TW201832778A - 對ａｓｃｔ２具有特異性的結合分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本揭露提供了ASCT2-結合分子，例如，抗ASCT2抗體、及其抗原結合片段，該ASCT2-結合分子被用於與癌症幹細胞相關之方法中，例如，結合癌症幹細胞。在某些方面中，將該等ASCT2-結合分子軛合至細胞毒性藥物，例如ASCT2抗體-藥物共軛物。在某些方面中，該等ASCT2-結合分子特異性結合至表現ASCT2的癌症幹細胞。

Description

對ASCT2具有特異性的結合分子及其用途
溶質運載體(SLC)家族包括多於300個編碼膜轉運蛋白的基因，組織成數十個亞家族。SLC1A亞家族包括轉運系統ASC，該系統介導脊椎動物細胞中鈉依賴性中性胺基酸轉運。丙胺酸；絲胺酸；和半胱胺酸係ASC系統的較佳的底物。已經鑒定出ASC系統的兩種亞型，ASC轉運蛋白1(ASCT1，又稱為SLC1A4)和ASC轉運蛋白2(ASCT2，又稱為SLC1A5)。
ASCT2係具有八種跨膜結構域的541個胺基酸的多通路膜蛋白。取決於各種醣苷化特性，ASCT2的分子量在從55至75KD之間變化。除了轉運L-丙胺酸、L-絲胺酸、和L-半胱胺酸，ASCT2還轉運L-蘇胺酸和L-穀胺醯胺。此外，ASCT2起細胞表面受體的作用，該細胞表面受體由D型猿逆轉錄病毒和C型病毒共用。
已報導ASCT2在各種癌症中的過表現，該等癌症包括結腸直腸癌、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、以及血液癌(如骨髓瘤和淋巴瘤)。藉由免疫組織化學分析(IHC)評估的ASCT2的過表現在各種癌症中顯示出預後不良，該等癌症包括結腸直腸癌、前列腺癌、肺癌、和胰腺癌(K Kaira等人，(2015)，Histopathology[組織病理學]；Shimizu等人，(2014)，BJC[英國癌症雜誌]；D Witte等人，(2002)，Anticancer Research[抗癌研究]；R Li等人，(2003)，Anticancer Research[抗癌研究])。劇報導，ASCT2係雷帕黴素(rapamycin)的哺乳動物靶標(mTOR)信號傳導途徑的一個驅動子，並且因此是腫瘤生長的一個驅動子(Nicklin P.等人，(2009)，Cell[細胞])。
抗體-藥物共軛物(ADC)代表了一種有希望的新治療方法，藉由將抗體的特異性與細胞毒素小分子或毒素的效力結合，更有效地治療癌症，同時減少藥物相關的毒性。ADC可以包含細胞毒素，該細胞毒素可以是經化學修飾以含有接頭的小分子。然後使用該接頭從而將細胞毒素與抗體或其抗原結合片段軛合。當ADC結合至靶陽性細胞的抗原表面時，誘導細胞毒性，被內化並被運送到溶酶體，在溶酶體中細胞毒素在可切割接頭的蛋白質水解(例如藉由在溶酶體中發現的組織蛋白酶B)或藉由抗體的蛋白質降解(當非可切割接頭用於將細胞毒素附接至抗體時)後釋放。細胞毒素然後從溶酶體中轉移出並且轉移到細胞溶質中，在細胞溶質中然後它可以根據其作用機制結合到其靶標上。通常，該等細胞毒素誘導細胞週期停滯，這隨後導致細胞凋亡。含有顯像劑的對應共軛物還代表在體內或體外檢測癌細胞的有希望的新方式。
本揭露提供了特異性結合ASCT2的分子，以及使用此類分子，例如，用於檢測ASCT2、用於將異源試劑遞送至細胞、或用於治療由ASCT2過表現表徵的疾病或障礙(例如，癌症)的方法。本揭露提供了軛合至細胞毒性藥物(如微管溶素(tubulysin)衍生物或吡咯并苯并二氮呯(抗ASCT2-ADC))的抗ASCT2抗體。本發明的該等抗體對於治療由ASCT2過表現表徵的疾病或障礙(例如，癌症)是有用的。例如，諸位發明人已經示出在人結腸直腸癌和頭頸部癌的異種小鼠模型中抗ASCT2 ADC引起腫瘤消退。
本發明的一些主要方面匯總如下。另外的方面描述於此揭露的具體實施方式、實例、附圖、和申請專利範圍部分。此揭露的每個部分中的描述旨在與其他部分一起閱讀。此外，此揭露的每部分中所述的各種實施方式可以以各種不同方式進行組合，以及所有該等組合旨在落入本發明的範圍之內。
本揭露提供了ASCT2-結合分子，例如，抗ASCT2抗體或其抗原結合片段，例如能夠結合ASCT2的單株抗體。在一些方面中，該結合分子軛合至試劑(如細胞毒素)。
在一些情況下，特異性地結合至ASCT2表位的分離的結合分子或其抗原結合片段，作為包含17c10或1e8的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的抗體或其抗原結合片段特異性地結合至相同的ASCT2表位。
在一些情況下，17c10的VH包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5，並且17c10的VL包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6。
在一些情況下，1e8的VH包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：7，並且1e8的VL包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：8。
在一些情況下，特異性結合至ASCT2的分離的結合分子或其抗原結合片段包含抗體VL，其中該VL包含與選自下組的參考胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、或100%一致性的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8。
在一些情況下，特異性結合至ASCT2的分離的結合分子或其抗原結合片段包含抗體VH，其中該VH包含與選自下組的參考胺基酸序 列具有至少85%、90%、95%、或100%一致性的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、和SEQ ID NO：7。
在一些情況下，將特異性結合至ASCT2的分離的結合分子或其抗原結合片段軛合至選自下組的試劑，該組由以下各項組成：抗微生物劑、治療劑、前藥、肽、蛋白質、酶、脂質、生物應答調節劑、藥劑、淋巴因子、異源抗體或其片段、可檢測標記、聚乙二醇(PEG)、以及任何所述試劑中的兩種或更多種的組合。
在一些情況下，將特異性結合至ASCT2的分離的結合分子或其抗原結合片段軛合至細胞毒素。在某些實施方式中，該細胞毒素選自由以下各項組成之群組：AZ1508、SG3249、和SG3315。
在一些情況下，該結合分子或其片段包含抗體或其抗原結合片段。
在一些情況下，特異性結合至ASCT2的分離的抗體或其抗原結合片段包含VH和VL，其中該VH和VL分別包含與選自下組的參考胺基酸序列至少85%、90%、95%、或100%一致性的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6、以及SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。在一些情況下，該VH包含胺基酸序列SEQ ID NO：5，並且該VL包含胺基酸序列SEQ ID NO：6。在一些情況下，該VH包含胺基酸序列SEQ ID NO：7，並且該VL包含胺基酸序列SEQ ID NO：8。
在一些情況下，該抗體或其抗原結合片段包含重鏈恒定區或其片段。在一些情況下，該重鏈恒定區或其片段係IgG恒定區。在一些情況下，該IgG恒定區包含胺基酸序列SEQ ID NO：9。在一些情況下，該IgG 恒定區係人IgG1恒定結構域。
在一些情況下，該抗體或其抗原結合片段包含選自下組的輕鏈恒定區，該組由以下各項組成：人κ恒定區和人λ恒定區。
在一些情況下，該抗體或其抗原結合片段係鼠類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多株抗體、重組抗體、多特異性抗體、或其抗原結合片段。在一些情況下，該抗原結合片段係Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv、和sc(Fv)2。
在一些情況下，該抗體或其抗原結合片段可以結合至人ASCT2和石蟹獼猴(cyno)ASCT2。
在一些情況下，該抗體或其抗原結合片段不特異性結合至人ASCT1。
在一些情況下，將該抗體或其抗原結合片段軛合至選自下組的試劑，該組由以下各項組成：抗微生物劑、治療劑、前藥、肽、蛋白質、酶、脂質、生物應答調節劑、藥劑、淋巴因子、異源抗體或其片段、可檢測標記、PEG、以及任何所述試劑中的兩種或更多種的組合。
在一些情況下，將該抗體或其抗原結合片段軛合至細胞毒素。在某些實施方式中，該細胞毒素選自由以下各項組成之群組：AZ1508、SG3249、和SG3315。
在一些情況下，本發明提供了分離的多核苷酸或多核苷酸的組合，該分離的多核苷酸或多核苷酸的組合包含編碼如本文所述的結合分子或其片段的核酸。在一些情況下，本發明提供了分離的多核苷酸或多核苷酸的組合，該分離的多核苷酸或多核苷酸的組合包含編碼如本文所述的抗體或其抗原結合片段的核酸。
在一些情況下，本發明提供了包含如本文所述的多核苷酸的 載體。在一些情況下，包含編碼VH的核酸的多核苷酸和包含編碼VL的核酸的多核苷酸在相同的載體中。在一些情況下，包含編碼VH的核酸的多核苷酸和包含編碼VL的核酸的多核苷酸在不同的載體中。
在一些情況下，本發明提供了組成物，該組成物包含(i)如本文所述的結合分子或其片段、和(ii)運載體。在一些情況下，本發明提供了組成物，該組成物包含(i)如本文所述的抗體或其抗原結合片段、和(ii)運載體。在一些情況下，本發明提供了組成物，該組成物包含(i)編碼如本文所述的抗體或其抗原結合片段的核酸、和(ii)運載體。在一些情況下，本發明提供了組成物，該組成物包含(i)如本文所述的載體、和(ii)運載體。在一些方面中，該運載體係藥學上可接受的運載體。
在一些情況下，本發明提供了宿主細胞，該宿主細胞包含如本文所述的多核苷酸、如本文所述的載體、或如本文所述的組成物。
在一些情況下，本發明提供了製備如本文所述的結合分子或片段之方法，該方法包括(a)培養如本文所述的宿主細胞；並且(b)分離結合分子或片段。在一些情況下，本發明提供了製備如本文所述之抗體或抗原結合片段之方法，該方法包括(a)培養如本文所述的宿主細胞；並且(b)分離該抗體或抗原結合片段。
在一些情況下，本發明提供了診斷試劑或套組，該試劑或套組包含如本文所述的結合分子或其片段、或如本文所述的抗體或其抗原結合片段。
在一些情況下，將試劑遞送至表現ASCT2的細胞的方法包括使細胞與如本文所述軛合至試劑的結合分子或片段接觸、或與如本文所述軛合至試劑的抗體或其抗原結合片段接觸，其中該試劑被細胞內化。在一些情況下，該試劑可以選自由以下各項組成之群組：抗微生物劑、治療 劑、前藥、肽、蛋白質、酶、脂質、生物應答調節劑、藥劑、淋巴因子、異源抗體或其片段、可檢測標記、PEG、以及任何所述試劑中的兩種或更多種的組合。在一些情況下，該試劑可以是細胞毒素。
在一些情況下，在表現ASCT2的細胞中誘導死亡的方法包使細胞與如本文所述軛合至細胞毒素的結合分子或片段接觸、或與如本文所述軛合至細胞毒素的抗體或其抗原結合片段接觸，其中該細胞毒素被細胞內化。在一個較佳的實施方式中，該細胞毒素選自由以下各項組成之群組：AZ1508、SG3249、和SG3315。
在一些情況下，在受試者中治療由ASCT2過表現表徵的疾病或障礙(例如，癌症)的方法包括向需要治療的受試者給予有效量的如本文所述的結合分子或片段、或如本文所述之抗體或抗原結合片段、或如本文所述的組成物。
在一些情況下，治療由ASCT2過表現表徵的疾病或障礙(例如，癌症)的方法包括從實體瘤到血液瘤的廣泛的癌症。治療方法的這種廣泛的有效性並不常見，而是出乎意料的。除了在實體瘤和血液瘤上證實的廣泛的有效之外，本文所述的本發明還可以用於確定癌症幹細胞(CSC)存在的方法和涉及CSC的治療的方法，該等方法進一步支持本文描述的本發明的用途的廣泛性和意想不到的效果。
在一些情況下，該癌症選自由以下各項組成之群組：結腸直腸癌、HNSCC、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、子宮內膜癌、以及血液癌(急性骨髓性白血病(AML)、多發性骨髓瘤(MM)、彌散性大B細胞淋巴瘤(DLBCL))。此外，方法包含含有靶向CSC治療的方法。較佳的是，該受試者係人受試者。
在一些情況下，本文描述的方法和組成物涉及治療在治療上 有抗性的或再發或復發性的血液癌之方法，該血液癌包括在治療上有抗性的或再發或復發性的AML、MM、DLBCL。
在一些情況下，本文描述的方法和組成物涉及結合CSC之方法。
在一些情況下，本文描述的方法和組成物涉及抑制或殺滅CSC之方法。
在一些情況下，本文描述的方法和組成物涉及治療包含CSC的癌症之方法。
在一些情況下，方法涉及治療由CSC的存在而引起的在治療上有抗性的癌症。
在一些情況下，方法涉及治療由CSC的存在而引起的再發或復發性的癌症。
在一些情況下，方法涉及在樣品中診斷、預後、量化、鑒定、和/或檢測CSC的存在。
在一些情況下，方法涉及確定，在接觸CSC之前，CSC存在於樣品中。
在一些情況下，方法涉及確定，在包括向受試者給予的處理之前，CSC存在於樣品中。
在一些情況下，用於在樣品中檢測ASCT2表現水平的方法包括(a)使所述樣品與如本文所述的結合分子或片段、或如本文所述之抗體或抗原結合片段、或如本文所述的組成物接觸，並且(b)在所述樣品中檢測結合分子或其片段、或抗體或其抗原結合片段與ASCT2的結合。在一些情況下，該樣品係細胞培養物。在一些情況下，該樣品係分離的組織。在一些情況下，該樣品來自受試者，較佳的是人受試者。
[圖1A]顯示流動式細胞測量術分析的量化，證實與來自健康樣品的骨髓相比，在來自AML和MM樣品的骨髓穿刺液中高的ASCT2表現。
[圖1B]顯示在CD34+/CD38+群中ASCT2(所報導的定義白血病幹細胞群(LSC)的標誌物)的高表現。另外，在所有其他亞型(如CD34+CD38-、CD34+CD38+和CD34-CD38+群)中評估ASCT2的表現。
[圖1C]顯示了在來自MM樣品的漿細胞(PC；CD138+/CD19-)和幹細胞(SC；CD138-/CD19+)中的ASCT2表現。
[圖1D]顯示了在EpCAM+/CD24+/CD44+細胞群中評估的ASCT2(所報導的胰腺CSC的標誌物)表現。流動式細胞測量術分析表明在胰腺腫瘤中CSC的高ASCT2表現。
[圖1E]顯示了在體內用ASCT2-PBD ADC(將抗體17c10軛合至SG3249)處理後胰腺腫瘤中CSC(EpCAM+/CD24+/CD44+)群的消融。
[圖2]顯示了一幅圖，該圖描繪了經純化的人抗ASCT2 IgG 1e8、3f7、5a2、9b3、10c3、16b8、17c10、和17a10與用表現人ASCT2的質粒轉染的293F細胞的結合活性的倍數變化。
[圖3A]顯示了表現ASCT的293F細胞的用以下各項處理的與未處理的對照細胞的相對活力的橫條圖：陰性對照(未處理的)；第一抗ASCT2抗體1e8和17c10；軛合至皂草素(saporin)的抗ASCT2抗體；或連接至皂草素(hIgG-皂草素)對照抗體。
[圖3B]顯示了Sw48細胞中經典軛合至微管溶素AZ1508的抗ASCT2 1 E8、抗ASCT2 17C10、和同型對照R347的細胞毒性之圖。
[圖4]顯示了一副橫條圖，該橫條圖描繪了如藉由流動式細胞測量術所評估的，在ASCT2表現的shRNA敲除的情況下，抗ASCT2抗體17c10和1e8與WiDr細胞或WiDr細胞的結合。
[圖5A]顯示了抗ASCT2抗體17c10和同型對照的內化動力學。
[圖5B]顯示了如藉由細胞毒性殺滅所測量的ASCT2-ADC(軛合至AZ1508的抗體17c10)的內化動力學。將細胞用ASCT2-ADC(17c10-AZ1508)進行脈衝，持續相應時間段。此後，含有介質的ADC被新鮮介質替換，並且再孵育4天。藉由使用CTG套組測量細胞活力。將劑量-應答曲線繪製為未處理的對照細胞的百分數。
[圖6A]至[圖6H]顯示了由抗ASCT2抗體17c10和1e8，以及同型對照R347與表現ASCT2的細胞系的結合而產生的流動式細胞測量術圖。圖6A，人癌細胞系Ca127；圖6B，人癌細胞系FaDu；圖6C，人癌細胞系SSC15；圖6D，人癌細胞系WiDr；圖6E，穩定表現人ASCT2的CHOK1細胞；圖6F，穩定表現cyno ASCT2的CHOK1細胞；圖6G，cyno癌細胞系CynoMK1；以及圖6H，mock轉染的CHOK1細胞。
[圖7A]顯示了抗ASCT2抗體17c10與SKMEL-2細胞的結合沒有被ASCT1 shRNA改變，然而在ASCT2特異性shRNA敲除後該結合顯著降低。
[圖7B]顯示了ASCT1 shRNA敲除後抗ASCT2抗體ADC(軛合至AZ1508的抗體17c10)的細胞毒性殺滅未受影響，然而在ASCT2 shRNA沈默後觀察到細胞毒性殺滅的顯著降低。將來自所有shRNA敲除組的數據相對於未處理的對照進行歸一化。
[圖8A]和[圖8B]顯示了軛合至針對表現人或cyno ASCT2蛋 白或無關受體的穩定CHO-K1細胞系的微管溶素1508的抗ASCT2抗體17c10(圖8A)和1e8(圖8B)的細胞毒性效應。
[圖9A]至[圖9D]顯示了17c10親本抗體、17c10種系化的(germlined)抗體、和R347同型對照抗體與表現人ASCT2的穩定的CHO-K1細胞系(圖9A)；表現cyano ASCT2的穩定CHO-K1細胞系(圖9B)；表現ASCT2的結腸直腸癌細胞WiDr(圖9C)；和mock轉染的對照細胞(圖9D)結合的流動式細胞測量術圖。
[圖10A]至[圖10F]顯示了對於胰腺癌細胞(圖10A)、結腸癌細胞(圖10B)、肺癌細胞(圖10C)、HNSCC癌細胞(圖10D)、前列腺癌細胞(圖10E)、以及不表現ASCT2的細胞系(圖10F)，用軛合至微管溶素AZ1508的抗ASCT2抗體17c10、和軛合至微管溶素AZ1508的R347同型對照抗體處理的癌細胞系的歸一化為未處理的對照細胞的相對活力(%)。
[圖11A]顯示了用軛合至SG3249的抗ASCT2抗體17c10歸一化為用軛合至SG3249的對照抗體處理的細胞的活力的相對活力。
[圖11B]顯示了用軛合至SG3315的抗ASCT2抗體17c10歸一化為用軛合至SG3315的對照抗體處理的細胞的活力的相對活力。
[圖12A]、[圖12B]、和[圖12C]顯示了用軛合至微管溶素或PBD的抗ASCT2抗體17c10處理後，在WiDr結腸直腸癌或原發性胰腺癌異種移植物模型中腫瘤體積的時程。圖12A，17c10抗體軛合至微管溶素1508；圖12B，抗ASCT2抗體17c10軛合至SG 3315；圖12C，抗ASCT2抗體17c10軛合至SG 3249。
[圖13A]顯示了ASCT2-PBD ADC(抗體17c10軛合至SG3249)在播散性TF1α AML小鼠模型中的抗腫瘤功效。將ADC和同型對 照按Q1Wx4計畫對進行給予。每天監測發病率和死亡率。與未處理的對照組相比，所有劑量水平的ADC(0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.25mg/kg、和0.5mg/kg)顯著改進了存活率。將數據呈現於Kaplan-Meier存活圖中，該Kaplan-Meier存活圖顯示了每組內個體動物的命運。
[圖13B]顯示了ASCT2-PBD ADC(抗體17c10軛合至SG3249)在播散性MM.1S MM小鼠模型中的抗腫瘤功效。如圖13A中所述，用ADC或同型對照對小鼠進行處理。每天監測發病率和死亡率。與未處理的對照組(55.5天)相比，兩種劑量水平的ADC(0.1mg/kg和0.4mg/kg)顯著改進了存活率(分別是117天和123.5天)。將數據呈現於Kaplan-Meier存活圖中，該Kaplan-Meier存活圖顯示了每組內個體動物的命運。
本發明提供了特異性結合至ASCT2的抗體及其抗原結合片段。在某些實施方式中，該抗體或抗原結合片段軛合至試劑，較佳的是細胞毒素。包括編碼抗體及其抗原結合片段的多核苷酸、含有該等多核苷酸的載體，以及表現該等抗體的宿主細胞。還提供了包含抗ASCT2抗體或其抗原結合片段的組成物，以及製備抗ASCT2抗體和抗原結合片段的方法。進一步提供了，如在診斷應用或在治療由ASCT2過表現表徵的疾病或障礙(例如，癌症)的方法中使用新穎抗ASCT2抗體的方法。
為了使本發明可以更容易理解，首先定義了某些術語。另外的定義貫穿詳細說明闡明。
I. 定義
如在本說明書和所附申請專利範圍中使用的，單數形式“一個/一種(a/an)”、和“該”包括複數指代物，除非上下文明確地指示其 他的情況。術語“一/一個/種(a或an)”、以及術語“一個或多個/一種或多種(one or more)”和“至少一個/至少一種(at least one)”可以在本文中互換使用。
此外，“和/或”被理解為這兩個指定的特徵或組分每一者與或不與另一者的特定揭露。因此，如在短語如“A和/或B”中使用的術語“和/或”，旨在包括A和B、A或B、A(單獨)、以及B(單獨)。同樣地，術語“和/或”如在片語如“A、B、和/或C”中使用時，旨在包括A、B、和C；A、B、或C；A或B；A或C；B或C；A和B；A和C；B和C；A(單獨)；B(單獨)；以及C(單獨)。
當用語言“包括”來描述實施方式時，包括了關於“由......組成”和/或“基本上由......組成”描述的其他類似實施方式。
除非另外定義，否則在本文使用的所有技術和科學術語具有如本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。例如，The Dictionary of Cell and Molecular Biology[細胞與分子生物學詞典](第5版，J.M.Lackie編輯，2013)，the Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology[生物化學和分子生物學牛津詞典](第2版，R.Cammack等人編輯，2008)，和The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology[生物醫學與分子生物學簡明詞典]，P-S.Juo，(第2版.2002)可以為技術人員提供本文使用的一些術語的通用定義。
單位、首碼和符號係以它們的國際單位系統(Système International de Unites)(SI)接受的形式表示。數值範圍包括定義該範圍的數位。除非另外說明，否則胺基酸序列以胺基至羧基取向從左向右書寫。本文提供的小標題不是本發明的不同方面或實施方式的限制，可以藉由作為一個整體參考本說明書來獲得該等方面。因此，緊接著在下文中定 義的術語藉由參考整個說明書來更全面地定義。
胺基酸在本文中藉由其通常已知的三字母符號抑或由IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的單字母符號來指代。同樣地，核苷酸藉由它們的普遍公認的單字母代碼來指代。
術語“ASCT2”係指系統ASC胺基酸轉運蛋白2蛋白、和/或其活性片段。ASCT2係以Na+-依賴性方式介導轉運小中性胺基酸(包括穀胺醯胺、丙胺酸、和絲胺酸、半胱胺酸、和蘇胺酸)的跨膜蛋白。ASCT2的RNA、DNA、和胺基酸序列對熟習該項技術者是已知的，並且可以在許多資料庫中(例如，在美國國家生物技術資訊中心(NCBI)資料庫中)找到。在NCBI發現的該等序列的實例係具有Genbank登錄號NM_005628和NP_005619的人ASCT2序列；具有Genbank登錄號NM_001284054和NP-001270983的石蟹獼猴(成束猴(Macaca fascicularis))ASCT2序列。
術語“抑制(inhibit)”、“阻斷(block)”、和“壓制(suppress)”可在本文中互換使用，並且是指任何統計學顯著的生物活性的降低，包括活性的完全阻斷。例如，“抑制”可以指生物活性或過程的約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的降低。
術語“抗體”或“免疫球蛋白”可在本文中互換使用。典型的抗體包含藉由二硫鍵互連的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。每個重鏈由重鏈可變區(本文縮寫為VH)和重鏈恒定區組成。重鏈恒定區由三個結構域CH1、CH2和CH3構成。每個輕鏈由輕鏈可變區(本文縮寫為VL)和輕鏈恒定區構成。輕鏈恒定區由一個結構域CL構成。VH和VL區可以進一步細分為稱為互補決定區(CDR)的高變區，其間插入更保守的稱為構架區(FW)的區域。每個VH和VL由三個CDR和四個FW構成，從胺基末 端到羧基末端按照以下順序排列：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或宿主因素(包括免疫系統的不同細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(C1q))的結合。本揭露的示例性抗體包括雜交瘤-產生的鼠類單株抗體17c10和1e8，人源化、親和力優化、種系化的、和/或其他類型的該等抗體，以及血清半衰期優化的抗ASCT2 YTE抗體(例如，K44VHa-N56Q、K44VHa6-N56Q、或K2Ha-N56Q)。
術語“種系化”意指抗體中特定位置的胺基酸突變回種系中的那些。
術語“抗體”可以指藉由免疫球蛋白分子的可變區中的至少一個抗原識別位點識別並特異性地結合靶標(如蛋白質、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂質或前述的組合)的免疫球蛋白分子。如本文使用的，術語“抗體”涵蓋完整多株抗體，完整單株抗體，抗體片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、以及Fv片段)，單鏈式Fv(scFv)突變體，產生自至少兩個完整抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、包含抗體的抗原決定部分的融合蛋白、以及包含抗原酶識別位點的任何其他修飾的免疫球蛋白分子的多特異性抗體(如雙特異性抗體)，只要該等抗體展現出所希望的生物活性。抗體可以是以下五大類免疫球蛋白中的任一種：IgA、IgD、IgE、IgG、以及IgM、或其亞類(同型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，基於它們的重鏈恒定域的特性分別被稱為α、δ、ε、γ、以及μ。不同類別的免疫球蛋白具有不同的和熟知的亞基結構和三維組態。抗體可以是裸的或軛合至其他分子如毒素、放射性同位素等等。
術語“ASCT2抗體”或“結合至ASCT2的抗體”或“抗 ASCT2”係指能夠以足夠親和力結合至ASCT2的抗體，這樣使得該抗體可用作靶向ASCT2的治療劑或診斷試劑。抗ASCT2抗體與不相關的、非ASCT2蛋白的結合程度少於該抗體與ASCT2結合的約10%，如例如藉由放射性免疫測定(RIA)、BIACORE®(使用重組ASCT2作為分析物，並且抗體作為配位基，或反之亦然)、KINEXA®、或本領域已知的其他結合測定所測量的。在某些實施方式中，結合至ASCT2的抗體具有1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、10pM、1pM、或0.1pM的解離常數(KD)。
術語“抗原結合片段”係指完整抗體的一部分並且是指完整抗體的互補決定可變區。全長抗體片段可以是抗體的抗原結合片段。抗體片段的實例包括但不限於：Fab、Fab'、F(ab')2、以及Fv片段、線性抗體、單鏈抗體(例如，ScFv)、以及由抗體片段形成的多特異性抗體。
“單株抗體”(mAb)係指涉及單一抗原決定位或表位的高度特異性識別和結合的同源抗體群。這與典型地包括針對不同抗原決定位的不同抗體的多株抗體相反。術語“單株抗體”涵蓋完整和全長單株抗體以及抗體片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(scFv)突變體、包含抗體部分的融合蛋白和包含抗原識別位點的任何其他修飾的免疫球蛋白分子。此外，“單株抗體”係指以任何數目的方式製備的此類抗體，包括但不限於：雜交瘤、噬菌體選擇、重組表現、和轉基因動物。
術語“人源化抗體”係指衍生自非人(例如，鼠類)免疫球蛋白的抗體，其被工程化成含有最小的非人(例如，鼠類)序列。典型地，人源化抗體係人免疫球蛋白，其中來自互補決定區(CDR)的殘基被來自非人物種(例如，小鼠、大鼠、兔、或倉鼠)的CDR的殘基替換，該來自非人物種的CDR的殘基具有所希望的特異性、親和力、和能力(Jones等人， 1986，Nature[自然]，321：522-525；Riechmann等人，1988，自然，332：323-327；Verhoeyen等人，1988，科學，239：1534-1536)。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv構架區(FW)殘基被來自具有所希望的特異性、親和力、和能力的非人物種的抗體中的對應殘基替換。
人源化抗體可以藉由在Fv構架區和/或替換的非人殘基內的另外的殘基的取代來進一步修飾，以增強和優化抗體特異性、親和力、和/或能力。通常，人源化抗體將包含基本上所有至少一個(並且典型地兩個或三個)可變結構域，該可變結構域含有對應於非人免疫球蛋白的所有或基本上所有CDR區，而所有或基本上所有FR區係人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗體還可以包含免疫球蛋白恒定區或結構域(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定區或結構域。用於產生人源化抗體的方法的實例描述於美國專利案號5,225,539或5,639,641中。
“藥學上可接受的運載體”係指在藥物配製物中除了活性成分之外的成分，該成分對於受試者係無毒性的。藥學上可接受的運載體包括，但不限於：緩衝液、賦形劑、穩定劑、或防腐劑。如本文使用的，“藥學上可接受的運載體”包括生理學上相容的任何和所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收/再吸收延遲劑等。
抗體的“可變區”指單獨的抗體輕鏈的可變區或抗體重鏈的可變區或它們的組合。重鏈和輕鏈的該等可變區各自由藉由三個互補決定區(CDR)(又稱為高變區)連接的四個構架區(FW)組成。每條鏈中的CDR由FW區緊密靠近地保持在一起，並且與來自另一條鏈的CDR促成了抗體的抗原結合位點的形成。存在至少兩種用於確定CDR的技術：(1)一種基於跨物種序列變異性的方法(即，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest[具有免疫學目的蛋白質的序列]，(第5版， 1991，國立衛生研究院(National Institutes of Health)，貝塞斯達(Bethesda)，馬里蘭州)；和(2)一種基於抗原-抗體複合物的晶體學研究的方法(Al-lazikani等人，(1997)，J.Molec.Biol.[分子生物學雜誌]273：927-948))。此外，本領域有時使用這兩種方法的組合來確定CDR。
當提及可變結構域中的殘基(大約輕鏈的殘基1-107和重鏈的殘基1-113)時，通常使用Kabat編號系統(例如，Kabat等人，Sequences of Immunological Interest[免疫學目的的序列]，第5版，公共衛生服務(Public Health Service)，國立衛生研究院(National Institutes of Health)，貝塞斯達，馬里蘭州(1991))。
在Kabat中的胺基酸位置編號係指在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫學目的的蛋白質的序列]，第5版，公共衛生服務，國立衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州(1991)中用於抗體編譯的重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域的編號系統。使用這個編號系統，實際的線性胺基酸序列可以含有更少或另外的胺基酸，其對應於可變結構域的FW或CDR的截短或插入。例如，重鏈可變結構域可以包括在H2的殘基52後的單個胺基酸插入(根據Kabat的殘基52a)和在重鏈FW殘基82後的插入殘基(例如，根據Kabat的殘基82a、82b和82c等)。
可以藉由在抗體序列與“標準”Kabat編號序列的同源性區域進行比對來確定給定抗體的殘基的Kabat編號。相反，Chothia係指結構環的位置(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]196：901-917(1987))。當使用Kabat編號慣例編號時，Chothia CDR-H1環的末端根據環的長度在H32和H34之間變化(這係因為Kabat編號方案將插入放置於H35A和H35B；如果35A和35B都不存在，則環在32處結束；如果僅存在35A，則環在33處結束；如果35A和35B都存在，則環在34處結束)。AbM 高變區表示Kabat CDR和Chothia結構環之間的折衷，並且被牛津分子(Oxford Molecular)AbM抗體建模軟體使用。表1，以下列出了包含在每個系統中抗體可變區的胺基酸的位置。
免疫遺傳學(IMGT)還提供了一種用於免疫球蛋白可變區(包括CDR)之編號系統。參見，例如，Lefranc,M.P.等人，Dev.Comp.Immunol.[發育和比較免疫學]27：55-77(2003)。IMGT編號系統係基於高變環的多於5,000個序列的比對、結構數據和表徵，並且允許容易地比較所有物種的可變區和CDR區。根據IMGT編號方案，VH-CDR1在位置26至35處，VH-CDR2在位置51至57處，VH-CDR3在位置93至102處，VL-CDR1在位置27至32處，VL-CDR2在位置50至52處，並且VL-CDR3在位置89至97處。
如貫穿本說明書使用的，所述的VH CDR序列對應於經典的Kabat編號位置，即Kabat VH-CDR1在位置31-35，VH-CDR2在位置50-65，並且VH-CDR3在位置95-102。VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3也對應於經典的Kabat編號位置，分別即位置24-34、50-56和89-97。
術語“人抗體”意指在人體中產生的抗體或具有與使用本領域已知的任何技術製備的在人體中產生的抗體對應的胺基酸序列的抗體。人抗體的這種定義包括完整或全長抗體、其片段、和/或包含至少一個人重鏈和/或輕鏈多肽的抗體，像例如包含鼠類輕鏈和人重鏈多肽的抗體。
術語“嵌合抗體”係指其中免疫球蛋白分子的胺基酸序列衍生自兩種或更多種物種的抗體。典型地，輕鏈和重鏈的可變區對應於衍生自具有所需特異性、親和力、和能力的一種哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔等)的抗體的可變區，而恒定區同源於衍生自另一種(通常為人)的抗體中的序列，以避免在該物種中引起免疫應答。
術語“YTE”或“YTE突變體”係指IgG1 Fc中的突變，這導致結合至人FcRn的增加，且提高了具有突變的抗體的血清半衰期。YTE突變體包含引入IgG1的重鏈的三個突變M252Y/S254T/T256E的組合(EU編號，Kabat等人，(1991)，Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫學感興趣的蛋白序列]，美國公共衛生服務，國立衛生研究院，華盛頓D.C.)。參見美國專利案號7,658,921，藉由引用將其併入本文。與相同抗體的野生型相比，YTE突變體顯示出增加了抗體的血清半衰期大約四倍(Dall’Acqua等人，J.Biol.Chem.[生物化學雜誌]281：23514-24(2006)；Robbie等人，(2013)，Antimicrob.Agents Chemother[抗微生物製劑與化學療法]57，6147-6153)。還參見美國專利案號7,083,784，其全部內容藉由引用併入本文。
“結合親和力”通常是指分子(例如，抗體)的單個結合位點與其結合配偶體(例如。抗原)之間的非共價相互作用的總和的強度。除非另有說明，如本文使用的，“結合親和力”係指反映結合對(例如，抗體和抗原)的成員之間的1：1相互作用的固有結合親和力。分子X對其 配偶體Y的親和力通常可以由解離常數(KD)表示。親和力可以藉由本領域已知的常規方法測量，包括本文所述的那些。低親和力抗體通常緩慢地結合抗原並且傾向於容易解離，而高親和力抗體通常更快地結合抗原並且傾向於更長地保持結合。測量結合親和力的多種方法係本領域中已知的，其中的任何方法均可以用於本發明的目的。
除非另外說明，否則結合分子的效力通常表現為以ng/ml計的IC50值。IC50係抗體分子的半數抑制濃度。在功能測定中，IC50係將生物應答降低其最大值的50%的濃度。在配位基結合研究中，IC50係減少受體結合達最大特異性結合水平的50%的濃度。IC50可以藉由本領域已知的任何數目的手段來計算。
與參考抗體相比，針對本發明的抗體或多肽的效力改進倍數可以是至少約2倍、至少約4倍、至少約6倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、至少約100倍、至少約110倍、至少約120倍、至少約130倍、至少約140倍、至少約150倍、至少約160倍、至少約170倍、或至少約180倍或更多。
除非另有說明，抗體的結合效力通常表示為以nM或pM計的EC50值。EC50係在具體暴露時間後誘導基線和最大值之間的中值應答的藥物的濃度。EC50可以藉由本領域已知的任何數目的手段來計算。
“治療性抗體”係可以向受試者給予以治療或預防疾病或病症的抗體。“受試者”係需要診斷、預後或治療的任何個體，特別是哺乳動物。哺乳動物受試者包括人、家畜、農畜、體育動物、和動物園動物，例如人、非人靈長類、狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛等。
“治療”係指治癒、減慢已診斷的病理狀況或障礙，減輕已 診斷的病理狀況或障礙的症狀，和/或停止已診斷的病理狀況或障礙的進展的治療性措施。因此，需要治療的患者包括已患有該障礙的那些。在某些實施方式中，如果患者顯示了例如全部、部分或者暫態減輕或消除與疾病或障礙相關的症狀，則根據本文提供的方法成功地“治療”了該受試者的疾病或障礙(例如，癌症)。
“預防”係指預防和/或減緩靶標病理狀況或障礙發展的防禦性或預防性措施。因此，需要預防的患者包括那些容易患有或易患該障礙的那些人。在某些實施方式中，如果相比於未經受本發明方法的患者，患者暫態或永久地表現出，例如與疾病或障礙相關的更少或不太嚴重的症狀，或與該疾病或障礙相關的症狀的更遲的發作，則根據本文提供的方法成功地預防了疾病或障礙。
術語“醫藥組成物”係指如下製劑，該製劑處於允許該活性成分的生物活性有效的形式，並且不含有另外的、對其將要給予的受試者具有不可接受的毒性的組分。這種組成物可以是無菌的並且可以包含藥學上可接受的運載體，如生理鹽水。適合的醫藥組成物可以包含一種或多種緩衝液(例如，乙酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝液)、表面活性劑(例如，聚山梨酯)、穩定劑(例如，人白蛋白)、防腐劑(例如，苄醇)、以及增強生物利用度的吸收促進劑、和/或其他常規的增溶劑或分散劑。
如本文揭露的，抗體的“有效量”係足以進行具體闡述目的的量。關於闡述的目的，“有效量”可以經驗為主地並且以常規方式來確定。
“標記”係指可以直接或間接地軛合至結合分子或抗體的可檢測的化合物或組成物，以便產生“標記的”結合分子或抗體。該標記可以是本身可檢測的(例如，放射性同位素標記或螢光標記)，或在酶標 記的情況下可以催化可檢測底物化合物或組成物的化學改變。
可在本文中互換使用的術語“多肽”、“肽”、和“蛋白質”係指具有任何長度的胺基酸的聚合物。該聚合物可以是線性或支化的，它可以包含修飾的胺基酸，並且它可以被非胺基酸中斷。該等術語還涵蓋已被天然修飾或藉由干預修飾的胺基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、醣苷化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作或修飾，如與標記組分軛合。該定義中還包括，例如，含有一種或多種胺基酸的類似物(包括，例如，非天然胺基酸等)以及本領域已知的其他修飾的多肽。在某些實施方式中，該等多肽可以作為單鏈或相關鏈出現。
如本文使用的“多核苷酸”可以包括一種或多種“核酸”、“核酸分子”、或“核酸序列”係指任何長度的核苷酸聚合體，並且包括DNA和RNA。該等多核苷酸可以是去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或鹼基，和/或它們的類似物，或可以藉由DNA或RNA聚合酶併入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含修飾的核苷酸，如甲基化核苷酸和它們的類似物。前述說明適用於本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
術語“載體”意指以下構建體，該構建體能夠在宿主細胞中遞送一個或多個感興趣的基因或序列並且在一些實施方式中，能夠表現該一個或多個基因或序列。載體的實例包括但不限於：病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質粒、黏接質體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑締合的DNA或RNA表現載體、包封在脂質體中的DNA或RNA表現載體，以及某些真核細胞(如生產細胞)。
“分離的”多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞、或組成物係呈自然界中未發現形式的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞、或組成 物。分離的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物包括已經被純化至它們不再呈自然界中發現形式的程度的那些。在一些實施方式中，分離的抗體、多核苷酸、載體、細胞、或組成物係基本上純的。
在兩個或更多個核酸或多肽的上下文中，術語“一致”或百分比“一致性”係指兩個或更多個在比較和比對(如有必要，引入缺口)以獲得最大對應性(不考慮任何保守胺基酸取代作為序列一致性的一部分)時相同或具有指定百分比的相同核苷酸或胺基酸殘基的序列或子序列。百分比一致性可以使用序列比較軟體或演算法或者藉由目測測量。本領域中已知有各種可用於獲得胺基酸或核苷酸序列的比對的演算法和軟體。
序列比對演算法的一個這樣的非限制性實例係描述於Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]，87：2264-2268(1990)中的演算法，如由Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]，90：5873-5877(1993)的改進，並納入NBLAST和XBLAST程式(Altschul等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]25：3389-3402(1991))。在某些實施方式中，有缺口的BLAST可如由Altschul等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]25：3389-3402(1997)中所述使用，BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等人，Methods in Enzymol.[酶學方法]266：460-480(1996))、ALIGN、ALIGN-2(基因泰克公司，南三藩市，加利福尼亞)或Megalign(DNASTAR)係另外可用於比對序列的可公開獲得的軟體程式。在某些實施方式中，兩個核苷酸序列間的百分比一致性係使用GCG套裝軟體中的GAP程式來確定(例如，使用NWSgapdna.CMP矩陣和40、50、60、70或90的缺口權重以及1、2、3、4、5或6的長度權重)。在某些替代性實施方式中，GCG套裝軟體中包含Needleman和Wunsch的演算法(J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]48： 444-453(1970))的GAP程式可用於測定兩個胺基酸序列間的百分比一致性(例如，使用BLOSUM 62矩陣或PAM250矩陣，和16、14、12、10、8、6、或4的缺口權重以及1、2、3、4、5的長度權重)。可替代地，在某些實施方式中，核苷酸或胺基酸序列間的百分比一致性係使用Myers和Miller的演算法來確定的(CABIOS，4：11-17(1989))。例如，百分比一致性可使用ALIGN程式(2.0版本)以及使用具有殘基表的PAM120和12的缺口長度罰分和4的缺口罰分來確定。熟習該項技術者可確定適當的參數以藉由特定比對軟體獲得最大比對。在某些實施方式中，使用比對軟體的預設參數。
在某些實施方式中，第一胺基酸序列與第二序列胺基酸的一致性百分比“X”計算為100 x(Y/Z)，其中Y係胺基酸殘基數目，計分為比對該第一和第二序列時的一致匹配數(如藉由目檢或特定序列比對程式比對的)，並且Z係該第二序列中的殘基的總數目。如果第一序列的長度比第二序列長，該第一序列與該第二序列的一致性百分比將高於該第二序列與該第一序列的一致性百分比。
“保守的胺基酸取代”係一個胺基酸殘基被具有相似側鏈的另一個胺基酸殘基替換。在本領域中已經定義了具有相似側鏈的胺基酸殘基家族，包括鹼性側鏈(例如，賴胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如，天門冬胺酸、穀胺酸)，不帶電荷的極性側鏈(例如，天冬醯胺、穀胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性的側鏈(例如，甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異亮胺酸)以及芳香族側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。例如，苯丙胺酸對於酪胺酸的取代係保守取代。在某些實施方式中，本發明的結合分子、抗體、和抗原結合片段的胺基酸序列中的保守取代沒有消除含有胺基 酸序列的結合分子、抗體、或抗原結合片段與一種或多種抗原，即與結合分子、抗體、或抗原結合片段結合的ASCT2的結合。鑒定沒有消除抗原結合的核苷酸和胺基酸保守取代的方法係本領域中熟知的。參見，例如，Brummell等人，Biochem.[生物化學]32：1180-1187(1993)；Kobayashi等人，Protein Eng.[蛋白質工程]12(10)：879-884(1999)；Burks等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]94：412-417(1997)。
II. 抗ASCT2-抗體和抗原結合片段
本發明提供了特異性結合ASCT2的抗ASCT2抗體及其抗原結合片段。人和石蟹獼猴ASCT2的全長胺基酸(aa)和核苷酸(nt)序列係本領域已知的，並且可以至少在美國國家生物技術資訊中心(NCBI)資料庫中找到。該NCBI資料庫可線上獲得。在一些實施方式中，本文提供的抗ASCT2抗體或其抗原結合片段係人源化抗體或人抗體。在一些實施方式中，抗ASCT2抗體軛合至細胞毒素，因此它們被稱為抗-ASTC2 ADC。
在一些實施方式中，本發明的抗ASCT2抗體結合至在細胞表面上的ASCT2，並且被內化至細胞中。在一些實施方式中，在IC50為如下的情況下，在10分鐘時，抗ASCT2抗體被內化至表現ASCT2的細胞中：約100ng/ml至約1μg/ml、約100ng/ml至約500ng/ml、約100ng/ml至約250ng/m1、約250ng/ml至約500ng/ml、約350ng/ml至約450ng/ml、約500ng/ml至約1μg/ml、約500ng/ml至約750ng/ml、約750ng/ml至約850ng/ml、或約900ng/ml至約1μg/ml。在一些實施方式中，在IC50為如下的情況下，在30分鐘時，抗ASCT2抗體被內化至表現ASCT2的細胞中：約100ng/ml至約1μg/ml、約100ng/ml至約500ng/ml、約100ng/ml至約250ng/ml、約250ng/ml至約500ng/ml、約250ng/ml至約350ng/ml、約350ng/ml至約450ng/ml、約500ng/ml至約1μg/ml、約500ng/ml至約750 ng/ml、約750ng/ml至約850ng/ml、或約900ng/ml至約1μg/ml。在一些實施方式中，在IC50為如下的情況下，在120分鐘時，抗ASCT2抗體被內化至表現ASCT2的細胞中：約50ng/ml至約500ng/ml、約50ng/ml至約100ng/ml、約100ng/ml至約200ng/ml、約200ng/ml至約300ng/ml、約300ng/ml至約400ng/ml、或約400ng/ml至約500ng/ml。在一些實施方式中，在IC50為如下的情況下，在8小時，抗ASCT2抗體被內化至表現ASCT2的細胞中：約5ng/ml至約250ng/ml、約10ng/ml至約25ng/ml、約25ng/ml至約50ng/ml、約50ng/ml至約100ng/ml、約100ng/ml至約150ng/ml、約150ng/ml至約200ng/ml、或約200ng/ml至約250ng/ml。在一些情況下，軛合至細胞毒素的抗ASCT2抗體係抗ASCT2 ADC。
在某些方面中，本揭露提供了包含三個重鏈互補決定區(HCDR)和三個輕鏈互補決定區(LCDR)的抗ASCT2抗體或其抗原結合片段。在某些方面中，HCDR1具有選自SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：16的胺基酸序列；HCDR2具有選自SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：11、和SEQ ID NO：17的胺基酸序列；HCDR3具有選自SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：18的胺基酸序列；LCDR1具有選自SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：19的胺基酸序列；LCDR2具有選自SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、和SEQ ID NO：24的胺基酸序列；LCDR3具有選自SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：21、和SEQ ID NO：25的胺基酸序列。如本文所提供的，VH包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且VL包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6的胺基酸序列。在一些方面中，該抗ASCT2抗體包含具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列的VL。視情況，抗ASCT2抗體包含具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：7的胺基酸序列的VH，以及具有SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：8的胺基酸序 列的VL。在一些實施方式中，該抗ASCT2抗體包含具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列的VH以及具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列的VL。
另外，本揭露提供了特異性結合至ASCT2的分離的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含VH和VL，其中該VH和VL分別含有與參考胺基酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分別具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%一致性的胺基酸序列。
在一個方面中，本揭露提供了抗ASCT2抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含VH胺基酸序列SEQ ID NO：5和VL胺基酸序列SEQ ID NO：6。在一個方面中，本揭露提供包含VH胺基酸序列SEQ ID NO：7和VL胺基酸序列SEQ ID NO：8的抗ASCT2抗體或其抗原結合片段。
如本文所述的抗ASCT2抗體或其抗原結合片段可以是，例如鼠類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多株抗體、重組抗體、多特異性抗體、或其任何組合。抗ASCT2抗體抗原結合片段可以是Fv片段、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、dsFv片段、scFv片段、或sc(Fv)2片段。
在一個方面中，本揭露提供在物種間可以結合至ASCT2分子的抗ASCT2抗體或其抗原結合片段，例如可以結合至小鼠ASCT2、大鼠ASCT2、兔ASCT2、人ASCT2和/或石蟹獼猴ASCT2的抗體或片段。例如，該抗體或片段可以結合至人ASCT2和石蟹獼猴ASCT2。在另外的實例中，該抗體或片段還可以結合至小鼠ASCT2。
在本文提供的某些實施方式中，抗ASCT2抗體或其抗原結 合片段可以特異性結合至ASCT2，例如人ASCT2和石蟹獼猴ASCT2，但不特異性結合至人ASCT1。
如本文所述的抗ASCT2抗體或其抗原結合片段可以包括，除了VH和VL之外的重鏈恒定區或其片段。在某些方面中，該重鏈恒定區係人重鏈恒定區，例如，人IgG恒定區，例如，人IgG1恒定區。在一些實施方式中，特別是在該抗體或其抗原結合片段軛合至試劑(如細胞毒素劑)的情況下，半胱胺酸殘基被插入到IgG1的CH2區中的胺基酸S239和V240之間。該半胱胺酸被稱為“239插入”或“239i”。
在某些方面中，重鏈恒定區或其片段，例如，人IgG恒定區或其片段相對於野生型IgG恒定結構域可以包括一個或多個胺基酸取代，其中與具有野生型IgG恒定結構域的IgG的半衰期相比，修飾的IgG具有增加的半衰期。例如，IgG恒定結構域可以含有在位置251-257、285-290、308-314、385-389、和428-436上的胺基酸殘基的一個或多個胺基酸取代，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所闡明的EU索引。在某些方面中，IgG恒定結構域可以含有以下中的一個或多個：Kabat位置252上的胺基酸經酪胺酸(Y)、苯丙胺酸(F)、色胺酸(W)、或蘇胺酸(T)的取代，Kabat位置254上的胺基酸經蘇胺酸(T)的取代，Kabat位置256上的胺基酸經絲胺酸(S)、精胺酸(R)、穀胺醯胺(Q)、穀胺酸(E)、天冬胺酸(D)、或蘇胺酸(T)的取代，Kabat位置257上的胺基酸經亮胺酸(L)的取代，Kabat位置309上的胺基酸經脯胺酸(P)的取代，Kabat位置311上的胺基酸經絲胺酸(S)的取代，Kabat位置428上的胺基酸經蘇胺酸(T)、亮胺酸(L)、苯丙胺酸(F)、或絲胺酸(S)的取代，Kabat位置433上的胺基酸經精胺酸(R)、絲胺酸(S)、Iso亮胺酸(I)、脯胺酸(P)、或穀胺醯胺(Q)的取代，或Kabat位置434上的胺基酸經色胺酸(W)、 甲硫胺酸(M)、絲胺酸(S)、組胺酸(H)、苯丙胺酸(F)、或酪胺酸的取代。更具體地，IgG恒定結構域相對於野生型人IgG恒定結構域可以含有胺基酸取代，包括Kabat位置252上的胺基酸經酪胺酸(Y)的取代，Kabat位置254上的胺基酸經蘇胺酸(T)的取代，和Kabat位置256上的胺基酸經穀胺酸(E)的取代。本揭露提供了抗ASCT2抗體或其抗原結合片段，其中重鏈係人IgG1 YTE突變體。
本文提供的例如如上所述的抗ASCT2抗體或其抗原結合片段可以包括除了VH和VL以及視情況重鏈恒定區或其片段之外的輕鏈恒定區或其片段。在某些方面中，該輕鏈恒定區係κ λ輕鏈恒定區，例如人κ恒定區或人λ恒定區。
如上所述的，VH和/或VL胺基酸序列可以與在本文列出的序列例如具有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相似性，和/或包含1、2、3、4、5或更多個取代，例如，相對於本文所闡明的序列的保守取代。具有與VH區或VL區具有一定百分比相似性的VH和VL區或具有一個或多個取代(例如，保守取代)的VH和VL區的ASCT2抗體，可以藉由編碼本文所述的VH和/或VL區的核酸分子的誘變(例如，定點誘變或PCR介導的誘變)獲得，隨後測試編碼的改變的抗體對ASCT2的結合，並且視情況使用本文所述的功能測定測試保留的功能。
抗體針對抗原的親和力或親合力可以使用本領域熟知的任何適合的方法(例如，流動式細胞測量術、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、或放射免疫測定(RIA)、或動力學(例如KINEXA®或BIACORETM分析))經實驗確定。可以容易地採用直接結合測定以及競爭性結合測定形式。(參見，例如，Berzofsky等人，Antibody-Antigen Interactions[抗體-抗原相互作用]，在Fundamental Immunology[在基礎免疫學]，Paul,W.E.編輯， 雷文出版社(Raven Press)：紐約市，紐約州(1984)；Kuby，Immunology[免疫學]，W.H.弗裡曼公司(W.H.Freeman and Company)：紐約市，紐約州(1992)；以及本文所述的方法)。如果在不同條件(例如，鹽濃度、pH、溫度)下測量，特定抗體-抗原相互作用的所測量的親和力可以變化。因此，親和力和其他抗原結合參數(例如，KD或Kd、Kon、Koff)的測量係用如本在領域中已知的抗體和抗原的標準化溶液和標準化緩衝液進行。
在一些實施方式中，在IC50為如下的情況下，抗ASCT2抗體或其抗原結合片段可以結合至表現ASCT2的細胞：低於約500nM、低於約350nM、低於約250nM、低於約150nM、低於約100nM、低於約75nM、低於約60nM、低於約50nM、低於約40nM、低於約30nM、低於約20nM、低於約15nM、低於約10nM、低於約5nM、低於約1nM、低於約500pM、低於約350pM、低於約250pM、低於約150pM、低於約100pM、低於約75pM、低於約60pM、低於約50pM、低於約40pM、低於約30pM、低於約20pM、低於約15pM、低於約10pM、或低於約5pM，如藉由流動式細胞測量術所測量的。
III. 結合到與抗ASCT2抗體及其抗原結合片段相同的表位的結合分子
在某些實施方式中，本揭露提供了結合至與本文所述的抗ASCT2抗體相同的表位的抗ASCT2抗體。術語“表位”係指能夠結合本發明抗體的靶蛋白決定位。表位通常由分子的化學活性表面基團如胺基酸或糖側鏈組成，並且通常具有特定的三維結構特徵以及特定的電荷特徵。構象表位和非構象表位的區別在於：在變性溶劑存在下，與前者的結合喪失但與後者的結合不喪失。在標準ASCT2結合測定或活性測定中，可以基於 此類抗體與抗體如本文所述的那些交叉競爭(例如，以統計學顯著的方式競爭性地抑制結合)的能力，對此類抗體進行鑒定。
因此，在一個實施方式中，本發明提供了抗ASCT2抗體及其抗原結合片段(例如單株抗體)，該抗體及其抗原結合片段與本發明另一種抗ASCT2抗體或其抗原結合片段(如鼠類單株抗體17c10或1e8、或如本文揭露的人源化變體)競爭結合至ASCT2。測試抗體抑制例如17c10或1e8的結合的能力證實該測試抗體可以與那種抗體競爭結合至ASCT2；根據非限制性理論，此種抗體可以結合到與它競爭的抗ASCT2抗體或其抗原結合片段的相同或相關的(例如，結構上相似或空間上接近的)ASCT2上的表位。在一個實施方式中，抗ASCT2抗體或其抗原結合片段結合做與例如鼠類單株抗體17c10或1e8相同的ASCT2上的表位。
IV. 抗ASCT2抗體和抗原結合片段的製備
單株抗ASCT2抗體可使用雜交瘤方法製備，如由Kohler和Milstein，Nature[自然]256：495(1975)所描述的那些。使用雜交瘤方法，小鼠、倉鼠、或其他適當的宿主動物如上所述進行免疫，以引發淋巴細胞產生將特異性地結合至免疫抗原的抗體。淋巴細胞也可以在體外免疫。免疫後，分離淋巴細胞，並使用例如聚乙二醇與適合的骨髓瘤細胞系融合，以形成可隨後從未融合的淋巴細胞和骨髓瘤細胞選擇出的雜交瘤細胞。然後產生特異性針對選定的抗原的單株抗體的雜交瘤(這係如藉由免疫沈澱法、免疫印跡法、或藉由體外結合測定(例如，放射免疫測定(RIA)或酶聯免疫吸附測定(ELISA))所確定的)可在體外培養物中使用標準方法(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice[單株抗體：原理和實踐]，學術出版社，1986)或在體內作為動物的腹水腫瘤繁殖。然後使用已知的方法可以將單株抗體從培養基或腹水進行純化。
可替代地，抗ASCT2單株抗體還可以使用如在美國專利案號4,816,567中所述的重組DNA方法製備。編碼單株抗體的多核苷酸係從成熟B細胞或雜交瘤細胞，如藉由RT-PCR，使用特異性擴增編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸引物分離，且它們的序列係利用常規程序測定。然後將編碼重鏈和輕鏈的分離的多核苷酸選殖到適合的表現載體中，該等載體在轉染進入不產生免疫球蛋白的宿主細胞，如大腸桿菌細胞、類人猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或骨髓瘤細胞中時，藉由該等宿主細胞生產單株抗體。同樣地，所希望物種的重組抗ASCT2單株抗體或其抗原結合片段可從表現如下所述的所希望物種的CDR的噬菌體展示文庫分離：McCafferty等人，Nature[自然]348：552-554(1990)；Clackson等人，自然，352：624-628(1991)；和Marks等人，J.Mol.Biol[分子生物學雜誌]222：581-597(1991)。
編碼抗ASCT2抗體或其抗原結合片段的一種或多種多核苷酸可進一步以多種不同的方式使用重組DNA技術修飾以產生可替代的抗體。在一些實施方式中，例如，小鼠單株抗體的輕鏈和重鏈的恒定結構域可以被(1)例如人抗體的那些區域取代以產生嵌合抗體或被(2)非免疫球蛋白多肽取代以產生融合抗體。在一些實施方式中，平截或去除該等恒定區以產生所希望的單株抗體的抗體片段。定點誘變或高密度誘變可變區可以用於優化單株抗體的特異性、親和性等。
在某些實施方式中，該抗ASCT2抗體或其抗原結合片段係人抗體或其抗原結合片段。可以使用本領域已知的不同技術來直接製備人抗體。可以產生在體外免疫的或從產生針對靶抗原的抗體的免疫個體分離的永生化人B淋巴細胞。參見，例如，Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy[單株抗體和癌症療法]，艾倫R.麗思出版社(Alan R. Liss)，第77頁(1985)；Boemer等人，J.Immunol.[免疫學雜誌]147(1)：86-95(1991)；美國專利5,750,373。
同樣，抗ASCT2人抗體或其抗原結合片段可以選自噬菌體文庫，其中該噬菌體文庫表現如在例如Vaughan等人，Nat.Biotech.[自然生物技術]14：309-314(1996)；Sheets等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]，95：6157-6162(1998)；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]227：381(1991)；以及Marks等人，J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]222：581(1991)中所述的人抗體。用於生成和使用抗體噬菌體文庫的技術還描述於美國專利案號5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915、6,593,081、6,300,064、6,653,068、6,706,484、和7,264,963；和Rothe等人，J.Molec.Biol.[分子生物學雜誌]376：1182-1200(2008)，其中每一個藉由引用以其全文併入本文。
親和力成熟策略和鏈改群組原則在本領域中是已知的，並且可用於產生高親和力人抗體或其抗原結合片段。參見Marks等人，BioTechnology[生物技術]10：779-783(1992)，將其藉由引用以其全文結合。
在一些實施方式中，抗ASCT2單株抗體可以是人源化抗體。用於工程化、人源化或表面重修非人抗體或人抗體的方法也可以使用並且是本領域熟知的。人源化、表面重修或相似工程化抗體可以具有來自非人來源的一個或多個胺基酸殘基，該來源例如但不限於：小鼠、大鼠、兔、非人靈長動物或其他哺乳動物。該等非人胺基酸殘基被通常稱為“輸入”殘基的殘基替換，該等殘基典型地取自已知人序列的“輸入”可變結構域、恒定結構域或其他結構域。此類輸入序列可以用於降低免疫原性或 減小、增強或修飾結合、親和力、結合速率、解離速率、親合力、特異性、半衰期、或如本領域已知的任何其他適合的特徵。一般來說，該等CDR殘基直接且最實質性地參與影響ASCT2結合。因此，保持部分或全部非人或人CDR序列，同時可變區和恒定區的非人序列可以被人或其他胺基酸替換。
抗體還可以視情況人源化、表面重修、工程化或人抗體工程化，保留針對抗原ASCT2的高親和力以及其他有利生物性質。為實現這個目標，人源化(或人)或工程化抗ASCT2抗體以及表面重修的抗體視情況藉由使用親本、工程化和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念人源化和工程化產物的方法來製備。三維免疫球蛋白模型係通常可得到的並且對於熟習該項技術者而言是熟悉的。說明並展示所選擇的候選免疫球蛋白序列的可能三維構象結構的電腦程式係可獲得的。檢查該等展示允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原如ASCT2的能力的殘基。按照此方式，可以從共有序列和輸入的序列中選擇並且組合FW殘基，這樣使得所希望的抗體特徵，如增加一種或多種靶抗原的親和性得以實現。
可以使用任何已知的方法進行本發明的抗ASCT2抗體或其抗原結合片段的人源化、表面重修或工程化，該等方法如但不限於描述於以下的那些，Jones等人，自然321：522(1986)；Riechmann等人，自然332：323(1988)；Verhoeyen等人，Science[科學]239：1534(1988)；Sims等人，J.Immunol.[免疫學雜誌]151：2296(1993)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]196：901(1987)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.[免疫學雜誌]151：2623(1993)；美國專利案號5,639,641、5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5,814,476、5,763,192、5,723,323、 5,766,886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539、4,816,567、7,557,189、7,538,195、和7,342,110；國際申請案號PCT/US 98/16280、PCT/US 96/18978、PCT/US 91/09630、PCT/US 91/05939、PCT/US 94/01234、PCT/GB 89/01334、PCT/GB 91/01134、PCT/GB 92/01755；國際專利申請公開案號WO 90/14443、WO 90/14424、WO 90/14430；以及歐洲專利公開案號EP 229246；該等中每個都藉由引用完全併入本文，包括其中引用的參考文獻。
抗ASCT2人源化抗體及其抗原結合片段也可以在含有人免疫球蛋白基因座的轉基因小鼠中製造，該等基因座在免疫時能夠在內源性免疫球蛋白產生不存在時產生全套人抗體。這種途徑描述在美國專利案號5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、以及5,661,016中。
在某些實施方式中，提供了抗ASCT2抗體片段。已知各種用於生產抗體片段的技術。傳統上，該等片段藉由完整抗體的蛋白水解衍生，例如由Morimoto等人，J.Biochem.Biophys.Meth.[生物化學和生物物理方法雜誌]24：107-117(1993)；Brennan等人，[科學]Science 229：81(1985)所描述的。在某些實施方式中，抗ASCT2抗體片段係重組地產生的。所有Fab、Fv、和scFv抗體片段都可以表現在大腸桿菌或其他宿主細胞中並且從其分泌，因而允許大量該等片段的生產。此類抗ASCT2抗體片段也可以從以上討論的抗體噬菌體文庫分離。抗ASCT2抗體片段也可以是如美國專利案號5,641,870中所述的線性抗體。用於產生抗體片段的其他技術對於熟練的從業人員將是清楚的。
根據本發明，可對技術進行改編以生產對ASCT2具有特異性的單鏈抗體(參見，例如，美國專利案號4,946,778)。此外，方法可經 改編以構建Fab表現文庫，以允許快速且有效地鑒定具有針對ASCT2或其衍生物、片段、類似物或同系物的所希望特異性的單殖株Fab片段。參見，例如，Huse等人，Science[科學]246：1275-1281(1989)。藉由本領域中已知的技術可以生產抗體片段，包括，但不限於：由抗體分子的胃蛋白酶消化產生F(ab’)2片段；藉由還原F(ab’)2片段的二硫鍵產生Fab片段；藉由用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產生Fab片段；或Fv片段。
在某些方面中，可以對抗ASCT2抗體或其抗原結合片段進行修飾以便於增加它的血清半衰期。這可以例如藉由將補救受體結合表位併入抗體或抗體片段，藉由使抗體或抗體片段中的適當的區域突變，或藉由將表位併入隨後融合在抗體或抗體片段的末端或中部的肽標籤(例如，藉由DNA或肽合成)，或藉由YTE突變來實現。本領域中已知其他增加抗體或其抗原結合片段的血清半衰期的方法，例如，軛合至異源分子如PEG。
如本文所提供的修飾的抗ASCT2抗體或其抗原結合片段可以包含任何類型的提供該抗體或多肽與ASCT2的締合的可變區。在這點上，可變區可包含或衍生自可誘導增加體液應答並生成針對所希望抗原的免疫球蛋白的任何類型的哺乳動物。正因如此，抗ASCT2抗體或其抗原結合片段的可變區可以是例如，人、鼠類、非人靈長類動物(例如，石蟹獼猴、獼猴等)或羽扇豆來源的。在一些實施方式中，修飾的抗ASCT2抗體或其抗原結合片段的可變區和恒定區二者係人的。在其他實施方式中，相容性抗體的可變區(通常衍生自非人來源)可經工程化或專門定制來改進結合性質或減少分子的免疫原性。在這點上，在本發明中有用的可變區可經人源化或另外藉由納入輸入的胺基酸序列改變。
在某些實施方式中，抗ASCT2抗體或其抗原結合片段的重鏈和輕鏈二者中的可變結構域藉由至少部分替換一個或多個CDR並且/或 者藉由部分框架區替換和序列改變而改變。雖然CDR可以衍生自與構架區所衍生自的抗體相同的類別或甚至子類別的抗體，但是設想CDR將衍生自不同類別的抗體並且在某些實施方式中衍生自不同物種的抗體。不必用來自供體可變區的完整CDR來替換所有CDR以將一個可變域的抗原結合能力轉移至另一個。而是，只需要轉移維持抗原結合位點的活性所必需的那些殘基。考慮到在美國專利案號5,585,089、5,693,761和5,693,762中所闡明的解釋，熟習該項技術者完全有能力藉由進行常規實驗獲得具有減少的免疫原性的功能抗體。
儘管對可變區進行改變，熟習該項技術者將理解，本發明的修飾的抗ASCT2抗體或其抗原結合片段將包含抗體(例如，全長抗體或其抗原結合片段)，其中至少一個或多個恒定區結構域的一部分已被缺失或以其他方式改變，以便提供所希望的生物化學特徵，如當與包含天然或未改變的恒定區的具有大約相同免疫原性的抗體相比時增加的腫瘤定位或減少的血清半衰期。在一些實施方式中，修飾的抗體的恒定區包含人恒定區。對與本發明相容的恒定區的修飾包括在一個或多個結構域中的一個或多個胺基酸的添加、缺失或取代。即，本文揭露的修飾的抗體可包含對三個重鏈恒定結構域(CH1、CH2或CH3)中的一個或多個和/或對輕鏈恒定結構域(CL)的改變或修飾。在一些實施方式中，考慮了修飾的恒定區，其中一個或多個結構域部分或全部缺失。在一些實施方式中，修飾的抗體將包含缺失結構域的構建體或變體，其中整個CH2結構域被移除(△CH2構建體)。在一些實施方式中，省略的恒定區結構域可被短胺基酸間隔區(例如，10個殘基)替換，該間隔區提供通常由不存在的恒定區所賦予的一定分子柔性。
除它們的組態以外，本領域中已知恒定區介導若干種效應子 功能。例如，抗體經由Fc區來結合至細胞，其中抗體Fc區上的Fc受體位點結合至細胞上的Fc受體(FcR)。存在許多對於不同類別的抗體具有特異性的Fc受體，包括IgG(γ受體)、IgE(η受體)、IgA(α受體)、以及IgM(μ受體)。抗體與細胞表面上的Fc受體的結合觸發許多重要並且多樣的生物應答，包括抗體包覆的顆粒的吞噬和破環、免疫複合物的清除、殺滅細胞溶解抗體包覆的靶標細胞(稱為抗體依賴性細胞介導的細胞毒性，或ADCC)、炎症介體的釋放、胎座轉移、以及對免疫球蛋白產生的控制。
在某些實施方式中，抗ASCT2抗體或其抗原結合片段提供改變的效應子功能，進而影響給予的抗體或其抗原結合片段的生物學特性。例如，恒定區結構域的缺失或失活(經由點突變或其他手段)可以減少循環的修飾抗體的Fc受體結合。在其他情況下，與本發明一致的，恒定區修飾可以緩和補體結合並且因而減少軛合的細胞毒素的血清半衰期和非特異性締合。恒定區的又其他修飾可以用於消除二硫鍵或寡糖部分，從而允許由於抗原特異性或抗體靈活性增加而增強定位。相似地，根據本發明對恒定區的修飾可容易地使用技術人員認知範圍內的熟知的生物化學或分子工程技術進行。
在某些實施方式中，作為抗體或其抗原結合片段的ASCT2-結合分子不具有一種或更多種效應子功能。例如，在一些實施方式中，該抗體或其抗原結合片段不具有抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性和/或不具有補體依賴性細胞毒性(CDC)活性。在某些實施方式中，該抗ASCT2抗體或其抗原結合片段不結合至Fc受體和/或補體因子。在某些實施方式中，該抗體或其抗原結合片段不具有效應子功能。
在某些實施方式中，抗ASCT2抗體或其抗原結合片段可以被工程化以將CH3結構域直接融合到相應的修飾抗體或其片段的鉸鏈區。 在其他構建體中，可以將肽間隔區插在鉸鏈區與修飾的CH2和/或CH3結構域之間。例如，可表現相容性構建體，其中CH2結構域已經缺失，且剩餘的CH3結構域(修飾的或未修飾的)與具有5-20個胺基酸間隔區的鉸鏈區結合。可添加此間隔區，例如以確保恒定結構域的調節元件保持游離且可接觸，或者鉸鏈區保持柔性。在一些情況中，胺基酸間隔區可被證明具有免疫原性，並引發針對構建體的非所需免疫應答。因此，在某些實施方式中，添加至構建體的任何間隔區都可以是相對無免疫原性的，或甚至被完全省略，以便維持修飾的抗體的所希望的生物化學性質。
除了缺失整個恒定區結構域之外，本文提供的抗ASCT2抗體或其抗原結合片段可以藉由恒定區中的幾個或甚至單個胺基酸的部分缺失或取代來修飾。例如，CH2結構域中的選定區域中的單個胺基酸的突變可足以實質性地減少Fc結合，並且從而增加腫瘤定位。相似地，控制效應子功能(例如，補體C1Q結合)的一個或多個恒定區結構域可以完全或部分缺失。恒定區的這類部分缺失可以改進該抗體或其抗原結合片段的選定特徵(例如，血清半衰期)，同時使與受試者恒定區結構域相關的其他所希望的功能保持完整。此外，所揭露的抗ASCT2抗體及其抗原結合片段的恒定區可藉由增強所得構建體特性的一個或多個胺基酸的突變或取代來修飾。在這個方面，可能干擾保守結合位點(例如，Fc結合)所提供的活性，同時基本上維持修飾的抗體或其抗原結合片段的組態和免疫原性特性。某些實施方式可以包括向恒定區添加一個或多個胺基酸以增強期望特徵，如減少或增加效應子功能，或提供更多細胞毒素或碳水化合物附接。在該等實施方式中，可以希望插入或複製衍生自選定的恒定區結構域的特定序列。
本發明進一步增強與在此所闡明的鼠類的、嵌合的、人源化或人抗ASCT2抗體、或其抗原結合片段基本同源的變體和等效物。該等可 以含有例如保守取代突變，即藉由相似的胺基酸取代一個或多個胺基酸。例如，保守取代係指用相同通用類別內的另一個胺基酸取代一個胺基酸，像例如，用另一個酸性胺基酸取代一個酸性胺基酸、用另一個鹼性胺基酸取代一個鹼性胺基酸或用另一個中性胺基酸取代一個中性胺基酸。保守胺基酸取代所指的內容在本領域是熟知的。
抗ASCT2抗體或其抗原結合片段可以被進一步修飾為含有通常不是蛋白質的一部分的另外的化學部分。那些衍生的部分可以改進蛋白質的溶解性、生物半衰期、或吸收。該等部分還可以減少或消除蛋白質的任何所希望的副作用等。對那些部分的綜述可以在Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明頓藥物科學]，第22版，Lloyd V.Allen,Jr.編輯，(2012)中發現。
V. 抗ASCT2抗體共軛物
本揭露進一步提供了如上所述的軛合至異源試劑的抗ASCT2抗體或其片段。出於本發明的目的，“軛合”意指藉由共價鍵或離子鍵的連接。在某些方面中，該試劑可以是抗微生物劑、治療劑、前藥、肽、蛋白質、酶、脂質、生物應答調節劑、藥劑、淋巴因子、異源抗體或其片段、可檢測標記、PEG、或任何所述試劑中的兩種或更多種的組合。在一些實施方式中，此類ASCT2-結合分子係ASCT2-ADC。
因此，本揭露還提供了ADC，該ADC包含本文所揭露的抗ASCT2抗體，進一步包含至少一種細胞毒素劑。在一些方面中，該ADC進一步包含至少一個視情況的間隔區。在一些方面中，該至少一個間隔區係肽間隔區。在一些方面中，該至少一個間隔區係非肽間隔區。
細胞毒素劑或細胞毒素可以本領域中已知的任何分子，該分子抑制或阻止細胞的功能和/或造成細胞破壞(細胞死亡)、和/或施加抗 腫瘤/抗增生作用。已知許多類別的細胞毒素劑在ADC分子中具有潛在效用。該等包括但不限於：瓢菌素、奧瑞斯他汀(auristatins)、道諾黴素(daunomycins)、多柔比星(doxorubicins)、多卡米新(duocarmycins)、朵拉司他汀(dolastatins)、烯二炔、來紅黴素(lexitropsins)、紫杉烷類、嘌呤黴素、美登木素生物鹼(maytansinoids)、長春花鹼、微管溶素以及吡咯并苯并二氮呯(PBD)。此類細胞毒素劑的實例係AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB、奧瑞斯他汀(auristatin)E、紫杉醇、多西他賽(docetaxel)、CC-1065、SN-38、拓撲替康(topotecan)、啉代-多柔比星、根黴素(rhizoxin)、氰基啉代-多柔比星、朵拉司他汀(dolastatin)-10、棘黴素(echinomycin)、康普瑞汀(combretatstatin)、杯形生長抑制素(chalicheamicin)、美登素(maytansine)、DM-1、長春鹼、胺甲喋呤、和紡錘菌素(netropsin)、及其衍生物和類似物。關於適合在ADC中使用的細胞毒素的另外的揭露可以，例如，在國際專利申請公開案號WO 2015/155345和WO 2015/157592中發現，將其藉由引用以其全部內容併入本文。
在一個實施方式中，該細胞毒素劑係微管溶素或微管溶素衍生物。微管溶素A具有以下化學結構：
微管溶素係從粘細菌物種分離出的一類天然產物中的成員(Sasse等人，J.Antibiot[抗生素雜質]53：879-885(2000))。作為細胞骨架相互作用劑，微管溶素係抑制微管蛋白聚合並且導致細胞週期停滯和 細胞凋亡的有絲分裂毒物(Steinmetz等人，Chem.Int.Ed[國際版應用化學]43：4888-4892(2004)；Khalil等人，Chem.Biochem[化學和生物化學]7：678-683(2006)；Kaur等人，Biochem.J[生物化學雜誌]396：235-242(2006))。如本文使用的，術語“微管溶素”共同地和單獨地是指天然存在的微管溶素和微管溶素的類似物及衍生物。微管溶素的說明性實例被揭露於，例如，WO 2004005326 A2、WO 2012019123 A1、WO 2009134279 A1、WO 2009055562 A1、WO 2004005327 A1、US 7776841、US 7754885、US 20100240701、US 7816377、US 20110021568、以及US 20110263650中，將其藉由引用併入本文。將理解的是此類衍生物包括，例如，包括一個或多個保護或保護基團，一個或多個連接部分的微管溶素前藥或微管溶素。
在某些方面中，該微管溶素係微管溶素1508(在本文中又稱為“AZ1508”)，並且更詳細地描述於WO 2015157594中，將其藉由引用併入本文，該微管溶素具有以下結構：
在另一個實施方式中，該細胞毒素劑可以是吡咯并苯并二氮呯(PBD)或PBD衍生物。PBD易位於其中其交聯DNA的細胞核，阻止有絲分裂期間的複製，藉由誘導單股斷裂來破壞DNA，並且隨後導致細胞凋亡。一些PBD具有識別和結合到DNA特定序列的能力；較佳的序列係 PuGPu。PBD具有以下通用結構：
PBD在取代基的數目、類型和位置方面，在它們的芳香族A環和吡咯并C環二者方面，以及在C環的飽和度方面不同。在B環中，在N10-C11位置處存在亞胺(N=C)、甲醇胺(NH-CH(OH))、或甲醇胺甲基醚(NH-CH(OMe))，其係負責使DNA烷基化的親電中心。所有已知的天然產物具有在手性C11a位置處的(S)-組態，當從從C環向A環觀察時，該組態向其提供了右旋扭曲。這給予它們針對異螺旋性具有B型DNA小溝的的三維形狀，導致在結合位點處的滑動配合(Kohn，在Antibiotics III[抗生素III]施普林格出版社(Springer-Verlag)，紐約，第3-11頁(1975)；Hurley和Needham-VanDevanter，Acc.Chem.Res.適當[化學研究述評]，19，230-237(1986))。它們在小溝中形成加合物的能力使得它們能夠干擾DNA加工，因此將它們用作抗腫瘤劑。
首例PBD抗腫瘤抗生素，安麯黴素於1965年(Leimgruber等人，J.Am.Chem.Soc.[美國化學學會雜誌]87：5793-5795(1965)；Leimgruber等人，J.Am.Chem.Soc.[美國化學學會雜誌]87：5791-5793(1965))發現。此後，已經報導了許多天然存在的PBD，並且針對各種類似物已經開發了超過10種合成路線(Thurston等人，Chem.Rev.[化學評論]1994：433-465(1994)；Antonow,D.和Thurston,D.E.，Chem.Rev.[化學評論]111：2815-2864(2011))。家族成員包括abbeymycin(Hochlowski等人，J.Antibiotics[抗體學雜誌]40：145-148(1987))、奇卡黴素 (chicamycin)(Konishi等人，J.Antibiotics[抗菌素雜誌]37：200-206(1984))、DC-81(日本專利58-180 487；Thurston等人，Chem.Brit.[英國化學]26：767-772(1990)；Bose等人，Tetrahedron[四面體]48：751-758(1992))、甲基胺茴黴素(mazethramycin)(Kuminoto等人，J.Antibiotics[抗菌素雜誌]33：665-667(1980))、新胺茴黴素A和B(Takeuchi等人，J.Antibiotics[抗菌素雜誌]29：93-96(1976))、波羅斯拉黴素(porothramycin)(Tsunakawa等人，J.Antibiotics[抗菌素雜誌]41：1366-1373(1988))、prothracarcin(Shimizu等人，J.Antibiotics[抗菌素雜誌]29：2492-2503(1982)；Langley和Thurston，J.Org.Chem.[有機化學雜誌]52：91-97(1987))、西班米星(sibanomicin)(DC-102)(Hara等人，J.Antibiotics[抗菌素雜誌]41：702-704(1988)；Itoh等人，J.Antibiotics[抗菌素雜誌]41：1281-1284(1988))、西伯利亞黴素(Leber等人，J.Am.Chem.Soc.[美國化學學會雜誌]110：2992-2993(1988))以及托馬黴素(Arima等人，J.Antibiotics[抗菌素雜誌]25：437-444(1972))。包含它們的PBD和ADC還被描述於國際專利申請國際專利申請公開案號WO 2015/155345和WO 2015/157592中，將其藉由引用以其全部內容併入本文。
在某些方面中，該PBD係PBD 3249(在本文中又稱為“SG3249”)，並且更詳細地描述於WO 2014/057074中，將其藉由引用併入本文，該PBD具有以下結構：
在某些方面中，該PBD係PBD 3315(在本文中又稱為“SG3315”)，並且更詳細地描述於WO 2015/052322中，將其藉由引用併入本文，該PBD具有以下結構：
使用軛合的位點特異性或非位點特異性方法可以將本文揭露的抗ASCT2抗體及其抗原片段軛合至異源試劑。在一些方面中，該ADC包含一個、兩個、三個、四個或更多個治療部分。在一些方面中，所有治療部分係相同的。
用於抗體或其抗原結合片段的常規的軛合策略依賴於藉由賴胺酸或半胱胺酸將有效負載隨機軛合到抗體或片段。因此，在一些方面中，將該抗體或其抗原結合片段隨機軛合至試劑，例如，藉由抗體或片段的部分還原，隨後與所希望的試劑反應，其中接頭部分被附接或不被附接。使用DTT或相似的還原劑可以還原抗體或片段。然後可以在DMSO的存在下，將接頭部分被附接或不被附接的試劑以莫耳過量添加至還原的抗體或片段中。軛合後，可以添加過量的游離半胱胺酸以淬滅未反應的試劑。然後可以將反應混合物進行純化，並且緩衝液更換為PBS。
在其他方面中，使用在具體位置處的反應的胺基酸殘基，治療部分與抗體的位點特異性軛合產出具有一致化學計量的同源ADC配製物。該位點特異性軛合可以藉由半胱胺酸、殘基或非天然胺基酸進行。在一個實施方式中，該細胞毒素劑或顯像劑藉由至少一個半胱胺酸殘基軛合至抗體或其抗原結合片段。在一些方面中，每個治療部分經化學軛合至Fc 區中的具體Kabat位置處胺基酸的側鏈上。在一些實施方式中，該細胞毒素劑或顯像劑藉由位置239、248、254、273、279、282、284、286、287、289、297、298、312、324、326、330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、384、389、398、400、413、415、418、422、440、441、442、443，以及446中至少一處的半胱胺酸取代軛合至抗體或其抗原結合片段，其中該編號對應於Kabat中的EU指數。在一些方面中，該具體的Kabat位置係239、442、或二者。在一些方面中，該具體的位置係Kabat位置442，Kabat位置239和240之間的胺基酸插入，或二者。在一些方面中，該試劑藉由硫醇-馬來醯亞胺鍵軛合至抗體或其抗原結合片段。在一些方面中，該胺基酸側鏈係巰基側鏈。
在一個實施方式中，ASCT2-結合分子(例如，ASCT2-ADC、抗ASCT2抗體、或其抗原結合片段)將細胞毒性有效載荷遞送至表現ASCT2的細胞，並且將增生抑制或壓制至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%或約100%。細胞增生可以使用本領域公認的技術測定，其測量的細胞分裂速率、和/或經歷細胞分裂的細胞群中細胞的分數、和/或由於終末分化或細胞死亡(例如，胸苷摻入)引起的細胞群的細胞損失的速率。
VI. 編碼ASCT2-結合分子的多核苷酸及其表現
本揭露提供了包含核酸序列的多核苷酸，該核酸序列編碼特異性結合ASCT2或其抗原結合片段的多肽。例如，本發明提供了包含核酸序列的多核苷酸，該核酸系列編碼抗ASCT2抗體或編碼此類抗體的抗原結合片段。本發明的多核苷酸可以處於RNA形式或處於DNA形式。DNA包括cDNA、基因組DNA、以及合成的DNA；並且如果單股可以是編碼股或非 編碼(反義)股，那麼DNA可以是雙股或單股的。
在某些實施方式中，多核苷酸可以是分離的。在某些實施方式中，多核苷酸可以是基本上純的。在某些實施方式中，多核苷酸可以是cDNA或衍生自cDNA。在某些實施方式中，多核苷酸可以是重組產生的。在某些實施方式中，多核苷酸可以包含在相同閱讀框中與有助於例如多肽從宿主細胞表現和分泌的多核苷酸(例如，起用於控制多肽從細胞轉運的分泌序列作用的前導序列)融合的成熟多肽的編碼序列。具有前導序列的多肽係前蛋白質並且可以使得前導序列被宿主細胞裂解以形成成熟形式的多肽。該等多核苷酸還可以編碼ASCT2-結合前蛋白質，該前蛋白質係成熟蛋白質加另外的5’胺基酸殘基。
本揭露進一步提供了分離的多核苷酸，該多核苷酸包含編碼抗體VH的核酸，其中該VH包含與選自下組的參考胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%一致性的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、和SEQ ID NO：7。
此外，本揭露提供了分離的多核苷酸，該多核苷酸包含編碼抗體VL的核酸，其中該VL包含與選自下組的參考胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%一致性的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、和SEQ ID NO：8。
在某些實施方式中，本揭露提供了分離的多核苷酸，該多核苷酸包含編碼抗體VH的核酸，其中該VH包含與參考胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%一致性的胺基酸序列，並且包含編碼抗體VL的核酸，其中該VL包含與參考胺基酸序 列SEQ ID NO：2具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%一致性的胺基酸序列。在某些實施方式中，本揭露提供了分離的多核苷酸，該多核苷酸包含編碼抗體VH的核酸，其中該VH包含與參考胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%一致性的胺基酸序列，並且包含編碼抗體VL的核酸，其中該VL包含與參考胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%一致性的胺基酸序列。在某些實施方式中，本揭露提供了分離的多核苷酸，該多核苷酸包含編碼抗體VH的核酸，其中該VH包含與參考胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%一致性的胺基酸序列，並且包含編碼抗體VL的核酸，其中該VL包含與參考胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%一致性的胺基酸序列。在某些實施方式中，本揭露提供了分離的多核苷酸，該多核苷酸包含編碼抗體VH的核酸，其中該VH包含與參考胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%一致性的胺基酸序列，並且包含編碼抗體VL的核酸，其中該VL包含與參考胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%一致性的胺基酸序列。
在某些方面中，包含由如上所述的多核苷酸編碼的VH或VL的抗體或其抗原結合片段可以特異性結合至ASCT2，例如人或石蟹獼猴ASCT2。在某些情況下，這樣的抗體或其抗原結合片段可以特異性結合與包含17c10或1e8的VH和VL的抗體或其抗原結合片段的相同的表位。在某些方面中，本揭露提供了編碼結合分子的多核苷酸或多核苷酸的組合，例如特異性結合至ASCT2的抗體或其抗原結合片段。
進一步提供了一種包含如上所述的多核苷酸的載體。適合的 載體在本文中進行了描述，並且是熟習該項技術者已知的。
在某些方面中，本揭露提供一種包含如上所述的多核苷酸或載體、視情況進一步包含一種或多種運載體、稀釋劑、賦形劑或其他添加劑的組成物，例如醫藥組成物。
在如上所述的多核苷酸組成物中，包含編碼VH的核酸的多核苷酸和包含編碼VL的核酸的多核苷酸可以存在於單個載體中，或可以在單獨的載體上。因此，本揭露提供了一種或多種包含上述多核苷酸組成物的載體。
本揭露進一步提供了包含如上所提供的多核苷酸、多核苷酸組成物、或載體的宿主細胞，其中在一些情況下，宿主細胞可以表現特異性結合至ASCT2的抗體或其抗原結合片段。這樣的宿主細胞可以用於製備如在本文中提供的抗體或其抗原結合片段的方法中，其中該方法包括(a)培養該宿主細胞，並且(b)分離從該宿主細胞所表現的抗體或其抗原結合片段。
在某些實施方式中，該等多核苷酸包含用於成熟ASCT2-結合多肽(例如，抗ASCT2抗體或其抗原結合片段)的編碼序列，該編碼序列在相同閱讀框中與允許例如純化該編碼多肽的標誌物序列融合。例如，在細菌宿主的情況下，該標誌物序列可以是由pQE-9載體供給的六聚組胺酸標籤以提供對融合至該標記物的成熟多肽的純化，或者當使用哺乳動物宿主(例如，COS-7細胞)時，該標記物序列可以是衍生自流感病毒血凝素蛋白的血球凝集素(HA)標籤。
還提供了多核苷酸變體。多核苷酸變體可以在編碼區、非編碼區、或兩者中含有改變。在一些實施方式中，多核苷酸變體含有產生沈默取代、添加、或缺失而不改變編碼的多肽的性質或活性的改變。在一些 實施方式中，多核苷酸變體由歸因於遺傳密碼的簡並性的沈默取代產生。多核苷酸變體可以因為各種原因而產生，例如，為了優化特定宿主的密碼子表現(將人mRNA中的密碼子改變成細菌宿主如大腸桿菌較佳的那些密碼子)。還提供了包含本文描述的多核苷酸的載體和細胞。
在一些實施方式中，使用寡核苷酸合成儀藉由化學合成來構建編碼ASCT2-結合分子的DNA序列。此類寡核苷酸可以是基於所希望的多肽的胺基酸序列並且基於選擇在宿主細胞(其中將產生感興趣的重組多肽)中偏愛的那些密碼子來設計。可以應用標準方法來合成編碼感興趣的分離多肽的分離多核苷酸序列。例如，完整胺基酸序列可以用於構建回譯基因。此外，可以合成含有編碼特定分離多肽的核苷酸序列的DNA寡聚體。例如，可以合成若干個編碼所需多肽部分的小寡核苷酸並且然後將其連接。個體的寡核苷酸典型地含有用於互補組裝的5’或3’突出端。
一旦組裝(藉由合成、定點誘變、或另一種方法)，編碼特定的感興趣的分離多肽的多核苷酸序列可以被插入至表現載體中並且可操作地連接至適於蛋白質在所需宿主中的表現的表現控制序列。可以藉由例如核苷酸定序、限制酶定位法、和/或在適合的宿主中表現生物活性多肽來確認適當的組裝。為了在宿主中獲得高表現水平的轉染基因，該基因可以可操作地連接至在所選擇的表現宿主中起作用的轉錄和翻譯表現控制序列或與該等轉錄和翻譯表現控制序列締合。
在某些實施方式中，重組表現載體被用於擴增和表現編碼抗ASCT2抗體或其抗原結合片段的DNA。重組表現載體係可複製的DNA構建體，它具有編碼抗ASCT2抗體的多肽鏈或及其抗原結合片段的合成的或cDNA衍生的DNA片段，操作性地連接到衍生自哺乳動物、微生物、病毒、或昆蟲基因的適合的轉錄和翻譯調節元件。轉錄單位總體上包含以下元 件：(1)基因表現中具有調節作用的一個或多個遺傳元件，例如轉錄啟動子或增強子，(2)轉錄成mRNA並翻譯成蛋白質的結構序列或編碼序列，以及(3)適當的轉錄和翻譯啟動和終止序列，如本文詳細所述。此類調節元件可以包括控制轉錄的操縱子序列。另外可併入通常由複製起點賦予的在宿主中複製的能力和促進識別轉化體的選擇基因。當DNA區域在功能上彼此相關時，將它們可操作地連接。例如，如果信號肽(分泌前導子)的DNA表現為參與多肽的分泌的先質，那麼該DNA可操作地連接至該多肽的DNA；如果啟動子控制編碼序列的轉錄，那麼該啟動子可操作地連接至該編碼序列；或如果核糖體結合位點被定位以便允許翻譯，那麼該核糖體結合位點可操作地連接至編碼序列。旨在於酵母表現系統中使用的結構元件包括前導序列，該前導序列使得宿主細胞可以將翻譯的蛋白質分泌到胞外。可替代地，在無前導子或轉運序列下表現重組蛋白的情況下，該蛋白可包括N端甲硫胺酸殘基。隨後，此殘基可以視情況從表現的重組蛋白上裂解下來，以提供終產物。
表現控制序列和表現載體的選擇將取決於宿主的選擇。可以採用多種多樣的表現宿主/載體組合。對於真核宿主有用的表現載體包括例如包含來自SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒、以及巨細胞病毒的表現控制序列的載體。對於細菌宿主有用的表現載體包括已知細菌質粒，如來自大腸桿菌的質粒，包括pCR 1、pBR322、pMB9、以及其衍生物，更廣泛的宿主範圍質粒，如M13和絲狀單股DNA噬菌體。
用於表現ASCT2-結合分子的適當的宿主細胞包括在適當的啟動子控制下的原核細胞、酵母、昆蟲、或高等真核細胞。原核細胞包括革蘭陰性或革蘭陽性生物體，例如大腸桿菌或桿菌。高等真核細胞包括如本文所述的哺乳動物來源的已建立的細胞系。還可以採用無細胞翻譯系 統。關於蛋白質產生(包括抗體產生)方法的另外的資訊可以在例如美國專利公開案號2008/0187954、美國專利案號6,413,746和6,660,501、以及國際專利公開案號WO 04009823中找到，該等專利各自藉由引用以其全文併入本文。
還可以有利地採用各種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統，以表現重組ASCT2-結合分子。可以在哺乳動物細胞中進行重組蛋白質的表現，因為此類蛋白質總體上被正確地折疊，適當地修飾並且完全起作用。適合的哺乳動物宿主細胞系的實例包括HEK-293和HEK-293T、由Gluzman，Cell[細胞]23：175(1981)描述的猴腎細胞的COS-7系，以及包括例如L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、HeLa、以及BHK細胞系的其他細胞系。哺乳動物表現載體可以包含非轉錄元件，如複製起點、連接至待表現的基因的適合的啟動子和增強子、以及其他5’或3’側接非轉錄序列、以及5’或3’非翻譯序列(如必要的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點)，以及轉錄終止序列。用於產生昆蟲細胞中的異源蛋白質的杆狀病毒系統藉由Luckow和Summers，BioTechnology[生物技術]6：47(1988)評價。
可以根據任何適合的方法對由轉化宿主產生的ASCT2-結合分子進行純化。此類標準方法包括層析法(例如，離子交換層析、親和層析、以及尺寸分級柱層析)、離心、差別溶解度、或者藉由用於蛋白質純化的任何其他標準技術。親和標籤如六組胺酸、麥芽糖結合結構域、流感外殼序列以及谷胱甘肽-S-轉移酶可以附接至蛋白質，以允許蛋白質通過適當的親和柱後較容易地得到純化。還可以使用如蛋白質水解、核磁共振和x射線結晶的此類技術來物理性表徵分離的蛋白質。
例如，可以首先使用商業上可獲得的蛋白濃縮過濾器例如艾 美康恩(Amicon)或密理博皮裡康恩(Millipore Pellicon)超濾單元濃縮來自將重組蛋白分泌到培養基中的系統的上清液。濃縮步驟後，可以將濃縮物施加到適合的純化基質。可替代地，可以採用陰離子交換樹脂，例如具有側接的二乙胺基乙基(DEAE)基團的基質或基底。基質可以是丙烯醯胺、瓊脂糖、右旋糖酐、纖維素、或在蛋白質純化中常採用的其他類型。可替代地，可以採用陽離子交換步驟。適合的陽離子交換劑包括包含磺丙基或羧甲基基團的各種不可溶基質。最後，可以使用採用疏水性RP-HPLC介質(例如，具有側接的甲基或其他脂族基團的矽膠)的一個或多個反相高效液相層析(RP-HPLC)步驟，以進一步純化ASCT2-結合分子。還可以採用不同組合的一些或所有上述純化步驟以提供均質的重組蛋白。
可以例如藉由最初從細胞沈澱中提取，隨後進行一次或多次濃縮、鹽析、水性離子交換或尺寸排阻層析步驟來分離在細菌培養物中產生的重組ASCT2-結合分子。可以採用高效液相層析(HPLC)進行最終純化步驟。在重組蛋白表現中採用的微生物細胞可以藉由任何常規方法來破壞，該等方法包括凍融循環、超音波處理、機械破壞、或使用細胞裂解劑。
用於純化抗體和其他蛋白質的本領域已知的方法還包括，例如在美國專利公開案號2008/0312425、2008/0177048、以及2009/0187005中描述的那些，該等專利各自藉由引用以其全部內容併入本文。
VII. 醫藥組成物和給予方法
製備本文提供的ASCT2-結合分子並將其給予至對其有需要的受試者的方法係熟習該項技術者所熟知的或容易由熟習該項技術者來確定的。ASCT2-結合分子的給予途徑可以是例如口服、胃腸外、藉由吸入、或局部給予。如本文使用的術語胃腸外包括例如靜脈內、動脈內、腹膜內、肌內、皮下、直腸、或陰道給予。雖然所有該等給予形式可清楚地考慮為 是在本發明的範圍之內，但給予形式的另一實例係用於注射，特別是用於靜脈或動脈注射或滴注的溶液。通常，適合的醫藥組成物可以包含緩衝液(例如，乙酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝液)、表面活性劑(例如，聚山梨酯)、視情況穩定劑試劑(例如，人白蛋白)等。在與本文傳授內容相容的其他方法中，如本文提供的ASCT2-結合分子可直接遞送到有害細胞群的位點處，從而增加患病組織對治療劑的暴露。在一個實施方式中，直接給予至氣道，例如藉由吸入或鼻內給予。
如本文所討論的，可以按藥學有效量給予本文提供的ASCT2-結合分子用於體內治療由ASCT2過表現表徵的疾病或障礙，如結腸直腸癌、HNSCC、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、子宮內膜癌、血液癌(AML、MM、DLBCL)、以及癌症幹細胞。在這點上，應理解可以配製所揭露的結合分子以便有助於給予並且促進活性劑的穩定性。根據本發明的醫藥組成物可包含藥學上可接受的、無毒性的、無菌的運載體，如生理鹽水、無毒性的緩衝劑、防腐劑等。出於本申請的目的，藥學上有效量的ASCT2-結合分子意指足以實現有效結合至靶標且實現益處，例如，改善疾病或病症的症狀或檢測物質或細胞的量。在本文揭露的治療方法中使用的適合的配製物被描述於Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明頓藥物科學]，第22版，Ed.Lloyd V.Allen,Jr.(2012)中。
本文提供的某些醫藥組成物可以按一種可接受的劑型(包括例如膠囊、片劑、水性混懸液或溶液)來口服給予。某些醫藥組成物也可以藉由鼻氣霧劑或吸入來給予。採用苄醇或其他適合的防腐劑、提高生物利用度的吸收促進劑、和/或其他常規增溶劑或分散劑，這樣的組成物可以作為鹽水中的溶液來製備。
可以與運載體材料組合以產生單一劑型的ASCT2-結合分子 的量將取決於所治療的受試者和特定的給予方式而變化。組成物可以作為單次劑量、多次劑量或經一個既定時間段的輸注來給予。還可以調整劑量方案以提供最佳的所希望的應答。
與本揭露的範圍相一致，ASCT2-結合分子可以根據前述治療方法以足以產生治療效果的量給予至人或其他動物。本文提供的ASCT2-結合分子可以按常規劑型給予至該人或其他動物，該劑型係藉由根據已知技術將本發明的ASCT2-結合分子與常規藥學上可接受的運載體或稀釋劑組合而製備的。藥學上可接受的運載體或稀釋劑的形式和特徵可藉由有待組合的活性成分的量、給予途徑和其他熟知的變數來決定。還可以使用本發明的包含一種或多種ASCT2-結合分子(例如，ASCT2-ADC、抗ASCT2抗體、或其抗原結合片段、變體、或衍生物)的混合物。
“治療有效劑量或量”或“有效量”旨在當給予ASCT2-結合分子時，在治療患有待治療的疾病或病症的患者方面產生積極的治療應答的量。
用於治療其中ASCT2係過表現的疾病或障礙(如某些癌症)的本發明的組成物的治療有效劑量取決於許多不同因素(包括給予手段、靶部位、患者的生理狀態、患者是人還是動物、以及給予的其他藥物)而變化。通常，患者係人，但是也可以治療非人哺乳動物，包括轉基因哺乳動物。可以使用熟習該項技術者已知的常規方法滴定治療劑量，以優化安全性和功效。
至少一種待給予的ASCT2-結合分子量容易由熟習該項技術者考確定，而無需過多的此揭露給出的實驗。影響給予方式和至少一種ASCT2-結合分子的相應量的因素包括但不限於：疾病的嚴重性，疾病的病史，以及經歷治療的個體的年齡、身高、體重、健康、和身體狀況。相似 地，有待給予的ASCT2-結合分子的量將取決於給予方式以及該受試者將經歷這種藥劑的單次劑量還是多次劑量。
本揭露還提供了ASCT2-結合分子(例如，ASCT2-ADC，抗ASCT2抗體，或其抗原結合片段、變體、或衍生物)在治療由ASCT2過表現表徵的疾病或障礙(例如，結腸直腸癌、HNSCC、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、或血液癌)中使用的用途。
本揭露還提供了ASCT2-結合分子(例如，ASCT2-ADC，抗ASCT2抗體，或其抗原結合片段、變體、或衍生物)在治療由ASCT2過表現表徵的疾病或障礙(例如，包含CSC的癌症)中使用的用途。
本揭露還提供了ASCT2-結合分子(例如，ASCT2-ADC，抗ASCT2抗體，或其抗原結合片段、變體、或衍生物)在製造用於治療由ASCT2過表現表徵的疾病或障礙(例如，結腸直腸癌、HNSCC、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、或血液癌)的藥物中的用途。
本揭露還提供了ASCT2-結合分子(例如，ASCT2-ADC，抗ASCT2抗體，或其抗原結合片段、變體、或衍生物)在製造用於治療由ASCT2過表現表徵的疾病或障礙(例如，包含CSC的癌症)的藥物中之用途。
VIII.診斷
本揭露進一步提供了在診斷由ASCT2-過表現表徵的疾病(如某些癌症)期間有用的診斷方法，該方法涉及對來自個體的細胞或組織中的ASCT2的表現水平進行測量，並且將所測量的表現水平與在正常的細胞或組織中的標準ASCT2表現進行比較，由此與標準相比，表現水平的增加表明可由本文提供的ASCT2-結合分子治療的障礙。本揭露還進一步提供了用於確定CSC的存在之方法，該方法包括確定ASCT2之表現水平。
使用熟習該項技術者已知的經典免疫組織方法，可以將本文提供的ASCT2-結合分子用於在生物樣品中測定ASCT2蛋白水平。參見Jalkanen等人，J.Cell Biol.[細胞生物雜誌]105：3087-3096(1987)；Jalkanen等人，J.Cell Biol.[細胞生物雜誌]101：976-985(1985)。用於檢測ASCT2蛋白表現的其他基於抗體之方法包括免疫測定，如ELISA、免疫沈澱法、或西方印漬術。
“測定ASCT2多肽的表現水平”旨在直接地(例如，藉由確定或估算絕對蛋白水平)或相對地(例如，藉由與第二生物樣品中的疾病相關多肽水平比較)定性或定量測量或估算第一生物樣品中的ASCT2多肽水平。可測量或估計第一生物樣品中的ASCT2多肽表現水平並且將該第一生物樣品中的ASCT2多肽表現水平與標準ASCT2多肽水平進行比較，標準取自從不患有障礙的個體中獲得的第二生物樣品或由來自不患有障礙的個體群的平均水平確定。正如本領域將理解的，一旦已知“標準”ASCT2多肽水平，其可重複地被用作為比較的標準。
“生物樣品”旨在從潛在地表現ASCT2的個體、細胞系、組織培養物、或其他細胞來源獲得的任何生物樣品。本領域熟知用於從哺乳動物獲得組織活檢和體液之方法。
IX. 包含ASCT2-結合分子的套組
本揭露進一步提供了套組(kit)，該套組包含本文所述的ASCT2-結合分子，並且該套組可以用於進行本文所述的方法。在某些實施方式中，套組在一個或多個容器中包含至少一種純化的抗ASCT2抗體或其抗原結合片段。在一些實施方式中，套組在一個或多個容器中包含至少一種純化的ASCT2-ADC。在一些實施方式中，該等套組含有進行檢測測定的必要和/或足夠的所有元件，該等元件包括所有對照、用於進行測定的指 導、以及用於分析和呈現結果的任何必要的軟體。熟習該項技術者將容易地認識到，所揭露的ASCT2-結合分子可以容易地併入本領域熟知的已建立的套組形式之一。
X. 免疫測定
可以藉由本領域已知的任何方法將本文提供的ASCT2-結合分子用於針對免疫特異性結合的測定。可使用的免疫測定包括但不限於，使用如以下技術的競爭性和非競爭性測定系統：西方墨點、RIA、ELISA、ELISPOT、“夾心”免疫測定、免疫沈澱測定、沈澱素反應、凝膠擴散沈澱素反應、免疫擴散測定、凝集測定、補體固定測定、免疫放射測定、螢光免疫測定、以及蛋白質A免疫測定。此類測定係常規的並且在本領域是熟知的。參見，例如，Ausubel等人，編輯，(1994)Current Protocols in Molecular Biology[分子生物學現代方法](約翰威利父子公司(John Wiley & Sons,Inc.)，紐約)第1卷，將其藉由引用以其全文併入本文。
可以在組織學上採用本文提供的ASCT2-結合分子，如在免疫螢光法、免疫電子顯微術、或非免疫學測定中，例如用於原位檢測ASCT2或其保守變體或肽片段。原位檢測可以藉由如下來完成：從患者中取出組織學樣本，並向其施用標記的ASCT2-結合分子，例如藉由將該標記的ASCT2-結合分子覆蓋在生物樣品上來施加。藉由使用這一程序，不僅可確定ASCT2、或保守變體或肽片段的存在，還可確定其在檢查的組織中的分佈。使用本發明，普通技術人員應容易地知道，可修改眾多的組織學方法(如染色程式)中的任一種以便實現這種原位檢測。
給定批次的ASCT2-結合分子的結合活性可根據熟知的方法來確定。熟習該項技術者應能夠藉由採用常規實驗確定每個測定的操作和最佳測定條件。
適用於確定分離的ASCT2-結合分子的結合特徵的方法和試劑係在本領域中已知的和/或可商購的。設計用於此類動力學分析的設備和軟體係可商購的(例如，BIAcore®，BIAevaluation®軟體，GE醫療集團(GE Healthcare)；KENEXA®軟體，Sapidyne儀器)。
除非另外說明，否則本發明的實踐將採用細胞生物學、細胞培養、分子生物學、轉基因生物學、微生物學、重組DNA、以及免疫學的常規技術，該等技術在本領域的技術範圍內。此類技術在文獻中得到充分解釋。參見，例如，Sambrook等人編輯(1989)，Molecular Cloning A Laboratory Manual[分子選殖：實驗室手冊](第2版，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))；Sambrook等人編輯(1992)Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子選殖：實驗室手冊]，(冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory)，紐約)；D.N.Glover編輯(1985)DNA Cloning[DNA選殖]，第I卷和第II卷；Gait編輯(1984)Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成]；Mullis等人，美國專利案號4,683,195；Hames和Higgins編輯(1984)Nucleic Acid Hybridization[核酸雜交]；Hames和Higgins編輯(1984)Transcription And Translation[轉錄與翻譯]；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells[動物細胞的培養](Alan R.Liss公司)；Immobilized Cells And Enzymes[固定化細胞與酶](IRL出版社)(1986)；Perbal(1984)A Practical Guide To Molecular Cloning[分子選殖實用指南]；專題論文，Methods In Enzymology[酶學方法]，(學術出版社公司，紐約州)；Miller和Calos編輯(1987)Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells[哺乳動物細胞的基因轉移載體]，(冷泉港實驗室)；Wu等人編輯，Methods In Enzymology[酶學方法]，第154卷和第155卷；Mayer和Walker編輯(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology[細胞與分子生物學中的免疫化學方法](學術出版社，倫敦)；Weir和Blackwell編輯(1986)Handbook Of Experimental Immunology[實驗免疫學手冊]，第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo[操縱小鼠胚胎]，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約州，(1986)；以及Ausubel等人(1989)Current Protocols in Molecular Biology[當代分子生物學方案](John Wiley and Sons(約翰威利父子公司)，巴爾的摩，馬里蘭州)。
在Borrebaeck編輯(1995)Antibody Engineering[抗體工程](第二版；牛津大學出版社)中闡明了抗體工程的普遍原理。在Rickwood等人編輯(1995)Protein Engineering,A Practical Approach[蛋白質工程：實用方法](在牛津大學出版社的IRL出版社，牛津，英格蘭)中闡明了蛋白質工程的普遍原理。在Nisonoff(1984)Molecular Immunology[分子免疫學](第2版；西諾埃聯合公司(Sinauer Associates)，桑德蘭，麻塞諸塞州)；以及Steward(1984)Antibodies,Their Structure and Function[抗體，它們的結構和功能](Chapman和Hall，紐約，紐約州)中闡明了抗體和抗體半抗原結合的普遍原理。另外，本領域中已知的免疫學標準方法，不再做具體的描述，大體上遵循以下：免疫學現代方法，約翰威利父子公司，紐約；Stites等人編輯(1994)Basic and Clinical Immunology[基礎和臨床免疫學](第8版；阿爾普頓和蘭格公司(Appleton & Lange)，諾瓦克，康涅狄格州)；以及Mishell和Shiigi(編輯)(1980)Selected Methods in Cellular Immunology[細胞免疫學中所選擇的方法](W.H.弗裡曼與公司(W.H.Freeman and Co.)，紐約州)。
闡明免疫學的普遍原理的標準參考文獻包括Current Protocols in Immunology[免疫學現代方法]，約翰威利父子公司，紐約； Klein(1982)J.,Immunology：The Science of Self-Nonself Discrimination[免疫學雜誌：自身-非自身辨別科學](約翰威利父子公司，紐約)；Kennett等人編輯(1980)Monoclonal Antibodies,Hybridoma：A New Dimension in Biological Analyses[單株抗體、雜交瘤：生物分析中的新維度](Plenum出版社，紐約州)；Campbell(1984)“Monoclonal Antibody Technology”in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology[生物化學與分子生物學的實驗室技術的“單株抗體技術”]，編輯，Burden等人，(愛思唯爾出版社(Elsevier)，阿姆斯特丹)；Goldsby等人，編輯(2000)Kuby Immunology[庫比免疫學](第4版；H.弗裡曼與公司(H.Freemand & Co.))；Roitt等人(2001)Immunology[免疫學](第6版；倫敦：莫斯比)；Abbas等人(2005)Cellular and Molecular Immunology[細胞和分子免疫學](第5版；愛思唯爾出版社健康科學部(Elsevier Health Sciences Division))；Kontermann和Dubel(2001)Antibody Engineering[抗體工程](施普林格出版社(Springer Verlan))；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子選殖：實驗室手冊](冷泉港出版社)；Lewin(2003)Genes VIII[基因VIII](普倫蒂斯．霍爾出版(Prentice Hall)2003)；Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual[抗體：實驗室手冊](冷泉港出版社)；Dieffenbach和Dveksler(2003)PCR Primer[PCR引物](冷泉港出版社)。
此揭露中所引用的所有該等參考文獻藉由引用以其全文併入本文。此外，任何製造商的針對本文所引用或提及的任何產品的說明或目錄均藉由引用併入。藉由引用併入本文的文獻或其中的任何傳授內容可以用於本發明的實踐中。藉由引用併入本文的檔不被承認係先前技術。
XI. 實施方式
實施方式1.一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段特異性地結合至中性胺基酸轉運蛋白2(ASCT2)的表位，其中該抗體或抗原結合片段特異性地結合至與抗體或其抗原結合片段的相同ASCT2表位，該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)的三個重鏈互補決定區(HCDR)和輕鏈可變區(VL)的三個輕鏈互補決定區(LCDR)；其中HCDR1的胺基酸序列在SEQ ID NO：10中闡明；HCDR2的胺基酸序列在SEQ ID NO：22中闡明；HCDR3的胺基酸序列在SEQ ID NO：23中闡明；LCDR1的胺基酸序列在SEQ ID NO：13中闡明；LCDR2的胺基酸序列在SEQ ID NO：24中闡明；以及LCDR3的胺基酸序列在SEQ ID NO：25中闡明。
實施方式2.如實施方式1所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含具有SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：16的胺基酸序列的HCDR1；胺SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：17的基酸序列的HCDR2、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：18的胺基酸序列的HCDR3、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：19的胺基酸序列的LCDR1、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：20的胺基酸序列的LCDR2、以及SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：21的胺基酸序列的LCDR3。
實施方式3.如實施方式1或實施方式2中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該VH包含選自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、和SEQ ID NO：7的胺基酸序列，並且其中該VL包含選自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、和SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
實施方式4.根據實施方式1至3中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該VH包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列，並且該VL包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列。
實施方式5.根據實施方式1至3中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該VH包含胺基酸序列SEQ ID NO：7，並且該VL包含胺基酸序列SEQ ID NO：8。
實施方式6.根據實施方式1至5中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該IgG恒定區包含在位置239處的絲胺酸(S)和位置240處的V之間的半胱胺酸(C)插入。
實施方式7.根據實施方式6所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體包括SEQ ID NO：9的胺基酸序列的重鏈。
實施方式8.根據實施方式1至7中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中當抗體結合至細胞表面上的ASCT2時，該抗體被內化到細胞中。
實施方式9.根據實施方式1至8中任一項所述之抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段包含選自下組的輕鏈恒定區，該組由以下各項組成：人κ恒定區和人λ恒定區。
實施方式10.根據實施方式9所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體包含SEQ ID NO：26的人κ恒定區。
實施方式11.根據實施方式1至10中任一項所述之抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段進一步軛合至選自下組的細胞毒素，該組由以下各項組成：抗微生物劑、治療劑、前藥、肽、蛋白質、酶、脂質、生物應答調節劑、藥劑、淋巴因子、異源抗體、異源抗體的片段、可檢測標記、聚乙二醇(PEG)、放射性同位素、以及任何所述細胞毒素中的兩種或更多種的組合。
實施方式12.根據實施方式11所述之抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段軛合至細胞毒素。
實施方式13.根據實施方式12所述之抗體或抗原結合片段，其中該細胞毒素選自微管溶素衍生物和吡咯并苯并二氮呯。
實施方式14.根據實施方式13所述之抗體或抗原結合片段，其中該微管溶素衍生物係微管溶素AZ1508。
實施方式15.根據實施方式13所述之抗體或抗原結合片段，其中該吡咯并苯并二氮呯選自SG3315和SG3249。
實施方式16.根據實施方式15所述之抗體或抗原結合片段，其中該吡咯并苯并二氮呯係SG3315。
實施方式16A.根據實施方式15所述之抗體或抗原結合片段，其中該吡咯并苯并二氮呯係SG3249。
實施方式17.根據實施方式1至16中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體結合至人ASCT2和石蟹獼猴ASCT2。
實施方式18.根據實施方式1至17中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體不特異性結合人ASCT1。
實施方式19.一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含如實施方式1至18中任一項所述之抗體或抗原結合片段以及藥學上可接受的運載體。
實施方式20.一種編碼根據實施方式1至19中任一項所述之抗體或其抗原結合片段的多核苷酸或多核苷酸的組合。
實施方式21.一種載體，該載體包含根據實施方式20所述的多核苷酸或多核苷酸的組合。
實施方式22.一種宿主細胞，該宿主細胞包含根據實施方式20所述的多核苷酸或多核苷酸的組合或根據實施方式21所述的載體。
實施方式23.一種抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列的HCDR1、SEQ ID NO：22 的胺基酸序列的HCDR2、SEQ ID NO：23的胺基酸序列的HCDR3、SEQ ID NO：13的胺基酸序列的LCDR1、SEQ ID NO：24的胺基酸序列的LCDR2、以及SEQ ID NO：23的胺基酸序列的LCDR3，並且其中該抗體或抗原結合片段軛合至細胞毒素。
實施方式23A.一種抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列的HCDR1、SEQ ID NO：22的胺基酸序列的HCDR2、SEQ ID NO：23的胺基酸序列的HCDR3、SEQ ID NO：13的胺基酸序列的LCDR1、SEQ ID NO：24的胺基酸序列的LCDR2、以及SEQ ID NO：25的胺基酸序列的LCDR3，並且其中該抗體或抗原結合片段軛合至細胞毒素。
實施方式24.根據實施方式23所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：7的VH結構域和含有胺基酸序列SEQ ID NO：8的VL結構域。
實施方式24A.根據實施方式23所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：5的VH結構域和含有胺基酸序列SEQ ID NO：6的VL結構域。
實施方式25.根據實施方式23或實施方式24所述之抗體或抗原結合片段，其中該細胞毒素選自由以下各項組成之群組：抗微生物劑、治療劑、前藥、肽、蛋白質、酶、脂質、生物應答調節劑、藥劑、淋巴因子、異源抗體、異源抗體的片段、可檢測標記、聚乙二醇(PEG)、放射性同位素、以及任何所述細胞毒素中的兩種或更多種的組合。
實施方式26.根據實施方式23或實施方式24所述之抗體或抗原結合片段，其中該細胞毒素選自微管溶素衍生物和吡咯并苯并二氮呯。
實施方式27.根據實施方式26所述之抗體或抗原結合片段， 其中該微管溶素衍生物係微管溶素AZ1508。
實施方式28.根據實施方式26所述之抗體或抗原結合片段，其中該吡咯并苯并二氮呯選自SG3315和SG3249。
實施方式29.根據實施方式28所述之抗體或抗原結合片段，其中該吡咯并苯并二氮呯係SG3315。
實施方式29A.根據實施方式28所述之抗體或抗原結合片段，其中該吡咯并苯并二氮呯係SG3249。
實施方式30.一種醫藥組成物，該組成物包含根據實施方式23至29所述之抗體或抗原結合片段以及藥學上可接受的運載體。
實施方式31.一種製備抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包括培養如實施方式22所述的宿主細胞；並且分離該抗體或抗原結合片段。
實施方式32.一種診斷試劑，該診斷試劑包含根據實施方式1至18或23至29中任一項所述之抗體或抗原結合片段。
實施方式33.一種套組，該套組包含根據實施方式1至18或23至29中任一項所述之抗體或抗原結合片段、或根據實施方式19或30所述的組成物。
實施方式34.一種將試劑遞送至表現ASCT2的細胞之方法，該方法包括使該細胞與根據實施方式23至29中任一項所述之抗體或抗原結合片段接觸，其中該試劑被該細胞內化。
實施方式35.一種誘導表現ASCT2的細胞死亡之方法，該方法包括使該細胞與根據實施方式23至29中任一項所述之抗體或抗原結合片段接觸，其中該軛合至細胞毒素的抗體誘導表現ASCT2的細胞的死亡。
實施方式36.一種在受試者中治療由ASCT2的過表現表徵的 癌症之方法，該方法包括向需要治療的受試者給予有效量的根據實施方式1至18或23至29中任一項所述之抗體或抗原結合片段、或根據實施方式19或實施方式30所述的組成物。
實施方式37.根據實施方式36所述之方法，其中該癌症選自由以下各項組成之群組：結腸直腸癌、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、子宮內膜癌、以及血液癌(AML、MM、DLBCL)。
實施方式37A.根據實施方式36所述之方法，其中該癌症包含CSC。
實施方式38.根據實施方式37所述之方法，其中該血液癌選自以下各項：急性淋巴球性白血病(ALL)、急性骨骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨骨髓性白血病(CML)、急性單核細胞性白血病(AmoL)、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、以及多發性骨髓瘤。
實施方式39.一種用於在樣品中檢測ASCT2表現水平之方法，該方法包括：使該樣品與根據實施方式1至18或23至29中任一項所述之抗體或其抗原結合片段或根據實施方式19或實施方式30所述的組成物接觸，並且檢測樣品中該抗體或其抗原結合片段與ASCT2的結合。
實施方式40.根據實施方式39所述之方法，其中該樣品係細胞培養物。
實施方式41.根據實施方式39所述之方法，其中該樣品係分離的組織。
實施方式42.根據實施方式39所述之方法，其中該樣品來自人。
實施方式43.一種ASCT2抗體-藥物共軛物(ASCT2-ADC)，該ASCT2抗體-藥物共軛物包含抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列的HCDR1、SEQ ID NO：11的胺基酸序列的HCDR2、SEQ ID NO：12的胺基酸序列的HCDR3、SEQ ID NO：13的胺基酸序列的LCDR1、SEQ ID NO：14的胺基酸序列的LCDR2、SEQ ID NO：15的胺基酸序列的LCDR3、以及微管溶素AZ1508。
實施方式44.一種ASCT2-ADC，該ASCT2-ADC包含抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列的HCDR1、SEQ ID NO：11的胺基酸序列的HCDR2、SEQ ID NO：12的胺基酸序列的HCDR3、SEQ ID NO：13的胺基酸序列的LCDR1、SEQ ID NO：14的胺基酸序列的LCDR2、SEQ ID NO：15的胺基酸序列的LCDR3、以及PBD SG3249。
實施方式45.一種ASCT2-ADC，該ASCT2-ADC包含抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列的HCDR1、SEQ ID NO：11的胺基酸序列的HCDR2、SEQ ID NO：12的胺基酸序列的HCDR3、SEQ ID NO：13的胺基酸序列的LCDR1、SEQ ID NO：14的胺基酸序列的LCDR2、SEQ ID NO：15的胺基酸序列的LCDR3、以及微管溶素、和PBD SG3315。
實施方式46.一種ASCT2-ADC，該ASCT2-ADC包含抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的HCDR1、SEQ ID NO：17的胺基酸序列的HCDR2、SEQ ID NO：18的胺基酸序列的HCDR3、SEQ ID NO：19的胺基酸序列的LCDR1、SEQ ID NO：20的胺基酸序列的LCDR2、SEQ ID NO：21的胺基酸序列的LCDR3、 以及微管溶素AZ1508。
實施方式47.一種ASCT2-ADC，該ASCT2-ADC包含抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的HCDR1、SEQ ID NO：17的胺基酸序列的HCDR2、SEQ ID NO：18的胺基酸序列的HCDR3、SEQ ID NO：19的胺基酸序列的LCDR1、SEQ ID NO：20的胺基酸序列的LCDR2、SEQ ID NO：21的胺基酸序列的LCDR3、以及PBD SG3249。
實施方式48.一種ASCT2-ADC，該ASCT2-ADC包含抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的HCDR1、SEQ ID NO：17的胺基酸序列的HCDR2、SEQ ID NO：18的胺基酸序列的HCDR3、SEQ ID NO：19的胺基酸序列的LCDR1、SEQ ID NO：20的胺基酸序列的LCDR2、SEQ ID NO：21的胺基酸序列的LCDR3、以及PBD SG3315。
實施方式48A.一種治療在治療上有抗性的或再發或復發性的血液癌(包括在治療上有抗性的或再發或復發性的AML、MM、DLBCL)之方法，該方法包括以有效治療該在治療上有抗性的或再發或復發性的癌症的量向需要治療的受試者給予ASCT2抗體或抗原結合片段。
實施方式48B.一種治療在治療上有抗性的或再發或復發性的血液癌(包括在治療上有抗性的或再發或復發性的AML、MM、DLBCL)之方法，該方法包括以有效治療該在治療上有抗性的或再發或復發性的癌症的量向需要治療的受試者給予包含ASCT2抗體或抗原結合片段的ADC。
實施方式48C.一種治療在治療上有抗性的或再發或復發性的血液癌(包括在治療上有抗性的或再發或復發性的AML、MM、DLBCL)之方法，該方法包括以有效治療該在治療上有抗性的或再發或復發性的癌 症的量向需要治療的受試者給予有效量的根據實施方式1至18或23至29中任一項所述之抗體或抗原結合片段、或根據實施方式19或實施方式30所述的組成物。
實施方式49.一種結合CSC之方法，該方法包括使該CSC與ASCT2抗體或抗原結合片段接觸。
實施方式50.一種結合CSC之方法，該方法包括使該CSC與包含ASCT2抗體或抗原結合片段的ADC接觸。
實施方式51.一種結合CSC之方法，該方法包括使CSC與根據實施方式1至18或23至29中任一項所述之抗體或抗原結合片段、或根據實施方式19或實施方式30所述的組成物接觸。
實施方式52.一種抑制或殺滅CSC之方法，該方法包括以有效抑制或殺滅CSC的量使該CSC與ASCT2抗體或抗原結合片段接觸。
實施方式53.一種抑制或殺滅CSC之方法，該方法包括以有效抑制或殺滅CSC的量使該CSC與包含ASCT2抗體或抗原結合片段的ADC接觸。
實施方式54.一種抑制或殺滅CSC之方法，該方法包括以有效抑制或殺滅CSC的量使該CSC與根據實施方式1至18或23至29中任一項所述之抗體或抗原結合片段、或根據實施方式19或實施方式30所述的組成物接觸。
實施方式55.一種治療包含CSC的癌症之方法，該方法包括以有效治療該包含CSC的癌症的量向需要治療的受試者給予ASCT2抗體或抗原結合片段。
實施方式56.一種治療包含CSC的癌症之方法，該方法包括以有效治療該包含CSC的癌症的量向需要治療的受試者給予包含ASCT2 抗體或抗原結合片段的ADC。
實施方式57.一種治療包含CSC的癌症之方法，該方法包括以有效治療該包含CSC的癌症的量向需要治療的受試者給予有效量的根據實施方式1至18或23至29中任一項所述之抗體或抗原結合片段、或根據實施方式19或實施方式30所述的組成物。
實施方式58.一種在先前已經接受過治療的受試者中治療由CSC的存在而引起的在治療上有抗性的癌症之方法，該方法包括以有效治療該在治療上有抗性的癌症的量向該受試者給予ASCT2抗體或抗原結合片段。
實施方式59.一種在先前已經接受過治療的受試者中治療由CSC的存在而引起的在治療上有抗性的癌症之方法，該方法包括以有效治療該在治療上有抗性的癌症的量向該受試者給予包含ASCT2抗體或抗原結合片段的ADC。
實施方式60.一種在先前已經接受過治療的受試者中治療由CSC的存在而引起的在治療上有抗性的癌症之方法，該方法包括以有效治療該在治療上有抗性的癌症的量向該受試者給予根據實施方式1至18或23至29中任一項所述之抗體或抗原結合片段、或根據實施方式19或實施方式30所述的組成物。
實施方式61.一種在先前已經接受過治療的受試者中治療由CSC的存在而引起的再發或復發性的癌症之方法，該方法包括以有效治療再發或復發性的癌症的量向該受試者給予ASCT2抗體或抗原結合片段。
實施方式62.一種在先前已經接受過治療的受試者中治療由CSC的存在而引起的再發或復發性的癌症之方法，該方法包括以有效治療再發或復發性的癌症的量向該受試者給予包含ASCT2抗體或抗原結合片 段的ADC。
實施方式63.一種在先前已經接受過治療的受試者中治療由CSC的存在而引起的再發或復發性的癌症之方法，該方法包括以有效治療該再發或復發性的癌症的量向該受試者給予根據實施方式1至18或23至29中任一項所述之抗體或抗原結合片段、或根據實施方式19或實施方式30所述的組成物。
實施方式64.一種在包含癌細胞的樣品中診斷、預後、量化、鑒定、和/或檢測CSC的存在的方法，其中該方法包括：(316)使該樣品與結合至ASCT2核酸序列或ASCT2胺基酸序列的試劑接觸；(ii)檢測在該試劑和該ASCT2核酸序列或該ASCT2胺基酸序列之間是否存在結合；並且(iii)當檢測在該試劑和該ASCT2核酸序列或該ASCT2胺基酸序列之間的結合時，鑒定該樣品中該CSC的存在，其中結合至ASCT2胺基酸序列的該試劑包含ASCT2抗體或抗原結合片段。
實施方式65.根據實施方式49至54中任一項所述之方法，其中在使該CSC與ASCT2抗體或抗原結合片段、或包含ASCT2抗體或抗原結合片段的ADC、或根據實施方式1至18或23至29中任一項所述之抗體或抗原結合片段、或根據實施方式19或實施方式30所述的組成物接觸之前，確定存在CSC。
實施方式66.根據實施方式65所述之方法，其中將實施方式64所述的方法用於確定CSC的存在。
實施方式67.根據實施方式55至63中任一項所述之方法，其 中在治療(包括向該受試者給予ASCT2抗體或抗原結合片段、或包含ASCT2抗體或抗原結合片段的ADC、或根據實施方式1至18或23至29中任一項所述之抗體或抗原結合片段、或根據實施方式19或實施方式30所述的組成物)之前，確定存在CSC。
實施方式68.根據實施方式67所述之方法，其中將實施方式64所述的方法用於確定CSC的存在。
實施方式69.一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段特異性結合至該中性胺基酸轉運蛋白2(ASCT2)的表位，其中該抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)的三個重鏈互補決定區(HCDR)和輕鏈可變區(VL)的三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其中該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：16的胺基酸序列的HCDR1；SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：17的胺基酸序列的HCDR2；SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：18的胺基酸序列的HCDR3；SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：19的胺基酸序列的LCDR1；SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：20的胺基酸序列的LCDR2；以及SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：21的胺基酸序列的LCDR3。
實施方式70.如實施方式69所述之抗體或抗原結合片段，其中該VH包含選自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、和SEQ ID NO：7的胺基酸序列，並且其中該VL包含選自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、和SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
實施方式71.根據實施方式69或70中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該VH包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列，並且該VL包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列。
實施方式72.根據實施方式69或70中任一項所述之抗體或抗 原結合片段，其中該VH包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列，並且該VL包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
實施方式73.根據實施方式69至71中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含IgG恒定區，該IgG恒定區包含在位置239處的絲胺酸(S)和位置240處的纈胺酸(V)之間的半胱胺酸(C)插入。
實施方式74.根據實施方式73所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體包括SEQ ID NO：9的胺基酸序列的重鏈。
實施方式75.根據實施方式69至74中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中當抗體結合至細胞表面上的ASCT2時，該抗體被內化到細胞中。
實施方式76.根據實施方式69至75中任一項所述之抗體或抗原結合片段，抗體或抗原結合片段包含選自下組的輕鏈恒定區，該組由以下各項組成：人κ恒定區和人λ恒定區。
實施方式77.根據實施方式76所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體包含SEQ ID NO：26的人κ恒定區。
實施方式78.根據實施方式69至77中任一項所述之抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段進一步軛合至選自下組的細胞毒素，該組由以下各項組成：抗微生物劑、治療劑、前藥、肽、蛋白質、酶、脂質、生物應答調節劑、藥劑、淋巴因子、異源抗體、異源抗體的片段、可檢測標記、聚乙二醇(PEG)、放射性同位素、以及任何所述細胞毒素中的兩種或更多種的組合。
實施方式79.根據實施方式78所述之抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段軛合至細胞毒素。
實施方式80.根據實施方式79所述之抗體或抗原結合片段，其中該細胞毒素選自微管溶素衍生物和吡咯并苯并二氮呯。
實施方式81.根據實施方式80所述之抗體或抗原結合片段，其中該微管溶素衍生物係微管溶素AZ1508。
實施方式82.根據實施方式80所述之抗體或抗原結合片段，其中該吡咯并苯并二氮呯選自SG3315和SG3249。
實施方式83.根據實施方式69至82中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體結合至人ASCT2和石蟹獼猴ASCT2。
實施方式84.根據實施方式69至83中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體不特異性結合人ASCT1。
實施方式85.一種醫藥組成物，該組成物包含如實施方式69至84中任一項所述之抗體或抗原結合片段以及藥學上可接受的運載體。
實施方式86.一種編碼根據實施方式69至84中任一項所述之抗體或其抗原結合片段的多核苷酸或多核苷酸的組合。
實施方式87.一種製備如實施方式69至84中任一項所述之抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包括培養包含如實施方式86所述的多核苷酸的宿主。
實施方式88.一種在受試者中治療由ASCT2的過表現表徵的癌症之方法，該方法包括向需要治療的受試者給予有效量的如實施方式69至84中任一項所述之抗體或抗原結合片段或如實施方式85所述的醫藥組成物。
實施方式89.根據實施方式49至68中任一項所述之方法，其中該ASCT2抗體或抗原結合片段係如實施方式69至84中任一項所述之抗體或抗原結合片段或在如實施方式85所述的醫藥組成物中。
【實例】
以說明的方式而不是以限制的方式提供以下實例。
本揭露的實施方式可以進一步藉由參考以下非限制性實例進行定義，該等非限制性實例詳細描述了本揭露的某些抗體的製備以及使用本揭露抗體之方法。熟習該項技術者應當清楚的是在不背離本揭露的範圍的情況下，可以對材料和方法二者做出許多修改。
實例1.在人正常組織和癌症組織中的ASCT2表現
藉由IHC分析的在正常組織和腫瘤組織中的ASCT2蛋白表現
為了評估ASCT2的蛋白表現，從正常人和從人腫瘤甲醛固定的組織切片進行IHC。用檸檬酸鹽緩衝液(pH=6.0)抗原修復處理後，遵循製造商的方案，將該等組織用抗ASCT2兔多株抗體(EMD Millipore(EMD密理博公司)，比爾裡卡，麻塞諸塞州；目錄號ABN73)進行測試。使用HT29細胞系作為陽性對照，並且使用原代人肝細胞作為陰性對照來進行方案優化。
在正常組織中，在肝臟、心臟、肺細胞(pneumocyes)、腎小球、和腦中均未觀察到ASCT2的染色。
在人腫瘤中的ASCT2表現
藉由IHC評估不同癌組織中的ASCT2表現。在包括結腸癌、肺鱗狀細胞癌、頭頸部癌、和前列腺癌組織在內的實體瘤中，以及在血液癌(如AML、MM，和DLBCL)中觀察到強列的膜ASCT2表現。此外，在卵巢子宮內膜癌組織和在黑色素瘤組織中觀察到高ASCT2表現。下表2提供了在人癌症組織中ASCT2表現的概述。
[表2]在人腫瘤中的ASCT2表現
在從AML和MM的癌症幹細胞中觀察到ASCT2表現。使用與螢光團Alexa 647軛合的ASCT2抗體17c10藉由流動式細胞測量術來評估癌症幹細胞中的ASCT2。如在圖1A中所述，ASCT2在AML和MM患者中的表現明顯高於在正常骨髓中。藉由使用流動式細胞測量術對不同的亞群(如CD38+、CD38-，CD34+、CD34-、CD38+和CD34+、以及CD38-和CD34-)進行分類，細胞被分離並且將它們的幹細胞性質藉由對每個亞群進行選殖生成測定來進一步表徵。我們發現只有CD38+、CD34+細胞形成菌落，這進一步證實了在文獻中描述的發現(Lapidot T等人，Nature[自然]1994；367(6464)：645-8；Bonnet D等人Nat Med[自然醫學雜誌]1997；3(7)：730-7)。評估以上所述的所有亞群中的ASCT2表現。圖1B 描述了在白血病幹細胞群(即，AML患者樣品的CD38+、CD34+群)中的高ASCT2表現。同樣地，如在圖1C中所述，ASCT2表現在AML的大部分或非白血病幹細胞群中也很高。此外，還評估了MM腫瘤細胞的CD138+、CD19-(漿細胞)和CD138-、CD19+(幹細胞)中的ASCT2表現。圖1C中的長條圖表明了與MM的幹細胞相比，漿細胞中的高ASCT2表現。數據支持，與來自正常供體的骨髓相比，在來自AML和MM患者樣品的骨髓中觀察到ASCT2表現。此外，ASCT2在AML患者樣品的白血病幹細胞(LSC)(CD34+/CD38+)中高度過表現。此外，與幹細胞群(CD138-，CD19+)相比，還被定義為MM漿細胞的CD138+、CD19-細胞顯示出更高的ASCT2的表現。
還在來自胰腺腫瘤的癌症幹細胞中觀察到ASCT2表現。用膠原蛋白III消化胰腺實體瘤片段並且製備單細胞懸浮液。用針對細胞表面蛋白、EpCAM、CD44、CD24的抗體，以及用先前描述的ASCT2抗體對解離的細胞進行染色。已經針對胰腺癌幹細胞的細胞表面蛋白標記進行了充分表徵。EpCAM+ CD44+ CD24+細胞被定義為胰腺腫瘤中的癌症幹細胞(Li,C等人，Cancer Res.[癌症研究]2007；67：1030-1037)。CSC群(EpCAM+、CD44+、CD24+)中ASCT2表現的實例在圖1D中進行了描述。使用此相同策略，在用ASCT2-PBD ADC或同型對照ADC的單次劑量處理後，評估了胰腺腫瘤的癌症幹細胞群中的ASCT2表現。圖1E證實ASCT2-PBD ADC消融癌症幹細胞群。本文數據證實靶向ASCT2不僅在實體瘤中，而且在血液癌症和癌症幹細胞中也是有效的。
實例2.抗ASCT2抗體的產生
免疫和雜交瘤產生
藉由具有人ASCT2基因的質粒的DNA免疫(Chowdhury等 人，J.Immunol.Methods[免疫方法雜誌]249：147，2001)產生對ASCT2的抗體。將人ASCT2的基因選殖到表現質粒pcDNA3.1(英傑公司(Invitrogen)，卡爾斯巴德，加利福尼亞州)中。對八週齡VelocImmune II小鼠(再生元公司(Regeneron)，塔里敦，紐約)在尾部的基部每隔一週以1mg/mL在PBS中經皮內注射100μg的ASCT2表現質粒。在第一次注射後的第28天開始以2週間隔收集測試血液，並藉由流動式細胞測量術測定ASCT2-特異性抗體。將測試血液的連續稀釋液與表現ASCT2或無關細胞表面蛋白的293F細胞一起孵育。在第56和70天，處死具有最高特異性滴度的小鼠。分離來自淋巴結和脾的淋巴細胞，並且遵循聚乙二醇(羅氏診斷公司(Roche Diagnostics)，印弟安納波里斯，印第安那州)融合方法，將該等淋巴細胞與骨髓瘤細胞系P3x/63Ag8.653以1：1比率融合。在含有次黃嘌呤-胺喋呤-胸苷(HAT)的雜交瘤生長介質中選擇融合的細胞。
流動式細胞測量術篩選測定
針對與表現ASCT2的HEK 293F細胞的結合來評估雜交瘤上清液。藉由流動式細胞測量術發現特異性結合至表現ASCT2的HEK 293F細胞的上清液進一步藉由用一組表現ASCT2的癌細胞系的流動式細胞測量術染色確認了ASCT2-特異性結合。最後，將確認的上清液轉化為人IgG1，用於進一步的結合評估。
人抗ASCT2 IgG mAb和Fab的選殖和表現
藉由有限稀釋法亞選殖雜交瘤。藉由如上所述針對親本雜交瘤的流動式細胞測量術，針對ASCT2-特異性抗體篩選蛋白質A-親和力純化的IgG亞選殖的上清液。使用Dynabeads mRNA Direct套組(英傑公司)分離亞選殖的雜交瘤的mRNA。使用SuperScript III逆轉錄酶(英傑公司)和隨機六聚體引物合成cDNA的第一股。藉由用一組Novagen®簡並的Ig- 引物(EMD密理博公司，目錄號69830)的PCR擴增人Ig VL和VH基因。將PCR擴增的VL和VH產物選殖到質粒pCR2.1-TOPO(英傑公司)中，並進行測序。在添加用於選殖到人IgGκ pOE載體的限制性內切酶位點的情況下，將來自每個雜交瘤的VH和VL基因藉由PCR進行再擴增，其中VL被選殖在與人c-κ融合的BssHII/BsiWI位點處，並且VH被選殖在與人IgG-1重鏈恒定區(或用於產生Fab的CH1區)融合的BsrGI/SalI位點處。將所得pOE質粒藉由DNA測序來驗證。
抗ASCT2抗體在Hek293F(英傑公司)或CHO-G22細胞中暫態表現。為了在Hek293F細胞中表現，根據製造商的方案使用293fectinTM(英傑公司；目錄號12347-019)進行轉染。將該等細胞在FreeStyleTM 293表現介質(英傑公司；目錄號12338-018)中培養，並且在轉然後第三天和第六天培養體積加倍。將轉染的Hek293F細胞總共培養十一天。為了在CHO-G22細胞中表現，使用製造商的方案利用25kDa線性聚乙烯亞胺(波利塞斯公司(Polysciences)，沃靈頓，賓夕法尼亞州)對細胞進行轉染。將該等細胞在CD CHO介質(英傑公司)中培養，並且用內部飼料每隔一天補料。漿轉染的CHO-G22細胞總共培養十二天。
藉由蛋白質A層析法分離全長人IgG後，藉由流動式細胞測量術對結合進行再次評估。圖2描繪了一副橫條圖，該橫條圖顯示了與mock轉染的細胞相比，分離的人IgG 1e8、3f7、5a2、9b3、10c3、16b8、17c10、和17a10與表現人ASCT2的細胞的結合的倍數變化。如在圖中所見，發現若干全長人IgG保持ASCT2結合活性。
實例3.ASCT2-結合抗體作為抗體-藥物共軛物(ADC)
評估ASCT2-結合抗體的ADC-介導的細胞毒性
為了確認親本抗體的內化，並且為了預測它們是否可以遞送 細胞毒性有效載荷，根據製造商的說明書在Hum-ZAP抗體內化測定(高級靶向系統公司(Advanced Targeting Systems)，聖地牙哥，加利福尼亞州)中測試親本抗體。簡言之，將ASCT2-陽性WiDr細胞以1,000個細胞/孔的處理的組織培養物的密度在在96孔板上鋪板於培養基中，並且允許該等細胞在37℃/5%CO2下粘附過夜。為了製備測試品，將每個親本抗體用與核糖體失活蛋白(皂草素)相軛合的第二抗體(山羊抗人IgG)在室溫下孵育30分鐘以形成第二共軛物。然後製備該第二共軛物的連續稀釋液，並且添加至含有細胞的孔中。
在37℃/5%CO2下孵育72小時後，將CellTiter-Glo®發光活力測定(普洛麥格公司(Promega)，麥迪森，威斯康辛州)用於確定相對細胞毒性。簡言之，將CellTiter-Glo®試劑添加至每個孔中，並且允許在室溫下伴隨輕微晃動孵育10分鐘。使用Perkin Elmer EnVision®光度計在560nM處對每個樣品的吸光度讀數。將用親本抗體1E8或17C10、化學連接至皂草素(hIgG-皂草素)的抗ASCT2抗體、或化學連接至皂草素的同型對照的處理的細胞的相對增生率(%)與未處理的對照細胞的相對活力進行比較。如在圖3A中示出，在用非化學連接皂草素的抗ASCT2抗體處理的細胞中比在用皂草素軛合的抗體處理的那些細胞中，相對細胞增生率較低。
評估經典軛合的抗ASCT2抗體與微管溶素有效載荷的ADC-介導的細胞毒性
為了確認由軛合至微管溶素有效載荷的抗ASCT2抗體的ADC-介導的殺滅，直接將前導抗體1E8和17C10軛合至毒素的微管溶素類，並且在ASCT2-陽性結腸癌細胞上測試用所軛合的抗體的細胞毒性殺滅。簡言之，將SW48細胞以1,000個細胞/孔的處理的組織培養物的密度在 在96孔板上鋪板於培養基中，並且允許該等細胞在37℃/5%CO2下粘附過夜。為了製備測試品，將與微管溶素有效載荷軛合的每種抗體(ASCT2前導1E8和17C10，以及同型對照)進行連續稀釋並且添加至對應的孔中。在37℃/5%CO2下孵育72小時後，如上所述，將CellTiter-Glo®發光活力測定用於確定相對細胞毒性。
藉由以下公式計算細胞活力百分比：(處理的樣品的平均發光/對照樣品的平均發光)x100。使用GraphPad Prism軟體的邏輯非線性回歸分析確定IC50值。圖3B顯示了經典軛合至微管溶素AZ1508的抗ASCT2 1 E8、抗ASCT2 17C10、和同型對照R347的細胞毒性的圖。該圖顯示了兩種抗ASCT2抗體具有相似的細胞毒性。將所計算的IC50值在下表3中示出。
針對位點特異性軛合的半胱胺酸突變的選殖
使用標準重疊PCR方法來將半胱胺酸殘基引入抗ASCT2抗體1E8和17C10的CH2區中的胺基酸S239和V240之間。此半胱胺酸(稱為“239插入”或“239i”)將充當在抗ASCT2 ADC抗體的製備中細胞毒性藥物的軛合位點。含有Maia插入的重鏈主鏈的胺基酸序列示出在SEQ ID NO：9中。將含有引入的半胱胺酸的抗體軛合至微管溶素有效載荷(微管溶素AZ1508)或軛合至吡咯并苯并二氮呯(PBD)有效載荷(SG3249或SG3315)，基本上如下文所述。
含有馬來醯亞胺的藥物的軛合
評估ADC有效載荷的所有化合物(AZ1508、SG3249、SG3315)都含有接頭和，易於與抗體的硫醇殘基軛合(形成巰基-馬來醯亞胺鍵)的馬來醯亞胺基團。可以將包含馬來醯亞胺基團(例如，微管溶素1508)的細胞毒素軛合至工程化到本發明的抗ASCT2抗體(例如，17c10，1e8)中的具體的半胱胺酸殘基上。可替代地、或視情況，人們可以使用經典的軛合方法將細胞毒素劑附接至所述的抗體。用於將細胞毒素軛合至抗體上的天然賴胺酸和半胱胺酸殘基的方法係本領域熟知的。以下提供了用於位點特異性(在工程化的半胱胺酸殘基處)和經典的軛合(在天然半胱胺酸殘基處)的代表性方法。
代表性的位點特異性抗體-藥物軛合過程包括以下步驟：(a)將可衍生的胺基酸(例如，半胱胺酸)的側鏈去封端，(b)氧化，(c)軛合有效載荷(例如，細胞毒素劑，如微管溶素1508)，以及(d)藉由去除軛合試劑和未反應的有效載荷進行精濾(polishing)。例如，可以藉由在1X PBS中用1mM乙二胺四乙酸(EDTA)配製抗體進行與工程化的半胱胺酸的軛合。藉由添加四十當量的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽/抗體並且在37℃下孵育三小時，使用輕度還原來產生游離硫醇。使用在1X PBS中的用1mM EDTA進行的三次連續滲析來去除三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽。可替代地，可以使用脫鹽柱來去除三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽。藉由添加約20當量的脫氫樅酸(dhAA)並且在室溫下孵育約四小時允許抗體鏈間二硫鍵重新形成。
在準備軛合時，將二甲亞碸添加至抗ASCT2抗體至十個百分比v/v。添加在二甲亞碸中的八或十二當量的微管溶素1508有效載荷(分別針對2T和4T載藥量)，並且將該混合物在室溫下孵育約1小時。可替代地，該孵育可以在4℃下進行約16小時。藉由添加約4莫耳當量的N-乙醯基半胱胺酸(NAC)/有效載荷(即，32或48)淬滅該反應。遵循製造商的 建議，藉由使用陶瓷羥基磷灰石從軛合的抗體中去除游離的有效載荷。如果需要，最終產品可以經受緩衝液更換。為了確認純度和與重鏈的軛合，可以藉由本領域已知的任何方法分析該等軛合的抗體。在一些情況下，可以將非還原性和還原性SDS-PAGE用於確認純度和與重鏈的綴合。
藉由部分還原抗體，然後用所希望的接頭-藥物反應來製備具有隨機軛合至天然半胱胺酸殘基的藥物的ADC。藉由在pH 8.0下添加約3莫耳當量的DTT，隨後在約37℃下孵育約2小時，將濃度為5mg/mL的抗體部分還原。然後將還原反應在冰中冷卻，並例如藉由透濾去除過量的DTT。然後以約1：10的接頭-藥物/硫醇莫耳比添加接頭-藥物。在約10%v/v DMSO的存在下進行軛合反應。軛合後，添加過量游離的半胱胺酸(超過接頭-藥物約2倍莫耳比)以淬滅未反應的接頭-藥物以產生半胱胺酸-接頭-藥物加合物。將反應混合物進行純化(例如，藉由疏水性相互作用層析法)，並且經受緩衝液更換為PBS。使用標準方法(如疏水性相互作用層析法和還原反相層析法)確定載藥量分佈。
實例4.ASCT2-結合mAb和ADC的特徵
結腸直腸癌細胞中ASCT2抗體的ASCT2特異性結合
為了確定某些雜交瘤殖株的結合對ASCT2抗原是否具有特異性，遵循ASCT2表現的shRNA敲除來評估結合。簡言之，用表現ASCT2 shRNA或非靶標shRNA(NTshRNA)的慢病毒轉導WiDr細胞。在感染後72小時對兩種抗ASCT2雜交瘤殖株17c10和1e8的結合進行評估。如圖4中所見，ASCT2表現的敲除顯著消融了對應殖株的結合，並且進一步確認了ASCT2 mAbs 17c10和1e8的抗原-特異性結合。
抗ASCT2未軛合抗體的內化動力學
當與靶抗原結合時抗體的內化係實現所希望的ADC效應的 先決條件。因此，檢驗ASCT2抗體的內化特徵。將WiDr細胞與軛合至Alexa 488的抗ASCT2抗體17c10(17c10-Alexa 488)進行孵育持續不同時間段。然後將細胞洗滌並在有或沒有抗Alexa 488抗體的情況下在冰上孵育45分鐘以淬滅細胞表面信號。藉由流動式細胞測量術分析測量總信號和淬滅信號(代表內化的抗體)的螢光強度。如在圖5A中所見，與未顯示內化的同型對照抗體相比，抗ASCT2抗體17c10顯示了隨時間增加的內化。
藉由細胞毒性殺滅測量的ASCT2-ADC(17c10AZ1508)的內化動力學
用軛合至微管溶素AZ1508的抗ASCT2抗體(17C10-AZ1508)將細胞進行脈衝持續不同的時間段。此後，含有介質的ADC被新鮮介質替換，並且將細胞再孵育4天。藉由使用CTG套組測量細胞活力。繪製劑量-應答曲線為未處理的對照細胞的百分比，並且將代表性的圖在圖5B中示出。如上所述的計算IC50值，並且將該等結果匯總在下表4中。
親和力確定(17c10 & 1e8與表現ASCT2的細胞系的結合)
利用表現ASCT2的人、石蟹獼猴，和CHO-衍生的細胞系來評估ASCT2-特異性抗體的結合親和力和交叉反應性。藉由滴定螢光團標記的抗體測量表觀親和力。將代表性的結果匯總在下表6中，並且在圖6中示出。
圖6顯示了由抗ASCT2抗體17c10和1e8，以及同型對照R347與表現ASCT2的細胞系的結合而產生的流動式細胞測量術圖。人癌細胞系Ca127的結果示於圖6A中；人癌細胞系FaDu的結果示於圖6B中；人癌細胞系SSC15的結果示於圖6C中；人癌細胞系WiDr的結果示於圖6D中；穩定表現人ASCT2的CHOK1細胞的結果示於圖6E中；穩定表現cyno ASCT2的CHOK1細胞的結果示於圖6F中；cyno癌細胞系CynoMK1的結果示於圖6G中；以及mock轉染的CHOK1細胞的結果示於圖6H中。將結合至表現ASCT2的細胞系的17c10和1e8的EC50值在下表5中示出。
17c10抗體對ASCT2抗原的特異性
抗ASCT2抗體17c10不具有針對ASCT1(SLC1A4)SLC1A家族的其他成員的親和力。由shRNA造成的ASCT1表現的沈默沒有消融17C10在SKMEL-2細胞中的ASCT2特異性結合，如在圖7A中所示的圖中所見。藉由西方墨點分析進一步確認shRNA的敲除效率。此外，如在圖7B中示出的圖中看出，在細胞的細胞毒性特性中沒有觀察到變化，其中藉由各自的shRNA沈默ASCT1表現。結果匯總在表6中。
ASCT2-ADC抗體對Cyno ASCT2的交叉反應性&細胞毒性
對軛合至微管溶素AZ1508的抗ASCT2-結合殖株17c10和1e8評估與在CHOK1細胞中穩定表現的cyno ASCT2、在CHOK1細胞中穩定表現的人ASCT2、以及在CHOK1細胞中表現的對照分子的結合。當軛合至微管溶素1508有效載荷時，ASCT2抗體17c10(圖8A)和ASCT2抗體1e8(圖8B)在表現人和cyno ASCT2的CHOK1細胞中顯示出有效的細胞毒活性，但在未轉染的CHOK1或CHOK1-ABCB5中顯示出。將該等結果匯總在下表7中。
17c10的種系化
將17c10的VH和VL結構域的胺基酸序列與VBASE資料庫中已知的人種系序列進行比對，並藉由序列相似性鑒定最接近的種系。對於VH結構域，這係IgVh4-34*01；對於VL結構域，它係IgKv1-5*03。對於17c10，該種系化過程涉及在VH結構域中回復1個構架殘基並且在VL結構域中回復5個殘基。在VH結構域中，回復突變係在Kabat位置82a處，其中蘇胺酸(T)回復為絲胺酸(S)。在VL結構域中，該等突變係在Kabat 位置13、21、39、70、和76處，其中在Kabat位置13處，蘇胺酸(T)回復為丙胺酸(A)；在Kabat位置21處亮胺酸(L)回復為異亮胺酸(I)；在Kabat位置39處天冬胺酸(N)回復為賴胺酸(K)；在Kabat位置70處天冬胺酸(D)回復為穀胺酸(E)，以及在Kabat位置76處蘇胺酸(T)回復為絲胺酸(S)。藉由用該等突變合成VH和VL結構域並使用限制性消化和連接替換現有的VH和VL來產生這變化。種系化的和原始的(非種系化的)17c10二者均表現為IgG，並且藉由流動式細胞測量術評估其對多個表現ASCT2的細胞系的親和力。如在圖9A至圖9D中所見，在種系化的17c10或親本17c10與WiDr細胞、或與表現HuASCT2或CyASCT2的CHO細胞的結合方面不存在差異。
實例5.在不同癌症中由ASCT2-ADC引起的細胞毒性殺滅
如上所述的，藉由位點特異性軛合位點，將17c10抗體與PBD(SG3315)或微管溶素(AZ1508)有效載荷軛合。每一個樣品的藥物-抗體比率(DAR)估計為約2.0。使用來自不同適應症(如來自胰腺癌、結腸癌、肺癌、頭頸部鱗狀癌(HNSCC)、前列腺癌，和ASCT2陰性肺癌)的癌細胞進行細胞毒性測定。如在圖10A至圖10F中所示，與AZ1508結合的17c10 ADC抗體比與微管溶素結合的對照抗體具有更高的細胞毒性活性。軛合至SG3249或SG3315的抗ASCT2抗體17c10也比與微管溶素AZ1508結合的、或與PBD SG3249結合的、或與SG3315結合的對照抗體具有更高的細胞毒性活性。顯示來自使用軛合至SG3249的17c10的細胞毒性測定的結果的圖示出在圖11A中，並且顯示來自使用軛合至SG3315的17c10的細胞毒性測定的結果的圖示出在圖11B中。將IC50值匯總在下表8中。
實例6. ASCT2-ADC抑制體內的腫瘤生長
所有體內操作均按照AAALAC認證設施的規格化指導進行，並得到米迪繆尼有限責任企業(MedImmune LLC)機構動物護理和使用委員會的批准。為了測試ASCT2-ADC抗體殺滅腫瘤細胞的能力，將WiDr(100μl/106細胞/小鼠)或原發性胰腺腫瘤(PDX)經皮下接種到雌 性3-5週齡裸鼠的右側翼(查理斯河實驗室(Charles River Laboratories)，威明頓，麻塞諸塞州)。將小鼠保留若干週以發展腫瘤；一旦腫瘤達到約150-200mm3，將小鼠隨機化並分配到治療組(10只小鼠/組)。此後，對小鼠經靜脈內注射不同劑量的抗ASCT2 ADC(17c10-Az1508或17c10-SG3315或17c10-SG3249)或同型對照藥物軛合的抗體。對處理的異種移植小鼠的體重和腫瘤體積進行監測，持續對應時間段。使用以下公式計算腫瘤體積：(最短直徑)2 x(最長直徑)x 0.5，並且將該等結果在圖12A、圖12B、和圖12C中示出。
另外，在代表表現不同水平的ASCT2的不同亞群的血液惡性腫瘤模型的小組中評估17c10-SG3249的體內功效。在播散性腫瘤異種移植物模型中，每週以0.4mg/kg(或0.5mg/kg)和0.1mg/kg的劑量給予ADC，共計四次劑量。如圖13A和圖13B中示出，與未經治療的或同型ADC對照相比，Kaplan-Meier曲線證實17c10-SG3249組的存活益處顯著增加。與其他組(如，SOC、未處理的、和同型對照ADC)相比，在若干AML異種移植物腫瘤模型中給予17c10-SG3249顯示出存活益處的顯著增加。與同型對照ADC(66天)相比，在TF1a AML模型中，17c10-SG3249證實了優異的活性(中位存活期>205天)。相似地，在若干MM1.S多發性骨髓瘤(MM)模型中，17c10-SG3249證實了強烈的腫瘤生長抑制和存活益處(中位存活期的123.5天對比未處理的對照的55.5天)。將若干惡性血液腫瘤中17c10-SG3249的結果匯總在下表9中。
來自未處理的統計學顯著性(對數秩(曼特爾-考克斯(Mantel-Cox))測試)-***=P<0.0001，**=P<0.001，*=P<0.01
實例7.化學部分與抗ASCT2抗體軛合以形成ADC
發展了抗ASCT2 mAb的純化方法。簡言之，使用MAbSelect Sure樹脂(GE醫療集團)將收穫的細胞培養液進行蛋白質A捕獲步驟，以從細胞培養上清液中捕獲蛋白質，並且以去除與過程和產物有關的雜質。以300cm/hr的線性流速進行所有的過程步驟。將該樹脂用50mM Tris(pH 7.4)平衡，並且將條件介質載入到柱上至30g/L樹脂的載入量挑戰。將該柱用50mM Tris(pH 7.4)再次平衡，並且然後暴露於經優化的兩個洗滌步驟中以減少雜質並減少存在於條件介質中的輕鏈過量。第一洗滌步驟由50mM Tris、500mM氯化鈉(pH 7)組成，並且第二洗滌步驟含有50mM乙酸鈉、500mM氯化鈉(pH 5.0)。然後將該柱用50mM Tris(pH 7.4)重新平衡，並且將該產物用25mM乙酸鈉(pH 3.6)洗提。從洗提峰上升一側的0.5OD至下降一側的0.5OD收集產物。在每個純化循環後，將柱用100mM乙酸汽提，然後用的50mM Tris(pH 7.4)重新平衡，用0.1N氫氧化鈉消毒，並儲存在2%(v/v)苄醇、100mM乙酸鈉(pH 5.0)中。該步驟的典型產率為70%-75%。
進行低pH處理用於病毒滅活。簡言之，藉由添加1M乙酸將MAbSelect Sure產物調節至3.5的靶pH。保持60分鐘後，藉由添加1M Tris將該溶液中和至7.4的靶pH。隨後過濾產物。
作為中間物純化步驟，使用樹脂Capto Adhere樹脂(GE醫療集團)進行混合模式層析法。該柱以流通模式運行：將該柱用50mM Tris (pH 7.4)平衡，並將中和的蛋白質溶液載入到該柱上。雜質與樹脂結合，而將產物在通過池的流體中回收。典型的步驟產率係80%-84%。
使用陽離子交換樹脂HS 50(POROS)進行精濾步驟。將該步驟以結合-洗提模式進行，並用於進一步減少與程式相關的雜質。將該柱用50mM Tris(pH 7.4)平衡，並將來自混合模式層析步驟的產物載入到柱上。隨後用50mM Tris(pH 7.4)，然後用50mM Tris、150mM氯化鈉(pH 7.4)洗滌該柱，並且然後用50mM Tris、400mM氯化鈉(pH 7.4)進行洗提。從洗提峰上升一側的0.5OD至下降一側的0.5OD收集產物。在每個純化循環後，將柱使用50mM Tris、500mM氯化鈉(pH 7.4)進行汽提，用1N氫氧化進行鈉消毒，並且儲存在0.1N NaOH中。該步驟的典型產率為95%-98%。
使用具有30kDa分子量截留(MWCO)的Pellicon 3 Ultracel膜將純化的mAb中間物進行濃縮，並且藉由透濾轉移至配製緩衝液(20mM組胺酸，240mM蔗糖，pH 6.0)中。最終的蛋白質濃度係約20mg/ml。如果需要，將蛋白質在-80℃下冷凍儲存直到軛合。下表10中匯總了單株抗體純化過程中的產物質量。
抗ASCT2抗體與微管溶素AZ1508的軛合
藉由經馬來醯亞胺化學的微管溶素(AZ1508)與兩個游離 的工程化的半胱胺酸殘基的定點軛合來製備抗體-藥物共軛物
將純化的mAb中間物解凍，並且藉由添加1M Tris鹼將pH調節至pH 7.0。用20mM組胺酸緩衝液(pH 7.0)，將蛋白質溶液稀釋至7.5mg/ml的終濃度，並且添加EDTA至1mM的終濃度。將該蛋白質轉移至適合的反應容器中，並且將溫度調節至37℃。以TCEP：mAb=30：1的莫耳比添加來自新鮮製備的50mM儲備溶液的還原劑三(2-羧乙基)膦(TCEP)。將該溶液在37℃下伴隨輕微攪動孵育3小時。此孵育時間後，藉由針對20mM組胺酸/1mM EDTA緩衝液(pH 7.0)的滲析或透濾，去除該還原劑。將該回收的產物通過0.22μm過濾器進行過濾。用於氧化，用脫氫抗壞血酸(DHA)以10：1(DHA：mAb)的莫耳比將蛋白質溶液進行孵育。在22℃-25℃下伴隨輕微攪動(以50rpm混合速度)進行孵育持續4小時。該時間後，以8：1(有效載荷：mAb)的莫耳比添加來自在DMSO中的10mM儲備溶液的微管溶素有效載荷(AZ1508)。逐滴添加另外的DMSO以達到10%(v/v)的終濃度。將該混合物在22℃-25-下伴隨輕微攪動孵育1小時，以允許抗體-藥物共軛物的形成。然後藉由以5：1的NAC：微管溶素的莫耳比添加來自100mM儲備溶液的N-乙醯半胱胺酸(NAC)將該反應淬滅。
為了去除蛋白質片段、聚合物、和過量的游離的微管溶素有效載荷，使用陶瓷羥磷灰石(CHT)I型(伯樂公司(Biorad))進行軛合後純化。將該柱以結合-洗提模式按180cm/hr的線性流速操作。向淬滅的抗體-藥物-軛合混合物中添加來自300mM儲備溶液的磷酸鈉至10mM的終濃度。將CHT柱用300mM磷酸鈉(pH 6.5)預平衡，並且用10mM磷酸鈉(pH 6.5)平衡。將抗體-藥物軛合混合物載入至20g/L的載入量挑戰，並且用10mM磷酸鈉(pH 6.5)將該柱重新平衡。以在10mM磷酸鈉(pH 6.5)中至1M氯化鈉的線性梯度，經10個柱體積進行洗提。將洗提峰分級，並且將該等級分藉由HP SEC進行分析。將含有具有單體純度>95%的軛合蛋白質的級分合併。在每個純化循環後，將柱用300mM磷酸鈉(pH 6.5)進行汽提，用1N氫氧化鈉消毒，並且儲存在0.1N氫氧化鈉中。
將合併的抗體藥物共軛物(ADC)濃縮並且藉由切向流過濾使用再生纖維素或具有30kDa MWCO的PES膜更換成最終配製的緩衝液。加入來自10%儲備溶液的賦形劑PS80。在20mM組胺酸、240mM蔗糖、0.02%PS80(pH 6.0)中，最終的ADC濃度係5mg/ml。在該等條件下，產生的ADC顯示了<12%未軛合的重鏈，75%至82%單軛合的重鏈，以及1.8-1.9的藥物-與-抗體的比率。
抗ASCT2抗體與吡咯并苯并二氮呯(PBD)SG3249的軛合
藉由經馬來醯亞胺化學的PBD(SG3249)與兩個游離的工程化的半胱胺酸殘基的定點軛合來製備抗體-藥物共軛物過程順序與針對以上匯總的微管溶素軛合所討論的相同，儘管精確的條件不同。
將純化的mAb中間物解凍，並且藉由添加1M Tris鹼將pH調節至pH 7.0。以在20mM組胺酸、1mm EDTA(pH 7.0)中20mg/ml的蛋白質濃度進行針對PBD共軛物的還原、氧化、和軛合步驟。將該蛋白質轉移至適合的反應容器中，並且將溫度調節至37℃。以DTT：mAb=30：1的莫耳比添加來自新鮮製備的50mM儲備溶液的還原劑二硫蘇糖醇(DTT)。將該溶液在37℃下伴隨輕微攪動孵育1小時。此孵育時間後，藉由針對20mM組胺酸/1mM EDTA緩衝液(pH 7.0)的滲析或透濾，去除該還原劑。將該回收的產物通過0.22μm過濾器進行過濾。用於氧化，用脫氫抗壞血酸(DHA)以10：1(DHA：mAb)的莫耳比將蛋白質溶液進行孵育。在22℃-25℃下伴隨輕微攪動(以50rpm混合速度)將孵育進行1 小時。該時間後，以8.5：1的有效載荷：mAb的莫耳比添加來自在DMSO中的10mM儲備溶液的PBD有效載荷(SG3249)。沒有向該反應中添加另外的DMSO，由於DHA和有效載荷添加造成的有效的DMSO濃度係約11.4%。將該混合物在22℃-25℃下伴隨輕微攪動孵育1小時，以允許抗體-藥物共軛物的形成。然後藉由以4：1的NAC：PBD的莫耳比添加來自100mM儲備溶液的N-乙醯半胱胺酸(NAC)將該反應淬滅。
為了去除蛋白質片段、聚合物、和過量的游離的PBD有效載荷，使用陶瓷羥磷灰石(CHT)I型(伯樂公司(BioRad))進行軛合後純化。將該柱以結合-洗提模式按180cm/hr的線性流速操作。藉由添加1M Tris鹼，將淬滅的抗體-藥物反應混合物的pH調節至pH 7.0。將CHT柱用300mM磷酸鈉(pH 6.5)預平衡，並且用10mM磷酸鈉(pH 6.5)平衡。將抗體-藥物軛合混合物載入至20g/L的載入量挑戰，並且用10mM磷酸鈉(pH 6.5)將該柱重新平衡。然後將結合蛋白用10mM磷酸鈉、25mM辛酸鈉(pH 6.5)進行洗滌以去除過量游離的藥物，隨後用10mM磷酸鈉(pH 6.5)重新平衡。以在10mM磷酸鈉(pH 6.5)中從0.3至1M氯化鈉的線性梯度，經10個柱體積進行洗提。將洗提峰分級，並且將所有級分藉由HP SEC進行分析。將含有具有單體純度>95%的軛合蛋白質的級分合併。在每個純化循環後，將柱用2M氯化鈉進行汽提，用1N氫氧化鈉消毒，並且儲存在0.1N氫氧化鈉中。
將ADC濃縮並且藉由切向流過濾使用再生纖維素或具有30kDa MWCO的PES膜更換成最終配製的緩衝液。加入來自10%儲備溶液的賦形劑PS80。在20mM組胺酸、240mM蔗糖、0.02%PS80(pH 6.0)中，最終的ADC濃度係5mg/ml。
胺基酸序列：
原始的17c10 VH；SEQ ID NO：1
原始的17c10 VL；SEQ ID NO：2
原始的1e8 VH；SEQ ID NO：3
原始的1e8 VL；SEQ ID NO：4
種系化的17c10 VH；SEQ ID NO：5
種系化的17c10 VL；SEQ ID NO：6
種系化的1e8 VH；SEQ ID NO：7
種系化的1e8 VL；SEQ ID NO：8
Maia重鏈主鏈(加框並且加粗的半胱胺酸插入)；SEQ ID NO：9
17c10種系化的HCDR1(Kabat編號)；SEQ ID NO：10 GYYWS
17c10種系化的HCDR2(Kabat編號)；SEQ ID NO：11 EIHHSGGANYNPSLKS
17c10種系化的HCDR3(Kabat編號)；SEQ ID NO：12 GQGKNWHYDYFDY
17c10種系化的LCDR1(Kabat編號)；SEQ ID NO：13 RASQSIRSWLA
17c10種系化的LCDR2(Kabat編號)；SEQ ID NO：14 KASILKI
17c10種系化的LCDR3(Kabat編號)；SEQ ID NO：15 QQYYSYSRT
1e8種系化的HCDR1(Kabat編號)；SEQ ID NO：16 GYYWS
1e8種系化的HCDR2(Kabat編號)；SEQ ID NO：17 EIHHSGSTNYNPSLKS
1e8種系化的HCDR3(Kabat編號)；SEQ ID NO：18 GQGKNWNYDYFDY
1e8種系化的LCDR1(Kabat編號)；SEQ ID NO：19 RASQSIRSWLA
1e8種系化的LCDR2(Kabat編號)；SEQ ID NO：20 KASSLKS
1e8種系化的LCDR3(Kabat編號)；SEQ ID NO：21 QQYYSFSRT
共有的HCDR2；SEQ ID NO：22 EIHHSGX1X2NYNPSLKS；其中X1係S或G，並且X2係A或T
共有的HCDR3；SEQ ID NO：23 GQGKNWX1YDYFDY；其中X1係H或N
共有的LCDR2；SEQ ID NO：24 KASX1LKX2；其中X1係I或S，並且X2係I或S
共有的LCDR3；SEQ ID NO：25 QQYYSX1SRT；其中X1係Y或F
人κ輕鏈；SEQ ID NO：26
具體實施方式的以上描述將充分地揭示本發明的總體性質，使得在不脫離本發明的一般概念的情況下，其他人可以無需過多的實驗藉由應用本領域的技術範圍內的知識，容易地針對此類具體實施方式的各種應用進行修改和/或改編。因此，基於本文提出的傳授內容和指導，此類改編和修改旨在處於所揭露的實施方式的含義和等效範圍內。應當理解本文的短語或術語係出於描述而非限制的目的，這樣使得本說明書的術語或短語可根據該等傳授內容和指導為技術人員所理解。本發明進一步藉由下述申請專利範圍進行描述。
<110> 美商麥迪紐有限責任公司
<120> 對ASCT2具有特異性的結合分子及其用途
<130> ASCT2-110-TW-NP
<140> TW 106138610
<141> 2017-11-08
<150> 62/501,923
<151> 2017-05-05
<150> 62/420,008
<151> 2016-11-10
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<221> MOD_RES
<223> Ser或Gly
<222> (7)..(7)
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<221> MOD_RES
<223> Ala或Thr
<222> (8)..(8)
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<210> 23
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成肽
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<222> (7)..(7)
<221> MOD_RES
<223> His或Asn
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成肽
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<222> (4)..(4)
<221> MOD_RES
<223> Ile或Ser
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<221> MOD_RES
<223> Ile或Ser
<222> (7)..(7)
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成肽
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<221> MOD_RES
<223> Tyr或Phe
<222> (6)..(6)
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<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
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<210> 27
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成6xHis標籤
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Claims (26)

  1. 一種ASCT2抗體或抗原結合片段之用途，其係用於製備結合癌症幹細胞(CSC)之藥物。
  2. 一種ASCT2抗體或抗原結合片段之用途，其係用於製備抑制或殺滅CSC之藥物。
  3. 一種ASCT2抗體或抗原結合片段之用途，其係用於製備治療需要治療之受試者之包含CSC的癌症之藥物。
  4. 一種ASCT2抗體或抗原結合片段之用途，其係用於製備在先前已經接受過治療的受試者中治療由CSC的存在而引起的在治療上有抗性的癌症之藥物。
  5. 一種ASCT2抗體或抗原結合片段之用途，其係用於製備在先前已經接受過治療的受試者中治療由CSC的存在而引起的再發或復發性的癌症之藥物。
  6. 一種在包含癌細胞的樣品中診斷、預後、量化、鑒定、和/或檢測CSC的存在之方法，其中該方法包括：(i)使該樣品與結合至ASCT2核酸序列或ASCT2胺基酸序列的試劑接觸；(ii)檢測在該試劑和該ASCT2核酸序列或該ASCT2胺基酸序列之間是否存在結合；並且(iii)當檢測在該試劑和該ASCT2核酸序列或ASCT2胺基酸序列之間的結合時，鑒定該樣品中該CSC的存在，其中結合至ASCT2胺基酸序列的該試劑包含ASCT2抗體或抗原結合片段。
  7. 一種ASCT2抗體或抗原結合片段之用途，其係用於製備治療在治療上有抗性的或再發或復發性的血液癌之藥物。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該血液癌選自由以下各項組成之群組：急性骨髓性白血病(AML)、多發性骨髓瘤(MM)、和彌散性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。
  9. 如申請專利範圍第1至5及7項中任一項所述之用途，其中該ASCT2抗體或抗原結合片段特異性結合至該中性胺基酸轉運蛋白2(ASCT2)的表位，其中該抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)的三個重鏈互補決定區(HCDR)和輕鏈可變區(VL)的三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其中該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：16的胺基酸序列的HCDR1；SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：17的胺基酸序列的HCDR2；SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：18的胺基酸序列的HCDR3；SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：19的胺基酸序列的LCDR1；SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：20的胺基酸序列的LCDR2；以及SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：21的胺基酸序列的LCDR3。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該ASCT2抗體或抗原結合片段包含含有選自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、和SEQ ID NO：7的胺基酸序列的VH，以及含有選自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、和SEQ ID NO：8的胺基酸序列的VL。
  11. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該ASCT2抗體或抗原結合片段包含含有SEQ ID NO：5的胺基酸序列的VH和含有SEQ ID NO：6的胺基酸序列的VL。
  12. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該ASCT2抗體或抗原結合片段包含含有SEQ ID NO：7的胺基酸序列的VH和含有SEQ ID NO：8的胺基酸序列的VL。
  13. 如申請專利範圍第1至5及7項中任一項所述之用途，其中將該ASCT2抗體或抗原結合片段軛合至細胞毒素，以形成包含ASCT2抗體或抗原結合片段的ADC。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之用途，其中該細胞毒素選自微管溶素衍生物和吡咯并苯并二氮呯。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之用途，其中該微管溶素衍生物係微管溶素AZ1508。
  16. 如申請專利範圍第14項所述之用途，其中該吡咯并苯并二氮呯選自SG3315和SG3249。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之用途，其中該ASCT2抗體或抗原結合片段結合至人ASCT2和石蟹獼猴ASCT2，但不特異性結合至人ASCT1。
  18. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該ASCT2抗體或抗原結合片段特異性結合至該中性胺基酸轉運蛋白2(ASCT2)的表位，其中該抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)的三個重鏈互補決定區(HCDR)和輕鏈可變區(VL)的三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其中該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：16的胺基酸序列的HCDR1 SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：17的胺基酸序列的HCDR2 SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：18的胺基酸序列的HCDR3；SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：19的胺基酸序列的 LCDR1；SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：20的胺基酸序列的LCDR2；以及SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：21的胺基酸序列的LCDR3。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中該ASCT2抗體或抗原結合片段包含含有選自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、和SEQ ID NO：7的胺基酸序列的VH，以及含有選自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、和SEQ ID NO：8的胺基酸序列的VL。
  20. 如申請專利範圍第18或19項所述之方法，其中該ASCT2抗體或抗原結合片段包含含有SEQ ID NO：5的胺基酸序列的VH和含有SEQ ID NO：6的胺基酸序列的VL。
  21. 如申請專利範圍第18或19項所述之方法，其中該ASCT2抗體或抗原結合片段包含含有SEQ ID NO：7的胺基酸序列的VH和含有SEQ ID NO：8的胺基酸序列的VL。
  22. 如申請專利範圍第6、18或19項所述之用途，其中將該ASCT2抗體或抗原結合片段軛合至細胞毒素，以形成包含ASCT2抗體或抗原結合片段的ADC。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之用途，其中該細胞毒素選自微管溶素衍生物和吡咯并苯并二氮呯。
  24. 如申請專利範圍第23項所述之用途，其中該微管溶素衍生物係微管溶素AZ1508。
  25. 如申請專利範圍第23項所述之用途，其中該吡咯并苯并二氮呯選自SG3315和SG3249。
  26. 如申請專利範圍第25項所述之方法，其中該ASCT2抗體或抗原結合片段結合至人ASCT2和石蟹獼猴ASCT2，但不特異性結合至人ASCT1。
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