JP6966678B2 - Ｎｋ細胞におけるサイトカイン誘導性ｓｈ２タンパク質の阻害 - Google Patents

Description

本明細書は、全体として治療剤の分野に関する。より詳細には、本明細書は、ＮＫ細胞媒介性療法に適する健康状態を予防または治療するための方法に関する。

腫瘍増殖及び感染の抑制における免疫系の役割は周知であり、免疫による検出を避けることががんの発症における重要な因子であることは現在通説である。例えば、細胞傷害性リンパ球（ナチュラルキラー（ＮＫ）及びＣＤ８エフェクターＴ細胞等）は、がん免疫編集を介して抗腫瘍免疫に寄与する。しかしながら、腫瘍及び感染性病原体（例えばウイルス）は、これらの細胞傷害性リンパ球を不能にする多様なメカニズムを利用する。多機能サイトカインＩＬ−１５は、ＮＫ細胞の発生、恒常性及び活性化の重要な調節因子であるにもかかわらず、ＮＫ細胞活性化に対するその効果は短期間であり、そのことは多様ながん及び感染の文脈におけるＮＫ細胞媒介性応答の有効性を限定する。今日まで、ＮＫ細胞応答を抑制する阻害シグナルの理解への大きな関心があったが、細胞内のＩＬ−１５シグナリングのスイッチがどのようにオフにされるのかは、依然として明らかではない。

したがって、ＮＫ細胞への応答の可能性のある多様な健康状態（がんが含まれる）の有効な治療のためのＮＫ細胞応答を引き起こす一方で、大部分の化学療法剤にある破壊的な副作用を避ける、新しいストラテジーを同定する継続的な必要性がある。

本発明者は、サイトカイン誘導性ＳＨ２タンパク質（ＣＩＳ）の阻害を使用して、数多くのＮＫ細胞応答性病態（ある特定のがん及び感染が含まれる）を治療できることを見出した。

したがって、一態様において、本発明は、ＣＩＳ阻害物質を被験体へ投与することを含む、ＮＫ細胞応答性病態を患う被験体またはＮＫ細胞応答性病態を患うリスクがある被験体を治療するための方法を提供する。

別の態様において、本発明は、ＮＫ細胞応答性病態を患う被験体またはＮＫ細胞応答性病態を患うリスクがある被験体へＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞を投与することを含む、養子細胞療法または予防のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞は自己由来である。他の実施形態において、ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞は同種異系である。いくつかの実施形態において、ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞は、ＣＩＳ阻害物質と接触させたＮＫ細胞である。

いくつかの実施形態において、ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞は、プログラム可能なヌクレアーゼによる遺伝子編集によって、または遺伝子サイレンシング（ＲＮＡ干渉）によって等で、ＣＩＳの発現を低減させるように遺伝的に修飾されたＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝的に修飾されたＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞はＣｉｓｈ^−／−である。いくつかの実施形態において、Ｃｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞はヒトＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞である。

上記の態様のうちの任意のものに関連して、いくつかの実施形態において、ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞の投与または生成に使用される、ＣＩＳ阻害物質は、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＣＩＳ阻害物質は、ＪＡＫ１及び／またはＪＡＫ３へのＣＩＳの結合を競合的
に阻害する。いくつかの実施形態において、ＣＩＳ阻害物質は、リン酸化ＪＡＫ１（例えばＴｙｒ１０３４でリン酸化されたＪＡＫ１）及び／またはリン酸化ＪＡＫ３（例えばＴｙｒ９８０でリン酸化されたＪＡＫ３）へのＣＩＳの結合を競合的に阻害する。さらなる実施形態において、ＣＩＳ阻害物質は、エロンギンＢ、エロンギンＣまたはカリン−５のうちの１つまたは複数へのＣＩＳの結合を競合的に阻害する。

いくつかの実施形態において、ＣＩＳ阻害物質がペプチドである場合に、ペプチドはホスホペプチドまたはリン酸化模倣ペプチドである。

いくつかの実施形態において、ＣＩＳ阻害物質がポリペプチドである場合に、ポリペプチドは抗ＣＩＳ抗体またはその抗原結合断片である。

いくつかの実施形態において、ＣＩＳ阻害物質がポリヌクレオチドである場合に、ポリヌクレオチドはｄｓＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ ＣＩＳ阻害物質は、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドＣＩＳ阻害物質の発現のためのベクターとして提供される。いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドＣＩＳ阻害物質は、ＣＩＳのドミナントネガティブ阻害物質をコードする。いくつかの実施形態において、コードされたドミナントネガティブ阻害物質は、Ｒ１０７Ｋ置換を含む、ＣＩＳのアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、コードされたドミナントネガティブ阻害物質は、Ｌ２２３Ａ置換を備えた、ＣＩＳのアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＣＩＳ阻害物質がポリヌクレオチドである場合に、ポリヌクレオチドは化学的に修飾されたｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、化学的に修飾されたｍＲＮＡは、ＣＩＳのドミナントネガティブ阻害物質（例えばＣＩＳ−Ｒ１０７Ｋ）をコードする。

いくつかの実施形態において、ＣＩＳ阻害物質が小分子である場合に、小分子ＣＩＳ阻害物質はＣＩＳを不安定化する。いくつかの実施形態において、小分子ＣＩＳ阻害物質がＣＩＳの不安定化によって作用する場合に、小分子ＣＩＳ阻害物質は脱ユビキチン化酵素阻害物質である。

いくつかの実施形態において、治療または予防の上述の方法のうちの任意のものは、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５アゴニストを被験体へ投与することをさらに含む。

他の実施形態において、治療または予防の上述の方法のうちの任意のものは、Ｂ−Ｒａｆプロテインキナーゼ阻害物質またはＭＥＫプロテインキナーゼ阻害物質を投与することをさらに含む。

いくつかの実施形態において、治療または予防の上述の方法のうちの任意のものは、免疫療法剤を投与することをさらに含む。かかる免疫療法剤の例としては、プログラム細胞死１受容体（ＰＤ−１）に対する抗体、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に対する抗体、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）に対する抗体、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−ｂ）に対する抗体、タクタイル（Ｔａｃｔｉｌｅ）（ＣＤ９６）に対する抗体、またはその組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記の治療のうちの任意のものは、ＴＧＦ−β受容体アンタゴニストの投与をさらに含み得る。

治療または予防の上述の方法のうちのいくつかの実施形態において、被験体はがんを患
うか、またはがんもしくは感染を患うリスクがあることが決定される。

いくつかの実施形態において、被験体ががんを患う場合に、がんは腫瘍の存在によって特徴づけられる。いくつかの実施形態において、被験体ががんを患うかまたはがんを患うリスクがある場合に、がんは、転移性メラノーマ、転移性前立腺癌、転移性乳癌、トリプルネガティブ乳癌、膀胱癌、脳腫瘍、食道癌、肝臓癌、頭頸部癌、肺扁平上皮細胞癌、非小細胞肺癌、メルケル細胞癌、肉腫、肝細胞癌、多発性骨髄腫、膵臓癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、胃癌、腎臓癌、転移性腎細胞癌、白血病、卵巣癌及び悪性神経膠腫である。いくつかの好ましい実施形態において、がんは、転移性メラノーマ、転移性前立腺癌または転移性乳癌である。いくつかの実施形態において、被験体ががんを患う場合に、被験体は、がんのための治療と関連する同種異系の組織移植を受けている。

他の実施形態において、被験体が感染を患うかまたは患うリスクがある場合に、感染はウイルス感染である。いくつかの実施形態において、被験体がウイルス感染を患う場合に、ウイルス感染は、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、ポックスウイルス、またはパピローマウイルスによる感染である。

別の態様において、本発明は、
ｉ）試験剤の存在下において、少なくとも１つのＣＩＳ結合パートナーとＣＩＳまたはその断片を接触させることと；
ｉｉ）試験剤が、ＣＩＳまたはその断片への結合についてＣＩＳタンパク質結合パートナーと競合するかどうかを決定することと；
ｉｉｉ）随意に、ステップｉｉ）において、ＣＩＳまたはその断片への結合についてＣＩＳタンパク質結合パートナーと競合することが示されるならば、試験剤をＣＩＳ阻害物質として同定することと、
を含む、ＣＩＳ阻害物質を同定するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＣＩＳ結合パートナーは、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３及びＩＬ−２Ｒβ、エロンギンＢ、エロンギンＣ及びカリン５またはその断片の中から選択される。

関連する態様において、本発明は、
ｉ）ＣＩＳまたはその断片を試験剤と接触させることと；
ｉｉ）試験剤が、ＣＩＳまたはその断片へ結合するかどうかを決定することと、
を含む、ＣＩＳ阻害物質を同定するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、試験剤が、ＣＩＳまたはその断片への結合についてＣＩＳ ＰＥＳＴドメインペプチドまたはＣＩＳ Ｎ末端ペプチドと競合するかどうかを決定することを、さらに含む。いくつかの実施形態において、ＣＩＳ ＰＥＳＴドメインペプチドの配列は、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３２及び配列番号：３７からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｎ末端ペプチドの配列は、配列番号：３１及び配列番号：３４からなる群から選択される。

別の関連する態様において、本発明は、
ｉ）リン酸化ＪＡＫ１タンパク質またはそのＣＩＳ結合断片を、
（ａ）少なくともＳＨ２ドメイン及びＳＯＣＳボックスを含むＣＩＳまたはその断片；エロンギンＢ；ならびにエロンギンＣを含む、三量体複合体と；
（ｂ）ユビキチン化混合物と；
（ｃ）試験剤と
の存在下において、インビトロでインキュベーションすることと；
ｉｉ）試験剤が、試験剤の非存在下におけるＣＩＳ誘導性ユビキチン化のレベルに比べて、リン酸化ＪＡＫ１タンパク質または断片のＣＩＳ誘導性ユビキチン化を阻害するかど
うかを決定することと、
を含む、ＣＩＳ阻害物質を同定するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、ユビキチン化混合物は、カリン５、Ｒｂｘ２、Ｅ１、Ｅ２及び遊離ユビキチンを含む。

さらに関連する態様において、本発明は、
ｉ）そのＪＨ１キナーゼドメインを含むＪＡＫ１タンパク質またはその断片を、
（ａ）少なくともＳＨ２ドメイン及びＳＯＣＳボックスを含むＣＩＳまたはその断片；エロンギンＢ；ならびにエロンギンＣを含む、三量体複合体と；
（ｂ）ＪＡＫ１キナーゼ基質と；
（ｃ）試験剤と
の存在下において、インビトロでインキュベーションすることと；
ｉｉ）試験剤が、試験剤の非存在下におけるＪＡＫ１キナーゼ基質のリン酸化に比べて、ＪＡＫ１キナーゼ基質のリン酸化を増加させるかどうかを決定することと、
を含む、ＣＩＳ阻害物質を同定するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＪＡＫ１キナーゼ基質は、ＳＴＡＴ５タンパク質またはＳＴＡＴ５ペプチドである。

別の関連する態様において、本発明は、
ｉ）ＣＩＳまたはその断片の三次元構造モデルを生成することと；
ｉｉ）モデル化された構造へ結合する試験剤についてインシリコでデザインまたはスクリーニングすることと、
を含む、ＣＩＳ阻害物質をインシリコで同定するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、三次元構造モデルは、ＪＡＫ１タンパク質もしくはそのＣＩＳ結合断片；またはＪＡＫ３タンパク質もしくはそのＣＩＳ結合断片へ結合された、ＣＩＳまたはその断片の複合体である。

別の関連する態様において、本発明は、
ｉ）ＣＩＳを発現する細胞を提供することと；
ｉｉ）試験剤が、試験剤と接触させない細胞に比較した場合に、細胞におけるＣＩＳ活性を低減するかどうかを決定することと、
を含む、ＣＩＳ阻害物質を同定するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、査定されるＣＩＳ活性は、ＪＡＫ１キナーゼ活性の阻害、ＳＴＡＴ５チロシンリン酸化の阻害、ＳＴＡＴ５プロモーター活性のダウンレギュレーション、またはＪＡＫ１の分解の増加である。いくつかの実施形態において、この方法において使用される細胞はＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、使用される細胞がＮＫ細胞である場合に、ステップｉｉ）は、ＮＫ細胞におけるＩＬ １５により誘導可能な応答に対する試験剤の効果を決定することを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−１５により誘導可能な応答は、ＮＫ細胞増殖、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生、細胞内グランザイム発現、ＪＡＫ１チロシンリン酸化、ＪＡＫ１分解、遺伝子発現の修飾、または細胞傷害性である。

いくつかの実施形態において、細胞ベースのスクリーニング方法において使用される試験剤は、記載された他のＣＩＳ阻害物質同定方法のうちの任意のものにおいて候補ＣＩＳ阻害物質であると事前に決定されていた。

ＣＩＳ阻害物質を同定するための上述の方法のうちの任意のもののいくつかの実施形態において、試験剤は、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドである。

ＣＩＳ阻害物質を同定するための上述の方法のうちの任意のもののいくつかの実施形態において、ＣＩＳまたはその断片のアミノ酸配列は、配列番号：６〜１０のうちの任意の
１つへ少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。

別の態様において、本発明は、被験体におけるＮＫ細胞応答性病態の治療または予防のための医薬品の製造におけるＣＩＳ阻害物質の使用を提供する。

さらなる態様において、本発明は、被験体におけるＮＫ細胞応答性病態の治療または予防のための医薬品の製造におけるＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞の使用を提供する。

別の態様において、本発明は、被験体におけるＮＫ細胞応答性病態の治療または予防のための医薬品としてのＣＩＳ阻害物質の使用を提供する。

別の態様において、本発明は、被験体におけるＮＫ細胞応答性病態の治療または予防のための医薬品としてのＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞の使用を提供する。

さらなる態様において、本発明は、ＮＫ細胞応答性病態の治療または予防における使用のためのＣＩＳ阻害物質を提供する。

さらに別の態様において、本発明は、腫瘍を患う患者において、患者におけるＣＩＳ阻害による治療への応答性の尤度を決定するための方法であって、腫瘍微小環境中のＩＬ−１５を１レベル決定することを含み、そこで、ＩＬ−１５の閾値レベルに比べた腫瘍微小環境中のＩＬ−１５のレベルの上昇が、治療への応答性の尤度がより高いことを指摘する、前記方法を提供する。

関連する態様において、本発明は、腫瘍を患う被験体において、腫瘍浸潤ＮＫ細胞におけるＣｉｓｈ発現の上昇の誘導を査定する方法であって、腫瘍微小環境中のＩＬ−１５を１レベル決定することを含み、そこで、ＩＬ−１５の閾値レベルに比べた腫瘍微小環境中のＩＬ−１５のレベルの上昇が、腫瘍浸潤ＮＫ細胞におけるＣｉｓｈ発現の上昇の誘導を指摘する、前記方法を提供する。

ＮＫ細胞のＩＬ−１５への応答性を増加させる方法であって、ＮＫ細胞におけるＣＩＳを阻害することを含む、前記方法も提供される。一実施形態において、かかる方法は、ＣＩＳ阻害物質を被験体へ投与することを含む。別の実施形態において、ＮＫ細胞のＩＬ−１５への応答性を増加させる方法は、ＮＫ細胞におけるＣＩＳの発現を低減することを含む。いくつかの実施形態において、ＣＩＳ発現の低減は、ＮＫ細胞においてエクスビボで実行される。他の実施形態において、ＣＩＳ発現の低減は、インビボの（例えばヒト被験体における）ＮＫ細胞である。本明細書における任意の実施形態は、特別に具体的に明示されない限り、必要な変更を加えて任意の他の実施形態に適用されると見なすべきである。例えば、当業者が理解するように、上で略述される本発明の方法のための阻害物質及び健康状態の例は、本発明の使用及び医薬組成物へ等しく適用される。

本発明は、本明細書において記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されず、これらは例示のみの目的が意図される。本明細書において記載されるような、機能的に等価な産物、組成物及び方法は、明らかに本発明の範囲内である。

本明細書を通して、特別に具体的に明示されないか、または特別に文脈が要求しない限り、単一のステップ、物質の組成物、ステップの群、または物質の組成物の群への参照は、それらのステップ、物質の組成物、ステップの群、または物質の組成物の群のうちの１つ及び複数（すなわち１つまたは複数）を包含すると見なされるだろう。

本発明は、以下の非限定的実施例によって、及び添付の図を参照して、以下に記載され
る。

ＣＩＳ欠損ＮＫ細胞は、ＩＬ−１５に応答して、優れた増殖、生存及び殺傷を提示する。（ａ）培養した野生型ＮＫ細胞を洗浄し、ＩＬ−１５について飢餓状態にし、その後に示される時間で５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５によりインキュベーションした。細胞を採取し、ＳＯＣＳ ｍＲＮＡの発現についてＱ−ＰＣＲによって分析した。（ｂ）ＮＫ細胞を（ａ）におけるように処理し、溶解し、ＣＩＳタンパク質発現についてウエスタンブロットによって分析した。（ｃ）ＮＫ細胞（ＮＫ１．１^＋ＮＫｐ４６^＋ＴＣＲ−β⁻）をフローサイトメトリーによってプロファイリングし、野生型マウス（Ｃｉｓｈ^＋／＋）及びＣｉｓｈ欠損マウス（Ｃｉｓｈ^−／−）の骨髄、肝臓、肺及び脾臓において列挙した。（ｄ）Ｃｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞及びＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞をそれぞれＣＦＳＥ及びＣＴＶにより標識し、フローサイトメトリーによる分析の前に、ＩＬ−１５の濃度を増加させて（５〜４０ｎｇ／ｍｌ）１：１の比で５日間培養した。プロットは５つの独立した実験の代表である。（ｅ）新たに単離した脾臓のＣｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞及びＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞を、免疫グロブリン対照（ｃＩｇ；陰性対照）、抗ＮＫ１．１抗体、抗ＮＫｐ４６抗体、抗Ｌｙ４９Ｈ抗体（抗ウイルス応答を付与する）またはＩＬ−１２／ＩＬ−１８（陽性対照）によりコーティングした組織培養プレート中で、ＩＬ−１５中で、４時間培養し、フローサイトメトリーによってＩＦＮ−γ産生及びＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ−１）発現について分析した。（ｆ）Ｃｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞及びＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞をＩＬ−１５中で増殖させ、示されるＮＫ：ＣＨＯ（Ｅ：Ｔ；エフェクター：標的）比で、ＣＨＯ標的細胞と共に経時的に共培養した。正規化したＣＨＯ細胞指数をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムを使用して決定した。（ｇ）Ｃｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞及びＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞をＩＬ−１５中で培養し（７日間）、ＲＮＡシーケンシングを実行した。Ｃｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞において差異的に発現される選択された遺伝子を、１００万リードあたりのエクソンの１キロベースあたりのリード（ＲＰＫＭ）として示す。図８及び表１も参照されたい。 ＣＩＳは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナリングの標的化によってＩＬ−１５シグナリングを負に調節する。（ａ）Ｃｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞及びＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞を精製し、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５中でエクスビボで２１時間培養した。ＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）及びＩＬ−２Ｒγ（ＣＤ１３２）の表面発現をフローサイトメトリーによって決定した。各々のヒストグラムは、個別のマウスに由来するＮＫ細胞を表わす。（ｂ）ＮＫ細胞をＣｉｓｈ^＋／＋脾臓及びＣｉｓｈ^−／−脾臓から精製し、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５によりインビトロでインキュベーションした。（ｃ）あるいは、ＮＫ細胞を精製し、７〜１０日間培養し、洗浄し、ＩＬ−１５処理の前に４時間ＩＬ−１５なしで休止させた。細胞を溶解し、示されるリン酸化（ｐ）タンパク質及び全タンパク質への抗体によりウエスタンブロットすることによって分析した。（ｄ）ＪＡＫ阻害物質ＣＹＴ３８７の修飾Ｎ−リンカーアナログをＮＨＳ−セファロースビーズへカップリングし、親和性試薬として使用して、（ｃ）におけるように生成した細胞溶解物からＪＡＫキナーゼをエンリッチした。エンリッチしたキナーゼを溶出し、トリプシンにより消化し、質量分析法によって分析した。合計のＪＡＫ１ペプチド及びＪＡＫ３ペプチドの強度は、Ｃｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞及びＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞から示される。平均±標準誤差、＊＊ｐ≦０．００５；ｎ＝３の生物学的反復（ｅ及びｆ）ＣＹＴ−３８７のエンリッチメントから６９のユニークなタンパク質キナーゼが同定され、そのうちの１６は有意な差異的発現を示した。火山型プロット（ｅ）は、定量的パイプライン分析に後続するＬｏｇ２タンパク質比を示す（Ｃｉｓｈ^＋／＋ ｖｓ Ｃｉｓｈ^−／−）。赤色線及び黄色線はタンパク質発現における２倍の変化（ｌｏｇ２比が１）を表わし、その一方で、青色線及び緑色線は４倍の変化（ｌｏｇ２比が２）を表わし；点は適宜着色され、個別のタンパク質を表わす。１．３以上の−ｌｏｇ１０ ｐ値のタンパク質は、差異的に多量であると見なされた。ヒートマップ（ｆ）は、有意な差異的発現を備えたキナーゼについてのＬｏｇ２変換された合計のペプチド強度（補完されない）を提示する。個別の反復からのデータが示される（ｎ＝３）。緑色から赤色は発現レベルの増加を指摘する。遺伝子オントロジー分析から、細胞周期及びＤＮＡ複製に関与するキナーゼのＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞におけるエンリッチメントが明らかにされた。図８も参照されたい。 ＣＩＳはＪＡＫ活性化ループへ結合して、ＪＡＫ１キナーゼ活性を阻害し、それをプロテアソーム分解のために標的化する。（ａ）等温熱量測定（ＩＴＣ）を使用して、ＪＡＫ１／３キナーゼドメイン活性化ループ及びＩＬ−２Ｒβ細胞質ドメイン内のチロシンへ対応するホスホペプチドへのｈＣＩＳ−ＳＨ２−ＢＣ結合の親和性を測定した。２つの独立した実験からの平均±標準偏差を示す結果の表。Ｎ．Ｄ．＝検出可能でない、ｐ＝リン酸化。（ｂ及びｃ）フラッグタグ付けされたＪＡＫ１及びＪＡＫ３を、フラッグタグ付けされたＣＩＳ、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ３、またはＣＩＳ突然変異体と一緒に２９３Ｔ細胞中で発現させ、このＣＩＳ突然変異体では、ＳＨ２ドメイン（ｍＳＨ２；Ｒ１０７Ｋ）またはＳＯＣＳボックス中のカリン−５結合部位（ｍＳＢ；Ｐ２４１Ａ／Ｌ２４２Ａ／Ｐ２４３Ａ）が突然変異させられた。いくつかの事例において、細胞をプロテアソーム阻害物質（ＭＧ１３２）により処理した。細胞を溶解し、抗フラッグビーズを使用してタンパク質を免疫沈降させ、その後にリン酸化された（ｐ）ＪＡＫ１及びＪＡＫ３を検出する抗体によるウエスタンブロットを行った。タンパク質発現レベルを全細胞溶解物の抗ＦＬＡＧブロットによって示す（下部パネル）。（ｄ）フラッグタグ付けされたＪＡＫ１及びＣＩＳを２９３Ｔ細胞中で共発現させ、抗ＣＩＳ抗体（上部左パネル）または抗ＪＡＫ１抗体（上部右パネル）のいずれかを使用して、免疫沈降（ＩＰ）させた。抗フラッグ抗体によるウエスタンブロットから、各々の事例において特異的なＣＩＳ−ＪＡＫ複合体の存在が明らかにされた（上部パネル）。タンパク質レベルを、細胞溶解物の抗フラッグブロットによって下部パネル中で示す。（ｅ）無細胞系を使用して、フラッグ−ＪＡＫ１を、ＣＩＳ−Ｅ３リガーゼ複合体（カリン５及びＲｂｘ２とＣＩＳ−ＳＨ２−ＢＣ）あり（＋）及びなし（−）で、ユビキチン、Ｅ１酵素及びＥ２酵素と一緒に、３７℃で示される時間で、インキュベーションした。ＪＡＫ１ユビキチン化を、リン酸化ＪＡＫ１への抗体によるウエスタンブロットによって視覚化した。（ｆ）キナーゼ阻害アッセイを、４つのすべてのＪＡＫ、及びＣＩＳ、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２またはＳＯＣＳ３のキナーゼドメイン（ＪＨ１）により遂行した。ＣＩＳはＪＡＫ１ ＪＨ１活性を優先的に阻害した（上部パネル）が、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ３及びＣＩＳは、ＪＡＫ１ ＪＨ１活性を変動する程度で阻害した（下部パネル）。データをＣＩＳなしの対照へ正規化した。挿入表：ＩＣ_５０値；平均±標準誤差；ｎ＝３〜５の独立した実験。（ｇ）インビトロのＥ３リガーゼユビキチン化構成要素を示す図解及びＪＡＫ活性のＣＩＳ媒介性阻害について提案されたモデルであり、それによれば、受容体複合体へのＣＩＳの動員は、活性のあるＪＡＫ１への結合を促進し、キナーゼ阻害及びプロテアソーム分解をもたらす。ｅｌｏＢ：エロンギンＢ；Ｃ：エロンギンＣ。図９も参照されたい。 Ｃｉｓｈの喪失は実験的な肺腫瘍転移を制御する。Ｃｉｓｈ^＋／＋マウス及びＣｉｓｈ^−／−マウスに、（ａ）３×１０^５のＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞または（ｂ）２×１０^５のＢ１６Ｆ１０メラノーマを静脈注射し、腫瘍接種に対して−１、０及び６日目に、対照Ｉｇ抗体（ｃＩｇ）、抗ＣＤ８抗体（αＣＤ８；ＣＤ８ Ｔ細胞枯渇）、抗アシアロＧＭ１抗体（αａｓＧＭ１；ＮＫ細胞枯渇）、または抗ＩＦＮγ抗体（αＩＦＮγ；中和）のいずれかを処理した。マウスを腫瘍注射後１４日目に屠殺した。（ｃ）ＮＫ細胞欠損（Ｎｃｒ１^{Ｍｃｌ１Δ／Δ}）マウスに、１×１０^５のＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞の注射の８時間前に、３×１０^６のインビトロで増殖させたＣｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞もしくはＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞またはＰＢＳを静脈注射した。マウスに、１．５×１０^６のインビトロで増殖させたＣｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞もしくはＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞またはＰＢＳの第２の注射を、腫瘍接種後２４時間で投与し、腫瘍注射後１８日目で屠殺した。（ａ〜ｃ）転移量（ｍｅｔｓ）を、肺表面上のコロニーのカウントによって肺において定量化した。（ｄ）Ｃｉｓｈ^＋／＋マウス、Ｃｉｓｈ^−／−マウス及びＮｃｒ１^{Ｍｃｌ１Δ／Δ}（ＮＫヌル）マウスに、５×１０^５のＥ０７７１ ｍＣｈｅｒｒｙ^＋乳癌細胞を静脈注射し、肺転移をＩＶＩＳ（蛍光発光；左パネル）またはヘマトキシリン・エオシン染色した組織切片（右パネル）によって分析した。（ｅ）１×１０^５のＥ０７７１細胞をＣｉｓｈ^＋／＋マウス及びＣｉｓｈ^−／−マウスの乳腺脂肪体の中へ移植し、腫瘍サイズを経時的に測定した。（ｆ）（ｅ）におけるように生成された正所性Ｅ０７７１腫瘍を４００〜６００ｍｍ^３で除去し、１４日後に自然肺転移をＩＶＩＳによって肺において測定し、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ発現についてＲＴ−ＰＣＲ行った。（ｇ）Ｃｉｓｈ^＋／＋マウス及びＣｉｓｈ^−／−マウスにＢ１６Ｆ１０肺癌腫（７．５×１０^５細胞）を静脈注射した。腫瘍接種に対して０、３及び６日目に、マウスに対照Ｉｇ抗体または組み合わせの抗ＰＤ−１抗体／抗ＣＴＬＡ−４抗体のいずれかを投与した。転移量を、肺表面上のコロニーのカウントによって１３日後に定量化した。平均±標準誤差及びすべてのデータ（ｎ）を示す。個別のマウスからの代表的な肺全体（ａ、ｃ、ｄ、ｆ）及び（ｄ）組織学的切片を示す。群間の有意差は、（ａ、ｃ、ｇ）Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定、（ｂ）事後Ｄｕｎｎ検定によるＫｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ、または（ｅ）Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定によって決定した。図１０も参照されたい。 Ｃｉｓｈ欠損マウスにおける、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、ＩＬＣ２及び調節性Ｔ細胞の分析。（ａ）Ｃｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞またはＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞をＩＬ−１５中で培養し、溶解し、Ｃｉｓｈ ｍＲＮＡをＱ−ＰＣＲによって分析した。データをＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現へ正規化した（上部パネル）。Ｎ．Ｄ．：検出されなかった。Ｃｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞またはＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞をＩＬ−１５及びプロテアソーム阻害物質ＭＧ１３２中で４時間培養し、その後に細胞を溶解し、ＣＩＳタンパク質をウエスタンブロットによって全細胞溶解物中で検出した（下部パネル）。（ｂ）ＮＫ細胞（ＮＫ１．１^＋ＮＫｐ４６^＋ＴＣＲ−β⁻）及び（ｃ）Ｔ細胞（ＮＫ１．１⁻ＴＣＲ−β^＋）を、フローサイトメトリーによって、Ｃｉｓｈ^＋／＋マウス及びＣｉｓｈ^−／−マウスからの示される器官において分析した。（ｄ及びｅ）ＩＬＣ２ Ｃｉｓｈ^＋／＋及びＣｉｓｈ^−／−を、ＰＢＳまたは抗ＩＬ−２抗体（ＩＬ−２−ＪＥＳ６．１）と複合体化したＩＬ−２により２日ごとに処理し、５日または７日（Ｄ５、Ｄ７）後に屠殺した。ＣＤ３／１９／ＮＫ１．１／Ｂ２２０／Ｇｒ１陰性細胞についてゲートした骨髄中のＩＬＣ２の代表的なフローサイトメトリープロットである。（ｅ）ＩＬ−２−ＪＥＳ６．１処理に後続する骨髄中のＩＬＣ２の頻度。（ａ、ｃ、ｅ）平均±標準誤差、ｎ＝３の生物学的反復。（ｆ）調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）。ＩＬ−２−ＪＥＳ６−１処理の前及び５日後の、Ｃｉｓｈ^＋／＋マウス及びＣｉｓｈ^−／−マウスの脾臓及びリンパ節からのＣＤ４^＋細胞上のＦｏｘＰ３及びＣＤ２５の発現である。代表的なフローサイトメトリープロットを示す。（ｇ）ＩＬ−２−ＪＥＳ６−１複合体処理に後続する脾臓及びリンパ節中でのＴｒｅｇの増殖及び縮小（平均±標準誤差、１群あたりｎ＝１〜２匹のマウス）。 Ｓｏｃｓ１及び／またはＳｏｃｓ３の喪失は、ＮＫ細胞におけるＩＬ−１５応答を改変しない。（ａ）Ｓｏｃｓ３^＋／＋ＥＲＴ２^{Ｃｒｅ／＋}（Ｃｒｅ＋）マウス、Ｓｏｃｓ１^−／−Ｉｆｎγ^−／−（Ｓｏｃｓ１Δ）マウス、Ｓｏｃｓ３^{ｆｌ／ｆｌ}ＥＲＴ２^{Ｃｒｅ／＋}（Ｓｏｃｓ３Δ）マウス、及びＳｏｃｓ１^−／−Ｉｆｎγ^−／−Ｓｏｃｓ３^{ｆｌ／ｆｌ}ＥＲＴ２^{Ｃｒｅ／＋}（Ｓｏｃｓ１ΔＳｏｃｓ３Δ）マウスを、４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ；Ｓｏｃｓ３欠失の誘導）により経口強制投与によって処理し、脾臓ＮＫ細胞を１４日後にフローサイトメトリーによって分析した。（ｂ）（ａ）におけるマウスからの脾臓ＮＫ細胞（ＴＣＲ−β⁻ＮＫ１．１^＋ＮＫｐ４６^＋）をＦＡＣＳで選別し、ＩＬ−１５（５０ｎｇ／ｍｌ）中で７日間培養し、その後にＣＦＳＥで標識し、無リンパ球のＲａｇ２^−／−ｇＣ^−／−レシピエントの中へ静注で移入するか、またはＩＬ−１５（５０ｎｇ／ｍｌ）中でインビトロで培養する、のいずれかであった。移入の５及び１０日後に、レシピエント肝臓をフローサイトメトリーによってドナーＮＫ細胞について分析した。インビトロの培養を５日目に分析した。Ｃｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞及びＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞の培養を差異的増殖についての参照として供する（下部右パネル）。（ｃ）Ｃｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞における促進されたエフェクター機能。Ｃｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞及びＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞を７日間培養し、その後に１：１の比でＣＨＯまたはＢ１６Ｆ１０の標的細胞と共培養した。５時間での標的細胞の殺傷を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムを使用して、電気インピーダンスにおける相対的変化によって決定した。Ｃｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞及びＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞は、９：１のエフェクター：標的の比で最大の殺傷を達成した（１００％殺傷として定義された）。（ｄ）Ｃｉｓｈ^＋／＋マウス及びＣｉｓｈ^−／−マウスにＲＭＡ−ｍ１５７細胞を腹腔内で注射し、腹膜ＮＫ細胞を、１８時間後にフローサイトメトリーによって細胞内グランザイム−Ａ及びグランザイム−Ｂの産生について分析した。２つの実験の平均＋標準偏差。ｎ＝２匹のマウス。ＭＦＩ：平均蛍光指数。 インビトロで培養したＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞及びエクスビボＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞のトランスクリプトームのプロファイリング。新鮮に選別したエクスビボのＣｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞及びＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞で、ならびにＩＬ−１５（５０ｎｇ／ｍＬ）中で７日間培養したＣｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞及びＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞で、１００ｂｐシングルエンドＲＮＡｓｅｑを遂行した。（ａ）最も差異的に発現された、トップの約１００のＣｉｓｈ^−／−細胞中の遺伝子の相対的発現レベル（Ｚスコア）を、ヒートマップ（凡例に従って色分けした）において示す。列を、０の平均及び１の標準偏差を有するようにスケール化した。ｎ＝２の生物学的反復。（ｂ）図３において生成された培養ＮＫ細胞データの平均−差のプロットであり、Ｌｏｇ２倍変化ｖｓ平均発現を示す。（ｃ）ＩＬ−１５で培養したＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞中で観察された、１２３０の差異的に発現した遺伝子の機能分析。遺伝子オントロジーをＰＡＮＴＨＥＲ分類システムを使用して遂行した。主要な遺伝子ネットワークを、Ｃｉｓｈ^−／−細胞中で差異的に発現した全遺伝子のパーセンテージとして示す。 Ｃｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナリングの増加ならびに正常な呼吸及び解糖を示す。（ａ）Ｃｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞及びＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞を培養し、ＩＬ−１５非含有培地で洗浄した。細胞を、様々な洗浄後の時間で示されるように溶解した。リン酸化タンパク質（ｐ）及び全シグナリングタンパク質のレベルを、特異的抗体によりウエスタンブロットすることによって分析した。（ｂ）Ｃｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞の呼吸及び解糖は乱されない。Ｃｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞及びＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞をＩＬ−１５の存在下において培養し、ＸＦ Ａｎａｌｙｚｅｒシステムを使用して、細胞外酸性化速度（ＡＣＲ；解糖）及び酸素消費速度（ＯＣＲ；ミトコンドリア呼吸）を測定した。グルコース（１）、オリゴマイシン（２）、ＦＣＣＰ及びピルビン酸塩（３）ならびにアンチマイシンＡ／ロテノン（４）を、ナンバリングされた矢印によって示した時間で添加した。（ｃ）本研究において使用されるプロテオームワークフローの概要。Ｃｉｓｈ^＋／＋マウス及びＣｉｓｈ^−／−マウスに由来する等しい数の培養ＮＫ細胞を溶解し、ＮＨＳ−ＣＹＴ−３８７ビーズを使用してキナーゼエンリッチメントを行った。ＣＹＴ−３８７樹脂からのタンパク質溶出物に加えて、全細胞溶解物（キナーゼエンリッチメント前）の一部に、トリプシン消化及びナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳを行った。（ｄ）包括的なタンパク質発現の標識不含の定量化。火山型プロットは、ＷＣＬからの定量的パイプライン分析（Ｃｉｓｈ^＋／＋ｖｓ Ｃｉｓｈ^−／−）に後続する、Ｌｏｇ２タンパク質比を示す。赤色線及び黄色線はタンパク質発現における２倍の変化（ｌｏｇ２比が１）を表わし、その一方で、青色線及び緑色線は４倍の変化（ｌｏｇ２比が２）を表わし；点は適宜着色され、個別のタンパク質を表わす。１．３以上の−ｌｏｇ_１０ ｐ値のタンパク質（≦０．０５のｐ値へ対応する）は、差異的に多量であると見なされた。（ｅ）ヒートマップは、（ｄ）における有意な差異的発現を備えたタンパク質についてのＬｏｇ２変換された合計のペプチド強度（補完されない）を提示する。個別の生物学的反復からのデータを示す（ｎ＝３）。緑色から赤色は発現レベルの増加を指摘する。 ＣＩＳはＪＡＫ及びＩＬ−２Ｒ複合体を標的とする。（ａ）野生型及びＣｉｓｈ^−／−マウスから培養されたＮＫ細胞を、溶解し、ｍＲＮＡを精製し、ＲＮＡｓｅｑによって分析した。二重サンプルについての平均ＲＰＫＭ値（左パネル）。ＪＡＫ１ ｍＲＮＡのレベルをＱ−ＰＣＲによって分析した（右パネル）。平均±標準偏差、ｎ＝３。（ｂ）精製されたｈＣＩＳ−ＳＨ２−ＢＣ複合体、エロンギンＢ及びエロンギンＣを示す４〜１２％のクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。（ｃ）等温熱量測定（ＩＴＣ）を使用して、ｈＣＩＳ−ＳＨ２−ＢＣの、ＪＡＫ１／３キナーゼドメイン活性化ループならびにＩＬ−２Ｒβ及びＩＬ−２Ｒγの細胞質ドメイン内のチロシンへ対応するホスホペプチドへの結合の親和性を測定した。３００μＭのホスホペプチドを、３０μＭのＧＳＴ−ＣＩＳ−ＳＨ２−ＢＣ三成分複合体の溶液へ滴定した。ＩＴＣ滴定曲線、及び２つの独立した実験からの平均±標準偏差を示すいくつかの結果の表（挿入図）。Ｎ．Ｄ．＝検出可能でない、ｐ＝リン酸化。滴定曲線はすべて単一部位モデルへ良好にフィットした。（ｄ）培養した野生型ＮＫ細胞を洗浄し、プロテアソーム阻害物質（ＭＧ１３２）の添加あり及びなしで４時間ＩＬ−１５について飢餓状態にした。次いで細胞を示される時間で５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５により刺激し、その後に細胞溶解及び示されるタンパク質への抗体によるウエスタンブロットを行った。（ｅ）キナーゼ阻害アッセイを、競合物として過剰のＪＡＫ１−Ｙ１０３４ホスホペプチドあり及びなしで、ＣＩＳ−ＳＨ２−ＢＣの存在下においてＪＡＫ１のキナーゼドメイン（ＪＨ１）により遂行した。ｐＹ１０３４ペプチドはＣＩＳ媒介性阻害を部分的に低減した。データをＣＩＳなしの対照へ正規化した。 Ｃｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞は実験的な肺転移に対する保護をする。Ｃｉｓｈ^＋／＋マウス及びＣｉｓｈ^−／−マウスに、（ａ）２×１０^５のＬＷＴ１（Ｂ−ＲＡＦ突然変異体）メラノーマまたは（ｂ）２×１０^５のＲＭ−１前立腺癌細胞を静脈注射した。転移量を、肺表面上のコロニーのカウントによって１４日後に肺において定量化した。（ｃ及びｄ）１×１０^５のＥ０７７１．ＬＭＢ−ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞をＣｉｓｈ^＋／＋マウス及びＣｉｓｈ^−／−マウスの乳腺脂肪体の中へ移植し、４００〜６００ｍｍ^３で外科的に除去し、（ｃ）切除後に秤量した。自然肺転移（ｄ）を１４日後にｍＣｈｅｒｒｙ蛍光についてＩＶＩＳによって測定した（ｄ；縦軸：全放射効率［（ｐ／ｓ）／ＩＷ／ｃｍ^２］×１０^７）。示されるもの（ｎ）の平均±標準誤差を示す。群間の統計的な差は、Ｍａｎｎ−Ｗｉｔｎｅｙ Ｕ検定（ａ、ｂ）または対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｄ）によって決定した。 ＣＩＳ Ｎ末端領域またはＰＥＳＴの欠失は、ＣＩＳがＪＡＫ１キナーゼ活性を阻害する能力を促進し、ホスホペプチドとのＣＩＳ−ＳＨ２の相互作用は、ＪＡＫ１キナーゼ活性のＣＩＳ阻害のために要求される。キナーゼ阻害アッセイを、増加する量の、ヒト全長ＣＩＳ（ＣＩＳ）、ＰＥＳＴモチーフを欠如するＣＩＳ（ΔＰＥＳＴ）、Ｎ末端領域及びＰＥＳＴモチーフの両方を欠如するＣＩＳ（ΔＮＴ／ΔＰＥＳＴ）、またはＮ末端３４残基を欠如するＣＩＳ（ΔＮ３４）存在下において、競合物としての過剰のリン酸フェニル（ＰＰ）なし（ａ）またはあり（ｂ）で、ＪＡＫ１のキナーゼドメイン（ＪＨ１）により遂行した。（ｃ）あるいは、５０μＭのＪＡＫ１−Ｙ１０３４ホスホペプチドまたはＪＡＫ３−Ｙ９８０、Ｙ９８１ホスホペプチドを競合物として使用した。データをＣＩＳなしの対照へ正規化した。ＣＩＳコンストラクトはすべてＳＯＣＳボックスを含有し、ＣＩＳ、エロンギンＢ及びエロンギンＣからなる三量体複合体として発現及び精製された。挿入図：表は（ａ）についてのＩＣ５０値を示す。 ＣＩＳ Ｎ末端領域またはＰＥＳＴモチーフの欠失は、ホスホペプチドへの結合に対して大きな影響を及ぼさない。等温熱量測定（ＩＴＣ）を使用して、（ａ）ヒト全長ＣＩＳ、ＰＥＳＴモチーフを欠如するＣＩＳ（ΔＰＥＳＴ）、Ｎ末端領域及びＰＥＳＴモチーフの両方を欠如するＣＩＳ（ΔＮＴ／ΔＰＥＳＴ）、またはＮ末端３４の残基を欠如するＣＩＳ（ΔＮ３４）の、ＪＡＫ１キナーゼドメイン活性化ループ内のチロシンへ対応するホスホペプチド（ＪＡＫ１−Ｙ１０３４）への結合の親和性、（ｂ）ヒト全長ＣＩＳ及びＣＩＳΔＮＴ／ΔＰＥＳＴの、ＪＡＫ３キナーゼドメイン活性化ループ内のチロシンへ対応するホスホペプチド（ＪＡＫ３−Ｙ９８０、Ｙ９８１）への結合の親和性、を測定した。３００μＭのホスホペプチドを、３０μＭのＧＳＴ−ＣＩＳ−ＳＨ２−ＢＣ三成分複合体の溶液へ滴定した。ＩＴＣ滴定曲線を示す。滴定曲線はすべて単一部位モデルへ良好にフィットした。 ＣＩＳ−ＳＨ２ドメインは延長ペプチド境界へ結合する。等温熱量測定（ＩＴＣ）を使用して、Ｎ末端領域及びＰＥＳＴモチーフの両方を欠如するＣＩＳ（ΔＮＴ／ΔＰＥＳＴ）の、ＪＡＫ１キナーゼドメイン活性化ループ内のチロシンへ対応するホスホペプチド（ＪＡＫ１−Ｙ１０３４）への結合の親和性を測定した。ペプチドは、野生型、または＋５、＋３もしくは−３の位置でアラニン置換を含有するもののいずれかであった。３００μＭのホスホペプチドを、３０μＭのＧＳＴ−ＣＩＳ−ＳＨ２−ＢＣ三成分複合体の溶液へ滴定した。ＩＴＣ滴定曲線を示す。滴定曲線はすべて単一部位モデルへ良好にフィットした。 ＣＩＳ阻害は用量依存的であり、機能的なＳＨ２ドメインを要求する。（ａ）ＮＫ細胞をＣｉｓｈ^−／−マウス、Ｃｉｓｈ^＋／−マウス及びＣｉｓｈ^＋／＋マウスの脾臓から精製し、細胞追跡用色素ＣＴＶにより標識し、増加する濃度のＩＬ−１５中で６日間培養し、その後にフローサイトメトリー分析を行った。全蛍光（幾何平均）の減少は、増殖の増加を指摘する。（ｂ）Ｃｉｓｈ^−／−マウス、Ｃｉｓｈ^＋／−マウス、Ｃｉｓｈ^＋／＋マウスの脾臓からの等しい数のＮＫ細胞を、ＩＬ−１５中で１０日間増殖させた。培養後のＮＫ細胞の絶対数である。（ｃ）次いでＮＫ細胞をサイトカインがないように洗浄し、４時間休止させ、その後に示されるように１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５及び１０μＭのＭＧ１３２による処理を行った。細胞溶解物を、ＣＩＳ及びローディング対照としてのアクチンへの示される抗体によるイムノブロットによって分析した。 ＣＩＳ誘導の動態は、ヒトＮＫ細胞におけるＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナリングの阻害と一致する。（ａ）患者由来ヒトＮＫ細胞、またはＮＫリンパ腫細胞株の（ｂ）ＳＮＫ−１０、（ｃ）ＮＫＬ及びＮＫ６、（ｄ）ＮＫ−９２を、サイトカインがないように洗浄し、４時間（ａ）または１６時間（ｂ〜ｄ）休止させ、その後に示される時間でＩＬ−１５による処理を行った。いくつかの事例において、細胞をプロテアソーム阻害物質ＭＧ１３２（１０μＭ）と共にインキュベーションした。細胞を溶解し、示されるリン酸化（ｐ）タンパク質及び全タンパク質への抗体によりイムノブロットすることによって分析した。 Ｃｉｓｈ ｍＲＮＡ誘導の動態は、ヒトＮＫ細胞におけるＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナリングの阻害と一致する。ヒトＮＫリンパ腫細胞株のＫＨＹＧ−１（ａ〜ｃ）及びＮＫ−９２（Ｄ〜Ｆ）を、サイトカインがないように洗浄し、一晩休止させ、その後に示される時間でＩＬ−１５による処理を行った。細胞を溶解し、Ｃｉｓｈ、Ｓｏｃｓ１、Ｓｏｃｓ３のｍＲＮＡ発現についてリアルタイム定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によって分析した。相対的発現を、対象となる各々の遺伝子量をハウスキーピング遺伝子１８ｓリボソームＲＮＡへ正規化することによって、決定した。各々の条件は３つの生物学的反復を有し、測定は二重で遂行した。 質量分析法によって同定されたユビキチン化（Ｕ）部位及びリン酸化（Ｐ）部位を要約する概略図。Ｐ＝リン酸化、Ｕ＝ユビキチン化、＊は残基がマウスＣＩＳとヒトＣＩＳとの間で保存されることを指す。フラッグタグ付けされたマウスＣＩＳを２９３Ｔ細胞中で発現させ、抗フラッグ抗体を使用する親和性エンリッチメントによって精製し、その後にトリプシンによる消化及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳの分析を行った。太い円は、この研究において同定された残基を指す。他のユビキチン化部位は、Ｊｅｎｓｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０１５中で報告されていた。 ＴＧＦβは、ＣＩＳ欠損ＮＫ細胞ではなく野生型においてＩＬ−１５駆動性増殖をブロックする。野生型（ＷＴ）マウス、ＴＧＦβＲＩＩ欠損（ＴｇｆＲＩＩ^{ｆｌ／ｆｌ}）マウス、またはＣｉｓｈ^−／−マウスからの脾臓ＮＫ細胞（２０，０００細胞／ウェル、Ｌｉｎ^陰性ＣＤ４９ａ^陰性ＣＤ４９ｂ^＋ＮＫ１．１^＋ＮＫｐ４６^＋）を、ＣＦＳＥにより標識し、以下の条件；ｒＩＬ−１５（５０ｎｇ／ｍＬ）、ｒＴＧＦｂ１（１ｎｇ／ｍＬ）とｒＩＬ−１５（５０ｎｇ／ｍＬ）、ｒＴＧＦｂ１（６．２５ｎｇ／ｍＬ）とｒＩＬ−１５（５０ｎｇ／ｍＬ）、またはｒＴＧＦｂ１（２５ｎｇ／ｍＬ）とｒＩＬ−１５（５０ｎｇ／ｍＬ）において、ＲＰＭＩまたはＴＧＦ−β不含培地（ＭａｘＴｅｘ）中で５日間培養した。ＣＦＳＥの喪失（増殖）をＦＡＣＳによってモニタリングした。 Ｃｉｓｈ欠失と一緒の、ＴＧＦβまたはＢＲＡＦ（Ｂ−Ｒａｆタンパク質キナーゼ）の阻害は、処理単独または組み合わせのいずれかよりも優れている。Ｃｉｓｈ^＋／＋マウス及びＣｉｓｈ^−／−マウスに、１×１０^６のＢＲＡＦ突然変異体メラノーマ細胞株（ＳＭ１ＬＷＴ１）、ならびに対照（ｃｔｒ）Ｉｇ、抗ＴＧＦ−β（１Ｄ１１）抗体、ＢＲＡＦ阻害物質（ＰＬＸ４７２０）、または１Ｄ１１及びＰＬＸ４７２０のいずれかを注射した。肺におけるメラノーマ量を、肉眼的カウントによって注射１４日後で測定した。平均±標準誤差、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５。 Ｃｉｓｈ欠損とチェックポイント阻害物質またはサイトカイン刺激を組み合わせることは、抗転移効果の改善を示す。（Ａ）５〜６匹のＢ６．ＷＴ（Ｃｉｓｈ^＋／＋）マウスまたはＢ６．Ｃｉｓｈ^−／−マウスの群に、２×１０^５のＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を静脈注射し、対照Ｉｇ（ｃＩｇ）（０、３及び６日目に腹腔内で２５０μｇ）、抗ＰＤ−１（０、３及び６日目に腹腔内で２５０μｇ）、マウスＩＦＮ−αβ（０、１、２及び３日目に腹腔内で２５μｇ）、または組換えＩＬ−２（０、１、２及び３日目に腹腔内で１０，０００ＩＵ）のいずれかを処理した。（Ｂ）５〜１１匹のＢ６．ＷＴ（Ｃｉｓｈ^＋／＋）マウスまたはＢ６．Ｃｉｓｈ^−／−マウスの群に、７．５×１０^５のＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を静脈注射し、ｃＩｇ（ｃＩｇ）（０、３及び６日目に腹腔内で２５０μｇ）、抗ＰＤ１／抗ＣＴＬＡ−４の組み合わせ（０、３及び６日目に腹腔内で２５０μｇ）、または組換えＩＬ−２（０、１、２、３及び４日目に腹腔内で１０，０００ＩＵ）のいずれかを処理した。（Ｃ）７〜１０匹のＢ６．ＷＴ（Ｃｉｓｈ^＋／＋）マウス及びＢ６．Ｃｉｓｈ^−／−マウスの群に、１×１０^５の親ＲＭＡ−Ｓ細胞を腹腔内注射し、ＰＢＳまたは組換えＩＬ−２（０、１、２、３及び４日目に腹腔内で１００，０００ＩＵ）のいずれかを処理した。マウスを腫瘍発生についてモニタリングし、腹部膨満及び不快症状のある時点で安楽死させた。群間の生存の改善は、ログランクＭａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定によって査定した。（Ｄ）５〜１５匹のＢ６．ＷＴ（Ｃｉｓｈ^＋／＋）マウスまたはＢ６．Ｃｉｓｈ^−／−マウスの群に、５×１０^５のＲＭ−１前立腺癌細胞を静脈注射し、ｃＩｇ、抗ＣＤ９６、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４または抗ＰＤ１／抗ＣＴＬＡ−４の組み合わせ（各々０及び３日目に腹腔内で２５０μｇ）のいずれかを処理した。（Ｅ）８〜１０匹のＢ６．ＷＴ（Ｃｉｓｈ^＋／＋）マウスまたはＢ６．Ｃｉｓｈ^−／−マウスの群に、７．５×１０^５のＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を静脈注射し、２５０μｇのｃＩｇまたは抗ＣＤ９６モノクローナル抗体（０及び３日目に腹腔内）のいずれかを処理した。（Ｆ）５〜６匹のＢ６．ＷＴ（Ｃｉｓｈ^＋／＋）マウスまたはＢ６．Ｃｉｓｈ^−／−マウスの群に、７．５×１０^５のＬＷＴ１メラノーマ細胞を静脈注射し、ベヒクルまたはＰＬＸ４７２０（１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内で、０〜６日目まで毎日）のいずれかを処理した。肺を（Ａ、Ｄ、Ｆ）１４日目または（Ｂ、Ｅ）１３日目に採取し、肉眼的な転移をカウントした。個別のマウスを各々の記号によって示し、結果を平均±標準誤差としてプロットする。示されるような統計的有意差は、Ｔｕｋｅｙ事後検定（多重比較について）による一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した（＊：ｐ＜０．５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１）。 ＢＲＡＦ阻害物質またはＭＥＫキナーゼ阻害物質とＣｉｓｈ欠損を組み合わせることは、抗転移効果の改善を実証する。５〜１０匹のＢ６．ＷＴ（Ｃｉｓｈ^＋／＋）マウス及びＢ６．Ｃｉｓｈ^−／−マウスの群に、７．５×１０^５のＬＷＴ１メラノーマ細胞を静脈から接種し、ベヒクル、ＢＲＡＦ阻害物質（ＰＬＸ４７２０；６日間毎日；１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内で）及び／またはＭＥＫ阻害物質（ＭＥＫｉ；トラメチニブ、０及び３日目、０．６ｍｇ／ｋｇを経口強制投与で）のいずれかを処理した。肺を１４日目に採取し、肉眼的な転移をカウントした。個別のマウスを各々の記号によって示し、結果を平均±標準誤差としてプロットする。示されるような統計的有意差は、Ｔｕｋｅｙ事後検定（多重比較について）による一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した（ｎ．ｓ．有意でない；＊＊＊：ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１）。 Ｃｉｓｈ欠損マウスはＭＣＡ誘導性腫瘍発生から保護される。（Ａ）１５匹のＢ６．ＷＴ（Ｃｉｓｈ^＋／＋）オスマウス及び１８匹のＢ６．Ｃｉｓｈ^−／−オスマウスの群に、０．１ｍｌのトウモロコシ油中の３００μｇのＭＣＡを後脇腹中に皮下で接種した。次いでマウスを２５０日にわたって線維肉腫発生についてモニタリングし、データを腫瘍不含マウスについてのパーセンテージとして記録した（直径で＞３ｍｍの腫瘍を陽性として記録した）。（Ｂ）１６〜１８匹のＢ６．ＷＴ（Ｃｉｓｈ^＋／＋）オスマウス及び１４匹のＢ６．Ｃｉｓｈ^−／−オスマウスの群に、０．１ｍｌのトウモロコシ油中の３００μｇのＭＣＡを後脇腹中に皮下で接種した。マウスを、２５０μｇのハムスターｃＩｇ、５０μｇの抗アシアロＧＭ１（抗ａｓＧＭ１；ＮＫ細胞枯渇）、または２５０μｇの抗ＩＦＮ−γ抗体のいずれかにより、−１、０、７、１２、２４、２８、３５及び４２日目に腹腔内注射で処理した。マウスを２００日にわたって線維肉腫発生についてモニタリングした。腫瘍を、２つの垂直な直径の積（ｍｍ^２）としてノギスにより毎週測定した。腫瘍が直径の２乗で＞１５０ｍｍ^２に達した場合に、マウスを安楽死させた。群間の統計的に有意な生存差を、ログランクＭａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定（Ａ）、後続して多重検定のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正（Ｂ）によって決定した（＊：ｐ＜０．０５；＊＊＊：ｐ＜０．００１）。 Ｃｉｓｈ欠損マウスは、急性骨髄白血病モデルにおいて生存の促進を示す。Ｃｉｓｈ^＋／＋（ＷＴ）マウス及びＣｉｓｈ^−／−マウスに、５×１０^５のＭＬＬ−ＡＦ９細胞を静脈注射した。倫理指針に従って、脾腫及び／または後肢麻痺が検出された場合に、マウスを安楽死させた。生存曲線結果は２つの独立した実験からのものである。各々の群は、１実験あたりｎ≧５マウスを有していた。＊＊＊ｐ＜０．０５。 ＮＫ細胞におけるＣＩＳ機能の喪失は、インビボでのターンオーバー及びより成熟したＮＫ細胞への分化の促進をもたらす。脾臓をＣｉｓｈ^−／−マウス及びＣｉｓｈ^＋／＋マウスから採取し、単一細胞懸濁液へとプロセシングした。表面及び細胞内の染色をフローサイトメトリーによって遂行して、以下のものを決定した。（Ａ）異なるＮＫ細胞サブセット中のＣｉｓｈ^＋／＋細胞及びＣｉｓｈ^−／−細胞のパーセンテージ。全ＮＫ細胞はＮＫ１．１＋ＮＫｐ４６＋であるものとして同定され、未成熟ＮＫ細胞（ＣＤ２７＋ＣＤ１１ｂ−；Ｉｍｍ）サブセット、Ｍ１（ＣＤ２７＋ＣＤ１１ｂ＋）サブセット、及びＭ２（ＣＤ２７−ＣＤ１１ｂ＋）サブセットへとさらに細分され、Ｍ２は最も成熟し細胞傷害性であるＮＫ細胞集団を表わす。（Ｂ）ＤＮＡＭ１＋ＫＬＲＧ１＋ＮＫ細胞の数。一般に、ＤＮＡＭ＋細胞は、炎症サイトカインのより高い産生及びＩＬ−１５への応答の増加を示すが、ＫＬＲＧ１は代替の成熟マーカーであると判断される。（Ｃ）各々のＮＫ細胞サブセット（Ｉｍｍ、Ｍ１、Ｍ２）中のＫｉ６７＋細胞のパーセンテージ。Ｋｉ６７は細胞増殖についてのマーカーである。１群あたりｎ＝６匹のマウス。ｐ＜０．０５。まとめると、これらのデータは、ＮＫ細胞の合計数はＣｉｓｈ^＋／＋マウスとＣｉｓｈ^−／−マウスとの間で異ならなかったが、Ｃｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞がより成熟し、サイトカイン産生及び細胞傷害性の増加を提示し、すべてのＣｉｓｈ^−／−サブセットが細胞周期の増加を示す可能性が高い、ということを示す。 ＭＣＡ１９５６肉腫の制御の促進はＮＫ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞の両方を要求する。６〜７匹のＢ６．ＷＴ（ＷＴ；Ｃｉｓｈ^＋／＋）マウス及びＢ６．Ｃｉｓｈ^−／−マウスの群に、１×１０^６のＭＣＡ１９５６線維肉腫細胞を皮下注射し、腫瘍接種に対して−１、０、７及び１４日目に、対照Ｉｇ（ｃＩｇ：５０μｇのウサギＩｇＧ＋１００μｇのラットＩｇＧ１）、５０μｇの抗アシアロＧＭ１（抗ａｓＧＭ１；ＮＫ細胞枯渇）、または１００μｇの抗ＣＤ８β（ＣＤ８^＋Ｔ細胞枯渇）のいずれかを処理した。１群あたり６〜７匹のマウスの平均±標準誤差。ＷＴ群とＣｉｓｈ^−／−群との間の統計的有意差を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定によって示されるように決定した（＊ｐ＜０．０５）。 Ｃｉｓｈ^−／−ＣＤ８＋ Ｔ細胞はＩＦＮγ産生の促進を示す。Ｃｉｓｈ^＋／＋（ＷＴ）マウス及びＣｉｓｈ^−／−マウスからの末梢リンパ節ＣＤ８＋Ｔ細胞を、示される条件下で４日間培養し、４時間のＰＭＡ／イオノマイシンに応答したＩＦＮγの産生をフローサイトメトリーによって評価した。ｎ＝３匹のマウス。平均±標準誤差、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。データを、２元配置ＡＮＯＶＡを使用して分析した。 Ｃｉｓｈ^−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞は、活性化条件下で増殖の促進を示す。Ｃｉｓｈ^＋／＋（ＷＴ）マウス及びＣｉｓｈ^−／−マウスからの末梢リンパ節ＣＤ８＋Ｔ細胞を、αＣＤ２８刺激（αＣＤ３なし）あり（下部）またはなし（上部）で、ＩＬ−１５中で４日間共培養した。各々の分裂を占める細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって評価した。このデータは、１遺伝子型あたりｎ＝３匹のマウスを表わす。平均±標準誤差を示す。 腫瘍及び腫瘍内微小環境中のＩＬ−１５レベルは、常在ＮＫ細胞におけるＣｉｓｈ発現レベルを調節する。ＩＬ−１５^＋／＋マウスまたはＩＬ−１５^−／−マウス（間質のＩＬ−１５ステータスがそれぞれ＋または−である）を、致死量照射し、Ｃｉｓｈ^{ＬａｃＺ／＋}骨髄により再構成した。１０週間後に、これらのキメラマウスに、乳腺脂肪体中に注射される１×１０^５のＥ０７７１乳癌細胞による攻撃接種を行ったか、または攻撃接種を行わないままであった。１週間後に、マウスを屠殺し、乳腺腫瘍を採取及び分離し、腫瘍常在ＮＫ細胞をβ−ガラクトシダーゼ（Ｃｉｓｈ発現）について染色し、フローサイトメトリーによって分析した。平均±標準誤差を示す。統計的有意差をＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって指摘及び決定した。

配列リストのキー
配列番号：１ ＪＡＫ１活性化ループホスホペプチド
配列番号：２ ＪＡＫ１リン酸化模倣ペプチド
配列番号：３ ＩＬ−２Ｒβホスホペプチド
配列番号：４ ＩＬ−２Ｒβホスホペプチド
配列番号：５ ＩＬ−２Ｒβホスホペプチド
配列番号：６ ヒトＣＩＳタンパク質アイソフォーム１
配列番号：７ ヒトＣＩＳタンパク質アイソフォーム１断片
配列番号：８ ヒトＣＩＳタンパク質アイソフォーム１ＳＯＣＳボックス
配列番号：９ Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＣＩＳタンパク質アイソフォーム１
配列番号：１０ Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ＣＩＳタンパク質
配列番号：１１ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＪＡＫ１タンパク質
配列番号：１２ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＪＡＫ３タンパク質
配列番号：１３ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＩＬ−２受容体サブユニットβ前駆体
配列番号：１４ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓエロンギンＢ
配列番号：１５ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓエロンギンＣ
配列番号：１６ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓカリン−５
配列番号：１７ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＪＡＫ１タンパク質ＪＨ１キナーゼドメインペプチド
配列番号：１８ ＳＴＡＴ５ｂペプチド
配列番号：１９ ＪＡＫ１ペプチド
配列番号：２０ ＪＡＫ３ペプチド
配列番号：２１ ＩＬ−２Ｒβホスホペプチド
配列番号：２２ ＩＬ−２Ｒβホスホペプチド
配列番号：２３ ｍＩＬ−２Ｒβホスホペプチド
配列番号：２４ ＩＬ２Ｒβホスホペプチド
配列番号：２５ ＩＬ２Ｒγホスホペプチド
配列番号：２６ ＩＬ２Ｒγホスホペプチド
配列番号：２７ ＩＬ２Ｒγホスホペプチド
配列番号：２８ ＩＬ２Ｒγホスホペプチド
配列番号：２９ ＣＩＳ ＰＥＳＴドメインペプチド
配列番号：３０ ＣＩＳ ＰＥＳＴドメインホスホペプチド
配列番号：３１ ＣＩＳ Ｎ末端ホスホペプチド
配列番号：３２ ＣＩＳ ＰＥＳＴドメインホスホペプチド
配列番号：３３ ＣＩＳ ＳＨ２／ＳＢドメインホスホペプチド
配列番号：３４ ＣＩＳ Ｎ末端糖鎖付加ペプチド
配列番号：３５ ＣＩＳ ＳＨ２糖鎖付加ペプチド
配列番号：３６ ＣＩＳ ＳＨ２糖鎖付加ペプチド
配列番号：３７ ＣＩＳ ＰＥＳＴ糖鎖付加ペプチド
配列番号：３８ ＣＩＳ ＳＨ２／ＳＢドメイン糖鎖付加ペプチド

一般的技法及び定義
特別に具体的に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者（例えば細胞培養、細胞生物学、分子遺伝学、がん生物学及びその治療、感染性疾患、特に急性感染、免疫学、薬理学、タンパク質化学、ならびに生化学における）によって共通して理解されるものと同じ意味を有すると見なされるべきである。

特別の指示のない限り、本発明において利用される細胞培養及び免疫学的技法は、当業者に周知の標準的な手順である。かかる技法は、文献出典（Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ
２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５ ａｎｄ １９９６）、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までのすべての改訂版が含まれる）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ
Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、及びＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（現在までのすべての改訂版が含まれる）等）の全体にわたって記載及び説明される。

本明細書において使用される時、約という用語は、相反することが明示されない限り、指定される値の±１０％、より好ましくは±５％を指す。

本明細書を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または変化形（「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等）は、明示された要素、整数値もしくはステップ、または要素、整数値もしくはステップの群を包含するが、他の要素、整数値もしくはステップ、または要素、整数値もしくはステップの群を除外しないことを示唆すると理解される。

本出願において使用される時、「または」という用語は、排他的な「または」ではなく、むしろ包括的な「または」を意味することが意図される。すなわち、特別の定めのない限り、または文脈から明瞭でない限り、「ＸはＡまたはＢを用いる」は、自然な包括的順列のうちの任意のものを意味することが意図される。すなわち、ＸがＡを用いるか；ＸがＢを用いるか；またはＸがＡ及びＢの両方を用いるならば、そのとき、「ＸはＡまたはＢを用いる」は、先の事例のうちのいずれかの下で満たされる。さらに、少なくともＡ及びＢのうちの１つ、ならびに／または同種のものは、一般的には、ＡもしくはＢまたはＡ及
びＢの両方を意味する。加えて、冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、本出願及び添付の請求項において使用される時、一般的には、特別の定めのない限り、または単数形への指示が文脈から明瞭でない限り、「１つまたは複数」を意味すると解釈され得る。

「ＣＩＳ阻害物質」という用語は、本明細書において使用される時、ＮＫ細胞におけるＣＩＳシグナリング活性を阻害する任意の薬剤を指す。かかる薬剤は、数多くの異なる作用モード（ＣＩＳ ｍＲＮＡのレベルを低減させること等によってＣＩＳタンパク質の総レベルを低減させること、かかる標的タンパク質（例えばＪＡＫ１）への結合またはシグナリング複合体結合パートナー（エロンギンＢ及びエロンギンＣ等）との相互作用を阻害すること、が含まれるがこれらに限定されない）のうちの任意のものによって、ＮＫ細胞におけるＣＩＳシグナリング活性を特異的に低減するように作用することができる。本明細書において使用される時、ＣＩＳに加えて広くもしく全体的にタンパク質に影響する薬剤（例えばアルキル化剤または架橋剤）、または基本的な細胞プロセス、例えば翻訳を阻害する薬剤（例えば翻訳阻害物質）、もしくは非選択的にタンパク質分解を改変する薬剤は、「ＣＩＳ阻害物質」から時に除外される。ＣＩＳ阻害物質の例としては、例えばポリヌクレオチド（例えばｓｉＲＮＡ及びｍＲＮＡ）、小分子、ペプチド、ポリペプチドまたはその組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、かかるＣＩＳ阻害物質のうちの１つまたは複数は、送達剤及び／または標的化剤（例えばナノ粒子媒介性送達が含まれる）と組み合わせて使用される。

「競合的阻害物質」または「競合的に阻害する」という用語は、本明細書において使用される時、標的タンパク質の阻害のモードを指し、そこで、阻害物質は、標的タンパク質それ自体（例えばリガンド結合部位）または標的タンパク質についてのリガンド（例えば結合パートナータンパク質）上の機能的に重要な部位へ結合し、それによって、リガンドとタンパク質標的の相互作用を立体的に妨害する。競合的阻害物質は、それが競合する生物学的に活性のある部位についてより高い親和性を有し得るが、必ずしもそうではない。

「ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞」という用語は、本明細書において使用される時、数多くのストラテジーのうちの任意のもの単独によって、または組み合わせて、ＣＩＳ活性が抑制されるＮＫ細胞を指す。例えば、ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞には、Ｃｉｓｈ「ノックアウト」ＮＫ細胞（Ｃｉｓｈ遺伝子は遺伝子編集等によって遺伝的に欠失または修飾される）；ＣＩＳタンパク質「ノックダウン」ＮＫ細胞（ＣＩＳのタンパク質の発現は、遺伝子サイレンシングストラテジー（例えばｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉによる）の使用、またはドミナントネガティブＣＩＳ配列バリアントもしくはドミナントネガティブＣＩＳ断片の発現によって低減される）が含まれるがこれらに限定されない。または、あるいは、ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞は、例えば標的タンパク質（例えばＪＡＫ１）への結合またはシグナリング複合体結合パートナー（エロンギンＢ及びエロンギンＣ、またはカリン−５等）との相互作用を阻害することによって、ＣＩＳの活性を阻害する、ＣＩＳ阻害物質（例えば小分子化合物、ペプチドまたはペプチド模倣剤）へ曝露されたＮＫ細胞である。あるいは、ＣＩＳ阻害物質は、ＣＩＳ活性を阻害するようにトランスで作用するＣＩＳに由来するペプチドまたは断片であり得る。いくつかの実施形態において、ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞は、例えば遺伝子修飾によって不可逆的にＣＩＳが阻害される。他の実施形態において、ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞は、細胞におけるＣＩＳ阻害が経時的に減少するように、可逆的にＣＩＳが阻害される。

「断片」という用語は、本明細書において使用される時、少なくとも１つの機能的ドメインまたは構造的ドメインを保持する、タンパク質の生物学的に活性のある部分（例えばＣＩＳ断片）を指す。例えば、ＣＩＳ断片は、ＳＨ２ドメイン及びＳＯＣＳボックスを含むことができ、ＪＡＫ１断片はＪＨ１キナーゼドメインを含むことができる。いくつかの
事例において、断片の活性は、結合パートナー（例えばタンパク質またはその断片）へ特異的に結合する能力を指す。本明細書において使用される時、「断片」は全長タンパク質を包含しない。

「ＮＫ細胞応答性病態」という用語は、本明細書において使用される時、１つまたは複数のＮＫ細胞活性（例えばＮＫ細胞による細胞傷害誘導性の腫瘍細胞死または感染した細胞の死、及びインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の産生）による有効な治療に適する病態を指す。ＮＫ細胞応答性病態の例としては、がん（例えばメラノーマ、前立腺癌、乳癌及び肝臓癌）及び感染（ウイルス感染（例えばＨＳＶ、肝炎ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス及びＨＩＶ−１による感染）、細菌感染（例えばＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓによる感染）及び原虫感染（例えばＰｌａｓｍｏｄｉｕｍによる感染）及び真菌感染（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓによる感染）等）が挙げられるがこれらに限定されない。

「ペプチド」という用語は、本明細書において使用される時、２〜約５０のアミノ酸（例えば４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０または４５の長さのアミノ酸）の範囲のアミノ酸のポリマーを指す。ペプチドという用語は、非修飾ペプチド、リン酸化されたペプチド（例えばホスホペプチド）の両方の、及びその他に化学的に誘導体化されたペプチドを包含するが、ペプチド模倣物は包含しない。

「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、本明細書において使用される時、長さで約５０を超えるアミノ酸であり、典型的には表的に特徴的な（ｔａｂｌｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）二次構造及び三次構造を有する、アミノ酸のポリマーを一般的には指す。

当業者が理解するように、ＣＩＳ阻害物質及びＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞は治療有効量で投与されるだろう。「有効量」または「治療有効量」という用語は、本明細書において使用される時、治療されている疾患または病態の症状のうちの１つまたは複数をある程度まで軽減する、投与されているＣＩＳ阻害物質の十分な量を指す。結果は、疾患の徴候、症状もしくは原因の低減及び／もしくは緩和、または生物学的系の他の所望される変更であり得る。例えば、治療法の使用のための「有効量」は、不必要な有害な副作用なしに疾患症状における臨床的に有意な減少を提供するのに要求されるＣＩＳ阻害物質の量である。適切な「有効量」は、任意の個別の事例において、用量漸増試験等の技法を使用して決定され得る。「治療有効量」という用語には、例えば予防有効量が含まれる。ＣＩＳ阻害物質の「有効量」は、不必要な有害な副作用なしに、所望される薬理効果または治療的改善を達成するのに有効な量である。任意の年齢についての化合物の代謝における変動、体重、被験体の一般的条件、治療されている病態、治療されている病態の重症度、及び処方する医師の判断に起因して、被験間の「効果量」または「治療有効量」は変動し得ることが理解される。単なる例としてではあるが、治療有効量は、ルーチンの実験（用量漸増臨床試験が含まれるがこれらに限定されない）によって決定され得る。２つ以上の治療剤が組み合わせて使用される場合に、各々の治療剤の「治療有効量」は、それ自体で使用された場合に治療的に有効であろう治療剤の量を指すことができるか、または１つもしくは複数の追加の治療剤とのその組み合わせによって治療的に有効な低減した量を指すことができる。

「小分子」という用語は、本明細書において使用される時、２０００ダルトン未満の分子量を有する分子を指す。

「化学的に修飾されたｍＲＮＡ」または「化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ」という用語
は、本明細書において使用される時、インビトロで生成された合成ＲＮＡを指し、そこで少なくとも１つのタイプのヌクレオチド（例えばシトシン）の一部（例えば１０％、３０％、５０％または１００％）が、細胞内でまたはそうでなければインビボでのその安定性を増加させるように化学的に修飾される。例えば、いくつかの事例において、修飾シストシン（ｃｙｓｔｏｓｉｎｅ）は５−メチルシトシンである。特にトランスフェクション／送達薬剤と組み合わせた場合に、かかるポリヌクレオチドは、細胞へのインビボでの送達／トランスフェクションのために特に有用である。いくつかの事例において、化学的に修飾されたｍＲＮＡは、シストシン（ｃｙｓｔｏｓｉｎｅ）の大部分（例えばすべて）が５−メチルシトシンであり、ウラシルの大部分（例えばすべて）がシュードウラシルである、化学的に修飾されたｍＲＮＡである。かかる修飾ＲＮＡの合成及び使用は、例えばＷＯ２０１１／１３０６２４中に記載される。

「治療すること」または「治療」という用語は、本明細書において使用される時、医学専門家による被験体の直接的治療（例えば被験体への治療剤の投与によって）、または任意の形態における指示を提供することによる少なくとも１人の者（例えば医師、看護師、薬剤師または医薬販売代理人）によって達成される間接的治療の両方を指し、その指示は、（ｉ）請求項に記載される方法に従って自分で治療する（例えば薬物を自己投与する）ように被験体に指示する、または（ｉｉ）請求項に記載される方法に従って被験体を治療するように第三者を指示する。例えば疾患の十分に初期の相でその進行を予防または減速するように治療剤を投与することによって治療される疾患の予防または低減も、「治療すること」または「治療」という用語の意味内に包含される。

「リスクがある」という用語は、本明細書において使用される時、一般集団においてよりも高い、ある健康状態を発症する確率を指す。したがって、特定の病態の「リスクがある」と判断される個体の治療は、被験体がその病態を発症することを予防するか、または少なくとも全体として一般集団中で見出されるものよりも高くないレベルまで、その病態を発症するリスクを低減するように、デザインされる。

「共投与」という用語または同種のものは、本明細書において使用される時、選択された治療剤の単一の患者への投与を包含することが意図され、同じもしくは異なる経路の投与によってまたは同じもしくは異なる時間で薬剤が投与される治療レジメンを含むことが意図される。

治療の方法
本明細書において記載される方法は、治療有効量または予防有効量のＣＩＳ阻害物質を投与することによって、ＮＫ細胞応答性病態を患う被験体またはＮＫ応答性病態を患うリスクがある被験体を治療することを包含する。本明細書において記載されるように、ＣＩＳ（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ Ｑ９ＮＳＥ２）は、ＮＫ細胞においてＩＬ−１５誘導性応答の強力なチェックポイント抑制因子として作用する。理論に拘束されるものではないが、ＮＫ細胞においてＣＩＳの機能を阻害することは、これらの細胞にＩＬ−１５への高い感受性を与え、治療有効性を達成するようにそれらの活性化を継続させると考えられる。

他の実施形態において、養子細胞療法のための方法は、ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞を、ＮＫ細胞応答性病態を患う被験体へ投与することを包含する。

いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞応答性病態を患う被験体またはＮＫ細胞応答性病態患うリスクがある被験体は、増殖性障害（がん等）を患っている。いくつかの実施形態において、がんを患う被験体は、被験体における１つまたは複数の腫瘍の存在によって特徴づけられるがんを患っている。本発明の方法による治療のために好適ながんの例としては、転移性メラノーマ、転移性前立腺癌、転移性乳癌、トリプルネガティブ乳癌、膀胱
癌、脳腫瘍、食道癌、肝臓癌、頭頸部癌、肺扁平上皮細胞癌、非小細胞肺癌、メルケル細胞癌、肉腫、肝細胞癌、多発性骨髄腫、膵臓癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、胃癌、腎臓癌、転移性腎細胞癌、白血病、卵巣癌及び悪性神経膠腫である、がんが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの好ましい実施形態において、がんは、転移性メラノーマ、転移性前立腺癌または転移性乳癌である。いくつかの実施形態において、被験体は、がんのための治療と関連する同種異系の組織移植（例えば白血病の治療のために使用される造血幹細胞移植後）を受けている。

ＮＫ細胞におけるＣＩＳ阻害によってＩＬ−１５へのＮＫ細胞の応答性を増加させる方法も本明細書において記載される。いくつかの実施形態において、ＩＬ−１５へのＮＫ細胞の応答性は、エクスビボのＮＫ細胞における（例えば培養されたＮＫ細胞における）ＣＩＳの阻害によって増加される。他の実施形態において、ＩＬ−１５へのＮＫ細胞の応答性は、インビボのＮＫ細胞におけるＣＩＳを阻害することによって（例えば被験体へのＣＩＳ阻害物質の投与によって）増加される。いくつかの実施形態において、かかる方法は、ＮＫ細胞におけるＣＩＳの発現をエクスビボで低減することを含む。随意に、ＣＩＳの発現がエクスビボで低減されるＮＫ細胞は、被験体に由来する自己由来のＮＫ細胞であり得、エクスビボでのＣＩＳ発現の低減後に、続いてドナー患者の中へ移植される。他の実施形態において、ＮＫ細胞は、同種異系のＮＫ細胞（すなわちレシピエント被験体とは異なるドナー源から得られた）であり得る。いくつかの実施形態において、被験体はがん患者である。他の実施形態において、被験体はＮＫ細胞ドナーである。随意に、かかる方法は、外来性ＩＬ−１５とＮＫ細胞をエクスビボまたはインビボで接触させることを包含し得る。

診断方法
本明細書において開示されるように、ＩＬ−１５は、腫瘍へのＮＫ細胞免疫応答を抑える負のフィードバックループの一部としてＣｉｓｈ発現を誘導する。本明細書において開示されるように、ＩＬ−１５のレベルが特定の腫瘍／腫瘍タイプの微小環境中で上昇される場合に、腫瘍浸潤ＮＫ細胞におけるＣｉｓｈ発現も増加される。理論に拘束されることを望むものではないが、腫瘍浸潤ＮＫ細胞においてＣｉｓｈ発現が増加することから、Ｃｉｓｈ阻害は、腫瘍へのＮＫ媒介性免疫応答の促進において有効である尤度を増加させることが指摘されると考えられる。したがって、いくつかの実施形態において、腫瘍を患う患者において、患者におけるＣｉｓｈ阻害による治療への応答性の尤度は、腫瘍微小環境中のＩＬ−１５のレベルを決定することによって（例えば腫瘍生検によって）査定され、そこで、ＩＬ−１５の閾値レベルに比べた腫瘍微小環境中のＩＬ−１５のレベルの上昇が、治療への応答性の尤度がより高いことを指摘する。

同様に、いくつかの実施形態において、腫瘍を患う被験体において、腫瘍浸潤ＮＫ細胞におけるＣｉｓｈ発現の上昇の誘導は、腫瘍微小環境中のＩＬ−１５のレベルを決定することによってアッセイされ、そこで、ＩＬ−１５の閾値レベルに比べた腫瘍微小環境中のＩＬ−１５のレベルの上昇が、腫瘍浸潤ＮＫ細胞におけるＣｉｓｈ発現の上昇の誘導を指摘する。

ＩＬ−１５の「閾値」レベルは、例えばＩＬ−１５の対照組織レベルの比較に基づいて決定され得る。当業者は、ルーチンの実験を使用して好適な閾値レベルを容易に決定することができる。

他の実施形態において、治療される被験体は感染を患う。いくつかの実施形態において、治療される感染はウイルス感染であり、これには、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、ポックスウイルスまたはパピローマウイルスによる感染が、限定されずに含まれる。他の実施
形態において、ＮＫ細胞応答性病態を患う被験体は、細菌感染（例えばＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、ＬｉｓｔｅｒｉａまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓによる感染）を患っている。他の実施形態において、治療される被験体は、原虫感染（例えばＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ感染）を患っている。さらなる実施形態において治療される被験体は、真菌感染（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ感染）を患っている。

本明細書において使用される時、「被験体」という用語は任意の動物であり得る。一実施例において、動物は脊椎動物である。例えば、動物は、哺乳動物、鳥類の動物、脊索動物、両生類の動物または爬虫類の動物であり得る。例示的な被験体としては、ヒト、霊長動物、家畜（例えばヒツジ、ウシ、ニワトリ、ウマ、ロバ、ブタ）、ペット用動物（例えばイヌ、ネコ）、実験室試験用の動物（例えばマウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲した野生動物（例えばキツネ、シカ）が挙げられるがこれらに限定されない。一実施例において、哺乳動物はヒトである。

上述の病態の各々についての症状、診断検査及び予診検査は、当技術分野において公知である。例えばＨａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（コピーライト）．”１９ｔｈ ｅｄ．，Ｖｏｌｓ１＆２，２０１５，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．を参照されたい。

数多くの動物モデルは、先のＮＫ応答性病態のうちの任意のものを治療するためのＣＩＳ阻害物質の治療有効用量の範囲の確立のために有用である。例えば、数多くのがんのマウスモデルは、例えばメラノーマ（Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、前立腺癌（Ｇｒａｂｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、及び乳癌（Ｂｏｒｏｗｓｋｙ，２０１１）について確立されている。

ＣＩＳ阻害物質
ＣＩＳ阻害は、本明細書において使用される時、正味のＣｉｓｈ遺伝子発現、正味のＣＩＳタンパク質レベル、またはＣＩＳ活性（例えばＪＡＫ１キナーゼ活性の阻害またはタンパク質分解のためのＪＡＫ１の標的化）のうちの１つまたは複数を低減することを指す。ＣＩＳ阻害は、その非存在下におけるＣＩＳの活性レベルに比べて、所与の用量のＣＩＳ阻害物質の存在下におけるＣＩＳ活性レベル、またはその用量のＣＩＳ阻害物質からもたらされるＣＩＳ活性レベル、の少なくとも約１０％〜１００％の低減（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％）または約１０％〜約１００％のＣＩＳ活性の別のパーセント低減を含み得る。いくつかの実施形態において、ＣＩＳ阻害物質は、治療される被験体へ投与される。他の実施形態において、ＣＩＳ阻害物質をＮＫ細胞へエクスビボで適用してＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞を得て、それは続いて治療剤として被験体へ投与される。いくつかの実施形態において、ＣＩＳ阻害物質は可逆的ＣＩＳ阻害物質である。他の実施形態において、ＣＩＳ阻害物質は不可逆的ＣＩＳ阻害物質である。

本発明のために有用なＣＩＳ阻害物質のタイプの例としては、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。

ペプチド
いくつかの実施形態において、治療の方法において使用されるＣＩＳ阻害物質はペプチドである。好適なペプチドは、ＣＩＳがＪＡＫ１のユビキチン化を増加させる能力を阻害することができる、及び／またはＣＩＳがＪＡＫ１キナーゼ酵素活性（例えばその標的タンパク質のリン酸化）を低減する能力を阻害する。いくつかの実施形態において、ペプチドはホスホペプチドであり、それはＣＩＳへ結合し、ＣＩＳが内在的にリン酸化された標
的タンパク質と相互作用する能力を競合的に阻害する。いくつかの実施形態において、ホスホペプチドはＪＡＫ１活性化ループのアミノ酸配列に由来し、ＪＡＫ１のアミノ酸１０２７〜１０４２（以下で示される活性化ループ配列）へ対応し、そこで、Ｔｙｒ１０３４は以下の通りリン酸化される。
(配列番号：１)Ａ^１０２７ＩＥＴＤＫＥｐＹＹＴＶＫＤＤＲＤ

あるいは、ペプチドは、Ｋ^１０３２Ｅ−［Ｆ_２ＰＭＰ］_２−ＴＶ（配列番号：２）等のＪＡＫ１活性化ループリン酸化模倣ペプチドであり得、配列中、［Ｆ_２ＰＭＰ］_２は、Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）中で記載されるような、ホスホチロシル模倣物の４−（ホスホノジフルオロメチル）フェニルアラニン部分である。

他の実施形態において、ペプチドはホスホペプチドまたはリン酸化模倣ペプチドであり、その配列はＩＬ−２Ｒβの細胞質ドメインに由来する（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００８６９．１）。例えば、
（配列番号：３）Ｃ^３５２ＱＶｐＹＦＴＹＤＰＹＳＥ
（配列番号：４）Ｙ^３５８ＤＰｐＹＳＥＥＤＰＤＥＧ
（配列番号：５）Ｄ^３８９ＤＡｐＹＣＴＦＰＳＲＤＤ

いくつかの実施形態において、ペプチドＣＩＳ阻害物質は、配列番号：１〜５のうちの１つのアミノ酸配列を含むホスホペプチドまたはリン酸化模倣ペプチドである。他の実施形態において、ペプチドＣＩＳ阻害物質のアミノ酸配列は配列番号：１〜５のうちの１つからなる。

本発明の方法において使用されるペプチドは、従来のペプチド合成方法に従う、１つまたは複数のアミノ酸残基の縮合経由のペプチド合成の様々な合成方法によって調製され得る。好ましくは、ペプチドは標準的な固相方法論に従って合成され、例えば製造者の指示に従ってＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル４３０Ａペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）上で遂行され得る。固相方法論によってまたは液体相においてのいずれかで、ペプチドを合成する他の方法は、当業者に周知である。固相合成が利用される場合に、Ｃ末端アミノ酸は不溶性樹脂支持体（それは、Ｃ末端アミノ酸中のカルボキシル基と反応することによって離脱可能な結合を生成できる）へ連結される。例えば、いくつかの事例において、使用される不溶性樹脂支持体は、ｐ−ヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン（ＨＭＰ）樹脂である。他の有用な樹脂には、いくつかのＮ−メチル含有ペプチドの合成のためのフェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）樹脂（この樹脂は固相合成のＢｏｃ方法により使用される）；及びＣ末端アミド基を有するペプチドの産生のためのＭＢＨＡ（ｐ−メチルベンズヒドリルアミン）樹脂が含まれるがこれらに限定されない。ペプチド合成の経過の間に、分岐鎖のアミノ基及びカルボキシル基は、一般的に公知の保護基を使用して、必要に応じて保護／脱保護され得る。いくつかの実施形態において、Ｎ−α−アミノ基は、塩基不安定な９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基またはｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ基）により保護される。Ｆｍｏｃ合成と合致する側鎖官能基は、以下に示される保護基：アルギニン（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）；アスパラギン（Ｏ−ｔ−ブチルエステル）；システイン、グルタミン及びヒスチジン（トリチル）；リジン（ｔ−ブチルオキシカルボニル）；セリン及びチロシン（ｔブチル）により保護され得る。ペプチド及びペプチド誘導体のための代替の保護基を利用する修飾は当業者に明らかである。

ペプチド模倣物
いくつかの実施形態において、ＣＩＳ阻害物質はペプチド模倣物である。すべてのペプチドは、酵素による分解にインビボで感受性がある。したがって、基本的なペプチドの生
物学的活性を保持するかまたは促進さえするが、より高い循環半減期を有するペプチド模倣物は、本発明の治療方法における使用のために特に有利である。ペプチド模倣物（例えば配列番号：１〜５のうちの任意のもののアミノ酸配列を有するペプチドに基づくペプチド模倣物）で要求されるリン酸化模倣修飾は、非発酵方法によって多量に容易に合成され得る。

ペプチド骨格は１つまたは複数の内部のペプチド結合によって特徴づけられる一方で、ペプチドは各々のアミノ酸残基を連結するペプチド結合を有するだろう。したがって、１つまたは複数のアミド結合は代替のリンカーによって置き換えられるが、そこで少なくとも１つのアミド結合が残存する化合物はペプチド模倣物と判断される。

ペプチド模倣物骨格は、一般的にはペプチド骨格を模倣する縮合環基の直線または直線状のストリングであるだろう。

ペプチド模倣物は、そのペプチド等価物の極性、三次元サイズ及び機能性（生物活性）の保持によって典型的には特徴づけられるが、そこでペプチド結合は、多くの場合より安定的な連結によって置き換えられる。「安定的な」によって、加水分解酵素による酵素分解へより耐性のあることが意味される。一般的に、アミド結合を置き換える結合（アミド結合代用物）は、アミド結合の特性（例えば立体配座、立体的なかさ、静電的な特徴、水素結合する可能性など）のうちの多くを保存する。「Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」の１４章、Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ，Ｌａｒｓｅｎ，Ｌｉｌｊｅｆｏｒｓ ａｎｄ Ｍａｄｓｅｎ（Ｅｄｓ）１９９６，Ｈｏｒｗｏｏｄ Ａｃａｄ．Ｐｕｂは、ペプチド模倣物のデザイン及び合成のための先行技術の技法の一般的な考察を提供する。好適なアミド結合代用物には、以下の基：Ｎ−アルキル化、レトロ逆アミド（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ ａｍｉｄｅ）、チオアミド、チオエステル、ホスホネート、ケトメチレン、ヒドロキシメチルエン、フルオロビニル、ビニル、メチレンアミノ、メチレンチオ、アルカン及びスルホンアミドが含まれる。

ペプチド及びペプチド模倣物は、一般的には４〜２０、好ましくは長さで７〜１６の原子の骨格を有するだろう。これらの範囲の上限の骨格を有する分子は、一般的にはβアミノ酸及び／もしくはγアミノ酸またはそれらの等価物を含むだろう。

いくつかの実施形態において、ペプチド模倣物は、ＣＩＳ自己阻害ペプチド配列に基づいて導き出されるだろう。いくつかの実施形態において、ＣＩＳ自己阻害ペプチド配列は、ＰＥＳＴペプチド配列（例えば配列番号：２９、３０、３２及び３７の中から選択されるペプチド配列）である。他の実施形態において、ＣＩＳ自己阻害ペプチド配列は、ＣＩＳ Ｎ末端ペプチド配列（例えば配列番号：３１及び３４の中から選択される）である。

小分子
いくつかの実施形態において、ＣＩＳ阻害物質は小分子である。いくつかの実施形態において、小分子はＣＩＳへ特異的に結合し、その活性（例えば結合パートナーまたは標的タンパク質とＣＩＳの相互作用）を低減する。本発明で使用される好適な小分子ＣＩＳ阻害物質は、本明細書において定義されるスクリーニング方法を使用して同定することができる。例えば、化合物は、ＣＩＳのＳｒｃ相同性２（ＳＨ２）ドメイン（ヒトＣＩＳ；ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ Ｑ９ＮＳＥ２；及び配列番号：６のうちのアミノ酸６６〜２１６）、ＳＯＣＳボックス６）、またはＣＩＳのＮ末端領域（アミノ酸１〜６５）へ結合し得る。

いくつかの実施形態において、投与される化合物は、不活性であるかまたは比較的低活性であるが、投与に後続して、活性のあるＣＩＳ阻害物質に変換される（すなわち代謝される）、「プロドラッグ」と通常は称される前駆物質化合物であり得る。それらの実施形
態において、投与される化合物はプロドラッグと称され得る。あるいはまたは加えて、投与される化合物は代謝されて、化合物を欠如する同種同系の細胞に比較した場合に、細胞の集団におけるＣＩＳの活性の発現の低減についての活性を有する活性のある代謝物質を産生することができる。かかる活性のある代謝物質の使用も本開示の範囲内である。

化合物中に存在する置換基に依存して、化合物は随意に塩の形態で存在し得る。記載される方法における使用のために好適な化合物の塩は、カウンターイオンが薬学的に許容されるものである。好適な塩には、有機酸もしくは無機酸または有機塩基もしく無機塩基により形成されたものが含まれる。特に、酸により形成される好適な塩には、鉱酸、強い有機カルボン酸、非置換もしくは例えばハロゲンによって置換された１〜４の炭素原子のアルカンカルボン酸等、飽和または非飽和のジカルボン酸等、ヒドロキシカルボン酸等、アミノ酸等により形成されたもの、または有機スルホン酸（例えばハロゲンによって置換されたかまたは非置換の、（Ｃ_１−４）−アルキル−スルホン酸または（Ｃ_１−４）−アリール−スルホン酸等）により形成されたものが含まれる。薬学的に許容される酸付加塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、クエン酸、酒石酸、酢酸、リン酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、コハク酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、オキサロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸、イセチオン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸、フタル酸、アスパラギン酸、及びグルタミン酸、リシン及びアルギニンから形成されたものが含まれる。薬学的に許容される塩基塩には、アンモニウム塩、アルカリ金属塩（例えばカリウム及びナトリウムのもの）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム及びマグネシウムのもの）、及び有機塩基（例えばジシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルコミン（ｇｌｕｃｏｍｉｎｅ）、モルホリン、チオモルホリン、ピペリジエン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｅｎ）、ピロリジン、モノ−低級−アルキルアミン、ジ−低級−アルキルアミンもしくはトリ−低級−アルキルアミン、例えばエチル−プロピルアミン、ｔブチル−プロピルアミン、ジエチル−プロピルアミン、ジイソプロピル−プロピルアミン、トリエチル−プロピルアミン、トリブチル−プロピルアミンもしくはジメチル−プロピルアミン、またはモノヒドロキシ低級アルキルアミン、ジヒドロキシ低級アルキルアミンもしくはトリヒドロキシ低級アルキルアミン、例えばモノエタノールアミン、ジエタノールアミンもしくはトリエタノールアミン）による塩が含まれる。対応する分子内塩も形成され得る。

有機化学及び／または医薬品化学の当業者は、多くの有機化合物が、それらが反応する溶媒、またはそれらが沈殿もしくは結晶化する溶媒と錯体を形成できることを認識するだろう。これらの錯体は「溶媒和物」として公知である。例えば、水との錯体は「水和物」として公知である。薬物物質が化学量論的量または非化学量論的量のいずれかにおいて結晶格子中に溶媒（水等）を取り込む場合に、溶媒和物（水和物等）は存在する。任意のステージでこれらに遭遇し得るので、薬物物質は溶媒和物（水和物等）の存在についてルーチンにスクリーニングされる。したがって、本発明のために有用な化合物が溶媒和物（水和物等）の形態で存在し得ることが理解されるだろう。本発明における使用のために好適な化合物の溶媒和形態は、関連する溶媒が薬学的に許容されるものである。例えば、水和物は薬学的に許容される溶媒和物の例である。

本発明のために有用な化合物は、非晶形態または結晶形態で存在し得る。多くの化合物が複数の多形形態で存在し、すべてのかかる形態における化合物の使用は本開示によって包含される。本開示のために有用な小分子は、ＣＩＳへの結合について候補化合物のライブラリーをスクリーニングし、次いで結合する化合物のうちの任意のものがＣＩＳ活性を低減するかどうか決定するという標準的な手順を使用して同定することができる。いくつかの実施形態において、本発明の化合物についてのスクリーニングは、化合物が細胞におけるＣＩＳ活性を阻害するかどうかを評価することを含む。本発明のために有用な小分子
は、ＣＩＳ活性を低減する候補を同定する、本明細書において記載されるようなインシリコのスクリーニング（それは既知のライブラリー化合物のスクリーニングを包含し得る）のための手順を使用しても同定することができる。いくつかの実施形態において、小分子ＣＩＳ阻害物質は不可逆的ＣＩＳ阻害物質である。他の実施形態において、小分子ＣＩＳ阻害物質は可逆的ＣＩＳ阻害物質である。

ポリヌクレオチド
いくつかの実施形態において、ＣＩＳ阻害物質はポリヌクレオチドであり、それは記載されるような数多くの異なるメカニズムのうちの少なくとも１つによってＣＩＳ活性を阻害し得る。

ＲＮＡ干渉
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドＣＩＳ阻害物質は、そのｍＲＮＡの標的化によるＣＩＳタンパク質の発現の低減によって作用する。例えば、ポリヌクレオチドはＲＮＡｉでもあり得る。

「ＲＮＡ干渉」、「ＲＮＡｉ」または「遺伝子サイレンシング」という用語は、一般的には、二本鎖ＲＮＡ分子が、核酸配列（その配列と二本鎖ＲＮＡ分子が実質的または全体の相同性を共有する）の発現を低減するプロセスを指す。しかしながら、非ＲＮＡ二本鎖分子を使用して、ＲＮＡ干渉を達成できることが示されている（例えばＵＳ２００７０００４６６７を参照）。

いくつかの実施形態において、ＣＩＳ阻害物質は、ＣＩＳをコードするＣｉｓｈ ｍＲＮＡ（ヒトＣｉｓｈ ｍＲＮＡ：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１３３２４．５）に対するＲＮＡ干渉のための二本鎖領域を含む及び／またはコードする、核酸分子を含む。核酸分子は典型的にはＲＮＡであるが、化学的に修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドを含み得る。

二本鎖領域は、少なくとも１９の連続したヌクレオチド（例えば約１９〜２３ヌクレオチド）であるか、またはより長い（例えば３０もしくは５０ヌクレオチド、または１００ヌクレオチド以上の）ものであり得る。全体の遺伝子転写物へ対応する全長配列が使用され得る。好ましくは、それらは長さで約１９〜約２３ヌクレオチドである。

標的とされる転写物への核酸分子の二本鎖領域の同一性の程度は、少なくとも９０％及びより好ましくは９５〜１００％であるべきである。核酸分子は、分子を安定化するように機能し得る、関連しない配列をもちろん含み得る。

「短鎖干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」という用語は、本明細書において使用される時、例えば配列に特異的な様式でＲＮＡｉを媒介することによって遺伝子発現を阻害またはダウンレギュレートできる、リボヌクレオチドを含む核酸分子を指し、そこで、二本鎖部分は、長さで５０ヌクレオチド未満、好ましくは長さで約１９〜約２３ヌクレオチドである。例えば、ｓｉＲＮＡは、自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を含む核酸分子であり得、そこで、アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその部分中のヌクレオチド配列へ相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその部分へ対応するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＲＮＡは２つの分離したオリゴヌクレオチドからアセンブルすることができ、そこで、１つの鎖はセンス鎖であり、他のものはアンチセンス鎖であり、アンチセンス鎖及びセンス鎖は自己相補的である。

本明細書において使用される時、ｓｉＲＮＡという用語は、配列特異的なＲＮＡｉを媒介できる核酸分子を記載するのに使用される他の用語（例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮ
Ａ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉オリゴヌクレオチド、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）及びその他）に等価であることが意図される。加えて、本明細書において使用される時、ＲＮＡｉという用語は、配列特異的なＲＮＡ干渉（転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、またはエピジェネティックス等）を記載するのに使用される他の用語に等価であることが意図される。例えば、ｓｉＲＮＡ分子を使用して、転写後のレベルまたは転写前レベルの両方で遺伝子をエピジェネティックにサイレンシングさせることができる。非限定例において、ｓｉＲＮＡ分子による遺伝子発現のエピジェネティック調節は、遺伝子発現を改変するようなクロマチン構造のｓｉＲＮＡ媒介性修飾から生じ得る。

「ｓｈＲＮＡ」または「短鎖ヘアピンＲＮＡ」によってＲＮＡ分子が意味され、そこで、約５０ヌクレオチド未満、好ましくは約１９〜約２３ヌクレオチドが、同じＲＮＡ分子上に所在する相補的な配列と塩基対を作り、前記配列及び相補的な配列は、少なくとも約４〜約１５ヌクレオチドの対合しない領域によって分離され、それは塩基相補性の２つの領域によって生じられたステム構造の上の一本鎖ループを形成する。

ｓｈＲＮＡには二重指または２指及び多重指のヘアピンｄｓＲＮＡが含まれ、そこで、ＲＮＡ分子は、一本鎖スペーサー領域によって分離された２つ以上のかかるステムループ構造を含む。

一旦デザインされたならば、二本鎖領域を含む核酸分子は、当技術分野において公知の任意の方法によって（例えば組換えによるインビトロの転写、または合成手段によって）生成され得る。

ヌクレオチドの修飾またはアナログを導入して、核酸分子の特性を改善することができる。特性の改善には、ヌクレアーゼ耐性の増加及び／または細胞膜を透過する能力の増加が含まれる。したがって、「核酸分子」及び「二本鎖ＲＮＡ分子」という用語は、合成的に修飾された塩基（イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル−アデニン、２−プロピル−アデニン及び他のアルキル−アデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザシトシン及び６−アザチミン、シュードウラシル、４−チウラシル（ｔｈｉｕｒａｃｉｌ）、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン及び他の８−置換されたアデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン及び他の置換されたグアニン、他のアザアデニン及びデアザアデニン、他のアザグアニン及びデアザグアニン、５−トリフルオロメチルウラシル及び５−トリフルオロシトシン等であるがこれらに限定されない）を包含する。

インビボの送達のために特に適した化学的に修飾されたｓｉＲＮＡは、当技術分野において、例えばＷＯ２０１４２０１３０６、ＷＯ２００７０５１３０３中で記載される。Ｃｉｓｈ ｍＲＮＡを標的化するのに使用することができる例示的なｓｉＲＮＡは、例えばＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（カタログ番号：１４６７１３及び１４６７１４）；Ｏｒｉｇｅｎｅ（カタログ番号ＳＲ３００８３０）、及びＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ（カタログ番号ＭＢＳ８２３２２４４）から商業的に入手可能である。

ペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドベースのＣＩＳ阻害物質はポリペプチドまたはポリペプチドをコードし、その結果、ＮＫ細胞へのポリヌクレオチドの送達は、コードされるペプチドまたはポリペプチドのＣＩＳタンパク質阻害物質の発現をもたらす
。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞中で一旦発現されたコードされたペプチドまたはポリペプチドは、その相互作用パートナー（例えばエロンギンＢ、エロンギンＣまたはカリン−５）または標的タンパク質（例えばＴｙｒ１０３４リン酸化ＪＡＫ１、またはＴｙｒ３５５、Ｔｙｒ３６１もしくはＴｙｒ３９２のうちの任意のものでリン酸化されたＩＬ ２Ｒβ）のうちの１つまたは複数と内在性ＣＩＳタンパク質の相互作用を阻害する。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＣＩＳ活性のドミナントネガティブ抑制因子をコードする。一実施形態において、コードされたドミナントネガティブ抑制因子は、ＳＨ２ドメインが不活性化された^１０７Ａｒｇ→^１０７Ｌｙｓ（Ｒ１０７Ｋ）突然変異を備えたアミノ酸配列を含むＣＩＳである。他の実施形態において、コードされたドミナントネガティブ抑制因子は、ＳＯＣＳボックス中のカリン−５結合部位における突然変異を備えたアミノ酸配列（例えばＰ２４１Ａ／Ｌ２４２Ａ／Ｐ２４３）を含むＣＩＳである。他の実施形態において、コードされたドミナントネガティブ抑制因子はＬ２２３Ａ置換を備えたアミノ酸配列を含むＣＩＳである。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドＣＩＳ阻害物質は、Ｃｉｓｈ遺伝子の発現を不活性化または低減することによってＣＩＳ活性を阻害するプログラム可能なヌクレアーゼをコードする。本明細書において使用される時、「プログラム可能なヌクレアーゼ」という用語は、所定の遺伝子の所在位置を認識し編集するように「標的化される」（「プログラムされる」）ヌクレアーゼに関連する。いくつかの実施形態において、コードされたポリペプチドは、Ｃｉｓｈ遺伝子またはその調節領域の中へ遺伝子修飾を導入するように「標的化」または「プログラム」されたプログラム可能なヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾は、Ｃｉｓｈ遺伝子またはその調節領域中の欠失または置換である。かかるプログラム可能なヌクレアーゼは、エクスビボのＣＩＳが阻害されたＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞の生成のために（例えば養子細胞療法における使用のためのＣｉｓｈ^−／−の自己由来のＮＫ細胞の生成のために）特に有用である。

いくつかの実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合性ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインの組み合わせによって遺伝子の所在位置を認識するようにプログラムされ得る。ＺＦＰはＤＮＡ配列中の特異的な３ｂｐを認識し、ＺＦＰの組み合わせを使用して特異的な遺伝子の所在位置を認識することができる。いくつかの実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインによって遺伝子の所在位置を認識するようにプログラムされ得る。代替の実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、１つまたは複数のＲＮＡ配列によって遺伝子の所在位置を認識するようにプログラムされ得る。代替の実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは１つまたは複数のＤＮＡ配列によってプログラムされ得る。代替の実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは１つまたは複数のハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ配列によってプログラムされ得る。代替の実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列及びハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ配列のうちの１つまたは複数によってプログラムされ得る。

本開示に従って使用することができるプログラム可能なヌクレアーゼには、細菌性のクラスター化し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）−ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）系に由来するＲＮＡガイド型操作ヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びアルゴノートが含まれるがこれらに限定されない。

いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼはＲＮＡガイド型操作ヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）である。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮは、古細菌ゲノムからのものまたはその組換えバージョンである。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮは、細菌ゲノム
からのものまたはその組換えバージョンである。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮは、タイプＩ（ＣＲＩＳＰＲ）−ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）系からのものである。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮは、タイプＩＩ（ＣＲＩＳＰＲ）−ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）系からのものである。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮは、タイプＩＩＩ（ＣＲＩＳＰＲ）−ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）系からのものである。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼはクラスＩ ＲＧＥＮである。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼはクラスＩＩ ＲＧＥＮである。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮは多重構成要素の酵素である。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮは単一構成要素の酵素である。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮはＣＡＳ３である。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮはＣＡＳ１０である。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮはＣＡＳ９である。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮはＣｐｆ１である（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮは単一のＲＮＡまたはＤＮＡによって標的化される。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮは２つ以上のＲＮＡ及び／またはＤＮＡによって標的化される。いくつかの実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼはＤＮＡでプログラムされたアルゴノートであり得る（ＷＯ１４／１８９６２８）。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドＣＩＳ阻害物質は、当技術分野において公知の数多くのトランスフェクション方法（例えば組換えウイルス形質導入、リポソームベースのトランスフェクション、エレクトロポレーション、またはナノ粒子ベースのトランスフェクション）のうちの任意のものを使用してＮＫ細胞へインビボでまたはインビトロで送達される、発現ベクター中で提供される。

本明細書において使用される時、「発現ベクター」は、宿主細胞（例えばＮＫ細胞）中で１つまたは複数のポリヌクレオチドの発現を達成することができる、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターである。ベクターは典型的にはプラスミドまたは組換えウイルスである。任意の好適な発現ベクターを使用することができ、その例としてはプラスミドまたはウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはアデノ随伴ウイルスベクターである。

かかるベクターは、ポリヌクレオチド（遺伝子サイレンシングのためのｄｓＲＮＡ等）の発現のための１つまたは複数のプロモーターを含むだろう。好適なプロモーターには、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが含まれるがこれらに限定されない。真核細胞プロモーター等の細胞プロモーター（ヒストンプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの発現の事例において）、及びβ−アクチンプロモーターが含まれるがこれらに限定されない）も、使用され得る。いくつかの実施形態において、プロモーターはＮＫ細胞選択的プロモーター（ヒトＮＫｐ４６プロモーター）である（例えばＷａｌｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７を参照）。好適なプロモーターの選択は、本明細書において含有される教示から当業者へ明らかである。

他の実施形態において、ポリヌクレオチドＣＩＳ阻害物質は、ドミナントネガティブＣＩＳをコードする合成の化学的に修飾されたｍＲＮＡである。化学的に修飾されたｍＲＮＡ及びそれらの合成は、例えばＷＯ２０１１／１３０６２４中で詳細に記載される。典型的には、化学的に修飾されたｍＲＮＡは、（ｉ）翻訳促進のための５’合成キャップ；（ｉｉ）ＲＮＡｓｅ耐性及び細胞のインターフェロン応答性の弱化を付与する、修飾されたヌクレオチド（それがなければ大幅に翻訳効率を低減するだろう）；及び（ｉｉｉ）３’ポリＡテイルを含む。典型的には、化学的に修飾されたｍＲＮＡは、ドミナントネガティブＣＩＳをコードするオープンリーディングフレームへ作動可能に連結された、ＳＰ６Ｒ
ＮＡポリメラーゼプロモーターまたはＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む、ＤＮＡテンプレートからインビトロで合成される。化学的に修飾されたｍＲＮＡ合成反応は、修飾ヌクレオチド及び非修飾ヌクレオチドの混合物の存在下において行われる。いくつかの実施形態において、化学的に修飾されたｍＲＮＡのインビトロの合成において含まれる修飾されたヌクレオチドは、シュード−ウリジン及び５−メチル−シトシンである。細胞のｍＲＮＡのプロセシングにおける重要なステップは５’キャップ構造の付加であり、それは、ＲＮＡの５’末端とグアノシンヌクレオチドとの間の５’−５’三リン酸塩連結である。キャップはグアノシンのＮ−７位で酵素によりメチル化されて、成熟ｍＣＡＰを形成する。ドミナントネガティブＣＩＳの化学的に修飾されたｍＲＮＡを調製する場合に、典型的には、修飾されたｍＲＮＡを安定化し翻訳を有意に促進するために、５’キャップはＮＫ細胞のトランスフェクションの前に付加される。いくつかの実施形態において、キャップアナログ対ＧＴＰの４：１の混合物を転写反応において使用して、５’キャッピングされた化学的に修飾されたｍＲＮＡを得る。好ましい実施形態において、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）（３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ）を使用して、ＮＫ細胞中で効率的に翻訳できる化学的に修飾されたｍＲＮＡを生成する。ｍＲＮＡＥｘｐｒｅｓｓ（商標）ｍＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｙｓｔｅｍ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）によって例示されるように、インビトロの合成のための系は商業的に入手可能である。インビトロ及びインビボのトランスフェクションのためのかかる修飾されたＲＮＡの合成及び使用は、例えばＷＯ２０１１／１３０６２４及びＷＯ／２０１２／１３８４５３中で記載される。

ポリペプチド
いくつかの実施形態において、ＣＩＳ阻害物質はポリペプチドであり、それは数多くの異なるメカニズム（例えば、ＣＩＳもしくはＣＩＳ結合パートナーへ特異的に結合し、それによってＣＩＳ及び結合パートナーの相互作用を低減すること、またはあるいは、結合パートナーとの相互作用についてＣＩＳと競合すること）のうちの少なくとも１つによって、ＣＩＳ活性を阻害し得る。

抗体
いくつかの実施形態において、ＣＩＳ阻害物質は、ＣＩＳへ結合し、結合パートナーまたは標的タンパク質とのその相互作用を阻害する、抗体またはそのＣＩＳ結合断片である。好ましくは、抗体は、哺乳動物細胞及び特にＮＫ細胞を透過するか、またはそれらの細胞中に取り込まれる（受動的または能動的に）ように修飾された抗体である。

「抗体」という用語には、本明細書において使用される時、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、融合ダイアボディ、トリアボディ、ヘテロコンジュゲート抗体、及びキメラ抗体が含まれる。対応する全長抗体に比べて、少なくとも実質的な（約１０％の）抗原結合を保持する抗体断片も企図される。かかる抗体断片は、本明細書において「抗原結合断片」と称される。抗体には多様な形態の修飾が含まれ、それらには、例えばＶＨドメインもしくはＶＬドメインのいずれかを含むドメイン抗体、重鎖可変領域の二量体（ＶＨＨ、ラクダについて記載されるような）、軽鎖可変領域の二量体（ＶＬＬ）、直接的にもしくはリンカーを介して連結され得る軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の可変領域のみを含有するＦｖ断片、または重鎖可変領域及びＣＨ１ドメインを含有するＦｄ断片が含まれるがこれらに限定されない。

一本鎖抗体を形成するように一緒に連結される重鎖及び軽鎖の可変領域からなるｓｃＦｖ、ならびにｓｃＦｖのオリゴマー（ダイアボディ及びトリアボディ等）も、「抗体」という用語によって包含される。可変領域及び定常領域の一部を含有する抗体の断片（Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２及びＦａｂＦｃ２断片等）も包含される。相補性決定領域（ＣＤＲ）をグラフトした抗体断片及び抗体断片のオリゴマーも包含される。Ｆｖの重鎖及び軽鎖の
構成要素は同じ抗体または異なる抗体に由来し、それによってキメラＦｖ領域を産生し得る。抗体は、動物（例えばマウス、ウサギまたはラット）起源もしくはヒト起源であり得るか、またはキメラかであるもしくはヒト化され得る。

本明細書において使用される時、「抗体」という用語にはこれらの様々な形態が含まれる。本明細書において提供されるガイドライン、ならびに上で引用される参照文献及びＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）のような出版物中で記載される当業者に周知のそれらの方法を使用して、本発明の方法で使用される抗体は容易に作製することができる。

抗体は可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）を含むＦｖ領域であり、そこで、軽鎖及び重鎖は直接的にまたはリンカーを介して連結され得る。本明細書において使用される時、リンカーは、軽鎖及び重鎖へ共有結合で連結され、指向されるエピトープを特異的に結合できる立体配座を達成することができるように、２つの鎖の間に十分な間隔及び柔軟性を提供する、分子を指す。タンパク質リンカーは、融合ポリペプチドのＩｇ部分の内因性構成要素として発現されて得るので、特に好ましい。

別の実施形態において、組換えにより産生された一本鎖ｓｃＦｖ抗体（好ましくはヒト化ｓｃＦｖ）は本発明の方法において使用される。

一実施形態において、抗体は細胞内伝達のための能力を有する。細胞内伝達のための能力を有する抗体には、ラクダ及びラマの抗体、サメ抗体（ＩｇＮＡＲ）、ｓｃＦｖ抗体、イントラボディまたはナノボディ、例えばｓｃＦｖイントラボディ、ＶＨＨイントラボディ等の抗体が含まれる。酵母ＳＰＬＩＮＴ抗体ライブラリーが、タンパク質−タンパク質相互作用を破壊できるイントラボディについて試験するために利用可能である。かかる薬剤は、細胞透過性ペプチド配列または核局在ペプチド配列（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）中で開示されるもの等）を含み得る。ＶｅｃｔｏｃｅｌｌまたはＤｉａｔｏのペプチドベクター（Ｄｅ Ｃｏｕｐａｄｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）中で開示されるもの等）もインビボの送達のために有用である。

加えて、抗体は、細胞透過剤（例えば細胞透過性ペプチド）へ融合され得る。細胞透過性ペプチドには、Ｔａｔペプチド、ペネトラチン、短い両親媒性ペプチド（Ｐｅｐファミリー及びＭＰＧファミリーからのもの等）、オリゴアルギニン及びオリゴリジンが含まれる。一例において、細胞透過性ペプチドは細胞内送達を改善するために脂質（Ｃ６−Ｃ１８脂肪酸）ドメインへもコンジュゲートされる（Ｋｏｐｐｅｌｈｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００８）。細胞透過性ペプチドの例は、Ｈｏｗｌ ｅｔ ａｌ．（２００７）及びＤｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００８）中で見出され得る。したがって、本発明は、共有結合（例えばペプチド結合）経由で、細胞透過性ペプチド配列へ随意にＮ末端またはＣ末端で融合される抗体の治療使用も提供する。

ＣＩＳを標的とする抗体は、様々な供給源（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（例えばカタログ番号ｓｃ−７４５８１）等）から利用可能である。

ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞
ＮＫ細胞におけるＣＩＳを、エクスビボで（例えば培養されたＮＫ細胞で）阻害して、ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞を得るために好適な任意のＣＩＳ阻害物質は、ＮＫ応答性病態についての養子細胞療法のために使用することができる。いくつかの実施形態において、投与されるＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞は、自己由来、すなわち治療される被験体に由来する。他の実施形態において、投与されるＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞は同種異系のＮ
Ｋ細胞である。

いくつかの実施形態において、ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞は、ＣＩＳの発現が低減されるように遺伝的に修飾されたＮＫ細胞である。例えば、いくつかの実施形態において、ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞は、ＣＩＳ ｓｈＲＮＡ発現ベクターまたはＣＩＳアンチセンス発現ベクターの一時的もしくは安定的なトランスフェクションまたはウイルスによる形質導入によって得られ、それは、発現された場合に、遺伝的に修飾された細胞におけるＣＩＳの発現レベルを低減させる。他の実施形態において、ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞は、標的化されたゲノム修飾によって（例えば１つもしくは複数のエクソンの欠失、終止コドンの導入、またはプロモーターの不活性化によって）、１つまたは両方のＣｉｓｈ対立遺伝子が不活性化された、遺伝的に修飾されたＮＫ細胞である。細胞株及び初代細胞の両方におけるゲノム遺伝子座の修飾のための方法は、当技術分野において十分に確立されている。例えば、プログラム可能なヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９−ＣＲＩＳＰＲ系は非常に効率的であり、遺伝子の標的化された破壊のためにルーチンに使用される。

他の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＣＩＳ阻害物質（例えばペプチド、ペプチド模倣物、ポリヌクレオチド、またはポリペプチド）とエクスビボで接触させられる。

ＮＫ細胞は数多くの異なる方法のうちの任意のものによって得ることができ、それらには、一次供給源からのＮＫ細胞の単離及び増殖、造血幹細胞（ＨＳＣ）からの分化及び増殖、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からの分化及び増殖、または別の多分化能性幹細胞タイプからの分化が含まれる。

いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞は、ヒト被験体（例えば自己由来養子細胞療法の事例において、治療される患者）から単離される。

ＮＫ細胞は、ＣＤ５６及びＣＤ３への抗体により組織源（例えば末梢血）からの細胞を染色し、ＣＤ５６^＋ＣＤ３⁻細胞について選択することによって、単離またはエンリッチされ得る。ＴＳＮＫ細胞は、商業的に入手可能なキット（例えばＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ））を使用して単離され得る。ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を含む細胞の集団中のＮＫ細胞以外の細胞の除去によっても、単離またはエンリッチされ得る。例えば、ＮＫ細胞は、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３６、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１２３、ＨＬＡ ＤＲ、及び／またはＣＤ２３５ａ（グリコフォリンＡ）のうちの１つまたは複数への抗体を使用して、非ＮＫ細胞マーカーを提示する細胞を枯渇させることによって、単離またはエンリッチされ得る。負の単離は、商業的に入手可能なキット（例えばＮＫ Ｃｅｌｌ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ））を使用して実行され得る。これらの方法によって単離された細胞を追加で選別して、例えばＣＤ５６^＋／ＣＤ１６⁻細胞及びＣＤ５６⁻／ＣＤ１６^＋細胞を分離することができる。

細胞分離は、例えばフローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、または好ましくは特異的抗体とコンジュゲートされたマイクロビーズを使用する磁気細胞選別によって達成され得る。細胞は、例えば磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）技法（１つまたは複数の特異的抗体、例えば抗ＣＤ５６抗体を含む磁気ビーズ（例えば約０．５〜１００μｍの直径）を結合する能力に基づく、粒子を分離するための方法）を使用して、単離され得る。磁気細胞分離は、例えばＡＵＴＯＭＡＣＳ（商標）Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、遂行及び自動化され得る。多様な有用な修飾は、磁気マイクロスフェア（特定の細胞表面分子またはハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合による付加が含まれる）上で遂行され得る。次いでビーズを細胞と混合して、結合させる。次いで細胞を磁界を介して通過させて、特異的細胞表面マーカーを有する細胞を分離する。一実
施形態において、次いでこれらの細胞は単離され、追加の細胞表面マーカーに対する抗体へカップリングされた磁気ビーズと再び混合され得る。細胞を磁界を介して再び通過させ、両方の抗体に結合する細胞を単離する。次いでかかる細胞は、分離したディッシュ（クローン単離のためのマイクロタイターディッシュ等）の中へ希釈され得る。

ＨＳＣからのヒトＮＫ細胞の分化は例えば米国特許第８，９２６，９６４号中で、及びｈｉＰＳＣからのものは米国特許第２０１３０２８７７５１号中で記載される。

ＮＫ細胞（特にヒトＮＫ細胞）を培養及び増殖して、養子細胞療法のための臨床グレードＮＫ細胞を得るための方法は、例えばＣｈｉｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）中で概説されるように、当技術分野において記載される。

ＣＩＳ阻害物質の投与
いくつかの実施形態において、ＮＫ応答性病態を患う被験体を治療するかまたはかかる病態を予防するための方法は、少なくとも１つのＣＩＳ阻害物質、またはその薬学的に許容される塩、薬学的に許容されるＮ−酸化物、薬学的に活性のある代謝物質、薬学的に許容されるプロドラッグ、もしくは薬学的に許容される溶媒和物を治療有効量で含有する医薬組成物の、前記被験体への投与を包含する。

ＣＩＳ阻害物質を投与して、ＮＫ応答性病態（例えばがんまたは感染）を既に患う及び／または有すると診断された患者の症状を予防、治癒、または部分的に停止する。この使用のために有効な量は、感染の重症度及び経過、以前の治療法、患者の健康状況、体重、治療への応答、ならびに感染性病原体の治療への耐性に依存するだろう。ルーチンの実験（用量漸増臨床試験が含まれるがこれらに限定されない）によって、かかる治療有効量を決定することは、十分に当業者の技能の範囲内にあると考慮される。

予防上の適用において、ＣＩＳ阻害物質を含有する組成物は、例えば免疫不全である個体（感染予防について）または遺伝子型に基づいて特定のタイプのがんへ高度に感受性がある個体の事例において、ＮＫ応答性病態（例えばがんまたは感染）を発症することへ感受性があるか、またはそうでなければそのリスクがある患者へ、投与される。かかる量は、「予防有効量または予防有効用量」、すなわち感染の発症を予防するかまたは減少させるのに十分な用量と定義される。この使用において、正確な量は、特定の条件、患者の健康状態、体重、タイミングなどにも依存する。ルーチンの実験（例えば用量漸増臨床試験）によって、かかる予防有効量を決定することは、十分に当業者の技能の範囲内にあると考慮される。

被験体の状況が、信頼できる医学的アドバイスに際して改善する事例において、ＣＩＳ阻害物質の投与は連続的に与えられ得るか；あるいは、投与されている薬物の用量は一時的に低減され得るか、またはある特定の長さの時間の間一時的に停止され得る（すなわち「休薬日」）。休薬日の長さは２日〜１年の間で変動することができ、単なる例としてではあるが、それには、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１５日、２０日、２８日、３５日、５０日または６０日が含まれる。休薬日の間の容量低減は１０％〜１００％であり得、単なる例としてではあるが、それには、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％が含まれる。

治療有効用量として好適である所与のＣＩＳ阻害物質の量は、因子（投与されるＣＩＳ阻害物質のタイプ及び効力、被験体の健康状態の重症度／ステージ、治療を必要とする被験体または宿主の特徴（例えば体重）、ならびに前治療または併用治療等）に依存して変動するだろうが、それにもかかわらず、その事例を取り巻く特定の状況（例えば投与され
ている具体的な薬剤、投与経路、治療されている病態、及び治療されている被験体または宿主が含まれる）に応じて、当技術分野において公知の様式で、ルーチンに決定することができる。一般に、しかしながら、成人ヒトの治療のために用いられる用量は、典型的には、１日あたり０．０２〜５０００ｍｇ、または１日あたり約１〜１５００ｍｇの範囲であるだろう。所望される用量は、単一用量で、または同時に（または短期間にわたって）もしくは適切なインターバルで投与される分割用量として（例えば１日あたり２、３、４以上のサブ用量として）、好都合に提示され得る。

個別の治療レジームに関する変数の数が多いので、先の範囲は単なる示唆的であり、これらの推奨値からのかなりの逸脱は稀ではない。かかる投薬量は、数多くの変数（使用されるＣＩＳ阻害物質の活性、治療されるＮＫ細胞応答性病態のタイプ及び重症度、投与モード、ならびに従事者の判断であるが限定されない）に依存して変更され得る。

かかる治療法レジメンの毒性及び治療有効性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができ、それらには、ＬＤ_５０（集団の５０％に致死の用量）及びＥＤ_５０（集団の５０％における治療有効用量）の決定が含まれるがこれらに限定されない。毒性と治療効果との間の用量比は治療法上の指標であり、ＬＤ_５０とＥＤ_５０の間の比として表現することができる。高い治療指数を示すＣＩＳ阻害物質が好ましい。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒト被験体及び非ヒト被験体における使用のための投薬量範囲の処方において使用され得る。かかる化合物の投薬量は、好ましくは最小の毒性を備えたＥＤ_５０が含まれる血中循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる投薬形態及び利用される投与経路に依存してこの範囲内で変動し得る。

ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞の投与
当技術分野において公知であるようなＮＫが阻害された細胞（ＮＫ−ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）は、任意の好適な経路によって投与することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、動脈内点滴または静脈内点滴として全身に投与される。当業者は、ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞の選択された投与経路は、治療される特定のＮＫ応答性病態に部分的に依存するだろうことを認識するだろう。例えば、被験体が１つまたは複数の腫瘍の存在を患う場合に、いくつかの実施形態において、経路投与は腫瘍内の投与及び／または腫瘍周囲の投与を包含するだろう。他の例示的な投与経路としては、腹腔内、髄腔内及びリンパ管内が挙げられる。

ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞は、個体へ検出可能な治療的または予防的な利益をもたらす任意の量または数（例えば有効量）で、個体へ投与することができ、そこで、個体はがんまたはウイルス感染を有する。いくつかの実施形態において、投与されるＣＩＳが阻害された細胞の用量は、単純に細胞の絶対数であり、例えば、前記個体は、約１×１０^５細胞、５×１０^５細胞、１×１０^６細胞、７×１０^６細胞、１×１０^７細胞、６×１０^７細胞、２×１０^８細胞、５×１０^８細胞、１×１０^９細胞、６×１０^９細胞、２×１０^１０細胞、５×１０^１０細胞、または１×１０^１１細胞を投与され得る。

他の実施形態において、ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞は、治療される被験体の体重に比べた細胞の数で、例えば治療される被験体１キログラムあたり約１×１０^５細胞、５×１０^５細胞、１×１０^６細胞、７×１０^６細胞、１×１０^７細胞、６×１０^７細胞、２×１０^８細胞、５×１０^８細胞、１×１０^９細胞、または６×１０^９細胞で、被験体へ投与される。

他の実施形態において、治療される被験体が１つまたは複数の腫瘍を患う場合に、ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞は、ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞対治療される被験体における腫
瘍細胞の近似数の所望される近似比に基づいて投与される。例えば、ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞は、約１：１、１：１、３：１、４：１、５：１、９：１、１０：１、１５：１、２５：１、３０：１、４０：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７５：１、８０：１、９０：１、９５：１または１００：１の比（ＮＫ細胞対腫瘍細胞）で投与され得る。腫瘍細胞の数は、例えば組織サンプル（例えば血液サンプル、生検または同種のもの）中の腫瘍細胞の数の決定によって推定することができる。いくつかの実施形態において、例えば固形腫瘍について、腫瘍細胞数の推定は、生検中の細胞カウント及び腫瘍画像化を組み合わせて、腫瘍体積及び常在細胞数を推定することよって行うことができる。

組み合わせ治療
ＣＩＳ阻害物質及びＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞組成物は、ＮＫ応答性健康状態（例えばがん及びウイルス感染）の治療において治療価値のある他の薬剤と組み合わせても使用され得る。一般に、他の薬剤は、必ずしも同じ医薬組成物中で投与される必要がなく、異なる物理的特徴及び化学的特徴があるので、好ましくは異なる経路によって投与され得る。投与モードの決定及び同じ医薬組成物中の投与（可能な場合には）の妥当性は、熟練臨床医の十分に知識内である。最初の投与は当技術分野において公知の確立されたプロトコルに従って行うことができ、次いで観察された効果に基づいて、投薬量、投与モード及び投与の時間は熟練臨床医によって変更され得る。

ＣＩＳ阻害物質及び追加の治療剤は、感染の性質及び相、患者の病態、ならびに使用される治療剤の実際の選択に依存して、同時に（例えば同時に、本質的に同時に、または同じ治療プロトコル内で）または連続して投与され得る。投与のオーダー、及び治療プロトコルの間の各々の治療剤の投与の反復回数、の決定は、治療されている疾患及び患者の病態の評価後に、熟練医師の十分に知識内である。

薬物が治療の組み合わせにおいて使用される場合に、治療有効投薬量が変動し得ることは当業者に公知である。薬物及び組み合わせ治療レジメンにおける使用のための他の薬剤の治療有効投薬量を実験的に決定する方法は、文献中で記載される。例えば、メトロノミック投薬の使用、すなわち毒性副作用を最小限にするために、より頻繁でより低い用量を提供することは、文献中で広汎に記載されている。組み合わせ治療は、患者の臨床管理を支援するために、様々な時間で開始及び中止する周期的治療をさらに包含する。

組み合わせ療法のために、共投与される治療剤の投薬量は、もちろん、用いられる共薬剤のタイプ、具体的なＣＩＳ阻害物質、及び治療されるＮＫ細胞応答性病態に依存して、変動するだろう。

軽減が求められる病態（複数可）を治療、予防または寛解する、投薬量レジメンは、多様な因子に従って変更され得ることが理解される。これらの因子には、被験体が罹患する病態に加えて、被験体の年齢、体重、性別、食餌及び一般的病状が含まれる。したがって、実際に用いられる投薬量レジメンは広く変動することがあり得、したがって、本明細書において説明される投薬量レジメンから逸脱し得る。

本明細書において開示される組み合わせ療法を構成するＣＩＳ阻害物質及び追加の治療剤は、組み合わせた投薬形態、または実質的に同時の投与を意図する分離した投薬形態であり得る。組み合わせ療法を構成する医薬用薬剤は、２ステップの投与を要求するレジメンによって投与されているいずれかの治療化合物と共に、連続して投与もされ得る。２ステップの投与レジメンは、活性のある薬剤の連続投与、または分離した活性のある薬剤の間隔を置いた投与を要求し得る。複数の投与ステップの間の期間は、各々の医薬用薬剤の特性（医薬用薬剤の効力、溶解度、バイオアベイラビリティー、血漿内半減期及び動態プロファイル等）に依存して、数分間〜数時間の範囲であり得る。様々な生理的パラメータ
ーの概日変動も評価して、至適用量インターバルを決定することができる。

加えて、感染の治療のためのＣＩＳ阻害物質の投与または共投与は、患者への追加利益または相乗利益を提供し得る手順と組み合わせて使用され得る。単なる例としてではあるが、治療パラメーター（例えば投与されるＣＩＳ阻害物質のタイプ、投薬レジメン、及び追加の治療剤との共投与）を至適化するように、患者は、自身のゲノムまたは病原体のゲノム中の遺伝変異を同定するために遺伝子検査を受けてもよい。

最初の投与は、任意の実践的な経路（例えば静脈注射、ボーラス注射、５分〜約５時間にわたる点滴、ピル、カプセル、吸入器、注射、経皮パッチ、頬腔送達、及び同種のもの、またはその組み合わせ等）経由であり得る。疾患または病態の発症が検出または疑われた後に実行可能なかぎり早く、及びＮＫ細胞応答性病態の治療または予防のために必要な時間長で、化合物は投与されるべきである。

随意に、被験体は、ＣＩＳ阻害物質を使用する治療と組み合わせた場合に、治療的に有効な用量でＩＬ−１５またはＩＬ−１５アゴニストも投与され得る。ＩＬ−１５アゴニストには、ＩＬ−１５の機能的ホモログ（例えばＷｕ（２０１３）中で記載されるもの等）が含まれる。他の実施形態において、本発明の治療のうちの任意のものは、１つまたは複数の免疫療法剤の投与をさらに含み得る。ＣＩＳ阻害、またはＩＬ−１５もしくはＩＬ−１５アゴニストと組み合わせたＣＩＳ阻害、と組み合わせた使用のために好適な免疫療法剤には、プログラム細胞死１受容体（ＰＤ−１）に対する抗体、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に対する抗体、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）に対する抗体、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−ｂ）に対する抗体、タクタイル（ＣＤ９６）に対する抗体、またはその組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。

さらなる実施形態において、他の実施形態において、本発明の治療のうちの任意のものは、Ｂ−Ｒａｆプロテインキナーゼ阻害物質またはＭＥＫプロテインキナーゼ阻害物質の投与をさらに含み得る。Ｂ−Ｒａｆプロテインキナーゼ阻害物質の例としては、ＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ）、ＰＬＸ−４７２０、ダブラフェニブ（ＧＳＫ２１１８４３６）、ＡＺ６２８、ＲＡＦ２６５（ＣＨＩＲ−２６５）、エンコラフェニブ（ＬＧＸ８１８）、ＳＢ５９０８８５、及びその組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。ＭＥＫプロテインキナーゼ阻害物質の例としては、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、コビメチニブ、ビニメチニブ（ＭＥＫ１６２）、セルメチニブ（ＰＤ−３２５９０１）、その組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記の治療のうちの任意のものは、ＴＧＦ−β受容体アンタゴニストの投与をさらに含み得る。好適なＴＧＦ−β受容体アンタゴニストの例としては、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）、ＧＷ ７８８３８８、ＬＹ ３６４９４７、Ｒ２６８７１２、ＳＢ ５２５３３４及びＳＤ２０８が挙げられるがこれらに限定されない。

投薬形態
本発明のために有用な組成物は、任意の従来の手段（経口、非経口（例えば静脈内、皮下または筋肉内）、頬腔、吸入、鼻腔内、直腸、経皮の投与経路が含まれるがこれらに限定されない）経由で被験体への投与のために製剤化され得る。

ＣＩＳ阻害物質（例えばペプチド模倣物）を単独で、または１つもしくは複数の他の治療剤と組み合わせて、含む医薬組成物は、任意の好適な投薬形態へと製剤化することができ、それには、治療される患者による経口摂取のための、水性経口分散液、液体、ミスト、ゲル、シロップ、エリキシル、スラリー、懸濁液及び同種のもの、固体経口投薬形態、エアロゾル、制御放出性製剤、速溶製剤、発泡製剤、凍結乾燥製剤、錠剤、粉末、ピル、
ドラジェ、カプセル、遅延放出製剤、延長放出製剤、パルス放出製剤、多重微粒子製剤、ならびに混合即時放出及び制御放出の混合製剤が含まれるがこれらに限定されない。

経口使用のための医薬調製物は、１つまたは複数の固体の賦形剤を化合物のうちの１つまたは複数と混合すること、随意にもたらされた混合物を粉砕すること、及び所望されるならば好適な補助剤を添加した後に、顆粒の混合物をプロセシングして錠剤またはドラジェコアを得ることによって得ることができる。好適な賦形剤には、例えば充填剤（糖等、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールが含まれる）；セルロース調製物（例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等）；または他のもの（ポリビニルピロリドン（ＰＶＰまたはポビドン）またはリン酸カルシウム等）が含まれる。所望されるならば、崩壊剤（架橋されたクロスカルメロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、アガー、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウム等）等）が添加され得る。

別の態様において、投薬形態はマイクロカプセル化製剤を包含し得る。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の他の適合性のある材料がマイクロカプセル化材料中に存在する。例示的な材料としては、ｐＨ修飾物質、侵食促進物質、消泡剤、抗酸化物質、着香剤及び担体材料（結合剤、懸濁化剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、溶解剤、安定剤、滑沢剤、湿潤剤及び希釈剤等）が挙げられるがこれらに限定されない。

ＣＩＳ阻害物質のマイクロカプセル化製剤は、当業者に公知の方法によって製剤化され得る。かかる公知の方法には、例えば噴霧乾燥プロセス、回転盤−溶媒プロセス、熱溶融プロセス、噴霧冷却法、流動床、静電沈着、遠心押出し、回転懸濁分離、液体−気体境界もしくは固体−気体境界での重合、圧力押出し、または噴霧溶媒抽出浴が含まれる。これらに加えて、いくつかの化学的技法（例えば複合コアセルベーション、溶媒蒸発、ポリマー−ポリマー非相容性、液体溶媒中の界面重合、インサイチューの重合、液中乾燥、及び液体溶媒中での脱溶媒和）が使用され得る。さらに、他の方法（ローラー圧縮、押出し／スフェロイド化、コアセルベーション、またはナノ粒子コーティング等）も使用され得る。

医薬用固体経口投薬形態（製剤が含まれる）をさらに製剤化して、ＣＩＳ阻害物質の制御放出を提供することができる。制御放出は、延長された期間にわたって所望されるプロファイルに従う、それらが組込まれる投薬形態からの１つまたは複数の活性のある薬剤の放出を指す。制御放出プロファイルには、例えば、継続放出プロファイル、持続放出プロファイル、パルス放出プロファイル、及び遅延放出プロファイルが含まれる。即時放出組成物とは対照的に、制御放出組成物は、既定のプロファイルに従う延長された期間にわたる、被験体への薬剤の送達を可能にする。かかる放出率は、延長された期間で治療有効レベルの薬剤を提供し、それによって、従来の急速放出投薬形態に比較して、副作用を最小限にする一方でより長い期間の薬理学的応答を提供することができる。応答のかかるより長い期間は、対応する短時間作用型即時放出調製物により達成されない多くの固有の利益を提供する。

いくつかの実施形態において、固体投薬形態は、腸溶性コーティング遅延放出経口投薬形態として（すなわち腸溶コーティングを利用して胃腸管の小腸中での放出に影響する、医薬組成物の経口投薬形態として）製剤化され得る。腸溶性コーティング投薬形態は、活性成分及び／または他の組成成分（それら自体がコーティングされるかまたはコーティングされない）の顆粒、粉末、ペレット、ビーズまたは粒子を含有する、圧縮または成型または押出された錠剤／型（コーティングされるかまたはコーティングされない）であり得
る。腸溶性コーティング経口投薬形態は、固体担体または組成物（それら自体はコーティングされるかまたはコーティングされない）の、ペレット、ビーズまたは顆粒を含有する、カプセル（コーティングされるかまたはコーティングされない）でもあり得る。

「遅延放出」という用語は、本明細書において使用される時、もし遅延放出による変更がなければ達成されていたであろうものからよりも遠位の腸管中のいくつかの一般的には予測可能な所在位置で、放出を達成できるような送達を指す。いくつかの実施形態において、放出の遅延のための方法はコーティングである。全体のコーティングが約５より下のｐＨで胃腸液中で溶解しないがｐＨ約５以上で溶解するように、任意のコーティングが十分な厚みで適用されるべきである。下方胃腸管への送達を達成する方法及び組成物において、腸溶コーティングとしてｐＨ依存性溶解度プロファイルを示す任意の陰イオン性ポリマーを使用できることが予想される。いくつかの実施形態において、ポリマーは陰イオン性カルボン酸ポリマーである。

いくつかの実施形態において、コーティングは、可塑剤及びおそらく他のコーティング賦形剤（当技術分野において周知である、着色剤、タルク、及び／またはステアリン酸マグネシウム等）を含有することができ、通常は含有する。好適な可塑剤には、クエン酸トリエチル（Ｃｉｔｒｏｆｌｅｘ ２）、トリアセチン（グリセリルトリアセテート）、クエン酸アセチルトリエチル（Ｃｉｔｒｏｆｌｅｃ Ａ２）、Ｃａｒｂｏｗａｘ ４００（ポリエチレングリコール４００）、フタル酸ジエチル、クエン酸トリブチル、アセチル化モノグリセリド、グリセロール、脂肪酸エステル、プロピレングリコール、及びフタル酸ジブチルが含まれる。特に、陰イオン性カルボン酸アクリルポリマーは、通常重量で１０〜２５％の可塑剤（特にフタル酸ジブチル、ポリエチレングリコール、クエン酸トリエチル及びトリアセチン）を含有するだろう。従来のコーティング技法（噴霧コーティングまたはパンコーティング等）を用いて、コーティングを適用する。腸管中での局所送達が所望される部位に到達するまで経口投薬形態がインタクトなままであること保証するように、コーティング厚は十分でなければならない。

着色剤、粘着防止剤、界面活性剤、消泡剤、滑沢剤（例えばカルヌバ（ｃａｒｎｕｂａ）ワックスまたはＰＥＧ）を、可塑剤以外にコーティングに添加して、コーティング材料を可溶化または分散させ、コーティング性能及びコーティング産物を改善することができる。

他の実施形態において、ＣＩＳ阻害物質製剤はパルス投薬形態を使用して送達される。パルス投薬形態は、制御されたラグタイム後の所定時間点または特異的部位で、１つまたは複数の即時放出パルスを提供することができる。パルス投薬形態は当技術分野において公知の多様なパルス製剤を使用して投与され得る。例えば、かかる製剤には、米国特許第５，０１１，６９２号、同第５，０１７，３８１号、同第５，２２９，１３５号、及び同第５，８４０，３２９号中で記載されるものが含まれるがこれらに限定されない。本製剤による使用のために好適な他のパルス放出投薬形態には、例えば米国特許第４，８７１，５４９号、同第５，２６０，０６８号、同第５，２６０，０６９号、同第５，５０８，０４０号、同第５，５６７，４４１号、及び同第５，８３７，２８４号が含まれるがこれらに限定されない。一実施形態において、制御放出投薬形態は、少なくとも２つの粒子の群（すなわち多重微粒子）を含み、各々が製剤を含有する、パルス放出固体経口投薬形態である。粒子の第１の群は、摂取に際してＣＩＳ阻害物質の実質的に即時の用量を提供する。粒子の第１の群は、コーティングされないか、またはコーティング及び／もしくはシーラントを含むか、のいずれかであり得る。粒子の第２の群はコーティングされた粒子を含み、それは、１つまたは複数の結合剤との混和物中で、製剤中の活性のある薬剤の全用量の重量で、約２％〜約７５％、約２．５％〜約７０％、または約４０％〜約７０％含む。コーティングは、第２の用量の放出の前に、摂取に後続して約２時間〜約７時間の遅延を
提供するのに十分な量で薬学的に許容される成分を含む。好適なコーティングには、１つまたは複数の差異的に分解可能なコーティング（単なる例としてではあるが、ｐＨ感受性コーティング（腸溶コーティング）等、単独であるかまたはセルロース誘導体（例えばエチルセルロース）とブレンドされたアクリル樹脂等）、または製剤の差異的な放出を提供する変動する厚みを有する非腸溶コーティングが含まれる。

他の多くのタイプの制御放出系は当業者に公知であり、製剤による使用のために好適である。かかる送達系の例としては、例えばポリマーベースの系（ポリ乳酸及びポリグリコール酸、プリアンヒドライド（ｐｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）及びポリカプロラクトン等）；多孔性マトリックス、脂質（ステロール（コレステロール、コレステロールエステル及び脂肪酸等）または中性脂肪（モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリド等）が含まれる）である、非ポリマーベースの系；ハイドロゲル放出系；サイラスティック系；ペプチドベースの系；ワックスコーティング、生体侵食性投薬形態、従来の結合剤を使用する圧縮錠剤及び同種のものが挙げられる。例えば米国第４，３２７，７２５号、同第４，６２４，８４８号、同第４，９６８，５０９号、同第５，４６１，１４０号、同第５，４５６，９２３号、同第５，５１６，５２７号、同第５，６２２，７２１号、同第５，６８６，１０５号、同第５，７００，４１０号、同第５，９７７，１７５号、同第６，４６５，０１４号、及び同第６，９３２，９８３号を参照されたい。

経口投与のための液体製剤投薬形態は、薬学的に許容される水性経口分散液、エマルション、溶液、エリキシル、ゲル、及びシロップが含まれるがこれらに限定されない群から選択される、水性懸濁液であり得る。

ＵＳＰ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ’ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（２００５年版、９０５章）中で定義されるように、水性の懸濁液及び分散液は、少なくとも４時間均一な状態でとどまることができる。均一性は、全体の組成物の均一性の決定に関して、一貫したサンプリング法によって決定されるべきである。一実施形態において、水性懸濁液は、１分間未満続く物理的撹拌によって均一な懸濁液へと再懸濁することができる。別の実施形態において、水性懸濁液は、４５秒間未満続く物理的撹拌によって均一な懸濁液へと再懸濁することができる。さらに別の実施形態において、水性懸濁液は、３０秒間未満続く物理的撹拌によって均一な懸濁液へと再懸濁することができる。さらになお別の実施形態において、均一な水性分散液の維持には、撹拌は必要ではない。

上でリストされた添加剤に加えて、液体製剤は、当技術分野において通常は使用される不活性希釈剤（水または他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤等）も含むことができる。例示的な乳化剤は、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、ラウリル硫酸ナトリウム、ドキュセートナトリウム、コレステロール、コレステロールエステル、タウロコール酸、ホスホチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、油（綿実油、落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油及びゴマ油等）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、またはこれらの物質の混合物、及び同種のものである。

注射可能製剤
筋肉内、皮下、静脈内の注射のために好適な製剤には、生理学的に許容される滅菌された水性溶液または非水性溶液、分散液、懸濁液またはエマルション、及び滅菌された注射可能な溶液または分散液への再構成のための滅菌された粉末が含まれ得る。好適な水性担体及び非水性担体、希釈剤、溶媒またはベヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、クレモフォール
及び同種のもの）、好適なその混合物、植物油（オリーブ油等）及び注射可能な有機エステル（オレイン酸エチル等）が挙げられる。適切な流動性は、例えばコーティング（レシチン等）の使用によって、分散液の事例では要求される粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。皮下注射のために好適な製剤は、添加物（保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分配剤等）も含有し得る。微生物の増殖の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤（パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、及び同種のもの等）によって確実にすることができる。等張剤（糖、塩化ナトリウム、及び同種のもの等）も含むことが所望され得る。注射可能な医薬形態の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤（モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等）の使用によって行われ得る。

静脈注射については、化合物は、水性溶液中で、好ましくは生理学的に適合性のあるバッファー（ハンクス溶液、リンガー溶液または生理的塩類バッファー等）中で、製剤化され得る。経粘膜投与については、透過されるバリアに適切な透過剤が製剤中で使用される。かかる透過剤は一般的には当技術分野において公知である。他の非経口注射については、適切な製剤は、好ましくは生理学的に適合性のあるバッファーまたは賦形剤と共に水性溶液または非水性溶液を含み得る。かかる賦形剤は一般的には当技術分野において公知である。

非経口注射はボーラス注射または連続点滴を包含し得る。注射のための製剤は、例えばアンプル中の単位投薬形態で、または防腐剤を添加して多重用量容器中で提供され得る。医薬組成物は、油性ベヒクルまたは水性ベヒクル中の滅菌された懸濁液、溶液またはエマルションとして非経口注射のために好適な形態であり、製剤化剤（懸濁化剤、安定化剤及び／または分散剤等）を含有し得る。非経口投与のための医薬製剤は、水溶性形態で活性のある化合物の水性溶液を包含する。加えて、活性のある化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製され得る。好適な親油性の溶媒またはベヒクルには、脂肪油（ゴマ油等）もしくは合成脂肪酸エステル（オレイン酸エチルまたはトリグリセリド等）またはリポソームが含まれる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質（カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストラン等）を含有し得る。随意に、懸濁液は、好適な安定剤、または高度に濃縮された溶液の調製を可能にするように化合物の溶解度を増加させる薬剤も含有し得る。あるいは、活性のある成分は、使用の前に好適なベヒクル（例えば滅菌されたパイロジェン不含有水）による構成のための粉末形態であり得る。

医薬組成物は、正確な投薬量の単一投与のために好適な単位投薬形態であり得る。単位投薬形態において、製剤は、適切な量の１つまたは複数の化合物を含有する単位用量へと分割される。単位投薬量は、製剤の離散量を含有するパッケージの形態であり得る。非限定例は、パッケージングされた錠剤またはカプセル、及びバイアルまたはアンプル中の粉末である。水性懸濁組成物は、単一用量の再び密閉できない容器中でパッケージングされ得る。あるいは、複数用量の再び密閉できる容器は使用することができ、その事例において典型的には組成物中に防腐剤を含む。単なる例としてではあるが、非経口注射のための製剤は、単位投薬形態（アンプルが含まれるがこれらに限定されない）で、または防腐剤を添加して多重用量容器中で提供され得る。

ＣＩＳ阻害物質を同定するための方法
ＣＩＳ阻害物質を同定するための方法（すなわち「スクリーニング」方法）も提供される。いくつかの実施形態において、スクリーニング方法は、少なくとも以下のステップ：（ｉ）試験剤の存在下において、少なくとも１つのＣＩＳ結合パートナーとＣＩＳまたはその断片を接触させることと；（ｉｉ）試験剤が、ＣＩＳまたはその断片への結合についてＣＩＳタンパク質結合パートナーと競合するかどうかを決定することと、を含む。いく
つかの実施形態において、アッセイにおいて使用されるＣＩＳ結合パートナーは、ＪＡＫ１、ＩＬ−２Ｒβ、エロンギンＢ、エロンギンＣ及びカリン５、またはその断片の中から選択される。

いくつかの実施形態において、方法は、実質的に精製されたタンパク質構成要素を使用してインビトロで実行される。他の実施形態において、かかる方法は、細胞において生来のものとしてまたは異種のものとして発現されるタンパク質構成要素に対して実行され得る。いくつかの実施形態において、タンパク質構成要素のうちの１つまたは複数はタグも含んで、タグ付けされたタンパク質のアッセイにおける検出を促進することができ、それは、例えば小さなエピトープタグ、融合蛍光タンパク質、フルオロフォア、またはタグ付けされたタンパク質の直接的もしくは間接的な検出（例えば抗体の使用によって）を促進する他の標識である。他の実施形態において、アッセイされるタンパク質のどれもタグ付けされない。

結合パートナー及び標的タンパク質との相互作用を阻害するＣＩＳ阻害物質を同定するための方法には、ＥＬＩＳＡ−タイプアッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）及び時間分解（ＴＲ）ＦＲＥＴアッセイ、ならびにＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）ビーズベースの相互作用、高質量ＭＡＬＤＩ質量分析が後続する化学的架橋が含まれるがこれらに限定されない（例えばＡｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｎｏｎ−Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｓｓａｙ Ｆｏｒｍａｔｓ；Ｓｉｔｔａｍｐａｌａｍ ｅｔ ａｌ ｅｄｓ．；Ａｓｓａｙ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．Ｂｅｔｈｅｓｄａ（ＭＤ）：Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ＆Ｃｏｍｐａｎｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｉｎｇ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照）。特に有用なものは、好適な試験剤の大きな試験剤ライブラリーのスクリーニングのためのハイスループットアッセイフォーマットである。

あるいは、タンパク質−タンパク質相互作用の阻害物質についてのスクリーニングは細胞において（例えば、酵母、細菌または哺乳動物のアッセイ系を使用する、タンパク質相補性アッセイ及び「ツーハイブリッド」アッセイ、「スリーハイブリッド」アッセイにおいて）実行することができる。かかるアッセイ、及びタンパク質−タンパク質相互作用阻害物質の探索へのそれらの適用は、当技術分野において（例えばＭａｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３）中で）記載される。

他の実施形態において、スクリーニング方法は、以下のステップ：（ｉ）ＣＩＳまたはその断片を試験剤と接触させることと；（ｉｉ）試験剤が、ＣＩＳまたはその断片へ結合するかどうかを決定することと、を包含する。いくつかの実施形態において、本方法は、試験剤が、ＣＩＳまたはその断片への結合についてＣＩＳ ＰＥＳＴドメインペプチドまたはＣＩＳ Ｎ末端ペプチドと競合するかどうかを決定することを、さらに含む。理論に拘束されることを望むものではないが、かかるペプチドは、ＣＩＳ中の自己阻害ドメインへ対応すると考えられている。したがって、ＣＩＳへの結合についてかかる自己阻害ペプチドと競合することができる試験剤は、ＣＩＳ活性も阻害し、例えば本明細書において記載されるようなＪＡＫキナーゼ活性の増加をもたらすと予想され得る。いくつかの実施形態において、上記のアッセイにおいて使用されるＣＩＳ ＰＥＳＴドメインペプチドの配列は、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３２、及び配列番号：３７からなる群から選択される。他の実施形態において、このアッセイにおいて使用されるＮ末端ドメインペプチドの配列は、配列番号：３１及び３４の中から選択される。標的タンパク質への検体の結合の検出のための数多くのアッセイが当技術分野において公知であり、それらには、光バイオセンサーアッセイ（例えば表面プラズモン共鳴、光学的勾配、または干渉法に基づく）、質量分析、等温熱量測定、示差走査熱量計、及び示差走査蛍光定量、ＮＭ
Ｒ、Ｘ線結晶解析が含まれるがこれらに限定されない。タンパク質結合化合物の同定のためのハイスループットの親和性ベースのアッセイは、例えばＺｈｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）中で概説される。例えばＣａｓａｌｅｎａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）中で記載されるような小分子マイクロアレイの使用も企図される。光学的検出または蛍光検出（例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、質量分析の使用、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、バイオセンサー技術、エバネッセントファイバーオプティクス、または蛍光共鳴エネルギー転移等）は、本発明によって明らかに包含される。

インビトロで査定されるＣＩＳ活性に対する試験剤の効果のモニタリングに基づくスクリーニング方法も企図される。いくつかの実施形態において、スクリーニングは、ＣＩＳが標的タンパク質（例えばＪＡＫ１）のユビキチン化を増加させる能力に対する試験剤の効果を査定する、インビトロの生化学アッセイであり、そこで、アッセイは、以下のステップ：
（ｉ）リン酸化ＪＡＫ１タンパク質（例えばＴｙｒ１０３４リン酸化ＪＡＫ１）またはそのＣＩＳ結合断片を、
（ａ）少なくともＳＨ２ドメイン及びＳＯＣＳボックスを含むＣＩＳまたはその断片；エロンギンＢ、ならびにエロンギンＣを含む、三量体複合体と；
（ｂ）ユビキチン化混合物と；
（ｃ）試験剤と
の存在下において、インビトロでインキュベーションすることと；
（ｉｉ）試験剤が、試験剤の非存在下におけるＣＩＳ誘導性ユビキチン化のレベルに比べて、リン酸化ＪＡＫ１タンパク質またはそのＣＩＳ結合断片のＣＩＳ誘導性ユビキチン化を阻害するかどうかを決定することと、
を包含する。ＪＡＫ１または断片のＣＩＳ依存性ユビキチン化を減少させる試験剤は、候補ＣＩＳ阻害物質と判断される。

例示的な実施形態において、ＣＩＳ Ｅ３リガーゼ複合体（カリン５及びＲｂｘ２と一緒の、三量体ＣＩＳ−エロンギンＢ−エロンギンＣ；２．５μＭ）は、２．５ｍＭのＭｇ／ＡＴＰの存在下において、ユビキチン（５０μＭ）、ヒトＥ１（１００ｎＭ）、精製された組換えＥ２（ＵｂｃＨ５ｃ、２．５μＭ）、及びフラッグタグ付けされた全長ＪＡＫ１により、変動する時間で３７℃でインキュベーションされる。フラッグタグ付けされたホスホ−ＪＡＫ１は、２９３Ｔ細胞中での発現によって生成され、抗フラッグ免疫沈降及び遊離フラッグペプチドによる溶出を使用して回収される。ＪＡＫ１ユビキチン化は、４〜２０％のトリス／グリシンゲル上での分離に後続する、抗リン酸化ＪＡＫ１によるウエスタンブロットによって可視化される。Ｅ３リガーゼ活性の修飾物質のためのハイスループットフォーマットスクリーニングは、当技術分野において（例えばＲｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）中で）記載され、かかるスクリーニングプラットフォームは商業的にも入手可能である（例えばＰｒｏＧｅｎｒａ，Ｉｎｃ．（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ、ＵＳＡ）からのＵｂｉＰｒｏ（商標）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ）。

他の実施形態において、ＣＩＳ阻害物質を同定するためのスクリーニング方法は、ＣＩＳがＪＡＫ１キナーゼ活性を阻害する能力に対する試験剤の効果を査定する、インビトロの生化学アッセイであり、そこで、アッセイは、以下のステップ：
ｉ）ＪＨ１キナーゼドメインを含むＪＡＫ１タンパク質またはその断片を、
（ａ）少なくともＳＨ２ドメイン及びＳＯＣＳボックスを含むＣＩＳまたはその断片；エロンギンＢ、ならびにエロンギンＣを含む、三量体複合体と；
（ｂ）ＪＡＫ１キナーゼ基質と；
（ｃ）試験剤と
の存在下において、インビトロでインキュベーションすることと；
ｉｉ）試験剤が、試験剤の非存在下におけるＪＡＫ１キナーゼ基質のリン酸化に比べて
、ＪＡＫ１キナーゼ基質のリン酸化を増加させるかどうかを決定することと、
を包含する。試験剤の非存在下におけるＪＡＫ１キナーゼ活性と比べて、ＪＡＫ１キナーゼ活性のＣＩＳ依存性阻害を減少させる（すなわちＪＡＫ１キナーゼ活性を増加させる）試験剤は、候補ＣＩＳ阻害物質と判断される。

いくつかの実施形態において、試験されるＪＡＫ１キナーゼ基質は、ＳＴＡＴ５またはＳＴＡＴ５ペプチドである。いくつかの実施形態において、使用されるＳＴＡＴ５ペプチド基質のアミノ酸配列は：配列番号：１８ ＲＲＡＫＡＡＤＧＹＶＫＰＱＩＫＱＶＶである。

タンパク質キナーゼアッセイ（ハイスループットキナーゼアッセイが含まれる）は、例えばＢａｂｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）及びＶｏｎ Ａｈｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）中で記載されるように、当該技術分野において公知である。例示的な一実施形態において、１３０μＭのＳＴＡＴ５ｂペプチド（配列番号：１８ ＲＲＡＫＡＡＤＧＹＶＫＰＱＩＫＱＶＶ）は、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、１００μＭのＡＴＰ、及び１μＣｉのγ−［^３２Ｐ］ＡＴＰ中で、５ｎＭのヒトＪＡＫ１（対応するアミノ酸配列については配列番号：１１を参照）により、２５℃で３０〜６０分間インキュベーションされる。組換え三量体複合体ＣＩＳ−ＳＨ２−エロンギンＢ−エロンギンＣ（対応するアミノ酸配列については、配列番号：７、１４及び１５を参照）は、０〜３０μＭの範囲の濃度で存在する。インキュベーション後に、反応物はＰ８１フォスフォセルロースペーパー上にスポットされ、５％のＨ_３ＰＯ_４中でクエンチングされる。次いで、ペーパーは５％のＨ_３ＰＯ_４により洗浄され（４×２００ｍｌ、１５分間）、ホスフォイメージャープレートへ露光される。定量はホスフォイメージャーソフトウェアを使用して遂行され、次いでＩＣ_５０曲線は積分した画素数に基づいて計算される。

他の実施形態において、ＣＩＳ阻害物質の同定は、以下のステップ：（ｉ）ＣＩＳまたはその断片の三次元構造モデルを生成することと；（ｉｉ）モデル化された構造へ結合する試験剤についてインシリコでデザインまたはスクリーニングすることと、を含む方法においてインシリコで実行される。いくつかの実施形態において、三次元構造モデルは、ＣＩＳもしくはその断片へ結合された、ＪＡＫ１ポリペプチドもしくはその断片の複合体、またはＣＩＳもしくはその断片へ結合された、ＩＬ−２Ｒβ細胞質ドメインポリペプチドもしくはそのＣＩＳ結合断片の複合体である。

ＣＩＳ阻害物質は、当業者に公知の任意の方法によって、ＣＩＳへの結合についてインシリコのスクリーニングによって同定することができる。タンパク質へのリガンド結合のインシリコのスクリーニングのための方法には、例えばＧｏｏｄ，（２００１）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）、Ｃｅｒｑｕｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）、Ｋｕｅｎｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）及びＷｅｓｔｅｒｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１５）中で提供されるものが含まれるがこれらに限定されない。

ＣＩＳタンパク質を結合する分子については、典型的には、好適なレベルの立体化学的相補性を要求するだろう。一般に、立体化学的相補性を保持する分子のデザインは、分子と標的受容体との間の「フィット」を化学的及び／または幾何学的に至適化する技法を用いて達成することができる。本発明に従って、ＣＩＳタンパク質またはその断片の立体化学を相補する分子をデザインする、少なくとも２つのアプローチがある。

第１のアプローチは、その部位への特定の分子のフィットの度合いを査定する幾何学的基準を主として、しかし排他的ではなく使用して、三次元構造的データベースからのイン
シリコの分子（「仮想試験剤」）を、受容体部位へ直接的にドッキングすることである。このアプローチにおいて、内部自由度の数（及び分子配座空間中の対応する極小値）は、２つの剛体の幾何学的（剛体球）相互作用のみの考慮によって低減され、そこで、１つの体（活性部位）は、第２の体（リガンドのような、相補する分子）についての結合部位を形成する「ポケット」または「溝」を含有する。

このアプローチはＥｗｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）によって説明され、リガンドデザインのためのそのアルゴリズムは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａの理事によって頒布された商業用ソフトウェアパッケージ（ＤＯＣＫバージョン４．０）において実装され、頒布者によって提供された文書中でさらに記載され、それは「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ＤＯＣＫ ｐｒｏｇｒａｍ ｓｕｉｔｅ．」という表題である。最近になって、Ａｕｔｏｄｏｃｋ ４が記載された。Ｋｕｎｔｚアルゴリズムに準じて、対象となる領域の形状は、異なる半径のシリーズのオーバーラップする球体として定義される。結晶学的データの１つまたは複数の現存するデータベース（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌｅｎｓｆｉｅｌｄ Ｒｏａｄ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＣＢ２ １ＥＷ、Ｕ．Ｋ．）によって維持されるＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｒｕｔｇｅｒｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎ．Ｊ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．）によって維持されるＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ、ＬｅａｄＱｕｅｓｔ（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ．、Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）、及びＮＣＩデータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｕ．Ｓ．Ａ）等）は、次いで、このように定義された形状に近似する分子についてサーチされる。

次いでこのような手法で（幾何学的パラメーターに基づいて）同定された分子は、化学的相補性（水素結合、イオン相互作用、及びＶａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ相互作用等）に関連する基準を満たすように修飾され得る。異なるスコアリング機能を用いて、データベースからの最良の分子を格付けし選択することができる（例えばＢｏｈｍ ｅｔ ａｌ．，１９９９を参照）。Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によって市場で取引されるソフトウェアパッケージＦｌｅｘＸ、は、この直接的なドッキングアプローチにおいて使用できる別のプログラムである。

第２の好ましいアプローチは、部位内及び部位の周囲のサンプル位置での、活性部位とそれぞれの化学基（「プローブ」）の相互作用の査定を伴うものであり、エネルギー価のアレイがもたらされ、それから選択されるエネルギー準位で三次元輪郭表面が生成され得る。リガンドデザインへの化学的プローブアプローチは、いくつかの商業用ソフトウェアパッケージ（ＧＲＩＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｔｄ．、Ｗｅｓｔ
Ｗａｙ Ｈｏｕｓｅ、Ｅｌｍｓ Ｐａｒａｄｅ、Ｏｘｆｏｒｄ ＯＸ２ ９ＬＬ、Ｕ．Ｋ．の製品）等）において実装される。このアプローチに準じて、部位を相補する分子についての化学的前提条件は、異なる化学的プローブ（例えば水、メチル基、アミン窒素、カルボキシル酸素、及びヒドロキシル）による、活性部位のプロービングによって、最初は同定される。活性部位と各々のプローブとの間の相互作用について好まれる部位は、このように決定され、もたらされた三次元パターンのかかる部位から、推定上の相補的な分子は生成され得る。これは、三次元データベースをサーチして所望されるファーマコフォアパターンを取り込んでいる分子を同定できるプログラム、または好まれる部位及びプローブをインプットとして使用してデノボデザインを遂行するプログラムのいずれかによって、行われ得る。

三次元データベースをサーチして所望されるファーマコフォアを持つ分子を同定するために好適なプログラムには、ＭＡＣＣＳ ３Ｄ及びＩＳＩＳ／３Ｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ．、Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）、ＣｈｅｍＤＢＳ ３Ｄ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．）、ならびにＳｙｂｙｌ／３ＤＢ Ｕｎｉｔｙ（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）が含まれる。

化学構造のデータベースは数多くの供給源から利用可能であり、これらには、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ Ｄａｔａ Ｃｅｎｔｒｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕ．Ｋ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｌｔｄ．（Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）、Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、及びＣｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）が含まれる。

デノボデザインプログラムには、Ｌｕｄｉ（Ｂｉｏｓｙｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｌｅａｐｆｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ａｌａｄｄｉｎ（Ｄａｙｌｉｇｈｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）、及びＬｉｇＢｕｉｌｄｅｒ（Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃｈｉｎａ）が含まれる。

模倣物（ペプチド模倣物及び有機模倣物等）は、最新のコンピューターモデリングソフトウェアにより（コンピューター支援薬物デザインまたはＣＡＤＤを使用して）、例えばペプチド結合部位をフィットさせるようにデザインされ得る（Ｗａｌｔｅｒｓ,１９９３
，ｉｎ “Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ”，ｉｎ Ｋｌｅｇｅｒｍａｎ＆Ｇｒｏｖｅｓ（ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９３，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ：Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，Ｉｌｌ．，ｐｐ．１６５−１７４；及びＭｕｎｓｏｎ，１９９５，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ １２）。かかる技法を使用して調製された模倣物も、本開示の範囲内に含まれる。一例において、模倣物は、ＣＩＳ ＳＨ２とドメインを相互作用することが公知のＪＡＫ１活性化ループのホスホペプチドを模倣する。

模倣物は、いくつかのペプチド構造から仮想ペプチドモデルを導き出すことができるソフトウェアを使用して生成され得る。これはＳＬＡＴＥアルゴリズムに由来するソフトウェアを使用して行うことができる（Ｐｅｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｍｉｌｌｓ
ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｄｅ Ｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００１）。

ペプチドアナログ、誘導体及び模倣物のデザインへの他のアプローチも当技術分野において周知である（例えばＦｌｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）を参照）。

ＣＩＳへ結合することが見出された分子は、多量に、合成できるか、または好適な供給源（商業的供給業者等）から得ることができる。次いで得られた試験剤を、上述のアッセイのうちの任意のものにおいて使用して、ＣＩＳへ結合する能力、及び／またはＣＩＳもしくはＣＩＳの断片へのＣＩＳ結合パートナーもしくは標的タンパク質の結合を阻害する能力を検証することができる。

薬物スクリーニングアッセイのすべてについて、一般的には薬物の構造へのさらなる精密化が必要であり、特定の薬物スクリーニングアッセイによって提供されるステップのうちの任意のもの及び／またはすべての逐次代入によって行うことができる。

他の実施形態において、ＣＩＳ阻害物質を同定する方法は、以下のステップ：（ｉ）ＣＩＳを発現する細胞を提供することと；（ｉｉ）試験剤が、試験剤と接触させない細胞に比較した場合に、細胞におけるＣＩＳ活性を低減するかどうかを決定することと、を包含する表現型アッセイである。いくつかの実施形態において、スクリーニング方法において使用される細胞タイプはＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞が使用される場合に、試験剤が細胞におけるＣＩＳ活性を低減するかどうかを決定することは、ＮＫ細胞におけるＩＬ−１５により誘導可能な応答に対する試験剤の効果を決定することを含む。好適なＩＬ−１５により誘導可能な応答には、ＮＫ細胞増殖、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生、細胞内グランザイム発現、ＪＡＫ１チロシンリン酸化、ＪＡＫ１分解、遺伝子発現の修飾、または細胞傷害性が含まれるがこれらに限定されない。かかるエンドポイントのうちの任意のものは、当技術分野において公知の数多くの標準的な方法のうちの任意のものによって査定することができる。例えば、細胞増殖アッセイは、Ｒｉｓｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）、Ａｓｓａｙ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．Ｂｅｔｈｅｓｄａ（ＭＤ）：Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ＆Ｃｏｍｐａｎｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｉｎｇ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ中で記載され；サイトカイン定量化アッセイはＷｈｉｔｅｓｉｄｅ（２００２）中で記載され；ＪＡＫ１キナーゼ活性についてのアッセイは例えばＢａｂｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）中で記載され；ＪＡＫ１のユビキチン媒介性分解についてのアッセイは、例えばＬｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）中で記載され；遺伝子発現アッセイ、例えばＲＮＡｓｅｑは、例えばＨｏｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１５）中で記載され；ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性のアッセイは、例えばＧｉａｍａｎｎ
ｅｔ ａｌ．（２００６）及びＪａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）中で記載される。いくつかの実施形態において、細胞ベースのアッセイにおいて使用される試験剤は、相互作用スクリーニング方法または結合スクリーニング方法のうちの１つにおいて候補ＣＩＳ阻害物質として最初に同定される。いくつかの実施形態において、細胞において決定されるＣＩＳ活性は、ＮＫ細胞における、ＪＡＫ１キナーゼ活性の阻害（ＳＴＡＴ５基質のリン酸化の減少）、ＳＴＡＴ５チロシンリン酸化の阻害、ＳＴＡＴ５プロモーター活性のダウンレギュレーション、またはＪＡＫ１の分解の増加である。

スクリーニング方法のために好適な試験剤には、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが含まれるが、試験剤がＣｉｓｈ遺伝子またはＣｉｓｈ ｍＲＮＡを標的とすることによってＣＩＳ活性を低減することに向けられる場合に、かかる薬剤が細胞アッセイにおいて査定されるだろうことを、当業者は認識するだろう。

いくつかの実施形態において、ＣＩＳ阻害物質を同定するための方法のうちの任意のものにおける使用のために好適なＣＩＳまたはＣＩＳの断片は、配列番号：６〜１０のうちの少なくとも１つへ少なくとも７０％同一の（例えば配列番号：６〜１０のうちの少なくとも１つへ少なくとも７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９９％または１００％同一の）アミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＣＩＳまたはその断片のアミノ酸配列は、配列番号：６〜１０のうちの１つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ＣＩＳまたはその断片のアミノ酸配列は、配列番号：６〜１０のうちの１つのアミノ酸配列のうちの１つからなる。

いくつかの実施形態において、そこで、ＣＩＳの結合パートナーまたは標的タンパク質は、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＩＬ−２Ｒβ、エロンギンＢ、エロンギンＣ及びカリン５、またはその断片の中から選択される。

ＪＡＫ１またはそのＣＩＳ結合断片は、配列番号：１１〜１６のうちの少なくとも１つへ少なくとも７０％同一の（例えば配列番号：１１〜１６のうちの少なくとも１つへ少なくとも７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９９％または１００％同一の）アミノ酸配列を含むことができる。

ポリペプチドまたはポリペプチドのクラスは、そのアミノ酸配列の参照アミノ酸配列への同一性の程度（％同一性）によって、または１つの参照アミノ酸配列へ、別のものよりも高い％同一性を有することによって、定義され得る。ポリペプチドの参照アミノ酸配列への％同一性は、典型的には、ギャップ生成ペナルティ＝５及びギャップ延長ペナルティ＝０．３のパラメーターによるＧＡＰ分析（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）；ＧＣＧプログラム）によって決定される。クエリ配列は少なくとも１５アミノ酸の長さであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１５アミノ酸の領域にわたって２つの配列をアライメントさせる。より好ましくは、クエリ配列は少なくとも５０アミノ酸の長さであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも５０アミノ酸の領域にわたって２つの配列をアライメントさせる。より好ましくは、クエリ配列は少なくとも１００アミノ酸の長さであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１００アミノ酸の領域にわたって２つの配列をアライメントさせる。さらにより好ましくは、クエリ配列は少なくとも２５０アミノ酸の長さであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも２５０アミノ酸の領域にわたって２つの配列をアライメントさせる。さらにより好ましくは、ＧＡＰの分析は、それらの全体の長さにわたって２つの配列をアライメントさせる。

数多くの考慮は、当業者がタンパク質またはペプチドの特定のアミノ酸配列バリアントが本発明における使用のために好適かどうかを決定することに有用である。これらの考慮には、（１）タンパク質またはペプチドと公知のタンパク質結合パートナーまたは結合パートナーモチーフとの間の相互作用についての公知の構造−機能の関係性；（２）配列アライメントアルゴリズムによって明らかにされるように、対象となるタンパク質の天然に存在するホモログの中での（例えばパラログ及びオルソログ中の）アミノ酸配列保存の存在、が含まれるがこれらに限定されない。顕著なことに、その機能に対するタンパク質のアミノ酸配列中の特定のアミノ置換の機能効果（すなわち「許容されるもの」）を成功裡に予測する、数多くのバイオインフォマティクスアルゴリズムが当技術分野において公知である。かかるアルゴリズムには、例えばＳｈｉｈａｂ ｅｔ ａｌ．（２０１３）中で記載される「隠れマルコフモデルを介する機能分析（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌｓ）」（ＦＡＴＨＭＭ）アルゴリズム；ならびにＮｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）；及び最近になってＳｉｍ
ｅｔ ａｌ．（２０１２）中で記載される「許容されるものから許容されないものを選別する（Ｓｏｒｔｉｎｇ Ｉｎｔｏｌｅｒａｎｔ ｆｒｏｍ Ｔｏｌｅｒａｎｔ）」アルゴリズムが含まれる。

ＳＩＦＴカリキュレーターはウェブサイト：ｓｉｆｔ．ｂｉｉ．ａ−ｓｔａｒ．ｅｄｕ．ｓｇ／でオンラインで利用可能である。ＦＡＴＨＭＭカリキュレーターはウェブサイト：ｆａｔｈｍｍ．ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｅ．ｏｒｇ．ｕｋでオンラインで利用可能である。対象となる任意のアミノ酸配列（例えば本明細書において提供される配列番号のうちの任意のものへ対応する配列）について、対応するタンパク質機能（例えば相互作用パートナーと結合する能力）に対する所与のアミノ酸置換の、予測された中立性または有害性を提
供する「アミノ酸置換マトリックス」が生成され得る。

タンパク質の天然に存在しない配列バリアントは数多くの公知の方法によって生成され得る。かかる方法には、米国特許第６，５２１，４５３号中で記載されるような「遺伝子シャッフリング」；Ｋｏｐｓｉｄａｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）中で記載されるような「ＲＮＡ突然変異誘発」；及び「エラープローンＰＣＲ法」が含まれるがこれらに限定されない。エラープローンＰＣＲ方法は、（ａ）ヌクレオチド濃度の均衡を失わせること及び／または化学化合物（塩化マンガン等）を添加することによって、ポリメラーゼのフィデリティーを低減する方法、（ｂ）ヌクレオチド類似体を用いる方法（例えば米国特許第６，１５３，７４５号を参照）、及び（ｃ）「突然変異誘発性」ポリメラーゼを利用する方法、へと分割され得る。

アッセイにおいて使用されるタンパク質のアミノ酸配列バリアントの機能保持、機能喪失、または機能獲得の確認は、査定されているタンパク質の機能に応じて、様々なタイプのアッセイ（例えば結合アッセイ、キナーゼアッセイ、またはユビキチン化アッセイ）において決定され得る。

実施例１ − 材料及び方法
マウス
Ｃｉｓｈ^−／−は、Ｓｔ．Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｍｅｍｐｈｉｓ、ＵＳＡ）のＪａｍｅｓ Ｉｈｌｅ教授及びＥｖａｎ Ｐａｒｇａｎａｓ博士によって惜しみなく提供され、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド上で維持した。Ｃｉｓｈ＋／＋はＣ５７ＢＬ／６野生型対照マウスを指す。Ｒｏｓａ２６−ＣｒｅＥＲＴ２マウス（ＴａｃｏｎｉｃＡｒｔｅｍｉｓ）、Ｓｏｃｓ３−ｌｏｘＰマウス（Ｃｒｏｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）、Ｉｆｎｇ−／−Ｓｏｃｓ１−／−マウス（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、及びＮｃｒ１−ｉＣｒｅマウス（Ｎａｒｎｉ−Ｍａｎｃｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１）は以前に記載されていた。オスマウス及びメスマウスを６〜１４週齢の間で使用した。すべてのマウスをＷａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで交配及び維持した。動物実験はＮａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ（ＮＨＭＲＣ）Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｆｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｒｐｏｓｅｓのガイドラインに従い、Ｗａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ ＣｏｍｍｉｔｔｅｅまたはＱＩＭＲ Ｂｅｒｇｈｏｆｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。

ＮＫ細胞の精製及び培養
マウスのナチュラルキラー細胞を様々な器官（脾臓、骨髄、血液）から採取し、器官を７０μｍのふるいを強制的に通すことによって単一細胞懸濁液を調製した。等張のパーコール（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）中での懸濁及び１８００×ｇでの遠心分離によって肝臓からリンパ球を単離した。製造者の仕様書に従って、抗ＣＤ４９ｂ（ＤＸ５）マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＮＫ細胞を精製した。ＮＫ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、Ｌ−グルタミン（１ｍＭ；Ｇｉｂｃｏ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）、ゲンタマイシン（５０ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）及び組換えｈＩＬ−１５（５０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補足したＩｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）中の培養によって、５〜１０日間増殖させた。

ＲＮＡシーケンシング及びバイオインフォマティクス分析
１００塩基対シングルエンドＲＮＡシーケンシングを、Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）のＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２０００を使用して、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５中で７日間増殖させた１×１０^６のＣｉｓｈ^＋／＋ＮＫ１．１^＋ＮＫｐ４６^＋ＴＣＲｂ⁻ＮＫ細胞及びＣｉｓｈ^−／−ＮＫ１．１^＋ＮＫｐ４６^＋ＴＣＲｂ⁻ＮＫ細胞の２つの生物学的反復、ならびに１×１０^６の新鮮分離したＣｉｓｈ^＋／＋ＮＫ１．１^＋ＮＫｐ４６^＋ＴＣＲβ⁻ＮＫ細胞及びＣｉｓｈ^−／−ＮＫ１．１^＋ＮＫｐ４６^＋ＴＣＲβ⁻ＮＫ細胞の２つの生物学的反復で遂行した。リードを、Ｓｕｂｒｅａｄアライナーを使用して、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓゲノムのＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０ビルドへアライメントさせた。ＧｅｎｅｗｉｓｅカウントはＦｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓを使用して得られた。ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑデータベースのアノテーションビルド３８．１中のエクソンにオーバーラップするリードが含まれていた。遺伝子が少なくとも２つのライブラリー中で少なくとも０．５のＣＰＭ（１００万のマップされたリードあたりのカウント）値を達成しなかったならば、遺伝子を下流の分析からフィルタリングした。カウントを１００万あたりのｌｏｇ２カウントに変換し、クオンタイル正規化し、ｌｉｍｍａパッケージのｖｏｏｍ関数により正確性の重み付けを行った。線形モデル及び経験ベイズ法を使用して、ＲＮＡｓｅｑ実験中の差異的発現を査定した。遺伝子が０．１以下の偽発見率を達成し、比較されている２つの細胞タイプのうちの１つまたは両方ともにおいて少なくとも８のＦＰＫＭ（１００万のマップされたリードあたりの１キロベースあたりの断片）も有していたならば、その遺伝子は差異的に発現されるとコールされる。負のｌｏｇ２ ＦＰＫＭ値をゼロへリセットして、ｇｐｌｏｔｓパッケージを使用してヒートマップを生成した。すべての分析をＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｒパッケージを使用して実行した。

インビトロのＮＫ細胞増殖アッセイ
標的細胞（ＣＨＯ、Ｂ１６Ｆ１０）を、１００μｌの培地の中で９６Ｘ Ｅ−プレートのウェルの中へ播種した。細胞が対数増殖相に達して単層を形成するまで（およそ２４時間）、細胞増殖をインピーダンスベースのＲＴ−ＣＥＳ（登録商標）システムによりダイナミックモニタリングした。次いで異なる濃度で培養されたＣｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞及びＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞を、標的細胞を含有する個別のウェルへ直接添加した。バックグラウンド対照のために、ＮＫ細胞を標的細胞を含有しないウェルへ添加し、標的細胞をＮＫ細胞の添加なしにウェルへ添加した。ＮＫ細胞の添加後に、この系で、４８時間までの間１５分ごとに測定をとり続けた。

フローサイトメトリー及び細胞選別
単一細胞懸濁液を、２％（ｖ／ｖ）のＦＣＳを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で適切なモノクローナル抗体により染色した。必要な場合に、細胞内染色を、製造者の指示に従って、ＦｏｘＰ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の使用によって遂行した。ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅ、Ｆｏｒｔｅｓｓａ、及びＡｒｉａＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を細胞選別及び分析のために使用し、死細胞をヨウ化プロピディウム染色またはフルオロ−ゴールド染色によって除外した。すべての単一細胞懸濁液を分析の前にＰＢＳ中で希釈し、Ａｄｖｉａ血液分析器（Ｓｉｅｍｅｎｓ）を使用して数えた。ＮＫ１．１（ＰＫ１３６；１：１００）、ＣＤ１９（１Ｄ３；１：５００）、ＣＤ３（１７Ａ２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１：４００）、ＣＤ１２２（ＴＭ−ｂ１；１：２００）、ＣＤ１３２（４Ｇ３；１：２００）、ＮＫｐ４６（２９Ａ１．４；１：１００）、ＴＣＲ−β（Ｈ５７−５９２１；１：５００）、ＫＬＲＧ１（２Ｆ１；１：１００）、ＣＤ２７（ＬＧ．７Ｆ９；１：２００）、ＦｏｘＰ３（ＦＪＫ１６ｓ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；１：４００）、ＣＤ２５（ＰＣ６１；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；１：１００）、Ｓｃａ−１（Ｄ７；１：１００）
、Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；１：１００）、Ｇｒ−１（１Ａ８；１：２００）、グランザイムＡ（ＧｚＡ３Ｇ８．５；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；１：２００）、グランザイムＢ（ＮＧＺＢ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；１：２００）、ＣＤ１０７ａ（１０４Ｂ；１：１００）、及びＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２；１：１００）について特異的な抗体は、特別に明記されない限り、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎからのものであった。

リアルタイム定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）
製造者の指示に従って、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して単離し、ｃＤＮＡ合成をＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により遂行した。ＰＣＲ反応を１０μＬ（５μＬのＦａｓｔＳｔａｒｔ ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）、０．５ｐｍｏｌのフォワードプライマー及びリバースプライマーならびに４μＬのｃＤＮＡ）中で遂行した。プライマー配列及びＰＣＲ条件は記載されている（Ｋｏｌｅｓｎｉｋ ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，２０１３）。リアルタイムＱ−ＰＣＲを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で遂行した。各々の増幅されたＰＣＲ断片へ対応するオリゴヌクレオチドの連続的な希釈を使用しＳＤＳ２．２ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して生成された標準的な曲線に対して、ｍＲＮＡのレベルを定量化した。相対的発現を、対象となる各々の遺伝子の量をハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）へ正規化することによって、決定した。各々の条件は３つの生物学的反復を有し、測定は二重で遂行した。統計解析を９５％の信頼レベルによる非対合ｔ検定を使用して遂行した。

ウエスタンブロット及び一過性トランスフェクション
およそ１サンプルあたり１．５×１０^８のＮＫ細胞を収集し、プロテアーゼ阻害物質（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｃｏｃｋｔａｉｌ ｔａｂｌｅｔｓ、Ｒｏｃｈｅ）、１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのＮａ_３ＶＯ_４、及び１ｍＭのＮａＦを補足した、２．５ｍＬのＫＡＬＢ溶解バッファー（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）中で溶解し、氷上で１時間インキュベーションした。溶解物を１６，０６０×ｇで４℃で１５分間の遠心分離によって清澄化した。タンパク質濃度をＢＣＡ方法（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）によって決定した。２９３Ｔ細胞を１００Ｕ／ｍＬペニシリン、０．１ｎｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１０％のＦＣＳを補足したＤＭＥＭ中で維持し、製造者の指示に従ってＦｕＧｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ベクター単独、またはフラッグタグ付けされたマウスＪａｋ１、Ｊａｋ３、ＣｉｓｈもしくはＣｉｓｈ突然変異体またはＭｙｃタグ付けされたマウスＣｉｓｈを発現するｃＤＮＡにより一過性にトランスフェクションした。いくつかの事例において、細胞を１０μＭのＭＧ１３２により４時間前処理して、プロテアソーム分解をブロックした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞をＫＡＬＢバッファー中で溶解した（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。フラッグタンパク質をＭ２ビーズ（Ｓｉｇｍａ）を使用して免疫沈降させ、タンパク質をＳＤＳサンプルバッファー中で溶出させた。免疫沈降、ゲル電気泳動及びウエスタンブロットは、本質的には記載されるように遂行された（Ｌｉｎｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。以下の一次抗体を使用した。ＣＩＳ（クローンＤ４Ｄ９）、ホスホ−ＳＴＡＴ３；ホスホ−ＡＫＴ１（Ｓｅｒ４７３）、ＡＫＴ、及びＭＡＰＫ（Ｙ７０５）への抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから得た。ホスホ−ＳＴＡＴ５Ａ／Ｂ（Ｙ６９４／６９９）への抗体はＭｉｌｌｉｐｏｒｅから、ホスホ−ＪＡＫ１（Ｙ１０２２／１０２３）及びＳＴＡＴ５Ａへの抗体はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから、ならびにＪＡＫ１、ＳＴＡＴ３及びβ−アクチンへの抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．から得た。ラット抗フラッグ抗体は、Ｄ．Ｈｕａｎｇ教授及びＬ．Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ博士（Ｗａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）か
らの好意による寄贈であった。

ＣＹＴ−３８７キナーゼ親和性試薬の合成及びＮＨＳセファロースへの共有結合性カップリング
アミノ官能化ＣＹＴ−３８７誘導体を、ＣＹＴ−３８７の合成のために記載されたものに類似する手順を使用して調製した（図６を参照）。修飾されたＣＹＴ ３８７化合物を、以前に記載されるように、ＮＨＳ活性化セファロース４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｂｅａｄｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の上へ固定化した（Ｓｃｈｉｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。簡潔には、１ｍＬのＮＨＳ−セファロースビーズのスラリーを５ｍＬのＤＭＳＯにより２回洗浄し、８０×ｇで３分間遠心分離して洗浄と洗浄の間にマトリックスをペレットにした。１つにパックされたマトリックス体積（５００μＬ）をＤＭＳＯにより再懸濁して、５０％のスラリーを製作した。ＣＹＴ−３８７（２μＭ、最終的）、後続して２０μＬのトリエチルアミンを１ｍＬのＮＨＳビーズのスラリーへ添加し、反転によって混合した。反応スラリーを光から保護された転倒回転機上で室温で一晩インキュベーションした。翌日、２５μＬのエタノールアミンを反応物へ添加し、再び、光から保護された転倒回転機上で室温で一晩インキュベーションしたままにした。ＣＹＴ−３８７をカップリングしたＮＨＳ−セファロースビーズを、５ｍＬのＤＭＳＯにより２回洗浄し、マトリックスをエタノール中で再懸濁し、光から保護して４℃で貯蔵した。

細胞溶解物からのキナーゼエンリッチメント
ＣＹＴ−３８７−結合樹脂を、キナーゼエンリッチメントの前にＫＡＬＢ溶解バッファーにより２回洗浄した。６つの個別のキナーゼエンリッチメントを、２ｍＬのタンパク質溶解物（約１０ｍｇ）によりインキュベーションされた１６０μＬの５０％のＣｙｔ３８７結合樹脂により遂行した（Ｃｉｓｈ^−／−またはＣｉｓｈ^＋／＋あたり３）。インキュベーションを、光から保護された回転ホイール上で４℃で３時間遂行した。インキュベーションに後続して、タンパク質結合Ｃｙｔ３８７樹脂をＫＡＬＢバッファーにより３回洗浄し、０．５％のＳＤＳ／５ｍＭのＤＴＴによる６０℃で３分間の連続する３ラウンド（２００μＬ、１００μＬ、１００μＬ）のインキュベーションにより溶出した。

トリプシン消化
樹脂に捕捉されたタンパク質の溶出物を、等しい量（約４００μｇ）の各々の生物学的反復に由来する全細胞溶解物と一緒に、以前に記載されるように（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ
ｅｔ ａｌ．，２００９）、以下の修飾により、ＦＡＳＰ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ、ＴＮ）を使用して、質量分析による分析のために調製した。タンパク質をトリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（５ｍＭの最終濃度）により還元し、５０ｍＭのＮＨ_４ＨＣＯ_３中の４μｇの配列グレードの修飾されたＴｒｙｐｓｉｎ Ｇｏｌｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により消化し、３７℃で一晩インキュベーションした。次いでペプチドを４０μＬの５０ｍＭのＮＨ_４ＨＣＯ_３の２回の連続的な洗浄により溶出し、１％のギ酸（最終濃度）中で酸性化した。

質量分析及びデータ分析
酸性化されたペプチド混合物を、自動化ＭＳ／ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のためのナノエレクトロスプレーイオン源を装備したＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計へカップリングされた、ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）上のナノフロー逆相液体クロマトグラフィータンデム型質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって分析した。ペプチド混合物を、バッファーＡ（０．１％のギ酸、３％のアセトニトリル、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）中で、１８０μｍの内径の２０ｍｍのトラップカラム（ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ２Ｇ−Ｖ／ＭＴｒａｐ ５ｍｍ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８）上に
ロードし、４００ｎＬ／分の一定の流速で設定した３〜５５％のバッファーＢ（０．１％のギ酸、８０％のアセトニトリル、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）の６０分間の直線的勾配で、７５μｍの内径の１５０ｍｍのカラム（ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ １．７μｍ ＢＥＨ１３０ Ｃ１８）を使用する逆相クロマトグラフィーによって分離した。Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅをデータ依存モードで操作し、１つのフルスキャンと続いて行われる１０の最大のピークのＭＳ／ＭＳスキャンとの間で自動的に切り替えた。Ｅｘａｃｔｉｖｅシリーズバージョン２．１ビルド１５０２及びＸｃａｌｉｂｕｒ ３．０を使用して、装置を制御した。フルスキャン（ｍ／ｚ ３５０−１，８５０）を、２００ｍ／ｚで７０，０００の解像度により取得した。１０の最も強いイオンが、１００００イオンの標的値及び２ｍ／ｚの単離幅により連続して単離され、１９．５の正規化衝突エネルギー及び１５％のステップ状衝突エネルギー（ｓｔｅｐｐｅｄ ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ）によるＨＣＤを使用して、断片化された。最大イオン蓄積時間２７を、ＭＳのフルスキャンについては５０ｍｓ及びＭＳ／ＭＳについては２００ｍｓへ設定した。アンダーフィル比を５％に設定し、ダイナミックエクスクルージョンを可能にし９０秒へ設定した。高解像度ＭＳ／ＭＳのスペクトルからなる生のファイルを、Ａｎｄｒｏｍｅｄａ ｓｅａｒｃｈ ｅｎｇｉｎｅ３６を使用して、フィーチャ検出及びタンパク質同定のために、ＭａｘＱｕａｎｔ（バージョン１．５．０．２５）によりプロセシングした。抽出したピークリストを、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔのＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓデータベース（ＬｕｄｗｉｇＮＲ）及び分離したリバースデコイデータベースに対してサーチして、最大３の切断に失敗したサイト（ｍｉｓｓｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ）を許容する厳格なトリプシン特異性を使用して、経験的に偽発見率（ＦＤＲ）を査定した。最小の要求されるペプチド長さを７アミノ酸に設定した。修飾：Ｃｙｓのカルバミドメチル化（ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）を固定修飾として設定したが、タンパク質のＮ−アセチル化、Ｍｅｔの酸化、ピログルタメートの付加（Ｎ末端のＧｌｕ及びＧｌｎでの）、リン酸化（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒ）、脱アミド化（Ａｓｎ、Ｇｌｎ及びＡｒｇ）を、可変修飾として設定した。前駆イオンについての質量許容差及び断片イオンはそれぞれ２０ｐｐｍ及び０．５Ｄａであった。ＭａｘＱｕａｎｔにおいて「ラン間の一致（ｍａｔｃｈ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｕｎｓ）」オプションを使用して、高い質量正確性により一致した前駆体に基づいてラン間で行われた同定を移す（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＰＳＭ及びタンパク質同定は、１％の偽発見率（ＦＤＲ）で標的デコイアプローチを使用して、フィルタリングされる。タンパク質同定は最低２つのユニークなペプチドに基づいていた。

定量的プロテオミクスパイプライン
Ｐｉｐｅｌｉｎｅ Ｐｉｌｏｔ（Ｂｉｏｖｉａ）及びＲ中で開発されたカスタムパイプライン（これは、ＭａｘＱｕａｎｔアウトプットファイルのａｌｌＰｅｐｔｉｄｅｓ．ｔｘｔ、ｐｅｐｔｉｄｅｓ．ｔｘｔ、及びｅｖｉｄｅｎｃｅ．ｔｘｔを利用する）を使用して、さらなる分析を遂行した。フィーチャは、ペプチド配列、電荷及び修飾の組み合わせとして定義された。各々の群における反復のうちの少なくとも半分の数において見出されないフィーチャを除去した。リバースデータベースへのヒットから同定されたタンパク質及び１つのみのユニークなペプチドのタンパク質も除去した。注入量変動について修正するために、フィーチャ強度を、２を底とする対数に変換すること、及び次いで、各々の値に、反復のメジアン強度に対するすべての反復の最大のメジアン強度の比を掛けることによって正規化した。同じタンパク質へアサインされたフィーチャは、それらの物理化学的特性及び荷電状態に起因する強度の範囲において異なる。これらの差についてさらに修正するために、各々の強度値に、フィーチャのメジアン強度に対するタンパク質についてのすべてのフィーチャのメジアン強度の最大値の比を掛けた。欠損値は、値の実際の分布の平均−１．８標準偏差で設定された平均、及び測定された強度の分布の標準偏差の０．５倍の標準偏差、による値のランダムな正規分布を使用して補完された（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。群間の差異的発現の確率は、酸化及びカルバミドメチル化以外の修飾
による、任意のユニークでない配列及び任意のフィーチャを除外して、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して計算された。確率値はＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ方法を使用して、多重検定について補正された。関数ｙ＝−ｌｏｇ_１０（０．０５）＋ｃ／（ｘ−ｘ_０）（Ｋｅｉｌｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）によるカットオフラインを導入して、有意にエンリッチされたタンパク質を同定した。ｃは０．２へ設定される一方で、ｘ_０は１へ設定され、それぞれタンパク質発現における２倍（１以上のｌｏｇ２タンパク質比）または４倍（２のｌｏｇ２タンパク質比）の変化のあるタンパク質を表わす。ｌｏｇ２変換された合計のペプチド強度（補完されない）は、ワン−マトリックスＣＩＭｍｉｎｅｒ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｇｒｏｕｐ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によって開発されたプログラム）において生成されたヒートマップにおいて可視化された。

ペプチドスクリーニングのためのＧＳＴ−ＣＩＳタンパク質の調製
ヒトＣｉｓｈの部分（残基６６〜２５８をコードする）をベクターｐＧＴＶＬ２の中へクローン化した。ヒトエロンギンＣ（残基１７〜１１２）及び全長エロンギンＢを、以前に記載されるように、ベクターｐＡＣＹＣＤＵＥＴの中へクローン化した（Ｂｕｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００６）。両方のプラスミドを、ＣＩＳ／エロンギンＣ／エロンギンＢ三成分複合体（ＣＩＳ−ＳＨ２−ＢＣ）の共発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）の中へ形質転換した。Ｌｕｒｉａブロス培地中の培養物を、０．４ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により１８℃で一晩誘導し、細胞を遠心分離によって採取した。ペレットを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのイミダゾール、５％のグリセロール（ｐＨ７．５）中で再懸濁し、細胞を音波処理によって溶解した。ＤＮＡを０．１５％のポリエチレンイミン（ｐＨ８）の添加によって沈殿させ、不溶性物質を２１，０００ｒｐｍでの遠心分離によって除去した。ＧＳＴタグ付けされたＣＩＳタンパク質複合体をグルタチオンセファロースカラム上で精製し、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＴＣＥＰを含むバッファー中の２０ｍＭの還元されたグルタチオンにより溶出した。精製タンパク質を０．７５ｍｇ／ｍｌへ濃縮し、−８０℃で貯蔵した。

ペプチドアレイの合成及びスクリーニング
ペプチドアレイを、記載されるように、Ｉｎｖａｔｉｓスポットアレイシンセサイザーを使用して、官能化ニトロセルロース膜上で合成した（Ｌｉ ａｎｄ Ｗｕ，２００９）。アレイプロービングのために、膜結合ペプチドを、トリス緩衝食塩水／０．０５％のツイーン−２０（ＴＢＳ−Ｔ）（ｐＨ７．２）の５％のスキムミルク中で５時間室温でブロックした。ＴＢＳ−Ｔによる洗浄後に、０．８ｎｇ／ｍｌのＧＳＴ−ＣＩＳ−ＳＨ２−ＢＣ複合体をブロッキングバッファー中に添加し、４℃で一晩インキュベーションした。同時に、４ｎｇ／ｍｌのＧＳＴタンパク質を、同じ実験条件下で陰性対照として、分離したペプチドアレイへ添加した。ペプチドアレイ膜をＴＢＳ−Ｔにより３×洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗ＧＳＴ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を室温で１時間添加し、その後に化学発光基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）による検出を行い、それをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ（ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ；Ｂｉｏｒａｄ）を使用して可視化した。

等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）
等温熱量滴定をＭｉｃｒｏｃａｌ ＩＴＣ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により遂行した。ホスホペプチドはＧｅｎｓｃｒｉｐｔから得た。至適化されたＧＳＴ−ＣＩＳタンパク質コンストラクト（内部のＰＥＳＴ領域（Δ１７４２０２）を欠失させた）を調製した。もたらされた三成分ＧＳＴ−ＣＩＳ−ＳＨ２−ＳＢ複合体を、バッファー（２
０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭの２−メルカプトエタノール）に対して透析した。特別に明記されない限り、実験を２９８Ｋで遂行した。典型的には、１２× ３．１５μｌの３００μＭのホスホペプチドの注入を、３０μＭのＧＳＴ−ＣＩＳ−ＳＨ２−ＳＢ三成分複合体の溶液の中へ滴定した。ＧＳＴ−ＣＩＳ−ＳＨ２−ＢＣの希釈熱は結合実験の生データから引いた。評価ソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｃａｌ Ｏｒｉｇｉｎバージョン５．０）を使用して、データを分析した。結合曲線は単一部位の結合モードにフィットし、すべてのＫ_Ｄ値は二重実験から決定した。

Ｅ３リガーゼアッセイ
ＪＡＫ１のＣＩＳ媒介性ユビキチン化を、本質的に以前に記載されるように遂行した（Ｂａｂｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＣＩＳ Ｅ３リガーゼ複合体（カリン５及びＲｂｘ２と一緒のＣＩＳ−ＳＨ２−ＢＣ；２．５μＭ）を、２．５ｍＭのＭｇ／ＡＴＰの存在下において、ユビキチン（５０μＭ）、ヒトＥ１（１００ｎＭ）、精製された組換えＥ２（ＵｂｃＨ５ｃ、２．５μＭ）、及び全長ＪＡＫ１により、３７℃で変動する時間でインキュベーションした。フラッグタグ付けされたＪＡＫ１を、２９３Ｔ細胞中での発現によって生成し、抗フラッグ免疫沈降及び遊離フラッグペプチドによる溶出を使用して回収した。ＪＡＫ１ユビキチン化を、４〜２０％のトリス／グリシンゲル上での分離に後続する、抗リン酸化ＪＡＫ１によるウエスタンブロットによって可視化した。

キナーゼアッセイ
キナーゼ阻害アッセイを、本質的に記載されるように遂行した（Ｂａｂｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。簡潔には、１３０μＭのＳＴＡＴ５ｂペプチド（配列番号：１８ ＲＲＡＫＡＡＤＧＹＶＫＰＱＩＫＱＶＶ）を、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、１００μＭのＡＴＰ、及び１ｍＣｉのγ−［^３２Ｐ］ＡＴＰ中で、５ｎＭのＪＡＫ１により、２５℃で３０〜６０分間インキュベーションした。組換えＣＩＳ−ＳＨ２−ＢＣは０〜３０μＭの範囲の濃度で存在した。インキュベーション後に、反応物をＰ８１フォスフォセルロースペーパー上にスポットし、５％のＨ_３ＰＯ_４中でクエンチングした。次いで、ペーパーを５％のＨ_３ＰＯ_４により洗浄し（４×２００ｍｌ、１５分間）、ホスフォイメージャープレート（Ｆｕｊｉ）へ露光した。定量をＦｕｊｉソフトウェアを使用して遂行し、ＩＣ_５０曲線をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して計算した。

腫瘍細胞株
Ｃ５７ＢＬ／６マウスリンパ腫細胞株ＲＭＡは、Ｒａｕｓｃｈｅｒマウス白血病ウイルス誘導性ＲＢＬ−５細胞株に由来するＴ細胞リンパ腫である。細胞株ＲＭＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍ１５７^＋ＲＭＡ−ＧＦＰは、それぞれｍＣｈｅｒｒｙまたはＧＦＰをコードするレトロウイルスベクター（マウス幹細胞ベクター）による形質導入によって生成された。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ、Ｅ０７７１及びＥ０７７１．ＬＭＢ ｍＣｈｅｒｒｙ＋乳癌、ＬＷＴ１メラノーマ、ならびにＲＭ−１前立腺癌細胞株を、以前に記載されるように維持した（Ｆｅｒｒａｒｉ ｄｅ Ａｎｄｒａｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｇｉｌｆｉｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｓｔａｇｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１ａ ａｎｄ ｂ；Ｓｗａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｒａｕｔｅｌａ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。

実験的な腫瘍転移
１実験あたり６〜１４匹のマウスの群を実験的な腫瘍転移のために使用した。これらの群サイズを使用して、生物学的差を検出するのに適切な検出力を確実にした。この研究において前もって確立された基準に基づいて除外されるマウスはおらず、能動的無作為化（ａｃｔｉｖｅ ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ）は実験群へ適用されなかった。調査者は、
実験の間及び／または転帰を査定する場合に、群割付けに対して盲検化されなかった。すべての腫瘍実験は、具体的に示されない限り、１回遂行した。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ、ＲＭ−１前立腺癌、またはＬＷＴ１メラノーマ細胞の単一細胞懸濁液を、マウスの指摘された系統の尾静脈の中へ静脈注射した（２．５〜７．５×１０^５細胞／マウス）。何匹かのマウスに、以前に記載されるように、１００μｇの抗ＣＤ８β（５３．５．８）（ＣＤ８^＋Ｔ細胞を枯渇させることが指摘される）、５０μｇの抗アシアロＧＭ１（ＮＫ細胞を枯渇させるため）、または２５０μｇの抗−ＩＦＮ−γ（Ｈ２２）（ＩＦＮ−γを中和するため）のいずれかを、追加で投与した（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ａｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。マウスのいくつかの群に、腫瘍接種（０日目）に対して、０、３及び６日目に、対照Ｉｇ（５００μｇ腹腔内、ｃＩｇ、１−１）、または抗ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）／抗ＣＴＬＡ−４（ＵＣ１０−４Ｆ１０）（各々２５０μｇ腹腔内）の組み合わせのいずれかを投与した。肺を１４日目に採取し、Ｂｏｕｉｎ液中で固定しＢ１６Ｆ１０の転移をカウントするか^４４、またはフローサイトメトリーによってＮＫ細胞増幅について分析するかのいずれかを行った。養子移入モデルのために、Ｍｃｌ１^ｆ／ｆＮｃｒ１−ｉＣｒｅマウス（Ｓａｔｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）に、３×１０^６のインビトロで増殖させたＣｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞もしくはＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞またはＰＢＳを静脈注射した。次いで８時間後に、マウスに、１×１０^５のＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を注射した。続いて１日目に、マウスを、１．５×１０^６のインビトロで増殖させたＣｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞もしくはＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞またはＰＢＳにより静脈送達で処理した。腫瘍注射後１８日目にマウスを屠殺し、肺灌流を実行した。次いで肺を採取し、転移をカウントした。

正所性Ｅ０７７１．Ｌ．ＭＢ及びＥ０７７１の自然転移
原発性腫瘍を生成するために、１×１０^５のＥ０７７１．ＬＭＢ ｍＣｈｅｒｒｙ＋腫瘍細胞を、８〜１０週齢のメスのＣｉｓｈ^−／−マウスまたはＣｉｓｈ^＋／＋マウスの第４鼠径部乳腺の中へ移植した［２０μｌのＰＢＳ中で］。原発性腫瘍体積を、電子キャリパーを使用して１週間あたり３回測定した。最大の縦径（長さ）及び最大の横径（幅）を測定した。腫瘍体積は、以下の改変楕円体計算式：体積＝１／２（長さ×幅^２）によって推定した。自然転移実験については、原発性腫瘍を４００〜６００ｍｍ^３のサイズで外科的に切除した。肺を１４日後に採取し、以前に記載されるように、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲ−ＩＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するエクスビボでの画像化によって、またはビメンチンに比べたｍＣｈｅｒｒｙの発現についてのデュプレックスＱ−ＰＣＲによって、転移量を定量化した（Ｒａｕｔｅｌａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。

ＣＹＴ−３８７の合成
液体クロマトグラフィー質量分光法（ＬＣＭＳ）を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析（カラム：Ｇｅｍｉｎｉ ３μＣ１８ ２０×４．０ｍｍ １１０Ａ）を使用するＦｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｍａｘを使用して実行した。溶媒Ａ：水、０．１％のギ酸、溶媒Ｂ：アセトニトリル、０．１％のギ酸、勾配：１０分間にわたって１０〜１００％のＢ、検出：１００〜６００ｎｍ及びエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）。生化学アッセイを受けたすべての化合物は、２５４ｎｍのＵＶ吸光度でのＨＰＬＣ分析によって測定されるように、≧９５％の純度を有すると評価された。プレパックされたシリカゲルカラム（粒子サイズ０．０４０〜０．０６３ｍｍ）を備えたＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）Ｒｆ精製システム（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ、ＩＳＣＯ、Ｌｉｎｃｏｎ、ＮＥ、ＵＳＡ）を使用して、クロマトグラフィーを遂行した。すべての市販の試薬は受け取ったままで使用した。Ｃｂｚ＝カルボキシベンジル。ベンジル４−（４−アミノフェニル）ピペラジン−１−カルボキシレート（Ｓ１）及びエチル４−（４−クロロピリミジン−２−イル）ベンゾエート（Ｓ２）は、以前に記載されるように、調製することができる（ＷＯ２０１４／２６２４２及びＷＯ２００８／１０９９４３）。

ベンジル４−（４−（（２−（４−（エトキシカルボニル）フェニル）ピリミジン−４−イル）アミノ）フェニル）ピペラジン−１−カルボキシレート（Ｓ３）
ｐ−ＴｓＯＨ（０．９７８ｇ、５．１３ｍｍｏｌ）を、ジオキサン（２０ｍＬ）中のピリミジンＳ２（１．５０ｇ、５．７１ｍｍｏｌ）及びアニリンＳ１（２．３１ｇ、７．４２ｍｍｏｌ）の磁石で撹拌された懸濁液へ添加した。混合物を２４時間加熱還流した。混合物を冷却し、ＤＣＭ（２５０ｍＬ）中で希釈し、ＮａＨＣＯ_３（１００ｍＬ）により洗浄し、水層を分離しＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）により抽出した。合わせた有機層を乾燥し（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、シリカの上で濃縮し、材料をフラッシュクロマトグラフィー（１：９〜１：０、ｖ／ｖ、ＥｔＯＡｃ：シクロヘキサン）にかけた。このようにして得られた画分を濃縮し、黄色沈殿物を濾過し、メタノールにより洗浄し、黄色固体として表題化合物（Ｓ３）（１．６１ｇ、５２％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ ９．５１ （ｓ， １Ｈ）， ８．５２ （ｄ， Ｊ ＝ ５．１ Ｈｚ，
１Ｈ）， ８．２５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ８．０８ （ｄ， Ｊ ＝ ８
．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．６５ （ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３７−７．３５ （ｍ， ５Ｈ）， ７．３１ （ｑ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９３ （ｄ
， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．０９ （ｓ， ２Ｈ）， ４．３３ （ｑ， Ｊ ＝
７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５８−３．４８ （ｍ， ４Ｈ）， ３．０４−３．０３ （
ｍ， ４Ｈ）， １．３３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ３Ｈ）． ＬＣＭＳ： ｔ_Ｒ ＝ ６．１４分， ｍ／ｚ ＝ ５３８．０ ［Ｍ＋Ｈ］^＋．

エチル４−（４−（（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）ベンゾエート（Ｓ４）
化合物Ｓ３（５００ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（７５ｍＬ）及びＴＨＦ（５０ｍＬ）中で溶解し、Ｐｄ／Ｃ（１０％）カートリッジを４５℃で使用して、フルＨ_２モードで１ｍＬ／分で「Ｈ−ｃｕｂｅ」を介して、溶液を通過させた。生成物を収集し減圧下で濃縮して、黒っぽい固体として表題化合物（Ｓ４）（３５２ｍｇ、９４％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ ８．４６ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．０，
５．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．１６−８．１４ （ｍ， ２Ｈ）， ８．１１ （ｄ， Ｊ ＝
８．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．５９ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．９， １．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１６−７．１３ （ｍ， １Ｈ），
６．９６ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．１， ４．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．４１ （ｑ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３６−３．２８ （ｍ， ４Ｈ）， ３．２５−３．１８ （ｍ
， ４Ｈ）， １．４２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ３Ｈ）． ＬＣＭＳ： ｔ_Ｒ ＝ ５．７８分， ｍ／ｚ ＝ ４０４．０ ［Ｍ＋Ｈ］^＋．

４−（４−（（４−（４−（５−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ペンタノイル）ピペラジン−１−イル）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）安息香酸（Ｓ５）
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＮ−Ｂｏｃ−アミノ吉草酸（１９４ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（２０１ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１４６ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）、Ｅｔ_３Ｎ（２３２μＬ、１．７５ｍｍｏｌ）の磁石で撹拌された溶液へ、化合物Ｓ４（３５０ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）をＮ_２下で添加し、混合物を１２時間撹拌した。反応混合物を水（２ｍＬ）により洗浄し、水性洗浄物をＥｔＯＡｃ（２×２ｍＬ）により抽出した。有機画分を合わせ、乾燥し（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。粗製材料をフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、淡黄色固体（３７３ｍｇ）を得た。この材料をＴＨＦ／ＭｅＯＨ（２ｍＬの１：３混合物）中で溶解し、水酸化リチウム（１２３ｍｇ、３．０９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２時間撹拌還流した。混合物を黄色固体へ濃縮し、水中で懸濁し、ＨＣｌ（５％の水溶液）によりｐＨ＝２に酸性化した。沈殿物を濾過によって収集し、ＭｅＯＨ（１ｍＬ）次いでＥｔ_２Ｏ（２×１ｍＬ）により洗浄し、減圧下で乾燥し、赤色固体として表題化合物（Ｓ５）（２２４ｍｇ、６０％）を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ_６）： δ ９．４９ （ｓ， １Ｈ）， ８．５２−８．５１ （ｍ， １Ｈ）， ８．２２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ８．０６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．６５−７．６４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３６ （ｄｄ， Ｊ ＝ ４．７， ０．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９４−６．９１ （ｍ， ２Ｈ）， ６．７７−６．７５ （ｍ， １Ｈ）， ３．５７−３．５５ （ｍ， ４Ｈ）， ３．
３６ （ｔｄ， Ｊ ＝ １．１， ０．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．０５−２．９９ （ｍ， ４Ｈ）， ２．９１−２．８７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３３−２．３１ （ｍ， ２Ｈ）， １
．４６−１．４５ （ｍ， ２Ｈ）， １．３４ （ｓ， ９Ｈ）． ＬＣＭＳ： ｔ_Ｒ ＝ ６
．３４分， ｍ／ｚ ＝ ５７５．０ ［Ｍ＋Ｈ］^＋．

４−（４−（（４−（４−（５−アミノペンタノイル）ピペラジン−１−イル）フェニル）アミノ）ピリミジン−２−イル）−Ｎ−（シアノメチル）ベンズアミド（Ｓ６）
Ｎ_２下の室温のＤＭＦ（６ｍＬ、無水）中の化合物Ｓ５（１９０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）の磁石で撹拌された溶液へ、トリエチルアミン（２６４μＬ、１．９９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を５分間超音波で処理した。次いでＥＤＣＩ（７６ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（５４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をＮ_２下で５分間撹拌した。次いでアミノアセトニトリル塩酸塩（６１ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をＮ_２下で室温で１２時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、粗製材料をフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、黄色固体としてカップリングされた生成物（１５５ｍｇ、７６％）を得た。この材料を直ちにジオキサン（０．５ｍＬ）中で溶解し、次いでＨＣｌを添加し（１ｍＬのジオキサン中の４Ｍの溶液）、反応混合物を室温で２時間撹拌した。次いで沈殿物を濾過によって収集し、ジオキサンにより洗浄し、その後にＭｅＯＨ中で溶解し、ＮＨ_３（ＭｅＯＨ中の４Ｍの溶液）によりクエンチングし、次いで濃縮した。粗製材料をフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、黄色固体（５１ｍｇ、４０％）として表題アミン（Ｓ６）を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ， ＣＤ_３Ｏ
Ｄ）： δ ８．３７ （ｄ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．１６ （ｄ， Ｊ ＝ ８
．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．９１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．５７ （ｄ
， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．２０ （ｄ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ６
．９３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．３４ （ｓ， ２Ｈ）， ３．６９ （
ｔ， Ｊ ＝ ５．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６３ （ｔ， Ｊ ＝ ５．０ Ｈｚ， ２Ｈ），
３．３０−３．２９ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０７ （ｔ， Ｊ ＝ ５．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．０３ （ｔ， Ｊ ＝ ５．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ，
２Ｈ）， ２．４１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６２ （ｄｔ， Ｊ ＝
１５．３， ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５１ （ｔｄ， Ｊ ＝ １１．３， ６．１ Ｈｚ， ２Ｈ）． ＬＣＭＳ： ｔ_Ｒ ＝ ４．１８分， ｍ／ｚ ＝ ５１３．０ ［Ｍ＋Ｈ］^＋．

実施例２ − ＩＬ−１５は、ＮＫ細胞中でＳＯＣＳ遺伝子（ＣＩＳが含まれる）の発現を誘導する
今日まで、ＮＫ細胞応答を抑制する阻害シグナルの理解への大きな関心があったが、細胞内のＩＬ−１５シグナリングのスイッチがどのようにオフにされるのかは、まだ依然として理解されていない。サイトカインシグナリングの抑制因子（ＳＯＣＳ）遺伝子ファミリーのメンバーはＳＴＡＴ５応答遺伝子であり、多くの場合、誘導されて、古典的な負のフィードバックシステムの一部としてサイトカイン受容体シグナリングの程度を限定する。どのＳＯＣＳタンパク質が、ＩＬ−１５シグナリング、そしてしたがってＮＫ細胞の発生及び機能を調節し得るかを調査するために、本発明者は、最初に、培養されたＮＫ細胞中のＩＬ−１５誘導性ＳＯＣＳ発現をプロファイリングした。Ｃｉｓｈ、Ｓｏｃｓ１、Ｓｏｃｓ２及びＳｏｃｓ３のｍＲＮＡはＩＬ−１５処理の２時間以内にＮＫ細胞中で誘導され、Ｃｉｓｈは早期且つ一過性に誘導され、その標的サイトカインによるＳｏｃｓ誘導を代表していた（図１ａ）。ＩＬ−１５の飽和濃度におけるｍＲＮＡの迅速誘導と一致して、ＣＩＳタンパク質は刺激の６０分以内にＮＫ細胞溶解物中で検出された（図１ｂ）。

実施例３ − ＣｉｓｈヌルＮＫ細胞はＩＬ−１５へ過感受性である
ＩＬ−１５シグナリングにおけるＣＩＳの生理的役割を調査するために、本発明者は生殖細胞系列のＣｉｓｈ欠失マウス（Ｃｉｓｈ^−／−）（Ｐａｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）を利用し、最初に、Ｃｉｓｈ ｍＲＮＡ及びＣｉｓｈタンパク質がＮＫ細胞に存在しないことを確認した（図５ａ）。１０か月齢まで、Ｃｉｓｈヌルマウスは健康で、妊性があり、いかなる表現型の異常も現れなかった。造血細胞の頻度及び機能（従来のＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞^９、調節性Ｔ細胞ならびに２型自然リンパ球（ＩＬＣ２）のものが含まれる）は、正常であると思われた（図５ｂ〜ｇ）。ＮＫ細胞は、Ｓｏｃｓ１及びＳｏｃｓ３の単一欠損マウスまたは二重欠損マウス（図６ａ）の事例のように、Ｃｉｓｈ^−／−マウス（図１ｃ、図５ｂ）においても正常に発生した。しかしながら、Ｓｏｃｓ１欠損ＮＫ細胞またはＳｏｃｓ３欠損ＮＫ細胞とは対照的に、Ｃｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞は、ＩＬ−１５に応答してインビトロで大規模な過増殖を提示した（図１ｄ、図６ｂ）。Ｃｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞及び対照Ｃ５７ＢＬ／６のＮＫ細胞（Ｃｉｓｈ^＋／＋）をＩＬ−１５の漸増において１：１で共培養した場合に、Ｃｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞は５ｎｇ／ｍｌを超える濃度で増殖の促進を実証した（図１ｄ）。さらに、Ｃｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞は、非細胞分裂促進性のＩＬ−１５濃度における共培養から回収された細胞のうちの約９５％を表わし、したがってＣＩＳの非存在下におけるＩＬ−１５媒介性のＮＫ細胞の優れた生存を実証した（図１ｄ）。Ｃｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞の過感受性は、ＩＬ−１５駆動性ＩＦＮ−γ産生の促進においても現われ、それは、受容体のＮＫｐ４６及びＮＫ１．１の活性化経由の共刺激によりさらに強まり、これらの受容体との相乗作用におけるＩＬ−１５の重要な役割を示唆した（図１ｅ）。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）標的細胞と共培養した場合に、Ｃｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞は、Ｃｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞へ比較した場合に、ＮＫ細胞：標的細胞の低い比でより大きな細胞傷害性を提示した（図１ｆ及び図６ｃ）。Ｃｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞はさらに、Ｃｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞よりもより効率的にＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を死滅させ、ＲＭＡ−ｍ１５７細胞により攻撃接種した場合により高いレベルの細胞内グランザイムを示し、ＮＫ細胞がＣｉｓｈの非存在下において幅広く非常に細胞毒性であるという証拠であった（図６ｃ、ｄ）。

ＣｉｓｈヌルＮＫ細胞における異常なＩＬ−１５シグナリングの程度を検討するために
、本発明者は、脾臓から直接的に精製された（エクスビボ）またはＩＬ−１５中での培養後（インビトロで）のいずれかの、Ｃｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞及びＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞で、１００ｂｐシングルエンドＲＮＡシーケンシングを遂行した。差異的に発現した遺伝子は、エクスビボのＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞において非常に少ないことが観察され（図７ａ）、このことは、インビボのＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞の正常な頻度、及び成熟ＮＫ細胞におけるＣｉｓｈの低発現と結び付けると、ＣＩＳが定常状態おけるＮＫ細胞生物学の主要な調節因子ではないことを示唆する。これとは対照的に、ＩＬ−１５の高濃度にインビトロで曝露されたＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞において、１０００を超える差異的に発現した遺伝子が検出された（図１ｇ及び図７ａ、ｂ、ｃ）。最も高くアップレギュレートされた遺伝子には、キラー細胞レクチン様受容体のメンバーのＫｌｒａ１及びＫｌｒａ６、ならびにＮＫ細胞エフェクター機能と関連するもの（セリンプロテアーゼＧｚｍｅ、Ｇｚｍｆ、Ｇｚｍｄ、Ｇｚｍｇならびにそれらの阻害物質Ｓｅｒｐｉｎｂ９ｂ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９及びＳｅｒｐｉｎ１ａ等）が含まれていた（図１ｇ、図７ａ）。Ｃｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞の優れた増殖及び細胞傷害性と共に、これらの所見は、ＩＬ−１５媒介性ＮＫ細胞エフェクター機能の重要な負の調節因子としてのＣＩＳのユニークで非冗長的役割を同定する。さらに、それらは、ＣＩＳがＮＫ細胞応答を制御する免疫チェックポイントとして作用することを示唆する。

実施例４ − ＪＡＫ１レベル及び酵素活性はＣＩＳタンパク質の非存在下において上昇する
ＳＯＣＳタンパク質はＥ３ユビキチンリガーゼ複合体のためのアダプターであり、ＳＯＣＳ相互作用タンパク質をユビキチン化し、それらをプロテアソーム分解のために標的化する（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ＣＩＳは最初に見出されたＳＯＣＳファミリータンパク質であり（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、ＩＬ−２受容体複合体と会合することが報告されたが（Ａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、正確にこの相互作用がどのように媒介されるかは明らかでないままであった。Ｃｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞の過増殖及びエフェクター能力の促進は、受容体レベル及び／または細胞内シグナリング構成要素の変化から示すことができた。しかしながら、ＩＬ−１５の存在下において培養された場合に、Ｃｉｓｈ^＋／＋脾臓ＮＫ細胞及びＣｉｓｈ^−／−脾臓ＮＫ細胞は、同等の受容体レベルを発現した（図２ａ）。したがって、本発明者は受容体近位のシグナリング事象を検査した。新鮮分離されたＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞及び培養されたＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞の両方において、ＩＬ−１５で刺激したＪＡＫ１チロシンリン酸化の大きさは、対照細胞に比較して増加し、リン酸化動態の延長とカップリングしていた（図２ｂ、ｃ及び図８ａ）。興味深いことには、全ＪＡＫ１タンパク質のレベルはＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞において上昇し、これは刺激の前の静止細胞において明らかであった（図２ｂ、ｃ）。ＪＡＫリン酸化の増加は、その基質（ＳＴＡＴ５）のリン酸化の増加と相関した。これとは対照的に、Ｃｉｓｈの非存在はＩＬ−１５依存性ＡＫＴリン酸化に対して効果がなく（図２ｂ、ｃ及び図８ａ）、ＩＬ−１５駆動性のＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路とＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ／ＡＫＴ経路の間のユニークな断絶が示唆される。このことは、正常なミトコンドリア呼吸及び解糖（ＡＫＴ活性によって調節されることが公知の応答）によってさらに確認された（図８ｂ）。

ＪＡＫ１酵素活性の上昇を確認し、ＣＩＳ欠損効果がどのくらい選択的だったのかを検討するために、本発明者は質量分析に基づくアプローチを利用して、活性のあるＪＡＫレベルの変化を定量した。汎ＪＡＫ阻害物質（ＣＹＴ−３８７に由来する；ＪＡＫ１／２／３）を合成し、セファロースビーズへカップリングし、親和性捕捉試薬として使用し、その後にトリプシン消化及び質量分光分析を行った。阻害物質がキナーゼドメイン中のＡＴＰ結合部位へ結合するので、活性のある立体配座のキナーゼは優先的にエンリッチされる。ＪＡＫ１ペプチド及びＪＡＫ３ペプチドはＣｉｓｈ^−／−細胞において増加した数及び強度でＮＫ細胞溶解物中で検出された（図２ｄ）。ＣＹＴ−３８７は、他のキナーゼ（特
にＴＢＫ１、ＣＤＫ２）へ標的外の結合を有することが公知であり、制限されたキノーム分析を遂行することが可能であった。６９のキナーゼが細胞溶解物中でのそれらの存在量と比べてエンリッチされ、１６のキナーゼがＣｉｓｈ^−／−細胞において差異的に調節された。ＪＡＫキナーゼは別として、増加した活性は、主として、細胞増殖の調節に関与するキナーゼ（例えばＣＤＫ１／２、Ｐｒｋｒ、オローラキナーゼ）に起因していた（図２ｅ、ｆ及び表１）。これらのデータは過増殖性表現型と一致し、これらのうちの多くのものがＩＬ−１５シグナリングの増加に対して二次的なものであり得ることをさらに示唆する。標識なしの全体的なプロテオーム解析から、増殖能の促進（細胞周期、ＤＮＡ複製、細胞骨格再編成）を反映する変化も明らかにされた（図８ｃ〜ｅ及び表２）。

実施例５ − ＣＩＳ−エロンギンＢ−エロンギンＣ三量体複合体の相互作用標的の同定
他のＳＯＣＳタンパク質のように、ＣＩＳは、ＳＨ２ドメイン（それは標的タンパク質中のリン酸化チロシンモチーフへ結合する）及びＳＯＣＳボックス（それはエロンギンＢ及びエロンギンＣ、スキャフォールドタンパク質カリン５、ならびにＲＩＮＧタンパク質Ｒｂｘ２と一緒に、Ｅ３ユビキチンリガーゼを構成する）を含有する。Ｃｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞において観察された全ＪＡＫ１／３タンパク質のレベルの増加が、ＲＮＡレベルの増加に起因しなかったことを考慮して（図９ａ）、本発明者は、ＣＩＳがユビキチン化及びプロテアソーム分解を介して直接的にＪＡＫタンパク質レベルを低減させ得る可能性を調査した。以前に、ＣＩＳはＩＬ−２Ｒβと相互作用することが示されており、受容体複合体へのＳＴＡＴタンパク質の動員をブロックすることによって、シグナリングを調節することが提案された（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。しかしながら、後者の提案を支持する証拠は限定的である。ＣＩＳによって調節されていたタンパク質標的の同定への予備的ステップとして、本発明者は、ヒトＧＳＴ−ＣＩＳコンストラクト（ｈＣＩＳ−ＳＨ２；残基６６〜２５８）ならびにエロンギンＢ及びエロンギンＣ（ｈＣＩＳ−ＳＨ２−ＢＣ）からなる組換え三量体複合体を使用して、ＩＬ−２受容体複合体内のチロシンへ対応するホスホチロシンペプチドのパネルに対して、スクリーニングを遂行した（図示せず）。次いで等温熱量測定（ＩＴＣ）を使用して、スクリーニングにおいて同定されたホスホペプチドへの結合を検証した。ｈＣＩＳ−ＳＨ２−ＢＣ複合体は、ＩＬ−２Ｒβ細胞質ドメイン内のチロシンへ対応する合成のリン酸化されたペプチド（Ｔｙｒ３５５、Ｔｙｒ３６１及びＴｙｒ３９２）へ、ならびにＪＡＫ１及びＪＡＫ３の活性化ループ（それぞれＴｙｒ１０３４及びＴｙｒ９８０）内に、高親和性（０．８〜２．１μＭ）で結合した（図３ａ；図９ｃ）。

実施例６ − ＣＩＳタンパク質は、標的化されたプロテアソーム分解経由でＩＬ−２受容体複合体の非存在下においてＪＡＫレベルをダウンレギュレートする
本発明者は、次にＣＩＳがＩＬ−２受容体複合体の非存在下においてＪＡＫレベルを調節することができるかどうかを調査した。２９３Ｔ細胞（それはＩＬ−２Ｒを欠如する）におけるＪＡＫの過剰発現は、構成的ＪＡＫ自己リン酸化をもたらす。ＣＩＳまたはＳＯ
ＣＳ１の共発現は、同等の程度へＪＡＫ１レベルを低減させ、ＪＡＫ１リン酸化の対応する減少が伴っていた。これとは対照的に、ＳＯＣＳ３は、このアッセイにおけるＪＡＫ活性を阻害することができなかった（ＳＯＣＳ３は受容体結合を要求する）（図３ｂ）。意外にも、本発明者はＪＡＫ３ Ｔｙｒ９８０ペプチドへのＣＩＳの結合を観察したが（図３ａ）、ＪＡＫ３リン酸化はこのアッセイにおいて阻害されなかった（図３ｂ）。

次に、本発明者は、どのＣＩＳのドメインがＪＡＫ１阻害のために要求されるのかを調べた。ＣＩＳ−ＳＨ２ドメイン（Ｒ１０７Ｋ）またはＳＯＣＳボックス中のカリン−５結合部位（Ｐ２４１Ａ／Ｌ２４２Ａ／Ｐ２４３Ａ）のいずれかの突然変異は、ＣＩＳの阻害活性を減じるのに十分であった（図３ｃ）。さらに、プロテアソーム阻害物質（ＭＧ１３２）による細胞のプレインキュベーションは、ＪＡＫ１リン酸化のＣＩＳ媒介性調節を低減し（図３ｃ）、ＣＩＳがそのＳＨ２ドメイン経由でＪＡＫ１へ結合し、次いでＪＡＫ１をプロテアソーム分解のために標的化するというモデルを支持する。共免疫沈降を使用して、ＪＡＫ１とＣＩＳとの間の複合体形成を実証した（図３ｄ）。ＪＡＫ１のＣＩＳ媒介性ユビキチン化を正式に実証するために、フラッグタグ付けされた全長ＪＡＫ１タンパク質（２９３Ｔ細胞中での発現によって生成された）を、組換えｈＣＩＳ−ＳＨ２−ＳＢ複合体、カリン５、Ｒｂｘ２、Ｅ１、Ｅ２（ＵｂｃＨ５ｃ）及び遊離ユビキチンにより、無細胞系においてインキュベーションした。ＣＩＳは、ウエスタンブロットによって検出された高分子量種によって指摘されるように、リン酸化ＪＡＫ１のユビキチン化を実質的には媒介した（図３ｅ）。総合すると、これらのデータはＣＩＳがＪＡＫタンパク質レベルを直接的に調節できることを実証する。

実施例７ − ＣＩＳタンパク質は、ＪＡＫタンパク質レベルのダウンレギュレーションとは無関係にＪＡＫ酵素活性を直接的に阻害する
以前に、ＳＯＣＳ１及びＳＯＣＳ３のみがＪＡＫへ結合し、活性を調節することが示されている。ＳＯＣＳ１及びＳＯＣＳ３は、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２及びＴｙｋ２の挿入ループ中に存在する「ＧＱＭ」モチーフへの非カノニカルなＳＨ２結合ならびに触媒クレフトへのキナーゼ阻害領域（ＫＩＲ）の結合経由で、ＪＡＫを阻害する（Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ
ａｌ．，２０１３）。ＣＩＳは「ＫＩＲ」領域を含有せず、それがＪＡＫ酵素活性を調節できたという従来の示唆はなかった。しかしながら、いくつかの証拠は、追加の機構が関与することを示唆した。第一に、本発明者は、時々、全ＪＡＫ１レベルの変化の非存在下においてＪＡＫ１リン酸化の阻害を観察した（例えば図３ｃ）。第二に、内在性ＪＡＫ１のリン酸化の増加をもたらす野生型ＮＫ細胞のＭＧ１３２処理にもかかわらず、本発明者は延長された動態を観察せず、実際ＪＡＫリン酸化は急速に抑えられた。これはＣＩＳの発現の増加と相関し、それはプロテアソーム分解から保護された（図９ｄ）。したがって本発明者はＣＩＳがＪＡＫ１キナーゼ活性を阻害できるかどうかを問うた。インビトロのキナーゼアッセイを使用して、ＣＩＳ−ＳＨ２−ＢＣ複合体は、０．１２±０．０２μＭのＩＣ_５０で、基質ペプチドのＪＡＫ１リン酸化を阻害することができた。ＪＡＫ１のＣＩＳ阻害は、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３またはＴＹＫ２の阻害よりも２０倍以上大きく（図３ｆ、上部パネル）、ＪＡＫ１とのユニークな境界に加えて、保存されたＪＡＫ活性化ループのチロシンとのカノニカルなＳＨ２相互作用を示唆する。この概念は、ＪＡＫ１活性化ループペプチドが競合物として使用された場合に見られる、阻害の部分的のみの低減によって支持された（図９ｅ）。ＣＩＳはＪＡＫ１への特異性を提示したが、ＳＯＣＳ１よりも約１００倍低い効率でＪＡＫ１を阻害した（図３ｆ、下部パネル）。これは、ＣＩＳ ｖｓ ＳＯＣＳ１の絶対レベルが特異性及び優位性の両方に寄与するだろうということを示唆する。この文脈において、ＣＩＳの受容体動員はＣＩＳの局所濃度を増加させることができ、それがＪＡＫ１活性を効率的に阻害することを可能にする（図３ｇ）。ＣＩＳのレベルの翻訳後調節は、たとえプロテアソームまたはプロテアーゼであろうと、制御についての別の精巧な層を加える。これらのデータは、ＣＩＳの作用のための新しい標的（ＪＡＫ１）及びメカニズム（キナーゼ阻害）を示唆し、ＣＩＳが以前に考えられたよりもＳ
ＯＣＳ１へ基本的により類似する可能性を高める。

実施例８ − マウス腫瘍モデルにおけるＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞の養子移入は、腫瘍形成及び転移の有意な低減をもたらす
ＩＬ−１５の高濃度へ曝露されたＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞の生物学的応答の著しい促進、及び恒常的条件下の健康なＣｉｓｈ^−／−マウスにおけるＮＫ細胞表現型の欠如は、インビボの定常状態のＩＬ−１５レベルがＣｉｓｈ発現を誘導するのに要求されるもの未満であることを示唆する。腫瘍形成と関連する炎症は、間質または浸潤する骨髄系系譜によるＩＬ−１５トランス提示を増加させ、常在ＮＫ細胞活性を増大するだろう（Ｍｌｅｃｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

したがって、本発明者は、同系の腫瘍細胞株（ＮＫ細胞を活性化しＮＫ細胞によって制御されることが公知）のパネルにより、Ｃｉｓｈ^＋／＋マウス及びＣｉｓｈ^−／−マウスを攻撃接種して、ＣＩＳのＩＬ−１５誘導がＮＫ細胞におけるチェックポイントとしてインビボで作用するかどうかを調査した。Ｃｉｓｈ^＋／＋マウスへのＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞の静脈内（ｉ．ｖ．）投与は、１４日目までに肺において広範囲な転移性結節形成をもたらした。これとは対照的に、Ｂ１６Ｆ１０転移性結節は、Ｃｉｓｈ^−／−マウスに概して存在しなかった（図４ａ）。Ｃｉｓｈ^−／−マウスにおいて観察されるＢ１６Ｆ１０の転移の低減が、ＮＫ細胞活性の促進に依存することを確認するために、Ｃｉｓｈ^＋／＋マウス及びＣｉｓｈ^−／−マウスに、抗アシオロ（ａｓｉｏｌｏ）ＧＭ１（ＮＫ細胞を枯渇させるため）、抗ＣＤ８（ＣＤ８ Ｔ細胞を枯渇させるため）、抗ＩＦＮ−γ（ＩＦＮ−γ活性をブロックするため）、または対照の抗免疫グロブリン（ｃＩｇ）を処理した。ＮＫ細胞の枯渇またはＩＦＮ−γの中和は、Ｃｉｓｈ^−／−マウスをＢ１６Ｆ１０転移へ感受性のあるようにしたが、ＣＤ８ Ｔ細胞の枯渇はそうせず（図４ｂ）、このモデルにおける、ＮＫ細胞活性及びＩＦＮ−γの負の調節におけるＣＩＳの役割が同定された。さらに、ＮＫ細胞を欠如するマウス（Ｍｃｌ１^ｆ／ｆＮｃｒ１−ｉＣｒｅ；Ｎｃｒ１^{Ｍｃｌ１Δ／Δ}）の中へ養子移入された場合に、Ｃｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞を受け入れたマウスはＣｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞を受け入れたマウスよりも有意に少数のＢ１６Ｆ１０肺転移を有しており（図４ｃ）、Ｃｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞が内因的により活性があるという証拠であった。セリン／スレオニンキナーゼｂｒａｆの突然変異形態を発現するメラノーマ細胞株（ＬＷＴ１ ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}）（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００２）によるＣｉｓｈ^＋／＋マウス及びＣｉｓｈ^−／−マウスの注射も、ＣＩＳ欠損マウスにおける肺転移の有意な低減をもたらした（図１０ａ）。ＲＭ−１前立腺癌細胞株を使用する場合に肺転移において類似の差が観察されたので、この所見はメラノーマに限定されていなかった（図１０ｂ）。

同様に、乳癌細胞（Ｅ０７７１．ＬＭＢ−ｍＣｈｅｒｒｙ）を、Ｃｉｓｈ^＋／＋マウス、Ｃｉｓｈ^−／−マウス、及びＮＫ細胞ヌルマウスへ静脈投与した場合に、本発明者は、Ｃｉｓｈ^＋／＋及びＮＫヌルマウスに比較して、Ｃｉｓｈ^−／−マウスの肺における腫瘍量の低減を観察した（図４ｄ）。これらのマウスからの肺の組織学的分析は、Ｃｉｓｈ^−／−マウスにおける時折のＥ０７７１微小転移を明らかにしたが、これらのマウスは、大きな転移（Ｃｉｓｈ^＋／＋マウスの血管の周囲で頻繁に観察され、臓側胸膜においてエンリッチされる）を欠いていた（図４ｄ）。正所性Ｅ０７７１．ＬＭＢ乳腺腫瘍の増殖も、Ｃｉｓｈ^＋／＋マウスに比較して、Ｃｉｓｈ^−／−マウスにおいて有意に改善された（図４ｇ）。類似のサイズの原発性正所性腫瘍が外科的に切除された場合に、Ｃｉｓｈ^＋／＋マウスのみが肺におけるＥ０７７１．ＬＭＢの自然転移を起こしたが、Ｃｉｓｈ^−／−マウスは起こさず（図４ｆ及びＦｉｇ．１０ｃ、ｄ）、ＣＩＳが抗転移性腫瘍免疫の強力な負の調節因子であるというさらなる証拠であった。

実施例９ − マウスメラノーマモデルにおけるＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞の養子移入は
、抗ＰＤ １／ＣＴＬＡ−４免疫療法単独よりも有効であり、抗ＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４免疫療法との組み合わせでより大きな有効性を有する
阻害性受容体ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４に対する抗体を使用する、組み合わせ免疫療法は、現在ヒトにおける進行性メラノーマに対して最も有効な治療である（Ｌａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｐｏｓｔｏｗ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ
ｅｔ ａｌ．，２０１５）。このベンチマーク免疫療法を、ＮＫ細胞におけるＣｉｓｈ欠失と比較するために、Ｃｉｓｈ^−／−マウス及びＣｉｓｈ^＋／＋マウスに高用量のＢ１６Ｆ１０メラノーマを注射し（ＮＫ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞の両方の応答を誘発するため）、抗ＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４抗体の組み合わせまたはｃＩｇにより処理した。Ｃｉｓｈ^＋／＋マウスにおいて、ｃＩｇに比較した場合に抗ＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４処理はメラノーマ転移を有意に低減したが、これは、Ｃｉｓｈ欠失単独（Ｃｉｓｈ^−／−マウス＋ｃＩｇ；図４ｇ）によって提供された保護より劣っていた。顕著なことには、抗ＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４により処理されたＣｉｓｈ^−／−マウスは、ｃＩｇにより処理されたＣｉｓｈ^−／−マウスよりもさらに少数の転移を起こし（図４ｇ）、抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１療法がＣＩＳ機能の喪失と組み合わせられたならば、可能性のある治療利益を達成できることが強調された。

Ｃｉｓｈの誘導は、インターロイキン（ＩＬ）−３、ＩＬ−２及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）に応答することが最初に実証され、ＣＩＳの強制発現はこれらの受容体を介してシグナリングを阻害することが示された（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。これらの観察にもかかわらず、これらの経路における生理的役割についての証拠は限定されている。加齢した（１０〜１８か月）Ｃｉｓｈ^−／−マウスは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞における乱れたＩＬ−４／ＳＴＡＴ６及びＩＬ−２／ＳＴＡＴ５シグナリングと関連する炎症性肺病態を発症することが報告された（Ｙａｎｇ
ｅｔ ａｌ．，２０１３）が、抗原受容体シグナリングがＣｉｓｈ^−／−ＣＤ８^＋Ｔ細胞において促進されていることを最近の報告が示唆した（Ｐａｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。しかしながら、成体Ｃｉｓｈ^−／−マウスは病変またはＴ細胞頻度の変化を示さず（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）本発明者の手技では、Ｃｉｓｈ^−／−ＣＤ８^＋Ｔ細胞の発生及びマウスサイトメガロウイルスへの抗原特異的応答は正常であった（データ不掲載）。Ｃｉｓｈ^−／−マウスが健康なままであることを考慮すると、我々の観察は、ＣＩＳを治療的にアンタゴナイズすることは恐らく何ら大きな副作用がないだろうということを示唆する。

深刻な標的外の効果及び薬物耐性は、現在、従来の化学療法（通常大部分のがんのための治療の第一選択）の使用を限定する。したがって、組み合わせて化学療法への補助剤として使用できる新しい標的化療法及び免疫療法を見出す、満たされていない必要性がある。

イピリムマブは抗体ベースの治療法であり、それは、エフェクターＴ細胞及び調節性Ｔ細胞上のＣＴＬＡ−４を標的化し、進行性悪性メラノーマの治療のために承認されており、いくつかの併発する免疫関連性有害事象を伴って、１０〜１２％の腫瘍応答を提供する。これは、いわゆる免疫チェックポイント分子を標的とするモノクローナル抗体の画期的新薬である。抗体（同じクラスの）は、ＰＤ−１（Ｔ細胞及びＮＫ細胞上で発現される）、またはそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１（一旦Ｔ細胞活性化が起こったならば、多くの腫瘍上で発現される）を認識し、ペムブロリズマブ及びニボルマブ（抗ヒトＰＤ−１）は、進行性メラノーマ、腎癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、及び他のがん徴候におけるフェーズＩ／ＩＩの治験において、２０〜５０％の客観的奏効率を既に生じている。ニボルマブ及びイピリムマブは、組み合わせで、進行性悪性メラノーマに対する多くの急速で目覚ましい抗癌効果（転移性疾患に対するものが含まれる）を生じている。これらの進歩にもかかわらず、いくつかのがん（例えば前立腺、結腸直腸）はそれほど目覚ましくない応答
を示し、メラノーマにおいてでさえ、抗ＣＴＬＡ−４及び抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の組み合わせが失敗するであろう多数の患者が依然として存在する。

本明細書において、本発明者は、ＮＫ細胞機能を限定する細胞内免疫チェックポイントとして、ＮＫ細胞におけるＩＬ−１５誘導性ＣＩＳ蓄積が作用することを示した。ＣＩＳ機能の消耗はＮＫ細胞活性のブレーキを解除し、実験的な腫瘍転移の劇的な減少をもたらし、それは、ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１遮断により観察されたものを超え、有害反応の徴候はない。この結果は、新規ＮＫ細胞チェックポイントとしてのＣＩＳを明らかにし、ヒトにおけるＣＩＳ機能の有効な治療的遮断が、ある特定のがんの予後を改善し得ることを示唆する。

実施例１０ − ＣＩＳのＮ末端領域またはＰＥＳＴモチーフのいずれかの欠失は、ＣＩＳがＪＡＫ１キナーゼ活性を阻害する能力を促進する
ＣＩＳのＮ末端領域及びＰＥＳＴモチーフの役割を調査するために、本発明者は、ＰＥＳＴモチーフ（残基１７３〜２０２；ΔＰＥＳＴ）、最初の２４残基（ΔＮ３４）、Ｎ末端領域（残基１〜６６）及びＰＥＳＴモチーフ（ΔＮＴΔＰＥＳＴ）のいずれかを欠如するか、または全長タンパク質（ＣＩＳ）へ対応するヒトＣＩＳについてのＥ．ｃｏｌｉ発現コンストラクトを生成した。すべてのＣＩＳタンパク質をエロンギンＢ及びＣと一緒に発現させ、記載されるように三量体複合体を精製した。次いでＪＡＫ１キナーゼドメイン（ＪＨ１）を阻害する能力を、インビトロのキナーゼ反応を使用して査定した。以前のデータと一致して（図３Ｆ）、ＣＩＳ−ΔＮＴΔＰＥＳＴは約０．６μＭのＩＣ_５０でＪＡＫ１を阻害した。これとは対照的に、ＣＩＳ−ΔＮ３４が示したように（ＩＣ_５０約９６．７７）、全長タンパク質はＪＡＫ１を阻害する能力の大幅な低減を示し（ＩＣ_５０約３２．３）、Ｎ末端内の領域（残基３５〜６６）が自己阻害性であることを示唆した。ＰＥＳＴ単独の欠失はＩＣ_５０を３．３２ｍＭへ増加させるのに十分であった（全長ＣＩＳに比較して）（図１１Ａ）。

実施例１１ − ホスホペプチドとのＣＩＳ−ＳＨ２の相互作用はＪＡＫ１キナーゼ活性のＣＩＳ阻害のために要求される
インビトロのキナーゼ反応の中へのリン酸フェニル（ＰＰ）の添加は、すべてのＣＩＳコンストラクトがＪＡＫ１キナーゼ活性を阻害する能力を無効にした（図１１Ｂ）。同様に、単一リン酸化ＪＡＫ１または二重リン酸化ＪＡＫ３（活性化ループ）へ対応する遊離ホスホペプチドの添加は、ＣＩＳがＪＡＫ１キナーゼ活性を阻害する能力を劇的に低減した（図１１Ｃ）。これらのデータは、ホスホチロシンモチーフへのＳＨ２ドメインのカノニカルな結合は、ＣＩＳがＪＡＫ１活性を阻害することに要求されることをさらに確認する。

実施例１２ − ＣＩＳのＮ末端領域またはＰＥＳＴモチーフの欠失はホスホペプチドへの結合に対して大きな影響を及ぼさない
ＰＥＳＴモチーフ（残基１７３〜２０２；ΔＰＥＳＴ）、最初の２４の残基（ΔＮ３４）、Ｎ末端領域（残基１〜６６）及びＰＥＳＴモチーフ（ΔＮＴΔＰＥＳＴ）のいずれかを欠如するか、または全長ＣＩＳへ対応する、ＣＩＳコンストラクトを、エロンギンＢ及びエロンギンＣと一緒に発現させ、ＪＡＫ１ホスホペプチドを結合するそれらの能力についてＩＴＣを使用して試験した。すべてコンストラクトはホスホペプチドを２．２〜１０μＭの親和性で結合し、Ｎ末端の３４残基の欠失で最も大きな結合の低減が観察された（図１２Ａ）。同様に、全長ＣＩＳ及びＣＩＳ−ΔＮＴΔＰＥＳＴはＪＡＫ３ホスホペプチドを同等の親和性で結合した（図１２Ｂ）。

総合すると、これらのデータは、Ｎ末端領域及び／またはＰＥＳＴモチーフは自己阻害性であり、これらの領域はＳＨ２ドメインがホスホペプチドを結合する能力に対して最小
の影響を及ぼすが、それらはＣＩＳがＪＡＫ１キナーゼ活性を阻害する能力に対して大きな影響を及ぼすことを示唆する。理論により限定されることを望むものではないが、おそらく、翻訳後修飾または立体配座的変化（ホスホチロシンへの結合に対するもの等）が、自己阻害を解放し、ＣＩＳを活性化するために要求されるだろう。これは、Ｎ末端領域及びＰＥＳＴモチーフの立体配座／所在位置を安定させるか、またはＣＩＳの翻訳後修飾をブロックする、薬剤が有効なＣＩＳのブロッカーであり得ることを示唆する。同様に、Ｎ末端領域またはＰＥＳＴモチーフを模倣する薬剤も有効なＣＩＳのブロッカーであり得る。

実施例１３ − ＣＩＳ−ＳＨ２ドメインは延長されたペプチド境界へ結合する
ＩＴＣを使用して、ホスホチロシン（ＪＡＫ１ Ｙ１０３４）に隣接する残基のどれが結合親和性（及び特異性）に寄与するかを調査した。＋５、＋３または−３の位置でのアラニンの置換は、結合に対して中等度のみの効果があった（＋３で約４倍の低減）（図１３）。これは、ＣＩＳ−ＳＨ２ドメインがその標的ペプチド配列と複数の接触をすることを示唆する。

実施例１４ − ＣＩＳの阻害は用量依存的である
ＣＩＳの小分子阻害物質は、恐らくＣＩＳの機能の完全な喪失を再現しない。本発明者は、したがって、１つの対立遺伝子の喪失が、ＩＬ−１５へのＮＫ細胞応答を促進するのに十分だったかどうかを調査した。ＮＫ細胞をＣｉｓｈ^＋／＋マウス、Ｃｉｓｈ^＋／−マウス、及びＣｉｓｈ^−／−マウスから精製し、ＣＴＶにより標識し、ＩＬ−１５の増加する濃度の存在下においてインビトロで増殖させ、その後にフローサイトメトリーによる分析を行った。Ｃｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞の増殖の促進が再現された一方で、Ｃｉｓｈ^＋／−ＮＫ細胞は中間の表現型を示し、野生型細胞に比較して増殖が促進されたが、それでもＣｉｓｈ^−／−細胞について観察されたもの以下であった（特に低いＩＬ−１５レベルで）（図１４Ａ）。この結果は培養後の細胞の絶対数に反映され（図１４Ｂ）、イムノブロットにより、１つのＣＩＳの対立遺伝子の喪失はＣＩＳタンパク質の対応する喪失（およそ５０％）をもたらしたことが、確認された（図１４Ｃ）。これらのデータは、ＣＩＳ機能を阻害する有用性を指摘する。

実施例１５ − 治療標的としてのＣＩＳ−ＳＨ２ドメインのさらなる検証
ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して、本発明者は、Ｃｉｓｈ遺伝子における生殖細胞系列突然変異を保有する、「ノックイン」変異マウスを生成した。この突然変異は、ＳＨ２ドメイン中のＡｒｇ１０７をＬｙｓへ変化させ、ホスホペプチドへのＳＨ２の結合を無効にする。突然変異の効果は組換えタンパク質及びＩＴＣ結合を使用して実証され（図示せず）、図３Ｃ中のデータ（それは、この突然変異がＣＩＳがＪＡＫ１リン酸化を阻害する能力を無効にすることを示す）と一致する。ＮＫ細胞をＳＨ２変異マウス（Ｃｉｓｈ^{Ｒ１０７Ｋ}）から精製し、インビトロで１０日間増殖し、絶対的な細胞数をＣｉｓｈ^＋／＋マウス、Ｃｉｓｈ^＋／−マウス、及びＣｉｓｈ^−／−マウスに由来するＮＫ細胞に比較した。Ｃｉｓｈ^{Ｒ１０７Ｋ}のＮＫ細胞数は、Ｃｉｓｈ^−／−マウスに由来したものに最も近かった（図１４Ｂ）。ＣＩＳ−Ｒ１０７Ｋタンパク質は、野生型タンパク質に同等のレベルで発現され（図１４Ｃ）、細胞数の増加がＣＩＳ−ＳＨ２機能の喪失から生じるという証拠であった。これらの予備的データは、ホスホペプチド結合の喪失がＣｉｓｈ欠失を再現するのに十分であることを指摘し、ＳＨ２機能（特にホスホペプチドを結合する能力）をブロックする化合物が薬物開発のための有効な開始点であるだろうことをさらに指摘する。

実施例１６ −ＣＩＳの誘導の動態は、ヒトＮＫ細胞におけるＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナリングの阻害と一致する
ヒト及びマウスのＣＩＳはアミノ酸レベルで９０．７％同一である。同様に、ヒト及びマウスのＪＡＫ１は９４．４％同一である一方で、活性化ループは１００％保存される。
初代ヒトＮＫ細胞及び様々なヒトＮＫ細胞株のイムノブロット分析は、１〜２時間のＩＬ−１５処理によるＣＩＳの誘導を、ＪＡＫ１及びＳＴＡＴ５のリン酸化の付随する減少と一緒に示した。これらのデータは、ＣＩＳがＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナリングを阻害することと一致する（図１５）。さらに、ＩＬ−１５及びプロテアソーム阻害物質（ＭＧ−１３２）による初代ヒトＮＫ細胞の２時間の処理は、ＪＡＫ１及びＣＩＳの全レベルを増加させるのに十分だったが、ＪＡＫ１リン酸化は低減されたままであった（図１５Ａ）。このことは、マウスＮＫ細胞を使用する我々の結果と一致して、ＪＡＫ１のユビキチン化及びＪＡＫ自己リン酸化阻害の両方経由で、ＣＩＳが、ヒトＮＫ細胞におけるＩＬ−１５シグナリングを阻害するという前提を支持する。

加えて、ＩＬ−１５処理は、ヒトＮＫ細胞株のＮＫ−９２及びＫＨＹＧ−１においてＣｉｓｈ ｍＲＮＡを誘導した（図１６）。顕著なことに、Ｃｉｓｈ誘導の大きさは、はるかに低いレベルとはいえ、Ｓｏｃｓ１及びＳｏｃｓ３（これも誘導された）について観察されたものよりはるかに大きかった（図１６）。このことは、他のＳＯＣＳファミリーメンバーによる代償なしに、ＩＬ−１５シグナリングの促進をもたらすＣＩＳの阻害についての前兆となる。

実施例１７ − ＣＩＳ上のリン酸化部位及びユビキチン化部位の同定
本発明者は、ＣＩＳそれ自体がプロテアソーム分解によって調節されたことを示し（図９Ｄ及び図１５Ａ）、ＣＩＳの翻訳後修飾がＮ末端／ＰＥＳＴ媒介性自己阻害を調節し得ることをさらに提案した。可能性のあるリン酸化部位及びユビキチン化部位を同定するために、フラッグタグ付けされたＣＩＳを２９３Ｔ細胞中で発現させ親和性精製し、その後に質量分析による分析を行った。６つのリン酸化部位が同定され、マウスとヒトのＣＩＳの間で保存された部位が５つあった（図１７及び表３）。リン酸化事象のうちの３つはＰＥＳＴモチーフ（ｐＳＤｐＳＰＤＰＡＰｐＴ）内に検出され、リン酸化が、分子内ポジショニング及び／またはこのモチーフの結合相互作用ならびにしたがってＣＩＳ機能を変更し得るという見解と一致する。３つのユビキチン化部位も同定され（図１７、表３）、以前の報告と合致していた（Ｊｅｎｓｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。これらの結果は、ユビキチン化またはリン酸化のいずれかによって修飾され得るＣＩＳ内の多くの残基を同定する。

実施例１８ − ＣＩＳは、ＴＧＦ−βが上昇し機能的な疾患における治療標的である
抗ＴＧＦ−βを使用してＥＭＴ（上皮間葉転換）を予防するいくつかの臨床試験は進行中であるが、ＴＧＦ−βは強力な免疫抑制剤でもある（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。本発明者は、ＣＩＳヌルＮＫ細胞がＴＧＦ−βによってインビトロで媒介される増殖の抑制へ概して不応性であることを見出した（図１８）。

しかしながら、ＣＩＳヌルＮＫ細胞は野生型細胞に比較した場合にＴＧＦ−βへ耐性があったが、ＣＩＳヌルＮＫ細胞がＴＧＦ−β受容体ヌルＮＫ細胞（ＴｇｆｂＲＩＩ^{ｆｌ／ｆｌ}）より増殖が少ないので、ＴＧＦ−β受容体シグナリングのある程度の阻害効果が依然としてあった。したがって、本発明者は、次にＣＩＳ及びＴＧＦ−βをインビボでブロックすることが単独療法を上回って腫瘍転帰を改善するかどうかを調査した。野生型マウス及びＣｉｓｈ^−／−マウスに、１×１０^６のＢＲＡＦ突然変異体メラノーマ細胞株（ＳＭ１ＬＷＴ１）、及び対照Ｉｇ、抗ＴＧＦ−β（１Ｄ１１）、ＢＲＡＦ阻害物質（ＰＬＸ４７２０）または１Ｄ１１＋ＰＬＸ４７２０のいずれかを注射した。単独でのＣＩＳまたはＴＧＦ−βのいずれかの阻害に比較した場合に、ＣＩＳ及びＴＧＦ−β（抗ＴＧＦ−β抗体、１Ｄ１１）の両方の阻害は、１４日目で肺におけるメラノーマ量の有意な低減をもたらした（図１９）。さらに、ＣＩＳ及びＢＲＡＦの両方の阻害は１４日目で肺における類似するメラノーマ量の有意な低減をもたらし、それはＣＩＳまたはＢＲＡＦの阻害に同等であった。ＣＩＳ、ＢＲＡＦ及びＴＧＦ−β阻害の３剤療法は、肺におけるＳＭ１ＬＷ
Ｔ１転移をほとんど予防し、ヒトにおけるＢＲＡＦ突然変異体メラノーマ転移はＴＧＦ−βまたはＢＲＡＦ遮断と組み合わせたＣＩＳ阻害から利益を得ることを示唆する。

実施例１９ − ＮＫ細胞依存性抗転移療法は、Ｃｉｓｈ欠損により、より有効である
本発明者は、次に、Ｂ１６Ｆ１０実験的転移モデルにおいて、Ｃｉｓｈ欠損を最新の免疫療法（免疫チェックポイント遮断（抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ９６）及びサイトカイン（ＩＦＮα／β、ＩＬ−２）が含まれ、それらはＮＫ細胞機能を促進する）と比較しようとした。顕著なことに、Ｃｉｓｈ欠損マウスは、抗ＰＤ−１、Ｉ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−αβ）またはＩＬ−２のレジメンにより処理された野生型マウスよりも、Ｂ１６Ｆ１０肺転移に、より耐性があった（図２０Ａ）。これらの免疫療法のすべては進行性ヒトメラノーマの治療において使用され、ある程度の成功を収めていた。Ｂ１６Ｆ１０転移のレベルはｃＩｇ処理Ｃｉｓｈ^−／−マウスにおいて低かったが、Ｉ型ＩＦＮ及びＩＬ−２治療の両方は転移をさらに低減するように思われた（図２０Ａ）。さらなる実験は、Ｂ１６Ｆ１０によるより高い用量の攻撃投与を査定し、本明細書において、抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４の組み合わせ及びＩＬ−２の両方は、Ｃｉｓｈ^−／−マウスにおけるｃＩｇよりも有効だったことが明らかになった（図２０Ｂ）。特に、低用量のＩＬ−２はＷＴマウスにおいて有効ではなかったが、Ｃｉｓｈ^−／−マウスにおいて有効であった。ＷＴマウスと比較してＣｉｓｈ^−／−マウスにおけるＩＬ−２のこの効果の改善は、ＲＭＡ−Ｓ腹腔内リンパ腫モデルにおいても観察された（図２０Ｃ）。ＷＴマウス及びＣｉｓｈ^−／−マウスにおけるＮＫ細胞媒介性制御が、無処理マウスまたはＰＢＳにより処理された対照処理マウスにおいて等しかったので、これは興味深い（図２０Ｃ）。第２の実験的転移モデル（ＲＭ−１）において遂行された追加の実験は、抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４または抗ＣＤ９６処理と組み合わせられたＣｉｓｈ欠損の優れた抗転移性活性を指摘した（図２０Ｄ）。Ｃｉｓｈ^−／−マウスにおける抗ＣＤ９６の優れた活性もＢ１６Ｆ１０実験的転移モデルにおいて観察された（図２０Ｅ）。

まとめると、これらの実験は、ＮＫ細胞の抗転移性活性のＣＩＳ調節が、免疫チェックポイント抗体の抗転移活性に依存しないことを指摘した。最終的に、マウスをＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}突然変異体転移性メラノーマ細胞株ＬＷＴ１により攻撃接種し、再び、有意により少ない肺転移がＣｉｓｈ^−／−マウスにおいて観察された。この転移は、ＢＲＡＦ阻害物質ＰＬＸ４７２０（図２０Ｆ）により、またはＭＥＫ阻害物質（トラメチニブ）単独もしくはＰＬＸ４７２０（図２１）と組み合わせて、処理することによってさらに低減された。要約すると、これらのデータは、ＣＩＳの標的化が他の免疫療法と良好に組み合わせられ、ＣＩＳがＮＫ細胞免疫療法における新規標的として有望であることを指摘する。

実施例２０ − 肉腫の治療
Ｃｉｓｈ^−／−マウスは、メチルコラントレン（ＭＣＡ）誘導性線維肉腫形成に高度に耐性があった（図２２Ａ）。ＮＫ細胞の枯渇またはＩＦＮγの中和は、再びＷＴ及びＣｉｓｈ^−／−マウスの生存を有意に低減し、Ｃｉｓｈ欠損の保護的効果を完全に消失させた（図２２Ｂ）。Ｃｉｓｈ^−／−マウスにおいて観察された実験的転移及びデノボ発癌からの保護の程度は目覚ましく、ＣＩＳの標的化がＮＫ細胞ベースの免疫療法のための新規標的として将来性があることを明確に指摘した。これらの結果は、ＮＫ細胞におけるＣＩＳの発現のＩＬ−１５誘導、及びＣｉｓｈの喪失がＮＫ細胞をＩＬ−１５へ過感受性にするという観察と一致する（Ｄｅｌｃｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

実施例２１ − 急性骨髄白血病の治療
ＮＫ細胞の抗腫瘍有効性の先駆的な例は、ドナーＮＫ細胞が宿主急性骨髄白血病（ＡＭＬ）に対して強く反応する、ハプロ同一性骨髄移植におけるものであり（Ｒｕｇｇｅｒｉ
ｅｔ ａｌ．，２０１６）、自己ＮＫ細胞が十分に活性化されるならば、ＡＭＬはかかるＮＫ細胞に対して免疫原性であり得ることを示唆する。本発明者は、自己骨髄がＡＭＬ
誘導性腫瘍誘発遺伝子ＭＬＬ−ＡＦ９をコードするレンチウイルスにより感染され、ＷＴマウスの中へ注射された場合に、これらのマウスが注射後約４０日目でＡＭＬにより死亡することを見出した（図２３）。これとは対照的に、Ｃｉｓｈ^−／−宿主にＭＬＬ−ＡＦ９発現骨髄を注射したならば、ＡＭＬ発症は有意に遅延し、ＷＴマウスの１００％に比較して、マウスは約３０％のみがＡＭＬにより死亡した（図２３）。これらのデータは、ＭＬＬ−ＡＦ９＋ ＡＭＬがＮＫ細胞によって検出され殺されること、及びこれは、ＣＩＳの非存在下において有意に促進されることを示唆する。

実施例２２ − ＣＩＳ欠損は、ＮＫ細胞のインビボでの増殖及び分化を促進する
最初の実験は、インビボの恒常的条件下でＣｉｓｈ^−／−マウスがＣｉｓｈ^＋／＋マウスに類似するＮＫ細胞数を有することを指摘した。ＮＫ細胞をより詳細に検査した場合に、Ｃｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞がより成熟すること（Ｍ２、ＤＮＡＭ１＋ＫＨＬＲＧ１＋；図２４Ａ、Ｂ）、及び野生型細胞よりもより急速に細胞周期が進むこと（Ｋｉ６７＋；図２４Ｃ）は明らかであった。合計数が一定のままであることを考慮すると（図２４Ａ）、これは、Ｃｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞が死滅する及び／または体からより急速に除去されることも指摘する。

実施例２３ − ＭＣＡ１９５６肉腫の制御の促進はＮＫ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞の両方を要求する
免疫原性ＭＣＡ誘導性線維肉腫（ＭＣＡ１９５６）を皮下注射した場合に、Ｃｉｓｈ^−／−マウスはＷＴマウスよりも良好な腫瘍制御を示した（図２５）。１／１０のＷＴマウスのみが自然に腫瘍を拒絶したが、５／１０のＣｉｓｈ^−／−マウスが移植後に３０日目までに首尾よく原発性腫瘍を除去した（図２５）。ＮＫ細胞またはＣＤ８β^＋Ｔ細胞のいずれかの枯渇は、腫瘍増殖を加速し、ＷＴ及びＣｉｓｈ欠損マウスにおいて見出された差を無効にした（図２５）。ＮＫ細胞がＭＣＡ１９５６腫瘍の増殖を直接的に制御するかどうか、またはそれらがＴ細胞活性の修飾によって間接的役割を果たすかどうかは、依然として不明である。総合すると、これらのデータは、ＮＫ細胞が重要な場合にＣｉｓｈ欠損が主として皮下腫瘍の自然増殖を変更することを示唆する。

実施例２４ − Ｃｉｓｈ^−／−ＣＤ８ Ｔ細胞は増殖及びＩＦＮγ産生の増加を示す
インビボの明らかなＣＤ８ Ｔ細胞表現型の欠如は、ＮＫ細胞とＣＤ８ Ｔ細胞の転写調節、エフェクタープログラム及びサイトカイン依存性の間の類似性を考慮すると、多少意外であった。ＣＤ８ Ｔ細胞がＩＬ−１５または抗原受容体刺激に過応答性かどうかを特異的に試験するために、６〜８週齢のＷＴ−Ｌｙ５．１マウス（ｎ＝３）及びＣｉｓｈ^−／−−Ｌｙ５．２マウス（ｎ＝３）からの末梢リンパ節（プールした、腸間膜リンパ節は除外）を、単一細胞懸濁液にプロセシングした。サンプルを、磁気ビーズの負の選択によってＣＤ８^＋Ｔ細胞についてエンリッチした。次いでもたらされた細胞を５μＭのＣＴＶにより標識した。ＷＴ細胞及びＣｉｓｈ^−／−細胞を、ＩＭＤＭ＋１０％のＦＣＳ中で、ＩＬ−２＋αＣＤ３、ＩＬ−１５＋αＣＤ３、ＩＬ−２＋αＣＤ２８＋αＣＤ３、及びＩＬ−１５＋αＣＤ２８＋αＣＤ３の条件下で、９６ウェルプレート中で共培養した。すべての条件について、αＣＤ３⁻ウェルを対照として含めた（図示せず）。ウェルは、統計解析のために技術的に三重で設定された。コンジェニックマーカーは、単一ウェル内の両方の遺伝子型の検査を可能にした。細胞を５％のＣＯ_２により３７℃で培養した。

ＩＦＮγ産生を、ＰＭＡ／イオノマイシンによる４時間の刺激、後続して細胞内染色及びＦＡＣＳ分析によって査定した。試験されたすべての条件下で、Ｃｉｓｈ^−／−ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＰＭＡ／イオノマイシン刺激に応答して、野生型（ＷＴ）細胞よりも有意に多くのＩＦＮγを産生した（図２６）。

培養は、ＣＴＶ希釈による増殖及び表面マーカー発現のＦＡＣＳ分析によって、培養の
４日目で検討された（図２７）。αＣＤ３刺激の非存在下において、７回までの分裂事象がＩＬ−１５^＋培養において観察可能であった。各々の分裂周期中の細胞の数を決定し、分裂数の関数としてプロットした（図２７Ａ）。類似の結果がＩＬ−２培養において示された（図示せず）。

検討されたすべての条件下で、ＷＴ ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＣｉｓｈ^−／− ＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方は、増殖し、刺激に応答してＩＦＮγを産生することが見出された。αＣＤ３の存在下において、すべての培養は４日目までに最大に増殖し、遺伝子型の比較を難しくした（図示せず）。しかしながら、αＣＤ３刺激の非存在下において、細胞数ｖｓ分裂数の分析は、Ｃｉｓｈ^−／−細胞が培養の４日目までにＷＴ対照よりも、より急速に増殖したことを指摘した（図２７Ｂ）。総合すると、これらの結果は、インビトロの条件下で、Ｃｉｓｈ^−／−ＣＤ８^＋Ｔ細胞がより急速に増殖すること、及びそれらのＷＴカウンターパートに比較して、促進されたエフェクター機能を提示することを指摘する。これらの予備的結果は有望であるが、増殖を誘導する条件のより詳細な分析は、Ｃｉｓｈ^−／−ＣＤ８^＋Ｔ細胞において指摘された表現型の促進へのより深い洞察を提供するだろう。

実施例２５ − 腫瘍微小環境中のＩＬ−１５のレベルの上昇は、腫瘍浸潤ＮＫ細胞においてＣｉｓｈレベルの増加を誘導する
本発明者は、ＩＬ−１５が培養されたＮＫ細胞においてＣｉｓｈ発現を急速に誘導すること、及びＣＩＳタンパク質発現はＩＬ−１５刺激に後続して１時間以内に誘導されることを確立した。インビボでのＣｉｓｈ発現を可視化するために、Ｃｉｓｈ−ｌａｃＺレポーター（Ｃｉｓｈ^{ＬａｃＺ／＋}）マウス系統を利用した。ＩＬ−１５^＋／＋マウスまたはＩＬ−１５^−／−マウス（間質のＩＬ−１５ステータスがそれぞれ＋または−である）を、致死量照射し、Ｃｉｓｈ^{ＬａｃＺ／＋}骨髄により再構成した。１０週間後に、これらのキメラマウスに、乳腺脂肪体中に注射される１×１０^５のＥ０７７１乳癌細胞による攻撃接種を行ったか、または攻撃接種を行わないままであった。１週間後に、マウスを屠殺し、乳腺腫瘍を採取及び分離し、腫瘍常在ＮＫ細胞をβ−ガラクトシダーゼ（Ｃｉｓｈ発現）について染色し、フローサイトメトリーによって分析した。間質のＩＬ−１５の存在はＮＫ細胞におけるＣｉｓｈ発現を約２倍有意に増大させることが観察された（図２８）。乳腺腫瘍（そこではＩＬ−１５が間質中に存在した）浸潤ＮＫ細胞はＣｉｓｈ発現の増加を提示し、これは、間質がＩＬ−１５を欠いていたマウスにおける乳腺腫瘍浸潤ＮＫ細胞において最も明らかであった。両方の状況において、ＮＫ細胞のＣｉｓｈレベルは、乳腺脂肪体ＮＫ細胞に比較して、腫瘍常在ＮＫ細胞において最も高く、ＥＯ７７１腫瘍内微小環境中でＩＬ−１５レベルがより高いことを示唆した。この腫瘍がＮＫ細胞によって厳密に制御されること及びＣＩＳ機能喪失に非常に応答性のモデルを考慮すると、これらのデータは、腫瘍におけるＩＬ−１５レベルの上昇及び腫瘍常在ＮＫ細胞におけるＣｉｓｈ発現の増加は、小分子ＣＩＳ阻害物質におそらく応答する腫瘍タイプについての予後徴候であることを示唆する。

実施例２６ − インビボのメラノーマ転移に対抗するヒトＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞の査定（予測）
ヒトＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞が、腫瘍増殖及び転移に対抗するマウスＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞の効果をどのくらいよくインビボで再現するかどうかを評価するために、本発明者は、リンパ性マウス（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｍｉｃｅ）（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γＣ；ＮＳＧ）における養子細胞移入実験を遂行するだろう。養子移入モデルのために、ＮＳＧマウスに、５×１０^６のインビトロで増殖させたヒトＣｉｓｈ^＋／＋もしくは同種同系のＣｉｓｈ^−／−ヒトＮＫ細胞またはＰＢＳを静脈注射する。次いで８時間後に、マウスに、１×１０６の我々の研究室において細胞株として維持されるＢＲＡＦ突然変異体患者由来メラノーマ細胞を注射する。続いて１日目に、マウスを、１．５×１０^６のインビトロで増殖させたＣｉｓｈ^＋／＋ＮＫ細胞もしくはＣｉｓｈ^−／−ＮＫ細胞またはＰＢＳにより静脈
送達で処理する。腫瘍注射後１８日目にマウスを屠殺し、肺灌流を実行する。次いで肺及び肝臓を採取し、転移をカウントする。

幅広く記載されるような本発明の趣旨または範囲から逸脱せずに、具体的な実施形態において示されるように、多数の変動及び／または変更が本発明へ行われ得ることは当業者によって認識されるだろう。したがって、本実施形態は、例示的であり限定的ではないとして、すべての点において考慮されるべきである。

本出願は２０１６年１２月１６日に出願されたＡＵ２０１５９０５２２０の優先権を主張し、その内容全体は参照として本明細書に援用される。

本明細書において引用されるすべての出版物は、それらの全体を参照することにより本明細書に援用される。ＵＲＬまたは他のかかる識別子もしくはアドレスが参照される場合に、かかる識別子が変化し得ること、及びインターネットについての特定の情報は移り変わり得るが、等価な情報はインターネットの検索によって見出せることが理解される。それへの参照は、かかる情報の利用可能性及び一般公開を証明する。

本明細書中に包含される文書、動作、材料、デバイス、論文、または同種のものの任意の考察は、もっぱら本発明のための文脈の提供の目的のためである。これらの事柄のうちの任意のものまたはすべてが、先行技術基準の一部を形成するか、または先行技術基準が本出願の各々の請求項の優先日の前に存在していたとする本発明に関連する分野における共通の一般知識であるという承認として見なされるべきではない。

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Ｂｅｒｎｈａｒｄ Ｋｕｓｔｅｒ）Ｃｈ．１１，１６１−１７７（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）．
Ｓｈｉｈａｂ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ３４：５７−６５．
Ｓｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４０（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ Ｉｓｓｕｅ）：Ｗ４５２−４５７．
Ｓｔａｇｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１ａ）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７１：２８９２−２９００．
Ｓｔａｇｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１ｂ）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８：７１４２−７１４７．
Ｓｗａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７８：７５４０−７５４９．
Ｖｏｎ Ａｈｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ ６：４８１−４９０．
Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｍｅｌａｎｏｍａ
Ｒｅｓ ２４：１１５８−１１７６．
Ｗａｌｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４：３３８４−３３８９．
Ｗｅｓｔｅｒｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｍｅｔｈｏｄｓ，７１：４４０５７．
Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３３：Ｓ４−Ｓ１５．
Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６：３５９−３６２．
Ｗｕ（２０１３）Ｊ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ，７：８５．
Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９８：９１−１０３．
Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４：７３２−７４０．Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｅｍｂｏ Ｊ １４：２８１６−２８２６．
Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ １６３：１−３
Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ
Ａ ９６：２０７１−２０７６．
Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ ５４：３２４−３３７．
Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
１４：１１５７−１１６４．

Claims (9)

1. ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞を含む、がん又は感染を治療若しくは予防するための、医薬組成物であって、
   該ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞が、ＣＩＳの発現を低減させるように遺伝的に修飾された、又はドミナントネガティブＣＩＳ配列バリアントもしくはドミナントネガティブＣＩＳ断片を発現するよう修飾されたＮＫ細胞である、医薬組成物。
2. 前記遺伝的修飾が、が、Ｃｉｓｈ遺伝子における欠失または置換である、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記ＣＩＳが阻害されたＮＫ細胞がＣｉｓｈ−／−である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
4. 投与対象ががんを患うか、またはがんを患うリスクがある、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
5. 前記がんが腫瘍を含む、請求項４に記載の医薬組成物。
6. 前記がんが、転移性メラノーマ、転移性前立腺癌、転移性乳癌、トリプルネガティブ乳癌、膀胱癌、脳腫瘍、食道癌、肝臓癌、頭頸部癌、肺扁平上皮細胞癌、非小細胞肺癌、メルケル細胞癌、肉腫、肝細胞癌、多発性骨髄腫、膵臓癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、胃癌、腎臓癌、転移性腎細胞癌、白血病、卵巣癌及び悪性神経膠腫からなる群より選択される一種のがんである、請求項４に記載の医薬組成物。
7. 投与対象が感染を患うか、または感染を患うリスクがある、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
8. 前記治療若しくは前記予防が、ＩＬ−１５及びＩＬ−１５アンタゴニスト、Ｂ−Ｒａｆタンパク質キナーゼ阻害物質、ＭＥＫタンパク質キナーゼ阻害物質、並びに免疫治療剤の一種以上の使用を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
9. 前記治療若しくは前記予防が、免疫治療剤の使用を含む、請求項８に記載の医薬組成物。

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