех Був Гецп Тит Уаї Авр Гуз бек Ак Тер біп біп Ту АвБп 230 2235 00
Уаї Ейе ех Суз баг Уаї Меї Нів бі діа Пес; Ні Авп Ніз Тук ТЕХ 305 310 315 320 біп Пує беїх Гей бек Пец бек РКко сб1у Був 325 330 «10» 41 «112 107 «2122 Білок «213» Ното варієпа «4005 41
Аку тп Уа1їі АтТа Аза Бко беїг Уа1ї Бце Ії Ріє Рго Ржхо Бек Авр бі 1 5 10 415 с5іп пе пух б5еї сіу ТК Аїа Бех Уаі Уаі Сук Пен Пе Ап Авп РБе 2о 25 30
Тук Рко Аг бій АЗіа Пув Уаї біп Ткр буз Уві Авр Ап Аза Тей бів
Зек с1у АБп бех б5іп біз бег Уаї Тик бій бів Авр обех ГПуя Авр Зехг з5 во
Типу Тух бек Пез бек Бех ТпхХ Пец Таж Пец бех Буз Аїа Авр Тут сі 58 70 75 А)
ув Нів уз Уаї Тух А1а Сув бій Уаї Ттаг нів біп біу рем бек Бех 55 зо з5
Рго Чаї Тс о Пувз Бех Рпе Авп Ах біу сій Сув 120 105 «кгі0» 42 «211» 105 «212» Білок «213» Ното кдрієпа «4005 42
Сіу сіп Рхо пуб Аза Аіа Ркто Бех Уаі ТВпх Бей Ріє Рко Рко бек Бех 1 5 10 15 сі бій песо біп Азїа Авп оБуз Аїа ТИХ Бец Уаї Суя цей Тіє бек Авр
Рпе Тух ВРко 5іу Аіа уаї ТБх Уаї Аза Ттр Пух Аза Авр Зек бет Рго 7аї йуз Аза біу Уаї біо Твх ТВ ТВх Рко Зех Буз Сіп Бек Ап Авт
ЗО 55 БО
Був Тух Аіа Аіа Зех Бек ТУук Пец бек пе) Твх Рко бій біп ТЕр Був 7о 75 Во
Бек Ні Був Бек Тук Зег Сув зів Уаї Три Ні сій б5іу бек Тк Маї 85 зо 5 із Був Ттпх Уаії Азїа Рко Тпх біз Суб Зехк

Claims (14)

150 195 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Кон'югований імуноглобулін, що містить імуноглобулін і функціональний агент, де а) імуноглобулін містить щонайменше один амінокислотний залишок, але менше 13 амінокислотних залишків після С-кінцевого лізину, де С-кінцевий лізин являє собою лізин 447 (К447), як нумеровано згідно із системою нумерації ЄС, ї) де, коли імуноглобулін містить один амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, один амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину являє собою гліцин, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, метіонін, фенілаланін, тирозин, триптофан, серин, треонін, цистеїн, аспарагін, глутамін або гістидин, і) де, коли імуноглобулін містить два амінокислотні залишки після С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину являє собою будь-який амінокислотний залишок, за винятком аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти або проліну; і другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну,
серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину, ії) де, коли імуноглобулін містить три амінокислотні залишки після С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину, їм) де, коли імуноглобулін містить чотири амінокислотні залишки після С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину, м) де, коли імуноглобулін містить п'ять амінокислотних залишків після С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і п'ятий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, п'ятий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину, або мі) де, коли імуноглобулін містить менше 13 амінокислотних залишків після С-кінцевого лізину, останній амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину, Зо Б) функціональний агент містить ацил-донорний субстрат, де ацил-донорний субстрат містить залишок глутаміну, і с) функціональний агент являє собою терапевтичний агент або діагностичний агент, де С-кінцевий лізин імуноглобуліну кон'юЮгований із залишком глутаміну ацил-донорного субстрату функціонального агента.
2. Кон'югований імуноглобулін, що містить імуноглобулін і функціональний агент, де а) імуноглобулін містить щонайменше один амінокислотний залишок, але менше 13 амінокислотних залишків після С-кінцевого лізину, де С-кінцевий лізин являє собою лізин 447 (К447), як нумеровано згідно із системою нумерації ЄС, ї) де, коли імуноглобулін містить один амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, один амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину являє собою гліцин, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, метіонін, фенілаланін, тирозин, триптофан, серин, треонін, цистеїн, аспарагін, глутамін або гістидин, і) де, коли імуноглобулін містить два амінокислотні залишки після С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину являє собою будь-який амінокислотний залишок, за винятком аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти або проліну; і другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину, ії) де, коли імуноглобулін містить три амінокислотні залишки після С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину, їм) де, коли імуноглобулін містить чотири амінокислотні залишки після С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, другий амінокислотний бо залишок після С-кінцевого лізину, третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину, м) де, коли імуноглобулін містить п'ять амінокислотних залишків після С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і п'ятий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, п'ятий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину, або мі) де, коли імуноглобулін містить менше 13 амінокислотних залишків після С-кінцевого лізину, останній амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину, Б) С-кінцевий лізин кон'югований із залишком глутаміну у ацил-донорному субстраті, де ацил- донорний субстрат додатково містить реакційноздатну групу, с) реакційноздатна група кон'югована з функціональним агентом, де функціональний агент являє собою терапевтичний агент або діагностичний агент.
3. Кон'югований імуноглобулін за п. 1, де функціональний агент, що містить ацил-донорний субстрат, відповідає одній з формул (І) або (І): (2)т-СіІп-( )а-СЮ), (І) (Х)-(О-Сп-(2) т, (І) де 7 являє собою карбоксибензилокси (СВІ) групу або амінокислотний залишок; СіІп являє собою залишок глутамінової кислоти; кожний І. незалежно являє собою прямий або розгалужений лінкер з 1-20 атомів вуглецю, де Зо один або більше атомів вуглецю можуть бути необов'язково і незалежно замінені атомом азоту, кисню або сірки, і де кожний атом вуглецю і азоту може бути необов'язково заміщений; або кожний Г. необов'язково і незалежно являє собою амінокислотний залишок; т дорівнює цілому числу від 0 до 5; п дорівнює цілому числу від О до 5; і У є функціональним агентом.
4. Кон'югований імуноглобулін за п. 3, де функціональний агент, що містить ацил-донорний субстрат: () відповідає формулі (І), і де 7 являє собою СВ групу; де Ї являє собою молекулу поліетиленгліколю (ПЕГ) (-О((СНе?г)2)-), етиламін (-МН((СН?г)2)-) або пропіламін (-МН(СН?)з)-); і де п дорівнює 0, 1, 2, 3, 4 або 5; (і) відповідає формулі (І), і де 7 являє собою СВ групу, і Ї являє собою амінокислоту; або (ії) відповідає формулі (Ії), де 7 являє собою СВ групу; т дорівнює 1; п дорівнює 1, 2 або 3; і щонайменше один Г. є су.
5. Кон'югований імуноглобулін за п. 2, де ацил-донорний субстрат відповідає одній з формул (ІІ) або (ІМ): (2)т-СІп-()а-СО, (1) (Х)-()а-Сп-(2) т, (ІМ) де 7 являє собою карбоксибензилокси (СВІ) групу або амінокислотний залишок; СіІп являє собою залишок глутамінової кислоти; кожний І. незалежно являє собою прямий або розгалужений лінкер з 1-20 атомів вуглецю, де один або більше атомів вуглецю можуть бути необов'язково і незалежно замінені атомом азоту, кисню або сірки, і де кожний атом вуглецю і азоту може бути необов'язково заміщений; або кожний Г. необов'язково та незалежно являє собою амінокислотний залишок; т дорівнює цілому числу від 0 до 5; п дорівнює цілому числу від О до 5; і Х є реакційноздатною групою.
6. Кон'югований імуноглобулін за п. 5, де ацил-донорний субстрат:
() відповідає формулі (ІІ), і де 7 являє собою СВ групу; де кожний ЇЙ являє собою незалежно молекулу поліетиленгліколю (ПЕГ) (-О((СНг)2)-), етиламін (-МН((СНг»г)2)-) або пропіламін (- МН(СНг)з)-); і де п дорівнює 0, 1, 2, 3, 4 або 5; (і) відповідає формулі (ІІ), де 7 являє собою СВА групу і Ї являє собою амінокислоту; або (ії) відповідає формулі (ІМ), де 7 являє собою СВ групу; т дорівнює 1; п дорівнює 1, 2 або З; і щонайменше один Г. є су.
7. Кон'югований імуноглобулін за п. 1 або 2, де терапевтичний агент являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, хіміотерапевтичний препарат, лікарський препарат, радіоактивний агент, цитотоксичний агент, антибіотик, невелику молекулу, нуклеїнову кислоту або поліпептид; або де діагностичний агент являє собою флуорофор, флуоресцентний барвник, радіонуклід або фермент.
8. Кон'югований імуноглобулін за п. 1 або 2, де імуноглобулін: () має два амінокислотні залишки після С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і другий амінокислотний залишок після С- кінцевого лізину; або (її має три амінокислотні залишки після С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, другий амінокислотний залишок після С- кінцевого лізину і третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину; або (ії) має чотири амінокислотні залишки після С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, другий амінокислотний залишок після С- кінцевого лізину, третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину; або (м) має п'ять амінокислотних залишків після С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, другий амінокислотний залишок після С- кінцевого лізину, третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і п'ятий амінокислотний залишок після С- кінцевого лізину; або (м) має менше 9 амінокислотних залишків після С-кінцевого лізину; або Зо (м) має менше 13 амінокислотних залишків після С-кінцевого лізину.
9. Кон'югований імуноглобулін за п. 1 або 2, де імуноглобулін: (ї) являє собою імуноглобулін до; або (її) являє собою імуноглобулін Ідс», ІдСз або Ідса; або (ії) являє собою імуноглобулін ІдА!, ІдА» або ІдМ; або (ім) являє собою імуноглобулін дО або ІДЕ; або (м) являє собою людський імуноглобулін або гуманізований імуноглобулін; або (м) являє собою химерний імуноглобулін або не є людським імуноглобуліном; або (мії) містить два важкі ланцюги і два легкі ланцюги.
10. Фармацевтична композиція, що містить кон'югований імуноглобулін за будь-яким із пп. 1-9 і фармацевтично прийнятний носій.
11. Спосіб одержання кон'югованого імуноглобуліну за будь-яким із пп. 1, З і 4, що включає: інкубацію імуноглобуліну з мікробною трансглутаміназою і функціональним агентом, що містить ацил-донорний субстрат, а) де імуноглобулін містить щонайменше один амінокислотний залишок але менше 13 амінокислотних залишків після С-кінцевого лізину, де С-кінцевий лізин являє собою лізин 447 (К447), як нумеровано згідно із системою нумерації ЄС, ї) де, коли імуноглобулін містить один амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, один амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину являє собою гліцин, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, метіонін, фенілаланін, тирозин, триптофан, серин, треонін, цистеїн, аспарагін, БО глутамін або гістидин, і) де, коли імуноглобулін містить два амінокислотні залишки після С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину являє собою будь-який амінокислотний залишок, за винятком аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти або проліну; і другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину, ії) де, коли імуноглобулін містить три амінокислотні залишки після С-кінцевого лізину, що бо включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину, їм) де, коли імуноглобулін містить чотири амінокислотні залишки після С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину, м) де, коли імуноглобулін містить п'ять амінокислотних залишків після С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і п'ятий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, п'ятий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину, або мі) де, коли імуноглобулін містить менше 13 амінокислотних залишків після С-кінцевого лізину, останній амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину, р) де ацил-донорний субстрат містить залишок глутаміну, і с) де функціональний агент являє собою терапевтичний агент або діагностичний агент, де мікробна трансглутаміназа каталізує кон'югацію С-кінцевого лізину імуноглобуліну із залишком глутаміну ацил-донорного субстрату у функціональному агентові, тим самим Зо забезпечуючи одержання кон'югованого імуноглобуліну.
12. Спосіб одержання кон'югованого імуноглобуліну за будь-яким із пп. 2, 5 і 6, що включає: (ї) інкубацію імуноглобуліну з мікробною трансглутаміназою і ацил-донорним субстратом, а) де імуноглобулін містить щонайменше один амінокислотний залишок але менше 13 амінокислотних залишків після С-кінцевого лізину, де С-кінцевий лізин являє собою лізин 447 (К447), як нумеровано згідно із системою нумерації ЄС, ї) де, коли імуноглобулін містить один амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, один амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину являє собою гліцин, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, метіонін, фенілаланін, тирозин, триптофан, серин, треонін, цистеїн, аспарагін, глутамін або гістидин, ії) де, коли імуноглобулін містить два амінокислотні залишки після С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину являє собою будь-який амінокислотний залишок, за винятком аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти або проліну; і другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину, ії) де, коли імуноглобулін містить три амінокислотні залишки після С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину, їм) де, коли імуноглобулін містить чотири амінокислотні залишки після С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину,
ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину, м) де, коли імуноглобулін містить п'ять амінокислотних залишків після С-кінцевого лізину, що включають перший амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, другий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, третій амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, четвертий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину і п'ятий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, п'ятий амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину, або мі) де, коли імуноглобулін містить менше 13 амінокислотних залишків після С-кінцевого лізину, останній амінокислотний залишок після С-кінцевого лізину, вибраний із групи, що складається з фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну, валіну, серину, проліну, треоніну, аланіну, тирозину, гістидину, глутаміну, аспарагіну, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, цистеїну, триптофану і гліцину, р) де ацил-донорний субстрат містить залишок глутаміну і реакційноздатну групу, де мікробна трансглутаміназа каталізує кон'югацію С-кінцевого лізину імуноглобуліну із залишком глутаміну ацил-донорного субстрату, і (її) кон'югацію функціонального агента з реакційноздатною групою ацил-донорного субстрату, де функціональний агент являє собою терапевтичний агент або діагностичний агент, тим самим забезпечуючи одержання кон'югованого імуноглобуліну.
13. Спосіб за п. 12, де реакційноздатна група ацил-донорного субстрату кон'югована з функціональним агентом за допомогою реакції клік-хімії.
14. Спосіб за п. 11 або 12, де мікробна трансглутаміназа є мікробною трансглутаміназою бактерії Бігеріотусев5 тобагепвів. : В Васш-о Ще о те т тоди Не ан «М й ше с МН М ве, щ й Не С Ко у тедеуниемінах шо трансччутамнаа : я ву о ій я. ня в а ЦН ШИ НО Шо вч; "В ше я щи Н ін КЗ ВИ Бо
Фіг. 1 т уки жо як, се шо «МНа НОВО се» ен га Я їн Беж дич Ж в еВ А 5. Я М Е ее Я | о ню У М ія з 55 ку САД-ВЮТИн 0. МН Му І -й ї я Еж Є Е хе ех са й с, ска, «З ге яру с шення с я и Ши я зе . я ї М м вон З її Я М вн й
Фіг.
т х. ямки Є поь ОНЕУ ВС 55. Во т Я о з З - що є я : «Вуж сюя пе ад: А ИН ИН Толя «7 Зо о 7 те ти Має КЕ ва а теру ди я Те її - Ши в М і 4 її її ЕІ ої х я і т КК. щі он в: Ж с КЕ. 2АОНОВВ. Осно Й З а п м ких св в Н не «Ж ке Ко ль -5 ій я я Ка я г В - в Моск с КЕ о зм пе Хм щ ї; Ї ши ше З ї СУ я в іо ер ти звИнй у ккаквхх Же НЕ кауристатин КЕ гу щи ОН, в З о ЯК Ну г п шк: є ке Я "В ря ; пи ни мн аа З Я ше а о ях ; і Її Ї ши ше я Й ЕІ З ше ке вх ен ст я З д. дея Її - Й
Фіг. 2 (продовження)
си й щи СА й вчи щі шани: в Бовсу пентафторфеноя ікрАЮНОЇ М кий о спе що ї не Шан али ВИ | зей онко В Днох ОПЕК евьнн я Ж й но. м, В НосоечеКу насту з кою едопровівенін 7 ши я р Я бехилинванни х Е сов: к : о лина й дн, Я поліно ї ние Бе | пи МКУ ви ХА А Кк вик : бно о я Ся го У р у Я Б КЕ х лі о в А Я. з ко до й лик КЗ Я. о КЕ ГІ В В ВЕ ня веди М "Я Кейси шк дове ще ШИ ши т Дно ВЕН ненйов (біг. Я бер; оо ен ШК ско не нь 4 лі, ж ши в А М З Ж жа спузетиламів жк уз ст з че. Я ач що диск окон ше зв но МН ПЕГеАйВЕ ИТю итрту те в г а С ЕЙ СК. Одне о А шия вк, Ка я ж За ТЛЕА МО екв) На , й ли а М в -7 и тет - в К АК. ко вренить Її М ля я у че С те шо й со Кі ви та ко) ЕВ) - ок Я й Ки ВІ Я М МН кивок ! я 2 ПЕГеАВЕ
Фіг. 3 (продовження!
Ка кала 00020002 ---- - - о лямбда о шк Й й Кз пн пива мила о пн ни нн з ие ЧИМ і о 555 зі З хека Й КЗ А. г кра і -- 5 ОВ З КУ Її Я !
й. ВЕ ЗБК ОКО в З-е КО В ОН І їх Я В З Ви Е що. ща фо 0050 В, З 3 й як ях В, В БЕХ ше в. Мн В її | Ж я "за а НК ев А У на С Дн о У В, 3 ж ов йо : Вк и МО » хо Я - ! й Б ОО о зай но Же зе тон а Б 1 5 БИ» шко є З сао й май З - ма 5 чи и и р, ЗМО С ех. ВО ЕК СЗЗ ЯК зе я щ ВЕН У Ко ЗНО ооо ко НЕ
Су . Бо ВИК чав Ба - Я ЗБ Ше, о г: т вай - їх ще я З а Заннй в ШИ ій. вх ЯК МО до щу полу й я де В « Зх С діння ек НК, я ї о швя ва ко Н їх ОО о п В ЧИ а ес ни КО З Ух ї
Н в. ОО 5 ща а в ши Як ї : - МОМ | нь м -і В : /, Я Ї З Коса о СЯ шо о В а шу ле ВОК ве ши ее Б. ие ! : а о І фр я МЕ Ши НИ : ! с ша з з. Сова Н УК "І Ва ще Б, а ВК й ОК ї і шк я УВУ М Же Я І р Н Є й : «ріг. 4а Фіг. 45 Фіг. ас В сх тів ВХІЩОРЕМЕЕ ПАРЕБДЕТОО БІЗАБУЬЄК ПУЕРЕРУТМО МИбОВБІОЇ ЯХКРАМІКВ БІТОБОУУУТ УББ ХОЗМВЕКРВ НТЖУТККУКВ 718 ЕОСІЖЕВІСТ СРЕРЕТІОС РОУЕБУРНЖЕ БІТІКІКЕТВ КУТОМ УТУЄ КЕОРБУКЕКИ ТУЯ ВИЯМА ДТКРКЕЕОУМ УЖЕУУВУЄЕ УСНО З БУБСЕУОНКА ПРАРІБКТІВ БАДОЗЕКЕКО УЄТЕРЕВОВ БУДОВИ МеКБЕТЕМН: ДУБНЕЗКООР ЕЕНУКЕТКХ БОШ КЖІ МЕТИ 18 Но СВІТ ЕУСВТ МЕХАСНЕНІТ ОБОВ Вз Сх 183 ВІУАЕВУМКІ РУВУОЕОІКО ОТАЗКТСЬЬК БЕТРИАВАЖУЮ НКУПНАЦО МОВОЮ ЗЕОМТІЯБ3О ТТБ Ь БИКУТАСВУТ ЩО 28 ошя СПРЖАДТОУТ СЕРРОЕЕВОЇ АХВАТЬУСЬК ЗПКЖРОВЖТТ АЖКАОБІРУЖ АСУКІТКІРЕК ШЕХНКТАНОЮ ТЬЗОТРЕОНК НК ТНКУКІ ВОСОТУВАТУ
Фіг. 5
Анти е Ое нс 23750. ща аБтвв ! зво ї шк й | гвіва 43749 Я гам 22500 25ОВО 27500 зо
Фіг. 6А Антитіно 05 ян. ЗТ. 1ю БЕ ! | 2508? о а5р58 КЗ ж ІО29981 ; Ї дк же й я І ЗБаВА 00 безе 23455 вія? 018 1755 ше і 2003 500 2500 зу50Ю заовоо
Фіг. 66 Антитіла о - 23213... ше в 25ова 4 | Зад5а ш | 2вов І | 14ОБЕ Е жави 2535 Зою 350 вело ЗБОЮ зо Фіг С
Антитіло 04 100 47953 25166 11580 27855 23508 й вет 68 0 у : ; маса 20000 22500 25000 27500 30000
Фіг. 60 Антитіло 05 22853 100 38784 26337 о51ов 26949 20182 й ; 24993 2018522631 28392 1999 1961 моз 1366 28944 и І. у 14650 0 ; -ж Маса 20000 22500 25000 27500 30000
Фіг. 6Е нтитіло 06 23470. " і 25381 36077 за | 25198. оол7143) 24995. 2943 0 піт ! маса 20000 22500 25000 27500 з0000
Фіг. бЕ
Пегкий ланцюг Важкий ланцюг 4 25218 500 - г дева авА1 о 100 5 НС ктвво - з Ї ж - за4ов щі іс Щ Шен К 48431 ї те 13 маса 1 ж маса ОБО панич в ач маса ре и МЕНЮ ї м ; панни 20009 22500 45000 47500 00Бобро са
Фіг. 7ТА Легкий ланцюг Важкий ланцюг Як 23216 са не ще ТЮ, у вт 0 88397 100 НОФ2 979 8ів38 нсез І | гтовя? іс но щ ЩА БОБ додав їс | Ї їх маса ЩЕ й Н ; х маса о- дні ЩЕ ІЙ ще одеса і ї й ! і З он ці ролеро маса со00о 0022500 о5000 00027500 ви с о ВИС і ВИ
Фіг. 78 Легкий ланцюг Важкий ланцюг Кг 25554 -- ад 19 зво30 аз тва ПЕ же 1 і І не тях 4 2 З ЩО ! щ- 003 маса Ол ж ; ва | 4 4 ї 4 ; Й ; НІ се ни вна х ся сійвій зе те сх їкя маса й -В р : рбсой 7 ; лежак: А У; ? Ь маса заодо яоро водо чо 50О0ю Зю
Фіг. 7с зп 48803. 100 3 185295 І ; 1 ев . зв7авіава в Боооо зва аввв5 яті КОТИ шен одвіве? торами 0) і, Деввзе 46000 4ВО0О 5ОООЮ мас:
Фіг. ВА 49674 Шк 221297 ж. 46425 72988 вав 0 Б02е5 051582 аб: «тів ЗВО 030029 0 вве ! МОМ 552373 Кй 1,1 0805 п-вАЬ зняв Кк й жде я а 46000 48000 5О00О маса
Фіг. 865 зв 40788 - 100 176368 вита ават | 49905 ШО ЗМО 41926 4392 відвЕ 51582 Нв ово. Урок ав ОТ, 0 СО колки шен Я Данні і пе А КЕ маса 46000 48000 5ОСОЮ
Фіг. 8С
ТС скан ве я 8.83 380- ще - що цк зага | Єчго185
: 1.4 зе зу . о ЩО її 1455 Ку : : трав о. слуа т Я т 19.8 ж ов3ої Т29148215 0 ро едволовзов ве п і І Очна ни 5 й кианииненинвенииниканииикийнннининкниннинонининениникикиннинлвини ванними кни Час Од 8.50 АЮ 7.53 чо 150 зваб іт8а зад Бе - УФ при 280 нм «ВО в? рр 4 чвай 08 я. щЕожня ТЯ «4 І щ ЕК Ані АК 8.50 БОЮ то , лю 1 1500 НЯ ОД дит ї снсчеко, а те р х Ше Ж х їй ту Ч пах їЯ яра. М! то. Я. зо. 00 ЯК тат - ЗВРМОВе БО чі в«еввя 1 ЗЩИбКова о ЗНТУ ві КІ ТОЖ ОБО, МЕ. х з. в ше й Ше що ш и ШЕ МД ЧИ ДЕ ї днем нів шо ї в вай ї . 2 емо ОБ 27500 рез, СК, КК Мекки ЗО
Фіг. ЗА за. НС скан ве вв КК, зе с З 15 1 вах Пон однини нн о о в ис Комі ве нн и НН ще я яд М Бек ва й ЩЕ «в ори ою ни ши ни вв ШЕ шаль ТА ди | пи Ті у НК: щи коти Еш її ке п Ко В: І НЯ НО: ТУ ож Ії вав Жов Й оооозюк 00 пи ши. ДУ В ен дир туту орто кути о ВН Мен у чних ут НВК ОК древні рон тен ЖИ ЯН а ее З Ой 18хю та чаю Зв аю т КЗ Пк їх о і же й Ша ж Ж со ж ЗА чо керу ов зак. ЕМ вен 1805 шва х м «шоме я : ЖК. Е ШЕ» І ат ек Я. ї і В іЗ й я КА Я Мов ода -ї | і жах з луни НОЯ Є В ще ШИ шо щі ш-: ше ее ше. Н ЯК уч а я кА ЕВ . ! ані ІВ и ши 3 НЕ бе я Я рент ут ув мата Прут уєу тр кумутя а зер емеуньюю Доу у ую маса зкю двЩке о ФК ЖАОЕ ФО маси НЕЮ ЖК от
Фіг. 928 п МЕ Зоя Я КОХ х КВ їе Я З с я і Ж ОХ СКК СО Ох : У о о Ох о Ох ше КООЕОа о о. ско сях ХХ Со нх МОЖЕ ДОК їх: ь БО -х о СХ ШЕ СУЯ Ох с ше о ХУ КК с п. ХХ З МО ОХ СО МЕ -Я мин й і о 0 о. ХХ З ре ОК ЕЕ З ее ЗК Я й о що У МЕМ ї . КК КЕ ПК 5 ЗО с М ОВО ОО КВ ОКХ Кк З СО ще Б По Зо о 1 о о о Кс ХХ ЗОВ о о о с о. З ОХ с :
о. о і по ХХ І з У п ІК За ЗВ Пп вх Сх СЯ шо х Як пи У с МУ ПО х ЗУ зо Би їх па ХУ КМТ но кН с. ще ХХ І я Ех о и пит хе Я ТЕ Ех х ях Зх Кх г В с о . хе о. я о о ММ пи с с ся о В о п ККд ОО Ко що о В о ; . З о о У са о о ЗЕ с о с улллке - с с о У 4 о ОХ Я о п . СЯ Ко що Ох п ТИМ З о У о. с х КК о. п Кеке о п и же п у; о. о п ОО жо КО і о. в п щкХ п о по ОО о ОХ ТИКИ я о ще КЕ с
Бе. Кк с ПЕ с в с 0 З о с. с п М с п п о МО с М Ж с і ШЕ ОХ ХХ КН І ЕМ 1 - з ох що о с о с о о о МО ЗО З о с о о о - - - шо о й ІНК с. КК КК ШЕ т о ШУ Х 0. » я о і: о І в ; о Ге м МОВ Б 42,0 иїв вська 1, м. К іхано а, 1, їха ов л.ц зун ка Л. Гла верст т» вул. рна ості", "ютеї асн Мп ї вл Ко ної аль екту. інтел ут ін інстит й інст 66 и їнськ аїнс п "Укр.
UAA201807950A 2015-12-18 2016-12-16 Кон'юговані імуноглобуліни з c-кінцевим лізином UA124622C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562269138P 2015-12-18 2015-12-18
PCT/US2016/067165 WO2017106643A1 (en) 2015-12-18 2016-12-16 C-terminal lysine conjugated immunoglobulins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA124622C2 true UA124622C2 (uk) 2021-10-20

Family

ID=57960810

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201807950A UA124622C2 (uk) 2015-12-18 2016-12-16 Кон'юговані імуноглобуліни з c-кінцевим лізином

Country Status (21)

Country Link
US (2) US11135304B2 (uk)
EP (2) EP4032902A1 (uk)
JP (2) JP6970090B2 (uk)
KR (1) KR20180095862A (uk)
CN (1) CN108602878B (uk)
AU (1) AU2016369524B2 (uk)
BR (1) BR112018012388A2 (uk)
CA (1) CA3008645A1 (uk)
CL (1) CL2018001565A1 (uk)
CO (1) CO2018005876A2 (uk)
ES (1) ES2910699T3 (uk)
IL (1) IL259754B (uk)
MA (1) MA44074A (uk)
MX (1) MX2018007451A (uk)
MY (1) MY192987A (uk)
NZ (1) NZ742916A (uk)
PH (1) PH12018501272A1 (uk)
RU (1) RU2747581C2 (uk)
SG (1) SG11201804856VA (uk)
UA (1) UA124622C2 (uk)
WO (1) WO2017106643A1 (uk)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2016306907A1 (en) * 2015-08-07 2018-03-29 Merck Patent Gmbh A transglutamine tag for efficient site-specific bioconjugation
US11135304B2 (en) * 2015-12-18 2021-10-05 Eisai R&D Management Co., Ltd. C-terminal lysine conjugated immunoglobulins
CN116731101A (zh) 2016-06-01 2023-09-12 雅斯娜 用于治疗多种疾病的n-己酸-l-酪氨酸-l-异亮氨酸-(6)-氨基己酰胺的衍生物
SG11201810470XA (en) * 2016-06-10 2018-12-28 Eisai R&D Man Co Ltd Lysine conjugated immunoglobulins
WO2019035681A2 (ko) 2017-08-17 2019-02-21 주식회사 엘지화학 전고체 전지용 전극 및 그 제조방법
WO2020028842A1 (en) * 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating hypertrophic cardiomyopathy
BR112022008756A2 (pt) 2019-11-07 2022-07-26 Eisai R&D Man Co Ltd Conjugados anticorpo-fármaco anti-mesotelina eribulina e métodos de uso
KR20230020441A (ko) 2020-06-05 2023-02-10 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 항-bcma 항체-약물 컨쥬게이트 및 이용 방법

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
ATE550041T1 (de) 2004-01-21 2012-04-15 Novo Nordisk Healthcare Ag Transglutaminase-vermittelte konjugation von peptiden
AT503902B1 (de) * 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von immunglobulinen
WO2009032247A1 (en) * 2007-08-30 2009-03-12 Northwestern University Synthetic peptide and peptide conjugates and related tissue coupling methods via transglutaminase enzyme
MX2010003718A (es) * 2007-10-19 2010-04-21 Genentech Inc Anticuerpos anti-tenb2 producidos por ingenieria de cisteina y conjugados de farmaco y anticuerpo.
US9676871B2 (en) * 2010-11-05 2017-06-13 Pfizer Inc. Engineered polypeptide conjugates and methods for making thereof using transglutaminase
WO2013176516A1 (ko) 2012-05-24 2013-11-28 한화케미칼 주식회사 트랜스글루타미나아제를 이용하여 제조한 항체-약물 결합체 및 이의 용도
KR20160040556A (ko) * 2013-07-11 2016-04-14 노파르티스 아게 미생물 트랜스글루타미나제를 사용한 리신-특이적 화학효소적 단백질 변형
US9608508B2 (en) * 2013-07-29 2017-03-28 Microsemi P.O.E Ltd. Integrated limiter and active filter
US10195289B2 (en) * 2013-07-31 2019-02-05 Rinat Neuroscience Corp. Engineered polypeptide conjugates using transglutaminase
SI3134127T1 (sl) * 2014-04-25 2020-06-30 Rinat Neuroscience Corp. Konjugati zdravil s protitelesi z visoko stopnjo zdravila
US11135304B2 (en) 2015-12-18 2021-10-05 Eisai R&D Management Co., Ltd. C-terminal lysine conjugated immunoglobulins
SG11201810470XA (en) * 2016-06-10 2018-12-28 Eisai R&D Man Co Ltd Lysine conjugated immunoglobulins

Also Published As

Publication number Publication date
RU2018126304A3 (uk) 2020-05-13
PH12018501272A1 (en) 2019-01-28
JP2022023181A (ja) 2022-02-07
US20220088212A1 (en) 2022-03-24
US11135304B2 (en) 2021-10-05
KR20180095862A (ko) 2018-08-28
SG11201804856VA (en) 2018-07-30
RU2747581C2 (ru) 2021-05-11
CN108602878B (zh) 2022-06-28
CL2018001565A1 (es) 2018-08-24
CA3008645A1 (en) 2017-06-22
RU2018126304A (ru) 2020-01-20
BR112018012388A2 (pt) 2018-12-04
MY192987A (en) 2022-09-20
EP3390440B1 (en) 2022-02-02
ES2910699T3 (es) 2022-05-13
NZ742916A (en) 2023-03-31
JP2019502684A (ja) 2019-01-31
WO2017106643A1 (en) 2017-06-22
EP3390440A1 (en) 2018-10-24
CO2018005876A2 (es) 2018-08-21
AU2016369524B2 (en) 2022-12-08
IL259754B (en) 2022-09-01
MX2018007451A (es) 2018-11-09
JP6970090B2 (ja) 2021-11-24
IL259754A (en) 2018-07-31
EP4032902A1 (en) 2022-07-27
MA44074A (fr) 2018-10-24
US20200009263A1 (en) 2020-01-09
CN108602878A (zh) 2018-09-28
AU2016369524A1 (en) 2018-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA124622C2 (uk) Кон'юговані імуноглобуліни з c-кінцевим лізином
US20200289662A1 (en) Antibody-active agent conjugates and methods of use
CN105026574B (zh) 细胞系
US9045543B2 (en) Humanized anti-CD20 monoclonal antibody
CN110099697B (zh) 用于消融造血干细胞的抗体药物缀合物
Zhang et al. Transient expression and purification of chimeric heavy chain antibodies
US11753669B2 (en) Lysine conjugated immunoglobulins
CA2097060A1 (en) Bifunctional antibodies and method of preparing same
EP2920210A1 (en) Recombinant bispecific antibody binding to cd20 and cd95
EP4261224A1 (en) Cd73 antigen-binding protein and application thereof
EP3795591B1 (en) Cys80 conjugated immunoglobulins
US20040136982A1 (en) Novel monoclonal antibody
EP4299589A1 (en) Anti-human cd73 antibody and use thereof
JP2003516121A (ja) 不可逆的に結合するエンジニアリング抗体
KR20050106459A (ko) 단일클론 항체, 이를 코딩하는 유전자, 하이브리도마, 의약조성물 및 진단 시약
KR20120051733A (ko) 베타 세포 마커 항체
EP3904384A1 (en) Fully humanized anti-gitr antibody and preparation method therefor
US20230322943A1 (en) Antibody binding to human cd38, preparation method thereof, and use thereof
US20220251206A1 (en) Anti-ctla4 antibody prodruggable (probody) at a cdr position
WO2022037665A1 (en) Site-specific antibody conjugates and the methods for preparation of the same
WO2023141855A1 (en) Protein conjugates with multiple payloads and methods for making the same
CN118027209A (zh) 重组抗体及其应用
WO2020243659A1 (en) Vector-based therapy for thyroid disease
CN118063612A (zh) 抗ror1抗体或其抗原结合片段及其用途