CN1897963A - 环形鱼腥藻肽－型肽治疗其中抑制羧肽酶u对其有益的病症的用途,新型鱼腥藻肽衍生物及其中间体 - Google Patents

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Abstract

式(I)的化合物的在制备治疗或预防其中抑制羧肽酶U对其有益的病症的药物的方法中的用途。详细说明了式(I)化合物和包含式(I)化合物和药学可接受辅助剂、稀释剂或载体的组合物。

Description

环形鱼腥藻肽-型肽治疗其中抑制羧肽酶U对其有益的病症的用途，新型 鱼腥藻肽衍生物及其中间体
本发明涉及新型化合物及其药学可接受盐，所述化合物可抑制碱性的羧肽酶，特别是羧肽酶U，因此可用于预防和治疗其中抑制羧肽酶U对其有益的病症，如血栓症和在血液和组织中的血凝过快、动脉粥样硬化、粘连、皮肤瘢痕、癌症、纤维变性病症，炎症性疾病以及从保持或加强体内的缓激肽水平中受益的病症。在另一方面，本发明涉及在治疗中的使用的本发明化合物；制备这种新型化合物的方法；包含至少一种本发明化合物或其药学可接受盐作为活性成份的药用组合物；以及活性化合物在制备上述医用药物中的用途。
纤维蛋白溶解作用是一系列酶促反应的结果，为通过纤溶酶导致纤维蛋白降解。纤溶酶原的活化为纤维蛋白溶解作用的重要程序。通过纤溶酶原激活剂、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)或尿激酶-型纤溶酶原激活剂(u-PA)，纤溶酶原裂解产生纤溶酶。纤维蛋白的初期纤溶酶降解作用产生羧端赖氨酸残基，其对纤溶酶原结合位点具有高度亲和力。因此该与纤维蛋白结合的纤溶酶原比游离纤溶酶原更容易被活化为纤溶酶，这种机制提供了纤维蛋白溶解作用的正反馈调节。
纤维蛋白溶解作用的其中一种内源性抑制剂为羧肽酶U(CPU)。CPU也被称为血浆羧肽酶B、活性凝血酶可激活(activatable)的纤维蛋白溶解作用抑制剂(TAFIa)、羧肽酶R和可诱导的羧肽酶活性。CPU是在凝固和纤维蛋白溶解作用期间从其前体前CPU通过蛋白水解酶的作用形成的，所述蛋白水解酶如凝血酶、凝血酶-血栓调节蛋白复合物或纤溶酶。CPU裂解纤维蛋白片段羧端上的碱性氨基酸。羧端赖氨酸的损失及因此造成的纤溶酶原的赖氨酸结合位点的损失会抑制纤维蛋白溶解作用。通过抑制纤溶酶原的赖氨酸结合位点的损失，从而提高纤溶酶形成速率，有效的羧肽酶U抑制剂预期可促进纤维蛋白溶解作用。
据报道2-巯基甲基-3-胍基乙基硫代丙酸为羧肽酶N抑制剂。最近，该化合物显示出抑制CPU的作用，Hendriks，D.et al.，Biochimica etBiophysica Acta，1034(1990)86-92。
据报道胍基乙基巯基丁二酸为羧肽酶N抑制剂。最近该化合物显示出抑制CPU的作用，Eaton，D.L.，et al.，The Journal of Biological Chemistry，266(1991)21833-21838。
WO 00/66550、WO 00/66557、WO 03/013526和WO 03/027128中公开了CPU抑制剂，WO 00/66152中公开了包含CPU抑制剂和凝血酶抑制剂的药物制剂。WO 01/19836和WO 03/080631中公开了血浆羧肽酶B抑制剂。WO 02/14285、WO 03/061652和WO 03/061653中公开了TAFIa抑制剂。
在下列文献中公开了环形鱼腥藻肽(anabaenopeptin)-型肽：TetrahedronLetters，Vol.36，No.9，pp.1511-1514(1995)；J.Org.Che m.(1997) 62 6199-6203；Tetrahedron Letters，Vol.36，No.33，pp.5933-5936，(1995)；J.Nat.Prod.(1996) 59 570-575；Tetrahedron Letters，Vol.38，No.31，pp.5525-5528，(1997)；J.Nat.Prod.(1997) 60139-141；Tetrahedron  54(1998)6719-6724；Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters  9(1999)1243-1246；Tetrahedron  56(2000)725-733；J.Nat.Prod.(2000) 63 1280-1282；J.Nat.Prod.(2001) 64 No.8 1053；Tetrahedron  58(2002)6863-6871；和J.Nat.Prod.(2002) 65 1187-1189。
在下列文献中公开了环形鱼腥藻肽-型肽的合成方法：Journal ofOrganic Chemistry，Vol.62，pp.6199-6203(1997)；和Angewandte ChemieInternational Edition，Vol.35，No.12，pp.1336-1338(1996)。现在发现了式(I)的化合物：
Figure A20048003905900161
或其药学可接受盐或溶剂合物，或其盐的溶剂合物，为特别有效的羧肽酶U抑制剂，因此用作治疗或预防从抑制羧肽酶U获益的病症的有效的药物，例如治疗或预防：血栓症和/或血液和/或组织中的血凝过快；动脉粥样硬化；粘连；皮肤瘢痕；癌症；纤维变性病症；炎症性疾病；从保持或提高哺乳动物(如人)体内缓激肽水平获益的病症；蛋白C抗性；抗凝血酶III、蛋白C、蛋白S或肝素辅因子II先天或后天缺陷；循环或败血症性休克；抗磷脂抗体的循环；高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia)；肝素诱导的血小板减少症；纤维蛋白溶解作用缺陷；静脉血栓症；肺动脉栓塞；动脉血栓症(如在心肌梗塞、不稳定心绞痛、基于血栓症的中风或外周动脉血栓症)；通常在心房颤动期间源自心房或穿壁性心肌梗塞后源自左心室的全身性栓塞；预防血栓溶解后的再阻塞和再狭窄(即血栓症)；经皮穿腔介入(PTI)和冠状动脉旁路手术；预防普通显微外科手术和血管外科手术后的血栓再形成；由细菌、多发性创伤、中毒或任何其它机制引起的弥散性血管内凝血；当血液在体内与外来表面如人造血管、血管支架、血管导管、机械的和生物的人工瓣膜或任何其它医用装置接触时的溶解纤维蛋白的治疗；当血液与体外医用装置如在心血管外科手术或血液透析期间用的人工心肺机接触时的溶解纤维蛋白的治疗；预防动脉粥样硬化发展和/或患者对器官移植如肾脏移植的移植排斥；抑制肿瘤成熟和发展；纤维变性为贡献因素的任何病症(如囊性纤维病、肺纤维变性疾病如慢性阻塞性肺病(COPD)、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、纤维肌肉结构不良、纤维化肺疾病或眼科手术中纤维蛋白在眼中沉积)；炎症(如哮喘、关节炎、子宫内膜异位、炎性肠疾病、牛皮癣或特应性皮炎)；神经变性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病；已知从保持或提高缓激肽水平获益的病症(如高血压、心绞痛、心力衰竭、肺动脉高血压、肾衰竭或器官衰竭)。
因此，本发明提供了式(I)化合物的用途：
其中：
X为(CH2)mY(CH2)n；
m和n独立为1、2、3、4、5或6；条件是m+n不超过6；
Y为键、O、S(O)p或S-S；
R1为CO2R15或羧酸电子等排体如S(O)2OH、S(O)2NHR15、PO(OR15)OH、PO(OR15)NH2、B(OR15)2、PO(R15)OH、PO(R15)NH2或四唑；
R2、R3、R4、R5和R6独立为氢、C1-6烷基(任选被卤素、羟基、氰基、SH、S(O)3H、S(O)q(C1-6烷基)、OC(O)(C1-4烷基)、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、COOH、CONH2、CONH(C1-6烷基)、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)、C3-6环烷基(C1-4)烷基(其中该环烷基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)、杂环基(C1-4)烷基(其中该杂环基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)、苯基(C1-4)烷基(其中该苯基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)或杂芳基(C1-4)烷基(其中该杂芳基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)；
P和q独立为0、1或2；
R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13独立为H或C1-4烷基；
R14为H或C1-4烷基；和，
R15为H或C1-4烷基；
或其药学可接受盐或溶剂合物，或其盐的溶剂合物；在制备治疗或预防其中抑制羧肽酶U对其有益的病症的药物的方法中的用途，如在治疗和预防：血栓形成和/或血液和/或组织中的血凝过快；动脉粥样硬化；粘连；皮肤瘢痕；癌症；纤维变性病症；炎症性疾病；或从保持或加强哺乳动物(如人)体内的缓激肽水平中受益的病症的药物；蛋白C抗性；抗凝血酶III、蛋白C、蛋白S或肝素辅因子II先天或后天缺陷循环或败血症休克；抗磷脂抗体的循环；高同型半胱氨酸血症；肝素诱导的血小板减少症；纤维蛋白溶解作用缺陷；静脉血栓症；肺动脉栓塞；动脉血栓症(如在心肌梗塞、不稳定心绞痛、基于血栓症的中风或外周动脉血栓症)；通常源自心房在心房颤动期间或源自左心室穿壁性心肌梗塞后的全身性栓塞；预防血栓溶解后的再阻塞和再狭窄(即血栓症)；经皮穿腔介入(PTI)和冠状动脉旁路手术；预防一般显微外科手术和血管外科手术后的血栓再形成；由细菌、多发性创伤、中毒或任何其它机制引起的弥散性血管内凝血；当血液与体内外来表面如人造血管、血管支架、血管导管、机械的和生物的人工瓣膜或任何其它医用装置接触时的溶解纤维蛋白的治疗；当血液与体外医用装置如在心血管外科手术或血液透析期间用的人工心肺机接触时的溶解纤维蛋白的治疗；预防动脉粥样硬化发展和/或患者对器官移植的移植排斥，如肾脏移植；抑制肿瘤成熟和发展；纤维变性为贡献因素的任何病症(如囊性纤维病、肺纤维变性疾病如慢性阻塞性肺病(COPD)、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、纤维肌肉结构不良、纤维化肺疾病or眼科手术中纤维蛋白在眼中沉积)；炎症(如哮喘、关节炎、子宫内膜异位、炎性肠疾病、牛皮癣或特应性皮炎)；神经变性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病；或已知从保持或提高缓激肽水平获益的病症(如高血压、心绞痛、心力衰竭、肺动脉高血压、肾衰竭或器官衰竭)。
在本发明的上下文中，术语“治疗”包括“预防”，除非有相反的特别说明。术语“治疗的”和“治疗上的”应据此理解。
在一个特别的方面，本发明提供了如此处所述的式(I)化合物在生产治疗或预防下列病症的药物的方法中的用途：血栓症和/或在血液和/或组织中的血凝过快；动脉粥样硬化；纤维变性病症；炎症性疾病；或从保持或提高哺乳动物(如人)体内缓激肽水平获益的病症。
在本发明的另一方面，提供了此处所述的的式(I)化合物在生产治疗或预防下列病症的药物的方法中的用途：血栓症和/或在血液和/或组织中的血凝过快；动脉粥样硬化；纤维变性病症；或从保持或提高哺乳动物(如人)体内缓激肽水平获益的病症；例如，治疗或预防血栓症和/或在血液和/或组织中的血凝过快的药物。
式(I)的化合物以异构体形式存在，本发明涵盖所有这些形式及其任何比例的混合物。单纯对映体，外消旋混合物和两种对映体的相等或不相等的混合物都在本发明的范围内。还应了解所有可能的非对映异构体形式都在本发明的范围内。
式(I)的化合物可为盐的形式。合适的盐包括酸加成盐如盐酸盐、二盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、乙酸盐、二乙酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、甲磺酸盐或对甲苯磺酸盐。盐还包括金属盐，如碱金属盐(如钠盐或钾盐)或碱土金属盐(如镁或钙)。
术语C1-4烷基表示链中具有1-4个碳原子的直链或支链烷基。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基.
术语C1-4烷氧基表示烷基-O基团，其中烷基为直链或支链，其实例包括甲氧基和乙氧基.
卤素包括氟、氯、溴和碘(但优选为(but is)，如氟、氯或溴).
环烷基为，如环丙基、环戊基或环己基。
术语杂环基表示包含碳和至少一个(如一个或两个)选自氮、氧或硫原子的非芳香环。杂环基为，如吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基或吗啉基。
术语杂芳基表示包含碳和至少一个(如一个或两个)选自氮、氧或硫原子的芳香环(如单环或二环)。杂芳基为，如呋喃、噻吩、吡咯、唑、异唑、噻唑、咪唑、吡唑、异噻唑、二唑、呋咱、[1，2，3]-三唑、[1，2，4]-三唑、噻二唑、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、吲哚或萘啶。
苯基烷基为，如苄基或1-苯基乙-2-基。
环烷基烷基为，如环己基甲基。
杂烷基烷基为，如吲哚-3-基甲基。
杂环基烷基为，如哌啶-1-基甲基。
在另一方面，本发明提供了式(I)的化合物或其药学可接受盐或溶剂合物，或这种盐的溶剂合物：
其中：
X为(CH2)4；
R1为CO2R15；
R2为末端被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的直链C1-6烷基；被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的C3-6环烷基；包含至少一个氮原子的杂环基；被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的无氮杂环基；被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的杂芳基；被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的苯基；被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的杂芳基(C1-4)烷基；被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的苯基(C1-4)烷基；或被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的C3-6环烷基(C1-4)烷基；上述所有环可任选被一个或多个卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基或OCF3进一步取代；
R3、R4、R5和R6之一独立为氢、杂芳基(C1-4)烷基(其中该杂芳基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)；其它独立为氢、C1-6烷基(任选被卤素、羟基、氰基、SH、S(O)3H、S(O)q(C1-6烷基)、OC(O)(C1-4烷基)、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、COOH、CONH2、CONH(C1-6烷基)、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)、C3-6环烷基(C1-4)烷基(其中该环烷基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)、杂环基(C1-4)烷基(其中该杂环基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)、苯基(C1-4)烷基(其中该苯基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)或杂芳基(C1-4)烷基(其中该杂芳基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)；
P和q独立为0、1或2；
R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13独立为H或C1-4烷基；
R14为H或C1-4烷基；和，
R15为H或C1-4烷基；
在再一方面，本发明提供了式(I)的化合物：
Figure A20048003905900211
其中：
R1为CO2R15；
R2为末端被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的直链C1-6烷基；C4烷基(如CH(CH3)CH2CH3或CH2CH(CH3)2)；或(氨基吡啶基)甲基(如(6-氨基吡啶-3-基)甲基)；
R3和R4之一为任选被卤素或羟基取代的(吲哚-3-基)CH2；其它为苄基(任选被卤素或羟基取代)或C4烷基(如CH(CH3)CH2CH3或CH2CH(CH3)2)；
或R3和R4都为甲基；
R5和R6独立为C1-6烷基(如CH3，CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3或CH2CH(CH3)2)；
R7、R8、R9、R11、R12、R13和R14为H；
R10为C1-4烷基；和，
R15为H或C1-4烷基。
在另一方面，本发明提供了具有如下手性特征的式(I)的化合物：
Figure A20048003905900221
在本发明的一个方面X为(CH2)4。
在本发明的再一方面，R1为CO2R15，其中R15为H或C1-4烷基(如甲基)。
在另一方面，R2为末端被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的直链C1-6烷基；C4烷基(如CH(CH3)CH2CH3或CH2CH(CH3)2)；或(氨基吡啶基)甲基(如(6-氨基吡啶-3-基)甲基)。
在本发明的再另一方面，R2为C1-6烷基(如异丙基、CH(CH3)CH2CH3或CH2CH(CH3)2)、苄基或末端被NH2、CNH(NH2)、NHCNH(NH2)或(6-氨基吡啶-3-基)甲基取代的直链C1-6烷基。在另一方面，R2为末端被NH2、CNH(NH2)、NHCNH(NH2)或(6-氨基吡啶-3-基)甲基取代的直链C1-6烷基。
在本发明的再另一个方面，R3为CH2吲哚基(其中该吲哚基任选被或多个卤素(如氯或溴)或羟基取代)、C1-4烷基或苄基(任选被卤素(如溴)或羟基取代)。
在本发明的另一方面，R4为CH2吲哚基(其中该吲哚基任选被一个或多个卤素(如氯或溴)或羟基取代)、C1-6烷基(如甲基、异丙基、CH(CH3)CH2CH3或CH2CH(CH3)2)或苄基(任选被卤素(如溴)或羟基取代)。
在本发明的再一方面，R5和R6独立为C1-6烷基(如甲基、异丙基、CH(CH3)CH2CH3或CH2CH(CH3)2)。
在本发明的另一方面，R7、R8、R9、R11、R12、R13和R14都为H。
在本发明的再另一方面，R10为C1-4烷基(如甲基)。
本发明的再另一方面提供了式(I)的化合物，其为化合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16，或其药学可接受盐或溶剂合物，或其药学可接受盐的溶剂合物。
本发明的化合物可由本领域中已知的方法或类似于实施例3和4的方法制备。应该了解，当用文献中或实施例3和4中的方法时，中间化合物的的官能团需要被保护基团保护。需要保护的官能团包括羟基、羧基(carboxylate)和氨基。合适的羟基保护基团包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基-甲硅烷基(如叔-丁基二甲基甲硅烷基、叔-丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、叔-丁基、甲氧基甲基、苄氧基甲基和4-甲氧基苄基。合适的羧基保护基团包括烯丙基、乙基、叔-丁基和苄基酯类。合适的氨基保护基团包括叔-丁氧基羰基、2，4，6-三甲氧基苄基和苄氧基羰基。在‘有机合成中的保护基团(Protective Groups in Organic Synthesis)’，第三版，T.W.Greene & P.G.M.Wutz，Wiley-Interscience(1999)中描述了保护基团的用途。保护基团还可为聚合物树脂如4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸树脂或2-氯三苯甲基氯树脂。
因此，式I的化合物可通过式VII化合物与式VIII化合物的反应制备
Figure A20048003905900241
其中R3-R12和X如上述定义
Figure A20048003905900242
其中R1、R2、R13、R14如式I中所定义，Y为活化的酸残基如4-硝基苯氧基羰基或活化的氨基羰基同等物如N＝C＝O。Y的特别的值(value)包括活化的酯类如4-硝基苯氧基羰基和叔-丁氧基羰基。Y的优选的值为4-硝基苯氧基羰基。其它值包括其中YN为异氰酸酯的基团。反应通常在合适的溶剂如DMF(或其它非质子溶剂)中和非亲核性碱如DIEA存在下进行。
式VII的中间体可用如下方法制备：
Figure A20048003905900251
a)化合物III的合成
将式Ia的化合物溶于非极性非质子溶剂如DCM或THF中，在非亲核性碱如DIEA存在下，与固体载体如2-氯三苯甲基在室温下反应2小时。然后，用甲醇将任何未反应的固体载体(化合物II)封端。然后过滤树脂，依次用DMF、DCM和DMF洗涤。
b)式(n＝4)的化合物的合成
将式III/V(n＝1-3)的化合物进行下述的固相多肽合成反应：
用20％哌啶的DMF溶液将PG2(在此实例中为Fmoc)从化合物III/V(n＝1-3)中除去，所得树脂依次用DMF、DCM和DMF洗涤。式IV的化合物通过下述方法制备：在极性非质子溶剂如DMF或DMSO中加入如HBTU或HATU的偶联试剂，然后加入到脱保护的式III/V(n＝1-3)的化合物中。加入非亲核性碱如DIEA，将反应混合物振摇1-2小时开始肽偶联。然后过滤树脂，依次用DMF、DCM和DMF洗涤。
b)式VI化合物的合成
用20％哌啶的DMF溶液将PG2(在此实例中为Fmoc)从化合物V(n＝4)中除去，所得树脂依次用DMF、DCM和DMF洗涤。用稀释的酸在非质子溶剂中通过式V化合物(n＝4)的快速流动洗涤，立即将产物稀释到较大体积的溶剂中，式VI的化合物从固体载体释放而不损失PG1。将2％TFA的DCM溶液流动洗涤到相等体积的水中为本程序的一个实例。
b)式VII化合物的合成
将DIEA或等量的非亲核性碱加入到在极性非质子溶剂如DMF或DMSO的式VI的化合物中。所得式VI的化合物的溶液在通过滴加到搅拌的偶联试剂如PyBOP的极性非质子溶剂如DMF或DMSO中的高度稀释条件下环化。将反应混合物蒸发至干，用强酸(TFA，HCl)同时加入消除剂(TIPS、对甲苯酚、水或硫代甲酚)除去剩下的酸敏感性保护基团(如PG1)。反应混合物再蒸发至干，然后用RPHPLC纯化，得到式VII的化合物。在式VII中PG1为合适的保护基团如任何酸敏感性氮保护基团，如对除去PG2所需的碱性条件稳定的Boc。PG2为任何碱敏感性氮保护基团如Fmoc，其可被除去而不需要裂解连接物L或除去PG1；在上述方法步骤中提到的“偶联剂”是指可激活羧酸对亲核性攻击的活性的任何基团。其实例包括活化的酯的前体，如对硝基苯酚和六氟苯酚、碳化二亚胺衍生物如DIC和DCC、苯并三唑基-四甲基盐如BOP和PyBOP、苯并三唑基-四甲基脲盐如HBTU和HATU。L为任何对固体载体上的羧酸极度敏感的连接物，其对除去PG2如2-氯三苯甲基氯连接物、Rink酸性树脂、4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸连接物所需的条件很稳定。
本文提到的制备中间体和新型中间体的新方法也是本发明的特征。
可选择地，式(I)的化合物可用实施例1或2中的方法从天然资源中分离。
本发明的化合物还可与具不同作用机制的抗凝血药组合和/或联合给药，如抗凝血剂(如维生素K拮抗剂、未分级分离的或低分子量肝素、合成的肝素片段如fondaparinux、凝血酶抑制剂、Xa因子抑制剂或其它凝结因子/酶抑制剂、重组凝结因子如重组人激活蛋白C)或抗血小板药(如阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷或其它ADP-受体[如P2Y12或P2Y1]拮抗剂、血栓素受体和/或合成酶抑制剂、纤维蛋白原受体拮抗剂、拟前列环素或磷酸二酯酶抑制剂)。
本发明的化合物还可与下列药物组合和/或联合给药：溶拴剂如组织纤溶酶原激活剂(天然的、重组的或修饰的)、链激酶、尿激酶、尿激酶原、茴香酰纤溶酶原-链激酶激活剂复合物(APSAC)、动物唾液腺纤溶酶原激活剂等，治疗血栓形成疾病，特别是心肌梗塞、缺血性中风和肺动脉大块栓塞。
因此，在本发明的另一方面提供了式(I)化合物的复合物(组合的和/或联合给药的)，其中X为CH2)mY(CH2)n；m和n独立为1、2、3、4、5或6；条件是m+n不超过6；Y为键、O、S(O)p、或S-S；R1为CO2R15或羧酸电子等排体如S(O)2OH、S(O)2NHR15、PO(OR15)OH、PO(OR15)NH2、B(OR15)2、PO(R15)OH、PO(R15)NH2或四唑；R2、R3、R4、R5和R6独立为氢、C1-6烷基(任选被卤素、羟基、氰基、SH、S(O)3H、S(O)q(C1-6烷基)、OC(O)(C1-4烷基)、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、COOH、CONH2、CONH(C1-6烷基)、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)、C3-6环烷基(C1-4)烷基(其中该环烷基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)、杂环基(C1-4)烷基(其中该杂环基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)、苯基(C1-4)烷基(其中该苯基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)或杂芳基(C1-4)烷基(其中该杂芳基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)；p和q独立为0、1或2；R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13独立为H或C1-4烷基；R14为H或C1-4烷基；和R15为H或C1-4烷基；或其药学可接受盐和溶剂合物，或其盐的溶剂合物；和具不同作用机制的抗凝血药{如抗凝血剂(如维生素K拮抗剂、未分馏的或低分子量肝素、合成的肝素片段如fondaparinux、凝血酶抑制剂、Xa因子抑制剂或重组凝结因子如重组人激活蛋白C)或抗血小板药(如阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷或其它ADP-受体[如P2Y12或P2Y1]拮抗剂、血栓素受体和/或合成酶抑制剂、纤维蛋白原受体拮抗剂、拟前列环素或磷酸二酯酶抑制剂)}或血栓溶解剂{如组织纤溶酶原激活剂(天然的、重组的或改良的)、链激酶、尿激酶、尿激酶原、茴香酰纤溶酶原-链激酶激活剂复合物(APSAC)、动物唾液腺纤溶酶原激活剂}。
本发明的化合物对羧肽酶U与羧肽酶N的选择性应＞50∶1，如＞100∶1，用下述方法检测。
本发明化合物的抑制作用是用下述文献中描述的方法评价的：DirkHendriks，Simon Scharpéand Marc van Sande，Clinical Chemistry，31，1936-1939(1985)；and Wei Wang，Dirk F.Hendriks，Simon S.Scharpé，The Journalof Biological Chemistry，269，15937-15944(1994)，用浓度为4mM的底物。
本发明还提供了一种治疗患有或具所述病症风险的哺乳动物的其中抑制羧肽酶对其有益的病症的方法，所述方法包括给予该哺乳动物治疗有效量的如上所述的式(I)化合物或其药学可接受盐或溶剂合物，或其盐的溶剂合物。
上述疗法的给药剂量随所用的化合物、给药的方式、所需的治疗和特定的疾病而不同。
式(I)的化合物及其药学可接受盐、溶剂合物或其盐的溶剂合物可单独使用，但是一般以药用组合物形式给药，所述药用组合物包括式(I)的化合物、盐、溶剂合物或其盐的溶剂合物(活性成份)和药学可接受辅助剂、稀释剂或载体。例如，根据给药方式，药用组合物可包含0.05-99％w(重量百分比)，如0.05-80％w、0.10-70％w、0.10-50％w的活性成份，所有的重量百分比都以总组合物为基础计算。
因此本发明还提供了药用组合物，所述组合物包含如上所述的式(I)化合物或其药学可接受盐或溶剂合物，或其盐的溶剂合物，和药学可接受辅助剂、稀释剂或载体。
本发明还提供了一种制备本发明的药用组合物的方法，所述方法包括将如上所述的式(I)化合物或其药学可接受盐或溶剂合物，或其盐的溶剂合物，与药学可接受辅助剂、稀释剂或载体混合。
本发明还包括式(I)的化合物的衍生物，所述衍生物具有式(I)的化合物的生物学功能，如前药。前药为，如羧酸的甲基、(新戊酰氧)甲基酯和[(乙氧基羰基)氧基]甲基酯。
下面的实施例举例说明了本发明。
实施例1
该实施例描述了化合物1-10的分离。
通用实验程序
水为Milli-Q过滤，所有其它所用溶剂为Omnisolv。制备HPLC使用YMC碱性C185uM，21.2mm×150mm，柱和Hypersil BDS C185uM，21.2×150mm柱。NMR光谱用Varian Inova 600或500MHz NMR波谱仪记录。样品用d6-DMSO溶解，化学位移相对于溶剂峰计算(DMSO 1H□2.49和13C 39.5ppm)。质谱用Fisons VG Platform II检测，用正电喷雾离子化方式。洗脱剂为乙腈/水各50％的混合物，流速为0.1ml/min。
动物材料
海绵(Melophlus sp.)为在澳大利亚Ribbon Reef No.5通过配套水下呼吸器潜水(SCUBA diving)收集，凭证样品存放于澳大利亚布里斯班昆士兰博物馆(Queensland Museum，Brisbane，Australia)。
提取和分离
将从澳大利亚远北昆士兰(Ribbon Reef No.5 in far North Queensland，Australia)收集的海绵(Melophlus sp)冻干研磨样品(ground sample)(128g)用甲醇(2l)充分提取。蒸发溶剂得到暗褐色残留物(28g)。将该残留物重新溶于EtOAc(20mL)和水(60mL)的混合物，用液滴逆流色谱法分离，水为固定相，梯度浓度的EtOAc和丁醇为流动相，流速为5mL/min。每两分钟收集流分，每隔一流分用电喷雾质谱分析。合并相同的流分得到5份流分。流分2(320mg)通过离心分配色谱(Sanki CPC，上升模式)，用三种溶剂混合物CHCl3/MeOH/H2O(7∶13∶8)分离，下层作为固定相。流速为2mL/min，每两分钟收集流分，洗脱360分钟。每隔一流分用正电喷雾质谱分析，合并同样的流分。合并流分91-101得到不纯的化合物2(10.8mg)，合并流分107-120得到不纯的化合物1(12.4mg)。化合物1和2的不纯的肽流分各自分配于TFA水溶液(1％)和己烷之间。从每个分配中分出的水层包含纯的化合物2(9.5mg)和化合物1(11.5mg)。从最初的DCCC分离物中分出的流分1、3和4与从CPC分离物中分出的剩余的流分合并，用C18(3g)预吸附。将预吸附的流分再用C18HPLC hypersil BDS C18(5uM，20mm×150mm)分离，用水/甲醇梯度洗脱，梯度为从含1％TFA的水到含1％TFA的甲醇，流速为10mL/min，在60分钟内洗脱。每一分钟收集流分，用电喷雾质谱分析所有流分。合并相同的流分。合并包含化合物1和2相关肽类的流分51-58(流分A；65mg)。然后再用RP HPLC在YMC碱性C185uM，20mm×150mm上纯化该肽类流分，用65％水(含1％TFA)和35％MeCN(含1％TFA)洗脱，流速为10mL/min。每隔12秒收集流分，洗脱36分钟。流分58-60为纯化合物2(11mg)，流分67-69为纯化合物1(11mg)，流分70-72为纯化合物3(2mg)，流分73-77为纯化合物7(11.2mg)，流分79-82为纯化合物4(7.29mg)，流分91-96为纯化合物8(8.75mg)，流分101-106为纯化合物9(6.02mg)，流分118-125为纯化合物5(2.08mg)，流分128-138为纯化合物10(5.73mg)and流分140-150为纯化合物6(5.94mg)。
化合物1：MS：(正ESI)[M+H]+m/z 826.1H和13C NMR(d6-DMSO)：见表1。
化合物2：MS：(正ESI)[M+H]+ m/z 876，878.1H和13C NMR(d6-DMSO)：见表2。
化合物3：MS：(正ESI)[M+H]+m/z 890，892.1H和13C NMR(d6-DMSO)：见表3。
化合物4：MS：(正ESI)[M+H]+m/z 840.1H和13C NMR(d6-DMSO)：见表4。
化合物5：MS：(正ESI)[M+H]+m/z 860，862.1H和13C NMR(d6-DMSO)：见表5。
化合物6：MS：(正ESI)[M+H]+m/z 861，863.1H和13C NMR(d6-DMSO)：见表6。
化合物7：MS：(正ESI)[M+H]+m/z 895，897.1H和13C NMR(d6-DMSO)：见表7。
化合物8：MS：(正ESI)[M＋H]+m/z 909，911.1H和13C NMR(d6-DMSO)：见表8。
化合物9：MS：(正ESI)[M+H]+m/z 909，911.1H和13C NMR(d6-DMSO)：见表9。
化合物10：MS：(正ESI)[M+H]+m/z 973，975，977.1H和13C NMR(d6-DMSO)：见表10。
在进行了包括1H、gHSQC、gHM C和gCOSY实验的深入研究之后，化合物1-10被鉴别为环形肽类。化合物1的绝对构型由单晶X-射线衍射分析确定。
化合物1-5
R3a    R3b    R15
H     H     H      化合物1
OH    Cl    H      化合物2
OH    Cl    CH3    化合物3
H     H     CH3    化合物4
H     Cl    H      化合物5
表1  1H(600MHz)，13C(125MHz)，HMBC和COSY
化合物1的NMR数据(d6-DMSO)
  原子No   13C(mult)a   1H(mult，JHz)  2，3JCH相关性   COSY
  N-甲基亮氨酸123456NMe亮氨酸891011121314丙氨酸15161718赖氨酸1920212223242526 169.3(s)58.2(d)36.6(t)24.3(d)22.2(q)23.1(q)27.6(q)172.8(s)45.7(d)39.8(t)24.7(d)21.6(q)22.9(q)-174.1(s)47.9(d)16.7(q)-172.7(s)54.6(d)32.5(t)20.3(t)28.3(t)38.0(t)-- -4.72(dd，5.9，8.8Hz，1H)1.22(m，1H)1.63(m，1H)1.34(m，1H)0.85(d，6.8Hz，3H)0.82(d，6.8Hz，3H)1.81(s，3H)-4.77(ddd，2.9，4.9，9.8Hz，1H)1.66(m，1H)1.17(m，1H)1.82(m，1H)0.87(d，6.8Hz，3H)0.91(d，6.8Hz，3H)8.73(d，4.9Hz，1H)-4.20(dq，7.8，7.8Hz，1H)1.30(d，7.8Hz，3H)7.20(d，4.9Hz，1H)-3.92(ddd，5.9，6.8，6.8Hz，1H)1.65(m，2H)1.40(m，1H)1.10(m，1H)1.40(m，2H)2.75(m，1H)3.58(m，1H)7.44(dd，1.2，7.8Hz，1H)6.45(d，6.8Hz，1H) -1，3，4，7-NMe，81，2，5，62，4，5，62，3，5，63，4，63，4，52，8-10，11，8--1010，11，1310，11，1210，15，16-15，1715，1619，20，16，17-19，21，22，40----2722，232739，20，21 -H3a，H3bH2，H3b，H4H2，H3a，H4H3a，H3b，H5，H6H4H4--H10a，H10b，H14H9，H10b，H11H9，H10a，H11H10a，H10b，H12，H13H11H11H9-H17，H18H16H16-H21，H26H20，H22a，H22bH21，H22b，H23H21，H22a，H23H22a，H22b，H24a，H24bH23，H24b，H25H23，H24a，H25H24a，H24bH20
  色氨酸2728293031323334353637383940精氨酸4142434445464748 171.4(s)53.9(d)27.9(t)110.4(s)124.0(d)-136.5(s)111.5(d)121.0(d)118.5(d)116.9(d)127.0(s)157.5(s)-52.9(d)29.1(t)25.1(t)40.0(t)-156.9(s)175.1(s) -4.40(ddd，2.9，8.8，11.7Hz，1H)2.88(dd，11.7，13.7Hz，1H)3.35(dd，2.9，13.7Hz，1H)-6.68(bs，1H)10.80(bs，1H)-7.24(d，7.8Hz，1H)7.00(dd，7.8，7.8Hz，1H)6.92(dd，7.8，7.8Hz，1H)7.20(d，7.8Hz，1H)-8.62(d，8.8Hz，1H)-6.42(d，7.8Hz，1H)4.05(ddd，5.9，7.8，7.8Hz，1H)1.52(m，1H)1.69(m，1H)1.40(m，2H)3.06(dt，5.9，5.9Hz，2H)7.64(t，5.9Hz，1H)-- -1，27，3028，27，30，31，3828，27，30，31，38-29，30，33，3830，31，33，38-36，3833，3734，3835，33-1，28，29-43，42，48，4041，43，44，48---43，44，4745，47-- -H29a，H29b，H39H28，H29bH28，H29a-H32H31-H35，H36H34，H36H35，H37H36，H35-H28-H42H41，H43a，H43bH42，H44，H43bH42，H43a，H44H43a，H43b，H45H45，H46H45-
a化学位移用2D异核实验测定
表2  1H(600MHz)，13C(125MHz)，HMBC和COSY
化合物2的NMR数据(d6-DMSO)
  原子No   13C(mult)a   1H(mult，J Hz)   2，3JCH相关性  COSY
  N-甲基亮氨酸123456NMe亮氨酸891011121314 169.4(s)58.4(d)36.5(t)23.8(d)22.1(q)22.8(q)27.7(q)172.9(s)47.8(d)39.9(t)23.4(d)22.5(q)23.0(q)- -4.72(dd，5.9，7.8Hz，1H)1.22(m，1H)1.63(m，1H)1.32(m，1H)0.86(d，6.8Hz，3H)0.83(d，6.8Hz，3H)1.80(s，3H)-4.77(ddd，2.9，4.9，9.8Hz，1H)1.66(m，1H)1.17(m，1H)1.82(m，1H)0.88(d，6.8Hz，3H)0.93(d，6.8Hz，3H)8.74(d，5.9Hz，1H) -1，3，4，8，7-NMe2，4，5，62，4，5，62，3，5，63，4，63，4，52，8-----10，11，1310，11，129，10，15 -H3a，H3bH2，H3b，H4H2，H3a，H4H3a，H3b，H5，H6H4H4--H10a，H10b，H14H9，H10b，H11H9，H10a，H11H10a，H10b，H12，H13H11H11H9
  丙氨酸15161718赖氨酸1920212223242526色氨酸2728293031323334353637383940精氨酸4142434445464748 174.0(s)48.0(d)16.8(q)172.5(s)53.9(d)32.9(t)20.1(t)28.1(t)37.0(t)--170.6(s)53.7(d)27.9(t)109.3(s)124.1(d)-131.1(s)111.1(d)115.0(s)145.9(s)102.1(d)126.3(s)-157.7(s)-52.7(d)29.2(t)25.3(t)40.7(t)-157.0(s)174.5(s) -4.17(dq，3.8，6.8Hz，1H)1.29(d，6.8Hz，3H)7.16(d，3.9Hz，1H)-3.92(ddd，5.9，6.8，6.8Hz，1H)1.57(m，2H)1.40(m，1H)1.10(m，1H)1.40(m，2H)2.75(m，1H)3.56(m，1H)7.45(dd，1.2，6.8Hz，1H)6.45(d，6.8Hz，1H)-4.38(ddd，2.9，8.8，12.7Hz，1H)2.83(dd，12.7，12.7Hz，1H)3.31(dd，2.9，12.7Hz，1H)-6.60(bs，1H)10.60(bs，1H)-7.20(s，1H)--7.01(s，1H)-8.64(d，9，8Hz，1H)6.36(d，5.6Hz，1H)4.07(ddd.5.6，7.8，7.8Hz，1H)1.52(m，1H)1.69(m，1H)1.46(m，2H)3.06(m，2H)7.53(m，1H)-- -15，1715，1619，16，17-19，21，22，40------27，19---28，27，30，31，3828，27，30，31，38-29，30，33，3830，31，33，38-35，36，38--30，35，33，36-1-41，42，4743，44，48---43，44，4745，47-- -H17，H18H16H16-H21，H26H20，H22a，H22bH21，H22b，H23H21，H22a，H23H22a，H22b，H24a，H24bH23，H24b，H25H23，H24a，H25H24a，H24bH20-H29a，H29b，H39H28，H29bH28，H29a-H32H31------H28-H42H41，H43a，H43bH42，H43b，H44H42，H43a，H44H43a，H43b，H45H46，H45H45--
a化学位移用2D异核实验测定
表3  1H(600MHz)，13C(125MHz)，HMBC和COSY
化合物3的NMR数据(d6-DMSO)
  原子No   13C(mult)a   1H(mult，JHz)   2，3JCH相关性   COSY
  N-甲基亮氨酸12 168.9(s)57.2(d) -4.77(dd，5.9，8.8Hz，1H) -8 -H3a，H3b
  3456NMe亮氨酸891011121314丙氨酸15161718赖氨酸1920212223242526色氨酸2728293031323334353637383940精氨酸4142434445   35.9(t)24.2(d)23.0(q)23.3(q)26.9(q)172.2(s)47.8(d)39.4(t)24.1(d)21.5(q)23.0(q)-173.6(s)47.5(d)16.5(q)-171.9(s)54.2(d)31.7(t)20.1(t)27.2(t)38.1(t)--172.8(s)53.7(d)27.9(t)109.4(s)124.5(d)-130.4(s)111.2(d)115.3(s)145.6(s)102.5(d)125.9(s)-157.2(s)-51.9(d)28.7(t)24.9(t)39.7(t)   1.20(m，1H)1.71(m，1H)1.35(m，1H)0.85(d，6.8Hz，3H)0.88(d，6.8Hz，3H)1.87(s，3H)-4.79(ddd，2.9，4.9，9.8Hz，1H)1.70(m，1H)1.22(m，1H)1.84(m，1H)0.90(d，6.8Hz，3H)0.95(d，6.8Hz，3H)8.76(d，4.9Hz，1H)-4.19(dq，5.8，6.8Hz，1H)1.32(d，6.8Hz，3H)7.22(d，5.9Hz，1H)-3.94(ddd，5.9，6.8，6.8Hz，1H)1.60(m，2H)1.40(m，1H)1.10(m，1H)1.40(m，2H)2.78(m，1H)3.60(m，1H)7.42(dd，1.2，7.8Hz，1H)6.31(d，6.8Hz，1H)-4.39(ddd，2.9，8.8，11.7Hz，1H)2.86(dd，11.7，13.7Hz，1H)3.27(dd，2.9，13.7Hz，1H)-6.62(bs，1H)10.65(bs，1H)-7.22(s，1H)--7.00(s，1H)-8.67(d，8.8Hz，1H)-6.50(d，7.8Hz，1H)4.05(ddd，5.9，7.8，7.8Hz，1H)1.56(m，1H)1.74(m，1H)1.46(m，2H)3.09(dt，5.9，5.9Hz，2H)   ---3，4，63，4，52，8-----10，11，1310，11，1215--15，1619-19，21，22----27-2740--28，27，30，31，3828，27，30，31，38-29，30，33，3830，31，33，38-36，38--30，35，33--4047---47   H2，H3b，H4H2，H3a，H4H3a，H3b，H5，H6H4H4--H10a，H10b，H14H9，H10b，H11H9，H10a，H11H10a，H10b，H12，H13H11H11H9-H17，H18H16H16-H21，H26H20，H22a，H22bH21，H22b，H23H21，H22a，H23H22a，H22b，H24a，H24bH23，H24b，H25H23，H24a，H25H24a，H24bH20-H29a，H29b，H39H28，H29bH28，H29a-H32H31------H28-H42H41，H43a，H43bH42，H43b，H44H42，H43a，H44H43a，H43b，H45H46，H45
  46474848-Me   -156.4(s)173.1(s)51.8(q)   7.42(t，5.9Hz，1H)--3.62(s，3H)   47--48   H45---
a化学位移用2D异核实验测定
表4  1H(600MHz)，13C(125MHz)和COSY
化合物4的NMR数据(d6-DMSO)
  原子No   13C(mult)a   1H(mult，J Hz)   COSY
  N-甲基亮氨酸123456NMe亮氨酸891011121314丙氨酸15161718赖氨酸1920212223242526色氨酸2728 n.o.57.9(d)36.1(t)24.1(d)23.7(q)20.9(q)27.3(q)n.o.47.0(d)40.0(t)24.2(d)20.7(q)23.9(q)-n.o.47.3(d)16.2(q)-n.o.54.3(d)32.1(t)21.1(t)28.1(t)38.1(t)--n.o.53.8(d) -4.78(dd，5.9，8.8Hz，1H)1.27(m，1H)1.68(m，1H)1.37(m，1H)0.79(d，6.8Hz，3H)0.83(d，6.8Hz，3H)1.81(s，3H)-4.78(ddd，2.9，4.9，9.8Hz，1H)1.63(m，1H)1.25(m，1H)1.83(m，1H)0.84(d，6.8Hz，3H)0.91(d，6.8Hz，1H)8.79(d，4.9Hz，1H)-4.19(dq，7.8，7.8Hz，1H)1.33(d，7.8Hz，3H)7.29(d，4.9Hz，1H)-3.87(ddd，5.9，6.8，6.8Hz，1H)1.60(m，2H)1.40(m，1H)1.10(m，1H)1.40(m，2H)2.75(m，1H)3.59(m，1H)7.41(dd，1.2，7.8Hz，1H)6.39(d，6.8Hz，1H)-4.38(ddd，2.9，8.8，11.7Hz，1H) -H3a，H3bH2，H3b，H4H2，H3a，H4H3a，H3b，H5，H6H4H4--H10a，H10b，H14H9，H10b，H11H9，H10a，H11H10a，H10b，H12，H13H11H11H9-H17，H18H16H16-H21，H26H20，H22a，H22bH21，H22b，H23H21，H22a，H23H22a，H22b，H24a，H24bH23，H24b，H25H23，H24a，H25H24a，H24bH20-H29a，H29b，H39
  293031323334353637383940精氨酸414243444546474848-Me   27.6(t)n.o.124.5(d)-n.o.111.2(d)120.2(d)121.0(d)117.8(d)n.o.-n.o.-52.2(d)28.0(t)24.7(t)40.1(t)-n.o.n.o.52.1(q)   2.81(dd，11.7，13.7Hz，1H)3.37(dd，2.9，13.7Hz，1H)-6.72(bs，1H)10.80(bs，1H)-7.37(d，7.8Hz，1H)6.89(dd，7.8，7.8Hz，1H)7.00(dd，7.8，7.8Hz，1H)7.21(d，7.8Hz，1H)-8.64(d，8.8Hz，1H)-6.49(d，7.8Hz，1H)4.19(ddd，5.9，7.8，7.8Hz，1H)1.52(m，1H)1.71(m，1H)1.40(m，2H)3.07(dt，5.9，5.9Hz，2H)7.42(t，5.9Hz，1H)-3.58(s，3H)   H28，H29bH28，H29a-H32H31-H35H34，H36H35，H37H36，H35-H28-H42H41，H43a，H43bH42，H43b，H44H42，H43a，H44H43a，H43b，H45H46，H45H45--
a化学位移用2D异核实验测定
n.o.＝未观察到
表5  1H(600MHz)，13C(125MHz)，HMBC和COSY
化合物5的NMR数据(d6-DMSO)
  原子No   13C(mult)a   1H(mult，J Hz)   2，3JCH相关性   COSY
  N-甲基亮氨酸123456NMe亮氨酸891011121314丙氨酸1516 168.9(s)57.5(d)36.6(t)24.4(d)23.7(q)21.2(q)27.5(q)172.6(s)46.8(d)40.0(t)24.5(d)21.4(q)23.0(q)-173.8(s)48.2(d) -4.76(dd，5.9，8.8Hz，1H)1.27(m，1H)1.65(m，1H)1.34(m，1H)0.82(d，6.8Hz，3H)0.84(d，6.8Hz，3H)1.77(s，3H)-4.77(ddd，2.9，4.9，9.8Hz，1H)1.68(m，1H)1.22(m，1H)1.82(m，1H)0.86(d，6.8Hz，3H)0.90(d，6.8Hz，3H)8.77(d，4.9Hz，1H)-4.16(dq，4.9，7.8Hz，1H) -1，3，8，7-NMe---3，4，63，4，52，8--9，11--10，11，1310，11，129，10，15-15，17 -H3a，H3bH2，H3b，H4H2，H3a，H4H3a，H3b，H5，H6H4H4--H10a，H10b，H14H9，H10b，H11H9，H10a，H11H10a，H10b，H12，H13H11H11H9-H17，H18
  1718赖氨酸1920212223242526色氨酸2728293031323334353637383940精氨酸4142434445464748   16.8(q)-172.3(s)54.1(d)32.1(t)20.6(t)27.1(t)38.1(t)--173.5(s)53.8(d)27.7(t)110.9(s)124.9(d)-136.7(s)111.3(d)125.8(s)118.7(d)118.3(d)125.5(s)157.5(s)-52.6(d)29.5(t)25.1(t)40.5(t)-156.8(s)174.3(s)   1.27(d，7.8Hz，3H)7.18(d，4.9Hz，1H)-3.91(ddd，5.9，6.8，6.8Hz，1H)1.60(m，2H)1.40(m，1H)1.10(m，1H)1.40(m，2H)2.76(m，1H)3.53(m，1H)7.50(dd，1.2，7.8Hz，1H)6.36(d，6.8Hz，1H)-4.41(ddd，2.9，9.6，11.7Hz，1H)2.90(dd，11.7，13.71H)3.30(dd，2.9，13.7Hz，1H)-6.78(bs，1H)11.00(bs，1H)-7.30(d，1.8Hz，1H)-6.93(dd，7.8，1.8Hz，1H)7.42(d，7.8Hz，1H)-8.64(d，9.6Hz，1H)-6.37(d，7.8Hz，1H)4.05(ddd，5.9，7.8，7.8Hz，1H)1.50(m，1H)1.67(m，1H)1.40(m，1H)1.19(m，1H)3.06(m，2H)7.50(m，1H)--   15，1619-19，21，22-------40--30，31，3830，31，38-29，30，33，3830，31，33，38-36，38-38，3435，33-1-4043，44，48---47---   H16H16-H21，H26H20，H22a，H22bH21，H22b，H23H21，H22a，H23H22a，H22b，H24a，H24bH23，H24b，H25H23，H24a，H25H24a，H24bH20-H29a，H29b，H39H28，H29bH28，H29a-H32H31-H36-H34，H37H36-H28-H42H41，H43a，H43bH42，H43b，H44H42，H43a，H44H43a，H43b，H45H44，H46H45--
a化学位移用2D异核实验测定
化合物6
表6  1H(600MHz)、13C(125MHz)、HMBC和COSY
化合物6的NMR数据(d6-DMSO)
  原子No   13C(mult)a   1H(mult，J Hz)  2，3JCH相关性   COSY
  N-甲基亮氨酸123456NMe亮氨酸891011121314缬氨酸151617181920赖氨酸21222324 169.4(s)58.0(d)36.2(t)23.0(d)23.7(q)24.0(q)27.0(q)172.5(s)47.8(d)39.2(t)27.0(d)21.0(q)24.9(q)-172.7(s)57.8(d)29.7(d)19.4(q)19.0(q)-172.5(s)54.8(d)31.5(t)20.1(t) -4.72(dd，5.9，8.8Hz，1H)1.25(m，1H)1.60(m，1H)1.93(m，1H)0.82(d，6.8Hz，3H)0.82(d，6.8Hz，3H)1.90(s，3H)-4.70(ddd，2.9，4.9，9.8Hz，1H)1.70(m，1H)1.22(m，1H)1.82(m，1H)0.84(d，6.8Hz，3H)0.96(d，6.8Hz，3H)8.69(d，4.9Hz，1H)-3.92(dd，5.8，7.8Hz，1H)1.95(m，1H)0.85(d，7.8Hz，3H)1.05(d，7.8Hz，3H)6.80(d，5.9Hz，1H)-3.91(ddd，5.9，6.8，6.8Hz，1H)1.60(m，2H)1.40(m，1H) -1，3，4，8，7-NMe1，2，42，42，33，4，63，4，52，8-----10，11，1310，11，129，10，15--16，18，1916，17，1916，17，1816，17，19-19，21，22，42-- -H3a，H3bH2，H3b，H4H2，H3a，H4H3a，H3b，H5，H6H4H4--H10a，H10b，H14H9，H10b，H11H9，H10a，H11H10a，H10b，H12，H13H11H11H9-H17，H20H16，H18，H19H17H17H16-H23，H28H22，H24a，H24bH23，H24b，H25
25262728色氨酸2930313233343536373839404142异亮氨酸43444546474849 28.1(t)38.1(t)--171.6(s)53.2(d)27.9(t)109.5(s)125.5(d)-130.4(s)111.1(d)115.0(s)146.3(s)102.3(d)126.0(s)-157.6(s)-56.9(d)36.8(d)24.7(t)11.7(q)15.4(q)173.7(s)   1.10(m，1H)1.40(m，2H)2.80(m，1H)3.61(m，1H)7.40(dd，1.2，7.8Hz，1H)6.47(d，5.9Hz，1H)-4.41(ddd，2.9，8.8，11.7Hz，1H)2.90(dd，11.7，13.7Hz，1H)3.40(dd，2.9，13.7Hz，1H)-6.65(bs，1H)10.64(bs，1H)-7.20(s，1H)--7.00(s，1H)-8.77(d，8.8Hz，1H)-6.35(d，7.8Hz，1H)4.06(dd，5.9，7.8Hz，1H)1.70(m，1H)1.40(m，1H)1.15(m，1H)0.82(t，6.8Hz，3H)0.84(d，6.8Hz，3H)-   --27-2742，22，23--29，33，32，3030，32，33-29，30，35，4032，33，35，40-33，37，38，40--35，33，32，37，38-1-4242，45，46，48，49-44，47，4844，47，4845，4644，45，46-   H23，H24a，H25H24a，H24b，H26a，H26bH25，H26b，H27H25，H26a，H27H26a，H26bH22-H31a，H31b，H41H30，H31bH30，H31a-H34H33------H30-H44H43，H45H44，H46b，H46a，H48H46b，H47，H45H47，H45，H46aH46a，H46bH45-
a化学位移用2D异核实验测定
化合物7
Figure A20048003905900411
表7  1H(600MHz)、13C(125MHz)、HMBC和COSY
化合物7的NMR数据(d6-DMSO)
  原子No   13C(mult)a   1H(mult，J Hz)   2，3JCH相关性   COSY
  N-甲基色氨酸123456789101112NMe亮氨酸14151617181920缬氨酸212223 169.8(s)61.0(d)22.3(t)108.9(s)124.3(d)-130.7(s)111.8(d)115.8(s)145.8(s)102.7(d)126.8(s)27.5(q)172.5(s)46.9(d)36.9(t)24.8(d)19.7(q)22.0(q)-172.2(s)57.6(d)30.0(d) -4.66(dd，2.6，10.4Hz，1H)2.73(m，1H)3.07(m，1H)-6.87(bs，1H)10.66(bs，1H)-7.26(s，1H)--6.98(s，1H)-1.91(s，3H)-4.21(ddd，2.9，4.9，9.8Hz，1H)-0.50(dd，11.7，11.7Hz，1H)0.90(m，1H)1.40(m，1H)0.26(d，6.8Hz，3H)0.40(d，6.8Hz，3H)8.42(d，43Hz，1H)-3.79(dd，6.9，7.8Hz，1H)1.90(m，1H) -1，3，4，14，13-NMe1，5，4，2，122，4，5，12-3，4，7，124，5，7，12-7，9，10，12--4，7，9，10，12-2，14-16，2114，17，18--16，17，1916，17，1815，16，21-23，24，2522，24，25 -H3a，H3bH2，H3bH2，H3a-H6H5--------H16a，H16b，H20H15，H16b，H17H15，H16a，H17H16a，H16b，H18，H19H17H17H15-H23，H26H22，H24，H25
  242526赖氨酸2728293031323334苯丙氨酸3536373839404142434445异亮氨酸46474849505152   18.9(q)18.8(q)-171.9(s)53.8(d)31.3(t)20.2(t)28.2(t)37.9(t)--171.0(s)54.8(d)37.9(t)138.6(s)128.9(d)127.9(d)126.2(d)127.9(d)128.29(d)-157.3(s)-56.6(d)36.9(d)24.5(t)11.1(q)15.6(q)173.8(s)   0.86(d，7.8Hz，3H)0.93(d，7.8Hz，3H)6.74(d，6.9Hz，1H)-3.86(ddd，5.9，6.9，6.8Hz，1H)1.54(m，2H)1.40(m，1H)1.10(m，1H)1.40(m，2H)2.86(m，1H)3.58(m，1H)7.40(dd，1.2，7.8Hz，1H)6.43(d，6.9Hz，1H)-4.57(ddd，2.9，9.5，11.7Hz，1H)2.75(dd，11.7，13.71H)3.40(dd，2.9，13.7Hz，1H)-7.07(d，7.8Hz，1H)7.22(dd，7.8，7.8Hz，1H)7.15(t，7.8Hz，1H)7.22(dd，7.8，7.8Hz，1H)7.07(d，7.8Hz，1H)8.76(d，9.5Hz，1H)-6.28(d，8.7Hz，1H)4.04(dd，5.9，7.8，7.8Hz，1H)1.71(m，1H)1.35(m，1H)1.10(m，1H)0.83(t，6.8Hz，3H)0.82(d，6.8Hz，3H)-   22，23，2522，23，2422，23，27-27，29，30，45----3530，31，3532，3527，29，45-1，35，3735，36，38，39，4336，38，39，43-37，38，41，4338，4239，4338，4037，38，39，411，36，37-45，47，5245，48，49，51，5247，49，50，5147，48，50，5147，48，50，5148，4947，48，49-   H23H23H22-H29，H34H28，H34H29，H30b，H31H29，H30a，H31H30a，H30b，H32a，H32bH31，H32b，H33H31，H32a，H33H32a，H32bH28-H37a，H37b，H44H36，H37bH36，H37a-H40，H41H39，H41H40，H42H41，H43H42H36-H47H46，H48H47，H49b，H51H48，H49b，H50H48，H49a，H50H49a，H49bH48-
a化学位移用2D异核实验测定
                             化合物8
Figure A20048003905900431
表8  1H(600MHz)，13C(125MHz)和COSY
化合物8的NMR数据(d6-DMSO)
  原子No   13C(mult)a   1H(mult，J Hz)   COSY
  N-甲基色氨酸123456789101112NMe亮氨酸14151617181920异亮氨酸2122232425 n.o.60.8(d)21.9(t)-n.o.124.7(d)n.o.111.5(d)n.o.n.o.103.4(d)n.o.27.4(q)n.o.47.4(d)37.0(t)24.9(d)19.5(q)22.3(q)-n.o.55.8(d)37.0(d)24.2(t)12.0(q) -4.65(dd，2.6，9.9Hz，1H)2.73(m，1H)3.08(m，1H)-6.87(d，1.9Hz，1H)10.66(bs，1H)-7.23(s，1H)--6.94(s，1H)-1.90(s，3H)-4.18(ddd，2.9，4.9，9.8Hz，1H)-0.50(dd，9.8，9.8Hz，1H)0.91(m，1H)1.40(m，1H)0.22(d，6.8Hz，3H)0.36(d，6.8Hz，3H)8.40(d，4.8Hz，1H)-3.93(dd，7.8，8.2Hz，1H)1.72(m，1H)1.08(m，1H)1.30(m，1H)0.82(d，7.0Hz，3H) -H3a，H3bH2，H3bH2，H3a-H6H5--------H16a，H16b，H20H15，H16b，H17H15，H16a，H17H16a，H16b，H19，H18H17H17H15-H23，H27H22，H24a，H24b，H26H24b，H23，H25H24a，H23，H25H24a，H24b
  2627赖氨酸2829303132333435苯丙氨酸3637383940414243444546异亮氨酸47484950515253   15.7(q)-n.o.54.3(d)31.8(t)24.9(t)28.1(t)38.0(t)--n.o.54.5(d)37.4(t)n.o.128.3(d)128.0(d)125.9(d)128.0(d)128.3(d)-n.o.-56.3(d)38.3(d)22.8(t)11.4(q)15.8(q)n.o.   0.83(d，7.0Hz，3H)6.70(d，6.9Hz，1H)-3.85(ddd，5.9，6.8，6.8Hz，1H)1.54(m，1H)1.72(m，1H)1.40(m，1H)1.10(m，1H)1.40(m，2H)2.80(m，1H)3.55(m，1H)7.43(dd，1.2，8.8Hz，1H)6.45(d，6.8Hz，1H)-4.58(ddd，2.9，8.8，11.7Hz，1H)2.73(dd，11.7，11.7Hz，1H)3.37(dd，2.9，11.7Hz，1H)-7.05(d，7.8Hz，1H)7.19(dd，7.8，7.8Hz，1H)7.14(t，7.8Hz，1H)7.19(dd，7.8，7.8Hz，1H)7.05(d，7.8Hz，1H)8.68(d，8.8Hz，1H)-6.29(d，8.8Hz，1H)4.01(dd，4.9，7.8，Hz，1H)1.71(m，1H)1.38(m，H)1.01(m，1H)0.79(t，6.8Hz，3H)0.79(d，6.8Hz，3H)-   H23H22-H30，H35H29，H30b，H31a，H31bH29，H30a，H31a，H31bH32，H31b，H30a，H30bH32，H31a，H30a，H30bH31a，H31b，H33a，H33bH32，H33b，H34H32，H33a，H34H33a，H33bH29-H38a，H38b，H45H37，H38bH37，H38a-H41，H42H40，H42H41，H43H42，H44H43，H42H37-H48H47，H49H48，H50，H50b，H52H50b，H49，H51H50a，H49，H51H50a，H50bH49-
a化学位移用2D异核实验测定
n.o.＝未观察到
化合物9
表9  1H(600MHz)、13C(125MHz)、HMBC和COSY
化合物9的NMR数据(d6-DMSO)
  原子No   13C(mult)a   1H(mult，JHz)  2，3JCH相关性   COSY
  N-甲基色氨酸123456789101112NMe亮氨酸14151617181920亮氨酸21222324 169.5(s)60.8(d)21.7(t)108.9(s)124.3(d)130.2(s)111.8(d)115.8(s)145.9(s)102.7(d)126.1(s)27.4(q)172.5(s)46.7(d)37.4(t)23.1(d)19.7(q)22.3(q)-173.5(s)50.7(d)39.7(t)23.3(d) -4.69(dd，2.6，10.4Hz，1H)2.76(m，1H)3.04(m，1H)-6.88(bs，1H)10.66(bs，1H)-7.27(s，1H)--6.99(s，1H)-1.91(s，3H)-4.22(ddd，2.9，4.9，9.8Hz，1H)-0.49(dd，9.8，9.8Hz，1H)0.95(m，1H)1.40(m，1H)0.25(d，6.8Hz，3H)0.42(d，6.8Hz，3H)8.47(d，4.3Hz，1H)-4.03(td，7.8，6.9Hz，1H)1.46(m，2H)1.67(m，1H) -12，4，122，4，12-4，7，124，5，7，12-9，10，12--4，7，9，10-2，14--18--16，17，1916，17，1821-21，23-15，16 -H3a，H3bH2，H3bH2，H3a-H6H5--------H16a，H16b，H20H15，H16b，H17H15，H16a，H17H16a，H16b，H19，H18H17H17H15-H23，H27H22，H24H23，H25，H26
  252627赖氨酸2829303132333435苯丙氨酸3637383940414243444546异亮氨酸47484950515253   21.6(q)22.8(q)-172.2(s)54.4(d)32.1(t)20.2(t)28.1(t)38.3(t)--171.4(s)54.5(d)37.9(t)138.3(s)128.7(d)129.2(d)126.6(d)129.2(d)128.7(d)-157.0(s)-56.9(d)37.6(d)24.6(t)11.7(q)15.8(q)173.8(s)   0.82(d，7.0Hz，3H)0.88(d，7.0Hz，3H)6.86(d，6.9Hz，1H)-3.88(ddd，5.9，6.8，6.8Hz，1H)1.54(m，2H)1.40(m，1H)1.10(m，1H)1.42(m，2H)2.84(m，1H)3.57(m，1H)7.38(dd，1.2，7.8Hz，1H)6.35(d，6.8Hz，1H)-4.52(ddd，2.9，8.8，11.7Hz，1H)2.74(dd，11.7，13.7Hz，1H)3.55(dd，2.9，13.7Hz，1H)-7.08(d，8.0Hz，1H)7.23(dd，8.0，8.0Hz，1H)7.17(t，8.0Hz，1H)7.23(dd，8.0，8.0Hz，1H)7.08(d，8.0Hz，1H)8.71(d，8.8Hz，1H)-6.26(d，8.7Hz，1H)4.03(dd，5.9，7.8，7.8Hz，1H)1.70(m，1H)1.35(m，1H)1.10(m，1H)0.86(t，6.8Hz，3H)0.85(d，6.8Hz，3H)-   23，24，2623，24，2528-28，30，31-------46-3639，40，4428，27，30，31，38-42，4439，4340，4439，4140，38，421--46，49，50，52，53-48，49，51，5249，51，5249，5048，49，50-   H24H24H22H30，H35H29，H31a，H31bH30，H31b，H32H30，H31a，H32H30，H22a，H23H31a，H31b，H33a，H33bH32，H33b，H34H32，H33a，H34H33a，H33bH29-H38a，H38b，H45H37，H38bH27，H38a-H41，H42H40，H42H41，H43，H40，H44H42，H44H43，H42H37-H48H47，H49H48，H50b，H50a，H52H49，H50a，H50b，H51H49，H50a，H50b，H51H50a，H50bH49-
a化学位移用2D异核实验测定
化合物10
表10  1H(600MHz)、13C(125MHz)、HMBC和COSY
化合物10的NMR数据(d6-DMSO)
  原子No   13C(mult)a   1H(mult，J Hz)   2，3JCH相关性   COSY
  N-甲基色氨酸123456789101112NMe亮氨酸14151617181920亮氨酸212223 169.8(s)60.9(d)21.9(t)109.3(s)126.1(d)-130.5(s)111.8(d)115.8(s)146.2(s)103.4(d)126.8(s)27.3(q)171.9(s)46.8(d)37.2(t)23.3(d)19.5(q)21.3(q)-172.9(s)57.7(d)29.8(t) -4.66(dd，2.9，10.7Hz，1H)2.77(m，1H)3.07(m，1H)-6.89(d，2.0Hz，1H)10.68(bs，1H)-7.26(s，1H)--6.98(s，1H)-1.97(s，3H)-4.21(ddd，2.9，4.9，11.7Hz，1H)-0.48(dd，11.7，11.7Hz，1H)0.95(m，1H)1.40(m，1H)0.27(d，6.8Hz，3H)0.41(d，6.8Hz，3H)8.42(d，4.9Hz，1H)-3.77(dd，6.8，7.8Hz，1H)1.88(m，2H) -1，3，4，14，13-NMe2，4，52，4，5-4，7，124，5，7，12-7，9，10，12--4，7，9-2，14-----16，17，1916，17，1815，16，21-21，23，24，25- -H3a，H3bH2，H3bH2，H3a-H6H5--------H16a，H16b，H20H15，H16b，H17H15，H16a，H17H16a，H16b，H19，H18H17H17H15-H23，H26H22，H23，H24
  242526赖氨酸2728293031323334苯丙氨酸3536373839404142434445异亮氨酸46474849505152   18.9(q)18.9(q)-172.2(s)54.5(d)31.5(t)20.2(t)28.2(t)38.3(t)--170.4(s)54.1(d)37.2(t)137.9(s)131.4(d)130.4(d)119.2(s)130.4(d)131.4(d)-157.3(s)-57.2(d)37.2(d)25.1(t)11.4(q)15.8(q)174.5(s)   0.84(d，7.0Hz，3H)0.93(d，7.0Hz，3H)6.74(d，6.9Hz，1H)-3.84(ddd，5.9，6.8，6.8Hz，1H)1.54(m，2H)1.40(m，1H)1.10(m，1H)1.42(m，2H)2.85(m，1H)3.57(m，1H)7.46(dd，1.2，7.0Hz，1H)6.41(d，6.8Hz，1H)-4.52(ddd，2.9，8.8，11.7Hz，1H)2.72(dd，11.7，13.71H)3.36(dd，2.9，13.7Hz，1H)-7.01(d，7.8Hz，1H)7.37(d，7.8Hz，1H)-7.39(d，7.8Hz，1H)7.08(d，7.8Hz，1H)8.81(d，8.8Hz，1H)-6.26(d，8.8Hz，1H)4.04(dd，4.9，8.8，7.8Hz，1H)1.70(m，1H)1.33(m，1H)1.07(m，1H)0.83(t，6.8Hz，3H)0.83(d，6.8Hz，3H)-   22，23，2522，23，2423，28-20，28，29，45-----30，313529，28，45-3536，38，39，4336，38，39，43-37，41，4342，38-40，3837，39，41--45，4745，48，49，51，52-47，48，50，5147，48，50，5148，4947，48，49-   H23H23H22-H29，H34H28，H30a，H30bH29，H30b，H31H29，H30a，H31H30a，H30b，H32a，H32bH31，H32b，H33H31，H32a，H33H32a，H32bH28-H37a，H37b，H44H36，H37bH36，H37a-H40H39-H43H42H36-H47H48，H46H47，H49b，H49aH49a，H48，H50H49b，H48，H50H49a，H49bH48-
a化学位移用2D异核实验测定
实施例2
该实施例描述了化合物11的分离。
通用实验程序
水为Milli-Q过滤，所有其它所用溶剂为Omnisolv。制备HPLC使用Hypersil BDS basic C18 5uM，21.2mm×150mm柱。NMR光谱用VarianInova 600或500MHz NMR波谱仪记录。样品用d6-DMSO溶解，化学位移相对于溶剂峰计算(DMSO 1H□2.50和13C 39.5ppm)。质谱用Fisons VGPlatform II检测，用正电喷雾离子化方式。洗脱剂为乙腈/水各50％的混合物，流速为0.1ml/min。
动物材料
六种Candidaspongia flabellata海绵样品为在Outer Gneering，Sunshine Coast，Old Reef，Fairfax Is和Chauvel Reef，Queensland，Australia通过SCUBA潜水收集，凭证样品(G315106，G314580，G314025，G315402，G318260，G317513)存放于澳大利亚布里斯班昆士兰博物馆。
提取和分离
研磨冻干的海绵材料(529g)并用甲醇充分提取，得到六份甲醇提取物。将该甲醇粗提物进行一系列分配：MeOH/正己烷、H2O∶MeOH(4∶1)/DCM、H2O∶MeOH(4∶1)/EtOAc。生物活性物质分布在H2O∶MeOH(4∶1)和EtOAc层。合并所有六份生物相(for all six biota)的H2O∶MeOH(4∶1)和EtOAc层然后用H2O/丁醇分配。活性物质在丁醇层(900mg)，将其通过逆流色谱{H2O/MeOH/EtOAc(4∶1∶5)}，上层为流动相。合并很早流出的流分13-24(325mg)，将其分配在正己烷：EtOAc∶MeOH∶H2O(1∶1∶1∶1)中。然后将含生物活性物质的水层(150mg)用色谱法纯化，再用逆流色谱法{(CHCl3∶MeOH∶H2O(7∶13∶8))纯化，下层为流动相。合并较早流出的活性流分25-32得到85mg物质。将该物质用HPLC(Hypersil BDS C18)进行最后的纯化步骤，用H2O/MeCN梯度洗脱30分钟，梯度从H2O(含1％TFA)到MeCN(含1％TFA)。洗脱18.2分钟后，得到化合物110.4mg。
化合物11：MS：(正ESI))[M+H]+m/z 1003.0(100)，1004.4(72)，1005.4(75)，1006.3(32).1H和13C NMR(d6-DMSO)：见表11.
经过详细的研究之后，这些研究包括1H、13C、gHSQC、gHMBC和gCOSY实验，化合物11也被鉴别为环形肽。
化合物11
表11  1H(600MHz)、13C(125MHz)、HMBC和COSY
NMR数据化合物11 in d6-DMSO
  原子No   13C(mult)a   1H(mult，J Hz)  2，3JCH相关性   COSY
  N-甲基色氨酸123456789101112NMe亮氨酸141516171819 n.o.60.0(d)22.4(t)n.o.108.9(s)-130.8(s)111.0(d)111.8(d)150.8(s)101.8(d)128.1(s)28.5(q)172.4(s)46.8(d)36.6(t)22.4(d)19.0(q)22.1(q) -4.70(bd，10.8Hz，1H)2.71(dd，14.5，10.8Hz，1H)3.14(d，14.5Hz，1H)--11.33(s，1H)-7.05(bd，8.0Hz，1H)6.60(bd，8.0Hz，1H)-6.82(bs，1H)-2.10(s，3H)-4.16(m，1H)0.32(bt，11.0Hz，1H)0.96(m，1H)a1.42(m，1H)0.22(d，6.6Hz，3H)0.41(d，6.6Hz，3H) ------4，7，12-12，10--7，10-2--15--16，17，1916，17，18 -H3a，H3bH2，H3bH3a----H9H8-----H16a，H16b，H20H16b，H17H15，H16a-H17H17
  20异亮氨酸21222324252627赖氨酸2829303132333435酪氨酸3637383940414243444546苯丙氨酸474849   -171.6(s)55.7(d)35.7(d)24.7(t)11.2(q)14.2(q)-172.4(s)54.3(d)31.0(t)20.1(t)26.6(t)37.8(t)--n.o.54.7(d)36.5(t)130.0(s)128.5(d)114.8(d)156.0(s)114.8(d)128.5(d)-n.o.-53.4(d)37.2(t)   8.38(d，4.8Hz，1H)-3.99(t，6.8Hz，1H)1.76(m，1H)1.10(m，1H)a1.44(m，1H)0.85(t，7.2Hz，3H)0.81(d，6.6Hz，3H)6.78(d，6.8Hz，1H)-3.85(ddd，7.0，6.5，5.0Hz，1H)1.52(m，1H)1.60(m，1H)1.14(m，1H)1.25(m，1H)138(m，1H)1.41(m，1H)2.85(m，1H)3.52(m，1H)7.35(m，1H)6.48(d，7.0Hz，1H)-4.50(ddd，11.7，9.0，4.9Hz，1H)2.62(bt，13.0Hz，1H)a3.23(m，1H)-6.87(d，7.5Hz，1H)6.62(d，7.5Hz，1H)-6.62(d，7.5Hz，1H)6.87(d，7.5Hz，1H)8.54(d，9.0Hz，1H)-6.26(d，8.0Hz，1H)4.36(ddd，8.0，7.5，5.2Hz，1H)2.86(dd，13.8，7.5Hz，1H)   14-23，2621--23，2422--28------------3939-38，39，4240，42，44-40，42，4438，39，42---56，4956，55，51，50，48   H15-H23，H27H22，H24a，H26H23，H24b，H25H24a，H25H24a，H24bH23H22-H30a，H30b，H35H29，H31aH29，H31bH30aH30bH33b-H34H34，H32aH33a，H33bH29-H38a，H38b，H45H37，H38bH37，H38a-H41H40-H44H43H37H48H49a，H49b，H47H48
50515253545556OHOH 137.5(s)129.0(d)128.0(d)126.2(d)128.0(d)129.0(d)173.8(s)--   2.99(dd，13.8，5.2Hz，1H)-7.16(d，7.5Hz，1H)7.27(t，7.5Hz，1H)7.20(t，7.5Hz，1H)7.27(t，7.5Hz，1H)7.16(d，7.5Hz，1H)-8.71(s，1H)9.13(s，1H)   56，55，51，50，48-53，495051，555053，49---   H48-H52，H54H51，H55-H51，H55H52，H54---
a化学位移用2D NMR实验测定
n.o.＝未检测
实施例3
该实施例描述了化合物12的合成。
通用实验程序
用装有电喷雾接口的Micromass LCT质谱仪(LC-HRMS)记录高分辨质谱。1H NMR测定在Varian UNITYplus 400，500和600分光计的上进行，分别在400，500和600 1H频率下操作。NMR光谱在d6-DMSO中用化学位移记录，单位ppm，溶剂为内标。
化合物12
Figure A20048003905900521
化合物12的合成
化合物12按照文献程序(Marsh and Bradley，J.Org.Chem.，1997，62，6199-6203)做了如下修改制得：先将Fmoc-L-Arg-Nω，ω’-(Boc)2-OH与树脂/连接物偶联，除去Fmoc基团后，将游离胺与Nα-(4-硝基苯基氧基羰基)-Nε-(9-芴基甲氧基羰基)-D-赖氨酸烯丙基酯偶联。用Fmoc-L-丙氨酸，接着用Fmoc-L-N-甲基丙氨酸、Fmoc-L-亮氨酸和Fmoc-L-丙氨酸在赖氨酸残基侧链继续进行Fmoc肽合成。除去烯丙基酯和Fmoc，然后环化，最后从树脂/连接物上切下。将所得残基用反相HPLC(Ace C8柱，线性梯度5％→95％MeCN的0.1M NH4OAc水溶液)纯化，得到化合物12(1.8mg，1.3％)。
1H NMR(500MHz，d6-DMSO)：□9.2(宽s，1H)，8.66(d，1H)，8.52(d，1H)，7.4-8.0(宽单峰，4H)，7.47(dd，1H)，7.10(d，1H)，6.56(d，1H)，6.08(d，1H)，4.77-4.83(m，1H)，4.70-4.77(m，1H)，4.23(qd，1H)，4.07(qd，1H)，3.88-3.98(m，1H)，3.65-3.75(m，1H)，3.47-3.52(m，1H)，3.03(宽t，2H)，2.71-2.78(m，1H)，2.52(s，3H)，1.78-1.84(m，1H)，1.68-1.79(m，1H)，1.30-1.65(m，12H)，1.15-1.23(m，2H)，1.18(二d，6H)，0.94(d，3H)，0.93(d，3H)，0.89(d，3H)，0.88(d，3H).
HRMS(ESI)计算值C32H59N10O8711.4517(M+H)+，实测值711.4525.
实施例4
该实施例描述了化合物1和13-16的合成。
化合物1的合成
a)中间体A的合成
中间体A
Figure A20048003905900541
将TFA(2mL)加入到Boc-D-赖氨酸(Fmoc)-O烯丙基(2.86g，5.6mmol)中并将其静置5分钟。然后用干燥的氮气流除去TFA，得到H-D-赖氨酸(Fmoc)-O烯丙基，将其在高度真空线路下干燥2小时，除去所有痕量TFA。将2-氯三苯甲基树脂(1g，1.4mmol)在DCM(10mL)中预膨胀1小时。排去树脂中的液体，加入H-D-赖氨酸(Fmoc)-O烯丙基(2.30g，5.64mmol)和DIEA(729mg，982μL，5.64mmol)的DCM(10mL)溶液，并将反应混合物振摇1小时。再向树脂中加入DIEA(1.46g，1.95mL，11.3mmol)，将反应混合物再振摇1小时。加入甲醇(1mL)将任何未反应的树脂封端，将反应化合物再振摇1小时。过滤树脂，用DMF(2×5mL)、DCM(2×5mL)和DMF(2×5mL)洗涤。将该树脂用下述条件进行Fmoc-固相肽合成(SPPS)：
(i)Fmoc脱保护：20％哌啶的DMF(2×10mL)溶液2分钟，然后用DMF(4×5mL)、DCM(4×5mL)和DMF(4×5mL)洗涤。
(ii)偶联条件：在所有偶联反应中，将偶联试剂的DMF溶液加入到Fmoc-氨基酸中。将此溶液加入到树脂中，然后加入DIEA。(a)Fmoc-色氨酸(Boc)-OH(2.95g，5.6mmol)、HBTU(0.5M溶液，11.2mL)和DIEA(0.975mL，5.6mmol)20分钟。(b)Fmoc-N-甲基-亮氨酸-OH(2.06g，5.6mmol)、HBTU(0.5M溶液，11.2mL)和DIEA(0.975mL，5.6mmol)20分钟。(c)Fmoc-亮氨酸-OH(1.98g，5.6mmol)、HOBt(756mg，5.6mmol)，HATU(2.13g，5.6mmol)和DIEA(314μL，1.8mmol)的DMF(10mL)溶液3小时。(d)Fmoc-丙氨酸-OH(1.74g，5.6mmol)、HBTU(0.5M溶液，11.2mL)和DIEA(0.975mL，5.6mmol)20分钟。所有的偶联反应之后，将树脂过滤，用DMF(4×5mL)、DCM(4×5mL)和DMF(4×5mL)洗涤。除了(c)，所有偶联反应都用茚三酮试验监测，偶联(c)用溴酚蓝试验监测。所有偶联反应也用MS监测，通过将少量树脂(5mg)用100％TFA裂解5分钟，滤出树脂，滤液用MS分析。
将Pd(PPh3)4(1.62g，1.4mmol)和二甲基环己二酮(1.96g，14mmol)的THF∶DCM(1∶1，50mL)溶液用氮气喷射(sparge)10分钟，加入到树脂中，将混合物振摇16小时。将反应混合物过滤，用DCM(3×5mL)、DMF(3×5mL)、0.5％DIEA和0.5％二乙基二硫代氨基甲酸钠盐的DMF(3×5mL)和DMF(3×5mL)溶液洗涤。将该树脂用20％哌啶的DMF(2×10mL)溶液处理2分钟，然后用DMF(4×5mL)、DCM(4×5mL)、10％吡啶盐酸盐的DCM∶DMF(1∶1，4×5mL)溶液和DMF(4×5mL)洗涤。将PyBroP(718mg，1.54mmol)和DIEA(1mL，5.74mmol)的DCM∶DMF(1∶1，10mL)溶液加入到该树脂中，所得混合物振摇3小时，之后茚三酮试验显示阴性。用50％TFA的DCM(20mL)溶液处理1小时，使环形肽从树脂上切下。过滤树脂，用TFA(2×5mL)和DCM(2×5mL)洗涤，浓缩至干，重新溶于MeCN∶H2O(0.1％TFA)，冻干得到中间体A粗品(435mg，50％，以2-氯三苯甲基树脂计)。用RPHPLC(95∶5H2O(1％TFA)∶MeCN(1％TFA)-2∶3H2O(1％TFA)∶MeCN(1％TFA))纯化，在60分钟内洗脱，得到中间体A(0.417g，3.6％)。
b)烯丙基-N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N5-{亚氨基[(2，2，4，6，7-五甲基-2，3-二氢-1-苯并呋喃-5-基)氨基]甲基}鸟氨酸酯
将N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N5-{亚氨基[(2，2，4，6，7-五甲基-2，3-二氢-1-苯并呋喃-5-基)氨基]甲基}鸟氨酸(1.0g，1.54mmol)溶于DMF(5mL)。加入碳酸铯(377mg，1.16mmol)，将反应混合物搅拌1小时。然后加入烯丙基溴(0.913mL，10.8mmol)，再继续搅拌1小时，得到乳白色溶液。加入水(25mL)，将反应混合物用2M KHSO4酸化。加入DCM(50mL)分离各相。水相用DCM(2×50mL)洗涤，合并的有机相用盐水(50mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩至干，得到无色泡沫状烯丙基-N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N5-{亚氨基[(2，2，4，6，7-五甲基-2，3-二氢-1-苯并呋喃-5-基)氨基]甲基}鸟氨酸酯(857mg，81％)。
1HNMR(CDCl3，500MHz)：1.43(s，6H)，1.59(m，2H)，1.73(m，1H)，1.86(m，1H)，2.09(s，3H)，2.52(s，3H)，2.61(s，3H)，2.91(s，2H)，3.22(m，2H)，4.17(t，J 7Hz，1H)，4.32(m，1H)，4.37(m，1H)，4.59(br d，J 4.5Hz，2H)，5.21(d，J 10.5Hz，1H)，5.30(d，J 17Hz，1H)，5.83(m，1H)，5.88(m，1H)，6.26(br s，1H)，6.35(br s，2H)，7.26(t，J 7.5Hz，2H)，7.37(t，J 7.5Hz，2H)，7.57(m，2H)，7.74(d，J 7.5Hz，2H).
13CNMR(CDCl3，125MHz)：□12.68，18.22，19.54，25.69，28.78，29.93，40.96，43.43，47.36，53.72，54.10，66.23，67.39，86.63，117.78，119.12，120.19，124.93，125.40，127.34，127.96，131.79，132.47，133.17，138.54，141.49，143.97，144.08，156.63，159.03，171.42).MS：(正ESI)[M+H]+m/z 689.
c)烯丙基-N5-[[(4-乙基-2，2，6，7-四甲基-2，3-二氢-1-苯并呋喃-5-基)氨基](亚氨基)甲基]-N2-[(4-硝基苯氧基)羰基]鸟氨酸酯
将烯丙基-N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N5-{亚氨基[(2，2，4，6，7-五甲基-2，3-二氢-1-苯并呋喃-5-基)氨基]甲基}鸟氨酸酯(800mg，1.16mmol)溶于DMF(4mL)。加入哌啶(1mL)，将反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后浓缩。所得残留物溶于DCM(9mL)，加入到冰盐浴冷却的4-硝基苯基氯甲酸酯(370mg，1.85mmol)和吡啶(750uL，9.3μmol)的DCM(6mL)混悬液中。搅拌2.5小时后，加入1M KHSO4(20mL)，分离有机层，水相用DCM(4×20mL)萃取。合并的有机萃取液干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，所得残留物用快速硅胶色谱法(100％己烷→7∶3EtOAc∶己烷)纯化，得到烯丙基-N5-[[(4-乙基-2，2，6，7-四甲基-2，3-二氢-1-苯并呋喃-5-基)氨基](亚氨基)甲基]-N2-[(4-硝基苯氧基)羰基]鸟氨酸酯(138mg，18％)。
1HNMR(CDCl3，500MHz)：1.42(s，6H)，1.62(m，2H)，1.79(m，1H)，1.89(m，1H)，2.04(s，3H)，2.48(s，3H)，2.55(s，3H)，2.90(s，2H)，3.20(m，2H)，4.30(m，1H)，4.60(br d，J 4.5Hz，2H)，5.22(d，J 10.5Hz，1H)，5.29(d，J 17Hz，1H)，5.86(m，1H)，6.25(br s，1H)，6.33(br s，1H)，6.50(br d，J 6.5Hz，1H)，6.90(d，J 7.5Hz，1H)，7.25(d，J 8Hz，2H)，8.05(d，J 7.5Hz，1H)，8.15(d，J 8Hz，2H).
13CNMR(CDCl3，125MHz)：□12.63，18.16，19.45，25.74，28.76，29.44，40.8，43.41，54.41，66.39，86.71，115.99，117.78，119.21，122.22，124.97，125.23，126.22，131.66，132.40，133.02，138.43，140.75，144.97，153.45，156.06，156.67，159.04，163.07，163.80，171.6.
MS：(正ESI)[M+H]+m/z 632.
d)化合物1
将中间体A(49.9mg，0.08mmol)溶于DMF(8mL)。加入烯丙基-N5-[[(4-乙基-2，2，6，7-四甲基-2，3-二氢-1-苯并呋喃-5-基)氨基](亚氨基)甲基]-N2-[(4-硝基苯氧基)羰基]鸟氨酸酯(60.6mg，0.096mmol)，然后加入DIEA(17uL，0.096mmol)，将反应混合物在室温下搅拌16小时。浓缩反应混合物，得到粗品脲。将(四)三苯基膦合钯(8mg，0.0072mmol)和二甲基环己二酮(25mg，0.18mmol)的THF∶DCM(1∶1，5mL)溶液用干燥的氮气喷射，然后经套管加入到脲中，室温下搅拌过夜，得到粗品羧酸。将该羧酸溶于DCM(1mL)，加入对甲苯酚(340μL)和TFA(250μL)，将反应混合物在室温下搅拌20小时，得到粗品化合物1。反应混合物用反相HPLC(YMC碱性半制备柱，线性梯度65％水(1％TFA)35％MeCN(1％TFA)→100％MeCN(1％TFA))纯化，得到化合物1(11.3mg，17％).NMR和MS的数据与可信样品的一致。
化合物1可选择的合成方法
式A的中间体也可用下述路线制备。
a)中间体C的合成
中间体C
Figure A20048003905900581
将2-氯三苯甲基树脂(300mg，0.42mmol)在DCM(2mL)中预膨胀1小时。排去树脂中的液体，加入Boc-D-赖氨酸(Fmoc)-OH(394mg，0.84mmol)和DIEA(0.586mL，3.36mmol)的DCM(2mL)溶液，将反应混合物振摇1小时。然后加入另一份DIEA(0.293mL，1.68mmol)，再将树脂振摇1小时。加入甲醇(1mL)将任何未反应的树脂封端，再将反应混合物振摇1小时。将树脂过滤，用DMF(2×5mL)、DCM(2×5mL)和DMF(2×5mL)洗涤。然后将树脂用下述条件进行Fmoc-固相肽合成(SPPS)：
(iii)Fmoc脱保护：20％哌啶的DMF(4mL)20分钟，然后用DMF(4×5mL)、DCM(4×5mL)和DMF(4×5mL)洗涤。
(iv)偶联条件：在所有偶联反应中，将偶联试剂加入到Fmoc-氨基酸中。将该溶液加入到树脂中，然后加入DIEA。(a)Fmoc-色氨酸(Boc)-OH(0.885g，1.68mmol)、HBTU(0.5M溶液，3.36mL)和DIEA(0.293mL，1.68mmol)1小时。(b)Fmoc-N-甲基-亮氨酸-OH(0.617g，1.68mmol)、HBTU(0.5M溶液，3.36mL)和DIEA(0.293mL，1.68mmol)1小时。(c)Fmoc-亮氨酸-OH(0.594g，1.68mmol)、HATU(0.5M，0.639g，1.68mmol的3.36mLDMF溶液)和DIEA(0.293mL，1.68mmol)2小时。(d)Fmoc-丙氨酸-OH(0.523g，1.68mmol)、HBTU(0.5M溶液，3.36mL)和DIEA(0.293mL，1.68mmol)1小时。所有偶联反应后，将树脂过滤，用DMF(4×5ml)、DCM(4×5mL)和DMF(4×5mL)洗涤。除了(c)，所有的偶联反应都用茚三酮试验监测，偶联(c)用溴酚蓝试验监测。
Fmoc脱保护之后用DMF(4×5ml)、DCM(4×5mL)和DMF(4×5mL)充分洗涤，用2％TFA的DCM(150mL)溶液通过快速流动洗涤到250mL水中，将线形肽从树脂上切下。真空除去DCM，将所得溶液冷冻干燥。所得胶状物重新悬浮于1∶1 MeCN∶H2O(100mL)，冷冻干燥，得到粗品中间体C(265mg，0.276mmol，65.9％，以2-氯三苯甲基树脂计)。
b)中间体A的合成
中间体A
Figure A20048003905900591
将粗品中间体C(0.401g，0.419mmol)和DIEA(0.438mL，1.26mmol)的DMF(208mL)溶液滴加到搅拌的PyBOP(1.09g，2.10mmol)和DIEA(0.146mL，0.838mmol)的DMF(208mL)溶液中。所得溶液在室温下搅拌18小时，浓缩至干，并分配于EtOAc(100mL)和水(100mL)之间。有机相用水(3×100mL)洗涤几次，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩至干。粗产物用90∶9∶1(TFA∶TIS[b1]∶DCM)溶液处理2小时，浓缩至干，用反相HPLC(95∶5H2O(1％TFA)∶MeCN(1％TFA)→3∶2H2O(1％TFA)∶MeCN(1％TFA)纯化，在60分钟内洗脱，得到中间体A(0.167g，0.226mmol，53.9％)。
化合物13
化合物13的合成
化合物13用类似于化合物1的步骤合成，从中间体A和N2-[(苄基氧基)羰基]-N5-(叔-丁氧基羰基)鸟氨酸开始。HRMS C39H61N9O8822.4280(M+H)+，实测值822.4262。
化合物14
Figure A20048003905900602
化合物14的合成
化合物14用类似于化合物1的步骤合成，从中间体A和N6-(叔-丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁基酯开始。
1H NMR(500MHz，CD3OD)：□8.98(d，1H)，8.71(d，1H)，7.95(dd，1H)，7.79(d，1H)，7.64(d，1H)，7.31(d，1H)，7.08(t，1H)，7.01(t，1H)，6.78(s，1H)，5.00-4.88(m，2H)，4.78-4.70(m，1H)，4.36-4.23(m，2H)，4.19-4.13(m，1H)，3.88-3.77(m，1H)，3.55(dd，1H)，3.04-2.86(m，4H)，2.03-1.88(m，3H)，1.85(s，3H)，1.84-1.66(m，6H)，1.66-1.57(m，3H)，1.52(d，3H)，1.56-1.44(m，3H)，1.42-130(m，3H)，1.04(two d，6H)，0.95(two d，6H).HRMS(ESI)计算值C40H64N9O8798.4878(M+H)+，实测值798.4858。
化合物15
化合物15的合成
化合物15用类似于化合物1的步骤合成，从中间体A和3-{6-[(叔-丁氧基羰基)氨基]吡啶-3-基}丙氨酸(WO 01/02364)开始。HRMSC42H61N10O8 833.4674(M+H)+，实测值833.4678。
化合物16
化合物16的合成
a)中间体B的合成
中间体B用类似于中间体A的步骤合成。
中间体B
Figure A20048003905900621
b)化合物16的合成
化合物16根据化合物1的步骤合成，从中间体B开始。
1H NMR(500MHz，d6-DMSO)：12.70(宽s 1H)，10.83(s，1H)，8.86(d，1H)，8.47(d，1H)，7.70-7.79(m，3H)，7.57(t，1H)，7.46(d，1H)，7.45(dd，1H)，7.35(d，1H)，7.28(d，1H)，7.02(dd，1H)，6.96(dd，1H)，6.81(宽s，1H)，6.47(d，1H)，6.46(d，1H)，4.82(m，1H)，4.74-4.75(ddd，1H)，4.43(ddd，1H)，4.22-4.24(m，1H)，4.13(ddd，1H)，4.02(ddd，1H)，3.78(dd，1H)，3.71(dd，1H)，3.60(m，1H)，3.35(m，1H)，3.11(dt，2H)，2.86-2.92(m，1H)，2.78-2.80(m，1H)，1.83(s，3H)，1.79-1.83(m，1H)，1.52-1.56(m，1H)，1.57-1.60(m，1H)，1.60-1.64(m，3H)，1.69-1.70(m，1H)，1.42-1.48(m，5H)，1.33-1.36(m，1H)，1.22-1.25(m，2H)，1.18-1.20(m，1H)，0.95(d，3H)，0.91(d，3H)，0.89(d，3H)，0.85(d，3H).HRMSC40H64N11O9 842.4888(M+H)+，实测值842.4885.
化合物16可选择的合成方法
式B的中间体也可用下述路线制备。
中间体D：[b2]的合成
中间体D
将2-氯三苯甲基树脂(1g，1.4mmol)在DCM(5mL)中预膨胀1小时。排出树脂中的液体，加入Boc-D-赖氨酸(Fmoc)-OH(1.31g，2.8mmol)和DIEA(1.45g，1.98mL，11.2mmol)的DCM(4mL)溶液，将反应混合物振摇2小时。加入甲醇(1mL)将任何未反应的树脂封端，再将反应混合物振摇1小时。过滤树脂，用DMF(2×5mL)、DCM(2×5mL)和DMF(2×5mL)洗涤。然后将树脂用下述条件进行Fmoc-固相肽合成(SPPS)：
(i)Fmoc脱保护：20％哌啶的DMF(4mL)20分钟，然后用DMF(4×5mL)、DCM(4×5mL)和DMF(4×5mL)洗涤。
(ii)偶联条件：在所有偶联反应中，将偶联试剂的DMF溶液加入到Fmoc-氨基酸中。将该溶液加入到树脂中，然后加入DIEA。(a)Fmoc-色氨酸(Boc)-OH(0.912g，1.732mmol)、HBTU(0.5M solution，3.46mL)和DIEA(0.301mL，1.732mmol)1小时。(b)Fmoc-N-甲基-亮氨酸-OH(0.637g，1.732mmol)、HBTU(0.5M溶液，3.46mL)和DIEA(0.301mL，1.732mmol)1小时。(c)Fmoc-亮氨酸-OH(0.612g，1.732mmol)、HATU(0.5M，0.658g，1.732mmol的3.5mL DMF溶液)和DIEA(0.301mL，1.732mmol)2小时。(d)Fmoc-Ser(tBu)-OH(0.664g，1.732mmol)、HBTU(0.5M溶液，3.46mL)和DIEA(0.301mL，1.732mmol)1小时。所有的偶联反应之后，将树脂过滤，用DMF(4×5ml)、DCM(4×5mL)和DMF(4×5mL)洗涤。除了(c)，所有的偶联反应用茚三酮试验监测，偶联(c)用溴酚蓝试验监测。
Fmoc脱保护后，用DMF(4×5ml)、DCM(4×5mL)和DMF(4×5mL)彻底洗涤，用2％TFA的DCM(400mL)溶液通过快速流动洗涤到500mL水中，将线形肽从树脂上切下。真空除去DCM，将所得溶液冷冻干燥。将所得胶状物重悬浮于1∶1MeCN∶H2O(100mL)，冷冻干燥得到中间体D粗品(994.6mg，0.88mmol，63％，以2-氯三苯甲基树脂计)。
中间体B的合成：
中间体B
将粗品中间体D(905mg，0.88mmol)和DIEA(0.304mL，1.74mmol)溶于DMF(440mL)，在搅拌下滴加PyBOP(2.13g，4.1mmol)和DIEA(0.918mL，5.3mmol)的DMF(440mL)溶液。滴加完后，将所得溶液在室温下搅拌20小时，然后浓缩至干，得到橙色胶状物，将该胶状物用Sephadex LH-20(MeOH)纯化，得到受保护的环形肽(551mg，70％)。然后将受保护的环形肽粗品用95∶2.5∶2.5(TFA∶TIS∶DCM)溶液处理20小时。将该反应混合物浓缩至干，用反相HPLC(95∶5H2O(1％TFA)∶MeCN(1％TFA)→3∶2H2O(1％TFA)∶MeCN(1％TFA)在60分钟内洗脱，得到中间体B(214mg，32％，已中间体D计)。
实施例5
Dirk Hendriks，Simon Scharpé和Marc van Sande，Clinical Chemistry，31，1936-1939(1985)中的测定方法描述了一些实施例的活性，底物浓度为4mM，列于下面的表I中：
        表I
  化合物No.   IC50
  2   0.1μM
  8   2.5μM
  12   0.2μM
                      缩写
EtOAc＝乙酸乙酯                   TFA＝三氟乙酸
DCCC＝液滴逆流色谱法               DCM＝二氯甲烷
MeOH＝甲醇                       MeCN＝乙腈
Leu＝亮氨酸                        Ala＝丙氨酸
DMSO＝二甲亚砜                     Arg＝精氨酸
Trp＝色氨酸                        TIS＝三异丙基甲硅烷
HPLC＝高压液相色谱法
RPHPLC＝反相高压液相色谱法
Boc＝叔-丁氧基羰基
Fmoc＝(9H-芴-9-基甲氧基)羰基
gHMBC＝梯度异核多键相关(gradient heteronuclear multiple bondcorrelation)
gCOSY＝梯度相关光谱(gradient correlated spectroscopy)
gHSQC＝梯度异核单量子相干(gradient heteronuclear single quantumcoherence)
CPC＝离心分配色谱法
DIEA＝二异丙基乙基胺
HATU＝O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐
HBTU＝O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐
THF＝四氢呋喃
DMF＝N，N-二甲基甲酰胺
Lys＝赖氨酸
PyBOP＝(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基六氟磷酸盐
PyBrOP＝溴-三吡咯烷基六氟磷酸盐
TIPS＝三异丙基甲硅烷

Claims (21)

1.一种式(I)的化合物或其药学可接受盐或溶剂合物，或其盐的溶剂合物在制备治疗或预防其中抑制羧肽酶U对其有益的病症的药物的方法中的用途，
其中：
X为(CH2)mY(CH2)n；
m和n独立为1、2、3、4、5或6；条件是m+n不超过6；
Y为键、O、S(O)p或S-S；
R1为CO2R15或羧酸电子等排体，如S(O)2OH、S(O)2NHR15、PO(OR15)OH、PO(OR15)NH2、B(OR15)2、PO(R15)OH、PO(R15)NH2或四唑；
R2、R3、R4、R5和R6独立为氢、C1-6烷基(任选被卤素、羟基、氰基、SH、S(O)3H、S(O)q(C1-6烷基)、OC(O)(C1-4烷基)、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、COOH、CONH2、CONH(C1-6烷基)、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)、C3-6环烷基(C1-4)烷基(其中该环烷基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)、杂环基(C1-4)烷基(其中该杂环基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)、苯基(C1-4)烷基(其中该苯基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)或杂芳基(C1-4)烷基(其中该杂芳基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)；
p和q独立为0、1或2；
R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13独立为H或C1-4烷基；
R14为H或C1-4烷基；和，
R15为H或C1-4烷基。
2.一种式(I)的化合物或其药学可接受盐或溶剂合物，或其盐的溶剂合物：
Figure A2004800390590003C1
其中：
X为(CH2)4；
R1为CO2R15；
R2为末端被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的直链C1-6烷基；被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的C3-6环烷基；包含至少一个氮原子的杂环基；被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的无氮杂环基；被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的杂芳基；被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的苯基；被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的杂芳基(C1-4)烷基；被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的苯基(C1-4)烷基；或被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的C3-6环烷基(C1-4)烷基；上述所有环任选被一个或多个卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基或OCF3进一步取代；
R3、R4、R5和R6之一独立为氢、杂芳基(C1-4)烷基(其中该杂芳基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)；其它独立为氢、C1-6烷基(任选被卤素、羟基、氰基、SH、S(O)3H、S(O)q(C1-6烷基)、OC(O)(C1-4烷基)、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、COOH、CONH2、CONH(C1-6烷基)、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)、C3-6环烷基(C1-4)烷基(其中该环烷基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)、杂环基(C1-4)烷基(其中该杂环基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)、苯基(C1-4)烷基(其中该苯基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)或杂芳基(C1-4)烷基(其中该杂芳基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)；
p和q独立为0、1或2；
R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13独立为H或C1-4烷基；
R14为H或C1-4烷基；和，
R15为H或G1-4烷基。
3.权利要求2的式(I)的化合物或其药学可接受盐或溶剂合物，或其盐的溶剂合物，其中：
X为(CH2)4；
R1为CO2R15；
R2为末端被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的直链C1-6烷基；被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的C3-6环烷基；包含至少一个氮原子的杂环基；被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的无氮杂环基；被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的杂芳基；被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的苯基；被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的杂芳基(C1-4)烷基；被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的苯基(C1-4)烷基或被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的C3-6环烷基(C1-4)烷基；上述所有环任选被一个或多个卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基或OCF3进一步取代；
R3、R4、R5和R6之一独立为氢、杂芳基(C1-4)烷基(其中该杂芳基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)；其它独立为氢、C1-6烷基(任选被卤素、羟基、氰基、SH、S(O)3H、S(O)q(C1-6烷基)、OC(O)(C1-4烷基)、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、COOH、CONH2、CONH(C1-6烷基)、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)、C3-6环烷基(C1-4)烷基(其中该环烷基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)、杂环基(C1-4)烷基(其中该杂环基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)、苯基(C1-4)烷基(其中该苯基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)或杂芳基(C1-4)烷基(其中该杂芳基环任选被卤素、羟基、氰基、C1-4烷基、CF3、C1-4烷氧基、OCF3、NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代)；
p和q独立为0、1或2；
R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13独立为H或C1-4烷基；
R14为H或C1-4烷基；和，
R15为H或C1-4烷基。
4.权利要求2或3的式(I)的化合物或其药学可接受盐或溶剂合物，或其盐的溶剂合物，其中：
R1为CO2R15；
R2为末端被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的直链C1-6烷基；C4烷基(如CH(CH3)CH2CH3或CH2CH(CH3)2)或(氨基吡啶基)甲基(如(6-氨基吡啶-3-基)甲基)；
R3和R4之一为任选被卤素或羟基取代的(吲哚-3-基)CH2；其它为苄基(任选被卤素或羟基取代)或C4烷基(如CH(CH3)CH2CH3或CH2CH(CH3)2)；
或R3和R4都为甲基；
R5和R6独立为C1-6烷基(如CH3、CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3或CH2CH(CH3)2)；
R7、R8、R9、R11、R12、R13和R14为H；
R10为C1-4烷基；和，
R15为H或C1-4烷基。
5.权利要求2-4中任一项的化合物，其中X为(CH2)4。
6.权利要求2-5中任一项的化合物，其中R1为CO2R15，其中R15为H或C1-4烷基。
7.权利要求2-6中任一项的化合物，其中R2为末端被NH2、CNH(NH2)或NHCNH(NH2)取代的直链C1-6烷基；C4烷基(如CH(CH3)CH2CH3或CH2CH(CH3)2)或(氨基吡啶基)甲基。
8.权利要求2-4中任一项的化合物，其中R2为C1-6烷基(CH(CH3)CH2CH3或CH2CH(CH3)2)、苄基或末端被NH2、CNH(NH2)、NHCNH(NH2)或(6-氨基吡啶-3-基)甲基取代的直链C1-6烷基。
9.权利要求2-8中任一项的化合物，其中R2为末端被NH2、CNH(NH2)、NHCNH(NH2)或(6-氨基吡啶-3-基)甲基取代的直链C1-6烷基。
10.权利要求2中任一项的化合物，其中R3为CH2吲哚基(其中该吲哚任选被一个或多个卤素或羟基取代、C1-4烷基或苄基(任选被卤素或羟基取代)。
11.权利要求2-10中任一项的化合物，其中R4为CH2吲哚基(其中该吲哚基任选被一个或多个卤素或羟基取代、C1-6烷基(CH(CH3)CH2CH3或CH2CH(CH3)2)或苄基(任选被卤素或羟基取代。
12.权利要求2-11中任一项的化合物，其中R5和R6独立为C1-6烷基(如甲基、异丙基、CH(CH3)CH2CH3或CH2CH(CH3)2)。
13.权利要求2-12中任一项的化合物，其中R7、R8、R9、R11、R12、R13和R14都为H。
14.权利要求2-4中任一项的化合物，其中R10为C1-4烷基。
15.权利要求2的化合物，其为下式的化合物或其药学可接受盐或溶剂合物，或其药学可接受盐的溶剂合物：
Figure A2004800390590007C1
其中
R3a为H，R3b为H且R15为H；
R3a为OH，R3b为Cl且R15为H；
R3a为OH，R3b为Cl且R15为CH3；
R3a为H，R3b为H且R15为CH3；
R3a为H，R3b为Cl且R15为H；
16.权利要求2-15中任一项的式(I)的化合物或其药学可接受盐或溶剂合物，或其盐的溶剂合物在制备治疗或预防其中抑制羧肽酶U对其有益的病症的药物的方法中的用途。
17.权利要求16的用途，所述用途为生产用于治疗或预防血栓症和/或血液和/或组织中的血凝过快；动脉粥样硬化；纤维变性病症；炎症性疾病；或从保持或加强哺乳动物(如人)体内的缓激肽水平中受益的病症的药物。
18.一种药用制剂，所述制剂包含作为活性成份的权利要求2-15中任一项的式(I)化合物或其药学可接受盐或溶剂合物或其盐的溶剂合物，以及辅助剂、稀释剂或载体。
19.一种具下式的化合物
其中R3-R12和X如权利要求1-14中任一项所定义。
20.一种制备权利要求19的化合物的方法，所述方法包括用肽偶联剂在非亲核性碱的存在下，在极性非质子溶剂中处理其中PG1为合适的保护基团的式VI的化合物，然后除去保护基团
Figure A2004800390590012C2
21.一种制备权利要求2-17中任一项的式I化合物的方法，所述方法包括将如权利要求19中所定义的式VII的化合物与式VIII的化合物反应
其中Y为活化的酯或NY为异氰酸酯基团。
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