JP6626101B2 - GalNAcホスホラミダイト、その核酸結合体およびそれらの使用 - Google Patents
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Description
本発明は、概して、ホスホラミダイト誘導体の分野に関する。特に、本発明は、N-アセチルガラクトサミンホスホラミダイト分子に関し、かつ核酸分子とN-アセチルガラクトサミン含有分子との結合体に関する。これらの分子の調製法、および、特に医学におけるその使用可能性もまた提供する。
近年、治療において核酸分子を用いるためのアプローチが発展してきた。薬学的に関連する特性に好ましい影響をおよぼすために、核酸分子が、ペプチド、脂質、ステロール、および炭水化物などの一定のリガンドに結合されている。核酸結合体はsiRNAにおける使用のために大々的に評価されており、それらの結合体は十分なインビボでの効力を得るために必須であると考えられている。例えば、末端ガラクトースを含む結合部分またはその誘導体を核酸に連結し、それによりアシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)への結合を介して核酸分子に肝細胞を標的とさせることによるもの、例えば、WO2009/073809(特許文献1)、WO2011/104169(特許文献2)およびWO2012/083046(特許文献3)を参照されたい。
本発明の目的は、生成が容易な新規結合体分子を提供することであった。
1つの局面において、本発明は、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)ホスホラミダイトに関する。
[本発明1001]
一般式(I):
を有する化合物であって、式中、
NR'R''が二級アミノ基であり、ここでR'およびR''は独立にC 1 〜C 6 -アルキルから選択されるか、またはR'およびR''は一緒に5もしくは6員環を形成し、これは置換されていてもよく、かつNおよびOから選択される1つのさらなるヘテロ原子を含んでいてもよく;
AがC 1 〜C 6 -アルキル基または保護ヒドロキシ-もしくはチオ-基であり;かつ
Gが一般式(II):
で表され、式中、
A 1 が適切なヒドロキシル保護基であり、これは各出現時に同じであっても、または異なっていてもよく;かつ
Lが、C 2 〜C 30 -アルケニレン、-(CH 2 ) 2 -、-(CH 2 ) 3 -、-(CH 2 ) 4 -、-(CH 2 ) 5 -、-(CH 2 ) 7 -、-(CH 2 ) 8 -、-(CH 2 ) 9 -、-(CH 2 ) 10 -、-(CH 2 ) 11 -、-(CH 2 ) 12 -、-CH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 -、-CH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 -、および-CH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) 2 OCH 2 CH 2 -からなる群より選択され、より好ましくは-(CH 2 ) 2 -、-(CH 2 ) 3 -、および-(CH 2 ) 8 -から選択されるリンカー基である、化合物。
[本発明1002]
リンカー基がCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 -、-CH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 -、および-CH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) 2 OCH 2 CH 2 -から選択される、本発明1001の化合物。
[本発明1003]
二級アミノ基-NR'R''がジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジブチルアミノ、ピロリジノ、ピペリジノ、2,6-ジメチルピペリジノ、モルホリノ、イミダゾリルおよび4-メチルイミダゾリルからなる群より選択され、かつ/または
Aが2-シアノエトキシ、2-シアノエチルチオ、メトキシ、エトキシ、S-イソブタノイル-2-(2-メルカプトエトキシ)エトキシ、S-ピバロイル-2-(2-メルカプトエトキシ)エトキシ、S-ピバロイル-2-メルカプトエトキシ、メチルおよびエチルからなる群より選択され、かつ/または
ヒドロキシル保護基A 1 がアシル基およびシリル基から選択され、好ましくはアセチル、ベンゾイル、フェノキシ-アセチル、ピバロイル、イソブチリル、t-ブチルジメチルシリル、t-ブチルジフェニルシリル、トリイソプロピルシリルおよびイソプロピルジメチルシリルからなる群より選択される、本発明1001または1002の化合物。
[本発明1004]
Aが-O-CH 2 CH 2 CNであり、A 1 がアセチルであり、R'およびR''がそれぞれイソプロピルであり、かつLが-(CH 2 ) 2 -、-(CH 2 ) 3 -、-(CH 2 ) 4 -、-(CH 2 ) 5 -、-(CH 2 ) 7 -、-(CH 2 ) 8 -、-(CH 2 ) 9 -、-(CH 2 ) 10 -、-(CH 2 ) 11 -、-(CH 2 ) 12 -、-CH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 -、-CH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 -、および-CH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) 2 OCH 2 CH 2 -からなる群より選択され、好ましくは-(CH 2 ) 2 -および-(CH 2 ) 3 -から選択される、前記本発明のいずれかの化合物。
[本発明1005]
一般式(III):
を有する化合物であって、式中、
Zが核酸分子であり;
Tが一般式(IV)または一般式(VI):
で表され、式(IV)中、
R 2 がHまたは-(CH 2 ) q -R 1 を表し、
R 1 およびR 3 が各出現時に一般式(V):
で表され、式中、各出現時に独立に、
Vが-O-、-NH-CO-および-CO-NH-から選択され;
Wが-(CH 2 ) 2-15 -および-CH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) 0-4 OCH 2 CH 2 -からなる群より選択され;
YがOまたはSであり;
mが1〜3の整数であり;
nが0〜5の整数であり;
pが0〜3の整数であり;かつ
qが1〜2の整数であり;
rが1〜5の整数であり;
前記式(V)中、および式(VI):
中、各出現時に独立に、
sが0または1であり
Gが一般式(II)':
で表され、式中、
A 1 がHまたは適切なヒドロキシル保護基であり、これは各出現時に同じであっても、または異なっていてもよく;かつ
LがC 2 〜C 20 -アルケニレン、-CH 2 CH 2 -(OCH 2 CH 2 ) 0-6 -OCH 2 CH 2 、-(CH 2 ) 2 -、-(CH 2 ) 3 -、-(CH 2 ) 4 -、-(CH 2 ) 5 -、-(CH 2 ) 7 -、-(CH 2 ) 8 -、-(CH 2 ) 9 -、-(CH 2 ) 10 -、-(CH 2 ) 11 -、-(CH 2 ) 12 -、-CH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 -、-CH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 -、および-CH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) 2 OCH 2 CH 2 -からなる群より選択され;かつ
式(III)、(V)および(VI)中、各出現時に独立に
X 1 が-OHであり、かつX 2 が=Oおよび=Sから選択されるか、または
X 1 が-O - であり、かつX 2 が=Oおよび=Sから選択されるか、または
X 1 が=Oであり、かつX 2 が-CH 3 、-OR、-NHR、および-BH 3 から選択され、ここで
Rが各出現時に独立にC 1 〜C 6 アルキル基であるか、または
X 1 が=Sであり、かつX 2 が-CH 3 および-SHから選択され、
ここで式(VI)中の、R1、R3、またはR2がHでない場合のR2におけるリンカーLの最初の原子で始まり、式(IV)中、またはTが式(VI)で表される場合の核酸分子中の連結点で終わる連続鎖が、最短で8原子の長さおよび最長で30原子の長さを有する、化合物。
[本発明1006]
sが1であり、かつWが好ましくは-CH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 -、-CH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) 4 OCH 2 CH 2 -、-CH 2 CH 2 CH 2 -、および-(CH 2 ) 12 -からなる群より選択される、本発明1005の化合物。
[本発明1007]
sが0である、本発明1005の化合物。
[本発明1008]
各出現時に独立に、
X 1 が-OHであり、かつX 2 が=Oであるか、または
X 1 がO - であり、かつX 2 が=Oであるか、または
X 1 が-OHであり、かつX 2 が=Sであるか、または
X 1 がO - であり、かつX 2 が=Sであるか、または
X 1 が=Sであり、かつX 2 が-SHである、本発明1005〜1007のいずれかの化合物。
[本発明1009]
アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)に結合することができる、本発明1005〜1008のいずれかの化合物。
[本発明1010]
本発明1001〜1004のいずれかの化合物を調製するための方法であって、以下の段階を含む、方法:
(i)N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)の炭素原子1と2との間で内部オキサゾリン環を立体選択的に形成する段階;
(ii)段階(i)の生成物を、
一般式HO-L-O-A 3 を有し、式中、
A 3 が適切な保護基であり、かつ
LがC 2 〜C 20 -アルケニレン、-CH 2 CH 2 -(OCH 2 CH 2 ) 0-6 -OCH 2 CH 2 、-(CH 2 ) 2 -、-(CH 2 ) 3 -、-(CH 2 ) 4 -、-(CH 2 ) 5 -、-(CH 2 ) 7 -、-(CH 2 ) 8 -、-(CH 2 ) 9 -、-(CH 2 ) 10 -、-(CH 2 ) 11 -、-(CH 2 ) 12 -、-CH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 -、-CH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 -、および-CH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) 2 OCH 2 CH 2 -からなる群より選択されるリンカー基である化合物
と反応させ、それによりGalNAc環の炭素原子1でエーテル結合を形成する段階;
(iii)段階(ii)の生成物の-O-A 3 基を脱保護し、それにより脱保護-OH基を提供する段階、
(iv)段階(iii)の生成物をホスホルジアミダイトと反応させ、それにより本発明1001〜1004のいずれかの化合物を提供する段階。
[本発明1011]
GalNAc-核酸結合体を調製するための方法であって、以下の段階:
(i)固体支持体上の核酸分子を提供する段階;
(ii)ホスホラミダイト化学を用いて分枝分子を核酸分子に任意で付加する段階;
(iii)ホスホラミダイト化学を用いてスペーサーホスホラミダイト分子を分枝分子の分枝のそれぞれに任意で付加する段階;
(iv)分枝分子が存在しない場合、本発明1001〜1004のいずれかの化合物を核酸分子の反応性末端と反応させ、または分枝分子が存在する場合、本発明1001〜1004のいずれかの化合物を分枝のそれぞれの反応性末端と反応させ、またはスペーサーが存在する場合、本発明1001〜1004のいずれかの化合物をスペーサーのそれぞれの反応性末端と反応させる段階;および
(v)段階(iv)の生成物を固体支持体から切断する段階
を含み、本発明1001〜1004のいずれかの化合物におけるリンカーLの最初の原子で始まり、結合分子を核酸に連結しているリン原子で終わる連続鎖が、最短で10原子の長さおよび最長で34原子の長さを有する、方法。
[本発明1012]
付加後の前記分枝分子が、好ましくは一般式(IVa):
で表される構造をもたらし、式中、
A 4 が適切な保護基であり;
V 1 が-O-、-NH-CO-および-CO-NH-から選択され;
V 2 が存在しないか、または-O-、-NH-CO-および-CO-NH-から選択され;
V 3 が-O-、-NH-CO-および-CO-NH-から選択され;
X 1 が-OHであり、かつX 2 が=Oおよび=Sから選択されるか、または
X 1 がO - であり、かつX 2 が=Oおよび=Sから選択されるか、または
X 1 が=Oであり、かつX 2 が-CH 3 、-SH、-OR、-NHR、および-BH 3 から選択され、ここでRが各出現時に独立にC 1 〜C 6 アルキル基であるか、または
X 1 が=Sであり、かつX 2 が-CH 3 および-SHから選択され;
mが1〜3の整数であり;
nが0〜5の整数であり;
pが0〜3の整数であり;かつ各出現時に独立に
qが1〜2の整数であり;
q'が0〜2の整数であり;かつ
rが1〜5の整数であり;
ただしV 2 が存在しない場合、q'は0であり、かつ式(IVa)中のV 2 に連結された-(CH 2 ) r -OA 4 も存在しないことを条件とし;かつ
付加後の前記スペーサーホスホラミダイト分子が、好ましくは一般式(Va):
で表される構造をもたらし、式中、各出現時に独立に、
A 5 が適切な保護基であり;
Wが-(CH 2 ) 2-15 -および-CH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) 0-4 OCH 2 CH 2 -からなる群より選択され;
X 1 が-OHであり、かつX 2 が=Oおよび=Sから選択されるか、または
X 1 がO - であり、かつX 2 が=Oおよび=Sから選択されるか、または
X 1 が=Oであり、かつX 2 が-CH 3 、-SH、-OR、-NHR、および-BH 3 から選択され、ここでRが各出現時に独立にC 1 〜C 6 アルキル基であるか、または
X 1 が=Sであり、かつX 2 が-CH 3 および-SHから選択され;かつ
ここで本発明1001〜1004のいずれかの化合物におけるリンカーLの最初の原子で始まり、式(IVa)中の連結点または核酸分子中の連結点で終わる連続鎖は、最短で8原子の長さおよび最長で30原子の長さを有する、本発明1011の方法。
[本発明1013]
分枝分子が下記:
1,3-ビス-[5-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)ペンチルアミド]プロピル-2-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)] ホスホラミダイト;トリス-2,2,2-[3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピルオキシメチル]エチル-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト;およびトリス-2,2,2-[3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピルオキシメチル]メチレンオキシプロピル-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト
からなる群より選択される、本発明1011または1012の方法。
[本発明1014]
スペーサーホスホラミダイト分子が一般式(VII):
で表され、式中、A 2 が適切な保護基、好ましくは-CH 2 CH 2 CNであり、A 6 が適切な保護基、例えば4',4'-ジメトキシトリチルであり、かつR 4 が-CH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 -、-CH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) 4 OCH 2 CH 2 -、-CH 2 CH 2 CH 2 -、および-(CH 2 ) 12 -からなる群より選択され;かつ
NR'R''が二級アミノ基であり、ここでR'およびR''が独立にC 1 〜C 6 -アルキルから選択されるか、またはR'およびR''が一緒に5もしくは6員環を形成し、これは置換されていてもよく、かつNおよびOから選択される1つのさらなるヘテロ原子を含んでいてもよい、本発明1011〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
核酸分子がDNA、RNAおよび1つまたは複数のヌクレオシド類縁体を含む分子から選択され、特に核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチド、ギャップマー、低分子干渉RNA、およびマイクロRNAから選択され、かつ核酸分子が好ましくは1つまたは複数のロックド核酸ヌクレオシドを含む、本発明1011のいずれかの方法。
[本発明1016]
本発明1005〜1009のいずれかの化合物の調製のための、本発明1001〜1004のいずれかの化合物の使用。
[本発明1017]
医薬としての本発明1005〜1009のいずれかの化合物の使用。
GalNAcホスホラミダイト
1つの局面において、本発明は、新規N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)ホスホラミダイトに関する。したがって、本発明は、一般式(I):
を有する化合物を提供し、式中、
NR'R''は二級アミノ基であり、ここでR'およびR''は独立にC1〜C6-アルキルから選択されるか、またはR'およびR''は一緒に5もしくは6員環を形成し、これは置換されていてもよく、かつNおよびOから選択される1つのさらなるヘテロ原子を含んでいてもよく;
AはC1〜C6-アルキル基または保護ヒドロキシ-もしくはチオ-基であり;かつ
Gは一般式(II):
で表され、式中、A1は適切なヒドロキシル保護基であり、これは各出現時に同じであっても、または異なっていてもよく;かつ
Lは2〜30炭素原子の鎖長を有するリンカー基であり、ここで鎖中の炭素原子の1つまたは複数はそれぞれ独立に-NHCO-、-CONH-および/またはヘテロ原子、特にOで置き換えられていてもよい。いくつかの態様において、リンカー基Lは、C2〜C30-アルケニレン、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-(CH2)11-、-(CH2)12-、-CH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-、および-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-からなる群より、より好ましくは-(CH2)2-、-(CH2)3-、および-(CH2)8-から選択される。
さらなる局面において、本発明は、新規GalNAc-核酸結合体、特にGalNAcクラスター結合体に関する。GalNAc結合部分は連結した核酸の薬動力学的および薬力学的特性を改変することができる。
を有する化合物を提供し、式中、
Zは核酸分子であり;
Tは一般式(IV):
で表され、式中、
R2はHまたは-(CH2)q-R1を表し、
R1およびR3は各出現時に一般式(V):
で表され、式中、各出現時に独立に、
Vは-O-、-NH-CO-および-CO-NH-から選択され;
Wは-(CH2)2-15-および-CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2-からなる群より選択され;
YはOまたはSであり;
mは1〜3の整数であり;
nは0〜5の整数であり;
pは0〜3の整数であり;かつ
qは1〜2の整数であり;
rは1〜5の整数であり;
sは0または1であり
Gは一般式(II)':
で表され、式中、A1はHまたは適切なヒドロキシル保護基であり、これは各出現時に同じであっても、または異なっていてもよく;かつLは2〜23炭素原子の鎖長を有するリンカー基であり、ここで鎖中の炭素原子の1つまたは複数はそれぞれ独立に-NH-CO-、-CO-NH-および/またはヘテロ原子、特にOで置き換えられていてもよく;かつ
各出現時に独立に、
X1は-OHであり、かつX2は=Oおよび=Sから選択されるか、または
X1は-O-であり、かつX2は=Oおよび=Sから選択されるか、または
X1は=Oであり、かつX2は-CH3、-OR、-NHR、および-BH3から選択され、ここでRは各出現時に独立にC1〜C6アルキル基であるか、または
X1は=Sであり、かつX2は-CH3および-SHから選択され、
ここで式(IV)中のR1、R3、またはR2がHでない場合のR2におけるリンカーLの最初の原子で始まり、連結点で終わる連続鎖は、最短で8原子の長さおよび最長で30原子の長さを有する。
を有する化合物を提供し、式中、
Zは核酸分子であり;
Tは一般式(VI):
で表され、式中、各出現時に独立に
Wは-(CH2)2-15-および-CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2-からなる群より選択され;
sは0または1であり
Gは一般式(II)':
で表され、式中、A1はHまたは適切なヒドロキシル保護基であり、これは各出現時に同じであっても、または異なっていてもよく;かつLは2〜23炭素原子の鎖長を有するリンカー基であり、ここで鎖中の炭素原子の1つまたは複数はそれぞれ独立に-NH-CO-、-CO-NH-および/またはヘテロ原子、特にOで置き換えられていてもよく;かつ
各出現時に独立に
X1は-OHであり、かつX2は=Oおよび=Sから選択されるか、または
X1は-O-であり、かつX2は=Oおよび=Sから選択されるか、または
X1は=Oであり、かつX2は-CH3、-OR、-NHR、および-BH3から選択され、ここでRは各出現時に独立にC1〜C6アルキル基であるか、または
X1は=Sであり、かつX2は-CH3および-SHから選択され、
ここでリンカーLの最初の原子で始まり、核酸分子中の連結点で終わる連続鎖は、最短で8原子の長さおよび最長で30原子の長さを有する。
中のR1、R3、またはR2がHでない場合のR2におけるリンカーLの最初の原子で始まり、分枝点炭素原子で終わる連続鎖は、9〜23原子の長さを有する。さらなる好ましい態様において、式(IV)中のR1、R3、またはR2がHでない場合のR2におけるリンカーLの最初の原子で始まり、分枝点炭素原子で終わる連続鎖は、12〜18原子などの、9〜21原子、例えば、16原子の長さを有する。「分枝点炭素原子」は、-(CH2)q-R1、-(CH2)q-R3およびR2が結合している炭素原子である(図1参照)。
他の態様において、X1は-OHであり、かつX2は=Sであり;
さらなる態様において、X1はO-であり、かつX2は=Oであり;
さらなる態様において、X1はO-であり、かつX2は=Sであり;
さらなる態様において、X1は=Oであり、かつX2は-CH3であり;
さらなる態様において、X1は=Oであり、かつX2は-SHであり;
さらなる態様において、X1は=Oであり、かつX2は-ORであり、ここでRはC1〜C6アルキル基、好ましくはメチルまたはエチルであり;
さらなる態様において、X1は=Oであり、かつX2は-NHRであり、ここでRはC1〜C6アルキル基、好ましくはメチルまたはエチルであり;
さらなる態様において、X1は=Oであり、かつX2は-BH3であり;
さらなる態様において、X1は=Sであり、かつX2は-CH3であり;
さらなる態様において、X1は=Sであり、かつX2は-SHである。
X1は-OHであり、かつX2は=Oである;
X1はO-であり、かつX2は=Oである;
X1は-OHであり、かつX2は=Sである;
X1はO-であり、かつX2は=Sである;および
X1は=Sであり、かつX2は-SHである。
さらなる局面において、本発明は、GalNAcホスホラミダイトの製造法に関する。したがって、本発明は、式(I)の化合物の調製法であって、以下の段階を含む方法を提供する:
(i)N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)の炭素原子1と2との間で内部オキサゾリン環を立体選択的に形成する段階;
(ii)段階(i)の生成物を、
一般式HO-L-O-A3を有する化合物であって、式中、
A3は適切な保護基であり、かつ
Lは2〜30炭素原子の鎖長を有するリンカー基であり、ここで鎖中の炭素原子の1つまたは複数はそれぞれ独立に-NH-CO-、-CO-NH-および/またはヘテロ原子、特にOで置き換えられていてもよく、ここでLは好ましくは、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-(CH2)11-、-(CH2)12-、-CH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-、および-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-からなる群より選択される化合物
と反応させ、それによりGalNAc環の炭素原子1でエーテル結合を形成する段階;
(iii)段階(ii)の生成物の-O-A3基を脱保護し、それにより脱保護-OH基を提供する段階;
(iv)段階(iii)の生成物をホスホルジアミダイト、またはクロロホスホラミダイトと反応させ、それにより式(I)の化合物を提供する段階。
さらなる局面において、本発明は、少なくとも1つのGalNAcホスホラミダイトを用いての核酸結合体の製造法に関する。
(i)固体支持体上の核酸分子を提供する段階;
(ii)ホスホラミダイト化学を用いて分枝分子を核酸分子に任意で付加する段階;
(iii)ホスホラミダイト化学を用いてスペーサーホスホラミダイト分子を分枝分子の分枝のそれぞれに任意で付加する段階;
(iv)分枝分子が存在しない場合、式(I)の化合物を核酸分子の反応性末端と反応させ、または分枝分子が存在し、かつスペーサーが存在しない場合、式(I)の化合物を分枝のそれぞれの反応性末端と反応させ、またはスペーサーが存在する場合、式(I)の化合物をスペーサーのそれぞれの反応性末端と反応させる段階;および
(v)段階(iv)の生成物を固体支持体から切断する段階;
ここで式(I)の化合物におけるリンカーLの最初の原子で始まり、結合部分を核酸に連結しているリン原子で終わる連続鎖は、最短で10原子の長さおよび最長で34原子の長さを有する。
(i)固体支持体上の核酸分子を提供する段階;
(ii)ホスホラミダイト化学を用いて分枝分子を核酸分子に任意で付加する段階、ここで付加後の該分枝分子は、好ましくは一般式(IVa):
で表される構造をもたらし、式中、
A4は適切な保護基であり;
V1は-O-、-NH-CO-および-CO-NH-から選択され;
V2は存在しないか、または-O-、-NH-CO-および-CO-NH-から選択され;
V3は-O-、-NH-CO-および-CO-NH-から選択され;
X1は-OHであり、かつX2は=Oおよび=Sから選択されるか、または
X1はO-であり、かつX2は=Oおよび=Sから選択されるか、または
X1は=Oであり、かつX2は-CH3、-SH、-OR、-NHR、および-BH3から選択され、ここでRは各出現時に独立にC1〜C6アルキル基であるか、または
X1は=Sであり、かつX2は-CH3および-SHから選択され;
mは1〜3の整数であり;
nは0〜5の整数であり;
pは0〜3の整数であり;かつ各出現時に独立に
qは1〜2の整数であり;
q'は0〜2の整数であり;かつ
rは1〜5の整数であり;
ただしV2が存在しない場合、q'は0であり、かつ式(IVa)中のV2に連結された-(CH2)r-OA4も存在しないことを条件とし;
(iii)ホスホラミダイト化学を用いてスペーサーホスホラミダイト分子を分枝分子の分枝のそれぞれに任意で付加する段階、ここで付加後の該スペーサー分子は、好ましくは一般式(Va):
で表される構造をもたらし、式中、各出現時に独立に、
A5は適切な保護基であり;
Wは-(CH2)2-15-および-CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2-からなる群より選択され;
X1は-OHであり、かつX2は=Oおよび=Sから選択されるか、または
X1はO-であり、かつX2は=Oおよび=Sから選択されるか、または
X1は=Oであり、かつX2は-CH3、-SH、-OR、-NHR、および-BH3から選択され、ここでRは各出現時に独立にC1〜C6アルキル基であるか、または
X1は=Sであり、かつX2は-CH3および-SHから選択され;
(iv)分枝分子が存在しない場合、式(I)の化合物を核酸分子の反応性末端と反応させ、または分枝分子が存在し、かつスペーサーが存在しない場合、式(I)の化合物を分枝のそれぞれの反応性末端と反応させ、またはスペーサーが存在する場合、式(I)の化合物をスペーサーのそれぞれの反応性末端と反応させる段階;および
(v)段階(iv)の生成物を固体支持体から切断する段階;
ここで式(I)の化合物におけるリンカーLの最初の原子で始まり、式(IVa)中の連結点または核酸分子中の連結点で終わる連続鎖は、最短で8原子の長さおよび最長で30原子の長さを有する。
(i)固体支持体上の核酸分子を提供する段階;
(ii)ホスホラミダイト化学を用いて分枝分子を核酸分子に付加する段階、ここで付加後の該分枝分子は、好ましくは一般式(IVa):
で表される構造をもたらし、式中、
A4は適切な保護基であり;
V1は-O-、-NH-CO-および-CO-NH-から選択され;
V2は存在しないか、または-O-、-NH-CO-および-CO-NH-から選択され;
V3は-O-、-NH-CO-および-CO-NH-から選択され;
X1は-OHであり、かつX2は=Oおよび=Sから選択されるか、または
X1はO-であり、かつX2は=Oおよび=Sから選択されるか、または
X1は=Oであり、かつX2は-CH3、-SH、-OR、-NHR、および-BH3から選択され、ここでRは各出現時に独立にC1〜C6アルキル基であるか、または
X1は=Sであり、かつX2は-CH3および-SHから選択され;
mは1〜3の整数であり;
nは0〜5の整数であり;
pは0〜3の整数であり;かつ各出現時に独立に
qは1〜2の整数であり;
q'は0〜2の整数であり;かつ
rは1〜5の整数であり;
ただしV2が存在しない場合、q'は0であり、かつ式(IVa)中のV2に連結された-(CH2)r-OA4も存在しないことを条件とし;
(iii)式(I)の化合物を分枝のそれぞれの反応性末端と反応させる段階;および
(v)段階(iv)の生成物を固体支持体から切断する段階;
ここで式(I)中のリンカーLの最初の原子で始まり、式(IVa)中の連結点で終わる連続鎖は、最短で8原子の長さおよび最長で30原子の長さを有する。
(i)固体支持体上の核酸分子を提供する段階;
(ii)ホスホラミダイト化学を用いて分枝分子を核酸分子に付加する段階、ここで付加後の該分枝分子は、好ましくは一般式(IVa):
で表される構造をもたらし、式中、
A4は適切な保護基であり;
V1は-O-、-NH-CO-および-CO-NH-から選択され;
V2は存在しないか、または-O-、-NH-CO-および-CO-NH-から選択され;
V3は-O-、-NH-CO-および-CO-NH-から選択され;
X1は-OHであり、かつX2は=Oおよび=Sから選択されるか、または
X1はO-であり、かつX2は=Oおよび=Sから選択されるか、または
X1は=Oであり、かつX2は-CH3、-SH、-OR、-NHR、および-BH3から選択され、ここでRは各出現時に独立にC1〜C6アルキル基であるか、または
X1は=Sであり、かつX2は-CH3および-SHから選択され;
mは1〜3の整数であり;
nは0〜5の整数であり;
pは0〜3の整数であり;かつ各出現時に独立に
qは1〜2の整数であり;
q'は0〜2の整数であり;かつ
rは1〜5の整数であり;
ただしV2が存在しない場合、q'は0であり、かつ式(IVa)中のV2に連結された-(CH2)r-OA4も存在しないことを条件とし;
(iii)ホスホラミダイト化学を用いてスペーサーホスホラミダイト分子を分枝分子の分枝のそれぞれに付加する段階、ここで付加後の該スペーサー分子は、好ましくは一般式(Va):
で表される構造をもたらし、式中、各出現時に独立に、
A5は適切な保護基であり;
Wは-(CH2)2-15-および-CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2-からなる群より選択され;
X1は-OHであり、かつX2は=Oおよび=Sから選択されるか、または
X1はO-であり、かつX2は=Oおよび=Sから選択されるか、または
X1は=Oであり、かつX2は-CH3、-SH、-OR、-NHR、および-BH3から選択され、ここでRは各出現時に独立にC1〜C6アルキル基であるか、または
X1は=Sであり、かつX2は-CH3および-SHから選択され;
(iv)式(I)の化合物をスペーサーのそれぞれの反応性末端と反応させる段階;および
(v)段階(iv)の生成物を固体支持体から切断する段階;
ここで式(I)中のリンカーLの最初の原子で始まり、式(IVa)中の連結点で終わる連続鎖は、最短で8原子の長さおよび最長で30原子の長さを有する。
(a)保護ヒドロキシ基、例えば、ヌクレオシド、もしくはリンカー部分の5'-OH基を脱保護するか、または式(IVa)および(Va)中のA4-OもしくはA5-Oにおけるオキシ基を脱保護する段階;
(b)ホスホラミダイト含有化合物、例えば、本発明のGalNAcアミダイトまたは分枝分子もしくはスペーサー分子を、非保護ヒドロキシ基(それぞれの分子の「反応性末端」と呼んでもよい)に結合する段階、および
(c)中間体を酸化する段階。
で表される。式(IVa)中、A4は適切な保護基である。そのような保護基は有機合成の分野の技術者には公知である。例えば、遊離OH基とエーテルを形成する基を挙げてもよい。一定の好ましい態様において、保護基A4はジメトキシトリチル(DMT)である。
他の態様において、X1は-OHであり、かつX2は=Sであり;
さらなる態様において、X1はO-であり、かつX2は=Oであり;
さらなる態様において、X1はO-であり、かつX2は=Sであり;
さらなる態様において、X1は=Oであり、かつX2は-CH3であり;
さらなる態様において、X1は=Oであり、かつX2は-SHであり;
さらなる態様において、X1は=Oであり、かつX2は-ORであり、ここでRはC1〜C6アルキル基、好ましくはメチルまたはエチルであり;
さらなる態様において、X1は=Oであり、かつX2は-NHRであり、ここでRはC1〜C6アルキル基、好ましくはメチルまたはエチルであり;
さらなる態様において、X1は=Oであり、かつX2は-BH3であり;
さらなる態様において、X1は=Sであり、かつX2は-CH3であり;
さらなる態様において、X1は=Sであり、かつX2は-SHである。
X1は-OHであり、かつX2は=Oである;
X1はO-であり、かつX2は=Oである;
X1は-OHであり、かつX2は=Sである;
X1はO-であり、かつX2は=Sである;および
X1は=Sであり、かつX2は-SHである。
1,3-ビス-[5-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)ペンチルアミド]プロピル-2-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]ホスホラミダイト(Glen Research Catalogue Number: 10-1920-xx);
トリス-2,2,2-[3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピルオキシメチル]エチル-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research Catalogue Number: 10-1922-xx);および
トリス-2,2,2-[3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピルオキシメチル]メチレンオキシプロピル-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト。
で表される。式(Va)中、A5は適切な保護基である。そのような保護基は有機合成の分野の技術者には公知である。
で表される。式(VII)中の二級アミノ基-NR'R''のR'およびR''は、C1〜C6アルキルから選択されるか、またはR'およびR''は一緒に5もしくは6員環を形成し、これは置換されていてもよく、かつNおよびOから選択される1つのさらなるヘテロ原子を含んでいてもよく、ここで具体的なC1〜C6アルキル基および環は式(I)に関して上で定義したものから選択される。特定の態様において、R'はR''と同じであり、かつ-NR'R''はジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、およびジブチルアミノからなる群より選択され、好ましくはジイソプロピルアミノである。他の態様において、R'およびR''は一緒に式(I)に関して上で示した5または6員環を形成する。特に、環はピロリジノ、ピペリジノ、2,6-ジメチルピペリジノ、モルホリノ、イミダゾリルおよび4-メチルイミダゾリルからなる群より選択される。
中の分枝点炭素原子で終わる連続鎖は、好ましくは9〜23原子の長さを有してもよい。
さらなる局面において、本発明は、記載した新規GalNAcホスホラミダイトの様々な使用に関する。例えば、本発明は、GalNAc-核酸結合体の調製のための式(I)の化合物の使用を提供する。結合部分は一価またはクラスターでありうる。好ましくは、クラスターはGalNAc部分に関して二価または三価である。本発明のGalNAc-核酸結合体、すなわち分枝分子および/またはスペーサー分子を有する、または有していない、好ましくは分枝分子および/またはスペーサー分子を有する、式(III)の化合物を、本発明のGalNAcホスホラミダイトを用いて生成することができる。特に、前述のGalNAc-核酸結合体の製造法において、式(I)の化合物を用いてもよい。
本発明の文脈における「核酸分子」なる用語は、複数のヌクレオシドの共有結合により生成される分子(すなわち、オリゴヌクレオチド)を意味する。本明細書において、1個のヌクレオシド(ユニット)を、モノマーまたはユニットと呼んでもよい。いくつかの態様において、「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」、「ユニット」および「モノマー」なる用語は交換可能に用いられる。ヌクレオチドまたはモノマーの配列に言及する場合、言及されるものはA、T、G、CもしくはUまたはその類縁体などの、塩基の配列であることが理解されよう。
本発明の文脈における「標的」なる用語は、細胞内に自然に存在する細胞または分子構造を意味し、ここで標的は薬学的活性分子が作用する関心対象の病態に関与する。好ましい態様において、標的は、調節後に関心対象の病態を変化させる、核酸配列(標的核酸)である。
いくつかの態様において、「ヌクレオシド類縁体」および「ヌクレオチド類縁体」なる用語は、交換可能に用いられる。
。
の構造、ならびにその塩基性塩および酸付加塩を有し、ここで、すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれかで見出されてもよく;
式中、Xは-O-、-S-、-N(RN*)-、-C(R6R6*)-から選択され、例えば、いくつかの態様において、-O-であり;
Bは水素、置換されていてもよいC1-4-アルコキシ、置換されていてもよいC1-4-アルキル、置換されていてもよいC1-4-アシルオキシ、天然および核酸塩基類縁体を含む核酸塩基、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドから選択され;好ましくは、Bは核酸塩基または核酸塩基類縁体であり;
Pは、隣接モノマーへのヌクレオチド間連結、または5'末端基を示し、そのようなヌクレオチド間連結または5'末端基は任意で置換基R5または同等に適用可能な置換基R5*を含み;
P*は、隣接モノマーへのヌクレオチド間連結、または3'末端基を示し;
R4*およびR2*は一緒に、-C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-、および>C=Zから選択される1〜4つの基/原子からなる二価のリンカー基を示し、ここでZは-O-、-S-、および-N(Ra)-から選択され、かつRaおよびRbはそれぞれ独立に水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、置換されていてもよいC1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、かつここで2つのジェミナルな置換基RaおよびRbは一緒に、置換されていてもよいメチレン(=CH2)を示してもよく、ここですべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれかで見出されてもよく、かつ;
存在する置換基R1*、R2、R3、R5、R5*、R6およびR6*はそれぞれ独立に水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、かつここで2つのジェミナルな置換基は一緒に、オキソ、チオキソ、イミノ、または置換されていてもよいメチレンを示してもよく;
ここでRNは水素およびC1-4-アルキルから選択され、かつここで2つの隣接(非ジェミナル)置換基はさらなる結合を示して二重結合をもたらしてもよく;かつRN*は、存在し、ビラジカルに関与しない場合、水素およびC1-4-アルキルから選択される。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれかで見出されてもよい。
の構造を有し、式中、Yは-O-、-CH2O-、-S-、-NH-、N(Re)および/または-CH2-からなる群より選択され;ZおよびZ*は独立にヌクレオチド間連結、RH、末端基または保護基の間で選択され;Bは天然または非天然ヌクレオチド塩基部分(核酸塩基)を構成し、かつRHは水素およびC1-4-アルキルから選択され;Ra、Rb Rc、RdおよびReは、任意で、独立に、水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドからなる群より選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、かつここで2つのジェミナルな置換基RaおよびRbは一緒に、置換されていてもよいメチレン(=CH2)を示してもよく;かつRHは水素およびC1-4-アルキルから選択される。いくつかの態様において、Ra、Rb Rc、RdおよびReは、任意で、独立に、水素およびC1-6アルキルからなる群より選択され、例えばメチルである。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれかで見出されてもよく、例えば、2つの例示的な立体化学異性体にはベータ-Dおよびアルファ-Lイソ型が含まれ、これらは以下のとおり例示しうる:
。
本明細書に記載の核酸分子のモノマーは連結基を介して結合される。適切には、各モノマーは、3'隣接モノマーに連結基を介して連結される。
本発明の化合物を、薬学的製剤および組成物中で用いてもよい。適切には、そのような組成物は薬学的に許容される希釈剤、担体、塩または補助剤を含む。WO2007/031091は、適切かつ好ましい薬学的に許容される希釈剤、担体および補助剤を提供しており−これは参照により本明細書に組み入れられる。適切な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組み合わせ、プロドラッグ製剤もWO2007/031091において提供され−これは参照により本明細書に組み入れられる。
本発明の化合物を、例えば、診断、治療および予防のための研究試薬として用いてもよい。
ベータ-GalNAcホスホラミダイトの合成
段階1
塩化tert-ブチルジフェニルシリル(TBDPSCl)(2.6mL、10mmol)をエチレングリコール(3.4mL、60.7mmol)およびピリジン(3.4mL、42.2mmol)の混合物に室温で滴加した。3.5時間撹拌した後、反応混合物をEtOAc(50mL)で希釈した。有機相を水(30mL)、20%NaHCO3(30mL)、食塩水(30mL)で抽出し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させた。残渣をDCVCクロマトグラフィ(溶離剤EtOAc/ヘキサン10%〜25%)で精製した。生成物(TBDPSグリコール)を白色固体で単離した、2.54g、収率84%。
30mL DCM中の過アセチル化ガラクトサミン(1.63g、4.17mmol)の懸濁液に、TMSOTf(1.90mL、10.4mmol)を加え、反応混合物を40〜45℃で5時間撹拌した。さらなるTMSOTf(0.30mL 2.8mmol)を加え、反応混合物をさらに16時間撹拌した。次いで、反応をNEt3(0.90mL)により0℃で停止し、DCMで希釈し、冷飽和NaHCO3(2×100mL)、食塩水(50mL)で抽出し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させた。生成物1を黄色油状物で単離した、1.40g、粗収率。
1(1.40g、4.17mmol)およびTBDPSグリコール(1.08g、1.60mmol)を20mL DCEに溶解した。カンファースルホン酸(CSA)(84mg、0.36mmol)を加え、反応混合物を70〜75℃で2時間撹拌した。さらなるCSA(84mg、0.36mmol)を加え、反応混合物を70〜75℃でさらに2時間撹拌した。NEt3(80μL)を反応混合物に室温で加え、次いでDCM(20mL)で希釈した。混合物を飽和NaHCO3(100mL)、水(100mL)、食塩水(50mL)で洗浄し、有機相をNa2SO4で乾燥し、蒸発させた。得られた残渣をカラムクロマトグラフィ(溶離剤:EtOAc/ヘキサン30%〜50%)で精製した。生成物を白色泡状物で単離した(1.59g、収率70%)、1H-NMRおよびMS、HPLC 99%。
NEt3*3HF(1.2mL、7.4mmol)を12mL THF中の2(776mg、1.23mmol)およびNEt3(0.44mL、3.07mmol)の溶液に加えた。反応混合物を室温で20時間撹拌し、次いで蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィ(溶離剤MeOH/DCM 4%〜10%)で精製した。3を白色固体で単離した、416mg、収率86%、1H-NMR。
DCM(60mL)およびMeCN(4mL)中の3(1.51g、3.87mmol)の溶液に、MeCN(2mL)中のDCI(320g、2.71mmol)の溶液を加え、続いてDCM(2.5mL)中のPN2(1.42g、4.47mmol)の溶液を加えた。反応混合物を室温で4時間撹拌した。DCM(30mL)を加え、反応混合物をNaHCO3(2×100mL)、水/食塩水 1/1(50mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィ(溶離剤DCM+3%NEt3)で精製し、次いで第二のカラムクロマトグラフィ(EtOAc/ヘキサン)で精製した。
段階6
TBDPSCl(9.1mL、35mmol)をエチレングリコール(28.4mL、210mmol)およびピリジン(11.3mL)の混合物に室温で滴加した。2時間撹拌した後、反応混合物をEtOAc(150mL)で希釈し、水(100mL)、食塩水(100ml)で抽出し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させた。残渣をDCVCクロマトグラフィ(溶離剤EtOAc/ヘキサン10%〜30%)で精製した。TBDPSトリエチレングリコールを粘稠油状物で単離した、10.7g、収率79%。
DCE(130mL)中の1(約7.4g、20.6mmol)およびTBDPSトリエチレングリコール(6.68g、17.2mmol)の混合物に、カンファースルホン酸(CSA、0.40、1.72mmol)を加え、反応混合物を70〜75℃で18時間撹拌した。NEt3(0.48mL)を反応混合物に室温で加え、次いでDCM(80mL)で希釈し、飽和NaHCO3(2×100mL)、水(100mL)、食塩水(100mL)で抽出し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させた。残渣をクロマトグラフィ(溶離剤EtOAc/ヘキサン66%〜80%)で精製した。2をわずかに黄色の油状物で単離した、8.90g、1H-NMR、MS [M+1]+ 718、HPLC純度95%、収率69%。
THF(125mL)中の2(8.90g、12.4mmol)の溶液に、NEt3(4.3mL、31mmol)およびNEt3 3HF(12mL、74mmol)を加えた。反応混合物お室温で24時間撹拌し、次いで蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィ(溶離剤MeOH/DCM 4%〜9%)で精製した。3をわずかに黄色の油状物で単離した、4.40g、1H-NMR、収率71%。
DCM(100mL)およびMeCN(3.5mL)中の3(4.4g、9.18mmol)の溶液に、MeCN(6mL)中のDCIの溶液と、続いてDCM(5mL)中のPN2(3.18、10.6mmol)の溶液を加えた。反応混合物を室温で22時間撹拌した(完全な変換ではなかった)。DCM(45mL)を加え、反応混合物をNaHCO3(2×100mL)、水/食塩水 1/1(50mL)で抽出し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィ(溶離剤EtOAc/ヘキサン1/4+9%NEt3)で精製した。1.52gの3を再生し、同じ方法(PN2 1.09g 3.64.6mmol、0.26g 2.22mmol、DCM 35mL、MeCN 3.5mL、反応時間24時間)で4に変換し、一回目のクロマトグラフィからの不純分画と共に精製した。4をわずかに黄色の油状物で単離した、2.45g 収率38%。
図3d〜eも参照されたい。
塩化アセチルを、DMF中のNAcGalおよびTBDPSグリコールの溶液に0℃で滴加する。反応混合物を70℃で完了するまで撹拌する。反応混合物を0℃まで冷却し、過剰の無水ピリジンで反応停止する。反応混合物を室温に戻し、過剰の無水酢酸を加える。混合物を完了するまで撹拌する。Medina et al, Biomaterials 32 (2011), 4118-4129(参照により本明細書に組み入れられる)。
オリゴヌクレオチドを、NittoPhase Unylinker 200支持体上でホスホラミダイトアプローチを用い、20μmolのスケールで合成した。合成終了時に、オリゴヌクレオチドを固体支持体から、濃水酸化アンモニウムを用い、60℃、16時間で切断した。オリゴヌクレオチドを逆相HPLCにより精製し、UPLCで特徴付け、さらに分子質量をESI-MSで確認した。
β-シアノエチル-ホスホラミダイト(DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-メチル-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)、LNA-T、GalNAcホスホラミダイトXおよびYならびにスペーサーホスホラミダイトC3およびスペーサー18(Glen Research、Sterling、VA)の連結を、アセトニトリル中0.1Mのホスホラミダイトおよび活性化剤としてのアセトニトリル中のDCI(4,5-ジシアノイミダゾール)(0.25M)の溶液を用いて実施した。ホスホロチオエート連結の導入のためのチオール化を、水素化キサンタン(アセトニトリル/ピリジン9:1中0.01M)を用いて実施した。ホスホルジエステル(phosphordiester)連結をTHF/ピリジン/水7:2:1中0.02Mヨウ素を用いて導入した。残りの試薬はオリゴヌクレオチド合成に典型的に用いられるものであった。
粗製化合物をPhenomenex Jupiter C18 10μ 150×10mmカラムでの分取逆相HPLCにより精製した。0.1M酢酸アンモニウムpH8およびアセトニトリルを緩衝液として流速5mL/分で用いた。集めた分画を凍結乾燥して、精製化合物を典型的には白色固体で得た。
異なるGalNAc作成物の効果を比較するために、C57BL6/Jマウスに単一用量の食塩水または0.25mg/kg GalNAc2クラスター結合LNA-アンチセンスオリゴヌクレオチド(GalNAc2)もしくは等モル量の本発明のGalNAc作成物に結合したLNAアンチセンスオリゴヌクレオチド(図6E、I、MおよびN)もしくは非結合LNAアンチセンスオリゴヌクレオチド(詳細は実施例2、表1参照)をsc注射し、第10日に屠殺して、肝臓および腎臓を単離した。
すべてのGalNAc結合LNAオリゴヌクレオチドは、非結合ApoB標的LNAオリゴヌクレオチドに比べて、ApoB mRNAの肝臓におけるノックダウンの改善を示した(図7)。GalNAcホスホラミダイトにより作成した新しい化合物(図6E、I、MおよびN)はすべて標的mRNA(ApoB mRNA)に対して、GalNAc2クラスター(GalNAc2)に匹敵する効果を示し、異なるリンカー長およびGalNAc結合部分の設計はASGP受容体によって許容されることを示している。腎臓におけるApoB mRNAのダウンレギュレーション(図7B)は、GalNAc結合化合物(図6E、I、MおよびNならびにGalNAc2)よりも非結合LNAオリゴヌクレオチド(対照)で高く、予想どおりGalNAc部分はLNAオリゴヌクレオチドの肝臓取り込みを改善し、腎臓取り込みを低下させることを示唆している。総コレステロールレベルを低下させる効果(図8)は、非結合LNAオリゴヌクレオチドに比べて、すべてのGalNAc結合LNAオリゴヌクレオチドで改善されている。
ApoB mRNAノックダウンの分析
動物を70%CO2−30%O2で麻酔し、頚椎脱臼により屠殺した。大きい肝葉の半分および一方の腎臓を刻み、RNAlater中に浸漬した。
屠殺直前に、血清調製のために後眼窩静脈叢血をS-monovette Serum-Gelバイアル(Sarstedt、Numbrecht、Germany)を用いて採取した。血清を総コレステロールについてABX Pentra Cholesterol CP(Triolab、Brondby、Denmark)を製造者の指示に従い用いて分析した。
本発明は、以下の項目によってさらに特徴付けられる。
一般式(I):
を有する化合物であって、式中、
NR'R''が二級アミノ基であり、ここでR'およびR''は独立にC1〜C6-アルキルから選択されるか、またはR'およびR''は一緒に5もしくは6員環を形成し、これは置換されていてもよく、かつNおよびOから選択される1つのさらなるヘテロ原子を含んでいてもよく;
AがC1〜C6-アルキル基または保護ヒドロキシ-もしくはチオ-基であり;かつ
Gが一般式(II):
で表され、式中、
A1が適切なヒドロキシル保護基であり、これは各出現時に同じであっても、または異なっていてもよく;かつ
Lが、C6アルキレンではないC3〜C19-アルキレン、C2〜C30-アルケニレン、-CH2CH2-(OCH2CH2)0-4-OCH2CH2-およびCH2CH2-(OCH2CH2)6-8-OCH2CH2からなる群より選択されるリンカー基である、化合物。
リンカー基LがC7〜C19-アルキレン、C2〜C20-アルケニレン、および-CH2CH2-(OCH2CH2)0-3-OCH2CH2-からなる群より選択される、項目1記載の化合物。
リンカー基Lが-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-(CH2)11-、-(CH2)12-、-CH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-、および-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-からなる群より選択される、項目1または2に記載の化合物。
リンカー基Lが-(CH2)2-、-(CH2)3-、および-(CH2)8-からなる群より選択される、項目1〜3のいずれかに記載の化合物。
リンカー基LがCH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-、および-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-からなる群より選択される、項目1〜3のいずれかに記載の化合物。
GalNAc部分がベータ配置である、項目1〜5のいずれかに記載の化合物。
二級アミノ基-NR'R''がジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジブチルアミノ、ピロリジノ、ピペリジノ、2,6-ジメチルピペリジノ、モルホリノ、イミダゾリルおよび4-メチルイミダゾリルからなる群より選択される、項目1〜6のいずれかに記載の化合物。
Aが2-シアノエトキシ、2-シアノエチルチオ、メトキシ、エトキシ、S-イソブタノイル-2-(2-メルカプトエトキシ)エトキシ、S-ピバロイル-2-(2-メルカプトエトキシ)エトキシ、S-ピバロイル-2-メルカプトエトキシ、メチルおよびエチルからなる群より選択される、項目1〜7のいずれかに記載の化合物。
ヒドロキシル保護基A1がアシル基およびシリル基から、好ましくはアセチル、ベンゾイル、フェノキシ-アセチル、ピバロイル、ジメトキシトリチル(DMT)、イソブチリル、t-ブチルジメチルシリル、t-ブチルジフェニルシリル、トリイソプロピルシリルおよびイソプロピルジメチルシリルからなる群より選択される、項目1〜8のいずれかに記載の化合物。
糖の6位のヒドロキシル保護基A1がジメトキシトリチル(DMT)である、項目1〜9のいずれかに記載の化合物。
Aが-O-CH2CH2CNであり、A1がアセチルであり、R'およびR''がそれぞれイソプロピルであり、かつLが-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-(CH2)11-、-(CH2)12-、-CH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-、および-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-からなる群より選択され、好ましくは-(CH2)2-および-(CH2)3-から選択される、項目1〜9aのいずれかに記載の化合物。
一般式(III):
を有する化合物であって、式中、
Zが核酸分子であり;
Tが一般式(IV)または一般式(VI):
で表され、式中、
R2がHまたは-(CH2)q-R1を表し、
R1およびR3が各出現時に一般式(V):
で表され、式中、各出現時に独立に、
Vが-O-、-NH-CO-および-CO-NH-から選択され;
Wが-(CH2)2-15-および-CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2-からなる群より選択され;
YがOまたはSであり;
mが1〜3の整数であり;
nが0〜5の整数であり;
pが0〜3の整数であり;かつ
qが1〜2の整数であり;
rが1〜5の整数であり;
前記式(V)中、および式(VI):
中、各出現時に独立に、
sが0または1であり
Gが一般式(II)':
で表され、式中、
A1がHまたは適切なヒドロキシル保護基であり、これは各出現時に同じであっても、または異なっていてもよく;かつ
LがC2〜C20-アルケニレン、-CH2CH2-(OCH2CH2)0-6-OCH2CH2、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-(CH2)11-、-(CH2)12-、-CH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-、および-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-からなる群より選択され;かつ
式(III)、(V)および(VI)中、各出現時に独立に
X1が-OHであり、かつX2が=Oおよび=Sから選択されるか、または
X1が-O-であり、かつX2が=Oおよび=Sから選択されるか、または
X1が=Oであり、かつX2が-CH3、-OR、-NHR、および-BH3から選択され、ここで
Rが各出現時に独立にC1〜C6アルキル基であるか、または
X1が=Sであり、かつX2が-CH3および-SHから選択され、
ここで式(VI)中の、R1、R3、またはR2がHでない場合のR2におけるリンカーLの最初の原子で始まり、式(IV)中、またはTが式(VI)で表される場合の核酸分子中の連結点で終わる連続鎖が、最短で8原子の長さおよび最長で30原子の長さを有する、化合物。
sが1である、項目11記載の化合物。
sが0である、項目11記載の化合物。
Tが式(VI)で表され、かつsが0である、項目11記載の化合物。
式(II')中のGalNAc部分がベータ配座である、項目11〜14のいずれかに記載の化合物。
Wが-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2(OCH2CH2)4OCH2CH2-、-CH2CH2CH2-、および-(CH2)12-からなる群より選択される、項目11〜15のいずれかに記載の化合物。
各出現時に独立に、
X1が-OHであり、かつX2が=Oであるか、または
X1がO-であり、かつX2が=Oであるか、または
X1が-OHであり、かつX2が=Sであるか、または
X1がO-であり、かつX2が=Sであるか、または
X1が=Sであり、かつX2が-SHである、項目11〜16のいずれかに記載の化合物。
式(IV):
中のR1、R3、またはR2がHでない場合のR2におけるリンカーLの最初の原子で始まり、分枝点炭素原子で終わる連続鎖が0〜23原子の長さを有する、項目11〜17のいずれかに記載の化合物。
核酸分子がDNA、RNAおよび核酸類縁体分子から、特にアンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉RNA、およびマイクロRNAから選択される、項目11〜18のいずれかに記載の化合物。
核酸分子がロックド核酸ヌクレオチドを含む、項目11〜19のいずれかに記載の化合物。
核酸分子が1つまたは複数のホスホロチオエートまたはボラノホスフェートヌクレオシド間連結を含む、項目11〜20のいずれかに記載の化合物。
すべてのDNAおよびRNAヌクレオシドがホスホロチオエートまたはボラノホスフェートで連結されている、項目11〜21のいずれかに記載の化合物。
核酸分子中のすべてのヌクレオシドおよび/またはヌクレオシド類縁体がホスホロチオエートまたはボラノホスフェートで連結されている、項目11〜22のいずれかに記載の化合物。
核酸分子の5'末端がGalNAc結合部分に結合されている、項目11〜23のいずれかに記載の化合物。
POリンカーが核酸とGalNAc結合部分との間に配置される、項目11〜24のいずれかに記載の化合物。
アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)に結合することができる、項目11〜25のいずれかに記載の化合物。
項目1〜9のいずれかに記載の化合物を調製するための方法であって、以下の段階を含む、方法:
(i)N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)の炭素原子1と2との間で内部オキサゾリン環を立体選択的に形成する段階;
(ii)段階(i)の生成物を、
一般式HO-L-O-A3を有し、式中、
A3が適切な保護基であり、かつ
Lが-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-(CH2)11-、-(CH2)12-、-CH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-、および-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-からなる群より選択されるリンカー基である
化合物
と反応させ、それによりGalNAc環の炭素原子1でエーテル結合を形成する段階;
(iii)段階(ii)の生成物の-O-A3基を脱保護し、それにより脱保護-OH基を提供する段階、
(iv)段階(iii)の生成物をホスホルジアミダイトと反応させ、それにより項目1〜9のいずれかに記載の化合物を提供する段階。
核酸結合体を調製するための方法であって、以下の段階:
(i)固体支持体上の核酸分子を提供する段階;
(ii)ホスホラミダイト化学を用いて分枝分子を核酸分子に任意で付加する段階であり、ここで付加後の該分枝分子が、好ましくは一般式(IVa):
で表される構造をもたらし、式中、
A4が適切な保護基であり;
V1が-O-、-NH-CO-および-CO-NH-から選択され;
V2が存在しないか、または-O-、-NH-CO-および-CO-NH-から選択され;
V3が-O-、-NH-CO-および-CO-NH-から選択され;
X1が-OHであり、かつX2が=Oおよび=Sから選択されるか、または
X1がO-であり、かつX2が=Oおよび=Sから選択されるか、または
X1が=Oであり、かつX2が-CH3、-SH、-OR、-NHR、および-BH3から選択され、ここでRが各出現時に独立にC1〜C6アルキル基であるか、または
X1が=Sであり、かつX2が-CH3および-SHから選択され;
mが1〜3の整数であり;
nが0〜5の整数であり;
pが0〜3の整数であり;かつ各出現時に独立に
qが1〜2の整数であり;
q'が0〜2の整数であり;かつ
rが1〜5の整数であり;
ただしV2が存在しない場合、q'は0であり、かつ式(IVa)中のV2に連結された-(CH2)r-OA4も存在しないことを条件とする、段階;
(iii)ホスホラミダイト化学を用いてスペーサーホスホラミダイト分子を分枝分子の分枝のそれぞれに任意で付加する段階であり、ここで付加後の該スペーサー分子が、好ましくは一般式(Va):
で表される構造をもたらし、式中、各出現時に独立に、
A5が適切な保護基であり;
Wが-(CH2)2-15-および-CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2-からなる群より選択され;
X1が-OHであり、かつX2が=Oおよび=Sから選択されるか、または
X1がO-であり、かつX2が=Oおよび=Sから選択されるか、または
X1が=Oであり、かつX2が-CH3、-SH、-OR、-NHR、および-BH3から選択され、ここでRが各出現時に独立にC1〜C6アルキル基であるか、または
X1が=Sであり、かつX2が-CH3および-SHから選択される、段階;
(iv)分枝分子が存在しない場合、項目1〜9のいずれかに記載の化合物を核酸分子の反応性末端と反応させ、または分枝分子が存在し、かつスペーサーが存在しない場合、項目1〜9のいずれかに記載の化合物を分枝のそれぞれの反応性末端と反応させ、またはスペーサーが存在する場合、項目1〜9のいずれかに記載の化合物をスペーサーのそれぞれの反応性末端と反応させる段階;および
(v)段階(iv)の生成物を固体支持体から切断する段階
を含み、ここで項目1〜9のいずれかに記載の化合物におけるリンカーLの最初の原子で始まり、式(IVa)中の連結点または核酸分子中の連結点で終わる連続鎖が、最短で8原子の長さおよび最長で30原子の長さを有する、方法。
核酸分子がDNA、RNAおよび1つまたは複数のヌクレオシド類縁体を含む分子から選択され、特に核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチド、ギャップマー、低分子干渉RNA、およびマイクロRNAから選択される、項目28記載の方法。
核酸分子がロックド核酸ヌクレオチドを含む、項目28または29のいずれかに記載の方法。
核酸分子が1つまたは複数のホスホロチオエートまたはボラノホスフェートヌクレオシド間連結を含む、項目28〜230のいずれかに記載の方法。
すべてのDNAおよびRNAヌクレオシドがホスホロチオエートまたはボラノホスフェートで連結されている、項目28〜31のいずれかに記載の方法。
核酸分子中のすべてのヌクレオシドおよび/またはヌクレオシド類縁体がホスホロチオエートまたはボラノホスフェートで連結されている、項目28〜32のいずれかに記載の方法。
分枝分子、スペーサー分子または項目1〜9のいずれかに記載の化合物を核酸分子の5'末端と反応させる、項目28〜33のいずれかに記載の方法。
POリンカーを核酸分子と分枝分子、スペーサー分子または項目1〜9のいずれかに記載の化合物との間に配置する、項目28〜34のいずれかに記載の方法。
分枝分子が下記:
1,3-ビス-[5-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)ペンチルアミド]プロピル-2-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)] ホスホラミダイト;
トリス-2,2,2-[3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピルオキシメチル]エチル-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト;および
トリス-2,2,2-[3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピルオキシメチル]メチレンオキシプロピル-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト
からなる群より選択される、項目28〜35のいずれかに記載の方法。
スペーサーホスホラミダイト分子が一般式(VII):
で表され、式中、A2が適切な保護基、好ましくは-CH2CH2CNであり、A6が適切な保護基、例えば4',4'-ジメトキシトリチルであり、かつR4が-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-、-CH2CH2(OCH2CH2)4OCH2CH2-、-CH2CH2CH2-、および-(CH2)12-からなる群より選択され;かつ
NR'R''が二級アミノ基であり、ここでR'およびR''が独立にC1〜C6-アルキルから選択されるか、またはR'およびR''が一緒に5もしくは6員環を形成し、これは置換されていてもよく、かつNおよびOから選択される1つのさらなるヘテロ原子を含んでいてもよい、項目28〜36のいずれか一項記載の方法。
項目10〜26のいずれかに記載の化合物の調製のための、項目1〜9のいずれかに記載の化合物の使用。
医薬としての項目10〜26のいずれかに記載の化合物の使用。
肝臓mRNA標的の低減における使用のための、項目10〜26のいずれかに記載の化合物。
肝疾患の処置における使用のための、項目10〜26のいずれかに記載の化合物。
代謝疾患もしくは障害、または肝疾患もしくは障害の処置における使用のための、項目10〜26のいずれかに記載の化合物。特に、肝炎(HBVまたはHCVなどのウイルス肝炎を含む)、脂肪肝(代謝機能不全を含む)、粥状動脈硬化、高脂血症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、例えば、アポリポ蛋白Bにおける機能変異の獲得、HDL/LDLコレステロール不均衡、脂質代謝異常、例えば、家族性高脂血症(FCHL)、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患(CAD)、および冠動脈心疾患(CHD)、急性冠症候群(ACS)、肝線維症(または肝線維症に関連する疾患)、硬変症ならびに癌などの疾患の処置のため。
処置の方法であって、ヒトまたは動物に有効量の項目10〜26のいずれかに記載の化合物を投与する段階を含む方法。
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