CN108778314A - Nk细胞中对细胞因子诱导的sh2蛋白的抑制 - Google Patents

Nk细胞中对细胞因子诱导的sh2蛋白的抑制 Download PDF

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尼古拉斯·D·亨廷顿
桑德拉·E·尼科尔森
杰夫·巴邦
塔蒂亚娜·科列斯尼克
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Inst Medical W & E Hall
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Abstract

本发明涉及基于NK细胞中CIS的抑制的治疗和预防方法。具体地讲，本发明涉及通过向受试者施用CIS抑制剂或CIS抑制性NK细胞来治疗或预防NK应答性病症。本发明还涉及用于鉴定CIS抑制剂，以及用于确定癌症对CIS抑制的治疗应答的可能性的方法。

Description

NK细胞中对细胞因子诱导的SH2蛋白的抑制
技术领域
本说明书整体涉及治疗剂领域。更具体地讲，本说明书涉及用于预防或治疗适合于NK细胞介导的疗法的健康病症的方法。
背景技术
免疫系统在抑制肿瘤生长和感染中的作用是熟知的，现在认为避免免疫检测是癌症发展的重要因素。例如，细胞毒性淋巴细胞诸如自然杀伤(NK)和CD8效应T细胞通过癌症免疫编辑来帮助抗肿瘤免疫。然而，肿瘤和感染原(例如，病毒)利用多种使这些细胞毒性淋巴细胞失能的机制。多效性细胞因子IL-15是NK细胞发育、自稳调节和活化的重要调节剂，但其对NK细胞活化的作用是短暂的，在许多癌症和感染的情况下，这限制了NK细胞介导的应答的有效性。迄今为止，人们对理解抑制NK细胞应答的抑制性信号有着极大的兴趣，但细胞内IL-15信号传导如何关闭仍不清楚。
因此，不断需要发现启动NK细胞应答的新策略，以有效治疗许多潜在的NK细胞应答性健康病症(包括癌症)，同时避免大多数化疗剂的破坏性副作用。
发明内容
本发明人已发现对细胞因子诱导的SH2蛋白(CIS)的抑制可以用于治疗许多NK细胞应答性病症，包括某些癌症和感染。
因此，在一个方面，本发明提供一种用于治疗患有NK细胞应答性病症或处于患有NK细胞应答性病症的风险中的受试者的方法，其包括向所述受试者施用CIS抑制剂。
在另一个方面，本发明提供一种用于过继性细胞治疗或预防的方法，其包括向患有NK细胞应答性病症或处于患有NK细胞应答性病症的风险中的受试者施用CIS抑制性NK细胞。在一些实施方案中，CIS抑制性NK细胞是自体的。在其他实施方案中，CIS抑制性NK细胞是同种异体的。在一些实施方案中，CIS抑制性NK细胞是与CIS抑制剂接触的NK细胞。
在一些实施方案中，CIS抑制性NK细胞是经遗传修饰，诸如通过使用可编程核酸酶进行基因编辑或通过基因沉默(RNA干扰)为具有降低的CIS表达的NK细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的CIS抑制性NK细胞是Cish-/-。在一些实施方案中，Cish-/-NK细胞是人Cish-/-NK细胞。
关于上述任何一个方面，在一些实施方案中，待施用或用于生成CIS抑制性NK细胞的CIS抑制剂是肽、肽模拟物、小分子、多核苷酸或多肽。在一些实施方案中，CIS抑制剂竞争性抑制CIS与JAK1和/或JAK3的结合。在一些实施方案中，CIS抑制剂竞争性抑制CIS与磷酸化JAK1(例如，在Tyr1034处磷酸化的JAK1)和/或磷酸化JAK3(例如，在Tyr980处磷酸化的JAK3)的结合。在另外的实施方案中，CIS抑制剂竞争性抑制CIS与延伸蛋白B、延伸蛋白C或滞蛋白-5中的一者或多者的结合。
在一些实施方案中，在CIS抑制剂是肽的情况下，所述肽是磷酸肽或磷酸模拟肽。
在一些实施方案中，在CIS抑制剂是多肽的情况下，所述多肽是抗CIS抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，在CIS抑制剂是多核苷酸的情况下，所述多核苷酸是dsRNA。在一些实施方案中，dsRNA CIS抑制剂是shRNA、siRNA或miRNA。在一些实施方案中，多核苷酸作为用于表达多核苷酸CIS抑制剂的载体提供。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，多核苷酸CIS抑制剂编码CIS的显性阴性抑制剂。在一些实施方案中，所编码的显性阴性抑制剂包含含有R107K置换的CIS的氨基酸序列。在其他实施方案中，所编码的显性阴性抑制剂包含具有L223A置换的CIS的氨基酸序列。
在一些实施方案中，在CIS抑制剂是多核苷酸的情况下，所述多核苷酸是化学修饰的mRNA。在一些实施方案中，所述化学修饰的mRNA编码CIS的显性阴性抑制剂(例如，CIS-R107K)。
在一些实施方案中，在CIS抑制剂是小分子的情况下，所述小分子CIS抑制剂使CIS不稳定。在一些实施方案中，在小分子CIS抑制剂通过使CIS不稳定而发挥作用的情况下，所述小分子CIS抑制剂是脱泛素酶抑制剂。
在一些实施方案中，任何上述治疗或预防方法还包括向受试者施用IL-15或IL-15激动剂。
在其他实施方案中，任何上述治疗或预防方法还包括施用B-Raf蛋白激酶抑制剂或MEK蛋白激酶抑制剂。
在一些实施方案中，任何上述治疗或预防方法还包括施用免疫治疗剂。此类免疫治疗剂的实例包括但不限于针对程序性细胞死亡1受体(PD-1)的抗体、针对程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体、针对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的抗体、针对转化生长因子β(TGF-b)的抗体、针对Tactile(CD96)的抗体或它们的组合。在一些实施方案中，任何上述治疗可以另外包括施用TGF-β受体拮抗剂。
在上述治疗或预防方法的一些实施方案中，受试者患有癌症或被确定为处于患有癌症或感染的风险中。
在一些实施方案中，在受试者患有癌症的情况下，所述癌症的特征在于肿瘤的存在。在一些实施方案中，在受试者患有癌症或处于患有癌症的风险中的情况下，所述癌症是转移性黑素瘤、转移性前列腺癌、转移性乳腺癌、三阴性乳腺癌、膀胱癌、脑癌、食道癌、肝癌、头颈癌、鳞状细胞肺癌、非小细胞肺癌、梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、肉瘤、肝细胞癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、胃癌、肾癌、转移性肾细胞癌、白血病、卵巢癌和恶性胶质瘤。在一些优选的实施方案中，癌症是转移性黑素瘤、转移性前列腺癌或转移性乳腺癌。在一些实施方案中，在受试者患有癌症的情况下，所述受试者已接受癌症治疗相关的同种异体组织移植。
在其他实施方案中，在受试者患有感染或处于患有感染的风险中的情况下，所述感染是病毒感染。在一些实施方案中，在受试者患有病毒感染的情况下，所述病毒感染是通过单纯疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒、人巨细胞病毒、流感病毒、痘病毒或乳头瘤病毒感染。
在另一个方面，本发明提供一种用于鉴定CIS抑制剂的方法，其包括：
i)在存在测试剂的情况下使CIS或其片段与至少一种CIS结合配偶体接触；以及
ii)确定所述测试剂是否与所述CIS蛋白结合配偶体竞争CIS或其片段的结合；以及
iii)任选地，如果在步骤ii)中所述测试剂显示出与所述CIS蛋白结合配偶体竞争CIS或其片段的结合，则将所述测试剂鉴定为CIS抑制剂。在一些实施方案中，CIS结合配偶体选自JAK1、JAK3、IL-2Rβ、延伸蛋白B、延伸蛋白C或滞蛋白5或其片段。
在一个相关方面，本发明提供一种用于鉴定CIS抑制剂的方法，其包括：
i)使CIS或其片段与测试剂接触；以及
ii)确定所述测试剂是否结合至CIS或其片段。在一些实施方案中，该方法还包括确定所述测试剂是否与CIS PEST结构域肽或CIS N-末端肽竞争CIS或其片段的结合。在一些实施方案中，CIS PEST结构域肽的序列选自SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:37。在一些实施方案中，N-末端肽的序列选自SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:34。
在另一个相关方面，本发明提供一种用于鉴定CIS抑制剂的方法，其包括：
i)在存在以下物质的情况下，体外温育磷酸化JAK1蛋白或其CIS结合片段：
(a)三聚体复合物，其包含CIS或其片段，所述CIS或其片段包含至少SH2结构域和SOCS框；延伸蛋白B；和延伸蛋白C；
(b)泛素化混合物；以及
(c)测试剂；以及
ii)相对于在不存在所述测试剂的情况下CIS诱导的泛素化的水平，确定所述测试剂是否抑制CIS诱导的所述磷酸化JAK1蛋白或片段泛素化。在一些实施方案中，泛素化混合物包含：滞蛋白5、Rbx2、E1、E2和游离的泛素。
在另一个相关方面，本发明提供一种用于鉴定CIS抑制剂的方法，其包括：
i)在存在以下物质的情况下，体外温育包含JH1激酶结构域的JAK1蛋白或其片段：
(a)三聚体复合物，其包含CIS或其片段，所述CIS或其片段包含至少SH2结构域和SOCS框；延伸蛋白B；和延伸蛋白C；
(b)JAK1激酶底物；以及
(c)测试剂；以及
ii)相对于在不存在所述测试剂的情况下所述JAK1激酶底物的磷酸化，确定所述测试剂是否增加所述JAK1激酶底物的磷酸化。在一些实施方案中，JAK1激酶底物是STAT5蛋白或STAT5肽。
在另一个相关方面，本发明提供一种用于计算机模拟鉴定CIS抑制剂的方法，其包括：
i)生成CIS或其片段的三维结构模型；以及
ii)计算机模拟设计或筛选结合至建模结构的测试剂。在一些实施方案中，三维结构模型是CIS或其片段结合至JAK1蛋白或其CIS结合片段；或JAK3蛋白或其CIS结合片段的复合物。
在另一个相关方面，本发明提供一种用于鉴定CIS抑制剂的方法，其包括：
i)提供表达CIS的细胞；以及
ii)与未接触所述测试剂的细胞相比，确定所述测试剂是否降低所述细胞中的CIS活性。在一些实施方案中，待评估的CIS活性是JAK1激酶活性的抑制、STAT5酪氨酸磷酸化的抑制、STAT5启动子活性的下调或JAK1降解的增加。在一些实施方案中，该方法所用的细胞是NK细胞。在一些实施方案中，在所用的细胞是NK细胞的情况下，步骤ii)包括确定测试剂在NK细胞中对IL 15可诱导应答的作用。在一些实施方案中，IL-15可诱导应答是NK细胞增殖、干扰素-γ(IFN-γ)产生、细胞内粒酶表达、JAK1酪氨酸磷酸化、JAK1降解、基因表达的调节或细胞毒性。
在一些实施方案中，用于基于细胞的筛选方法的测试剂此前在所述任何其他CIS抑制剂鉴定方法中被确定为候选CIS抑制剂。
在任何上述鉴定CIS抑制剂的方法的一些实施方案中，测试剂是肽、肽模拟物、小分子、多核苷酸或多肽。
在任何上述鉴定CIS抑制剂的方法的一些实施方案中，CIS或其片段的氨基酸序列包括与SEQ ID NO:6-10中的任一者具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供CIS抑制剂在制造治疗或预防受试者中的NK细胞应答性病症的药物中的用途。
在另一个方面，本发明提供CIS抑制性NK细胞在制造治疗或预防受试者中的NK细胞应答性病症的药物中的用途。
在另一个方面，本发明提供CIS抑制剂作为治疗或预防受试者中的NK细胞应答性病症的药物的用途。
在另一个方面，本发明提供CIS抑制性NK细胞作为治疗或预防受试者中的NK细胞应答性病症的药物的用途。
在另一个方面，本发明提供用于治疗或预防NK细胞应答性病症的CIS抑制剂。
在又一个方面，本发明提供用于确定患有肿瘤的患者中对CIS抑制的治疗应答的可能性的方法，所述方法包括确定肿瘤微环境中IL-15的水平，其中肿瘤微环境中IL-15的水平相对于IL-15的阈值水平升高表示对治疗应答的可能性提高。
在一个相关方面，本发明提供一种评估诱导患有肿瘤的受试者中的肿瘤侵润性NK细胞中的Cish表达升高的方法，所述方法包括确定肿瘤微环境中IL-15的水平，其中肿瘤微环境中IL-15的水平相对于IL-15的阈值水平升高表示诱导肿瘤侵润性NK细胞中的Cish表达升高。
还提供一种用于增加NK细胞对IL-15的应答的方法，所述方法包括抑制NK细胞中的CIS。在一个实施方案中，这种方法包括向受试者施用CIS抑制剂。在另一个实施方案中，用于增加NK细胞对IL-15的应答的方法包括降低NK细胞中CIS的表达。在一些实施方案中，CIS表达的降低在离体NK细胞中进行。在其他实施方案中，CIS表达的降低在体内NK细胞中(例如，在人受试者中)。除非另外特别说明，本文的任何实施方案都应被认为对任何其他实施方案施加必要的修改。例如，如技术人员将理解，上文概述的用于本发明的方法的抑制剂和健康病症的实例同样适用于本发明的用途和药物组合物。
本发明在范围上不受本文描述的具体实施方案的限制，这些实施方案仅仅是为了举例说明的目的。如本文所述，功能上等同的产品、组合物和方法显然在本发明的范围内。
贯穿本说明书，除非另外特别说明或上下文另有要求，否则提及单个步骤、物质的组合物、步骤组或物质的组合物组应被认为涵盖一个和许多个(即一个或多个)这些步骤、物质的组成、步骤组或物质的组合物组。
下文通过以下非限制性实施例并参考附图来描述本发明。
附图说明
图1为CIS缺陷型NK细胞显示出响应于IL-15的优异的增殖、存活率和杀死作用。(a)洗涤培养的野生型NK细胞并使其缺乏IL-15，然后与50ng ml-1IL-15一起温育指定时间。收集细胞并通过Q-PCR分析SOCS mRNA的表达。(b)如(a)所述处理NK细胞，裂解并通过蛋白质印迹分析CIS蛋白表达。(c)通过流式细胞术分析NK细胞(NK1.1+NKp46+TCR-β-)并在野生型(Cish+/+)和Cish缺陷型(Cish-/-)小鼠的骨髓、肝、肺和脾中计数。(d)分别用CFSE和CTV标记Cish+/+和Cish-/-NK细胞，并以1:1的比率和浓度逐渐增加的IL-15(5-40ng ml-1)中培养5天，然后通过流式细胞术分析。图片表示5个独立的实验。(e)将新鲜分离的脾Cish+/+和Cish-/-NK细胞在涂覆有免疫球蛋白对照(cIg；阴性对照)、抗NK1.1、抗NKp46、抗Ly49H(赋予抗病毒应答)抗体或IL-12/IL-18(阳性对照)组织培养板中的IL-15中培养4h，并通过流式细胞术分析IFN-γ产生和CD107a(LAMP-1)表达。(f)将Cish+/+和Cish-/-NK细胞在IL-15中扩增，并以指定的NK:CHO(E:T；效应细胞:靶细胞)比率与CHO靶细胞一起共培养一段时间。使用xCELLigence系统确定归一化CHO细胞指数。(g)Cish+/+和Cish-/-NK细胞在IL-15中培养7天，并进行RNA测序。在Cish-/-NK细胞中差异表达的选定基因以每百万读数的每千碱基外显子的读数(RPKM)显示。还可参见图8和表1。
图2为CIS通过靶向JAK/STAT信号传导来负调节IL-15信号传导。(a)纯化Cish+/+和Cish-/-NK细胞，并在50ng ml-1IL-15中离体培养21h。通过流式细胞术确定IL-2Rβ(CD122)和IL-2Rγ(CD132)表面表达。每个直方图表示来源于单只小鼠的NK细胞。(b)从Cish+/+和Cish-/-脾纯化NK细胞，并与50ng ml-1IL-15一起体外温育。(c)或者，纯化NK细胞并培养7-10天，洗涤并在无IL-15的情况下静置4h，然后进行IL-15处理。裂解细胞并与指定的磷酸化(p)和总蛋白的抗体一起进行蛋白质印迹分析。(d)将JAK抑制剂CYT387的修饰N-接头类似物偶联至NHS-琼脂糖凝胶珠，并用作亲和试剂以从(c)中生成的细胞裂解物富集JAK激酶。洗脱富集的激酶，用胰蛋白酶消化并通过质谱分析。合计JAK1和JAK3肽强度由Cish+/+和Cish-/-NK细胞显示。平均值±S.E.M。**p≤0.005；n＝3个生物学重复(e和f)CYT-387富集鉴定了69个独特的蛋白激酶，其中的16个表现出显著差异的表达。火山图(e)示出了定量管道分析(Cish+/+与Cish-/-)后的Log2蛋白质比率。红线和黄线表示蛋白质表达的2倍变化(log2比率为1)，而蓝线和绿线表示4倍变化(log2比率为2)；点相应地着色且表示单个蛋白质。–log10p值为1.3或更大的蛋白质被认为具有差异化丰度。热图(f)显示了具有显著差异的表达的激酶的Log2变换的合计肽强度(非填补)。示出了来自单个重复的数据(n＝3)。绿色至红色表示表达水平增加。基因本体分析揭示，激酶的富集涉及Cish-/-NK细胞中的细胞周期和DNA复制。还可参见图8。
图3为CIS结合至JAK活化环以抑制JAK1激酶活性并靶向该JAK1激酶以进行蛋白酶体降解。(a)使用等温量热法(ITC)测定hCIS-SH2-BC结合至对应于JAK1/3激酶结构域活化环和IL-2Rβ胞质结构域内的酪氨酸的磷酸肽的亲和力。结果列表视图示出了两个独立的实验的平均值±S.D.。N.D.＝未检出，p＝磷酸化的。(b和c)Flag标记的JAK1和JAK3在293T细胞中与Flag标记的CIS、SOCS1、SOCS3或CIS突变体一起表达，其中SOCS框中的SH2结构域(mSH2；R107K)或滞蛋白-5结合位点已突变(mSB；P241A/L242A/P243A)。在一些例子中，用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞。裂解细胞并使用抗FLAG-珠免疫沉淀蛋白质，然后与抗体一起进行蛋白质印迹以检测磷酸化(p)JAK1和JAK3。蛋白质表达水平以全细胞裂解物的抗FLAG印迹显示(下图)。(d)使FLAG标记的JAK1和CIS在293T细胞中共表达，并使用抗CIS(左上图)或抗JAK1抗体(右上图)免疫沉淀(IP)。与抗FLAG抗体一起进行的蛋白质印迹揭示，在每个例子中都存在特定的CIS-JAK复合物(上图)。蛋白质水平在下图中以细胞裂解物的抗FLAG印迹显示。(e)使用无细胞系统，在存在(+)和不存在(-)CIS-E3连接酶复合物(CIS-SH2-BC与滞蛋白5和Rbx2)的情况下，将FLAG-JAK1与泛素、E1和E2酶一起在37℃下温育指定时间。通过与磷酸化JAK1的抗体一起进行蛋白质印迹来使JAK1泛素化可视化。(f)使用全部四种JAK和CIS、SOCS1、SOCS2或SOCS3的激酶结构域(JH1)进行激酶抑制测定。CIS优先抑制JAK1 JH1活性(上图)，而SOCS1、SOCS3和CIS抑制JAK1 JH1活性达到不同的程度(下图)。数据归一化为非CIS对照。插入表格：IC50值；平均值±S.E.M.；n＝3-5个独立的实验。(g)示出体外E3连接酶泛素化组分和CIS介导的JAK活性抑制的建议模型的图解，其中CIS募集至受体复合物促进了与活性JAK1的结合并导致激酶抑制和蛋白酶体降解。eloB：延伸蛋白B；C：延伸蛋白C。还可参见图9。
图4为Cish的丧失控制实验性肺肿瘤转移。给Cish+/+和Cish-/-小鼠静脉内注射(a)3×105个B16F10黑素瘤细胞或(b)2×105个B16F10黑素瘤，并在相对于肿瘤接种第-1、0和6天用对照Ig(cIg)、抗CD8(αCD8；CD8 T细胞消耗)、抗asialoGM1(αasGM1；NK细胞消耗)或抗IFNγ(αIFNγ；中和)抗体进行处理。在肿瘤注射后第14天处死小鼠。(c)给NK细胞缺陷型(Ncr1Mcl1Δ/Δ)小鼠静脉内注射3×106个体外扩增的Cish+/+或Cish-/-NK细胞或PBS，8h后注射1×105个B16F10黑素瘤细胞。在肿瘤接种后24h，小鼠接受第二次注射1.5×106个体外扩增的Cish+/+或Cish-/-NK细胞或PBS，并在肿瘤注射后第18天处死。(a-c)在肺中通过对肺表面上的群落计数来定量转移负荷(mets)。(d)给Cish+/+、Cish-/-和Ncr1Mcl1Δ/Δ(NK-裸)小鼠静脉内注射5×105个E0771mCherry+乳腺癌细胞，并通过IVIS(荧光发射；左图)或H&E染色组织切片(右图)分析肺转移。(e)将1×105个E0771细胞植入Cish+/+和Cish-/-小鼠的乳腺脂肪垫，并测定随时间推移的肿瘤大小。(f)在400–600mm3通过手术移除(e)中生成的原位E0771肿瘤，在14天后通过IVIS测定肺中的自发性肺转移，并通过RT-PCR测定mCherry mRNA表达。(g)给Cish+/+和Cish-/-小鼠静脉内注射B16F10肺癌(7.5×105个细胞)。在相对于肿瘤接种第0、3和6天，小鼠接受对照Ig或组合抗PD-1/抗CTLA-4抗体。在13天后通过对肺表面上的群落计数来定量转移负荷。示出了平均值±S.E.M.和全部数据(n)。示出了来自单只小鼠的代表性全肺(a、c、d、f)和(d)组织切片。通过(a、c、g)Mann-Whitney U检验(b)Kruskal Wallis以及事后Dunn检验或(e)Mantel-Cox检验确定组间显著差异。还可参见图10。
图5为Cish缺陷型小鼠中NK、T细胞、Treg、ILC2和调节T细胞的分析。(a)在IL-15中培养Cish+/+或Cish-/-NK细胞，裂解并通过Q-PCR分析Cish mRNA。数据归一化为GAPDH mRNA的表达(上图)。N.D.：未检出。在IL-15和蛋白酶体抑制剂MG132中培养Cish+/+或Cish-/-NK细胞4h，然后进行细胞裂解，并通过蛋白质印迹检测全细胞裂解物中的CIS蛋白(下图)。通过流式细胞术分析Cish+/+和Cish-/-小鼠的指定器官中的(b)NK细胞(NK1.1+NKp46+TCR-β-)和(c)T细胞(NK1.1-TCR-β+)。(d和e)ILC2每2天用与抗IL-2抗体复合的PBS或IL-2(IL-2-JES6.1)处理Cish+/+和Cish-/-，并在5天或7天(D5、D7)后处死。在骨髓中对CD3/19/NK1.1/B220/Gr1阴性细胞门控的ILC2的代表性流式细胞图。(e)在IL-2-JES6.1处理后骨髓中ILC2的频率。(a、c、e)平均值±S.E.M.n＝3个生物学重复。(f)调节T细胞(Treg)在IL-2-JES6-1处理之前和5天后Cish+/+和Cish-/-小鼠的脾和淋巴结的CD4+细胞上FoxP3和CD25的表达。示出了代表性流式细胞图。(g)在IL-2-JES6-1复合物处理后脾和淋巴结中Treg的扩大和缩小(平均值±S.E.M.，n＝1-2只小鼠/组)。
图6为Socs1和/或Socs3的丧失不改变NK细胞中的IL-15应答。(a)通过管饲法用4-羟基三苯氧胺(4-OHT；诱导Socs3缺失)处理Socs3+/+ERT2Cre/+(Cre+)、Socs1-/-Ifnγ-/-(Socs1Δ)、Socs3fl/flERT2Cre/+(Socs3Δ)和Socs1-/-Ifnγ-/-Socs3fl/flERT2Cre/+(Socs1ΔSocs3Δ)小鼠，并在14天后通过流式细胞术分析脾NK细胞。(b)通过FACS分选(a)中的小鼠的脾NK细胞(TCR-β-NK1.1+NKp46+)，在IL-15(50ng ml-1)中培养7天，然后用CFSE标记，并静脉内转移至无淋巴Rag2-/-gC -/-受体或在IL-15(50ng ml-1)中体外培养。在转移后五天和十天，通过流式细胞术分析受体肝的供体NK细胞。在第5天分析体外培养物。Cish+/+和Cish-/-NK细胞培养物用作差异增殖的参考(右下图)。(c)Cish-/-NK细胞中的增强效应子功能。使Cish+/+和Cish-/-NK细胞培养7天，然后以1:1的比率与CHO或B16F10靶细胞共培养。使用xCELLigence系统通过电阻抗的相对变化确定5h的靶向细胞杀死。Cish+/+和Cish-/-NK细胞以9:1的效应细胞:靶细胞比率实现最大杀死(定义为100％杀死)。(d)给Cish+/+和Cish-/-小鼠腹膜内注射RMA-m157细胞，在18h后通过流式细胞术分析腹膜NK细胞的细胞内粒酶-A和粒酶-B产生。两个实验的平均值±SD。n＝2只小鼠。MFI：平均荧光指数。
图7为体外培养的和离体的Cish-/-NK细胞的转录组分析。对新鲜分选的离体Cish+/+和Cish-/-NK细胞，以及在IL-15(50ng ml-1)中培养7天的Cish+/+和Cish-/-NK细胞进行100bp单末端RNAseq。(a)热图中示出了Cish-/-细胞中大约前100个差异表达最大的基因的相对表达水平(Z-分数)，颜色编码根据图例进行。行缩放至平均值为0且s.d.为1。n＝2个生物学重复。(b)图3中生成的培养NK细胞数据的平均差图，其示出了Log2倍变化相对于平均表达。(c)在IL-15培养的Cish-/-NK细胞中观察到的1230个差异表达基因的功能分析。使用PANTHER分类系统进行基因本体分析。主要基因网络以Cish-/-细胞中总差异表达基因的百分比示出。
图8为Cish-/-NK细胞显示出增加的JAK/STAT信号传导以及正常的呼吸和糖酵解。(a)培养Cish+/+和Cish-/-NK细胞并洗掉含IL-15的培养基。在洗涤后的多个指定时间点裂解细胞。通过与特定抗体一起进行蛋白质印迹来分析磷酸化(p)和总信号传导蛋白质的水平。(b)Cish-/-NK细胞呼吸和糖酵解不受干扰。在存在IL-15的情况下培养Cish+/+和Cish-/-NK细胞，并使用XF分析仪系统测定胞外酸化率(ACR；糖酵解)和耗氧率(OCR；线粒体呼吸)。在标号箭头指定的时间点添加葡萄糖(1)、寡霉素(2)、FCCP和丙酮酸(3)以及抗霉素A/鱼藤酮(4)。(c)本研究中使用的蛋白质组学工作流程概述。裂解等量来源于Cish+/+和Cish-/-小鼠的培养NK细胞并使用NHS-CYT-387珠进行激酶富集。除一部分全细胞裂解物(前激酶富集)之外，还使来自CYT-387树脂的蛋白质洗脱液经受胰蛋白酶消化和纳米LC-MS/MS。(d)全局蛋白质表达的无标记定量。火山图示出了来自WCL的定量管道分析(Cish+/+与Cish-/-)后的Log2蛋白质比率。红线和黄线表示蛋白质表达的2倍变化(log2比率为1)，而蓝线和绿线表示4倍变化(log2比率为2)；点相应地着色且表示单个蛋白质。-log10p值为1.3或更大(对应于p值≤0.05)的蛋白质被认为具有差异化丰度。(e)热图显示了在(d)中具有显著差异的表达的蛋白质的Log2变换的合计肽强度(非填补)。示出了来自单个生物学重复的数据(n＝3)。绿色至红色表示表达水平增加。
图9为CIS靶向JAK和IL-2R复合物。(a)将来自野生型和Cish-/-小鼠的培养NK细胞裂解，纯化mRNA并通过RNAseq分析。重复样品的平均RPKM值(左图)。通过Q-PCR分析JAK1mRNA水平(右图)。平均值±S.D.，n＝3。(b)4-12％考马斯染色SDS-PAGE凝胶示出了纯化的hCIS-SH2-BC复合物、延伸蛋白B和延伸蛋白C。(c)使用等温量热法(ITC)测定hCIS-SH2-BC结合至对应于JAK1/3激酶结构域活化环和IL-2Rβ和γ胞质结构域内的酪氨酸的磷酸肽的亲和力。将300μM磷酸肽滴定至30μM GST-CIS-SH2-BC三元复合物溶液中。ITC滴定曲线和一些结果的列表视图(插图)示出了两个独立的实验的平均值±S.D.。N.D.＝未检出，p＝磷酸化。滴定曲线均很好地拟合单点模型。(d)洗涤培养的野生型NK细胞并在添加和不添加蛋白酶体抑制剂MG132的情况下使其缺乏IL-15 4h。然后用50ng ml-1IL-15刺激细胞指定时间，然后进行细胞裂解，并与指定的蛋白质的抗体一起进行蛋白质印迹。(e)在存在CIS-SH2-BC，存在和不存在过量的JAK1-Y1034磷酸肽竞争剂的情况下，使用JAK1的激酶结构域(JH1)进行激酶抑制测定。pY1034肽部分减少了CIS介导的抑制。数据归一化为非CIS对照。
图10为保护Cish-/-NK细胞免于实验肺转移。给Cish+/+和Cish-/-小鼠静脉内注射(a)2×105个LWT1(B-RAF突变体)黑素瘤或(b)2×105个RM-1前列腺癌细胞。在14天后通过对肺表面上的群落计数来定量肺中的转移负荷。(c和d)将1×105个E0771.LMB-mCherry+细胞植入Cish+/+和Cish-/-小鼠的乳腺脂肪垫，通过手术移除400-600mm3并且(c)在切除后称重。在14天后通过IVIS测定mCherry荧光来确定自发性肺转移(d)。(d；垂直轴：总辐射效率)。示出了指定(n)的平均值±S.E.M。通过Mann-Witney U检验(a、b)或非配对Student t检验(d)来确定组间统计学差异。
图11为CIS N-末端区或PEST的缺失增强了CIS抑制JAK1激酶活性的能力，并且CIS-SH2与磷酸肽的相互作用对于JAK1激酶活性的CIS抑制是必须的。在存在增加量的人全长CIS(CIS)、缺乏PEST基序(ΔPEST)的CIS、缺乏N-末端区和PEST基序(ΔNT/ΔPEST)二者的CIS、或缺乏N-末端34个残基(ΔN34)的CIS，不存在(a)或存在(b)过量磷酸苯酯(PP)作为竞争剂的情况下，使用JAK1的激酶结构域(JH1)进行激酶抑制测定。(c)或者，将50μM JAK1-Y1034或JAK3-Y980、Y981磷酸肽用作竞争剂。数据归一化为非CIS对照。所有CIS构造含有SOCS框，并且以由CIS、延伸蛋白B和延伸蛋白C构成的三聚复合物表达和纯化。插图：表格示出了(a)的IC50值。
图12为CIS N-末端区或PEST基序的缺失不对与磷酸肽的结合具有主要影响。使用等温量热法(ITC)测定(a)人全长CIS、缺乏PEST基序(ΔPEST)的CIS、缺乏N-末端区和PEST基序(ΔNT/ΔPEST)二者的CIS，或缺乏N-末端34个残基(ΔN34)的CIS结合至对应于JAK1激酶结构域活化环内的酪氨酸的磷酸肽(JAK1-Y1034)的亲和力。(b)人全长CIS和CISΔNT/ΔPEST结合至对应于JAK3激酶结构域活化环内的酪氨酸的磷酸肽(JAK3-Y980、Y981)的亲和力。将300μM磷酸肽滴定至30μM GST-CIS-SH2-BC三元复合物溶液中。示出了ITC滴定曲线。滴定曲线均很好地拟合单点模型。
图13为CIS-SH2结构域结合至延伸的肽界面。使用等温量热法(ITC)测定缺乏N-末端区和PEST基序(ΔNT/ΔPEST)二者的CIS结合至对应于JAK1激酶结构域活化环内的酪氨酸的磷酸肽(JAK1-Y1034)的亲和力。肽为野生型的或在+5、+3或-3位置含有丙氨酸置换。将300μM磷酸肽滴定至30μM GST-CIS-SH2-BC三元复合物溶液中。示出了ITC滴定曲线。滴定曲线均很好地拟合单点模型。
图14为CIS抑制是剂量依赖性的并且需要功能SH2结构域。(a)从Cish-/-、Cish+/-和Cish+/+小鼠的脾纯化NK细胞，用细胞追踪染料CTV标记并在增加浓度的IL-15中培养6天，然后进行流式细胞术分析。总荧光(几何平均值)减少表示增殖增加。(b)将等量的来自Cish-/-、Cish+/-和Cish+/+小鼠的脾的NK细胞在IL-15中扩增10天。培养后的绝对NK细胞数。(c)如上所述，然后将NK细胞洗涤至不含细胞因子并静置4h，然后用指定的100ng/mL IL-15和10μM MG132处理。使用指定的CIS和肌动蛋白抗体作为上样对照，通过免疫印迹分析细胞裂解物。
图15为CIS诱导的动力学与人NK细胞中JAK/STAT信号传导的抑制一致。将患者来源的人NK细胞(a)或NK淋巴细胞系(b)SNK-10、(c)NKL和NK6、(d)NK-92洗涤至不含细胞因子并静置4h(a)或16h(b-d)，然后用IL-15处理指定时间。在一些例子中，用蛋白酶体抑制剂MG132(10μM)温育细胞。裂解细胞并与指定的磷酸化(p)和总蛋白的抗体一起进行免疫印迹分析。
图16为Cish mRNA诱导的动力学与人NK细胞中JAK/STAT信号传导的抑制一致。将人NK淋巴细胞系KHYG-1(a-c)和NK-92(D-F)洗涤至不含细胞因子并静置过夜，然后用IL-15处理指定时间。裂解细胞并通过实时定量PCR(Q-PCR)分析Cish、Socs1、Socs3mRNA表达。通过将每个所关注的基因的量归一化为管家基因18s核糖体RNA来确定相对表达。每种情况有三个生物学重复且测定一式两份进行。
图17为汇总通过质谱鉴定泛素化(U)和磷酸化(P)位点的示意图。P＝磷酸化，U＝泛素化，*表示在小鼠和人CIS之间保守的残基。将FLAG标记的小鼠CIS在293T细胞中表达，并使用抗FLAG抗体通过亲和力富集纯化，然后用胰蛋白酶消化并进行LC-MS/MS分析。粗体圆圈表示本研究中鉴定的残基。Jensik等人，2015报道了其他泛素化位点。
图18为TGFβ在野生型中阻断IL-15驱动的增殖，但在CIS缺陷型NK细胞中则不阻断。用CFSE标记来自野生型(WT)、TGFβRII缺陷型(TgfRIIfl/fl)或Cish-/-小鼠(20,000个细胞/孔LinnegCD49anegCD49b+NK1.1+NKp46+)的脾NK细胞，并且在RPMI或无TGF-β培养基(MaxTex)中在以下条件下培养5天；rIL-15(50ng/mL)、rIL-15(50ng/mL)与rTGFb1(1ng/mL)、rIL-15(50ng/mL)与rTGFb1(6.25ng/mL)或rIL-15(50ng/mL)与rTGFb1(25ng/mL)。通过FACS监测CFSE(增殖)的丧失。
图19为TGFβ或BRAF(B-Raf蛋白激酶)抑制以及Cish缺失优于单独或联合处理。给Cish+/+和Cish-/-小鼠注射1×106个BRAF突变黑素瘤细胞系(SM1LWT1)以及对照(ctr)Ig、抗TGF-β(1D11)抗体、BRAF抑制剂(PLX4720)或者1D11和PLX4720。在注射后第14天通过显微计数测定肺中的黑素瘤负荷。平均值±S.E.M.*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005。
图20为组合Cish缺陷和检查点抑制剂或细胞因子刺激显示出改善的抗转移作用。(A)给5-6只B6.WT(Cish+/+)或B6.Cish-/-小鼠组静脉内注射2×105个B16F10黑素瘤细胞，并用对照Ig(cIg)(250μg腹膜内，在第0、3和6天)、抗PD-1(250μg腹膜内，在第0、3和6天)、小鼠IFN-αβ(25μg腹膜内，在第0、1、2和3天)或重组IL-2(10,000IU腹膜内，在第0、1、2和3天)处理。(B)给5-11只B6.WT(Cish+/+)或B6.Cish-/-小鼠组静脉内注射7.5×105个B16F10黑素瘤细胞，并用cIg(250μg腹膜内，在第0、3和6天)、抗PD1/抗CTLA-4组合(250μg腹膜内，各自在第0、3和6天)或重组IL-2(10,000IU腹膜内，在第0、1、2、3和4天)处理。(C)给7-10只B6.WT(Cish+/+)和B6.Cish-/-小鼠组腹膜内注射1×105个亲代RMA-S细胞，并用PBS或重组IL-2(100,000IU腹膜内，在第0、1、2、3和4天)处理。监测小鼠的肿瘤发展并在腹部肿胀和不适时实施安乐死。通过对数秩Mantel-Cox检验评估组间存活率的改善。(D)给5-15只B6.WT(Cish+/+)或B6.Cish-/-小鼠组静脉内注射5×105个RM-1前列腺癌细胞，并用cIg、抗CD96、抗PD-1、抗CTLA-4或抗PD1/抗CTLA-4组合(250μg腹膜内，各自在第0和3天)处理。(E)给8-10只B6.WT(Cish+/+)或B6.Cish-/-小鼠组静脉内注射7.5×105个B16F10黑素瘤细胞，并用250μg cIg或抗CD96mAb(腹膜内，在第0和3天)处理。(F)给5-6只B6.WT(Cish+/+)或B6.Cish-/-小鼠组静脉内注射7.5×105个LWT1黑素瘤细胞，并用媒介物或PLX4720(10mg/kg腹膜内，第0至6天每天)处理。在(A、D、F)第14天或(B、E)第13天收集肺并对宏转移计数。每个符号示出单只小鼠，结果以平均值±SEM绘图。如上所述，通过单因素ANOVA以及Tukey事后检验(对于多重比较)确定统计学显著差异(*：p<0.5；**：p<0.01；***：p<0.001；****：p<0.0001)。
图21为组合Cish缺陷和BRAF或MEK激酶抑制剂显示出改善的抗转移作用。给5-10只B6.WT(Cish+/+)和B6.Cish-/-小鼠组静脉内接种7.5×105个LWT1黑素瘤细胞，并用媒介物、BRAF抑制剂(PLX4720；每天处理达6天；10mg/kg腹膜内)和/或MEK抑制剂(MEKi；曲美替尼(trametinib)，第0和3天，0.6mg/kg管饲)处理。在第14天收集肺并对宏转移计数。每个符号示出单只小鼠，结果以平均值±S.E.M.绘图。如上所述，通过单因素ANOVA以及Tukey事后检验(对于多重比较)确定统计学显著差异(n.s.无显著性；***：p<0.001；****：p<0.0001)。
图22为保护Cish缺陷型小鼠免于MCA诱导的肿瘤发展。(A)给15只B6.WT(Cish+/+)和18只B6.Cish-/-雄性小鼠组后侧皮下接种溶于0.1ml玉米油的300μg MCA。然后监测小鼠在250天内的纤维肉瘤发展，数据记录为无肿瘤小鼠的百分比(肿瘤直径>3mm记录为阳性)。(B)给16-18只B6.WT(Cish+/+)和14只B6.Cish-/-雄性小鼠组后侧皮下接种溶于0.1ml玉米油的300μg MCA。用250μg仓鼠cIg、50μg抗asialoGM1(抗asGM1；NK细胞消耗)或250μg抗IFN-γ抗体(在第-1、0、7、12、24、28、35和42天腹膜内注射)处理小鼠。监测小鼠在200天内的纤维肉瘤发展。每周用卡尺测量肿瘤的平方直径，以两个垂直的直径(mm2)的乘积表示。当肿瘤的平方直径达到>150mm2时对小鼠实施安乐死。通过对数秩Mantel-Cox检验(A)然后是Bonferroni校正(对于多重测试)(B)确定统计学显著的组间存活率差异(*：p<0.05；***：p<0.001)。
图23为Cish缺陷型小鼠示出了急性骨髓性白血病模型中的增强存活率。给Cish+/+(WT)和Cish-/-小鼠静脉内注射5×105个MLL-AF9细胞。当检测到脾大和/或后腿麻痹时，根据道德准则对小鼠实施安乐死。存活率曲线结果来自两个独立的实验。每组具有n≥5只小鼠/实验。***p<0.05。
图24为NK细胞中CIS功能的丧失导致在体内针对更成熟的体内NK细胞的增强周转和分化。从Cish-/-和Cish+/+小鼠收集脾并加工成单细胞悬浮液。通过流式细胞术进行表面和细胞内染色以确定：(A)不同NK细胞亚群中Cish+/+和Cish-/-细胞的百分比。总NK细胞被鉴定为NK1.1+NKp46+，并进一步细分为不成熟的NK细胞(CD27+CD11b-；Imm)、M1(CD27+CD11b+)和M2(CD27-CD11b+)亚群，其中M2表示最成熟和具有细胞毒性的NK细胞群体。(B)DNAM1+KLRG1+NK细胞数。一般来讲，DNAM+细胞显示出更多的促炎性细胞因子产生和增强的对IL-15的应答，而KLRG1被视为替代性成熟标记物(C)每个NK细胞亚群(Imm、M1、M2)中Ki67+细胞的百分比。Ki67是细胞增殖的标记物。n＝6只小鼠/组。p<0.05。总体来说，这些数据显示，虽然NK细胞的总数在Cish+/+和Cish-/-小鼠之间没有差异，但Cish-/-NK细胞更成熟且可能显示出细胞因子产生和细胞毒性增加，其中所有Cish-/-亚群显示出增加的细胞周期。
图25为MCA1956肉瘤的增强控制需要NK细胞和CD8 T细胞二者。给6-7只B6.WT(WT；Cish+/+)和B6.Cish-/-小鼠组皮下注射1×106个MCA1956纤维肉瘤细胞，并在第-1、0、7和14天相对于接种有对照Ig(cIg：50μg兔IgG+100μg大鼠IgG1)、50μg抗asialoGM1(抗asGM1；NK细胞消耗)或100μg抗CD8β(CD8+T细胞消耗)的肿瘤进行处理。6-7只小鼠/组的平均值±SEM。如上所述，通过Mann-Whitney U检验确定WT和Cish-/-组间的统计学显著差异(*p<0.05)。
图26为Cish-/-CD8+ T细胞显示出增强的IFNγ产生。在指定的条件下培养来自Cish+/+(WT)和Cish-/-小鼠的外周淋巴结CD8+ T细胞4天，并通过流式细胞术评价响应于4hPMA/离子霉素的IFNγ产生。n＝3只小鼠。平均值±S.E.M.***P<0.0005，****P<0.0001。使用双因素ANOVA分析数据。
图27为Cish-/-CD8+ T细胞显示出在活化条件下的增强增殖。将来自Cish+/+(WT)和Cish-/-小鼠的外周淋巴结CD8+ T细胞在IL-15中，存在(下图)或不存在(上图)αCD28刺激(无αCD3)的情况下共培养4天。通过流式细胞术评价占据每个分区的细胞的百分比。该数据表示n＝3只小鼠/基因型。示出了平均值±S.E.M.
图28为肿瘤和肿瘤微环境中的IL-15水平调节驻留的NK细胞中的Cish表达水平。IL-15+/+或IL-15-/-小鼠(基质IL-15状态分别为+或–)经受致死剂量照射并用CishLacZ/+骨髓重建。10周后，使这些嵌合小鼠经受在乳腺脂肪垫中注射1×105个E0771乳腺癌细胞的攻击或保留未受攻击。一周后处死小鼠，收集乳腺肿瘤并切下，对肿瘤驻留的NK细胞进行β-半乳糖苷酶染色(Cish表达)并通过流式细胞术进行分析。示出了平均值±SEM。示出了统计学显著性并通过Student t检验确定。
序列表索引
SEQ ID NO:1 JAK1活化环磷酸肽
SEQ ID NO:2 JAK1磷酸模拟肽
SEQ ID NO:3 IL-2Rβ磷酸肽
SEQ ID NO:4 IL-2Rβ磷酸肽
SEQ ID NO:5 IL-2Rβ磷酸肽
SEQ ID NO:6 人CIS蛋白同种型1
SEQ ID NO:7 人CIS蛋白同种型1片段
SEQ ID NO:8 人CIS蛋白同种型1SOCS框
SEQ ID NO:9 小鼠(Mus musculus)CIS蛋白同种型1
SEQ ID NO:10 褐鼠(Rattus norvegicus)CIS蛋白
SEQ ID NO:11 智人(Homo sapiens)JAK1蛋白
SEQ ID NO:12 智人JAK3蛋白
SEQ ID NO:13 智人IL-2受体亚基β前体
SEQ ID NO:14 智人延伸蛋白B
SEQ ID NO:15 智人延伸蛋白C
SEQ ID NO:16 智人滞蛋白-5
SEQ ID NO:17 智人JAK1蛋白JH1激酶结构域肽
SEQ ID NO:18 STAT5b肽
SEQ ID NO:19 JAK1肽
SEQ ID NO:20 JAK3肽
SEQ ID NO:21 IL-2Rβ磷酸肽
SEQ ID NO:22 IL-2Rβ磷酸肽
SEQ ID NO:23 mIL-2Rβ磷酸肽
SEQ ID NO:24 IL2Rβ磷酸肽
SEQ ID NO:25 IL2Rγ磷酸肽
SEQ ID NO:26 IL2Rγ磷酸肽
SEQ ID NO:27 IL2Rγ磷酸肽
SEQ ID NO:28 IL2Rγ磷酸肽
SEQ ID NO:29 CIS PEST结构域肽
SEQ ID NO:30 CIS PEST结构域磷酸肽
SEQ ID NO:31 CIS N-末端磷酸肽
SEQ ID NO:32 CIS PEST结构域磷酸肽
SEQ ID NO:33 CIS SH2/SB结构域磷酸肽
SEQ ID NO:34 CIS N-末端糖基化肽
SEQ ID NO:35 CIS SH2糖基化肽
SEQ ID NO:36 CIS SH2糖基化肽
SEQ ID NO:37 CIS PEST糖基化肽
SEQ ID NO:38 CIS SH2/SB结构域糖基化肽
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
一般技术和定义
除非另外特别定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都应被认为具有该领域中(例如，细胞培养、细胞生物学、分子遗传学、癌症生物学及其治疗、传染病特别是急性感染、免疫学、药理学、蛋白质化学和生物化学中)的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
除非另外说明，否则本发明中使用的细胞培养和免疫学技术是本领域的技术人员熟知的标准程序。此类技术在以下各原始文献中有所描述和解释：诸如J.Perbal,APractical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984)，J.Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(编),Essential Molecular Biology:A Practical Approach,第1卷和第2卷,IRL Press(1991),D.M.Glover和B.D.Hames(编),DNA Cloning:A PracticalApproach,第1-4卷,IRL Press(1995和1996)，以及F.M.Ausubel等人(编),CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括目前所有最新版本)，Ed Harlow和David Lane(编)Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988)，以及J.E.Coligan等人(编)CurrentProtocols in Immunology,John Wiley&Sons(包括目前所有最新版本)。
如本文所用，除非说明与此相反，否则术语约是指指定值的+/-10％，更优选地+/-5％。
贯穿本说明书，词语“包括”或诸如“包含”或“含有”的变化将被理解为意味着包括所陈述的要素、整体或步骤或要素、整体或步骤组，但不排除任何其他要素、整体或步骤或要素、整体或步骤组。
如本申请所用，术语“或”旨在意指包含性的“或”而非排他性的“或”。也就是说，除非另外指明或上下文明确指出，“X使用A或B”旨在意指任何自然的包含性排列。也就是说，如果X使用A；X使用B；或X使用A和B二者，则在任何上述情况下满足“X使用A或B”。另外，A和B中的至少一者和/或同样的用法通常意指A或B或者A和B二者。此外，除非另外指明或上下文明确指出涉及单数形式，否则本申请和所附权利要求中使用的冠词“一个”和“一种”通常可以被解释为意指“一个(种)或多个(种)”。
如本文所用，术语“CIS抑制剂”是指抑制NK细胞中的CIS信号传导活性的任何试剂。此类试剂可以通过任何许多不同的作用模式用于特异性降低NK细胞中的CIS信号传导活性，所述作用模式包括但不限于降低CIS蛋白的总水平(诸如通过降低CIS mRNA水平)，抑制其与靶蛋白(例如，JAK1)的结合或其与信号传导复合物结合配偶体(诸如延伸蛋白B和延伸蛋白C)的相互作用。如本文所用，特别排除在“CIS抑制剂”之外的是广泛或全局影响除CIS之外的蛋白质(例如，烷基化剂或交联剂)或抑制基本细胞过程例如翻译(例如，翻译抑制剂)或非选择性地改变蛋白质降解的试剂。CIS抑制剂的实例包括例如多核苷酸(例如，siRNA和mRNA)、小分子、肽、多肽或其组合。在一些实施方案中，一种或多种此类CIS抑制剂与递送和/或靶向剂联合使用，例如包括纳米粒子介导的递送。
如本文所用，术语“竞争性抑制剂”或“竞争性抑制”是指靶蛋白的抑制模式，其中抑制剂结合至靶蛋白本身(例如，配体结合位点)上或靶蛋白的配体(例如，结合配偶体蛋白)上的功能关键位点，从而使蛋白质靶标与配体发生空间位阻相互作用。竞争性抑制剂可以但不必对其竞争的生物学活性位点具有更高的亲和力。
如本文所用，术语“CIS抑制性NK细胞”是指其中CIS活性受到许多单独或联合策略中的任一个的抑制的NK细胞。例如，CIS抑制性NK细胞包括但不限于其中Cish基因已经诸如通过基因编辑而遗传缺失或修饰的Cish“敲除”NK细胞；其中CIS蛋白的表达已经通过使用基因沉默策略(例如，使用siRNA或RNAi)或显性阴性CIS序列变体或显性阴性CIS片段的表达而降低的CIS蛋白“敲低”NK细胞；或者，CIS抑制性NK细胞是已暴露至CIS抑制剂(例如，小分子化合物、肽或肽模拟剂)的NK细胞，所述CIS抑制剂抑制CIS的活性，例如通过抑制其与靶蛋白(例如，JAK1)的结合或其与信号传导复合物结合配偶体(诸如延伸蛋白B和延伸蛋白C或滞蛋白-5)的相互作用。或者，CIS抑制剂可以是来源于CIS的肽或片段，其以反式作用抑制CIS活性。在一些实施方案中，CIS抑制性NK细胞例如通过遗传修饰来进行不可逆CIS抑制。在其他实施方案中，CIS抑制性NK细胞是可逆CIS抑制的，以使得细胞中的CIS抑制随时间的推移而减少。
如本文所用，术语“片段”是指保留至少一个功能或结构域的蛋白质的生物学活性部分(例如，CIS片段)。例如，CIS片段可以包括SH2结构域和SOCS框，并且JAK1片段可以包括JH1激酶结构域。在一些情况下，片段的活性是指其特异性结合至结合配偶体(例如，蛋白质或其片段)的能力。如本文所用，“片段”不涵盖全长蛋白质。
如本文所用，术语“NK细胞应答性病症”是指适合于通过一种或多种NK细胞活性(例如，NK细胞细胞毒性诱导的肿瘤细胞死亡或感染细胞的死亡，以及干扰素-γ(IFN-γ)的产生)来有效治疗的病症。NK细胞应答性病症的实例包括但不限于癌症(例如，黑素瘤、前列腺癌、乳腺癌和肝癌)和感染，诸如病毒感染(例如，HSV、肝炎病毒、人巨细胞病毒、流感病毒、黄病毒和HIV-1感染)、细菌感染(例如，分枝杆菌(Mycobacteria)、李斯特菌(Listeria)和葡萄球菌(Staphylococcus)感染)和原生动物感染(例如，疟原虫(Plasmodium)感染)和真菌感染(例如，曲霉(Aspergillus)感染)。
如本文所用，术语“肽”是指在两个至约五十个氨基酸(例如，长度为4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40或45个氨基酸)范围内的氨基酸聚合物。术语肽涵盖未修饰的肽、磷酸化肽(例如，磷酸肽)二者，以及其他化学衍生的肽，但不涵盖肽模拟物，
如本文所用，术语“多肽”或“蛋白质”是指通常长度大于约50个氨基酸并且通常具有表特征性二级和三级结构的氨基酸聚合物。
如技术人员所理解，CIS抑制剂和CIS抑制性NK细胞将以治疗有效量施用。如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指将在一定程度上减轻待治疗的疾病或病症的一个或多个症状的所施用的CIS抑制剂的足够量。结果可以是疾病的征兆、症状或病因的减少和/或缓解或者生物系统的任何其他所需改变。例如，用于治疗用途的“有效量”是提供疾病症状的临床显著性减少而没有过度的不良副作用所需的CIS抑制剂的量。在任何个别情况下，适当的“有效量”可以使用技术，诸如剂量递增研究来确定。术语“治疗有效量”包括例如预防有效量。CIS抑制剂的“有效量”是有效实现所需药理学作用或治疗改善而没有过度的不良副作用的量。应当理解，由于受试者的年龄、体重、一般状况、待治疗的病症、待治疗的病症的严重性以及处方医师的判断中的任一者的化合物的代谢变化，“有效量”或“治疗有效量”可以因受试者而异。仅作为例子，治疗有效量可以通过常规实验，包括但不限于剂量递增临床试验来确定。在多于一种治疗剂联合使用的情况下，每种治疗剂的“治疗有效量”可以指当单独使用时可为治疗有效的治疗剂的量，或可以指由于其与一种或多种另外的治疗剂联合而为治疗有效的减少量。
如本文所用，术语“小分子”是指分子量小于2000道尔顿的分子。
如本文所用，术语“化学修饰的mRNA”或“化学修饰的siRNA”是指体外生成的合成RNA，其中至少一种类型的核苷酸例如胞嘧啶的一部分(例如，10％、30％、50％或100％)被化学修饰为增加其在细胞内或者体内的稳定性。例如，在一些情况下，修饰的胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。此类多核苷酸特别适用于在体内递送/转染至细胞，特别是当与转染/递送剂组合时。在一些情况下，化学修饰的mRNA是其中大部分(例如，全部)胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，并且其中大部分(例如，全部)尿嘧啶是假尿嘧啶的化学修饰的mRNA。此类修饰的RNA的合成和使用在例如WO 2011/130624中有所描述。
如本文所用，术语“治疗”或“医治”是指由医学专业人员直接治疗受试者(例如，通过向受试者施用治疗剂)或由至少一方(例如，医生、护士、药剂师或药物销售代表)通过提供任何形式的指示而实现的间接治疗二者，所述指示(i)教导受试者根据受权利要求保护的方法自我治疗(例如，自我施用药物)或(ii)教导第三方根据受权利要求保护的方法治疗受试者。术语“治疗”或“医治”的含义还涵盖预防或减少待治疗的疾病，例如通过在疾病的足够早期施用治疗剂，以预防或减缓其进展。
如本文所用，术语“处于风险中”是指发展健康病症的可能性高于一般群体。因此，治疗被视为“处于”特定病症的“风险中”的个体被设计为防止受试者发展病症或至少使发展病症的风险降低至不高于作为一个整体的一般群体中存在的水平。
如本文所用，术语“共施用”等等意指涵盖向单个患者施用选定的治疗剂，并且旨在包括其中药剂通过相同的或不同的施用途径或者在相同的或不同的时间施用的治疗方案。
治疗方法
本文所述的方法包括通过施用治疗或预防有效量的CIS抑制剂来治疗患有NK细胞应答性病症或处于患有NK应答性病症的风险中的受试者。如本文所述，CIS(UniprotKBQ9NSE2)在NK细胞中充当IL-15诱导的应答的强效检查点抑制剂。不受理论的束缚，据信抑制NK细胞中CIS的功能，极大地增强了这些细胞对IL-15的敏感性，并维持其活化以实现治疗作用。
在其他实施方案中，用于过继性细胞疗法的方法包括向患有NK细胞应答性病症的受试者施用CIS抑制性NK细胞。
在一些实施方案中，患有NK细胞应答性病症或处于患有NK细胞应答性病症的风险中的受试者患有增殖性病状诸如癌症。在一些实施方案中，患有癌症的受试者所患有的癌症的特征在于受试者中存在一种或多种肿瘤。适用于通过本发明的方法治疗的癌症的实例包括但不限于以下癌症：转移性黑素瘤、转移性前列腺癌、转移性乳腺癌、三阴性乳腺癌、膀胱癌、脑癌、食道癌、肝癌、头颈癌、鳞状细胞肺癌、非小细胞肺癌、梅克尔细胞癌、肉瘤、肝细胞癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、胃癌、肾癌、转移性肾细胞癌、白血病、卵巢癌和恶性胶质瘤。在一些优选的实施方案中，癌症是转移性黑素瘤、转移性前列腺癌或转移性乳腺癌。在一些实施方案中，受试者已接受癌症治疗相关的同种异体组织移植，例如在用于治疗白血病的造血干细胞移植之后。
本文还描述了一种用于通过抑制NK细胞中的CIS来增加NK细胞对IL-15的应答的方法。在一些实施方案中，NK细胞对IL-15的应答通过抑制离体NK细胞中的CIS(例如，在培养的NK细胞中)来增加。在其他实施方案中，NK细胞对IL-15的应答通过抑制体内NK细胞中的CIS，例如通过向受试者施用CIS抑制剂来增加。在一些实施方案中，这种方法包括降低离体NK细胞中的CIS的表达。任选地，其中离体CIS表达降低的NK细胞可以是来源于受试者并且随后在离体CIS表达降低后移植到供体患者的自体NK细胞。在其他实施方案中，NK细胞可以是同种异体的NK细胞，即从不同于受体受试者的供体来源获得。在一些实施方案中，受试者是癌症患者。在其他实施方案中，受试者是NK细胞供体。任选地，此类方法可以包括使离体或体内NK细胞与外源性IL-15接触。
诊断方法
如本文所公开，IL-15诱导作为负反馈环的一部分的Cish表达，该负反馈环减少对肿瘤的NK细胞免疫应答。如本文所公开，在微环境中的IL-15的水平升高的情况下，特定肿瘤/肿瘤类型肿瘤侵润性NK细胞中的Cish表达也增加。虽然不希望受理论的束缚，但据信肿瘤侵润性NK细胞中Cish表达增加表示Cish抑制将在增强对肿瘤的NK介导的免疫应答中有效的可能性增加。因此，在一些实施方案中，在患有肿瘤的患者中，对通过患者中的Cish抑制治疗的应答的可能性通过确定肿瘤微环境中IL-15的水平(例如，通过肿瘤活检)来评估，其中肿瘤微环境中IL-15的水平相对于IL-15的阈值水平升高表示对治疗应答的可能性提高。
类似地，在一些实施方案中，患有肿瘤的受试者中的肿瘤侵润性NK细胞中的Cish表达升高的诱导通过确定肿瘤微环境中IL-15的水平来测定，其中肿瘤微环境中IL-15的水平相对于IL-15的阈值水平升高表示诱导肿瘤侵润性NK细胞中的Cish表达升高。
IL-15的“阈值”水平可以根据例如IL-15的对照组织水平的比较来确定。合适的阈值水平可以由技术人员使用常规实验容易地确定。
在其他实施方案中，待治疗的受试者患有感染。在一些实施方案中，待治疗的感染是病毒感染，包括但不限于单纯疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒、人巨细胞病毒、流感病毒、痘病毒或乳头瘤病毒感染。在其他实施方案中，患有NK细胞应答性病症的受试者患有细菌感染，例如分枝杆菌、李斯特菌或葡萄球菌感染。在其他实施方案中，待治疗的受试者患有原生动物感染(例如，疟原虫感染)。在另外的实施方案中，待治疗的受试者患有真菌感染(例如，曲霉感染)。
如本文所用，术语“受试者”可以是任何动物。在一个实例中，动物是脊椎动物。例如，动物可以是哺乳动物、鸟类、脊索动物、两栖动物或爬行动物。示例性受试者包括但不限于人、灵长类、家畜(例如绵羊、奶牛、鸡、马、驴、猪)、伴侣动物(例如狗、猫)、实验室试验动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)、圈养野生动物(例如狐狸、鹿)。在一个实例中，哺乳动物是人。
每个上述病症的症状、诊断试验和预后试验是本领域已知的。参见例如Harrison's Principles of Internal .”第19版,第1卷和第2卷,2015,The McGraw-HillCompanies,Inc.。
许多动物模型用于建立用于治疗任何前述NK应答性病症的CIS抑制剂的一系列治疗有效剂量。例如，已建立许多小鼠癌症模型，例如黑素瘤模型(Walker等人，2011)、前列腺癌模型(Grabowska等人，2014)和乳腺癌模型(Borowsky，2011)。
CIS抑制剂
如本文所用，CIS抑制是指减少净Cish基因表达、净CIS蛋白水平或CIS活性中的一者或多者(例如，其对JAK1激酶活性的抑制或其靶向JAK1以进行蛋白酶解)。CIS的抑制可以包括CIS活性水平在存在给定剂量的CIS抑制剂的情况下或由给定剂量的CIS抑制剂产生的，相对于其不存在的情况下的CIS活性水平降低至少约10％至100％，例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或CIS活性降低约10％至约100％的其他百分比。在一些实施方案中，向待治疗的受试者施用CIS抑制剂。在其他实施方案中，将CIS抑制剂离体施用于NK细胞，以获得CIS抑制性NK细胞，随后将CIS抑制性NK细胞作为治疗剂向受试者施用。在一些实施方案中，CIS抑制剂是可逆CIS抑制剂。在其他实施方案中，CIS抑制剂是不可逆CIS抑制剂。
用于本发明的CIS抑制剂的类型的实例包括但不限于肽、肽模拟物、小分子、多核苷酸或多肽。
肽
在一些实施方案中，用于治疗方法的CIS抑制剂是肽。合适的肽可以抑制CIS增加JAK1的泛素化的能力和/或抑制CIS降低JAK1激酶的酶活性，例如其靶蛋白的磷酸化的能力。在一些实施方案中，肽是磷酸肽，其结合至CIS从而竞争性抑制CIS与内源性磷酸化靶蛋白相互作用的能力。在一些实施方案中，磷酸肽来源于JAK1活化环的氨基酸序列，并且对应于JAK1的氨基酸1027-1042(活化环序列如下所示)，其中Tyr1034是磷酸化的：
或者，肽可以是JAK1活化环磷酸模拟肽，诸如(SEQ ID NO:2) K1032E-[F2PMP]2-TV，其中[F2PMP]2是磷酸酪氨酰模拟4-(膦酰基二氟甲基)苯基丙氨酸部分，如Yao等人(2005)所述。
在其他实施方案中，肽是磷酸肽或磷酸模拟肽，其序列来源于IL-2Rβ(GenBank登录号NP_000869.1)的胞质结构域。例如：
在一些实施方案中，肽CIS抑制剂是包含SEQ ID NO:1-5中的一个的氨基酸序列的磷酸肽或磷酸模拟肽。在其他实施方案中，肽CIS抑制剂的氨基酸序列由SEQ ID NO:1-5中的一个构成。
根据传统肽合成方法，本发明的方法中所用的肽可以通过肽合成的多种合成方法，经由一个或多个氨基酸残基的缩合反应来制备。优选地，肽根据标准固相方法合成，诸如可以根据制造商的指示在Applied Biosystems Model 430A肽合成仪(AppliedBiosystems, Foster City, Calif.)上进行。其他合成肽的方法(通过固相方法或在液相中)是本领域的技术人员熟知的。当利用固相合成时，C-末端氨基酸连接至不溶性树脂载体，该树脂载体可以通过与C-末端氨基酸中的羧基基团反应生成可分离的键。例如，在一些情况下，所用的不溶性树脂载体是对羟甲基苯氧基甲基聚苯乙烯(HMP)树脂。其他有用的树脂包括但不限于：用于合成一些含N-甲基的肽的苯乙酰胺甲基(PAM)树脂(该树脂与固相合成的Boc方法一起使用)；和用于生成具有C-末端酰胺基团的肽的MBHA(对甲基二苯甲基胺)树脂。在肽合成的过程中，支链氨基和羧基基团可以根据需要使用熟知的保护基团保护/去保护。在一些实施方案中，使用碱不稳定的9-芴甲氧羰基(Fmoc)基团或叔丁氧羰基(Boc基团)来保护N-α-氨基基团。与Fmoc合成一致的侧链官能团可以使用以下指定的保护基团保护：精氨酸(2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基)；天冬酰胺(O-叔丁基酯)；半胱氨酸谷氨酰胺和组氨酸(三苯甲基)；赖氨酸(叔丁氧羰基)；丝氨酸和酪氨酸(叔丁基)。利用肽和肽衍生物的替代保护基团的修饰将是本领域的技术人员显而易见的。
肽模拟物
在一些实施方案中，CIS抑制剂是肽模拟物。所有肽都对体内酶促降解敏感。所以，保持或甚至增强基本肽的生物学活性，但具有更大的循环半衰期的肽模拟物用于本发明的治疗方法是特别有利的。肽模拟物，例如基于具有SEQ ID NO:1-5中的任一个的氨基酸序列的肽的肽模拟物，所需的磷酸模拟物修饰可以通过非发酵方法容易地大量合成。
虽然肽主链的特征在于一个或多个内部肽键，但肽将具有连接每个氨基酸残基的肽键。因此，其中一个或多个酰胺键已被可替代接头替代但保留其中至少一个酰胺键的化合物被视为肽模拟物。
肽模拟物主链通常将为直链的或模拟肽主链的稠合环状基团的直链。
肽模拟物通常的特征在于保持其肽等同物的极性、三维大小和功能(生物活性)，但其中肽键已被替代，通常被更稳定的键替代。所谓“稳定”意指更耐受水解酶的酶促降解。通常，替代酰胺键的键(酰胺键替代物)保留了酰胺键的很多性质，例如构象、空间位阻、静电特性、形成氢键的可能性等。"Drug Design and Development",Krogsgaard,Larsen,Liljefors和Madsen(编)1996,Horwood Acad.Pub的第14章提供了肽模拟物的设计和合成的现有技术的一般性讨论。合适的酰胺键替代物包括：N-烷基化、逆反酰胺、硫代酰胺、硫酯、膦酸酯、酮亚甲基、羟基亚甲基、氟乙烯基、乙烯基、亚甲基氨基、亚甲基硫基、烷烃和磺酰胺基。
肽和肽模拟物通常将具有长度为4至20个，优选地7至16个原子的主链。具有这些范围的上端值的主链的分子通常将包括β和/或γ氨基酸或其等同物。
在一些实施方案中，肽模拟物将根据CIS自体抑制肽序列衍生。在一些实施方案中，CIS自体抑制肽序列是PEST肽序列，例如选自SEQ ID NO:29、30、32和37的肽序列。在其他实施方案中，CIS自体抑制肽序列是CIS N-末端肽序列，例如选自SEQ ID NO:31和34。
小分子
在一些实施方案中，CIS抑制剂是小分子。在一些实施方案中，小分子特异性结合至CIS并降低其活性，例如CIS与结合配偶体或靶蛋白的相互作用。用于本发明的合适的小分子CIS抑制剂可以使用本文定义的筛选方法鉴定。例如，化合物可以结合至CIS的Src同源2(SH2)结构域(人CIS的氨基酸66-216；UniprotKB Q9NSE2；和SEQ ID NO:6)、SOCS框6)或CIS的N-末端区(氨基酸1-65)。
在一些实施方案中，所施用的化合物可以是前体化合物，通常称为“前药”，它是无活性的或活性相当低的，但在施用后，其转化(即，代谢)为活性CIS抑制剂。在那些实施方案中，所施用的化合物可以称为前药。作为另外一种选择或除此之外，所施用的化合物可以代谢生成活性代谢物，与缺乏该化合物的同基因细胞相比，所述活性代谢物具有降低细胞群中CIS表达活性的活性。此类活性代谢物的使用也在本公开的范围内。
根据化合物中存在的取代基，化合物可以任选地以盐的形式存在。适用于所述方法的化合物的盐是其中抗衡离子是药学上可接受的那些盐。合适的盐包括与有机或无机酸或碱形成的那些盐。具体地讲，与酸形成的合适的盐包括与无机酸、强有机羧酸，或与有机磺酸形成的那些盐，所述强有机羧酸诸如具有未取代的或取代的(例如被卤素取代的)1至4个碳原子的烷烃羧酸，诸如饱和的或不饱和的二羧酸，诸如羟基羧酸，诸如氨基酸，所述有机磺酸诸如取代的或未取代的(例如被卤素取代的)(C1-4)-烷基或芳基磺酸。药学上可接受的酸加成盐包括由以下酸形成的那些：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、柠檬酸、酒石酸、乙酸、硫酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、琥珀酸、高氯酸、富马酸、马来酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟乙磺酸、抗坏血酸、苹果酸、邻苯二甲酸、天冬氨酸和谷氨酸、赖氨酸和精氨酸。药学上可接受的碱盐包括铵盐、碱金属盐(例如钾盐和钠盐)、碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)以及与有机碱(例如二环己胺、N-甲基-D-葡糖胺(glucomine)、吗啉、硫代吗啉、哌啶、吡咯烷、单、二或三低级烷基胺(例如乙胺、叔丁胺、二乙胺、二异丙胺、三乙胺、三丁胺或二甲基丙胺)或单、二或三羟基低级烷基胺(例如单、二或三乙醇胺))形成的盐。也可以形成对应的内盐。
有机和/或药物化学领域的技术人员将会理解，很多有机化合物可以与溶剂形成络合物，其中它们与溶剂反应或从溶剂中沉积或结晶。这些络合物称为“溶剂化物”。例如，与水形成的络合物称为“水合物”。当药物物质掺入溶剂诸如水时，溶剂化物(诸如水合物)以化学计量或非化学计量的量存在于晶格中。以常规方式筛选以溶剂化物(诸如水合物)存在的药物物质，因为这些药物物质可能会在任何阶段遇到。因此，可以理解，用于本发明的化合物可以以溶剂化物(诸如水合物)的形式存在。适用于本发明的化合物的溶剂化物形式是其中缔合的溶剂是药学上可接受的那些。例如，水合物是药学上可接受的溶剂化物的实例。
用于本发明的化合物可以以无定形形式或结晶形式存在。很多化合物以许多多晶型形式存在，并且所有这种形式的化合物的使用涵盖在本公开内。可以使用标准程序鉴定用于本公开的小分子，诸如在候选化合物文库中筛选结合至CIS的化合物，然后确定所结合的任何化合物是否降低CIS活性。在一些实施方案中，筛选本发明的化合物包括评估化合物是否抑制细胞中的CIS活性。还可以使用本文所述的计算机模拟筛选程序鉴定用于本发明的小分子，该程序可以包括筛选已知的文库化合物，以鉴定降低CIS活性的候选物。在一些实施方案中，小分子CIS抑制剂是不可逆CIS抑制剂。在其他实施方案中，小分子CIS抑制剂是可逆CIS抑制剂。
多核苷酸
在一些实施方案中，CIS抑制剂是多核苷酸，所述多核苷酸可以通过所述的许多不同的机制中的至少一种抑制CIS活性。
RNA干扰
在一些实施方案中，多核苷酸CIS抑制剂通过靶向其mRNA从而降低CIS蛋白的表达来发挥作用。例如，多核苷酸可以是RNAi。
术语“RNA干扰”、“RNAi”或“基因沉默”通常是指其中双链RNA分子降低与该双链RNA分子共有大部分或全部同源性的核酸序列的表达的过程。然而，已显示RNA干扰也可以使用非RNA双链分子实现(参见例如US20070004667)。
在一些实施方案中，CIS抑制剂包括包含和/或编码双链区的核酸分子，该双链区用于针对编码CIS的Cish mRNA(人Cish mRNA：GenBank登录号NM_013324.5)的RNA干扰。核酸分子通常是RNA，但可以包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。
双链区应为至少19个连续核苷酸，例如约19至23个核苷酸，或可以更长，例如30或50个核苷酸或100个核苷酸或更长。可以使用对应于整个基因转录物的全长序列。优选地，它们的长度为约19至约23个核苷酸。
核酸分子的双链区与靶标转录物的同一性程度应为至少90％，更优选地95-100％。核酸分子当然可以包含可以起稳定分子作用的不相关序列。
如本文所用，术语“短干扰RNA”或“siRNA”是指这样的核酸分子：其包含能够抑制或下调基因表达，例如通过以序列特异性方式介导RNAi的核糖核苷酸，其中双链部分的长度小于50个核苷酸，优选地长度为约19至约23个核苷酸。例如，siRNA可以是包含自互补正义和反义区的核酸分子，其中该反义区包含与靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且正义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。siRNA可以由两个单独的寡核苷酸组装而成，其中一条链是正义链，另一条链是反义链，其中反义链和正义链是自互补的。
如本文所用，术语siRNA意在等同于用于描述能够介导序列特异性RNAi的核酸分子的其他术语，例如微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸(siNA)、短干扰修饰的寡核苷酸、化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)等等。此外，如本文所用，术语RNAi意在等同于用于描述序列特异性RNA干扰的其他术语，诸如转录后基因沉默、翻译抑制或表观遗传学。例如，siRNA分子可以用于在转录后水平或转录前水平上表观遗传学沉默基因。在一个非限制性实例中，通过siRNA分子表观遗传学调节基因表达可以由siRNA介导的染色质结构修饰而产生，从而改变基因表达。
所谓“shRNA”或“短发夹RNA”意指这样的RNA分子：其中小于约50个核苷酸，优选地约19至约23个核苷酸与位于相同RNA分子上的互补序列碱基配对，并且其中所述序列和互补序列被至少约4至约15个核苷酸的非配对区分开，所述核苷酸在碱基互补的两个区产生的茎结构之上形成单链环。
所包括的shRNA是双指或二指和多指发夹dsRNA，其中RNA分子包含两个或更多个这种被单链间隔区分开的茎-环结构。
一旦包含双链区的核酸分子设计出来，即可通过本领域已知的任何方法产生，例如通过体外转录、重组或通过合成手段。
可以引入核苷酸的修饰或类似物，以改善核酸分子的性质。改善的性质包括增加的核酸酶耐受性和/或增加的穿透细胞膜的能力。因此，术语“核酸分子”和“双链RNA分子”包括合成修饰的碱基，诸如但不限于肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤和其他烷基腺嘌呤、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-硫醇腺嘌呤、8-硫代烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤和其他8-取代腺嘌呤、8-卤代鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-硫醇鸟嘌呤、8-硫代烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤和其他取代鸟嘌呤、其他氮杂和脱氮杂腺嘌呤、其他氮杂和脱氮杂鸟嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。
特别适用于体内递送的化学修饰的siRNA在本领域中，例如WO2014201306、WO2007051303中有所描述。可以用于靶向Cish mRNA的示例性siRNA可以例如从ThermoFisher(目录号：146713和146714)；Origene(目录号SR300830)和MyBioSource(目录号MBS8232244)商购获得。
编码肽或多肽的多核苷酸
在一些实施方案中，基于多核苷酸的CIS抑制剂编码一种或多种多肽，以使得多核苷酸递送至NK细胞引起所编码的肽或多肽CIS蛋白抑制剂表达。在一些实施方案中，所编码的肽或多肽一旦在NK细胞中表达，即抑制内源性CIS蛋白与一个或多个其相互作用配偶体(例如，延伸蛋白B、延伸蛋白C或滞蛋白-5)或靶蛋白(例如，Tyr1034磷酸化JAK1或在Tyr355、Tyr361或Tyr392中的任一个磷酸化的IL-2Rβ)相互作用。
在一些实施方案中，多核苷酸编码CIS活性的显性阴性抑制剂。在一个实施方案中，所编码的显性阴性抑制剂是包含具有其中SH2结构域是失活的107Arg→107Lys(R107K)突变的氨基酸序列的CIS。在其他实施方案中，所编码的显性阴性抑制剂是包含SOCS框中的滞蛋白-5结合位点具有突变(例如，P241A/L242A/P243)的氨基酸序列的CIS。在其他实施方案中，所编码的显性阴性抑制剂是包含具有L223A置换的氨基酸序列的CIS。
在一些实施方案中，多核苷酸CIS抑制剂编码可编程核酸酶，所述可编程核酸酶通过失活或降低Cish基因的表达来抑制CIS活性。如本文所用，术语“可编程核酸酶”涉及“靶向”(“编程”)为识别和编辑预定基因组位置的核酸酶。在一些实施方案中，所编码的多肽是“靶向”或“编程”为将遗传修饰引入Cish基因或其调节区的可编程核酸酶。在一些实施方案中，遗传修饰是Cish基因中或其调节区中的缺失或置换。此类可编程核酸酶特别适用于产生离体的CIS抑制性Cish-/-NK细胞，例如用于产生用于过继性细胞疗法的Cish-/-自体NK细胞。
在一些实施方案中，可编程核酸酶可以编程为通过DNA结合的锌指蛋白(ZFP)结构域的组合来识别基因组位置。ZFP识别DNA序列中的特定3-bp，ZFP的组合可以用于识别特定的基因组位置。在一些实施方案中，可编程核酸酶可以编程为通过转录活化因子样效应子(TALE)DNA结合结构域识别基因组位置。在一个替代实施方案中，可编程核酸酶可以编程为通过一个或多个RNA序列识别基因组位置。在一个替代实施方案中，可编程核酸酶可以通过一个或多个DNA序列编程。在一个替代实施方案中，可编程核酸酶可以通过一个或多个杂交DNA/RNA序列编程。在一个替代实施方案中，可编程核酸酶可以通过RNA序列、DNA序列和杂交DNA/RNA序列中的一者或多者编程。
可以根据本公开使用的可编程核酸酶包括但不限于：来源于细菌规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)-cas(CRISPR相关)系统的RNA引导的工程化核酸酶(RGEN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样核酸酶(TALEN)和argonaute。
在一些实施方案中，核酸酶是RNA引导的工程化核酸酶(RGEN)。在一些实施方案中，RGEN来自古细菌基因组或为其重组形式。在一些实施方案中，RGEN来自细菌基因组或为其重组形式。在一些实施方案中，RGEN来自I型(CRISPR)-cas(CRISPR相关)系统。在一些实施方案中，RGEN来自II型(CRISPR)-cas(CRISPR相关)系统。在一些实施方案中，RGEN来自III型(CRISPR)-cas(CRISPR相关)系统。在一些实施方案中，核酸酶是I类RGEN。在一些实施方案中，核酸酶是II类RGEN。在一些实施方案中，RGEN是多组分酶。在一些实施方案中，RGEN是单组分酶。在一些实施方案中，RGEN是CAS3。在一些实施方案中，RGEN是CAS10。在一些实施方案中，RGEN是CAS9。在一些实施方案中，RGEN是Cpf1(Zetsche等人，2015)。在一些实施方案中，RGEN被单RNA或DNA靶向。在一些实施方案中，RGEN被多于一种RNA和/或DNA靶向。在一些实施方案中，可编程核酸酶可以是DNA编程的argonaute(WO 14/189628)。
在一些实施方案中，多核苷酸CIS抑制剂以表达载体的形式提供，以使用本领域已知的许多转染方法中的任一种，例如重组病毒转导、基于脂质体的转染、电穿孔或基于纳米粒子的转染，体内或体外递送至NK细胞。
如本文所用，“表达载体”是能够在宿主细胞(例如，NK细胞)中实现一种或多种多核苷酸的表达的DNA或RNA载体。载体通常是质粒或重组病毒。可以使用合适的表达载体，表达载体的实例包括但不限于质粒或病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、疱疹病毒或腺相关病毒载体。
此类载体将包括用于表达多核苷酸(诸如用于基因沉默的dsRNA)的一种或多种启动子。合适的启动子包括但不限于逆转录病毒LTR；SV40启动子；和人巨细胞病毒(CMV)启动子。也可以使用细胞启动子(诸如真核细胞启动子)，包括但不限于组蛋白、RNA聚合酶III(就shRNA或miRNA表达而言)、β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，启动子是NK细胞选择性启动子，诸如人NKp46启动子(参见例如，Walzer等人，2007)。根据本文包含的教导，合适的启动子的选择将是本领域的技术人员显而易见的。
在其他实施方案中，多核苷酸CIS抑制剂是编码显性阴性CIS的、合成的、化学修饰的mRNA。化学修饰的mRNA及其合成在例如WO 2011/130624中详细描述。通常，化学修饰的mRNA包含(i)用于增强翻译的5'合成帽；(ii)赋予RNA酶耐受性和减弱的细胞干扰素应答，否则将大大降低翻译效率的修饰的核苷酸；以及(iii)3'多聚-A尾。通常，化学修饰的mRNA从包含可操作地连接至编码显性阴性CIS的开放阅读框的SP6或T7 RNA聚合酶启动子的DNA模板体外合成。化学修饰的mRNA合成反应在存在修饰的和未修饰的核苷酸的混合物的情况下进行。在一些实施方案中，化学修饰的mRNA的体外合成中包括的修饰的核苷酸是假尿苷和5-甲基胞嘧啶。细胞mRNA加工中的关键步骤是添加5'帽结构，它是RNA的5'末端和鸟苷核苷酸之间的5'-5'三磷酸键。帽在鸟苷的N-7位置酶促甲基化，以形成成熟的mCAP。当制备显性阴性CIS化学修饰的mRNA时，通常添加5'帽，然后转染NK细胞，以稳定修饰的mRNA并显著增强翻译。在一些实施方案中，将帽类似物与GTP的4:1混合物用于转录反应，以获得5'-加帽的化学修饰的mRNA。在优选的实施方案中，将抗反向帽类似物(ARCA)3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G用于生成可以在NK细胞中有效翻译的化学修饰的mRNA。用于体外合成的系统可商购获得，其示例为mRNAExpressTM mRNA合成试剂盒(System Biosciences,Mountain View,Calif.)。此类用于体外和体内转染的修饰的RNA的合成和使用在例如WO 2011/130624和WO/2012/138453中有所描述。
多肽
在一些实施方案中，CIS抑制剂是多肽，它可以通过许多不同机制中的至少一种抑制CIS活性，例如特异性结合至CIS或CIS结合配偶体，从而减少CIS和结合配偶体的相互作用，或者与CIS竞争与结合配偶体的相互作用。
抗体
在一些实施方案中，CIS抑制剂是结合至CIS并且抑制其与结合配偶体或靶蛋白的相互作用的抗体或其CIS结合片段。优选地，抗体是被修饰为穿透或被吸收(被动或主动)到哺乳动物细胞，特别是NK细胞中的抗体。
如本文所用，术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、融合二体、三体、异源缀合抗体和嵌合抗体。还设想了相对于对应的全长抗体保留至少大部分(约10％)抗原结合的抗体片段。此类抗体片段在本文中称为“抗原-结合片段”。抗体包括许多形式的修饰，包括例如但不限于结构域抗体(包括VH或VL结构域)、重链可变区(VHH，如针对骆驼科所述)的二聚体、轻链可变区(VLL)的二聚体、仅含有轻链(VL)和重链(VH)可变区的Fv片段(它可以直接或通过接头连接)或含有重链可变区和CH1结构域的Fd片段。
术语“抗体”还涵盖由重链和轻链(连接在一起形成单链抗体)的可变区构成的scFv，以及scFv的寡聚体(诸如二体和三体)。还涵盖含有可变区和恒定区的一部分的抗体的片段，诸如Fab、(Fab')2和FabFc2片段。还涵盖互补决定区(CDR)移植的抗体片段和抗体片段的寡聚体。Fv的重链和轻链组分可以来源于相同的抗体或不同的抗体，从而产生嵌合Fv区。抗体可以是动物(例如小鼠、兔或大鼠)或人来源的，或可以是嵌合的或人源化的。
如本文所用，术语“抗体”包括这些多种形式。使用本文提供的准则和本领域的技术人员熟知的那些方法(这些方法在上文引用的参考文献和诸如以下出版物中有所描述：Harlow&Lane,Antibodies:a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,(1988))，可以容易地制备用于本发明的方法的抗体。
抗体可以是包含可变轻链(VL)和可变重链(VH)的Fv区，其中轻链和重链可以直接或通过接头连接。如本文所用，接头是指这样的分子：其共价连接至轻链和重链并在两条链之间提供足够的间隔和柔性，使得它们能够实现其中它们能够特异性结合它们指向的表位的构象。蛋白质接头是特别优选的，因为它们可以表示为融合多肽的Ig部分的内在组分。
在另一个实施方案中，将重组产生的单链scFv抗体，优选地人源化scFv用于本发明的方法中。
在一个实施方案中，该抗体具有细胞内传递能力。具有细胞内传递能力的抗体包括诸如以下的抗体：骆驼科和美洲驼抗体、鲨鱼抗体(IgNAR)、scFv抗体、胞内体或纳米体(例如scFv胞内体和VHH胞内体)。酵母SPLINT抗体文库可用于测试能够破坏蛋白质-蛋白质相互作用的胞内体。此类试剂可包含细胞穿透肽序列或核定位肽序列，诸如Constantini等人(2008)公开的那些。也可用于体内递送的是Vectocell或Diato肽载体，诸如De Coupade等人(2005)公开的那些。
此外，抗体可以融合至细胞穿透剂，例如细胞穿透肽。细胞穿透肽包括Tat肽、穿透蛋白(Penetratin)、短两亲肽(诸如来自Pep和MPG家族的那些)、寡精氨酸和寡赖氨酸。在一个实例中，细胞穿透肽也缀合至脂质(C6-C18脂肪酸)结构域，以改善细胞内递送(Koppelhus等人，2008)。细胞穿透肽的实例可见于Howl等人(2007)和Deshayes等人(2008)。因此，本发明还提供经由共价键(例如肽键)在任选地N-末端或C-末端融合至细胞穿透肽序列的抗体的治疗用途。
靶向CIS的抗体可从许多来源获得，诸如Santa Cruz Biotechnology(例如，目录号sc-74581)。
CIS抑制性NK细胞
适用于在离体NK细胞中(例如，在培养NK细胞中)抑制CIS以获得CIS抑制性NK细胞的任何CIS抑制剂，均可用于NK应答性病症的过继性细胞疗法。在一些实施方案中，待施用的CIS抑制性NK细胞是自体的，即来源于待治疗的受试者。在其他实施方案中，待施用的CIS抑制性NK细胞是同种异体的NK细胞。
在一些实施方案中，CIS抑制性NK细胞是经遗传修饰为具有降低的CIS表达的NK细胞。例如，在一些实施方案中，CIS抑制性NK细胞通过CIS shRNA或CIS反义表达载体的瞬时或稳定转染或病毒转导获得，所述CIS shRNA或CIS反义表达载体在表达时，降低了经遗传修饰的细胞中CIS的表达水平。在其他实施方案中，CIS抑制性NK细胞是经遗传修饰的NK细胞，其中一个或两个Cish等位基因通过靶向基因组修饰，例如通过一个或多个外显子的缺失、终止密码子的引入或启动子的失活来失活。用于在细胞系和原代细胞中进行基因组基因座修饰的方法在领域中已经很好地确立。例如，可编程核酸酶(例如，Cas9-CRISPR系统)是非常有效的且常规用于基因的靶向断裂。
在其他实施方案中，NK细胞离体接触CIS抑制剂，例如肽、肽模拟物、多核苷酸或多肽。
NK细胞可以通过任何许多不同的方法获得，包括从原代来源分离和扩增NK细胞、从造血干细胞(HSC)分化和扩增、从人诱导的多能干细胞(hiPSC)分化和扩增或从另一种多能干细胞类型分化。
在一些实施方案中，就自体过继性细胞疗法而言，从人受试者，例如待治疗的患者分离NK细胞。
NK细胞可以通过以下步骤分离或富集：使用CD56和CD3的抗体对来自组织来源(例如外周血)的细胞染色，并选择CD56+CD3-细胞。可以使用商购获得试剂盒，例如NK细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)分离TSNK细胞。也可以通过移除包含NK细胞的细胞群中除NK细胞之外的细胞来分离或富集NK细胞。例如，NK细胞可以通过使用例如CD3、CD4、CD14、CD19、CD20、CD36、CD66b、CD123、HLA DR和/或CD235a(血型糖蛋白A)中的一者或多者的抗体消耗显示非NK细胞标记物的细胞来分离或富集。阴性分离可以使用商购获得试剂盒，例如NK细胞阴性分离试剂盒(Dynal)进行。通过这些方法分离的细胞可以另外分选，例如以分离CD56+/CD16-和CD56-/CD16+细胞。
细胞分离可以通过例如流式细胞术、荧光活化细胞分选(FACS)或优选地使用与特定抗体缀合的微珠的磁性细胞分选来实现。细胞可以例如使用磁性活化细胞分选(MACS)技术，根据结合包含一种或多种特定抗体(例如抗CD56抗体)的磁珠(例如，约0.5-100μM直径)的能力来分离颗粒的方法来分离。磁性细胞分离可以使用例如AUTOMACSTM分离仪(Miltenyi)来进行和自动化。许多有用的修饰可以在磁性微球上进行，包括共价添加特异性识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体。然后使珠与细胞混合以允许结合。然后使细胞通过磁场以分离出具有特定细胞表面标记物的细胞。在一个实施方案中，然后可以分离这些细胞并与偶联至针对另外的细胞表面标记物的抗体的磁珠重新混合。使细胞再次通过磁场，分离结合两种抗体的细胞。然后可以将这些细胞稀释至单独的培养皿，诸如用于克隆分离的微量滴定皿中。
从HSC分化人NK细胞在例如U.S.8,926,964中有所描述，从hiPSC分化人NK细胞在U.S.20130287751中有所描述。
培养和扩增NK细胞(特别是人NK细胞)以获得用于过继性细胞疗法的临床级NK细胞的方法在本领域中有所描述，如例如Childs等人(2013)所综述。
CIS抑制剂的施用
在一些实施方案中，治疗患有NK应答性病症的受试者或预防这种病症的方法，包括将含有至少一种CIS抑制剂或其药学上可接受的盐、药学上可接受的N-氧化物、药学活性代谢物、药学上可接受的前药或药学上可接受的溶剂化物的药物组合物以治疗有效量向所述受试者施用。
施用CIS抑制剂以防止、治愈或至少部分阻止已经患有和/或被诊断为具有NK应答性病症(例如，癌症或感染)的患者的症状。该用途的有效量将取决于感染的严重性和过程、先前疗法、患者的健康状况、体重、对治疗的应答以及感染原对治疗的耐受性。对于通过常规实验(包括但不限于剂量递增临床试验)来确定此类治疗有效量的本领域的技术人员来说，这被认为是良好的。
在预防性应用中，将含有CIS抑制剂的组合物向易患或者处于发展NK应答性病症(例如癌症或感染)的风险中的患者施用，例如就免疫功能受损(对于感染的预防)或根据基因型高度易患特定类型的癌症的个体而言。这种量被定义为“预防有效量或剂量”，即足以防止或减少感染的发生的剂量。在该用途中，精确量还取决于特定的病症、患者的健康状况、体重、时间安排等。对于通过常规实验(例如，剂量递增临床试验)来确定此类预防有效量的本领域的技术人员来说，这被认为是良好的。
在受试者的状况确实改善的情况下，根据可靠的医疗建议，CIS抑制剂的施用可以连续给予；或者所施用的药物的剂量可以暂时减少或暂时停止一定长度的时间(即，“药物假期”)。药物假期的长度可以在2天和1年之间变化，包括仅作为例子，2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天或60天。药物假期期间的剂量减少可为10％-100％，包括仅作为例子，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
适合作为治疗有效剂量的给定CIS抑制剂的量将根据以下因素而变化：诸如待施用的CIS抑制剂的类型和效力、受试者的健康病症的严重性/分期、需要治疗的受试者或宿主的特征(例如，体重)以及既往或同时治疗，但仍然可以根据围绕病例的特定情况以本领域已知的方式常规确定，包括例如所施用的具体药剂、施用途径、所治疗的病症以及所治疗的受试者或宿主。然而，一般来讲，用于成人治疗的剂量通常将在每天0.02-5000mg或每天约1-1500mg的范围内。所需的剂量可以以单剂量或以同时(或在一段短时间内)或在适当的间隔施用的分剂量，例如以每天两次、三次、四次或更多次亚剂量方便地提供。
前述范围仅仅是建议性的，因为关于单个治疗方案的变量数很大，并且这些推荐值的巨大偏差并不少见。此类剂量可以根据许多变量来改变，不限于所用的CIS抑制剂的活性、待治疗的NK细胞应答性病症的类型和严重性、施用模式以及专业人员的判断。
此类治疗方案的毒性和治疗功效可以在细胞培养物或实验动物中通过标准制药程序来确定，包括但不限于LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)的测定。毒性和治疗作用之间的剂量比为治疗指数，它可以以LD50和ED50之间的比率表示。展现出高治疗指数的CIS抑制剂是优选的。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人和非人受试者的一系列剂量。此类化合物的剂量优选地位于包括具有最小毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可以取决于采用的剂型和利用的施用途径，而在该范围内变化。
CIS抑制性NK细胞的施用
NK抑制性细胞可以通过本领域已知的任何合适的途径施用。在一些实施方案中，细胞以动脉内或静脉内输注全身施用。本领域的技术人员将会理解，选定的CIS抑制性NK细胞的施用途径将部分取决于待治疗的特定NK应答性病症。例如，在受试者患有存在一种或多种肿瘤的情况下，在一些实施方案中，施用途径将包括瘤内施用和/或瘤周施用。其他示例性施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴内施用。
CIS抑制性NK细胞可以以对个体产生可检出治疗性或预防性益处的任何量或数量，例如有效量向个体施用，其中所述个体具有癌症或病毒感染。在一些实施方案中，待施用的CIS抑制性细胞的剂量仅仅是细胞的绝对数，例如可以给所述个体施用约1×105个细胞、5×105个细胞、1×106个细胞、7×106个细胞、1×107个细胞、6×107个细胞、2×108个细胞、5×108个细胞、1×109个细胞、6×109个细胞、2×1010个细胞、5×1010个细胞或1×1011个细胞。
在其他实施方案中，CIS抑制性NK细胞以相对于待治疗的受试者的体重的细胞数，例如以每千克待治疗的受试者约1×105个细胞、5×105个细胞、1×106个细胞、7×106个细胞、1×107个细胞、6×107个细胞、2×108个细胞、5×108个细胞、1×109个细胞或6×109个细胞向受试者施用。
在其他实施方案中，在待治疗的受试者患有一种或多种肿瘤的情况下，CIS抑制性NK细胞根据CIS抑制性NK细胞与待治疗的受试者中大致肿瘤细胞数的大致所需比率施用。例如，CIS抑制性NK细胞可以以约1:1、1:1、3:1、4:1、5:1、9:1、10:1、15:125:1、30:1、40:1、50:1、55:1、60:1、65:1、75:1、80:1、90:1、95:1或100:1的比率(NK细胞与肿瘤细胞)施用。肿瘤细胞数可以通过例如确定组织样品(例如，血样、活检样品等等)中的肿瘤细胞数来估算。在一些实施方案中，例如对于实体肿瘤，肿瘤细胞数估算可以通过活检样品中的细胞计数和肿瘤成像的组合来进行，以估算肿瘤体积和驻留细胞数。
联合治疗
CIS抑制剂和CIS抑制性NK细胞组合物也可以与在NK应答性健康病症(例如，癌症和病毒感染)的治疗中有治疗价值的其他药剂联合使用。一般来讲，其他药剂不一定必须在相同的药物组合物施用，并且由于不同的物理和化学特征，可以优选地以不同的途径施用。如果可能的话，在相同的药物组合物中，施用模式和施用的可行性的确定，在熟练的临床医生的知识范围内。初始施用可以根据本领域已知的确立方案进行，然后，根据所观察到的效果，熟练的临床医生可以修改剂量、施用模式和施用时间。
根据感染的性质和阶段、患者的病症以及所用治疗剂的实际选择，CIS抑制剂和另外的治疗剂可以同时(例如，同时、基本上同时或在相同的治疗方案内)或按顺序施用。在治疗方案期间，在评估所治疗的疾病和患者的病症之后，每种治疗剂的施用顺序和重复施用次数的确定在熟练的内科医生的知识范围内。
本领域的技术人员已知，当药物用于治疗组合时，治疗有效剂量可以变化。实验确定用于联合治疗方案的药物和其他药剂治疗有效剂量的方法在文献中有所描述。例如，节拍给药的使用，即提供更频繁、更低剂量以使毒性副作用最小化，已在文献中广泛描述。联合治疗还包括在不同时间开始和停止以协助患者的临床管理的周期治疗。
对于联合疗法，共施用的治疗剂的剂量当然将根据所利用的共同药剂的类型、根据具体CIS抑制剂和待治疗的NK细胞应答性病症而变化。
可以理解的是，治疗、防止或改善一种或多种寻求缓解的病症的剂量方案，可以根据许多因素修改。这些因素包括受试者患有的病症，以及受试者的年龄、体重、性别、饮食和一般医疗状况。因此，实际利用的剂量方案可以宽泛地变化，所以可以偏离本文所示的剂量方案。
构成本文公开的联合疗法的CIS抑制剂和另外的治疗剂可以是组合剂型或旨在基本上同时施用的单独剂型。构成联合疗法的药剂也可以按顺序施用，其中任一种治疗化合物通过要求两步施用的方案施用。两步施用方案可以要求按顺序施用活性剂或分开施用单独的活性剂。根据每种药剂的性质，诸如药剂的效力、溶解度、生物利用度、血浆半衰期和动力学特征，多个施用步骤之间的时间段可以在几分钟至几小时的范围内。还可以评价许多生理参数的昼夜节律变化以确定最佳剂量间隔。
此外，用于治疗感染的CIS抑制剂的施用或共施用可以与多个程序联合使用，所述程序可以为患者提供另外的或协同益处。仅作为例子，患者可以经历遗传测试，以鉴定其自身的基因组或病原体的基因组的遗传变异，以优化治疗参数，例如待施用的CIS抑制剂的类型、给药方案以及与另外的治疗剂的共施用。
初始施用可以经由任何实际途径进行，诸如例如静脉内注射、弹丸注射、超过5分钟至约5小时的输注、丸剂、胶囊剂、吸入剂、注射剂、透皮贴剂、面颊递送等等或其组合。在检测到或怀疑疾病或病症的发生后，化合物应在可行的情况下尽快施用，并持续治疗或预防NK细胞应答性病症所需的时间长度。
任选地，当与使用CIS抑制剂的治疗联合时，也可以给受试者施用治疗有效剂量的IL-15或IL-15激动剂。IL-15激动剂包括IL-15的功能同系物，诸如例如Wu(2013)描述的那些。在其他实施方案中，本发明的任何治疗还可以包括施用一种或多种免疫治疗剂。适用于与CIS抑制联合或与IL-15或IL-15激动剂联合的CIS抑制联合的免疫治疗剂可以包括但不限于针对程序性细胞死亡1受体(PD-1)的抗体、针对程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体、针对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的抗体、针对转化生长因子β(TGF-b)的抗体、针对Tactile(CD96)的抗体或它们的组合。
在另外的实施方案中，在其他实施方案中，本发明的任何治疗还可以包括施用B-Raf蛋白激酶抑制剂或MEK蛋白激酶抑制剂。B-Raf蛋白激酶抑制剂的实例包括但不限于PLX4032(维罗菲尼(Vemurafenib))、PLX-4720、达拉菲尼(Dabrafenib,GSK2118436)、AZ628、RAF265(CHIR-265)、恩考菲尼(Encorafenib,LGX818)、SB590885及其组合。MEK蛋白激酶抑制剂的实例包括但不限于曲美替尼(Trametinib,GSK1120212)、考比替尼(Cobimetinib)、比尼替尼(Binimetinib,MEK162)、司美替尼(Selumetinib,PD-325901)、它们的组合。在一些实施方案中，任何上述治疗可以另外包括施用TGF-β受体拮抗剂。合适的TGF-β受体拮抗剂的实例包括但不限于Galunisertib(LY2157299)、GW 788388、LY 364947、R268712、SB 525334和SD208。
剂型
用于本发明的组合物可配制为经由任何传统手段向受试者施用，包括但不限于口服、肠胃外(例如，静脉内、皮下或肌内)、面颊、吸入、鼻内、直肠或透皮施用途径。
包括单独或与一种或多种其他治疗剂组合的CIS抑制剂(例如，肽模拟物)的药物组合物可以配制成任何合适的剂型，包括但不限于水性口服分散剂、液体、雾剂、凝胶剂、糖浆剂、酏剂、浆剂、混悬剂等等用于由待治疗的患者口服摄取的剂型、固体口服剂型、气雾剂、控释制剂、速溶制剂、泡腾制剂、冻干制剂、片剂、粉剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多微粒制剂以及混合速释和控释制剂。
口服使用的药物制剂可以通过以下步骤获得：将一种或多种固体赋形剂与一种或多种化合物混合，任选地研磨所得的混合物，在添加合适的助剂(如果需要)之后，加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸核。合适的赋形剂包括例如填充剂，诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，诸如例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、微晶纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；或其他填充剂诸如：聚乙烯吡咯烷酮(PVP或聚维酮)或磷酸钙。如果需要，可以加入崩解剂，诸如交联羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐诸如藻酸钠。
在另一个方面，剂型可以包括微胶囊化制剂。在一些实施方案中，一种或多种相容性材料存在于微胶囊化材料中。示例性材料包括但不限于pH调节剂、促腐蚀剂、消泡剂、抗氧化剂、调味剂和载剂材料诸如粘合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂和稀释剂。
CIS抑制剂的微胶囊化制剂可以通过本领域的普通技术人员已知的方法配制。这些已知的方法包括例如喷雾干燥法、转盘-溶剂法、热熔法、喷雾冷却法、流化床、静电沉积、离心挤出、旋转悬浮分离、在液体-气体或固体-气体界面处聚合、压力挤出或喷雾溶剂提取浴。除这些方法之外，还可以使用多种化学技术，例如复合凝聚、溶剂蒸发、聚合物-聚合物不相容性、液体介质中的界面聚合、原位聚合、液中干燥和液体介质中的去溶剂化。此外，还可以使用其他方法，诸如碾压、挤出/滚圆、凝聚或纳米粒子包衣。
包括制剂的药物固体口服剂型还可以配制为提供CIS抑制剂的控释。控释是指一种或多种活性剂根据所需的特征在延长的时间段内从它们所掺入的剂型中释放。控释特征包括例如持续释放、延长释放、脉冲释放和延迟释放特征。与速释组合物相比，控释组合物允许根据预定特征在延长的时间段内将药剂递送至受试者。这种释放速率可以在延长的时间段内提供治疗有效的水平的药剂，从而与传统的速释剂型相比，提供长期的药理学响应，同时使副作用最小化。这种长期响应提供了对应的短效速释制剂未实现的许多固有益处。
在一些实施方案中，固体剂型可以配制为肠溶包衣延迟释放口服剂型，即利用肠溶包衣来影响胃肠道的小肠中的释放的药物组合物的口服剂型。肠溶包衣剂型可以是含有活性成分和/或其他组合物组分(其本身是包衣的或无包衣的)的颗粒剂、粉剂、小丸剂、珠粒或颗粒的压制或模制或挤出片剂/铸模(包衣的或无包衣的)。肠溶包衣口服剂型也可以是含有固体载剂或组合物(其本身是包衣的或无包衣的)的小丸剂、珠粒或颗粒的胶囊剂(包衣的或无包衣的)。
如本文所用，术语“延迟释放”是指这样的递送：其使得释放可以在肠道中的一些通常可预测的位置实现，所述位置远离在延迟释放无改变的情况下可以实现的位置。在一些实施方案中，用于释放延迟方法是包衣。任何包衣都应施涂至足够的厚度，以使得整个包衣在pH小于约5的胃肠液中不溶解，但在约5和更大的pH下溶解。预期，任何展现出pH依赖性溶解度特征的阴离子聚合物均可在实现递送至下胃肠道的方法和组合物中用作肠溶包衣。在一些实施方案中，聚合物是阴离子羧基聚合物。
在一些实施方案中，包衣可以并且通常确实含有增塑剂以及可能地本领域熟知的其他包衣赋形剂，诸如着色剂、滑石和/或硬脂酸镁。合适的增塑剂包括柠檬酸三乙酯(Citroflex 2)、三醋精(三乙酸甘油酯)、乙酰柠檬酸三乙酯(Citroflec A2)、Carbowax400(聚乙二醇400)、邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三丁酯、乙酰化甘油单酯、甘油、脂肪酸酯、丙二醇和邻苯二甲酸二丁酯。具体地讲，阴离子羧基丙烯酸聚合物通常将含有10-25重量％的增塑剂，特别是邻苯二甲酸二丁酯、聚乙二醇、柠檬酸三乙酯和三醋精。利用传统包衣技术诸如喷涂包衣或锅包衣施涂包衣。包衣厚度必须足以确保口服剂型保持完整，直到到达肠道中所需的局部递送位点。
除增塑剂之外，还可以将着色剂、防粘剂、表面活性剂、消泡剂、润滑剂(例如，巴西棕榈蜡或PEG)添加到包衣，以增溶或分散包衣材料，并改善包衣性能和包衣产品。
在其他实施方案中，使用脉冲剂型递送CIS抑制剂制剂。脉冲剂型能够在控制滞后时间之后的预定时间点或在特定位点提供一个或多个速释脉冲。可以使用本领域已知的许多脉冲制剂施用脉冲剂型。例如，此类制剂包括但不限于US 5,011,692、5,017,381、5,229,135和5,840,329描述的那些。适用于本发明的制剂的其他脉冲释放剂型包括但不限于例如US 4,871,549、5,260,068、5,260,069、5,508,040、5,567,441和5,837,284。在一个实施方案中，控释剂型是包括至少两组颗粒(即多微粒)，每组含有一种制剂的脉冲释放固体口服剂型。第一组颗粒在摄取时提供基本上速释剂量的CIS抑制剂。第一组颗粒可以是无包衣的或包括包衣和/或密封剂。第二组颗粒包括与一种或多种粘合剂混合的包衣颗粒，所述包衣颗粒以制剂中活性剂的总剂量的总量计，约2％至约75％、约2.5％至约70％或约40％至约70％包括。所述包衣包括药学上可接受的成分，所述药学上可接受的成分的量足以提供在摄取之后、第二剂量释放之前约2小时至约7小时的延迟。合适的包衣包括一种或多种可差异降解的包衣，诸如仅作为例子pH敏感性包衣(肠溶包衣)，诸如单独或与纤维素衍生物(例如，乙基纤维素)共混的丙烯酸树脂，或具有可变厚度以提供制剂的差异释放的非肠溶包衣。
很多其他类型的控释系统是本领域的普通技术人员已知的并且适用于与所述制剂。此类递送系统的实例包括例如基于聚合物的系统，诸如聚乳酸和聚乙醇酸、聚酐和聚己内酯；多孔基质、基于非聚合物的系统(其为脂质)，包括甾醇，诸如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪，诸如单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯；水凝胶释放系统；硅橡胶系统；基于肽的系统；蜡包衣、生物蚀解性剂型、使用传统粘合剂的压缩片剂等等。参见例如US 4,327,725、4,624,848、4,968,509、5,461,140、5,456,923、5,516,527、5,622,721、5,686,105、5,700,410、5,977,175、6,465,014和6,932,983。
用于口服施用的液体制剂剂型可以是选自以下的水性混悬剂，包括但不限于药学上可接受的水性口服分散剂、乳剂、溶液剂、酏剂、凝胶剂和糖浆剂。
水性混悬剂和分散剂可以保持如The USP Pharmacists'Pharmacopeia(2005年版，第905章)所定义的均质状态至少4小时。均质性应通过与关于确定整个组合物的均质性一致的取样方法来确定。在一个实施方案中，水性混悬剂可以通过持续小于1分钟的物理搅拌重悬为均质混悬剂。在另一个实施方案中，水性混悬剂可以通过持续小于45秒的物理搅拌重悬为均质混悬剂。在又一个实施方案中，水性混悬剂可以通过持续小于30秒的物理搅拌重悬为均质混悬剂。在又一个实施方案中，无需搅拌即可维持均质水性分散剂。
除上文列出的添加剂之外，液体制剂也可包括本领域通常使用的惰性稀释剂，诸如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂。示例性乳化剂为乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、月桂基硫酸钠、多库酯钠、胆固醇、胆固醇酯、牛磺胆酸、磷脂酰胆碱、油诸如棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇、脱水山梨糖醇的脂肪酸酯或这些物质的混合物等等。
可注射制剂
适用于肌内、皮下或静脉内注射的制剂可以包括生理学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散剂、混悬剂或乳剂以及用于复原为无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌粉剂。合适的水性和非水性载剂、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油、克列莫佛(cremophor)等等)、它们的合适混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯诸如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣诸如卵磷脂，就分散体而言通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。适用于皮下注射的制剂也可以含有添加剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。微生物生长的防止可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂，诸如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等等来确保。包括等渗剂，诸如糖、氯化钠等等也可以是所期望的。可注射药物形式的延长吸收可以通过使用延迟吸收药剂，诸如单硬脂酸铝和明胶来实现。
对于静脉内注射，化合物可以在水溶液中，优选地在生理相容性缓冲液诸如汉克斯溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中配制。对于经粘膜施用，在制剂中使用适于待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂通常在本领域中是已知的。对于其他肠胃外注射，适当的制剂可以包括水性或非水性溶液，优选地生理相容性缓冲液或赋形剂。此类赋形剂通常在本领域中是已知的。
肠胃外注射可以涉及弹丸注射或连续输注。注射用制剂可以以单位剂型，例如添加有防腐剂的安瓿瓶或多剂量容器提供。药物组合物可以是适用于肠胃外注射的形式，作为溶于油性或水性媒介物的无菌混悬剂、溶液剂或乳剂，并且可以含有配制剂诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。用于肠胃外施用的药物制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的混悬剂可以制备成适当的油性注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油诸如芝麻油，或合成脂肪酸酯诸如油酸乙酯或三甘油酯，或脂质体。水性注射混悬剂可以包含增加混悬剂的粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，混悬剂还可以包含合适的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高浓度溶液的试剂。或者，活性成分可以是在使用前用合适的媒介物(例如灭菌无热原水)复原的粉末形式。
药物组合物可以是适用于精确剂量的单次施用的单位剂型。在单位剂型中，制剂被分成含有适当量的一种或多种化合物的单位剂量。单位剂量可以是含有不连续量制剂的包装的形式。非限制性实例为包装片剂或胶囊剂以及小瓶或安瓿瓶中的粉剂。水性混悬剂组合物可以包装在单剂量不可重复开启式容器中。或者，可以使用多剂量可重复开启式容器，在这种情况下通常在组合物中包括防腐剂。仅作为例子，用于肠胃外注射的制剂可以以单位剂型提供，其包括但不限于添加有防腐剂的安瓿瓶或多剂量容器。
鉴定CIS抑制剂的方法
还提供了鉴定CIS抑制剂的方法，即“筛选”方法。在一些实施方案中，筛选方法包括至少以下步骤：(i)在存在测试剂的情况下使CIS或其片段与至少一种CIS结合配偶体接触；并且(ii)确定所述测试剂是否与所述CIS蛋白结合配偶体竞争CIS或其片段的结合。在一些实施方案中，该测定所用的CIS结合配偶体选自JAK1、IL-2Rβ、延伸蛋白B、延伸蛋白C或滞蛋白5或其片段。
在一些实施方案中，该方法使用基本上纯的蛋白质组分体外进行。在其他实施方案中，这种方法可以对在细胞中天然或异源表达的蛋白质组分进行。在一些实施方案中，一种或多种蛋白质组分也可以包括标签以便于检测测定中标记的蛋白质，例如小表位标签、融合荧光蛋白、荧光团或有助于标记的蛋白质的直接或间接检测(例如，通过使用抗体)的任何其他标签。在其他实施方案中，待测定的蛋白质不需要标记。
鉴定抑制CIS与结合配偶体和靶蛋白的相互作用的CIS抑制剂的方法包括但不限于ELISA型测定、荧光共振能量转移(FRET)和时间分辨(TR)FRET测定和基于AlphaScreenTM珠粒的相互作用、化学交联然后是High-Mass MALDI质谱(参见例如Arkin等人(2012),Inhibition of Protein-Protein Interactions:Non-Cellular Assay Formats；Sittampalam等人编；Assay Guidance Manual[Internet].Bethesda(MD):Eli Lilly&Company and the National Center for Advancing Translational Sciences)。高通量测定形式在大测试剂文库中筛选合适的测试剂是特别有用的。
或者，筛选蛋白质-蛋白质相互作用的抑制剂可以在细胞中进行，例如在使用酵母、细菌或哺乳动物测定系统的蛋白质互补测定和“双杂交”、“三杂交”测定中。此类测定及其在发现蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂中的应用在本领域中，例如在Male等人(2013)中有所描述。
在其他实施方案中，筛选方法包括以下步骤：(i)使CIS或其片段与测试剂接触；并且(ii)确定所述测试剂是否结合至CIS或其片段。在一些实施方案中，该方法还包括确定所述测试剂是否与CIS PEST结构域肽或CIS N-末端肽竞争CIS或其片段的结合。虽然不希望受理论的束缚，但据信此类肽对应于CIS中的自体抑制结构域。因此，可以期望可以与此类自体抑制肽竞争CIS的结合的测试剂还抑制CIS活性，例如如本文所述使JAK激酶活性增加。在一些实施方案中，上述测定所用的CIS PEST结构域肽的序列选自SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:37。在其他实施方案中，该测定所用的N-末端结构域肽的序列选自SEQ ID NO:31和34。许多用于检测分析物与靶蛋白的结合的测定是本领域已知的，其包括但不限于光学生物传感器测定(例如，基于表面等离子共振、光学梯度或干涉测量法)、质谱、等温量热法、差示扫描量热法和差示扫描荧光测量法、NMR、X射线晶体学。用于鉴定蛋白质结合化合物的基于高通量亲和力的测定如例如Zhu等人(2009)所综述。还设想了小分子微阵列的使用，如例如Casalena等人(2012)所述。光学或荧光检测，诸如例如使用质谱、MALDI-TOF、生物传感器技术、渐逝光纤光学或荧光共振能量转移的荧光活化细胞分选(FACS)明显涵盖在本发明的范围内。
还设想了基于监测测试剂对体外评估的CIS活性的作用的筛选方法。在一些实施方案中，筛选是评估测试剂对CIS增加靶蛋白(例如，JAK1)的泛素化的能力的作用的体外生物化学测定，其中该测定包括以下步骤：
(i)在存在以下物质的情况下，体外温育磷酸化JAK1蛋白(例如，Tyr1034磷酸化JAK1)或其CIS结合片段：
(a)三聚体复合物，其包含CIS或其片段，所述CIS或其片段包含至少SH2结构域和SOCS框；延伸蛋白B和延伸蛋白C；
(b)泛素化混合物；以及
(c)测试剂；并且
(ii)相对于在不存在所述测试剂的情况下CIS诱导的泛素化的水平，确定所述测试剂是否抑制CIS诱导的所述磷酸化JAK1蛋白或其CIS结合片段泛素化。降低JAK1或片段的CIS依赖性泛素化的测试剂被视为候选CIS抑制剂。
在一个示例性实施方案中，在存在2.5mM Mg/ATP的情况下，将CIS E3连接酶复合物(三聚体CIS-延伸蛋白B-延伸蛋白C以及滞蛋白5和Rbx2；2.5μM)与泛素(50μM)、人E1(100nM)、纯化的重组E2(UbcH5c,2.5μM)和Flag标记的全长JAK1一起在37℃下温育不同的时间。FLAG标记的磷酸化JAK1通过以下步骤产生：在293T细胞中表达，并使用抗FLAG免疫沉淀和游离的FLAG肽洗脱来回收。JAK1泛素化通过与抗磷酸化JAK1一起进行蛋白质印迹，然后在4-20％Tris/甘氨酸凝胶上分离来可视化。E3连接酶活性调节剂的高通量形式筛选已在本领域中，例如Rossi等人(2014)中有所描述，并且此类筛选平台也可商购获得，例如得自ProGenra,Inc.(Malvern,PA,USA)的UbiProTM药物发现平台。
在其他实施方案中，用于鉴定CIS抑制剂的筛选方法是评估测试剂对CIS抑制JAK1激酶活性的能力的作用的体外生物化学测定，其中该测定包括以下步骤：
i)在存在以下物质的情况下体外温育包含JH1激酶结构域的JAK1蛋白或其片段：
(a)三聚体复合物，其包含CIS或其片段，所述CIS或其片段包含至少SH2结构域和SOCS框；延伸蛋白B和延伸蛋白C；
(b)JAK1激酶底物；以及
(c)测试剂；并且
ii)相对于在不存在所述测试剂的情况下所述JAK1激酶底物的磷酸化，确定所述测试剂是否增加所述JAK1激酶底物的磷酸化。减少JAK1激酶活性的CIS依赖性抑制，即相对于在不存在所述测试剂的情况下的JAK1激酶活性，增加JAK1激酶活性的测试剂被视为候选CIS抑制剂。
在一些实施方案中，待测试的JAK1激酶底物是STAT5或STAT5肽。在一些实施方案中，待使用的STAT5肽底物的氨基酸序列为：SEQ ID NO:18RRAKAADGYVKPQIKQVV。
蛋白激酶测定，包括高通量激酶测定是本领域已知的，如例如Babon等人(2013)和Von Ahsen等人(2005)所述。在一个示例性实施方案中，将130μM STAT5b肽(SEQ ID NO:18RRAKAADGYVKPQIKQVV)与5nM人JAK1(对应的氨基酸序列参见SEQ ID NO:11)一起在20mMTris pH8.0、100mM NaCl、5mM 2-巯基乙醇、0.2mg ml-1牛血清白蛋白、2mM MgCl2、100μMATP和1μCiγ-[32P]ATP中在25℃下温育30–60min。重组三聚复合物CIS-SH2-延伸蛋白B-延伸蛋白C(对应的氨基酸序列参见SEQ ID NO:7、14和15)以在0-30μM范围内的浓度提供。在温育之后，将反应点在P81磷酸纤维素纸上并在5％H3PO4中淬火。然后用5％H3PO4洗涤纸(4×200ml,15min)并暴露于磷成像板。使用磷相仪软件进行定量，然后根据积分像素数计算IC50曲线。
在其他实施方案中，CIS抑制剂的鉴定在包括以下步骤的方法中通过计算机模拟进行：(i)生成CIS或其片段的三维结构模型；并且(ii)计算机模拟设计或筛选结合至建模结构的测试剂。在一些实施方案中，三维结构模型是JAK1多肽或其片段结合至CIS或其片段的复合物或IL-2Rβ胞质结构域多肽或其CIS结合片段结合至CIS或其片段的复合物。
CIS抑制剂可以通过本领域的技术人员已知的任何方法通过计算机模拟筛选CIS的结合鉴定。计算机模拟筛选结合至蛋白质的配体的方法包括但不限于例如Good,(2001)、Zhang等人(2015)、Cerqueira等人(2015)、Kuenemann等人(2015)和Westermaier等人(2015)中提供的那些。
对于结合CIS蛋白的分子，通常将需要合适的立体化学互补性水平。一般来讲，具有立体化学互补性的分子的设计可以通过化学上和/或几何上优化分子和靶受体之间的“拟合”的技术来实现。根据本发明，存在至少两种设计与CIS蛋白或其片段的立体化学互补的分子的方法。
第一种方法是将三维结构数据库的计算机模拟分子(“虚拟测试剂”)直接对接受体位点，使用大部分但非排他性几何标准评估特定分子与位点的适配性。在该方法中，内部自由度数(以及分子构象空间中对应的局部最小值)大幅减少仅两个刚体的几何(硬球)相互作用，其中一个体(活性位点)含有形成第二体(互补分子，作为配体)的结合位点的“口袋“或”凹槽”。
该方法由Ewing等人(2001)展示，其配体设计算法在Regents of the Universityof California发布的商业化软件包DOCK 4.0版中实施，并且在发布者提供的标题为“DOCK程序套件概述”的文档中进一步描述。最近，Autodock 4已有所描述。根据Kuntz算法，所关注区域的形状被定义为一系列不同半径的相交球。然后在一个或多个现有的晶体学数据的数据库，诸如Cambridge University(University Chemical Laboratory,LensfieldRoad,Cambridge CB2 1EW,U.K.)维护的Cambridge Structural Database System、Research Collaboratory for Structural Bioinformatics(Rutgers University,N.J.,U.S.A.)维护的Protein Data Bank、LeadQuest(Tripos Associates,Inc.,St.Louis,MO)、Available Chemicals Directory(Molecular Design Ltd.,San Leandro,CA)和NCI数据库(National Cancer Institute,U.S.A)中搜索近似于所定义形状的分子。
然后可以根据几何参数修改这样鉴定的分子，以满足化学互补性，诸如氢键、离子相互作用和范德华(Van der Waals)相互作用相关的标准。可以利用不同的评分函数来对数据库排序和选择最佳分子(参见例如Bohm等人,1999)。Tripos Associates,Inc.(St.Louis,MO)销售的软件包FlexX是另一个可用于该直接对接方法的程序。
第二种优选方法需要评估相应的化学基团(“探针”)与位点内部和周围的样品位置处的活性位点的相互作用，得到可在选定的能量水平生成三维等值面的一系列能量值。配体设计的化学探针方法在许多商业化软件包，诸如GRID(Molecular Discovery Ltd.,West Way House,Elms Parade,Oxford OX2 9LL,U.K.的产品)中实施。根据该方法，在开始时，通过使用不同的化学探针，例如水、甲基基团、胺氮、羧基氧和羟基探测活性位点来鉴定位点互补分子的化学先决条件。从而确定活性位点和每个探针之间相互作用的有利位点，并且从所得的这些位点的三维图案可以生成推定的互补分子。这可以通过可以搜索三维数据库以鉴定包括所需药效团图案的分子的程序，或通过使用有利位点和探针作为输入执行从头设计的程序来进行。
适用于搜索三维数据库以鉴定具有所需药效团的分子的程序包括：MACCS 3D和ISIS/3D(Molecular Design Ltd.,San Leandro,CA)、ChemDBS 3D(Chemical DesignLtd.,Oxford,U.K.)和Sybyl/3DB Unity(Tripos Associates,Inc.,St.Louis,MO)。
化学结构数据库可以从许多来源获得，包括Cambridge Crystallographic DataCentre(Cambridge,U.K.)、Molecular Design,Ltd.(San Leandro,CA)、TriposAssociates,Inc.(St.Louis,MO)和Chemical Abstracts Service(Columbus,OH)。
从头设计程序包括Ludi(Biosym Technologies Inc.,San Diego,CA)、Leapfrog(Tripos Associates,Inc.)、Aladdin(Daylight Chemical Information Systems,Irvine,CA)和LigBuilder(Peking University,China)。
可以使用当前的计算机建模软件(使用计算机辅助药物设计或CADD)将模拟物(诸如肽模拟物和有机模拟物)设计为拟合例如肽结合位点(Walters，1993，载于"Computer-Assisted Modeling of Drugs"，载于Klegerman&Groves(编)，PharmaceuticalBiotechnology，1993，Interpharm Press:Buffalo Grove,Ill.，第165-174页；和Munson，1995，Principles of Pharmacology，Chapman&Hall，第12章)。使用此类技术制备的模拟物也包括在本公开的范围内。在一个实例中，模拟物模拟已知与CIS SH2结构域相互作用的JAK1活化环的磷酸肽。
可以使用可从多个肽结构衍生出虚拟肽模型的软件生成模拟物。这可以使用来源于SLATE算法的软件进行(Perkin等人，1995；Mills等人，2001；De Esch等人，2001)。
其他设计肽类似物、衍生物和模拟物的方法也是本领域熟知的，参见例如Floris等人(2011)。
被发现结合至CIS的分子可以合成或从合适的来源，诸如商业供应商大量获得。然后可以将所获得的测试剂用于任何上述测定，以验证其结合至CIS和/或抑制CIS结合配偶体或靶蛋白与CIS或CIS片段结合的能力。
对于所有药物筛选测定，进一步精炼药物的结构通常将是必要的，并且可以通过特定药物筛选测定提供的任何和/或所有步骤的连续重复来进行。
在其他实施方案中，鉴定CIS抑制剂的方法是表型测定法，其包括以下步骤：(i)提供表达CIS的细胞；并且(ii)与未接触所述测试剂的细胞相比，确定所述测试剂是否降低所述细胞中的CIS活性。在一些实施方案中，筛选方法所用的细胞类型是NK细胞。在一些实施方案中，在使用NK细胞的情况下，确定测试剂是否减少细胞中的CIS活性包括确定测试剂对NK细胞中的IL-15可诱导应答的作用。合适的IL-15可诱导应答包括但不限于NK细胞增殖、干扰素-γ(IFN-γ)产生、细胞内粒酶表达、JAK1酪氨酸磷酸化、JAK1降解、基因表达的调节或细胞毒性中的一者或多者。任何这些端点均可通过本领域已知的许多标准方法中的任一种来评估。例如，细胞增殖测定如Riss等人(2013),Assay Guidance Manual[Internet].Bethesda(MD):Eli Lilly&Company and the National Center for AdvancingTranslational Sciences所述；细胞因子定量测定如Whiteside(2002)所述；JAK1激酶活性测定如例如Babon等人(2013)所述；泛素介导的JAK1降解测定如例如Lee等人(2008)所述；基因表达测定，例如RNAseq如例如Hoek等人(2015)所述；并且NK细胞介导的细胞毒性测定如例如Giamann等人(2006)和Jang等人(2012)所述。在一些实施方案中，在相互作用或结合筛选方法中的一者中用于基于细胞的测定的测试剂最初鉴定为候选CIS抑制剂。在一些实施方案中，在细胞中测定的CIS活性是JAK1激酶活性的抑制(例如，STAT5底物的磷酸化减少)、STAT5酪氨酸磷酸化的抑制、STAT5启动子活性的下调或NK细胞中JAK1的降解增加。
用于筛选方法的合适测试剂包括肽、肽模拟物、小分子、多核苷酸或多肽，但本领域的技术人员将会理解，在测试剂涉及通过靶向Cish基因或Cish mRNA来减少CIS活性的情况下，此类试剂将在细胞测定中评估。
在一些实施方案中，用于鉴定CIS抑制剂的任何方法中使用的合适的CIS或CIS片段包含与SEQ ID NO:6-10的至少一者具有至少70％同一性，例如与SEQ ID NO:6-10的至少一者具有至少75％、80％、85％、88％、90％、92％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
(SEQ ID NO:6；人CIS蛋白同种型1；UniprotKB Q9NSE2)
MVLCVQGPRPLLAVERTGQRPLWAPSLELPKPVMQPLPAGAFLEEVAEGTPAQTESEPKVLDPEEDLLCIAKTFSYLRESGWYWGSITASEARQHLQKMPEGTFLVRDSTHPSYLFTLSVKTTRGPTNVRIEYADSSFRLDSNCLSRPRILAFPDVVSLVQHYVASCTADTRSDSPDPAPTPALPMPKEDAPSDPALPAPPPATAVHLKLVQPFVRRSSARSLQHLCRLVINRLVADVDCLPLPRRMADYLRQYPFQL
(SEQ ID NO:7；人CIS蛋白同种型1片段：残基66-258，其中残基174-202缺失，即缺乏内部PEST序列；用于与延伸蛋白B和C生成三聚复合物)
DLLCIAKTFSYLRESGWYWGSITASEARQHLQKMPEGTFLVRDSTHPSYLFTLSVKTTRGPTNVRIEYADSSFRLDSNCLSRPRILAFPDVVSLVQHYVASCTADTRSATAVHLKLVQPFVRRSSARSLQHLCRLVINRLVADVDCLPLPRRMADYLRQYPFQL
(SEQ ID NO:8；人CIS蛋白同种型1SOCS框(来自GenBank登录号：NP_034025.1)
SSARSLQHLCRLVINRLVADVDCLPLPRRMADYLRQYPFQL
(SEQ ID NO:9；小鼠CIS蛋白同种型1；GenBank登录号：NP_034025.1)
MVLCVQGSCPLLAVEQIGRRPLWAQSLELPGPAMQPLPTGAFPEEVTEETPVQAENEPKVLDPEGDLLCIAKTFSYLRESGWYWGSITASEARQHLQKMPEGTFLVRDSTHPSYLFTLSVKTTRGPTNVRIEYADSSFRLDSNCLSRPRILAFPDVVSLVQHYVASCAADTRSDSPDPAPTPALPMSKQDAPSDSVLPIPVATAVHLKLVQPFVRRSSARSLQHLCRLVINRLVADVDCLPLPRRMADYLRQYPFQL
(SEQ ID NO:10；褐鼠CIS蛋白；GenBank登录号：AAI61930.1)
MVLCVQGSCPLLVVEQIGQRPLWAQSLELPGPAMQPLPTGAFPEEVTEETPVQSENEPKVLDPEGDLLCIAKTFSYLRESGWYWGSITASEARQHLQKMPEGTFLVRDSTHPSYLFTLSVKTTRGPTNVRIEYADSSFRLDSNCLSRPRILAFPDVVSLVQHYVASCTADTRSDSPDPAPTPALPVPKPDAPGDPVLPIPVATAVHLKLVQPFVRRSSARSLQHLCRLVINRLVTDVDCLPLPRRMADYLRQYPFQL
在一些实施方案中，CIS或其片段的氨基酸序列包含SEQ ID NO:6-10中的一者的氨基酸序列。在其他实施方案中，CIS或其片段的氨基酸序列由SEQ ID NO:6-10中的一者的氨基酸序列中的一者构成。
在一些实施方案中，其中CIS结合配偶体或靶蛋白选自JAK1、JAK3、IL-2Rβ、延伸蛋白B、延伸蛋白C和滞蛋白5或其片段。
JAK1或其CIS结合片段可以包含与SEQ ID NO:11-16中的至少一者具有至少70％同一性，例如与SEQ ID NO:11-16中的至少一者具有至少75％、80％、85％、88％、90％、92％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
(SEQ ID NO:11；智人JAK1蛋白；UniProtKB–P23458；活化环以粗体表示；Tyr1034加下划线)
(SEQ ID NO:12；智人JAK3蛋白；UniProtKB-P52333；Tyr980以粗体加下划线表示)
(SEQ ID NO:13；智人IL-2受体亚基β前体；UniProtKB–P14784；信号肽氨基酸1-26加下划线；Tyr355、Tyr361和Tyr392各自的成熟序列编号以粗体加下划线表示)
(SEQ ID NO:14；智人延伸蛋白B；UniProtKB–Q15370)
MDVFLMIRRHKTTIFTDAKESSTVFELKRIVEGILKRPPDEQRLYKDDQLLDDGKTLGECGFTSQTARPQAPATVGLAFRADDTFEALCIEPFSSPPELPDVMKPQDSGSSANEQAVQ
(SEQ ID NO:15；智人延伸蛋白C；UniProtKB–Q15369)
MDGEEKTYGGCEGPDAMYVKLISSDGHEFIVKREHALTSGTIKAMLSGPGQFAENETNEVNFREIPSHVLSKVCMYFTYKVRYTNSSTEIPEFPIAPEIALELLMAANFLDC
(SEQ ID NO:16；智人滞蛋白-5；UniProtKB–Q93034)
MATSNLLKNKGSLQFEDKWDFMRPIVLKLLRQESVTKQQWFDLFSDVHAVCLWDDKGPAKIHQALKEDILEFIKQAQARVLSHQDDTALLKAYIVEWRKFFTQCDILPKPFCQLEITLMGKQGSNKKSNVEDSIVRKLMLDTWNESIFSNIKNRLQDSAMKLVHAERLGEAFDSQLVIGVRESYVNLCSNPEDKLQIYRDNFEKAYLDSTERFYRTQAPSYLQQNGVQNYMKYADAKLKEEEKRALRYLETRRECNSVEALMECCVNALVTSFKETILAECQGMIKRNETEKLHLMFSLMDKVPNGIEPMLKDLEEHIISAGLADMVAAAETITTDSEKYVEQLLTLFNRFSKLVKEAFQDDPRFLTARDKAYKAVVNDATIFKLELPLKQKGVGLKTQPESKCPELLANYCDMLLRKTPLSKKLTSEEIEAKLKEVLLVLKYVQNKDVFMRYHKAHLTRRLILDISADSEIEENMVEWLREVGMPADYVNKLARMFQDIKVSEDLNQAFKEMHKNNKLALPADSVNIKILNAGAWSRSSEKVFVSLPTELEDLIPEVEEFYKKNHSGRKLHWHHLMSNGIITFKNEVGQYDLEVTTFQLAVLFAWNQRPREKISFENLKLATELPDAELRRTLWSLVAFPKLKRQVLLYEPQVNSPKDFTEGTLFSVNQEFSLIKNAKVQKRGKINLIGRLQLTTERMREEENEGIVQLRILRTQEAIIQIMKMRKKISNAQLQTELVEILKNMFLPQKKMIKEQIEWLIEHKYIRRDESDINTFIYMA
(SEQ ID NO:17；智人JAK1蛋白JH1激酶结构域；残基854-1154)
DIVSEKKPATEVDPTHFEKRFLKRIRDLGEGHFGKVELCRYDPEGDNTGEQVAV)KSLKPESGGNHIADLKKEIEILRNLYHENIVKYKGICTEDGGNGIKLIMEFLPSGSLKEYLPKNKNKINLKQQLKYAVQICKGMDYLGSRQYVHRDLAARNVLVESEHQVKIGDFGLTKAIETDKEYYTVKDDRDSPVFWYAPECLMQSKFYIASDVWSFGVTLHELLTYCDSDSSPMALFLKMIGPTHGQMTVTRLVNTLKEGKRLPCPPNCPDEVYQLMRKCWEFQPSNRTSFQNLIEGFEALLK
多肽或多肽种类可以通过其氨基酸序列与参考氨基酸序列的同一性程度(％同一性)或通过与一种参考氨基酸序列的％同一性大于另一种来定义。通常通过GAP分析来确定多肽与参考氨基酸序列的％同一性(Needleman和Wunsch(1970)；GCG程序)，其中参数为空位产生罚分＝5，空位延伸罚分＝0.3。查询序列的长度为至少15个氨基酸，GAP分析在至少15个氨基酸的区域上比对两个序列。更优选地，查询序列的长度为至少50个氨基酸，GAP分析在至少50个氨基酸的区域上比对两个序列。更优选地，查询序列的长度为至少100个氨基酸，GAP分析在至少100个氨基酸的区域上比对两个序列。甚至更优选地，查询序列的长度为至少250个氨基酸，GAP分析在至少250个氨基酸的区域上比对两个序列。甚至更优选地，GAP分析在整个长度上比对两个序列。
技术人员在确定蛋白质或肽的特定氨基酸序列变体是否适用于本发明时，许多考虑因素是有用的。这些考虑因素包括但不限于：(1)蛋白质或肽和已知蛋白质结合配偶体或结合配偶体基序之间的相互作用的已知结构-功能关系；(2)如序列比对算法所揭示，所关注的蛋白质的天然存在的同系物(例如，旁系同源物和直系同源物)之间存在氨基酸序列保守性。值得注意的是，许多生物信息学算法是本领域已知的，可成功预测功能作用，即蛋白质的氨基酸序列中的特定氨基置换对其功能的“耐受性”。这种算法包括例如Shihab等人(2013)描述的“通过隐马尔可夫模型的功能分析”(FATHMM)算法；和Ng等人(2003)描述的“从容许分选不容许”算法；以及Sim等人(2012)最近所述。
SIFT计算器可在网站上在线获取：sift.bii.a-star.edu.sg/。FATHMM计算器可在网站上在线获取：fathmm.biocompute.org.uk。对于所关注的任何氨基酸序列(例如，对应于本文提供的SEQ ID NO中的任一个的序列)，可以生成这样的“氨基酸置换矩阵”：其提供任何给定氨基酸置换对对应蛋白质的功能的预测中性或有害性，例如与相互作用配偶体结合的能力。
可以通过许多已知的方法生成蛋白质的非天然存在的序列变体。这些方法包括但不限于U.S.6,521,453所述的“基因改组”；Kopsidas等人(2007)所述的“RNA诱变”；和“易错PCR方法”。易错PCR方法可分为(a)通过使核苷酸浓度失衡和/或添加化合物诸如氯化锰来减少聚合酶的保真度的方法，(b)利用核苷酸类似物的方法(参见例如U.S.6,153,745)，和(c)利用“诱变”聚合酶的方法。
测定中所用的蛋白质的氨基酸序列变体的保留确认、功能丧失或获取可以根据所评估的蛋白质功能在多种类型的测定，例如结合测定、激酶测定或泛素化测定中确定。
实施例
实施例1材料和方法
小鼠
Cish-/-由美国孟菲斯圣裘德儿童研究医院(St.Jude Children’s ResearchHospital,Memphis USA)的James Ihle教授和Evan Parganas博士慷慨提供并维持在C57BL/6背景下。Cish+/+是指C57BL/6野生型对照小鼠。Rosa26-CreERT2(TaconicArtemis)、Socs3-loxP(Croker等人，2003)、Ifng-/-Socs1-/-(Alexander等人，1999)和Ncr1-iCre(Narni-Mancinelli等人，2011)小鼠上文已有所描述。使用在6-14周龄之间的雄性和雌性小鼠。所有小鼠均在沃尔特和伊丽莎·霍尔研究所(Walter and ElizaHall Institute)繁育和维持。动物实验遵循美国国家卫生和医学研究委员会(NHMRC)用于科学目的的动物护理和使用行为准则(National Health and Medical Research CouncilCode of Practice for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes)指导原则，并由沃尔特和伊丽莎·霍尔研究所动物伦理委员会(Walter and Eliza HallInstitute Animal Ethics Committee)或QIMR贝格霍菲尔医学研究所动物伦理委员会(QIMR Berghofer Medical Research Institute Animal Ethics Committee)批准。
NK细胞的纯化和培养
从多个器官(脾、骨髓、血液)收集鼠科动物自然杀伤细胞，并通过将器官强制通过70μm筛来制备单细胞混悬剂。通过悬浮于等渗percoll(Amersham Pharmacia Biotech)中并以1800×g离心从肝分离淋巴细胞。使用抗CD49b(DX5)微珠(Miltenyi Biotec)根据制造商的说明书纯化NK细胞。通过在补充有10％(v/v)胎牛血清(FCS)、L-谷氨酰胺(1mM；Gibco)、链霉素(100μg/mL；Sigma)、青霉素(100IU/mL；Sigma)、庆大霉素(50ng ml-1；Sigma)和重组hIL-15(50ng ml-1；Peprotech)的达尔伯克改良伊格尔氏培养基(IMDM)中培养来扩增NK细胞5-10天。
RNA测序和生物信息学分析
在Australia Genomic Research Facility,Melbourne使用Illumina HiSeq2000对在50ng ml-1IL-15中生长7天的1×106个Cish+/+和Cish-/-NK1.1+NKp46+TCRb-NK细胞的两个生物学重复和1×106个新鲜分离的Cish+/+和Cish-/-NK1.1+NKp46+TCRβ-NK细胞的两个生物学重复进行100个碱基对单端RNA测序。使用Subread比对器将读数与小鼠基因组的GRCm38/mm10build对齐。使用FeatureCounts获得Genewise计数。包括NCBI RefSeq数据库注解build 38.1中覆盖外显子的读数。如果它们不能在至少两个文库实现至少0.5的CPM(每百万个映射读数的计数)值，则从下游分析过滤基因。将计数转换为每百万log2计数，使用limma软件包的voom函数进行分位数标准化和精度加权。使用线性模型和经验贝叶斯方法评估RNAseq实验中的差异表达。如果它们在所比较的两种细胞类型中的一种或两种中实现0.1或更小的错误发现率，并且还具有至少8个FPKM(每千碱基每百万个映射读数的片段)，则基因称为差异表达。使用gplots软件包生成热图，并且负的log2FPKM值被重置为零。使用Bioconductor R软件包进行所有分析。
体外NK细胞增殖测定
将靶细胞(CHO,B16F10)接种至96X E-板的孔的100μl培养基中。使用基于阻抗的系统动态监测细胞生长，直到它们达到对数生长期并形成单层(大约24h)。然后将不同浓度的培养的Cish+/+和Cish-/-NK细胞直接加入含有靶细胞的单个孔中。对于背景对照，将NK细胞添加到不含有靶细胞的孔，并且将靶细胞添加到没有添加NK细胞的孔。在添加NK细胞之后，系统继续每15min进行测定直到48h。
流式细胞术和细胞分选
在含有2％(v/v)FCS的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中使用适当的单克隆抗体对单细胞悬浮液染色。如果必要，通过使用FoxP3/转录因子染色缓冲液套件(eBioscience)根据制造商的指示进行细胞内染色。将FACS Verse、Fortessa和AriaII(BD Biosciences)用于细胞分选和分析，通过碘化丙啶或Fluoro-Gold染色排除死细胞。在PBS中稀释所有单细胞悬浮液，然后使用Advia血液学分析仪(Siemens)进行分析和计数。除非另有说明，否则对NK1.1(PK136；1:100)、CD19(1D3；1:500)、CD3(17A2；Biolegend；1:400)、CD122(TM-b1；1:200)、CD132(4G3；1:200)、NKp46(29A1.4；1:100)、TCR-β(H57-5921；1:500)、KLRG1(2F1；1:100)、CD27(LG.7F9；1:200)、FoxP3(FJK-16s；eBioscience；1:400)、CD25(PC61；Biolegend；1:100)、Sca-1(D7；1:100)、B220(RA3-6B2；eBioscience；1:100)、Gr-1(1A8；1:200)、粒酶A(GzA-3G8.5；eBioscience；1:200)、粒酶B(NGZB；eBioscience；1:200)、CD107a(104B；1:100)和IFN-γ(XMG1.2；1:100)有特异性抗体来自BD Pharmingen。
实时定量PCR(Q-PCR)
使用RNeasy plus试剂盒(QIAGEN)分离总RNA，并使用Superscript III(Invitrogen)根据制造商的指示进行cDNA合成。在10μL(5μL FastStart SYBRGreenMaster Mix(Roche)、0.5pmol正向和反向引物和4μL cDNA)中进行PCR反应。引物序列和PCR条件已有所描述(Kolesnik和Nicholson，2013)。在ABI Prism 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)上进行实时Q-PCR。针对标准曲线定量mRNA水平，所述标准曲线使用对应于每个扩增PCR片段的寡核苷酸的连续稀释和使用SDS2.2软件(Applied Biosystems)生成。通过将每个所关注的基因的量归一化为管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)来确定相对表达。每种情况有三个生物学重复且测定一式两份进行。使用95％置信水平的非配对t检验进行统计学分析。
蛋白质印迹和瞬时转染
每个样品收集大约1.5×108个NK细胞，在补充有蛋白酶抑制剂(CompleteCocktail tablets，Roche)、1mM PMSF、1mM Na3VO4和1mM NaF的2.5mLKALB裂解缓冲液(Nicholson等人，1995)中裂解，并在冰上冰育1h。通过在4℃下以16,060×g离心15min来澄清裂解物。通过BCA方法(Pierce,Rockford)测定蛋白质浓度。在补充有100U/mL青霉素、0.1ng ml-1链霉素和10％FCS的DMEM中维持293T细胞，并且使用FuGene6(Promega)根据制造商的指示用单独的载体或表达Flag标记的小鼠Jak1、Jak3、Cish或Cish突变体或Myc标记的小鼠Cish的cDNA瞬时转染。在一些例子中，用10μM MG132预处理细胞4h，以阻断蛋白酶体降解。转染后48h，在KALB缓冲液(Nicholson等人，1995)中裂解细胞。使用M2-珠粒(Sigma)免疫沉淀FLAG蛋白质，并在SDS样品缓冲液中洗脱蛋白质。免疫沉淀、凝胶电泳和蛋白质印迹基本上如所述进行(Linossi等人，2013)。使用以下一抗：CIS(Clone D4D9)、磷酸化STAT3(Y705)的抗体；磷酸化AKT1(Ser473)、AKT和MAPK得自Cell Signalling Technology。磷酸化STAT5A/B(Y694/699)的抗体得自Millipore，磷酸化JAK1(Y1022/1023)和STAT5A得自Invitrogen，并且JAK1、STAT3和β-肌动蛋白得自Santa Cruz Biotechnology Inc.。大鼠抗Flag抗体是D.Huang教授和L.O’Reilly博士(Walter and Eliza Hall Institute)的慷慨赠送。
CYT-387激酶亲和试剂的合成以及与NHS琼脂糖凝胶的共价偶联
使用类似于CYT-387合成所述的程序制备氨基官能化CYT-387衍生物(参见图6)。如上文所述，将修饰的CYT-387化合物固定化至NHS活化琼脂糖凝胶4Fast Flow珠粒(GEHealthcare)上(Schirle等人，2012)。简言之，用5mL DMSO洗涤1mL NHS-琼脂糖凝胶珠浆液两次，以80×g离心3min以沉淀洗涤之间的基质。用DMSO重悬一个填充基质体积(500μL)以制备50％浆液。将CYT-387(2μM最终体积)加入1mL NHS-珠粒浆液，然后是20μL三乙胺并倒置混合。将反应浆液在室温下避光直立圆筒反应器上温育过夜。第二天，将25μL乙醇胺加入反应，并且再次置于室温下避光直立圆筒反应器上温育过夜。用5mL DMSO洗涤CYT-387偶联的NHS-琼脂糖凝胶珠两次，并将基质重悬于乙醇中，避光储存于4℃下。
从细胞裂解物富集激酶
用KALB裂解缓冲液洗涤CYT-387结合的树脂两次，然后进行激酶富集。使用160μL50％Cyt387结合的树脂进行六次单独的激酶富集(Cish-/-或Cish+/+各自三次)，该树脂用2mL(～10mg)蛋白质裂解物温育。温育在4℃下避光转筒上进行3h。在温育之后，用KALB缓冲液洗涤蛋白质结合的Cyt387树脂3次，并通过3轮连续的60℃0.5％SDS/5mM DTT(200μL、100μL、100μL)温育3min洗脱。
胰蛋白酶消化
使用FASP蛋白质消化试剂盒(Protein Discovery,Knoxville,TN)如上所述(Wisniewski等人，2009)制备树脂捕获的蛋白质以及来源于每个生物学重复的等量全细胞裂解物(～400μg)的洗脱液以用于质谱分析，但进行以下修改。用三(2-羧乙基)膦(TCEP)(5mM最终浓度)还原蛋白质，用溶于50mM NH4HCO3的4μg测序级修饰的Trypsin Gold(Promega)消化并在37℃下温育过夜。然后用50mM NH4HCO3以两次40μL连续洗涤洗脱肽并在1％甲酸(最终浓度)中酸化。
质谱和数据分析
在nanoAcquity系统(Waters,Milford,MA,USA)上通过纳升级反相液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析酸化肽混合物，nanoAcquity系统偶联至配备有用于自动化MS/MS的纳电喷雾离子源(Thermo Fisher Scientific,Bremen,Germany)的Q-Exactive质谱仪。将肽混合物装载到具有180μm内径的20mm捕集柱(nanoAcquity UPLC 2G-V/MTrap 5mmSymmetry C18)的缓冲液A(0.1％甲酸、3％乙腈、Milli-Q水)中，并使用具有75μm内径的150mm柱(nanoAcquity UPLC 1.7μm BEH130 C18)在60min线性梯度组上以400nL/min的恒定流速通过反相色谱从3-55％缓冲液B(0.1％甲酸、80％乙腈、Milli-Q水)分离。Q-Exactive以数据依赖性模式运行，在一次全扫描和随后十个丰度最大的峰的MS/MS扫描之间自动切换。使用Exactive系列2.1版build 1502和Xcalibur 3.0控制该仪器。全扫描(m/z350–1,850)在200m/z下以70,000的分辨率获取。依次分离10个强度最大的离子，目标值为10000个离子，分离宽度为2m/z，并使利用归一化碰撞能量为19.5和阶梯碰撞能量为15％的HCD碎片化。对于全MS扫描，最大离子累积时间27被设定为50ms，对于MS/MS为200ms。底部填充比率被设定为5％，启用动态排除并设定为90秒。用MaxQuant(版本1.5.0.25)处理由高分辨率MS/MS谱图构成的原始文件，用于使用Andromeda搜索引擎36进行特征检测和蛋白质鉴定。在UniProtKB/Swiss-Prot小鼠数据库(LudwigNR)和单独的反向诱饵数据库搜索提取峰列表，以使用允许最多3次错误切割的严格胰蛋白酶特异性经验性地评估错误发现率(FDR)。所需的最小肽长度被设定为7个氨基酸。修饰：Cys的脲甲基化被设定为固定修饰，而蛋白质的N-乙酰化、Met的氧化、焦谷氨酸的添加(在N-末端Glu和Gln)、磷酸化(Ser、Thr和Tyr)、脱酰胺化(Asn、Gln和Arg)被设定为可变修饰。前体离子和碎片离子的质量容差分别为20ppm和0.5Da。MaxQuant中的“运行之间匹配”选项用于转移在以高质量准确度的匹配前体为基础的运行之间作出的鉴定(Cox等人，2014)。使用靶标-诱饵方法以1％的错误发现率(FDR)过滤PSM和蛋白质鉴定。蛋白质鉴定基于两个独特肽的最小值。
定量蛋白质组学管线
使用Pipeline Pilot(Biovia)和R开发的定制管线进行进一步分析，所述开发利用MaxQuant输出文件allPeptides.txt、peptides.txt和evidence.txt进行。特征被定义为肽序列、电荷和修饰的组合。每组中至少一半数量的重复中不存在的特征将被移除。从反向数据库的命中鉴定的蛋白质和仅具有一个独特肽的蛋白质也被移除。为了校正注射体积可变性，通过将特征强度转换为底数2的对数，然后将每个值乘以所有重复的最大中值强度与中值重复强度之比来归一化。分配至相同蛋白质的特征，由于其化学物理性质和电荷状态，在强度范围中存在差异。为了进一步校正这些差异，将每个强度值乘以蛋白质的所有特征的中值强度的最大值与该特征的中值强度之比。缺失值使用数值的随机正态分布填补，其中平均值设定为数值的实际分布的平均值减去1.8倍标准偏差，标准偏差为测定强度分布的标准偏差的0.5倍(Cox等人，2014)。使用Wilcoxon秩和检验计算组间差异表达的概率，排除任何非独特序列和具有除氧化和脲甲基化之外的修饰的任何特征。使用Benjamini–Hochberg方法校正多次测试的概率值。引入函数y＝-log10(0.05)+c/(x-x0)(Keilhauer等人，2015)的截止线以鉴定显著富集的蛋白质。c被设定为0.2，而x0被设定为1，分别表示蛋白质表达具有2倍(log2蛋白质比率为1或更大)或4倍(log2蛋白质比率为2)变化的蛋白质。Log2变换的合计肽强度(非填补)在one-matrix CIMminer中生成的热图中可视化，one-matrix CIMminer是Genomics and Bioinformatics Group(Laboratory of MolecularPharmacology,Center for Cancer Research,National Cancer Institute)开发的程序。
用于肽筛选的GST-CIS蛋白的制备
将人Cish的一部分(编码残基66-258)克隆至载体pGTVL2。如上文所述，将人延伸蛋白C(残基17–112)和全长延伸蛋白B克隆至载体pACYCDUET(Bullock等人，2006)。将两种质粒转化到BL21(DE3)，以进行CIS/延伸蛋白C/延伸蛋白B三元复合物(CIS-SH2-BC)的共表达。在18℃下用0.4mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导Luria肉汤培养基中的培养物过夜，并通过离心收集细胞。将沉淀重悬于50mM HEPES pH7.5、500mM NaCl、5mM咪唑、5％甘油中，并通过超声裂解细胞。通过加入0.15％聚乙烯亚胺pH8沉淀DNA，通过以21,000rpm离心排除不溶性物质。在谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱上纯化GST标记的CIS蛋白复合物，并用20mM还原型谷胱甘肽在包含50mM HEPES、300mM NaCl、0.5mM TCEP的缓冲液中洗脱。将纯化的蛋白质浓缩至0.75mg ml-1并储存在-80℃下。
肽阵列合成和筛选
如所述使用Invatis点阵列合成仪在官能化硝基纤维素膜上合成肽阵列(Li和Wu，2009)。对于阵列探测，在室温下Tris缓冲的盐水/0.05％Tween-20(TBS-T)pH7.2的5％脱脂乳中封闭膜结合的肽5h。在用TBS-T洗涤之后，将0.8ng ml-1GST-CIS-SH2-BC复合物加入封闭缓冲液，并在4℃下温育过夜。同时，在相同的实验条件下，将4ng ml-1GST蛋白质作为阴性对照加入单独的肽阵列。用TBS-T 3×洗涤肽阵列膜，并在室温下加入过氧化物酶标记的抗GST抗体(Bio-Rad)1h，然后用化学发光底物(Bio-Rad Clarity Western ECL底物)检测，所述化学发光底物使用Molecular Imager(ChemiDoc XRS；Biorad)可视化。
等温滴定量热法(ITC)
使用Microcal ITC200(GE Healthcare)进行等温量热滴定。磷酸肽从Genscript获得。制备其中内部PEST区(Δ174-202)缺失的优化的GST-CIS蛋白构建体。针对缓冲液(20mM Tris pH8.0、100mM NaCl、2mM 2-巯基乙醇)透析所得的三元GST-CIS-SH2-SB复合物。除非另有说明，否则实验在298K下进行。通常，将12×3.15μl 300μM磷酸肽注射液滴定至30μM GST-CIS-SH2-SB三元复合物溶液。从结合实验的原始数据减去GST-CIS-SH2-BC的稀释热。使用评价软件Microcal Origin 5.0版分析数据。结合曲线拟合单点结合模式，并且从重复实验确定所有KD值。
E3连接酶测定
基本上如上文所述进行JAK1的CIS介导的泛素化(Babon等人，2013)。在存在2.5mMMg/ATP的情况下，将CIS E3连接酶复合物(CIS-SH2-BC以及滞蛋白5和Rbx2；2.5μM)与泛素(50μM)、人E1(100nM)、纯化的重组E2(UbcH5c,2.5μM)和全长JAK1一起在37℃下温育不同的时间。FLAG标记的JAK1通过以下步骤产生：在293T细胞中表达，并使用抗FLAG免疫沉淀和游离的FLAG肽洗脱来回收。JAK1泛素化通过与抗磷酸化JAK1一起进行蛋白质印迹，然后在4-20％Tris/甘氨酸凝胶上分离来可视化。
激酶测定
激酶抑制测定基本上如所述进行(Babon等人，2012)。简言之，将130μM STAT5b肽(SEQ ID NO:18RRAKAADGYVKPQIKQVV)与5nM JAK1一起在20mM Tris pH8.0、100mM NaCl、5mM 2-巯基乙醇、0.2mg ml-1牛血清白蛋白、2mM MgCl2、100μM ATP和1mCiγ-[32P]ATP中在25℃下温育30–60min。重组CIS-SH2-BC以0-30μM的浓度范围存在。在温育之后，将反应点在P81磷酸纤维素纸上并在5％H3PO4中淬火。用5％H3PO4洗涤纸(4×200ml,15min)并暴露于磷成像板(Fuji)。使用Fuji软件和使用Graphpad Prism计算的IC50曲线进行定量。
肿瘤细胞系
C57BL/6鼠科动物淋巴细胞系RMA是来源于Rauscher鼠科动物白血病病毒诱导的RBL-5细胞系的T细胞淋巴瘤。分别用编码mCherry或GFP的逆转录病毒载体(鼠科动物干细胞载体)转导生成细胞系RMA-mCherry和m157+RMA-GFP。如上文所述维持B16F10黑素瘤、E0771和E0771.LMB mCherry+乳腺癌、LWT1黑素瘤和RM-1前列腺癌细胞系(Ferrari deAndrade等人，2014；Gilfillan等人，2008；Stagg等人，2011a和b；Swann等人，2007；Rautela等人，2005；Johnstone等人，2015)。
实验性肿瘤转移
将每个实验的6-14只小鼠组用于实验性肿瘤转移。这些组的大小用于确保检测生物学差异的足够能力。根据本研究中预先确立的标准没有小鼠被排除，并且无主动随机化应用于实验组。研究者并非不了解实验期间和/或评估结果时的组分配。除非特别说明，否则所有肿瘤实验均进行一次。将B16F10黑素瘤、RM-1前列腺癌或LWT1黑素瘤细胞的单细胞悬浮液静脉内注射至指定小鼠品系的尾静脉(2.5-7.5×105个细胞/小鼠)。一些小鼠还另外接受100μg抗CD8β(53.5.8)(如上所述消耗CD8+T细胞)、50μg抗asialoGM1(消耗NK细胞)或250μg抗IFN-γ(H22)(如上所述中和IFN-γ)(Chan等人，2014；Allard等人，2013)。一些小鼠组在相对于肿瘤接种(第0天)第0、3和6天接受：对照Ig(500μg腹膜内，cIg，1-1)或组合抗PD-1(RMP1-14)/抗CTLA-4(UC10-4F10)(各250μg腹膜内)。在第14天收集肺并固定在Bouin溶液中，进行B16F10转移计数44或通过流式细胞术分析NK细胞扩增。对于过继性转移模型，给Mcl1f/f Ncr1-iCre小鼠(Sathe等人，2014)静脉内注射3×106个体外扩增的Cish+/+或Cish-/-NK细胞或PBS。然后在8h后，用1×105个B16F10黑素瘤细胞注射小鼠。随后在第1天用1.5×106体外扩增的Cish+/+或Cish-/-NK细胞或PBS静脉内递送来处理小鼠。在肿瘤注射后第18天处死小鼠，并进行肺灌注。然后收集肺并进行转移计数。
原位E0771.L.MB和自发性E0771转移
为了产生原发性肿瘤，将1×105个E0771.LMB mCherry+肿瘤细胞植入8至10周龄雌性Cish-/-或Cish+/+小鼠的第四腹股沟乳腺[在20μl PBS中]。每周使用电子卡尺测量原发性肿瘤体积三次。测量最大纵径(长)和最大横径(宽)。通过修改的椭圆体公式估算肿瘤体积：体积＝1/2(长×宽2)。对于自发性转移实验，通过手术切除400–600mm3大小的原发性肿瘤。如上文所述，在14天后收集肺，并通过使用IVIS Lumina XR-III(Caliper LifeSciences)离体成像或通过双重Q-PCR测定mCherry相对于波形蛋白的表达来定量转移负荷(Rautela等人，2005)。
CYT-387合成
液相色谱质谱(LCMS)通过使用反相高效液相色谱(HPLC)分析的Finnigan LCQAdvantage Max进行(柱：Gemini 3μC18 20×4.0mm 110A)溶剂A：水0.1％甲酸，溶剂B：乙腈0.1％甲酸，梯度：10-100％B超过10min，检测：100-600nm和电喷雾电离(ESI)。所有提交用于生物化学测定的化合物均被评估为具有通过在254nm UV吸收下的HPLC分析测定的的纯度。使用 Rf纯化系统(Teledyne,ISCO,Lincon,NE,USA)以及预填充硅胶柱(粒度0.040-0.063mm)进行色谱分析。所有商业化试剂按原样使用。Cbz＝羧基苄基。4-(4-氨基苯基)哌嗪-1-甲酸苄酯(S1)和4-(4-氯嘧啶-2-基)苯甲酸乙酯(S2)可以如上文所述制备(WO 2014/26242和WO 2008/109943)。
4-(4-((2-(4-(乙氧基羰基)苯基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸苄酯(S3)
将p-TsOH(0.978g,5.13mmol)加入磁力搅拌的于二氧杂环乙烷(20mL)的嘧啶S2(1.50g,5.71mmol)和苯胺S1(2.31g,7.42mmol)中的悬浮液中。将混合物加热回流24h。冷却混合物，在DCM(250mL)中稀释并用NaHCO3(100mL)洗涤，分离水层并用EtOAc(3×50mL)萃取。干燥合并的有机物(Na2SO4)，过滤并浓缩到二氧化硅上，用该物质进行快速色谱(1:9至1:0，v/v，EtOAc:环己烷)。浓缩由此获得的级分，过滤黄色沉淀并用甲醇洗涤得到呈黄色固体的标题化合物(S3)(1.61g,52％)。1H NMR(600MHz,DMSO-d6):(s,1H),8.52(d,J＝5.1Hz,1H),8.25(d,J＝8.3Hz,2H),8.08(d,J＝8.4Hz,2H),7.65(d,J＝9.0Hz,2H),7.37-7.35(m,5H),7.31(q,J＝4.4Hz,1H),6.93(d,J＝9.0Hz,2H),5.09(s,2H),4.33(q,J＝7.1Hz,2H),3.58-3.48(m,4H),3.04-3.03(m,4H),1.33(t,J＝7.1Hz,3H)。LCMS:tR＝6.14min,m/z＝538.0[M+H]+。
4-(4-((4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)苯甲酸乙酯(S4)
将化合物S3(500mg,0.93mmol)溶解于MeOH(75mL)和THF(50mL)中，在45℃下使用Pd/C(10％)管柱，使溶液在全H2模式下以1mL/min通过'H-cube’。收集产物并在低压下浓缩得到呈深色固体的标题化合物(S4)(352mg,94％)。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ8.46(dd,J＝8.0,5.2Hz,1H),8.16-8.14(m,2H),8.11(d,J＝8.3Hz,2H),7.59(dd,J＝8.9,1.9Hz,1H),7.55(d,J＝8.9Hz,1H),7.16-7.13(m,1H),6.96(dt,J＝9.1,4.6Hz,2H),4.41(q,J＝7.1Hz,2H),3.36-3.28(m,4H),3.25-3.18(m,4H),1.42(t,J＝7.1Hz,3H)。LCMS:tR＝5.78min,m/z＝404.0[M+H]+。
4-(4-((4-(4-(5-((叔丁氧基羰基)氨基)戊酰基)哌嗪-1-基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)苯甲酸(S5)
在N2下，向磁力搅拌的于DMF(2mL)的N-Boc-氨基戊酸(194mg,0.96mmol)、EDCI(201mg,1.05mmol)、HOBt(146mg,1.05mmol)、Et3N(2321.75mmol)中的溶液加入化合物S4(350mg,0.87mmol)并搅拌混合物12h。用水(2mL)洗涤反应混合物并用EtOAc(2×2mL)萃取水性洗涤液。将有机级分合并、干燥(Na2SO4)、过滤并浓缩。通过快速色谱纯化粗物质得到浅黄色固体(373mg)。将该物质溶解于THF/MeOH(2mL 1:3混合物)中，并加入氢氧化锂(123mg,3.09mmol)，回流搅拌混合物2h。将该混合物浓缩成黄色固体并悬浮于水中，用HCl(5％水溶液)酸化至pH＝2。通过过滤收集沉淀，用MeOH(1mL)然后用Et2O(2×1mL)洗涤，在低压下干燥得到呈红色固体的标题化合物(S5)(224mg,60％)。1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ9.49(s,1H),8.52-8.51(m,1H),8.22(t,J＝6.8Hz,2H),8.06(d,J＝8.1Hz,2H),7.65-7.64(m,2H),7.36(dd,J＝4.7,0.3Hz,1H),6.94-6.91(m,2H),6.77-6.75(m,1H),3.57-3.55(m,4H),3.36(td,J＝1.1,0.5Hz,2H),3.05-2.99(m,4H),2.91-2.87(m,2H),2.33-2.31(m,2H),1.46-1.45(m,2H),1.34(s,9H)。LCMS:tR＝6.34min,m/z＝575.0[M+H]+。
4-(4-((4-(4-(5-氨基戊酰基)哌嗪-1-基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)-N-(氰甲基)苯甲酰胺(S6)
在室温、N2下，向磁力搅拌的于DMF(6mL，无水)中的化合物S5(190mg,0.33mmol)的溶液加入三乙胺(2641.99mmol)，并将混合物超声5min。然后加入EDCI(76mg,0.40mmol)和HOBt(54mg,0.40mmol)，并在N2下将混合物搅拌5min。然后加入氨基乙腈盐酸盐(61mg,0.66mmol)，在室温、N2下搅拌反应12h。浓缩反应混合物并通过快速色谱纯化粗物质得到呈黄色固体的偶联产物(155mg,76％)。立即将该物质溶解于二氧杂环乙烷(0.5mL)中，然后加入HCl(1mL于二氧杂环乙烷中的4M溶液)，并在室温下搅拌反应混合物2h。然后通过过滤收集沉淀，在溶解于MeOH中之前用二氧杂环乙烷洗涤，用NH3(于MeOH中的4M溶液)淬火然后浓缩。通过快速色谱纯化粗物质得到呈黄色固体的标题胺(S6)(51mg,40％)。1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ8.37(d,J＝5.2Hz,1H),8.16(d,J＝8.3Hz,2H),7.91(d,J＝8.3Hz,2H),7.57(d,J＝8.8Hz,2H),7.20(d,J＝5.2Hz,1H),6.93(d,J＝8.9Hz,2H),4.34(s,2H),3.69(t,J＝5.1Hz,2H),3.63(t,J＝5.0Hz,2H),3.30-3.29(m,2H),3.07(t,J＝5.0Hz,2H),3.03(t,J＝5.1Hz,2H),2.67(t,J＝7.2Hz,2H),2.41(t,J＝7.4Hz,2H),1.62(dt,J＝15.3,7.6Hz,2H),1.51(td,J＝11.3,6.1Hz,2H)。LCMS:tR＝4.18min,m/z＝513.0[M+H]+。
实施例2 IL-15诱导NK细胞中SOCS基因(包括CIS)的表达
迄今为止，人们对理解抑制NK细胞应答的抑制性信号有着极大的兴趣，但仍不理解细胞内IL-15信号传导如何关闭。细胞因子信号传导抑制剂(SOCS)基因家族成员是STAT5应答基因，并且通常被诱导以限制作为经典负反馈系统的一部分的细胞因子受体信号传导的程度。为了研究哪些SOCS蛋白可能调节IL-15信号传导，从而调节NK细胞发育和功能，本发明人首先分析了培养的NK细胞中的IL-15诱导的SOCS表达。在2h的IL-15治疗内诱导NK细胞中的Cish、Socs1、Socs2和Socs3 mRNA，Cish的早期和瞬时诱导代表通过其靶细胞因子诱导Socs(图1a)。与饱和浓度的IL-15中mRNA的快速诱导一致，在60分钟的刺激内在NK细胞裂解物中检测到CIS蛋白(图1b)。
实施例3 Cish-裸NK细胞是IL-15超敏感的
为了研究CIS在IL-15信号传导中的生理作用，本发明人利用种系Cish缺失的小鼠(Cish-/-)(Palmer等人，2015)，首先证实了Cish mRNA和蛋白质不存在于NK细胞中(图5a)。Cish-裸小鼠是健康的、可育的，并且当达到10月龄时没有出现任何表型异常。造血细胞的频率和功能，包括传统的CD4+和CD8+T细胞9、调节T细胞和2型先天淋巴细胞(ILC2)的频率和功能看起来正常(图5b-g)。NK细胞在Cish-/-小鼠中也正常发育(图1c、图5b)，与Socs1和Socs3单或双缺陷型小鼠中的情况一样(图6a)。然而，与Socs1或Socs3缺陷型NK细胞相比，Cish-/-NK细胞在体外显示出显著的响应于IL-15的超增殖(图1d，图6b)。当Cish-/-和对照C57BL/6NK细胞(Cish+/+)在IL-15的滴定中1:1共培养时，Cish-/-NK细胞在大于5ng ml-1的浓度下显示出增强的增殖(图1d)。此外，Cish-/-NK细胞代表～95％从非丝裂原IL-15浓度的共培养物回收的细胞，因此在不存在CIS的情况下显示出优异的IL-15介导的NK细胞存活率(图1d)。Cish-/-NK细胞的超敏感性也表现在增强的IL-15驱动的IFN-γ产生中，所述产生通过经由活化受体NKp46和NK1.1的共刺激进一步提高，表明IL-15在与这些受体的协同作用中具有重要作用(图1e)。当与中国仓鼠卵巢(CHO)靶细胞共培养时，与Cish+/+NK细胞相比，Cish-/-NK细胞在低NK:靶细胞比率下显示出更大的细胞毒性(图1f和图6c)。Cish-/-NK细胞也比Cish+/+NK细胞更有效地杀死B16F10黑素瘤细胞，并且当用RMA-m157细胞攻击时，显示出更高的细胞内粒酶水平，证实了NK细胞在不存在Cish的情况下具有广泛的超细胞毒性(图6c、d)。
为了检查Cish-裸NK细胞中异常IL-15信号传导的程度，本发明人对Cish+/+和Cish-/-NK细胞进行100bp单末端RNA测序，所述Cish+/+和Cish-/-NK细胞直接从脾纯化(离体)或在IL-15中培养后纯化(体外)。在离体Cish-/-NK细胞中观察到很少差异表达的基因(图7a)，这与体内Cish-/-NK细胞的正常频率和成熟NK细胞中的低Cish表达一起，表明CIS不是稳态下NK细胞生物学的主要调节剂。相比之下，在体外暴露至高浓度的IL-15的Cish-/-NK细胞中检测到超过1000个差异表达的基因(图1g和图7a、b、c)。最高的上调基因包括杀伤细胞凝集素样受体的成员Klra1和Klra6，以及NK细胞效应子功能相关成员，诸如丝氨酸蛋白酶Gzme、Gzmf、Gzmd、Gzmg及其抑制剂Serpinb9b、Serpinb9和Serpin1a(图1g、图7a)。这些发现与Cish-/-NK细胞的优异增殖和细胞毒性一起，确定了CIS作为IL-15介导的NK细胞效应子功能的关键负调节剂具有独特和非冗余作用。另外，他们提出CIS充当控制NK细胞应答的免疫检查点。
实施例4在不存在CIS蛋白的情况下JAK1水平和酶活性升高
SOCS蛋白是E3泛素连接酶复合物的衔接子，它使SOCS相互作用蛋白泛素化，靶向该蛋白以进行蛋白酶体降解(Zhang等人，1999)。CIS是第一个被发现的SOCS家族蛋白质(Matsumoto等人，1997)，虽然其被报道为与IL-2受体复合物缔合(Aman等人，1999)，但是如何准确地介导该相互作用仍不清楚。Cish-/-NK细胞的超增殖和增强效应子能力可以从受体水平和/或细胞内信号传导组分的变化表现出来。然而，当在存在IL-15的情况下培养时，Cish+/+和Cish-/-脾NK细胞表达相似的受体水平(图2a)。所以，本发明人检查了受体近端信号传导事件。在新鲜分离的和培养的Cish-/-NK细胞中，与对照细胞相比，IL-15刺激的JAK1酪氨酸磷酸化程度增加，并且与延长的磷酸化动力学关联(图2b、c和图8a)。有趣的是，Cish-/-NK细胞中的总JAK1蛋白水平升高，这在刺激前的静息细胞中是明显的(图2b、c)。JAK磷酸化增加与其底物STAT5的磷酸化增加相关。相比之下，Cish缺陷对IL-15依赖性AKT磷酸化无影响(图2b、c和图8a)，表明IL-15驱动的JAK/STAT和PI3K/mTOR/AKT通路之间的独特分离。这通过正常线粒体呼吸和糖酵解(已知受AKT活性调节的响应)进一步证实(图8b)。
为了证实JAK1酶活性升高和检查CIS缺陷作用的选择性如何，本发明人利用基于质谱的方法来定量活性JAK水平的变化。合成泛JAK抑制剂(来源于CYT-387；JAK1/2/3)，将其偶联至琼脂糖凝胶珠粒并用作亲和捕获试剂，然后进行胰蛋白酶消化和质谱分析。由于抑制剂结合至激酶结构域中的ATP结合位点，因此优先富集处于活性构象的激酶。通过Cish-/-细胞中数量和强度的增加来检测NK细胞裂解物中的JAK1和JAK3肽(图2d)。已知CYT-387脱靶结合其他激酶，特别是TBK1和CDK2，这允许我们进行限制激酶组分析。相对于细胞裂解物中的丰度，对六十九个激酶进行富集，其中16个激酶在Cish-/-细胞中受到差异调节。除JAK激酶之外，增加的活性主要归因于涉及调节细胞增殖的激酶(例如CDK1/2、Prkr、Aurora激酶)(图2e、f和表1)。这些数据与超增殖表型一致，且进一步表明很多这些表型可能是IL-15信号传导增加继发性的。无标记全局蛋白质组学分析还突出了反映增强的增殖能力(细胞周期、DNA复制、细胞骨架重组)的变化(图8c-e和表2)。
表1.CYT-387亲和力富集后的定量蛋白质组学分析，其示出了与图2相关的培养的Cish-/-NK细胞中的差异表达的激酶。
表2.定量蛋白质组学分析示出了培养的Cish-/-NK细胞中的差异表达的蛋白质(参见图10)。
实施例5 CIS-延伸蛋白B-延伸蛋白C三聚复合物的相互作用靶标的鉴定
与其他SOCS蛋白一样，CIS结构域含有结合至靶蛋白中的磷酸化酪氨酸基序和SOCS框的SH2结构域，SH2结构域与延伸蛋白B和C、支架蛋白滞蛋白5和RING蛋白Rbx2一起构成E3泛素连接酶。鉴于在Cish-/-NK细胞中观察到的总JAK1/3蛋白的水平增加不是由于RNA水平增加图9a)，本发明人研究了CIS可能通过泛素化和蛋白酶体降解直接降低JAK蛋白水平的可能性。过去，CIS已显示出与IL-2Rβ相互作用，并且被提出通过阻断STAT蛋白质募集至受体复合物来调节信号传导(Matsumoto等人，1997；Aman等人，1999)；然而，支持后一种主张的证据有限。作为鉴定受CIS调节的蛋白质靶标的初步步骤，本发明人使用由人GST-CIS构建体(hCIS-SH2；残基66-258)以及延伸蛋白B和C(hCIS-SH2-BC)组成的重组三聚复合物针对一组对应于IL-2受体复合物内的酪氨酸的磷酸酪氨酸肽进行筛选(未示出)。然后使用等温量热法(ITC)验证结合至筛选中鉴定的磷酸肽。hCIS-SH2-BC复合物以高亲和力(0.8-2.1μM)结合至对应于IL-2Rβ胞质结构域内(Tyr355、Tyr361和Tyr392)，以及JAK1和JAK3活化环内(分别地，Tyr1034和Tyr980)的酪氨酸的合成磷酸化肽(图3a；图9c)。
实施例6 CIS蛋白在不存在IL-2受体复合物的情况下经由靶向蛋白酶体降解下调 JAK水平
本发明人接下来研究了CIS是否可以在不存在IL-2受体复合物的情况下调节JAK水平。293T细胞(其缺乏IL-2R)中JAK的过表达引起组成型JAK自磷酸化。CIS或SOCS1的共表达将JAK1水平降低至可比较的程度，对应的JAK1磷酸化也减少。相比之下，在该测定中SOCS3不能抑制JAK活性(SOCS3需要受体结合)(图3b)。出乎意料的是，虽然本发明人观察到CIS结合至JAK3Tyr980肽(图3a)，但在该测定中JAK3磷酸化未受抑制(图3b)。
本发明人接下来查询哪些CIS结构域是JAK1抑制必须的。SOCS框中的CIS-SH2结构域(R107K)或滞蛋白-5结合位点(P241A/L242A/P243A)的突变足以减少CIS抑制活性(图3c)。另外，细胞与蛋白酶体抑制剂(MG132)的预温育减少了CIS介导的JAK1磷酸化调节(图3c)，支持CIS由此通过其SH2结构域结合至JAK1，然后靶向JAK1以进行蛋白酶体降解的模型。免疫共沉淀用于证实JAK1和CIS之间的复合物形成(图3d)。为了正式证实CIS介导的JAK1泛素化，在无细胞体系中将Flag标记的全长JAK1蛋白(通过在293T细胞中表达产生)与重组hCIS-SH2-SB复合物、滞蛋白5、Rbx2、E1、E2(UbcH5c)和游离的泛素一起温育。如上文通过蛋白质印迹检测到的高分子量物质所示，CIS有效地介导磷酸化JAK1的泛素化(图3e)。这些数据共同证实CIS能够直接调节JAK蛋白水平。
实施例7 CIS蛋白独立于其对JAK蛋白水平的下调而直接抑制JAK酶活性
过去，仅SOCS1和SOCS3显示出结合至和调节JAK活性。SOCS1和SOCS3经由非经典SH2来抑制JAK，所述SH2结合至JAK1、JAK2和Tyk2插入环中存在的“GQM”基序，并使激酶抑制区(KIR)结合至催化裂口(Kershaw等人，2013)。CIS不含有“KIR”区，并且先前未提出它能够调节JAK酶活性。然而，有几条证据表明涉及另外的机制。首先，本发明人偶尔观察到在不存在总JAK1水平变化的情况下JAK1磷酸化的抑制(例如，图3c)。其次，尽管野生型NK细胞的MG132治疗引起内源性JAK1磷酸化增加，但本发明人未观察到延长的动力学，以及实际上JAK磷酸化的迅速减少。这与CIS的表达增加相关，所述CIS被保护免于蛋白酶体降解(图9d)。所以，本发明人询问CIS是否可以抑制JAK1激酶活性。使用体外激酶测定，CIS-SH2-BC复合物能够抑制底物肽的JAK1磷酸化，IC50为0.12±0.02μM。JAK1的CIS抑制为其对JAK2、JAK3或TYK2的抑制20倍或更高(图3f，上图)，表明除经典的SH2与保守的JAK活化环酪氨酸的相互作用之外，还存在与JAK1的独特界面。此概念得到JAK1活化环肽用作竞争剂时发现的仅部分减少的抑制的支持(图9e)。虽然CIS显示出对JAK1的特异性，但其抑制效率比SOCS1低～100倍(图3f，下图)。这表明，CIS与SOCS1的绝对水平将有助于特异性和支配性。在这种情况下，CIS的受体募集可以增加CIS的局部浓度，使其有效地抑制JAK1活性(图3g)。CIS水平的翻译后调节，无论是蛋白酶体还是蛋白酶，都增加了另一个灵敏的控制层。这些数据表明了CIS作用的新靶标(JAK1)和机制(激酶抑制)，并且提高了CIS基本上比之前设想更类似于SOCS1的可能性。
实施例8小鼠肿瘤模型中Cish-/-NK细胞的过继性转移导致肿瘤形成和转移显著减 少
Cish-/-NK细胞暴露至高浓度IL-15的显著增强的生物学应答以及在稳态下健康Cish-/-小鼠中缺乏NK细胞表型，表明体内稳态IL-15水平低于诱导Cish表达所需的那些水平。肿瘤形成相关的炎症很可能通过基质或浸润骨髓谱系增加IL-15反式呈递，并增加驻留NK细胞活性(Mlecnik等人，2014)。
所以，本发明人通过用一组已知激活和受NK细胞控制的同系肿瘤细胞系攻击Cish+/+和Cish-/-小鼠，研究了CIS的IL-15诱导是否在体内NK细胞中充当检查点。B16F10黑素瘤细胞静脉内(i.v.)施用至Cish+/+小鼠在14天内在肺中导致广泛的转移性结节形成。相比之下，B16F10转移性结节大部分不存在于Cish-/-小鼠中(图4a)。为了证实在Cish-/-小鼠中观察到的B16F10转移减少依赖于NK细胞活性的增强，用抗asiolo GM1(消耗NK细胞)、抗CD8(消耗CD8 T细胞)、抗IFN-γ(阻断IFN-γ活性)或对照抗免疫球蛋白(cIg)处理Cish+/+和Cish-/-小鼠。NK细胞的消耗或IFN-γ的中和，而非CD8 T细胞的消耗，使得Cish-/-小鼠易患B16F10转移(图4b)，鉴定了CIS在NK细胞活性的负调节中以及IFN-γ在该模型中的作用。此外，当过继性转移至缺乏NK细胞的小鼠(Mcl1f/f Ncr1-iCre；Ncr1Mcl1Δ/Δ)时，接受Cish-/-NK细胞的小鼠的B16F10肺转移显著比接受Cish+/+NK细胞的小鼠更低(图4c)，证实了Cish-/-NK细胞本质上更具活性。用表达突变形式的丝氨酸/苏氨酸激酶braf(LWT1 BRAFV600E)的黑素瘤细胞系注射Cish+/+和Cish-/-小鼠(Davies等人，2002)，也引起CIS缺陷型小鼠中肺转移的显著减少(图10a)。这些发现不限于黑素瘤，因为当使用RM-1前列腺癌细胞系时，也观察到类似的肺转移差异(图10b)。
类似地，当向Cish+/+、Cish-/-和NK细胞裸小鼠静脉内施用乳腺癌细胞(E0771.LMB-mCherry)时，本发明人观察到与Cish+/+和NK裸小鼠相比，Cish-/-小鼠的肺中肿瘤负荷减少(图4d)。这些小鼠的肺的组织学分析揭示了Cish-/-小鼠中偶然的E0771微转移，但它们缺乏血管周围常见且富集在Cish+/+小鼠内脏胸膜中的大转移(图4d)。与Cish+/+小鼠相比，原位E0771.LMB乳腺瘤的生长在Cish-/-小鼠中也显著增加(图4g)。当通过手术切除类似大小的原发性原位肿瘤时，仅Cish+/+小鼠在肺中发展自发性E0771.LMB转移，而Cish-/-小鼠则不发展(图4f和图10c、d)，进一步证实了CIS是转移性抗肿瘤免疫的强效负调节剂。
实施例9小鼠黑素瘤模型中Cish-/-NK细胞的过继性转移比单独抗-PD-1/CTLA-4免 疫疗法更有效，并且与抗PD-1/CTLA-4免疫疗法联合具有更大的功效
使用针对抑制性受体PD-1和CTLA-4的抗体的联合免疫疗法目前是针对人晚期黑素瘤的最有效治疗(Larkin等人，2015；Postow等人，2015；Yoshimura等人，2015)。为了将该基准免疫疗法与NK细胞中的Cish缺失相比较，向Cish-/-和Cish+/+小鼠注射高剂量的B16F10黑素瘤(以引发NK细胞和CD8 T细胞应答)并用抗PD-1/CTLA-4抗体或cIg的组合治疗。在Cish+/+小鼠中，与cIg相比，抗PD-1/CTLA-4治疗显著减少黑素瘤转移，然而这劣于单独Cish缺失提供的保护(Cish-/-小鼠+cIg；图4g)。值得注意的是，用抗PD-1/CTLA-4处理的Cish-/-小鼠发展的转移甚至显著少于用cIg处理的Cish-/-小鼠(图4g)，突出了在抗CTLA-4/PD-1疗法与CIS功能的丧失联合的情况下可以实现的潜在治疗益处。
Cish的诱导首先显示为对白介素(IL)-3、IL-2和促红细胞生成素(EPO)的应答，并且CIS的强制表达已显示出通过这些受体抑制信号传导(Matsumoto等人，1997；Aman等人，1999)。尽管得到这些观察结果，但在这些通路中的生理作用的证据仍然有限。老年(10-18月龄)Cish-/-小鼠被报道为在CD4+T细胞中发展与IL-4/STAT6和IL-2/STAT5信号传导扰乱相关的炎性肺病(Yang等人，2013)，而最近的报道表明，在Cish-/-CD8+T细胞中抗原受体信号传导增强(Palmer等人，2015)。然而，成年Cish-/-小鼠在T细胞频率上未显示出病理或改变(Yang等人，2013)，在本发明人来看，Cish-/-CD8+T细胞发育和对小鼠巨细胞病毒的抗原特异性应答是正常的(数据未示出)。鉴于Cish-/-小鼠保持健康，我们的观察结果表明，治疗性拮抗CIS不太可能具有任何重大副作用。
严重脱靶效应和耐药性目前限制了我们对传统化学疗法(通常大部分癌症的第一线治疗)的使用。因此，仍需要发现新靶向疗法和免疫疗法，所述靶向疗法和免疫疗法可以联合使用和作为化学疗法的补充。
伊匹单抗(Ipilimumab)是靶向效应和调节T细胞上的CTLA-4的基于抗体的疗法，并且被批准用于治疗晚期恶性黑素瘤，提供10-12％的肿瘤应答以及一些复杂的免疫相关不良事件。这是靶向所谓的免疫检查点分子的一流单克隆抗体。抗体(相同种类)识别PD-1(在T细胞和NK细胞上表达)或其配体、PD-L1(一旦发生T细胞活化，即在很多肿瘤上表达)，并且帕姆单抗(pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab)(抗人PD-1)在晚期黑素瘤、肾癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和其他癌症适应症的I/II期试验中已经产生20-50％的客观应答率。针对晚期恶性黑素瘤的纳武单抗和伊匹单抗联合产生了甚至更迅速和显著的抗癌效应，包括抗转移性疾病。尽管取得了这些进展，但是一些癌症(例如，前列腺癌、结肠直肠癌)显示出并不显著的应答，甚至在黑素瘤中仍存在许多其中抗CTLA-4和抗PD-1/PD-L1联合无效的患者。
在此，本发明人示出了，NK细胞中IL-15诱导的CIS累积充当限制NK细胞功能的细胞内免疫检查点。CIS功能的消融释放了对NK细胞活性的抑制，导致实验性肿瘤转移的急剧减少，大于CTLA-4/PD-1阻断的观察结果，并且无不良反应的迹象。我们的结果揭示，CIS是新的NK细胞检查点，并且表明人中CIS功能的有效治疗阻断可以改善某些癌症的预后。
实施例10 CIS N-末端区或PEST基序的缺失增强了CIS抑制JAK1激酶活性的能力
为了研究CIS N-末端区和PEST基序的作用，本发明人制备了人CIS的大肠杆菌(E.coli)表达构建体，该构建体缺乏PEST基序(残基173-202；ΔPEST)、前24个残基(ΔN34)、N-末端区(残基1-66)和PEST基序(ΔNTΔPEST)或对应于全长蛋白质(CIS)。所有CIS蛋白与延伸蛋白B和C一起表达，并且如上文所述纯化三聚复合物。然后使用体外激酶反应评估抑制JAK1激酶结构域(JH1)的能力。与之前数据(图3F)一致，CIS-ΔNTΔPEST抑制JAK1，IC50为～0.6μM。相比之下，全长蛋白质显示出抑制JAK1的能力大大下降(IC50～32.3)，CIS-ΔN34也是如此(IC50～96.77)，表明N-末端(残基35-66)内的区域是自体抑制的。单独PEST缺失足以使IC50增加至3.32mM(与全长CIS相比)(图11A)。
实施例11 CIS-SH2与磷酸肽的相互作用对于JAK1激酶活性的CIS抑制是必需的
磷酸苯酯(PP)加入体外激酶反应消除了所有CIS构建体抑制JAK1激酶活性的能力(图11B)。类似地，对应于单磷酸化JAK1或双磷酸化JAK3、活化环的游离磷酸肽的添加显著降低了CIS抑制JAK1激酶活性的能力(图11C)。这些数据进一步证实了SH2结构域与磷酸酪氨酸基序的经典结合对于CIS抑制JAK1活性是必需的。
实施例12 CIS N-末端区或PEST基序的缺失不对与磷酸肽的结合具有主要影响
使缺乏PEST基序(残基173-202；ΔPEST)、前24个残基(ΔN34)、N-末端区(残基1-66)和PEST基序(ΔNTΔPEST)或对应于全长CIS的CIS构建体与延伸蛋白B和C一起表达，并使用ITC测试其结合JAK1磷酸肽的能力。所有构建体以2.2-10μM的亲和力结合磷酸肽，观察到N-末端34个残基的缺失时结合降低最大(图12A)。类似地，全长CIS和CIS-ΔNTΔPEST以可比较的亲和力结合JAK3磷酸肽(图12B)。
这些数据共同表明N-末端区和/或PEST基序是自体抑制的，而这些区域对SH2结构域结合磷酸肽的能力影响最小，它们对CIS抑制JAK1激酶活性的能力具有主要影响。不希望受理论的限制，翻译后修饰或构象变化(诸如对于结合至磷酸酪氨酸)可能释放自体抑制，并且需要活化CIS。这表明稳定N-末端区和PEST基序的构象/位置或阻断CIS的翻译后修饰的试剂可以是有效的CIS阻断剂。类似地，模拟N-末端区或PEST基序的试剂也可以是有效的CIS阻断剂。
实施例13 CIS-SH2结构域结合至延伸的肽界面
ITC用于研究侧接磷酸酪氨酸(JAK1Y1034)的哪个残基有助于结合亲和力(和特异性)。位于+5、+3或-3位置的丙氨酸置换仅对结合具有适度作用(在+3处减少～4倍)(图13)。这表明CIS-SH2结构域与其靶肽序列进行多次接触。
实施例14 CIS抑制是剂量依赖性的
CIS小分子抑制剂不可能再现CIS功能的完全丧失。所以，本发明人研究了一个等位基因的丧失是否足以增强NK细胞对IL-15的应答。从Cish+/+、Cish+/-和Cish-/-小鼠纯化NK细胞，用CTV标记并且在存在增加浓度的IL-15的情况下体外扩增，然后通过流式细胞术分析。再现了Cish-/-NK细胞的增强增殖，而Cish+/-NK细胞显示出中间表型，与野生型细胞相比具有增强的增殖，但仍小于Cish-/-细胞的观察结果(特别是在低IL-15水平)(图14A)。该结果在培养后细胞的绝对数中得以反映(图14B)，并且免疫印迹证实一个CIS等位基因的丧失导致对应的CIS蛋白丧失(大约50％)(图14C)。这些数据表示抑制CIS功能的效用。
实施例15 CIS-SH2结构域作为治疗靶标的进一步验证
本发明人使用CRISPR技术制备了Cish基因中携带种系突变的“敲入”突变小鼠。该突变将SH2结构域中的Arg107变为Lys，消除了SH2与磷酸肽的结合。突变的作用使用重组蛋白和ITC结合(未示出)证实，并且与图3C中的数据一致，其显示该突变消除了CIS抑制JAK1磷酸化的能力。从SH2突变小鼠(CishR107K)纯化NK细胞，体外扩增10天并将绝对细胞数与来源于Cish+/+、Cish+/-和Cish-/-小鼠的NK细胞进行比较。CishR107K NK细胞数最接近来源于Cish-/-小鼠的那些细胞数(图14B)。CIS-R107K蛋白以与野生型蛋白相当的水平表达(图14C)，证实了细胞数的增加是CIS-SH2功能丧失的结果。这些初步数据表明磷酸肽结合的丧失足以再现Cish缺失，并且还表明阻断SH2功能特别是能够结合磷酸肽的化合物，将是药物开发的有效起点。
实施例16 CIS诱导的动力学与人NK细胞中JAK/STAT信号传导的抑制一致
人和小鼠CIS在氨基酸水平上具有90.7％同一性。类似地，人和小鼠JAK1具有94.4％同一性，而活化环具有100％保守性。原代人NK细胞和许多人NK细胞系的免疫印迹分析显示，IL-15处理1-2h诱导了CIS，并且伴随着JAK1和STAT5磷酸化减少。这些数据与CIS抑制JAK/STAT信号传导一致(图15)。此外，虽然用IL-15和蛋白酶体抑制剂(MG-132)处理原代人NK细胞2h足以提高总JAK1和CIS水平，但是JAK1磷酸化仍然减少(图15A)。这支持了以下前提：CIS经由JAK1的泛素化和JAK自磷酸化的抑制来抑制人NK细胞中的IL-15信号传导，与我们使用小鼠NK细胞的结果一致。
此外，IL-15处理在人NK细胞系NK-92和KHYG-1中诱导Cish mRNA(图16)。值得注意的是，Cish诱导的程度远大于Socs1和Socs3的观察结果，即使在很低水平，Socs1和Socs3也会被诱导(图16)。这很好地预示了，在无其他SOCS家族成员的补偿的情况下，CIS的抑制引起了IL-15信号传导的增强。
实施例17 CIS上的磷酸化和泛素化位点的鉴定
本发明人示出了CIS本身受蛋白酶体降解调节(图9D和图15A)，还提出了CIS的翻译后修饰可以调节N-末端/PEST介导的自体抑制。为了鉴定潜在磷酸化和泛素化位点，使FLAG标记的CIS在293T细胞中表达，并进行亲和力纯化，然后通过质谱分析。鉴定出六个磷酸化位点，其中五个位点在小鼠和人CIS之间是保守的(图17和表3)。在PEST基序(pSDpSPDPAPpT)内检测到三个磷酸化事件，与以下观点一致：磷酸化可以改变该基序的分子内定位和/或结合相互作用从而改变CIS功能。还鉴定了三个泛素化位点(图17，表3)，与之前报道一致(Jensik等人，2015)。这些结果鉴定了CIS内可以通过泛素化或磷酸化修饰的许多残基。
实施例18 CIS是具有升高的和功能性TGF-β的疾病中的治疗靶标
若干使用抗TGF-β防止EMT(上皮至间质转化)的临床试验正在进行中，然而TGF-β也是强效免疫抑制剂(Chen等人，2016)。本发明人发现，CIS裸NK细胞在很大程度上难以抑制体外TGF-β介导的增殖(图18)。
然而，虽然与野生型细胞相比，CIS裸NK细胞能够耐受TGF-β，但是TGF-β受体信号传导仍存在一些抑制作用，因为CIS裸NK细胞的增殖小于TGF-β受体裸NK细胞(TgfbRIIfl /fl)。因此，本发明人接下来研究了与单一疗法相比，体内阻断CIS和TGF-β是否将改善肿瘤结局。给野生型和Cish-/-小鼠注射1×106个BRAF突变黑素瘤细胞系(SM1LWT1)以及对照Ig、抗TGF-β(1D11)、BRAF抑制剂(PLX4720)或1D11+PLX4720。与离体CIS或TGF-β的抑制相比，CIS和TGF-β(抗TGF-β抗体，1D11)二者的抑制在14天引起肺中黑素瘤负荷的显著减少(图19)。此外，与CIS或BRAF的分别抑制相比，CIS和BRAF二者的抑制在14天引起类似的肺中黑素瘤负荷的显著减少。CIS、BRAF和TGF-β抑制的三重疗法几乎防止了肺中的SM1LWT1转移，表明人中的BRAF突变黑素瘤转移可能受益于CIS抑制与TGF-β或BRAF阻断的组合。
实施例19 Cish缺陷对于NK细胞依赖性抗转移疗法更有效
本发明人接下来试图将Cish缺陷与同期免疫疗法比较，包括免疫检查点阻断(抗PD-1、抗CTLA-4、抗CD96)和细胞因子(IFNα/β,IL-2)，它们促进了B16F10实验性转移模型中的NK细胞功能。值得注意的是，Cish缺陷型小鼠比用抗PD-1、I型IFN(IFN-αβ)或IL-2方案处理的野生型小鼠更能耐受B16F10肺转移(图20A)。所有这些免疫疗法的使用在治疗晚期人黑素瘤方面已取得了一定程度的成功。虽然B16F10转移的水平在cIg处理的Cish-/-小鼠中较低，但是I型IFN和IL-2治疗似乎都进一步减少转移(图20A)。另一个实验评估了B16F10的高剂量攻击，在此显而易见的是，在Cish-/-小鼠中抗PD-1/抗CTLA-4联合和IL-2二者均比cIg更有效(图20B)。具体地讲，低剂量IL-2在WT小鼠中是无效的，但在Cish-/-小鼠中是有效的。这种与WT小鼠相比IL-2在Cish-/-小鼠中的改善效果也在RMA-S腹膜内淋巴瘤模型中观察到(图20C)。这是人们所关注的，因为在WT和Cish-/-小鼠中，NK细胞介导的对照在未处理的或用PBS处理的对照处理小鼠中是等同的(图20C)。在第二实验性转移模型RM-1中进行的另外实验表明，Cish缺陷与抗PD-1/抗CTLA-4或抗CD96治疗联合具有优异的抗转移活性(图20D)。在Cish-/-小鼠中抗CD96的优异活性也在B16F10实验转移模型中观察到(图20E)。
总体来说，这些实验表明NK细胞抗转移活性的CIS调节独立于免疫检查点抗体的抗转移活性。最后，用BRAFV600E-突变转移性黑素瘤细胞系LWT1攻击小鼠，在Cish-/-小鼠中再次观察到显著减少的肺转移。通过用单独的或与PLX4720联合的BRAF抑制剂PLX4720(图20F)或MEK抑制剂(曲美替尼)(图21)处理进一步减少了该转移。总之，这些数据表明，靶向CIS能够很好地与其他免疫疗法联合，并且CIS作为NK细胞免疫疗法中的新靶标具有很大的前景。
实施例20肉瘤的治疗
Cish-/-小鼠对甲基胆蒽(MCA)诱导的纤维肉瘤形成具有高度耐受性(图22A)。NK细胞的消耗或IFNγ的中和再次显著降低了WT和Cish-/-小鼠的存活率，并且完全消除了Cish缺陷的保护作用(图22B)。在Cish-/-小鼠中观察到的保护免于实验性转移和癌症从头发生的程度是显著的，并且清楚地表明靶向CIS作为基于NK细胞的免疫疗法的新靶标是有前景的。这些结果与NK细胞中IL-15诱导的CIS表达，以及Cish的丧失赋予NK细胞对IL-15的超敏感性的观察结果一致(Delconte等人，2016)。
实施例21急性骨髓性白血病的治疗
NK细胞抗肿瘤功效的开创性实例处于单倍体相同的骨髓移植中，其中供体NK细胞与宿主急性骨髓性白血病(AML)强烈反应(Ruggeri等人，2016)，表明如果这种NK细胞充分活化，AML可能对自身NK细胞具有免疫原性。本发明人发现，当用编码AML诱导的癌基因MLL-AF9的慢病毒转染自身骨髓，并且注射至WT小鼠时，这些小鼠在注射后约40天死于AML(图23)。相比之下，如果用MLL-AF9表达骨髓注射Cish-/-宿主，则AML发生显著推迟，并且与100％的WT小鼠相比，仅约30％的小鼠死于AML(图23)。这些数据表明MLL-AF9+AML被NK细胞检测到并杀死，并且在不存在CIS的情况下，这显著增强。
实施例22 CIS缺陷促进体内NK细胞增殖和分化
初始实验表明，在体内稳态下，Cish-/-小鼠具有类似于Cish+/+小鼠的NK细胞数。当更深入地检查NK细胞时，显然Cish-/-NK细胞比野生型细胞更成熟(M2、DNAM1+KHLRG1+；图24A、B)并且循环更迅速(Ki67+；图24C)。鉴于总数保持一致(图24A)，这还表明Cish-/-NK细胞是垂死的和/或更迅速地从体内清除。
实施例23 MCA1956肉瘤的增强控制需要NK细胞和CD8 T细胞
当皮下注射免疫原性MCA诱导的纤维肉瘤MCA1956时，Cish-/-小鼠显示出比WT小鼠更好的肿瘤控制(图25)。虽然只有1/10的WT小鼠自发性排斥肿瘤，但5/10的Cish-/-小鼠在移植后第30天成功地清除原发性肿瘤(图25)。NK细胞或CD8β+T细胞的消耗加速了肿瘤生长并且消除了WT和Cish缺陷型小鼠中可见的差异(图25)。NK细胞是否直接控制MCA1956肿瘤的生长，或它们是否通过调节T细胞活性来发挥间接作用尚待阐明。综上所述，我们的数据表明，Cish缺陷主要改变了其中NK细胞至关重要的皮下肿瘤的自然生长。
实施例24 Cish-/-CD8 T细胞展现出增殖和IFNγ产生增加
鉴于NK细胞和CD8 T细胞之间转录调节、效应子程序和细胞因子依赖性的相似性，体内缺乏明显的CD8 T细胞表型稍微出乎意料。为了特别测试CD8 T细胞是否对IL-15或抗原受体刺激具有超应答性，将6-8周龄WT-Ly5.1(n＝3)和Cish-/--Ly5.2(n＝3)小鼠的外周淋巴结(收集，不包括肠系膜)加工为单细胞悬浮液。通过磁珠负选择富集样品的CD8+T细胞。然后用5μM CTV标记所得的细胞。WT和Cish-/-细胞在96孔板中的IMDM+10％FCS中，在IL-2+αCD3、IL-15+αCD3、IL-2+αCD28+αCD3和IL-15+αCD28+αCD3的条件下共培养。对于所有条件，包括αCD3-孔作为对照(未示出)。将孔设置为技术一式三份，以用于统计分析。同类系标记物允许检查单个孔内两种基因型。在37℃和5％C02下培养细胞。
通过用PMA/离子霉素刺激4小时，然后是细胞内染色和FACS分析来评估IFNγ产生。在所有测试条件下，Cish-/-CD8+T细胞响应于PMA/离子霉素刺激产生比野生型(WT)细胞显著更多的IFNΥ(图26)。
在培养的第4天通过FAC分析经由CTV稀释的增殖和表面标记物表达来检查培养物(图27)。在不存在αCD3刺激的情况下，在IL-15+培养物中可观察到最多7个分裂事件。确定每个分裂循环中的细胞数，并将其作为分裂数的函数作图(图27A)。在IL-2培养物中记录到类似的结果(未示出)。
在所有检查条件下，WT和Cish-/-CD8+T细胞均被发现增殖以及响应于刺激而产生IFNγ。在存在αCD3的情况下，所有培养物在第4天增殖达到最大，使基因型之间的比较难以进行(未示出)。然而，在不存在αCD3刺激的情况下，细胞数与分裂数的分析表明Cish-/-细胞在培养的第4天比WT对照增殖更迅速(图27B)。综上所述，这些结果表明，在体外条件下，Cish-/-CD8+T细胞增殖更迅速，并且与其WT对应物相比，显示出增强的效应子功能。这些初步结果是由前景的，然而更详细的增殖诱导条件分析将提供对Cish-/-CD8+T细胞中记录的增强表型的更深入了解。
实施例25肿瘤微环境中的IL-15的水平升高诱导肿瘤侵润性NK细胞中的Cish水平升高
本发明人确定IL-15迅速诱导培养NK细胞中的Cish表达，并且在IL-15刺激后1小时后诱导CIS蛋白表达。为了可视化体内Cish表达，利用Cish-lacZ报告基因(CishLacZ/+)小鼠品系。IL-15+/+或IL-15-/-小鼠(基质IL-15状态分别为+或–)经受致死剂量照射并用CishLacZ/+骨髓重建。10周后，使这些嵌合小鼠经受在乳腺脂肪垫中注射1×105个E0771乳腺癌细胞的攻击或保留未受攻击。一周后处死小鼠，收集乳腺肿瘤并切下，对肿瘤驻留的NK细胞进行β-半乳糖苷酶染色(Cish表达)并通过流式细胞术进行分析。观察到基质IL-15的存在显著增加了NK细胞中Cish表达约2倍(图28)。IL-15存在于基质中的NK细胞侵润性乳腺肿瘤显示出Cish表达增加，并且这在基质缺乏IL-15的小鼠中侵润乳腺肿瘤的NK细胞中最明显。在两种情况下，与乳腺脂肪垫NK细胞相比，NK细胞Cish水平在肿瘤驻留NK细胞中最大，表明IL-15水平在EO771肿瘤微环境中更高。鉴于该肿瘤受到NK细胞和对CIS功能丧失具有极大响应的模型的严格控制，我们的数据表明，肿瘤中IL-15水平的升高和肿瘤驻留NK细胞中Cish表达的增加是可能响应于小分子CIS抑制剂的肿瘤类型的预兆。
实施例26人Cish-/-NK细胞针对体内黑素瘤转移的评估(预测)
为了评估人Cish-/-NK细胞如何精密地再现小鼠Cish-/-NK细胞对肿瘤生长和体内转移的作用，我们将在淋巴小鼠(NOD/SCID/γC；NSG)中进行过继性细胞转移实验。对于过继性转移模型，给NSG小鼠静脉内注射5×106个体外扩增的人Cish+/+或同基因Cish-/-人NK细胞或PBS。然后8h后给小鼠注射1×106个BRAF突变患者来源的黑素瘤细胞，该细胞在我们实验室以细胞系维持。随后在第1天用1.5×106个体外扩增的Cish+/+或Cish-/-NK细胞或PBS静脉内递送处理小鼠。在肿瘤注射后第18天处死小鼠，并进行肺灌注。然后收集肺和肝并进行转移计数。
本领域的技术人员将会理解，可以如具体实施方案中所示对本发明进行许多变化和/或修改，而不脱离广泛描述的本发明的精神或范围。所以，本发明的实施方案在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。
本专利申请要求2016年12月16日提交的AU 2015905220的优先权，该专利的全部内容以引用的方式并入本文。
本文引用的所有出版物据此以引用的方式整体并入。当引用URL或其他此类标识符或地址时，应当理解此类标识符可改变，互联网上的具体信息是不断变化的，但等同的信息可通过搜索互联网获得。此类信息引用证实了其可用性和公开传播。
对已经包括在本说明书中的文档、法案、材料、装置、文章等等的任何讨论仅仅是出于为本发明提供背景的目的。并不视为承认任何或全部这些事项构成现有技术基础的一部分，或是与本发明相关的领域中的普通常识，因为它在本专利申请的每项权利要求的优先权日之前存在。
表3.CIS中检测到的磷酸化和泛素化位点汇总
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序列表
<110> 沃尔特及伊莱萨霍尔医学研究院
<120> NK细胞中对细胞因子诱导的SH2蛋白的抑制
<130> P181114988WP
<150> AU 2015905220
<151> 2015-12-16
<160> 38
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 磷酸化酪氨酸
<400> 1
Ala Ile Glu Thr Asp Lys Glu Tyr Tyr Thr Val Lys Asp Asp Arg Asp
1 5 10 15
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> X
<222> (3)..(3)
<223> [F2PMP]2-磷酸酪氨酰模拟物
4-(膦酰二氟甲基)苯基丙氨酸部分
<400> 2
Lys Glu Xaa Thr Val
1 5
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 磷酸化残基
<400> 3
Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 磷酸化酪氨酸
<400> 4
Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp Glu Gly
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 磷酸化酪氨酸
<400> 5
Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp
1 5 10
<210> 6
<211> 258
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Met Val Leu Cys Val Gln Gly Pro Arg Pro Leu Leu Ala Val Glu Arg
1 5 10 15
Thr Gly Gln Arg Pro Leu Trp Ala Pro Ser Leu Glu Leu Pro Lys Pro
20 25 30
Val Met Gln Pro Leu Pro Ala Gly Ala Phe Leu Glu Glu Val Ala Glu
35 40 45
Gly Thr Pro Ala Gln Thr Glu Ser Glu Pro Lys Val Leu Asp Pro Glu
50 55 60
Glu Asp Leu Leu Cys Ile Ala Lys Thr Phe Ser Tyr Leu Arg Glu Ser
65 70 75 80
Gly Trp Tyr Trp Gly Ser Ile Thr Ala Ser Glu Ala Arg Gln His Leu
85 90 95
Gln Lys Met Pro Glu Gly Thr Phe Leu Val Arg Asp Ser Thr His Pro
100 105 110
Ser Tyr Leu Phe Thr Leu Ser Val Lys Thr Thr Arg Gly Pro Thr Asn
115 120 125
Val Arg Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Ser Phe Arg Leu Asp Ser Asn Cys
130 135 140
Leu Ser Arg Pro Arg Ile Leu Ala Phe Pro Asp Val Val Ser Leu Val
145 150 155 160
Gln His Tyr Val Ala Ser Cys Thr Ala Asp Thr Arg Ser Asp Ser Pro
165 170 175
Asp Pro Ala Pro Thr Pro Ala Leu Pro Met Pro Lys Glu Asp Ala Pro
180 185 190
Ser Asp Pro Ala Leu Pro Ala Pro Pro Pro Ala Thr Ala Val His Leu
195 200 205
Lys Leu Val Gln Pro Phe Val Arg Arg Ser Ser Ala Arg Ser Leu Gln
210 215 220
His Leu Cys Arg Leu Val Ile Asn Arg Leu Val Ala Asp Val Asp Cys
225 230 235 240
Leu Pro Leu Pro Arg Arg Met Ala Asp Tyr Leu Arg Gln Tyr Pro Phe
245 250 255
Gln Leu
<210> 7
<211> 164
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Asp Leu Leu Cys Ile Ala Lys Thr Phe Ser Tyr Leu Arg Glu Ser Gly
1 5 10 15
Trp Tyr Trp Gly Ser Ile Thr Ala Ser Glu Ala Arg Gln His Leu Gln
20 25 30
Lys Met Pro Glu Gly Thr Phe Leu Val Arg Asp Ser Thr His Pro Ser
35 40 45
Tyr Leu Phe Thr Leu Ser Val Lys Thr Thr Arg Gly Pro Thr Asn Val
50 55 60
Arg Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Ser Phe Arg Leu Asp Ser Asn Cys Leu
65 70 75 80
Ser Arg Pro Arg Ile Leu Ala Phe Pro Asp Val Val Ser Leu Val Gln
85 90 95
His Tyr Val Ala Ser Cys Thr Ala Asp Thr Arg Ser Ala Thr Ala Val
100 105 110
His Leu Lys Leu Val Gln Pro Phe Val Arg Arg Ser Ser Ala Arg Ser
115 120 125
Leu Gln His Leu Cys Arg Leu Val Ile Asn Arg Leu Val Ala Asp Val
130 135 140
Asp Cys Leu Pro Leu Pro Arg Arg Met Ala Asp Tyr Leu Arg Gln Tyr
145 150 155 160
Pro Phe Gln Leu
<210> 8
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Ser Ser Ala Arg Ser Leu Gln His Leu Cys Arg Leu Val Ile Asn Arg
1 5 10 15
Leu Val Ala Asp Val Asp Cys Leu Pro Leu Pro Arg Arg Met Ala Asp
20 25 30
Tyr Leu Arg Gln Tyr Pro Phe Gln Leu
35 40
<210> 9
<211> 257
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 9
Met Val Leu Cys Val Gln Gly Ser Cys Pro Leu Leu Ala Val Glu Gln
1 5 10 15
Ile Gly Arg Arg Pro Leu Trp Ala Gln Ser Leu Glu Leu Pro Gly Pro
20 25 30
Ala Met Gln Pro Leu Pro Thr Gly Ala Phe Pro Glu Glu Val Thr Glu
35 40 45
Glu Thr Pro Val Gln Ala Glu Asn Glu Pro Lys Val Leu Asp Pro Glu
50 55 60
Gly Asp Leu Leu Cys Ile Ala Lys Thr Phe Ser Tyr Leu Arg Glu Ser
65 70 75 80
Gly Trp Tyr Trp Gly Ser Ile Thr Ala Ser Glu Ala Arg Gln His Leu
85 90 95
Gln Lys Met Pro Glu Gly Thr Phe Leu Val Arg Asp Ser Thr His Pro
100 105 110
Ser Tyr Leu Phe Thr Leu Ser Val Lys Thr Thr Arg Gly Pro Thr Asn
115 120 125
Val Arg Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Ser Phe Arg Leu Asp Ser Asn Cys
130 135 140
Leu Ser Arg Pro Arg Ile Leu Ala Phe Pro Asp Val Val Ser Leu Val
145 150 155 160
Gln His Tyr Val Ala Ser Cys Ala Ala Asp Thr Arg Ser Asp Ser Pro
165 170 175
Asp Pro Ala Pro Thr Pro Ala Leu Pro Met Ser Lys Gln Asp Ala Pro
180 185 190
Ser Asp Ser Val Leu Pro Ile Pro Val Ala Thr Ala Val His Leu Lys
195 200 205
Leu Val Gln Pro Phe Val Arg Arg Ser Ser Ala Arg Ser Leu Gln His
210 215 220
Leu Cys Arg Leu Val Ile Asn Arg Leu Val Ala Asp Val Asp Cys Leu
225 230 235 240
Pro Leu Pro Arg Arg Met Ala Asp Tyr Leu Arg Gln Tyr Pro Phe Gln
245 250 255
Leu
<210> 10
<211> 257
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 10
Met Val Leu Cys Val Gln Gly Ser Cys Pro Leu Leu Val Val Glu Gln
1 5 10 15
Ile Gly Gln Arg Pro Leu Trp Ala Gln Ser Leu Glu Leu Pro Gly Pro
20 25 30
Ala Met Gln Pro Leu Pro Thr Gly Ala Phe Pro Glu Glu Val Thr Glu
35 40 45
Glu Thr Pro Val Gln Ser Glu Asn Glu Pro Lys Val Leu Asp Pro Glu
50 55 60
Gly Asp Leu Leu Cys Ile Ala Lys Thr Phe Ser Tyr Leu Arg Glu Ser
65 70 75 80
Gly Trp Tyr Trp Gly Ser Ile Thr Ala Ser Glu Ala Arg Gln His Leu
85 90 95
Gln Lys Met Pro Glu Gly Thr Phe Leu Val Arg Asp Ser Thr His Pro
100 105 110
Ser Tyr Leu Phe Thr Leu Ser Val Lys Thr Thr Arg Gly Pro Thr Asn
115 120 125
Val Arg Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Ser Phe Arg Leu Asp Ser Asn Cys
130 135 140
Leu Ser Arg Pro Arg Ile Leu Ala Phe Pro Asp Val Val Ser Leu Val
145 150 155 160
Gln His Tyr Val Ala Ser Cys Thr Ala Asp Thr Arg Ser Asp Ser Pro
165 170 175
Asp Pro Ala Pro Thr Pro Ala Leu Pro Val Pro Lys Pro Asp Ala Pro
180 185 190
Gly Asp Pro Val Leu Pro Ile Pro Val Ala Thr Ala Val His Leu Lys
195 200 205
Leu Val Gln Pro Phe Val Arg Arg Ser Ser Ala Arg Ser Leu Gln His
210 215 220
Leu Cys Arg Leu Val Ile Asn Arg Leu Val Thr Asp Val Asp Cys Leu
225 230 235 240
Pro Leu Pro Arg Arg Met Ala Asp Tyr Leu Arg Gln Tyr Pro Phe Gln
245 250 255
Leu
<210> 11
<211> 1154
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Met Gln Tyr Leu Asn Ile Lys Glu Asp Cys Asn Ala Met Ala Phe Cys
1 5 10 15
Ala Lys Met Arg Ser Ser Lys Lys Thr Glu Val Asn Leu Glu Ala Pro
20 25 30
Glu Pro Gly Val Glu Val Ile Phe Tyr Leu Ser Asp Arg Glu Pro Leu
35 40 45
Arg Leu Gly Ser Gly Glu Tyr Thr Ala Glu Glu Leu Cys Ile Arg Ala
50 55 60
Ala Gln Ala Cys Arg Ile Ser Pro Leu Cys His Asn Leu Phe Ala Leu
65 70 75 80
Tyr Asp Glu Asn Thr Lys Leu Trp Tyr Ala Pro Asn Arg Thr Ile Thr
85 90 95
Val Asp Asp Lys Met Ser Leu Arg Leu His Tyr Arg Met Arg Phe Tyr
100 105 110
Phe Thr Asn Trp His Gly Thr Asn Asp Asn Glu Gln Ser Val Trp Arg
115 120 125
His Ser Pro Lys Lys Gln Lys Asn Gly Tyr Glu Lys Lys Lys Ile Pro
130 135 140
Asp Ala Thr Pro Leu Leu Asp Ala Ser Ser Leu Glu Tyr Leu Phe Ala
145 150 155 160
Gln Gly Gln Tyr Asp Leu Val Lys Cys Leu Ala Pro Ile Arg Asp Pro
165 170 175
Lys Thr Glu Gln Asp Gly His Asp Ile Glu Asn Glu Cys Leu Gly Met
180 185 190
Ala Val Leu Ala Ile Ser His Tyr Ala Met Met Lys Lys Met Gln Leu
195 200 205
Pro Glu Leu Pro Lys Asp Ile Ser Tyr Lys Arg Tyr Ile Pro Glu Thr
210 215 220
Leu Asn Lys Ser Ile Arg Gln Arg Asn Leu Leu Thr Arg Met Arg Ile
225 230 235 240
Asn Asn Val Phe Lys Asp Phe Leu Lys Glu Phe Asn Asn Lys Thr Ile
245 250 255
Cys Asp Ser Ser Val Ser Thr His Asp Leu Lys Val Lys Tyr Leu Ala
260 265 270
Thr Leu Glu Thr Leu Thr Lys His Tyr Gly Ala Glu Ile Phe Glu Thr
275 280 285
Ser Met Leu Leu Ile Ser Ser Glu Asn Glu Met Asn Trp Phe His Ser
290 295 300
Asn Asp Gly Gly Asn Val Leu Tyr Tyr Glu Val Met Val Thr Gly Asn
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Leu Gly Ile Gln Trp Arg His Lys Pro Asn Val Val Ser Val Glu Lys
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Glu Lys Asn Lys Leu Lys Arg Lys Lys Leu Glu Asn Lys His Lys Lys
340 345 350
Asp Glu Glu Lys Asn Lys Ile Arg Glu Glu Trp Asn Asn Phe Ser Tyr
355 360 365
Phe Pro Glu Ile Thr His Ile Val Ile Lys Glu Ser Val Val Ser Ile
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Asn Lys Gln Asp Asn Lys Lys Met Glu Leu Lys Leu Ser Ser His Glu
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Glu Ala Leu Ser Phe Val Ser Leu Val Asp Gly Tyr Phe Arg Leu Thr
405 410 415
Ala Asp Ala His His Tyr Leu Cys Thr Asp Val Ala Pro Pro Leu Ile
420 425 430
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435 440 445
Ala Ile Asn Lys Leu Arg Gln Glu Gly Ser Glu Glu Gly Met Tyr Val
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Leu Arg Trp Ser Cys Thr Asp Phe Asp Asn Ile Leu Met Thr Val Thr
465 470 475 480
Cys Phe Glu Lys Ser Glu Gln Val Gln Gly Ala Gln Lys Gln Phe Lys
485 490 495
Asn Phe Gln Ile Glu Val Gln Lys Gly Arg Tyr Ser Leu His Gly Ser
500 505 510
Asp Arg Ser Phe Pro Ser Leu Gly Asp Leu Met Ser His Leu Lys Lys
515 520 525
Gln Ile Leu Arg Thr Asp Asn Ile Ser Phe Met Leu Lys Arg Cys Cys
530 535 540
Gln Pro Lys Pro Arg Glu Ile Ser Asn Leu Leu Val Ala Thr Lys Lys
545 550 555 560
Ala Gln Glu Trp Gln Pro Val Tyr Pro Met Ser Gln Leu Ser Phe Asp
565 570 575
Arg Ile Leu Lys Lys Asp Leu Val Gln Gly Glu His Leu Gly Arg Gly
580 585 590
Thr Arg Thr His Ile Tyr Ser Gly Thr Leu Met Asp Tyr Lys Asp Asp
595 600 605
Glu Gly Thr Ser Glu Glu Lys Lys Ile Lys Val Ile Leu Lys Val Leu
610 615 620
Asp Pro Ser His Arg Asp Ile Ser Leu Ala Phe Phe Glu Ala Ala Ser
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Met Met Arg Gln Val Ser His Lys His Ile Val Tyr Leu Tyr Gly Val
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Cys Val Arg Asp Val Glu Asn Ile Met Val Glu Glu Phe Val Glu Gly
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Gly Pro Leu Asp Leu Phe Met His Arg Lys Ser Asp Val Leu Thr Thr
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Leu Glu Asp Lys Asp Leu Val His Gly Asn Val Cys Thr Lys Asn Leu
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<213> 智人
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<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
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<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 磷酸化酪氨酸
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<211> 12
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<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 磷酸化酪氨酸
<400> 23
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<210> 24
<211> 12
<212> PRT
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 磷酸化酪氨酸
<400> 24
Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly
1 5 10
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 磷酸化酪氨酸
<400> 25
Leu Val Thr Glu Tyr Gln Gly Asn Phe Ser Ala
1 5 10
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 磷酸化酪氨酸
<400> 26
Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Phe Cys His
1 5 10
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 磷酸化酪氨酸
<400> 27
Ile His Ser Pro Tyr Trp Pro Pro Pro Cys Tyr
1 5 10
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 磷酸化酪氨酸
<400> 28
Pro Pro Pro Cys Tyr Ser Leu Lys Pro Glu Ala
1 5 10
<210> 29
<211> 38
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> 磷酸化丝氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 磷酸化丝氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> 磷酸化苏氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> 泛素化赖氨酸
<400> 29
Ala Ala Asp Thr Arg Ser Asp Ser Pro Asp Pro Ala Pro Thr Pro Ala
1 5 10 15
Leu Pro Met Ser Lys Gln Asp Ala Pro Ser Asp Ser Val Leu Pro Ile
20 25 30
Pro Val Ala Thr Ala Val
35
<210> 30
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
Ser Asp Ser Pro Asp Pro Ala Pro Thr Pro Ala Leu Pro Met Ser Lys
1 5 10 15
<210> 31
<211> 40
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Arg Pro Leu Trp Ala Gln Ser Leu Glu Leu Pro Gly Pro Ala Met Gln
1 5 10 15
Pro Leu Pro Thr Gly Ala Phe Pro Glu Glu Val Thr Glu Glu Thr Pro
20 25 30
Val Gln Ala Glu Asn Glu Pro Lys
35 40
<210> 32
<211> 43
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Ser Asp Ser Pro Asp Pro Ala Pro Thr Pro Ala Leu Pro Met Ser Lys
1 5 10 15
Gln Asp Ala Pro Ser Asp Ser Val Leu Pro Ile Pro Val Ala Thr Ala
20 25 30
Val His Leu Lys Leu Val Gln Pro Phe Val Arg
35 40
<210> 33
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Gln Asp Ala Pro Ser Asp Ser Val Leu Pro Ile Pro Val Ala Thr Ala
1 5 10 15
Val His Leu Lys Leu Val Gln Pro Phe Val Arg Arg Ser Ser Ala Arg
20 25 30
<210> 34
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Val Leu Asp Pro Glu Gly Asp Leu Leu Cys Ile Ala Lys Thr Phe Ser
1 5 10 15
Tyr Leu Arg
<210> 35
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
Gln His Leu Gln Lys Met Pro Glu Gly Thr Phe Leu Val Arg
1 5 10
<210> 36
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Asp Ser Thr His Pro Ser Tyr Leu Phe Thr Leu Ser Val Lys Thr Thr
1 5 10 15
Arg Gly Pro Thr Asn Val Arg
20
<210> 37
<211> 36
<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Ser Asp Ser Pro Asp Pro Ala Pro Thr Pro Ala Leu Pro Met Ser Lys
1 5 10 15
Gln Asp Ala Pro Ser Asp Ser Val Leu Pro Ile Pro Val Ala Thr Ala
20 25 30
Val His Leu Lys
35
<210> 38
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Gln Asp Ala Pro Ser Asp Ser Val Leu Pro Ile Pro Val Ala Thr Ala
1 5 10 15
Val His Leu Lys Leu Val Gln Pro Phe Val Arg
20 25

Claims (64)

1.一种用于治疗患有NK细胞应答性病症或处于患有NK细胞应答性病症的风险中的受试者的方法，其包括向所述受试者施用CIS抑制剂。
2.一种过继性细胞治疗或预防的方法，其包括向患有NK细胞应答性病症或处于患有NK细胞应答性病症的风险中的受试者施用CIS抑制性NK细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述CIS抑制性NK细胞是自体的。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述CIS抑制性NK细胞是同种异体的。
5.如权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述CIS抑制性NK细胞是与CIS抑制剂接触的NK细胞。
6.如权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述CIS抑制性NK细胞是经遗传修饰为具有减少的CIS表达的NK细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述CIS抑制性NK细胞是Cish-/-。
8.如权利要求1或权利要求5所述的方法，其中所述CIS抑制剂是肽、肽模拟物、小分子、多核苷酸或多肽。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述肽是磷酸肽或磷酸模拟肽。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述多肽是抗CIS抗体或其抗原结合片段。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述多核苷酸是dsRNA。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述dsRNA是shRNA、siRNA或miRNA。
13.如权利要求8所述的方法，其中所述多核苷酸作为用于表达所述多核苷酸的载体提供。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述载体是病毒载体。
15.如权利要求8所述的方法，其中多核苷酸是化学修饰的mRNA。
16.如权利要求13或权利要求15所述的方法，其中所述多核苷酸编码显性阴性CIS抑制剂。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述编码的显性阴性抑制剂是CIS-R107K。
18.如权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述CIS抑制剂竞争性抑制CIS与JAK1和/或JAK3的结合。
19.如权利要求18所述的方法，其中JAK1是磷酸化JAK1和/或JAK3是磷酸化JAK3。
20.如权利要求19所述的方法，其中磷酸化JAK1在Tyr1034处被磷酸化和/或磷酸化JAK3在Tyr980处被磷酸化。
21.如权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述CIS抑制剂竞争性抑制CIS与在Tyr355、Tyr361和Tyr392中的一个或多个处被磷酸化的IL-2Rβ的结合。
22.如权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述CIS抑制剂竞争性抑制CIS与延伸蛋白B、延伸蛋白C或滞蛋白-5中的一个或多个的结合。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，还包括向所述受试者施用IL-15或IL-15激动剂。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，还包括施用B Raf蛋白激酶抑制剂或MEK蛋白激酶抑制剂。
25.如权利要求1至2423中任一项所述的方法，还包括施用免疫治疗剂。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述免疫治疗剂包括针对程序性细胞死亡1受体(PD-1)的抗体、针对程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体、针对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的抗体、针对转化生长因子β(TGF-b)的抗体、针对Tactile(CD96)的抗体或它们的组合。
27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述受试者患有癌症或感染，或被确定为处于患有癌症或感染的风险中。
28.如权利要求27所述的方法或用途，其中所述癌症包括肿瘤。
29.如权利要求27或权利要求28所述的方法，其中所述癌症是转移性黑素瘤、转移性前列腺癌、转移性乳腺癌、三阴性乳腺癌、膀胱癌、脑癌、食道癌、肝癌、头颈癌、鳞状细胞肺癌、非小细胞肺癌、梅克尔细胞癌、肉瘤、肝细胞癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、胃癌、肾癌、转移性肾细胞癌、白血病、卵巢癌和恶性胶质瘤。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述癌症是转移性黑素瘤、转移性前列腺癌或转移性乳腺癌。
31.如权利要求27至30中任一项所述的方法，其中所述受试者已接受癌症治疗相关的同种异体组织移植。
32.如权利要求27所述的方法，其中所述感染是病毒感染。
33.如权利要求32所述的方法或用途，其中所述病毒感染是单纯疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒、人巨细胞病毒、流感病毒、痘病毒或乳头瘤病毒感染。
34.一种用于鉴定CIS抑制剂的方法，其包括：
i)在存在测试剂的情况下使CIS或其片段与至少一种CIS结合配偶体接触；以及
ii)确定所述测试剂是否与所述CIS结合配偶体竞争CIS或其片段的结合；以及
iii)任选地，如果在步骤ii)中所述测试剂显示出与所述CIS结合配偶体竞争CIS或其片段的结合，则将所述测试剂鉴定为CIS抑制剂。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述CIS结合配偶体选自JAK1、JAK3、IL-2Rβ、延伸蛋白B、延伸蛋白C、滞蛋白5及其片段。
36.一种用于鉴定CIS抑制剂的方法，其包括：
i)使CIS或其片段与测试剂接触；以及
ii)确定所述测试剂是否结合至CIS或其片段。
37.如权利要求36所述的方法，还包括确定所述测试剂是否与CIS PEST结构域肽或CISN-末端肽竞争CIS或其片段的结合。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述CIS PEST结构域肽的序列选自SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:37。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述CIS N-末端结构域肽的序列选自SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:34。
40.一种用于鉴定CIS抑制剂的方法，其包括：
i)在存在以下物质的情况下，体外温育磷酸化JAK1蛋白或其CIS结合片段：
(a)三聚体复合物，其包含CIS或其片段，所述CIS或其片段包含至少SH2结构域和SOCS框；延伸蛋白B；和延伸蛋白C；
(b)泛素化混合物；以及
(c)测试剂；以及
ii)相对于在不存在所述测试剂的情况下CIS诱导的泛素化的水平，确定所述测试剂是否抑制CIS诱导的所述磷酸化JAK1蛋白或片段泛素化。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述泛素化混合物包含：滞蛋白5、Rbx2、E1、E2和游离的泛素。
42.一种用于鉴定CIS抑制剂的方法，其包括：
i)在存在以下物质的情况下体外温育包含JH1激酶结构域的JAK1蛋白或其片段：
(a)三聚体复合物，其包含CIS或其片段，所述CIS或其片段包含至少SH2结构域和SOCS框；延伸蛋白B和延伸蛋白C；
(b)JAK1激酶底物；以及
(c)测试剂；以及
ii)相对于在不存在所述测试剂的情况下所述JAK1激酶底物的磷酸化，确定所述测试剂是否增加所述JAK1激酶底物的磷酸化。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述JAK1激酶底物是STAT5蛋白或STAT5肽。
44.一种用于计算机模拟鉴定CIS抑制剂的方法，其包括：
i)生成CIS或其片段的三维结构模型；以及
ii)计算机模拟设计或筛选结合至所述建模结构的测试剂。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述三维结构模型是CIS或其片段结合至JAK1蛋白或其CIS结合片段；或JAK3蛋白或其CIS结合片段的复合物。
46.一种用于鉴定CIS抑制剂的方法，其包括：
i)提供表达CIS的细胞；以及
ii)与未接触所述测试剂的细胞相比，确定所述测试剂是否降低所述细胞中的CIS活性。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述细胞是NK细胞。
48.如权利要求47所述的方法，其中步骤ii)包括确定所述测试剂在NK细胞中对IL 15可诱导应答的作用。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述IL-15可诱导应答是NK细胞增殖、干扰素-γ(IFN-γ)产生、细胞内粒酶表达、JAK1酪氨酸磷酸化、JAK1降解、基因表达的调节或细胞毒性。
50.如权利要求46至49中任一项所述的方法，其中所述测试剂在权利要求34至42中任一项所述的方法中被鉴定为CIS抑制剂。
51.如权利要求46至450中任一项所述的方法，其中所述CIS活性是JAK1激酶活性的抑制、STAT5酪氨酸磷酸化的抑制、STAT5启动子活性的下调或JAK1降解的增加。
52.如权利要求34至51中任一项所述的方法，其中所述CIS或其片段的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:6-10中的任一者具有至少80％同一性的氨基酸序列。
53.CIS抑制剂在制造用于治疗或预防受试者中的NK细胞应答性病症的药物中的用途。
54.CIS抑制性NK细胞在制造用于治疗或预防受试者中的NK细胞应答性病症的药物中的用途。
55.CIS抑制剂作为用于治疗或预防受试者中的NK细胞应答性病症的药物的用途。
56.CIS抑制性NK细胞作为用于治疗或预防受试者中的NK细胞应答性病症的药物的用途。
57.一种用于治疗或预防NK细胞应答性病症的CIS抑制剂。
58.一种用于确定患有肿瘤的患者中对CIS抑制的治疗应答的可能性的方法，所述方法包括确定肿瘤微环境中IL-15的水平，其中所述肿瘤微环境中IL-15的水平相对于IL-15的阈值水平升高表示对所述治疗应答的可能性更高。
59.一种用于评估患有肿瘤的受试者中的肿瘤侵润性NK细胞中的Cish表达升高的诱导的方法，所述方法包括确定肿瘤微环境中IL-15的水平，其中所述肿瘤微环境中IL-15的水平相对于IL-15的阈值水平升高表示诱导所述肿瘤侵润性NK细胞中的Cish表达升高。
60.一种用于增加NK细胞对IL-15的应答的方法，所述方法包括抑制NK细胞中的CIS。
61.如权利要求60所述的方法，其包括将CIS抑制剂以足以增加受试者中NK细胞的应答的量向所述受试者施用。
62.如权利要求60所述的方法，其中所述方法包括降低所述NK细胞中CIS的表达。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述CIS表达的降低在所述离体NK细胞中进行。
64.如权利要求62所述的方法，其中所述CIS表达的降低在所述体内NK细胞中进行。
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