CN113874042A - 病毒感染及活性抑制方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过诱导关于病毒核糖核酸(RNA)的混合的拖尾来预防或治疗病毒感染及感染症的技术。

Description

病毒感染及活性抑制方法

技术领域

本发明在韩国科学技术信息通信部的支持下，由课题编号1711079098完成，上述课题的研究管理机构为基础科学研究院，研究项目名为“基础科学研究院研究运营费用支持”，研究课题名为“通过核糖核酸细胞命运调控研究”，主办机构为基础科学研究院，研究时间为2018年01月01日～2018年12月31日。

本申请要求于2019年5月30日提交且申请号为第10-2019-0064129号的韩国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

本发明涉及通过诱导关于病毒核糖核酸的混合的拖尾来预防或治疗病毒感染及感染症的技术。

背景技术

乙型肝炎为通过血液及血液生成物、如受污染的针的受污染的材料以肠胃外的途径感染，或者，从携带者(carrier)母体通过性传播及从他们的子女垂直传染的病毒性疾病。据世界卫生组织(World Health Organization)统计，全世界20亿以上的人被感染，每年约有4百万名为急性病理，每年有一百万名死亡，以及350万～400万名为慢性携带者(World Health Organization:Geographic Prevalence of Hepatitis B Prevalence,2004.http://www.who.int/vaccines-surveillance/graphics/htmls/hepbprev.htm)。

该病毒，乙型肝炎病毒(HBV)为双链嗜肝病毒(hepatotropic)，仅感染人类及非人类灵长类。病毒复制主要发生在肝中，并且，在较少程度上发生在肾脏、胰腺、骨髓及脾脏中(Hepatitis B virus biology.Microbiol Mol Biol Rev.64:2000；51-68.)。可在血液中检测病毒及免疫标志物，并且，特征性抗原-抗体模式随着时间的推移而演变。第一个可检测的病毒性标志物为HBsAg，其次为乙型肝炎e抗原(HBeAg)及乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(DNA)。潜伏期(incubation period)内的效价可能很高，但是，乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸及HBeAg水平在疾病的发作时开始下降，并且，在疾病的临床高峰期可能无法检测到(Hepatitis B virus infectionnatural history and clinical consequences.N EnglJ Med..350:2004；1118-1129)。HBeAg为可在血液中检测到的病毒性标志物，并且，与活性病毒性复制相关，因此，病毒载量(load)及感染性高(Hepatitis B virus e antigenthedangerous end game of hepatitis B virus.N Engl J Med.347:2002；208-210)。抗-HBsAb及抗-HBcAb(免疫球蛋白G(IgG))的存在示出已感染的个体的恢复及免疫性。

根据美国肝病研究学会(American Association for the Study of LiverDiseases，AASLD)及欧洲肝病学会(European Association for the Study of theLiver，EASL)，目前推荐的乙型肝炎病毒慢性感染治疗法包括干扰素α(IFNα)、聚乙二醇干扰素α-2a(Peg-IFN2a)、恩替卡韦(entecavir)及替诺福韦(tenofovir)。核苷及核甘酸治疗剂(therapies)、恩替卡韦及替诺福韦成功减少病毒载量，但HBeAg血清转化(seroconversion)及HBsAg消失率远低于利用干扰素α治疗剂获取的效果。还利用包含拉米夫定(3TC)、替比夫定(LdT)及阿德福韦(adefovir)的相似的其他治疗剂，但整体上，核苷/核甘酸治疗剂的耐药性发生限制了治疗效果。

因此，在本领域中，需要发现并研发新的抗-病毒性治疗剂。

另外，人巨细胞病毒(HCMV)为属于疱疹病毒家族的普遍存在的病毒。上述病毒由如下的线性双链脱氧核糖核酸构成：包含在被外皮(tegument)包围的衣壳中，并被在其表面上带有糖蛋白尖峰的脂质双层包围。与该家族的其他成员相同地，人巨细胞病毒具有潜伏期及再激活的特性。人巨细胞病毒具有感染许多细胞并潜伏的能力。

在免疫活性宿主中，大部分的人巨细胞病毒感染为轻微的非特异性症状，例如疲劳、不适、中度发热、淋巴结肿大、肝肿大或肝酶轻度升高，是无症状或轻症。但是，之前在健康人群的10％中观察到异种亲和阴性单核细胞增多。

人巨细胞病毒治疗也需要新的战略。

发明内容

技术问题

本发明人阐明了，TENT4A/B参与病毒核糖核酸，更具体地，信使核糖核酸(mRNA)的混合的拖尾(mixedtailing)，由此，有助于抑制宿主细胞中的病毒信使核糖核酸的分解，在抑制作为宿主细胞的对象(subject)的TENT4A/B表达及活性的情况下，通过抑制混合的拖尾来促进病毒核糖核酸的脱腺苷化，并可促进病毒核糖核酸的快速分解，从而完成了本发明。

因此，本发明的目的在于，提供一种用于预防病毒感染或用于治疗病毒感染症的药剂学组合物。

本发明的再一目的在于，提供一种用于预防病毒感染或用于治疗病毒感染症的药剂学组合物的筛选方法。

本发明的另一目的在于，提供一种病毒耐性细胞制备方法。

本发明的还有一目的在于，提供一种核糖核酸序列稳定化方法。

技术方案

根据本发明的一实施方式，本发明提供一种药剂学组合物，上述药剂学组合物为包含参与病毒核糖核酸的混合的拖尾的TENT4A及TENT4B中的一种以上的抑制剂的用于预防病毒感染或用于治疗病毒感染症的药剂学组合物，上述抑制剂为抑制TENT4A及TENT4B中的一种以上的表达的小干扰核糖核酸(siRNA)或短发夹核糖核酸(shRNA)、或者抑制TENT4A及TENT4B中的一种以上的活性的抗体或其抗原结合片段。

本发明人阐明了TENT4A/B有助于抑制病毒核糖核酸，更具体地，有助于抑制参与信使核糖核酸的混合的拖尾的宿主细胞中的病毒信使核糖核酸的分解，并证明了，在抑制作为宿主细胞的对象的TENT4A/B表达及活性的情况下，抑制混合的拖尾，由此，可通过促进病毒核糖核酸的脱腺苷化来促进病毒核糖核酸的快速分解。

核糖核酸拖尾(向3'末端添加非模板化的核甘酸)为最普遍且保存类型的核糖核酸修饰。还以末端核苷酸转移酶(terminal nucleotidyltransferases，TENT)而周知的非规范性(Noncanonical)聚(A)聚合酶转录后在核糖核酸的3'末端掺入核甘酸来调节成熟、稳定性及活性。之前本发明人研发了用于搜索核糖核酸3'末端并测量聚(A)尾长的称为TAIL-seq的方法。在TAIL-seq实验中，发现了关于脊椎动物多个信使核糖核酸(mRNAs)的如尿苷化(uridylation)及鸟苷酸化(guanylation)的非规范性的拖尾事件。末端尿甙基转化酶(TUT4及TUT7)在去除PABPC后对脱腺苷化的多个聚(A)尾(短于～25核甘酸)进行尿苷化。多个U尾，尤其，多个寡聚U尾促进信使核糖核酸衰变。相反。鸟苷酸化对于多个长聚(A)尾发生，保护多个信使核糖核酸免于受到快速脱腺苷化的影响。两种相关酶TENT4A(还称为PAPD7或TUT5)及TENT4B(还称为PAPD5或TUT3)利用间歇性非腺苷残基(通常为鸟苷)延长信使核糖核酸聚(A)尾来生成“混合尾(Mixed tails)”。这种不纯的聚(A)尾妨碍通过CCR4-NOT(CNOT)复合物的脱腺苷化，并提高信使核糖核酸的稳定性。混合的拖尾以起到新型的转录后调控(post-transcriptional regulation)作用的方式提出。

本说明书中的术语“混合的拖尾”是指病毒性核糖核酸，更具体地，病毒性信使核糖核酸的聚(A)尾序列部分的一个以上的序列被鸟苷酸化或尿苷化而被如鸟嘌呤或尿苷的其他核酸序列取代的作用。在本说明书中，上述的“混合的拖尾”还可简单记载为“混合拖尾”、“拖尾”等。若在病毒性核糖核酸的聚(A)尾序列发生鸟苷酸化或尿苷化，则抑制相应聚(A)尾的脱腺苷化且延迟信使核糖核酸的分解。

本发明的TENT4A及TENT4B为属于末端核苷酸转移酶的非规范性聚(A)聚合酶，本发明人首次阐明了TENT4A及TENT4B参与病毒信使核糖核酸的聚(A)尾的混合的拖尾。

在本发明的一实例中，本发明的TENT4A及TENT4B源自具有病毒感染风险或处于病毒感染状态的对象。本发明人阐明了，向对象内感染的病毒信使核糖核酸可通过源自对象的TENT4A及TENT4B诱导混合的拖尾。

在本发明的一实例中，本发明的病毒为由TENT4A及TENT4B中的一种以上诱发核糖核酸拖尾的病毒。更具体地，本发明人阐明了，为了TENT4A及TENT4B依赖性调节，转录后调控元件(post-transcriptional regulatory element，PRE)，更具体地，CNGGN-类型的五环(pentaloop)起到重要作用。并且，本发明人阐明了，乙型肝炎病毒及人巨细胞病毒均以利用五环的相似的方式作用来募集TENT4A/B并诱发混合的拖尾。本发明的乙型肝炎病毒及人巨细胞病毒，具有非常不同的寿命周期和组织特异性的该两种不同的病毒(属于嗜肝脱氧核糖核酸病毒科的病毒和属于疱疹病毒科的病毒)使用用于基因表达的优点的相同战略，这种趋同进化和该顺式作用(cis-acting)元件的简单性表示出该机制还可用于其他病毒中。

在本发明的一具体例中，本发明的病毒为属于嗜肝脱氧核糖核酸病毒科或疱疹病毒科的病毒。

在本发明的一实例中，本发明的属于嗜肝脱氧核糖核酸病毒科的病毒为选自由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)、地松鼠乙型肝炎病毒(Ground Squirrel HepatitisB)、土拨鼠乙型肝炎病毒(Woodchuck Hepatitis B)、鸭乙型肝炎病毒(Duck hepatitis B)及苍鹭乙型肝炎病毒(Heron Hepatitis B)组成的组中的一种以上。

在本发明的一实例中，本发明的属于疱疹病毒科的病毒为选自由传染性喉气管炎病毒(Iltovirus)、马立克病毒(Mardivirus)、盾板病毒(Scutavirus)、单纯疱疹病毒(Simplexvirus)、水痘病毒(Varicellovirus)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus)、鼠巨细胞病毒(Muromegalovirus)、长鼻动物病毒(Proboscivirus)、玫瑰疱疹病毒(Roseolovirus)、淋巴滤泡病毒(Lymphocryptovirus)、玛卡病毒(Macavirus)、马疱疹病毒(Percavirus)及猴病毒(Rhadinovirus)组成的组中的一种以上。

在本发明中使用的术语“小干扰核糖核酸”是指可通过特定信使核糖核酸的切割(cleavage)诱导核糖核酸干扰(RNAi，RNA interference)现象的短双链核糖核酸。由具有与靶基因的信使核糖核酸同源的序列的有义核糖核酸链和具有与其互补的序列的反义核糖核酸链组成。小干扰核糖核酸可抑制靶基因的表达，因此可作为有效的基因敲除方法或基因治疗的方法提供。

小干扰核糖核酸并不限定于核糖核酸相互配对的双链核糖核酸部分完全配对，还可包含因错配(相对应的碱基并不互补)、凸起(在一侧的链没有相对应的碱基)等而未配对的部分。全长为10个至100个碱基，优选为15个至80个碱基，更优选为20个至70个碱基。只要可通过核糖核酸干扰效应抑制靶基因的表达，小干扰核糖核酸末端结构就可具有平(blunt)末端或粘合(cohesive)末端两者。粘合末端结构可具有3'末端侧突出的结构和5'末端侧突出的结构两者。突出的碱基数并不受限。并且，小干扰核糖核酸可在保持靶基因的表达抑制效果的范围内，例如，在一侧末端的突出部分包含低分子核糖核酸(例如，如转运核糖核酸(tRNA)、核糖体核糖核酸(rRNA)、病毒核糖核酸的天然核糖核酸分子或人工核糖核酸分子)。小干扰核糖核酸末端结构无需两侧均具有切割结构，还可以为双链核糖核酸通常的末端位点通过衔接物核糖核酸连接的茎环型结构。

在本发明中使用的小干扰核糖核酸可以为本身具有多核苷酸配对的完整形态，即，在试管中通过直接合成小干扰核糖核酸的两个转化过程引入至细胞内的形态，或者以给药至生物体内后具有这种形态的方式可从一个单链寡核苷酸片段与其的反向(reverse)互补物被间隔区分离的单链多核苷酸衍生的形态，例如，以小干扰核糖核酸在细胞内表达的方式制备的小干扰核糖核酸表达载体或聚合酶链式反应(PCR)-诱导的小干扰核糖核酸表达盒通过转化或感染(infection)过程引入至细胞内的形态。制备小干扰核糖核酸并向细胞或动物引入的方法的确定可根据目的及靶基因产物的细胞生物学功能不同。

在本发明中使用的术语“短发夹核糖核酸”用于克服小干扰核糖核酸的高昂的生物合成费用、低细胞转染效率引起的核糖核酸干扰效应的短时间保持等的缺点，可利用腺病毒、慢病毒及质粒表达载体系统从核糖核酸聚合酶Ⅲ的启动子将其引入至细胞内来表达，这种短发夹核糖核酸通过在细胞中存在的小干扰核糖核酸加工酶(Dicer or RnaseⅢ)转化为具有准确结构的小干扰核糖核酸，由此诱导靶基因的沉默而周知。

在本发明的一实例中，本发明的小干扰核糖核酸例示性地示出于表1中，但并不局限于此。

本发明的抑制TENT4A及TENT4B中的一种以上的活性的抗体包括单克隆抗体及对于其的嵌合抗体、人源化抗体及人抗体，除新的抗体之外，还可包括本技术领域公知的抗体。只要是与TENT4A和/或TENT4B特异性结合，上述抗体不仅包括具有2个重链和2个轻链的全长的完整形态，还包括抗体分子的功能性片段。抗体的分子的功能性片段是指至少拥有抗原结合功能的片段，有Fab、F(ab')、F(ab')2及Fv等。

在本发明的实施例中，使用了下述抗体，但并不局限于此。

抗-TENT4A抗体(invitrogen，PA5-61302)、抗-TENT4A抗体(Atlas Antibodies，HPA045487)、抗-TENT4A小鼠抗体(labmade)、抗-TENT4B抗体(invitrogen，PA5-60177)、抗-TENT4B抗体(Atlas Antibodies，HPA042968)、抗-TENT4B小鼠抗体(labmade)。

在将本发明的组合物用作药剂学组合物的情况下，上述组合物中的有效成分的含量可根据疾病的症状、症状的进展程度、患者的状态等适当调节，例如，以组合物的总重量为基准，可包含0.0001重量百分比至99.9重量百分比，但并不限定于此。上述含量比为以去除溶剂的干燥量为基准的值。

上述药剂学组合物还可包含在药学组合物的制备过程中通常使用的适当的载体、赋形剂及稀释剂，可根据常规的方法以散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳剂、糖浆剂、气雾剂等的口服剂型、外用制剂、栓剂或无菌注射液等的形态剂型化来使用。

在将上述药剂学组合物制剂化的情况下，使用通常使用的填充剂、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等的稀释剂或赋形剂来配制。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这种固体制剂可包含一种以上的赋形剂和/或润滑剂等。用于口服给药的液相制剂包括悬浮剂、口服溶剂、乳剂、糖浆剂等，除了经常使用的作为简单稀释剂的水、液体石蜡之外，还可包含各种赋形剂，例如，湿润剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。用于肠胃外给药的制剂可包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳剂、冻结干燥制剂、栓剂等。

上述药学组合物的优选剂量根据患者的状态及体重、疾病的程度、药物形态、给药途径及时间不同，可由本技术领域的普通技术人员适当选择。为了更优选的效果，以有效成分为基准，本发明的组合物的剂量以1天0.1mg/kg至100mg/kg为佳，但并不局限于此。给药可一天给药一次或者一天给药数次。本发明的组合物可通过各种途径向动物，优选地，包括人类的哺乳动物给药。可预测给药的所有方式，例如，可通过口服、静脉、肌肉、皮下注射等给药。本发明的组合物的药学给药形态能够以有效成分的药学上可接受的盐的形态使用，并且，可单独使用或者以与其他药学活性化合物结合或适当的组合使用。

根据本发明的再一实施方式，本发明提供用于预防病毒感染或用于治疗病毒感染症的药剂学组合物的筛选方法，其包括：步骤(a)，使用病毒转染宿主细胞(host cell)；步骤(b)，对宿主细胞处理药物候选物质；以及步骤(c)，分析处理药物候选物质的实验组的核糖核酸拖尾水平，与药物候选物质未处理对照组的核糖核酸拖尾水平进行比较，在实验组的核糖核酸拖尾水平与未处理对照组相比相对减少的情况下，选定为有效的药物候选物质。

包含在聚(A)尾的腺嘌呤通过鸟苷酸化或尿苷化被如鸟嘌呤或尿苷的其他核酸取代的次数确定核糖核酸拖尾水平。

本发明中的步骤(a)及步骤(b)的执行顺序可随时调换。

在利用试样处理感染病毒的宿主细胞来抑制混合的拖尾的情况下，可将相应试样选定为有效的药物候选物质。

本发明的药物筛选方法在利用通过TENT4A/B的混合的拖尾操作原理的方面具有与作为本发明的再一实施方式的药剂学组合物共同的特性，因此，引用了药剂学组合物的详细的说明记载内容，为了避免本说明书记载过于复杂，将省略重复的记载。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供一种病毒耐性细胞制备方法，其包括敲除(Knock-out)从生物体分离的细胞的TENT4A及TENT4B中的一种以上的表达的步骤。

本发明的敲除可通过利用各种以往周知的多种基因编辑技术来引入，在本说明书中的实施例中，利用了CRISPR-Cas基因组编辑方法(参照：实施例6)，但并不局限于此。

根据本发明的还有一实施方式，本发明提供一种核糖核酸序列稳定化方法，其包括向靶核糖核酸序列插入包含由以下述通式表示的氨基酸序列构成的五环结构的茎环序列的步骤。

通式

5’-CNGGN-3’

上述N各自独立地为选自腺苷(A)及尿嘧啶(U)的一种。

本说明书中的术语“茎环”结构(Stem-Loop Structure)为在单链脱氧核糖核酸或核糖核酸中发生的碱基对之间的结合。将该结构还称为发夹(Hairpin)或发夹结构(Hairpin Structure)。当一条链的两个区域以相反方向读取时，碱基对彼此互补时发生。茎环结构的例示出于图12b，但并不局限于此。

本发明的术语“五环”是指在未形成茎环结构中的碱基对之间的结合的连接位点存在5个碱基的单链序列位点。本发明的茎环结构包括五环结构，例示图示出于图13。

在本发明的一实例中，本发明的茎环结构包括2-15碱基对之间的结合。更具体地，例如，包括2-14碱基对结合、2-13碱基对结合、2-12碱基对结合、2-11碱基对结合、2-10碱基对结合、3-10碱基对结合、3-9碱基对结合，但并不局限于此。碱基对之间的结合可以为腺嘌呤-尿嘧啶结合或胞嘧啶-鸟嘌呤结合，结合的种类并不受限。

向靶核糖核酸序列插入本发明的茎环结构，由此，提高靶核糖核酸序列利用TENT4A/B诱发混合的拖尾的频率，并可期待相应核糖核酸序列的稳定化。

本发明的具体实例示出于图13。

发明的效果

本发明的特征及优点概括如下：

(a)本发明提供一种用于预防病毒感染或用于治疗病毒感染症的药剂学组合物。

(b)本发明提供一种用于预防病毒感染或用于治疗病毒感染症的药剂学组合物的筛选方法。

(c)本发明提供病毒耐性细胞制备方法。

(d)本发明提供通过引入规定的茎环结构序列来使核糖核酸序列稳定化的方法。

(e)在利用本发明的药剂学组合物的情况下，可有效预防及治疗病毒感染。

(f)在利用本发明的核糖核酸序列稳定化方法的情况下，对于所要的核糖核酸序列诱导混合的拖尾，从而可诱导序列稳定化。

附图说明

图1a、图1b、图1c、图1d、图1e、图1f、图1g、图1h示出病毒核糖核酸的广泛的混合尾。在图1a中，细胞及病毒信使核糖核酸的鸟苷酸化尾的分率针对聚(A)尾长为25nt以上的信使核糖核酸而计算(n＝2TAIL-seq实验)。在图1b中，细胞核糖核酸、人巨细胞病毒核糖核酸及核糖核酸2.7(病毒核糖核酸2.7(VRNA2.7))的鸟苷酸化尾的分率针对聚(A)尾长为25nt以上的核糖核酸而计算(n＝1TAIL-seq实验)。图1c为细胞(灰色)及乙型肝炎病毒(黄色)信使核糖核酸的总聚(A)尾长分布。中位数由垂直虚线表示，在括号中表示中位数长度。图1d为细胞(灰色)、人巨细胞病毒(黄色)及病毒核糖核酸2.7(橙色)核糖核酸的总聚(A)尾长分布。中位数由垂直虚线表示，在括号中表示中位数长度。图1e为在TENT4-耗尽的HepG2.2.15细胞中具有25nt以上的聚(A)尾长的乙型肝炎病毒信使核糖核酸的鸟苷酸化的尾的分率(n＝1TAIL-seq实验)。图1f为在TENT4-耗尽的人巨细胞病毒-感染的人包皮成纤维(HFF)细胞中的聚(A)尾长为25nt以上的人巨细胞病毒核糖核酸的鸟苷酸化的尾的分率(n＝1TAIL-seq实验)。在图1g中，通过使用两个单独引物组的实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)测定TENT4-耗尽的HepG2.2.15细胞中的乙型肝炎病毒信使核糖核酸水平。数据由平均±s.e.m.表示(n＝3独立实验)。**P＜0.01；两侧学生t检验(Student’s t-test)。在图1h中，通过使用两个单独引物组的实时荧光定量聚合酶链式反应测定乙型肝炎病毒信使核糖核酸的半衰期。数据由平均±s.e.m.表示(n＝3独立实验)。磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)信使核糖核酸用于归一化。

图2a、图2b示出支持乙型肝炎病毒核糖核酸为通过乙型肝炎病毒的PRE的TENT4的主要信使核糖核酸底物的实验结果。图2a为乙型肝炎病毒基因组(NCBI U95551.1)中的fCLIP-seq文库的标准化的读取范围。由黄色强调表示乙型肝炎病毒的PRE区域。乙型肝炎病毒转录体及其各自的编码序列区域作为参照示出于下方。将输入(input)及正常小鼠免疫球蛋白G(NMG)文库用作阴性对照组。图2b为fCLIP-seq峰簇的丰度(abundance，x轴)及富集得分(enrichment score，y轴)的散点图(scatter plot)。由红点表示乙型肝炎病毒PRE。在该分析中，将大小匹配输入文库(size-matched input library)用作阴性对照组。

图3a、图3b、图3c、图3d、图3e、图3f、图3g、图3h为示出PRE的茎环结构是必须的，但不足于乙型肝炎病毒信使核糖核酸的TENT4-依赖性核糖核酸拖尾(tailing)的图。图3a为在3'UTR中携带PRE的突变及亚区的萤火虫荧光素酶报告基因构建体的简图。蓝色表示La-结合基序(motif)，绿色表示茎环α，红色星号表示点突变(point mutation)的区域。图3b为亲本(parental)HeLaT(灰色)及TENT4 KO(红色)细胞中包含PRE的亚区的报告基因的萤火虫荧光素酶活性。数据由平均±s.e.m.表示(n＝7PRE、PREα及PREβ的独立实验，n＝6其他所有的独立实验)。海肾(Renilla)及对照组载体两者的荧光素酶活性用于归一化。*P＜0.01，**P＜0.001；两侧t-检验(two-sided t-test)。图3c为通过Hire-PAT分析测定的报告基因核糖核酸的聚(A)尾长的分布。包含PREα及PREβ序列的报告基因构建体在TENT4耗尽后转染到HEK293T细胞。图3d为异位(ectopically)表达的野生型TENT4或具有催化失活突变的亲本细胞(parental)或TENT4 KO细胞中的PRE报告基因构建体的萤火虫荧光素酶活性。数据由平均±s.e.m.表示(n＝3独立实验)。海肾及对照组载体均用于归一化。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；两侧学生t检验(two-sided Student’s t-test)。图3e为在3'UTR中携带WPRE的亚区的萤火虫荧光素酶报告基因构建体的简图。图3f为TENT4 KO细胞中的WPRE报告基因构建体的萤火虫荧光素酶活性。数据由平均±s.e.m.表示(n＝3Wβ的独立实验，n＝7其他所有的独立实验)。海肾及对照组载体两者的荧光素酶活性用于归一化。*P＜0.05，**P＜0.01；两侧学生t检验。图3g为乙型肝炎病毒PRE、突变乙型肝炎病毒PRE及WPRE的茎环结构。图3h为TENT4 KO细胞中的在图3a示出的突变PRE报告基因构建体的萤火虫荧光素酶活性。数据由平均±s.e.m.表示(n＝4独立实验)。海肾及对照组载体两者的荧光素酶活性用于归一化。*P＜0.05,**P＜0.01；两侧学生t检验。

图4a、图4b、图4c、图4d、图4e为示出人巨细胞病毒核糖核酸2.7的茎环结构为成为TENT4-依赖性调节的原因的顺式作用核糖核酸元件的图。图4a为核糖核酸2.7-转染的HEK293T细胞中的通过甲醛交联结合(crosslinking)及抗-TENT4A抗体的免疫沉淀后显示的核糖核酸的实时荧光定量聚合酶链式反应。数据由平均±s.e.m.表示(n＝3独立实验)。通过正常小鼠免疫球蛋白G的免疫沉淀用于标准化。**P＜0.01，***P＜0.001；两侧学生t检验。图4b为3'UTR中携带人巨细胞病毒核糖核酸2.7的亚区及突变的萤火虫荧光素酶报告基因构建体的简图。绿色表示茎环，红色星号表示点突变。在左侧示出人巨细胞病毒核糖核酸2.7的茎环结构及突变。在1E mut(1E突变)构建体中，环中的红色核苷酸及环底部的C以如显示的方式突变。FRG、片段。图4c至图4e为亲本细胞及TENT4 KO细胞中的报告基因的萤火虫荧光素酶活性。数据由平均±s.e.m.表示。具有核糖核酸2.7的亚区的报告基因(n＝3独立实验)(图4c)、核糖核酸2.7的片段1(1-513)的部分缺失突变(n＝3独立实验)(图4d)、以及构建体1D、1E即1E的茎环突变(n＝3独立实验)(图4e)。海肾及对照组载体两者的荧光素酶活性用于归一化。*P＜0.05，**P＜0.01；两侧学生t检验。

图5a、图5b、图5c、图5d为示出包括ZCCHC14的包含SAM结构域的蛋白质与茎环结构结合并调节乙型肝炎病毒信使核糖核酸的图。图5a为从HEK293T细胞裂解物(cell lysate)的SL2.7核糖核酸沉降(pulldown)的质谱分析(mass spectrometry analysis)(n＝2质谱实验)。将SL2.7突变及“仅珠(bead only)”样品用作阴性对照组。蛋白质富集得分作为从关于突变数据的SL2.7样品的非标记定量(label-free quantification，LFQ)强度的log₂倍变化计算。光谱系数用于过滤富集(enrichment)候选物。在图5b中，顶部(top)为具有假定的核糖核酸-结合SAM结构域的蛋白质的系统树(phylogenetic tree)。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，Sc)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe，Sp)、白色念珠菌(Candida albicans，Ca)、秀丽隐杆线虫(C.elegans，Ce)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster，Dm)、斑马鱼(Danio rerio，Dr)、非洲爪蟾(Xenopus laevis，Xl)、小家鼠(Mus musculus，Mm)及人类(Homo sapiens，Hs)。星号表示基于系统树的手动基因名称分配。UniProt ID罗列在方法部分。底部，底部(bottom)为具有SAM结构域的3个人类蛋白质的结构域结构。橙色表示SAM结构域，紫色表示CCHC锌指(zinc finger，ZnF)结构域。图5c为使用显示的抗体进行蛋白质印迹后从HEK293T细胞沉降生物素化的SL2.7的沉降。星号表示交叉反应带。在图5d中，通过使用两组引物的实时荧光定量聚合酶链式反应测定ZCCHC14-耗尽的及SAMD4A/B-耗尽的HepG2.2.15细胞中的乙型肝炎病毒信使核糖核酸水平。数据由平均±s.e.m.表示(n＝4独立实验)。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；两侧t-检验。关于图5c的未切割的印记及关于图5d的图表的源数据可在网上利用。

图6a、图6b、图6c、图6d、图6e、图6f、图6g为示出细胞质ZCCHC14为茎环结构，为了保护核糖核酸而募集(recruit)TENT4的图。在图6a中，在ZBHC14-耗尽的HepG2.2.15细胞中对于具有25nt以上的聚(A)尾长的信使核糖核酸计算乙型肝炎病毒信使核糖核酸的鸟苷酸化的尾的分率。在图6b中，对照组(灰色)及ZCCHC14-耗尽的HepG2.2.15细胞(红色)中的乙型肝炎病毒信使核糖核酸的总聚(A)尾长分布、中位数由垂直虚线表示，在括号中表示中位数。图6c为在ZCCHC14-耗尽的HEK293T细胞中携带人巨细胞病毒核糖核酸2.7 1E、乙型肝炎病毒PREα、WHV WPRE(Wγ+Wα)及其各自的突变(1E mut、αmut2及Wγ+Wαmut)的报告基因的萤火虫荧光素酶活性。数据由平均±s.e.m.表示(n＝4PREα及αmut2的独立实验，n＝3其他所有的独立实验)。重要的是，WPRE突变报告基因(Wγ+Wαmut)在WPREα茎环结构中均由点突变构成(辅助图6b)。海肾及对照组载体两者的荧光素酶活性用于归一化。*P＜0.05；两侧学生t检验。图6d为HepG2.2.15细胞中的利用抗-ZCCHC14抗体进行免疫沉淀后指定的核糖核酸的实时荧光定量聚合酶链式反应。数据由平均±s.e.m.表示(n＝3独立实验)。使用正常兔免疫球蛋白G的免疫沉淀用于标准化。*P＜0.05；两侧学生t检验。在图6e中，通过超离心细胞分离法(subcellular fractionation)及蛋白质印迹在HeLaT细胞中检测到ZCCHC14蛋白质的局部化(localization)：细胞质(Cyto)、膜(Memb)及核(Nuc)。将磷酸甘油醛脱氢酶(细胞质)、GM130(高尔基体)及组蛋白H3(核)用作分离标志物。在图6f中，通过抗-TENT4A及抗-TENT4B进行免疫沉淀后，为了在HeLaT细胞质提取物中测定TENT4A/B与ZCCHC14之间的物理相互作用而使用蛋白质印迹。利用核糖核酸酶A(RNase A)处理细胞提取物。将磷酸甘油醛脱氢酶用作加载对照组。图6g为所提出的模型。乙型肝炎病毒信使核糖核酸及人巨细胞病毒核糖核酸2.7为了诱导靶混合拖尾(targeted mixed tailing)而通过CNGGN五环募集TENT4-ZCCHC14复合物，这之后保护病毒核糖核酸免受于细胞衰变元件的影响。

图7a、图7b、图7c、图7d、图7e、图7f、图7g、图7h、图7i、图7j、图7k、图7l、图7m为示出病毒核糖核酸的广泛的3'末端尾(3'end tail)修饰的图。在图7a中，乙型肝炎病毒信使核糖核酸在HepG2.2.15细胞中的呈高度混合的尾(G：鸟苷酸化，U：尿苷化，C：胞苷化(cytidylation))。各修饰的分率包括其相应末端(terminal)及内部(internal)修饰。对于聚(A)尾长为25nt以上的计算胞苷化、尿苷化尾及病毒信使核糖核酸的分率(n＝2TAIL-seq实验)。在图7b中，人巨细胞病毒核糖核酸也在人巨细胞病毒-感染的人包皮成纤维细胞中呈高度混合尾。尤其，人巨细胞病毒核糖核酸2.7(病毒核糖核酸2.7)实质上为混合尾(n＝1TAIL-seq实验)。图7c为在人巨细胞病毒-感染的人包皮成纤维细胞中分析细胞(灰色)及病毒(黄色)信使核糖核酸的鸟苷酸化尾的基因-水平。在图7d中，通过实时荧光定量聚合酶链式反应确认小干扰核糖核酸敲减(knockdown)。在图7e中，在TENT4-耗尽的(depleted)HepG2.2.15细胞中，乙型肝炎病毒信使核糖核酸的混合尾的分率减少。在图7f中，在人巨细胞病毒-感染的人包皮成纤维细胞中诱导TENT4A/B表达。在人巨细胞病毒-感染的人包皮成纤维细胞中，通过实时荧光定量聚合酶链式反应(n＝1)测定TENT4A及TENT4B核糖核酸水平。在图7g中，在TENT4-耗尽的人巨细胞病毒-感染的人包皮成纤维细胞中，人巨细胞病毒核糖核酸2.7的混合尾的分率减少。在图7h中，乙型肝炎病毒信使核糖核酸在TENT4-耗尽的HepG2.2.15细胞中示出更短的聚(A)尾长。中位数由垂直虚线表示，在括号中示出。图7i为在人巨细胞病毒-感染的人包皮成纤维细胞中，TENT4耗尽后的病毒信使核糖核酸的总聚(A)尾长分布。图7j为TENT4耗尽后的人巨细胞病毒核糖核酸2.7的聚(A)尾长分布。图7k示出乙型肝炎病毒转录体及其相应CDS区域。条形表示实时荧光定量聚合酶链式反应扩增子(#1-3)的位置。图7l为在TENT4-耗尽的HepG2.2.15细胞中的跨聚(A)尾长的乙型肝炎病毒信使核糖核酸的尾修饰。在图7m中，在TENT4耗尽后人巨细胞病毒-感染的人包皮成纤维细胞中，通过实时荧光定量聚合酶链式反应(n＝3独立实验)测定人巨细胞病毒核糖核酸2.7的半衰期。磷酸甘油醛脱氢酶信使核糖核酸用于归一化(normalization)。计算平均。图7a～图7b、图7d～图7g、图7m的图表数据可用作源数据。

图8a、图8b为示出TENT4A/B及乙型肝炎病毒信使核糖核酸相互作用的分析及确认结果的图。在图8a中，TENT4B-结合核糖核酸片段在乙型肝炎病毒的PRE区域中(用黄色突出显示)再次富集(enriched)。fCLIP-seq文库在乙型肝炎病毒基因组(NCBI:U95551.1)中的归一化的读取范围(standardized read coverage)。X-轴可读与图2a相同。在图8b中，通过抗-TENT4A及抗-TENT4B的免疫沉淀(immunoprecipitation)后，为了在HepG2.2.15细胞中测定TENT4-结合核糖核酸的富集而使用实时荧光定量聚合酶链式反应(n＝3独立实验)。使用正常小鼠免疫球蛋白G的免疫沉淀用于标准化。计算了平均，误差条形表示SEM。**P＜0.01，****P＜0.0001；两侧t-检验。图8b的图表数据可用作源数据。

图9a、图9b、图9c、图9d、图9e、图9f为示出确认PRE报告基因的TENT4-依赖性调节的结果的图。在图9a中，通过蛋白质印迹确认敲除(Knockout)。将磷酸甘油醛脱氢酶用作加载对照组。在图9b中，通过实时荧光定量聚合酶链式反应测定携带PRE的亚区的萤火虫(firefly)报告基因的核糖核酸水平(PRE∶PREα∶PREβ，n＝4；αΔ1，n＝2；αΔ2，n＝1独立实验)。海肾及对照组载体两者的信使核糖核酸水平用于归一化。计算了平均，误差条表示SEM。*P＜0.05；两侧t-检验。在图9c中，通过HEK293T细胞中的蛋白质印迹确认小干扰核糖核酸敲减。将磷酸甘油醛脱氢酶用作加载对照组。图9d为TENT4-耗尽的HEK293T细胞中的PRE报告基因构建体的萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)活性(PRE∶PREα∶PREβ，n＝7；αΔ1，n＝6；αΔ2，n＝5独立实验)。海肾及对照组载体两者的荧光素酶活性用于归一化。计算了平均，误差条表示SEM。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；两侧t-检验。在图9e中，通过KO细胞中的蛋白质印迹确认过表达。将磷酸甘油醛脱氢酶用作加载对照组。在图9f中，在具有异位表达的TENT4野生型或突变型的TENT4 KO细胞中，通过实时荧光定量聚合酶链式反应(n＝3独立实验)测定用于救援实验(rescue experiment)的萤火虫报告基因的核糖核酸水平(n＝3独立实验)。海肾及对照组载体两者的信使核糖核酸水平用于归一化。计算了平均，误差条表示SEM。*P＜0.05，**P＜0.01；两侧t-检验。关于图9a、图9c、图9e的未切割的印记及关于图9b、图9d、图9f的图表的数据可用作源数据。

图10a、图10b、图10c、图10d、图10e为示出核糖核酸2.7报告基因的TENT4-依赖性调节的确认结果。在图10a中，通过核糖核酸2.7-转染的HEK293T细胞中的蛋白质印迹确认利用抗-TENT4A的免疫沉淀。将正常小鼠免疫球蛋白G(Normal mouse IgG，NMG)用作阴性对照组。核糖核酸2.7转录体与表示实时荧光定量聚合酶链式反应扩增子的位置的条形一同示出。图10b～图10e为携带下述的萤火虫报告基因的核糖核酸水平，图10b中携带核糖核酸2.7的亚区(n＝3独立实验)，图10c中携带核糖核酸2.7的片段1(1-513)的缺失构建体(n＝3独立实验)，图10d中携带构建体1D(314-413)、1E(414-513)及茎环(stem-loop)突变1E(n＝3独立实验)，图10e中携带亲本细胞及TENT4 KO细胞中的构建体SL2.7(414-463)及对照组(n＝3独立实验)。海肾及对照组载体两者的信使核糖核酸水平用于归一化。计算了平均，误差条由SEM表示。*P＜0.05，**P＜0.00.0；两侧t-检验。关于图10a的未切割的印记及关于图10b～图10e的图表的数据可用作源数据。

图11为确认ZCCHC14及SAMD4A/B敲减的图。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(n＝4独立实验)及HepG2.2.15细胞中的蛋白质印迹确认小干扰核糖核酸敲减。计算了平均，误差条由SEM表示。****P＜0.0001；两侧t-检验。将磷酸甘油醛脱氢酶用作加载对照组。

图12a、图12b、图12c、图12d、图12e为示出ZCCHC14敲减、茎环-依赖性尾调节及免疫沉淀的确认结果的图。在图12a中，通过ZCCHC14-耗尽的HEK293T细胞中的蛋白质印迹确认小干扰核糖核酸敲减。将磷酸甘油醛脱氢酶用作加载对照组。虚线表示相同凝胶(gel)中的不连续泳道(lane)。图12b为WPREα的茎环结构及其各自的突变。图12c为通过Hire-PAT分析测定的报告核糖核酸的聚(A)尾长的分布。报告基因构建体在ZCCHC14耗尽后转染到HEK293T细胞内。在图12d中，通过HepG2.2.15细胞中的蛋白质印迹确认利用抗-ZCCHC14的免疫沉淀。将正常兔免疫球蛋白G(Normal rabbit IgG，NRG)用作阴性对照组。在图12e中，利用抗-TENT4A及抗-TENT4B的免疫沉淀后的蛋白质印迹为了测定HepG2.2.15及原代(primary)人包皮成纤维细胞中的TENT4A/B与ZCCHC14之间的物理相互作用而使用。利用核糖核酸酶A处理细胞提取物。将正常小鼠免疫球蛋白G用作阴性对照组。星号表示交叉反应带(cross-reacting band)。关于图12a、图12d～图12e的未切割的印记可用作源数据。

图13为表示包含五环的茎环结构。

本发明的将茎环结构插入于靶核糖核酸序列的方法可通过现有的公知的各种方法执行，并不特别受限。

具体实施方式

以下，通过实施例更加详细地说明本发明。这些实施例仅用于具体说明本发明，根据本发明的主旨，本发明的范围并不局限于这些实施例，这对普通技术人员而言是显而易见的。

实施例

实验方法

实施例1：准备TAIL-seq文库及处理数据

TAIL-seq通过现有的周知的方式执行[3]。简要如下：使用处理～50μg的DNaseI(Takara，2270A)的总核糖核酸(＞200nt)，通过Ribo-Zero试剂盒(Epicentre,MRZH11124(discontinued)for primary HFF library or Illumina,TruSeq Stranded Total RNALibrary Prep Human/Mouse/Rat,20020596for HepG2.2.15library)将核糖体核糖核酸(ribosomal RNA)耗尽两次。将核糖体核糖核酸-耗尽的核糖核酸连接到3'衔接头，通过核糖核酸酶T1(RNase T1)(Ambion)进行部分片段化。利用链霉亲和素珠(Invitrogen)沉降片段化的核糖核酸，进行5'磷酸化，并利用6％的尿素-聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶(500nt～1000nt)纯化。将纯化的核糖核酸连接到5'衔接头，进行逆转录并通过聚合酶链式反应扩增。文库在Illumina平台(MiSeq)通过双末端运行(paired-end run)(51×251循环)对PhiXcontrol library v.3(Illumina)及掺入混合物进行测序。TAIL-seq测序数据由保藏编号GSE146600保藏在韩国国家生命工程信息中心(NCBI)基因表达综合(GEO)数据库中。TAIL-seq分析通过使用Tailseeker v.3.1.5[9]来执行。简而言之，将Read 1用于基因识别，使用Read 2来检测3'末端修饰，并测量聚(A)尾长。对于各个TAIL-seq文库，Read 1映射到具有STAR 2.5.2b[50]的人类基因组GRCh38及具有bowtie2.2.6[51]的乙型肝炎病毒基因组NCBI U95551.1或人巨细胞病毒基因组NCBI GU937742.2。仅将聚(A)尾长为25nt以上的TAIL-seq片段以如之前的方式[6]使用。在Read 2中，通过研究具有末端或内部单-鸟苷酸化(或-胞苷化、-尿苷化)的3'末端10-mer序列来推定聚(A)尾的非-腺苷掺入分率(fraction)。

实施例2：准备fCLIP-seq文库及处理数据

fCLIP-seq稍作调整并如前所述的方式执行[16、52]。简而言之，利用0.1％地多聚甲醛(Pierce，28906)将两个150mm培养皿上的HepG2.2.15细胞交联，收集并裂解。将各个15μg的抗体(正常小鼠免疫球蛋白G，Santa Cruz，sc-2025；TENT4A，实验室制备；TENT4B，实验室制备)缀合在蛋白A及G琼脂糖珠(1∶1混合，共20μl，GE Healthcare，分别为17-5138-01及17-0618-01)。裂解物与抗体-偶联的珠一同培养，从洗脱液中纯化核糖核酸后，执行DNaseI处理及洗涤。之后，针对文库制备1μg的输入核糖核酸(input RNA)或源自各个样品的核糖核酸。通过Ribo-Zero试剂盒(Illumina,TruSeq Stranded Total RNA Library PrepHuman/Mouse/Rat,20020596)将核糖体核糖核酸耗尽两次。将核糖体核糖核酸-耗尽的核糖核酸连接到3'衔接头，通过6％的尿素-聚丙烯酰胺凝胶(80nt～500nt，与通过超声波处理片段化的50nt～470nt的核糖核酸相对应)纯化，之后，执行5'磷酸化、5'衔接头连接、逆转录及聚合酶链式反应扩增。fCLIP-seq文库利用PhiX control library v.3(Illumina)在Illumina平台(MiSeq)通过双末端运行(151×151循环)进行测序。fCLIP-seq测序数据由保藏编号GSE146597存储在NCBI GEO数据库。

对于各个fCLIP-seq文库，利用pear v.0.9.10[53]组装双末端读取值，通过STAR2.5.2b[50]校准人类基因组GRCh38，通过bowtie2.2.6[51]校准乙型肝炎病毒基因组NCBIU95551.1。利用bedtools v.2.26.0计算fCLIP-seq文库的Raw read coverage。通过使用200nt(-z 200)的簇大小、内部归一化(-n)、对数转换(-l)及具有正常小鼠免疫球蛋白G文库的Piranha v1.2.1[54]作为协变量来推定细胞信使核糖核酸的fCLIP-seq峰簇。作为参照，乙型肝炎病毒PRE跨度约为400nt。通过TENT4 fCLIP-seq文库及正常小鼠免疫球蛋白G文库的读取值的log2比计算峰簇的富集得分。将输入文库用作该分析的阴性对照组(negative control)[55]。为了说明读取范围的技术背景，使用了对于乙型肝炎病毒基因组的Hodges-Lehmann推定。具体地，若提供长度n的乙型肝炎病毒基因组，则计算下一组的中位数(median)。

{(X_i+X_j)/2∶1≤i≤j≤n}

其中，X_i和X_j分别为位置i和j中的原始读取覆盖率(raw read coverage)。之后，通过该Hodges-Lehmann推定将原始读取覆盖率归一化(normalized)，并使用ggplot2 R包进行可视化。

实施例3：细胞培养、转染及放线菌素D处理

在该研究中使用的所有细胞株均进行了支原体-阴性试验。HeLaT源自在TUT4基因中具有null突变的HeLa(由首尔大学C.-H.Chung提供)。HeLaT及HEK293T(由首尔大学S.Kim提供)细胞通过ATCC(STR分析(profiling))认证。HepG2.2.15、HeLaT及HEK293T细胞在包含10％的胎牛血清(FBS)(Welgene，S001-01)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)(Welgene，LM001-05)中生长。原代人包皮成纤维(ATCC SCRC-1041)细胞在包含10％的胎牛血清(HyClone)、GlutaMAX-1(Gibco)及青霉素-链霉素(Gibco)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(HyClone)中生长。转染之前，将原代人包皮成纤维在不含抗生素的培养基中生长。

在组合敲除(combinatorialknockdown)的情况下，对于靶基因混合相同量的小分子干扰核糖核酸(small-interfering RNA)或GAPmer来使最终浓度成为如下述所说明。在TENT4A及TENT4B敲减的情况下，在第0天、第2天及第4天，通过脂质体RNAiMAX(Invitrogen)利用100nM的小干扰核糖核酸转染HepG2.2.15细胞，并在第6天收集。对于ZCCHC14、SAMD4A及SAMD4B敲减，在第0天及第2天，利用通过脂质体RNAiMAX(Invitrogen)的100nM的小干扰核糖核酸或GAPmer转染HepG2.2.15细胞，并在第4天收集。在第0天，利用通过脂质体3000用于表达用于核糖核酸免疫沉淀的核糖核酸2.7的pCK载体转染HEK293T细胞，在第2天收集。在第0天及第2天，通过DharmaFECT 1(Dharmacon)并利用20nM的小干扰核糖核酸转染原代人包皮成纤维细胞，并在第5天收集。小干扰核糖核酸的序列信息示出于表1。

表1

为了HepG2.2.15中的更好的敲减效率，本发明人从ON-TARGETplus SMARTpool(Dharmacon)购入了关于TENT4A的小干扰核糖核酸以及从Antisense LNA GapmeRStandard(Qiagen，339511LG00236046-DDA)购入关于SAMD4A的GAPmer。将放线菌素D(Sigma，A9415，4μg ml-1)添加至HepG2.2.15细胞来防止转录，在显示的时间收集细胞。

实施例4：人巨细胞病毒感染

通过电穿孔法(electroporation)(Invitrogen，Neon)将HCMV Toledo BAC DNA(由普林斯顿大学T.Shenk提供)转染到原代人包皮成纤维细胞中来制备了感染性人巨细胞病毒颗粒。当观察到100％细胞病变效应(cytopathic effect)时，收集细胞培养上清液，进行离心分离来去除细胞碎片，在-80℃的温度下以1ml的等分试样(aliquots)储存。为了滴定病毒原液，向在盖玻片上生长的原代人包皮成纤维接种稀释的病毒原液1小时，接种24小时后，利用3.7％的甲醛固定。使用0.1％的Triton X-100来使细胞渗透化(permeabilized)，与封闭缓冲液(磷酸缓冲盐水中2％的牛血清白蛋白)一同培养，利用人巨细胞病毒IE1抗体(MAB810R；Millipore)染色后，利用异硫氰酸荧光素(FITC)-偶联的抗-小鼠抗体(115-095-146；Jackson Laboratories)及包含4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的溶液(H1200；Vector Laboratory)进行培养。通过计算人巨细胞病毒IE1阳性细胞的数来计算IE1-阳性细胞与总细胞之比，由此确定感染复数(MOI，the Multiplicity ofinfection)。在人巨细胞病毒感染的情况下，将原代人包皮成纤维细胞与稀释在无血清杜尔贝科改良伊格尔培养基的人巨细胞病毒(感染复数，2)一同培养1小时，利用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，并为了追加培养，在杜尔贝科改良伊格尔培养基中培养。

实施例5：构建质粒

除了FLAG标签外，使用前述的野生型TENT4A及TENT4B异构体(分比为792及666aa)[6]。引入对于催化死亡突变体的点突变(各自为，在TENT4A的情况下为D352A，在TENT4B的情况下为D326A)。在PRE报告基因构建体的情况下，PRE(1154-1687bp)、PREα(1154-1351bp)、PREβ(1352-1687bp)、αΔ1(1276-1351bp)及αΔ2(1154-1275bp)在HepG2.2.15互补脱氧核糖核酸中扩增，在pmirGLO-3XmiR-1载体(vector)[6]中，引入至萤火虫荧光素酶信使核糖核酸序列的3'UTR区域。对于La-结合基序及茎环α的点突变与之前记载的突变体[30]相同。α-mut1、α-mut2及α-mut3通过聚合酶链式反应-指定突变诱发生成。在WPRE报告基因组成的情况下，WPRE(1095-1670bp)、Wγ+Wα(1095-1507bp)、Wα+Wβ(1300-1670bp)、Wγ(1093-1299bp)、Wα(1300-1507bp)、Wβ(1508-1670bp)从pLenti-CMV载体(Addgene，17492)扩增，在pmirGLO-3Xmir-1载体中，引入至萤火虫荧光素酶的3'UTR。对于WPREα的CNGGN五环的点突变以与PRE突变体相似的方式设计。在核糖核酸2.7构建体的情况下，FRG1(1-513bp)、FRG2(414-913bp)、FRG3(814-1313bp)、FRG4(1214-1713bp)、FRG5(1614-2113bp)、FRG6(2014-2513bp)、1ΔA(1-513bp，Δ1-100bp)、1ΔB(1-513bp，Δ101-200bp)、1ΔC(1-513bp，Δ201-300bp)、1ΔD(1-513bp，Δ301-400bp)、1ΔE(1-513bp，Δ401-513bp)、1D(301-400bp)、1E(401-513bp)及SL2.7(414-463bp)从人巨细胞病毒感染的原代人包皮成纤维互补脱氧核糖核酸(cDNA)扩增，从pmirGLO-3Xmir-1载体引入至3'UTR区域。1E及SL2.7突变构建体通过与PRE突变体相同的方式生成。为了核糖核酸免疫沉淀，从pmirGLO-3Xmir-1载体扩增核糖核酸2.7(1-2513bp)，利用pCK载体进行亚克隆。

实施例6：制备TENT4A及TENT4B敲除细胞

为了去除TENT4A及TENT4B，CRISPR-Cas基因组编辑如前所述的方式[56]执行，其中有一个小应用，使用T7核酸内切酶I(NEB，M0302)代替Survey or核酸酶。首先对于TENT4A，使用Metafectene(Biontex，T020)同时转染24-孔板上的6E4 HeLaT细胞和具有单链向导核糖核酸(single-guide RNA)(agccacgttgtgcttccgcg，PAM序列为GGG)的300ngpSpCas9(BB)-2A-GFP-px458质粒(Addgene no.48138)。该HeLaT亲本细胞源自HeLa，在TUT4基因包含null突变。在进行用于确认敲除的单细胞筛选及桑格测序(Sanger sequencing)后，在表2列举了母体及变更的基因组序列，插入的序列由粗体及下划线标出。

表2

使用TENT4A敲除细胞，对于TENT4B追加去除小向导核糖核酸(sgRNA)(gacatcgacctagtggtgtt，PAM序列为TGG)。在表2列举了变更的基因组序列，插入及缺失的序列分别由红色及虚线标出。

实施例7：准备TENT4A及TENT4B抗体

利用TENT4A抗原(源自792aa异构体的126-571aa，NCBI NP_008930.2)或TENT4B抗原(源自666aa异构体的106-533aa，NCBI XP_006721308.1)免疫小鼠并杀死其。将收集的脾细胞与Sp2/O骨髓瘤融合，并选择生成高亲和力抗体的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞腹腔注射到小鼠后，获得腹水(Youngin Frontier Inc.)并用于免疫沉淀实验。

实施例8：蛋白质印迹

将HepG2.2.15细胞裂解在RIPA缓冲液(20mM的Tris-HCl(pH值为7.5)，150mM的NaCl，1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)，10％的NP-40(Sigma，74385)，1％的脱氧胆酸钠(Sigma，D6750)，1％的十二烷基硫酸钠(SDS)(Ambion，AM9823))。将其他细胞裂解在缓冲液D(200mM的KCl，10mM的Tris-HCl(pH值为8.0)，0.2mM的乙二胺四乙酸，0.1％的Triton X-100(Promega，H5142)。将约60μg的裂解物与梯(ladder)(Thermo，26616及26619)一同加载到10％或8％～16％(Novex)的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶。转移到甲醇-活化聚偏二氟乙烯膜(Millipore)后，在包含5％的脱脂乳(skim milk)的包含0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液(PBS-T)中封闭膜，用一抗标记并利用包含0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤3次。培养抗-小鼠或抗-兔辣根过氧化物酶(HRP)-偶联的二抗(Jackson ImmunoResearchLaboratories)，并利用包含0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤3次。化学发光利用WestPico或Femto Luminol试剂(Thermo)执行，通过ChemiDoc XRS+System(BioRad)检测到信号。将抗-TENT4A(1∶500，Invitrogen，PA5-61302；1∶250～1∶500，Atlas Antibodies，HPA045487)、抗-TENT4B(1∶500，Invitrogen，PA5-60177；1∶500，Atlas Antibodies，HPA042968；1∶500，实验室制备)、抗-ZCCHC14(1∶1000～1∶2000，Bethyl Laboratories，A303-096A)、抗-磷酸甘油醛脱氢酶(1∶1000～1∶2000，Santa Cruz，sc32233)、抗-SAMD4B(1∶500，Invitrogen，PA5-53490)、抗-GM130(1∶500，BD Bioscience，610822)及抗-组蛋白H3(1∶2000，Cell signaling，4499)用作一抗。

实施例9：实时荧光定量聚合酶链式反应

使用Trizol试剂(Invitrogen，15596018)或RNeasy MinElute Cleanup Kit(Promega，AS1280)提取总核糖核酸，利用DNaseI处理，使用RNeasy MinElute Cleanup Kit(Qiagen)纯化，利用RevertAid逆转录酶(Thermo)及对于萤光素酶测定样品的oligo dT或对于其他样品的随机六聚体(Invitrogen)进行逆转录。通过SYBR Green分析(Thermo)及StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems)或QuantStudio 3(AppliedBiosystems)测定信使核糖核酸水平。实时荧光定量聚合酶链式反应引物的列表示出于表3。

表3

实施例10：核糖核酸免疫沉淀

在使用HepG2.2.15细胞的TENT4A及TENT4B免疫沉淀的情况下，收集来自一个150mm培养皿的细胞，利用裂解缓冲液(20mM HEPES(pH值为7.0～7.6)，(Sigma，H0887))、4％的NP-40、100mM的KCl、0.1mM的乙二胺四乙酸、10％的甘油、1mM的二硫苏糖醇(DTT)、20Uml^-1核糖核酸酶抑制剂(Ambion，AM2696)、1x蛋白酶抑制剂(Calbiochem，535140)并在冰上溶解，并进行离心分离。将各个0.375μg的抗体(正常小鼠免疫球蛋白G，Santa Cruz，sc-2025；抗-TENT4A，实验室制备；抗-TENT4B，实验室制备)与蛋白A及蛋白G琼脂糖珠偶联(1∶1混合，共10μl)。裂解物与抗体-偶联的珠一同培养后，利用洗涤缓冲剂(除2％的NP-40之外相同的裂解缓冲剂)洗涤。作为用于归一化的掺入，将10ng的萤火虫荧光素酶信使核糖核酸添加至样品后，利用TRIzol试剂纯化核糖核酸，利用DNaseI处理并用于实时荧光定量聚合酶链式反应。相似的方法为了使用HepG2.2.15细胞的ZCCHC14免疫沉淀而使用，并且，在裂解过程中，利用Turbo DNaseI(Ambion，AM2239)处理，分别使用10μg的抗体(普通兔免疫球蛋白G(Cell signaling，2729S)及抗-ZCCHC14(Bethyl Laboratories，A303-096A))。在使用HEK293T细胞(一个100mm的培养皿)的TENT4A免疫沉淀的情况下，相似的方法与各个6μg的抗体(正常小鼠免疫球蛋白G及抗-TENT4A)一同使用，细胞也在收集之前交联结合(0.1％的多聚甲醛)。

实施例11：共免疫沉淀

使用与核糖核酸免疫沉淀相似的步骤，添加Turbo DNaseI及核糖核酸酶A(Thermo，EN0531)。简而言之，裂解来自5个150mm培养皿的HepG2.2.15细胞，将各个17.5μg的抗体(正常小鼠免疫球蛋白G、抗-TENT4A、抗-TENT4B)用于免疫沉淀，这与蛋白A及蛋白G琼脂糖珠(1∶1混合，共25μl)缀合。裂解来自两个150mm培养皿的原代人包皮成纤维细胞，分别将6μg的抗体(正常小鼠免疫球蛋白G、抗-TENT4A、抗-TENT4B)用于免疫沉淀，这与蛋白A及蛋白G琼脂糖珠(1∶1混合，共20μl)偶联。将核糖核酸酶A添加至裂解物来使最终浓度成为0.2μg/μl～0.3μg/μl。为了共免疫沉淀实验，如下所述，通过细胞外分离法获取来自HeLaT细胞的1及1/3 150mm的培养皿的细胞质提取物后，与各个18μg的抗体(正常小鼠免疫球蛋白G、抗-TENT4A、抗-TENT4B)一同用于免疫沉淀。

实施例12：荧光素酶分析及转染

为了萤光素酶报告基因分析，在第0天，通过脂质体3000将24-孔板上的1E5HeLaT细胞转染到200ng的pmirGLO质粒，在第2天收集其。为了恢复实验，在第0天，通过脂质体3000将24-孔板上的1.5E5 HeLaT亲本细胞及TENT4 KO细胞与50ng的pmirGLO质粒一同转染到20ng的null载体或TENT4A/B(1∶1混合)质粒，在2天收集其。在第0天，将HEK293T细胞转染到100nM的小干扰核糖核酸，在第2天，通过脂质体3000将24-孔板上的1.5E5细胞与100ng或200ng的pmirGLO质粒一同追加转染到100nM的小干扰核糖核酸。在第4天，收集HEK293T细胞。为了荧光素酶分析，裂解细胞，根据制造商的说明，利用双荧光素酶报告基因分析系统(Promega)进行分析。

实施例13：细胞内分馏

收集2E6 HeLaT细胞并利用冷磷酸盐缓冲液洗涤。为了获取细胞质分馏，利用200μl的细胞质裂解缓冲剂(0.2μg/μl的洋地黄皂苷(digitonin)(Sigma，D141)、150mM的NaCl，50mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)(pH值为7.0～7.6)、0.1mM的乙二胺四乙酸、1mM的二硫苏糖醇、20U ml-1核糖核酸酶抑制剂、1x蛋白酶抑制剂、1x磷酸酶抑制剂)裂解细胞。在4℃的温度下以2000相对离心力(relative centifugal force)离心分离5分钟后，收集上清液并用作细胞质分馏。在膜及核分馏的情况下，根据制造商的说明使用细胞内蛋白质分离试剂盒(Thermo Scientific，78840)。

实施例14：Hire-PAT分析

如前所记载[3、57]，在毛细管电泳数据的Hire-PAT分析及信号处理经过轻微调整，使得总核糖核酸通过酵母聚(A)聚合酶(Thermo Scientific，74225Z25KU)成为G/I尾。通过桑格测序确认萤火虫荧光素酶基因的聚(A)位点，正向聚合酶链式反应引物示出于表4。

表4

Hire-PAT聚合酶链式反应引物
		Hire-PAT-FireflyLuc-F	GGACAAACCACAACTAGAATG

实施例15：系统发生学分析

为了确认推定茎环结合蛋白，与10的E值阈值一同使用UniProt BLAST分析Drosophila Smaug(UniProtKB Q23972)及人SAMD4A/B(UniProtKB Q9UPU9及Q5PRF9)的核糖核酸-结合SAM结构域的同源物，并没有间隙[58]。用于分析的蛋白质序列：UniProtKBQ08831(S.cerevisiae)、UniProtKB Q9P6R7(S.pombe)、UniProtKB Q5AI80(C.albicans)、UniProtKB O76699(C.elegans)、UniProtKB Q23972(D.melanogaster)、UniProtKB E7F85E7FBA1、A0A0R4IUM4(D.rerio)、UniProtKB Q6GLT9、Q5FWP2、A0A1L8GL36(X.laevis)、UniProtKB Q8CBY1、Q80XS6、Q8VIG0(M.musculus)及UniProtKB Q9UPU9、Q5PRF9、Q8WYQ9(H.sapiens)。将具有基本参数的MUSCLE v.3.8.31[59]用于生成的17个蛋白质序列的多序列排列。使用PhyML v.3.1/3.0aLRT[60]重建系统发生树(phylogenetic tree)，在Phylogeny.fr平台[62]中，使用TreeDyn v.198.3[61]进行可视化。重新调整重建的系统发生树的边缘和叶，为了视觉化，进行手动根植(rooted)。

实施例16：分析核糖核酸沉降

合成核糖核酸2.7茎环(SL2.7)及茎环突变体(SL2.7突变)的3'TEG(tetraethylene glycol spacer)-生物素化核糖核酸(Bioneer Inc.)，序列记载于表5。

表5

利用沉降缓冲液(50mM的Tris(pH值为8.0)、150mM的NaCl、5％的甘油、1mM的二硫苏糖醇、100U ml-1核糖核酸酶抑制剂、1x蛋白酶抑制剂)洗涤对于第一组的链霉亲和素M-270珠(Thermo Scientific，65305)及对于第二组的链霉亲和素磁珠(NEB，S1420S)两次。接着，在4℃的温度下，将SL2.7的10μg的寡核苷酸或其突变体缀合到沉降缓冲剂中的链霉亲和素珠一夜后，利用沉降缓冲剂洗涤。收集来自四个150mm的培养皿的HEK293T细胞后，利用1.5ml的沉降缓冲液溶解后进行超声波处理。离心分离后，将上清液与珠一同培养，并利用1号洗涤缓冲液(50mM的Tris(pH值为8.0)、300mM的NaCl、5％的甘油)、2号洗涤缓冲液(50mM的Tris(pH值为8.0)、150mM的NaCl、5％的甘油、0.1％的Triton X-100)及沉降缓冲剂洗涤。为了洗脱，在1600r.p.m的条件下，将珠与60μl的洗脱缓冲剂(100mM(pH值为7.5)、4％的十二烷基硫酸钠、100mM的二硫苏糖醇)一同在65℃的温度下通过热混合器培养10分钟。接着，将10μl及50μl的洗脱液分别用于蛋白质印迹及质谱。

实施例17：液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析

包含十二烷基硫酸钠的免疫沉淀的蛋白质样品应用于制备助滤剂样品。简而言之，首先还原蛋白质样品，并利用改性ABC缓冲剂(50mM的重碳酸铵(ABC)中的8M尿素)进行烷基化。将烷基化的样品放置于实现调整的30kDa的MWCO Amicon过滤器(Millipore，UFC5030)，在14000g的条件下离心分离30分钟。利用200μl的8M尿素或50mM的ABC缓冲液连续洗涤，在14000g的条件下离心分离15分钟，由此在过滤器单元去除十二烷基硫酸钠。接着，在37℃的温度下，利用2％(w/w)的胰蛋白酶消化蛋白质样品一夜。生成的肽样品应用于C18拉链头清洁(Millipore，Z720070)及LC-MS/MS分析。将内置有3μm的Jupiter C18颗粒(Phenomenex)的自包装长毛细管柱(内部直径为100cm×75μm)及捕集柱(内部直径为3cm×150μm)用于肽分离。以300nl/分钟(min)的流速及100分钟的时间，将95％的溶剂A(包含0.1％的甲酸的水)至40％的溶剂B(包含0.1％的甲酸的乙腈)范围的线性梯度应用于与Orbitrap Fusion Lumos质谱仪(Thermo Scientific)结合的nanoACQUITY UPLC(Waters)上，其使用下述参数起作用：前体扫描范围的m/z 300-1800，前体隔离窗口1.4Th，高能量碰撞解离(HCD)的归一化的碰撞能量的30％，30秒钟的动态排除时间，以及对于全(full)MS或MS/MS扫描dp的m/z 200中的分辨率分别为60000或75000。

对于质谱原始数据文件，在默认设置(初始或主要搜索的前体离子质量公差分别为20ppm或6ppm，碎片离子质量为0.5Da)中，对于人通用蛋白质资源(Uniprot)数据库[58](v.12/5/2018)使用MaxQuant的内置Andromeda搜索引擎[65]并利用MaxQuant(v.1.5.3.30)处理。利用胰蛋白酶/P设置酶特异性，允许最大2个的缺失的切割。半胱氨酸氨基甲基化及甲硫氨酸氧化分别作为固定及可变修饰选择。在蛋白质及肽水平中均需要1％的错误发现率(FDR)。质谱蛋白质组学数据与数据集标识符PXD018061及10.6019/PXD018061一同通过PRIDE[66]合作伙伴存储库存储在ProteomeXchange联盟中。为了说明对于SL2.7构建体的虚假或非特异性结合，将从“仅(only)珠”及突变构建体获取的结果视为技术背景，并设计用于增加蛋白质光谱数的定制的统计测试。利用SL2.7构建体确认的蛋白质p的光谱数设为Np，将背景构建体中的数设为Mp。对于Np≥1的各蛋白质p，计算了富集的统计学显著性(或P值)。

其中，N＝∑_PN_P为光谱总数，ρ＝(M_p+1)/∑_P(M_P+1)为背景概率，B(k；n，p)为利用P的成功概率在n次的尝试中获取k个成功的二项分布。最终，通过Benjamini-Hochberg方法调整P值。当使用技术背景(“仅珠”或突变体)时，调整的P＜0.01的蛋白质视作具有统计学显著性。在第一组或第二组数据集中，为了后续蛋白质强度分析，考虑了具有统计学显著性的蛋白质。为了处理缺失值，数据集的最小非0的强度值被替代。接着，将蛋白质富集得分作为对于突变数据的SL2.7的蛋白质强度的log₂倍变化计算。

结果

1.乙型肝炎病毒和人巨细胞病毒犯利用混合的拖尾工具。

为了研究病毒核糖核酸拖尾并使其特性化，首先，将TAIL-seq应用于两种病毒感染模型：与乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸整合的HepG2.2.15细胞及人巨细胞病毒感染的代人包皮成纤维细胞(primary human foreskin fibroblast；HFF)。HepG2.2.15细胞源自肝亲本细胞肿瘤细胞株HepG2，当支持乙型肝炎病毒颗粒的生产及组装时，用于研究乙型肝炎病毒的寿命周期。与HepG2.2.15细胞有关的TAIL-seq数据对于病毒核糖核酸示出非常高的鸟苷酸化频率(图1a、图7a)。混合拖尾频率(G、U及C系数)在病毒核糖核酸中与细胞核糖核酸相比实质上更高(图7a)。并且，与人巨细胞病毒-感染的人包皮成纤维细胞有关的TAIL-seq数据对于人巨细胞病毒核糖核酸食醋高的鸟苷酸化及混合拖尾频率(图1b及图7b)。修饰主要原因在于人巨细胞病毒的四个更夫且保存的长非编码核糖核酸之一的核糖核酸2.7(图7c，病毒核糖核酸2.7)。乙型肝炎病毒及人巨细胞病毒核糖核酸的尾均与细胞信使核糖核酸相比显著长(图1c、图1d)，这表示，这种病毒核糖核酸可进行与细胞信使核糖核酸相比慢的净(net)脱腺苷化。

为了研究病毒混合拖尾是否由与宿主对应物相同的酶介导，我们耗尽了TENT4A及TENT4B。乙型肝炎病毒信使核糖核酸及人巨细胞病毒核糖核酸2.7的鸟苷酸化及混合的拖尾频率在TENT4A-耗尽的细胞及TENT4B-耗尽的细胞中减少(图1e、图1f及图7d～图7g)。TENT4A及TENT4B的敲减还示出病毒核糖核酸的聚(A)尾变短(图7h～图7j)而使TENT4酶有助于病毒核糖核酸尾的延长。一致地，乙型肝炎病毒信使核糖核酸在TENT4耗尽后下调及不稳定(图1g、图1h及图7k)，这表示乙型肝炎病毒使用TENT4来使信使核糖核酸稳定化。值得注意的是，当没有TENT4时，除补偿机制可能性之外，如寡尿苷化(图7l)的尾修饰未增加。高度稳定的人巨细胞病毒核糖核酸2.7在实验时间窗口(experimental time window)范围内，在核糖核酸半衰期中未示出显著变化(图7m，P＞0.05；两侧学生t检验)，这启示了脱腺苷化后存在追加地下游机制，这将阻止核糖核酸2.7衰变。

2.乙型肝炎病毒核糖核酸为HepG2.2.15细胞中的TENT4的主要底物。

为了说明TENT4募集的机制，在HepG2.2.15细胞中执行甲醛-介导的交联结合及免疫沉淀测序(fCLIP-seq)(图2)。在基于甲醛的交联中，在核糖核酸-蛋白质相互作用为瞬态且结构依赖性的情况下，也有效且强力的捕捉核糖核酸-蛋白质相互作用。使用正常小鼠免疫球蛋白G、TENT4A抗体或TENT4B抗体并利用输入(input)裂解物及免疫沉淀物制备了四个文库。将输入及正常小鼠免疫球蛋白G文库用作用于推定背景的大小匹配的对照组。在乙型肝炎病毒基因组的标准化的读取范围中，使用TENT4A及TENT4B抗体两者来从乙型肝炎病毒基因组确认了实质上丰富的峰(图2a)，这表示乙型肝炎病毒核糖核酸上的TENT4的相互作用位点。对于TENT4B抗体的独立实验示出相似的结果(图8a)。

乙型肝炎病毒核糖核酸由3.2kb的环状(circular)脱氧核糖核酸基因组生成。五个重叠的病毒转录体与共同3'末端序列(～700碱基对)共享聚腺苷酸化位点(图2a)。TENT4结合读取值的3'末端区域达到了丰富的1154～1687(图2a)。该区域与转录后调控元件(PRE)相对应，以提高核糖核酸核释放及稳定化而周知。WPRE(woodchuck hepatitisvirus)的PRE普遍用于增加异位基因表达及慢病毒基因传递。据报告，如La、PTB、磷酸甘油醛脱氢酶及ZC3H18的几种核糖核酸-结合蛋白与PRE相互作用，但它们的相互作用的功能重要性尚不明确。在本发明的fCLIP-seq实验中，乙型肝炎病毒的PRE与人转录体的其他推定的峰簇相比示出最高的富集得分(图2b)。通过免疫沉淀及利用其之后的逆转录(实时荧光定量聚合酶链式反应)的定量聚合酶链式反应确认了TENT4A、TENT4B及乙型肝炎病毒信使核糖核酸之间的相互作用(图8b)。综上所述，这种结果证明了，乙型肝炎病毒信使核糖核酸在HepG2.2.15细胞中是TENT4的主要底物，TENT4通过PRE区域与乙型肝炎病毒信使核糖核酸相互作用。

3.在TENT4-依赖性尾调节中需要乙型肝炎病毒核糖核酸的茎环α。

为了确认被TENT4识别的顺式作用核糖核酸元件，我们在3'非翻译区(UTR)中生成了具有PRE的不同亚区的报告基因(图3a)。PRE由PREα(1154-1351)和PREβ(1352-1687)的两种子元件组成)(图3a)。并且，为了测试TENT4A及TENT4B依赖性，生成了TENT4A及TENT4B敲除(KO)细胞(图9a)。

仅在报告基因中配备完整PRE或PREα的情况下，荧光素酶蛋白及核糖核酸水平通过TENT4依赖性方式显著上调(图3b及图9b)。在TENT4耗尽的人胚肾293T(HEK293T)细胞中获取了相似的结果(图9c、图9d)，确认了TENT4依赖性稳定化中需要PREα。通过Hier-PAT分析测定聚(A)尾长的结果，TENT4耗尽在PREα构建体中缩短聚(A)尾，但PREβ构建体中并不如此(图3c)。

示出TENT4以PREα-依赖性方式通过尾修饰直接作用。并且，在敲除细胞中，在蛋白质及核糖核酸水平两者中，PRE及PREα报告基因表达被异位表达的TENT4挽救(图3d及图9e、图9f)。催化失活的突变体未能恢复活性。因此，当上调包含PREα的信使核糖核酸时，需要TENT4的催化活性。

为了研究PRE的机械保存，使用了与乙型肝炎病毒的PRE同源的土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus，WHV)片段(WPRE)(图3e)。与乙型肝炎病毒的PRE不同地，WPRE由下述三种子元件组成：WPREγ、WPREα及WPREβ。WPREα及WPREβ保存在WHV与乙型肝炎病毒之间，相反，WPREγ独特，且与乙型肝炎病毒的PRE相比负责WPRE的更大的活性。具有WPREα(Wα)的所有构建体示出了TENT4-依赖性上调(图3f)，这表明TENT4介导的机制保存在WHV中。

WPREγ(Wγ)和WPREα(Wα)的组合导出协同效应(图3f)，这启示了，WPREγ可作为对于WHV的TENT4-介导调节的增强因子起作用。

为了在PREα特定核心基序，引入了追加的点突变(图3a)。PREα包含La-结合基序及茎环α(SLα)，据报告，两者均在核糖核酸释放及稳定性中需要。在最近的突变诱发研究中示出了，SLα的La-结合位点及顶端(apical)环序列对于DHQ-1-介导的乙型肝炎病毒基因表达中是必不可少的。值得注意的是，SLα为A-螺旋区位于侧面的单一突出G残基，包含本质上采用CNGG(N)家族环结构的CAGGU五环(图3g，左侧)。SLα的结构在WHV中也进化性保存(图3g，右侧)。为了测试这种元件是否在TENT4依赖性调节中是必须的，生成了妨碍SLα的顶点序列和形状的PREα突变体报告基因(图3a)(图3g，箭头)。La-结基序(αmut1)的突变诱发并不影响TENT4依赖性，SLα突变(αmut2)和双重突变(αmut3)中断PREα功能(图3h)。因此，PREα的茎环(SLα)为在通过TENT4转录后的调节中是必不可少的元件。

4.人巨细胞病毒核糖核酸2.7拥有用于TENT4-依赖性调节的茎环。

除了乙型肝炎病毒信使核糖核酸，人巨细胞病毒核糖核酸2.7(病毒核糖核酸2.7)也进行混合的拖尾(图1b、图1d及图7b)。在使用TENT4A抗体的核糖核酸-免疫沉淀实验后，实时荧光定量聚合酶链式反应示出TENT4A与在HEK293T细胞中异位表达的核糖核酸2.7相互作用(图4a及图10a)，启示了在TENT4A与核糖核酸2.7之间的相互作用中不需要病毒因子。为了确认负责TENT4相互作用的核糖核酸2.7的功能性结构域，生成了包含核糖核酸2.7的部分重叠的片段的报告基因(图4b，FRG1-6)。与TENT4 KO细胞相比，初始两个报告基因(FRG1及FRG2)的蛋白质及核糖核酸水平在亲本细胞中显著高(图4c及图10b)。因此，顺式元件存在于5'末端附近。经发现，在FRG1的部分缺失中，仅1E片段(414-513)赋予TENT4依赖性增强效应(图4d、图4e及图10c、图10d)。1E结构域拥有与PREα及WPREα的SLα的CNGG(N)家族环形态相似的茎环结构(图4b，右侧下端)(图3g)。对于1E的茎环的点突变(1E mut)中断TENT4的调节(图4e及图10d)。包含茎环(之后称为SL2.7的414-463)的更小的50-nt切割片段具有与FRG1及1E相似的活性(图10e)。乙型肝炎病毒PRE及WPRE的SLα存在于核糖核酸的3'末端附近，人巨细胞病毒核糖核酸2.7的SL2.7存在于5'末端附近，这启示了五环能够以与位置无关的方式起作用。

综上所述，本发明证明了TENT4依赖性调节中的SLα-相似结构的功能重要性。

5.细胞质ZCCHC14与茎环结构结合并与TENT4相互作用。

CNGGN五环最初被特性化为与酵母Vts1p的无菌α基序(SAM)结构域结合的Smaug识别元件，Drosophila Smaug介导转录后抑制[32-36]。Schwalbe和同事建议，基于结构相似性，乙型肝炎病毒SLα五环可起到SAM结构域与蛋白质的结合位点作用。但是，TENT4不包含SAM结构域[31]，使用重组TENT4的我们的拖尾分析中未检测到对于PRE-体外的值得关注的亲和力，这示出核糖核酸-相互作用辅助因子。

为了找到识别SLα及SL2.7的潜在辅助因子，利用生物素化的合成SL2.7及HEK293T细胞提取物执行了核糖核酸沉降(图5a)。将环突变体用作阴性对照组。质谱法示出显著富集的六个蛋白质，即，TENT4A、TENT4B、K0355、SAMD4A、SAMD4B及ZCCHC14(图5a)。尤其，具有Smaug-相似SAM结构域的三种人类蛋白质包含在列表中：Smaug的两个同源物(SAMD4A及SAMD4B)及ZCCHC14(图5b)。通过核糖核酸沉降及蛋白质印迹追加确认了ZCCHC14的特异性富集(图5c)。据报告，K0355(或KIAA0355)中没有SAM结构域，与SAMD4B37相互作用，可知K0355并不与五环直接相互作用。为了确认何种SAM结构域蛋白质负责TENT4-依赖性调节，我们重新检讨了乙型肝炎病毒-生成HepG2.2.15细胞。ZCCHC14的敲减并未在SAMD4蛋白质的敲减中减少乙型肝炎病毒核糖核酸水平(图5d及图11)。一致地，最近的全基因组CRISPR筛选报告了ZCCHC14是用于生产乙型肝炎病毒的表面抗原的重要宿主因子。

为了了解ZCCHC14的作用机制，我们执行了ZCCHC14-耗尽的HepG2.2.15细胞中的TAIL-seq实验。证明了，乙型肝炎病毒信使核糖核酸的鸟苷酸化频率减少(图6a)，聚(A)尾在ZCCHC14敲减中实质上缩短(图6b)，在乙型肝炎病毒核糖核酸混合尾中，ZCCHC14起到重要作用。一致地，ZCCHC14耗尽从拥有CNGGN茎-环(核糖核酸2.7 1E、PREα、Wγ+Wα)的报告基因减少荧光素酶表达(图6c)。作为对照，各个五环突变体(1E mut、αmut2、Wγ+Wαmut)在ZCCHC14敲减后为示出显著变化(P＞0.05；两侧雪上t检验)(图6c)，这表明ZCCHC14的功能依赖CNGGN基序。本发明人还通过执行Hire-PAT分析来确认了报告基因多个信使核糖核酸的聚(A)尾长以CNGGN基序-依赖性方式在ZCCHC14耗尽细胞中减少(图12a～图12c)。

通过使用ZCCHC14抗体的核糖核酸免疫沉淀确认了HepG2.2.15细胞中的ZCCHC14与乙型肝炎病毒转录体之间的相互作用(图6d及图12d)。尤其，在HepG2.2.15及原代人包皮成纤维细胞两者中，与核糖核酸酶无关地，ZCCHC14与TENT4A及TENT4B一同共免疫沉淀(图12e)，这表明ZCCHC14与TENT4之间的核糖核酸-非依赖性相互作用。最终，本发明人发现，ZCCHC14主要局限在细胞质(图6e)，ZCCHC14通过使用HeLaT细胞的细胞质分馏与TENT4A及TENT4B共免疫沉淀(图6f)。综上所述，本发明示出，ZCCHC14主要在于细胞质中与TENT4相互作用，并无意中保护包含SLα-相似元件的病毒转录体免受脱腺苷化的影响。

本发明人揭示了在病毒性基因表达中靶向和混合的拖尾的机制(图6g)。乙型肝炎病毒信使核糖核酸及人巨细胞病毒核糖核酸2.7包含在模具ZCCHC14及TENT4时重要的CNGGN五环和顺式作用元件。通过TENT4的混合尾对抗CNOT二腺苷酶复合物来保护病毒核糖核酸。有趣的是，具有非常不同的寿命周期和组织特异性的这两种不同的病毒(属于嗜肝脱氧核糖核酸病毒科的病毒和属于疱疹病毒科的病毒)提出了用于基因表达的优点的相同策略。这种趋同进化和概顺式作用元件的简单性启示了该机制还可用于其他病毒中。

除了混合的拖尾机制外，TENT4B作为核TRAMP复合物(酵母中的Trf4-Air1/2-Mtr4及人类中的TENT4B-ZCCHC7-hMTR4)的成分起作用，参与非正常的转录体的分解或者切割及成熟，或者，参与位于核中的多个小非编码核糖核酸(small noncoding RNAs)的修剪及成熟[5、39-43]。本发明人之前已经表明，混合拖尾作为有别于TRAMP复合物(complex)的模块有助于信使核糖核酸稳定性。考虑hMTR4及ZCCHC7的敲减不影响乙型肝炎病毒蛋白及信使核糖核酸水平，TENT4在乙型肝炎病毒调节中独立于TRAMP复合物起作用。ZCCHC14的细胞质定位(cytoplasmic localization)也启示了，TENT4-ZCCHC14复合物在独立于核TRAMP复合物的亚细胞室中起作用，但并不排除，TENT4-ZCCHC14复合物的微小部分在核中起作用的可能性。

混合的拖尾似乎对乙型肝炎病毒基因表达中尤其重要。在五种信使核糖核酸种中，四种(不包括X的前基因组核糖核酸(pgRNA)、Precore、PreS1及PreS2/S)包含SLα茎环，若TENT4酶耗尽，半衰期实质上减少。在目前的治疗选项中，包含核苷(酸)(nucleos(t)ide)类似物和干扰素α，治疗效果少且通常没有效率，因此，乙型肝炎病毒感染成为每年全世界范围内死亡约8千万名的主要医疗负担。可通过阻断病毒性蛋白，尤其，诱导免疫逃避的病毒性S抗原(HBsAg)的生产来实现功能性治疗。对于病毒性混合尾的发现及病毒基因表达，可提供与参与TENT4及ZCCHC14的新型抗-乙型肝炎病毒药物的发达有关的机制上的见解。为了避免靶向TENT4作用方式的潜在副作用，理解TENT4蛋白质和其伙伴的内源性功能和作用机制非常重要。

经确认，CNGGN五环与核糖核酸-结合SAM蛋白之间的物理相互作用为高度保存且普遍使用的功能性模块。在果蝇(fruit fly)中，Smaug利用nanos信使核糖核酸的CUGGC环识别发夹来诱导信使核糖核酸及时分解。这在前-后轴(anterior-posterior axis)的设置中是必须的。在酵母中，Vts1p为了分解靶向的信使核糖核酸而与具有CNGG(N)五环的信使核糖核酸结合。脊椎动物具有三个核糖核酸-结合SAM蛋白，似乎扩展了相互作用模块的使用。Smaug的脊椎动物直向同源物(ortholog)之一的SAMD4B靶向nanos1信使核糖核酸，在哺乳动物神经发育过程中至关重要。作为Smaug的其他脊椎动物直向同源物的SAMD4A抑制包含五环-的报告基因的翻译，与细胞质病灶的形成有关。其中，本发明人示出，为了相同的机制，尤其，病毒性核糖核酸的利益，通过脊椎动物-特异性蛋白质ZCCHC14以相反目的使用。

Claims (9)

1.一种药剂学组合物，用于预防病毒感染或用于治疗病毒感染症，上述药剂学组合物包含参与病毒核糖核酸的混合拖尾的TENT4A及TENT4B中的一种以上的抑制剂，其特征在于，上述抑制剂为抑制TENT4A及TENT4B中的一种以上的表达的小干扰核糖核酸或短发夹核糖核酸、或者抑制TENT4A及TENT4B中的一种以上的活性的抗体或其抗原结合片段。

2.根据权利要求1所述的药剂学组合物，其特征在于，上述TENT4A及TENT4B源自具有病毒感染风险或处于病毒感染状态的对象。

3.根据权利要求1所述的药剂学组合物，其特征在于，上述病毒为由TENT4A及TENT4B中的一种以上诱发核糖核酸拖尾的病毒。

4.根据权利要求3所述的药剂学组合物，其特征在于，上述病毒为属于嗜肝脱氧核糖核酸病毒科或疱疹病毒科的病毒。

5.根据权利要求4所述的药剂学组合物，其特征在于，属于上述嗜肝脱氧核糖核酸病毒科的病毒为选自由乙型肝炎病毒、地松鼠乙型肝炎病毒、土拨鼠乙型肝炎病毒、鸭乙型肝炎病毒及苍鹭乙型肝炎病毒组成的组中的一种。

6.根据权利要求4所述的药剂学组合物，其特征在于，属于上述疱疹病毒科的病毒为选自由传染性喉气管炎病毒、马立克病毒、盾板病毒、单纯疱疹病毒、水痘病毒、巨细胞病毒、鼠巨细胞病毒、长鼻动物病毒、玫瑰疱疹病毒、淋巴滤泡病毒、玛卡病毒、马疱疹病毒及猴病毒组成的组中的一种。

7.一种用于预防病毒感染或用于治疗病毒感染症的药剂学组合物的筛选方法，其特征在于，包括：

步骤(a)，使用病毒转染宿主细胞；

步骤(b)，对宿主细胞处理药物候选物质；以及

步骤(c)，分析处理药物候选物质的实验组的核糖核酸拖尾水平，与药物候选物质未处理对照组的核糖核酸拖尾水平进行比较，在实验组的核糖核酸拖尾水平与未处理对照组相比相对减少的情况下，选定为有效的药物候选物质。

8.一种病毒耐性细胞制备方法，其特征在于，包括敲除从生物体分离的细胞的TENT4A及TENT4B中的一种以上的表达的步骤。

9.一种核糖核酸序列稳定化方法，其特征在于，

包括向靶核糖核酸序列插入包含由以下述通式表示的氨基酸序列构成的五环结构的茎环序列的步骤，

通式：5’-CNGGN-3’，

上述N各自独立地为选自腺苷及尿嘧啶的一种。

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