KR20220095197A - 항-메소텔린 에리불린 항체-약물 컨쥬게이트 및 이용 방법 - Google Patents

항-메소텔린 에리불린 항체-약물 컨쥬게이트 및 이용 방법 Download PDF

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Abstract

메소텔린에 결합하는 항체, 이의 항원-결합 단편 및 컨쥬게이트(예를 들어, 항체-약물 컨쥬게이트, 예컨대 에리불린을 포함하는 것들)이 개시된다. 본 개시는 추가로 본원에 제공되는 조성물을 투여함으로써 암의 치료에 사용하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

항-메소텔린 에리불린 항체-약물 컨쥬게이트 및 이용 방법
본 개시는 본원에 이의 전체가 참조로 포함되는 2019년 11월 7일자 출원된 미국 특허 가출원 제62/932,373호에 대한 우선권의 이익을 주장한다.
본 개시는 항-메소텔린 항체 및 이의 항원-결합 단편, 및 컨쥬게이트, 예컨대 항체-약물 컨쥬게이트(ADC), 예를 들어 에리불린(eribulin)을 포함하는 것들 및 메소텔린을 발현하고/하거나 튜불린을 파괴함으로써 또는 본원에 개시된 조성물을 투여함으로써 치료될 수 있는 암의 치료 및 진단에서의 이들의 용도에 관한 것이다.
암은 전세계적으로 이환율 및 사망률의 주요 원인 중 하나이며, 2012년도에 대략 1,400만 건의 새로운 사례 및 820만 건의 암-관련 사망이 있었다. 암 사망의 가장 흔한 원인은 하기의 암이다: 폐(159만 건의 사망); 간(745,000건의 사망); 위(723,000건의 사망); 대장(694,000건의 사망); 유방(521,000건의 사망); 및 식도(400,000건의 사망). 새로운 암 사례의 수는 다음 20년에 걸쳐 약 70% 증가하여, 연간 대략 2,200만건의 새로운 암 사례로 증가할 것으로 예상된다(문헌[World Cancer Report 2014]).
메소텔린, 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)-고정된 세포 표면 단백질은 중피종, 난소암 및 췌장 선암종을 포함하는 다양한 암 유형에서의 이의 높은 발현으로 인하여 항체-기반의 암 치료법을 위한 매력적인 표적이다(문헌[Tang et al. (2013) Anticancer Agents Med. Chem. 13(2):276-80]). 메소텔린 낙아웃 마우스가 임의의 검출 가능한 표현형을 보이지 않은 점을 고려하여 메소텔린의 생물학적 기능의 완전한 이해가 결여되어 있지만, 메소텔린이 종양 유착 및 전이에서 역할을 수행하는 것이 제시된 바 있다(문헌[Bera and Pastan (2000) Mol. Cell Biol. 20(8):2902-6]; 문헌[Rump et al. (2004) J. Biol. Chem. 279(10):9190-8]). 메소텔린은 또한 특정 형태의 화학요법에 대하여 저항성을 부여하고, 세포에 증식 효과를 가짐으로써 종양 진행에 기여하는 것으로 여겨진다(문헌[Bharadwaj et al. (2011) Mol. Cancer. 10:106]; 문헌[Li et al. (2008) Mol. Cancer Ther. 7(2):286-96]).
최근의 연구에 의해, 메소텔린이 암 전이 및 재발과 밀접하게 관련된 과정인 상피-중간엽 전이(EMT)의 가장 중요한 조절제로서 기능할 수 있는 것이 나타났다(문헌[He et al. (2017). Mol Cancer. 16:63]). 이론에 결부시키고자 하지 않고, 메소텔린의 저해, 예를 들어, 항-메소텔린 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC에 의한 결합이 TGF-β(전환 성장 인자 베타) 신호전달의 억제를 통해 역 과정, 중간엽 상피 전이(MET)를 유도함으로써 EMT를 감소시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 역으로, 메소텔린의 과발현이 종양 진행 및 불량한 치료 반응과 연관된 암 줄기 세포-유사 표현형의 유도를 통해 EMT를 유도할 수 있는 것으로 여겨진다(문헌[He et al. (2017). Mol Cancer. 16:63]; 문헌[Koyama et al. (2017). J. Clin. Invest. 127(4): 1254-1270]).
암 치료법에서 흔히 마주치는 문제는 화학치료제의 제한된 치료 지수가 정상 조직에 상당한 독성을 초래함에 따라, 이들의 치료적 유용성을 제한하는 것이다. 암 세포를 표적화하기 위해 더 높은 특이성을 달성하는 한가지 접근법은 항체를 사용하여, 특정 종양-특이적 항원을 전혀 발현하지 않거나, 훨씬 더 낮은 수준의 이러한 항원을 발현하는 정상 세포를 보존하면서, 특정 종양-특이적 항원을 발현하는 세포에 세포 독성 효과를 전달함으로써 이루어진다(문헌[Awwad et al. Pharmaceutics (2018) 10(3)]; 문헌[Lambert and Berkenblit (2018) 69: 191-207]). 이러한 종양-특이적 표적화를 이용하여, 항-종양 활성을 증가시킬 수도 있고, 치료제의 표적외 세포 독성을 감소시킬 수도 있다. 종양-특이적 항원을 표적화하는 항체는 항원의 생물학적 활성의 저해, 면역 이펙터 활성의 유도 및/또는 항체-의존성 세포의 세포 독성의 유도를 포함하는 다양한 메커니즘을 통해 세포 독성 효과를 전달할 수 있다(문헌[Hendrinks et al. International Review of Cell and Molecular Biology (2017)]; 문헌[Therapeutic Antibody Engineering (2012): 163-196, 459-595]).
항체-기반의 치료적 접근법을 위한 종양-특이적 항원의 선택은 종양 세포에 의한 항원의 특이적인 발현 및 항원-발현 종양 세포의 강력한 살해를 포함할 수 있다. 폐암, 난소암, 췌장암 및 위암을 포함하는 몇몇의 인간 암은 높은 수준의 메소텔린을 발현하는 것으로 밝혀졌다(문헌[Hassan et al. Eur. J. Cancer (2008) 44(1): 46-53]; 문헌[Hassan et al. J. Clin. Oncol. (2016) 34(34): 4171-4179]). 메소텔린 발현은 또한, 약물 저항성 암, 예컨대 체크포인트 차단 면역요법에 대하여 불량한 임상 반응을 갖는 KRAS 및 STK11 돌연변이를 갖는 폐암 및 HER2-음성 위암에서 관찰되었다. 또한, 메소텔린 발현과 폐 선암종을 갖는 환자 및 위암 전이를 갖는 환자의 전체 생존 간의 상관관계가 보고되었으며, 이는 높은 메소텔린 발현이 더 나쁜 임상 결과의 예측인자일 수 있음을 시사한다(문헌[Kachala et al. (2014) Clin. Cancer. Res. 20(4): 1020-1028]; 문헌[Han et al. (2017) J. Pathol. Transl. Med. 51(2): 122-128]). 인간 암에서의 메소텔린 발현의 출현율 및 이의 불량한 임상 결과와의 연관성에 의해, 메소텔린은 종양 항원-특이적 약물 전달 접근법, 예를 들어, 항체-매개의 접근법을 위한 잠재적인 표적이 된다. 세포 독성 화합물, 예컨대 화학치료제와 컨쥬게이트된 항체는 종양 세포로의 항체-기반의 약물 전달의 세포-살해 활성을 향상시키는 것으로 분석되었다. 그럼에도 불구하고, 효율적인 종양 표적화, 표적내 효과, 방관자 살해(bystander killing) 및/또는 감소된 표적외 효과의 조합을 제공하는 적합한 항체 및/또는 ADC를 제공하는 것이 필요하다.
에리불린은 튜불린 중합, 미세소관 어셈블리 및 튜불린-의존적 GTP 가수분해의 강력한 저해제인 것으로 이전에 밝혀진 마크로사이클릭 화합물 할리콘드린 B의 합성 유사체이다. 튜불린은 세포내 이동 및 수송, 세포 신호전달, 세포 형상의 유지 및 세포 분열을 포함하는 다양한 필수 세포 기능에 수반되는 미세소관으로 지칭되는 동적 미세섬유 세포골격 단백질을 구성한다. 암 세포의 신속한 분열 속도는 이들이 튜불린 기능의 차단에 특히 민감성이 되게 한다. 이와 같이, 할리콘드린 B 및 에리불린은 시험관내 및 생체내에서 주목할 만한 항암 활성이 입증된 바 있다(문헌[Tan et al. (2009) Clin Cancer Res. 15(12): 4213-4219]; 문헌[Vahdat et al. (2009) J. Clin. Oncol. 27(18): 2954-2961]). 에리불린의 메실레이트 염(에리불린 메실레이트)은 불응성 전이성 유방암을 갖는 환자의 치료를 위하여 상표명 Halaven™ 하에 현재 시판되고 있다.
에리불린의 이용이 ADC 환경을 포함하여 당업계에 보고된 바 있지만, 에리불린을 특정 조직, 예를 들어, 메소텔린을 발현하는 암 조직에 표적화된 방식으로 더 잘 전달하는 것이 필요하다. 마찬가지로, 예를 들어, 항원-결합에 관하여 뛰어난 특성 및/또는 페이로드, 예컨대 에리불린을 메소텔린을 발현하는 표적 세포 또는 조직에 효과적으로 전달하기 위한 능력을 갖는 메소텔린에 결합하는 개선된 항체가 당업계에서 필요하다.
다양한 실시형태에서, 본 개시는 부분적으로, 단독으로 사용되거나, (예를 들어, ADC로서) 하나 이상의 추가의 작용제에 연결되거나, 더 큰 거대분자(예를 들어, 이중특이적 항체, 단독의 또는 ADC 형식으로 페이로드에 연결된 다중특이적 항체로서의 다중특이적 항체)의 부분으로서 존재할 수 있고, 약제학적 조성물 또는 병용 요법의 부분으로서 투여될 수 있는 신규한 항체 및 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하며, 인간에서 면역원성이 더 적으면서, 비-인간 항체의 반응성을 보유한다. 특정 실시형태에서, 항체 및 항원-결합 단편은 인간 암 환자를 치료하는 데 유용할 수 있다.
본 개시는 더욱 구체적으로, 다양한 실시형태에서, 종양 세포에 결합하고/하거나 살해할 수 있는 항체 및 항체-약물 컨쥬게이트 화합물에 관한 것이다. 다양한 실시형태에서, 화합물은 또한, 결합 후에 표적 세포 내로 내재화될 수 있다. 에리불린 약물 모이어티를 항체 모이어티에 부착시키는 링커를 포함하는 ADC 화합물이 개시된다. 항체 모이어티는 전장 항체 또는 항원-결합 단편일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편은 카바트(Kabat) 넘버링 시스템(문헌[Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))])에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 1(HCDR1), SEQ ID NO: 2(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 3(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR); 및 SEQ ID NO: 4(LCDR1), SEQ ID NO: 5(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 6(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR); 또는 IMGT 넘버링 시스템(문헌[International ImMunoGeneTics Information System (IMGT®)])에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 7(HCDR1), SEQ ID NO: 8(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 9(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR); 및 SEQ ID NO: 10(LCDR1), SEQ ID NO: 11(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 12(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역으로부터의 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역으로부터의 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편은 항-메소텔린 항체 또는 항원-결합 단편이다. 다양한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 또는 개시된 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 및 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 인간 Ig 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 17의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 18의 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편은 카바트 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 19(HCDR1), SEQ ID NO: 20(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 21(HCDR3)의 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR); 및 SEQ ID NO: 22(LCDR1), SEQ ID NO: 23(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 24(LCDR3)의 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR); 또는 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 25(HCDR1), SEQ ID NO: 26(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 27(HCDR3)의 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR); 및 SEQ ID NO: 28(LCDR1), SEQ ID NO: 29(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 30(LCDR3)의 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR)을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 31의 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 32의 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 33의 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및 SEQ ID NO: 34의 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 35의 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 36의 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 전장 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 단일특이적 항체 또는 항원-결합 단편, 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 다중특이적 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 단일 쇄 가변 단편(scFv), 또는 Fab 단편이다.
다양한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 치료제, 예를 들어, 하나 이상의 소분자 및/또는 추가의 항체 또는 항원-결합 단편에 컨쥬게이트된다. 일부 실시형태에서, 치료제는 에리불린이다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 345A12-HC15-LC4이다.
다양한 실시형태에서, 본원에 개시된 ADC는 하기 화학식 I을 포함한다:
[화학식 I]
Ab-(L-D) p
상기 식에서,
Ab는 항체 또는 항원-결합 단편이고, 항체 또는 항원-결합 단편은 메소텔린에 결합할 수 있고, 카바트 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 1(HCDR1), SEQ ID NO: 2(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 3(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR); 및 SEQ ID NO: 4(LCDR1), SEQ ID NO: 5(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 6(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR); 또는 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 7(HCDR1), SEQ ID NO: 8(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 9(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR); 및 SEQ ID NO: 10(LCDR1), SEQ ID NO: 11(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 12(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR)을 포함하며;
D는 치료제, 예를 들어, 에리불린 모이어티이며;
L은 Ab를 D에 공유적으로 부착시키는 절단 가능한 링커이며;
p는 1 내지 8의 정수이다.
일부 실시형태에서, p는 1 내지 6의 정수이다. 일부 실시형태에서, p는 2 또는 6이다.
일부 실시형태에서, ADC는 절단 시에 링커 또는 항체 또는 항원-결합 단편의 부분이 치료제(예를 들어, 에리불린)에 결합된 채 남아 있지 않도록 위치한 절단 가능한 모이어티를 포함하는 절단 가능한 링커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 효소, 예컨대 카텝신(cathepsin) B에 의해 절단 가능한, 절단 가능한 펩티드 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 절단 가능한 모이어티는 절단 가능한 펩티드 모이어티, 예를 들어, 아미노산 유닛, 예컨대 Val-Cit를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산 유닛은 발린-시트룰린(Val-Cit)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 적어도 하나의 PEG 모이어티를 포함하는 적어도 하나의 스페이서 유닛을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이서 유닛 또는 링커는 (PEG)2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이서 유닛은 말레이미드(Mal) 모이어티("Mal-스페이서 유닛")를 통해 항체 모이어티에 부착한다. 일부 실시형태에서, Mal-스페이서 유닛은 항체 또는 항원-결합 단편 상의 시스테인 잔기(예를 들어, 항체 상의 LCcys80 잔기)를 통해 항체 또는 항원-결합 단편에 연결된다. 일부 실시형태에서, Mal-스페이서 유닛은 항체 또는 항원-결합 단편 상의 경쇄 가변 영역의 시스테인 잔기(예를 들어, LCcys80)에 연결된다. 일부 실시형태에서, 2개의 -L-D 모이어티가 항체 또는 항원-결합 단편에 부착되도록, p는 2이다. 일부 실시형태에서, 각각의 -L-D 모이어티는 항체 또는 항원-결합 단편 상의 경쇄 가변 영역의 시스테인 잔기(예를 들어, LCcys80)에 부착된다. 일부 실시형태에서, 시스테인 잔기는 LCcys80, 즉, 카바트 넘버링 시스템에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 상의 경쇄 가변 영역의 아미노산 위치 80에서의 시스테인 잔기이다. 일부 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 Mal-스페이서 유닛 및 절단 가능한 펩티드 모이어티를 포함하며, 절단 가능한 펩티드 모이어티는 Val-Cit를 포함한다. 일부 실시형태에서, Mal-스페이서 유닛은 항체 또는 항원-결합 단편을 절단 가능한 모이어티에 부착시킨다.
일부 실시형태에서, Mal-스페이서 유닛은 적어도 하나의 PEG 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 Mal-(PEG)2를 포함한다. 일부 실시형태에서, Mal-스페이서 유닛은 항체 모이어티를 링커 내의 절단 가능한 모이어티에 부착시킨다. 일부 실시형태에서, 링커 내의 절단 가능한 모이어티는 절단 가능한 펩티드 모이어티, 예를 들어, 아미노산 유닛이다. 일부 실시형태에서, 링커는 Mal-(PEG)2-Val-Cit를 포함한다.
일부 실시형태에서, ADC의 절단 가능한 모이어티는 에리불린에 직접 연결되거나, 스페이서 유닛은 링커 내의 절단 가능한 모이어티를 에리불린 약물 모이어티에 부착시키고, 컨쥬게이트의 절단에 의해, 항체 또는 항원-결합 단편 및 링커로부터 에리불린이 방출된다.
일부 실시형태에서, 절단 가능한 모이어티를 에리불린 약물 모이어티에 부착시키는 스페이서 유닛은 자가-희생적(self-immolative)이다. 일부 실시형태에서, 자가-희생적 스페이서 유닛은 p-아미노벤질옥시카보닐(pAB)을 포함한다. 일부 실시형태에서, pAB 스페이서 유닛은 C-35 아민을 통해 절단 가능한 모이어티를 에리불린 약물 모이어티에 부착시킨다. 일부 실시형태에서, 절단 가능한 모이어티는 절단 가능한 펩티드 모이어티, 예를 들어, 아미노산 유닛이다. 일부 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 Val-Cit-pAB를 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 Val-Cit-pAB, 및 링커를 Mal 모이어티를 통해 항체 모이어티에 연결하는 PEG 스페이서 유닛을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB를 포함한다.
다양한 실시형태에서, ADC의 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 또는 하나 이상의 복귀 돌연변이를 갖는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크를 포함한다. 다양한 실시형태에서, ADC의 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO 13의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다양한 실시형태에서, ADC의 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 및 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 인간 Ig 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다. 다양한 실시형태에서, ADC의 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 17의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 18의 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 실시형태에서, ADC는 하기 화학식 I을 갖는다:
[화학식 I]
Ab-(L-D) p
상기 식에서,
Ab는 항체 또는 항원-결합 단편이고, 항체 또는 항원-결합 단편은 메소텔린에 결합할 수 있고, 카바트 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 1(HCDR1), SEQ ID NO: 2(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 3(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR); 및 SEQ ID NO: 4(LCDR1), SEQ ID NO: 5(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 6(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR); 또는 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 7(HCDR1), SEQ ID NO: 8(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 9(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR); 및 SEQ ID NO: 10(LCDR1), SEQ ID NO: 11(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 12(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR)을 포함하며;
D는 에리불린이며;
L은 Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB를 포함하는 절단 가능한 링커이며;
p는 1 내지 8의 정수이며, 예를 들어, p는 2 내지 6 또는 3 내지 4의 정수이다.
일부 실시형태에서, p는 1 내지 6의 정수이다. 일부 실시형태에서, p는 2 또는 6이다.
다양한 실시형태에서, ADC(예를 들어, 상기 기술된 ADC)의 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 또는 하나 이상의 복귀 돌연변이를 갖는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크를 포함한다. 다양한 실시형태에서, ADC의 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 13과 적어도 90% 동일한 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 SEQ ID NO: 14와 적어도 90% 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다양한 실시형태에서, ADC의 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 및 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 인간 Ig 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다. 다양한 실시형태에서, ADC의 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 17의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 18의 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 실시형태에서, ADC는 하기 화학식 I을 갖는다:
[화학식 I]
Ab-(L-D) p
상기 식에서,
Ab는 항체 또는 항원-결합 단편이고, 항체 또는 항원-결합 단편은 메소텔린에 결합할 수 있고, SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며;
D는 에리불린이며;
L은 Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB를 포함하는 절단 가능한 링커이며;
p는 1 내지 8의 정수이며, 예를 들어, p는 2 내지 6 또는 3 내지 4의 정수이다.
일부 실시형태에서, p는 1 내지 6의 정수이다. 일부 실시형태에서, p는 2 또는 6이다.
일부 실시형태에서, ADC의 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 및 인간 Ig 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 중쇄 불변 영역 및 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 Ig 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 기술된 항체, 항원-결합 단편, 컨쥬게이트 및/또는 ADC 조성물을 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 본원에 기술된 하나 이상의 항체 또는 항원-결합 단편 및/또는 하나 이상의 ADC를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 다수의 카피의 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 다수의 카피의 본원에 개시된 ADC를 포함하며, ADC의 평균 p는 약 1 내지 약 6이다. 일부 실시형태에서, 조성물 내의 ADC의 평균 p는 약 1.7 또는 2, 또는 약 6이다.
다양한 실시형태에서, 예를 들어, 암의 치료에서의, 기술된 항체, 항원-결합 단편, 컨쥬게이트 및/또는 ADC 조성물에 대한 치료적 용도가 본원에 제공된다. 특정 양태에서, 본 개시는 컨쥬게이트 또는 ADC의 항체, 항원-결합 단편 및/또는 항체 모이어티에 의해 표적화된 항원, 예컨대 메소텔린을 발현하는 암의 치료 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 본 개시는 치료적 유효량 및/또는 요법의 본원에 기술된 항체, 항원-결합 단편, 컨쥬게이트 및/또는 ADC 중 어느 하나를 투여함으로써 종양 세포 또는 암 세포의 살해 또는 이의 증식의 저해 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 암은 메소텔린-발현 암, 예컨대 중피종, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 자궁내막암, 두경부암, 간암, 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암), 난소암(예를 들어, 장액성 또는 투명 세포 난소암), 췌장암, 전립선암, 신장암, 위암, 갑상선암, 방광암, 자궁암, 담도암, 또는 백혈병이다.
특정 양태에서, 본 개시는 예를 들어, 암(예를 들어, 메소텔린-발현 암)을 갖거나, 이를 갖는 것으로 의심되는 대상체가 메소텔린을 표적화하는 작용제, 예를 들어, 본원에 개시된 항체 또는 항체 결합 단편, 컨쥬게이트 또는 ADC로의 치료에 반응성일지 여부를 결정하기 위한 기술된 항체, 항원-결합 단편, 컨쥬게이트 및/또는 ADC 화합물 및 조성물에 대한 용도를 제공한다. 일부 실시형태에서, 당해 방법은 대상체로부터 생물학적 시료를 제공하는 단계; 시료를 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 및 시료 내의 하나 이상의 암 세포로의 항체 또는 항원-결합 단편의 결합을 검출하는 단계를 포함한다.
특정한 다른 양태에서, 본 개시는 항체 또는 항체 결합 단편, 컨쥬게이트 및/또는 ADC 및 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 개시된 항체 또는 항체 결합 단편, 컨쥬게이트 또는 ADC 화합물 및 조성물의 생성 방법도 또한 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 항체 또는 항원-결합 단편, 컨쥬게이트, 또는 ADC를 인코딩하는 핵산 서열(들)이 제공된다. 핵산(들)은 단리된 핵산, 포함하는 단리된 벡터 내로 혼입된 핵산 및/또는 항체 또는 항원-결합 단편을 생성하기에 적합한 조건 하에서 세포 모집단에 의해 발현되는 항체 또는 항원-결합 단편의 형태일 수 있다.
도 1은 유세포측정에 의한 인간 메소텔린에 대한 면역 혈청의 특이적인 반응성의 검출을 보여준다.
도 2는 ELISA에 의한 인간 메소텔린에 대한 배양 상청액의 특이적인 반응성의 검출을 보여준다.
도 3은 겔 전기영동에 의한 항-메소텔린 항체의 인-퓨전(In-Fusion) PCR 증폭을 보여준다.
도 4는 인-퓨전 클로닝 및 발현을 위한 항-메소텔린 클론을 보여준다.
도 5는 정제된 48 Rb-hu-xi 항-메소텔린 항체의 요약을 보여준다.
도 6은 항-메소텔린-AuF 컨쥬게이트에 대한 시험관내 세포-기반의 효력 결과를 보여준다.
도 7은 항-메소텔린 항체의 에피토프 비닝(binning) 특성화를 보여준다.
도 8은 인간화된 345A12 항체에 대한 DSC 분석 결과를 보여준다. 345A12 F(ab')2 단편을 100℃/시간의 스캔 속도를 사용하여 25 내지 100℃ 범위의 열 분석으로 처리하였다.
도 9는 다양한 매트릭스에서의 MORAb-109(345A12-HC15-LC4-VCP-에리불린)(DAR2)의 안정성을 보여준다.
도 10a 및 도 10b는 2.5 ㎎/㎏의 345A12-HC1-LC2-diOH 에리불린 이량체 ADC 또는 2.5 ㎎/㎏의 102A6A2-HC1-LC2-diOH 에리불린 이량체 ADC로 처리되는 인간 비소세포 폐암(NSCLC) NCI-H2110 이종이식편 모델에서의 항-종양 효과(도 10a) 및 체중 변화(도 10b)를 보여준다(연구 M109-004-2016).
도 11a 및 도 11b는 345A12-HC1-LC2-diOH 에리불린 이량체 ADC(5, 10, 15, 또는 20 ㎎/㎏)(도 11a) 또는 345A12-HC15-LC4-diOH 에리불린 이량체 ADC(5, 10, 또는 20 ㎎/㎏)(도 11b)로 처리되는 암컷 CD-1 마우스의 체중 변화를 보여준다(연구 M109-006-2017).
도 12a 및 도 12b는 2.5 ㎎/㎏의 345A12-HC10-LC4-diOH 에리불린 이량체 ADC 또는 2.5 ㎎/㎏의 345A12-HC15-LC4-diOH 에리불린 이량체 ADC로 처리되는 인간 NSCLC NCI-H2110 이종이식편 모델에서의 항-종양 효과(도 12a) 및 체중 변화(도 12b)를 보여준다(연구 M109-007-2017).
도 13a 및 도 13b는 MORAb-109(DAR2 또는 DAR6)로 처리되는 인간 위암 NCI-N87 이종이식편 모델에서의 항-종양 효과(도 13a) 및 체중 변화(도 13b)를 보여준다(연구 M109-010-2018).
도 14a 및 도 14b는 MORAb-109(DAR2 또는 DAR6) 또는 에리불린으로 처리되는 인간 중피종 HAY 이종이식편 모델에서의 항-종양 효과(도 14a) 및 체중 변화(도 14b)를 보여준다(연구 M109-010-2018).
도 15a 및 도 15b는 MORAb-109(DAR6) 또는 에리불린으로 처리되는 인간 중피종 PDX 모델(Meso7212)에서의 항-종양 효과(도 15a) 및 체중 변화(도 15b)를 보여준다.
도 16a 및 도 16b는 MORAb-109의 상이한 DAR 종 또는 에리불린으로 처리되는 인간 중피종 PDX 모델(Meso7212)에서의 항-종양 효과(도 16a) 및 체중 변화(도 16b)를 보여준다.
도 17은 다양한 세포주에서의 에리불린 및 MORAb-109(DAR2 및 DAR6)의 메소텔린(MSLN) 발현 및 시험관내 효력(IC50) 간의 상관관계 분석을 보여준다. MORAb-109(DAR2)에 대한 상관관계를 모든 51개 세포주에서 그리고 더 높은 메소텔린 발현 수준(80 이상의 평균 형광 세기(MFI)의 FACS 염색)을 갖는 세포주의 하위세트에서 분석하였다. 하위세트는 더 낮은 메소텔린 발현 수준(80 미만의 MFI의 FACS 염색)을 갖는 세포주를 배제하였다.
도 18a 내지 도 18c는 5 ㎎/㎏ 내지 25 ㎎/㎏의 범위의 상이한 용량의 MORAb-109(DAR2)로 처리되는 인간 위암 NCI-N87 이종이식편 모델에서의 항-종양 효과(도 18a 및 도 18b) 및 체중 변화(도 18c)를 보여준다.
도 19는 5 ㎎/㎏ 내지 25 ㎎/㎏의 범위의 상이한 용량의 MORAb-109(DAR2)로의 처리 후의 NCI-N87 종양-보유 마우스에서의 전체 및 온전한 MORAb-109(DAR2)의 농도(㎍/㎖)를 보여준다.
도 20a 및 도 20b는 MORAb-109(DAR2)(5 ㎎/㎏) 또는 에리불린(0.1 또는 3.2 ㎎/㎏)으로 처리되는 인간 난소암 OVCAR-3-A1-T1 이종이식편 모델에서의 항-종양 효과(도 20a) 및 체중 변화(도 20b)를 보여준다.
도 21a 및 도 21b는 MORAb-109(DAR2)(10 ㎎/㎏) 또는 에리불린(0.1 또는 3.2 ㎎/㎏)으로 처리되는 인간 NSCLC PDX 모델(LC-F-25)에서의 항-종양 효과(도 21a) 및 체중 변화(도 21b)를 보여준다.
도 22a 및 도 22b는 MORAb-109(DAR2)(10 ㎎/㎏) 또는 에리불린(0.2 또는 3.2 ㎎/㎏)으로 처리되는 인간 NSCLC PDX 모델(LXFA-737)에서의 항-종양 효과(도 22a) 및 체중 변화(도 22b)를 보여준다.
도 23a 및 도 23b는 10 ㎎/㎏의 단회 용량의 MORAb-109(DAR2 또는 DAR6)(군당 3마리 마우스)로 처리되는 인간 위암 NCI-N87 이종이식편 모델에서의 항-종양 효과(도 23a) 및 체중 변화(도 23b)를 보여준다.
도 24a 및 도 24b는 10 ㎎/㎏의 단회 용량의 MORAb-109(DAR2 또는 DAR6)로의 처리 후의 NCI-N87 종양-보유 마우스 유래의 혈장 시료에서의 MORAb-109 (DAR2)(도 24a) 또는 MORAb-109(DAR6)(도 24b)의 DAR을 보여준다.
도 25a 및 도 25b는 NCI-N87 위암 세포에서의 MORAb-109(DAR2)(도 25a) 또는 BAY 94-9343(도 25b)의 세포 독성(살해%)을 보여준다. 둘 모두의 항-MSLN ADC를 단독으로 및 비컨쥬게이트된 항체의 존재 하에 평가하였다.
도 26a 및 도 26b는 루시퍼라제 검정에 의해 측정되는 바와 같은 MORAb-109(DAR2) 및 345A12-HC15-LC4(도 26a) 또는 BAY 94-9343 및 아네투맙(anetumab)(도 26b)의 ADCC 활성을 보여준다. ADCC 활성을 상대적 곡선 아래 면적(AUC)에 의해 계산하였다.
도 27은 마우스 및 인간 혈장에서의 항-MSLN ADC, MORAb-109(DAR2) 및 BAY 94-9343의 안정성 분석을 보여준다.
도 28a 및 도 28b는 MORAb-109(DAR2)(5 ㎎/㎏), BAY 94-9343(5 ㎎/㎏), 또는 에리불린(1 ㎎/㎏)으로 처리되는 인간 위암 NCI-N87 이종이식편 모델에서의 항-종양 효과(도 28a) 및 체중 변화(도 28b)를 보여준다.
도 29a 및 도 29b는 MORAb-109(DAR2)(5 ㎎/㎏), BAY 94-9343(5 ㎎/㎏), 또는 에리불린(1 ㎎/㎏)으로 처리되는 인간 중피종 HAY 이종이식편 모델에서의 항-종양 효과(도 29a) 및 체중 변화(도 29b)를 보여준다.
도 30a 및 도 30b는 MORAb-109(DAR2)(10 ㎎/㎏), BAY 94-9343(10 ㎎/㎏), 에리불린(1 ㎎/㎏), 또는 DM4(0.3 ㎎/㎏)로 처리되는 인간 중피종 PDX 모델(Meso7212)에서의 항-종양 효과(도 30a) 및 체중 변화(도 30b)를 보여준다.
도 31a 및 도 31b는 MORAb-109(DAR2)(25 ㎎/㎏), BAY 94-9343(DAR ~ 4)(25 ㎎/㎏), 또는 에리불린(3.2 ㎎/㎏)으로 처리되는 인간 NSCLC PDX 모델(LXFA-586)에서의 항-종양 효과(도 31a) 및 체중 변화(도 31b)를 보여준다.
도 32a 및 도 32b는 MORAb-109(DAR2)(25 ㎎/㎏), MORAb-109(DAR2)(12.5 ㎎/㎏), MORAb-109(DAR2)(12.5 ㎎/㎏, QWx3), BAY 94-9343(DAR ~ 4)(12.5 ㎎/㎏), 또는 에리불린(3.2 ㎎/㎏)으로 처리되는 인간 NSCLC PDX 모델(LXFL-529)에서의 항-종양 효과(도 32a) 및 체중 변화(도 32b)를 보여준다.
개시된 조성물 및 방법은 본 개시의 일부를 형성하는 첨부된 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 대한 참조에 의해 보다 용이하게 이해될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어가 오직 예로서 특정 실시형태를 기술하는 목적을 위한 것이며, 문맥에서 다르게 나타내지 않는 한, 청구된 조성물 및 방법을 제한하는 것으로 의도되지 않는 것을 이해해야 한다.
이 본문 전체에서, 설명은 조성물 및 조성물의 이용 방법을 언급한다. 본 개시가 조성물과 관련된 특징 또는 실시형태를 기재하거나 청구하는 경우, 이러한 특징 또는 실시형태는 조성물을 사용하는 방법에 동일하게 적용 가능하다. 마찬가지로, 본 개시가 조성물을 사용하는 방법과 관련된 특징 또는 실시형태를 기재하거나 청구하는 경우, 이러한 특징 또는 실시형태는 조성물에 동일하게 적용 가능하다.
값의 범위가 표현되는 경우, 이는 범위 내의 임의의 구체적인 값을 사용하는 실시형태를 포함한다. 추가로, 범위로 명시된 값에 대한 언급은 해당 범위 내의 모든 값 각각을 포함한다. 모든 범위는 그의 종점을 포함하며 조합 가능하다. 값이 선행사 "약"의 사용에 의해, 근사치로서 표현되는 경우, 구체적인 값이 또 다른 실시형태를 형성함이 이해될 것이다. 구체적인 수치에 대한 언급은, 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 적어도 해당 구체적인 값을 포함한다. "또는"의 사용은 그 사용의 특정 문맥이 달리 지시하지 않는 한 "및/또는"을 의미할 것이다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 임의의 목적을 위해 참조로서 포함된다. 참고문헌과 명세서가 상충하는 경우, 명세서가 우선할 것이다.
명확성을 위해, 개별 실시형태의 맥락에서 본원에 기술된, 개시된 조성물 및 방법의 일정 특징은, 또한 단일 실시형태에서 조합으로 제공될 수 있음이 인식되어야 한다. 반대로, 간결성을 위해, 단일 실시형태의 맥락에서 기술된 개시된 조성물 및 방법의 다양한 특징은, 또한 개별적으로 또는 임의의 하위조합으로 제공될 수 있다.
정의
명세서 및 청구범위 전체에서 설명의 양태와 관련된 다양한 용어가 사용된다. 이러한 용어에는 달리 표시되지 않는 한 당업계에서의 이들의 통상적 의미가 주어져야 한다. 다른 구체적으로 정의된 용어는 본원에 제공된 정의와 일관된 방식으로 해석되어야 한다.
본원에 사용된 단수 형태 부정관사 "a", "an" 및 정관사 "the"는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수 형태를 포함한다.
수치 및 범위의 맥락에서 용어 "약" 또는 "대략"은 실시형태가, 본원에 포함된 교시로부터 당업자에게 명백한 바와 같이, 반응 혼합물 중에 원하는 양의 핵산 또는 폴리펩티드를 갖는 것과 같이, 의도된 바와 같이 수행될 수 있도록 열거된 값 또는 범위에 근사하거나 이와 가까운 값 또는 범위를 지칭한다. 따라서, 이들 용어는 시스템 오류로부터 초래되는 것들 이상의 값을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약은 수치적 양의 플러스 또는 마이너스 10%를 의미한다.
용어 "항체-약물 컨쥬게이트", "항체 컨쥬게이트", "컨쥬게이트", "면역컨쥬게이트" 및 "ADC"는 상호 교환 가능하게 사용되며, 항체 모이어티에 연결된 치료 화합물(예를 들어, 에리불린 모이어티)을 지칭하며, 하기의 일반식에 의해 정의된다: Ab-(L-D) p (화학식 I), 여기서 Ab는 항체 모이어티(예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편)이며, L은 링커 모이어티이며, D는 약물 모이어티(예를 들어, 에리불린 약물 모이어티)이며, p는 항체 모이어티당 약물 모이어티의 수이다. 에리불린 약물 모이어티를 포함하는 ADC에서, "p"는 항체 모이어티에 연결된 에리불린 모이어티의 수를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 링커 L은 항체 모이어티에, 그리고 치료 화합물에 직접적으로 부착될 수 있는 절단 가능한 모이어티를 포함할 수 있거나, 또는 절단 가능한 모이어티는 스페이서 유닛(들)에 의해 항체 모이어티 및 치료 화합물 중 어느 하나에 또는 둘 모두에 부착될 수 있다. 일부 실시형태에서, 스페이서 유닛이 절단 가능한 모이어티를 치료 화합물에 부착시키는 경우, 이는 자가-희생적 스페이서 유닛이다.
용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역 내의 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해, 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 또는 전술한 것의 조합과 같은 표적을 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭하기 위해 가장 넓은 의미로 사용된다. 항체의 중쇄는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 경쇄는 경쇄 가변 도메인(VL) 및 경쇄 불변 도메인(CL)으로 구성된다. 본 출원의 목적을 위해, 성숙한 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 각각 N-말단에서 C-말단으로 배열된 4개의 프레임워크 영역(FR1, FR2, FR3, 및 FR4) 내에 3개의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. "항체"는 자연적으로 발생하거나, 종래의 하이브리도마 기술에 의해 생성되는 모노클로널 항체와 같이, 인공일 수 있다. 용어 "항체"는 전장 모노클로널 항체 및 전장 폴리클로널 항체뿐만 아니라, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 및 단일 사슬 항체와 같은 항체 단편도 포함한다. 항체는 5개 주요 면역글로불린 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 중 어느 하나, 또는 이의 하위 부류(예를 들어, 아이소타입 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)일 수 있다. 용어는, 원하는 생물학적 활성을 보여주는 한, 인간 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 항원 인식 부위를 함유하는 임의의 변형된 면역글로불린 분자를 추가로 포함한다.
본원에 사용된, 용어 "모노클로널 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로널 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원 에피토프에 대해 유도된다. 대조적으로, 종래의(폴리클로널) 항체 제제는 전형적으로 상이한 에피토프에 대해 유도된(또는 이에 특이적인) 다수의 항체를 포함한다. 수식어 "모노클로널"은 항체의 특성을 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득되는 것으로 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생성을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 개시에 따라 사용될 모노클로널 항체는 문헌[Kohler et al. (1975) Nature 256: 495]에 의해 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)에 의해 제조될 수 있다. 모노클로널 항체는 또한 예를 들어, 문헌[Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-8], 및 문헌[Marks et al. (1991) J Mol Biol. 222: 581-97]에 기술된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에 기술된 모노클로널 항체는, 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체 내의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이면서, 사슬(들)의 나머지가 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체 내의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체뿐만 아니라, 이들이 표적 항원에 특이적으로 결합하고/하거나 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 이러한 항체의 단편을 포함한다.
본원에 사용된, 용어 "키메라 항체"는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 둘 이상의 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 일부 예에서, 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 영역은 원하는 특이성, 친화성, 및 활성을 갖는 하나의 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역에 대응하는 반면, 불변 영역은 또 다른 종(예를 들어, 인간)으로부터 유래된 항체에 상동성이어서 후자의 종에서의 면역 반응을 최소화한다.
본원에 사용된, 용어 "인간화 항체"는 인간 항체뿐만 아니라 비-인간(예를 들어, 토끼) 항체 유래의 서열을 함유하는 항체의 형태를 지칭한다. 이러한 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 모든 적어도 1개 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크(FR) 영역은 인간 면역글로불린 서열의 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크(FR) 영역이다. 인간화 항체는 선택적으로 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 것이다. 인간화 항체는 항체 특이성, 친화성, 및/또는 활성을 개선 및 최적화하기 위해, Fv 프레임워크 영역 내의 및/또는 대체된 비-인간 잔기 내의 잔기의 치환에 의해 추가로 변형될 수 있다.
본원에 사용된, 용어 항체의 "항원-결합 단편", "항원-결합 도메인" 또는 "항원-결합 부분"은 항원(예를 들어, 메소텔린)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 또는 단백질의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항원-결합 단편은 또한 항원-발현 세포 내로 내재화하는 능력을 보유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 또한 면역 이펙터 활성을 보유한다. 전장 항체의 단편이 전장 항체의 항원-결합 기능을 수행할 수 있음이 나타났다. 용어 항체의 "항원-결합 단편", "항원-결합 도메인" 또는 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인, Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인, F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) 단일 가변 도메인, 예를 들어 VH 도메인을 포함하는, dAb 단편(예를 들어, 문헌[Ward et al. (1989) Nature 341: 544-6]; 및 국제 공개 제WO 1990/005144호 참조); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 또한, Fv 단편의 두 도메인인, VL 및 VH는 개별 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은, 단일 단백질 사슬로서 제조되는 것이 가능하게 하는 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 사용하여, 연결될 수 있으며 여기서 VL 및 VH 영역은 쌍을 이루어 1가 분자(단일 사슬 Fv(scFv)로 알려짐)를 형성한다. 예를 들어, 문헌[Bird et al. (1988) Science 242: 423-6]; 및 문헌[Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci. USA 85: 5879-83]을 참조한다. 이러한 단일 사슬 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 단편" 또는 "항원-결합 부분" 내에 포함되도록 의도되고, 결합 시 세포 내로 내재화될 수 있는 결합 단편의 예시적인 유형으로서 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Zhu et al. (2010) 9: 2131-41]; 문헌[He et al. (2010) J Nucl Med. 51: 427-32]; 및 문헌[Fitting et al. (2015) MAbs 7: 390-402] 참조). 특정 실시형태에서, scFv 분자는 융합 단백질로 통합될 수 있다. 디아바디와 같은, 다른 형태의 단일 사슬 항체 또한 포함된다. 디아바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 발현되지만, 동일한 사슬 상의 두 도메인 사이에서 쌍 형성이 가능하도록 하기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인이 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 형성하도록 하고 2개의 항원-결합 부위를 생성하는 2가의 이중 특이적 항체이다(예를 들어, 문헌[Holliger et al. (1993) Proc Natl Acad Sci. USA 90: 6444-8]; 및 문헌[Poljak et al. (1994) Structure 2: 1121-3] 참조). 항원-결합 단편은 당업자에게 알려진 종래의 기술을 사용하여 수득되고, 결합 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성(예를 들어, 결합 친화성, 내재화)에 대해 스크리닝된다. 항원-결합 단편은 온전한 단백질의 절단에 의해, 예를 들어 프로테아제 또는 화학적 절단에 의해, 제조될 수 있다.
항체 또는 항원-결합 단편에 관하여 본원에 사용된 "내재화"는 세포에 결합 시 세포의 지질 이중층 막을 통해 내부 구획으로, 전형적으로는 세포의 분해성 구획 내로 이동될 수 있는(즉, "내재화된") 항체 또는 항원-결합 단편을 지칭한다. 예를 들어, 내재화되는 항-메소텔린 항체는 세포 막 상의 메소텔린에 결합한 후 세포 내로 이동될 수 있는 것이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 ADC에 사용되는 항체 또는 항원-결합 단편은 내재화 항체 또는 내재화 항원-결합 단편을 통해 세포 표면 항원(예를 들어, 메소텔린)을 표적화한다(ADC가 항원-결합 후 세포막을 통해 전달되게 함).
본원에 사용되는 용어 "메소텔린" 또는 "MSLN"은 임의의 고유 형태의 인간 메소텔린(MSLN)을 지칭한다. 당해 용어는 전장 메소텔린(예를 들어, NCBI 참조 서열: AAC50348.1) 및 세포 가공으로부터 초래되는 임의의 형태의 인간 메소텔린을 포함한다. 당해 용어는 또한, 스플라이스 변이체, 대립유전자 변이체 및 아이소폼을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는 메소텔린의 자연 발생 변이체를 포함한다. 메소텔린은 인간으로부터 단리될 수 있거나, 재조합적으로 또는 합성 방법에 의해 생성될 수 있다. 당해 용어는 또한, 항-메소텔린 항체, 예를 들어, 본원에 개시된 항체 및/또는 항원-결합 단편이 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 합성 변이체를 포함할 수 있다.
용어 "항-메소텔린 항체" 또는 "메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체"는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 임의의 형태의 항체 또는 이의 단편을 지칭하며, 모노클로널 항체(전장 모노클로널 항체 포함), 폴리클로널 항체 및 이들이 메소텔린에 특이적으로 결합하는 한 생물학적으로 기능성인 항체 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 ADC에서 사용되는 항-메소텔린 항체는 내재화 항체 또는 내재화 항체 단편이다. 345A12(예를 들어, 345A12-HC15-LC4) 및 102A6A2는 예시적인 내재화 항-인간 메소텔린 항체이다. 본원에 사용된, 용어 "특이적", "특이적으로 결합하는" 및 "특이적으로 결합한다"는 표적 항원 에피토프로의 항체의 선택적인 결합을 지칭한다. 항체는, 주어진 조건의 세트 하에서 관련 없는 항원 또는 항원 혼합물으로의 결합과 적절한 항원으로의 결합을 비교함으로써 결합의 특이성에 대해 시험될 수 있다. 항체가 관련 없는 항원 또는 항원 혼합물에 비해 적어도 2배, 5배, 7배 또는 10배 더 큰 친화성으로 적절한 항원에 결합하면, 특이적이라고 고려된다. "특이적 항체" 또는 "표적-특이적 항체"는 표적 항원(예를 들어, 메소텔린)에만 결합하고, 다른 항원에는 결합하지 않는(또는 최소 결합을 나타내는) 것이다.
용어 "에피토프"는 항체에 의해 인식되고 특이적으로 결합될 수 있는 항원의 부분을 지칭한다. 항원이 폴리펩티드인 경우, 에피토프는 폴리펩티드의 3차 폴딩에 의해 병치되는 인접 아미노산 또는 비인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 항체에 의해 결합되는 에피토프는, 항원-항체 복합체의 직접적인 가시화에 의한 에피토프 식별을 위한 X-선 결정학뿐만 아니라, 항원의 단편 또는 돌연변이된 변이에 대한 항체의 결합을 모니터링하는 것, 또는 항체 및 항원의 상이한 부분의 용매 접근성을 모니터링하는 것을 포함하여, 당업계에 알려진 임의의 에피토프 맵핑 기법을 사용하여 식별될 수 있다. 항체 에피토프를 맵핑하는 데 사용되는 예시적인 전략으로는 어레이-기반 올리고-펩티드 스캐닝, 제한된 단백질 분해, 부위-지정 돌연변이 유발, 고-처리량 돌연변이 유발 맵핑, 수소-중수소 교환, 및 질량 분광분석법이 포함되나 이에 한정되지 않는다(예를 들어, 문헌[Gershoni et al. (2007) 21: 145-56]; 및 문헌[Hager-Braun and Tomer (2005) Expert Rev Proteomics 2: 745-56] 참조).
경쟁적 결합 및 에피토프 비닝(binning)은 또한 동일하거나 중첩되는 에피토프를 공유하는 항체를 결정하는 데 사용될 수 있다. 경쟁적 결합은, 문헌["Antibodies, A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow and Lane (1st edition 1988, 2nd edition 2014)]에 기술된 검정법과 같은, 교차-차단 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시험 항체 또는 결합 단백질이 교차-차단 검정에서 메소텔린과 같은 표적 항원에 대한 참조 항체 또는 결합 단백질(예를 들어, 표 1 내지 3에서 확인된 것들로부터 선택되는 CDR 및/또는 가변 도메인을 포함하는 결합 단백질)의 결합을 적어도 약 50%(예를 들어, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99.5% 이상, 또는 그 사이의 임의의 백분율) 감소시키는 경우 및/또는 그 반대의 경우, 경쟁적 결합이 확인된다. 일부 실시형태에서, 경쟁적 결합은 공유되거나 유사한(예를 들어, 부분적으로 중첩되는) 에피토프에 기인하거나, 항체 또는 결합 단백질이 인근의 에피토프에서 결합하는 입체 장애에 기인할 수 있다(예를 들어, 문헌[Tzartos, Methods in Molecular Biology (Morris, ed. (1998) vol.66, pp.55-66)] 참조). 일부 실시형태에서, 경쟁적 결합은 유사한 에피토프를 공유하는 결합 단백질의 군을 분류하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 결합을 위해 경쟁하는 결합 단백질은 중첩되거나 인근의 에피토프를 갖는 결합 단백질의 군으로 "비닝"될 수 있으며, 경쟁하지 않는 것들은 중첩되거나 인근의 에피토프를 갖지 않는 개별 결합 단백질의 군에 배치된다.
용어 "kon" 또는 "ka"는 항원에 대한 항체의 회합으로 항체/항원 복합체를 형성하는 것에 대한 결합-속도(on-rate) 상수를 지칭한다. 속도는, 표면 플라즈몬 공명, 생물층 간섭계, 또는 ELISA 검정과 같은, 표준 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
용어 "koff" 또는 "kd"는 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리에 대한 해리-속도(off-rate) 상수를 지칭한다. 속도는, 표면 플라즈몬 공명, 생물층 간섭계, 또는 ELISA 검정과 같은, 표준 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭한다. KD는 ka/kd로 계산된다. 속도는, 표면 플라즈몬 공명, 생물층 간섭계, 또는 ELISA 검정과 같은, 표준 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
용어 "p" 또는 "약물 로딩" 또는 "약물:항체 비" 또는 "약물-대-항체 비" 또는 "DAR"은 항체 모이어티당 약물 모이어티의 수, 즉, 약물 로딩, 또는 화학식 I의 ADC에서 항체 또는 항원-결합 단편(Ab) 당 -L-D 모이어티의 수를 지칭한다. 에리불린 약물 모이어티를 포함하는 ADC에서, "p"는 항체 모이어티에 연결된 에리불린 모이어티의 수를 지칭한다. 예를 들어, 2개의 에리불린 모이어티가 항체 모이어티에 연결되는 경우, p=2이다. 화학식 I의 ADC의 다수 카피를 포함하는 조성물에서, "평균 p"는, 또한 "평균 약물 로딩"으로도 지칭되는, ADC의 모집단 내의 항체 또는 항원-결합 단편 당 -L-D 모이어티의 평균 수를 지칭한다.
"링커" 또는 "링커 모이어티"는 화합물, 통상적으로 약물 모이어티, 예컨대 에리불린을 또 다른 모이어티, 예컨대 항체 모이어티에 공유적으로 연결할 수 있는 임의의 화학적 모이어티를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 링커는 화합물 또는 항체가 활성을 유지하는 조건에서, 산-유도 절단, 펩티다제-유도 절단, 광-기반 절단, 에스테라제-유도 절단, 및/또는 이황화 결합 절단에 영향을 받기 쉽거나 실질적으로 저항성일 수 있다.
용어 "작용제"는 본원에서 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대 분자, 또는 생물학적 물질로부터 제조된 추출물을 지칭하기 위해 사용된다. 용어 "치료제" 또는 "약물"은 생물학적 과정을 조절할 수 있고/있거나 생물학적 활성을 갖는 작용제를 지칭한다. 본원에 기술된 에리불린 단량체는 예시적인 치료제이다.
용어 "화학치료제" 또는 "항암제"는 작용 메커니즘에 관계 없이 암 치료에 효과적인 모든 작용제를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 전이 또는 혈관신생의 저해는 종종 화학치료제의 특성이다. 화학치료제는 항체, 생물학적 분자, 및 소분자를 포함하고, 본원에 기술된 에리불린을 포함한다. 화학치료제는 세포 독성 또는 세포 증식 억제제일 수 있다. 용어 "세포 증식 억제제"는 세포 성장 및/또는 세포 증식을 저해 또는 억제하는 작용제를 지칭한다. 용어 "세포 독성제"는 주로 세포의 발현 활성 및/또는 기능을 방해함으로써 세포 사멸을 유발하는 물질을 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "에리불린" 또는 "에리불린 단량체"는 원래 해양 해면 할리콘드리아 오카다이스(Halichondria okadais)로부터 단리된 마크로사이클릭 화합물인 할리콘드린 B의 합성 유사체를 지칭한다. 에리불린은 튜불린에 결합하는 것으로 여겨지고 유사분열 방추사 어셈블리를 저해함으로써 G2/M 단계에서 세포 주기 정지를 유도하는 미세소관 역학 저해제이다. 용어 "에리불린 메실레이트"는 상표명 Halaven™ 하에 시판되는 에리불린의 메실레이트 염을 지칭한다. 예시적인 에리불린 유사체는 개시된 에리불린 구조 및 이들 구조의 합성 방법에 대하여 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제6,214,865호 및 미국 특허 제6,653,341호에 나타나 있고, 기술된 것들을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "에리불린 이량체"는 2개의 에리불린 단량체가 공유적 또는 비공유적 결합을 통해 직접적으로 또는 화학적 링커(예를 들어, 이차 아민, 디하이드록실 이차 아민)에 의해 부착되는 이량체 형태의 에리불린을 지칭한다. 에리불린 이량체는 일부 실시형태에서, C-34 위치에서 이차 아민에 의해 공유적으로 결된 2개의 에리불린 단량체, 또는 C-35 위치에서 디하이드록실 이차 아민에 의해 공유적으로 연결된 2개의 에리불린 단량체로 이루어질 수 있다. C-34 위치에서 이차 아민에 의해 공유적으로 연결된 2개의 에리불린 단량체로 이루어진 에리불린 이량체는 본원에서 "desOH 에리불린 이량체"로 지칭될 수 있다. C-35 위치에서 디하이드록실 이차 아민에 의해 공유적으로 연결된 2개의 에리불린 단량체로 이루어진 에리불린 이량체는 본원에서 "diOH 에리불린 이량체"로 지칭될 수 있다. 용어 "에리불린 이량체 약물 모이어티"는 에리불린 이량체의 구조를 제공하는 ADC 또는 조성물의 성분, 예를 들어, 화학식 I의 ADC에서의 또는 -L-D를 포함하는 조성물에서의 에리불린 이량체(D) 성분을 지칭한다. 일부 실시형태에서, desOH 에리불린 이량체 및/또는 diOH 에리불린 이량체는 다른 에리불린 이량체 형식에 비하여 개선된 컨쥬게이트 능력을 제공한다.
본원에 사용되는 용어 "크립토피신"은 원래 시아노박테리아 노스톡(Nostoc)으로부터 단리된 마크롤라이드 화합물인 크립토피신-1, 또는 항-튜불린 활성을 보유하는 이의 임의의 합성 유사체를 지칭한다. 예시적인 크립토피신 유사체는 모든 이의 개시된 크립토피신 구조 및 이들 구조의 합성 방법에 대하여 본원에 참조로 포함되는 국제 공개 제WO 2017/136769호에 나타나 있고 기술된 것들을 포함한다. 용어 "크립토피신 약물 모이어티"는 크립토피신의 구조를 갖는 ADC 또는 조성물의 성분을 지칭한다.
용어 "상동체"는 예를 들어 대응하는 위치에 동일하거나 유사한 화학적 잔기의 서열을 가짐으로써 또 다른 분자에 대해 상동성을 나타내는 분자를 지칭한다.
본원에 사용된, 용어 "저해하다" 또는 "의 저해"는 측정 가능한 양만큼 감소시키는 것을 의미하고, 완전한 방지 또는 저해를 포함할 수 있으나 이를 요하지는 않는다.
용어 "방관자 살해" 또는 "방관자 효과"는 표적-양성 세포의 존재 하의 표적-음성 세포의 살해를 지칭하며, 여기서 표적-양성 세포의 부재에서는 표적-음성 세포의 살해가 관찰되지 않는다. 세포-대-세포 접촉, 또는 적어도 표적-양성 세포와 표적-음성 세포 사이의 근접성은 방관자 살해를 가능하게 한다. 이러한 유형의 살해는, 표적-음성 세포의 무차별적 살해를 지칭하는, "표적외 살해"와 구별 가능하다. "표적외 살해"는 표적-양성 세포의 부재 하에서 관찰될 수 있다.
용어 "암"은 세포의 모집단이 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유류에서의 생리학적 조건을 지칭한다. 암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 구체적인 예에는 메소텔린-발현 암, 예컨대 중피종, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 자궁내막암, 두경부암, 간암, 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암), 난소암(예를 들어, 장액성 또는 투명 세포 또는 상피 난소암), 췌장암, 전립선암, 신장암, 위암, 갑상선암, 방광암, 자궁암, 담도암, 또는 백혈병이 포함된다.
용어 "종양" 및 "신생물"은, 전암성 병변을 포함하는, 양성 또는 악성의, 과도한 세포 성장 또는 증식으로부터 기인하는 임의의 조직 덩어리를 지칭한다.
용어 "종양 세포"는 비-종양 형성 세포 및 암 줄기 세포 둘 모두를 포함하여, 종양으로부터 유래된 개별 세포 또는 세포의 총 집단을 지칭한다. 종양 세포를 암 줄기 세포와 구별하기 위해 재생 및 분화하는 능력이 결여된 종양 세포만을 지칭하는 경우 본원에 사용된, 용어 "종양 세포"는 용어 "비-종양 형성"에 의해 수식될 것이다.
용어 "대상체" 및 "환자"는, 인간, 비-인간 영장류, 설치류 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 포유류와 같은, 임의의 동물을 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 일부 실시형태에서, 포유류는 마우스이다. 일부 실시형태에서, 포유류는 인간이다.
"약제학적 조성물"은 투여를 가능하게 하고 이어서 활성 성분(들)의 의도된 생물학적 활성을 제공하고/하거나 치료 효과를 달성하기 위한 형태이고, 제형이 투여될 대상체에게 허용되지 않게 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 약제학적 조성물은 멸균될 수 있다.
"약제학적 부형제"는 애쥬번트, 담체, pH 조절 및 완충제, 장성(tonicity) 조절제, 습윤제, 보존제 등과 같은 물질을 포함한다.
"약제학적적으로 허용 가능한"은 동물, 보다 구체적으로 인간에서 사용하기 위해, 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 승인 가능하거나, 미국 약전 또는 기타 일반적으로 공인되는 약전에 등재된 것을 의미한다.
예를 들어, 본원에 개시된 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC의 "유효량"은 구체적으로 명시된 목적을 수행하기에, 예를 들어, 종양 성장 속도 또는 종양 부피의 감소, 암 증상의 감소, 또는 치료 효능의 일부 다른 적응증과 같은, 투여 후 치료 효과를 생성하기에 충분한 양이다. 유효량은 명시된 목적과 관련하여 일상적인 방식으로 결정될 수 있다. 용어 "치료적 유효량"은 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 데 유효한 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC의 양을 지칭한다. 암의 경우에, 치료적 유효량의 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC는 암 세포의 수를 감소시키고/시키거나 종양 크기를 감소시키고/시키거나 종양 전이를 저해(예를 들어, 늦추거나 중지)시키고/시키거나, 종양 성장을 저해(예를 들어, 늦추거나 중지)시키고/시키거나 하나 이상의 증상을 완화시킬 수 있다. "예방적 유효량"은 원하는 예방적 결과를 달성하기 위해, 필요한 투여량에서 및 기간 동안, 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로, 예방적 용량은 질병 이전 또는 초기 단계의 대상체에서 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 더 적을 것이다.
본원에 사용된, "치료하기 위한" 또는 "치료적" 및 문법적으로 관련된 용어는, 연장된 생존, 더 적은 이환율, 및/또는 대안적 치료 양식의 부산물인 부작용의 감소와 같은, 질병의 임의의 결과의 임의의 개선을 지칭한다. 당업계에서 용이하게 인식되는 바와 같이, 치료 조치를 위해 질병의 완전한 근절이 포함되나 이것이 요구되지는 않는다. 본원에 사용된, "치료" 또는 "치료하다"는 대상체, 예를 들어, 환자로의 기술된 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC의 투여를 지칭한다. 치료는 장애, 장애의 증상 또는 장애, 예를 들어 암에 대한 소인을 고치거나, 치유하거나, 경감하거나, 완화하거나, 변경하거나, 바로잡거나, 개선하거나, 증상완화시키거나, 개선하거나 영향을 주는 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 질환을 갖는 대상체를 치료하는 것에 추가하여, 본원에 개시된 조성물은 또한 그 질환이 발생할 가능성을 감소시키거나 이를 방지하기 위해 예방적으로 제공될 수 있다.
일부 실시형태에서, 표지된 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC가 사용된다. 적합한 "표지"에는 방사성핵종, 효소, 기질, 보조인자, 저해제, 형광 모이어티, 화학발광 모이어티, 자성 입자 등이 포함된다.
본원에 사용된, "단백질"은 적어도 2개의 공유적으로 부착된 아미노산을 의미한다. 당해 용어는 폴리펩티드, 올리고펩티드, 및 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 공유적으로 부착된 아미노산은 펩티드 결합에 의해 부착된다. 예를 들어, 단백질이 발현 시스템 및 숙주 세포를 사용하여 재조합적으로 제조되는 경우, 단백질은 자연적으로 발생하는 아미노산 및 펩티드 결합으로 구성될 수 있다. 대안적으로, 단백질은 합성 아미노산(예를 들어, 호모페닐알라닌, 시트룰린, 오르니틴 및 노르류신)을 포함할 수 있다. "재조합 단백질"은 당업계에 알려진 임의의 기법 및 방법을 사용한 재조합 기법을 사용하여, 즉, 재조합 핵산의 발현을 통해 제조된 단백질이다. 재조합 단백질의 생산을 위한 방법 및 기법은 당업계에 잘 알려져 있다.
아미노산 서열의 경우, 서열 동일성 및/또는 유사성은, 문헌[Smith and Waterman (1981) Adv Appl Math. 2: 482]의 국소 서열 동일성 알고리즘, 문헌[Needleman and Wunsch (1970) J Mol Biol. 48: 443]의 서열 동일성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc Nat Acad Sci. USA 85: 2444]의 유사성 검색 방법, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 구현(위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 문헌[Devereux et al.(1984) Nucl Acid Res. 12: 387-95]에 의해 기술된 베스트 핏(Best Fit) 서열 프로그램을 포함하나 이에 한정되지 않는, 당업계에 알려진 표준 기법을 사용하여, 예를 들어, 디폴트 설정을 사용하거나, 검사에 의해, 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 동일성 퍼센트는 다음의 파라미터에 기초하여 FastDB에 의해 계산된다: 미스매치 패널티 1; 갭 패널티 1; 갭 크기 패널티 0.33; 및 연결 패널티 30(문헌["Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc]).
일반적으로, 본원에 개시된 단백질과, 표적 항원(예컨대 메소텔린)의 변이체, 튜불린 서열의 변이체 및 항체 가변 도메인의 변이체(개별 변이체 CDR 포함)를 포함하는, 이의 변이체 간의 아미노산 상동성, 유사성, 또는 동일성은 본원에 묘사된 서열에 대해 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 거의 100%, 또는 100%의 상동성 또는 동일성이다.
유사한 방식으로, 본원에서 확인된 항체 및 기타 단백질의 핵산 서열에 관한 "핵산 서열 동일성 퍼센트(%)"는 항원-결합 단백질의 코딩 서열 내의 뉴클레오티드 잔기와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오티드 잔기의 백분율로 정의된다. 특정 방법은 디폴트 파라미터로 설정된 WU-BLAST-2의 BLASTN 모듈을 활용하며, 중첩 범위 및 중첩 분율은 각각 1 및 0.125로 설정된다.
아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위 또는 영역은 사전 결정되어 있으나, 돌연변이 그 자체는 사전 결정될 필요는 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 최적화하기 위해, 무작위 돌연변이 유발이 표적 코돈 또는 영역에서 수행될 수 있고 발현된 항원-결합 단백질 CDR 변이체가 원하는 활성의 최적 조합을 위해 스크리닝된다. 알려진 서열을 갖는 DNA의 사전 결정된 부위에서 치환 돌연변이를 만드는 기법, 예를 들어, MI3 프라이머 돌연변이 유발 및 PCR 돌연변이 유발은 잘 알려져 있다.
항-메소텔린 항체 및 항원-결합 단편
본 개시는 다양한 실시형태에서, 종양 세포(예를 들어, 메소텔린-발현 종양 세포)에 결합하고/하거나 이를 살해할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 컨쥬게이트 및 치료적 조성물에서의 이들의 용도에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 항체는 단독으로 사용되거나, 약제학적 조성물 또는 병용 요법의 부분으로서 및/또는 ADC 내의 항체 모이어티로서 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항-메소텔린 항체 및 항원-결합 단편은 이들의 자체로(즉, 비컨쥬게이트된 형태로) 및 ADC 내의 항체 모이어티로서 유용하다. 일부 실시형태에서, 항-메소텔린 항체 및 항원-결합 단편은 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-메소텔린 항체 및 항원-결합 단편은 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하며, 인간에서 덜 면역원성이면서 비-인간(예를 들어, 토끼) 항체의 반응성을 보유한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항-메소텔린 항체 및 항원-결합 단편은 당업자에게 알려져 있는 하나 이상의 항-메소텔린 항체에 비하여 개선된 안정성, 제형화 가능성(formulatability), 응집, 결합 친화성, 치료 효능, 표적외 독성 및/또는 대사 프로필 중 하나 이상을 제공한다.
다양한 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편은 예를 들어, 암 세포 상에 발현되는 메소텔린에 특이적으로 결합한다. 항체 또는 항원-결합 단편은 예를 들어, 비아코어(BIAcore)® 분석에 의해 측정되는 바와 같이, ≤1 mM, ≤100 nM 또는 ≤10 nM, 또는 이들 사이의 임의의 양의 해리 상수(KD)로 표적 항원에 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, KD는 1 pM 내지 500 pM이다. 일부 실시형태에서, KD는 500 pM 내지 1 μM, 1 μM 내지 100 nM, 또는 100 mM 내지 10 nM이다.
일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 4-쇄 항체(면역글로불린으로도 지칭됨)이다. 일부 실시형태에서 항체 모이어티는 2-쇄 절반 항체(1개의 경쇄 및 1개의 중쇄) 또는 면역글로불린의 항원-결합 단편이다.
일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 내재화 항체 또는 이의 내재화 항원-결합 단편이다. 일부 실시형태에서, 내재화 항체 또는 이의 내재화 항원-결합 단편은 세포의 표면 상에 발현되는 표적 암 항원에 결합하고, 결합 시에 세포에 유입된다. 일부 실시형태에서, ADC의 에리불린 약물 모이어티는 ADC가 유입되고 표적 암 항원을 발현하는 세포에 존재한 후에(즉, ADC가 내재화된 후에) ADC의 항체 모이어티로부터 방출된다.
다양한 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편은 표 3 내지 5에 열거된 것들로부터 취한 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 쌍형성된 세트, 또는 쌍형성된 중쇄 및 경쇄 세트로부터의 6개의 CDR 서열의 세트, 예를 들어, 표 1 내지 2에 열거된 CDR의 세트를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 (선택적으로 결합 친화성을 개선시키기 위한 하나 이상의 복귀 돌연변이를 갖는) 인간 중쇄 및 경쇄 프레임워크 및/또는 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 IgG 중쇄 불변 도메인(예컨대, IgG1) 및 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 Ig 카파 경쇄 불변 도메인을 갖는 인간 면역글로불린 G 하위유형 1(IgG1) 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
본 개시의 예시적인 항체의 아미노산 및 핵산 서열은 표 1 내지 10에 제시되어 있다.
[표 1]
Figure pct00001
[표 2]
Figure pct00002
[표 3]
Figure pct00003
[표 4]
Figure pct00004
[표 5]
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[표 6]
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[표 7]
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[표 8]
Figure pct00008
[표 9]
Figure pct00009
Figure pct00010
[표 10]
Figure pct00011
Figure pct00012
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 메소텔린에 결합하며, 카바트 넘버링 시스템(문헌[Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest])에 의해 정의된 바와 같이, SEQ ID NO: 1(HCDR1), SEQ ID NO: 2(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 3(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR); 및 SEQ ID NO: 4(LCDR1), SEQ ID NO: 5(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 6(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 메소텔린에 결합하며, IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같이, SEQ ID NO: 7(HCDR1), SEQ ID NO: 8(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 9(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR); 및 SEQ ID NO: 10(LCDR1), SEQ ID NO: 11(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 12(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR)을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 항-메소텔린 항체 또는 항원-결합 단편은 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR을 포함하며, CDR은 HCDR1(카바트에 따라 SEQ ID NO: 1 또는 IMGT에 따라 SEQ ID NO: 7), HCDR2(카바트에 따라 SEQ ID NO: 2 또는 IMGT에 따라 SEQ ID NO: 8), HCDR3(카바트에 따라 SEQ ID NO: 3 또는 IMGT에 따라 SEQ ID NO: 9); 및 LCDR1(카바트에 따라 SEQ ID NO: 4 또는 IMGT에 따라 SEQ ID NO: 10), LCDR2(카바트에 따라 SEQ ID NO: 5 또는 IMGT에 따라 SEQ ID NO: 11) 및 LCDR3(카바트에 따라 SEQ ID NO: 6 또는 IMGT에 따라 SEQ ID NO: 12)의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-메소텔린 항체 또는 항원-결합 단편은 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-메소텔린 항체 또는 항원-결합 단편은 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하며, 인간에서 덜 면역원성이면서, 비-인간(예를 들어, 토끼) 항체의 반응성을 보유한다. 일부 실시형태에서, 항-메소텔린 항체 또는 항원-결합 단편은 하나 이상의 대안적인 항-메소테린 항체에 비하여, 개선된 안정성, 제형화 가능성, 결합 친화성, 치료 효능 및/또는 감소된 응집 수준 중 하나 이상을 제공한다.
다양한 실시형태에서, 항-메소텔린 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 13과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 14와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 항-메소텔린 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 15와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 항-메소텔린 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 17의 중쇄 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 17과 적어도 90% 동일한 서열 및/또는 SEQ ID NO: 18의 경쇄 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 18과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-메소텔린 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 및 인간 Ig 카파 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 항-메소텔린 항체 또는 항원-결합 단편은 카바트 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 19(HCDR1), SEQ ID NO: 20(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 21(HCDR3)의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR); 및 SEQ ID NO: 22(LCDR1), SEQ ID NO: 23(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 24(LCDR3)의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR); 또는 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 25(HCDR1), SEQ ID NO: 26(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 27(HCDR3)의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR); 및 SEQ ID NO: 28(LCDR1), SEQ ID NO: 29(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 30(LCDR3)의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR)을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 항-메소텔린 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 31의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 32의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 항-메소텔린 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 33의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및 SEQ ID NO: 34의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 항-메소텔린 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 35의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 36의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 항-메소텔린 항체 또는 항원-결합 단편은 345A12-HC15-LC4이다.
본원에 기술된 항-메소텔린 항원-결합 도메인은 단독으로(예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편으로서), 하나 이상의 추가의 작용제에 연결되어(예를 들어, ADC로서), 또는 더 큰 거대분자(예를 들어, 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체)의 부분으로서 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 치료제에 컨쥬게이트된다. 일부 실시형태에서, 화학치료제는 에리불린이다. 일부 실시형태에서, 화학치료제는 에리불린 이량체이다.
일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 이중특이적 또는 다중특이적 항체 내의 항원-결합 도메인이고/이거나 이의 부분이다. 일부 실시형태에서, 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 메소텔린에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하며, 카바트 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 1(HCDR1), SEQ ID NO: 2(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 3(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 HCDR; 및 SEQ ID NO: 4(LCDR1), SEQ ID NO:5(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 6(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR); 또는 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 7(HCDR1), SEQ ID NO: 8(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 9(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR); 및 SEQ ID NO: 10(LCDR1), SEQ ID NO: 11(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 12(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다중특이적 항체는 예를 들어, 동일한 항원(즉, 메소텔린)에 대한 또는 다른 항원에 대한 하나 이상의 추가의 항원 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 도메인은 항원-결합 단편이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 도메인 및/또는 항원-결합 단편은 단일 사슬 가변 단편(scFv) 또는 Fab 단편이다.
일부 실시형태에서, 단독으로 또는 더 큰 거대분자의 부분으로서 사용하기 위한 본원에 개시된 항원-결합 도메인(예를 들어, 항-메소텔린 항원-결합 도메인)은 메소텔린-결합 기능을 보유하면서, 추가의 변형(예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입)을 포함할 수 있다.
항체-약물 컨쥬게이트
다양한 실시형태에서, 화학치료적 약물 모이어티, 예를 들어, 에리불린을 본원에 개시된 항-메소텔린 항체에 부착시키는 링커를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트(ADC) 화합물이 본원에 추가로 제공된다. 항체-약물 컨쥬게이트(ADC) 화합물은 하기 화학식 I로 표현될 수 있다:
[화학식 I]
Ab-(L-D) p
상기 식에서,
Ab는 본원에 개시된 내재화 항-메소텔린 항체 또는 이의 내재화 항원-결합 단편이며;
D는 에리불린이며;
L은 Ab를 D에 공유적으로 부착시키는 절단 가능한 링커이며;
p는 1 내지 8의 정수이다.
본 개시의 ADC 화합물은 약물 모이어티(예를 들어, 에리불린)에 컨쥬게이트된(예를 들어, 링커에 의해 공유적으로 부착된) 항체 모이어티(이의 항원-결합 단편 포함)를 포함하며, 약물 모이어티는 항체 모이어티에 컨쥬게이트되지 않은 경우, 세포 독성 또는 세포 증식 억제 효과를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 약물 모이어티는 컨쥬게이트에서 결합되는 경우 감소된 세포 독성을 나타내거나 세포 독성을 나타내지 않지만, 링커 및 항체 모이어티로부터의 절단 후에 세포 독성이 재개된다. 다양한 실시형태에서, 약물 모이어티는 컨쥬게이트에서 결합되는 경우 감소된 방관자 살해를 나타내거나 방관자 살해를 나타내지 않지만, 컨쥬게이트로부터의 절단 후에 증가된 방관자 살해를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 ADC 화합물은 ADC의 항체 모이어티에 의해 표적화된 항원(예를 들어, 메소텔린)을 발현하는 암 세포 또는 종양 조직으로 유효 용량의 약물 모이어티(예를 들어, 에리불린)를 선택적으로 전달할 수 있다. 일부 실시형태에서, 개시된 ADC 화합물은 메소텔린을 발현하지 않거나, 메소텔린을 훨씬 더 낮은 수준으로 발현하는 정상 세포 또는 조직을 보존하면서, 메소텔린을 발현하는 세포 또는 조직에 에리불린을 전달함으로써 암을 특이적으로 표적화한다. 일부 실시형태에서, 개시된 ADC 화합물은 대안적인 항체, 링커 및/또는 약물 모이어티, 예를 들어, BAY 94-9343을 포함하는 ADC와 비교하여, 개선된 표적내 살해 및/또는 감소된 표적외 살해를 갖는다. 일부 실시형태에서, 개시된 ADC 화합물은 대안적인 항체, 링커 및/또는 약물 모이어티, 예를 들어, BAY 94-9343을 포함하는 ADC와 비교하여, ADC에 의한 ADCC 활성 보유의 개선을 갖는다. 일부 실시형태에서, 개시된 ADC 화합물은 대안적인 항체, 링커 및/또는 약물 모이어티, 예를 들어, BAY 94-9343을 포함하는 ADC와 비교하여, 개선된 안정성(예를 들어, 혈장 안정성)을 갖는다. 일부 실시형태에서, 개시된 ADC 화합물은 대안적인 항체, 링커 및/또는 약물 모이어티, 예를 들어, BAY 94-9343을 포함하는 ADC와 비교하여 개선된 항-종양 효능을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 ADC 화합물은 독립형 약물(즉, 항체 모이어티에 컨쥬게이트되지 않음)로서 평가되는 경우의 에리불린의 용량에 비하여, 더 낮은 용량의 에리불린으로 유리한 항-종양 효능을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 ADC 화합물의 종양-특이적 표적화는 독립형 약물로서 평가되는 경우의 에리불린에 비하여, ADC의 항-종양 활성을 증가시키고/시키거나 표적외 세포 독성을 감소시킨다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 ADC 화합물은 독립형 약물로서 평가되는 경우의 에리불린의 용량보다 적어도 10배 더 낮은, 적어도 15배 더 낮은, 적어도 20배 더 낮은, 또는 적어도 30배 더 낮은 용량의 에리불린으로 유리한 항-종양 활성을 보인다. 일부 실시형태에서, 개시된 ADC 화합물은 그 자체로 에리불린의 것에 비하여 개선된 독성학 또는 안전성 프로필을 제공하면서, 독립형 약물로서 평가되는 경우의 에리불린의 활성과 유사하거나 이보다 뛰어난 항-종양 활성을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 링커는 세포 외측에서 안정하여, ADC가 세포외 조건에 존재하는 경우 온전하게 유지되지만, 세포, 예를 들어, 암 세포 내의 내재화 시에 절단될 수 있도록 한다. 일부 실시형태에서, ADC가 메소텔린을 발현하는 세포에 유입되는 경우에 에리불린 약물 모이어티는 항-메소텔린 항체 모이어티로부터 절단되며, 절단에 의해 비변형된 형태의 에리불린이 방출된다.
일부 실시형태에서, 링커는 링커 또는 항체 모이어티의 일부가 절단 시에 에리불린 약물 모이어티에 결합된 채 남아 있지 않도록 위치된 절단 가능한 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커 내의 절단 가능한 모이어티는 절단 가능한 펩티드 모이어티이다. 일부 실시형태에서, 절단 가능한 펩티드 모이어티를 포함하는 ADC는 대안적인 링커 모이어티를 포함하는 ADC에 비하여, 더 낮은 응집 수준, 개선된 항체:약물 비, 증가된 암 세포의 표적내 살해, 감소된 비-암 세포의 표적외 살해 및/또는 더 높은 약물 로딩(p)을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 증가된 효력 및/또는 세포 독성은 중등의 수준의 메소텔린을 발현하는 암에 제공된다. 일부 실시형태에서, 절단 가능한 펩티드 모이어티는 효소에 의해 절단 가능하며, 링커는 효소-절단 가능한 링커이다. 일부 실시형태에서, 효소는 카텝신 B이며, 링커는 카텝신-절단 가능한 링커이다. 일부 실시형태에서, 효소-절단 가능한 링커(예를 들어, 카텝신-절단 가능한 링커)는 대안적인 절단 메커니즘에 비하여, 상기 언급된 개선된 특성 중 하나 이상을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 링커 내의 절단 가능한 펩티드 모이어티는 아미노산 유닛을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산 유닛은 발린-시트룰린(Val-Cit)을 포함한다. 일부 실시형태에서, Val-Cit를 포함하는 ADC는 대안적인 아미노산 유닛 또는 대안적인 절단 가능한 모이어티를 포함하는 ADC에 비하여, 증가된 안정성, 감소된 표적외 세포 살해, 증가된 표적내 세포 살해, 더 낮은 응집 수준 및/또는 더 높은 약물 로딩을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 링커는 항체 모이어티를 절단 가능한 모이어티에 연결하는 적어도 하나의 스페이서 유닛을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커 내의 스페이서 유닛은 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티를 포함할 수 있다. PEG 모이어티는 예를 들어, -(PEG)m-을 포함할 수 있으며, 여기서, m은 1 내지 10의 정수이다. 일부 실시형태에서, 링커 내의 스페이서 유닛은 (PEG)2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 더 짧은 스페이서 유닛(예를 들어, (PEG)2)을 포함하는 ADC는 더 짧은 링커 길이에도 불구하고, 더 긴 스페이서 유닛(예를 들어, (PEG)8)을 포함하는 ADC에 비하여 더 낮은 응집 수준 및/또는 더 높은 약물 로딩을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 링커 내의 스페이서 유닛은 말레이미드 모이어티(Mal)를 통해 ADC의 항체 모이어티에 부착된다. 일부 실시형태에서, Mal을 통해 항체 모이어티에 부착된 링커를 포함하는 ADC는 대안적인 모이어티를 통해 항체 모이어티에 부착된 링커를 포함하는 ADC에 비하여 더 높은 약물 로딩을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 링커 내의 Mal은 시스테인 잔기(예를 들어, LCcys80)를 통해 항체 모이어티에 연결된다. 일부 실시형태에서, 링커 내의 Mal은 항체 또는 항원-결합 단편 상의 경쇄 가변 영역의 시스테인 잔기(예를 들어, LCcys80)에 연결된다. 일부 실시형태에서, p는 2이며, 2개의 -L-D 모이어티는 항체 또는 항원-결합 단편에 부착된다. 일부 실시형태에서, 각각의 -L-D 모이어티는 항체 또는 항원-결합 단편 상의 경쇄 가변 영역의 시스테인 잔기(예를 들어, LCcys80)에 부착된다. 일부 실시형태에서, 시스테인 잔기는 LCcys80이다. 일부 실시형태에서, Mal-스페이서 유닛은 PEG 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 Mal-(PEG)m, 예를 들어, Mal-(PEG)2를 포함한다. 일부 실시형태에서, Mal-스페이서 유닛은 항체 모이어티를 링커 내의 절단 가능한 모이어티에 부착시킨다. 일부 실시형태에서, 링커 내의 절단 가능한 모이어티는 절단 가능한 펩티드 모이어티, 예를 들어, 아미노산 유닛이다. 일부 실시형태에서, 링커는 Mal-(PEG)2-Val-Cit를 포함한다.
일부 실시형태에서, 링커 내의 절단 가능한 모이어티는 ADC의 에리불린 약물 모이어티에 직접 연결되며, 절단 가능한 모이어티는 항체 모이어티에 직접 연결되거나, 스페이서 유닛을 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, 스페이서 유닛은 또한, 링커 내의 절단 가능한 모이어티를 에리불린 약물 모이어티에 부착시킨다. 일부 실시형태에서, 링커 내의 절단 가능한 모이어티를 에리불린 약물 모이어티에 부착시키는 스페이서 유닛은 자가-희생적이다. 일부 실시형태에서, 자가-희생적 스페이서는 표적 세포에서 비변형된 에리불린을 방출시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 자가-희생적 스페이서 유닛은 p-아미노벤질 알코올, 예를 들어, p-아미노벤질옥시카보닐(pAB)을 포함한다. 링커 내의 pAB는 일부 실시형태에서, 절단 가능한 모이어티를 에리불린 약물 모이어티에 부착시킨다. 일부 실시형태에서, 절단 가능한 모이어티는 절단 가능한 펩티드 모이어티, 예를 들어, 아미노산 유닛이다. 일부 실시형태에서, 링커는 Val-Cit-pAB를 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 Val-Cit-pAB 및 링커를 Mal을 통해 항체 모이어티에 연결하는 PEG 스페이서 유닛을 포함한다.
일부 실시형태에서, p는 1 내지 8, 또는 2 내지 6의 정수이다. 일부 실시형태에서, p는 2 또는 6이다. 일부 실시형태에서, 링커는 Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB를 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB를 포함하며, p는 2이다. 일부 실시형태에서, 링커는 Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB를 포함하며, p는 6이다.
일부 실시형태에서, 항체 모이어티는 Mal 모이어티, PEG 모이어티, Val-Cit 및 pAB를 포함하는 링커를 통해 에리불린 약물 모이어티에 컨쥬게이트된다. 이들 실시형태에서, 말레이미드 모이어티는 링커-약물 모이어티를 항체 모이어티에 공유적으로 부착시키며, pAB는 자가-희생적 스페이서 유닛으로서 작용한다. 이러한 링커는 "Mal-VC-pAB" 링커, "Mal-VCP", "말레이미드-VCP", 또는 "VCP" 링커, "Mal-(PEG)2-VCP" 링커, 또는 "Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB" 링커로 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 에리불린 약물 모이어티는 C-35 위치에서 공유적으로 연결된 에리불린이다. 일부 실시형태에서, Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB 링커의 pAB는 에리불린 약물 모이어티 상의 C-35 아민에 부착된다.
345A12-HC15-LC4는 상기 표 1 내지 10에 나타낸 서열을 포함하거나 이에 의해 인코딩되는, 예를 들어, SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 예시적인 항-메소텔린 항체이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 ADC의 항체 모이어티는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 ADC의 항체 모이어티는 345A12-HC15-LC4이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 ADC는 345A12-HC15-LC4-VCP-에리불린을 포함한다. 이들 실시형태에서, 345A12-HC15-LC4를 포함하는 항체 모이어티는 Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB를 포함하는 링커를 통해 에리불린 약물 모이어티에 연결된다. 이러한 ADC는 "MORAb-109"로 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 ADC는 MORAb-109이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 ADC는 MORAb-109이며, 2의 p를 갖는다. 일부 실시형태에서, p가 2인 경우, ADC는 "MORAb-109(DAR2)"로 지칭될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본원에 개시된 ADC는 MORAb-109이며, 6의 p를 갖는다. 일부 실시형태에서, p가 6인 경우, ADC는 "MORAb-109(DAR6)"로 지칭될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 링커는 이웃 세포로의 링커-약물 모이어티 및/또는 단독의 약물 모이어티의 세포 내재화 및 확산 후에 절단을 통해 방관자 살해(이웃 세포, 예를 들어, 메소텔린을 발현하지 않는 것들의 살해)를 용이하게 하도록 설계된다. 일부 실시형태에서, 링커는 세포 내재화를 촉진시킨다. 일부 실시형태에서, 링커는 표적 조직으로의 ADC 결합 및 ADC의 항체 모이어티에 의해 표적화된 항원을 발현하지 않지만 그 항원을 발현하는 표적 암 조직을 둘러싸는 암성 조직의 방관자 살해를 유지하면서, 세포외 환경에서 절단을 최소화함으로써, 표적외 조직(예를 들어, 비-암성 조직)에 대한 독성을 감소시키도록 설계된다. 일부 실시형태에서, 말레이미드(Mal) 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티, 발린-시트룰린(Val-Cit 또는 "VC") 및 pAB를 포함하는 링커는 이들 기능적 특징을 제공한다. 일부 실시형태에서, Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB를 포함하는 링커는 항체 모이어티와 에리불린 약물 모이어티를 연결하는 경우 이들 기능적 특징을 제공하는 데 특히 효과적이다. 일부 실시형태에서, Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB를 포함하는 링커는 항-메소텔린 항체 모이어티, 예컨대 345A12-HC15-LC4와 에리불린 약물 모이어티를 연결하는 경우 이들 기능적 특징 중 일부 또는 전부를 제공하는 데 효과적이다.
일부 실시형태에서, 항-메소텔린 항체 또는 항원-결합 단편은 (예를 들어, 표 1 내지 3에 개시된 6개의 CDR 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는) 본원에 개시된 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 전장 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 단일특이적 항체 또는 항원-결합 단편, 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 다중특이적 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 단일 사슬 가변 단편(scFv) 또는 Fab 단편이다.
일부 실시형태에서, 항-메소텔린 항체(Ab) 모이어티 및 절단 가능한 펩티드 모이어티를 포함하는 ADC는 대안적인 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 ADC에 비하여, 더 낮은 응집 수준, 개선된 항체:약물 비, 증가된 암 세포의 표적내 살해, 감소된 비-암 세포의 표적외 살해, 더 높은 약물 로딩(p), 증가된 세포 독성 및/또는 효력을 나타낸다. 일부 실시형태에서, ADC는 하기 화학식 I의 ADC이다:
[화학식 I]
Ab-(L-D) p
상기 식에서,
Ab는 항체 또는 항원-결합 단편이고, 항체 또는 항원-결합 단편은 메소텔린에 결합할 수 있고, 카바트 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 1(HCDR1), SEQ ID NO: 2(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 3(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR); 및 SEQ ID NO: 4(LCDR1), SEQ ID NO: 5(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 6(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR); 또는 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 7(HCDR1), SEQ ID NO: 8(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 9(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR); 및 SEQ ID NO: 10(LCDR1), SEQ ID NO: 11(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 12(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR)을 포함하며;
D는 화학치료제(예를 들어, 에리불린)이며;
L은 Ab를 D에 공유적으로 부착시키는 절단 가능한 링커이며;
p는 1 내지 8의 정수이다.
일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 및 인간 Ig 카파 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, ADC는 하기 화학식 I을 갖는다:
[화학식 I]
Ab-(L-D) p
상기 식에서,
Ab는 항체 또는 항원-결합 단편이고, 항체 또는 항원-결합 단편은 메소텔린 및/또는 메소텔린-발현 세포에 결합할 수 있고, 카바트 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 1(HCDR1), SEQ ID NO: 2(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 3(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR); 및 SEQ ID NO: 4(LCDR1), SEQ ID NO: 5(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 6(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR); 또는 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 7(HCDR1), SEQ ID NO: 8(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 9(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR); 및 SEQ ID NO: 10(LCDR1), SEQ ID NO: 11(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 12(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR)을 포함하며;
D는 에리불린이며;
L은 Ab를 D에 공유적으로 부착시키는 절단 가능한 링커이며;
p는 1 내지 8의 정수이다.
일부 실시형태에서, 메소텔린 및/또는 메소텔린-발현 세포를 표적화하는 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 및 인간 Ig 카파 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, ADC는 하기 화학식 I을 갖는다:
[화학식 I]
Ab-(L-D) p
상기 식에서,
Ab는 카바트 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 1(HCDR1), SEQ ID NO: 2(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 3(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR); 및 SEQ ID NO: 4(LCDR1), SEQ ID NO: 5(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 6(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR); 또는 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 7(HCDR1), SEQ ID NO: 8(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 9(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR); 및 SEQ ID NO: 10(LCDR1), SEQ ID NO: 11(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 12(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR)을 포함하는 메소텔린 및/또는 메소텔린-발현 세포를 표적화하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며;
D는 에리불린이며;
L은 Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB를 포함하는 절단 가능한 링커이며;
p는 1 내지 8의 정수이다.
일부 실시형태에서, 메소텔린 및/또는 메소텔린-발현 세포를 표적화하는 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 및 인간 Ig 카파 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 중쇄 불변 영역 및 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 Ig 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, ADC는 하기 화학식 I을 갖는다:
[화학식 I]
Ab-(L-D) p
상기 식에서,
Ab는 항체 또는 항원-결합 단편이며, 항체 또는 항원-결합 단편은 메소텔린에 결합할 수 있으며, SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며;
D는 에리불린이며;
L은 Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB를 절단 가능한 링커이며;
p는 1 내지 8의 정수이다.
일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 및 인간 Ig 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, ADC의 항체 또는 항원-결합 단편은 345A12-HC15-LC4이다. 일부 실시형태에서, p는 1 내지 8이다. 일부 실시형태에서, p는 2 또는 6이다. 일부 실시형태에서, p는 2이다.
일부 실시형태에서, 더 낮은 수준의 에리불린 약물 로딩(예를 들어, 2의 p) 을 갖는 본원에 개시된 ADC(예를 들어, 본원에 개시된 항-메소텔린 항체 및 링커를 포함하는 것)는 더 높은 수준의 약물 로딩(예를 들어, 6의 p)을 갖는 ADC와 동일하거나 유사한 수준의 에리불린을 암 세포에 또는 종양 조직에 전달할 수 있다. 일부 실시형태에서, 더 낮은 수준의 약물 로딩(예를 들어, 2의 p)을 갖는 ADC는 더 높은 수준의 약물 로딩(예를 들어, 6의 p)을 갖는 ADC의 것과 대략적으로 유사하거나, 그보다 뛰어난 종양 성장 저해 및/또는 생체내 항암 치료 효능을 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 각각의 에리불린 모이어티는 절단 가능한 링커에 의해 항체 또는 단편 상의 시스테인 잔기(예를 들어, LCcys80)를 통해 메소텔린-표적화 항체 또는 항원-결합 단편에 연결된다. 일부 실시형태에서, 총 2개의 링커-에리불린 모이어티가 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편 상의 2개의 시스테인 잔기를 통해 메소텔린-표적화 항체 또는 항원-결합 단편에 부착된다(즉, ADC가 DAR2를 갖게 한다). 일부 실시형태에서, 시스테인 잔기(들)는 LCcys80이다.
인간 치료제로서, 예를 들어, 종양학적 작용제로서 사용하기 위한 ADC의 개발 및 생성은 원하는 표적 또는 표적들에 결합하고 암을 치료하기 위해 그 자체로 사용되는 약물에 부착할 수 있는 항체의 확인보다 더 많은 것을 필요로 할 수 있다. 항체를 약물에 연결하는 것은 항체 및 약물 중 하나 또는 둘 모두의 활성에 유의미하고 예측 가능하지 않은 영향을 가질 수 있으며, 이 영향은 항체 및/또는 링커의 유형 및/또는 선택된 약물에 따라 달라질 것이다. 따라서, 일부 실시형태에서, (i) 단리된 상태의 항체 및 약물 모이어티에 의해 나타나는 하나 이상의 치료 특성을 보유하고/하거나; (ii) 항체 모이어티의 특이적인 결합 특성을 유지하고/하거나; (iii) 약물 로딩 및 약물-대-항체 비를 최적화하고/하거나; (iv) 항체 모이어티에 대한 안정적 부착을 통해 약물 모이어티의 전달, 예를 들어 세포내 전달을 가능하게 하고/하거나; (v) 표적 부위로의 수송 또는 전달까지 온전한 컨쥬게이트로서 ADC 안정성을 보유하고/하거나; (vi) 투여 전 또는 후에 ADC의 응집을 최소화하고/하거나; (vii) 세포 환경에서의 절단 후에 약물 모이어티의 치료 효과, 예를 들어 세포 독성 효과를 가능하게 하고/하거나; (viii) 단리된 상태의 항체 및 약물 모이어티의 것과 유사하거나 그보다 뛰어난 생체내 항암 치료 효능을 나타내고/내거나; (ix) 약물 모이어티에 의한 표적외 살해를 최소화하고/하거나; (x) 바람직한 약동학적 및 약력학적 특성, 제형화 가능성, 및 독성학적/면역학적 프로필을 나타내도록 ADC의 성분이 선택된다. 이들 특성의 각각의 스크리닝은 치료적 용도를 위한 개선된 ADC를 확인하기 위해 필요할 수 있다(문헌[Ab et al. (2015) Mol. Cancer Ther. 14:1605-13]).
일부 실시형태에서, 화학치료제, 예를 들어, 에리불린에 연결된 항-메소텔린 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 본원에 개시된 ADC는 바람직한 특성의 특정한 조합을 나타낸다. 이들 특성은 다른 항체 모이어티를 사용하는 ADC와 비교하여 유효한 수준의 약물 로딩, 낮은 응집 수준, 저장 조건 하에서의 및/또는 체 내에서 순환하는 경우의 안정성(예를 들어, 혈청 및 매트릭스 안정성), 비컨쥬게이트된 항체와 비교하여 표적-발현 세포에 대하여 유지되는 친화성, 표적-발현 세포에 대한 강력한 세포 독성, 높은 수준의 방관자 살해 및/또는 효과적인 생체내 항암 활성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 이들 컨쥬게이트의 높은 항암 활성은 심지어 중등의 항원 발현을 갖는 세포주에서 시험되는 경우에도 관찰되며, 이는 ADC에 의해 전달되는 독소 페이로드에 대한 강력한 민감성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항-메소텔린 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 ADC는 대안적인 항체 모이어티를 포함하는 ADC에 비하여 특히 바람직한 항-종양 세포 독성 및/또는 효력 및 개선된 표적외 독성 및 약물 대사 및 약동학적(DMPK) 프로필을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 인간화된 항-메소텔린 항체 및 에리불린을 포함하는 ADC는 대안적인 항체 모이어티 및/또는 컨쥬게이트를 포함하는 ADC에 비하여, 놀랄 만큼 바람직한 약리학적 및 독성학적 특성을 제공한다.
본 개시의 ADC 화합물은 유효 용량의 세포 독성제 또는 세포 증식 억제제를 암 세포에 또는 종양 조직에 선택적으로 전달할 수 있다. 일부 실시형태에서, ADC의 세포 독성 및/또는 세포 증식 억제 활성은 세포 내의 표적 항원 발현 수준에 따라 달라진다. 일부 실시형태에서, 개시된 ADC는 동일한 항원을 낮은 수준으로 발현하는 암 세포에 비하여, 높은 수준의 표적 항원을 발현하는 암 세포를 살해하는 데 특히 효과적이다. 일부 실시형태에서, 개시된 ADC는 동일한 항원을 낮은 수준으로 발현하는 암 세포에 비하여, 표적 항원을 중등의 수준으로 발현하는 암 세포를 살해하는 데 특히 효과적이다.
예시적인 고 메소텔린-발현 암은 난소암(예를 들어, 장액성 난소암, 투명 세포 난소암), 췌장암, 중피종, 자궁내막암, 비소세포 폐암(예를 들어, 선암종) 및 대장암을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 중등의 메소텔린-발현 암은 위암, 흉선 암종 및 담관세포 암종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 저 메소텔린-발현 암은 흑색종 및 림프종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 메소텔린-발현 암은 돌연변이 및/또는 약물 저항성을 갖는 암, 예를 들어, KRAS/STK11 돌연변이된 폐암(비소세포 폐 선암종), 예를 들어, PD-1 체크포인트 차단을 사용한 치료에 대하여 저항성을 나타내는 이들 돌연변이된 폐암을 포함할 수 있다.
약물 모이어티
본원에 기술된 ADC의 약물 모이어티(D)는 임의의 화학치료제일 수 있다. 화학치료제의 유용한 부류는 예를 들어, 항-튜불린 작용제를 포함한다. 특정 실시형태에서, 약물 모이어티는 항-튜불린 작용제이다. 기술된 ADC 및 조성물에 사용하기 위한 하나의 예시적인 약물 모이어티는 에리불린이다. 기술된 ADC 및 조성물에 사용하기 위한 또 다른 예시적인 약물 모이어티는 에리불린 이량체이다.
다양한 실시형태에서, 개시된 ADC에서 이의 천연 형태로 사용되는 에리불린의 구조는 하기 화학식 II에 나타낸 바와 같다:
[화학식 II]
Figure pct00013
다양한 다른 실시형태에서, 개시된 ADC에서 사용되는 에리불린의 구조는 모든 에리불린 구조 및 이들 구조의 합성 방법에 대하여 본원에 참조로 포함되는 공개 제US 20180193478호에 나타낸 바와 같다.
약물 로딩
약물 로딩은 p로 표현될 수 있으며, 본원에서 약물-대-항체 비(DAR)로도 지칭된다. 약물 로딩은 예를 들어, 항체 모이어티당 1 내지 10개의 약물 모이어티의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, p는 1 내지 10의 정수이다. 일부 실시형태에서, p는 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3 또는 1 내지 2의 정수이다. 일부 실시형태에서, p는 2 내지 10, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4 또는 2 내지 3의 정수이다. 일부 실시형태에서, p는 1 내지 8의 정수이다. 일부 실시형태에서, p는 1 내지 6의 정수이다. 일부 실시형태에서, p는 2 내지 6의 정수이다. 일부 실시형태에서, p는 2이다. 일부 실시형태에서, p는 6이다.
약물 로딩은 일부 실시형태에서, 항체 모이어티 상의 부착 부위의 수에 의해 제한될 수 있다. 일부 실시형태에서, ADC의 링커 모이어티(L)는 항체 모이어티 상의 하나 이상의 아미노산 잔기 상의 화학적 활성기를 통해 항체 모이어티에 부착된다. 예를 들어, 링커는 유리 아미노, 이미노, 하이드록실, 티올 또는 카복실 기를 통해 항체 모이어티에(예를 들어, N- 또는 C-말단에, 하나 이상의 라이신 잔기의 엡실론 아미노 기에, 하나 이상의 글루탐산 또는 아스파르트산 잔기의 유리 카복실산 기에, 또는 하나 이상의 시스테인 잔기의 술프하이드릴 기에) 부착될 수 있다. 링커가 부착되는 부위는 항체 모이어티의 아미노산 서열 내의 천연 잔기일 수 있거나, 이것은 예를 들어, DNA 재조합 기술에 의해(예를 들어, 시스테인 잔기를 아미노산 서열 내로 도입함으로써) 또는 단백질 생화학에 의해(예를 들어, 환원, pH 조정 또는 가수분해에 의해) 항체 모이어티 내로 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체 모이어티에 컨쥬게이트될 수 있는 약물 모이어티의 수는 유리 시스테인 잔기의 수에 의해 제한된다. 예를 들어, 부착이 시스테인 티올 기인 경우, 항체는 오직 하나의 또는 소수의 시스테인 티올 기를 가질 수 있거나, 오직 하나의 또는 소수의 충분히 반응성인 티올 기를 가질 수 있으며, 이를 통해 링커가 부착될 수 있다. 일반적으로, 항체는 약물 모이어티에 연결될 수 있는 많은 유리 및 반응성 시스테인 티올 기를 함유하지 않는다. 실제로, 항체 내의 대부분의 시스테인 티올 잔기는 쇄간 또는 쇄내 이황화 결합에 연루된다. 따라서, 시스테인으로의 컨쥬게이션은 일부 실시형태에서, 항체의 적어도 부분적인 환원을 필요로 할 수 있다. 항체로의 링커-독소의 과다-부착은 이황화 결합을 형성하는 데 이용 가능한 시스테인 잔기를 환원시킴으로써 항체를 불안정화시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 최적의 약물:항체 비는 항체 모이어티를 불안정화시키지 않고, (항체당 부착되는 약물 모이어티의 수를 증가시킴으로써) ADC의 효력을 증가시킬 것이다. 일부 실시형태에서, 최적의 비는 2 또는 6일 수 있다. 일부 실시형태에서, 최적의 비는 2이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 부위-특이적 컨쥬게이션 기술은 정의된 약물 로딩, 즉, 정의된 약물-대-항체 비(DAR)를 갖는 균질한 ADC 생성물을 생성하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 유리 시스테인 잔기는 잔기-특이적 컨쥬게이션 기술(Residue-SPEcific Conjugation Technology; RESPECT)을 통한 부위-특이적 컨쥬게이션을 위해 항체의 경쇄 또는 중쇄에서 생성될 수 있다. RESPECT-포맷팅된 항체의 생성을 위한 예시적인 프로토콜은 문헌[Albone et al. (2017) Cancer Biol. Ther. 18(5):347-57] 및 국제 공개 제WO/2016205618호 및 제WO/2017106643호에 기술되어 있으며, 이의 각각은 부위-특이적 컨쥬게이션의 수행 방법에 대하여 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시형태에서, ADC는 항체 모이어티를 링커(예를 들어, Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB 링커)를 통해 약물 모이어티에 공유적으로 부착시키기 위하여 부위-특이적 컨쥬게이션을 사용하여 생성된다. 일부 실시형태에서, 부위-특이적 컨쥬게이션은 에리불린 약물 모이어티를 포함하는 ADC 또는 조성물에 대하여 약 2의 DAR을 표적화하도록 사용된다.
인간 불변 영역으로 키메라화되거나 인간화된 토끼 모노클로널 항체는 경쇄 내에 쌍형성되지 않은 시스테인을 생성하여, 이들 잔기를 컨쥬게이션을 위해 이용 가능하게 남겨 둘 수 있다(문헌[Albone et al. (2017) Cancer Biol. Ther. 18(5):347-57]; 국제 공개 제WO/2016205618호). 일부 실시형태에서, 부위-특이적 컨쥬게이션을 위해 사용되는 항체 모이어티는 RESPECT-L-포맷팅된 항체이다. 경쇄 위치 80에 쌍형성되지 않은 시스테인(LCcys80)을 갖는 예시적인 RESPECT-L-포맷팅된 항체가 본원에 기술된다. 본원에 사용되는 바와 같이, "LCcys80" 또는 "Cys80"은 카바트 넘버링 시스템에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 상의 경쇄 가변 영역의 아미노산 위치 80에서의 시스테인 잔기를 나타낸다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 경쇄 가변 영역에서, LCcys80은 아미노산 위치 80에 존재한다. RESPECT-L-유래된 항체는 약 2의 DAR을 갖는 ADC를 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약 2의 약물 로딩 및/또는 평균 약물 로딩이 예를 들어, 부위-특이적 컨쥬게이션을 사용하여 달성된다.
약제학적 조성물
일부 실시형태에서, 본 개시는 하나 이상의 본원에 개시된 항체, 항원-결합 단편, 컨쥬게이트 및/또는 ADC 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 적어도 하나의 추가의 작용제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시는 다수의 카피의 본원에 개시된 항체, 항원-결합 단편, 컨쥬게이트 및/또는 ADC를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는 다수의 카피의 본원에 개시된 ADC를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, 조성물 내의 ADC의 평균 p는 약 1 내지 약 8이다. 일부 실시형태에서, 조성물 내의 ADC의 평균 p는 약 2 또는 약 6이다. 일부 실시형태에서, 조성물 내의 ADC의 평균 p는 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9, 약 2.0, 약 2.1, 약 2.2, 또는 약 2.3이다. 일부 실시형태에서, 조성물 내의 ADC의 평균 p는 약 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 또는 6.5이다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어, 메소텔린-발현 암을 치료할 수 있는 하나 이상의 작용제, 스테로이드 등을 추가로 포함할 수 있다.
치료적 용도 및 치료 방법
장애, 예를 들어, 종양학적 장애를 위한 대상체의 치료에서의 개시된 항체, 항원-결합 단편, 컨쥬게이트, ADC 및/또는 약제학적 조성물의 이용 방법이 본원에 개시된다. 항체, 항원-결합 단편, 컨쥬게이트 및/또는 ADC는 단독으로 또는 제2 치료제와 조합하여 투여될 수 있으며, 임의의 약제학적으로 허용 가능한 제형, 투여량 및 투여 요법으로 투여될 수 있다. 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC 치료 효능은 독성 및 효능의 지표에 대하여 평가되고, 이에 따라 조정될 수 있으다. 효능 척도는 시험관내 또는 생체내에서 관찰되는 세포 증식 억제 및/또는 세포 독성 효과, 감소된 종양 부피, 종양 성장 저해 및/또는 연장된 생존을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC가 세포 상에 세포 증식 억제 및/또는 세포 독성 효과를 발휘하는지의 여부의 결정 방법이 알려져 있다. 예를 들어, 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC의 세포 독성 또는 세포 증식 억제 활성은 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC의 표적 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 세포 배양 배지에 노출시키고; 세포를 약 6시간 내지 약 5일의 기간 동안 배양하고; 세포 생존력을 측정함으로써 측정될 수 있다. 또한, 세포-기반의 시험관내 검정을 사용하여, ADC의 생존력(증식), 세포 독성 및 아폽토시스의 유도(카스파제 활성화)를 측정할 수 있다.
항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC가 세포 증식 억제 효과를 발휘하는지의 여부를 결정하기 위하여, 티미딘 혼입 검정이 사용될 수 있다. 예를 들어, 96-웰 플레이트의 5,000개 세포/웰의 밀도로 표적 항원을 발현하는 암 세포를 72시간 기간 동안 배양하고, 72시간 기간의 마지막 8시간 동안 0.5 μCi의 3H-티미딘에 노출시킬 수 있다. 배양물의 세포 내로의 3H-티미딘의 혼입은 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC의 존재 및 부재 하에 측정된다.
세포 독성을 결정하기 위하여, 괴사 또는 아폽토시스(세포 예정사)를 측정할 수 있다. 괴사는 전형적으로 증가된 원형질막의 투과성; 세포의 팽윤 및 원형질막의 파열을 동반한다. 아폽토시스는 전형적으로 막 블레빙(membrane blebbing), 세포질의 응축 및 내인성 엔도뉴클레아제의 활성화를 특징으로 한다. 암 세포 상에서 이들 효과 중 임의의 것을 결정하는 것은, ADC가 암의 치료에서 유용하다는 것을 나타낸다.
세포 생존력은 예를 들어, 세포에서 염료, 예컨대 뉴트럴 레드(neutral red), 트립판 블루(trypan blue), 크리스탈 바이올렛(Crystal Violet) 또는 ALAMAR™ 블루(blue)의 흡수를 결정함으로써 측정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Page et al. (1993) Intl. J. Oncology 3:473-6] 참조). 이러한 검정에서, 세포를 염료를 함유하는 배지에서 인큐베이션시키고, 세포를 세척하고, 염료의 세포 흡수를 반영하는 잔류 염료를 분광 광도계에 의해 측정한다. 특정 실시형태에서, 제조된 ADC의 시험관내 효력 및/또는 세포 독성을 크리스탈 바이올렛 검정을 사용하여 평가한다. 크리스탈 바이올렛은 생존 가능한 세포의 핵에 축적되는 트리아릴메탄 염료이다. 이 검정에서, 세포를 정의된 기간 동안 ADC 또는 대조군 작용제에 노출시킨 후에, 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 물로 방대하게 세척한 다음, 1% SDS로 용해화시키고, 분광 광도계에 의해 판독한다. 또한, 단백질-결합 염료 술포로다민 B(SRB)를 사용하여 세포 독성을 측정할 수 있다(문헌[Skehan et al. (1990) J. Natl. Cancer Inst. 82:1107-12]).
아폽토시스는 예를 들어, DNA 단편화를 측정함으로써 정량화될 수 있다. DNA 단편화의 정량적 시험관내 결정을 위한 상업적 광도계 방법이 이용 가능하다. TUNEL(단편화된 DNA 내의 표지된 뉴클레오티드의 혼입을 검출함) 및 ELISA-기반의 검정을 포함하는 이러한 검정의 예는 문헌[Biochemica (1999) No. 2, pp. 34-37]에 기술되어 있다(로슈 몰레큘러 바이오케미컬즈(Roche Molecular Biochemicals)).
또한, 아폽토시스는 세포에서 형태학적 변화를 측정함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 괴사와 마찬가지로, 원형질막 온전성의 소실은 특정 염료(예를 들어, 형광 염료, 예컨대, 예를 들어, 아크리딘 오렌지(acridine orange) 또는 에티듐 브로마이드)의 흡수를 측정함으로써 결정될 수 있다. 아폽토시스 세포수의 측정 방법은 문헌[Duke and Cohen, Current Protocols in Immunology (Coligan et al., eds. (1992) pp. 3.17.1-3.17.16)]에 기술되어 있다. 또한, 세포는 DNA 염료(예를 들어, 아크리딘 오렌지, 에티듐 브로마이드 또는 프로피듐 아이오다이드)로 표지될 수 있으며, 세포를 염색질 응축 및 내부 핵 막을 따른 변연화에 대하여 관찰할 수 있다. 아폽토시스를 결정하기 위해 측정될 수 있는 다른 형태학적 변화는, 예를 들어, 세포질 응축, 증가된 막 블레빙 및 세포 수축을 포함한다.
개시된 ADC는 또한 방관자 살해 활성에 대하여 평가될 수 있다. 방관자 살해 활성은, 예를 들어, 2가지 세포주, 표적 항원에 대해 양성인 것 및 표적 항원에 대해 음성인 것을 사용하는 검정에 의해 결정될 수 있다. 세포주는 이들을 분화하기 위해 표지될 수 있다. 예를 들어, Nuclight™ 그린(Green)(NLG)으로 표지된 표적-양성 세포 및 Nuclight™ 레드(Red)(NLR)로 표지된 표적-음성 세포를 동시-배양하고, ADC로 처리하고, 이어서 세포 독성의 모니터링을 행할 수 있다. 표적-양성 세포와 혼합된 경우 표적-음성 세포의 살해는 방관자 살해를 나타내는 한편, 표적-양성 세포의 부재 하의 표적-음성 세포의 살해는 표적외 살해를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 개시는 튜불린의 파괴에 의한 암 세포 또는 조직의 살해, 이의 성장의 저해 또는 조절, 또는 이의 대사의 방해 방법을 특징으로 한다. 당해 방법은 튜불린의 파괴가 치료적 이점을 제공하는 임의의 대상체와 함께 사용될 수 있다. 튜불린의 파괴로부터 유익할 수 있는 대상체는, 위암, 난소암(예를 들어, 상피 난소암), 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암), 유방암, 자궁내막암(예를 들어, 장액성 자궁내막 암종), 골육종, 카포시 육종, 고환 생식 세포 암, 두경부암, 간암, 신장암, 방광암, 자궁암, 담도암, 백혈병(예를 들어, 급성 골수성 백혈병), 림프종(예를 들어, 호지킨 질병, 비-호지킨 림프종), 골수종, 두경부암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 뇌암(예를 들어, 교모세포종), 갑상선암, 대장암 및/또는 피부암(예를 들어, 흑색종), 또는 이의 임의의 전이(문헌[Dumontet and Jordan (2010) Nat. Rev. Drug Discov.9:790-803])를 갖거나 이를 가질 위험이 있는 대상체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
다양한 실시형태에서, 개시된 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC는 메소텔린을 발현하는 임의의 세포 또는 조직, 예컨대 메소텔린-발현 암 세포 또는 조직에 투여될 수 있다. 예시적인 실시형태는 메소텔린-매개된 세포 신호전달의 저해 방법 또는 세포의 살해 방법을 포함한다. 당해 방법은 메소텔린을 발현하는 임의의 세포 또는 조직, 예컨대 암성 세포 또는 전이성 병변과 함께 사용될 수 있다. 메소텔린-발현 암의 비-제한적인 예는 중피종, 췌장암(예를 들어, 췌장 선암종), 난소암(예를 들어, 장액성 난소암, 투명 세포 난소암, 상피 난소암) 및 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암, 폐 선암종)을 포함한다(문헌[Wang et al. (2012) PLoS ONE 7:e33214]). 다른 예시적인 메소텔린-암은 자궁내막암, 대장암, 위암, 백혈병, 유방암, 자궁경부암, 두경부암, 간암, 전립선암, 신장암, 갑상선암, 방광암, 자궁암 및 담도암을 포함한다. 메소텔린-발현 세포의 비제한적인 예는 OVCAR3 인간 난소 암종 세포, HEC-251 인간 자궁내막양 세포, H226 인간 폐 편평 세포 중피종 세포 및 메소텔린을 인코딩하는 재조합 핵산 또는 이의 일부를 포함하는 세포를 포함한다.
예시적인 방법은 세포를 유효량, 즉, 세포를 살해하기에 충분한 양의 본원에 기술된 바와 같은 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC와 접촉시키는 단계를 포함한다. 당해 방법은 배양 중에, 예를 들어, 시험관내, 생체내, 생체외 또는 원위치(in situ)에서 세포 상에 사용될 수 있다. 예를 들어, 메소텔린을 발현하는 세포(예를 들어, 종양 또는 전이성 병변의 생검에 의해 수집된 세포; 확립된 암 세포주로부터의 세포; 또는 재조합 세포)는 배양 배지에서 시험관내 배양될 수 있으며 접촉 단계는 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC를 배양 배지에 첨가하는 것에 의해 영향을 받을 수 있다. 당해 방법은, 특히 메소텔린을 발현하는 종양 세포를 포함하는 메소텔린을 발현하는 세포의 살해를 초래할 것이다. 대안적으로, 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC는 생체내에서 효과를 갖도록 임의의 적합한 투여 경로(예를 들어, 정맥내, 피하, 또는 종양 조직과의 직접적인 접촉)에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 접근법은 또한 다른 세포 표면 항원을 표적화하는 항체 및 ADC에 대해 사용될 수 있다.
개시된 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC 치료적 조성물의 생체내 효과는 적합한 동물 모델에서 평가될 수 있다. 예를 들어, 이종발생 암 모델이 사용될 수 있으며, 여기서 암 외식편 또는 계대된 이종이식편 조직이, 누드 또는 SCID 마우스와 같은, 면역 손상 동물 내로 도입된다(문헌[Klein et al.(1997) Nature Med. 3: 402-8]). 효능은 종양 형성, 종양 퇴행 또는 전이 등의 저해를 측정하는 검정을 사용하여 예측될 수 있다.
아폽토시스와 같은 메커니즘에 의한 종양 사멸의 촉진을 평가하는 생체내 검정이 또한 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 치료적 조성물로 처리된 종양 보유 마우스로부터의 이종이식편은 아폽토시스 병소의 존재에 대해 조사될 수 있고 처리되지 않은 대조군 이종이식편-보유 마우스와 비교될 수 있다. 처리된 마우스의 종양에서 아폽토시스 병소가 발견되는 정도는 조성물의 치료적 효능의 지표를 제공한다.
암을 치료하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 본원에 개시된 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC는 치료적 목적을 위해 비-인간 포유류 또는 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 치료적 방법은 발현된 항원에 결합하거나, 결합에 접근 가능하거나, 암 세포 표면 상에 국소화되는 표적화 항체에 연결된 에리불린을 포함하는 생물학적 유효량의 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC를 종양을 갖는 포유류에게 투여하는 것을 수반한다.
예시적인 실시형태는 에리불린을 메소텔린 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체에 컨쥬게이트시키는 단계 및 세포를 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC에 노출시키는 단계를 포함하는 메소텔린을 발현하는 세포로의 에리불린의 전달 방법이다. 본 개시의 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC가 권고되는 메소텔린을 발현하는 예시적인 종양 세포는 난소 암종 세포, 자궁내막양 세포 및 폐 편평 세포 중피종 세포를 포함한다.
또 다른 예시적인 실시형태는, 치료적 유효량의 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC를 투여하는 단계를 포함하는, 표적 항원-발현 종양(예를 들어, 메소텔린-발현 종양)의 성장의 감소 또는 저해 방법이다. 일부 실시형태에서, 치료는 환자의 종양의 성장을 감소시키거나 저해하고/하거나 전이성 병변의 수 또는 크기를 감소시키고/시키거나, 종양 부하를 감소시키고/시키거나 일차 종양 부하를 감소시키고/시키거나 침습성을 감소시키고/시키거나 생존 시간을 연장시키고/시키거나 삶의 질을 유지하거나 개선시키기에 충분하다. 일부 실시형태에서, 종양은 단독으로 투여되는 경우 ADC의 항체 또는 항원-결합 모이어티를 사용한 치료에 저항성이거나 난치성이고/이거나 종양은 단독으로 투여되는 경우 에리불린을 사용한 치료에 저항성이거나 난치성이다.
더욱이, 본 개시의 항체는 수의학적 목적을 위해 또는 인간 질병의 동물 모델로서 메소텔린을 발현하는 비-인간 포유류에게 투여될 수 있다. 후자와 관련하여, 이러한 동물 모델은 개시된 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC의 치료 효능을 평가하는 데 유용할 수 있다(예를 들어, 투여량 및 투여의 시간 경과의 시험).
개시된 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC의 치료적 용도가 본원에 추가로 제공된다. 표적 항원-발현 암(예를 들어, 메소텔린-발현 암)의 치료에서의 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC의 용도인 예시적인 실시형태가 또한 개시된다. 표적 항원(예를 들어, 메소텔린)을 발현하는 암을 갖는 대상체의 확인 방법은 당업계에 알려져 있고 개시된 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC를 사용하는 치료에 적합한 환자를 확인하는 데 사용될 수 있다.
또 다른 예시적인 실시형태는 표적 항원-발현 암(예를 들어, 메소텔린-발현 암)의 치료를 위한 의약의 제조 방법에서의 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC의 용도이다.
전술한 방법의 실시에 사용되는 치료적 조성물은 원하는 전달 방법에 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 예시적인 실시형태는 본 개시의 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 적합한 담체는, 치료적 조성물과 조합되는 경우, 치료적 조성물의 항-종양 기능을 유지하고 일반적으로 환자의 면역계와 비-반응성인 임의의 물질을 포함한다.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리학적으로 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체의 예로는 물, 염수, 인산염 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올, 메실레이트 염 등뿐만 아니라 이들의 조합 중 하나 이상이 포함된다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨이 조성물 내에 포함된다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 ADC의 저장 기간 또는 효과를 향상시키는, 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제와 같은 미량의 보조 물질을 추가로 포함할 수 있다.
치료적 제형은 가용화되고 치료적 조성물을 종양 부위에 전달할 수 있는 임의의 경로를 통해 투여될 수 있다. 잠재적으로 효과적인 투여 경로로는 정맥내, 비경구, 복강내, 근육내, 종양내, 피내, 기관내, 정위 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 치료적 단백질 제제는 동결 건조되어 멸균 분말로서, 예를 들어 진공 하에 보관된 다음, 주사 전에 정균 수(예를 들어, 벤질 알코올 보존제 함유) 또는 멸균 수 중에 재구성될 수 있다. 치료적 제형은 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 예를 들어 메실레이트 염을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC는 이를 필요로 하는 환자에게 약 0.2 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏ 범위의 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC는 환자에게 매일, 격월로, 또는 그 사이의 임의의 기간으로 투여된다. 전술한 방법을 사용하는 암 치료를 위한 투여량 및 투여 프로토콜은 방법 및 표적 암에 따라 달라질 것이며, 일반적으로 당업계에서 인식되는 다수의 다른 인자에 좌우될 것이다.
다양한 전달 시스템이 알려져 있으며 본 개시의 하나 이상의 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC를 투여하는 방법으로는 비경구 투여(예를 들어, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하), 경막외 투여, 종양내 투여, 및 점막 투여(예를 들어, 비내 및 경구 경로)가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 추가로, 예를 들어 흡입기 또는 분무기의 사용, 및 에어로졸화 작용제를 사용한 제형에 의해, 폐 투여가 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,019,968호, 제5,985,320호, 제5,985,309호, 제5,934,272호, 제5,874,064호, 제5,855,913호, 제5,290,540호, 및 제4,880,078호; 및 국제 공개 제WO 1992/019244호, 제WO 1997/032572호, 제WO 1997/044013호, 제WO 1998/031346호, 및 제WO 1999/066903호에 기재된 폐 투여를 위한 조성물 및 방법을 참조한다. ADC는 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 또는 상피 또는 점막 피부 내벽(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소일 수 있다.
본원에 개시된 치료적 조성물은 제조 및 보관 조건 하에서 멸균이고 안정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC, 또는 약제학적 조성물 중 하나 이상은 기밀 밀봉된 용기 내에 건조 멸균 동결건조 분말 또는 수부재 농축물로서 공급되고, (예를 들어, 물 또는 염수를 사용하여) 대상체로의 투여를 위해 적절한 농도로 재구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예방제 또는 치료제 또는 약제학적 조성물 중 하나 이상은 기밀 밀봉된 용기 내에 건조 멸균 동결 건조 분말로서 적어도 5 mg, 적어도 10 mg, 적어도 15 mg, 적어도 25 mg, 적어도 35 mg, 적어도 45 mg, 적어도 50 mg, 적어도 75 mg, 또는 적어도 100 mg, 또는 그 사이의 임의의 양의 단위 투여량으로 공급된다. 일부 실시형태에서, 동결건조된 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC 또는 약제학적 조성물은 원래 용기에서 2℃ 내지 8℃에서 보관된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC 또는 약제학적 조성물 중 하나 이상은 기밀 밀봉된 용기, 예를 들어 작용제의 양 및 농도를 표시하는 용기 내에 액체 형태로 공급된다. 일부 실시형태에서, 적어도 0.25 ㎎/㎖, 적어도 0.5 ㎎/㎖, 적어도 1 ㎎/㎖, 적어도 2.5 ㎎/㎖, 적어도 5 ㎎/㎖, 적어도 8 ㎎/㎖, 적어도 10 ㎎/㎖, 적어도 15 ㎎/㎖, 적어도 25 ㎎/㎖, 적어도 50 ㎎/㎖, 적어도 75 ㎎/㎖, 또는 적어도 100 ㎎/㎖ ADC의 액체 형태의 투여되는 조성물이 밀봉된 용기에 공급된다. 액체 형태는 원래 용기에서 2℃ 내지 8℃에서 보관될 수 있다.
일부 실시형태에서, 개시된 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC는 비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물 내로 혼입될 수 있다. 주사 가능한 용액은 플린트(flint) 또는 앰버(amber) 바이알, 앰풀(ampule), 또는 프리-필드 시린지(pre-filled syringe), 또는 기타 알려진 전달 또는 보관 디바이스 내에 액체 또는 동결 건조된 투여형으로 구성될 수 있다.
본원에 기술된 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이들에는, 예를 들어, 액체 용액(예를 들어, 주사 가능 및 주입 가능 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환약, 분말, 리포솜, 및 좌약과 같은, 액체, 반-고체, 및 고체 투여형이 포함된다. 형태는 의도된 투여 방식 및 치료적 응용에 좌우된다.
다양한 실시형태에서, 치료는 허용 가능한 투여 경로를 통한 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC 제제의 단회 볼루스 또는 반복 투여를 포함한다.
가장 효과적인 투여 요법 등을 결정하는 데에 도움이 되기 위해 환자는 주어진 시료에서의 표적 항원의 수준(예를 들어, 표적 항원 발현 세포의 수준)에 대해 평가될 수 있다. 예시적인 실시형태는 환자로부터 생물학적 시료를 제공하는 단계 및 생물학적 시료를 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC와 접촉시키는 단계를 포함하는, 본 개시의 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC를 사용하는 치료에 환자가 반응할지 여부를 결정하는 방법이다. 예시적인 생물학적 시료에는, 염증 삼출물, 혈액, 혈청, 장액, 대변 시료 또는 종양 생검(예를 들어, 표적 항원-발현 암, 예를 들어, 메소텔린-발현 암을 갖거나 이의 위험이 있는 환자로부터 유래된 종양 생검)과 같은, 조직 또는 체액이 포함된다. 일부 실시형태에서, 시료(예를 들어, 조직 및/또는 체액)는 대상체로부터 수득될 수 있고, 적합한 면역학적 방법을 사용하여 표적 항원(예를 들어, 메소텔린)의 단백질 발현을 검출 및/또는 측정할 수 있다. 이러한 평가는 치료 전반에 걸쳐 모니터링 목적을 위하여 또한 사용되고, 다른 파라미터의 평가와 조합하여 치료 성공을 판단하는 데 유용하다.
일부 실시형태에서, 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC의 효능은 대상체로부터의 종양 시료를 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC와 접촉시키고 종양 성장 속도 또는 부피를 평가함으로써 평가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC가 효과적인 것으로 결정된 경우, 이는 대상체에게 투여될 수 있다.
상기 치료적 접근법은 매우 다양한 추가의 수술, 화학 요법, 또는 방사선 치료 요법 중 임의의 것과 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC 또는 조성물은 하나 이상의 추가 치료제, 예를 들어 하나 이상의 화학치료제와 공동-제형화 및/또는 공동-투여된다. 화학치료제의 비-제한적인 예로는 알킬화제, 예를 들어 질소 머스타드, 에틸렌이민 화합물, 및 알킬 설포네이트; 항대사물질, 예를 들어 엽산, 푸린 또는 피리미딘 길항제; 항-유사분열제, 예를 들어, 에리불린 또는 에리불린 메실레이트(HalavenTM), 빈카 알칼로이드, 및 아우리스타틴과 같은, 항-튜불린 작용제; 세포 독성 항생제; DNA 발현 또는 복제를 손상시키거나 방해하는 화합물, 예를 들어 DNA 작은 홈(minor groove) 결합제; 및 성장 인자 수용체 길항제가 포함된다. 일부 실시형태에서, 화학치료제는 세포 독성제 또는 세포 증식 억제제일 수 있다. 세포 독성제의 예로는, 항-유사분열제, 예컨대 에리불린 또는 에리불린 메실레이트(HalavenTM), 아우리스타틴(예를 들어, 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE), 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF)), 메이탄시노이드(예를 들어, 메이탄신), 돌라스타틴, 듀오스타틴, 크립토피신, 빈카 알칼로이드(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴), 탁산, 탁솔, 및 콜히신; 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신, 독소루비신, 디하이드록시안트라신디온); 세포 독성 항생제(예를 들어, 미토마이신, 악티노마이신, 듀오카르마이신(예를 들어, CC-1065), 아우로마이신, 듀오마이신, 칼리케아미신, 엔도마이신, 페노마이신); 알킬화제(예를 들어, 시스플라틴); 삽입제(예를 들어, 에티듐 브로마이드); 토포아이소머라제 저해제(예를 들어, 에토포시드, 테노포시드); 방사성 동위 원소, 예컨대 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212 또는 213, P32, 및 루테튬의 방사성 동위 원소(예를 들어, Lu177); 및 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 독소(예를 들어, 리신(예를 들어, 리신 A-사슬), 디프테리아 독소, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소 A(예를 들어, PE40), 내독소, 미토겔린, 콤브레스타틴, 레스트릭토신(restrictocin), 겔로닌, 알파-사르신, 아브린(예를 들어, 아브린 A-사슬), 모덱신(예를 들어, 모덱신 A-사슬), 큐리신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(Sapaonaria officinalis) 저해제, 글루코코르티코이드)가 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
예를 들어 상기 기술된 방법에 따라, 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 개시된 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC 중 하나 이상의 용도가 또한 본원에 개시된다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 ADC는, 예를 들어 상기 기술된 방법에 따라, 암을 치료하기 위해 사용된다.
다양한 실시형태에서, 본원에 기술된 실험실 및 치료적 적용에서의 용도를 위한 키트는 본 개시의 범위 내에 있다. 이러한 키트는 바이알, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기를 수용하도록 구획화된 캐리어, 패키지, 또는 용기를 포함할 수 있으며, 용기(들) 각각은 본원에 기술된 용도와 같은, 용도를 위한 설명서를 포함하는 라벨 또는 삽입물과 함께, 본원에 개시된 방법에 사용될 개별 요소 중 하나를 포함한다. 키트는 약물 모이어티를 포함하는 용기를 포함할 수 있다. 본 개시는 또한, 작용제의 양을 표시하는, 앰풀 또는 봉지(sachette)와 같은, 기밀 밀봉된 용기 내에 포장된 항체, 항원-결합 단편 및/또는 ADC, 또는 이의 약제학적 조성물 중 하나 이상을 제공한다.
키트는 상기 기술된 용기, 및 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지를 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 물질을 포함하는 이와 관련된 하나 이상의 다른 용기; 내용물 및/또는 사용 설명을 나열한 캐리어, 패키지, 용기, 바이알 및/또는 튜브 라벨, 및 사용 설명이 있는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다.
조성물이, 예후, 예방, 진단, 또는 실험실 적용과 같은, 특정 요법 또는 비-치료적 적용에 사용됨을 표시하기 위해 라벨이 용기 상에 또는 용기와 함께 존재할 수 있다. 라벨은 또한, 본원에 기술된 것과 같은, 생체내 또는 시험관내 사용을 위한 지시를 나타낼 수 있다. 지시 및 또는 기타 정보는, 키트와 함께 또는 키트 상에 포함된, 삽입물(들) 또는 라벨(들) 상에도 또한 포함될 수 있다. 라벨은 용기 상에 있거나 용기와 연관될 수 있다. 라벨을 형성하는 글자, 숫자, 또는 기타 부호가 용기 자체에 성형되거나 에칭되는 경우 라벨은 용기 상에 있을 수 있다. 라벨은, 그것이 용기를 또한 보유하는 그릇 또는 캐리어 내에 존재하는 경우, 예를 들어 패키지 삽입물로서, 용기와 연관될 수 있다. 라벨은 조성물이, 본원에 기재된 암과 같은, 질환의 진단 또는 치료에 사용됨을 지시할 수 있다.
본원에 기술된 본 발명의 방법의 다른 적합한 변형 및 조정이 명백하고 본 발명 또는 본원에 개시된 실시형태의 범위를 벗어나지 않고 적합한 균등물을 사용하여 이루어질 수 있음이 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 지금 본 발명을 상세히 기술하였지만, 이는, 단지 예시의 목적으로 포함되고 제한하려고 의도되지 않은, 다음의 실시예를 참조함으로써 보다 명확하게 이해될 것이다.
실시예
실시예 1: 인간 메소텔린에 대한 키메라 항체 생성
토끼 및 인간 면역글로불린 서열을 함유하는 키메라 항체를 하기 기술된 절차에 따라 생성하였다. 항체를 인간 메소텔린으로의 결합 및 에피토프 결합에 대하여 분석하였다. 재조합 키메라 항-메소텔린 항체의 초기 ADC 세포 독성을 다양한 수준의 메소텔린을 발현하는 인간 세포주에서 평가하였다. 인간화 및 ADC 개발을 위한 선도 항체는 실시예 2 내지 3에 기술되어 있다.
1.1 시약 및 재료
1.1.1 항체
하기의 연구에 사용되는 항체는 토끼-인간 키메라(-xi) 형태의 항-인간 메소텔린 항체이며, 경쇄 위치 80에 쌍형성되지 않은 시스테인(LCcys80)을 갖는다. 항체를 정제하고, 하기 섹션 1.5에 기술된 바와 같이 시스테인 제거하였다(decysteinylate). 최종 단백질 함량을 BCA 검정 및 SDS-PAGE에 의해 평가하였다.
1.1.2 컨쥬게이트 가능한 세포 독소 및 LCcys80 ADC
하기의 연구에 사용되는 링커-세포 독소 화합물은 Mal-PEG2-아우리스타틴 F를 포함한다. 항체를 1:5(mAb:페이로드)의 몰비로 Mal-PEG2-아우리스타틴 F와 컨쥬게이트시켰다. 컨쥬게이트된 LCcys80 항체를 전개 완충제로서 1X DPBS를 사용하여, AKTA FPLC 상의 2x5 ㎖ HiTrap 탈염 컬럼(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))을 사용한 탈염 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 최종 단백질 함량을 BCA 검정에 의해 결정하였다.
1.1.3 종양 세포주
토끼-인간 키메라 ADC의 분석에 사용되는 인간 종양 세포주는 A431-K5(인간 메소텔린으로 안정적으로 트랜스펙션된 인간 흑색종 세포 A431, MSLNhi), A431 (MSLNlo) 및 OVCAR3(인간 난소 암종, MSLNhi)을 포함하였다. A431-K5 세포를 미국 국립 암 염구소(National Cancer Institute)로부터 수득하였다. 사용되는 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection; ATCC)으로부터 직접 수득하였다.
1.1.4 기타 시약
사용되는 모든 시약을 달리 나타내지 않는 한, 연구-등급 이상으로 상업적 공급처로부터 수득하였다.
1.2 인간 메소텔린에 대한 토끼에서의 항체의 생성
벡터 p0301로부터 인간 메소텔린 cDNA를 Aldevron 발현 벡터 내로 클로닝하였다(pB8-메소텔린-hum). 그 다음, 2마리의 토끼를 면역화 벡터 pB8-메소텔린-인간을 사용하여 면역화시켰다. 4회의 유전학적 적용 후에, 면역 혈청을 면역화 프로토콜의 제52일에 취하였다. 토끼 면역 혈청을 1% BSA를 함유하는 PBS 중에 1:1000 또는 1:5000 희석하고, 이전에 Aldevron 발현 벡터 내로 클로닝된 인간 메소텔린 cDNA(pB1-메소텔린-hum)로 일시적으로 트랜스펙션된 포유류 세포 및 동일한 벡터 내로 클로닝된 무관한 cDNA로 일시적으로 트랜스펙션된 포유류 세포를 사용하여 유세포측정에 의해 시험하였다. 그 다음, 면역 혈청으로부터 항체를 10 ㎍/㎖ 염소 항-토끼 IgG R-피코에리트린(서던 바이오테크(Southern Biotech), #4030-09)을 사용하여 검출하였다. 면역화, 유세포측정 및 세포의 동결-보존을 Aldevron(독일 드라이부르크 소재)에 의해 수행하였다.
1.3 항-메소텔린 항체를 생성하는 배양물의 고 처리량 스크리닝
1.3.1 세포 배양물
동결-보존된 토끼 림프절 세포(2.0x107개의 세포)를 해동시킨 다음, 피토라카 아메리카나(Phytolacca americana) 유래의 2.5 ㎍/㎖의 렉틴으로 활성화시키고, 5% CO2와 함께 37℃에서 1시간 동안 DNAse I을 사용하여 회수하였다. 세포를 피더(feeder) 세포(토끼 CD154를 발현하는 CHO)와 함께 384 웰 플레이트 상에 웰당 5개의 세포로 씨딩하고, 10.5 ng/㎖의 인간 IL2 및 10.5 ng/㎖의 인간 IL21 사이토카인(페프로테크(PeproTech))을 함유하는 완전 IMDM(10% FBS, 2 mM L-글루타민, 1X MEM NEAA, 1 mM 피루브산나트륨, 50 U/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 55 μM 2-Me가 보충된 IMDM) 중에 배양하였다.
1.3.2 토끼 IgG 및 인간 메소텔린에 대한 폴리클로널 항체의 단리
제2주에, 토끼 IgG 항체를 생성하는 웰을 유로퓸 크립테이트를 사용하여 IgG FRET에 의해 확인하였다. IgG를 생성하는 웰을 1 ㎍/㎖의 CHO-MT40 메소텔린이 코팅된 플레이트에 대하여 ELISA에 의해 토끼 IgG Fcγ 항체의 존재에 대하여 스크리닝하였다. 메소텔린 특이적인 토끼 IgG를 생성하는 배양물을 1 ㎍/㎖의 메소텔린에 대한 ELISA 스크리닝에 의해 확인하였으며, 1 ㎍/㎖의 CD73-his에 대하여 카운터 스크리닝하였다. FRET 및 ELISA를 Biomek® FX 로보틱 시스템(베크만(Beckman)) 상에서 수행하였다.
1.3.3 인간 메소텔린에 대한 토끼 항체의 mRNA 유전자 구제
전체 RNA를 RNAqueous™-96 전체 RNA 단리 키트(앰비온(Ambion))를 사용하여 토끼 IgG 항-메소텔린 항체를 생성하는 웰로부터 단리하였다. cDNA를 합성하고, 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 인-하우스 프라이머(표 11)를 사용하여 플래티늄(Platinum) Taq 원 스텝(one step) RT-PCR 키트(인비트로겐(Invitrogen))를 사용해 PCR에 의해 증폭시켰다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 플래티늄 Taq 증폭 키트 및 열순환기(40 사이클, 1분 94℃, 1분 54℃, 1.5분 68℃)를 사용하여 네스티드(nested) 프라이머(표 12)로 증폭시켰다. 증폭된 DNA 주형을 겔 전기영동에 의해 가시화시키고, QIAquick 96 PCR 정제 키트(퀴아젠(Qiagen))에 의해 정제하고, DNA 서열을 인-하우스 프라이머(표 13)를 사용하여 GeneWiz(미국 뉴저지주 사우쓰 플레인필드(South Plainfield))에 의해 결정하였다. DNA 서열을 V-유전자 및 J-유전자 토끼 패밀리(IMGT/V-QUEST)에 대해 및 인-하우스 인-퓨전 프라이머 데이터베이스(Blastn)에 대해 분석하였다. V 및 J 유전자 프라이머에 대하여 5' 말단에 부가된 인간 Fc 링커를 함유하는 인-퓨전 프라이머(표 14)를 확인하거나 설계하였다. 프라이머를 IDT(아이오와 주 코랄빌 소재)에 의해 합성하였다.
[표 11]
Figure pct00014
[표 12]
Figure pct00015
[표 13]
Figure pct00016
[표 14]
Figure pct00017
1.3.4 PCR 단편
PCR-증폭된 가변 도메인은 5' 및 3' 말단에서 서브클로닝 벡터 내의 클로닝 부위에 상동성인 15개 염기쌍을 포함하였다. PCR 단편을 제조처의 프로토콜에 따라 인-퓨전 HD 클로닝 키트(클론테크(Clontech))를 사용하여 인간 감마(p1974 pC+75IZ-ldr-InFusion-hugamma) 또는 카파 불변 영역(p1975 pC+75IB-ldr-InFusion-hukappa)을 함유하는 발현 플라스미드 내로 서브클로닝하였다. 1 ㎕의 인-퓨전 반응물을 제조처의 프로토콜에 따라 스텔라(Stellar) 컴피턴트(Competent) 세포(클론테크) 내로 형질전환시켰다. 형질전환체를 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate) 진탕기 상에 37℃에서 하룻밤 1 ㎖ TB 배지(테크노바(Teknova)) 중에 성장시켰다. 다음날, 배양물을 제조처의 프로토콜에 따라 엡모션(epMotion) 5075를 사용하여 퀴아프렙(QIAprep) 96 터보(Turbo) 미니프렙 키트(퀴아젠)로 미니프렙하였다.
1.3.5 유전자 합성 단편
인간화된 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화시키고, 진아트(GeneArt)에 의해 합성하였다. 가변 도메인을 코작(Kozak) 번역 개시 서열 및 Ig 분비 리더 서열과 함께 합성하였으며, 5' 및 3' 말단에 서브클로닝 벡터 내의 클로닝 부위에 상동성인 15개 염기쌍을 포함하였다. 진아트에 의해 합성된 PCR 단편을 InFusion HD 클로닝 키트(클론테크)를 사용하여 인간 감마(p1974 pC+75IZ-ldr-InFusion-hugamma) 또는 카파 불변 영역(p1975 pC+75IB-ldr-InFusion-hukappa)을 함유하는 발현 플라스미드 내로 서브클로닝하였다. 모든 클론을 서열결정하여, 삽입물의 존재 및 정확도를 확인하였다.
1.4 일시적인 mAb 생성
1.4.1 HEK 세포
엑스피펙타민(ExpiFectamine)(써모피셔(ThermoFisher))으로 트랜스펙션시킬 각각의 밀리리터의 3x106개의 세포에 있어서, 333.3 ng의 HC 플라스미드 및 333.3 ng의 LC 플라스미드를 50 ㎕의 Opti-MEM(써모피셔) 중에 5분 내지 10분 동안 인큐베이션시켰다. 마찬가지로, 2.67 ㎕의 엑스피펙타민을 50 ㎕의 Opti-MEM 중에 인큐베이션시켰다. 엑스피펙타민 용액을 DNA 혼합물에 첨가하고, 실온에서 20분 내지 30분 동안 인큐베이션시켰다. DNA:엑스피펙타민 혼합물을 와류시키면서 세포에 첨가하고, 125 rpm으로 진탕시키면서 37℃, 8% CO2에서 인큐베이션시켰다. 다음 날, 세포 ㎖당 5 ㎕의 인핸서(enhancer) 1 및 50 ㎕의 인핸서 2를 트랜스펙션에 첨가하였으며, 인큐베이션을 또 다른 7일 내지 10일 동안 계속하였다. 48시간 내지 72시간 후에, 세포를 10 g/ℓ의 이스톨레이트(Yeastolate)(비디 바이오사이언스즈(BD Biosciences)), 5 mM 발레르산(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)) 및 1:100 CD 지질 농축물(써모피셔)의 최종 농도로 공급하였다.
1.4.2 CHO 세포
엑스피펙타민 CHO(써모피셔)로 트랜스펙션시킬 각각의 밀리리터의 6x106개의 세포에 있어서, 500 ng의 HC 플라스미드 및 500 ng의 LC 플라스미드를 40 ㎕의 총 부피 중에 Opti-PRO(써모피셔)에서 혼합하였다. 마찬가지로, 3.2 ㎕의 엑스피펙타민 CHO를 36.8 ㎕의 Opti-PRO에서 혼합하였다. 엑스피펙타민 CHO 용액을 DNA 혼합물에 첨가하고, 실온에서 1분 내지 5분 동안 인큐베이션시켰다. DNA:엑스피펙타민 CHO 혼합물을 와류시키면서 세포에 첨가하고, 125 rpm에서 진탕시키면서 37℃, 8% CO2에서 인큐베이션시켰다. 다음 날, 세포 ㎖당 6 ㎕의 인핸서 및 160 ㎕의 피드(feed)를 트랜스펙션에 첨가하였으며, 세포를 32℃, 5% CO2로 옮겼다. 제5일에, 세포 ㎖당 추가 160 ㎕의 피드를 첨가하였다. 제12일 내지 제14일에, 상청액을 수집하였다.
1.5 mAb 정제 및 시스테인 제거
1.5.1 항체 정제
Prosep-vA 고 용량 단백질 A 수지(밀리포어(Millipore))를 DPBS로 평형화시키고, 50 ㎕를 2 ㎖의 시료에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안의 인큐베이션 후에, 배지 및 수지를 필터 플레이트에 첨가하고, 1 ㎖의 DPBS로 2회 세척하였다. 시료를 400 ㎕의 0.1 M 글리신, pH 2.9의 첨가에 이어서 15,000 x g에서 30초 동안의 원심분리에 의해 수지로부터 용리시켰다. 시료를 20 ㎕의 1 M 트리스(Tris), pH 8.0으로 중화시켰다. 시료를 0.5 ㎖의 아미콘 울트라(Amicon Ultra), 10k 컷오프 필터(밀리포어)를 사용하여 15,000 x g에서 5분 동안 원심분리에 의해 대략 100 ㎕로 농축시키고, 제조처의 프로토콜에 따라 0.5 ㎖ Zeba 탈염 컬럼, 7K MWCO를 사용하여 DPBS 내로 완충제-교환하였다. AU280을 측정함으로써 mAb 농도를 결정하고, mAb의 흡광 계수를 사용하여 ㎎/㎖로 전환시켰다.
1.5.2 시스테인 디캡핑(decapping)
AKTA 엑스프레스(Xpress) 정제 플랫폼(지이 헬쓰케어)을 사용하여 정제를 수행하였다. 최대 1 ℓ의 조정 배지를 20 mM 인산나트륨, 150 mM NaCl, pH 7.0에 평형화된 5 ㎖ MabSelect 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 로딩하였다. 컬럼을 안정한 기준선이 관찰될 때까지 로딩 후에 평형화 완충제로 광범위하게 세척하였다. 결합된 물질을 100 mM 글리신, pH 2.9를 사용하여 용리시켰다. 용리된 물질을 1X 인산염-완충 염수(PBS)에 평형화된 26/10 HiPrep 탈염 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 직접 주입하였으며, 동일한 완충제 중에 용리하였다. 피크 분획을 풀링하였다. 물질을 BCA 검정(써모피셔) 및 환원 및 비-환원 SDS-PAGE에 의한 전기영동에 의해 단백질 함량에 대하여 분석하였다.
1.6 ADC 개발을 위한 제조합 키메라 항-메소텔린 항체의 초기 스크리닝 및 특성화
항-메소텔린 항체를 일시적으로 발현시키고, 엑스피(Expi)-293 배지를 사용하여 96 딥-웰(deep-well) 플레이트에서 배양하였다. 상청액으로부터의 항체를 정제하고, 상기 기술된 바와 같이 시스테인 제거하였다. 항체를 1:5(mAb:페이로드)의 몰 비를 사용하여 페이로드로서 Mal-PEG2-아우리스타틴 F를 사용하여 컨쥬게이트시켰다. 컨쥬게이트된 항체를 Thermo Zeba 스핀 탈염 플레이트를 사용하여 탈염시켜, 과잉의 유리 페이로드를 제거하였다.
1.7 결합 특성화
1.7.1 옥텟(Octet)을 사용한 항-메소텔린 에피토프 비닝(binning)
메소텔린에 대한 항체 결합 에피토프를 초기에 맞춤 결합 검정을 사용하여 스트렙트아비딘 팁과 함께 옥텟을 사용하여 특성화시켰다. 항-메소텔린 항체의 에피토프 결합을 공지된 항-메소텔린 항체, MORAb-009(아마툭시맙(Amatuximab))에 의해 결합된 에피토프에 대하여 정규화시켰다. 항체를 MORAb-009와 동일한, 근처의 또는 상이한 에피토프로의 이들의 결합에 기초하여 그룹화시켰다. 모든 항체가 상이한 에피토프 비닝으로 정렬될 때까지 단계를 반복하였다. 결합 친화성을 옥텟 결과에 기초하여 높음, 중간 및 낮음으로 순위를 정하였다. 모든 결합 단계를 0.2% BSA를 함유하는 PBST 완충제에서 행하였다.
1.7.2 표면 플라스몬 공명(비아코어) 결합 분석
메소텔린에 대한 항-메소텔린 항체 결합 친화성을 시리즈 S CM5 칩을 사용하여 비아코어(비아코어 T-100, 지이 헬쓰케어, #1426075)에 의해 측정하였다. 항체 농도를 1 ㎍/㎖로 조정하고, 메소텔린(50 ㎍)을 1X HBS-P+ 완충제(지이 헬쓰케어) 중에 100 nM로 조정하였다. 항-인간 항체 포획 칩을 고정화 위자드(immobilization wizard)와 함께 CM5 칩을 사용하여 제조처의 프로토콜에 따라 제조하였다. 최종 포획 항체 수준은 HBS-P+에서 8000-9000 RU였다. 칩을 300초 완충제 주입에 이어서 30초 재생의 5개 사이클을 사용하여 검정을 위하여 제조하였으며, 모든 4개의 유동 셀에 걸쳐 모두 30 ㎕/분에서 이루어졌다. 항체를 10 ㎕/분에서 90초 동안의 개별 리간드 용액의 순차적인 주입에 의해 유동 셀 2-4 상에서 포획하였다. 분석물 주입을 각각 30 ㎕/분에서 240초 동안 저농도에서 고농도로의 분석물 용액의 순차적인 주입에 의해 단일-사이클 동역학 방식으로 행하였다. 검출은 2-1, 3-1, 4-1이었다. 이중-참조를 상기와 같이 동일한 리간드 포획 주입에 이어서 각각 240초 동안 5회의 완충제만의 주입, 1800초 동안의 해리 및 재생의 순서에 의해 수행하였다. 모든 리간드를 메소텔린으로의 결합에 대하여 2벌로 분석하였다. 동역학적 분석을 1:1 랑뮤어(Langmuir) 핏팅 모델을 사용하여 비아이밸류에이션(BIAEvaluations) 소프트웨어를 사용해 수행하였다. 결합-속도, 해리-속도 및 친화도 상수를 2벌의 시행으로부터 평균을 구하였다.
1.8 시험관내 세포 독성 분석
A431, A431-K5 및 OVCAR3 세포를 계대 배양하고, 96-웰 조직 배양 플레이트에서 완전 성장 배지 중에 5,000개 세포/웰로 씨딩하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤(16시간) 인큐베이션시켰다. 시험 시약을 200 nM에서 시작하여, 2 ㎖ 딥-웰 희석 플레이트에서 1:3 연속 희석하였다(총 10회 희석). 희석된 시료(100 ㎕)를 세포 플레이트에 첨가하였다(100 nM에서 시험 시료의 시작 농도). 플레이트를 추가 5일 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 배지를 폐기하고, 플레이트를 200 ㎕의 DPBS로 1회 세척하고, 실온에서 15분 동안 50 ㎕의 0.2% 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색한 다음, 수돗물로 광범위하게 세척하였다. 플레이트를 자연-건조시키고, 크리스탈 바이올렛을 200 ㎕의 1% SDS 용액으로 용해시켰다. 플레이트를 570 nm에서 판독하였다. 데이터를 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 6을 사용하여 분석하였다.
1.9 결과
1.9.1 토끼 면역화
2마리의 토끼를 4가지 유전학적 적용을 위하여 플라스미드 pB8-메소텔린-인간으로 DNA 면역화시켰다. 면역 혈청을 면역화 프로토콜 제52일에 취하고, 1% BSA를 함유하는 PBS 중에 1:1000 또는 1:5000 희석하고, 메소텔린-발현 세포를 사용하여 유세포측정법에 의해 시험하였다. 둘 모두의 면역화된 토끼로부터의 혈청은 pB1-메소텔린-hu로 트랜스펙션된 세포였던 메소텔린-발현 세포에 결합하였다(도 1, 하측 곡선). 반대로, 면역화된 토끼로부터의 혈청은 무관한 cDNA로 트랜스펙션된 세포에 결합하지 않았다(도 1, 상측 곡선).
1.9.2 인간 메소텔린에 대한 토끼 폴리클로널 항체를 생성하는 배양물의 고 처리량 스크리닝
토끼 림프절 세포를 수거하고, 동결-보존하였다. 해동된 림프절로부터의 세포(2x107개의 세포)를 피더 세포가 있는 384 웰 플레이트 상에 웰당 5개 세포로 씨딩하고, 10.5 ng/㎖의 인간 IL-2 및 10.5 ng/㎖의 인간 IL-21 사이토카인을 함유하는 완전 IMDM에서 배양하였다. 유로퓸 크립테이트를 사용한 IgG FRET를 통하여 씨딩 2주 후에 토끼 IgG 항체를 생성하는 웰을 확인하였으며, 18,715개의 IgG-생성 배양물을 ELISA에 의해 인간 메소텔린 반응성에 대하여 스크리닝하였다. 85개의 메소텔린-특이적 배양물을 메소텔린에 대한 반응성에 대하여 재확인하였으며, 인간 CD73에 대한 반응성에 대하여 카운터-스크리닝하였다. CD73에 대하여 교차 반응성을 갖지 않는 0.2 초과의 OD450으로 메소텔린에 결합하는 토끼 Fcγ 항체를 생성하는 54개의 확인된 배양물이 존재하였다(도 2). 일차 ELISA 결과는 가장 우측의 막대의 세트에 의해 나타나 있고, 이차 ELISA 결과는 가장 좌측의 막대의 세트에 의해 나타나 있고, 인간 CD73 결합은 중간의 막대의 세트에 의해 나타나 있다.
1.9.3 가변 영역의 RT-PCR, 서열결정 및 클로닝
전체 RNA를 토끼 IgG 항-메소텔린 항체를 생성하는 54개의 확인된 배양물로부터 단리하였으며, cDNA를 RT-PCR에 의해 합성하고, 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 PCR 증폭시켰다. 52개의 DNA 서열을 V-유전자 및 J-유전자 토끼 패밀리(IMGT/V-QUEST)를 사용하여 분석하였으며, 51개를 불변 영역 발현 벡터 내로의 인-퓨전 클로닝에 특이적인 프라이머로 PCR 증폭시켰다(도 3). 총 48개의 항체를 인간 불변 영역 발현 벡터 내로 클로닝한 후에, expi293F 세포 내로 트랜스펙션시켰다. 항체가 51개의 트랜스펙턴트 중 45개에서 검출되었으며(도 4), 토끼 가변 영역을 인간 불변 영역 발현 벡터 내로 인-퓨전 클로닝하였다.
1.9.4 메소텔린-발현 세포에 대한 ADC의 초기 스크리닝
키메라 토끼 항-인간 메소텔린(rb-hu-xi 항-MSLN) 항체를 섹션 1.5에 기술된 방법에 따라 정제하였다. 정제된 항체의 단백질 농도를 결정하였다(도 5). ADC 개발을 위한 항-메소텔린 항체의 스크리닝을 완료하기 위하여, 항-메소텔린 항체와 Mal-PEG2 아우리스타틴 F의 마이크로-컨쥬게이션을 수행하였으며, ADC를 OVCAR3, A431-K5 및 A431 세포주를 사용하여 시험관내 세포 기반의 효력 검정에서 특성화하였으며, 여기서, OVCAR3 및 A431-K5는 높은 수준의 메소텔린을 발현하였고, A431(MSLN-)을 ADC의 표적외 살해 및 특이성을 평가하기 위한 대조군 세포주로서 사용하였다(도 6).
1.9.5 항-메소텔린 항체의 에피토프 결합
48개의 항-메소텔린 항체의 메소텔린에 대한 결합 에피토프를 섹션 1.7.1에 나타낸 바와 같이 옥텟을 사용하여 특성화하였다. 6개의 상이한 에피토프를 항체에 대하여 확인하였으며, 102A6은 옥텟에 의해 현재의 형식에서 결합이 관찰되지 않았다(도 7). 메소텔린에 대한 항체 결합 친화도를 섹션 1.7.2에 나타낸 바와 같이 비아코어에 의해 측정하였다. 결합 친화도 결과는 표 15에 요약되어 있다.
[표 15]
Figure pct00018
상기 결과에 기초하여, 모든 에피토프 빈을 포괄하는 15개의 항체를 표 16에 나타낸 바와 같이, 규모 확대 컨쥬게이션 및 특성화를 위해 선택하였다. 또한, 102A6A를 아우리스타틴 F에 컨쥬게이션되는 때의 유리한 실험관내 효력에 기초하여 선택하였다.
[표 16]
Figure pct00019
실시예 2: 항-메소텔린 ADC의 인간화
인간화된 항-메소텔린 항체를 하기 기술된 절차에 따라 생성하였다. 항체 및 ADC를 인간 메소텔린으로의 결합 활성의 보유 및 메소텔린을 발현하는 세포를 향한 세포 살해 효력에 대하여 분석하였다. 또한, 항체를 약물 로딩, 응집, 열 안정성 및 혈청 및 기질 안정성에 대하여 생물물리학적으로 특성화하였다. 선도 인간화 항체 및 ADC를 실시예 3에 기술된 바와 같이 생체내에서 평가하였다.
2.1 시약 및 재료
2.1.1 항체
하기의 연구에서 사용되는 항체는 경쇄 위치 80에 쌍형성되지 않은 시스테인(LCcys80)을 가지며, 항-인간 메소텔린 항체 33O11, 201C15, 111B10, 324O5, 178F16, 264E24, 237N18, 383I18, 393L14, 346C6, 62B10, 55B4, MORAb009, 120N18, 345A12 및 102A6A2의 토끼-인간 키메라(-xi) 및 인간화(-zu) 형태 둘 모두를 포함한다. 항체를 Prosep-vA 고 용량 단백질 A 수지 및 Zeba 탈염 컬럼을 사용하여 일괄 정제하였다. 조정 배지를 정제하고, 섹션 1.5(실시예 1)에 기술된 바와 같이 시스테인 제거하였다. 최종 단백질 함량을 BCA 검정 및 SDS-PAGE를 통해 평가하였다.
2.1.2 컨쥬게이트 가능한 세포 독소 및 LCcys80 ADC
하기의 연구에서 사용되는 링커-세포 독소 화합물은 말레이미드-VCP-에리불린, 말레이미드-VCP-크립토피신 및 말레이미드-VCP-에리불린 이량체를 포함한다. 컨쥬게이트된 항체를 1X DPBS에서 평형화된 HiTrap 탈염 컬럼(지이 헬쓰케어)과 함께 탈염 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 최종 단백질 함량을 BCA 검정에 의해 결정하였다.
2.1.3 종양 세포주
토끼-인간 키메라 ADC의 분석에서 사용되는 인간 종양 세포주는 A431(인간 흑색종 세포, MSLNneg), A3(인간 메소텔린으로 안정적으로 트랜스펙션된 A431, MSLNhi) OVCAR3(인간 난소 암종 세포, MSLNhi), HEC-251(인간 자궁내막양, MSLNmed) 및 H226(인간 폐 편평 세포 중피종, MSLNlo)을 포함하였다. JCRB로부터 수득된 HEC-251 및 A431 부모 세포주로부터의 Morphotek에서 생성된 A3을 제외하고 사용되는 모든 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)으로부터 직접 수득하였다.
2.1.4 기타 시약
사용되는 모든 시약을 달리 나타내지 않는 한, 연구-등급 이상으로 상업적 공급처로부터 수득하였다.
2.2 ADC의 생물물리학적 특성화
2.2.1 SEC-HPLC 응집 분석
SEC-HPLC 분석을 Agilent(아질런트) 1200 HPLC 시스템을 사용하여 행하였다. 어드밴스바이오(AdvanceBio) SEC 300A(2.7 ㎛, 7.8 x 50 mm, 시리얼 번호 0006344424-13, 뱃치 번호 0006344424) 가드 컬럼을 0.1 M 인산나트륨, 0.15 M 염화나트륨, 5% IPA, pH 7.4에서 평형화된 어드밴스바이오 SEC 300A 분석 컬럼(2.7 ㎛, 7.8 x 300 mm, 시리얼 번호 0006336837-4, 뱃치 번호 0006336837)에 0.5 ㎖/분의 유속으로 연결하였다.
LCcys80 ADC의 응집을 아질런트 1200 HPLC를 사용하여 크기-배제, 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)에 의해 분석하였다. 항체 및 ADC를 1X DPBS 중에 2 ㎎/㎖로 제조하고, 각각의 시료의 8 ㎕(16 ㎍)를 주입하고, 36분 동안 실행하였다. 모든 데이터를 아질런트 켐스테이션(ChemStation) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 응집 퍼센트, 단량체 퍼센트 및 단편화 퍼센트를 기록하였다.
2.2.2 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC-HPLC) DAR 분석
DAR을 아질런트 HPLC 1260 시스템 상에서 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC-HPLC)를 사용하여 분석하였다. 시료를 TSKgel 에틸-5PW 컬럼(토소 바이오사이언스(TOSOH Bioscience), 7.5 mm ID x 7.5 cm, 10 ㎛, 비공성 크기) 상에 주입하고, 0.7 ㎖/분으로, 100%의 이동상 A에서의 3분 평형화, 15분 기울기(0-100% B), 100% B에서 5분 유지, 100% A로의 1분 변화 및 100%의 이동상 A에서의 5분 재평형화를 사용하여 컬럼으로부터 용리시켰다. 이동상 A는 25 mM 인산나트륨, 1.5 M 황산암모늄, pH 7.0이었다. 이동상 B는 25 mM 인산나트륨, 25% 이소프로판올, pH 7.0이었다. 검출을 280 nm(참조 320 nm)에서 수행하였다. DAR을 하기의 화학식에 의해 결정하였다:
[AUC+1 + 2(AUC+2) + 3(AUC+3) +…n(AUC+n)]/ΣAUCtot]
상기 식에서, AUC+1은 하나의 세포 독소와 컨쥬게이트된 ADC에 대응하는 항체 피크에 대한 곡선 아래 면적이며, AUC+2는 2개의 세포 독소와 컨쥬게이트된 ADC에 대응하는 항체 피크에 대한 곡선 아래 면적이다. ΣAUCtot는 컨쥬게이트된 및 비컨쥬게이트된 피크에 대한 조합된 곡선 아래 면적이다(DAR = 0, 1 및 2).
2.2.3 액체 크로마토그래피/질량분석법(LC-MS) DAR 분석
또한, DAR을 SQD/PDA 검출과 함께 워터스(Waters) 얼라이언스(Alliance) HPLC를 사용하는 LC-MS 방법을 사용하여 분석하였다. 시료를 65℃에서 프로테오믹스(Proteomix) RP-1000 컬럼(5 ㎛, 1000 Å, 4.6 mm x 15 cm, 세팍스(Sepax)) 상에 주입하고, 25% B에서의 3분 평형화, 25% 내지 55% B의 27분 선형 기울기, 55% B에서 5분 유지, 90% B로의 1분 변경, 90% B에서 5분 유지, 25% B로의 1분 재변경 및 25% B에서의 5분 재평형화로 용리하였다. 이동상 A는 수 중 0.1% TFA였으며, 이동상 B는 아세토니트릴 중 0.1% TFA였다. 그 다음, 용리액을 PDA 및 SQD 검출기 내로 10:1 분할하였다. SQD 검출기를 ES 포지티브로, 모세관 전압을 3.5 KV로, 콘 전압을 50 V로, 추출기를 5 V로, RF 렌즈를 0.3 V로, 소스 온도를 150℃로, 탈용매화 온도를 350℃로 설정하였다. 질량 데이터를 40분 동안 200-2000 m/z, 컨티넘 모드(continuum mode) 및 스캔 시간 1초에서 획득하였다. 데이터를 MassLynx 및 MaxEnt1을 사용하여 오프라인에서 분석하고, 데콘볼루션시켰다(deconvolute). DAR을 하기 화학식을 사용하여 계산하였다:
2[[AUCLC+1 + 2(AUCLC+2) + 3(AUCLC+3) +…n (AUCLC+n)]/ΣILCtot] +2[[AUCHC+1 + 2(AUCHC+2) + 3(AUCHC+3) +…n (AUCHC+n)]/ΣAUCHCtot]
상기 식에서, AUCLC+1은 하나의 세포 독소와 컨쥬게이트된 경쇄 피크의 곡선 아래 면적이며, AUCLC+2는 2개의 세포 독소와 컨쥬게이트된 경쇄 피크의 곡선 아래 면적인 등등이다. AUCHC는 대응하는 중쇄의 곡선 아래 면적이며, ΣAUCLCtot 및 ΣAUCHCtot는 각각 모든 비컨쥬게이트된 및 컨쥬게이트된 경쇄 및 중쇄의 조합된 곡선 아래 면적이다.
2.3 결합 특성화
2.3.1 옥텟을 사용한 항-메소텔린 에피토프 비닝
메소텔린에 대한 항체 결합 에피토프를 맞춤화 결합 검정을 사용하여, 스트렙트아비딘 팁과 함께, 옥텟을 사용하여 초기에 특성화하였다. 항-메소텔린 항체의 에피토프 결합을 공지된 항-메소텔린 항체, MORAb-009에 의해 결합된 에피토프에 대해 정규화시켰다. 항체를 MORAb-009와 동일한, 인근의 또는 상이한 에피토프로의 이들의 결합에 기초하여 그룹화시켰다. 모든 항체가 상이한 에피토프 비닝으로 정렬될 때까지 단계를 반복하였다. 결합 친화도를 옥텟 결과에 기초하여 높음, 중간 및 낮음으로서 평가하였다. 모든 결합 단계를 0.2% BSA를 함유하는 PBST 완충제 중에서 행하였다.
2.3.2 표면 플라스몬 공명(비아코어) 결합 분석
메소텔린에 대한 항-메소텔린 항체 결합 친화도를 시리즈 S CM5 칩을 사용하여 비아코어에 의해 측정하였다(비아코어 T-100, 지이 헬쓰케어, #1426075). 항체 농도를 1 ㎍/㎖로 조정하고, 메소텔린(50 ㎍)을 1X HBS-P+ 완충제(지이 헬스케어) 중에 100 nM로 조정하였다. 항-인간 항체 포획 칩을 고정화 위자드와 함께 CM5 칩을 사용하여 제조처의 프로토콜에 따라 준비하였다. 최종 포획 항체 수준은 HBS-P+에서 8000-9000 RU였다. 칩을 300초 완충제 주입에 이어서 30초 재생의 5개 사이클을 사용한 검정을 위하여 제조하였으며, 모든 4개의 유동 셀에 걸쳐 모두 30 ㎕/분에서 이루어졌다. 항체를 10 ㎕/분에서 90초 동안의 개별 리간드 용액의 순차적인 주입에 의해 유동 셀 2-4 상에서 포획하였다. 분석물 주입을 각각 30 ㎕/분에서 240초 동안 저농도에서 고농도로의 분석물 용액의 순차적인 주입에 의해 단일-사이클 동역학 방식으로 행하였다. 검출은 2-1, 3-1, 4-1이었다. 이중-참조를 상기와 같은 동일한 리간드 포획 주입에 이어서 각각 240초 동안 5회의 완충제만의 주입, 1800초 동안의 해리 및 재생의 순서에 의해 수행하였다. 모든 리간드를 메소텔린으로의 결합에 대하여 2벌로 분석하였다. 동역학적 분석을 1:1 랑뮤어 핏팅 모델을 사용하여 비아이밸류에이션스 소프트웨어를 사용해 수행하였다. 결합-속도, 해리-속도 및 친화도 상수를 2벌의 시행으로부터 평균을 구하였다.
2.4 시차 주사 열량측정법(DSC) 열 안정성 분석
VP 모세관 시차 주사 열량측정법(VP-CapDSC; 마이크로칼(Microcal), VP-CapDSC, #12-07-149와 오리진(Origin)-7 그래핑 및 마이크로칼 VP-모세관 DSC 소프트웨어 v.2.0)을 사용하여, 다양한 F(ab')2 단편 및 대조군의 고차 구조 및 열 안정성을 해독하고 비교하였다. 시료를 20% 콘트라드(Contrad) 용액을 사용하여 96-웰 검정 플레이트(마이크로리터 애널리티컬 서플라이(Microliter Analytical Supply))에서 제조하고, 10℃에서 오토-샘플러(auto-sampler)에서 분석하였다.
2.5 모세관 등전점 포커싱(cIEF) 분석
오토-샘플러 시약을 CFR 설치 및 시작 절차에 따라 채웠다. 헤모글로빈을 시스템 안정성 표준으로 사용하였다. 뱃치 데이터 분석을 위한 디폴트 설정을 사용하였다. 포커스 기간 #1을 시스템 적합성 표준 및 시료 둘 모두에 대하여 1,500 V에서 1분 동안 수행하였다. 포커스 기간 #2를 시스템 적합성 표준에 대하여 3,000 V에서 5분 동안, 그리고 TIGC 시료 및 일치되는 완충제 대조군에 대하여 3,000 V에서 11분 동안 수행하였다. 중복 TIGC 시료는 4.5분에 포커스 기간 #2를 사용하였으며, 모든 시료를 시스템 적합성 표준과 괄호로 묶었다. 시료를 0.1의 피크 폭 파라미터 및 5의 임계값을 사용하여 자동으로 통합하고, pI 7.5 내지 9.4에서 통합하였다.
2.6 DAR2 및 DAR6 MORAb-109 ADC의 제조
345A12-HC15-LC4 CHOZN 세포주를 생존력이 30% 미만이 될 때까지 웨이브 백(wave bag)(20 ℓ)에서 배양하고, TFF를 사용하여 2 ℓ로 농축시켰다. 항체를 20 mM 인산나트륨, 10 mM EDTA, pH 7.2 중에 사전평형화된 아모스피어(Amosphere) A3 수지 상에 포획하고, 안정한 기준선이 달성될 때까지 동일한 완충제에서 세척한 다음(미결합 물질을 제거하기 위함), 낮은 유속으로 20 mM 인산나트륨, 10 mM EDTA, 10 mM 시스테인, pH 7.2를 사용하여 8시간 동안 컬럼 상에서 환원시킨 다음, 20 mM Tris, pH 7.5를 사용하여 컬럼 상에서 60시간 동안 재산화시켰다. 결합된 물질을 0.1 M 글리신, pH 3.0 중에 용리한 다음, 1X PBS, 2 mM EDTA, pH 7.4 내로 정용여과하고, 10 ㎎/㎖ 초과로 농축시켰다. 최종 회수는 100%였다.
DAR2 MORAb-109에 있어서, 말레이미드-VCP-에리불린을 (DMSO 중에) 1:2.5(mAb:페이로드)의 몰 비로 실온에서 1시간 동안 첨가하였다. 컨쥬게이션 후에, 물질을 2 ㎎/㎖로 희석시키고, 1X PBS, 2 mM EDTA 내로 정용여과하여, 비컨쥬게이트된 링커-페이로드를 제거하고, 5 ㎎/㎖로 농축시켰다. DAR2 물질을 분취용 에테르-5PW HIC 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 최종 물질을 SEC-HPLC, RP-HPLC 및 HIC-HPLC에 의해 특성화하였다.
DAR6 MORAb-109에 있어서, 정제된/시스테인 제거된 항체를 1X PBS, 2 mM EDTA 중에 7.5 ㎎/㎖로 희석하고, 동일한 부피의 동일한 완충제 중 250 μM TCEP를 50분 동안 첨가함으로써 추가로 환원시킨 다음, 동일한 총 부피의 1X DPBS/1mM EDTA 중 50% 프로필렌 글리콜을 첨가한 다음, 마지막으로 말레이미드-VCP-에리불린을 1:8(mAb:페이로드)의 몰 비로 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. ADC를 G-25 크로마토그래피에 의해 정제하여, 비컨쥬게이트된 페이로드를 제거하고, 1X PBS, 2 mM EDTA 내로 제형화하였다. 최종 물질을 SEC-HPLC, RP-HPLC 및 HIC-HPLC에 의해 특성화하였다.
2.7 시험관내 혈청 안정성
항-메소텔린 ADC(페이로드로서 말레이미드-VCP-에리불린)를 PBS 또는 인간 혈청 중에 0.5 ㎎/㎖로 제조하였다. 시료를 37℃에서 0, 24, 48, 72, 96, 또는 240시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 보관을 위하여 -80℃로 옮겼다. 모든 시료를 주위 온도까지 해동시키고, 시험을 위하여 1:2,000 단일 희석하였다. 시료를 전체 mAb, 전체 ADC에 대하여, 그리고 세포 기반의 효력에서 시험하였다. 전체 mAb 검정을 자이로랩(Gyrolab) XP 상에서 단계적 샌드위치 형식으로서 개발하고, 비오티닐화된 메소텔린으로 포획하고, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647 항-IgG1 Fc로 검출하였다. 전체 mAb 및 온전한 ADC 검정에 대한 정량화 가능한 범위는 각각 6.25 내지 800 ng/㎖ 및 6.25 내지 800 ng/㎖였다. 표준 곡선 및 QC를 MORAb-109(345A12-HC15-LC4-VCP-에리불린)로 제작하였다.
2.8 MORAb-109 ADC의 시험관내 DAR-감수성 매트릭스 안정성
MORAb-109(345A12-HC15-LC4-VCP-에리불린) DAR 2를 PBS 또는 인간, 원숭이, 랫트 또는 마우스 혈청 중에 0.1 ㎎/㎖로 3벌로 제조하였다. 시료를 37℃에서 0, 24, 48, 72, 96, 또는 240시간 동안 인큐베이션시켰다. 각각의 시점으로부터 제거된 시료를 보관을 위하여 -80℃로 옮겼다. 무표지 생물층 간섭계 검정을 사용하여 분석을 수행하였다. 매트릭스 시료를 0.05% Tween-20 및 1% BSA를 함유하는 1X PBS(검정 완충제) 중에 1:20 희석하였다. MORAb-109 DAR 0, DAR 1, DAR 2 및 DAR 6의 대조군 시료를 일치되는 매트릭스에서 0.1 ㎎/㎖로 희석하였다. 음성 대조군 시료는 5% 매트릭스-단독이었다. 검정 완충제 중 5 ㎍/㎖의 비오티닐화된 메소텔린을 SA 스트렙트아비딘 바이오센서 팁(300초; 폴-포르테바이오(Pall-ForteBio)) 상에서 포획한 후에, 희석된 안정성 시료 및 대조군의 포획(300초)으로 이어졌다. 이어서, 100 ㎎/㎖의 토끼-인간 키메라 항-에리불린 항체 5E4의 결합에 의해 페이로드를 정량화하였다. 회합을 결합이 평형화에 도달한 시점에 300초 동안 모니터링하였다. 해리 단계의 마지막(Req)에 결합 수준을 회합 295초에 각각의 시료에 대하여 결정하였다. t0에 비하여 Req 퍼센트를 플롯팅함으로써 안정성을 결정하였으며, 여기서,
Req 퍼센트 = Reqtx/Reqt0 [100] 및 tx = 0 - 240시간이다.
2.9 시험관내 세포 독성 분석
A431, A3, OVCAR3, HEC-251 및 H226 세포를 계대 배양하고, 96-웰 조직 배양 플레이트에서 완전 성장 배지 중에 5,000개 세포/웰로 씨딩하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤(16시간) 인큐베이션시켰다. 시험 시약을 200 nM에서 시작하여, 2 ㎖ 딥-웰 희석 플레이트에서 1:3 연속 희석하였다(총 10회 희석). 희석된 시료(100 ㎕)를 세포 플레이트에 첨가하였다(100 nM에서 시험 시료의 시작 농도). 플레이트를 추가 5일 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 배지를 폐기하고, 플레이트를 200 ㎕의 DPBS로 1회 세척하고, 실온에서 15분 동안 50 ㎕의 0.2% 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색한 다음, 수돗물로 광범위하게 세척하였다. 플레이트를 자연 건조시키고, 크리스탈 바이올렛을 200 ㎕의 1% SDS 용액으로 용해시켰다. 플레이트를 570 nm에서 판독하였다. 데이터를 그래프패드 프리즘 6을 사용하여 분석하였다.
2.10 결과
2.10.1 인간화된 항-메소텔린 에리불린 ADC의 초기 스크리닝
15개의 항-메소텔린 항체를 서브-클로닝하고, 규모 확대 발현하고, 정제하고, Cys80 위치에서 페이로드로서 말레이미드-VCP-에리불린을 사용하여 컨쥬게이트시켰다. 모든 ADC를 정제하고, 응집 분석을 위하여 SEC-HPLC, DAR 분석을 위하여 HIC-HPLC 및 A431-A3(MSLNhi), A431(MSLNlo) 및 OVCAR3(MSLNhi) 세포주를 사용한 세포-기반의 검정을 사용하여 특성화시켰다. 세포를 6시간 동안 ADC로 처리한 다음, 세척하거나, 효력 비교를 위하여 48시간(A431-A3 및 A431 세포) 또는 72시간(OVCAR3 세포) 동안 처리하였다. 특성화 데이터는 하기에 요약되어 있다.
표 17. 하기의 특성화 데이터에 기초하여, 6개의 항체(볼드체)를 인간화를 위해 선택하였다.
[표 17]
Figure pct00020
2.10.2 ADC의 HC1-LC1 인간화 및 시험관내 세포 독성
토끼 102A6A2, 11B10, 201C15, 345A12 및 346C6 Fv 영역에 대한 서열을 IGBLAST(미국 국립 생물 정보 센터(NCBI)) 및 IMGT/DomainGapAlign(국제 면역유전학 정보 시스템(IMGT®)) 툴을 사용하여 인간 생식계 가변 도메인 단백질 서열에 대한 가장 근접한 상동성에 대하여 블라스팅하였다. 토끼 프레임워크 서열을 가장 근접한 상동성 인간 생식계 서열로 대체하여, CDR-그라프트된 인간화 변이체(HC1 및 LC1)를 생성하였다. 카바트-정의된 FWRH2의 마지막 2개의 잔기를 토끼 잔기로서 유지하였다. 최종 카바트 정의된 FWRH3 잔기를 111B10에 대하여 유지하였다. Vκ 영역 내의 RESPECT-L 모티프 Cys80 및 Ala83을 모든 클론에 대하여 유지하였다. 인간화 항체를 생성한 후에, 키메라 및 인간화 항체 둘 모두를 3가지 상이한 페이로드(말레이미드-VCP-에리불린, 말레이미드-VCP-크립토피신 및 말레이미드-VCP-에리불린 이량체)와 컨쥬게이트시켜, 소수성을 달라지게 하였다. 표 18에 요약된 바와 같이, 메소텔린에 대한 결합 친화도를 모든 항체에 대하여 비아코어에 의해 측정하였으며, ADC를 응집 백분율(%), DAR 및 시험관내 효력에 대하여 특성화하였다. 인간화 항-메소텔린 ADC의 효력 페이로드도 또한 측정하였으며, 표 19에 요약되어 있다. ADC는 시험된 모든 5가지 세포주에서 낮은 나노몰의 세포 살해 EC50 값을 가졌다.
[표 18]
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
[표 19]
Figure pct00024
2.10.3 인간화 개선
201C15, 345A12 및 346C6 클론에 대한 메소텔린 결합의 소실로 인하여, 메소텔린에 대한 결합을 유지하기 위하여 후속적인 돌연변이가 필요하였다. 토끼 및 CDR-그라프트된 Fv 서열을 사용하여 가변 도메인의 인 실리코 모델을 생성하였다. 토끼 및 인간화 모델의 이론적 구조를 중첩시켰으며, CDR에 매우 근접한 잔기를 CDR 루프의 전체 구조에 대한 잠재적인 구조적 영향에 대하여 분석하였다. 토끼와 인간화 서열 간에 상이한 잔기를 확인하였다. 대부분의 상이한 잔기는 이량체 계면에 위치하지 않거나, CDR에 대해 원위였다. VH 및 Vκ 영역 내의 몇몇의 잔기가 CDR에 매우 근접(5 Å 이내)한 것으로 관찰되었으며, 추가로 분석하였다.
VH 영역 내의 2개의 인간화 영역이 클론 201C15, 345A12 및 346C6에서 항원-결합을 방해할 가능성이 있는 것으로 확인되었다. 모든 클론에 대한 N 말단은 HC1에서 토끼 서열보다 1개 아미노산이 더 길었다. 또한, 각각은 FWRH3 내에 2-아미노산 결실을 가졌다(잔기 72 내지 73). 이들 클론의 각각에 대하여, 처음 5개의 아미노산 및 HC1의 FWRH3 결실 주위의 6개의 아미노산(잔기 71-76)을 토끼 서열로 복귀시켰다. 345A12의 잔기 93도 또한 HC5에서 토끼로 복귀시켰다. LC1에 관하여, 201C15, 345A12 및 346C6의 N 말단을 토끼 서열로 복귀시켰다. 201C5(잔기 67) 및 345A12(잔기 70)의 FWRL3 내의 1개의 잔기가 CDR과 상호작용할 가능성이 있는 것으로 확인되었으며, 346C6의 FWRL2 내의 1개의 잔기(잔기 36)가 마찬가지로 확인되었다.
2.10.4 슈퍼-인간화 345A12
항원-결합에 중요한 것으로서의 Vκ 내의 추가의 토끼 잔기의 확인과 함께, 345A12의 추가의 돌연변이체를 생성하여, VH 및 Vκ 영역의 도처에 증가하는 수의 인간 잔기를 도입하였다. 인 실리코 모델의 분석에 의해, VH에서 잔기 35, 48, 49, 57, 58, 61, 62, 63 및 64, 및 Vκ에서 잔기 1, 3, 24, 55 및 70이 확인되었다.
2.10.5 슈퍼-인간화 345A12 항체의 생물물리학적 특성화
슈퍼-인간화 345A12 항체를 350 ㎖의 규모 확대 세포 배양물로부터 정제하고, 1X DPBS에서 제형화하였다. 물리-화학적 특성 평가를 위하여 항체를 농축시켰다. 표 20에 나타낸 바와 같이, HC10-LC7 및 HC15-LC7의 조합은 아마도 상대적으로 낮은 pI 또는 불량한 용해도로 인하여, 농축 단계 동안 침전되었다. 정제된 항체를 메소텔린 결합 친화도에 대하여 비아코어에 의해 분석하였으며, 데이터는 하기 표 21에 요약되어 있다.
[표 20]
Figure pct00025
[표 21]
Figure pct00026
2.10.6 DSC 및 cIEF 분석
F(ab')2 단편의 열 용융 곡선을 DSC에 의해 분석하였다. HC15-LC4 F(ab')2 및 HC10-LC4 F(ab')2의 프로필은 도 8에 나타나 있다.
345A12-HC10-LC4 및 345A12-HC15-LC4 mAb의 pI를 cIEF에 의해 분석하였다. pI는 각각의 mAb 사이에 0.06 pH 단위 내에서 달라졌으며, 345A12-HC10-LC4에 대하여 8.19 및 345A12-HC15-LC4에 대하여 8.25였다(표 22).
[표 22]
Figure pct00027
2.10.7 혈청 안정성
345A12-HC10-LC4 및 345A12-HC15-LC4 ADC의 PBS/인간 혈청 안정성 평가를 섹션 2.7에 기술된 바와 같이 최대 10일 동안 시험하였다. 데이터는 하기 표 23에 요약되어 있다.
[표 23]
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
2.10.8 DAR-감수성 옥텟 검정을 사용한 다양한 매트릭스에서의 345A12-HC15-LC4-VCP-에리불린의 매트릭스 안정성
345A12-HC15-LC4-VCP-에리불린(DAR2)을 마우스, 랫트, 시노몰구스 원숭이 및 인간 혈장 및 혈청에서 시험관내 안정성에 대하여 분석하였다. ADC를 1주 동안 0.1 ㎎/㎖로 매트릭스 중에서 인큐베이션시켰으며, 시점을 1, 2, 3, 4 및 10일 후에 제거하였다. 섹션 2.3.1에 기술된 바와 같이 DAR-감수성 옥텟(생물층 간섭계)-기반의 검정을 사용하여 분석을 행하였다. 결과는 도 9에 나타나 있다. 345A12-HC15-LC4-VCP-에리불린(DAR2)은 페이로드의 시간-의존적 방출을 보였으며, 37℃에서 10일 인큐베이션 후에 평균 20% 방출을 가졌다.
2.10.9 토끼 IgG 및 인간 메소텔린에 대한 폴리클로널 항체를 생성하는 배양물
제2주에, 토끼 IgG 항체를 생성하는 웰을 유로퓸 크립테이트를 사용하여 IgG FRET에 의해 확인하였다. IgG를 생성하는 웰을 1 ㎍/㎖의 CHO-MT40 메소텔린이 코팅된 플레이트에 대하여 ELISA에 의해 토끼 IgG Fcγ 항체의 존재에 대하여 스크리닝하였다. 메소텔린 특이적 토끼 IgG를 생성하는 배양물을 1 ㎍/㎖의 메소텔린에 대한 ELISA 스크리닝에 의해 확인하였으며, 1 ㎍/㎖의 CD73-his에 대하여 카운터 스크리닝하였다. FRET 및 ELISA를 바이오메크(Biomek)® FX 로보틱 시스템(베크만(Beckman)) 상에서 수행하였다.
실시예 3: 생체내 연구
선도 인간화 항-메소텔린 항체 및 에리불린 컨쥬게이트를 포함하는 ADC를 하기 기술된 프로토콜에 따라 인간 폐 및 위암 이종이식편 모델 및 인간 중피종 환자-유래 이종이식편(PDX) 모델을 사용하여 마우스에서 평가하였다. ADC의 상이한 DAR 종의 항암 활성 및 표적외 독성을 평가하였다.
3.1 시약 및 재료
3.1.1 항체
하기 연구에서 사용되는 항체는 경쇄 위치 80에서 쌍이 형성되지 않은 시스테인(LCcys80)을 가지며, 항-인간 메소텔린 항체 xi345A12-HC1-LC2, xi102A6A2-HC1-LC2, zu345A12-HC1-LC2, zu345A12-HC10-LC4 및 zu345A12-HC15-LC4의 토끼-인간 키메라(-xi) 및 인간화(-zu) 형태 둘 모두를 포함한다.
3.1.2 컨쥬게이트 가능한 세포 독소 및 LCcys80 ADC
하기 연구에서 사용되는 링커-세포 독소 화합물은 말레이미드-VCP-에리불린 및 말레이미드-VCP-diOH 에리불린 이량체를 포함한다.
3.1.3 종양 세포주
인간 NSCLC 세포주 NCI-H2110, 인간 위암 세포주 NCI-N87 및 인간 중피종 암 세포주 HAY를 하기 연구에서 사용하였다. NCI로부터 수득된 HAY 세포를 제외하고, 사용된 모든 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)으로부터 직접 수득하였다.
3.1.4 기타 시약
사용된 모든 시약을 달리 나타내지 않는 한, 상업적 공급처로부터 연구-등급 이상으로 수득하였다.
3.2 인간 암 이종이식편 모델에서의 생체내 스크리닝 및 효능 연구
3.2.1 연구 동물
암컷 CD-1 IGS 마우스(찰스 리버(Charles River), 7 내지 9주령)를 최대 허용 용량(MTD) 연구를 위해 사용하였으며, 암컷 NOD.CB17-SCID 마우스(잭슨 래보러터리(Jackson Laboratory))를 NCI-H2110 및 HAY 이종이식편 연구를 위해 사용하였으며, 암컷 NCr 누드 마우스(타코닉(Taconic), 5주령)를 NCI-N87 이종이식편 연구를 위해 사용하였다. 도착 시에, 동물을 접종 전 5일 내지 7일 동안 순응시켰다. 동물을 자유롭게 이용 가능한 멸균된 식품 펠렛 및 물병과 함께 환기된 케이지당 3마리 내지 5마리 마우스로 수용하였다. 동물을 연구 개시 이전에 귀 태깅하고, 칭량하였다.
3.2.2 세포 배양
동결된 원액으로부터의 동결보존된 NCI-H2110, NCI-N87 또는 HAY 세포를 필수 보충제를 함유하는 배지 중에서 배양하였다. 생체내 접종을 위해 사용하기 전에 세포를 2회 계대 동안 완전 배지에서 계대 배양하였다.
3.2.3 종양 이식, 등록 과정 및 처리
세포를 1:1(부피:부피)로 NCI-H2110 및 HAY 세포에 대하여 1.0x108개 세포/㎖ 또는 5.0x107개 세포/㎖의 최종 농도로 빙냉 매트리겔(Matrigel)과 혼합된 PBS 중에 현탁화시켰다. 마우스에 100 ㎕/마우스의 세포 혼합물을 피하 주사하고, 체중 및 종양 성장에 대하여 모니터링하였다. 이식 후 3일에 시작하여, 디지털 캘리퍼(caliper)에 의해 주 3회 측정치를 취하였다.
3.2.4 종양 측정 및 처리
종양 부피를 하기의 화학식을 사용하여 계산하였다: W(㎜) × L(㎜) × D(㎜) × π/6. 종양 이식물이 100 ㎣의 평균 부피에 도달하면, 마우스를 군당 5마리의 마우스로 무작위화시켰다. 처리를 200 ㎕의 부피로 정맥내 제공하였다. 각 연구의 마지막에 최종 체중을 측정하고, 기록하였다.
3.2.5 통계 분석
각각의 처리군으로부터의 동물의 종양 부피를 반복 측정 2원 ANOVA에 이어서 본페로니(Bonferroni) 사후 검정에 의해 대조군과 비교하였다. 각각의 실험군 내에서의 종양 성장의 비교도 또한 동일한 통계 분석을 사용하여 수행하였다.
3.3 인간 중피종 PDX 모델에서의 생체내 효능 연구
3.3.1 연구 동물
NMRI nu/nu 암컷 마우스(잔비에르 랩스(Janvier Labs), 5 내지 6주)를 접종 이전에 도착 시에 적어도 4일 동안 순응시켰다. 동물을 자유롭게 이용 가능한 멸균된 식품 펠렛 및 물병과 함께 환기된 케이지당 3마리 내지 5마리 마우스로 수용하였다. 동물을 연구 개시 이전에 귀 마킹하고, 칭량하였다.
3.3.2 이종이식
연구 제0일에, Meso 7212 종양을 무균 조건 하에서 5마리의 공여자 마우스로부터 제거하였다. 공여자 종양 조직을 2 x 2 ㎜ 단편으로 절단하고, 0.9% 염수로 덮인 멸균 페트리(Petri) 접시에 배치하였다. 병행하여, 수여자 동물을 진통제 메타캄(Metacam)®(2 ㎎/㎏)으로 피하 처리한 다음, 에토미다트-리푸로(Etomidat-Lipuro)®(12 ㎎/㎏)로의 단회 정맥내 주사(0.15 ㎖/마우스)에 의해 마취하였다. 좌측 옆구리 상의 5 내지 8 ㎜의 피부에서 표재 수직 절개를 수행하였다. 수술용 가위의 끝을 옆구리 바로 위의 절개부 내로 삽입하였으며, 이를 사용하여 피하 공간에 포켓을 형성하였다. 마우스당 하나의 종양 단편을 수술용 핀셋을 사용하여 포켓 내로 이식하였다. 절개부를 금속 클립으로 폐쇄하고, 동물을 깨끗한 케이지 내로 다시 배치하였다.
3.3.3 실험 절차
종양 증식 동안, 종양 직경을 디지털 캘리퍼(미투토요(Mitutoyo))를 사용하여 측정하였다. 동물을 이들의 종양 부피(종양 부피에 대한 포함 기준, 0.1 내지 0.3 ㎤)에 따라 실험 군으로 무작위로 지정하였다. 종양 부피 및 체중을 주 2회 기록하였다.
3.3.4 처리
에리불린을 무작위화 일에 0.2, 0.3 및 3.2 ㎎/㎏의 용량으로 정맥내 투여하였다. MORAb-109(DAR 0, 2 및 6)를 무작위화 일에 10.0 ㎎/㎏의 용량으로, 또는 연속 4일에 2.5 ㎎/㎏의 용량으로 정맥내 투여하였다. 투여 부피는 모든 실험군에 걸쳐 정맥내 주사에 대하여 10 ㎖/㎏이었다.
3.3.5 통계 분석
기술 통계학을 종양 부피 및 체중에 대한 데이터에서 수행하였다. 각각의 처리군으로부터의 동물의 종양 부피를 반복 측정 2원 ANOVA에 이어서 본페로니 사후 검정을 사용함으로써 대조군과 비교하였다. 또한, 각각의 군 내에서의 동물의 종양 성장의 비교를 또한 동일한 통계 분석을 사용하여 수행하였다.
3.4 결과 - 생체내 스크리닝 및 효능 연구
3.4.1 연구 M109-004-2016: 인간 NSCLC 이종이식편 모델에서의 345A12-HC1-LC2 및 102A6A2 HC1-LC2 에리불린 이량체 ADC의 생체내 스크리닝
항-메소텔린 항체의 2개의 클론(345A12-HC1-LC2 및 102A6A2-HC1-LC2)의 상대적인 생체내 스크리닝을 인간 비소세포 폐암(NSCLC) NCI-H2110 이종이식편 모델에서 수행하였다. 마우스를 2.5 ㎎/㎏의 345A12-HC1-LC2-diOH 에리불린 이량체 ADC 또는 2.5 ㎎/㎏의 102A6A2-HC1-LC2-diOH 에리불린 이량체 ADC로 처리하였다. 둘 모두의 ADC에 대한 항-종양 활성 및 체중 변화는 각각 도 10a 및 도 10b에 나타나 있다.
3.4.2 연구 M109-006-2017: CD-1 마우스에서의 345A12-HC1-LC2 및 345A12-HC15-LC4 에리불린 이량체 ADC의 최대 허용 용량(MTD)의 예비 평가
암컷 CD-1 마우스의 체중 변화를 5, 10, 15, 또는 20 ㎎/㎏의 345A12-HC1-LC2-diOH 에리불린 이량체 ADC, 또는 5, 10, 또는 20 ㎎/㎏의 345A12-HC15-LC4-diOH 에리불린 이량체 ADC의 투여 후에 측정하였다. 각각의 ADC에 대한 체중 변화는 각각 도 11a 및 도 11b에 나타나 있다.
3.4.3 연구 M109-007-2017: 인간 NSCLC 이종이식편 모델에서의 345A12-HC10-LC4 및 345A12-HC15-LC4 에리불린 이량체 ADC의 생체내 스크리닝
항-메소텔린 항체의 2개의 추가의 클론(345A12-HC10-LC4 및 345A12-HC15-LC4)의 상대적인 생체내 스크리닝을 인간 NSCLC NCI-H2110 이종이식편 모델에서 수행하였다. 마우스를 2.5 ㎎/㎏의 345A12-HC10-LC4-diOH 에리불린 이량체 ADC 또는 2.5 ㎎/㎏의 345A12-HC15-LC4-diOH 에리불린 이량체 ADC로 처리하였다. 둘 모두의 ADC에 대한 항-종양 활성 및 체중 변화는 각각 도 12a 및 도 12b에 나타나 있다.
345A12-HC15-LC4 클론을 이의 항-종양 활성 및 독성 프로필에 기초하여, MORAb-109 ADC에서 사용되는 항체에 대한 후보 클론으로서 선택하였다.
3.4.4 연구 M109-010-2018: 인간 위암 이종이식편 모델에서의 345A12-HC15-LC4-VCP-에리불린 ADC(MORAb-109)의 DAR2 및 DAR6 종의 항-종양 효과
345A12-HC15-LC4-VCP-에리불린 ADC(MORAb-109)의 2개의 DAR 종(DAR2 및 DAR6)을 인간 위암 NCI-N87 이종이식편 모델에서 10 ㎎/㎏의 용량으로 비교하였다. DAR2 및 DAR6 ADC 종 둘 모두는 영구적이고 유사한 항-종양 반응을 나타내었으며(도 13a), 어느 하나의 DAR 종의 투여 후에 체중 손실이 관찰되지 않거나, 거의 관찰되지 않았다(도 13b).
3.4.5 연구 M109-010-2018: 인간 중피종 이종이식편 모델에서의 345A12-HC15-LC4-VCP-에리불린 ADC(MORAb-109)의 DAR2 및 DAR6 종의 항-종양 효과
345A12-HC15-LC4-VCP-에리불린 ADC(MORAb-109)의 2개의 DAR 종(DAR2 및 DAR6)을 인간 중피종 HAY 이종이식편 모델에서 비교하였다. DAR2 및 DAR6 ADC 종 둘 모두는 단회 용량(5 ㎎/㎏)의 MORAb-109로 처리된 마우스에서 영구적이고 유사한 항-종양 반응을 나타내는 한편, 에리불린은 단독으로(MTD(3.2 ㎎/㎏)로 또는 MORAb-109(0.1 ㎎/㎏)에서 관찰되는 것과 등몰량의 에리불린으로 투여됨) 제한된 항-종양 효과를 보였다(도 14a). 급성 및 일시적인 체중 손실이 MTD 용량의 에리불린으로 처리되는 마우스에서 관찰되는 한편, 어느 하나의 ADC로 처리되는 마우스에서는 체중 손실이 관찰되지 않았다(도 14b).
3.4.6 인간 중피종 PDX 모델에서의 MORAb-109(DAR6)의 항-종양 효과
345A12-HC15-LC4-VCP-에리불린 ADC(MORAb-109)(DAR6)의 항-종양 효과를 인간 중피종 PDX 모델, Meso7212(MV15369)에서 조사하였다. 2가지 상이한 치료 요법을 시험하였다: 10 ㎎/㎏ MORAb-109의 단회 투여 또는 2.5 ㎎/㎏의 1일 4회 연속 투여. MORAb-109의 둘 모두의 치료 요법은 영구적이고 유사한 항-종양 반응을 보인 한편, 등몰량의 에리불린 단독(0.2 ㎎/㎏)은 제한된 항-종양 효과를 보였다(도 15a). 둘 모두의 MORAb-109 ADC 처리는 MTD 용량의 에리불린 단독에 비하여 유의미하게 증가된 항-종양 활성을 보였다(P<0.05). 모든 처리에 대한 체중 변화는 도 15b에 나타나 있다.
3.4.7 인간 중피종 PDX 모델에서의 MORAb-109(DAR2 및 DAR6)의 항-종양 효과
345A12-HC15-LC4-VCP-에리불린 ADC(MORAb-109)의 2개의 DAR 종(DAR2 및 DAR6)의 항-종양 효과를 인간 중피종 PDX 모델, Meso7212(MV16071)에서 10 ㎎/㎏의 단회 투여로 조사하였다. MORAb-109의 둘 모두의 DAR2 및 DAR6 종은 영구적이고 유사한 항-종양 반응을 나타낸 한편, 등몰량의 에리불린 단독(0.3 ㎎/㎏) 및 비-에리불린 컨쥬게이트된 MORAb-109 종(DAR0)은 제한된 항-종양 효과를 보이거나, 항-종양 효과를 보이지 않았다(도 16a). 체중 손실이 어느 군에서도 관찰되지 않았다(도 16b). MORAb-109의 DAR2와 DAR6 종 간의 항-종양 효과의 통계적 차이가 존재하지 않았다.
실시예 4: 메소텔린(MSLN) 발현 및 시험관내 효력
4.1 방법
세포 독성: 세포를 계대-배양하고, 96-웰 조직 배양 플레이트에서 완전 성장 배지 중에 5,000개 세포/웰로 씨딩하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤(16시간) 인큐베이션시켰다. 시험 시약을 200 nM에서 시작하여, 2 ㎖ 딥-웰 희석 플레이트에서 1:3 연속 희석하였다(총 10회 희석). 희석된 시료(100 ㎕)를 세포 플레이트에 첨가하였다(100 nM에서 시험 시료의 시작 농도). 플레이트를 추가 5일 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 배지를 폐기하고, 플레이트를 200 ㎕의 DPBS로 1회 세척하고, 실온에서 15분 동안 50 ㎕의 0.2% 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색한 다음, 수돗물로 광범위하게 세척하였다. 플레이트를 자연-건조시키고, 크리스탈 바이올렛을 200 ㎕의 1% SDS 용액으로 용해시켰다. 플레이트를 570 nm에서 판독하였다. 데이터를 IC50 결정을 위하여 그래프패드 프리즘 6을 사용하여 분석하였다. 상관관계 분석을 비-파라미터 스피어만 분석을 사용하여 그래프패드 프리즘에서 수행하였다.
4.2 결과
MORAb-109(DAR6)의 효력과 메소텔린 발현 간의 상관관계가 모든 세포주에 대하여 관찰되었다(도 17; 표 24 및 표 25).
MORAb-109(DAR2)에 있어서, 더 낮은 메소텔린 발현(80 미만의 평균 형광 세기(MFI)의 FACS 염색)을 갖는 세포주가 분석으로부터 배제된 경우, 효력과 메소텔린 발현 간에 유의미한 상관관계가 관찰되었다(도 17; 표 24 및 표 25). MORAb-109(DAR2)의 효력은 더 높은 메소텔린 발현 수준에서 메소텔린 발현과 상관관계가 있었다.
[표 24]
Figure pct00031
[표 25]
Figure pct00032
Figure pct00033
실시예 5: 인간 위암(NCI-N87) 이종이식편 모델에서의 MORAb-109의 용량-반응
5.1 방법
5.1.1 생체내 효능
동물: 도착 시에 5주령인 암컷 NCr 누드 마우스(타코닉)를 접종 이전에 5일 내지 7일 동안 순응시켰다. 동물을 자유롭게 이용 가능한 멸균된 식품 펠렛 및 물병과 함께 환기된 케이지당 3마리 내지 5마리 마우스로 수용하였다. 동물을 연구 개시 이전에 귀 태깅하고, 칭량하였다.
세포 배양: 동결보존된 NCI-N87 세포를 해동시키고, 필수 보충제를 함유하는 배지에서 성장시켰다. 세포를 생체내 접종을 위해 사용하기 전에 2회 계대 동안 완전 배지에서 계대 배양하였다.
종양 이식, 등록 과정 및 처리: PBS 중 세포 현탁액을 빙냉 매트리겔과 1:1(부피:부피)로 1.0x108개 세포/㎖의 최종 농도로 혼합하였다. 100 ㎕/마우스의 혼합물을 피하 주사하였다. 마우스를 이식 후 제3일에 시작하여, 주 3회 디지털 캘리퍼에 의한 체중 및 종양 측정과 함께 임상적 웰-빙에 대하여 모니터링하였다.
종양 측정 및 처리: 종양 부피(TV)(㎣)를 하기 화학식을 사용하여 계산하였다: W(㎜) × L(㎜) × D(㎜) × π/6. 종양이 평균하여 대략 100 ㎣에 도달하는 경우, 동물을 군당 5마리로 무작위화시켰다. 처리를 200 ㎕의 부피의 시험 용품 중에 정맥내 제공하였다. 연구의 마지막에, 최종 체중을 측정하고 기록하였다.
통계 분석: 기술 통계학을 종양 부피 및 체중의 데이터에서 수행하였다. 각각의 처리군으로부터의 동물의 종양 부피를 반복 측정 2원 ANOVA에 이어서 본페로니 사후 검정을 사용함으로써 대조군과 비교하였다. 또한, 각각의 군 내에서의 동물의 종양 성장의 비교를 동일한 통계 분석을 사용하여 수행하였다.
5.1.2 약동학(PK)
PK 분석을 온전한 ADC 검정 및 전체 항체 검정 둘 모두를 사용하여 수행하였다. 전체 항체는 컨쥬게이트된 및 비컨쥬게이트된 종(즉, DAR0 + DAR1 + DAR2 + … + DARn)을 포함하는 모든 종의 총 합을 지칭하는 한편, 온전한 ADC는 모든 컨쥬게이트된 종(즉, DAR1 + DAR2 + … + DARn)을 지칭한다. 전체 항체 검정은 포획을 위하여 비오티닐화된 메소텔린을 사용하였다. 온전한 ADC 검정은 포획을 위하여 비오티닐화된 항-에리불린 5E4 Fab 단편을 사용하고, 검출을 위하여 알렉사플루오르647-표지된 항-인간 Fc를 사용하였다. 시료 분석을 자이로스(Gyros) 분석기에서 수행하였다. 데이터 분석을 WatsonLIMS 7.4.1에서 수행하고, 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel)에서 플롯팅하였다.
5.2 결과
용량-의존적 효능이 5 ㎎/㎏ 내지 25 ㎎/㎏의 MORAb-109(DAR2)의 용량 범위에 대하여 관찰되었다(도 18a 및 도 18b). 어느 용량 군에서도 체중 손실이 관찰되지 않았다(도 18c). AUC의 용량-의존적 증가에 의해 나타난 바와 같이, ADC의 용량-의존적 노출이 처리된 동물에서 관찰되었다(도 19 및 표 26).
[표 26]
Figure pct00034
실시예 6: 인간 난소암(OVCAR-3-A1-T1) 이종이식편 모델에서의 MORAb-109의 생체내 항-종양 효능
6.1 방법
동물: 도착 시에 5주령인 암컷 NOD.CB17-SCID 마우스(잭슨 래보러터리즈)를 접종 이전에 5일 내지 7일 동안 순응시켰다. 동물을 자유롭게 이용 가능한 멸균된 식품 펠렛 및 물병과 함께 환기된 케이지당 3마리 내지 5마리 마우스로 수용하였다. 동물을 연구 개시 이전에 귀 태깅하고, 칭량하였다.
세포 배양: 동결보존된 OVCAR-3-A1-T1 세포를 해동시키고, 필수 보충제를 함유하는 배지에서 성장시켰다. 세포를 생체내 접종을 위해 사용하기 전에 2회 계대 동안 완전 배지에서 계대 배양하였다.
종양 이식, 등록 과정 및 처리: PBS 중 세포 현탁액을 빙냉 매트리겔과 1:1(부피:부피)로 5.0x107개 세포/㎖의 최종 농도로 혼합하였다. 100 ㎕/마우스의 혼합물을 피하 주사하였다. 마우스를 이식 후 제3일에 시작하여, 주 3회 디지털 캘리퍼에 의한 체중 및 종양 측정과 함께 임상적 웰-빙에 대하여 모니터링하였다.
종양 측정 및 처리: 종양 부피(TV)(㎣)를 하기 화학식을 사용하여 계산하였다: W(㎜) × L(㎜) × D(㎜) × π/6. 종양이 평균하여 대략 100 ㎣에 도달하는 경우, 동물을 군당 5마리로 무작위화시켰다. 처리를 200 ㎕의 부피의 시험 용품 중에 정맥내 제공하였다. 연구의 마지막에, 최종 체중을 측정하고 기록하였다.
통계 분석: 기술 통계학을 종양 부피 및 체중의 데이터에서 수행하였다. 각각의 처리군으로부터의 동물의 종양 부피를 반복 측정 2원 ANOVA에 이어서 본페로니 사후 검정을 사용함으로써 대조군과 비교하였다. 또한, 각각의 군 내에서의 동물의 종양 성장의 비교를 동일한 통계 분석을 사용하여 수행하였다.
6.2 결과
MORAb-109(DAR2)는 인간 난소암 OVCAR-3-A1-T1 이종이식편 모델에서 종양 성장 지연을 보였다(도 20a 및 도 20b).
실시예 7: 인간 NSCLC PDX 모델(LC-F-25)에서의 MORAb-109의 생체내 항-종양 효능
7.1 방법
동물: 도착 시에 5주령인 이계교배된 무흉선(nu/nu) 암컷 마우스(HSD:Athymic Nude-Foxn1nu)를 접종 이전에 적어도 4일 동안 순응시켰다. 동물을 자유롭게 이용 가능한 멸균된 식품 펠렛 및 물병과 함께 환기된 케이지당 3마리 내지 5마리 마우스로 수용하였다. 동물을 연구 개시 이전에 귀 마킹하고, 칭량하였다.
이종이식: LC-F-25를 인간 환자 유래의 일차 비소세포 폐 선암종으로부터 성장하는 종양(P9.1.1/0)으로서 확립하였다. LC-F-25는 다른 종양 유형(예컨대, 예를 들어, LXFA-737(실시예 8))에 비하여, 면역조직화학(IHC) 분석에 기초하여, 양성 퍼센트 및 전체 세기에 관하여 더 낮은 MSLN 발현을 갖는다.
실험 절차: 108 내지 288 ㎣의 성장하는 LC-F-25 종양(P9.1.1/0)이 확립된 서른 한(31) 마리의 마우스를 평균 및 중간값 종양 부피가 각각 153.5 및 126 ㎣에 도달하는 때 처리에 배정하였다.
처리: 효능을 각각 7마리 내지 8마리 마우스의 4개의 군에서 평가하였다:
· 군 1에서, 비히클을 제1일에 5 ㎖/㎏, 정맥내, 단회 용량으로 투여하였다.
· 군 2 및 3에서, 에리불린을 각각 제1일에 0.1 ㎎/㎏(5 ㎖/㎏) 및 3.2 ㎎/㎏(6.4 ㎖/㎏), 정맥내, 단회 용량으로 투여하였다.
· 군 4에서, MORAb-109를 제1일에 10 ㎎/㎏(5 ㎖/㎏), 정맥내, 단회 용량으로 투여하였다.
종양을 측정하고, 마우스를 실험 기간 동안 주 2회 칭량하였다.
통계 분석: 통계 분석을 만-휘트니(Mann-Whitney) 비-파라미터 비교 시험에 의해 각각의 측정을 위하여 수행하였다. 각각의 처리군을 대조군과 비교하였다.
7.2 결과
정맥내 경로에 의해 10 ㎎/㎏의 단회 용량으로 제공되는 MORAb-109(DAR2)는 LC-F-25 종양-보유 마우스에 의해 체중 손실 없이 내약성이 좋았다(도 21b). MORAb 109(DAR2)는 10 ㎎/㎏에서 LC-F-25 NSCLC PDX 모델에서 종양 성장 지연을 나타내었다(도 21a).
정맥내 경로에 의해 0.1 ㎎/㎏(10 ㎎/㎏으로 투여되는 경우 MORAb-109에서의 등몰량의 페이로드)의 단회 용량으로 제공되는 에리불린은 LC-F-25 종양-보유 마우스에 의한 내약성이 좋았지만, 통계적으로 유의미한 종양 성장 저해를 유도하지 않았다(도 21a 및 도 21b).
정맥내 경로에 의해 3.2 ㎎/㎏(마우스 MTD 투여량 또는 10 ㎎/㎏으로 투여되는 경우 MORAb-109에서의 에리불린의 몰량보다 32배 더 많음)의 단회 용량으로 제공되는 에리불린은 LC-F-25 종양-보유 마우스에 의한 내약성이 좋았지만, 투여 후 3일 내지 10일에 약간의 일시적인 체중 손실을 유도하였다(도 21b). 이 용량에서, 에리불린은 통계적으로 유의미한 종양 성장 저해를 유도하였으며, 8마리 중 6마리의 마우스에서 부분적인 종양 퇴행을 갖는다(도 21a).
실시예 8: 인간 NSCLC PDX 모델(LXFA-737)에서의 MORAb-109의 생체내 항-종양 효능
8.1 방법
동물: 암컷 NMRI nu/nu 마우스(Crl:NMRI-Foxn1nu), 4 내지 6주령.
이종이식: LXFA-737을 인간 환자 유래의 일차 비소세포 폐 선암종으로부터 성장하는 종양(P14N4)으로서 확립하였다. LXFA-737은 다른 종양 유형(예컨대, 예를 들어, LC-F-25(실시예 7))에 비하여, IHC 분석에 기초하여, 더 높은 양성 퍼센트 및 전체 세기에 관하여 중등의 MSLN 발현을 갖는다.
실험 절차: 충분한 수의 동물에서 종양 이식물이 50 내지 250 ㎣(예를 들어, 80 내지 200 ㎣)의 연구 부피 기준에 도달할 때까지 동물을 모니터링하였다. 마우스를 비슷한 군 중간값 및 평균 종양 부피를 목적으로, 군으로 지정하였다. 무작위화 일을 제0일로 지정하였다.
처리: 효능을 각각 6마리 내지 7마리 마우스의 4개의 군에서 평가하였다:
· 군 1에서, 비히클을 제1일에 5 ㎖/㎏, 정맥내, 단회 용량으로 투여하였다.
· 군 2 및 3에서, 에리불린을 각각 제1일에 0.2 ㎎/㎏ 및 3.2 ㎎/㎏, 정맥내, 단회 용량으로 투여하였다.
· 군 4에서, MORAb-109를 제1일에 10 ㎎/㎏, 정맥내, 단회 용량으로 투여하였다.
종양을 측정하고, 마우스를 실험 기간 동안 주 2회 칭량하였다. 처음 투여 일은 무작위화(제0일) 1일 후인 제1일이었다.
통계 분석: 종양 성장의 저해, 시험/대조군 값(% 단위)(최소 T/C): 시험군 대 대조군 값(T/C(% 단위))은, 제X일에 시험군 대 대조군의 중간값 잔류 종양 부피(RTV) 값의 비와 100을 곱하여 계산하였다. 시험군 및 대조군에 대한 종양 부피 2배 및 4배 시간(Td, Tq)을 군이 200% 또는 400%의 중간값 RTV에 도달하는 데 필요한 시간 간격(일 단위)으로 정의하였다.
8.2 결과
MORAb-109(DAR2)는 10 ㎎/㎏에서 LXFA-737 NSCLC PDX 모델에서 강력한 항-종양 효능(최소 T/C, 제41일에 2.3%)을 나타내었으며(도 22a), 이의 Tq는 연구 동안 도달되지 않았다. 단회 용량으로 제공되는 MORAb-109는 또한, LXFA-737 종양-보유 마우스에 의해 체중 손실 없이 내약성이 좋았다(도 22b).
정맥내 경로에 의해 3.2 ㎎/㎏(마우스 MTD 투여량 또는 10 ㎎/㎏으로 투여되는 경우 MORAb-109에서의 에리불린의 몰량보다 32배 더 많음)의 단회 용량으로 제공되는 에리불린은 LXFA-737 종양-보유 마우스에 의한 내약성이 좋았으며, 항-종양 효능(최소 T/C, 제27일에 4.2%)을 보였으며, 이의 Tq는 80.1%였다. 그러나, 에리불린은 투여 후에 약간의 일시적인 체중 손실을 유도하였다(도 22a 및 도 22b). 10 ㎎/㎏으로 투여되는 경우 MORAb-109에서의 에리불린의 몰량의 2배인 0.2 ㎎/㎏의 단회 용량은 제한된 항-종양 효능(최소 T/C, 제44일에 51.1%)을 보였다.
실시예 9: 인간 위암(NCI-N87) 이종이식편 모델에서의 MORAb-109의 용량-반응
9.1 방법
9.1.1 생체내 효능
동물: 도착 시에 5주령인 암컷 NCr 누드 마우스(타코닉)를 접종 전에 5일 내지 7일 동안 순응시켰다. 동물을 자유롭게 이용 가능한 멸균된 식품 펠렛 및 물병과 함께 환기된 케이지당 3마리 내지 5마리 마우스로 수용하였다. 동물을 연구 개시 이전에 귀 태깅하고, 칭량하였다.
세포 배양: 동결보존된 NCI-N87 세포를 해동시키고, 필수 보충제를 함유하는 배지에서 성장시켰다. 세포를 생체내 접종을 위해 사용하기 전에 2회 계대 동안 완전 배지에서 계대 배양하였다.
종양 이식, 등록 과정 및 처리: PBS 중 세포 현탁액을 빙냉 매트리겔과 1:1(부피:부피)로 1.0x108개 세포/㎖의 최종 농도로 혼합하였다. 100 ㎕/마우스의 혼합물을 피하 주사하였다. 마우스를 이식 후 제3일에 시작하여, 주 3회 디지털 캘리퍼에 의한 체중 및 종양 측정과 함께 임상적 웰-빙에 대하여 모니터링하였다.
종양 측정 및 처리: 종양 부피(TV)(㎣)를 하기 화학식을 사용하여 계산하였다: W(㎜) × L(㎜) × D(㎜) × π/6. 종양이 평균하여 대략 100 ㎣에 도달하는 경우, 동물을 군당 5마리로 무작위화시켰다. 처리를 200 ㎕의 부피의 시험 용품 중에 정맥내 제공하였다. 연구의 마지막에, 최종 체중을 측정하고 기록하였다.
통계 분석: 기술 통계학을 종양 부피 및 체중의 데이터에서 수행하였다. 각각의 처리군으로부터의 동물의 종양 부피를 반복 측정 2원 ANOVA에 이어서 본페로니 사후 검정을 사용함으로써 대조군과 비교하였다. 또한, 각각의 군 내에서의 동물의 종양 성장의 비교를 동일한 통계 분석을 사용하여 수행하였다.
9.1.2 약동학(PK)
PK 분석을 온전한 ADC 검정 및 전체 항체 검정 둘 모두를 사용하여 수행하였다. 전체 항체는 컨쥬게이트된 및 비컨쥬게이트된 종(즉, DAR0 + DAR1 + DAR2 + … + DARn)을 포함하는 모든 종의 총 합을 지칭하는 한편, 온전한 ADC는 모든 컨쥬게이트된 종(즉, DAR1 + DAR2 + … + DARn)을 지칭한다. 전체 항체 검정은 포획을 위하여 비오티닐화된 메소텔린을 사용하고, 검출을 위해 알렉사플루오르647-표지된 항-인간 Fc를 사용하였다. 온전한 ADC 검정은 포획을 위하여 비오티닐화된 항-에리불린 5E4를 사용하고, 검출을 위하여 알렉사플루오르647-표지된 항-인간 Fc를 사용하였다. 시료 분석을 자이로스 분석기에서 수행하였다. 데이터 분석을 WatsonLIMS 7.4.1에서 수행하고, 마이크로소프트 엑셀에서 플롯팅하였다. 혈장, 종양 및 골수 시료로부터 에리불린을 LC-MS를 사용하여 정량화하였다.
9.1.3 LC-MS
개별 마우스로부터의 20 내지 50 ㎕의 MORAb-109(DAR2) 혈장 또는 MORAb-109(DAR6)-투여된 마우스로부터의 50 ㎕의 동일하게 풀링된 혈장을 분석을 위해 사용하였다. 다이나비즈(Dynabeads) M-280 스트렙트아비딘(100 ㎕)을 실온에서 1시간 동안 3 ㎍의 포획 선택 인간 IgG-Fc PK 비오틴 컨쥬게이트와 인큐베이션시킨 다음, HBS-EP 완충제로 세척하였다. 이어서, HBS-EP 완충제 중에 희석된 혈장 시료를 MORAb-109 복합체의 포획을 위하여 복합체화/세척된 비드와 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 다음, HBS-EP 완충제 중에 2회 세척하였다. 복합체를 함유하는 세척된 비드를 37℃에서 1시간 동안 PNGase 완충제 중 Rapid PNGaseF(1 ㎕)를 사용하여 탈글리코실화(deglycosylate)시킨 다음, HBS-EP 완충제 중에 1회 세척하였다. 포획된/탈글리코실화된 MORAb-109의 용리를 0.1% 포름산과 함께 10% 아세토니트릴(30 ㎕)을 사용하여 행하였다. 시료를 시냅트(Synapt) G2/M-클래스 UPLC 분석을 사용하여 온전한 또는 환원된 질량에 대하여 분석하였다.
9.2 결과
10 ㎎/㎏의 단회 용량의 MORAb-109(DAR2 또는 DAR6)로 처리되는 인간 위암 NCI-N87 이종이식편 모델에서의 항-종양 효과 및 체중 변화는 각각 도 23a 및 도 23b에 나타나 있다.
MORAb-109(DAR2), MORAb-109(DAR6) 및 비컨쥬게이트된 항체의 PK 분석은 표 27에 나타나 있다. 비컨쥬게이트된 및 MORAb-109(DAR2)에 대한 전체 항체는 유사하였지만, MORAb-109(DAR6)는 더 낮았으며, 이는 MORAb-109(DAR2)가 순환계에서 안정한 것을 나타낸다.
혈장 시료 유래의 ADC의 DAR 분석에 의해, 페이로드 방출 속도가 DAR6 종에 대하여 더 높았으며, 더 높은 에리불린의 혈장 수준에 기여하는 것이 나타났다(표 28 및 표 29).
[표 27]
Figure pct00035
[표 28]
Figure pct00036
[표 29]
Figure pct00037
실시예 10: 345A12 HC15 LC4와 아네투맙의 비교 - 결합 친화도
10.1 방법
항체: 345A12 HC15 LC4(MORAb-109에서의 항-메소텔린 항체) 및 아네투맙. 아네투맙, 인간 항-메소텔린 항체에 대한 서열은 표 30에 제시되어 있다.
결합 친화도: 결합 측정을 비아코어 T-100 기기 상에서 HBS-P+ 완충제 중에 수행하였다. 항체를 HBS-P+ 중에 1 ㎍/㎖로 희석하였다. 시료를 실온에서 5분 동안 14,000 x g에서 원심분리한 다음, 상청액을 새로운 1.5 ㎖ 비아코어 튜브로 옮기고, 캡핑하였다. 메소텔린(50 ㎍)을 1xHBS-P+ 완충제 중에 100 nM로 희석한 다음, 비아코어 튜브에서 100, 20, 4, 0.8 및 0.16 nM로 5배 연속 희석하고, 캡핑하였다. 항-인간 항체 포획 칩을 고정화 위자드와 함께 CM5 칩을 사용하여 제조처의 프로토콜에 따라 준비하였다. 최종 포획 항체 수준은 HBS-P+에서 8000-9000RU였다. 칩을 300초 완충제 주입에 이어서 30초 재생의 5개 사이클을 사용한 검정을 위하여 제조하였으며, 모든 4개의 유동 셀에 걸쳐 모두 30 ㎕/분에서 이루어졌다.
항체를 10 ㎕/분에서 90초 동안의 개별 리간드 용액의 순차적인 주입에 의해 유동 셀 2-4 상에서 포획하였다. 분석물 주입을 각각 30 ㎕/분에서 240초 동안 저농도에서 고농도로의 분석물 용액의 순차적인 주입에 의해 단일-사이클 동역학 방식으로 행하였다. 검출은 2-1, 3-1, 4-1이었다. 이중-참조를 상기와 같은 동일한 리간드 포획 주입에 이어서 각각 240초 동안 5회의 완충제만의 주입, 1800초 동안의 해리 및 재생의 순서에 의해 수행하였다. 모든 리간드를 메소텔린으로의 결합에 대하여 2벌로 분석하였다. 동역학적 분석을 1:1 랑뮤어 핏팅 모델을 사용하여 비아이밸류에이션스 소프트웨어를 사용해 수행하였다. 결합-속도, 해리-속도 및 친화도 상수를 2벌의 시행으로부터 평균을 구하였다.
10.2 결과
345A12 HC15 LC4는 아네투맙보다 40배 더 높은 친화성을 나타내었다(표 31). 345A12 HC15 LC4는 시노몰구스 원숭이 메소텔린에 대한 결합 친화도를 유지하는 한편, 아네투맙은 시노몰구스 원숭이 메소텔린에 결합하지 않았다. 어느 항체도 랫트 메소텔린에 결합하지 않았다.
[표 30]
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
[표 31]
Figure pct00041
실시예 11: MORAb-109와 BAY 94-9343의 비교 - 시험관내 효력
11.1 방법
ADC: MORAb-109(DAR2 및 DAR6) 및 아네투맙 라브탄신(BAY 94-9343)을 평가하였다. BAY 94-9343으로도 지칭되는 아네투맙 라브탄신은 이황화물-함유 링커(환원 가능한 SPDB 링커[N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)부타노에이트])를 통해 마이탄시노이드 튜불린 저해제 DM4에 컨쥬게이트된 아네투맙을 포함하는 ADC이다. BAY 94-9343을 실시예 15에 기술된 바와 같이 생성하였다.
세포 독성: 세포를 계대-배양하고, 96-웰 조직 배양 플레이트에서 완전 성장 배지 중에 5,000개 세포/웰로 씨딩하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤(16시간) 인큐베이션시켰다. 시험 시약을 200 nM에서 시작하여, 2 ㎖ 딥-웰 희석 플레이트에서 1:3 연속 희석하였다(총 10회 희석). 희석된 시료(100 ㎕)를 세포 플레이트에 첨가하였다(100 nM에서 시험 시료의 시작 농도). 플레이트를 추가 5일 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 배지를 폐기하고, 플레이트를 200 ㎕의 DPBS로 1회 세척하고, 실온에서 15분 동안 50 ㎕의 0.2% 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색한 다음, 수돗물로 광범위하게 세척하였다. 플레이트를 자연-건조시키고, 크리스탈 바이올렛을 200 ㎕의 1% SDS 용액으로 용해시켰다. 플레이트를 570 nm에서 판독하였다. 데이터를 그래프패드 프리즘 6을 사용하여 IC50 결정을 위해 분석하였다.
11.2 결과
MORAb-109(DAR2 및 DAR6)는 MSLN-양성 세포주에서 특정 세포 독성을 보였다(표 32). 대조적으로, BAY 94-9343은 MSLN-양성 및 MSLN-음성 세포주 둘 모두에서 살해를 나타내었다.
[표 32]
Figure pct00042
실시예 12: MORAb-109와 BAY 94-9343의 비교 - 특이성
12.1 방법
세포 독성: 세포를 계대-배양하고, 96-웰 조직 배양 플레이트에서 완전 성장 배지 중에 5,000개 세포/웰로 씨딩하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤(16시간) 인큐베이션시켰다. 시험 시약을 200 nM에서 시작하여, 2 ㎖ 딥-웰 희석 플레이트에서 1:3 연속 희석하였다(총 10회 희석). 희석된 시료(100 ㎕)를 세포 플레이트에 첨가하였다(100 nM에서 시험 시료의 시작 농도). 플레이트를 추가 5일 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 배지를 폐기하고, 플레이트를 200 ㎕의 DPBS로 1회 세척하고, 실온에서 15분 동안 50 ㎕의 0.2% 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색한 다음, 수돗물로 광범위하게 세척하였다. 플레이트를 자연-건조시키고, 크리스탈 바이올렛을 200 ㎕의 1% SDS 용액으로 용해시켰다. 플레이트를 570 nm에서 판독하였다. 데이터를 그래프패드 프리즘 6을 사용하여 IC50 결정을 위하여 분석하였다.
12.2 결과
비컨쥬게이트된 항체를 사용한 세포 독성 검정은 MORAb-109(DAR2)에 의해 메소텔린-발현 세포의 특이적인 살해를 나타내었지만(도 25a), BAY 94-9343에 의해서는 그렇지 않았다(도 25b). 이론에 결부시키지 않고, BAY 94-9343에 대해서 관찰되는 비컨쥬게이트된 항체에 의한 경쟁의 결여는 페이로드의 방출을 시사하며, 이는 항체 결합이 비컨쥬게이트된 경쟁자에 의해 차단되는 경우에도 살해를 야기할 수 있다. 이러한 페이로드 방출은 메소텔린-음성 세포주에서 BAY 94-9343에 대해 관찰되는 상대적으로 높은 수준의 세포 독성과 일치한다(표 32). 페이로드 방출은 또한 도 27에서 직접적으로 관찰된다(혈장 안정성 비교).
실시예 13: MORAb-109와 BAY 94-9343의 비교 - ADCC 활성
13.1 방법
MSLN-발현 CHO 세포를 해동시키고, 96-웰 조직 배양 플레이트에서 완전 RPMI-4% 울트라로우(Ultralow) IgG FBS 중에 1,000개 세포/웰(25 ㎕)로 씨딩하였다. 시험 시약(345A12 항체, MORAb-109(DAR2) 및 BAY 94-9343)을 20 ㎍/㎖에서 시작하여, 완전 RPMI-4% 울트라-로우 IgG FBS 중에 1:2.5 연속 희석한 다음, 세포 플레이트로 옮기고(25 ㎕), 37℃, 5% CO2에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 6,000개의 Jurkat-이펙터 세포(프로메가)를 해동시키고, 세포 플레이트에 첨가하고(25 ㎕), 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 18 내지 22시간 동안 인큐베이션시켰다.
루시퍼라제 검정 시약을 암소에서 해동시켰다. 75 ㎕의 루시퍼라제 검정 시약을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 플레이트 진탕기 상에서 30초 동안 진탕시켰다. 플레이트를 5분 인큐베이션 후에 루미노미터(luminometer) 상에서 판독하였다.
13.2 결과
MORAb-109(DAR2) 및 345A12 HC15 LC4는 유사한 ADCC 활성을 갖는 한편(도 26a 및 표 33), BAY 94-9343은 아네투맙보다 더 약한 ADCC 활성을 가졌다(도 26b 및 표 34).
[표 33]
Figure pct00043
[표 34]
Figure pct00044
실시예 14: 매트릭스 중 MORAb-109 및 BAY 94-9343의 안정성
14.1 방법
항-MSLN ADC를 인간 또는 마우스 혈장에서 0.1 ㎎/㎖로 제조하고, 시료를 37℃에서 0, 24, 48, 72, 96 및 240시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 시점이 달성될 때 보관을 위하여 -80℃로 옮겼다. 모든 시료를 주위 온도까지 해동시키고, 시험을 위하여 1:100 희석하였다. DAR-감수성 안정성 검정을 자이로랩 상에서 단계적 샌드위치 형식으로 개발하였다. 검정은 블로킹 및 시료 결합 후에 포획을 위하여 비오티닐화된 메소텔린을 사용하고, 검출을 위해 알렉사 플루오르 647 항-에리불린 5E4 Fab 또는 알렉사 플루오르 647 항-DM4(레베나 바이오파마(Levena Biopharma))를 사용하였다. 표준 곡선 및 품질 관리를 MORAb-109 및 BAY 94-9343으로 행하였다.
14.2 결과
MORAb-109(DAR2)는 인간 및 마우스 혈장 둘 모두에서 BAY 94-9343보다 더욱 안정하였다(도 27).
실시예 15: 인간 위암(NCI-N87) 이종이식편 모델에서의 MORAb-109 및 BAY 94-9343의 항-종양 효능
15.1 방법
15.1.1 BAY 94-9343의 생성
BAY 94-9343은 이황화물-함유 링커(환원 가능한 SPDB 링커[N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)부타노에이트])를 통해 마이탄시노이드 튜불린 저해제 DM4에 컨쥬게이트된 아네투맙을 포함하는 ADC이다. 아네투맙으로부터의 서열을 비콘(Beacon) 데이터베이스(핸슨-웨이드(Hanson-Wade))로부터 수득하였다. 항체 서열(표 30)을 중첩 올리고뉴클레오티드로부터 생성하고, PCR-증폭시키고, 발현 플라스미드 내로 클로닝하고, 서열-확인하였다. 안정한 푸울을 293F 세포에서 생성하였으며, 생존력이 30% 미만이 될 때까지 세포를 성장시켰다. 아네투맙을 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 조정 배지로부터 정제하였다. BAY 94-9343을 SPDB-DM4(레베나 바이오파마(Levena BioPharma))와의 라이신-반응성 컨쥬게이션에 의해 생성하여, 3.7의 DAR을 달성하였다. 비컨쥬게이트된 페이로드를 탈염 크로마토그래피에 의해 제거하였다.
15.1.2 생체내 효능
동물: 도착 시에 5주령인 암컷 NCr 누드 마우스(타코닉)를 접종 이전에 5일 내지 7일 동안 순응시켰다. 동물을 자유롭게 이용 가능한 멸균된 식품 펠렛 및 물병과 함께 환기된 케이지당 3마리 내지 5마리 마우스로 수용하였다. 동물을 연구 개시 이전에 귀 태깅하고, 칭량하였다.
세포 배양: 동결보존된 NCI-N87 세포를 해동시키고, 필수 보충제를 함유하는 배지에서 성장시켰다. 세포를 생체내 접종을 위해 사용하기 전에 2회 계대 동안 완전 배지에서 계대 배양하였다.
종양 이식, 등록 과정 및 처리: PBS 중 세포 현탁액을 빙냉 매트리겔과 1:1(부피:부피)로 1.0x108개 세포/㎖의 최종 농도로 혼합하였다. 100 ㎕/마우스의 혼합물을 피하 주사하였다. 마우스를 이식 후 제3일에 시작하여, 주 3회 디지털 캘리퍼에 의한 체중 및 종양 측정과 함께 임상적 웰-빙에 대하여 모니터링하였다.
종양 측정 및 처리: 종양 부피(TV)(㎣)를 하기 화학식을 사용하여 계산하였다: W(㎜) × L(㎜) × D(㎜) × π/6. 종양이 평균하여 대략 100 ㎣에 도달하는 경우, 동물을 군당 5마리로 무작위화시켰다. 처리를 200 ㎕의 부피의 시험 용품 중에 정맥내 제공하였다. 연구의 마지막에, 최종 체중을 측정하고 기록하였다.
통계 분석: 기술 통계학을 종양 부피 및 체중의 데이터에서 수행하였다. 각각의 처리군으로부터의 동물의 종양 부피를 반복 측정 2원 ANOVA에 이어서 본페로니 사후 검정을 사용함으로써 대조군과 비교하였다. 또한, 각각의 군 내에서의 동물의 종양 성장의 비교를 동일한 통계 분석을 사용하여 수행하였다.
15.2 결과
MORAb-109(DAR2) 및 BAY 94-9343은 둘 모두 NCI-N87 종양-보유 마우스에서 유사한 효능을 나타내었다(도 28a). 어느 군에서도 체중 손실이 관찰되지 않았다(도 28b).
실시예 16: 인간 중피종(HAY) 이종이식편 모델에서의 MORAb-109 및 BAY 94-9343의 항-종양 효능
16.1 방법
동물: 도착 시에 5주령인 암컷 NOD.CB17-SCID 마우스(잭슨 래보러터리즈)를 접종 이전에 5일 내지 7일 동안 순응시켰다. 동물을 자유롭게 이용 가능한 멸균된 식품 펠렛 및 물병과 함께 환기된 케이지당 3마리 내지 5마리 마우스로 수용하였다. 동물을 연구 개시 이전에 귀 태깅하고, 칭량하였다.
세포 배양: 동결보존된 HAY 세포를 해동시키고, 필수 보충제를 함유하는 배지에서 성장시켰다. 세포를 생체내 접종을 위해 사용하기 전에 2회 계대 동안 완전 배지에서 계대 배양하였다.
종양 이식, 등록 과정 및 처리: PBS 중 세포 현탁액을 빙냉 매트리겔과 1:1(부피:부피)로 5.0x107개 세포/㎖의 최종 농도로 혼합하였다. 100 ㎕/마우스의 혼합물을 피하 주사하였다. 마우스를 이식 후 제3일에 시작하여, 주 3회 디지털 캘리퍼에 의한 체중 및 종양 측정과 함께 임상적 웰-빙에 대하여 모니터링하였다.
종양 측정 및 처리: 종양 부피(TV)(㎣)를 하기 화학식을 사용하여 계산하였다: W(㎜) × L(㎜) × D(㎜) × π/6. 종양이 평균하여 대략 100 ㎣에 도달하는 경우, 동물을 군당 5마리로 무작위화시켰다. 처리를 200 ㎕의 부피의 시험 용품 중에 정맥내 제공하였다. 연구의 마지막에, 최종 체중을 측정하고 기록하였다.
통계 분석: 기술 통계학을 종양 부피 및 체중의 데이터에서 수행하였다. 각각의 처리군으로부터의 동물의 종양 부피를 반복 측정 2원 ANOVA에 이어서 본페로니 사후 검정을 사용함으로써 대조군과 비교하였다. 또한, 각각의 군 내에서의 동물의 종양 성장의 비교를 동일한 통계 분석을 사용하여 수행하였다.
16.2 결과
MORAb-109(DAR2) 및 BAY 94-9343은 둘 모두 HAY 종양-보유 마우스에서 유사한 효능을 나타내었다(도 29a). 체중 손실이 어느 군에서도 관찰되지 않았다(도 29b).
실시예 17: 인간 중피종 PDX 모델(Meso7212)에서의 MORAb-109 및 BAY 94-9343의 항-종양 효능
17.1 방법
동물: 도착 시에 5 내지 6주령인 NMRI nu/nu 암컷 마우스(잔비에르 랩스)를 접종 이전에 적어도 4일 동안 순응시켰다. 동물을 자유롭게 이용 가능한 멸균된 식품 펠렛 및 물병과 함께 환기된 케이지당 3마리 내지 5마리 마우스로 수용하였다. 동물을 연구 개시 이전에 귀 마킹하고, 칭량하였다.
이종이식: 제0일에, Meso 7212 종양을 무균 조건 하에서 5마리의 공여자 마우스로부터 제거하였다. 공여자 종양 조직을 2 x 2 ㎜ 단편으로 절단하고, 0.9% 염수로 덮인 멸균 페트리 접시에 배치하였다. 병행하여, 수여자 동물을 진통제 메타캄®(2 ㎎/㎏)으로 피하로 진통제-처리한 다음, 에토미다트-리푸로®(12 ㎎/㎏)로의 단회 정맥내 주사(0.15 ㎖/마우스)에 의해 마취하였다. 좌측 옆구리 상의 5 내지 8 ㎜의 피부에서 표재 수직 절개를 수행하였다. 수술용 가위의 끝을 옆구리 바로 위의 절개부 내로 삽입하였으며, 이를 사용하여 피하 공간에 포켓을 형성하였다. 마우스당 하나의 종양 단편을 수술용 핀셋을 사용하여 포켓 내로 이식하였다. 마지막으로, 절개부를 금속 클립으로 폐쇄하고, 동물을 깨끗한 케이지 내에 배치하였다.
실험 절차: 이종이식 후에, 마우스에서의 종양의 생착 및 증식을 촉진에 의해 적어도 주 2회 관리하였다. 종양이 촉진 가능한 때, 종양 직경의 측정을 디지털 캘리퍼(미투토요)로 수행하였다.
처리를 시작하기 전에, 동물을 이들의 종양 부피(종양 부피에 대한 포함 기준, 0.1-0.3 ㎤)에 따라 실험군 내로 무작위로 지정하였다. 처음 처리일로부터 계속해서, 종양 부피 및 체중을 주 2회 기록하였다. 동물 복지를 1일 2회 관리하였다.
처리: 모든 작용제를 무작위화 일에 단회 용량으로 정맥내 투여하였다. 대조군에서의 동물을 동일한 방식으로 DPBS로 처리하였다.
통계 분석: 기술 통계학을 종양 부피 및 체중의 데이터에서 수행하였다. 각각의 처리군으로부터의 동물의 종양 부피를 반복 측정 2원 ANOVA에 이어서 본페로니 사후 검정을 사용함으로써 대조군과 비교하였다. 또한, 각각의 군 내에서의 동물의 종양 성장의 비교를 또한 동일한 통계 분석을 사용하여 수행하였다.
17.2 결과
MORAb-109(DAR2) 및 BAY 94-9343은 둘 모두 Meso7212 종양-보유 마우스에서 종양 퇴행을 나타내었다(도 30a). 체중 손실이 어느 군에서도 관찰되지 않았다(도 30b).
실시예 18: 인간 NSCLC PDX 모델(LXFA-586)에서의 MORAb-109 및 BAY 94-9343의 항-종양 효능
18.1 방법
동물: 암컷 NMRI nu/nu 마우스, 4 내지 6주령.
이종이식: LXFA-586은 일차 비소세포 폐 선암종 인간 환자로부터 성장하는 종양(T2N1M0)을 확립하였다.
실험 절차: 충분한 수의 동물에서 종양 이식물이 50 내지 250 ㎣(예를 들어, 80 내지 200 ㎣)의 연구 부피 기준에 도달할 때까지 동물을 모니터링하였다. 마우스를 비슷한 군 중간값 및 평균 종양 부피를 목적으로 군으로 지정하였다. 군으로의 지정 과정(등록, 계층화된 무작위화)은 또한 무작위화로도 지칭될 수 있다. 무작위화 일을 실험 제0일로 표기하였다.
처리: 효능을 각각 6마리 내지 7마리 마우스의 4개의 군에서 평가하였다:
· 군 1에서, 비히클을 제1일에 5 ㎖/㎏, 정맥내, 단회 용량으로 투여하였다.
· 군 2에서, BAY 94-9343(DAR ~ 4)을 제1일에 25 ㎎/㎏, 정맥내, 단회 용량으로 투여하였다.
· 군 3에서, MORAb-109(DAR2)를 제1일에 25 ㎎/㎏, 정맥내, 단회 용량으로 투여하였다.
· 군 4에서, 에리불린을 제1일에 3.2 ㎎/㎏, 정맥내, 단회 용량으로 투여하였다.
종양을 측정하고, 마우스를 실험 기간 동안 주 2회 칭량하였다. 처음 투여 일은 제1일, 무작위화(제0일) 1일 후인 제1일이었다.
18.2 결과
MORAb-109(DAR2)는 25 ㎎/㎏에서 LXFA-586 NSCLC PDX 모델에서 강력한 항-종양 효능(최소 T/C, 제41일에 1.8%)을 나타내었으며(도 31a), 이의 Tq는 연구 동안 도달되지 않았다. 단회 용량으로 제공되는 MORAb-109는 또한, LXFA-586 종양-보유 마우스에 의해 체중 손실 없이 내약성이 좋았다(도 31b).
BAY 94-9343(DAR ~ 4)은 25 ㎎/㎏에서 LXFA-586 NSCLC PDX 모델에서 MORAb-109와 유사한 강력한 항-종양 효능을 나타내었으며(도 31a), 이의 Tq는 연구 동안 도달되지 않았다. 그러나, BAY 94-9343에서의 DM4 페이로드의 몰량은 MORAb-109에서의 에리불린 페이로드의 양의 대략 2배이다.
정맥내 경로에 의해 3.2 ㎎/㎏(마우스 MTD 투여량 또는 10 ㎎/㎏으로 투여되는 경우 MORAb-109에서의 에리불린의 몰량보다 32배 더 많음)의 단회 용량으로 제공되는 에리불린은 LXFA-586 종양-보유 마우스에 의한 내약성이 좋았으며, 항-종양 효능(최소 T/C, 제21일에 14.8%)을 보였다. 그러나, 에리불린은 투여 후에 약간의 일시적인 체중 손실을 유도하였다(도 31a 및 도 31b).
실시예 19: 인간 NSCLC PDX 모델(LXFL-529)에서의 MORAb-109 및 BAY 94-9343의 항-종양 효능
19.1 방법
동물: 암컷 NMRI nu/nu 마우스, 4 내지 6주령.
이종이식: LXFL-529는 일차 비소세포 폐 선암종 인간 환자로부터 성장하는 종양(T3N1M0)을 확립하였다.
실험 절차: 충분한 수의 동물에서 종양 이식물이 50 내지 250 ㎣(예를 들어, 80 내지 200 ㎣)의 연구 부피 기준에 도달할 때까지 동물을 모니터링하였다. 마우스를 비슷한 군 중간값 및 평균 종양 부피를 목적으로 군으로 지정하였다. 군으로의 지정 과정(등록, 계층화된 무작위화)은 또한 무작위화로도 지칭될 수 있다. 무작위화 일을 실험 제0일로 표기하였다.
처리: 효능을 각각 6마리 내지 7마리 마우스의 6개의 군에서 평가하였다:
· 군 1에서, 비히클을 제1일에 5 ㎖/㎏, 정맥내, 단회 용량으로 투여하였다.
· 군 2에서, BAY 94-9343(DAR ~ 4)을 제1일에 12.5 ㎎/㎏, 정맥내, 단회 용량으로 투여하였다.
· 군 3에서, 에리불린을 제1일에 3.2 ㎎/㎏, 정맥내, 단회 용량으로 투여하였다.
· 군 4에서, MORAb-109(DAR2)를 제1일에 25 ㎎/㎏, 정맥내, 단회 용량으로 투여하였다.
· 군 5에서, MORAb-109(DAR2)를 제1일에 12.5 ㎎/㎏, 정맥내, 단회 용량으로 투여하였다.
· 군 6에서, MORAb-109(DAR2)를 제1일, 제8일 및 제16일에 12.5 ㎎/㎏, 정맥내, 용량으로 투여하였다.
종양을 측정하고, 마우스를 실험 기간 동안 주 2회 칭량하였다. 처음 투여 일은 무작위화(제0일) 1일 후인 제1일이었다.
19.2 결과
MORAb-109(DAR2)는 12.5 및 25 ㎎/㎏에서 LXFL-529 NSCLC PDX 모델에서 강력한 항-종양 효능을 나타내었다(도 32a). 단회 용량으로 제공되는 MORAb-109는 또한 LXFL-529 종양-보유 마우스에 의해 체중 손실 없이 내약성이 좋았다(도 32b).
그러나, BAY 94-9343(DAR ~ 4)은 12.5 ㎎/㎏(25 ㎎/㎏의 MORAb-109에서의 에리불린 페이로드의 양과 등몰량의 DM4 페이로드)에서, 항-종양 효능을 나타내지 않았다(도 32a).
정맥내 경로에 의해 3.2 ㎎/㎏(마우스 MTD 투여량)의 단회 용량으로 제공되는 에리불린은 LXFL-529 종양-보유 마우스에 의한 내약성이 좋았으며, 항-종양 효능을 보였다. 그러나, 에리불린은 투여 후에 약간의 일시적인 체중 손실을 유도하였다(도 32a 및 도 32b).
SEQUENCE LISTING <110> EISAI R&D MANAGEMENT CO., LTD. <120> ERIBULIN ANTIBODY-DRUG CONJUGATES AND METHODS OF USE <130> 08061.0043-00304 <140> PCT/IB2020/000917 <141> 2020-11-06 <150> 62/932,373 <151> 2019-11-07 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Val Ile Asp Ile Ser Gly Asn Arg Phe Tyr Ala Asp Trp Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Val Asp Ser Arg Ala Trp Gly Pro Phe Asn Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 4 Gln Ala Ser 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primer" <400> 49 gccaccggcg tgcactccgc ctatgatatg acccagactc ca 42 <210> 50 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 50 agccacagtt cgtttgacsa ccacctcggt ccc 33 <210> 51 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 51 Gln Val Glu Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asp Pro Gly Asp Ser Arg Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gln Leu Tyr Gly Gly Thr Tyr Met Asp Gly Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 52 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 52 caggttgaac tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaagc ctggcgagag cctgaagatc 60 agctgcaaag gcagcggcta cagcttcacc agctattgga tcggctgggt tcgacaggcc 120 cctggcaaag gactggaatg gatgggaatc atcgaccccg gcgacagcag aaccagatac 180 agccctagct ttcagggcca agtgaccatc agcgccgaca agagcatcag cacagcctac 240 ctgcagtggt ctagcctgaa agccagcgac accgccatgt actattgtgc cagaggccag 300 ctgtacggcg gcacctatat ggatggatgg ggccagggca cactggtcac agtgtctagc 360 gcctctacaa agggccctag cgttttccca ctggctccta gcagcaagag cacatctggt 420 ggaacagccg ctctgggctg cctggtcaag gattactttc ctgagcctgt gaccgtgtcc 480 tggaatagcg gagcactgac aagcggcgtg cacacatttc cagctgtgct gcagagcagc 540 ggcctgtact ctctgtctag cgtcgtgaca gtgcctagca gctctctggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaacca caagcctagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660 aagagctgcg acaagaccca cacctgtcct ccatgtcctg ctccagaact gctcggcgga 720 ccctccgttt tcctgtttcc acctaagcct aaggacaccc tgatgatcag caggacccct 780 gaagtgacct gtgtggtggt ggatgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gttcaattgg 840 tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga acagtacaac 900 agcacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa 960 gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgctc ctatcgagaa aaccatcagc 1020 aaggccaagg gccagccaag agaaccccag gtttacacac tgcctccaag cagggacgag 1080 ctgaccaaga atcaggtgtc cctgacctgc ctcgtgaagg gcttctaccc ttccgatatc 1140 gccgtggaat gggagagcaa tggccagcct gagaacaact acaagacaac ccctcctgtg 1200 ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac agcaagctga cagtggacaa gtccagatgg 1260 cagcagggca acgtgttcag ctgttctgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320 cagaaaagcc tgtctctgag ccccggcaaa 1350 <210> 53 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 53 Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Gly Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Asp Ile Glu 85 90 95 Ser Ala Thr Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 130 135 140 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Gly Asp Ser Ser Pro Val 145 150 155 160 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 165 170 175 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 180 185 190 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 195 200 205 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 54 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 54 gatattgctc tgacacagcc tgccagcgtg tccggatctc ctggccagag catcacaatc 60 agctgtaccg gcacaagcag cgacatcggc ggctacaata gcgtgtcctg gtatcagcag 120 caccccggaa aggcccctaa gctgatgatc tacggcgtga acaacagacc cagcggcgtg 180 tccaatagat tcagcggcag caagagcggc aataccgcct ctctgacaat tagcggactg 240 caggccgagg acgaggccga ttactactgc agcagctacg acatcgagag cgccacacct 300 gtgtttggcg gcggaacaaa actgacagtg ctgggccaac ctaaggccgc tcctagcgtt 360 acactgttcc cacctagcag cgaggaactg caggctaaca aggccacact cgtgtgcctg 420 atcagcgatt tttaccctgg cgccgtgaca gtggcctgga aaggcgatag ttctcctgtg 480 aaggccggcg tggaaaccac cacacctagc aagcagagca acaacaaata cgccgccagc 540 tcctacctga gcctgacacc tgagcagtgg aagtcccaca gatcctacag ctgccaagtg 600 acccacgagg gcagcaccgt ggaaaaaaca gtggccccta ccgagtgcag c 651

Claims (110)

  1. 단리된 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 메소텔린에 결합할 수 있으며, 카바트(Kabat) 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 1(HCDR1), SEQ ID NO: 2(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 3(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역; 및 SEQ ID NO: 4(LCDR1), SEQ ID NO: 5(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 6(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역; 또는 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 7(HCDR1), SEQ ID NO: 8(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 9(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역; 및 SEQ ID NO: 10(LCDR1), SEQ ID NO: 11(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 12(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  2. 단리된 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 메소텔린에 결합할 수 있으며, SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역으로부터의 3개의 중쇄 상보성 결정 영역 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역으로부터의 3개의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크, 또는 하나 이상의 복귀 돌연변이를 갖는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 및 인간 Ig 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 치료제에 컨쥬게이트된 항체 또는 항원-결합 단편.
  12. 제11항에 있어서, 상기 치료제가 에리불린(eribulin)인 항체 또는 항원-결합 단편.
  13. 하기 화학식 I의 항체-약물 컨쥬게이트:
    [화학식 I]
    Ab-(L-D) p
    [상기 식에서,
    Ab는 항체 또는 항원-결합 단편이고, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 메소텔린에 결합할 수 있고, 카바트 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 1(HCDR1), SEQ ID NO: 2(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 3(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역; 및 SEQ ID NO: 4(LCDR1), SEQ ID NO: 5(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 6(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역; 또는 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 7(HCDR1), SEQ ID NO: 8(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 9(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역; 및 SEQ ID NO: 10(LCDR1), SEQ ID NO: 11(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 12(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하며;
    D는 에리불린이며;
    L은 Ab를 D에 공유적으로 부착시키는 절단 가능한 링커이며;
    p는 1 내지 8의 정수임].
  14. 제13항에 있어서, p가 1 내지 6의 정수인 항체-약물 컨쥬게이트.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, p가 6인 항체-약물 컨쥬게이트.
  16. 제13항 또는 제14항에 있어서, p가 2인 항체-약물 컨쥬게이트.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단 가능한 링커는 링커 또는 항체 또는 항원-결합 단편의 일부가 절단 시에 에리불린에 결합된 채 남아 있지 않도록 위치되는 절단 가능한 모이어티를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단 가능한 링커가 절단 가능한 펩티드 모이어티를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  19. 제18항에 있어서, 상기 절단 가능한 펩티드 모이어티가 효소에 의해 절단 가능한 항체-약물 컨쥬게이트.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 절단 가능한 펩티드 모이어티가 카텝신(cathepsin)에 의해 절단 가능한 항체-약물 컨쥬게이트.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단 가능한 펩티드 모이어티가 카텝신 B에 의해 절단 가능한 항체-약물 컨쥬게이트.
  22. 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단 가능한 펩티드 모이어티 또는 절단 가능한 링커가 아미노산 유닛을 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  23. 제22항에 있어서, 상기 아미노산 유닛이 발린-시트룰린(Val-Cit)을 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  24. 제13항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단 가능한 링커가 적어도 하나의 스페이서 유닛을 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  25. 제13항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스페이서 유닛 또는 절단 가능한 링커가 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  26. 제25항에 있어서, 상기 PEG 모이어티가 -(PEG)m-을 포함하며, m이 1 내지 10의 정수인 항체-약물 컨쥬게이트.
  27. 제26항에 있어서, m이 2인 항체-약물 컨쥬게이트.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스페이서 유닛이 말레이미드(Mal) 모이어티("Mal-스페이서 유닛")를 통해 항체 또는 항원-결합 단편에 부착되는 항체-약물 컨쥬게이트.
  29. 제28항에 있어서, 상기 Mal-스페이서 유닛이 상기 항체 또는 항원-결합 단편 상의 시스테인 잔기를 통해 상기 항체 또는 항원-결합 단편에 연결되는 항체-약물 컨쥬게이트.
  30. 제29항에 있어서, 상기 시스테인 잔기가 카바트 넘버링 시스템에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 상의 경쇄 가변 영역의 아미노산 위치 80에서의 시스테인 잔기("LCcys80")인 항체-약물 컨쥬게이트.
  31. 제30항에 있어서, p가 2인 항체-약물 컨쥬게이트.
  32. 제31항에 있어서, 각각의 -L-D 모이어티가 상기 항체 또는 항원-결합 단편 상의 LCcys80에 부착되는 항체-약물 컨쥬게이트.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단 가능한 링커가 Mal-스페이서 유닛 및 절단 가능한 펩티드 모이어티를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  34. 제33항에 있어서, 상기 절단 가능한 펩티드 모이어티가 Val-Cit를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Mal-스페이서 유닛이 상기 항체 또는 항원-결합 단편을 상기 링커 내의 절단 가능한 모이어티에 부착시키는 항체-약물 컨쥬게이트.
  36. 제35항에 있어서, 상기 링커 내의 절단 가능한 모이어티가 절단 가능한 펩티드 모이어티를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  37. 제36항에 있어서, 상기 절단 가능한 펩티드 모이어티가 Val-Cit를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단 가능한 링커가 Mal-(PEG)2-Val-Cit를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  39. 제24항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 내의 절단 가능한 모이어티가 에리불린에 직접 연결되거나, 스페이서 유닛이 상기 링커 내의 절단 가능한 모이어티를 에리불린에 부착시키는 항체-약물 컨쥬게이트.
  40. 제39항에 있어서, 상기 컨쥬게이트의 절단이 상기 항체 또는 항원-결합 단편 및 링커로부터 에리불린을 방출시키는 항체-약물 컨쥬게이트.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 링커 내의 절단 가능한 모이어티를 에리불린에 부착시키는 스페이서 유닛이 자가-희생적(self-immolative)인 항체-약물 컨쥬게이트.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 내의 절단 가능한 모이어티를 에리불린에 부착시키는 스페이서 유닛이 p-아미노벤질옥시카보닐(pAB)을 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  43. 제42항에 있어서, 상기 pAB가 상기 링커 내의 절단 가능한 모이어티를 에리불린에 부착시키는 항체-약물 컨쥬게이트.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 pAB가 C-35 아민을 통해 에리불린에 공유적으로 부착되는 항체-약물 컨쥬게이트.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 내의 절단 가능한 모이어티가 절단 가능한 펩티드 모이어티를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  46. 제45항에 있어서, 상기 절단 가능한 펩티드 모이어티가 Val-Cit를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 절단 가능한 링커가 Val-Cit-pAB를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  48. 제13항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크, 또는 하나 이상의 복귀 돌연변이를 갖는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  49. 제13항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  50. 제13항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  51. 제13항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 인간 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  52. 제13항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  53. 제13항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 인간 Ig 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  54. 제13항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  55. 제13항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  56. 제13항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  57. 하기 화학식 I의 항체-약물 컨쥬게이트:
    [화학식 I]
    Ab-(L-D) p
    [상기 식에서,
    Ab는 항체 또는 항원-결합 단편이고, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 메소텔린에 결합할 수 있고, 카바트 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 1(HCDR1), SEQ ID NO: 2(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 3(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역; 및 SEQ ID NO: 4(LCDR1), SEQ ID NO: 5(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 6(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역; 또는 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 SEQ ID NO: 7(HCDR1), SEQ ID NO: 8(HCDR2) 및 SEQ ID NO: 9(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역; 및 SEQ ID NO: 10(LCDR1), SEQ ID NO: 11(LCDR2) 및 SEQ ID NO: 12(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하며;
    D는 에리불린이며;
    L은 Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB를 포함하는 절단 가능한 링커이며;
    p는 1 내지 8의 정수임].
  58. 제57항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크, 또는 하나 이상의 복귀 돌연변이를 갖는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  61. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 및 인간 Ig 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  62. 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  63. 제57항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  64. 하기 화학식 I의 항체-약물 컨쥬게이트:
    [화학식 I]
    Ab-(L-D) p
    [상기 식에서,
    Ab는 항체 또는 항원-결합 단편이고, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 메소텔린에 결합할 수 있고, SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며;
    D는 에리불린이며;
    L은 Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB를 포함하는 절단 가능한 링커이며;
    p는 1 내지 8의 정수임].
  65. 제64항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 및 인간 Ig 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  67. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  68. 제57항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, p가 1 내지 6인 항체-약물 컨쥬게이트.
  69. 제57항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, p가 6인 항체-약물 컨쥬게이트.
  70. 제57항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, p가 2인 항체-약물 컨쥬게이트.
  71. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 제13항 내지 제70항 중 어느 한 항의 항체-약물 컨쥬게이트 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  72. 제71항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 다수의 카피의 항체, 항원-결합 단편, 또는 항체-약물 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 다수의 카피의 항체-약물 컨쥬게이트를 포함하며, 상기 조성물 내의 항체-약물 컨쥬게이트의 평균 p가 약 1 내지 약 6이며, 선택적으로, 상기 조성물 내의 항체-약물 컨쥬게이트의 평균 p가 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9, 약 2.0, 약 2.1, 약 2.2 또는 약 2.3인 약제학적 조성물.
  74. 제73항에 있어서, 상기 조성물 내의 항체-약물 컨쥬게이트의 평균 p가 약 6인 약제학적 조성물.
  75. 제73항에 있어서, 상기 조성물 내의 항체-약물 컨쥬게이트의 평균 p가 약 1.9 또는 약 2.0인 약제학적 조성물.
  76. 치료적 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편, 제13항 내지 제70항 중 어느 한 항의 항체-약물 컨쥬게이트, 또는 제71항 내지 제75항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 갖거나 암을 갖는 것으로 의심되는 대상체의 치료 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 암이 메소텔린을 발현하는 방법.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 상기 암이 중피종, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 자궁내막암, 두경부암, 간암, 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 위암, 갑상선암, 방광암, 자궁암, 담도암 또는 백혈병인 방법.
  79. 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 중피종, 폐암, 난소암 또는 위암인 방법.
  80. 치료적 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편, 제13항 내지 제70항 중 어느 한 항의 항체-약물 컨쥬게이트, 또는 제71항 내지 제75항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서의 암 세포 모집단의 감소 또는 성장의 둔화 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 암 세포 모집단이 메소텔린을 발현하는 방법.
  82. 제80항 또는 제81항에 있어서, 상기 암 세포 모집단이 고형 종양 또는 혈액학적 악성종양인 방법.
  83. 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포 모집단이 중피종, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 자궁내막암, 두경부암, 간암, 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 위암, 갑상선암, 방광암, 자궁암, 담도암 또는 백혈병인 방법.
  84. 제80항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포 모집단이 중피종, 폐암, 난소암 또는 위암인 방법.
  85. 제80항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체, 항원-결합 단편, 항체-약물 컨쥬게이트 또는 약제학적 조성물의 투여가 상기 암 세포 모집단을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 감소시키는 방법.
  86. 제80항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체, 항원-결합 단편, 항체-약물 컨쥬게이트 또는 약제학적 조성물의 투여가 상기 암 세포 모집단의 성장을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 둔화시키는 방법.
  87. 대상체로부터 생물학적 시료를 제공하는 단계; 상기 시료를 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 및 상기 시료 내의 하나 이상의 암 세포로의 항체 또는 항원-결합 단편의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 암을 갖거나 암을 갖는 것으로 의심되는 대상체가 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편, 제13항 내지 제70항 중 어느 한 항의 항체-약물 컨쥬게이트, 또는 제71항 내지 제75항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 사용한 치료에 대하여 반응성일지 여부의 결정 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 하나 이상의 암 세포가 메소텔린을 발현하는 방법.
  89. 제87항 또는 제88항에 있어서, 상기 암이 메소텔린을 발현하는 방법.
  90. 제87항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 중피종, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 자궁내막암, 두경부암, 간암, 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 위암, 갑상선암, 방광암, 자궁암, 담도암 또는 백혈병인 방법.
  91. 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 중피종, 폐암, 난소암 또는 위암인 방법.
  92. 제87항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료가 조직 생검 시료, 혈액 시료, 림프 시료, 골수 시료, 피부 시료 또는 뇌척수액(CSF) 시료인 방법.
  93. 암을 갖거나, 암을 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편, 제13항 내지 제70항 중 어느 한 항의 항체-약물 컨쥬게이트 또는 제71항 내지 제75항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물.
  94. 제93항에 있어서, 상기 암이 메소텔린을 발현하는 항체, 항원-결합 단편, 항체-약물 컨쥬게이트 또는 약제학적 조성물.
  95. 제93항 또는 제94항에 있어서, 상기 암이 중피종, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 자궁내막암, 두경부암, 간암, 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 위암, 갑상선암, 방광암, 자궁암, 담도암 또는 백혈병인 항체, 항원-결합 단편, 항체-약물 컨쥬게이트 또는 약제학적 조성물.
  96. 제93항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 중피종, 폐암, 난소암 또는 위암인 항체, 항원-결합 단편, 항체-약물 컨쥬게이트 또는 약제학적 조성물.
  97. 암을 갖거나, 암을 갖는 것으로 의심되는 대상체의 치료에서의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편, 제13항 내지 제70항 중 어느 한 항의 항체-약물 컨쥬게이트, 또는 제71항 내지 제75항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 용도.
  98. 제97항에 있어서, 상기 암이 메소텔린을 발현하는 용도.
  99. 제97항 또는 제98항에 있어서, 상기 암이 중피종, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 자궁내막암, 두경부암, 간암, 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 위암, 갑상선암, 방광암, 자궁암, 담도암 또는 백혈병인 용도.
  100. 제97항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 중피종, 폐암, 난소암 또는 위암인 용도.
  101. 암을 갖거나, 암을 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하기 위한 의약의 제조 방법에서의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편, 제13항 내지 제70항 중 어느 한 항의 항체-약물 컨쥬게이트, 또는 제71항 내지 제75항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 용도.
  102. 제101항에 있어서, 상기 암이 메소텔린을 발현하는 용도.
  103. 제101항 또는 제102항에 있어서, 상기 암이 중피종, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 자궁내막암, 두경부암, 간암, 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 위암, 갑상선암, 방광암, 자궁암, 담도암 또는 백혈병인 용도.
  104. 제101항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 중피종, 폐암, 난소암 또는 위암인 용도.
  105. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산.
  106. 제105항의 핵산을 포함하는 단리된 벡터.
  107. 제105항의 핵산 또는 제106항의 벡터를 포함하는 단리된 세포 또는 세포 모집단.
  108. 제107항의 세포 또는 세포 모집단을 항체 또는 항원-결합 단편을 생성하기에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편의 생성 방법.
  109. 항체 또는 항원-결합 단편을 컨쥬게이션을 허용하는 조건 하에서 에리불린에 부착된 절단 가능한 링커와 반응시키는 단계를 포함하는 제13항 내지 제70항 중 어느 한 항의 항체-약물 컨쥬게이트의 생성 방법.
  110. 제109항에 있어서, 상기 에리불린에 부착된 절단 가능한 링커가 상기 항체 또는 항원-결합 단편의 경쇄 상의 시스테인 잔기와 반응하는 방법.
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