TW202132345A - 艾日布林抗體-藥物結合物及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示結合至間皮素之抗體、抗原結合片段及結合物(例如抗體-藥物結合物，諸如包含艾日布林(eribulin)之結合物)。本發明進一步關於用於藉由投與本文所提供之組合物來治療癌症之方法及組合物。

Description

艾日布林抗體-藥物結合物及使用方法
本發明係關於抗間皮素抗體及其抗原結合片段，以及諸如抗體-藥物結合物(ADC)之結合物，例如包含艾日布林(eribulin)之結合物，及其用於治療及診斷表現間皮素及/或藉由破壞微管蛋白或藉由投與本文揭示之組合物經受治療之癌症的用途。
癌症為全世界發病率及死亡率之主要原因之一，其中在2012年約有1400萬新病例及820萬癌症相關死亡。癌症死亡之最常見原因為以下癌症：肺癌(159萬例死亡)、肝癌(745,000例死亡)、胃癌(723,000例死亡)、大腸直腸癌(694,000例死亡)、乳癌(521,000例死亡)、及食道癌(400,000例死亡)。預期新癌症病例之數目在接下來的二十年內上升約70%至每年約2200萬例新癌症病例(World Cancer Report 2014)。
間皮素，糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨定之細胞表面蛋白質由於其在各種癌症類型，包括間皮瘤、卵巢癌及胰臟腺癌中之高表現而為基於抗體之癌症療法之有吸引力的靶標(Tang等人(2013) Anticancer Agents Med. Chem. 13(2):276-80)。在間皮素基因剔除小鼠不顯示任何可偵測表型之條件下，雖然缺乏間皮素之生物功能的充分理解，但已表明間皮素在腫瘤黏附及癌轉移中起作用(Bera and Pastan (2000) Mol. Cell Biol. 20(8):2902-6; Rump等人(2004) J. Biol. Chem. 279(10):9190-8)。間皮素亦被認為對某些形式之化學療法產生耐藥性，且被認為藉由對細胞具有增生作用來促成腫瘤進展(Bharadwaj等人(2011) Mol. Cancer. 10:106; Li等人(2008) Mol. Cancer Ther. 7(2):286-96)。
近期研究已顯示間皮素可充當上皮-間質轉移(EMT)，一種與癌症轉移及復發密切相關之方法的主要調節因子(He等人(2017). Mol Cancer. 16:63)。不希望受理論所束縛，咸信抑制間皮素，例如藉由抗間皮素抗體、抗原結合片段及/或ADC結合可藉由經由抑制TGF-β(轉型生長因子β)信號傳導誘導反向製程，間質上皮轉移(MET)來減少EMT。相反，咸信間皮素之過度表現可經由誘導與腫瘤進展及不良治療反應相關之癌症幹細胞樣表型驅動EMT(He等人(2017). Mol Cancer. 16:63; Koyama等人(2017). J. Clin. Invest. 127(4): 1254-1270)。
癌症療法中通常遭遇之挑戰為化學治療劑之有限治療指數對正常組織產生顯著毒性且因此限制其治療效用。一種達成較高的靶向癌細胞之特異性的方法為藉由使用抗體向表現某些腫瘤特異性抗原之細胞傳遞細胞毒性效應，同時保留表現程度低得多的抗原或不表現任何抗原的正常細胞(Awwad等人Pharmaceutics (2018) 10(3); Lambert and Berkenblit (2018) 69: 191-207)。此類腫瘤特異性靶向可用於增加抗腫瘤活性且減少治療劑之脫靶細胞毒性。靶向腫瘤特異性抗原之抗體可經由多種機制，包括抑制抗原之生物活性、引發免疫效應活性及/或誘導抗體依賴性細胞毒性傳遞細胞毒性效應(Hendrinks等人International Review of Cell and Molecular Biology (2017); Therapeutic Antibody Engineering (2012): 163-196, 459-595)。
基於抗體之治療方法選擇腫瘤特異性抗原可涉及藉由腫瘤細胞特異性表現抗原及穩定殺滅抗原表現腫瘤細胞。已發現若干人類癌症表現高程度之間皮素，包括肺癌、卵巢癌、胰臟癌及胃癌(Hassan等人Eur. J. Cancer (2008) 44(1): 46-53; Hassan等人J. Clin. Oncol. (2016) 34(34): 4171-4179)。間皮素表現亦已發現於耐藥性癌症，諸如具有KRAS及STK11突變且對檢查點阻斷免疫療法具有不良臨床反應之肺癌，及HER2-陰性胃癌中。另外，已報導間皮素表現與患有肺腺癌之患者及患有胃癌轉移之患者的總存活率之間的相關性，表明高間皮素表現可為惡化臨床結果之預測因子(Kachala等人(2014) Clin. Cancer. Res. 20(4): 1020-1028; Han等人(2017) J. Pathol. Transl. Med. 51(2): 122-128)。人類癌症中間皮素表現之發病率及其與不良臨床結果之關聯使得間皮素成為腫瘤抗原特異性藥物遞送方法，例如抗體介導之方法之潛在目標。亦已研究與諸如化學治療劑之細胞毒性化合物結合之抗體來增強基於抗體之藥物傳遞至腫瘤細胞之細胞殺滅活性。然而，仍需要提供適合抗體及/或ADC，其提供有效腫瘤靶向、標靶作用、旁觀者殺滅及/或降低之脫靶作用之組合。
艾日布林為巨環化合物軟海綿素B之合成類似物，其先前已展示為微管蛋白聚合、微管組裝及微管蛋白依賴性GTP水解之強力抑制劑。微管蛋白構成稱作微管之動態絲狀細胞骨架蛋白，其參與多種重要細胞功能，包括細胞內遷移及轉運、細胞信號傳導、維持細胞形狀及細胞分裂。癌細胞之快速劃分速率使得其對微管蛋白功能之阻塞特別敏感。因此，軟海綿素B及艾日布林已表明活體外及活體內顯著抗癌活性(Tan等人(2009) Clin Cancer Res. 15(12): 4213-4219; Vahdat等人(2009) J. Clin. Oncol. 27(18): 2954-2961)。艾日布林之甲磺酸鹽(艾日布林甲磺酸鹽)當前以商標名Halaven™銷售以用於治療患有難治性轉移性乳癌之患者。
儘管已在此項技術中，包括在ADC情形中報導使用艾日布林，但仍需要以靶向方式將艾日布林較佳傳遞至特定組織，例如表現間皮素之癌症組織。同樣，在此項技術中仍需要結合例如在抗原結合方面具有優良特性之間皮素之改良抗體及/或有效地將有效負載，諸如艾日布林遞送至表現間皮素之目標細胞或組織的能力。
在各種實施例中，本發明部分提供新穎抗體及抗原結合片段，其可單獨使用、連結至一或多種額外試劑(例如ADC)或作為較大大分子(例如雙特異性抗體、多特異性抗體，單獨或作為連結至呈ADC格式之有效載荷的多特異性抗體)之一部分使用且作為醫藥組合物或組合療法之一部分投與。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段經人類化。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列且保留非人類抗體之反應性，同時在人類中免疫原性較小。在某些實施例中，抗體及抗原結合片段可適用於治療人類癌症患者。
在各種實施例中，本發明更特定言之係關於能夠結合及/或殺滅腫瘤細胞之抗體及抗體-藥物結合物化合物。在各種實施例中，ADC複合物亦能夠在結合之後內化至目標細胞中。揭示包含使艾日布林藥物部分連接至抗體部分之連接子的ADC化合物。抗體部分可為全長抗體或抗原結合片段。
在一些實施例中，本文揭示之抗體或抗原結合片段包含：三個重鏈互補決定區(HCDR)，其包含SEQ ID NO:1(HCDR1)、SEQ ID NO:2(HCDR2)及SEQ ID NO:3(HCDR3)之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其包含SEQ ID NO:4(LCDR1)、SEQ ID NO:5(LCDR2)及SEQ ID NO:6(LCDR3)之胺基酸序列，如藉由Kabat編號系統(Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)))所定義；或三個重鏈互補決定區(HCDR)，其包含SEQ ID NO:7(HCDR1)、SEQ ID NO:8(HCDR2)及SEQ ID NO:9(HCDR3)之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其包含SEQ ID NO:10(LCDR1)、SEQ ID NO:11(LCDR2)及SEQ ID NO:12(LCDR3)之胺基酸序列，如藉由IMGT編號系統(International ImMunoGeneTics Information System (IMGT®))所定義。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體或抗原結合片段包含三個重鏈互補決定區(HCDR)，其來自包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的重鏈可變區；及三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其來自包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一些實施例中，本文揭示之抗體或抗原結合片段為抗間皮素抗體或抗原結合片段。在各種實施例中，抗體或抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列或與所揭示序列至少90%一致之序列。在各種實施例中，抗體或抗原結合片段包含：人類IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列；及人類Ig κ輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列。在各種實施例中，抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO:17之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO:18之輕鏈胺基酸序列。
在各種實施例中，本文所揭示之抗體或抗原結合片段包含：三個重鏈互補決定區(HCDR)，其包含由SEQ ID NO:19(HCDR1)、SEQ ID NO:20(HCDR2)及SEQ ID NO:21(HCDR3)之核酸序列編碼的胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其包含由SEQ ID NO:22(LCDR1)、SEQ ID NO:23 (LCDR2)及SEQ ID NO:24 (LCDR3)之核酸序列編碼的胺基酸序列，如藉由Kabat編號系統所定義；或三個重鏈互補決定區(HCDR)，其包含由SEQ ID NO:25(HCDR1)、SEQ ID NO:26(HCDR2)及SEQ ID NO:27(HCDR3)之核酸序列編碼的胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其包含由SEQ ID NO:28 (LCDR1)、SEQ ID NO:29 (LCDR2)及SEQ ID NO:30 (LCDR3)之核酸序列編碼的胺基酸序列，如藉由IMGT編號系統所定義。
在各種實施例中，抗體或抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO:31之核酸序列編碼的胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO:32之核酸序列編碼的胺基酸序列。在各種實施例中，抗體或抗原結合片段包含：重鏈恆定區，其包含由SEQ ID NO:33之核酸序列編碼的胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含由SEQ ID NO:34之核酸序列編碼的胺基酸序列。在各種實施例中，抗體或抗原結合片段包含：重鏈，其包含由SEQ ID NO:35之核酸序列編碼的胺基酸序列；及輕鏈，其包含由SEQ ID NO:36之核酸序列編碼的胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段為全長抗體。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段為單特異性抗體或抗原結合片段、雙特異性抗體或抗原結合片段，或多特異性抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段為單鏈可變片段(scFv)或Fab片段。
在各種實施例中，抗體或抗原結合片段與治療劑，例如一或多種小分子及/或其他抗體或抗原結合片段結合。在一些實施例中，治療劑為艾日布林。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段為345A12-HC15-LC4。
在各種實施例中，本文所揭示之ADC包含式(I)： Ab-(L-D) p (I) 其中 Ab為抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段能夠結合至間皮素且包含：三個重鏈互補決定區(HCDR)，其包含SEQ ID NO:1(HCDR1)、SEQ ID NO:2(HCDR2)及SEQ ID NO:3(HCDR3)之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其包含SEQ ID NO:4 (LCDR1)、SEQ ID NO:5 (LCDR2)及SEQ ID NO:6 (LCDR3)之胺基酸序列，如藉由Kabat編號系統所定義；或三個重鏈互補決定區(HCDR)，其包含SEQ ID NO:7(HCDR1)、SEQ ID NO:8(HCDR2)及SEQ ID NO:9(HCDR3)之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其包含SEQ ID NO:10(LCDR1)、SEQ ID NO:11(LCDR2)及SEQ ID NO:12(LCDR3)之胺基酸序列，如藉由IMGT編號系統所定義； D為治療劑，例如艾日布林部分； L為將Ab共價連接至D之可裂解連接子；且p 為1至8之整數。
在一些實施例中，p 為1至6之整數。在一些實施例中，p 為2或6。
在一些實施例中，ADC包含可裂解連接子，該可裂解連接子包含可裂解部分，該可裂解部分經定位使得在裂解後不存在連接子或抗體或抗原結合片段之一部分保持結合至治療劑(例如艾日布林)。在一些實施例中，可裂解連接子包含可藉由酶，諸如組織蛋白酶B裂解之可裂解肽部分。在一些實施例中，可裂解部分包含可裂解肽部分，例如胺基酸單元，諸如Val-Cit。在一些實施例中，胺基酸單元包含纈胺酸-瓜胺酸(Val-Cit)。
在一些實施例中，可裂解連接子包含至少一個包含至少一個PEG部分之間隔子單元。在一些實施例中，間隔子單元或連接子包含(PEG)2 。在一些實施例中，間隔子單元經由順丁烯二醯亞胺(Mal)部分(「Mal-間隔子單元」)連接至該抗體部分。在一些實施例中，Mal-間隔子單元經由抗體或抗原結合片段上之半胱胺酸殘基(例如抗體上之LCcys80殘基)接合至抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，Mal-間隔子單元接合至抗體或抗原結合片段上輕鏈可變區之半胱胺酸殘基(例如LCcys80)。在一些實施例中，p 為2，使得兩個-L-D部分連接至抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，各-L-D部分連接至抗體或抗原結合片段上輕鏈可變區之半胱胺酸殘基(例如LCcys80)。在一些實施例中，半胱胺酸殘基為LCcys80，亦即根據Kabat編號系統之抗體或抗原結合片段上之輕鏈可變區之胺基酸位置80處的半胱胺酸殘基。在一些實施例中，可裂解連接子包含Mal-間隔子單元及可裂解肽部分且可裂解肽部分包含Val-Cit。在一些實施例中，Mal-間隔子單元將抗體或抗原結合片段連接至可裂解部分。
在一些實施例中，Mal-間隔子單元包含至少一個PEG部分。在一些實施例中，連接子包含Mal-(PEG)2 。在一些實施例中，Mal-間隔子單元使抗體部分連接至連接子中之可裂解部分。在一些實施例中，連接子中之可裂解部分為可裂解肽部分，例如胺基酸單元。在一些實施例中，連接子包含Mal-(PEG)2 -Val-Cit。
在一些實施例中，ADC之可裂解部分直接接合至艾日布林，或間隔子單元將連接子中之可裂解部分連接至艾日布林藥物部分，且結合物之裂解自抗體或抗原結合片段及連接子釋放艾日布林。
在一些實施例中，將可裂解部分連接至艾日布林藥物部分之間隔子單元為自我分解型。在一些實施例中，自我分解型間隔子單元包含對胺基苯甲氧基羰基(pAB)。在一些實施例中，pAB間隔子單元經由C-35胺使可裂解部分連接至艾日布林藥物部分。在一些實施例中，可裂解部分為可裂解肽部分，例如胺基酸單元。在一些實施例中，可裂解連接子包含Val-Cit-pAB。在一些實施例中，連接子包含Val-Cit-pAB及經由Mal部分將連接子接合至抗體部分之PEG間隔子單元。在一些實施例中，連接子包含Mal-(PEG)2 -Val-Cit-pAB。
在各種實施例中，ADC之抗體或抗原結合片段包含人類重鏈及輕鏈可變區框架，或具有一或多個回復突變之人類重鏈及輕鏈可變區框架。在各種實施例中，ADC之抗體或抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列或與SEQ ID NO:13之胺基酸序列至少90%一致；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列或與SEQ ID NO:14之胺基酸序列至少90%一致。在各種實施例中，ADC之抗體或抗原結合片段包含：人類IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列；及人類Ig κ輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列。在各種實施例中，ADC之抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO:17之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO:18之輕鏈胺基酸序列。
在各種實施例中，ADC具有式(I)： Ab-(L-D) p (I) 其中 Ab為抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段能夠結合至間皮素且包含：三個重鏈互補決定區(HCDR)，其包含SEQ ID NO:1(HCDR1)、SEQ ID NO:2(HCDR2)及SEQ ID NO:3(HCDR3)之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其包含SEQ ID NO:4 (LCDR1)、SEQ ID NO:5 (LCDR2)及SEQ ID NO:6 (LCDR3)之胺基酸序列，如藉由Kabat編號系統所定義；或三個重鏈互補決定區(HCDR)，其包含SEQ ID NO:7(HCDR1)、SEQ ID NO:8(HCDR2)及SEQ ID NO:9(HCDR3)之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其包含SEQ ID NO:10(LCDR1)、SEQ ID NO:11(LCDR2)及SEQ ID NO:12(LCDR3)之胺基酸序列，如藉由IMGT編號系統所定義； D為艾日布林； L為包含Mal-(PEG)2 -Val-Cit-pAB之可裂解連接子；且p 為1至8之整數，例如p 為2至6或3至4之整數。
在一些實施例中，p 為1至6之整數。在一些實施例中，p 為2或6。
在各種實施例中，ADC(例如上述ADC)之抗體或抗原結合片段包含人類重鏈及輕鏈可變區框架，或具有一或多個回復突變之人類重鏈及輕鏈可變區框架。在各種實施例中，ADC之抗體或抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列或與SEQ ID NO:13至少90%一致；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列或與SEQ ID NO:14至少90%一致。在各種實施例中，ADC之抗體或抗原結合片段包含：人類IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列；及人類Ig κ輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列。在各種實施例中，ADC之抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO:17之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO:18之輕鏈胺基酸序列。
在各種實施例中，ADC具有式I： Ab-(L-D) p (I) 其中Ab為抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段能夠結合至間皮素且包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列； D為艾日布林； L為包含Mal-(PEG)2 -Val-Cit-pAB之可裂解連接子；且p 為1至8之整數，例如p 為2至6或3至4之整數。
在一些實施例中，p 為1至6之整數。在一些實施例中，p 為2或6。
在一些實施例中，ADC之抗體或抗原結合片段包含人類IgG1重鏈恆定區及人類Ig κ輕鏈恆定區。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含：IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列；及Ig κ輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含：重鏈，其包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列；及輕鏈，其包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列。
在各種實施例中，本文提供醫藥組合物，其包含所述抗體、抗原結合片段、結合物及/或ADC組合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含一或多種本文所描述之抗體或抗原結合片段及/或一或多種ADC以及至少一種醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含抗體、抗原結合片段及/或ADC之多個拷貝。在一些實施例中，醫藥組合物包含本文所揭示之ADC之多個拷貝，其中ADC之平均值p 為約1至約6。在一些實施例中，組合物中ADC之平均值p 為約1.7或2或約6。
在各種實施例中，本文提供所述抗體、抗原結合片段、結合物及/或ADC組合物例如治療癌症之治療用途。在某些態樣中，本發明提供治療表現由抗體、抗原結合片段及/或結合物或ADC之抗體部分，諸如間皮素靶向之抗原的癌症的方法。在某些態樣中，本發明提供藉由投與治療有效量之本文所描述之抗體、抗原結合片段、結合物及/或ADC及/或其中之任一者之方案來殺滅腫瘤細胞或癌細胞或抑制其增殖之方法。在一些實施例中，癌症為間皮素表現癌，諸如間皮瘤、乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、肺癌(例如非小細胞肺癌)、卵巢癌(例如漿液性或透明細胞卵巢癌)、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、甲狀腺癌、尿道上皮癌、子宮癌、膽管癌或白血病。在一些實施例中，癌症表現較高或中等程度之間皮素。在一些實施例中，較高或中等程度之間皮素表現為等於或大於80之平均螢光強度(MFI)，如藉由FACS染色所量測。
在某些態樣中，本發明提供針對所描述之抗體、抗原結合片段、結合物及/或ADC化合物及組合物之用途，例如用於確定患有或疑似患有癌症(例如，間皮素表現癌)之個體是否將對用靶向間皮素之試劑，例如本文所揭示之抗體或抗體結合片段、結合物或ADC進行之治療有反應。在一些實施例中，該方法包含提供來自個體之生物樣品；使樣品與本文所揭示之抗體或抗原結合片段接觸；及偵測抗體或抗原結合片段與樣品中之一或多個癌細胞的結合。
在某些其他態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含抗體或抗體結合片段、結合物及/或ADC及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑及/或賦形劑。亦提供產生所揭示之抗體或抗體結合片段、結合物或ADC化合物及組合物之方法。
在一些實施例中，提供編碼本發明之抗體或抗原結合片段、結合物或ADC之核酸序列。核酸可呈經分離核酸的形式，併入經分離載體中之核酸包含及/或在適合於產生抗體或抗原結合片段之條件下由細胞群體表現之抗體或抗原結合片段形式。
本發明主張2019年11月7日申請之美國臨時專利申請案第62/932,373號之優先權，其以全文引用之方式併入本文中。
結合附圖，參照以下詳細描述可更容易地理解所揭示之組合物及方法，該等附圖形成本發明之一部分。應理解，除非上下文另外指示，否則本文中所用之術語僅出於作為實例描述特定實施例之目的且不意欲限制所主張之組合物及方法。
在本文通篇，描述涉及組合物及使用該等組合物之方法。當本發明描述或主張與組合物相關聯之特徵或實施例時，此類特徵或實施例同樣適用於使用該組合物之方法。同樣，當本發明描述或主張與使用組合物之方法相關聯之特徵或實施例時，此類特徵或實施例同樣適用於該組合物。
當表示值之範圍時，其包括使用該範圍內之任何特定值之實施例。另外，對按範圍陳述的值的提及包括彼範圍內的每一值。所有範圍均包括其端點在內且可組合。當藉由在前面使用「約」，以近似值表示值時，應理解特定值形成另一實施例。除非上下文另外明確指示，否則提及特定數字值至少包括該特定值。除非另外規定其使用之具體環境，否則使用「或」將意謂「及/或」。本文中引用之所有參考文獻均以引用的方式併入用於任何目的。在參考文獻與本說明書矛盾之情況下，將以本說明書為準。
應瞭解，本文中為清楚起見而在單獨實施例之情形下描述的所揭示之組合物及方法之某些特徵亦可以單個實施例之組合形式提供。相反地，所揭示之組合物及方法為了簡便起見在單個實施例之情形下描述的各種特徵亦可單獨或以任何子組合形式提供。定義
貫穿本說明書及申請專利範圍使用與本說明書之態樣相關之多種術語。除非另外指示，否則該等術語將提供其在此項技術中之普通含義。其他特定定義之術語以符合本文所提供之定義的方式解釋。
除非上下文另外明確規定，否則如本文所使用，單數形式「一個(種)(a/an)」及「該(the)」包括複數形式。
如熟習此項技術者自本文中所含教示顯而易知，在數字值及範圍之情形中，術語「約」或「近似地」係指近似值或範圍或該等值或範圍接近所述值或範圍，以使得實施例可根據預期執行，諸如在反應混合物中具有所需量之核酸或多肽。因此，此等術語涵蓋超出由系統誤差產生之值的值。在一些實施例中，約意謂數字量±10%。
術語「抗體-藥物結合物」、「抗體結合物」、「結合物」、「免疫結合物」及「ADC」可互換使用，且係指與抗體部分連接且由以下通式定義之治療性化合物(例如艾日布林部分)：Ab-(L-D) p (式I)，其中Ab為抗體部分(例如抗體或抗特異性結合片段)，L為連接部分，D為藥物部分(例如艾日布林藥物部分)，且p 為根據抗體部分之藥物部分的數目。在包含艾日布林藥物部分之ADC中，「p 」係指連接至抗體部分之艾日布林部分之數目。在一些實施例中，連接子L可包括可直接連接至抗體部分及連接至治療性化合物之可裂解部分，或可裂解部分可藉由間隔子單元連接至抗體部分及治療性化合物中之任一者或兩者。在一些實施例中，當間隔子單元將可裂解部分連接至治療性化合物時，其為自我分解型間隔子單元。
術語「抗體」以最廣泛的含義使用，係指經由免疫球蛋白分子可變區內之至少一個抗原識別位點識別且特異性結合於目標，諸如蛋白質、多肽、碳水化合物、聚核苷酸、脂質或前述之組合的免疫球蛋白分子。抗體之重鏈由重鏈可變域(VH)及重鏈恆定區(CH)構成。輕鏈由輕鏈可變域(VL)及輕鏈恆定域(CL)構成。出於本申請之目的，成熟重鏈及輕鏈可變域各自包含自N端至C端排列之四個框架區(FR1、FR2、FR3及FR4)內之三個互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3)：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。「抗體」可為天然存在的或人造的，諸如藉由習知雜交瘤技術產生之單株抗體。術語「抗體」包括全長單株抗體及全長多株抗體，以及抗體片段諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv及單鏈抗體。抗體可為五個主要類別之免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM或其子類(例如同型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)中之任一種。術語進一步涵蓋人類抗體、嵌合抗體、人類化抗體及含有抗原識別位點之任何經修飾免疫球蛋白分子，只要其展現所需生物活性即可。
如本文所使用，術語「單株抗體」係指自實質上均質之抗體群體獲得的抗體，亦即，除可能少量存在的可能天然存在之突變以外，構成該群體之各個抗體係相同的。單株抗體針對單一抗原性抗原決定基具有高度特異性。相比之下，習知(多株)抗體製劑通常包括針對不同抗原決定基(或對其具有特異性)之多種抗體。修飾語「單株」指示抗體之特徵為自實質上均質之抗體群體獲得，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由Kohler等人(1975) Nature 256:495首先描述的融合瘤方法製得，或可藉由重組DNA方法(參見例如美國專利案第4,816,567號)製得。單株抗體亦可使用例如Clackson等人(1991) Nature 352:624-8及Marks等人(1991) J Mol Biol. 222:581-97中所述之技術自噬菌體抗體文庫分離。
本文所描述之單株抗體具體地包括「嵌合」抗體，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或子類別之抗體中之對應序列相同或同源，而鏈之剩餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類別之抗體中之對應序列相同或同源；以及該等抗體之片段，只要其特異性結合目標抗原且/或展現所需生物活性即可。
如本文所使用，術語「嵌合抗體」係指免疫球蛋白分子之胺基酸序列源自兩種或更多種物種的抗體。在一些情況下，重鏈及輕鏈之可變區對應於來源於具有所需特異性、親和力及活性之一種物種之抗體的可變區，而恆定區與來源於另一物種(例如人類)之抗體同源以使後一物種中之免疫反應最小化。
如本文所用，術語「人類化抗體」係指含有來自非人類(例如兔子)抗體以及人類抗體之序列的抗體形式。此類抗體為含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列之嵌合抗體。一般而言，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實質上全部，其中所有或實質上所有高變環對應於非人類免疫球蛋白之該等區域且所有或實質上所有框架(FR)區係人類免疫球蛋白序列之該等區域。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常，人類免疫球蛋白之恆定區的至少一部分。人類化抗體可藉由Fv框架區中及/或所置換之非人類殘基內殘基之取代而進一步修飾，以改進及優化抗體特異性、親和力及/或活性。
如本文所用，術語抗體之「抗原結合片段」、「抗原結合域」或「抗原結合部分」係指抗體或蛋白質之一或多個片段，其保留特異性結合於抗原(例如間皮素)之能力。抗原結合片段亦可保持內化至抗原表現細胞中之能力。在一些實施例中，抗原結合片段亦保持免疫效應子活性。已展示全長抗體之片段可以進行抗體之抗原結合功能。術語抗體之「抗原結合片段」、「抗原結合域」或「抗原結合部分」內所涵蓋之結合片段的實例包括(i) Fab片段，一種由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii) F(ab')2 片段，一種包含藉由鉸鏈區處之二硫橋鍵連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1域組成之Fd片段；(iv)由抗體單一組之VL及VH域組成之Fv片段；(v) dAb片段，其包含單一可變域，例如VH域(參見例如Ward等人(1989)Nature 341:544-6；以及國際公開案第WO 1990/005144號)；以及(vi)經分離之互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個域VL及VH係由獨立基因編碼，但其可以使用重組方法，藉由使其能夠以單一蛋白質鏈形式製造之合成連接子接合，其中VL與VH區域配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv))。參見例如Bird等人(1988) Science 242:423-6；及Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83。此類單鏈抗體亦意欲涵蓋在術語抗體之「抗原結合片段」或「抗原結合部分」內，且在此項技術中稱為例示性類型之可在結合後內化至細胞中之結合片段(參見例如Zhu等人(2010) 9:2131-41；He等人(2010) J Nucl Med. 51:427-32；及Fitting等人(2015) MAbs 7:390-402)。在某些實施例中，scFv分子可以併入融合蛋白中。亦涵蓋其他形式之單鏈抗體，諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價的雙特異性抗體，其中VH及VL域表現於單一多肽鏈上，但使用太短而不允許相同鏈上之兩個域之間進行配對的連接子，藉此迫使該等域與另一鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點(參見例如，Holliger等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-8;及Poljak等人(1994) Structure 2:1121-3)。抗原結合片段係使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且結合片段係以與完整抗體相同之方式進行效用(例如結合親和力、內化)篩檢。抗原結合片段可藉由裂解完整蛋白質，例如藉由蛋白酶或化學裂解來製備。
關於抗體或抗原結合片段如本文所用之「內化性」係指能夠在結合於細胞後通過細胞之脂質雙層膜吸收進入內部隔室(亦即，「經內化」)，通常進入細胞中之降解隔室的抗體或抗原結合片段。舉例而言，內化抗間皮素抗體為能夠在結合至細胞膜上之間皮素之後進入細胞中的抗體。在一些實施例中，本文所揭示之ADC中所用的抗體或抗原結合片段經由內化性抗體或內化性抗原結合片段(允許ADC在抗原結合之後轉移通過細胞膜)靶向細胞表面抗原(例如間皮素)。
如本文所使用，術語「間皮素」或「MSLN」係指任何天然形式之人類間皮素(MSLN)。該術語涵蓋全長間皮素(例如NCBI參考序列：AAC50348.1)以及由細胞處理產生之任何形式之人類間皮素。該術語亦涵蓋天然存在之間皮素之變異體，包括但不限於剪接變異體、對偶基因變異體及同功異型物。間皮素可自人類分離，或可以重組方式或藉由合成方法製造。該術語亦可涵蓋抗間皮素抗體(例如本文揭示之抗體)及/或抗原結合片段可特異性結合之任何合成變異體。
術語「抗間皮素抗體」或「特異性結合間皮素之抗體」係指特異性結合間皮素之抗體或其片段的任何形式，且涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體及生物學上功能性抗體片段，只要其特異性結合間皮素即可。在一些實施例中，本文所揭示之ADC中使用的抗間皮素抗體為內化性抗體或內化性抗體片段。345A12(例如345A12-HC15-LC4)及102A6A2為例示性內化性人類間皮素抗體。如本文所用，術語「特異性」、「特異性結合」及「特異性地結合」係指抗體與目標抗原抗原抗原決定基之選擇性結合。可藉由在一組給定條件下比較同適當抗原之結合與同不相關抗原抗原混合物之結合來測試抗體之結合特異性。若抗體結合至適當抗原且親和力為與不相關抗原或抗原混合物之親和力的至少2倍、5倍、7倍、10倍更多倍，則認為其具有特異性。「特異性抗體」或「目標特異性抗體」為僅結合目標抗原(例如間皮素)但不結合(或展現極少結合)至其他抗原的抗體。
術語「抗原決定基」係指抗原中能夠被抗體識別且特異性結合之部分。當抗原為多肽時，抗原決定基可由連續胺基酸或藉由多肽之三級摺疊而並列之非連續胺基酸形成。抗體所結合之抗原決定基可以使用此項技術中已知之任何抗原決定基定位技術鑑別，包括X射線結晶學，藉由直接觀測抗原-抗體複合物，以及監測抗體與該抗原之片段或突變型變異體之結合，或監測抗體及抗原之不同部分的溶劑可接近性鑑別抗原決定基。用於定位抗體抗原決定基之例示性策略包括但不限於基於陣列之寡肽掃描、受限蛋白質水解、定點突變誘發、高通量突變誘發定位、氫-氘交換及質譜法(參見例如Gershoni等人(2007) 21:145-56；及Hager-Braun及Tomer (2005) Expert Rev. Proteomics 2:745-56)。
亦可使用競爭性結合及抗原決定基分組確定共有一致或重疊抗原決定基之抗體。競爭性結合可以使用交叉阻斷分析，諸如「Antibodies, A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow及Lane(1988年第1版, 2014年第2版)中所描述之分析評價。在一些實施例中，當測試抗體或結合蛋白使參考抗體或結合蛋白與諸如間皮素之目標抗原(例如包含選自表1-3中鑑別之CDR及/或可變域的結合蛋白)的結合在交叉阻斷分析中減少至少約50% (例如50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.5%或更大或任何百分比)時，鑑別競爭性結合，及/或反之亦然。在一些實施例中，競爭性結合可歸因於共用或類似(例如部分重疊)之抗原決定基，或由於其中抗體或結合蛋白在鄰近抗原決定基處結合之位阻(參見例如Tzartos, Methods in Molecular Biology (Morris,編(1998)第66卷,第55-66頁))。在一些實施例中，可使用競爭性結合分選共有類似抗原決定基之結合蛋白群組。舉例而言，競爭結合之結合蛋白可「分組」為具有重疊或鄰近抗原決定基之結合蛋白組，而不競爭之該等結合蛋白歸入不具有重疊或鄰近抗原決定基之獨立結合蛋白組。
術語「kon 」或「ka 」係指抗體與抗原締合形成抗體/抗原複合物之締合速率常數。該速率可使用標準分析，諸如表面電漿共振、生物層干涉法或ELISA分析測定。
術語「koff 」或「kd 」係指抗體自抗體/抗原複合物解離之解離速率常數。該速率可使用標準分析，諸如表面電漿共振、生物層干涉法或ELISA分析測定。
術語「KD 」係指具體抗體-抗原相互作用之平衡解離常數。KD 藉由ka /kd 計算。該速率可使用標準分析，諸如表面電漿共振、生物層干涉法或ELISA分析測定。
術語「p 」或「藥物負載」或「藥物：抗體比率」或「藥物與抗體比率」或「DAR」係指每個抗體部分之藥物部分之數目，亦即式(I)之ADC中每個抗體或抗原結合片段(Ab)之藥物負載，或-L-D部分之數目。在包含艾日布林藥物部分之ADC中，「p 」係指連接至抗體部分之艾日布林部分之數目。舉例而言，若兩個艾日布林部分連接至抗體部分，則p =2。在包含式(I)之ADC之多個拷貝的組合物中，「平均值p 」係指ADC群體中每個抗體或抗原結合片段之-L-D部分之平均數目，亦稱為「平均藥物負載」。
「連接子」或「連接子部分」在本文中用於指能夠將化合物，通常諸如艾日布林之藥物部分共價連接至另一部分，諸如抗體部分之任何化學部分。連接子在使化合物或抗體保持活性之條件下易於發生或實質上抵抗酸誘導之裂解、肽酶誘導之裂解、光誘導之裂解、酯酶誘導之裂解及二硫鍵裂解。
術語「試劑」在本文中用於指化合物、化合物之混合物、生物大分子或由生物材料製成之提取物。術語「治療劑」或「藥物」係指能夠調節生物過程及/或具有生物活性之試劑。本文所述之艾日布林單體為例示性治療劑。
術語「化學治療劑」或「抗癌劑」在本文中用於指有效治療癌症之所有試劑，不管作用機制如何。抑制轉移或血管生成常常係化學治療劑之一種特性。化學治療劑包括如本文所述之抗體、生物分子及小分子，且涵蓋艾日布林。化學治療劑可以為細胞毒性劑或細胞生長抑制劑。術語「細胞生長抑制劑」係指抑制或遏止細胞生長及/或細胞繁殖之試劑。術語「細胞毒性劑」係指主要藉由干擾細胞之表現活性及/或功能引起細胞死亡之物質。
如本文所使用，術語「艾日布林」或「艾日布林單體」係指軟海綿素B之合成類似物，軟海綿素B為原先自海洋海綿岡田軟海綿(Halichondria okadais)分離之巨環化合物。艾日布林為微管動力學抑制劑，其被認為結合微管蛋白且藉由抑制有絲分裂紡錘體組合件來誘導細胞週期停滯於G2/M期。術語「艾日布林甲磺酸鹽」係指以商品名Halaven™市售之艾日布林之甲磺酸鹽。例示性艾日布林類似物包括美國專利第6,214,865號及美國專利第6,653,341號中所展示及描述之彼等，該等專利關於所揭示之艾日布林結構及合成彼等結構之方法以引用之方式併入本文中。
如本文所使用，術語「艾日布林二聚體」係指一種二聚形式之艾日布林，其中兩個艾日布林單體經由共價或非共價鍵直接地或藉由化學連接子(例如二級胺、二羥基二級胺)連接。在一些實施例中，艾日布林二聚體可由以下組成：在C-34位置處藉由二級胺共價連接之兩個艾日布林單體，或在C-35位置處藉由二羥基二級胺共價連接之兩個艾日布林單體。由在C-34位置處藉由二級胺共價連接之兩個艾日布林單體組成之艾日布林二聚體在本文中可稱為「desOH艾日布林二聚體」。由在C-35位置處藉由二羥基二級胺共價連接之兩個艾日布林單體組成之艾日布林二聚體在本文中可稱為「diOH艾日布林二聚體」。術語「艾日布林二聚體藥物部分」係指ADC或組合物之組分，其提供艾日布林二聚體之結構，例如式(I)之ADC或包含-L-D之組合物中之艾日布林二聚體(D)組分。在一些實施例中，desOH艾日布林二聚體及/或diOH艾日布林二聚體相比於其他艾日布林二聚體形式提供改良之可結合性。
如本文所使用之術語「念珠藻素」係指念珠藻素-1，一種巨環內酯化合物，其原先自藍藻菌念珠藻屬分離，或係指保留抗微管蛋白活性之其任何合成類似物。例示性念珠藻素類似物包括在國際公開案第WO 2017/136769號中展示及描述之類似物，對於所有其所揭示之念珠藻素結構及合成彼等結構之方法，其以引用之方式併入本文中。術語「念珠藻素藥物部分」係指具有念珠藻素結構之ADC或組合物之組分。
術語「同源物」係指因例如在相應位置處具有相同或類似之化學殘基序列而與另一分子展現同源性的分子。
如本文所使用，術語「抑制(inhibit)」或「之抑制(inhibition of)」意思指減少可量測之量，且可包括但不需要完全預防或抑制。
術語「旁觀者殺滅」或「旁觀者效應」係指在靶陽性細胞存在下目標陰性細胞之殺滅，其中在無目標陽性細胞存在下未觀察到目標陰性細胞之殺滅。細胞間接觸、或目標陽性與目標陰性細胞之間至少鄰近能夠進行旁觀者殺滅。此類殺滅可與「脫靶殺滅」相區分，脫靶殺滅係指對目標陰性細胞之無差別殺滅。在目標陽性細胞不存在之情況下可觀測到「脫靶殺滅」。
術語「癌症」係指哺乳動物中之生理病狀，其中細胞群體之特徵為不受調控之細胞生長。癌之實例包括但不限於癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病。此類癌症之特定實例包括間皮素表現癌，諸如間皮瘤、乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、肺癌(例如非小細胞肺癌)、卵巢癌(例如漿液癌、透明細胞癌或上皮卵巢癌)、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、甲狀腺癌、尿道上皮癌、子宮癌、膽管癌或白血病。在一些實施例中，本文所述之癌症表現較高或中等程度之間皮素。在一些實施例中，較高或中等程度之間皮素表現為等於或大於80之平均螢光強度(MFI)，如藉由FACS染色所量測。
術語「腫瘤」及「贅瘤」係指由過量細胞生長或增殖引起之任何組織腫塊，可為良性或惡性的，包括癌前病變。
術語「腫瘤細胞」係指來源於腫瘤之個別細胞或全部細胞群體，包括非致瘤細胞及癌症幹細胞。如本文所使用，當僅提及缺乏更新及分化能力之腫瘤細胞時，術語「腫瘤細胞」將以術語「非致瘤」修飾以區分腫瘤細胞與癌症幹細胞。
術語「個體」與「患者」在本文中可互換地使用，意思指任何動物，諸如任何哺乳動物，包括但不限於人類、非人類靈長類動物、嚙齒動物及類似動物。在一些實施例中，哺乳動物為小鼠。在一些實施例中，哺乳動物為人類。
「醫藥組合物」係指呈准許投與活性成分且隨後提供活性成分之預定生物活性及/或實現治療作用之形式的製劑，且其不含對將投與該調配物之個體具有不可接受毒性之額外組分。該醫藥組合物可為無菌的。
「醫藥賦形劑」包含諸如佐劑、載劑、pH調節劑及緩衝劑、張力調節劑、濕潤劑、防腐劑及類似物之材料。
「醫藥學上可接受」意謂聯邦管理機構或洲政府批准或可批准，或美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或其他一般公認之藥典中列出可用於動物且更特定言之用於人類。
「有效量」之例如如本文所揭示之抗體、抗原結合片段及/或ADC為足以執行特定陳述之目的，例如在投與後產生治療效果，諸如腫瘤生長率或腫瘤體積減小、癌症症狀減少或治療功效之一些其他標誌的量。有效量可以與所述目的相關之常規方式測定。術語「治療有效量」係指有效治療個體之疾病或病症之抗體、抗原結合片段及/或ADC的量。在癌症之情況下，治療有效量之抗體、抗原結合片段及/或ADC可減少癌細胞數目、減小腫瘤尺寸、抑制(例如減緩或阻止)腫瘤轉移、抑制(例如減緩或阻止)腫瘤生長及/或減輕一或多種症狀。「預防有效量」係指在所需劑量及時間段下，可有效實現所需預防結果之量。通常，由於預防劑量係在疾病之前或在疾病早期階段時用於個體，因此預防有效量將小於治療有效量。
如本文所使用，「治療」或「治療性」及語法相關術語係指疾病之任何結果之任何改良，諸如延長存活期、較低發病率及/或減輕由替代性治療模式引起之副作用。如此項技術中易於理解，治療操作涵蓋但不需要疾病之完全根除。如本文所使用之「治療(treatment/treat)」係指將所描述之抗體、抗原結合片段及/或ADC投與個體，例如患者。治療可為治癒、癒合、減輕、緩解、改變、補救、改善、緩和、改良或影響病症、病症之症狀或患該病症，例如癌症之傾向性。在一些實施例中，除治療患有病狀之個體外，亦可預防性提供本文所揭示之組合物以預防或降低發展該病狀之可能性。
在一些實施例中，使用經標記之抗體、抗原結合片段及/或ADC。適合「標記」包括放射性核種、酶、受質、輔因子、抑制劑、螢光部分、化學發光部分、磁性粒子及類似物。
如本文所使用，「蛋白質」意謂至少兩個共價連接之胺基酸。該術語涵蓋多肽、寡肽及肽。在一些實施例中，兩個或更多個共價連接之胺基酸係藉由肽鍵連接。蛋白質可以由天然存在之胺基酸及肽鍵構成，例如當蛋白質係使用表現系統及宿主細胞以重組方式製備時。或者，蛋白質可包括合成胺基酸(例如高苯丙胺酸、瓜胺酸、鳥胺酸及正白胺酸)。「重組蛋白」為使用重組技術、使用此項技術中已知之任何技術及方法，亦即經由表現重組核酸而製成之蛋白質。用於產生重組蛋白之方法及技術在本領域中為熟知的。
對於胺基酸序列，序列一致性及/或相似性可使用此項技術中已知之標準技術來確定，包括但不限於Smith及Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482之局部序列一致性演算法、Needleman及Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443之序列一致性比對演算法、Pearson及Lipman (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:2444之相似性方法的檢索、此等算法之電腦化實施方案(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)、由Devereux等人(1984) Nucl. Acid Res. 12:387-95所描述之最佳擬合序列程式，例如使用預設設定，或藉由檢驗。在一些實施例中，一致性百分比係藉由FastDB基於以下參數來計算：錯配罰分1；空隙罰分1；空隙尺寸罰分0.33；及接合罰分30 (「Current Methods in Sequence Comparison and Analysis」, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications,第127-149頁(1988), Alan R. Liss, Inc)。
一般而言，本文所揭示之蛋白質與其變異體，包括目標抗原(諸如間皮素)之變異體、微管蛋白序列之變異體及抗體可變域(包括個別變異體CDR)之變異體之間的胺基酸同源性、相似性或一致性與本文所描繪之序列為至少80%，例如具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、幾乎100%或100%之同源性或一致性。
以類似方式，關於抗體及本文所識別之其他蛋白質之核酸序列之「核酸序列一致性百分比(%)」定義為與抗原結合蛋白之編碼序列中之核苷酸殘基相同的候選序列中的核苷酸殘基百分比。特定方法利用設定為預設參數的WU-BLAST-2之BLASTN模組，其中重疊間隔及重疊分數分別設定為1及0.125。
引入胺基酸序列變化之位點或區域係預先確定的，而突變本身無需預先確定。舉例而言，為使給定位點處之突變之效能最佳化，可在目標密碼子或區域處進行隨機突變誘發且篩檢表現之抗原結合蛋白CDR變異體之所需活性的最佳組合。在具有已知序列之DNA中的預定位點處進行取代突變之技術為人所熟知，例如MI3引子突變誘發及PCR突變誘發。抗間皮素抗體及抗原結合片段
在各種實施例中，本發明係關於能夠結合及/或殺滅腫瘤細胞(例如間皮素表現腫瘤細胞)之抗體或其抗原結合片段，以及其在結合物及治療性組合物中之用途。
在一些實施例中，抗體可單獨使用，作為醫藥組合物或組合療法之一部分投與，及/或作為ADC中之抗體部分投與。在一些實施例中，本文揭示之抗間皮素抗體及抗原結合片段本身(亦即呈未結合形式)及作為ADC中之抗體部分適用。在一些實施例中，抗間皮素抗體及抗原結合片段經人類化。在一些實施例中，抗間皮素抗體及抗原結合片段含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列且保留非人類(例如兔子)抗體之反應性同時在人類中免疫原性較小。在一些實施例中，本文所揭示之抗間皮素抗體及抗原結合片段提供相比於熟習此項技術者已知之一或多種抗間皮素抗體改良的穩定性、可調配性、聚集、結合親和力、治療功效、脫靶毒性及/或代謝型態中之一或多者。
在各種實施例中，本文所揭示之抗體或抗原結合片段特異性結合至間皮素，例如如癌細胞上所表現。抗體或抗原結合片段可結合至目標抗原，其中如藉由例如BIAcore® 分析所量測，解離常數(KD ) ≤1 mM、≤100 nM或≤10 nM或其間任何量。在某些實施例中，KD 為1 pM至500 pM。在一些實施例中，KD 在500 pM至1 µM、1 µM至100 nM或100 mM至10 nM之間。
在一些實施例中，抗體部分為包含兩個重鏈及兩個輕鏈之四鏈抗體(亦稱為免疫球蛋白)。在一些實施例中，抗體部分為免疫球蛋白之雙鏈半主體(一個輕鏈及一個重鏈)或抗原結合片段。
在一些實施例中，抗體部分為抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗體部分為內化性抗體或其內化性抗原結合片段。在一些實施例中，內化性抗體或其內化性抗原結合片段結合至細胞表面上表現之目標癌症抗原且在結合後進入細胞。在一些實施例中，ADC之艾日布林藥物部分在ADC進入之後自ADC之抗體部分釋放且存在於表現目標癌症抗原之細胞中(亦即在ADC已內化之後)。
在各種實施例中，本文揭示之抗體或抗原結合片段可包含取自表3-5中所列之彼等的配對集合之重鏈及輕鏈可變域或來自配對重鏈及輕鏈集合之六個CDR序列集合，例如表1-2中所列之CDR之集合。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段進一步包含人類重鏈及輕鏈框架(視情況具有一或多個回復突變以改良結合親和力)及/或人類重鏈及輕鏈恆定域或其片段。舉例而言，抗體或抗原結合片段可包含人類IgG重鏈恆定域(諸如IgG1)及人類κ或λ輕鏈恆定域。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含人類免疫球蛋白G次型1 (IgG1)重鏈恆定域與人類Ig κ輕鏈恆定域。
本發明之例示性抗體之胺基酸及核酸序列闡述於表1-10中。表 1. 針對抗間皮素抗體之 Kabat CDR 的胺基酸序列
mAb IgG 鏈 SEQ ID 胺基酸序列
345A12-HC15-LC4 HC CDR1 1 SYAMS
HC CDR2 2 VIDISGNRFYADWVKG
HC CDR3 3 VDSRAWGPFNL
LC CDR1 4 QASQSIFSYLA
LC CDR2 5 DASDLAS
LC CDR3 6 QQGYTRSDVDNA
表 2. 針對抗間皮素抗體之 IMGT CDR 的胺基酸序列
mAb IgG 鏈 SEQ ID 胺基酸序列
345A12-HC15-LC4 HC CDR1 7 GIDLSSYA
HC CDR2 8 IDISGNR
HC CDR3 9 ARVDSRAWGPFNL
LC CDR1 10 QSIFSY
LC CDR2 11 DAS
LC CDR3 12 QQGYTRSDVDNA
表 3. 針對抗間皮素抗體之可變區之胺基酸序列
mAb IgG 鏈 SEQ ID 胺基酸序列
345A12-HC15-LC4 重鏈 13 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGIDLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGVIDISGNRFYADWVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVDSRAWGPFNLWGQGTLVTVSS
輕鏈 14 DYQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSIFSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQCEDAATYYCQQGYTRSDVDNAFGGGTKVEIK
表 4. 針對抗間皮素抗體之恆定區的胺基酸序列
mAb IgG 鏈 恆定區 SEQ ID 胺基酸序列
345A12-HC15-LC4 重鏈 人類IgG1 15 astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
輕鏈 人類Ig κ 16 rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
表 5. 針對抗間皮素抗體之全長抗體 Ig 鏈的胺基酸序列
mAb IgG 鏈 SEQ ID 胺基酸序列
345A12-HC15-LC4 重鏈 17 qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgidlssyamswvrqapgkglewigvidisgnrfyadwvkgrftisrdnskntlylqmsslraedtavyycarvdsrawgpfnlwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
輕鏈 18 dyqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqsifsylawyqqkpgkapklliydasdlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqcedaatyycqqgytrsdvdnafgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
表 6. 編碼針對抗間皮素抗體之 Kabat CDR 的核酸序列
mAb IgG 鏈 SEQ ID 核酸序列
345A12-HC15-LC4 HC CDR1 19 TCCTACGCCATGTCC
HC CDR2 20 gtgatcgacatctccggcaaccggttctacgccgactgggtgaagggC
HC CDR3 21 GTGGACTCTAGAGCCTGGGGCCCCTTCAACCTG
LC CDR1 22 CAGGCCTCCCAGTCCATCTTCTCCTACCTGGCC
LC CDR2 23 GACGCCTCTGATCTGGCCTCC
LC CDR3 24 CAGCAGGGCTACACCAGATCCGACGTGGACAACGCC
表 7. 編碼針對抗間皮素抗體之 IMGT CDR 的核酸序列
mAb IgG 鏈 SEQ ID 核酸序列
345A12-HC15-LC4 HC CDR1 25 GGAATCGACCTGTCCTCCTACGCC
HC CDR2 26 ATCGACATCTCCGGCAACCGG
HC CDR3 27 GCCAGAGTGGACTCTAGAGCCTGGGGCCCCTTCAACCTG
LC CDR1 28 CAGTCCATCTTCTCCTAC
LC CDR2 29 GACGCCTCT
LC CDR3 30 CAGCAGGGCTACACCAGATCCGACGTGGACAACGCC
表 8. 編碼針對抗間皮素抗體之可變區的核酸序列
mAb IgG 鏈 SEQ ID 核酸序列
345A12- HC15-LC4 重鏈 31 caggtgcagctggtggaatctggtggcggagtggtgcagcctggcagatccctgagactgtcttgtgccgcctccggaatcgacctgtcctcctacgccatgtcctgggtgcgacaggctcctggcaagggcctggaatggatcggcgtgatcgacatctccggcaaccggttctacgccgactgggtgaagggccggttcaccatctccagagacaactccaagaacaccctgtacctccagatgtcctccctgcgggccgaggataccgccgtgtactactgcgccagagtggactctagagcctggggccccttcaacctgtggggccagggaacactcgtgaccgtgtcctct
輕鏈 32 Gattaccagatgacccagtccccctccagcctgtccgcttctgtgggcgacagagtgaccatcacctgtcaggcctcccagtccatcttctcctacctggcctggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgacgcctctgatctggcctccggcgtgccctctagattctccggctctggctctggcaccgactttaccctgaccatcagctccctccagtgcgaggatgccgccacctactactgccagcagggctacaccagatccgacgtggacaacgcctttggcggaggcaccaaggtggaaatcaaa
表 9. 編碼針對抗間皮素抗體之恆定區的核酸序列
mAb IgG 鏈 恆定區 SEQ ID 核酸序列
345A12-HC15-LC4 重鏈 人類IgG1 33 GCATCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCTTATATTCAAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGGAAATGA
輕鏈 人類Ig κ 34 CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
表 10. 編碼針對抗間皮素抗體 + 之全長抗體 Ig 鏈的核酸序列
mAb IgG 鏈 SEQ ID 核酸序列
345A12-HC15-LC4 重鏈 35 caggtgcagctggtggaatctggtggcggagtggtgcagcctggcagatccctgagactgtcttgtgccgcctccggaatcgacctgtcctcctacgccatgtcctgggtgcgacaggctcctggcaagggcctggaatggatcggcgtgatcgacatctccggcaaccggttctacgccgactgggtgaagggccggttcaccatctccagagacaactccaagaacaccctgtacctccagatgtcctccctgcgggccgaggataccgccgtgtactactgcgccagagtggactctagagcctggggccccttcaacctgtggggccagggaacactcgtgaccgtgtcctctgcatccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcttatattcaaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctcccgggaaatga
輕鏈 36 gattaccagatgacccagtccccctccagcctgtccgcttctgtgggcgacagagtgaccatcacctgtcaggcctcccagtccatcttctcctacctggcctggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgacgcctctgatctggcctccggcgtgccctctagattctccggctctggctctggcaccgactttaccctgaccatcagctccctccagtgcgaggatgccgccacctactactgccagcagggctacaccagatccgacgtggacaacgcctttggcggaggcaccaaggtggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttga
+ 所列出之核酸序列不包括前導序列。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體或抗原結合片段結合至人類間皮素且包含：三個重鏈互補決定區(HCDR)，其包含SEQ ID NO:1(HCDR1)、SEQ ID NO:2(HCDR2)及SEQ ID NO:3(HCDR3)之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其包含SEQ ID NO:4(LCDR1)、SEQ ID NO:5(LCDR2)及SEQ ID NO:6(LCDR3)之胺基酸序列，如藉由Kabat編號系統(Kabat，免疫學感興趣的蛋白質之序列)所定義。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體或抗原結合片段結合至人類間皮素且包含：三個重鏈互補決定區(HCDR)，其包含SEQ ID NO:7(HCDR1)、SEQ ID NO:8(HCDR2)及SEQ ID NO:9(HCDR3)之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其包含SEQ ID NO:10(LCDR1)、SEQ ID NO:11(LCDR2)及SEQ ID NO:12(LCDR3)之胺基酸序列，如藉由IMGT編號系統所定義。
在各種實施例中，抗間皮素抗體或抗原結合片段包含三個重鏈CDR及三個輕鏈CDR，其中CDR包括不超過以下之一個、兩個、三個、四個、五個或六個胺基酸加成、缺失或取代：HCDR1(根據Kabat之SEQ ID NO:1或根據IMGT之SEQ ID NO:7)、HCDR2(根據Kabat之SEQ ID NO:2或根據IMGT之SEQ ID NO:8)、HCDR3(根據Kabat之SEQ ID NO:3或根據IMGT之SEQ ID NO:9)；及LCDR1(根據Kabat之SEQ ID NO:4或根據IMGT之SEQ ID NO:10)、LCDR2(根據Kabat之SEQ ID NO:5，或根據IMGT之SEQ ID NO:11)及LCDR3(根據Kabat之SEQ ID NO:6或根據IMGT之SEQ ID NO:12)。
在一些實施例中，抗間皮素抗體或抗原結合片段經人類化。在一些實施例中，抗間皮素抗體或抗原結合片段含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列且保留非人類(例如兔子)抗體之反應性，同時在人類中免疫原性較小。在一些實施例中，與一或多種替代性抗間皮素抗體相比，抗間皮素抗體或抗原結合片段提供改良之穩定性、可調配性、結合親和力、治療功效及/或降低之聚集程度中的一或多者。
在各種實施例中，抗間皮素抗體或抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列或與SEQ ID NO:13至少90%一致之序列；及/或輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列或與SEQ ID NO:14至少90%一致之序列。在各種實施例中，抗間皮素抗體或抗原結合片段包含：重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列或與SEQ ID NO:15至少90%一致之序列；及/或輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列或與SEQ ID NO:16至少90%一致之序列。
在各種實施例中，抗間皮素抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO:17之重鏈胺基酸序列或與SEQ ID NO:17至少90%一致之序列；及/或SEQ ID NO:18之輕鏈胺基酸序列或與SEQ ID NO:18至少90%一致之序列。
在一些實施例中，抗間皮素抗體或抗原結合片段包含人類IgG1重鏈恆定域及人類Ig κ輕鏈恆定域。
在各種實施例中，抗間皮素抗體或抗原結合片段包含：三個重鏈互補決定區(HCDR)，其包含由SEQ ID NO:19(HCDR1)、SEQ ID NO:20(HCDR2)及SEQ ID NO:21(HCDR3)之核酸序列編碼之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其包含由SEQ ID NO:22 (LCDR1)、SEQ ID NO:23 (LCDR2)及SEQ ID NO:24 (LCDR3)之核酸序列編碼之胺基酸序列，如藉由Kabat編號系統所定義；或三個重鏈互補決定區(HCDR)，其包含由SEQ ID NO:25(HCDR1)、SEQ ID NO:26(HCDR2)及SEQ ID NO:27(HCDR3)之核酸序列編碼的胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其包含由SEQ ID NO:28 (LCDR1)、SEQ ID NO:29 (LCDR2)及SEQ ID NO:30 (LCDR3)之核酸序列編碼的胺基酸序列，如藉由IMGT編號系統所定義。
在各種實施例中，抗間皮素抗體或抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO:31之核酸序列編碼的胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO:32之核酸序列編碼的胺基酸序列。
在各種實施例中，抗間皮素抗體或抗原結合片段包含：重鏈恆定區，其包含由SEQ ID NO:33之核酸序列編碼的胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含由SEQ ID NO:34之核酸序列編碼的胺基酸序列。
在各種實施例中，抗間皮素抗體或抗原結合片段包含：重鏈，其包含由SEQ ID NO:35之核酸序列編碼的胺基酸序列；及輕鏈，其包含由SEQ ID NO:36之核酸序列編碼的胺基酸序列。
在各種實施例中，抗間皮素抗體或抗原結合片段為345A12-HC15-LC4。
本文所述之抗間皮素抗原結合域可單獨適用(例如作為抗體或抗原結合片段)、連接至一或多種額外試劑(例如作為ADC)或作為較大大分子(例如雙特異性抗體或多特異性抗體)之一部分。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段與治療劑結合。在一些實施例中，化學治療劑為艾日布林。在一些實施例中，化學治療劑為艾日布林二聚體。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段為雙特異性或多特異性抗體中之抗原結合域及/或為雙特異性或多特異性抗體之一部分。在一些實施例中，雙特異性或多特異性抗體包含能夠結合至間皮素之抗原結合域且包含：三個HCDR，其包含SEQ ID NO:1(HCDR1)、SEQ ID NO:2(HCDR2)及SEQ ID NO:3(HCDR3)之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其包含SEQ ID NO:4 (LCDR1)、SEQ ID NO:5 (LCDR2)及SEQ ID NO:6 (LCDR3)之胺基酸序列，如藉由Kabat編號系統所定義；或三個重鏈互補決定區(HCDR)，其包含SEQ ID NO:7(HCDR1)、SEQ ID NO:8(HCDR2)及SEQ ID NO:9(HCDR3)之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其包含SEQ ID NO:10(LCDR1)、SEQ ID NO:11(LCDR2)及SEQ ID NO:12(LCDR3)之胺基酸序列，如藉由IMGT編號系統所定義。在一些實施例中，多特異性抗體包含一或多個額外抗原結合域，例如針對相同抗原(亦即間皮素)或針對其他抗原。
在一些實施例中，抗原結合域為抗原結合片段。在一些實施例中，抗原結合域及/或抗原結合片段為單鏈可變片段(scFv)或Fab片段。
在一些實施例中，本文所揭示之用於單獨或作為較大大分子之一部分使用的抗原結合域(例如抗間皮素抗原結合域)可包括其他修飾(例如一或多個胺基酸取代、缺失及/或插入)，同時保留間皮素結合功能。抗體 - 藥物結合物
在各種實施例中，本文進一步提供抗體-藥物結合物(ADC)化合物，其包含使化學治療藥物部分，例如艾日布林連接至本文所揭示之抗間皮素抗體的連接子。抗體-藥物結合物(ADC)化合物可由式I表示： Ab-(L-D) p (I) 其中Ab為本文揭示之內化性抗間皮素抗體或其內化性抗原結合片段； D為艾日布林； L為將Ab共價連接至D之可裂解連接子；且p 為1至8之整數。
本發明之ADC化合物包括與藥物部分(例如艾日布林)結合(例如藉由連接子共價連接)之抗體部分(包括其抗原結合片段)，其中藥物部分當不結合於抗體部分時具有細胞毒性或細胞生長抑制作用。在各種實施例中，藥物部分在結合於結合物中時展現減少之細胞毒性或不展現細胞毒性，但在自連接子及抗體部分裂解之後恢復細胞毒性。在各種實施例中，藥物部分在結合於結合物中時展現減少之旁觀者殺滅作用或不展現旁觀者殺滅作用，但在自結合物裂解後展現增加之旁觀者殺滅作用。
在一些實施例中，本文所揭示之ADC化合物可選擇性地將有效劑量之藥物部分(例如艾日布林)遞送至表現由ADC之抗體部分靶向之抗原(例如間皮素)之癌細胞或腫瘤組織。在一些實施例中，所揭示之ADC化合物藉由將艾日布林遞送至表現間皮素之細胞或組織而避開不表現間皮素或以更低程度表現間皮素之正常細胞或組織來特異性靶向癌症。在一些實施例中，所揭示之ADC化合物相較於包含替代性抗體、連接子及/或藥物部分，例如BAY 94-9343之ADC具有改良之標靶殺滅及/或降低之脫靶殺滅。在一些實施例中，藉由ADC，所揭示之ADC化合物相較於包含替代性抗體、連接子及/或藥物部分，例如BAY 94-9343之ADC具有改良之ADCC活性保留。在一些實施例中，所揭示之ADC化合物相較於包含替代性抗體、連接子及/或藥物部分，例如BAY 94-9343之ADC具有改良之穩定性(例如血漿穩定性)。在一些實施例中，所揭示之ADC化合物相較於包含替代性抗體、連接子及/或藥物部分，例如BAY 94-9343之ADC具有改良之抗腫瘤功效。
在一些實施例中，相較於在評估為單獨藥物(亦即不結合於抗體部分)時之艾日布林劑量，本文所揭示之ADC化合物可在較低劑量之艾日布林情況下提供有利的抗腫瘤功效。在一些實施例中，相較於在評估為單獨藥物時之艾日布林，本文所揭示之ADC化合物之腫瘤特異性靶向提高ADC之抗腫瘤活性及/或降低脫靶細胞毒性。舉例而言，在一些實施例中，本文所揭示之ADC化合物展示有利抗腫瘤活性，其中艾日布林之劑量比當評估為單獨藥物時之艾日布林劑量低至少10倍、低至少15倍、低至少20倍或低至少30倍。在一些實施例中，所揭示之ADC化合物表明當評估為單獨藥物時與艾日布林活性相當或大於艾日布林活性之抗腫瘤活性，同時提供與其自身之艾日布林相比改良之毒理學或安全概況。
在一些實施例中，連接子在細胞外部為穩定的，使得ADC當存在於細胞外條件中時保持完整，但能夠在細胞，例如癌細胞中內化時裂解。在一些實施例中，當ADC進入表現間皮素之細胞時，艾日布林藥物部分自抗間皮素抗體部分裂解，且裂解釋放未經修飾形式之艾日布林。
在一些實施例中，連接子包含可裂解部分，該可裂解部分經定位使得在裂解後無連接子之一部分或抗體部分保持結合於艾日布林藥物部分。在一些實施例中，連接子中之可裂解部分為可裂解肽部分。在一些實施例中，相對於包含替代性連接子部分之ADC，包含可裂解肽部分之ADC展現較低聚集程度、改良之抗體：藥物比率、癌細胞之標靶殺滅增加、非癌細胞之脫靶殺滅減少及/或較高藥物負載(p)。在一些實施例中，增加之效能及/或細胞毒性提供於表現中等程度之間皮素的癌症中。在一些實施例中，可裂解肽部分可藉由酶裂解，且連接子為可酶裂解連接子。在一些實施例中，酶為組織蛋白酶B，且連接子為組織蛋白酶可裂解連接子。在一些實施例中，與替代性裂解機制相比，該酶可裂解連接子(例如組織蛋白酶可裂解連接子)展現上述改良特性中之一或多者。
在一些實施例中，連接子中之可裂解肽部分包含胺基酸單元。在一些實施例中，胺基酸單元包含纈胺酸-瓜胺酸(Val-Cit)。在一些實施例中，相對於包含替代性胺基酸單元或替代性可裂解部分之ADC，包含Val-Cit之ADC展現穩定性增加、脫靶細胞殺滅減少、標靶細胞殺滅增加、聚集程度降低及/或藥物負載更高。
在一些實施例中，連接子包含至少一個將抗體部分接合至可裂解部分的間隔子單元。在一些實施例中，連接子中之間隔子單元可包含至少一個聚乙二醇(PEG)部分。PEG部分可例如包含-(PEG)m -，其中m為1至10之整數。在一些實施例中，連接子中之間隔子單元包含(PEG)2 。在一些實施例中，不管較短連接子長度如何，相對於包含較長間隔子單元(例如(PEG)8 )之ADC，包含較短間隔子單元(例如(PEG)2 )之ADC展現更低的聚集程度及/或更高的藥物負載。
在一些實施例中，間隔子單元經由順丁烯二醯亞胺(Mal)部分連接至ADC之抗體部分。在一些實施例中，相對於包含經由替代性部分連接至抗體部分之連接子的ADC，包含經由Mal連接至抗體部分之連接子的ADC展現更高藥物負載。在一些實施例中，連接子中之Mal經由半胱胺酸殘基(例如LCcys80)接合至抗體部分。在一些實施例中，連接子中之Mal接合至抗體或抗原結合片段上輕鏈可變區之半胱胺酸殘基(例如LCcys80)。在一些實施例中，p 為2，且兩個-L-D部分連接至抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，各-L-D部分連接至抗體或抗原結合片段上輕鏈可變區之半胱胺酸殘基(例如LCcys80)。在一些實施例中，半胱胺酸殘基為LCcys80。在一些實施例中，Mal-間隔子單元包含PEG部分。在一些實施例中，連接子包含Mal-(PEG)m ，例如Mal-(PEG)2 。在一些實施例中，Mal-間隔子單元使抗體部分連接至連接子中之可裂解部分。在一些實施例中，連接子中之可裂解部分為可裂解肽部分，例如胺基酸單元。在一些實施例中，連接子包含Mal-(PEG)2 -Val-Cit。
在一些實施例中，連接子中之可裂解部分直接接合至ADC之艾日布林藥物部分，且可裂解部分直接連接至抗體部分或經由間隔子單元連接。在一些實施例中，間隔子單元亦使連接子中之可裂解部分連接至艾日布林藥物部分。在一些實施例中，使連接子中之可裂解部分連接至艾日布林藥物部分之間隔子單元為自我分解型。在一些實施例中，自我分解型間隔子能夠釋放目標細胞中之未經修飾之艾日布林。在一些實施例中，自我分解型間隔子單元包含對胺基苯甲基醇，例如對胺基苯甲氧基羰基(pAB)。在一些實施例中，連接子中之pAB將可裂解部分連接至艾日布林藥物部分。在一些實施例中，可裂解部分為可裂解肽部分，例如胺基酸單元。在一些實施例中，連接子包含Val-Cit-pAB。在一些實施例中，連接子包含Val-Cit-pAB及經由Mal將連接子接合至抗體部分之PEG間隔子單元。
在一些實施例中，p 為1至8、或2至6之整數。在一些實施例中，p 為2或6。在一些實施例中，連接子包含Mal-(PEG)2 -Val-Cit-pAB。在一些實施例中，連接子包含Mal-(PEG)2 -Val-Cit-pAB且p 為2。在一些實施例中，連接子包含Mal-(PEG)2 -Val-Cit-pAB且p 為6。
在一些實施例中，抗體部分經由包含Mal部分、PEG部分、Val-Cit及pAB之連接子結合於艾日布林藥物部分。在此等實施例中，順丁烯二醯亞胺部分將連接子藥物部分共價連接至抗體部分，且pAB充當自我分解型間隔子單元。此類連接子可稱為「Mal-VC-pAB」連接子、「Mal-VCP」、「順丁烯二醯亞胺-VCP」或「VCP」連接子、「Mal-(PEG)2 -VCP」連接子、或「Mal-(PEG)2 -Val-Cit-pAB」連接子。在一些實施例中，艾日布林藥物部分為在C-35位置共價連接之艾日布林。在一些實施例中，Mal-(PEG)2 -Val-Cit-pAB連接子之pAB連接至艾日布林藥物部分上之C-35胺。
345A12-HC15-LC4為例示性抗間皮素抗體，其包含上文在表1-10中所示之序列或由其編碼，例如包含重鏈可變區，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列。在一些實施例中，本文所揭示之ADC之抗體部分包含重鏈可變區，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列。在一些實施例中，本文所揭示之ADC之抗體部分為345A12-HC15-LC4。
在一些實施例中，本文所揭示之ADC包含345A12-HC15-LC4-VCP-艾日布林。在此等實施例中，包含345A12-HC15-LC4之抗體部分經由包含Mal-(PEG)2 -Val-Cit-pAB之連接子接合至艾日布林藥物部分。此類ADC可稱作「MORAb-109」。在一些實施例中，本文所揭示之ADC為MORAb-109。
在一些實施例中，本文所揭示之ADC為MORAb-109且具有為2之p 。在一些實施例中，當p 為2時，ADC可稱為「MORAb-109 (DAR2)」。在其他實施例中，本文所揭示之ADC為MORAb-109且具有為6之p 。在一些實施例中，當p 為6時，ADC可稱為「MORAb-109 (DAR6)」。
在各種實施例中，連接子經設計以在連接子藥物部分及/或藥物部分單獨擴散至相鄰細胞之後經由裂解促進旁觀者殺滅(相鄰細胞，例如不表現間皮素之細胞的殺滅)。在其他實施例中，連接子促進細胞內化。在一些實施例中，連接子經設計以使細胞外環境中之裂解最小化，且從而降低脫靶組織(例如非癌性組織)之毒性，同時保持結合於目標組織之ADC及不表現靶向ADC之抗體部分之抗原但包圍表現該抗原之目標癌症組織之癌組織的旁觀者殺滅。在一些實施例中，包含順丁烯二醯亞胺(Mal)部分、聚乙二醇(PEG)部分、纈胺酸-瓜胺酸(Val-Cit或「VC」)及pAB之連接子提供此等功能特徵。在一些實施例中，包含Mal-(PEG)2 -Val-Cit-pAB之連接子在接合抗體部分及艾日布林藥物部分時在提供此等功能特徵方面尤其有效。在一些實施例中，包含Mal-(PEG)2 -Val-Cit-pAB之連接子在接合抗間皮素抗體部分，諸如345A12-HC15-LC4及艾日布林藥物部分時在提供此等功能特徵中之一些或全部方面有效。
在一些實施例中，抗間皮素抗體或抗原結合片段包含本文中所揭示之序列(例如包含表1-3中所揭示之六個CDR及/或重鏈及輕鏈可變域)。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段為全長抗體。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段為單特異性抗體或抗原結合片段、雙特異性抗體或抗原結合片段，或多特異性抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段為單鏈可變片段(scFv)或Fab片段。
在一些實施例中，相對於包含替代性抗體或抗原結合片段之ADC，包含抗間皮素抗體(Ab)部分及可裂解肽部分之ADC展現較低聚集程度、改良之抗體：藥物比率、癌細胞之標靶殺滅增加、非癌細胞之脫靶殺滅減少、較高藥物負載(p)、提高細胞毒性及/或效能。在一些實施例中，ADC為式(I)之ADC： Ab-(L-D) p (I) 其中Ab為抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段能夠結合至間皮素且包含：三個重鏈互補決定區(HCDR)，其包含SEQ ID NO:1(HCDR1)、SEQ ID NO:2(HCDR2)及SEQ ID NO:3(HCDR3)之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區(HCDR)，其包含SEQ ID NO:4(LCDR1)、SEQ ID NO:5(LCDR2)及SEQ ID NO:6(LCDR3)之胺基酸序列，如藉由Kabat編號系統所定義；或三個重鏈互補決定區(HCDR)，其包含SEQ ID NO:7(CDR1)、SEQ ID NO:8(HCDR2)及SEQ ID NO:9(HCDR3)之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其包含SEQ ID NO:10(LCDR1)、SEQ ID NO:11(LCDR2)及SEQ ID NO:12(LCDR3)之胺基酸序列，如藉由IMGT編號系統所定義； D為化學治療劑(例如艾日布林)； L為將Ab共價連接至D之可裂解連接子；且p 為1至8之整數。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含人類IgG1重鏈恆定域及人類Ig κ輕鏈恆定域。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含：重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含：重鏈，其包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列；及輕鏈，其包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列。
在一些實施例中，ADC具有式(I)： Ab-(L-D) p (I) 其中： Ab為抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段能夠結合至間皮素及/或間皮素表現細胞且包含：三個重鏈互補決定區(HCDR)，其包含SEQ ID NO:1(HCDR1)、SEQ ID NO:2(HCDR2)及SEQ ID NO:3(HCDR3)之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其包含SEQ ID NO:4 (LCDR1)、SEQ ID NO:5 (LCDR2)及SEQ ID NO:6 (LCDR3)之胺基酸序列，如藉由Kabat編號系統所定義；或三個重鏈互補決定區(HCDR)，其包含SEQ ID NO:7(HCDR1)、SEQ ID NO:8(HCDR2)及SEQ ID NO:9(HCDR3)之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其包含SEQ ID NO:10(LCDR1)、SEQ ID NO:11(LCDR2)及SEQ ID NO:12(LCDR3)之胺基酸序列，如藉由IMGT編號系統所定義； D為艾日布林； L為將Ab共價連接至D之可裂解連接子；且p 為1至8之整數。
在一些實施例中，靶向間皮素及/或間皮素表現細胞之抗體或抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含人類IgG1重鏈恆定域及人類Ig κ輕鏈恆定域。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含：重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含：重鏈，其包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列；及輕鏈，其包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列。
在一些實施例中，ADC具有式(I)： Ab-(L-D) p (I) 其中： Ab為靶向間皮素及/或間皮素表現細胞之抗體或其抗原結合片段，該片段包含：三個重鏈互補決定區(HCDR)，其包含SEQ ID NO:1(HCDR1)、SEQ ID NO:2(HCDR2)及SEQ ID NO:3(HCDR3)之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其包含SEQ ID NO:4 (LCDR1)、SEQ ID NO:5 (LCDR2)及SEQ ID NO:6 (LCDR3)之胺基酸序列，如藉由Kabat編號系統所定義。或三個重鏈互補決定區(HCDR)，其包含SEQ ID NO:7(HCDR1)、SEQ ID NO:8(HCDR2)及SEQ ID NO:9(HCDR3)之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其包含SEQ ID NO:10(LCDR1)、SEQ ID NO:11(LCDR2)及SEQ ID NO:12(LCDR3)之胺基酸序列，如藉由IMGT編號系統所定義； D為艾日布林； L為包含Mal-(PEG)2 -Val-Cit-pAB之可裂解連接子；且p 為1至8之整數。
在一些實施例中，靶向間皮素及/或間皮素表現細胞之抗體或抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含人類IgG1重鏈恆定域及人類Ig κ輕鏈恆定域。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含：IgG1重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列；及Ig κ輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含：重鏈，其包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列；及輕鏈，其包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列。
在一些實施例中，ADC具有式(I)： Ab-(L-D) p (I) 其中： Ab為抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段能夠結合至間皮素且包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列；及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列； D為艾日布林； L為包含Mal-(PEG)2 -Val-Cit-pAB之可裂解連接子；且p 為1至8之整數。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含人類IgG1重鏈恆定區及人類Ig κ輕鏈恆定區。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含：重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含：重鏈，其包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列；及輕鏈，其包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列。
在一些實施例中，ADC之抗體或抗原結合片段為345A12-HC15-LC4。在一些實施例中，p 為1至8。在一些實施例中，p 為2或6。在一些實施例中，p 為2。
在一些實施例中，具有較低含量之艾日布林藥物負載(例如，p 為2)的本文所揭示之ADC(例如，包含本文所揭示之抗間皮素抗體及連接子的ADC)可將相同或類似含量之艾日布林傳遞至癌細胞或傳遞至腫瘤組織作為具有較高含量之藥物負載(例如，p 為6)的ADC。在一些實施例中，具有較低含量之藥物負載(例如p 為2)的ADC可提供與具有較高含量之藥物負載(例如p 為6)的ADC相當或更優的腫瘤生長抑制及/或活體內抗癌治療功效。
在一些實施例中，各艾日布林部分藉由可裂解連接子經由抗體或片段上之半胱胺酸殘基(例如LCcys80)接合至靶向間皮素之抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，總共兩個連接子-艾日布林部分連接至靶向間皮素之抗體或抗原結合片段，例如經由抗體或抗原結合片段上之兩個半胱胺酸殘基連接(亦即使得ADC具有DAR2)。在一些實施例中，半胱胺酸殘基為LCcys80。
用作人類治療劑，例如作為腫瘤試劑之ADC的開發及製造可能不僅僅需要鑑別能夠結合至一或多個所需目標且連接至單獨使用以治療癌症之藥物的抗體。將抗體連接至藥物可對抗體及藥物中之一者或兩者之活性具有顯著且不可預測之作用，該等作用將視抗體及/或連接子及/或所選擇藥物之類型而變化。因此，在一些實施例中，ADC之組分經選擇以(i)保持分離之抗體及藥物部分所展現的一或多種治療特性；(ii)維持抗體部分之特異性結合特性；(iii)使藥物負載及藥物與抗體比率最佳化；(iv)允許經由穩定連接將藥物部分遞送，例如胞內遞送至抗體部分；(v)保持ADC作為完整結合物之穩定性，直至轉運或遞送至目標位點；(vi)使ADC在投與之前或之後之聚集減到最少；(vii)在藥物部分於細胞環境中經歷裂解之後實現治療效果，例如細胞毒性效果；(viii)展現類似於或優於分離之抗體及藥物部分的活體內抗癌治療功效；(ix)使藥物部分引起之脫靶殺滅降至最低；及/或(x)展現所需藥物動力學及藥效學特性、可調配性及毒理/免疫譜。可能需要篩選此等特性中之各者以識別用於治療用途之經改良之ADC (Ab等人(2015) Mol. Cancer Ther. 14:1605-13)。
在一些實施例中，包含接合至化學治療劑，例如艾日布林之抗間皮素抗體或抗原結合片段的本文揭示之ADC表明所需特性之特定組合。此等特性包括但不限於藥物負載之有效含量、低聚集含量、儲存條件下及/或當在體內循環中時之穩定性(例如血清及基質穩定性)、與未結合抗體相當的對目標表現細胞的保留親和力、針對目標表現細胞之強力細胞毒性、高含量之旁觀者殺滅及/或有效的活體內抗癌活性，所有均與使用其他抗體部分之ADC相比較。在一些實施例中，即使當在具有中等抗原表現之細胞株中測試時，仍可見此等結合物之高抗癌活性，表明對ADC遞送之毒素有效負載之有效敏感性。在一些實施例中，與包含替代性抗體部分之ADC相比，包含本文揭示之抗間皮素抗體或抗原結合片段的ADC展現尤其有利的抗腫瘤細胞毒性及/或效能，以及改良的脫靶毒性及藥物代謝及藥物動力學(DMPK)曲線。在一些實施例中，相較於包含替代性抗體部分及/或結合物之ADC，包含本文揭示之人類化抗間皮素抗體及艾日布林之ADC提供出人意料有利的藥理學及毒理學特性。
本發明之ADC化合物可以將有效劑量之細胞毒性或細胞生長抑制劑選擇性遞送至癌細胞或腫瘤組織。在一些實施例中，ADC之細胞毒性及/或細胞生長抑制活性視細胞中之目標抗原表現量而定。在一些實施例中，相較於在低含量下表現相同抗原之癌細胞，所揭示之ADC在殺滅表現高含量之目標抗原之癌細胞方面特別有效。在一些實施例中，相較於在低含量下表現相同抗原之癌細胞，所揭示之ADC在中等含量下對殺滅表現目標抗原之癌細胞特別有效。在一些實施例中，所揭示之ADC在殺滅表現高或中等含量之目標抗原，諸如間皮素的癌細胞方面特別有效，其中高或中等含量為如藉由FACS染色所量測等於或大於80之平均螢光強度(MFI)。表現高或中等含量之間皮素之癌細胞的非限制性實例描述於本文中且包括例如胃癌細胞(例如NCI-N87)、卵巢癌細胞(例如OVCAR3 A1)等。其他非限制性實例提供於表25中。
例示性高間皮素表現癌症包括但不限於卵巢癌(例如漿液性卵巢癌、透明細胞卵巢癌)、胰臟癌、間皮瘤、子宮內膜癌、非小細胞肺癌(例如腺癌)及大腸直腸癌。例示性中等間皮素表現癌症包括但不限於胃癌、胸腺癌及膽管細胞癌。例示性低間皮素表現癌症包括但不限於黑素瘤及淋巴瘤。在一些實施例中，間皮素表現癌症可包括具有突變及/或耐藥性之癌症，例如KRAS/STK11突變肺癌(非小細胞肺腺癌)，例如展現對用PD-1檢查點阻斷之治療具有耐藥性的彼等突變肺癌。藥物部分
本文所描述之ADC之藥物部分(D)可為任何化學治療劑。適用類別之化學治療劑包括例如抗微管蛋白劑。在某些實施例中，藥物部分為抗微管蛋白劑。用於所描述之ADC及組合物中之一個例示性藥物部分為艾日布林。用於所描述之ADC及組合物中之另一例示性藥物部分為艾日布林二聚體。
在各種實施例中，所揭示之ADC中以其天然形式使用之艾日布林的結構如式(II)中所示：
Figure 02_image003
在各種其他實施例中，所揭示之ADC中所用之艾日布林的結構係如美國公開案第20180193478號中所示，其以引用的方式併入本文中用於所有艾日布林結構及合成彼等結構之方法。藥物負載
藥物負載可由p 表示，且在本文中亦稱為藥物與抗體比率(DAR)。藥物負載可在例如每一抗體部分1至10個藥物部分之範圍內。在一些實施例中，p 為1至10之整數。在一些實施例中，p 為1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2之整數。在一些實施例中，p 為2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4或2至3之整數。在一些實施例中，p 為1至8之整數。在一些實施例中，p 為1至6之整數。在一些實施例中，p 為2至6之整數。在一些實施例中，p 為2。在一些實施例中，p 為6。
在一些實施例中，藥物負載可受抗體部分上之連接位點數目限制。在一些實施例中，ADC之連接子部分(L)經由抗體部分上之一或多個胺基酸殘基上之化學活性基團連接至抗體部分。舉例而言，連接子可經由游離胺基、亞胺基、羥基、硫醇或羧基連接至抗體部分(例如連接至N端或C端、連接至一或多個離胺酸殘基之ε胺基、連接至一或多個麩胺酸或天冬胺酸殘基之游離羧酸基，或連接至一或多個半胱胺酸殘基之硫氫基)。連接子所連接之位點可為抗體部分之胺基酸序列中之天然殘基，或其可例如藉由DNA重組技術(例如藉由將半胱胺酸殘基引入胺基酸序列中)或藉由蛋白質生物化學(例如藉由還原、pH調節或水解)引入抗體部分中。
在一些實施例中，可結合於抗體部分之藥物部分之數目受游離半胱胺酸殘基之數目限制。舉例而言，在附接係半胱胺酸硫醇基之情況下，抗體可具有僅一個或數個半胱胺酸硫醇基，或可具有僅一個或數個具有足夠反應性之硫醇基，藉由該等硫醇基可附接連接子。一般而言，抗體不含有許多可連接至藥物部分的游離及反應性半胱胺酸硫醇基。實際上，抗體中之大部分半胱胺酸硫醇殘基參與鏈間或鏈內二硫鍵。因此，在一些實施例中，結合至半胱胺酸可能需要至少部分還原抗體。連接子-毒素與抗體之過量附接可藉由還原可用於形成二硫鍵之半胱胺酸殘基使抗體不穩定。因此，在一些實施例中，最佳的藥物:抗體比率應當增加ADC之效能(藉由增加每個抗體附接之藥物部分之數目)，同時不會使抗體部分不穩定。在一些實施例中，最佳比率可為2或6。在一些實施例中，最佳比率為2。
在一些實施例中，使用一或多種定點結合技術產生具有限定的藥物負載，亦即限定的藥物與抗體比率(DAR)的均相ADC產物。在一些實施例中，游離半胱胺酸殘基可經由殘基特異性結合技術(RESPECT)在抗體之輕鏈或重鏈中產生用於定點結合。用於產生RESPECT格式化抗體之例示性方案描述於Albone等人(2017) Cancer Biol. Ther. 18(5):347-57及國際公開案第WO/2016205618號及第WO/2017106643號中，其中之每一者以引用之方式併入本文中用於進行定點結合之方法。在一些實施例中，使用定點結合產生ADC以經由連接子(例如Mal-(PEG)2 -Val-Cit-pAB連接子)使抗體部分共價連接至藥物部分。在一些實施例中，使用定點結合靶向包含針對艾日布林藥物部分之ADC或組合物之約2之DAR。
嵌合或人類化至人類恆定區之兔子單株抗體可在輕鏈內產生不成對半胱胺酸，使得彼等殘基可用於結合(Albone等人(2017) Cancer Biol. Ther. 18(5):347-57;國際公開案第WO/2016205618號)。在一些實施例中，用於定點結合之抗體部分為RESPECT-L-格式化之抗體。本文描述例示性RESPECT-L-格式化抗體，其在輕鏈位置80處具有不成對半胱胺酸(LCcys80)。如本文所用，根據Kabat編號系統，「LCcys80」或「Cys80」係指抗體或抗原結合片段上輕鏈可變區之胺基酸位置80處的半胱胺酸殘基。舉例而言，在一些實施例中，在本文所揭示之輕鏈可變區中，LCcys80發生在胺基酸位置80處。RESPECT-L-來源之抗體可產生DAR為約2之ADC。在一些實施例中，例如使用定點結合達成約2之藥物負載及/或平均藥物負載。醫藥組合物
在一些實施例中，本發明進一步提供包含一或多種本文所揭示之抗體、抗原結合片段、結合物及/或ADC及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。在一些實施例中，本文所描述之醫藥組合物包含至少一種額外試劑。
在一些實施例中，本發明進一步提供包含本文所揭示之抗體、抗原結合片段、結合物及/或ADC之多個拷貝的醫藥組合物。在一些實施例中，本發明進一步提供包含本文所揭示之ADC之多個拷貝的醫藥組合物。在一些實施例中，組合物中之ADC之平均值p 為約1至約8。在一些實施例中，組合物中ADC之平均值p 為約2或約6。在一些實施例中，組合物中ADC之平均值p 為約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2或約2.3。在一些實施例中，組合物中ADC之平均值p 為約5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5。
在一些實施例中，醫藥組合物可進一步包含一或多種額外治療劑，例如一或多種能夠治療間皮素表現癌、類固醇及其類似物的試劑。治療性用途及治療方法
本文揭示使用所揭示之抗體、抗原結合片段、結合物、ADC及/或醫藥組合物治療個體之病症，例如腫瘤病症的方法。抗體、抗原結合片段、結合物及/或ADC可單獨或與第二治療劑組合投與，且可以醫藥學上可接受之任何調配物、劑量及給藥方案投與。可針對毒性以及功效之指標評估抗體、抗原結合片段及/或ADC治療功效且相應地調整。功效量度包括但不限於在活體外或活體內觀察到的細胞生長抑制及/或細胞毒性效果、腫瘤體積減小、腫瘤生長抑制作用及/或長時間存活期。
確定抗體、抗原結合片段及/或ADC是否對細胞發揮細胞生長抑制及/或細胞毒性作用之方法為已知的。舉例而言，抗體、抗原結合片段及/或ADC之細胞毒性或細胞生長抑制活性可藉由以下量測：在細胞培養基中暴露表現抗體、抗原結合片段及/或ADC之目標蛋白的哺乳動物細胞；培養細胞約6小時至約5天之時段；且量測細胞存活率。基於細胞之活體外分析亦可用於量測ADC之活力(增殖)、細胞毒性及對細胞凋亡之誘導(凋亡蛋白酶活化)。
對於測定抗體、抗原結合片段及/或ADC是否發揮細胞生長抑制作用，可使用胸苷結合分析。舉例而言，可將以5,000個細胞/孔之密度塗鋪於96孔盤的表現目標抗原之癌細胞培養72小時的時間，且在72小時之時段的最後8小時期間，使其暴露於0.5 μCi之3H-胸苷。在抗體、抗原結合片段及/或ADC存在及不存在下量測3H-胸苷與培養物之細胞的結合。
為測定細胞毒性，可量測壞死或細胞凋亡(計劃性細胞死亡)。壞死通常伴隨著質膜之磁導率增加；細胞膨脹及質膜破裂。細胞凋亡通常特徵在於膜起皰、細胞質凝聚及內源核酸內切酶活化。測定對癌細胞之此等作用中之任一種指示，ADC適用於治療癌症。
細胞活力可例如藉由測定細胞中諸如中性紅、錐蟲藍(trypan blue)、結晶紫或ALAMAR™藍之類染料之吸收來量測(參見例如Page等人(1993) Intl. J. Oncology 3:473-6)。在該分析中，在含有染料之培養基中培育細胞，洗滌細胞，且以分光光度法量測剩餘染料，其反映細胞對染料之吸收。在某些實施例中，使用結晶紫分析評定所製備之ADC的活體外效能及/或細胞毒性。結晶紫為在活細胞之細胞核中積聚之三芳基甲烷染料。在此分析中，細胞暴露於ADC或控制劑持續界定時間段，其後細胞用結晶紫染色，用水同時洗滌，接著用1% SDS溶解且以分光光度法讀取。亦可使用蛋白質結合染料磺醯羅丹明B (sulforhodamine B，SRB)來量測細胞毒性(Skehan等人(1990) J. Natl. Cancer Inst. 82:1107-12)。
細胞凋亡可例如藉由量測DNA斷裂來定量。用於定量活體外測定DNA斷裂之市售光學量測方法係可用的。包括TUNEL (其偵測經斷裂之DNA中經標記核苷酸之併入)及基於ELISA之分析之該等分析之實例描述於Biochemica (1999)第2期,第34-37頁(Roche Molecular Biochemicals)中。
細胞凋亡亦可藉由量測細胞之形態變化來測定。舉例而言，如同壞死，質膜完整性之損失可藉由量測對某些染料(例如螢光染料，如吖啶橙或溴化乙錠)之吸收來測定。用於量測凋亡細胞數目之方法已由Duke及Cohen, Current Protocols in Immunology (Coligan等人編(1992)第3.17.1-3.17.16頁)描述。細胞亦可用DNA染料(例如吖啶橙、溴化乙錠或碘化丙錠)標記且細胞觀測到沿內部核膜之染色體凝聚及邊聚。可經量測以測定細胞凋亡之其他形態變化包括例如細胞質凝聚、增加之膜起皰及細胞收縮。
亦可評價所揭示之ADC的旁觀者殺滅活性。旁觀者殺滅活性可以例如藉由採用一個針對目標抗原呈陽性且一個針對目標抗原呈陰性之兩個細胞株之分析測定。細胞株可經標記以區分其。舉例而言，經Nuclight™綠色(NLG)標記之目標陽性細胞及Nuclight™紅色(NLR)標記之目標陰性細胞可經共培養，用ADC處理，隨後監測細胞毒性。當將目標陰性細胞與目標陽性細胞混合時，目標陰性細胞之殺滅指示旁觀者殺滅，而在無目標陽性細胞存在下，目標陰性細胞之殺滅指示脫靶殺滅。
在一些實施例中，本發明提供一種藉由分裂微管蛋白來殺滅、抑制或調節癌細胞或組織之生長或干擾癌細胞或組織之代謝的方法。該方法可與其中破壞微管蛋白提供治療益處之任何個體一起使用。可受益於干擾微管蛋白之個體包括但不限於患有以下或處於以下風險下之個體：胃癌、卵巢癌(例如上皮卵巢癌)、肺癌(例如非小細胞肺癌)、乳癌、子宮內膜癌(例如漿液子宮內膜癌)、骨肉瘤、卡堡氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、睪丸生殖細胞癌、頭頸癌、肝癌、腎癌、尿道上皮癌、子宮癌、膽管癌、白血病(例如急性骨髓白血病)、淋巴瘤(例如，霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma))、骨髓瘤、頭頸癌、食道癌、胰臟癌、前列腺癌、腦癌(例如，神經膠母細胞瘤)、甲狀腺癌、大腸直腸癌及/或皮膚癌(例如，黑素瘤)或其任何癌轉移(Dumontet and Jordan (2010) Nat. Rev. Drug Discov. 9:790-803)。
在各種實施例中，在表現間皮素之任何細胞或組織，諸如表現間皮素之癌細胞或組織中可投與所揭示之抗體、抗原結合片段及/或ADC。例示性實施例包括抑制間皮素介導之細胞信號傳導之方法或殺滅細胞之方法。該方法可以用於表現間皮素之任何細胞或組織，諸如癌細胞或轉移性病變。表現間皮素之癌症之非限制性實例包括間皮瘤、胰臟癌(例如胰腺癌)、卵巢癌(例如漿液性卵巢癌、透明細胞卵巢癌、上皮卵巢癌)及肺癌(例如非小細胞肺癌、肺腺癌) (Wang等人(2012) PLoS ONE 7:e33214)。其他例示性間皮素癌包括子宮內膜癌、大腸直腸癌、胃癌、白血病、乳癌、子宮頸癌、頭頸癌、肝癌、前列腺癌、腎癌、甲狀腺癌、尿道上皮癌、子宮癌及膽管癌。表現間皮素之細胞之非限制性實例包括OVCAR3人類卵巢癌細胞、HEC-251人類子宮內膜樣細胞、H226人類肺鱗狀細胞間皮瘤細胞，及包含編碼間皮素或其部分之重組核酸的細胞。在一些實施例中，癌症表現較高或中等程度之間皮素。在一些實施例中，較高或中等程度之間皮素表現為等於或大於80之平均螢光強度(MFI)，如藉由FACS染色所量測。
例示性方法包括使細胞與如本文所述之抗體、抗原結合片段及/或ADC以有效量，亦即足以殺滅細胞之量接觸的步驟。該方法可用於例如活體外、活體內、離體或原位培養物中之細胞上。舉例而言，表現間皮素之細胞(例如，藉由腫瘤或轉移性病變之切片收集之細胞；來自建立之癌細胞株之細胞；或重組細胞)可在培養基中活體外培養，且接觸步驟可受將抗體、抗原結合片段及/或ADC添加至培養基影響。該方法將引起殺滅表現間皮素之細胞，尤其包括表現間皮素之腫瘤細胞。或者，抗體、抗原結合片段及/或ADC可藉由任何適合之投與途徑(例如靜脈內、皮下或與腫瘤組織直接接觸)向個體投與以在活體內具有作用。此方法亦可用於靶向其他細胞表面抗原之抗體及ADC。
所揭示之抗體、抗原結合片段及/或ADC治療性組合物之活體內效應可在適合之動物模型中評估。舉例而言，可使用異種癌症模型，其中將癌症外植體或所傳代之異種移植組織引入諸如裸小鼠或SCID小鼠之免疫受損動物中(Klein等人(1997) Nature Med. 3:402-8)。可使用量測對腫瘤形成、腫瘤消退或轉移之抑制作用的分析及類似分析量測功效。
亦可使用評估藉由諸如細胞凋亡之機制促進腫瘤死亡之活體內分析。在一些實施例中，可以檢查來自用治療性組合物治療之腫瘤攜帶小鼠的異種移植物中細胞凋亡病灶之存在且與未治療之對照異種移植物攜帶小鼠相比較。在經治療小鼠之該中發現細胞凋亡灶點之範圍提供關於該組合物治療功效之指示。
本文進一步提供治療癌症之方法。本文所揭示之抗體、抗原結合片段及/或ADC可出於治療目的而投與至非人類哺乳動物或人類個體。治療方法需要向具有腫瘤之哺乳動物投與生物學有效量之包含連接至靶向與所表現抗原結合、可獲得結合或定位於癌細胞表面上之抗體的艾日布林之抗體、抗原結合片段及/或ADC。
例示性實施例為一種將艾日布林遞送至表現間皮素之細胞的方法，其包含將艾日布林結合至免疫特異性結合至間皮素抗原決定基之抗體且使細胞暴露於抗體、抗原結合片段及/或ADC。指示本發明之抗體、抗原結合片段及/或ADC之表現間皮素之例示性腫瘤細胞包括卵巢癌細胞、子宮內膜樣細胞及肺鱗狀細胞間皮瘤細胞。
另一例示性實施例為一種減少或抑制表現目標抗原之腫瘤(例如，表現間皮素之腫瘤)之生長的方法，其包含投與治療有效量之抗體、抗原結合片段及/或ADC。在一些實施例中，該治療足以減少或抑制患者之腫瘤的生長、減少轉移性病變之數目或尺寸、減小腫瘤負荷、減小原發腫瘤負荷、降低侵襲性、延長存活時間及/或維持或改善生活品質。在一些實施例中，腫瘤在單獨投與時對用ADC之抗體或抗原結合部分治療具有抗性或難治性，及/或腫瘤在單獨投與時對用艾日布林治療具有抗性或難治性。
此外，本發明之抗體可出於獸醫學目的或作為人類疾病之動物模型投與表現間皮素之非人類哺乳動物。關於後者，此類動物模型可適用於評估所揭示之抗體、抗原結合片段及/或ADC之治療功效(例如測試投與之劑量及時程)。
本文進一步提供所揭示之抗體、抗原結合片段及/或ADC之治療性用途。亦揭示例示性實施例為抗體、抗原結合片段及/或ADC在治療表現目標抗原之癌症(例如，表現間皮素之癌症)中的用途。鑑別患有表現目標抗原(例如間皮素)之癌症的個體的方法在此項技術中已知且可用於鑑別適於用所揭示之抗體、抗原結合片段及/或ADC治療的患者。
另一例示性實施例為抗體、抗原結合片段及/或ADC在製造用於治療表現目標抗原之癌症(例如，表現間皮素之癌症)之藥劑的方法中之用途。
用於實踐前述方法之治療性組合物可以調配成包含適合於所需遞送方法的醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。例示性實施例為包含本發明之抗體、抗原結合片段及/或ADC及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。合適載劑包括在與治療性組合物組合時保持治療性組合物之抗腫瘤功能且一般不可與患者免疫系統反應之任何材料。
醫藥學上可接受之載劑包括生理上相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑，及類似物。醫藥學上可接受之載劑之實例包括水、生理鹽水、磷酸鹽緩衝生理鹽水、右旋糖、甘油、乙醇、甲磺酸鹽及其類似物以及其組合中之一或多者。在許多情況下，該組合物中包括等張劑，例如糖；多元醇，諸如甘露糖醇、山梨糖醇；或氯化鈉。醫藥學上可接受之載劑可進一步包含極少量輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑，由此可增加ADC之保存期限或有效性。
治療性調配物可經溶解且經由能夠將治療性組合物遞送至腫瘤部位之任何途徑投與。可能有效之投藥途徑包括但不限於靜脈內、非經腸、腹膜內、肌肉內、腫瘤內、皮內、器官內、原位及類似途徑。治療性蛋白質製劑可經凍乾並以無菌粉末形式例如在真空下儲存，且接著在注射之前於抑菌水(含有例如苯甲醇防腐劑)中或無菌水中復原。治療性調配物可包含抗體、抗原結合片段及/或ADC或其醫藥學上可接受之鹽，例如甲磺酸鹽。
本文所揭示之抗體、抗原結合片段及/或ADC可以約0.2 mg/kg至約10 mg/kg範圍內之劑量向有需要之患者投與。在一些實施例中，每天、兩月或其間的任何時段向患者投與抗體、抗原結合片段及/或ADC。使用前述方法治療癌症之劑量及投與方案將隨該方法及目標癌症而變化，且一般將取決於此項技術中所理解之多種其他因素。
各種遞送系統為已知的且可用於投與一或多種本發明之抗體、抗原結合片段及/或ADC。投與抗體、抗原結合片段及/或ADC之方法包括但不限於非經腸投與(例如皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內及皮下)、硬膜外投與、腫瘤內投與及黏膜投與(例如鼻內及經口途徑)。另外，可採用例如藉由使用吸入器或噴霧器及具有氣霧劑之調配物進行之經肺投與。參見例如美國專利第6,019,968號、第5,985,320號、第5,985,309號、第5,934,272號、第5,874,064號、第5,855,913號、第5,290,540號及第4,880,078號；以及國際公開案第WO 1992/019244號、第WO 1997/032572號、第WO 1997/044013號、第WO 1998/031346號及第WO 1999/066903號中所描述的用於經肺投與之組合物及方法。ADC可藉由任何便利途徑投與，例如藉由輸注或推注注射或藉由經上皮或黏膜皮膚內層(例如口腔黏膜、直腸及腸黏膜等)吸收。投與可為全身或局部的。
本文所揭示之治療性組合物可在製造及儲存條件下無菌且穩定。在一些實施例中，一或多種抗體、抗原結合片段及/或ADC或醫藥組合物係以乾燥滅菌凍乾粉末或無水濃縮物形式提供於氣密密封式容器中且可復原(例如用水或生理鹽水)成適當濃度以向個體投與。在一些實施例中，預防劑或治療劑或醫藥組合物中之一或多種係以至少5 mg、至少10 mg、至少15 mg、至少25 mg、至少35 mg、至少45 mg、至少50 mg、至少75 mg或至少100 mg、或其間任何量之單位劑量，以乾燥無菌凍乾粉末形式提供於氣密密封式容器中。在一些實施例中，凍乾抗體、抗原結合片段及/或ADC或醫藥組合物以2℃與8℃之間儲存於初始容器中。在一些實施例中，本文所描述之抗體、抗原結合片段及/或ADC或醫藥組合物中之一或多者以液體形式供應於氣密密封式容器，例如指示試劑之量及濃度之容器中。在一些實施例中，液體形式的所投與之組合物係以至少0.25 mg、至少0.5 mg/mL、至少1 mg /mL、至少2.5 mg/mL、至少5 mg/mL、至少8 mg/mL、至少10 mg/mL、至少15 mg/mL、至少25 mg/mL、至少50 mg/mL、至少75 mg/mL或至少100 mg/mL ADC提供於氣密密封式容器中。液體形式可以在原始容器中在2℃與8℃之間儲存。
在一些實施例中，所揭示之抗體、抗原結合片段及/或ADC可併入適於非經腸投與之醫藥組合物中。可注射溶液可以由在弗林特(flint)或琥珀色小瓶、安瓿或預填充注射器、或其他已知之遞送或儲存裝置中之液體或凍乾劑型構成。
本文所描述之組合物可呈多種形式。此等形式包括例如液體、半固體及固體劑型，諸如液體溶液(例如可注射溶液及可輸注溶液)、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、粉劑、脂質體及栓劑。該形式取決於預期之投與模式及治療性應用。
在各種實施例中，治療涉及經由可接受之投與途徑單次推注或重複投與抗體、抗原結合片段及/或ADC製劑。
可針對給定樣品中目標抗原之含量(例如表現目標抗原之細胞之含量)對患者進行評估以便幫助確定最有效之給藥方案等。例示性實施例為一種確定患者是否對用本發明之抗體、抗原結合片段及/或ADC治療起反應之方法，其包含提供來自患者之生物樣品及使生物樣品與抗體、抗原結合片段及/或ADC接觸。例示性生物樣品包括組織或體液，諸如炎性滲出物、血液、血清、腸液、糞便樣品或腫瘤切片(例如源自患有具有以下或處於以下風險下之患者的腫瘤切片：表現目標抗原之癌症，例如表現間皮素之癌症)。在一些實施例中，樣品(例如組織及/或體液)可獲自個體，且適合之免疫方法可用於偵測及/或量測目標抗原(例如間皮素)之蛋白表現。此類評價亦在整個療法用於監測目的，且可用於測量治療成功性並評價其他參數。
在一些實施例中，抗體、抗原結合片段及/或ADC之功效可藉由使來自個體之腫瘤樣品與抗體、抗原結合片段及/或ADC接觸及評估腫瘤生長速率或體積來評估。在一些實施例中，當已確定抗體、抗原結合片段及/或ADC有效時，可向個體投與抗體、抗原結合片段及/或ADC。
以上治療方法可以與多種額外手術、化學療法或放射療法方案中之任一組合。在一些實施例中，本文所揭示之抗體、抗原結合片段及/或ADC或組合物與一或多種其他治療劑，例如一或多種化學治療劑共調配及/或共投與。化學治療劑之非限制性實例包括烷基化劑，例如氮芥(nitrogen mustard)、伸乙亞胺化合物及磺酸烷基酯；抗代謝物，例如葉酸、嘌呤或嘧啶拮抗劑；抗有絲分裂劑，例如抗微管蛋白劑，諸如艾日布林或甲磺酸艾日布林(Halaven™)、長春花生物鹼(vinca alkaloid)及奧瑞他汀(auristatin)；細胞毒性抗生素；損害或干擾DNA表現或複製之化合物，例如DNA小溝結合劑；以及生長因子受體拮抗劑。在一些實施例中，化學治療劑可以為細胞毒性或細胞生長抑制劑。細胞毒素劑之實例包括但不限於抗有絲分裂劑，諸如艾日布林或甲磺酸艾日布林(Halaven™)、奧瑞他汀(例如單甲基奧瑞他汀E(MMAE)、單甲基奧瑞他汀F(MMAF)、類美登素(例如美登素)、海兔毒素、倍癌黴素、念珠藻環肽、長春花生物鹼(例如長春新鹼、長春鹼)、紫杉烷、紫杉醇及秋水仙鹼；蒽環黴素(例如道諾黴素、小紅莓、二羥基蒽二酮)；細胞毒性抗生素(例如絲裂黴素、放射菌素、倍癌黴素(例如CC-1065)、金黴素、杜黴素、卡奇黴素、內胞黴素、酚黴素)；烷基化劑(例如順鉑(cisplatin))；插入劑(例如溴化乙錠)；拓樸異構酶抑制劑(例如依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide))；放射性同位素，諸如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212或213、P32及鎦之放射性同位素(例如Lu177)；及細菌、真菌、植物或動物來源之毒素(例如蓖麻毒素(例如蓖麻毒素A鏈)、白喉毒素、綠膿桿菌外毒素A(例如PE40)、內毒素、有絲分裂素、康普瑞汀(combrestatin)、侷限麴菌素、白樹素、α-帚麴菌素、相思子毒素(例如相思子毒素A鏈)、莫迪素(例如莫迪素A鏈)、麻瘋樹逆境蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、糖皮質激素)。
本文亦揭示所揭示之抗體、抗原結合片段及/或ADC中之一或多者在製造用於例如根據上文所描述之方法治療癌症之藥劑中的用途。在一些實施例中，使用本文所揭示之ADC，例如根據以上所描述之方法治療癌症。
在各種實施例中，用於本文所描述之實驗室及治療應用之套組係在本發明之範圍內。此類套組可以包含載劑、包裝或經分隔以接納一或多個容器諸如小瓶、管及類似物之容器，每個容器包含擬用於本文所揭示之方法中之獨立成分之一，以及包含使用說明書，諸如本文所描述之用途之標籤或插頁。套組可包含容器，該容器包含藥物部分。本發明亦提供包裝在指示試劑之數目的氣密密封式容器，諸如安瓿或藥囊中之一或多種抗體、抗原結合片段及/或ADC或其醫藥組合物。
套組可包含上文所描述之容器及與其相聯之一或多個其他容器，該一或多個其他容器包含自商業及使用者觀點看合乎需要之材料，包括緩衝劑、稀釋劑、過濾劑、針、注射器；列舉內容物及/或使用說明書之載架、封裝、容器、小瓶及/或套管標籤；及具有使用說明書之藥品說明書。
標籤可存在於容器上或與容器一起存在以容器該組合物係用於特定療法或非治療性應用，諸如預後、預防、診斷或實驗室應用。標籤亦可指示關於活體內或活體外用途，諸如本文所述之用途的指導。在插頁或標籤上亦可包括指導及或其他資訊，該插頁或標籤係包括在套組中或之上。標籤可位於容器之上或與容器相聯。當將形成標籤之字母、數字或其他字符模製或蝕刻至容器自身中時，標籤可在容器上。當標籤存在於亦固持容器之貯器或載體其內時，標籤可例如以封裝插頁形式與容器相關。標籤可指示該組合物係用於診斷或治療病狀，諸如本文所描述之癌症。
熟習此項技術者將易於瞭解，本文所描述之本發明之方法的其他適合之修改及改編顯而易見且可在不脫離本發明之範疇或本文中所揭示之實施例的情況下使用適合等效物進行。現已詳細描述本發明，參考以下實例將更清楚地理解本發明，該等實例僅出於說明之目的包括在內且並不意欲為限制性的。實例 實例1：針對人類間皮素之嵌合抗體產生
含有兔子及人類免疫球蛋白序列之嵌合抗體根據下文所描述之程序產生。分析抗體與人類間皮素之結合及抗原決定基結合。在表現不同程度之間皮素的人類細胞株中評價重組嵌合抗間皮素抗體的初始ADC細胞毒性。用於人類化及ADC研發之主要抗體描述於實例2-3中。 1.1  試劑及材料  1.1.1    抗體
用於以下研究中之抗體為兔子人類嵌合(-xi)形式之抗人類間皮素抗體且在輕鏈位置80處具有不成對半胱胺酸(LCcys80)。如下文在章節1.5中所述純化及去半胱胺酸化抗體。藉由BCA分析及SDS-PAGE評估最終蛋白質含量。 1.1.2    可結合細胞毒素及LCcys80 ADC
用於以下研究中之連接子-細胞毒素化合物包括Mal-PEG2 -奧瑞他汀F。抗體與Mal-PEG2 -奧瑞他汀F以1:5(mAb:有效負載)莫耳比結合。在AKTA FPLC上使用2x5 mL HiTrap去鹽管柱(GE Healthcare)的去鹽層析純化可結合的LCcys80抗體，使用1X DPBS作為操作緩衝液。最終蛋白質含量藉由BCA分析測定。 1.1.3    腫瘤細胞株
用於分析兔子-人類嵌合ADC之人類腫瘤細胞株包括A431-K5(經人類間皮素穩定轉染之人類黑色素瘤細胞A431，MSLNhi )、A431(MSLNlo )及OVCAR3(人類卵巢癌，MSLNhi )。A431-K5細胞獲自國家癌症研究所。直接自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)獲得所使用之細胞株。 1.1.4    其他試劑
除非另外指明，否則所有所用試劑均以研究級別或更高級別購自商業供應商。 1.2 在針對人類間皮素之兔子中產生抗體
將來自載體p0301之人類間皮素cDNA選殖至Aldevron表現載體(pB8-間皮素-hum)中。隨後用免疫載體pB8-間皮素-人類免疫兩隻兔子。在四次遺傳應用之後，在免疫接種方案之第52天獲得免疫血清。兔子免疫血清在含有1% BSA之PBS中以1:1000或1:5000稀釋，且藉由流式細胞術使用以下來測試：選殖至Aldevron表現載體(pB1-間皮素-hum)中之預先用人類間皮素cDNA短暫轉染之哺乳動物細胞及選殖至相同載體中之用不相關cDNA短暫轉染之哺乳動物細胞。接著用10 μg/mL山羊抗兔子IgG R-藻紅素(Southern Biotech, #4030-09)偵測來自免疫血清之抗體。免疫接種、流式細胞量測術及低溫保存細胞藉由Aldevron (Dreiburg, Germany)進行。 1.3 產生抗間皮素抗體之培養物的高通量篩選  1.3.1    細胞培養
將冷凍保存之兔子淋巴結細胞(2.0×107 個細胞)解凍，隨後用2.5 μg/mL來自Phytolacca americana之凝集素活化且在37℃下在5% CO2 下用DNA酶I回收一小時。細胞以每孔5個細胞用飼養細胞(表現表現CD154之CHO)接種在384孔盤上，且在含有10.5 ng/mL人類IL2及10.5 ng/mL人類IL21細胞介素(PeproTech)之完整IMDM(IMDM補充有10% FBS、2 mM L-麩醯胺酸、1×MEM NEAA、1 mM丙酮酸鈉、50 U/mL青黴素、50 μg/mL鏈黴素、55 μM 2-Me)中培養。 1.3.2    分離針對人類間皮素之兔子IgG及多株抗體
在第2週，藉由使用銪穴狀化合物之IgG FRET鑑別產生兔子IgG抗體之孔。藉由ELISA針對塗佈有1 μg/mL CHO-MT40間皮素之盤篩選產生IgG之孔的兔子IgG Fcγ抗體之存在。藉由針對1 μg/mL間皮素之ELISA篩選及針對1 μg/mL CD73-his之相反篩選來證實產生間皮素特異性兔子IgG之培養物。FRET及ELISA在Biomek® FX機器系統(Beckman)上進行。 1.3.3    針對人類間皮素之兔子抗體的mRNA基因拯救
使用RNAqueous™-96總RNA分離套組(Ambion)自產生兔子IgG抗間皮素抗體之孔分離總RNA。合成cDNA且藉由PCR使用鉑Taq一步法RT-PCR套組(Invitrogen)使用內部引子擴增輕鏈及重鏈可變區(表11)。使用鉑Taq擴增套組及熱循環儀(40個循環，1分鐘94℃，1分鐘54℃，1.5分鐘68℃)，用嵌套引子擴增輕鏈及重鏈可變區(表12)。藉由凝膠電泳觀測擴增之DNA模板，藉由QIAquick 96 PCR純化套組(Qiagen)純化，且藉由GeneWiz(South Plainfield，NJ)，使用內部引子測定DNA序列(表13)。針對V基因及J基因兔子家族(IMGT/V-QUEST)且針對內部In-Fusion引子資料庫(Blastn)分析DNA序列。In-Fusion引子(表14)經識別或設計為含有添加至用於V及J基因引子之5'端之人類Fc連接子。引子藉由IDT(Coralville, IA)合成。表 11. 用於一步法 RT-PCR 之引子序列
基因 5'引子 3'引子
重 TYCTCCTGGTCRCTSYGCTC (SEQ ID NO: 37) TTGGTGTTGGTGGCTGGGTG (SEQ ID NO: 38)
輕 GGGCCCCCACTCAGCTGCTG (SEQ ID NO: 39) GTTBTACTGKTMTYGATGCC (SEQ ID NO: 40)
表 12. 用於 PCR 之引子序列
基因 5'引子 3'引子
重 TYCTCCTGGTCRCTSYGCTC (SEQ ID NO: 41) TTGGTGTTGGTGGCTGGGTG (SEQ ID NO: 42)
輕 ACTCAGCTGCTGGGGCTCCT (SEQ ID NO: 43) GTTBTACTGKTMTYGATGCC (SEQ ID NO: 44)
表 13. 用於 DNA 模板測序之引子序列
基因 3'引子
重 TTGGTGTTGGTGGCTGGGTG (SEQ ID NO: 45)
輕 GTTBTACTGKTMTYGATGCC (SEQ ID NO: 46)
表 14. 用於樣品 345A12 之 In-Fusion PCR 之引子序列
基因 5'引子 3'引子
重 gccaccggcgtgcactccCAGTCGYTGGAGGAGTCCGGGGG (SEQ ID NO: 47) gggcccttggtggatgcTGARGAGACRGTGACSAGGGTSCC (SEQ ID NO: 48)
輕 gccaccggcgtgcactccGCCTATGATATGACCCAGACTCCA (SEQ ID NO: 49) agccacagttcgTTTGACSACCACCTCGGTCCC (SEQ ID NO: 50)
1.3.4    PCR片段
PCR擴增可變域在與次選殖載體內之選殖位點同源之5'及3'端包括15個鹼基對。根據製造商之方案，使用In-Fusion HD選殖套組(Clontech)將PCR片段次選殖至含有人類γ(p1974 pC+75IZ-ldr-InFusion-huγ)或κ恆定區(p1975 pC+75IB-ldr-InFusion-huκ)之表現質體中。根據製造商之方案，將1 μL In-Fusion反應物轉變成Stellar勝任細胞(Clontech)。在微量滴定盤震盪器上在37℃下在1 mL TB培養基(Teknova)中使轉化體生長隔夜。第二天，根據製造商之方案使用epMotion 5075，培養物藉由QIAprep 96 Turbo小規模純化套組(Qiagen)來小規模純化。 1.3.5    基因合成片段
人類化重及輕可變域經密碼子優化用於在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表現且藉由基因技術合成。可變域合成為有Kozak轉譯起始序列及Ig分泌前導序列，且在與次選殖載體內之選殖位點同源的5'及3'端處包括15個鹼基對。使用In-Fusion HD選殖套組(Clontech)將藉由基因技術合成之PCR片段次選殖至含有人類γ(p1974 pC+75IZ-ldr-InFusion-huγ)或κ恆定區(p1975 pC+75IB-ldr-InFusion-huκ)之表現質體中。對所有純系測序以證實插入序列之存在及保真性。 1.4 瞬時mAb產生  1.4.1    HEK細胞
對於各毫升3×106 個待經ExpiFectamine (ThermoFisher)轉染之細胞，將333.3 ng HC質體及333.3 ng LC質體於50 μL Opti-MEM (ThermoFisher)中培育5-10分鐘。同樣，將2.67 μL ExpiFectamine於50 μL Opti-MEM中培育。將ExpiFectamine溶液添加至DNA混合物且在室溫下培育20-30分鐘。在渦旋的同時將DNA:ExpiFectamine混合物添加至細胞且在37℃，8% CO2 ，125 rpm震盪下培育。第二天，添加5 μL強化子1及50 μL強化子2/mL細胞至轉染，其中再繼續培育7-10天。在48-72小時之後，以10 g/L酵母提取物(BD Biosciences)、5 mM戊酸(Sigma-Aldrich)及1:100 CD脂質濃縮物(ThermoFisher)之最終濃度饋入細胞。 1.4.2    CHO細胞
對於各毫升6×106 個待經ExpiFectamine CHO (ThermoFisher)轉染之細胞，將500 ng HC質體及500 ng LC質體混合於40 μL總體積中之Opti-PRO(ThermoFisher)中。同樣，在36.8 μL Opti-PRO中混合3.2 μL ExpiFectamine CHO。將ExpiFectamine CHO溶液添加至DNA混合物且在室溫下培育1-5分鐘。在渦旋的同時將DNA:ExpiFectamine CHO混合物添加至細胞且在37℃，8% CO2 ，125 rpm震盪下培育。第二天，添加6 μL強化子及160 μL進料/mL細胞至轉染，且將細胞轉移至32℃，5% CO2 。在第5天，添加額外160 μL進料/mL細胞。在第12至14天，收集上清液。 1.5 mAb純化及去半胱胺酸化  1.5.1    抗體純化
用DPBS使Prosep-vA高容量蛋白A樹脂(Millipore)平衡，且將50 μL添加至2 mL樣品中。在於室溫下培育1小時之後，將培養基及樹脂添加至過濾盤且用1 mL DPBS洗滌兩次。藉由添加400 μL 0.1 M甘胺酸，pH 2.9使樣品自樹脂溶離，隨後在15,000×g下進行離心30秒。用20 μL 1 M Tris，pH 8.0中和樣品。藉由使用0.5 mL Amicon Ultra，10k截止過濾器(Millipore)在15,000×g下離心5分鐘將樣品濃縮至約100 μL，且根據製造商之方案使用0.5 mL Zeba脫鹽管柱，7K MWCO緩衝交換至DPBS中。mAb濃度藉由量測AU280來測定且使用mAb之消光係數轉化成mg/mL。 1.5.2    半胱胺酸去封端
使用AKTA Xpress純化平台(GE Healthcare)進行純化。將多達1 L改良性培養基負載至於20 mM磷酸鈉、150 mM NaCl，pH 7.0中平衡之5 mL MabSelect管柱(GE Healthcare)上。在負載之後用平衡緩衝液充分洗滌管柱直至觀測到穩定基線。使用100 mM甘胺酸，pH 2.9溶離結合之物質。將溶離之物質立即注射至於1×磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)中平衡之26/10 HiPrep脫鹽管柱(GE Healthcare)上，且於相同緩衝液中溶離。彙集峰溶離份。材料藉由BCA分析(ThermoFisher)及藉由還原及非還原SDS-PAGE之電泳分析蛋白質含量。 1.6 用於ADC研發之重組嵌合抗間皮素抗體的初始篩選及表徵
使用Expi-293培養基暫時表現抗間皮素抗體且在96深孔培養盤中培養。如上文所述純化及去半胱胺醯化來自上清液之抗體。使用1:5(mAb:有效負載)莫耳比，抗體與使用Mal-PEG2 -奧瑞他汀F作為有效負載結合。使用Thermo Zeba旋轉脫鹽盤使結合抗體脫鹽以移除超游離有效負載。 1.7 結合表徵  1.7.1    使用Octet之抗間皮素抗原決定基分組
首先使用定製結合分析用抗生蛋白鏈菌素尖端使用Octet表徵將抗原決定基結合至間皮素之抗體。將結合抗間皮素抗體之抗原決定基相對於由已知抗間皮素抗體MORAb-009(阿瑪西單抗(Amatuximab))結合之抗原決定基標準化。抗體基於其與作為MORAb-009之相同、鄰近或不同抗原決定基的結合而分組。重複步驟直至所有抗體與不同抗原決定基分組比對為止。基於Octet結果，結合親和力排列為高、中等及低。所有結合步驟在含有0.2% BSA之PBST緩衝液中進行。 1.7.2    表面電漿子共振(BIAcore)結合分析
抗間皮素抗體對間皮素之結合親和力係藉由BIAcore(BIAcore T-100, GE healthcare, #1426075)使用一系列S CM5晶片來量測。將抗體濃度在1×HBS-P+緩衝液(GE Healthcare)中調節至1 μg/mL且將間皮素(50 μg)調節至100 nM。根據製造商之方案使用具有固定嚮導之CM5晶片製備抗人類抗體捕捉晶片。在HBS-P+中，最終捕捉抗體水準為8000-9000 RU。製備晶片用於分析，其中五個循環為300秒緩衝液注射，接著為30秒再生，所有循環均在30 µL/min下跨越所有四個流動池。藉由以10 µL/min依序注射個別配體溶液90秒，在流動池2-4上捕獲抗體。以單一循環動力學方式如下進行分析物注射：各自以30 µL/min依序注射自低變高濃度之分析物溶液240秒。偵測為2-1、3-1、4-1。藉由相同配體捕捉注射之序列進行雙重參考，隨後各自進行5次僅緩衝液注射持續240秒，解離1800秒且如上所述再生。一式兩份地分析所有配體與間皮素之結合。使用BIAEvaluations軟體使用1:1 Langmuir擬合模型進行動力學分析。自重複操作平均化締合速率、解離速率及親和力常數。 1.8 活體外細胞毒性分析
繼代培養A431、A431-K5及OVCAR3細胞且以5,000個細胞/孔接種於96孔組織培養盤中之完全生長培養基中，且在37℃，5% CO2 下培育隔夜(16小時)。以200 nM起始，在2 mL深孔稀釋盤中以1:3連續稀釋測試試劑(總共10個稀釋液)。將經稀釋之樣品(100 µL)添加至細胞培養盤中(以100 nM之測試樣品之起始濃度)。在37℃，5% CO2 下再培育培養盤5天。接著丟棄培養基，且將盤用200 µL DPBS洗滌一次，在室溫下用50 µL之0.2%結晶紫溶液染色15 min，且隨後用自來水充分洗滌。將培養盤風乾，且用200 µL 1% SDS溶液溶解結晶紫。在570 nm下讀取培養盤。使用GraphPad Prism 6分析資料。 1.9 結果  1.9.1    兔子免疫接種
兩個兔子用質體pB8-間皮素-人類進行DNA免疫以用於四個遺傳應用。在免疫方案之第52天獲得免疫血清，在含有1% BSA之PBS中以1:1000或1:5000稀釋，且使用表現間皮素之細胞藉由流式細胞量測術測試。來自兩個經免疫兔子之血清結合表現間皮素之細胞，該等細胞為經pB1-中間皮素-hu轉染之細胞(圖1，下部曲線)。反之，來自經免疫兔子之血清不結合經不相關cDNA轉染之細胞(圖1，上部曲線)。 1.9.2    產生針對人類間皮素之兔子多株抗體之培養物的高通量篩選
收集兔子淋巴結細胞且低溫保存。將來自解凍淋巴結之細胞(2×107 個細胞)用飼養細胞以5個細胞/孔接種於384孔盤上，且在含有10.5 ng/mL人類IL-2及10.5 ng/mL人類IL-21細胞介素之完整IMDM中培養。在經由IgG FRET使用銪穴狀化合物接種之後兩週鑑別產生兔子IgG抗體之孔，且18,715 IgG產生培養物藉由ELISA針對人類間皮素反應性篩選。針對間皮素之反應性重新確認第八十五個間皮素特異性培養物，且針對人類CD73之反應性進行相反篩選。存在54個產生兔子Fcγ抗體之培養物，該抗體結合超過0.2 OD450 之間皮素，對CD73無交叉反應性(圖2)。初級ELISA結果顯示為最右組條形圖，二級ELISA結果顯示為最右組條形圖，且人類CD73結合藉由一組條形圖顯示。 1.9.3    可變區之RT-PCR、定序及選殖
自產生兔子IgG抗間皮素抗體之54個確認培養物分離總RNA，藉由RT-PCR合成cDNA，且對輕鏈及重鏈可變區進行PCR擴增。使用V基因及J基因兔子家族(IMGT/V-QUEST)分析五十二個DNA序列且用對選殖至恆定區表現載體中之In-Fusion具有特異性之引子對51進行PCR擴增(圖3)。將總共48種抗體選殖至人類恆定區表現載體中且隨後轉染至expi293F細胞中。在51個轉染物之45個中偵測到抗體(圖4)，將兔子可變區經In-Fusion選殖至人類恆定區表現載體中。 1.9.4    針對表現間皮素之細胞之ADC的初始篩選
根據章節1.5中所描述之方法純化嵌合兔子抗人類間皮素(rb-hu-xi抗-MSLN)抗體。測定經純化抗體之蛋白質濃度(圖5)。為了完成針對ADC發展之抗間皮素抗體的篩選，進行抗間皮素抗體與Mal-PEG2 奧瑞他汀F的微小結合，且ADC之特徵在於使用OVCAR3、A431-K5及A431細胞株之基於活體外細胞之效能分析，其中OVCAR3及A431-K5表現高程度之間皮素，且將A431(MSLN- )用作用於評估ADC之脫靶殺滅及特異性的對照細胞株(圖6)。 1.9.5    抗間皮素抗體之抗原決定基結合
48種抗間皮素抗體之間皮素的結合抗原決定基使用Octet表徵，如章節1.7.1中所指示。針對抗體鑑別六種不同抗原決定基，且102A6在當前型式中藉由Octet未觀測到結合(圖7)。如章節1.7.2中所指示，藉由BIAcore量測與間皮素之抗體結合親和力。結合親和力結果概述於表15中。表 15. 與間皮素之抗間皮素抗體結合親和力
抗原決定基組 曲線 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Rmax (RU) Chi ² (RU ² )
   M09-3 1.95E+06 2.92E-04 1.50E-10 40.19 0.646
   55B4-1 1.67E+06 8.32E-03 4.98E-09 42.33 1.72
   55B4-2 1.04E+06 5.52E-03 5.33E-09 42.6 0.586
MORAb-009 62B10-1 2.10E+06 8.57E-03 4.08E-09 47.6 3.54
   62B10-2 9.91E+05 6.71E-03 6.77E-09 46.58 0.398
   131F9-1 8.36E+05 7.23E-03 8.65E-09 48.89 0.458
   131F9-2 8.71E+05 6.79E-03 7.79E-09 48.71 0.639
   145D4-1 8.05E+05 6.83E-03 8.48E-09 50.61 0.489
   145D4-2 8.69E+05 6.90E-03 7.95E-09 51.21 0.681
   342P20-1 1.74E+06 2.27E-04 1.30E-10 29.15 0.498
   342P20-2 2.32E+06 2.51E-04 1.08E-10 27.51 0.447
   Xi-33O11 1.99E+06 6.68E-04 3.35E-10 35.89 0.169
   43F8-1 7.10E+05 6.37E-03 8.97E-09 35.29 0.48
#1 43F8-2 7.77E+05 5.82E-03 7.48E-09 36.43 0.78
   201C15-1 2.74E+05 1.29E-04 4.70E-10 63.95 0.75
   201C15-2 2.64E+06 3.45E-04 1.31E-10 58.09 0.568
   X-237N18 1.27E+06 4.28E-03 3.38E-09 41.45 0.295
   Xi-393L14 1.10E+06 2.57E-04 2.33E-10 46.47 0.627
#3 Xi-383I18(AuF) 1.01E+06 2.81E-04 2.80E-10 43.9 0.494
   346C6-1 6.82E+05 4.81E-04 7.06E-10 44.85 0.218
   346C6-2 1.15E+06 6.09E-04 5.29E-10 45.06 0.503
   345A12-1 2.89E+06 4.12E-04 1.43E-10 39 0.793
#5 345A12-2 2.85E+06 3.89E-04 1.36E-10 38.63 0.833
   120N18-1 6.26E+05 5.26E-04 8.41E-10 50.28 0.323
   120N18-2 6.57E+05 5.13E-04 7.80E-10 50.89 0.395
   82M2-1 7.18E+05 4.35E-04 6.06E-10 47.12 0.493
#6 82M2-2 8.98E+05 4.74E-04 5.28E-10 48.64 0.961
M09/#2 264E24-1 4.01E+05 5.81E-05 1.45E-10 48.8 0.347
hybrid 264E24-2 4.10E+05 5.47E-05 1.34E-10 49.33 0.423
M09/#3 238B22-1 2.60E+05 3.03E-03 1.17E-08 153.1 6.95
hybrid 238B22-2 4.31E+05 6.03E-03 1.40E-08 57.04 0.318
基於以上結果，選擇覆蓋所有抗原決定基組之十五個抗體用於擴大結合及表徵，如表16中所指示。當與奧瑞他汀F結合時，亦基於有利的活體外效能選擇102A6A。表 16. 十五個經選擇之抗間皮素抗體及其抗原決定基組
抗原決定基組 主要抗體
組#1 33O11、210C15
組#2 111B10、324O5、178F16、264E24
組#3 237N18、383I18、393L14、346C6
組#4 62B10、55B4、MORAb009
組#5 120N18、345A12
未結合 102A6A
實例2：抗間皮素ADC之人類化
根據下文所述之程序產生人類化抗間皮素抗體。分析抗體及ADC對人類間皮素之保留的結合活性及對表現間皮素之細胞的細胞殺滅能力。亦針對藥物負載、聚集、熱穩定性及血清及基質穩定性對抗體進行生物物理學表徵。如實例3中所述，活體內評價主要人類化抗體及ADC。 2.1 試劑及材料  2.1.1    抗體
用於以下研究之抗體具有輕鏈位置80處之不成對半胱胺酸(LCcys80)且包括兔子-人類嵌合(-xi)及人類化(-zu)形式之抗人類間皮素抗體33O11、201C15、111B10、324O5、178F16、264E24、237N18、383I18、393L14、346C6、62B10、55B4、MORAb009、120N18、345A12及102A6A2。使用Prosep-vA高容量蛋白A樹脂及Zeba去鹽管柱分批純化抗體。如章節1.5中所述，純化及去半胱胺酸化改良性培養基(實例1)。經由BCA分析及SDS-PAGE評估最終蛋白質含量。 2.1.2    可結合細胞毒素及LCcys80 ADC
以下研究中使用之連接子-細胞毒素化合物包括順丁烯二醯亞胺-VCP-艾日布林、順丁烯二醯亞胺-VCP-念珠藻素及順丁烯二醯亞胺-VCP-艾日布林二聚體。用在1×DPBS中平衡之HiTrap去鹽管柱(GE Healthcare)使用去鹽層析純化結合抗體。最終蛋白質含量藉由BCA分析測定。 2.1.3    腫瘤細胞株
用於分析兔子-人類嵌合ADC之人類腫瘤細胞株包括A431(人類黑色素瘤細胞，MSLNneg )、A3(用人類間皮素穩定轉染之A431、MSLNhi )、OVCAR3(人類卵巢癌細胞，MSLNhi )、HEC-251(人類子宮內膜樣，MSLNmed )及H226(人類肺鱗狀細胞間皮瘤，MSLNlo )。所使用之所有細胞株均直接獲自美國菌種保藏中心(ATCC)，除了A3外，其在Morphotek處自A431親本細胞株及HEC-251產生，自JCRB獲得。 2.1.4    其他試劑
除非另外指明，否則所有所用試劑均以研究級別或更高級別購自商業供應商。 2.2 ADC之生物物理學表徵  2.2.1    SEC-HPLC聚集分析
使用Agilent 1200 HPLC系統進行SEC-HPLC分析。將AdvanceBio SEC 300A (2.7 µm, 7.8×50 mm,序列號0006344424-13,批次號0006344424)保護管柱連接至AdvanceBio SEC 300A分析管住(2.7 µm, 7.8×300 mm,序列號0006336837-4,批次號0006336837)，在0.1 M磷酸鈉、0.15 M氯化鈉、5% IPA，pH 7.4中以0.5 mL/min之流動速率平衡。
藉由使用Agilent 1200 HPLC進行尺寸排外、高效液相層析(SEC-HPLC)來分析LCcys80 ADC之聚集。抗體及ADC係在1×DPBS中以2 mg/mL製備，注射8 µL(16 µg)之各樣品且運作36 min。使用Agilent ChemStation軟體分析所有資料。報導聚集百分比、單體百分比及片段化百分比。 2.2.2    疏水相互作用層析(HIC-HPLC) DAR分析
在Agilent HPLC 1260系統上使用疏水相互作用層析(HIC-HPLC)分析DAR。將樣品注射至TSKgel乙基-5PW管柱(TOSOH Bioscience，7.5 mm ID×7.5 cm，10 µm，無孔尺寸)上，且藉由100%移動相A之平衡3分鐘、15分鐘梯度(0-100% B)、在100% B中保持5分鐘、改變1分鐘至100% A及在100%移動相A中再平衡5分鐘以0.7 mL/min自管柱溶離。移動相A為25 mM磷酸鈉、1.5 M硫酸銨，pH 7.0。移動相B為25 mM磷酸鈉、25%異丙醇，pH 7.0。在280 nm(參考320 nm)下進行偵測。藉由下式測定DAR： [AUC+1 + 2(AUC+2) + 3(AUC+3) +…n(AUC+n)]/ΣAUCtot] 其中AUC+1為對應於與一種細胞毒素結合之ADC的抗體峰之曲線下面積，且AUC+2為對應於與兩種細胞毒素結合之ADC的抗體峰之曲線下面積。ΣAUCtot為結合及未結合峰之組合的曲線下面積(DAR=0、1及2)。 2.2.3    液相層析/質譜(LC-MS) DAR分析
DAR亦使用具有SQD/PDA偵測之Waters Alliance HPLC之LC-MS方法分析。將樣品在65℃下注射至Proteomix RP-1000管柱(5 µm，1000 Å，4.6 mm×15 cm，Sepax)上，且藉由25% B中之平衡3分鐘、25%-55% B之27分鐘線性梯度、在55% B中保持5分鐘、改變1分鐘至90% B、在90% B下保持5分鐘、改變1分鐘返回至25% B及以25%B之5分鐘再平衡溶離。移動相A為含0.1% TFA之水，且移動相B為含0.1% TFA之乙腈。溶離液接著以10:1分裂至PDA及SQD偵測器。SQD偵測器設置為ES正，3.5 KV下之毛細管電壓，50 V下之錐體電壓，5 V下之提取器，及0.3 V下之RF透鏡，150℃下之源溫度，350℃下之去溶劑化溫度。在200-2000 m/z下以連續模式獲得質量資料40分鐘，且掃描時間1秒。使用MassLynx及MaxEnt1分析資料且去卷積脫機。使用下式計算DAR： 2[[AUCLC+1 + 2(AUCLC+2) + 3(AUCLC+3) +…n (AUCLC+n)]/ΣILCtot] +2[[AUCHC+1 + 2(AUCHC+2) + 3(AUCHC+3) +…n (AUCHC+n)]/ΣAUCHCtot] 其中AUCLC+1為與一種細胞毒素結合之輕鏈峰之曲線下面積，AUCLC+2為與兩種細胞毒素結合之輕鏈峰之曲線下面積等。AUCHC為相應重鏈之曲線下面積，且ΣAUCLCtot及ΣAUCHCtot分別為所有未結合及所結合輕鏈及重鏈之曲線下的組合面積。 2.3 結合表徵  2.3.1    使用Octet之抗間皮素抗原決定基分組
首先使用定製結合分析用抗生蛋白鏈菌素尖端使用Octet表徵將抗原決定基結合至間皮素之抗體。將結合抗間皮素抗體之抗原決定基相對於由已知抗間皮素抗體MORAb-009結合之抗原決定基標準化。抗體基於其與作為MORAb-009之相同、鄰近或不同抗原決定基的結合而分組。重複步驟直至所有抗體與不同抗原決定基分組比對為止。基於octet結果，結合親和力排列為高、中等及低。所有結合步驟在含有0.2% BSA之PBST緩衝液中進行。 2.3.2    表面電漿子共振(BIAcore)結合分析
抗間皮素抗體對間皮素之結合親和力係藉由BIAcore(BIAcore T-100, GE healthcare, #1426075)使用一系列S CM5晶片來量測。將抗體濃度在1×HBS-P+緩衝液(GE Healthcare)中調節至1 μg/mL且將間皮素(50 μg)調節至100 nM。根據製造商之方案使用具有固定嚮導之CM5晶片製備抗人類抗體捕捉晶片。在HBS-P+中，最終捕捉抗體水準為8000-9000 RU。製備晶片用於分析，其中五個循環為300秒緩衝液注射，接著為30秒再生，所有循環均在30 µL/min下跨越所有四個流動池。藉由以10 µL/min依序注射個別配體溶液90秒，在流動池2-4上捕獲抗體。以單一循環動力學方式如下進行分析物注射：各自以30 µL/min依序注射自低變高濃度之分析物溶液240秒。偵測為2-1、3-1、4-1。藉由相同配體捕捉注射之序列進行雙重參考，隨後各自進行5次僅緩衝液注射持續240秒，解離1800秒且如上所述再生。一式兩份地分析所有配體與間皮素之結合。使用BIAEvaluations軟體使用1:1 Langmuir擬合模型進行動力學分析。自重複操作平均化締合速率、解離速率及親和力常數。 2.4 差示掃描熱量測定(DSC)熱穩定性分析
VP毛細管差示掃描量熱計(VP-CapDSC；MicroCal，VP-CapDSC，#12-07-149與Origin-7繪圖及MicroCal VP毛細管DSC軟體2.0版)用於解密及比較各種F(ab')2片段及對照之較高階結構及熱穩定性。在96孔分析盤(微升分析型)上使用20% Contrad溶液製備樣品且在10℃下在自動進樣器中分析。 2.5 毛細管等電聚焦(cIEF)分析
根據CFR安裝及啟動程序填充自動取樣器試劑。將血紅素用作系統穩定性標準。使用用於分批資料分析之預設設置。以1,500 V進行聚焦時段#1持續1 min用於系統適用性標準及樣品。以3,000 V進行聚焦時段#2持續5 min用於系統適用性標準且以3,000 V持續11 min用於TIGC樣品且符合緩衝器對照。複製TIGC樣品以4.5 min使用聚集時段#2且將所有樣品以系統適用性標準歸類，使用0.1之峰值寬度參數及5之臨限值及pI 7.5與9.4之間之積體使樣品自動整合。 2.6 製備DAR2及DAR6 MORAb-109 ADC
345A12-HC15-LC4 CHOZN細胞株在波袋(20 L)中培養直至存活率＜30%且使用TFF濃縮至2 L。在預平衡於20 mM磷酸鈉、10 mM EDTA，pH 7.2中之Amosphere A3樹脂上捕獲抗體，在相同緩衝液中洗滌直至實現穩定基線(以移除未結合材料)，隨後在低流速下使用20 mM磷酸鈉、10 mM EDTA、10 mM半胱胺酸，pH 7.2在管柱上還原8小時，隨後使用20 mM Tris，pH 7.5在管柱上再氧化60小時。在0.1 M甘胺酸，pH 3.0中溶離結合之物質，隨後在1×PBS、2 mM EDTA，pH 7.4中透濾並濃縮至＞10 mg/mL。最終回收率為100%。
對於DAR2 MORAb-109，在室溫下以1:2.5(mAb:有效負載)之莫耳比添加(於DMSO中)順丁烯二醯亞胺-VCP-艾日布林1小時。在結合之後，將材料稀釋至2 mg/mL，在1×PBS、2 mM EDTA中透濾以移除未結合連接子有效負載且濃縮至5 mg/mL。藉由製備型醚-5PW HIC層析純化DAR2材料。最終材料藉由SEC-HPLC、RP-HPLC及HIC-HPLC表徵。
對於DAR6 MORAb-109，純化/去半胱胺酸化抗體在1×PBS、2 mM EDTA中稀釋至7.5 mg/mL，且藉由在相同緩衝液中添加相等體積之250 µM TCEP持續50分鐘進一步降低，隨後添加相等總體積之50%丙二醇於1×DPBS/1 mM EDTA中，隨後之最終順丁烯二醯亞胺-VCP-艾日布林處於1:8(mAb:有效負載)莫耳比下，在室溫下培育1小時。ADC藉由G-25層析純化以移除未結合之有效負載且調配成1×PBS、2 mM EDTA。最終材料藉由SEC-HPLC、RP-HPLC及HIC-HPLC表徵。 2.7 活體外血清穩定性
在PBS或人類血清中以0.5 mg/mL製備抗間皮素ADC(順丁烯二醯亞胺-VCP-艾日布林作為有效負載)。樣品在37℃下培育0、24、48、72、96或240小時，接著轉移至-80℃以便儲存。所有樣品解凍至環境溫度，且單一稀釋為1:2,000用於測試。測試樣品之總mAb、總ADC及基於細胞之效能。總mAb分析作為逐步夾層型式在Gyrolab XP上發展，用生物素化間皮素捕獲，且用Alexa Fluor 647抗IgG1 Fc偵測。總mAb及完整ADC分析之可定量範圍分別為6.25-800 ng/mL及6.25至800 ng/mL。標準曲線及QC使用MORAb-109(345A12-HC15-LC4-VCP-艾日布林)製得。 2.8 MORAb-109 ADC之活體外DAR-敏感性基質穩定性
在PBS或人類、猴、大鼠或小鼠血清中，一式三份地以0.1 mg/mL製備MORAb-109(345A12-HC15-LC4-VCP-艾日布林) DAR 2。在37℃下培育樣品0、24、48、72、96或240小時。將自各時間點移出之樣品轉移至-80℃以便儲存。使用不含標記之生物層干擾量測法分析進行分析。在含有0.05% Tween-20及1% BSA之1×PBS(分析緩衝液)中將基質樣品稀釋至1:20。在匹配基質中將MORAb-109 DAR 0、DAR 1、DAR 2及DAR 6之對照樣品稀釋至0.1 mg/mL。陰性對照樣品為單獨5%基質。在分析緩衝液中以5 µg/mL將經生物素標記之間皮素捕捉於SA抗生蛋白鏈菌素生物感測器尖端上(300秒；Pall-ForteBio)，隨後捕捉經稀釋之穩定性樣品及對照物(300秒)。隨後藉由兔子-人類嵌合抗艾日布林抗體5E4之結合以100 mg/mL定量有效負載。監測結合持續300秒，此時結合達到平衡。在結合之295秒時測定各樣品在解離階段結束時之結合程度(Req )。藉由繪製相對於t0 之Req 百分比來測定穩定性，其中： Req = Req tx /Req t0 [100]及tx 百分比= 0 - 240小時。 2.9 活體外細胞毒性分析
繼代培養A431、A3、OVCAR3、HEC-251及H226細胞且以5,000個細胞/孔接種於96孔組織培養盤中之完全生長培養基中，且在37℃，5% CO2 下培育隔夜(16小時)。以200 nM起始，在2 mL深孔稀釋盤中以1:3連續稀釋測試試劑(總共10個稀釋液)。將經稀釋之樣品(100 µL)添加至細胞培養盤中(以100 nM之測試樣品之起始濃度)。在37℃，5% CO2 下再培育培養盤5天。接著丟棄培養基，且將盤用200 µL DPBS洗滌一次，在室溫下用50 µL之0.2%結晶紫溶液染色15 min，且隨後用自來水充分洗滌。將培養盤風乾，且用200 µL 1% SDS溶液溶解結晶紫。在570 nm下讀取培養盤。使用GraphPad Prism 6分析資料。 2.10     結果  2.10.1  人類化抗間皮素艾日布林ADC之初始篩檢
十五種抗間皮素抗體經次選殖、經按比例擴大表現且經純化，且在Cys80位置處使用順丁烯二醯亞胺-VCP-艾日布林作為有效負載結合。所有ADC均使用SEC-HPLC純化及表徵以用於聚集分析，HIC-HPLC用於DAR分析，且使用A431-A3(MSLNhi )、A431(MSLNlo )及OVCAR3(MSLNhi )細胞株之基於細胞之分析。細胞用ADC處理6小時，隨後洗滌掉，或處理48小時(A431-A3及A431細胞)或72小時(OVCAR3細胞)以便進行效能比較。表徵資料概述於表17中。基於下文之表徵資料，選擇六個抗體(加粗)用於人類化。表 17. 十五個抗間皮素艾日布林 ADC 之表徵
               SEC-HPLC SEC-HPLC-15% IPA 基於細胞之細胞毒性分析， EC50 (nM)
編號 樣品名稱 濃度 (mg/mL) 批次 DAR 單體 mAb% 單體 ADC% A3-6 小時 A3-48 小時 A431-6 小時 A431-48 小時 OVCAR3- 6 小時 OVCAR3-72 小時
1 33O11-VCP- 艾日布林 0.46 02750-83G 2.00 95.4 97.58 0.90 0.50 ＞100 ＞100 2.74 4.59
2 111B10-VCP- 艾日布林 0.98 02750-83H 2.00 89.9 93.69 0.30 0.14 ＞100 ＞100 3.11 3.15
3 324O5-VCP-艾日布林 0.97 02750-83I 2.00 83.5 85.92 1.15 0.72 ＞100 ＞100 3.33 2.40
4 178F16-VCP-艾日布林 0.99 02750-83J 2.00 81.4 84.54 0.65 0.38 ＞100 ＞100 1.36 0.08
5 237N18-VCP-艾日布林 0.83 02750-83K 2.00 92.8 95.84 0.51 0.24 ＞100 ＞100 14.65 4.41
6 383I18-VCP-艾日布林 0.71 02750-84I 1.83 93.5 95.80 1.06 0.83 ＞100 ＞100 16.25 2.16
7 393L14-VCP-艾日布林          93.0 93.88 1.70 1.18 ＞100 ＞100 13.37 4.04
8 62B10-VCP-艾日布林 0.48 02750-84J 2.00 98.7 46.84 0.64 0.33 ＞100 ＞100 11.70 1.84
9 55B4-VCP-艾日布林 0.42 02750-84K 2.00 98.4 73.44 0.55 0.27 ＞100 ＞100 32.17 1.33
10 120N18-VCP-艾日布林 0.3 02750-83G 2.00 97.4 61.42 1.67 0.98 ＞100 ＞100 2.16 0.20
11 201C15-VCP- 艾日布林 0.61 02750-83H 2.00 94.3 95.84 0.71 0.54 ＞100 ＞100 2.83 0.05
12 346C6-VCP- 艾日布林 0.9 02750-83I 2.00 91.4 92.28 0.95 0.29 ＞100 ＞100 8.20 0.49
13 264E24-VCP-艾日布林 0.66 02750-83J 1.63 46.2? 73.67 1.04 0.74 ＞100 ＞100 1.71 0.14
14 345A12-VCP- 艾日布林 0.4 02750-83K 2.00 95.7 98.53 0.95 0.80 ＞100 ＞100 0.66 0.09
15 102A6A-VCP- 艾日布林 0.19 02750-83D 2.00 98.1 67.87 0.38 0.21 ＞100 ＞100 1.92 0.12
16 102A6B-VCP-艾日布林 0.31 02750-83L 2.00 97.9 19.02 0.84 0.53 ＞100 ＞100 1.85 0.14
17 1552-VCP-艾日布林 0.63 02750-83F 1.89 97.1 97.20 ＞100 58.78 ＞100 ＞100 ＞100 10.60
18 艾日布林 6 mM             4.08 1.09 2.86 0.00 2.81 0.25
2.10.2  ADC之HC1-LC1人類化及活體外細胞毒性
兔子102A6A2、11B10、201C15、345A12及346C6 Fv區域之序列係使用IGBLAST(National Center for Biotechnology Information (NCBI))及IGMT/DomainGapAlign(International ImMunoGeneTics Information System (IMGT®))工具BLAST化，用於與人類生殖系可變域蛋白質序列最接近之同源。將兔子框架序列用最接近的同源人類生殖系序列置換以產生CDR移植之人類化變異體(HC1及LC1)。保留Kabat-限定的FWRH2之最後兩個殘基作為兔子殘基。針對111B10保留最終Kabat限定的FWRH3殘基。保留所有純系之Vκ區域中之RESPECT-L基元Cys80及Ala83。在產生人類化抗體之後，嵌合及人類化抗體均與三個不同的改變疏水性之有效負載(順丁烯二醯亞胺-VCP-艾日布林、順丁烯二醯亞胺-VCP-念珠藻素及順丁烯二醯亞胺-VCP-艾日布林二聚體)結合。針對所有抗體，藉由BIAcore量測與間皮素之結合親和力，且如表18中所概述，針對聚集百分比(%)、DAR及活體外效能表徵ADC。亦量測人類化抗間皮素ADC之效能有效負載且概述於表19中。在所測試之所有五個細胞株中，ADC具有低奈莫耳之細胞殺滅EC50值。表 18. 主要嵌合及人類化抗間皮素 ADC 之表徵概述
      親本 mAb ADC
      抗原決定基組 親和力 有效負載 HIC-Ethyl SEC-HPLC 基於細胞之細胞毒性分析， EC50 (nM)
         ka (105  M-1 sec-1 ) kd (10-3 sec-1 ) KD (10-9 M) 藥物 - 連接子 DAR 聚集體 % 單體 % A431 OVCAR3 HEC-251 H226 A3
33O11 xi 1          VCP-艾日布林 1.92 8.97 91.03 40.67 0.008 3.950 ＞100 0.14
VCP-念珠藻素 1.87 12.74 87.26 6.79 0.010 0.110 0.06 0.03
VCP-艾日布林二聚體 1.17 32.70 67.30 1.40 0.030 0.33 0.93 0.05
zu 2.2 0.65 3.4 VCP-艾日布林 1.69 1.42 98.58 ~100 0.064 26.500 ＞100 0.28
VCP- 念珠藻素 1.33 0.90 99.10 22.50 0.066 5.35 5.81 0.04
VCP-艾日布林二聚體 1.63 1.08 98.92 2.01 0.025 0.31 0.22 0.04
111B10 xi 2 6.5 3.9 6.3 VCP-艾日布林 1.90 4.25 95.75 38.10 0.004 13.960 ~100 0.05
VCP-念珠藻素 1.86 8.83 91.17 10.93 0.011 1.600 2.66 0.016
VCP-艾日布林二聚體 1.85 9.25 90.75 0.96 0.007 0.06 0.71 0.011
zu 5.1 3 6.5 VCP-艾日布林 1.81 3.64 96.36 68.92 0.014 27.42 ＞100 0.12
VCP- 念珠藻素 1.76 1.80 98.20 4.30 0.011 0.820 1.36 0.015
VCP-艾日布林二聚體 1.78 4.47 95.53 1.68 0.007 0.13 1.15 0.025
201C15 xi 1 2.4 0.26 1.1 VCP-艾日布林 1.85 1.62 98.38 48.50 0.004 14.82 ~100 0.27
VCP-念珠藻素 1.75 2.10 97.90 8.08 0.012 0.540 1.02 0.12
VCP-艾日布林二聚體 0.96 0.00 100.00 0.63 ＜0.003 0.10 0.64 0.065
zu 3.1 1.1 4.2 VCP-艾日布林 1.80 5.84 94.16 68.88 0.290 20.42 ＞100 0.41
VCP- 念珠藻素 1.74 11.51 88.49 2.55 0.120 0.600 1.73 0.037
VCP-艾日布林二聚體 1.75 9.94 90.06 1.12 0.063 0.28 1.26 0.082
346C6 xi 3 3.8 0.49 1.4 VCP-艾日布林 1.56 5.28 94.72 34.49 0.087 5.73 ~100 0.11
VCP-念珠藻素 1.52 8.28 91.72 4.18 0.042 0.190 1.21 0.043
VCP-艾日布林二聚體 1.60 10.43 89.57 1.32 0.026 0.09 0.99 0.035
zu 133 93 8.9 VCP-艾日布林 1.63 4.48 95.52 72.86 1.180 32.54 ＞100 0.55
VCP- 念珠藻素 1.65 13.70 86.30 2.30 0.380 0.800 2.21 0.13
VCP-艾日布林二聚體 1.68 4.86 95.14 1.36 0.140 0.34 1.86 0.13
345A12 xi 5 26 0.42 0.12 VCP-艾日布林 n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a
VCP-念珠藻素 n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a
VCP-艾日布林二聚體 n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a
zu 35 2.1 0.2 VCP-艾日布林 1.72 4.24 95.76 63.49 0.004 20.70 ＞100 0.091
VCP- 念珠藻素 1.60 6.17 93.83 3.03 ＜0.003 0.350 0.69 0.01
VCP-艾日布林二聚體 1.59 5.05 94.95 1.04 ＜0.003 0.06 0.79 0.016
102A6A2 xi 7 n.b. n.b n.b VCP-艾日布林 n/a 89.50 10.50 36.18 0.024 2 ＞100 0.12
VCP-念珠藻素 n/a 100.00 0.00 9.52 0.110 0.280 0.21 0.11
VCP-艾日布林二聚體 n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a
zu n.b. n.b n.b VCP-艾日布林 1.87 3.60 96.40 57.44 0.046 8.67 ＞100 3.02
VCP- 念珠藻素 1.87 3.64 96.36 3.54 0.021 0.054 0.08 0.0092
VCP-艾日布林二聚體 1.68 1.74 98.26 1.40 0.047 0.05 0.50 0.018
155D5 xi             VCP-艾日布林二聚體 1.62 14.42 81.63 1.20 0.210 0.47 1.50 1.41
                  艾日布林 n/a n/a n/a 0.47 0.11 0.2 5.3 1.03
                  念珠藻素 n/a n/a n/a 0.8 0.24 0.43 1.94 1.01
                  VCP-DiOH艾日布林二聚體 n/a n/a n/a 0.03 ＜0.003 0.003 0.32 0.08
表 19. 有效負載之基於活體外細胞之效能
   基於細胞之細胞毒性分析 EC50(nM)
   A431 OVCAR3 HEC-251 H226 A3
艾日布林 0.47 0.11 0.2 5.3 1.03
念珠藻素 0.8 0.24 0.43 1.94 1.01
VCP-DiOH艾日布林二聚體 0.03 ＜0.003 0.003 0.32 0.08
2.10.3  人類化改進
由於損失針對201C15、345A12及346C6純系之間皮素結合，因此需要後續突變以保留與間皮素結合。兔子及CDR移植之Fv序列用於產生可變域之電子雜交模型。將兔子及人類化模型之理論結構疊置，且分析極接近CDR之殘基對CDR環之整體結構的潛在結構影響。鑑別兔子與人類化序列之間不同的殘基。大多數不同殘基不位於二聚體界面或遠離CDR。發現VH及Vκ區域中之若干殘基緊密接近CDR(在5Å內)，且進一步分析。
VH區中之兩個人類化區域鑑別為可能干擾純系201C15、345A12及346C6中之抗原結合。所有純系之N端比在兔子序列中之HC1長一個胺基酸。此外，各自在FWRH3中具有2-胺基酸缺失(殘基72-73)。對於此等純系中之每一者，將HC1之FWRH3缺失周圍之前五個胺基酸及六個胺基酸(殘基71-76)恢復為兔子序列。345A12之殘基93亦恢復為HC5中之兔子。關於LC1，201C15、345A12及346C6之N端恢復為兔子序列。201C5(殘基67)及345A12(殘基70)之FWRL3中之一個殘基鑑別為潛在地與CDR相互作用且同樣鑑別346C6(殘基36)之FWRL2中之一個殘基。 2.10.4  超人類化345A12
在鑑別Vκ中之其他兔子殘基對抗原結合而言至關重要的情況下，產生345A12之其他突變體以將增加數目之人類殘基引入整個VH及Vκ區域中。對電子雜交模型之分析鑑別VH中之殘基35、48、49、57、58、61、62、63及64及Vκ中之殘基1、3、24、55及70。 2.10.5  超人類化345A12抗體之生物物理學表徵
超人類化345A12抗體自350 mL按比例擴大細胞培養物純化且在1×DPBS中調配。濃縮抗體以用於物理-化學特性評估。如表20中所示，HC10-LC7與HC15-LC7之組合在濃縮步驟期間沈澱，潛在地歸因於相對低pI或不良溶解度。藉由BIAcore針對間皮素結合親和力來分析純化抗體，且資料概述於下表21中。表 20. 純化人類化 345A12 抗體之概述
mAbs 清液層體積 (mL) 純化量 mAb-VCP-DiOH 艾日布林二聚體，產量 mAb-VCP- 艾日布林，產量 濃縮至 5 mg/mL
345A12-HC10-LC4 350 mL 77.5 mg以5.1 mg/mL 3.9 mg以1.3 mg/mL, 78% 11 mg以5.0 mg/mL, 73% 是
345A12-HC10-LC7 350 mL 78 mg以5.2 mg/mL 4.5 mg以1.6 mg/mL, 90% 8.1 mg以2.7 mg/mL, 54% 否，沈澱
345A12-HC15-LC4 350 mL 191 mg以8.3 mg/mL 4.2 mg以1.4 mg/mL, 84% 11 mg以4.85 mg/mL, 73% 是
345A12-HC15-LC7 350 mL 87.2 mg以4.0 mg/mL 3.3 mg以1.1 mg/mL, 66% 4.6 mg以1.54 mg/mL, 31% 否，沈澱
表 21. 針對人類化 345A12 之間皮素的結合親和力
聚集 結合 親和力
         操作1 操作2 操作3 操作4
   單體% 結合% ka kd KD ka kd KD ka kd KD ka kd KD
嵌合       2.63E+06 4.64E-04 1.76E-10                           
HC1-LC2 88.85 1.6 2.59E+06 4.32E-04 1.67E-10 2.47E+06 3.04E-04 1.13E-10                  
HC1-LC4 82.96 1.33          2.35E+06 2.57E-04 1.18E-10 1.96E+06 1.30E-04 6.61E-11 1.35E+06 1.61E-04 1.19E-10
HC1-LC7 87.23 1.29                   1.83E+06 1.40E-04 7.66E-11 1.38E+06 1.79E-04 1.29E-10
HC10-LC4 80.73 1.32                   1.80E+06 1.52E-04 8.47E-11 1.21E+06 1.80E-04 1.49E-10
HC10-LC7 82.75 1.21                            1.26E+06 1.89E-04 1.50E-10
HC15-LC4 86.56 1.3                            1.44E+06 1.12E-04 7.79E-11
HC15-LC7 92.7 1.42                            1.49E+06 1.16E-04 7.82E-11
2.10.6  DSC及cIEF分析
藉由DSC分析F(ab')2片段之熱熔融曲線。HC15-LC4 F(ab')2及HC10-LC4 F(ab')2之曲線展示於圖8中。
藉由cIEF分析345A12-HC10-LC4及345A12-HC15-LC4 mAb之pI。pI在各mAb之間的0.06 pH單位內變化，對於345A12-HC10-LC4為8.19且對於345A12-HC15-LC4為8.25(表22)。 表22.cIEF分析
樣品名稱 pI 酸性峰% 中性峰 % 鹼性峰%
345A12-HC10-LC4 8.19 24.412 57.171 18.417
345A12-HC15-LC4 8.25 34.787 50.790 14.424
2.10.7  血清穩定性
如章節2.7中所描述，測試345A12-HC10-LC4及345A12-HC15-LC4 ADC之PBS/人類血清穩定性評估長達10天。資料概述於下表23中。表 23.zu345A12-VCP- 艾日布林 ADC ， HC15-LC4 相對於 HC10-LC4 之活體外 PBS/ 人類血清穩定性
         總 Ab 完整 ADC
樣品 # 樣品描述 稀釋度 平均濃度 (ng/mL) CV% 經調整之結果 (µg/mL) 與T=0 之差異% 平均濃度 (ng/mL) CV% 經調整之結果 (µg/mL) 與T=0 之差異%
1 Zu345A12-HC10LC4-VCP-艾日布林 T=0，在人類血清中 1:2,000 231 2.14 462 N/A 258 1.42 516 N/A
2 Zu345A12-HC10LC4-VCP-艾日布林 T=24，在人類血清中 1:2,000 221 4.59 442 -4.3 190 1.70 380 -26.4
3 Zu345A12-HC10LC4-VCP-艾日布林 T=48，在人類血清中 1:2,000 208 0.840 416 -10.0 154 3.19 308 -40.3
4 Zu345A12-HC10LC4-VCP-艾日布林 T=72,在人類血清中 1:2,000 213 1.46 426 -7.8 142 1.66 284 -45.0
5 Zu345A12-HC10LC4-VCP-艾日布林 T=96，在人類血清中 1:2,000 210 2.55 420 -9.1 105 21.5 210 -59.3
6 Zu345A12-HC10LC4-VCP-艾日布林 T=240，在人類血清中 1:2,000 207 4.27 414 -10.4 97.0 6.31 194 -62.4
7 Zu345A12-HC15LC4-VCP-艾日布林 T=0，在人類血清中 1:2,000 284 0.387 568 N/A 278 4.84 556 N/A
8 Zu345A12-HC15LC4-VCP-艾日布林 T=24，在人類血清中 1:2,000 282 4.19 564 -0.7 229 2.71 458 -17.6
9 Zu345A12-HC15LC4-VCP-艾日布林 T=48，在人類血清中 1:2,000 273 0.103 546 -3.9 180 1.87 360 -35.3
10 Zu345A12-HC15LC4-VCP-艾日布林 T=72，在人類血清中 1:2,000 258 0.744 516 -9.2 144 0.436 288 -48.2
11 Zu345A12-HC15LC4-VCP-艾日布林 T=96，在人類血清中 1:2,000 270 0.669 540 -4.9 135 3.13 270 -51.4
12 Zu345A12-HC15LC4-VCP-艾日布林 T=240，在人類血清中 1:2,000 270 1.48 540 -4.9 111 0.669 222 -60.1
13 Zu345A12-HC10LC4-VCP-艾日布林 T=0，在PBS中 1:2,000 180 1.03 360 N/A 229 1.40 458 N/A
14 Zu345A12-HC10LC4-VCP-艾日布林 T=24，在PBS中 1:2,000 184 0.583 368 2.2 187 2.07 374 -18.3
15 Zu345A12-HC10LC4-VCP-艾日布林 T=48，在PBS中 1:2,000 166 3.12 332 -7.8 177 1.64 354 -22.7
16 Zu345A12-HC10LC4-VCP-艾日布林 T=72,在PBS中 1:2,000 180 0.829 360 0.0 177 2.00 354 -22.7
17 Zu345A12-HC10LC4-VCP-艾日布林 T=96，在PBS中 1:2,000 179 1.73 358 -0.6 174 3.87 348 -24.0
18 Zu345A12-HC10LC4-VCP-艾日布林 T=240，在PBS中 1:2,000 171 0.915 342 -5.0 131 6.24 262 -42.8
19 Zu345A12-HC15LC4-VCP-艾日布林 T=0，在PBS中 1:2,000 225 1.14 450 N/A 233 0.325 466 N/A
20 Zu345A12-HC15LC4-VCP-艾日布林 T=24，在PBS中 1:2,000 226 1.45 452 0.4 209 3.53 418 -10.3
21 Zu345A12-HC15LC4-VCP-艾日布林 T=48，在PBS中 1:2,000 233 0.754 466 3.6 210 0.942 420 -9.9
22 Zu345A12-HC15LC4-VCP-艾日布林 T=72，在PBS中 1:2,000 210 4.03 420 -6.7 186 2.11 372 -20.2
23 Zu345A12-HC15LC4-VCP-艾日布林 T=96，在PBS中 1:2,000 247 10.4 494 9.8 182 0.0585 364 -21.9
24 Zu345A12-HC15LC4-VCP-艾日布林 T=240，在PBS中 1:2,000 226 0.514 452 0.4 145 6.91 290 -37.8
2.10.8  使用DAR-敏感性Octet分析之各種基質中之345A12-HC15-LC4-VCP-艾日布林之基質穩定性
分析345A12-HC15-LC4-VCP-艾日布林(DAR2)在小鼠、大鼠、食蟹獼猴及人類血漿及血清中之活體外穩定性。ADC在基質中以0.1 mg/mL培育1週，且在1、2、3、4及10天之後移除時間點。如章節2.3.1中所述，使用基於DAR-敏感性Octet(生物層干涉法)之分析進行分析。結果展示於圖9中。345A12-HC15-LC4-VCP-艾日布林(DAR2)顯示有效負載之時間依賴性釋放，其中在37℃下培育10天之後平均20%之釋放。 2.10.9  產生針對人類間皮素之兔子IgG及多株抗體的培養物
在第2週，藉由使用銪穴狀化合物之IgG FRET鑑別產生兔子IgG抗體之孔。藉由ELISA針對塗佈有1 μg/mL CHO-MT40間皮素之盤篩選產生IgG之孔的兔子IgG Fcγ抗體之存在。藉由針對1 μg/mL間皮素之ELISA篩選及針對1 μg/mL CD73-his之相反篩選來證實產生間皮素特異性兔子IgG之培養物。FRET及ELISA在Biomek® FX機器系統(Beckman)上進行。 實例3：活體內研究
根據下文所述之方案，使用人類肺癌及胃癌異種移植模型及人類間皮瘤患者源異種移植(PDX)模型在小鼠中評估包含主要人類化抗間皮素抗體及艾日布林結合物之ADC。評估ADC之不同DAR物種之抗癌活性及脫靶毒性。 3.1 試劑及材料  3.1.1    抗體
用於以下研究之抗體具有輕鏈位置80處之不成對半胱胺酸(LCcys80)且包括兔子-人類嵌合(-xi)及人類化(-zu)形式之抗人類間皮素抗體xi345A12-HC1-LC2、xi102A6A2-HC1-LC2、zu345A12-HC1-LC2、zu345A12-HC10-LC4及zu345A12-HC15-LC4。 3.1.2    可結合細胞毒素及LCcys80 ADC
以下研究中使用之連接子-細胞毒素化合物包括順丁烯二醯亞胺-VCP-艾日布林及順丁烯二醯亞胺-VCP-diOH艾日布林二聚體。 3.1.3    腫瘤細胞株
將人類NSCLC細胞株NCI-H2110、人類胃癌細胞株NCI-N87及人類間皮瘤癌細胞株HAY用於以下研究。所使用之所有細胞株均直接獲自美國菌種保藏中心(ATCC)，除HAY細胞以外，其係獲自NCI。 3.1.4    其他試劑
除非另外指明，否則所有所用試劑均以研究級別或更高級別購自商業供應商。 3.2 在人類癌症異種移植模型中之活體內篩檢及功效研究  3.2.1    研究動物
將雌性CD-1 IGS小鼠(Charles River, 7-9週齡)用於最大耐受劑量(MTD)研究，雌性NOD.CB17-SCID小鼠(Jackson實驗室)用於NCI-H2110及HAY異種移植研究，且將雌性NCr裸鼠(Taconic, 5週齡)用於NCI-N87異種移植研究。在出現之後，動物在接種之前適應5-7天。將動物關養在每個通風籠3-5隻小鼠，其中滅菌食品塊及水瓶可供隨意使用。在研究開始之前對動物進行標記且稱重。 3.2.2    細胞培養
來自冷凍儲備液之冷凍保存之NCI-H2110、NCI-N87或HAY細胞在含有必需補充劑之培養基中培養。細胞在用於活體內接種之前在完全培養基中再培養2個繼代。 3.2.3    腫瘤植入、入選方法及處理
細胞以1:1(體積：體積)懸浮於與冷基質膠混合之PBS中，達到對於NCI-H2110及HAY細胞1.0×108 個細胞/毫升或5.0×107 個細胞/毫升之最終濃度。向小鼠皮下注射100 µL/小鼠之細胞混合物且監測體重及腫瘤生長。在植入後第3天開始，藉由數位測徑規每週3次獲取量測結果。 3.2.4    腫瘤量測及處理
腫瘤體積使用下式計算：W(mm)×L(mm)×D(mm)×π/6。一旦腫瘤植入達到100 mm3 之平均體積，則將小鼠隨機分成每組五隻小鼠。以200 µL之體積靜脈內給予處理。量測最終體重且在各研究結束時記錄。 3.2.5    統計分析
藉由重複-量測雙向方差分析，隨後藉由Bonferroni事後檢定，將來自各處理組之動物腫瘤體積與對照組進行比較。各實驗組內之腫瘤生長之比較亦使用相同統計分析進行。 3.3 在人類間皮瘤PDX模型中之活體內功效研究  3.3.1    研究動物
在接種之前在到達後時，使NMRI nu/nu雌性小鼠(Janvier實驗室, 5-6週)適應至少4天。將動物關養在每個通風籠3-5隻小鼠，其中滅菌食品塊及水瓶可供隨意使用。在研究開始之前對動物進行標記且稱重。 3.3.2    異種移植
在研究第0天，在無菌條件下自五隻供體小鼠移除Meso 7212腫瘤。將供體腫瘤組織切割成2×2 mm片段且置放於覆蓋有0.9%生理食鹽水之無菌皮氏培養皿中。同時，受體動物用止痛Metacam®(2 mg/kg)皮下處理，且隨後藉由單次靜脈內注射(0.15 mL/小鼠)用Etomidat-Lipuro®(12 mg/kg)麻醉。在左側腰窩上在皮膚中形成5-8 mm之表面豎直切口。將外科剪刀之尖端直接在側腹上插入至切口中，且用於在皮下空間中形成凹穴。使用手術鑷子將每個小鼠一個腫瘤片段植入凹穴中。用金屬夾子封閉切口且將動物放回乾淨籠子中。 3.3.3    實驗程序
在腫瘤繁殖期間，使用數位卡尺(Mitutoyo)量測腫瘤直徑。根據動物之腫瘤體積(腫瘤體積之納入標準，0.1-0.3 cm3 )將動物隨機分配至實驗組中。每週兩次記錄腫瘤體積及體重。 3.3.4    處理
在隨機化當天，艾日布林以0.2、0.3及3.2 mg/kg之劑量靜脈內投與。在隨機化當天以10.0 mg/kg之劑量或在四個連續日以2.5 mg/kg之劑量靜脈內投與MORAb-109(DAR 0、2及6)。對於在所有實驗組中之靜脈內注射，投與體積為10 mL/kg。 3.3.5    統計分析
對腫瘤體積及體重之資料進行描述性統計資料。藉由使用重複-量測雙向方差分析，隨後藉由Bonferroni事後檢定，將來自各處理組之動物腫瘤體積與對照組進行比較。另外，亦用相同統計分析進行各組內動物之腫瘤生長之比較。 3.4 結果-活體內篩選及功效研究  3.4.1    研究M109-004-2016：人類NSCLC異種移植模型中345A12-HC1-LC2及102A6A2 HC1-LC2艾日布林二聚體ADC之活體內篩檢
在人類非小細胞肺癌(NSCLC) NCI-H2110異種移植模型中進行抗-間皮素抗體之兩個純系(345A12-HC1-LC2及102A6A2-HC1-LC2)之比較活體內篩選。小鼠用2.5 mg/kg之345A12-HC1-LC2-diOH艾日布林二聚體ADC或2.5 mg/kg之102A6A2-HC1-LC2-diOH艾日布林二聚體ADC處理。兩種ADC之抗腫瘤活性及體重變化分別展示於圖10A及圖10B中。 3.4.2    研究M109-006-2017：CD-1小鼠中之345A12-HC1-LC2及345A12-HC15-LC4艾日布林二聚體ADC之最大耐受劑量(MTD)之初步評估
在投與5、10、15或20 mg/kg之345A12-HC1-LC2-diOH艾日布林二聚體ADC或5、10或20 mg/kg之345A12-HC15-LC4-diOH艾日布林二聚體ADC之後量測雌性CD-1小鼠之體重變化。各ADC之體重變化顯示於圖11A及圖11B中。 3.4.3    研究M109-007-2017：人類NSCLC異種移植模型中345A12-HC10-LC4及345A12-HC15-LC4艾日布林二聚體ADC之活體內篩檢
在人類NSCLC NCI-H2110異種移植模型中進行抗-間皮素抗體之兩個其他純系(345A12-HC10-LC4及345A12-HC15-LC4)之比較活體內篩選。小鼠用2.5 mg/kg之345A12-HC10-LC4-diOH艾日布林二聚體ADC或2.5 mg/kg之345A12-HC15-LC4-diOH艾日布林二聚體ADC處理。兩種ADC之抗腫瘤活性及體重變化分別展示於圖12A及圖12B中。
基於345A12-HC15-LC4純系的抗腫瘤活性及毒性概況選擇其作為MORAb-109 ADC中所用之抗體的候選純系。 3.4.4    研究M109-010-2018：人類胃癌異種移植模型中345A12-HC15-LC4-VCP-艾日布林ADC(MORAb-109)之DAR2及DAR6物種之抗腫瘤作用
在10 mg/kg之劑量下，在人類胃癌NCI-N87異種移植模型中比較345A12-HC15-LC4-VCP-艾日布林ADC(MORAb-109)之兩個DAR物種(DAR2及DAR6)。DAR2及DAR6 ADC物種均展現持久及類似抗腫瘤反應(圖13A)，在投與任一DAR物種後，觀測到較少體重減輕至無體重減輕(圖13B)。 3.4.5    研究M109-010-2018：人類間皮瘤異種移植模型中345A12-HC15-LC4-VCP-艾日布林ADC(MORAb-109)之DAR2及DAR6物種之抗腫瘤作用
在人類間皮瘤HAY異種移植模型中比較345A12-HC15-LC4-VCP-艾日布林ADC(MORAb-109)之兩個DAR物種(DAR2及DAR6)。DAR2及DAR6 ADC物種證明，在用單次劑量(5 mg/kg)之MORAb-109處理之小鼠中持久且類似抗腫瘤反應，而單獨的艾日布林(以MTD(3.2 mg/kg)或以等效莫耳量之艾日布林投與，如在MORAb-109(0.1 mg/kg)中所發現)顯示有限抗腫瘤作用(圖14A)。在用艾日布林之MTD劑量處理之小鼠中觀測到急性及臨時體重損失，而在用任一ADC處理之小鼠中未觀測到體重損失(圖14B)。 3.4.6    MORAb-109(DAR6)在人類間皮瘤PDX模型中之抗腫瘤作用
在人類間皮瘤PDX模型Meso7212(MV15369)中研究345A12-HC15-LC4-VCP-艾日布林ADC(MORAb-109) (DAR6)之抗腫瘤作用。測試兩種不同治療方案：單次投與10 mg/kg MORAb-109或四次連續每日投與2.5 mg/kg。MORAb-109之兩種治療方案均證明持久及類似的抗腫瘤反應，而單獨艾日布林(0.2 mg/kg)之等效莫耳量顯示有限的抗腫瘤作用(圖15A)。與單獨艾日布林之MTD劑量相比，MORAb-109 ADC處理均顯示顯著增加之抗腫瘤活性(P＜0.05)。所有處理之體重變化展示於圖15B中。 3.4.7    MORAb-109(DAR2及DAR6)在人類間皮瘤PDX模型中之抗腫瘤作用
在人類間皮瘤PDX模型Meso7212(MV16071)中在單次投與10 mg/kg下研究345A12-HC15-LC4-VCP-艾日布林ADC(MORAb-109)之兩個DAR物種(DAR2及DAR6)之抗腫瘤作用。MORAb-109之DAR2及DAR6物種均證明持久且可比較的抗腫瘤反應，而單獨的艾日布林(0.3 mg/kg)之等效莫耳量及與MORAb-109物種(DAR0)結合之無艾日布林顯示有限的抗腫瘤作用或無抗腫瘤作用(圖16A)。在任何群組中均未觀測到體重減輕(圖16B)。MORAb-109之DAR2與DAR6物種之間不存在抗腫瘤作用之統計學差異。 實例4：間皮素(MSLN)表現及活體外效能4.1 方法
細胞毒性 ：將細胞繼代培養且以5,000個細胞/孔接種於96孔組織培養盤中之完全生長培養基中，且在37℃，5% CO2 下培育隔夜(16小時)。以200 nM起始，在2 mL深孔稀釋盤中以1:3連續稀釋測試試劑(總共10個稀釋液)。將經稀釋之樣品(100 µL)添加至細胞培養盤中(以100 nM之測試樣品之起始濃度)。在37℃，5% CO2 下再培育培養盤5天。接著丟棄培養基，且將盤用200 µL DPBS洗滌一次，在室溫下用50 µL之0.2%結晶紫溶液染色15 min，且隨後用自來水充分洗滌。將培養盤風乾，且用200 µL 1% SDS溶液溶解結晶紫。在570 nm下讀取培養盤。使用GraphPad Prism 6分析IC50 測定之資料。在GraphPad Prism中使用非參數Spearman分析進行相關性分析。4.2 結果
觀測所有細胞株之MORAb-109(DAR6)效能與間皮素表現之間的相關性(圖17；表24及25)。
對於MORAb-109(DAR2)，當來自分析中排除具有較低間皮素表現之細胞株(平均螢光強度之FACS染色(MFI)＜80)時，在效能與間皮素表現之間觀測到顯著相關性(圖17；表24及25)。MORAb-109(DAR2)之效能在較高間皮素表現量下與間皮素表現相關。表 24. 間皮素表現及效能相關性分析 (DAR2 及 DAR6)
   MSLN (MFI)相較於艾日布林 MSLN (MFI) 相較於 MORAb109 MSLN (MFI) 相較於 MORAb109(DAR6) MSLN (MFI) 相較於 MORAb109_MSLN高
相關係數r            
r -0.1113 -0.2906 -0.6773 -0.6267
95%信賴區間 -0.3935至0.1902 -0.5472至0.01591 -0.8093至-0.4803 -0.8502至-0.2118
              
P值            
P(雙尾) 0.4566 0.0557 ＜0.0001 0.0054
P值概述 ns ns **** **
精確或估算P值? 估算 估算 估算 估算
顯著? (α= 0.05) 否 否 是 是
              
 XY對之數目 47 44 48 18
表 25. 間皮素表現及效能相關性分析中所用之細胞株 *
   活體外效能 ，IC50, nM
細胞株 MSLN (MFI) 艾日布林 MORAb109 MORAb109(DAR6)
EGI-1 14.8 1.48 187.8 15.45
TFK1 132.81 1.27   5.65
SNU-245 23.9 78.24 355.8  
SNU-478 53.8 1.58 227.5 55.16
SNU-1196 40.2 1.14 128.4 6.49
T-47D 4.4 0.68 95.86 22.04
JIMT-1 36.4 0.39 61.8 11.4
HCC1806 189.3 0.37 35.54 0.24
HEC-1-A 16.5 0.68 140.7 23.7
HEC-1-B 16.9 0.54 66.29 1.6
HEC-251 53.3 0.5 67.15 0.67
MFE-280 45.1 3.24 196.5 164.9
NCI-H292 108.6 0.58 147.3 6.37
NCI-H322 83.9 0.46 62.84 3.62
NCI-H1355 11.5 0.67 79.77 7.09
NCI-H1355-Sorted 32.7 0.7 96.92 6.48
NCI-H1573 17.4   60.41 6.46
NCI-H1568/MSLN 4474 0.44 1.69 1.08
NCI-H1650 31.5 0.61 92.2 4.09
NCI-H1650/MSLN 1865.5 0.84 1 0.57
NCI-H2110 112.2 0.32 52.23 4.17
NCI-H2126 73.6 0.53 87.89 10.82
PC9 11.24 0.56 85.14 15.22
H226 725.3 0.66 7.46 0.13
NCI-H23 4.42 0.6 66.74 17.31
Lu65 13.13 0.56   15.85
NCI-H460 8.56 35.29    
MOR/CPR 120.79 3.69   5.68
A549 14.2 2.72 276 41.33
CNE2 147.7 0.49 69.55 1.64
HK1 39.2 0.89 197.5 5.88
HNE-1 110.8 0.87 239.2 2.03
HNE-1-T1 79.3 1.03 347 11.28
HONE1 108.6 0.89 197.5 5.88
SUNE1 212.4 0.56 77.8 0.27
CaOV-3 137.6 0.44 20.93 0.51
COV362 113.5 2.78 193 45.29
HAC-2 172.3 26.65 228 320
Kuramochi 211.2 0.89 897.8 0.1
OVCAR3 A1 220 0.15 0.005 0.005
AsPC1 33.47 1.62   3.13
BxPC3 15.59 0.66 86.2 5.88
Capan-2 36 1.21 138 1.99
A431 5.6 0.55 71.51 14.17
A431-K5 1430.3 1.5 0.45 0.35
NCI-N87 125.8 0.11 14.7 0.1
MKN1 22.06 0.96 20.14 2.89
MKN74 7.73 0.78 66.96 9.62
SNU216 94.91 1.78 73.42 0.29
MKN45 57.94 3.65 100 10.39
MKN7 18.48 0.58 86.53 10.39
*加粗文字指示包括於具有較高間皮素表現之亞群中的細胞株。 實例5：MORAb-109在人類胃癌(NCI-N87)異種移植模型中之劑量反應5.1 方法 5.1.1 活體內功效
動物 ：在出現時達5週齡之雌性NCr裸鼠(Taconic)在接種之前適應5-7天。將動物關養在每個通風籠3-5隻小鼠，其中滅菌食品塊及水瓶可供隨意使用。在研究開始之前對動物進行標記且稱重。
細胞培養 ：將經冷凍保存之NCI-N87細胞解凍且在含有必需補充劑之培養基中生長。細胞在用於活體內接種之前在完全培養基中再培養2個繼代。
腫瘤植入、入選方法及處理 ：將PBS中之細胞懸浮液與冰冷基質膠以1:1(體積：體積)混合至1.0×108 個細胞/毫升之最終濃度。皮下注射100 µL/小鼠之混合物。自植入後第3天開始，監測小鼠之臨床健康，其中體重及腫瘤藉由數位卡尺每週3次量測。
腫瘤量測及處理 ： 腫瘤體積(TV) (mm3 )係使用下式計算：W(mm)×L(mm)×D(mm)×π/6。當腫瘤平均達到約100 mm3 時，將動物隨機分組為5隻/組。在200 µL體積之測試物品中靜脈內給予處理。在研究結束時，量測且記錄最終體重。
統計分析 ：對腫瘤體積及體重之資料進行描述性統計。藉由使用重複-量測雙向方差分析，隨後藉由Bonferroni事後檢定，將來自各處理組之動物腫瘤體積與對照組進行比較。另外，用相同統計分析進行各組內動物之腫瘤生長之比較。5.1.2 藥物動力學 (PK)
使用完整ADC分析及總抗體分析進行PK分析。總抗體係指所有物種之總和，包括結合及未結合之物種(亦即DAR0+DAR1+DAR2+……+DARn)，而完整ADC係指所有結合物種(亦即DAR1+DAR2 + ……+DARn)。總抗體分析法使用生物素標記之間皮素進行捕獲。完整ADC分析使用生物素標記之抗艾日布林5E4 Fab片段用於捕捉且AlexaFluor647標記之抗人類Fc用於偵測。用Gyros分析儀進行樣品分析。資料分析在WatsonLIMS 7.4.1中進行且繪製於電子表格軟體中。5.2 結果
在5 mg/kg至25 mg/kg之MORAb-109(DAR2)之劑量範圍下觀測到劑量依賴型功效(圖18A及18B)。在任何劑量組中未觀測到體重損失(圖18C)。在經處理之動物中觀測到ADC之劑量依賴性暴露，如AUC之劑量依賴性增加所指示(圖19及表26)。表 26. 在 NCI-N87 腫瘤攜帶小鼠中 MORAb-109( 劑量滴定 ) 之 PK
劑量(mg/kg 完整ADC或總Ab T1/2 (hr) Vdss (mL/kg) CL (mL/kg/hr) AUC (μg*hr/kg) Cmax (μg/mL)
5 完整 125.1 78.7 0.509 9512 62.9
總 173.9 75.1 0.316 14375 73.2
10 完整 148.2 99.5 0.475 19559 105
總 231.6 89.6 0.259 31631 123
15 完整 142.1 81.1 0.414 34557 169
總 209.2 68.8 0.236 56134 205
20 完整 151.5 90.9 0.429 43852 214
總 218.6 70.6 0.230 75718 270
25 完整 143.5 91.1 0.463 51253 271
總 226.1 78.2 0.240 88099 322
實例6：MORAb-109在人類卵巢癌(OVCAR-3-A1-T1)異種移植模型中之活體內抗腫瘤功效6.1 方法
動物 ：在出現時5週齡之雌性NOD.CB17-SCID小鼠(Jackson實驗室)在接種之前適應5-7天。將動物關養在每個通風籠3-5隻小鼠，其中滅菌食品塊及水瓶可供隨意使用。在研究開始之前對動物進行標記且稱重。
細胞培養 ：將經冷凍保存之OVCAR-3-A1-T1細胞解凍且在含有必需補充劑之培養基中生長。細胞在用於活體內接種之前在完全培養基中再培養2個繼代。
腫瘤植入、入選方法及處理 ：將PBS中之細胞懸浮液與冰冷基質膠以1:1(體積：體積)混合至5.0×107 個細胞/毫升之最終濃度。皮下注射100 µL/小鼠之混合物。自植入後第3天開始，監測小鼠之臨床健康，其中體重及腫瘤藉由數位卡尺每週3次量測。
腫瘤量測及處理 ： 腫瘤體積(TV) (mm3 )係使用下式計算：W(mm) ×L(mm) ×D(mm) ×π/6。當腫瘤平均達到約100 mm3 時，將動物隨機分組為5隻/組。在200 µL體積之測試物品中靜脈內給予處理。在研究結束時，量測且記錄最終體重。
統計分析 ：對腫瘤體積及體重之資料進行描述性統計。藉由使用重複-量測雙向方差分析，隨後藉由Bonferroni事後檢定，將來自各處理組之動物腫瘤體積與對照組進行比較。另外，用相同統計分析進行各組內動物之腫瘤生長之比較。6.2 結果
MORAb-109(DAR2)證明人類卵巢癌OVCAR-3-A1-T1異種移植模型中之腫瘤生長延遲(圖20A及圖20B)。 實例7：MORAb-109在人類NSCLC PDX模型(LC-F-25)中之活體內抗腫瘤功效7.1 方法
動物 ：在出現時達5週齡之遠親雜交無胸腺(nu/nu)雌性小鼠(HSD:無胸腺裸露的-Foxn1nu)在接種之前適應至少4天。將動物關養在每個通風籠3-5隻小鼠，其中滅菌食品塊及水瓶可供隨意使用。在研究開始之前對動物進行標記且稱重。
異種移植 ：LC-F-25建立為來自人類患者之原發性非小細胞肺腺癌之生長腫瘤(P9.1.1/0)。基於免疫組織化學(IHC)分析，相對於其他腫瘤類型(諸如LXFA-737(實例8))，LC -F-25在陽性百分比及整體強度方面具有較低MSLN表現。
實驗程序 ：當平均腫瘤體積及中值腫瘤體積分別達到153.5及126 mm3 時，分配具有108與288 mm3 之間的現有生長LC-F-25腫瘤(P9.1.1/0)之三十以個(31)小鼠進行處理。
處理 ：在4組各7至8隻小鼠中評估功效： ●  在第1組中，在第1天以5 mL/kg靜脈內單次劑量給藥媒劑。 ●  在第2組及第3組中，在第1天，分別以0.1 mg/kg(5 mL/kg)及3.2 mg/kg(6.4 mL/kg)靜脈內單次劑量給藥艾日布林。 ●  在第4組中，在第1天以10 mg/kg(5 mL/kg)靜脈內單次劑量給藥MORAb-109。
量測腫瘤且在實驗時段期間一週兩次稱重小鼠。
統計分析 ：針對藉由曼-惠特尼非參數比較測試(Mann-Whitney non-parametric comparison test)之各量測進行統計分析。將各處理組與對照組進行比較。7.2 結果
藉由靜脈內途徑以10 mg/kg之單次劑量給與之MORAb-109(DAR2)具有良好耐受性，而無攜帶LC-F-25腫瘤之小鼠之體重損失(圖21B)。MORAb-109(DAR2)展現在LC-F-25 NSCLC PDX模型中在10 mg/kg下之腫瘤生長延遲(圖21A)。
攜帶LC-F-25腫瘤之小鼠對藉由靜脈內途徑以0.1 mg/kg之單次劑量(以10 mg/kg投與時，MORAb-109中有效負載之等效莫耳量)給予的艾日布林具有良好耐受性，但不誘導統計學上顯著之腫瘤生長抑制(圖21A及圖21B)。
攜帶LC-F-25腫瘤之小鼠對藉由靜脈內途徑以3.2 mg/kg之單次劑量(小鼠MTD劑量或當以10 mg/kg投與時高於MORAb-109中艾日布林之莫耳量的32倍)給予之艾日布林具有良好耐受性，但在投與之後3至10天誘發輕微及瞬時體重減輕(圖21B)。在此劑量下，艾日布林誘導統計學上顯著之腫瘤生長抑制，其中8隻小鼠中之6隻有部分腫瘤消退(圖21A)。 實例8：MORAb-109在人類NSCLC PDX模型(LXFA-737)中之活體內抗腫瘤功效8.1 方法
動物 ： 4至6週齡之雌性NMRI nu/nu小鼠(Crl:NMRI-Foxn1nu)。
異種移植 ：將LXFA-737確定為來自人類患者之原發性非小細胞肺腺癌之生長腫瘤(P14N4)。基於IHC分析，相對於其他腫瘤類型(諸如LC-F-25(實例7))，LXFA-737在整體強度及較高的陽性百分比方面具有中等MSLN表現。
實驗程序 ：監測動物直至腫瘤植入物在足夠數目之動物中達到50-250 mm3 (例如80-200 mm3 )之研究體積標準。將小鼠分配至群組，以相當的組中值及平均腫瘤體積為目標。將隨機化的一天表示為第0天。
處理 ：在4組各6至7隻小鼠中評估功效： ●  在第1組中，在第1天以5 mL/kg靜脈內單次劑量給藥媒劑。 ●  在第2組及第3組中，在第1天，分別以0.2 mg/kg及3.2 mg/kg靜脈內單次劑量給藥艾日布林。 ●  在第4組中，在第1天以10 mg/kg靜脈內單次劑量給藥MORAb-109。
量測腫瘤且在實驗時段期間一週兩次稱重小鼠。在隨機之一天(第0天)後，給藥第一天為第1天。
統計分析 ：腫瘤生長之抑制、測試/對照值以(Min.T/C)%為單位之抑制：將在第X天測試組與對照組之中值殘餘腫瘤體積(RTV)值之比率乘以100來計算測試值相對於對照值(T/C %)。測試組及對照組之腫瘤體積加倍及四倍時間(Td，Tq)定義為達至200%或400%之中值RTV所需之時間間隔(天數)。8.2 結果
在LXFA-737 NSCLC PDX模型中，MORAb-109(DAR2)證實在10 mg/kg下穩定抗腫瘤功效(最小T/C，在第41天為2.3%) (圖22A)且其Tq在研究期間未達到。在單次劑量下給定之MORAb-109亦具有良好耐受性，而無藉由攜帶LXFA-737腫瘤之小鼠之體重損失(圖22B)。
攜帶LXFA-737腫瘤之小鼠對藉由靜脈內途徑以3.2 mg/kg之單次劑量(小鼠MTD劑量或當以10 mg/kg投與時高於MORAb-109中艾日布林之莫耳量的32倍)給予之艾日布林具有良好耐受性，顯示抗腫瘤功效(最低T/C，在第27天為4.2%)且其Tq為80.1%。然而，在投與之後，艾日布林誘發輕微及瞬時體重減輕(圖22A及圖22B)。為MORAb-109中以10 mg/kg投與艾日布林之莫耳量的兩倍之單次劑量0.2mg/kg顯示出有限的抗腫瘤療效(最小T/C，在第44天為51.1%)。 實例9：MORAb-109在人類胃癌(NCI-N87)異種移植模型中之劑量反應9.1 方法 9.1.1 活體內功效
動物 ：在出現時達5週齡之雌性NCr裸鼠(Taconic)在接種之前適應5-7天。將動物關養在每個通風籠3-5隻小鼠，其中滅菌食品塊及水瓶可供隨意使用。在研究開始之前對動物進行標記且稱重。
細胞培養 ：將經冷凍保存之NCI-N87細胞解凍且在含有必需補充劑之培養基中生長。細胞在用於活體內接種之前在完全培養基中再培養2個繼代。
腫瘤植入、入選方法及處理 ：將PBS中之細胞懸浮液與冰冷基質膠以1:1(體積：體積)混合至1.0×108 個細胞/毫升之最終濃度。皮下注射100 µL/小鼠之混合物。自植入後第3天開始，監測小鼠之臨床健康，其中體重及腫瘤藉由數位卡尺每週3次量測。
腫瘤量測及處理 ： 腫瘤體積(TV) (mm3 )係使用下式計算：W(mm) ×L(mm) ×D(mm) ×π/6。當腫瘤平均達到約100 mm3 時，將動物隨機分組為5隻/組。在200 µL體積之測試物品中靜脈內給予處理。在研究結束時，量測且記錄最終體重。
統計分析 ：對腫瘤體積及體重之資料進行描述性統計。藉由使用重複-量測雙向方差分析，隨後藉由Bonferroni事後檢定，將來自各處理組之動物腫瘤體積與對照組進行比較。另外，用相同統計分析進行各組內動物之腫瘤生長之比較。9.1.2 藥物動力學 (PK)
使用完整ADC分析及總抗體分析進行PK分析。總抗體係指所有物種之總和，包括結合及未結合之物種(亦即DAR0 + DAR1 + DAR2 + ……+ DARn)，而完整ADC係指所有結合物種(亦即DAR1 + DAR2 + ……+ DARn)。總抗體分析使用生物素標記之間皮素用於捕捉且使用AlexaFluor647標記之抗人類Fc用於偵測。完整ADC分析使用生物素標記之抗艾日布林5E4用於捕捉且AlexaFluor647標記之抗人類Fc用於偵測。用Gyros分析儀進行樣品分析。資料分析在WatsonLIMS 7.4.1中進行且繪製於電子表格軟體中。使用來自血漿、腫瘤及骨髓樣品之LC-MS定量艾日布林。9.1.3        LC-MS
將來自個別小鼠之20-50 µL MORAb-109(DAR2)血漿或50 µL來自MORAb-109(DAR6)給藥小鼠之相同彙集血漿用於分析。將戴諾磁珠M-280抗生蛋白鏈菌素(100 µL)與3 µg捕捉選擇人類IgG-Fc PK生物素結合物一起在室溫下培育1小時，接著用HBS-EP緩衝液洗滌。在HBS-EP緩衝液中稀釋之血漿樣品接著與複合/洗滌之珠粒混合以捕獲MORAb-109複合物，在室溫下培育1小時，接著在HBS-EP緩衝液中洗滌兩次。在37℃下用含快速PNGaseF(1 µL)之PNGase緩衝液使含有複合物之經洗滌珠粒去糖基化1小時，隨後在HBS-EP緩衝液中洗滌一次。用10%乙腈w/0.1%甲酸(30 µL)溶離所捕捉/去糖基化MORAb-109。用Synapt G2/M類UPLC分析分析樣品之完整或減少的質量。9.2 結果
圖23A及圖23B分別顯示在用10 mg/kg之MORAb-109(DAR2或DAR6)之單次給藥處理之人類胃癌NCI-N87異種移植模型中之抗腫瘤作用及體重變化。
MORAb-109(DAR2)、MORAb-109(DAR6)及未結合抗體之PK分析展示於表27中。未結合及MORAb-109(DAR2)之總抗體類似，而MORAb-109(DAR6)較低，表明MORAb-109(DAR2)在循環中穩定。
來自血漿樣品之ADC的DAR分析指示，對於DAR6物種而言，有效負載釋放速率較高且引起艾日布林之血漿含量較高(圖24A及24B;表28及29)。表 27. 在 NCI-N87 腫瘤攜帶小鼠中 MORAb-109(DAR2 及 DAR6) 之 PK 概況
DAR2
參數 單位 ADC 總Ab 血漿ERI 腫瘤ERI 骨髓ERI
CLtot mL/hr/kg 0.71 N/A N/A N/A N/A
Vd ss mL/kg 121 N/A N/A N/A N/A
AUC0 -inf mg×hr/mL 14.2 20.9 44.0 (ng×hr/mL) 17.8 (μg×hr/mL) 9.9 (μg×hr/mL)
Tmax hr N/A 0.17 0.17 24 1
Cmax μg/mL N/A 137 0.65 (ng/mL) 64 (ng/g) 121 (ng/g)
T1/2 hr 134 191 59 162 151
DAR6
CLtot mL/hr/kg 0.73 N/A N/A N/A N/A
Vd ss mL/kg 100 N/A N/A N/A N/A
AUC0 -inf mg×hr/mL 13.7 14.4 121 (ng×hr/mL) 16.0 (μg×hr/mL) 6.7 (μg×hr/mL)
Tmax hr N/A 0.17 1 24 3
Cmax μg/mL N/A 148 2.6 (ng/mL) 96 (ng/g) 94 (ng/g)
T1/2 hr 103 129 33 98 76
裸Ab  
CLtot mL/hr/kg    0.54  
Vd ss mL/kg    126  
AUC0 -inf mg×hr/mL    18.5  
Cmax μg/mL    183  
T1/2 hr    164  
表 28. 血漿中 MORAb-109 (DAR2) 之 DAR
小時 1 2 3 平均 DAR
0.167 1.92 1.93 1.94 1.93
8 1.88 1.86 1.92 1.89
24 1.83 1.86 1.90 1.86
48 1.87 1.82 1.83 1.84
96 1.83 1.65 1.78 1.75
168 1.69 1.75 1.63 1.69
336 1.38 1.54 1.64 1.52
504 1.08 1.18 1.63 1.30
表 29. 血漿中 MORAb-109 (DAR6) 之 DAR
時間(小時) 輕鏈 重鏈 平均 DAR
0.167 1.52 1.23 5.52
8 1.46 1.13 5.18
24 1.26 0.81 4.15
48 1.25 0.71 3.91
96 1.27 0.44 3.42
168 0.93 0.38 2.61
336 0.86 0.35 2.41
504 N.D. N.D. N.A.
實例10：345A12 HC15 LC4與阿內圖單抗結合親和力之比較10.1 方法
抗體 ：345A12 HC15 LC4(MORAb-109中之抗間皮素抗體)及阿內圖單抗。針對阿內圖單抗之序列，人類抗間皮素抗體闡述於表30中。
結合親和力 ：在BIAcore T-100儀器上之HBS-P+緩衝液中進行結合量測。在HBS-P+中將抗體稀釋至1 µg/mL。在室溫下將樣品以14,000×g離心5分鐘，且隨後將上清液轉移至新的1.5 mL BIAcore管中且加蓋。將間皮素(50 µg)在1xHBS-P+緩衝液中稀釋至100 nM，接著在BIAcore管中以100、20、4、0.8及0.16 nM連續稀釋5倍且加蓋。根據製造商之方案使用具有固定嚮導之CM5晶片製備抗人類抗體捕捉晶片。在HBS-P+中，最終捕捉抗體水準為8000-9000 RU。製備晶片用於分析，其中五個循環為300秒緩衝液注射，接著為30秒再生，所有循環均在30 µL/min下跨越所有四個流動池。
藉由以10 µL/min依序注射個別配體溶液90秒，在流動池2-4上捕獲抗體。以單一循環動力學方式如下進行分析物注射：各自以30 µL/min依序注射自低變高濃度之分析物溶液240秒。偵測為2-1、3-1、4-1。藉由相同配體捕捉注射之序列進行雙重參考，隨後各自進行5次僅緩衝液注射持續240秒，解離1800秒且如上所述再生。一式兩份地分析所有配體與間皮素之結合。使用BIAEvaluations軟體使用1:1 Langmuir擬合模型進行動力學分析。自重複操作平均化締合速率、解離速率及親和力常數。10.2 結果
345A12 HC15 LC4呈現比阿內圖單抗高40倍之親和力(表31)。345A12 HC15 LC4保持與食蟹獼猴間皮素之結合親和力，而阿內圖單抗不與食蟹獼猴間皮素結合。較低抗體結合大鼠間皮素。表 30. 阿內圖單抗序列
IgG 鏈 NA/AA SEQ ID 序列
重鏈 胺基酸 51 QVELVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQAPGKGLEWMGIIDPGDSRTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGQLYGGTYMDGWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
核酸 52 CAGGTTGAACTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCTGGCGAGAGCCTGAAGATCAGCTGCAAAGGCAGCGGCTACAGCTTCACCAGCTATTGGATCGGCTGGGTTCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGATGGGAATCATCGACCCCGGCGACAGCAGAACCAGATACAGCCCTAGCTTTCAGGGCCAAGTGACCATCAGCGCCGACAAGAGCATCAGCACAGCCTACCTGCAGTGGTCTAGCCTGAAAGCCAGCGACACCGCCATGTACTATTGTGCCAGAGGCCAGCTGTACGGCGGCACCTATATGGATGGATGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTGTCTAGCGCCTCTACAAAGGGCCCTAGCGTTTTCCCACTGGCTCCTAGCAGCAAGAGCACATCTGGTGGAACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGATTACTTTCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGCGGAGCACTGACAAGCGGCGTGCACACATTTCCAGCTGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCTCTGTCTAGCGTCGTGACAGTGCCTAGCAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAACTGCTCGGCGGACCCTCCGTTTTCCTGTTTCCACCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCTGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCCAGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCAAGAGAACCCCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCAGGGACGAGCTGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGACCTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAAAGCCTGTCTCTGAGCCCCGGCAAA
輕鏈 胺基酸 53 DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDIGGYNSVSWYQQHPGKAPKLMIYGVNNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYDIESATPVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKGDSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 
核酸 54 GATATTGCTCTGACACAGCCTGCCAGCGTGTCCGGATCTCCTGGCCAGAGCATCACAATCAGCTGTACCGGCACAAGCAGCGACATCGGCGGCTACAATAGCGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCCGGAAAGGCCCCTAAGCTGATGATCTACGGCGTGAACAACAGACCCAGCGGCGTGTCCAATAGATTCAGCGGCAGCAAGAGCGGCAATACCGCCTCTCTGACAATTAGCGGACTGCAGGCCGAGGACGAGGCCGATTACTACTGCAGCAGCTACGACATCGAGAGCGCCACACCTGTGTTTGGCGGCGGAACAAAACTGACAGTGCTGGGCCAACCTAAGGCCGCTCCTAGCGTTACACTGTTCCCACCTAGCAGCGAGGAACTGCAGGCTAACAAGGCCACACTCGTGTGCCTGATCAGCGATTTTTACCCTGGCGCCGTGACAGTGGCCTGGAAAGGCGATAGTTCTCCTGTGAAGGCCGGCGTGGAAACCACCACACCTAGCAAGCAGAGCAACAACAAATACGCCGCCAGCTCCTACCTGAGCCTGACACCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGATCCTACAGCTGCCAAGTGACCCACGAGGGCAGCACCGTGGAAAAAACAGTGGCCCCTACCGAGTGCAGC
表 31.345A12 HC15 LC4 及阿內圖單抗與人類、食蟹獼猴及大鼠間皮素之結合
      ka (M-1 sec-1 ) kd (sec-1 ) Kd (M)
人類 345A12 HC15 LC4阿內圖單抗 1.46 ±0.05 x 106 2.85 ±0.14 x 10-4 1.95 ±0.16 x 10-10
1.68 ±0.64 x 105 1.12 ±1.00 x 10-3 7.26 ±2.29 x 10-9
食蟹獼猴 345A12 HC15 LC4阿內圖單抗 1.05 ±1.15x 104 7.51 ±5.76 x 10-4 8.86 ±5.16 x 10-8
未結合 未結合 未結合
大鼠 345A12 HC15 LC4阿內圖單抗 未結合 未結合 未結合
未結合 未結合 未結合
實例11：MORAb-109與BAY 94-9343活體外效能之比較11.1 方法
ADC ：評估MORAb-109 (DAR2及DAR6)及阿內圖單抗拉夫坦辛(ravtansine)(BAY 94-9343)。亦稱作BAY 94-9343之阿內圖單抗拉夫坦辛為ADC，其包含經由含二硫化物連接子(可還原SPDB連接子[丁酸4-(2-吡啶基二硫基)N-丁二醯亞胺酯])與類美登素微管蛋白抑制劑DM4結合之阿內圖單抗。BAY 94-9343如實例15中所述產生。
細胞毒性 ：將細胞繼代培養且以5,000個細胞/孔接種於96孔組織培養盤中之完全生長培養基中，且在37℃，5% CO2 下培育隔夜(16小時)。以200 nM起始，在2 mL深孔稀釋盤中以1:3連續稀釋測試試劑(總共10個稀釋液)。將經稀釋之樣品(100 µL)添加至細胞培養盤中(以100 nM之測試樣品之起始濃度)。在37℃，5% CO2 下再培育培養盤5天。接著丟棄培養基，且將盤用200 µL DPBS洗滌一次，在室溫下用50 µL之0.2%結晶紫溶液染色15 min，且隨後用自來水充分洗滌。將培養盤風乾，且用200 µL 1% SDS溶液溶解結晶紫。在570 nm下讀取培養盤。使用GraphPad Prism 6分析IC50 測定之資料。11.2 結果
MORAb-109 (DAR2及DAR6)展示對MSLN-陽性細胞株之特異性細胞毒性(表32)。相比之下，BAY 94-9343表明對MSLN陽性及MSLN陰性細胞株之殺滅，表明不佳有效負載穩定性。表 32.MSLN+ 及 MSLN- 細胞株上活體外活性之比較
   基於細胞之活體外效能 ，IC50，nM
   OVCAR3-A1 NCI-H1568/MSLN NCI-H292 BxPC3 A431 SKOV3
MORAb109_DAR2 0.01 2.17 ＞300 88.24 109.30 213.80
MORAb109_DAR6 0.02 1.09 4.80 2.66 20.12 21.77
艾日布林 0.02 0.14 0.11 0.13 0.18 0.14
                    
BAY 94-9343 0.41 0.15 3.07 2.53 5.31 0.31
DM4 0.10 0.57 0.24 0.57 0.71 0.28
阿內圖單抗 ＞100 ＞100 ＞300 ＞300 ＞300 ＞300
           
   最大殺滅 %
MORAb109_DAR2 98.39 73.49 58.22 90.62 84.97 58.41
MORAb109_DAR6 98.47 77.89 75.34 94.63 90.76 72.79
艾日布林 99.31 74.39 85.37 97.28 93.04 72.82
                    
BAY 94-9343 100.00 75.10 84.15 97.33 96.82 74.99
DM4 100.00 77.49 92.40 97.98 92.52 81.89
阿內圖單抗 19.80 5.50 15.15 25.73 18.58 31.55
                    
MSLN表現(MFI) 220.0 4474.00 108.6 15.59 5.6 20
實例12：MORAb-109與BAY 94-9343特異性之比較12.1 方法
細胞毒性 ：將細胞繼代培養且以5,000個細胞/孔接種於96孔組織培養盤中之完全生長培養基中，且在37℃，5% CO2 下培育隔夜(16小時)。以200 nM起始，在2 mL深孔稀釋盤中以1:3連續稀釋測試試劑(總共10個稀釋液)。將經稀釋之樣品(100 µL)添加至細胞培養盤中(以100 nM之測試樣品之起始濃度)。在37℃，5% CO2 下再培育培養盤5天。接著丟棄培養基，且將盤用200 µL DPBS洗滌一次，在室溫下用50 µL之0.2%結晶紫溶液染色15 min，且隨後用自來水充分洗滌。將培養盤風乾，且用200 µL 1% SDS溶液溶解結晶紫。在570 nm下讀取培養盤。使用GraphPad Prism 6分析IC50 測定之資料。12.2 結果
藉由未結合抗體之細胞毒性分析證實藉由MORAb-109(DAR2)(圖25A)而非BAY 94-9343(圖25B)之表現間皮素之細胞的特異性殺滅。 實例13：MORAb-109與BAY 94-9343 ADCC活性之比較13.1 方法
將表現MSLN之CHO細胞解凍且在完全RPMI-4% Ultralow IgG FBS中在96孔組織培養盤中以1,000個細胞/孔(25 µL)接種。將測試試劑(345A12抗體、MORAb-109(DAR2)及BAY 94-9343)以20 µg/mL為起始在完整的RPMI-4% ultra-low IgG FBS中以1:2.5連續稀釋，隨後轉移(25 µL)至細胞培養盤，且在37℃及5% CO2 下培育60分鐘。將6,000 Jurkat效應細胞(Promega)解凍且添加(25 µL)至細胞培養盤中，且培養盤在37℃，5% CO2 下培育18-22小時。
使螢光素酶分析試劑在暗處解凍。將75 µL螢光素酶分析試劑添加至各孔中，培養盤在培養盤震盪器上震盪30秒。培育5分鐘後，在光度計上讀取培養盤。13.2 結果
MORAb-109 (DAR2)及345A12 HC15 LC4具有類似ADCC活性(圖26A及表33)，而與阿內圖單抗相比，BAY 94-9343具有較弱ADCC活性(圖26B及表34)。 表33.ADCC活性-MORAb-109及345A12 HC15 LC4
345A12 MORAb-109
100% 96.9%
表34.ADCC活性-BAY 94-9343及阿內圖單抗
阿內圖單抗 BAY 94-9343
100% 65.06%
實例14：基質中MORAb-109及BAY 94-9343之穩定性14.1 方法
在人類或小鼠血漿中以0.1 mg/mL製備抗MSLN ADC，樣品在37℃下培育0、24、48、72、96及240小時，接著在達到時間點時轉移至-80℃以儲存。所有樣品解凍至環境溫度且以1:100稀釋用於測試。DAR敏感性穩定性分析在Gyrolab上以逐步夾層形式發展。在阻斷及樣品結合之後，分析使用生物素標記之間皮素用於捕獲，且使用Alexa Fluor 647抗艾日布林5E4 Fab或Alexa Fluor 647抗DM4 (Levena Biopharma)用於偵測。用MORAb-109及BAY 94-9343製得標準曲線及品質對照。14.2 結果
在人類及小鼠血漿中，MORAb-109 (DAR2)比BAY 94-9343更穩定(圖27)。 實例15：MORAb-109及BAY 94-9343在人類胃癌(NCI-N87)異種移植模型中之抗腫瘤功效15.1 方法 15.1.1 產生 BAY 94-9343
BAY 94-9343為ADC，其包含經由含二硫化物連接子(可還原SPDB連接子[丁酸4-(2-吡啶基二硫基)N-丁二醯亞胺酯])與類美登素微管蛋白抑制劑DM4結合之阿內圖單抗。來自阿內圖單抗之序列獲自Beacon資料庫(Hanson-Wade)。由重疊寡核苷酸產生抗體序列(表30)，進行PCR擴增，選殖至表現質體中，且進行序列確認。在293F細胞中產生穩定池且使細胞生長直至存活率＜30%。使用蛋白A親和層析自改良性培養基純化阿內圖單抗。藉由與SPDB-DM4(Levena BioPharma)之賴氨酸反應性結合產生BAY 94-9343，以獲得為3.7之DAR。藉由去鹽層析法移除未結合的有效負載。15.1.2 活體內功效
動物 ：在出現時達5週齡之雌性NCr裸鼠(Taconic)在接種之前適應5-7天。將動物關養在每個通風籠3-5隻小鼠，其中滅菌食品塊及水瓶可供隨意使用。在研究開始之前對動物進行標記且稱重。
細胞培養 ：將經冷凍保存之NCI-N87細胞解凍且在含有必需補充劑之培養基中生長。細胞在用於活體內接種之前在完全培養基中再培養2個繼代。
腫瘤植入、入選方法及處理 ：將於PBS中之細胞懸浮液以1:1(體積：體積)與冰冷基質膠混合至最終濃度為1.0×108 個細胞/mL。皮下注射100 µL/小鼠之混合物。自植入後第3天開始，監測小鼠之臨床健康，其中體重及腫瘤藉由數位卡尺每週3次量測。
腫瘤量測及處理 ： 腫瘤體積(TV) (mm3 )係使用下式計算：W(mm) ×L(mm) ×D(mm) ×π/6。當腫瘤平均達到約100 mm3 時，將動物隨機分組為5隻/組。在200 µL體積之測試物品中靜脈內給予處理。在研究結束時，量測且記錄最終體重。
統計分析 ：對腫瘤體積及體重之資料進行描述性統計。藉由使用重複-量測雙向方差分析，隨後藉由Bonferroni事後檢定，將來自各處理組之動物腫瘤體積與對照組進行比較。另外，用相同統計分析進行各組內動物之腫瘤生長之比較。15.2 結果
MORAb-109 (DAR2)及BAY 94-9343均展示在NCI-N87腫瘤攜帶小鼠中之類似功效(圖28A)。任一組中未觀測到體重損失(圖28B)。 實例16：MORAb-109及BAY 94-9343在人類間皮瘤(HAY)異種移植模型中之抗腫瘤功效16.1 方法
動物 ：在出現時5週齡之雌性NOD.CB17-SCID小鼠(Jackson實驗室)在接種之前適應5-7天。將動物關養在每個通風籠3-5隻小鼠，其中滅菌食品塊及水瓶可供隨意使用。在研究開始之前對動物進行標記且稱重。
細胞培養 ：將經冷凍保存之HAY細胞解凍且在含有必需補充劑之培養基中生長。細胞在用於活體內接種之前在完全培養基中再培養2個繼代。
腫瘤植入、入選方法及處理 ：將於PBS中之細胞懸浮液以1:1(體積：體積)與冰冷基質膠混合至最終濃度為5.0×107 個細胞/mL。皮下注射100 µL/小鼠之混合物。自植入後第3天開始，監測小鼠之臨床健康，其中體重及腫瘤藉由數位卡尺每週3次量測。
腫瘤量測及處理 ： 腫瘤體積(TV) (mm3 )係使用下式計算：W(mm) ×L(mm) ×D(mm) ×π/6。當腫瘤平均達到約100 mm3 時，將動物隨機分組為5隻/組。在200 µL體積之測試物品中靜脈內給予處理。在研究結束時，量測且記錄最終體重。
統計分析 ：對腫瘤體積及體重之資料進行描述性統計。藉由使用重複-量測雙向方差分析，隨後藉由Bonferroni事後檢定，將來自各處理組之動物腫瘤體積與對照組進行比較。另外，用相同統計分析進行各組內動物之腫瘤生長之比較。16.2 結果
MORAb-109(DAR2)及BAY 94-9343均展示在HAY腫瘤攜帶小鼠中之類似功效(圖29A)。任一組中未觀測到體重損失(圖29B)。 實例17：MORAb-109及BAY 94-9343在人類間皮瘤PDX模型(Meso7212)中之抗腫瘤功效17.1 方法
動物 ：在出現時5至6週齡之NMRI nu/nu雌性小鼠(Janvier實驗室)在接種之前適應至少4天。將動物關養在每個通風籠3-5隻小鼠，其中滅菌食品塊及水瓶可供隨意使用。在研究開始之前對動物進行標記且稱重。
異種移植 ：在研究第0天，在無菌條件下自五隻供體小鼠移除Meso 7212腫瘤。將腫瘤組織切割成2×2 mm片段且置放於覆蓋有0.9%生理食鹽水之無菌皮氏培養皿中。同時，受體動物用Metacam®(2 mg/kg)進行皮下止痛處理，且隨後藉由單次靜脈內注射(0.15 mL/小鼠)用Etomidat-Lipuro®(12 mg/kg)麻醉。在左側腰窩上在皮膚中形成5-8 mm之表面豎直切口。將外科剪刀之尖端直接在側腹上插入至切口中，且用於在皮下空間中形成凹穴。使用手術鑷子將每個小鼠一個腫瘤片段植入凹穴中。最後，用金屬夾子封閉切口且將動物放回乾淨籠子中。
實驗程序 ：在異種移植之後，藉由觸診控制小鼠中腫瘤之移植及傳播至少每週兩次。當腫瘤可觸知時，用數位卡尺(Mitutoyo)進行腫瘤直徑之量測。
在處理開始前，根據動物之腫瘤體積(腫瘤體積之納入標準，0.1-0.3 cm3 )將動物隨機分配至實驗組中。自第一次處理日開始，每週兩次記錄腫瘤體積及體重。每日兩次控制動物福利。
處理 ：所有試劑在隨機分組當天以單次劑量靜脈內投與。對照組中之動物以相同方式用DPBS處理。
統計分析 ：對腫瘤體積及體重之資料進行描述性統計。藉由使用重複-量測雙向方差分析，隨後藉由Bonferroni事後檢定，將來自各處理組之動物腫瘤體積與對照組進行比較。另外，亦用相同統計分析進行各組內動物之腫瘤生長之比較。17.2 結果
MORAb-109 (DAR2)及BAY 94-9343均展示在Meso7212腫瘤攜帶小鼠中之腫瘤消退(圖30A)。任一組中未觀測到體重損失(圖30B)。 實例18：MORAb-109及BAY 94-9343在人類NSCLC PDX模型(LXFA-586)中之抗腫瘤功效18.1 方法
動物 ：4至6週齡之雌性NMRI nu/nu小鼠。
異種移植 ：將LXFA-586確定為來自原發性非小細胞肺腺癌人類患者之生長腫瘤(T2N1M0)。
實驗程序 ：監測動物直至腫瘤植入物在足夠數目之動物中達到50-250 mm3 (例如80-200 mm3 )之研究體積標準。將小鼠分配至群組，以相當的組中值及平均腫瘤體積為目標。分配至組之方法(登記、分層隨機化)亦可稱作隨機化。將隨機化的一天表示為實驗之第0天。
處理 ：在4組各6至7隻小鼠中評估功效： ●  在第1組中，在第1天以5 mL/kg靜脈內單次劑量給藥媒劑。 ●  在第2組中，在第1天以25 mg/kg靜脈內單次劑量給藥BAY 94-9343 (DAR約4)。 ●  在第3組中，在第1天以25 mg/kg靜脈內單次劑量給藥MORAb-109 (DAR2)。 ●  在第4組中，在第1天以3.2 mg/kg靜脈內單次劑量給藥艾日布林。
量測腫瘤且在實驗時段期間一週兩次稱重小鼠。在隨機之一天(第0天)後，給藥第一天為第1天。18.2 結果
在LXFA-586 NSCLC PDX模型中，MORAb-109(DAR2)證實在25 mg/kg下穩定抗腫瘤功效(最小T/C，在第41天為1.8%) (圖31A)且其Tq在研究期間未達到。在單次劑量下給定之MORAb-109亦具有良好耐受性，而無藉由攜帶LXFA-586腫瘤之小鼠之體重損失(圖31B)。
在LXFA-586 NSCLC PDX模型中，BAY 94-9343 (DAR約4)證實在25 mg/kg下類似於MORAb-109之穩定抗腫瘤功效(圖31A)且其Tq在研究期間未達到。然而，BAY 94-9343中DM4有效負載之莫耳量約為MORAb-109中艾日布林有效負載之量的兩倍。
攜帶LXFA-586腫瘤之小鼠對藉由靜脈內途徑以3.2 mg/kg之單次劑量(小鼠MTD劑量或當以10 mg/kg投與時高於MORAb-109中艾日布林之莫耳量的32倍)給予之艾日布林具有良好耐受性，且顯示抗腫瘤功效(最低T/C，在第21天為14.8%)。然而，在投與之後，艾日布林誘發輕微及瞬時體重減輕(圖31A及圖31B)。 實例19：MORAb-109及BAY 94-9343在人類NSCLC PDX模型(LXFA-529)中之抗腫瘤功效19.1 方法
動物 ：4至6週齡之雌性NMRI nu/nu小鼠。
異種移植 ：將LXFL-529確定為來自原發性非小細胞肺腺癌人類患者之生長腫瘤(T3N1M0)。
實驗程序 ：監測動物直至腫瘤植入物在足夠數目之動物中達到50-250 mm3 (例如80-200 mm3 )之研究體積標準。將小鼠分配至群組，以相當的組中值及平均腫瘤體積為目標。分配至組之方法(登記、分層隨機化)亦可稱作隨機化。將隨機化的一天表示為實驗之第0天。
處理 ：在6組各6至7隻小鼠中評估功效： ●  在第1組中，在第1天以5 mL/kg靜脈內單次劑量給藥媒劑。 ●  在第2組中，在第1天以12.5 mg/kg靜脈內單次劑量給藥BAY 94-9343(DAR約4)。 ●  在第3組中，在第1天以3.2 mg/kg靜脈內單次劑量給藥艾日布林。 ●  在第4組中，在第1天以25 mg/kg靜脈內單次劑量給藥MORAb-109 (DAR2)。 ●  在第5組中，在第1天以12.5 mg/kg靜脈內單次劑量給藥MORAb-109 (DAR2)。 ●  在第6組中，在第1、8及16天以12.5 mg/kg靜脈內劑量給藥MORAb-109 (DAR2)。
量測腫瘤且在實驗時段期間一週兩次稱重小鼠。在隨機之一天(第0天)後，給藥第一天為第1天。19.2 結果
MORAb-109(DAR2)展現在LXFL-529 NSCLC PDX模型中在12.5及25 mg/kg下之穩定抗腫瘤功效(圖32A)。在單次劑量下給定之MORAb-109亦具有良好耐受性，而無藉由攜帶LXFL-529腫瘤之小鼠之體重損失(圖32B)。
然而，以12.5 mg/kg之BAY 94-9343 (DAR約4)(DM4有效負載之等效莫耳量作為以25 mg/kg之MORAb-109中艾日布林有效負載的量)證實無抗腫瘤功效(圖32A)。
攜帶LXFL-529腫瘤之小鼠對藉由靜脈內途徑以3.2 mg/kg之單次劑量(小鼠MTD劑量)給予之艾日布林具有良好耐受性且展示抗腫瘤功效。然而，在投與之後，艾日布林誘發輕微及瞬時體重減輕(圖32A及圖32B)。
圖1顯示藉由流式細胞量測術偵測針對人類間皮素之免疫血清的特異性反應性。
圖2顯示藉由ELISA偵測培養物上清液對人類間皮素之特異性反應性。
圖3顯示藉由凝膠電泳進行的抗間皮素抗體之In-Fusion PCR擴增。
圖4顯示用於In-Fusion克隆及表現之抗間皮素純系。
圖5顯示經純化之48個Rb-hu-xi抗間皮素抗體之概述。
圖6展示針對抗間皮素-AuF結合物之基於活體外細胞之效能結果。
圖7顯示抗間皮素抗體之抗原決定基分組表徵。
圖8顯示人類化345A12抗體之DSC分析結果。使用100℃/小時之掃描速率在25-100℃範圍內對345A12F(ab')2片段進行熱分析。
圖9顯示MORAb-109(345A12-HC15-LC4-VCP-艾日布林) (DAR2)在各種基質中之穩定性。
圖10A及圖10B顯示在用2.5 mg/kg之345A12-HC1-LC2-diOH艾日布林二聚體ADC或2.5 mg/kg之102A6A2-HC1-LC2-diOH艾日布林二聚體ADC處理之人類非小細胞肺癌(NSCLC) NCI-H2110異種移植模型中之抗腫瘤作用(圖10A)及體重變化(圖10B)(研究M109-004-2016)。
圖11A及圖11B顯示用345A12-HC1-LC2-diOH艾日布林二聚體ADC(5、10、15或20 mg/kg)(圖11A)或345A12-HC15-LC4-diOH艾日布林二聚體ADC(5、10或20 mg/kg) (圖11B)處理之雌性CD-1小鼠之體重變化(研究M109-006-2017)。
圖12A及圖12B顯示在用2.5 mg/kg之345A12-HC10-LC4-diOH艾日布林二聚體ADC或2.5 mg/kg之345A12-HC15-LC4-diOH艾日布林二聚體ADC處理之人類NSCLC NCI-H2110異種移植模型中之抗腫瘤作用(圖12A)及體重變化(圖12B)(研究M109-007-2017)。
圖13A及圖13B顯示在用MORAb-109(DAR2或DAR6)處理之人類胃癌NCI-N87異種移植模型中之抗腫瘤作用(圖13A)及體重變化(圖13B)(研究M109-010-2018)。
圖14A及圖14B顯示在用MORAb-109(DAR2或DAR6)或艾日布林處理之人類間皮瘤HAY異種移植模型中之抗腫瘤作用(圖14A)及體重變化(圖14B)(研究M109-010-2018)。
圖15A及圖15B顯示在用MORAb-109(DAR6)或艾日布林處理之人類間皮瘤PDX模型(Meso7212)中之抗腫瘤作用(圖15A)及體重變化(圖15B)。
圖16A及圖16B顯示在用MORAb-109或艾日布林之不同DAR物種處理之人類間皮瘤PDX模型(Meso7212)中之抗腫瘤作用(圖16A)及體重變化(圖16B)。
圖17顯示不同細胞株中間皮素(MSLN)表現與艾日布林及MORAb-109(DAR2及DAR6)之活體外效能(IC50 )之間的相關性分析。在所有51個細胞株及具有更高間皮素表現量(平均螢光強度(MFI)等於或＞80之FACS染色)之細胞株子組中分析MORAb-109(DAR2)之相關性。子組排除具有較低間皮素表現量之細胞株(MFI＜80之FACS染色)。
圖18A-C顯示在用5 mg/kg至25 mg/kg範圍內之不同劑量之MORAb-109(DAR2)處理之人類胃癌NCI-N87異種移植模型中之抗腫瘤作用(圖18A及圖18B)及體重變化(圖18C)。
圖19展示在以5 mg/kg至25 mg/kg範圍內之不同劑量之MORAb-109(DAR2)處理後，具有NCI-N87腫瘤之小鼠中之總及完整MORAb-109(DAR2)之濃度(µg/mL)。
圖20A及圖20B顯示在用MORAb-109(DAR2) (5 mg/kg)或艾日布林(0.1或3.2 mg/kg)處理之人類卵巢癌OVCAR-3-A1-T1異種移植模型中之抗腫瘤作用(圖20A)及體重變化(圖20B)。
圖21A及圖21B顯示在用MORAb-109(DAR2) (10 mg/kg)或艾日布林(0.1或3.2 mg/kg)處理之人類NSCLC PDX模型(LC-F-25)中之抗腫瘤作用(圖21A)及體重變化(圖21B)。
圖22A及圖22B顯示在用MORAb-109(DAR2) (10 mg/kg)或艾日布林(0.2或3.2 mg/kg)處理之人類NSCLC PDX模型(LXFA-737)中之抗腫瘤作用(圖22A)及體重變化(圖22B)。
圖23A及圖23B顯示在用單次劑量之10 mg/kg之MORAb-109(DAR2或DAR6)(3隻小鼠/組)處理之人類胃癌NCI-N87異種移植模型中之抗腫瘤作用(圖23A)及體重變化(圖23B)。
圖24A及圖24B顯示在用單次劑量之10 mg/kg之MORAb-109(DAR2或DAR6)處理後，來自攜帶NCI-N87腫瘤之小鼠的血漿樣品中之MORAb-109(DAR2)(圖24A)或MORAb-109(DAR6)(圖24B)之DAR。
圖25A及圖25B顯示在NCI-N87胃癌細胞上之MORAb-109(DAR2)(圖25A)或BAY 94-9343(圖25B)之細胞毒性(殺滅%)。單獨且在未結合抗體存在下評估抗MSLN ADC。
如藉由螢光素酶分析所量測，圖26A及圖26B展示MORAb-109(DAR2)及345A12-HC15-LC4(圖26A)或BAY 94-9343及阿內圖單抗(anetumab)(圖26B)之ADCC活性。藉由相對的曲線下面積(AUC)計算ADCC活性。
圖27顯示小鼠及人類血漿中抗MSLN ADC、MORAb-109(DAR2)及BAY 94-9343之穩定性分析。
圖28A及圖28B顯示在用MORAb-109(DAR2) (5 mg/kg)、BAY 94-9343(5 mg/kg)或艾日布林(1 mg/kg)處理之人類胃癌NCI-N87異種移植模型中之抗腫瘤作用(圖28A)及體重變化(圖28B)。
圖29A及圖29B顯示在用MORAb-109(DAR2)(5 mg/kg)、BAY 94-9343(5 mg/kg)或艾日布林(1 mg/kg)處理之人類間皮瘤HAY異種移植模型中之抗腫瘤作用(圖29A)及體重變化(圖29B)。
圖30A及圖30B顯示在用MORAb-109(DAR2) (10 mg/kg)、BAY 94-9343(10 mg/kg)、艾日布林(1 mg/kg)或DM4(0.3 mg/kg)處理之人類間皮瘤PDX模型(Meso7212)中之抗腫瘤作用(圖30A)及體重變化(圖30B)。
圖31A及圖31B顯示在用MORAb-109(DAR2) (25 mg/kg)、BAY 94-9343 (DAR約4) (25 mg/kg)或艾日布林(3.2 mg/kg)處理之人類NSCLC PDX模型(LXFA-586)中之抗腫瘤作用(圖31A)及體重變化(圖31B)。
圖32A及圖32B顯示在用MORAb-109 (DAR2) (25 mg/kg)、MORAb-109 (DAR2) (12.5 mg/kg)、MORAb-109 (DAR2) (12.5 mg/kg，每週一次×3)、BAY 94-9343 (DAR約4) (12.5 mg/kg)或艾日布林(3.2 mg/kg)處理之人類NSCLC PDX模型(LXFL-529)中之抗腫瘤作用(圖32A)及體重變化(圖32B)。
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Claims (116)

  1. 一種經分離抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段能夠結合至間皮素且包含：三個重鏈互補決定區，其包含SEQ ID NO:1 (HCDR1)、SEQ ID NO:2 (HCDR2)及SEQ ID NO:3 (HCDR3)之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區，其包含SEQ ID NO:4 (LCDR1)、SEQ ID NO:5 (LCDR2)及SEQ ID NO:6 (LCDR3)之胺基酸序列，如藉由Kabat編號系統所定義；或三個重鏈互補決定區，其包含SEQ ID NO:7 (HCDR1)、SEQ ID NO:8 (HCDR2)及SEQ ID NO:9 (HCDR3)之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區，其包含SEQ ID NO:10 (LCDR1)、SEQ ID NO:11 (LCDR2)及SEQ ID NO:12 (LCDR3)之胺基酸序列，如藉由IMGT編號系統所定義。
  2. 一種經分離抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段能夠結合至間皮素且包含：三個重鏈互補決定區，其來自包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的重鏈可變區；及三個輕鏈互補決定區，其來自包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  3. 如請求項1或2之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含人類重鏈及輕鏈可變區框架，或具有一或多個回復突變之人類重鏈及輕鏈可變區框架。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含：重鏈可變區，其與SEQ ID NO:13之胺基酸序列至少90%一致；及輕鏈可變區，其與SEQ ID NO:14之胺基酸序列至少90%一致。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含人類IgG1重鏈恆定區及人類Ig κ輕鏈恆定區。
  7. 如請求項1至6中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列。
  8. 如請求項1至7中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列。
  9. 如請求項1至8中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含：重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列。
  10. 如請求項1至9中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含：重鏈，其包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列；及輕鏈，其包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列。
  11. 如請求項1至10中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段與治療劑結合。
  12. 如請求項11之抗體或抗原結合片段，其中該治療劑為艾日布林(eribulin)。
  13. 一種式(I)之抗體-藥物結合物， Ab-(L-D) p (I) 其中 Ab為抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段能夠結合至間皮素且包含：三個重鏈互補決定區，其包含SEQ ID NO:1 (HCDR1)、SEQ ID NO:2 (HCDR2)及SEQ ID NO:3 (HCDR3)之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區，其包含SEQ ID NO:4 (LCDR1)、SEQ ID NO:5 (LCDR2)及SEQ ID NO:6 (LCDR3)之胺基酸序列，如藉由Kabat編號系統所定義；或三個重鏈互補決定區，其包含SEQ ID NO:7 (HCDR1)、SEQ ID NO:8 (HCDR2)及SEQ ID NO:9 (HCDR3)之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區，其包含SEQ ID NO:10 (LCDR1)、SEQ ID NO:11 (LCDR2)及SEQ ID NO:12 (LCDR3)之胺基酸序列，如藉由IMGT編號系統所定義； D為艾日布林； L為將Ab共價連接至D之可裂解連接子；且p 為1至8之整數。
  14. 如請求項13之抗體-藥物結合物，其中p 為1至6之整數。
  15. 如請求項13或14之抗體-藥物結合物，其中p 為6。
  16. 如請求項13或14之抗體-藥物結合物，其中p 為2。
  17. 如請求項13至16中任一項之抗體-藥物結合物，其中該可裂解連接子包含可裂解部分，該可裂解部分經安置使得在裂解後不存在該連接子或該抗體或抗原結合片段之部分保持與艾日布林結合。
  18. 如請求項13至17中任一項之抗體-藥物結合物，其中該可裂解連接子包含可裂解肽部分。
  19. 如請求項18之抗體-藥物結合物，其中該可裂解肽部分可藉由酶裂解。
  20. 如請求項18或19之抗體-藥物結合物，其中該可裂解肽部分可藉由組織蛋白酶裂解。
  21. 如請求項18至20中任一項之抗體-藥物結合物，其中該可裂解肽部分可藉由組織蛋白酶B裂解。
  22. 如請求項13至21中任一項之抗體-藥物結合物，其中該可裂解肽部分或可裂解連接子包含胺基酸單元。
  23. 如請求項22之抗體-藥物結合物，其中該胺基酸單元包含纈胺酸-瓜胺酸(Val-Cit)。
  24. 如請求項13至23中任一項之抗體-藥物結合物，其中該可裂解連接子包含至少一個間隔子單元。
  25. 如請求項13至24中任一項之抗體-藥物結合物，其中該間隔子單元或可裂解連接子包含聚乙二醇(PEG)部分。
  26. 如請求項25之抗體-藥物結合物，其中該PEG部分包含-(PEG)m -，且m為1至10之整數。
  27. 如請求項26之抗體-藥物結合物，其中m為2。
  28. 如請求項24至27中任一項之抗體-藥物結合物，其中該間隔子單元經由順丁烯二醯亞胺(Mal)部分(「Mal-間隔子單元」)連接至該抗體或抗原結合片段。
  29. 如請求項28之抗體-藥物結合物，其中該Mal-間隔子單元經由該抗體或抗原結合片段上之半胱胺酸殘基接合至該抗體或抗原結合片段。
  30. 如請求項29之抗體-藥物結合物，其中根據Kabat編號系統，該半胱胺酸殘基為抗體或抗原結合片段上之輕鏈可變區之胺基酸位置80處的半胱胺酸殘基(「LCcys80」)。
  31. 如請求項30之抗體-藥物結合物，其中p 為2。
  32. 如請求項31之抗體-藥物結合物，其中各-L-D部分連接至該抗體或抗原結合片段上之LCcys80。
  33. 如請求項28至32中任一項之抗體-藥物結合物，其中該可裂解連接子包含該Mal-間隔子單元及可裂解肽部分。
  34. 如請求項33之抗體-藥物結合物，其中該可裂解肽部分包含Val-Cit。
  35. 如請求項28至34中任一項之抗體-藥物結合物，其中該Mal-間隔子單元將該抗體或抗原結合片段連接至該連接子中之該可裂解部分。
  36. 如請求項35之抗體-藥物結合物，其中該連接子中之該可裂解部分包含可裂解肽部分。
  37. 如請求項36之抗體-藥物結合物，其中該可裂解肽部分包含Val-Cit。
  38. 如請求項35至37中任一項之抗體-藥物結合物，其中該可裂解連接子包含Mal-(PEG)2 -Val-Cit。
  39. 如請求項24至38中任一項之抗體-藥物結合物，其中該連接子中之該可裂解部分直接接合至艾日布林，或其中間隔子單元將該連接子中之該可裂解部分連接至艾日布林。
  40. 如請求項39之抗體-藥物結合物，其中該結合物之裂解自該抗體或抗原結合片段及連接子釋放艾日布林。
  41. 如請求項39或40之抗體-藥物結合物，其中將該連接子中之該可裂解部分連接至艾日布林之該間隔子單元為自我分解型。
  42. 如請求項39至41中任一項之抗體-藥物結合物，其中將該連接子中之該可裂解部分連接至艾日布林之該間隔子單元包含對胺基苯甲氧基羰基(pAB)。
  43. 如請求項42之抗體-藥物結合物，其中該pAB將該連接子中之該可裂解部分連接至艾日布林。
  44. 如請求項42或43之抗體-藥物結合物，其中該pAB經由C-35胺共價連接至艾日布林。
  45. 如請求項39至44中任一項之抗體-藥物結合物，其中該連接子中之該可裂解部分包含可裂解肽部分。
  46. 如請求項45之抗體-藥物結合物，其中該可裂解肽部分包含Val-Cit。
  47. 如請求項45或46之抗體-藥物結合物，其中該可裂解連接子包含Val-Cit-pAB。
  48. 如請求項13至47中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段包含人類重鏈及輕鏈可變區框架，或具有一或多個回復突變之人類重鏈及輕鏈可變區框架。
  49. 如請求項13至48中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段包含：重鏈可變區，其與SEQ ID NO:13之胺基酸序列至少90%一致；及輕鏈可變區，其與SEQ ID NO:14之胺基酸序列至少90%一致。
  50. 如請求項13至49中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列。
  51. 如請求項13至50中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段包含人類IgG1重鏈恆定區。
  52. 如請求項13至51中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列。
  53. 如請求項13至52中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段包含人類Ig κ輕鏈恆定區。
  54. 如請求項13至53中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列。
  55. 如請求項13至54中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段包含：重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列。
  56. 如請求項13至55中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段包含：重鏈，其包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列；及輕鏈，其包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列。
  57. 一種式(I)之抗體-藥物結合物， Ab-(L-D) p (I) 其中 Ab為抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段能夠結合至間皮素且包含：三個重鏈互補決定區，其包含SEQ ID NO:1 (HCDR1)、SEQ ID NO:2 (HCDR2)及SEQ ID NO:3 (HCDR3)之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區，其包含SEQ ID NO:4 (LCDR1)、SEQ ID NO:5 (LCDR2)及SEQ ID NO:6 (LCDR3)之胺基酸序列，如藉由Kabat編號系統所定義；或三個重鏈互補決定區，其包含SEQ ID NO:7 (HCDR1)、SEQ ID NO:8 (HCDR2)及SEQ ID NO:9 (HCDR3)之胺基酸序列；及三個輕鏈互補決定區，其包含SEQ ID NO:10 (LCDR1)、SEQ ID NO:11 (LCDR2)及SEQ ID NO:12 (LCDR3)之胺基酸序列，如藉由IMGT編號系統所定義； D為艾日布林； L為包含Mal-(PEG)2 -Val-Cit-pAB之可裂解連接子；且p 為1至8之整數。
  58. 如請求項57之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段包含人類重鏈及輕鏈可變區框架，或具有一或多個回復突變之人類重鏈及輕鏈可變區框架。
  59. 如請求項57或58之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段包含：重鏈可變區，其與SEQ ID NO:13之胺基酸序列至少90%一致；及輕鏈可變區，其與SEQ ID NO:14之胺基酸序列至少90%一致。
  60. 如請求項57至59中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列。
  61. 如請求項57至60中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段包含人類IgG1重鏈恆定區及人類Ig κ輕鏈恆定區。
  62. 如請求項57至61中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段包含：重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列；及輕鏈恆定區，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列。
  63. 如請求項57至62中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段包含：重鏈，其包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列；及輕鏈，其包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列。
  64. 一種式(I)之抗體-藥物結合物， Ab-(L-D) p (I) 其中 Ab為抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段能夠結合至間皮素且包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列； D為艾日布林； L為包含Mal-(PEG)2 -Val-Cit-pAB之可裂解連接子；且p 為1至8之整數。
  65. 如請求項64之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段包含人類IgG1重鏈恆定區及人類Ig κ輕鏈恆定區。
  66. 如請求項64或65之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列。
  67. 如請求項64至66中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段包含：重鏈，其包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列；及輕鏈，其包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列。
  68. 如請求項57至67中任一項之抗體-藥物結合物，其中p 為1至6。
  69. 如請求項57至68中任一項之抗體-藥物結合物，其中p 為6。
  70. 如請求項57至68中任一項之抗體-藥物結合物，其中p 為2。
  71. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至12中任一項之抗體或抗原結合片段或如請求項13至70中任一項之抗體-藥物結合物及醫藥學上可接受之載劑。
  72. 如請求項71之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含該抗體、抗原結合片段或抗體-藥物結合物之多個拷貝。
  73. 如請求項71或72之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含該抗體-藥物結合物之多個拷貝，其中該組合物中該抗體-藥物結合物之平均值p 為約1至約6，視情況，該組合物中該抗體-藥物結合物之該平均值p 為約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2或約2.3。
  74. 如請求項73之醫藥組合物，其中該組合物中該抗體-藥物結合物之該平均值p 為約6。
  75. 如請求項73之醫藥組合物，其中該組合物中該抗體-藥物結合物之該平均值p 為約1.9或約2.0。
  76. 一種治療患有或疑似患有癌症之個體之方法，其包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至12中任一項之抗體或抗原結合片段、如請求項13至70中任一項之抗體-藥物結合物或如請求項71至75中任一項之醫藥組合物。
  77. 如請求項76之方法，其中該癌症表現間皮素。
  78. 如請求項76或77之方法，其中該癌症為間皮瘤、乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、甲狀腺癌、尿道上皮癌、子宮癌、膽管癌或白血病。
  79. 如請求項76至78中任一項之方法，其中該癌症為間皮瘤、肺癌、卵巢癌或胃癌。
  80. 如請求項76至79中任一項之方法，其中該癌症表現高等或中等程度之間皮素。
  81. 一種減少或減緩個體之癌細胞群體之生長的方法，其包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至12中任一項之抗體或抗原結合片段、如請求項13至70中任一項之抗體-藥物結合物或如請求項71至75中任一項之醫藥組合物。
  82. 如請求項81之方法，其中該癌細胞群體表現間皮素。
  83. 如請求項81或82之方法，其中該癌細胞群體為實體腫瘤或血液惡性病。
  84. 如請求項81至83中任一項之方法，其中該癌細胞群體為間皮瘤、乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、甲狀腺癌、尿道上皮癌、子宮癌、膽管癌或白血病。
  85. 如請求項81至84中任一項之方法，其中該癌細胞群體為間皮瘤、肺癌、卵巢癌或胃癌。
  86. 如請求項81至85中任一項之方法，其中該癌細胞群體表現高等或中等程度之間皮素。
  87. 如請求項81至86中任一項之方法，其中投與該抗體、抗原結合片段、抗體-藥物結合物或醫藥組合物使該癌細胞群體減少至少約10%、至少約20%、至少約50%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約99%。
  88. 如請求項81至87中任一項之方法，其中投與該抗體、抗原結合片段、抗體-藥物結合物或醫藥組合物使該癌細胞群體之生長減緩至少約10%、至少約20%、至少約50%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約99%。
  89. 一種確定患有或疑似患有癌症之個體是否將對用如請求項1至12中任一項之抗體或抗原結合片段、如請求項13至70中任一項之抗體-藥物結合物或如請求項71至75中任一項之醫藥組合物進行之治療有反應的方法，其包含提供來自該個體之生物樣品；使該樣品與該抗體或抗原結合片段接觸；及偵測該抗體或抗原結合片段與該樣品中之一或多種癌細胞之結合。
  90. 如請求項89之方法，其中該一或多種癌細胞表現間皮素。
  91. 如請求項89或90之方法，其中該癌症表現間皮素。
  92. 如請求項89至91中任一項之方法，其中該癌症為間皮瘤、乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、甲狀腺癌、尿道上皮癌、子宮癌、膽管癌或白血病。
  93. 如請求項89至92中任一項之方法，其中該癌症為間皮瘤、肺癌、卵巢癌或胃癌。
  94. 如請求項89至93中任一項之方法，其中該一或多種癌細胞及/或癌症表現高等或中等程度之間皮素。
  95. 如請求項89至94中任一項之方法，其中該樣品為組織切片樣品、血液樣品、淋巴樣品、骨髓樣品、皮膚樣品或腦脊髓液(CSF)樣品。
  96. 如請求項1至12中任一項之抗體或抗原結合片段、如請求項13至70中任一項之抗體-藥物結合物或如請求項71至75中任一項之醫藥組合物，其用於治療患有或疑似患有癌症之個體。
  97. 如請求項96之抗體、抗原結合片段、抗體-藥物結合物或醫藥組合物，其中該癌症表現間皮素。
  98. 如請求項96或97之抗體、抗原結合片段、抗體-藥物結合物或醫藥組合物，其中該癌症為間皮瘤、乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、甲狀腺癌、尿道上皮癌、子宮癌、膽管癌或白血病。
  99. 如請求項96至98中任一項之抗體、抗原結合片段、抗體-藥物結合物或醫藥組合物，其中該癌症為間皮瘤、肺癌、卵巢癌或胃癌。
  100. 如請求項96至99中任一項之抗體、抗原結合片段、抗體-藥物結合物或醫藥組合物，其中該癌症表現高等或中等程度之間皮素。
  101. 一種如請求項1至12中任一項之抗體或抗原結合片段、如請求項13至70中任一項之抗體-藥物結合物或如請求項71至75中任一項之醫藥組合物之用途，其用於治療患有或疑似患有癌症之個體。
  102. 如請求項101之用途，其中該癌症表現間皮素。
  103. 如請求項101或102之用途，其中該癌症為間皮瘤、乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、甲狀腺癌、尿道上皮癌、子宮癌、膽管癌或白血病。
  104. 如請求項101至103中任一項之用途，其中該癌症為間皮瘤、肺癌、卵巢癌或胃癌。
  105. 如請求項101至104中任一項之用途，其中該癌症表現高等或中等程度之間皮素。
  106. 一種如請求項1至12中任一項之抗體或抗原結合片段、如請求項13至70中任一項之抗體-藥物結合物或如請求項71至75中任一項之醫藥組合物之用途，其用於製造用於治療患有或疑似患有癌症之個體之藥劑的方法中。
  107. 如請求項106之用途，其中該癌症表現間皮素。
  108. 如請求項106或107之用途，其中該癌症為間皮瘤、乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、甲狀腺癌、尿道上皮癌、子宮癌、膽管癌或白血病。
  109. 如請求項106至108中任一項之用途，其中該癌症為間皮瘤、肺癌、卵巢癌或胃癌。
  110. 如請求項106至109中任一項之用途，其中該癌症表現高等或中等程度之間皮素。
  111. 一種經分離核酸，其編碼如請求項1至12中任一項之抗體或抗原結合片段。
  112. 一種經分離載體，其包含如請求項111之核酸。
  113. 一種經分離細胞或細胞群體，其包含如請求項111之核酸或如請求項112之載體。
  114. 一種產生如請求項1至12中任一項之抗體或抗原結合片段的方法，其包含在適合於產生該抗體或抗原結合片段之條件下培養如請求項113之細胞或細胞群體。
  115. 一種產生如請求項13至70中任一項之抗體-藥物結合物的方法，其包含在允許結合之條件下使抗體或抗原結合片段與連接至艾日布林之可裂解連接子反應。
  116. 如請求項115之方法，其中該連接至艾日布林之可裂解連接子與該抗體或抗原結合片段之輕鏈上的半胱胺酸殘基反應。
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