CN1242708A - 用于治疗前列腺癌的偶联物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了含有寡肽和已知细胞毒试剂的化学偶联物,其中所述的寡肽含被游离前列腺特异性抗原(PSA)以选择性蛋白水解的方式裂解的氨基酸序列。这些偶联物用于治疗前列腺癌和良性前列腺增生。
Description
发明背景
1994年，预计在美国有200,000位男性被诊断患有前列腺癌，并且有38,000美国男性会死于此疾病(Garnick，M.B.(1994).前列腺癌的难题-《美国科学》(The Dilemmas of Prostate Cancer.ScientificAmerican)，4月：72-81)。因此，前列腺癌是美国男性中发病率最高的恶性肿瘤(除皮肤癌外)并且是与癌症有关的死亡率排在第二位的原因(第一位为肺癌)。
前列腺特异性抗原(PSA)是单链33 kDa糖蛋白，它几乎完全由人前列腺上皮产生，在人精液中其浓度为0.5至2.0mg/ml(Nadji，M.，Taber，S.Z.，Castro，A.等，(1981)《癌症》(Cancer)48：1229；Papsidero，L.，Kuriyama，M.，Wang，M.等，(1981).JNCI 66：37；Qui，S.D.，Young，C.Y.F.，Bihartz，D.L.等，(1990)，《泌尿科学杂志》(J.Urol.)144：1550；Wang，M.C.，Valenzuela，L.A.，Murphy，G.P.等，(1979).《泌尿科学研究》(Invest.Urol.)17：159)。此单个碳水化合物单元连接在第45号天冬酰胺残基上并占总分子量的2至3kDa。PSA是具有胰凝乳蛋白酶样特异性的蛋白酶(Christensson，A.，Laurell，C.B.，Lilja，H.(1990).《欧洲生物化学杂志》(Eur.J.Biochem.)194：755-763)。现已表明，通过对精液诱捕凝胶：精液凝胶I(Semenogelin I)、精液凝胶II(Semenogelin II)和纤连蛋白中主要代表的蛋白水解作用，PSA主要负责射精时形成的凝胶结构的分解(Lilja，H.(1985).《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)76：1899；Lilja，H.，Oldbring，J.，Rannevik，G.等，(1987).《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)80：281；McGee，R.S.，Herr，J.C.(1988).《生物生殖》(Biol.Reprod.)39：499)。对凝胶形成蛋白的PSA介导的蛋白水解产生几种可溶解的精液凝胶I和精液凝胶II片段和可溶解的纤连蛋白片段，同时将精液液化并释放有活力的精子(Lilja，H.，Laurell，C.B.(1984).《斯堪的纳维亚临床实验室研究杂志》(Scand.J.Clin.Lab.Invest.)44：447；McGee，R.S.，Herr，J.C.(1987).《生物生殖》(Biol.Reprod.)37：431)。此外，PSA可以蛋白水解的方式降解IGFBP-3(胰岛素样生长因子结合蛋白3)使IGF特异性刺激PSA分泌细胞的生长(Cohen等，(1992)《临床内分泌学和超生物学杂志》(J.Clin.Endo.& Meta.)75：1046-1053)。
与α1-抗凝乳蛋白酶复合的PSA是血清PSA的主要分子形式并可能占被检测血清PSA的95％或95％以下(Christensson，A.，Bjork，T.，Nilsson，O.等，(1993).《泌尿科学杂志》(J.Urol.)150：100-105；Lilja，H.，Christensson，A.，Dahlen，U.(1991).《临床化学》(Clin.Chem.) 37：1618-1625；Stenman，U.H.，Leinoven，J.，Alfthan，H.等，(1991).《癌症研究》(Cancer Res.)51：222-226)。推断前列腺组织(正常、良性增生或恶性组织)主要释放成熟的、具有酶活性的PSA，因为此形式是与α1-抗凝乳蛋白酶复合物需要的(Mast，A.E.，Enghild，J.J.，Pizzo，S.V.等，(1991).《生物化学》(Biochemistry)30：1723-1730；Perlmutter，D.H.，Glover，G.I.，Rivetna，M.等，(1990).《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87：3753-3757)。因此，确信在前列腺PSA分泌细胞的微环境中，在其成熟的具有酶活性的形式而不是与任何抑制分子复合的形式处理并分泌PSA。PSA还与α2-巨球蛋白形成稳定的复合物，但是作为在PSA包封和PSA表位完全缺失的结果，此复合物形成在体内的显著性尚不清楚。游离的、非复合形式的PSA构成了血清PSA的一小部分(Christensson，A.，Bjork，T.，Nilsson，O.等，(1993).《泌尿科学杂志》(J.Urol.)150：100-105；Lilja，H.，Christensson，A.，Dahlen，U.(1991).《临床化学》(Clin.Chem.)37：1618-1625)。在血清PSA中的此形式与其在精液PSA中的形式相似(Lilja，H.，Christensson，A.，Dahlen，U.(1991).《临床化学》(Clin.Chem.)37：1618-1625)，但是还不知道血清PSA的游离形式可能是酶原、成熟PSA的内在裂解的灭活形式、还是具有酶活性的PSA。然而，与检测的PSA游离33kDa形式的血清浓度比较，它似乎与表现有酶活性的血清PSA的游离形式不同，因为其中有摩尔量过量很大(100至1000倍)的未反应α1-抗凝乳蛋白酶和α2-巨球蛋白(Christensson，A.，Bjork，T.，Nilsson，O.等，(1993).《泌尿科学杂志》(J.Urol.)150：100-105；Lilja，H.，Christensson，A.，Dahlen，U.(1991).《临床化学》(Clin.Chem.)37：1618-1625)。
PSA的血清检测有利于监控前列腺腺癌的治疗(Duffy，M.S.(1989).《临床生物化学年鉴》(Ann.Clin.Biochem.)26：379-387；Brawer，M.K.和Lange，P.H.(1989).《泌尿科学增刊》(Urol.Suppl.)5：11-16；Hara，M.和Kimura，H.(1989).《临床实验室药物杂志》(J.Lab.Clin.Med.)113：541-548)，虽然上述正常血清浓度的PSA也见于良性前列腺增生和前列腺手术创伤后(Lilja，H.，Christensson，A.，Dahlen，U.(1991).(Clin.Chem)37：1618-1625)。由于在表现有广泛转移前列腺癌的前列腺切除患者体内检测到高浓度的血清PSA，故还已知前列腺转移瘤分泌具有免疫活性的PSA(Ford，T.F.，Butcher，D.N.，Masters，R.W.等，(1985).《英国泌尿科学杂志》(Brit.J.Urology)57：50-55)。因此，可被PSA蛋白水解活性灭活的细胞毒化合物可能是前列腺细胞特异性和分泌PSA的前列腺转移瘤特异性的。
本发明的目的是提供新的、用于治疗前列腺癌的抗癌组合物，其中含有寡肽，该寡肽被游离的前列腺特异性抗原(PSA)以选择性蛋白水解的方式裂解，并且其中包括一种环氨基酸，该氨基酸具有亲水取代基，并与细胞毒试剂轭合。
本发明的另一目的是提供治疗前列腺癌的方法，包括使用此新的抗癌组合物。
发明概述
本发明公开了含有寡肽和已知细胞毒试剂的化学偶联物，其中寡肽被游离的前列腺特异性抗原(PSA)以选择性蛋白水解的方式裂解，并且其中包括一种环氨基酸，该氨基酸具有亲水取代基。这种偶联物可用于治疗前列腺癌和良性前列腺增生(BPH)。
发明详述
本发明涉及用于治疗前列腺癌的、新的抗癌组合物。这种组合物含有与细胞毒试剂直接共价键合或通过化学连接剂键合的寡肽。该寡肽选自被游离前列腺特异性抗原(PSA)选择性识别的并通过此游离前列腺特异性抗原的酶活性以蛋白水解的方式裂解的寡聚体。寡肽和细胞毒试剂的如此结合可命名为偶联物。
本发明的偶联物的特征还在于将带有亲水取代基的环氨基酸作为一部分加入该寡肽中，所述环氨基酸对此偶联物的水溶性有贡献。这种亲水环氨基酸的例子包括但不限于羟基化的、多羟基化的及烷氧基化的脯氨酸和2-哌啶酸部分。
理想的是，当此含有PSA蛋白水解裂解位点的寡肽与细胞毒试剂直接键合或通过化学连接剂键合而完整时，此细胞毒试剂的细胞毒活性大大降低或消失。同样理想的是，当键合的寡肽在裂解位点被蛋白水解裂解时，该细胞毒试剂的细胞毒活性显著增加或回到未修饰的细胞毒试剂原来的细胞毒活性。
此外，优选此寡肽选自与游离的具有酶活性的PSA存在下寡肽裂解相比，在非PSA蛋白水解酶存在下不裂解或以非常低的速率裂解的寡肽。
基于上述原因，要求此寡肽含有短的肽序列，优选少于10个氨基酸。最优选此寡肽含有7个或6个氨基酸。因为此接合物优选含有短的氨基酸序列，故通常细胞毒试剂组份的疏水性可能对此偶联物的溶解度影响极大。因此，选择本偶联物的环氨基酸上的亲水取代基来抵消或减小细胞毒试剂带来的这种疏水性。
虽然对实施本发明的此方面内容不是必需的，但是本发明优选的实施方案是偶联物，其中寡肽和化学连接剂(如果存在)通过游离PSA的蛋白水解活性及附近组织存在的任何天然蛋白水解酶的蛋白水解活性与细胞毒试剂分离，因此使细胞毒试剂、或仍是寡肽/连接剂单元的一部分但是保留细胞毒作用的细胞毒试剂进入蛋白水解裂解的生理环境。还包括此偶联物的药用盐。
应理解与细胞毒试剂轭合的此寡肽，不论通过直接共价键合或通过化学连接剂，不需要是被游离PSA最大限度识别并最易被游离PSA蛋白水解裂解的寡肽。因此，选择加入这种抗癌组合物中的此寡肽时，要考虑其被游离PSA选择性蛋白水解裂解和由这类裂解产生的细胞毒试剂-蛋白水解残基偶联物的细胞毒活性(或对未修饰细胞毒试剂来说理想的情况)。与蛋白水解PSA裂解有关的术语“选择性”指相对于含随机序列氨基酸的寡肽来说，游离PSA对本发明的寡肽组份的裂解速率大得多。因此，本发明的寡肽组份是游离PSA的优选底物。术语“选择性”还指此寡肽被游离PSA在此寡肽的两个特定氨基酸之间以蛋白水解的方式裂解。
本发明的此寡肽组份被游离前列腺特异性抗原(PSA)选择性识别并被此游离前列腺特异性抗原的酶活性蛋白水解裂解。这些寡肽包括选自如下的寡聚体：
a)HaaXaaSerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.：1)；
b)HaaTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.：2)；
c)HaaXaaLysTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.：3)；
d)HaaXaaLysTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.：4)；
e)HaaXaahArgTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.：5)；
f)HaaXaahArgChaGln|SerSer (SEQ.ID.NO.：6)；
g)HaaXaaSerTyrGln|SerXaa (SEQ.ID.NO.：7)；
h)HaaTyrGln|SerXaa (SEQ.ID.NO.：8)；
i)HaaXaaSerChgGln|SerXaa (SEQ.ID.NO.：9)；
j)HaaChgGln|SerXaa (SEQ.ID.NO.：10)；
其中Haa是被亲水部分取代的环氨基酸，Xaa是任何氨基酸，hArg是高精氨酸，Cha是环己基丙氨酸而Chg是环己基甘氨酸。
在本发明的一个实施方案中，此寡肽包括选自如下的寡聚体：
a)HaaTyrGln|SerSerSerLeu (SEQ.ID.NO.：11)，
b)HaaXaaSerTyrGln|SerAla (SEQ.ID.NO.：12)，
c)AlaHaaXaaSerTyrTyr|Ser (SEQ.ID.NO.：13)，
d)AlaAsnHaaXaaSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.：14)，
e)HaaXaaSerTyrGln|SerSerThr (SEQ.ID.NO.：15)，
f)HaaTyrGln|SerSerThr (SEQ.ID.NO.：16)，
g)HaaXaaSerTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.：17)，
h)HaaTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.：18)，
i)HaaXaaLysTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.：19)，
j)HaaXaahArgTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.：20)，
k)HaaXaaSerTyrGln|SerSerLeu (SEQ.ID.NO.：21)；
l)HaaTyrGln|SerSerLeu (SEQ.ID.NO.：22)；
m)HaaXaaSerTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：23)；
n)HaaTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：24)；
p)HaaXaaSerTyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.：25)；
q)HaaTyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.：26)；
r)HaaXaaSerTyrGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.：27)；
s)HaaTyrGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.：28)；
t)HaaXaaSerChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：29)；
u)HaaChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：30)；
v)HaaXaaSerChgGln|SerNle (SEQ.ID.NO.：31)；
w)HaaChgGln|SerNle (SEQ.ID.NO.：32)；
x)HaaXaaSerChgGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.：33)；
y)HaaChgGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.：34)；
z)hArgChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：35)；and
aa)hArgTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：36).在本发明的更优选的实施方案中，此寡肽包括选自如下的寡聚体：
a)4-HypXaaSerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.：37)，
b)4-HypXaaSerTrGln|SerAla (SEQ.ID.NO.：38)，
c)Ala-4-HypXaaSerTyrTyr|Ser (SEQ.ID.NO.：39)，
d)AlaAsn4-HypXaaSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.：40)，
e)4-HypXaaSerTyrGln|SerSerThr (SEQ.ID.NO.：41)，
f)4-HypTyrGln|SerSerThr (SEQ.ID.NO.：42)，
g)4-HypXaaSerTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.：43)，
h)4-HypTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.：44)，
i)4-HypXaaLysTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.：45)，
j)4-HypXaahArgTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.：46)，
k)4-HypXaaSerTyrGln|SerSerLeu (SEQ.ID.NO.：47)；
l)4-HypTyrGln|SerSerLeu (SEQ.ID.NO.：48)；
m)4-HypXaaSerTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：49)；
n)4-HypTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：50)；
p)4-HypXaaSerTyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.：51)；
q)4-HypTyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.：52)；
r)4-HypXaaSerTyrGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.：53)；
s)4-HypTyrGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.：54)；
t)4-HypXaaSerChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：55)；
u)4-HypChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：56)；
v)4-HypXaaSerChgGln|SerNle (SEQ.ID.NO.：57)；
w)4-HypChgGln|SerNle (SEQ.ID.NO.：58)；
x)4-HypXaaSerChgGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.：59)；
y)4-HypChgGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.：60)；
其中4-Hyp是4-羟基脯氨酸，Xaa是任何氨基酸，hArg是高精氨酸，Cha是环己基丙氨酸而Chg是环己基甘氨酸。
在更优选的实施方案中，优选Xaa选自Ala、Ser和Ile。
上文及本发明详述中使用的术语“含氨基酸序列的寡聚体”描述了含约3至约100个氨基酸残基的寡聚体，在其氨基酸序列中包括所述特异性氨基酸序列并因此被游离的PSA在所述氨基酸序列内以蛋白水解的方式被裂解。优选此寡聚体含有5至10个氨基酸残基。因此，例如，下面的寡聚体：
hArgSer4-HypChgGln|SerLeu(SEQ.ID.NO：61)；
含有氨基酸序列：
4-HypChgGln|SerLeu(SEQ.ID.NO：56)；
并因此包括在本发明中。
肽化学领域的普通技术人员会容易地鉴别生物活性寡肽中的某种氨基酸可被其它同系的、同配的和/或等电子的氨基酸取代，其中原寡肽的生物活性在修饰的寡肽中得到保留。某些非天然的和经修饰的天然氨基酸也可用来代替本发明寡肽中的相应天然氨基酸。因此，例如，酪氨酸可被3-碘代酪氨酸、2-甲基酪氨酸、3-氟酪氨酸、3-甲基酪氨酸等代替。在如赖氨酸可以被N′-(2-咪唑基)赖氨酸等代替。下表中氨基酸替换只是举例而非限制：
原氨基酸 替换氨基酸
Ala Gly
Arg Lys，鸟氨酸
Asn Gln
Asp Glu
Glu Asp
Gln Asn
Gly Ala
Ile Val，Leu，Met，Nle
Leu Ile，Val，Met，Nle
Lys Arg，鸟氨酸
Met Leu，Ile，Nle，Val
鸟氨酸 Lys，Arg
Phe Tyr，Trp
Ser Thr
Thr Ser
Trp Phe，Tyr
Tyr Phe，Trp
Val Leu，Ile，Met，Nle
因此，例如，下列寡肽可通过本领域普通技术人员熟知的技术合成并当加入本发明偶联物时预计被游离PSA以蛋白水解的方式裂解：
Asn4-HypIleSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.：62)
Asn4-HypValSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.：63)
4-HypAlaSerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.：64)
(3，4-二羟脯氨酸)AlaSerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.：65)
3-羟脯氨酸 SerChgGln|Ser (SEQ.ID.NO.：66)
4-HypAlaSerChgGln|SerSer (SEQ.ID.NO.：67).
氨基酸序列中包括的符号“|”表示此寡肽被游离PSA以蛋白水解的方式裂解在该序列中的位置。
本发明的化合物可具有不对称中心并存在外消旋体、外消旋混合物和单个非对映异构体，所有可能的异构体、包括旋光异构体均包括在本发明中。除非特别说明，将所谓氨基酸理解为天然“L”立体构型。
本说明书中使用的缩写如下，此表指出了氨基酸和其部分：
hR或hArg： 高精氨酸
hY或hTyr： 高酪氨酸
Cha： 环己基丙氨酸
Amf： 4-氨基甲基苯丙氨酸
DPL： 2-(4，6-二甲基嘧啶基)赖氨酸
(咪唑基)K： N′-(2-咪唑基)赖氨酸
Me2PO3-Y： O-二甲基磷酸酪氨酸
O-Me-Y： O-甲基酪氨酸
TIC： 1，2，3，4-四氢-3-异喹啉甲酸
DAP： 1，3-二氨基丙烷
TFA： 三氟乙酸
AA： 乙酸
3PAL： 3-吡啶基丙氨酸
4-Hyp： 4-羟基脯氨酸
Abu： α-氨基丁酸
Thi 噻吩基丙氨酸
本领域熟知，并在本发明中可理解，如本发明寡肽-细胞毒试剂偶联物的肽基治疗剂优选任何寡肽取代基的末端氨基部分被适宜的保护基保护，例如，乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基等。对末端氨基的这种保护降低或消除了此肽基治疗剂由于温血动物血浆中存在的氨基肽酶作用而发生的酶降解。
这种保护基还包括亲水保护基团，根据亲水官能度的存在对其进行选择。增加此偶联物亲水性并因此增加此偶联物的水溶性的保护基包括但不限于羟基化的链烷酰基、多羟基化的链烷酰基、羟基化的芳酰基、多羟基化的芳酰基、聚乙二醇、糖基化物(glycosylate)、糖和冠醚。N-末端非天然氨基酸部分也可通过氨基肽酶改善这种酶降解。
优选N-末端保护基选自：
a)乙酰基；其中：
R1和R2独立地选自：
a)氢原子，
b)未被取代或取代的芳基、未被取代或取代的杂环、C3-C10环烷基、C2-C6链烯基、C2-C6链炔基、卤素、C1-C6全氟烷基、R3O-、R3-C(O)NR3-、(R3)2NC(O)-、R3 2N-C(NR3)-、R4S(O)mNH、CN、NO2、R3C(O)-、N3、-N(R3)2或R4OC(O)NR3-，
c)未被取代的C1-C6烷基，
d)取代的C1-C6烷基，其中在取代的C1-C6烷基上的取代基选自未被取代或取代的芳基、未被取代或取代的杂环、C3-C10环烷基、C2-C6链烯基、C2-C6链炔基、R3O-、R4S(O)mNH、R3-C(O)NR3、(R3)2NC(O)-、R3 2N-C(NR3)-、CN、R3C(O)-、N3、-N(R3)2或R4OC(O)NR3-；或
R1和R2结合形成-(CH2)s-，其中一个碳原子被下列部分选择性地代替：O、S(O)m、-NC(O)-、HN和-N(COR4)-；
R3选自氢原子、芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环、C1-C6烷基和C3-C10环烷基；
R4选自芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环、C1-C6烷基和C3-C10环烷基；
m是0、1或2；
n是1、2、3或4；
p是0或1至100之间的整数；
q是0或1，条件是如果p是0，则q是1；
r是1至10之间的整数；而
s是3、4或5。
优选r是1、2或3。
本偶联物中的寡肽包括被亲水部分取代的环氨基酸，前面用术语“Haa”表示，还可用下列通式表示：
其中：
R5选自HO-和C1-C6烷氧基；
R6选自氢原子、卤素、C1-C6烷基、HO-和C1-C6烷氧基；
且t是3或4。
结构：
表示5或6元环胺部分，此环胺可选择性地与苯基或环己基环稠合。此环胺部分的例子包括但不限于下列特定结构：
本发明的偶联物可具有不对称中心，并产生外消旋体、外消旋混合物及单个非对映异构体，所有可能的异构体，包括旋光异构体，包括在本发明中。当任何取代基发生不只1次任何变化(例如，芳基、杂环、R3等)时，每次发生变化的定义独立于其它变化。例如，HO(CR1R2)2-表示HOCH2CH2-、HOCH2CH(OH)-、HOCH(CH3)CH(OH)-等。另外，只要该结合产生稳定的化合物，取代基和/或变化形式的结合是容许的。
在本文中，“烷基”和芳烷基的烷基部分以及类似的术语旨在包括含特定碳原子数的直链或支链饱和脂肪烃基团；“烷氧基”表示通过氧桥连接的指定碳原子数的烷基。
在本文中，“环烷基”旨在包括具有特定碳原子数的非芳香环烃基。环烷基的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
“链烯基”包括具有特定碳原子数并具有一个或几个双键的基团。链烯基的例子包括乙烯基、烯丙基、异丙烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、1-丙烯基、2-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、异戊烯基、法呢基、香叶基、香叶基香叶基等。
“链炔基”包括具有特定碳原子数并具有一个三键的基团。链炔基的例子包括乙炔基、2-丁炔基、2-戊炔基、3-戊炔基等。
“卤素”或“卤原子”在本文中指氟、氯、溴和碘。
在本文中，“芳基”和芳烷基和芳酰基的芳基部分指每个环最多含7个原子的任何稳定单或双碳环，其中至少一个环是芳族环。此芳基的例子包括苯基、萘基、四氢萘基、2，3-二氢化茚基、联苯基、菲基、蒽基或苊基(acenaphthyl)。
本文中，术语杂环或杂环的表示稳定的5至7元单环或稳定的8至11元双环杂环，它们可以是饱和或不饱和的，并由碳原子和选自N、O和S的1至4个杂原子组成，并且包括上述任何杂环与苯环稠合组成的任何双环。此杂环可连接在产生稳定结构的任何杂原子或碳原子上。此杂环的例子包括但不限于吖庚因基、苯并咪唑基、苯并异噁唑基、苯并呋咱基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并二氢吡喃基、1，2-二氮杂萘基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并噻喃基、二氢苯并噻喃基砜、呋喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、异苯并二氢吡喃基、异二氢吲哚基、异喹啉基、异噻唑烷基、异噻唑基、异噻唑烷基、吗啉基、1，5-二氮杂萘基、噁二唑基、2-氧代吖庚因基、噁唑基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吡啶基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、硫吗啉基、硫吗啉基亚砜、噻唑基、噻唑啉基、噻吩并呋喃基、噻吩并噻吩基和噻吩基。
在本文中，术语“取代的C1-C8烷基”、“取代的芳基”和“取代的杂环”包括除与该化合物其余部分连接的位点外还含1至3个取代基的部分。这些取代基选自氟、氯、溴、CF3、NH2、N(C1-C6烷基)2、硝基、氰基、(C1-C6烷基)O-、羟基、(C1-C6烷基)S(O)m-、(C1-C6烷基)C(O)NH-、H2N-C(NH)-、(C1-C6烷基)C(O)-、(C1-C6烷基)OC(O)-、N3、(C1-C6烷基)OC(O)NH-和C1-C20烷基。
术语“1至10之间的整数”表示数字1和10以及在它们之间的整数。术语“1至100之间的整数”表示数字1和100以及在它们之间的整数。
当R1和R2结合形成-(CH2)s-时，所定义的环部分或含杂原子的环部分包括但不限于：
在本文中，术语“PEG”表示具有指定数目的乙烯氧基亚单元的含取代基的某种聚乙二醇。因此，术语PEG(2)表示
而术语PEG(6)表示
在本文中，术语“(2R)(2，3-二羟基丙酰基)”表示下列结构：
在本文中，术语“(2R，3S)2，3，4-三羟基丁酰基”表示下面的结构：
因为本发明的偶联物可用来修饰已知的生物反应，因此细胞毒试剂并不解释限定为经典化学治疗剂。例如，此细胞毒试剂可以是具有所需生物活性的蛋白质或多肽。这些蛋白质可包括，例如，毒素如红豆因、蓖麻毒A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生因子、组织纤溶酶原激活物；或生物反应修饰剂如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生长因子。
一般来说，优选的细胞毒试剂包括烷化剂、抗繁殖剂、微管蛋白结合剂等。细胞毒试剂优选的种类包括，例如，蒽环类药物、长春花属药物、丝裂霉素类、博莱霉素类、细胞毒核苷、紫杉烷类、蝶啶类药物、二炔类(diynenes)和鬼臼毒素类。特别优选的类型包括，例如，阿霉素、洋红霉素、柔红酶素、氨基蝶呤、甲氨蝶呤、甲基叶酸、二氯甲氨蝶呤、丝裂霉素C、紫菜霉素、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物如依托泊苷或依托泊苷磷酸盐、马法兰、长春碱、长春新碱、异长春碱、长春地辛、环氧长春碱、紫杉醇等。其它可利用的细胞毒试剂包括雌莫司汀、顺铂和环磷酰胺。本领域技术人员可对所需细胞毒试剂进行化学修饰以便该化合物的反应更便于制备本发明偶联物的目的。
高度优选的本发明的细胞毒试剂包括下列通式的药物：
通式(1)的甲氨蝶呤组：
其中
R12是氨基或羟基；
R7是氢原子或甲基；
R8是氢原子、氟、氯、溴或碘；
R9是羟基或形成羧酸盐的部分；
通式(2)的丝裂霉素组：
其中
R10是氢原子或甲基；
通式(3)的博莱霉素组：
其中
R11是羟基、氨基、C1-C3烷氨基、二(C1-C3烷基)氨基、C4-C6聚亚甲基氨基、或通式(4)的马法兰：
通式(5)的6-巯基嘌呤：通式(6)的阿糖胞苷：
通式(7)的鬼臼毒素或其磷酸盐：
其中
R13是氢原子或甲基；
R14是甲基或噻吩基；
通式(8)的长春花属生物碱组：
其中
R15是H、CH3或CHO；
当R17和R18各自独立时，R18是H，且R16和R17之一是乙基而另一个是H或OH；
当R17和R18与它们连接的碳原子连接在一起时，它们形成环氧乙烷环，此时R16是乙基；
R19是氢原子、(C1-C3烷基)-CO或氯代(C1-C3烷基)-CO；
通式(9)的二氟核苷：
其中
R21是下列通式的基团之一：
其中
R22是氢原子、甲基、溴、氟、氯或碘；
R23是-OH或-NH2；
R24是氢原子、溴、氯或碘；或者
通式(10)的蒽环类抗生素：其中
Ra是-CH3、-CH2OH、-CH2OCO(CH2)3CH3或-CH2OCOCH(OC2H5)2；
Rb是-OCH3、-OH或-H；
Rc是-NH2、-NHCOCF3、4-吗啉基、3-氰基-4-吗啉基、1-哌啶基、4-甲氧基-1-哌啶基、苄胺、二苄基胺、氰基甲基胺或1-氰基-2-甲氧基乙胺；
Rd是-OH、-OTHP或-H；而
Re是-OH或-H，条件是当R5是-OH或-OTHP时R6不是-OH。
雌莫司汀(11)
环磷酰胺(12)
最优选的药物为上述通式(10)的蒽环抗生素。本领域技术人员懂得此结构式包括作为药物的化合物，或药物的衍生物，在本领域它们已获得了不同的通用名和俗名。下表1表示了一些蒽环药物及其通用名或俗名，它们特别优选用于本发明。
表1
化合物 Ra Rb Rc Rd Re柔红霉素a CH3 OCH3 NH2 OH H阿霉素b CH2OH OCH3 NH2 OH H地托比星 CH2OCOCH(OC2H5)2 OCH3 NH2 OH H详红霉素 CH3 OH NH2 OH H伊达比星 CH3 H NH2 OH H表柔比星 CH2OH OCH3 NH2 OH OH依索比星 CH2OH OCH3 NH2 H HTHP CH2OH OCH3 NH2 OTHP HAD-32 CH2OCO(CH2)3CH3 OCH3 NHCOCF3 OH Ha″“道诺霉素”是柔红霉素的另一名称。b″“亚德里亚霉素”是阿霉素的另一名称。
表1所示的化合物中，最优选的细胞毒试剂是阿霉素、长春碱和去乙酰基长春碱。阿霉素(本文中也称为“DOX”)属于通式(10)的蒽环类，其中Ra是-CH2OH、Rb是-OCH3、Rc是-NH2、Rd是-OH而Re是-H。
其中细胞毒试剂优选阿霉素的、用如下通式(I)描述的、本发明的寡肽-细胞毒试剂偶联物或其药用盐：
其中：
寡肽是被游离前列腺特异性抗原(PSA)选择性识别并能被游离前列腺特异性抗原的酶活性以蛋白水解的方式裂解的寡肽，其中该寡肽包括下列通式的环氨基酸：
并且其中C末端羰基与阿霉素的氨基以共价键的方式连接；
R选自如下：
a)氢原子
b)-(C＝O)R1a，
R1和R2独立地选自氢原子、OH、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6芳烷基和芳基；
R1a是C1-C6烷基、羟基化芳基、多羟基化芳基或芳基；
R5选自HO-和C1-C6烷氧基；
R6选自氢原子、卤素、C1-C6烷基、HO-和C1-C6烷氧基；并且
n是1、2、3或4；
p是0或1至100之间的整数；
q是0或1，条件是如果p是0，则q是1；
r是1至10之间的整数；而
t是3或4。
在寡肽-细胞毒试剂偶联物或其旋光异构体或其药用盐的优选实施方案中：
环氨基酸是
R选自如下：a)氢原子，b)-(C＝O)R1a， 
R1和R2独立地选自氢原子、C1-C6烷基和芳基；R1a是C1-C6烷基或芳基，n是1、2、3或4；n′是0、1、2或3；p是0或1至14之间的整数；q是0或1，条件是如果p是0，则q是1；r是1至10之间的整数；而t是3。下列化合物是本发明的寡肽-细胞毒试剂偶联物的特别实例：
其中X是
| SEQ.ID.NO. | |
| 琥珀酰基|-(4-Hyp)ASChgQ-SV-DOX(3′) | 75 |
| 戊二酰基-(4-Hyp)ASChgQ-SV-DOX(3′) | 76 |
| 戊二酰基-(4-Hyp)ASChgQ-SI-DOX(3′) | 77 |
| 琥珀酰基-(4-Hyp)SSChgQ-SI-DOX(3′) | 78 |
| 琥珀酰基-(4-Hyp)ASChgQ-SI-DOX(3′) | 79 |
| 琥珀酰基-(4-Hyp)ASChgQ-SAbu-DOX(3′) | 80 |
| 戊二酰基-(4-Hyp)SSChgQ-SI-DOX(3′) | 81 |
| 戊二酰基-(4-Hyp)SSChgQ-SL-DOX(3′) | 82 |
| PEG(2)-(4-Hyp)SSChgQ-SL-DOX(3′) | 83 |
| 琥珀酰基-(4-Hyp)ASChgQ-SThi-DOX (3′) | 84 |
| PEG(4)-(4-Hyp)-SSChgQ-SL-DOX(3′) | 85 |
| PEG(2)-(4-Hyp)ASChgQ-SThi-DOX(3′) | 86 |
| 琥珀酰基-3，4-(diOH)PASChgQ-SL-DOX (3′) | 87 |
| 丙二酰基-(4-Hyp)ASChgQ-SL-DOX (3′) | 88 |
细胞毒试剂优选长春碱和去乙酰基长春碱的、用如下通式II描述的、本发明的寡肽-细胞毒试剂偶联物或其药用盐：
其中：
寡肽是被游离前列腺特异性抗原(PSA)选择性识别并能被游离前列腺特异性抗原的酶活性以蛋白水解的方式裂解的寡肽，且该寡肽包括下列通式的环氨基酸：
XL是-NH-(CH2)u-NH-，R选自如下：a)氢原子b)-(C＝O)R1a，
R1和R2独立地选自氢原子、OH、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6芳烷基和芳基；
R1a是C1-C6烷基、羟基化芳基、多羟基化芳基或芳基；
R19是氢原子、(C1-C3烷基)-CO或氯取代的(C1-C3烷基)-CO；
n是1、2、3或4；
p是0或1至100之间的整数；
q是0或1，条件是如果p是0，则q是1；
r是1、2或3；
t是3或4；
u是1、2、3、4或5。
细胞毒试剂优选长春碱和去乙酰基长春碱的、用如下通式III描述的、本发明的寡肽-细胞毒试剂偶联物或其药用盐的另一种实施方案：
其中：
寡肽是被游离前列腺特异性抗原(PSA)选择性识别并能被游离前列腺特异性抗原的酶活性以蛋白水解的方式裂解的寡肽，且该寡肽包括下列通式的环氨基酸：
Rg和Rh独立地选自氢原子、C1-C6烷基、C1-C6烷基-OH、-C1-C6烷基-二-OH、-C1-C6烷基-三-OH和
条件是Rd和Re中至少一个不是氢原子或C1-C6烷基，或者
Rg和Rh联合形成-CH2CH2OCH2CH2-双游离基；
R19是氢原子、(C1-C3烷基)-CO或氯取代的(C1-C3烷基)-CO；
p是0或1至100之间的整数；
q是0或1，条件是如果p是0，则q是1。
下列化合物或其旋光异构体或其药用盐是本发明的寡肽-去乙酰基长春碱偶联物的特别实例：
本发明的寡肽、肽亚单位和肽衍生物(也称为“肽”)可通过常规肽合成技术由它们的组成氨基酸合成，优选通过固相技术。然后通过反相高效液相色谱(HPLC)将这些肽纯化。
例如，肽合成的标准方法描述于下列著述中：Schroeder等，“《肽》(The Peptides)”，Vol.I，Academic Press 1965；Bodansky等，“《肽合成》(Peptides Synthesis)”，Interscience Publishers，1966；McOmie(编辑.)“《有机化学中的保护基》(Protective GroupsinOrganic Chemistry)”，Plenum Press，1973；Barany等，《肽：分析、合成、生物学》(The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology)2，第一章，Academic Press，1980和Stewart等，《固相肽合成》(Solid Phase Peptide Synthesis)，第二版，Pierce ChemicalCompany，1984。将这些著述中的描述在此引为参考。
适宜取代的环氨基酸带有亲水取代基，可将它们通过标准肽合成技术加入到本偶联物中，其本身也可商购或通过本领域熟知技术或本文中描述的技术容易地合成。因此，适宜取代的脯氨酸的合成描述于下列文章并将其引为参考：J.Ezquerra等，《有机化学杂志》(J.Org.Chem.)，60：2925-2930(1995)；P.Gill和W.D.Lubell，《有机化学杂志》J.Org.Chem.，60：2658-2659(1995)和M.W.Holladay等，《药物化学杂志》(J.Med.Chem.)，34：457-461(1991)。将这些著述中的描述在此引为参考。
本发明化合物的药用盐包括常规无毒盐，该盐由本发明化合物与如无毒无机或有机酸形成。例如，这些常规无毒盐包括得自无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的盐；以及由有机酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、双羟萘酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸、草酸、羟乙磺酸、三氟乙酸等制备的盐。
含有具有PSA裂解位点的寡肽和细胞毒试剂的本发明的偶联物可通过药物化学领域熟知的技术类似地合成。例如，可将细胞毒试剂的游离胺部分与寡肽的羧基末端共价连接形成酰胺键。同样，通过将寡肽的胺部分与细胞毒试剂的羧基部分共价偶合可形成酰胺键。为了这些目的，可单独或联合使用试剂如六氟磷酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，3，3-四甲基脲盐(称为HBTU)、1-羟基苯并三唑水合物(称为HOBT)、二环己基碳化二亚胺(DCC)、N-乙基-N-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)、二苯基膦酰基叠氮化物(DPPA)、苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)六氟磷酸鏻(BOP)等。
此外，本发明的偶联物可通过PSA裂解位点和细胞毒试剂之间的非肽键形成。例如，此细胞毒试剂可通过细胞毒试剂上的羟基部分与寡肽的羧基末端共价连接，由此形成酯连接。为此，可使用试剂如HBTU和HOBT的混合物、BOP和咪唑的混合物、DCC和DMAP的混合物等。此羧酸也可通过形成硝基苯酯等而活化并在DBU(1，8-二氮杂二环[5，4，0]十一碳-7-烯)存在下反应。
本发明的偶联物也可通过连接剂单元将此寡肽连接到细胞毒试剂上。此连接剂单元包括，例如，二羰基烷基双游离基，其中此细胞毒试剂的胺部分与连接剂单元连接形成酰胺键而此寡肽的氨基末端与此连接剂单元的另一端连接形成酰胺键。相反，也可使用二氨基烷基双游离基连接剂单元，其中此细胞毒试剂的羰基部分与此连接剂单元的一个胺共价连接而此连接剂单元的另一个胺与此寡肽的C末端共价连接。也可预想出当不存在游离PSA时对生理环境稳定，但是在PSA蛋白水解裂解位点可裂解其它这样的连接剂单元。此外，可使用PSA蛋白水解裂解位点裂解时仍保留在此细胞毒试剂上，但与未修饰的细胞毒试剂相比不显著降低此裂解后细胞毒试剂衍生物的细胞毒活性的连接剂单元。
本领域技术人员会理解本发明化合物的合成中，可能需要保护起始化合物和中间体的多种反应官能团，同时该分子的其它部分进行所需的反应。在所需反应完成后，或在任何需要的时间，一般通过，例如，水解或氢解方法将这样的保护基除去。此保护和脱保护步骤是有机化学中常规方法。本领域技术人员可参照《有机化学中的保护基》，McOmie，编辑，Plenum Press，NY，NY(1973)和《有机合成中的保护基》，Greene，编辑，John Wiley & Sons，NY，NY(1981)中有关保护基的描述。这些描述可用于本发明化合物的制备。
例如，可利用的氨基保护基可包括，例如，C1-C10烷酰基如甲酰基、乙酰基、二氯乙酰基、丙酰基、己酰基、3，3-二乙基己酰基、γ-氯代丁酰基等；C1-C10烷氧基羰基和C5-C15芳氧基羰基如叔丁氧基羰基、苄氧基羰基、烯丙氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、芴基甲氧基羰基和肉桂酰氧基羰基；卤代-(C1-C10)-烷氧基羰基如2，2，2-三氯乙氧基羰基；以及C1-C15芳烷基和链烯基如苄基、苯乙基、烯丙基、三苯甲游基等。其它通常使用的氨基保护基为由β-酮基酯如乙酰基乙酸甲酯或乙酯制备的烯胺的形式。
可利用的羧基保护基可包括，例如，C1-C10烷基如甲基、叔丁基、癸基；卤代-C1-C10烷基如2，2，2-三氯乙基和2-碘代乙基；C5-C15芳烷基如苄基、4-甲氧基苄基、4-硝基苄基、三苯基甲基、二苯基甲基；C1-C10烷酰氧基甲基如乙酰氧基甲基、丙酰氧基甲基等；以及基团如苯甲酰甲基、4-卤代苯甲酰甲基、烯丙基、二甲基烯丙基、三(C1-C3烷基)甲硅烷基如三甲基甲硅烷基、β-对甲苯磺酰基乙基、β-对硝基苯硫基乙基、2，4，6-三甲基苄基、β-甲硫基乙基、苯二甲酰亚氨基甲基、2，4-二硝基-苯基亚磺酰基、2-硝基二苯甲基和相关基团。
同样，可利用的羟基保护基可包括，例如，甲酰基、氯乙酰基、苄基、二苯甲基、三苯甲游基、4-硝基苄基、三甲硅烷基、苯甲酰甲基、叔丁基、甲氧基甲基、四氢吡喃基等。
针对寡肽与蒽环抗生素阿霉素结合的优选实施方案，下面的反应方案说明了本发明偶联物的合成。
反应方案I
反应方案II
反应方案III
反应方案IV
反应方案V
反应方案VI说明了用于本发明治疗方法中的偶联物的制备，其中此寡肽与长春花属生物碱细胞毒试剂长春碱结合。说明了此寡肽的N末端与长春碱的连接(S.P.Kandukuri等，《药物化学杂志》(J.Med.Chem.)，28：1079-1088(1985))。
反应方案VII说明了本发明的寡肽和长春花属生物碱细胞毒试剂长春碱的偶联物的制备，其中将此长春碱连接在此寡肽的C末端。使用1，3-二氨基丙烷连接剂仅用于说明；也可预想出在长春碱的羰基和寡肽的C末端之间的其它空间连接剂单元。此外，方案VII说明了偶联物的合成，其中C-4-位羟基部分在加入连接剂单元后又被乙酰化。申请人已发现去乙酰基长春碱偶联物也是有效的并可通过除去反应方案VII中保护伯胺连接剂并将此中间体与乙酸酐反应的步骤，然后将此胺脱保护而制备。寡肽的其它位置和长春碱官能团的轭合可由本领域普通技术人员容易地完成并也预期地提供了用于治疗前列腺癌的化合物。
还应理解可制备这样的偶联物，其中用于本发明治疗方法的、含带有亲水取代基的环氨基酸的寡肽的N末端与一种细胞毒试剂如长春碱结合，而C末端同时连接另一种相同或不同的细胞毒试剂如阿霉素。反应方案VIII描述了这种多细胞毒试剂偶联物的合成。这种多细胞毒试剂偶联物可较仅含一种细胞毒试剂的偶联物具有某些优点。
反应方案VI
反应方案VI(续)
其中R是-NH2、-O-烷基等
反应方案VII
反应方案VII(续)
反应方案VIII
反应方案VIII(续)
本发明的寡肽-细胞毒试剂偶联物给患者以药物组合物的形式使用，该组合物含有本发明的偶联物和药用载体、赋形剂或稀释剂。在本文中，“药用”指用于治疗或诊断温血动物包括，例如，人、马、猪、牛、鼠、犬、猫或其它哺乳动物，以及鸟类或其它温血动物的试剂。优选的给药方式是非肠道给药，特别是静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内或淋巴管内给药。可用本领域技术人员熟悉的载体、稀释剂或赋形剂制备这些制剂。在这方面，参见，例如，《Remington′s药物学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，16版，1980，MackPublishing Company，Osol等主编。这些组合物中可含有蛋白质如血清蛋白质，例如，人血清白蛋白，缓冲液或缓冲物质如磷酸盐或其它盐，或电解质等。适宜的稀释剂包括，例如，灭菌水、等渗盐水、稀葡萄糖水溶液、多元醇或这些醇的混合物，例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等。该组合物可含有防腐剂如苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、乙基汞硫代水杨酸钠等。如果需要，此组合物可含有约0.05至约0.20％(重量)的抗氧化剂如次焦亚硫酸钠或亚硫酸氢钠。
在本文中，术语“组合物”包括含特定量的特定组份的产品，以及直接或间接由特定量的特定组份混合后得到的任何产品。
对于静脉内给药，优选此组合物制备成给患者的使用量为约0.01至约1g偶联物的形式。优选此偶联物的给药量为约0.2至约1g。根据多种因素如所治疗的疾病状态、要改良的生物作用、此偶联物的给药方式、患者的年龄、体重和状况以及主治医生确定的其它因素，本发明的偶联物在很宽的剂量范围内是有效的。因此，对任何患者的给药量必需按照具体情况确定。
本领域技术人员会领会到虽然下列实施例中给出了特定试剂和反应条件，但是可对其进行改进，这些改进在本发明的实质和范围内。因此，下列制备例和实施例只是进一步说明本发明，而不是对其进行限制。
实施例
实施例1
含有PSA介导的裂解位点的寡肽的制备
在Applied Biosystems 430A型全自动肽合成仪中，用双偶合方法引入氨基酸，通过固相合成制备保护的寡肽。用液体氢氟酸处理达到由树脂支持物上将此寡肽脱保护并除去的目的。通过制备高压液相色谱在反相C18硅胶柱上用0.1％三氟乙酸水溶液/乙腈梯度洗脱纯化此寡肽。通过氨基酸组成分析、高压液相色谱和快速原子轰击质谱分析确定寡肽的同一性和均一性。通过此方法制备的寡肽见表2。
表2
| SEQ.ID.NO. | 肽/肽-DOX偶联物 | 被PSA裂解50％底物需要的时间(分) |
| 73 | Ac-PSSChgQ-SV-酸 | 120 |
| 74 | Ac-PASChgQ-SL-酸 | 150 |
| 75 | Ac-(4-脱氢-Pro)-AsChgQ-SL-酸 | 3小时＝28％ |
| 68 | Ac-(4-反式-L-Hyp)AsChgQ-SL-酸 | 75 |
| 76 | Ac-(4-反式-L-Hyp)ChgQ-SSSL-酸 | 3小时＝0％，n＝2 |
| 77 | Ac-(4-反式-L-Hyp)AsChgQ-SThi-酸 | 20 |
| 78 | Ac-(4-反式-L-Hyp)AsChgQ-S(TIC)-酸 | 3小时＝16％ |
| 68 | PEG(2)-(4-反式-L-Hyp)-AsChgQ-SL-酸 | 3小时＝44％ |
4-反式-L-Hyp是反式-4-羟基-L-脯氨酸
脱氢-Pro是3，4-脱氢-L-脯氨酸
实施例2
被游离PSA识别的寡肽的评估
将实施例1制备的寡肽单个溶解于PSA消化缓冲液(12mM三(羟甲基)氨基甲烷pH8.0、25mM氯化钠、0.5mM氯化钙)并将此溶液以摩尔比100比1加入到PSA中。或者，所用PSA消化缓冲液是50mM三(羟甲基)-氨基甲烷pH7.4、140mM氯化钠。不同的反应时间后通过加入三氟乙酸(TFA)达到最终浓度1％(体积/体积)停止该反应。或者用10mm氯化锌停止该反应。在反相C18柱上用0.1％TFA/乙腈梯度洗脱通过HPLC分析停止的反应。评估结果见表2。表2表明利用具有酶活性的游离PSA裂解50％所述寡肽需要的时间(分钟)。含游离胺部分(即含hArg、Orn、Lys和/或3PAL)的寡肽以TFA盐的形式测定。所有其它寡肽以中性化合物的形式检测。
实施例3制备[N-Ac-(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox(SEQ.ID.NO.：68)
步骤A：[N-Ac-(4-反式-L-Hyp(Bzl))]-Ala-Ser(Bzl)Chg-Gln-Ser(Bzl)Leu-PAM树脂(3-1)
以0.5mmol(0.67g)Boc-Leu-PAM树脂开始，在430A ABI肽合成仪中合成被保护的肽。此方法中使用4倍过量(2mmol)的下列各个被保护的氨基酸：Boc-Ser(Bzl)、Boc-Gln、Boc-Chg、Boc-Ala、N-Boc-(4-反式-L-Hyp(Bzl))。用DCC和HOBT在甲基-2-吡咯烷酮中活化达到偶合。用乙酸引入N末端乙酰基。用50％TFA在二氯甲烷中除去Boc基并用二异丙基乙胺中和TFA盐。合成完毕时，将该肽树脂干燥得到中间体3-1。
步骤B：[N-Ac-(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-OH(3-2)
将1.2g被保护的肽树脂(3-1)用HF(20ml)在0℃在苯甲醚(2ml)的存在下处理1小时。将HF蒸发后，用乙醚洗涤此残余物，过滤并用水(200ml)萃取。将此滤液冻干得到中间体3-2。
步骤C：[N-Ac-(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox
将1.157g(1.45mmol)上述中间体(3-2)溶解于DMSO(30ml)中并用DMF(30ml)稀释。向此溶液中加入盐酸阿霉素516mg(0.89mmol)，然后加入0.310ml二异丙基乙胺(1.78mmol)。将此搅拌的溶液冷却(0℃)并加入0.276ml二苯基磷酰基叠氮化物(1.28mmol)。30分钟后，再加入0.276ml(1.28mmol)DPPA并用二异丙基乙胺(DIEA)将pH调节至约7.5(pH试纸)。随后的3小时内，用DIEA将此冷却的反应(0℃)的pH维持在约7.5并在0-4℃将此反应搅拌过夜。18小时后，将此反应(通过分析用HPLC，系统A发现反应完全)浓缩为油状物。将此得到的粗品通过制备HPLC纯化，缓冲液A＝0.1％乙酸铵-水；B＝乙腈。将此粗品溶解于400ml 100％A缓冲液中，过滤并在C-18反相HPLC径向压缩柱(Waters，Delta-Pak，15μM，100埃)上纯化。用梯度100％A至60％A以75ml/分钟(UV＝214nm)流速洗脱。收集均匀的产物馏份(通过HPLC，系统A评价)并冻干。将此产物溶解于水(300ml)中，过滤并冻干得到纯化的标题化合物。HPLC条件，系统A柱：Vydac 15cm # 218TP5415，C18洗脱剂： 梯度95∶5(A∶B)至5∶95(A∶B)，洗脱45分钟
A＝0.1％TFA/水，B＝0.1％TFA/乙腈流速： 1.5ml/分钟波长： 214nM，254nM保留时间：阿霉素＝13.66分钟
Ac-Hyp-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-OH＝10.8分钟
Ac-Hyp-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox＝18.2分钟物理性质
步骤C的产物的理化性质如下：分子式： C62H85N9O23分子量： 1323.6高分辨ES质谱：1341.7(NH4 +)HPLC：系统A柱：Vydac 15cm#218TP5415，C18洗脱剂：梯度95∶5(A∶B)至5∶95(A∶B)，洗脱45分钟
A＝0.1％TFA/水，B＝0.1％TFA/乙腈流速： 1.5ml/分钟波长： 214nM，254nM保留时间：18.2分钟氨基酸组分分析1：
理论值 实测值
Ala(1) 1.00
Ser(2) 1.88
Chg(1) 0.91
Gln2(1) 1.00(为Glu)
Hyp(1) 0.80
Leu(1) 1.01
肽含量： 0.657μmol/mg
注：120小时，100℃，6N HCl
2Gln转变为Glu
表3说明了通过实施例3描述的方法但是用适当氨基酸残基和保护基团酰化而制备的其它肽-阿霉素偶联物。
表3
| SEQ.ID.NO. | 肽/肽-DOX偶联物 | 被PSA裂解50％底物需要的时间(分) |
| 89 | Ac-(4-反式-L-Hyp)AsChgQ-SThi-DOX(3′) | 不溶 |
| 74 | Ac-(4-反式-L-Hyp)ASChgQ-StBuAla-DOX(3′) | 25 |
| 73 | PEG(2)-(4-反式-L-Hyp)ASChgQ-SL-DOX(3′) | 20 |
| 68 | Ac-(4-反式-L-Hyp)AsChgQ-SL-DOX(3′) | 20 |
实施例4
制备[N-戊二酰基-(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox(SEQ.ID.NO.：71)
步骤A：[N-戊二酰基(OFm)-(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-PAM树脂
以0.5mmol(0.67g)Boc-Leu-PAM树脂开始，在430A ABI肽合成仪中合成被保护的肽。此方法中使用4倍过量(2mmol)的下列各个被保护的氨基酸：Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Chg、Fmoc-Ala、Boc-(4-反式-L-Hyp)。用DCC和HOBT在甲基-2-吡咯烷酮中活化达到偶合。用中间体戊二酸单芴基甲基酯[戊二酰基(OFm)]引入N末端戊二酰基。用20％哌啶除去Fmoc基。用50％TFA在二氯甲烷中除去对酸敏感的保护基Boc、Trth和tBu。用二异丙基乙胺中和TFA盐。合成完毕时，将该肽树脂干燥得到标题化合物。
步骤B：[N-戊二酰基(OFm)-(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-OH
将1.2g步骤A的被保护的树脂用HF(20ml)在0℃在苯甲醚(2ml)的存在下处理1小时。将HF蒸发后，用乙醚洗涤此残余物，过滤并用DMF萃取。将此DMF滤液(75ml)浓缩至干并用水研制。滤出不溶的产物并干燥得到标题化合物。
步骤C：[N-戊二酰基(OFm)-(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox
将来自步骤B的上述制备的中间体(1.33g，1.27mmol)溶解于DMSO(6ml)和DMF(69ml)中。向此溶液中加入盐酸阿霉素599mg(1.03mmol)，然后加入376μl二异丙基乙胺(2.16mmol)。将此搅拌的溶液冷却(0℃)并加入324μl二苯基磷酰基叠氮化物(1.5mmol)。30分钟后，再加入324μl DPPA并用二异丙基乙胺(DIEA)将pH调节至约7.5(pH试纸)。随后的3小时内，用DIEA将此冷却的反应(0℃)的pH维持在约7.5并在0-4℃将此反应搅拌过夜。18小时后，将此反应(通过分析用HPLC，系统A发现反应完全)浓缩得到标题化合物，为油状物。
步骤D：[N-戊二酰基-(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox
将步骤C制备的上述产物溶解于DMF(54ml)中，冷却至0℃并加入14ml哌啶。将此溶液浓缩至干并通过制备HPLC纯化(A＝0.1％乙酸铵-水；B＝乙腈)。将此粗品溶解于100ml 80％A缓冲液中，过滤并在C-18反相HPLC径向压缩柱(Waters，Delta-Pak，15μM，100埃)上纯化。用梯度80％A至67％A以75ml/分钟(UV＝214nm)流速洗脱。收集均匀的产物馏份(通过HPLC，系统A评价)并冻干。将此产物用上述HPLC柱进一步纯化。缓冲液A＝15％乙酸-水；B＝15％乙酸-甲醇。将此产物溶解于100ml 20％B/80％A缓冲液中并纯化。用梯度20％B至80％B以75ml/分钟(UV＝260nm)流速洗脱。收集均匀的产物馏份(通过HPLC，系统A评价)、浓缩并从水中冻干得到纯标题化合物。HPLC条件，系统A柱： Vydac 15cm#218TP5415，C18洗脱剂：梯度95∶5(A∶B)至5∶95(A∶B)，洗脱45分钟
A＝0.1％TFA/水，B＝0.1％TFA/乙腈流速： 1.5ml/分钟波长： 214nM，254nM保留时间：阿霉素＝13.66分钟
[N-戊二酰基(OFm)-(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-
Ser-Leu-OH＝19.66分钟
[N-戊二酰基(OFm)-(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-
Ser-Leu-Dox＝24.8分钟
[N-戊二酰基-(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-
Leu-Dox＝18.3分钟高分辨ES质谱：1418.78(Na+)HPLC： 系统A柱： Vydac 15cm#218TP5415，C18洗脱剂： 梯度95∶5(A∶B)至5∶95(A∶B)，洗脱45分钟
A＝0.1％TFA/水，B＝0.1％TFA/乙腈流速： 1.5ml/分钟波长： 214nM，254nM保留时间： 18.3分钟
氨基酸组分分析1：
理论值 实测值
Ala(1) 0.99
Ser(2) 2.02
Chg(1) 1.00
Gln2(1) 1.01(为Glu)
Hyp(1) 0.99
Leu(1) 1.00
肽含量： 0.682μmol/mg
注：120小时，100℃，6N HCl
2Gln转变为Glu
表4说明了通过实施例4描述的方法但是用适当氨基酸残基和保护基团酰化而制备的其它肽-阿霉素偶联物。
表4
| SEQ. ID. N0. | |
| 琥珀酰基-(4-反式-L-Hyp)ASChgQ-SV-DOX(3′) | 75 |
| 戊二酰基-(4-反式-L-Hyp)ASChgQ-SV-DOX(3′) | 76 |
| 戊二酰基-(4-反式-L-Hyp)ASChgQ-SI-DOX(3′) | 77 |
| 琥珀酰基-(4-反式-L-Hyp)SSChgQ-SI-DOX(3′) | 78 |
| 琥珀酰基-(4-反式-L-Hyp)ASChgQ-SI-DOX(3′) | 79 |
| 琥珀酰基-(4-反式-L-Hyp)ASChgQ-SAbu-DOX(3′) | 80 |
| 戊二酰基-(4-反式-L-Hyp)SSChgQ-SI-DOX(3′) | 81 |
| 戊二酰基-(4-反式-L-Hyp)SSChgQ-SL-DOX(3′) | 82 |
| PEG(2)-(4-反式-L-Hyp)SSChgQ-SL-DOX(3′) | 83 |
| 琥珀酰基-(4-反式-L-Hyp)ASChgQ-SThi-DOX(3′) | 84 |
| PEG(4)-(4-反式-L-Hyp)-SSChgQ-SL-DOX(3′) | 85 |
| PEG(2)-(4-反式-L-Hyp)ASChgQ-SThi-DOX(3′) | 86 |
| 琥珀酰基-3，4-(二羟基)PASChgQ-SL-DOX(3′) | 87 |
| 丙二酰基-(4-反式-L-Hyp)ASChgQ-SL-DOX(3′) | 88 |
实施例5制备(4-反式-L-Hyp)-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox(SEQ.ID.NO.：70)
步骤A：Fmoc-(4-反式-L-Hyp(Bzl))-Ala-Ser(Bzl)Chg-Gln-Ser(Bzl)Leu-PAM树脂
以0.5mmol(0.67g)Boc-Leu-PAM树脂开始，在430A ABI肽合成仪中合成被保护的肽。此方法中使用4倍过量(2mmol)的下列各个被保护的氨基酸：Boc-Ser(Bzl)、Boc-Gln、Boc-Chg、Boc-Ala、N-Boc-(4-反式-L-Hyp(Bzl))。用DCC和HOBT在甲基-2-吡咯烷酮中活化达到偶合。用Fmoc-OSu(Fmoc的琥珀酰基酯)引入N末端保护基。用50％TFA在二氯甲烷中除去Boc基。用二异丙基乙胺中和TFA盐。合成完毕时，将该肽树脂干燥得到标题中间体。
步骤B：Fmoc-(4-反式-L-Hyp)-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-OH
将1.1g步骤A的被保护的肽树脂用HF(20ml)在0℃在苯甲醚(2ml)的存在下处理1小时。将HF蒸发后，用乙醚洗涤此残余物，过滤并用水(200ml)萃取。将此滤液冻干得到标题中间体。
步骤C：Fmoc-(4-反式-L-Hyp)-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox
将上述步骤B的中间体0.274g溶解于DMSO(10ml)并用DMF(10ml)稀释。向此溶液中加入盐酸阿霉素104mg，然后加入62μl二异丙基乙胺。将此搅拌的溶液冷却(0℃)并加入56μl二苯基磷酰基叠氮化物。30分钟后，再加入56μl DPPA并用二异丙基乙胺(DIEA)将pH调节至约7.5(pH试纸)。用DIEA将此冷却的反应(0℃)的pH维持在约7.5。4小时后，将此反应(通过分析用HPLC，系统A发现反应完全)浓缩为油状物。HPLC条件，系统A
步骤D：(4-反式-L-Hyp)-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox
将步骤C制备的上述产物溶解于DMF(10ml)中，冷却至0℃并加入4ml哌啶。将此溶液浓缩至干并通过制备HPLC纯化(A＝0.1％乙酸铵-水；B＝乙腈)。将此粗品溶解于100ml 90％A缓冲液中，过滤并在C-18反相HPLC径向压缩柱(Waters，Delta-Pak，15μM，100埃)上纯化。用梯度90％A至65％A以75ml/分钟(UV＝214nm)流速洗脱。收集均匀的产物馏份(通过HPLC，系统A评价)并冻干。
HPLC条件，系统A
柱： Vydac 15cm#218TP5415，C18
洗脱剂： 梯度95∶5(A∶B)至5∶95(A∶B)，洗脱45分钟
A＝0.1％TFA/水，B＝0.1％TFA/乙腈
流速： 1.5ml/分钟
波长： 214nM，254nM
保留时间：阿霉素＝13.66分钟
Fmoc-(4-反式-L-Hyp)-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-OH
＝18.6分钟
Fmoc-(4-反式-L-Hyp)-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-
Dox＝23.8分钟
(4-反式-L-Hyp)-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox
＝17.6分钟
分子式：C62H83N9O22
分子量：1281.56
高分辨ES质谱：1282.59(MH+)
HPLC： 系统A
柱： Vydac 15cm#218TP5415，C18
洗脱剂： 梯度95∶5(A∶B)至5∶95(A∶B)，洗脱45分钟
A＝0.1％TFA/水，B＝0.1％TFA/乙腈
流速： 1.5ml/分钟
波长： 214nM，254nM
保留时间：17.6分钟
氨基酸组分分析1：
理论值 实测值
Ala(1) 1.00
Ser(2) 1.94
Chg(1) 0.94
Gln2(1) 1.05(为Glu)
Hyp(1) 0.96
Leu(1) 1.03
肽含量： 0.690μmol/mg
注：120小时，100℃，6N HCl
2Gln转变为Glu
实施例6
对游离PSA识别寡肽-阿霉素偶联物的评价
将实施例3-5制备的偶联物分别溶解于PSA消化缓冲液中(12mM三(羟甲基)-氨基甲烷pH8.0，25mM氯化钠，0.5mM氯化钙)并将此溶液以100比1的摩尔比加入到PSA中。或者，所用PSA消化缓冲液是50mM三(羟甲基)-氨基甲烷pH7.4、140mM氯化钠。不同的反应时间后通过加入三氟乙酸(TFA)达到最终浓度1％(体积/体积)停止该反应。或者用10mm氯化锌停止该反应。在反相C18柱上用0.1％TFA/乙腈梯度洗脱通过HPLC分析停止的反应。评估结果见表3。表3表明利用具有酶活性的游离PSA裂解50％所述寡肽细胞毒试剂偶联物需要的时间(分钟)。如果未指出是偶联物的盐，则用游离偶联物作试验。对实施例4和5中所述的寡肽-细胞毒试剂偶联物评价利用具有酶活性的游离PSA裂解50％所述寡肽需要的时间(分钟)，且这些偶联物50％裂解需要的时间少于2小时。
实施例7
阿霉素肽基衍生物细胞毒性体外试验
用Alamar Blue试验，评价按照实施例3和4所述制备的裂解的寡肽-阿霉素偶联物对已知被未修饰阿霉素杀伤的细胞系的细胞毒性。具体地讲，将LNCap前列腺肿瘤细胞的细胞培养物(它们表达有具有酶活性的PSA)或DuPRO细胞在96孔板中用含不同浓度的给定偶联物的培养基(Dulbecco′s极限必需培养基-α[MEM-α])稀释(最终板孔体积为200μl)。将这些细胞在37℃培养3天，向试验孔中加入20μl AlamarBlue。将这些孔进一步孵育并将此试验板在EL-310 ELISA读数器在加入Alamar Blue后4和7小时在双波长570和600nm读数。然后计算被测偶联物不同浓度与对照(无偶联物)培养物的相对百分率变化。此评价的一些结果见表5。如果未指出是盐，则检测的是游离偶联物。
表5
| SEQ.ID.NO. | 肽/肽-DOX偶联物 | LNCaP细胞杀伤72小时的EC50(μM) |
| 74 | Ac-(4-反式-L-Hyp)ASChgQ-StBuAla-DOX(3′) | 100(DuPRO＞100)n＝2 |
| 68 | Ac-(4-反式-L-Hyp)ASChgQ-SL-DOX(3′) | 4.5(DuPRO＝90) |
实施例8
肽基-细胞毒试剂偶联物的体内效果
将LNCaP.FGC或DuPRO-1细胞进行胰蛋白酶消化，再悬浮于生长培养基中并以200×g离心6分钟。将这些细胞再悬浮于无血清的MEM-α中并计数。然后将含所需数量细胞的适当体积的此溶液转移至圆锥形离心管中，离心并再悬浮于适当体积的冷的MEM-αMatrigel(Collaborative Biomedical Products，New Bedford，Mass)的1∶1混合物中。将此悬浮液保持在冰上直到给动物接种。
不麻醉将Harlan Sprague Dawley雄性裸鼠(10-12周龄)关养并在其左肋通过用22号针皮下注射用0.5ml细胞悬浮液接种。小鼠使用约5×105 DuPRO细胞或1.5×107 LNCaP.FGC细胞。
用如下两种方案之一治疗用肿瘤细胞接种后的小鼠：
方案A：
细胞接种后第一天，通过腹膜内给动物使用0.1至0.5ml的被测偶联物、阿霉素或载体对照(无菌水)。偶联物和阿霉素的起始剂量为非致死量最大值，但随后可降低用量。5天内以24小时为一周期使用相同的剂量。10天后，从小鼠中采集血样并检测血清的PSA水平。在5-10天内检测到相似的血清PSA水平。在第5.5周结束时将小鼠处死并称量存在的任何肿瘤的重量并再次检测血清PSA水平。在试验开始和结束称量动物的体重。
方案B：
细胞接种后第10天，从动物中采集血样并检测血清PSA水平。然后根据它们的PSA血清水平给动物分组。在细胞接种后第14-15天，通过腹膜内给动物使用0.1至0.5ml体积的被测偶联物、阿霉素和载体对照(无菌水)。偶联物和阿霉素的起始剂量为非致死量最大值，但随后可降低用量。5天内以24小时为一周期使用相同的剂量。在5-10天内检测到相似的血清PSA水平。在第5.5周结束时将小鼠处死并称量存在的任何肿瘤的重量并再次检测血清PSA水平。在试验开始和结束称量动物的体重。
方案C：
细胞接种后第一天，通过腹膜内给动物使用0.1至0.5ml的被测偶联物、阿霉素或载体对照(无菌水)。偶联物和阿霉素的起始剂量为非致死量最大值，但随后可降低用量。连续5周内以7天为一周期使用相同的剂量。在处死小鼠之前或之时立即检测血清PSA水平。在第5.5周结束时将小鼠处死并称量存在的任何肿瘤的重量。在试验开始和结束称量动物的体重。
实施例9
内源性非PSA蛋白酶对偶联物蛋白水解裂解的体外测定
步骤A：制备蛋白水解组织提取物
所有步骤在4℃进行。将适宜的动物处死并分离出相关的组织并保存在液氮中。将冷冻组织用研钵和研杵粉碎并将此粉碎的组织转移至Potter-Elvejeh均浆器中并加入2体积的缓冲液A(50mM Tris，其中含1.15％氯化钾，pH 7.5)。然后将此组织用研杵捣20个来回，先松散地捣，然后再紧密地捣。将此均浆以10000×g在水平式超离心头(HB4-5)中离心，弃去沉淀并将此上清液以100000×g(Ti70)离心。保存上清液(胞质溶胶)。
将此沉淀再悬浮于缓冲液B(10mM EDTA，其中含1.15％氯化钾，pH7.5)，使用的体积与上述缓冲液A相同。将此悬浮液在杜恩斯均浆器中均浆化并将此溶液以100000×g离心。弃去上清液并将沉淀(膜)再悬浮于缓冲液C(10mM磷酸钾缓冲液，其中含0.25M蔗糖，pH 7.4)，用上述体积的1/2，并用杜恩斯均浆器均浆化。
用Bradford试验测定两种溶液(胞质溶胶和膜)的蛋白质含量。然后将试验的等份试样移出并在液氮中冷冻。在-70℃保存此等份试样。
步骤B：蛋白水解裂解试验
对每个时间点，将20微克的肽-阿霉素偶联物和如步骤A所述制备的并通过Bradfod在反应缓冲液中检测的150微克的组织蛋白置于终体积200微升缓冲液(50mm TRIS，140mM氯化钠，pH 7.2)的溶液中。在0、30、60、120和180分钟检测反应，然后立即在沸水中保持90秒以停止反应。通过HPLC用VYDAC C18 15cm柱在水/乙腈(5％至50％乙腈，在30分钟内)中分析反应产物。
序列表(1)一般信息(i)申请人：Garsky，Victor M.Feng，Dong-MeiDeFeo-Jones，Deborah(ii)发明名称：用于治疗前列腺癌的偶联物(iii)序列数：97(iv)相应地址：(A)地址：Merck & Co.，Inc.(B)街道：P.0.Box 2000，126 E.Lincoln Ave.(C)城市：Rahway(D) 州：NJ(E)国家：USA(F)邮编：07065-0900(v)计算机可读形式：(A)媒体类型：磁盘(B)计算机：IBM兼容机(C)操作系统：DOS(D)软件：FastSEQ Windows 2.0版(vi)当前申请数据：(A)申请号：(B)申请日：(C)分类号：(vii)优先权申请数据：(A)申请号：60/029,224(B)申请日：1996年10月30日(A)申请号：60/042,921(B)申请日：1997年4月4日(viii)律师/代理人资料：(A)姓名：Muthard，David A(B)注册号：35,297(C)参考/登记号：19821Y(ix)通信资料：(A)电话：908-594-3903(B)远程电传：908-594-4720(C)电传：(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：(A)长度：7个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链数：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(ix)特征：(A)名称/要点：其它(B)位置：1...1(D)其它信息：被亲水部分取代的环氨基酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Xaa Xaa Ser Tyr Gln Ser Ser1 5(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：(A)长度：5个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链数：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(ix)特征：(A)名称/要点：其它(B)位置：1...1(D)其它信息：被亲水部分取代的环氨基酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Xaa Tyr Gln Ser Ser1 5(2)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征：(A)长度：7个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链数：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(ix)特征：(A)名称/要点：其它(B)位置：1...1(D)其它信息：被亲水部分取代的环氨基酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Xaa 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Claims (36)
1.用于治疗前列腺癌的偶联物或其药用盐，其中含有连接在寡肽上的细胞毒试剂，其中该寡肽含有被游离前列腺特异性抗原以选择性蛋白水解的方式裂解的氨基酸序列，而其中连接方式是共价键或通过化学连接剂，所述氨基酸序列含有最少一个环氨基酸，该氨基酸带有亲水取代基。
2.权利要求1所述的偶联物，其中细胞毒试剂选自如下一些类型的细胞毒试剂或其药用盐：
a)蒽环类药物，
b)长春花属生物碱药物，
c)丝裂霉素类，
d)博莱霉素类，
e)细胞毒核苷，
f)蝶啶类药物，
g)二炔类(diynenes)，
h)雌莫司汀
i)环磷酰胺，
j)紫杉烷类和
k)鬼臼毒素类。
3.权利要求所述的偶联物，其中细胞毒试剂选自如下一些细胞毒试剂或其药用盐：
a)阿霉素，
b)洋红霉素，
c)柔红霉素，
d)氨基蝶呤，
e)甲氨蝶呤，
f)甲基叶酸，
g)二氯甲氨蝶呤，
h)丝裂霉素C，
i)紫菜霉素(porfiromycine)
j)5-氟尿嘧啶，
k)6-巯基嘌呤，
l)阿糖胞苷，
m)鬼臼毒素，
n)依托泊苷，
o)依托泊苷磷酸盐，
p)马法兰，
q)长春碱，
r)长春新碱，
s)异长春碱，
t)长春地辛，
u)雌莫司汀(estramustine)，
v)顺铂，
w)环磷酰胺，
x)紫杉醇，和
y)环氧长春碱。
4.权利要求2所述的偶联物，其中细胞毒试剂选自阿霉素和长春碱或其细胞毒衍生物。
5.权利要求2所述的偶联物，其中细胞毒试剂是阿霉素或其细胞毒衍生物。
6.权利要求1所述的偶联物，其中寡肽含有选自如下的寡聚体：
a)HaaXaaSerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.：1)；
b)HaaTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.：2)；
c)HaaXaaLysTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.：3)；
d)HaaXaaLysTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.：4)；
e)HaaXaahArgTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.：5)；
f)HaaXaahArgChaGln|SerSer (SEQ.ID.NO.：6)；
g)HaaXaaSerTyrGln|SerXaa (SEQ.ID.NO.：7)；
h)HaaTyrGln|SerXaa (SEQ.ID.NO.：8)；
i)HaaXaaSerChgGln|SerXaa (SEQ.ID.NO.：9)；
j)HaaChgGln|SerXaa (SEQ.ID.NO.：10)；
其中Haa是被亲水部分取代的环氨基酸，Xaa是任何氨基酸，hArg是高精氨酸，Cha是环己基丙氨酸而Chg是环己基甘氨酸。
7.权利要求1所述的偶联物，其中寡肽含有选自如下的寡聚体：
a)HaaXaaSerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.：11)，
b)HaaXaaSerTyrGln|SerAla (SEQ.ID.NO.：12)，
c)AlaHaaXaaSerTyrTyr|Ser (SEQ.ID.NO.：13)，
d)AlaAsnHaaXaaSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.：14)，
e)HaaXaaSerTyrGn|SerSerThr (SEQ.ID.NO.：15)，
f)HaaTyrGln|SerSerThr (SEQ.ID.NO.：16)，
g)HaaXaaSerTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.：17)，
h)HaaTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.：18)，
i)HaaXaaLysTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.：19)，
j)HaaXaahArgTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.：20)，
k)HaaXaaSerTyrGln|SerSerLeu (SEQ.ID.NO.：21)；
l)HaaTyrGln|SerSerLeu (SEQ.ID.NO.：22)；
m)HaaXaaSerTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：23)；
n)HaaTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：24)；
p)HaaXaaSerTyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.：25)；
q)HaaTyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.：26)；
r)HaaXaaSerTyrGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.：27)；
s)HaaTyrGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.：28)；
t)HaaXaaSerChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：29)；
u)HaaChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：30)；
v)HaaXaaSerChgGln|SerNle (SEQ.ID.NO.：31)；
w)HaaChgGln|SerNle (SEQ.ID.NO.：32)；
x)HaaXaaSerChgGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.：33)；
y)HaaChgGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.：34)；
z)hArgChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：35)；and
aa)hArgTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：36).
8.权利要求1所述的偶联物，其中寡肽含有选自如下的寡聚体：
a)4-HypXaaSerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.：37)，
b)4-HypXaaSerTyrGln|SerAla (SEQ.ID.NO.：38)，
c)Ala4-HypXaaSerTyrTyr|Ser (SEQ.ID.NO.：39)，
d)AlaAsn4-HypXaaSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.：40)，
e)4-HypXaaSerTyrGln|SerSerThr (SEQ.ID.NO.：41)，
f)4-HypTyrGln|SerSerThr (SEQ.ID.NO.：42)，
g)4-HypXaaSerTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.：43)，
h)4-HypTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.：44)，
i)4-HypXaaLysTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.：45)，
j)4-HypXaahArgTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.：46)，
k)4-HypXaaSerTyrGln|SerSerLeu (SEQ.ID.NO.：47)；
l)4-HypTyrGln|SerSerLeu (SEQ.ID.NO.：48)；
m)4-HypXaaSerTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：49)；
n)4-HypTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：50)；
p)4-HypXaaSerTyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.：51)；
q)4-HypTyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.：52)；
r)4-HypXaaSerTyrGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.：53)；
s)4-HypTyrGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.：54)；
t)4-HypXaaSerChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：55)；
u)4-HypChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：56)；
v)4-HypXaaSerChgGln|SerNle (SEQ.ID.NO.：57)；
w)4-HypChgGln|SerNle (SEQ.ID.NO.：58)；
x)4-HypXaaSerChgGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.：59)；
y)4-HypChgGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.：60)；
其中4-Hyp是4-羟基脯氨酸，Xaa是任何氨基酸，hArg是高精氨酸，Cha是环己基丙氨酸而Chg是环己基甘氨酸.
9.权利要求1所述的偶联物，其中环氨基酸带有的亲水取代基选自：
其中：R5选自HO-和C1-C6烷氧基；R6选自氢原子、卤素、C1-C6烷基、HO-和C1-C6烷氧基；而t是3或4。
10.用于治疗前列腺癌的通式I的偶联物或其药用盐：
其中：
寡肽是被游离前列腺特异性抗原(PSA)选择性识别并能被游离前列腺特异性抗原的酶活性以蛋白水解的方式裂解的寡肽，其中该寡肽包括下列通式的环氨基酸：
并且其中C末端羰基与阿霉素的氨基以共价键的方式连接；R选自如下：a)氢原子b)-(C＝O)R1a，
R1和R2独立地选自氢原子、OH、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6芳烷基和芳基；
R1a是C1-C6烷基、羟基化芳基、多羟基化芳基或芳基；
R5选自HO-和C1-C6烷氧基；
R6选自氢原子、卤素、C1-C6烷基、HO-和C1-C6烷氧基；并且
n是1、2、3或4；
p是0或1至100之间的整数；
q是0或1，条件是如果p是0，则q是1；
r是1至10之间的整数；而
t是3或4。
11.权利要求10所述的偶联物或其旋光异构体或其药用盐：
其中环氨基酸是R选自如下：a)氢原子，b)-(C＝O)R1a，
R1和R2独立地选自氢原子、C1-C6烷基和芳基；R1a是C1-C6烷基或芳基，n是1、2、3或4；
n′是0、1、2或3；
p是0或1至14之间的整数；
q是0或1，条件是如果p是0，则q是1；
r是1至10之间的整数；
t是3。
12.权利要求10所述的偶联物，其中寡肽是含有选自如下氨基酸序列的寡聚体或其旋光异构体或其药用盐：
a)4-HypXaaSerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.：37)，
b)4-HypXaaSerTyrGln|SerAla (SEQ.ID.NO.：38)，
c)Ala-4-HypXaaSerTyrTyr|Ser (SEQ.ID.NO.：39)，
d)AlaAsn4-HypXaaSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.：40)，
e)4-HypXaaSerTyrGln|SerSerThr (SEQ.ID.NO.：41)，
f)4-HypTyrGln|SerSerThr (SEQ.ID.NO.：42)，
g)4-HypXaaSerTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.：43)，
h)4-HypTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.：44)，
i)4-HypXaaLysTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.：45)，
j)4-HypXaahArgTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.：46)，
k)4-HypXaaSerTyrGln|SerSerLeu (SEQ.ID.NO.：47)；
l)4-HypTyrGln|SerSerLeu (SEQ.ID.NO.：48)；
m)4-HypXaaSerTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：49)；
n)4-HypTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：50)；
p)4-HypXaaSerTyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.：51)；
q)4-HypTyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.：52)；
r)4-HypXaaSerTyrGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.：53)；
s)4-HypTyrGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.：54)；
t)4-HypXaaSerChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：55)；
u)4-HypChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.：56)；
v)4-HypXaaSerChgGln|SerNle (SEQ.ID.NO.：57)；
w)4-HypChgGln|SerNle (SEQ.ID.NO.：58)；
x)4-HypXaaSerChgGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.：59)；
y)4-HypChgGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.：60)；
其中4-Hyp是4-羟基脯氨酸，Xaa是任何氨基酸，hArg是高精氨酸，Cha是环己基丙氨酸而Chg是环己基甘氨酸。
13.权利要求12所述的偶联物，其中Xaa是丙氨酸或异亮氨酸。
14.权利要求10所述的偶联物，选自如下：
其中X是 
SEQ.ID.NO.
琥珀酰基-(4-Hyp)ASChgQ-SV-DOX(3′)
75
戊二酰基-(4-Hyp)ASChgQ-SV-DOX(3′)
76
戊二酰基-(4-Hyp)ASChgQ-SI-DOX(3′)
77
琥珀酰基-(4-Hyp)SSChgQ-SI-DOX(3′)
78
琥珀酰基-(4-Hyp)ASChgQ-SI-DOX(3′)
79
琥珀酰基-(4-Hyp)ASChgQ-SAbu-DOX(3′)
80
戊二酰基-(4-Hyp)SSChgQ-SI-DOX(3′)
81
戊二酰基-(4-Hyp)SSChgQ-SL-DOX(3′)
82
PEG(2)-(4-Hyp)SSChgQ-SL-DOX(3′)
83
琥珀酰基-(4-Hyp)ASChgQ-SThi-DOX(3′)
84
PEG(4)-(4-Hyp)-SSChgQ-SL-DOX(3′)
85
PEG(2)-(4-Hyp)ASChgQ-SThi-DOX(3′)
86
琥珀酰基-3，4-(diOH)PASChgQ-SL-DOX(3′)
87
丙二酰基-(4-Hyp)ASChgQ-SL-DOX (3′)
88
或其旋光异构体或其药用盐。
15.权利要求10所述的偶联物，它们是：
SEQ.ID.NO.
琥珀酰基-(4-反式-L-Hyp)ASChgQ-SV-DOX(3′)
75
戊二酰基-(4-反式-L-Hyp)ASChgQ-SV-DOX(3′)
76
戊二酰基-(4-反式-L-Hyp)ASChgQ-SI-DOX(3′)
77
琥珀酰基-(4-反式-L-Hyp)SSChgQ-SI-DOX(3′)
78
琥珀酰基-(4-反式-L-Hyp)ASChgQ-SI-DOX(3′)
79
琥珀酰基-(4-反式-L-Hyp)ASChgQ-SAbu-DOX(3′)
80
戊二酰基-(4-反式-L-Hyp)SSChgQ-SI-DOX(3′)
81
戊二酰基-(4-反式-L-Hyp)SSChgQ-SL-DOX(3′)
82
PEG(2)-(4-反式-L-Hyp)SSChgQ-SL-DOX(3′)
83
琥珀酰基-(4-反式-L-Hyp)ASChgQ-SThi-DOX(3′)
84
PEG(4)-(4-反式-L-Hyp)-SSChgQ-SL-DOX(3′)
85
PEG(2)-(4-反式-L-Hyp)ASChgQ-SThi-DOX(3′)
86
琥珀酰基-3，4-(二羟基)PASChgQ-SL-DOX(3′)
87
丙二酰基-(4-反式-L-Hyp)ASChgQ-SL-DOX(3′)
88
或其旋光异构体或其药用盐。
16.权利要求10的偶联物是[N-Ac-(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox(SEQ.ID.NO.：68)
或其旋光异构体或其药用盐。
17.权利要求10的偶联物，是(SEQ.ID.No.：71)或其旋光异构体或其药用盐。
18.权利要求10的偶联物是(SEQ.ID.No.：70)或其旋光异构体或其药用盐。
19.权利要求1所述的通式II的偶联物或其药用盐：
其中：
寡肽是被游离前列腺特异性抗原(PSA)选择性识别并能被游离前列腺特异性抗原的酶活性以蛋白水解的方式裂解的寡肽，且该寡肽包括下列通式的环氨基酸：
XL是-NH-(CH2)u-NH-，R选自如下：a)氢原子b)-(C＝O)R1a，
R1和R2独立地选自氢原子、OH、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6芳烷基和芳基；
R1a是C1-C6烷基、羟基化芳基、多羟基化芳基或芳基；
R19是氢原子、(C1-C3烷基)-CO或氯取代的(C1-C3烷基)-CO；
n是1、2、3或4；
p是0或1至100之间的整数；
q是0或1，条件是如果p是0，则q是1；
r是1、2或3；
t是3或4；
u是1、2、3、4或5。
20.权利要求16所述的偶联物，选自如下：
或其药用盐或其旋光异构体。
21.权利要求1所述的通式III的偶联物或其药用盐：
其中：
寡肽是被游离前列腺特异性抗原(PSA)选择性识别并能被游离前列腺特异性抗原的酶活性以蛋白水解的方式裂解的寡肽，且该寡肽包括下列通式的环氨基酸：
Rg和Rh独立地选自氢原子、OH、C1-C6烷基、C1-C6烷基-OH、-C1-C6烷基-二-OH、-C1-C6烷基-三-OH和条件是Rd和Re中至少一个不是氢原子或C1-C6烷基，或者Rg和Rh联合形成-CH2CH2OCH2CH2-双游离基；R19选自氢原子、(C1-C3烷基)-CO或氯取代的(C1-C3烷基)-CO；p是0或1至100之间的整数；q是0或1，条件是如果p是0，则q是1。
22.权利要求18所述的偶联物是
或其药用盐或其旋光异构体。
23.含有药物载体和分散在其中的治疗有效量的权利要求1化合物的药物组合物。
24.含有药物载体和分散在其中的治疗有效量的权利要求10化合物的药物组合物。
25.含有药物载体和分散在其中的治疗有效量的权利要求14化合物的药物组合物。
26.含有药物载体和分散在其中的治疗有效量的权利要求17化合物的药物组合物。
27.治疗前列腺癌的方法，该方法包括给需要的哺乳动物使用治疗有效量的权利要求23的组合物。
28.治疗前列腺癌的方法，该方法包括给需要的哺乳动物使用治疗有效量的权利要求24的组合物。
29.治疗前列腺癌的方法，该方法包括给需要的哺乳动物使用治疗有效量的权利要求25的组合物。
30.治疗前列腺癌的方法，该方法包括给需要的哺乳动物使用治疗有效量的权利要求26的组合物。
31.治疗良性前列腺增生的方法，该方法包括给需要的哺乳动物使用治疗有效量的权利要求23的组合物。
32.治疗良性前列腺增生的方法，该方法包括给需要的哺乳动物使用治疗有效量的权利要求24的组合物。
33.治疗良性前列腺增生的方法，该方法包括给需要的哺乳动物使用治疗有效量的权利要求25的组合物。
34.治疗良性前列腺增生的方法，该方法包括给需要的哺乳动物使用治疗有效量的权利要求26的组合物。
35.通过将权利要求1化合物和药用载体混合而制备的药物组合物。
36.药物组合物的制备方法，包括将权利要求1所述的化合物与药用载体混合。
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