KR20240026216A - Myoc 발현을 침묵시키기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Myoc 발현을 침묵시키기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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아담 카스토레노
바우믹 에이. 팬디아
리잘도스 엘레나 카스텔라노스
마크 케이. 슐러겔
바산트 알. 자드하브
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알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

본 개시내용은 MYOC를 표적으로 하는 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 조성물, 및 이러한 dsRNA 조성물을 사용하여 MYOC의 발현을 변경(예를 들어, 억제)하는 방법에 관한 것이다.

Description

MYOC 발현을 침묵시키기 위한 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 6월 28일자로 제출된 미국 가출원 제63/215,804호에 대한 우선권의 이익을 주장하고, 2021년 12월 8일자로 제출된 미국 가출원 제63/287,404호에 대한 우선권의 이익을 주장하고, 2022년 6월 10일자로 제출된 미국 가출원 제63/351,033호에 대한 우선권의 이익을 주장한다. 전술한 출원의 전문이 본원에 참조로서 통합된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 본원에 그 전체가 참조로서 통합된다. 2022년 6월 22일자로 생성된 상기 ASCII 복사본은 파일명이 A108868_1490WO_SL.txt이며, 크기가 596,467 바이트이다.
본 개시내용의 기술분야
본 개시내용은 MYOC 발현의 특이적 억제에 관한 것이다.
녹내장(예를 들어, 원발성 개방각 녹내장(POAG))은 오늘날의 노령 인구에서 되돌릴 수 없는 시력 상실의 주요 원인이다. MYOC 단백질 오접힘은 섬유주(trabecular meshwork) 세포로부터의 분비를 차단하여 안압 상승을 초래하고, 이는 결국 시신경을 압박하고 손상시켜 뇌에 시각 정보를 전달하는 능력을 감소시켜 시력 상실을 초래한다. 녹내장에 대한 새로운 치료법이 필요하다.
본 개시내용은 MYOC 발현을 조절하기 위한 방법 및 iRNA 조성물을 기술한다. 특정 구현예에서, MYOC 발현은 MYOC-특이적 iRNA를 사용하여 감소되거나 억제된다. 이러한 억제는 안구 장애(예를 들어, 원발성 개방각 녹내장(POAG)과 같은 녹내장)와 같은 MYOC 발현과 관련된 장애를 치료하는 데 유용할 수 있다.
따라서, 본원에는 예컨대 세포에서 또는 대상체에서(예를 들어, 인간 대상체와 같은 포유동물)에서, MYOC의 RNA 전사체의 RNA-유도 침묵 복합체(RISC) 매개 절단에 영향을 미치는 조성물 및 방법이 기술된다. 또한, 녹내장(예를 들어, 원발성 개방각 녹내장(POAG))과 같은 MYOC 발현과 관련된 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법이 기술된다.
본원에서 특징지어지는 조성물에 포함된 iRNA(예를 들어, dsRNA)는 MYOC(예를 들어, 인간 MYOC)의 mRNA 전사체의 적어도 일부에 실질적으로 상보적인 영역, 예를 들어, 30개 이하의 뉴클레오타이드, 일반적으로 19~24개 뉴클레오타이드 길이인 영역을 갖는 RNA 가닥(안티센스 가닥)을 포함한다(본원에서 "MYOC-특이적 iRNA"로도 지칭됨). 일부 구현예에서, MYOC mRNA 전사체는 인간 MYOC mRNA 전사체, 예를 들어 본원의 서열번호 1이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 iRNA(예를 들어, dsRNA)는 인간 MYOC mRNA의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 MYOC mRNA는 서열 NM_000261.2(서열번호 1)를 갖는다. NM_000261.2의 서열은 또한 그 전체가 본원에 참조로서 통합된다. 서열번호 1의 역상보체는 본원에 서열번호 2로서 제공된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 미오실린(MYOC)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하되, 상기 dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 인간 MYOC의 코딩 가닥의 일부 중 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 안티센스 가닥은 센스 가닥이 안티센스 가닥 내의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드에 상보적이도록 인간 MYOC의 비-코딩 가닥의 상응하는 일부 중 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 MYOC의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하되, 상기 dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 센스 가닥이 안티센스 가닥 내의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드에 상보적이도록 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 일부 중 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 MYOC의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하되, 상기 dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥은 듀플렉스 AD-1565804의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 센스 가닥은 듀플렉스 AD-1565804의 센스 가닥 뉴클레오타이드 서열로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 MYOC의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하되, 상기 dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥은 듀플렉스 AD-1565837의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 센스 가닥은 듀플렉스 AD-1565837의 센스 가닥 뉴클레오타이드 서열로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 달리 유사한 미처리 세포 또는 조직과 비교하여 감소된 수준의 MYOC mRNA 또는 MYOC 단백질 수준을 포함하는 인간 세포 또는 조직을 제공하되, 선택적으로 상기 세포 또는 조직은 유전적으로 조작되지 않고(예를 들어, 상기 세포 또는 조직은 하나 이상의 자연 발생 돌연변이, 예를 들어 MYOC 돌연변이를 포함), 선택적으로 상기 수준은 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%만큼 감소한다. 일부 구현예에서, 인간 세포 또는 조직은 섬유주대 조직, 섬모체, 망막 색소 상피(RPE), 망막 조직, 성상세포, 혈관주피세포, 뮐러(Muller) 세포, 신경절 세포, 내피 세포, 광수용체 세포, 망막 혈관(예를 들어, 내피 세포 및 혈관 평활근 세포 포함), 또는 맥락막 조직, 예를 들어 맥락막 혈관이다.
본 개시내용은 또한, 일부 양태에서, 본원에 기술된 dsRNA 제제를 함유하는 세포를 제공한다.
또 다른 양태에서, 달리 유사한 미치료 세포와 비교하여 감소된 수준의 MYOC mRNA 또는 MYOC 단백질 수준을 포함하는 인간 안구 세포(예를 들어, 섬유주대 세포, 섬모체 세포, RPE 세포, 망막 세포, 성상세포, 혈관주피세포, 뮐러 세포, 신경절 세포, 내피 세포, 또는 광수용체 세포)가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 수준은 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%만큼 감소된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 또한 본원에 기술된 dsRNA 제제를 포함하는, MYOC를 암호화하는 유전자의 발현을 억제하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 또한, 일부 양태에서, 세포에서 MYOC의 발현을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
(a) 상기 세포를 본원에 기술된 dsRNA 제제, 또는 본원에 기술된 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 생성된 세포를 MYOC의 mRNA 전사체의 분해를 수득하기에 충분한 시간 동안 유지시켜, 세포에서 MYOC의 발현을 억제하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한, 일부 양태에서, 세포에서 MYOC의 발현을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
(a) 상기 세포를 본원에 기술된 dsRNA 제제, 또는 본원에 기술된 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 생성된 세포를 MYOC mRNA, MYOC 단백질, 또는 MYOC mRNA 및 단백질 둘 다의 수준을 감소시키기에 충분한 시간 동안 유지시켜, 세포에서 MYOC의 발현을 억제하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한, 일부 양태에서, 안구 세포 또는 조직에서 MYOC의 발현을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
(a) 상기 세포 또는 조직을 MYOC에 결합하는 dsRNA 제제와 접촉시키는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 생성된 세포 또는 조직을 MYOC mRNA, MYOC 단백질, 또는 MYOC mRNA 및 단백질 둘 다의 수준을 감소시키기에 충분한 시간 동안 유지시켜, 세포 또는 조직에서 MYOC의 발현을 억제하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한, 일부 양태에서, MYOC-관련 장애를 진단받은 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기술된 dsRNA 제제 또는 본원에 기술된 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여함으로써, 장애를 치료하는 단계를 포함한다.
본원의 양태 중 어느 하나에서, 예를 들어, 상기 조성물 및 방법에서, 본원의 구현예 중 어느 하나(예를 들어, 하기의 것)가 적용될 수 있다.
일부 구현예에서, 인간 MYOC의 코딩 가닥은 서열번호 1의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 인간 MYOC의 비-코딩 가닥은 서열번호 2의 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 상응하는 부분의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 또는 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하되, 안티센스 가닥은 센스 가닥이 안티센스 가닥 내의 적어도 17개의 연속 뉴클레오타이드에 상보적이도록 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 일부 중 적어도 17개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 상응하는 부분 중 적어도 17개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 또는 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하되, 안티센스 가닥은 센스 가닥이 안티센스 가닥 내의 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드에 상보적이도록 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 일부 중 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 상응하는 부분 중 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하되, 안티센스 가닥은 센스 가닥이 안티센스 가닥 내의 적어도 21개의 연속 뉴클레오타이드에 상보적이도록 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 일부 중 적어도 21개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 상응하는 부분 중 적어도 21개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 또는 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 센스 가닥의 일부는 표 2a 및 2b 중 어느 하나의 센스 가닥 내의 부분이다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥의 일부는 표 2a 및 2b 중 어느 하나의 안티센스 가닥 내의 부분이다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 표 2a 및 2b 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 하나로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 안티센스 서열에 상응하는 표 2a 및 2b 중 어느 하나에 열거된 센스 서열로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 표 2a 및 2b 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 하나로부터 적어도 17개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 안티센스 서열에 상응하는 표 2a 및 2b 중 어느 하나에 열거된 센스 서열로부터 적어도 17개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 표 2a 및 2b 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 하나로부터 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 안티센스 서열에 상응하는 표 2a 및 2b 중 어느 하나에 열거된 센스 서열로부터 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 표 2a 및 2b 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 하나로부터 적어도 21개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 안티센스 서열에 상응하는 표 2a 및 2b 중 어느 하나에 열거된 센스 서열로부터 적어도 21개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제의 센스 가닥은 적어도 23개 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어 23~30개 뉴클레오타이드 길이이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥 중 적어도 하나는 하나 이상의 친유성 모이어티에 접합된다. 일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 dsRNA 제제의 이중 가닥 영역 중 하나 이상의 위치에 접합된다. 일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 링커 또는 캐리어를 통해 접합된다. 일부 구현예에서, logKow에 의해 측정된 친유성 모이어티의 친유성은 0을 초과한다.
일부 구현예에서, 이중 가닥 RNAi 제제의 혈장 단백질 결합 검정에서 미결합 분율에 의해 측정된 이중 가닥 RNAi 제제의 소수성은 0.2를 초과한다. 일부 구현예에서, 혈장 단백질 결합 검정은 인간 혈청 알부민 단백질을 사용한 전기영동 이동성 변화 검정이다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 적어도 하나의 변형 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5개 이하의 센스 가닥 뉴클레오타이드 및 5개 이하의 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드는 미변형 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 데옥시-뉴클레오타이드, 3'-말단 데옥시-티미딘(dT) 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 변형 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오타이드, 잠김 뉴클레오타이드, 잠김 해제된 뉴클레오타이드, 입체적으로 제한된 뉴클레오타이드, 구속된 에틸 뉴클레오타이드, 무염기 뉴클레오타이드, 2'-아미노-변형 뉴클레오타이드, 2'-O-알릴-변형 뉴클레오타이드, 2'-C-알킬-변형 뉴클레오타이드, 2'-메톡시에틸 변형 뉴클레오타이드, 2'-O-알킬-변형 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포라미데이트, 뉴클레오타이드를 포함하는 비-천연 염기, 테트라하이드로피란 변형 뉴클레오타이드, 1,5-안하이드로헥시톨 변형 뉴클레오타이드, 시클로헥세닐 변형 뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오타이드, 메틸포스포네이트기를 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-포스페이트 모사체를 포함하는 뉴클레오타이드, 글리콜 변형 뉴클레오타이드, 및 2-O-(N-메틸아세트아미드) 변형 뉴클레오타이드; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 5개 이하의 센스 가닥 뉴클레오타이드 및 5개 이하의 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 변형 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오타이드, 잠김 해제된 핵산(UNA) 또는 글리세롤 핵산(GNA) 이외의 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, dsRNA는 센스 가닥의 2개의 연속 뉴클레오타이드 사이 또는 안티센스 가닥의 2개의 연속 뉴클레오타이드 사이에 비-뉴클레오타이드 스페이서(선택적으로 비-뉴클레오타이드 스페이서는 C3-C6 알킬을 포함함)를 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 가닥은 길이가 30개 이하의 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 가닥은 2개 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중 가닥 영역은 길이가 15~30개 뉴클레오타이드 쌍이다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 영역은 길이가 17~23개 뉴클레오타이드 쌍이다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 영역은 길이가 17~25개 뉴클레오타이드 쌍이다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 영역은 길이가 23~27개 뉴클레오타이드 쌍이다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 영역은 길이가 19~21개 뉴클레오타이드 쌍이다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 영역은 길이가 21~23개 뉴클레오타이드 쌍이다. 일부 구현예에서, 각각의 가닥은 19~30개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 구현예에서, 각각의 가닥은 19~23개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 구현예에서, 각각의 가닥은 21~23개의 뉴클레오타이드를 갖는다.
일부 구현예에서, 제제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합은 하나의 가닥의 3'-말단에 존재한다. 일부 구현예에서, 가닥은 안티센스 가닥이다. 일부 구현예에서, 가닥은 센스 가닥이다.
일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합은 하나의 가닥의 5'-말단에 존재한다. 일부 구현예에서, 가닥은 안티센스 가닥이다. 일부 구현예에서, 가닥은 센스 가닥이다.
일부 구현예에서, 하나의 가닥의 5'-말단 및 3'-말단 각각은 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 가닥은 안티센스 가닥이다.
일부 구현예에서, 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5'-말단의 1 위치에서 염기쌍은 AU 염기쌍이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 총 21개의 뉴클레오타이드를 갖고, 안티센스 가닥은 총 23개의 뉴클레오타이드를 갖는다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 적어도 하나의 가닥 상의 하나 이상의 내부 위치에 접합된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 링커 또는 캐리어를 통해 적어도 하나의 가닥 상의 하나 이상의 내부 위치에 접합된다.
일부 구현예에서, 내부 위치는 적어도 하나의 가닥의 각각의 말단으로부터 말단인 두 개의 위치를 제외한 모든 위치를 포함한다. 일부 구현예에서, 내부 위치는 적어도 하나의 가닥의 각각의 말단으로부터 말단인 세 개의 위치를 제외한 모든 위치를 포함한다. 일부 구현예에서, 내부 위치는 센스 가닥의 절단 부위 영역을 배제한다. 일부 구현예에서, 내부 위치는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 위치 9~12를 제외한 모든 위치를 포함한다. 일부 구현예에서, 내부 위치는 센스 가닥의 3'-말단으로부터 계수하여 위치 11~13을 제외한 모든 위치를 포함한다. 일부 구현예에서, 내부 위치는 안티센스 가닥의 절단 부위 영역을 배제한다. 일부 구현예에서, 내부 위치는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 위치 12~14를 제외한 모든 위치를 포함한다. 일부 구현예에서, 내부 위치는 3'-말단으로부터 계수하여 센스 가닥 상의 위치 11~13, 및 5'-말단으로부터 계수하여 안티센스 가닥 상의 위치 12~14를 제외한 모든 위치를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 각각의 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여, 센스 가닥 상의 위치 4~8 및 13~18 및 안티센스 가닥 상의 위치 6~10 및 15~18로 이루어진 군으로부터 선택된 내부 위치 중 하나 이상에 접합된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 각각의 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여, 센스 가닥 상의 위치 5, 6, 7, 15, 및 17 및 안티센스 가닥 상의 위치 15 및 17로 이루어진 군으로부터 선택된 내부 위치 중 하나 이상에 접합된다.
일부 구현예에서, 이중 가닥 영역 내의 위치는 센스 가닥의 절단 부위 영역을 배제한다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 길이가 21개 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥은 길이가 23개 뉴클레오타이드이고, 친유성 모이어티는 센스 가닥의 위치 21, 위치 20, 위치 15, 위치 1, 위치 7, 위치 6, 또는 위치 2 또는 안티센스 가닥의 위치 16에 접합된다. 일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 센스 가닥의 위치 21, 위치 20, 위치 15, 위치 1, 또는 위치 7에 접합된다. 일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 센스 가닥의 위치 21, 위치 20, 또는 위치 15에 접합된다. 일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 센스 가닥의 위치 20 또는 위치 15에 접합된다. 일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 안티센스 가닥의 위치 16에 접합된다. 일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 위치 6에 접합된다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 지방족, 지환족 또는 폴리지환족 화합물이다. 일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 지질, 콜레스테롤, 레티노산, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥산올, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 군, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 포화 또는 불포화 C4-C30 탄화수소 쇄, 및 히드록실, 아민, 카르복시산, 술포네이트, 포스페이트, 티올, 아지드 및 알킨으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 작용기를 함유한다. 일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 포화 또는 불포화 C6-C18 탄화수소 쇄를 함유한다. 일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 포화 또는 불포화 C16 탄화수소 쇄를 함유한다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 내부 위치(들) 또는 이중 가닥 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드(들)를 대체하는 캐리어를 통해 접합된다. 일부 구현예에서, 캐리어는 피롤리디닐, 파라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐, 및 데칼리닐로 이루어진 군으로부터 선택된 환형 작용기이거나; 세리놀 골격 또는 디에탄올아민 골격을 기반으로 하는 비환형 모이어티이다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 에테르, 티오에테르, 우레아, 카보네이트, 아민, 아미드, 말레이미드-티오에테르, 디설파이드, 포스포디에스테르, 술폰아미드 결합, 클릭 반응의 생성물 또는 카바메이트를 함유하는 링커를 통해 이중 가닥 iRNA 제제에 접합된다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 핵염기, 당 모이어티 또는 뉴클레오사이드간 결합에 접합된다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티 또는 표적화 리간드는 DNA, RNA, 디설파이드, 아미드, 갈락토사민의 관능화된 단당류 또는 올리고당, 글루코사민, 글루코스, 갈락토스, 만노스, 및 이의 조합로 이루어진 군으로부터 선택된 생체 절단 가능한 링커를 통해 접합된다.
일부 구현예에서, 센스 가닥의 3' 말단은 아민을 갖는 환형 작용기인 말단 캡을 통해 보호되고, 상기 환형 작용기는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐 및 데칼리닐로 이루어진 군으로으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 표적화 리간드, 예를 들어, 안구 조직 또는 간 조직을 표적으로 하는 리간드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 안구 조직은 섬유주대 조직, 섬모체, 망막 조직, 망막 색소 상피(RPE) 또는 맥락막 조직, 예를 들어 맥락막 혈관이다.
일부 구현예에서, 리간드는 센스 가닥에 접합된다. 일부 구현예에서, 리간드는 센스 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단에 접합된다. 일부 구현예에서, 리간드는 센스 가닥의 3' 말단에 접합된다.
일부 구현예에서, 리간드는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 하나 이상의 GalNAc 접합체 또는 하나 이상의 GalNAc 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드는 1가 링커, 또는 2가, 3가, 또는 4가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 접합체 또는 하나 이상의 GalNAc 유도체이다. 일부 구현예에서, 리간드는 다음이다
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 다음의 개략도에 도시된 것과 같이 리간드에 접합되고
상기 식에서 X는 O 또는 S이다. 일부 구현예에서, X는 O이다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 Sp 배위로 결합 인 원자를 갖는 안티센스 가닥의 3' 말단의 제1 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하는 말단, 키랄 변형, Rp 배위로 결합 인 원자를 갖는 안티센스 가닥의 5' 말단의 제1 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하는 말단, 키랄 변형, 및 Rp 배위 또는 Sp 배위 중 어느 하나로 결합 인 원자를 갖는 센스 가닥의 5' 말단의 제1 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하는 말단, 키랄 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 Sp 배위로 결합 인 원자를 갖는 안티센스 가닥의 3' 말단의 제1 및 제2 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하는 말단, 키랄 변형, Rp 배위로 결합 인 원자를 갖는 안티센스 가닥의 5' 말단의 제1 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하는 말단, 키랄 변형, 및 Rp 또는 Sp 배위 중 어느 하나로 결합 인 원자를 갖는 센스 가닥의 5' 말단의 제1 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하는 말단, 키랄 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 Sp 배위로 결합 인 원자를 갖는 안티센스 가닥의 3' 말단의 제1, 제2, 및 제3 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하는 말단, 키랄 변형, Rp 배위로 결합 인 원자를 갖는 안티센스 가닥의 5' 말단의 제1 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하는 말단, 키랄 변형, 및 Rp 또는 Sp 배위 중 어느 하나로 결합 인 원자를 갖는 센스 가닥의 5' 말단의 제1 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하는 말단, 키랄 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 Sp 배위로 결합 인 원자를 갖는 안티센스 가닥의 3' 말단의 제1, 및 제2 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하는 말단, 키랄 변형, Rp 배위로 결합 인 원자를 갖는 안티센스 가닥의 3' 말단의 제3 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하는 말단, 키랄 변형, Rp 배위로 결합 인 원자를 갖는 안티센스 가닥의 5' 말단의 제1 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하는 말단, 키랄 변형, 및 Rp 또는 Sp 배위 중 어느 하나로 결합 인 원자를 갖는 센스 가닥의 5' 말단의 제1 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하는 말단, 키랄 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 Sp 배위로 결합 인 원자를 갖는 안티센스 가닥의 3' 말단의 제1, 및 제2 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하는 말단, 키랄 변형, Rp 배위로 결합 인 원자를 갖는 안티센스 가닥의 5' 말단의 제1, 및 제2 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하는 말단, 키랄 변형, 및 Rp 또는 Sp 배위 중 어느 하나로 결합 인 원자를 갖는 센스 가닥의 5' 말단의 제1 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하는 말단, 키랄 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 5'-말단에 포스페이트 또는 포스페이트 모사체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 포스페이트 모사체는 5'-비닐 포스포네이트(VP)이다.
전술한 dsRNA 제제의 다양한 구현예에서, dsRNA 제제는 MYOC를 암호화하는 mRNA의 핫스팟 영역을 표적으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 미오실린(MYOC) mRNA의 핫스팟 영역을 표적으로 하는 dsRNA 제제를 제공한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 세포, 예를 들어, 인간 세포는 인간 세포를 본원에 기술된 dsRNA 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 공정에 의해 생산되었다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 dsRNA 제제 및 지질 제형을 포함한다.
일부 구현예(예를 들어, 본원에 기술된 방법의 구현예)에서, 세포는 대상체 내에 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, MYOC mRNA의 수준은 적어도 50%만큼 억제된다. 일부 구현예에서, MYOC 단백질의 수준은 적어도 50%만큼 억제된다. 일부 구현예에서, MYOC의 발현은 적어도 50%만큼 억제된다. 일부 구현예에서, MYOC의 발현을 억제하는 것은 대상체로부터의 생물학적 샘플(예를 들어, 수성 안액 샘플)에서 MYOC 단백질 수준을 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, MYOC 유전자의 발현을 억제하는 것은 대상체로부터의 생물학적 샘플(예를 들어, 수성 안액 샘플)에서 MYOC mRNA 수준을 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%만큼 감소시킨다.
일부 구현예에서, 대상체는 MYOC 관련 장애를 진단받았다. 일부 구현예에서, 대상체는 MYOC 관련 장애에 대한 적어도 하나의 진단 기준을 충족한다. 일부 구현예에서, MYOC 관련 장애는 녹내장이다. 일부 구현예에서, MYOC 관련 장애는 원발성 개방각 녹내장(POAG)이다.
일부 구현예에서, 안구 세포 또는 조직은 섬유주대 조직, 섬모체, RPE, 망막 세포, 성상세포, 혈관주피세포, 뮐러 세포, 신경절 세포, 내피 세포, 광수용체 세포, 망막 혈관(예를 들어, 내피 세포 및 혈관 평활근 세포 포함), 또는 맥락막 조직, 예를 들어 맥락막 혈관이다.
일부 구현예에서, MYOC 관련 장애는 녹내장이다. 일부 구현예에서, 녹내장은 안압 상승에 의해 야기되거나 이와 연관된다. 일부 구현예에서, 녹내장은 원발성 개방각 녹내장(POAG))이다.
일부 구현예에서, 치료한다는 것은 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 완화를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 징후 또는 증상은 시신경 손상, 시력 상실, 터널 시력, 시야 흐림, 안구 통증 또는 MYOC의 존재, 수준, 또는 활성(예를 들어, MYOC 유전자, MYOC mRNA, 또는 MYOC 단백질) 중 하나 이상의 측정치를 포함한다.
일부 구현예에서, 기준 수준보다 높은 MYOC의 수준은 대상체가 녹내장을 갖고 있음을 나타낸다. 일부 구현예에서, 치료는 장애의 진행을 예방하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료는 (a) MYOC의 발현 또는 활성을 억제하거나 감소시키는 단계; (b) 오접힌 MYOC 단백질의 수준을 감소시키는 단계; (c) 섬유주대 세포 사멸을 감소시키는 단계; (d) 안압을 감소시키는 단계; 또는 (e) 시력을 증가시키는 단계 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료는 섬유주대 조직, 섬모체, 망막, RPE, 망막 혈관(예를 들어, 내피 세포 및 혈관 평활근 세포 포함), 또는 맥락막 조직, 예를 들어 맥락막 혈관 내 베이스라인 대비 MYOC mRNA의 적어도 30%의 평균 감소를 초래한다. 일부 구현예에서, 치료는 섬유주대 조직, 섬모체, 망막, RPE, 망막 혈관(예를 들어, 내피 세포 및 혈관 평활근 세포 포함), 또는 맥락막 조직, 예를 들어 맥락막 혈관 내 베이스라인 대비 MYOC mRNA의 적어도 60%의 평균 감소를 초래한다. 일부 구현예에서, 치료는 섬유주대 조직, 섬모체, 망막, RPE, 망막 혈관(예를 들어, 내피 세포 및 혈관 평활근 세포 포함), 또는 맥락막 조직, 예를 들어 맥락막 혈관 내 베이스라인 대비 MYOC mRNA의 적어도 90%의 평균 감소를 초래한다.
일부 구현예에서, 치료 후, 대상체는 망막 내 MYOC 단백질에 의해 평가됐을 때 dsRNA의 1회 투여 후 적어도 8주의 녹다운 기간을 경험한다. 일부 구현예에서, 치료는 망막 내 MYOC 단백질에 의해 평가됐을 때 dsRNA의 1회 투여 후 적어도 12주의 녹다운 기간을 초래한다. 일부 구현예에서, 치료는 망막 내 MYOC 단백질에 의해 평가됐을 때 dsRNA의 1회 투여 후 적어도 16주의 녹다운 기간을 초래한다.
일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 약 0.01mg/kg 내지 약 50mg/kg의 용량으로 투여된다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 대상체에게 안구내 투여된다. 일부 구현예에서, 안구내 투여는 유리체내 투여, 예를 들어, 유리체내 주사; 경공막 투여, 예를 들어, 경공막 주사; 결막하 투여, 예를 들어, 결막하 주사; 안구후 투여, 예를 들어, 안구후 주사; 전방내 투여, 예를 들어, 전방내 주사, 또는 망막하 투여, 예를 들어, 망막하 주사를 포함한다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 대상체에게 정맥내 투여된다. 일부 구현예에서, dsRNA 제제는 대상체에게 국소 투여된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 대상체에서 MYOC(예를 들어, MYOC 유전자, MYOC mRNA, 또는 MYOC 단백질)의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체에서 MYOC의 수준을 측정하는 단계는 대상체로부터의 생물학적 샘플(예를 들어, 수성 안액 샘플)에서 MYOC 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 혈액 검사, 영상 검사, 또는 수성 안액 생검(예를 들어, 수성 휴머 탭(aqueous humor tap))을 수행하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체에서 MYOC(예를 들어, MYOC 유전자, MYOC mRNA, 또는 MYOC 단백질)의 수준을 추가로 측정하는 본원에 기술된 방법은 dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물로 치료하기 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 대상체가 기준 수준보다 큰 MYOC 수준을 갖고 있음이 결정 시, dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물이 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체에서 MYOC의 수준을 측정하는 단계는 dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물로 치료한 후에 수행된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 MYOC 관련 장애를 치료하거나 예방하는 데 적합한 요법으로 대상체를 치료하는 단계를 추가로 포함하되, 예를 들어, 요법은 레이저 섬유주성형술, 섬유주절제술, 최소 침습성 녹내장 수술, 또는 안구에 배액관의 배치를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 MYOC 관련 장애를 치료하거나 예방하는 데 적합한 추가 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 추가 제제는 탄산 탈수효소 억제제, 프로스타글란딘, 베타 차단제, 알파-아드레날린 작용제, 탄산 탈수효소 억제제, Rho 키나아제 억제제, 또는 콜린성 제제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 추가 제제는 경구 약물 또는 점안제를 포함한다.
본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참조 문헌은 그 내용 전체가 참조로 통합된다.
본 명세서에 통합되고 본 명세서의 일부를 구성하는 첨부 도면은 본 개시내용의 여러 특징을 예시한다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 만들어진 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)이 포함된 본 특허 또는 특허 출원 공개물의 사본은 요청 시 및 필요한 수수료의 지불 시 관청에서 제공한다.
도 1a는 AAV2.Y3F-SAM-g4로 처리된 Y437H 돌연변이를 포함하는 인간화 MYOC 유전자좌를 포함하는 SAM 마우스(SAM-MYOC 마우스, 각 대립유전자에 대해 동형접합체)에서 인간 MYOC siRNA AD-822899가 안구내 압력(IOP)에 미치는 영향을 시험하기 위한 실험 설정을 보여준다.
도 1b는 AAV2.Y3F-SAM-g4로 처리되거나 아무 것으로도 처리되지 않은(미처리) Y437H 돌연변이를 포함하는 인간화 MYOC 유전자좌를 포함하는 SAM 마우스(SAM-MYOC 마우스, 각 대립유전자에 대해 동형접합체)의 안압(IOP)을 보여주며, 여기서 AAV2.Y3F-SAM-g4로 처리한 마우스는 인간 MYOC siRNA 또는 대조군 루시페라아제 siRNA로 후속적으로 처리되었다.
도 2a는 LV-SAM-g4로 처리된 Y437H 돌연변이를 포함하는 인간화 MYOC 유전자좌를 포함하는 SAM 마우스(SAM-MYOC 마우스, 각 대립유전자에 대해 동형접합체)에서 인간 MYOC siRNAs AD-822899, AD-1565804, AD-1565837, AD-1193175, 및 AD-1565503이 안압(IOP)에 미치는 영향을 시험하기 위한 실험 설정을 보여준다.
도 2b는 LV-SAM-g4 또는 PBS로 처리된 Y437H 돌연변이를 포함하는 인간화 MYOC 유전자좌를 포함하는 SAM 마우스(SAM-MYOC 마우스, 각 대립유전자에 대해 동형접합체)에서의 안압(IOP)을 보여주며, 여기서 LV-SAM-g4-처리 마우스는 인간 MYOC siRNA AD-822899, AD-1565804, AD-1565837, AD-1193175, 또는 AD-1565503로 후속적으로 처리되었다.
도 2c는 LV-SAM-g4 또는 PBS로 처리된 Y437H 돌연변이를 포함하는 인간화 MYOC 유전자좌를 포함하는 SAM 마우스(SAM-MYOC 마우스, 각 대립유전자에 대해 동형접합체)에서의 Gapdh에 대한 인간 MYOC mRNA 발현의 백분율을 보여주는 qPCR 결과를 도시하며, 여기서 LV-SAM-g4-처리 마우스는 인간 MYOC siRNA AD-822899, AD-1565804, AD-1565837, AD-1193175, 또는 AD-1565503으로 후속적으로 처리되었다.
도 2d는 LV-SAM-g4 또는 PBS로 처리된 Y437H 돌연변이를 포함하는 인간화 MYOC 유전자좌를 포함하는 SAM 마우스(SAM-MYOC 마우스, 각 대립유전자에 대해 동형접합체)의 눈에서의 인간 MYOC mRNA 발현의 RNASCOPE® 분석을 도시하며, 여기서 LV-SAM-g4-처리 마우스는 인간 MYOC siRNA AD-1565804 또는 AD-1565837로 후속적으로 처리되었다.
도 3a는 LV-SAM-g4로 처리된 Y437H 돌연변이를 포함하는 인간화 MYOC 유전자좌를 포함하는 SAM 마우스(SAM-MYOC 마우스, 각 대립유전자에 대해 동형접합체)에서 인간 MYOC siRNA AD-1565804 또는 AD-1565837이 안압(IOP)에 미치는 영향을 시험하기 위한 실험 설정을 보여준다.
도 3b는 LV-SAM-g4 또는 PBS로 처리된 Y437H 돌연변이를 포함하는 인간화 MYOC 유전자좌를 포함하는 SAM 마우스(SAM-MYOC 마우스, 각 대립유전자에 대해 동형접합체)에서의 안압(IOP)을 보여주며, 여기서 LV-SAM-g4-처리 마우스는 인간 MYOC siRNA AD-1565804 또는 AD-1565837로 후속적으로 처리되었다.
도 3c는 LV-SAM-g4 또는 PBS로 처리된 Y437H 돌연변이를 포함하는 인간화 MYOC 유전자좌를 포함하는 SAM 마우스(SAM-MYOC 마우스, 각 대립유전자에 대해 동형접합체)에서의 Gapdh에 대한 인간 MYOC mRNA 발현의 백분율을 보여주는 qPCR 결과를 도시하며, 여기서 LV-SAM-g4-처리 마우스는 인간 MYOC siRNA AD-1565804 또는 AD-1565837로 후속적으로 처리되었다.
도 4는 비인간 영장류(NHP) 모델에서 AD-1565837 듀플렉스 또는 AD-1565804 듀플렉스 중 어느 하나를 투여한 후 85일차에 TM에서 PBS에 대해 남아 있는 MYOC 단백질 백분율을 보여준다. 2개의 상이한 MYOC 항체, R&D 및 Abnova에 대한 결과가 도시되어 있다.
도 5는 비인간 영장류(NHP) 모델에서 AD-1565837 듀플렉스 또는 AD-1565804 듀플렉스 중 어느 하나를 투여한 후 -35일, 22일, 50일, 및 85일차에 투여 전 대비 수양액에 남아 있는 MYOC 단백질 백분율을 보여준다.
도 6a는 비인간 영장류(NHP) 모델에서 AD-1565837 듀플렉스 또는 AD-1565804 듀플렉스 중 어느 하나를 투여한 후 85일차에 유리체 및 섬모체에서 PBS에 대해 남아 있는 MYOC 단백질 백분율을 보여준다.
도 6b는 비인간 영장류(NHP) 모델에서 AD-1565837 듀플렉스 또는 AD-1565804 듀플렉스 중 어느 하나를 투여한 후 85일차에 홍채 및 공막에서 PBS에 대해 남아있는 MYOC 단백질 백분율을 보여준다.
도 7은 비인간 영장류(NHP) 모델에서 AD-1565837 듀플렉스 또는 AD-1565804 듀플렉스 중 어느 하나를 투여한 후 85일차에 PBS에 대해 수양액에 남아 있는 MYOC mRNA 백분율을 보여준다.
본 개시내용의 다양한 구현예의 세부 사항은 아래의 설명에 제시되어 있다. 본 개시내용의 다른 특징, 목적 및 장점 들은 설명 및 도면으로부터, 그리고 청구범위로부터 명백해질 것이다.
iRNA는 RNA 간섭(RNAi)으로 알려진 공정을 통해 mRNA의 서열 특이적 분해를 지시한다. iRNA 및 MYOC의 발현을 조절(예를 들어, 억제)하기 위해 이를 사용하는 방법이 본원에 기술된다. 또한, 녹내장(예를 들어, 원발성 개방각 녹내장(POAG))과 같은 MYOC 발현과 관련된 장애의 치료를 위한 조성물 및 방법이 제공된다.
인간 MYOC는 약 57kDa의 분비된 당단백질로서, 세포 부착, 세포 기질 부착, 세포골격 조직, 및 세포 이동을 포함하는 상이한 과정을 제어하기 위해 인접 세포에서 여러 신호 전달 경로의 활성화를 조절한다. MYOC는 통상적으로 망막 및 수양액 조절에 관여하는 구조를 포함하는 섬유주대 조직 및 섬모체와 같은 다양한 조직에 의해 발현되고 분비된다. 비정상적인 MYOC는 녹내장, 예를 들어 원발성 개방각 녹내장(POAG)과 관련이 있다. 이론에 의해 얽매이지 않고, 비정상적인 MYOC는, 예를 들어, 수양액의 배수를 방해하여 결과적으로 안압을 증가시킴으로써, 녹내장의 병인을 악화시킬 수 있다.
다음의 설명은 MYOC의 발현을 조절(예를 들어, 억제)하기 위해 iRNA를 함유하는 조성물을 제조하고 사용하는 방법뿐만 아니라, MYOC의 발현과 관련된 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 개시한다.
일부 양태에서, MYOC iRNA 및 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 함유하는 약제학적 조성물, MYOC의 발현을 억제하기 위해 조성물을 사용하는 방법, 및 MYOC의 발현과 관련된 장애(예를 들어, 녹내장, 예를 들어, 원발성 개방각 녹내장(POAG))를 치료하기 위해 약제학적 조성물을 사용하는 방법이 본원에서 특징화된다.
I. 정의
편의를 위해, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에 사용된 특정 용어 및 문구의 의미가 아래에 제공된다. 본 명세서의 다른 부분에서의 용어의 사용과 본 섹션에서 제공된 그 정의 사이에 명백한 불일치가 있는 경우, 본 섹션의 정의가 우선한다.
수 또는 수치 범위를 지칭할 때 용어 "약"은 언급된 수 또는 수치 범위가 실험 변동성 내에서(또는 통계적 실험 오차 내에서) 근사치이며, 따라서 수 또는 수치 범위는, 예를 들어, 언급된 수 또는 수치 범위의 1% 내지 15% 사이에서 변할 수 있음을 의미한다.
수 또는 일련의 수들 앞의 용어 "이상" 및 "적어도"는 용어 "적어도"에 근접한 수, 및 문맥으로부터 분명해지듯 논리적으로 포함될 수 있는 모든 후속 수 또는 정수를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 핵산 분자 내 뉴클레오타이드의 수는 정수이어야 한다. 예를 들어, "20개 뉴클레오타이드 핵산 분자의 적어도 17개의 뉴클레오타이드"는 17, 18, 19, 또는 20개의 뉴클레오타이드가 표시된 특성을 가짐을 의미한다. 적어도가 일련의 수 또는 범위 앞에 존재하는 경우, "적어도"는 일련의 수 또는 범위 내의 수 각각을 수식할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "이하" 및 "미만"은 문구에 근접한 값 및, 문맥상 논리적으로, 0까지의 논리적으로 더 낮은 값 또는 정수를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, "2개 이하의 뉴클레오타이드"의 표적 부위에 대한 미스매치를 갖는 듀플렉스는 2, 1, 또는 0개의 미스매치를 갖는다. "이하"가 일련의 수 또는 범위 앞에 존재하는 경우, "이하"는 일련의 수 또는 범위 내의 수 각각을 수식할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "미만"은 문구에 근접한 값을 포함하지 않고, 문맥상 논리적으로, 0까지의 논리적으로 더 낮은 값 또는 정수를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, "3개 미만의 뉴클레오타이드"의 표적 부위에 대한 미스매치를 갖는 듀플렉스는 2, 1, 또는 0개의 미스매치를 갖는다. "미만"이 일련의 수 또는 범위 앞에 존재하는 경우, "미만"은 일련의 수 또는 범위 내의 수 각각을 수식할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "초과"는 문구에 근접한 값을 포함하지 않고, 문맥상 논리적으로, 무한까지의 논리적으로 더 높은 값 또는 정수를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, "3개 초과의 뉴클레오타이드"의 표적 부위에 대한 미스매치를 갖는 듀플렉스는 4, 5, 6개 이상의 미스매치를 갖는다. "초과"가 일련의 수 또는 범위 앞에 존재하는 경우, "초과"는 일련의 수 또는 범위 내의 수 각각을 수식할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "최대 10"에서와 같이 "최대"는 최대 10까지, 즉, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10까지 포함하는 것으로 이해된다.
본원에 제공된 범위는 범위 내의 모든 개별 정수 값 및 모든 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.
용어 "활성화시키다", "강화하다", "~의 발현을 상향 조절하다", "~의 발현을 증가시키다" 등은 이들이 MYOC 유전자를 지칭하는 한, 본원에서 MYOC 유전자가 전사되고 MYOC 유전자의 발현이 증가하도록 처리된 제1 세포 또는 세포군으로부터 분리되거나 이에서 검출된 MYOC mRNA의 양이 제1 세포 또는 세포군과 실질적으로 동일하지만 그렇게 처리되지 않은 제2 세포 또는 세포군(대조군 세포)과 비교하여 증가한 것으로 나타나는 바와 같이 MYOC 유전자 발현의 적어도 부분적인 활성화를 지칭한다.
일부 구현예에서, MYOC 유전자의 발현은 본원에 기술된 것과 같은 iRNA의 투여에 의해 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%만큼 활성화된다. 일부 구현예에서, MYOC 유전자는 본 개시내용에서 특징지어지는 iRNA의 투여에 의해 적어도 약 60%, 70%, 또는 80%만큼 활성화된다. 일부 구현예에서, MYOC 유전자의 발현은 본원에 기술된 것과 같은 iRNA의 투여에 의해 적어도 약 85%, 90%, 또는 95% 이상만큼 활성화된다. 일부 구현예에서, MYOC 유전자 발현은 미처리 세포에서의 발현과 비교하여 본원에 기술된 것과 같은 iRNA로 처리된 세포에서 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배, 적어도 1000배 이상만큼 증가된다. 작은 dsRNA에 의한 발현의 활성화는, 예를 들어 문헌[Li 등, 2006 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:17337~42] 및 US2007/0111963 및 US2005/226848에 기술되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로서 통합된다.
용어 "침묵시키다", "~의 발현을 억제하다(inhibit)", "~의 발현을 하향 조절하다", "~의 발현을 억제하다(suppress)" 등은 MYOC를 지칭하는 한, 본원에서, 예를 들어, MYOC mRNA 발현, MYOC 단백질 발현, 또는 MYOC 발현에 기능적으로 결합된 다른 파라미터에 기초하여 평가했을 때, MYOC 발현의 적어도 부분적인 억제를 지칭한다. 예를 들어, MYOC 발현의 억제는 MYOC가 전사되고 MYOC의 발현이 억제되도록 처리된 제1 세포 또는 세포군으로부터 분리되거나 이에서 검출될 수 있는 MYOC mRNA의 양이 대조군과 비교하여 감소함으로써 나타날 수 있다. 대조군은, 제2 세포 또는 세포군이 그렇게 처리되지 않았다는 것을 제외하고는, 제1 세포 또는 세포군과 실질적으로 동일한 제2 세포 또는 세포군(대조군 세포)일 수 있다. 억제 정도는 일반적으로 대조군 수준의 백분율로서 표현되며, 예를 들어, 다음과 같다.
대안적으로, 억제 정도는 MYOC 발현에 기능적으로 결합된 파라미터, 예를 들어, MYOC 유전자에 의해 암호화된 단백질의 양 감소의 관점에서 주어질 수 있다. MYOC 발현에 기능적으로 결합된 파라미터의 감소는 유사하게 대조군 수준의 백분율로서 표현될 수 있다. 원칙적으로, MYOC 침묵은 구성적으로 또는 게놈 조작에 의해 MYOC를 발현하는 임의의 세포에서 임의의 적절한 검정에 의해 결정될 수 있다.
예를 들어, 특정한 경우에, MYOC의 발현은 본원에 개시된 iRNA의 투여에 의해 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%만큼 억제된다. 일부 구현예에서, MYOC는 본원에 개시된 iRNA의 투여에 의해 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80%만큼 억제된다. 일부 구현예에서, MYOC는 본원에 기술된 것과 같은 iRNA의 투여에 의해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 그 이상만큼 억제된다.
용어 "안티센스 가닥" 또는 "가이드 가닥"은 표적 서열에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 iRNA의 가닥, 예를 들어, dsRNA를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 것과 같이, 용어 "상보성 영역"은 본 명세서에 정의된 것과 같이, 서열, 예를 들어 표적 서열에 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥 상의 영역을 지칭한다. 상보성 영역이 표적 서열에 완전히 상보적이지 않은 경우, 미스매치는 분자의 내부 또는 말단 영역에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 상보성 영역은 0, 1, 또는 2개의 미스매치를 포함한다.
본원에서 사용된 것과 같이 용어 "센스 가닥" 또는 "패신저 가닥"은 해당 용어가 본원에 정의된 것과 같은 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 iRNA의 가닥을 지칭한다.
dsRNA와 관련하여 본 명세서에서 사용된 용어 "둔화" 또는 "둔화 말단"은 dsRNA의 소정의 말단에 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체가 없음을, 즉 뉴클레오타이드 오버행이 없음을 의미한다. dsRNA의 말단 중 하나 또는 모두는 둔화 말단일 수 있다. dsRNA의 말단 모두가 둔화인 경우, dsRNA는 둔화 말단인 것으로 일컬어진다. 명백하게, "둔화 말단" dsRNA는 양말단이 둔화인 dsRNA이고, 즉 분자의 어느 말단에도 뉴클레오타이드 오버행이 없다. 가장 흔하게, 그러한 분자는 그 전체 길이에 걸쳐 이중 가닥일 것이다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 그리고 달리 명시되지 않는 한, 용어 "상보적"은 제2 뉴클레오타이드 서열과 관련하여 제1 뉴클레오타이드 서열을 설명하는 데 사용될 때, 당업자에 의해 이해될 수 있는 것과 같이, 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 특정한 조건 하에서 듀플렉스 구조를 혼성화하고 형성하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 능력을 지칭한다. 이러한 조건은, 예를 들어 엄격한 조건일 수 있으며, 엄격한 조건은: 50°C 또는 70°C에서 12~16시간 동안 400mM NaCl, 40mM PIPES pH 6.4, 1mM EDTA에 이어서 세척하는 것을 포함할 수 있다. 유기체 내에서 접할 수 있는 생리학적 관련 조건과 같은 다른 조건들이 적용될 수 있다. 당업자는 혼성화된 뉴클레오타이드의 궁극적인 적용에 따라 2개 서열의 상보성 시험에 가장 적합한 조건들의 세트를 결정할 수 있을 것이다.
iRNA 내의, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 것과 같은 dsRNA 내의 상보적인 서열은 하나 또는 둘 모두의 뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 염기쌍 형성을 포함한다. 그러한 서열은 본 명세서에서 서로에 대해 "완전히 상보적"인 것으로 지칭될 수 있다. 그러나, 본원에서 제1 서열이 제2 서열에 대하여 "실질적으로 상보적"인 것으로 지칭되는 경우, 2개의 서열은 완전히 상보적일 수 있거나, 이들은 최대 30개 염기쌍의 듀플렉스에 대한 혼성화 시, 하나 이상, 그러나 일반적으로 5, 4, 3 또는 2개 이하의 미스매칭된 염기쌍을 형성할 수 있는 한편, 이들의 궁극적인 적용, 예를 들어, RISC 경로를 통한 유전자 발현의 억제와 가장 관련된 조건 하에서 혼성화하는 능력을 보유한다. 그러나, 혼성화 시, 2개의 올리고뉴클레오타이드가 하나 이상의 단일 가닥 오버행을 형성하도록 설계된 경우, 그러한 오버행은 상보성 결정과 관련하여 미스매치로서 간주되지 않는다. 예를 들어, 길이가 21개 뉴클레오타이드인 하나의 올리고뉴클레오타이드 및 길이가 23개 뉴클레오타이드인 또 다른 올리고뉴클레오타이드를 포함하되, 보다 긴 올리고뉴클레오타이드가 보다 짧은 올리고뉴클레오타이드에 완전히 상보적인 21개 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 dsRNA는 본 명세서에서 기술된 목적을 위해 "완전히 상보적"인 것으로 여전히 언급될 수 있다.
본원에 사용된 것과 같이 상보적 서열은 또한 혼성화하는 이들의 능력과 관련하여 위의 요건이 충족되는 한, 비-왓슨-크릭(non-Watson-Crick) 염기쌍 및/또는 비-천연 및 변형 뉴클레오타이드로부터 형성된 염기쌍을 포함하거나 이들로부터 전적으로 형성될 수 있다. 그러한 비-왓슨-크릭 염기쌍은 G:U 워블(Wobble) 또는 후그슈타인(Hoogsteen) 염기쌍 형성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
이들 사용의 문맥으로부터 이해되는 것과 같이, 본원의 용어 "상보적인", "완전히 상보적인", 및 "실질적으로 상보적인"은 dsRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이, 또는 iRNA 제제의 안티센스 가닥과 표적 서열 사이의 염기 매칭과 관련해 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 메신저 RNA(mRNA)의 "적어도 일부에 실질적으로 상보적"인 폴리뉴클레오타이드는 관심 mRNA(예를 들어, MYOC 단백질을 암호화하는 mRNA)의 연속 부분에 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 서열이 MYOC를 암호화하는 mRNA의 중단되지 않은 부분에 실질적으로 상보적인 경우 MYOC mRNA의 적어도 일부에 상보적이다. 용어 "상보성"은 제1 핵산의 핵염기와 제2 핵산 사이의 페어링 능력을 지칭한다.
본원에서 사용되는 것과 같이, 용어 "상보성 영역"은 본원에 정의된 것과 같이 다른 서열에 실질적으로 상보적인 하나의 뉴클레오타이드 서열 제제의 영역, 예를 들어, dsRNA의 센스 서열 및 상응하는 안티센스 서열, 또는 iRNA의 안티센스 가닥 및 표적 서열, 예를 들어, MYOC 뉴클레오타이드 서열의 영역을 지칭한다. 상보성 영역이 표적 서열에 완전히 상보적이지 않은 경우, 미스매치는 iRNA의 안티센스 가닥의 내부 또는 말단 영역에 존재할 수 있다. 일반적으로 가장 허용되는 미스매치는 말단 영역, 예를 들어, iRNA 제제의 5'- 또는 3'-말단의 5, 4, 3, 또는 2개 뉴클레오타이드 이내에 존재한다.
본원에서 사용되는 것과 같이, "접촉"은 세포를 직접 접촉시키는 것뿐만 아니라 세포를 간접적으로 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 대상체 내의 세포는 iRNA를 포함하는 조성물이 대상체에게 (예를 들어, 안구내, 국소, 또는 정맥내) 투여될 때 접촉될 수 있다.
iRNA를 지칭할 때, "세포 내로 도입"은 세포 내로의 흡수(uptake) 또는 흡수(absorption)를 용이하게 하거나 수행하는 것을 의미한다. iRNA의 흡수(uptake) 또는 흡수(absorption)는 비보조 확산 또는 활성 세포 과정을 통해, 또는 보조제 또는 장치에 의해 일어날 수 있다. 이 용어의 의미는 시험관 내 세포에 한정되지 않으며; iRNA는 또한 "세포 내로 도입"될 수 있되, 세포는 살아있는 유기체의 일부이다. 이러한 경우, 세포 내로의 도입은 유기체로의 전달을 포함할 것이다. 예를 들어, 생체 내 전달을 위해, iRNA는 조직 부위 내로 주사되거나 전신 투여될 수 있다. 생체 내 전달은 또한 미국 특허 번호 제5,032,401호 및 제5,607,677호, 및 미국 공개 번호 제2005/0281781호에 기술된 것과 같은 β-글루칸 전달 시스템에 의한 것일 수 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로서 통합된다. 세포 내로의 시험관 내 도입은 전기천공 및 지질감염과 같은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 추가의 접근법은 하기 본원에 기술되어 있거나 당업계에 공지되어 있다. 본원에서 사용되는 것과 같이, "MYOC 발현과 관련된 장애", "MYOC 발현과 관련된 질환", "MYOC 발현과 관련된 병리학적 과정", "MYOC 관련 장애", "MYOC 관련 질환" 등은 MYOC 발현이 변화(예를 들어, 기준 수준, 예를 들어, 비질환 대상체의 수준 특징 대비 감소 또는 증가)된 임의의 병태, 장애, 또는 질환을 포함한다. 일부 구현예에서, MYOC 발현은 증가된다. 일부 구현예에서, MYOC 발현은 증가된다. 일부 구현예에서, MYOC 발현의 감소 또는 증가는 대상체로부터의 조직 샘플에서 (예를 들어, 수성 안액 샘플에서) 검출 가능하다. 감소 또는 증가는 장애의 발생 전에 동일한 개체에서 관찰된 수준에 비해 또는 장애를 갖고 있지 않는 다른 개체(들)에 비해 평가될 수 있다. 감소 또는 증가는 신체의 특정 기관, 조직, 또는 영역(예를 들어, 눈)으로 제한될 수 있다. MYOC 관련 장애는 녹내장(예를 들어, 원발성 개방각 녹내장(POAG))을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 것과 같이, 용어 "녹내장"은 시신경 손상에 의해 야기되거나 이와 연관된 눈의 임의의 질환을 의미한다. 일부 구현예에서,녹내장은 안압 상승과 연관된다. 일부 구현예에서,녹내장은 무증상이다. 다른 구현예에서, 녹내장은 하나 이상의 증상, 예를 들어, 주변 시력, 터널 시력, 또는 사각지대의 상실을 갖는다. 본원에 제공된 방법을 사용하여 치료 가능한 녹내장의 비제한적인 예는 원발성 개방각 녹내장(POAG)이다.
본원에서 사용되는 것과 같이, 용어 "이중 가닥 RNA", "dsRNA", 또는 "siRNA"는 표적 RNA에 대해 "센스" 및 "안티센스" 배향을 갖는 것으로 지칭될, 2개의 항평행하며 실질적으로 상보적인 핵산 가닥을 포함하는 혼성화된 듀플렉스 영역을 갖는 RNA 분자 또는 분자의 복합체를 포함하는 iRNA를 지칭한다. 듀플렉스 영역은, 예를 들어, RISC 경로를 통해 바람직한 표적 RNA의 특이적 분해를 허용하는 임의의 길이일 수 있지만, 통상적으로 9 내지 36개 범위의 염기쌍 길이, 예를 들어, 15~30개 염기쌍 길이일 것이다. 9 내지 36개 염기쌍의 듀플렉스를 고려하면, 듀플렉스는 이 범위, 예를 들어, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 또는 36개, 및 15~30개 염기쌍, 15~26개 염기쌍, 15~23개 염기쌍, 15~22개 염기쌍, 15~21개 염기쌍, 15~20개 염기쌍, 15~19개 염기쌍, 15~18개 염기쌍, 15~17개 염기쌍, 18~30개 염기쌍, 18~26개 염기쌍, 18~23개 염기쌍, 18~22개 염기쌍, 18~21개 염기쌍, 18~20개 염기쌍, 19~30개 염기쌍, 19~26개 염기쌍, 19~23개 염기쌍, 19~22개 염기쌍, 19~21개 염기쌍, 19~20개 염기쌍, 20~30개 염기쌍, 20~26개 염기쌍, 20~25개 염기쌍, 20~24개 염기쌍, 20~23개 염기쌍, 20~22개 염기쌍, 20~21개 염기쌍, 21~30개 염기쌍, 21~26개 염기쌍, 21~25개 염기쌍, 21~24개 염기쌍, 21~23개 염기쌍, 또는 21~22개 염기쌍을 포함하지만 이에 제한되지 않는 그 사이의 임의의 하위 범위의 임의의 길이일 수 있다. 다이서 및 유사한 효소로 처리함으로써 세포 내에서 생성된 dsRNA는 일반적으로 19~22개 염기쌍 길이의 범위이다. dsDNA의 듀플렉스 영역의 하나의 가닥은 표적 RNA의 영역에 실질적으로 상보적인 서열을 포함한다. 듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥은 적어도 하나의 자가-상보성 영역을 갖는 단일 RNA 분자로부터 유래할 수 있거나, 2개 이상의 별도의 RNA 분자로부터 형성될 수 있다. 듀플렉스 영역이 단일 분자의 2개의 가닥으로부터 형성되는 경우, 분자는 듀플렉스 구조를 형성하는 하나의 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이 뉴클레오타이드의 단일 가닥 사슬(본원에서 "헤어핀 루프"로 지칭됨)에 의해 분리된 듀플렉스 영역을 가질 수 있다. 헤어핀 루프는 적어도 하나의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고; 일부 구현예에서 헤어핀 루프는 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 23개 이상의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. dsRNA의 2개의 실질적으로 상보적인 가닥이 별개의 RNA 분자로 이루어지는 경우, 이들 분자는 그럴 필요는 없지만 공유 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 가닥은 헤어핀 루프 이외의 수단에 의해 공유 결합되고, 결합 구조는 링커이다.
일부 구현예에서, iRNA 제제는 표적 mRNA를 억제하기 위해 세포 또는 유기체 내로 도입되는 "단일 가닥 siRNA"일 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 RNAi 제제는 RISC 엔도뉴클레아제 아르고너트(Argonaute) 2에 결합하여 표적 mRNA를 절단할 수 있다. 단일 가닥 siRNA는 일반적으로 15~30개의 뉴클레오타이드이며 선택적으로 화학적으로 변형된다. 단일 가닥 siRNA의 설계 및 시험은 미국 특허 번호 제8,101,348호 및 문헌[Lima 등, (2012) Cell 150:883~894]에 기술되어 있고, 이의 각각의 전문은 본원에 참조로서 통합된다. 본원에 기술된 안티센스 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 표 2a 또는 2b에 제공된 서열) 중 어느 하나는 본원에 기술된 것과 같은 단일 가닥 siRNA로서 사용될 수 있고, 예를 들어 문헌[Lima 등, (2012) Cell 150:883~894]에 기술된 방법에 의해, 예를 들어, 본원에 기술된 것과 같이, 선택적으로 화학적으로 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, RNA 간섭 제제는 표적 RNA 서열과 상호작용하여 표적 RNA의 절단을 지시하는 단일 가닥 RNA를 포함한다. 이론에 얽매이고자 하는 것 없이 세포 내로 도입된 긴 이중 가닥 RNA는 다이서(Dicer)로 알려진 III형 엔도뉴클레아제에 의해 siRNA로 분해된다(문헌참조: Sharp 등(2001) Genes Dev. 15:485). 리보뉴클레아제 III형 효소인 다이서는 dsRNA를 특징적인 2개의 염기 3' 오버행을 갖는 19~23개 염기쌍의 짧은 간섭 RNA로 가공한다(문헌참조: Bernstein, 등, (2001) Nature 409:363). 이어서 siRNA는 RNA-유도 침묵 복합체(RISC)로 혼입되며, 여기서 하나 이상의 헬리카제는 siRNA 듀플렉스를 풀어 상보적 안티센스 가닥이 표적 인식을 유도할 수 있도록 한다(문헌참조: Nykanen, 등(2001) Cell 107:309). 적절한 표적 mRNA에 결합 시, RISC 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제는 표적을 절단하여 침묵을 유도한다(문헌참조: Elbashir, 등(2001) Genes Dev. 15:188). 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용은 표적 유전자의 침묵을 달성하기 위해 RISC 복합체의 형성을 촉진하는 단일 가닥 RNA에 관한 것이다.
"G," "C," "A," "T" 및 "U"는 일반적으로 염기로서 각각 구아닌, 시토신, 아데닌, 티미딘 및 우라실을 함유하는 뉴클레오타이드를 각각 의미한다. 그러나, 용어 "데옥시리보뉴클레오타이드", "리보뉴클레오타이드", 또는 "뉴클레오타이드"는 또한 하기에 추가로 상세히 설명되는 것과 같은 변형 뉴클레오타이드, 또는 대용 대체 모이어티를 지칭할 수 있음이 이해될 것이다. 당업자는 구아닌, 시토신, 아데닌, 및 우라실이 이러한 대체 모이어티를 보유하는 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 염기쌍 형성 특성을 실질적으로 변경하지 않고 다른 모이어티로 대체될 수 있음을 잘 알고 있다. 예를 들어, 비제한적으로, 이노신을 그 염기로서 포함하는 뉴클레오타이드는 아데닌, 시토신, 또는 우라실을 함유하는 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성할 수 있다. 따라서, 우라실, 구아닌, 또는 아데닌을 함유하는 뉴클레오타이드는 본 개시내용에서 특징지어진 dsRNA의 뉴클레오타이드 서열에서, 예를 들어, 이노신을 함유하는 뉴클레오타이드에 의해 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, 올리고뉴클레오타이드 어느 곳의 아데닌 및 시토신은 각각 구아닌 및 우라실과 대체되어 표적 mRNA와 G-U 워블 염기쌍을 형성할 수 있다. 이러한 대체 모이어티를 함유하는 서열은 본 개시내용에서 특징지어진 조성물 및 방법에 적합하다.
본원에서 사용되는 것과 같이, 용어 "iRNA", "RNAi", "iRNA 제제", 또는 "RNAi 제제" 또는 "RNAi 분자"는 해당 용어가 본원에 정의된 것과 같은 RNA를 함유하고, 예를 들어, RNA-유도 침묵 복합체(RISC) 경로를 통해 RNA 전사체의 표적화된 절단을 매개하는 제제를 지칭한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 것과 같은 iRNA는, 예를 들어, 세포 또는 포유동물에서, MYOC 발현의 억제에 영향을 미친다. MYOC 발현의 억제는 MYOC mRNA 수준의 감소 또는 MYOC 단백질 수준의 감소에 기초하여 평가될 수 있다.
용어 "링커" 또는 "결합기"는 화합물의 두 부분을 연결하는, 예를 들어 화합물의 두 부분을 공유적으로 부착시키는 유기 모이어티를 의미한다.
용어 “친유성”또는 “친유성 모이어티”는 광범위하게 지질에 대해 친화성을 갖는 임의의 화합물 또는 화학적 모이어티를 지칭한다. 친유성 모이어티의 친유성을 특징 분석하기 위한 한 가지 방법은 옥탄올-물 분배 계수인 logKow이며, 여기서 Kow는 평형 상태에서 2상 시스템의 수성 상에서 이의 농도에 대한 옥탄올 상에서의 화학물질 농도의 비율이다. 옥탄올-물 분배 계수는 물질의 연구실-측정된 성질이다. 그러나 제1원리 또는 경험적 방법을 사용하여 계산된 화학물질의 구조적 성분에 기인하는 계수를 사용하여 예측할 수도 있다(문헌참조: 예를 들어, Tetko 등, J. Chem. Inf. Comput. Sci. 41:1407~21(2001), 이의 전문이 본원에 참조로 인용됨). 이것은 물 보다 비수성 또는 유성 환경을 선호하는 물질의 경향(즉, 이의 친수성/친유성 균형)의 열역학 척도를 제공한다. 원칙적으로 화학 물질은 logKow가 0을 초과할 때 특징이 친유성이다. 통상적으로, 친유성 모이어티는 1 초과, 1.5 초과, 2 초과, 3 초과, 4 초과, 5 초과 또는 10 초과의 logKow를 보유한다. 예를 들어, 6-아미노 헥산올의 logKow는 대략 0.7인 것으로 예상된다. 동일한 방법을 사용하여, 콜레스테릴 N-(헥산-6-올) 카바메이트의 logKow는 10.7인 것으로 예상된다.
분자의 친유성은 이것이 갖는 작용기와 관련하여 변화할 수 있다. 예를 들어, 친유성 모이어티의 말단에 하이드록실기 또는 아민기의 첨가는 친유성 모이어티의 분배 계수(예를 들어, logKow) 값을 증가 또는 감소시킬 수 있다.
대안적으로, 하나 이상의 친유성 모이어티에 접합된 이중 가닥 RNAi 제제의 소수성은 이의 단백질 결합 특성에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 이중 가닥 RNAi 제제의 혈장 단백질 결합 검정에서 미결합된 분획은 이중 가닥 RNAi 제제의 상대적 소수성과 양의 상관관계가 있는 것으로 결정될 수 있고, 이는 이어서 이중 가닥 RNAi 제제의 침묵 활성과 양의 상관관계가 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 결정된 혈장 단백질 결합 검정은 인간 혈청 알부민 단백질을 사용한 전기영동 이동성 변화 검정(EMSA)이다. 이러한 결합 검정의 예시적인 프로토콜은, 예를 들어, PCT/US2019/031170에 상세히 기재되어 있다. 결합 검정에서 미결합 siRNA의 분획으로 측정된 이중 가닥 RNAi 제제의 소수성은 siRNA의 증진된 생체 내 전달에 대해 0.15 초과이거나, 0.2 초과이거나, 0.25 초과이거나, 0.3 초과이거나, 0.35 초과이거나, 0.4 초과이거나, 0.45 초과이거나 0.5 초과이다.
따라서, 이중 가닥 RNAi 제제의 내부 위치(들)에 친유성 모이어티를 접합하는 것은 siRNA의 증진된 생체 내 전달에 대해 최적의 소수성을 제공한다.
용어 "지질 나노입자" 또는 "LNP"는 핵산 분자, 예를 들어, RNAi 제제가 전사되는 RNAi 제제 또는 플라스미드와 같은 약제학적 활성 분자를 캡슐화하는 지질 층을 포함하는 소포이다. LNP는, 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,858,225호, 제6,815,432호, 제8,158,601호, 및 제8,058,069호에 기술되어 있고, 이의 전문은 본원에 참조로서 통합된다.
본원에서 사용되는 것과 같이, 용어 "~의 발현을 조절하는"은 대조군 세포의 상응하는 유전자 발현과 비교하여 본원에 기술된 것과 같은 iRNA 조성물로 처리된 세포에서 유전자(예를 들어, MYOC 유전자) 발현의 적어도 부분적인 "억제" 또는 부분적인 "활성화"를 지칭한다. 대조군 세포는 미처리 세포, 또는 비표적화 대조군 iRNA로 처리된 세포를 포함한다.
당업자는 용어 "RNA 분자" 또는 "리보핵산 분자"가 자연에서 발현되거나 발견되는 것과 같은 RNA 분자뿐만 아니라, 본원에 기술된 것과 같거나 당업계에 공지된 것과 같은 하나 이상의 리보뉴클레오타이드/리보뉴클레오사이드 유사체 또는 유도체를 포함하는 RNA의 유사체 및 유도체를 포함한다는 것을 인식할 것이다. 엄격히 말하자면, "리보뉴클레오사이드"는 뉴클레오사이드 염기 및 리보오스 당을 포함하고, "리보뉴클레오타이드"는 1, 2 또는 3개의 포스페이트 모이어티 또는 이의 유사체(예를 들어, 포스포로티오에이트)를 갖는 리보뉴클레오사이드이다. 그러나, 용어 "리보뉴클레오사이드" 및 "리보뉴클레오타이드"는 본원에서 사용되는 것처럼 동등한 것으로 간주될 수 있다. RNA는, 예를 들어, 본원에서 후술되는 바와 같이 핵염기 구조, 리보오스 구조, 또는 리보오스-포스페이트 백본 구조에서 변형될 수 있다. 그러나, 리보뉴클레오사이드 유사체 또는 유도체를 포함하는 분자는 듀플렉스를 형성하는 능력을 보유해야 한다. 비제한적인 예로서, RNA 분자는 또한 2'-O-메틸 변형 뉴클레오사이드, 5' 포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오사이드, 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드기에 결합된 말단 뉴클레오사이드, 잠김 뉴클레오사이드, 비염기성 뉴클레오사이드, 비환형 뉴클레오사이드, 글리콜 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 뉴클레오사이드, 2'-아미노-변형 뉴클레오사이드, 2'-알킬-변형 뉴클레오사이드, 모르폴리노 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드를 포함하는 포스포라미데이트 또는 비-천연 염기, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 변형 리보뉴클레오사이드를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 조합되어, RNA 분자는 dsRNA 분자의 전체 길이까지 적어도 2개의 변형 리보뉴클레오사이드, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개 이상을 포함할 수 있다. 변형은 RNA 분자 내의 이러한 복수의 변형 리보뉴클레오사이드 각각에 대해 동일할 필요는 없다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법 및 조성물에 사용하기 위해 고려되는 변형된 RNA는, 필요한 듀플렉스 구조를 형성하는 능력을 갖고, 예를 들어 RISC 경로를 통해 표적 RNA의 특이적 분해를 허용하거나 매개하는 펩타이드 핵산(PNA)이다. 명확성을 위해, 용어 "iRNA"는 자연 발생 이중 가닥 DNA 분자 또는 100% 데옥시뉴클레오사이드 함유 DNA 분자를 포함하지 않는 것으로 이해된다.
일부 양태에서, 변형된 리보뉴클레오사이드는 데옥시리보뉴클레오사이드를 포함한다. 이러한 경우에, iRNA 제제는, 예를 들어 데옥시뉴클레오사이드 오버행(들), 또는 dsRNA의 이중 가닥 부분 내의 하나 이상의 데옥시뉴클레오사이드를 포함하는 하나 이상의 데옥시뉴클레오사이드를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, RNA 분자는, 예를 들어, 하나 또는 양 가닥에서 데옥시리보뉴클레오사이드의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% 이상의 (100%는 아님) 데옥시리보뉴클레오사이드의 백분율을 포함한다.
본원에서 사용된 것과 같이, 용어 "뉴클레오타이드 오버행"은 iRNA, 예를 들어, dsRNA의 듀플렉스 구조로부터 돌출된 적어도 하나의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드를 지칭한다. 예를 들어, dsRNA의 한 가닥의 3'-말단이 다른 가닥의 5'-말단을 넘어 확장되거나 그 반대의 경우에 뉴클레오타이드 오버행이 존재한다. dsRNA는 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 오버행을 포함할 수 있고; 대안적으로, 오버행은 적어도 2개 뉴클레오타이드, 적어도 3개 뉴클레오타이드, 적어도 4개 뉴클레오타이드, 또는 적어도 5개 뉴클레오타이드 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 오버행은 데옥시뉴클레오타이드/뉴클레오사이드를 포함하는 뉴클레오타이드/뉴클레오사이드 유사체를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 오버행(들)은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 이들의 임의의 조합 상에 있을 수 있다. 또한, 오버행의 뉴클레오타이드(들)는 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥의 5' 말단, 3' 말단 또는 양 말단 상에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, dsRNA의 안티센스 가닥은 3' 말단 및/또는 5' 말단에 1~10개의 뉴클레오타이드 오버행을 갖는다. 일부 구현예에서, dsRNA의 센스 가닥은 3' 말단 및/또는 5' 말단에 1~10개의 뉴클레오타이드 오버행을 갖는다. 일부 구현예에서, 오버행 내 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 뉴클레오사이드 티오포스페이트와 대체된다.
본원에서 사용되는 것과 같이, "약제학적 조성물"은 약리학적 유효량의 치료제(예를 들어, iRNA) 및 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함한다. 본원에서 사용되는 것과 같이, "약리학적 유효량", "치료적 유효량" 또는 단순히 "유효량"은 의도된 약리학적, 치료적 또는 예방적 결과를 생성하는 데 효과적인 제제(예를 들어, iRNA)의 양을 지칭한다. 예를 들어, MYOC 발현과 관련된 장애(예를 들어, 녹내장, 예를 들어, 원발성 개방각 녹내장(POAG))를 치료하는 방법에서, 유효량은 장애와 관련된 하나 이상의 증상을 감소시키는 데 효과적인 양(예를 들어, 다음에 효과적인 양; (a) MYOC의 발현 또는 활성을 억제하거나 감소; (b) 오접힌 MYOC 단백질의 수준을 감소; (c) 섬유주대 세포 사멸을 감소; (d) 안압을 감소; 또는 (e) 시력을 증가)을 포함한다. 예를 들어, 소정의 임상 치료가 질환 또는 장애와 관련된 측정 가능한 파라미터에서 적어도 10% 감소가 있을 때 효과적인 것으로 간주되는 경우, 해당 질환 또는 장애의 치료를 위한 약물의 치료적 유효량은 해당 파라미터에서 적어도 10% 감소를 얻는 데 필요한 양이다. 예를 들어, MYOC를 표적으로 하는 iRNA의 치료적 유효량은 MYOC mRNA의 수준 또는 MYOC 단백질의 수준을 임의의 측정 가능한 양만큼, 예를 들어, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%만큼 감소시킬 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한 캐리어"는 치료제의 투여를 위한 캐리어를 지칭한다. 이러한 캐리어는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이 용어는 특히 세포 배양 배지를 배제한다. 경구 투여되는 약물의 경우, 약제학적으로 허용 가능한 캐리어는 불활성 희석제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 감미제, 향미제, 착색제 및 보존제와 같은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 적절한 불활성 희석제는 나트륨 및 탄산칼슘, 나트륨 및 인산칼슘, 및 락토오스를 포함하는 반면, 옥수수 전분 및 알긴산은 적절한 붕해제이다. 결합제는 전분 및 젤라틴을 포함할 수 있는 반면, 윤활제는 존재하는 경우 일반적으로 스테아린산마그네슘, 스테아린산 또는 탈크일 것이다. 바람직한 경우, 정제는 위장관에서의 흡수를 지연시키기 위해 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 물질로 코팅될 수 있다. 약물 제형에 포함된 제제가 이하에서 추가로 설명된다.
본원에서 사용되는 것과 같이, 용어 "SNALP"는 안정한 핵산-지질 입자를 지칭한다. SNALP는 iRNA 또는 iRNA가 전사되는 플라스미드와 같은 핵산을 포함하는 감소된 수성 내부를 코팅하는 지질의 소포를 나타낸다. SNALP는, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제2006/0240093호, 제2007/0135372호, 및 국제 출원 번호 WO 2009/082817에 기술되어 있다. 이들 출원은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 일부 구현예에서, SNALP는 SPLP이다. 본원에서 사용되는 것과 같이, 용어 "SPLP"는 지질 소포 내에 캡슐화된 플라스미드 DNA를 포함하는 핵산-지질 입자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 것과 같이, 용어 "서열을 포함하는 가닥"은 표준 뉴클레오타이드 명명법을 사용하여 지칭된 서열에 의해 기술된 뉴클레오타이드 쇄를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다.
본원에서 사용되는 것과 같이, 본원에 기술된 방법에 따라 치료될 "대상체"는 인간 또는 비인간 동물, 예를 들어, 포유동물을 포함한다. 포유동물은, 예를 들어 설치류(예를 들어, 랫트 또는 마우스) 또는 영장류(예를 들어, 원숭이)일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
"이를 필요로 하는 대상체"는 MYOC 발현, 예를 들어 과발현과 관련된 장애(예를 들어,녹내장)을 갖고 있거나, 갖고 있는 것으로 의심되거나, 발병 위험이 있는 대상체를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 MYOC 발현 또는 과발현과 관련된 장애를 갖고 있거나 갖고 있는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 대상체는 MYOC 발현 또는 과발현과 관련된 장애가 발생할 위험이 있다.
본원에서 사용되는 것과 같이, "표적 서열"은 일차 전사 생성물의 RNA 처리 생성물인 mRNA를 포함하는, 유전자, 예를 들어, MYOC의 전사 동안 형성된 mRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열의 연속 부분을 지칭한다. 서열의 표적 부분은 해당 부위에서 또는 그 근처에서 iRNA-지시 절단을 위한 기질로서 작용하기에 적어도 충분히 길 것이다. 예를 들어, 표적 서열은 일반적으로 9~36개 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 15~30개 뉴클레오타이드 길이일 것이고, 이들 사이의 모든 하위 범위를 포함할 것이다. 비제한적인 예로서, 표적 서열은 15~30개의 뉴클레오타이드, 15~26개의 뉴클레오타이드, 15~23개의 뉴클레오타이드, 15~22개의 뉴클레오타이드, 15~21개의 뉴클레오타이드, 15~20개의 뉴클레오타이드, 15~19개의 뉴클레오타이드, 15~18개의 뉴클레오타이드, 15~17개의 뉴클레오타이드, 18~30개의 뉴클레오타이드, 18~26개의 뉴클레오타이드, 18~23개의 뉴클레오타이드, 18~22개의 뉴클레오타이드, 18~21개의 뉴클레오타이드, 18~20개의 뉴클레오타이드, 19~30개의 뉴클레오타이드, 19~26개의 뉴클레오타이드, 19~23개의 뉴클레오타이드, 19~22개의 뉴클레오타이드, 19~21개의 뉴클레오타이드, 19~20개의 뉴클레오타이드, 20~30개의 뉴클레오타이드, 20~26개의 뉴클레오타이드, 20~25개의 뉴클레오타이드, 20~24개의 뉴클레오타이드, 20~23개의 뉴클레오타이드, 20~22개의 뉴클레오타이드, 20~21개의 뉴클레오타이드, 21~30개의 뉴클레오타이드, 21~26개의 뉴클레오타이드, 21~25개의 뉴클레오타이드, 21~24개의 뉴클레오타이드, 21~23개의 뉴클레오타이드, 또는 21~22개의 뉴클레오타이드일 수 있다.
본원에서 사용되는 것과 같이, 문구 "치료적 유효량" 및 "예방적 유효량" 등은 MYOC 발현과 관련된 임의의 장애 또는 병리학적 과정(예를 들어, 녹내장, 예를 들어, 원발성 개방각 녹내장(POAG))의 치료, 예방 또는 관리에 치료적 이점을 제공하는 양을 지칭한다. 치료적으로 효과적인 특정 양은 당업계에 공지된 인자, 예를 들어 장애 또는 병리학적 과정의 유형, 환자의 병력 및 연령, 장애 또는 병리학적 과정의 단계, 및 다른 요법의 투여와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다.
본 개시내용의 맥락에서, 용어 "치료하다", "치료" 등은 MYOC 발현과 관련된 장애와 연관된 적어도 하나의 증상을 예방, 지연, 완화(relieve) 또는 완화(alleviate)하거나, 이러한 장애의 진행 또는 예상되는 진행을 늦추거나 역전시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 본원에서 특징지어진 방법은, 녹내장을 치료하기 위해 사용될 때, 본원에 기술된 것과 같이, 녹내장의 하나 이상의 증상을 감소시키거나 방지하거나, 또는 연관된 병태의 위험 또는 중증도를 감소시키는 역할을 할 수 있다. 따라서, 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한, 용어 "치료하다", "치료" 등은 MYOC 발현과 관련된 장애 및/또는 장애의 증상의 예방(prophylaxis), 예를 들어, 예방(prevention)하는 것을 포함하도록 의도된다. 치료는 또한 치료의 부재 시에 예상되는 생존률과 비교하여 생존률을 연장시키는 것을 의미할 수 있다.
질환 마커 또는 증상의 맥락에서 "낮추다"는 임의의 감소, 예를 들어, 이러한 수준의 통계적으로 또는 임상적으로 유의미한 감소를 의미한다. 감소는, 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%일 수 있다. 감소는 이러한 장애가 없는 개체에 대한 정상 범위 내에서 허용되는 수준으로 내려갈 수 있다.
본원에서 사용되는 것과 같이, "MYOC"는 "미오실린" 상응하는 mRNA("MYOC mRNA") 또는 상응하는 단백질("MYOC 단백질")을 지칭한다. 인간 MYOC mRNA 전사체의 서열은 서열번호 1에서 발견할 수 있다.
II. iRNA 제제
MYOC의 발현을 조절(예를 들어, 억제)하는 iRNA 제제가 본원에 기술된다.
일부 구현예에서, iRNA 제제는 세포 또는 포유동물에서 MYOC의 발현을 활성화시킨다.
일부 구현예에서, iRNA 제제는 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물에서, 예를 들어, 인간에서) MYOC의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 분자를 포함하고, 여기서 dsRNA는 MYOC의 발현에서 형성된 mRNA의 적어도 일부에 상보적인 상보성 영역을 갖는 안티센스 가닥을 포함하고, 상보성 영역은 30개 이하의 뉴클레오타이드 길이, 일반적으로 19~24개의 뉴클레오타이드 길이이고, dsRNA는, MYOC를 발현하는 세포와 접촉 시, MYOC의 발현을, 예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%만큼 억제한다.
MYOC의 발현의 조절(예를 들어, 억제)은, 예를 들어 PCR 또는 분지형 DNA(bDNA) 기반 방법에 의해, 또는 단백질 기반 방법에 의해, 예컨대 웨스턴 블롯에 의해 분석될 수 있다. COS 세포, ARPE-19 세포, hTERT RPE-1 세포, HeLa 세포, 일차 간세포, HepG2 세포, 일차 배양된 세포와 같은 세포 배양 내 또는 대상체로부터의 생물학적 샘플 내 MYOC의 발현은, 예를 들어 bDNA 또는 TaqMan 검정에 의해 MYOC mRNA 수준을 측정함으로써, 또는 예를 들어 웨스턴 블롯팅 또는 유세포 계측 기술을 사용하여 예컨대 면역형광 분석에 의해 단백질 수준을 측정함으로써 검정될 수 있다.
dsRNA는 통상적으로 dsRNA가 사용될 조건 하에서 듀플렉스 구조를 형성하기 위해 혼성화하기에 충분히 상보적인 2개의 RNA 가닥을 포함한다. dsRNA의 하나의 가닥(안티센스 가닥)은 통상적으로 MYOC의 발현 동안 형성된 mRNA의 서열로부터 유래된 표적 서열에 실질적으로 상보적인, 및 일반적으로 완전히 상보적인 상보성 영역을 포함한다. 다른 가닥(센스 가닥)은 통상적으로 안티센스 가닥에 상보적인 영역을 포함하여, 2개의 가닥이 적합한 조건 하에서 조합되는 경우 혼성화하여 듀플렉스 구조를 형성한다. 일반적으로, 듀플렉스 구조는 15 내지 30개, 보다 일반적으로 18 내지 25개, 보다 더 일반적으로 19 내지 24개, 그리고 가장 일반적으로 19 내지 21개 염기쌍의 길이이다. 유사하게, 표적 서열에 대한 상보성 영역은 15 내지 30개, 보다 일반적으로 18 내지 25개, 보다 더 일반적으로 19 내지 24개, 그리고 가장 일반적으로 19 내지 21개 뉴클레오타이드 길이이다.
일부 구현예에서, dsRNA는 15 내지 20개 뉴클레오타이드 길이이고, 다른 구현예에서, dsRNA는 25 내지 30개 뉴클레오타이드 길이이다. 당업자가 인지하는 것과 같이, 절단을 위해 표적화된 RNA의 표적화된 영역은 가장 흔하게는 더 큰 RNA 분자, 종종 mRNA 분자의 일부일 것이다. 관련이 있는 경우, mRNA 표적의 "일부"는 RNAi-지시 절단(즉, RISC 경로를 통한 절단)을 위한 기질이 되기에 충분한 길이의 mRNA 표적의 연속 서열이다. 9개의 염기쌍만큼 짧은 듀플렉스를 갖는 dsRNA는 일부 상황에서 RNAi-지시된 RNA 절단을 매개할 수 있다. 가장 빈번하게, 표적은 적어도 15개 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어 15~30개 뉴클레오타이드 길이일 것이다.
당업자는 또한 듀플렉스 영역이 dsRNA의 일차 기능성 부분, 예를 들어, 9 내지 36개, 예를 들어, 15~30개 염기쌍의 듀플렉스 영역이라는 것을 인식할 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, 절단을 위한 바람직한 RNA를 표적으로 하는, 예를 들어, 15~30개 염기쌍의 기능성 듀플렉스로 처리되는 정도까지, 30개를 초과하는 염기쌍의 듀플렉스 영역을 갖는 RNA 분자 또는 RNA 분자의 복합체는 dsRNA이다. 따라서, 그 다음에 당업자는 일부 구현예에서, miRNA가 dsRNA임을 인지할 것이다. 일부 구현예에서, dsRNA는 자연 발생하는 miRNA가 아니다. 일부 구현예에서, MYOC 발현을 표적으로 하는 데 유용한 iRNA 제제는 더 큰 dsRNA의 절단에 의해 표적 세포 내에서 생성되지 않는다.
본원에 기술된 dsRNA는 하나 이상의 단일 가닥 뉴클레오타이드 오버행을 추가로 포함할 수 있다. dsRNA는 이하에서 추가로 논의되는 것과 같은 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예를 들어, Biosearch, Applied Biosystems, Inc.로부터 상업적으로 입수 가능한 것과 같은, 예를 들어, 자동화된 DNA 합성기의 사용에 의해 합성될 수 있다.
일부 구현예에서, MYOC는 인간 MYOC이다.
특정 구현예에서, dsRNA는 표 2a 또는 2b에 제공된 센스 서열로부터 선택된 센스 서열을 포함하거나 이로 이루어진 센스 가닥 및 표 2a 또는 2a에 제공된 안티센스 서열로부터 선택된 안티센스 서열을 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 가닥을 포함한다.
일부 양태에서, dsRNA는 적어도 센스 및 안티센스 뉴클레오타이드 서열을 포함할 것이며, 이에 의해 센스 가닥은 표 2a 또는 2b에 제공된 서열로부터 선택되고, 상응하는 안티센스 가닥은 표 2a 또는 2b에 제공된 서열로부터 선택된다.
이들 양태에서, 2개의 서열 중 하나는 2개의 서열 중 다른 하나에 상보적이고, 서열 중 하나는 MYOC의 발현에 의해 생성된 mRNA의 서열에 실질적으로 상보적이다. 이와 같이, dsRNA는 2개의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 것이고, 여기서 하나의 올리고뉴클레오타이드는 센스 가닥으로서 기술되고, 제2 올리고뉴클레오타이드는 상응하는 안티센스 가닥으로서 기술된다. 본원의 다른 곳에서 기술되고 당업계에 공지된 것과 같이, dsRNA의 상보적 서열은 별개의 올리고뉴클레오타이드 상에 존재하는 것과는 달리, 단일 핵산 분자의 자체-상보적 영역으로서 함유될 수도 있다.
당업자는 20 내지 23개, 그러나 특히 21개 염기쌍의 듀플렉스 구조를 갖는 dsRNA가 RNA 간섭을 유도하는 데 특히 효과적인 것으로 환영받고 있음을 잘 알고 있다(문헌참조: Elbashir 등, EMBO 2001, 20:6877~6888). 그러나, 다른 이들은 더 짧거나 더 긴 RNA 듀플렉스 구조 또한 효과적일 수 있음을 발견하였다.
전술된 구현예에서, 표 2a 및 2b에 제공된 올리고뉴클레오타이드 서열의 특성에 의해, 본원에 기술된 dsRNA는 최소 19개 뉴클레오타이드 길이의 적어도 하나의 가닥을 포함할 수 있다. 표 2a 및 2b의 서열에서 하나 또는 양 말단 상의 단지 몇 개의 뉴클레오타이드를 뺀 것을 갖는 더 짧은 듀플렉스가 전술한 dsRNA와 비교하여 유사하게 효과적일 수 있음을 합리적으로 예상할 수 있다.
일부 구현예에서, dsRNA는 표 2a 또는 2b의 서열 중 하나로부터 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 연속 뉴클레오타이드의 부분 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, dsRNA는 표 2a 또는 2b에 제공된 안티센스 서열의 적어도 15, 16, 17, 18, 또는 19개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 서열 및 표 2a 또는 2b에 제공된 상응하는 센스 서열의 적어도 15, 16, 17, 18, 또는 19개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 센스 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, dsRNA는 표 2a 또는 2b에 제공된 안티센스 서열의 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 서열 및 표 2a 또는 2b에 제공된 상응하는 센스 서열의 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 센스 서열을 포함한다.
일부 이러한 구현예에서, dsRNA는 표 2a 또는 2b에 제공된 서열의 일부분만을 포함하지만, 표 2a 또는 2b에 제공된 전장 서열을 포함하는 dsRNA와 마찬가지로 MYOC 발현의 수준을 억제하는 데 동등하게 효과적이다. 일부 구현예에서, dsRNA는 억제에서 본원에 개시된 전체 서열을 포함하는 dsRNA와 비교하여 MYOC의 발현 수준의 억제가 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50% 이하만큼 상이하다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 iRNA는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 일부 중 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 iRNA는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 상응하는 부분 중 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 또는 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 센스 가닥을 포함한다.
인간 MYOC mRNA는 본원에 제공된 서열번호 1의 서열을 가질 수 있다.
호모 사피엔스 미오실린(MYOC), mRNA
GAGCCAGCAAGGCCACCCATCCAGGCACCTCTCAGCACAGCAGAGCTTTCCAGAGGAAGCCTCACCAAGCCTCTGCAATGAGGTTCTTCTGTGCACGTTGCTGCAGCTTTGGGCCTGAGATGCCAGCTGTCCAGCTGCTGCTTCTGGCCTGCCTGGTGTGGGATGTGGGGGCCAGGACAGCTCAGCTCAGGAAGGCCAATGACCAGAGTGGCCGATGCCAGTATACCTTCAGTGTGGCCAGTCCCAATGAATCCAGCTGCCCAGAGCAGAGCCAGGCCATGTCAGTCATCCATAACTTACAGAGAGACAGCAGCACCCAACGCTTAGACCTGGAGGCCACCAAAGCTCGACTCAGCTCCCTGGAGAGCCTCCTCCACCAATTGACCTTGGACCAGGCTGCCAGGCCCCAGGAGACCCAGGAGGGGCTGCAGAGGGAGCTGGGCACCCTGAGGCGGGAGCGGGACCAGCTGGAAACCCAAACCAGAGAGTTGGAGACTGCCTACAGCAACCTCCTCCGAGACAAGTCAGTTCTGGAGGAAGAGAAGAAGCGACTAAGGCAAGAAAATGAGAATCTGGCCAGGAGGTTGGAAAGCAGCAGCCAGGAGGTAGCAAGGCTGAGAAGGGGCCAGTGTCCCCAGACCCGAGACACTGCTCGGGCTGTGCCACCAGGCTCCAGAGAAGTTTCTACGTGGAATTTGGACACTTTGGCCTTCCAGGAACTGAAGTCCGAGCTAACTGAAGTTCCTGCTTCCCGAATTTTGAAGGAGAGCCCATCTGGCTATCTCAGGAGTGGAGAGGGAGACACCGGATGTGGAGAACTAGTTTGGGTAGGAGAGCCTCTCACGCTGAGAACAGCAGAAACAATTACTGGCAAGTATGGTGTGTGGATGCGAGACCCCAAGCCCACCTACCCCTACACCCAGGAGACCACGTGGAGAATCGACACAGTTGGCACGGATGTCCGCCAGGTTTTTGAGTATGACCTCATCAGCCAGTTTATGCAGGGCTACCCTTCTAAGGTTCACATACTGCCTAGGCCACTGGAAAGCACGGGTGCTGTGGTGTACTCGGGGAGCCTCTATTTCCAGGGCGCTGAGTCCAGAACTGTCATAAGATATGAGCTGAATACCGAGACAGTGAAGGCTGAGAAGGAAATCCCTGGAGCTGGCTACCACGGACAGTTCCCGTATTCTTGGGGTGGCTACACGGACATTGACTTGGCTGTGGATGAAGCAGGCCTCTGGGTCATTTACAGCACCGATGAGGCCAAAGGTGCCATTGTCCTCTCCAAACTGAACCCAGAGAATCTGGAACTCGAACAAACCTGGGAGACAAACATCCGTAAGCAGTCAGTCGCCAATGCCTTCATCATCTGTGGCACCTTGTACACCGTCAGCAGCTACACCTCAGCAGATGCTACCGTCAACTTTGCTTATGACACAGGCACAGGTATCAGCAAGACCCTGACCATCCCATTCAAGAACCGCTATAAGTACAGCAGCATGATTGACTACAACCCCCTGGAGAAGAAGCTCTTTGCCTGGGACAACTTGAACATGGTCACTTATGACATCAAGCTCTCCAAGATGTGAAAAGCCTCCAAGCTGTACAGGCAATGGCAGAAGGAGATGCTCAGGGCTCCTGGGGGGAGCAGGCTGAAGGGAGAGCCAGCCAGCCAGGGCCCAGGCAGCTTTGACTGCTTTCCAAGTTTTCATTAATCCAGAAGGATGAACATGGTCACCATCTAACTATTCAGGAATTGTAGTCTGAGGGCGTAGACAATTTCATATAATAAATATCCTTTATCTTCTGTCAGCATTTATGGGATGTTTAATGACATAGTTCAAGTTTTCTTGTGATTTGGGGCAAAAGCTGTAAGGCATAATAGTTTCTTCCTGAAAACCATTGCTCTTGCATGTTACATGGTTACCACAAGCCACAATAAAAAGCATAACTTCTAAAGGAAGCAGAATAGCTCCTCTGGCCAGCATCGAATATAAGTAAGATGCATTTACTACAGTTGGCTTCTAATGCTTCAGATAGAATACAGTTGGGTCTCACATAACCCTTTACATTGTGAAATAAAATTTTCTTACCCAA (서열번호 1)
서열번호 1의 역상보체는 본원에서 서열번호 2로서 제공된다:
TTGGGTAAGAAAATTTTATTTCACAATGTAAAGGGTTATGTGAGACCCAACTGTATTCTATCTGAAGCATTAGAAGCCAACTGTAGTAAATGCATCTTACTTATATTCGATGCTGGCCAGAGGAGCTATTCTGCTTCCTTTAGAAGTTATGCTTTTTATTGTGGCTTGTGGTAACCATGTAACATGCAAGAGCAATGGTTTTCAGGAAGAAACTATTATGCCTTACAGCTTTTGCCCCAAATCACAAGAAAACTTGAACTATGTCATTAAACATCCCATAAATGCTGACAGAAGATAAAGGATATTTATTATATGAAATTGTCTACGCCCTCAGACTACAATTCCTGAATAGTTAGATGGTGACCATGTTCATCCTTCTGGATTAATGAAAACTTGGAAAGCAGTCAAAGCTGCCTGGGCCCTGGCTGGCTGGCTCTCCCTTCAGCCTGCTCCCCCCAGGAGCCCTGAGCATCTCCTTCTGCCATTGCCTGTACAGCTTGGAGGCTTTTCACATCTTGGAGAGCTTGATGTCATAAGTGACCATGTTCAAGTTGTCCCAGGCAAAGAGCTTCTTCTCCAGGGGGTTGTAGTCAATCATGCTGCTGTACTTATAGCGGTTCTTGAATGGGATGGTCAGGGTCTTGCTGATACCTGTGCCTGTGTCATAAGCAAAGTTGACGGTAGCATCTGCTGAGGTGTAGCTGCTGACGGTGTACAAGGTGCCACAGATGATGAAGGCATTGGCGACTGACTGCTTACGGATGTTTGTCTCCCAGGTTTGTTCGAGTTCCAGATTCTCTGGGTTCAGTTTGGAGAGGACAATGGCACCTTTGGCCTCATCGGTGCTGTAAATGACCCAGAGGCCTGCTTCATCCACAGCCAAGTCAATGTCCGTGTAGCCACCCCAAGAATACGGGAACTGTCCGTGGTAGCCAGCTCCAGGGATTTCCTTCTCAGCCTTCACTGTCTCGGTATTCAGCTCATATCTTATGACAGTTCTGGACTCAGCGCCCTGGAAATAGAGGCTCCCCGAGTACACCACAGCACCCGTGCTTTCCAGTGGCCTAGGCAGTATGTGAACCTTAGAAGGGTAGCCCTGCATAAACTGGCTGATGAGGTCATACTCAAAAACCTGGCGGACATCCGTGCCAACTGTGTCGATTCTCCACGTGGTCTCCTGGGTGTAGGGGTAGGTGGGCTTGGGGTCTCGCATCCACACACCATACTTGCCAGTAATTGTTTCTGCTGTTCTCAGCGTGAGAGGCTCTCCTACCCAAACTAGTTCTCCACATCCGGTGTCTCCCTCTCCACTCCTGAGATAGCCAGATGGGCTCTCCTTCAAAATTCGGGAAGCAGGAACTTCAGTTAGCTCGGACTTCAGTTCCTGGAAGGCCAAAGTGTCCAAATTCCACGTAGAAACTTCTCTGGAGCCTGGTGGCACAGCCCGAGCAGTGTCTCGGGTCTGGGGACACTGGCCCCTTCTCAGCCTTGCTACCTCCTGGCTGCTGCTTTCCAACCTCCTGGCCAGATTCTCATTTTCTTGCCTTAGTCGCTTCTTCTCTTCCTCCAGAACTGACTTGTCTCGGAGGAGGTTGCTGTAGGCAGTCTCCAACTCTCTGGTTTGGGTTTCCAGCTGGTCCCGCTCCCGCCTCAGGGTGCCCAGCTCCCTCTGCAGCCCCTCCTGGGTCTCCTGGGGCCTGGCAGCCTGGTCCAAGGTCAATTGGTGGAGGAGGCTCTCCAGGGAGCTGAGTCGAGCTTTGGTGGCCTCCAGGTCTAAGCGTTGGGTGCTGCTGTCTCTCTGTAAGTTATGGATGACTGACATGGCCTGGCTCTGCTCTGGGCAGCTGGATTCATTGGGACTGGCCACACTGAAGGTATACTGGCATCGGCCACTCTGGTCATTGGCCTTCCTGAGCTGAGCTGTCCTGGCCCCCACATCCCACACCAGGCAGGCCAGAAGCAGCAGCTGGACAGCTGGCATCTCAGGCCCAAAGCTGCAGCAACGTGCACAGAAGAACCTCATTGCAGAGGCTTGGTGAGGCTTCCTCTGGAAAGCTCTGCTGTGCTGAGAGGTGCCTGGATGGGTGGCCTTGCTGGCTC (서열번호 2)
일부 구현예에서, 본원에 기술된 iRNA는 표 2a 및 2b에 제공된 서열 중 하나로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 선택적으로 MYOC에서 선택된 서열에 인접한 영역으로부터 취해진 추가 뉴클레오타이드 서열에 결합될 수 있다.
표적 서열은 일반적으로 길이가 15~30개 뉴클레오타이드이지만, 임의의 주어진 표적 RNA의 절단을 유도하기 위한 이러한 범위의 특정 서열의 적합성에는 폭넓은 변화가 있다. 본원에 제시된 다양한 소프트웨어 패키지 및 지침은 임의의 주어진 유전자 표적에 대한 최적의 표적 서열의 식별을 위한 지침을 제공하지만, 주어진 크기(비제한적인 예로서, 21개의 뉴클레오타이드)의 "윈도우" 또는 "마스크"가 문자 그대로 또는 비유적으로(예를 들어, 인실리코를 포함하여) 표적 RNA 서열 상에 배치되어 표적 서열로서 기능할 수 있는 크기 범위의 서열을 식별하는 경험적 접근법이 취해질 수도 있다. 점진적으로 하나의 뉴클레오타이드를 초기 표적 서열 위치의 상류 또는 하류로 서열 "윈도우"를 이동시킴으로써, 선택된 임의의 주어진 표적 크기에 대해 가능한 서열의 완전한 세트가 식별될 때까지 다음 잠재적 표적 서열이 식별될 수 있다. 최적으로 수행되는 서열을 식별하기 위한, (본원에 기술되거나 당업계에 공지된 검정을 사용하여) 식별된 서열의 체계적인 합성 및 시험과 결합된 이러한 과정은 iRNA 제제로 표적화될 때 표적 유전자 발현의 최상의 억제를 매개하는 RNA 서열을 식별할 수 있다. 따라서, 억제 효율의 추가적인 최적화는 동일하거나 더 양호한 억제 특성을 갖는 서열을 식별하기 위해 주어진 서열의 하나의 뉴클레오타이드 상류 또는 하류를 점진적으로 "윈도우를 걷는 것(walking the window)"에 의해 달성될 수 있는 것으로 고려된다.
또한, 예를 들어, 표 2a 및 2b에서 식별된 임의의 서열에 대해, 뉴클레오타이드를 체계적으로 추가하거나 제거하여 더 길거나 더 짧은 서열을 생성하고, 이들 서열 및 해당 지점으로부터 표적 RNA의 더 길거나 더 짧은 크기의 윈도우를 상하로 걸음으로써 생성된 서열을 시험함으로써, 추가적인 최적화가 달성될 수 있는 것으로 고려된다. 다시 말해, 새로운 후보 표적을 생성하기 위한 이러한 접근법을 당업계에 공지되거나 본원에 기술된 억제 검정에서 이들 표적 서열에 기초하여 iRNA의 효과를 시험하는 것과 결합하면 억제 효율의 추가적인 개선으로 이어질 수 있다. 또한, 이러한 최적화된 서열은, 예를 들어, 본원에 기술된 것과 같거나 당업계에 공지된 것과 같은 변형 뉴클레오타이드의 도입, 오버행의 추가 또는 변화, 또는 발현 억제제로서의 분자를 추가적으로 최적화(예를 들어, 혈청 안정성 또는 순환 반감기의 증가, 열 안정성의 증가, 막관통 전달의 향상, 특정 위치 또는 세포 유형의 표적화, 침묵 경로 효소와의 상호작용의 증가, 엔도솜으로부터의 방출의 증가, 등)시키는 당업계에 공지되어 있고/있거나 본원에서 논의된 것과 같은 다른 변형에 의해 조정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 비변형되거나 미접합된 표 2b의 iRNA를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 RNAi 제제는 표 2a에 제공된 뉴클레오타이드 서열을 갖지만, 표에서 보여진 리간드 또는 모이어티가 하나 이상 결여되어 있다. 리간드 또는 모이어티(예를 들어, 친유성 리간드 또는 모이어티)는 본 출원에서 제공된 임의의 위치에 포함될 수 있다.
본원에 기술된 iRNA는 표적 서열에 대한 하나 이상의 미스매치를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 iRNA는 3개 이하의 미스매치를 함유한다. 일부 구현예에서, iRNA의 안티센스 가닥이 표적 서열에 대한 미스매치를 함유하는 경우, 미스매치 영역은 상보성 영역의 중심에 위치하지 않는다. 일부 구현예에서, iRNA의 안티센스 가닥이 표적 서열에 대한 미스매치를 함유하는 경우, 미스매치는 상보성 영역의 5' 또는 3' 말단으로부터 마지막 5개 뉴클레오타이드 내에 존재하는 것으로 제한된다. 예를 들어, 23개 뉴클레오타이드 iRNA 제제의 MYOC의 영역에 상보적인 RNA 가닥의 경우, RNA 가닥은 일반적으로 중앙 13개 뉴클레오타이드 내에 임의의 미스매치를 함유하지 않는다. 본원에 기술된 방법 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 표적 서열에 대한 미스매치를 함유하는 iRNA가 MYOC의 발현을 억제하는 데 효과적인지를 결정할 수 있다. MYOC의 발현을 억제하는 데 있어서 미스매치를 갖는 iRNA의 효능을 고려하는 것이 중요하며, MYOC 유전자 내 특정 상보성 영역이 집단 내 다형성 서열 변화를 갖는 것으로 알려진 경우 특히 그러하다.
일부 구현예에서, dsRNA의 적어도 하나의 말단은 1개 내지 4개, 일반적으로 1개 또는 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 뉴클레오타이드 오버행을 갖는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 오버행을 갖는 dsRNA는 이들의 둔화 말단 대응체에 비해 우수한 억제 특성을 갖는다. 일부 구현예에서, iRNA의 RNA(예를 들어, dsRNA)는 안정성 또는 다른 이로운 특징을 증진하도록 화학적으로 변형된다. 본 개시내용에서 특징화된 핵산은 당업계에서 잘 확립된 방법, 예컨대 본원에 참조로 통합된, 문헌["Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. 등(Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA]에 기술된 것과 같은 방법들에 의해 합성되거나 변형될 수 있다. 변형은, 예를 들어, (a) 말단 변형, 예를 들어, 5' 말단 변형(인산화, 접합, 역위 결합 등) 3' 말단 변형(접합, DNA 뉴클레오타이드, 역위 결합, 등), (b) 염기 변형, 예를 들어, 안정화 염기, 불안정화 염기, 또는 파트너의 확장된 레퍼토리와 염기쌍을 형성하는 염기와의 대체, 염기(무염기 뉴클레오타이드), 또는 접합된 염기의 제거, (c) 당 변형(예를 들어, 2' 위치 또는 4' 위치에서 또는 비환형 당을 가짐) 또는 당의 대체, 및 (d) 포스포디에스테르 결합의 변형 또는 대체를 포함하는 골격 변형을 포함한다. 본 개시내용에 유용한 RNA 화합물의 특정 예는 변형된 골격을 함유하거나 어떠한 천연 뉴클레오타이드 간 결합을 함유하지 않는 RNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 변형된 골격을 갖는 RNA는 무엇보다 골격 내 인 원자를 갖지 않는 것들을 포함한다. 본 명세서의 목적을 위해서 그리고 당업계에서 때로 언급되는 것과 같이, 이들의 뉴클레오사이드 간 골격 내 인 원자를 갖지 않는 변형된 RNA는 또한 올리고뉴클레오타이드인 것으로 고려될 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 RNA는 이의 뉴클레오사이드 간 골격 내 인 원자를 가질 것이다,
변형된 RNA 골격은, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트를 포함하는 포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 결합을 갖는 보라노포스페이트, 이들 중 2'-5'-결합 유사체, 및 인접한 뉴클레오사이드 단위의 쌍이 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'로 결합되는 역극성을 갖는 것들을 포함한다. 다양한 염, 혼합 염 및 유리산 형태가 또한 포함된다.
전술한 인-함유 결합의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 번호 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,195호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,316호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 제5,625,050호; 제6,028,188호; 제6,124,445호; 제6,160,109호; 제6,169,170호; 제6,172,209호; 제6, 239,265호; 제6,277,603호; 제6,326,199호; 제6,346,614호; 제6,444,423호; 제6,531,590호; 제6,534,639호; 제6,608,035호; 제6,683,167호; 제6,858,715호; 제6,867,294호; 제6,878,805호; 제7,015,315호; 제7,041,816호; 제7,273,933호; 제7,321,029호; 및 미국 특허번호 RE39464호를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이의 각각이 본원에 참조로서 통합된다.
그 안에 인 원자를 포함하지 않는 변형 RNA 골격은 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드 간 결합, 혼합 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드 간 결합, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오사이드 간 결합에 의해 형성된 골격을 갖는다. 이들은 (부분적으로 뉴클레오사이드의 당 부분으로부터 형성된) 모르폴리노 결합; 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 아미드 골격을 갖는 것들; 및 혼합 N, O, S, 및 CH2 성분 부분을 갖는 기타를 포함한다.
앞서 말한 올리고뉴클레오사이드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허번호 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,64,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 및 제5,677,439호를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이의 각각이 본원에 참조로서 통합된다.
iRNA에 적합하거나 사용하기 위해 고려되는 다른 RNA 모사체에서, 뉴클레오타이드 단위의 당 및 뉴클레오사이드 간 결합, 즉, 골격 둘 모두가 신규 기로 대체된다. 염기 단위는 적당한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 우수한 혼성화 성질을 갖는 것으로 나타난 RNA 모사체인 하나의 그러한 올리고머 화합물은 펩타이드 핵산(PNA)으로서 지칭된다. PNA 화합물에서, RNA의 당 골격은 아미드 함유 골격, 특히 아미노에틸글리신 골격과 대체된다. 핵염기는 보유되고 직접적으로 또는 간접적으로 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허번호 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이의 각각이 본원에 참조로서 통합된다. PNA 화합물의 추가 교시는, 예를 들어, 문헌[Nielsen 등, Science, 1991, 254, 1497~1500]에서 확인할 수 있다.
본 개시내용에서 특징화된 일부 구현예는 포스포로티오에이트 골격을 갖는 RNA 및 헤테로원자 골격을 갖는 올리고뉴클레오사이드, 그리고 특히 위에서 참조된 미국 특허번호 제5,489,677호의 --CH2--NH--CH2--, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 골격으로 공지됨], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- 및 --N(CH3)--CH2--CH2--[여기서 천연 포스포디에스테르 골격은 --O--P--O--CH2--로 표시됨], 및 위에서 참조된 미국 특허번호 제5,602,240호의 아미드 골격을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 특징화된 RNA는 위에서 참조된 미국 특허번호 제5,034,506호의 모르폴리노 골격 구조를 갖는다.
변형 RNA는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수 있다. 본원에서 특징화된 iRNA, 예를 들어, dsRNA는 2' 위치에서 다음 중 하나를 포함할 수 있다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬로, 여기서 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 치환되지 않은 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 예시적인 적합한 변형은 O[(CH2)nO] mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2) nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2를 포함하고, 여기서, n 및 m은 1 내지 약 10이다. 다른 구현예에서, dsRNA는 2' 위치에서 다음 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 기, 리포터 기, 삽입제, iRNA의 약동학 성질을 개선시키기 위한 기, 또는 iRNA의 약력학 성질을 개선시키기 위한 기, 및 유사한 성질을 갖는 기타 치환체. 일부 구현예에서, 변형은 2'-메톡시에톡시(2'-O--CH2CH2OCH3, 또한 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로 공지됨)(문헌참조: Martin 등, Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486~504), 즉, 알콕시-알콕시 기를 포함한다. 또 다른 예시적인 변형은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, 2'-DMAOE로도 공지된 O(CH2)2ON(CH3)2 기, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시(당업계에 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로도 공지됨), 즉, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2이다.
다른 구현예에서, iRNA 제제는 하나 이상(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상)의 비환형 뉴클레오타이드(또는 뉴클레오사이드)를 포함한다. 특정 구현예에서, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥, 또는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 모두는 가닥 당 5개 미만의 비환형 뉴클레오타이드(예를 들어, 가닥 당 4개, 3개, 2개 또는 1개의 비환형 뉴클레오타이드)를 포함한다. 하나 이상의 비환형 뉴클레오타이드는, 예를 들어, 센스 또는 안티센스 가닥, 또는 두 가닥 모두의 이중 가닥 영역에서; iRNA 제제의 센스 또는 안티센스 가닥, 또는 두 가닥 모두의 5'-말단에서, 3'-말단에서, 5' 및 3'-말단 모두에서 발견될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 비환형 뉴클레오타이드는 센스 또는 안티센스 가닥, 또는 둘 모두의 위치 1 내지 8에 존재한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 비환형 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 4 내지 10(예를 들어, 위치 6~8)에서 안티센스 가닥에서 발견된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 비환형 뉴클레오타이드는 iRNA 제제의 하나 또는 둘 모두의 3'-말단 오버행에서 발견된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "비환형 뉴클레오타이드" 또는 "비환형 뉴클레오사이드"는 비환형 당, 예를 들어 비환형 리보오스를 갖는 임의의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드를 지칭한다. 예시적인 비환형 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드는 핵염기, 예를 들어, 자연 발생 또는 변형된 핵염기(예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은 핵염기)를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 임의의 리보오스 탄소(C1, C2, C3, C4, 또는 C5) 사이의 결합은 독립적으로 또는 조합되어 뉴클레오타이드에 부재한다. 일부 구현예에서, 리보오스 고리의 C2-C3 탄소 사이의 결합은 부재하며, 예를 들어, 비환형 2'-3'-세코-뉴클레오타이드 단량체이다. 다른 구현예에서, C1-C2, C3-C4, 또는 C4-C5 사이의 결합은 부재한다(예를 들어, 1'-2', 3'-4', 또는 4'-5'-세코 뉴클레오타이드 단량체). 예시적인 비환형 뉴클레오타이드는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 미국 특허번호 제8,314,227호에 개시되어 있다. 예를 들어, 비환형 뉴클레오타이드는 미국 특허번호 제8,314,227호의 도 1~도 2의 단량체 D~J 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비환형 뉴클레오타이드는 다음의 단량체를 포함한다:
여기서 염기는 핵염기, 예를 들어, 자연 발생 또는 변형된 핵염기(예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은 핵염기)이다.
특정 구현예에서, 비환형 뉴클레오타이드는, 예를 들어, 비환형 뉴클레오타이드를 다른 모이어티, 예를 들어 리간드(예를 들어, GalNAc, 콜레스테롤 리간드), 알킬, 폴리아민, 당, 폴리펩티드 등에 결합시킴으로써 변형되거나 유도체화될 수 있다.
다른 구현예에서, iRNA 제제는 하나 이상의 비환형 뉴클레오타이드 및 하나 이상의 LNA(예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은 LNA)를 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 비환형 뉴클레오타이드 및/또는 하나 이상의 LNA는 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 둘 모두에 존재할 수 있다. 하나의 가닥 내 비환형 뉴클레오타이드의 수는 대향하는 가닥 내 LNA의 수와 동일하거나 상이할 수 있다. 특정 구현예에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 이중 가닥 영역 또는 3'-오버행에 위치한 5개 미만의 LNA(예를 들어, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 LNA)를 포함한다. 다른 구현예에서, 1개 또는 2개의 LNA는 이중 가닥 영역 또는 센스 가닥의 3'-오버행에 위치한다. 대안적으로 또는 조합하여, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 이중 가닥 영역 또는 3'-오버행에 5개 미만의 비환형 뉴클레오타이드(예를 들어, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 비환형 뉴클레오타이드)를 포함한다. 일부 구현예에서, iRNA 제제의 센스 가닥은 센스 가닥의 3'-오버행에 1개 또는 2개의 LNA, 및 iRNA 제제의 안티센스 가닥의 이중 가닥 영역에 (예를 들어, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 4 내지 10(예를 들어, 위치 6~8)에) 1개 또는 2개의 비환형 뉴클레오타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, (단독으로 또는 하나 이상의 LNA에 더하여) 하나 이상의 비환형 뉴클레오타이드를 iRNA 제제에 포함시키면: (i) 표적 외 효과의 감소; (ii) RNAi 내 패신저 가닥 참여의 감소; (iii) 가이드 가닥의 표적 mRNA에 대한 특이성의 증가; (iv) 마이크로RNA 표적 외 효과의 감소; (v) 안정성 증가; 또는 (vi) iRNA 분자의 분해에 대한 내성 증가 중 하나 이상(또는 전부)을 초래한다.
기타 변형은 2'-메톡시(2'-OCH3), 2'-5 아미노프로폭시(2'-OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. 유사한 변형은 또한 iRNA의 RNA 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오타이드 상 또는 2'-5' 결합된 dsRNA의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오타이드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다. iRNA는 또한 펜토푸라노실 당 대신에 시클로부틸 모이어티와 같은 당 모사체를 가질 수 있다. 이러한 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허번호 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 및 제5,700,920호를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이중 일부는 본 출원과 함께 일반적으로 소유되며, 이의 각각이 본원에 참조로서 통합된다.
iRNA는 또한 핵염기(종종 당업계에서 단순히 "염기"로 지칭) 변형 또는 치환을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "미변형" 또는 "천연" 핵염기는 퓨린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 변형 핵염기는 다른 합성 및 천연 핵염기, 예컨대 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 아날 기타 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-다아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다.
추가적인 핵염기는 미국 특허번호 제3,687,808호에 개시된 것들, 문헌[Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008]에 개시된 것들; 문헌[The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 페이지 858~859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990]에 개시된 것들, 문헌[Englisch 등 Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613]에 의해 개시된 것들, 및 문헌[Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, 페이지 289~302, Crooke, S. T. 및 Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993]에 의해 개시된 것들을 포함한다. 이들 핵염기 중 일부는 특히 본 개시내용에서 특징화된 올리고머 화합물의 결합 친화도를 증가시키는 데 유용하다. 이들은 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는 5-치환 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 0-6 치환 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 듀플렉스 안정성을 0.6~1.2°C 증가시키는 것으로 나타났으며(문헌참조: Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. 및 Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276~278), 특히 더 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합될 때, 예시적인 염기 치환이다.
전술한 변형 핵염기뿐만 아니라 다른 변형 핵염기의 특정 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 전술된 미국 특허번호 제3,687,808호뿐만 아니라, 미국 특허번호 제4,845,205호; 제5,130,30호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,594,121호, 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,681,941호; 제6,015,886호; 제6,147,200호; 제6,166,197호; 제6,222,025호; 제6,235,887호; 제6,380,368호; 제6,528,640호; 제6,639,062호; 제6,617,438호; 제7,045,610호; 제7,427,672호; 및 제7,495,088호를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이의 각각은 본원에 참조로서 통합되고, 미국 특허번호 제5,750,692호 또한 본원에 참조로서 통합된다.
iRNA의 RNA는 또한 하나 이상의(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의) 이환식 당 모이어티를 포함하도록 변형될 수 있다. "이환식 당"은 2개 원자의 가교에 의해 변형된 푸라노실 고리이다. "이환식 뉴클레오사이드"("BNA")는 당 고리의 2개의 탄소 원자를 연결하여 이환식 고리 시스템을 형성하는 가교를 포함하는 당 모이어티를 갖는 뉴클레오사이드이다. 특정 구현예에서, 가교는 당 고리의 4'-탄소와 2'-탄소를 연결한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 제제는 하나 이상의 잠김 핵산(LNA)(본원에서 "잠김 뉴클레오타이드"로도 지칭됨)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 잠김 핵산은 변형 리보오스 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드이고, 여기서 리보오스 모이어티는, 예를 들어, 2'와 4' 탄소를 연결하는 여분의 가교를 포함한다. 해당 구조는 3'-엔도 구조 형태에서 리보오스를 효과적으로 "잠근다". siRNA에 잠김 핵산을 추가하는 것이 혈청의 siRNA 안정성을 증가시키고, 열 안정성을 증가시키며, 표적 외 효과를 감소시키는 것으로 나타났다(문헌참조: Elmen, J. 등(2005) Nucleic Acids Research 33(1):439~447; Mook, OR. 등(2007) Mol Canc Ther 6(3):833~843; Grunweller, A. 등(2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185~3193).
본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드에 사용하기 위한 이환식 뉴클레오사이드의 예는 4'와 2' 리보실 고리 원자 사이 가교를 포함하는 뉴클레오사이드를 비제한적으로 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 안티센스 폴리뉴클레오타이드 제제는 4'에서 2'로의 가교를 포함하는 하나 이상의 이환식 뉴클레오사이드를 포함한다. 이러한 4'에서 2'로 가교된 이환식 뉴클레오사이드의 예는 4'-(CH2)―O-2'(LNA); 4'-(CH2)―S-2'; 4'-(CH2)2―O-2'(ENA); 4'-CH(CH3)―O-2'("구속된 에틸" 또는 "cEt"로도 지칭됨) 및 4'-CH(CH2OCH3)―O-2'(및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허번호 제7,399,845호를 참조함); 4'-C(CH3)(CH3)―O-2'(및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허번호 제8,278,283호를 참조함); 4'-CH2―N(OCH3)-2'(및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허번호 제8,278,425호를 참조함); 4'-CH2―O―N(CH3)-2'(예를 들어, 미국 특허 공개번호 제2004/0171570호를 참조함); R은 H, C1-C12 알킬, 또는 보호기인, 4'-CH2―N(R)―O-2'(예를 들어, 미국 특허번호 제7,427,672호를 참조함); 4'-CH2―C(H)(CH3)-2'(예를 들어, 문헌[Chattopadhyaya 등 J. Org. Chem., 2009, 74, 118~134]을 참조함); 및 4'-CH2－C(〓CH2)-2'(및 이의 유사체; 미국 특허번호 제8,278,426호를 참조함)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 전술한 문헌의 각각의 내용이 본원에 제공된 방법에 대한 참조로서 본원에 통합된다. 잠김 핵산의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음: 미국 특허번호 제6,268,490호; 제6,670,461호; 제6,794,499호; 제6,998,484호; 제7,053,207호; 제7,084,125호; 제7,399,845호, 및 제8,314,227호를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이의 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 예시적인 LNA는 2', 4'-C 메틸렌 바이시클로 뉴클레오타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다(예를 들어, Wengel 등의 국제 PCT 5 공개번호 WO 00/66604 및 WO 99/14226을 참조함).
예를 들어 α-L-리보푸라노스 및 β-D-리보푸라노스를 포함하는 하나 이상의 입체화학적 당 구성을 갖는 임의의 전술한 이환식 뉴클레오사이드를 제조할 수 있다(WO 99/14226을 참조함).
본 개시내용의 RNAi 제제는 또한 하나 이상의 구속된 에틸 뉴클레오타이드를 포함하도록 변형될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "구속된 에틸 뉴클레오타이드" 또는 "cEt"는 4'-CH(CH3)-O-2' 가교를 포함하는 이환식 당 모이어티를 포함하는 잠김 핵산이다. 일부 구현예에서, 구속된 에틸 뉴클레오타이드는 본원에서 "S-cEt"로 지칭되는 S 형태로 존재한다.
본 개시내용의 RNAi 제제는 또한 하나 이상의 "형태적으로 제한된 뉴클레오타이드"("CRN")를 포함할 수 있다. CRN은 리보오스의 C2'와 C4' 탄소 또는 리보오스의 C3'와 -C5' 탄소를 연결하는 링커를 갖는 뉴클레오타이드 유사체이다. CRN은 리보오스 고리를 안정한 형태로 잠그고 mRNA에 대한 혼성화 친화도를 증가시킨다. 링커는 안정성과 친화도를 위한 최적의 위치에 산소를 배치하여 리보오스 고리 퍼커링을 감소시키기에 충분한 길이이다.
전술된 CRN의 특정 제조를 교시하는 대표적인 공개 공보는 미국 공개번호 제2013/0190383호; 및 WO 2013/036868을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 이들 각각의 내용이 본원에 제공된 방법에 대한 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 RNAi 제제는 UNA(잠김 해제된 핵산) 뉴클레오타이드인 하나 이상의 단량체를 포함한다. UNA는 잠김 해제된 비환형 핵산이고, 여기서 당의 임의의 결합이 제거되어 잠김 해제된 "당" 잔기를 형성한다. 일례에서, UNA는 또한 C1'-C4' 사이의 결합(즉, C1'과 C4' 탄소 사이의 공유 탄소-산소-탄소 결합)이 제거된 단량체를 포괄한다. 또 다른 예에서, 당의 C2'-C3' 결합(즉, C2'와 C3' 탄소 사이의 공유 탄소-탄소 결합)이 제거되었다(문헌[Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133~134(2008)] 및 문헌[Fluiter 등, Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039] 참조함).
UNA의 제조를 교시하는 대표적인 미국 공개 공보는 미국 특허번호 제8,314,227호; 및 미국 특허 공개번호 제2013/0096289호; 제2013/0011922호; 및 제2011/0313020호를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이의 각각의 내용이 본원에 제공된 방법에 대한 참조로서 본원에 통합된다.
다른 구현예에서, iRNA 제제는 하나 이상(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상)의 G-클램프 뉴클레오타이드를 포함한다. G-클램프 뉴클레오타이드는 변형된 시토신 유사체로, 여기서 변형은 듀플렉스 내에서 상보적인 구아닌의 왓슨-크릭 및 후그슈타인 면 모두를 수소 결합하는 능력을 부여하며, 예를 들어 문헌[Lin 및 Matteucci, 1998, J. Am. Chem. Soc., 120, 8531~8532]을 참조한다. 올리고뉴클레오타이드 내의 단일 G-클램프 유사체 치환은 상보적인 올리고뉴클레오타이드에 혼성화될 때 실질적으로 향상된 나선형 열 안정성 및 미스매치 구별을 초래할 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드를 iRNA 분자에 포함시키면 핵산 표적, 상보적 서열, 또는 템플릿 가닥에 대한 친화도 및 특이성이 향상될 수 있다.
RNA 분자의 말단에 대한 잠재적인 안정화 변형은 N-(아세틸아미노카프로일)-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-C6-NHAc), N-(카프로일-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-C6), N-(아세틸-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-NHAc), 티미딘-2'-O-데옥시티미딘(에테르), N-(아미노카프로일)-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-C6-아미노), 2-도코사노일-우리딘-3"-포스페이트, 역염기 dT(idT) 등을 포함할 수 있다. 해당 변형의 개시내용은 PCT 공개번호 WO 2011/005861에서 확인할 수 있다.
본 개시내용의 RNAi 제제의 기타 변형은 RNAi 제제의 안티센스 가닥 상의 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모사체, 예를 들어, 5'-말단 포스페이트 또는 포스페이트 모사체를 포함한다. 적합한 포스페이트 모사체는 예를 들어, 미국 공개번호 제2012/0157511호에 개시되어 있고, 이의 내용은 본원에 제공된 방법에 대한 참조로서 본원에 통합된다. 일 구현예에서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥의 5' 뉴클레오타이드에 5'-포스페이트 또는 5'-포스페이트 모사체를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥의 5' 뉴클레오타이드에 5'-포스페이트 모사체를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 5'-포스페이트 모사체는 5'-비닐 포스포네이트(5'-VP)이다. 일 구현예에서, 포스페이트 모사체는 5'-사이클로프로필 포스포네이트(VP)이다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 iRNA 제제의 안티센스 가닥의 5'-말단은 5'-비닐 포스포네이트(VP)를 함유하지 않는다.
일 구현예에서, 변형 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 데옥시-뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 변형 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오타이드, 글리콜 변형 뉴클레오타이드(GNA), 예를 들어 Ggn, Cgn, Tgn, 또는 Agn, 2' 포스페이트를 갖는 뉴클레오타이드, 예를 들어 G2p, C2p, A2p 또는 U2p 및 비닐-포스포네이트 뉴클레오타이드; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 표 5 및 6의 듀플렉스 각각은 본 개시내용의 또 다른 이중 가닥 iRNA 제제를 제공하도록 특히 변형될 수 있다. 일례에서, 각각의 센스 듀플렉스의 3'-말단은 3'-말단 L96 리간드를 제거하고 3개의 3'-말단 뉴클레오타이드 사이의 2개의 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 간 결합을 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합과 교환함으로써 변형될 수 있다. 즉, 다음 식의 센스 서열의 3개의 3'-말단 뉴클레오타이드(N)는:
5'-N1-… -Nn-2Nn-1NnL96 3'
다음으로 대체될 수 있다
5'-N1-… -Nn-2sNn-1sNn 3'.
RNA 표적은 표적 RNA의 뉴클레오타이드 서열의 영역 또는 범위를 가질 수 있으며, 이는 RNAi 제제가 해당 영역에 결합함으로써 유도된 RNA 간섭을 통해 RNA 표적의 절단을 매개하는 데 RNA 표적의 다른 영역보다 상대적으로 더 민감하거나 순응적이다. 이러한 "핫스팟 영역"(또는 단순히 "핫스팟") 내에서의 RNA 간섭에 대한 증가된 감수성은 영역을 표적으로 하는 iRNA 제제가 표적 RNA의 다른 영역을 표적으로 하는 iRNA 제제보다 iRNA 간섭을 유도하는 데 더 높은 효능을 가질 가능성이 있음을 의미한다. 예를 들어, 이론에 얽매이지 않고, 표적 RNA의 표적 영역의 접근성은 해당 영역을 표적으로 하는 iRNA 제제의 효능에 영향을 미칠 수 있으며, 일부 핫스팟 영역은 접근성이 증가된다. 예를 들어, RNA 표적에 (예를 들어, 핫스팟 영역 내에 또는 이에 근접하여) 형성되는 이차 구조는 표적 영역에 결합하고 RNA 간섭을 유도하는 iRNA 제제의 능력에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명의 특정 양태에 따르면, iRNA 제제는 표적 RNA의 임의의 식별된 부분(예를 들어, 특정 엑손)을 포함하여, 본원에 기술된 표적 RNA 중 어느 하나의 핫스팟 영역을 표적으로 하도록 설계될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 핫스팟 영역은 RNAi 제제를 사용한 표적화가 동일한 표적 RNA의 다른 영역의 표적화에 비해 관찰 가능한 더 높은 효과적인 침묵의 가능성을 제공하는 표적 RNA 서열의 대략 19~200, 19~150, 19~100, 19~75, 19~50, 21~200, 21~150, 21~100, 21~75, 21~50, 50~200, 50~150, 50~100, 50~75, 75~200, 75~150, 75~100, 100~200, 또는 100~150개의 뉴클레오타이드 영역을 지칭할 수 있다. 본 발명의 특정 양태에 따르면, 핫스팟 영역은 표적 RNA의 제한된 영역, 및 일부 경우에, 예를 들어 표적 RNA 길이의 절반 미만, 예컨대 표적 RNA 길이의 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 또는 30%를 포함하는 실질적으로 제한된 표적 영역을 포함할 수 있다. 반대로, 핫스팟이 비교되는 다른 영역은 표적 RNA 길이의 적어도 대부분을 누적적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 다른 영역은 표적 RNA 길이의 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%를 누적적으로 포함할 수 있다.
표적 RNA의 비교 영역은 시험관 내 또는 생체 내 스크리닝 검정으로부터 수득된 효능 데이터를 사용하여 핫스팟의 식별을 위해 경험적으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 표적 RNA에 걸쳐 있는 다양한 영역을 표적으로 하는 RNAi 제제는 각 영역에 결합하는 효과적인 iRNA 제제의 빈도(예를 들어, mRNA 발현 또는 단백질 발현에 의해 측정되는 것과 같이 표적 유전자 발현이 억제되는 양)에 대해 비교될 수 있다. 일반적으로, 핫스팟은 RNA 표적의 제한된 영역에 결합하는 다수의 효과적인 RNAi 제제의 군집(clustering)을 관찰함으로써 인식될 수 있다. 핫스팟은, 영역의 양 말단을 포함하여, 핫스팟으로 식별된 표적 영역의 적어도 약 60%, 예컨대 영역 길이의 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 95% 이상에 누적적으로 걸쳐 있는 iRNA 제제의 효능을 관찰함으로써 충분히 특성화될 수 있다(즉, 영역의 각 말단에 있는 뉴클레오타이드를 포함하여, 영역 내 뉴클레오타이드의 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상이 iRNA 제제에 의해 표적화됨). 본 발명의 일부 양태에 따르면, 영역에 걸쳐 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 억제(예를 들어, 약 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만의 mRNA 잔류)를 나타내는 iRNA 제제가 효과적인 것으로 식별될 수 있다.
또한 정의된 크기(예를 들어, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 nts)의 상이한 영역에 걸친 억제 측정의 정량적 비교를 사용하여 RNA 영역의 표적화에 대한 순응성이 평가될 수 있다. 예를 들어, 평균 억제 수준이 각 영역에 대해 결정될 수 있고, 각 영역의 평균이 비교될 수 있다. 핫스팟 영역 내의 평균 억제 수준은 평가된 모든 영역에 대한 평균의 평균보다 실질적으로 더 높을 수 있다. 일부 양태에 따르면, 핫스팟 영역의 평균 억제 수준은 평균의 평균보다 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 더 높을 수 있다. 일부 양태에 따르면, 핫스팟 영역의 평균 억제 수준은 평균의 평균보다 적어도 약 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 또는 2.0 높은 표준 편차일 수 있다. . 평균 억제 수준은 통계적으로 유의미한(예를 들어, p < 0.05) 양만큼 더 높을 수 있다. 일부 양태에 따르면, 핫스팟 영역 내의 각각의 억제 측정은 임계량을 초과할 수 있다(예를 들어, mRNA 잔류의 임계량 이하). 일부 양태에 따르면, 영역 내의 각각의 억제 측정은 측정된 모든 영역에 걸친 모든 억제 측정의 평균보다 실질적으로 높을 수 있다. 예를 들어, 핫스팟 영역의 각각의 억제 측정은 모든 억제 측정의 평균보다 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 더 높을 수 있다. 일부 양태에 따르면, 각각의 억제 측정은 모든 억제 측정의 평균보다 적어도 약 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 2.0 높은 표준 편차일 수 있다. 각각의 억제 측정은 모든 억제 측정의 평균보다 통계적으로 유의미한(예를 들어, p < 0.05) 양만큼 더 높을 수 있다. 핫스팟을 평가하기 위한 표준은 양립 가능한 경우(예를 들어, 적어도 약 제1 양의 평균 억제 수준 및 제1 양보다 적은 제2 양의 임계 수준 미만인 억제 측정치를 갖지 않음), 전술한 표준의 다양한 조합을 포함할 수 있다.
따라서, 표적 RNA의 핫스팟 영역을 표적으로 하는, 본원에 기술된 예시적인 특이적 iRNA 제제를 포함하는 임의의 iRNA 제제는 이러한 핫스팟 영역을 표적화하는 것이 핫스팟 영역이 아닌 영역을 표적화하는 것에 비해 강력한 억제 반응을 나타낼 가능성이 있기 때문에 바람직하게는 표적 mRNA의 RNA 간섭을 유도하기 위해 선택될 수 있음이 명백하게 고려된다. (예를 들어, 표적 서열 길이의 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%만큼) 실질적으로 중첩되거나, 바람직하게는 핫스팟 영역 내에 완전히 존재하는 표적 서열을 표적으로 하는 RNAi 제제는 핫스팟 영역을 표적으로 하는 것으로 간주될 수 있다. 본 발명의 RNA 표적(들)의 핫스팟 영역은, 본원에 개시된 데이터가 이러한 핫스팟 영역(들)의 범위(들)가 명시적으로 특정되었는지 여부와 상관없이, 본원의 다른 곳에서 기술된 표준 중 어느 하나를 포함하는 효과적인 RNAi 제제에 의한 더 높은 표적화 빈도를 나타내는 임의의 영역을 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 MYOC를 암호화하는 mRNA의 핫스팟 영역을 표적으로 한다.
III. iRNA 모티프
본 개시내용의 특정 양태에서, 본 개시내용의 이중 가닥 RNAi 제제는, 예를 들어, 그 내용이 본원에 제공된 방법에 대한 참조로서 본원에 통합된, WO 2013/075035에 개시된 것과 같은 화학적 변형을 갖는 제제를 포함한다. 본원 및 WO 2013/075035에 나타낸 것과 같이, 우수한 결과는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형 중 하나 이상의 모티프를 RNAi 제제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥으로, 특히 절단 부위에서 또는 이의 부근에서 도입함으로써 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 다르게는 완전히 변형될 수 있다. 이들 모티프의 도입은 존재하는 경우 센스 또는 안티센스 가닥의 변형 패턴을 방해한다. RNAi 제제는, 예를 들어, 센스 가닥 상의 친유성 모이어티 또는 리간드, 예를 들어 C16 모이어티 또는 리간드와 선택적으로 접합될 수 있다. RNAi 제제는, 예를 들어, 안티센스 가닥의 하나 이상의 잔기 상에서 (S)-글리콜 핵산(GNA) 변형과 선택적으로 변형될 수 있다. 생성된 RNAi 제제는 우수한 유전자 침묵 활성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 센스 가닥 서열은 화학식 I로 나타낼 수 있되:
5’np-Na-(X X X )i-Nb-Y Y Y -Nb-(Z Z Z )j-Na-nq 3'(I)
상기 식에서:
i 및 j는 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p 및 q는 각각 독립적으로 0~6이고;
각각의 Na는 독립적으로 0~25개 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형 뉴클레오타이드를 포함하고;
각각의 Nb는 독립적으로 0~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
np 및 nq 각각은 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
여기서 Nb 및 Y는 동일한 변형을 갖지 않고;
XXX, YYY, 및 ZZZ 각각은 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형 중 하나의 모티프를 나타낸다. 일부 구현예에서, YYY는 모두 2'-F 변형된 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, Na 및/또는 Nb는 교호 패턴의 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 부위에서 또는 이의 부근에서 발생한다. 예를 들어, RNAi 제제가 길이가 17~23개의 뉴클레오타이드인 듀플렉스 영역을 갖는 경우, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 부위에서 또는 그 부근에서 발생할 수 있고(예를 들어, 위치 6, 7, 8; 7, 8, 9; 8, 9, 10; 9, 10, 11; 10, 11, 12 또는 11, 12, 13에서 발생할 수 있음), 계수는 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오타이드에서 시작하거나; 선택적으로, 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내 첫 번째 쌍을 형성한 뉴클레오타이드에서 시작한다.
일부 구현예에서, i는 1이고 j는 0이거나, i는 0이고 j는 1이거나, i 및 j 둘 모두는 1이다. 센스 가닥은 따라서 다음의 화학식들로 나타낼 수 있다:
센스 가닥을 화학식 Ib로 나타내는 경우, Nb는 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
센스 가닥을 화학식 Ic로 나타내는 경우, Nb는 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
센스 가닥을 화학식 Id로 나타내는 경우, 각각의 Nb는 독립적으로 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, Nb는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
X, Y 및 Z 각각은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
다른 구현예에서, i는 0이고 j는 0이고, 센스 가닥은 다음의 화학식으로 나타낼 수 있다:
5' np-Na-YYY- Na-nq 3' (Ia).
센스 가닥을 화학식 Ia로 나타내는 경우, 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15, 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, RNAi의 안티센스 가닥 서열은 화학식 Ie로 나타낼 수 있되:
5' nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np' 3' (Ie)
상기 식에서:
k 및 l는 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p' 및 q'는 각각 독립적으로 0~6이고;
각각의 Na'는 독립적으로 0~25개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고;
각각의 Nb'는 독립적으로 0~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
np' 및 nq' 각각은 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
여기서 Nb' 및 Y'는 동일한 변형을 갖지 않고;
그리고
X'X'X', Y'Y'Y', 및 Z'Z'Z' 각각은 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형 중 하나를 나타낸다.
일부 구현예에서, Na' 및/또는 Nb'는 교호 패턴의 변형을 포함한다.
Y'Y'Y' 모티프는 안티센스 가닥의 절단 부위에서 또는 그 부근에서 발생한다. 예를 들어, RNAi 제제가 길이가 17~23개의 뉴클레오타이드인 듀플렉스 영역을 갖는 경우, Y'Y'Y' 모티프는 안티센스 가닥의 위치 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; 또는 13, 14, 15에서 발생할 수 있고, 계수는 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오타이드에서 시작하거나; 선택적으로, 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내 첫 번째 쌍을 형성한 뉴클레오타이드에서 시작한다. 일부 구현예에서, Y'Y'Y' 모티프는 위치 11, 12, 13에서 발생한다.
일부 구현예에서, Y'Y'Y' 모티프는 모든 2'-OMe 변형된 뉴클레오타이드이다.
일 구현예에서, k는 1이고 l은 0이거나, k는 0이고 l은 1이거나, k 및 l 둘 모두는 1이다.
안티센스 가닥은 따라서 다음의 화학식들로 나타낼 수 있다:
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'np' 3' (Ig);
5' nq'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np' 3' (Ih); 또는
5' nq'-Na'- Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'- X'X'X'-Na'-np' 3' (Ii).
안티센스 가닥을 화학식 Ig로 나타내는 경우, Nb' 는 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2 또는 0개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na'는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
안티센스 가닥을 화학식 Ii로 나타내는 경우, 각각의 Nb'는 독립적으로 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na'는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, Nb는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
다른 구현예에서, k는 0이고 l는 0이고, 안티센스 가닥은 다음의 화학식으로 나타낼 수 있다:
5' np'-Na'-Y'Y'Y'- Na'-nq' 3' (If).
안티센스 가닥을 화학식 If로 나타내는 경우, 각각의 Na'은 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
X', Y' 및 Z' 각각은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
센스 가닥 및 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 각각은 독립적으로 LNA, HNA, CeNA, GNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-하이드록실, 또는 2'-플루오로로 변형될 수 있다. 예를 들어, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 각각은 독립적으로 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 변형된다. X, Y, Z, X', Y' 및 Z' 각각은 특히 2'-O-메틸 변형 또는 2'-플루오로 변형을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, RNAi 제제의 센스 가닥은 듀플렉스 영역이 21개의 뉴클레오타이드인 경우에 가닥의 9, 10, 및 11 위치에서 발생하는 YYY 모티프를 함유할 수 있고, 계수는 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오타이드에서 시작하거나, 선택적으로, 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내 첫 번째 쌍을 형성한 뉴클레오타이드에서 시작하고; Y는 2'-F 변형을 나타낸다. 센스 가닥은 추가로 듀플렉스 영역의 반대 말단에 윙 변형으로서 XXX 모티프 또는 ZZZ 모티프를 함유할 수 있고; XXX 및 ZZZ는 각각 독립적으로 2'-OMe 변형 또는 2'-F 변형을 나타낸다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 가닥의 위치 11, 12, 13에서 발생하는 Y'Y'Y' 모티프를 함유할 수 있고, 계수는 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오타이드에서 시작하거나, 선택적으로, 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내 첫 번째 쌍을 형성한 뉴클레오타이드에서 시작하고; Y'는 2'-O-메틸 변형을 나타낸다. 안티센스 가닥은 추가로 듀플렉스 영역의 반대 말단에 윙 변형으로서 X'X'X' 모티프 또는 Z'Z'Z' 모티프를 함유할 수 있고; X'X'X' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 2'-OMe 변형 또는 2'-F 변형을 나타낸다.
위의 화학식 Ia, Ib, Ic, 및 Id 중 어느 하나로 나타낸 센스 가닥은 안티센스 가닥을 화학식 If, Ig, Ih, 및 Ii 중 어느 하나로 각각 나타낸 듀플렉스를 형성한다.
따라서, 본 개시내용의 방법에 사용하기 위한 특정 RNAi 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함할 수 있고, 각각의 가닥은 14 내지 30개의 뉴클레오타이드를 갖고, RNAi 듀플렉스는 다음의 화학식 Ij로 나타내되:
센스: 5' np -Na-(XXX)i -Nb- YYY -Nb -(ZZZ)j-Na-nq 3'
안티센스: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5'
(Ij)
상기 식에서,
i, j, k, 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p, p', q, 및 q'는 각각 독립적으로 0~6이고;
각각의 Na 및 Na'는 독립적으로 0~25개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고;
각각의 Nb 및 Nb'는 독립적으로 0~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 나타내고;
여기서
각각의 np', np, nq', 및 nq는 이의 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', 및 Z'Z'Z' 각각은 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형 중 하나의 모티프를 나타낸다.
일부 구현예에서, i는 0이고 j는 0이거나; i는 1이고 j는 0이거나; i는 0이고 j는 1이거나; i 및 j 둘 모두는 0이거나; i 및 j 둘 모두는 1이다. 일부 구현예에서, k는 0이고 l은 0이거나; k는 1이고 l은 0이거나; k는 0이고 l은 1이거나; k 및 l 둘 모두는 0이거나; k 및 l 둘 모두는 1이다.
RNAi 듀플렉스를 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 예시적인 조합은 아래 화학식들을 포함한다:
5' np -Na-Y Y Y-Na-nq 3'
3' np' -Na'- Y'Y'Y'-Na'nq' 5'
(Ik)
5' np -Na -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na-nq 3'
3' np -Na'- Y'Y'Y'-Nb'- Z'Z'Z'- Na'-nq' 5'
(Il)
5' np -Na - X X X -Nb- Y Y Y -Na-nq 3'
3' np -Na'- X'X'X' -Nb'- Y'Y'Y'- Na'-nq' 5'
(Im)
5' np -Na - X X X -Nb -Y Y Y - Nb- Z Z Z-Na-nq 3'
3' np -Na'- X'X'X'-Nb'- Y'Y'Y'-Nb'- Z'Z'Z'-Na'-nq' 5'
(In)
RNAi 제제를 화학식 Ik로 나타내는 경우, 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15, 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
RNAi 제제를 화학식 Il로 나타내는 경우, 각각의 Nb는 독립적으로 1~10, 1~7, 1~5 또는 1~4개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15, 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
RNAi 제제를 화학식 Im으로 나타내는 경우, 각각의 Nb, Nb'는 독립적으로 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2 또는 0개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15, 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
RNAi 제제를 화학식 In으로 나타내는 경우, 각각의 Nb, Nb'는 독립적으로 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2 또는 0개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na, Na'는 독립적으로 2~20, 2~15, 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na, Na', Nb 및 Nb'는 독립적으로 교호 패턴의 변형을 포함한다.
화학식 Ij, Ik, Il, Im, 및 In의 X, Y 및 Z 각각은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
RNAi 제제를 화학식 Ij, Ik, Il, Im, 및 In으로 나타내는 경우, Y 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 Y' 뉴클레오타이드 중 하나와 염기쌍을 형성할 수 있다. 대안적으로, Y 뉴클레오타이드 중 적어도 2개는 상응하는 Y' 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성하거나; Y 뉴클레오타이드 중 3개 모두는 상응하는 Y' 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성한다.
RNAi 제제를 화학식 Il 또는 In으로 나타내는 경우, Z 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 Z' 뉴클레오타이드 중 하나와 염기쌍을 형성할 수 있다. 대안적으로, Z 뉴클레오타이드 중 적어도 2개는 상응하는 Z' 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성하거나; Z 뉴클레오타이드 중 3개 모두는 상응하는 Z' 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성한다.
RNAi 제제를 화학식 Im 또는 In으로 나타내는 경우, X 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 X' 뉴클레오타이드 중 하나와 염기쌍을 형성할 수 있다. 대안적으로, X 뉴클레오타이드 중 적어도 2개는 상응하는 X' 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성하거나; X 뉴클레오타이드 중 3개 모두는 상응하는 X' 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, Y 뉴클레오타이드 상의 변형은 Y' 뉴클레오타이드 상의 변형과 상이하고/하거나, Z 뉴클레오타이드 상의 변형은 Z' 뉴클레오타이드 상의 변형과 상이하고/하거나, X 뉴클레오타이드 상의 변형은 X' 뉴클레오타이드 상의 변형과 상이하다.
일부 구현예에서, RNAi 제제를 화학식 IIId로 나타내는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이다. 일부 구현예에서, RNAi 제제를 화학식 In으로 나타내는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np' >0이고 적어도 하나의 np'는 이웃하는 뉴클레오타이드에 포스포로티오에이트 결합을 통해 결합된다. 일부 구현예에서, RNAi 제제를 화학식 In으로 나타내는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np' >0이고 적어도 하나의 np'는 이웃하는 뉴클레오타이드에 포스포로티오에이트 결합을 통해 결합되고, 센스 가닥은 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 모이어티 또는 리간드(예를 들어, 하나 이상의 친유성 모이어티, 선택적으로 하나 이상의 C16 모이어티, 또는 하나 이상의 GalNAc 모이어티)에 접합된다. 일부 구현예에서, RNAi 제제를 화학식 In으로 나타내는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np' >0이고 적어도 하나의 np'는 이웃하는 뉴클레오타이드에 포스포로티오에이트 결합을 통해 결합되고, 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 센스 가닥은 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 모이어티 또는 리간드(예를 들어, 하나 이상의 친유성 모이어티, 선택적으로 하나 이상의 C16 모이어티, 또는 하나 이상의 GalNAc 모이어티)에 접합된다.
일부 구현예에서, RNAi 제제를 화학식 IIIa로 나타내는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np' >0이고 적어도 하나의 np'는 이웃하는 뉴클레오타이드에 포스포로티오에이트 결합을 통해 결합되고, 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 센스 가닥은 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 모이어티 또는 리간드(예를 들어, 하나 이상의 친유성 모이어티, 선택적으로 하나 이상의 C16 모이어티, 또는 하나 이상의 GalNAc 모이어티)에 접합된다.
일부 구현예에서, RNAi 제제는 화학식 Ij, Ik, Il, Im, 및 In으로 나타낸 적어도 2개의 듀플렉스를 함유하는 다량체이고, 여기서 듀플렉스는 링커에 의해 연결된다. 링커는 절단가능하거나 절단가능하지 않을 수 있다. 선택적으로, 다량체는 추가로 리간드를 포함한다. 듀플렉스 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적으로 할 수 있거나; 듀플렉스 각각은 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적으로 할 수 있다.
일부 구현예에서, RNAi 제제는 화학식 Ij, Ik, Il, Im, 및 In으로 나타낸 3개, 4개, 5개, 6개 이상의 듀플렉스를 함유하는 다량체이고, 여기서 듀플렉스는 링커에 의해 연결된다. 링커는 절단가능하거나 절단가능하지 않을 수 있다. 선택적으로, 다량체는 추가로 리간드를 포함한다. 듀플렉스 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적으로 할 수 있거나; 듀플렉스 각각은 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적으로 할 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 Ij, Ik, Il, Im, 및 In으로 나타낸 2개의 RNAi 제제는 5' 말단, 및 3' 말단의 하나 또는 둘 모두에서 서로 결합되고, 선택적으로 리간드에 접합된다. 제제의 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적으로 할 수 있거나; 제제의 각각은 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적으로 할 수 있다.
다양한 공보는 본 개시내용의 방법에 사용될 수 있는 다량체 RNAi 제제를 기술한다. 이러한 공보는 WO2007/091269, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887, 및 WO2011/031520; 및 미국 특허번호 제7858769호를 포함하고, 이의 각각의 내용은 본원에 제공된 방법에 대한 참조로 본원에 통합된다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 RNAi 제제는 GalNAc 리간드를 포함할 수 있다.
아래에서 더 상세히 기술되는 바와 같이, 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 RNAi 제제로의 접합을 함유하는 RNAi 제제는 RNAi 제제의 하나 이상의 성질을 최적화할 수 있다. 많은 경우에, 탄수화물 모이어티가 RNAi 제제의 변형 서브유닛에 부착될 것이다. 예를 들어, dsRNA 제제의 하나 이상의 리보뉴클레오타이드 서브유닛의 리보오스 당은 또 다른 모이어티, 예를 들어, 탄수화물 리간드가 부착된 비-탄수화물(바람직하게는, 환형) 캐리어로 대체될 수 있다. 서브유닛의 리보오스 당이 그렇게 대체된 리보뉴클레오타이드 서브유닛은 본원에서 리보오스 대체 변형 서브유닛(RRMS)으로 지칭된다. 환형(cyclic) 캐리어는 카르보사이클릭 고리 시스템일 수 있고, 즉, 모든 환(ring) 원자는 탄소 원자, 또는 헤테로사이클릭(heterocyclic) 고리 시스템이고, 즉, 하나 이상의 환 원자는 헤테로원자, 예를 들어 질소, 산소, 황일 수 있다. 환형 캐리어는 모노사이클릭(monocyclic) 고리 시스템일 수 있거나, 2개 이상의 고리, 예를 들어, 융합된 고리를 함유할 수 있다. 환형 캐리어는 완전히 포화된 고리 시스템일 수 있거나, 하나 이상의 이중 결합을 함유할 수 있다.
리간드는 캐리어를 통해 폴리뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. 캐리어는 (i) 적어도 하나의 "골격 부착점", 바람직하게는 2개의 "골격 부착점" 및 (ii) 적어도 하나의 "테더링 부착점"을 포함한다. 본원에 사용된 "골격 부착점"은 작용기, 예를 들어, 하이드록실기를 지칭하거나, 또는 일반적으로, 리보핵산의 골격으로의 캐리어의 혼입에 이용가능하고, 이에 적합한 결합, 예를 들어, 포스페이트, 또는 변형된 포스페이트, 예를 들어 황 함유 골격을 지칭한다. 일부 구현예에서 "테더링 부착점"(TAP)은 선택된 모이어티를 연결하는, 환형 캐리어의 구성 환 원자, 예를 들어, 탄소 원자 또는 헤테로원자(골격 부착점을 제공하는 원자와 구별됨)를 지칭한다. 모이어티는, 예를 들어, 탄수화물, 예를 들어, 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당류 및 다당류일 수 있다. 선택적으로, 선택된 모이어티는 환형 캐리어로의 삽입 테더에 의해 연결된다. 따라서, 환형 캐리어는 종종 작용기, 예를 들어, 아미노기를 포함하거나, 또는 일반적으로 또 다른 화학적 실체, 예를 들어, 구성 고리에 대한 리간드의 혼입 또는 테더링에 적합한 결합을 제공한다.
RNAi 제제는 캐리어를 통해 리간드에 접합될 수 있되, 캐리어는 환형 작용기 또는 비환형 작용기일 수 있고; 바람직하게는, 환형 작용기는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔란, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸릴 및 데칼린으로부터 선택되고; 바람직하게는, 비환형 작용기는 세리놀 골격 또는 디에탄올아민 골격으로부터 선택된다.
구체적인 특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법에 사용하기 위한 RNAi 제제는 표 2a 및 표 2b 중 어느 하나에 열거된 제제의 군으로부터 선택된 제제이다. 이들 제제는 리간드를 추가로 포함할 수 있다. 리간드는 3'-말단, 5'-말단, 또는 양 말단에서 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 양 가닥에 부착될 수 있다. 예를 들어, 리간드는 센스 가닥, 특히 센스 가닥의 3'-말단에 접합될 수 있다.
IV. iRNA 접합체
본원에 개시된 iRNA 제제는 접합체의 형태일 수 있다. 접합체는 iRNA 분자 내 임의의 적절한 위치에, 예를 들어, 센스 또는 안티센스 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단에 부착될 수 있다. 접합체는 링커를 통해 임의로 부착된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 iRNA 제제는, 예를 들어 iRNA의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수에 영향을 미침으로써(예를 들어, 향상시킴으로써) 기능성을 부여할 수 있는 하나 이상의 리간드, 모이어티 또는 접합체에 화학적으로 결합된다. 이러한 모이어티는 콜레스테롤 모이어티와 같은 지질 모이어티(문헌참조: Letsinger 등, Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553~6556), 콜산(문헌참조: Manoharan 등, Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053~1060), 티오에테르, 예를 들어, 베릴-S-트리틸티올(문헌참조: Manoharan 등, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306~309; Manoharan 등, Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765~2770), 티오콜레스테롤(문헌참조: Oberhauser 등, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533~538), 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(문헌참조: Saison-Behmoaras 등, EMBO J, 1991, 10:1111~1118; Kabanov 등, FEBS Lett., 1990, 259:327~330; Svinarchuk 등, Biochimie, 1993, 75:49~54), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-포스포네이트(문헌참조: Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651~3654; Shea 등, Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777~3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(문헌참조: Manoharan 등, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969~973), 또는 아다만탄 아세트산(문헌참조: Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651~3654), 손바닥 모이어티(문헌참조: Mishra 등, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229~237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐옥시콜레스테롤 모이어티(문헌참조: Crooke 등, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923~937)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 리간드는 이것이 혼입되는 iRNA 제제의 분포, 표적화 또는 수명을 변경시킨다. 일부 구현예에서, 리간드는, 예를 들어, 이러한 리간드가 부재하는 종과 비교하여, 선택된 표적, 예를 들어 분자, 세포 또는 세포 유형, 구획, 예를 들어 세포 또는 기관 구획, 조직, 기관 또는 신체의 영역에 대해 증진된 친화도를 제공한다. 통상적인 리간드는 듀플렉스된 핵산 내 듀플렉스 쌍형성에 관여하지 않을 것이다.
리간드는 자연 발생 물질, 예컨대 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민(HSA), 저밀도 지질단백질(LDL) 또는 글로불린); 탄수화물(예를 들어, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 사이클로덱스트린 또는 히알루론산); 또는 지질을 포함할 수 있다. 리간드는 또한 합성 중합체, 예를 들어 합성 폴리아미노산과 같은 재조합 또는 합성 분자일 수 있다. 폴리아미노산의 예는 폴리라이신(PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리(L- 락티드-코-글리콜화된) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체(HMPA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체 또는 폴리포스파진을 포함한다. 폴리아민의 예는 다음을 포함한다: 폴리에틸렌이민, 폴리라이신(PLL), 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리아민, 슈도펩타이드-폴리아민, 펩티도미메틱 폴리아민, 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포르피린, 폴리아민의 사차 염, 또는 α 나선 펩타이드.
리간드는 또한 표적화 군, 예를 들어, 세포 또는 조직 표적화 제제, 예를 들어, 렉틴, 당단백질, 지질 또는 단백질, 예를 들어, 신장 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 표적화 군은 티로트로핀, 멜라노트로핀, 렉틴, 당단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토스아민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노스, 다가 푸코스, 글리코실화된 폴리아미노산, 다가 갈락토스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파르테이트, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산, 폴레이트, 비타민 B12, 비오틴, 또는 RGD 펩타이드 또는 RGD 펩타이드 모사체일 수 있다.
리간드의 다른 예는 염료, 중간증량제(예를 들어, 아크리딘), 가교제(예를 들어, 소랄렌, 미토마이신 C), 포르피린(TPPC4, 텍사피린, 사피린), 다환 방향족 탄화수소(예를 들어, 페나진, 디하이드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제(예를 들어, EDTA), 친유성 분자, 예를 들어, 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥실기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜레산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진) 및 펩타이드 접합체(예를 들어, 안테나피디아 펩타이드, Tat 펩타이드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 메르캅토, PEG(예를 들어, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사성 표지된 마커, 효소, 합텐(예를 들어, 비오틴), 수송/흡수 촉진제(예를 들어, 아스피린, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레아제(예를 들어, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 접합체, 테트라아자마크로사이클의 Eu3+ 복합체), 디니트로페닐, HRP, 또는 AP를 포함한다.
리간드는 단백질, 예를 들어, 당단백질, 또는 펩타이드, 예를 들어, 공동-리간드에 대해 특이적 친화도를 갖는 분자, 또는 항체, 예를 들어, 안구 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 항체일 수 있다. 리간드는 또한 호르몬 및 호르몬 수용체를 포함할 수 있다. 이들은 또한 비-펩타이드 종, 예컨대, 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민, 조인자, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노스, 또는 다가 푸코스를 포함할 수 있다. 리간드는, 예를 들어, 지질다당류, p38 MAP 키나제의 활성화제 또는 NF-κB의 활성화제일 수 있다.
리간드는, 예를 들어, 세포의 미세소관, 마이크로필라멘트, 및/또는 중간 필라멘트를 붕괴시킴에 의해 세포의 세포골격을 예를 들어 파괴함으로써 iRNA 제제의 세포로의 흡수를 증가시킬 수 있는 물질, 예를 들어 약물일 수 있다. 약물은, 예를 들어, 탁손, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 시토칼라신, 노코다졸, 자플라키놀리드, 라트룬쿨린 A, 팔로이딘, 스윈홀리드 A, 인다노신, 또는 미오세빈일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 것과 같은 iRNA에 부착된 리간드는 약동학적 조절제(PK 조절제)로서 작용한다. PK 조절제는 친유성체, 담즙산, 스테로이드, 인지질 유사체, 펩타이드, 단백질 결합제, PEG, 비타민 등을 포함한다. 예시적인 PK 조절제는 콜레스테롤, 지방산, 콜산, 리토콜산, 디알킬글리세리드, 디아실글리세리드, 인지질, 스핑고지질, 나프록센, 이부프로펜, 비타민 E, 비오틴 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다수의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 또한 혈청 단백질에 결합하는 것으로 알려져 있으므로, 따라서, 짧은 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 골격 내 다수의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 약 5개 염기, 10개 염기, 15개 염기 또는 20개 염기의 올리고뉴클레오타이드 또한 본 개시내용에 리간드로서(예를 들어, PK 조절 리간드로서) 적용될 수 있다. 또한, 혈청 성분(예를 들어, 혈청 단백질)에 결합하는 압타머는 또한 본원에 기술된 구현예에서 PK 조절 리간드로 사용하기에 적합하다.
본 개시내용의 리간드-접합 올리고뉴클레오타이드는 (하기에 기술되는) 올리고뉴클레오타이드 상으로의 결합 분자의 부착으로부터 유래된 것과 같은 펜던트 반응성 작용기를 함유하는 올리고뉴클레오타이드의 사용에 의해 합성될 수 있다. 이러한 반응성 올리고뉴클레오타이드는 상업적으로 이용가능한 리간드, 임의의 다양한 보호기를 보유하는 합성된 리간드, 또는 이에 부착된 결합 모이어티를 갖는 리간드와 직접 반응할 수 있다.
본 개시내용의 접합체에 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 널리 공지된 고체상 합성 기술을 통해 편리하고 통상적으로 제조될 수 있다. 그러한 합성을 위한 기기는 여러 판매업자에 의해 시판되고 있고, 예를 들어, Applied Biosystems(Foster City, Calif.)을 포함한다. 당업계에 공지된 그러한 합성을 위한 임의의 다른 수단은 추가로 또는 대안적으로 사용될 수 있다. 또한 다른 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체를 제조하기 위한 유사한 기술을 사용하는 것이 공지되어 있다.
본 개시내용의 리간드-접합된 올리고뉴클레오타이드 및 리간드-분자 함유 서열-특이적 결합된 뉴클레오사이드에서, 올리고뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오사이드는 표준 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 전구체, 또는 이미 결합 모이어티를 보유하는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 접합 전구체, 이미 리간드 분자를 보유하는 리간드-뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드-접합체 전구체, 또는 비-뉴클레오사이드 리간드-보유 빌딩 블록을 사용하여 적합한 DNA 합성기 상에서 제조될 수 있다.
이미 결합 모이어티를 보유하는 뉴클레오사이드 접합 전구체를 사용하는 경우, 서열-특이적 결합된 뉴클레오사이드의 합성은 통상적으로 완료되고, 리간드 분자는 결합 모이어티와 반응하여 리간드-접합 올리고뉴클레오타이드를 형성한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드 또는 결합된 뉴클레오사이드는 상업적으로 이용가능하고 올리고뉴클레오타이드 합성에 통상적으로 사용되는 표준 포스포르아미디트 및 비표준 포스포르아미디트에 추가하여 리간드-뉴클레오사이드 접합체로부터 유래된 포스포르아미디트를 사용하여 자동화된 합성기에 의해 합성된다.
A. 친유성 모이어티
특정 구현예에서, 친유성 모이어티는 지방족, 환형, 예컨대 지환형, 또는 다중지환형, 예컨대 다환형 화합물, 예컨대 스테로이드(예를 들어, 스테롤) 또는 선형 또는 분지형 지방족 탄화수소이다. 친유성 모이어티는 일반적으로 환형 또는 비환형일 수 있는 탄화수소 쇄를 포함할 수 있다. 탄화수소 쇄는 다양한 치환기 또는 산소 또는 질소 원자와 같은 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있다. 이러한 친유성 지방족 모이어티는, 포화 또는 불포화 C4-C30 탄화수소(예를 들어, C6-C18 탄화수소), 포화 또는 불포화 지방산, 왁스(예를 들어, 지방산 및 지방산 디아미드의 일가 알코올 에스테르), 테르펜(예를 들어, C10 테르펜, C15 세스퀴테르펜, C20 디테르펜, C30 트리테르펜, 및 C40 테트라테르펜), 및 다른 다환형 탄화수소를 비제한적으로 포함한다. 예를 들어, 친유성 모이어티는 C4-C30 탄화수소 쇄(예를 들어, C4-C30 알킬 또는 알케닐)을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 포화 또는 불포화 C6-C18 탄화수소 쇄(예를 들어, 선형 C6-C18 알킬 또는 알케닐)를 함유한다. 일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 포화 또는 불포화 C16 탄화수소 쇄(예를 들어, 선형 C16 알킬 또는 알케닐)를 함유한다.
친유성 모이어티는, 친유성 모이어티에 이미 존재하거나 RNAi 제제에 도입되는 작용기, 예컨대 하이드록시기(예를 들어, ―CO―CH2―OH)를 통한 것을 포함해, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 RNAi 제제에 부착될 수 있다. 친유성 모이어티에 이미 존재하거나 RNAi 제제에 도입되는 작용기는 하이드록실, 아민, 카르복실산, 설포네이트, 포스페이트, 티올, 아지드, 및 알킨을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
RNAi 제제와 친유성 모이어티의 접합은, 예를 들어, 하이드록시와 알킬기 R―, 알카노일기 RCO― 또는 치환된 카르바모일기 RNHCO- 사이의 에테르 또는 카르복실 또는 카르바모일 에스테르 결합의 형성을 통해 발생할 수 있다. 알킬기 R은 환형(예를 들어, 시클로헥실) 또는 비환형(예를 들어, 직쇄 또는 분지형; 및 포화 또는 불포화)일 수 있다. 알킬기 R은 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실, 헥사데실, 헵타데실 또는 옥타데실기 등일 수 있다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 에테르, 티오에테르, 우레아, 카보네이트, 아민, 아미드, 말레이미드-티오에테르, 디설파이드, 포스포디에스테르, 술폰아미드 결합, 클릭 반응의 생성물(예를 들어, 아지드-알킨 고리화 첨가 반응로부터의 트리아졸) 또는 카바메이트를 함유하는 링커를 통해 이중 가닥 RNAi 제제에 접합된다.
다른 구현예에서, 친유성 모이어티는 스테롤과 같은 스테로이드이다. 스테로이드는 과하이드로-1,2-시클로펜타노페난트렌 고리 시스템을 함유하는 다환 화합물이다. 스테로이드는 비제한적으로, 담즙산(예를 들어, 콜산, 데옥시콜산 및 디하이드로콜산), 코르티손, 디곡시게닌, 테스토스테론, 콜레스테롤, 및 양이온성 스테로이드, 예컨대 코르티손을 포함한다. "콜레스테롤 유도체"는, 예를 들어 치환, 치환기의 첨가 또는 제거에 의해 콜레스테롤로부터 유래된 화합물을 지칭한다.
다른 구현예에서, 친유성 모이어티는 방향족 모이어티이다. 이러한 맥락에서, 용어 "방향족"은 단방향족 및 다방향족 탄화수소를 광범위하게 지칭한다. 방향족 기는, 비제한적으로, 선택적으로 치환될 수 있는 1개 내지 3개의 방향족 고리를 포함하는 C6-C14 아릴 모이어티; 알킬기에 공유 결합된 아릴기를 포함하는 "아랄킬" 또는 "아릴알킬" 기로서, 이들 중 어느 하나는 독립적으로 선택적으로 치환되거나 치환되지 않을 수 있는 기; 및 "헤테로아릴" 기를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "헤테로아릴"은 5 내지 14개의 고리 원자, 바람직하게는 5, 6, 9, 또는 10개의 고리 원자를 갖는 기; 환형 어레이로 공유된 6, 10, 또는 14π 전자를 갖고, 탄소 원자 이외에 질소(N), 산소(O), 및 황(S)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 내지 약 3개의 헤테로원자를 갖는 기를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치환된" 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 또는 헤테로환형 기는 1개 내지 약 4개, 바람직하게는 1개 내지 약 3개, 보다 바람직하게는 1개 또는 2개의 비-수소 치환기를 갖는 기이다. 적절한 치환기는, 비제한적으로, 할로, 하이드록시, 니트로, 할로알킬, 알킬, 알카릴, 아릴, 아랄킬, 알콕시, 아릴옥시, 아미노, 아실아미노, 알킬카바모일, 아릴카바모일, 아미노알킬, 알콕시카르보닐, 카르복시, 하이드록시알킬, 알칸설포닐, 아렌설포닐, 알칸설폰아미도, 아렌설폰아미도, 아랄킬설폰아미도, 알킬카르보닐, 아실옥시, 시아노, 및 우레이도 기를 포함한다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 아랄킬기, 예를 들어 2-아릴프로파노일 모이어티이다. 아랄킬기의 구조적 특징은 친유성 모이어티가 생체 내에서 적어도 하나의 단백질에 결합하도록 선택된다. 특정 구현예에서, 아랄킬기의 구조적 특징은 친유성 모이어티가 혈청, 혈관 또는 세포 단백질에 결합하도록 선택된다. 특정 구현예에서, 아랄킬기의 구조적 특징은 알부민, 면역글로불린, 지단백질, α-2-마크로글루불린, 또는 α-1-당단백질에 대한 결합을 촉진한다.
특정 구현예에서, 리간드는 나프록센 또는 나프록센의 구조적 유도체이다. 나프록센의 합성 절차는 미국 특허 번호 제3,904,682호 및 미국 특허 번호 제4,009,197호에서 확인할 수 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 나프록센은 화학명 (S)-6-메톡시-α-메틸-2-나프탈렌아세트산을 가지며, 구조는 이다.
특정 구현예에서, 리간드는 이부프로펜 또는 이부프로펜의 구조적 유도체이다. 이부프로펜의 합성 절차는 미국 특허 번호 제3,228,831호에서 확인할 수 있으며, 이는 본원에 제공된 방법에 대한 참조로서 본원에 통합된다. 이부프로펜의 구조는 이다.
추가의 예시적인 아랄킬기는 미국 특허 번호 제7,626,014호에 예시되어 있으며, 이는 본원에 제공된 방법에 대한 참조로서 본원에 통합된다.
또 다른 구현예에서, 적합한 친유성 모이어티는 지질, 콜레스테롤, 레티노산, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥산올, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 이부프로펜, 나프록센, 디메톡시트리틸 또는 페녹사진을 포함한다.
특정 구현예에서, 특히 친유성 모이어티가 낮은 친유성 또는 소수성을 가질 때, 하나 초과의 친유성 모이어티가 이중 가닥 RNAi 제제에 혼입될 수 있다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 친유성 모이어티는 이중 가닥 RNAi 제제의 동일한 가닥으로 혼입된다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 RNAi 제제의 각각의 가닥은 혼입된 하나 이상의 친유성 모이어티를 갖는다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 친유성 모이어티는 이중 가닥 RNAi 제제의 동일한 위치(즉, 동일한 핵염기, 동일한 당 모이어티, 또는 동일한 뉴클레오사이드 간 결합)에 혼입된다. 이는, 예를 들어 캐리어를 통해 2개 이상의 친유성 모이어티에 접합하거나, 분지형 링커를 통해 2개 이상의 친유성 모이어티에 접합하거나, 하나 이상의 링커를 통해 2개 이상의 친유성 모이어티에 접합함으로써 달성될 수 있으며, 하나 이상의 링커는 친유성 모이어티를 연속적으로 결합한다.
친유성 모이어티는 RNAi 제제의 리보당에 직접 부착됨으로써 RNAi 제제에 접합될 수 있다. 대안적으로, 친유성 모이어티는 링커 또는 캐리어를 통해 이중 가닥 RNAi 제제에 접합될 수 있다.
특정 구현예에서, 친유성 모이어티는 하나 이상의 링커(테더)를 통해 RNAi 제제에 접합될 수 있다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 에테르, 티오에테르, 우레아, 카보네이트, 아민, 아미드, 말레이미드-티오에테르, 디설파이드, 포스포디에스테르, 술폰아미드 결합, 클릭 반응의 생성물(예를 들어, 아지드-알킨 고리화 첨가 반응로부터의 트리아졸) 또는 카바메이트를 함유하는 링커를 통해 이중 가닥 RNAi 제제에 접합된다.
B. 지질 접합체
일부 구현예에서, 리간드는 지질 또는 지질 기반 분자이다. 그러한 지질 또는 지질 기반 분자는 통상적으로 혈청 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합할 수 있다. HSA 결합 리간드는 접합체의 표적 조직으로의 혈관 분포를 허용한다. 예를 들어, 표적 조직은 눈일 수 있다. HSA에 결합할 수 있는 다른 분자는 또한 리간드로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 나프록센 또는 아스피린이 사용될 수 있다. 지질 또는 지질 기반 리간드는 (a) 접합체의 분해에 대한 내성을 증가시킬 수 있고/있거나, (b) 표적 세포 또는 세포막으로의 표적화 또는 수송을 증가시킬 수 있고/있거나, (c) 혈청 단백질, 예를 들어, HSA로의 결합을 조정하는 데에 사용될 수 있다.
지질 기반 리간드를 사용하여 접합체의 표적 조직으로의 결합을 조절, 예를 들어, 제어(예를 들어, 억제)할 수 있다. 예를 들어, 보다 강하게 HSA에 결합하는 지질 또는 지질 기반 리간드는 신장으로 표적화될 가능성이 적고 따라서 신체로부터 제거될 가능성이 적다. HSA에 덜 강하게 결합하는 지질 또는 지질 기반 리간드를 사용하여 접합체를 신장으로 표적화시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 지질 기반 리간드는 HSA에 결합한다. 예를 들어, 리간드는 충분한 친화도로 HSA에 결합하여 비-신장 조직으로의 접합체의 분포가 증진될 수 있다. 그러나, 친화도는 통상적으로 HSA-리간드 결합이 역행될 수 없을 정도로 강하지 않다.
일부 구현예에서, 지질 기반 리간드는 HSA에 약하게 결합하거나 전혀 결합하지 않아, 신장으로의 접합체의 분포가 증진된다. 신장 세포를 표적으로 하는 다른 모이어티는 또한 지질 기반 리간드 대신에 또는 이에 추가로 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 리간드는 모이어티, 예를 들어, 표적 세포, 예를 들어, 증식 세포에 의해 흡수되는 비타민이다. 이들은 특히 예를 들어 악성 또는 비악성 유형의 원치 않는 세포 증식을 특징으로 하는 장애, 예를 들어 암세포를 치료하는 데 유용하다. 예시적인 비타민은 비타민 A, E, 및 K를 포함한다. 다른 예시적인 비타민은 B 비타민, 예를 들어, 폴산, B12, 리보플라빈, 비오틴, 피리독살 또는 암 세포에 의해 흡수되는 다른 비타민 또는 영양물을 포함한다. 또한 HSA 및 저밀도 지질단백질(LDL)이 포함된다.
C. 세포 투과 제제
또 다른 양태에서, 리간드는 세포 투과 제제, 예를 들어 나선 세포 투과 제제이다. 일부 구현예에서, 제제는 양친매성이다. 예시적인 제제는 tat 또는 안테노페디아와 같은 펩타이드이다. 제제가 펩타이드인 경우, 이는 펩티딜모사체, 인버토머, 비펩타이드 또는 슈도-펩타이드 연결 및 D-아미노산의 사용을 포함하여 변형될 수 있다. 나선 제제는 통상적으로 α-나선 제제이고 친유성 및 소유성(lipophobic) 상을 가질 수 있다.
리간드는 펩타이드 또는 펩티도모사체일 수 있다. (본원에서 올리고펩티도모사체라고도 지칭되는) 펩티도모사체는 천연 펩타이드와 유사한 한정된 3차원 구조로 폴딩할 수 있는 분자이다. iRNA 제제로의 펩타이드 및 펩티도모사체의 부착은 예를 들어, 세포 인지 및 흡착을 증진시킴에 의해 iRNA의 약동학적 분포에 영향을 미칠 수 있다. 펩타이드 또는 펩티도모사체 모이어티는 약 5~50개 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 아미노산 길이일 수 있다.
펩타이드 또는 펩티도모사체는 예를 들어, 세포 투과 펩타이드, 양이온성 펩타이드, 양친매성 펩타이드 또는 소수성 펩타이드(예를 들어, 주로 Tyr, Trp, 또는 Phe로 이루어짐)일 수 있다. 펩타이드 모이어티는 덴드리머 펩타이드, 구속된 펩타이드 또는 가교결합된 펩타이드일 수 있다. 또 다른 대안에서, 펩타이드 모이어티는 소수성 막 전좌 서열(MTS)을 포함할 수 있다. 예시적인 소수성 MTS-함유 펩타이드는 아미노산 서열 AAVALLPAVLLALLAP(서열번호 3)를 갖는 RFGF이다. 소수성 MTS를 함유하는 RFGF 유사체(예를 들어, 아미노산 서열 AALLPVLLAAP(서열번호 4))는 또한 표적화 모이어티일 수 있다. 펩타이드 모이어티는 세포막에 걸쳐 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드 및 단백질을 포함하는 대형 극성 분자를 운반할 수 있는 "전달" 펩타이드일 수 있다. 예를 들어, HIV Tat 단백질(GRKKRRQRRRPPQ(서열번호 5)) 및 드로소필라 안테나페디아(Drosophila Antennapedia) 단백질(RQIKIWFQNRRMKWKK(서열번호 6))로부터의 서열이 전달 펩타이드로서 기능할 수 있음이 밝혀졌다. 펩타이드 또는 펩티도모사체는 파아지-디스플레이 라이브러리 또는 OBOC(one-bead-one-compound) 조합 라이브러리로부터 식별된 펩타이드와 같은, DNA의 무작위 서열에 의해 암호화될 수 있다(Lam 등, Nature, 354:82~84, 1991). 통상적으로, 혼입된 단량체 단위를 통해 dsRNA 제제에 테터링된 펩타이드 또는 펩티도모사체는 아르지닌-글리신-아스파르트산(RGD)-펩타이드, 또는 RGD 모사체와 같은 세포 표적화 펩타이드이다. 펩타이드 모이어티는 길이가 약 5개 아미노산 내지 약 40개 아미노산 범위일 수 있다. 펩타이드 모이어티는 예를 들어, 안정성을 증가시키거나 형태적 성질을 지시하기 위해 구조적 변형을 가질 수 있다. 하기 기술된 임의의 구조적 변형이 사용될 수 있다.
본 개시내용의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 RGD 펩타이드는 선형 또는 환형일 수 있고, 변형, 예를 들어, 글리코실화되거나 메틸화되어 특이적 조직(들)으로의 표적화를 촉진시킬 수 있다. RGD-함유 펩타이드 및 펩티도모사체는 합성 RGD 모사체 뿐만 아니라 D-아미노산을 포함할 수 있다. RGD에 추가로, 당업자는 인테그린 리간드를 표적으로 하는 다른 모이어티를 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 리간드의 접합체는 PECAM-1 또는 VEGF를 표적으로 한다.
RGD 펩타이드 모이어티를 사용하여 특정 세포 유형, 예를 들어, 종양 세포, 예컨대, 내피 종양 세포 또는 유방암 종양 세포를 표적으로 할 수 있다(문헌참조: Zitzmann 등, Cancer Res., 62:5139~43, 2002). RGD 펩타이드는 폐, 신장, 비장 또는 간을 포함하는 다양한 다른 조직의 종양으로 dsRNA 제제의 표적화를 용이하게 할 수 있다(문헌참조: Aoki 등, Cancer Gene Therapy 8:783~787, 2001). 통상적으로, RGD 펩타이드는 iRNA 제제의 신장으로의 표적화를 용이하게 한다. RGD 펩타이드는 선형 또는 환형일 수 있고, 변형, 예를 들어, 글리코실화 또는 메틸화되어 특이적 조직으로의 표적화를 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 글리코실화된 RGD 펩타이드는 iRNA 제제를 αVß3를 발현하는 종양 세포로 전달할 수 있다(문헌참조: Haubner 등, Jour. Nucl. Med., 42:326~336, 2001).
"세포 투과 펩타이드"는 세포, 예를 들어, 박테리아 또는 진균류 세포와 같은 미생물 세포, 또는 인간 세포와 같은 포유동물 세포를 투과할 수 있다. 미생물 세포-투과 펩타이드는 예를 들어, α-나선 선형 펩타이드(예를 들어, LL-37 또는 세로핀 P1), 디설파이드 결합-함유 펩타이드(예를 들어, α-데펜신, β-데펜신 또는 박테네신), 또는 단지 하나 또는 2개의 주요 아미노산을 함유하는 펩타이드(예를 들어, PR-39 또는 인돌리시딘)일 수 있다. 세포 투과 펩타이드는 또한 핵 국소화 신호(NLS)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 투과 펩타이드는 HIV-1 gp41의 융합 펩타이드 도메인 및 SV40 대형 T 항원의 NLS로부터 유래된 MPG와 같은 이분형 양친매성 펩타이드일 수 있다(문헌참조: Simeoni 등, Nucl. Acids Res. 31:2717~2724, 2003).
D. 탄수화물 접합체 및 리간드
본 개시내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, iRNA 올리고뉴클레오타이드는 추가로 탄수화물을 포함한다. 탄수화물 접합된 iRNA는 본원에 기술된 것과 같이 생체내 치료학적 사용을 위해 적합한 조성물 뿐만 아니라 핵산의 생체내 전달을 위해 유리하다. 본원에 사용된 것과 같은, "탄수화물"은 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께 적어도 6개의 탄소 원자를 갖는 하나 이상의 단당류 유닛(선형, 분지형 또는 환형일 수 있는)으로 이루어진 탄수화물 자체인 화합물; 또는 이의 일부로서 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께 각각 적어도 6개의 탄소 원자를 갖는 하나 이상의 단당류 유닛(선형, 분지형 또는 환형일 수 있는)으로 이루어진 탄수화물 모이어티를 갖는 화합물을 지칭한다. 대표적인 탄수화물은 당(단당류, 이당류, 삼당류 및 약 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 단당류 단위를 함유하는 올리고당류) 및 다당류, 예를 들어, 전분, 글리코겐, 셀룰로스 및 폴리사카라이드 검을 포함한다. 특이적 단당류는 C5 이상(예를 들어, C5, C6, C7, 또는 C8) 당을 포함하고; 이당류 및 삼당류는 2개 또는 3개의 단당류 단위(예를 들어, C5, C6, C7, 또는 C8)을 갖는 당을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 조성물 및 방법은 C16 리간드를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본 개시내용의 C16 리간드는 다음의 구조(우라실 염기에 대해 이하에서 예시되지만, 2' 리보 부착이 보존되는 경우, C16 리간드의 부착은 임의의 염기(C, G, A 등)를 제시하거나 본원에 제시된 바와 같은 임의의 다른 변형을 갖는 뉴클레오타이드에 대해 고려됨)를 가지며, 그렇게 변형된 잔기 내에서 리보의 2' 위치에 부착된다:
위에서 도시한 바와 같이, C16 리간드-변형 잔기는 그렇게 변형된 예시적인 잔기(본원에서는 우라실)의 2'-리보 위치에서 직쇄 알킬을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 RNAi 제제의 탄수화물 접합체는 전술된 것과 같은 하나 이상의 추가 리간드, 예를 들어 비제한적으로 PK 조절제 또는 세포 투과 펩타이드를 추가로 포함한다.
본 개시내용에 사용하기에 적합한 추가 탄수화물 접합체(및 링커)는 국제특허번호 제2014/179620호 및 국제특허번호 제2014/179627호에 기술된 것들을 포함하고, 이의 각각의 전문은 본원에 참조로서 통합된다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 조성물 및 방법은 본원에 기술된 것과 같은 RNAi 제제의 비닐 포스포네이트(VP) 변형을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본 개시내용의 비닐 포스포네이트는 다음의 구조를 갖는다:
본 개시내용의 비닐 포스포네이트는 본 개시내용의 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥에 부착될 수 있다. 특정한 바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 비닐 포스포네이트는 선택적으로 dsRNA의 안티센스 가닥의 5' 말단에서, dsRNA의 안티센스 가닥에 부착된다. dsRNA 제제는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 5'-말단에 인 함유기를 포함할 수 있다. 5'-말단 인 함유기는 5'-말단 포스페이트(5'-P), 5'-말단 포스포로티오에이트(5'-PS), 5'-말단 포스포로디티오에이트(5'-PS2), 5'-말단 비닐포스포네이트(5'-VP), 5'-말단 메틸포스포네이트(MePhos), 또는 5'-데옥시-5'-C-말로닐일 수 있다. 5'-말단 인 함유기가 5'-말단 비닐포스포네이트(5'-VP)인 경우, 5'-VP는 5'-E-VP 이성질체(즉, 트랜스-비닐포스포네이트, ), 5'-Z-VP 이성질체(즉, 시스-비닐포스포네이트, ), 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
비닐 포스페이트 변형은 또한 본 개시내용의 조성물 및 방법을 위해 고려된다. 예시적인 비닐 포스페이트 구조는 다음과 같다:
일부 구현예에서, 탄수화물 접합체는 단당류를 포함한다. 일부 구현예에서, 단당류는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)이다. 하나 이상의 N-아세틸갈락토스아민(GalNAc) 유도체를 포함하는 GalNAc 접합체는 예를 들어, 미국 특허 번호 제8,106,022호에 기술되어 있고, 이의 전문은 본원에 참조로 통합된다. 일부 구현예에서, GalNAc 접합체는 iRNA를 특정 세포로 표적화하는 리간드로서 작용한다. 일부 구현예에서, GalNAc 접합체는 예를 들어, 간 세포(예를 들어, 간 세포(hepatocyte))의 아시알로당단백질(asialoglycoprotein) 수용체에 대해 리간드로서 작용함에 의해 iRNA를 간 세포로 표적화한다.
일부 구현예에서, 탄수화물 접합체는 하나 이상의 GalNAc 유도체를 포함한다. GalNAc 유도체는 링커, 예를 들어, 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, GalNAc 접합체는 센스 가닥의 3' 말단에 접합된다. 일부 구현예에서, GalNAc 접합체는 링커, 예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은 링커를 통해 iRNA 제제에 (예를 들어, 센스 가닥의 3' 말단에) 접합된다.
일부 구현예에서, GalNAc 접합체는 다음이다:
일부 구현예에서, RNAi 제제는 하기의 도식에 나타낸 것과 같이 링커를 통해 탄수화물 접합체에 부착되고, 여기서 X는 O 또는 S이다.
일부 구현예에서, RNAi 제제는 표 1에 정의되고 아래에 도시된 것과 같이 L96에 접합된다:
일부 구현예에서, 본 개시내용의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 탄수화물 접합체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
본원에 기술된 구현예에 사용하기 위한 또 다른 대표적인 탄수화물 접합체는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않고
(화학식 XXIII), X 또는 Y 중 하나가 올리고뉴클레오타이드인 경우, 다른 하나는 수소이다.
일부 구현예에서, 탄수화물 접합체는 전술된 하나 이상의 추가 리간드, 예를 들어 PK 조절제 및/또는 세포 투과 펩타이드를 추가로 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 iRNA는 링커를 통해 탄수화물에 접합된다. 본 개시내용의 조성물 및 방법의 링커와 iRNA 탄수화물 접합체의 비제한적인 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
및
X 또는 Y 중 하나가 올리고뉴클레오타이드인 경우, 다른 하나는 수소이다.
E. 열 불안정화 변형
특정 구현예에서, dsRNA 분자는 안티센스 가닥의 시드 영역에(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 위치 2~9에서) 열 불안정화 변형을 혼입시켜 오프-타겟 유전자 침묵을 감소시키거나 억제함으로써 RNA 간섭에 대해 최적화될 수 있다. 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여 처음 9개 뉴클레오타이드 위치 내 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 변형을 포함하는 안티센스 가닥을 갖는 dsRNA가 오프-표적 유전자 침묵 활성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 5' 영역의 처음 9개 뉴클레오타이드 위치 내에 듀플렉스의 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상)의 열 불안정화 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 듀플렉스의 하나 이상의 열 불안정화 변형(들)은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 2~9, 또는 바람직하게는 위치 4~8에 위치한다. 일부 추가 구현예에서, 듀플렉스의 열 불안정화 변형(들)은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 6, 7 또는 8에 위치한다. 또 일부 추가의 구현예에서, 듀플렉스의 열 불안정화 변형은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 7에 위치한다. 용어 "열 불안정화 변형(들)"은 보다 낮은 전체 용융 온도(Tm)(바람직하게, 이러한 변형(들)을 갖지 않는 dsRNA의 Tm 보다 1, 2, 3 또는 4도 낮은 Tm)을 갖는 dsRNA를 생성시키는 변형(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 듀플렉스의 열 불안정화 변형은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부 위치 2, 3, 4, 5 또는 9에 위치한다.
열 불안정화 변형은 무염기 변형; 반대 가닥 내 반대 뉴클레오타이드와의 미스매치; 및 2'-데옥시 변형 또는 비환형 뉴클레오타이드, 예를 들어, 잠김 해제된 핵산(UNA) 또는 글리콜 핵산(GNA)과 같은 당 변형을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
예시된 무염기 변형은 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
여기서 R = H, Me, Et 또는 OMe이고; R' = H, Me, Et 또는 OMe이고; R" = H, Me, Et 또는 OMe이며,
여기서 B는 변형되거나 미변형 핵염기이다.
예시된 당 변형은 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
여기서 B는 변형 또는 미변형 핵염기이다.
일부 구현예에서, 듀플렉스의 열 불안정화 변형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
여기서 B는 변형되거나 미변형 핵염기이고 각각의 구조 상에 별표는 R, S 또는 라세미체를 나타낸다.
용어 "비환형 뉴클레오타이드"는 비환형 리보스 당을 갖는 임의의 뉴클레오타이드를 지칭하고, 예를 들어, 여기서, 리보스 탄소 간의 임의의 결합(예를 들어, C1'-C2', C2'-C3', C3'-C4', C4'-O4', 또는 C1'-O4')은 부재하거나 리보스 탄소 또는 산소 (예를 들어, C1', C2', C3', C4' 또는 O4') 중 적어도 하나는 독립적으로 또는 조합되어 뉴클레오타이드가 부재한다. 일부 구현예에서, 비환형 뉴클레오타이드는 , , , 또는 이고, 여기서 B는 변형 또는 미변형 핵염기이고, R1 및 R2는 독립적으로 H, 할로겐, OR3, 또는 알킬이고; R3은 H, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당이다. 용어 "UNA"는 잠김 해제된 비환형 핵산이고, 여기서 당의 임의의 결합은 제거되어 잠김 해제된 "당" 잔기를 형성한다. 일례에서, UNA는 또한 C1'-C4' 사이의 결합(즉, C1'과 C4' 탄소 사이의 공유 탄소-산소-탄소 결합)이 제거된 단량체를 포괄한다. 또 다른 예에서, 당의 C2'-C3' 결합(즉, C2'와 C3' 탄소 사이의 공유 탄소-탄소 결합)이 제거된다(문헌참조: Mikhailov 등, Tetrahedron Letters, 26 (17): 2059 (1985); 및 Fluiter 등, Mol. Biosyst., 10: 1039 (2009), 이의 전문이 본원에 참조로서 통합됨). 비환형 유도체는 왓슨-크릭 쌍형성에 영향을 주는 것 없이 보다 큰 골격 가요성을 제공한다. 비환형 뉴클레오타이드는 2'-5' 또는 3'-5' 결합을 통해 결합될 수 있다.
용어 'GNA'는 글리콜 핵산을 지칭하며 이는 DNA 또는 RNA과 유사하지만 포스포디에스테르 결합에 의해 결합된 반복 글리세롤 유닛으로 이루어진다는 점에서 이의 "골격"의 조성이 상이하다.
듀플렉스의 열 불안정화 변형은 dsRNA 듀플렉스 내 열 불안정화 뉴클레오타이드와 반대 가닥의 반대 뉴클레오타이드 간의 미스매치(즉, 비상보성 염기쌍)일 수 있다. 예시적인 미스매치 염기쌍은 G:G, G:A, G:U, G:T, A:A, A:C, C:C, C:U, C:T, U:U, T:T, U:T, 또는 이의 조합을 포함한다. 당업계에 공지된 다른 미스매치 염기쌍 형성은 또한 본 발명에 적합할 수 있다. 미스매치는 천연적으로 존재하는 뉴클레오타이드 또는 변형 뉴클레오타이드인 뉴클레오타이드 간에 존재할 수 있고, 즉, 미스매치 염기쌍 형성은 뉴클레오타이드의 리보스 당에 대한 변형과는 무관하게 각각의 뉴클레오타이드로부터의 핵염기 사이에 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, dsRNA 분자는 2'-데옥시 핵염기인, 미스매치 쌍형성에 적어도 하나의 핵염기를 포함하고; 예를 들어, 2'-데옥시 핵염기는 센스 가닥 내 존재한다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥의 씨드 영역 내 듀플렉스의 열 불안정화 변형은 하기와 같은 표적 mRNA 상의 상보적 염기로의 손상된 W-C H-결합을 갖는 뉴클레오타이드를 포함한다:
.
무염기 뉴클레오타이드, 비환형 뉴클레오타이드 변형(UNA 및 GNA 포함) 및 미스매치 변형의 보다 많은 예는 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 국제특허번호 제2011/133876호에 상세히 기재되었다.
열 불안정화 변형은 또한 반대 염기와 수소 결합을 형성하는 능력이 감소되거나 폐지된 범용 용기, 및 포스페이트 변형을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 듀플렉스의 열 불안정화 변형은 반대 가닥에서 염기와 수소 결합을 형성하는 능력이 손상되거나 완전히 폐지된 핵염기 변형과 같은 비카노니칼 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 핵염기 변형은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 국제특허번호 제2010/0011895호에 기재된 것과 같이 dsRNA 듀플렉스의 중심 영역의 불안정화에 대해 평가되었다. 예시적인 핵염기 변형은 다음과 같다:
일부 구현예에서, 안티센스 가닥의 시드 영역 내 듀플렉스의 열 불안정화 변형은 하기와 같은 표적 mRNA 상의 염기에 상보적인 하나 이상의 α-뉴클레오타이드를 포함한다:
여기서 R은 H, OH, OCH3, F, NH2, NHMe, NMe2 또는 O-알킬이다.
천연 포스포디에스테르 결합과 비교하여 dsRNA 듀플렉스의 열 안정성을 감소시키는 것으로 알려진 예시적인 포스페이트 변형은 다음과 같다:
R 군에 대한 알킬은 C1-C6알킬일 수 있다. R 군에 대한 특이적 알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 펜틸 및 헥실을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
당업자가 인식하는 것과 같이, 핵염기의 기능적 역할의 관점에서 본 개시내용의 RNAi 제제의 특이성을 정의하는 한편, 핵염기 변형은 예를 들어, 오프-표적 효과에 상대적으로 온-표적 효과를 증진시킬 목적을 위해 본 명세서에 기재된 것과 같이 다양한 방식으로 수행되어, 예를 들어, 불안정화 변형을 본 개시내용의 RNAi 제제 내로 도입할 수 있으며, 다양한 범위의 변형이 가용하고, 일반적으로 본 개시내용의 RNAi 제제에 존재 시 비-핵염기 변형, 예를 들어 폴리리보뉴클레오타이드의 당 군 또는 포스페이트 골격에 대한 변형에 대해 훨씬 더 큰 경향이 있다. 이러한 변형은 본 개시내용의 다른 섹션에서 보다 상세히 기술되며, 명백하게 본 개시내용의 RNAi 제제에 대해 전술된 또는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 것과 같은 본래의 핵염기 또는 변형 핵염기를 소유하는 것으로 고려된다.
열 불안정화 변형을 포함하는 안티센스 가닥에 더해, dsRNA는 또한 하나 이상의 안정화 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, dsRNA는 적어도 2개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상)의 안정화 변형을 포함할 수 있다. 제한 없이, 안정화 변형은 모두 하나의 가닥에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 모두는 적어도 2개의 안정화 변형을 포함한다. 안정화 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 임의의 뉴클레오타이드 상에 존재할 수 있다. 예를 들어, 안정화 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 모든 뉴클레오타이드상에 존재할 수 있거나; 각각의 안정화 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 교호 패턴으로 존재할 수 있거나; 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교호 패턴으로 안정화 변형 모두를 포함한다. 센스 가닥 상의 안정화 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 상이할 수 있고, 센스 가닥 상의 안정화 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥 상의 안정화 변형의 교호 패턴에 상대적인 전환을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 적어도 2개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상)의 안정화 변형을 포함한다. 제한 없이, 안티센스 가닥에서 안정화 변형은 임의의 위치에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 5'-말단으로부터 위치 2, 6, 8, 9, 14, 및 16에 안정화 변형을 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 안티센스 가닥은 5'-말단으로부터 위치 2, 6, 14 및 16에 안정화 변형을 포함한다. 일부 또 다른 구현예에서, 안티센스 가닥은 5'-말단으로부터 위치 2, 14 및 16에 안정화 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 불안정화 변형에 인접하게 적어도 하나의 안정화 변형을 포함한다. 예를 들어, 안정화 변형은 불안정화 변형의 5'-말단 또 는 3'-말단에서, 즉, 불안정화 변형의 위치로부터 위치 -1 또는 +1에서의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 불안정화 변형의 5'-말단 및 3'-말단 각각에서, 즉 불안정화 변형의 위치로부터 위치 -1 및 +1에서 안정화 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 불안정화 변형의 3'-말단에서, 즉, 불안정화 변형의 위치로부터 위치 +1 및 +2에서 적어도 2개의 안정화 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 적어도 2개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상)의 안정화 변형을 포함한다. 제한 없이, 센스 가닥에서 안정화 변형은 임의의 위치에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 5'-말단으로부터 위치 7, 10 및 11에 안정화 변형을 포함한다. 일부 또 다른 구현예에서, 센스 가닥은 5'-말단으로부터 위치 7, 9, 10 및 11에 안정화 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여, 안티센스 가닥의 위치 11, 12, 및 15에 반대 또는 상보적인 위치에서 안정화 변형을 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여, 안티센스 가닥의 위치 11, 12, 13 및 15에 반대 또는 상보적인 위치에서 안정화 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 2, 3, 또는 4개의 안정화 변형의 블록을 포함한다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥에서 듀플렉스의 열 불안정화 변형과 반대 또는 상보적인 위치에서 안정화 변형을 포함하지 않는다.
예시적인 열 안정화 변형은 2'-플루오로 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 열 안정화 변형은 LNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 dsRNA는 적어도 4개(예를 들어, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 그 이상)의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 제한 없이, 2'-플루오로 뉴클레오타이드 모두는 하나의 가닥에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 모두는 적어도 2개의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 2'-플루오로 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 임의의 뉴클레오타이드 상에 존재할 수 있다. 예를 들어, 2'-플루오로 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 모든 뉴클레오타이드상에 존재할 수 있거나; 각각의 2'-플루오로 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 교호 패턴으로 존재할 수 있거나; 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교호 패턴으로 2'-플루오로 변형 모두를 포함한다. 센스 가닥 상의 2'-플루오로 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 상이할 수 있고, 센스 가닥 상의 2'-플루오로 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥 상의 2'-플루오로 변형의 교호 패턴에 상대적인 전환을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 적어도 2개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상)의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 제한 없이, 안티센스 가닥에서 2'-플루오로 변형은 임의의 위치에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 안티센스는 5'-말단으로부터 위치 2, 6, 8, 9, 14, 및 16에 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 안티센스는 5'-말단으로부터 위치 2, 6, 14, 및 16에 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 또 다른 구현예에서, 안티센스는 5'-말단으로부터 위치 2, 14, 및 16에 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 불안정화 변형에 인접하게 적어도 하나의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 2'-플루오로 뉴클레오타이드는 불안정화 변형의 5'-말단 또는 3'-말단에서, 즉, 불안정화 변형의 위치로부터 위치 -1 또는 +1에서의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 불안정화 변형의 5'-말단 및 3'-말단 각각에서, 즉 불안정화 변형의 위치로부터 위치 -1 및 +1에서 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 불안정화 변형의 3'-말단에, 즉, 불안정화 변형의 위치로부터 위치 +1 및 +2에 적어도 2개의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 적어도 2개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상)의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 제한 없이, 센스 가닥에서 2'-플루오로 변형은 임의의 위치에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 안티센스는 5'-말단으로부터 위치 7, 10, 및 11에 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 센스 가닥은 5'-말단으로부터 위치 7, 9, 10, 및 11에 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여, 안티센스 가닥의 위치 11, 12, 및 15에 반대 또는 상보적인 위치에서 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여, 안티센스 가닥의 위치 11, 12, 13 및 15에 반대 또는 상보적인 위치에서 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 2, 3, 또는 4개의 2'-플루오로 뉴클레오타이드의 블록을 포함한다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥 내 듀플렉스의 열 불안정화 변형과 반대 또는 상보적인 위치에 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 dsRNA 분자는 21개의 뉴클레오타이드(nt) 센스 가닥 및 23개의 뉴클레오타이드(nt) 안티센스를 포함하되, 안티센스 가닥은 적어도 하나의 열 불안정화 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 열 불안정화 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 시드 영역에서 (즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 위치 2~9) 발생하고, dsRNA의 하나의 단부는 둔화인 반면, 다른 단부는 2개의 뉴클레오타이드 오버행을 포함하되, dsRNA는 다음의 특징 중 선택적으로 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 모두)를 추가로 갖는다: (i) 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로 변형을 포함; (ii) 안티센스는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함; (iii) 센스 가닥은 리간드와 접합; (iv) 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개의 2'-플루오로 변형을 포함; (v) 센스 가닥은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함; (vi) dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 변형을 포함; 그리고 (vii) dsRNA는 안티센스 가닥의 5'-말단에 둔화 말단을 포함. 바람직하게, 2개 뉴클레오타이드 오버행은 안티센스의 3'-말단에 존재한다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형될 수 있다. 각각의 뉴클레오타이드는 동일하거나 상이한 변형으로 변형될 수 있으며, 이는 비-결합 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 모두 또는 결합 포스페이트 산소 중 하나 이상의 하나 이상의 변경; 리보스 당의 성분, 예를 들어, 리보스 당의 2' 하이드록실의 변경; 포스페이트 모이어티를 "데포스포" 링커로 대량 대체; 자연 발생 염기의 변형 또는 대체; 및 리보스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형을 포함할 수 있다.
핵산은 서브유닛의 중합체이므로, 많은 변형, 예를 들어, 염기, 또는 포스페이트 모이어티의 변형, 또는 포스페이트 모이어티의 비-결합 O이 핵산 내에서 반복되는 위치에서 발생한다. 일부 경우에, 변형은 핵산 내의 모든 대상체 위치에서 발생하지만, 많은 경우에 그렇지 않을 것이다. 예를 들어, 변형은 3'- 또는 5' 말단 위치에서만 발생할 수 있고, 말단 영역 내, 예를 들어, 말단 뉴클레오타이드 상의 위치에서 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10개 뉴클레오타이드에서만 발생할 수 있다. 변형은 이중 가닥 영역, 단일 가닥 영역 또는 둘 모두에서 발생할 수 있다. 변형은 RNA의 이중 가닥 영역에서만 발생할 수 있거나 RNA의 단일 가닥 영역에서만 발생할 수 있다. 예를 들어, 비-결합 O 위치에서 포스포로티오에이트 변형은 한쪽 또는 양쪽 말단에서만 발생할 수 있고, 말단 영역 내, 예를 들어, 말단 뉴클레오타이드 상의 위치에서 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10개 뉴클레오타이드에서만 발생할 수 있거나, 이중 가닥 및 단일 가닥 영역, 특히 말단에서 발생할 수 있다. 5'- 말단 또는 말단들은 인산화될 수 있다.
예를 들어, 안정성을 향상시키거나, 오버행에 특정 염기를 포함하거나, 변형 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 대리물을 단일 가닥 오버행에, 예를 들어, 5'- 또는 3'-오버행에, 또는 둘 모두에 포함하는 것이 가능할 수 있다. 예를 들어, 오버행에 퓨린 뉴클레오타이드를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서 3' 또는 5' 오버행의 염기 모두 또는 일부는, 예를 들어, 본원에 기술된 변형으로 변형될 수 있다. 변형은, 예를 들어, 당업계에 공지된 변형을 갖는 리보스 당의 2' 위치에서의 변형의 사용, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-플루오로(2'-F) 또는 핵염기의 리보당 대신 변형 2'-O-메틸의 사용, 및 포스페이트 군에서의 변형, 예를 들어, 포스포로티오에이트 변형의 사용을 포함할 수 있다. 오버행은 표적 서열과 상동성일 필요는 없다.
일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 잔기는 LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-데옥시, 또는 2'-플루오로로 독립적으로 변형된다. 가닥은 하나 초과의 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 잔기는 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 독립적으로 변형된다. 이들 변형은 안티센스 가닥 내 존재하는 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 변형에 추가로 있는 것으로 이해되어야만 한다.
적어도 2개의 상이한 변형은 통상적으로 센스 가닥 및 안티센스 가닥 상에 존재한다. 그러한 2개의 변형은 2'-데옥시, 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형, 비환형 뉴클레오타이드 또는 기타일 수 있다. 일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티 센스 가닥 각각은 2'-O-메틸 또는 2'-데옥시로부터 선택된 2개의 상이한 변형 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 잔기는 2'-O-메틸 뉴클레오타이드, 2'-데옥시 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오타이드, 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 뉴클레오타이드, 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸(2'-O-DMAEOE) 뉴클레오타이드, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP) 뉴클레오타이드 또는 2'-ara-F 뉴클레오타이드로 독립적으로 변형된다. 다시, 이들 변형은 안티센스 가닥 내 존재하는 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 변형에 추가로 있는 것으로 이해되어야만 한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 특히 B1, B2, B3, B1', B2', B3', B4' 영역에서 교호 패턴의 변형을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "교호 모티프" 또는 "교호 패턴"은 하나 이상의 변형을 갖는 모티프를 지칭하며, 각각의 변형은 한 가닥의 교호 뉴클레오타이드 상에서 발생한다. 교호 뉴클레오타이드는 하나 걸러 뉴클레오타이드 당 하나 또는 3개 뉴클레오타이드 당 하나 또는 유사한 패턴을 지칭할 수 있다. 예를 들어, A, B 및 C 각각이 뉴클레오타이드에 대한 하나의 유형의 변형을 나타내는 경우, 교호 모티프는 "ABABABABABAB…" "AABBAABBAABB…" "AABAABAABAAB…" "AAABAAABAAAB…" "AAABBBAAABBB…" 또는 "ABCABCABCABC…" 등일 수 있다.
교호 모티프에 포함된 변형의 유형은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, A, B, C, D 각각이 뉴클레오타이드 상에 한 유형의 변형을 나타내는 경우, 교호 패턴, 즉, 하나 걸러 뉴클레오타이드 상의 변형은 동일할 수 있지만, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 각각은 "ABABAB…", "ACACAC…" "BDBDBD…" 또는 "CDCDCD…" 등과 같은 교호 모티프 내 변형의 몇 가지 가능성으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNAi 분자는 전환한 안티센스 가닥 상의 교호 모티프에 대한 변형 패턴에 비해 센스 가닥 상의 교호 모티프에 대한 변형 패턴을 포함한다. 전환(shift)은 센스 가닥의 뉴클레오타이드의 변형 군이 안티 센스 가닥의 뉴클레오타이드의 상이하게 변형 군에 상응하도록 할 수 있고 그 반대의 경우도 마찬가지일 수 있다. 예를 들어, 센스 가닥이 dsRNA 듀플렉스 내 안티센스 가닥과 쌍을 형성하는 경우, 센스 가닥 내 교호 모티프는 가닥의 5'에서 3'로 "ABABAB"로 시작할 수 있고, 안티센스 가닥 내 교호 모티프는 듀플렉스 영역 내 가닥의 3'에서 5'로 "BABABA"로 시작할 수 있다. 또 다른 예로서, 센스 가닥 내 교호 모티프는 가닥의 5'-3'으로부터 "AABBAABB"로 시작할 수 있고, 안티센스 가닥 내 교호 모티프는 듀플렉스 영역 내 가닥의 3'-5'로부터 "BBAABBAA"로 시작할 수 있어, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이 변형 패턴의 완전한 또는 부분적인 전환이 존재한다.
본 개시내용의 dsRNA 분자는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합을 추가로 포함할 수 있다. 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형은 가닥의 임의의 위치의 센스 가닥, 또는 안티센스 가닥, 또는 둘 모두의 임의의 뉴클레오타이드 상에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 간 결합 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 모든 뉴클레오타이드에서 발생할 수 있고; 각각의 뉴클레오타이드 간 결합 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 교호 패턴으로 발생할 수 있고; 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교호 패턴으로 뉴클레오타이드 간 결합 변형 둘 모두를 포함한다. 센스 가닥 상의 뉴클레오타이드 간 결합 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 상이할 수 있고, 센스 가닥 상의 뉴클레오타이드 간 결합 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥 상의 뉴클레오타이드 간 결합 변형의 교호 패턴에 상대적인 전환을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자는 오버행 영역에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 포함한다. 예를 들어, 오버행 영역은 2개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합을 갖는 2개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 뉴클레오타이드 간 결합 변형은 또한 오버행 뉴클레오타이드를 듀플렉스 영역 내의 말단 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드와 결합하기 위해 만들어질 수 있다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4개, 또는 모든 오버행 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합을 통해 결합될 수 있고, 선택적으로, 오버행 뉴클레오타이드를 오버행 뉴클레오타이드 옆에 있는 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드와 결합하는 추가의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합이 있을 수 있다. 예를 들어, 말단 3개의 뉴클레오타이드 사이에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합이 있을 수 있고, 여기서 3개의 뉴클레오타이드 중 2개는 오버행 뉴클레오타이드이고, 세 번째는 오버행 뉴클레오타이드 옆의 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드이다. 바람직하게, 이들 말단 3개 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 3'-말단에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자의 센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개의 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합에 의해 분리된 2 내지 10개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 1~10개 블록을 포함하되, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열 내 임의의 위치에 위치하고 상기 센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합의 임의의 조합을 포함하는 안티센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18개의 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합에 의해 분리된 2개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 2개 블록을 포함하되, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열 내 임의의 위치에 위치하고 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개의 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합에 의해 분리된 3개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 2개 블록을 포함하되, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열 내 임의의 위치에 위치하고 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개의 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합에 의해 분리된 4개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 2개 블록을 포함하되, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열 내 임의의 위치에 위치하고 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합에 의해 분리된 5개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 2개 블록을 포함하되, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열 내 임의의 위치에 위치하고 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합에 의해 분리된 6개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 2개 블록을 포함하되, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열 내 임의의 위치에 위치하고 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합에 의해 분리된 7개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 2개 블록을 포함하되, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열 내 임의의 위치에 위치하고 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합에 의해 분리된 8개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 2개 블록을 포함하되, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열 내 임의의 위치에 위치하고 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 또는 4개의 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합에 의해 분리된 9개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 2개 블록을 포함하되, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열 내 임의의 위치에 위치하고 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 dsRNA 분자는 센스 또는 안티센스 가닥의 말단 위치(들)의 위치 1~10 내에 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 추가로 포함한다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오타이드는 센스 또는 안티센스 가닥의 하나의 말단 또는 두 말단 모두에서 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합을 통해 결합될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 dsRNA 분자는 각각의 센스 또는 안티센스 가닥의 듀플렉스의 내부 영역의 위치 1~10개 내에 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 추가로 포함한다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오타이드는 센스 가닥의 5 '-말단으로부터 계수하여 듀플렉스 영역의 위치 8~16에서 포스포로티오에이트 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합을 통해 결합될 수 있고; dsRNA 분자는 선택적으로 말단 위치(들)의 위치 1~10 내에 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1~5 내에 1 내지 5개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형(들) 및 위치 18~23 내에 1 내지 5개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형(들), 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2에 1 내지 5개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내에 1 내지 5개를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1~5 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 1개 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형, 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 2개 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1~5 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들 및 위치 18~23 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형, 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1~5 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들 및 위치 18~23 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들, 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1~5 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들 및 위치 18~23 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들, 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1~5 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형, 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들 및 위치 18~23 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 dsRNA 분자는 (5'-말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 위치 1~5 내 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 하나, 및 (5'-말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 위치 1 및 2 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 dsRNA 분자는 (5'-말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 위치 1~5 내 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형, 및 (5'-말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 위치 1 및 2 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 dsRNA 분자는 (5'-말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 위치 1~5 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형, 및 (5'-말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 위치 1 및 2 내 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 dsRNA 분자는 (5'-말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 위치 1~5 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 하나, 및 (5'-말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 위치 1 및 2 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 dsRNA 분자는 (5'-말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 위치 1~5 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형, 및 (5'-말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 위치 1 및 2 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 dsRNA 분자는 (5'-말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 위치 1~5 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형, 및 (5'-말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 위치 1 및 2 내 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 dsRNA 분자는 (5'-말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 20 및 21에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 (5'-말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 위치 1에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 21에 하나를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 dsRNA 분자는 (5'-말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 위치 1에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 21에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형, 및 (5'-말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 20 및 21에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 dsRNA 분자는 (5'-말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 21 및 22에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 (5'-말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 위치 1에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 21에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 dsRNA 분자는 (5'-말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 위치 1에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 21에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 (5'-말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 21 및 22에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 dsRNA 분자는 (5'-말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 22 및 23에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 (5'-말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 위치 1에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 21에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 dsRNA 분자는 (5'-말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 위치 1에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 21에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 (5'-말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 23 및 23에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 화합물은 골격 키랄 중심 패턴을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 5개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 6개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 7개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 8개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 9개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 10개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 11개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 12개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 13개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 14개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 15개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 16개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 17개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 18개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 19개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 8개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 7개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 6개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 5개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 4개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 3개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 2개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 1개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 (비제한적인 예로서, 포스포디에스테르) 8개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 7개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 6개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 5개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 4개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 3개 이하의 뉴클레오타이 드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 2개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 1개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 10개의 뉴클레오타이드 간 결합 및 키랄이 아닌 8개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 11개의 뉴클레오타이드 간 결합 및 키랄이 아닌 7개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 12개의 뉴클레오타이드 간 결합 및 키랄이 아닌 6개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 13개의 뉴클레오타이드 간 결합 및 키랄이 아닌 6개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 14개의 뉴클레오타이드 간 결합 및 키랄이 아닌 5개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 15개의 뉴클레오타이드 간 결합 및 키랄이 아닌 4개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, Sp 배위에서 뉴클레오타이드 간 결합은 선택적으로 연속성이거나 연속성이 아니다. 일부 구현예에서, Rp 배위에서 뉴클레오타이드 간 결합은 선택적으로 연속성이거나 연속성이 아니다. 일부 구현예에서, 키랄이 아닌 뉴클레오타이드 간 결합은 선택적으로 연속성이거나 연속성이 아니다.
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 블록을 포함하고 이는 입체화학 블록이다. 일부 구현예에서, 블록은 블록의 각각의 뉴클레오타이드 간 결합이 Rp인 Rp 블록이다. 일부 구현예에서, 5'-블록은 Rp 블록이다. 일부 구현예에서, 3'-블록은 Rp 블록이다. 일부 구현예에서, 블록은 블록의 각각의 뉴클레오타이드 간 결합이 Sp인 Sp 블록이다. 일부 구현예에서, 5'-블록은 Sp 블록이다. 일부 구현예에서, 3'-블록은 Sp 블록이다. 일부 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오타이드는 Rp 및 Sp 블록 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오타이드는 Sp 블록이 아닌 하나 이상의 Rp를 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오타이드는 Rp 블록이 아닌 하나 이상의 Sp를 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 PO 블록을 포함하고, 여기서 각각의 뉴클레오타이드 간 결합은 천연 포스페이트 결합이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 5'-블록을 포함하고 이는 Sp 블록이고, 각각의 당 모이어티는 2'-F 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 5'-블록은 Sp 블록이고, 여기서, 뉴클레오타이드 간 결합 각각은 변형 뉴클레오타이드 간 결합이고, 각각의 당 모이어티는 2'-F 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 5'-블록은 Sp 블록이되, 각각의 뉴클레오타이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고, 각각의 당 모이어티는 2'-F 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 5'-블록은 4개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 5'-블록은 5개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 5'-블록은 6개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 5'-블록은 7개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 3'-블록은 Sp 블록이고, 여기서 각각의 당 모이어티는 2'-F 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 3'-블록은 Sp 블록이고, 여기서, 뉴클레오타이드 간 결합 각각은 변형 뉴클레오타이드 간 결합이고, 각각의 당 모이어티는 2'-F 변형을 포함한다. 일부 구현예에 서, 3'-블록은 Sp 블록이고, 여기서, 뉴클레오타이드 간 결합 각각은 포스포로티오에이트 결합이고 각각의 당 모이어티는 2'-F 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 3'-블록은 4개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 3'-블록은 5개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 3'-블록은 6개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 3'-블록은 7개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 화합물은 영역 내 한 유형의 뉴클레오사이드를 포함하거나, 올리고뉴클레오타이드에 이어서 특정 유형의 뉴클레오타이드 간 결합, 예를 들어, 천연 포스페이트 결합, 변형 뉴클레오타이드 간 결합, Rp 키랄 뉴클레오타이드 간 결합, Sp 키랄 뉴클레오타이드 간 결합 등이 온다. 일부 구현예에서, A에 이어서 Sp가 있다. 일부 구현예에서, A에 이어서 Rp가 있다. 일부 구현예에서, A에 이어서 천연 포스페이트 결합(PO)이 있다. 일부 구현예에서, U에 이어서 Sp가 있다. 일부 구현예에서, U에 이어서 Rp가 있다. 일부 구현예에서, U에 이어서 천연 포스페이트 결합(PO)이 있다. 일부 구현예에서, C에 이어서 Sp가 있다. 일부 구현예에서, C에 이어서 Rp가 있다. 일부 구현예에서, C에 이어서 천연 포스페이트 결합(PO)이 있다. 일부 구현예에서, G에 이어서 Sp가 있다. 일부 구현예에서, G에 이어서 Rp가 있다. 일부 구현예에서, G에 이어서 천연 포스페이트 결합(PO)이 있다. 일부 구현예에서, C 및 U에 이어서 Sp가 있다. 일부 구현예에서, C 및 U에 이어서 Rp가 있다. 일부 구현예에서, C 및 U에 이어서 천연 포스페이트 결합(PO)이 있다. 일부 구현예에서, A 및 G에 이어서 Sp가 있다. 일부 구현예에서, A 및 G에 이어서 Rp가 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 dsRNA 분자는 듀플렉스 내에서 표적과 미스매치(들), 또는 이들의 조합을 포함한다. 미스매치는 오버행 영역 또는 듀플렉스 영역에서 발생할 수 있다. 염기쌍은 해리 또는 용융을 촉진하는 경향에 따라 순위가 매겨질 수 있다(예를 들어, 특정 쌍형성의 결합 또는 해리의 자유 에너지에 따라 가장 간단한 접근법은 개별 쌍을 기준으로 쌍을 검사하는 것이지만, 다음 이웃 또는 유사한 분석이 사용될 수도 있다). 해리를 촉진시키는 측면에서: A:U는 G:C 보다 바람직하고; G:U는 G:C 보다 바람직하고; I:C는 G:C 보다 바람직하다(I=이노신). 미스매치, 예를 들어, 비-카노니칼 또는 카노니칼 이외의 쌍형성(본원의 다른 곳에 기술된 것과 같이)은 카노니칼(A:T, A:U, G:C) 쌍형성 보다 바람직하고; 범용 염기를 포함하는 쌍형성은 카노니칼 쌍형성보다 바람직하다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 듀플렉스의 5'-말단에서 안티센스 가닥의 해리를 촉진하기 위해, 하기를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내에서 처음 1, 2, 3, 4, 또는 5개 염기쌍 중 적어도 하나를 포함한다: A:U, G:U, I:C, 및 미스매치쌍, 예를 들어, 비-카노니칼 또는 카노니칼쌍 이외의 것 또는 범용 염기를 포함하는 쌍은 듀플렉스의 5'-말단에서 안티센스 가닥의 해리를 촉진한다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥 내 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 1 위치에 있는 뉴클레오타이드는 A, dA, dU, U, 및 dT으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 대안적으로, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 처음 1, 2, 또는 3개 염기쌍 중 적어도 하나는 AU 염기쌍이다. 예를 들어, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 처음 염기쌍은 AU 염기쌍이다.
단일 가닥 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드의 임의의 위치에서 4'-변형 또는 5'-변형 뉴클레오타이드의 디뉴클레오타이드의 포스포티에스테르(PO), 포스포로티오에이트(PS), 또는 포스포로디티오에이트(PS2) 결합의 3'-말단으로의 도입이 뉴클레오타이드 간 결합에 대한 입체 효과를 나타낼 수 있어 뉴클레아제에 대해 이를 보호하거나 안정화시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
일부 구현예에서, 5'-변형 뉴클레오사이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에서 도입된다. 예를 들어, 5'-알킬화된 뉴클레오사이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에서 도입될 수 있다. 리보스 당의 5' 위치에서 알킬 군은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 5'-알킬화된 뉴클레오사이드는 5'-메틸 뉴클레오사이드이다. 5'-메틸은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다.
일부 구현예에서, 4'-변형 뉴클레오사이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에서 도입된다. 예를 들어, 4'-알킬화된 뉴클레오사이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에서 도입될 수 있다. 리보스 당의 4' 위치에서 알킬 군은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 4'-알킬화된 뉴클레오사이드는 4'-메틸 뉴클레오사이드이다. 4'-메틸은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 대안적으로, 4'-O-알킬화된 뉴클레오사이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에 도입될 수 있다. 리보스 당의 4'-O-아킬은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성질체일 수 있다. 예시적인 4'-O-알킬화된 뉴클레오사이드는 4'-O-메틸 뉴클레오사이드이다. 4'-O-메틸은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성질체일 수 있다.
일부 구현예에서, 5'-알킬화된 뉴클레오사이드는 dsRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 임의의 위치에 도입되고, 이러한 변형은 dsRNA의 효능을 유지시키거나 개선시킨다. 5'-알킬은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 5'-알킬화된 뉴클레오사이드는 5'-메틸 뉴클레오사이드이다. 5'-메틸은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다.
일부 구현예에서, 4'-알킬화된 뉴클레오사이드는 dsRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 임의의 위치에 도입되고, 이러한 변형은 dsRNA의 효능을 유지시키거나 개선시킨다. 4'-알킬은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 4'-알킬화된 뉴클레오사이드는 4'-메틸 뉴클레오사이드이다. 4'-메틸은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다.
일부 구현예에서, 4'-O-알킬화된 뉴클레오사이드는 dsRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 임의의 위치에 도입되고, 이러한 변형은 dsRNA의 효능을 유지시키거나 개선시킨다. 5'-알킬은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 4'-O-알킬화된 뉴클레오사이드는 4'-O-메틸 뉴클레오사이드이다. 4'-O-메틸은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성질체일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 dsRNA 분자는 2'-5' 결합(2'-H, 2'-OH 및 2'-OMe를 갖고 P=O 또는 P=S)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2'-5' 결합 변형을 사용하여 뉴클레아제 내성을 촉진시키거나 센스 가닥의 안티센스 가닥으로의 결합을 억제할 수 있거나, 센스 가닥의 5' 말단에서 사용하여 RISC에 의한 센스 가닥 활성화를 회피할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 dsRNA 분자는 L 당(예를 들어, 2'-H, 2'-OH 및 2'-OMe를 갖는 L 리보스, L-아라비노스)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이들 L 당 변형을 사용하여 뉴클레아제 내성을 촉진시키거나 센스 가닥의 안티센스 가닥으로의 결합을 억제할 수 있거나, 센스 가닥의 5' 말단에서 사용하여 RISC에 의한 센스 가닥 활성화를 회피할 수 있다.
다양한 공개 공보는 모두 본 발명의 dsRNA와 함께 사용될 수 있는 다량체 siRNA를 기재한다. 이러한 공개 공보는 국제특허번호 제2007/091269호, 미국 특허번호 제7858769호, 국제특허번호 제2010/141511호, 제2007/117686호, 제2009/014887호, 및 제2011/031520호를 포함하고 이의 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 dsRNA 분자는 5' 인산화되었거나 5' 원 말단에서 포스포릴 유사체를 포함한다. 5'-포스페이트 변형은 RISC 매개 유전자 침묵과 양립할 수 있는 것들을 포함한다. 적절한 변형은 다음을 포함한다: 5'-모노포스페이트((HO)2(O)P-O-5'); 5'-디포스페이트((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-트리포스페이트((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-구아노신 캡(7-메틸화 또는 비-메틸화)(7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-아데노신 캡(Appp), 및 임의의 변형 또는 미변형 뉴클레오타이드 캡 구조(N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-모노티오포스페이트(포스포로티오에이트; (HO)2(S)P-O-5'); 5'-모노디티오포스페이트(포스포로디티오에이트; (HO)(HS)(S)P-O-5'), 5'-포스포로티올레이트 ((HO)2(O)P-S-5'); 산소/황 대체 모노포스페이트, 디포스페이트 및 트리포스페이트의 임의의 추가 조합(예를 들어, 5'-알파-티오트리포스페이트, 5'-감마-티오트리포스페이트, 등), 5'-포스포라미데이트 ((HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5'), 5'-알킬포스포네이트(R=알킬=메틸, 에틸, 이소프로필, 프로필, 등, 예를 들어, RP(OH)(O)-O-5'-, 5'-알케닐포스포네이트(즉, 비닐, 치환된 비닐), (OH)2(O)P-5'-CH2-), 5'-알킬에테르포스포네이트(R=알킬에테르=메톡시메틸(MeOCH2-), 에톡시메틸, 등, 예를 들어, RP(OH)(O)-O-5'-). 일례에서, 변형은 dsRNA 분자의 안티센스 가닥에 배치될 수 있다.
F. 링커
일부 구현예에서, 본원에 기술된 접합체 또는 리간드는 절단될 수 있거나 절단될 수 없는 다양한 링커로 iRNA 올리고뉴클레오타이드에 부착될 수 있다.
링커는 통상적으로 직접 결합 또는 산소 또는 황과 같은 원자, NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH와 같은 단위 또는 원자 사슬, 예를 들어, 하지만 비제한적으로, 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 알케닐, 치환되거나 비치환된 알키닐, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알킬, 헤테로아릴알케닐, 헤테로아릴알키닐, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로사이클릴알케닐, 헤테로사이클릴알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬아릴알킬, 알킬아릴알케닐, 알킬아릴알키닐, 알케닐아릴알킬, 알케닐아릴알케닐, 알케닐아릴알키닐, 알키닐아릴알킬, 알키닐아릴알케닐, 알키닐아릴알키닐, 알킬헤테로아릴알킬, 알킬헤테로아릴알케닐, 알킬헤테로아릴알키닐, 알케닐헤테로아릴알킬, 알케닐헤테로아릴알케닐, 알케닐헤테로아릴알키닐, 알키닐헤테로아릴알킬, 알키닐헤테로아릴알케닐, 알키닐헤테로아릴알키닐, 알킬헤테로사이클릴알킬, 알킬헤테로사이클릴알케닐, 알킬헤테로사이클릴알키닐, 알케닐헤테로사이클릴알킬, 알케닐헤테로사이클릴알케닐, 알케닐헤테로사이클릴알키닐, 알키닐헤테로사이클릴알킬, 알키닐헤테로사이클릴알케닐, 알키닐헤테로사이클릴알키닐, 알킬아릴, 알케닐아릴, 알키닐아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐헤테로아릴, 알키닐헤테로아릴을 포함하고, 여기서 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), 치환되거나 비치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릭에 의해 중단되거나 종결될 수 있고; 여기서 R8은 수소, 아실, 지방족 또는 치환된 지방족이다. 일부 구현예에서, 링커는 약 1~24개 원자 사이, 2~24, 3~24, 4~24, 5~24, 6~24, 6~18, 7~18, 8~18개 원자, 7~17, 8~17, 6~16, 7~16, 또는 8~16개 원자이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 dsRNA는 화학식 (XXXI) ~ (XXXIV) 중 임의의 것에 나타낸 구조의 군으로부터 선택된 2가 또는 3가 분지형 링커에 접합된다:
상기 식에서:
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B 및 q5C는 각 경우에 독립적으로 0~20을 나타내고, 여기서 반복 단위는 동일하거나 상이할 수 있고;
P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C는 부재하는 각 경우에 각각 독립적으로 CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH 또는 CH2O이고;
Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C는 부재하는 각 경우에 독립적으로 알킬렌, 치환된 알킬렌이고, 여기서 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R')=C(R''), C≡C 또는 C(O) 중 하나 이상에 의해 중단되거나 종결될 수 있고;
R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C는 부재하는 각 경우에 각각 독립적으로 NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O, , , , , 또는 헤테로시클릴이고;
L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B 및 L5C는 리간드를 나타내고; 즉, 각각의 발생에 대해 각각 독립적으로 단당류(예컨대 GalNAc), 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당류 또는 다당류를 나타내고; Ra는 H 또는 아미노산 측쇄이다. 3가 접합 GalNAc 유도체는, 화학식 XXXV의 것과 같은 표적 유전자의 발현을 억제하기 위해 RNAi 제제와 함께 사용하기에 특히 유용하다:
,
여기서 L5A, L5B 및 L5C는 GalNAc 유도체와 같은 단당류를 나타낸다.
GalNAc 유도체를 접합시키는 적합한 2가 및 3가 분지형 링커 군의 예는 화학식 II, VII, XI, X, 및 XIII로서 앞서 언급된 구조를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
절단가능한 결합기는 세포 외부에서 충분히 안정할 수 있지만 표적 세포로 진입 시 절단되어 링커가 함께 유지하고 있는 2개의 부분을 방출시키는 군이다. 일부 구현예에서, 절단가능한 결합기는 대상체의 혈액에서 또는 제2 참조 조건(예를 들어, 혈액 또는 혈청 중에서 발견되는 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있는) 하에서 보다 표적 세포에서 또는 제1 참조 조건(예를 들어, 세포내 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있는) 하에서 적어도 약 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 이상 또는 적어도 약 100배 신속하게 절단된다.
절단가능한 결합기는 절단제, 예를 들어, pH, 산화환원 전위 또는 분해 분자의 존재에 민감할 수 있다. 일반적으로, 절단제는 혈청 또는 혈액에서 보다 세포 내부에서 보다 높은 수준 또는 활성인 상태로 보다 만연해 있거나 발견된다. 그러한 분해제의 예는 다음을 포함한다: 특정 기질에 대해 선택되거나 어떠한 기질 특이성을 갖지 않는 산화환원제로서, 이는 예를 들어, 산화 또는 환원 효소 또는 환원제, 예를 들어, 환원에 의해 산화환원 절단가능한 결합기를 분해시킬 수 있는 세포에 존재하는 머캅탄을 포함하는 산화환원제; 에스테라제; 엔도좀 또는 산성 환경을 생성시킬 수 있는 제제, 예를 들어, 5 이하의 pH를 유도하는 것들; 일반산으로서 작용함에 의해 산 절단가능한 결합기를 가수분해시키거나 분해할 수 있는 효소, 펩티다제(이는 기질 특이적일 수 있다), 및 포스파타제.
절단가능한 결합기, 예를 들어, 디설파이드 결합은 pH에 민감할 수 있다. 사람 혈청의 pH는 7.4이고, 평균 세포내 pH는 약간 더 낮아 약 7.1~7.3 범위이다. 엔도좀은 5.5~6.0의 범위에서 보다 산성의 pH를 갖고, 리소좀은 약 5.0에서 심지어 보다 산성의 pH를 갖는다. 일부 링커는 적합한 pH에서 절단되어 세포 내부의 리간드로부터 양이온성 지질을 방출하거나 세포의 목적하는 구획으로 양이온성 지질을 방출하는 절단가능한 결합기를 갖는다.
링커는 특정 효소에 의해 절단될 수 있는 절단가능한 결합기를 포함할 수 있다. 링커로 혼입된 절단가능한 결합기의 유형은 표적화될 세포에 의존할 수 있다.
일반적으로, 후보 절단가능한 결합기의 적합성은 후보 결합기를 절단하는 분해제(또는 조건)의 능력을 시험함으로써 평가될 수 있다. 또한 혈액 내에서 또는 다른 비표적 조직과 접촉할 때 절단에 저항하는 능력에 대해 후보 절단가능한 결합기를 테스트하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 따라서, 당업자는 제1 조건 과 제2 조건 사이의 절단에 대한 상대적인 감수성을 결정할 수 있고, 여기서 제1 조건은 표적 세포에서 절단을 나타내도록 선택되고, 제2 조건은 다른 조직 또는 생물학적 유체, 예를 들어 혈액 또는 혈청 내 절단을 나타내도록 선택된다. 평가는 무세포 시스템, 세포, 세포 배양물, 기관 또는 조직 배양물 또는 전체 동물에서 수행될 수 있다. 무세포 또는 배양 조건에서 초기 평가를 수행하고 전체 동물에서 추가적으로 평가함으로써 확인하는 것이 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 유용한 후보 화합물은 혈액 또는 혈청(또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에서)과 비교하여 세포(또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에서)에서 적어도 약 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 약 100배 더 신속하게 절단된다.
i. 산화환원 절단가능한 결합기
일부 구현예에서, 절단가능한 결합기는 환원 또는 산화 시 절단되는 산화환원 절단가능한 결합기이다. 환원 절단가능한 결합기의 예는 디설파이드 결합기(-S-S-)이다. 후보 절단 가능한 결합기가 적합한 "환원 절단가능한 결합기"인지 또는 예를 들어 특정 iRNA 모이어티 및 특정 표적화제와 함께 사용하기에 적합한지의 여부를 결정하기 위해, 당업자는 본원에 기술된 방법을 살펴볼 수 있다. 예를 들어, 후보물은 세포, 예를 들어 표적 세포에서 관찰되는 절단 속도를 모방하는 당업계에 공지된 시약을 사용하여 디티오트레이톨(DTT) 또는 기타 환원제를 사용한 항온처리에 의해 평가될 수 있다. 후보물은 또한 혈액 또는 혈청 조건을 모방하도록 선택된 조건 하에서 평가될 수 있다. 하나에서, 후보 화합물은 혈액에서 최대 약 10%만큼 절단된다. 다른 구현예에서, 유용한 후보 화합물은 혈액(또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건하에서)과 비교하여 세포(또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건하에서)에서 적어도 약 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 약 100배 보다 신속하게 분해 된다. 후보 화합물의 절단 속도는 세포내 배지를 모방하도록 선택된 조건 및 세포외 배지를 모방하도록 선택된 조건과 비교하여 표준 효소 동역학 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
ii. 포스페이트-기반 절단가능한 결합기
일부 구현예에서, 절단가능한 링커는 포스페이트 기반 절단가능한 결합기를 포함한다. 표스페이트 기반 절단가능한 결합기는 포스페이트기를 분해하거나 가수분해하는 제제에 의해 절단된다. 세포에서 포스페이트기를 절단하는 제제의 예는 세포의 포스파타제와 같은 효소이다. 포스파타제 기반 결합기의 예는 -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)( Rk)-S-이다. 일부 구현예서, 포스페이트 기반 결합기는 -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-이다. 일부 구현예에서, 포스페이트 기반 결합기는 -O-P(O)(OH)-O-이다. 이들 후보물은 전술된 것들과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
iii. 산 절단가능한 결합기
일부 구현예에서, 절단가능한 링커는 산 절단가능한 결합기를 포함한다. 산 절단가능한 결합기는 산성 조건 하에서 절단되는 결합기이다. 일부 구현예에서, 산 절단가능한 결합기는 pH가 약 6.5 이하(예를 들어, 약 6.0, 5.75, 5.5, 5.25, 5.0 이하)인 산성 환경에서 또는 일반 산으로서 작용할 수 있는 효소와 같은 제제에 의해 절단된다. 세포에서, 엔도좀 및 리소좀과 같은 특정 낮은 pH 기관은 산 절단가능한 결합기에 대한 절단 환경을 제공할 수 있다. 산 절단가능한 결합기의 예는 하이드라존, 에스테르, 및 아미노산의 에스테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 산 절단가능한 기는 일반 화학식 -C=NN-, C(O)O, 또는 -OC(O)를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 에스테르의 산소에 부착된 탄소(알콕시 기)는 아릴 기, 치환된 알킬 기 또는 3급 알킬 기, 예를 들어, 디메틸 펜틸 또는 t-부틸이다. 이들 후보물은 전술된 것들과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
iv. 에스테르 기반 절단가능한 결합기
일부 구현예에서, 절단가능한 링커는 에스테르 기반 절단가능한 결합기를 포함한다. 에스테르 기반 절단가능한 결합기는 세포의 에스테라제 및 아미다제와 같은 효소에 의해 절단된다. 에스테르 기반 절단가능한 결합기의 예는 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌 기의 에스테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 에스테르 절단가능한 연결기는 화학식 -C(O)O- 또는 -OC(O)-를 갖는다. 이들 후보물은 전술된 것들과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
v. 펩타이드 기반 절단가능한 결합기
일부 구현예에서, 절단가능한 링커는 펩타이드 기반 절단가능한 결합기를 포함한다. 펩타이드 기반 절단가능한 결합기는 세포의 펩티다제 및 프로테아제와 같은 효소에 의해 절단된다. 펩타이드 기반 절단가능한 결합기는 아미노산 사이에 형성된 펩타이드 결합이고 올리고펩타이드(예를 들어, 디펩타이드, 트리펩타이드 등) 및 폴리펩타이드를 생성한다. 펩타이드 기반 절단가능한 기는 아미드 기(-C(O)NH-)를 포함하지 않는다. 아미드 기는 임의의 알킬렌, 알케닐렌 또는 알키넬렌 사이에 형성될 수 있다. 펩타이드 결합은 아미노산 사이에 형성된 특별한 유형의 아미드 결합이고 펩타이드 및 단백질을 생성한다. 펩타이드 기반 절단 기는 일반적으로 펩타이드 및 단백질을 생성하는 아미노산 사이에 형성된 펩타이드 결합(즉, 아미드 결합)으로 제한되고, 전체 아미드 작용기를 포함하지 않는다. 펩타이드-기반 절단가능한 결합기는 일반 화학식 - NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-을 갖고, 여기서 RA 및 RB는 2개의 인접한 아미노산의 R 군이다. 이들 후보물은 전술된 것들과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다. RNA 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 번호 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호, 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호, 제5,391,723호; 제5,416,203호, 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호; 및 제5,688,941호; 제6,294,664호; 제6,320,017호; 제6,576,752호; 제6,783,931호; 제6,900,297호; 제7,037,646호; 제8,106,022호를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이들 각각의 전문은 본원에 참조로 통합된다.
주어진 화합물의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없으며 실제로 앞서 언급한 변형 중 하나 이상이 단일 화합물 또는 심지어 iRNA 내의 단일 뉴클레오사이드에 혼입될 수 있다. 본 개시내용은 또한 키메라 화합물인 iRNA 화합물을 포함한다.
본 개시내용의 맥락에서, "키메라" iRNA 화합물 또는 "키메라"는 iRNA 화합물, 예를 들어 dsRNA이고, 이는 2개 이상의 화학적으로 상이한 영역을 함유하고, 이들 각각은 적어도 하나의 단량체 유닛, 즉, dsRNA 화합물의 경우에는 뉴클레오타이드로 구성된다. 이들 iRNA는 통상적으로 적어도 하나의 영역을 함유하고, 여기서 RNA는 iRNA에 뉴클레아제 분해에 대해 증가된 내성, 증가된 세포 취득, 및/또는 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화성을 부여하도록 변형된다. iRNA의 추가의 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질로서 작용할 수 있다. 예를 들어, RNase H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포 엔도뉴클레아제이다. RNase H의 활성화는 따라서 RNA 표적을 절단하여 유전자 발현의 iRNA 억제의 효율을 증진시킨다. 결과적으로, 상응하는 결과는 흔히 키메라 dsRNA가 사용되는 경우 동일한 표적 영역에 하이브리드화하는 포스포로티오에이트 데옥시 dsRNA와 비교하여, 보다 짧은 iRNA를 사용하여 수득될 수 있다. RNA 표적의 절단은 통상적으로 겔 전기영동 및 필요한 경우, 당업계에 공지된 연합된 핵산 하이브리드화 기술에 의해 검출될 수 있다.
특정 경우에, iRNA의 RNA는 비-리간드 군에 의해 변형될 수 있다. 다수의 비-리간드 분자는 iRNA에 접합되어 iRNA의 활성, 세포 분포 또는 세포 취득을 증진시키고, 이러한 접합을 수행하기 위한 과정은 과학 문헌에서 이용가능하다. 이러한 비-리간드 모이어티는 지질 모이어티, 예컨대 콜레스테롤(문헌참조: Kubo, T. 등, Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54~61; Letsinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), 콜산(문헌참조: Manoharan 등, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), 티오에테르, 예를 들어, 헥실-S-트리틸티올(문헌참조: Manoharan 등, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan 등, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), 티오콜레스테롤(문헌참조: Oberhauser 등, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), 지방족 사슬, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기(문헌참조: Saison-Behmoaras 등, EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov 등, FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk 등, Biochimie, 1993, 75:49), 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(문헌참조: Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea 등, Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(문헌참조: Manoharan 등, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), 또는 아다만탄 아세트산(문헌참조: Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), 손바닥 모이어티(문헌참조: Mishra 등, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티(문헌참조: Crooke 등, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923)를 포함한다. 이러한 RNA 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 앞서 열거되었다. 통상적인 접합 프로토콜은 서열의 하나 이상의 위치에서 아미노링커를 함유하는 RNA의 합성을 포함한다. 아미노 군은 이어서 적당한 커플링 또는 활성화 시약을 사용하여 접합된 분자와 반응시킨다. 접합 반응은 고체 지지체에 여전히 결합된 RNA를 사용하거나 용액 상에서 RNA의 절단 후 수행될 수 있다. HPLC에 의한 RNA 접합체의 정제는 통상적으로 순수한 접합체를 제공한다.
V. iRNA의 전달
iRNA를 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하는 것은 다수의 상이한 방식으로 달성될 수 있다. 생체내 전달은 iRNA, 예를 들어, dsRNA를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함으로써 직접적으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 전달은 iRNA의 발현을 암호화하고 이를 지시하는 하나 이상의 벡터를 투여함으로써 간접적으로 수행될 수 있다. 이들 대안은 하기에서 추가로 논의된다.
A. 직접 전달
일반적으로, 핵산 분자를 전달하는 임의의 방법은 iRNA와 사용하기 위해 채택될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Akhtar S. 및 Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139~144 및 WO94/02595, 이의 전문은 본원에 참조로서 통합된다). 그러나, iRNA 분자를 생체내로 성공적으로 전달하기 위해 고려해야 할 중요한 세 가지 인자들에는 다음이 있다: (a) 전달된 분자의 생물학적 안정성, (2) 비특이적 효과의 예방, 및 (3) 표적 조직에서의 전달된 분자의 축적. iRNA의 비특이적 효과는 국소 투여에 의해, 예를 들어, 조직(비제한적인 예로서, 눈)으로의 직접적인 주사 또는 이식에 의해 또는 국소적으로 제제를 투여함에 의해 최소화될 수 있다. 치료 부위로의 국소 투여는 제제의 국소 농도를 최대화하고, 다르게는 제제에 의해 방해될 수 있거나 제제를 분해시킬 수 있는 전신 조직으로의 제제의 노출을 제한하고, 보다 낮은 총 용량의 iRNA 분자가 투여될 수 있게 한다. 여러 연구는 iRNA가 국소로 투여되는 경우 유전자 생성물의 성공적인 녹다운을 보여주었다. 예를 들어, 시노몰구스 원숭이에서 유리체내 주사에 의해 VEGF dsRNA의 안내 전달(문헌참조: Tolentino, MJ. 등(2004) Retina 24:132~138) 및 마우스에서 망막하 주사(문헌참조: Reich, SJ. 등 (2003) Mol. Vis. 9:210~216)는 모두 연령-관령 반점 변성 실험 모델에서 신혈관 형성을 예방하는 것으로 나타났다. 또한, 마우스에서의 dsRNA의 직접 종양내 주사는 종양 부피를 감소시키고(문헌참조: Pille, J. 등 (2005) Mol. Ther. 11:267~274) 종양 보유 마우스의 생존을 연장시킨다(문헌참조: Kim, WJ. 등(2006) Mol. Ther. 14:343~350; Li, S. 등(2007) Mol. Ther. 15:515~523). RNA 간섭은 또한 직접 주사에 의한 CNS로의 국소 전달에서 성공적이고(문헌참조: Dorn, G. 등(2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH. 등(2005) Gene Ther. 12:59~66; Makimura, H. 등(2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., 등(2004) Neuroscience 129:521~528; Thakker, ER., 등(2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270~17275; Akaneya,Y., 등(2005) J. Neurophysiol. 93:594~602) 비강내 투여에 의한 폐로의 국소 전달에서 성공적인 것으로 나타났다(Howard, KA. 등(2006) Mol. Ther. 14:476~484; Zhang, X. 등(2004) J. Biol. Chem. 279:10677~10684; Bitko, V. 등(2005) Nat. Med. 11:50~55). 질환의 치료를 위한 iRNA의 전신 투여를 위해, RNA는 변형될 수 있거나 대안적으로 약물 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있고; 방법 모두는 엔도- 및 엑소- 뉴클레아제에 의해 생체내 dsRNA의 신속한 분해를 방지하는 작용을 한다.
RNA 또는 약제학적 캐리어의 변형은 또한 iRNA 조성물을 표적 조직으로 표적화할 수 있도록 하고, 바람직하지 않은 오프-표적 효과를 피할 수 있도록 한다. iRNA 분자는 다른 기, 예를 들어 본원에 기술된 것과 같은 지질 또는 탄수화물에 대한 화학적 접합에 의해 변형될 수 있다. 이러한 접합체는 iRNA를 특정 세포, 예를 들어 간 세포(liver cells), 예를 들어 간세포(hepatocytes)로 표적화하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, GalNAc 접합체 또는 지질(예를 들어, LNP) 제형은 iRNA를 특정 세포, 예를 들어 간 세포, 예를 들어 간세포로 표적화하는 데 사용될 수 있다.
iRNA 분자는 또한 콜레스테롤과 같은 친유성 기에 대한 화학적 접합에 의해 변형되어 세포 흡수를 증진시키고 분해를 방지할 수 있다. 예를 들어, 친유성 콜레스테롤 모이어티에 접합된 ApoB에 대해 지시된 iRNA가 마우스에 전신 주사되고 간과 공장 둘 모두에서 apoB mRNA의 녹다운을 초래하였다(문헌참조: Soutschek, J., 등(2004) Nature 432:173~178). iRNA의 압타머로의 접합은 전립선암의 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하고 종양 퇴행을 매개하는 것으로 나타났다(문헌참조: McNamara, JO. 등(2006) Nat. Biotechnol. 24:1005~1015). 대안적인 구현예에서, iRNA는 나노입자, 덴드리머, 중합체, 리포좀 또는 양이온성 전달 시스템과 같은 약물 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 양으로 하전된 양이온성 전달 시스템은 iRNA 분자(음으로 하전된)의 결합을 촉진시키고 또한 음으로 하전된 세포막에서 상호작용을 증진시켜 세포에 의한 iRNA의 효율적인 흡수를 가능하게 한다. 양이온성 지질, 덴드리머 또는 중합체는 iRNA에 결합될 수 있거나 iRNA를 내장하는 소포 또는 마이셀을 형성하도록 유도될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Kim SH, 등(2008) Journal of Controlled Release 129(2):107~116). 소포 또는 마이셀의 형성은 전신 투여되는 경우 iRNA의 분해를 추가로 방지한다. 양이온성-iRNA 복합체를 제조하고 투여하기 위한 방법은 능히 당업자의 능력 범위 내에 있다(문헌참조: 예를 들어, Sorensen, DR, 등(2003) J. Mol. Biol 327:761~766; Verma, UN, 등(2003) Clin. Cancer Res. 9:1291~1300; Arnold, AS 등(2007) J. Hypertens. 25:197~205, 이의 전문이 본원에 참조로서 통합된다). iRNA의 전신 전달에 유용한 약물 전달 시스템의 일부 비제한적인 예는 DOTAP(문헌참조: Sorensen, DR., 등(2003), 전술됨; Verma, UN, 등(2003), 전술됨), 올리고펙타민, "고체 핵산 지질 입자"(문헌참조: Zimmermann, TS, 등(2006) Nature 441:111~114), 카디오리핀(문헌참조: Chien, PY, 등(2005) Cancer Gene Ther. 12:321~328; Pal, A, 등(2005) Int J. Oncol. 26:1087~1091), 폴리에틸렌이민(문헌참조: Bonnet ME, 등(2008) Pharm. Res. Aug 16 인쇄 전 Epub; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), Arg-Gly-Asp(RGD) 펩타이드(문헌참조: Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472~487), 및 폴리아미도아민(문헌참조: Tomalia, DA, 등(2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61~67; Yoo, H., 등(1999) Pharm. Res. 16:1799~1804)을 포함한다. 일부 구현예에서, iRNA는 전신 투여를 위해 사이클로덱스트린과 복합체를 형성한다. iRNA 및 사이클로덱스트린의 투여 및 약제학적 조성물 위한 방법은 미국 특허번호 제7,427,605호에서 확인할 수 있고, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
B. 벡터 암호화된 iRNA
또 다른 양태에서, MYOC를 표적으로 하는 iRNA는 DNA 또는 RNA 벡터에 삽입된 전사 유닛으로부터 발현될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Couture, A, 등, TIG. (1996), 12:5~10; Skillern, A, 등, 국제 PCT 공개번호 WO 00/22113, Conrad, 국제 PCT 공개번호 WO 00/22114, 및 Conrad, 미국 특허번호 제6,054,299호). 발현은 사용된 특정 작제물 및 표적 조직 또는 세포 유형에 따라 일시적(수 시간 내지 수 주의 순서로)이거나 지속될(수 주 내지 수 개월 또는 그 이상) 수 있다. 이들 전이유전자는 선형 작제물, 환형 플라스미드 또는 바이러스 벡터로서 도입될 수 있고, 이는 통합 또는 비-통합 벡터일 수 있다. 전이유전자는 또한 염색체외 플라스미드로서 유전될 수 있도록 구성될 수 있다(문헌참조: Gassmann, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
iRNA의 개별 가닥 또는 가닥들은 발현 벡터 상에서 프로모터로부터 전사될 수 있다. 2개의 별개의 가닥이 발현되어, 예를 들어, dsRNA를 생성하는 경우, 2개의 별개의 발현 벡터는 (예를 들어, 형질감염 또는 감염에 의해) 표적 세포 내로 공동 도입될 수 있다. 대안적으로, dsRNA의 각각의 개별 가닥은 동일한 발현 플라스미드에 위치한 프로모터 둘 모두에 의해 전사될 수 있다. 일부 구현예에서, dsRNA는 dsRNA가 스템 및 루프 구조를 갖도록 링커 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 연결된 역위 반복으로서 발현된다.
iRNA 발현 벡터는 통상적으로 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다. 진핵 세포와, 예를 들어 영양 세포와 상용성인 발현 벡터를 사용하여 본원에 기술된 것과 같은 iRNA의 발현을 위한 재조합 작제물을 생성할 수 있다. 진핵 세포 발현 벡터는 당업계에 잘 알려져 있으며 다수의 상업적 공급원으로부터 입수 가능하다. 통상적으로, 이러한 벡터는 원하는 핵산 분절의 삽입을 위한 편리한 제한 부위를 함유한다. iRNA 발현 벡터의 전달은 예컨대 정맥내 또는 근육내 투여에 의해, 환자로부터 추출된 표적 세포에 투여한 후 환자에게 재도입함으로써, 또는 목적하는 표적 세포로의 도입을 허용하는 임의의 다른 수단에 의해 전신적일 수 있다.
iRNA 발현 플라스미드는 양이온성 지질 캐리어(예를 들어, 올리고펙타민) 또는 비-양이온성 지질 기반 캐리어(예를 들어, Transit-TKOTM)와의 복합체로서 표적 세포 내로 형질감염될 수 있다. 일주일 이상의 기간에 걸쳐 표적 RNA의 상이한 영역을 표적으로 하는 iRNA-매개된 녹다운에 대한 다수의 지질 형질감염이 또한 본 개시내용에 의해 고려된다. 벡터의 숙주 세포 내로의 성공적인 도입은 다양한 공지된 방법을 사용하여 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 일시적인 형질감염은 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 형광 마커와 같은 리포터를 통해 신호 전달될 수 있다. 생체외 세포의 안정적인 형질감염은 형질감염된 세포에 하이그로마이신 B 내성과 같은 특정 환경 인자(예를 들어, 항생제 및 약물)에 대한 내성을 제공하는 마커를 사용하여 보장될 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 조성물과 사용될 수 있는 바이러스 벡터 시스템은 (a) 아데노바이러스 벡터; (b) 렌티바이러스 벡터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 레트로바이러스 벡터; (c) 아데노-관련 바이러스 벡터; (d) 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터; (e) SV40 벡터; (f) 폴리오마 바이러스 벡터; (g) 파필로마 바이러스 벡터; (h) 피코나바이러스 벡터; (i) 수두 바이러스 벡터, 예컨대, 오르토폭스, 예를 들어, 백시니아 바이러스 벡터 또는 아비폭스, 예를 들어, 카나리 수두 또는 가금류 수두; 및 (j) 헬퍼-의존성 또는 거트리스(gutless) 아데노바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 복제 결함 바이러스가 또한 유리할 수 있다. 상이한 벡터는 세포의 게놈에 도입되거나 도입되지 않는다. 작제물은 경우에 따라 형질감염을 위한 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 작제물은 에피좀 복제가 가능한 벡터, 예를 들어, EPV 및 EBV 벡터 내로 혼입될 수 있다. iRNA의 재조합 발현을 위한 작제물은 일반적으로 표적 세포 내 iRNA의 발현을 확실히 하기 위해 조절 요소, 예를 들어, 프로모터, 인핸서 등을 필요로 한다. 벡터 및 작제물에 대해 고려할 다른 양태가 하기에 추가로 기술되어 있다.
iRNA의 전달에 유용한 벡터는 원하는 표적 세포 또는 조직에서 iRNA의 발현에 충분한 조절 요소(프로모터, 인핸서 등)를 포함할 것이다. 조절 요소는 구성적 또는 조절된/유도성 발현을 제공하도록 선택될 수 있다.
iRNA의 발현은, 예를 들어 특정 생리학적 조절인자, 예를 들어 순환 포도당 수준, 또는 호르몬에 민감한 유도성 조절 서열을 사용함으로써 정확하게 조절될 수 있다(문헌참조: Docherty 등, 1994, FASEB J. 8:20~24). 세포 또는 포유동물에서 dsRNA 발현의 조절에 적합한 이러한 유도성 발현 시스템은, 예를 들어 엑디손, 에스트로겐, 프로게스테론, 테트라사이클린, 이량체화의 화학적 유도제, 및 이소프로필-β-D1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)에 의한 조절을 포함한다. 당업자는 iRNA 이식유전자의 의도된 용도에 기초하여 적절한 조절/프로모터 서열을 선택할 수 있을 것이다.
특정 구현예에서, iRNA를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터가 사용될 수 있다(문헌참조: Miller 등, Meth. Enzymol. 217:581~599(1993)). 이들 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 정확한 패키징 및 숙주 세포 DNA 내로의 통합에 필요한 성분을 함유한다. iRNA를 암호화하는 핵산 서열은 하나 이상의 벡터 내로 클로닝되며, 이는 핵산의 환자로의 전달을 용이하게 한다. 레트로바이러스 벡터에 대한 보다 상세한 내용은, 예를 들어, 문헌[Boesen 등, Biotherapy 6:291~302(1994)]에서 확인할 수 있으며, 이는 줄기 세포가 화학요법에 더 내성이 있게 하기 위해 조혈 줄기 세포에 mdr1 유전자를 전달하기 위한 레트로바이러스 벡터의 사용을 기술한다. 유전자 요법에서의 레트로바이러스 벡터 사용을 예시하는 다른 참조 문헌은 다음과 같다: Clowes 등, J. Clin. Invest. 93:644~651(1994); Kiem 등, Blood 83:1467~1473(1994); Salmons 및 Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129~141(1993); 및 Grossman 및 Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110~114(1993). 사용을 위해 고려되는 렌티바이러스 벡터는, 예를 들어, 본원에 참조로 인용되는 미국 특허번호 제6,143,520호; 제5,665,557호; 및 제5,981,276호에 기술된 HIV 기반 벡터를 포함한다.
아데노바이러스는 또한 iRNA의 전달에 사용하기 위해 고려된다. 아데노바이러스는, 예를 들어, 호흡기 상피에 유전자를 전달하기 위한 특히 매력적인 비히클이다. 아데노바이러스는 자연적으로 호흡기 상피를 감염시켜 경미한 질환을 유발한다. 아데노바이러스 기반 전달 시스템의 다른 표적은 간, 중추신경계, 내피 세포, 및 근육이다. 아데노바이러스는 비분할 세포를 감염시킬 수 있는 이점을 갖는다. 문헌[Kozarsky 및 Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499~503(1993)]은 아데노바이러스 기반 유전자 요법에 대한 검토를 제시한다. 문헌[Bout 등, Human Gene Therapy 5:3~10(1994)]은 붉은털 원숭이의 호흡기 상피에 유전자를 전달하기 위한 아데노바이러스 벡터의 사용을 입증하였다. 유전자 요법에서 아데노바이러스를 사용하는 다른 경우는 문헌[Rosenfeld 등, Science 252:431~434(1991); Rosenfeld 등, Cell 68:143~155(1992); Mastrangeli 등, J. Clin. Invest. 91:225~234(1993); PCT 공개번호 WO94/12649; 및 Wang, 등, Gene Therapy 2:775~783(1995)]에서 확인할 수 있다. 본 개시내용에서 특징 지어진 iRNA를 발현시키기 위한 적절한 AV 벡터, 재조합 AV 벡터를 작제하기 위한 방법, 및 벡터를 표적 세포 내로 전달하기 위한 방법은 문헌[Xia H 등(2002), Nat. Biotech. 20: 1006~1010]에 기술되어 있다.
아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터의 사용 또한 고려된다(문헌참조: Walsh 등., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289~300(1993); 미국 특허번호 제5,436,146호). 일부 구현예에서, iRNA는, 예를 들어 U6 또는 H1 RNA 프로모터, 또는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터를 갖는 재조합 AAV 벡터로부터 2개의 별도의 상보적 단일-가닥 RNA 분자로서 발현될 수 있다. 본 개시내용에서 특징 지어진 dsRNA를 발현시키기 위한 적절한 AAV 벡터, 재조합 AV 벡터를 작제하기 위한 방법, 및 벡터를 표적 세포 내로 전달하기 위한 방법은 문헌[Samulski R 등(1987), J. Virol. 61: 3096~3101; Fisher K J 등(1996), J. Virol., 70: 520~532; Samulski R 등(1989), J. Virol. 63: 3822~3826]; 미국 특허번호 제5,252,479호; 제5,139,941호; 국제 특허출원 번호 WO 94/13788; 및 WO 93/24641에 기술되어 있으며, 이의 전체 개시내용이 본원에 참조로 인용된다.
또 다른 통상적인 바이러스 벡터는 우두 바이러스와 같은 수두 바이러스, 예를 들어, 변형된 바이러스 앙카라(MVA) 또는 NYVAC와 같은 약독화된 우두, 가금류 수두 또는 카나리 수두와 같은 아비폭스이다.
바이러스 벡터의 향성은 외피 단백질 또는 다른 바이러스로부터의 다른 표면 항원으로 벡터를 위형화함으로써, 또는 적절한 경우 상이한 바이러스 캡시드 단백질을 치환함으로써 변형될 수 있다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터는 소포성 구내염 바이러스(VSV), 광견병, 에볼라, 모콜라 등의 표면 단백질로 위형화될 수 있다. AAV 벡터는 벡터가 상이한 캡시드 단백질 혈청형을 발현하도록 조작함으로써 상이한 세포를 표적화하도록 제조될 수 있다; 예를 들어 문헌[Rabinowitz J E 등(2002), J Virol 76:791~801]을 참조하며, 이의 전체 개시내용이 본원에 참조로 인용된다.
벡터의 약제학적 제제는 허용 가능한 희석제의 벡터를 포함하거나, 유전자 전달 비히클이 삽입된 저속 방출 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 완전한 유전자 전달 벡터가 재조합 세포, 예를 들어 레트로바이러스 벡터로부터 온전하게 생산될 수 있는 경우, 약제학적 제제는 유전자 전달 시스템을 생산하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.
VI. iRNA를 함유하는 약제학적 조성물
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 것과 같은 iRNA를 함유하는 약제학적 조성물 및 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 제공된다. iRNA를 함유하는 약제학적 조성물은 MYOC의 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 장애(예를 들어, 원발성 개방각 녹내장(POAG)과 같은 녹내장)를 치료하는 데 유용하다. 이러한 약제학적 조성물은 전달 방식을 기준으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 조성물은, 예를 들어, 안구내 전달(예를 들어, 유리체내 주사와 같은 유리체내 투여; 경공막 주사와 같은 경공막 투여; 결막하 주사와 같은 결막하 투여; 역외 주사와 같은 역외 투여; 장내 주사와 같은 장내 투여; 또는 망막하 주사와 같은 망막하 투여)에 의한 국소(localized) 전달을 위해 제형화될 수 있다. 다른 구현예에서, 조성물은 국소(topical) 전달을 위해 제형화될 수 있다. 또 다른 예에서, 조성물은 비경구 전달을 통한, 예를 들어 피하(IV) 전달에 의한 전신 투여를 위해 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조성물(예를 들어, GalNAc 접합체 또는 LNP 제형을 포함하는 조성물)은 정맥내 전달을 위해 제형화된다.
본원에서 특징 지어진 약제학적 조성물은 MYOC의 발현을 억제하기에 충분한 용량으로 투여된다. 일반적으로, iRNA의 적절한 투여량은 수용자의 킬로그램 체중 당 일일 0.01 내지 200.0mg의 범위일 것이다. 약제학적 조성물은 1일 1회 투여될 수 있거나, iRNA는 하루 종일 적절한 간격으로 2회, 3회 또는 그 이상의 하위 용량으로 투여되거나, 심지어 조절 방출 제형을 통한 연속 주입 또는 전달을 사용하여 투여될 수 있다. 이 경우, 각각의 하위 용량에 함유된 iRNA는 총 일일 투여량을 달성하기 위해 이에 상응하여 더 작아야 한다. 투여 단위는 또한, 예를 들어, 수일에 걸쳐 iRNA의 서방출을 제공하는 종래의 서방형 제형을 사용하여, 수일에 걸쳐 전달하기 위해 화합될 수 있다. 서방형 제형은 당업계에 잘 알려져 있고, 특정 부위에서의 제제의 전달에 특히 유용하며, 예컨대 본 개시내용의 제제와 함께 사용될 수 있다. 본 구현예에서, 투여 단위는 일일 투여량에 상응하는 배수를 함유한다.
MYOC 수준에 대한 단일 투여량의 효과는, 후속 투여량이 3, 4, 또는 5일 미만의 간격, 또는 1, 2, 3, 4, 12, 24, 또는 36주 미만의 간격으로 투여되도록 오래 지속될 수 있다.
당업자는 질환 또는 장애의 중증도, 이전의 치료, 대상체의 일반적인 건강 및/또는 연령 및 존재하는 다른 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는 소정의 요인들이 대상체를 효과적으로 치료하기 위해 요구되는 용량 및 타이밍에 영향을 줄 수 있음을 인지한다. 또한, 치료학적 유효량의 조성물을 사용한 대상체의 치료는 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 본 개시내용에 포함되는 개별 iRNA에 대한 유효 투여량 및 생체내 반감기의 추정치는 종래의 방법론을 사용하여 또는 적절한 동물 모델을 사용한 생체내 시험에 기초하여 이루어질 수 있다.
적절한 동물 모델, 예를 들어, 마우스 또는 시노몰구스 원숭이, 예를 들어, 인간 MYOC를 발현하는 이식유전자를 함유하는 동물이 MYOC siRNA의 치료적 유효 투여량 및/또는 유효 투여량 요법 투여를 결정하는 데 사용될 수 있다.
본 개시내용은 또한 본원에서 특징 지어진 iRNA 화합물을 포함하는 약제학적 조성물 및 제형을 포함한다. 본 개시내용의 약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지의 여부 및 치료될 부위에 따라 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소(예를 들어, 안구내 주사에 의해), 국소(예를 들어, 점안액에 의해), 또는 비경구일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입; 예를 들어 이식된 장치를 통한 피하 투여; 또는 두개내, 예를 들어 실질내, 척추강내 또는 뇌실내 투여를 포함한다.
국소 투여를 위한 약제학적 조성물 및 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 적가제, 좌제, 분무, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 약제학적 캐리어, 수성, 분말 또는 오일 기제, 증점제 등이 필요하거나 요구될 수 있다. 코팅된 콘돔, 글로브 등 또한 유용할 수 있다. 적합한 국소 제형은 본 개시내용에서 특징 지어진 iRNA가 지질, 리포좀, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트화제 및 계면활성제와 같은 국소 전달제와 혼합되어 있는 것들을 포함한다. 적절한 지질 및 리포좀은 중성(예를 들어, 디올레오일포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아로리포스파티딜 콜린) 음성(예를 들어, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온성(예를 들어, 디올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)을 포함한다. 본 개시내용에서 특징 지어진 iRNA는 리포좀 내에 캡슐화될 수 있거나, 특히 양이온성 리포좀에 복합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, iRNA는 지질, 특히 양이온성 지질과 복합체화될 수 있다. 적합한 지방산 및 에스테르는 아라키돈산, 올레산, 에이코산산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린 또는 C1-20 알킬 에스테르(예를 들어, 이소프로필미리스테이트 IPM), 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 국소 제형은 본원에 참조로 인용된 미국 특허번호 제6,747,014호에 상세히 기술되어 있다.
A. 리포좀 제형
약물의 제형화에 대해 연구되고 사용된 미세유화액 이외에 많은 조직화된 계면활성제 구조가 존재한다. 이들은 단층, 마이셀, 이중층 및 소포를 포함한다. 리포좀과 같은 소포는 약물 전달의 관점에서 이들이 제공하는 특이성 및 작용 지속 기간 때문에 큰 관심을 끌었다. 본 개시내용에서 사용되는 것과 같이, 용어 "리포좀"은 구형 이중층 또는 이중층으로 배열된 양친매성 지질로 이루어진 소포를 의미한다.
리포좀은 친유성 물질 및 수성 내부로 형성된 막을 갖는 단층 및 다중층 소포이다. 수성 부분은 전달될 조성물을 함유한다. 양이온성 리포좀은 세포 벽에 융합할 수 있는 이점을 갖는다. 비-양이온성 리포좀은 세포 벽과 효율적으로 융합할 수는 없지만, 생체내에서 대식세포에 의해 흡수된다.
온전한 포유동물 피부를 통과하기 위해 지질 소포는 적합한 경피 농도구배의 영향 하에 각각 직경이 50nm 미만인 일련의 미세 공극을 통과해야 한다. 따라서, 고도로 변형 가능하고 이러한 미세 공극을 통과할 수 있는 리포좀을 사용하는 것이 바람직하다.
리포좀의 추가 이점은 다음을 포함한다; 천연 인지질로부터 수득된 리포좀은 생체적합이며 생분해 가능하고; 리포좀은 광범위한 수용성 및 지용성 약물을 포함할 수 있고; 리포좀은 이들의 내부 격실에서 캡슐화된 약물을 대사 및 분해로부터 보호할 수 있다(문헌참조: Rosoff의 Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). 리포좀 제형의 제조에서 중요한 고려사항은 지질 표면 전하, 소포 크기 및 리포좀의 수성 용적이다.
리포좀은 활성 성분을 작용 부위로 수송 및 전달하는 데 유용하다. 리포좀 막은 생물학적 막과 구조적으로 유사하기 때문에, 리포좀이 조직에 적용될 때, 리포좀은 세포 막과 병합되기 시작하고, 리포좀과 세포의 병합이 진행됨에 따라, 리포좀 함량은 활성제가 작용할 수 있는 세포 내로 비워진다.
리포좀 제형은 많은 약물의 전달 방법으로서 광범위한 조사의 초점이 되어 왔다. 국소 투여의 경우, 리포좀이 다른 제형에 비해 여러 이점을 제공한다는 증거가 증가하고 있다. 이러한 이점들은 투여된 약물의 높은 전신 흡수와 관련된 부작용 감소, 목적하는 표적에서의 투여된 약물의 축적 증가, 및 피부로 친수성 및 소수성 둘 모두인 다양한 약물을 투여하는 능력을 포함한다.
몇몇 보고는 고분자량 DNA를 포함하는 제제를 피부에 전달하는 리포좀의 능력을 상세히 설명하였다. 진통제, 항체, 호르몬 및 고분자량 DNA를 포함하는 화합물이 피부에 투여되었다. 대부분의 적용은 상부 표피의 표적화를 초래하였다
리포좀은 2개의 광범위한 부류로 분류된다. 양이온성 리포좀은 안정한 복합체를 형성하기 위해 음으로 하전된 DNA 분자와 상호작용하는 양으로 하전된 리포좀이다. 양으로 하전된 DNA/리포좀 복합체는 음으로 하전된 세포 표면에 결합하고 엔도좀에 내재화된다. 엔도좀 내 산성 pH로 인해, 리포좀은 붕괴되어, 이들의 내용물을 세포질로 방출한다(문헌참조: Wang 등, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980~985).
pH 민감성이거나 음으로 하전된 리포좀은 이와의 복합체 보다 DNA를 포집한다. DNA와 지질 둘 모두는 유사하게 하전되기 때문에 복합체 형성보다는 반발이 일어난다. 그럼에도 불구하고, 일부 DNA는 이들 리포좀의 수성 내부에 포집된다. pH 민감성 리포좀은 티미딘 키나아제 유전자를 암호화하는 DNA를 배양 중의 세포 단층으로 전달하는 데 사용되어 왔다. 외인성 유전자의 발현이 표적 세포에서 검출 되었다(문헌참조: Zhou 등, Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269~274).
리포좀 조성물 중 하나의 주요 유형은 자연적으로 유래된 포스파티딜콜린 이외에 인지질을 포함한다. 중성 리포좀 조성물은, 예를 들어 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)으로부터 형성될 수 있다. 음이온성 리포좀 조성물은 일반적으로 디미리스토일 포스파티딜글리세롤로부터 형성되는 반면, 음이온성 융합 리포좀은 주로 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로부터 형성된다. 또 다른 유형의 리포좀 조성물은 예를 들어, 대두 PC 및 계란 PC와 같은 포스파티딜콜린(PC)으로부터 형성된다. 또 다른 유형은 인지질 및/또는 포스파티딜콜린 및/또는 콜레스테롤의 혼합물로부터 형성된다.
여러 연구에서 피부에 대한 리포좀 약물 제형의 국소 전달이 평가되어 왔다. 인터페론을 함유하는 리포좀을 기니피그 피부에 적용하면 피부 헤르페스 궤양이 감소한 반면, 다른 수단(예를 들어, 용액 또는 유화액)을 통한 인터페론의 전달은 효과적이지 않았다(문헌참조: Weiner 등, Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405~410). 또한, 추가 연구는 수성 시스템을 사용한 인터페론의 투여에 대한 리포좀 제형의 일부로서 투여된 인터페론의 효능을 시험하였고, 리포좀 제형이 수성 투여보다 우수하다는 결론을 내렸다(문헌참조: du Plessis 등, Antiviral Research, 1992, 18, 259~265).
비이온성 리포좀 시스템은 또한 피부, 특히 비이온성 계면활성제 및 콜레스테롤을 포함하는 시스템으로의 약물 전달에서의 유용성을 결정하기 위해 조사되었다. NovasomeTM I(글리세릴 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 NovasomeTM II(글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비이온성 리포좀 제형은 마우스 피부의 진피로 사이클로스포린-A를 전달하기 위해 사용되었다. 결과는 이러한 비이온성 리포좀 시스템이 피부의 다른 층에 사이클로스포린-A의 침착을 촉진하는 데 효과적임을 나타냈다(문헌참조: Hu 등, S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
리포좀은 또한 "입체적으로 안정화된" 리포좀을 포함하는데, 본원에 사용된 용어는 리포좀으로 도입될 때 이러한 특수화된 지질이 부족한 리포좀에 비해 순환 수명을 증진시키는 하나 이상의 특수화된 지질을 포함하는 리포좀을 지칭한다. 입체적으로 안정화된 리포좀의 예는 리포좀의 소포 형성 지질 부분의 일부가 (A)모노시알로강글리오사이드 GM1과 같은 하나 이상의 당지질을 포함하거나 (B) 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티와 같은 하나 이상의 친수성 중합체로 유도체화된 것들이다. 임의의 특정 이론에 국한시키고자 하는 것 없이, 당업계에서 적어도 강글리오사이드, 스핑고마이엘린 또는 PEG 유도체화된 지질을 함유하는 적어도 입체적으로 안정화된 리포좀에 대해, 이들 입체적으로 안정화된 리포좀의 증진된 순환 반감기는 세망내피 시스템(RES)의 세포로의 감소된 흡수로부터 유래한다고 여겨진다(문헌참조: Allen 등, FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu 등, Cancer Research, 1993, 53, 3765).
하나 이상의 당지질을 포함하는 다양한 리포좀은 당업계에 공지되어 있다. Papahadjopoulos 등 (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64)은 리포좀의 혈액 반감기를 개선하는 모노시알로간글리오사이드 GM1, 갈락토세레브로사이드 설페이트 및 포스파티딜리노시톨의 능력을 보고하였다. 이러한 소견은 Gabizon 등(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949)에 의해 설명되었다. Allen 등의 미국 특허번호 제4,837,028호 및 국제특허번호 제88/04924호 둘 모두는 (1) 스핑고마이엘린 및 (2) 강글리오사이드 GM1 또는 갈락토세레브로사이드 설페이트 에스테르를 포함하는 리포좀을 개시한다. 미국 특허번호 제5,543,152호(Webb 등)는 스핑고마이엘린을 포함하는 리포좀을 개시한다. 1,2-sn-디미리스토일포스파티딜콜린을 포함하는 리포좀이 국제특허번호 제97/13499호(Lim 등)에 개시되어 있다.
하나 이상의 친수성 중합체로 유도체화된 지질을 포함하는 많은 리포좀, 및 이의 제조 방법이 당업계에 공지되어 있다. Sunamoto 등(Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778)은 PEG 모이어티를 함유하는 비이온성 세제, 2C1215G를 포함하는 리포좀을 기술하였다. Illum 등(FEBS Lett., 1984, 167, 79)은 폴리스티렌 입자를 중합체 글리콜로 친수성 코팅하면 혈액 반감기가 상당히 향상됨을 언급하였다. 폴리알킬렌 글리콜(예를 들어, PEG)의 카르복실기의 부착에 의해 변형된 합성 인지질은 Sears(미국 특허번호 제4,426,330호 및 제4,534,899호)에 의해 기술되었다. Klibanov 등(FEBS Lett., 1990, 268, 235)은 PEG 또는 PEG 스테아레이트로 유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PE)을 포함하는 리포좀이 혈액 순환 반감기를 상당히 증가시킨다는 것을 입증하는 실험을 기술하였다. Blume 등(Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91)은 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE)과 PEG의 조합으로 형성된 다른 PEG-유도체화된 인지질, 예를 들어 DSPE-PEG로 이러한 관찰을 확장시켰다. 외부 표면 상에 공유 결합된 PEG 모이어티를 갖는 리포좀은 Fisher의 유럽 특허 EP 0 445 131 B1 및 국제특허번호 제90/04384호에 기술되어 있다. PEG로 유도체화된 1~20 몰%의 PE를 함유하는 리포좀 조성물, 및 이의 사용 방법은 Woodle 등(미국 특허번호 제5,013,556호 및 제5,356,633호) 및 Martin 등(미국 특허번호 제5,213,804호 및 유럽 특허번호 EP 0 496 813 B1)에 의해 기술된다. 다수의 다른 지질-중합체 접합체를 포함하는 리포좀은 국제특허번호 제91/05545호 및 미국 특허번호 제5,225,212호(둘 다 Martin 등) 및 국제특허번호 제94/20073호(Zalipsky 등)에 개시되어 있다. PEG-변형된 세라마이드 지질을 포함하는 리포좀은 국제특허번호 제96/10391호(Choi 등)에 기술되어 있다. 미국 특허번호 제5,540,935호(Miyazaki 등) 및 미국 특허번호 제5,556,948호(Tagawa 등)는 표면 상의 기능성 모이어티로 추가로 유도체화될 수 있는 PEG 함유 리포좀을 기술한다.
핵산을 포함하는 다수의 리포좀이 당업계에 공지되어 있다. Thierry 등의 국제특허번호 제96/40062호는 리포좀에 고분자량 핵산을 캡슐화하는 방법을 개시한다. Tagawa 등의 미국 특허번호 제5,264,221호는 단백질-결합 리포좀을 개시하며, 이러한 리포좀의 함량이 dsRNA를 포함할 수 있다고 주장한다. Rahman 등의 미국 특허번호 제5,665,710호는 리포좀에 올리고데옥시뉴클레오타이드를 캡슐화하는 특정 방법을 기술한다. Love 등의 국제특허번호 제97/04787호는 raf 유전자로 표적화된 dsRNA를 포함하는 리포좀을 개시한다.
또 다른 유형의 리포좀인 트랜스페로좀은 약물 전달 비히클에 대한 매력적인 후보인 고도로 변형 가능한 지질 응집체이다. 트랜스페로좀은 변형이 매우 커서 액적보다 작은 공극을 통해 쉽게 투과할 수 있는 지질 액적으로서 기술될 수 있다. 트랜스페로좀은 이들이 사용되는 환경에 적용 가능한데, 예를 들어, 이들은 자가 최적화(피부의 공극 형태에 적응)하고, 자가 복구하고, 흔히 단편화 없이 이들의 표적에 도달하고, 종종 자가 부하한다. 트랜스페로좀을 제조하기 위해, 표면 엣지 활성화제, 일반적으로 계면활성제를 표준 리포솜 조성물에 첨가할 수 있다. 트랜스페로좀은 혈청 알부민을 피부에 전달하기 위해 사용되었다. 혈청 알부민의 트랜스페로좀-매개 전달은 혈청 알부민을 함유하는 용액의 피하 주사만큼 효과적인 것으로 나타났다.
계면활성제는 제형, 예컨대 에멀젼(마이크로에멀젼 포함) 및 리포좀에 광범위하게 적용된다. 천연 및 합성 계면활성제의 많은 다양한 유형의 성질을 분류하고 순위를 매기는 가장 일반적인 방법은 친수성/친유성 균형(HLB)을 사용하는 것이다. 친수성 군("헤드"로서도 공지된)의 특성은 제형에 사용되는 다양한 계면활성제를 분류하는 데 가장 유용한 수단을 제공한다(문헌참조: Rieger의 Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
계면활성제 분자가 이온화되지 않으면 비이온성 계면활성제로 분류된다. 비이온성 계면활성제는 약제 및 화장품에 광범위하게 적용되며 광범위한 pH 값에서 사용할 수 있다. 일반적으로 이들의 HLB 값은 이들의 구조에 의존하여 2 내지 약 18 범위이다. 비이온성 계면활성제는 에틸렌 글리콜 에스테르, 프로필렌 글리콜 에스테르, 글리세릴 에스테르, 폴리글리세릴 에스테르, 소르비탄 에스테르, 슈크로스 에스테르, 및 에톡실화된 에스테르와 같은 비이온성 에스테르를 포함한다. 지방 알콜 에톡실레이트, 프로폭실화된 알콜 및 에톡실화된/프로폭실화된 블록 중합체와 같은 비이온성 알칸올아미드 및 에테르도 이러한 부류에 포함된다. 폴리옥시에틸렌 계면활성제는 비이온성 계면활성제 부류의 가장 대중적인 구성원이다.
계면활성제 분자가 물에 용해되거나 분산될 때 음전하를 띠면 계면활성제는 음이온성으로 분류된다. 음이온성 계면활성제는 비누와 같은 카복실레이트, 아실 락틸레이트, 아미노산의 아실 아미드, 황산의 에스테르, 예를 들어, 알킬 설페이트 및 에톡실화된 알킬 설페이트, 설포네이트, 예를 들어, 알킬 벤젠 설포네이트, 아실 이세티오네이트, 아실 타우레이트 및 설포숙시네이트, 및 포스페이트를 포함한다. 음이온성 계면활성제 부류의 가장 중요한 구성원은 알킬 설페이트와 비누이다.
계면활성제 분자가 물에 용해되거나 분산될 때 양전하를 띠면 계면활성제는 양이온성으로 분류된다. 양이온성 계면활성제는 4차 암모늄 염 및 에톡실화된 아민을 포함한다. 4차 암모늄 염은 이러한 부류의 가장 널리 사용되는 구성원이다.
계면활성제 분자가 양전하 또는 음전하를 운반하는 능력을 갖는 경우, 계면활성제는 양쪽성으로 분류된다. 양쪽성 계면활성제는 아크릴산 유도체, 치환된 알킬아미드, N-알킬베타인 및 인지질을 포함한다.
약물 제품, 제형 및 에멀젼에서 계면활성제의 사용이 검토되었다(문헌참조: Rieger의 Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
B. 핵산 지질 입자
일부 구현예에서, 본 개시내용에서 특징 지어진 MYOC dsRNA는, 예를 들어 SPLP, pSPLP, SNALP, 또는 다른 핵산-지질 입자를 형성하기 위해 지질 제형에 완전히 캡슐화된다. SNALP 및 SPLP는 통상적으로 양이온성 지질, 비-양이온성 지질 및 입자의 응집을 방지하는 지질(예를 들어, PEG-지질 접합체)을 함유한다. SNALP 및 SPLP는 이들이 정맥내(i.v.) 주사 후 연장된 순환 수명을 나타내며 말단 부위(예를 들어, 투여 부위로부터 물리적으로 분리된 부위)에 축적되기 때문에 전신 적용에 매우 유용하다. SPLP는 PCT 공개 국제특허번호 제00/03683호에 제시된 캡슐화된 응축 제제-핵산 복합체를 포함하는 "pSPLP"를 포함한다. 본 개시내용의 입자는 통상적으로 약 50nm 내지 약 150nm, 보다 통상적으로 약 60nm 내지 약 130nm, 보다 통상적으로 약 70nm 내지 약 110nm, 가장 통상적으로 약 70nm 내지 약 90nm의 평균 직경을 갖고, 실질적으로 무독성이다. 또한, 본 개시내용의 핵산-지질 입자에 존재할 때 핵산은 뉴클레아제에 의한 분해에 대해 수용액에서 저항성이다. 핵산-지질 입자 및 이의 제조 방법은 예를 들어, 미국 특허번호 제5,976,567호; 제5,981,501호; 제6,534,484호; 제6,586,410호; 제6,815,432호; 및 PCT 공개 국제특허번호 제96/40964호에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 지질 대 약물 비율(질량/질량 비율)(예를 들어, 지질 대 dsRNA 비율)은 약 1:1 내지 약 50:1, 약 1:1 내지 약 25:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 또는 약 6:1 내지 약 9:1의 범위일 것이다.
양이온성 지질은, 예를 들어 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(I-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP), N-(I-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), N,N-디메틸-2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DODMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), l,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLenDMA), 1,2-디리놀레일카르바모일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-C-DAP), 1,2-딜리놀레옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판(DLin-DAC), 1,2-딜리놀레옥시-3-모르폴리노프로판(DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판(DLinDAP), 1,2-디리놀레일티오-3-디메틸아미노프로판(DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TMA.Cl), 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TAP.Cl), 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판(DLin-MPZ), 또는 3-(N,N-디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올(DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디올(DOAP), 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판(DLin-EG-DMA), l,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA) 또는 이의 유사체, (3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)테트라하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-5-아민(ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트(MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)에틸)(2-하이드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸아잔디일)디도데칸-2-올(Tech G1), 또는 이의 혼합물일 수 있다. 양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 20 몰% 내지 약 50 몰% 또는 약 40 몰%를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 화합물 2,2-딜리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란은 지질-siRNA 나노입자를 제조하는 데 사용될 수 있다. 2,2-딜리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란의 합성은 2008년 10월 23일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 제61/107,998호에 기술되어 있으며, 이는 참조로서 본원에 인용된다.
일부 구현예에서, 지질-siRNA 입자는 40% 2,2-딜리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란: 10% DSPC: 40% 콜레스테롤: 63.0 ± 20nm의 입자 크기 및 0.027 siRNA/지질 비율을 갖는 10% PEG-C-DOMG(몰%)를 포함한다.
비-양이온성 지질은 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는 음이온성 지질 또는 중성 지질일 수 있다: 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-l-카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민(SOPE), 콜레스테롤, 또는 이들의 혼합물. 비-양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 몰% 내지 약 90 몰%, 약 10 몰%, 또는 콜레스테롤이 포함되는 경우 약 58 몰%일 수 있다.
입자의 응집을 억제하는 접합된 지질은, 예를 들어 PEG-디아실글리세롤(DAG), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라미드(Cer), 또는 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질일 수 있다. PEG-DAA 접합체는, 예를 들어, PEG-디라우릴옥시프로필(Ci2), PEG-디미리스틸옥시프로필(Ci4), PEG-디팔미틸옥시프로필(Ci6), 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필(C]8)일 수 있다. 입자의 응집을 방지하는 접합된 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 0 몰% 내지 약 20 몰% 또는 약 2 몰%일 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산-지질 입자는, 예를 들어 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 몰% 내지 약 60 몰% 또는 약 48 몰%에서 콜레스테롤을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, iRNA는 지질 나노입자(LNP)로 제형화된다.
LNP01
일부 구현예에서, 리피도이드(lipidoid) ND98·4HCl(MW 1487)(2008년 3월 26일에 출원된 미국 특허 출원번호 제12/056,230호 참조, 이는 본원에 참조로서 인용됨), 콜레스테롤(Sigma-Aldrich), 및 PEG-세라마이드 C16(Avanti Polar Lipids)을 사용해 지질-dsRNA 나노입자(예를 들어, LNP01 입자)를 제조할 수 있다. 에탄올 중 각각의 모액은 다음과 같이 제조될 수 있다: ND98, 133mg/ml; 콜레스테롤, 25mg/ml, PEG-세라마이드 C16, 100mg/ml. 그런 다음, ND98, 콜레스테롤, 및 PEG-세라마이드 C16 모액은 예를 들어, 42:48:10 몰비로 조합될 수 있다. 조합된 지질 용액은, 최종 에탄올 농도가 약 35~45%이고 최종 아세트산나트륨 농도가 약 100~300mM이 되도록 수성 dsRNA와 (예를 들어, 아세트산나트륨 pH 5에서) 혼합될 수 있다. 지질-dsRNA 나노입자는 통상적으로 혼합 시 자발적으로 형성된다. 원하는 입자 크기 분포에 따라, 생성된 나노입자 혼합물은, 예를 들어 Lipex Extruder(Northern Lipids, Inc)와 같은 열 배럴 압출기를 사용하여 폴리카보네이트 막(예를 들어, 100nm 컷오프)을 통해 압출될 수 있다. 일부 경우에, 압출 단계는 생략될 수 있다. 에탄올 제거 및 동시 완충액 교환은, 예를 들어 투석 또는 접선 유동 여과에 의해 달성될 수 있다. 완충액은, 예를 들어 약 pH 7, 예를 들어 약 pH 6.9, 약 pH 7.0, 약 pH 7.1, 약 pH 7.2, 약 pH 7.3, 또는 약 pH 7.4에서 포스페이트 완충 식염수(PBS)와 교환될 수 있다.
LNP01 제형은, 예를 들어, 국제 출원 공개 제2008/042973호에 기술되어 있으며, 이는 본원에 참조로서 인용된다.
추가의 예시적인 지질-dsRNA 제형은 하기의 표에 제공된다.
DSPC: 디스테아로일포스파티딜콜린
DPPC: 디팔미토일포스파티딜콜린
PEG-DMG: PEG-디디미리스토일 글리세롤(C14-PEG, 또는 PEG-C14)(평균 분자량이 2000인 PEG)
PEG-DSG: PEG-디스티릴 글리세롤(C18-PEG, 또는 PEG-C18)(평균 분자량 이 2000인 PEG)
PEG-cDMA: PEG-카바모일-1,2-디미리스틸옥시프로필아민(평균 분자량이 2000인 PEG)
SNALP(l,2-딜리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA)) 포함 제형이 2009년 4월 15일에 출원된 국제 특허공개 번호 제2009/127060호에 기술되어 있으며, 이는 본원에 참조로 인용된다.
XTC 포함 제형은, 예를 들어, 2009년 1월 29일에 출원된 미국 가출원 제61/148,366호; 2009년 3월 2일에 출원된 미국 가출원 제61/156,851호; 2009년 6월 10일에 출원된 미국 가출원 제61/185,712호; 2009년 7월 24일에 출원된 미국 가출원 제61/228,373호; 2009년 9월 3일에 출원된 미국 가출원 제61/239,686호; 및 2010년 1월 29일에 출원된 국제 출원번호 PCT/US2010/022614에 기술되어 있으며, 이는 본원에 참조로 인용된다.
MC3 포함 제형은, 예를 들어, 2009년 9월 22일에 출원된 미국 가출원 제61/244,834호, 2009년 6월 10일에 출원된 미국 가출원 제61/185,800호, 및 2010년 6월 10일에 출원된 국제 출원번호 PCT/US10/28224에 기술되어 있으며, 이들은 본원에 참조로 인용된다.
ALNY-100 포함 제형은, 예를 들어, 2009년 11월 10일에 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/US09/63933에 기술되며, 이는 본원에 참조로 인용된다.
C12-200 포함 제형은 2009년 5월 5일에 출원된 미국 가출원 제61/175,770호 및 2010년 5월 5일에 출원된 국제 출원 PCT/US10/33777에 기술되어 있으며, 이는 본원에 참조로서 인용된다.
C. 양이온성 지질의 합성
본 개시내용에서 특징 지어진 핵산-지질 입자에 사용된 임의의 화합물, 예를 들어 양이온성 지질 등은 공지된 유기 합성 기술에 의해 제조될 수 있다. 모든 치환기는 달리 명시되지 않는 한 아래에 정의된 바와 같다.
"알킬"은 1 내지 24개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지형, 비환형 또는 환형, 포화 지방족 탄화수소를 의미한다. 대표적인 포화 직쇄 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실 등을 포함하는 반면; 포화 분지형 알킬은 이소프로필, 이차-부틸, 이소부틸, 털트-부틸, 이소펜틸 등을 포함한다. 대표적인 포화 환형 알킬은 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 등을 포함하는 반면; 불포화 환형 알킬은 시클로펜테닐 및 시클로헥세닐 등을 포함한다.
"알케닐"은 앞서 정의한 것과 같이, 인접한 탄소 원자 사이에 적어도 하나의 이중 결합을 함유하는 알킬을 의미한다. 알케닐은 시스 및 트랜스 이성질체 둘 다를 포함한다. 대표적인 직쇄 및 분지형 알케닐은 에틸레닐, 프로필레닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 이소부틸레닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-메틸-1-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 2,3-디메틸-2-부테닐 등을 포함한다.
"알키닐"은 앞서 정의한 것과 같이, 인접한 탄소 사이에 적어도 하나의 삼중 결합을 추가로 함유하는 임의의 알킬 또는 알케닐을 의미한다. 대표적인 직쇄 및 분지형 알키닐은 아세틸레닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 3-메틸-1 부티닐 등을 포함한다.
"아실"은 임의의 알킬, 알케닐, 또는 알키닐을 의미하며, 부착 지점의 탄소는 후술하는 옥소기로 치환된다. 예를 들어, -C(=O)알킬, -C(=O)알케닐, 및 -C(=O)알키닐은 아실기이다.
"헤테로고리"는 포화, 불포화, 또는 방향족이고 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1개 또는 2개의 헤테로원자를 함유하는 5- 내지 7-원 단환, 또는 7- 내지 10-원 이환, 헤테로환 고리를 의미하며, 질소 및 황 헤테로원자는 임의로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 임의로 사차화될 수 있으며, 상기 헤테로고리 중 어느 하나가 벤젠 고리에 융합되는 이환 고리를 포함한다. 헤테로고리는 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자를 통해 부착될 수 있다. 헤테로고리는 아래에 정의된 것과 같은 헤테로아릴을 포함한다. 헤테로고리는 모르폴리닐, 피롤리디노닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페리디닐, 피페리지닐, 하이단토이닐, 발레롤락타밀, 옥시라닐, 옥세타닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로피리디닐, 테트라하이드로프리미디닐, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피라닐, 테트라하이드로피리미디닐, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피라닐 등을 포함한다.
용어 "임의 치환된 알킬", "임의 치환된 알케닐", "임의 치환된 알키닐", "임의 치환된 아실", 및 "임의 치환된 헤테로고리"는 치환될 때, 적어도 하나의 수소 원자가 치환기로 치환되는 것을 의미한다. 옥소 치환기(=O)의 경우, 2개의 수소 원자가 치환된다. 이와 관련하여, 치환기는 옥소, 할로겐, 헤테로고리, -CN, -ORx, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry , -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx 및 -SOnNRxRy를 포함하고, 여기서 n은 0, 1 또는 2이고, Rx 및 Ry는 동일하거나 상이하고 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로고리이며, 상기 알킬 및 헤테로고리 치환기 각각은 옥소, 할로겐, -OH, -CN, 알킬, -ORx, 헤테로고리, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry , -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx 및 -SOnNRxRy 중 하나 이상으로 추가 치환될 수 있다.
"할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오드를 의미한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에서 특징 지어진 방법은 보호기의 사용을 요구할 수 있다. 보호기 방법론은 당업자에게 잘 알려져 있다(문헌참조: 예를 들어, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. 등, Wiley-Interscience, New York City, 1999). 간략하게, 본 개시내용의 맥락에서 보호기는 작용기의 원치 않는 반응성을 감소시키거나 제거하는 임의의 기이다. 보호기는 소정의 반응 동안 그의 반응성을 가리기 위해 작용기에 첨가된 다음 원래의 작용기를 드러내기 위해 제거될 수 있다. 일부 구현예에서, "알코올 보호기"가 사용된다. "알코올 보호기"는 알코올 작용기의 원치 않는 반응성을 감소시키거나 제거하는 임의의 기이다. 보호기는 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 첨가되고 제거될 수 있다.
화학식 A의 합성
일부 구현예에서, 본 개시내용에서 특징 지어진 핵산-지질 입자는 화학식 A의 양이온성 지질을 사용하여 제형화되며:
여기서 R1 및 R2는 독립적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 각각은 임의 치환될 수 있고, R3 및 R4는 독립적으로 더 낮은 알킬이거나, R3 및 R4는 함께 취해져 임의 치환된 헤테로환 고리를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 XTC(2,2-딜리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란)이다. 일반적으로, 전술한 화학식 A의 지질은 다음의 반응식 1 또는 2에 의해 제조될 수 있으며, 여기서 모든 치환기는 달리 명시되지 않는 한 전술한 바와 같다.
지질 A, 여기서 R1 및 R2는 독립적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐이며, 각각은 임의 치환될 수 있고, R3 및 R4는 독립적으로 더 낮은 알킬이거나 R3 및 R4가 함께 취해져 임의 치환된 헤테로환 고리를 형성할 수 있으며, 반응식 1에 따라 제조될 수 있다. 케톤 1 및 브로마이드 2는 당업자에게 공지된 방법에 따라 구매되거나 제조될 수 있다. 1 및 2의 반응은 케탈 3을 수득한다. 케탈 3을 아민 4로 처리하여 화학식 A의 지질을 수득한다. 화학식 A의 지질은 화학식 5의 유기 염을 갖는 상응하는 암모늄 염으로 변환될 수 있으며, 여기서 X는 할로겐, 수산화물, 포스페이트, 설페이트 등으로부터 선택된 음이온 반대 이온이다.
대안적으로, 케톤 1 출발 물질은 반응식 2에 따라 제조될 수 있다. 그리나드 시약 6 및 시안화물 7은 당업자에게 공지된 방법에 따라 구매되거나 제조될 수 있다. 6 및 7의 반응은 케톤 1을 수득한다. 케톤 1을 화학식 A의 상응하는 지질로 변환하는 것은 반응식 1에 기술된 것과 같다.
MC3의 합성
DLin-M-C3-DMA(즉, (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트)의 제조는 다음과 같았다. 디클로로메탄(5mL) 중 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-올(0.53g), 4-N,N-디메틸아미노부티르산 하이드로클로라이드(0.51g), 4-N,N-디메틸아미노피리딘(0.61g) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(0.53g)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 용액을 희석 염산으로 세척한 다음, 희석 수성 중탄산나트륨으로 세척하였다. 유기 분획을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 회전증발기 상에서 제거하였다. 잔류물을 1~5% 메탄올/디클로로메탄 용리 구배를 사용하여 실리카 겔 컬럼(20g)에 내려 보냈다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 합치고 용매를 제거하여 무색 오일(0.54g)을 수득하였다.
ALNY-100의 합성
케탈 519[ALNY-100]의 합성은 다음 반응식 3을 사용하여 수행되었다:
515의 합성:
2구 RBF(1L)의 200ml 무수 THF 중 LiAlH4(3.74g, 0.09852 몰)의 교반 현탁액에 70mL의 THF 중 514(10g, 0.04926 몰)의 용액을 질소 분위기 하 0°C에서 서서히 첨가하였다. 첨가를 완료한 후, 반응 혼합물을 실온으로 가온시킨 다음, 4시간 동안 환류되도록 가열하였다. TLC에 의한 반응의 진행을 모니터링하였다. (TLC에 의한) 반응 완료 후, 혼합물을 0°C로 냉각시키고 포화 Na2SO4 용액을 조심스럽게 첨가하여 퀀칭시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하고 여과하였다. 잔류물을 THF로 잘 세척하였다. 여액과 세척액을 혼합하고 400mL 디옥산 및 26mL 농축액으로 희석하였다. HCl로 실온에서 20분 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 진공 하에 제거하여 515의 염산염을 백색 고형분으로서 수득하였다. 수율율: 7.12 g 1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 9.34 (넒음, 2H), 5.68 (s, 2H), 3.74 (m, 1H), 2.66-2.60 (m, 2H), 2.50-2.45 (m, 5H).
516의 합성:
250mL 2구 RBF의 100mL 건조 DCM 중 화합물 515의 교반 용액에 NEt3(37.2mL, 0.2669 몰)을 첨가하고 질소 분위기 하에 0°C로 냉각시켰다. 50mL 건조 DCM 중 N-(벤질옥시-카르보닐옥시)-숙신이미드(20g, 0.08007 몰)를 천천히 첨가한 후, 반응 혼합물을 실온으로 가온시켰다. 반응 완료 후(TLC로 2~3시간), 혼합물을 1N HCl 용액(1x100mL) 및 포화 NaHCO3 용액(1x50mL)으로 연속 세척하였다. 그런 다음, 유기층을 무수물로 건조시켰다. Na2SO4 및 용매를 증발시켜 미정제 물질을 수득하고, 이를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 516을 점착성 질량으로서 수득하였다. 수율: 11g(89%). 1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ = 7.36-7.27(m, 5H), 5.69 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.96 (br., 1H) 2.74 (s, 3H), 2.60(m, 2H), 2.30-2.25(m, 2H). LC-MS [M+H] -232.3 (96.94%).
517A 및 517B의 합성:
시클로펜텐 516(5g, 0.02164 몰)을 단일 목 500mL RBF의 220mL 아세톤 및 물(10:1)의 용액에 용해시키고, N-메틸 모르폴린-N-옥사이드(7.6g, 0.06492 몰)에 이어서 실온에서 털트-부탄올 중 4.2mL의 7.6% OsO4(0.275g, 0.00108 몰) 용액을 첨가하였다. 반응 완료 후(약 3시간), 혼합물을 고형분 Na2SO3을 첨가하여 퀀칭시키고, 생성된 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM(300mL)으로 희석하고, 물(2x100mL)로 세척한 다음, 포화 NaHCO3(1x50mL) 용액, 물(1x30mL)로 세척하고, 마지막으로 염수(1x50mL)로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조시키고, 용매를 진공에서 제거하였다. 미정제 물질의 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 정제를 통해 부분 입체이성질체의 혼합물을 수득하고, 이를 분취 HPLC로 분리하였다. 수율: - 6g 미정제
517A - 피크-1(백색 고형분), 5.13g(96%). 1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 7.39-7.31(m, 5H), 5.04(s, 2H), 4.78-4.73 (m, 1H), 4.48-4.47(d, 2H), 3.94-3.93(m, 2H), 2.71(s, 3H), 1.72- 1.67(m, 4H). LC-MS - [M+H]-266.3, [M+NH4 +]-283.5 존재, HPLC-97.86%. X-선에 의해 확인된 입체화학.
518의 합성:
화합물 505의 합성에 대해 기술된 것과 유사한 절차를 사용하여, 화합물 518(1.2g, 41%)을 무색 오일로서 수득하였다. 1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ= 7.35-7.33(m, 4H), 7.30-7.27(m, 1H), 5.37-5.27(m, 8H), 5.12(s, 2H), 4.75(m,1H), 4.58-4.57(m,2H), 2.78-2.74(m,7H), 2.06-2.00(m,8H), 1.96-1.91(m, 2H), 1.62(m, 4H), 1.48(m, 2H), 1.37-1.25(br m, 36H), 0.87(m, 6H). HPLC-98.65%.
화합물 519의 합성에 대한 일반 절차:
헥산(15mL) 중 화합물 518(1당량)의 용액을 THF 중 LAH의 얼음처럼 차가운 용액(1M, 2당량)에 적가하였다. 첨가가 완료된 후, 혼합물을 40°C에서 0.5시간에 걸쳐 가열한 다음, 얼음조 상에서 다시 냉각시켰다. 혼합물을 포화 수성 Na2SO4로 조심스럽게 가수분해한 다음, 셀라이트를 통해 여과하고 오일로 환원시켰다. 컬럼 크로마토그래피를 통해 순수한 519(1.3g, 68%)를 수득하고, 이를 무색 오일로서 수득하였다. 13C NMR = 130.2, 130.1 (x2), 127.9 (x3), 112.3, 79.3, 64.4, 44.7, 38.3, 35.4, 31.5, 29.9 (x2), 29.7, 29.6 (x2), 29.5 (x3), 29.3 (x2), 27.2 (x3), 25.6, 24.5, 23.3, 226, 14.1; 전기분무 MS (+ve): C44H80NO2(M + H)+의 분자량 계산치 654.6, 실측치 654.6.
표준 또는 무압출 방법에 의해 제조된 제형은 유사한 방식으로 특성화될 수 있다. 예를 들어, 제형은 통상적으로 육안 검사에 의해 특징화된다. 이들은 응집체 또는 침강물이 없는 백색 반투명 용액이어야 한다. 지질-나노입자의 입자 크기 및 입자 크기 분포는, 예를 들어 Malvern Zetasizer Nano ZS(미국, 맬번)를 사용하여 광 산란에 의해 측정될 수 있다. 입자는 크기가 약 20~300nm, 예컨대 40~100nm이어야 한다. 입자 크기 분포는 단일 모드여야 한다. 제형 내 총 dsRNA 농도 및 포획된 분획은 염료 배제 검정을 사용하여 추정된다. 제형화된 dsRNA의 샘플은 제형 파괴 계면활성제, 예를 들어 0.5% Triton-X100의 존재 또는 부재 하에 Ribogreen(Molecular Probes)과 같은 RNA 결합 염료와 함께 항온처리될 수 있다. 제형 내 총 dsRNA는 표준 곡선에 대해, 계면활성제를 함유하는 샘플로부터의 신호에 의해 결정될 수 있다. 포획된 분획은 총 dsRNA 함량으로부터 (계면활성제가 없는 상태에서 신호에 의해 측정된) "유리" dsRNA 함량을 빼 결정된다. 포획된 dsRNA의 백분율은 통상적으로 >85%이다. SNALP 제형의 경우, 입자 크기는 적어도 30nm, 적어도 40nm, 적어도 50nm, 적어도 60nm, 적어도 70nm, 적어도 80nm, 적어도 90nm, 적어도 100nm, 적어도 110nm, 및 적어도 120nm이다. 적절한 범위는 통상적으로 적어도 약 50nm 내지 적어도 약 110nm, 적어도 약 60nm 내지 적어도 약 100nm, 또는 적어도 약 80nm 내지 적어도 약 90nm이다.
경구 투여를 위한 조성물 및 제형은 분말 또는 과립, 미세입자, 나노입자, 물 또는 비수성 매질 중 현탁액 또는 용액, 캡슐, 겔 캡슐, 사쉐, 정제 또는 소형정제를 포함한다. 증점제, 향미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, 경구 제형은 본 개시내용에서 특성 지어진 dsRNA가 하나 이상의 투과 증진제 계면활성제 및 킬레이트화제와 함께 투여되는 제형이다. 적합한 계면활성제는 지방산 및/또는 에스테르 또는 이의 염, 담즙산 및/또는 이의 염을 포함한다. 적합한 담즙산/염은 케노데옥시콜산(CDCA) 및 우르소데옥시케노데옥시콜산(UDCA), 콜산, 데하이드로콜산, 데옥시콜산, 글루콜산, 글리콜산, 글리코데옥시콜산, 타우로콜산, 타우로데옥시콜산, 나트륨 타우로-24,25-디하이드로-푸시데이트 및 나트륨 글리코디하이드로푸시데이트를 포함한다. 적합한 지방산은 아라키돈산, 운데칸산, 올레산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 또는 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염(예를 들어, 나트륨)을 포함한다. 일부 구현예에서, 투과 증진제들의 조합이 사용되고, 예를 들어, 담즙산/염과 조합된 지방산/염이 사용된다. 하나의 예시적인 조합은 라우르산, 카프르산 및 UDCA의 나트륨 염이다. 추가의 투과 증진제는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르를 포함한다. 본 개시내용에서 특성 지어진 dsRNA는 분무된 건조 입자 또는 마이크로 또는 나노입자를 형성하도록 복합체화된 입자를 포함하는 과립 형태로 경구적으로 전달될 수 있다. dsRNA 복합 제제는 폴리아미노산; 폴리이민; 폴리아크릴레이트; 폴리알킬아크릴레이트, 폴리옥시에탄, 폴리알킬시아노아크릴레이트; 양이온화된 젤라틴, 알부민, 전분, 아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 전분; 폴리알킬시아노아크릴레이트; DEAE 유도체화된 폴리이민, 꽃가루, 셀룰로스 및 전분을 포함한다. 적합한 복합 제제는 키토산, N-트리메틸키토산, 폴리-L-라이신, 폴리히스티딘, 폴리오르니틴, 폴리스페민, 프로타민, 폴리비닐피리딘, 폴리티오디에틸아미노메틸에틸렌 P(TDAE), 폴리아미노스티렌(예를 들어, p-아미노), 폴리(메틸시아노아크릴레이트), 폴리(에틸시아노아크릴레이트), 폴리(부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소헥실시아노아크릴레이트), DEAE-메타크릴레이트, DEAE-헥실아크릴레이트, DEAE-아크릴아미드, DEAE-알부민 및 DEAE-덱스트란, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리헥실아크릴레이트, 폴리(D,L-락트산), 폴리(DL-락트산-코-글리콜산(PLGA), 알기네이트 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 포함한다. dsRNA를 위한 경구 제형 및 이의 제조는 미국 특허번호 제6,887,906호, 미국 특허 공개번호 제20030027780호, 및 미국 특허번호 제6,747,014호에 자세히 기술되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로서 인용된다.
비경구, (뇌로의) 조직내, 척추강내, 유리체내, 망막하, 경공막, 결막하, 눈뒤, 전방내, 심실내 또는 간내 투여용 조성물 및 제형은 완충제, 희석제 및 이에 제한되지 않지만 투과 증진제, 캐리어 화합물과 같은 기타 적합한 첨가제 및 기타 약제학적으로 허용 가능한 캐리어 또는 부형제를 또한 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 용제, 에멀젼 및 리포좀 함유 제형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 조성물은 미리 형성된 액체, 자가-유화 고체 및 자가-유화 반고체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 성분으로부터 생성될 수 있다.
단위 투여 형태로 편리하게 제시될 수 있는, 본 개시내용에서 특징 지어진 약제학적 제형이 제약 산업에 잘 공지된 종래의 기술에 따라 제조될 수 있다. 그러한 기술들은 활성 성분을 약제학적 캐리어(들) 또는 부형제(들)과 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 액체 캐리어 또는 미분된 고체 캐리어 또는 모두와 활성 성분을 균일하고 친밀하게 회합시키고 이어서 필요하다면 생성물을 성형함으로써 제조된다.
본 개시내용에서 특징 지어진 조성물은 정제, 캡슐, 겔 캡슐, 액체 시럽, 연질 겔, 좌제 및 관장제와 같은 임의의 많은 가능한 투여 형태로 제형화될 수 있다. 조성물은 또한 수성, 비-수성 또는 혼합 매질 중에 현탁액로서 제형화될 수 있다. 수성 현탁액은 예를 들어 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 추가로 함유할 수 있다. 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다.
D. 추가 제형
i. 에멀젼
본 개시내용의 조성물은 에멀젼으로 제조되고 제형화될 수 있다. 통상적으로 에멀젼은 일반적으로 직경이 0.1mm를 초과하는 액적의 형태로 또 다른 액체에 분산된 하나의 액체의 이종성 시스템이다(문헌참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 2권, 페이지. 335; Higuchi 등, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, 페이지. 301). 에멀젼은 종종 서로 밀접하게 혼합되고 분산된 2개의 비혼화성 액체상을 포함하는 이상성 시스템이다. 일반적으로, 에멀졀은 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 다양성 중 어느 하나일 수 있다. 수성상이 미세하게 나누어져 미세한 액적으로서 벌크 오일상으로 분산되는 경우, 생성된 조성물은 유중수(w/o) 에멀젼으로 불리운다. 대안적으로 오일상이 미세하게 나누어져 미세한 액적으로서 벌크 수성상으로 분산되는 경우, 생성된 조성물은 수중유(o/w) 에멀젼으로 불리운다. 에멀젼은 분산상 외에 추가 성분을 함유할 수 있으며, 수성상, 오일상 또는 별도의 상으로 자체적으로 용액으로 존재할 수 있는 활성 약물을 함유할 수 있다. 유화제, 안정화제, 염료 및 항산화제와 같은 약제학적 부형제는 또한 필요에 따라 에멀젼에 존재할 수 있다. 약제학적 에멀젼은 또한 예를 들어 유중수중유(o/w/o) 및 수중유중수 (w/o/w) 에멀젼의 경우에 2개 이상의 상으로 이루어진 다중 에멀젼일 수 있다. 이러한 복합 제형은 종종 단순 이원 에멀젼이 제공하지 않는 특정 이점을 제공한다. o/w 에멀젼의 개별 오일 액적이 작은 물 액적을 내포하는 다중 에멀젼은 w/o/w 에멀젼을 구성한다. 또한, 오일 연속 상으로 안정화된 물의 구체에 내포된 오일 액적 시스템은 o/w/o 에멀젼을 제공한다.
에멀젼은 거의 열역학 안정성이 없음을 특징으로 한다. 흔히, 에멀젼의 분산 또는 불연속 상은 외부 또는 연속 상으로 잘 분산되고 유화제 또는 제형의 점도를 통해 이러한 형태로 유지된다. 에멀젼의 상 중 어느 하나는 에멀젼 유형의 연고 기제 및 크림의 경우에서와 같이 반고체 또는 고체일 수 있다. 에멀젼을 안정화시키는 다른 수단은 에멀젼의 어느 하나의 상에 도입될 수 있는 유화제의 사용을 수반한다. 유화제는 광범위하게 4가지 범주로 분류될 수 있다: 합성 계면활성제, 천연적으로 존재하는 유화제, 흡수 기제, 및 미세 분산 고체(문헌참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 199).
표면 활성제로도 공지된 합성 계면활성제는 에멀젼의 제형에서 광범위하게 적용할 수 있음을 발견했고, 문헌에서 검토되었다(문헌참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199). 계면활성제는 통상적으로 양친매성이고 친수성 및 소수성 부분을 포함한다. 계면활성제의 친수성 대 소수성 특성의 비율을 친수성/친유성 균형(HLB)이라고 하며 제형의 제조에서 계면활성제를 분류하고 선택하는데 유용한 도구이다. 계면활성제는 친수성 군의 특성에 따라 비이온성, 음이온성, 양이온성 및 양쪽성의 상이한 부류로 분류될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 285).
에멀젼 제형에 사용되는 천연적으로 존재하는 유화제는 라놀린, 밀랍, 포스파타이드, 렉시틴 및 아카시아를 포함한다. 흡수 기제는 물을 흡수하여 w/o 에멀젼을 형성하면서도 무수 라놀린 및 친수성 바셀린(petrolatum)과 같은 반고체 농도를 유지할 수 있는 친수성을 가지고 있다. 미분된 고체는 특히 계면활성제 및 점성 제제와 조합하여 우수한 유화제로서 사용되었다. 이들은 중금속 수산화물과 같은 극성 무기 고체, 벤토나이트, 아타풀기트, 헥토라이트, 카올린, 몬모릴로나이트, 콜로이드성 알루미늄 실리케이트 및 콜로이드성 마그네슘 알루미늄 실리케이트와 같은 비팽윤성 점토, 안료 및 탄소 또는 글리세릴 트리스테아레이트와 같은 비극성 고체를 포함한다.
다양한 비-유화 재료는 또한 에멀젼 제형에 포함되고, 에멀젼의 성질에 기여한다. 이들은 지방, 오일, 왁스, 지방산, 지방 알코올, 지방 에스테르, 보습제, 친수성 콜로이드, 방부제 및 항산화제를 포함한다(문헌참조: Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 199).
친수성 콜로이드 또는 하이드로콜로이드는 천연적으로 존재하는 검 및 합성 중합체, 예를 들어 폴리사카라이드(예를 들어, 아카시아, 한천, 알긴산, 카라기난, 구아검, 카라야 검 및 트라가칸트), 셀룰로스 유도체(예를 들어, 카복시메틸셀룰로스 및 카복시프로필셀룰로스) 및 합성 중합체(예를 들어, 카보머, 셀룰로오스 에테르 및 카르복시비닐 중합체)를 포함한다. 이들은 물에 분산되거나 팽창하여 분산 상 액적 주위에 강한 계면 필름을 형성하고 외부 상의 점도를 증가시켜 에멀젼을 안정화시키는 콜로로이드성 용액을 형성한다.
에멀젼이 종종 미생물의 성장을 용이하게 지원할 수 있는 탄수화물, 단백질, 스테롤 및 포스파타이드와 같은 많은 성분을 포함하기 때문에 이러한 제형은 종종 보존제가 혼입된다. 에멀젼 제형에 포함된 일반적으로 사용되는 보존제는 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 4차 암모늄 염, 벤잘코늄 클로라이드, p-하이드록시벤조산의 에스테르 및 붕산을 포함한다. 항산화제는 또한 제형의 악화를 방지하기 위해 일반적으로 에멀젼 제형에 첨가된다. 사용되는 항산화제는 토코페롤, 알킬 갈레이트, 부틸화된 하이드록시아니솔, 부틸화된 하이드록시톨루엔과 같은 자유 라디칼 소거제 또는 아스코르브산 및 나트륨 메타바이설피트와 같은 환원제 및 시트르산, 타르타르산, 및 리시틴과 같은 항상화 상승제일 수 있다.
피부과, 경구 및 비경구 경로를 통한 에멀젼 제형의 적용 및 이들의 제조를 위한 방법이 문헌에서 검토되었다(문헌참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 199). 경구 전달용 에멀젼 제형은 제형이 용이할 뿐만 아니라 흡수 및 생체이용률 측면에서 효능 때문에 매우 널리 사용되어 왔다(문헌참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 199). 미네랄-오일 기반 완하제, 지용성 비타민 및 고지방 영양 제제는 일반적으로 o/w 에멀젼으로 경구 투여되는 물질 중에 있다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, iRNA 및 핵산의 조성물은 마이크에멀젼으로 제형화된다. 마이크로에멀젼은, 단일 광학적으로 등방성 및 열역학적으로 안정한 액체 용액인 물, 오일 및 양친매체의 시스템으로서 정의될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 245). 통상적으로 마이크로에멀젼은 먼저 수성 계면활성제 용액에 오일을 분산시킨 다음 충분한 양의 제4 성분, 일반적으로 중간 쇄 길이의 알코올을 첨가하여 투명한 시스템을 형성함으로써 제조되는 시스템이다. 따라서, 마이크로에멀젼은 또한 표면 활성 분자의 계면 필름에 의해 안정화되는 두 개의 불혼화성 액체의 열역학적으로 안정하고 등방성으로 투명한 분산액으로 기술되었다(문헌참조: Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, 페이지 185~215). 마이크로에멀젼은 일반적으로 오일, 물, 계면활성제, 보조계면활성제 및 전해질을 포함하는 3 내지 5개 성분의 조합을 통해 제조된다. 마이크로에멀젼이 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 유형인지 여부는 사용된 오일 및 계면활성제의 성질, 및 계면활성제 분자의 극성 헤드와 탄화수소 꼬리의 구조 및 기하학적 팩킹에 따라 상이하다(문헌참조: Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, 페이지. 271).
상 도표를 활용하는 현상학적 접근법은 광범위하게 연구되었으며, 기술분야의 숙련자에게 마이크로에멀젼을 제형화하는 방법에 대한 종합적인 지식을 산출해 냈다(문헌참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 335). 통상적인 에멀젼과 비교하여 마이크로에멀젼은 자발적으로 형성되는 열역학적으로 안정적인 액적의 제형에서 수불용성 약물을 가용화하는 이점을 제공한다.
마이크로에멀젼의 제조에 사용되는 계면활성제는 단독으로 또는 보조계면활성제와 조합되어, 이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, Brij 96, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르, 폴리글리세롤 지방산 에스테르, 테트라글리세롤 모노라우레이트(ML310), 테트라글리세롤 모노올레에이트(MO310), 헥사글리세롤 모노올레에이트(PO310), 헥사글리세롤 펜타올레에이트(PO500), 데카글리세롤 모노카프레이트(MCA750), 데카글리세롤 모노올레에이트(MO750), 데카글리세롤 세퀴올레에이트(SO750), 데카글리세롤 데카올레에이트(DAO750)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일반적으로 에탄올, 1-프로판올, 및 1-부탄올과 같은 단쇄 알콜인 보조계면활성제는 계면활성제 필름에 침투하여 결과적으로 계면활성제 분자 사이에 생성된 보이드(void) 공간으로 인해 무질서한 필름을 생성함으로써 계면 유동성을 증가시키는 작용을 한다. 그러나 마이크로에멀젼은 보조계면활성제를 사용하지 않고 제조될 수 있으며 무알콜 자가-유화 마이크로에멀젼 시스템은 당업계에 공지되어 있다. 수성상은 통상적으로 물, 약물의 수용액, 글리세롤, PEG300, PEG400, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜의 유도체일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 유상은 Captex 300, Captex 355, Capmula MCM, 지방산 에스테르, 중쇄(C8-C12) 모노, 디, 및 트리-글리세리드, 폴리옥시에틸화 글리세릴 지방산 에스테르, 지방 알코올, 폴리글리콜화 글리세리드, 포화 폴리글리콜화 C8-C10 글리세리드, 식물성 오일 및 실리콘 오일과 같은 물질을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
마이크로에멀젼은 특히 약물 가용화 및 약물의 증진된 흡수의 관점에서 관심 대상이다. 지질 기반 마이크로에멀젼(o/w 및 w/o 모두)은 펩타이드를 포함한 약물의 경구 생체이용률을 증진시키기 위해 제안되었다(문헌참조: 예를 들어, 미국 특허번호 제6,191,105호; 제7,063,860호; 제7,070,802호; 제7,157,099호; Constantinides 등, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385~1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). 마이크로에멀젼은 개선된 약물 가용화, 효소 가수분해로부터 약물의 보호, 계면활성제에 의한 막 유동성 및 투과성 변경으로 인한 약물 흡수의 가능한 증진, 제조 용이성, 고체 투여 형태에 대한 경구 투여의 용이성, 개선된 임상 효능 및 감소된 독성의 이점을 제공한다(문헌참조: 예를 들어, 미국 특허번호 제6,191,105호; 제7,063,860호; 제7,070,802호; 제7,157,099호; Constantinides 등, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho 등, J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138~143). 흔히 마이크로에멀젼은 이들의 성분이 주위 온도에서 함께 합쳐지는 경우 자발적으로 형성될 수 있다. 이것은 특히 열 불안정성 약물, 펩타이드 또는 iRNA를 제형화할 때 유리할 수 있다. 마이크로에멀젼은 또한 화장품 및 약제학적 적용 모두에서 활성 성분의 경피 전달에 효과적이었다. 본 개시내용의 마이크로에멀젼 조성물 및 제형은 위장관으로부터 iRNA 및 핵산의 증가된 전신 흡수를 촉진할 뿐만 아니라 iRNA 및 핵산의 국소 세포 흡수를 개선할 것으로 기대된다.
본 개시내용의 마이크로에멀젼은 또한 제형의 특성을 개선하고 본 개시내용의 iRNA 및 핵산의 흡수를 증진시키기 위해 소르비탄 모노스테아레이트(그릴 3), 라브라솔 및 투과 증진제와 같은 추가 성분 및 첨가제를 함유할 수 있다. 본 개시내용의 마이크로에멀젼에 사용되는 투과 증진제는 5개의 광범위한 카테고리--계면활성제, 지방산, 담즙염, 킬레이트화제, 및 비-킬레이트성 비-계면활성제 중 하나에 속하는 것으로서 분류될 수 있다(문헌참조: Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 페이지. 92). 이들 부류 각각이 위에서 논의되었다.
ii. 투과 증진제
일부 구현예에서, 본 개시내용은 핵산, 특히 iRNA를 동물의 피부에 효율적으로 전달하기 위해 다양한 투과 증진제를 사용한다. 대부분의 약물은 이온화된 및 비이온화된 형태 둘 모두로 용액 중에 존재한다. 그러나, 일반적으로 지용성 또는 친유성 약물만이 용이하게 세포막을 통과한다. 심지어 비친유성 약물이 통과될 막이 투과 증진제로 처리되는 경우 세포막을 통과할 수 있다는 것이 발견되었다. 세포막을 통한 비친유성 약물의 확산을 돕는 것 외에도, 투과 증진제는 친유성 약물의 투과성 또한 증진시킨다.
투과 증진제는 5개의 광범위한 카테고리, 즉, 계면활성제, 지방산, 담즙염, 킬레이트화제 및 비-킬레이트성 비-계면활성제 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee 등., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 페이지.92). 앞에서 언급된 부류의 침투 증진제 각각은 하기에 보다 상세하게 기재한다.
계면활성제: 본 개시내용과 관련하여, 계면활성제(또는 "표면 활성제")는 수용액에 용해되는 경우 용액의 표면 장력 또는 수용액과 또 다른 액체 간의 계면 장력을 감소시켜 그 결과 점막을 통한 iRNA의 흡수를 증진시키는 화학적 실체이다. 담즙염 및 지방산에 더하여, 이들 침투 증강제는, 예를 들어, 나트륨 라우릴 설페이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 및 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르(문헌참조: 예를 들어, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee 등., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 페이지.92); 및 FC-43과 같은 과불화화학 에멀젼을 포함한다 (문헌참조: Takahashi 등, J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
지방산: 침투 증강제로서 작용하는 다양한 지방산 및 이들의 유도체는, 예를 들어, 올레산, 라우르산, 카프르산(n-데카노산), 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인(1-모노올레오일-rac-글리세롤), 딜라우린, 카프릴산, 아라키돈산, 글리세롤 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 이의 C1-20 알킬 에스테르(예를 들어, 메틸, 이소프로필 및 t-부틸), 및 이의 모노- 및 디-글리세리드(즉, 올레이트, 라우레이트, 카프레이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 리놀레에이트, 등)를 포함한다(문헌참조: 예를 들어, Touitou, E., 등. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee 등., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 페이지.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1~33; El Hariri 등., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651~654).
담즙염: 담즙의 생리학적 역할에는 지질 및 지용성 비타민의 분산 및 흡수의 촉진이 포함된다(문헌참조: 예를 들어, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman 등. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, 페이지. 934~935). 다양한 천연 담즙염 및 이들의 합성 유도체는 침투 증강제로서 작용한다. 따라서, 용어 "담즙염"은 담즙의 임의의 자연 발생 성분 뿐만 아니라 이들의 임의의 합성 유도체를 포함한다. 적절한 담즙염은, 예를 들어, 콜산(또는 약제학적으로 허용 가능한 나트륨 염, 콜산나트륨), 디하이드로콜산(나트륨 디하이드로콜레이트), 데옥시콜산(데옥시콜산나트륨), 글루콜산(글루콜산나트륨), 글리콜산(글리코산 나트륨), 글리코데옥시콜산(글리코데옥시콜산나트륨), 타우로콜산(타우로콜산 나트륨), 타우로데옥시콜산(타우로데옥시콜산 나트륨), 케노데옥시콜산(케노데옥시콜산 나트륨), 우르소데옥시콜산(UDCA), 나트륨 타우로-24,25-디하이드로-푸시데이트(STDHF), 나트륨 글리코디하이드로푸시데이트 및 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르(POE)를 포함한다(문헌참조: 예를 들어, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee 등., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 페이지 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, 페이지 782~783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1~33; Yamamoto 등., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita 등., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579~583).
킬레이트화제: 본 개시내용과 관련하여 사용되는 킬레이트화제는, 그것과 복합체를 형성함으로써 용액으로부터 금속 이온을 제거하는 화합물로서 정의될 수 있으며, 그 결과 점막을 통한 iRNA의 흡수가 향상될 수 있다. 본 개시내용에서 침투 증진제로서 이들의 사용과 관련하여, 대부분의 특성화된 DNA 뉴클레아제는 촉매작용을 위해 2가 금속 이온을 필요로 하며 따라서 킬레이트화제에 의해 억제되기 때문에, 킬레이트화제는 또한 DNase 억제제로서 작용하는 추가적인 이점을 갖는다(문헌참조: Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315~339). 적합한 킬레이트화제는 에틸렌디아민테트라아세트산이나트륨(EDTA), 시트르산, 살리실산염(예를 들어, 살리실산나트륨, 5-메톡시살리실레이트 및 호모바닐레이트), 콜라겐의 N-아실 유도체, β-다이케톤(에나민)의 라우레스-9 및 N-아미노 아실 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.(문헌참조: 예를 들어, Katdare, A. 등., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee 등., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 페이지 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1~33; Buur 등., J. Control Rel., 1990, 14, 43~51).
비-킬레이트성 비계면활성제: 본원에서 사용되는 것과 같이, 비-킬레이트성 비-계면활성제 투과 증강 화합물은 킬레이트화제 또는 계면활성제로서 중요하지 않은 활성을 나타내지만 그럼에도 불구하고 소화관 점막을 통한 iRNA의 흡수를 향상시키는 화합물로서 정의될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1~33). 이러한 부류의 투과 증진제는 예를 들어, 불포화 환형 우레아, 1-알킬- 및 1-알케닐아자사이클로-알카논 유도체(문헌참조: Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 페이지 92); 및 비-스테로이드성 항-염증성 제제, 예를 들어, 디클로페낙 나트륨, 인도메타신 및 페닐부타존(문헌참조: Yamashita 등, J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621~626)을 포함한다.
세포 수준에서 iRNA의 흡수를 증진시키는 제제는 또한 본 개시내용의 약제 및 기타 조성물에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 양이온성 지질, 예를 들어, 리포펙틴(문헌참조: Junichi 등, 미국 특허번호 제5,705,188호), 양이온성 글리세롤 유도체, 및 폴리라이신 같은 다가양이온 분자(Lollo 등, PCT 출원 국제특허번호 제97/30731호) 또한 dsRNA의 세포 흡수를 증진시키는 것으로 알려져 있다. 상업적으로 이용 가능한 형질감염 시약의 예는 예를 들어, 다른 것들 중에서, Lipofectamine?? (Invitrogen; 캘리포니아 주 칼스배드 소재), Lipofectamine 2000?? (Invitrogen; 캘리포니아 주 칼스배드 소재), 293fectin?? (Invitrogen; 캘리포니아 주 칼스배드 소재), Cellfectin?? (Invitrogen; 캘리포니아 주 칼스배드 소재), DMRIE-C?? (Invitrogen; 캘리포니아 주 칼스배드 소재), FreeStyle?? MAX (Invitrogen; 캘리포니아 주 칼스배드 소재), Lipofectamine?? 2000 CD (Invitrogen; 캘리포니아 주 칼스배드 소재), Lipofectamine?? (Invitrogen; 캘리포니아 주 칼스배드 소재), RNAiMAX (Invitrogen; 캘리포니아 주 칼스배드 소재), Oligofectamine?? (Invitrogen; 캘리포니아 주 칼스배드 소재), Optifect?? (Invitrogen; 캘리포니아 주 칼스배드 소재), X-tremeGENE Q2 형질감염 시약 (Roche; 스위스 그렌차허가 소재), DOTAP 리포좀 형질감염 시약 (스위스 그렌차허가 소재), DOSPER리포좀 형질감염 시약 (스위스 그렌차허가 소재), 또는 Fugene (스위스 그렌차허가 소재), Transfectam® 시약 (Promega; 위스콘신 주 매디슨 소재), TransFast?? 형질감염 시약 (Promega; 위스콘신 주 매디슨 소재), Tfx??-20 시약 (Promega; 위스콘신 주 매디슨 소재), Tfx??-50 시약 (Promega; 위스콘신 주 매디슨 소재), DreamFect?? (OZ Biosciences; 프랑스 마르세유 소재), EcoTransfect (OZ Biosciences; 프랑스 마르세유 소재), TransPassª D1 형질감염 시약 (New England Biolabs; 미국 매사추세츠 주 입스위치 소재), LyoVec??/LipoGen?? (Invivogen; 미국 캘리포니아 주 샌디에이고 소재), PerFectin 형질감염 시약 (Genlantis; 미국 캘리포니아 주 샌디에이고 소재), NeuroPORTER 형질감염 시약 (Genlantis; 미국 캘리포니아 주 샌디에이고 소재), GenePORTER 형질감염 시약 (Genlantis; 미국 캘리포니아 주 샌디에이고 소재), GenePORTER 2 형질감염 시약 (Genlantis; 미국 캘리포니아 주 샌디에이고 소재), Cytofectin 형질감염 시약 (Genlantis; 미국 캘리포니아 주 샌디에이고 소재), BaculoPORTER 형질감염 시약 (Genlantis; 미국 캘리포니아 주 샌디에이고 소재), TroganPORTER?? 형질감염 시약 (Genlantis; 미국 캘리포니아 주 샌디에이고 소재), RiboFect (Bioline; 미국 매사추세츠 주 톤턴 소재), PlasFect (Bioline; 미국 매사추세츠 주 톤턴 소재), UniFECTOR (B-Bridge International; 미국 캘리포니아 주 마운틴뷰 소재), SureFECTOR (B-Bridge International; 미국 캘리포니아 주 마운틴뷰 소재), 또는 HiFect?? (B-Bridge International, 미국 캘리포니아 주 마운틴뷰 소재)를 포함한다.
에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜, 2-피롤과 같은 피롤, 아존, 및 리모넨 및 멘톤과 같은 테르펜을 포함하는 다른 제제는 투여된 핵산의 투과를 증진시키는 데 활용될 수 있다.
iii. 캐리어
본 개시내용의 특정 조성물은 또한 캐리어 화합물을 제형에 포함한다. 본원에서 사용되는 것과 같이, "캐리어 화합물"은 불활성(즉, 그 자체로서 생물학적 활성을 갖지 않음)이지만, 예를 들어 생물학적으로 활성인 핵산을 분해하거나 순환으로부터의 제거를 촉진함으로써 생물학적 활성을 갖는 핵산의 생체이용률을 감소시키는 생체내 프로세스에 의해 핵산으로서 인식되는 핵산 또는 이의 유사체를 지칭할 수 있다. 핵산과 캐리어 화합물의 공동 투여는, 통상적으로 과량의 캐리어 물질을 갖는 경우, 아마도 캐리어 화합물과 핵산 사이의 공통 수용체에 대한 경쟁으로 인해 간, 신장 또는 다른 순환외 저장소에서 회수된 핵산의 양을 실질적으로 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 간 조직에서의 부분적인 포스포로티오에이트 dsRNA의 회수는 폴리이노신산, 덱스트란 설페이트, 폴리시티드산 또는 4-아세트아미도-4'이소티오시아노-스틸벤-2,2'-디설폰산과 공동 투여될 때 감소될 수 있다(문헌참조: Miyao 등., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115~121; Takakura 등., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177~183).
iv. 부형제
캐리어 화합물과 대조적으로, 약제학적 캐리어 또는 부형제는 예를 들어, 하나 이상의 핵산을 동물에게 전달하기 위한 약제학적으로 허용 가능한 용매, 현탁제, 또는 임의의 다른 약리학적 불활성 비히클을 포함할 수 있다. 부형제는 액체 또는 고체일 수 있으며, 주어진 약제학적 조성물의 핵산 및 기타 성분과 조합될 때 목적하는 벌크, 일관성 등을 제공하도록 하기 위해 계획된 투여 방식을 염두에 두고 선택된다. 통상적인 약제학적 캐리어는 결합제(예를 들어, 사전 젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 등); 충전제(예를 들어, 락토스 및 기타 당, 미세결정질 셀룰로스, 펙틴, 젤라틴, 황산칼슘, 에틸 셀룰로스, 폴리아크릴레이트 또는 인산수소 칼슘 등); 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 실리카, 콜로이드성 이산화규소, 스테아르산, 금속 스테아레이트, 수소화된 식물성 오일, 옥수수 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트 등); 붕해제(예를 들어, 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트 등); 및 습윤제(예를 들어, 나트륨 라우릴 설페이트 등)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
핵산과 해롭게 반응하지 않는 비경구 투여가 아닌 투여에 적합한 약제학적으로 허용가능한 유기 및 무기 부형제는 또한 본 발명의 조성물을 제형화하는 데 사용될 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용 가능한 캐리어는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 규산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
핵산의 국소 투여를 위한 제형은 멸균 및 비멸균 수성 용액, 알콜과 같은 일반적인 용매 중의 비수성 용액, 또는 액체 또는 고체 오일 기제 중의 핵산 용액을 포함할 수 있다. 용액은 또한 완충제, 희석제 및 기타 적합한 첨가제를 함유할 수 있다. 핵산과 해롭게 반응하지 않는 비경구 투여에 적합한 약제학적으로 허용 가능한 유기 또는 무기 부형제가 사용될 수 있다.
적합한 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 규산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
v. 다른 성분
본 개시내용의 조성물은 약제학적 조성물에서 통상적으로 발견되는 다른 부가 성분을, 예를 들어, 이들의 당업계에 확립된 사용 수준으로 추가로 함유할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 예를 들어 항소양제, 수렴제, 국소 마취제 또는 항염증제와 같은 추가의 상용성 약제학적 활성 물질을 함유할 수 있거나 본 개시내용의 조성물의 다양한 투여 형태를 물리적으로 제형화하는 데 유용한 추가 물질, 예를 들어, 염료, 착향제, 방부제, 항산화제, 불투명화제, 증점제 및 안정화제를 함유할 수 있다. 그러나, 이러한 물질은 첨가될 때 본 개시내용의 조성물의 성분의 생물학적 활성을 과도하게 방해해서는 안 된다. 제형은 멸균화될 수 있고, 바람직한 경우, 보조제, 예를 들어, 윤활제, 방부제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 착색제, 향미제 및/또는 방향 물질 등과 혼합될 수 있고, 이들은 제형의 핵산(들)과 해롭게 상호 작용하지 않는다.
수성 현탁액은 예를 들어 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에서 특징 지어진 약제학적 조성물은 (a) 하나 이상의 iRNA 화합물 및 (b) 비-RNAi 기전에 의해 기능하는 하나 이상의 생물학적 제제를 포함한다. 이러한 생물학적 제제의 예는 MYOC 및 적어도 하나의 MYOC 결합 파트너의 상호작용을 방해하는 제제를 포함한다.
이러한 화합물의 독성 및 치료학적 효능은 예를 들어, LD50(집단의 50%에게 치명적인 투여량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료학적으로 효과적인 투여량)을 결정하기 위한 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 약제학적 과정에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료학적 효과 사이의 용량비가 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50 비율로 나타낼 수 있다. 높은 치료학적 지수를 나타내는 화합물이 통상적이다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에게 사용하기 위한 용량의 범위를 정하는데 사용될 수 있다. 본 개시내용에서 특징 지어진 조성물의 투여량은 일반적으로 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있으며, 독성은 거의 없거나 전혀 없다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 본 개시내용에서 특징 지어진 방법에 사용되는 임의의 화합물의 경우, 치료학적 유효량은 세포 배양 검정으로부터 초기에 평가될 수 있다. 투여량은 동물 모델에서 제형화하여 화합물의 순환 혈장 농도 범위를 성취하거나, 적절한 경우 세포 배양물에서 결정된 것과 같이 IC50(즉, 증상의 절반-최대 억제를 성취하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 (예를 들어, 폴리펩타이드의 감소된 농도를 성취하는) 표적 서열의 폴리펩타이드 생성물의 순환 혈장 농도 범위를 성취할 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 사람에게 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다. 혈장 내 수준은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
이들의 투여에 더하여, 위에서 논의한 바와 같이, 본 개시내용에서 특징 지어진 iRNA는 MYOC 발현과 관련된 질환 또는 장애(예를 들어, 녹내장, 예를 들어 원발성 개방각 녹내장(POAG))의 치료에 효과적인 다른 공지된 제제와 조합되어 투여될 수 있다. 어떠한 경우에도, 투여하는 의사는 당업계에 공지되거나 본원에 기술된 것과 같은 표준 효능 측정을 사용하여 관찰된 결과에 기초하여 iRNA 투여의 양 및 타이밍을 조정할 수 있다.
VII. MYOC의 발현과 관련된 장애를 치료하는 방법
본 개시내용은 MYOC 발현을 억제하고/하거나 MYOC 발현과 관련된 질환, 장애, 또는 병리학적 과정(예를 들어, 녹내장, 예를 들어, 원발성 개방각 녹내장(POAG))을 치료하기 위해 MYOC를 표적으로 하는 iRNA의 용도에 관한 것이다.
일부 양태에서, MYOC의 발현과 관련된 장애의 치료 방법이 제공되며, 본 방법은 본원에 개시된 iRNA(예를 들어, dsRNA)를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, iRNA는 MYOC 발현을 억제(감소)한다.
일부 구현예에서, 대상체는 MYOC 발현과 관련된 장애, 예를 들어, 녹내장, 예를 들어, 원발성 개방각 녹내장(POAG)에 대한 모델로서 기능하는 동물이다.
A. 녹내장
일부 구현예에서, MYOC 발현과 관련된 장애는 녹내장이다. 본원에 기술된 방법을 사용하여 치료할 수 있는 녹내장의 비제한적인 예는 원발성 개방각 녹내장(POAG)을 포함한다.
녹내장의 임상적 및 병리학적 특징은 시력 상실, 시력 감소(예를 들어, 빛 주위의 후광 및 흐림) 및 눈으로부터의 수양액 누출 감소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 녹내장을 앓고 있는 대상체는 18세 미만이다. 일부 구현예에서,녹내장을 앓고 있는 대상체는 성인이다. 일부 구현예에서,녹내장을 앓고 있는 대상체는 60세를 초과한다. 일부 구현예에서, 대상체는 기준 수준에 비해 상승된 수준의 MYOC mRNA 또는 단백질(예를 들어, 기준 수준보다 큰 MYOC 수준)을 갖거나 갖는 것으로 식별된다.
일부 구현예에서, 녹내장은 대상체로부터의 샘플(예를 들어, 수성 안구 유체 샘플)의 분석을 사용하여 진단된다. 일부 구현예에서, 샘플은 다음 중 하나 이상으로부터 선택된 방법을 사용하여 분석된다: 형광 제자리 혼성화(FISH), 면역조직화학, MYOC 면역분석, 전자 현미경, 레이저 미세박리, 및 질량 분광분석. 일부 구현예에서, 녹내장은 임의의 적절한 진단 시험 또는 기술, 예를 들어, 골드만 압평 안압계, 중앙 각막 두께(CCT)의 측정, 자동화 정적 임계값 주변측정(예를 들어, 험프리 필드 분석), 반 헤릭(Van Herick) 기술, 전방각경검사, 초음파 생체현미경 및 전안부 광간섭 단층촬영(AS-OCT), 혈관조영술(예를 들어, 형광 혈관조영술 또는 인도시아닌 녹색 혈관조영술), 망막전도검사, 초음파 검사, 각막두께 측정법, 광 간섭 단층촬영(OCT), 컴퓨터 단층촬영(CT) 및 자기 공명 영상(MRI), 안압측정, 색각 검사, 시야 시험, 세극등 검사, 검안경 검사, 및 신체검사(예를 들어, (예를 들어, 안저검사 또는 광간섭 단층촬영(OCT)에 의한) 시력 측정)을 사용해 진단될 수 있다.
B. 병용 요법
일부 구현예에서, 본원에 개시된 iRNA(예를 들어, dsRNA)는 MYOC 발현과 관련된 장애(녹내장, 예를 들어, 원발성 개방각 녹내장(POAG)) 또는 이러한 장애의 증상을 치료하는 데 효과적인 것으로 알려진 제2 요법(예를 들어, 하나 이상의 추가 요법)과 조합되어 투여된다. iRNA는 제2 요법 전, 후, 또는 동시에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, iRNA는 제2 요법 전에 투여된다. 일부 구현예에서, iRNA는 제2 요법 후에 투여된다. 일부 구현예에서, iRNA는 제2 요법과 동시에 투여된다.
제2 요법은 추가 치료제일 수 있다. iRNA 및 추가 치료제는 동일한 조성물과 조합되어 투여될 수 있거나, 추가 치료제는 별도의 조성물의 일부로서 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 제2 요법은 장애 또는 장애의 증상을 치료하는 데 효과적인 비-iRNA 치료제이다.
일부 구현예에서, iRNA는 요법과 함께 투여된다.
예시적인 병용 요법은 레이저 섬유주성형술 수술, 섬유주절제술 수술, 최소 침습성녹내장 수술, 눈 내 배액관 배치, 경구 약물 또는 점안액을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
투여 용량, 경로, 및 타이밍
대상체(예를 들어, 인간 대상체, 예를 들어, 환자)에게 치료적 양의 iRNA가 투여될 수 있다. 치료량은, 예를 들어, 0.05~50mg/kg일 수 있다.
일부 구현예에서, iRNA는 표적 기관, 예를 들어, 눈에 전달되도록 제형화된다.
일부 구현예에서, iRNA는 지질 제형, 예를 들어 본원에 기술된 것과 같은 LNP 제형으로서 제형화된다. 일부 이러한 구현예에서, 치료량은 0.05~5mg/kg의 dsRNA이다. 일부 구현예에서, 지질 제형, 예를 들어 LNP 제형은 정맥내 투여된다.
일부 구현예에서, iRNA는 예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은 GalNAc 접합체 형태이다. 일부 이러한 구현예에서, 치료량은 0.5~50mg의 dsRNA이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, GalNAc 접합체는 피하 투여된다.
일부 구현예에서, 투여는 예를 들어 규칙적으로, 예컨대 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 6개월 또는 그 이상 동안 매일, 격주(즉, 2주마다)마다 반복된다. 초기 치료 용법 후, 치료제는 덜 빈번한 기준으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 격주로 3개월 동안 투여한 후, 투여는 월 1회, 6개월 동안 또는 1년 이상 반복될 수 있다.
일부 구현예에서, iRNA 제제는 2회 이상의 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 후속 투여량의 횟수 또는 양은 원하는 효과의 달성, 예를 들어, (a) MYOC의 발현 또는 활성을 억제 또는 감소시키거나; (b) 오접힘 MYOC 단백질의 수준을 감소시키거나; (c) 섬유주대 세포 사멸을 감소시키거나; (d) 안압을 감소시키거나; (e) 시력을 증가시키거나, 치료 또는 예방 효과의 달성, 예를 들어 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 감소 또는 예방에 좌우된다.
일부 구현예에서, iRNA 제제는 일정에 따라 투여된다. 예를 들어, iRNA 제제는 주당 1회, 주당 2회, 주당 3회, 주당 4회, 또는 주당 5회 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 일정은 규칙적인 간격의 투여, 예를 들어, 매시간마다, 4시간마다, 6시간마다, 8시간마다, 12시간마다, 매일, 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 매주, 격주, 또는 매월 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, iRNA 제제는 원하는 효과를 달성하는 데 필요한 빈도로 투여된다.
일부 구현예에서, 일정은 가까운 간격의 투여에 이어서 제제가 투여되지 않는 보다 긴 기간을 포함한다. 예를 들어, 일정은 비교적 짧은 기간(예를 들어, 약 6시간마다, 약 12시간마다, 약 24시간마다, 약 48시간마다, 또는 약 72시간마다)에 투여되고, 이어서 iRNA 제제가 투여되지 않는 보다 긴 기간(예를 들어, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 또는 약 8주)에 투여되는 초기 투여량 세트를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, iRNA 제제는 초기에 매시간 투여되고, 나중에 더 긴 간격(예를 들어, 매일, 매주, 격주, 또는 매월)으로 투여된다. 일부 구현예에서, iRNA 제제는 초기에 매일 투여되고, 나중에 더 긴 간격(예를 들어, 매주, 격주, 또는 매월)으로 투여된다. 소정의 구현예에서, 더 긴 간격은 시간 경과에 따라 증가하거나 원하는 효과의 달성에 기초하여 결정된다.
전체 투여량의 iRNA를 투여하기 전에 환자는 5% 주입 투여량과 같은 보다 작은 용량을 투여받고 알레르기 반응과 같은 부작용 또는 지질 수준 또는 혈압 상승에 대해 모니터링될 수 있다. 다른 예에서, 환자는 원치 않는 효과에 대해 모니터링될 수 있다.
VIII. MYOC의 발현을 조절하는 방법
일부 양태에서, 본 개시내용은, 예를 들어 세포, 조직, 또는 대상체에서 MYOC의 발현을 조절(예를 들어, 억제 또는 활성화)하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포 또는 조직은 생체외, 시험관내, 또는 생체내에 존재한다. 일부 구현예에서, 세포 또는 조직은 눈(예를 들어, 섬유주대 조직, 섬모체, 망막 색소 상피(RPE), 망막 조직, 성상세포, 혈관주피세포, 뮐러(Muller) 세포, 신경절 세포, 내피 세포, 광수용체 세포, 망막 혈관(예를 들어, 내피 세포 및 혈관 평활근 세포 포함), 또는 맥락막 조직, 예를 들어 맥락막 혈관)에 존재한다. 일부 구현예에서, 세포 또는 조직은 대상체(예를 들어, 인간과 같은 포유동물)에 존재한다. 일부 구현예에서, 대상체(예를 들어, 인간)는 본원에 기술된 MYOC 발현의 발현과 관련된 장애의 위험이 있거나 이로 진단된다.
일부 구현예에서, 방법은 세포에서 MYOC의 발현을 감소시키기에 효과적인 양으로, 본원에 기술된 iRNA와 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, RNAi 제제와 세포의 접촉은 RNAi 제제와 시험관내 세포를 접촉시키는 것 또는 RNAi 제제와 생체내 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, RNAi 제제는 방법을 수행하는 개체로 의해 세포와 물리적 접촉에 놓이거나, RNAi 제제는 후속적으로 세포와 접촉하도록 허용되거나 이를 야기하는 상황에 놓일 수 있다. 시험관내 세포와의 접촉은, 예를 들어, 세포를 RNAi 제제와 항온처리함으로써 수행될 수 있다. 생체내 세포와의 접촉은, 예를 들어, 세포가 위치하는 조직 내로 또는 그 근처로 RNAi 제제를 주입하거나, RNAi 제제를 다른 영역, 예를 들어 안구 조직 내로 주입함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, RNAi 제제는 관심 대상의 부위에서 RNAi 제제를 지시하거나 다르게는 안정화시키는 리간드, 예를 들어 아래에 기술되고, 예를 들어 친유성 모이어티를 기술하는 그 안의 구절을 포함하여 그 전체가 본원에 참조로서 인용되는 PCT/US2019/031170에서 상세히 추가로 기술된 친유성 모이어티 또는 모이어티들을 함유할 수 있거나 이에 결합될 수 있다. 시험관내 및 생체내 접촉 방법의 조합도 가능하다. 예를 들어, 세포는 또한 RNAi 제제와 시험관내 접촉될 수 있고, 후속적으로 대상체에 이식될 수 있다.
MYOC의 발현은 MYOC mRNA, MYOC 단백질의 발현 수준, 또는 MYOC의 발현 수준에 기능적으로 연결된 다른 파라미터의 수준에 기초하여 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, MYOC의 발현은 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%만큼 억제된다. 일부 구현예에서, iRNA는 0.001~0.01nM, 0.001~0.10nM, 0.001~1.0nM, 0.001~10nM, 0.01~0.05nM, 0.01~0.50nM, 0.02~0.60nM, 0.01~1.0nM, 0.01~1.5nM, 0.01~10nM 범위의 IC50을 갖는다. IC50 값은 적절한 대조 값, 예를 들어 비표적화 iRNA의 IC50에 대해 정규화될 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 본원에 기술된 iRNA를 세포 또는 조직 내로 도입하고 MYOC의 mRNA 전사체의 분해를 수득하기에 충분한 시간 동안 세포 또는 조직을 유지함으로써, 세포 또는 조직에서 MYOC의 발현을 억제하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 본원에 기술된 조성물, 예를 들어, MYOC에 결합하는 iRNA를 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여하여, 표적 MYOC의 발현이 예컨대 연장된 지속 기간 동안, 예를 들어, 적어도 2일, 3일, 4일 이상, 예를 들어, 1주, 2주, 3주, 또는 4주 이상 동안 감소되도록 하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, MYOC의 발현 감소는 1차 투여 후 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 또는 24시간 이내에 검출 가능하다.
일부 구현예에서, 방법은 본원에 기술된 조성물을 포유동물에게 투여하여 표적 MYOC의 발현이 미치료 동물과 비교하여 예를 들어 적어도 10%만큼 증가되도록 하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, MYOC의 활성화는 연장된 지속 기간, 예를 들어, 적어도 2일, 3일, 4일 이상, 예를 들어, 1주, 2주, 3주, 4주 이상에 걸쳐 발생한다. 이론에 구속되고자 함 없이, iRNA는 MYOC mRNA 전사체를 안정화시키거나, 게놈 내의 프로모터와 상호작용하거나, MYOC 발현의 억제제를 억제함으로써 MYOC 발현을 활성화시킬 수 있다.
본 개시내용에서 특징 지어진 방법 및 조성물에 유용한 iRNA는 MYOC의 RNA(일차 또는 가공된)를 특이적으로 표적으로 한다. iRNA를 사용하여 MYOC의 발현을 억제하는 조성물 및 방법은 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 제조되고 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 iRNA를 함유하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 iRNA는 치료될 대상체, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간의 MYOC의 RNA 전사체의 적어도 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 조성물은 안구(예를 들어, 안구내), 국소 및 정맥내 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다.
소정의 구현예에서, 조성물은 안구내(예를 들어, 유리체내 투여, 예를 들어, 유리체내 주사; 경공막 투여, 예를 들어, 경공막 주사; 결막하 투여, 예를 들어, 결막하 주사; 안구후 투여, 예를 들어, 안구후 주사; 전방내 투여, 예를 들어, 전방내 주사; 또는 망막하 투여, 예를 들어, 망막하 주사) 투여된다. 다른 구현예에서, 조성물은 국소 투여된다. 다른 구현예에서, 조성물은 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다.
소정의 구현예에서, 조성물은 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 일부 이러한 구현예에서, 조성물은 정맥내 주입을 위한 지질 제형화된 siRNA(예를 들어, LNP11 제형과 같은 LNP 제형)를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 개시내용이 속하는 기술분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가인 방법 및 재료가 본 개시내용에서 특징 지어진 iRNA의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기재되어 있다. 본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참조 문헌은 그 내용 전체가 참조로 통합된다. 상기 문헌들과 내용상 상충하는 경우가 발생하는 경우에는, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
특정 구현예
1. 미오실린(MYOC)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서, dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 인간 MYOC의 코딩 가닥의 일부 중 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 안티센스 가닥은 센스 가닥이 안티센스 가닥 내의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드에 상보적이도록 인간 MYOC의 비-코딩 가닥의 상응하는 일부 중 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
2. 구현예 1에 있어서, 인간 MYOC의 코딩 가닥은 서열 서열번호 1을 포함하는, dsRNA 제제.
3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 인간 MYOC의 비-코딩 가닥은 서열 서열번호 2를 포함하는, dsRNA 제제.
4. MYOC의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서, dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥은 센스 가닥이 안티센스 가닥 내의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드에 상보적이도록 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 일부 중 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
5. 구현예 4에 있어서, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 상응하는 일부 중 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 또는 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
5a. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 가닥은 듀플렉스 AD-1565804의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 센스 가닥은 듀플렉스 AD-1565804의 센스 가닥 뉴클레오타이드 서열로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
5b. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 가닥은 듀플렉스 AD-1565837의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 센스 가닥은 듀플렉스 AD-1565837의 센스 가닥 뉴클레오타이드 서열로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
6. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하되, 안티센스 가닥은 센스 가닥이 안티센스 가닥 내의 적어도 17개의 연속 뉴클레오타이드에 상보적이도록 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 일부 중 적어도 17개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA.
7. 구현예 6에 있어서, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 상응하는 일부 중 적어도 17개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 또는 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA.
8. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하되, 안티센스 가닥은 센스 가닥이 안티센스 가닥 내의 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드에 상보적이도록 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 일부 중 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA.
9. 구현예 8에 있어서, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 상응하는 일부 중 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA.
10. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하되, 안티센스 가닥은 센스 가닥이 안티센스 가닥 내의 적어도 21개의 연속 뉴클레오타이드에 상보적이도록 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 일부 중 적어도 21개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA.
11. 구현예 10에 있어서, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 상응하는 일부 중 적어도 21개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 또는 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA.
12. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥의 일부는 표 2a 및 2b 중 어느 하나의 센스 가닥 내의 일부인, dsRNA 제제.
13. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 가닥의 일부는 표 2a 및 2b 중 어느 하나의 안티센스 가닥 내의 일부인, dsRNA 제제.
14. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 가닥은 표 2a 및 2b 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 하나로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
15. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥은 안티센스 서열에 상응하는 표 2a 및 2b 중 어느 하나에 열거된 센스 서열로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
16. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 가닥은 표 2a 및 2b 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 하나로부터 적어도 17개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
17. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥은 안티센스 서열에 상응하는 표 2a 및 2b 중 어느 하나에 열거된 센스 서열로부터 적어도 17개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
18. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 가닥은 표 2a 및 2b 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 하나로부터 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
19. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥은 안티센스 서열에 상응하는 표 2a 및 2b 중 어느 하나에 열거된 센스 서열로부터 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
20. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 가닥은 표 2a 및 2b 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 하나로부터 적어도 21개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
21. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥은 안티센스 서열에 상응하는 표 2a 및 2b 중 어느 하나에 열거된 센스 서열로부터 적어도 21개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
22. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥은 적어도 23개 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어 23~30개 뉴클레오타이드 길이인, dsRNA 제제.
23. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥 중 적어도 하나는 하나 이상의 친유성 모이어티에 접합되는, dsRNA 제제.
24. 구현예 23에 있어서, 친유성 모이어티는 dsRNA 제제의 이중 가닥 영역 내 하나 이상의 위치에 접합되는, dsRNA 제제.
25. 구현예 23 또는 24에 있어서, 친유성 모이어티는 링커 또는 캐리어를 통해 접합되는, dsRNA 제제.
26. 구현예 23 내지 25 중 어느 하나에 있어서, logKow에 의해 측정된 친유성 모이어티의 친유성은 0을 초과하는, dsRNA 제제.
27. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 이중 가닥 RNAi 제제의 혈장 단백질 결합 검정에서 미결합 분율에 의해 측정된 이중 가닥 RNAi 제제의 소수성은 0.2를 초과하는, dsRNA 제제.
28. 구현예 27에 있어서, 혈장 단백질 결합 검정은 인간 혈청 알부민 단백질을 사용한 전기영동 이동성 변화 검정인, dsRNA 제제.
29. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, dsRNA 제제가 적어도 하나의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
30. 구현예 29에 있어서, 5개 이하의 센스 가닥 뉴클레오타이드 및 5개 이하의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드는 미변형 뉴클레오타이드인, dsRNA 제제.
31. 구현예 29에 있어서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형을 포함하는, dsRNA 제제.
32. 구현예 29 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 변형 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 데옥시-뉴클레오타이드, 3'-말단 데옥시-티민(dT) 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 변형 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오타이드, 잠김 뉴클레오타이드, 잠김 해제된 뉴클레오타이드, 입체적으로 제한된 뉴클레오타이드, 구속된 에틸 뉴클레오타이드, 비염기 뉴클레오타이드, 2'-아미노-변형 뉴클레오타이드, 2'-O-알릴-변형 뉴클레오타이드, 2'-C-알킬-변형 뉴클레오타이드, 2'-메톡시에틸 변형 뉴클레오타이드, 2'-O-알킬-변형 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포라미데이트, 뉴클레오타이드를 포함하는 비-천연 염기, 테트라하이드로피란 변형 뉴클레오타이드, 1,5-안하이드로헥시톨 변형 뉴클레오타이드, 시클로헥세닐 변형 뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오타이드, 메틸포스포네이트기를 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-포스페이트 모사체를 포함하는 뉴클레오타이드, 글리콜 변형 뉴클레오타이드, 및 2-O-(N-메틸아세트아미드) 변형 뉴클레오타이드; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, dsRNA 제제.
33. 구현예 29 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 5개 이하의 센스 가닥 뉴클레오타이드 및 5개 이하의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 변형 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오타이드, 잠김 해제된 핵산(UNA) 또는 글리세롤 핵산(GNA) 이외의 변형을 포함하는, dsRNA 제제.
34. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥의 연속 뉴클레오타이드 중 2개 사이 또는 안티센스 가닥의 연속 뉴클레오타이드 중 2개 사이에 비-뉴클레오타이드 스페이서(임의로 비-뉴클레오타이드 스페이서는 C3-C6 알킬을 포함함)를 포함하는, dsRNA 제제.
35. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 각각의 가닥은 길이가 30개 이하의 뉴클레오타이드인, dsRNA 제제.
36. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함하는, dsRNA 제제.
37. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함하는, dsRNA 제제.
38. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 15~30개의 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
39. 구현예 38에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 17~23개의 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
40. 구현예 38에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 17~25개의 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
41. 구현예 38에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 23~27개의 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
42. 구현예 38에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 19~21개의 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
43. 구현예 38에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 21~23개의 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
44. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 각각의 가닥은 19~30개의 뉴클레오타이드를 갖는, dsRNA 제제.
45. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 각각의 가닥은 19~23개의 뉴클레오타이드를 갖는, dsRNA 제제.
46. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 각각의 가닥은 21~23개의 뉴클레오타이드를 갖는, dsRNA 제제.
47. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 제제가 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함하는, dsRNA 제제.
48. 구현예 47에 있어서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합은 한 가닥의 3'-말단에 존재하는, dsRNA 제제.
49. 구현예 48에 있어서, 가닥은 안티센스 가닥인, dsRNA 제제.
50. 구현예 48에 있어서, 가닥은 센스 가닥인, dsRNA 제제.
51. 구현예 47에 있어서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합은 한 가닥의 5'-말단에 존재하는, dsRNA 제제.
52. 구현예 51에 있어서, 가닥은 안티센스 가닥인, dsRNA 제제.
53. 구현예 51에 있어서, 가닥은 센스 가닥인, dsRNA 제제.
54. 구현예 47에 있어서, 한 가닥의 5'-말단 및 3'-말단 각각은 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함하는, dsRNA 제제.
55. 구현예 54에 있어서, 가닥은 안티센스 가닥인, dsRNA 제제.
56. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5'-말단의 1 위치에서 염기쌍은 AU 염기쌍인, dsRNA 제제.
57. 구현예 54에 있어서, 센스 가닥은 총 21개의 뉴클레오타이드를 갖고, 안티센스 가닥은 총 23개의 뉴클레오타이드를 갖는, dsRNA 제제.
58. 구현예 23 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 적어도 하나의 가닥 상에서 하나 이상의 내부 위치에 접합되는, dsRNA 제제.
59. 구현예 58에 있어서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 링커 또는 캐리어를 통해 적어도 하나의 가닥 상에서 하나 이상의 내부 위치에 접합되는, dsRNA 제제.
60. 구현예 59에 있어서, 내부 위치는 적어도 하나의 가닥의 각각의 말단으로부터 말단인 두 개의 위치를 제외한 모든 위치를 포함하는, dsRNA 제제.
61. 구현예 59에 있어서, 내부 위치는 적어도 하나의 가닥의 각각의 말단으로부터 말단인 세 개의 위치를 제외한 모든 위치를 포함하는, dsRNA 제제.
62. 구현예 59 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 내부 위치는 센스 가닥의 절단 부위 영역을 배제하는, dsRNA 제제.
63. 구현예 62에 있어서, 내부 위치는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여, 위치 9~12를 제외한 모든 위치를 포함하는, dsRNA 제제.
64. 구현예 62에 있어서, 내부 위치는 센스 가닥의 3'-말단으로부터 계수하여, 위치 11~13을 제외한 모든 위치를 포함하는, dsRNA 제제.
65. 구현예 59 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 내부 위치는 안티센스 가닥의 절단 부위 영역을 배제하는, dsRNA 제제.
66. 구현예 65에 있어서, 내부 위치는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여, 위치 12~14를 제외한 모든 위치를 포함하는, dsRNA 제제.
67. 구현예 59 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 내부 위치는 3'-말단으로부터 계수하여, 센스 가닥 상의 위치 11~13, 및 5'-말단으로부터 계수하여, 안티센스 가닥 상의 위치 12~14를 제외한 모든 위치를 포함하는, dsRNA 제제.
68. 구현예 23 내지 67 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 각각의 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여, 센스 가닥 상의 위치 4~8 및 13~18 및 안티센스 가닥 상의 위치 6~10 및 15~18로 이루어진 군으로부터 선택된 내부 위치 중 하나 이상에 접합되는, dsRNA 제제.
69. 구현예 68에 있어서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 각각의 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여, 센스 가닥 상의 위치 5, 6, 7, 15, 및 17 및 안티센스 가닥 상의 위치 15 및 17로 이루어진 군으로부터 선택된 내부 위치 중 하나 이상에 접합되는, dsRNA 제제.
70. 구현예 24에 있어서, 이중 가닥 영역에서의 위치는 센스 가닥의 절단 부위 영역을 배제하는, dsRNA 제제.
71. 구현예 23 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥은 길이가 21개 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥은 길이가 23개 뉴클레오타이드이고, 친유성 모이어티는 센스 가닥의 위치 21, 위치 20, 위치 15, 위치 1, 위치 7, 위치 6, 또는 위치 2 또는 안티센스 가닥의 위치 16에 접합되는, dsRNA 제제.
72. 구현예 71에 있어서, 친유성 모이어티는 센스 가닥의 위치 21, 위치 20, 위치 15, 위치 1, 또는 위치 7에 접합되는, dsRNA 제제.
73. 구현예 71에 있어서, 친유성 모이어티는 센스 가닥의 위치 21, 위치 20, 또는 위치 15에 접합되는, dsRNA 제제.
74. 구현예 71에 있어서, 친유성 모이어티는 센스 가닥의 위치 20 또는 위치 15에 접합되는, dsRNA 제제.
75. 구현예 71에 있어서, 친유성 모이어티는 안티센스 가닥의 위치 16에 접합되는, dsRNA 제제.
76. 구현예 71에 있어서, 친유성 모이어티는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여, 위치 6에 접합되는, dsRNA 제제.
77. 구현예 23 내지 76 중 어느 하나에 있어서, 친유성 모이어티는 지방족, 지환족 또는 폴리지환족 화합물인, dsRNA 제제.
78. 구현예 77에 있어서, 친유성 모이어티는 지질, 콜레스테롤, 레티노산, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥산올, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진으로 이루어진 군으로부터 선택되는, dsRNA 제제.
79. 구현예 78에 있어서, 친유성 모이어티는 포화 또는 불포화 C4-C30 탄화수소 쇄 및 하이드록실, 아민, 카르복시산, 설포네이트, 포스페이트, 티올, 아지드 및 알킨으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 작용기를 함유하는, dsRNA 제제.
80. 구현예 79에 있어서, 친유성 모이어티는 포화 또는 불포화 C6-C18 탄화수소 쇄를 함유하는, dsRNA 제제.
81. 구현예 79에 있어서, 친유성 모이어티는 포화 또는 불포화 C16 탄화수소 쇄를 함유하는, dsRNA 제제.
82. 구현예 23 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 친유성 모이어티는 내부 위치(들) 또는 이중 가닥 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드(들)를 대체하는 캐리어를 통해 접합되는, dsRNA 제제.
83. 구현예 82에 있어서, 캐리어는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐, 및 데칼리닐로 이루어진 군으로부터 선택된 환형 작용기이거나; 세리놀 골격 또는 디에탄올아민 골격을 기반으로 하는 비환형 모이어티인, dsRNA 제제.
84. 구현예 23 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 친유성 모이어티는 에테르, 티오에테르, 우레아, 카보네이트, 아민, 아미드, 말레이미드-티오에테르, 디설파이드, 포스포디에스테르, 술폰아미드 결합, 클릭 반응의 생성물 또는 카바메이트를 함유하는 링커를 통해 이중 가닥 iRNA 제제에 접합되는, dsRNA 제제.
85. 구현예 23 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 친유성 모이어티는 핵염기, 당 모이어티, 또는 뉴클레오사이드 간 결합에 접합되는, 이중 가닥 iRNA 제제.
86. 구현예 23 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 친유성 모이어티는 DNA, RNA, 디설파이드, 아미드, 갈락토사민, 글루코사민, 글루코스, 갈락토스, 만노스의 작용화된 단당류 또는 올리고당류 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이오 절단가능한 링커를 통해 접합되는, dsRNA 제제.
87. 구현예 23 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥의 3' 말단은 아민을 갖는 환형 작용기인 말단 캡을 통해 보호되고, 상기 환형 작용기는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐 및 데칼리닐로 이루어진 군으로으로부터 선택되는, dsRNA 제제.
88. 구현예 23 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드, 예를 들어, 안구 조직 또는 간 조직을 표적으로 하는 리간드를 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
89. 구현예 88에 있어서, 리간드는 센스 가닥에 접합되는, dsRNA 제제.
90. 구현예 88 또는 89에 있어서, 리간드는 센스 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단에 접합되는, dsRNA 제제.
91. 구현예 88 또는 89에 있어서, 리간드는 센스 가닥의 3' 말단에 접합되는, dsRNA 제제.
92. 구현예 88 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 안구 조직은 섬유주대 조직, 섬모체, 망막 조직, 망막 색소 상피(RPE) 또는 맥락막 조직, 예를 들어 맥락막 혈관인, dsRNA 제제.
93. 구현예 88 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)을 포함하는, dsRNA 제제.
94. 구현예 88 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드는 하나 이상의 GalNAc 접합체 또는 하나 이상의 GalNAc 유도체인, dsRNA 제제.
95. 구현예 94에 있어서, 하나 이상의 GalNAc 접합체 또는 하나 이상의 GalNAc 유도체는 1가 링커, 또는 2가, 3가, 또는 4가 분지형 링커를 통해 부착된, dsRNA 제제.
96. 구현예 94에 있어서, 리간드는 다음인, dsRNA 제제.
97. 구현예 96에 있어서, dsRNA 제제가 하기 도식에 도시된 것과 같이 리간드에 접합되고,
여기서 X는 O 또는 S인, dsRNA 제제.
98. 구현예 97에 있어서, X는 O인, dsRNA 제제.
99. 구현예 1 내지 98 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 가닥의 3' 말단의 제1 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하고, Sp 배위의 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형,
안티센스 가닥의 5' 말단의 제1 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하고, Rp 배위의 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형, 및
센스 가닥의 5' 말단의 제1 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하고, Rp 배위 또는 Sp 배위의 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형을 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
100. 구현예 1 내지 98 중 어느 하나에 있어서,
안티센스 가닥의 3' 말단의 제1 및 제2 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하고, Sp 배위의 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형,
안티센스 가닥의 5' 말단의 제1 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하고, Rp 배위의 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형, 및
센스 가닥의 5' 말단의 제1 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하고, Rp 또는 Sp 배위의 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형을 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
101. 구현예 1 내지 98 중 어느 하나에 있어서,
안티센스 가닥의 3' 말단의 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하고, Sp 배위의 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형,
안티센스 가닥의 5' 말단의 제1 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하고, Rp 배위의 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형, 및
센스 가닥의 5' 말단의 제1 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하고, Rp 또는 Sp 배위의 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형을 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
102. 구현예 1 내지 98 중 어느 하나에 있어서,
안티센스 가닥의 3' 말단의 제1 및 제2 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하고, Sp 배위의 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형,
안티센스 가닥의 3' 말단의 제3 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하고, Rp 배위의 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형,
안티센스 가닥의 5' 말단의 제1 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하고, Rp 배위의 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형, 및
센스 가닥의 5' 말단의 제1 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하고, Rp 또는 Sp 배위의 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형을 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
103. 구현예 1 내지 98 중 어느 하나에 있어서,
안티센스 가닥의 3' 말단의 제1 및 제2 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하고, Sp 배위의 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형,
안티센스 가닥의 5' 말단의 제1 및 제2 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하고, Rp 배위의 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형, 및
센스 가닥의 5' 말단의 제1 뉴클레오타이드 간 결합에서 발생하고, Rp 또는 Sp 배위의 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형을 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
104. 구현예 1 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 가닥의 5'-말단에 포스페이트 또는 포스페이트 모사체를 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
105. 구현예 104에 있어서, 포스페이트 모사체는 5'-비닐 포스포네이트(VP)인, dsRNA 제제.
106. 구현예 1 내지 105 중 어느 하나의 dsRNA 제제를 함유하는 세포.
107. 인간 안구 세포, 예를 들어, 다른 유사한 미치료 세포와 비교하여 감소된 수준의 MYOC mRNA 또는 MYOC 단백질의 수준을 포함하는 인간 안구 세포(섬유주대 세포, 섬모체 세포, RPE 세포, 성상세포, 주피세포, 뮐러 세포, 신경절 세포, 내피 세포, 또는 광수용체 세포)로서, 임의로 수준은 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%만큼 감소되는, 인간 안구 세포.
108. 구현예 107에 있어서, 구현예 1 내지 94 중 어느 하나의 dsRNA 제제와 인간 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 공정에 의해 생산된, 인간 세포.
109. 구현예 1 내지 105 중 어느 하나의 dsRNA 제제를 포함하는, MYOC의 발현을 억제하기 위한 약제학적 조성물.
110. 구현예 1 내지 105 중 어느 하나의 dsRNA 제제 및 지질 제형을 포함하는 약제학적 조성물.
111. 세포에서 MYOC의 발현을 억제하는 방법으로서, 본 방법은:
(a) 구현예 1 내지 105 중 어느 하나의 dsRNA 제제 또는 구현예 109 또는 110의 약제학적 조성물과 세포를 접촉시키는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 생산된 세포를 MYOC의 mRNA 전사체의 분해를 수득하기에 충분한 시간 동안 유지시켜, 세포에서 MYOC의 발현을 억제하는 단계를 포함하는, 방법.
112. 세포에서 MYOC의 발현을 억제하는 방법으로서, 본 방법은:
(a) 구현예 1 내지 105 중 어느 하나의 dsRNA 제제 또는 구현예 109 또는 110의 약제학적 조성물과 세포를 접촉시키는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 생산된 세포를 MYOC mRNA, MYOC 단백질, 또는 MYOC mRNA 및 단백질 둘 다의 수준을 감소시키기에 충분한 시간 동안 유지시켜, 세포에서 MYOC의 발현을 억제하는 단계를 포함하는, 방법.
113. 구현예 111 또는 112에 있어서, 세포는 대상체 내에 존재하는, 방법.
114. 구현예 113에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
115. 구현예 111 내지 114 중 어느 하나에 있어서, MYOC mRNA의 수준은 적어도 50%만큼 억제되는, 방법.
116. 구현예 111 내지 114 중 어느 하나에 있어서, MYOC 단백질의 수준은 적어도 50%만큼 억제되는, 방법.
117. 구현예 114 내지 116에 있어서, MYOC의 발현을 억제하는 것이 대상체로부터의 생물학적 샘플(예를 들어, 수성 안액 샘플)에서 MYOC 단백질 수준을 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%만큼 감소시키는, 방법.
118. 구현예 114 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 MYOC 관련 장애, 예를 들어, 녹내장, 예를 들어, 원발성 개방각 녹내장(POAG)을 진단받은, 방법.
119. 안구 세포 또는 조직에서 MYOC의 발현을 억제하는 방법으로서, 본 방법은:
(a) 세포 또는 조직을 MYOC에 결합하는 dsRNA 제제와 접촉시키는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 생산된 세포 또는 조직을 MYOC mRNA, MYOC 단백질, 또는 MYOC mRNA 및 단백질 둘 다의 수준을 감소시키기에 충분한 시간 동안 유지시켜, 세포 또는 조직에서 MYOC의 발현을 억제하는 단계를 포함하는, 방법.
120. 구현예 119에 있어서, 안구 세포 또는 조직은 섬유주대 조직, 섬모체, RPE 세포, 망막 조직, 성상세포, 혈관주피세포, 뮐러 세포, 신경절 세포, 내피 세포, 광수용체 세포, 망막 혈관(예를 들어, 내피 세포 및 혈관 평활근 세포 포함), 또는 맥락막 조직, 예를 들어 맥락막 혈관을 포함하는, 방법.
120a. 대상체에서 안압을 감소시키는 방법으로서, 방법은 구현예 1 내지 105 중 어느 하나의 dsRNA 제제 또는 구현예 109 또는 110의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 대상체에서 안압을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
120b. 대상체에서 안압 증가를 제한하거나 일정한 안압을 유지하는 방법으로서, 방법은 구현예 1 내지 105 중 어느 하나의 dsRNA 제제 또는 구현예 109 또는 110의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 대상체에서 안압 증가를 제한하거나 일정한 안압을 유지하는 단계를 포함하는, 방법.
121. MYOC 관련 장애를 앓고 있거나 이를 앓고 있는 것으로 진단된 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 구현예 1 내지 105 중 어느 하나의 dsRNA 제제 또는 구현예 109 또는 110의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
122. 구현예 118 또는 121에 있어서, MYOC 관련 장애는 녹내장인, 방법.
122a. 녹내장을 갖고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 구현예 1 내지 105 중 어느 하나의 dsRNA 제제 또는 구현예 109 또는 110의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 녹내장을 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
123. 구현예 122 또는 122a에 있어서, 녹내장은 원발성 개방각 녹내장(POAG)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
124. 구현예 121 내지 123 중 어느 하나에 있어서, 치료가 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 완화시키는 것을 포함하는, 방법.
125. 구현예 124에 있어서, 녹내장의 적어도 하나의 징후 또는 증상은
시신경 손상, 시력 상실, 터널 시력, 시야 흐림, 안구 통증 또는 MYOC의 존재, 수준, 또는 활성(예를 들어, MYOC 유전자, MYOC mRNA, 또는 MYOC 단백질) 중 하나 이상의 측정치를 포함하는, 방법.
126. 구현예 121 내지 123 중 어느 하나에 있어서, 치료가 장애의 진행을 예방하는 것을 포함하는, 방법.
127. 구현예 124 내지 126에 있어서, 치료가 (a) MYOC의 발현 또는 활성을 억제 또는 감소시키거나; (b) 오접힘 MYOC 단백질의 수준을 감소시키거나; (c) 섬유주대 세포 사멸을 감소시키거나; (d) 안압을 감소시키거나; (e) 시력을 증가시키는 것 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
128. 구현예 127에 있어서, 치료가 섬유주대 조직, 섬모체, 망막, RPE, 망막 혈관(예를 들어, 내피 세포 및 혈관 평활근 세포 포함), 또는 맥락막 조직, 예를 들어 맥락막 혈관 내 MYOC mRNA의 베이스라인 대비 적어도 30%의 평균 감소를 초래하는, 방법.
129. 구현예 128에 있어서, 치료가 섬유주대 조직, 섬모체, 망막, RPE, 망막 혈관(예를 들어, 내피 세포 및 혈관 평활근 세포 포함), 또는 맥락막 조직, 예를 들어 맥락막 혈관 내 MYOC mRNA의 베이스라인 대비 적어도 60%의 평균 감소를 초래하는, 방법.
130. 구현예 129에 있어서, 치료가 섬유주대 조직, 섬모체, 망막, RPE, 망막 혈관(예를 들어, 내피 세포 및 혈관 평활근 세포 포함), 또는 맥락막 조직, 예를 들어 맥락막 혈관 내 MYOC mRNA의 베이스라인 대비 적어도 90%의 평균 감소를 초래하는, 방법.
131. 구현예 124 내지 129 중 어느 하나에 있어서, 치료 후, 대상체는 망막 내 MYOC 단백질에 의해 평가됐을 때 dsRNA의 1회 투여 후 적어도 8주의 녹다운 기간을 경험하는, 방법.
132. 구현예 131에 있어서, 치료가 망막 내 MYOC 단백질에 의해 평가됐을 때 dsRNA의 1회 투여 후 적어도 12주의 녹다운 기간을 초래하는, 방법.
133. 구현예 132에 있어서, 치료가 망막 내 MYOC 단백질에 의해 평가됐을 때 dsRNA의 1회 투여 후 적어도 16주의 녹다운 기간을 초래하는, 방법.
134. 구현예 113 내지 133 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
135. 구현예 114 내지 134 중 어느 하나에 있어서, dsRNA 제제가 약 0.01mg/kg 내지 약 50mg/kg의 용량으로 투여되는, 방법.
136. 구현에 114 내지 135 중 어느 하나에 있어서, dsRNA 제제가 대상체에게 안구내, 정맥내, 또는 국소 투여되는, 방법.
137. 구현예 136에 있어서, 안구내 투여는 유리체내 투여(예를 들어, 유리체내 주사), 경공막 투여(예를 들어, 경공막 주사), 결막하 투여(예를 들어, 결막하 주사), 안구후 투여(예를 들어, 안구후 주사), 전방내 투여(예를 들어, 전방내 주사), 또는 망막하 투여(예를 들어, 망막하 주사)를 포함하는, 방법.
138. 구현예 114 내지 137 중 어느 하나에 있어서, 대상체 내 MYOC(예를 들어, MYOC 유전자, MYOC mRNA, 또는 MYOC 단백질)의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
139. 구현예 138에 있어서, 대상체 내 MYOC의 수준을 측정하는 단계는 대상체로부터의 생물학적 샘플(예를 들어, 수성 안액 샘플)에서 MYOC 유전자, MYOC 단백질 또는 MYOC mRNA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
140. 구현예 114 내지 139 중 어느 하나에 있어서, 혈액 검사, 영상 검사, 또는 수성 안액 생검을 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
141. 구현예 138 내지 140 중 어느 하나에 있어서, 대상체 내 MYOC(예를 들어, MYOC 유전자, MYOC mRNA, 또는 MYOC 단백질)의 수준을 측정하는 단계는 dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물로 치료하기 전에 수행되는, 방법.
142. 구현예 141에 있어서, 대상체가 기준 수준보다 큰 MYOC(예를 들어, MYOC 유전자, MYOC mRNA, 또는 MYOC 단백질)의 수준을 갖고 있음을 결정 시, dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물이 대상체에게 투여되는, 방법.
143. 구현예 139 내지 142 중 어느 하나에 있어서, 대상체 내 MYOC(예를 들어, MYOC 유전자, MYOC mRNA, 또는 MYOC 단백질)의 수준을 측정하는 단계는 dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물로 치료한 후에 수행되는, 방법.
144. 구현예 121 내지 143 중 어느 하나에 있어서, 대상체에게 MYOC 관련 장애의 치료 또는 예방에 적합한 추가의 제제 및/또는 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
145. 구현예 144에 있어서, 추가의 제제 및/또는 요법은 광역학적 요법, 광응고 요법, 스테로이드, 비스테로이드성 항염증제, 항-MYOC 제제, 및/또는 유리체절제술 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
실시예
실시예 1. MYOC siRNA
본원에 제공된 핵산 서열은 표준 명명법을 사용하여 표시된다. 표 1의 약어를 참조한다.
[표 1] 핵산 서열 표현에 사용되는 뉴클레오타이드 단량체의 약어.
이들 단량체는 올리고뉴클레오타이드에 존재할 때 5'-3'-포스포디에스테르 결합에 의해 상호 결합된다는 것을 이해할 것이다.
1L96의 화학 구조는 다음과 같다:
실험 방법
생물정보학
전사체
인간 MYOC를 표적으로 하는 4개의 siRNA 세트, "미오실린"(인간: NCBI refseqID NM_000261.2; NCBI GeneID: 4653)을 생성하였다. 인간 NM_000261.2 REFSEQ mRNA는 2100개 염기의 길이를 갖는다. 생물정보학적 방법을 사용하여 올리고 쌍을 생성하고 순위를 매겼으며, 예시적인 올리고 쌍을 표 2a 및 표 2b에 나타내었다. 변형된 서열은 표 2a에 제시되어 있다. 미변형 서열은 표 2b에 제시되어 있다.
[표 2a]. 예시적인 인간 MYOC siRNA 변형 단일 가닥 및 듀플렉스 서열
열 1은 듀플렉스 명칭을 나타내며 듀플렉스 명칭의 소수점 다음에 오는 숫자는 단지 배치 생산 번호를 지칭한다. 열 2는 센스 서열의 명칭을 나타낸다. 열 3은 열 4의 서열에 대한 서열 ID를 나타낸다. 열 4는 본원에 기술된 듀플렉스에 사용하기에 적합한 센스 가닥의 변형된 서열을 제공한다. 열 5는 안티센스 서열 명칭을 나타낸다. 열 6은 열 7의 서열에 대한 서열 ID를 나타낸다. 열 7은 본원에 기술된 듀플렉스, 예를 들어 표의 동일한 행의 센스 서열을 포함하는 듀플렉스에 사용하기에 적합한 변형된 안티센스 가닥의 서열을 제공한다. 열 8은 열 7의 안티센스 가닥에 상보적인 표적 mRNA(NM_000261.2) 내 위치를 나타낸다. 열 9는 열 8의 서열에 대한 서열 ID를 나타낸다.
[표 2b]. 예시적인 인간 MYOC siRNA 미변형 단일 가닥 및 듀플렉스 서열
열 1은 듀플렉스 명칭을 나타내고; 듀플렉스 명칭의 소수점 다음에 오는 숫자는 단지 배치 생산 번호를 지칭한다. 열 2는 센스 서열 명칭을 나타낸다. 열 3은 열 4의 서열에 대한 서열 ID를 나타낸다. 열 4는 본원에 기술된 듀플렉스에 사용하기에 적합한 센스 가닥의 미변형 서열을 제공한다. 열 5는 열 4의 센스 가닥의 표적 mRNA(NM_000261.2) 내 위치를 제공한다. 열 6은 안티센스 서열 명칭을 나타낸다. 열 7은 열 8의 서열에 대한 서열 ID를 나타낸다. 열 8은 화학적 변형을 특정하지 않고, 본원에 기술된 듀플렉스에 사용하기에 적합한 안티센스 가닥의 서열을 제공한다. 열 9는 열 8의 안티센스 가닥에 상보적인 표적 mRNA(NM_000261.2) 내 위치를 나타낸다.
실시예 2. MYOC siRNA의 시험관내 스크리닝
실험 방법
세포 배양 및 형질감염
인간 섬유주대 세포(HTMC) 세포 형질감염
HTMC 세포(ATCC)가 각각의 siRNA 듀플렉스의 4개의 복사체와 함께 웰당 5μL의 siRNA 듀플렉스에 대해 웰당(Invitrogen, 캘리포니아 주 칼스배드 소재. cat # 13778-150) 4.9μL의 Opti-MEM + 0.1μL의 RNAiMAX을 384-웰 플레이트에 첨가함으로써 형질감염되고, 15분동안 실온에서 항온처리되었다. 이어서 약 5x103개의 세포를 함유하는 40μL의 DMEM:F12 배지(ThermoFisher)를 siRNA-형질감염 혼합물에 첨가하였다. 세포는 RNA 정제 전에 24시간 동안 항온처리되었다. 실험은 10nM, 1nM, 및 0.1nM에서 수행되었다.
DYNABEADS mRNA 단리 키트를 사용한 총 RNA 단리:
RNA는 DYNABEAD(Invitrogen, cat#61012)를 사용한 BioTek-EL406 플랫폼 상에서 자동화 프로토콜을 사용하여 단리되었다. 간략하게, 70μL의 용해/결합 완충액 및 3μL의 자기 비드를 함유하는 10μL의 용해 완충액을 세포를 있는 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 10분 동안 전자기 진탕기 상에서 항온처리한 다음, 자기 비드를 포획하고 상등액을 제거하였다. 그런 다음 비드 결합된 RNA를 150μL 세척 완충액 A로 2회 세척하고 세척 완충액 B로 1회 세척하였다. 그런 다음 비드를 150μL의 용출 완충액으로 세척하고, 재포획하고 상등액을 제거하였다.
ABI 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems, 캘리포니아 주 포스터 시티 소재, Cat #4368813)를 사용한 cDNA 합성:
1μL의 10X 완충액, 0.4μL의 25X dNTP, 1μL의 10x 무작위 프라이머, 0.5μL의 역전사효소, 0.5μL의 RNase 억제제 및 반응당 6.6μL의 H2O를 함유하는 10μL의 마스터 혼합물을 전술한 단리된 RNA에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 혼합하고, 실온에서 10분 동안 전자기 진탕기 상에서 항온처리한 다음, 37°C에서 2시간 항온처리하였다.
실시간 PCR:
2μL의 cDNA 및 5μl의 Lightcycler 480 프로브 마스터 혼합물(Roche Cat # 04887301001)을 384 웰 플레이트(Roche cat # 04887301001)에 웰 당 0.5μl의 인간 GAPDH TaqMan 프로브(4326317E) 및 0.5μl의 MYOC 인간 프로브 중 어느 하나에 첨가하였다. 실시간 PCR이 Lightcycler480 실시간 PCR 시스템(Roche)에서 수행되었다. 각각의 듀플렉스는 적어도 2회 시험되었고, 데이터가 비표적화 대조군 siRNA로 형질감염시킨 세포에 대해 정규화되었다. 상대적 배수 변화를 계산하기 위해, 실시간 데이터를 △△Ct 방법을 사용하여 분석하였고 비표적화 대조군 siRNA로 형질감염시킨 세포로 수행된 검정에 대해 정규화되었다.
결과
예시적인 인간 MYOC siRNA를 갖는 인간 섬유주대 세포(HTMC)에서의 다회 투여 스크리닝의 결과를 표 3에 나타냈다(표 2a의 siRNA에 상응함). 다회 투여 실험을 10nM, 1nM, 및 0.1nM의 최종 듀플렉스 농도에서 수행하였고, 데이터는 비표적화 대조군에 대해 남아 있는 백분율 메시지로서 표현하였다.
아래 표 3에서 평가된 예시적인 siRNA 듀플렉스 중, 10nM 농도로 투여했을 때 HTMC 세포에서 174개는 MYOC의 ≥ 90%의 녹다운을 달성하였고, 347개는 MYOC의 ≥ 70%의 녹다운을 달성하였고, 392개는 MYOC의 ≥ 50%의 녹다운을 달성하였고, 424개는 MYOC의 ≥ 20%의 녹다운을 달성하였고, 433개는 MYOC의 ≥ 10%의 녹다운을 달성하였다.
아래 표 3에서 평가된 예시적인 siRNA 듀플렉스 중, 1nM 농도로 투여했을 때 HTMC 세포에서 142개는 MYOC의 ≥ 90%의 녹다운을 달성하였고, 341개는 MYOC의 ≥ 70%의 녹다운을 달성하였고, 391개는 MYOC의 ≥ 50%의 녹다운을 달성하였고, 424개는 MYOC의 ≥ 20%의 녹다운을 달성하였고, 431개는 MYOC의 ≥ 10%의 녹다운을 달성하였다.
아래 표 3에서 평가된 예시적인 siRNA 듀플렉스 중, 0.1nM 농도로 투여했을 때 HTMC 세포에서 57개는 MYOC의 ≥ 90%의 녹다운을 달성하였고, 277개는 MYOC의 ≥ 70%의 녹다운을 달성하였고, 361개는 MYOC의 ≥ 50%의 녹다운을 달성하였고, 416개는 MYOC의 ≥ 20%의 녹다운을 달성하였고, 425개는 MYOC의 ≥ 10%의 녹다운을 달성하였다.
아래 표 3에서 평가된 예시적인 siRNA 듀플렉스 중, AD-1565448.1, AD-1193175.5, AD-1565798.1, AD-1565452.1, AD-1565453.1, AD-1565454.1, AD-1565456.1, AD-1565492.1, AD-1565493.1, AD-1565503.1, AD-1073418.5, AD-1565804.1, AD-1565806.1, AD-1244366.3, AD-1565589.1, AD-1565837.1, AD-1565624.1, AD-1565626.1은 HTMC 세포에서 MYOC의 우수한 녹다운을 보여주었다.
[표 3] 예시적인 인간 MYOC siRNA의 한 세트를 사용한 MYOC 내인성 시험관내 다회 투여 스크리닝(*듀플렉스 명칭의 소수점 다음에 오는 숫자는 단지 배치 생산 번호를 지칭함)
실시예 3. 마우스 녹내장 모델에서 인간 MYOC siRNA의 검증
생체내에서 인간 MYOC siRNA를 시험하기 위해, 녹내장 마우스 모델이 사용되었다: 상승적 활성화 매개체(SAM) 마우스로서 Y437H 돌연변이를 포함하는 인간화 MYOC 유전자좌를 포함한다(SAM-MYOC 마우스). 이들 마우스에서, MYOC 프로모터를 표적으로 하는 SAM 가이드 RNA(SAM gRNA)를 Y437H 돌연변이를 포함하는 인간화 MYOC의 발현을 증가시키는 데 사용하여 안압(IOP)을 증가시킬 수 있다. SAM-MYOC 마우스는 내인성 Rosa26 프로모터(US 2019/0284572 및 WO 2019/183123에 기술되며, 이들 각각은 본원에 참조로서 인용됨)에 의해 유도된 하나의 전사물로서 게놈적으로 통합된 dCas9 상승적 활성화 매개체(SAM) 시스템 성분(dCas9-VP64 및 MCP-p65-HSF1)을 포함하는 마우스를 Y437H 돌연변이를 포함하는 인간화 MYOC 유전자좌를 포함하는 마우스와 교배시킴으로써 생성되었다. 이들 마우스에서, 시작 코돈에서 종결 코돈까지의 마우스 Myoc 서열을 상응하는 인간 MYOC 서열로 대체하였다. 삽입된 인간 MYOC 서열은 Y437H 돌연변이를 포함하며, 이는 상승된IOP 및 녹내장의 발생과 연관된 돌연변이이다. MYOC 프로모터를 표적으로 하는 SAM 가이드 RNA를 암호화하는 AAV2.Y3F 또는 렌티바이러스의 주사는 윤부 고리(섬유주대(TM), 홍채, 및 섬모체(CB))에서 인간화 MYOC Y437H 발현을 증가시켰고, 이는 증가된 IOP와 상관 관계가 있었으며, SAM-MYOC 마우스를 증가된 IOP를 갖는 적절한 MYOC 질환 모델로서 검증하였다(데이터 미도시).
인간 MYOC를 표적으로 하는 siRNA를 시험하여, SAM gRNA로 치료한 후 Y437H 돌연변이를 포함하는 인간화 MYOC 유전자좌를 포함하는 SAM 마우스(SAM-MYOC 마우스)에서 관찰된 높은 안압(IOP)을 낮출 수 있는지를 결정하였다. 실험 설정은 도 1a에 도시되어 있다. SAM gRNA를 0일차에 전방내(IC) 주사를 통해 투여하고, 베이스라인 IOP를 측정하였다. 그런 다음, IOP를 다음 5주에 걸쳐 측정하였다. 5주차에, 유리체내(IVT) 주사를 통해 MYOC siRNA AD-822899(1μL, 15μg 투여량)를 투여하고, 후속 주에 걸쳐 다양한 시점에 IOP를 측정하였다. 3개의 치료군이 존재했다: (1) 미처리 대조군 마우스; (2) 인간 MYOC siRNA로 치료한 SAM-gRNA-치료 마우스; 및 (3) 루시페라아제 siRNA로 치료한 SAM-gRNA-치료 마우스. 도 1b에 도시한 바와 같이, 인간 MYOC siRNA는 SAM gRNA로 치료한 SAM-MYOC 마우스에서 IOP를 낮추었고, siRNA 주사 후 7일차부터 IOP를 베이스라인 수준으로 반전 및 복귀시킨 반면, 루시페라아제 siRNA는 IOP에 영향을 미치지 않았다.
그런 다음, 인간 MYOC를 표적으로 하는 여러 개의 추가 siRNA를 더 낮은 투여량으로 시험하여 렌티바이러스 SAM gRNA로 치료한 후 SAM-MYOC 마우스에서 관찰된 IOP를 낮출 수 있는지를 결정하였다. 마우스에게 SAM gRNA 및 siRNA를 양쪽으로 주사하였다. 실험 설정은 도 2a에 도시되어 있다. SAM gRNA를 0일차에 전방내(IC) 주사를 통해 투여하고, 베이스라인 IOP를 측정하였다. 그런 다음, IOP를 다음 5주에 걸쳐 측정하였다. 5주차에, MYOC siRNA AD-822899, AD-1565804, AD-1565837, AD-1193175, 또는 AD-1565503(1μL, 7.5μg 투여량)을 유리체내(IVT) 주사를 통해 투여하고, 후속 주에 걸쳐 다양한 시점에 IOP를 측정하였다. 윤부 고리에서의 mRNA 녹다운을 qPCR로 시험하고, RNASCOPE® 분석을 수행하였다. 대조군에는 미처리 대조군 마우스, PBS-치료 마우스, 및 LV-SAM gRNA-치료 마우스가 포함되었다. 도 2b에 도시한 바와 같이, 각각의 인간 MYOC siRNA는 SAM gRNA로 치료한 SAM-MYOC 마우스에서 IOP를 낮추었고, siRNA 주사 후 곧 IOP를 베이스라인 수준으로 반전 및 복귀시켰다. 도 2c에 도시한 바와 같이, 각각의 인간 MYOC siRNA는 윤부 고리로부터의 샘플에서 qPCR로 측정했을 때, LV-SAM-gRNA 군에 비해 인간 MYOC mRNA 발현을 감소시켰다. RNASCOPE® 분석은 siRNA가 SAM-MYOC 마우스에서 인간 MYOC mRNA의 녹다운을 매개하였음을 확인시켜 주었다(도 2d).
그런 다음, 인간 MYOC siRNA AD-1565804 또는 AD-1565837을 훨씬 더 낮은 투여량으로 시험하여 렌티바이러스 SAM-g4로 치료한 후 SAM-MYOC 마우스에서 관찰된 IOP를 낮출 수 있는지를 결정하였다. 마우스에게 SAM gRNA 및 siRNA를 양쪽으로 주사하였다. 실험 설정은 도 3a에 도시되어 있다. SAM-g4를 0일차에 전방내(IC) 주사를 통해 투여하고, 베이스라인 IOP를 측정하였다. 그런 다음, IOP를 다음 5주에 걸쳐 측정하였다. 5주차에, MYOC siRNA AD-1565804 또는 AD-1565837(1μL, 3.75μg 투여량 또는 1.87μg 투여량)을 유리체내(IVT) 주사를 통해 투여하고, 후속주에 걸쳐 다양한 시점에 IOP를 측정하였다. 윤부 고리에서의 mRNA 녹다운을 qPCR로 시험하고, RNASCOPE® 분석을 수행하였다. 대조군에는 미처리 대조군 마우스, PBS-치료 마우스, 및 LV-SAM-gRNA-치료 마우스가 포함되었다. 도 3b에 도시한 바와 같이, 각각의 인간 MYOC siRNA는 시험된 각각의 투여량에서 SAM gRNA로 치료한 SAM-MYOC 마우스에서 IOP를 낮추었고, siRNA 주사 후 곧 IOP를 베이스라인 수준으로 반전 및 복귀시켰다. 도 3c에 도시한 바와 같이, 각각의 인간 MYOC siRNA는 윤부 고리로부터의 샘플에서 qPCR로 측정했을 때, LV-SAM gRNA 군에 비해 인간 MYOC mRNA 발현을 시험된 각각의 투여량에서 감소시켰다.
실시예 4. 비인간 영장류(NHP) 녹내장 모델에서 인간 MYOC siRNA의 검증
MYOC를 표적으로 하는 siRNA를 시험하여 비인간 영장류(NHP)의 녹내장 모델에서 관찰된 높은 안압(IOP)을 낮출 수 있는지를 결정하였다. 연구 설계는 표 4에 도시되어 있다. 동물에게 PBS 대조군 또는 다양한 투여량의 듀플렉스 AD-1565837 또는 듀플렉스 AD-1565804를 투여하였다.
OE 및 안압(IOP)을 연구 전, 3, 8, 15, 29, 및 57일차에 측정하였고, 12주차 동안 1회 측정하였다. 전기망막조영술(ERG)은 연구 전, 연구 중(6주차), 및 종료 시(12주차)에 수행되었다. 수양액(AH)을 투여 전, 4주차, 8주차 및 종료 시에 수집하였다. 종료 시, 다음의 안구 샘플을 우측 눈으로부터 채취하였다: AH, 유리체액(VH), 각막, 홍채, 섬유주대(TM), 섬모체(CB), 공막(TM이 없는 윤부 고리), 망막, 및 눈의 후방 구역의 모든 잔여 조직. 투여 전 및 종료 시 혈액을 2회 채취하였다. 혈액학, 응고, 및 임상 화학 연구가 혈액 샘플에 대해 수행되었다.
종결 시 병리학을 위해 우측 눈, 시신경 및 안구외 및 안구주위 조직을 포함하여 조직이 채취되었다: 뇌, 우측(대뇌 반구); 식도, 근위; 위, 식도-위 접합부; 눈꺼풀, 안검 결막이 있는 상부, 우측; 눈꺼풀, 안검 결막이 있는 하부, 우측; 심장, 정점; 공장; 신장, 우측 피질; 간, 우측 중앙 로브; 눈물샘, 우측; 심층 경추, 림프절, 우측; 하악골, 림프절, 우측; 좌골 신경, 우측; 근육, 대퇴직근; 근육, 횡경막; 근육, 안구외(측면 및 내직근, 우측); 난소, 우측; 하악 침샘, 우측; 척수, 경추; 척수, 흉부; 척수, 요추; 갑상선, 우측; 혀; 편도선, 우측; 기관; 및 자궁.
[표 4]: NHP DC 선택 연구 설계
TM에서의 MYOC 단백질 녹다운을 85일차에 분석하였다. 녹다운 결과가 도 4에 도시되어 있다. AD-1565837 듀플렉스에서 TM 내 MYOC 단백질의 약 50% 감소가 관찰된 반면, AD-1565804 듀플렉스에서 최소 녹다운이 관찰되었다. 수양액의 MYOC 단백질이 -35일, 22일, 50일, 및 85일차(최종 수집)에 분석되었다. 도 5에 도시한 바와 같이, 약 50%의 MYOC 단백질 녹다운이 50일차에 관찰되었지만, 85일차에는 관찰되지 않았다. 유리체액, 홍채, 섬모체, 및 공막에서의 MYOC 단백질 녹다운이 85일차(최종 수집)에 분석되었다. 유리체액 및 섬모체에 대해 결과가 도 6a에 도시되어 있고, 홍채 및 공막에 대해 도 6b에 도시되어 있다. 85일차에, 평가된 듀플렉스에 대해 MYOC mRNA에서 녹다운이 관찰되지 않았다(도 7).
SEQUENCE LISTING <110> ALNYLAM PHARMACEUTICALS, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR SILENCING MYOC EXPRESSION <130> A108868 1490WO <140> <141> <150> 63/351,033 <151> 2022-06-10 <150> 63/287,404 <151> 2021-12-08 <150> 63/215,804 <151> 2021-06-28 <160> 2226 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2100 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gagccagcaa ggccacccat ccaggcacct ctcagcacag cagagctttc cagaggaagc 60 ctcaccaagc ctctgcaatg aggttcttct gtgcacgttg ctgcagcttt gggcctgaga 120 tgccagctgt ccagctgctg cttctggcct gcctggtgtg ggatgtgggg gccaggacag 180 ctcagctcag gaaggccaat gaccagagtg gccgatgcca gtataccttc agtgtggcca 240 gtcccaatga atccagctgc ccagagcaga gccaggccat gtcagtcatc cataacttac 300 agagagacag cagcacccaa cgcttagacc tggaggccac caaagctcga ctcagctccc 360 tggagagcct cctccaccaa ttgaccttgg accaggctgc caggccccag gagacccagg 420 aggggctgca gagggagctg ggcaccctga ggcgggagcg ggaccagctg gaaacccaaa 480 ccagagagtt ggagactgcc tacagcaacc tcctccgaga caagtcagtt ctggaggaag 540 agaagaagcg actaaggcaa gaaaatgaga 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 13 aaugagguuc uucugugcac a 21 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 14 augagguucu ucugugcacg a 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 15 ugagguucuu cugugcacgu a 21 <210> 16 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 16 ugagguucuu cugugcacgu a 21 <210> 17 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 17 gagguucuuc ugugcacguu a 21 <210> 18 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 18 agguucuucu gugcacguug a 21 <210> 19 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial 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Synthetic oligonucleotide <400> 25 agguucuucu gugcacguug a 21 <210> 26 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 gguucuucug ugcacguugc a 21 <210> 27 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 gguucuucug ugcacguugc a 21 <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 28 guucuucugu gcacguuga 19 <210> 29 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 29 guucuucugu gcacguugcu a 21 <210> 30 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 30 uucuucugug cacguugcug a 21 <210> 31 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 62 cuggaggcca ccaaagcucg a 21 <210> 63 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 63 gaaacccaaa ccagagaguu a 21 <210> 64 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 64 cagcaaccuc cuccgagaca a 21 <210> 65 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 65 cagcaaccuc cuccgagaca a 21 <210> 66 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 66 gcaaccuccu ccgagacaag a 21 <210> 67 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 67 gcaaccuccu ccgagacaag a 21 <210> 68 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 68 gcaaccuccu ccgagacaag a 21 <210> 69 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 69 agacaaguca guucuggagg a 21 <210> 70 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 70 caagucaguu cuggaggaag a 21 <210> 71 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 71 gucaguucug gaggaagaga a 21 <210> 72 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 72 agaaucuggc caggagguug a 21 <210> 73 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 73 uggccaggag guuggaaagc a 21 <210> 74 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 74 uggccaggag guuggaaagc a 21 <210> 75 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 75 cagccaggag guagcaaggc a 21 <210> 76 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 76 ugccaccagg cuccagagaa a 21 <210> 77 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 77 aauuuggaca cuuuggccuu a 21 <210> 78 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 78 aauuuggaca cuuuggccuu a 21 <210> 79 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 79 acacuuuggc cuuccaggaa a 21 <210> 80 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 80 cuuuggccuu ccaggaacug a 21 <210> 81 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 81 aggaacugaa guccgagcua a 21 <210> 82 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 82 aggaacugaa guccgagcua a 21 <210> 83 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 83 gaaguccgag cuaacugaag a 21 <210> 84 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 84 gcuaacugaa guuccugcuu a 21 <210> 85 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 85 cuaacugaag uuccugcuuc a 21 <210> 86 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 86 gaaguuccug cuucccgaau a 21 <210> 87 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 87 gagaacuagu uuggguagga a 21 <210> 88 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 88 gagaacuagu uuggguagga a 21 <210> 89 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 89 acuaguuugg guaggagagc a 21 <210> 90 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 90 acuaguuugg guaggagagc a 21 <210> 91 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 91 ggguaggaga gccucucacg a 21 <210> 92 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 92 guaggagagc cucucacgcu a 21 <210> 93 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 93 guaggagagc cucucacgcu a 21 <210> 94 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 94 uaggagagcc ucucacgcug a 21 <210> 95 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 95 aggagagccu cucacgcuga a 21 <210> 96 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 96 gccucucacg cugagaacag a 21 <210> 97 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 97 gccucucacg cugagaacag a 21 <210> 98 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 98 gccucucacg cugagaacag a 21 <210> 99 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 99 cacgcugaga acagcagaaa a 21 <210> 100 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 100 acgcugagaa cagcagaaac a 21 <210> 101 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 101 cgcugagaac agcagaaaca a 21 <210> 102 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 cgcugagaac agcagaaaca a 21 <210> 103 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 103 gcugagaaca gcagaaacaa a 21 <210> 104 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 104 cugagaacag cagaaacaau a 21 <210> 105 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 105 ugagaacagc agaaacaauu a 21 <210> 106 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 106 gagaacagca gaaacaauua a 21 <210> 107 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 107 agaacagcag aaacaauuac a 21 <210> 108 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 108 agaacagcag aaacaauuac a 21 <210> 109 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 109 gaacagcaga aacaauuacu a 21 <210> 110 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 110 aacagcagaa acaauuacug a 21 <210> 111 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 111 aacagcagaa acaauuacug a 21 <210> 112 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 112 aacaccagaa acaauuacug a 21 <210> 113 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 113 aacugcagaa acaauuacug a 21 <210> 114 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 114 aagagcagaa acaauuacug a 21 <210> 115 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 115 aacagcagaa acaauuacug a 21 <210> 116 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 116 aacagcagaa acaauuacug a 21 <210> 117 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 117 aacagcagaa acaauuacug a 21 <210> 118 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 118 acagcagaaa caauuacugg a 21 <210> 119 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 119 cagcagaaac aauuacuga 19 <210> 120 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 120 cagcagaaac aauuacuggc a 21 <210> 121 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 121 agcagaaaca auuacuggca a 21 <210> 122 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 122 gcagaaacaa uuacuggcaa a 21 <210> 123 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 123 cagaaacaau uacuggcaag a 21 <210> 124 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 124 cagaaacaau uacuggcaag a 21 <210> 125 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 125 agaaacaauu acugucaagu a 21 <210> 126 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 126 gaaacaauua cuggcaagua a 21 <210> 127 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 127 aaacaauuac uggcaaguau a 21 <210> 128 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 128 aacaauuacu ggcaaguaug a 21 <210> 129 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 129 aacaauuacu ggcaaguaug a 21 <210> 130 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 130 ggcaaguaug guguguggau a 21 <210> 131 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 131 ggcaaguaug guguguggau a 21 <210> 132 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 132 ggcaaguaug guguguggau a 21 <210> 133 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 133 caaguauggu guguggaugc a 21 <210> 134 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 134 caaguauggu guguggaugc a 21 <210> 135 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 135 ugaguaugac cucaucagcc a 21 <210> 136 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 136 gaguaugacc ucaucagcca a 21 <210> 137 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 137 aguaugaccu caucagccag a 21 <210> 138 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 138 guaugaccuc aucagccagu a 21 <210> 139 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 139 guaugaccuc aucagccagu a 21 <210> 140 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 140 uaugaccuca ucagccaguu a 21 <210> 141 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 141 augaccucau cagccaguuu a 21 <210> 142 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 142 ugaccucauc agccaguuua a 21 <210> 143 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 143 gaccucauca gccaguuuau a 21 <210> 144 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 144 accucaucag ccaguuuaug a 21 <210> 145 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 145 ccucaucagc caguuuaugc a 21 <210> 146 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 146 ccucaucagc caguuuaugc a 21 <210> 147 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 147 ccucaucagc caguuuaugc a 21 <210> 148 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 148 ccucaucagc caguuuaugc a 21 <210> 149 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 149 ccucaucagc caguuuaugc a 21 <210> 150 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 150 ccucaucagc caguuuaugc a 21 <210> 151 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 151 ccucaucagc caguuuaugc a 21 <210> 152 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 152 ccucuucagc caguuuaugc a 21 <210> 153 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 153 ccugaucagc caguuuaugc a 21 <210> 154 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 154 ccacaucagc caguuuaugc a 21 <210> 155 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 155 ccucaucagc caguuuaugc a 21 <210> 156 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 156 cucaucagcc aguuuaugca a 21 <210> 157 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 157 ucaucagcca guuuaugca 19 <210> 158 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 158 ucaucagcca guuuaugcag a 21 <210> 159 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 159 ucaucagcca guuuaugcag a 21 <210> 160 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 160 caucagccag uuuaugcagg a 21 <210> 161 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 161 aucagccagu uuaugcaggg a 21 <210> 162 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 162 aucagccagu uuaugcaggg a 21 <210> 163 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 163 ucagccaguu uaugcagggc a 21 <210> 164 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 164 cagccaguuu augcagggcu a 21 <210> 165 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 165 agccaguuua ugcagggcua a 21 <210> 166 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 166 agccaguuua ugcagggcua a 21 <210> 167 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 167 gccaguuuau gcagggcuac a 21 <210> 168 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 168 gccaguuuau gcagugcuac a 21 <210> 169 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 169 ccaguuuaug cagggcuacc a 21 <210> 170 <211> 21 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RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 212 agaacuguca uaagauauga a 21 <210> 213 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 213 agaacuguca uaagauauga a 21 <210> 214 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 214 gaacugucau aagauaugag a 21 <210> 215 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 215 aacugucaua agauaugagc a 21 <210> 216 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 216 acugucauaa gauaugagcu a 21 <210> 217 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 217 cugucauaag auaugagcug a 21 <210> 218 <211> 21 <212> RNA 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 266 caacuuugcu uaugacacag a 21 <210> 267 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 267 aacuuugcuu augacacagg a 21 <210> 268 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 268 acuuugcuua ugacacaggc a 21 <210> 269 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 269 cuuugcuuau gacacaggca a 21 <210> 270 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 270 acaggcacag guaucagcaa a 21 <210> 271 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 271 auaaguacag cagcaugauu a 21 <210> 272 <211> 21 <212> RNA <213> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 326 uugaacaugg ucacuuauga a 21 <210> 327 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 327 uugaacaugg ucacuuauga a 21 <210> 328 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 328 uugaacaugg ucacuuauga a 21 <210> 329 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 329 uugaucaugg ucacuuauga a 21 <210> 330 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 330 uuguacaugg ucacuuauga a 21 <210> 331 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 331 uucaacaugg ucacuuauga a 21 <210> 332 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 332 uugaacaugg ucacuuauga a 21 <210> 333 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 333 uugaacaugg ucacuuauga a 21 <210> 334 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 334 ugaacauggu cacuuauga 19 <210> 335 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 335 ugaacauggu cacuuaugac a 21 <210> 336 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 336 gaacaugguc acuuaugaa 19 <210> 337 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 337 gaacaugguc acuuaugaca a 21 <210> 338 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 338 aacaugguca cuuaugacau a 21 <210> 339 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 339 acauggucac uuaugacauc a 21 <210> 340 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 340 acauggucac uuaugacauc a 21 <210> 341 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 341 acauggucac uuaugacauc a 21 <210> 342 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 342 cauggucacu uaugacauca a 21 <210> 343 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 343 auggucacuu augacaucaa a 21 <210> 344 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 344 uggucacuua ugacaucaag a 21 <210> 345 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 345 ggucacuuau gacaucaagc a 21 <210> 346 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 346 gucacuuaug acaucaagcu a 21 <210> 347 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 347 gcagaaggag augcucaggg a 21 <210> 348 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 348 aagggagagc cagccagcca a 21 <210> 349 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 349 gaugaacaug gucaccaucu a 21 <210> 350 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 350 gcauuuaugg gauguuuaau a 21 <210> 351 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 351 uguuuaauga cauaguucaa a 21 <210> 352 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 352 uguuuaauga cauaguucaa a 21 <210> 353 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 353 uguuuaauga cauaguucaa a 21 <210> 354 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 354 guuuaaugac auaguucaag a 21 <210> 355 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 355 guuuaaugac auaguucaag a 21 <210> 356 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 356 uuuaaugaca uaguucaagu a 21 <210> 357 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 357 uuaaugacau aguucaaguu a 21 <210> 358 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 358 uaaugacaua guucaaguuu a 21 <210> 359 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 359 uaaugacaua guucaaguuu a 21 <210> 360 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 360 aaugacauag uucaaguuuu a 21 <210> 361 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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oligonucleotide <400> 367 acauaguuca aguuuucuug a 21 <210> 368 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 368 acauaguuca aguuuucuug a 21 <210> 369 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 369 acauuguuca aguuuucuug a 21 <210> 370 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 370 acaaaguuca aguuuucuug a 21 <210> 371 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 371 acuuaguuca aguuuucuug a 21 <210> 372 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 372 acauaguuca aguuuucuug a 21 <210> 373 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 463 ucaacgtgca cagaagaacc ucg 23 <210> 464 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 464 ucaacgtgca cagaagaacc ucg 23 <210> 465 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 465 ucaacgtgca cagaagaacc ucg 23 <210> 466 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 466 ucaacgtgca cagaaguacc ucg 23 <210> 467 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 467 ucaacgtgca cagaagaucc ucg 23 <210> 468 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 468 ucaacgtgca cagaagaagc ucg 23 <210> 469 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 469 ucaacgtgca cagaagaacc uca 23 <210> 470 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 470 ugcaacgugc acagaagaac cuc 23 <210> 471 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 471 ugcaacgugc acagaagaac cuc 23 <210> 472 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 472 ucaacgtgca cagaagaacc u 21 <210> 473 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 473 uagcaacgug cacagaagaa ccu 23 <210> 474 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 474 ucagcaacgu gcacagaaga acc 23 <210> 475 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 475 ugcagcaacg ugcacagaag aac 23 <210> 476 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 476 ugcagcaacg ugcacagaag aac 23 <210> 477 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 477 uugcagcaac gugcacagaa gaa 23 <210> 478 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 478 uugcagcaac gugcacagaa gaa 23 <210> 479 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 479 ucugcagcaa cgugcacaga aga 23 <210> 480 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 480 ugcugcagca acgugcacag aag 23 <210> 481 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 481 uagcugcagc aacgugcaca gaa 23 <210> 482 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 482 uagctgcagc aacgugcaca gaa 23 <210> 483 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 483 uaagcugcag caacgugcac aga 23 <210> 484 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 484 uaaagctgca gcaacgugca cag 23 <210> 485 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 485 uccaaagcug cagcaacgug cac 23 <210> 486 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 486 ucccaaagcu gcagcaacgu gca 23 <210> 487 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 491 uucccacacc aggcaggcca gaa 23 <210> 492 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 492 uucccacacc aggcaggcca gaa 23 <210> 493 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 493 uucccacacc aggcaggcca gaa 23 <210> 494 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 494 uaucccacac caggcaggcc aga 23 <210> 495 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 539 uucagcguga gaggcucucc uac 23 <210> 540 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 540 ucugtucuca gcgugagagg cuc 23 <210> 541 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 541 ucugutcuca gcgugagagg cuc 23 <210> 542 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 542 ucugutctca gcgugagagg cuc 23 <210> 543 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 543 uuuucugcug uucucagcgu gag 23 <210> 544 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 544 uguutctgcu guucucagcg uga 23 <210> 545 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 545 uugutucugc uguucucagc gug 23 <210> 546 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 546 uugtutcugc uguucucagc gug 23 <210> 547 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 547 uuugtutcug cuguucucag cgu 23 <210> 548 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 548 uauugutucu gcuguucuca gcg 23 <210> 549 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 549 uaautgtuuc ugcuguucuc agc 23 <210> 550 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 550 uuaatuguuu cugcuguucu cag 23 <210> 551 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 551 uguaautguu ucugcuguuc uca 23 <210> 552 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 552 uguaautguu ucugcuguuc uca 23 <210> 553 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 553 uaguaatugu utcugcuguu cuc 23 <210> 554 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 554 ucagtaauug uuucugcugu ucu 23 <210> 555 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 555 ucagtaauug uuucugcugu ucu 23 <210> 556 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 556 ucagtaauug utucuggugu ucu 23 <210> 557 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 557 ucagtaauug utucugcagu ucu 23 <210> 558 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 558 ucagtaauug utucugcucu ucu 23 <210> 559 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 559 ucaguaauug uuucugcugu ucu 23 <210> 560 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 560 ucagtaauug utucugcugu ucu 23 <210> 561 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 561 ucagtaauug utucugcugu ucu 23 <210> 562 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 562 uccaguaauu gtuucugcug uuc 23 <210> 563 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 563 ucagtaauug utucugcugu u 21 <210> 564 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 564 ugccagtaau uguuucugcu guu 23 <210> 565 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 565 uugccaguaa uuguuucugc ugu 23 <210> 566 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 566 uuugccagua auuguuucug cug 23 <210> 567 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 567 ucuugccagu aauuguuucu gcu 23 <210> 568 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 568 ucuugccagu aauuguuucu gcu 23 <210> 569 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 569 uacutgacag uaauuguuuc ugc 23 <210> 570 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 570 uuactugcca guaauuguuu cug 23 <210> 571 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 571 uauacutgcc aguaauuguu ucu 23 <210> 572 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 572 ucauactugc caguaauugu uuc 23 <210> 573 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 573 ucauactugc caguaauugu uuc 23 <210> 574 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 574 uauccacaca ccauacuugc cag 23 <210> 575 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 575 uauccacaca ccauacuugc cag 23 <210> 576 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 576 uauccacaca ccauacuugc cag 23 <210> 577 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 577 ugcatccaca caccauacuu gcc 23 <210> 578 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 578 ugcauccaca caccauacuu gcc 23 <210> 579 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 579 uggctgauga ggucauacuc aaa 23 <210> 580 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 580 uuggcugaug aggucauacu caa 23 <210> 581 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 581 ucuggctgau gaggucauac uca 23 <210> 582 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 582 uacuggcuga ugaggucaua cuc 23 <210> 583 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 583 uacuggctga ugaggucaua cuc 23 <210> 584 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 584 uaactggcug augaggucau acu 23 <210> 585 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 585 uaaacuggcu gaugagguca uac 23 <210> 586 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 586 uuaaactggc ugaugagguc aua 23 <210> 587 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 587 uauaaacugg ctgaugaggu cau 23 <210> 588 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 588 ucauaaacug gcugaugagg uca 23 <210> 589 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 589 ugcauaaacu ggcugaugag guc 23 <210> 590 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 590 ugcataaacu ggcugaugag guc 23 <210> 591 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 591 ugcataaacu ggcugaugag guc 23 <210> 592 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 592 ugcataaacu ggcugaugag guc 23 <210> 593 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 593 ugcataaacu ggcugaugag guc 23 <210> 594 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 594 ugcataaacu ggcugaugag guc 23 <210> 595 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 595 ugcataaacu ggcugaugag guc 23 <210> 596 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 596 ugcataaacu ggcugaagag guc 23 <210> 597 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 597 ugcataaacu ggcugaucag guc 23 <210> 598 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 598 ugcataaacu ggcugaugug guc 23 <210> 599 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 599 ugcataaacu ggcugaugag guc 23 <210> 600 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 600 utgcauaaac uggcugauga ggu 23 <210> 601 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 601 ugcataaacu ggcugaugag g 21 <210> 602 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 602 ucugcataaa cuggcugaug agg 23 <210> 603 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 603 ucugcataaa ctggcugaug agg 23 <210> 604 <211> 23 <212> DNA <213> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 616 uccgagtaca ccacagcacc cgu 23 <210> 617 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 617 uccgagtaca ccacagcacc cgu 23 <210> 618 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 618 ucgccctgga aauagaggcu ccc 23 <210> 619 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 619 ucgccctgga aauagaggcu ccc 23 <210> 620 <211> 23 <212> DNA <213> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 624 uagutctgga cucagcgccc ugg 23 <210> 625 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 625 ucagtucugg acucagcgcc cug 23 <210> 626 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 626 ucagutcugg acucagcgcc cug 23 <210> 627 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 627 ucagtucugg acucagcgcc cug 23 <210> 628 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 628 uacagutcug gacucagcgc ccu 23 <210> 629 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 629 ugacagtucu ggacucagcg ccc 23 <210> 630 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 630 uugacaguuc uggacucagc gcc 23 <210> 631 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 631 uaugacaguu cuggacucag cgc 23 <210> 632 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 632 uuaugacagu ucuggacuca gcg 23 <210> 633 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 633 uuatgacagu ucuggacuca gcg 23 <210> 634 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 634 uuaugacagu ucuggacuca gcg 23 <210> 635 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 635 uuuatgacag uucuggacuc agc 23 <210> 636 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 636 ucuuaugaca guucuggacu cag 23 <210> 637 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 637 ucuuaugaca gtucuggacu cag 23 <210> 638 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 638 uucutatgac aguucuggac uca 23 <210> 639 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 639 utcutatgac aguucuggac uca 23 <210> 640 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 640 uaucuuauga caguucugga cuc 23 <210> 641 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 641 uauctuauga caguucugga cuc 23 <210> 642 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 642 uauctuauga caguucugga cuc 23 <210> 643 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 643 uauctuauga caguucugga cuc 23 <210> 644 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 697 ucauaagcaa aguugagggu agc 23 <210> 698 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 698 ucauaagcaa aguugaccgu agc 23 <210> 699 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 699 ucauaagcaa aguugacgcu agc 23 <210> 700 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 700 ucauaagcaa aguugacggu agc 23 <210> 701 <211> 23 <212> DNA <213> 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 709 uugtgtcaua agcaaaguug acg 23 <210> 710 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 710 ucugtgtcau aagcaaaguu gac 23 <210> 711 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 711 uccuguguca uaagcaaagu uga 23 <210> 712 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 712 ugcctgtguc auaagcaaag uug 23 <210> 713 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 713 uugccugugu cauaagcaaa guu 23 <210> 714 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 714 uuugcugaua ccugugccug ugu 23 <210> 715 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 715 uaaucatgcu gcuguacuua uag 23 <210> 716 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 716 ucaatcaugc ugcuguacuu aua 23 <210> 717 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 717 uucaaucaug cugcuguacu uau 23 <210> 718 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 718 uucaatcaug cugcuguacu uau 23 <210> 719 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 719 uucaatcaug cugcuguacu uau 23 <210> 720 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 720 ugucaatcau gcugcuguac uua 23 <210> 721 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 721 ugucaatcau gcugcuguac uua 23 <210> 722 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 722 uagucaauca ugcugcugua cuu 23 <210> 723 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 723 uagucaauca ugcugcugua cuu 23 <210> 724 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 724 uagucaauca ugcugcugua cuu 23 <210> 725 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 725 uagucaauca ugcugcugua cuu 23 <210> 726 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 726 uagucaauca ugcugcugua cuu 23 <210> 727 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 727 uagucaauca ugcugcugua cuu 23 <210> 728 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 728 uagucaauca ugcugcagua cuu 23 <210> 729 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 729 uagucaauca ugcugcucua cuu 23 <210> 730 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 730 uagucaauca ugcugcugaa cuu 23 <210> 731 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 731 uagucaauca ugcugcugua cuu 23 <210> 732 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 732 uuagtcaauc augcugcugu acu 23 <210> 733 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 770 uucataagug accauguuca agu 23 <210> 771 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 771 utcataagug accauguuca agu 23 <210> 772 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 772 utcataagug accauguuca agu 23 <210> 773 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 773 uucataagug accaugauca agu 23 <210> 774 <211> 23 <212> 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oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 794 uauuaaacau cccauaaaug cug 23 <210> 795 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 795 uuugaacuau gucauuaaac auc 23 <210> 796 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 796 uuugaacuau gucauuaaac auc 23 <210> 797 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 797 uuugaactau gucauuaaac auc 23 <210> 798 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 851 ucauguaaca ugcaagagga aug 23 <210> 852 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 852 ucauguaaca ugcaagagca aug 23 <210> 853 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 853 ucauguaaca ugcaagagca aug 23 <210> 854 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 854 ucauguaaca ugcaagagca aug 23 <210> 855 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 855 uccatgtaac augcaagagc aau 23 <210> 856 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 856 ucauguaaca ugcaagagcg g 21 <210> 857 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 857 uaccauguaa caugcaagag caa 23 <210> 858 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 858 uaaccatgua acaugcaaga gca 23 <210> 859 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 863 ugguaaccau guaacaugca aga 23 <210> 864 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 864 uggtaaccau guaacaugca aga 23 <210> 865 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 865 ugguaaccau gtaacaugca aga 23 <210> 866 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 866 uuggtaacca uguaacaugc aag 23 <210> 867 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 867 ugugguaacc auguaacaug caa 23 <210> 868 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 868 ugugguaacc atguaacaug caa 23 <210> 869 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 869 uuguggtaac cauguaacau gca 23 <210> 870 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 870 uuugtgguaa ccauguaaca ugc 23 <210> 871 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 871 ucuuguggua accauguaac aug 23 <210> 872 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 872 utucgatgcu ggccagagga gcu 23 <210> 873 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 873 uuaaaugcau cuuacuuaua uuc 23 <210> 874 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 874 uguaaatgca ucuuacuuau auu 23 <210> 875 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 875 uaguaaaugc atcuuacuua uau 23 <210> 876 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 876 utagtaaaug caucuuacuu aua 23 <210> 877 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 877 uguaguaaau gcaucuuacu uau 23 <210> 878 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 878 uguaguaaau gcaucuuacu ugu 23 <210> 879 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 879 uguaguaaau gcaucuuacu ugu 23 <210> 880 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 880 uguaguaaau gcaucuuacu ugu 23 <210> 881 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 881 uguaguaaau gcaucuuacu ugu 23 <210> 882 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 882 uguaguaaau gcaucuuacu ugu 23 <210> 883 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 883 uguaguaaau gcaucuuacu ugu 23 <210> 884 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 884 uguaguaaau gcaucuaacu ugu 23 <210> 885 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 885 uguaguaaau gcaucuuucu ugu 23 <210> 886 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 886 uguaguaaau gcaucuuagu ugu 23 <210> 887 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 887 uguaguaaau gcaucuuacu uau 23 <210> 888 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 888 uguaguaaau gcaucuuacu uau 23 <210> 889 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 889 uuguagtaaa ugcaucuuac uua 23 <210> 890 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 890 uguaguaaau gcaucuuacu u 21 <210> 891 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 891 uucugaagca uuagaagcca acu 23 <210> 892 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 892 uucuaucuga agcauuagaa gcc 23 <210> 893 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 893 uuctatcuga agcauuagaa gcc 23 <210> 894 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 894 uucuatctga agcauuagaa gcc 23 <210> 895 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 895 accucucagc acagcagagc uuu 23 <210> 896 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 896 accucucagc acagcagagc uuu 23 <210> 897 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 897 accucucagc acagcagagc uuu 23 <210> 898 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 898 ccucucagca cagcagagcu uuc 23 <210> 899 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 899 cacagcagag cuuuccagag gaa 23 <210> 900 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 900 gcaaugaggu ucuucugugc acg 23 <210> 901 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 901 gcaaugaggu ucuucugugc acg 23 <210> 902 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<210> 908 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 908 ugagguucuu cugugcacgu ugc 23 <210> 909 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 909 ugagguucuu cugugcacgu ugc 23 <210> 910 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 910 ugagguucuu cugugcacgu ugc 23 <210> 911 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 911 ugagguucuu cugugcacgu ugc 23 <210> 912 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 912 ugagguucuu cugugcacgu ugc 23 <210> 913 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 913 ugagguucuu cugugcacgu 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<400> 931 cugagaugcc agcuguccag cug 23 <210> 932 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 932 gagaugccag cuguccagcu gcu 23 <210> 933 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 933 agcuguccag cugcugcuuc ugg 23 <210> 934 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 934 guccagcugc ugcuucuggc cug 23 <210> 935 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 935 uucuggccug ccuggugugg gau 23 <210> 936 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 936 uucuggccug ccuggugugg gau 23 <210> 937 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 937 uucuggccug ccuggugugg gau 23 <210> 938 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 938 ucuggccugc cugguguggg aug 23 <210> 939 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 939 uggccugccu ggugugggau gug 23 <210> 940 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 940 uggccugccu ggugugggau gug 23 <210> 941 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 941 ccagaguggc cgaugccagu aua 23 <210> 942 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 942 ucaguguggc cagucccaau gaa 23 <210> 943 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 943 caguguggcc agucccaaug aau 23 <210> 944 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 944 caguguggcc agucccaaug aau 23 <210> 945 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 945 gagccaggcc augucaguca ucc 23 <210> 946 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 946 gagccaggcc augucaguca ucc 23 <210> 947 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 947 gagccaggcc augucaguca ucc 23 <210> 948 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 948 caggccaugu cagucaucca uaa 23 <210> 949 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 955 cagcaaccuc cuccgagaca agu 23 <210> 956 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 956 cagcaaccuc cuccgagaca agu 23 <210> 957 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 957 cgagacaagu caguucugga gga 23 <210> 958 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 958 gacaagucag uucuggagga aga 23 <210> 959 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 959 aagucaguuc uggaggaaga gaa 23 <210> 960 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 960 ugagaaucug gccaggaggu ugg 23 <210> 961 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 961 ucuggccagg agguuggaaa gca 23 <210> 962 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 962 ucuggccagg agguuggaaa gca 23 <210> 963 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 963 agcagccagg agguagcaag gcu 23 <210> 964 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 964 ugugccacca ggcuccagag aag 23 <210> 965 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 965 ggaauuugga cacuuuggcc uuc 23 <210> 966 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 966 ggaauuugga cacuuuggcc uuc 23 <210> 967 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 967 ggacacuuug gccuuccagg aac 23 <210> 968 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 968 cacuuuggcc uuccaggaac uga 23 <210> 969 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 969 ccaggaacug aaguccgagc uaa 23 <210> 970 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 970 ccaggaacug aaguccgagc uaa 23 <210> 971 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 971 cugaaguccg agcuaacuga agu 23 <210> 972 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 972 gagcuaacug aaguuccugc uuc 23 <210> 973 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1026 gaguaugacc ucaucagcca guu 23 <210> 1027 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1027 gaguaugacc ucaucagcca guu 23 <210> 1028 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1028 aguaugaccu caucagccag uuu 23 <210> 1029 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1029 guaugaccuc aucagccagu uua 23 <210> 1030 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1030 uaugaccuca ucagccaguu uau 23 <210> 1031 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1031 augaccucau cagccaguuu aug 23 <210> 1032 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial 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Synthetic oligonucleotide <400> 1061 acgggugcug ugguguacuc ggg 23 <210> 1062 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1062 gggagccucu auuuccaggg cgc 23 <210> 1063 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1063 gggagccucu auuuccaggg cgc 23 <210> 1064 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1064 agccucuauu uccagggcgc uga 23 <210> 1065 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1065 auuuccaggg cgcugagucc aga 23 <210> 1066 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1066 auuuccaggg cgcugagucc aga 23 <210> 1067 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1067 auuuccaggg cgcugagucc aga 23 <210> 1068 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1068 ccagggcgcu gaguccagaa cug 23 <210> 1069 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1069 cagggcgcug aguccagaac ugu 23 <210> 1070 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1070 cagggcgcug aguccagaac ugu 23 <210> 1071 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1071 cagggcgcug aguccagaac ugu 23 <210> 1072 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1072 agggcgcuga guccagaacu guc 23 <210> 1073 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1073 gggcgcugag uccagaacug uca 23 <210> 1074 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1074 ggcgcugagu ccagaacugu cau 23 <210> 1075 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1075 gcgcugaguc cagaacuguc aua 23 <210> 1076 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1076 cgcugagucc agaacuguca uaa 23 <210> 1077 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1077 cgcugagucc agaacuguca uaa 23 <210> 1078 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1078 cgcugagucc agaacuguca uaa 23 <210> 1079 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1079 gcugagucca gaacugucau aag 23 <210> 1080 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1080 cugaguccag aacugucaua aga 23 <210> 1081 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1081 cugaguccag aacugucaua aga 23 <210> 1082 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1082 ugaguccaga acugucauaa gau 23 <210> 1083 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1083 ugaguccaga acugucauaa gau 23 <210> 1084 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1084 gaguccagaa cugucauaag aua 23 <210> 1085 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1085 gaguccagaa cugucauaag aua 23 <210> 1086 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1086 gaguccagaa cugucauaag aua 23 <210> 1087 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1087 gaguccagaa cugucauaag aua 23 <210> 1088 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1088 gaguccagaa cugucauaag aua 23 <210> 1089 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1089 gaguccagaa cugucauaag aua 23 <210> 1090 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1090 gaguccagaa cugucauaag aua 23 <210> 1091 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1091 gaguccagaa cugucauaag aua 23 <210> 1092 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1092 gaguccagaa cugucauaag aua 23 <210> 1093 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1093 gaguccagaa cugucauaag aua 23 <210> 1094 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1094 aguccagaac ugucauaaga uau 23 <210> 1095 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1095 guccagaacu gucauaagau a 21 <210> 1096 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1096 guccagaacu gucauaagau aug 23 <210> 1097 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1097 uccagaacug ucauaagaua uga 23 <210> 1098 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1098 uccagaacug ucauaagaua uga 23 <210> 1099 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1099 uccagaacug ucauaagaua uga 23 <210> 1100 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1100 ccagaacugu cauaagauau gag 23 <210> 1101 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1101 ccagaacugu cauaagauau gag 23 <210> 1102 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1102 cagaacuguc auaagauaug agc 23 <210> 1103 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1103 agaacuguca uaagauauga gcu 23 <210> 1104 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1104 gaacugucau aagauaugag cug 23 <210> 1105 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1105 aacugucaua agauaugagc uga 23 <210> 1106 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1106 aacugucaua agauaugagc uga 23 <210> 1107 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1107 aacugucaua agauaugagc uga 23 <210> 1108 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1108 acugucauaa gauaugagcu gaa 23 <210> 1109 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1109 gucauaagau augagcugaa uac 23 <210> 1110 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1110 agcugaauac cgagacagug aag 23 <210> 1111 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1111 aauaccgaga cagugaaggc uga 23 <210> 1112 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1112 aauaccgaga cagugaaggc uga 23 <210> 1113 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1113 agacagugaa ggcugagaag gaa 23 <210> 1114 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1114 agacagugaa ggcugagaag gaa 23 <210> 1115 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1115 agacagugaa ggcugagaag gaa 23 <210> 1116 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1116 gcugagaagg aaaucccugg agc 23 <210> 1117 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1117 aggccaaagg ugccauuguc cuc 23 <210> 1118 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1118 cuccaaacug aacccagaga auc 23 <210> 1119 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1119 cuccaaacug aacccagaga auc 23 <210> 1120 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1120 cuccaaacug aacccagaga auc 23 <210> 1121 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1121 uccaaacuga acccagagaa ucu 23 <210> 1122 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1122 cauccguaag cagucagucg cca 23 <210> 1123 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1123 cauccguaag cagucagucg cca 23 <210> 1124 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1124 cauccguaag cagucagucg cca 23 <210> 1125 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1125 cauccguaag cagucagucg cca 23 <210> 1126 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1126 cguaagcagu cagucgccaa ugc 23 <210> 1127 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1127 agcagucagu cgccaaugcc uuc 23 <210> 1128 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1128 agucagucgc caaugccuuc auc 23 <210> 1129 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1129 ucagucgcca augccuucau cau 23 <210> 1130 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1130 ucgccaaugc cuucaucauc ugu 23 <210> 1131 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1131 ugccuucauc aucuguggca ccu 23 <210> 1132 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1132 ugccuucauc aucuguggca ccu 23 <210> 1133 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1133 aucuguggca ccuuguacac cgu 23 <210> 1134 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1134 ugcuaccguc aacuuugcuu aug 23 <210> 1135 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1135 ugcuaccguc aacuuugcuu aug 23 <210> 1136 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1136 gcuaccguca acuuugcuua uga 23 <210> 1137 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1137 gcuaccguca 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<400> 1143 gcuaccguca acuuugcuua uga 23 <210> 1144 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1144 gcuaccguca acuuugcuua uga 23 <210> 1145 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1145 gcuaccguca acuuugcuua uga 23 <210> 1146 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1146 cuaccgucaa cuuugcuuau gac 23 <210> 1147 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1147 cuaccgucaa cuuugcuuau gac 23 <210> 1148 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1148 uaccgucaac uuugcuuaug a 21 <210> 1149 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1149 uaccgucaac uuugcuuaug aca 23 <210> 1150 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1150 accgucaacu uugcuuauga cac 23 <210> 1151 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1151 ccgucaacuu ugcuuaugac aca 23 <210> 1152 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1152 cgucaacuuu gcuuaugaca cag 23 <210> 1153 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1153 cgucaacuuu gcuuaugaca cag 23 <210> 1154 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1154 gucaacuuug cuuaugacac agg 23 <210> 1155 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1155 ucaacuuugc uuaugacaca ggc 23 <210> 1156 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1156 caacuuugcu uaugacacag gca 23 <210> 1157 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1157 aacuuugcuu augacacagg cac 23 <210> 1158 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1158 acacaggcac agguaucagc aag 23 <210> 1159 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1159 cuauaaguac agcagcauga uug 23 <210> 1160 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1160 uauaaguaca gcagcaugau uga 23 <210> 1161 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1161 auaaguacag cagcaugauu gac 23 <210> 1162 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1162 auaaguacag cagcaugauu gac 23 <210> 1163 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1163 auaaguacag cagcaugauu gac 23 <210> 1164 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1164 uaaguacagc agcaugauug acu 23 <210> 1165 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1165 uaaguacagc agcaugauug acu 23 <210> 1166 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1166 aaguacagca gcaugauuga cua 23 <210> 1167 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1167 aaguacagca gcaugauuga cua 23 <210> 1168 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1168 aaguacagca gcaugauuga cua 23 <210> 1169 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1169 aaguacagca gcaugauuga cua 23 <210> 1170 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1170 aaguacagca gcaugauuga cua 23 <210> 1171 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1171 aaguacagca gcaugauuga cua 23 <210> 1172 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1172 aaguacagca gcaugauuga cua 23 <210> 1173 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1173 aaguacagca gcaugauuga cua 23 <210> 1174 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1174 aaguacagca gcaugauuga cua 23 <210> 1175 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1175 aaguacagca gcaugauuga cua 23 <210> 1176 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1176 aguacagcag caugauugac uac 23 <210> 1177 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1177 guacagcagc augauugacu a 21 <210> 1178 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1178 guacagcagc augauugacu aca 23 <210> 1179 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1179 guacagcagc augauugacu aca 23 <210> 1180 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1180 guacagcagc augauugacu aca 23 <210> 1181 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1181 uacagcagca ugauugacua caa 23 <210> 1182 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1182 acagcagcau gauugacuac aac 23 <210> 1183 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1183 cagcagcaug auugacuaca acc 23 <210> 1184 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1184 agcagcauga uugacuacaa ccc 23 <210> 1185 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1185 cagcaugauu gacuacaacc ccc 23 <210> 1186 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1186 gaagcucuuu gccugggaca acu 23 <210> 1187 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1187 gaagcucuuu gccugggaca acu 23 <210> 1188 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1188 uugccuggga caacuugaac aug 23 <210> 1189 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1189 uugccuggga caacuugaac aug 23 <210> 1190 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1190 uugccuggga caacuugaac aug 23 <210> 1191 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1191 gccugggaca acuugaacau ggu 23 <210> 1192 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1192 ccugggacaa cuugaacaug guc 23 <210> 1193 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1193 cugggacaac uugaacaugg uca 23 <210> 1194 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1194 cugggacaac uugaacaugg uca 23 <210> 1195 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1195 ugggacaacu ugaacauggu cac 23 <210> 1196 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1196 gggacaacuu gaacaugguc acu 23 <210> 1197 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1197 gggacaacuu gaacaugguc acu 23 <210> 1198 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1198 ggacaacuug aacaugguca cuu 23 <210> 1199 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1199 ggacaacuug aacaugguca cuu 23 <210> 1200 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1200 gacaacuuga acauggucac uua 23 <210> 1201 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1201 acaacuugaa cauggucacu uau 23 <210> 1202 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1202 caacuugaac auggucacuu aug 23 <210> 1203 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1203 aacuugaaca uggucacuua uga 23 <210> 1204 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1204 aacuugaaca uggucacuua uga 23 <210> 1205 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1205 aacuugaaca uggucacuua uga 23 <210> 1206 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1206 aacuugaaca uggucacuua uga 23 <210> 1207 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1207 aacuugaaca uggucacuua uga 23 <210> 1208 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1208 aacuugaaca uggucacuua uga 23 <210> 1209 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1209 aacuugaaca uggucacuua uga 23 <210> 1210 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1210 aacuugaaca uggucacuua uga 23 <210> 1211 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1211 aacuugaaca uggucacuua uga 23 <210> 1212 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1212 aacuugaaca uggucacuua uga 23 <210> 1213 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1213 acuugaacau ggucacuuau gac 23 <210> 1214 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1214 acuugaacau ggucacuuau gac 23 <210> 1215 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1215 acuugaacau ggucacuuau gac 23 <210> 1216 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1216 acuugaacau ggucacuuau gac 23 <210> 1217 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1217 acuugaacau ggucacuuau gac 23 <210> 1218 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1218 acuugaacau ggucacuuau gac 23 <210> 1219 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1219 acuugaacau ggucacuuau gac 23 <210> 1220 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1220 acuugaacau ggucacuuau gac 23 <210> 1221 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1221 acuugaacau ggucacuuau gac 23 <210> 1222 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1222 cuugaacaug gucacuuaug a 21 <210> 1223 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1223 cuugaacaug gucacuuaug aca 23 <210> 1224 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1224 uugaacaugg ucacuuauga c 21 <210> 1225 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1225 uugaacaugg ucacuuauga cau 23 <210> 1226 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1226 ugaacauggu cacuuaugac auc 23 <210> 1227 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1227 gaacaugguc acuuaugaca uca 23 <210> 1228 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1228 gaacaugguc acuuaugaca uca 23 <210> 1229 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1229 gaacaugguc acuuaugaca uca 23 <210> 1230 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1230 aacaugguca cuuaugacau caa 23 <210> 1231 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1231 acauggucac uuaugacauc aag 23 <210> 1232 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1232 cauggucacu uaugacauca agc 23 <210> 1233 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1233 auggucacuu augacaucaa gcu 23 <210> 1234 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1234 uggucacuua ugacaucaag cuc 23 <210> 1235 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1235 uggcagaagg agaugcucag ggc 23 <210> 1236 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1236 ugaagggaga gccagccagc cag 23 <210> 1237 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1237 aggaugaaca uggucaccau cua 23 <210> 1238 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1238 cagcauuuau gggauguuua aug 23 <210> 1239 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1239 gauguuuaau gacauaguuc aag 23 <210> 1240 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1240 gauguuuaau gacauaguuc aag 23 <210> 1241 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1241 gauguuuaau gacauaguuc aag 23 <210> 1242 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1242 auguuuaaug acauaguuca agu 23 <210> 1243 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1243 auguuuaaug acauaguuca agu 23 <210> 1244 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1244 uguuuaauga cauaguucaa guu 23 <210> 1245 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1245 guuuaaugac auaguucaag uuu 23 <210> 1246 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1246 uuuaaugaca uaguucaagu uuu 23 <210> 1247 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1247 uuuaaugaca uaguucaagu uuu 23 <210> 1248 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1248 uuaaugacau aguucaaguu uuc 23 <210> 1249 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1249 uuaaugacau aguucaaguu uuc 23 <210> 1250 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1250 uaaugacaua guucaaguuu ucu 23 <210> 1251 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1251 aaugacauag uucaaguuuu cuu 23 <210> 1252 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1252 augacauagu ucaaguuuuc uug 23 <210> 1253 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1253 ugacauaguu caaguuuucu ugu 23 <210> 1254 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1254 ugacauaguu caaguuuucu ugu 23 <210> 1255 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1255 ugacauaguu caaguuuucu ugu 23 <210> 1256 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1256 ugacauaguu caaguuuucu ugu 23 <210> 1257 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1257 ugacauaguu caaguuuucu ugu 23 <210> 1258 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1258 ugacauaguu caaguuuucu ugu 23 <210> 1259 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1259 ugacauaguu caaguuuucu ugu 23 <210> 1260 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1260 ugacauaguu caaguuuucu ugu 23 <210> 1261 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1261 gacauaguuc aaguuuucuu gug 23 <210> 1262 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1262 acauaguuca aguuuucuug u 21 <210> 1263 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1263 acauaguuca aguuuucuug u 21 <210> 1264 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1264 acauaguuca aguuuucuug uga 23 <210> 1265 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1265 cauaguucaa guuuucuugu gau 23 <210> 1266 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1266 cauaguucaa guuuucuugu gau 23 <210> 1267 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1267 auaguucaag uuuucuugug auu 23 <210> 1268 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1268 auaguucaag uuuucuugug auu 23 <210> 1269 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1269 uaguucaagu uuucuuguga uuu 23 <210> 1270 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1270 uaguucaagu uuucuuguga uuu 23 <210> 1271 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1271 aguucaaguu uucuugugau uug 23 <210> 1272 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1272 guucaaguuu ucuugugauu ugg 23 <210> 1273 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1273 guucaaguuu ucuugugauu ugg 23 <210> 1274 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1274 guucaaguuu ucuugugauu ugg 23 <210> 1275 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1275 guucaaguuu ucuugugauu ugg 23 <210> 1276 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1276 uucaaguuuu cuugugauuu ggg 23 <210> 1277 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1277 ucaaguuuuc uugugauuug ggg 23 <210> 1278 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1284 gaaaaccauu gcucuugcau guu 23 <210> 1285 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1285 aaaaccauug cucuugcaug uua 23 <210> 1286 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1286 aaaccauugc ucuugcaugu uac 23 <210> 1287 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1287 aaccauugcu cuugcauguu aca 23 <210> 1288 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1288 accauugcuc uugcauguua cau 23 <210> 1289 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1289 accauugcuc uugcauguua cau 23 <210> 1290 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1290 ccauugcucu ugcauguuac aug 23 <210> 1291 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1291 cauugcucuu gcauguuaca ugg 23 <210> 1292 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1292 cauugcucuu gcauguuaca ugg 23 <210> 1293 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1293 cauugcucuu gcauguuaca ugg 23 <210> 1294 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1294 cauugcucuu gcauguuaca ugg 23 <210> 1295 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1295 cauugcucuu gcauguuaca ugg 23 <210> 1296 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial 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<400> 1319 auauaaguaa gaugcauuua cua 23 <210> 1320 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1320 uauaaguaag augcauuuac uac 23 <210> 1321 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1321 auaaguaaga ugcauuuacu aca 23 <210> 1322 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1322 auaaguaaga ugcauuuacu aca 23 <210> 1323 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1323 auaaguaaga ugcauuuacu aca 23 <210> 1324 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1324 auaaguaaga ugcauuuacu aca 23 <210> 1325 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1325 auaaguaaga ugcauuuacu aca 23 <210> 1326 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1326 auaaguaaga ugcauuuacu aca 23 <210> 1327 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1327 auaaguaaga ugcauuuacu aca 23 <210> 1328 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1328 auaaguaaga ugcauuuacu aca 23 <210> 1329 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1329 auaaguaaga ugcauuuacu aca 23 <210> 1330 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1330 auaaguaaga ugcauuuacu aca 23 <210> 1331 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1331 auaaguaaga ugcauuuacu aca 23 <210> 1332 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1332 auaaguaaga ugcauuuacu aca 23 <210> 1333 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1333 uaaguaagau gcauuuacua cag 23 <210> 1334 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1334 aaguaagaug cauuuacuac a 21 <210> 1335 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1335 aguuggcuuc uaaugcuuca gau 23 <210> 1336 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1336 ggcuucuaau gcuucagaua gaa 23 <210> 1337 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> 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RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1355 aggaucuucu gugcacguug a 21 <210> 1356 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1356 agcuucuucu gugcacguug a 21 <210> 1357 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1357 agguucuucu gugcacguug a 21 <210> 1358 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1358 gguucuucug ugcacguugc a 21 <210> 1359 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1359 gguucuucug ugcacguugc a 21 <210> 1360 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1360 guucuucugu gcacguuga 19 <210> 1361 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1361 guucuucugu gcacguugcu a 21 <210> 1362 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1362 uucuucugug cacguugcug a 21 <210> 1363 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1363 ucuucugugc acguugcugc a 21 <210> 1364 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1364 ucuucugugc acguugcugc a 21 <210> 1365 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1365 cuucugugca cguugcugca a 21 <210> 1366 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1366 cuucugugca cguugcugca a 21 <210> 1367 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1367 uucugugcac guugcugcag a 21 <210> 1368 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1368 ucugugcacg uugcugcagc a 21 <210> 1369 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1369 cugugcacgu ugcugcagcu a 21 <210> 1370 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1370 cugugcacgu ugcugcagcu a 21 <210> 1371 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1371 ugugcacguu gcugcagcuu a 21 <210> 1372 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1372 gugcacguug cugcagcuuu a 21 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oligonucleotide <400> 1396 cagcaaccuc cuccgagaca a 21 <210> 1397 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1397 cagcaaccuc cuccgagaca a 21 <210> 1398 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1398 gcaaccuccu ccgagacaag a 21 <210> 1399 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1399 gcaaccuccu ccgagacaag a 21 <210> 1400 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1400 gcaaccuccu ccgagacaag a 21 <210> 1401 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1401 agacaaguca guucuggagg a 21 <210> 1402 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1402 caagucaguu cuggaggaag a 21 <210> 1403 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1403 gucaguucug gaggaagaga a 21 <210> 1404 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1404 agaaucuggc caggagguug a 21 <210> 1405 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1405 uggccaggag guuggaaagc a 21 <210> 1406 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1406 uggccaggag guuggaaagc a 21 <210> 1407 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1407 cagccaggag guagcaaggc a 21 <210> 1408 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1408 ugccaccagg cuccagagaa a 21 <210> 1409 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1409 aauuuggaca cuuuggccuu a 21 <210> 1410 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1410 aauuuggaca cuuuggccuu a 21 <210> 1411 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1411 acacuuuggc cuuccaggaa a 21 <210> 1412 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1412 cuuuggccuu ccaggaacug a 21 <210> 1413 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1413 aggaacugaa guccgagcua a 21 <210> 1414 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1414 aggaacugaa guccgagcua a 21 <210> 1415 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1415 gaaguccgag cuaacugaag a 21 <210> 1416 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1416 gcuaacugaa guuccugcuu a 21 <210> 1417 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1417 cuaacugaag uuccugcuuc a 21 <210> 1418 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1418 gaaguuccug cuucccgaau a 21 <210> 1419 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1419 gagaacuagu uuggguagga a 21 <210> 1420 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1420 gagaacuagu uuggguagga a 21 <210> 1421 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1421 acuaguuugg guaggagagc a 21 <210> 1422 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1422 acuaguuugg guaggagagc a 21 <210> 1423 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1423 ggguaggaga gccucucacg a 21 <210> 1424 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1424 guaggagagc cucucacgcu a 21 <210> 1425 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1425 guaggagagc cucucacgcu a 21 <210> 1426 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1426 uaggagagcc ucucacgcug a 21 <210> 1427 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1427 aggagagccu cucacgcuga a 21 <210> 1428 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1428 gccucucacg cugagaacag a 21 <210> 1429 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1429 gccucucacg cugagaacag a 21 <210> 1430 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1430 gccucucacg cugagaacag a 21 <210> 1431 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1431 cacgcugaga acagcagaaa a 21 <210> 1432 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1432 acgcugagaa cagcagaaac a 21 <210> 1433 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1433 cgcugagaac agcagaaaca a 21 <210> 1434 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1434 cgcugagaac agcagaaaca a 21 <210> 1435 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1435 gcugagaaca gcagaaacaa a 21 <210> 1436 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1436 cugagaacag cagaaacaau a 21 <210> 1437 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1437 ugagaacagc agaaacaauu a 21 <210> 1438 <211> 21 <212> RNA <213> 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RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1444 aacaccagaa acaauuacug a 21 <210> 1445 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1445 aacugcagaa acaauuacug a 21 <210> 1446 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1446 aagagcagaa acaauuacug a 21 <210> 1447 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1447 aacagcagaa acaauuacug a 21 <210> 1448 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1448 aacagcagaa acaauuacug a 21 <210> 1449 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1449 aacagcagaa acaauuacug a 21 <210> 1450 <211> 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<210> 1462 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1462 ggcaaguaug guguguggau a 21 <210> 1463 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1463 ggcaaguaug guguguggau a 21 <210> 1464 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1464 ggcaaguaug guguguggau a 21 <210> 1465 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1465 caaguauggu guguggaugc a 21 <210> 1466 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1466 caaguauggu guguggaugc a 21 <210> 1467 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1467 ugaguaugac 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<400> 1479 ccucaucagc caguuuaugc a 21 <210> 1480 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1480 ccucaucagc caguuuaugc a 21 <210> 1481 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1481 ccucaucagc caguuuaugc a 21 <210> 1482 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1482 ccucaucagc caguuuaugc a 21 <210> 1483 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1483 ccucaucagc caguuuaugc a 21 <210> 1484 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1484 ccucuucagc caguuuaugc a 21 <210> 1485 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1485 ccugaucagc caguuuaugc a 21 <210> 1486 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1486 ccacaucagc caguuuaugc a 21 <210> 1487 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1487 ccucaucagc caguuuaugc a 21 <210> 1488 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1488 cucaucagcc aguuuaugca a 21 <210> 1489 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1489 ucaucagcca guuuaugca 19 <210> 1490 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1490 ucaucagcca guuuaugcag a 21 <210> 1491 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1491 ucaucagcca guuuaugcag a 21 <210> 1492 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1492 caucagccag uuuaugcagg a 21 <210> 1493 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1493 aucagccagu uuaugcaggg a 21 <210> 1494 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1494 aucagccagu uuaugcaggg a 21 <210> 1495 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1495 ucagccaguu uaugcagggc a 21 <210> 1496 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1496 cagccaguuu augcagggcu a 21 <210> 1497 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1497 agccaguuua ugcagggcua a 21 <210> 1498 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1498 agccaguuua ugcagggcua a 21 <210> 1499 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1499 gccaguuuau gcagggcuac a 21 <210> 1500 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1500 gccaguuuau gcagugcuac a 21 <210> 1501 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1501 ccaguuuaug cagggcuacc a 21 <210> 1502 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1502 ccaguuuaug caggucuacc a 21 <210> 1503 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1503 ugcagggcua cccuucuaag a 21 <210> 1504 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1504 gggugcugug guguacucgg a 21 <210> 1505 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1505 gggugcugug guguacucgg a 21 <210> 1506 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1506 gagccucuau uuccagggcg a 21 <210> 1507 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1507 gagccucuau uuccagggcg a 21 <210> 1508 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1508 ccucuauuuc cagggcgcug a 21 <210> 1509 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1509 uuccagggcg cugaguccag a 21 <210> 1510 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1510 uuccagggcg cugaguccag a 21 <210> 1511 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1511 uuccagggcg cugaguccag a 21 <210> 1512 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1512 agggcgcuga guccagaacu a 21 <210> 1513 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1513 gggcgcugag uccagaacug a 21 <210> 1514 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1514 gggcgcugag uccagaacug a 21 <210> 1515 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1515 gggcgcugag uccagaacug a 21 <210> 1516 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1516 ggcgcugagu ccagaacugu a 21 <210> 1517 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1517 gcgcugaguc cagaacuguc a 21 <210> 1518 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1518 cgcugagucc agaacuguca a 21 <210> 1519 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1519 gcugagucca gaacugucau a 21 <210> 1520 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1520 cugaguccag aacugucaua a 21 <210> 1521 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1521 cugaguccag aacugucaua a 21 <210> 1522 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1522 cugaguccag aacugucaua a 21 <210> 1523 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1523 ugaguccaga acugucauaa a 21 <210> 1524 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1524 gaguccagaa cugucauaag a 21 <210> 1525 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1525 gaguccagaa cugucauaag a 21 <210> 1526 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1526 aguccagaac ugucauaaga a 21 <210> 1527 <211> 21 <212> RNA <213> 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RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1533 guccugaacu gucauaagau a 21 <210> 1534 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1534 gucgagaacu gucauaagau a 21 <210> 1535 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1535 gugcagaacu gucauaagau a 21 <210> 1536 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1536 guccagaacu gucauaagau a 21 <210> 1537 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1537 guccagaacu gucauaagau a 21 <210> 1538 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1538 uccagaacug ucauaagaua a 21 <210> 1539 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1539 ccagaacugu cauaagaua 19 <210> 1540 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1540 ccagaacugu cauaagauau a 21 <210> 1541 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1541 cagaacuguc auaagauaug a 21 <210> 1542 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1542 cagaacuguc auaagauaug a 21 <210> 1543 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1543 cagaacuguc auaagauaug a 21 <210> 1544 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1544 agaacuguca uaagauauga a 21 <210> 1545 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ccaaacugaa cccagagaau a 21 <210> 1563 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1563 ccaaacugaa cccagagaau a 21 <210> 1564 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1564 ccaaacugaa cccagagaau a 21 <210> 1565 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1565 caaacugaac ccagagaauc a 21 <210> 1566 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1566 uccguaagca gucagucgcc a 21 <210> 1567 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1567 uccguaagca gucagucgcc a 21 <210> 1568 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1568 uccguaagca gucagucgcc a 21 <210> 1569 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1569 uccguaagca gucagucgcc a 21 <210> 1570 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1570 uaagcaguca gucgccaaug a 21 <210> 1571 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1571 cagucagucg ccaaugccuu a 21 <210> 1572 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1572 ucagucgcca augccuucau a 21 <210> 1573 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1573 agucgccaau gccuucauca a 21 <210> 1574 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1574 gccaaugccu ucaucaucug a 21 <210> 1575 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1575 ccuucaucau cuguggcacc a 21 <210> 1576 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1576 ccuucaucau cuguggcacc a 21 <210> 1577 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1577 cuguggcacc uuguacaccg a 21 <210> 1578 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1578 cuaccgucaa cuuugcuuau a 21 <210> 1579 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1579 cuaccgucaa cuuugcuuau a 21 <210> 1580 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1580 uaccgucaac uuugcuuaug a 21 <210> 1581 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1581 uaccgucaac uuugcuuaug a 21 <210> 1582 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1582 uaccgucaac uuugcuuaug a 21 <210> 1583 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1583 uaccgucaac uuugcuuaug a 21 <210> 1584 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1584 uaccgucaac uuugcuuaug a 21 <210> 1585 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1585 uacccucaac uuugcuuaug a 21 <210> 1586 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1586 uacggucaac uuugcuuaug a 21 <210> 1587 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1587 uagcgucaac uuugcuuaug a 21 <210> 1588 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1588 uaccgucaac uuugcuuaug a 21 <210> 1589 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1589 uaccgucaac uuugcuuaug a 21 <210> 1590 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1590 accgucaacu uugcuuauga a 21 <210> 1591 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1591 accgucaacu uugcuuauga a 21 <210> 1592 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1592 ccgucaacuu ugcuuauga 19 <210> 1593 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1593 ccgucaacuu ugcuuaugac a 21 <210> 1594 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1594 cgucaacuuu gcuuaugaca a 21 <210> 1595 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1595 gucaacuuug cuuaugacac a 21 <210> 1596 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1596 ucaacuuugc uuaugacaca a 21 <210> 1597 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1597 ucaacuuugc uuaugacaca a 21 <210> 1598 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1598 caacuuugcu uaugacacag a 21 <210> 1599 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1599 aacuuugcuu augacacagg a 21 <210> 1600 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1600 acuuugcuua ugacacaggc a 21 <210> 1601 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1601 cuuugcuuau gacacaggca a 21 <210> 1602 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1602 acaggcacag guaucagcaa a 21 <210> 1603 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1603 auaaguacag cagcaugauu a 21 <210> 1604 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence 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<400> 1657 uugaacaugg ucacuuauga a 21 <210> 1658 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1658 uugaacaugg ucacuuauga a 21 <210> 1659 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1659 uugaacaugg ucacuuauga a 21 <210> 1660 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1660 uugaacaugg ucacuuauga a 21 <210> 1661 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1661 uugaucaugg ucacuuauga a 21 <210> 1662 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1662 uuguacaugg ucacuuauga a 21 <210> 1663 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1663 uucaacaugg ucacuuauga a 21 <210> 1664 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1664 uugaacaugg ucacuuauga a 21 <210> 1665 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1665 uugaacaugg ucacuuauga a 21 <210> 1666 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1666 ugaacauggu cacuuauga 19 <210> 1667 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1667 ugaacauggu cacuuaugac a 21 <210> 1668 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1668 gaacaugguc acuuaugaa 19 <210> 1669 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1669 gaacaugguc acuuaugaca a 21 <210> 1670 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1670 aacaugguca cuuaugacau a 21 <210> 1671 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1671 acauggucac uuaugacauc a 21 <210> 1672 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1672 acauggucac uuaugacauc a 21 <210> 1673 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1673 acauggucac uuaugacauc a 21 <210> 1674 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1674 cauggucacu uaugacauca a 21 <210> 1675 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1675 auggucacuu augacaucaa a 21 <210> 1676 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1676 uggucacuua ugacaucaag a 21 <210> 1677 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1677 ggucacuuau gacaucaagc a 21 <210> 1678 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1678 gucacuuaug acaucaagcu a 21 <210> 1679 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1679 gcagaaggag augcucaggg a 21 <210> 1680 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1680 aagggagagc cagccagcca a 21 <210> 1681 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1681 gaugaacaug gucaccaucu a 21 <210> 1682 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1682 gcauuuaugg gauguuuaau a 21 <210> 1683 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1683 uguuuaauga cauaguucaa a 21 <210> 1684 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1684 uguuuaauga cauaguucaa a 21 <210> 1685 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1685 uguuuaauga cauaguucaa a 21 <210> 1686 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1686 guuuaaugac auaguucaag a 21 <210> 1687 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1687 guuuaaugac auaguucaag a 21 <210> 1688 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1688 uuuaaugaca uaguucaagu a 21 <210> 1689 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1689 uuaaugacau aguucaaguu a 21 <210> 1690 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1690 uaaugacaua guucaaguuu a 21 <210> 1691 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1691 uaaugacaua guucaaguuu a 21 <210> 1692 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1692 aaugacauag uucaaguuuu a 21 <210> 1693 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1693 aaugacauag uucaaguuuu a 21 <210> 1694 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1694 augacauagu ucaaguuuuc a 21 <210> 1695 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1695 ugacauaguu caaguuuucu a 21 <210> 1696 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1696 gacauaguuc aaguuuucuu a 21 <210> 1697 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1697 acauaguuca aguuuucuug a 21 <210> 1698 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1698 acauaguuca aguuuucuug a 21 <210> 1699 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1699 acauaguuca aguuuucuug a 21 <210> 1700 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1700 acauaguuca aguuuucuug a 21 <210> 1701 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1701 acauuguuca aguuuucuug a 21 <210> 1702 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1702 acaaaguuca aguuuucuug a 21 <210> 1703 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1703 acuuaguuca aguuuucuug a 21 <210> 1704 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1704 acauaguuca aguuuucuug a 21 <210> 1705 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1705 cauaguucaa guuuucuugu a 21 <210> 1706 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1706 auaguucaag uuuucuuga 19 <210> 1707 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1707 auaguucaag uuuucuuga 19 <210> 1708 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1708 auaguucaag uuuucuugug a 21 <210> 1709 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1709 uaguucaagu uuucuuguga a 21 <210> 1710 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1710 uaguucaagu uuucuuguga a 21 <210> 1711 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1711 aguucaaguu uucuugugau a 21 <210> 1712 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1712 aguucaaguu uucuugugau a 21 <210> 1713 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1713 guucaaguuu ucuugugauu a 21 <210> 1714 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1714 guucaaguuu ucuugugauu a 21 <210> 1715 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1715 uucaaguuuu cuugugauuu a 21 <210> 1716 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1716 ucaaguuuuc uugugauuug a 21 <210> 1717 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1717 ucaaguuuuc uugugauuug a 21 <210> 1718 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1718 ucaaguuuuc uugugauuug a 21 <210> 1719 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1719 ucaaguuuuc uugugauuug a 21 <210> 1720 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1720 caaguuuucu ugugauuugg a 21 <210> 1721 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1721 aaguuuucuu gugauuuggg a 21 <210> 1722 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1722 ugaaaaccau ugcucuugca a 21 <210> 1723 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1723 gaaaaccauu gcucuugcau a 21 <210> 1724 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1724 gaaaaccauu gcucuugcau a 21 <210> 1725 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1725 aaaaccauug cucuugcaug a 21 <210> 1726 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1726 aaaaccauug cucuugcaug a 21 <210> 1727 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1727 aaaccauugc ucuugcaugu a 21 <210> 1728 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1728 aaaccauugc ucuugcaugu a 21 <210> 1729 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1729 aaccauugcu cuugcauguu a 21 <210> 1730 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1730 accauugcuc uugcauguua a 21 <210> 1731 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1731 ccauugcucu ugcauguuac a 21 <210> 1732 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1732 cauugcucuu gcauguuaca a 21 <210> 1733 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1733 cauugcucuu gcauguuaca a 21 <210> 1734 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1734 auugcucuug cauguuacau a 21 <210> 1735 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1735 uugcucuugc auguuacaug a 21 <210> 1736 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1736 uugcucuugc auguuacaug a 21 <210> 1737 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1737 uugcacuugc auguuacaug a 21 <210> 1738 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1738 uuggucuugc auguuacaug a 21 <210> 1739 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1739 uuccucuugc auguuacaug a 21 <210> 1740 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1740 uugcucuugc auguuacaug a 21 <210> 1741 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1741 uugcucuugc auguuacaug a 21 <210> 1742 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1742 uugcucuugc auguuacaug a 21 <210> 1743 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1743 ugcucuugca uguuacaugg a 21 <210> 1744 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1744 gcucuugcau guuacauga 19 <210> 1745 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1745 gcucuugcau guuacauggu a 21 <210> 1746 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1746 cucuugcaug uuacaugguu a 21 <210> 1747 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1747 cucuugcaug uuacaugguu a 21 <210> 1748 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1748 ucuugcaugu uacaugguua a 21 <210> 1749 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1749 cuugcauguu acaugguuac a 21 <210> 1750 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1750 cuugcauguu acaugguuac a 21 <210> 1751 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1751 uugcauguua caugguuacc a 21 <210> 1752 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1752 uugcauguua caugguuacc a 21 <210> 1753 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1753 uugcauguua caugguuacc a 21 <210> 1754 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1754 ugcauguuac augguuacca a 21 <210> 1755 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1755 gcauguuaca ugguuaccac a 21 <210> 1756 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1756 gcauguuaca ugguuaccac a 21 <210> 1757 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1757 cauguuacau gguuaccaca a 21 <210> 1758 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1758 auguuacaug guuaccacaa a 21 <210> 1759 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1759 uguuacaugg uuaccacaag a 21 <210> 1760 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1760 cuccucuggc cagcaucgaa a 21 <210> 1761 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1761 auauaaguaa gaugcauuua a 21 <210> 1762 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1762 uauaaguaag augcauuuac a 21 <210> 1763 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1763 auaaguaaga ugcauuuacu a 21 <210> 1764 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1764 uaaguaagau gcauuuacua a 21 <210> 1765 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1765 aaguaagaug cauuuacuac a 21 <210> 1766 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1766 aaguaagaug cauuuacuac a 21 <210> 1767 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1767 aaguaagaug cauuuacuac a 21 <210> 1768 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1768 aaguaagaug cauuuacuac a 21 <210> 1769 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1769 aaguaagaug cauuuacuac a 21 <210> 1770 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1770 aaguaagatg cauuuacuac a 21 <210> 1771 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1771 aaguaagaug cauuuacuac a 21 <210> 1772 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1772 aaguuagaug cauuuacuac a 21 <210> 1773 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1773 aagaaagaug cauuuacuac a 21 <210> 1774 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1774 aacuaagaug cauuuacuac a 21 <210> 1775 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1775 aaguaagaug cauuuacuac a 21 <210> 1776 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1776 aaguaagaug cauuuacuac a 21 <210> 1777 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1777 aguaagaugc auuuacuaca a 21 <210> 1778 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1778 guaagaugca uuuacuaca 19 <210> 1779 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1779 uuggcuucua augcuucaga a 21 <210> 1780 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1780 cuucuaaugc uucagauaga a 21 <210> 1781 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1781 cuucuaaugc 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1786 uaaagctcug cugugcugag agg 23 <210> 1787 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1787 uucctctgga aagcucugcu gug 23 <210> 1788 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1788 ugugcacaga agaaccucau ugc 23 <210> 1789 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1789 ugugcacaga agaaccucau ugc 23 <210> 1790 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1790 ucgugcacag aagaaccuca uug 23 <210> 1791 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1791 uacgugcaca gaagaaccuc auu 23 <210> 1792 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1792 uacgtgcaca gaagaaccuc auu 23 <210> 1793 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1793 uaacgugcac agaagaaccu cau 23 <210> 1794 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1794 ucaacgugca cagaagaacc uca 23 <210> 1795 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1795 ucaacgtgca cagaagaacc ucg 23 <210> 1796 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1796 ucaacgtgca cagaagaacc ucg 23 <210> 1797 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1797 ucaacgtgca cagaagaacc ucg 23 <210> 1798 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1798 ucaacgtgca cagaaguacc ucg 23 <210> 1799 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1799 ucaacgtgca cagaagaucc ucg 23 <210> 1800 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1816 uaaagctgca gcaacgugca cag 23 <210> 1817 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1817 uccaaagcug cagcaacgug cac 23 <210> 1818 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1818 ucccaaagcu gcagcaacgu gca 23 <210> 1819 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1819 uagctggaca gcuggcaucu cag 23 <210> 1820 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1820 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oligonucleotide <400> 1826 uaucccacac caggcaggcc aga 23 <210> 1827 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1827 uacatcacac accaggcagg cca 23 <210> 1828 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1828 uacatcccac accaggcagg cca 23 <210> 1829 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1829 uauacuggca ucggccacuc ugg 23 <210> 1830 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1830 uucatuggga cuggccacac uga 23 <210> 1831 <211> 23 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Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1839 uaactctcug guuuggguuu cca 23 <210> 1840 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1840 uugtctcgga ggagguugcu gua 23 <210> 1841 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1841 uugucucgga ggagguugcu gua 23 <210> 1842 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1842 ucutgtcucg gaggagguug cug 23 <210> 1843 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1843 ucuugtctcg gaggagguug cug 23 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of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1848 ucaacctccu ggccagauuc uca 23 <210> 1849 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1849 ugctutccaa ccuccuggcc aga 23 <210> 1850 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1850 ugcutuccaa ccuccuggcc aga 23 <210> 1851 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1851 ugcctugcua ccuccuggcu gcu 23 <210> 1852 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1852 uuuctctgga gccugguggc aca 23 <210> 1853 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1853 uaaggccaaa guguccaaau ucc 23 <210> 1854 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1854 uaaggccaaa guguccaaau ucc 23 <210> 1855 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1855 uuuccuggaa ggccaaagug ucc 23 <210> 1856 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1856 ucagtuccug gaaggccaaa gug 23 <210> 1857 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1857 uuagcucgga cuucaguucc ugg 23 <210> 1858 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1858 uuagctcgga cuucaguucc ugg 23 <210> 1859 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1859 ucuucaguua gcucggacuu cag 23 <210> 1860 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1860 uaagcaggaa cuucaguuag cuc 23 <210> 1861 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1861 ugaagcagga acuucaguua gcu 23 <210> 1862 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1862 uauucgggaa gcaggaacuu cag 23 <210> 1863 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1863 uucctaccca aacuaguucu cca 23 <210> 1864 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1864 uuccuaccca aacuaguucu cca 23 <210> 1865 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1865 ugcucuccua cccaaacuag uuc 23 <210> 1866 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1866 ugctctcuac ccaaacuagu uc 22 <210> 1867 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1867 ucgugagagg cucuccuacc caa 23 <210> 1868 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1868 uagcgugaga ggcucuccua ccc 23 <210> 1869 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1869 uagcgugaga ggcucuccua ccc 23 <210> 1870 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1870 ucagcgtgag aggcucuccu acc 23 <210> 1871 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1871 uucagcguga gaggcucucc uac 23 <210> 1872 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1872 ucugtucuca gcgugagagg cuc 23 <210> 1873 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1873 ucugutcuca gcgugagagg cuc 23 <210> 1874 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1874 ucugutctca gcgugagagg cuc 23 <210> 1875 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1875 uuuucugcug uucucagcgu gag 23 <210> 1876 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1876 uguutctgcu guucucagcg uga 23 <210> 1877 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1877 uugutucugc uguucucagc gug 23 <210> 1878 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1878 uugtutcugc uguucucagc gug 23 <210> 1879 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1879 uuugtutcug cuguucucag cgu 23 <210> 1880 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1880 uauugutucu gcuguucuca gcg 23 <210> 1881 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1881 uaautgtuuc ugcuguucuc agc 23 <210> 1882 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1882 uuaatuguuu cugcuguucu cag 23 <210> 1883 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1883 uguaautguu ucugcuguuc uca 23 <210> 1884 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1884 uguaautguu ucugcuguuc uca 23 <210> 1885 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1893 ucagtaauug utucugcugu ucu 23 <210> 1894 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1894 uccaguaauu gtuucugcug uuc 23 <210> 1895 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1895 ucagtaauug utucugcugu u 21 <210> 1896 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1896 ugccagtaau uguuucugcu guu 23 <210> 1897 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1897 uugccaguaa uuguuucugc ugu 23 <210> 1898 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1898 uuugccagua auuguuucug cug 23 <210> 1899 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1899 ucuugccagu aauuguuucu gcu 23 <210> 1900 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1900 ucuugccagu aauuguuucu gcu 23 <210> 1901 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1901 uacutgacag uaauuguuuc ugc 23 <210> 1902 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1902 uuactugcca guaauuguuu cug 23 <210> 1903 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1903 uauacutgcc aguaauuguu ucu 23 <210> 1904 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1904 ucauactugc caguaauugu uuc 23 <210> 1905 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1905 ucauactugc caguaauugu uuc 23 <210> 1906 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1906 uauccacaca ccauacuugc cag 23 <210> 1907 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1907 uauccacaca ccauacuugc cag 23 <210> 1908 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1908 uauccacaca ccauacuugc cag 23 <210> 1909 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1909 ugcatccaca caccauacuu gcc 23 <210> 1910 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1910 ugcauccaca caccauacuu gcc 23 <210> 1911 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1911 uggctgauga ggucauacuc aaa 23 <210> 1912 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1912 uuggcugaug aggucauacu caa 23 <210> 1913 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1913 ucuggctgau gaggucauac uca 23 <210> 1914 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1914 uacuggcuga ugaggucaua cuc 23 <210> 1915 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1915 uacuggctga ugaggucaua cuc 23 <210> 1916 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1916 uaactggcug augaggucau acu 23 <210> 1917 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1917 uaaacuggcu gaugagguca uac 23 <210> 1918 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1918 uuaaactggc ugaugagguc aua 23 <210> 1919 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1919 uauaaacugg ctgaugaggu cau 23 <210> 1920 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1920 ucauaaacug gcugaugagg uca 23 <210> 1921 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1921 ugcauaaacu ggcugaugag guc 23 <210> 1922 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1922 ugcataaacu ggcugaugag guc 23 <210> 1923 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1923 ugcataaacu ggcugaugag guc 23 <210> 1924 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1924 ugcataaacu ggcugaugag guc 23 <210> 1925 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1925 ugcataaacu ggcugaugag guc 23 <210> 1926 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1926 ugcataaacu ggcugaugag guc 23 <210> 1927 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1927 ugcataaacu ggcugaugag guc 23 <210> 1928 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1928 ugcataaacu ggcugaagag guc 23 <210> 1929 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1929 ugcataaacu ggcugaucag guc 23 <210> 1930 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1930 ugcataaacu ggcugaugug guc 23 <210> 1931 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1931 ugcataaacu ggcugaugag guc 23 <210> 1932 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1932 utgcauaaac uggcugauga ggu 23 <210> 1933 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1933 ugcataaacu ggcugaugag g 21 <210> 1934 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1934 ucugcataaa cuggcugaug agg 23 <210> 1935 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1935 ucugcataaa ctggcugaug agg 23 <210> 1936 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1936 uccugcauaa acuggcugau gag 23 <210> 1937 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1937 uccctgcaua aacuggcuga uga 23 <210> 1938 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1938 ucccugcaua aacuggcuga uga 23 <210> 1939 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1939 ugcccugcau aaacuggcug aug 23 <210> 1940 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1940 uagccctgca uaaacuggcu gau 23 <210> 1941 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1941 uuagcccugc auaaacuggc uga 23 <210> 1942 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1942 uuagccctgc auaaacuggc uga 23 <210> 1943 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1943 uguagcccug cauaaacugg cug 23 <210> 1944 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1944 uguagcacug cauaaacugg cug 23 <210> 1945 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1945 ugguagcccu gcauaaacug gcu 23 <210> 1946 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1946 ugguagaccu gcauaaacug gcu 23 <210> 1947 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1947 ucuuagaagg gtagcccugc aua 23 <210> 1948 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1948 uccgagtaca ccacagcacc cgu 23 <210> 1949 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1949 uccgagtaca ccacagcacc cgu 23 <210> 1950 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1950 ucgccctgga aauagaggcu ccc 23 <210> 1951 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1951 ucgccctgga aauagaggcu ccc 23 <210> 1952 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1952 ucagcgcccu ggaaauagag gcu 23 <210> 1953 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1953 ucuggacuca gcgcccugga aau 23 <210> 1954 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1954 ucuggacuca gcgcccugga aau 23 <210> 1955 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1955 ucuggactca gcgcccugga aau 23 <210> 1956 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1956 uagutctgga cucagcgccc ugg 23 <210> 1957 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1957 ucagtucugg acucagcgcc cug 23 <210> 1958 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1958 ucagutcugg acucagcgcc cug 23 <210> 1959 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1959 ucagtucugg acucagcgcc cug 23 <210> 1960 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1960 uacagutcug gacucagcgc ccu 23 <210> 1961 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1961 ugacagtucu ggacucagcg ccc 23 <210> 1962 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1962 uugacaguuc uggacucagc gcc 23 <210> 1963 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1963 uaugacaguu cuggacucag cgc 23 <210> 1964 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1964 uuaugacagu ucuggacuca gcg 23 <210> 1965 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1965 uuatgacagu ucuggacuca gcg 23 <210> 1966 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1966 uuaugacagu ucuggacuca gcg 23 <210> 1967 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1967 uuuatgacag uucuggacuc agc 23 <210> 1968 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1968 ucuuaugaca guucuggacu cag 23 <210> 1969 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1969 ucuuaugaca gtucuggacu cag 23 <210> 1970 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1970 uucutatgac aguucuggac uca 23 <210> 1971 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1971 utcutatgac aguucuggac uca 23 <210> 1972 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1972 uaucuuauga caguucugga cuc 23 <210> 1973 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1973 uauctuauga caguucugga cuc 23 <210> 1974 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1974 uauctuauga caguucugga cuc 23 <210> 1975 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1975 uauctuauga caguucugga cuc 23 <210> 1976 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1976 uauctuauga caguucugga cuc 23 <210> 1977 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1977 uauctuauga caguucagga cuc 23 <210> 1978 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1978 uauctuauga caguucucga cuc 23 <210> 1979 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1979 uauctuauga caguucugga cuc 23 <210> 1980 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1980 uauctuauga caguucugga cuc 23 <210> 1981 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1981 uauctuauga caguucugga cuc 23 <210> 1982 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1982 uuaucutaug acaguucugg acu 23 <210> 1983 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1983 uauctuauga caguucuggg c 21 <210> 1984 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1984 uauatctuau gacaguucug gac 23 <210> 1985 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1985 ucauaucuua ugacaguucu gga 23 <210> 1986 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1986 ucatatcuua ugacaguucu gga 23 <210> 1987 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1987 ucauaucuua ugacaguucu gga 23 <210> 1988 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1988 uucatatcuu augacaguuc ugg 23 <210> 1989 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1989 utcatatcuu atgacaguuc ugg 23 <210> 1990 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1990 ucucauaucu uaugacaguu cug 23 <210> 1991 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1991 ugcucatauc uuaugacagu ucu 23 <210> 1992 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1992 uagctcauau cuuaugacag uuc 23 <210> 1993 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1993 ucagcucaua ucuuaugaca guu 23 <210> 1994 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1994 ucagctcaua ucuuaugaca guu 23 <210> 1995 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1995 ucagctcaua ucuuaugaca guu 23 <210> 1996 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1996 uucagctcau aucuuaugac agu 23 <210> 1997 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1997 uuautcagcu cauaucuuau gac 23 <210> 1998 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1998 uuucactguc ucgguauuca gcu 23 <210> 1999 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1999 ucagcctuca cugucucggu auu 23 <210> 2000 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2000 ucagcctuca ctgucucggu auu 23 <210> 2001 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2001 uucctucuca gccuucacug ucu 23 <210> 2002 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2002 uuccutcuca gccuucacug ucu 23 <210> 2003 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2003 uuccutctca gccuucacug ucu 23 <210> 2004 <211> 23 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DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2013 uggcgacuga ctgcuuacgg aug 23 <210> 2014 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2014 ucautggcga cugacugcuu acg 23 <210> 2015 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2015 uaaggcauug gcgacugacu gcu 23 <210> 2016 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2016 uaugaaggca uuggcgacug acu 23 <210> 2017 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2017 uugatgaagg cauuggcgac uga 23 <210> 2018 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2018 ucagaugaug aaggcauugg cga 23 <210> 2019 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2019 uggugccaca gaugaugaag gca 23 <210> 2020 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2020 uggugccaca gaugaugaag gca 23 <210> 2021 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2021 ucggtgtaca aggugccaca gau 23 <210> 2022 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2022 uauaagcaaa guugacggua gca 23 <210> 2023 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2023 uauaagcaaa guugacggua gca 23 <210> 2024 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2024 ucauaagcaa aguugacggu agc 23 <210> 2025 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2025 ucauaagcaa aguugacggu agc 23 <210> 2026 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2026 ucauaagcaa aguugacggu agc 23 <210> 2027 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2027 ucataagcaa aguugacggu agc 23 <210> 2028 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2028 ucauaagcaa aguugacggu agc 23 <210> 2029 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2029 ucauaagcaa aguugagggu agc 23 <210> 2030 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2030 ucauaagcaa aguugaccgu agc 23 <210> 2031 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2031 ucauaagcaa aguugacgcu agc 23 <210> 2032 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2032 ucauaagcaa aguugacggu agc 23 <210> 2033 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2033 ucauaagcaa aguugacggu agc 23 <210> 2034 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2110 ucauaaguga ccauguucag g 21 <210> 2111 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2111 ugucauaagu gaccauguuc aag 23 <210> 2112 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2112 uucataagug accauguucg g 21 <210> 2113 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2113 uugucataag ugaccauguu caa 23 <210> 2114 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2114 uaugtcauaa gugaccaugu uca 23 <210> 2115 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2115 ugaugucaua agugaccaug uuc 23 <210> 2116 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2116 ugatgtcaua agugaccaug uuc 23 <210> 2117 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2117 ugaugtcaua agugaccaug uuc 23 <210> 2118 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2118 uugatgtcau aagugaccau guu 23 <210> 2119 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2119 uuugauguca uaagugacca ugu 23 <210> 2120 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2120 ucuugatguc auaagugacc aug 23 <210> 2121 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2121 ugcutgaugu cauaagugac cau 23 <210> 2122 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2122 uagctugaug ucauaaguga cca 23 <210> 2123 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2123 uccctgagca ucuccuucug cca 23 <210> 2124 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2124 uuggcuggcu ggcucucccu uca 23 <210> 2125 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2125 uagatgguga ccauguucau ccu 23 <210> 2126 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2126 uauuaaacau cccauaaaug cug 23 <210> 2127 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2127 uuugaacuau gucauuaaac auc 23 <210> 2128 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2128 uuugaacuau gucauuaaac auc 23 <210> 2129 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2129 uuugaactau gucauuaaac auc 23 <210> 2130 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2130 ucuugaacua ugucauuaaa cau 23 <210> 2131 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2131 ucuugaacua ugucauuaaa cau 23 <210> 2132 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2132 uacutgaacu augucauuaa aca 23 <210> 2133 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2133 uaactugaac uaugucauua aac 23 <210> 2134 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2134 uaaacutgaa cuaugucauu aaa 23 <210> 2135 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2135 uaaacutgaa ctaugucauu aaa 23 <210> 2136 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2136 uaaaactuga acuaugucau uaa 23 <210> 2137 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2137 uaaaactuga acuaugucau uaa 23 <210> 2138 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2138 ugaaaacuug aacuauguca uua 23 <210> 2139 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2139 uagaaaacuu gaacuauguc auu 23 <210> 2140 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2140 uaagaaaacu ugaacuaugu cau 23 <210> 2141 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2141 ucaagaaaac uugaacuaug uca 23 <210> 2142 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2142 ucaagaaaac utgaacuaug ucg 23 <210> 2143 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2143 ucaagaaaac uugaacuaug ucg 23 <210> 2144 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2144 ucaagaaaac utgaacuaug ucg 23 <210> 2145 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2145 ucaagaaaac uugaacaaug ucg 23 <210> 2146 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2146 ucaagaaaac uugaacuuug ucg 23 <210> 2147 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2147 ucaagaaaac uugaacuaag ucg 23 <210> 2148 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2148 ucaagaaaac utgaacuaug uca 23 <210> 2149 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2149 uacaagaaaa ctugaacuau guc 23 <210> 2150 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2150 ucaagaaaac uugaacuaug u 21 <210> 2151 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2151 ucaagaaaac utgaacuaug u 21 <210> 2152 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2152 ucacaagaaa acuugaacua ugu 23 <210> 2153 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2153 uucacaagaa aacuugaacu aug 23 <210> 2154 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2154 utcacaagaa aacuugaacu aug 23 <210> 2155 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2155 uaucacaaga aaacuugaac uau 23 <210> 2156 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2156 uaucacaaga aaacuugaac uau 23 <210> 2157 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2157 uaaucacaag aaaacuugaa cua 23 <210> 2158 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2158 uaatcacaag aaaacuugaa cua 23 <210> 2159 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2159 uaaatcacaa gaaaacuuga acu 23 <210> 2160 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2160 ucaaaucaca agaaaacuug aac 23 <210> 2161 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2161 ucaaatcaca agaaaacuug aac 23 <210> 2162 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2162 ucaaatcaca agaaaacuug aac 23 <210> 2163 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2163 ucaaaucaca agaaaacuug aac 23 <210> 2164 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2164 uccaaatcac aagaaaacuu gaa 23 <210> 2165 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2165 ucccaaauca caagaaaacu uga 23 <210> 2166 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2166 uugcaagagc aaugguuuuc agg 23 <210> 2167 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial 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oligonucleotide <400> 2172 uacaugcaag agcaaugguu uuc 23 <210> 2173 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2173 uaacaugcaa gagcaauggu uuu 23 <210> 2174 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2174 uuaacatgca agagcaaugg uuu 23 <210> 2175 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2175 uguaacaugc aagagcaaug guu 23 <210> 2176 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2176 uuguaacaug caagagcaau ggu 23 <210> 2177 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2177 uugtaacaug caagagcaau ggu 23 <210> 2178 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2178 uaugtaacau gcaagagcaa ugg 23 <210> 2179 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2179 ucauguaaca ugcaagagca aug 23 <210> 2180 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2180 ucauguaaca ugcaagagca aug 23 <210> 2181 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2181 ucauguaaca ugcaagugca aug 23 <210> 2182 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2182 ucauguaaca ugcaagacca aug 23 <210> 2183 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2183 ucauguaaca ugcaagagga aug 23 <210> 2184 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2184 ucauguaaca ugcaagagca aug 23 <210> 2185 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2185 ucauguaaca ugcaagagca aug 23 <210> 2186 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2186 ucauguaaca ugcaagagca aug 23 <210> 2187 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2187 uccatgtaac augcaagagc aau 23 <210> 2188 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2188 ucauguaaca ugcaagagcg g 21 <210> 2189 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2189 uaccauguaa caugcaagag caa 23 <210> 2190 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2190 uaaccatgua acaugcaaga gca 23 <210> 2191 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2191 uaaccatgua acaugcaaga gca 23 <210> 2192 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2192 uuaaccaugu aacaugcaag agc 23 <210> 2193 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2193 uguaaccaug uaacaugcaa gag 23 <210> 2194 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2194 uguaaccaug uaacaugcaa gag 23 <210> 2195 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2195 ugguaaccau guaacaugca aga 23 <210> 2196 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2196 uggtaaccau guaacaugca aga 23 <210> 2197 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2197 ugguaaccau gtaacaugca aga 23 <210> 2198 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial 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oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2202 uuugtgguaa ccauguaaca ugc 23 <210> 2203 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2203 ucuuguggua accauguaac aug 23 <210> 2204 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2204 utucgatgcu ggccagagga gcu 23 <210> 2205 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2205 uuaaaugcau cuuacuuaua uuc 23 <210> 2206 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2206 uguaaatgca ucuuacuuau auu 23 <210> 2207 <211> 23 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Claims (41)

  1. 미오실린(MYOC)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서, 상기 dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하되, 상기 안티센스 가닥은 표 2a 및 표 2b 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 하나로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 센스 가닥은 상기 안티센스 서열에 상응하는 표 2a 및 표 2b 중 어느 하나에 열거된 센스 서열로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 듀플렉스 AD-1565804의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 센스 가닥은 듀플렉스 AD-1565804의 센스 가닥 뉴클레오타이드 서열로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 듀플렉스 AD-1565837의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 센스 가닥은 듀플렉스 AD-1565837의 센스 가닥 뉴클레오타이드 서열로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 0, 1, 2, 또는 3개의 미스매치와 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥 중 적어도 하나는 하나 이상의 친유성 모이어티에 접합되는, dsRNA 제제.
  5. 제4항에 있어서, 상기 친유성 모이어티는 링커 또는 캐리어를 통해 접합되는, dsRNA 제제.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 친유성 모이어티는 적어도 하나의 가닥 상에서 하나 이상의 내부 위치에 접합되는, dsRNA 제제.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥 중 적어도 하나는 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD)-펩타이드 또는 RGD 펩타이드 모사체 중 하나 이상에 접합되는, dsRNA 제제.
  8. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친유성 모이어티는 지방족, 지환족 또는 폴리지환족 화합물인, dsRNA 제제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 친유성 모이어티는 포화 또는 불포화 C16 탄화수소 쇄를 함유하는, dsRNA 제제.
  10. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친유성 모이어티는 상기 내부 위치(들) 또는 상기 이중 가닥 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드(들)를 대체하는 캐리어를 통해 접합되는, dsRNA 제제.
  11. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친유성 모이어티는 에테르, 티오에테르, 우레아, 카보네이트, 아민, 아미드, 말레이미드-티오에테르, 디설파이드, 포스포디에스테르, 술폰아미드 결합, 클릭 반응의 생성물 또는 카바메이트를 함유하는 링커를 통해 이중 가닥 iRNA 제제에 접합되는, dsRNA 제제.
  12. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친유성 모이어티는 핵염기, 당 모이어티, 또는 뉴클레오사이드 간 결합에 접합되는, 이중 가닥 iRNA 제제.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsRNA 제제가 적어도 하나의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  14. 제13항에 있어서, 5개 이하의 상기 센스 가닥 뉴클레오타이드 및 5개 이하의 상기 안티센스 가닥 뉴클레오타이드는 미변형 뉴클레오타이드인, dsRNA 제제.
  15. 제13항에 있어서, 상기 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드 및 상기 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형을 포함하는, dsRNA 제제.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 데옥시-뉴클레오타이드, 3'-말단 데옥시-티민(dT) 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 변형 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오타이드, 잠김 뉴클레오타이드, 잠김 해제된 뉴클레오타이드, 입체적으로 제한된 뉴클레오타이드, 구속된 에틸 뉴클레오타이드, 무염기 뉴클레오타이드, 2'-아미노-변형 뉴클레오타이드, 2'-O-알릴-변형 뉴클레오타이드, 2'-C-알킬-변형 뉴클레오타이드, 2'-메톡시에틸 변형 뉴클레오타이드, 2'-O-알킬-변형 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포라미데이트, 뉴클레오타이드를 포함하는 비-천연 염기, 테트라하이드로피란 변형 뉴클레오타이드, 1,5-안하이드로헥시톨 변형 뉴클레오타이드, 시클로헥세닐 변형 뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오타이드, 메틸포스포네이트기를 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-포스페이트 모사체를 포함하는 뉴클레오타이드, 글리콜 변형 뉴클레오타이드, 및 2-O-(N-메틸아세트아미드) 변형 뉴클레오타이드; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, dsRNA 제제.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 뉴클레오타이드 2개의 3' 오버행을 포함하는, dsRNA 제제.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역은 길이가 15~30개의 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
  19. 제18항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역은 길이가 17~23개의 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 가닥은 19~30개의 뉴클레오타이드를 갖는, dsRNA 제제.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함하는, dsRNA 제제.
  22. 제4항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드, 예를 들어, 안구 조직을 표적으로 하는 리간드를 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
  23. 제22항에 있어서, 상기 안구 조직은 섬유주대 조직, 섬모체, 망막 조직, 망막 색소 상피(RPE) 또는 맥락막 조직, 예를 들어 맥락막 혈관인, dsRNA 제제.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에 포스페이트 또는 포스페이트 모사체를 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
  25. 제24항에 있어서, 상기 포스페이트 모사체는 5'-비닐 포스포네이트(VP)인, dsRNA 제제.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsRNA 제제는 MYOC를 암호화하는 mRNA의 핫스팟 영역을 표적으로 하는, dsRNA.
  27. 미오실린(MYOC) mRNA의 핫스팟 영역을 표적으로 하는 dsRNA 제제.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제를 함유하는 세포.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제를 포함하는, MYOC의 발현을 억제하기 위한 약제학적 조성물.
  30. 세포에서 MYOC의 발현을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 상기 세포를 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제 또는 제29항의 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 생산된 세포를 MYOC mRNA, MYOC 단백질, 또는 MYOC mRNA 및 단백질 둘 다의 수준을 감소시키기에 충분한 시간 동안 유지시켜, 상기 세포에서 MYOC의 발현을 억제하는 단계를 포함하는, 방법
  31. 제30항에 있어서, 상기 세포는 대상체 내에 존재하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 대상체는 MYOC 관련 장애, 예를 들어, 녹내장(예를 들어, 원발성 개방각 녹내장(POAG), 폐쇄각 녹내장, 선천성 녹내장, 및 속발 녹내장)을 진단받은, 방법.
  34. MYOC 관련 장애를 진단받은 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제 또는 제29항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하여 상기 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 MYOC 관련 장애는 녹내장인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 녹내장은 원발성 개방각 녹내장(POAG)인, 방법.
  37. 제34항 내지 36항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 상기 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 완화시키는 것을 포함하는, 방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 (a) MYOC의 발현 또는 활성을 억제 또는 감소시키거나; (b) 오접힘 MYOC 단백질의 수준을 감소시키거나; (c) 섬유주대 세포 사멸을 감소시키거나; (d) 안압을 감소시키거나; (e) 시력을 증가시키는 것을 포함하는, 방법.
  39. 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsRNA 제제가 상기 대상체에게 안구내, 정맥내, 또는 국소 투여되는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 안구내 투여는 유리체내 투여(예를 들어, 유리체내 주사), 경공막 투여(예를 들어, 경공막 주사), 결막하 투여(예를 들어, 결막하 주사), 안구후 투여(예를 들어, 안구후 주사), 전방내 투여(예를 들어, 전방내 주사), 또는 망막하 투여(예를 들어, 망막하 주사)를 포함하는, 방법.
  41. 제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, MYOC 관련 장애의 치료 또는 예방에 적합한 추가 제제 또는 요법(예를 들어, 레이저 섬유주성형술 수술, 섬유주절제술 수술, 최소 침습성녹내장 수술, 눈 내 배액관 배치, 경구 약물, 또는 점안액)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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