JP2023526090A - オリゴヌクレオチド - Google Patents

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Abstract

本発明は、トル様受容体７（ＴＬＲ７）反応を維持し、及び／又はトル様受容体８（ＴＬＲ８）センシングを増強するオリゴヌクレオチドに関する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月１９日に出願されたオーストラリア特許仮出願第２０２０９０１６０６号の優先権を主張するものであり、この仮出願の内容は、それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている。
発明の分野
本発明は、トル様受容体７（ＴＬＲ７）反応を維持し、及び／又はトル様受容体８（ＴＬＲ８）センシングを増強するオリゴヌクレオチドに関する。
発明の背景
米国及び欧州連合における８種のオリゴヌクレオチド－ベースの治療の承認(Yin及びRogge、2019；Al Shaerら、2020)、及び現在第ＩＩＩ相試験から市場に出されているより多くのものの展望(Coutinhoら、2019)により、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の治療上の標的化は、疾患管理において大きな役割を果たすように設定されている。ＲＮＡｓｅ－Ｈ１（イノテルセン、もしくはボラネリルセンなどの、アンチセンスオリゴヌクレオチド［ＡＳＯ］による）又はＡｇｏ２（パチシラン、インクリシランもしくはギボシランなどの、低分子干渉ＲＮＡ［ｓｉＲＮＡ］による）の動員などｍＲＮＡ翻訳に影響を及ぼすため、標的ｍＲＮＡを能動的に分解するため、或いはスプライシング調節を促進するため（エテプリルセン及びヌシネルセンなど、ＡＳＯによる）に、様々な戦略が開発されているが、今日までに承認された全ての治療的オリゴヌクレオチドは、広範囲にわたる化学修飾に頼っていることは、注目に値する。そのような修飾は、ヌクレアーゼによる分解を防ぐために必須であり、且つ標的ｍＲＮＡへの結合親和性に影響を及ぼすこともできる。これらの修飾は、ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格修飾において認められるように、ホスホジエステル（ＰＯ）ヌクレオチド間連結を安定化するためか、又は糖修飾（例えば、２’－Ｏ－メチル［２’ＯＭｅ］、２’－メトキシエチル［２’ＭＯＥ］、２’－フルオロ［２’Ｆ］、もしくはロックド核酸［ＬＮＡ］による）により塩基を安定化するためのいずれかで使用されることができる(Yin及びRogge、2019)。
哺乳動物において、外来性核酸の認識は、病原体に対する免疫反応の重要な構成要素であり、且つとりわけ、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及びＴＬＲ９などのトル様受容体（ＴＬＲ）、レチノイン酸－誘導性遺伝子－Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）－様受容体、ＮＯＤ－様受容体、及びサイクリック－ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）経路を含む、様々な自然免疫系のセンサーにより達成される。従って、選択的オリゴヌクレオチド療法は、そのようなセンサーの直接の関与を通じ強力な免疫反応を引き起こすこと(Hornungら、2005；Kleinmanら、2008；Kriegら、1995；Pichlmairら、2006)は、驚くべきことではなく、このことは、前臨床及び臨床の開発時に、そのような免疫反応を綿密に考慮し且つモニタリングするように産業を方向付けている(Frazierら、2015)。しかしながら、自然免疫系のセンサーによる自己核酸と非自己核酸の間の識別は、病原体においては遭遇することが稀な核酸修飾の存在により調節され得－これは、２’－Ｏメチル化された（２’ＯＭｅ）ヌクレオシドにより認められるように、細菌ＲＮＡよりも、ヒトリボソームＲＮＡにおいて２５倍以上豊富である(Karikoら、2005)。ＴＬＲ７及びＴＬＲ８は、ＲＮＡ分子及び塩基アナログ（イミダゾキノリン及びヌクレオシドアナログなど）を選択的に検出し、且つ２’ＯＭｅ塩基により阻害され、これは自己ＲＮＡと非自己ＲＮＡの間の分子識別を促進する(Karikoら、2005)。従って、２’ＯＭｅを含む治療的オリゴヌクレオチドにおける選択的塩基修飾の組込みは、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８による異常な免疫反応の軽減を助けるための有用な戦略であり(Karikoら、2005；Hammら、2010)、且つ治療的ｓｉＲＮＡに広範に適用される(Coutinhoら、2019)。
しかしこのアプローチはまた、特異的２’ＯＭｅモチーフを含むオリゴヌクレオチド配列によるＴＬＲ７及びＴＬＲ８拮抗作用の場合に認められるように、意図しない免疫抑制効果も生じ得る(Sarvestaniら、2015)。同様に、ＰＳ－修飾されたＤＮＡオリゴヌクレオチドは、配列－依存的様式で(Bayikら、2016)、ＴＬＲ９(Gurselら、2003)、ＴＬＲ７(Beignonら、2005)、ＡＩＭ２(Kaminkskiら、2013)及びｃＧＡＳ(Steinhagenら、2018)によるセンシングを拮抗することも報告されている。決定的には、現在承認されるか又は研究中のほとんどの治療的オリゴヌクレオチドは、ＰＳ及び塩基修飾と組合せられたとすると、そのような組合せが免疫抑制の頻度に影響を及ぼすかどうかは、現時点で定かではない。
従ってトル様受容体７（ＴＬＲ７）及び／又はＴＬＲ８の反応に対する限定された免疫抑制効果を伴うオリゴヌクレオチドの必要性が、存在する。
発明の概要
本発明者らは、オリゴヌクレオチドを設計し且つ試験する一方で、トル様受容体７（ＴＬＲ７）反応を維持することを補助する構造特徴を観察した。
従って一局面において、本発明は、オリゴヌクレオチドの５’端及び／又は３’端の７個の塩基内に、３個の連続ピリミジン塩基を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
別の局面において、本発明は、該オリゴヌクレオチドの５’端に又はそれに向かって、２個の連続シトシン塩基を含むオリゴヌクレオチドに関連している。好適には、この２個の連続シトシン塩基の一方又は両方は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する。
ある実施態様において、先の局面のオリゴヌクレオチドは：
ａ）修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含む、５’領域、
ｂ）リボ核酸、デオキシリボ核酸、又はそれらの組合せの塩基を含む、中間領域、並びに
ｃ）修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含む、３’領域：を含む。
関連する局面において、本発明は、５’領域、３’領域、並びにリボ核酸、デオキシリボ核酸、もしくはそれらの組合せの塩基を含む中間領域を含む、オリゴヌクレオチドを提供し、ここで５’領域及び３’領域の一方又は両方は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含み、且つ以下の少なくとも一つが適用される：
ａ）５’領域は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する３個の連続ピリミジン塩基を含む、
ｂ）５’領域は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含み、並びに５’領域と中間領域の間の接合部は、３個の連続ピリミジン塩基を含む、
ｃ）３’領域は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する３個の連続ピリミジン塩基を含む、
ｄ）３’領域は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含み、並びに３’領域と中間領域の間の接合部は、３個の連続ピリミジン塩基を含む、並びに
ｅ）５’領域は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する２個の連続シトシン塩基を含む。
ある実施態様において、この中間領域は、長さが約２０、約１５又は約１０塩基である。
ある実施態様において、５’領域及び／又は３’領域は、長さが約７、約５、又は約３塩基である。
ある実施態様において、３個の連続ピリミジン塩基は、該オリゴヌクレオチドの５’端及び／又は３’端に又はそれに向かって存在する。
本発明の５’側の３個の連続ピリミジン塩基の例は、配列５’－ＣＵＵ－３’、５’－ＣＵＴ－３’、５’－ＣＣＵ－３’、５’－ＵＵＣ－３’、５’－ＵＵＵ－３’又は５’－ＣＴＴ－３’を有するものを含むが、これらに限定されるものではない。ある実施態様において、５’側の３個の連続ピリミジン塩基は、配列５’－ＣＵＵ－３’を含む。
本発明の３’側の３個の連続ピリミジン塩基の例は、配列５’－ＵＵＣ－３’、５’－ＴＵＣ－３’、５’－ＵＣＣ－３’、５’－ＣＵＵ－３’、５’－ＵＵＵ－３’又は５’－ＴＴＣ－３’を有するものを含むが、これらに限定されるものではない。ある実施態様において、３’側の３個の連続ピリミジン塩基は、配列５’－ＵＵＣ－３’を有する。別の実施態様において、３’側ピリミジン塩基は、配列５’－ＣＵＵＣ－３’を有する。
ある実施態様において、このピリミジン塩基の１、２又は３個全ては、修飾された塩基であるか及び／又は修飾された骨格を有する。
ある実施態様において、接合部の３個の連続ピリミジン塩基は、配列５’－ｍＣｍＵＴ－３’、５’－ｍＣＴＴ－３’、５’－ＴｍＵｍＣ－３’又は５’－ＴＴｍＣ－３’を有し、ここでｍは、修飾された塩基であるか及び／又は修飾された骨格を有する。
本発明に有用な修飾された塩基の例は、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエトキシ、２’－フルオロ、２’－アリル、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］、４’－チオ、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’－架橋、４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’－架橋、２’－ＬＮＡ、２’－アミノ、フルオロアラビノヌクレオチド、トレオース核酸又は２’－Ｏ－－（Ｎ－メチルカルバメート）を含むものを含むが、これらに限定されるものではない。一部の実施態様において、この修飾された塩基は、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－アリル、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］、４’－チオ、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’－架橋、４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’－架橋、２’－アミノ、フルオロアラビノヌクレオチド、トレオース核酸又は２’－Ｏ－（Ｎ－メチルカルバメート）を含む。
本発明に有用な修飾された骨格の例は、ホスホロチオエート、イオウ原子を置換する非－架橋の酸素原子、メチルホスホネートなどのホスホネート、ホスホジエステル、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデート、アミド、メチレン（メチルアミノ）、フロマセタール、チオフロマセタール、ペプチド核酸又はホスホロアミダート、例えばモルホリノホスホロアミダート（ＰＭＯ）、Ｎ３’－Ｐ５’ホスホロアミダイト又はチオホスホロアミダイトを含むものを含むが、これらに限定されるものではない。
ある実施態様において、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、リボ核酸、デオキシリボ核酸、ＤＮＡホスホロチオエート、ＲＮＡホスホロチオエート、２’－Ｏ－メチル－オリゴヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－オリゴデオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－ヒドロカルビルリボ核酸、２’－Ｏ－ヒドロカルビルＤＮＡ、２’－Ｏ－ヒドロカルビルＲＮＡホスホロチオエート、２’－Ｏ－ヒドロカルビルＤＮＡホスホロチオエート、２’－Ｆ－ホスホロチオエート、２’－Ｆ－ホスホジエステル、２’－メトキシエチルホスホロチオエート、２－メトキシエチルホスホジエステル、デオキシメチレン（メチルイミノ）（デオキシＭＭＩ）、２’－Ｏ－ヒドロカルビルＭＭＩ、デオキシ－メチルホス－ホネート、２’－Ｏ－ヒドロカルビルメチルホスホネート、モルホリノ、４’－チオＤＮＡ、４’－チオＲＮＡ、ペプチド核酸、３’－アミダート、デオキシ３’－アミダート、２’－Ｏ－ヒドロカルビル３’－アミダート、ロックド核酸、シクロヘキサン核酸、三環式－ＤＮＡ、２’フルオロ－アラビノ核酸、Ｎ３’－Ｐ５’ホスホロアミダート、連結されたカルバメート、連結されたホスホトリエステル、ナイロン骨格修飾、並びにそれらの任意の組合せを有するか／これらである。
ある実施態様において、修飾された塩基は、２’Ｏ－メチルを含み、及びオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を含む。
前記局面の一部の実施態様において、２個の連続シトシン塩基は、２’－ＬＮＡ及びホスホロチオエート骨格を含む。
ある実施態様において、３個の連続ピリミジン塩基の１、２又は３個全ては、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない。
前記局面のある実施態様において、２個の連続シトシン塩基の一方又は両方は、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない。
別の局面において、本発明は：
ｉ）５’端に、５’－ＣＵＵＧＵ－３’、５’－ＣＣＵＡＵ－３’、５’－ＣＡＵＵＡ－３’、５’－ＣＧＡＡＵ－３’、５’－ＣＵＵＡＵ－３’、５’－ＣＵＵＵＡ－３’又は５’ＡＣＵＧＵ－３’；並びに
ｉｉ）３’端に、５’－ＣＵＵＣＵ－３’、５’－ＣＡＵＡＵ－３’、５’－ＣＵＵＣＵ－３’、５’－ＡＡＵＵＵ－３’、５’－ＡＡＡＵＵ－３’、５’－ＣＣＵＵＣ－３’、５’－ＡＡＵＣＡ－３’又は５’－ＣＧＵＣＵ－３’：を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
前記局面のある実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、末端５’Ｕを含む。別の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、末端５’ＵＣを含む。
ある実施態様において、先に説明されたように、以下のいずれか一つを、５’領域、好ましくは末端に、及び／又は３’領域、好ましくは末端に、含むように、修飾される；
５’－ＡＵＧＧＡＡＵＡＣＵＣＵＵＧＧＵＵＡＣＴＴ－３’及び／又は５’－ＧＵＡＡＣＣＡＡＧＡＧＵＡＵＵＣＣＡＵＴＴ－３’（パチシランと称される、多発性ニューロパシーを治療するために使用されるｓｉＲＮＡの鎖）；
５’－ＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧ－３’（ホミビルセンと称される、サイトメガロウイルス網膜炎を治療するために使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチド）；
５’－ｍＧ－ｍＣ＊－ｍＣ＊－ｍＵ＊－ｍＣ＊－ｄＡ－ｄＧ－ｄＴ－ｄＣ＊－ｄＴ－ｄＧ－ｄＣ＊－ｄＴ－ｄＴ－ｄＣ＊－ｍＧ－ｍＣ＊－ｍＡ－ｍＣ＊－ｍＣ＊－３’、ここでｍは、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）ヌクレオシドであり、及び２’－デオキシヌクレオシドであり、Ｃ及びＵ（＊）の５位にメチル基を伴う（ミポメルセンと称される、ホモ接合性家族性高コレステロール血症を治療するために使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチド）；
５’－ＭｅＵ ＭｅＣ ＭｅＵ Ｇ ＧＴＴＡ ＭｅＣ ＡＴＧＡＡＡ ＭｅＵ ＭｅＣ ＭｅＣ ＭｅＣ－３’、ここで下線付き文字は、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）リボヌクレオチドであり；下線なし文字は、２’デオキシリボヌクレオチドであり；全てのピリミジンは、５－メチル化されており；全ての連結は、ホスホロチオエートである（イノテルセンと称される、遺伝性トランスチレチン-媒介性アミロイド症に罹患した成人の神経損傷の治療に使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチド)；
５’－ＣＵＣＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵＡＧ－３’（エテプリセンと称される、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチド）；
５’－ＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧ－３’、これはホスホロチオエート骨格上で修飾された完全な２′－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）である（ヌシネルセンと称される、脊髄性筋萎縮症を治療するために使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチド）；
５’－ＸＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ－３’、ここで、塩基は、合成中性ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）骨格を介して連結され、並びにＸは、親水性トリエチレングリコール鎖である（ゴロジルセンと称される、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するために使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチド）；もしくは
５’－ＣＡＧＡＡＡＧＡＧＵＧＵＣＵＣＡＵＣＵＵＡ－３’及び／又は５’－ＵＡＡＧＡＵＧＡＧＡＣＡＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＵ－３’（ギボシランと称される、急性肝性ポルフィリン症を治療するために使用されるｓｉＲＮＡの鎖）。更に、そのようなオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において標準のもののような他の修飾を有してよい。
ある実施態様において、先の局面のいずれかのオリゴヌクレオチドは、動物へ投与された場合に、トル様受容体７（ＴＬＲ７）活性を阻害しない。ある実施態様において、この動物はヒトである。
更なる局面において、本発明は、１又は複数の修飾された塩基及び少なくとも４個のチミジンを含むオリゴヌクレオチドを提供し、ここで該オリゴヌクレオチドは、動物へ投与された場合に、トル様受容体８（ＴＬＲ８）活性を増強する。
ある実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、５’Ｕを含む。別の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、５’ＵＣを含む。
ある実施態様において、該オリゴヌクレオチドは：
ａ）修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する、長さが少なくとも５個の塩基の５’領域、
ｂ）少なくとも４個の塩基がチミジンである、１０個の塩基のストレッチを含む中間領域、
ｃ）長さが少なくとも５個の塩基の３’領域：を含む。
更なる実施態様において、少なくとも４個のチミジン塩基は、連続するストレッチ内にある。
別の実施態様において、少なくとも４個のチミジン塩基の１、２、３又は４個は、連続するストレッチ内にない。
また更なる局面において、本発明は：
ａ）長さが少なくとも５個の塩基の５’領域であって、ここでこの５’端は、末端５’－ｍＵｍＣ－３’又は末端５’－ｍＣｍＵ－３’からなり、ここでｍは、修飾された塩基であるか及び／又は修飾された骨格を有するもの、
ｂ）１０個の塩基のストレッチを含む、中間領域であって、ここでこれらの塩基の少なくとも２個は、チミジンであるもの、並びに
ｃ）長さが少なくとも５個の塩基であるか及び／又は修飾された骨格を有する、３’領域：を含むオリゴヌクレオチドであって、
ここで該オリゴヌクレオチドは、動物（ヒトなど）へ投与された場合に、トル様受容体８（ＴＬＲ８）活性を増強する：オリゴヌクレオチドを提供する。
ある実施態様において、前記２つの局面のオリゴヌクレオチドはまた、他の局面に関して規定されたオリゴヌクレオチドでもある。
該オリゴヌクレオチドは、任意のサイズであることができる。好適なサイズの例は、長さが少なくとも約１０、少なくとも約１８、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約２６、少なくとも約２７、少なくとも約２８、少なくとも約２９、少なくとも約３０、少なくとも約４０、約１０～約５０ヌクレオチド、約１８～約５０ヌクレオチド、約１８～約３０ヌクレオチド、約２０～約３０ヌクレオチド、約２０～１，０００ヌクレオチド、約２０～５，０００ヌクレオチド、又は約２０塩基を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明のオリゴヌクレオチドは、様々な目的のために使用されることができる。一実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズし、その翻訳を低下するような、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、遺伝子サイレンシング（ＲＮＡ干渉など）のためのストランド化されたオリゴヌクレオチドであるか、又はその一部を形成する。別の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、トル様受容体８（ＴＬＲ８）活性を増強するが、標的ＲＮＡにハイブリダイズしないために使用される。
一実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ある実施態様において、３個の連続ピリミジン塩基の１、２又は３個全ては、インビボにおいて、エンドヌクレアーゼにより除去される。
ある実施態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、遺伝子の発現をダウンレギュレートし、且つトル様受容体８（ＴＬＲ８）活性を増強する。
ある実施態様において、遺伝子サイレンシングのための２本鎖オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである。
ある実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、長さが１０～１６塩基であり、且つ動物（ヒトなど）へ投与された場合に、トル様受容体８（ＴＬＲ８）活性を増強する。
また更なる局面において、本発明は、標的遺伝子の発現を低下するためのオリゴヌクレオチドを選択する方法を提供し、この方法は：
ｉ）少なくとも３個の連続ピリミジン塩基を伴う領域について、標的ポリヌクレオチド、又はその相補体をスキャニングする工程；
ｉｉ）３個の連続ピリミジン塩基を含む１又は複数の候補オリゴヌクレオチドを作製する工程であって、ここで以下の一方又は両方が適用される工程：
ａ）候補オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドの５’端の７個の塩基内に、３個の連続ピリミジン塩基を含む、及び
ｂ）候補オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドの３’端の７個の塩基内に３個の連続ピリミジン塩基を含む；
ｉｉｉ）１又は複数の候補オリゴヌクレオチドの、標的遺伝子の発現を低下する能力を試験する工程；並びに
ｉｖ）標的遺伝子の発現を低下するオリゴヌクレオチドを選択する工程：を含む。
ある実施態様において、候補オリゴヌクレオチドの３個の連続ピリミジン塩基は、修飾された塩基及び／又は修飾された骨格を有する。
別の局面において、本発明は、標的遺伝子の発現を低下するためのオリゴヌクレオチドを選択する方法を提供し、この方法は：
ｉ）少なくとも３個の連続ピリミジン塩基を伴う領域について、標的ポリヌクレオチド、又はその相補体をスキャニングする工程；
ｉｉ）５’領域、３’領域、並びにリボ核酸、デオキシリボ核酸、もしくはそれらの組合せの塩基を含む中間領域を含む、１又は複数の候補オリゴヌクレオチドを作製する工程であって、ここで５’領域及び３’領域の一方又は両方は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含み、且つ以下の少なくとも一つが適用される工程：
ａ）５’領域は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する３個の連続ピリミジン塩基を含む、
ｂ）５’領域は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含み、並びに５’領域と中間領域の間の接合部は、３個の連続ピリミジン塩基を含む、
ｃ）３’領域は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する３個の連続ピリミジン塩基を含む、並びに
ｄ）３’領域は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含み、並びに３’領域と中間領域の間の接合部は、３個の連続ピリミジン塩基を含む；
ｉｉｉ）１又は複数の候補オリゴヌクレオチドの、標的遺伝子の発現を低下する能力を試験する工程；並びに
ｉｖ）標的遺伝子の発現を低下するオリゴヌクレオチドを選択する工程：を含む。
別の局面において、本発明は、標的遺伝子の発現を低下するために、オリゴヌクレオチドを選択する方法を提供し、この方法は：
ｉ）以下の配列の１つを伴う領域について、標的ポリヌクレオチド、又はその相補体をスキャニングする工程：５’－ＣＵＵＧＵ－３’、５’－ＣＣＵＡＵ－３’、５’－ＣＡＵＵＡ－３’、５’－ＣＧＡＡＵ－３’、５’－ＣＵＵＡＵ－３’、５’－ＣＵＵＵＡ－３’、５’ＡＣＵＧＵ－３’、５’－ＣＵＵＣＵ－３’、５’－ＣＡＵＡＵ－３’、５’－ＣＵＵＣＵ－３’、５’－ＡＡＵＵＵ－３’、５’－ＡＡＡＵＵ－３’、５’－ＣＣＵＵＣ－３’、５’－ＡＡＵＣＡ－３’又は５’－ＣＧＵＣＵ－３’、ここでＵはＴであってよい；
ｉｉ）以下を含む１又は複数の候補オリゴヌクレオチドを作製する工程：
ａ）５’端に、５’－ＣＵＵＧＵ－３’、５’－ＣＣＵＡＵ－３’、５’－ＣＡＵＵＡ－３’、５’－ＣＧＡＡＵ－３’、５’－ＣＵＵＡＵ－３’、５’－ＣＵＵＵＡ－３’又は５’ＡＣＵＧＵ－３’、及び／又は
ｂ）３’端に、５’－ＣＵＵＣＵ－３’、５’－ＣＡＵＡＵ－３’、５’－ＣＵＵＣＵ－３’、５’－ＡＡＵＵＵ－３’、５’－ＡＡＡＵＵ－３’、５’－ＣＣＵＵＣ－３’、５’－ＡＡＵＣＡ－３’又は５’－ＣＧＵＣＵ－３’；
ｉｉｉ）１又は複数の候補オリゴヌクレオチドの標的遺伝子の発現を低下する能力を試験する工程；並びに
ｉｖ）標的遺伝子の発現を低下するオリゴヌクレオチドを選択する工程：を含む。
なお更なる局面において、本発明は、標的遺伝子の発現を低下するためのオリゴヌクレオチドを選択する方法に存在し、この方法は：
ｉ）少なくとも２個の連続シトシン塩基を伴う領域について、標的ポリヌクレオチド、又はその相補体をスキャニングする工程；
ｉｉ）この２個の連続シトシン塩基を含む１又は複数の候補オリゴヌクレオチドを作製する工程であって、ここで候補オリゴヌクレオチドは、２個の連続シトシン塩基を該オリゴヌクレオチドの５’端に又はそれに向かって含む工程；
ｉｉｉ）１又は複数の候補オリゴヌクレオチドの標的遺伝子の発現を低下する能力を試験する工程；並びに
ｉｖ）標的遺伝子の発現を低下するオリゴヌクレオチドを選択する工程：を含む。
一部の実施態様において、該オリゴヌクレオチドの２個の連続シトシン塩基は、修飾された塩基及び／又は修飾された骨格を有する。
他の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは：
ａ）修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含む、５’領域；
ｂ）リボ核酸、デオキシリボ核酸、又はそれらの組合せの塩基を含む、中間領域；並びに
ｃ）修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含む、３’領域：を含む。
一実施態様において、５’領域及び／又は３’領域は、長さが約３塩基である。
別の実施態様において、中間領域は、長さが約１０塩基である。
関連した局面において、本発明は、標的遺伝子の発現を低下するためのオリゴヌクレオチドを選択する方法に関し、この方法は：
ｉ）少なくとも２個の連続シトシン塩基を伴う領域について、標的ポリヌクレオチド、又はその相補体をスキャニングする工程；
ｉｉ）５’領域、３’領域、及びリボ核酸、デオキシリボ核酸、又はその組合せの塩基を含む、中間領域を含む、１又は複数の候補オリゴヌクレオチドを作製する工程であって、ここで５’領域及び３’領域の一方又は両方は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含み、並びに５’領域は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する２個の連続シトシン塩基を含む工程；
ｉｉｉ）１又は複数の候補オリゴヌクレオチドの、標的遺伝子の発現を低下する能力を試験する工程；並びに
ｉｖ）標的遺伝子の発現を低下するオリゴヌクレオチドを選択する工程：を含む。
一実施態様において、５’領域及び／又は３’領域は、長さが約３塩基である。
別の実施態様において、中間領域は、長さが約１０塩基である。
先の２つの局面のある種の実施態様において、２個の連続シトシン塩基の一方又は両方は、修飾された塩基であるか及び／又は修飾された骨格を有する。好適には、先の２つの局面に関して、２個の連続シトシン塩基は、２’－ＬＮＡ及びホスホロチオエート骨格を含む。
先の３つの局面のある実施態様において、この方法は、１又は複数の候補オリゴヌクレオチドの、トル様受容体７（ＴＬＲ７）活性を阻害する能力を試験する工程、及びＴＬＲ７活性を阻害しないオリゴヌクレオチドを選択する工程を更に含む。これに関して、先の局面の方法は、該オリゴヌクレオチドのＴＬＲ７阻害活性を低下するのに適している。
オリゴヌクレオチドを設計し且つ試験する一方で、本発明者らはまた、トル様受容体８（ＴＬＲ８）活性の増強を補助する新規の構造特徴も認めた。
従ってまた更なる局面において、本発明は、標的遺伝子の発現を低下するオリゴヌクレオチドを選択する方法を提供し、この方法は：
ｉ）チミジンである少なくとも４個の塩基を含む領域について、標的ポリヌクレオチド、又はその相補体をスキャニングする工程；
ｉｉ）１又は複数の修飾された塩基及び少なくとも４個のチミジンを含む、１又は複数の候補オリゴヌクレオチドを作製する工程；
ｉｉｉ）１又は複数の候補オリゴヌクレオチドの、標的遺伝子の発現を低下し及びトル様受容体８（ＴＬＲ８）活性を増強する能力を試験する工程；並びに
ｉｖ）標的遺伝子の発現を低下し及びＴＬＲ８活性を増強するオリゴヌクレオチドを選択する工程：を含む。
別の局面において、本発明は、トル様受容体８（ＴＬＲ８）活性を増強するオリゴヌクレオチドを選択する方法を提供し、この方法は：
ｉ）配列ＵＣもしくはＣＵ及び１０個の塩基のストレッチを伴う領域について、標的ポリヌクレオチド、又はその相補体をスキャニングする工程であって、ここでこれらの塩基の少なくとも２個は、チミジンである工程；
ｉｉ）以下を含む１又は複数の候補オリゴヌクレオチドを作製する工程：
ａ）長さが少なくとも５個の塩基の５’領域であって、ここで５’端は、末端５’－ｍＵｍＣ－３’又は末端５’－ｍＣｍＵ－３’からなり、ここでｍは、修飾された塩基であるか及び／又は修飾された骨格であるもの；
ｂ）１０個の塩基のストレッチを含む中間領域であって、ここでこれらの塩基の少なくとも２個は、チミジンであるもの；並びに
ｃ）長さが少なくとも５塩基の、及び／又は修飾された骨格を有する、３’領域；
ｉｉｉ）１又は複数の候補オリゴヌクレオチドの、ＴＬＲ８活性を増強する能力を試験する工程；並びに
ｉｖ）ＴＬＲ８活性を増強するオリゴヌクレオチドを選択する工程：を含む。
一部の場合において、必要とされるピリミジン塩基を伴う好適なオリゴヌクレオチドを設計することは不可能なことがある。或いは、別の場合において、必要とされるピリミジン塩基を欠いている既存のオリゴヌクレオチドの機能を改善することが望ましいことがある。従って別の局面において、本発明は、オリゴヌクレオチドのトル様受容体７（ＴＬＲ７）阻害活性を低下する方法を提供し、この方法は、修飾されたオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの５’端及び／又は３’端の７個の塩基内に３個の連続ピリミジン塩基を含むように、該オリゴヌクレオチドの５’端及び／又は３’端へヌクレオチド配列を付加することにより、該オリゴヌクレオチドを修飾することを含む。
ある実施態様において、１、２又は３個全てのピリミジン塩基は、修飾された塩基であるか及び／又は修飾された骨格を有する。
別の局面において、本発明は、オリゴヌクレオチドのトル様受容体７（ＴＬＲ７）阻害活性を低下する方法を提供し、この方法は、修飾されたオリゴヌクレオチドが、以下の少なくとも１つを含むように、該オリゴヌクレオチドを修飾すること：
ａ）修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する３個の連続ピリミジン塩基を含む５’領域、
ｂ）修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含む５’領域、並びに３個の連続ピリミジン塩基を含む５’領域と中間領域の間の接合部、
ｃ）修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する３個の連続ピリミジン塩基を含む３’領域、並びに
ｄ）修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含む３’領域、並びに３個の連続ピリミジン塩基を含む３’領域と中間領域の間の接合部：を含む。
先の２つの局面のある実施態様において、３個の連続ピリミジン塩基は、修飾されたオリゴヌクレオチドの５’端及び／又は３’端である。
更なる局面において、本発明は、オリゴヌクレオチドのトル様受容体７（ＴＬＲ７）阻害活性を低下する方法を提供し、この方法は、修飾されたオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの５’端に又はそれに向かって２個の連続シトシン塩基を含むように、該オリゴヌクレオチドの５’端へヌクレオチド配列を付加することにより、該オリゴヌクレオチドを修飾することを含む。
ある種の実施態様において、この２個の連続シトシン塩基の一方又は両方は、修飾された塩基であるか及び／又は修飾された骨格を有する。
関連する局面において、本発明は、オリゴヌクレオチドのトル様受容体７（ＴＬＲ７）阻害活性を低下する方法に存在し、この方法は、修飾されたオリゴヌクレオチドが、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する２個の連続シトシン塩基を含む５’領域を含むように、該オリゴヌクレオチドを修飾することを含む。
先の２つの局面の特定の実施態様において、２個の連続シトシン塩基は、修飾されたオリゴヌクレオチドの５’端に又はそれに向かって存在する。
先の２つの局面の他の実施態様において、２個の連続シトシン塩基は、２’－ＬＮＡ及びホスホロチオエート骨格を含む。
先の４つの局面の別の実施態様において、本方法は、修飾されたオリゴヌクレオチドの、ＴＬＲ７活性を阻害する能力を試験する工程、及び未修飾のオリゴヌクレオチドよりもより少ない程度に（ＴＬＲ７）活性を阻害するオリゴヌクレオチドを選択する工程を更に含む。
また本発明の方法を使用し選択されたオリゴヌクレオチド、又は本発明の方法を使用し修飾されたオリゴヌクレオチドも、提供される。
別の局面において、本発明は、表１～６に示された核酸配列又はそのバリアントを含む、からなる又はから本質的になるオリゴヌクレオチドに存在する。
別の局面において、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを含有する組成物を提供する。
ある実施態様において、本組成物は、医薬として許容し得る担体を更に含有する。
別の実施態様において、本組成物は、免疫反応調節物質を更に含有する。
別の局面において、本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を低下する方法を提供し、この方法は、細胞を、本発明のオリゴヌクレオチドと接触させることを含む。
別の局面において、本発明は、対象における疾患を治療又は予防する方法を提供し、この方法は、本発明のオリゴヌクレオチドを対象へ投与することを含み、ここで該オリゴヌクレオチドは、該疾患に関与した標的遺伝子の発現を低下する。
ある実施態様において、動物は、免疫反応調節物質が投与されているか、又は投与されるであろう。
ある実施態様において、この免疫反応調節物質は、トル様受容体（ＴＬＲ）アゴニストである。好適なトル様受容体（ＴＬＲ）アゴニストの例は、塩基アナログ（グアノシンアナログ、デアザ－アデノシンアナログ、イミダゾキノリンもしくは誘導体、ヒドロキシアデニン化合物もしくは誘導体、チアゾロキノロン化合物もしくは誘導体、ベンゾアゼピン化合物もしくは誘導体を含む）、又はＲＮＡ分子を含むが、これらに限定されるものではない。
ある実施態様において、ＴＬＲアゴニストは、グアノシン、ウリジン、レシキモッド（Ｒ８４８）、ロキソリビン、イサトリビン、イミキモド、ＣＬ０７５、ＣＬ０９７、ＣＬ２６４、ＣＬ３０７、８５２Ａ、又はＴＬ８－５０６である。
同じく、対象における疾患を治療又は予防するための医薬品の製造における本発明のオリゴヌクレオチドの使用も提供され、ここで該オリゴヌクレオチドは、該疾患に関与した標的遺伝子の発現を低下する。
更に、対象における疾患の治療又は予防において使用するための本発明のオリゴヌクレオチドが提供され、ここで該オリゴヌクレオチドは、該疾患に関与した標的遺伝子の発現を低下する。
本明細書の任意の実施態様は、別に具体的に言及されない限りは、変更すべきところは変更して、いずれか他の実施態様に適用されるものとする。
本発明は、本明細書に記載された具体的な実施態様により範囲は限定されず、これは単に例証の目的であることが意図される。機能的に同等の生成物、組成物及び方法は、明確に本明細書記載の本発明の範囲内である。
本明細書を通じて、別に具体的に言及されないか又は別に状況が必要としない限りは、単独の工程、物質の組成物、工程の群、又は物質の組成物の群への言及は、単数及び複数の（すなわち、１又はそれよりも多い）それらの工程、物質の組成物、工程の群、又は物質の組成物の群を包含するとされるものとする。
本発明は、以下の非限定的「実施例」により、及び添付された図面を参照し、以下に説明される。
添付図面の簡単な説明
ＴＬＲ７／８によるＲ８４８センシングのＡＳＯ－依存型調節。 （Ａ） ｃＧＡＳを標的化した１００ｎＭの指定されたＡＳＯ（表１）により一晩前処理した野生型ＴＨＰ－１は、１μｇ／ｍｌ Ｒ８４８で８．５ｈ刺激するか又は刺激せず（非－処理［ＮＴ］）、並びに上清中のＩＰ－１０（左側パネル）及びＴＮＦ－α（右側パネル）のレベルをＥＬＩＳＡにより決定した。示したデータは、生物学的に３つ組での３回（左側）又は２回（右側）の独立した実験から平均化した（±ｓ．ｅ．ｍ、及び「ＡＳＯ非含有Ｒ８４８」条件に対するダネット多重比較検定を伴う通常の一元配置ＡＮＯＶＡを示している）。いずれのサイトカインについてもＮＴ細胞上のＡＳＯの基本的効果は存在しなかった。 （Ｂ、Ｃ） ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーターを発現するＨＥＫ－ＴＬＲ７細胞（Ｂ）及びＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞（Ｃ）を、５００ｎＭの指定したＡＳＯにより５０分間処理し、その後１μｇ／ｍｌ Ｒ８４８により刺激した。ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレベルを、一晩インキュベーションした後に測定した。条件である「ＡＳＯ非含有Ｒ８４８」条件と比べた百分率（Ｂ）又は増加倍率（Ｃ）を、生物学的３つ組での３回の独立した実験から平均化した（±ｓ．ｅ．ｍ、及びＮＴ条件［Ｂ］又は「ＡＳＯ非含有Ｒ８４８」条件［Ｃ］に対するダネットの多重比較検定を伴う通常の一元配置ＡＮＯＶＡを示している）。 （Ｄ） ＵＮＣ９３Ｂ１－欠損ＴＨＰ－１（ＫＯ）及び救済されたＵＮＣ９３Ｂ１発現を伴うマッチした対照（ＷＴ）を、１００ｎＭ ＡＳＯで一晩処理し、その後１μｇ／ｍｌ Ｒ８４８で２４ｈ刺激し、上清中のＩＰ－１０レベルを、ＥＬＩＳＡにより決定した。示したデータは、各細胞株に関して生物学的３つ組での２回の独立した実験から平均化した（±ｓ．ｅ．ｍ及び対応のないｔ－検定を示した）。ｃＧＡＳリガンドＩＳＤ７０を、ＩＰ－１０を誘導する陽性対照として２．５μｇ／ｍｌで使用した。（Ｅ、Ｆ）２人の血液ドナー由来のＰＢＭＣを、１００ｎＭ ＡＳＯと共に２０～４５分間インキュベーションし、その後ＴＮＦ－αのＥＬＩＳＡ前４ｈ（Ｅ）、又はＩＦＮ－αのＥＬＩＳＡの前２４ｈ（Ｆ）に、０．５μｇ／ｍｌ Ｒ８４８で刺激した。 （Ｅ） 示したデータは、生物学的３つ組での２人の血液ドナーから平均化した（±ｓ．ｅ．ｍ．、及び「ＡＳＯ非含有Ｒ８４８」条件に対するダネットの多重比較検定を伴う通常の一元配置ＡＮＯＶＡを示している）。 （Ｆ） データは、患者間の変動を限定するために、条件「ＡＳＯ非含有Ｒ８４８」に対して正規化し、且つ生物学的３つ組で２人の血液ドナーから平均化した（±ｓ．ｅ．ｍ．、及び「ＡＳＯ非含有Ｒ８４８」条件に対するダネットＴ３多重比較検定を伴うブラウン－フォーサイス及びウェルチＡＮＯＶＡを示している）。
ＴＬＲ７／８によるＲ８４８センシングのＡＳＯ－依存型調節。 （Ｇ） 使用した［ｃＧＡＳ］ＡＳＯ２配列バリアント。中央のＤＮＡ領域は、明灰色で強調した。３’及び５’フランキング領域（暗灰色で強調した）に関して、ＤＮＡ塩基は黒色であり、ＡＳＯ２、ＡＳＯｓ－Ｃｙｓ３及びＡＳＯ－ＰＯの５個の５’及び３’塩基は、２’ＯＭｅ塩基であり、ＡＳＯ２－ＬＮＡの３個の５’及び３’塩基は、ＬＮＡ塩基であり、並びにＡＳＯ２－ＭＯＥの５個の５’及び３’塩基は、２’ＭＯＥ塩基である。下線を付けた塩基は、ＰＳ骨格上にある。 （Ｈ、Ｉ） ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーターを発現するＨＥＫＴＬＲ７細胞（Ｈ）及びＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞（Ｉ）を、５００ｎＭの指定されたＡＳＯで２０分間処置し、その後１μｇ／ｍｌ Ｒ８４８で刺激した。ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレベルを、一晩インキュベーションした後に測定した。条件である「ＡＳＯ非含有Ｒ８４８」条件と比べた百分率（Ｈ）又は増加倍率（Ｉ）を、生物学的３つ組で３回（Ｉ）又は２回（Ｈ）の独立した実験から平均化した（±ｓ．ｅ．ｍ、及びＮＴ条件［Ｈ］又は「ＡＳＯ非含有Ｒ８４８」条件［Ｉ］に対するダネットの多重比較検定を伴う通常の一元配置ＡＮＯＶＡを示している）。＊ Ｐ≦０．０５、＊＊ Ｐ≦０．０１、＊＊＊ Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ Ｐ≦０．０００１、ｎｓ：有意性なし。
低いＴＬＲ７阻害及び高いＴＬＲ８増強を伴うＡＳＯの同定。 （Ａ、Ｂ） ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーターを発現するＨＥＫ－ＴＬＲ７細胞（Ａ）及びＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞（Ｂ）を、１００ｎＭ又は５００ｎＭの指定されたＡＳＯにより２０～５０分間処理し、その後１μｇ／ｍｌ Ｒ８４８で刺激した。ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレベルを、一晩インキュベーションした後に測定した。条件「ＡＳＯ非含有Ｒ８４８」と比べた百分率（Ａ）又は増加倍率（Ｂ）を、生物学的２つ組から平均化した（平均化したデータは表２に提供している）。１００ｎＭ及び５００ｎＭ ＡＳＯによる刺激は、独立した実験において行った（各濃度について示されたデータは単独の実験に由来する）。［ＣＤＫＮ２Ｂ－ＡＳ１］－８５２、及び［ＬＩＮＣＰＩＮＴ］－２５０４は、ＡＳＯ８５２及びＡＳＯ２５０４と称され、このプロット上に示している。５００ｎＭでＴＬＲ７活性の≧８０％減少を伴うＡＳＯ（Ａ）及び１００ｎＭでＴＬＲ８増強が≦２倍のＡＳＯ（Ｂ）は、灰色影で強調した。
（Ｃ、Ｄ） ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーターを発現するＨＥＫ－ＴＬＲ７細胞（左側パネル）及びＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞（右側パネル）を、漸増ＡＳＯ濃度（４、２０、１００及び５００ｎＭ）（Ｃ）又は５００ｎＭ ＡＳＯ（Ｄ）で、２０分間処理し、その後１μｇ／ｍｌ Ｒ８４８で（Ｃ）又は漸増Ｒ８４８濃度で（０．０１５６、０．０３１、０．０６２、０．１２５、０．２５０、０．５、１μｇ／ｍｌ）（Ｄ）刺激した。ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレベルを、一晩インキュベーションした後に測定した。条件「ＡＳＯ非含有Ｒ８４８」（Ｃ）又はＮＴ条件（Ｄ）と比べた百分率（左側パネル）又は増加倍率（右側パネル）を、生物学的３つ組で２回の独立した実験から平均化した（±ｓ．ｅ．ｍ及びＡＳＯ４条件［Ｃ］又はＲ８４８のみ条件［Ｄ］に対するダネットの多重比較検定を伴う通常の二元配置ＡＮＯＶＡを示している）。＊ Ｐ≦０．０５、＊＊ Ｐ≦０．０１、＊＊＊ Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ Ｐ≦０．０００１、ｎｓ：有意性なし。
ＴＬＲ７／８に対するＡＳＯ作用の分子決定因子の同定。 （Ａ）上側：ＨＥＫ－ＴＬＲ７細胞におけるスクリーンからのＡＳＯの配列アラインメント（図２Ａ）であり、これは、１００ｎＭでの低いＴＬＲ７阻害を描き、及び有意にエンリッチされたモチーフを収容している（この分析に使用した１７種のＡＳＯの詳細については表２を参照されたい）。［ＣＤ．］は、ＣＤＫＮ２Ｂ－ＡＳ１であり；［ＣＴ．］はＣＴＮＮＢ１である。中央のＤＮＡ領域は、明灰色で強調し、並びに３’及び５’の２’ＯＭｅフランキング領域は、暗灰色で強調している。下側：非－阻害モチーフを構成する塩基の相対頻度のＭＥＭＥピクトグラム。ＣＵＵモチーフは、太字の明灰色であるのに対し、ＵＵＣモチーフには、下線をつけた。 （Ｂ、Ｅ） ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーターを発現するＨＥＫ－ＴＬＲ７細胞を、１００ｎＭ（Ｂ）又は５００ｎＭ（Ｅ）の指定されたＡＳＯで、２０分間処理し、その後１μｇ／ｍｌ Ｒ８４８で刺激した。ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレベルを、一晩インキュベーションした後に測定した。条件「ＡＳＯ非含有Ｒ８４８」と比べた百分率を、生物学的３つ組で３回（Ｂ）又は２回（Ｅ）の独立した実験から平均化した（±ｓ．ｅ．ｍ、及びＮＴ条件に対するダネットの多重比較検定を伴う通常の二元配置ＡＮＯＶＡ［Ｂ］又はマン－ホイットニーＵ検定［Ｅ］を示している）。 （Ｃ、Ｄ） ＰＩＮＴシリーズ由来のＡＳＯ（Ｃ）及び［ｃＧＡＳ］ＡＳＯ１１バリアント（Ｄ）の配列アラインメント。（Ｃ）全ての配列の間の保存された領域は、明灰色で強調した。２’ＯＭｅフランキング領域は、暗灰色で強調した。（Ｄ）中央のＤＮＡ領域は、明灰色で強調し、並びに３’及び５’の２’ＯＭｅフランキング領域は、暗灰色で強調した。（Ｃ、Ｄ）ＣＵＵモチーフは、太字の明灰色であるのに対し、ＵＵＣモチーフには下線をつけた。 （Ｆ、Ｇ） ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーターを発現するＥＫ－ＴＬＲ８細胞を、１００ｎＭ（Ｆ）又は５００ｎＭ（Ｇ）の指定されたＡＳＯで、２０分間処理し、その後１μｇ／ｍｌ Ｒ８４８で刺激した。ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレベルを、一晩インキュベーションした後に測定した。条件「ＡＳＯ非含有Ｒ８４８」と比べた倍率を、生物学的３つ組で３回（Ｂ）又は２回（Ｅ）の独立した実験から平均化した（±ｓ．ｅ．ｍ、及びＮＴ条件に対するダネットの多重比較検定を伴う通常の一元配置ＡＮＯＶＡ［Ｆ］又はマン－ホイットニーＵ検定［Ｇ］を示した）。
ＴＬＲ７／８に対するＡＳＯ作用の分子決定因子の同定。 （Ｈ、Ｉ） 該スクリーン由来の１９２種のＡＳＯを、末端５’ｍＵ（Ｈ）又は５’ｍＵｍＣ（Ｉ）の存在／非存在に従い２群に選別し、並びにＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレベルのＲ８４８単独に対する増加倍率（５００ｎＭ ＡＳＯを使用－表２）を、各集団についてバイオリンプロットとして示した。マン－ホイットニーＵ検定を示している。 （Ｊ） スクリーニングされた１９２種のＡＳＯ由来の上位２０及び下位２０のＴＬＲ８増強因子の中央の１０個のＤＮＡ塩基（表２）を、塩基含量について分析した。これらのバイオリンプロットは、両方のＡＳＯ集団に関する各中央の塩基の累積数の分布を示している。シダック多重比較検定を伴う通常の二元配置ＡＮＯＶＡを示している。 （Ｋ） ＡＳＯ８５２及びＡＳＯ２５０４バリアント。中央のＤＮＡ領域は、青色で強調し、並びに３’及び５’の２’ＯＭｅフランキング領域は、オレンジ色で強調した。 （Ｌ） ＷＴ ＴＨＰ－１を１００ｎＭ ＡＳＯにより一晩前処理し、１μｇ／ｍｌ Ｒ８４８で７ｈ刺激し、上清中のＩＰ－１０レベルをＥＬＩＳＡにより決定した。示したデータは、生物学的３つ組で２回の独立した実験から平均化した（±ｓ．ｅ．ｍ、及び対応のないｔ－検定を示している）。 （Ｍ） ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーターを発現するＨＥＫ－ＴＬＲ７細胞及びＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞を、５００ｎＭの指定されたＡＳＯで２０分間処理し、その後１μｇ／ｍｌ Ｒ８４８で刺激した。ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレベルを、一晩インキュベーションした後に測定した。条件「ＡＳＯ非含有Ｒ８４８」と比べた百分率又は増加倍率を、生物学的３つ組で３回の独立した実験から平均化した（±ｓ．ｅ．ｍ、及びＮＴ条件に対するダネットの多重比較検定を伴う通常の一元配置ＡＮＯＶＡ［ＴＬＲ７］、又はマン－ホイットニーＵ検定［ＴＬＲ８］を示している）。＊ Ｐ≦０．０５、＊＊ Ｐ≦０．０１、＊＊＊ Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ Ｐ≦０．０００１、ｎｓ：有意性なし。
ＴＬＲ８によるＲ８４８センシングのＡＳＯ増強の特徴決定。 （Ａ） ＭＯＬＭ１３細胞及びＯＣＩＡＭＬ３細胞を、５００ｎＭ ＡＳＯと共に一晩インキュベーションし、１μｇ／ｍｌ Ｒ８４８により８ｈ（ＭＯＬＭ１３）又は２４ｈ（ＯＣＩ－ＡＭＬ３）刺激し、上清中のＩＰ－１０レベルを、ＥＬＩＳＡにより決定した。示したデータは、生物学的３つ組で、ＡＳＯのみの条件（２回の独立した実験を実行）を除いて、全ての条件について、５回（ＭＯＭＬ１３）又は４回（ＯＣＩ－ＡＭＬ３）の独立した実験から平均化した（±ｓ．ｅ．ｍ、及び「ＡＳＯ非含有Ｒ８４８」条件に対するダネットの多重比較検定を伴う通常の一元配置ＡＮＯＶＡを示している）。
（Ｂ） ＭＯＬＭ１３及びＴＨＰ－１は、漸増投与量のＡＳＯ（４、２０、１００、５００ｎＭ）と共に一晩インキュベーションし、１μｇ／ｍｌ Ｒ８４８で８ｈ刺激し、上清中のＩＰ－１０レベルを、ＥＬＩＳＡにより決定した。示したデータは、生物学的３つ組で２回の独立した実験から平均化した（±ｓ．ｅ．ｍ、及びＡＳＯ４条件に対するダネットの多重比較検定を伴う通常の二元配置ＡＮＯＶＡを示している）。
（Ｃ） ＣＣＬ５－ルシフェラーゼレポーター（右手側）又はＩＦＮ－β－ルシフェラーゼレポーター（左手側） を発現するＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞を、５００ｎＭの指定されたＡＳＯで２０分間処理し、その後１μｇ／ｍｌ Ｒ８４８で刺激した。ルシフェラーゼレベルを、一晩インキュベーションした後に測定した。データは、ＮＴ条件に対する増加倍率として示し、生物学的３つ組で２回の独立した実験から平均化した（±ｓ．ｅ．ｍ、及びＮＴ条件に対するダネットの多重比較検定を伴う通常の一元配置ＡＮＯＶＡを示している）。
（Ｄ） ＷＴ ＴＨＰ－１を、５００ｎＭのＡＳＯ８５２－ｄＴ（又はＮＴ）と共に一晩インキュベーションし、及び１μｇ／ｍｌ Ｒ８４８で４ｈ刺激したかあるいは刺激せず、その後ＲＮＡ精製した。４種のＩＲＦ－駆動した遺伝子のパネルの発現を、ＲＴ－ｑＰＣＲにより分析した。指定された遺伝子の発現を、１８Ｓ発現に対して報告し、更に「ＡＳＯ非含有Ｒ８４８」条件の平均に対し正規化した。示したデータは、生物学的２つ組で実行された２回の独立した実験の平均を表している（±ｓ．ｅ．ｍ、及びマン－ホイットニーＵ検定を示している）。
（Ｅ） ＩＦＮ－β－ルシフェラーゼレポーターを発現するＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞を、５００ｎＭのＡＳＯ８５２－ｄＴ（又はＮＴ）により２０分間処理し、その後漸増投与量のＲ８４８（１、５、１０、１５μｇ／ｍｌ）により刺激した。ＩＦＮ－β－ルシフェラーゼレベルを、一晩インキュベーションした後に測定した。データは、ＮＴ条件に対する増加倍率として示し、生物学的３つ組で２回の独立した実験から平均化した（±ｓ．ｅ．ｍ、及びＮＴ条件及び選択された条件対に対するターキー多重比較検定を伴う通常の一元配置ＡＮＯＶＡを示している）。＊ Ｐ≦０．０５、＊＊ Ｐ≦０．０１、＊＊＊ Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ Ｐ≦０．０００１、ｎｓ：有意性なし。
ＴＬＲ８増強を示すＨＰＲＴ－標的化ＡＳＯの合理的選択。 （Ａ） 実施例１及び表３に詳述したように、ＨｅＬａ細胞を、ＨＰＲＴ－標的化ＡＳＯの１ｎＭ（左手側）又は１０ｎＭ（右手側）により逆トランスフェクションし、並びに２４ｈインキュベーションした後、ＨＰＲＴレベルを、ＲＴ－ｑＰＣＲにより測定した。ＨＰＲＴレベルは、ＳＦＲＳ９発現に対して報告し、更に非－標的化ＡＳＯＮＣ１及びＡＳＯＮＣ５対照条件の平均に対して正規化した。示したデータは、生物学的３つ組で実行した３回の独立した実験の平均を表している（±ｓ．ｅ．ｍ）。
（Ｂ、Ｃ） ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーターを発現するＨＥＫＴＬＲ７細胞（Ｂ）及びＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞（Ｃ）を、５００ｎＭのＡＳＯで２０分間処理し、その後１μｇ／ｍｌ Ｒ８４８で刺激した。ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレベルを、一晩インキュベーションした後に測定した。条件「ＡＳＯ非含有Ｒ８４８」（Ｂ）又はＮＴ条件（Ｃ）と比べた百分率（Ｂ）又は増加倍率（Ｃ）を、生物学的３つ組で３回の独立した実験から平均化した（±ｓ．ｅ．ｍ、及びＮＴ条件［Ｂ］又は「ＡＳＯ非含有Ｒ８４８」条件［Ｃ］に対するダネットの多重比較検定を伴う通常の一元配置ＡＮＯＶＡを示している）。
（Ｄ） 低いＴＬＲ７阻害を伴う選択されたＨＰＲＴ ＡＳＯ配列。全ての配列間の保存された領域は、明灰色で強調した。２’ＯＭｅフランキング領域は、暗灰色で強調した。ＣＵＵモチーフは、太字の明灰色であるのに対し、ＵＵＣモチーフには下線をつけた。
（Ｅ、Ｆ） ＷＴ ＴＨＰ－１は、１００ｎＭ ＡＳＯと共に一晩インキュベーションした。翌日、これらの細胞を、Ｒ８４８刺激（１μｇ／ｍｌ－Ｆについてのみ）の直前に、リポフェクタミン２０００で処理した（２．５μｌ／ｍｌ、ＡＳＯの細胞質送達を増強するため）。８ｈ後ＩＰ－１０のＥＬＩＳＡのために上清を収集し（Ｆ）、及び２４ｈ後ＲＮＡ精製のために細胞を溶解した（Ｅ）。（Ｅ）ＨＰＲＴレベルを、１８Ｓに対して報告し、ＮＴ条件に対して正規化した。データは、２つ組で４回（Ｅ）又は３回（Ｆ）の独立した実験について平均化した（±ｓ．ｅ．ｍ、及び「ＡＳＯ非含有Ｒ８４８」条件に対するダネットの多重比較検定を伴う通常の一元配置ＡＮＯＶＡ［Ｆ］又はマン－ホイットニーＵ検定［Ｅ］を示している）。＊ Ｐ≦０．０５、＊＊ Ｐ≦０．０１、＊＊＊ Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ Ｐ≦０．０００１、ｎｓ：有意性なし。
ＨｅＬａ細胞においてヒトＨＰＲＴ遺伝子を標的化する４８種のＡＳＯの予備スクリーン。ＨｅＬａ細胞は、実施例１に詳述したような指定されたＡＳＯ量で逆トランスフェクションし、及び２４ｈインキュベーションした後、ＨＰＲＴレベルを、ＲＴ－ｑＰＣＲにより測定した。ＨＰＲＴレベルは、ＳＦＲＳ９発現に対して報告し、且つ更に非－標的化ＡＳＯＮＣ１及びＡＳＯＮＣ５対照条件の平均に対し正規化した。示したデータは、１回の実験からの生物学的３つ組の平均を表す（±ｓ．ｅ．ｍ．）。
ＴＬＲ７及びＴＬＲ８リガンドのＡＳＯ８５２－ｄＴ増強。ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーターを発現するＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞を、１００ｎＭ ＡＳＯ８５２－ｄＴ（又はＮＴ）により２０分間処理し、その後ロキソリビン（５ｍＭ）、ＣＬ０７５（１μｇ／ｍｌ）、ガルディキーモッド（１μｇ／ｍｌ）で刺激した。一晩インキュベーションした後、ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレベルを測定した。データは、ＮＴ条件に対する増加倍率として示し、並びに生物学的３つ組で２回の独立した実験からの平均である（±ｓ．ｅ．ｍ．、及びマン－ホイットニーＵ検定を伴う通常の一元配置ＡＮＯＶＡが示される）。
ＴＬＲ７、８、９－ＨＥＫ細胞及びＴＨＰ－１細胞に対するＡＳＯの基本活性。（Ａ、Ｂ、Ｃ） ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーターを発現するＨＥＫ－ＴＬＲ７細胞（Ａ）、ＴＬＲ８細胞（Ｂ）、及びＴＬＲ９細胞（Ｃ）を、５００ｎＭの指定されたＡＳＯで処理した。一晩インキュベーションした後、ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレベルを測定した。（Ａ、Ｂ） 細胞を、陽性対照として１μｇ／ｍｌ Ｒ８４８単独で、又は５００ｎＭのＡＳＯ２の存在下で（パネルＢについてのみ）処理した。（Ｃ） ＨＥＫ－ＴＬＲ９細胞を、陽性対照として２００ｎＭのＯＤＮ ２００６で刺激した。ＮＴ条件と比べた倍率増加を、生物学的３つ組で２回（Ａ、Ｂ）又は３回の独立した実験（Ｃ）から平均化した（±ｓ．ｅ．ｍ、及びダネット多重比較検定を伴う通常の一元配置ＡＮＯＶＡ［Ａ、Ｂ］、又はＮＴ条件及び選択された条件対に対するターキー多重比較検定［Ｃ］を示している）。（Ｄ） ＷＴ ＴＨＰ－１は、１００ｎＭ ＡＳＯにより一晩前処理し（５００ｎＭ ＡＳＯを使用した条件「８５２－ｄＴ ５００ｎＭ」を除いて）、１μｇ／ｍｌ Ｒ８４８で８ｈ刺激し、上清中のＩＰ－１０レベルを、ＥＬＩＳＡにより決定した。示したデータは、生物学的３つ組で２回の独立した実験から平均化した（±ｓ．ｅ．ｍ、及びＮＴ条件に対するダネット多重比較検定を伴う通常の一元配置ＡＮＯＶＡが示される）。（Ａ－Ｄ）別に注記しない限りは、ＮＴ条件に対する差異に、有意性はなかった。＊ Ｐ≦０．０５、＊＊ Ｐ≦０．０１、＊＊＊ Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ Ｐ≦０．０００１。
モチーフ－特異的ＴＬＲ８増強。ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーターを発現するＴＨＰ－１細胞及びＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞を、指定された濃度のＡＳＯで前処理し（ＴＨＰ－１について一晩、及びＨＥＫについて～３０分間）、その後Ｒ８４８で７ｈ刺激するか（ＴＨＰ－１、ＩＰ－１０ ＥＬＩＳＡ）、又はＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼについて一晩刺激した。示したデータは、生物学的３つ組で３回の独立した実験から平均化した。ＨＥＫ－ＴＬＲ８に関して、ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼ値は、Ｒ８４８条件に対して報告される。全てのＡＳＯ条件は、Ｒ８４８共－刺激を伴った。ＳＥＭ及びＲ８４８のみの条件に対するダネット多重比較による一元配置ＡＮＯＶＡを示している。
ＡＳＯによるウリジンセンシングの配列－特異的増強。ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーター又はＲＡＮＴＥＳ－ルシフェラーゼレポーターを発現するＴＨＰ－１細胞及びＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞を、１００ｎＭ（ＴＨＰ－１）又は５００ｎＭ ＡＳＯ（ＨＥＫ）により前処理し（ＴＨＰ－１について一晩、及びＨＥＫについて～３０分間）、その後ウリジン刺激（２０ｍＭ）を７ｈ（ＴＨＰ－１、ＩＰ－１０ ＥＬＩＳＡ）又はＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞について一晩行った。示したデータは、生物学的３つ組で３回（ＴＨＰ－１及びＲＡＮＴＥＳ－Ｌｕｃ ＨＥＫ）又は２回（ＮＦ－κＢ－Ｌｕｃ ＨＥＫ）の独立した実験から平均化した。ＨＥＫ－ＴＬＲ８に関して、ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼ値は、Ｒ８４８条件に対して報告し；ＲＡＮＴＥＳ－ルシフェラーゼ値については、ＮＴ条件に対して報告した。全てのＡＳＯ条件は、ウリジン共－刺激を伴った（Ｒ８４８条件の１ｕｇ／ｍｌを除いて）。ＳＥＭ、及び「ウリジン単独」条件に対するダネット多重比較による一元配置ＡＮＯＶＡが示される。
ＴＬＲ８センシングを増強するＬＮＡ及び２’ＭＯＥギャップマーＡＳＯの同定。ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーターを発現するＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞を、指定された濃度のＡＳＯにより～３０分間前処理し、その後Ｒ８４８（１μｇ／ｍｌ）により一晩刺激した。条件「ＡＳＯ非含有Ｒ８４８」に対する倍率増加を、生物学的２つ組から平均化した（平均化したデータは表１に提供される）。１００ｎＭ及び５００ｎＭのＡＳＯによる刺激は、独立した実験において行った（各濃度について示したデータは、単独の実験に由来する）。
ＴＬＲ８を増強するＬＮＡ ＡＳＯのバリデーション。ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーターを発現するＴＨＰ－１細胞及びＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞を、指定された濃度のＬＮＡ ＡＳＯにより前処理し（ＴＨＰ－１について一晩、及びＨＥＫについて～３０分間）、その後Ｒ８４８で７ｈ（ＴＨＰ－１、ＩＰ－１０ ＥＬＩＳＡ）又はＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼについて一晩刺激した。示したデータは、生物学的３つ組（ＴＨＰ－１）又は２つ組（ＨＥＫ）で３回の独立した実験から平均化した。ＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞に関して、ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼ値を、「Ｒ８４８単独」条件に対して報告した。全てのＡＳＯ条件は、Ｒ８４８共－刺激を伴った。ＳＥＭ、及びＲ８４８単独条件に対するダネット多重比較による一元配置ＡＮＯＶＡを示している。
ＴＬＲ８を増強する２’ＭＯＥ ＡＳＯのバリデーション。ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーターを発現するＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞を、５００ｎＭの指定された２’ＭＯＥ ＡＳＯで～３０分間前処理し、その後Ｒ８４８（１μｇ／ｍｌ）で一晩刺激した。全てのＡＳＯ条件を、Ｒ８４８で共－刺激した。条件「ＡＳＯ非含有Ｒ８４８」に対する倍率増加を、生物学的反復から平均化し－示されたデータは、１回の実験に由来している（±ＳＥＭ）。
ｄＴ２０によるＴＬＲ８センシングの強化は、オリゴヌクレオチドの洗浄後は持続されない。左側：ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーターを発現するＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞を、５００ｎＭ ｄＴ２０により一晩前処理し、その後洗浄するか（又は洗浄せず）、Ｒ８４８刺激（１μｇ／ｍｌ）により一晩刺激した。示したデータは、生物学的３つ組で２回の独立した実験から平均化し、Ｒ８４８単独条件に対して報告した。ＳＥＭ、及びＲ８４８単独条件に対するダネット多重比較による一元配置ＡＮＯＶＡを示している。右側：ＴＨＰ－１細胞を、１００ｎＭの指定されたＡＳＯと一晩（紫色）又は２．５ｈインキュベーションし、その後Ｒ８４８（１μｇ／ｍｌ）で～７ｈ刺激した。ＩＰ－１０レベルを、ＥＬＩＳＡにより測定した。示したデータは、生物学的３つ組で１回の実験に由来している（各々生物学的反復は表さない）。全てのＡＳＯ条件は、Ｒ８４８共－刺激を伴う。
ＡＳＯ－トランスフェクションした細胞と貪食細胞の共培養は、配列特異的ＴＬＲ８増強に繋がる。ＨＥＫ ＷＴ細胞を、５００ｎＭのＡＳＯ３（ＴＬＲ８を増強しない）又は５００ｎＭの８５２ｄＴ（ＴＬＲ８を強力に増強する）により４ｈトランスフェクションし、その後ＵＶ処理し（２５４ｎｍ、１２０ｍＪ／ｃｍ２）、大規模に洗浄し（２×５ｍｌ－トランスフェクションされなかったＡＳＯを除くため）、６日目のＰＭＡ－分化したＴＨＰ－１と一晩共－培養し、その２４ｈ後にＲ８４８刺激した（５μｇ／ｍｌ）。ＴＮＦαレベルを、ＥＬＩＳＡにより測定した。示したデータは、ＡＳＯ３又はＡＳＯ ８５２ｄＴ条件と比べ、生物学的反復で２回の独立した実験から平均化した。ＳＥＭ及び対応のない両側ｔ－検定を示している。
完全に２’Ｏｍｅ修飾されたＡＳＯによるＴＬＲ８－増強。ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーターを発現するＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞を、５００ｎＭの指定された２’ＭＯＥ ＡＳＯにより～３０分間前処理し、その後Ｒ８４８（１μｇ／ｍｌ）で一晩刺激した。全てのＡＳＯ条件を、Ｒ８４８と共－刺激した。条件「ＡＳＯ非含有Ｒ８４８」に対する倍率増加を、生物学的３つ組で３回の独立した実験から平均化した（±ＳＥＭ、及びＲ８４８単独条件に対するダネット多重比較による一元配置ＡＮＯＶＡを示している）。
５’－末端ＣＵＵモチーフは、ＬＮＡ ＡＳＯではなく２’ＯＭｅ ＡＳＯの状況において、ＴＬＲ７センシングを調節する。ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーターを発現するＨＥＫ－ＴＬＲ７細胞を、５００ｎＭの指定された２’ＭＯＥ ＡＳＯにより～３０分間前処理し、その後Ｒ８４８（１μｇ／ｍｌ）で一晩刺激した。全てのＡＳＯ条件を、Ｒ８４８と共－刺激した。示したデータは、生物学的３つ組で３回の独立した実験から平均化し、Ｒ８４８単独条件に対し報告した。ＳＥＭ、及び「６６０－Ｍｕｔ」条件に対するダネット多重比較による一元配置ＡＮＯＶＡを示している）。
ＴＬＲ７センシングを阻害しないＬＮＡ及び２’ＭＯＥギャップマーＡＳＯの同定。ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーターを発現するＨＥＫ－ＴＬＲ７細胞を、指定された濃度のＡＳＯにより～３０分間前処理し、その後Ｒ８４８（１μｇ／ｍｌ）で一晩刺激した。条件「ＡＳＯ非含有Ｒ８４８」と比べた倍率増加を、生物学的２つ組から平均化した（平均化したデータは表２に提供される）。１００ｎＭ及び５００ｎＭ ＡＳＯによる刺激は、独立した実験で行った（各濃度について示されたデータは、単独の実験に由来する）。
限定されたＴＬＲ７阻害を伴うＬＮＡ及び２’ＭＯＥギャップマーＡＳＯのバリデーション。ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーターを発現するＨＥＫ－ＴＬＲ７細胞を、５００ｎＭの指定された２’ＭＯＥ ＡＳＯにより～３０分間前処理し、その後Ｒ８４８（１μｇ／ｍｌ）で一晩刺激した。全てのＡＳＯ条件は、Ｒ８４８共－刺激した。示したデータは、生物学的３つ組で３回の独立した実験（ＬＮＡについて）又は１回の実験（２’ＭＯＥについて）から平均化し、Ｒ８４８単独条件に対して報告した。ＳＥＭ、及び「Ｒ８４８単独」条件に対するダネット多重比較による一元配置ＡＮＯＶＡを、ＬＮＡ ＡＳＯについて示した（左側）。ハッチ付きバーは、５’ ＋Ｃ＋Ｃ モチーフを伴うＡＳＯを指す。２’ＭＯＥ実験に関して、本発明者らは、Ｅ１及びいくつかの他のＡＳＯ（示さず）は、ＴＬＲ７センシングを完全にアブレーションしたが－Ｇ１－Ａ２－Ｃ１－Ａ９はしなかったことに注目している。
配列の簡単な説明
配列番号：１及び配列番号：２は、表１からの負の標的化対照ＡＳＯのヌクレオチド配列を表す。配列番号：３から配列番号：２０は、表１からのヒトｃＧＡＳ ｍＲＮＡを標的化するＡＳＯのヌクレオチド配列及びその修飾された型を表す。配列番号：２１及び配列番号：２２は、表１からのＡＳＯ８５２及びＡＳＯ８５２－ＤＴのヌクレオチド配列を表す。配列番号：２３及び配列番号：２４は、表１からのＡＳＯ２５０４及びＡＳＯ２５０４－ｄＴのヌクレオチド配列を表す。配列番号：２５は、表１からのｄＴ２０のヌクレオチド配列を表す。配列番号：２６から配列番号：３４は、各々、表１からの、Ｈｓ ＨＰＲＴ Ｆ５１７、Ｈｓ ＨＰＲＴ Ｒ５９１、Ｈｓ ＨＰＲＴ Ｐ５５４ ＦＡＭ、Ｈｓ ＳＦＲＳ９ Ｆ５９４、Ｈｓ ＳＦＲＳ９ Ｒ６９０、Ｈｓ ＳＦＲＳ９ Ｐ６２５ ＨＥＸ、ＯＤＮ ２００６、ＩＳＤ７０－ＦＷＤ及びＩＳＤ７０－ＲＥＶのヌクレオチド配列を表す。
配列番号：３５から配列番号：８２は、表２からのＣＤＫＮ２Ｂ－ＡＳ１ ＡＳＯのヌクレオチド配列を表す。配列番号：８３から配列番号：１３０は、表２からのＣＴＮＮＢ１ ＡＳＯのヌクレオチド配列を表す。配列番号：１３１から配列番号：１７８は、表２からのＥＧＦＲ ＡＳＯのヌクレオチド配列を表す。配列番号：１７９から配列番号：２２６は、表２からのＬＩＮＣ－ＰＩＮＴ ＡＳＯのヌクレオチド配列を表す。
配列番号：２２７から配列番号：２７３は、表３からのＨＰＲＴ ＡＳＯのヌクレオチド配列を表す。配列番号：２７４から配列番号：２８２は、各々、表４からのＡＳＯ１－ＵＣ、ＡＳＯ２ ＬＮＡ、ＡＳＯ２－ＬＮＡ Ｍｕｔ１、ＡＳＯ２－ＬＮＡ Ｍｕｔ２、ＡＳＯ ６６０、ＡＳＯ ６６０－Ｍｕｔ、Ｃ２Ｍｕｔ－１、Ｃ２Ｍｕｔ１－ＰＳ、Ｃ２Ｍｕｔ１－２ＯＭｅのヌクレオチド配列を表す。配列番号：２８３から配列番号：３７３は、表５のＬＮＡ－修飾されたヌクレオチド配列を表す。配列番号：３７４から配列番号：４４９は、表６の２’－ＭＯＥ－修飾されたヌクレオチド配列を表す。
発明の詳細な説明
全般的技術及び定義
別に具体的に定義されない限りは、全ての技術用語及び科学用語は、当該技術分野（例えば、オリゴヌクレオチドデザイン、分子遺伝学、アンチセンスオリゴヌクレオチド、遺伝子サイレンシング、遺伝子発現及び生化学）の業者により通常理解されるものと同じ意味を有するものとする。
別に指定されない限りは、本発明において利用される組換えタンパク質技術、細胞培養技術、及び免疫学技術は、当業者に周知の標準手順である。そのような技術は、J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)、J. Sambrookら、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)、T.A. Brown (編集者), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, 第1及び2巻、IRL Press (1991)、D.M. Glover及びB.D. Hames (編集者), DNA Cloning: A Practical Approach, 第1-4巻, IRL Press (1995及び1996)、並びにF.M. Ausubelら(編集者), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 現在までの全ての改訂版を含む)、Ed Harlow及びDavid Lane (編集者) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory (1988)、並びにJ.E. Coliganら(編集者) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons(現在までの全ての改訂版を含む)などの情報源の文献を通じて説明及び解説されている。
用語「及び／又は」、例えば「Ｘ及び／又はＹ」は、「Ｘ及びＹ」もしくは「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味すると理解されるべきであり、且つ両方の趣旨又はいずれかの趣旨について明白な支持を提供するとされるべきである。
本明細書において使用される用語約は、相容れないことが言及されない限りは、指定された値の±１０％、より好ましくは±５％、より好ましくは±１％を指す。
本明細書を通じて単語「含む」又は「一つを含む」もしくは「含んでいる」などのその変形は、ある言及された要素、整数もしくは工程、又は要素、整数もしくは工程の群の包含を暗示するが、いずれか他の要素、整数もしくは工程、又は要素、整数もしくは工程の群を排除するものではないと理解されるであろう。
オリゴヌクレオチド配列の文脈において「本質的になる」により、その５’端又は３’端に１、２もしくは３個の核酸の付加と一緒にした列挙されたオリゴヌクレオチド配列を意味する。
本明細書において使用される語句「トル様受容体７（ＴＬＲ７）活性を阻害しない」又はその変形は、本発明のオリゴヌクレオチドの動物への投与後、その動物は、病原体などに対する、ＴＬＲ７ベースの免疫反応を依然誘発することができることを意味する。ある実施態様において、該オリゴヌクレオチドの存在下でのＴＬＲ７ベースの免疫反応は、該オリゴヌクレオチドの非存在下での反応の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％である。
同様に、語句「オリゴヌクレオチドのトル様受容体７（ＴＬＲ７）阻害活性を低下する」又はそれに類似するものは、本発明に従い修飾された後に、この修飾されたオリゴヌクレオチドが投与された動物は、出発の（未修飾）オリゴヌクレオチドと比べた場合に、より強力なＴＬＲ７ベースの免疫反応をマウントすることができることを意味する。
本明細書において使用される語句「トル様受容体８（ＴＬＲ８）活性を増強する」及び同類のものは、本発明のオリゴヌクレオチドの動物への投与後に、動物が、強化された（増大された）ＴＬＲ８ベースの免疫反応を有することを意味する。
本明細書において使用される「免疫反応調節物質」は、最適な有効性のために宿主免疫細胞の参加を模倣する、増大する、もしくは必要とするか、並びに／又は特異的免疫反応を活性化する、増大する、もしくは強化する公知の能力を有する任意の物質を指す。免疫反応調節物質の例は、レシキモッド（Ｒ８４８）、ロキソリビン、イサトリビン、イミキモド、ＣＬ０７５、ＣＬ０９７、ＣＬ２６４、ＣＬ３０７、８５２Ａ、及び／又はＴＬ８－５０６を含むトル様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含むが、これらに限定されるものではない。他のトル様受容体（ＴＬＲ）アゴニストは、塩基アナログ（グアノシンアナログ、デアザ－アデノシンアナログ、イミダゾキノリンもしくは誘導体、ヒドロキシアデニン化合物もしくは誘導体、チアゾロキノロン化合物もしくは誘導体、ベンゾアゼピン化合物もしくは誘導体を含む）及び／又はＲＮＡ分子を含むことができる。
語句「医薬として許容し得る」は、理にかなった医学的判断の範囲内で、妥当なベネフィット／リスク比に見合う、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、及び／又は他の問題点もしくは合併症を伴わずに、ヒト及び動物の組織と接触した使用に適している、それらの化合物、物質、組成物、及び／又は剤形を指すように本明細書において利用される。
本明細書において使用される用語「治療している」、「治療する」又は「治療」は、疾患の少なくとも１つの症状を軽減もしくは排除するのに十分な本明細書記載の化合物（複数可）の治療的有効量を投与することを含む。
本明細書において使用される用語「予防している」、「予防する」又は「予防」は、疾患の少なくとも１つの症状の発症を停止もしくは妨害するのに十分な本明細書記載の化合物（複数可）の治療的有効量を投与することを含む。
オリゴヌクレオチド
本発明の文脈において、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマー又はポリマーを指し、ここでヌクレオチドモノマーのポリマー又はオリゴマーは、核酸塩基（当該技術分野及び本明細書において簡単に「塩基」と称される）、修飾された核酸塩基、糖、修飾された糖、ホスフェート架橋、又は修飾されたリン原子架橋（「ヌクレオチド間連結」とも称される）の任意の組合せを含む。
オリゴヌクレオチドは、１本鎖又は２本鎖又はそれらの組合せであることができる。１本鎖オリゴヌクレオチドは、２本鎖領域を有することができ、並びに２本鎖オリゴヌクレオチドは、１本鎖領域を有することができる（マイクロＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなど）。
「ギャップマー」は、１又は複数のヌクレオシドを有する外部領域間に配置されたＲＮａｓｅＨ切断を補助する複数のヌクレオシドを有する内部領域を含むオリゴヌクレオチドを指し、ここで内部領域を含むヌクレオシドは、外部領域を含む１個又は複数のヌクレオシドとは化学的に区別される。内部領域は、「ギャップ」と称されてもよく、並びに外部領域は、「ウイング」と称されてよい。
本明細書において使用される「標的遺伝子」又は「標的ポリヌクレオチド」などの「標的」は、それに対し本発明のオリゴヌクレオチドが、直接又は間接にその作用を発揮する分子を指す。典型的には、本発明のオリゴヌクレオチド又はその一部と、標的、又は遺伝子によりコードされたｍＲＮＡなどの標的産物又はその一部は、生理的条件下でハイブリダイズすることができる。
本明細書において使用される語句「標的遺伝子の発現を低下する」又は類似のものは、遺伝子が生物学的効果を発揮する能力を低下する本発明のオリゴヌクレオチドを指す。これは、遺伝子によりコードされたＲＮＡの量の減少、及び／又はＲＮＡから翻訳されたタンパク質の量の減少により、直接又は間接に達成され得る。
典型的には、本発明のオリゴヌクレオチドは、インビトロにおいて合成されるであろう。しかし、修飾された塩基及び骨格が必要とされない一部の場合においては、これらは、組換えウイルス又は細胞によるなど、好適なシステムにおいて、インビトロ又はインビボにおいて発現され得る。
本発明のオリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞取込みを増強する１又は複数の部分又は基に複合されてよい。これらの部分又は基は、第一級又は第二級ヒドロキシル基などの官能基へ共有結合されてよい。例証的部分又は基は、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学特性を増強する基、及びオリゴマーの薬物動態特性を増強する基を含む。典型的複合基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸エステル、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン及び色素を含む。
特定の実施態様において、本明細書記載のオリゴヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチド配列を含んでよい。本明細書において使用される「合成オリゴヌクレオチド配列」とは、天然に生じる対応する配列を欠くオリゴヌクレオチド配列を指す。例として、合成オリゴヌクレオチド配列は、内在性ポリペプチドをコードしているものなどの、特定のＲＮＡ分子に対し、相補性がない。従って、合成オリゴヌクレオチド配列は、好適なことに、ＲＮＡ翻訳などの転写後事象と干渉することは不可能である。
本明細書において使用されるオリゴヌクレオチド「バリアント」は、定義可能なヌクレオチド配列関係を、参照核酸配列と共有している。この参照核酸配列は、例えば、表１から６に提供されたもの（例えば配列番号：１－４４９）の一つであってよい。「バリアント」オリゴヌクレオチドは、欠失された又は異なる核酸により置換された参照核酸配列の１又は複数の核酸を有してよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドバリアントは、参照核酸配列と、少なくとも７０％又は７５％、好ましくは少なくとも８０％又は８５％、もしくはより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を共有する。
修飾された塩基
本発明のオリゴヌクレオチドは、核酸塩基（「塩基」）の修飾又は置換を有してよい。
例としては、２’位に以下の一つを含むオリゴヌクレオチドを含み：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、又はＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、又はＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－又はＮ－アルキニル；又は、Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル：ここでアルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ１－Ｃ１０アルキル又はＣ２－Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであってよい。一実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、２’位に以下の一つを含む：Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２（ここで、ｎ及びｍは、１～約１０である）。
修飾されたオリゴヌクレオチドの更なる例としては、２’位に以下の一つを含むオリゴヌクレオチドを含む：Ｃ１－Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリル又はＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善する基、及び同様の特性を有する他の置換基。
一実施態様において、この修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（同じく２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）又は２’－ＭＯＥとしても公知）(Martinら、1995)、すなわちアルコキシアルコキシ基を含む。一部の実施態様において、修飾は、２’－ＭＯＥを含まない。更なる実施態様において、修飾は、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（同じく２’－ＤＭＡＯＥとしても公知）、又は２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（同じく２’－Ｏ－ジメチル－アミノ－エトキシ－エチル又は２’－ＤＭＡＥＯＥとしても当該技術分野において公知）、すなわち２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
他の修飾は、２’－メトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’－アリル（２’－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）、２’－Ｏ－アリル（２’－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）、及び２’－フルオロ（２’－Ｆ）を含む。２’－修飾は、アラビノ（上）位置又はリボ（下）位置であってよい。一実施態様において、２’－アラビノ修飾は、２’－Ｆである。
同様の修飾は、該オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位又は２’－５’連結したオリゴヌクレオチド内、並びに５’末端ヌクレオチドの５’位でも行われてよい。
オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに糖模倣物、例えばシクロブチル部分を有してもよい。
そのような修飾された糖構造の調製を開示している代表的米国特許は、US 4,981,957、US 5,118,800、US 5,319,080、US 5,359,044、US 5,393,878、US 5,446,137、US 5,466,786、US 5,514,785、US 5,519,134、US 5,567,811、US 5,576,427、US 5,591,722、US 5,597,909、US 5,610,300、US 5,627,053、US 5,639,873、US 5,646,265、US 5,658,873、US 5,670,633、US 5,792,747、及びUS 5,700,920を含むが、これらに限定されるものではない。
この糖の更なる修飾は、２’－ヒドロキシル基が、糖環の３’又は４’炭素原子に連結され、これにより二環式糖部分を形成している、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。一実施態様において、この連結は、２’酸素原子と４’炭素原子を架橋するメチレン（－ＣＨ２－）ｎ基であり、ここでｎは、１又は２である。ＬＮＡ及びその調製は、WO 98/39352及びWO 99/14226に開示されている。しかし一部の実施態様において、この修飾は、ＬＮＡを含まない。
修飾された核酸塩基は、他の合成及び天然の核酸塩基、例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６－メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニル（－ＣＣ－ＣＨ３）ウラシル及びシトシン及び他のピリミジン塩基のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（プソイドウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８－置換されたアデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換されたウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－アデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン及び３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンなどを含む。
更に修飾された核酸塩基は、三環式ピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）など、Ｇ－クランプ、例えば、置換されたフェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）などを含む。
修飾された核酸塩基はまた、プリン又はピリミジン塩基が、他のヘテロ環で置き換えられているもの、例えば、７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン及び２－ピリドンなどを含んでもよい。更なる核酸塩基は、US 3,687,808に開示されたもの、J.I. Kroschwitz(編集者)、The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, 858-859頁, John Wiley and Sons (1990)に開示されたもの、Englischら(1991)に開示されたもの、及びY.S. Sanghvi, 第15章: Antisense Research and Applications, 289-302頁, S.T. Crooke, B. Lebleu(編集者), CRC Press, 1993に開示されたものを含む。
ある種のこれらの核酸塩基は、オリゴヌクレオチドの結合親和性を増大するのに特に有用である。これらは、５－置換されたピリミジン、６－アザピリミジン、並びに、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシンを含む、Ｎ－２、Ｎ－６及びＯ－６置換されたプリンを含む。５－メチルシトシン置換は、０．６－１．２ ｏＣにより、核酸二重鎖の安定性を増大することが示されている。一実施態様において、これらの核酸塩基置換は、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組合せられる。
ある種の先に注記した修飾された核酸塩基、並びに他の修飾された核酸塩基の調製を開示する代表的米国特許は、US 3,687,808、US 4,845,205、US 5,130,302、US 5,134,066、US 5,175,273、US 5,367,066、US 5,432,272、US 5,457,187、US 5,459,255、US 5,484,908、US 5,502,177、US 5,525,711、US 5,552,540、US 5,587,469、US 5,594,121、US 5,596,091、US 5,614,617、US 5,645,985、US 5,830,653、US 5,763,588、US 6,005,096、US 5,681,941及びUS 5,750,692を含むが、これらに限定されるものではない。
相反するものに言及しない限りは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｕ又はＣへの言及は、天然の塩基又はその修飾された型のいずれかを意味することができる。
特定の実施態様において、本明細書記載のオリゴヌクレオチドの２個又はそれよりも多い塩基（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０塩基で、その中の任意の範囲を含むもの）は、修飾される。一部の実施態様において、本明細書記載のオリゴヌクレオチドの塩基は全て、修飾される。代わりの実施態様において、本明細書記載のオリゴヌクレオチドの塩基は、修飾されない。
骨格
本開示のオリゴヌクレオチドは、修飾された骨格又は非天然のヌクレオシド間連結を有するものを含む。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドは、骨格内にリン原子を保持するもの、及び骨格内にリン原子を有さないものを含む。
その中にリン原子を含む修飾されたオリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル；３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート；ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート；チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、及び通常の３’－５’連結を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’連結されたアナログ、並びに逆極性を有するもの（ここで、１又は複数のヌクレオチド間連結は、３’から３’、５’から５’、又は２’から２’連結である）を含む。逆極性を有するオリゴヌクレオチドは、最も３’－側のヌクレオチド間連結に、単独の３’から３’連結、すなわち脱塩基であり得る単独の逆方向ヌクレオシド残基（この核酸塩基は、ヒドロキシル基を失うか、又はその適所に有する）を含む。様々な塩、混合した塩及び遊離酸の形も含まれる。
前記リン－含有連鎖の調製を開示する代表的米国特許は、US 3,687,808、US 4,469,863、US 4,476,301、US 5,023,243、US 5,177,196、US 5,188,897、US 5,264,423、US 5,276,019、US 5,278,302、US 5,286,717、US 5,321,131、US 5,399,676、US 5,405,939、US 5,453,496、US 5,455,233、US 5,466,677、US 5,476,925、US 5,519,126、US 5,536,821、US 5,541,306、US 5,550,111、US 5,563,253、US 5,571,799、US 5,587,361、US 5,194,599、US 5,565,555、US 5,527,899、US 5,721,218、US 5,672,697及びUS 5,625,050を含むが、これらに限定されるものではない。
その中にリン原子を含まない修飾されたオリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、又は１もしくは複数の短鎖ヘテロ原子性もしくは複素環式ヌクレオシド間連結により形成される骨格を含む。これらは、モルホリノ連結（一部ヌクレオシドの糖部分から形成される）を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；並びに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有する他の骨格を含む。
前記オリゴヌクレオチドの調製を開示している代表的米国特許は、US 5,034,506、US 5,166,315、US 5,185,444、US 5,214,134、US 5,216,141、US 5,235,033、US 5,264,562、US 5,264,564、US 5,405,938、US 5,434,257、US 5,466,677、US 5,470,967、US 5,489,677、US 5,541,307、US 5,561,225、US 5,596,086、US 5,602,240、US 5,610,289、US 5,602,240、US 5,608,046、US 5,610,289、US 5,618,704、US 5,623,070、US 5,663,312、US 5,633,360、US 5,677,437、US 5,792,608、US 5,646,269及びUS 5,677,439を含むが、これらに限定されるものではない。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、例えば内在性ポリペプチドをコードし、及びｍＲＮＡ翻訳などの転写後事象と干渉することが可能であるような、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部と相補性であるオリゴヌクレオチドを意味するものとする。アンチセンス法の使用は、当該技術分野において周知である(例えば、G. Hartmann及びS. Endres, Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999)参照)。
一実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理的条件下でハイブリダイズし、すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチド（これは完全な又は部分的に１本鎖である）は、細胞内の通常の条件下で、内在性ポリペプチドをコードしているようなｍＲＮＡと、２本鎖ポリヌクレオチドを形成することが少なくとも可能である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、構造遺伝子に対応する配列又は遺伝子発現もしくはスプライシング事象の制御に影響する配列を含んでよい。例えば、アンチセンス配列は、内在性遺伝子の標的化されたコード領域、又は５’－非翻訳領域（ＵＴＲ）又は３’－ＵＴＲ又はこれらの組合せに対応してよい。これは、転写時又は転写後にスプライシングされ得るイントロン配列に対して、好ましくは標的遺伝子のエキソン配列に対してのみ、一部相補性がある。一般に多様性がより大きいＵＴＲを考慮すると、これらの領域の標的化は、遺伝子阻害のより大きい特異性を提供する。
このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、全遺伝子転写物、又はその一部に対し、相補性であってよい。標的化された転写物に対するアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも９０％及びより好ましくは９５～１００％である。アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、当然、本明細書記載のもののような分子を安定化するように機能する無関係の配列を含んでよい。
遺伝子サイレンシング
オリゴヌクレオチド分子、特にＲＮＡは、遺伝子発現を調節するために利用され得る。用語「ＲＮＡ干渉」、「ＲＮＡｉ」又は「遺伝子サイレンシング」は、ｄｓＲＮＡ分子が、それと２本鎖ＲＮＡ分子が実質的又は全体的相同性を共有している核酸配列の発現を低下するプロセスを一般に指す。しかし、ＲＮＡ干渉は、非－ＲＮＡの２本鎖分子を使用し達成することができることが示されている(例えばUS 20070004667参照)。
この２本鎖領域は、少なくとも１９の隣接ヌクレオチド、例えば、約１９～２３ヌクレオチドでなければならないか、又はより長い、例えば３０もしくは５０ヌクレオチド、もしくは１００ヌクレオチドもしくはそれ以上であってよい。全遺伝子転写物に対応する完全長配列が、使用されてよい。好ましくは、これらは長さが約１９～約２３ヌクレオチドである。
標的化された転写物に対する核酸分子の２本鎖の領域の同一性の程度は、少なくとも９０％、及びより好ましくは９５～１００％でなければならない。この核酸分子は、当然、この分子を安定化するように機能し得る無関係の配列を含んでよい。
本明細書において使用される用語「低分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」は、例えば配列－特異的様式でＲＮＡｉを媒介することにより、遺伝子発現を阻害又はダウンレギュレーションすることが可能なリボヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを指し、ここで２本鎖部分は、長さが５０ヌクレオチド未満、好ましくは長さが約１９～約２３ヌクレオチドである。例えば、ｓｉＲＮＡは、自己相補的センス領域及びアンチセンス領域を含む核酸分子であることができ、ここでアンチセンス領域は、標的核酸分子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、並びにセンス領域は、標的核酸配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＲＮＡは、２つの個別のオリゴヌクレオチドから集成されることができ、ここで一方の鎖はセンス鎖であり、他方はアンチセンス鎖であり、ここでアンチセンス鎖とセンス鎖は自己相補的である。これらの２本の鎖は、長さが異なることができる。
本明細書において使用される用語ｓｉＲＮＡは、配列特異的ＲＮＡｉ、例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉オリゴヌクレオチド、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾されたｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）などを媒介することが可能であるポリヌクレオチドを説明するために使用される他の用語と同等であることを意味する。加えて、本明細書において使用される用語ＲＮＡｉは、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、又はエピジェネティックスなどの、配列特異的ＲＮＡ干渉を説明するために使用される他の用語と同等であることを意味する。例えば、ｓｉＲＮＡ分子は、転写後レベル又は転写前レベルの両方で遺伝子をエピジェネティックにサイレンシングするために使用することができる。非限定的例において、ｓｉＲＮＡ分子による遺伝子発現のエピジェネティック調節は、遺伝子発現を変更するためのクロマチン構造のｓｉＲＮＡ媒介した修飾から生じ得る。
「ｓｈＲＮＡ」又は「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」は、約５０ヌクレオチド未満、好ましくは約１９～約２３ヌクレオチドが、同じＲＮＡ分子上に位置した相補的配列と塩基対形成しているＲＮＡ分子を意味し、ここで該配列及び相補的配列は、塩基相補性のある２つの領域により作製されたステム構造上に１本鎖ループを形成する、少なくとも約４～約１５ヌクレオチドの対応のない領域により隔てられている。１本鎖ループの配列の例としては、以下を含む：５’ ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ ３’。
ｓｈＲＮＡは、デュアル又はバイフィンガー又はマルチフィンガーヘアピン型ｄｓＲＮＡを含み、ここでこのＲＮＡ分子は、１本鎖スペーサー領域により隔てられたそのようなステムループ構造を２以上含む。
候補オリゴヌクレオチドの設計及び試験
当業者が承知しているように、本発明の要素を設計することに加え、オリゴヌクレオチドを作製する場合に考慮されるべき多くの公知の要因が存在する。特異性は、オリゴヌクレオチドの目的に応じて左右されるが、ｍＲＮＡ二次構造、熱力学安定性、ハイブリダイゼーション部位の位置、及び／又は機能性モチーフなどの、オリゴヌクレオチド－標的核酸相互作用の強度及び安定性などの性質を含む。
本発明の一部の方法は、特異的性質について、標的ポリヌクレオチド、又はその相補体をスキャニングすることに関与している。これは、目視によるか、又は当該技術分野において公知のコンピュータプログラムを使用することにより、実行され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドの機能特性を設計、分析及び予測するために使用することができるソフトウェアプログラムは、Mfold、Sfold、NUPACK、Nanofoldr、Hyperfold、及び／又はRNA designerを含む。遺伝子サイレンシングに関するオリゴヌクレオチドの機能特性を設計、分析及び予測するために使用することができるソフトウェアプログラムは、dsCheck、E-RNAi及び／又はsiRNA-Finderを含む。
一実施態様において、利用可能なソフトウェアが、可能性のある有用なオリゴヌクレオチドを選択するために使用され、次にこれらは、本明細書記載の望ましい性質についてスキャニングされる。あるいは、ソフトウェアは、本明細書記載のような所望の性質について、標的ポリヌクレオチド、又はその相補体をスキャニングするために、容易に開発され得る。
一旦合成された候補オリゴヌクレオチドは、当該技術分野における標準の手順を使用し、それらの所望の活性について試験されることができる。これは、インビトロにおいて関心対象の遺伝子を発現している細胞へ、該候補を投与し、並びにＲＮＡ及び／又はタンパク質などの遺伝子産物の量を分析することに関与してよい。別の例において、該候補は、動物へ投与され、並びにこの動物は、標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質の量について、及び／又は機能アッセイを使用し、スクリーニングされる。別の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡなど）にハイブリダイズするその能力について試験される。
一部の例において、発現及びオリゴヌクレオチド活性は、ｍＲＮＡ逆転写定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）により決定され得る。例えば、ＲＮＡは、候補オリゴヌクレオチドと共にインキュベーションされた細胞から抽出及び精製されることができる。次にｃＤＮＡは、単離されたＲＮＡから合成され、及びＲＴ－ｑＰＣＲが、当該技術分野において公知の方法及び試薬を使用し、実行され得る。一例において、ＲＮＡは、ISOLATE II RNAミニキット(Bioline)を使用し、細胞から精製され得、並びにｃＤＮＡは、単離されたＲＮＡから、ハイキャパシティcDNAアーカイブキット(Thermo Fisher Scientific)を製造業者の指示に従い使用し、合成され得る。ＲＴ－ｑＰＣＲは、HT7900及びQuantStudio 6 RT-PCRシステム(Thermo Fisher Scientific)上で、パワーSYBRグリーンマスターミックス(Thermo Fisher Scientific)を製造業者の指示に従い使用し実行することができる。
ＴＬＲ７活性の阻害の試験
本発明の一部の局面は、当該技術分野において公知の任意の方法を使用し決定することができるＴＬＲ７活性の阻害を試験することに関与している。一部の実施態様において、細胞内のＴＬＲ７活性は、１又は複数の炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦα、ＩＰ－１０）の発現及び／もしくは分泌によるか、及び／又は転写因子（例えば、ＮＦ－κＢ）の活性化もしくは発現により測定され得る。
ＴＬＲ７活性を阻害するオリゴヌクレオチドの能力は、例えば、ＴＬＲ７を発現する細胞を、オリゴヌクレオチドと共にインキュベーションし、その後該細胞を、ＴＬＲ７アゴニストで刺激し、並びに細胞集団における全般的ＴＬＲ７反応を分析するか、又は規定された時間経過後ＴＬＲ７－陽性活性を有する細胞の割合を分析することにより、分析されることができる。
そのような例において、ＴＬＲ７活性の阻害は、細胞集団の全般的に減少したＴＬＲ７反応、又は細胞が該オリゴヌクレオチドの非存在下（又は好適な対照阻害剤の存在下）でＴＬＲ７アゴニストにより処理される陽性対照条件と比べＴＬＲ７－陽性活性を有する細胞の低下した割合の観察により、確定されることができる。一例において、２９３ＸＬｈＴＬＲ７（ＨＥＫ－ＴＬＲ７と称される）細胞は、ｐＮＦ－κＢ－Ｌｕｃ４レポーターによりトランスフェクションされ、オリゴヌクレオチドとインキュベーションされ、その後Ｒ８４８により刺激される。ＴＬＲ７活性は、ルミネセンスにより活性化されたＮＦ－κＢを測定するルシフェラーゼアッセイにより決定され得る。ＴＬＲ７活性はまた、例えばＥＬＩＳＡにより、サイトカインレベルを測定することによっても分析され得る。
ＴＬＲ８活性の増強の試験
本発明の一部の局面は、当該技術分野において公知の任意の方法を使用し決定することができるＴＬＲ８活性の増強を試験することに関与している。一部の実施態様において、細胞内のＴＬＲ８活性は、１又は複数の炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦα、ＩＰ－１０）の発現及び／もしくは分泌、並びに／又は転写因子（例えば、ＮＦ－κＢ）の活性化もしくは発現により測定され得る。
ＴＬＲ８活性を増強するオリゴヌクレオチドの能力は、例えば、ＴＬＲ８を発現する細胞を、オリゴヌクレオチドと共にインキュベーションし、その後該細胞を、ＴＬＲ８アゴニストで刺激し、並びに細胞集団における全般的ＴＬＲ８反応を分析するか、又は規定された時間経過後ＴＬＲ８－陽性活性を有する細胞の割合を分析することにより、分析されることができる。
そのような実施例において、ＴＬＲ８活性の増強は、細胞集団の全般的に減少したＴＬＲ８反応、又は細胞が該オリゴヌクレオチドの非存在下（又は好適な対照の非－増強剤の存在下）でＴＬＲ８アゴニストにより処理される陰性対照条件と比べＴＬＲ８－陽性活性を有する細胞のより高い割合の観察により、確定されることができる。一例において、２９３ＸＬｈＴＬＲ８（ＨＥＫ－ＴＬＲ８と称される）細胞は、ｐＮＦ－κＢ－Ｌｕｃ４レポーターによりトランスフェクションされ、オリゴヌクレオチドとインキュベーションされ、その後Ｒ８４８により刺激される。ＴＬＲ８活性は、ルミネセンスにより活性化されたＮＦ－κＢを測定するルシフェラーゼアッセイにより決定され得る。ＴＬＲ８活性はまた、例えばＥＬＩＳＡにより、サイトカインレベルを測定することによっても分析され得る。
「増強」は、対照条件と比べた機能特性の増加を指す。ＴＬＲ８活性の増強は、約１００％より大きく、例えば約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約２０倍又は約５０倍であってよい。好ましくは、ＴＬＲ８増強のレベルは、約２倍～５０倍、約２倍～２０倍、及び／又は約５倍～２０倍以上である。
使用
本発明のオリゴヌクレオチドは、動物へ投与されるように設計される。一例において、動物は、脊椎動物である。例えば、動物は、哺乳動物、鳥類、脊索動物、両生類、又は爬虫類であることができる。例証的対象は、ヒト、霊長類、家畜（例えば、ヒツジ、ウシ、ニワトリ、ウマ、ロバ、ブタ）、伴侶動物（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲野生動物（例えば、キツネ、シカ）を含むが、これらに限定されるものではない。一例において、哺乳動物はヒトである。
本発明のオリゴヌクレオチドは、関心対象の任意の遺伝子／ポリヌクレオチド／機能を標的化するために使用することができる。典型的には、該オリゴヌクレオチドは、動物の形質を修飾するため、より典型的には疾患を治療又は予防するために使用される。好ましい実施態様において、特にＴＬＲ７反応が阻害されず及び／又はＴＬＲ８反応が増強される場合において、疾患は、該オリゴヌクレオチドの投与後にＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８反応をマウントすることができる動物から恩恵がある。
本発明のオリゴヌクレオチドを使用し治療又は予防され得る疾患は、癌（例えば、乳癌、卵巣癌、中枢神経系の癌、消化管癌、膀胱癌、皮膚癌、肺癌、頭頸部癌、血液及びリンパ系の癌、骨癌）、希遺伝性疾患、神経筋及び神経系の疾患（例えば、脊髄性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ハンチントン病、バッテン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調、脳性麻痺）、ウイルス（例えば、サイトメガロウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、エボラ出血熱ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、コロナウイルス）、心臓血管疾患（例えば、家族性高コレステロール血症、高トリグリセリド血症）、自己免疫疾患及び炎症疾患（例えば、関節炎、狼瘡、嚢炎、乾癬、喘息）、並びに非－アルコール性及びアルコール性脂肪肝疾患を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明のオリゴヌクレオチドの標的遺伝子（ポリヌクレオチド）の例は、ＰＬＫ１ＥＲＢＢ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＥＲＢＢ３、ＨＤＡＣ１、ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＴＹＭＳ、ＴＵＢＢ４Ｂ、ＦＧＦＲ２、ＥＳＲ１、ＦＡＳＮ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＮＤＵＦＢ４、ＰＰＡＴ、ＮＤＵＦＢ７、ＤＮＭＴ１、ＢＣＬ２、ＡＴＰ１Ａ１、ＨＤＡＣ３、ＦＧＦＲ１、ＮＤＵＦＳ２、ＨＤＡＣ２、ＮＤＵＦＳ３、ＨＭＧＣＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＡＫＴ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＣＤＫ２、ＭＴＯＲ、ＰＤＰＫ１、ＣＳＮＫ２Ａ１、ＰＩＫ３ＣＢ、ＣＤＫ１２、ＭＣＬ１、ＡＴＲ、ＰＬＫ４、ＭＥＮ１、ＰＴＫ２、ＦＺＤ５、ＫＲＡＳ、ＷＲＮ、ＣＲＥＢＢＰ、ＮＲＡＳ、ＭＡＴ２Ａ、ＲＨＯＡ、ＴＰＸ２、ＰＰＰ２ＣＡ、ＡＬＤＯＡ、ＲＡＥ１、ＳＫＰ１、ＡＴＰ５Ａ１、ＥＩＦ４Ｇ１、ＣＴＮＮＢ１、ＴＦＲＣ、ＣＤＨ１、ＣＣＮＥ１、ＣＬＴＣ、ＭＥＴＡＰ２、ＧＲＢ２、ＭＤＭ４、ＳＬＣ１６Ａ１、ＦＥＲＭＴ２、ＥＮＯ１、ＳＴＸ４、ＳＦ３Ｂ１、ＲＢＢＰ４、ＦＥＮ１、ＭＲＰＬ２８、ＣＣＮＡ２、ＰＴＰＮ１１、ＳＡＥ１、ＫＭＴ２Ｄ、ＡＰＣ、ＣＡＤ、ＮＡＭＰＴ、ＯＧＴ、ＨＳＰＡ８、ＵＳＰ５、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＰＧＤ、ＶＲＫ１、ＳＥＰＳＥＣＳ、ＳＵＰＴ４Ｈ１、ＤＮＡＪＣ９、ＴＲＩＡＰ１、ＤＬＤ、ＰＴＰＮ７、ＶＤＡＣ１、ＳＴＡＴ３、ＴＣＥＢ２、ＡＤＳＬ、ＧＭＰＳ、ＤＨＰＳ、ＭＥＴＡＰ１、ＴＡＦ１３、ＣＦＬ１、ＳＣＤ、ＲＢＭ３９、ＰＧＡＭ１、ＦＮＴＢ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＡＲＦ１、ＵＢＥ２Ｔ、ＵＭＰＳ、ＭＹＣ、ＰＲＭＴ５、ＥＩＦ４Ｇ２、ＳＫＰ２、ＳＴＡＧ２、ＡＴＦ４、ＷＤＲ７７、ＩＬＫ、ＭＥＴＴＬ１６、ＳＯＤ１、ＤＤＸ６、ＦＵＲＩＮ、ＡＡＲＳ、ＦＮＴＡ、ＰＡＢＰＣ１、ＲＡＮＢＰ２、ＣＤＣ２５Ｂ、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＥＮＰＥ、ＡＤＡＲ、ＣＤＣ４２、ＲＮＦ３１、ＣＣＮＣ、ＰＲＩＭ１、ＳＬＣ３８Ａ２、ＳＮＵＰＮ、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＲＴＮ４ＩＰ１、ＶＭＰ１、ＴＧＦＢＲ１、ＴＸＮ、ＵＢＥ２Ｎ、ＵＡＰ１、ＲＡＣ１、ＧＧＰＳ１、ＲＡＢ１０、ＲＡＢ６Ａ、ＴＰＩ１、ＲＰＥ、ＴＨＧ１Ｌ、ＵＢＥ２Ｄ３、ＲＨＥＢ、ＰＫＭ、ＧＭＮＮ、ＨＧＳ、ＮＣＫＡＰ１、ＮＵＰ９８、ＳＭＡＲＣＡ２、ＲＮＦ４、ＤＤＸ３９Ｂ、ＡＣＬＹ、ＸＰＯ１、ＰＰＰ１Ｒ８、ＹＡＰ１、ＭＴＨＦＤ１、ＬＰＡＲ１、ＴＡＦ１、ＵＲＯＤ、ＳＴＸＢＰ３、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＶＨＬ、ＥＦＲ３Ａ、ＦＥＣＨ、ＭＲＰＬ４４、ＡＩＦＭ１、ＭＡＧＯＨ、ＭＲＰＬ１７、ＳＵＺ１２、ＲＮＭＴ、ＲＡＢ１Ｂ、ＰＮＰＴ１、ＲＡＤ１、ＷＤＲ４８、ＰＩＴＲＭ１、ＭＲＰＬ４７、ＡＰ２Ｍ１、ＥＩＦ４Ａ１、ＵＢＥ２Ｃ、ＬＯＮＰ１、ＶＰＳ４Ａ、ＳＮＲＮＰ２５、ＴＵＢＧＣＰ６、ＤＮＭ２、ＵＢＥ２Ｍ、ＥＸＯＳＣ９、ＴＡＦ１Ｂ、ＣＤＣ３７、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１、ＰＯＰ１、ＪＵＰ、ＰＲＰＳ１、ＧＰＸ４、ＣＦＬＡＲ、ＣＨＭＰ４Ｂ、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＲ１Ａ、ＰＴＰＮ２３、ＳＨＣ１、ＴＲＰＭ７、ＳＬＣ４Ａ７、ＨＳＰＤ１、ＸＲＮ１、ＷＤＲ１、ＩＴＧＢ５、ＵＢＲ４、ＡＴＰ５Ｂ、ＣＰＤ、ＴＵＦＭ、ＭＹＨ９、ＡＴＰ５Ｆ１、ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ１、ＳＯＤ２、ＰＦＡＳ、ＮＦＥ２Ｌ２、ＡＲＦ４、ＩＴＧＡＶ、ＤＨＸ３６、ＫＩＦ１８Ａ、ＤＤＸ５、ＸＲＣＣ５、ＤＮＡＪＣ１１、ＺＢＴＢ８ＯＳ、ＮＣＬ、ＳＤＨＢ、ＡＴＰ５Ｃ１、ＮＤＣ１、ＳＮＦ８、ＣＵＬ３、ＳＬＣ７Ａ１、ＡＳＮＡ１、ＥＤＦ１、ＴＭＥＤ１０、ＣＨＭＰ６、ＡＲＩＨ１、ＤＤＯＳＴ、ＲＰＬ２８、ＤＩＭＴ１、ＣＭＰＫ１、ＰＰＩＬ１、ＰＰＡ２、ＳＭＡＤ７、ＣＥＰ５５、ＭＶＤ、ＭＶＫ、ＰＤＳ５Ａ、ＫＮＴＣ１、ＣＡＰＺＢ、ＧＭＰＰＢ、ＴＰＴ１、ＡＣＩＮ１、ＳＡＲ１Ａ、ＴＡＦ６Ｌ、ＰＴＢＰ１、ＰＡＫ２、ＣＲＫＬ、ＮＨＬＲＣ２、ＩＮＯ８０、ＳＬＣ２５Ａ３、ＡＣＴＲ３、ＤＤＸ３Ｘ、ＨＵＷＥ１、ＴＢＣＡ、ＩＫ、ＳＳＢＰ１、ＡＲＰＣ４、ＳＬＣ７Ａ５、ＯＳＧＥＰ、ＰＤＣＤ２、ＴＲＡＦ２、ＳＮＡＰ２３、ＲＰＮ１、ＥＩＦ５Ａ、ＧＥＭＩＮ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＡＨＣＹＬ１、ＣＨＭＰ５、ＴＲＡＰＰＣ１、ＬＲＰ８、ＡＲＩＤ２、ＵＢＥ２Ｌ３、ＳＴＡＭＢＰ、ＫＤＳＲ、ＵＱＣＲＣ２、ＰＮＮ、ＵＳＰ７、ＴＢＣＤ、ＡＴＰ６Ｖ０Ｅ１、ＰＣＹＴ１Ａ、ＴＡＺ、ＰＯＬＲＭＴ、ＣＥＬＳＲ２、ＴＥＲＦ１、ＢＵＢ１、ＹＲＤＣ、ＳＭＧ６、ＴＢＸ３、ＳＬＣ３９Ａ１０、ＩＰＯ１３、ＣＤＩＰＴ、ＵＢＡ５、ＥＭＣ７、ＦＥＲＭＴ１、ＶＥＺＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＦＰＧＳ、ＪＵＮ、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＮＰＭ１、ＧＴＦ２Ａ１、ＭＢＴＰＳ１、ＨＭＧＣＳ１、ＬＲＲ１、ＨＳＤ１７Ｂ１２、ＬＣＥ２Ａ、ＮＵＰ１５３、ＦＯＳＬ１、ＩＲＳ２、ＣＹＢ５Ｒ４、ＰＭＰＣＢ、ＡＲＨＧＥＦ７、ＴＲＲＡＰ、ＮＲＢＰ１、ＡＲＭＣ７、ＭＯＣＳ３、ＴＩＰＡＲＰ、ＳＥＣ６１Ａ１、ＰＦＤＮ５、ＭＹＢ、ＩＲＦ４、ＳＴＸ５、ＭＹＣＮ、ＦＯＸＡ１、ＳＯＸ１０、ＧＡＴＡ３、ＺＥＢ２、ＭＹＢＬ２、ＭＦＮ２、ＴＢＣＢ、ＫＬＦ４、ＴＲＩＭ３７、ＣＥＢＰＡ、ＳＴＡＧ１、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＨＹＰＫ、ＦＬＩ１、ＮＣＡＰＤ２、ＭＡＦ、ＮＵＰ９３、ＲＢＢＰ８、ＨＪＵＲＰ、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＯＣＳ３、ＧＲＷＤ１、ＮＫＸ２－１、ＦＤＸＲ、ＳＰＤＥＦ、ＳＢＤＳ、ＳＨ３ＧＬ１、ＫＬＦ５、ＣＮＯＴ３、ＺＮＦ４０７、ＣＰＳＦ１、ＲＰＴＯＲ、ＥＸＴ１、ＳＭＣ１Ａ、ＧＵＫ１、ＴＩＭＭ２３、ＦＡＵ、ＡＣＯ２、ＡＬＧ１、ＣＣＮＬ１、ＳＣＡＰ、ＳＲＳＦ６、ＳＰＡＧ５、ＳＯＸ９、ＬＤＢ１、ＡＳＰＭ、ＬＩＧ１、ＴＦＤＰ１、ＲＰＡＩＮ、ＣＥＮＰＡ、ＭＩＳ１２、ＩＬＦ３、ＨＳＣＢ、ＥＲＣＣ２、ＳＯＸ２、ＡＲＦＲＰ１、ＰＭＦ１、ＰＯＬＲ３Ｅ、ＭＡＤ２Ｌ２、ＰＥＬＰ１、ＮＸＴ１、ＷＤＨＤ１、ＺＷＩＮＴ、Ｅ２Ｆ３、ＦＺＲ１、ＪＵＮＢ、ＯＧＤＨ、ＮＯＢ１、ＳＫＡ３、ＴＡＣＣ３、ＵＴＰ１４Ａ、ＸＲＮ２、ＳＭＧ５、ＩＤＨ３Ａ、ＣＩＡＯ１、ＣＯＱ４、ＺＦＰ３６Ｌ１、ＣＤＣＡ５、ＰＲＫＲＡ、ＰＦＤＮ６、ＰＡＫ１ＩＰ１、ＰＳＴＫ、ＥＤＣ４、ＵＴＰ１８、ＴＯＭＭ２２、ＣＡＳＣ５、ＰＴＴＧ１、ＲＢＢＰ５、ＰＰＰ１Ｒ１２Ａ、ＦＡＲＳ２、ＦＯＸＭ１、ＳＩＮ３Ａ、ＢＵＢ１Ｂ、ＧＮＢ１Ｌ、ＳＭＣ５、ＳＡＲＳ２、ＳＹＮＣＲＩＰ、ＩＰＰＫ、ＦＡＮＣＤ２、ＷＤＲ４６、ＦＡＮＣＩ、ＤＣＰ２、ＲＦＣ２、ＲＮＦ２０、ＤＭＡＰ１、ＭＥＤ２３、ＭＢＮＬ１、ＣＴＰＳ１、ＴＢＰ、ＭＭＳ１９、ＲＡＤ５１Ｃ、ＣＤＳ２、ＮＯＮＯ、ＵＳＰ１８、ＰＡＲＳ２、ＦＢＸＷ１１、ＳＵＭＯ２、ＲＲＰ１２、ＦＡＭ５０Ａ、ＵＲＢ２、ＭＣＭ４、ＳＬＣ２５Ａ２８、ＩＰＯ７、ＭＡＸ、ＳＦＳＷＡＰ、ＳＢＮＯ１、ＤＰＡＧＴ１、ＴＩＮＦ２、ＢＲＣＡ２、ＮＵＰ５０、ＲＰＩＡ、ＥＰ４００、ＩＫＢＫＡＰ、ＫＩＦ１４、ＲＴＴＮ、ＣＣＤＣ１１５、ＧＥＭＩＮ６、ＷＷＴＲ１、ＢＣＳ１Ｌ、ＧＴＦ３Ａ、ＳＣＹＬ１、ＮＥＬＦＢ、ＤＤＸ３９Ａ、ＴＲＡ２Ｂ、ＳＹＶＮ１、ＩＳＬ１、ＣＹＢ５Ｂ、ＡＣＳＬ３、ＤＰＨ３、Ｅ２Ｆ１、ＩＲＥＢ２、ＳＲＥＢＦ１、ＳＭＣ６、ＩＲＦ８、ＩＤ１、ＰＤＣＤ１１、ＳＮＡＰＣ２、ＴＩＭＭ１７Ａ、ＡＮＡＰＣ１０、ＮＵＰ８５、ＳＥＨ１Ｌ、ＶＢＰ１、ＮＵＤＣ、ＭＴＸ２、ＲＰＰ２５Ｌ、ＩＳＹ１、ＬＥＭＤ２、ＡＴＰ５Ｄ、ＥＸＯＳＣ２、ＴＡＦ１Ｃ、ＰＰＩＬ４、ＳＥＰＨＳ２、ＨＮＲＮＰＨ１、ＣＴＲ９、ＣＤＣ２６、ＴＩＭＭ１３、ＦＡＭ９６Ｂ、ＣＥＢＰＺ、ＵＦＬ１、ＺＮＦ２３６、ＣＯＰＧ１、ＴＰＲ、ＭＩＯＳ、ＵＢＥ２Ｇ２、ＭＥＤ１２、ＧＴＦ３Ｃ１、ＰＰＰ２Ｒ２Ａ、ＵＢＩＡＤ１、ＷＴＡＰ、ＭＹＢＢＰ１Ａ、ＮＵＰ８８、ＮＥＬＦＣＤ、ＷＤＲ７３、ＲＴＣＢ、ＣＥＰ１９２、ＧＴＦ３Ｃ５、ＬＥＮＧ１、ＲＩＮＴ１、ＭＥＤ２４、ＣＯＸ６Ｂ１、ＤＣＴＮ６、ＳＬＣ２５Ａ３８、ＬＹＲＭ４、ＳＴＲＡＰ、ＴＴＦ２、ＤＤＸ２７、ＧＴＦ２Ｆ１、ＺＮＨＩＴ２、ＢＣＬＡＦ１、ＷＤＲ１８、ＧＴＦ２Ｈ２Ｃ、ＮＤＥ１、ＴＩＭＭ９、ＣＨＭＰ７、ＩＰＯ１１、ＴＧＩＦ１、ＮＯＣ４Ｌ、ＥＸＯＳＣ６、ＷＤＲ２４、ＩＮＴＳ６、ＤＤＸ４１、ＵＢＥ２Ｓ、ＡＲＧＬＵ１、ＳＨＯＣ２、ＡＴＰ５Ｊ、ＣＳＴＦ２、ＲＰＰ３０、ＮＨＰ２、ＧＲＨＬ２、ＲＰＬ２２Ｌ１、ＷＤＲ７４、ＵＴＰ２３、ＣＣＤＣ１７４、ＲＰＰ２１、ＵＢＥ２Ｊ２、ＧＥＭＩＮ８、ＡＴＰ６Ｖ０Ｂ、ＫＩＡＡ１４２９、ＰＮＯ１、ＭＥＤ２２、ＥＮＹ２、ＴＨＯＣ７、ＤＤＸ１９Ａ、ＳＵＧＰ１、ＰＥＬＯ、ＥＬＡＣ２、ＣＨＣＨＤ４、ＲＮＰＣ３、ＩＮＴＳ３、ＰＳＭＧ４、ＵＱＣＲＣ１、ＴＡＦ１Ａ、ＴＳＲ１、ＵＴＰ６、ＴＲＭＴ５、ＥＩＦ１ＡＤ、ＧＴＦ３Ｃ２、ＤＣＴＮ３、ＧＰＳ１、ＷＤＲ７、ＥＸＯＳＣ８、ＫＡＮＳＬ１、ＳＰＲＴＮ、ＫＡＮＳＬ３、ＥＸＯＳＣ５、ＰＲＣＣ、ＴＲＮＡＵ１ＡＰ、ＥＩＦ３Ｊ、ＴＡＭＭ４１、ＨＡＵＳ６、ＯＩＰ５、ＨＡＵＳ５、ＴＡＦ６、ＭＲＰＳ２２、ＭＲＰＳ３４、ＷＢＰ１１、ＣＯＧ８、ＤＨＸ３８、ＤＮＬＺ、ＬＡＧＥ３、ＦＵＢＰ１、ＭＥＤ２６、ＳＬＣ７Ａ６ＯＳ、ＭＡＲＳ２、ＲＢＭ２８、ＡＳＣＣ３、ＰＳＭＧ３、ＴＵＢＧＣＰ５、ＰＣＦ１１、又はＬＡＳ１Ｌを含むが、これらに限定されるものではない。
ある実施態様において、標的化される遺伝子は、ＰＫＮ３、ＶＥＧＦＡ、ＫＩＦ１１、ＭＹＣ、ＥＰＨＡ２、ＫＲＡＳ（Ｇ１２）、ＥＲＢＢ３、ＢＩＲＣ５、ＨＩＦ１Ａ、ＢＣＬ２、ＳＴＡＴ３、ＡＲ、ＥＰＡＳ１、ＢＲＣＡ２、又はＣＬＵを含む。
本明細書記載のように修飾され得る市販のオリゴヌクレオチドの例は、インクリシラン、ミポメルセン(Kynamro)、ヌシネルセン(Spinraza)、エテプリルセン(Exondys51)、ミラビルセン(SPC3649)、RG6042(IONIS-HTTRx)、イノテルセン、ボラネソルセン、ゴロジルセン(Vyondys53)、ホミビルセン(Vitravene)、パチシラン、ギボシラン、インクリシラン、ダンバトリセン、及びIONIS-AR-2.5Rxを含むが、これらに限定されるものではない。
組成物
本開示のオリゴヌクレオチドは、取込み、分布及び／又は吸収を補助するために、他の分子、分子構造又は化合物の混合物と、混合されるか、内封されるか、複合されるか（融合など）、又はそれ以外に会合されてよく、例えば、リポソーム、受容体－標的化分子、経口、経直腸、局所又は他の製剤を生じる。そのような取込み、分布及び／又は吸収を補助する製剤の調製を開示する代表的米国特許は、US 5,108,921、US 5,354,844、US 5,416,016、US 5,459,127、US 5,521,291、US 5,543,158、US 5,547,932、US 5,583,020、US 5,591,721、US 4,426,330、US 4,534,899、US 5,013,556、US 5,108,921、US 5,213,804、US 5,227,170、US 5,264,221、US 5,356,633、US 5,395,619、US 5,416,016、US 5,417,978、US 5,462,854、US 5,469,854、US 5,512,295、US 5,527,528、US 5,534,259、US 5,543,152、US 5,556,948、US 5,580,575、及びUS 5,595,756を含むが、これらに限定されるものではない。
本開示のオリゴヌクレオチドは、医薬として許容し得る担体中で投与されてよい。この医薬として許容し得る担体は、固体又は液体であってよい。医薬として許容し得る担体の有用な例は、本開示の活性物質の活性に影響を及ぼさない、希釈剤、溶媒、界面活性剤、賦形剤、懸濁化剤、緩衝剤、滑沢剤、アジュバント、ビヒクル、乳化剤、吸収剤、分散媒、コーティング剤、安定化剤、保護的コロイド、接着剤、増粘剤、チキソトロピック剤、浸透剤、金属イオン封鎖剤、等張化剤及び吸収遅延剤を含むが、これらに限定されるものではない。
一実施態様において、医薬担体は、注射用水（ＷＦＩ）であり、及び医薬組成物は、ｐＨ７．４、７．２～７．６に調節される。一実施態様において、塩は、ナトリウム塩又はカリウム塩である。
該オリゴヌクレオチドは、キラル（不斉）中心を含むか、又は総じてこの分子は、キラルであってよい。個々の立体異性体（エナンチオマー及びジアステレオマー）及びこれらの混合物は、本開示の範囲内である。
本開示のオリゴヌクレオチドは、医薬として許容し得る塩、エステル、もしくはエステルの塩、又は投与時にその生物学的活性代謝産物を提供する（直接的又は間接的）ことが可能である任意の他の化合物であってよい。本明細書において使用される用語「医薬として許容し得る塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、且つ投与時に望ましくない毒性作用をもたらさない、該オリゴヌクレオチドの生理的に又は医薬として許容し得る塩を指す。医薬として許容し得る塩及びその使用の例は、US 6,287,860に更に説明される。
本開示のオリゴヌクレオチドは、プロドラッグ又はプロドラッグの医薬として許容し得る塩、或いは他の生物学的同等物であってよい。本明細書において使用される用語「プロドラッグ」は、投与時に内在性酵素又は他の化学物質及び／もしくは条件により活性型(すなわち薬物)へ転換される不活性型で調製される治療薬を指す。特に、本開示のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ型は、WO 93/24510、WO 94/26764及びUS 5,770,713に開示された方法に従い、ＳＡＴＥ［（Ｓアセチル－２－チオエチル）リン酸エステル］誘導体として調製される。
プロドラッグは、例えば体内で、例として血液中の加水分解により、医学的作用を有するその活性型へ転換されてよい。医薬として許容し得るプロドラッグは、T. Higuchi及びV. Stella, Prodrugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 of the A. C. S. Symposium Series (1976)；"Design of Prodrugs" 編集H. Bundgaard, Elsevier, 1985；並びに、Edward B. Roche, 編集, Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987に説明されている。有機化学分野の業者は、多くの有機化合物は、そこでそれらが反応することができるか、又はそれから沈殿もしくは結晶化される溶媒と、複合体を形成することができることを理解するであろう。これらの複合体は、「溶媒和物」として公知である。例えば、水との複合体は、「水和物」として公知である。
一実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの細胞取込みを増大するために、複合体化剤と複合体化され得る。複合体化剤の例は、カチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、オリゴヌクレオチドを細胞へ送達するために使用することができる。
用語「カチオン性脂質」は、極性ドメイン及び非極性ドメインの両方を有し、且つ生理的ｐＨでもしくはその付近で正に荷電することが可能であり、並びに核酸などのポリアニオンに結合し、核酸の細胞への送達を促進する、脂質及び合成脂質を含む。概して、カチオン性脂質は、飽和及び不飽和のアルキル、並びに脂環式エーテル及びアミンのエステル、アミド、又はそれらの誘導体を含む。カチオン性脂質の直鎖及び分岐鎖のアルキル基及びアルケニル基は、例えば１～約２５個の炭素原子を含むことができる。好ましい直鎖又は分岐鎖のアルキル基又はアルケン基は、６個以上の炭素原子を含む。脂環式基は、コレステロール基及び他のステロイド基を含む。カチオン性脂質は、例えば、Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｉ－、Ｆ－、酢酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン、硫酸イオン、亜硝酸イオン、及び硝酸イオンを含む、様々な対イオン（アニオン）と共に調製され得る。
カチオン性脂質の例は、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）スターバーストデンドリマー、リポフェクチン（ＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥの組合せ）、Lipofectase、LIPOFECTAMINE(商標)(例えば、LIPOFECTAMINE(商標)2000)、ＤＯＰＥ、サイトフェクチン(Gilead Sciences, Foster City, Calif.)、及びユーフェクチン(JBL, San Luis Obispo, Calif.)を含む。例証的カチオン性リポソームは、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオロキシ）－プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオロキシ）－プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、２，３，－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド；並びに、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）から製造することができる。オリゴヌクレオチドはまた、例えばポリ（Ｌ－リジン）又はアビジンと、複合体化されることができ、及び脂質は、例えばステリル－ポリ（Ｌ－リジン）など、この混合物中に含まれても含まれなくともよい。
カチオン性脂質は、オリゴヌクレオチドを細胞へ送達するために、当該技術分野において使用されている(例えば、US 5,855,910；5,851,548；5,830,430；5,780,053；5,767,099；Lewisら、1996；Hopeら、1998参照)。本オリゴヌクレオチドの取込みを促進するために使用することができる他の脂質組成物は、この発明の方法と結びつけて使用され得る。先に列挙されたものに加え、他の脂質組成物もまた、当該技術分野において公知であり、且つ例えばUS 4,235,871；US 4,501,728；4,837,028；4,737,323において考察されたものを含む。
一実施態様において、脂質組成物は、オリゴヌクレオチドの脂質-媒介したトランスフェクションを増強する物質、例えばウイルスタンパク質を更に含有することができる。別の実施態様において、Ｎ－置換したグリシンオリゴヌクレオチド（ペプトイド）を、オリゴヌクレオチドの取込みを最適化するために、使用することができる。
別の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドを送達するための組成物は、約１～約４個の塩基性残基を有するペプチドを含有する。これらの塩基性残基は、例えば、ペプチドのアミノ末端、Ｃ－末端、又は内部領域上に、位置することができる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電極性側鎖（例えば、グリシン（無極性とも考えられ得る）、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ－分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸を含む。塩基性アミノ酸は別として、このペプチドの他の残基の大部分又は全ては、非塩基性アミノ酸、例えばリジン、アルギニン、又はヒスチジン以外のアミノ酸から選択され得る。好ましくは、圧倒的多数の長い中性側鎖を持つ中性アミノ酸が使用される。
一実施態様において、オリゴヌクレオチドは、本明細書において「輸送ペプチド」と称される、オリゴヌクレオチドを細胞へ輸送するペプチド配列の結合により、修飾される。一実施態様において、本組成物は、タンパク質をコードしている標的核酸分子と相補的であるオリゴヌクレオチド、及び共有的に結合した輸送ペプチドを含む。
更なる実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、抗体、抗体－様分子又はアプタマーなどの標的化部分に結合される(例えば、Toloue及びFord(2011)、並びにEspositoら(2018)参照)。
投与
一実施態様において、本開示のオリゴヌクレオチドは、全身的に投与される。本明細書において使用される「全身投与」は、腸内又は非経口のいずれかである投与経路である。
本明細書において使用される「腸内」は、消化管の任意の部分に関与している投与の形式を指し、並びに、例えば、錠剤、カプセル剤又はドロップ型でのオリゴヌクレオチドの経口投与；経胃栄養チューブ、経十二指腸栄養チューブ、又は胃瘻造設；並びに、例えば坐薬又は浣腸の形でのオリゴヌクレオチドの経直腸投与を含む。
本明細書において使用される「非経口」は、注射又は注入による投与を含む。例としては、静脈内（静脈へ）、動脈内（動脈へ）、筋肉内（筋肉へ）、心内（心臓へ）、皮下（皮膚の下側）、骨髄内輸液（骨髄へ）、皮内（皮膚それ自身へ）、髄腔内（脊柱管へ）、腹腔内（腹膜への注入又は注射）、膀胱内（膀胱への注入）、経真皮（傷のない皮膚を通じた拡散）、経粘膜（粘膜を通じた拡散）、吸入を含む。
一実施態様において、本医薬組成物の投与は、皮下である。
該オリゴヌクレオチドは、単回投与量として、又は例えば、毎日１回、２日に、３日に、４日に、５日に、６日に、７日に、８日に、９日に、１０日に、１１日に、１２日に、１３日にもしくは１４日に１回、毎週１回、毎週２回、毎週３回、２週間に１回、３週間に１回、毎月１回、２ヶ月に１回、３ヶ月から６ヶ月に１回、もしくは１２ヶ月に１回など、ある期間を基に反復投与量として、投与されてよい。
一実施態様において、投与は、１週間につき１～３回、又は毎週、２週間、３週間、４週間に１回、又は２ヶ月に１回である。
一実施態様において、投与は、毎週１回である。
一実施態様において、低投与量が、３～６ヶ月間、例えば約２５～５０ｍｇ／週が少なくとも３～６ヶ月間投与され、その後最大１２ヶ月間及び日常的に投与される。
例示的投与量は、約１０～５，０００ｍｇである。例示的投与量は、２５、５０、１００、１５０、２００、１，０００、２，０００ｍｇを含む。例示的投与量は、１．５ｍｇ／ｋｇ（約５０～１００ｍｇ）及び３ｍｇ／ｋｇ（１００～２００ｍｇ）、４．５ｍｇ／ｋｇ（１５０～３００ｍｇ）、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇを含む。一実施態様において、投与量は、１週間に１回投与される。従って一実施態様において、およそ１０～３０、又は２０～４０、又は２０～２８ｍｇの低投与量が、典型的には体重が約２５～６５ｋｇの対象へ投与されてよい。一実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、治療効果をもたらすために、１回投与量につき５０ｍｇ未満、又は３０ｍｇ未満、又は約２５ｍｇの投与量で投与される。
実施例
実施例１－方法
倫理的陳述
健常ドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の収集は、オーストラリアヒト研究倫理委員会（ＨＲＥＣ）参照番号02052Aの下で、Monash Healthにより承認された。
細胞の単離、培養及び刺激
ＰＢＭＣを、先に報告されたように(Gantierら、2010)、Histopaque-1770(Sigma-Aldrich)を使用する密度勾配遠心により、全血液提供物から単離し、並びに１×抗生物質／抗真菌薬及び１０％熱失活したウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ １６４０プラスＬ－グルタミン培地(Thermo Fisher Scientific)（完全ＲＰＭＩと称す）に播種した。
各々、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ９を安定して発現している、２９３ＸＬ－ｈＴＬＲ８－ＨＡ（ＨＥＫ－ＴＬＲ８と称す）及び２９３ＸＬ－ｈＴＬＲ７－ＨＡ（ＨＥＫ－ＴＬＲ７と称す）及び２９３ＸＬ－ｈＴＬＲ９－ＨＡを、Invivogenから購入し、１０％熱失活したウシ胎仔血清(Thermo Fisher Scientific)及び1×抗生物質/抗真菌薬(Thermo Fisher Scientific)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(Thermo Fisher Scientific)（完全ＤＭＥＭと称す）に１０μｇ／ｍｌブラストサイジン(Invivogen)を補充したものにおいて維持した。親の野生型（ＷＴ）ＴＨＰ－１、ＵＮＣ９３Ｂ１－欠損ＴＨＰ－１(Schmid-Burgkら、2014)及び蛍光野生型ＵＮＣ９３Ｂ１で再構築したマッチしたクローン(Pelkaら、2014)を、完全ＲＰＭＩにおいて成長させた。ＯＣＩ－ＡＭＬ３及びＭＯＬＭ１３を、２０％熱失活したウシ胎仔血清及び１×抗生物質／抗真菌薬を補充したＲＰＭＩにおいて成長させた(それらのアイデンティティは、PowerPlex HS16システムキット(Promega)によるインハウス細胞株同定サービスにより確認した)。全ての細胞は、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。細胞株は、１週間に２～３回継代し、ＰＣＲにより日常的に、マイコプラズマ混入について試験した。
刺激については、ＴＨＰ－１、ＭＯＬＭ１３及びＯＣＩ－ＡＭＬ３を、ＡＳＯで一晩処理し、その後１μｇ／ｍｌ Ｒ８４８(Invivogen)により刺激した。ＨＥＫ－ＴＬＲ７及びＨＥＫＴＬＲ８を、指定された濃度のＡＳＯにより２０～５０分間処理し、その後Ｒ８４８、ＣＬ０７５、ガルディキーモッド(全てInvivogenより)、又は７－アリル－７，８－ジヒドロ－８－オキソグアノシン(ロキソリビン－SigmaAldrich)により処理した。ＡＳＯは全て、Integrated DNA Technologies(IDT)により合成され、ＲＮａｓｅ－非含有ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）(Thermo Fisher Scientific)中に再浮遊させた。ＡＳＯの配列及び修飾を、表１、２及び３に提供している。ｃＧＡＳリガンドＩＳＤ７０（表１）は、先に説明したように調製し(Pepinら、2020)、リポフェクタミン２０００により最終濃度２．５μｇ／ｍｌでトランスフェクションした。クラスＢ ＣｐＧオリゴヌクレオチドヒトＴＬＲ９リガンドＯＤＮ ２００６は、ＩＤＴにより合成され、ＲＮａｓｅ－非含有ＴＥ緩衝液中に再浮遊させた。
ルシフェラーゼアッセイ
ＴＬＲ７、８又は９を安定して発現しているＨＥＫ２９３細胞を、製造業者のプロトコールに従い、リポフェクタミン２０００(Thermo Fisher Scientific)により、ｐＮＦ－κＢ－Ｌｕｃ４レポーター(Clontech)、ｐＬｕｃ－ＩＦＮ－β(K. Fitzgerald, University of Massachusettsのご厚意による)又はｐＣＣＬ５［ＲＡＮＴＥＳ］－Ｌｕｃ(G. Scholz, University of Melbourneのご厚意による)でトランスフェクションした。簡単に述べると、５００，０００～７００，０００個の細胞を、６－ウェルプレートの１ウェルにつき１．２μｌのリポフェクタミン２０００により、レポーター４００ｎｇと、逆トランスフェクションし、並びに５％ＣＯ２、３７℃で３～２４ｈインキュベーションした。トランスフェクション後、これらの細胞を、６－ウェルから収集し、９６－ウェルにアリコートとし、直後にＡＳＯ及び一晩ＴＬＲ刺激した（先に記載したように）。翌日、これらの細胞を、１×Ｇｌｏ溶解緩衝液(Promega)の４０μｌ（９６－ウェルプレートについて）において、室温で１０分間溶解した。次にこの溶解液１５μｌを、ルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega)４０μｌを使用する、ホタルルシフェラーゼアッセイに供した。ルミネセンスを、Fluostar OPTIMA (BMG LABTECH)ルミノメーターにより定量した。
ＨｅＬａ細胞におけるＡＳＯによるＨＰＲＴのダウンレギュレーション
各ウェルにおいて総容積５０μｌで、ＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ(Thermo Fisher Scientific)中の０．５μｌリポフェクタミン２０００(Thermo Fisher Scientific)により様々なＡＳＯ投与量を複合体化することにより、各ＡＳＯを、９６－ウェルプレートにおいて、生物学的３つ組で逆トランスフェクションした。ＨｅＬａ細胞（２０，０００個）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充した１００μｌ ＤＭＥＭ中に再浮遊させ、脂質－ＡＳＯ複合体に添加し、その後３７℃及び５％ＣＯ２で、２４ｈインキュベーションした。ＲＮＡを、ＳＶ総ＲＮＡ単離キット(Promega)により、ＤＮａｓｅ１処理し収集した。ｃＤＮＡを、～２００ｎｇ総ＲＮＡから、製造業者の指示に従い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素(Thermo Fisher Scientific)を使用し、アンカードオリゴヌクレオチドｄＴ及びランダムヘキサマープライマー(Integrated DNA Technologies)により合成した。ｑＰＣＲ反応を、３８４－ウェルプレートフォーマットで１０μｌ反応物中、Ｉｍｍｏｌａｓｅ ＤＮＡポリメラーゼ(Bioline)、５００ｎＭ各プライマー及び２５０ｎＭプローブにより、～１０ｎｇ ｃＤＮＡを用いて実行した。増幅反応は、Applied Biosystems 7900HT(Thermo Fisher Scientific)上で試行した。全てのｑＰＣＲ反応は、各試料について３つ組で実行し、平均化した。
線状化されクローン化されたアンプリコンを、コピー数標準として使用し、各アッセイについて、絶対量測定値を確立した。ＨＰＲＴ（ＮＭ０００１９４）及びＳＦＲＳ９（ＮＭ００３７６９）発現レベルを、５’－ヌクレアーゼアッセイを多重化(multiplexing)することにより定量し、且つＨＰＲＴレベルを、内部参照対照として使用したＳＦＲＳ９に対して正規化した。プライマーの配列及び使用したプローブアッセイを、表１に提供している。ノックダウン効率は、ＮＣ１及びＮＣ５陰性対照ＡＳＯに対して計算した。
サイトカインの検出
ヒトＴＮＦ－α及びＩＰ－１０を、ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡセット(BD Biosciences、各々、#555212及び#550926)を、製造業者の指示に従い使用し測定した。ヒトＩＦＮ－α検出は、先に報告されたように(Gantier、2013)、実行した。テトラメチルベンジジン基質(Thermo Fisher Scientific)を、Ｆｌｕｏｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ(BMG LABTECH)プレートリーダー上でのサイトカインの定量に使用した。
ｍＲＮＡ逆転写定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）
総ＲＮＡを、ＩＳＯＬＡＴＥ ＩＩ ＲＮＡミニキット(Bioline)を使用し、細胞から精製した。ランダムヘキサマーｃＤＮＡを、単離したＲＮＡから、ハイキャパシティｃＤＮＡアーカイブキット(Thermo Fisher Scientific)を製造業者の指示に従い使用し合成した。ＲＴ－ｑＰＣＲを、ＨＴ７９００及びＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ ＲＴ－ＰＣＲシステム(Thermo Fisher Scientific)上で、パワーＳＹＢＲグリーンマスターミックス(Thermo Fisher Scientific)により実行した。各ＰＣＲは、技術的に２つ組で実行し、並びにヒト１８Ｓを、参照遺伝子として使用した。各アンプリコンは、ゲル精製し、且つ遺伝子発現の定量のための標準曲線（各試行において使用した）を作製するために使用した。融解曲線を、各試行において使用し、増幅の特異性を確認した。
使用したプライマーは、以下のようであった：ヒトRSAD2：hRSAD2-RT-FWD TGGTGAGGTTCTGCAAAGTAG；hRSAD2-RT-REV GTCACAGGAGATAGCGAGAATG；hIFIT1：hIFIT1-FWD TCACCAGATAGGGCTTTGCT；hIFIT1-REV CACCTCAAATGTGGGCTTTT；h18S：h18S-FWD CGGCTACCACATCCAAGGAA；h18S-REV GCTGGAATTACCGCGGCT；hIFI44：hIFI44-FWD ATGGCAGTGACAACTCGTTTG；hIFI44：TCCTGGTAACTCTCTTCTGCATA；hIFNB：hIFNB-FWD GCTTGGATTCCTACAAAGAAGCA；hIFNBREV：ATAGATGGTCAATGCGGCGTC；hHPRT-FWD：GACTTTGCTTTCCTTGGTCAG；hHPRT-REV GGCTTATATCCAACACTTCGTGGG；ＲＳＡＤ２、ＩＦＩＴ１、及び１８Ｓ ＰＣＲ由来のアンプリコンは、サンガー配列決定により検証した。ＩＦＩ４４及びＩＦＮＢプライマーは、プライマーバンクから得(Wangら、2012)、並びにＨＰＲＴプライマーは、ＩＤＴにより設計した。
統計解析
統計解析は、Ｐｒｉｓｍ ８(GraphPad Software Inc.)を使用し実行した。各実験は、生物学的３つ組で実行し（生物学的２つ組で実行した図２Ａ、２Ｂ、４Ｄ及び５Ｅを除く）、並びに２つの独立した時点の最小値(minimum of two independent times)を反復した。条件群を比較する場合には、片側及び両側分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用する一方で、条件の対を比較する場合には、両側対応のないノンパラメトリックマン－ホイットニーＵ検定又は対応のない両側ｔ－検定を使用した。使用した記号：＊ Ｐ≦０．０５、＊＊ Ｐ≦０．０１、＊＊＊ Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ Ｐ≦０．０００１、及び「ｎｓ」は有意性なし。
実施例２：ＴＬＲ７／８センシングに対するＡＳＯの配列及び骨格－依存型作用
本発明者らは最初に、未分化のＴＨＰ－１細胞の免疫反応に対する、自然免疫センサーｃＧＡＳのｍＲＮＡへ標的化された１１種の２’ＯＭｅギャップマーＡＳＯのパネルの活性を調べた。驚くべきことに、これらのＡＳＯによる一晩の前処理は、選択されたＡＳＯに関する（例えば、ＡＳＯ２、ＡＳＯ９、ＡＳＯ１１であるが、ＡＳＯ４ではない－図１Ａ）、この細胞におけるＴＬＲ７／８のＲ８４８刺激時の、ＩＰ－１０及びＴＮＦ－α産生の強力な増強に繋がった。先行する研究は、Ｔ－リッチＰＳオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ８センシングを促進することができる一方で、ＴＬＲ７を阻害することを報告している(Gordenら、2006；Jurkら、2006)。ＴＨＰ－１は、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８の両リガンドに反応することができるので(Gantierら、2008)、本発明者らは、観察されたＲ８４８センシングに対するＡＳＯの配列－特異的作用は、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８に対するそれらの異なる活性に起因しているであろうと推測した。これを確定するために、本発明者らは次に、ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーターと共に、ＴＬＲ７又はＴＬＲ８を安定して発現しているＨＥＫ ２９３細胞（以後ＨＥＫ－ＴＬＲ７及びＨＥＫＴＬＲ８と称する）における配列の本発明者らのパネルを試験した（図１Ｂ、１Ｃ、８Ａ及び８Ｂ）。
興味深いことに、本発明者らは、効力の低いインヒビターであるＡＳＯ８及びＡＳＯ１１を除いて、ほとんどのＡＳＯは、Ｒ８４８のＴＬＲ７センシングを強力に阻害したことを発見した（図１Ｂ）。対照的に、及びＴＨＰ－１細胞における本発明者らの知見と直接合致して、いくつかのＡＳＯは、Ｒ８４８のＴＬＲ８センシングを強力に増強した（例えば、ＡＳＯ２、ＡＳＯ９及びＡＳＯ１１－図１Ｃ）。それらのＡＳＯだけでは、ＴＬＲ７又はＴＬＲ８を刺激しなかった（図８Ａ、８Ｂ）。ＡＳＯ２及びＡＳＯ１１に注目すると、これらはＴＬＲ８を同等に増強するが、ＴＬＲ７に対しては異なる活性を有し、本発明者らは、ＴＬＲ７／８シグナリングにとって必須である(Pelkaら、2014)、ＴＨＰ－１欠損ＵＮＣ９３Ｂ１におけるそれらのＴＬＲ７／８－依存型活性を更に検証した。Ｒ８４８センシングに対するＡＳＯ２及びＡＳＯ１１の増強作用は、ＴＨＰ－１欠損ＵＮＣ９３Ｂ１においては認められないが、ＵＮＣ９３Ｂ１－Ｃｉｔｒｉｎｅ発現の再構成時には回復され得(Pelkaら、2014)（図１Ｄ）、これによりこの作用におけるＴＬＲ７／８の関与を裏付けている。加えて、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＡＳＯ２及びＡＳＯ１１による刺激は、Ｒ８４８誘導したＴＮＦ－αを強力に増強したが、ＩＦＮ－αレベルには影響を及ぼさず、これはＲ８４８のＴＬＲ８センシングに対する優先的作用の指標である(Gantierら、2008)（図１Ｅ、１Ｆ）。ＩＦＮ－α及びＴＮＦ－αに対するこの作用は、これらのＡＳＯによるＰＢＭＣのＴＬＲ９活性化には関係せず、その理由は、ＡＳＯ２は、ＨＥＫ－ＴＬＲ９細胞におけるＴＬＲ９シグナリングを活性化しないが、ＡＳＯ１１は活性化するからである（図８Ｃ）。
ＴＬＲ７／８に対するＡＳＯのこの作用が、それらの骨格又は塩基修飾により左右されるかどうかを確定するために、本発明者らは次に、ＡＳＯ２の配列を基に一連のＡＳＯバリアントを試験した（図１Ｇ、１Ｈ、１Ｉ）。Ｒ８４８で刺激したＨＥＫ－ＴＬＲ７細胞におけるこれらのバリアントの分析は、ＰＳ骨格を含む全てのＡＳＯ２バリアントは、使用した塩基修飾の種類（ＤＮＡのみ、２’ＯＭｅ、ＬＮＡ又は２’ＭＯＥ）とは無関係に、ＴＬＲ７を阻害したことを明らかにした（図１Ｇ、１Ｈ、表１）。対照的に、ＴＬＲ８によるＲ８４８センシングの増強は、５’及び３’端塩基修飾により直接左右され、２’ＯＭｅは、この配列状況において最強の増強をもたらした（図１Ｇ、１Ｉ）。３’端Ｃｙ３リンカーの付加は、ＴＬＲ８センシングのこの増強を減少したのに対し、２’ＯＭｅ塩基の２’ＭＯＥ塩基又はＬＮＡ塩基による置換は、この増強を取り除いた。
増強は、二重ＴＬＲ７／８アゴニストＲ８４８に限定されず、並びに同じくＣＬ０７５（ＴＬＲ８アゴニスト）、ロキソリビン（ＴＬＲ７アゴニスト）により、及びある程度はガルディキーモッド（ＴＬＲ７アゴニスト）によっても認められた（図７）。
ＴＬＲ７に対し観察された作用と同様に、ＰＳ骨格もまた、ＴＬＲ８増強に必要であり；しかしこれは、それだけでこの作用に十分ではなく、その理由は、２’ＯＭＥ及びＬＮＡ ＡＳＯ２バリアントはまた、ＰＳ骨格上にも合成され、且つ限定された増強のみが、ＰＳ修飾のみを特徴とするバリアント（ＡＳＯ２－ＰＳ）により認められたからである。まとめるとこれらの結果は、ＰＳ ＡＳＯは、配列－依存型様式で、強力なＴＬＲ７／８免疫調節を発揮することができることを明らかにした。
表１：本試験で使用した様々なオリゴヌクレオチド（全て５’－３’）。ＤＮＡについてのみ大文字、‘ｍ’は２’ＯＭｅ塩基を示し、‘／ｉ２ＭＯＥｒ’は２’ＭＯＥ塩基を示し、‘＋’はＬＮＡ塩基を示し、及び＊はホスホロチオエート骨格を意味する。Ｃｙ３Ｓｐは、Ｃｙ３タグを意味する。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＺＥＮ、３ＩＡＢｋＦＱは、ｑＰＣＲプローブ修飾である。
Figure 2023526090000002
Figure 2023526090000003
実施例３：低ＴＬＲ７阻害及び高ＴＬＲ８増強を伴うＡＳＯを同定するためのスクリーニング
選択したＰＳ ＡＳＯによるＴＬＲ７阻害及びＴＬＲ８増強の観察は、Ｔ－リッチＰＳオリゴヌクレオチドは、類似の活性を促進することができるという先の報告(Gordenら、2006；Jurkら、2006)と合致した。しかし、一部の２’ＯＭｅ ＡＳＯ配列は、ＴＬＲ７に対しより少ない阻害活性を有する（例えばＡＳＯ８及びＡＳＯ１１）という知見は、ＰＳ骨格により促進されたＴＬＲ７阻害は、選択した２’ＯＭｅギャップマーＡＳＯにおいて釣り合いがとれることを示唆している。本発明者らは、この活性のモダリティの規定は、ＴＬＲ７に対し低下した免疫抑制活性を持つＡＳＯの設計を補助すると考えた。加えてＡＳＯ１１は、Ｒ８４８のＴＬＲ８センシングを増強する一方で、ＴＬＲ７活性を保存することができるという観察は、ＴＬＲ７及び８に対する活性は、同じ配列決定因子により支配されないことを示唆している。
これらの観察を特徴付けるために更に、本発明者らは、１９２種の２’ＯＭｅ ＡＳＯライブラリーをスクリーニングした。これらのＡＳＯは、これらのＡＳＯ間の単独の塩基増分が最小である、４種の異なる転写物（各４８種のＡＳＯ）を標的化するように設計されることは、特筆に値する（表２）。このスクリーンは、各ＴＬＲについて２種の異なるＡＳＯ濃度で行い、並びにＨＥＫ－ＴＬＲ７細胞及びＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞におけるＲ８４８によるＮＦ－κＢルシフェラー誘導に対するそれらの影響を測定した（図２Ａ、２Ｂ及び表２）。
ＡＳＯの最初のパネルと一致して、本発明者ら、５００ｎＭで使用したＡＳＯの大部分は、ＴＬＲ７センシングを強力に抑制したことを発見した。従ってこれらのＡＳＯの７８％は、ＴＬＲ７に対するＲ８４８活性を８０％以上減少し、及び２種のＡＳＯのみが、両方の濃度で、ＴＬＲ７センシングを４０％未満低下した（図２Ａ及び表２－ＡＳＯ‘［ＣＤＫＮ２Ｂ－ＡＳ１］－８５２’及び‘［ＬＩＮＣ－ＰＩＮＴ］－２５０４’、以後ＡＳＯ８５２及びＡＳＯ２５０４と称す）。対照的に、ＴＬＲ８増強に対するＡＳＯの作用は、ＡＳＯについて多様であり、これらのＡＳＯの５１％は、１００ｎＭで少なくとも２倍だけＲ８４８センシングを増強した（図２Ｂ）。重要なことに、ＡＳＯ８５２及びＡＳＯ２５０４は、両方共低いＴＬＲ７阻害を示すが、ＴＬＲ８に対しては異なる活性を有した（図２Ａ、２Ｂ及び表２）。ＨＥＫ２９３－ＴＬＲ７細胞及びＨＥＫ２９３－ＴＬＲ８細胞におけるＡＳＯ投与量－反応試験は、ＡＳＯ２５０４及びＡＳＯ８５２は、ＡＳＯ４と比べ、ＴＬＲ７によるＲ８４８センシングに対しほとんど影響を有さないが、しかしＡＳＯ８５２は、ＴＬＲ８センシングを、ＡＳＯ４と比べ有意に増強したことを確認した（図２Ｃ）。様々な投与量のＲ８４８に対するＡＳＯ８５２の影響の分析は、Ｒ８４８に対するＴＬＲ７の感受性が～２．５倍減少したことを明らかにした（図２Ｄ）。しかし、ＡＳＯ８５２処理は、ＴＬＲ８に対するＲ８４８の活性を～１３倍増加した（図２Ｄ）。
表２：１９６種のＡＳＯスクリーンデータ。標的化された遺伝子名は、括弧内に提供している（例えば［ＥＧＦＲ］）。ＡＳＯは、以下の修飾を伴い合成した：ＤＮＡについてのみ大文字、‘ｍ’は２’ＯＭｅ塩基を示し、及び＊はホスホロチオエート骨格を意味する。指定されたＡＳＯ濃度での各スクリーンからの平均化されたＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼデータが供されている（１μｇ／ｍｌ Ｒ８４８共－刺激を使用）。ＰＩＮＴファミリーからの下線付きの配列は、図３Ｂ及び３Ｆにおいて更に試験した。黒色太字の配列は、１７種の低ＴＬＲ７インヒビターとして使用し、図３Ａに示したように、モチーフエンリッチメントについてＭＥＭＥにより分析した（［ｃＧＡＳ］ＡＳＯ８及びＡＳＯ１１と共に）。
Figure 2023526090000004
Figure 2023526090000005
Figure 2023526090000006
Figure 2023526090000007
Figure 2023526090000008
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Figure 2023526090000010
Figure 2023526090000011
実施例４：２’ＯＭｅ ＡＳＯによるＴＬＲ７阻害は、ＣＵＵ末端モチーフにより復帰され得る
先のスクリーンを基に最低のＴＬＲ７阻害活性を伴う１９種のＡＳＯのＭＥＭＥモチーフ発見分析(Bailey及びElkan、1994)は、末端５’及び３’“Ｃ”塩基を示しているＡＳＯの２’ＯＭｅ領域は、ウリジン残基と共に、８配列において過剰に出現したことの観察に繋がった（図３Ａ、表２）。加えて、単独の塩基増分を伴うこのスクリーンからの配列のファミリー（ＰＩＮＴファミリーと称す）の分析は、密接に関連した配列に関するＴＬＲ７に対する異なる阻害活性を示唆した（図３Ｂ、３Ｃ及び表２－ＡＳＯ ‘［ＬＩＮＣ－ＰＩＮＴ］－１０８’から［ＬＩＮＣ－ＰＩＮＴ］－１１６’まで、ＡＳＯ１０８－ＡＳＯ１１６と称す）。
ＨＥＫ２９３－ＴＬＲ７細胞におけるＡＳＯのＰＩＮＴファミリーのバリデーションは、ＡＳＯ１１１のみが、このファミリーにおけるＲ８４８によるＴＬＲ７活性化をブロックすることが可能であることを確認した（図３Ｂ、３Ｃ）。決定的に、配列アラインメント分析は、ＡＳＯ１１１は、その５’又は３’端領域にＣＵＵ／ＣＵＴ／ＣＴＴモチーフを欠く唯一の配列であることを明らかにした（図３Ｃ）。［ｃＧＡＳ］ＡＳＯ１１もまた、その５’及び３’両端にそのような末端２’ＯＭｅ ＣＵＵモチーフを収容するので（図３Ａにおいてエンリッチされたモチーフを収容する４種の他の配列と共に）、本発明者らは次に、その５’及び３’端の２’ＯＭｅ領域が、そのような“ＣＵＵ”モチーフを欠き且つＴＬＲ７の強力なリプレッサーであるＡＳＯ２のそれと交換された、［ｃＧＡＳ］ＡＳＯ１１バリアント（ＡＳＯ１１－Ｍｕｔ１及びＡＳＯ１１－Ｍｕｔ２）を試験した（図３Ｄ、３Ｅ）。５’及び３’端の両領域の重要な役割と合致して、両方のＡＳＯ１１変異体は、親ＡＳＯ１１と比べ、ＴＬＲ７阻害を有意に増加した（図３Ｄ、３Ｅ）。これらの知見は集合的に、５’及び３’ＣＵＵモチーフは、２’ＯＭｅ－ＰＳ ＡＳＯによる、ＴＬＲ７阻害の重要なモジュレーターであることを指摘した。
実施例５：ＴＬＲ８増強は、２’ＯＭｅ ＰＳ ＡＳＯの中央のＤＮＡ領域及び５’端により駆動される
本発明者らはまた、ＴＬＲ８増強についても、ＰＩＮＴファミリー（ＡＳＯ１０８－１１６）及び［ｃＧＡＳ］ＡＳＯ１１変異体を分析した。２つの配列はより強力であるが（例えば、ＡＳＯ１０８及びＡＳＯ１１０）、これらの配列のほとんどは、類似のＴＬＲ８増強を示し、このことは、これらの分子の中央領域は、ＴＬＲ８ 調節に優先的に関与していることを示唆している（図３Ｃ、３Ｆ）。同様に、これらのＡＳＯ１１変異は、ＴＬＲ８増強には控えめにのみ影響を及ぼしたが、ＡＳＯ２ ３’端の付加（ＡＳＯ１１－Ｍｕｔ１）は、ＴＬＲ８センシングを有意に減少した一方で、ＡＳＯ２ ５’端（ＡＳＯ１１－Ｍｕｔ２）は、これを有意に増加した（図３Ｄ、３Ｇ）。これらの結果は、２’ＯＭｅ－ＰＳ ＡＳＯによるＴＬＲ８増強の制御は、ＡＳＯの中央１０－ｍｅｒ ＤＮＡ領域により優先的に支配されるが、その２’ＯＭｅ末端も役割を果たすことを指摘している。
これらのＡＳＯの５’端領域に関する寄与の更なる裏付けにおいて、本発明者らは、自身のスクリーンにおけるＴＬＲ８センシングの上位２０の増強物のほとんどは、末端５’－Ｕを有したが（２０中１４）、そのような末端５’－Ｕの出現は、下位２０の増強物の中でははるかに少ない（２０中３）ことに注目した（表２）。末端５’－Ｕを持つ又は持たない配列を含む１９２種のＡＳＯに対するＴＬＲ８増強の分析は、末端５’－Ｕを収容する配列に関するＴＬＲ８センシングの有意に増大された増強を確認した（図３Ｈ及び表２）。同様の傾向が、末端５’－ＵＣモチーフを考慮し認められた（上位ＡＳＯの９／２０に存在－図３Ｉ及び表２）。決定的に、ＡＳＯ１０８及びＡＳＯ１１０は、ＡＳＯ２及びＡＳＯ１１－Ｍｕｔ２にも存在するそのような末端５’－ＵＣモチーフを収容する、ＰＩＮＴファミリー由来のわずか２つのＡＳＯである。
本発明者らはまた、ＴＬＲ８増強するＡＳＯ８５２の中央の１０－ｍｅｒ ＤＮＡ領域は、中央のＴ－リッチ領域(TTTCTGTGGT)を含む一方で、ＡＳＯ２５０４は、Ａ－リッチである(TAAAAAAATT)ことにも注目した。ＴＬＲ８センシングの上位２０及び下位２０の増強物の中央のＤＮＡ領域の比較は、ＴＬＲ８センシングを増強するＡＳＯにおけるチミジン残基の有意に増加した割合－４個の中央のチミジンの中央値を伴うものを確認した（図３Ｊ及び表２）。これはＴ－リッチ領域はＴＬＲ８増強にとって重要である(Gordenら、2006；Jurkら、2006)という先の報告と直接合致したので、本発明者らは、ＡＳＯ８５２を、１０ ｄＴの中央ストレッチを含むＡＳＯ８５２－ｄＴへ変異した（図３Ｋ）。加えて本発明者らは、ＡＳＯ２５０４の中央の１０－ｍｅｒ ＤＮＡ領域を、ＡＳＯ８５２のそれと交換し、ＡＳＯ２５０４－Ｍｕｔ（図３Ｋ）を生じ、その理由はＡＳＯ２５０４は、ＡＳＯ８５２と同じ程度にＴＬＲ８を増強しなかったからである。Ｒ８４８センシングに対するこれらのオリゴヌクレオチドの活性の比較を、ＴＨＰ－１細胞、ＨＥＫ－ＴＬＲ７細胞及びＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞において行った（図３Ｌ、３Ｍ、８Ａ、８Ｂ及び８Ｄ）。２５０４－Ｍｕｔ ＡＳＯは、ＴＨＰ－１細胞におけるＩＰ－１０産生及びＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞におけるＮＦ－κＢルシフェラーゼの駆動において有意により強力であり、観察は、ＴＬＲ８に対するそれらの作用におけるＡＳＯの中央のＴ－リッチ１０－ｍｅｒ ＤＮＡ領域に関する重要な役割を裏付けている。加えてＡＳＯ８５２－ｄＴも、ＩＰ－１０誘導において、ＡＳＯ８５２よりもより強力であり、ＴＨＰ－１細胞において２０－ｍｅｒ ｄＴ ＰＳオリゴヌクレオチド（ｄＴ２０）により得られるものと同様のレベルの刺激に達する。対照的に、ＡＳＯ８５２－ｄＴ及びＡＳＯ２５０４－Ｍｕｔに関する中央領域の置換は、Ｒ８４８のＴＬＲ７センシングに有意に影響を及ぼさないのに対し、ｄＴ２０はＴＬＲ７活性化をブロックした。ＨＥＫ－ＴＬＲ７細胞、ＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞又はＴＨＰ－１細胞において単独で使用したこれらのＡＳＯは、ＨＥＫ細胞におけるＮＦ－κＢルシフェラーゼ及びＴＨＰ－１細胞におけるＩＰ－１０産生に影響を及ぼさなかった（図８Ａ、８Ｂ、８Ｄ）。しかし、ＡＳＯ８５２の中央Ｔ－リッチ領域の増加は、ＴＬＲ９－駆動したＮＦ－κＢルシフェラーゼに対するその基本的活性を更に増強し－ｄＴ２０は単独でも、ＨＥＫ－ＴＬＲ９細胞における穏やかなＴＬＲ９リガンドとしても作用するという観察と合致した（図８Ｃ）。
実施例６：ＡＳＯによるＲ８４８のＴＬＲ８増強は、ＩＲＦ活性化に繋がる
Ｒ８４８センシング時にＩＰ－１０産生を強力に増強するＡＳＯ８５２－ｄＴの能力を、２種の他のＴＬＲ８発現するＡＭＬ細胞株（ＭＯＬＭ１３及びＯＣＩ－ＡＭＬ３；図４Ａ）において確認し、且つ４～２０ｎＭとわずかなＡＳＯ８５２－ｄＴで容易に観察可能であった（図４Ｂ）。ＩＲＦ活性化を示す、認められた高いＩＰ－１０産生を考慮し、本発明者らは、ＩＲＦにより駆動される、ＣＣＬ５－ルシフェラーゼレポーター又はＩＦＮ－β－ルシフェラーゼレポーターを発現するＨＥＫＴＬＲ８細胞におけるＡＳＯ８５２－ｄＴシリーズの活性を試験した(Chowら、2018；Schaferら、1998)。Ｒ８４８単独は、いずれのレポーターも活性化しなかったが、これらのオリゴヌクレオチドとの共－刺激は、両方のプロモーターを増強し、ＡＳＯ８５２－ｄＴ及びｄＴ２０は、最も効力が高く、これにＡＳＯ８５２／２５０４－Ｍｕｔが続き、並びにＡＳＯ２５０４は最小の効力であり（図４Ｃ）；従ってこの知見は、ＴＨＰ－１細胞におけるＩＰ－１０産生により得られた結果を反映している（図３Ｌ）。
ＩＲＦ－駆動した反応の誘導を更に裏付けるために、本発明者らは、ＴＨＰ－１細胞のＲ８４８刺激後４時間で、ＩＦＮＢ１を含むいくつかのＩＲＦ－駆動した遺伝子のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を実行した。ＩＦＩＴ１、ＲＳＡＤ２、ＩＦＩ４４及びＩＦＮＢ１の誘導は、Ｒ８４８単独ではほとんど認められなかったが、これらの全ての遺伝子は、ＡＳＯ８５２－ｄＴとの共－刺激により有意に増加された（図４Ｄ）。本発明者らは、ＡＳＯ共－刺激は、ＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞におけるＲ８４８に対するＴＬＲ８の感度を強力に増大することを認め（図２Ｄ）、このことはＩＦＮ－β誘導時に認められた作用は、Ｒ８４８に対するＴＬＲ８の増大した感度によるものであることを示唆している。ＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞におけるＲ８４８に対するＩＦＮ－β－ルシフェラーゼレポーターの投与量－反応（１～１５μｇ／ｍｌの範囲）は、高投与量のＲ８４８は、低投与量Ｒ８４８＋ＡＳＯ８５２－ｄＴによるものと同程度まで、これらの細胞におけるＩＦＮ－β反応に連動していることを明らかにした。
まとめると、これらの結果は、ＡＳＯ８５２－ｄＴなどのＡＳＯは、それ以外は非常に高投与量のＲ８４８によってのみ達成可能である、ＩＲＦ－駆動した反応の活性化を促進することを示唆した。
実施例７：ＴＬＲ８センシングを増強する遺伝子－標的化するＡＳＯの同定
次に本発明者らは、遺伝子－標的化とＴＬＲ８増強（一方でＴＬＲ７阻害を回避する）を組合せる二機能性ＡＳＯを実現することができることの原理証明を確立することを求めた。この目的のために、本発明者らは、ヒトＨＰＲＴ遺伝子のｍＲＮＡに対して設計した４８種の２’ＯＭｅ ＡＳＯのパネルを試験した。
ＨｅＬａ細胞における予備試験は、この４８種のＡＳＯ中２９種は、１０ｎＭで、ＨＰＲＴ ｍＲＮＡレベルを少なくとも５０％だけ有意に減少したことを示唆した（図６及び表３）。従って本発明者らは、後続の実験に関してこの２９種の配列のサブパネルに焦点を当て、遺伝子－標的化、Ｒ８４８センシングのＴＬＲ７阻害及びＴＬＲ８増強を比較した（各々、図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃ）。先の知見と合致するように、これらの実験は、ほとんどのＡＳＯは、Ｒ８４８によるＴＬＲ７活性化をブロックしたが、注目すべき例外は［ＨＰＲＴ］ＡＳＯ５５１、ＡＳＯ６６０－６６３及びＡＳＯ６６５ ＡＳＯであったことを確認した（図５Ｂ）。決定的に、これらの各配列は、それらの５’又は３’端に少なくとも１つのＣＵＵ／ＣＵＴモチーフを収容し、このことは更に、ＴＬＲ７センシングの保持におけるこれらのモチーフに関する重要な役割を示唆している（図５Ｄ）。興味深いことに、ＡＳＯ５５１及びＡＳＯ６６２ ＡＳＯの両方は、１つの５’－ＣＵＵ及び１つの３’－ＵＵＣのモチーフを収容するが、ＡＳＯ５５１ ＡＳＯは、ＴＬＲ７センシングを全体的に保存する唯一のＡＳＯであった。これらの５’－ＣＵＵ及び３’－ＵＵＣのモチーフの位置は、両方のＡＳＯ間で変動するので、ＣＵＵモチーフの最適な配置は、これらのＡＳＯの末端５’－端であってよく、このことは末端３’－端のＵＵＣモチーフもまた重要であることを指摘している。この時点で、本発明者らは再度、［ＬＩＮＣ－ＰＩＮＴ］ＡＳＯ１０９及び［ｃＧＡＳ］ＡＳＯ８もまた、そのような末端３’－ＵＵＣモチーフを有することに注目した。これらのデータは、末端５’及び３’のＣが、非阻害配列において広く行き渡っていることを示したＭＥＭＥモチーフと合致する（図３Ａ）。
表３：ＨＰＲＴ－標的化するＡＳＯ配列。ＡＳＯは、以下の修飾を伴い合成した：ＤＮＡについてのみ大文字、‘ｍ’は２’ＯＭｅ塩基を示し、及び＊はホスホロチオエート骨格を意味する。図５において使用した２９種の配列は、太字である。
Figure 2023526090000012
Figure 2023526090000013
加えて、ほとんどのＡＳＯは、ＴＬＲ８センシングを、様々な程度まで有意に増強したが、４種のＨＰＲＴ ＡＳＯ（ＡＳＯ３２９、ＡＳＯ３２１、ＡＳＯ３３３、ＡＳＯ６６６）は例外であった（図５Ｃ）。これらの分析を基に、本発明者らは、良好なＨＰＲＴ標的化を伴い（１０ｎＭで＞７０％）、ＴＬＲ７活性を維持し（～８０％）、且つＲ８４８のＴＬＲ８センシングを～５倍増強するＡＳＯとして、ＡＳＯ６６２を選択した。加えて本発明者らは、ＡＳＯ６６２のそれに近い、高い遺伝子標的化活性（＞９３％）、強力なＴＬＲ７阻害及びＴＬＲ８増強活性を伴うＡＳＯとして、ＡＳＯ８４７を選択した。これら２種のＡＳＯを、ＴＨＰ－１細胞においてトランスフェクションし、及び有意なＨＰＲＴダウンレギュレーションに繋がり、これはＡＳＯ８４７についてより顕著であり－ＨｅＬａ細胞からのデータと合致した（図５Ａ及び５Ｅ）。加えて同じトランスフェクションプロトコールに従い、ＡＳＯ６６２は、Ｒ８４８により誘導されたＩＰ－１０産生を強力に増強した（対照ｄＴ２０オリゴヌクレオチドと類似のレベルまで）（図５Ｆ）。予想外に、ＡＳＯ８４７は、Ｒ８４８共－刺激後のＩＰ－１０産生の増加に失敗し、このことは、ＴＬＲ７に対するその阻害作用に起因し、これはまたＴＨＰ－１細胞においても機能する(Gantierら、2008)。
実施例８：ＴＬＲ８増強－５’端モチーフによる調節
２’ＯＭｅ ＡＳＯは、中央の１０ ＤＮＡ塩基のセンシングを通じて、Ｒ８４８のＴＬＲ８センシングを増強することができること、並びに“Ｔ”リッチ領域は、よりよい増強物である（ＡＳＯ－８５２及びそのバリアントＡＳＯ－８５２ｄＴにおいて認められるように）ことは、これまでに観察されている（図３－Alharbiら、2020)。
加えて本発明者らは、ＡＳＯ２の５’ＵＣＣＧＧ領域を含むための、ＡＳＯ１１の５’端２’ＯＭｅ領域の変化は、ＴＬＲ８増強の有意な増加に繋がったことを示した（図３－Alharbiら、2020)。１９２種のＡＳＯを基にした、５’Ｕ又は５’ＵＣモチーフを末端とするＡＳＯのＴＬＲ８増強の比較は、５’Ｕ又は５’ＵＣのＡＳＯは、有意により強力なＴＬＲ８増強物であることを指摘した(Alharbiら、2020)。
ＴＬＲ８センシングの調節における５’Ｕ／ＵＣの役割を直接関係づけるために、本発明者らは次に、そうでなければＴＬＲ８を増強しないＡＳＯへの、末端２’ＯＭｅ ＵＣモチーフの付加の作用を試験した。本発明者らが試験した第一の分子は、ＡＳＯ１－ＵＣであり、これは補足された５’ＵＣモチーフを伴う（５’端に７の２’ＯＭｅ塩基）、２２ｎｔ分子であった。ＡＳＯ１は、ＨＥＫＴＬＲ８細胞又はＴＨＰ－１細胞においてＴＬＲ８を増強しなかったが、その５’端バリアントは、両方のモデルにおいてＴＬＲ８増強を有意に促進した（図９）。このことは、５’端ＵＣモチーフの付加は、そうでなければ増強しない２’ＯＭｅギャップマーＡＳＯに、ＴＬＲ８増強を付与するための戦略として使用することができることの、原理証明である。
本発明者らはまた、先に本発明者らがＴＬＲ８の強力な増強物であることを発見した（図5－Alharbiら、2020)、ＡＳＯ ＨＰＲＴ－６６０の５’端修飾の作用も試験した。ＡＳＯ ６６０の未変性の配列は、５’ＣＵＵ領域を含み、これを本発明者らは５’ＧＡＡ領域に変異させた（ＡＳＯ ６６０－Ｍｕｔを生じる）。この変異は、ＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞及びＴＨＰ－１細胞におけるＴＬＲ８増強を完全に除去し、２’ＯＭｅ ＡＳＯによるＴＬＲ８の増強における５’端ウリジン残基の重要性を確認した（図９）。
更なるこれらの結果に対し、本発明者らは、ＴＬＲ８を増強しないことを本発明者らが先に発見した（図１－Alharbiら、2020)、ＡＳＯ２ ＬＮＡにおいて同じ戦略の作用を試験した。この配列状況において、５’端２’ＯＭｅ ＵＣモチーフの付加（ＬＮＡ ＡＳＯ２－Ｍｕｔ１を生じる）は、ＴＬＲ８増強を促進することに失敗した。同様に、５’ＣＵＵ及び３’ＵＵＣ ２’ＯＭｅモチーフによるＡＳＯ２の５’及び３’伸長（ＬＮＡ ＡＳＯ２－Ｍｕｔ２を生じる）は、ＴＬＲ８増強に影響を及ぼさなかった。このことは、２’ＯＭｅ ＡＳＯのＴＬＲ８増強を付与することができる５’端修飾の戦略は、ギャップマーＬＮＡ ＡＳＯとは適合性がないことを指摘している。本発明者らは、これを、ヌクレアーゼによる５’端のプロセッシングを強力に変更するＬＮＡ修飾の結果であるとしている（下記参照－ＴＬＲ８のＬＮＡ ＡＳＯ増強のセクション）（図９）。
表４：下記実施例に使用した様々なオリゴヌクレオチド（全て５’－３’）。ＤＮＡについてのみ大文字、‘ｍ’は２’ＯＭｅ塩基を示し、‘／ｉ２ＭＯＥｒ’は２’ＭＯＥ塩基を示し、‘＋’はＬＮＡ塩基を示し、及び＊はホスホロチオエート骨格を意味する。
Figure 2023526090000014
実施例９：ＴＬＲ８増強は、Ｒ８４８－様分子に限定されない
先の報告は、ＴＬＲ８のＲ８４８－依存型活性化は、ウリジンが通常結合している部位（サイト１と称される）への、その結合に依存していることを明らかにしている(Tanjiら、2015)。他方で、ウリジン－含有ＲＮＡの分解産物は、一般に短いジヌクレオチド（例えば、ＵＧ又はＵＵＧ又はＣＧ）として、ＴＬＲ８ダイマーの第二の部位（サイト２）に結合する(Tanjiら、2015)。
サイト２に結合する短いＲＮＡ中のウリジン残基は、サイト１へのウリジン／Ｒ８４８結合によるＴＬＲ８活性化に必須ではなく、その理由はＰＳ－ｓｓＲＮＡ４１（ウリジンを欠いている）によるＴＬＲ８のセンシングは、ＴＬＲ１３リガンドＳａ１９（単独のウリジン残基を伴う）と共に、ウリジンにより増強されたからである(Shibataら、2016)。興味深いことに、ＰＳ－ｐｏｌｙＡ、ｐｏｌｙＣ又はｐｏｌｙＧは、ウリジンのＴＬＲ８センシングを増強することに失敗し－これは構造データに合致し、且つむしろ選択的ＲＮＡモチーフへの結合を示唆している(Shibataら、2016)。
本２’ＯＭｅ ＡＳＯ（又はそれらの分解産物）は、ＴＬＲ８のサイト２への結合によりＲ８４８センシングを増強したと推測し、本発明者らは次に、２’ＯＭｅ ＡＳＯは、遊離のウリジンのＴＬＲ８センシングを増強することができるかどうかを試験した。これと一致して、本発明者らは、ＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞（ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼによる）及びＴＨＰ－１細胞（ＩＰ－１０による）における、選択された２’ＯＭｅ（ＡＳＯ ６６０、８５２ｄＴ）及びｄＴ２０による、ウリジンセンシングの配列－特異的ＴＬＲ８増強を観察した（図１０）。しかし、ＡＳＯ ６６０の５’端変異体は、ＴＬＲ８センシングの増強に失敗し－これは、Ｒ８４８により認められた作用を反映し、且つＡＳＯの配列－依存型作用を確認している。
本発明者らは、Ｒ８４８センシングのＡＳＯ増強は、増大したＩＲＦ活性化（恐らくＴＡＳＬ動員を通じてのＩＲＦ５）を生じたことを先に示した。これと一致して、ＴＬＲ８によるウリジンセンシングのＡＳＯ－増強は、ＲＡＮＴＥＳ－ルシフェラーゼ誘導を生じた（配列－特異的様式－ＡＳＯ ６６０及びＡＳＯ ６６０－Ｍｕｔとの比較）（図１０）。
まとめると、これらの結果は、２’ＯＭｅ ＡＳＯによるＴＬＲ８増強は、合成イミダゾキノリン化合物に限定されず、且つ同じく天然ウリジン（これはＴＬＲ８のサイト１へ結合する）でも認められることを確認している。
重要なことに、Ｒ８４８及びウリジン増強に対するＡＳＯ ６６０の作用は、ＡＳＯ ６６０ Ｍｕｔにおけるその５’ＣＵＵモチーフのＧＡＡモチーフによる置換により完全に除去されるので、本結果は、ＴＬＲ８の増強に必要とされる短いジ－ヌクレオチドは、このＡＳＯの５’端から始まる必要がある（ＡＳＯ１及びＡＳＯ１－ＵＣに関するものと類似の知見）ことを示唆している。ＡＳＯ ６６０における増強のために認められるＣＵＵの重要性は、ｓｓＲＮＡにおいてＧＵ又はＡＵモチーフを優先的に切断する（ＰＳ及びホスホジエステル骨格の両方）、ＲＮａｓｅ Ｔ２の役割と一致するようには見えない(Greulichら、2019)。決定的には、ＡＳＯ ６６０中のＣＵＵモチーフは、５’ ｍＣｍＵｍＵ／ｍＣｍＧ 状況（全て２’ＯＭｅ）である。
ＬＮＡ ＡＳＯ２ Ｍｕｔ２もまた、５’ ｍＣｍＵｍＵ／＋Ｃ＋Ｇ状況を含む（ここで＋は、ＬＮＡ塩基である）。これはＴＬＲ８増強を生じないので、本発明者らは、ＣＵＵ断片の放出に必要であるエンドヌクレアーゼは、ＬＮＡ塩基の状況においては有効ではないと推測し－５’ ｍＣｍＵ／ｍＵ位置で切断が操作される場合とは異なり、両方共この配列を有するＬＮＡ ＡＳＯ２ Ｍｕｔ２とＡＳＯ ６６０の間にはＴＬＲ８増強の差異は存在しないであろう。
実施例１０：ＬＮＡ及び２ＭＯＥ ギャップマーＡＳＯによるＴＬＲ８増強
本発明者らは、ＬＮＡ又は２’ＭＯＥ修飾を伴うＡＳＯであるギャップマーＡＳＯ２は、Ｒ８４８のＴＬＲ８センシングを有意に増強しなかったことを先に明らかにした（図１－Alharbiら、2020)。これらのオリゴは、ウリジン及びＲ８４８活性を強化するために、ＴＬＲ８のサイト２へ結合する断片へプロセッシングされるという概念を基に、これらの知見は、ＬＮＡ及び２’ＭＯＥ修飾は、ＡＳＯ２の状況におけるプロセッシングを妨害することを示唆した（同じくＬＮＡ ＡＳＯ２は、わずかに１６ｎｔであり、且つ５’及び３’端に２ｎｔを欠いていることも注目される）。
ＴＬＲ８センシングに対するＬＮＡ及び２’ＭＯＥ ＡＳＯの作用に関するより広範な洞察を得るために、本発明者らは、Ｒ８４８で処理したＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞において、９１種のＬＮＡ ＡＳＯ、及び７６種の２’ＭＯＥ ＡＳＯのパネルを、１００及び５００ｎＭで、スクリーニングした（図１１、表５及び表６）。ＬＮＡ ＡＳＯに関して、本発明者らは、ＴＬＲ８増強は制限され、ＡＳＯのわずか２７％（２５／９１）が、５００ｎＭでのＮＦ－κＢルシフェラーゼの＞２倍の増加に繋がり、どのＡＳＯも、１００ｎＭでは２倍以上増強しなかったことを発見した。このことは、その分子の＞５０％が、１００ｎＭでＴＬＲ８センシングを＞２倍増強した、２’ＯＭｅ ＡＳＯとは著しく対照的であった（図２－Alharbiら、2020)。
２’ＭＯＥ ＡＳＯに関して、本発明者らは、ＴＬＲ８増強は、ＬＮＡによるものよりも大きいが、２’ＯＭｅよりも少なく、これらのＡＳＯの５０％（３８／７６）は、５００ｎＭで、ＮＦ－κＢルシフェラーゼの＞２倍の増加に繋がり、及び３４％（２６／７６）のＡＳＯは、１００ｎＭで、２倍以上増強することを発見した（図１１）。
本発明者らは次に、このスクリーンからの数個の分子を使用する、ＨＥＫ ＴＬＲ８細胞における反復実験において、これらの結果を検証しようとした。ＬＮＡ ＡＳＯに関して、本発明者らは、Ａ７及びＨ１１は、Ｒ８４８のＴＬＲ８センシングを有意に増強したことを確認した（図１２）。しかし、同じ配列をＴＨＰ－１細胞で試験した場合には、ｄＴ２０と比べ非常に少ない増強が存在し（～１／１０倍）、並びにＡ７は、ＩＰ－１０産生を一貫して増加する唯一の配列であった（Ｈ１１は、これらの細胞における産生に失敗した）（図１２）。これらの結果は、ＴＬＲ８センシングを増強するＬＮＡ ＡＳＯの限定された能力と一致するが、これらはまた、ＬＮＡ ＡＳＯの分解パターンは、細胞－依存型である（すなわち、ＨＥＫ細胞においてＡＳＯ Ｈ１１を分解するエンドヌクレアーゼは、ＴＨＰ－１細胞には存在しない）可能性も指摘している。
本発明者らはまた、ＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞における予備実験における２’ＭＯＥスクリーンからの結果も検証した（図１３）。この実験は、Ｒ８４８によるわずかなＴＬＲ８活性化にのみ繋がったが（これはここではこれらの細胞を最適には活性化しなかった）、ＡＳＯを最高に増強する（Ｇ９、Ｄ２、Ｄ７、Ｂ５、Ａ９）ことは検証された。重要なことに、本発明者らは、このスクリーンデータにおいて、ＨＰＲＴファミリー由来の単独のヌクレオチド増分を伴う配列は、ＴＬＲ８に対し異なる作用を示したことに注目した。このことは、この予備実験により検証され、ＡＳＯ ６６３は、ＴＬＲ８センシングを増強することができるが、６６４／６６５／６６６のＡＳＯはできないことを示している。更なる確認の理由にはなるが、このことは、２’ＯＭｅ化学により作製された同じＡＳＯシリーズは、類似の傾向を示し、２’ＯＭｅ ＨＰＲＴ ６６３は、最も強力なＴＬＲ８増強である（６６３＞６６４＞６６５）ので、特に興味深い（図５－Alharbiら、2020)。
本発明者らが使用した２’ＯＭｅ及び２’ＭＯＥギャップマーＡＳＯは、同じ長さ／配列を有し、且つ５’及び３’の５ｎｔ領域において使用した塩基の性質によってのみ異なるので、これらの結果は、エンドヌクレアーゼ切断のパターンは、保存される（ヌクレアーゼにより標的化される配列は保存されない）が、２’ＭＯＥ ＡＳＯは、２’ＯＭｅ ＡＳＯと比べ恐らく効率が低いことを示唆している。
表５－ＬＮＡ ＡＳＯによるＴＬＲ７及びＴＬＲ８調節
Figure 2023526090000015
Figure 2023526090000016
Figure 2023526090000017
Figure 2023526090000018
Figure 2023526090000019
Figure 2023526090000020
Figure 2023526090000021
Figure 2023526090000022
表６－２’ＭＯＥ ＡＳＯによるＴＬＲ７及びＴＬＲ８調節
Figure 2023526090000023
Figure 2023526090000024
Figure 2023526090000025
Figure 2023526090000026
Figure 2023526090000027
Figure 2023526090000028
Figure 2023526090000029
Figure 2023526090000030
実施例１１：ＴＬＲ８増強は、サイト１及びサイト２リガンドの共－刺激を必要とする
今日までの全ての実験において、本発明者らはＲ８４８刺激の前に、それらのＡＳＯによる細胞の前処理（ＨＥＫ細胞において～３０分間－ＴＨＰ－１細胞において一晩）を使用した。決定的には、本発明者らは、ウリジン又はＲ８４８刺激時には、上清中にＡＳＯを常に維持した。オリゴヌクレオチドの新たな分解は、Ｒ８４８に対する作用に必要かどうかをより良く規定するために、本発明者らは、ＰＳ－ｄＴ２０をＨＥＫ－ＴＬＲ８細胞とプレインキュベーションし、次にそれらを洗浄除去し、その後Ｒ８４８刺激した（図１４）。驚くべきことに、Ｒ８４８刺激時の上清からのｄＴ２０の除去は、このオリゴヌクレオチドによるＴＬＲ８増強を強力に減少した。このことは、ｄＴ２０は、エンドソームにおいて一度に迅速に分解されること、及び恐らくＴＬＲ８のサイト２に結合するその分解産物は、非常に短期間存在し、且つＲ８４８活性を増強するのに必須であることを指摘している。
本発明者らは、ＴＨＰ－１中のそれらの２’ＯＭｅ ＡＳＯの短いインキュベーション（～２．５時間）は、一晩のインキュベーションと比べ、それらの増強能を強力に減少したこと、しかしこれは、ｄＴ２０の作用を変更しなかったことに気がついたことも、特筆に値する（図１４）。ｄＴ２０の作用は、ＨＥＫにおける洗浄除去後持続されないという観察を基に、本発明者らは、それらの２’ＯＭｅ ＡＳＯの分解は恐らく、ｄＴ２０の分解よりもより遅いと推測した（これによりそれらの作用が、ｄＴ２０と比べ、２．５ｈのプレ－インキュベーションにより減少される理由を説明する）。
まとめると、これらの結果は、更なる研究を必要とするが、ＡＳＯ安定性とＴＬＲ８増強の間の負の相関関係を示唆している。ＨＰＲＴ ６６３－６６５シリーズの２’ＭＯＥ増強は、２’ＯＭｅのそれに類似しているように見えるので、これは、２’ＭＯＥ ＡＳＯは、２’ＯＭｅと類似の様式で（恐らく同じヌクレアーゼにより）依然プロセッシングされるが、恐らくより迅速ではないことを指摘している。このことは、２’ＭＯＥ ＡＳＯは、より大きい細胞内安定性に潜在的に部分的に関連している２’ＯＭｅ ＡＳＯのそれより、ｍＲＮＡダウンレギュレーションの促進時に通常より強力であるという概念と一致している。
これは、ウリジン又はＲ８４８のＴＬＲ８センシングを増強するＡＳＯを選択及び設計する機会を提供することができ－これは、より長い時間について、ＡＳＯ及びＲ８４８／ウリジン／サイト１アゴニストが同時に投与されない場合に特に重要である。
実施例１２：共－培養した細胞のＴＬＲ８増強－及び癌との関与
次に本発明者らは、ＴＬＲ８を増強するそれらの２’ＯＭｅ ＡＳＯの一つ（モデルとして８５２ｄＴを使用）でトランスフェクションされた細胞は、貪食細胞と共－培養される場合に、貪食細胞におけるＴＬＲ８センシングを増強することができるかどうかを試験することに関心を持った。合成ＰＳ－修飾されたＤＮＡ分子でトランスフェクションされたアポトーシス細胞の貪食は、貪食細胞におけるＤＮＡのファゴリソソーム送達を生じるということを示した最近の刊行物(Ahnら、2018)を基に、本発明者らは、プロセッシングされないＡＳＯ又はそれらの分解産物は、ＴＬＲ８のＲ８４８センシングに好ましいと論理的に考えた。
ここで本発明者らは、ＨＥＫ細胞を、２’ＯＭｅ ＡＳＯ３（ＴＬＲ８を増強しない）又は８５２ｄＴ（ＴＬＲ８を強力に増強する）によりトランスフェクションし、その後ＵＶ処理し、且つＰＭＡ－分化されたＴＨＰ－１と一晩共－培養し、その２４時間後にＲ８４８刺激した（図１５）。この設定において、ＡＳＯ３でトランスフェクションしたＨＥＫ細胞との共－培養物のＲ８４８刺激は、ＴＮＦα産生をわずかにのみアップレギュレートした（２．８倍）のに対し、８５２ｄＴでトランスフェクションしたＨＥＫ細胞との共－培養物のＲ８４８刺激は、ＴＮＦα産生を強力にアプレギュレートした（＞１３倍）（図１５）。
これらの結果は、ＴＨＰ－１細胞のエンドソームへのそれらの過程において認められた、ＨＥＫにおける細胞内ＡＳＯ（又はそれらの分解産物）は、ＴＬＲ８センシングの増強を生じることを示唆している。
この観察は、腫瘍を標的化するＡＳＯの状況に関与することができる。従って、癌細胞殺傷活性及びＴＬＲ８増強活性を持つ二機能性ＡＳＯはまた、密接に取り囲む貪食細胞により、取り込まれることができる（又はそれらの分解産物）。ウリジン／Ｒ８４８サイト１リガンドにより刺激される場合、これらの腫瘍貪食細胞は、更なる免疫細胞の動員を促進する一方で、また貪食される(engulf)癌細胞ペプチドのＭＨＣ提示に有利であるように、最後は強力に活性化される。決定的に、死滅する癌細胞の貪食に直接従事しない（並びにエンドソームのＡＳＯ分解産物及び提示するための癌エピトープを有さない）腫瘍貪食細胞は、Ｒ８４８により強力に活性化されないであろう。
実施例１３：完全な２’ＯＭｅ ＡＳＯによるＴＬＲ８増強
本発明者らはまた、完全に２’ＯＭｅ－修飾されたＡＳＯ（中央のＤＮＡ＜ギャップ＞は持たない）のＴＬＲ８を増強する能力も試験した。このために、本発明者らは、ＡＳＯ Ｃ２Ｍｕｔ１、及び２’ＯＭｅを完全に欠く（Ｃ２Ｍｕｔ１－ＰＳと称される）か、又は完全に２’ＯＭｅ修飾された（Ｃ２Ｍｕｔ１－２ＯＭｅ）そのいずれかのバリアントの作用を比較した。これらの実験は、中央のＤＮＡ領域が存在しなくとも、このＡＳＯは、ＴＬＲ８を依然有意に増強したことを示した（このＡＳＯファミリーは、他の配列に比べ強力な増強物ではないことに注意）（図１６）。決定的に、これらの結果は、完全な２’ＯＭｅオリゴヌクレオチドは、トランスフェクションには必要とされることなく、細胞により自発的に取り込まれ、エンドソームＴＬＲ８を活性化し得ることを示唆している。
実施例１４：ＴＬＲ７阻害－５’端モチーフによる調節
本発明者らはまた、Ｒ８４８のＴＬＲ７センシングに対し、変異体配列（ＡＳＯ１－ＵＣ、ＬＮＡ ＡＳＯ２－ｍｕｔ１及びｍｕｔ２、並びにＡＳＯ ６６０／ＡＳＯ ６６０－Ｍｕｔ）を試験した。５’末端ＣＵＵモチーフは、２’ＯＭｅ ＡＳＯによるＴＬＲ７阻害の制限に重要であるという先の彼等の知見に従い、ＡＳＯ ６６０－Ｍｕｔ（その５’末端ｍＣｍＵｍＵモチーフを欠いている）は、ＡＳＯ－６６０よりも有意により大きく阻害した（図１７）。対照的に、ＬＮＡ ＡＳＯ２ ｍｕｔ２（同じく５’ ｍＣｍＵｍＵモチーフを収容している）は、ＴＬＲ７阻害を保持した。ＡＳＯ１－ＵＣにおける５’ＵＣモチーフの付加は、ＴＬＲ７阻害を変更しなかった（他方でこれはＴＬＲ８増強を強力に増大した）。
実施例１５：ＴＬＲ７阻害－塩基修飾による調節
本発明者らは、ＡＳＯ２ ＬＮＡ又は２’ＭＯＥバリアントは、ＴＬＲ７センシングを強力に阻害したことを、先に観察した(図1、Alharbiら、2020)。ＬＮＡ ＡＳＯ又は２’ＭＯＥ ＡＳＯ内の選択モチーフは、ＴＬＲ７阻害を排除するかどうかを規定するために、本発明者らは、１００及び５００ｎＭで、９１種のＬＮＡ ＡＳＯ、及び７６種の２’ＭＯＥ ＡＳＯのそれらのパネルを、Ｒ８４８で処理したＨＥＫ－ＴＬＲ７細胞において試験した（図１８）。
ＬＮＡ ＡＳＯに関して、本発明者らは、ＴＬＲ７阻害は、支配的であり、ＡＳＯの８５％のみ（７８／９１）が、５００ｎＭで５０％減少したＮＦ－κＢルシフェラーゼに繋がり、並びにＡＳＯの５２％（４８／９１）が、その投与量で８０％減少したＮＦ－κＢルシフェラーゼに繋がったことを認めた。しかしそのようなＴＬＲ７阻害は、その分子の＞７８％が５００ｎＭで８０％倍だけＴＬＲ７センシングを阻害した、２’ＯＭｅについて本発明者らが観察したものよりも、頻度がわずかに低かった(図2－Alharbiら、2020)。
２’ＭＯＥに関して、本発明者らは、ＡＳＯの９５％（７２／７６）は、５００ｎＭで５０％減少したＮＦ－κＢルシフェラーゼに繋がり、並びにＡＳＯの５４％（４１／７６）が、その投与量で８０％減少したＮＦ－κＢルシフェラーゼに繋がった（図１８）ことを認めた。しかし決定的に、本発明者らが２’ＯＭｅについて認めたものと同様に、いくつかの選択されたＡＳＯは、ＴＬＲ７を阻害しなかった（例えば、ＬＮＡに関してＡ９、Ｈ１１、Ｄ１、Ｈ１、並びに２’ＭＯＥに関してＧ１、Ｃ２、Ｃ１、Ａ９、Ａ２）。
本発明者らは次に、ＴＬＲ７を阻害しなかったＡＳＯに焦点を当てた、反復実験において、これらの結果を検証することを試みた。具体的には、本発明者らは、ＬＮＡ ＡＳＯのＡ９、Ｈ１１、Ｄ１、Ｈ１は全て、５’ ＋Ｃ＋Ｃモチーフ（＋はＬＮＡ修飾を意味する）を有したこと－並びに、そのようなモチーフは、全ての強力なＴＬＲ７インヒビター（すなわち、５００ｎＭで＞７５％阻害を伴う）において存在しなかったことに注目した。本発明者らはまた、ＴＬＲ７を阻害したＡ１１、Ｂ１及びＣ１１も含んだ。反復実験は、このスクリーンの傾向を確認し、ＬＮＡ Ｄ１及びＨ１１は、ＮＦ－κＢルシフェラーゼ活性を有意に減少しなかったことを検証した（Ａ９はむしろＮＦ－κＢルシフェラーゼをわずかに増大し、並びにＨ１はこれをわずかにのみ減少したことに注目）（図１９）。
２’ＭＯＥ ＡＳＯに関して、本発明者らは、Ｇ１、Ａ２、Ｃ１及びＡ９による減少したＴＬＲ７阻害を確認する（この実験において、ＴＬＲ７シグナリングを全体的に取り除いた試験した他のＡＳＯと比べた）単独の予備実験のみを試行した。重要なことに、本発明者らは、単独のヌクレオチド増分Ｅ１（６６５）、Ａ２（６６６）、及びＧ１（６６７）を伴う配列は、ＴＬＲ７に対し異なる作用を示したことに注目した。従って、Ａ２及びＧ１の２’ＭＯＥ ＡＳＯのみが、低下したＴＬＲ７活性を有した（ＴＬＲ７阻害を調節するモチーフの存在は、２’ＯＭｅ ＡＳＯについて本発明者らが発見したものに類似していることを示唆している）。更なる確認の理由にはなるが、２’ＯＭｅ化学により作製された同じＡＳＯシリーズは、ＴＬＲ７を異なる様に阻害し－６６６及び６６７の２’ＯＭｅ ＡＳＯは、６６５よりも、より大きくＴＬＲ７を阻害したことは特に興味深い（図5－Alharbiら、2020)(図19)。
まとめると、これらの結果は、一部の配列は、３つのギャップマーＡＳＯ化学全てを伴う他のものよりも、ＴＬＲ７に対しより少なく免疫抑制する能力を有することを確認している。
広範に説明された本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、具体的実施態様において示されたような、数多くの変動及び／又は修飾を本発明に行うことができることは、当業者には理解されるであろう。従って本実施態様は、全ての観点で例証と考えられるべきであり、限定するものではない。
本明細書において考察され及び／又は言及された全ての刊行物は、それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている。
本明細書に含まれている文献、活動、材料、装置、商品などの任意の考察は、単に本発明の状況を提供する目的のためである。任意又は全てのこれらの事柄は、先行技術の基礎の一部を形成するか、又は本出願の各請求項の優先日以前に存在するものとして、本発明に関連する分野の共通の一般的知識であることの承認としてとらえられるべきではない。
参考文献
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Claims (80)

  1. 標的遺伝子の発現を低下するためのオリゴヌクレオチドを選択する方法であって：
    ｉ）少なくとも３個の連続ピリミジン塩基を伴う領域について、標的ポリヌクレオチド、又はその相補体をスキャニングする工程；
    ｉｉ）この３個の連続ピリミジン塩基を含む１又は複数の候補オリゴヌクレオチドを作製する工程であって、ここで以下の一方又は両方が適用される工程：
    ａ）候補オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドの５’端の７個の塩基内に、３個の連続ピリミジン塩基を含む、及び
    ｂ）候補オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドの３’端の７個の塩基内に３個の連続ピリミジン塩基を含む；
    ｉｉｉ）１又は複数の候補オリゴヌクレオチドの、標的遺伝子の発現を低下する能力を試験する工程；並びに
    ｉｖ）標的遺伝子の発現を低下するオリゴヌクレオチドを選択する工程：を含む、方法。
  2. 前記候補オリゴヌクレオチドの３個の連続ピリミジン塩基が、修飾された塩基及び／又は修飾された骨格を有する、請求項１記載の方法。
  3. 前記オリゴヌクレオチドが：
    ａ）修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含む、５’領域、
    ｂ）リボ核酸、デオキシリボ核酸、又はそれらの組合せの塩基を含む、中間領域、並びに
    ｃ）修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含む、３’領域：を含む、請求項１又は２記載の方法。
  4. 標的遺伝子の発現を低下するためのオリゴヌクレオチドを選択する方法であって：
    ｉ）少なくとも３個の連続ピリミジン塩基を伴う領域について、標的ポリヌクレオチド、又はその相補体をスキャニングする工程；
    ｉｉ）５’領域、３’領域、並びにリボ核酸、デオキシリボ核酸、もしくはそれらの組合せの塩基を含む中間領域を含む、１又は複数の候補オリゴヌクレオチドを作製する工程であって、ここで５’領域及び３’領域の一方又は両方は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含み、且つ以下の、少なくとも一つが適用される工程：
    ａ）５’領域は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する３個の連続ピリミジン塩基を含む、
    ｂ）５’領域は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含み、並びに５’領域と中間領域の間の接合部は、３個の連続ピリミジン塩基を含む、
    ｃ）３’領域は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する３個の連続ピリミジン塩基を含む、並びに
    ｄ）３’領域は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含み、並びに３’領域と中間領域の間の接合部は、３個の連続ピリミジン塩基を含む；
    ｉｉｉ）１又は複数の候補オリゴヌクレオチドの、標的遺伝子の発現を低下する能力を試験する工程；並びに
    ｉｖ）標的遺伝子の発現を低下するオリゴヌクレオチドを選択する工程：を含む、方法。
  5. 前記中間領域が、長さ約１０個の塩基である、請求項３又は４記載の方法。
  6. 前記５’領域及び／又は３’領域が、長さ約５個の塩基である、請求項３～５のいずれか一項記載の方法。
  7. 前記３個の連続ピリミジン塩基が、該オリゴヌクレオチドの ５’及び／又は３’端の５個の塩基内にある、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
  8. 前記３個の連続ピリミジン塩基が、該オリゴヌクレオチドの ５’及び／又は３’端の３個の塩基内にある、請求項１～７のいずれか一項記載の方法。
  9. 前記３個の連続ピリミジン塩基が、該オリゴヌクレオチドの５’及び／又は３’端にある、請求項１～８のいずれか一項記載の方法。
  10. 前記５’側の３個の連続ピリミジン塩基が、配列５’－ＣＵＵ－３’、５’－ＣＵＴ－３’、５’－ＣＣＵ－３’、５’－ＵＵＣ－３’、５’－ＵＵＵ－３’又は５’－ＣＴＴ－３’を有する、請求項１～９のいずれか一項記載の方法。
  11. 前記５’側の３個の連続ピリミジン塩基が、配列５’－ＣＵＵ－３’を含む、請求項１０記載の方法。
  12. 前記３’側の３個の連続ピリミジン塩基が、配列５’－ＵＵＣ－３’、５’－ＴＵＣ－３’、５’－ＵＣＣ－３’、５’－ＣＵＵ－３’、５’－ＵＵＵ－３’又は５’－ＴＴＣ－３’を有する、請求項１～１１のいずれか一項記載の方法。
  13. 前記３’側の３個の連続ピリミジン塩基が、配列５’－ＵＵＣ－３’を有する、請求項１２記載の方法。
  14. 前記３’側のピリミジン塩基が、配列５’－ＣＵＵＣ－３’を有する、請求項１３記載の方法。
  15. 前記ピリミジン塩基の１、２又は３個全てが、修飾された塩基であるか及び／又は修飾された骨格を有する、請求項１～１４のいずれか一項記載の方法。
  16. 前記３個の連続ピリミジン塩基が、接合部に、配列５’－ｍＣｍＵＴ－３’、５’－ｍＣＴＴ－３’、５’－ＴｍＵｍＣ－３’又は５’－ＴＴｍＣ－３’を有し、ここでｍは、修飾された塩基であるか及び／又は修飾された骨格を有する、請求項４～１５のいずれか一項記載の方法。

  17. 前記修飾された塩基が、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエトキシ、２’－フルオロ、２’－アリル、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］、４’－チオ、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’－架橋、４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’－架橋、２’－ＬＮＡ、２’－アミノ、フルオロアラビノヌクレオチド、トレオース核酸、又は２’－Ｏ－（Ｎ－メチルカルバメート）を含む、請求項１～１６のいずれか一項記載の方法。
  18. 前記修飾された骨格が、ホスホロチオエート、イオウ原子を置換する非－架橋の酸素原子、メチルホスホネートなどのホスホネート、ホスホジエステル、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデート、アミド、メチレン（メチルアミノ）、フロマセタール、チオフロマセタール、ペプチド核酸又はホスホロアミダート、例えばモルホリノホスホロアミダート（ＰＭＯ）、Ｎ３’－Ｐ５’ホスホロアミダイト又はチオホスホロアミダイトを含む、請求項２～１７のいずれか一項記載の方法。
  19. 前記オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、リボ核酸、デオキシリボ核酸、ＤＮＡホスホロチオエート、ＲＮＡホスホロチオエート、２’－Ｏ－メチル－オリゴヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－オリゴデオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－ヒドロカルビルリボ核酸、２’－Ｏ－ヒドロカルビルＤＮＡ、２’－Ｏ－ヒドロカルビルＲＮＡホスホロチオエート、２’－Ｏ－ヒドロカルビルＤＮＡホスホロチオエート、２’－Ｆ－ホスホロチオエート、２’－Ｆ－ホスホジエステル、２’－メトキシエチルホスホロチオエート、２－メトキシエチルホスホジエステル、デオキシメチレン（メチルイミノ）（デオキシＭＭＩ）、２’－Ｏ－ヒドロカルビルＭＭＩ、デオキシ－メチルホス－ホネート、２’－Ｏ－ヒドロカルビルメチルホスホネート、モルホリノ、４’－チオＤＮＡ、４’－チオＲＮＡ、ペプチド核酸、３’－アミダート、デオキシ３’－アミダート、２’－Ｏ－ヒドロカルビル３’－アミダート、ロックド核酸、シクロヘキサン核酸、三環式－ＤＮＡ、２’フルオロ－アラビノ核酸、Ｎ３’－Ｐ５’ホスホロアミダート、連結されたカルバメート、連結されたホスホトリエステル、ナイロン骨格修飾、並びにそれらの任意の組合せを有するか／これらである、請求項１～１８のいずれか一項記載の方法。
  20. 前記修飾された塩基が、２’Ｏ－メチル及びホスホロチオエート骨格を含む、請求項１～１９のいずれか一項記載の方法。
  21. 前記オリゴヌクレオチドが、長さが少なくとも１０、少なくとも約１８、少なくとも約２０、少なくとも約２５、約１０～約５０ヌクレオチド、約１８～約５０ヌクレオチド、約１８～約３０ヌクレオチド、約２０～約３０ヌクレオチド、約２０～５，０００ヌクレオチド、又は約２０塩基である、請求項１～２０のいずれか一項記載の方法。
  22. 前記オリゴヌクレオチドが、遺伝子サイレンシングのために、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は２本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１～２１のいずれか一項記載の方法。
  23. 前記オリゴヌクレオチドが、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２１又は２２記載の方法。
  24. 前記３個の連続ピリミジン塩基の１、２又は３個全てが、インビボにおいてエンドヌクレアーゼにより除去される、請求項２２又は２３記載の方法。
  25. 前述の遺伝子サイレンシングのための２本鎖オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである、請求項２２記載の方法。
  26. 前記オリゴヌクレオチドが、長さが１０～１６塩基であり、且つ動物へ投与された場合にトル様受容体８（ＴＬＲ８）活性を増強する、請求項２１記載の方法。
  27. 前記オリゴヌクレオチドが、動物へ投与された場合にトル様受容体７（ＴＬＲ７）活性を阻害しない、請求項１～２６のいずれか一項記載の方法。
  28. 前記動物が、ヒトである、請求項２７記載の方法。
  29. 標的遺伝子の発現を低下するためのオリゴヌクレオチドを選択する方法であって：
    ｉ）以下の配列の１つを伴う領域について、標的ポリヌクレオチド、又はその相補体をスキャニングする工程：５’－ＣＵＵＧＵ－３’、５’－ＣＣＵＡＵ－３’、５’－ＣＡＵＵＡ－３’、５’－ＣＧＡＡＵ－３’、５’－ＣＵＵＡＵ－３’、５’－ＣＵＵＵＡ－３’、５’ＡＣＵＧＵ－３’、５’－ＣＵＵＣＵ－３’、５’－ＣＡＵＡＵ－３’、５’－ＣＵＵＣＵ－３’、５’－ＡＡＵＵＵ－３’、５’－ＡＡＡＵＵ－３’、５’－ＣＣＵＵＣ－３’、５’－ＡＡＵＣＡ－３’又は５’－ＣＧＵＣＵ－３’、ここでＵはＴであってよい；
    ｉｉ）以下を含む１又は複数の候補オリゴヌクレオチドを作製する工程：
    ａ）５’端に、５’－ＣＵＵＧＵ－３’、５’－ＣＣＵＡＵ－３’、５’－ＣＡＵＵＡ－３’、５’－ＣＧＡＡＵ－３’ ５’－ＣＵＵＡＵ－３’、５’－ＣＵＵＵＡ－３’又は５’ＡＣＵＧＵ－３’、及び／又は
    ｂ）３’端に、５’－ＣＵＵＣＵ－３’、５’－ＣＡＵＡＵ－３’、５’－ＣＵＵＣＵ－３’、５’－ＡＡＵＵＵ－３’、５’－ＡＡＡＵＵ－３’、５’－ＣＣＵＵＣ－３’、５’－ＡＡＵＣＡ－３’又は５’－ＣＧＵＣＵ－３’；
    ｉｉｉ）１又は複数の候補オリゴヌクレオチドの標的遺伝子の発現を低下する能力を試験する工程；並びに
    ｉｖ）標的遺伝子の発現を低下するオリゴヌクレオチドを選択する工程：を含む、方法。
  30. 標的遺伝子の発現を低下するためのオリゴヌクレオチドを選択する方法であって：
    ｉ）少なくとも２個の連続シトシン塩基を伴う領域について、標的ポリヌクレオチド、又はその相補体をスキャニングする工程；
    ｉｉ）この２個の連続シトシン塩基を含む１又は複数の候補オリゴヌクレオチドを作製する工程であって、ここで候補オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドの５’端にあるか又はそれに向かって２個の連続シトシン塩基を含む工程；
    ｉｉｉ）１又は複数の候補オリゴヌクレオチドの標的遺伝子の発現を低下する能力を試験する工程；並びに
    ｉｖ）標的遺伝子の発現を低下するオリゴヌクレオチドを選択する工程：を含む、方法。
  31. 前記オリゴヌクレオチドの２個の連続シトシン塩基が、修飾された塩基及び／又は修飾された骨格を有する、請求項３０記載の方法。
  32. 前記オリゴヌクレオチドが：
    ａ）修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含む、５’領域；
    ｂ）リボ核酸、デオキシリボ核酸、又はそれらの組合せの塩基を含む、中間領域；並びに
    ｃ）修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含む、３’領域：を含む、請求項３０又は３１記載の方法。
  33. 標的遺伝子の発現を低下するためのオリゴヌクレオチドを選択する方法であって：
    ｉ）少なくとも２個の連続シトシン塩基を伴う領域について、標的ポリヌクレオチド、又はその相補体をスキャニングする工程；
    ｉｉ）５’領域、３’領域、及びリボ核酸、デオキシリボ核酸、又はその組合せの塩基を含む中間領域を含む、１又は複数の候補オリゴヌクレオチドを作製する工程であって、ここで５’領域及び３’領域の一方又は両方は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含み、並びに５’領域は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する２個の連続シトシン塩基を含む工程；
    ｉｉｉ）１又は複数の候補オリゴヌクレオチドの、標的遺伝子の発現を低下する能力を試験する工程；並びに
    ｉｖ）標的遺伝子の発現を低下するオリゴヌクレオチドを選択する工程：を含む、方法。
  34. 前記５’領域及び／又は３’領域が、長さが約３塩基である、請求項３２又は３３記載の方法。
  35. 前記中間領域が、長さが約１０塩基である、請求項３２～３４のいずれか一項記載の方法。
  36. 前記２個の連続シトシン塩基が、２’－ＬＮＡ及びホスホロチオエート骨格を含む、請求項３０～３５のいずれか一項記載の方法。
  37. 前記１又は複数の候補オリゴヌクレオチドの、トル様受容体７（ＴＬＲ７）活性を阻害する能力を試験し、並びにＴＬＲ７活性を阻害しないオリゴヌクレオチドを選択する工程を更に含む、請求項１～３６のいずれか一項記載の方法。
  38. 前記オリゴヌクレオチドが、請求項２、３又は５～２８のいずれか一項に記載された１又は複数の特徴を更に含む、請求項２９～３７のいずれか一項記載の方法。
  39. 標的遺伝子の発現を低下するためのオリゴヌクレオチドを選択する方法であって：
    ｉ）チミジンである少なくとも４個の塩基を含む領域について、標的ポリヌクレオチド、又はその相補体をスキャニングする工程；
    ｉｉ）１又は複数の修飾された塩基及び少なくとも４個のチミジンを含む、１又は複数の候補オリゴヌクレオチドを作製する工程；
    ｉｉｉ）１又は複数の候補オリゴヌクレオチドの、標的遺伝子の発現を低下し及びトル様受容体８（ＴＬＲ８）活性を増強する能力を試験する工程；並びに
    ｉｖ）標的遺伝子の発現を低下し及びＴＬＲ８活性を増強するオリゴヌクレオチドを選択する工程：を含む、方法。
  40. 前記オリゴヌクレオチドが：
    ａ）修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する、長さが少なくとも５個の塩基の、５’領域、
    ｂ）その塩基の少なくとも４個がチミジンである、１０個の塩基のストレッチを含む、中間領域、
    ｃ）長さが少なくとも５個の塩基の、３’領域：を含む、請求項３９記載の方法。
  41. ｉ）少なくとも４個のチミジン塩基が、連続ストレッチ内にあり、及び／又は
    ｉｉ）少なくとも４個のチミジン塩基の１、２、３又は４個が、連続ストレッチ内にない、請求項３９又は４０記載の方法。
  42. トル様受容体８（ＴＬＲ８）活性を増強するオリゴヌクレオチドを選択する方法であって：
    ｉ）配列ＵＣもしくはＣＵ及び１０個の塩基のストレッチを伴う領域について、標的ポリヌクレオチド、又はその相補体をスキャニングする工程であって、ここでこれらの塩基の少なくとも２個は、チミジンである工程；
    ｉｉ）以下を含む１又は複数の候補オリゴヌクレオチドを作製する工程：
    ａ）長さが少なくとも５個の塩基の５’領域であって、ここで５’端は、末端５’－ｍＵｍＣ－３’又は末端５’－ｍＣｍＵ－３’からなり、ここでｍは、修飾された塩基であるか及び／又は修飾された骨格を有するもの；
    ｂ）１０個の塩基のストレッチを含む中間領域であって、ここでこれらの塩基の少なくとも２個は、チミジンであるもの；並びに
    ｃ）長さが少なくとも５塩基の、及び／又は修飾された骨格を有する、３’領域；
    ｉｉｉ）１又は複数の候補オリゴヌクレオチドの、ＴＬＲ８活性を増強する能力を試験する工程；並びに
    ｉｖ）ＴＬＲ８活性を増強するオリゴヌクレオチドを選択する工程：を含む、方法。
  43. 前記オリゴヌクレオチドが、請求項２、３又は５～２８のいずれか一項記載の１又は複数の特徴を更に含む、請求項３９～４２のいずれか一項記載の方法。
  44. 前述のオリゴヌクレオチドのトル様受容体７（ＴＬＲ７）阻害活性を低下する方法であって、修飾されたオリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドの５’及び／又は３’端の７個の塩基内に３個の連続ピリミジン塩基を含むように、該オリゴヌクレオチドの５’及び／又は３’端にヌクレオチド配列を付加することにより、該オリゴヌクレオチドを修飾することを含む、方法。
  45. 前記ピリミジン塩基の１、２又は３個全てが、修飾された塩基であるか及び／又は修飾された骨格を有する、請求項４４記載の方法。
  46. 前述のオリゴヌクレオチドのトル様受容体７（ＴＬＲ７）阻害活性を低下する方法であって、修飾されたオリゴヌクレオチドが、以下の少なくとも１つを含むように、該オリゴヌクレオチドを修飾すること：
    ａ）修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する３個の連続ピリミジン塩基を含む５’領域、
    ｂ）修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含む５’領域、並びに３個の連続ピリミジン塩基を含む５’領域と中間領域の間の接合部、
    ｃ）修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する３個の連続ピリミジン塩基を含む３’領域、並びに
    ｄ）修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含む３’領域、並びに３個の連続ピリミジン塩基を含む３’領域と中間領域の間の接合部：を含む、方法。
  47. 前記３個の連続ピリミジン塩基が、修飾されたオリゴヌクレオチドの５’及び／又は３’端に存在する、請求項４４～４６のいずれか一項記載の方法。
  48. 前述のオリゴヌクレオチドのトル様受容体７（ＴＬＲ７）阻害活性を低下する方法であって、修飾されたオリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドの５’端にもしくはそれに向かって２個の連続シトシン塩基を含むように、オリゴヌクレオチドの５’端にヌクレオチド配列を付加することにより、該オリゴヌクレオチドを修飾することを含む、方法。
  49. 前記２個の連続シトシン塩基の一方又は両方が、修飾された塩基であるか及び／又は修飾された骨格を有する、請求項４８記載の方法。
  50. 前述のオリゴヌクレオチドのトル様受容体７（ＴＬＲ７）阻害活性を低下する方法であって、修飾されたオリゴヌクレオチドが、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する２個の連続シトシン塩基を含む５’領域を含むように、該オリゴヌクレオチドを修飾することを含む、方法。
  51. 前記２個の連続シトシン塩基が、修飾されたオリゴヌクレオチドの５’端に又はそれに向かって存在する、請求項４８～５０のいずれか一項記載の方法。
  52. 前記２個の連続シトシン塩基が、２’－ＬＮＡ及びホスホロチオエート骨格を含む、請求項４８～５１のいずれか一項記載の方法。
  53. 前記修飾されたオリゴヌクレオチドが、請求項２、３、５～２８、３１、３２又は３４～３６のいずれか一項記載の１又は複数の特徴を更に含む、請求項４４～５２のいずれか一項記載の方法。
  54. 前記修飾されたオリゴヌクレオチドの、ＴＬＲ７活性を阻害する能力を試験し、且つ未修飾のオリゴヌクレオチドよりも少ない程度に（ＴＬＲ７）活性を阻害するオリゴヌクレオチドを選択することを更に含む、請求項４４～５３のいずれか一項記載の方法。
  55. 請求項１～４３のいずれか一項記載の方法を使用し選択されるか、又は請求項４４～５４のいずれか一項記載の方法を使用し修飾された、オリゴヌクレオチド。
  56. 前記オリゴヌクレオチドの５’及び／又は３’端の７個の塩基内に３個の連続ピリミジン塩基を含む、オリゴヌクレオチド。
  57. 前記オリゴヌクレオチドの５’端に又はそれに向かって、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する２個の連続シトシン塩基を含む、オリゴヌクレオチド。
  58. ５’領域、３’領域、及びリボ核酸、デオキシリボ核酸、もしくはそれらの組合せ塩基を含む中間領域を含む、オリゴヌクレオチドであって、ここで５’領域及び３’領域の一方又は両方は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含み、並びに以下の少なくとも１つが適用される：
    ａ）５’領域は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する３個の連続ピリミジン塩基を含む、
    ｂ）５’領域は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含み、並びに５’領域と中間領域の間の接合部は、３個の連続ピリミジン塩基を含む、
    ｃ）３’領域は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する３個の連続ピリミジン塩基を含む、
    ｄ）３’領域は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する塩基を含み、並びに３’領域と中間領域の間の接合部は、３個の連続ピリミジン塩基を含む、並びに
    ｅ）５’領域は、修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する２個の連続シトシン塩基を含む：オリゴヌクレオチド。
  59. 前記２個の連続シトシン塩基が、２’－ＬＮＡ及びホスホロチオエート骨格を含む、請求項５７又は５８記載のオリゴヌクレオチド。
  60. 前述の３個の連続ピリミジン塩基及び／又は２個の連続シトシン塩基の少なくとも１つが、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない、請求項５６～５９のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
  61. 前記連続ピリミジン塩基の３個全てが、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズせず、及び／又は前記２個の連続シトシン残基の両方が、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない、請求項６０記載のオリゴヌクレオチド。
  62. ｉ）５’端に、５’－ＣＵＵＧＵ－３’、５’－ＣＣＵＡＵ－３’、５’－ＣＡＵＵＡ－３’、５’－ＣＧＡＡＵ－３’ ５’－ＣＵＵＡＵ－３’、５’－ＣＵＵＵＡ－３’又は５’ＡＣＵＧＵ－３’、並びに
    ｉｉ）３’端に、５’－ＣＵＵＣＵ－３’、５’－ＣＡＵＡＵ－３’、５’－ＣＵＵＣＵ－３’、５’－ＡＡＵＵＵ－３’、５’－ＡＡＡＵＵ－３’、５’－ＣＣＵＵＣ－３’、５’－ＡＡＵＣＡ－３’又は５’－ＣＧＵＣＵ－３’：を含む、オリゴヌクレオチド。
  63. １又は複数の修飾された塩基及び少なくとも４個のチミジンを含むオリゴヌクレオチドであって、ここで該オリゴヌクレオチドが、動物へ投与された場合に、トル様受容体８（ＴＬＲ８）活性を増強する、オリゴヌクレオチド。
  64. ａ）修飾されているか及び／又は修飾された骨格を有する、長さが少なくとも５個の塩基の５’領域、
    ｂ）少なくとも４個の塩基はチミジンである、１０個の塩基のストレッチを含む、中間領域、
    ｃ）長さが少なくとも５個の塩基の３’領域：を含む、請求項６３記載のオリゴヌクレオチド。
  65. ｉ）少なくとも４個のチミジン塩基が、連続ストレッチ内に存在し、及び／又は
    ｉｉ）少なくとも４個のチミジン塩基の１、２、３又は４個は、連続ストレッチ内に存在しない：請求項６３又は６４記載のオリゴヌクレオチド。
  66. ａ）長さが少なくとも５個の塩基である、５’領域であって、ここで５’端が、末端５’－ｍＵｍＣ－３’又は末端５’－ｍＣｍＵ－３’からなり、ここでｍは、修飾された塩基であるか及び／又は修飾された骨格を有するもの、
    ｂ）１０個の塩基のストレッチを含む、中間領域であって、ここでこれらの塩基の少なくとも２個は、チミジンであるもの、並びに
    ｃ）長さが少なくとも５個の塩基である、３’領域であって、及び／又は修飾された骨格を有するもの：を含むオリゴヌクレオチドであって、ここで該オリゴヌクレオチドは、動物へ投与された場合に、トル様受容体８（ＴＬＲ８）活性を増強する、オリゴヌクレオチド。
  67. 同じく、請求項５５～６２のいずれか一項に定義されたオリゴヌクレオチドでもある、請求項６３～６６のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
  68. 請求項２、３、５～２８、３１、３２、３４～３６、４０又は４１のいずれか一項記載の１又は複数の特徴を更に含む、請求項５５～６７のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
  69. 表１～６に示された核酸配列又はそのバリアントを含む、からなる、又はから本質的になる、オリゴヌクレオチド。
  70. 請求項５５～６９のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドを含有する、組成物。
  71. 医薬として許容し得る担体を更に含有する、請求項７０記載の組成物。
  72. 免疫反応調節物質を更に含有する、請求項７１記載の組成物。
  73. 細胞における標的遺伝子の発現を低下する方法であって、細胞を、請求項５５～６９のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、方法。
  74. 対象において疾患を治療又は予防する方法であって、請求項５５～６９のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドを、対象へ投与することを含み、ここで該オリゴヌクレオチドは、該疾患に関与した標的遺伝子の発現を低下する、方法。
  75. 前記動物が、免疫反応調節物質が投与されているか、又は投与されるであろう、請求項７４記載の方法。
  76. 前記免疫反応調節物質が、トル様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、例えば塩基アナログ（グアノシンアナログ、デアザ－アデノシンアナログ、イミダゾキノリンもしくは誘導体、ヒドロキシアデニン化合物もしくは誘導体、チアゾロキノロン化合物もしくは誘導体、ベンゾアゼピン化合物もしくは誘導体を含む）、又はＲＮＡ分子である、請求項７５記載の方法。
  77. 前記ＴＬＲアゴニストが、レシキモッド（Ｒ８４８）、ロキソリビン、イサトリビン、イミキモド、ＣＬ０７５、ＣＬ０９７、ＣＬ２６４、ＣＬ３０７、８５２Ａ、又はＴＬ８－５０６である、請求項７６記載の方法。
  78. 対象における疾患の治療又は予防のための医薬品の製造における、請求項５５～６９のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドの使用であって、ここで該オリゴヌクレオチドは、該疾患に関与した標的遺伝子の発現を低下する、使用。
  79. 対象における疾患の治療又は予防における使用のための、請求項５５～６９のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドであって、ここで該オリゴヌクレオチドが、該疾患に関与した標的遺伝子の発現を低下する、オリゴヌクレオチド。
  80. 個別に又は集合的に、ここに開示された又は本出願の明細書において指摘された、工程、特徴、整数、組成物及び／又は化合物、並びに該工程又は特徴の2以上の任意の及び全ての組合せ。
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