ES2952064T3 - Inhibición de la proteína SH2 inducida por citocinas en células NK - Google Patents

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Abstract

La divulgación se refiere a métodos terapéuticos y profilácticos basados en la inhibición de CIS en células NK. En particular, la presente invención se refiere al tratamiento o prevención de una afección que responde a NK administrando a un sujeto un inhibidor de CIS o administrando células NK inhibidas por CIS. La divulgación se refiere además a métodos para identificar un inhibidor de CIS y para determinar la probabilidad de respuesta del cáncer al tratamiento con inhibición de CIS. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCION
Inhibición de la proteína SH2 inducida por citocinas en células NK
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La especificación se refiere a métodos para prevenir o tratar condiciones de salud susceptibles de terapias mediadas por células NK.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El papel del sistema inmunitario en la supresión del crecimiento tumoral y la infección es bien conocido, y ahora se acepta que evitar la detección inmunitaria es un factor importante en el desarrollo del cáncer. Por ejemplo, los linfocitos citotóxicos como los linfocitos citolíticos naturales (NK) y los linfocitos T efectores CD8 contribuyen a la inmunidad antitumoral a través de la inmunoedición del cáncer. Sin embargo, los tumores y los agentes infecciosos (p. ej., virus) explotan una variedad de mecanismos para desactivar estos linfocitos citotóxicos. La citocina pleiotrópica IL-15 es un regulador importante del desarrollo, la homeostasis y la activación de las células NK; sin embargo, sus efectos sobre la activación de las células NK son de corta duración, lo que limita la eficacia de las respuestas mediadas por las células NK en el contexto de una variedad de cánceres e infecciones. Hasta la fecha, ha habido un gran interés en la comprensión de las señales inhibitorias que frenan las respuestas de las células NK, pero aún no está claro cómo se desactiva la señalización intracelular de IL-15.
La proteína SH2 inducida por citoquinas (CISH) está codificada por el gen Cish y se sabe que es inducida por la estimulación del receptor de células T (TCR) en las células T CD8+ e inhibe su avidez funcional contra los tumores (Palmer, et al. 2015. “Cish actively silences TCR signaling in CD8+ T cells to maintain tumor tolerance” J. Exp. Med. Vol. 212; No. 12; pp. 2095-2113).
Por lo tanto, existe una necesidad continua de identificar nuevas estrategias para desencadenar las respuestas de las células NK para el tratamiento eficaz de una variedad de condiciones de salud potencialmente sensibles a las células NK, incluido el cáncer, mientras se evitan los efectos secundarios devastadores de la mayoría de los agentes quimioterapéuticos.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Los presentes inventores han encontrado que la inhibición de la proteína SH2 inducida por citoquinas (CIS) se puede usar para tratar una serie de condiciones que responden a las células NK que incluyen ciertos tipos de cáncer e infecciones.
Por consiguiente, la presente invención proporciona células NK inhibidas por CIS para uso en terapia celular adoptiva o profilaxis del cáncer, en las que las células NK inhibidas por CIS son Cish
En algunas formas de realización, las células NK inhibidas por CIS son autólogas. En otras formas de realización, las células NK inhibidas por CIS son alogénicas.
En algunas formas de realización, las células NK Cish'/_ son células NK Cish'/_ humanas.
En algunas formas de realización, cualquiera de los métodos de tratamiento o profilaxis mencionados anteriormente incluye además la administración de IL-15 o un agonista de IL-15 al sujeto.
En otras formas de realización, cualquiera de los métodos de tratamiento o la profilaxis incluye además la administración de un inhibidor de proteína quinasa B-Raf o un inhibidor de proteína quinasa MEK.
En algunas formas de realización, cualquiera de los métodos de tratamiento o profilaxis mencionados anteriormente incluye además la administración de un agente inmunoterapéutico. Los ejemplos de tales agentes inmunoterapéuticos incluyen, entre otros, un anticuerpo contra el receptor de muerte celular programada 1 (PD-1), un anticuerpo contra el ligando de muerte programada 1 (PD-L1), un anticuerpo contra el linfocito T citotóxico- proteína asociada 4 (CTLA-4), un anticuerpo contra el factor de crecimiento transformante beta (TGF-b), un anticuerpo contra Tactile (CD96), o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, cualquiera de los tratamientos anteriores puede incluir además la administración de un antagonista del receptor de TGF-beta.
En algunas formas de realización de los métodos de tratamiento o profilaxis mencionados anteriormente, el sujeto padece un cáncer o se determina que está en riesgo de padecer un cáncer.
En algunas formas de realización, en las que el sujeto padece un cáncer, el cáncer se caracteriza por la presencia de un tumor. En algunas formas de realización, cuando el sujeto padece o corre el riesgo de padecer un cáncer, el cáncer es melanoma metastásico, cáncer de próstata metastásico cáncer de mama metastásico, cáncer de mama triple negativo, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de esófago, cáncer de hígado, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón de células escamosas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células de Merkel, sarcoma, cáncer hepatocelular, mieloma múltiple, cáncer de páncreas, carcinoma colorrectal, cáncer de cuello uterino, carcinoma gástrico, cáncer de riñón, carcinoma metastásico de células renales, leucemia, cáncer de ovario y glioma maligno. En algunas formas de realización preferidas, el cáncer es melanoma metastásico, cáncer de próstata metastásico o cáncer de mama metastásico. En algunas formas de realización, cuando el sujeto padece un cáncer, el sujeto ha recibido un injerto de tejido alogénico asociado con el tratamiento del cáncer.
También se proporciona un método para aumentar la capacidad de respuesta de las células NK a la IL-15, comprendiendo el método la inhibición de CIS en las células Nk como se ha descrito anteriormente. En otra forma de realización, un método para aumentar la capacidad de respuesta de las células NK a la IL-15 comprende reducir la expresión de CIS en las células NK. En algunas formas de realización, la reducción de la expresión de CIS se lleva a cabo en células NK ex vivo. En otras formas de realización, la reducción de la expresión de CIS es de células NK in vivo (p. ej., en un sujeto humano). Se considerará que cualquier forma de realización del presente documento se aplica mutatis mutandis a cualquier otra forma de realización a menos que se indique específicamente lo contrario. Por ejemplo, como entendería el experto, ejemplos de inhibidores y condiciones de salud descritos anteriormente para los métodos de la invención se aplican igualmente al uso y las composiciones farmacéuticas de la invención.
A lo largo de esta especificación, a menos que se indique específicamente lo contrario o el contexto requiera lo contrario, la referencia a un solo paso, composición de la materia, grupo de pasos o grupo de composiciones de materia se entenderá que abarca uno y una pluralidad (es decir, uno o más) de esos pasos, composiciones de materia, grupos de pasos o grupo de composiciones de materia.
La invención se describe a continuación por medio de los siguientes ejemplos no limitativos y con referencia a las figuras adjuntas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS ADJUNTOS
Figura 1: las células NK deficientes en CIS muestran una proliferación, supervivencia y destrucción superiores en respuesta a la IL-15. (a) Las células NK de tipo salvaje cultivadas se lavaron y se privaron de IL-15 antes de la incubación con 50 ng m1 ’1 de IL-15 durante los tiempos indicados. Se recogieron y analizaron células por Q-PCR para la expresión de ARNm de SOCS. (b) Las células NK se trataron como en (a), se lisaron y analizaron mediante transferencia Western para determinar la expresión de la proteína CIS. (c) Las células NK (NK1.1+NKp46+TCR-p‘) se perfilaron mediante citometría de flujo y se enumeraron en médula ósea, hígado, pulmón y bazo de tipo salvaje (Cish+/+) y ratones deficientes en Cish (Cish-/-). (d) Las células NK Cish+/+ y Cish-/- se marcaron con CFSE y CTV, respectivamente, y cultivaron en una proporción de 1:1 en concentraciones crecientes de IL-15 (5-40 ng ml-1) durante 5 días antes del análisis por citometría de flujo. Las parcelas son representativas de 5 experimentos independientes.
(e) Células NK Cish+/+ y Cish-/- esplénicas recién aisladas se cultivaron en IL-15 en placas de cultivo de tejido recubiertas con un control de inmunoglobulina (clg; control negativo), anticuerpos anti-NK1.1, anti-NKp46, anti-Ly49H (confiere respuesta antiviral) o IL-12/IL-18 (control positivo) durante 4 h y se analizó la producción de IFN-y y la expresión de CD107a (LAMP-1) mediante citometría de flujo. (f) Las células NK Cish+/+ y Cish-/- se expandieron en IL-15 y se cocultivaron con células diana CHO en las proporciones NK:CHO (E:T; efector:objetivo) indicadas a lo largo del tiempo. El índice de células CHO normalizado se determinó utilizando el sistema xCELLigence. (g) Se cultivaron células NK Cish+/+ y Cish-/- en IL-15 durante 7 días y secuenciación de ARN realizada. Genes seleccionados diferencialmente expresados en las células NK Cish-/- se muestran como lecturas por kilobase de exón por millón de lecturas (RPKM). Ver también la Fig. 8 y la Tabla 1.
Figura 2: CIS regula negativamente la señalización de IL-15 al apuntar a señalización JAK/STAT. (a) Las células Cish+/+ y Cish-/- NK se purificaron y cultivaron ex vivo durante 21 horas en 50 ng m1-1 IL-15. La expresión superficial de IL-2R (CD122) e IL-2Ry (CD132) se determinó mediante citometría de flujo. Cada histograma representa células NK derivadas de ratones individuales. (b) Las células NK se purificaron a partir de bazos Cish+/+ y Cish-/- y se incubaron in vitro con 50 ng m1-1 de IL-15. (c) Alternativamente, las células NK se purificaron y cultivaron durante 7-10 días, se lavaron y reposaron sin IL-15 durante 4 h, antes del tratamiento con IL-15. Las células se lisaron y analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos contra las proteínas fosforiladas (p) y totales indicadas. (d) Un análogo N-linker modificado del inhibidor de JAK CYT387 se acopló a perlas de NHS-sefarosa y se usó como un reactivo de afinidad para enriquecer las quinasas JAK de los lisados celulares generados como en (c). Se eluyeron las quinasas enriquecidas, se dirigieron con tripsina y analizaron por espectrometría de masas. Las intensidades de los péptidos JAK1 y JAK3 sumadas se muestran a partir de células NK Cish+/+ y Cish--. Media ± S.E.M. **p: < 0,005; n = 3 réplicas biológicas (e y f) El enriquecimiento de CYT-387 identificó 69 proteínas quinasas únicas, 16 de las cuales exhibieron una expresión diferencial significativa. El diagrama de volcán (e) muestra las proporciones de proteína Log2 después del análisis de canalización cuantitativa (Cish+/+ frente a Cish-/~\ Las líneas rojas y amarillas representan un cambio de 2 veces en la expresión de proteínas (relación log2 de 1), mientras que las líneas azules y verdes representan un cambio de 4 veces (relación log2 de 2); los puntos están coloreados en consecuencia y representan proteínas individuales. Proteínas con un valor p -log10 de 1,3 o más se consideraron diferencialmente abundantes. Mapa de calor (f) que muestra las intensidades peptídicas sumadas transformadas por Log2 (no imputadas) para quinasas con expresión diferencial. Se muestran los datos de las réplicas individuales (n=3). Verde a rojo indica niveles de expresión crecientes. El análisis de Gene Ontology reveló un enriquecimiento de quinasas implicadas en el ciclo celular y la replicación del ADN en células NK Cish-/-. Véase también la figura 8.
Figura 3: CIS se une al bucle de activación de JAK para inhibir la actividad de la quinasa JAK1 y dirigirla a la degradación proteasómica. (a) Se usó calorimetría isotérmica (CIT) para medir la afinidad de la unión de hCIS-SH2-BC a fosfopéptidos correspondientes a tirosinas dentro de los bucles de activación del dominio quinasa JAK1/3 y los dominios citoplásmicos IL-2R. Vista tabular de los resultados, que muestra la media ± D.E. de dos experimentos independientes. ND=No detectable, p=fosforilado. (b y c) JAK1 y JAK3 marcados con FLAG se expresaron en células 293T junto con mutantes CIS, Socs1, SOCS3 o CIS marcados con FLAG en los que se ha mutado el dominio SH2 (mSH2; R107K) o el sitio de unión Cullin-5 en la caja SOCS (mSB; P241NL242NP243A). En algunos casos, las células se trataron con el inhibidor del proteasoma, MG132. Las células se lisaron y las proteínas se inmunoprecipitaron utilizando perlas anti-FLAG, antes de la transferencia Western con anticuerpos para detectar JAK1 y JAK3 fosforilados (p). Los niveles de expresión de proteínas se muestran mediante transferencias anti-FLAG de lisados de células completas (paneles inferiores). (d) JAK1 y CIS marcados con FLAG se coexpresaron en células 293T e inmunoprecipitaron (I.P.) usando anticuerpos anti-CIS (panel superior izquierdo) o anti-JAK1 (panel superior derecho). La transferencia Western con anticuerpos anti FLAG reveló la presencia de complejos CIS-JAk específicos en cada caso (paneles superiores). Los niveles de proteína se muestran en los paneles inferiores mediante transferencia anti-FLAG de lisados celulares. (e) Usando un sistema libre de células, FLAG-JAK1 se incubó con (+) y sin (~) el complejo ligasa CIS-E3 (CIS-SH2-BC con Cullin5 y Rbx2), junto con las enzimas ubiquitina, El y E2 a 37°C durante los tiempos indicados. La ubiquitinación de JAK1 se visualizó mediante transferencia de Western con anticuerpos contra JAK1 fosforilado. (f) Se realizaron ensayos de inhibición de quinasa con el dominio quinasa (JHI) de las cuatro JAK y CIS, SOCS1, s Oc S2 o SOCS3. CIS inhibió preferentemente la actividad de JAK1 JHI (panel superior), mientras que SOCS1, 3 y CIS inhibieron la actividad de JAK1 JHI en diversos grados (panel inferior). Los datos se normalizaron a controles sin CIS. Tabla empotrada: valores CI50; Promedio±SEM; n=3-5 experimentos independientes). (g) Diagrama que ilustra los componentes de ubiquitinación de ligasa E3 in vitro y el modelo propuesto para la inhibición de la actividad de JAK mediada por CIS, mediante el cual el reclutamiento de CIS al complejo receptor promueve la unión a JAK1 activo y da como resultado la inhibición de la quinasa y la degradación proteasomal. eloB: elongina B; C: elongina C. Véase también la Fig. 9.
Figura 4 - Pérdida de Cish controla metástasis de tumor de pulmón experimental. A los ratones Cish+/+ y Cish~'~ se les inyectaron i.v. (a) células de melanoma 3x105 B16F10 o (b) melanoma 2x105 B16F10 y se trataron los días -1, 0 y 6 en relación con la inoculación del tumor con Ig de control (clg), anticuerpos anti-CD8 (aCD8; depleción de células T CD8), anti-asialoGMI (aasGMI; depleción de células NK) o anti-IFNy (alFNy; neutralizante). Los ratones fueron sacrificados el día 14 después de la inyección del tumor. (c) ratones deficientes en células NK (Ncr1Mcl1ú/A) se inyectaron i.v. con 3 x 106 células Cish+/+ o Cish-/- NK expandidas in vitro o PBS, 8 h antes de la inyección con células de melanoma 1x105 B16F10. Los ratones recibieron una segunda inyección de 1,5 x 106 células Cish+/+ o Cish-/~ NK expandidas in vitro o PBS, 24 horas después de la inoculación del tumor y se sacrificaron el día 18 después de la inyección del tumor. (a-c) Se cuantificó la carga metastática (mets) en los pulmones contando las colonias en la superficie del pulmón. (d) Ratones Cish+/+, Cish-/~y Ncr1Mcl1ü/ü (NK-nulo) fueron inyectados i.v. con células de cáncer de mama mCherry+ 5x105 E0771 y metástasis de pulmón analizadas por IVIS (emisión de fluorescencia; paneles de la izquierda) o secciones histológicas teñidas con H&E (paneles de la derecha). (e) Se implantaron células 1x105 E0771 en la almohadilla de grasa mamaria de ratones Cish+/+ y Cish~/- y se midió el tamaño del tumor a lo largo del tiempo. (f) Los tumores ortotópicos E0771 generados como en (e) fueron extirpados quirúrgicamente a 400-600 mm3 y metástasis pulmonares espontáneas medidas en los pulmones 14 días después mediante IVIS y RT-PCR para la expresión de ARNm de mCherry. (g) A ratones Cish+/+ y Cish-/~ se les inyectó i.v. carcinoma de pulmón B16F10 (7,5 x 105 células). En los días 0, 3 y 6 con respecto a la inoculación del tumor, los ratones recibieron Ig de control o anticuerpos anti-PD-1/anti-CTLA-4 combinados. La carga metastásica se cuantificó a los 13 días mediante el cómputo de las colonias en la superficie pulmonar. Se muestran la media ± S.E.M. y todos los datos (n). Se muestran secciones histológicas representativas de pulmones completos (a, c, d, f) y (d) de ratones individuales. Las diferencias significativas entre los grupos se determinaron mediante una (a, c, g) prueba U de Mann Whitney (b) Kruskal Wallis con la prueba post Dunn o (e) prueba de Mantel-Cox. Véase también la figura 10.
Figura 5- Análisis de NK, células T, Tregs, ILC2 y células T reguladoras en ratones deficientes en Cish. (a) Cish+/+ o Cish-/~ Las células NK se cultivaron en IL-15, se lisaron y el ARNm de Cish se analizó mediante Q-PCR. Los datos se normalizaron a la expresión de ARNm de GAPDH (panel superior). ND: no detectado. Se cultivaron células NK Cish+/+ o Cish-/~ en IL-15 y el inhibidor proteasómico MG132 durante 4 h antes de la lisis celular y la proteína CIS detectada en lisados de células completas mediante transferencia de Western (panel inferior). (b) Células NK (NK1.1+NKp46+TCR-) y (c) células T (NK1.1TCR-P+) se analizaron en los órganos indicados de ratones Cish+/+ y Cish~/- mediante citometría de flujo. (d y e) ILC2 Cish+/+ y Cish~/- se trataron con PBS o IL-2 en complejo con anticuerpos anti-IL-2 (IL-2-JES6.1) cada 2 días y se sacrificaron después de 5 o 7 días (D5, D7). Gráficos representativos de citometría de flujo de ILC2 en la médula ósea seleccionados en CD3/19/NK1.1/B220/Gr1 células negativas. (e) Frecuencia de ILC2 en la médula ósea después de tratamiento IL-2-JES6.1 (a, c, e) Media ± S.E.M. n = 3 réplicas biológicas. (f) Células T reguladoras (Tregs) Expresión de FoxP3 y CD25 en células CD4+ del bazo y ganglios linfáticos de ratones Cish+/+ y Cish-/~ antes y 5 días después del tratamiento con IL-2-JES6-1. Se muestran gráficos representativos de citometría de flujo. (g) Expansión y contracción de Tregs en el bazo y los ganglios linfáticos después del tratamiento con complejo IL-2-JES6-1 (Media ± SEM n = 1-2 ratones por grupo).
Figura 6 - La pérdida de S ocs l y/o Socs3 no altera las respuestas de IL-15 en las células NK. (a) Los ratones Socs3+/+ERT2Cre/+ (Cre+), S o c s ^ I ^ (SocslA), Socs3fl/fl ERT2Cre/+ (Socs3A) y Socs1-/-|fnY-/-Socs3fl/flERT2Cre/+ (Socsl A Socs3A) fueron tratados con 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT; para inducir la eliminación de Socs3) por sonda oral y células NK esplénicas analizadas 14 días después por citometría de flujo. (b) Células NK esplénicas (TCR-p-NK1.1+NKp46+) de ratones en (a) se clasificaron mediante FACS y se cultivaron en IL-15 (50 ng ml-1) durante 7 días antes de etiquetarse con CFSE y transferirse i.v. a receptores de alinfoide Rag2~A gcA o cultivados en IL-15 (50 ng ml-1) in vitro. Cinco y diez días después de la transferencia, los hígados de los receptores se analizaron en busca de células NK del donante mediante citometría de flujo. Los cultivos in vitro se analizaron el día 5. Los cultivos de células Cish+/+ y Cish~A NK sirven como referencia para la proliferación diferencial (panel inferior derecho). (c) Función efectora mejorada en células NK Cish-/-. Las células NK Cish+/+ y Cish-A se cultivaron durante 7 días antes del cocultivo con células diana CHO o B16F10 en una proporción de 1:1. La destrucción de células diana a las 5 h se determinó mediante cambios relativos en la impedancia eléctrica utilizando el sistema xCELLigence. Las células NK Cish+/+ y Cish~A lograron la destrucción máxima en proporciones de efector:objetivo de 9:1 (definidas como 100% de destrucción). (d) Se inyectaron ratones Cish+/+ y Cish~A con células RMA-ml57 i.p. y células NK peritoneales analizadas 18 h más tarde para producción intracelular de granzima-A y granzima-B por citometría de flujo. Media±DE de dos experimentos. n = 2 ratones. IMF: índice medio de fluorescencia.
Figura 7 - Perfil del transcriptoma de células NK Cish-/- cultivadas in vitro y ex vivo. Se realizó ARNseq de un solo extremo de 100 pb en células NK Cish+/+ y Cish~A ex vivo recién clasificadas y en células NK Cish+/+ y Cish~A que habían sido cultivadas durante 7 días en IL-15 (50 ng ml'1). (a) Los niveles de expresión relativos (puntuaciones Z) de los 100 genes más expresados diferencialmente en las células Cish~A se muestran en el mapa de calor, codificados por colores según la leyenda. Las filas se escalan para tener una media de 0 y una desviación estándar de 1. n=2 réplicas biológicas. (b) Gráfico de diferencia de medias de los datos de células Nk cultivadas generados en Figura 3, que muestra el cambio de múltiplos Log2 frente a la expresión media. (c) Análisis funcional de los 1230 genes expresados diferencialmente observados en células NK Cish-/- cultivadas con IL-15. La ontología génica se realizó utilizando el sistema de clasificación PANTHER. Las principales redes de genes se muestran como un porcentaje del total de genes expresados diferencialmente en células Cish~A.
Figura 8: Las células NK Cish-/- muestran un aumento de la señalización de JAK/STAT y una respiración y glucólisis normales. (a) Se cultivaron células NK Cish+/+ y Cish~A y se lavaron para eliminar los medios que contenían IL-15. Las células se lisaron a varios tiempos después del lavado como se indica. Los niveles de proteínas de señalización fosforiladas (p) y totales se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos específicos. (b) Cish~A La respiración de las células NK y la glucólisis es imperturbable. Se cultivaron células n K Cish+/+ y Cish-A en presencia de IL-15 y el índice de acidificación extracelular (ACR; glucólisis) y el índice de consumo de oxígeno (OCR; respiración mitocondrial) medido con el sistema XF Analyzer. Se añadieron glucosa (1), oligomicina (2), FCCP y piruvato (3) y antimicina Arotenona (4) en los momentos indicados por las flechas numeradas. (c) Descripción general del flujo de trabajo proteómico utilizado en este estudio. Números iguales de células NK cultivadas derivadas de ratones Cish+/+ y Cish~A se lisaron y se sometieron a enriquecimiento de quinasa utilizando perlas NHS-CYT-387. Los eluatos de proteína de la resina c YT-387, además de una porción de lisado de células enteras (enriquecimiento previo a la quinasa), se sometieron a digestión con tripsina y nanoCL-EM/EM. (d) Cuantificación sin etiquetas de la expresión global de proteínas. Gráfica de volcán que muestra las proporciones de proteína Log2 después del análisis de canalización cuantitativa (Cish+/+ frente a Cish-/J) de WCL. Las líneas rojas y amarillas representan un cambio de 2 veces en la expresión de proteínas (relación log2 de 1), mientras que las líneas azules y verdes representan un cambio de 4 veces (relación log2 de 2); los puntos están coloreados en consecuencia y representan proteínas individuales. Las proteínas con un valor de p de -log10 de 1,3 o mayor (que corresponde a un valor de p de ≤ 0,05) se consideraron diferencialmente abundantes. (e) Mapa de calor que muestra las intensidades de péptidos sumadas transformadas por Log2 (no imputadas) para proteínas con expresión significativamente diferencial en (d). Se muestran datos de réplicas biológicas individuales (n=3). Verde a rojo indica niveles de expresión crecientes.
Figura 9: CIS se dirige a JAK y al complejo IL-2R. (a) Las células NK cultivadas de ratones de tipo salvaje y Cish~A se lisaron, se purificó el ARNm y se analizó mediante ARNseq. Los valores medios RPM para muestras duplicadas (panel izquierdo). Los niveles de ARNm de JAK1 se analizaron mediante Q-PCR (panel derecho). Media±DE, n=3. (b) Gel SDS-PAGE teñido con Coomassie al 4-12 % que muestra complejo hCIS-SH2-BC purificado, elongina B y elongina C. (c) Se usó calorimetría isotérmica (CIT) para medir la afinidad de la unión de hCIS-SH2-BC a fosfopéptidos correspondientes a tirosinas dentro de los bucles de activación del dominio quinasa JAK1/3 y dominios citoplasmáticos IL-2Rp y y. Se titularon fosfopéptidos 300 μM en una solución 30 μM del complejo temático GST-CIS-SH2-BC. Curvas de titulación CIT y vista tabular de algunos resultados (recuadro) que muestran la media ± D.E. de dos experimentos independientes. Nd =No detectable, p=fosforilado. Todas las curvas de titulación se ajustaron bien a un modelo de sitio único. (d) Las células NK de tipo salvaje cultivadas se lavaron y se privaron de IL-15 durante 4 h, con y sin adición del inhibidor proteasómico, MG132. A continuación, las células se estimularon con 50 ng m1-1 IL-15 durante los tiempos indicados, antes de la lisis celular y transferencia Western con anticuerpos contra las proteínas indicadas. (e) Se realizaron ensayos de inhibición de quinasa con el dominio de quinasa (JH1) de JAK1 en presencia de CIS-SH2-BC con y sin exceso de fosfopéptido JAK1-Y1034 como competidor. El péptido pY1034 redujo parcialmente la inhibición mediada por CIS. Los datos se normalizaron a controles sin CIS.
Figura 10: Las células NK Cish-/- protegen contra las metástasis pulmonares experimentales. A los ratones Cish+/+ y Cish-/- se les inyectaron i.v. (a) 2 x 105 LWT1 (mutante B-RAF) de melanoma o (b) 2 x 105 células de carcinoma de próstata RM-1. La carga metastásica se cuantificó en los pulmones después de 14 días contando las colonias en la superficie pulmonar. (c y d) Se implantaron células 1x105 E0771.LMB-mCherry+ en la almohadilla de grasa mamaria de ratones Cish+/+ y Cish~/-, se extrajeron quirúrgicamente a 400-600 mm3 y (e) se pesaron después de la escisión. Las metástasis pulmonares espontáneas (d) se midieron 14 días después mediante IVIS para fluorescencia mCherry. (d; eje vertical: eficiencia radiante total [(p/s)/ÍW/cm2)] x 107). Media ± S.E.M. de indicado (n) se muestran. Las diferencias estadísticas entre los grupos se determinaron mediante la prueba U de Mann-10 Witney (a, b) o la prueba de la t de Student no pareada (d).
Figura 11: La eliminación de la región N-terminal de CIS o PEST mejora la capacidad de CIS para inhibir la actividad de quinasa JAK1, y se requiere la interacción de CIS-SH2 con el fosfopéptido para la inhibición de CIS de la actividad de quinasa JAK1. Los ensayos de inhibición de la quinasa se realizaron con el dominio quinasa (JH1) de JAK1 en presencia de cantidades crecientes de CIS humano de longitud completa (CIS), CIS que carece del motivo PEST (APEST), CIS que carece tanto de la región N-terminal como del motivo PEST (ANT/ APe St ), o CIS que carece de los 34 residuos N-terminales (AN34), sin (a) o con (b), exceso de fosfato de fenilo (PP) como competidor.
(c) Alternativamente, fosfopéptidos 50 μM JAK1-Y1034 o JAK3-Y980,Y981 se utilizaron como competidores. Los datos se normalizaron a controles sin CIS. Todas las construcciones de CIS contenían la caja SOCS y se expresaron y purificaron como un complejo trimérico que consiste en CIS, elongina B y elongina C. Recuadro: la tabla muestra los valores de CI50 para (a).
Figura 12: La eliminación de la región N-terminal de CIS o el motivo PEST no tiene un impacto importante en la unión al fosfopéptido. Se usó calorimetría isotérmica (CIT) para medir (a) la afinidad del CIS humano de longitud completa, CIS que carece del motivo PEST (APEST), CIS que carece tanto de la región N-terminal como del motivo PEST (ANT/APEST), o CIS que carece de los 34 residuos N-terminales (AN34) que se unen a los fosfopéptidos correspondientes a tirosinas dentro del bucle de activación del dominio quinasa JAK1 (JAK1-Y1034). (b) La afinidad de la unión de CIS de longitud completa humana y CISANT/APEST a fosfopéptidos correspondientes a tirosinas dentro del bucle de activación del dominio quinasa jAK3 (JAK3-Y980, Y981). Se titularon fosfopéptidos 300 μM en una solución 30 μM del complejo ternario GST-CIS-SH2-BC. Se muestran las curvas de titulación CIT. Las curvas de titulación se ajustaron bien a un modelo de sitio único.
Figura 13: El dominio CIS-SH2 se une a una interfaz peptídica extendida. Se usó calorimetría isotérmica (CIT) para medir la afinidad de CIS que carece tanto de la región N-terminal como del motivo PEST (ANT/APEST) que se une a los fosfopéptidos correspondientes a las tirosinas dentro del bucle de activación del dominio quinasa JAK1 (JAK1-Y1034). Los péptidos eran de tipo salvaje o contenían una sustitución de alanina en la posición 5, 3 o -3. Se titularon fosfopéptidos 300 μM en una solución 30 μM del complejo ternario GST-CIS-SH2-BC. Se muestran las curvas de titulación CIT. Todas las curvas de titulación se ajustaron bien a un modelo de sitio único.
Figura 14- La inhibición de CIS depende de la dosis y requiere un dominio SH2 funcional. (a) Las células NK se purificaron a partir de bazos de ratones Cish-1-, Cish+I- y Cish+/+, se marcaron con el colorante de rastreo celular CTV y se cultivaron durante 6 días en una concentración creciente de IL-15, antes del análisis de citometría de flujo. Una disminución en la fluorescencia total (Media Geo) indica un aumento en la proliferación. (b) Números iguales de células NK de los bazos de ratones Cish~/-, Cish+I- y Cish+/+ se expandieron en IL-15 durante 10 días. Números absolutos de células NK después del cultivo. (c) A continuación, las células NK se lavaron sin citoquinas y se dejaron descansar durante 4 h antes del tratamiento con 100 ng/ml de IL-15 y 10 μM de MG132, como se indica. Los lisados celulares se analizaron mediante inmunotransferencia con los anticuerpos contra CIS indicados y actina como control de carga.
Figura 15 - La cinética de la inducción de CIS es consistente con la inhibición de la señalización de JAK/STAT en células NK humanas. Células NK humanas derivadas de pacientes (a) o líneas celulares de linfoma NK (b) SNK-10, (c) NKL y NK6, (d) NK-92 se lavaron sin citoquinas y se dejaron descansar durante 4 h (a) o 16 h (b-d) antes del tratamiento con IL-15 para los tiempos indicados. En algunos casos, las células se incubaron con el inhibidor proteasómico MG132 (10 μM). Las células se lisaron y analizaron mediante inmunotransferencia con anticuerpos contra las proteínas fosforiladas (p) y totales indicadas.
Figura 16 - La cinética de inducción de ARNm de Cish es consistente con la inhibición de la señalización de JAK/STAT en células NK humanas. Las líneas celulares de linfoma NK humano KHYG-1 (a-c) y NK-92 (D-F) se lavaron para eliminar las citoquinas y descansaron durante la noche antes del tratamiento con IL-15 durante los tiempos indicados. Las células fueron lisadas y analizadas PCR cuantitativa en tiempo real (Q-PCR) para la expresión de ARNm de Cish, Socsl, Socs3. La expresión relativa se determinó normalizando la cantidad de cada gen de interés para el ARN ribosomal 18s del gen de mantenimiento. Cada condición tenía tres réplicas biológicas y las mediciones se realizaron por duplicado.
Figura 17 - Esquema que resume los sitios de ubiquitinación (U) y fosforilación (P) identificados por espectrometría de masas. P = fosforilación, U = ubiquitinación, *indica que los residuos son conservación entre el ratón y el CIS humano. El CIS de ratón marcado con FLAG se expresó en células 293T y se purificó mediante enriquecimiento por afinidad utilizando anticuerpos anti FLAG antes de la digestión con tripsina y análisis CL-EM/EM.
Círculos en negrita indican residuos identificados en este estudio. Otros sitios de ubiquitinación se informaron en Jensik et al., 2015.
Figura 18 - TGFp bloquea la proliferación impulsada por IL-15 en células NK de tipo salvaje, pero no deficientes en CIS. Las células NK esplénicas de tipo salvaje (WT), deficientes en TGFpRIl (TGFpNfl/fl) o ratones Cish-/- (20.000 células/pocillo LinnegCD49anegCD49b+NK1.1+NKp46+) se marcaron con CFSE y se cultivaron en medios libres de RPMI o TGF-p (MaxTex) durante 5 días en las siguientes condiciones; rIL-15 (50 ng/ml), rIL-15 (50 ng/ml) con rTGFbl (1 ng/ml), rIL-15 (50 ng/ml) con rTGFbl (6,25 ng/ml) o rIL-15 (50 ng/ml) con rTGFbl (25 ng/ml). La pérdida de CFSE (proliferación) fue monitoreada por FACS.
Figura 19 - La inhibición de TGFp o BRAF (proteína quinasa B-Raf) junto con la eliminación de Cish es superior al tratamiento solo o en combinación. Se inyectaron ratones Cish+/+ y Cish-/~ con líneas celulares de melanoma mutante BRAF 1x106 (SM1LWT1) y Ig de control (ctr), anticuerpos anti-TGF-p (1D11), inhibidor de BRAF (PLX4720) o 1D11 y PLX4720. La carga de melanoma en los pulmones se midió el día 14 después de la inyección, mediante recuento macroscópico. Media ± S.E.M. *p≤0,05, **p≤0,005, ***p≤0,0005.
Figura 20: La combinación de deficiencia de Cish e inhibidores de puntos de control o estimulación de citoquinas muestra un efecto antimetastásico mejorado. (A) Grupos de 5-6 ratones B6.WT (Cish+/+) o B6.Cish~A se inyectaron i.v. con 2 x 105 células de melanoma B16F10 y se trataron con Ig de control (clg) (250 μg i.p. en los días 0, 3 y 6), anti-PD-1 (250 μg i.p. los días 0, 3 y 6), IFN-ap de ratón (25 μg i.p. los días 0, 1,2 y 3) o IL-2 recombinante (10.000 UI i.p. los días 0, 1, 2 y 3). (B) Grupos de 5-11 ratones B6.WT (Cish+/+) o B6.Cish-/-se inyectaron i.v. con 7,5 x 105 células de melanoma B16F10 y se trataron con clg (250 μg i.p. en los días 0, 3 y 6), combinación anti-PDl/anti-CTLA-4 (250 μg i.p. cada uno en los días 0, 3 y 6), o IL-2 recombinante (10.000 UI i.p. en los días 0, 1, 2, 3 y 4). (C) Se inyectaron i.p. grupos de 7-10 ratones B6.WT (Cish+/+) y B6.Cish-/~ con 1 x 105 células RMA-S parentales y se trataron con PBS o IL-2 recombinante (100000 UI i.p. en días 0, 1, 2, 3 y 4). Se controló el desarrollo de tumores en los ratones y se les practicó la eutanasia en el punto de hinchazón e incomodidad abdominal. La supervivencia mejorada entre grupos se evaluó mediante la prueba Log-rank de Mantel-Cox. (D) Grupos de 5-15 ratones B6.WT (Cish+/+) o B6.Cish-/- se inyectaron i.v. con 5 x 105 células de carcinoma de próstata RM-1 y se trataron con clg, anti-CD96, anti-PD-1, combinación de anti-CTLA-4 o anti-PDl/anti-CTLA-4 (250 μg i.p. cada uno en los días 0 y 3). (E) Se inyectaron i.v. grupos de 8-10 ratones B6.WT (Cish+/+) o B6.Cish-/- con 7,5 x 105 células B16F10 de melanoma y se trataron con 250 μg clg o mAb anti-CD96 (i.p. en los días 0 y 3). (F) Grupos de 5-6 ratones B6.WT (Cish+/+) o B6.Cish-/- se inyectaron i.v. con 7,5 x 105 células de melanoma LWT1 y se trataron con vehículo o PLX4720 (10 mg/kg i.p., diariamente desde el día 0 a 6). Los pulmones se recogieron el día (A, D, F) 14 o el día (B, E) 13 y se contaron las macrometástasis. Los ratones individuales se muestran con cada símbolo y los resultados son representados como media ± S.E.M. Las diferencias estadísticamente significativas, como se indica, se determinaron mediante ANOVA unidireccional con prueba posterior de Tukey (para comparaciones múltiples) (*: p ≤0,5; **: p ≤0,01; ***: p ≤0,001; ****:p≤0,0001).
Figura 21 - Combinación de la deficiencia de Cish con inhibidores de la quinasa BRAF o MEK demuestra un efecto antimetastásico mejorado. Grupos de 5-10 ratones B6.WT (Cish+/+) y B6.Cish-/- se inocularon i.v. con 7,5 x 105 células de melanoma lWt 1 y se trataron con vehículo, inhibidor de BRAF (PLX4720; diariamente durante 6 días; 10 mg/kg i.p.) y/o inhibidor de MEK (MEKi; trametinib, días 0 y 3, 0,6 mg/kg por sonda oral). Se recogieron los pulmones el día 14 y se contaron las macrometástasis. Los ratones individuales se muestran por cada símbolo y los resultados se representan como media ± S.E.M. Las diferencias estadísticamente significativas, como se indica, se determinaron mediante ANOVA unidireccional con prueba posterior de Tukey (para comparaciones múltiples) (ns no significativo; ***: p ≤ 0,001; ****:p≤0,0001).
Figura 22: Los ratones con deficiencia de Cish están protegidos contra el desarrollo de tumor inducido por MCA. (A) Grupos de 15 ratones macho B6.WT (Cish+/+) y 18 B6.Cish-/- se inocularon S.C. en el costado trasero con 300 μg de m Ca en 0,1 ml de aceite de maíz. A continuación, los ratones fueron controlados por el desarrollo de fibrosarcoma durante 250 días, y los datos se registraron como un porcentaje de ratones libres de tumores (los tumores > 3 mm de diámetro se registraron como positivos). (B) Grupos de 16-18 ratones macho B6.WT (Cish+/+) y 14 B6.Cish-/- se inocularon S.C. en el costado trasero con 300 μg de MCA en 0,1 ml de aceite de maíz. Los ratones fueron tratados con 250 μg de clg de hámster, 50 μg de anti-asialoGMl (anti-asGMl; agotamiento de células NK) o 250 μg de anticuerpos anti-IFN-y inyectados i.p. en los días -1,0, 7, 12, 24, 28, 35 y 42. Se controló el desarrollo de fibrosarcoma en ratones durante 200 días. Los tumores se midieron cada semana con un calibrador cuadrado como el producto de dos diámetros perpendiculares (mm2). Los ratones se sacrificaron cuando el tumor alcanzó >150 mm2 de diámetro cuadrado. Estadísticamente, se determinaron 10 diferencias significativas de supervivencia entre los grupos mediante la prueba de rango logarítmico de Mantel-Cox (a) seguida de la corrección de Bonferroni para pruebas múltiples (B) (*: p≤0,05; ***: p ≤0,001).
Figura 23: Los ratones con deficiencia de Cish muestran una mayor supervivencia en un modelo de leucemia de mieloide de acote. A los ratones Cish+/+ (WT) y Cish-/- se les inyectaron i.v. 5 x 105 células MLL-AF9. Los ratones fueron sacrificados cuando se detectó un agrandamiento del bazo y/o parálisis de las patas traseras, de acuerdo con las pautas éticas. Los resultados de la curva de supervivencia son de dos experimentos independientes. Cada grupo tenía n>5 ratones por experimento. ***p≤0,05.
Figura 24: La pérdida de la función CIS en las células NK da como resultado una mayor renovación y diferenciación hacia células NK más maduras in vivo . Se recogieron bazos de ratones Cish~/- y Cish+/+ y se procesaron en suspensiones de células individuales. La tinción superficial e intracelular se realizó mediante citometría de flujo para determinar: (A) El porcentaje de células Cish +;+ y Cish -/- en diferentes subconjuntos de células NK. Las células NK totales se identificaron como NK1.1+ NKp46+ y se subdividieron en subconjuntos de células NK inmaduras (CD27+ CD11 b-; 1 mm), MI (CD27+ CD11 b+) y M2 (CD27- CD11 b+), donde M2 denota las más maduras y citotóxicas población de células NK. (B) El número de células NK DNAM1 KLRG1+. En general, las células DNAM+ muestran una mayor producción de citocinas proinflamatorias y una mayor respuesta a IL-15, mientras que KLRG1 es considerado como un marcador de maduración alternativo (C) El porcentaje de células Ki67+ en cada subconjunto de células NK (1 mm, M1, M2). Ki67 es un marcador de proliferación celular. n=6 ratones por grupo. p≤0,05. En conjunto, estos datos muestran que, aunque el número total de células NK no difirió entre los ratones Cish+/+ y Cish~/-, las células NK CistH' eran más maduras y probablemente mostraban una mayor producción de citoquinas y citotoxicidad, al mostrar todos los subconjuntos Cish-/~ un aumento del ciclo celular.
Figura 25: El control mejorado del sarcoma MCA1956 requiere células NK y células T CD8. A grupos de 6-7 ratones B6.WT (WT; Cish+/+) y B6.Cish~/- se les inyectaron S.C. 1 x 106 células de fibrosarcoma MCA1956 y se trataron los días -1, 0, 7 y 14 en relación con la inoculación del tumor con Ig de control (clg: 50 μg de IgG de conejo más 100 μg de IgG1 de rata), 50 μg de anti-asialoGMl (anti-asGMl; agotamiento de células NK) o 100 μg de anti-CD8 (agotamiento de células T CD8+). Media ± S.E.M. de 6-7 ratones por grupo. Las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos WT y Cish-/- como se indica se determinaron mediante una prueba U de Mann-Whitney (*p≤0,05).
Figura de referencia 26 - Las células T Cish -/- CD8+ muestran una producción mejorada de IFNy. Células T CD8+ de nódulo linfático periférico de ratones Cish+/+ (WT) y Cish'A se cultivaron durante 4 días en las condiciones indicadas y se evaluó la producción de IFNy en respuesta a PMa/ionomicina durante 4 h mediante citometría de flujo. n=3 ratones. Media ± S.E.M. ***p≤0,0005, ****p≤0,0001. Los datos se analizaron utilizando un ANOVA de 2 vías.
Figura de referencia 27: Las células T Cish -/- CD8+ muestran una proliferación potenciada en condiciones de activación. Células T CD8+ de nódulo linfático periférico de ratones Cish+/+ (WT) y Cish~/- se cocultivaron durante 4 días en IL-15 con (inferior) o sin (superior) estimulación aCD28 (sin aCD3). Se evaluó el porcentaje de células que ocupan cada división por citometría de flujo. Estos datos representan n=3 ratones por genotipo. Se indica la media ± S.E.M.
Figura 28 - Los niveles de IL-15 en tumores y microambiente tumoral regulan niveles de expresión Cish en células NK residentes. Se irradiaron letalmente ratones IL-15+/+ o IL-15_/" (estado de IL-15 estromal o -respectivamente) y se reconstituyeron con médula ósea CishLacZ/+. 10 semanas más tarde, estos ratones quiméricos se expusieron a 1 x 105 E0771 de células de cáncer de mama inyectadas en la almohadilla de grasa mamaria o se dejaron sin exposición. Una semana después, los ratones se sacrificaron, los tumores mamarios se recolectaron y disociaron y las células NK residentes del tumor se tiñeron para p-galactosidasa (expresión de Cish) y se analizaron por citometría de flujo. Se indica la media ± S.E.M. La significación estadística se indica y determina mediante la prueba t de Student.
CLAVE DEL LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID NO:1 Fosfopéptido del bucle de activación de JAK1
SEQ ID NO:2 Péptido fosfomimético JAK1
SEQ ID NO:3 Fosfopéptido IL-2R0
SEQ ID NO:4 Fosfopéptido IL-2R0
SEQ ID NO:5 Fosfopéptido IL-2R0
SEQ ID NO:6 Isoforma 1 de proteína CIS humana
SEQ ID NO:7 Fragmento de isoforma 1 de proteína CIS humana
SEQ ID NO:8 Isoforma 1 de proteína CIS humana Caja SOCS
SEQ ID NO:9 Isoforma 1 de proteína CIS de Mus musculus
SEQ ID NO:10 Proteína CIS de Rattus norvegicus
SEQ ID NO:11 Proteína homo sapiens JAK1
SEQ ID NO:12 Proteína homo sapiens JAK3
SEQ ID NO:13 Precursor beta de la subunidad del receptor de IL-2 de homo sapiens
SEQ ID NO:14 Homo sapiens Elongin B
SEQ ID NO:15 Homo sapiens Elongin C
SEQ ID NO:16 Homo sapiens Cullin-5
SEQ ID NO:17 Homo sapiens JAK1 proteína péptido de dominio de quinasa JH1
SEQ ID NO:18 péptido STAT5b
SEQ ID NO:19 péptido JAK1
SEQ ID NO:20 péptido JAK3
SEQ ID NO:21 fosfopéptido IL-2R0
SEQ ID NO:22 fosfopéptido IL-2R0
SEQ ID NO:23 fosfopéptido mIL-2R0
SEQ ID NO:24 fosfopéptido IL2R0
SEQ ID NO:25 fosfopéptido IL2Ry
SEQ ID NO:26 fosfopéptido IL2Ry
SEQ ID NO:27 fosfopéptido IL2Ry
SEQ ID NO:28 fosfopéptido IL2Ry
SEQ ID NO:29 péptido de dominio CIS PEST
SEQ ID NO:30 fosfopéptido de dominio CIS PEST
SEQ ID NO:31 fosfopéptido N-terminal CIS
SEQ ID NO:32 fosfopéptido de dominio CIS PEST
SEQ ID NO:33 fosfopéptido de dominio CIS SH2/SB
SEQ ID NO:34 péptido glicosilado N-terminal
SEQ ID NO:35 péptido glicosilado CIS SH2
SEQ ID NO:36 péptido glicosilado CIS SH2
SEQ ID NO:37 péptido glicosilado CIS PEST
SEQ ID NO:38 péptido glicosilado del dominio CIS SH2/SB
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La divulgación técnica que se establece a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá del alcance de las reivindicaciones. Los elementos de la descripción que no caen dentro del alcance de las reivindicaciones se proporcionan a título informativo.
Técnicas generales y definiciones
A menos que se defina específicamente lo contrario, se considerará que todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona de conocimientos ordinarios en la técnica (p. ej., en cultivo celular, biología celular, genética molecular, biología del cáncer y su tratamiento, enfermedades infecciosas, especialmente infecciones agudas, inmunología, farmacología, química de proteínas y bioquímica).
A menos que se indique lo contrario, el cultivo celular y las técnicas inmunológicas utilizadas en la presente invención son procedimientos estándar, bien conocidos por los expertos en la técnica. Dichas técnicas se describen y explican a lo largo de la literatura en fuentes como J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover y B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 y 1996), y F.M. Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluidas todas las actualizaciones hasta el presente), Ed Harlow y David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988) y J.E. Coligan et al. (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluidas todas las actualizaciones hasta el presente).
Como se usa aquí, el término aproximadamente, a menos que se indique lo contrario, se refiere a /- 10 %, más preferiblemente /- 5 %, del valor designado.
A lo largo de esta especificación, la palabra “comprende”, o variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, se entenderá que implica la inclusión de un elemento, número entero o paso enunciado, o grupo de elementos, números enteros o pasos, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos.
Tal como se utiliza en esta solicitud, el término “o” pretende significar un “o” inclusivo en lugar de un “o” exclusivo. Es decir, a menos que se especifique lo contrario, o que quede claro por el contexto, “X emplea A o B” significa cualquiera de las permutaciones inclusivas naturales. Esto es, si X emplea a A; X emplea a B; o X emplea tanto A como B, entonces “X emplea A o B” se cumple en cualquiera de los casos anteriores. Además, al menos uno de A y B y/o similares generalmente significa A o B o ambos A y B. Además, los artículos “un” y “una” como se usan en esta solicitud y las reivindicaciones adjuntas generalmente pueden interpretarse para significar “uno o más” a menos que se especifique lo contrario o está claro del contexto para ser dirigido a una forma singular.
El término “inhibidor de CIS”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier agente que inhiba la actividad de señalización de CIS en las células n K. Dichos agentes pueden actuar para reducir específicamente la actividad de señalización de CIS en las células NK mediante cualquiera de los diferentes modos de acción que incluyen, entre otros, la reducción de los niveles totales de proteína CIS, como la reducción de los niveles de ARNm de CIS, que inhibe su unión a proteínas diana como (p. ej., JAK1) o su interacción con socios de unión de complejos de señalización como Elongin B y Elongin C. Específicamente excluidos de los “ inhibidores de CIS” como se usa en este documento, están los agentes que afectan amplia o globalmente a las proteínas además a CIS (p. ej., agentes alquilantes o agentes de reticulación) o inhibir procesos celulares básicos, p. ej., traducción (p. ej., inhibidores de la traducción) o alterar la degradación de proteínas de forma no selectiva. Los ejemplos de inhibidores de CIS incluyen, por ejemplo, polinucleótidos (p. ej., ARNip y ARNm), moléculas pequeñas, péptidos, polipéptidos o combinaciones de los mismos. En algunas formas de realización, uno o más de tales inhibidores de CIS se usan en combinación con un agente de administración y/o direccionamiento, por ejemplo, incluida la administración mediada por nanopartículas.
El término “inhibidor competitivo” o “ inhibe competitivamente” como se usa en este documento, se refiere a un modo de inhibición de una proteína diana en la que un inhibidor se une a un sitio funcionalmente crítico en una proteína diana misma (p. ej., un sitio de unión a ligando) o en un ligando (p. ej., una proteína asociada a la unión) para la proteína diana, obstaculizando estéricamente la interacción de la proteína diana con el ligando. El inhibidor competitivo puede, pero no necesariamente, tener mayor afinidad por un sitio biológicamente activo por el que compite.
El término “células NK inhibidas por CIS”, como se usa en el presente documento, se refiere a las células NK en las que la actividad de CIS se suprime mediante cualquiera de varias estrategias solas o en combinación. Por ejemplo, las células NK inhibidas por CIS incluyen, pero no se limitan a células NK “knock out” de Cish en las que el gen Cish se ha eliminado o modificado genéticamente, por ejemplo, mediante edición de genes; La proteína CIS “derriba” las células NK en las que se ha reducido la expresión de la proteína CIS mediante el uso de una estrategia de silenciamiento génico (p. ej., con ARNip o ARNi) o expresión de una variante de secuencia CIS dominante negativa, o fragmento CIS dominante negativo; o, alternativamente, las células NK inhibidas por CIS son células NK que han sido expuestas a un inhibidor de CIS (por ejemplo, un compuesto de molécula pequeña, un péptido o un agente peptidomimético) que inhibe la actividad de CIS, por ejemplo, al inhibir su unión a proteínas objetivo (p. ej., JAK1) o su interacción con socios de unión de complejos de señalización como Elongin B y Elongin C, o Cullin-5. Alternativamente, el inhibidor de CIS puede ser un péptido o fragmento derivado de CIS que actúa en trans para inhibir la actividad de CIS. En algunas formas de realización, las células NK inhibidas por CIS se inhiben irreversiblemente por CIS, por ejemplo, mediante modificación genética. En otras formas de realización, las células NK inhibidas por CIS son inhibidas por CIS de forma reversible, de modo que con el tiempo disminuye la inhibición de CIS en las células.
El término “fragmento”, como se usa en el presente documento, se refiere a una porción biológicamente activa de una proteína (p. ej., un fragmento CIS) que retiene al menos un dominio funcional o estructural. Por ejemplo, un fragmento CIS puede incluir un dominio SH2 y una caja SOCS, y un fragmento JAK1 puede incluir un dominio quinasa JH1. En algunos casos, la actividad de un fragmento se refiere a su capacidad para unirse específicamente a un compañero de unión (p. ej., una proteína o fragmento de la misma). Como se usa en el presente documento, “fragmento” no abarca una proteína de longitud completa.
El término “condición sensible a las células NK”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una condición que es susceptible de tratamiento eficaz mediante una o más actividades de células NK (p. ej., muerte de células tumorales inducida por citotoxicidad de células NK o muerte de células infectadas, y producción de interferón-y (IFN-y)). Los ejemplos de afecciones que responden a las células NK incluyen, entre otros, cánceres (p. ej., melanoma, cáncer de próstata, cáncer de mama y cáncer de hígado) e infecciones, como infecciones virales (p. ej., infecciones por HSV, virus de la hepatitis, citomegalovirus humanos, virus de influenza, flavivirus y VIH-1), infecciones bacterianas (p. ej., infecciones por micobacterias, listeria y estafilococos) e infecciones por protozoos (p. ej., infecciones por Plasmodio) e infecciones fúngicas (p. ej., infecciones por Aspergillus).
El término “péptido”, como se usa en el presente documento, se refiere a un polímero de aminoácidos que van desde dos hasta aproximadamente cincuenta aminoácidos (p. ej., 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o 45 aminoácidos de longitud). El término péptido abarca tanto péptidos no modificados, péptidos fosforilados (p. ej., fosfopéptidos) y péptidos derivados químicamente de otro modo, pero no peptidomiméticos.
El término “polipéptido” o “proteína”, como se usa en el presente documento, se refiere a un polímero de aminoácidos generalmente de más de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud y que típicamente tiene estructuras secundarias y terciarias características de la tabla.
Como comprendería el experto en la materia, los inhibidores de CIS y los inhibidores de NK inhibidos por CIS se administrarán células en una cantidad terapéuticamente eficaz. Los términos “cantidad eficaz” o “cantidad terapéuticamente eficaz”, tal como se utilizan aquí, se refieren a una cantidad suficiente de un inhibidor de CIS administrado que aliviará en cierta medida uno o más de los síntomas de la enfermedad o afección que se está tratando. El resultado puede ser la reducción y/o el alivio de los signos, síntomas o causas de una enfermedad, o cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. Por ejemplo, una “cantidad eficaz” para usos terapéuticos es la cantidad del inhibidor de CIS requerida para proporcionar una disminución clínicamente significativa de los síntomas de la enfermedad sin efectos secundarios adversos indebidos. Se puede determinar una “cantidad efectiva” apropiada en cualquier caso individual usando técnicas, tales como el estudio de aumento de dosis. El término “cantidad terapéuticamente eficaz” incluye, por ejemplo, una cantidad efectiva. Una “cantidad efectiva” de un inhibidor de CIS es una cantidad efectiva para lograr un efecto farmacológico deseado o una mejora terapéutica sin efectos secundarios adversos indebidos. Se entiende que “una cantidad de efecto” o “una cantidad terapéuticamente eficaz” puede variar de un sujeto a otro, debido a la variación en el metabolismo del compuesto de cualquier edad, peso, condición general del sujeto, la condición que se está tratando, la gravedad de la condición que se está tratando, y el juicio del médico que prescribe. Solo a modo de ejemplo las cantidades terapéuticamente efectivas pueden determinarse mediante experimentación de rutina, que incluye, entre otros, un ensayo clínico de aumento de dosis. Cuando se usa más de un agente terapéutico en combinación, una “cantidad terapéuticamente efectiva” de cada agente terapéutico puede referirse a una cantidad del agente terapéutico que sería terapéuticamente efectiva cuando se usa solo, o puede referirse a una cantidad reducida que es terapéuticamente eficaz en virtud de su combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales.
El término “molécula pequeña”, como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que tiene un peso molecular inferior a 2000 daltons.
El término “ARNm modificado químicamente” o “ARNsi modificados químicamente” como se ha utilizado aquí se refiere a los ARN sintéticos generados in vitro, donde una proporción (p. ej., 10 %, 30 %, 50 % o 100 %) de al menos un tipo de nucleótido, p. ej., citosina, se modifica químicamente para aumentar su estabilidad dentro de células o de otro modo in vivo. Por ejemplo, en algunos casos las cistosinas modificadas son 5-metilcitosinas. Dichos polinucleótidos son particularmente útiles para la entrega/transfección a células in vivo, especialmente cuando se combinan con un agente de transfección/entrega. En algunos casos, un ARNm modificado químicamente es un ARNm modificado químicamente en el que la mayoría de (p. ej., todas) las cistosinas son 5-metilcitosinas, y donde la mayoría (p. ej., todos) de los uracilos son pseudouracilos. La síntesis y el uso de dichos ARN modificados se describen, por ejemplo, en el documento WO 2011/130624.
Los términos “tratar” o “tratamiento” como se usan en este documento, se refieren tanto al tratamiento directo de un sujeto por un profesional médico (p. ej., mediante la administración de un agente terapéutico al sujeto), o tratamiento indirecto, efectuado por al menos una de las partes (p. ej., un médico, una enfermera, un farmacéutico o un representante vendedor farmacéutico)proporcionando instrucciones, en cualquier forma, que (i) instruya a un sujeto para que se autotrate de acuerdo con un método reivindicado (por ejemplo, autoadministrarse un medicamento) o (ii) instruya a un tercero para que trate a un sujeto de acuerdo con un método reivindicado. También se incluyen dentro del significado del término “tratar” o “tratamiento” la prevención o reducción de la enfermedad a tratar, por ejemplo, mediante la administración de un tratamiento en una fase suficientemente temprana de la enfermedad para prevenir o retardar su progresión.
El término “en riesgo”, como se usa en este documento, se refiere a una probabilidad de desarrollar una condición de salud que es mayor que en la población general. En consecuencia, el tratamiento de un individuo considerado como “en riesgo” de una condición particular está diseñado para evitar que un sujeto desarrolle la afección o al menos para reducir el riesgo de desarrollar la afección a un nivel no superior al que se encuentra en la población general en su conjunto.
Los términos “coadministración” o similares, tal como se usan en este documento, pretenden abarcar la administración de los agentes terapéuticos seleccionados a un solo paciente, y pretenden incluir regímenes de tratamiento en los que los agentes se administran por la misma o diferente vía de administración o en el mismo o diferente momento.
Métodos de tratamiento
El método para la terapia celular adoptiva incluye la administración de células NK inhibidas por CIS a un sujeto que padecía una condición sensible a células NK.
En algunas formas de realización, el sujeto que padece una afección sensible a las células NK, o en riesgo de padecer una afección sensible a las células NK, sufre un trastorno proliferativo tal como un cáncer. En algunas formas de realización, el sujeto que padece un cáncer padece un cáncer que se caracteriza por la presencia de uno o más tumores en el sujeto. Los ejemplos de cánceres adecuados para el tratamiento mediante los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan al cáncer es melanoma metastásico, cáncer de próstata metastásico, cáncer de mama metastásico, cáncer de mama triple negativo, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de esófago, cáncer de hígado, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón de células escamosas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células de Merkel, sarcoma, cáncer hepatocelular, cáncer de mieloma múltiple, cáncer de páncreas, carcinoma colorrectal, cáncer de cuello uterino, carcinoma gástrico, cáncer de riñón, carcinoma de células renales metastásico, leucemia, cáncer de ovario y glioma maligno. En algunas formas de realización preferidas, el cáncer es melanoma metastásico, cáncer de próstata metastásico o cáncer de mama metastásico. En algunas formas de realización, el sujeto ha recibido un injerto de tejido alogénico asociado con el tratamiento del cáncer, por ejemplo, después de un trasplante de células madre hematopoyéticas utilizado para el tratamiento de una leucemia.
También se describe aquí un método para aumentar la capacidad de respuesta de las células NK a la IL-15 mediante la inhibición de CIS en las células NK. En algunas formas de realización, la capacidad de respuesta de las células NK a IL-15 aumenta mediante la inhibición de CIS en células NK ex vivo (p. ej., en células NK cultivadas). En otras formas de realización, la capacidad de respuesta de las células NK a IL-15 aumenta al inhibir CIS en células NK in vivo, por ejemplo, mediante la administración de un inhibidor de CIS a un sujeto. En algunas formas de realización, dicho método comprende reducir la expresión de CIS en células NK ex vivo. Opcionalmente, las células NK en las que se reduce la expresión de CIS ex vivo pueden ser células NK autólogas derivadas de un sujeto y posteriormente trasplantadas al paciente donante tras la reducción de la expresión de CIS ex vivo. En otras formas de realización, las células NK pueden ser células NK alogénicas, es decir, obtenidas de una fuente donante diferente del sujeto receptor. En algunas formas de realización, el sujeto es un paciente con cáncer. En otras formas de realización, el sujeto es un donante de células NK. Opcionalmente, dichos métodos pueden incluir el contacto de células NK ex vivo o in vivo con IL-15 exógena.
Métodos de diagnóstico
Como se describe en este documento, la IL-15 induce la expresión de Cish como parte de un ciclo de retroalimentación negativa que reduce la respuesta inmunitaria de las células NK a los tumores. Como se describe en el presente documento, cuando el nivel de IL-15 es elevado en el microentorno de un tumor/tipo de tumor particular, también aumenta la expresión de Cish en las células NK que infiltran el tumor. Si bien no se desea ceñirse a la teoría, se cree que el aumento de la expresión de Cish en células NK infiltrantes de tumores indica una mayor probabilidad de que la inhibición de Cish sea eficaz para mejorar la respuesta inmunitaria mediada por NK a un tumor. Por consiguiente, en algunas formas de realización, la probabilidad de respuesta al tratamiento con inhibición de Cish en un paciente que padece un tumor se evalúa determinando un nivel de IL-15 en el microambiente tumoral (p. ej., mediante una biopsia tumoral), en donde un nivel elevado de IL-15 en el microambiente tumoral en relación con un nivel de umbral de iL-15 indica una mayor probabilidad de respuesta al tratamiento.
De manera similar, en algunas formas de realización, se analiza la inducción de expresión elevada de Cish en células NK infiltrantes de tumor en un sujeto que padece un tumor determinando un nivel de IL-15 en el microambiente tumoral, en donde un nivel elevado de IL-15 en el microambiente tumoral en relación con un nivel umbral de IL-15 indica la inducción de expresión elevada de Cish en las células NK infiltrantes del tumor.
Puede determinarse un nivel “umbral” de IL-15 basándose, por ejemplo, en la comparación de un nivel de IL-15 en un tejido de control. Los niveles de umbral adecuados pueden ser determinados fácilmente por un experto en la materia usando experimentación de rutina.
Como se usa aquí, el término “sujeto” puede ser cualquier animal. En un ejemplo, el animal es un vertebrado. Por ejemplo, el animal puede ser un mamífero, un ave, un cordado, un anfibio o un reptil. Los sujetos ejemplares incluyen, entre otros, humanos, primates, ganado (p. ej., ovejas, vacas, pollos, caballos, burros, cerdos), animales de compañía (p. ej., perros, gatos), animales de prueba de laboratorio (p. ej., ratones, conejos, ratas, cobayos, hámsteres), animal cautivo salvaje (por ejemplo, zorro, ciervo). En un ejemplo, el mamífero es un ser humano.
Los síntomas, las pruebas de diagnóstico y las pruebas de pronóstico para cada una de las condiciones mencionadas anteriormente se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Harrison's Principles of Internal Medicine©.” 19.a ed., Vols. 1 y 2, 2015, The McGraw-Hill Companies, Inc.
Una serie de modelos animales son útiles para establecer una gama de dosis terapéuticamente efectivas de inhibidores de CIS para tratar cualquiera de las condiciones de respuesta a NK anteriores. Por ejemplo, se han establecido varios modelos de cáncer en ratones, por ejemplo, para melanoma (Walker et al., 2011), para cáncer de próstata (Grabowska et al., 2014) y para cáncer de mama (Borowsky, 2011).
Inhibidores de la CIS
La inhibición de CIS, como se usa en este documento, se refiere a la reducción de uno o más de la expresión del gen Cish neto, niveles netos de proteína CIS, o actividad de CIS (p. ej., su inhibición de la actividad de la quinasa JAK1 o su direccionamiento de JAK1 para la proteólisis). La inhibición de CIS puede incluir al menos alrededor de un 10 % a un 100 % de reducción en el nivel de actividad de CIS en presencia de, o como resultado de una dosis determinada del inhibidor de CIS en relación con el nivel de actividad de CIS en su ausencia, p. ej., 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% u otra reducción de porcentaje en la actividad de CIS de alrededor del 10% a alrededor del 100%. En algunas formas de realización, se administra un inhibidor de CIS a un sujeto a tratar. En otras formas de realización, se aplica un inhibidor de CIS ex vivo a las células NK para obtener células NK inhibidas por CIS, que posteriormente se administran al sujeto como agente terapéutico. En algunas formas de realización, un inhibidor de CIS es un inhibidor reversible de CIS. En otras formas de realización, el inhibidor de CIS es un inhibidor irreversible de la CIS.
Polinucleótidos
En algunas formas de realización, un inhibidor de CIS es un polinucleótido, que puede inhibir la actividad de CIS mediante al menos uno de los diversos mecanismos descritos.
Polinucleótidos que codifican péptidos o polipéptidos
En algunas formas de realización, el inhibidor de CIS polinucleótido contiene una nucleasa programable que inhibe la actividad de CIS inactivando o reduciendo la expresión del gen Cish. Como se usa en este documento, el término “nucleasa programable” se refiere a las nucleasas que son “dirigidas” (“programadas”) para reconocer y editar una ubicación genómica predeterminada. En algunas formas de realización, el polipéptido codificado es una nucleasa programare “dirigida” o “programada” para introducir una modificación genética en el gen Cish o en la región reguladora del mismo. En algunas formas de realización, la modificación genética es una deleción o sustitución en el gen Cish o en una región reguladora del mismo. Las nucleasas tan programables son particularmente útiles para generar células NK Cish~/- inhibidas por CIS ex vivo, por ejemplo, para generar células n K autólogas Cish^~ para uso en terapia celular adoptiva.
En algunas formas de realización, la nucleasa programable puede programarse para reconocer una ubicación genómica mediante una combinación de dominios de proteína con dedos de zinc (ZFP) que se unen al ADN. Las ZFP reconocen un 3-bp específico en una secuencia de a Dn , una combinación de los ZFP se puede usar para reconocer una ubicación genómica específica. En algunas formas de realización, la nucleasa programable puede programarse para reconocer una ubicación genómica mediante dominios de unión a ADN de efectores de tipo activador de transcripción (TALE). En una forma de realización alternativa, la nucleasa programable puede programarse para reconocer una ubicación genómica por una o más secuencias de ARN. En una forma de realización alternativa, la nucleasa programable puede programarse mediante una o más secuencias de ADN. En una forma de realización alternativa, la nucleasa programable puede programarse mediante una o más secuencias híbridas de ADN/ARN. En una forma de realización alternativa, la nucleasa programable puede programarse mediante una o más secuencias de ARN, secuencias de ADN y una secuencia de a Dn /ARN híbrida.
Las nucleasas programables que se pueden usar de acuerdo con la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a nucleasa diseñada guiada por ARN (RGEN) derivada del sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas bacterianos (CRISPR)-cas (asociadas a CRISPR), nucleasa de dedo de zinc (ZFN), nucleasas de transcripción similares a activadores (TALEN) y argonautas.
En algunas formas de realización, la nucleasa es una nucleasa modificada por ingeniería guiada por ARN (RGEN). En algunas formas de realización, el RGEN procede de un genoma de arqueas o es una versión recombinante del mismo. En algunas formas de realización, el RGEN es de un genoma bacteriano o es una versión recombinante del mismo. En algunas formas de realización, el RGEN es de un Sistema Tipo I (CRISPR)-cas (asociado a CRISPR). En algunas formas de realización, el RGEN es de un sistema Tipo II (CRISPR)-cas (asociado a CRISPR). En algunas formas de realización, el RGEN es de un sistema Tipo III (CRISPR)-cas (asociado a CRISPR). En algunas formas de realización, la nucleasa es un RGEN de clase I. En algunas formas de realización, la nucleasa es un RGEN de clase II. En algunas formas de realización, el RGEN es una enzima de múltiples componentes. En formas de realización, el RGEN es una enzima de un solo componente. En algunas formas de realización, el RGEN es CAS3. En algunas formas de realización, el RGEN es CASIO. En algunas formas de realización, el RGEN es CAS9. En algunas formas de realización, el RGEN es Cpf1 (Zetsche et al., 2015). En algunas formas de realización, el RGEN está dirigido por un solo ARN o ADN. En algunas formas de realización, el RGEN es el objetivo de más de un ARN y/o ADN. En algunas formas de realización, la nucleasa programable puede ser un argonauta programado por ADN (documento WO 14/189628).
En algunas formas de realización, el polinucleótido inhibidor de CIS se proporciona en un vector de expresión para administrarse in vivo o in vitro a las células NK utilizando cualquiera de los métodos de transfección conocidos en la técnica, por ejemplo, transducción de virus recombinantes, transfección basada en liposomas, electroporación o transfección basada en nanopartículas.
Como se usa en el presente documento, un “vector de expresión” es un vector de ADN o ARN que es capaz de efectuar la expresión de uno o más polinucleótidos en una célula huésped (p. ej., una célula NK). El vector suele ser un plásmido o un virus recombinante. Puede usarse cualquier vector de expresión adecuado, cuyos ejemplos incluyen, pero no se limitan a un plásmido o un vector viral. En algunas formas de realización, el vector viral es un retrovirus, un lentivirus, un adenovirus, un virus del herpes o un vector viral adenoasociado.
Dichos vectores incluirán uno o más promotores para expresar el polinucleótido, como un ARNbc para silenciar genes. Los promotores adecuados incluyen, pero no se limitan al LTR retroviral; el promotor SV40; y el promotor humano de citomegalovirus (CMV). También se pueden usar promotores celulares tales como promotores celulares eucarióticos que incluyen, pero no se limitan a la histona, la a Rn polimerasa 111 (en el caso de la expresión de ARNhc o miARN) y los promotores de -actina. En algunas formas de realización, el promotor es un promotor selectivo de células NK tal como el promotor NKp46 humano (ver, por ejemplo, Walzer et al., 2007). La selección de un promotor adecuado será evidente para los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas contenidas en este documento.
Células NK inhibidas por CIS
En algunas formas de realización, las células NK inhibidas por CIS a administrar son autólogas, es decir, derivadas de un sujeto a tratar. En otras formas de realización, las células NK inhibidas por CIS que se van a administrar son células NK alogénicas.
En otras formas de realización, las células NK inhibidas por CIS son células NK modificadas genéticamente en las que uno o ambos alelos Cish se han inactivado mediante una modificación genómica dirigida, por ejemplo, mediante la eliminación de uno o más exones, la introducción de un codón de terminación o la inactivación del promotor. Métodos para la modificación de loci genómicos en ambas líneas celulares y las células primarias están bien establecidas en la técnica. Por ejemplo, las nucleasas programables, por ejemplo, el sistema Cas9-CRISPR es muy eficiente y se usa de forma rutinaria para la interrupción dirigida de genes.
Las células NK se pueden obtener por cualquiera de varios métodos diferentes, que incluyen aislamiento y expansión de células NK de una fuente primaria, diferenciación y expansión de células madre hematopoyéticas (CMH), diferenciación y expansión de células madre pluripotentes inducidas por humanos (CMPih) o diferenciación de otro tipo de células madre pluripotentes.
En algunas formas de realización, las células NK se aíslan de un sujeto humano, por ejemplo, un paciente a tratar en el caso de terapia celular adoptiva autóloga.
Las células NK pueden aislarse o enriquecerse tiñendo células de una fuente de tejido, por ejemplo, sangre periférica, con anticuerpos contra CD56 y CD3, y seleccionando células CD56+CD3-. Las células TSNK se pueden aislar utilizando un kit comercialmente disponible, por ejemplo, el kit de aislamiento de células NK (Miltenyi Biotec). Las células NK también se pueden aislar o enriquecer mediante la eliminación de células distintas de las células NK en una población de células que comprende las células NK. Por ejemplo, las células NK se pueden aislar o enriquecer mediante el agotamiento de las células que muestran marcadores de células no NK usando, por ejemplo, anticuerpos contra uno o más de CD3, CD4, CD14, CD19, CD20, CD36, CD66b, CD123, HLA DR y/o o CD235a (glicoforina A). El aislamiento negativo se puede llevar a cabo utilizando un kit disponible en el mercado, por ejemplo, el kit de aislamiento de células negativas NK (dinámico). Las células aisladas mediante estos métodos pueden clasificarse adicionalmente, por ejemplo, para separar células Cd 56+/CD16- y CD56VCD16+.
La separación de células se puede lograr, por ejemplo, mediante citometría de flujo, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o, preferiblemente, clasificación de células magnéticas utilizando microperlas conjugadas con anticuerpos específicos. Las células se pueden aislar, por ejemplo, utilizando una técnica magnética de clasificación de células activadas (MACS), un método para separar partículas en función de su capacidad para unir perlas magnéticas (p. ej., de aproximadamente 0,5-100 μm de diámetro) que comprenden uno o más anticuerpos específicos, p. ej., anticuerpos anti-CD56. La separación de células magnéticas se puede realizar y automatizar utilizando, por ejemplo, un AUTOMACS™. Separador (Miltenyi). Se puede realizar una variedad de modificaciones útiles en las microesferas magnéticas, que incluyen la adición covalente de un anticuerpo que reconoce específicamente una molécula o hapteno de la superficie celular en particular. A continuación, las perlas se mezclan con las células para permitir la unión. A continuación, las células se pasan a través de un campo magnético para separar las células que tienen el marcador de superficie celular específico. En una forma de realización, estas células se pueden aislar y volver a mezclar con perlas magnéticas acopladas a un anticuerpo contra marcadores de superficie celular adicionales. Las células se pasan nuevamente a través de un campo magnético, aislando las células que unen ambos anticuerpos. A continuación, dichas células se pueden diluir en placas separadas, como placas de microtitulación para el aislamiento clonal.
La diferenciación de células NK humanas de CMH se describe, por ejemplo, en U.S. 8.926.964 y de hiPSCs en US 20130287751.
Los métodos para cultivar y expandir células NK, particularmente células NK humanas para obtener células NK de grado clínico para terapia celular adoptiva, se describen en la técnica, como se revisa, por ejemplo, en Childs et al. (2013).
Administración de células NK inhibidas por CIS
Las células inhibidas por NK pueden administrarse por cualquier vía adecuada como se conoce en la técnica. En algunas formas de realización, las células se administran sistémicamente como una vía intraarterial o infusión intravenosa. Un experto en la técnica apreciará que la vía de administración seleccionada de células NK inhibidas por CIS dependerá en parte de la condición de respuesta a NK particular que se va a tratar. Por ejemplo, cuando el sujeto sufre la presencia de uno o más tumores, en algunas formas de realización, la vía de administración incluirá administración intratumoral y/o administración peritumoral. Otras rutas ejemplares de administración incluyen intraperitoneal, intratecal e intralinfática.
Las células NK inhibidas por CIS se pueden administrar a un individuo, en cualquier cantidad o número que resulte en un beneficio terapéutico o profiláctico detectable para el individuo, por ejemplo, una cantidad eficaz, en la que el individuo tiene un cáncer. En algunas formas de realización la dosis de células inhibidas por CIS a administrar es simplemente un número absoluto de células, por ejemplo, a dicho individuo se le puede administrar alrededor de 1 x 105 células, 5 x 105 células, 1 x 106 células, 7 x 106 células, 1 x 107 células, 6 x 107 células, 2 x 108 células, 5 x 108 células, 1 x 109 células, 6 x 109 células, 2 x 1010 células, 5 x 1010 células o 1 x 1011 células.
En otras formas de realización, las células NK inhibidas por CIS se administran a un sujeto mediante un número de células en relación con el peso del sujeto a tratar, por ejemplo aproximadamente 1 x 105 células, 5 x 105 células, 1 x 106 células, 7 x 106 células, 1 x 107 células, 6 x 107 células, 2 x 108 células, 5 x 108 células, 1 x 109 células o 6 x 109 células por kilogramo del sujeto a tratar.
En otras formas de realización, cuando el sujeto a tratar padece uno o más tumores, las células NK inhibidas por CIS se administran en función de una relación aproximada deseada de células NK inhibidas por CIS a un número aproximado de células tumorales en el sujeto a tratar. Por ejemplo, las células NK inhibidas por CIS pueden administrarse en una proporción (células NK a células tumorales) de aproximadamente 1:1, 1:1,3:1,4:1,5:1,9:1, 10:1, 15:125:1, 30:1, 40:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 75:1, 80:1, 90:1, 95:1 o 100:1. El número de células tumorales se puede estimar mediante, por ejemplo, la determinación del número de células tumorales en una muestra de tejido, por ejemplo, una muestra de sangre, biopsia, o similar. En algunas formas de realización, por ejemplo, para tumores sólidos, la estimación del número de células tumorales se puede realizar mediante una combinación de recuento de células en biopsias e imágenes de tumores para estimar el volumen tumoral y el número de células residentes.
Tratamientos combinados
Composiciones de células NK inhibidas por CIS también se pueden usar en combinación con otros agentes de valor terapéutico en el tratamiento de condiciones de salud sensibles a NK, por ejemplo, cáncer. En general, otros agentes no tienen que administrarse necesariamente en la misma composición farmacéutica y, debido a las diferentes características físicas y químicas, pueden administrarse preferiblemente por diferentes vías. La determinación del modo de administración y la conveniencia de la administración, cuando sea posible, en la misma composición farmacéutica, está dentro del conocimiento del médico experto. La administración inicial puede realizarse según protocolos establecidos conocidos en la técnica, y, a continuación, en base a los efectos observados, el médico experto puede modificar la dosis, los modos de administración y los tiempos de administración.
Es conocido por los expertos en la técnica que las dosis terapéuticamente eficaces pueden variar cuando los medicamentos se usan en combinaciones de tratamiento. En la bibliografía se describen métodos para determinar experimentalmente dosificaciones terapéuticamente eficaces de fármacos y otros agentes para uso en regímenes de tratamiento combinado. Por ejemplo, el uso de dosificación metronómica, es decir, proporcionar dosis más bajas y más frecuentes para minimizar los efectos secundarios tóxicos, se ha descrito ampliamente en la literatura. El tratamiento combinado incluye además tratamientos periódicos que comienzan y terminan en varios momentos para ayudar con el manejo clínico del paciente.
Para las terapias combinadas, las dosis de los agentes terapéuticos coadministrados variarán, por supuesto, según el tipo de coagentes empleados y la condición sensible a células NK a tratar.
Se entiende que el régimen de dosificación para tratar, prevenir o mejorar la(s) condición(es) para las cuales se busca alivio, puede modificarse de acuerdo con una variedad de factores. Estos factores incluyen la afección que padece el sujeto, así como la edad, el peso, el sexo, la dieta y el estado médico general del sujeto. Por lo tanto, el régimen de dosificación realmente empleado puede variar ampliamente y, por lo tanto, puede desviarse de los regímenes de dosificación establecidos en este documento.
Los agentes farmacéuticos que componen la terapia de combinación también pueden administrarse secuencialmente, administrándose cualquiera de los compuestos terapéuticos mediante un régimen que requiere una administración en dos etapas. El régimen de administración de dos pasos puede requerir la administración secuencial de los agentes activos o la administración espaciada de los agentes activos separados. El período de tiempo entre los múltiples pasos de administración puede oscilar entre unos pocos minutos y varias horas, dependiendo de las propiedades de cada agente farmacéutico, como potencia, solubilidad, biodisponibilidad, vida media plasmática y perfil cinético del agente farmacéutico. También se puede evaluar la variación circadiana de varios parámetros fisiológicos para determinar el intervalo de dosis óptimo.
La administración inicial puede ser a través de cualquier práctica muda, como, por ejemplo, una inyección intravenosa, una inyección en bolo, una infusión durante 5 minutos a aproximadamente 5 horas, una píldora, una cápsula, un inhalador, una inyección, un parche transdérmico, administración bucal y similares, o una combinación de los mismos. Un compuesto debe administrarse tan pronto como sea posible después de que se detecte o sospeche la aparición de una enfermedad o afección, y durante el tiempo necesario para el tratamiento o la prevención de la afección que responde a las células NK.
Opcionalmente, al sujeto también se le puede administrar IL-15 o un agonista de IL-15 a una dosis que es terapéuticamente efectiva cuando se combina con el tratamiento usando células NK inhibidas por CIS. Los agonistas de IL-15 incluyen homólogos funcionales de IL-15 como los descritos en, por ejemplo, Wu (2013). En otras formas de realización, cualquiera de los tratamientos de la invención puede incluir, además, la administración de uno o más agentes inmunoterapéuticos. Los agentes inmunoterapéuticos adecuados para usar en combinación con la inhibición de CIS o la inhibición de CIS en combinación con IL-15 o un agonista de IL-15 pueden incluir, entre otros, un anticuerpo contra el receptor de muerte celular programada 1 (PD-1), un anticuerpo contra el ligando de muerte programada 1 (PD-L1), un anticuerpo contra la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), un anticuerpo contra el factor de crecimiento transformante beta (TGF-b), un anticuerpo contra Tactile (CD96), o una combinación de los mismos.
En otras formas de realización, cualquiera de los tratamientos de la invención puede incluir además la administración de un inhibidor de la proteína quinasa B-Raf o un inhibidor de la proteína quinasa MEK. Los ejemplos de inhibidores de la proteína quinasa B-Raf incluyen, entre otros, PLX4032 (vemurafenib), PLX-4720, dabrafenib (GSK2118436), AZ6 2 8 , RAF265 (CHIR-265), Encorafenib (LGX818), SB590885 y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de inhibidores de la proteína quinasa MEK incluyen, entre otros, trametinib (GSK1120212), cobimetinib, binimetinib (MEK162), selumetinib (PD-325901), combinaciones de los mismos. En algunas formas de realización, cualquiera de los tratamientos anteriores puede incluir además la administración de un antagonista del receptor de TGF-beta. Los ejemplos de antagonistas del receptor de TGF-beta adecuados incluyen, entre otros, Galunisertib (LY2157299), GW 788388, LY 364947, R268712, SB 525334 y SD208.
Formas de dosificación
Las composiciones útiles para la invención se pueden formular para la administración a un sujeto a través de cualquier medio convencional, incluidos, entre otros, la administración oral, parenteral (p. ej., intravenosa, subcutánea o intramuscular), bucal, por inhalación, intranasal, rectal o transdérmica.
Formulaciones inyectables
Las formulaciones adecuadas para inyección intramuscular, subcutánea o intravenosa pueden incluir soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas estériles fisiológicamente aceptables y polvos estériles para reconstituir en soluciones o dispersiones inyectables. Ejemplos de cámaras, diluyentes, disolventes o vehículos acuosos y no acuosos adecuados, incluidos agua, etanol, polioles (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, cremophor y similares), mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (como el aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables como el oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones y por el uso de tensioactivos. Las formulaciones adecuadas para inyección subcutánea también pueden contener aditivos tales como agentes conservantes, humectantes, emulsionantes y dispensadores. La prevención del crecimiento de microorganismos puede garantizarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, tales como parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, como azúcares, cloruro de sodio y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede lograrse mediante el uso de agentes que retrasan la absorción, como el monoestearato de aluminio y la gelatina.
Para inyecciones intravenosas, los compuestos pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. Para la administración transmucosa, se utilizan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a permear. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica. Para otras inyecciones parenterales, las formulaciones apropiadas pueden incluir soluciones acuosas o no acuosas, preferiblemente con tampones o excipientes fisiológicamente compatibles. Dichos excipientes son generalmente conocidos en la técnica.
Las inyecciones parenterales pueden implicar una inyección en bolo o una infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis, con un conservante añadido. La composición farmacéutica puede estar en una forma adecuada para inyección parenteral como suspensiones, soluciones o emulsiones estériles en vehículos oleosos o acuosos, y puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Formulaciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Además, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para la reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en formas de dosificación unitaria adecuadas para la administración única de dosificaciones precisas. En forma de dosificación unitaria, la formulación se divide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas de uno o más compuestos. La dosificación unitaria puede estar en forma de un paquete que contiene cantidades discretas de la formulación. Los ejemplos no limitantes son tabletas o cápsulas envasadas y polvos en viales o ampollas. Las composiciones de suspensión acuosa se pueden envasar en contenedores resellables de monodosis. Como alternativa, se pueden usar envases que se pueden volver a cerrar de dosis múltiples, en cuyo caso es típico incluir un conservante en la composición. Únicamente a modo de ejemplo, las formulaciones para inyección parenteral pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, que incluyen, entre otras, ampollas, o en envases multidosis, con un conservante añadido.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 - Materiales y Métodos
Ratones
Cish-/- fueron proporcionados generosamente por el Prof. James Ihle y el Dr. Evan Parganas en St. Jude Children's Research Hospital, Memphis (EE. UU.) y se mantuvieron en un fondo C57BL/6. Cish+/+ se refiere a ratones de control de tipo salvaje C57BL/6. Ratones Rosa26-CreERT2 (TaconicArtemis), Socs3-loxP (Croker et al., 2003), Ifng-/-Socs1-/- (Alexander et al., 1999) y Ncrl-iCre (Nami-Mancinelli et al., 2011) han sido descritos anteriormente. Se usaron ratones macho y ratones hembra entre las edades de 6-14 semanas. Todos los ratones fueron criados y mantenidos en el Instituto Walter y Eliza Hall. Los experimentos con animales siguieron las pautas del Código de Práctica para el Cuidado y Uso de Animales con Fines Científicos del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud (NHMRC) y fueron aprobados por el Walter and Eliza Hall Institute animal Ethics Committee o el QIMR Berghofer Medical Research Institute Animal Ethics Committee.
Purificación y cultivo de células NK
Se recogieron células asesinas naturales murinas de varios órganos (bazo, médula ósea, sangre) y se prepararon suspensiones de células individuales forzando los órganos a través de tamices de 70 μm. Los linfocitos se aislaron del hígado mediante suspensión en percoll isotónico (Amersham Pharmacia Biotech) y centrifugación a 1800 x g. Las células NK se purificaron utilizando microesferas anti-CD49b (DX5) (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Las células NK se expandieron durante 5-10 días mediante cultivo en medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) suplementado con suero de ternero fetal (FCS) al 10 % (v/v), L-glutamina (1 mM; Gibco), estreptomicina (100 μg/ml; Sigma), penicilina (100 UI/ml; Sigma), gentamicina (50 ng ml-1; Sigma) y hIL-15 recombinante (50 ng ml'1; Peprotech).
Secuenciación de ARN y análisis bioinformático
Se realizó una secuenciación de ARN de un solo extremo de 100 pares de bases para dos réplicas biológicas de 1x106 Cish+/+ y Cish-/- NK1.1+NKp46+TCRb-Células NK cultivadas en 50 ng ml-1 IL-15 durante 7 días y dos réplicas biológicas de 1x106 células recién aisladas Cish+/+ y Cish'1' NK1.1+NKp46+TCRp- NK utilizando Illumina HiSeq2000 en el Centro de Investigación Genómica de Australia, Melboume. Las lecturas se alinearon con la compilación GRCm38/mm10 del genoma de Mus musculus utilizando el alineador Subread. Los conteos genéticos se obtuvieron utilizando FeatureCounts. Se incluyeron lecturas de exones superpuestos en la compilación de anotaciones 38.1 de la base de datos NCBI RefSeq. Los genes se filtraron del análisis posterior si no lograban un valor de CPM (recuentos por millón de lecturas asignadas) de al menos 0,5 en al menos dos bibliotecas. Los conteos se convirtieron a log2 conteos por millón, se normalizaron por cuantiles y se ponderaron con precisión con la función voom del paquete limma. Se utilizaron modelos lineales y métodos empíricos de bayes para evaluar la expresión diferencial en experimentos ARNseq. Los genes se llamaban diferencialmente expresados si lograban una tasa de descrubrimiento falsa de 0,1 o menos y también tenían al menos 8 FPKM (fragmentos por kilobases por millón de lecturas mapeadas) en uno o ambos de los dos tipos de células que se comparan. Los mapas de calor se generaron utilizando el paquete de gráficos g, con valores negativos de log2 FPKM restablecidos a cero. Todos los análisis se llevaron a cabo utilizando paquetes Bioconductor R.
Ensayos de proliferación de células NK in vitro
Se sembraron células diana (CHO, B16F10) en los pocillos de placas E 96X en 100 μl de medio. El crecimiento celular se controló dinámicamente con el sistema RT CES® basado en impedancia hasta que alcanzaron la fase de crecimiento logarítmico y formaron una monocapa (aproximadamente 24 h). A continuación, las células NK Cish+/+ y Cish'/' cultivadas a diferentes concentraciones se añadieron directamente a los pocillos individuales que contenían las células diana. Para los controles de fondo, se añadieron células NK a pocillos que no contenían células diana y se añadieron células diana a pocillos sin la adición de células NK. Después de la adición de células NK, el sistema continuó tomando medidas cada 15 min hasta 48 h.
Citometría de flujo y clasificación de células
Las suspensiones de células individuales se tiñeron con el anticuerpo monoclonal apropiado en la solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía FCS al 2% (v/v). Cuando necesario, se realizó la tinción intracelular mediante el uso del juego de tampones de tinción FoxP3/Factor de transcripción (eBioscience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron FACS Verse, Fortessa y AriaII (BD Biosciences) para la clasificación y el análisis de las células, excluyéndose las células muertas mediante tinción con yoduro de propidio o Fluoro-Gold. Todas las suspensiones unicelulares se diluyeron en PBS antes del análisis y se enumeraron utilizando el analizador de hematología Advia (Siemens). Anticuerpos específicos para NK1.1 (PK136; 1:100), CD19 (1D3; 1:500), CD3 (17A2; Biolegend; 1:400) CD122 (TM-bl; 1:200), CD132 (4G3; 1:200), NKp46 (29Al.4; 1:100), TCR-(H57-5921; 1:500), KLRGl (2Fl; 1:100), CD27 (LG.7F9;
5 1:200), FoxP3 (FJK-16s; eBioscience; 1:400), CD25 (PC61; BioLegend; 1:100), Sca-1 (D7; 1:100), B220 (RA3-6B2; eBioscience; 1:100), Gr-1 (1A8; 1:200), Granzima A (GzA-3G8.5; eBioscience; 1:200), Granzima B (NGZB; eBioscience; 1:200), CD107a (104B; 1:100) e IFN-y (XMG1.2; 1:100) eran de BD Pharmingen a menos que se indique lo contrario.
PCR cuantitativa en tiempo real (Q-PCR)
El ARN total se aisló usando el kit RNeasy plus (QIAGEN) y la síntesis de ADNc se realizó con Superscript 111 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones de PCR se realizaron en 10 μL; 5 μL de FastStart SYBR Green Master Mix (Roche), 0,5 pmol de cebadores directo e inverso y 4 μL de ADNc. Se han descrito secuencias de cebadores y condiciones de PCR (Kolesnik y Nicholson, 2013). La Q-Pc R en tiempo real se realizó en un sistema de detección de secuencias ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems). Los niveles de ARNm se cuantificaron frente a las curvas estándar generadas utilizando diluciones secuenciales de un oligonucleótido correspondiente a cada fragmento de PCR amplificado y usando el software SDS2.2 (Applied Biosystems). La expresión relativa se determinó mediante la normalización de la cantidad de cada gen de interés con respecto al gen de limpieza gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Cada condición tenía tres réplicas biológicas y las mediciones se realizaron por duplicado. El análisis estadístico se realizó utilizando una prueba t no pareada con un nivel de confianza del 95%.
Transferencia Western y transfecciones transitorias
Se recogieron aproximadamente 1,5 x 108 células NK por muestra y se lisaron en 2,5 ml de tampón de lisis KALB (Nicholson et al., 1995) suplementado con inhibidores de la proteasa (Complete Cocktail tablets, Roche), PMSF 1 mM, Na3VÜ41 mM y NaF 1 mM y se incubaron durante 1 h en hielo. Los lisados se clarificaron por centrifugación a 16.060 x g durante 15 min a 4°C. Las concentraciones de proteína se determinaron por el método BCA (Pierce, Rockford). Las células 293T se mantuvieron en DMEM suplementado con 100 U/ml de penicilina, 0,1 ng m1-1 de estreptomicina y FCS al 10 % y se transfectaron transitoriamente con vector solo o ADNc que expresaba Jak1, Jak3, Cish o mutantes de Cish de ratón marcados con Flag o Cish de ratón etiquetado con Myc, usando FuGene6 (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos casos, las células se pretrataron con MG132 10 μM durante 4 h para bloquear la degradación proteosomal. 48 h después de la transfección, las células se lisaron en tampón KALB (Nicholson et al., 1995). Las proteínas FLAG se inmunoprecipitaron utilizando perlas M2 (Sigma) y las proteínas se eluyeron en tampón de muestra SDS. La inmunoprecipitación, la electroforesis en gel y la transferencia Western se realizaron esencialmente como se describe (Linossi et al., 2013). Se usaron los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpos contra CIS (clon D4D9), fosfo-STAT3 (Y705); fosfo-AKT1 (Ser473), AKT y MAPK se obtuvieron de Cell Signaling Technology. Los anticuerpos contra fosfo-STAT5A/B (Y694/699) fueron de Millipore, fosfo-JAK1 (Yl022/1023) y STAt 5a de Invitrogen, y JAK1, STAT3 y p-Actin se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology Inc. El anticuerpo de ratón anti-Flag fue un amable obsequio del Prof. D. Huang y el Dr. L. O'Reilly (Walter and Eliza Hall Institute).
Síntesis del reactivo de afinidad de quinasa CYT-387 y acoplamiento covalente a sefarosa NHS
Se preparó un derivado de CYT-387 funcionalizado con amino usando un procedimiento similar al descrito para la síntesis de CYT-387 (Ver Fig. 6). El compuesto CYT-387 modificado se inmovilizó en perlas de flujo rápido de sefarosa 4 activadas por NHS (GE Healthcare) como se describió anteriormente (Schirle et al., 2012). Brevemente, se lavó dos veces 1 ml de suspensión de perlas de NHS-sefarosa con 5 ml de DMSO, centrifugando a 80 x g durante 3 min para sedimentar la matriz entre lavados. Un volumen de matriz empaquetada (500 μl) fue resuspendido con DMSO para hacer una suspensión al 50%. Se añadió CYT-387 (2 μM final) a la suspensión de 1 ml de perlas de NHS seguido de 20 μl de trietilamina y se mezcló por inversión. La suspensión de reacción se incubó durante la noche a temperatura ambiente en un rotador de extremo a extremo protegido de la luz. Al día siguiente, se añadieron 25 μl de etanolamina a la reacción y se dejó incubar durante toda la noche a temperatura ambiente en un rotador de extremo a extremo protegido de la luz. Las perlas de NHS-Sefarosa acopladas a CYT-387 se lavaron dos veces con 5 ml de DMSO y la matriz se resuspendió en etanol y se almacenó a 4 °C protegida de la luz.
Enriquecimiento de quinasas a partir de lisados celulares
La resina unida a CYT-387 se lavó dos veces con tampón de lisis KALB antes del enriquecimiento de quinasa. Se realizaron seis enriquecimientos de quinasa individuales (tres por Cish-/-o Cish+/+) con 160 μl de resina unida a Cyt387 al 50 % incubada con 2 ml (~10 mg) de lisado de proteínas. Las incubaciones se realizaron durante 3 h en una rueda giratoria protegida de la luz a 4 °C. Después de la incubación, las resinas Cyt387 unidas a proteínas se lavaron 3 veces con tampón KALB y se eluyeron con 3 rondas consecutivas de incubación con SDS al 0,5 %/DTT 5 mM (200 μl, 100 μl, 100 μl) durante 3 min a 60 °C.
Digestión de tripsina
Se prepararon eluatos de proteínas capturadas con resina junto con cantidades iguales de lisado celular completo (~400 μg) derivados de cada réplica biológica para espectrometría de masas utilizando el kit de digestión de proteínas FASP (Protein Discovery, Knoxville, TN) como se describió anteriormente (Wisniewski et al., 2009), con las siguientes modificaciones. Las proteínas se redujeron con Tris-(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (concentración final 5 mM), se digirieron con 4 μg de Trypsin Gold (Promega) modificada con grado de secuencia en NH4HCO350 mM y se incubaron durante la noche a 37°C. A continuación, se eluyeron los péptidos con NH4HCO350 mM en dos lavados secuenciales de 40 μl y se acidificaron en ácido fórmico al 1% (concentración final).
Espectrometría de masas y análisis de datos
Las mezclas de péptidos acidificados se analizaron mediante líquido de fase reversa de nanoflujo espectrometría de masas en tándem de cromatografía (CL-EM/EM) en un sistema nanoAcquity (Waters, Milford, MA, EE. UU.), acoplado a un espectrómetro de masas Q-Exactive equipado con una fuente de iones de nanoelectrospray para e M/EM automatizado (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania). Las mezclas de péptidos se cargaron en una columna trampa de 20 mm con un diámetro interior de 180 μm (nanoAcquity UPLC 2G-V/MTrap 5 mm Symmetry C18) en tampón A (0,1 % de ácido fórmico, acetonitrilo al 3 %, agua Milli-Q) y se separaron mediante cromatografía de fase inversa utilizando una columna de 150 mm con un diámetro interior de 75 μm (nanoAcquity UPLC 1,7 μm BEH130 C18) en un gradiente lineal de 60 min ajustado a una velocidad de flujo constante de 400 nl/min de 3-55 % de tampón B (0,1 % de ácido fórmico, 80 % de acetonitrilo, agua Milli-Q). El Q-Exactive funcionaba en un modo dependiente de los datos, cambiando automáticamente entre un escaneo completo y escaneos EM/EM posteriores de los diez picos más abundantes. El instrumento se controló utilizando la serie Exactive versión 2.1 build 1502 y Xcalibur 3.0. Se adquirieron escaneos completos (m/z 350-1,850) con una resolución de 70.000 a 200 m/z. Los 10 iones más intensos se aislaron secuencialmente con un valor objetivo de 10.000 iones y un ancho de aislamiento de 2 m/z y se fragmentaron usando HCD con energía de colisión normalizada de 19,5 y energía de colisión escalonada del 15%. Los tiempos máximos de acumulación de iones 27 se establecieron en 50 ms para el análisis completo de EM y en 200 ms para EM/EM. La proporción de llenado insuficiente se estableció en 5 % y la exclusión dinámica se habilitó y se estableció en 90 segundos. Los archivos sin procesar que consisten en espectros EM/EM de alta resolución se procesaron con MaxQuant (versión 1.5.0.25) para la detección de características y la identificación de proteínas utilizando el motor de búsqueda Andromeda36. Las listas de picos extraídas se buscaron en la base de datos UniProtκΒ/Swiss-Prot Mus musculus (LudwigNR) y una base de datos de señuelo inverso separada para evaluar empíricamente la tasa de descubrimiento falso (FDR) utilizando una especificidad de tripsina estricta que permite hasta 3 escisiones perdidas. La longitud peptídica mínima requerida se fijó en 7 aminoácidos. Modificaciones: La carbamidometilación de Cys se fijó como modificación fija, mientras que la N-acetilación de proteínas, la oxidación de Met, la adición de piroglutamato (en N-terminales Glu y Gln), la fosforilación (Ser, Thr y Tyr), desamidación (Asn, Gln y Arg), se establecieron como modificaciones variables. La tolerancia de masa para los iones precursores y los iones de fragmentos fue de 20 ppm y 0,5 Da, respectivamente. La opción “coincidencia entre ejecuciones” en MaxQuant se utilizó para transferir identificaciones realizadas entre ejecuciones sobre la base de la coincidencia de precursores con alta precisión de masa (Cox et al., 2014). Las identificaciones de PSM y proteínas se filtraron utilizando un enfoque de señuelo objetivo con una tasa de falso descubrimiento (FDR) del 1%. La identificación de proteínas se basó en un mínimo de dos péptidos únicos.
Canalización proteómica cuantitativa
Se realizó un análisis adicional utilizando una canalización personalizada desarrollada en Pipeline Pilot (Biovia) y R, que utiliza los archivos de salida de MaxQuant allPeptides.txt, peptides.txt y evidence.txt. Una característica se definió como la combinación de secuencia peptídica, carga y modificación. Se eliminaron las características que no se encontraron en al menos la mitad del número de réplicas en cada grupo. También se eliminaron las proteínas identificadas a partir de aciertos en la base de datos inversa y las proteínas con un solo péptido único. Para corregir la variabilidad del volumen de inyección, las intensidades de las características se normalizaron convirtiendo a logaritmos de base 2 y luego multiplicando cada valor por la proporción de la intensidad mediana máxima de todas las réplicas sobre la intensidad de réplica mediana. Las características asignadas a una misma proteína difieren en el rango de intensidad debido a sus propiedades fisicoquímicas y estado de carga. Para corregir aún más estas diferencias, cada valor de intensidad se multiplicó por la proporción del máximo de las intensidades medianas de todas las características de una proteína sobre la intensidad mediana de la característica. Los valores faltantes se imputaron utilizando una distribución normal aleatoria de valores con la media establecida en la media de la distribución real de valores menos 1,8 desviaciones estándar y una desviación estándar de 0,5 veces la desviación estándar de la distribución de las intensidades medidas (Cox et al., 2014). La probabilidad de la expresión diferencial entre los grupos se calculó utilizando la prueba Wilcoxon Rank Sum excluyendo cualquier secuencia no única y cualquier característica con modificaciones distintas de la oxidación y la carbamidometilación. Los valores de probabilidad se corrigieron para pruebas múltiples utilizando el método de Benjamini-Hochberg. Se introdujeron líneas de corte con la función y= -log10(0,05)+c/(x-x0) (Keilhauer et al., 2015) para identificar significativamente proteínas enriquecidas. c se estableció en 0,2 mientras que x0 se estableció en 1 que representa proteínas con un cambio de 2 veces (proporción de proteína log2 de 1 o más) o 4 veces (proporción de proteína log2 de 2) en expresión de proteínas, respectivamente. Las intensidades peptídicas sumadas transformadas en log2 (no imputadas) se visualizaron en un mapa de calor generado en CIMminer de matriz única, un programa desarrollado por el Grupo de Genómica y Bioinformática (Laboratorio de Farmacología Molecular, Centro de Investigación del Cáncer, Instituto Nacional del Cáncer).
Preparación de la detección de péptido lejano de proteína GST-CIS
Se clonó una porción de Cish humano (que codifica los residuos 66-258) en el vector pGTVL2. La Elongina C humana (residuos 17-112) y la Elongina B completa se clonaron en el vector pACYCDUET como se describió previamente (Bullock et al., 2006). Se transformaron ambos plásmidos en BL21(DE3) para la coexpresión del complejo ternario CIS/Elongina C/Elongina B (CIS-SH2-BC). Los cultivos en medio de caldo Luria se indujeron con isopropil (3- d -1 -tiogalactopiranósido (IPTG) 0,4 mM durante la noche a 18°C y las células se recolectaron mediante centrifugación. Los sedimentos se resuspendieron en HEPES 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 5 mM, glicerol al 5% y las células se lisaron mediante sonicación. El ADN se precipitó mediante la adición de polietilenimina al 0,15 %, pH 8, y el material insoluble se excluyó mediante centrifugación a 21.000 rpm. El complejo proteico CIS marcado con GST se purificó en una columna de glutatión sefarosa y se eluyó con glutatión reducido 20 mM en un tampón que comprendía HEPES 50 mM, NaCl 300 mM, TCEP 0,5 mM. La proteína purificada se concentró a 0,75 mg ml-1 y se almacenó a -80°C.
Síntesis y selección de matriz de péptidos
Las matrices de péptidos se sintetizaron en membranas de nitrocelulosa funcionalizadas usando un sintetizador de matriz puntual Invatis como se describe (Li y Wu, 2009). Para el sondeo de matriz, los péptidos unidos a la membrana se bloquearon a temperatura ambiente durante 5 horas con leche descremada al 5 % de solución salina tamponada con Tris/Tween-20 al 0,05 % (TBS-T), pH 7,2. Después de lavar con TBS-T, se agregaron 0,8 ng ml-1 del complejo GST-CIS-SH2-BC en tampón de bloqueo y se incubó a 4 °C durante la noche. Al mismo tiempo, se añadieron 4 ng mt 1 de proteína GST a una matriz peptídica separada como control negativo en las mismas condiciones experimentales. Las membranas de la matriz peptídica se lavaron con TBS-T 3x y un anticuerpo de anti-GST marcado con peroxidasa de (Bio-Rad) añadido a temperatura ambiente durante 1 h, antes de la detección con un sustrato de quimioluminiscencia (Bio-Rad Clarity Western ECL Substrate), que se visualizó utilizando un Molecular Imager (ChemiDoc XRS; Biorad).
Calorimetría isotérmica de titulación (CIT)
Se realizaron titulaciones calorimétricas isotérmicas con un Microcal ITC200 (GE Healthcare). Los fosfopéptidos se obtuvieron de Genscript. Se preparó una construcción de proteína GST-CIS optimizada en la que se eliminó la región PEST interna (A174-202). Los complejos temáticos GST-CIS-SH2-SB resultantes se dializaron frente a tampón (Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, 2-mercaptoetanol 2 mM). Los experimentos se realizaron a 298 K a menos que se indique lo contrario. Por lo general, se titularon inyecciones de 12x 3,15 μl fosfopéptidos de 300 μM en una solución 30 μM del complejo ternario GST-CIS-SH2-SB. El calor de dilución de Gs T-CIS-Sh 2-BC se restó de los datos sin procesar del experimento de unión. Los datos se analizaron utilizando el software de evaluación, Microcal Origin versión 5.0. La curva de unión se ajustó a un modo de unión de sitio único y todos los valores de K d se determinaron a partir de experimentos por duplicado.
Ensayo de ligasa E3
La ubiquitinación de JAK1 mediada por CIS se realizó esencialmente como se describió anteriormente (Babon et al., 2013). El complejo de ligasa CIS E3 (CIS-SH2-BC junto con Cullin5 y Rbx2; 2,5 μM) se incubó con ubiquitina (50 μM), E1 humano (100 nM), E2 recombinante purificado (UbcH5c, 2,5 μM) y JAK1 de longitud completa en presencia de Mg/ATP 2,5 mM a 37 °C durante tiempos variables. JAK1 marcado con FLAG se generó por expresión en células 293T y se recuperó usando inmunoprecipitación anti-FLAG y elución con péptido FLAG libre. La ubiquitinación de JAK1 se visualizó mediante transferencia Western con JAK1 antifosforilado después de la separación en geles de Tris/Glicina al 4-20%.
Ensayo de quinasa
Los ensayos de inhibición de quinasa se realizaron esencialmente como se describe (Babon et al., 2012). Brevemente, se incubó péptido STAT5b 130 μM (SEQ ID NO:18 RRAKAADGYVKPQIKQVV) con JAK1 5 nM a 25°C durante 30-60 min. en Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 100 mM, 2-mercaptoetanol 5 mM, 0,2 mg ml-1 de albúmina de suero bovino, MgCh 2 mM, ATP 100 μM y y-[32P]ATP 1 mCi. El CIS SH2-BC recombinante estaba presente en concentraciones que oscilaban entre 0 y 30 μM. Después de la incubación, la reacción se colocó sobre papel de fosfocelulosa P8l y se extinguió en H3PO4 al 5 %. El papel se lavó (4 x 200 ml, 15 min) con H3PO4 al 5% y se expuso a un phosphoroimager plate (Fuji). La cuantificación se realizó con el software Fuji y las curvas CI50 se calcularon con Graphpad Prism.
Líneas de células tumorales
La línea celular RMA de linfoma murino C57BL/6 es un linfoma de células T derivado de la línea celular RBL-5 inducida por el virus de la leucemia murina de Rauscher. Las líneas celulares RMA-mCherry y m157+RMA-GFP se generaron por transducción con un vector retroviral (vector de células madre murinas) que codifica mCherry o GFP, respectivamente. Las líneas celulares de melanoma B16F10, E0771 y E0771.LMB mCherry+ mama, LWTl melanoma y carcinoma de próstata RM-1 se mantuvieron como se describió anteriormente (Ferrari de Andrade et al., 2014; Gilfillan et al., 2008; Stagg et al., 201 la y b; Swann et al., 2007; Rautela et al., 2005; Johnstone et al., 2015).
Metástasis tumoral experimental
Se usaron grupos de 6-14 ratones por experimento para las metástasis tumorales experimentales. Estos tamaños de grupo se utilizaron para garantizar la potencia adecuada para detectar diferencias biológicas. No se excluyó a ningún ratón en base a criterios preestablecidos en este estudio y no se aplicó aleatorización activa a los grupos experimentales. Los investigadores no estaban cegados a la asignación de grupos durante el experimento y/o al evaluar el resultado. Todos los experimentos con tumores se realizaron una vez a menos que se indique específicamente. Suspensiones unicelulares de melanoma B16F10, carcinoma de próstata RM-1 o células de melanoma LWTl se inyectaron por vía i.v. en la vena de la cola de las cepas de ratones indicadas (2,5-7,5 x 105 células/ratón). Algunos ratones recibieron además 100 μg de anti-CD8 (53.5.8) como se indica para eliminar las células T CD8+, 50 μg de anti-asialoGM1 para eliminar las células NK o 250 μg de anti-IFN-y (H22) para neutralizar el IFN-y como descrito anteriormente (Chan et al., 2014; Allard et al., 2013). Algunos grupos de ratones recibieron los días 0, 3 y 6 en relación con la inoculación tumoral (día 0) ya sea: control Ig (500 μg i.p., clg, 1-1) o combinación anti-PD-1 (RMPl-14)/anti-CTLA-4 (UC10-4Fl0) (250 μg i.p. cada uno). Los pulmones se recogieron el día 14 y se fijaron en solución de Bouin y se contaron las metástasis de Bl 6F1044 o se analizaron para la expansión de células NK mediante citometría de flujo. Para los modelos de transferencia adoptiva, se inyectaron i.v. ratones Mcl1f/f Ncr1-iCre (Sathe et al., 2014) con 3 x 106 células NK o PBS Cish+/+ o Cish-/- expandidas in vitro. A los ratones se les inyectó 8 h más tarde 1 x 105 B16F10 de células de melanoma. Posteriormente, los ratones se trataron el día 1 con 1,5 x 106 células NK o PBS Cish+/+ o Cish-/-expandidas in vitro administradas i.v. Los ratones se sacrificaron el día 18 después de la inyección del tumor y se realizó la perfusión pulmonar. A continuación, se recogieron los pulmones y se contaron las metástasis.
Metástasis ortotópica E0771.L.MB y espontánea E077I
Para generar tumores primarios, se implantaron 1x105 células tumorales E0771.LMB mCherry+ en la cuarta glándula mamaria inguinal [en 20 μl de PBS] de ratones hembra Cish-/- o Cish+/+ de 8 a 10 semanas de edad. El volumen del tumor primario se midió tres veces por semana utilizando calibradores electrónicos. Se midió el mayor diámetro longitudinal (largo) y el mayor diámetro transversal (ancho). Los volúmenes tumorales se estimaron por la fórmula elipsoidal modificada: volumen=1/2(largoxancho2). Para los experimentos de metástasis espontánea, los tumores primarios se resecaron quirúrgicamente a un tamaño de 400-600 mm3. Los pulmones se recolectaron 14 días después y la carga metastásica se cuantificó mediante imágenes ex vivo utilizando un IVIS Lumina XR-III (Caliper Life Sciences) o mediante Q-PCR dúplex para expresión de mCherry en relación con la vimentina, como se describió anteriormente (Rautela et al., 2005).
Síntesis de CYT-387
La espectroscopia de masas por cromatografía líquida (CLEM) se llevó a cabo usando un 10 Finnigan LCQ Advantage Max usando análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de fase inversa (columna: Gemini 3p C18 20 x 4,0 mm 110A) Disolvente A: agua 0,1 % ácido fórmico, disolvente B: acetonitrilo 0,1 % ácido fórmico, gradiente: 10-100 % B durante 10 min Detección: 100-600 nm e ionización por electropulverización (ESI). Se evaluó que todos los compuestos enviados para el ensayo bioquímico tenían una pureza del 95% como medido por análisis HPLC a 254 nm de absorbancia UV. La cromatografía se realizó utilizando el sistema de purificación CombiFlash® Rf (Teledyne, ISCO, Lincon, NE, EE. UU.) con columnas de gel de sílice preempaquetadas (tamaño de partícula 0,040­ 0,063 mm). Todos los reactivos comerciales se usaron tal como se recibieron. Cbz = carboxibencilo. El 4-(4-aminofenil)piperazina-1-carboxilato de bencilo (S1) y el 4-(4-cloropirimidin-2-il)benzoato de etilo (S2) se pueden preparar como se ha descrito anteriormente (w O 2014/26242 y WO 2008/109943).
Figure imgf000022_0001
4-(4-((2-(4-(etoxicarbonil)fenil)pirimidin-4-il)amino)fenil)piperazina-1-carboxilato de bencilo ( S3 )
Se añadió p-TsOH (0,978 g, 5,13 mmol) a una suspensión agitada magnéticamente de pirimidina S2 (1,50 g, 5,71 mmol) y anilina S1 (2,31 g, 7,42 mmol) en dioxano (20 ml). La mezcla se calentó a reflujo durante 24 h. La mezcla se enfrió, se diluyó en DCM (250 ml) y se lavó con NaHCO3 (100 ml) y la capa acuosa se separó y se extrajo con EtOAc (3 x 50 ml). Los extractos orgánicos combinados se secaron (Na2SÜ4), se filtraron y concentraron sobre sílice y el material se sometió a cromatografía flash (1:9 a 1:0, v/v, EtOAc:ciclohexano). Las fracciones así obtenidas se concentraron y el precipitado amarillo se filtró y se lavó con metanol proporcionando el compuesto del título (S3) (1,61 g, 52 %) como un sólido amarillo. 1H RMN (600 MHz, DMSO-d6): ó 9,51 (s, 1H), 8,52 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 8,25 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 8,08 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,65 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,37-7,35 (m, 5H), 7,31 (q, J = 4,4 Hz, 1H), 6,93 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 5,09 (s, 2H), 4,33 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,58-3,48 (m, 4H), 3,04-3,03 (m, 4H), 1,33 (t, J = 7,1 15 Hz, 3H). CLEM: tR = 6,14 min, m/z = 538,0 [M+H]+.
4-(4-((4-(piperazin-1-il)fenil)amino)pirimidin-2-il)benzoato de etilo ( S4 )
El compuesto S3 (500 mg, 0,93 mmol) se disolvió en MeOH (75 ml) y THF (50 ml) y la solución se pasó a través del “cubo H” a 1 ml/min en modo H2 total utilizando un cartucho de Pd/C (10%) a 45 °C. El producto se recogió y se concentró a presión reducida para dar el compuesto del título (S4) (352 mg, 94 %) como un sólido oscuro. 1H RMN (600 MHz, CDCla): ó 8,46 (dd, J = 8,0, 5,2 Hz, 1H), 8,16-8,14 (m, 2H), 8,11 (d, J= 8,3 Hz, 2H), 7,59 (dd, J= 8,9, 1,9 Hz, 1H), 7,55 (d, J= 8,9 Hz, 1H), 7,16-7,13 (m, 1H), 6,96 (dt, J = 9,1, 4,6 Hz, 2H), 4,41 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,36-3,28 (m, 4H), 3,25-3,18 (m, 4H), 1,42 (t, J= 7,1 Hz, 3H). CLEM: tR = 5,78 min, m/z = 404,0 [M+H]+.
Ácido 4-(4-((4-(4-(5-((terc-butoxicarbonil)amino)pentanoil)piperazin l-il)fenil)amino)pirimidin-2-il)benzoico (S5)
A una solución agitada magnéticamente de ácido N-Boc-aminovalérico (194 mg, 0,9630 mmol), EDCI (201 mg, 1,05 mmol), HOBt (146 mg, 1,05 mmol), Et3N (232 μl, 1,75 mmol) en DMF (2 ml) se añadió el compuesto S4 (350 mg, 0,87 mmol) bajo N2 y la mezcla se agitó durante 12 h. La mezcla de reacción se lavó con agua (2 ml) y los lavados acuosos se extrajeron con EtOAc (2 x 2 ml). Las fracciones orgánicas se combinaron, secaron (Na2SÜ4), filtraron y concentraron. El material crudo fue purificado por cromatografía flash para proporcionar un sólido amarillo pálido (373 mg). Este material se disolvió en THF/MeOH (2 ml de una mezcla 1:3) e hidróxido de litio (123 mg, 3,09 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 2 h. La mezcla se concentró hasta un sólido amarillo y se suspendió en agua y se acidificó a pH = 2 con Hcl (solución acuosa al 5%). El precipitado se recogió por filtración, se lavó con MeOH (1 ml) y luego con Et2O (2 x 1 ml) y se secó a presión reducida proporcionando el compuesto del título (S5) (224 mg, 60 %) como un sólido rojo. 1H-RMN (600 MHz, DMSO-d6): ó 9,49 (s, 1H), 8,52-8,51 (m, 1H), 8,22 (t, J= 6,8 Hz, 2H), 8,06 (d, J= 8,1 Hz, 2H), 7,65-7,64 (m, 2H), 7,36 (dd, J=4,7, 0,3 Hz, 1H), 6,94-6,91 (m, 2H), 6,77-6,75 (m, 1H), 3,57-3,55 (m, 4H), 3,36 (td, J = 1,1, 0,5 Hz, 2H), 3,05-2,99 (m, 4H), 2,91-2,87 (m, 2H), 2,33-2,31 (m, 2H), 1,46-1,45 (m, 2H), 1,34 (s, 9H). CLEM: tR = 6,34 min, m/z = 575,0 [M+H]+.
4-(4-((4-(4-(5-Aminopentanoil)piperazin-l-il)fenil)amino)pirimidin-2-il)-N (cianometil)benzamida (S6)
A una solución agitada magnéticamente del compuesto S5 (190 mg, 0,33 mmol) en DMF (6 ml, anhidro) a temperatura ambiente bajo N2 se le añadió trietilamina (264 μL, 1,99 mmol) y la mezcla se sonicó durante 5 min. Luego se añadieron EDCI (76 mg, 0,40 mmol) y HOBt (54 mg, 0,40 mmol) y la mezcla se agitó durante 5 min bajo N2. Luego se añadió clorhidrato de aminoacetonitrilo (61 mg, 0,66 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente bajo N2 durante 12 h. La mezcla de reacción se concentró y el material crudo se purificó por cromatografía flash para producir el producto acoplado (155 mg, 76 %) como un sólido amarillo. Este material se disolvió inmediatamente en dioxano (0,5 ml), luego se añadió HCl (1 ml de una solución 4 M en dioxano) y la mezcla de reacción se agitó durante 2 h a temperatura ambiente. A continuación, el precipitado se recogió por filtración y se lavó con dioxano antes de disolverlo en MeOH y se inactivó con NH3 (solución 4 M en MeOH) y luego se concentró. El material bruto se purificó por cromatografía flash para proporcionar la amina del título (S6) como un sólido amarillo (51 mg, 40%). 1H-RMN (600 MHz, CD3OD): 58,37 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 8,16 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,91 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,57 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,20 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 6,93 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 4,34 (s, 2H), 3,69 (t, J = 5,1 Hz, 2H), 3,63 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 3,30-3,29 (m, 2H), 3,07 (t, J= 5,0 Hz, 2H), 3,03 (t, J= 5,1 Hz, 2H), 2,67 (t, J= 7,2 Hz, 2H), 2,41 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,62 (dt, J = 15,3, 7,6 Hz, 2H), 1,51 (td, J = 11,3, 6,1 Hz, 2H). CLEM: tn = 4,18 min, m/z= 513,0 [M+H]+.
Ejemplo 2 - IL-15 induce la expresión de genes SOCS, incluido CIS, en células NK
Hasta la fecha, ha habido un gran interés en la comprensión de las señales de inhibición que frenan las respuestas de las células NK, pero aún no comprenden cómo se desactiva la señalización intracelular de IL-15. Los miembros del supresor de la señalización de citoquinas (SOCS) son genes de respuesta STAT5 y, a menudo, se inducen para limitar el alcance de la señalización del receptor de citoquinas como parte de un sistema de retroalimentación negativa clásico. Con el fin de investigar qué proteínas SOCS podrían regular la señalización de IL-15 y, por lo tanto, el desarrollo y la función de las células n K, los inventores primero perfilaron la expresión de SOCS inducida por IL-15 en células NK cultivadas. Se indujo ARNm de Cish, Socsl, Socs2 y Socs3 en células NK dentro de las 2 h del tratamiento con IL-15, con la inducción temprana y transitoria de Cish que tipifica la inducción de Socs por su citoquina objetivo (Fig. 1a). De acuerdo con la rápida inducción de ARNm en concentraciones saturadas de IL-15, la proteína CIS se detectó en los lisados de células NK dentro de los 60 minutos posteriores a la estimulación (Fig. 1b).
Ejemplo 3: Las células NK nulas en Cish son hipersensibles a la IL-15
Para investigar el papel fisiológico de CIS en la señalización de IL-15, los inventores utilizaron un ratón con eliminación de Cish de línea germinal (Cish'/-'> (Palmer et al., 2015), confirmando primero que el ARNm y la proteína de Cish estaban ausentes de las células NK (Fig. 5a). Los ratones Cish-nulo fueron sanos, fértiles y sin anomalías fenotípicas a los 10 meses de edad. La frecuencia y la función de las células hematopoyéticas parecían normales, incluidas las de las células T CD4+ y CD8+ convencionales9, las células T reguladoras y las células linfoides innatas tipo 2 (ILC2) (Fig. 5b-g). Las células NK también se desarrollaron normalmente en ratones Cish-/- (Fig. 1c, Fig. 5b), como fue el caso en ratones Socs1 y Socs3 con deficiencia simple o doble Fig. 6a). Sin embargo, a diferencia de las células NK deficientes en Socs1 o Socs3, las células NK Cish-/- mostraron una hiperproliferación profunda en respuesta a la IL-15 in vitro (Fig. 1d, Fig. 6b). Cuando las células NK Cish 1- y C57BL/6 de control (Cish+/+) se cocultivaron 1:1 en una titulación de IL-15, las células NK Cish~/- demostraron una proliferación mejorada a concentraciones superiores a 5 ng m1-1 (Fig. 1d). Además, las células NK Cish'/' representaron ~95% de las células recuperadas de co-cultivo en concentraciones de IL-15 no mitogénicas, demostrando así una supervivencia de células NK mediada por IL-15 superior en ausencia de CIS (Fig. 1d). La hipersensibilidad de las células NK Cish~/- también se manifestó en una producción mejorada de IFN-y impulsada por IL-15, que se incrementó aún más con la coestimulación a través de los receptores activadores NKp46 y NK1.1, lo que sugiere un papel importante para la IL-15 en la sinergia con estos receptores (Fig. 1 e). Cuando se cocultivaron con células diana de ovario de hámster chino (CHO), las células NK Cish' /- mostraron una mayor citotoxicidad en proporciones bajas de NK:células diana en comparación con las células NK Cish+/+ (Fig. 1f y Fig. 6c). Las células NK Cish-/- también destruyeron las células de melanoma B16F10 de manera más eficiente que las células NK Cish+/+ y mostraron mayores niveles de granzimas intracelulares cuando se desafiaron con células RMA-ml57, evidencia de que las células NK son ampliamente hipercitotóxicas en ausencia de Cish (Fig. 6c, d).
Para examinar el alcance de la señalización aberrante de IL-15 en células NK sin Cish, los inventores realizaron una secuenciación de ARN de un solo extremo de 100 pb en células NK Cish+/+ y Cish-/-, ya sea purificadas directamente del bazo (ex vivo) o después del cultivo en IL-15 (in vitro). Se observaron muy pocos genes expresados diferencialmente en células NK Cish-/- ex vivo Fig. 7a) y esto, junto con la frecuencia normal de células NK Cish-/- in vivo y la baja expresión de Cish en células NK maduras, sugiere que CIS no es un regulador importante de la biología de las células NK en estado estacionario. Por el contrario, se detectaron más de 1000 genes expresados diferencialmente en células NK Cish~/- expuestas a altas concentraciones de IL-15 in vitro (Fig. 1g y Fig. 7a, b, c). Los genes más regulados incluyeron miembros del receptor asesino similar a lectina de células Klral y Klra6 y aquellos asociados con funciones efectoras de células NK tales como las proteasas de serina Gzme, Gzmf, Gzmd, Gzmg y sus inhibidores Serpinb9b, Serpinb9 y Serpin1a (Fig. 1g, Fig. 7a). Estos hallazgos, junto con la proliferación superior y la citotoxicidad de las células NK Cish-/-, identifican un papel único y no redundante para CIS como un regulador negativo clave de funciones del efector de células NK mediadas por IL-15. Además, sugieren que el CIS actúa como un punto de control inmunitario que controla las respuestas de las células NK.
Ejemplo 4: Los niveles de JAK1 y la actividad enzimática están elevados en ausencia de la proteína CIS
Las proteínas SOCS son adaptadores para un complejo de ubiquitina ligasa E3, que ubiquitina las proteínas que interactúan con SOCS y las dirige a la degradación proteasomal (Zhang et al., 1999). CIS fue la primera proteína de la familia SOCS que se descubrió (Matsumoto et al., 1997) y, aunque se informó que se asociaba con el complejo receptor de IL-2 (Aman et al., 1999), no estaba claro exactamente cómo mediaba esta interacción. La hiperproliferación y la capacidad efectora mejorada de las células NK Cish-/- podrían manifestarse a partir de cambios en los niveles de receptor y/o componentes de señalización intracelular. Sin embargo, las células NK esplénicas Cish+/+ y Cish-/~ expresaron niveles de receptor comparables cuando se cultivaron en presencia de IL-15 (Fig. 2a). Por lo tanto, los inventores examinaron los eventos de señalización proximal del receptor. En células NK Cish-/- recién aisladas y cultivadas, la magnitud de la fosforilación de tirosina JAK1 estimulada por IL-15 aumentó en comparación con las células de control, y se combinó con una cinética de fosforilación extendida (Fig. 2b, c y Fig. 8a). Curiosamente, los niveles de proteína JAK1 total se elevaron en las células NK Cish^ y esto fue evidente en las células en reposo antes de la estimulación (Fig. 2b, c). El aumento de la fosforilación de JAK se correlacionó con el aumento de la fosforilación de su sustrato, STAT5. Por el contrario, la ausencia de Cish no tuvo efecto sobre la fosforilación de AKT dependiente de IL-15 (Fig. 2b, c y Fig. 8a), lo que sugiere una desconexión única entre JAK/STAT impulsado por IL-15 y vías PBK/mTOR/AKT. Esto se confirmó además por la respiración mitocondrial y la glucólisis normales, respuestas que se sabe que están reguladas por la actividad de AKT (Fig. 8b).
Para confirmar la elevada actividad enzimática de JAK1 y examinar lo selectivos que son los efectos deficientes en CIS, los presentes inventores utilizaron un enfoque basado en espectrometría de masas para cuantificar los cambios en los niveles activos de JAK. Se sintetizó un inhibidor pan-JAK (derivado de CYT-387; JAK1/2/3), se acopló a perlas de Sefarosa y se usó como reactivo de captura por afinidad, antes de la digestión tríptica y el análisis espectrométrico de masas. A medida que el inhibidor se une al sitio de unión de ATP en el dominio quinasa, las quinasas en las conformaciones activas están preferentemente enriquecidas. Se detectaron péptidos JAK1 y JAK3 en lisados de células NK con mayor número e intensidad en células Cish~/- (Fig. 2d). Se sabe que CYT-387 tiene una unión fuera del objetivo con otras quinasas, en particular TBK1 y CDK2, lo que nos permite realizar un análisis de kinoma restringido. Sesenta y nueve quinasas se enriquecieron en relación con su abundancia en lisados celulares, con 16 quinasas reguladas diferencialmente en células Cish-/-. Aparte de las quinasas JAK, el aumento de la actividad se atribuyó en gran medida a las quinasas implicadas en la regulación de la proliferación celular (por ejemplo, CDK1/2, Prkr, quinasas Aurora) (Fig. 2e, f y Tabla 1). Estos datos son consistentes con el fenotipo hiperproliferativo y además sugieren que muchos de estos pueden ser secundarios al aumento en la señalización de IL-15. Un análisis proteómico global sin etiquetas también destacó los cambios que reflejan la capacidad proliferativa mejorada (ciclo celular, replicación del ADN, reorganización del citoesqueleto) (Fig. 8c-e y Tabla 2).
Tabla l. Análisis proteómico cuantitativo después del enriquecimiento por afinidad de CYT-387, que muestra quinasas expresadas diferencialmente en células NK Cish-/- cultivadas, relacionadas con la Figura 2.
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Ejemplo 5 - Identificación de dianas de interacción de un complejo trimérico CIS-Elongina B-Elongina C
Al igual que otras proteínas SOCS, CIS contiene un dominio SH2 que se une a motivos de tirosina fosforilados en proteínas diana y una caja SOCS, que junto con Elonginas B y C, la proteína de armazón Cullin 5 y la proteína RING Rbx2, constituyen una ubiquitina ligasa E3. Dado que los niveles aumentados de proteína JAK1/3 total observados en células NK Cish-/- no se debieron a niveles aumentados de ARN Fig. 9a), los inventores investigaron la posibilidad de que CIS podría reducir directamente los niveles de proteína JAK a través de la ubiquitinación y la degradación proteasómica. Anteriormente, se había demostrado que CIS interactúa con el IL-2R y se propuso regular la señalización al bloquear el reclutamiento de proteínas STAT al complejo receptor (Matsumoto et al., 1997; Aman et al., 1999); sin embargo, hay evidencia limitada para apoyar la última proposición. Como un paso preliminar hacia la identificación de los objetivos proteicos que estaban siendo regulados por CIS, los inventores realizaron una selección utilizando un complejo trimérico recombinante compuesto por una construcción de proteína GST-CIS humana (hCIS-SH2; residuos 66-258) y Elonginas B y C (hCIS-SH2-BC) contra un panel de péptidos de fosfotirosina correspondientes a tirosinas dentro del complejo receptor de IL-2 (no mostrado). A continuación, se usó calorimetría isotérmica (CIT) para validar la unión a los fosfopéptidos identificados en la pantalla. El complejo hCIS-SH2-BC se unió con alta afinidad (0,8-2,1 μM) a péptidos fosforilados sintéticos correspondientes a tirosinas dentro del dominio citoplasmático de IL-2R (Tyr355, Tyr361 y Tyr392), y dentro de los bucles de activación JAK1 y JAK3 (Tyr1034 y Tyr980, respectivamente) (Fig. 3a; Fig. 9c).
Ejemplo 6: La proteína CIS regula a la baja los niveles de JAK en ausencia del complejo del receptor IL-2 a través de la degradación proteasómica dirigida
A continuación, los inventores investigaron si el CIS pudiera regular los niveles de JAK en ausencia del complejo receptor de IL-2. La sobreexpresión de JAK en células 293T (que carecen de IL-2R) da como resultado la autofosforilación constitutiva de JAK. La coexpresión de CIS o Socs1 redujo los niveles de JAK1 en un grado comparable, con una disminución correspondiente en la fosforilación JAK1. Por el contrario, SOCS3 no pudo inhibir la actividad de JAK en este ensayo (SOCS3 requiere la unión al receptor) (Fig. 3b). Sorprendentemente, aunque los inventores observaron la unión de CIS al péptido JAK3 Tyr980 (Fig. 3a), la fosforilación de JAK3 no se inhibió en este ensayo (Fig. 3b).
Los inventores luego interrogaron qué dominios CIS se requerían para la inhibición de JAK1. La mutación del dominio CIS-SH2 (R107K) o del sitio de unión de Cullin-5 en la caja SOCS (P241NL242NP243A) fue suficiente para disminuir la actividad inhibidora de CIS (Fig. 3c). Además, la preincubación de las células con un inhibidor proteasómico (MG132) redujo la regulación mediada por CIS de la fosforilación de JAK1 (Fig. 3c), lo que respalda un modelo en el que CIS se une a JAK1 a través de su dominio SH2 y luego se dirige a JAK1 para la degradación proteasómica. Se utilizó coinmunoprecipitación para demostrar la formación de complejos entre JAK1 y CIS (Fig. 3d). Para demostrar formalmente la ubiquitinación de JAK1 mediada por CIS, se incubó la proteína JAK1 de longitud completa etiquetada con Flag (generada por expresión en células 293T) en un sistema libre de células con complejo hCIS SH2-SB recombinante, Cullin5, Rbx2, E1, E2 (UbcH5c) y ubiquitina libre. CIS efectivamente medió la ubiquitinación de JAK1 fosforilado como lo indica las especies de peso alto molecular detectadas por transferencia Western (Fig. 3e). Juntos, estos datos demuestran que CIS es capaz de regular directamente los niveles de proteína JAK.
Ejemplo 7 - La proteína CIS inhibe directamente la actividad enzimática de JAK independientemente de su regulación a la baja de los niveles de proteína JAK
Anteriormente, solo se había demostrado que SOCS1 y SOCS3 se unían y regulaban la actividad de JAK. SOCS1 y SOCS3 inhiben JAK a través de la unión no canónica de SH2 a un motivo “GQM” presente en los bucles de inserción JAK1, JAK2 y Tyk2 y la unión de la región inhibidora de la quinasa (KIR) a la hendidura catalítica (Kershaw et al., 2013). CIS no contiene una región “KIR” y no hubo ninguna sugerencia previa de que pudiera regular la actividad enzimática de JAK. Sin embargo, varias líneas de evidencia sugirieron que estaba involucrado un mecanismo adicional. En primer lugar, los inventores observaron ocasionalmente la inhibición de la fosforilación de JAK1 en ausencia de cambios en los niveles totales de JAK1 (por ejemplo, Fig. 3c). En segundo lugar, a pesar del tratamiento con MG132 de las células NK de tipo salvaje que dio como resultado un aumento en la fosforilación de JAK1 endógeno, los inventores no observaron una cinética prolongada y, de hecho, la fosforilación de JAK se redujo rápidamente. Esto se correlacionó con una mayor expresión de CIS, que estaba protegida de la degradación proteasómica (Fig. 9d). Por lo tanto, los inventores preguntaron si CIS podría inhibir la actividad de la quinasa JAK1. Usando un ensayo de quinasa in vitro, el complejo CIS-SH2-BC pudo inhibir la fosforilación JAK1 de un péptido sustrato con una CI50 de 0,12 ± 0,02 μM. La inhibición de CIS de JAK1 fue 20-30 veces o más que su inhibición de JAK2, JAK3 o TYK2 (Fig. 3f, panel superior), lo que sugiere una interfaz única con JAK1 además de una interacción canónica de SH2 con la tirosina del bucle de activación de JAK conservada. Este concepto fue respaldado por la única reducción parcial de la inhibición observada cuando se usó el péptido del bucle de activación JAK1 como competidor (Fig. 9e). Aunque CIS mostró especificidad hacia JAK1, inhibió con 35-100 veces menor eficiencia que SOCS1 (Fig. 3f, panel inferior). Esto sugiere que el nivel absoluto de CIS frente a SOCS1 contribuirá tanto a la especificidad como a la dominancia. En este contexto, el reclutamiento de receptores de CIS puede aumentar la concentración local de CIS, lo que le permite inhibir de manera eficiente la actividad de JAK1 (Fig. 3g). La regulación postraduccional de los niveles de CIS, ya sea proteasoma o proteasa, agrega otra exquisita capa de control Estos datos sugieren un nuevo objetivo (JAK1) y mecanismo (inhibición de la quinasa) para la acción de CIS, y plantean la posibilidad de que CIS sea fundamentalmente más similar a SOCS1 de lo que se pensaba anteriormente.
Ejemplo 8: La transferencia adoptiva de células NK Cish~;~ en modelos de tumores de ratón da como resultado una formación de tumores y metástasis significativamente reducidas
Las respuestas biológicas marcadamente mejoradas de las células NK Cish-/- expuestas a altas concentraciones de IL-15 y la falta de un fenotipo de células NK en ratones Cish-/- sanos en condiciones homeostáticas, sugiere que los niveles de IL-15 en estado estacionario in vivo están por debajo de los necesarios para inducir la expresión de Cish. Es probable que la inflamación asociada con la formación de tumores aumente la transpresentación de IL-15 por estroma o linajes de mieloide infiltrante y aumente la actividad de las células NK residentes (Mlecnik et al., 2014).
Por lo tanto, los inventores investigaron si la inducción de CIS por IL-15 actúa como un punto de control en las células NK in vivo, exponiendo ratones Cish+/+ y Cish-/- con un panel de líneas de células tumorales singénicas, conocidas por activar y ser controladas por células NK. La administración intravenosa (i.v.) de células de melanoma B16F10 a ratones Cish+/+ resultó en la formación extensa de nódulos metastásicos en los pulmones a los 14 días. Por el contrario, los nódulos metastásicos B16F10 estaban en gran parte ausentes de los ratones Cish-/- (Fig. 4a). Para confirmar que la metástasis B16F10 reducida observada en ratones Cish-/- dependía de la actividad mejorada de las células n K, los ratones Cish+/+ y Cish-/- se trataron con GMl anti-asiolo (para agotar las células NK), anti-CD8 (para agotar las células T CD8 células), anti-IFN-y (para bloquear la actividad de IFN-y) o anti-inmunoglobulina de control (clg). El agotamiento de las células NK o la neutralización de IFN-y, pero no el agotamiento de las células T CD8, hizo que los ratones Cish-/- fueran susceptibles a la metástasis B16F10 (Fig. 4b), identificando un papel para CIS en la regulación negativa de la actividad de las células NK e IFN-y en este modelo. Además, cuando se transfirieron adoptivamente a ratones que carecían de células NK (Mcl1f/f Ncr1-iCre; Ncr1Mcl NA, los ratones que recibieron células NK Cish'/' tenían significativamente menos metástasis pulmonares B16F10 que los ratones que recibieron células NK Cish+/+ (Fig. 4c), evidencia de que las células NK Cish-/- son intrínsecamente más activas. La inyección de ratones Cish+/+ y Cish-/- con una línea celular de melanoma que expresa una forma mutada de la serina/treonina quinasa braf (LWTl BRAFv600E) (Davies et al., 2002), también resultó en metástasis pulmonares significativamente reducidas en ratones con deficiencia de CIS (Figura 10a). Este hallazgo no se limitó al melanoma, ya que se observaron diferencias similares en la metástasis pulmonar cuando se utilizó la línea celular de cáncer de próstata RM-1 (Fig. 10b).
De manera similar, cuando se administraron células de cáncer de mama (E0771.LMB-mCherry) por vía i.v. a ratones sin células Cish+/+, Cish-/- y NK, los inventores observaron una carga tumoral reducida en los pulmones de ratones Cish-/-en comparación con Cish+/+. y ratones nulos para NK (Fig. 4d). El análisis histológico de los pulmones de estos ratones reveló micrometástasis ocasionales de E0771 en ratones Cish-/-, sin embargo, carecían de las grandes metástasis observadas con frecuencia alrededor de los vasos sanguíneos y estaban enriquecidas en la pleura visceral de los ratones Cish+/+ (Fig. 4d). El crecimiento de tumores mamarios ortotópicos E0771.LMB también mejoró significativamente en ratones Cish-/- en comparación con ratones Cish+/+ (Fig. 4g). Cuando se extirparon quirúrgicamente tumores ortotópicos primarios de tamaño similar, solo los ratones Cish+/+ desarrollaron metástasis E0771.LMB espontáneo en el pulmón, mientras que los ratones Cish-/- no lo hicieron (Fig. 4f y Fig. 10c, d), evidencia adicional de que CIS es un potente regulador negativo de la inmunidad antitumoral metastásica.
Ejemplo 9: La transferencia adoptiva de células NK Cish~;~ en un modelo de melanoma de ratón es más eficaz que la inmunoterapia anti-PD-1/CTLA-4 sola y tiene eficacia mayor en combinación con inmunoterapia anti-PD-1/CTLA-4
La inmunoterapia combinada que usa anticuerpos dirigidos contra los receptores inhibidores PD-1 y CTLA-4 es actualmente el tratamiento más efectivo contra el melanoma avanzado en humanos (Larkin et al., 2015; Postow et al., 2015; Yoshimura et al., 2015). Para comparar esta inmunoterapia de referencia con la eliminación de Cish en células NK, a ratones Cish-/- y Cish+/+ se les inyectó una dosis alta de melanoma B16F10 (para provocar una respuesta tanto de células NK como de células T CD8) y se trataron con una combinación de anticuerpos anti-PD-1/CTLA-4 o clg. El tratamiento con anti-PD-1/CTLA-4 redujo significativamente las metástasis de melanoma en comparación con clg en ratones Cish+/+; sin embargo, esto fue inferior a la protección proporcionada por la eliminación de Cish sola (ratones Cish-/- + clg; Fig. 4g). Notablemente, los ratones Cish-/- tratados con anti-PD-1/CTLA-4 desarrollaron incluso menos metástasis que ratones Cish-/- tratados con clg (Fig. 4g), lo que destaca el beneficio terapéutico potencial que podría lograrse si la terapia anti-CTLA-4/PD-1 se combinara con la pérdida de la función CIS.
La inducción de Cish se demostró por primera vez en respuesta a la interleucina (IL)-3, IL-2 y eritropoyetina (EPO) y la expresión forzada de CIS inhiben la señalización a través de estos receptores (Matsumoto et al., 1997; Aman et al., 1999). A pesar de estas observaciones, la evidencia de un papel fisiológico en estas vías ha sido limitada. Se informó que los ratones Cish-/- de edad (10-18 meses) desarrollaron una afección pulmonar inflamatoria asociada con la señalización perturbada de IL-4/STAT6 e IL-2/STAT5 en células T CD4+ (Yang et al., 2013), mientras que un informe reciente sugirió que la señalización del receptor de antígeno se mejoró en las células T Cish-/- CD8+ (Palmer et al., 2015). Sin embargo, los ratones Cish-/- adultos no mostraron patología ni alteración en las frecuencias de las células T (Yang et al., 2013) y en las manos de los inventores, el desarrollo de las células T Cish-/- CD8+ y las respuestas específicas de antígeno a citomegalovirus de ratón eran normales (datos no mostrados). Dado que los ratones Cish-/-permanecen sanos, nuestras observaciones sugieren que es poco probable que el antagonismo terapéutico de CIS tenga efectos secundarios importantes.
Los efectos secundarios graves y la resistencia a los medicamentos actualmente limitan nuestro uso de quimioterapias convencionales, generalmente la primera línea de tratamiento para la mayoría de los cánceres. De este modo, existe una necesidad insatisfecha de encontrar nuevas terapias dirigidas e inmunoterapias que puedan usarse en combinación y como complemento de la quimioterapia.
Ipilimumab es una terapia basada en anticuerpos que se dirige a CTLA-4 en las células T reguladoras y efectoras y está aprobada para el tratamiento del melanoma maligno avanzado, lo que brinda respuestas tumorales del 10 al 12 % con algunas complicaciones adversas relacionadas con el sistema inmunitario. Este es el primero en su clase de anticuerpos monoclonales dirigidos a las llamadas moléculas de punto de control inmunitario. Los anticuerpos (de la misma clase) reconocen PD-1 (expresado en células T y células NK) o su ligando, PD-L1 (expresado en muchos tumores una vez que se ha producido la activación de las células T), y pembrolizumab y nivolumab (PD-1 anti-humano) ya están produciendo tasas de respuesta objetiva del 20-50 % en ensayos de fase 1/11 en melanoma avanzado, cáncer renal, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y otras indicaciones de cáncer. Nivolumab e ipilimumab en combinación contra el melanoma maligno avanzado han producido efectos anticancerígenos aún más rápidos e impresionantes, incluso contra la enfermedad metastásica. A pesar de estos avances, algunos cánceres (p. ej., próstata, colorrectal) muestran respuestas menos impresionantes e incluso en el melanoma sigue existiendo un gran número de pacientes en los que fallarán las combinaciones de anti-CTLA-4 y anti-PD-1/PD-L1.
Aquí, los inventores han demostrado que la acumulación de CIS inducida por IL-15 en las células NK actúa como un punto de control inmunitario intracelular que limita la función de las células NK. La ablación de la función CIS libera un freno en la actividad de las células NK, lo que da como resultado una disminución drástica de la metástasis tumoral experimental, mayor que la observada con el bloqueo de CTLA-4/PD-1 y sin signos de reacciones adversas. Nuestros resultados revelan que el CIS es un nuevo punto de control de las células NK y sugieren que el bloqueo terapéutico efectivo de la función del CIS en humanos podría mejorar el pronóstico de ciertos tipos de cáncer.
Ejemplo 10: La eliminación de la región N-terminal de CIS o del motivo PEST mejora la capacidad de CIS para inhibir la actividad de la quinasa JAK1
Para investigar el papel del motivo reg10n y PEST N-terminal de CIS, los inventores generaron construcciones de expresión de E. coli para CIS humano que carecían del motivo PEST (residuos 173-202; APEST), los primeros 24 residuos (AN34), la región N-terminal (residuos 1-66) y el motivo PEST (ANTAPEST), o correspondía a la proteína de longitud completa (CIS). Todas las proteínas CIS se expresaron junto con las elonginas B y C y el complejo trimérico se purificó como se describe. A continuación, se evaluó la capacidad para inhibir el dominio de quinasa JAK1 (JH1) usando una reacción de quinasa in vitro. De acuerdo con los datos anteriores (Fig. 3F), CIS-ANTAPEST inhibió JAK1 con un CI50 de ~0,6 μM. Por el contrario, la proteína de longitud completa mostró una capacidad muy reducida para inhibir JAK1 (CI50 ~32,3), al igual que CIS-AN34 (CI50 ~96,77), lo que sugiere que una región dentro del N-terminal (residuos 35-66) es autoinhibidora. La deleción del PEST solo fue suficiente para aumentar el CI50 a 3,32 mM (en comparación con el CIS de longitud completa) (Fig. 11A).
Ejemplo 11 - Se requiere interacción CIS-SH2 con fosfopéptido para la inhibición de CIS de la actividad de la quinasa JAK1
La adición de fosfato de fenilo (PP) en la reacción de la quinasa in vitro anuló la capacidad de todas las construcciones CIS para inhibir la actividad de la quinasa JAK1 (Fig. 11B). De manera similar, la adición de fosfopéptido libre correspondiente a un bucle de activación de JAK1 fosforilado simple o JAK3 doblemente fosforilado, redujo drásticamente la capacidad de CIS para inhibir la actividad de la quinasa JAK1 (Fig. 11C). Estos datos confirman además que se requiere la unión canónica del dominio SH2 a un motivo de fosfotirosina para que CIS inhiba la actividad de JAK1.
Ejemplo 12: La eliminación de la región N-terminal del CIS o el motivo PEST no tiene un impacto principal en la unión al fosfopéptido
Construcciones CIS que carecían del motivo PEST (residuos 173-202; APEST), los primeros 24 residuos (AN34), la región N-terminal (residuos 1-66) y el motivo PEST (ANTAPEST), o que correspondían a CIS de longitud completa, se expresaron junto con elonginas B y C y se ensayaron usando CIT para determinar su capacidad para unirse al fosfopéptido JAK1. Todas las construcciones se unieron al fosfopéptido con una afinidad de 2,2-10 μM, observándose la mayor reducción en la unión con la eliminación de los 34 residuos N-terminales (Fig. 12A). De manera similar, CIS de longitud completa y CIS-ANTAPEST se unieron al fosfopéptido JAK3 con afinidad comparable (Fig. 12B).
Juntos, estos datos sugieren que la región N-terminal y/o el motivo PEST son autoinhibidores y que, si bien estas regiones tienen un impacto mínimo en la capacidad del dominio SH2 para unirse al fosfopéptido, tienen un impacto importante en la capacidad de CIS para inhibir la actividad de la quinasa JAK1. Sin pretender estar limitado por la teoría, es probable que la modificación postraduccional o los cambios conformacionales (como en la unión a la fosfotirosina) liberen la autoinhibición y sean necesarios para activar el CIS. Esto sugiere que los agentes que estabilizan la conformación/ubicación de la región N-terminal y el motivo PEST, o bloquear la modificación postraduccional de CIS, podrían ser bloqueadores de CIS efectivos. De manera similar, los agentes que imitan la región N-terminal o el motivo PEST también pueden ser bloqueadores de CIS efectivos.
Ejemplo 13: El dominio CIS-SH2 se une a una interfaz peptídica extendida
Se usó CIT para investigar cuál de los residuos que flanqueaban la fosfotirosina (JAK1 Y1034) contribuía a la afinidad (y especificidad) de unión. La sustitución de alanina en las posiciones 5, 3 o -3 tuvo solo un efecto modesto en la unión (~ reducción de 4 múltiplos en 3) (Fig. 13). Esto sugiere que el dominio CIS-SH2 establece múltiples contactos con su secuencia peptídica diana.
Ejemplo 14: La inhibición de CIS depende de la dosis
Es poco probable que un inhibidor de molécula pequeña de CIS recapitule una pérdida total de la función de CIS. Por lo tanto, los inventores investigaron si la pérdida de un alelo era suficiente para potenciar la respuesta de las células NK a la IL-15. Las células NK se purificaron de ratones Cish+/+, Cish+I- y Cish-/- marcados con CTV y expandidos in vitro en presencia de concentraciones crecientes de IL-15, previo al análisis por citometría de flujo. Se recapituló la proliferación mejorada de las células NK Cish~/-, mientras que las células NK Cish+I- mostraron un fenotipo intermedio, con una proliferación mejorada en comparación con las células de tipo salvaje, pero aún por debajo de la observada para las células Cish-/- (particularmente a niveles bajos de IL-15) (Fig. 14A). Este resultado fue reflejado en los números absolutos de células después del cultivo (Fig. 14B) y la inmunotransferencia confirmó que la pérdida de un alelo CIS resultó en una pérdida correspondiente de proteína CIS (aproximadamente 50%) (Fig. 14C). Estos datos indican la utilidad de inhibir la función CIS.
Ejemplo 15 - Validación adicional del dominio CIS-SH2 como diana terapéutica
Usando la tecnología CRISPR, los inventores generaron un ratón mutante “knock-in” que porta una mutación de línea germinal en el gen Cish. Esta mutación cambia Arg107 a Lys en el dominio SH2 y anula la unión de SH2 al fosfopéptido. El efecto de la mutación se demostró usando proteína recombinante y unión a CIT (no mostrada) y es coherente con los datos de la Fig. 3C, que muestra que esta mutación anula la capacidad de CIS para inhibir la fosforilación de JAK1. Las células NK se purificaron del ratón mutante SH2 (Cislr107K), expandido in vitro durante 10 días y números absolutos de células en comparación con las células NK derivadas de ratones Cish+/+, Cish+I- y Cish'A. Los números de células NK CishR107K fueron los más cercanos a los derivados de ratones Cish~/- (Fig. 14B). La proteína CIS-R107K se expresó a niveles comparables a la proteína de tipo salvaje (Fig. 14C), evidencia de que el aumento del número de células resultó de la pérdida de la función CIS-SH2. Estos datos preliminares indican que la pérdida de la unión de fosfopéptidos es suficiente para recapitular la deleción de Cish e indican además que los compuestos que bloquean la función SH2 y, en particular, la capacidad de unirse a fosfopéptidos, serán puntos de partida válidos para el desarrollo de fármacos.
Ejemplo 16 - La cinética de inducción de CIS es consistente con la inhibición de la señalización de JAK/STAT en células NK humanas
El CIS humano y de ratón son idénticos en un 90,7 % a nivel de aminoácidos. De manera similar, JAK1 humano y de ratón son idénticos en un 94,4 %, mientras que los bucles de activación se conservan en un 100 %. Análisis de inmunotransferencia de células NK humanas primarias y varias líneas de células NK humanas, mostraron inducción de CIS con 1-2 h de tratamiento con IL-15, junto con una disminución concomitante en la fosforilación de JAK1 y STAT5. Estos datos son consistentes con CIS que inhibe la señalización JAK/STAT (Fig. 15). Además, aunque el tratamiento de 2 h de células NK humanas primarias con IL-15 y un inhibidor proteasómico (MG-132) fue suficiente para aumentar los niveles totales de JAK1 y CIS, la fosforilación de JAK1 permaneció reducida (Fig. 15A). Esto respalda la premisa de que, de acuerdo con nuestros resultados utilizando células NK de ratón, CIS inhibe la señalización de IL-15 en células NK humanas mediante la ubiquitinación de JAK1 y la inhibición de la autofosforilación de JAK.
Además, el tratamiento con IL-15 indujo ARNm de Cish en las líneas de células NK humanas NK-92 y KHYG-1 (Fig. 16). En particular, la magnitud de la inducción de Cish fue mucho mayor que la observada para Socsl y Socs3 que también fueron inducidos, aunque a niveles mucho más bajos (Fig. 16). Esto es un buen augurio para la inhibición de CIS que da como resultado una señalización mejorada de IL-15, sin compensación por parte de otros miembros de la familia SOCS.
Ejemplo 17 - Identificación de sitios de fosforilación y ubiquitinación en CIS
Los inventores habían demostrado que el propio CIS estaba regulado por la degradación proteasomal (Fig. 9D y Fig. 15A) y además propusieron que la modificación postraduccional del CIS puede regular la autoinhibición mediada por N-terminal/PEST. Para identificar los sitios potenciales de fosforilación y ubiquitinación, se expresó CIS marcado con FLAG en células 293T y se purificó por afinidad, antes del análisis por espectrometría de masas. Se identificaron seis sitios de fosforilación, con cinco de los sitios conservados entre el ratón y el CIS humano (Fig. 17 y Tabla 3). Tres de los eventos de fosforilación fueron detectados dentro del motivo PEST (pSDpSPDPAPpT), de acuerdo con la idea de que la fosforilación puede alterar el posicionamiento intramolecular y/o las interacciones de unión de este motivo y, por lo tanto, la función CIS. También se identificaron tres sitios de ubiquitinación (Fig. 17, Tabla 3) y coincidieron con un informe anterior (Jensik et al., 2015). Estos resultados identifican un número de residuos dentro de CIS que pueden modificarse por ubiquitinación o fosforilación.
Ejemplo 18 - CIS es una diana terapéutica en enfermedad con TGF-P elevado y funcional
Se están realizando varios ensayos clínicos que utilizan anti-TGF-p para prevenir la EMT (transformación epitelial 10 en mesenquimatosa); sin embargo, el TGF-p también es un potente supresor inmunitario (Chen et al., 2016). Los inventores encontraron que las células NK nulas en CIS son en gran parte refractarias a la supresión de la proliferación mediada por TGF-p in vitro (Fig. 18).
Sin embargo, aunque las células NK nulas en CIS eran resistentes a TGF-p en comparación con las células de tipo salvaje, todavía había algunos efectos inhibidores de la señalización del receptor de TGF-p como las células NK sin CIS proliferaron menos que las células NK sin receptor de TGF-p (TgfbRIIfl/fl). Por lo tanto, los inventores investigaron a continuación si el bloqueo de CIS y TGF-p in vivo mejoraría los resultados del tumor en comparación con la monoterapia. Se inyectaron ratones de tipo salvaje y Cish~/- con líneas celulares de melanoma mutante BRAF 1x106 (SM1LWT1) y Ig de control, anti-TGF-p (1D11), inhibidor de BRAF (PLX4720) o 1D11 PLX4720. La inhibición de CIS y TGF-p (anticuerpo anti-TGF-p, 1D11) dio como resultado una carga de melanoma significativamente reducida en los pulmones a los 14 días en comparación con la inhibición de CIS o TGF-p de forma aislada (Fig. 19). Además, la inhibición tanto de CIS como de BRAF dio como resultado una carga similar de melanoma significativamente reducida en los pulmones a los 14 días, que fue comparable a la inhibición de CIS o BRAF. La terapia triple de inhibición de CIS, BRAF y TGF-p prácticamente previene la metástasis de SM1LWT1 en el pulmón, lo que sugiere que la metástasis de melanoma mutante BRAF en humanos podría beneficiarse de la inhibición de CIS en combinación con el bloqueo de TGF-p o BRAF.
Ejemplo 19 - Las terapias antimetastásicas dependientes de células NK son más eficaces con la deficiencia de Cish
A continuación, los inventores buscaron comparar la deficiencia de Cish con las inmunoterapias contemporáneas, incluido el bloqueo del punto de control inmunitario (anti-PD-1, anti-CTLA-4, anti-CD96) y las citoquinas (IFNa/p, IL-2), que promueven la función celular NK, en el modelo de metástasis experimental B16F10. En particular, los ratones con deficiencia de Cish eran más resistentes a las metástasis pulmonares B16F10 que los ratones de tipo salvaje tratados con un régimen de IFN de tipo I anti-PD-1 (IFN-ap) o IL-2 (Fig. 20A). Todas estas inmunoterapias han sido utilizadas con cierto grado de éxito en el tratamiento del melanoma humano avanzado. Aunque el nivel de metástasis de B16F10 fue bajo en ratones Cish-/- tratados con clg, el tratamiento con IFN de tipo I e IL-2 pareció reducir aún más la metástasis (Fig. 20A). Otro experimento evaluó una exposición de dosis más alta con B16F10, y aquí se hizo evidente que tanto la combinación de anti-PD-1/anti-CTLA-4 como la IL-2 fueron más eficaces que clg en los ratones Cish~/- (Fig. 20B). En particular, la dosis baja de IL-2 fue ineficaz en ratones WT, pero eficaz en ratones Cish~/-. Este efecto mejorado de IL-2 en ratones Cish~/- en comparación con ratones WT también se observó en el modelo de linfoma i.p. RMA-S (Fig. 20C). Esto es de interés ya que el control mediado por células NK en ratones WT y Cish~/- fue equivalente en ratones no tratados o tratados con control tratados con PBS (Fig. 20C). Un experimento adicional realizado en un segundo modelo de metástasis experimental, RM-1, indicó la actividad antimetastásica superior de la deficiencia de Cish combinada con tratamiento anti-PD-1/anti-CTLA-4 o anti-CD96 (Fig. 20D). La actividad superior de anti-CD96 en ratones Cish-/- también se observó en el modelo de metástasis experimental B16F10 (Fig. 20E).
En conjunto, estos experimentos indicaron que la regulación CIS de la actividad antimetastásica de las células NK era independiente de las actividades antimetastásicas de los anticuerpos del punto de control inmunitario. En última instancia, los ratones fueron desafiados con la línea celular LWT1 de melanoma metastásico mutante BRAFV600E, y nuevamente se observó significativamente menos metástasis pulmonar en ratones Cish~/-. Esta metástasis se redujo aún más mediante el tratamiento con el inhibidor de BRAF PLX4720 (Fig. 20F) o un inhibidor de MEK (trametinib) solo o en combinación con PLX4720 (Fig. 21). En resumen, estos datos indican que dirigirse a CIS se combina bien con otras inmunoterapias y CIS es muy prometedor como un nuevo objetivo en la inmunoterapia con células NK.
Ejemplo 20 - Tratamiento de sarcoma
Los ratones Cish'A eran altamente resistentes a la formación de fibrosarcoma inducida por metilcolantreno (MCA) (Fig. 22A). El agotamiento de las células NK o la neutralización de IFNy redujeron significativamente de nuevo la supervivencia de los ratones WT y Cish-/-, y abolieron completamente el efecto protector de la deficiencia de Cish (Fig. 22B). El alcance de la protección contra la metástasis experimental y la carcinogénesis de novo observadas en ratones Cish-/- son impresionantes e indican claramente que la orientación al CIS es prometedora como un nuevo objetivo para la inmunoterapia basada en células NK. Estos resultados son consistentes con la inducción de IL-15 de la expresión de CIS en células NK y la observación de que la pérdida de Cish hace que las células NK sean hipersensibles a IL-15 (Delconte et al., 2016).
Ejemplo 21 - Tratamiento de la leucemia mieloide aguda
Un ejemplo pionero de la eficacia antitumoral de las células NK es el trasplante de médula ósea haploidéntico, en el que las células NK del donante reaccionan fuertemente contra la leucemia mieloide aguda (LMA) del huésped (Ruggeri et al., 2016), lo que sugiere que la LMA podría ser inmunogénica para las células NK propias, si dichas células NK estaban suficientemente activadas. Los inventores encontraron que cuando la médula ósea propia se infectó con un lentivirus que codifica el oncogén inductor de LMA MLL-AF9 y se inyectó en ratones WT, estos ratones sucumbieron a LMA alrededor de 40 días después de la inyección (Fig. 23). Por el contrario, si al huésped Cish-/- se le inyectó MLL-AF9 que expresaba médula ósea, el inicio de la LMA se retrasó significativamente y solo alrededor del 30 % de los ratones sucumbieron a la LMA en comparación con el 100 % de los ratones WT (Fig. 23). Estos datos sugieren que las células NK detectan y destruyen la LMA MLL-AF9+ y esto mejora significativamente en ausencia de CIS.
Ejemplo 22 - La deficiencia de CIS promueve la proliferación y diferenciación de células NK in vivo
Los experimentos iniciales indicaron que in vivo, en condiciones homeostáticas, los ratones Cish~/-tenían números de células NK similares a los ratones Cish+/+. Cuando las células NK se examinaron con mayor profundidad, fue evidente que las células NK Cish-- eran más maduras (M2, DNAM1+ KHLRG1+; Fig. 24A, B) y ciclaban más rápidamente (Ki67+; Fig. 24C) que las células de tipo salvaje. Dado que los números totales se mantienen constantes (Fig. 24A), esto también indica que las células NK Cish-/- mueren y/o se eliminan más rápidamente del cuerpo.
Ejemplo 23 - El control mejorado del sarcoma MCA1956 requiere células NK y células T CDS
Cuando se inyecta por vía subcutánea con el fibrosarcoma inmunogénico inducido por MCA, MCA1956, los ratones Cish-- mostraron un mejor control del tumor que los ratones WT (Fig. 25). Mientras que solo 1/10 de los ratones WT rechazaron espontáneamente el tumor, 5/10 de los ratones Cish-- eliminaron con éxito el tumor primario el día 30 después del trasplante (Fig. 25). El agotamiento de las células NK o de las células T CD8+ aceleró el crecimiento tumoral y anuló las diferencias observadas en los ratones WT y deficientes en Cish (Fig. 25). Si las células NK controlan el crecimiento de tumores MCA1956 directamente o si juegan un papel indirecto mediante la modulación de la actividad de las células T queda por dilucidar. En conjunto, nuestros datos sugieren que la deficiencia de Cish altera principalmente el crecimiento natural de los tumores subcutáneos donde las células NK son fundamentales.
Ejemplo 24 - Los linfocitos T Cish-- CDS exhiben una mayor proliferación y producción de IFNy (solo como referencia)
La falta de un fenotipo obvio de células T CD8 in vivo fue algo sorprendente dadas las similitudes entre la regulación transcripcional, los programas efectores y la dependencia de citoquinas de las células NK y las células T CD8. Para probar específicamente si las células T c D8 eran hipersensibles a la IL-15 o a la estimulación del receptor de antígeno, los ganglios linfáticos periféricos (agrupados, excluyendo mesentéricos) de WT-Ly5.1 de 6 a 8 semanas de edad (n=3) y Cish-- -Ly5.2 (n=3) se procesaron ratones en suspensiones de células individuales. Las muestras se enriquecieron en células T CD8+ mediante selección negativa con perlas magnéticas. A continuación, las células resultantes se marcaron con CTV 5 μM. Las células WT y Cish-- se cocultivaron en placas de 96 pocillos en condiciones de IL-2+aCD3, IL-15+aCD3, IL-2+aCD28+aCD3 e IL-15+aCD28+aCD3 en Im Dm +10%FCS. Para todas las condiciones, se incluyeron pocillos aCD3‘ como control (no mostrado). Los pocillos se prepararon por triplicado técnico para el análisis estadístico. Los marcadores de congenie permitieron el examen de ambos genotipos dentro de pocillos individuales. Las células se cultivaron a 37°C con 5% de CO2.
La producción de IFNy se evaluó mediante estimulación de 4 horas con PMNionomicina seguida de tinción intracelular y análisis FACS. Bajo todas las condiciones probadas, células T Cish- - CD8+ produjeron significativamente más IFNy en respuesta a la estimulación con PMAionomicina que las células de tipo salvaje (WT) (Fig. 26).
Los cultivos se examinaron en el día 4 de cultivo mediante análisis FAC de proliferación mediante dilución de CTV y expresión de marcador de superficie (Fig. 27). En ausencia de estimulación de aCD3, se observaron hasta 7 eventos de división en cultivos de IL-15+. El número de células se determinó en cada ciclo de división y se representó gráficamente en función del número de división (Fig. 27A). Se observaron resultados similares en cultivos de IL-2 (no mostrados).
En todas las condiciones examinadas, se encontró que tanto las células T WT como las Cish-- CD8+ proliferaban y producían IFNy en respuesta a la estimulación. En presencia de aCD3, todos los cultivos habían proliferado al máximo el día 4, haciendo comparaciones entre los genotipos difíciles (no mostrados). Sin embargo, en ausencia de estimulación con aCD3, el análisis del número de células frente al número de divisiones indicó que las células Cish--habían proliferado más rápidamente que los controles WT en el día 4 de cultivo (Fig. 27B). Tomados en conjunto, estos resultados indican que, en condiciones in vitro, las células T Cish-- CD8+ proliferan más rápidamente y muestran una función efectora mejorada en comparación con sus contrapartes WT. Estos resultados preliminares son prometedores, sin embargo, un análisis más detallado de las condiciones que inducen la proliferación proporcionará una mayor comprensión del fenotipo mejorado observado en las células T Cish- - CD8+.
Ejemplo 25 - Niveles elevados de IL-15 en el microambiente tumoral inducen niveles aumentados de Cish en células NK infiltrantes de tumores
Los inventores establecieron que la IL-15 induce rápidamente la expresión de Cish en células NK cultivadas y que la expresión de la proteína CIS se induce dentro de la hora siguiente a la estimulación con IL-15. Para visualizar la expresión de Cish in vivo, se utilizó una cepa de ratón informador Cish-lacZ (CishLacZ/+). Ratones IL-15+/+ o IL-15-/-(estado estromal de IL-15+ o - respectivamente) fueron letalmente irradiados y reconstituidos con CishLacZ/+ médula ósea. 10 semanas más tarde, estos ratones quiméricos se expusieron a 1 x 105 E0771 de células de cáncer de mama inyectadas en la almohadilla de grasa mamaria o se dejaron sin exposición. Una semana después, se sacrificaron los ratones, se recolectaron y disociaron los tumores mamarios y las células NK residentes en el tumor se tiñeron pgalactosidasa (expresión de Cish) y se analizaron mediante citometría de flujo. Se observó que la presencia de IL-15 estromal aumentaba significativamente la expresión de Cish en células NK alrededor de 2 veces (Fig. 28). Las células NK que se infiltraron en tumores mamarios en los que estaba presente IL-15 en el estroma mostraron una mayor expresión de Cish y esto fue más evidente en las células NK que se infiltraron en tumores mamarios en ratones cuyo estroma carecía de IL-15. En ambas situaciones, los niveles de Cish de las células NK fueron mayores en las células NK residentes del tumor en comparación con células NK de la almohadilla de grasa mamaria que sugieren niveles más altos de IL-15 en el microambiente tumoral EO771. Dado que este tumor está estrechamente controlado por las células NK y un modelo que responde extremadamente a la pérdida de función del CIS, nuestros datos sugieren que los niveles elevados de IL-15 en los tumores y el aumento de la expresión de Cish en las células NK residentes en el tumor es un pronóstico para un tumor que probablemente responda a un inhibidor de CIS de molécula pequeña.
Ejemplo 26 Evaluación de células NK Cish-/- humanas frente a metástasis de melanoma in vivo (profético)
Con el fin de evaluar la medida en qué las células NK Cish^ humanas recapitulan el efecto de las células NK Cish^ de ratón contra el crecimiento tumoral y la metástasis in vivo, realizaremos un experimento de transferencia de células adoptivas en ratones linfoides (NOD/SCID/gammaC; NSG). Para los modelos de transferencia adoptiva, a los ratones NSG se les inyectan i.v. 5 x 106 células NK humanas Cish+/+ o Cish-/- humanas isogénicas expandidas in vitro o PBS. A los ratones se les inyectan 8 h más tarde 1 x 106 células de melanoma derivadas de pacientes mutantes BRAF que se mantienen como una línea celular en nuestro laboratorio. Los ratones se tratan posteriormente el día 1 con 1,5 x 106 células NK Cish+/+ o Cish-/- expandidas in vitro o PBS administrados i.v. Los ratones se sacrifican el día 18 después de la inyección del tumor y se realiza la perfusión pulmonar. A continuación, se recogen los pulmones y los hígados y se cuentan las metástasis.
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Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Células NK inhibidas por CIS para uso en terapia celular adoptiva o profilaxis del cáncer, en las que las células NK inhibidas por CIS son Cish~/-.
2. Células NK Cish~/- para su uso según la reivindicación 1, en las que el cáncer comprende un tumor.
3. Células NK Cish'1' para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en las que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: melanoma metastásico, cáncer de próstata metastásico, cáncer de mama metastásico, cáncer de mama triple negativo, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de esófago, cáncer de hígado, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón de células escamosas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células de Merkel, sarcoma, cáncer hepatocelular, mieloma múltiple, cáncer de páncreas, carcinoma colorrectal, cáncer de cuello uterino, carcinoma gástrico, cáncer de riñón, células renales metastásicas carcinoma, leucemia, cáncer de ovario y glioma maligno.
4. Células NK Cish~/- para su uso según la reivindicación 3, en las que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: melanoma metastásico, cáncer de próstata metastásico y cáncer de mama metastásico.
5. Células NK Cish~/- para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en las que la terapia o profilaxis celular adoptiva comprende además el uso de IL-15, un agonista de IL-15, un inhibidor de la proteína quinasa B-Raf, un inhibidor de la proteína quinasa MEK, y/o un agente inmunoterapéutico en el tratamiento o prevención del cáncer.
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Jiang et al. Cristiana Perrotta1*, Davide Cervia2, Ilaria Di Renzo1, Claudia Moscheni1, Maria Teresa Bassi3, Lara Campana4, 5, Cristina Martelli6, Elisabetta Catalani2, Matteo Giovarelli1, Silvia Zecchini7, Marco Coazzoli1, Annalisa Capobianco4, Luisa Ottobrini6, 8, Giovanni Lucignani9, Patrizia Rosa10, Patrizia Rovere-Querini4, 11, Clara De Palma7 and Emilio Clementi 3, 7
Bassi et al. Cristiana Perrotta*, Davide Cervia 2, Ilaria Di Renzo, Claudia Moscheni
Muroyama Tumor-infiltrating Regulatory T cells–Phenotype and Expansion by Radiation Therapy
Hamilton Role of Nitric Oxide-Signalling in Hypoxia-Induced Immune Escape in Cancer