CN117940165A

CN117940165A - 利用剪接控制化合物的肿瘤免疫原性的提高

Info

Publication number: CN117940165A
Application number: CN202280060399.5A
Authority: CN
Inventors: 萩原正敏; 纲代将彦; 松岛慎吾
Original assignee: Kyoto University NUC
Current assignee: Kyoto University NUC
Priority date: 2021-09-06
Filing date: 2022-09-06
Publication date: 2024-04-26
Also published as: CA3231596A1; WO2023033189A1; JPWO2023033189A1; EP4400114A1; KR20240083176A; AU2022338478A1

Abstract

本公开提供一种能够提高肿瘤的免疫原性的药物组合物。本公开涉及一种药物组合物，其含有调节富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子(SRSFs)的活性的剪接控制化合物作为有效成分。

Description

利用剪接控制化合物的肿瘤免疫原性的提高

技术领域

本发明涉及利用剪接控制化合物的肿瘤免疫原性的提高及免疫检查点疗法的增强、以及用于该目的的药物组合物及方法。

背景技术

新抗原(neoantigen)在CD8⁺T细胞依赖性的免疫监视和后续的肿瘤坏死方面具有重要的作用。强化宿主的免疫系统的免疫检查点疗法对各种恶性肿瘤发挥优异的治疗效果。但是，对免疫检查点疗法无反应或具有抗性的患者也以无法忽视的比例存在，需要用于提高其效果的新的途径。对免疫检查点疗法的反应主要与由新抗原的量决定的肿瘤的免疫原性相关。实际上，最近的临床试验显示了，属于新抗原量的间接性指标的肿瘤变异负荷(TMB)与对PD-1阻断疗法的反应性相关。此外，在对免疫检查点疗法具有原发性或后天性的抗性的患者的肿瘤中，大量观察到JAK1/2、B2M等MHC I类相关基因的突变，其成为新抗原的呈递缺陷的原因。由这些结果启示，就对免疫检查点疗法的反应而言，基于适当的新抗原负荷的肿瘤的免疫原性是极其重要的。

随着近年来的新一代测序技术的发展，提倡超出以往概念的新型的新抗原。通过使用了癌基因组图谱(TCGA)数据库的综合性分析，清楚了在各种各样的癌中频繁发生前体mRNA的剪接异常，其中可能存在翻译可成为新抗原的抗原的新表位，因此尝试了验证这些“剪接-新抗原”是否实际地在癌细胞中产生并有助于免疫原性。作为证明该概念的尝试，Bigot等报告了，在具有剪接因子SF3B1的突变的葡萄膜黑色素瘤患者的外周血和肿瘤中存在识别免疫原性的剪接-新抗原的CD8⁺T细胞，这些CD8⁺T细胞克隆特异性地识别SF3B1突变肿瘤细胞并将其杀死(非专利文献1)。这些结果表明，改变肿瘤细胞中的RNA剪接方式(splicing pattern)会产生剪接-新抗原，这是管理肿瘤免疫原性的关键，支持该剪接变化成为癌免疫疗法中的一个治疗靶点。

最近，有“Pharmacologic modulation of RNA splicing enhances anti-tμMorimmunity”的论文发表(非专利文献2)。该文献表明，使用作用于剪接因子RBM39的RNA剪接调节剂(splicing modulator)Indisulam和MS-023使剪接事件多样地发生变化，肿瘤细胞中会生成剪接-新抗原。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Cancer Discov.2021Apr 2.doi:10.1158/2159-8290.CD-20-0555.

非专利文献2：Cell.2021Jul 22；184(15):4032-4047.e31.

发明内容

发明所要解决的课题

RNA剪接调节剂所影响的剪接方式依赖于分子靶点。如果是以与非专利文献2中公开的RNA剪接调节剂的分子靶点不同的剪接因子为分子靶点的RNA剪接调节剂，则能够通过独自的剪接-新靶标的repertoire来提高肿瘤的免疫原性。通过并用以不同的剪接因子为分子靶点的多个RNA剪接调节剂，可期待协同地提高肿瘤的免疫原性。

用于解决课题的手段

在一个方式中，本公开涉及一种用于提高肿瘤的免疫原性的药物组合物，其含有调节富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子(SRSFs)的活性的剪接控制化合物作为有效成分。

在一个方式中，本公开涉及一种提高肿瘤的免疫原性的方法，其包含使调节富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子(SRSFs)的活性的剪接控制化合物与肿瘤接触。

在一个方式中，本公开涉及一种提高肿瘤的免疫原性的方法，其包含使本公开的药物组合物与肿瘤接触。

在一个方式中，本公开涉及一种增强免疫检查点疗法的方法，其包含将免疫检查点抑制剂和本公开的药物组合物同时、分别或依次地并用给药。

在一个方式中，本公开涉及一种用于癌免疫疗法的试剂盒，其包含本公开的药物组合物和免疫检查点抑制剂。

在一个方式中，本公开涉及本公开的药物组合物与免疫检查点抑制剂的组合的用于癌免疫疗法的用途。

在一个方式中，本公开涉及调节富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子(SRSFs)的活性的剪接控制化合物在制造用于提高肿瘤的免疫原性的药物组合物中的用途。

在一个方式中，本公开涉及一种剪接-新抗原的制造方法，其包含使肿瘤与本公开中的剪接控制化合物接触。

在一个方式中，本公开涉及一种用于提高肿瘤的免疫原性的药物组合物，其含有通过所述肿瘤与本公开中的剪接控制化合物接触而产生的剪接-新抗原作为有效成分。

发明效果

在一个或多个实施方式中，根据本公开，能够提高肿瘤的免疫原性。

在一个或多个实施方式中，根据本公开，能够在肿瘤中诱导新的剪接-新抗原。

在一个或多个实施方式中，根据本公开，能够增强免疫检查点疗法。

附图说明

图1-1为图1。SRSF的化学活化CD8⁺T细胞依赖性地发挥抗肿瘤效果，增强对PD-1阻断的反应。A：使用了MC38肿瘤模型的实验步骤。B和C：表示肿瘤体积(B)和存活期间(C)(n＝12/组)。**为p<0.01，**为p<0.001。D和E：将MC38细胞用化合物1处理72小时(D)或显示时间(E)。分别使用CCK-8和LDH分析测定细胞增殖和细胞死亡(n＝3/组)。F和G：表示流式细胞仪的代表图像(F)和定量数据(G)(n＝89/组)。*为p<0.05。H：MC38肿瘤负载模型中的抗体注入的实验步骤。

图1-2为图1续。I～L：表示流式细胞仪的代表图像(I和K)和定量数据(J和L)(对于脾脏(J)，n＝7/组，对于肿瘤(L)，n＝10/组)。***为p<0.001。M和N：表示肿瘤生长曲线(M)和第23天的肿瘤体积(N)(n＝10/组)。*为p<0.05。“ns”表示“没有显著性”。O和P：集合(O)或单个(P)地表示小鼠(n＝12/组)的肿瘤体积。**为p<0.01，***为p<0.001vs.同型IgG+载体。#为p＜0.05，###用在显示p＜0.001的组间。Q：小鼠体重的变化(n＝5/组)。在图1中，所有的数据表示为平均值±SEM。所有实验至少进行2次。关于统计学上的显著性，对于(G)、(J)、(L)和(N)，使用没有对应的Student’s t检验，对于(B)和(O)，在单因素方差分析之后，使用Bonferroni's多重比较检验来确定。

图2-1为图2。化合物1提高肿瘤的免疫原性，且不伴随T细胞的抗原非依赖性活化和自身免疫反应。A：离体(ex vivo)脾细胞分析的实验步骤。脾细胞从8周龄的雌性C57BL/6N小鼠制备，用化合物1处理24小时。B～E：通过流式细胞仪测定CD8⁺T细胞中的CD44⁺及CD69⁺的频度，示出代表图像(B及C)及定量数据(D及E)(n＝3/组)。F及G：测定上清液中的IFN-γ(F)及TNF-α(G)的浓度(n＝3/组)。“LOD”表示“检测限”。

图2-2为图2续。H～M：向7周龄的雌性C57BL/6N小鼠经口给药化合物1(100mg/kg)或载体对照(0.5％CMC-Na)，1天2次、连续7天(J和K)或1天1次、4周(I、L和M)，每周1次腹腔注射αPD-L1抗体或同型对照(同型IgG)。将实验方案示于(H)。每周监测体重(n＝6/组)(I)。第7天处死小鼠(n＝5/组)以分析外周血(J)和脾脏(K)。

图2-3为图2续。L和M：第28天(n＝3/组)处死小鼠以进行CD8免疫组化染色(IHC)。比例尺为50μm。CD8⁺细胞的数量在各组织的3个区域中经由image J软件进行计数。所有数据均表示为平均值±SEM。关于实验，B～G至少进行2次，其他进行1次。***p＜0.001vs.载体对照通过在单因素方差分析之后使用Bonferroni’s多重比较检验来确定。

图3-1为图3。肿瘤细胞内的MHC I类对化合物1的抗肿瘤效果是不可缺少的。A：用10ng/mL IFN-γ处理24小时后的MC38细胞来源的非靶点对照(NC)和B2m敲除克隆(B2m KO#1和#2)的细胞溶解物中的显示蛋白的蛋白印迹(Western blotting)分析。GAPDH用作加载对照(loading control)。B：细胞增殖使用CCK-8分析进行测定(n＝3/组)。C～F：将各克隆用1ng/mL IFN-γ处理24小时，分析细胞表面的H2-K^b((C)为流式细胞仪图像，(D)为定量)及PD-L1的表达((E)为流式细胞仪图像，(F)为定量)(n＝3/组)。**为p<0.01，***为p<0.001vs.同型IgG对照。###为p<0.001vs.非处置(NT)。

图3-2为图3续。G～J：表示第23天的肿瘤浸润CD8⁺T细胞的实验方案(G)、肿瘤体积(H)、流式细胞仪图像(I)和定量数据(J)(n＝5～9/组)。*为p<0.05，**为p<0.01。K：小鼠的肿瘤体积(n＝5～6/组)。向小鼠每周1次腹腔注射35μg的αPD-L1抗体或同型对照(同型IgG)，对于NC，在第9天和第16天注射，对于B2M KO#2，在第11天和第18天注射。*为p<0.05。所有数据均表示为平均值±SEM。关于实验，A～F进行了至少2次，其他进行了1次。关于统计学上的显著性，对于(H)、(J)、(K)，使用没有对应的Student’s t检验，对于(D)和(F)，使用单因素方差分析和Bonferroni’s的多重比较检验来确定。

图4-1为图4。基于RNA-seq分析的化合物1诱导性剪接-新抗原候选物的鉴定。A：经由诱导性剪接-新抗原的肿瘤免疫强化的图。B：基于转录组分析及MHC I类呈递的预测的化合物1诱导性剪接-新抗原候选物的筛选方案。对于用10μM化合物1或0.1％DMSO处理6小时后的MC38细胞，分别通过3生物学复制实施RNA-seq。RNA-seq分析如“实验方法”部分中详述的那样实施。

图4-2为图4续。C：表示有关H2-D^b或H2-K^b的ΔPSI(化合物1-DMSO)、log2 TPM(化合物1-处理样品的平均值)和log10 EL_RANK的化合物1诱发169个剪接事件的热力图(heatmap)。D：22个剪接-新抗原候选物的列表。E：将所选择的剪接新抗原候选物的例子以Nf1进行表示。

图5-1为图5。新鉴定的剪接-新抗原候选物的离体验证。A：ELISPot分析的方案。B：利用化合物1的剪接-新抗原候选物的IFN-γELISpot分析(n＝3/肽)。将TRP2_180-188肽用作阳性对照。*为p＜0.05，**为p＜0.01，***为p＜0.001vs.(-)表示无肽脉冲。C：检查的免疫原性肽、以及对应的阳性和阴性对照的ELISpot斑点图像。

图5-2为图5续。D及E：用10μM的化合物1或载体对照(0.1％DMSO)处理6小时后的MC38细胞中的剪接-新抗原密码形态(剪接-NA形态)的RT-PCR分析。将Actb用作加载对照。*为p<0.05，**为p<0.01，***为p<0.001。F：用ΔPSI(化合物1-DMSO)表示根据RNA-seq数据计算出的剪接新抗原产生率(n＝3生物学复制)。所有数据表示为平均值±SEM。所有实验至少实施2次。关于统计学上的显著性，对于(B)和(E)，使用未成对的Student’s t检验来确定。

图6-1为图6。诱导性剪接新表位的6价疫苗接种促进化合物1诱发的癌免疫应答。A：杀癌分析的方案。B和C：表示由抗原诱发效应细胞产生的肿瘤杀伤活性的代表流式细胞仪图像(B)和膜联蛋白V⁺/CFSE⁺频度的定量数据(C)(n＝3/组)。使用6价(Kifc1、Nf1、Acbd4、Rfx7、Qpct1、Nup153来源)肽或无关的Trp2_180-188肽来诱导抗原反应性效应细胞。用0.1％DMSO或6价肽将用活细胞荧光染色色素CFSE标记的MC38细胞刺激2小时，与效应细胞共培养24小时，使用膜联蛋白V监测初始和后期的凋亡细胞频度。***为p<0.001。D：对于非靶点对照(NC)或B2M KO克隆(n＝3/组)，表示与(C)相同的实验条件下的膜联蛋白V⁺/CFSE⁺频度。**为p<0.01。

图6-2为图6续。E～H：将由6价肽免疫小鼠产生激发的效应细胞在0.1％DMSO或25μM化合物1存在下与CFSE标记靶细胞共培养24小时，对于MC38(E)、B16(F)、LLC(G)和MEF(H)，示出膜联蛋白V⁺/CFSE⁺(n＝3/组)的定量数据。*为p<0.05，***为p<0.001。I：MC38肿瘤负载小鼠中的疫苗接种试验的方案。J：小鼠的肿瘤体积(n＝8/组)。*为p<0.05，***为p<0.01vs.Poly(I：C)+载体。#为p＜0.05，###为在显示p＜0.001的组间的比较。所有数据用平均值±SEM表示。“ns”表示“没有显著性”。所有实验至少进行2次。关于统计学上的显著性，对于(C)～(H)，使用没有对应的Student’s t检验，对于(J)，使用单因素方差分析和Bonferroni’s多重比较检验来确定。

图7。A：由各个剪接-新抗原介导的体外肿瘤杀伤活性。表示膜联蛋白V⁺/CFSE⁺频度的定量的数据(n＝3/组)。不论有无IFN-前处理，均用0.1％DMSO、6价肽或各个肽进一步刺激CFSE标记的MC38细胞2小时，与6价肽反应性效应细胞共培养24小时。数据用平均值±SEM表示。实验至少进行2次。B：6价或各个剪接-新抗原疫苗接种带来的抑瘤效果。第23天的小鼠的肿瘤体积。小鼠在第11天和第18天用100μg肽和50μg Poly(I:C)进行皮下疫苗接种。用(-)表示的组中，注射5％DMSO代替肽。将化合物1(10μM)或载体对照(0.1％DMSO)肿瘤内给药1天1次。数据用平均值±SEM表示(n＝7/组)。实验实施1次。

图8表示RAN-Seq分析的结果，其显示通过化合物2的给药，在各种癌细胞中发生产生剪接-新抗原的剪接事件(剪接的变化)。

具体实施方式

在一个方式中，本公开是基于如下见解：通过调节富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子(SRSFs)的活性的剪接控制化合物，能够诱导与已知的抗原不同的剪接-新抗原，能够提高肿瘤的免疫原性。

在一个方式中，本公开是基于如下见解：调节SRSFs的活性的剪接控制化合物能够增强免疫检查点疗法。

在一个或多个实施方式中，本公开中的剪接控制化合物能够改变肿瘤细胞中的RNA剪接方式，使肿瘤细胞容易被免疫细胞识别，对于免疫检查点疗法没有效果的恶性肿瘤也发挥效果。

在一个或多个实施方式中，本公开中的剪接控制化合物能够相对于除肿瘤细胞以外的细胞、例如正常细胞，更选择性地诱导肿瘤细胞产生剪接-新抗原。

在一个或多个实施方式中，本公开中的剪接控制化合物能够超越癌种类地诱导多种肿瘤细胞产生剪接-新抗原。

在一个或多个实施方式中，本公开中的剪接控制化合物通过CD8⁺T细胞和肿瘤细胞的MHC I类发挥抗肿瘤作用，因此能够提高PD-1阻断效果，增强免疫检查点疗法。

本公开中，“富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子(SRSFs)”是指参与剪接的SR蛋白的总称。

本公开中，没有特别说明时，剪接是指RNA剪接。

本公开中，SR蛋白是指包含具有丝氨酸(S)和精氨酸(R)的长的重复序列的蛋白结构域(RS结构域)的蛋白。在一个或多个实施方式中，SR蛋白是200～600个氨基酸的蛋白，由RNA识别基序(RRM)区域和精氨酸/丝氨酸-重复(RS结构域)这两个结构域构成。

本公开中，在一个或多个实施方式中，SRSFs是人或非人动物的SRSFs。SRSFs包括人的SRSF1～12。

本公开中，在一个或多个实施方式中，“调节SRSFs的活性”包括调节至少一个SRSF的活性。

本公开中，在一个或多个实施方式中，“调节SRSFs的活性”包括改变RNA剪接，或者包括发生产生剪接-新抗原的RNA剪接事件。

“剪接控制化合物”

在一个方式中，本公开中的剪接控制化合物是可调节SRSFs的活性的化合物。

在一个或多个实施方式中，本公开中的剪接控制化合物可以是能够调节Cdc2样激酶(CLK)的化合物。CLK的调节包括抑制或提高CLK激酶活性。在一个或多个实施例中，CLK的调节包括通过CLK的调节来调节SRSFs的活性。

在一个或多个实施方式中，本公开中的剪接控制化合物可以是使提高肿瘤的免疫原性的肽在肿瘤中产生亢进的化合物。

本公开中，“使提高肿瘤的免疫原性的肽在肿瘤中产生亢进”是指使翻译“提高肿瘤的免疫原性的肽”的异常剪接后的mRNA(成熟mRNA)的表达量亢进。

在一个或多个实施方式中，本公开中的剪接控制化合物可以是使后述的肽(1)～(6)在小鼠癌细胞株MC38中产生亢进的化合物。

在一个或多个实施方式中，本公开中的剪接控制化合物可以不是调节剪接因子RBM39的化合物，也可以不包含该化合物。在一个或多个实施方式中，本公开中的剪接控制化合物不是Indisulam和MS-023，且不包含它们。

[化学式1]

在一个或多个实施方式中，本公开中的剪接控制化合物可以是选自下述式(I)～(II)所示的化合物及其制药上可接受的盐中的至少1种化合物。

[化学式2]

其中，式(I)和(I′)中，

R¹和R²分别独立地为氢原子、取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的苄基、取代或未取代的杂芳基甲基、取代或未取代的杂芳基乙基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的杂芳基氧基、取代或未取代的烷氧基酰胺烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基，或者R¹和R²键合而与N一起形成环，所述环是取代或未取代的单环式杂环、或取代或未取代的二环式杂环；

R⁵为氢原子、卤素原子、取代或未取代的C₁-C₆烷氧基、或二烷基氨基；

X¹为N或-CH-；

X²为-N(R³)-、S或O；

R³为氢原子、C₁-C₆烷基、苄基或杂芳基甲基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、或CH₂OC(O)R⁴-；

R⁴为C₁-C₆烷基、苄基或杂芳基甲基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基；

X为氢原子、卤素原子、氨基、R¹及R²取代的氨基、叠氮基、氰基、硝基、羟基、C₁-C₆烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的杂芳基氧基、巯基、C₁-C₆烷硫基、取代或未取代的芳硫基、取代或未取代的杂芳基硫基、苄基或杂芳基甲基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基；

式(II)中，

X³和X⁴分别独立地为S或NH，

R⁶为

[化学式3]

Z与用a及b标记的原子一起形成选自1个苯环、1个杂芳香环、1个以上的苯环稠合而成的芳香环、1个以上的杂芳香环稠合而成的杂芳香环、1个以上的苯环与1个以上的杂芳香环稠合而成的混合稠多环、和环状脂肪族中的环，所述环可以具有1个以上的取代基，所述取代基为氢、卤素原子或C₁-C₆烷基；

R⁷为氢原子、卤素原子或C₁-C₆烷基。

R⁶中，带有波浪线的结合键是与式(II)所示的化合物的键合部分。

本公开中，作为“取代或未取代”中的取代基，可以是一个或、相同或不同的多个，在一个或多个实施方式中，可举出卤素原子、氰基、三氟甲基、硝基、羟基、亚甲基二氧基、低级烷基、低级烷氧基、苄氧基、低级烷酰氧基、氨基、单低级烷基氨基、二低级烷基氨基、氨基甲酰基、低级烷基氨基羰基、二低级烷基氨基羰基、羧基、低级烷氧基羰基、低级烷基硫基、低级烷基亚磺酰基、低级烷基磺酰基、低级烷酰基氨基或低级烷基磺酰胺基。在一个或多个实施方式中，卤素原子可举出氟、氯、溴或碘原子。

式(I)或(I’)中，X¹和X²分别为N和NH时，上述式(I)和(I’)分别为互变异构体。在上述具体例中，有时也仅例示一个，但本公开中，互变异构体中一个的公开被视为也公开了另一个互变异构体。式(I)或(I′)所示的化合物在存在不对称碳原子的情况和/或存在立体异构体的情况下，在一个或多个实施方式中，是各异构体的混合物或分离的化合物。

在一个或多个实施方式中，式(I)或(I’)中，R¹为杂芳基甲基，R²为氢原子，X¹为N或-CH-，X²为-N(R³)-、S或O，R³为氢原子或甲基，R⁵为氢原子、卤素取代或未取代的C₁-C₆烷氧基、或二烷基氨基，X为卤素原子。

在一个或多个实施方式中，式(I)或(I’)中，R¹为杂芳基甲基，R²为氢原子，X¹为N或-CH-，X²为-NH-、S或O，R⁵为氢原子，X为卤素原子。

在一个或多个实施方式中，式(I)或(I’)中，R¹为含氧杂芳基甲基，R²为氢原子，X¹为N，X²为-NH-，R⁵为氢原子，X为卤素原子。

含氧杂芳基甲基可以为呋喃基甲基。

在一个或多个实施方式中，作为式(I)或(I')所示的化合物，可举出下述化合物。

[化学式4]

在一个或多个实施方式中，式(II)中，X³及X⁴分别独立地为S或NH，R⁶为-CH₂-CH₂-或-CH＝CH-，R⁷为氢原子、卤素原子或C₁-C₆烷基。

在一个或多个实施方式中，式(II)中，X³为S，X⁴为S或NH，R⁶为-CH₂-CH₂-或-CH＝CH-，R⁷为氢原子或卤素原子。

在一个或多个实施方式中，作为式(II)所示的化合物，可举出下述化合物。

[化学式5]

上述式中，R⁷为氢原子、卤素原子、或C₁-C₆烷基，优选为氢原子，X⁴为S或NH。

在一个或多个实施方式中，本公开中的剪接控制化合物可以为选自下述式(III)～(VII)所示的化合物及其制药上可接受的盐中的至少1种化合物。

[化学式6]

式(III)中，

R⁸和R⁹分别独立地为氢原子、卤素取代或未取代的C₁-C₁₀烷基、或C₂-C₆烯基；

R¹⁰为氢原子、卤素原子、卤素取代或未取代的C₁-C₁₀烷基、-OR¹¹、-NHR¹¹或-N(R¹¹)₂；

R¹¹为氢原子、或C₁-C₁₀烷基。

在一个或多个实施方式中，作为式(III)所示的化合物，可举出下述化合物。

[化学式7]

上述式中，R¹⁰为氢原子、卤素原子、卤素取代或未取代的C₁-C₁₀烷基，优选为氢原子、氟原子、氯原子、甲基或乙基，R¹¹为氢原子、或C₁-C₁₀烷基，优选为氢原子、甲基或乙基。

[化学式8]

式(IV)中，

R¹²和R¹³分别独立地为氢原子、或C₁-C₆烷基；

R¹⁴为

[化学式9]

Z与用a及b标记的原子一起形成选自1个苯环、1个杂芳香环、1个以上的苯环稠合而成的芳香环、1个以上的杂芳香环稠合而成的杂芳香环、1个以上的苯环与1个以上的杂芳香环稠合而成的混合稠多环、和环状脂肪族中的环，所述环可以具有1个以上的取代基，所述取代基为氢、卤素原子、或C₁-C₆烷基；

R¹⁵为氢原子、卤素原子、或C₁-C₆烷基。

R¹⁴中，带有波浪线的结合键是与式(IV)表示的化合物的键合部分。

在一个或多个实施方式中，作为式(IV)所示的化合物，可举出下述化合物。

[化学式10]

上述式中，R¹²及R¹³分别独立地为氢原子、或C₁-C₆烷基，优选为氢原子、甲基或乙基，更优选为甲基，R¹⁵为氢原子、卤素原子、或C₁-C₆烷基，优选为氢原子、氟原子、氯原子或甲基，R³²及R³³分别独立地为氢原子、卤素原子、C₁-C₆烷基，优选为氢原子、氟原子、氯原子或甲基，更优选一个为氢原子，另一个为氯原子或甲基，或两个均为甲基。

[化学式11]

上述式中，R³²及R³³分别独立地为氢原子、卤素原子、C₁-C₆烷基，优选为氢原子、氟原子、氯原子或甲基，更优选一个为氢原子，另一个为氯原子或甲基，或两个均为甲基。

[化学式12]

式(V)和(VI)中，

R¹⁶和R¹⁸分别独立地为氢原子、C₁-C₆的烷基、苄基或杂芳基甲基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基；

R¹⁷为-R²¹、-C≡C-R²¹、-CH＝CH-R²¹、或-O-(CH₂)n-R²¹，n为1～6，R²¹为氢原子、羟基、C₁-C₈烷基、-Si(R²²)₃、或取代或未取代的苯基、单环式杂芳香环基或环状脂肪族基；

或者，R¹⁶与R¹⁷键合而形成环，-R¹⁶-R¹⁷-为-(CH₂)m-CH₂-、-CH＝CH-、-(CH₂)m-O-、或被卤素原子取代的这些基团，m为1～6，R²²为氢原子、C₁-C₆烷基、三卤甲基或羟基，-Si(R²²)₃中的3个R²²可分别不同；

R¹⁹和R²⁰为氢原子或C₁-C₆烷基。

在一个或多个实施方式中，作为式(V)或(VI)所示的化合物，，可举出下述化合物。

[化学式13]

R¹⁷为氢原子、羟基、或C₁-C₆烷基，优选为氢原子、羟基或甲基。

在一个或多个实施方式中，作为式(V)或(VI)所示的化合物，可举出下述化合物。

[化学式14]

式(VII)中，

X⁵为

[化学式15]

R²⁵、R²⁶、R²⁷分别独立地为氢、卤素原子、羧基、氨基、羟基、C₁-C₄烷基、或被卤素原子取代的C₁-C₄烷基；

X⁶为-(结合键)或-NH-；

R²³为

[化学式16]

R²⁸、R²⁹、R³⁰和R³¹分别独立地为氢、卤素原子、羧基、氨基、羟基、C₁-C₄烷基、或被卤素原子取代的C₁-C₄烷基；

R²⁴为氢原子、卤素原子、羧基、氨基、羟基、卤素取代或未取代的C₁-C₄烷基。

X⁵及R²³中，带有波浪线的结合键是与式(VII)所示的化合物的键合部分。

在一个或多个实施方式中，作为式(VIII)所示的化合物，可举出下述化合物。

[化学式17]

上述式中，R²⁴、R²⁵、R²⁶、R²⁷、R²⁸、R²⁹、R³⁰、及R³¹分别独立地为氢原子、卤素原子、羧基、氨基、羟基、C₁-C₄烷基、或被卤素原子取代的C₁-C₄烷基，优选为氢原子、氟原子、氯原子或甲基。

在一个或多个实施方式中，作为式(VII)所示的化合物，可举出下述化合物。

[化学式18]

本公开中，“制药上可接受的盐”是指药学上、药理上、和/或医药上可接受的盐，例如无机酸盐、有机酸盐、无机碱盐、有机碱盐、酸性或碱性氨基酸盐等。

作为无机酸盐的优选例，例如可举出盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等。

作为有机酸盐的优选例，例如可举出乙酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、硬脂酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐等。

作为无机碱盐的优选例，例如可举出钠盐、钾盐等碱金属盐、钙盐、镁盐等碱土金属盐、铝盐、铵盐等。

作为有机碱盐的优选例，例如可举出二乙基胺盐、二乙醇胺盐、葡甲胺盐、N,N'-二苄基乙二胺盐等。

作为酸性氨基酸盐的优选例，例如可举出天冬氨酸盐、谷氨酸盐等。

作为碱性氨基酸盐的优选例，例如可举出精氨酸盐、赖氨酸盐、鸟氨酸盐。

本公开中，“化合物的盐”可以包含由于将化合物放置在大气中、吸收水分而形成的水合物。另外，本公开中，“化合物的盐”还可以包含化合物吸收其他某种溶剂而形成的溶剂化物。

[提高肿瘤的免疫原性的肽]

在一个或多个实施方式中，本公开中的“提高肿瘤的免疫原性的肽”是剪接-新抗原。

本公开中，在一个或多个实施方式中，剪接-新抗原是指通过翻译由异常的剪接产生的mRNA而产生的癌特异性的抗原。本公开中，在一个或多个实施方式中，剪接-新抗原是通过使本公开中的剪接控制化合物与肿瘤接触而产生的剪接-新抗原。

本公开中，在一个或多个实施方式中，剪接-新抗原是指通过肿瘤细胞的MHC I类进行抗原呈递的抗原。

因此，在一个方式中，本公开涉及一种剪接-新抗原的制造方法，其包含使肿瘤与本公开中的剪接控制化合物接触。

在一个或多个实施方式中，作为本公开中的提高肿瘤的免疫原性的肽(剪接-新抗原)，可举出下述肽(1)～(6)中的任意1个和它们的2、3、4、5或6的组合。

肽(1)：包含MALSNKAYV(序列号：1)的氨基酸序列的肽、或在该肽中缺失、替换和/或添加有相当于序列号1的氨基酸序列的1个～数个氨基酸且具有提高肿瘤的免疫原性的能力的肽。

肽(2)：包含RNRSIPFPL(序列号：2)的氨基酸序列的肽、或在该肽中缺失、替换和/或添加有相当于序列号2的氨基酸序列的1个～数个氨基酸且具有提高肿瘤的免疫原性的能力的肽。

肽(3)：包含SILGFTMV(序列号：3)的氨基酸序列的肽、或在该肽中缺失、替换和/或添加有相当于序列号3的氨基酸序列的1个～数个氨基酸且具有提高肿瘤的免疫原性的能力的肽。

肽(4)：包含SLLLLYLQL(序列号：4)的氨基酸序列的肽、或在该肽中缺失、替换和/或添加有相当于序列号4的氨基酸序列的1个～数个氨基酸且具有提高肿瘤的免疫原性的能力的肽。

肽(5)：包含KQQELFVLL(序列号：5)的氨基酸序列的肽、或在该肽中缺失、替换和/或添加有相当于序列号5的氨基酸序列的1个～数个氨基酸且具有提高肿瘤的免疫原性的能力的肽。

肽(6)：包含SQPLPNKIGF(序列号：6)的氨基酸序列的肽、或在该肽中缺失、替换和/或添加有相当于序列号6的氨基酸序列的1个～数个氨基酸且具有提高肿瘤的免疫原性的能力的肽。

肽(1)～(6)中，数个例如为2个或3个。

在一个或多个实施方式中，本公开中的提高肿瘤的免疫原性的肽可举出肽(1)和(2)中的至少一个。

本公开中，“包含氨基酸序列的肽”可以是在该氨基酸序列的N末端和/或C末端进一步附加有氨基酸的肽，也可以是由无所附加的氨基酸的“由该氨基酸序列构成的”肽。相当于序列号1～6的氨基酸序列由于是在本公开的剪接控制化合物作用下发生剪接异常的翻译部位，因此上述(1)～(6)的肽通常是在包含从其他外显子翻译的氨基酸序列的状态下被翻译，然后，作为包含相当于序列号1～6的氨基酸序列或由其构成的新抗原而发挥功能。

本公开中，在一个或多个实施方式中，提高肿瘤的免疫原性包含抑制肿瘤的生长。

本公开中，在一个或多个实施方式中，提高肿瘤的免疫原性包含增加CD8⁺T细胞对肿瘤部位的浸润。

本公开中，在一个或多个实施方式中，提高肿瘤的免疫原性包含增强免疫检查点抑制剂的抗肿瘤效果。

本公开中，在一个或多个实施方式中，提高肿瘤的免疫原性包含癌的免疫疗法。

本公开中，在一个或多个实施方式中，提高肿瘤的免疫原性包含癌的改善、进展抑制和/或治疗。

本公开中，在一个或多个实施方式中，提高肿瘤的免疫原性包含增强免疫检查点疗法。

本公开中，在一个或多个实施方式中，“免疫检查点疗法”是指使用了免疫检查点抑制剂的癌的免疫疗法。

本公开中，在一个或多个实施方式中，“肿瘤”可以是恶性肿瘤。本公开中，恶性肿瘤与癌为相同的含义。

本公开中，“癌”包括白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。另外，癌还包括原发性或复发性的癌。作为癌的非限定例，可举出肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、消化系统癌、胃肠癌、结直肠癌、胃肠间质性肿瘤、胃肠类癌肿瘤、大肠癌、直肠癌、肛门癌、胆管癌、小肠癌、胃癌、食道癌、胆囊癌、肝癌；胰腺癌、阑尾癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、肾细胞癌、前列腺癌、中枢神经系统的癌、皮肤癌、黑色素瘤、淋巴瘤、神经胶质母细胞瘤、间皮瘤、绒毛癌、胆管细胞癌、胞状软组织肉瘤、头颈部癌、甲状腺癌、骨源性肉瘤、血液癌。在一个或多个实施方式中，这些癌或肿瘤是人、非人的灵长类、啮齿类、小鼠、狗、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊等哺乳类的癌或肿瘤。

本公开中，在一个或多个实施方式中，提高肿瘤的免疫原性的对象、癌的免疫疗法的对象、以及癌的改善、进展抑制和/或治疗的对象可举出需要这些处置的个体，在一个或多个实施方式中，所述个体包括人、非人的灵长类、啮齿类、小鼠、狗、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊等哺乳类。

本公开中，在一个或多个实施方式中，免疫检查点抑制剂可举出针对选自(1)CTLA-4、(2)PD-1、(3)LAG-3、(4)BTLA、(5)KIR、(6)TIM-3、(7)PD-L1、(8)PD-L2、(9)B7-H3、(10)B7-H4、(11)HVEM、(12)GAL9、(13)CD160、(14)VISTA、(15)BTNL2、(16)TIGIT、(17)PVR、(18)BTN1A1、(19)BTN2A2、(20)BTN3A2、及(21)CSF-1R、以及它们的组合中的分子的药剂。在一个或多个实施方式中，作为所述药剂，可举出抗体、部分抗体、低分子抗体和低分子化合物。在一个或多个实施方式中，免疫检查点抑制剂可以是抗PD-1单克隆抗体、抗PD-L1单克隆抗体或抗PD-L2单克隆抗体。

[药物组合物]

在一个方式中，本公开涉及含有本公开的剪接控制化合物作为有效成分的药物组合物(以下也称为“本公开的药物组合物”)。本公开的剪接控制化合物如上所述。

在一个或多个实施方式中，本公开的药物组合物是含有调节SRSFs的活性的剪接控制化合物作为有效成分的药物组合物。

在一个或多个实施方式中，本公开的药物组合物是含有能够调节Cdc2样激酶(CLK)的化合物作为有效成分的药物组合物。

在一个或多个实施方式中，本公开的药物组合物是含有使提高肿瘤的免疫原性的肽在肿瘤中产生亢进的化合物作为有效成分的药物组合物。提高肿瘤的免疫原性的肽如上所述。

在一个或多个实施方式中，本公开的药物组合物是含有使选自上述肽(1)～(6)和它们中的2～6个的组合中的肽在肿瘤中产生亢进的化合物作为有效成分的药物组合物。在进一步的一个或多个实施方式中，本公开的药物组合物含有使肽(1)和(2)中的至少一个肽在肿瘤中产生亢进的化合物作为有效成分的药物组合物。

在一个或多个实施方式中，作为本公开的药物组合物的有效成分的剪接控制化合物也可以不包含调节剪接因子RBM39的化合物作为有效成分。

另外，在一个或多个实施方式中，作为本公开的药物组合物的有效成分的剪接控制化合物可以不包含Indisulam和MS-023作为有效成分。

在一个或多个实施方式中，本公开的药物组合物可以包含式(I)、(I’)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)所示的化合物或它们的组合作为有效成分，还可以进一步包含药学上可接受的载体、防腐剂、稀释剂、赋形剂或其他药学上可接受的成分。

在一个或多个实施方式中，本公开的药物组合物是用于提高肿瘤的免疫原性的药物组合物。

在一个或多个实施方式中，本公开的药物组合物是用于癌的免疫疗法的药物组合物。

在一个或多个实施方式中，本公开的药物组合物是用于癌的改善、进展抑制和/或治疗的药物组合物。

在一个或多个实施方式中，本公开的药物组合物是用于增强免疫检查点疗法的药物组合物。

在一个或多个实施方式中，本公开的药物组合物是用于与免疫检查点抑制剂并用的药物组合物。在一个或多个实施方式中，并用包括与免疫检查点抑制剂同时、分别、或依次地并用给药。

本公开中，在一个或多个实施方式中，“药物组合物”可以应用公知的制剂技术，制成适合于给药方式的剂型。作为其给药方式，并不限定于这些，例如可举出通过片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、锭剂(troche)、糖浆剂或液剂等剂型的经口给药。或者，可举出通过注射剂、液剂、气溶胶剂、栓剂、贴布剂、糊剂、洗剂、擦剂、软膏剂、或滴眼剂等剂型的非经口给药。本公开的药物组合物可以使用，并不限定于这些，赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、稳定剂、矫味矫臭剂、或稀释剂等添加剂，通过公知的方法来制造。

在一个或多个实施方式中，本公开的药物组合物可以不含有具有治疗效果的其他有效成分，或者进一步含有一个或多个有效成分。

作为赋形剂，并不限定于这些，可举出淀粉、土豆淀粉、玉米淀粉等淀粉、乳糖、结晶纤维素、磷酸氢钙等。

作为润滑剂，并不限定于这些，可举出乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、虫胶、滑石、巴西棕榈蜡、石蜡等。

作为粘合剂，并不限定于这些，可举出聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇(macrogol)及与赋形剂同样的化合物。

作为崩解剂，并不限定于这些，可举出与赋形剂同样的化合物及交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮之类的经化学修饰的淀粉-纤维素类。

作为稳定剂，并不限定于这些，可举出对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯之类的对羟基苯甲酸酯类；氯丁醇、苄醇、苯乙醇之类的醇类；苯扎氯铵；苯酚、甲酚之类的苯酚类；硫柳汞；脱氢乙酸；以及山梨酸。

作为矫味矫臭剂，并不限定于这些，可举出通常使用的甜味剂、酸味剂、香料等。

液剂的制造中，作为溶剂，并不限定于这些，可以使用乙醇、苯酚、氯甲酚、纯化水、蒸馏水等，根据需要也可以使用表面活性剂或乳化剂等。作为表面活性剂或乳化剂，并不限定于这些，可举出聚山梨醇酯80、硬脂酸多元醇酯40、月桂醇聚乙二醇等。

本公开的药物组合物的使用方法可以根据症状、年龄、给药方法等的不同而不同。关于使用方法，并不限定于这些，可以将作为有效成分的本公开的剪接控制化合物以有效量、间歇性或持续性地经口、经皮、粘膜下、皮下、肌肉内、血管内、脑内或腹腔内给药，或者，可以按照作为有效成分的本公开的剪接控制化合物的体内浓度达到100nM～1mM之间的任一个的方式，间歇性或持续性地经口、经皮、粘膜下、皮下、肌肉内、血管内、脑内或腹腔内给药。作为不是用于限定的实施方式，可举出在经口给药的情况下，向对象(如果是人，为成人)，每1天分为1次或多次，根据症状给药，换算为本公开的剪接控制化合物，作为下限，为0.01mg(优选为0.1mg)，作为上限，为2000mg(优选为500mg，更优选为100mg)。作为不是用于限定的实施方式，可举出在静脉内给药的情况下，向对象(如果是人，为成人)每1天分为1次或数次，根据症状进行给药，作为下限，为0.001mg(优选为0.01mg)，作为上限，为500mg(优选50mg)。

本公开中，在一个或多个实施方式中，有效量可以是能够提高肿瘤的免疫原性的量，可以是能够抑制肿瘤的生长的量，可以是能够增加CD8⁺T细胞向肿瘤部位的浸润的量，可以是能够改善癌、抑制进展和/或治疗的量，也可以是能够增强免疫检查点疗法的量。

[方法]

在一个方式中，本公开涉及一种提高肿瘤的免疫原性的方法，其包含将本公开的药物组合物给药至对象。

对象可以如上所述，给药方法和给药量可以如上所述。

在一个或多个实施方式中，将本公开的药物组合物给药至对象包含使本公开的药物组合物与肿瘤接触。

在一个或多个实施方式中，本公开的方法是提高肿瘤的免疫原性的方法，其包含使本公开的剪接控制化合物与肿瘤接触。另外，在一个或多个实施方式中，本公开的方法是提高肿瘤的免疫原性的方法，其包含使调节SRSFs的活性的剪接控制化合物与肿瘤接触。

在一个或多个实施方式中，本公开的方法是癌的免疫疗法，其包含将本公开的药物组合物给药至对象，或包含使本公开与肿瘤接触。

在一个或多个实施方式中，本公开的方法是癌的改善、进展抑制和/或治疗，其包含将本公开的药物组合物给药至对象、或包含使本公开与肿瘤接触。

在一个或多个实施方案中，本公开的方法是增强免疫检查点疗法的方法，其包含将本公开的药物组合物给药至对象，或包含使本公开与肿瘤接触。

在一个或多个实施方式中，本公开的方法包含将本公开的药物组合物与免疫检查点抑制剂并用。在一个或多个实施方式中，并用包含将本发明的药物组合物与免疫检查点抑制剂同时、分别、或依次地并用给药。

免疫检查点抑制剂的给药方法没有特别限制，可以与单独使用该药剂时相同。

[用途]

在一个或多个实施方式中，本公开涉及本公开的药物组合物的用于提高肿瘤的免疫原性的用途。

在一个或多个实施方式中，本公开的用途是本公开的药物组合物的用于癌的免疫疗法的用途。

在一个或多个实施方式中，本公开的用途是本公开的药物组合物的用于癌的改善、进展抑制和/或治疗的用途。

在一个或多个实施方式中，本公开的用途是本公开的药物组合物的用于增强免疫检查点疗法的用途。

在一个或多个实施方式中，本公开的用途是本公开的药物组合物的用于与免疫检查点抑制剂的并用的用途。

在另一个或多个实施方式中，本公开涉及本公开的药物组合物与免疫检查点抑制剂的组合的用于癌的免疫疗法的用途。

本公开的药物组合物的具体的使用方法可以如上所述。

在另一实施方式中，本公开涉及调节SRSFs的活性的剪接控制化合物在制造本公开的药物组合物中的用途。

[第二药物组合物]

在另一方式中，本公开涉及一种药物组合物(以下也称为“本公开的第二药物组合物”)，其含有选自通过使本公开中的剪接控制化合物与肿瘤接触而产生的剪接-新抗原、上述肽(1)～(6)以及它们中的2～6个的组合、以及它们的制药上可接受的盐中的至少1种作为有效成分。

本公开的第二药物组合物中的通过使本公开中的剪接控制化合物与肿瘤接触而产生的剪接-新抗原和/或肽(1)～(6)可以作为提高肿瘤的免疫原性的疫苗发挥功能。

因此，在一个或多个实施方式中，本公开的第二药物组合物是用于提高肿瘤的免疫原性的药物组合物，其含有通过所述肿瘤与本公开中的剪接控制化合物接触而产生的剪接-新抗原作为有效成分。

本公开的第二药物组合物可以与本公开的药物组合物并用。

本公开的第二药物组合物可以与免疫检查点抑制剂并用。

本公开的第二药物组合物可以与本公开的药物组合物和免疫检查点抑制剂并用。

本公开的第二药物组合物的使用用途和使用方法可以与本公开的药物组合物相同。

[试剂盒]

在一个或多个实施方式中，本公开涉及一种用于癌免疫疗法的试剂盒，其包含本公开的药物组合物和免疫检查点抑制剂。

本公开的试剂盒可以进一步包含本公开的第二药物组合物。

本公开涉及以下的一个或多个实施方式：

[1]一种用于提高肿瘤的免疫原性的药物组合物，其含有调节富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子(SRSFs)的活性的剪接控制化合物作为有效成分。

[2]根据[1]所述的药物组合物，其中，所述化合物为能够调节Cdc2样激酶(CLK)的化合物。

[3]根据[1]或[2]所述的药物组合物，其中，所述化合物为使提高肿瘤的免疫原性的肽在肿瘤中产生亢进的化合物。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的药物组合物，其中，所述肽选自下述肽(1)～(6)及它们中的2～6个的组合。

肽(2)：包含RNRSHIFPL(序列号：2)的氨基酸序列的肽、或在该肽中缺失、替换和/或添加有相当于序列号2的氨基酸序列的1个～数个氨基酸且具有提高肿瘤的免疫原性的能力的肽。

[5]根据[4]所述的药物组合物，其中，所述肽为肽(1)和(2)中的至少一个。

[6]一种药物组合物，其含有使选自[4]中限定的肽(1)～(6)及它们中的2～6个的组合中的肽在肿瘤中产生亢进的剪接控制化合物作为有效成分。

[7]一种药物组合物，其含有使[4]中限定的肽(1)和(2)中的至少一个在肿瘤中产生亢进的剪接控制化合物作为有效成分。

[8]根据[1]～[7]中任一项所述的药物组合物，其中，所述剪接控制化合物不是调节剪接因子RBM39的剪接控制化合物。

[9]根据[1]～[8]中任一项所述的药物组合物，其中，所述剪接控制化合物为选自上述式(I)、(I')、(II)所示的化合物及其制药上可接受的盐中的至少1种化合物。

[10]根据[1]～[8]中任一项所述的药物组合物，其中，所述剪接控制化合物为选自上述式(III)～(VII)所示的化合物及其制药上可接受的盐中的至少1种化合物。

[11]一种药物组合物，其含有选自[4]中限定的肽(1)～(6)及它们中的2～6个的组合、以及它们的制药上可接受的盐中的至少1种作为有效成分。

[12]根据[1]～[10]中任一项所述的药物组合物，其为用于提高肿瘤的免疫原性的药物组合物。

[13]根据[1]～[12]中任一项所述的药物组合物，其与免疫检查点抑制剂同时、分别、或依次地并用给药。

[14]根据[13]所述的药物组合物，其中，免疫检查点抑制剂为针对选自(1)CTLA-4、(2)PD-1、(3)LAG-3、(4)BTLA、(5)KIR、(6)TIM-3、(7)PD-L1、(8)PD-L2、(9)B7-H3、(10)B7-H4、(11)HVEM、(12)GAL9、(13)CD160、(14)VISTA、(15)BTNL2、(16)TIGIT、(17)PVR、(18)BTN1A1、(19)BTN2A2、(20)BTN3A2、及(21)CSF-1R中的分子的1种以上的药剂。

[15]一种提高肿瘤的免疫原性的方法，其包含使调节富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子(SRSFs)活性的剪接控制化合物与肿瘤接触。

[16]一种提高肿瘤的免疫原性的方法，其包含使[1]～[14]中任一项所述的药物组合物与肿瘤接触。

[17]一种增强免疫检查点疗法的方法，其包含将免疫检查点抑制剂与[1]～[14]中任一项所述的药物组合物同时、分别、或依次地并用给药。

[18]一种用于癌免疫疗法的试剂盒，其包含[1]～[14]中任一项所述的药物组合物和免疫检查点抑制剂。

[19][1]～[14]中任一项所述的药物组合物与免疫检查点抑制剂的组合的用于癌免疫疗法的用途。

[20]调节富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子(SRSFs)的活性的剪接控制化合物在用于制造提高肿瘤的免疫原性的药物组合物中的用途。

[21]一种剪接-新抗原的制造方法，其包含使肿瘤与调节富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子(SRSFs)的活性的剪接控制化合物接触。

[22]一种用于提高肿瘤的免疫原性的药物组合物，其含有通过所述肿瘤与调节富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子(SRSFs)的活性的剪接控制化合物接触而产生的剪接-新抗原作为有效成分。

实施例

以下，通过实施例对本公开进行更详细的说明，但这些是例示性的，本公开并不限于这些实施例。另外，本公开中引用的文献全部被纳入作为本公开的一部分。

下述化合物1是以富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子(SRSFs)为靶的剪接调节剂(也称为低分子剪接修饰剂)之一。化合物1显示出伴有前体mRNA剪接异常的基因性疾病的治疗药的潜在能力(Nat Commun.2011；2：308.，Proc Natl Acad Sci USA.2015Mar 3；112(9)：2764-9.，Sci Rep.2017May 30；7：46126.，J Clin Invest.2019Feb 1；129(2)：583-597.，Cell Chem Biol.2020Dec 17；27(12)：1472-1482.e6.)。特别是近年来，报告了作为强力的RNA剪接调节剂的化合物1通过调节SRSFs的活性，实现了在体外和体内改善具有作为家族性自主神经失调的原因的IVS20+6T＞C突变的IKBKAP基因的剪接异常(NatCommun.2021Jul 23；12(1)：4507.)。

[化学式19]

在下述的本实施例中，进行了以下的实验。

首先，为了确认作为以SRSF为靶的剪接调节剂的化合物1是否通过提高抗肿瘤免疫而抑制肿瘤的生长，实施了使用免疫缺陷小鼠的荷瘤动物实验。通过化合物1给药，确认了CD8⁺T细胞和肿瘤MHC I依赖性地抑制肿瘤生长，PD-1阻断效果也得到增强。

接着，尝试了使用化合物1进行可诱导的新抗原的探索。为了解决该课题，提取由化合物1诱导或增强的无注释的剪接变体，为了制作由这些新变体翻译的异常肽而实施了RNA-seq。使用IFN-γELISpot分析从所提取的新抗原候选物中筛选出免疫原性肽并进行鉴定。

之后，通过体内的疫苗接种试验可知，当免疫可化学诱导的剪接新抗原时，在共培养条件下用于肿瘤溶解的内源性T细胞反应受到激发，当用化合物1致敏癌细胞时，肿瘤增殖受到抑制。

以下详述。

[化合物1CD8⁺T细胞依赖性地发挥抗肿瘤效果，增强对免疫检查点疗法的反应]

恶性肿瘤的治疗一直以来使用直接杀死肿瘤细胞的以往的细胞毒性化疗，但由于严重的副作用其使用多受到限制。通过使用作为低分子RNA剪接调节剂的化合物1来操作RNA剪接事件，可提高肿瘤的免疫原性，增强对不伴有直接的细胞杀伤作用的免疫检查点疗法的反应。

首先，使用皮内移植到免疫缺陷小鼠的同种MC38肿瘤进行体内的活性评价(图1-1A)。化合物1在不与体外的细胞毒性和细胞增殖相关的浓度(图1-1D和E)下即导致体内的肿瘤增殖抑制和存活期间的延长(图1-1B和C)。

通过分析所提取的肿瘤，发现了肿瘤浸润CD8⁺T细胞的频度在化合物1处理后增加至约1.5倍(图1-1F和G)。

根据这些观察，接着研究化合物1的抗肿瘤效果是否是由癌免疫的增强引起的。使用CD8耗尽抗体(αCD8)进行内源性CD8⁺T细胞的耗尽，评价化合物1给药的抗肿瘤效果(图1-1H)。发现脾脏(图1-2I和J)以及肿瘤(图1-2K和L)中，实现了80％以上的CD8⁺T细胞的耗尽，CD8⁺T细胞耗尽时，化合物1的给药对肿瘤抑制无效(图1-2M和N)。表明MC38肿瘤负载模型中的化合物1的抗肿瘤活性是由介由CD8⁺T细胞的免疫反应的增强引起的。

癌的免疫原性与对PD-1阻断的临床反应相关，由此确认了化合物1的治疗是否提高抗PD-L1抗体(αPD-L1)的抗肿瘤效果。

在第23天，化合物1单体时确认到28.5％的肿瘤增殖的抑制(同型IgG+载体vs.同型IgG+化合物1，p＝1.1×10^-3)，另一方面，αPD-L1时，确认到41.0％的肿瘤增殖的抑制(同型IgG+载体vs.αPD-L1+载体，p≤1.0×10^-4)(图1-2O和P)。因此，化合物1与αPD-L1相加地发挥功能时，可期待约57.8％的肿瘤抑制。

但是，在将化合物1与αPD-L1共给药的情况下，观察到67.8％的肿瘤抑制(同型IgG+载体vs.αPD-L1+化合物1，p≤1.0×10^-4)，该结果启示它们有相加或些许协同地发挥功能(图1-2O和P)。

另外，通过流式细胞仪可知，在用化合物1和αPD-L1共处理的组中，与用αPD-L1单独处理的组相比，肿瘤浸润CD8⁺T细胞的数量增加。此外，在这些实验中，确认到所采集的肿瘤量与所测定的肿瘤体积良好相关。然而，在用同型IgG、αPD-L1或αCD8处置的小鼠中，无论有无化合物1，均未发现体重的变化或明显的副作用(图1-2Q)。

这些结果表明，化合物1对SRSF的化学活化是CD8⁺T细胞依赖性地发挥抗肿瘤效果，没有针对癌细胞的直接性的细胞毒性或细胞增殖性效果地提高PD-1阻断的效力。

[化合物1不诱发直接性的T细胞的活化或自身免疫反应]

认为T细胞活化中的剪接亚型的产生的变化可能对其后的功能产生影响。基于化合物1CD8⁺T细胞依赖性地发挥抗肿瘤效果的情况，接着使用离体脾细胞培养分析研究化合物1是否是抗原非依赖性地诱导T细胞的活化。

首先，从正常小鼠分离脾细胞，将细胞用化合物1处理24小时(图2-1A)。接着，使用流式细胞仪测定CD8⁺或CD4⁺T细胞中的CD44⁺效应T细胞标记物及CD69⁺急性T细胞活化标记物的频度(图2-1B及C)。如预想那样，使用伴刀豆球蛋白(concanavalin A，ConA)的处理促进了CD8⁺和CD4⁺T细胞中的CD44⁺和CD69⁺标记物这两者的表达，但在使用化合物1的处理中没有这样的效果(图2-1C-E)。另外，在化合物1给药组中，没有观察到包括干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在内的炎症性细胞因子的分泌(图2-1F和G)。

根据这些结果，伴随化合物1给药的T细胞的抗原非依赖性活化的参与被否定了。

接着，为了判断化合物1与αPD-L1的共给药所引起的癌免疫的增强是否有导致自身免疫反应的顾虑，向正常小鼠全身给药4周高剂量的化合物1(图2-2H)。

关于体重变化，在实验期间中在全组中确认为相同程度(图2-2I)。关于初次给药后第7天的急性反应，确认了无论有无αPD-L1，化合物1给药都不影响脾脏重量、白细胞数、脾脏和外周血中的T细胞活化标记物(CD44^high/CD8⁺、CD69⁺/CD8⁺、CD44^high/CD4⁺、CD69⁺/CD4⁺)的表达(图2-2J和K)。

此外，通过第28天得到的非恶性组织的组织学分析，即使将正常小鼠慢性地暴露于化合物1，也与αPD-L1的共处理无关地，没有观察到CD8⁺T细胞的蓄积、炎症性病变的出现(图2-3L和M)。此外，末梢血中的白细胞数和生化参数也没有观察到变化(未示出数据)。

这些结果表明，化合物1可没有有害的炎症反应或自身免疫反应地提高癌的免疫原性。

[癌细胞的MHC I类对于化合物1的抗肿瘤效果是不可缺少的]

癌细胞中表达的MHC I类对于CD8⁺T细胞依赖性的免疫监视和肿瘤杀伤所不可缺少的新抗原呈递而言是重要的。为了研究化合物1是否调节新抗原呈递路径，首先，根据CD8⁺T细胞分泌IFN-γ是MHC I类成分的主要诱导因子，研究了化合物1对MC38细胞中的IFN-γ信号以及β2微球蛋白(B2M)和H2-K^b等MHC I类成分的表达的影响。IFN-γ的给药强力地诱导了STAT1和STAT3的磷酸化，使B2M蛋白的表达增加，但化合物1给药没有这样的影响。另外，确认了H2-K^b表达的微小增加(给药72h 0和0.1ng/mL的IFN-γ时为11.1％和12.4％)和细胞表面的PD-L1表达的减少(给药72h 0、0.1和1ng/mL的IFN-γ时为3.8％、3.2％和26.1％)。另一方面，在宿主的树突细胞、巨噬细胞中，PD-L1的表达没有发现变化。根据RNA-seq数据，H2-K^b以及PD-L1的mRNA表达和剪接方式在使用化合物1的处理后的MC38细胞中没有显著性变化，因此判断这些变化起因于翻译后调节。但是，根据通过与αPD-L1的共给药可见化合物1的抗肿瘤效果的增强的情况，认为这些变化不是化合物1发挥抗肿瘤效果(图1-2O和P)的功能性机制。

此外，使用MC38细胞建立MHC I类的必须成分B2m的利用CRISPR-Cas9的敲除，研究癌细胞中的新抗原呈递是否对化合物1的抗肿瘤效果是重要的。得到的B2m敲除MC38克隆(B2m KO#1和#2)在不影响细胞增殖的情况下显示出内源性B2m的完全丧失(图3-1A)。此外，在这些细胞中，确认了在不对IFN-γ信号传递(图3-1A)和细胞表面的PD-L1的表达(图3-1E和F)产生影响的情况下，表面的H2-K^b消失(图3-1C和D)。

接着，向免疫缺陷小鼠皮内接种这些B2m KO MC38克隆，评价化合物1的抗肿瘤效果(图3-2G)。当给药化合物1时，在阴性对照克隆中，肿瘤的生长自始至终受到抑制，但在B2m KO克隆中，该效果完全消失(图3-2H)。

此外，CD8⁺T细胞的数量在B2m KO肿瘤中低，与T细胞增殖的促进中的MHC I类的本质作用一致，在B2m KO来源的肿瘤中不再因使用化合物1的处理而被诱导(图3-2I和J)。另外，阴性对照克隆中确认到αPD-L1的抗肿瘤效果，但B2m KO克隆中没有确认到(图3-2K)。

这些结果明确表明，在癌细胞中，MHC I类在决定化合物1的抗肿瘤效果方面起重要作用。

[化合物1调节RNA剪接，形成潜在性的剪接-新抗原]

肿瘤细胞中的异常的选择性剪接事件可能是潜在性的新抗原的来源。由于确认了肿瘤细胞的MHC I类对于化合物1的抗肿瘤效果是不可缺少的，因此预期化合物1改变异常的选择性剪接事件，促进剪接-新抗原的产生(图4-1A)。为了验证该概念，进行了RNA-seq分析，以评价MC38细胞中化合物1影响的RNA剪接方式和产生能够与MHC I类结合的潜在性新抗原的剪接产物(图4-1B)。首先，提取在化合物1作用下发生显著性变化的剪接事件。接着，为了鉴定翻译潜在性的剪接-新抗原的新表位，提取可产生异常的编码序列的由化合物1诱发的剪接事件，接着，将这些事件是否产生异常的肽与参照肽数据库进行比较来确认。

在化合物1作用下受到显著性影响的全部的剪接事件中，把焦点放在成为形成具有UniProt和Ensembl这两者中没有登记的无注释(non-annotated)表位的异常的编码序列的原因的事件，鉴定了剪接新抗原候选物。通过该途径，对于130个基因，将169个化合物1诱导无注释剪接事件鉴定为新抗原候选物，进而基于利用Net MHC pan4.1的各肽与MHC I类等位基因(H2-K^b和H2-D^b)的结合亲和性的预测评分、以及剪接率的程度和mRNA表达进行优先排序(图4-2C)。

最后，筛选出由化合物1诱导的22个剪接新抗原候选物(8～11个氨基酸)，以供后续评价(图4-2D和表1)。

举一个例子，在神经纤维瘤蛋白(neurofibromin 1，Nf1)中，通过利用化合物1的处理诱导108bp的外显子化，其结果，生成编码预测为迄今为止无注释且与H2-K^b的亲和性为238.15nM的“RNRSHIFPL”候选新表位的剪接(图4-2E)。RNA-seq解析还表明，利用化合物1的处理不影响编码MC38细胞中产生的以往的新抗原的基因的mRNA表达(未示出数据)。

[表1]

[由化合物1产生的免疫原性剪接-新抗原的肿瘤杀伤活性的验证]

由于得到了剪接-新抗原候选物，接着，通过实验验证由化合物1产生的剪接-新抗原是否与MHC I类结合、并促进CD8⁺T细胞的活化。

合成22个剪接-新抗原候选物和作为阳性对照的黑色素瘤抗原肽酪氨酸酶相关蛋白(tyrosinase related protein 2，TRP2)_180-188。向免疫缺陷小鼠在作为佐剂的Poly(I：C)存在下接种2次所合成的肽。接着，从疫苗接种的小鼠制备脾细胞，与经肽脉冲的骨髓来源的树突细胞(BMDC)共培养24小时，使用IFN-γELISpot分析评价CD8⁺T细胞的活化(图5-1A)。

所研究的22个肽中，通过INF-γELISpot分析鉴定具有免疫原性的6个肽，它们来源于Kifc1、Nf1、Acbd4、Rfx7、Qpctl、和Nup153的剪接变化(图5-1B和C)。

除这些RNA-seq解析以外，通过使用了MC38细胞的neojunction引物的RT-PCR解析，验证了化合物1处理对编码这些剪接创新抗原的转录物的诱导(图5-2D和E)。通过IFN-γELISpot分析，确认了所鉴定的剪接新抗原的免疫原性。

接着，使用小鼠肺癌LLC、胰管腺癌Pan02、白血病WEHI3、大肠癌CT26、淋巴瘤EG7、皮肤黑色素瘤B16细胞，研究了由化合物1诱导的剪接新抗原是否在癌种间是共通的。令人感兴趣的是，清楚了由化合物1诱导的这些剪接变化在所研究的细胞的大部分中是共有的(图5-2F)，启示化合物1能够适用于广谱的癌。

进一步研究与化合物1给药小鼠的结肠、肺、肝脏组织对应的RNA-seq数据，分析剪接变化的程度。发现正常组织中的化合物1诱导剪接事件与MC38细胞中的剪接事件相比少50～60％。考虑在这些组织中免疫应答未被化合物1诱导，认为正常组织中这些发生了变化的剪接事件与免疫原性无关的可能性高(图2-2I～图2-3M)。实际上清楚了，对于已验证的剪接-新抗原形态，其表达在正常组织中均未被显著诱导(未示出数据)。

6种免疫原性肽所来源的基因和该肽的氨基酸序列如下所述。

Kifc1基因：MALSNKAYV(序列号：1)

Nf1基因：RNRSHIFPL(序列号：2)

Acbd4基因：SILGFTMV(序列号：3)

Rfx7基因：SLLLLYLQL(序列号：4)

Qpct1基因：KQQELFVLL(序列号：5)

Nup153基因：SQPLPNKIGF(序列号：6)

[通过诱导性剪接新表位的6价疫苗接种促进化合物1诱导的癌免疫应答]

由于确认了化合物1诱导性剪接-新抗原发挥免疫原性，因此接着研究了对抗癌免疫应答的贡献。为了该目的，使用共培养分析，以可靠地进行肿瘤的杀伤(图6-1A)。

脾细胞由接种了6价的剪接新抗原或无关的Tpr2_180-188抗原的小鼠制备，进而在IL-2的存在下用经相同的抗原脉冲的BMDC进行刺激。肿瘤杀伤活性基于由抗原诱导的效应细胞和用活细胞荧光染色色素CFSE预标记的靶细胞共培养24小时后的膜联蛋白V⁺/CFSE⁺的频度来定量化。Tpr2免疫小鼠的效应细胞与肽负荷无关地均未显示任何反应，但被6价的剪接新抗原刺激的效应细胞选择性地杀伤呈递6个剪接新抗原的MC38细胞(图6-1B和C)。其结果，B2m KO MC38细胞中未观察到该肿瘤杀伤活性(图6-1D)。这结果表明，该效果依赖于MHCI类。

进而，根据基于共培养分析的肿瘤杀伤研究各个表位的贡献，结果确认了大多数表位(Kifc1、Nf1、Acbd4、Rfx7、Nup153)分别显著性地引起肿瘤杀伤应答(图7A)。此外，根据与通过化合物1处理诱导内源性剪接-新抗原的产生的癌细胞的关联研究肿瘤杀伤应答，结果来自6价疫苗免疫小鼠的效应细胞对所研究的3个癌细胞全部、即MC38(图6-2E)、B16(图6-2F)和LLC(图6-2G)显示细胞毒性活性，全部对化合物1处理产生反应而表达剪接新抗原(图5-2)。

另一方面，这些效应细胞未显示出对B6小鼠的非癌性小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的细胞溶解活性(图6-2H)。启示剪接-新抗原的表达与MC38相比非常低，MEF没有充分诱导剪接-新抗原，因此避免CD8+T细胞引起的溶解。

癌细胞中的诱导性剪接来源的肽是以前提出的，但其在体内的肿瘤增殖中的意义并不清楚。因此，接着研究了化合物1诱导性剪接-新抗原表位反应性T细胞是否能够抑制肿瘤的生长(图6-2I)。

6价疫苗单独接种时确认到肿瘤增殖的延迟(Poly(I：C)+载体vs.Poly(I：C)/6价肽+载体，在23天抑制24.7％)(图6-2J)。这起因于在癌细胞中基底表达的剪接-新抗原的免疫原性(图5-2D和E)，该效果通过化合物1的同时给药而进一步增强(Poly(I：C)+载体vs.Poly(I：C)/6价肽+化合物1，第23天抑制57.0％)(图6-2J)。另外，对基于化合物1的单独疫苗接种产生的各剪接-新抗原的效果进行了评价，结果与疫苗非接种对照相比，肿瘤增殖被抑制了6～23％(图7B)。单独接种的肿瘤抑制效果比抑制率为30.7％的6价疫苗接种弱(图6-2J)，显示通过所鉴定的6个新表位的同时接种，抗癌免疫应答得到增强。

[使用了化合物2的RNA-Seq解析]

下述化合物2是以富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子(SRSFs)为靶的剪接调节剂之一。另外，化合物2具有调节Cdc2样激酶(CLK)的功能，通过CLK的调节影响SRSFs(Cell chembiol.，2020，vol.27，P 1472-1482)。

[化学式20]

除了将化合物1替换为化合物2以外，与图5-2F同样地，通过RNA-Seq解析，研究化合物2在各种小鼠癌细胞株中对产生上述6种剪接-新抗原的RNA剪接事件(剪接变化)的影响(图8)。图8表示化合物2在各种小鼠癌细胞株中，使剪接-新抗原的产生亢进。其中，产生包含Kifc1基因的MALSNKAYV(序列号：1)的肽的剪接变化在癌细胞株MC38和皮肤黑色素瘤株B16中显著，产生包含Rfx7基因的SLLLLYLQL(序列号：4)的肽的剪接变化在所有的癌细胞株中均显著。

[实验方法]

ELISpot分析

在第0天和第7天，向8周龄的雌性C57BL/6N小鼠皮下给药所合成的肽(GenscriptJapan)100μg和配合在PBS中的聚(I：C)50μg(5肽/小鼠)。将H2-K^b TRP-2_180-188肽(MBLInternational，Woburn，MA)用作阳性对照。将小鼠在初次注射12天后处死，分离脾细胞。作为刺激物，除了进行几个修正外，如以前所记载的那样生成对骨髓来源的树突细胞(BMDC)。简言之，在第2天通过离心分离从8周龄的雌性C57BL/6N小鼠的大腿骨分离骨髓细胞。将细胞通入70μm的细胞筛网，用含有10％FBS、100U/mL P/S、2mM L-谷氨酰胺、50μM 2-ME和20ng/mL Gm-csf(Peprotech，Rocky Hill，NJ)的RPMI 1640接种于10cm培养皿中。培养通过每2天或3天更换培养基的一半来维持。第12天，非粘附细胞大部分获得典型的树状形态，将这些细胞用2μg/ml的肽在37℃进行2小时脉冲。ELISpot分析使用Mouse IFN-γELISpotBASIC试剂盒(Mabtech AB，Nacka Strand，Sweden)，按照制造者的说明书实施。将新鲜的分离脾细胞(5×10⁵细胞)在涂布了抗IFN-γ抗体(克隆AN18)的ELISPpot PVDF白板中，在5％CO₂条件下，在37℃下与经肽脉冲的BMDC(4×10⁴细胞)共培养过夜。然后，使用捕获抗体(克隆R4-6A2)和BCIP/NBT-plus底物检测IFN-γ的分泌。放置板并使其干燥后，使用解剖显微镜对斑点数进行计数。使用ImmunoSpot S6 Ultimate Analyzer(Cellular TechnologyLimited，Cleveland，OH)获取斑点图像。

用于肿瘤杀伤活性测定的共培养分析

如“ELISpot分析”项中所记载的，从第14天接种了Poly(I：C)的肽小鼠制备脾细胞。为了进一步激发抗原特异性CD8⁺T细胞，将新分离出的脾细胞在10ng/mL的IL-2(Peprotech)的存在下与经肽(s)-脉冲的骨髓来源的树突细胞(BMDC)进一步共培养7天。培养通过每2天或3天更换培养基的一半来维持。接着，将用BMDCs刺激的脾细胞作为效应细胞，将靶细胞和效果细胞以效果细胞：靶细胞＝5：1的比率共培养24小时，研究其溶菌活性。关于靶细胞的制备，在前一天的与效应细胞的共培养中，将细胞用2M羧基荧光素琥珀酰亚胺二醋酸酯(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE；同仁堂)标记10分钟，进而用FBS孵育10分钟，使标记反应停止。用培养基洗涤2次后，将细胞在10ng/mLIFN-γ存在下培养过夜，次日，将靶细胞在共培养前用10ng/mL肽脉冲2小时，或在效应细胞的存在下用化合物1进行处理。共培养24小时后，将细胞在膜联蛋白V结合缓冲液中用膜联蛋白V(Biolegend)染色15分钟，供于流式细胞仪解析。经由效应细胞的杀伤活性根据膜联蛋白V⁺/CFSE⁺的频度算出。

RT-PCR

使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)，按照制造商的方案从细胞中提取总RNA，使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行逆转录。基因用KOD One DNA polymerase(To Yos Bo)和靶特异性引物组扩增。RT-PCR产物通过电泳分离。用ChemiDoc MP Imaging System拍摄用溴化乙锭染色的图像，用Image J软件分析数据。引物使用以下引物。对于Kife1，使用5’-TTC CTG TGA GAA AGA GGTGGA G-3’(序列号：23)和5’-CAC AAA CAT AAG CCT TAT TGC TCA G-3’(序列号：24)。对于Nfl，使用5’-CAC TTT AGT GAA GAG ACC AAG CAA G-3’(序列号：25)和5’-TCA TAC ATGCTT GTT GTG GCA GAG-3’(序列号：26)。对于Acbd4，使用5’-CAT GGG TAC CGA GAA GGAAGA G-3’(序列号：27)和5’-TCC AAT GGG GTC CCA GAA C-3’(序列号：28)。对于Rfx7，使用5’-AAA CTG GAG ATG GGG ACT TA-3’(序列号：29)和5’-TGA GGA TTC TCC TGG CAA TG-3’(序列号：30)。对于Qpctl，使用5’-CCA AGT GAG AAA GTT CCT GGA G-3’(序列号：31)和5’-GAG GAC AAA GAG CTC CTG CTG-3’(序列号：32)。对于Nup153，使用5’-CCA GAG AAT GAGGAA GTG GAA G-3’(序列号：33)和5’-GTA AAT CCA ATC TTG TTT GG-3’(序列号：34)。对于Actb，使用5’-TCT TTG CAG CTC CTT CGT TG-3’(序列号：35)和5’-GGC CTC GTC ACC CACATA G-3’(序列号：36)。Actb用作加载对照。

RNA-seq和剪接-新抗原候选物的鉴定

RNA-Seq文库使用TruSeq Stranded mRNA Library Kit(IlluMina，San Diego，CA)制备，IlluMina NovaSeq 6000平台用于配对末端测序(paired-end sequencing)。在HISAT2程序版本2.2.0中，使用“--rna-stradness RF”选项将RNA-seq数据映射到GRC38(mm10)基因组序列中。此时，使用从Ensembl gene annotation version 100获得的剪接的信息。映射的结果在配对读数的某一个未映射到基因组的情况下、映射位置的关系异常的情况下被废弃。

剪接解析使用rMATS program version 4.1.0。关于用于rMATS解析的参考转录产物模型，使用cufflinks程序版本2.2.1构建基于RNA-seq数据的新转录产物组。在rMATS程序中，由于具有柔性剪峰(soft clipping)或indel的读数在对准时被跳过，因此柔性剪峰或indel的信息作为不变更剪接信息的信息，对bam文件进行修正。在rMATS解析后，按照以下的基准，提取变化的剪接事件。FDR＜0.01，dPSI≥5.0，平均剪接数≥15，存在于任一样本中。

将剪接后的区域与用于描述由该区域编码的氨基酸序列的Ensembl基因注释进行比较。原来的肽数据库中没有观察到的氨基酸序列从已知序列中取出7个氨基酸的差额(margins)进行检索、保存。

对剪接来源的肽与MHC I类(H2-K^b、H2-D^b)的亲和性的预测采用NetMHCpanversion 4.1的“-1,8,9,10,11”的选项来执行。DEG解析使用RSEM程序版本1.2.31算出Transcripts per million(TPM)值和raw reads counts。然后，使用DESeq2程序版本1.8.2，检索满足以下基准的DEG：在任一样品中，adjusted-p＜0.05，fold change≥1.3或≤1/1.3，average TPM≥1，及average raw-readcounts≥32，在样品中。

Claims

1.一种用于提高肿瘤的免疫原性的药物组合物，其含有调节富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子(SRSFs)的活性的剪接控制化合物作为有效成分。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述化合物为能够调节Cdc2样激酶(CLK)的化合物。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中，所述化合物为使提高肿瘤的免疫原性的肽在肿瘤中产生亢进的化合物。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的药物组合物，其中，所述肽选自下述肽(1)～(6)及它们中的2～6个的组合：

肽(1)：包含MALSNKAYV(序列号：1)的氨基酸序列的肽、或在该肽中缺失、替换和/或添加有相当于序列号1的氨基酸序列的1个～数个氨基酸且具有提高肿瘤的免疫原性的能力的肽；

肽(2)：包含RNRSHIFPL(序列号：2)的氨基酸序列的肽、或在该肽中缺失、替换和/或添加有相当于序列号2的氨基酸序列的1个～数个氨基酸且具有提高肿瘤的免疫原性的能力的肽；

肽(3)：包含SILGFTMV(序列号：3)的氨基酸序列的肽、或在该肽中缺失、替换和/或添加有相当于序列号3的氨基酸序列的1个～数个氨基酸且具有提高肿瘤的免疫原性的能力的肽；

肽(4)：包含SLLLLYLQL(序列号：4)的氨基酸序列的肽、或在该肽中缺失、替换和/或添加有相当于序列号4的氨基酸序列的1个～数个氨基酸且具有提高肿瘤的免疫原性的能力的肽；

肽(5)：包含KQQELFVLL(序列号：5)的氨基酸序列的肽、或在该肽中缺失、替换和/或添加有相当于序列号5的氨基酸序列的1个～数个氨基酸且具有提高肿瘤的免疫原性的能力的肽；

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中，所述肽为肽(1)和(2)中的至少一个。

6.一种药物组合物，其含有使选自权利要求4中限定的肽(1)～(6)及它们中的2～6个的组合中的肽在肿瘤中产生亢进的剪接控制化合物作为有效成分。

7.一种药物组合物，其含有使权利要求4中限定的肽(1)和(2)中的至少一个在肿瘤中产生亢进的剪接控制化合物作为有效成分。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的药物组合物，其中，所述剪接控制化合物不是调节剪接因子RBM39的剪接控制化合物。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的药物组合物，其中，所述剪接控制化合物为选自下述式(I)～(II)所示的化合物及其制药上可接受的盐中的至少1种化合物：

[化学式1]

其中，式(I)和(I′)中，

X¹为N或-CH-；

X²为-N(R³)-、S或O；

式(II)中，

X³和X⁴分别独立地为S或NH，

R⁶为[化学式2]

R⁷为氢原子、卤素原子或C₁-C₆烷基。

10.根据权利要求1～8中任一项所述的药物组合物，其中，所述剪接控制化合物为选自下述式(III)～(VII)所示的化合物及其制药上可接受的盐中的至少1种化合物：

[化学式3]

式(III)中，

R¹¹为氢原子、或C₁-C₁₀烷基；

式(IV)中，

R¹²和R¹³分别独立地为氢原子、或C₁-C₆烷基；

R¹⁴为[化学式4]

R¹⁵为氢原子、卤素原子、或C₁-C₆烷基；

式(V)和(VI)中，

R¹⁷为-R²¹、-C≡C-R²¹、-CH＝CH-R²¹、或-O-(CH₂)n-R²¹，n为1～6，

R²¹为氢原子、羟基、C₁-C₈烷基、-Si(R²²)₃、或取代或未取代的苯基、单环式杂芳香环基或环状脂肪族基；

R¹⁹和R²⁰为氢原子或C₁-C₆烷基；

式(VII)中，

X⁵为[化学式5]

X⁶为-(结合键)或-NH-；

R²³为[化学式6]

11.一种药物组合物，其含有选自权利要求4中限定的肽(1)～(6)及它们中的2～6个的组合、以及它们的制药上可接受的盐中的至少1种作为有效成分。

12.根据权利要求6～11中任一项所述的药物组合物，其为用于提高肿瘤的免疫原性的药物组合物。

13.根据权利要求1～12中任一项所述的药物组合物，其与免疫检查点抑制剂同时、分别、或依次地并用给药。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中，免疫检查点抑制剂为针对选自(1)CTLA-4、(2)PD-1、(3)LAG-3、(4)BTLA、(5)KIR、(6)TIM-3、(7)PD-L1、(8)PD-L2、(9)B7-H3、(10)B7-H4、(11)HVEM、(12)GAL9、(13)CD160、(14)VISTA、(15)BTNL2、(16)TIGIT、(17)PVR、(18)BTN1A1、(19)BTN2A2、(20)BTN3A2、及(21)CSF-1R中的分子的1种以上的药剂。

15.一种提高肿瘤的免疫原性的方法，其包含使调节富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子(SRSFs)的活性的剪接控制化合物与肿瘤接触。

16.一种提高肿瘤的免疫原性的方法，其包含使权利要求1～14中任一项所述的药物组合物与肿瘤接触。

17.一种增强免疫检查点疗法的方法，其包含将免疫检查点抑制剂与权利要求1～14中任一项所述的药物组合物同时、分别、或依次地并用给药。

18.一种用于癌免疫疗法的试剂盒，其包含权利要求1～14中任一项所述的药物组合物和免疫检查点抑制剂。

19.权利要求1～14中任一项所述的药物组合物与免疫检查点抑制剂的组合的用于癌免疫疗法的用途。

20.调节富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子(SRSFs)的活性的剪接控制化合物在用于制造提高肿瘤的免疫原性的药物组合物中的用途。

21.一种剪接-新抗原的制造方法，其包含使肿瘤与调节富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子(SRSFs)的活性的剪接控制化合物接触。

22.一种用于提高肿瘤的免疫原性的药物组合物，其含有通过所述肿瘤与调节富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子(SRSFs)的活性的剪接控制化合物接触而产生的剪接-新抗原作为有效成分。